KR20200030875A

KR20200030875A - 트리코스타틴 a를 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20200030875A
Application number: KR1020180109665A
Authority: KR
Inventors: 박상우; 성미선; 엄광현
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 전남대학교병원
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2020-03-23

Abstract

본 발명은 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로서 구체적으로, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA)를 포함하는 약학적 조성물은 결막의 섬유화, 염증 발생 및 혈관 형성을 억제하고 녹내장 수술 효과를 오래 지속시킬 수 있다.

Description

트리코스타틴 A를 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising trichostatin A for inhibiting conjunctival fibrosis}

본 발명은 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 트리코스타틴 A를 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

녹내장은 망막신경절세포 손상에 의한 비가역적인 시력 손상의 원인질환이며, 전 세계적으로 녹내장 인구는 2010년에 6050만 명 이던 것이, 2020년에는 7960만 명까지 증가할 것으로 추산된다. 안구 압력의 상승이 지속되면, 시신경의 외관 및 기능에 손상을 일으키며, 궁극적으로 시력을 상실하게 되므로. 현재까지 녹내장 치료의 최우선 목표는 안압을 낮춤으로써 더 이상의 시신경 손상이 발생하지 않도록 방지하는 것이고, 약물 치료나 레이저 치료 외의 외과적 수술로서 녹내장 수술로는 결막에 여과포를 만들어 안압을 조절하는 여과수술(filtering glaucoma surgery) 및 방수유출장치 삽입술 등이 있다.

녹내장 여과수술 중에서 주로 실시되는 섬유주 절제술(trabeculectomy)은 새로운 공막 경유(transscleral route) 경로를 만들어, 전방내의 방수가 결막 하 공간으로 배출되어 여과포를 형성하고 이것이 다시 결막 혈관조직 등을 통하여 흡수되게 하여 안압을 낮추는 수술방법이다. 수술 후 창상 치유 과정에서 발생하는 염증반응(inflammatory response)과 이때 분비되는 PDGF, VEGF-A, TGF-β1 등이 테논 낭(tenon's capsule) 섬유아세포(fibroblast)의 분화와 증식을 촉진하면서 결막의 섬유화가 발생하고, 이는 결국 여과포의 기능을 저해하는 요인으로 작용하게 된다. 이를 극복하기 위한 일환으로 MMC(mitomycin-C), 5-FU(5-fluorouracil) 등의 항대사제가 보조적으로 사용되지만, 그 기전이 비특이적이며 결막의 섬유화를 억제할 뿐 아니라 정상적인 결막 또는 공막 조직에도 영향을 미치고 광범위하게 세포 사멸을 유도하고 여과포염(blebitis), 내안구염(endophthalmitis), 각막 상피 결함(corneal epithelial defects), 저안압(hypotony)과 같은 다양한 합병증을 유발할 수 있다는 문제점을 가지고 있다. 따라서 녹내장 수술 후의 섬유화 과정에 선택적으로 작동하는 유전자 발현의 조절 또는 후성 유전학 기전(epigenetic mechanism)을 통한 새로운 치료 방법 개발이 필수적이다.

히스톤 탈아세틸화 효소(histone deacetylase; HDAC)는 유전자 발현을 억제하여 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는데, 최근 HDAC가 다양한 신체 기관에서 발생하는 섬유화 과정에 연관이 있음이 보고되었으나 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제가 결막의 섬유화를 억제한다는 보고가 없고 이를 녹내장 수술후에 수술 효과를 유지하기 위하여 사용된 바도 없으므로, 본 출원의 발명자들은 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제 중의 하나인 트리코스타틴 A(trichostatin A)를 포함하는 조성물이 결막의 섬유화 억제 효능을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0091146호

본 발명의 목적은 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화(conjunctival fibrosis) 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 결막 섬유화(conjunctival fibrosis) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA)는 "(7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide)"로 명명되고 다음의 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 트리코스타틴 A는 천연물에서 추출 및 분리하여 얻거나, 통상적인 유기합성 방법으로 제조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서 "결막 섬유화"는 손상된 결막 조직이 정상적인 결막 조직으로 복구되지 않고 콜라겐과 같은 섬유 조직으로 변형된 상태를 나타내는 것으로서, 안구의 심각한 영구적 기능장애를 유발하게 되는데, 결막 섬유화는 스티브존슨 증후군, 이식편대 숙주반응 등의 질환에서 나타날 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 트리코스타틴 A는 히스톤으로부터 히스톤 아세틸 그룹의 제거를 방해하는 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제일 수 있으며, 바람직하게는 히스톤 탈아세틸화 효소 1(histone deacetylase 1; HDAC1) 저해제일 수 있다.

