ES2959242T3 - Agentes de reticulación y métodos asociados - Google Patents

Abstract

Una composición oftálmica o forma de dosificación puede incluir una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente reticulante y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición o forma de dosificación se puede usar para tratar una afección oftálmica administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición al ojo de un sujeto durante un período de tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes de reticulación y métodos asociados

Antecedentes

Varias afecciones oftálmicas pueden producir el adelgazamiento de la córnea y debilidad biomecánica de la córnea. En algunos casos, la forma de la córnea puede alterarse, provocando visión distorsionada, sensibilidad a la luz y otras complicaciones. Tales afecciones pueden incluir queratocono, úlceras corneales, ectasia corneal, degeneración marginal pelúcida y similares.

Por ejemplo, el queratocono (KCN) es un trastorno progresivo asociado con cambios estructurales en la organización del colágeno corneal que pueden conducir al adelgazamiento de la córnea y roturas en la capa de Bowman y/o la membrana de Descemet. Normalmente, la enfermedad se manifiesta en la segunda década de la vida, cuando la córnea adopta una forma más cónica, lo que conduce a astigmatismo irregular, miopía progresiva, adelgazamiento de la córnea y, posteriormente, mala agudeza visual. La prevalencia de KCN es variable y depende de consideraciones genéticas, geográficas, étnicas, de género y de diagnóstico, siendo la prevalencia más citada de 50 por 100000. La gravedad de la KCN a menudo se evalúa por el espesor corneal mínimo, asimetría inferior-superior o entre ojos, queratometría máxima o histéresis corneal.

El documento US 2003/175259 describe el uso de una lente de contacto rígida para dar forma a una córnea en combinación con agentes de reticulación para endurecer la córnea.

El documento US 2006/276777 se refiere a composiciones y métodos para moldear tejido corneal en un paciente. El documento WO 2014/065863 describe composiciones y métodos para promover la reticulación del colágeno. El documento US 2006/134226 describe una composición que incluye (a) xantofilas, (b) vitamina C, (c) vitamina E, (d) zinc y (e) cobre. Se describe además un método para tratar la degeneración macular en un ser humano.

El documento US 4490389 describe un método para esterilizar lentes de contacto y especialmente lentes de contacto hidrófilas (blandas), de modo que la lente se pone en contacto con una composición que comprende iones de cobre. Dudakova et al. ("Is copper imbalance an environmental factor influencing keratoconus development?",Medical Hypotheses,vol. 84, no. 5, páginas 518-524), Dudakova et al. ("Changes in lysyl oxidase (LOX) distribution and its decreased activity in keratoconus corneas",Experimental Eye Research,vol. 104, páginas 74-81) y Avetisov et al. ("The role of tear acidity and Cu-cofactor of lysyl oxidase activity in the pathogenesis of keratoconus",Annals of Ophthalmology,vol. 2, no. 127, 1 de marzo de 2011, páginas 3-8) discuten la función del cobre en la actividad de la lisil oxidasa en las córneas del queratocono y ofrecen la hipótesis de que niveles más bajos de Cu en las córneas del queratocono pueden conducir a una reticulación insuficiente del colágeno seguida de una pérdida de cohesión entre las fibrillas de colágeno, promoviendo así la ectasia corneal.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A es un gráfico que muestra mayor actividad de la lisil oxidasa en células de fibroblastos corneales en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 1B es otro gráfico que muestra mayor actividad de la lisil oxidasa en células de fibroblastos corneales en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 2A ilustra una cromatografía que muestra mayor reticulación de lisinonorleucina en una córnea de queratocono en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 2B ilustra una cromatografía que muestra que no hay reticulación de lisinonorleucina detectable en una córnea de queratocono no tratada.

La FIG. 2C ilustra una cromatografía que muestra reticulación de lisinonorleucina en una córnea normal.

La FIG. 3A ilustra una cromatografía que muestra mayor reticulación de histidino-hidroxilisinonorleucina en una córnea de queratocono en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 3B ilustra una cromatografía que muestra reticulación mínima de histidino-hidroxilisinonorleucina en una córnea de queratocono no tratada.

La FIG. 3C ilustra una cromatografía que muestra la reticulación de histidino-hidroxilisinonorleucina en una córnea normal.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra mayor resistencia corneal en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra una biomecánica corneal mejorada en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra mediciones de dioptrías corneales disminuidas en respuesta al tratamiento con Cu.

La FIG. 7A ilustra una imagen de una córnea teñida después de 6 semanas de tratamiento con Cu.

La FIG. 7B ilustra una imagen de una retina/coroides teñida después de 6 semanas de tratamiento con Cu.

Estos dibujos se proporcionan para ilustrar diversos aspectos de la invención y no pretenden ser limitativos del alcance en términos de dimensiones, materiales, configuraciones, disposiciones o proporciones a menos que las reivindicaciones lo limiten de otro modo.

Las referencias a métodos de tratamiento en el resumen y descripción detallada de la invención en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)

Descripción de realizaciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción.

Tal como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células.

En esta descripción, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden significar "incluye", "que incluye" y similares, y generalmente se interpretan como términos abiertos. Las expresiones "que consiste en" o "consiste en" son expresiones cerradas e incluyen sólo los componentes, estructuras, etapas o similares específicamente mencionados junto con dichas expresiones. "Que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente en" son expresiones generalmente cerradas, con la excepción de permitir la inclusión de artículos, materiales, componentes, etapas o elementos adicionales, que no afecten materialmente a las características o funciones básicas y novedosas del(de los) artículo(s) utilizados en relación con el mismo. Por ejemplo, los elementos en pequeñas cantidades presentes en una composición, pero que no afectan a la naturaleza o las características de la composición, estarían permitidos si estuvieran presentes bajo la expresión "que consiste esencialmente en", incluso aunque no se mencionen expresamente en una lista de artículos que siga a dicha terminología. Cuando se utiliza un término abierto, como "que comprende" o "que incluye", en la descripción escrita se entiende que se debe proporcionar apoyo directo también a la expresión "que consiste esencialmente en" así como a la expresión "que consiste en" como si se indicara explícitamente y viceversa.

Los términos "primero", "segundo", "tercero", "cuarto" y similares en la descripción y en las reivindicaciones, si los hay, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico particular. Debe entenderse que cualquier término así utilizado es intercambiable en circunstancias apropiadas, de modo que las realizaciones descritas en el presente documento sean, por ejemplo, capaces de funcionar en secuencias distintas a las ilustradas o descritas de otro modo en el presente documento. De manera similar, si en el presente documento se describe un método que comprende una serie de etapas, el orden de dichas etapas tal como se presenta en el presente documento no es necesariamente el único orden en el que se pueden realizar dichas etapas, y algunas de las etapas indicadas posiblemente se pueden omitir y/o algunas otras etapas no descritas en el presente documento se pueden añadir al método.

