UA115046C2 - Гуманізоване антитіло проти епірегуліну - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла проти епірегуліну, яке демонструє цитотоксичну активність та нейтралізуючу активність проти ракових клітин, що експресують епірегулін людини.

Description

Галузь техніки

Цей винахід стосується способів лікування раку, агентів для інгібування проліферації ракових клітин та протиракових агентів.

Попередній рівень техніки

Рак - це лідируюча причина смертності в індустріалізованих країнах. За останні 50 років з метою лікування раку було розроблено багато хіміотерапевтичних агентів. Більшість хіміотерапевтичних агентів можна розподілити на алкілуючі агенти, антиметаболіти, антрацикліни, рослинні алкалоїди, інгібітори топоїзомерази та протипухлинні агенти. Усі ці фармацевтичні агенти впливають на ділення клітин або синтез ДНК та зумовлюють терапевтичні ефекти через механізм, який діє певним чином.

Ефективність певного хіміотерапевтичного агента різниться для різних видів раку або пацієнтів або різниться залежно від періоду дії для окремих пацієнтів. У ракових клітинах, які піддаються дії хіміотерапевтичних агентів, розвивається резистентність до /- цих хіміотерапевтичних агентів, та подібно до цього часто розвивається перехресна резистентність до ряду інших протиракових агентів. Крім того, з метою контролювання побічних ефектів, які є наслідком руйнування здорових клітин цими хіміотерапевтичними агентами через вищезгаданий механізм цих агентів, дозування та застосування агентів часто обмежується.

Замість традиційних хіміотерапевтичних агентів нещодавно почали розробляти націлені на молекули ліки, які улучають у молекули, які експресуються специфічно на ракових клітинах. З появою цих націлених на молекули ліків можна уникнути побічних ефектів, притаманних традиційним хіміотерапевтичним агентам, та стають здійсненними способи лікування раку, які сприяють підвищенню якості життя ракових пацієнтів. Такі націлені на молекули ліки включають низькомолекулярні фармацевтичні агенти, а також фармацевтичні агенти 3 високою молекулярною масою, такі як антитіла. Терапевтичні антитіла - це молекули, які є невід'ємно присутніми у тілі, та їх перевага полягає у низькій токсичності щодо живих організмів, а також у тому, що вони демонструють терапевтичні ефекти, специфічно руйнуючи клітини-мішені за допомогою механізму дії, відмінного від механізму низькомолекулярних фармацевтичних агентів, такого як цитотоксична активність, опосередкована ефекторними функціями. Отже, багато терапевтичних антитіл нещодавно з'явилося на ринку.

Зо Терапевтичні антитіла, що націлені на епірегулін, який надзвичайно високо експресується при раку товстої кишки, аденокарциномі легеня, раку підшлункової залози, раку шлунку та раку нирки, описано як антитіла, які специфічно руйнують клітини-мішені за допомогою механізму дії, відмінного від механізму низькомолекулярних фармацевтичних агентів, такого як цитотоксична активність, опосередкована такими ефекторними функціями (патентний документ 1).

Специфічно, внаслідок вимірювання активності комплемент-залежної цитотоксичності (СОС) та активності антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АОСС) антитіл проти епірегуліну виявили, що антитіла проти епірегуліну мають активність СОС та активність АОСС стосовно клітин, що експресують епірегулін. Крім того, було визначено, що антитіла проти епірегуліну мають ефекти інгібування проліферації ракових клітинних ліній внаслідок нейтралізуючої дії. Крім того, на підставі вищезгаданих результатів виявили, що антитіла проти епірегуліну є ефективними для діагностики, профілактики та лікування різних первинних та метастатичних видів раку.

Будь-який новий фармацевтичний агент-кандидат, включаючи протиракові агенти, такі, які описано вище, повинен пройти жорсткі випробування до того, як він стане комерційно доступним. Наприклад, ці випробування розділяють на доклінічні випробування та клінічні випробування. Зазвичай, останні далі розділяються на випробування фази І, випробування фази І та випробування фази Ш, та їх здійснюють на пацієнтах-людях, проте попередні дослідження виконуються із застосуванням тварин. Зазвичай, метою доклінічних досліджень є демонстрування того, що ліки-кандидати є сильними, а також ефективними та безпечними.

Специфічно, цілями цих досліджень на тваринах є демонстрування того, що фармацевтичний агент не є канцерогенним, мутагенним або тератогенним, а також зрозуміти фармакокінетику фармацевтичного агента. Клінічні дослідження з введенням людям тестового фармацевтичного агента дозволяються лише тоді, коли під час доклінічних досліджень встановлено безпечність та ефективність тестового фармацевтичного агента відносно тварин.

У багатьох випадках дія низькомолекулярного тестового фармацевтичного агента (наприклад, нового протиракового агента, що походить від антрацикліну) у тварин може стати індикатором для передбачених дій фармацевтичного агента, коли його вводять людям. Отже, загальні дані, отримані в ході таких доклінічних досліджень, можуть з високим ступенем ймовірності передбачити дії, які будуть відбуватися, коли його будуть вводити людям. Проте, бо таку ймовірність передбачення не отримують для кожного типу тестового фармацевтичного агента; та ймовірність передбачення на підставі результатів доклінічних досліджень, та можливість того, що фармацевтичні агенти-кандидати будуть ухвалені, суттєво знижуються під час клінічних досліджень.

Зазвичай, антитіла можуть функціонувати через надзвичайно специфічне розпізнавання молекул-мішеней, які зазвичай є білюковоподібними. У більшості випадків тестові фармацевтичні агенти-антитіла є моноклональними антитілами, та вони розпізнають тільки єдину ділянку або єдиний епітоп на молекулі-мішені. Оскільки моноклональні антитіла звичайно мають високу функцію ідентифікації мішені, антитіла стали кандидатами, які представляють великий інтерес для розробки фармацевтичних агентів, проте, з іншого боку, ця функція ідентифікації у деяких випадках ускладнює доклінічні дослідження. Це зумовлюється тим, що існують видоспецифічні варіації у послідовностях молекул-мішеней, що зв'язуються з цими антитілами. Наприклад, моноклональне антитіло, які специфічно розпізнає молекулу У через епітоп Х у людей та зв'язується з цією молекулою, буде тестуватися стосовно відповідного епітопу Х" у відповідній молекулі-мішені (ортолог) У" у тому виді тварин, що застосовується у доклінічних дослідженнях, проте Х" може бути відмінним від Х, що є присутнім у відповідній молекулі-мішені у людей.

Отже, часто моноклональне антитіло не може специфічно розпізнати ортолог У" та зв'язатися з молекулою. Навіть серед груп моноклональних антитіл, які мають реактивність до антигенів людей та приматів, існує багато прикладів антитіл, які реагують тільки з гомологами антигенів людини та шимпанзе. Наприклад, такі випадки спостерігали для моноклональних антитіл проти

СО3. Одним з найбільш широко використовуваних специфічних до комплексів СОЮЗ моноклональних антитіл, яке має більш за все визначених властивостей, є ОКТ-3. ОКТ-3 реагує з СОЗ шимпанзе, але не реагує з гомологами СОЗ інших приматів, таких як макаки-резус, або з

СОЮЗ собак (непатентний документ 2). З іншого боку, існують приклади моноклоналоних антитіл, які розпізнають резус-антигени, але не розпізнають їхні ортологи людини. Прикладом в цій групі є ЕМ-18, яке є моноклональним антитілом проти СОЗ, що походить від макаки-резус (непатентний документ 2).

Було запроваджено декілька стратегій, щоб подолати проблеми, які виникають під час доклінічних випробувань на тваринах та які є наслідком високої специфічності таких моноклональних антитіл.

Перший відомий підхід - це виконання доклінічних досліджень на тестових фармацевтичних засобах-антитілах із застосуванням моделі-шимпанзе. Шимпанзе - це найближчі генетичні родичі людей, та, оскільки їхній геном має 99 95 ідентичність з геномом людини, дуже ймовірно, що різні варіанти молекули-мішені, що специфічно зв'язується з тестовим фармацевтичним засобом-антитілом у шимпанзе, є ідентичними до варіантів цієї молекули у людей. Фактично, зЗопіегейй еї аі. визначили, що варіанти СОЗ є спільними у людей та шимпанзе (непатентний документ 3). Отже, вважають, що ризик того, що ця молекула не буде розпізнаватися тестовим фармацевтичним засобом-антитілом у шимпанзе, є низьким. Проте, дослідження (із застосуванням шимпанзе є дуже дорогими, та вони також мають етичні проблеми. Крім того, оскільки шимпанзе - це тварини під загрозою зникнення, та кількість тварин, яку можна застосовувати в експериментах, є жорстко обмеженою, такі доклінічні дослідження на шимпанзе не застосовуються під час розробки більшості тестових фармацевтичних засобів-антитіл.

Другий підхід - це підхід, який полягає в адаптації молекули, що застосовується у доклінічних дослідженнях, до тварини, яка застосовується у дослідженнях. При цьому підході під час доклінічних досліджень отримують необхідну інформацію щодо безпечності, конструюючи так зване "сурогатне" антитіло для введення тваринам, використовуваним у дослідженнях. Зазвичай, таке сурогатне антитіло - це антитіло, яке специфічно розпізнає у тестовій тварині її ортолог молекули-мішені, яка зв'язується з несурогатним антитілом (актуальним тестовим фармацевтичним засобом-антитілом для людей), та воно є антитілом, яке було модифіковано так, щоб воно зв'язувалося з цим ортологом. Отже, при підході із застосуванням "сурогатного" антитіла слід окремо розробляти дві різні молекули: клінічний тестовий фармацевтичний агент та доклінічний тестовий фармацевтичний агент, який слід застосовувати у доклінічних дослідженнях на певному виді тварин та який має цільову специфічність, яка відповідає клінічному фармацевтичному агенту, та безпечність якого та їй подібне слід дослідити. Великий недолік цього сурогатного підходу полягає у тому, що сурогатне антитіло для доклінічних досліджень - це модифікований продукт клінічного тестового фармацевтичного засобу-антитіла. Отже, дані, отримані у ході доклінічних досліджень із застосуванням сурогатного антитіла, часто не можна застосовувати безпосередньо до людей.

Отже, можливість передбачення результатів клінічних досліджень на основі результатів доклінічних досліджень із застосуванням таких підходів, може знизитися. бо Вищезгаданий підхід адаптує тестовий фармацевтичний агент так, що він стає придатним для тварини, яку застосовують у доклінічних дослідженнях. З іншого боку, інші відомі підходи адаптують тварин, що застосовуються у доклінічних дослідженнях, до фармацевтичного агента- кандидата, який слід вводити людям.

Прикладом адаптування тварини тесту до тестового фармацевтичного засобу-антитіла, призначеного для введення людям, є отримання трансгенної тварини, яка експресує молекулу людини, з якою специфічно зв'язується тестовий фармацевтичний засіб-антитіло, замість молекули, що не походить від людини, притаманній тому виду тварини, що використовується у дослідженні. У цьому способі очікують, що тестовий фармацевтичний агент-антитіло, який вводиться під час доклінічних досліджень, буде зв'язуватися з антигеном людини у трансгенній тварині, що використовується у дослідженні. Наприклад, у дослідженні, яке виконували Виде!5кКі еї аї,, доклінічне оцінювання безпечності здійснювали на моноклональному антитілі Кеїїхітаб із застосуванням трансгенних мишей з СО4 людини для того, щоб передбачити довготривале лікування ревматоїдного артриту у пацієнтів-людей. Кеїїхітар - це моноклональне антитіло, яке має специфічність до СО4 людей та шимпанзе. Видеї5Кі еї аІ. дійшли висновку, що застосування трансгенної миші, яка експресує білок людини, забезпечує корисним альтернативним способом для досліджень, які здійснюються на шимпанзе із застосуванням біологічних фармацевтичних засобів, які мають обмежену міжвидову специфічність. Проте, отримання трансгенних тварин для цілей випробування потребує багато часу та коштів, оскільки необхідно виконати багато роботи.

Документи попереднього рівня техніки

Патентні документи

ІПатентний документ 1| УМО2008/047723

Непатентні документи

ІНепатентний документ 1) У.Меа.Ргітацої!. (1986) 15, 441-451

ІНепатентний документ 2) У.Меа.Ргітацо!.(2001) 40, 141-147

ІНепатентний документ 3З| Сапсег Іттипої.Іттипоїпег. 2006 Мау; 55(5), 503-14

ІНепатентний документ 4) Нит.Ехр. Тохісої. (2000) 19, 230-243.