히스톤 변형(histone modification)은 많은 진핵 세포의 전사 조절에 관여하는 과정으로, 주로 히스톤의 코아 단백질이 아미노 말단에서 아세틸화 및 탈아세틸화 되는 것이 알려져 있다. 이 과정에는 2가지 효소, 즉 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 및 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC)가 작용하는데, 이 중 히스톤 탈아세틸화 효소는 주요한 2가지, 제Ⅰ군 및 제Ⅱ군으로 나누어지고, 제Ⅰ군에는 HDAC1, HDAC2, HDAC3 및 HDAC8 이 속하며 보편적으로 발현되고, 제Ⅱ군에는 HDAC4, HDAC5, HDAC6 및 HDAC7 이 속하고 심장, 뇌 및 골격 근육에서 주로 발현된다.

특히 히스톤 탈아세틸화 효소인 HDAC1 및 HDAC2 는 염기 서열 상에서 높은 상동성(약 82%)을 나타내고 상호 단백질 복합체를 형성하여 히스톤을 탈아세틸화하고 이로써 전사 기작에 관여한다. 또한 HDAC1 은 몇 가지 전사 인자의 전사 활성에 직접적으로 영향을 미치고 세포 분화 과정과도 밀접하게 관련되어 있다.

본 발명에서 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 결막 섬유화는 녹내장 수술 후에 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 녹내장 수술 후에 발생하는 염증을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 녹내장 수술 후에 발생하는 혈관 형성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에서 "녹내장"은 안압이 정상보다 높아져 시신경을 압박하고, 이에 시신경이 손상 또는 파괴됨으로써 시력이 저하 또는 상실되는 안과 질환을 의미한다. 현재 녹내장에 대한 치료는 약제 또는 수술을 통해 안압을 저하시켜 시신경 손상이 진행되지 않도록 하는 방법으로 실시되고 있다. 안압은 방수의 생산과 방수의 유출에 대한 저항 사이의 균형에 의해 결정되는데, 대개의 경우 안압 상승은 방수 유출에 대한 저항이 증가함으로써 초래되므로, 녹내장 수술의 대부분은 주로 안내에서 방수가 유출될 수 있는 통로를 만들어주는 여과 수술의 원리를 이용한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 녹내장 수술에는 여과수술, 최소침습 녹내장 수술법, 모양체 광응고술 등이 있고, 바람직하게는 상기 녹내장 수술은 섬유주 절제술(trabeculectomy) 또는 방수유출장치 삽입술(drainage inplant surgery)일 수 있다.

눈의 잔기둥 그물(trabecular meshwork)의 일부를 제거하여 안내로부터 결막으로의 방수의 배출을 허용함으로써 안내 압력을 감소시키는 섬유주 절제술은 수술 후에 섬유아세포 증식, 염증반응으로 인해 결막의 섬유화가 발생하여 방수의 배출에 문제가 발생할 수 있으며, 이와 같은 결막의 섬유화는 녹내장 수술 실패의 가장 흔한 원인이다.

섬유주 절제술의 성공률이 많이 떨어지는 환자군에서는 관을 통해 방수를 유출시킬 수 있는 방수유출장치 삽입술을 시행하기도 하는데, 방수유출장치 삽입술은 관과 연결된 몸체로 방수를 유출시켜 후부 결막으로 방수를 흡수시키는 수술방법으로서 이 방법도 안구의 안과 밖이 통하기 때문에 수술 후에 감염성 안내염이 발생할수 있고 결막 섬유화으로 인해 방수 유출장치의 몸체 주변이 막히게 되면 삽입된 방수유출장치가 기능을 못하게 될 수 있다.