El término "acoplado", tal como se utiliza en el presente documento, se define como conectado directa o indirectamente de manera química, mecánica, eléctrica o no eléctrica. Los objetos descritos en el presente documento como "adyacentes" entre sí pueden estar en contacto físico entre sí, muy cerca unos de otros, o en la misma región o área general entre sí, según sea apropiado para el contexto en donde se usa la frase. Los casos en que aparece la frase "en una realización" o "en un aspecto" en el presente documento no necesariamente se refieren todos a la misma realización o aspecto.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "agente terapéutico", "agente activo" y similares se pueden usar indistintamente y se refieren a un agente que puede tener un efecto beneficioso o positivo en un sujeto cuando se administra al sujeto en una cantidad apropiada o eficaz. En un aspecto, el agente terapéutico o activo puede ser un compuesto que contiene cobre.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de un agente es una cantidad suficiente para realizar una tarea o función específica deseada del agente. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición, fármaco o agente se refiere a una cantidad no tóxica, pero suficiente, de la composición, fármaco o agente, para lograr resultados terapéuticos en el tratamiento o prevención de una afección para la cual la composición, fármaco, o agente se sabe que es eficaz. Se entiende que varios factores biológicos pueden afectar a la capacidad de una sustancia para realizar la tarea prevista. Por lo tanto, una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" puede depender en algunos casos de dichos factores biológicos. Además, si bien un médico, veterinario u otro personal médico calificado puede medir la consecución de efectos terapéuticos utilizando evaluaciones conocidas en la técnica, se reconoce que la variación y respuesta individual a los tratamientos pueden hacer que la consecución de efectos terapéuticos sea una decisión un tanto subjetiva. La determinación de una cantidad eficaz o de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de los conocimientos habituales en la técnica de las ciencias farmacéuticas y la medicina. Véase, por ejemplo, Meiner y Tonascia, "Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis," Monographs in Epidemiology and Biostatistics, vol. 8 (1986).

Como se usa en el presente documento, una "pauta posológica" o "pauta" tal como "pauta posológica de tratamiento" o una " pauta posológica profiláctica" se refiere a cómo, cuándo, cuánto y durante cuánto tiempo se puede o debe administrar una dosis de un agente activo o composición a un sujeto con el fin de lograr un tratamiento o efecto deseado.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "trata", "tratamiento" o "tratar" se refieren a la administración de un agente terapéutico a sujetos que son asintomáticos o sintomáticos. En otras palabras, "trata", "tratamiento" o "tratar" puede ser reducir, mejorar o eliminar los síntomas asociados con una afección presente en un sujeto, o puede ser profiláctico (es decir, prevenir o reducir la aparición de los síntomas en un sujeto). Este tratamiento profiláctico también puede denominarse prevención de la afección.

Como se usan en el presente documento, los términos "formulación" y "composición" se usan indistintamente y se refieren a una mezcla de dos o más compuestos, elementos o moléculas. En algunos aspectos, los términos "formulación" y "composición" pueden usarse para referirse a una mezcla de uno o más agentes activos con un vehículo u otros excipientes. Las composiciones pueden adoptar casi cualquier estado físico, incluido sólido, líquido (es decir, solución) o gas. Además, la expresión "forma farmacéutica" puede incluir una o más formulaciones o composiciones proporcionadas en un formato para administración a un sujeto. Por ejemplo, una forma farmacéutica inyectable sería una formulación o composición preparada de una manera que es adecuada para la administración mediante inyección.

Tal como se utiliza en el presente documento, un “sujeto” se refiere a un animal. En un aspecto, el animal puede ser un mamífero. En otro aspecto, el mamífero puede ser un ser humano.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" se refiere a la extensión o grado completo o casi completo de una acción, característica, propiedad, estado, estructura, elemento o resultado. Por ejemplo, un objeto que está "sustancialmente" cerrado significaría que el objeto está completamente cerrado o casi completamente cerrado. El grado exacto permitido de desviación de la integridad absoluta puede, en algunos casos, depender del contexto específico. Sin embargo, en términos generales, la cercanía de la finalización será tal que se obtenga el mismo resultado global que si se obtuviera la finalización absoluta y total. El uso de "sustancialmente" es igualmente aplicable cuando se usa con una connotación negativa para referirse a la falta completa o casi completa de una acción, característica, propiedad, estado, estructura, artículo o resultado. Por ejemplo, una composición que está "sustancialmente exenta de" partículas carecería completamente de partículas, o carecería casi tan completamente de partículas que el efecto sería el mismo que si careciera completamente de partículas. En otras palabras, una composición que está "sustancialmente exenta de" un ingrediente o elemento aún puede contener de hecho dicho elemento siempre que no exista un efecto mensurable del mismo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" se utiliza para proporcionar flexibilidad a un punto final de intervalo numérico al proporcionar que un valor dado pueda estar "un poco por encima" o "un poco por debajo" del punto final. A menos que se indique lo contrario, el uso del término "aproximadamente" de acuerdo con un número o intervalo numérico específico también debe entenderse para proporcionar respaldo para dichos términos o intervalos numéricos sin el término "aproximadamente". Por ejemplo, por conveniencia y brevedad, también debe entenderse que un intervalo numérico de "aproximadamente 50 angstroms a aproximadamente 80 angstroms" proporciona respaldo para el intervalo de "50 angstroms a 80 angstroms". Además, debe entenderse que en esta memoria descriptiva se proporciona respaldo para valores numéricos reales incluso cuando se utiliza el término "aproximadamente". Por ejemplo, la mención de "aproximadamente" 30 debe interpretarse en el sentido de que no sólo respalda los valores un poco por encima y un poco por debajo de 30, sino también el valor numérico real de 30.

Como se usa en el presente documento, una pluralidad de artículos, elementos estructurales, elementos de composición y/o materiales pueden presentarse en una lista común por conveniencia. Sin embargo, estas listas deben interpretarse como si cada miembro de la lista estuviera identificado individualmente como un miembro separado y único. Por lo tanto, ningún miembro individual de dicha lista debe interpretarse como equivalente de facto de cualquier otro miembro de la misma lista basándose únicamente en su presentación en un grupo común sin indicación de lo contrario.

Las concentraciones, cantidades y otros datos numéricos pueden expresarse o presentarse en el presente documento en un formato de intervalo. Debe entenderse que dicho formato de intervalo se utiliza simplemente por conveniencia y brevedad y, por lo tanto, debe interpretarse de manera flexible para incluir no sólo los valores numéricos explícitamente citados como límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos abarcados dentro de ese intervalo como si cada valor numérico y subintervalo se recitara explícitamente. A modo de ilustración, se debe interpretar que un intervalo numérico de "aproximadamente 1 a aproximadamente 5" incluye no sólo los valores explícitamente citados de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, sino que también incluye valores individuales y subintervalos dentro del intervalo indicado. Por lo tanto, en este intervalo numérico se incluyen valores individuales tales como 2, 3 y 4 y subintervalos tales como 1-3, 2-4 y 3-5, etc., así como 1,2, 3, 4 y 5, individualmente.

Este mismo principio se aplica a intervalos que citan solo un valor numérico como un mínimo o un máximo. Además, esa interpretación debería aplicarse independientemente de la amplitud del intervalo o de las características que se describen.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "un ejemplo" significa que una propiedad, estructura o característica particular descrita en relación con el ejemplo está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, los casos de aparición de las frases "en un ejemplo" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren todas a la misma realización.

Realizaciones de ejemplo

A continuación, se proporciona una descripción general inicial de las realizaciones de la invención y luego se describen con más detalle realizaciones específicas. Este resumen inicial tiene como objetivo ayudar a los lectores a comprender los conceptos tecnológicos más rápidamente.

En un ejemplo, en el presente documento se describe una composición o forma farmacéutica oftálmica. La composición o forma farmacéutica oftálmica puede incluir una cantidad de un agente de reticulación, tal como un agente que contiene cobre, que es suficiente para aumentar la actividad de la lisil oxidasa en el ojo de un sujeto o aumentar de otro modo la reticulación en la córnea del sujeto.

Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere a una composición para usar en un método para tratar el queratocono, que comprende una combinación de un agente que contiene cobre seleccionado del grupo que consiste en sulfato de cobre, carbonato de cobre, acetato de cobre, cloruro de cobre, gluconato de cobre, bromuro de cobre, fluoruro de cobre, nitrato de cobre, yoduro de cobre, perclorato de cobre, molibdato de cobre, tiocianato de cobre, tartrato de cobre, tetrafluoroboratos de cobre, seleniuro de cobre, pirofosfato de cobre, GHK-cobre, cobre-histidina, glicinato de cobre y combinaciones de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el agente que contiene cobre está presente en una cantidad de 0.001% en peso a 0.1% en peso.

En otra realización, la invención se refiere a una forma farmacéutica oftálmica tópica, que comprende la composición descrita anteriormente para su uso, que se formula como un colirio y se transporta en un envase adaptado para dispensar la composición gota a gota en un volumen de gota de 5 μl a 50 μl.

Se describe además un método para usar dicha composición o forma farmacéutica. El método puede incluir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición o forma farmacéutica, como se describe en el presente documento, durante un período de tratamiento.

Como será más evidente por las diversas realizaciones y ejemplos proporcionados en el presente documento, las composiciones, formas farmacéuticas y métodos descritos en la presente descripción pueden aumentar la actividad de la lisil oxidasa corneal en el ojo de un sujeto, pueden aumentar la resistencia del tejido corneal en el ojo de un sujeto, y pueden proporcionar una serie de otros beneficios descritos en el presente documento.

Teniendo esto en cuenta, las composiciones, formas farmacéuticas y métodos pueden usarse para tratar una variedad de indicaciones oftálmicas. Por ejemplo, una variedad de afecciones oftálmicas puede producir el adelgazamiento de la córnea, debilidad biomecánica de la córnea y otras complicaciones corneales. Tales afecciones pueden incluir úlceras corneales, queratitis ulcerosa periférica, derretimiento corneal, degeneración marginal pelúcida, degeneración marginal de Terrien, enfermedad neurotrófica de la córnea, ectasia corneal (tal como después de cirugía refractiva), queratocono, similares, o combinaciones de las mismas. La descripción actual describe composiciones, formas farmacéuticas y métodos para tratar estas afecciones, afecciones similares o combinaciones de las mismas. Sin embargo, según la invención, la composición descrita en el presente documento es para uso en un método de tratamiento del queratocono.

Teniendo esto en cuenta, el queratocono (KCN) es una enfermedad corneal caracterizada por el adelgazamiento gradual, no inflamatorio y ectasia del estroma, cicatrices y posibles roturas de la membrana de Descemet. La prevalencia de KCN es variable y depende de consideraciones genéticas, geográficas, étnicas, de género y de diagnóstico, siendo la prevalencia más citada de 50 por 100000. La gravedad del KCN depende de la resistencia biomecánica de la córnea, a menudo evaluada por el espesor más fino de la córnea. Sin embargo, este criterio está siendo reemplazado por parámetros emergentes tales como la elevación corneal posterior, histéresis corneal y reticulaciones de colágeno por unidad de espesor corneal. La última medición tiene en cuenta las diferencias étnicas y de género en el contenido de colágeno corneal inherentes a la población.

Las consecuencias del KCN son tan variables como su epidemiología, y van desde un astigmatismo leve hasta una visión gravemente distorsionada. Sin embargo, las opciones de tratamiento son sorprendentemente limitadas. La mayoría de los KCN leves se pueden corregir con gafas o lentes de contacto blandas, pero muy a menudo los pacientes necesitarán lentes de contacto tóricas o duras a medida que avanza la enfermedad. Finalmente, 1 de cada 5 pacientes requerirá cirugía, lo más comúnmente queratoplastia lamelar anterior profunda o un trasplante de córnea penetrante. Estos procedimientos requieren costes considerables y conllevan un riesgo importante de complicaciones intraoperatorias y posoperatorias (sangrado, cicatrización, formación de cataratas, etc.). Por lo tanto, se necesitan desesperadamente opciones de tratamiento prequirúrgico más eficaces.

Los Intacs (piezas transparentes de polímero plástico en forma de medialuna) se han utilizado como opción de tratamiento para el queratocono leve a moderado. Estos anillos corneales intraestromales se insertan como un procedimiento mínimamente invasivo y tienen una tasa de éxito de 74% para restaurar la visión mejor corregida de 20/20. Sin embargo, el coste y el riesgo (neovascularización, depósitos en los canales, cirugía secundaria, etc.) son nuevamente limitantes.

También se han intentado métodos para fortalecer las reticulaciones del colágeno. La terapia de reticulación del colágeno corneal (CXL) es una técnica bien tolerada en donde se aplican gotas de riboflavina sobre o debajo del epitelio corneal y luego se emplea luz ultravioleta A para liberar radicales libres de oxígeno para fortalecer los enlaces de colágeno. Se ha mostrado que este procedimiento retrasa o detiene significativamente la progresión del KCN. Aunque esta técnica tiene efectos secundarios mínimos (la luz UVA rica en energía y una concentración excesivamente alta de radicales libres de oxígeno pueden producir toxicidad), sigue teniendo un coste prohibitivo para muchos sujetos.

La presente descripción describe una composición, forma farmacéutica y método alternativos para fortalecer las reticulaciones de colágeno usando un agente de reticulación, tal como un agente que contiene cobre, un agente que contiene calcio, un agente que contiene magnesio, un agente que contiene plata, un agente que contiene aluminio, un agente que contiene zinc, un agente que contiene hierro u otro agente de reticulación adecuado. Algunos ejemplos específicos, pero no limitantes, de agentes de reticulación pueden incluir extracto de acai, decorina, sulfato de cobre (II) o combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, el agente de reticulación puede ser o incluir cualquier ion o compuesto divalente o multivalente que sea adecuado para inducir o facilitar la reticulación en la córnea. En algunos ejemplos, el agente de reticulación puede ser o incluir un ion metálico, tal como un metal alcalinotérreo, un metal de transición, un metal de post-transición o combinaciones de los mismos, por ejemplo. En algunos ejemplos, el agente de reticulación puede ser o incluir un catión. En algunos ejemplos específicos, el agente de reticulación puede ser o incluir un ion metálico divalente, tal como cobre, magnesio, hierro, zinc o similares. Sin embargo, según la invención, la composición descrita en el presente documento comprende un agente que contiene cobre seleccionado del grupo que consiste en sulfato de cobre, carbonato de cobre, acetato de cobre, cloruro de cobre, gluconato de cobre, bromuro de cobre, fluoruro de cobre, nitrato de cobre, yoduro de cobre, perclorato de cobre, molibdato de cobre, tiocianato de cobre, tartrato de cobre, tetrafluoroboratos de cobre, seleniuro de cobre, pirofosfato de cobre, GHK-cobre, cobrehistidina, glicinato de cobre y combinaciones de los mismos.

El cobre es un cofactor de la lisil oxidasa (LOX), una enzima que forma varios tipos de reticulaciones del colágeno. Un polimorfismo de un solo nucleótido de la LOX, rs1800449, aumenta el riesgo genético de KCN. Además, los tejidos de KCN de los pacientes presentan una menor actividad de LOX. Por lo tanto, la deficiencia de cobre puede producir reducciones en el contenido de colágeno en los tejidos. Así pues, se puede utilizar la suplementación con cobre por medio de una sal, compuesto, quelato o similar que contenga cobre para aumentar los enlaces del colágeno. Dicha suplementación puede mejorar las propiedades biomecánicas de las córneas enfermas al aumentar la actividad de la lisil oxidasa. Debido a que la baja actividad de la LOX en la córnea puede contribuir al desarrollo de KCN y la suplementación con cobre puede mejorar las reticulaciones del colágeno, el tratamiento tópico con cobre puede proporcionar una herramienta no evasiva y relativamente rentable para prevenir la progresión del KCN.

