BRPI0905076B1

BRPI0905076B1 - anticorpo anti-receptor de il-6, gene e composição farmacêutica compreendendo o mesmo

Info

Publication number: BRPI0905076B1
Application number: BRPI0905076-0A
Authority: BR
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Atsuhiko Maeda; Mika Sakurai; Tetsuo Kojima; Tatsuhiko Tachibana; Hirotake Shiraiwa; Hiroyuki Tsunoda; Yoshinobu Higuchi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2021-01-05
Also published as: HK1147107A1; RU2430111C1; CR20110204A; MY153908A; TW201021829A; US20110098450A1; CL2011000632A1; US20230159648A1; JPWO2010035769A1; NL301152I1; ZA201103027B; AR073404A1; ES2546800T3; FR21C1054I1; NO2021048I1; KR20110046385A; DK2330193T3; JP4550938B2; HUS2100050I1; HUE027533T2

Abstract

POLIPEPTÍDEO, ANTICORPO, REGIÃO VARIÁVEL CADEIA PESADA OU CADEIA LEVE, GENE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR O REFERIDO POLIPETÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem moléculas de segunda geração que são superiores aquelas de TOCILIZUMAB, que é um anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado para realçar a capacidade de neutralização de antígeno e aumentar os farmacocinéticos, de modo que o efeito terapêutico seja exercido com uma frequência menor de administração, e a imunogenicidade,segurança e propriedade físico-químicas (estabilidade e homogeneidade)sejam melhoradas. A presente invenção também fornece métodos para produzir essas composições farmacêuticas. Os presentes inventores geraram, de forma bem-sucedidas, as moléculas de segunda geração que são superiores aquelas de TOCILIZUMAB apropriadamente combinando-se as alterações da sequência de aminoácido nos domínios de CDR, regiões variáveis, regiões constantes.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo de receptor anti-IL-6 como um ingrediente ativo, métodos para produzir as composições, e similares.

Técnica Antecedente

[002] Os anticorpos estão chamando a atenção como produtos farmacêuticos, uma vez que eles são altamente estáveis no plasma e têm poucos efeitos adversos. Entre eles, vários produtos farmacêuticos de anticorpo do tipo IgG estão disponíveis no mercado e muitos produtos farmacêuticos de anticorpo estão atualmente em desenvolvimento (Documentos de Não-Patente 1 e 2). IL-6 é uma citocina envolvida em várias doenças autoimunes, doenças inflamatórias, tumores malignos, e assim por diante (Documento de Não-Patente 3). TOCILIZUMAB, um anticorpo IgG1 de receptor anti-IL- 6 humanizado, especificamente se liga ao receptor de IL-6. É considerado que TOCILIZUMAB pode ser usado como um agente terapêutico para doenças associadas a IL-6 tal como artrite reumatoide, uma vez que ele neutraliza a atividade biológica de IL-6 (Documentos de Patente 1 a 3, e Documento de Não-Patente 4). TOCILIZUMAB foi aprovado como um agente terapêutico para doença de Castleman e artrite reumatoide no Japão (Documento de Não- Patente 5).

[003] Os anticorpos humanizados tal como TOCILIZUMAB são produtos farmacêuticos de anticorpo de primeira geração. Os produtos farmacêuticos de anticorpo de segunda geração estão atualmente sendo desenvolvidos melhorando-se a eficácia, conveniência, e custo de produtos farmacêuticos de anticorpo de primeira geração. Várias tecnologias que são aplicáveis aos produtos farmacêuticos de anticorpo de segunda geração estão sendo desenvolvidas. As tecnologias para realçar a função efetora, capacidade de ligação de antígeno, farmacocinéticos, e estabilidade, bem como tecnologias para reduzir o risco de imunogenicidade foram reportadas. Como métodos para realçar a eficácia do fármaco ou reduzir a dosagem, tecnologias que realçam a atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo (atividade ADCC) ou atividade citotóxica dependente de complemento (atividade CDC) através de substituição de aminoácido na região Fc de um anticorpo foram reportadas (Documento de Não- Patente 6). Além disso, a maturação por afinidade foi reportada como uma tecnologia para realçar a capacidade de ligação de antígeno ou capacidade de neutralização de antígeno (Documento de Não-Patente 7). Esta tecnologia permite alguém realçar a atividade de ligação de antígeno introduzindo-se mutações de aminoácido na região de determinação de complementaridade (CDR) de uma região variável ou similar. O realce da capacidade de ligação de antígeno melhora a atividade biológica in vitro ou reduz a dosagem, e também melhora a eficácia in vivo (Documento de Não-Patente 8). Atualmente, as experiências clínicas estão sendo administradas para avaliar Motavizumab (produzido por maturação por afinidade), que é esperado ter uma eficácia superior do que Palivizumab, um produto farmacêutico de anticorpo anti-RSV de primeira geração (Documento de Não- Patente 9). Um anticorpo de receptor anti-IL-6 com uma afinidade de cerca de 0,05 nM (isto é, maior afinidade do que aquela de TOCILIZUMAB) foi reportado (Documento de Patente 4). Entretanto, não há nenhum relato que descreva um anticorpo humano, humanizado, ou quimérico tendo uma afinidade maior do que 0,05 nM.

[004] Um problema encontrado com os produtos farmacêuticos atuais de anticorpo é o custo de produção elevado associado à administração de quantidades extremamente grandes de proteína. Por exemplo, a dosagem de TOCILIZUMAB, um anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado, foi estimado ser cerca de 8 mg/kg/mês por injeção intravenosa (Documento de Não-Patente 4). Sua forma preferida de administração é formulação subcutânea em doenças autoimunes crônicas. Em geral, é necessário que as formulações subcutâneas sejam formulações de concentração elevada. A partir da perspectiva de estabilidade ou similar, o limite para formulações de anticorpo do tipo IgG é geralmente cerca de 100 mg/ml (Documento de Não-Patente 10). Os produtos farmacêuticos de anticorpo de segunda geração de custo baixo, convenientes que podem ser administrados subcutaneamente em intervalos mais longos podem ser fornecidos aumentando-se a meia-vida de um anticorpo no plasma para prolongar seu efeito terapêutico e desse modo reduzir a quantidade de proteína administrada, e concedendo-se o anticorpo com estabilidade elevada.

[005] FcRn está estritamente envolvido em farmacocinéticos de anticorpo. Com respeito às diferenças na meia-vida do plasma de isótipos de anticorpo, IgG1 e IgG2 são conhecidos por terem meia-vida de plasma superior todo que IgG3 e IgG4 (Documento de Não-Patente 11). Como um método para também melhorar a meia-vida do plasma de anticorpos IgG1 e IgG2 que têm meias vidas de plasma superiores, a substituição de aminoácidos na região constante que realça a ligação a FcRn foi reportada (Documentos de Não-Patente 12 e 13). Do ponto de vista de imunogenicidade, outra melhora da meia-vida de plasma é realizada substituindo-se aminoácidos preferivelmente na região variável exceto na região constante (Documento de Patente 5). Entretanto, não há nenhum relato até hoje sobre a melhora da meia- vida de plasma de anticorpos de receptor de IL-6 através da alteração da região variável.

[006] Outro problema importante encontrado no desenvolvimento de bioprodutos farmacêuticos é a imunogenicidade. Em geral, a imunogenicidade de anticorpos de camundongo é reduzida por humanização de anticorpos. É suposto que o risco de imunogenicidade possa ser também reduzido usando-se uma sequência de estrutura de linha germinativa como um modelo na humanização de anticorpo (Documento de Não-Patente 14). Entretanto, mesmo Adalimumab, um anticorpo anti-TNF completamente humano, mostrou imunogenicidade de frequência elevada (13% a 17%), e o efeito terapêutico foi constatado ser reduzido em pacientes que mostraram imunogenicidade (Documentos de Não-Patente 15 e 16). Os epítopos de célula T podem estar presentes mesmo no CDR de anticorpos humanos, e esses epítopos de célula T em CDR são possíveis causas de imunogenicidade. Os métodos in silico e in vitro para prognóstico de epítopos de célula T foram reportados (Documentos de Não-Patente 17 e 18). É suposto que o risco de imunogenicidade pode ser reduzido removendo-se os epítopos de célula T prognosticados usando tais métodos. (Documento de Não-Patente 19).

[007] TOCILIZUMAB, um anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado, é um anticorpo IgG1 obtido por humanização de anticorpo de camundongo PM1. O enxerto de CDR é realizado usando sequências humanas de NEW e REI como estrutura modelo para as cadeias H e L, respectivamente; entretanto, cinco aminoácidos de sequência de camundongo são retidos na estrutura como aminoácidos essenciais para manter a atividade (Documento de Não-Patente 20). Não há nenhum relato prévio que completamente humanize a sequência de camundongo restante na estrutura do anticorpo humanizado TOCILIZUMAB sem reduzir a atividade. Além disso, a sequência de CDR de TOCILIZUMAB é uma sequência de camundongo, e desse modo, como Adalimumab, pode ter epítopos de célula T no CDR, que pode ter um risco de imunogenicidade potencial. Em experiências clínicas de TOCILIZUMAB, os anticorpos anti- TOCILIZUMAB não foram detectados na dose eficaz de 8 mg/kg, porém eles foram observados nas doses de 2 mg/kg e 4 mg/kg (Documento de Patente 6). Isto sugere que ainda há possibilidade para a imunogenicidade de TOCILIZUMAB. Entretanto, nesse aspecto foi reportado não foi reportado na redução do risco de imunogenicidade de TOCILIZUMAB por substituição de aminoácido.

[008] O isótopo de TOCILIZUMAB é IgG1. A diferença de isótopo refere-se a diferença na sequência de região constante. Uma vez que a sequência de região constante é considerada ter forte influência na função efetora, farmacocinéticos, propriedades físicas, e assim por diante, a seleção da sequência de região constante é muito importante para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos de anticorpo (Documento de Não-Patente 11). Nos últimos anos, a segurança de produtos farmacêuticos de anticorpo se tornou de grande importância. A interação entre a porção de anticorpo Fc e receptor FCY (função efetora) pode ter causado sérios efeitos adversos em experiências clínicas de fase I de TGN1412 (Documento de Não-Patente 21). Para produtos farmacêuticos de anticorpo designados para neutralizar a atividade biológica de um antígeno, a ligação ao receptor FCY, que é importante para as funções efetoras tal como ADCC, é desnecessária. A ligação ao receptor Fcy pode ainda ser favorável do ponto de vista de efeitos adversos. Um método para reduzir a ligação ao receptor Fcy é alterar o isótipo de um anticorpo IgG de IgG1 para IgG2 ou IgG4 (Documento de Não-Patente 22). IgG2 é mais favorável do que IgG4 do ponto de vista de farmacocinéticos e ligação de receptor I Fcy (Documento de Não-Patente 11). TOCILIZUMAB é um anticorpo neutralizante de receptor de IL-6-, e seu isótipo é IgG1. Desse modo, em vista dos efeitos adversos potenciais, IgG2 pode ser um isótipo preferido uma vez que as funções efetoras tal como ADCC não são necessárias.

[009] Entretanto, ao desenvolver produtos farmacêuticos de anticorpo, as propriedades físico-químicas das proteínas, em particular, homogeneidade e estabilidade são muito cruciais. Foi reportado que para o isótipo de IgG2, há heterogeneidade significante derivada das ligações de dissulfeto na região de articulação (Documento de Não-Patente 23). Não é fácil e seria mais dispendioso fabricá-los como produto farmacêutico em grande escala ao mesmo tempo em que mantendo a heterogeneidade das substâncias objetivas/substâncias relacionadas derivadas de ligações de dissulfeto entre as produções. Desse modo, as substâncias únicas são desejáveis tanto quanto possível. Além disso, para heterogeneidade das sequências C-terminais de cadeia H de um anticorpo, a deleção de resíduo de lisina de aminoácido C-terminal, e amidação do grupo carboxila C-terminal devido à deleção de ambos os aminoácidos C- terminais, glicina e lisina, foi reportada (Documento de Não-Patente 24). Ao desenvolver os anticorpos de isótipo IgG2 como produtos farmacêuticos, é preferível reduzir tal heterogeneidade e manter a estabilidade elevada. Para produzir formulações administradas subcutaneamente de concentração elevada, estáveis, convenientes, é preferível que não somente a estabilidade seja elevada, porém também a meia-vida do plasma seja superior àquela de IgG1 que é o isótipo de TOCILIZUMAB. Entretanto, não há nenhum relato anterior sobre as sequências de região constante para anticorpos com a região constante de isótipo de IgG2 que tivesse heterogeneidade reduzida, estabilidade elevada, e meia-vida de plasma superior do que os anticorpos com a região constante de isótipo IgG1.

[010] Os documentos da técnica anterior relacionados com a presente invenção são mostrados abaixo:

[011] [Documentos da Técnica Anterior]

[012] [Documentos de Patente]

[013] [Documento de Patente 1] WO 92/19759

[014] [Documento de Patente 2] WO 96/11020

[015] [Documento de Patente 3] WO 96/12503

[016] [Documento de Patente 4] WO 2007/143168

[017] [Documento de Patente 5] WO 2007/114319

[018] [Documento de Patente 6] WO 2004/096273

[019] [Documentos de Não-Patente]

[020] [Documento de Não-Patente 1] Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005). [Documento de Não-Patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. Abril de 2005; 59(3):389-96. [Documento de Não-Patente 3] Nishimoto N, Kishimoto T., Interleucina 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. Novembro de 2006; 2(11):619-26. [Documento de Não- Patente 4] Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, Broll J, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleucina-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. Setembro de 2006; 54(9):2817-29. [Documento de Não-Patente 5] Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh T, Nakamura M, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki T, Nishioka K, Hara M, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto T. Humanized anti-interleucina-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 15 de outubro de 2005; 106(8):2627-32. [Documento de Não-Patente 6] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 31 de agosto de 2005; 20(1):17-29. Review. [Documento de Não-Patente 7] Rothe A, Hosse RJ, Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. Fevereiro de 2006; 6(2):177-87. [Documento de Não- Patente 8] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 14 de junho de 2005; 102(24):8466-71. Epub 6 de junho de 2005. [Documento de Não-Patente 9] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper e Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665. [Documento de Não-Patente 10] Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. Junho de 2004; 93(6):1390-402. [Documento de Não-Patente 11] Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. Dezembro de 2007; 25(12):1369-72. [Documento de Não-Patente 12] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-live., J Immunol. 1 de janeiro de 2006; 176(1):346-56. [Documento de Não- Patente 13] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. Julho de 1997; 15(7):637-40. [Documento de Não-Patente 14] Hwang WY, Almagro JC, Buss TN, Tan P, Foote J. Use of human line germinative genes in a CDR homology-com base approach to antibody humanization .Methods. Maio de 2005; 36(1):35-42. [Documento de Não-Patente 15] Bartelds GM, Wijbrandts CA, Nurmohamed MT, Stapel S, Lems WF, Aarden L, Dijkmans BA, Tak P, Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti- adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 9 de março de 2007; [Epub antes da impressão] [Documento de Não-Patente 16] Bender NK, Heilig CE, Droll B, Wohlgemuth J, Armbruster FP, Heilig B. Imunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. Janeiro de 2007; 27(3):269-74. [Documento de Não-Patente 17] Van Walle I, Gansemans Y, Parren PW, Stas P, Lasters I. Imunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. Março de 2007; 7(3):405-18. [Documento de Não-Patente 18] Jones TD, Phillips WJ, Smith BJ, Bamford CA, Nayee PD, Baglin TP, Gaston JS, Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. Maio de 2005; 3(5):991-1000. [Documento de Não-Patente 19] Chirino AJ, Ary ML, Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 15 de janeiro de 2004; 9(2):82-90. [Documento de Não-Patente 20] Sato K, Tsuchiya M, Saldanha J, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kishimoto T, Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleucin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 15 de fevereiro de 1993; 53(4):851-6. [Documento de Não-Patente 21] Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan; 6(1):75-92. [Documento de Não- Patente 22] Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. Junho de 1998; 76(6):231-48. [Documento de Não-Patente 23] Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 6 de junho de 2008; 283(23):16206-15. [Documento de Não-Patente 24] Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal terminal-C amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 1 de janeiro de 2007; 360(1):75-83. Descrição da Invenção Problemas a serem Resolvidos pela Invenção

[021] A presente invenção foi obtida em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é fornecer as composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de segunda geração que são superiores àquelas do anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado TOCILIZUMAB, alterando-se as sequências de aminoácido das regiões variável e constante de TOCILIZUMAB para realçar a capacidade de neutralizar antígeno e melhorar os farmacocinéticos, tal que os efeitos terapêuticos prolongados sejam exercidos com uma frequência menor de administração, e imunogenicidade, segurança, e propriedades físico-químicas (estabilidade e homogeneidade) sejam melhoradas (a seguir, essas composições farmacêuticas também podem ser referidas como os "agentes" ou as "formulações"). Outro objetivo é fornecer métodos para produzir tais composições farmacêuticas.