이를 해결하고자, 항대사제(mitomycin C 또는 5-FU 등)가 보조적으로 사용되고 있으나 그 작용 기전이 비특이적이어서 정상적인 결막 또는 공막 조직에도 영향을 미치고 광범위하게 세포 사멸을 유도하고 각막 상피 독성, 여과포염(blebitis), 내안구염(endophthalmitis), 각막 상피 결함(corneal epithelial defects), 저안압(hypotony) 및 저안압 황반병증과 같은 다양한 합병증을 유발할 수 있다는 문제점을 가지고 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 트리코스타틴 A를 포함하는 약학적 조성물은 결막의 섬유화, 염증 및 혈관 생성을 억제하고 안구에 투여시 독성이 없으므로 합병증이 없으면서도 녹내장 수술 후에 발생할 수 있는 결막의 섬유화에 의한 녹내장 수술 실패를 예방할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 적합한 단위투여형의 제제 및 주사제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 점안제, 안구용 주사제 또는 연고제로서 제공되는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들어, 피부내, 근육내 또는 안구내 국소적 또는 경피 투여를 통하여 전달될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방, 유리체(초자체), 안구내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 주입과 같은 안조직 주입에 의해; 카테터 또는 망막펠렛, 안구내 삽입, 좌약 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 대체기구의 사용으로; 국소적 점안액 또는 연고로; 또는 쿨데삭(Cul-De-Sac)의 서방성 기구 또는 공막에 인접하거나 눈 안의 임플란트에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 용해를 위한 용해 보조제등을 첨가할 수도 있다. 안과적 전달을 위하여, 안과학적으로 허용되는 방부제, 공용매, 계면활성제, 점성증진제, 침투증진제, 버퍼, 염화나트륨 또는 물과 배합되어, 멸균된 안용 수성 현탁액 또는 용액을 형성할 수도 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 200 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 24회, 2일 내지 1주에 1 내지 7회, 또는 1개월 내지 12개월에 1 내지 24회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물에서 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 용매화물, 또는 약학적으로 허용가능한 염은 전체 조성물 총 중량에 대하여 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA)를 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물은 결막의 섬유화, 염증 및 혈관 형성을 억제하고 녹내장 수술 효과를 오래 지속시킬 수 있다.

도 1은 정상 결막하 조직 및 섬유화된 여과포 조직에서 HDAC1 및 HDAC2에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 2는 녹내장 수술 중 아데노바이러스 HDAC1과 HDAC2를 투여하여 HDAC1과 HDAC2를 과발현 시킨 랫트의 조직에서 α-SMA의 발현양을 나타낸다.
도 3은 녹내장 수술 중 아데노바이러스 HDAC1과 HDAC2를 투여하여 HDAC1과 HDAC2를 과발현시킨 랫트의 조직에서 masson's trichrome 염색 결과를 나타낸다.
도 4는 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직을 massons's trichrome 염색한 결과를 나타낸다.
도 5는 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직에서 α-SMA의 발현양을 나타내고, 도 6은 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직에서 α-SMA에 대한 면역조직화학염색 결과를 나타낸다.
도 7은 녹내장 수술을 시술 받고 랫트에 다양한 점안제를 투여한 랫트의 여과포의 혈관 분포 정도를 나타낸다.
도 8은 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 조직에서 CD45 양성 세포에 대한 면역조직화학염색 결과를 나타낸다.
도 9는 TGF-β1 에 대한 발현양 및 Smad2/3 과 p-Smad2/3에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 10은 녹내장 수술을 시술 받은 랫트에 다양한 종류의 점안제를 투여하고 수술 후 1일차 및 14일차에 각막 형광 표층염색 후의 각막 염색 정도를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 섬유화된 여과포 조직에서 HDAC1 및 HDAC2의 단백질 발현 비교

결막 조직의 섬유화에서도 HDAC1 및 HDAC2가 중요한 역할을 하는지에 대해 보고된 바가 없으므로 섬유화된 결막 조직에서 HDAC1과 HDAC2의 발현이 증가하는지 확인하기 위해, 약물치료나 수술치료의 기왕력이 없는 정상인에게서 얻은 정상 결막하 조직(subconjunctival tissue)과 섬유주 절제술에 실패한 환자에서 얻은 섬유화된 여과포 조직(bleb tissue)에 대해서 웨스턴 블롯을 수행하였다.

1-1. 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석

1% NP-40 버퍼(150mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10mM NaF, 1mM Na₃VO₄, 1mM PMSF, 프로테아제 억제제) 1 내지 2㎖에 상기 조직을 넣고 15분간 반응시킨 후에 호모게나이저(homogenizer)로 균질화하였다. 균질액을 13,000rpm으로 15분 동안 원심 분리하고 상층액을 회수하여, BCA Protein 시약을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 10㎍을 취하여 SDS-PAGE 젤에 전기영동한 후에 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 그 후에 5% 탈지분유를 포함하는 TBS-T 완충액(10 mmol/L Tris-HCl [pH 7.6], 150 mmol/L NaCl, 0.1 % NaCl 및 0.1% Tween-20 용액)에 1 시간 동안 실온에서 멤브레인을 블록킹하였다. 4℃에서 1차 항체(HDAC1(1:1000), HDAC2(1:1000) 또는 β-actin; Cell Signaling Technology, Denvers, MA, USA)로 밤새 접촉시켰다. TBS-T를 이용하여 3회 세척 후에 실온에서 2차 항체(anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase(HRP)-linked antibody, 1:3000, Cell Signaling Technology)로 1시간 반응시켰다. 그 후에 멤브레인을 TBS-T 완충액으로 3회 이상 세척하고 기질(Immobilion Western Chemiluminescent HRP substrate; Millipore, USA)을 이용하여 단백질을 확인하였다. LAS-3000 이미지 분석기(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량하였다.