Суть винаходу

Проблеми, які слід розв'язати за допомогою винаходу

Зо Цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Цей винахід далі стосується антитіл проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом. Цей винахід також стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою. Крім того, цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату. Крім того, цей винахід стосується фармацевтичних композицій або терапевтичних агентів для лікування раку, які включають вищезгадані антитіла проти епірегуліну. Цей винахід також стосується способів отримання вищезгаданих антитіл проти епірегуліну.

Засоби для розв'язання проблем

Автори цього винаходу визначили, що відношення зв'язувальної активності з епірегуліном, виділеним з яванських макак, до зв'язувальної активності з епірегуліном людини зростає внаслідок заміщення залишком аргініну амінокислотного залишку у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27, яке інгібує зростання ракових клітин, демонструючи цитотоксичну активність та нейтралізуючу активність проти ракових клітин, які експресують епірегулін людини. Більш специфічно, автори цього винаходу побудували антитіла проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між людьми та яванськими макаками, які не є тваринами-людьми. Крім того, антитіла проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом було побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. На додаток до цього, антитіла проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою будо побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. Антитіла проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату було побудовано шляхом відповідного заміщення амінокислотних залишків у послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла ЕР27. Автори цього винаходу виявили, що антитіла проти епірегуліну, які мають ці властивості, демонструють ефекти інгібування росту внаслідок нейтралізуючої активності та цитотоксичної активності на ракових клітинних лініях. Крім того, на підставі вищезгаданих результатів автори цього винаходу визначили, що антитіла проти епірегуліну є ефективними для лікування різних первинних та метастатичних видів раку, що, у свою чергу, свідчить про виконання цього винаходу.

Більш специфічно, цей винахід стосується наступного: бо ПІ антитіло проти епірегуліну, яке є антитілом, що зв'язується з епітопом, який зв'язується з антитілом проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки легкого ланцюга за 5ЕО ІЮО МО: 12, 13 та 14, де антитіло характеризується тим, що воно має менше відношення значення КО для епірегуліну мавп за 5ЕО ІЮО МО: 170 (СЕКЕС КО) до значення КО для епірегуліну людини за 5ЕО ІЮ МО: 34 (ПЕКЕС КО) (СЕКЕС КО/ЛЕКЕС КО) порівняно з відношенням СЕКЕС КО/ЛЕКЕС КО антитіла проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки легкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 12, 13 та 14; (ЇЇ антитіло за (1), де СЕКЕс КО/ЛЕКЕС КО становить менш ніж 40;

ІЗ) антитіло за | 1І, де СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО становить менш ніж 10;

ЇЇ антитіло за (1І, де СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО становить менш ніж 6;

ІЗ антитіло за | 1І, де СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО становить менш ніж 4;

І6Ї антитіло за будь-яким одним від (| до ІЗ), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає СОКІ1 важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 9, СОК2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та СОКЗ важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає

СОКІ легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 163, 68, 67 та 12, СОК2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 71, 69 та 13, та СОКЗ легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 164, 48, 47 та 14;

Ї/Ї антитіло за будь-яким одним від (| до І5), яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116 та 115, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮ МО: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29;

ІВІЇ антитіло проти епірегуліну, вибране з переліченого нижче: (1) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138,

Зо 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 та 38; (2) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29; та (3) антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97,96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 та 38, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 та 29;

ІЗЇ антитіло за будь-яким одним від |б| до І8ВЇ, яке включає константну ділянку важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 26; 191 антитіло за будь-яким одним від |бЇ до ІФ), яке включає константну ділянку легкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 27; 1) антитіло за будь-яким одним від || до (10), яке має нейтралізуючу активність; 121 антитіло за будь-яким одним від || до (111, яке має цитотоксичність;

І13Ї антитіло за (121, де цитотоксичність -- це СОС та/або АОСС;

І14|Ї антитіло за будь-яким одним від |(1| до (12), де інгібітор росту або цитотоксична речовина зв'язані з антитілом; 151 антитіло за (14), де антитіло - це низькомолекулярне антитіло;

І16Ї антитіло за будь-яким одним від (121 до (15), де константна ділянка важкого ланцюга за

ЗЕО ІЮ МО: 26 включає принаймні одне заміщення амінокислоти на позиції, вибраній з групи, що складається з: 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328 та 332, згідно з нумерацією ЕБО; 17 вектор, який включає полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає СОКІ важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 9, СОК2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІО МО: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та СОКЗ важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; бо 18) вектор за |17)Ї, який включає полінуклеотид, що кодує константну ділянку важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 26; 191 вектор, який включає полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає СОКІ1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 163, 68, 67 та 12, СОК2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІО МО: 71, 69 та 13, та СОКЗ легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5БЕО ІЮО МО: 164, 48, 47 та 14;

І20Ї вектор за (19), який включає полінуклеотид, що кодує константну ділянку легкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 27; (211 вектор, який включає: (1) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає СОМК1 важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 9, СОК2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮО МО: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та

СОКЗ важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11; та (2) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає СОКІ1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 163, 68, 67 та 12, СОМТ2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 71, 69 та 13, та СОКЗ легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 164, 48, 47 та 14; (221 вектор, який включає: (1) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає СОМК1 важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 9, СОК2 важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з

ЗЕО ІЮО МО: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 та 100, та

СОКЗ важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 та 11, та полінуклеотид, що кодує константну ділянку важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 26; та (2) полінуклеотид, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка включає СОК1 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 163, 68, 67 та 12, СОК2 легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 71, 69 та 13, та СОКЗ легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 164, 48, 47 та 14, та полінуклеотид, що кодує константну ділянку легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 27;

Зо (23) вектор, який включає полінуклеотид за (18) або (22), який включає мутований нуклеотид, який кодує константну ділянку важкого ланцюга з принаймні одним заміщенням амінокислоти на позиції, вибраній з групи, що складається з 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 та 440, згідно з нумерацією Є), у константній ділянці важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 26; (24) клітина-хазяїн, яка включає вектори за (171 та (19), вектори за |18) та (20) або вектор за (211 або (221; (251 клітина-хазяїн, яка включає вектор за (231; (26) клітина-хазяїн за (25), де спроможність додавати фукозу до цукрового ланцюга у клітині- хазяїні є низькою;

І(27| клітина-хазяїн за (26, де клітина-хазяїн з низькою спроможністю додавати фукозу до цукрового ланцюга - це клітина-хазяїн з дефіцитом одного або більше функціональних білків, вибраних з групи, що складається з фукозилтрансферази, транспортера фукози, СМО (0ОР- маноза-4,6б-дегідратази), Ех(БОР-кето-6-дезоксиманоза-3,5-епімераза, 4-редуктази) та сЕРР (СОР-В-І -фукоза пірофосфорилази); (28) клітина-хазяїн за |25), де клітина-хазяїн має спроможність утворювати розподільну пополам структуру М-ацетилглюкозаміну на цукровому ланцюзі;

І29| клітина-хазяїн за (281, де клітина-хазяїн, яка має спроможність утворювати розподільну пополам структуру М-ацетилглюкозаміну на цукровому ланцюзі, - це клітина-хазяїн, яка має активність В(1,4)-галактозилтрансферази та включає вектор, який включає полінуклеотид, що кодує функціональний домен локалізації Гольджі Гольджі-резидентного поліпептиду;

ЗОЇ клітина-хазяїн за (29), яка включає вектор, який включає полінуклеотид, що кодує функціональний домен локалізації Гольджі, вибраний з групи, що складається з домену локалізації манозидази ІЇ, домену локалізації В(1,2)-М-ацетилглюкозамінілтрансферази І, домену локалізації. В(1,2)-М-ацетилглюкозамінілтрансферази ІІ, домену локалізації манозидази ! та домену локалізації «1-6 стрижневої фукозилтрансферази; та полінуклеотид, що кодує злитий бо поліпептид, який включає каталітичний домен В(1,4)-галактозилтрансферази;

ІЗ1| клітина-хазяїн за будь-яким одним від (24| до ІЗОЇ, де клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з клітини СНО, клітини ВНК, клітини М5О, клітини 5Р2/0, мієломної клітини ХО, мієломної клітини миші РЗ х 63, клітини РЕК, клітини РЕК.Сб, клітини НЕК293 та клітини гібридоми;

ІЗ2Ї спосіб отримання антитіла за будь-яким одним від (1| до (16Ї, який включає узяття клітини-хазяїна за будь-яким одним від (24 до (31) з культурального розчину;

ІЗ3Ї антитіло, отримане за способом за (321;

ЇЗ4Ї антитіло за |З3), де агент інгібування росту або цитотоксична речовина зв'язані з антитілом;

ІЗ5Ї фармацевтична композиція, яка включає антитіло за будь-яким одним від (1) до (16), або за (331, або за ІЗ34| як активний інгредієнт;

ІЗ6Ї терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу, який включає антитіло за будь-яким одним від (| до (16), або за ІЗЗІ, або за ІЗ4| як активний інгредієнт;

ІЗ7|Ї терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за ІЗ6Ї, де рак - це будь-який вид раку, вибраний з групи, яка складається з раку товстої кишки, аденокарциноми легеня, раку підшлункової залози, раку шлунка та раку нирки;

ІЗ8Ї терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за ІЗ7)Ї, де рак товстої кишки - це слабо диференційований рак товстої кишки, середньо диференційований рак товстої кишки або добре диференційований рак товстої кишки; та

ІЗ9|Ї терапевтичний агент для лікування раку або агент для пригнічення рецидиву раку або метастазу за будь-яким одним від ІЗбЇ до |З81, де суб'єкт, якому вводиться терапевтичний агент для лікування раку, - це суб'єкт, який є носієм ракових клітин, які експресують білок епірегуліну та які виявлено у виділеному тканинному зразку.

Цей винахід також стосується способів пригнічення проліферації клітин, способів профілактики або лікування раку та способів пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому вони включають етап введення суб'єктові антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого згідно зі способом виготовлення цього винаходу. Крім того, цей винахід стосується

Зо застосування антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого за способом виготовлення цього винаходу, у виробництві агентів для інгібування проліферації клітин, агентів для профілактики або лікування раку або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку. Цей винахід також стосується антитіл цього винаходу або антитіл, отриманих за способом виробництва цього винаходу, для застосування під час пригнічення проліферації клітин, профілактики або лікування раку, пригнічення рецидиву або метастазу раку. Крім того, цей винахід стосується способів отримання агентів для інгібування проліферації клітин, агентів для профілактики або лікування раку або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому вони включають етап використання антитіла цього винаходу або антитіла, отриманого за способом виробництва цього винаходу.

Стислий опис ілюстративного матеріалу

Фігура 1 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного антитіла до епірегуліну людини (значення КО кожного антитіла / значення КО химерного антитіла ЕР27).

Незважаючи на те, що умовне позначення назви антитіла описується тільки назвою варіабельної ділянки, фігура зображує результати тесту антитіл, які містять константні ділянки с14 важкого ланцюга та каппа легкого ланцюга.

Фігура 2 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного з антитіл (значення КО для епірегуліну мавпи / значення КО епірегуліну людини). Незважаючи на те, що умовне позначення назви антитіла описується тільки назвою варіабельної ділянки, фігура зображує результати тесту антитіл, які містять константні ділянки 14 важкого ланцюга та каппа легкого ланцюга.

Фігура З демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного антитіла до епірегуліну людини (значення КО кожного антитіла / значення КО химерного антитіла ЕР27).

Фігура 4 демонструє графік, на якому зображено відношення афінності кожного з антитіл (значення КО для епірегуліну мавпи / значення КО епірегуліну людини).

Фігура 5 демонструє графік, на якому зображено активність АЮСС кожного антитіла (специфічна швидкість вивільнення кальцеїну АМ (Саїсеіп-АМ)).

Фігура 6 демонструє графік, на якому зображено нейтралізуючу активність кожного антитіла у термінах швидкості інгібування проліферації клітин ВАЄ ЕСЕК, залежної від епірегуліну людини. бо Фігура 7 демонструє графік, на якому зображено нейтралізуючу активність кожного антитіла (с;

у термінах швидкості інгібування проліферації клітин ВАЄ ЕСЕК, залежної від епірегуліну мавпи.

Фігура 8 демонструє графік, на якому зображено активність кожного антитіла щодо пригнічення іп мімо росту пухлини людини у термінах протипухлинної активності на мишачих моделях, яким трансплантували ракові клітини людини.

Фігура 9 - це зображення, яке демонструє електрофоретичні картини епірегуліну людини (нзЕВЕС-НІі5) та епірегуліну мавпи (СсУхЕКЕС-НІів).

Фігура 10 демонструє результати флуоресцентного забарвлення клітин, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну, імуногістологічного забарвлення мишей, яким трансплантували ці клітини.