Meios para Resolver os Problemas

[022] Os presentes inventores conduziram estudos dedicados para gerar moléculas de segunda geração que são superiores àquelas do anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado de primeira geração TOCILIZUMAB, alterando-se as sequências de aminoácido das regiões variável e constante de TOCILIZUMAB para realçar a eficácia e melhorar os farmacocinéticos, de modo que o efeito terapêutico prolongado seja exercido com uma frequência menor de administração, e imunogenicidade, segurança, e propriedades físico- químicas (estabilidade e homogeneidade) sejam melhoradas. Como um resultado, os presentes inventores descobriram múltiplas mutações de CDR nas regiões variáveis de TOCILIZUMAB que melhoram a capacidade de ligação (afinidade) ao antígeno. Os presentes inventores desse modo de forma bem-sucedida melhoraram a afinidade significantemente usando uma combinação de tais mutações. Os presentes inventores também foram bem-sucedidos na melhora de farmacocinéticos introduzindo-se modificações que reduziram o ponto isoelétrico da sequência de região variável. Os presentes inventores também foram bem-sucedidos na melhora de farmacocinéticos fazendo com que a ligação ao antígeno de receptor de IL-6 fosse dependente de pH, de modo que uma molécula de anticorpo única possa neutralizar o antígeno múltiplas vezes. Além disso, os presentes inventores de forma bem-sucedida reduziram o risco de imunogenicidade completamente humanizando-se as sequências derivadas de camundongo que permanecem na estrutura de TOCILIZUMAB e reduzindo o número de peptídeos de epítopos de célula T nas regiões variáveis prognosticadas in silico. Além disso, os presentes inventores também de forma bem-sucedida descobriram novas sequências de região constante para a região constante de TOCILIZUMAB, que reduz a ligação ao receptor FCY quando comparado com IgG1 para melhorar a segurança, melhorar os farmacocinéticos quando comparado com IgG1, e reduzir a heterogeneidade devido às ligações de dissulfeto na região de articulação de IgG2 e a heterogeneidade devido ao C-terminal de cadeia H sem diminuir a estabilidade. Os presentes inventores de forma bem-sucedida produziram moléculas de segunda geração que são superiores àquelas de TOCILIZUMAB apropriadamente combinando-se essas alterações de sequência de aminoácido no CDR, regiões variáveis, e regiões constantes.

[023] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo IgG de receptor anti-IL- 6 humanizado tendo capacidade de ligação de antígeno (receptor de IL-6) superior, farmacocinéticos superiores , segurança superior e propriedades físicas (estabilidade e homogeneidade), e também o risco de imunogenicidade reduzido, alterando-se as sequências de aminoácido de regiões variáveis e constantes do anticorpo IgG1 de receptor anti-IL-6 humanizado TOCILIZUMAB; e métodos para produzir tais composições farmacêuticas. Mais especificamente, a presente invenção fornece: 1 um polipeptídeo de qualquer um dentre: (a) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 (CDR1 de VH4-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 (CDR2 de VH4- M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 (CDR3 de VH4-M73); (b) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 (CDR1 de VH3-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 (CDR2 de VH3- M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 6 (CDR3 de VH3-M73); (c) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7 (CDR1 de VH5-M83), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 (CDR2 de VH5- M83), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 (CDR3 de VH5-M83); (d) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 (CDR1 de VL1), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 11 (CDR2 de VL1), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 12 (CDR3 de VL1); (e) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 (CDR1 de VL3), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 (CDR2 de VL3), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 15 (CDR3 de VL3); e (f) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 (CDR1 de VL5), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 17 (CDR2 de VL5), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 18 (CDR3 de VL5); 2 um anticorpo de qualquer um dentre: (a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 (CDR1 de VH4-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 (CDR2 de VH4-M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 (CDR3 de VH4-M73), e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 (CDR1 de VL1), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 11 (CDR2 de VL1), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 12 (CDR3 de VL1); (b) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 (CDR1 de VH3-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 (CDR2 de VH3-M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 6 (CDR3 de VH3-M73), e um região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 (CDR1 de VL3), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 (CDR2 de VL3), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 15 (CDR3 de VL3); e (c) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7 (CDR1 de VH5-M83), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 (CDR2 de VH5-M83), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 (CDR3 de VH5-M83), e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 (CDR1 de VL5), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 17 (CDR2 de VL5), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 18 (CDR3 de VL5); 3 uma região variável de qualquer uma dentre: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (região variável de VH4-M73); (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 20 (região variável de VH3-M73); (c) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (região variável de VH5-M83); (d) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 (região variável de VL1); (e) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (região variável de VL3); e (f) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (região variável de VL5); 4 um anticorpo de qualquer um dentre: (a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (região variável de VH4-M73) e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 (região variável de VL1); (b) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 20 (região variável de VH3-M73) e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (região variável de VL3); e (c) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (região variável de VH5-M83) e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (região variável de VL5); 5 uma cadeia pesada ou cadeia leve de qualquer uma dentre: (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73); (b) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73); (c) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83); (d) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 28 (VL1); (e) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 (VL3); e (f) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 (VL5); 6 um anticorpo de qualquer um dentre: (a) um anticorpo que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 28 (VL1); (b) um anticorpo que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73) e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 (VL3); e (c) um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83) e uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 (VL5); 7 um gene que codifica o polipeptídeo de qualquer um dentre 1 a 6; 8 um vetor que carrega o gene de [7]; 9 uma célula hospedeira que carrega o vetor de [8]; 10 um método para produzir o polipeptídeo de qualquer uma dentre 1 a 6 cultivando-se a célula hospedeira de 9; e 11 uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo de qualquer um dentre 1 a 6 ou um polipeptídeo produzido pelo método de 10.

Efeitos da Invenção

[024] Os anticorpos IgG de receptor anti-IL-6 humanizados obtidos de acordo com a presente invenção tiveram eficácia realçada e farmacocinéticos melhorados; desse modo, eles podem exercer um efeito terapêutico prolongado com uma frequência de administração menor.

Breve Descrição dos Desenhos

[025] Figura 1 é uma listagem dos sítios de mutação que melhoram a afinidade de TOCILIZUMAB com o receptor de IL-6. A Sequência de HCDR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 81; a sequência de HCDR2 após a mutação (linha superior) é mostrada na SEQ ID NO: 82; a sequência de HCDR2 após a mutação (linha inferior) é mostrada na SEQ ID NO: 83; a Sequência de HCDR3 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 84; a sequência de HCDR3 após a mutação (linha superior) é mostrada na SEQ ID NO: 85; a sequência de HCDR3 após a mutação (linha inferior) é mostrada na SEQ ID NO: 86; a Sequência de LCDR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 87; a sequência de LCDR1 após a mutação (linha superior) é mostrada na SEQ ID NO: 88; a sequência de LCDR1 após a mutação (linha inferior) é mostrada na SEQ ID NO: 89; a Sequência de LCDR3 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 90; a sequência de LCDR3 após a mutação (linha superior) é mostrada na SEQ ID NO: 91; e a sequência de LCDR3 após a mutação (linha inferior) é mostrada na SEQ ID NO: 92.

[026] Figura 2 é um gráfico que mostra as atividades de neutralização de TOCILIZUMAB e RDC-23 em BaF/gp130.

[027] Figura 3 é uma listagem de sítios de mutação que podem reduzir o ponto isoelétrico da região variável sem significantemente reduzir a ligação de TOCILIZUMAB ao receptor de IL-6. Asterisco no desenho representa um sítio que não tem nenhuma influência no ponto isoelétrico, porém que foi mutado para conversão em uma sequência humana. A sequência de HFR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 93; a sequência de HFR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 94; a sequência de HCDR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 95; a sequência de HCDR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 96; a sequência de HFR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 97; a sequência de HFR2 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 98; a sequência de HCDR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 81; a sequência de HCDR2 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 99; a sequência de HFR4 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 100; a sequência de HFR4 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 101; a sequência de LFR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 102; a sequência de LFR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 103; a sequência de LCDR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 87; a sequência de LCDR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 104; a sequência de LFR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 105; a sequência de LFR2 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 106; a sequência de LCDR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 107; as sequências de LCDR2 após a mutação são mostradas nas SEQ ID NOs: 108 e 109; a sequência de LFR3 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 110; a sequência de LFR3 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 111; a sequência de LFR4 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 112; e a sequência de LFR4 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 113.

[028] Figura 4 é um gráfico que mostra as atividades de neutralização de TOCILIZUMAB e H53/L28 em BaF/gp130.

[029] Figura 5 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB e H53/L28 em camundongos após administração intravenosa.

[030] Figura 6 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB e H53/L28 em camundongos após administração subcutânea.

[031] Figura 7 é uma ilustração esquemática que mostra que uma molécula de IgG pode se ligar novamente a outro antígeno dissociando-se de um antígeno do tipo de membrana no endossoma.

[032] Figura 8 é uma listagem de sítios de mutação que podem conceder dependência de pH à ligação de TOCILIZUMAB ao receptor de IL-6 (ligação em pH 7,4 e dissociação em pH 5,8). A sequência de HFR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 93; a sequência de HFR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 114; a sequência de HCDR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 95; a sequência de HCDR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 115; a sequência de LCDR1 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 87; a sequência de LCDR1 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 116; a sequência de LCDR2 de TOCILIZUMAB é mostrada na SEQ ID NO: 107; e a sequência de LCDR2 após a mutação é mostrada na SEQ ID NO: 117.

[033] Figura 9 é um gráfico que mostra atividades de neutralização de TOCILIZUMAB e H3pI/L73 em BaF/gp130.

[034] Figura 10 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB e H3pI/L73 em macacos cinomolgos após a administração intravenosa.

[035] Figura 11 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB e H3pI/L73 em camundongos transgênicos de receptor de IL-6 humano após administração intravenosa.

[036] Figura 12 é um diagrama que mostra o resultado da avaliação da Heterogeneidade derivada do C-terminal de TOCILIZUMAB, TOCIUZUMABdK, e TOCIUZUMABDGK por cromatografia de permuta de cátion.

[037] Figura 13 é um diagrama que mostra o resultado da avaliação da heterogeneidade derivada de ligação de dissulfeto de TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-IgG2, e TOCILIZUMAB-SKSC por cromatografia de permuta de cátion.

[038] Figura 14 é um diagrama que mostra as curvas de desnaturação para TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-IgG2, e TOCILIZUMAB-SKSC obtidos por calorimetria de varredura diferencial (DSC), e o valor de Tm para cada domínio de Fab.

[039] Figura 15 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB- M44, TOCILIZUMAB-M58, e TOCILIZUMAB-M73 em camundongos transgênicos de FcRn humano após administração intravenosa.

[040] Figura 16 é um gráfico que mostra atividades de neutralização de TOCILIZUMAB, controle, e Fv5-M83 em BaF/gp130.

[041] Figura 17 é um gráfico que mostra atividades de neutralização de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, e Fv4-M73 em BaF/gp130.

[042] Figura 18 é um gráfico que mostra os cursos de tempo de concentração de plasmas para TOCILIZUMAB, controle, Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 em macacos cinomolgos após administração intravenosa.

[043] Figura 19 é um gráfico que mostra cursos de tempo de concentração de CRP para TOCILIZUMAB, controle, Fv3-M73, Fv4- M73, ou Fv5-M83 em macacos cinomolgos após administração intravenosa.

[044] Figura 20 é um gráfico que mostra cursos de tempo de porcentagens de receptor de IL-6 solúvel livre em macacos cinomolgos após a administração intravenosa de TOCILIZUMAB, controle, Fv3- M73, Fv4-M73 ou Fv5-M83.

[045] Figura 21 é um gráfico que mostra os efeitos inibidores por TOCILIZUMAB e Fv4-M73 na produção de MCP-1 de células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos.

[046] Figura 22 é um gráfico que mostra os efeitos inibidores por TOCILIZUMAB e Fv4-M73 na produção de VEGF de células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos.

Modo para Realizar a Invenção

[047] A presente invenção fornece os polipeptídeos de (a) a (f) abaixo: (a) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 (CDR1 de VH4-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 (CDR2 de VH4- M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 (CDR3 de VH4-M73); (b) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 (CDR1 de VH3-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 (CDR2 de VH3- M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 6 (CDR3 de VH3-M73); (c) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7 (CDR1 de VH5-M83), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 (CDR2 de VH5- M83), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 (CDR3 de VH5-M83); (d) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 (CDR1 de VL1), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 11 (CDR2 de VL1), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 12 (CDR3 de VL1); (e) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 (CDR1 e VL3), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 (CDR2 de VL3), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 15 (CDR3 de VL3); e (f) um polipeptídeo que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 (CDR1 de VL5), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 17 (CDR2 de VL5), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 18 (CDR3 de VL5).

[048] Os polipeptídeos da presente invenção não são particularmente limitados; entretanto, eles são preferivelmente substâncias de ligação de antígeno tendo a atividade de ligação ao receptor de IL-6 humano. Tais substâncias de ligação de antígeno preferivelmente incluem, por exemplo, regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo (VH), regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo (VL), cadeias pesadas de anticorpo, cadeias leves anticorpo, e anticorpos.

[049] Dos polipeptídeos de (a) a (f) acima, os polipeptídeos de (a) a (c) são os exemplos preferíveis de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, ao mesmo tempo em que os polipeptídeos de (d) a (f) são os exemplos preferíveis de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo.

[050] Essas regiões variáveis podem ser usadas como uma porção de um anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano. Os anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano nos quais tal região variável é usada, têm atividade de ligação superior, excelentes farmacocinéticos, segurança excelente, imunogenicidade reduzida, e/ou propriedades físico-químicas superiores. Na presente invenção, farmacocinéticos excelentes ou melhora dos farmacocinéticos refere- se a qualquer um dentre: diminuição na "purificação (CL)", aumento na "área sob a curva (AUC)", aumento no "tempo de permanência médio", e aumento na "meia-vida do plasma (t1/2)", que são parâmetros farmacocinéticos calculados do curso de tempo de concentração de plasma quando um anticorpo é administrado no corpo. Aqui, a propriedade físico-químicas superior ou propriedade físico-química melhorada refere-se a, porém não está limitado a estabilidade melhorada, heterogeneidade diminuída, ou similares.

[051] As regiões de estrutura de anticorpo humano (FRs) a serem ligadas com CDR são selecionadas de modo que CDR forme um sítio de ligação de antígeno favorável. FRs a serem usados para as regiões variáveis da presente invenção não são particularmente limitados e qualquer FR pode ser usado; entretanto, FRs derivados de ser humano são preferivelmente usados. É possível usar FRs derivados de ser humano tendo uma sequência natural. Alternativamente, se necessário, substituição, deleção, adição e/ou inserção ou similares de um ou mais aminoácidos podem ser introduzidos na região de estrutura tendo uma sequência natural de modo que CDR forme um sítio de ligação de antígeno adequado. As sequências FR mutantes tendo uma propriedade desejada podem ser selecionadas, por exemplo, medindo-se e avaliando-se a atividade de ligação a um antígeno para um anticorpo com um FR com substituições de aminoácido (Sato, K. e outros, Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

[052] Além disso, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos na sequência CDR descrita acima. É preferido que uma sequência de CDR após a substituição, deleção, adição, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos tenha atividade equivalente à sequência de CDR antes da alteração com respeito à atividade de ligação, atividade de neutralização, estabilidade, imunogenicidade e/ou farmacocinéticos. Vários aminoácidos a serem substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos não são particularmente limitados; entretanto, são preferivelmente três aminoácidos ou menos, mais preferivelmente dois aminoácidos ou menos, e ainda mais preferivelmente um aminoácido por CDR.

[053] Os métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácido com outros aminoácidos de interesse incluem, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, e Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, e Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, e Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, e Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Rapid e efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 82, 488-492). Este método pode ser usado para substituir os aminoácidos desejados em um anticorpo com outros aminoácidos de interesse. Além disso, os aminoácidos nas estruturas e CDRs podem ser substituídos por outros aminoácidos apropriados usando técnicas de biblioteca tais como rearranjo de estrutura (Mol. Immunol. Abril de 2007; 44(11): 3049-60) e reparo de CDR (US 2006/0122377).