1-2. HDAC1 및 HDAC2 단백질 발현 비교

도 1은 정상 결막하 조직(normal tissue) 및 섬유화된 여과포 조직(failed bleb)에서 HDAC1 및 HDAC2에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 1에서 나타난 바와 같이, HDAC2의 경우 정상 결막하 조직과 섬유화된 여과포 조직 사이에 발현양의 차이가 없었으나, 정상 결막하 조직에 비해 섬유화된 여과포 조직에서 HDAC1의 발현이 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2. HDAC1 및 HDAC2의 과발현이 결막 섬유화에 미치는 영향

섬유주 절제술 후 결막 섬유화에 HDAC 활성이 영향을 미치는지 알아보기 위하여 HDAC1 및 HDAC2의 과발현을 유도하는 아데노바이러스를 점안하고, α-SMA의 발현양 및 콜라겐 침작 정도를 살펴보았다.

2-1. 녹내장 수술 동물 모델

녹내장 수술(섬유주 절제술)은 245 내지 255g 사이의 Sprague-Dawley 랫트의 좌측 안구에 실시하였다. 랫트 마취는 자일라진 하이드로클로라이드(5 mg/kg, xylazine hydrochloride, Rompun, Bayer Korea, Seoul, Korea) 및 틸레타민/졸라제팜(20 mg/kg, tiletamine/zolazepam, Zoletil 50, Virbac, France, France)의 혼합물을 근육내 주사(intramuscular injection)로 투여하여 수행하였다. 0.5 % 프로파라카인 하이드로클로라이드(proparacaine hydrochloride) 점안액(Alcaine; Alcon, Fort Worth, TX, USA)를 이용하여 국소 마취하였다.

랫트를 전신 마취시키고 눈벌리개로 눈을 벌려 안구를 하측으로 견인시킴으로써 상측 결막을 노출시켰다. 10시에서 2시 사이에 위치해 있는 상측 결막을 윤부에서 3 내지 4 ㎜ 뒤까지 박리시킨 후 30 게이지 바늘을 이용한 각막 측면 천자를 통해 점탄물질(Hyalu injection 1.5%; Hanmi Pharmaceutical, Seoul, Korea)을 주사하였다. 그 후 27 게이지 바늘을 이용하여 결막 박리 후 노출된 상측 공막에 full-thickness scleral tunnel을 생성하고, 박리된 결막조직을 다시 원래 위치의 윤부에 봉합한 후 수술을 마무리하였다. 이때 5-FU(5-fluorouracil) 또는 MMC(mitomycin-C)와 같은 항 대사제는 사용하지 않았다. 수술을 받은 모든 랫트에 하루 4회, 수술 후 14일 동안 오플록사신(ofloxacin)을 포함하는 항생제(Ocuflox eye drop; Samil Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 투여하였다. 거의 모든 세포가 효과적으로 아데노 바이러스에 감염되었다.

2-2. HDAC1 및 HDAC2의 과발현

HDAC1 및 HDAC2가 결막 섬유화에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 녹내장 수술 중 HDAC1 및 HDAC2 아데노바이러스(Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canada)를 점안하여 HDAC1 및 HDAC2를 각각 과발현 시켰다. 아데노바이러스 GFP(green fluorescent protein)는 대조군 벡터로서 유전자 전달의 효능을 확인하는데 사용되었다. 섬유주 절제술 중 결막 박리 후 3㎕의 HDAC1, HDAC2 또는 GFP 아데노바이러스 용액(1Х10¹⁰ pfu)을 결막 아래 공간으로 투여하였다. 아데노바이러스의 역가(titer)는 Adeno-X Rapid Titer 키트(Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 확인하였다.

랫트를 (ⅰ) 정상군(normal group). (ⅱ) 바이러스 용액 투여 없이 섬유주 절제술을 시행한 대조군(control group), (ⅲ) 섬유주 절제술 중 GFP 아데노바이러스를 투여한 군(adenoviral GFP group; Ad-GFP), (ⅳ) 섬유주 절제술 중 HDAC1 아데노바이러스를 투여한 군(adenoviral HDAC1 group; Ad-HDAC1), (ⅴ) 섬유주 절제술 중 HDAC2 아데노바이러스를 투여한 군(adenoviral HDAC2 group; Ad-HDAC2)으로 나누어 수술 후 14일차에 랫트를 안락사 시키고, 여과포 조직을 적출하여 masson's trichrome 염색과 α-SMA에 대한 PCR을 시행하여 섬유화 정도를 비교하였다.