Фігура 11 демонструє графік, на якому зображено активність АОСС проти клітин, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну.

Фігура 12 демонструє графік, на якому зображено активність інгібування росту пухлини людини іп омімо у термінах протипухлинної активності на мишачих моделях, яким трансплантували клітини, кожна з яких експресує різні кількості білка епірегуліну.

Фігура 13 представляє фотографії, на яких зображено експресію епірегуліну у клінічних випадках слабо диференційованого раку товстої кишки.

Фігура 14 демонструє діаграму, на якій зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 СіІусотаб проти онкогенезу стовбурових клітин раку товстої кишки РІ К123, та яка демонструє ефективність ліків проти метастазу раку товстої кишки.

Фігура 15 демонструє діаграму, на якій зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 СіІусотар проти легеневого метастазу стовбурових клітин раку товстої кишки

РІ К123, та яка демонструє ефективність ліків проти метастазу стовбурових клітин раку товстої кишки.

Фігура 16 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 СіІусотаб проти слабо диференційованого раку товстої кишки із застосуванням моделі слабо диференційованого раку товстої кишки СОЇ -53-УСК.

Фігура 17 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 СІусотар проти середньо диференційованого раку товстої кишки із

Зо застосуванням моделі середньо диференційованого раку товстої кишки РІ К379.

Фігура 18 демонструє фотографії, на яких зображено експресію епірегуліну у клінічних випадках аденокарциноми легеня.

Фігура 19 демонструє графік, на якому зображено активність АОСС (специфічна швидкість вивільнення кальцеїну АМ (Саїсеіп-АМ)) гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотаб проти клітинної лінії аденокарциноми легеня людини Саїи-3.

Фігура 20 демонструє графік, на якому зображено ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотар проти аденокарциноми легеня із застосуванням моделі аденокарциноми легеня Са/ш-3.

Фігура 21 демонструє, що кон'югат антитіло-ліки, який включає гуманізоване антитіло ЕР27

СіІусотарб, засвоюється у клітинах клітинної лінії ОО-1, які експресують епірегулін, та спричиняє руйнування клітин проти клітинної лінії ОСО-1.

Варіант здійснення винаходу

Цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Цей винахід далі стосується антитіл проти епірегуліну з пригніченим хімічним розпадом. Цей винахід також стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою ізоелектричною точкою. Крім того, цей винахід стосується антитіл проти епірегуліну зі зниженою кількістю агрегату. Крім того, цей винахід стосується фармацевтичних композицій або терапевтичних агентів для лікування раку, які включають вищезгадані антитіла проти епірегуліну. Цей винахід також стосується способів отримання вищезгаданих антитіл проти епірегуліну.

Визначення та докладний опис нижче наведено з метою сприяти розумінню цього винаходу, проілюстрованого у цьому описі.

Визначення

Амінокислоти

У цьому описі винаходу амінокислоти описуються одно- або трилітерними кодами, або обома способами, наприклад, АїйЇа/А, Геш//, Аго/К, Гуз/К, Азп/М, Мей/М, Азр/О, РІеє/Е, Суз/С,

Рго/Р, СіІп/О, Зег/5, (ІШ/Е, Тиг/Т, сіу/5, Тгр/М, Ніз/Н, Туг/у, Пе/Л або МаїЛ/. Амінокислоти, які містяться в амінокислотних послідовностях цього винаходу, можуть зазнавати посттрансляційної модифікації (наприклад, модифікація М-кінцевого глютаміну в бо піроглютамінову кислоту шляхом піроглютамілування, що є добре відомим для фахівців у галузі). Природно, що такі посттрансляційно модифіковані амінокислоти включено в амінокислотні послідовності цього винаходу.

Антигени

Антитіла, запропоновані цим винаходом, зв'язуються з епірегуліном, як з антигеном.

Епірегулін - це мембраннозв'язаний білок епідермального фактору росту. Його амінокислотну послідовність розкрито у СепВапк Ассеззіоп Митбрег МР 001423 (ЗЕО ІЮО МО: 167). У цьому винаході визначення епірегуліну включає як білок повної довжини, так і його фрагменти. Термін "фрагменти" позначає поліпептиди, які включають будь-яку ділянку епірегуліну, та вони можуть не мати функції природного епірегуліну. Приклад фрагментів включає фрагмент, який включає зовнішньоклітинну ділянку епірегуліну. Позиції від 30 до 118 амінокислотної послідовності ЗЕ

ІЮ МО: 167 відповідають зовнішньоклітинній ділянці епірегуліну. Позиції від 119 до 140 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 167 відповідають трансмембранній ділянці. У цьому описі винаходу епірегулін може бути позначеним як ЕКЕС, та ці терміни застосовуються як синоніми.

Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту в антигені та позначає ділянку антигену, з якою зв'язується антиген-зв'язувальний домен антитіла проти епірегуліну, описаного в цьому описі винаходу. Отже, наприклад, епітоп можна визначити згідно з його структурою.

Альтернативно, епітоп можна визначити на підставі антиген-зв'язувальної активності антитіла проти епірегуліну, яке розпізнає цей епітоп. Коли антиген - це пептид або поліпептид, тоді епітоп можна визначити на основі амінокислотних залишків, що утворюють цей епітоп.

Альтернативно, коли епітоп - це цукровий ланцюг, тоді цей епітоп можна визначити на підставі його специфічної структури цукрового ланцюга.

Лінійний епітоп - це епітоп, первинна амінокислотна послідовність якого розпізнається так, як епітоп, що складається з ряду послідовних амінокислот у первинній амінокислотній послідовності. Такий лінійний епітоп зазвичай містить принаймні три та більш звичайно принаймні п'ять, наприклад, приблизно від 8 до 10 або від б до 20 амінокислот в його специфічній послідовності.

На відміну від лінійного епітопу "конформаційний епітоп" - це епітоп, у якому первинна амінокислотна послідовність, що містить епітоп, не є тільки єдиною детермінантою епітопу, що

Зо розпізнається (наприклад, первинна амінокислотна послідовність конформаційного епітопу необов'язково розпізнається антитілом, яке визначає епітоп). Конформаційні епітопи можуть містити більшу кількість амінокислот порівняно з лінійними епітопами. Антитіло, що розпізнає конформаційний епітоп, розпізнає тривимірну структуру пептиду або білка. Наприклад, коли молекула білка згортається та утворює тривимірну структуру, тоді амінокислоти та/або головні ланцюги поліпептиду, які утворюють конформаційний епітоп, стають в рядок, та епітоп стає таким, що може розпізнаватися антитілом. Способи визначення конформацій епітопу включають, проте не обмежуються ними, наприклад, рентгенівську кристалографію, двовимірний ядерний магнітний резонанс, сайт-специфічне спін-мічення та електронний парамагнітний резонанс. Дивись, наприклад, Ерйоре Марріпод Ргоїосої5 іп Меї/оа5 іп МоІесшаг

Віоіоду (1996), Мої. 66, Моттіз (вєд.).

Зв'язувальна активність

Приклади способу підтвердження зв'язування антитіла з епірегуліном або, більш специфічно, епітопом, присутнім у молекулі епірегуліну, наведено далі, проте спосіб не обмежується наступними способами, та будь-який фахівець у галузі може відповідним чином застосовувати відомі способи для вимірювання антиген-зв'язувальної активності антитіла.

Наприклад, чи розпізнає антитіло проти епірегуліну лінійний епітоп у молекулі епірегуліну, можна підтвердити, наприклад, так, як згадується далі. Лінійний пептид, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен епірегуліну, синтезують для здійснення вищезгаданої мети. Пептид можна синтезувати хімічними способами або отримати із застосуванням способів генної інженерії, застосовуючи ділянку, що кодує амінокислотну послідовність, яка відповідає зовнішньоклітинному домену у кКДНК, яка кодує епірегулін (приклади включають СК541887 (5ЕО ІО МО: 169), та таку як послідовність кКДНК та

ММ 001432, та таку як послідовність МРНК). Після цього антитіло проти епірегуліну оцінюють щодо його активності зв'язування з лінійним пептидом, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен. Наприклад, іммобілізований лінійний пептид можна застосовувати як антиген при ЕЛАЙЗА, щоб оцінити активність зв'язування антитіла з пептидом. Альтернативно, активність зв'язування з лінійним пептидом можна оцінити на підставі рівня, на якому лінійний пептид інгібує зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін. Ці тести можуть продемонструвати активність зв'язування антитіла з 60 лінійним пептидом.

Чи розпізнає антитіло проти епірегуліну конформаційний епітоп, можна визначити наступним способом. Для вищевказаної цілі готують клітини, що експресують епірегулін. Можна визначити, що антитіло проти епірегуліну розпізнає конформаційний епітоп, коли воно міцно зв'язується з клітинами, що експресують епірегулін, після контактування з ними, проте несуттєво зв'язується з іммобілізованим лінійним пептидом, який включає амінокислотну послідовність, яка утворює зовнішньоклітинний домен епірегуліну. У цьому описі винаходу вираз "несуттєво зв'язується" означає, що зв'язувальна активність становить 80 96 або менше, зазвичай 50 956 або менше, переважно 30 96 або менше та особливо переважно 15 95 або менше, порівняно з активністю зв'язування з клітинами, що експресують епірегулін людини.

Способи визначення активності зв'язування антитіла проти епірегуліну з клітинами, що експресують епірегулін, включають, наприклад, способи, описані в "Апіїродіев: А І арогаїогу

Мапиа!" (Ед Напом/, Оамій Іапе, Соїй Зрііпа Нарог І арогаїогу (1988) 359-420). Специфічно, оцінку можна здійснювати на основі принципу ЕЛАЙЗА або сортування флюоресцентно- активованих клітин (ЕАС5), застосовуючи при цьому клітини, що експресують епірегулін, як антиген.

У форматі ЕЛАЙЗА активність зв'язування антитіла проти епірегуліну з клітинами, що експресують епірегулін, можна оцінити кількісно, порівнявши рівні сигналів, генерованих ферментативною реакцією. Специфічно, антитіло тесту додають до планшета ЕЛАЙЗА, на якому іммобілізовано клітини, що експресують епірегулін. Після цього антитіло тесту, зв'язане з клітинами, виявляють, застосовуючи мічене ферментом антитіло, яке розпізнає антитіло тесту.

Альтернативно, коли застосовується ЕАС5, тоді готують серію розведень антитіла тесту, та титр зв'язування антитіла для клітин, що експресують епірегулін, можна визначити, щоб порівняти активність зв'язування антитіла тесту з клітинами, що експресують епірегулін.

Зв'язування антитіла тесту з антигеном, що експресується на поверхні клітин, суспендованих у буфері або йому подібному, можна визначити, застосовуючи проточний цитометр. Відомі проточні цитометри включають, наприклад, наступні пристрої:

ЕАС5Сапіо "М

ЕАС5АГатм

ЕАСБЗАтаутм

ЕАС5Мапіаде М 5Е

ЕАСсСЗСаїйриг "М (усі є торговельними марками ВО Віозсієпсев)

ЕРІС5 АГ ТВА НуРегзоп

Суютісв ЕС 500

ЕРІС5 ХІ-МОСЇ АОС ЕРІС5 ХІ АОС

Сеїї Сар Оцапіа/СеїЇ Габ Омцапіа 5С (усі є торговельними марками Весктап СошикКег).

Переважні способи оцінювання активності зв'язування антитіла проти епірегуліну з епірегуліном включають, наприклад, наступний спосіб. По-перше, клітини, що експресують епірегулін, вступають в реакцію з антитілом тесту, а потім їх забарвлюють РІТС-міченим вторинним антитілом, яке розпізнає антитіло тесту. Антитіло проти епірегуліну тесту відповідним чином розводять придатним буфером, щоб отримати антитіло у бажаній концентрації. Наприклад, антитіло можна застосовувати у концентрації, яка становить діапазон від 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Після цього інтенсивність флюоресценції та кількість клітин визначають із застосуванням ЕАСзсСаїїриг (ВО). Інтенсивність флюоресценції, визначена шляхом аналізу із застосуванням СЕ ОШОЕ5ЗТ Зоймаге (ВО), тобто, середнє геометричне значення, відображає кількість антитіла, зв'язаного з клітинами. Тобто, зв'язувальну активність антитіла тесту, яке представлено кількістю зв'язаного антитіла тесту, можна визначити шляхом вимірювання середнього геометричного значення.

Чи використовує антитіло проти епірегуліну такий самий епітоп, що й інше антитіло, можна визначити на основі конкурування між двома молекулами для одного й того ж епітопу.