Por consiguiente, en el presente documento se describe una composición o forma farmacéutica oftálmica que puede incluir una cantidad de un agente de reticulación, tal como un agente que contiene cobre, que es suficiente para aumentar la actividad de la lisil oxidasa en el ojo de un sujeto o aumentar de otro modo la reticulación corneal. Se puede utilizar una variedad de agentes que contienen cobre, tales como una sal, compuesto, quelato o similares que contienen cobre. Los ejemplos no limitantes de sales de cobre pueden incluir sulfatos de cobre, carbonatos de cobre, acetatos de cobre, cloruros de cobre, bromuros de cobre, fluoruros de cobre, nitratos de cobre, yoduros de cobre, percloratos de cobre, molibdatos de cobre, tiocianatos de cobre, tartratos de cobre, tetrafluoroboratos de cobre, seleniuros de cobre, pirofosfatos de cobre, similares o una combinación de los mismos. Otros vehículos de cobre adecuados pueden incluir GHK-cobre, sulfato de cobre de tetraamina, cobre-histidina, glicinato de cobre, gluconato de cobre, similares o combinaciones de los mismos.

Según la invención, el agente que contiene cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, carbonato de cobre, acetato de cobre, cloruro de cobre, gluconato de cobre, bromuro de cobre, fluoruro de cobre, nitrato de cobre, yoduro de cobre, perclorato de cobre, molibdato de cobre, tiocianato de cobre, tartrato de cobre, tetrafluoroboratos de cobre, seleniuro de cobre, pirofosfato de cobre, GHK-cobre, cobre-histidina, glicinato de cobre y combinaciones de los mismos.

Por lo tanto, el agente que contiene cobre puede ser cualquier agente que contiene cobre adecuado según se define en las reivindicaciones que pueda proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de cobre biodisponible. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser suficiente para aumentar la actividad de la lisil oxidasa corneal en el ojo de manera que la reticulación del colágeno aumente en comparación con la reticulación del colágeno antes del tratamiento. Esto también puede aumentar la resistencia biomecánica de la córnea en comparación con la resistencia biomecánica antes del tratamiento. Además, esto puede disminuir las dioptrías de la córnea en el ojo tratado en comparación con las dioptrías antes del tratamiento.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que contiene cobre puede basarse en la cantidad de cobre transportada por el agente que contiene cobre. En algunos ejemplos, el agente que contiene cobre puede proporcionar niveles de cobre inferiores a aproximadamente 0.05 mg/ml, aproximadamente 0.02 mg/ml, aproximadamente 0.005 mg/ml o aproximadamente 0.002 mg/ml, pero que siguen siendo eficaces para aumentar la actividad de la lisil oxidasa. Puede ser importante mantener el nivel de cobre lo suficientemente bajo para evitar la toxicidad inducida por el cobre, manteniendo al mismo tiempo una cantidad suficiente de cobre biodisponible para aumentar la actividad de la lisil oxidasa.

Por lo tanto, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente que contiene cobre se puede determinar basándose en el tipo de vehículo de suministro, el tipo de agente que contiene cobre, la duración de administración deseada, etc. Por ejemplo, dependiendo de cómo se formula la composición, la composición puede incluir una cantidad de cobre de aproximadamente 0.0001 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml. En otros ejemplos, la composición puede incluir una cantidad de cobre de aproximadamente 0.0005 mg/ml a aproximadamente 0.03 mg/ml, de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.005 mg/ml. En algunos ejemplos adicionales, la composición puede incluir una cantidad de cobre de aproximadamente 0.0001 mg/ml a aproximadamente 0.05 mg/ml, de aproximadamente 0.00025 mg/ml a aproximadamente 0.015, de aproximadamente 0.0005 mg/ml a aproximadamente 0.00075 mg/ml o de aproximadamente 0.0008 mg/ml a aproximadamente 0.0011 mg/ml. Así, en algunos ejemplos, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede definir como la cantidad de cobre incluida en la composición. Por ejemplo, una cantidad de 0.0016 mg/ml de sulfato de cobre (II), anhidro, proporciona a la composición un contenido de cobre de aproximadamente 0.00064 mg/ml de cobre. Esto se debe a que el peso molecular del sulfato de cobre (II) es de aproximadamente 159.6 g/mol, pero sólo aproximadamente 63.5 g/mol o aproximadamente 40% del agente es el propio cobre. Por lo tanto, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar basándose en el contenido de cobre proporcionado por el agente que contiene cobre en lugar de la cantidad de agente que contiene el propio cobre. Como ejemplo alternativo, una cantidad de 0.0018 mg/ml de acetato de cobre (II), anhidro, proporciona a la composición un contenido de cobre de aproximadamente 0.00063 mg/ml.

Alternativamente, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede definir como un % en peso del agente que contiene cobre en la composición. Según la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente que contiene cobre es una cantidad de 0.001% en peso a 0.1% en peso. Cabe señalar que estos porcentajes en peso se calculan basados en el sulfato de cobre (II), anhidro. Por lo tanto, cuando se emplea un agente que contiene cobre alternativo, los porcentajes en peso se pueden convertir en consecuencia.

Sin embargo, una cantidad particular de agente que contiene cobre en la composición no significa necesariamente que todo el contenido de cobre estará biodisponible tras la administración. La biodisponibilidad del cobre puede variar hasta cierto punto de un componente que contiene cobre a otro, así como el pH y otros factores de composición. Por lo tanto, la cantidad terapéuticamente eficaz de agente que contiene cobre también se puede ajustar basándose en la biodisponibilidad del cobre con respecto a un vehículo de cobre, pH, formulación en particular, o similares.

El agente que contiene cobre también se puede administrar con una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo agente activo o terapéutico. Dichos agentes adicionales pueden incluir riboflavina, rosa de bengala, hidroxilisina, similares o combinaciones de los mismos. Además, se pueden administrar simultáneamente una pluralidad de agentes de reticulación diferentes, tales como una pluralidad de agentes que contienen cobre diferentes, o un agente que contiene cobre en combinación con otro agente de reticulación que no contiene cobre, tal como un agente que contienen zinc, agente que contiene magnesio, agente que contiene hierro o agente que contiene plata, por ejemplo.

El agente que contiene cobre se puede proporcionar en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable se puede formular de diversas maneras para suministrar el agente que contiene cobre. Los ejemplos no limitantes pueden incluir soluciones, suspensiones, geles, hidrogeles, geles termosensibles, inyecciones subconjuntivales, depósitos, películas, lentes de contacto, vendajes o similares. En un ejemplo específico, la formulación puede ser un colirio oftálmica. En algunos ejemplos, la composición se puede formular como una lente de contacto que libera cobre, tal como una lente blanda, una lente tórica, una lente dura, una lente escleral, similares o una combinación de las mismas.