2-3. RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative Real-time polymerase chain reaction) 분석

녹내장 수술을 받은 후 14일차에 수술 부위에서 절제된 여과포 조직(bleb tissue)을 채취하여 qRT-PCR(quantitative Real-time polymerase chain reaction)을 수행하였다.

트리졸 시약(TRIzol reagent; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 사용하여 여과포 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 이때 사용한 모든 용액은 0.1% 디에틸피로카보네이트처리수(diethyl pryrocarbonate-treated water, DEPC-dH2O)를 처리하여 RNA 분해효소 활성을 억제하였다. 여과포 조직을 PBS로 완전하게 세척한 다음 트리졸 시약을 첨가하여 피펫팅하여 세포를 분쇄하였다. 상온에서 5분간 방치 후, 상층액에 200㎕의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 세게 흔들어 섞어준 후, 상온에서 15분간 방치한다. 이후 혼합물을 4℃에서 13,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 새로운 튜브에 상층액만 분리하여 200㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 격렬하게 흔들어 혼합한 후 얼음이 든 아이스박스에서 10분간 방치하였다. 혼합액은 4℃, 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 총 RNA를 수득하였다.

iScript cDNA Systhesis Kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 QuantiTech SYBR Green RT-PCR Master Mix(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재되었다. 18S rRNA를 대조군으로 사용하여 각 유전자의 발현양을 계산하였다.

2-4. HDAC1이 과발현된 랫트의 조직에서의 α-SMA의 발현양 증가

도 2는 녹내장 수술 중 아데노바이러스 HDAC1과 HDAC2를 점안하여 HDAC1과 HDAC2를 과발현 시킨 랫트의 여과포 조직에서 α-SMA의 발현양을 나타낸다. α-SMA(α-smooth muscle actin)는 근섬유아세포(myofibroblast)의 마커로서, 근섬유아세포(myofibroblast)는 정상 결막에는 거의 존재하지 않고 주로 수술과 같은 섬유성 자극에 대한 반응으로 테논(Tenon) 조직에 있는 상주 섬유아세포(fibroblast) 분화에 기인한다. 따라서 α-SMA는 조직의 섬유화 발생시 증가하는 대표적인 마커 유전자이다.

도 2에 나타난 바와 같이 섬유주 절제술을 받은 랫트의 조직에서는 수술을 받지 않은 정상 랫트의 조직에 비해 α-SMA의 발현이 유의하게 증가하였고, HDAC1이 과발현된 랫트의 조직에서는 α-SMA의 발현양이 증가된 것을 확인할 수 있다. 그러나 HDAC2와 GFP 아데노바이러스를 투여한 랫트에서는 바이러스 용액의 투여 없이 수술만을 시행했던 랫트(대조군)와 비교하여 α-SMA 발현 정도에 큰 차이가 없었다.

2-5. HDAC1이 과발현된 랫트의 조직에서의 섬유화 정도

masson's trichrome 염색을 통해 조직의 섬유화 정도를 관찰하였다. 상기 2-1 및 2-2의 방법으로 녹내장 수술 및 HDAC 과발현 시킨 후 14일차에 전신마취 하에서 실시예 2-2 에 기재된 (ⅰ) 내지 (ⅴ)군의 랫트를 안락사시키고, 랫트의 안구를 여과포를 그대로 보존한 상태로 적출하고, 상측에 위치한 여과포의 형태를 최대한 유지하기 위하여 상측 눈꺼풀까지 함께 적출하여 최적의 절삭 온도 화합물(optimum cutting temperature compound)에 담고 -80℃에서 동결시켰다. 조직 절단시 여과포의 위치를 확인하기 위하여 여과포의 중간인 윤부 12시 지점에 펜을 이용하여 표시 후 안구를 적출하였다. 7㎛ 두께로 크리오섹션(cryosection)을 한 후 masson's trichrome 염색을 하여 각 군의 섹션을 디지털 카메라가 장착 된 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)에서 검사하고 촬영하여 섬유 조직과 콜라겐 섬유를 관찰하였다. 전체 여과포(bleb) 영역에 대한 콜라겐 영역의 백분율은 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정되었다.