[054] A presente invenção também fornece os anticorpos de (a) a (c) abaixo: (a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1 (CDR1 de VH4-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 (CDR2 de VH4-M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3 (CDR3 de VH4-M73), e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10 (CDR1 de VL1), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 11 (CDR2 de VL1), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 12 (CDR3 de VL1); (b) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 (CDR1 de VH3-M73), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 (CDR2 de VH3-M73), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 6 (CDR3 de VH3-M73), e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 (CDR1 de VL3), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 (CDR2 de VL3), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 15 (CDR3 de VL3); e (c) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7 (CDR1 de VH5-M83), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 8 (CDR2 de VH5-M83), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 (CDR3 de VH5-M83), e uma região variável de cadeia leve que compreende CDR1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 (CDR1 de VL5), CDR2 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 17 (CDR2 de VL5), e CDR3 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 18 (CDR3 de VL5).

[055] Os anticorpos descritos acima podem ser usados como anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano tendo atividade de ligação superior, farmacocinéticos excelentes, segurança excelente, imunogenicidade reduzida e/ou propriedades físico-químicas superiores.

[056] As regiões de estrutura de anticorpo humano a serem ligadas com CDR da presente invenção são selecionadas de modo que o CDR forme um sítio de ligação de antígeno favorável. FRs a serem usados para as regiões variáveis da presente invenção não são particularmente limitados, e qualquer FR pode ser usado; entretanto, FR derivado de ser humano é preferivelmente usado. É possível usar FRs derivados de ser humano tendo uma sequência natural. Alternativamente, se necessário, substituição, deleção, adição e/ou inserção ou similares de um ou mais aminoácidos podem ser introduzidas na região de estrutura tendo uma sequência natural de modo que o CDR forme um sítio de ligação de antígeno adequado. As sequências de FR mutantes tendo uma propriedade desejada podem ser selecionadas, por exemplo, medindo-se e avaliando-se a atividade de ligação a um antígeno para um anticorpo tendo um FR com substituições de aminoácido (Sato, K. e outros, Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

[057] Entretanto, a região constante a ser usada para um anticorpo da presente invenção não é particularmente limitada, e qualquer região constante pode ser usada. As regiões constantes preferidas a serem usadas para os anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, regiões constantes derivadas de ser humano (regiões constantes derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, CK, CÀ e similares). Um ou mais aminoácidos podem ser substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos nas regiões constantes derivadas de ser humano. As regiões constantes de cadeia pesada derivadas de ser humano preferidas incluem, por exemplo, regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (região constante de VH4-M73), regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 (região constante VH3-M73)), e regiões constantes que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 (região constante de VH5-M83), ao mesmo tempo em que as regiões constantes preferidas de cadeia leve derivadas de ser humano incluem, por exemplo, regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (VL1), regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 (VL3), e regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 (VL5).

[058] Além disso, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos na sequência de CDR descrita acima. É preferido que uma sequência de CDR após a substituição, deleção, adição, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos tenha atividade equivalente à sequência de CDR antes da alteração com respeito à atividade de ligação, atividade de neutralização, estabilidade, imunogenicidade e/ou farmacocinéticos. Vários aminoácidos a serem substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos não são particularmente limitados; entretanto, há preferivelmente três aminoácidos ou menos, mais preferivelmente dois aminoácidos ou menos, e ainda mais preferivelmente um aminoácido por CDR.

[059] Os aminoácidos podem também ser substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos pelos métodos descritos acima.

[060] A presente invenção também fornece as regiões variáveis de (a) a (f) abaixo: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (região variável de VH4-M73); (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 20 (região variável de VH3-M73); (c) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (região variável de VH5-M83); (d) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 (região variável de VL1); (e) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (região variável de VL3); e (f) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (região variável de VL5).

[061] As regiões variáveis descritas acima podem ser usadas como parte de um anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano. Anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano nos quais tais regiões variáveis são usadas têm atividade de ligação superior, farmacocinéticos excelentes, segurança excelente, imunogenicidade reduzida, e/ou propriedades físico-químicas superiores.

[062] As regiões variáveis descritas acima podem também compreender substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos (por exemplo, cinco aminoácidos ou menos, preferivelmente três aminoácidos ou menos). Os métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácido com outros aminoácidos de interesse incluem, por exemplo, os métodos descritos acima.

[063] A presente invenção também fornece polipeptídeos que compreendem as regiões variáveis descritas acima.

[064] Além disso, a presente invenção fornece os anticorpos de (a) a (c) abaixo: (a) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (região variável de VH4-M73) e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 (região variável de VL1); (b) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 20 (região variável de VH3-M73) e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (região variável de VL3); e (c) um anticorpo que compreende a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (região variável de VH5-M83) e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (região variável de VL5).

[065] As regiões variáveis descritas acima podem ser usadas como parte de um anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano. Os anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano nos quais essas regiões variáveis são usadas têm atividade de ligação superior, farmacocinéticos excelentes, segurança excelente, imunogenicidade reduzida, e/ou propriedades físicas superiores.

[066] As regiões variáveis descritas acima podem também compreender substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos (por exemplo, cinco aminoácidos ou menos, preferivelmente três aminoácidos ou menos). Os métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácido com outros aminoácidos de interesse incluem, por exemplo, os métodos descritos acima.

[067] Entretanto, a região constante a ser usada para um anticorpo da presente invenção não é particularmente limitada, e qualquer região constante pode ser usada. As regiões constantes preferidas a serem usadas para os anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, regiões constantes derivadas de ser humano (regiões constantes derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, cadeia K, cadeia À, e similares). Um ou mais aminoácidos podem ser substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos nas regiões constantes derivadas de ser humano. As regiões constantes preferidas de cadeia pesada derivadas de ser humano incluem, por exemplo, regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (região constante de VH4-M73), regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 (região constante VH3-M73)), e regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 (região constante de VH5-M83), ao mesmo tempo em que as regiões constantes preferidas de cadeia leve derivadas de ser humano incluem, por exemplo, regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 (VL1), regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 (VL3), e regiões constantes que compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 (VL5).

[068] A presente invenção também fornece as cadeias pesadas ou leves de (a) a (f) abaixo: (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73); (b) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73); (c) uma cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83); (d) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 28 (VL1); (e) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 (VL3); e (f) uma cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 (VL5).

[069] As cadeias pesadas e cadeias leves descritas acima podem ser usadas como parte de um anticorpo de receptor de IL-6 anti- humano. Os anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano nos quais essas cadeias pesadas e cadeias leves são usadas têm atividade de ligação superior, farmacocinéticos excelentes, segurança excelente, imunogenicidade reduzida, e/ou propriedades físico-químicas superiores.

[070] As cadeias pesadas e cadeias leves descritas acima podem também compreender substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos (por exemplo, dez aminoácidos ou menos, preferivelmente cinco aminoácidos ou menos, e mais preferivelmente três aminoácidos ou menos). Os métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácido com outros aminoácidos de interesse incluem, por exemplo, os métodos descritos acima.

[071] As substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos podem ser realizadas para as regiões variáveis, regiões constantes, ou ambas.

[072] A presente invenção também fornece os anticorpos de (a) a (c) abaixo: (a) um anticorpo que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 28 (VL1); (b) um anticorpo que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 (VL3); e (c) um anticorpo que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 (VL5).

[073] Os anticorpos descritos acima são anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano que têm atividade de ligação superior, farmacocinéticos excelentes, segurança excelente, imunogenicidade reduzida, e/ou superior propriedades físico-químicas.

[074] Os anticorpos descritos acima podem também compreender substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 20 aminoácidos ou menos, preferivelmente dez aminoácidos ou menos, e mais preferivelmente cinco aminoácidos ou menos). Os métodos para substituir um ou mais resíduos de aminoácido com outros aminoácidos de interesse incluem, por exemplo, os métodos descritos acima.

[075] As substituições, deleções, adições, e/ou inserções de um ou mais aminoácidos podem ser realizadas para as regiões variáveis, regiões constantes, ou ambas.

[076] Os anticorpos da presente invenção são preferivelmente anticorpos humanizados.

[077] Os anticorpos humanizados são também referidos como anticorpos humanos remoldados. Um tal anticorpo humanizado é obtido por enxerto de uma região de determinação de complementaridade (CDR) derivada de um mamífero não humano na CDR de um anticorpo humano. As técnicas de recombinação genética convencionais para a preparação de tais anticorpos são também conhecidas (vide Pedido de Patente Europeu n°. EP 125023; e WO 96/02576).

[078] Especificamente, por exemplo, uma sequência de DNA designada tal que uma CDR de interesse e uma região de estrutura (FR) de interesse estejam unidas, é sintetizada por PCR, usando vários oligonucleotídeos preparados para ter porções de sobreposição com as extremidades de ambos CDR e FR como iniciadores (vide o método descrito em WO 98/13388). Um anticorpo humanizado é obtido por: ligação do DNA resultante a um DNA que codifica uma região constante de anticorpo humano ou uma região constante anticorpo humano modificada; inserção deste em um vetor de expressão; e introdução deste em um hospedeiro para produzir o anticorpo (vide, Pedido de Patente Europeu n°. EP 239400 e Publicação de Pedido de Patente Internacional n°. WO 96/02576).

[079] As regiões de estrutura de anticorpo humano a serem ligadas com CDR são selecionadas de modo que CDR forme um sítio de ligação de antígeno favorável. Se necessário, substituição de aminoácido, deleção, adição e/ou inserção podem ser introduzidas na região de estrutura de um anticorpo região variável.

[080] Uma região constante de anticorpo humano, ou uma região constante de anticorpo humano alterado na qual um ou mais aminoácidos foram substituídos, deletados, adicionados, e/ou inseridos em uma região constante de anticorpo humano, pode ser usada como a região constante de um anticorpo humanizado.

[081] Por exemplo, Cy1, CY2, CY3, CY4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, e Cε podem ser usados para a cadeia H, e CK e CÀ podem ser usados para a cadeia L. A sequência de aminoácido de CK é mostrada na SEQ ID NO: 38, e a sequência de nucleotídeo que codifica esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 37. A sequência de aminoácido de CY1 é mostrada na SEQ ID NO: 40, e a sequência de nucleotídeo que codifica esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 39. A sequência de aminoácido de CY2 é mostrada na SEQ ID NO: 42, e a sequência de nucleotídeo que codifica esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 41. A sequência de aminoácido de CY4 é mostrada na SEQ ID NO: 44, e a sequê ncia de nucleotídeo que codifica esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 43.

[082] Além disso, as regiões C de anticorpo humano podem ser modificadas para melhorar a estabilidade do anticorpo ou estabilidade de produção de anticorpo. Os anticorpos humanos de qualquer isótipo tal como IgG, IgM, IgA, IgE, ou IgD podem ser usados na humanização de anticorpo; entretanto, IgG é preferivelmente usado na presente invenção. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ou similares podem ser usados como o IgG.

[083] Os aminoácidos na região variável (por exemplo, CDR e FR) e região constante de um anticorpo humanizado podem ser deletados, adicionados, inseridos, e/ou substituídos com aminoácidos após a preparação. Os anticorpos da presente invenção também incluem tais anticorpos humanizados que compreendem as substituições de aminoácido e similares.

[084] Os anticorpos da presente invenção incluem não somente anticorpos divalentes como representados por IgG, porém também anticorpos monovalentes e anticorpos multivalentes como representados por IgM, contanto que eles tenham a atividade de neutralização e/ou atividade de ligação de receptor de IL-6. Os anticorpos multivalentes da presente invenção incluem anticorpos multivalentes nos quais os sítios de ligação de antígeno são todos idênticos, e os anticorpos multivalentes nos quais todos ou alguns dos sítios de ligação de antígeno são diferentes. Os anticorpos da presente invenção incluem não somente moléculas de anticorpo inteiras, porém também minicorpos e produtos modificados dos mesmos, contanto que eles se liguem à proteína de receptor de IL-6.

[085] Os minicorpos são anticorpos que compreende um fragmento de anticorpo sem uma porção de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteiro ou similar), e não são particularmente limitados contanto que eles tenham a atividade de neutralização e/ou atividade de ligação de receptor de IL-6 e compreendam um fragmento de anticorpo sem uma porção de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteiro ou similar). Os minicorpos da presente invenção não são particularmente limitados, contanto que eles compreendam uma porção de um anticorpo inteiro. Entretanto, os minicorpos preferivelmente compreendem VH ou VL, e particularmente preferivelmente compreendem ambos VH e VL. Outros minicorpos preferíveis da presente invenção incluem, por exemplo, minicorpos que compreendem anticorpos de CDR. Os minicorpos podem compreender todos ou alguns dos seis CDRs de um anticorpo.

[086] Os minicorpos da presente invenção preferivelmente têm um peso molecular menor do que os anticorpos inteiros. Entretanto, os minicorpos podem formar multímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, ou tetrâmeros, e desse modo seu peso molecular é algumas vezes maior do que aquele de anticorpos inteiros.

[087] Especificamente, os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv. Entretanto, os minicorpos incluem, por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv (Fv de cadeia única), diacorpos, e sc(Fv)2 ( (Fv)2 de cadeia única). Os multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros, e polímeros) destes anticorpos estão também incluídos nos minicorpos da presente invenção.

[088] Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos, por exemplo, tratando-se os anticorpos com enzimas para produzir os fragmentos de anticorpos. As enzimas conhecidas por gerar os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, papaína, pepsina e plasmina. Alternativamente, um gene que codifica tal fragmento de anticorpo pode ser construído, introduzido em um vetor de expressão, e expresso em células hospedeiras apropriadas (vide, por exemplo, Co, M.S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, R. E. e outros, TIBTECH (1991) 9, 132-137).

[089] As enzimas digestivas clivam em sítios específicos de um fragmento de anticorpo, produzindo fragmento de anticorpos de estruturas específicas mostradas abaixo. As técnicas de engenharia genética podem ser aplicadas a tal fragmento enzimaticamente obtido de anticorpos para deletar uma porção arbitrária do anticorpo.

[090] Os fragmentos de anticorpos obtidos usando-se as enzimas digestivas acima são como segue.

[091] Digestão de Papaína: F(ab)2 ou Fab

[092] Digestão de Pepsina: F(ab’)2 ou Fab’

[093] Digestão de Plasmina: Facb

[094] Os minicorpos da presente invenção incluem os fragmentos de anticorpos sem uma região arbitrária, contanto que eles tenham atividade de neutralização e/ou atividade de ligação de receptor de IL- 6.

[095] "Diacorpo" refere-se a um fragmento de anticorpo bivalente construído por fusão de gene (Holliger P e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; EP 404,097; WO 93/11161, etc). Os diacorpos são dímeros compostos de duas cadeias de polipeptídeo. Em cada das cadeias de polipeptídeo formando um dímero, um VL e um VH são geralmente ligados por um linker na mesma cadeia. Em geral, um linker em um diacorpo é curto o bastante tal que o VL e VH não possa se ligar a cada outro. Especificamente, vários resíduos de aminoácido que constituem o linker são, por exemplo, cerca de cinco resíduos. Desse modo, o VL e VH codificados no mesmo polipeptídeo não podem formar um fragmento de região variável de cadeia única, e formarão um dímero com outro fragmento de região variável de cadeia única. Como um resultado, o diacorpo tem dois sítios de ligação de antígeno.

[096] Os anticorpos de ScFv são polipeptídeos de cadeia única produzidos ligando-se VH e VL através de um linker ou similar (Huston, J. S. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879- 5883; Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg e Moore, Springer Verlag, Nova Iorque, pp. 269- 315, (1994)). A região V de cadeia H e região V de cadeia L de scFv podem ser derivadas de qualquer anticorpo descrito aqui. O linker de peptídeo para ligar as regiões V não é particularmente limitado. Por exemplo, um peptídeo de cadeia única arbitrário contendo cerca de três a 25 resíduos pode ser usado como o linker. Especificamente, é possível usar os linkers de peptídeo descritos abaixo ou similar.