Конкурування між антитілами можна визначити, застосовуючи епітоп-перехресний конкурентний аналіз або йому подібне. Наприклад, конкурентний аналіз ЕЛАЙЗА є переважним епітоп- перехресним конкурентним аналізом.

Специфічно, при епітоп-перехресному конкурентному аналізі білок епірегуліну, іммобілізований у комірках мікротитраційного планшета, заздалегідь інкубують у присутності або відсутності конкуруючого антитіла-кандидата, а потім до нього додають антитіло тесту.

Кількість антитіла тесту, зв'язаного з білком епірегуліну у комірках, непрямо корелює зі зв'язувальною активністю конкуруючого антитіла-кандидата, яке конкурує за зв'язування з тим же епітопом. Тобто, чим вище афінність антитіла-конкурента для того ж самого епітопу, тим нижче активність зв'язування антитіла тесту з комірками, покритими білком епірегуліну. бо Кількість антитіл тесту, зв'язаних з комірками за допомогою білка епірегуліну, можна легко визначити за допомогою мічення антитіла заздалегідь. Наприклад, мічене біотином антитіло вимірюється за допомогою кон'югату авідину/пероксидази та відповідного субстрату. Зокрема, епітоп-перехресний конкурентний аналіз, при якому застосовуються ферментні мітки, такі як пероксидаза, називається "конкурентним аналізом ЕЛАЙЗА". Антитіло можна також мітити іншими речовинами мічення, які сприяють виявленню або вимірюванню. Специфічно, відомими є радіоактивні мітки, флуоресцентні мітки тощо.

Коли конкуруюче антитіло-кандидат може блокувати зв'язування антитіла з епірегуліном принаймні на 20 95, переважно принаймні на 20 - 50 95 та більш переважно принаймні на 50 95 порівняно зі зв'язувальною активністю у контрольному експерименті, який здійснюється у відсутності антитіла-конкурента, тоді визначають, що антитіло тесту суттєво зв'язується з тим самим епітопом, зв'язаним з антитілом-конкурентом, або конкурує за зв'язування з тим самим епітопом.

Коли структуру епітопу, зв'язаного з антитілом проти епірегуліну, вже визначили, тоді можна визначити, чи ділять між собою антитіло тесту та контрольне антитіло спільний епітоп, шляхом порівняння активності зв'язування двох антитіл з пептидом, отриманим шляхом введення амінокислотних мутацій у пептид, який утворює епітоп.

Для того, щоб вимірити вищезгадану активність зв'язування, наприклад, активність зв'язування антитіла тесту та контрольного антитіла з лінійним пептидом, у який вводиться мутація, порівнюють у вищезгаданому форматі ЕЛАЙЗА. Окрім способів ЕЛАЙЗА активність зв'язування з мутантним пептидом, зв'язаним з колонкою, можна визначити за допомогою гідродинамічного дослідження та контрольних антитіл у колонці, а потім здійснити кількісну оцінку антитіла, елюйованого у розчин елюювання. Відомі способи адсорбції мутантного пептиду до колонки, наприклад, у формі злитого пептиду 517.

Альтернативно, коли ідентифікований епітоп - це конформаційний епітоп, тоді наступним способом можна визначити, чи ділять між собою тестове антитіло та контрольне антитіло спільний епітоп. По-перше, отримують клітини, що експресують епірегулін, та клітини, що експресують епірегулін з мутацією, введеною в епітоп. Антитіло тесту та контрольне антитіло додають до клітинної суспензії, отриманої внаслідок суспендування цих клітин у відповідному буфері, такому як РВ5 (фосфатно-сольовий буфер). Після цього клітинні суспензії відповідним чином промивають буфером, та до них додають РІТС-мічене антитіло, яке розпізнає антитіло тесту та контрольне антитіло. Інтенсивність флюоресценції та кількість клітин, забарвлених міченим антитілом, визначають із застосуванням ЕБАСобсСаїїриг (ВО). Антитіло тесту та контрольне антитіло відповідним чином розводять із застосуванням придатного буферу та їх застосовують при бажаній концентрації. Наприклад, їх можна застосовувати у концентрації, яка становить діапазон від 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Інтенсивність флюоресценції, визначена шляхом аналізу із застосуванням СЕ ЇЇ ОШЕ5ЗТ бБойулаге (ВО), тобто середнього геометричного значення, відображає кількість міченого антитіла, зв'язаного з клітинами. Тобто, зв'язувальну активність антитіла тесту та контрольного антитіла, яка представлена кількістю міченого антитіла, яке є зв'язаним, можна визначити шляхом вимірювання середнього геометричного значення.

У вищеописаному способі можна визначити, наприклад, наступним способом, чи антитіло "не зв'язується суттєво з клітинами, що експресують мутантний епірегулін". По-перше, антитіло тесту та контрольне антитіло, зв'язані з клітинами, що експресують мутантний епірегулін, забарвлюють міченим антитілом. Після цього визначають інтенсивність флюоресценції клітин.

Коли ЕРАСзсСаїйбиг застосовується для виявлення флюоресценції шляхом проточної цитометрії, тоді можна проаналізувати визначену інтенсивність флюоресценції, застосовуючи СЕСІЇ ООЕЗТ зопПмаге. З середніх геометричних значень у присутності та відсутності антитіла значення порівняння (ДбСео-Меап) можна розрахувати згідно з наступною формулою (Формула 1), щоб визначити коефіцієнт підвищення інтенсивності флюоресценції, як результат зв'язування антитілом.

Формула 1

Абео-Меап-Сео-Меап (у присутності антитіла)уХзео-Меап (у відсутності антитіла), де Сео-

Меап означає середнє геометричне.

Значення порівняння середніх геометричних значень (значення ДСео-Меап для молекули мутантного епірегуліну), яке визначено завдяки вищеописаному аналізу та яке відображає кількість антитіла тесту, зв'язаного з клітинами, що експресують мутантний епірегулін, порівнюється зі значенням порівняння ДОСео-Меап, яке відображає кількість антитіла тесту, зв'язаного з клітинами, що експресують епірегулін. У цьому випадку концентрації антитіла тесту, яке застосовується для визначення значень порівняння ДСео-Меап для клітин, що експресують бо епірегулін, та клітин, що експресують мутантний епірегулін, особливо переважно регулюються так, щоб вони були рівними або по суті рівними. Антитіло, про яке підтверджено, що воно розпізнає єпітоп в епірегуліні, застосовується як контрольне антитіло.

Якщо значення порівняння ДАСео-Меап антитіла тесту для клітин, що експресують мутантний епірегулін, є меншим ніж значення порівняння ДСео-Меап антитіла тесту для клітин, що експресують епірегулін, на принаймні 8095, переважно 5095, більш переважно 3095 та особливо переважно 15 95, тоді антитіло тесту "суттєво не зв'язується з клітинами, що експресують мутантний епірегулін': Формулу для визначення Сео-Меап (середнього геометричного) значення описано в інструкції користувача СЕ ОШОЕ5БТ боймжаге (ВО ріозсіепсе5). Коли порівняння показує, що значення порівняння є по суті еквівалентними, тоді можна визначити, що епітоп для тестового та контрольного антитіл проти епірегуліну є одним і тим самим.

Антитіла

У цьому описі винаходу термін "антитіло" означає природний імуноглобулін або імуноглобулін, отриманий внаслідок часткового або повного синтезу. Антитіла можна виділити з природних джерел, таких як природно-виникаючі плазма та сироватка, або з культуральних надосадових рідин гібридом, що виробляють антитіло. Альтернативно, антитіла можна частково або повністю синтезувати, застосовуючи способи, такі як генетична рекомбінація. Переважні антитіла включають, наприклад, антитіла ізотипу імуноглобуліну або підкласу, що належить до нього. Відомі імуноглобуліни людини включають антитіла наступних дев'яти класів (ізотипів):

ІЧОС1, Ідс2, 93, Ідс4, ІдАТ, ІдДА2, 1940, ІДЕ та І9М. З цих ізотипів антитіла цього винаходу включають Іде, Ідо2, ІдОЗ та Ідса4.

Способи отримання антитіла з бажаною зв'язувальною активністю є відомими для фахівців у галузі. Нижче наведено необмежувальний приклад, який описує спосіб отримання антитіла, яке зв'язується з епірегуліном (антитіло проти епірегуліну).

Антитіла проти епірегуліну можна отримати як поліклональні або моноклональні антитіла, застосовуючи відомі способи. Антитіла проти епірегуліну, які переважно отримують, - це моноклональні антитіла, що походять від ссавців. Такі похідні від ссавців моноклональні антитіла включають антитіла, отримані завдяки гібридомам або клітинам-хазяїнам, трансформованим вектором експресії, який є носієм гена антитіла, за допомогою способів

Зо генної інженерії. "Гуманізовані антитіла" або "химерні антитіла" включено до моноклональних антитіл цього винаходу.

Гібридоми, що виробляють моноклональні антитіла, можна отримати, застосовуючи відомі способи, наприклад так, як описано далі. Специфічно, ссавців імунізують традиційними способами імунізації, застосовуючи білок епірегулін як сенсибілізуючий антиген. Отримані імунні клітини зливають з відомими батьківськими клітинами, застосовуючи традиційні способи злиття клітин. Після цього гібридоми, які виробляють антитіло проти епірегуліну, можна вибрати шляхом скринінгу з метою виявлення моноклональних клітин, які виробляють антитіло, яке зв'язується з епітопом у молекулі епірегуліну, застосовуючи при цьому традиційні способи скринінгу.

Специфічно, моноклональні антитіла отримують так, як описано далі. По-перше, ген епірегуліну людини, нуклеотидна послідовність якого розкрита у 5ЕБЕО ІЮ МО: 169, можна експресувати, щоб отримати білок епірегуліну людини, зображений у ЗЕО ІЮ МО: 167, який буде застосовуватися як сенсибілізуючий антиген для отримання антитіла. Тобто, послідовність гена, яка кодує епірегулін людини, вставляється у відомий вектор експресії, та відповідні клітини- хазяїни трансформуються цим вектором. Бажаний білок епірегуліну людини очищують від клітин-хазяїнів відомими способами. Для того, щоб отримати розчинний епірегулін людини з культуральних надосадових рідин, наприклад, поліпептид, що включає амінокислоти на позиціях від 30 до 118 у поліпептидній послідовності епірегуліну людини ЗЕО ІЮО МО: 167, або білок, включений в амінокислоти на позиціях від ЗО до 108, показаний як 5ЗЕО ІЮО МО: 34.

Очищений природний білок епірегуліну людини можна також застосовувати як сенсибілізуючий антиген.

Очищений білок епірегуліну можна застосовувати як сенсибілізуючий антиген для імунізації ссавців. Частковий пептид епірегуліну можна також застосовувати як сенсибілізуючий антиген. У цьому випадку частковий пептид можна отримати за допомогою хімічного синтезу на основі амінокислотної послідовності епірегуліну людини або шляхом вставлення часткового гена епірегуліну людини у вектор експресії для експресії. Альтернативно, частковий пептид можна отримати внаслідок деградації білка епірегуліну людини протеазою. Довжина та ділянка часткового пептиду епірегуліну людини не обмежується особливими варіантами здійснення.

Переважну ділянку можна довільно вибрати з амінокислотної послідовності на амінокислотних 60 позиціях від 30 до 118 або на позиціях від 30 до 108 в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:

167. Кількість амінокислот, які утворюють пептид, який слід застосовувати як сенсибілізуючий антиген, переважно становить принаймні 5 або більше, наприклад, 6 або більше, або 7 або більше. Більш специфічно, як сенсибілізуючий антиген можна застосовувати пептид з 8 - 50 залишків, більш переважно з 10 - 30 залишків.

Для сенсибілізуючого антигену альтернативно можна застосовувати злитий білок, отриманий внаслідок злиття бажаного часткового поліпептиду або пептиду білка епірегуліну з іншим поліпептидом. Наприклад, фрагменти антитіла Ес та пептидні мітки переважно застосовують, щоб отримати злиті білки, які будуть застосовуватися як сенсибілізуючі антигени.

Вектори для експресії таких злитих білків можна побудувати внаслідок злиття генів рамки, які кодують два або більше бажаних поліпептидних фрагментів, або внаслідок вставлення злитого гена у вектор експресії, як описано вище. Способи отримання злитих білків описано у МоїЇесціаг

Сіопіпа 2па єд. (Затьгоок, ./ еї а)І., МоІесшаг Сіопіпуд 2па єад., 9.47-9.58 (1989) Соїай брііпу Натбог

Гар. Рге55). Способи отримання епірегуліну, який слід застосовувати як сенсибілізуючий антиген, та способи імунізації із застосуванням епірегуліну специфічно описано у УМО 2008/047723 тощо.