도 3은 녹내장 수술 중 아데노바이러스 HDAC1과 HDAC2를 투여하여 HDAC1과 HDAC2를 과발현 시킨 랫트의 조직에서 masson's trichrome 염색 결과를 나타낸다. 도 3의 결과와 같이, masson's trichrome 염색은 공막(sclera) 위 결막하 공간(subconjunctival space)에 대조군의 수술 부위가 두꺼운 콜라겐 물질을 포함하고 있음을 보여준다. 섬유주 절제술을 받은 랫트에서는 수술을 받지 않은 정상 랫트에 비해 섬유화 정도가 심한 것을 확인할 수 있었다. 아데노바이러스 HDAC1을 투여한 눈은 여과포 구역에서 보다 고밀도의 단단한 결합 조직이 보이므로 HDAC1이 과발현된 랫트에서는 섬유화가 더 증가된 것을 확인할 수 있다.

HDAC1과 HDAC2는 유전적으로 염기 서열이 유사하고 특성이 비슷하여, 통상적으로 타 장기에서는 섬유화에 유사한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있지만, 실시예 2-4 및 상기 결과에 의해서 결막 조직에서는 HDAC1은 결막 섬유화에 밀접한 영향을 미치지만 HDAC2는 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하여 HDAC1과 HDAC2의 섬유화에 대해 미치는 효과가 상이한 것을 알 수 있다.

실시예 3. Trichostatin A(이하, TSA)를 포함하는 점안제의 결막 섬유화 억제 효과

실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술을 시행한 후 랫트를 다음과 같이 6개의 군으로 나누어 서로 다른 점안제의 결막 섬유화 억제 효과를 비교하였다.

(ⅰ) 녹내장 수술을 시술받지 않은 정상 랫트군(normal), (ⅱ) 수술을 시술 받고 항생제 점안제를 투여한 대조군(control), (ⅲ) 수술을 시술 받고 항생제 점안제 및 TSA가 포함되지 않은 용매 점안제를 투여한 랫트군(vehicle control), (ⅳ) 수술을 시술 받고 항생제 점안제 및 스테로이드 제제인 0.1% 플루오로메톨론(fluorometholone) 점안제를 투여한 랫트군(steroid), (ⅴ) 수술을 시술 받고 항생제 및 500nmol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 랫트군(500nmol/L TSA), (ⅵ) 수술을 시술 받고 항생제 및 1㎛ol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 랫트군(1㎛ol/L TSA)

3-1. Trichostatin A 점안제의 제조

Trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)를 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 용액에 녹여 10 mmol/L의 TSA 농축액을 만들고 이것을 다시 평형 염액(balanced salt solution, BSS; Alcon, Fort Worth, TX, USA)으로 희석하여 500nmol/L와 1㎛ol/L의 TSA 용액을 제조하였다. Vehicle control 군에서 사용한 점안제는 BSS로 희석한 0.01% DMSO를 사용하였다. 모든 점안제를 실험 기간이 끝날 때까지 하루 4 번 마취되지 않은 랫트의 수술된 눈에 국소 투여하였다. 수술 후 14 일차에 모든 랫트를 안락사시키고 조직을 채취하였다. 실험은 독립적으로 3회 수행되었다.

3-2. Trichostatin A(TSA) 점안제의 결막 섬유화 억제 효과

상기 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직에 대해 상기의 방법으로 massons's trichrome 염색을 수행하였다. 도 4는 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직을 massons's trichrome 염색한 결과를 나타낸다. 녹내장 수술을 시술 받고 항생제 점안제만을 투여했던 대조군(control), 용매 대조군(vehicle control) 및 500nmol/L TSA 점안제를 투여했던 군에 비하여 steroid 점안제를 투여했던 군과 1㎛ol/L TSA 점안제를 사용했던 군에서 유의한 섬유화의 감소를 확인할 수 있다.

도 5는 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직에서 α-SMA의 발현양을 나타내고, 도 6은 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 여과포 조직에서 α-SMA에 대한 면역조직화학염색 결과를 나타낸다. 상기에서 서술한 실시예 2-3과 같은 방법으로 조직을 처리한 후, α-SMA에 대한 항체(ab5694; Abcam, Cmbridge, MA, UK)를 이용하여 면역조직화학염색을 실시하였다.

도 5에 나타난 바와 같이 녹내장 수술을 시행 받고 항생제 점안제만을 사용했던 대조군(control), 용매 점안제만을 사용했던 용매 대조군(vehicle control), 500nmol/L TSA 점안제를 사용했던 군에 비하여 steroid 점안제를 사용했던 군과 1㎛ol/L TSA 점안제를 사용했던 군에서 α-SMA 발현이 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있고, 도 6에 나타난 바와 같이 면역조직화학염색에서도 α-SMA를 나타내는 녹색 형광이 steroid 점안제를 사용했던 군과 1㎛ol/L TSA 점안제를 사용했던 군에서 감소한 것을 확인할 수 있다.