Dependiendo de cómo se formule la composición, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir una variedad de excipientes. Por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un agente solubilizante, un agente de tonicidad, un regulador de pH, un agente espesante o gelificante, un polímero o matriz polimérica, un conservante, agua, similares y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos no limitantes de agentes solubilizantes pueden incluir solución salina tamponada con fosfato (PBS), PBS de Dulbecco, solución de Alsever, solución salina tamponada con Tris (TBS), agua, soluciones salinas equilibradas (BSS), tales como BSS de Hank, BSS de Earle, BSS de Grey, BSS de Puck, BSS de Simm, BSS de Tyrode, BSS Plus, solución de lactato de Ringer, solución salina normal (es decir, solución salina al 0.9%), solución salina / normal, similares o combinaciones de las mismas. Los agentes solubilizantes pueden estar presentes en el vehículo farmacéuticamente aceptable en diversas cantidades. En un aspecto, el agente solubilizante puede tener una concentración en el vehículo de aproximadamente 10% en peso, aproximadamente 20% en peso, aproximadamente 30% en peso, aproximadamente 40% en peso o de aproximadamente 50% en peso a aproximadamente 80% en peso, aproximadamente 90% en peso, aproximadamente 95% en peso, aproximadamente 97% en peso, aproximadamente 99% en peso o aproximadamente 99.9999% en peso.

Los ejemplos no limitantes de agentes de tonicidad pueden incluir los agentes solubilizantes mencionados anteriormente, así como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, manitol, sorbitol, dextrosa, glicerina, propilenglicol, etanol, trehalosa, similares o combinaciones de los mismos. El agente de tonicidad se puede utilizar para proporcionar una tonicidad apropiada de la formulación. En un aspecto, la tonicidad de la formulación es de 270 a 330 miliosmoles/litro (mOsm/l). Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en el vehículo farmacéuticamente aceptable en diversas cantidades. En un aspecto, el agente de tonicidad puede tener una concentración en el vehículo de aproximadamente 0.1% en peso, aproximadamente 0.5% en peso o de aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 2% en peso, aproximadamente 5% en peso o aproximadamente 10% en peso.

Los ejemplos no limitantes de reguladores de pH pueden incluir varios ácidos, bases y combinaciones de los mismos, tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido cítrico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio y similares. Los reguladores de pH se pueden usar para proporcionar un pH apropiado para la formulación. Según la invención, el pH oscila es de 5.8 a 7.8. Los reguladores de pH pueden estar presentes en el vehículo farmacéuticamente aceptable en diversas cantidades. En un aspecto, el regulador de pH puede tener una concentración en el vehículo de aproximadamente 0.01% en peso, aproximadamente 0.05% en peso, aproximadamente 0.1% en peso o de aproximadamente 0.5% en peso a aproximadamente 1% en peso, aproximadamente 2% en peso, aproximadamente 5% en peso, o aproximadamente 10% en peso.

Los ejemplos no limitantes de agentes espesantes o gelificantes pueden incluir glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, poli(alcohol vinílico), derivados de celulosa (tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y similares), alcohol etilvinílico, ácido hialurónico, similares, o combinaciones de los mismos. Los agentes espesantes o gelificantes pueden estar presentes en el vehículo farmacéuticamente aceptable en diversas cantidades. En un aspecto, el agente espesante o gelificante puede tener una concentración en el vehículo de aproximadamente 0.01% en peso, aproximadamente 0.05% en peso, aproximadamente 0.1% en peso o de aproximadamente 0.5% en peso a aproximadamente 2% en peso, aproximadamente 8% en peso, aproximadamente 15% en peso, o aproximadamente 30% en peso.

Los ejemplos no limitantes de polímeros que se pueden usar para preparar una matriz polimérica para una película, lente de contacto o similares, pueden incluir polímeros biodegradables o no biodegradables. Los ejemplos no limitantes de polímeros o combinaciones de polímeros pueden incluir poli(metacrilato de metilo), metacrilato de hidroxietilo, polisiloxanos, poli(ácido láctico-co-glicólico) (diferentes proporciones de contenido de láctico a glicólido y grupos terminales tales como terminación ácida o éster), poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo), acetato de etilenvinilo, polietilenglicol, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, croscarmelosa, policaprolactona, ácido hialurónico, albúmina, copolímeros de bloque de cloruro de sodio de los mismos, sales de los mismos, similares, o combinaciones de los mismos. Copolímeros específicos tales como copolímeros de bloque de poli(ácido láctico)-poli(ácido glicólico) (PLGA), copolímeros de bloque de poli(ácido glicólico)-poli(alcohol vinílico) (PGA/PVA), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), copolímeros de bloque de policaprolactona-polietilenglicol, croscarmelosa y similares pueden ser particularmente eficaces para matrices biodegradables, cuando convenga.

En algunos ejemplos, la composición puede incluir polímeros termosensibles. Los ejemplos no limitantes de polímeros termosensibles pueden incluir poli(N-isopropil-acrilamida), poli[metacrilato de 2-(dimetilamino)etilo], hidroxipropilcelulosa, poli(vinilcaprolactama), polivinilmetiléter, poli(óxido de etileno), poli(metacrilato de hidroxietilo), polímeros de pentabloque tipo ABCBA, quitosano, similares o combinaciones de los mismos. Dichos polímeros termosensibles pueden unirse o pueden funcionalizarse para unirse a un agente que contiene cobre particular dentro de un intervalo de temperaturas y liberar el agente que contiene cobre al cambiar la temperatura del entorno circundante, tal como poniendo la composición en contacto con los ojos, aplicando una fuente de calor al ojo después de la administración de la composición, o similar.

Los ejemplos no limitantes de conservantes pueden incluir cloruro de benzalconio (BAK), cetrimonio, perborato de sodio, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y sus diversas formas de sal, clorobutanol y similares. Los conservantes pueden estar presentes en el vehículo farmacéuticamente aceptable en diversas cantidades. En un aspecto, el conservante puede tener una concentración en el vehículo de aproximadamente 0.001% en peso, aproximadamente 0.005% en peso, aproximadamente 0.01% en peso o aproximadamente 0.05% en peso a aproximadamente 0.1% en peso, aproximadamente 0.25% en peso, aproximadamente 0.5% en peso, o aproximadamente 1% en peso.

En un ejemplo específico, el vehículo farmacéuticamente aceptable se puede formular como un colirio y puede incluir BSS en una cantidad de aproximadamente 50% en peso a aproximadamente 99.9999% en peso. En otro ejemplo específico, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede formularse como un colirio y puede incluir lágrimas artificiales (es decir, Refresh Tears®, Genteal®, Oasis Tears®, y similares).

Independientemente de cómo se formule la composición oftálmica, la composición oftálmica se puede usar como una forma farmacéutica oftálmica para administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente que contiene cobre. En algunos ejemplos, la forma farmacéutica oftálmica puede proporcionar de aproximadamente 0.0005 μg a aproximadamente 0.5 μg de cobre por episodio de administración. En otros ejemplos más, la forma farmacéutica oftálmica puede proporcionar de aproximadamente 0.006 μg a aproximadamente 0.06 μg, de aproximadamente 0.01 μg a aproximadamente 0.03 μg, o de aproximadamente 0.016 μg a aproximadamente 0.044 μg de cobre por episodio de administración. En otros ejemplos más, la forma farmacéutica oftálmica puede proporcionar de aproximadamente 0.0005 μg a aproximadamente 5 μg de cobre por día. En otros ejemplos más, la forma farmacéutica oftálmica puede proporcionar de aproximadamente 0.001 μg a aproximadamente 2 μg, de aproximadamente 0.006 μg a aproximadamente 0.24 μg, de aproximadamente 0.01 μg a aproximadamente 0.12 μg, o de aproximadamente 0.016 μg a aproximadamente 0.18 μg de cobre por día. Cabe señalar que no todo el cobre que proporciona la forma farmacéutica es necesariamente biodisponible, pero en algunos ejemplos puede serlo.