Не існує особливого обмеження щодо ссавців, яких слід імунізувати сенсибілізуючим антигеном. Проте, бажано вибирати ссавців з урахуванням їх сумісності з батьківськими клітинами, які слід застосовувати для злиття клітин. Зазвичай, переважно застосовують гризунів, таких як миші, щури та хом'ячки, кролів та мавп.

Вищезгаданих тварин імунізують сенсибілізуючим антигеном за відомими способами.

Способи імунізації, які зазвичай виконуються, включають, наприклад, внутрішньочеревну або підшкірну ін'єкцію сенсибілізуючого антигену ссавцям. Специфічно, сенсибілізуючий антиген відповідним чином розводиться РВЗ (фосфатно-сольовим буфером), фізіологічним сольовим розчином або їм подібним. Якщо бажано, то традиційний ад'ювант, такий як повний ад'ювант

Фрейнда, змішують з антигеном, та суміш емульгують. Після цього сенсибілізуючий антиген вводять ссавцеві декілька разів з інтервалами від 4 до 21 дня. Відповідні носії можна застосовувати при імунізації сенсибілізуючим антигеном. Зокрема, коли низькомолекулярний частковий пептид застосовується як сенсибілізуючий антиген, тоді для імунізації іноді є бажаним зчепити пептид сенсибілізуючого антигену з білком носія, таким як альбумін або гемоціанін

Зо лімфи равлика.

Альтернативно, гібридоми, які виробляють бажане антитіло, можна отримати, застосовуючи

ДНК-імунізацію, як згадується далі. ДНК-імунізація - це спосіб імунізації, який сприяє імуностимуляції внаслідок експресії сенсибілізуючого антигену у тварині, імунізованій внаслідок введення ДНК вектора, побудованої для того, щоб дозволити експресію гена, що кодує білок антигену, у тварині. На відміну від традиційних способів імунізації, при яких антиген білка вводиться тваринам, які підлягають імунізації, очікують, що ДНК-імунізація буде мати переваги у наступному: імуностимуляцію можна здійснити, зберігаючи при цьому структуру мембранного білка, такого як епірегулін; та немає необхідності в очищенні антигену для імунізації.

Для того, щоб отримати моноклональне антитіло цього винаходу із застосуванням ДНК- імунізації по-перше, ДНК, що експресує білок епірегуліну, вводять тварині, яка підлягає імунізації. ДНК, що кодує епірегулін, можна синтезувати за відомими способами, такими як ПЛР.

Отриману ДНК вставляють у відповідний вектор експресії, а потім цей вектор вводять тварині, яка підлягає імунізації. Вектори експресії, які переважно застосовуються, включають, наприклад, комерційно доступні вектори експресії, такі як рРсСОМАЗ.1. Вектори можна вводити в організм, застосовуючи традиційні способи. Наприклад, ДНК-імунізацію виконують, застосовуючи генну гармату, щоб ввести частинки золота, покриті вектором експресії, в клітини у тілі тварини, що підлягає імунізації. Антитіла, що розпізнавали епірегулін, можна також

БО отримати за способами, описаними в УУО 2003/1 04453.

Після імунізації ссавця описаним вище способом підвищення титру антитіла, що зв'язується з епірегуліном, підтверджується у сироватці. Після цього імунні клітини беруть у ссавця, а потім піддають їх клітинному злиттю. Зокрема, як імунні клітини переважно застосовують спленоцити.

Клітину мієломи ссавців застосовують як клітину, яку слід злити з вищезгаданими імунними клітинами. Клітини мієломи переважно включають придатний маркер відбору для скринінгу.

Маркер відбору надає клітинам характеристики для їх виживання (або загибелі) при специфічних умовах у культурі. Як маркери відбору відомими є дефіцит гіпоксантин-гуанін фосфорибозилтрансферази (далі скорочується як дефіцит НОРКТ) та дефіцит тимідинкінази (далі скорочується як дефіцит ТК). Клітини з дефіцитом НОРЕТ або ТК мають чутливість до бо гіпоксантин-аміноптерин-тимідину (далі скорочується як чутливість НАТ). НАТ-чутливі клітини не можуть синтезувати ДНК у середовищі відбору НАТ, та, як наслідок, вони гинуть. Проте, коли клітини зливаються зі здоровими клітинами, тоді вони можуть продовжити синтез ДНК, застосовуючи реутилізаційний шлях здорових клітин, та внаслідок цього вони можуть зростати навіть у середовищі відбору НАТ.

Клітини з дефіцитом НОРКТ та ТК можна вибирати у середовищі, що містить б-тіогуанін, 8- азагуанін (далі скорочується як ВАС) або 5'-бромдезоксиуридин, відповідно. Здорові клітини гинуть, оскільки вони залучають ці аналоги піримідину в свої ДНК. Між тим, клітини, які мають дефіцит цих ферментів, можуть вижити у середовищі відбору, оскільки вони не можуть залучати ці аналоги піримідину. Крім того, маркер відбору, який позначається як резистентність до 5418 та який є наслідком гена резистентності до неоміцину, надає резистентності до 2- дезоксистрептамінових антибіотиків (аналоги гентаміцину). Відомі різні типи клітин мієломи, які є придатними для злиття клітин.

Наприклад, можна переважно застосовувати клітини мієломи, які включають наступні клітини:

РЗ(РЗ х 63А98.653) (9. Іттипої. (1979) 123 (4), 1548-1550);

РЗ х 63ЗА980.1 (Сигтепі Торісз іп Містобіоіоду апа Іттипо!іоду (1978)81, 1-7);

М5-1 (6. Єиг. у. Іттипої!. (1976)6 (7), 511-519);

МРО-11 (Сеї! (1976) 8 (3), 405-415);

ЗР2/О (Маїшге (1978) 276 (5685), 269-270);

ЕО (у. Іттипої. Меїнодз (1980) 35 (1-2), 1-21); 5194/5.ХХО.ВИ 1 (9. Ехр. Мед. (1978) 148 (1), 313-323);

В210 (Машгте (1979) 277 (5692), 131-133) тощо.

Злиття клітин між імуноцитами та клітинами мієломи переважно здійснюється за допомогою відомих способів, наприклад, за допомогою способу Копіег апа Міївієїп еї а. (Меїпод»5 Епгуто!). (1981) 73: 3-46).

Більш специфічно, злиття клітин можна виконувати, наприклад, у традиційному культуральному середовищі у присутності агента, який сприяє злиттю клітин. Агенти, що сприяють злиттю клітин, включають, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ) та вірус Сендай (НМ).

Якщо необхідно, допоміжну речовину, таку як диметилсульфоксид, також додають, щоб

Зо покращити ефективність злиття.

Відношення імунних клітин до клітин мієломи можна визначити на свій власний розсуд, переважно, наприклад, одна клітина мієломи на кожен від одного до десяти імуноцитів.

Культуральні середовища, які слід застосовувати для злиття клітин, включають, наприклад, середовища, які є придатними для росту клітинних ліній мієломи, такі як середовище КРМІ1640 та середовище МЕМ, та інше традиційне культуральне середовище, яке застосовується для цього типу клітинної культури. Крім того, до культурального середовища можна переважно додавати інші конглютиніни сироватки, такі як фетальна теляча сироватка (ЕС5).

Для злиття клітин попередньо визначені кількості вищезгаданих імунних клітин та клітин мієломи змішуються належним чином у вищезгаданому культуральному середовищі. Після цього розчин ПЕГ (наприклад, середня молекулярна маса становить приблизно від 1000 до 6000), попередньо нагрітий до приблизно 37 "С, додають до середовища у концентрації зазвичай від 30 95 до 60 95 (маси/об'єму). Все це обережно змішують, щоб отримати бажані злиті клітини (гібридоми). Після цього відповідне культуральне середовище, згадане вище, поступово додають до клітин та отриману суміш неодноразово центрифугують, щоб видалити надосадову рідину. Таким чином можна видалити агенти злиття клітин та агенти, які не є бажаними для росту гібридом.

Отримані таким чином гібридоми можна відібрати шляхом культивування, застосовуючи традиційне середовище відбору, наприклад, середовище НАТ (культуральне середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин та тимідин). Клітини, відмінні від бажаних гібридом (незлиті клітини), можна вбити, продовжуючи культивування у вищезгаданому середовищі НАТ протягом достатнього періоду часу. Зазвичай, цей період становить від декількох днів до декількох тижнів. Після цього гібридоми, що виробляють бажане антитіло, піддають скринінгу та поодинці клонують за традиційними способами граничного розведення.

Отримані таким чином гібридоми можна відібрати, застосовуючи середовище відбору на основі маркера відбору, який має мієлома, яка застосовується у злитті клітин. Наприклад, клітини з дефіцитом НОРКТ або ТК можна відібрати шляхом культивування, застосовуючи середовище НАТ (культуральне середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин та тимідин).

Специфічно, коли НАТ-чутливі клітини мієломи застосовуються для злиття клітин, тоді клітини, які успішно злилися зі здоровими клітинами, можуть вибірково проліферуватися у середовищі 60 НАТ. Клітини, відмінні від бажаних гібридом (незлиті клітини) можна вбити, продовжуючи культивування у вищезгаданому середовищі НАТ протягом достатнього періоду часу.

Специфічно, бажані гібридоми можна відбирати шляхом культивування зазвичай протягом періоду від декількох днів до декількох тижнів. Після цього гібридоми, що виробляють бажане антитіло, піддають скринінгу та поодинці клонують традиційними способами граничного розведення.

Бажані антитіла можна переважно відбирати та поодинці клонувати за способами скринінгу на основі відомої реакції антиген-антитіло. Наприклад, моноклональне антитіло, що зв'язує епірегулін, може зв'язуватися з епірегуліном, який експресується на клітинній поверхні. Таке моноклональне антитіло можна піддати скринінгу шляхом сортування флюоресцентно- активованих клітин (ЕАС5). ГАС - це система, яка оцінює зв'язування антитіла з клітинною поверхнею, аналізуючи клітини, які контактували з флуоресцентним антитілом, за допомогою лазерного променя та вимірюючи флюоресценцію, яка випромінюється з окремих клітин.

Для скринінгу за допомогою РАСЗ гібридом, які виробляють моноклональне антитіло цього винаходу, по-перше, отримують клітини, що експресують епірегулін. Клітини, які переважно застосовують для скринінгу, - це клітини ссавців, у яких епірегулін експресується примусово. З метою контролю активність антитіла зв'язуватися з епірегуліном на клітинній поверхні можна вибірково визначити, застосовуючи нетрансформовані клітини ссавців як клітини-хазяїни.

Специфічно, гібридоми, що виробляють моноклональне антитіло проти епірегуліну, можна виділити шляхом вибору гібридом, які виробляють антитіло, яке зв'язується з клітинами, змушеними експресувати епірегулін, проте не з клітинами-хазяїнами.

Альтернативно, активність антитіла зв'язуватися з іммобілізованими клітинами, що експресують епірегулін, можна оцінити на підставі принципу ЕЛАЙЗА. Наприклад, клітини, що експресують епірегулін, іммобілізуються на комірках планшета для ЕЛАЙЗА. Культуральні надосадові рідини гібридом контактують з іммобілізованими клітинами у комірках, та виявляють антитіла, які зв'язуються з іммобілізованими клітинами. Коли моноклональні антитіла походять від мишей, тоді антитіла, зв'язані з клітинами, можна виявити, застосовуючи антитіло проти мишачого імуноглобуліну. Гібридоми, які виробляють бажане антитіло, яке має антиген- зв'язувальну спроможність, вибираються шляхом вищезгаданого скринінгу, та їх можна клонувати способом граничного розведення або йому подібним.

Зо Отримані таким способом гібридоми, що виробляють моноклональне антитіло, можна пропустити крізь традиційне культуральне середовище та зберігати у рідкому азоті протягом тривалого періоду часу.

Вищеописані гібридоми культивують традиційним способом, та бажані моноклональні антитіла можна отримати з культуральних надосадових рідин. Альтернативно, гібридоми вводять у та вирощують у сумісних ссавцях, та моноклональні антитіла отримують з асцитів.

Попередній спосіб є придатним для отримання антитіл з високою чистотою.

Можна також переважно застосовувати антитіла, які кодуються генами антитіла, які клонуються з клітин, які виробляють антитіла та які описано вище. Клонований ген антитіла вставляється у відповідний вектор, та потім вектор вводиться у хазяїна, щоб експресувати антитіло, яке кодується геном. Способи виділення генів антитіл, вставлення генів у вектори та трансформації клітин-хазяїнів вже розроблено, наприклад, Мапдатте еї аї. (Єшиг. 9. Віоспет. (1990) 192(3), 767-775). Способи отримання рекомбінантних антитіл є також відомими та їх описано далі.