실시예 4. Trichostatin A 점안제의 혈관 형성 억제 효과

실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술을 시행한 후 랫트를 다음과 같이 6개의 군으로 나누어 서로 다른 점안제의 혈관 형성 억제 효과를 비교하였다.

세극등 생체 현미경(slit lamp biomicroscopy; BQ-900; Haag-Streit, Bern, Switzerland)을 사용하여 혈관 형성 억제에 대한 TSA의 효능을 녹내장 수술 후 14일차에 평가하였다. 도 7은 섬유주 절제술을 시술 받고 랫트에 다양한 점안제를 투여한 랫트의 여과포의 혈관 분포 정도를 나타낸다. 여과포의 혈관 분포가 증가할수록 섬유화가 심하고 여과포의 기능이 좋지 못함을 의미한다. 도 7에 나타난 바와 같이, 수술을 시술 받고 항생제 점안제를 투여한 대조군(control), TSA가 포함되지 않은 용매 점안제를 투여한 군(vehicle control), 500nmol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 군(500nmol/L TSA)에 비하여 스테로이드 제제인 0.1% 플루오로메톨론(fluorometholone) 점안제를 투여한 군(steroid)과 1㎛ol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 군(1㎛ol/L TSA)에서 여과포의 혈관 분포가 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있다.

실시예 5. Trichostatin A 를 포함하는 점안제의 염증 억제 효과

실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술(섬유주 절제술)을 시행한 후 랫트를 다음과 같이 6개의 군으로 나누어 서로 다른 점안제의 염증 억제 효과를 비교하였다.

5-1. 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining)

여과포의 염증은 조직의 섬유화를 유발하므로 염증 억제는 섬유화 예방을 위해 중요하다. CD45는 백혈구세포를 나타내는 마커로서 조직내의 CD45 양성 세포 증가는 염증 증가 상태를 의미하므로 염증은 CD45에 대한 면역조직화학 염색으로 분석하였다.

상기 실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술을 시술 받은 랫트에 상기 6개의 군과 같이 다른 종류의 점안제를 투여하고 수술 후 2주차에 상측에 위치한 여과포의 형태를 최대한 유지하기 위하여 상측 눈꺼풀까지 함께 적출하여 최적의 절삭 온도 화합물(optimum cutting temperature compound)에 담고 -80℃에서 동결시켰다. 조직 절단시 여과포의 위치를 확인하기 위하여 여과포의 중간인 윤부 12시 지점에 펜을 이용하여 표시 후 안구를 적출하였다. 7㎛ 두께로 크리오섹션(cryosection)을 한 후 절편을 1 차 항체(항 마우스 CD45 항체, 1/150; ab10558; Abcam)와 함께 배양한 후, Alexa Fluor 488 결합 염소 항 마우스 IgG 2차 항체(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 1 시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 슬라이드를 DAPI(4'6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)를 함유한 배지로 마운트하였다. 절편 조직의 형광 이미지는 공 초점 레이저 현미경(LSM 510, Carl Zeiss Microscopy, Peabody, MA, USA)을 사용하여 획득하였다.

5-2. Trichostatin A 를 포함하는 점안제의 염증 억제 효과

도 8은 다양한 종류의 점안제를 투여한 랫트의 조직에서 CD45 양성 세포에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. 도 8에 나타난 결과와 같이 대조군(control)과 용매 점안제를 투여한 군(vehicle control)에 비하여 0.1% 플루오로메톨론(fluorometholone) 점안제를 투여한 군(steroid), 500nmol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 군(500nmol/L TSA), 및 1㎛ol/L TSA를 포함하는 점안제를 투여한 군(1㎛ol/L TSA)에서 CD45 양성 세포의 분포가 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었고, 그 감소 정도는 steroid 군과 1㎛ol/L TSA군에서 더욱 두드러졌음을 알 수 있었다. 이를 통하여 trichostatin A 점안제가 녹내장 수술 후 염증 억제에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6. Trichostatin A 를 포함하는 점안제의 섬유화 억제 기전

상기 실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술을 시행 받은 쥐에 각기 다른 안약을 점안하고 수술 후 2주차에 여과포 조직을 얻어 TGF-β1(transforming growth factor-β1)에 대한 PCR과 Smad2/3, phosphorylated Smad 2/3에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. PCR은 상기 실시예 2-3의 방법으로 수행하였고, 웨스턴 블롯은 1차 항체로 Smad2/3(1:1,000; Cell Signaling Technology)와 phosphorylated-Smad2/3(p-Smad2/3; 1:1,000; Cell Signaling Technology)를 사용하였다는 점 외에 상기 실시예 1-1의 방법과 동일하게 수행하였다.