[097] As regiões V das duas cadeias podem ser ligadas, por exemplo, por PCR como descrito acima. Primeiro, um DNA que codifica a sequência de aminoácido completa ou uma sequência de aminoácido parcial desejada de um dos DNAs mostrados abaixo é usado como um modelo para ligar as regiões V por PCR:

[098] uma sequência de DNA que codifica uma cadeia H ou região V de cadeia H de um anticorpo, e

[099] uma sequência de DNA que codifica uma cadeia L ou região V de cadeia L de um anticorpo.

[0100] Os DNAs que codificam a região V de uma cadeia H ou cadeia L são amplificados por PCR usando um par de iniciadores contendo as sequências correspondentes de duas extremidades do DNA a ser amplificado. Em seguida, um DNA que codifica a porção peptídica do linker é preparado. O DNA que codifica o linker de peptídeo pode também ser sintetizado por PCR. Uma sequência de nucleotídeo que pode ser usada para ligar os produtos de amplificação separadamente sintetizados da região V é adicionada à extremidade 5’ dos iniciadores a serem usados. Em seguida, o PCR é realizado usando cada dos DNAs em [DNA de região V de cadeia H]-[DNA de linker de peptídeo]-[DNA de região V de cadeia L] e iniciadores de PCR de montagem.

[0101] Os iniciadores de PCR de montagem contêm uma combinação de um iniciador que se anela com a extremidade 5’ do [DNA de região V de cadeia H] e um iniciador que se anela com a extremidade 3’ do [DNA de região V de cadeia L]. Em outras palavras, os iniciadores de PCR de montagem são um conjunto de iniciadores que podem ser usados para amplificar DNAs que codificam a sequência de tamanho natural do scFv a ser sintetizado. Entretanto, as sequências nucleicas que podem ser usadas para ligar cada dos DNAs de região V são adicionadas ao [DNA de linker de peptídeo]. Então, esses DNAs são ligados, e em seguida o scFv inteiro é finalmente gerado como um produto de amplificação usando os iniciadores de PCR de montagem. Uma vez que os DNAs de codificação de scFv são gerados, os vetores de expressão contendo esses DNAs e células recombinantes transformadas com esses vetores de expressão podem ser obtidos por métodos convencionais. Além disso, o scFv pode ser obtido através de expressão dos DNAs de codificação de scFv cultivando-se as células recombinantes resultantes.

[0102] A ordem de VH e VL a serem ligados não é particularmente limitada, e eles podem ser dispostos em qualquer ordem. Os exemplos da disposição são listados abaixo. [VH] linker [VL] [VL] linker [VH]

[0103] sc(Fv)2 é um minicorpo de cadeia única produzido ligando- se dois VHs e dois VLs usando os linkers e similares (Hudson e outros, 1999, J Immunol. Methods 231:177-189). sc(Fv)2 pode ser produzido, por exemplo, ligando-se o scFv usando um linker.

[0104] Preferivelmente, os dois VHs e dois VLs de um anticorpo são dispostos na ordem de VH, VL, VH, e VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]) do N-terminal do polipeptídeo de cadeia única; entretanto, a ordem dos dois VHs e dois VLs não está limitada à disposição acima, e eles podem ser dispostos em qualquer ordem. Os exemplos da disposição são listados abaixo: [VL] linker [VH] linker [VH] linker [VL] [VH] linker [VL] linker [VL] linker [VH] [VH] linker [VH] linker [VL] linker [VL] [VL] linker [VL] linker [VH] linker [VH] [VL] linker [VH] linker [VL] linker [VH]

[0105] A sequência de aminoácido do minicorpo VH ou VL pode conter substituições, deleções, adições, e/ou inserções. Além disso, contanto que VH e VL tenham atividade de ligação de antígeno quando montados, uma porção pode ser deletada ou outros polipeptídeos podem ser adicionados. Além disso, as regiões variáveis podem ser quimerizadas ou humanizadas.

[0106] Na presente invenção, os linkers que podem ser usados para ligar as regiões variáveis de anticorpo incluem linkers de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos por engenharia genética, e linkers sintéticos, por exemplo, os linkers descritos em Protein Engineering, (1996) 9(3), 299-305.

[0107] Os linkers preferidos na presente invenção são linkers de peptídeo. O comprimento dos linkers de peptídeo não é particularmente limitado e aqueles versados na técnica podem apropriadamente selecionar o comprimento de acordo com o propósito. O comprimento típico é um a 100 aminoácidos, preferivelmente 3 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 5 a 30 aminoácidos, e particularmente preferivelmente 12 a 18 aminoácidos (por exemplo, 15 aminoácidos).

[0108] Por exemplo, a sequência de aminoácidos para linkers de peptídeo inclui as seguintes sequências: Ser Gly^Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 45) Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 46) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 47) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 48) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 49) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 50) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 51) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 52) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser [SEQ ID NO: 47])n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly [SEQ ID NO: 48])n

[0109] onde n é um número inteiro de 1 ou mais.

[0110] A sequência de aminoácidos de linkers de peptídeo pode ser apropriadamente selecionada por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito. Por exemplo, o "n" acima que determina o comprimento do linker de peptídeo é tipicamente um a cinco, preferivelmente um a três, e mais preferivelmente um ou dois.

[0111] Os linkers sintéticos (agentes de reticulação química) incluem agentes de reticulação rotineiramente usados para peptídeo de reticulação, por exemplo, N-hidroxissucinimida (NHS), suberato de dissucinimidila (DSS), bis(sulfossucinimidil)suberato (BS3), propionato de ditiobis(sucinimidil) (DSP), propionato de ditiobis(sulfossucinimidil) (DTSSP), sucinato de bis(sucinimidil) etileno glicol (EGS), sucinato de bis(sulfosucinimidil) de etileno glicol (sulfo-EGS), tartarato de dissucinimidila (DST), tartarato de dissulfossucinimidila (sulfo-DST), bis[2-(sucinimidooxicarbonilóxi)etil]sulfona (BSOCOES), e bis[2- (sulfossucinimidooxicarbonilóxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES). Esses agentes de reticulação estão comercialmente disponíveis.

[0112] Em geral, três linkers são requeridos para ligar quatro regiões variáveis de anticorpo. Esses linkers múltiplos podem ser linkers iguais ou diferentes.

[0113] Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados à sequência de aminoácido de um anticorpo da presente invenção. Além disso, os anticorpos da presente invenção também incluem proteínas de fusão nas quais um anticorpo descrito acima é fundido com outro peptídeo ou proteína. A proteína de fusão pode ser preparada ligando-se um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção e um polinucleotídeo que codifica outro peptídeo ou polipeptídeo na estrutura, introduzindo isto em um vetor de expressão, e expressando este em um hospedeiro. As técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas. O peptídeo ou polipeptídeo a ser fundido com um anticorpo da presente invenção pode ser um peptídeo conhecido, por exemplo, FLAG (Hopp, T. P. e outros, BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His consistindo em seis resíduos His (histidina), 10x His, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, rótulo T7, rótulo HSV, rótulo E, fragmento de antígeno SV40 T, rótulo lck, fragmento de α-tubulina, rótulo B, e fragmento de Proteína C. Os polipeptídeos a serem fundidos com os anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, GST (glutationa-S- transferase), HA (hemaglutinina de influenza), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase, e MBP (proteína de ligação de maltose). Os polinucleotídeos comercialmente disponíveis que codificam esses peptídeos ou polipeptídeos podem ser fundidos com um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão pode ser preparado expressando-se o polinucleotídeo de fusão desse modo preparado.

[0114] Além disso, os anticorpos da presente invenção podem também ser anticorpos conjugados ligados a várias moléculas tais como polímeros, incluindo polietileno glicol (PEG) e ácido hialurônico; substâncias radioativas; substâncias fluorescentes; substâncias luminescentes; enzimas; e toxinas. Tais anticorpos conjugados podem ser obtidos quimicamente modificando-se os anticorpos obtidos. Os métodos para modificação de anticorpo já estão estabelecidos na técnica (vide, por exemplo, US 5.057.313 e US 5.156.840). Os "anticorpos" da presente invenção também incluem tais anticorpos conjugados.

[0115] Além disso, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos com cadeias de açúcar alteradas.

[0116] Além disso, os anticorpos usados na presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. O anticorpo biespecífico refere-se a um anticorpo que tem regiões variáveis que reconhecem epítopos diferentes na mesma molécula de anticorpo. Um anticorpo biespecífico da presente invenção pode ser um anticorpo biespecífico que reconhece epítopos diferentes na molécula de receptor de IL-6, ou um anticorpo biespecífico no qual um dos sítios de ligação de antígeno reconhece o receptor de IL-6 e o outro sítio de ligação de antígeno reconhece outra substância. Os exemplos de antígenos que se ligam a outro sítio de ligação de antígeno de um anticorpo biespecífico que compreende um anticorpo de reconhecimento de receptor de IL-6 da presente invenção incluem IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, linfotoxina α, linfotoxina β, ligando LIGHT, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M- CSFR, IFN-alfa, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, e APRILR.

[0117] Os métodos para produzir os anticorpos biespecíficos são conhecidos. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, ligando-se dois tipos de anticorpos reconhecendo diferentes antígenos. Os anticorpos a serem ligados podem ser uma meia molécula cada contendo uma cadeia H e uma cadeia L, ou um quarto da molécula contendo somente uma cadeia H. Alternativamente, as células de fusão que produzem anticorpos biespecíficos podem ser preparadas por fusão de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais diferentes. Além disso, os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por técnicas de engenharia genética.

[0118] Como descrito abaixo, os anticorpos da presente invenção podem diferir em sequência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presença/ausência de cadeias de açúcar, e conformação, dependendo do método de purificação, ou a célula ou hospedeiro usado para produzir os anticorpos. Entretanto, contanto que o anticorpo obtido seja funcionalmente equivalente a um anticorpo da presente invenção, ele é incluído na presente invenção. Por exemplo, quando um anticorpo da presente invenção é expresso em células procarióticas, por exemplo, Escherichia coli, um resíduo de metionina é adicionado ao N-terminal da sequência de aminoácido de anticorpo original. Tais anticorpos são também incluídos nos anticorpos da presente invenção.

[0119] Os polipeptídeos de anticorpos de receptor anti-IL-6 e similares da presente invenção podem ser produzidos por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0120] Um anticorpo de receptor anti-IL-6 pode ser preparado, por exemplo, por técnicas de recombinação genética conhecidas por aqueles versados na técnica com base na sequência do anticorpo de receptor anti-IL-6 obtido. Especificamente, um anticorpo de receptor anti-IL-6 pode ser preparado construindo-se um polinucleotídeo que codifica o anticorpo com base na sequência de um anticorpo de reconhecimento de receptor de IL-6, inserindo o polinucleotídeo em um vetor de expressão, e em seguida expressando em uma célula hospedeira apropriada (vide, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. e Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. e Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137).

[0121] Desse modo, a presente invenção fornece métodos de produzir (i) um polipeptídeo da presente invenção, ou (ii) um polipeptídeo codificado por um gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção, onde os métodos compreendem a etapa de cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor no qual um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente invenção é introduzido.

[0122] Mais especificamente, a presente invenção fornece os métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor no qual um gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção é introduzido; e (b) obter o polipeptídeo codificado pelo gene.

[0123] Os exemplos do vetor incluem vetores do tipo M13, vetores do tipo UC, pBR322, pBluescript, e pCR-Script. Alternativamente, quando um objetivo é subclonar e excisar o cDNA, outros exemplos do vetor em adição àqueles descritos acima incluem pGEM-T, pDIRECT, e pT7. Os vetores de expressão são particularmente úteis para produzir os anticorpos da presente invenção. Por exemplo, quando o vetor de expressão é usado para expressão em E. coli, o vetor teria características que permitem sua amplificação em E. coli. Além disso, quando o hospedeiro é E. coli tais como JM109, DH5α, HB101, ou XL1-Blue, é essencial que o vetor carregue um promotor que permita sua expressão eficiente em E. coli, por exemplo, promotor lacZ (Ward e outros, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better e outros, Science (1988) 240, 1041-1043), promotor T7 ou similar. Tal vetor inclui pGEX-5X-1 (Pharmacia), "sistema QIAexpress" (Quiagen), pEGFP, e pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa T7 RNA polimerase), além daqueles descritos acima.

[0124] Além disso, os vetores de expressão de plasmídeo podem conter sequências de sinal para secreção de anticorpo. Como uma sequência de sinal para secreção de anticorpo, a sequência de sinal pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada para a produção no periplasma de E. coli. Os vetores podem ser introduzidos nas células hospedeiras, por exemplo, por métodos de cloreto de cálcio ou eletroporação.

[0125] Além de vetores para E. coli, os vetores para produção de anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, vetores de expressão derivados de mamífero (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. (1990) 18(17), p5322), pEF, e pCDM8), vetores de expressão derivados de célula de inseto (por exemplo, o "sistema de expressão de baculovírus Bac a BAC" (Gibco-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de planta (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animal (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão derivados de retrovírus (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão derivados de levedura (por exemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, e SP-Q01), e vetores de expressão derivadas de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50).

[0126] Quando o vetor de plasmídeo de expressão é usado para expressão em células de animal tais como células CHO, COS, e NIH3T3, ele deve ter um promotor necessário para expressão naquelas células, por exemplo, promotor SV40 (Mulligan e outros, Nature (1979) 277, 108), promotor MMLV-LTR, promotor EF1α (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), ou promotor CMV. É ainda mais preferível se o vetor tiver um gene para seleção de células transformadas (por exemplo, um gene de resistência ao fármaco que permite a distinção por um agente (neomicina, G418 ou similar). Os vetores com tais características incluem, por exemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13.

[0127] Além disso, quando o objetivo é estavelmente expressar genes e amplificar um número de cópia de gene nas células, um método no qual as células CHO deficientes em uma série de reações de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor tendo um gene DHFR que compensa quanto à deficiência (por exemplo, pSV2- dhfr ("Molecular Cloning 2a edição" Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))) e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX) podem ser usados. Além disso, quando o objetivo é expressão de gene transitória, um método no qual as células COS que carregam um gene expressando o antígeno SV40 T em seu cromossoma são transformadas com um vetor carregando uma origem de replicação de SV40 (pcD e similar) pode ser usado. É possível usar as origens de replicação derivadas de vírus de polioma, adenovírus, vírus de papiloma bovino (BPV), e similares. Além disso, para amplificar o número de cópia de gene nas linhagens de célula hospedeira, os vetores de expressão podem compreender o gene de aminoglicosídeo transferase (APH), gene de timidina cinase (TK), gene de xantina- guanina fosforibosiltransferase de E. coli (Ecogpt), gene de di- hidrofolato reductase (dhfr), e similares como um marcador de seleção.

[0128] Os anticorpos resultantes da presente invenção podem ser isolados de células hospedeiras ou do lado de fora das células (o meio, ou similar), e purificados como anticorpos substancialmente puros e homogêneos. Os anticorpos podem ser separados e purificados usando métodos de separação e purificação convencionais para purificação de anticorpo, sem estar limitado a isto. Por exemplo, os anticorpos podem ser separados e purificados apropriadamente selecionando-se e combinando-se a cromatografia de coluna, filtração, ultrafiltração, precipitação por saturação, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, isoeletrofocagem, diálise, recristalização e similar.

[0129] A cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia de permuta de íon, cromatografia hidrofóbica, por filtração em gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia por absorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Essas cromatografias podem ser realizadas usando cromatografia de fase líquida, por exemplo, HPLC e FPLC. As colunas usadas para cromatografia por afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Os exemplos de colunas usando Proteína A incluem Hyper D, POROS, e Sefarose FF (GE Amersham Biosciences). A presente invenção também inclui anticorpos altamente purificados usando tais métodos de purificação.