Наприклад, кКДНК, яка кодує варіабельну ділянку (М-ділянку) антитіла проти епірегуліну, отримують з клітин гібридоми, які експресують антитіло проти епірегуліну. Для цього суцільну

РНК спочатку екстрагують з гібридом. Методи, які застосовуються для екстрагування мРНК з клітин, включають, наприклад: спосіб ультрацентрифугування гуанідину (Віоспетівігу (1979) 18(24), 5294-5299), та спосіб АСРС (Апаї. Віоспе т. (1987) 162(1), 156-159).

Екстраговані мРНК можна очистити, застосовуючи набір для очищення мРНК тЕМА

Ритітісаноп Кії (СЕ Неайнсаге Віозсіеєпсе) або йому подібне. Альтернативно, також комерційно доступні набори для екстрагування суцільної мРНК безпосередньо з клітин, такі як набір для очищення мРНК ОпціскРгер тЕМА Ригіїйсацйоп Кий (СЯ4ЄЕ Неайнсаге Віозсієпсе). мРНК можна отримати з гібридом, застосовуючи такі набори. кКДНК, які кодують М-ділянку антитіла, можна синтезувати з отриманих мРНК, застосовуючи зворотну транскриптазу. кКДНК можна синтезувати, застосовуючи набір синтезу КДНК АММ Кемегзе Тгапзогіріабе Ріг5ї-вїтапа сОМА

Зупіпезів Кії (Зеїкадаки Со.) або йому подібне. Крім того, набір ампліфікації ЗМАКТ КАСЕ сЬМА (Сіопіесі) та спосіб 5'-КАСЕ на основі ПЛР (Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА (1988) 85(23), 8998-9002;

Мисівїс Асіаз Нев. (1989) 17(8), 2919-2932) можна відповідним чином застосовувати для синтезу бо та ампліфікації КДНК. У такому процесі синтезу кКДНК відповідні ділянки рестрикційних ферментів, описані далі, можна вводити в обидва кінці КДНК.

Фрагмент кДНК, який представляє інтерес, очищують з отриманого продукту ПЛР, а потім його зшивають з векторною ДНК. Таким способом будують рекомбінантний вектор, та його вводять в Е. Соїї або їй подібну. Після відбору колонії бажаний рекомбінантний вектор можна отримати з утворюючої колонії Е. соїї. Після цього визначається, чи має рекомбінантний вектор нуклеотидну послідовність кКДНК, яка представляє інтерес, у ході тесту за відомим способом, таким як спосіб обриву дидезоксинуклеотидного ланцюга.

Спосіб 5-КАСЕ, при якому застосовуються праймери для ампліфікації гена варіабельної ділянки, традиційно застосовується для виділення гена, що кодує варіабельну ділянку. По- перше, бібліотеку КДНК 5-КАСЕ будують за допомогою синтезу кКДНК, застосовуючи РНК, екстраговані з клітин гібридом, як матрицю. Комерційно доступний набір, такий як набір ампліфікації КДНК 5МАКТ КАСЕ, відповідним чином застосовується для синтезування бібліотеки КДНК 5-ВАСЕ.

Ген антитіла ампліфікують шляхом ПЛР, застосовуючи отриману бібліотеку КДНК 5'-КАСЕ як матрицю. Праймери для ампліфікації гена антитіла миші можна побудувати на основі відомих послідовностей гена антитіла. Нуклеотидні послідовності праймерів різняться залежно від підкласу імуноглобуліну. Отже, переважно, щоб підклас визначали заздалегідь, застосовуючи комерційно доступний набір, такий як набір ізотипування моноклонального антитіла миші Іо

Зір (Восне Оіадпозіїсв).

Специфічно, наприклад, праймери, які дозволяють ампліфікувати гени, які кодують важкі ланцюги ут, уга, у256 та уЗ та легкі ланцюги к та А застосовуються для виділення генів, що кодують дб миші. Зазвичай, праймер, який гібридизується до області константної ділянки, близької до варіабельної ділянки, застосовується як 3'-бічний праймер для ампліфікації гена варіабельної ділянки ДО. Між тим, праймер, приєднаний до набору для побудови бібліотеки

КДНК 5" КАСЕ, застосовується як 5'-бічний праймер.

Продукти ПЛР, ампліфіковані таким способом, застосовуються для зміни форми імуноглобулінів, які складаються з комбінації важких та легких ланцюгів. Бажане антитіло можна вибрати, застосовуючи епірегулін-зв'язувальну активність імуноглобуліну зі зміненою формою, як індикатор. Коли метою є виділити антитіло проти епірегуліну, тоді більш переважно, щоб

Зо зв'язування антитіла з епірегуліном було специфічним. Антитіло, що зв'язується з епірегуліном, можна скринувати, наприклад, за наступними етапами: контактування клітини, що експресує епірегулін з антитілом, яке включає М-ділянку, кодовану кДНК, виділеною з гібридоми; виявлення зв'язування антитіла з клітиною, що експресує епірегулін; та вибір антитіла, яке зв'язується з клітиною, що експресує епірегулін.

Відомі способи виявлення зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін.

Специфічно, зв'язування антитіла з клітинами, що експресують епірегулін, можна виявити за допомогою вищеописаних способів, таких як РАС5. Іммобілізовані зразки клітин, що експресують епірегулін, відповідним чином застосовуються для оцінки зв'язувальної активності антитіла.

Переважні способи скринінгу антитіл, які застосовують зв'язувальну активність як індикатор, також включають способи пенінгу, які застосовують фагові вектори. Способи скринінгу, які застосовують фагові вектори, є переважними, коли гени антитіла виділяються з бібліотек підкласів важкого ланцюга та легкого ланцюга з популяції клітин, які експресують поліклональне антитіло. Гени, що кодують варіабельні ділянки важкого ланцюга та легкого ланцюга, можна зшити за допомогою послідовності відповідного лінкера, щоб утворити одноланцюговий Ем (5сЕм). Фаги, які презентують 5сЕм на своїй поверхні, можна отримати шляхом вставлення гена, який кодує 5СЕм, у фаговий вектор. Фаги контактують з антигеном, що представляє інтерес.

Після цього ДНК, яка кодує 5сЕм, що має зв'язувальну активність, яка представляє інтерес, можна виділити шляхом узяття фагів, зв'язаних з антигеном. За необхідністю цей процес можна повторювати, щоб збагатити 5сЕм, який має зв'язувальну активність, що представляє інтерес.

Після виділення кКДНК, яка кодує М-ділянку антитіла проти епірегуліну, яке представляє інтерес, кКДНК перетравлюється рестрикційними ферментами, які розпізнають ділянки рестрикції, введенні в обидва кінці КДНК. Переважні рестрикційні ферменти розпізнають та розщеплюють нуклеотидну послідовність, яка виникає у нуклеотидній послідовності гена антитіла з низькою частотою. Крім того, ділянку рестрикції для ферменту, який виробляє липке закінчення, переважно вводять у вектор, щоб вставити одну копію перетравленого фрагмента у правильній орієнтації. КДНК, що кодує М-ділянку антитіла проти епірегуліну, перетравлюється, як описано вище, а потім цей продукт вставляється у відповідний вектор експресії, щоб бо побудувати вектор експресії антитіла. У цьому випадку, якщо ген, який кодує константну ділянку

(С-ділянку) антитіла, та ген, який кодує вищезгадану М-ділянку, зливаються у рамці, тоді отримують химерне антитіло. У цьому описі винаходу вираз "химерне антитіло" означає, що походження константної ділянки є відмінним від походження варіабельної ділянки. Отже, окрім гетерохимерних антитіл миші/людини алохимерні антитіла людини/людини включено в химерні антитіла цього винаходу. Вектор експресії химерного антитіла можна побудувати шляхом вставлення гена вищезгаданої М-ділянки в вектор експресії, який вже має константну ділянку.

Специфічно, наприклад, послідовність розпізнавання для рестрикційного ферменту, який вирізає ген вищезгаданої М-ділянки, можна відповідним чином розташувати на боці 5" вектора експресії, який несе ДНК, яка кодує константну ділянку (С-ділянку) бажаного антитіла. Вектор експресії химерного антитіла будується шляхом злиття у рамці двох генів, перетравлених такою самою комбінацією рестрикційних ферментів.

Для того, щоб отримати моноклональне антитіло, яке зв'язується з епірегуліном, гени антитіла вставляються у вектор експресії так, що гени експресуються під контролем ділянки регуляції експресії. Ділянка регуляції експресії для експресії антитіла включає, наприклад, енхансери та промотори. Крім того, відповідну сигнальну послідовність можна приєднати до аміно-закінчення, так щоб експресоване антитіло виділялося назовні клітин. У прикладах, описаних далі, пептид, що має амінокислотну послідовність МЕОУУЗСПІ РІ МАТАТаМУНн5 (5ЕО І

МО: 168), застосовується як сигнальна послідовність. Між тим, можна приєднати інші відповідні сигнальні послідовності. Експресований поліпептид розщеплюється на карбоксильному кінці (С- кінці) вищезгаданої послідовності, та отриманий поліпептид виділяється назовні клітин як зрілий поліпептид. Після цього відповідні клітини-хазяїни трансформуються вектором експресії, внаслідок чого отримують рекомбінантні клітини, які експресують ДНК, що кодує антитіло проти епірегуліну.

ДНК, які кодують важкий ланцюг (Н-ланцюг) антитіла та легкий ланцюг (І -ланцюг) антитіла, окремо вставляються у різні вектори експресії, щоб експресувати ген антитіла. Молекулу антитіла, яка має Н- та І-ланцюги, можна експресувати шляхом спільної трансфекції тієї самої клітини-хазяїна векторами, у які гени Н-ланцюга та гени І -ланцюга відповідним чином вставлені.

Альтернативно, клітини-хазяїни можна трансформувати сигнальним вектором експресії, у який вставлено ДНК, які кодують Н- та І -ланцюги (дивись УУО 1994/011523).

Зо Існують різні відомі комбінації клітин-хазяїнів / вектора експресії для отримання антитіла шляхом введення генів виділеного антитіла у відповідні хазяїни. Усі ці системи експресії можна застосовувати для того, щоб виділити антиген-зв'язувальні домени цього винаходу. Відповідні еукаріотичні клітини, які застосовуються як клітини-хазяїни, включають клітини тварин, клітини рослин та клітини грибів. Специфічно, клітини тварин включають, наприклад, наступні клітини: (1) клітини ссавців: СНО, СО5, мієлома, нирки хом'ячка (ВНК), НеГа, Мего, ембріональної нирки людини (НЕК) 293 або їм подібне; (2) клітини земноводних: овоцити Хепоризх або їм подібне; та (3) клітини комах: 519, 5121, Тп5 або їм подібне.

Крім того, як рослинна клітина, відома система експресії гена антитіла, яка застосовує клітини, що походять з роду Місоїапа, така як Місомйапа їарасит. Клітини з калюсних культур можна відповідним чином застосовувати для трансформації рослинних клітин.

Крім того, як клітини грибів можна застосовувати наступні клітини: дріжджі: рід Засспаготусе5, наприклад Засспаготусез сегемізіає, та рід Ріспіа, наприклад

Ріспіа разіогів; та міцеліальні гриби: рід Азрегодіййш5, наприклад АзрегоіПи5 підег.

Крім того, також відомі системи експресії гена антитіла, які застосовують прокаріотичні клітини. Наприклад, коли застосовуються бактеріальні клітини, тоді у цьому винаході можна придатним чином застосовувати клітини Е. Соїї, клітини Васійив5 5иЇибійй та їм подібні. Вектори експресії, які несуть гени антитіла, які представляють інтерес, вводяться в ці клітини шляхом трансфекції. Трансфектовані клітини культивуються іп міїго, та бажане антитіло можна отримати з культури трансформованих клітин.

Окрім вищеописаних клітин-хазяїнів можна також застосовувати трансгенні тварини для отримання рекомбінантного антитіла. Тобто, антитіло можна отримати з тварини, у яку вводиться ген, що кодує антитіло, що представляє інтерес. Наприклад, ген антитіла можна побудувати як злитий ген шляхом вставлення у рамку у ген, який кодує білок, який специфічно виробляється у молоці. Козлячий р-казеїн або йому подібне можна застосовувати, наприклад, як білок, що виділяється у молоці. Фрагменти ДНК, які містять злитий ген, у який вставлено ген антитіла, впорскуються в ембріон козла, а потім цей ембріон вводиться у козу-самку. Бажані антитіла можна отримати як білок, злитий з молочним білком з молока, яке виробляється бо трансгенною козою, народженою від кози - реципієнта ембріона (або її потомства). Крім того,

для того, щоб збільшити об'єм молока, яке містить бажане антитіло, вироблене трансгенною козою, якщо необхідно, трансгенній козі можна вводити гормони (Ебегі, К. М. еї аї.,

Віо/Тесппоіоду (1994) 12 (7), 699-702).