도 9는 TGF-β1에 대한 상대적인 발현양 및 Smad2/3 과 p-Smad2/3에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 9에 나타난 바와 같이, 1㎛ol/L TSA 점안제를 사용하였던 군에서 TGF-β1과 phosphorylated Smad 2/3의 발현이 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있는데, 이 결과로부터 TSA 점안제의 작용 기전이 TGF-β1 의존 경로를 통한 Smad2/3의 활성의 억제와 연관이 있음을 알 수 있다.

실시예 7. Trichostatin A 를 포함하는 점안제의 안전성

점안제의 중요한 요건 중 하나는 각막 상피 세포에 대해 독성이 없어야 한다는 것이므로, 실시예 2-1의 방법으로 녹내장 수술을 시행한 후 랫트를 다음과 같이 6개의 군으로 나누어 각막 형광 염색 분석을 통하여 TSA를 포함하는 점안제의 안정성을 평가하였다.

7-1. 각막 형광 염색 분석(Corneal fluorescein staining analysis)

세극등 생체 현미경(slit lamp biomicroscopy; BQ-900; Haag-Streit, Bern, Switzerland)을 사용하여 각막 상피에 대한 국소 TSA의 독성을 녹내장 수술 후 1일차 및 14일차에 평가하였다. 각막 형광 염색 분석(Corneal fluorescein staining analysis)은 각막에 대한 독성평가에 많이 사용되는 방법으로서 각막의 표면에 있는 epithelial layer에 손상이 있는 경우 형광염색이 일어난다.

마이크로 파이펫을 이용하여 1㎕의 1% 소디움 플루오레세인(sodium fluorescein)을 결막낭(conjunctival sac)에 점안 후 각막 표면의 점상(punctuate) 염색을 맹검 방식으로 평가하였다. 각막 염색정도에 따라 0점에서 16점의 점수를 부여하였고, 16점에 가까울수록 각막상피손상이 심함을 의미한다.

7-2. Trichostatin A 를 포함하는 점안제의 안전성

도 10은 녹내장 수술을 시술 받은 랫트에 다양한 종류의 점안제를 투여하고 수술 후 1일차 및 14일차에 각막 형광 표층염색 후의 각막 염색 정도를 나타낸다. 도 10에 나타난 바와 같이, 수술 후 모든 군에서 각막 형광염색 점수가 증가하였으나 점안제에 따른 차이는 없었다. 이 결과는 수술 자체에 의한 각막상피손상이 발생하지만 TSA 점안제가 각막에 대한 추가적인 독성을 갖지 않는다는 것을 보여주므로 TSA를 포함하는 점안제가 안정한 것을 알 수 있다.

통계 분석

실험결과는 평균의 평균±표준 오차로 표현되었다. 분석은 Windows용 SPSS 소프트웨어 버전 19.0(SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다. 통계 분석은 일방 분산 분석(ANOVA)과 사후 임시 피셔 최소 중요 차이(LSD) 테스트를 사용하여 실험군을 비교하여 수행되었다. 녹내장 수술 후 1 일차와 14 일차에 Wilcoxon의 sign-rank test를 사용하여 각막 형광염색 점수를 비교하였다. P <0.05의 확률 값이 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY Chonnam National University Hospital <120> Pharmaceutical composition comprising trichostatin A for inhibiting conjunctival fibrosis <130> PN180196 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a(alpha)-SMA_forward <400> 1 actgggacga catggaaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a(alpha)-SMA_reverse <400> 2 catctccaga gtccagcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b(beta)1_forward <400> 3 atgacatgaa ccgacccttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b(beta)1_reverse <400> 4 acttccaacc caggtccttc 20

Claims

트리코스타틴 A(trichostatin A; TSA) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 결막 섬유화(conjunctival fibrosis) 억제용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 트리코스타틴 A 는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 (histone deacetylase; HDAC1) 저해제인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 결막 섬유화는 녹내장 수술 후에 발생하는 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 녹내장 수술 후에 발생하는 염증을 억제하는 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 녹내장 수술 후에 발생하는 혈관 형성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹내장 수술은 섬유주 절제술(trabeculectomy) 또는 방수유출장치 삽입술(drainage inplant surgery)인 것인 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 점안제, 안구용 주사제 또는 연고제로서 제공되는 것인 약학적 조성물.