[0130] A atividade de ligação de receptor de IL-6 dos anticorpos obtidos pode ser medida por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os métodos para medir a atividade de ligação de antígeno de um anticorpo incluem, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), imunoensaio de enzima (EIA), radioimunoensaio (RIA), e métodos de anticorpo fluorescente. Por exemplo, quando o imunoensaio de enzima é usado, as amostras contendo anticorpo tais como anticorpos purificados e sobrenadantes de cultura de células de produção de anticorpo, são adicionadas às placas revestidas por antígeno. Um anticorpo secundário rotulado com uma enzima tal como alcalina fosfatase é adicionado, e as placas são incubadas. Após lavar, um substrato de enzima tal como fosfato de p- nitrofenila é adicionado, e a absorção é medida para avaliar a atividade de ligação de antígeno. Composições farmacêuticas

[0131] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo descrito acima como um ingrediente ativo. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para doenças associadas a IL-6 tal como artrite reumatoide. Desse modo, a presente invenção também fornece agentes para tratar doenças tal como artrite reumatoide, que compreende um anticorpo descrito acima como um ingrediente ativo. Os exemplos preferidos de doenças-alvo na presente invenção incluem, porém não estão limitados a, artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite idiopática juvenil sistêmica, doença de Castleman, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), lúpus nefrite, doença de Crohn, linfoma, colite ulcerativa, anemia, vasculite, doença de Kawasaki, doença de Still, amiloidose, esclerose múltipla, transplante, degeneração macular relacionada com a idade, espondilite ancilosante, psoríase, artrite psoriática, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), nefropatia de IgA, osteoartrite, asma, nefropatia diabética, GVHD, endometriose, hepatite (NASH), infarto do miocárdio, arteriosclerose, sepse, osteoporose, diabete, mieloma múltiplo, câncer de próstata, câncer de rim, linfoma de não-Hodgkin de célula B, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer esofágico, câncer de cólon, caquexia de câncer, neuroinvasão de câncer, infarto do miocárdio, neovascularização coroidal miópica, neovascularização coroidal idiopática, uveíte, tiroidite crônica, hipersensibilidade retardada, dermatite de contato, dermatite atópica, mesotelioma, polimiosite, dermatomiosite, panuveíte, uveíte anterior, uveíte intermediária, esclerite, ceratite, inflamação orbital, neurite ótica, retinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa, olho seco, e inflamação pós- operatória.

[0132] A frase "para compreender um anticorpo de receptor anti- IL-6 como um ingrediente ativo" significa que compreende um anticorpo de receptor anti-IL-6 como pelo menos um dos ingredientes ativos, sem limitação particular em seu conteúdo. Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem conter outros ingredientes ativos em combinação com os polipeptídeos descritos acima.

[0133] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas não somente para propósitos terapêuticos, porém também para propósitos preventivos.

[0134] Os polipeptídeos da presente invenção podem ser formulados de acordo com os métodos convencionais (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, USA). Se necessário, eles podem conter veículos e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, eles podem incluir detergentes (por exemplo, PEG e Tween), excipientes, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico), agentes de coloração, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizadores, agentes de tamponamento (por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, e outros ácidos orgânicos), agentes de quelação (por exemplo, EDTA), agentes de suspensão, agentes de isotonização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, promotores de fluidez, e corretores. Entretanto, os agentes da presente invenção para prevenir ou tratar doenças inflamatórias não estão limitados aos anteriores e podem apropriadamente conter outros veículos convencionais. Especificamente, os exemplos incluem ácido cítrico anidroso leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, cálcio de carmelose, sódio de carmelose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, dietilaminoacetato de acetal de polivinila, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, óleo de rícino 60 hidrogenado de polioxietileno, sacarose, carboximetilcelulose, amido de milho, e sais inorgânicos. Eles podem também conter outros polipeptídeos de peso molecular baixo; proteínas tais como albumina de soro, gelatina e imunoglobulina; e aminoácidos. Ao preparar as soluções aquosas para injeção, os anticorpos de receptor anti-IL-6 são dissolvidos, por exemplo, em soluções isotônicas contendo solução salina fisiológica, glicose, ou outros adjuvantes. Os adjuvantes incluem, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Além disso, os agentes solubilizantes apropriados, por exemplo, álcool (etanol, e similar), poliálcool (propileno glicol, PEG e similar), e tensoativos não-iônicos (polissorbato 80 e HCO-50) podem ser combinados.

[0135] Se necessário, os polipeptídeos podem ser encapsulados em microcápsulas (microcápsulas feitas de hidroxicelulose, gelatina, metacrilato de poli(metila), e similar), ou feitos em um sistema de liberação de fármaco coloidal (lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas, nanocápsulas, etc.) (vide, por exemplo, "Remington’s Pharmaceutical Science 16a edição", Oslo Ed. (1980)). Além disso, os métodos para preparar os agentes como agentes de liberação prolongada são conhecidos, e esses podem ser aplicados aos polipeptídeos (Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; Patente US n°. 3.773.919; Pedido de Patente Europeu (EP) n°. 58.481; Sidman e outros, Biopolymers (1983) 22:547-56; EP No.133.988). Além disso, o volume líquido para administração subcutânea pode ser aumentado adicionando-se ou misturando-se hialuronidase a um agente (por exemplo, vide WO 2004/078140).

[0136] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas tanto oralmente quanto parenteralmente, porém são preferivelmente administradas parenteralmente. Especificamente, as composições são administradas aos pacientes por injeção ou transdermicamente. As injeções incluem, por exemplo, administrações sistêmicas e locais por injeção intravenosa, intramuscular, ou subcutânea, ou similar. As composições podem ser localmente injetadas no sítio de tratamento ou na periferia do sítio por injeção intramuscular, em particular. As formas de dosagem transdérmicas incluem, por exemplo, unguentos, gel, creme, cataplasmas, e emplastros, que podem ser administrados localmente ou sistemicamente. Além disso, os métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados de acordo com os sintomas e idade do paciente. A dose administrada pode ser selecionada, por exemplo, da faixa de 0,0001 mg a 100 mg de ingrediente ativo por kg de peso corporal para cada administração. Alternativamente, quando as composições são administradas a pacientes humanos, por exemplo, o ingrediente ativo pode ser selecionado da faixa de 0,001 a 1000 mg por kg de peso corporal para cada paciente. Uma administração de dose única preferivelmente contém, por exemplo, um anticorpo da presente invenção em cerca de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal. Entretanto, a dose de um anticorpo da presente invenção não está limitada a essas doses.

[0137] Os aminoácidos contidos na sequência de aminoácidos na presente invenção podem ser pós-traducionalmente modificados (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piroglutâmico por piroglutamilação é bem-conhecida por aqueles versados na técnica). Naturalmente, tais aminoácidos pós- traducionalmente modificados são incluídos na sequência de aminoácidos na presente invenção.

[0138] Além disso, as cadeias de açúcar que são ligadas aos anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer estrutura. Uma cadeia de açúcar na posição 297 (numeração EU) pode ser de qualquer estrutura de cadeia de açúcar (preferivelmente uma cadeia de açúcar fucosilada), ou nenhuma cadeia de açúcar pode estar ligada (por exemplo, isto pode ser obtido produzindo-se os anticorpos em Escherichia coli ou por introdução da alteração de modo que nenhuma cadeia de açúcar se ligue à posição 297, numeração EU).

[0139] Todas as referências da técnica anterior citadas aqui estão incorporadas por referência nesta descrição. Exemplos

[0140] A seguir, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos exemplos, porém não deve ser considerada como estando limitada a eles.

[0141] Exemplo 1 - Identificação de sítios de mutação nas regiões variáveis para realçar a afinidade de TOCILIZUMAB para receptor de IL-6.

[0142] Uma biblioteca de sequências de CDR na qual as mutações foram introduzidas foi construída e ensaiada para melhorar a afinidade de TOCILIZUMAB (Cadeia H WT-IgG1/SEQ ID NO: 53; Cadeia L WT- capa/SEQ ID NO: 54) para receptor de IL-6. A avaliação de uma biblioteca de mutações de CDR revelou mutações que melhoram a afinidade para o receptor de IL-6. As mutações são mostradas na figura 1. Uma combinação dessas mutações produziu TOCILIZUMAB de afinidade elevada tal como RDC-23 (Cadeia H RDC23H-IgG1/SEQ ID NO: 55; Cadeia L RDC-23L-capa/SEQ ID NO: 56). A afinidade para receptor de IL-6 solúvel e atividade biológica determinada usando BaF/gp130 foram comparadas entre RDC-23 e TOCILIZUMAB (vide, Exemplos de Referência para o método).

[0143] O resultado da medição de afinidade é mostrado na tabela 1. O resultado de determinação de atividade biológica usando BaF/gp130 (a concentração final de IL-6 foi 30 ng/ml) é mostrada na figura 2. Os resultados mostraram que a afinidade de RDC-23 foi cerca de 60 vezes maior, e a atividade expressa como concentração para 100% de inibição de BaF/gp130 foi cerca de 100 vezes maior quando comparada com TOCILIZUMAB. Tabela 1

[0144] Exemplo 2 Identificação de mutações para melhorar os farmacocinéticos de TOCILIZUMAB através da redução de seu ponto isoelétrico.

[0145] Para melhorar os farmacocinéticos de TOCILIZUMAB, a investigação foi realizada para identificar os sítios de mutação que diminuiriam o ponto isoelétrico das regiões variáveis sem significantemente reduzir a ligação ao receptor de IL-6. A avaliação dos sítios de mutação nas regiões variáveis, que foram prognosticados com base em um modelo de estrutura tridimensional de TOCILIZUMAB, revelou os sítios de mutação que diminuíram o ponto isoelétrico das regiões variáveis sem significantemente reduzir sua ligação ao receptor de IL-6. Esses são mostrados na figura 3. Uma combinação dessas mutações produziu TOCILIZUMAB com ponto isoelétrico reduzido incluindo, por exemplo, H53/L28 (Cadeia H H53- IgG1/SEQ ID NO: 57; Cadeia L L28-capa/SEQ ID NO: 58). A afinidade para receptor de IL-6 solúvel, o ponto isoelétrico, farmacocinéticos em camundongos, e atividade biológica determinada usando BaF/gp130 foram comparados entre H53/L28 e TOCILIZUMAB (vide, Exemplos de Referência para o método).

[0146] O resultado de medição de afinidade é mostrado na tabela 2. O resultado de medição para a atividade biológica obtida usando BaF/gp130 (a concentração final de IL-6 foi 30 ng/mL) é mostrado na figura 4. Os resultados mostraram que a afinidade de H53/L28 foi cerca de seis vezes maior e a atividade expressa como concentração para 100% de inibição de BaF/gp130 foi cerca de várias vezes maior quando comparada com TOCILIZUMAB. Tabela 2

[0147] O resultado da determinação do ponto isoelétrico por eletroforese de ponto isoelétrico conhecido por aqueles versados na técnica mostrou que os pontos isoelétricos de TOCILIZUMAB e H53/L28 foram cerca de 9,3 e 6,5 a 6,7, respectivamente. Desse modo, o ponto isoelétrico de H53/L28 foi reduzido em cerca de 2,7 quando comparado com TOCILIZUMAB. Além disso, o ponto isoelétrico teórico das regiões variáveis de VH/VL foi calculado usando GENETYX (GENETYX CORPORATION). O resultado mostrou que os pontos isoelétricos teóricos de TOCILIZUMAB e H53/L28 foram 9,20 e 4,52, respectivamente. Desse modo, o ponto isoelétrico de H53/L28 foi reduzido em cerca de 4,7 quando comparado com TOCILIZUMAB.

[0148] Para avaliar os farmacocinéticos do anticorpo alterado H53/L28 que tem um ponto isoelétrico reduzido, os farmacocinéticos de TOCILIZUMAB e H53/L28 em camundongos normais foram comparados. Uma dose única de TOCILIZUMAB ou H53/L28 foi intravenosamente (IV) ou subcutaneamente (SC) administrada em 1 mg/kg ao camundongo (C57BL/6J; Charles River Japão, Inc.) para avaliar o curso de tempo de concentração de plasma. Os cursos de tempo de concentração de plasma para TOCILIZUMAB e H53/L28 após a administração intravenosa ou administração subcutânea são mostrados nas figuras 5 e 6, respectivamente. Os parâmetros farmacocinéticos (purificação (CL) e meia-vida (T1/2)) obtidos usando WinNonlin (Pharsight) são mostrados na tabela 3. A meia-vida do plasma (T1/2) de H53/L28 após a administração intravenosa foi prolongada em cerca de 1,3 vez daquela de TOCILIZUMAB, ao mesmo tempo em que a purificação foi reduzida em cerca de 1,7 vez. T1/2 de H53/L28 após a administração subcutânea foi aumentada em cerca de duas vezes aquela de TOCILIZUMAB, ao mesmo tempo em que a purificação foi reduzida em cerca de 2,1 vezes. Desse modo, descobriu-se que os farmacocinéticos podem ser significantemente melhorados reduzindo-se o ponto isoelétrico de TOCILIZUMAB através da substituição de aminoácido. Tabela 3

[0149] Exemplo 3 - Identificação de sítios de mutação que reduzem a imunogenicidade de TOCILIZUMAB Identificação de mutações que reduzem o risco de imunogenicidade de epítopos de célula T presentes nas regiões variáveis.

[0150] Os epítopos de célula T presentes na sequência de região variável de TOCILIZUMAB foram analisados usando TEPITOPE (Methods. Dezembro de 2004; 34(4):468-75). Como um resultado, o CDR2 de cadeia L foi predito ter muitos epítopos de célula T que se ligaria a HLA (isto é, ter uma sequência com um alto risco de imunogenicidade). Desse modo, a análise de TEPITOPE foi realizada para examinar as substituições de aminoácido que reduziriam o risco de imunogenicidade do CDR2 de cadeia L sem diminuir a estabilidade, atividade de ligação, ou atividade de neutralização.

[0151] Como descrito abaixo, o resultado da avaliação demonstrou que o risco de imunogenicidade pode ser reduzido sem diminuir a estabilidade, atividade de ligação, ou atividade de neutralização substituindo-se a treonina em L51 (Kabat’s numbering; Kabat EA e outros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)) do CDR2 de cadeia L (SEQ ID NO: 59) de TOCILIZUMAB com glicina, e a arginina em L53 com ácido glutâmico (SEQ ID NO: 60).

[0152] TOCILIZUMAB CDR2 de cadeia L (SEQ ID NO: 59)

[0153] TOCILIZUMAB CDR2 de cadeia L com epítopos de célula T removidos (SEQ ID NO: 60)

[0154] Exemplo 4 - Redução do risco de imunogenicidade por humanização total das sequências de estrutura de região variável de TOCILIZUMAB.

[0155] No processo de humanização de TOCILIZUMAB, algumas sequências de camundongo permanecem na sequência da estrutura para manter a atividade de ligação (Cancer Res. 15 de fevereiro de 1993; 53(4):851-6). Essas sequências são H27, H28, H29, e H30 na cadeia H FR1, e H71 na cadeia H FR3 (Kabat’s numbering; Kabat EA e outros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH) da sequência de região variável de TOCILIZUMAB. As sequências de camundongo que restaram são uma causa potencial de risco de imunogenicidade aumentado. Desse modo, foi avaliado se a sequência de estrutura pode ser completamente humanizada para também reduzir o risco de imunogenicidade de TOCILIZUMAB.

[0156] O resultado mostrou que a estrutura completa de TOCILIZUMAB pode ser completamente humanizada sem diminuir a estabilidade, atividade de ligação, ou atividade de neutralização, substituindo-se a cadeia H FR1 (SEQ ID NO: 61) de TOCILIZUMAB com a cadeia H humanizada FR1-A (SEQ ID NO: 62) mostrada abaixo, e substituindo a cadeia H FR3 (SEQ ID NO: 63) com a cadeia H FR3 humanizada (SEQ ID NO: 64) mostrada abaixo.

[0157] TOCILIZUMAB cadeia H FR1 (SEQ ID NO: 61)

[0158] Cadeia H humanizada FR1-A (SEQ ID NO: 62) (derivada da linha germinativa IMGT hVH_4)

[0159] TOCILIZUMAB cadeia H FR3 (SEQ ID NO: 63)

[0160] Cadeia H humanizada FR3 (SEQ ID NO: 64) (derivada de Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422).

[0161] Exemplo 5 - Identificação de sítios de mutação para melhorar os farmacocinéticos com base na ligação dependente de pH de TOCILIZUMAB ao receptor de IL-6

[0162] Um dos métodos para melhorar os farmacocinéticos de TOCILIZUMAB é para melhorar a molécula tal que uma única molécula de TOCILIZUMAB repetidamente se ligue e neutralize várias moléculas do receptor de IL-6. É suposto que após a ligação ao receptor de IL-6 do tipo de membrana, TOCILIZUMAB é absorvido em endossomas intracelulares através de internalização ao mesmo tempo em que ligado ao receptor de IL-6 do tipo de membrana, em seguida transferido em lisossomas ao mesmo tempo em que ligado ao receptor de IL-6 do tipo de membrana, e se torna degradado por lisossomas. Especificamente, uma molécula de TOCILIZUMAB tipicamente se liga a uma ou duas moléculas de receptor de IL-6 do tipo de membrana (de uma maneira monovalente ou divalente) e é degradada em lisossomas após a internalização. Por conseguinte, uma molécula de TOCILIZUMAB pode somente se ligar e neutralizar uma ou duas moléculas de receptor de IL-6 do tipo de membrana.