Коли описане в цьому описі винаходу антитіло проти епірегуліну вводиться людині, тоді антиген-зв'язувальний домен, що походить з генетично рекомбінантного антитіла, яке штучно модифікували для зменшення гетерологічної антигенності проти людини, та йому подібного, можна відповідним чином застосовувати як антиген-зв'язувальний домен цього антитіла. Такі генетично рекомбінантні антитіла включають, наприклад, гуманізовані антитіла. Ці модифіковані антитіла відповідним чином отримують за допомогою відомих способів.

Варіабельна ділянка антитіла, яка застосовується для отримання антиген-зв'язувального домену антитіла проти епірегуліну, описаного в цьому описі винаходу, зазвичай утворюється трьома гіперваріабельними ділянками (СОМ), які відокремлюються чотирма каркасними ділянками (ЕК). СОК - це ділянка, яка по суті визначає зв'язувальну специфічність антитіла.

Амінокислотні послідовності СОМ є надзвичайно різноманітними. З іншого боку, амінокислотні послідовності, які утворюють ЕК, часто мають високу ідентичність навіть серед антитіл з різною специфічністю зв'язування. Отже, зазвичай, специфічність зв'язування певного антитіла можна ввести в інше антитіло шляхом трансплантації СОК.

Гуманізоване антитіло також називається антитілом людини зі зміненою формою.

Специфічно, відомі гуманізовані антитіла, отримані внаслідок трансплантації СОК антитіла тварини, яка не є людиною, такого як антитіло миші, до антитіла людини, та їм подібні. Також відомі загальні способи генної інженерії для отримання гуманізованих антитіл. Специфічно, наприклад, ПЛР розширення перекривання є відомим способом для трансплантації СО антитіла миші до ЕК людини. При ПЛР розширення перекривання нуклеотидна послідовність, яка кодує СОК антитіла миші, яку слід трансплантувати, додається до праймерів для синтезування ЕК антитіла людини. Праймери отримують для кожної з чотирьох ЕК. Зазвичай вважають, що коли СОК миші трансплантують до ЕК людини, тоді вибір ЕК людини, яка має високу ідентичність з ЕК миші, є переважним для підтримання функції СОК. Тобто, зазвичай переважно застосовувати ЕК людини, яка включає амінокислотну послідовність, яка має високу ідентичність з амінокислотною послідовністю ЕК, прилеглої до мишачої СОК, яку слід

Зо трансплантувати.

Нуклеотидні послідовності, які підлягають зшиванню, будують так, щоб вони були з'єднаними одна з іншою у рамці. ЕК людини окремо синтезують, застосовуючи відповідні праймери. Внаслідок цього отримують продукти, у яких ДНК, яка кодує мишачу СОК, приєднується до окремих ДНК, які кодують ЕК. Нуклеотидні послідовності, які кодують мишачу

СОМ кожного продукту, будують так, щоб вони перекривалися одна з іншою. Після цього реакцію синтезу комплементарного ланцюга здійснюють для того, щоб гібридизувати ділянки

СОК, що перекриваються, продуктів, синтезованих із застосуванням гена антитіла людини як матриці. ЕК людини зшиваються послідовностями СОК миші за допомогою цієї реакції.

Ген М-ділянки повної довжини, у якому зрештою зшиті три СОК та чотири ЕК, ампліфікується із застосуванням праймерів, які гібридизують до його 5'- або 3'-кінця та які додаються з придатними послідовностями розпізнавання рестрикційних ферментів. Вектор експресії для гуманізованого антитіла можна отримати внаслідок вставлення ДНК, отриманої, як описано вище, та ДНК, яка кодує С-ділянку антитіла людини, у вектор експресії, так що вони зшиються у рамці. Після того, як рекомбінантний вектор трансфектується у хазяїна, щоб отримати рекомбінантні клітини, ці рекомбінантні клітини культивують, та ДНК, яка кодує гуманізоване антитіло, експресується для того, щоб отримати гуманізоване антитіло у клітинній культурі (дивись Європейську патентну публікацію Мо. ЕР 239400 та Міжнародну патентну публікацію Мо. УМО 1996/002576).

За допомогою якісного або кількісного вимірювання та оцінювання антиген-зв'язувальної активності гуманізованого антитіла, отриманого за описаним вище способом, можна придатним чином вибрати ЕК антитіла людини, які дозволять СОК утворити сприятливу антиген- зв'язувальну ділянку при зшиванні через СОК. Якщо необхідно, амінокислотні залишки у ЕР можна замістити так, щоб СОК антитіла людини зі зміненою формою утворили відповідну антиген-зв'язувальну ділянку. Наприклад, мутації амінокислотної послідовності можна ввести у

ЕК, застосовуючи спосіб ПЛР, який застосовується для трансплантації мишачої СОК у ЕК людини. Більш специфічно, мутації послідовності часткового нуклеотиду можна ввести до праймерів, які гібридизують до ЕК. Мутації нуклеотидної послідовності вводяться у ЕК, синтезовані із застосуванням таких праймерів. Мутантні послідовності ЕК, які мають бажані характеристики, можна вибрати шляхом вимірювання та оцінювання активності мутантного 60 антитіла з заміщеною амінокислотою, щоб зв'язати з антигеном за допомогою вищезгаданого способу (Сапсег Кев5. (1993) 53: 851-856).

Альтернативно, бажані антитіла людини можна отримати шляхом імунізації трансгенних тварин, які мають увесь репертуар генів антитіла людини (дивись УМО 1993/012227; МО 1992/003918; УУХО 1994/002602; УМО 1994/025585; УМО 1996/034096; УМО 1996/033735), способом

ДНК-імунізації.

Крім того, також відомі способи отримання антитіл людини шляхом пенінгу із застосуванням бібліотек антитіл людини. Наприклад, М-ділянка антитіла людини експресується як одноланцюгове антитіло (5СЕм) на поверхні фагу за допомогою способу фагового відображення.

Можна вибрати фаги, які експресують 5сЕм, яке зв'язується з антигеном. Послідовність ДНК, яка кодує М-ділянку антитіла людини, яка зв'язується 3 антигеном, можна визначити, проаналізувавши гени вибраних фагів. Визначається послідовність ДНК 5сЕм, що зв'язується з антигеном. Вектор експресії отримують шляхом зливання послідовності М-ділянки у рамці з послідовністю С-ділянки бажаного антитіла людини та вставлення цього продукту у відповідний вектор експресії. Вектор експресії вводять у клітини, відповідні для експресії, такі, як описано вище. Антитіло людини можна отримати шляхом експресії гена, що кодує антитіло людини, у клітинах. Ці способи є вже відомими (дивись УМО 1992/001047; УМО 1992/020791; УМО 1993/006213; УМО 1993/011236; УМО 1993/019172; МО 1995/001438; УМО 1995/015388).

Окрім способів, описаних вище, для виділення генів антитіла можна відповідним чином застосовувати способи клонування В-клітин (ідентифікація кожної послідовності, що кодує антитіло, клонування та її виділення; застосування у побудові вектора експресії для отримання кожного антитіла (9401, Ідс2, ІдсЗ або Ідсб4 особливо); та їм подібне) так, як описано у

Вегпазсопі єї а. (Зсієпсе (2002) 298: 2199-2202) або у УМО2008/081008.

Нумерація ЕІ та нумерація за Кабаї

Згідно зі способами, що застосовуються у цьому винаході, амінокислотні позиції, приписані

СОК та ЕК антитіла, позначаються згідно з нумерацією за Кабаї (Зедиепсев5 ої Ргоївїн5 ої

Іптпітипо!одісаї! Іпіегев5і (Маїіопаї Іпбзійше ої Неанй, Веїпезаа, Ма., 1987 та 1991)). У цьому описі винаходу амінокислоти варіабельної ділянки антитіла проти епірегуліну позначаються згідно з нумерацією за Кабаї, проте амінокислоти константної ділянки позначаються згідно з нумерацією

ЕО на основі амінокислотних позицій за Кабаї.

Зо Зміни амінокислот

Відомі способи, такі як сайт-спрямований мутагенез (Кипкеї еї аї., (Ргос. Маїй!. Асад. 5сі. ОБА (1985) 82, 488-492)) та ПЛР розширення перекривання, можна відповідним чином застосовувати для модифікації амінокислот в амінокислотних послідовностях антитіл. Крім того, різні способи можна також застосовувати як спосіб зміни для заміщення амінокислот тими амінокислотами, що є відмінними від природних амінокислот (Аппи. Кем. Віорпу5. Віотої.Бігисії. (2006) 35, 225- 249; Ргос. Май. Асай. сі. 0.5.А. (2003) 100 (11), 6353-6357). Наприклад, можна відповідним чином застосовувати систему безклітинної трансляції (Сіомег Оігесі (Ргоївіп Ехрге55)), яка містить тРНК, зшиту з неприродною амінокислотою на тРНК амберного супресора, які є комплементарними до кодону ПАС (амбер-кодону), який є стоп-кодоном.

Як застосовується в цьому описі винаходу, коли описується позиція амінокислотної зміни, значення терміна "та/"або" включає кожну комбінацію, де "та" й "або" відповідним чином комбінуються. Специфічно, наприклад, вираз "амінокислота(-и) на позиції (позиціях) 33, 55 та/"або 96 є заміщеними" включає наступне варіювання амінокислотних змін: амінокислоти (амінокислот) на (а) позиції 33, (Б) позиції 55, (с) позиції 96, (а) позиціях 33 та 55, (е) позиціях 33 та 96, (І) позиціях 55 та 96 та (9) позиціях 33, 55 та 96.

Зниження імуногенності

Переважно, передбачена імуногенність антитіла цього винаходу у людині-хазяїні є зниженою.

Вираз "низька імуногенність" означає, що протягом достатнього для досягнення терапевтичної ефективності часу антитіло не індукує гуморальну імунну реакцію у принаймні більшості окремих пацієнтів, які отримують кількість антитіл достатню, щоб знизилася б ефективність тривалого введення антитіла.

Рівень імуногенності у людей можна передбачити, застосовуючи програму Ргоргей для передбачення зв'язування головного комплексу гістосумісності (МНС) класу (пиру/лямли.іттесп.гев.іп/гадпама/ргоргед), застосовуючи аналіз 1 90 порогового значення усіх алелей. Інші програми, які можна застосовувати, включають: -КапКрер (пер://ріо аїсі.пагмага. еди/ТГооі5/гапКрер.піті) та -Ерібазе (АІдопотісз ргоргівїагу зоїмаге: аїідопотісв.сот).

У порівнянні з початковою донорською молекулою молекули зі зниженою імуногенністю або 60 не містять пептидів, або містять їх зменшену кількість, про які передбачається, що вони зв'язуються з алелями МНС класу ІІ, які надзвичайно високо експресуються у популяції-мішені (Ріоухег єї а!., Огид Оізсом. Тодау (2004) 9(2), 82-90).

Функціональний аналіз зв'язування МНС класу ІЇ можна виконувати шляхом генерування перекриваючих пептидів, які відповідають білку, який представляє інтерес, та тестування їхньої спроможності спричиняти активацію Т-клітин (аналіз проліферації Т-клітин) або заміщення відомого пептиду, що зв'язується з МНС класу ІІ - пептгидом-репортером (Наттег ./ еї а!., У. Ехр.

Меа. (1994) 180, 2353-2358).

Декілька способів можна застосовувати, щоб знизити імуногенність антитіл проти епірегуліну цього винаходу. Переший спосіб - це гуманізувати вищезгадані антитіла. Більш специфічно, в антитіло людини імплантуються ділянки СОК антитіла проти епірегуліну, виділеного з тварини, яка не є людиною, такої як миша. Для того, щоб підтримувати або підсилювати зв'язування з епірегуліном, амінокислотний залишок (залишки) каркасної ділянки (каркасних ділянок) можна додатково замістити так, щоб СОК гуманізованого антитіла проти епірегуліну утворювали відповідні антиген-зв'язувальні ділянки.

Необмежувальний варіант здійснення СОК антитіла проти епірегуліну цього винаходу, виділеного з мишей, включає СОКІ1 важкого ланцюга (НСОКІ) за 5ЕО ІЮ МО: 9, СОК2 важкого ланцюга (НСОК2) за 5ЕО ІЮО МО: 10 та СОКЗ важкого ланцюга (НСОКЗ) за 5ЕО ІО МО: 11. Крім того, необмежувальний варіант здійснення СОК антитіла проти епірегуліну цього винаходу, виділеного з мишей, включає СОКІ1 легкого ланцюга (СОМ) за ЗЕО ІЮ МО: 12, СОК2 легкого ланцюга (-СОК2) за 5ЕО ІЮО МО: 13 та СОКЗ легкого ланцюга (СОКЗ) за БЕО ІЮ МО: 14.