En algunos ejemplos, la forma farmacéutica oftálmica se puede usar en una pauta posológica eficaz para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente que contiene cobre. La pauta posológica eficaz puede incluir la administración de la forma farmacéutica oftálmica una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o más.

En otros ejemplos más, la forma farmacéutica oftálmica se puede formular para que se biodegrade y proporcione una liberación controlada y sostenida del agente que contiene cobre durante un período de tiempo predeterminado. En otros ejemplos más, la forma farmacéutica oftálmica se puede formular para liberar el agente que contiene cobre de una matriz no biodegradable de manera controlada y sostenida. En ejemplos como estos, la forma farmacéutica se puede formular para liberar el agente que contiene cobre durante un período de horas, días o semanas, según convenga. En algunos ejemplos específicos, la forma farmacéutica puede formularse para administrar de aproximadamente 0.005 mcg de cobre a aproximadamente 250 mcg de cobre por semana. En otros ejemplos más, la forma farmacéutica puede formularse para administrar de aproximadamente 0.008 mcg a aproximadamente 200 mcg por semana, de aproximadamente 0.01 mcg a aproximadamente 150 mcg por semana, o de aproximadamente 0.1 mcg a aproximadamente 100 mcg por semana. Además, la forma farmacéutica normalmente puede formularse para que tenga una cinética de liberación del fármaco de orden cero.

La forma farmacéutica se puede mantener o almacenar en el envase como una composición premezclada que está lista para administrar sin dilución o preparación adicional. En algunas realizaciones, un único envase puede contener un volumen o cantidad de la composición que sea adecuada para una única dosis. En otros ejemplos más, un único envase puede contener un volumen o cantidad de la composición que sea adecuada para múltiples dosis.

Se pueden utilizar varios envases adecuados. En un aspecto, el envase puede ser un envase de color ámbar. En algunos ejemplos, el envase puede estar hecho de vidrio, polipropileno, polietileno, policarbonato, poli(cloruro de vinilo), similares o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, el envase puede tener un volumen de aproximadamente 0.5 ml a aproximadamente 50 ml. En otro aspecto, el envase puede tener un volumen de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 30 ml, de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 20 ml, o de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 15 ml. En un aspecto, el envase puede contener una dosis única de la composición o forma farmacéutica terapéutica. En otro aspecto, el envase puede contener una pluralidad de dosis de la composición o forma farmacéutica terapéutica.

En algunos ejemplos, se pueden incluir en el envase de aproximadamente 0.005 mg a aproximadamente 1 mg del agente que contiene cobre. En otros ejemplos más, se pueden incluir en el envase de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 0.5 mg del agente que contiene cobre. En algunos ejemplos, se pueden incluir en el envase de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.5 mg de cobre. En algunos ejemplos, se pueden incluir en el envase de aproximadamente 0.005 mg a aproximadamente 0.2 mg de cobre.

Según la invención, la forma farmacéutica es una forma farmacéutica oftálmica tópica que se formula como un colirio y se transporta en un envase adaptado para dispensar la composición gota a gota en un volumen de gota de 5 μl a 50 μl. Cuando la composición se formula como un colirio, en algunos ejemplos, el envase puede incluir una boquilla o punta ajustada desde la cual se puede dispensar la composición. Así pues, el envase normalmente puede ser plegable para dispensar la composición. Sin embargo, en algunos casos, después de dispensar la composición, el envase puede volver a aspirar aire, lo que puede contaminar la composición. En algunos ejemplos, la boquilla o punta puede incluir un mecanismo de válvula, filtro, similar o una combinación de los mismos para evitar o minimizar la introducción de bacterias y otros contaminantes en el envase. Además, como se ha comentado previamente el envase se puede adaptar para dispensar la composición oftálmica en forma de gotas. Según la invención, el envase se puede adaptar para dispensar la composición oftálmica en un volumen de gota de 5 μl a 50 μl. En particular, el volumen de gota es de 15 μl a 40 μl.

Además, con la forma farmacéutica puede incluirse un mecanismo de administración, tal como una jeringa, un cuentagotas u otro mecanismo. En realizaciones adicionales, se puede usar un empaquetamiento adecuado para proporcionar la composición, el envase y las instrucciones para su uso y, opcionalmente, un mecanismo de administración en un único sistema integrado.

Las composiciones o formas farmacéuticas descritas en el presente documento también se pueden emplear en un método para tratar una afección oftálmica. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición para usar en un método para tratar el queratocono como se describe en el presente documento, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición a un ojo de un sujeto durante un período de tratamiento.

En un ejemplo, la composición o forma farmacéutica se puede administrar de 1 a 4 momentos específicos por día por ojo que lo necesite. La cantidad de dosificación en cada momento específico es de aproximadamente 15 gl a aproximadamente 40 gl.

El período de tratamiento puede depender de varios factores, tales como el tipo y la gravedad de la afección, la edad del sujeto en el momento del diagnóstico y similares. Normalmente, el período de tratamiento puede ser de aproximadamente 1 mes a un tratamiento crónico, dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, en algunos casos, un niño pequeño puede recibir tratamiento crónico, mientras que los niños mayores y los adolescentes (p. ej., de 10 a 18 años) pueden recibir tratamiento de dos a tres años, un adulto joven (p. ej., de 18 a 30 años) puede recibir tratamiento de uno a dos años, y un adulto de 30 años o más puede recibir tratamiento durante aproximadamente seis meses a un año. Así, en algunos ejemplos, el período de tratamiento puede ser de aproximadamente 1 mes a un tratamiento crónico. En otros ejemplos más, el período de tratamiento puede ser de aproximadamente 1 mes, aproximadamente 3 meses o aproximadamente 6 meses a aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 24 meses, aproximadamente 30 meses, aproximadamente 36 meses, o hasta que la afección se haya resuelto satisfactoriamente.

En algunos ejemplos, la composición oftálmica se puede administrar como un colirio. En otros ejemplos más, la composición oftálmica se puede administrar como una inyección subconjuntival. En otros ejemplos más, la composición oftálmica se puede administrar en forma de una película tópica o lente de contacto. En algunos ejemplos, la película tópica o lente de contacto se puede configurar para que se biodegrade con el tiempo para proporcionar una liberación controlada y sostenida del agente que contiene cobre.

Generalmente, los métodos descritos en el presente documento pueden aumentar la reticulación del colágeno en la córnea en comparación con un ojo no tratado. Más específicamente, el método puede aumentar la densidad de reticulación de la lisinonorleucina, la densidad de reticulación de la histidinil-hidroxilisinonorleucina, o ambas, así como otras reticulaciones de colágeno asociadas con la córnea en comparación con un ojo no tratado. Además, los métodos descritos en el presente documento pueden disminuir la tensión radial de la córnea en al menos aproximadamente 10%, 25% o 50% en comparación con la córnea sin tratamiento. Además, los métodos descritos en el presente documento pueden disminuir las dioptrías corneales de una córnea con queratocono en comparación con una córnea con queratocono no tratada.

Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición para uso según la invención aumenta la reticulación de la lisinonorleucina y/o la reticulación de la histidinil-hidroxilisinonorleucina en la córnea en comparación con la reticulación en la córnea sin tratamiento; o disminuye la tensión radial de la córnea en comparación con la tensión radial de la córnea sin tratamiento; o disminuye la dioptría corneal en comparación con la dioptría corneal sin tratamiento.