[0163] Desse modo, os presentes inventores consideraram que se fosse possível criar TOCILIZUMAB que se ligasse de uma maneira dependente de pH, no qual a ligação de TOCILIZUMAB é mantida sob condições neutras porém significantemente reduzidas sob condições ácidas, TOCILIZUMAB que se liga de uma maneira dependente de pH poderia se dissociar do receptor de IL-6 do tipo de membrana (antígeno) nos endossomas e retornar ao plasma ligando-se ao FcRn presente nos endossomas, como ilustrado na figura 7. Uma vez retornado ao plasma, TOCILIZUMAB que se liga de uma maneira dependente de pH pode novamente se ligar ao receptor de IL-6 do tipo de membrana. Repetindo-se esta ligação no plasma e dissociação nos endossomas, é considerado que uma molécula de TOCILIZUMAB pode repetidamente ligar/neutralizar várias moléculas do receptor de IL-6. Desse modo, TOCILIZUMAB que se liga de uma maneira dependente de pH é suposto ter farmacocinéticos melhorados comparados com TOCILIZUMAB.

[0164] Para TOCILIZUMAB dissociar-se do receptor de IL-6 sob condição ácida no endossoma, a ligação deve ser significantemente enfraquecida sob a condição ácida quando comparado com sob a condição neutra. Na superfície da célula, a ligação de receptor de IL-6 forte é requerida para neutralização; portanto, em pH 7,4 que é o pH da superfície de célula, o anticorpo deve se ligar ao receptor de IL-6 tão fortemente ou mais fortemente do que TOCILIZUMAB. Foi reportado que o pH endossômico é geralmente 5,5 a 6,0 (Nat Rev Mol Cell Biol. Fevereiro de 2004; 5(2):121-32). Desse modo, se TOCILIZUMAB que se liga de uma maneira dependente de pH for modificado para fracamente se ligar ao receptor de IL-6 em pH 5,5 a 6,0, ele pode ser predito se dissociar do receptor de IL-6 sob condição ácida nos endossomas. Especificamente, se TOCILIZUMAB que se liga de uma maneira dependente de pH é melhorado para fortemente se ligar ao receptor de IL-6 em pH 7,4, que é o pH de superfície de célula, e para fracamente se ligar ao receptor de IL-6 em pH 5,5 a 6,0, que é o pH endossômico, uma molécula de TOCILIZUMAB pode se ligar e neutralizar várias moléculas do receptor de IL-6, e os farmacocinéticos podem portanto ser melhorados.

[0165] Um possível método para conceder dependência de pH na ligação de TOCILIZUMAB ao receptor de IL-6 é introduzir os resíduos de histidina na região variável de TOCILIZUMAB, uma vez que o pKa de um resíduo de histidina é cerca de 6,0 a 6,5, e seu estado de dissociação de próton altera entre condições neutras (pH 7,4) e ácidas (pH 5,5 a 6,0). Desse modo, a avaliação foi realizada para identificar os sítios para a introdução de histidina nas regiões variáveis com base em um modelo de estrutura tridimensional de TOCILIZUMAB. Além disso, as sequências de região variável selecionadas de TOCILIZUMAB foram aleatoriamente substituídas com histidina para designar uma biblioteca para avaliação. A avaliação foi realizada usando a ligação ao receptor de IL-6 em pH 7,4 e dissociação do receptor de IL-6, ou a redução de afinidade em pH 5,5 a 5,8 como um índice.

[0166] Como um resultado, os presentes inventores descobriram sítios de mutação que concedem a ligação de TOCILIZUMAB ao receptor de IL-6 com dependência de pH (a propriedade de se ligar em pH 7,4 e se dissociar em pH 5,8). Esses são mostrados na figura 8. Na figura 8, a substituição de tirosina em H27 para histidina é uma mutação na cadeia H FR1, não no CDR. Entretanto, como descrito em Eur. J. Immunol. (1992) 22: 1719-1728, uma sequência com histidina em H27 é uma sequência humana (SEQ ID NO: 65). Desse modo, o anticorpo pode ser completamente humanizado usando-se a seguinte estrutura em combinação com o exemplo 4.

[0167] Cadeia H Humanizada FR1-B (SEQ ID NO: 65)

[0168] Uma combinação de mutações incluindo, por exemplo, H3pI/L73 (Cadeia H H3pI-IgG1/SEQ ID NO: 66; Cadeia L L73- capa/SEQ ID NO: 67) pode produzir TOCILIZUMAB com propriedades de ligação dependentes de pH. H3pI/L73 e TOCILIZUMAB foram comparados quanto a sua afinidade para receptor de IL-6 solúvel em pH 7,4, a taxa de dissociação de receptor de IL-6 do tipo de membrana em pH 7,4 e pH 5,8, a atividade biológica usando BaF/gp130, e farmacocinéticos em macaco cinomolgo e camundongos transgênicos de receptor de IL-6 humano (vide, Exemplos de Referência para o método).

[0169] O resultado de ensaio de afinidade para receptor de IL-6 solúvel em pH 7,4 é mostrado na tabela 4. O resultado do ensaio para a atividade biológica obtida usando BaF/gp130 (concentração de IL-6 final de 30 ng/ml) é mostrado na figura 9. Esses resultados mostraram que H3pI/L73 é comparável com TOCILIZUMAB em termos de afinidade para o receptor de IL-6 solúvel em pH 7,4 e atividade em BaF/gp130. Tabela 4

[0170] O resultado da medição para a taxa de dissociação de TOCILIZUMAB ou H3pI/L73 de receptor de IL-6 do tipo de membrana em pH 7,4 e pH 5,8 é mostrado na tabela 5. Quando comparada com TOCILIZUMAB, a taxa de dissociação de H3pI/L73 em pH 5,8 foi mais rápida e a dependência do pH da taxa de dissociação do receptor de IL-6 do tipo de membrana foi aumentada em cerca de 2,6 vezes. Tabela 5

[0171] Uma dose única de TOCILIZUMAB ou H3pI/L73 foi intravenosamente administrada em 1 mg/kg aos macacos cinomolgos para avaliar o curso de tempo de concentração de plasma. Os cursos de tempo de concentração de plasma de TOCILIZUMAB ou H3pI/L73 após a administração intravenosa são mostrados na figura 10. O resultado mostrou que os farmacocinéticos de H3pI/L73 em macacos cinomolgos foram significantemente melhorados quando comparado com TOCILIZUMAB.

[0172] Uma dose única de TOCILIZUMAB ou H3pI/L73 foi intravenosamente administrada em 25 mg/kg aos camundongos transgênicos de receptor de IL-6 humano (hIL-6R tg camundongos; Proc Natl Acad Sci U S A. 23 de Mao de 1995; 92(11):4862-6) para avaliar o curso de tempo de concentração de plasma. Os cursos de tempo de concentração de plasma de TOCILIZUMAB ou H3pI/L73 após a administração intravenosa são mostrados na figura 11. O resultado mostrou que os farmacocinéticos de H3pI/L73 em camundongos transgênicos de receptor de IL-6 humano foi significantemente melhorado quando comparado com TOCILIZUMAB.

[0173] H3pI/L73, que é um TOCILIZUMAB com propriedades de ligação dependentes de pH, mostrou farmacocinéticos significantemente melhorados em macacos cinomolgos e camundongos transgênicos de receptor de IL-6 humano quando comparado com TOCILIZUMAB. Isto sugere que é possível se ligar a e neutralizar várias moléculas do receptor de IL-6 com uma única molécula, conferindo-se a propriedade de ligar um antígeno em pH 7,4 e dissociar do antígeno em pH 5,8. Foi também considerado que os farmacocinéticos podem ser também melhorados conferindo-se a ligação do receptor de IL-6 com uma dependência de pH mais pronunciada do que aquela de H3pI/L73.

[0174] Exemplo 6 - Otimização da região constante de TOCILIZUMAB Redução da heterogeneidade de terminal C de cadeia H de TOCILIZUMAB

[0175] Para heterogeneidade das sequências C-C-terminaladeia H de um anticorpo IgG, a deleção de resíduo de lisina de aminoácido C- terminal, e amidação do grupo carboxila C-terminal devido à deleção de ambos os dois aminoácidos C-terminal, glicina e lisina, foram reportados (Anal Biochem. 1 de janeiro de 2007; 360(1):75-83). Também em TOCILIZUMAB, o componente principal é uma sequência na qual a lisina de aminoácido C-terminal na sequência de nucleotídeo é deletada por modificação pós- translacional; entretanto, os subcomponentes nos quais a lisina permanece e subcomponentes nos quais o grupo carboxila C-terminal é amidado devido à deleção tanto de glicina quanto de lisina também existe como heterogeneidade. Não é fácil e seria mais dispendioso fabricá-los como um produto farmacêutico em grande escala ao mesmo tempo em que mantendo as substâncias objetivo/substâncias relacionadas, relacionadas com a heterogeneidade entre as produções. Se possível, é desejável ser substâncias únicas, e ter heterogeneidade reduzida ao desenvolver os anticorpos como produtos farmacêuticos. Desse modo, é preferível que a heterogeneidade C-C-terminaladeia H esteja ausente ao desenvolver anticorpos como produtos farmacêuticos.

[0176] O aminoácido C-terminal foi alterado para reduzir a heterogeneidade de aminoácido C-terminal. O resultado mostrou que a heterogeneidade derivada do C-terminal pode ser prevenida por pré- deleção da sequência de nucleotídeo, dos resíduos de lisina e glicina no C-terminal da região constante de cadeia H de TOCILIZUMAB. TOCILIZUMAB, TOCILIZUMAB sem o resíduo de lisina C-terminal (TOCILIZUMABΔK: Cadeia H WT-IgG1ΔK/SEQ ID NO: 68; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54), e TOCILIZUMAB sem os resíduos de lisina e glicina C-terminal (TOCILIZUMABΔGK: Cadeia H WT-IgG1ΔGK/SEQ ID NO: 69; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54) foram avaliados quanto à heterogeneidade por cromatografia de permuta de cátion. A coluna ProPac WCX-10, de 4x250 mm (Dionex) foi usada; e fase móvel A foi 25 mmol/L de MES/NaOH (pH 6,1) e a fase móvel B foi 25 mmol/L de MES/NaOH, 250 mmol/L de NaCl (pH 6,1). A taxa de fluxo apropriada e gradiente foram usados. O resultado da avaliação obtido por cromatografia de permuta de cátion é mostrado na figura 12. O resultado mostrou que a heterogeneidade de aminoácido C-terminal pode ser reduzida por pré-deleção da sequência de nucleotídeo dos resíduos tanto de lisina quanto de glicina no C-terminal da região constante de cadeia H, porém não por pré-deleção somente dos resíduos de lisina no C-terminal da Região constante de cadeia H. Todas as sequências C-terminal da região constante de anticorpos humanos IgG1, IgG2, e IgG4 contêm lisina e glicina nas posições 447 e 446, respectivamente, de acordo com a numeração EU (vide, Sequences of proteins of immunological interest, Publicação NIH No.91-3242). Portanto, o método para reduzir a Heterogeneidade de aminoácido C-terminal encontrado no presente estudo é esperado ser também aplicável às regiões constantes IgG2 e IgG4 e variantes das mesmas. Redução de heterogeneidade derivada de ligação de dissulfeto em isótipo de IgG2 TOCILIZUMAB

[0177] O isótipo de TOCILIZUMAB é IgG1. Uma vez que TOCILIZUMAB é um anticorpo neutralizante, a ligação ao receptor FCY pode ser desfavorável em vista da imunogenicidade e efeitos adversos. Um possível método para reduzir a ligação de receptor de FCY é converter o isótipo do anticorpo IgG de IgG1 para IgG2 ou IgG4 (Ann Hematol. Junho de 1998; 76(6):231-48). Do ponto de vista de ligação de receptor I de Fcy e farmacocinéticos, IgG2 foi considerado ser mais desejável do que IgG4 (Nat Biotechnol. Dezembro de 2007; 25(12):1369-72). Entretanto, as propriedades físico-químicas de proteínas, em particular, homogeneidade e estabilidade são muito importantes ao desenvolver anticorpos como produtos farmacêuticos. O isótipo de IgG2 foi reportado ter heterogeneidade muito elevada devido às ligações de dissulfeto na região de articulação (J Biol Chem. 6 de junho de 2008; 283(23):16206-15). Não é fácil e seria mais dispendioso fabricá-los como produto farmacêutico em grande escala ao mesmo tempo em que mantendo as substâncias objetivo/substâncias relacionadas, relacionadas com a heterogeneidade derivada de ligações de dissulfeto entre as produções. Desse modo, as substâncias únicas são desejáveis tanto quanto possível. Desse modo, ao desenvolver os anticorpos de isótipo de IgG2 em produtos farmacêuticos, é preferível reduzir a heterogeneidade derivada de ligações de dissulfeto sem reduzir a estabilidade.

[0178] Para o propósito de reduzir a heterogeneidade do isótipo de IgG2, vários variantes foram avaliados. Como um resultado, descobriu- se que a heterogeneidade pode ser reduzida sem diminuir a estabilidade usando a região constante de WT-SKSC (SEQ ID NO: 70), na qual das sequências de região constante de IgG2, o resíduo de cisteína na posição 131 e o resíduo de arginina na posição 133 (numeração EU) no domínio CH1 de cadeia H foram substituídos por serina e lisina, respectivamente, e o resíduo de cisteína na 219 (Numeração EU) na articulação superior da cadeia H foi substituído por serina. TOCILIZUMAB-IgG1 (Cadeia H WT-IgG1/SEQ ID NO: 53; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54), TOCILIZUMAB-IgG2 (Cadeia H WT-IgG2/SEQ ID NO: 71; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54), e TOCILIZUMAB-SKSC (Cadeia H WT-SKSC/SEQ ID NO: 70; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54) foram preparados e avaliados quanto à heterogeneidade e à estabilidade. A heterogeneidade foi avaliada por cromatografia de permuta de cátion. A coluna ProPac WCX-10 (Dionex) foi usada; e fase móvel A foi acetato de sódio a 20 mM (pH 5,0) e a fase móvel B foi acetato de sódio a 20 mM, NaCl a 1 M (pH 5,0). A taxa de fluxo apropriada e gradiente foram usados. O resultado da avaliação obtido por cromatografia de permuta de cátion é mostrado na figura 13. A estabilidade foi avaliada com base na temperatura intermediária na desnaturação térmica (valor Tm) determinada por calorimetria de varredura diferencial (DSC) (VP-DSC; Microcal). O resultado da medição de DSC em acetato de sódio a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 6,0 e o valor de Tm do domínio Fab são mostrados na figura 14.

[0179] O resultado mostrou que a heterogeneidade foi acentuadamente aumentada em TOCILIZUMAB-IgG2 quando comparada com TOCILIZUMAB-IgG1; entretanto, a heterogeneidade pode ser significantemente reduzida por conversão para TOCILIZUMAB-SKSC. Além disso, quando comparado com TOCILIZUMAB-IgG1, o DSC de TOCILIZUMAB-IgG2 produziu um componente pico dianteiro (Fab*) com estabilidade baixa, isto é, Tm baixo, nos picos de desnaturação térmica do domínio Fab, que é considerado ser devido a um componente heterogêneo. Entretanto, quando convertido para TOCILIZUMAB-SKSC, o pico dianteiro (Tm baixo), que é suposto ser devido a um componente heterogêneo, desapareceu, e em seguida o valor de Tm foi de cerca de 94 °C, que foi equivalente àquele do domínio Fab de TOCILIZUMAB-IgG1 e TOCILIZUMAB-IgG2. Desse modo, TOCILIZUMAB-SKSC foi revelado ter estabilidade elevada. Identificação de sítios de mutação de melhora de farmacocinéticos na região constante de TOCILIZUMAB

[0180] Como descrito acima, a partir de IgG1, que é o isótipo de TOCILIZUMAB, a redução da heterogeneidade C-terminal e redução da heterogeneidade de anticorpos com regiões constantes de isótipo IgG2 ao mesmo tempo em que reduzindo a ligação ao receptor de FCY e mantendo a estabilidade elevada, podem ser obtidas. Além disso, é preferido que a região constante também tenha farmacocinéticos superiores àqueles de IgG1, que é o isótipo de TOCILIZUMAB.