Ejemplos

Ejemplo 1: Los agentes activos que contienen cobre pueden aumentar la actividad de la lisil oxidasa corneal

Células del estroma corneal cultivadas de córneas normales y de queratocono (n = 3 de cada una) en FBS DMEM al 10% se expusieron a BSS de control o a CuSÜ40.0016 mg/ml en solución salina equilibrada (BSS) y luego se filtraron a través de un filtro de 0.25 g. El medio de cultivo condicionado se sometió a un ensayo de actividad fluorométrica acoplada a peroxidasa para determinar la LOX.

Los tejidos se recogieron mediante técnicas estériles en un entorno operativo. Las muestras de tejido se almacenaron en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm en una solución Optisol. El tejido corneal se suspendió en DMEM/F12 suero bovino fetal (FBS) al 15% con penicilina/estreptomicina. El epitelio y la membrana de Descemet se separaron mecánicamente bajo un microscopio estereoscópico. La muestra se cortó además en trozos pequeños con una tijera quirúrgica y se añadió a colagenasa 1 mg/ml; se utilizaron 10 ml por córnea. Los trozos de muestra se pusieron en placas, en placa de cultivo de tejidos de 10 cm y se pusieron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37°C con 5% de CO<2>. Después de 5 días, las células se recogieron y se pusieron en placa en FBS DMEM al 10% sin rojo de fenol.

La actividad de la enzima LOX en el medio de cultivo se midió usando un ensayo fluorométrico acoplado a peroxidasa usando rojo Amplex. Brevemente, las células del estroma corneal se sembraron en placas, en placas de 6 pocillos con 0.2x10A6 células con 2 ml de medio de cultivo. Después de 3 días, se recogió el cultivo para el ensayo de actividad de la enzima LOX. Se pusieron 50 ul de cada medio de cultivo en una placa negra de 96 pocillos. Luego, 50 gl de tampón de ensayo 2x (urea 2.4 M, borato de sodio 100 mM (pH 8.2), 1,5-diaminopentano 20 mM, rojo Amplex 20 uM y peroxidasa de rábano picante 2 unidades/ml). Como un ensayo paralelo, se añadió aminopropionitrilo (BAPN) 500 uM que puede disminuir completamente la actividad de la LOX. La fluorescencia del rojo Amplex oxidado se registró cada 10 minutos utilizando un lector de placas de fluorescencia. Después de restar la fluorescencia de fondo, se representó gráficamente la intensidad de la fluorescencia frente al tiempo de incubación (FIG. 1A y 1B).

Basado en el ensayo fluorométrico acoplado a peroxidasa de la actividad de lox, y como se ilustra en las FIGs. 1A-1B, se puede observar que el cobre aumentó notablemente la actividad de la enzima lox en células de fibroblastos corneales normales y de queratocono. Esto indicaba que el cobre tiene el potencial de aumentar la reticulación del colágeno al mejorar la actividad de lox en la córnea del queratocono.

Ejemplo 2 - Los agentes activos que contienen cobre pueden aumentar la reticulación del colágeno en la córnea

Preparación de la muestra: Cada córnea de queratocono humana se dividió en dos partes iguales. Una mitad se trató con CuSO4 0.0016 mg/ml en solución Optisol durante 1 semana y la otra mitad se dejó sin tratar. Después de una semana, cada córnea se mantuvo a 80°C negativos para análisis futuros.

Extracción de muestras: Las muestras de córnea se lavaron con PBS a pH 7.4, se redujeron a polvo en nitrógeno líquido y se pulverizaron con un molino congelador. Las muestras de córnea se desmineralizaron con EDTA 0.5 M en tampón T ris 0.05 M, pH 7.4, durante 48 h a 4°C. La fracción insoluble se lavó dos veces con agua destilada mediante centrifugación a 5000 g a 47C durante 20 min y se liofilizó. La muestra liofilizada se hidrolizó con HCl 6 N redestilado en constante ebullición al vacío durante 24 h a 110°C. El hidrolizado se neutralizó con NaOH 2.5 N y se disolvió en agua destilada. Se llevaron a cabo análisis de la lisinonorleucina (LNL) e histidinohidroxilisinonorleucina (HHL) por separado mediante HPLC.

Método de HPLC para la lisinonorleucina (LNL): El análisis de aminoácidos es un campo de aplicación importante en la química de proteínas y el análisis de alimentos. Existen muchas aplicaciones diferentes en este campo. La derivatización automática previa a la columna seguida de LC en fase inversa se ha convertido en un procedimiento útil para el análisis eficiente, ya que es una técnica fácil y sencilla de usar. Se utilizó un sistema LC Agilent 1290 Infinity con derivatización previa a la columna automatizada para un análisis rápido y sensible de lisinonorleucina (LNL). La columna utilizada para este método es Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18 (3.0 mm x 50 mm, 1.8 gm) y la fase móvil consistía en disolvente A: fosfato disódico 10 mM tetraborato de sodio 10 mM, pH 8.2 y disolvente B: ACN/MeOH/ H2O (45:45:10)

Método de HPLC para la histidinohidroxilisinonorleucina (HHL): A 25 ml de la muestra de hidrolizado de proteínas (menos de 3 mM como concentración de aminoácidos totales), se añadieron 50 gl de hidrocloruro de Ne -metil-L-lisina (Mly) 1.5 mM en tampón de borato 0.26 M, pH 9.5, y 50 gl de acetona en un vial de reacción de 1.5 ml. Luego se añadieron 25 gl de reactivo FMOC-Cl (FMOC-Cl 6 mM en acetona) y la mezcla se dejó reaccionar durante 2 min a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo dos veces con 350 ml de pentano para eliminar el exceso de reactivo FMOC-Cl. La fase acuosa se sometió a cromatografía.

La reticulación de la córnea es específica del tejido. Las reticulaciones predominantes generadas en la córnea humana son de lisinonorleucina (LNL). Las LNL son los componentes básicos para las reticulaciones multivalentes posteriores, tales como la histidinil-hidroxilisinonorleucina (HHL). Se trataron córneas humanas normales y queratocónicas durante 1 semana con CuSO40.0016 mg/ml. Luego, se realizó un análisis de HPLC para medir los niveles de LNL (FIG. 2A-2C) y HHL (FIG. 3A-3C).

De hecho, se observó un aumento significativo en los niveles de LNL y HHL en las córneas tratadas con cobre. Como se ilustra en la FIG. 2A, se observaron reticulaciones de LNL en córneas de queratocono humanas tratadas con CuSO4, como se describió anteriormente. Por el contrario, como se ilustra en la FIG. 2B, no se observaron reticulaciones de LNL en córneas de queratocono que no se trataron con CuSO4. La FIG. 2C ilustra que las reticulaciones de LNL también están presentes en córneas normales.

De manera similar, como se ilustra en la FIG. 3A, también se observan reticulaciones de HHL en córneas de queratocono humanas tratadas con CuSO4, como se describió anteriormente. Por el contrario, como se ilustra en la FIG. 3B, se observaron niveles insignificantes de reticulaciones de HHL en córneas de queratocono que no se trataron con CuSO4. La FIG. 3C ilustra que las reticulaciones de HHL en córneas normales están en niveles más altos que las observadas en córneas de queratocono que no se trataron con CuSO4.

Por lo tanto, el tratamiento con CuSO4proporcionó claramente un aumento en la reticulación tanto de LNL como de HHL en las córneas de queratocono.