[0181] Para encontrar regiões constantes tendo uma meia-vida de plasma superior àquela de anticorpos com regiões constantes de isótipo de IgG1, a avaliação foi realizada para identificar os sítios de mutação para melhorar os farmacocinéticos de TOCILIZUMAB-SKSC que têm estabilidade elevada e heterogeneidade reduzida relacionada com os anticorpos com regiões constantes de isótipo de IgG2 como mencionado acima. Como um resultado, WT-M58 (SEQ ID NO: 72 (sequência de aminoácido)) foi descrito, no qual quando comparado com WT-SKSC, o ácido glutâmico na posição 137, numeração EU é substituído por glicina, a serina na posição 138 é substituída por glicina, a histidina na posição 268 é substituída por glutamina, a arginina na posição 355 é substituída por glutamina, a glutamina na posição 419 é substituída por ácido glutâmico, e no qual a glicina na posição 446 e a lisina na posição 447 são deletadas para reduzir a heterogeneidade do C-terminal de cadeia H. Além disso, WT-M44 (SEQ ID NO: 73 (sequência de aminoácido)) foi preparado para ter a substituição de asparagina na posição 434 por alanina, relativo a IgG1. Além disso, WT-M83 (SEQ ID NO: 74 (sequência de aminoácido)) foi produzido deletando-se a glicina na posição 446 e lisina na posição 447 de M44 para reduzir a heterogeneidade do C-terminal de cadeia H. Além disso, WT-M73 (SEQ ID NO: 75 (sequência de aminoácido)) foi produzido substituindo-se asparagina na posição 434 com alanina na WT-M58.

[0182] TOCILIZUMAB-M44 (Cadeia H WT-M44/SEQ ID NO: 73; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54), TOCILIZUMAB-M58 (Cadeia H WT-M58/SEQ ID NO: 72; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54), e TOCILIZUMAB-M73 (Cadeia H WT-M73/SEQ ID NO: 75; Cadeia L WT-capa/SEQ ID NO: 54) foram preparados e avaliados quanto a sua afinidade para FcRn humano e farmacocinéticos usando os camundongos transgênicos de FcRn humano (vide, os Exemplos de Referência para o método).

[0183] A ligação de TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58, e TOCILIZUMAB-M73 a FcRn humano foi avaliada usando Biacore. Como mostrado na tabela 6, a ligação de TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58, e TOCILIZUMAB-M73 foi cerca de 2,7 vezes, 1,4 vez, e 3,8 vezes superior do que aquela de TOCILIZUMAB-IgG1, respectivamente. Tabela 6

[0184] TOCILIZUMAB-IgG1, TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB- M58, e TOCILIZUMAB-M73 foram avaliados quanto aos seus farmacocinéticos em camundongos transgênicos de FcRn humano. O resultado é mostrado na figura 15. Quando comparado com TOCILIZUMAB-IgG1, todos dentre TOCILIZUMAB-M44, TOCILIZUMAB-M58, e TOCILIZUMAB-M73 foram constatados exibir farmacocinéticos melhorados, como mostrado na figura 15. O efeito de melhorar os farmacocinéticos correlacionou-se com a capacidade de se ligar ao FcRn humano. Em particular, a concentração de TOCILIZUMAB-M73 no plasma após 28 dias foi melhorada em cerca de 16 vezes quando comparado com TOCILIZUMAB-IgG1. Desse modo, os anticorpos tendo a região constante de M73 foram também considerados ter farmacocinéticos significantemente melhorados em humanos quando comparado com anticorpos tendo a região constante de IgG1.

[0185] Exemplo 7 - Preparação de anticorpos de receptor de IL-6 completamente humanizados com PK/PD melhorado

[0186] Os variantes de TOCILIZUMAB foram preparados combinando-se mutações múltiplas nas regiões variáveis e constantes de TOCILIZUMAB encontradas nos exemplos acima. Os anticorpos de receptor de IL-6 completamente humanizados descobertos de várias avaliações foram: Fv3-M73 (Cadeia H VH4-M73/SEQ ID NO: 25; Cadeia L VL1-capa/SEQ ID NO: 28), Fv4-M73 (Cadeia H VH3- M73/SEQ ID NO: 26; Cadeia L VL3-capa/SEQ ID NO: 29), e Fv5-M83 (Cadeia H VH5-M83/SEQ ID NO: 27; Cadeia L VL5-capa/SEQ ID NO: 30).

[0187] As afinidades de Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 preparados contra o receptor de IL-6 foram comparadas àquelas de TOCILIZUMAB (vide, Exemplo de Referência para o método). As afinidades destes anticorpos para o receptor de IL-6 solúvel determinadas em pH 7,4 são mostradas na tabela 7. Além disso, suas atividades de neutralização de BaF/gp130 foram comparadas àquelas de TOCILIZUMAB e ao controle (o anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido descrito no Exemplo de Referência, e VQ8F11-21 hIgG1 descrito na US 2007/0280945) (vide, Exemplo de Referência para o método). Os resultados obtidos determinando-se as atividades biológicas desses anticorpos usando BaF/gp130 são mostrados na figura 16 (TOCILIZUMAB, o controle, e Fv5-M83 com uma concentração de IL-6 final de 300 ng/ml) e figura 17 (TOCILIZUMAB, Fv3-M73, e Fv4-M73 com uma concentração de IL-6 final de 30 ng/ml). Como mostrado na tabela 7, Fv3-M73 e Fv4-M73 têm afinidade de cerca de duas a três vezes maior do que TOCILIZUMAB, ao mesmo tempo em que Fv5-M83 exibe afinidade cerca de 100 vezes maior do que TOCILIZUMAB (uma vez que foi difícil medir a afinidade de Fv5-M83, ao invés da afinidade ter sido determinada usando Fv5-IgG1 (Cadeia H VH5-IgG1 /SEQ ID NO: 76; Cadeia L VL5-capa /SEQ ID NO: 30), que tem uma região constante do tipo IgG1; a região constante é geralmente considerada ter nenhum efeito na afinidade). Como mostrado na figura 17, Fv3-M73 e Fv4-M73 exibem atividade ligeiramente mais fortes do que TOCILIZUMAB. Como mostrado na figura 16, Fv5-M83 tem atividade muito forte, que é mais do que 100 vezes maior do que aquela de TOCILIZUMAB em termos de 50% de concentração inibidora. Fv5-M83 também exibe atividade de neutralização de cerca de 10 vezes maior em termos de 50% de concentração inibidora do que o controle (o anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido). Tabela 7

[0188] As taxas de dissociação de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, e Fv4-M73 de receptor de IL-6 do tipo de membrana em pH 7,4 e 5,8 foram determinadas. Como demonstrado pelo resultado mostrado na tabela 8 (vide, Exemplo de Referência para o método), a dependência do pH da taxa de dissociação de Fv3-M73 e Fv4-M73 de receptor de IL-6 do tipo de membrana COI cerca de 11 vezes e 10 vezes melhorada, respectivamente, quando comparada com TOCILIZUMAB. A melhora considerável da dependência do pH da taxa de dissociação relativa ao H3pI/L73 descrito no exemplo 5 sugeriu que quando comparado a H3pI/L73, os farmacocinéticos de Fv3-M73 e Fv4-M73 seriam significantemente melhorados. Tabela 8

[0189] Os pontos isoelétricos de TOCILIZUMAB, o controle, Fv3- M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 foram determinados por eletroforese de focagem isoelétrica usando um método conhecido por aqueles versados na técnica. O resultado mostrou que o ponto isoelétrico foi cerca de 9,3 para TOCILIZUMAB; cerca de 8,4 a 8,5 para o controle; cerca de 5,7 a 5,8 para Fv3-M73; cerca de 5,6 a 5,7 para Fv4-M73; e 5,4 a 5,5 para Fv5-M83. Desse modo, cada anticorpo teve um ponto isoelétrico significantemente reduzido quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle. Além disso, o ponto isoelétrico teórico das regiões variáveis VH/VL foi calculado por GENETYX (GENETYX CORPORATION). O resultado mostrou que o ponto isoelétrico teórico foi 9,20 para TOCILIZUMAB; 7,79 para o controle; 5.49 para Fv3-M73; 5,01 para Fv4-M73; e 4,27 para Fv5-M83. Desse modo, cada anticorpo teve um ponto isoelétrico significantemente reduzido quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle. Uma vez que foi mostrado no exemplo 2 que o farmacocinético é melhorado reduzindo-se o ponto isoelétrico, o farmacocinético de Fv3- M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 foi considerado ser melhorado quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle.

[0190] Os epítopos de célula T na sequência de região variável de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73, ou Fv5-M83 foram analisados usando TEPITOPE (Methods. Dezembro de 2004; 34(4):468-75). Como um resultado, TOCILIZUMAB foi predito ter epítopos de célula T, dos quais muitos puderam se ligar a HLA, como mostrado no exemplo 3. Em contraste, várias sequências que foram preditas se ligar aos epítopos de célula T foram significantemente reduzidas em Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83. Além disso, a estrutura de Fv3-M73, Fv4-M73, ou Fv5-M83 não tem nenhuma sequência de camundongo e é desse modo completamente humanizada. Isto sugere a possibilidade que o risco de imunogenicidade é significantemente reduzido em Fv3- M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 quando comparado com TOCILIZUMAB.

[0191] Exemplo 8 - Teste de PK/PD de anticorpos de receptor de IL-6 completamente humanizados em macacos.

[0192] Cada de TOCILIZUMAB, o controle, Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 foi intravenosamente administrado uma vez em uma dose de 1 mg/kg aos macacos cinomolgos para avaliar seu curso de tempo de concentração de plasma (vide, Exemplo de Referência para o método). Os cursos de tempo de concentração de plasma de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 após a administração intravenosa são mostrados na figura 18. O resultado mostrou que cada dentre Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 exibiu farmacocinéticos significantemente melhorados em macacos cinomolgos quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle. Deles, Fv3-M73 e Fv4-M73 exibiram farmacocinéticos altamente melhorados quando comparados com TOCILIZUMAB.

[0193] A eficácia de cada anticorpo para neutralizar o receptor de IL-6 de macaco cinomolgo do tipo de membrana foi avaliada. O IL-6 de macaco cinomolgo foi administrado subcutaneamente no dorso inferior em 5 μg/kg todo dia do dia 6 ao dia 18 após a administração de anticorpo (dia 3 ao dia 10 para TOCILIZUMAB), e a concentração de CRP em cada animal foi determinada 24 horas depois (vide, Exemplo de Referência para o método). O curso de tempo de concentração de CRP após a administração de cada anticorpo é mostrado na figura 19. Para avaliar a eficácia de cada anticorpo para neutralizar o receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel, a concentração de plasma de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel livre nos macacos cinomolgos foi determinada e as porcentagens de receptor de IL-6 solúvel livre foram calculadas (vide, Exemplo de Referência para o método). O curso de tempo de porcentagem de receptor de IL-6 solúvel livre após administração de cada anticorpo é mostrado na figura 20.

[0194] Cada dentre Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 neutralizou o receptor de IL-6 de macaco cinomolgo do tipo de membrana de um modo mais sustentável, e suprimiu o aumento de CRP durante um período mais longo quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle (o anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido). Além disso, cada dentre Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 neutralizou o receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel de um modo mais sustentável, e suprimiu o aumento de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel livre durante um período mais longo quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle. Essas descobertas demonstraram que todos dentre Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 são superiores na sustentação da neutralização de receptores IL-6 do tipo de membrana e solúveis do que TOCILIZUMAB e do que o controle. Deles, Fv3-M73 e Fv4-M73 são acentuadamente superiores na sustentação da neutralização. Entretanto, Fv5-M83 suprimiu CRP e receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel livre mais fortemente do que Fv3-M73 e Fv4-M73. Desse modo, Fv5-M83 é considerado ser mais forte do que Fv3-M73, Fv4-M73, e do que o controle (o anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido) na neutralização de receptores IL-6 do tipo de membrana e solúveis. Foi considerado que os resultados em in vivo de macacos cinomolgos refletem a afinidade mais forte de Fv5-M83 para o receptor de IL-6 e atividade biológica mais forte de Fv5-M83 no sistema de ensaio de BaF/gp130 relativo ao controle.

[0195] Essas descobertas sugerem que Fv3-M73 e Fv4-M73 são altamente superiores na sustentação de suas atividades como um anticorpo de neutralização de receptor anti-IL-6 quando comparado com TOCILIZUMAB e com o controle, e desse modo permite significantemente reduzir a dosagem e frequência de administração. Além disso, Fv5-M83 foi demonstrado ser acentuadamente superior em termos da resistência da atividade como um anticorpo de neutralização de receptor anti-IL-6 bem como sustentação de sua atividade. Desse modo, Fv3-M73, Fv4-M73, e Fv5-M83 são esperados serem úteis como antagonistas de IL-6 produtos farmacêuticos.

[0196] Exemplo 9

[0197] A proteína quimioatraente de monócito (MCP)-1 é conhecida por estar envolvida na invasão celular de monócitos, células T, células NK, e basófilos. MCP-1 foi reportado ser altamente expresso em tecidos sinoviais/fluido sinovial de pacientes RA (J. Clin. Invest., Setembro de 1992, 90(3):772-779) e é considerado estar envolvido na condição patológica de RA (Inflamm. Allergy Drug Targets, Março de 2008, 7(1):53-66).

[0198] VEGF é um fator angiogênico potente e é conhecido por ser produzido, por exemplo, por macrófagos, fibroblastos, e células sinoviais na membrana sinovial de pacientes RA (J. Rheumatol., Setembro de 1995, 22(9):1624-1630). Além disso, o nível de VEGF no soro de pacientes RA se correlaciona com a atividade da doença e progressão radiográfica (Arthritis Rheum., Junho de 2003, 48(6):1521- 1529; e Arthritis Rheum., Setembro de 2001, 44(9):2055-2064) e o nível de VEGF no soro diminui tratando-se pacientes de RA com o anticorpo anti-IL-6R TOCILIZUMAB; portanto, VEGF é também considerado desempenhar uma função importante na condição patológica de RA (Mod. Rheumatol. 2009, 19(1):12-19; e Mediators Inflamm. 2008, 2008:129873).

[0199] Desse modo, foi examinado se TOCILIZUMAB e Fv4-M73 podem inibir as produções de MCP-1 e VEGF a partir de células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos que ocorrem da estimulação de sIL-6R e IL-6.

[0200] As células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos (TOYOBO) foram cultivadas em placas de 96 poços em meio IMDM contendo FCS a 5% em 2 x 104 de células/0,05 ml/poço, e colocadas durante 90 minutos em uma incubadora de CO2 (37°C, 5% de CO2). 0,05 ml de TOCILIZUMAB e Fv4-M73 diluídos para concentrações apropriadas foram adicionados, as placas foram deixadas paradas durante 15 minutos, em seguida 0,05 ml de receptor de IL-6 solúvel (SR344: preparado de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência) foi adicionado. As placas foram também deixadas paradas durante 30 minutos, e 0,05 ml de IL-6 (TORAY) foi também adicionado (a concentração final de receptor de IL-6 solúvel e IL-6 foi 50 ng/mL para cada). Após dois dias de cultura, os sobrenadantes de cultura foram coletados, e as concentrações de MCP-1 e VEGF nos sobrenadantes de cultura foram medidas usando kit ELISA (Biosource e Pierce Biotechnology). Os resultados são mostrados nas figuras 21 e 22. TOCILIZUMAB e Fv4-M73 inibiram a produção de MCP-1 e VEGF de células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos seguinte a estimulação de receptor de IL-6 solúvel e IL-6 de uma maneira dependente da concentração.

[0201] Consequentemente, a persistência do efeito de Fv4-M73 como um anticorpo de neutralização de receptor anti-IL-6 (o efeito de ligação ao receptor de IL-6 e bloqueio dos sinais do receptor de IL-6 do tipo de membrana e receptor de IL-6 solúvel) é significantemente superior quando comparada a TOCILIZUMAB, a frequência de administração e dose pode ser grandemente reduzida quando comparada com TOCILIZUMAB, e além disso, Fv4-M73 inibe a produção de MCP-1 e VEGF de células sinoviais derivadas de pacientes RA humanos. Portanto, Fv4-M73 foi mostrado ser um agente terapêutico muito eficaz contra RA. Exemplos de Referência Preparação de receptor de IL-6 humano recombinante solúvel

[0202] O receptor de IL-6 humano recombinante solúvel do receptor de IL-6 humano, que é o antígeno, foi produzido como descrito abaixo. Uma linhagem de célula CHO constitutivamente expressando um receptor de IL-6 solúvel humano contendo uma sequência dos 1o ao 344o aminoácidos N-terminal reportado em J. Biochem. (1990) 108, 673-676 (Yamasaki e outros, Science (1988) 241, 825-828 (GenBank #X12830)) foi gerada. O receptor de IL-6 solúvel humano foi purificado de sobrenadante de cultura de células CHO expressando SR344 por três cromatografias de coluna: cromatografia de coluna Azul Sefarose 6 FF, cromatografia por afinidade usando uma coluna imobilizada com um anticorpo específico a SR344, e cromatografia de coluna por filtragem em gel. A fração eluída como o pico principal foi usada como a amostra purificada final. Preparação de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo recombinante solúvel (cIL-6R)

[0203] Os iniciadores de oligo-DNA foram preparados com base na sequência de gene descrita para Receptor de IL-6 de macaco reso (Birney e outros, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 1 de janeiro de 2006; 34 (emissão de banco de dados):D556-61). Um fragmento de DNA que codifica o gene de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo inteiro foi preparado por PCR usando os iniciadores, e como um modelo, cDNA preparado do pâncreas de macaco cinomolgo. O fragmento de DNA resultante foi inserido em um vetor de expressão de célula de mamífero, e uma linhagem de CHO de expressão estável (linhagem de célula CHO de produção de cyno.sIL-6R) foi preparada usando o vetor. O meio de cultura de células CHO de produção de cyno.sIL-6R foi purificado usando uma coluna HisTrap (GE Healthcare Bioscience) e em seguida concentrado com Amicon Ultra-15 Ultracel- 10k (Millipore). Uma amostra purificada final de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel (a seguir cIL-6R) foi obtida através de purificação adicional em uma coluna de filtração de gel Superdex200pg16/60 (GE Healthcare Bioscience). Preparação de IL-6 de macaco cinomolgo recombinante (cIL-6)

[0204] IL-6 de macaco cinomolgo foi preparado pelo procedimento descrito abaixo. A sequência de nucleotídeo que codifica 212 aminoácidos depositados sob o SWISSPROT n°. de Acesso P79341 foi preparada e clonada em um vetor de expressão de célula de mamífero. O vetor resultante foi introduzido em células CHO para preparar uma linhagem de célula de expressão estável (linhagem de célula CHO de produção de cyno.IL-6). O meio de cultura de células CHO de produção de cyno.IL-6 foi purificado usando uma coluna P- Sefarose/FF (GE Healthcare Bioscience) e em seguida concentrado com Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Uma amostra purificada final de IL-6 de macaco cinomolgo (a seguir cIL-6) foi obtida através de outra purificação em uma coluna de filtragem em gel Superdex75pg26/60 (GE Healthcare Bioscience), seguido por concentração com Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Preparação de um anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido

[0205] Um vetor de expressão de célula de mamífero foi construído para expressar VQ8F11-21 hIgG1, um anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada conhecido. VQ8F11-21 hIgG1 é descrito na US 2007/0280945 A1 (US 2007/0280945 A1; a sequência de aminoácidos de cadeia H e cadeia L como apresentado em SEQ ID NOs: 77 e 78, respectivamente). A região variável de anticorpo foi construída por PCR usando uma combinação de oligo-DNAs sintéticos (PCR de montagem) e IgG1 foi usado para a região constante. As regiões variáveis e constantes de anticorpo foram combinadas juntas por montagem de PCR, e em seguida inseridas em um vetor de expressão de mamífero para construir vetores de expressão para a cadeia H e cadeia L de interesse. A sequência de nucleotídeos dos vetores de expressão resultantes foi determinada por um método conhecido por aqueles versados na técnica. O anticorpo de receptor anti-IL-6 de afinidade elevada (a seguir abreviado como "controle") foi expresso e purificado usando os vetores de expressão construídos pelo método descrito no exemplo 1. Preparação, expressão, e purificação de variantes de TOCILIZUMAB

[0206] Os variantes de TOCILIZUMAB foram preparados usando o Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio QuikChange (Stratagene) de acordo com o método descrito no manual de instrução em anexo. Os fragmentos de plasmídeo resultantes foram inseridos nos vetores de expressão de célula de mamífero para construir vetores de expressão para as cadeias H e cadeias L de interesse. As sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão obtidos foram determinadas por um método conhecido pelos versados na técnica. Os anticorpos foram expressos pelo método descrito abaixo. A linhagem de célula HEK293H derivada de câncer de rim embriônico humana (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) suplementada com Soro Bovino a 10% Fetal (Invitrogen). As células foram cultivadas em 10 ml por placa em placas para células aderentes (10 cm em diâmetro; CORNING) em uma densidade de célula de 5 a 6 x 105 de células/ml e cultivadas em uma incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%) durante um dia e uma noite inteira. Em seguida, o meio foi removido por aspiração, e 6,9 ml de meio de CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados. O plasmídeo preparado foi introduzido nas células pelo método de lipofeção. Os sobrenadantes de cultura resultantes foram coletados, centrifugados (aproximadamente 2000 g, 5 min, à temperatura ambiente) para remover as células, e esterilizados por filtração através de 0,22-μm de filtro MILLEX(R)-GV (Millipore) para obter os sobrenadantes. Os anticorpos foram purificados dos sobrenadantes de cultura obtidos por um método conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sefarose® Fast Flow (Amersham Biosciences). Para determinar a concentração do anticorpo purificado, a absorção foi medida em 280 nm usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas dos valores determinados usando um coeficiente de absorção calculado pelo método PACE (Protein Science 1995; 4:2411-2423). Estabelecimento de uma linhagem de célula BaF3 expressando gp130 humano

[0207] A linhagem de célula BaF3 expressando gp130 humano foi estabelecida pelo procedimento descrito abaixo para obter uma linhagem de célula que prolifera de uma maneira dependente de IL-6.

[0208] Um cDNA de gp130 humano de tamanho natural (Hibi e outros, Cell (1990) 63:1149-1157 (GenBank #NM_002184)) foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão pCOS2Zeo para construir pCOS2Zeo/gp130. pCOS2Zeo é um vetor de expressão construído removendo-se a região de expressão de gene de DHFR de pCHOI (Hirata e outros, FEBS Letter (1994) 356:244-248) e inserindo a região de expressão do gene de resistência a Zeocina. O cDNA de IL-6R humano de tamanho natural foi amplificado por PCR e clonado em pcDNA3.1(+) (Invitrogen) para construir hIL-6R/pcDNA3.1(+).

[0209] 10 μg de pCOS2Zeo/gp130 foram misturados com as células BaF3 (0,8 x 107 células) suspensas em PBS, e em seguida pulsados em 0,33 kV e 950 μFD usando Gene Pulser (Bio-Rad). As células de BaF3 tendo o gene introduzido por eletroporação foram cultivadas durante um dia e uma noite inteira em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementadas com 0,2 ng/mL de interleucina-3 de camundongo (Peprotech) e 10% de soro bovino fetal (a seguir FBS, HyClone), e selecionadas adicionando-se meio RPMI 1640 suplementado com 100 ng/mL de interleucina-6 humana (R&D systems), 100 ng/mL de receptor de interleucina-6 humano solúvel (R&D systems), e 10% de FBS para estabelecer uma linhagem de célula BaF3 de expressão de gp130 humano (a seguir "BaF3/gp130"). Este BaF/gp130 prolifera na presença de interleucina-6 humana (R&D systems) e receptor de IL-6 solúvel humano, e desse modo pode ser usado para avaliar a atividade de inibição de crescimento (ou atividade de neutralização do receptor de IL-6) de um anticorpo de receptor anti- IL-6. Avaliação quanto à atividade biológica por células BaF3 de expressão de gp130 humano (BaF/gp130)

[0210] A atividade de neutralização de receptor de IL-6 foi avaliada usando BaF3/gp130 que prolifera de uma maneira dependente do IL- 6/Receptor de IL-6. Após três lavagens com RPMI1640 suplementado com 10% de FBS, as células BaF3/gp130 foram suspensas em 5 x 104 de células/mL em RPMI1640 suplementado com 600 ng/mL ou 60 ng/mL de interleucina-6 humana (TORAY) (concentração final de 300 ng/mL ou 30 ng/mL), a quantidade apropriada de receptor de IL-6 solúvel humano, e 10% de FBS. As suspensões de célula foram distribuídas (50 μL/poço) em placas de 96 poços (CORNING). Em seguida, os anticorpos purificados foram diluídos com RPMI1640 contendo 10% de FBS, e adicionados a cada poço (50 μL/poço). As células foram cultivadas a 37°C a 5% de CO2 durante três dias. O reagente de WST-8 (Cell Counting Kit-8; Dojindo Laboratories) foi diluído duas vezes com PBS. Imediatamente após, 20 μL do reagente foram adicionados a cada poço, a absorção em 450 nm (comprimento de onda de referência: 620 nm) foi medida usando SUNRISE CLASSIC (TECAN). Após cultivar durante duas horas, a absorção em 450 nm (comprimento de onda de referência: 620 nm) foi medida novamente. A atividade de neutralização do receptor de IL-6 foi avaliada usando a alteração de absorção durante duas horas como um indicador. Análise com base em Biacore de ligação ao receptor de IL-6 solúvel humano

[0211] Os cinéticos de reação de antígeno-anticorpo foram analisados usando Biacore T100 (GE Healthcare). A interação de anticorpo-receptor de IL-6 solúvel humano foi medida imobilizando-se as quantidades apropriadas de proteína A ou proteína A/G ou F(ab’)2 anti-IgG (específico de cadeia Y) sobre um chip sensor pelo método de acoplamento de amina, ligando os anticorpos de interesse no chip em pH 7,4, e em seguida executando o receptor de IL-6 solúvel ajustado a várias concentrações em pH 7,4 sobre o chip como um analisado. Todas as medições foram realizadas a 37°C. Os parâmetros cinéticos, constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s) foram calculados a partir dos sensógrafos obtidos por medição. Em seguida, KD (M) foi determinado com base nas constantes de taxa. Os parâmetros respectivos foram determinados usando Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare). Avaliação quanto à dissociação dependente de pH do receptor de IL-6 do tipo de membrana usando Biacore

[0212] A reação de antígeno-anticorpo com o receptor de IL-6 do tipo de membrana em pH 5,8 e pH 7,4 foi observada usando Biacore T100 (GE Healthcare). A ligação ao receptor de IL-6 do tipo de membrana foi avaliada avaliando-se a ligação ao receptor de IL-6 solúvel humano imobilizado sobre o chip sensor. SR344 foi biotinilado por um método conhecido por aqueles versados na técnica. Com base na afinidade entre biotina e estreptavidina, o receptor de IL-6 solúvel humano biotinilado foi imobilizado no chip sensor através da estreptavidina. Todas as medições foram administradas a 37°C. O tampão de fase móvel foi MES a 10 mM (pH 5,8), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%. Uma ligação dependente de pH de exibição de clone foi injetada sob a condição de pH 7,4 para se ligar ao receptor de IL-6 solúvel humano (o tampão de amostra de injeção foi MES a 10 mM (pH 7,4), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%). Em seguida, a dissociação dependente de pH de cada clone foi observada em pH 5,8, que é o pH da fase móvel. A constante de taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 5,8 foi calculada usando Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) ajustando-se somente a fase de dissociação em pH 5,8. A concentração de amostra foi 0,25 μg/ml. A ligação foi realizada em MES a 10 mM (pH 7,4), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%, e a dissociação foi realizada em MES a 10 mM (pH 5,8), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%. Do mesmo modo, a constante de taxa de dissociação (kd (1/s)) em pH 7,4 foi calculada usando Software de Avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) ajustando-se somente a fase de dissociação em pH 7,4. A concentração da amostra foi 0,5 μg/mL. A ligação foi realizada em MES a 10 mM (pH 7,4), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%, e a dissociação foi realizada em MES a 10 mM (pH 7,4), NaCl a 150 mM, e Tween 20 a 0,05%. Avaliação da ligação a FcRn humano

[0213] FcRn é um complexo de FcRn e β2-microglobulina. Os iniciadores de oligo-DNA foram preparados com base na sequência de gene de FcRn humano descrita (J. Exp. Med. (1994) 180(6):2377- 2381). Um fragmento de DNA que codifica o gene inteiro foi preparado por PCR usando cDNA humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como um modelo e os iniciadores preparados. Ao usar o fragmento de DNA obtido como um modelo, um fragmento de DNA que codifica o domínio extracelular contendo a região de sinal (Met1-Leu290) foi amplificado por PCR, e inserido em um a vetor de expressão de célula de mamífero (a sequência de aminoácido de FcRn humano como apresentado em SEQ ID NO: 79). Da mesma forma, os iniciadores de oligo-DNA foram preparados com base na sequência de gene de β2-microglobulina humana descrita (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99(26):16899-16903). Um fragmento de DNA que codifica o gene inteiro foi preparado por PCR usando cDNA humano (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) como um modelo e os iniciadores preparados. Ao usar o fragmento de DNA obtido como um modelo, um fragmento de DNA que codifica a β2- microglobulina inteira contendo a região de sinal (Met1-Met119) foi amplificado por PCR e inserido em um vetor de expressão de célula de mamífero (a sequência de aminoácido de β2-microglobulina humana como apresentado em SEQ ID NO: 80).

[0214] O FcRn humano solúvel foi expresso pelos seguintes procedimentos. Os plasmídeos construídos para FcRn e β2- microglobulina humana foram introduzidos nas células da linhagem de célula derivada de câncer do rim embriônico humano HEK293H (Invitrogen) usando 10% de FBS (Invitrogen) por lipofecção. O sobrenadante de cultura resultante foi coletado, e FcRn foi purificado usando IgG Sefarose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) pelo método descrito em J. Immunol. 1 de novembro de 2002;169(9):5171- 80, seguido por outra purificação usando HiTrap Q HP (GE Healthcare). Determinação de concentração de anticorpo em plasma de camundongo

[0215] As concentrações de anticorpo em plasma de camundongo foram determinadas por ELISA de acordo com um método conhecido por aqueles versados na técnica. Teste de PK/PD para determinar a concentração de anticorpo no plasma, Concentração de CRP, e receptor de IL-6 solúvel livre em macacos

[0216] As concentrações de plasma em macacos cinomolgos foram determinadas por ELISA usando um método conhecido por aqueles versados na técnica.

[0217] A concentração de CRP foi determinada com analisador automatizado (TBA-120FR; Toshiba Medical Systems Co.) usando Cias R CRP (KANTO CHEMICAL CO., INC.).

[0218] A concentração de plasma de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel livre em macacos cinomolgos foi determinada pelo procedimento descrito abaixo. Todos os anticorpos do tipo de IgG (IgG de macaco cinomolgo, anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano, e complexo de anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano-receptor de IL- 6 de macaco cinomolgo solúvel) no plasma foram absorvidos em proteína A carregando-se 30 μl de plasma de macaco cinomolgo em uma quantidade apropriada de resina rProtein A Sefarose Fast Flow (GE Healthcare) secada em um copo de filtro de 0,22-μm (Millipore). Em seguida, a solução no copo foi centrifugada usando uma centrífuga de alta velocidade para coletar a solução que passou de lado a lado. A solução que passou de lado a lado não contém o complexo de anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano ligado a proteína A-receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel. Portanto, a concentração de receptor de IL-6 solúvel livre pode ser determinada medindo-se a concentração de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel na solução que passou através da proteína A. A concentração de receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel foi determinada usando um método conhecido por aqueles versados na técnica para medir as concentrações de receptor de IL-6 solúvel humano. O receptor de IL-6 de macaco cinomolgo solúvel (cIL-6R) preparado como descrito acima foi usado como um padrão. A percentagem de receptor de IL-6 solúvel livre foi calculada pela seguinte fórmula.

Claims

1. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 20 (região variável de VH3- M73) e a região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 23 (região variável de VL3).

2. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19 (região variável de VH4- M73) e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 22 (região variável de VL1).

3. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 (região variável de VH5- M83) e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 24 (região variável de VL5).

4. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 (VL3).

5. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 28 (VL1).

6. Anticorpo anti-receptor de IL-6, caracterizado pelo fato de que compreende a cadeia pesada que compreende a sequência de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83) e a cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 30 (VL5).

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.