Ejemplo 3 - El tratamiento con un agente que contiene cobre aumenta la resistencia de la córnea

Las mediciones de la tensión radial de la córnea se realizaron en córneas de cadáveres humanos y en córneas de conejos. Se cultivaron córneas de cadáveres humanos (n=2 pares) como se mencionó anteriormente en el Ejemplo 1. El grupo tratado se sumergió en CuSO40.0016 mg/ml durante 2 semanas. Las muestras también contenían una pequeña porción de esclerótica en ambos extremos. Se aplicó aceite mineral sobre la superficie de la tira escleróticacórnea-esclerótica para minimizar la deshidratación del tejido. Las córneas de conejo se dividieron en 4 grupos. Dos grupos eran grupos de tratamiento que recibieron CuSO40.0025 mg/ml tres veces al día o CuSO40.0025 mg/ml una vez al día. Dos grupos servían como control y recibieron solo BSS.

La muestra se acopló entre un motor y un transductor que aplicaba una presión controlada de 5-30 mmHg y se midió la tensión radial resultante. La longitud de la muestra entre las dos mordazas de sujeción fue de aproximadamente 10 mm. La información geométrica de la muestra, incluido el ancho y el espesor, se introdujo en el panel de control del Analizador del sistema reométrico (RSA). El espesor de la muestra se midió mediante un paquímetro de ultrasonidos (DGH 550 Pa-chette2; DGH Technology, Exton, PA).

Los resultados muestran un marcado aumento de la rigidez y una disminución de la tensión radial después del tratamiento con sulfato de cobre (FIG. 4). La tensión radial máxima promedio inducida por el pulso ocular a 20 mmHg en las córneas tratadas fue aproximadamente 1.5 veces menor que en las córneas no tratadas. Esto representa aproximadamente un aumento de 50% en la resistencia corneal, lo que demuestra que la reticulación produce una respuesta corneal más rígida. Además, como se ilustra en la FIG. 5, el tratamiento con CuSO4también proporcionó una biomecánica corneal comparable a la observada con la reticulación con láser.

Ejemplo 4 - Topografía corneal de conejo

La curvatura corneal de áreas específicas se vigiló mediante topografía corneal, que presenta los resultados en valores dióptricos. Se administró sulfato de cobre (CuSO4) a 0.0025 mg/ml a conejos blancos de Nueva Zelanda en una dosis de una vez al día y tres veces al día. Además, se administró una muestra de alta concentración de 0.025 mg/ml a conejos de Nueva Zelanda una vez al día durante el período de tratamiento. A tres controles diferentes se les administró ninguna gota, BSS o lágrimas artificiales. Cada uno de los 6 grupos incluía 6 sujetos de ensayo cada uno. Se tomaron imágenes topográficas antes del tratamiento y semanalmente durante 5 semanas. Las mediciones de dioptrías fueron los valores medios de K y a 3 mm. Estos valores se compararon con mediciones de dioptrías en córneas reticuladas con láser después de 1 mes y 1 año.

Como puede verse en la FIG. 6, hubo una mayor disminución en las mediciones de dioptrías en los grupos de tratamiento en comparación con los grupos de control. Además, 1 mes de tratamiento con CuSO4proporcionó mediciones de dioptrías similares a las observadas en córneas reticuladas con láser después de 1 año.

Ejemplo 5 - Seguridad de colirios de cobrein vivo

Se preparó solución de sulfato de cobre (CuSO4) en una concentración de 0.0025 mg/ml y se administró tres veces al día (3xdía) o una vez al día (1xdía) a conejos. Se realizó una evaluación del segmento anterior con biomicroscopía con lámpara de hendidura y tomografía de coherencia óptica del segmento anterior Heidelberg Spectralis (AS-OCT). Se sacrificaron dos conejos (n = 4 ojos) en cada uno de los días 1, semana 1, semana 4 y semana 6 para determinar los niveles de cobre en los tejidos oculares y se compararon con conejos de control (sin colirio). Se analizaron muestras de humor acuoso, vítreo, retina, córnea, cristalino y sangre para determinar los iones de cobre usando espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).

Los conejos (n=2) se sacrificaron después de 42 días mediante inyección intravenosa de 0.3 ml/kg de solución de eutanasia y se enuclearon los ojos para evaluaciones histológicas y lecturas de signos de inflamación, daño tisular, cicatrices y fibrosis. La sección anterior de los ojos se fijó en solución de formaldehído-glutaraldehído al 10%, se deshidrató en una serie gradual de alcohol, se embebió en parafina y se seccionó con un microtomo. Las secciones se tiñeron con tinción adecuada (hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson).

No hubo efecto en las mediciones de electrorretinografía (ERG) debido al tratamiento con Cu. Además, no se observó toxicidad en ninguno de los tejidos oculares disecados. Además, no se observó turbidez corneal, mientras que la reticulación con láser puede inducir turbidez corneal durante hasta aproximadamente 1 año. Estos resultados se ilustran con más detalle en las FIGs. 7A-7B. La FIG. 7A ilustra imágenes de una córnea teñida con hematoxilina y eosina después de 6 semanas de tratamiento con Cu. La FIG. 7B ilustra imágenes de una retina/coroides teñida con hematoxilina y eosina después de 6 semanas de tratamiento con Cu.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usar en un método para tratar el queratocono, que comprende:

una combinación de un agente que contiene cobre seleccionado del grupo que consiste en sulfato de cobre, carbonato de cobre, acetato de cobre, cloruro de cobre, gluconato de cobre, bromuro de cobre, fluoruro de cobre, nitrato de cobre, yoduro de cobre, perclorato de cobre, molibdato de cobre, tiocianato de cobre, tartrato de cobre, tetrafluoroboratos de cobre, seleniuro de cobre, pirofosfato de cobre, GHK-cobre, cobre-histidina, glicinato de cobre y combinaciones de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el agente que contiene cobre está presente en una cantidad de 0.001% en peso a 0.1% en peso.

2. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde la composición se formula como una de una solución, una suspensión, un gel, un hidrogel, un gel termosensible, un depósito, una película y una lente de contacto.

3. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde:

el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye al menos uno de un agente de tonicidad, un agente solubilizante, un espesante, un polímero, un tampón, un regulador de pH y agua; o

la composición tiene una tonicidad de 270 mOsm/kg a 330 mOsm/kg; o

la composición tiene un pH de 5.8 a 7.8; o

la composición comprende además un ingrediente activo adicional.

4. La composición para uso de la reivindicación 3, en donde el ingrediente activo adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste en riboflavina, rosa de bengala, hidroxilisina y combinaciones de los mismos.

5. Una forma farmacéutica oftálmica tópica, que comprende:

una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que se formula como un colirio y se transporta en un envase adaptado para dispensar la composición gota a gota en un volumen de gota de 5 μl a 50 μl.

6. La forma farmacéutica de la reivindicación 5, en donde el envase está adaptado para dispensar la composición para su uso en un volumen de gota de 15 μl a 40 μl.

7. La composición para usar en un método para tratar el queratocono según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprendiendo dicho método:

administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición a un ojo de un sujeto durante un período de tratamiento.

8. La composición para uso de la reivindicación 7, en donde el medicamento se administra de 1 a 4 momentos específicos por día por ojo que lo necesita.

9. La composición para uso de la reivindicación 8, en donde se administran de aproximadamente 15 μl a aproximadamente 40 μl del medicamento en cada momento específico.

10. La composición para uso de la reivindicación 7, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz:

aumenta la reticulación de lisinonorleucina y/o la reticulación de histidinil-hidroxilisinonorleucina en la córnea en comparación con la reticulación en la córnea sin tratamiento; o

disminuye la tensión radial de la córnea en comparación con la tensión radial de la córnea sin tratamiento; o disminuye las dioptrías corneales en comparación con las dioptrías corneales sin tratamiento.