Необмежувальний варіант здійснення ЕК антитіла людини цього винаходу включає ЕК1 важкого ланцюга (НЕКТ) за 5ЕО ІО МО: 1, ЕК2 важкого ланцюга (НЕК2) за 5ЕО ІЮО МО: 2, ЕКЗ важкого ланцюга (НЕКЗ) за 5ЕО І МО: З та ЕК4 важкого ланцюга (НЕК4) за 5ЕО ІО МО: 4. Крім того, необмежувальний варіант здійснення ЕК антитіла людини цього винаходу включає ЕК1 легкого ланцюга (ЕК) за 5ЕО ІО МО: 5, ЕК2 легкого ланцюга (ГЕК2) за 5ЕО ІО МО: 6, ЕКЗ легкого ланцюга (І ЕКЗ) за 5ЕО ІЮО МО: 7 та ЕКА4 легкого ланцюга (І ЕК4) за БЕО ІЮО МО: 8.

Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за 5ЕО ІЮО МО: 15.

Крім того, необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла

Зо проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 16.

Крім того, необмежувальний варіант здійснення ЕК антитіла людини цього винаходу включає ЕК1 важкого ланцюга (НЕКТ) за ЗЕО ІЮ МО: 17 та ЕКЗ важкого ланцюга (НЕКЗ) за ЗЕО

ІО МО: 18. Крім того, необмежувальний варіант здійснення ЕК антитіла людини цього винаходу включає ЕК2 легкого ланцюга (І ЕК2) за 5ЕО ІО МО: 20, ЕКЗ легкого ланцюга (ЕКЗ) за 5ЕО ІЮ

МО: 21 та ЕКЗ легкого ланцюга (ЕКЗ) за 5ЕО ІЮ МО: 23.

Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за 5ЕО ІЮО МО: 19.

Крім того, необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 22 або 24.

Крім того, необмежувальний варіант здійснення ЕЕ гуманізованого антитіла цього винаходу включає ЕКЗ важкого ланцюга (НЕКЗ) за 5ЕО ІЮО МО: 35 та ЕКЗ важкого ланцюга (НЕКЗ) за ЗЕО

ІО МО: 36. Необмежувальний варіант здійснення варіабельної ділянки гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає варіабельну ділянку важкого ланцюга за ЗЕО ІЮО МО: 37 або 38.

Другий спосіб - це спосіб будування зміненої послідовності зі зниженою імуногенністю за допомогою аналізу зміненої послідовності з амінокислотними змінами в амінокислотній послідовності антитіла проти епірегуліну із застосуванням вищезгаданої програми передбачення зв'язування МНС класу ІІ. Придатні необмежувальні приклади ділянки (ділянок) амінокислотної зміни (амінокислотних змін) для зниження імуногенності антитіла проти епірегуліну цього винаходу включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 87 та/або 101, згідно з нумерацією за Кабраї, в послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за ЗЕО ІО МО: 38. Крім того, переважні необмежувальні приклади ділянки амінокислотної зміни для зниження імуногенності антитіл проти епірегуліну включають амінокислоту на позиції 24, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за 5БЕО ІЮ МО: 29.

Переважний приклад необмежувального варіанту здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) включає заміщення зЗег (5) для бо амінокислоти на позиції 87 та/або заміщення Туг(У) або Рпе(Р) для амінокислоти на позиції 101,

згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за

ЗБО І МО: 38. Крім того, переважний приклад необмежувального варіанта здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення включає заміщення Аго(К) для амінокислоти на позиції 24, згідно з нумерацією за Кабраї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за БЕО ІЮ МО: 29.

Третій спосіб - це спосіб відповідного вибору константної ділянки алотипу Ідс1, вибраного серед типу С1т3З (послідовність, отримана внаслідок додавання ОК до С-кінця послідовності

ЗБО ІО МО: 31), типу б1т17,1 (5ЕБО ІО МО: 26) та типу б1т17 (послідовність, отримана внаслідок додавання СК до С-кінця послідовності ФЕО ІЮО МО: 30), коли відбувається будування антитіла проти епірегуліну, яке включає константну ділянку антитіла Ідс1. Відомо, що сумісність між алотипом тваринного виду, якому вводиться фармацевтичний засіб з антитіла, та алотипом цього фармацевтичного засобу з антитіла, впливає на імунні реакції у цього виду тварини (Сепез апа Іттипйу (2011) 12, 213-221).

Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою імуногенністю включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150.

Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ

МО: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 та 141.

Необмежувальний варіант здійснення гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою імуногенністю включає гуманізовані антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з

ЗЕО І МО: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 та 141.

Пригнічення дезамідування, ізомеризації та гідролізу

Переважно, щоб дезамідування, ізомеризація та гідроліз пригнічувалися в антитілах проти епірегуліну цього винаходу.

Дуже важливо контролювати кількість агрегату у білоовому фармацевтичному засобі, коли враховується контроль якості та вплив на ефективність та імуногенність ліків (Сигг. Оріп.

Зо Віотесппої. (2009) 20 (6), 708-714). Зазвичай, на утворення агрегату впливає як колоїдна стабільність, яка зумовлюється оточенням білкового розчину, так і конформаційна стабільність, яка зумовлюється структурою білка (9. Рпагт 5сі. (2010) 100 (4), 1306-1315). Умови, ефективні для колоїдної стабільності, можна отримати за допомогою скринінгу концентрації антитіла або рН, типу буферного розчину, іонної сили, добавок та їм подібного, звернувшись до регламентації щодо фармацевтичного складу антитіла. З іншого боку, конформаційна стабільність частково залежить від амінокислотної послідовності, та у випадку з антитілами, вважають важливим підтримувати характерні структури, такі як канонічна структура СОК, консенсусні послідовності ЕК та взаємодія УНЛ/!. та їм подібне (дип еї аї., у. Мої. Віої. (2001) 309 (3), 701-716; Хіапо еї аї., 9У. Мої. Віої. (1995) 253 (3), 385-390; Ємен 6ї а!., Меїпод5. (2004) 34 (2), 184-199; Магда5-Майга?о еї аї., У. Мої. Несоодпії. (2003) 16 (3) 113-120 та Могеа еї аї., 9). Мої.

Віо!. (1998) 275, 269-294).

Реакція дезамідування означає реакції, які відбуваються неферментативно на бічних аспарагінових та глютамінових ланцюгах, та вона змінює аміди на бічних аспарагінових та глютамінових ланцюгах на карбонові кислоти. Ізомеризація є наслідком утворення проміжної сполуки нестабільного циклічного іміду внаслідок дезамідування аспарагіну або дегідрування аспарагінової кислоти, як результат атаки карбонільної групи, присутній на бічному ланцюзі аспарагіну або аспарагінової кислоти, електронною парою азоту на залишку, розташованому на

С-кінці. Ця проміжна сполука змінюється здебільшого на ізоаспарагінову кислоту внаслідок розщеплення, та решта стає аспарагіновою кислотою. У випадку з глютаміном швидкість дезамідування зазвичай становить 1/10 від аспарагіну, проте механізм є по суті таким самим, та для того, щоб реакція продовжувалася потрібні тільки молекули води. Оскільки ці реакції дезамідування та ізомеризації, які відбуваються під час зберігання білків, таких як антитіла, стають причинами вищеописаної гетерогенності, то їх бажано пригнітити до можливого ступеню.

Крім того, повідомлялося, що реакції дезамідування легко відбуваються особливо на ділянках, де аспарагін та гліцин є прилеглими один до одного (Азп-Сіу) (Сівідег еї аї., у. Віої. Спет. (1987) 262, 785-794). Крім того, повідомлялося, що розщеплення пептидного ланцюга внаслідок реакції гідролізу відбувається в аспарагіновій кислоті, та вважають, що гідроліз відбувається легко у кислотних умовах, особливо у послідовності, де пролін є присутнім на боці С-кінця (А5р-Рго) (Зедаїаз єї аІ., РЕВ5 І енегз (1995) 371, 171-175). 60 Для того, щоб пригнітити дезамідування, ізомеризацію та гідроліз, там, де це доречно,

можна здійснити амінокислотні зміни та їм подібне, щоб видалити залишки глютамініл та аспарагініл, які є ділянками, які зазнають дезамідування. Переважний необмежувальний варіант здійснення ділянки дезамідування, видалення якої є особливо ефективним, включає ділянки, де відбувається сприяння реакції дезамідування, або більш специфічно залишок гліцину, залишок аспарагіну або залишок глютаміну у мотивах, позначених як послідовності МО та Об.

Заміщення будь-якого з цих амінокислотних залишків (М, 0 або б) може помітно пригнітити реакції дезамідування (М/О2003/057881, ММО2005/067620 або їм подібне). Крім того, коли це є доречним, можна також застосовувати способи отримання антитіл з пригніченою реакцією дезамідування шляхом контролю способу культивування клітин, що виробляють антитіло.

Антитіла проти епірегуліну, запропоновані цим винаходом, також включають антитіла проти епірегуліну, до яких застосовано вищезгаданий спосіб пригнічення реакції дезамідування.

Необмежувальні приклади ділянок, які зазнають дезамідування, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 31, 52, 54, 56 та/або 101, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за 5ЕО ІЮО МО: 38. Крім того, необмежувальні приклади ділянок, які зазнають дезамідування, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 28, 92 та/або 94, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за ЗЕО ІО МО: 29.

Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Аа (А) для амінокислоти на позиції 31 та/(або заміщення ТНг (Т), Гуз (К), Ре (Р), Ма! (М), Агу (К) або ГГ еи (І) для амінокислоти на позиції 55, згідно з нумерацією за Кабраї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за ЗЕО ІЮ МО: 38. Крім того, необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Сім (Е) для амінокислоти на позиції 92 та/(або заміщення Агуд (К) або Сіп (0) для амінокислоти на позиції 93, згідно з нумерацією за Кабраї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за БЕО ІЮ МО: 29.

Необмежувальні варіанти здійснення важкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 49-56, 98, 115-127,

Зо 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальні варіанти здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ

МО: 57, 58, 128 та 141.

Необмежувальні варіанти здійснення гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з пригніченим дезамідуванням, ізомеризацією та гідролізом включають гуманізовані антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з ЗЕО

ІО МО: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 57, 58, 128 та 141.

Модуляція ізоелектричної точки

Переважно, ізоелектричні точки антитіл проти епірегуліну цього винаходу модулюються.

Способи контролю поверхневого заряду молекули антитіла шляхом змінення амінокислотних залишків, розташованих на поверхні молекули антитіла, відомі як один із способів регулювання періоду напіврозпаду антитіл у плазмі (М/02007/114319 та М/02009/041543). Специфічно, відомо, що зниження значення ізоелектричної точки (рі) антитіла дає змогу подовжити період напіврозпаду антитіла у плазмі. Навпаки, відомо, що підвищення значення ізоелектричної точки антитіла скорочує його період напіврозпаду у плазмі та покращує властивості антитіла мігрувати у тканині (Маїзійі еї аї., 9. ВіоїЇ. Кеди). Нотеовзі.Адепівз. (2005) 19 (3-4), 105-112;

Рагагідодє еї аї., 9). Ріпаптасої. Ехр. Тег. (1998) 286 (1), 548-554). З іншого боку, відомо, що протипухлинний ефект антитіла, ізоелектрична точка якого є зниженою, збільшується порівняно з протипухлинним ефектом антитіла до змін (ММО2009/041062). рі білка, такого як антитіло, визначається як рН, при якому поліпептид має ефективний заряд. У цій галузі зазвичай відомо, що розчинність білка буде найнижчою, коли рН розчину є еквівалентним ізоелектричній точці (рі) білка. Отже, на основі рі можна визначити розчинність білка при заданому рН, наприклад при рнб. рі білка є також гарним індикатором для в'язкості білка у рідкому препараті. Висока рі вказує на високу розчинність та низьку в'язкість (що є особливо важливим для препарату з високою концентрацією). У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вибирають домени-кандидати, які мають більш високу рі, ніж попередньо визначене порогове значення. рі антитіла також відіграє специфічну роль в ефективності ліків та біологічному розповсюдженні антитіла. Наприклад, відомо, що коли рі бо антитіла стає високою, тоді локалізація у клітинах та/або назовні судини зростає. Для досягнення бажаної цілі необхідно визначити найбільш бажані властивості рі для певного антитіла. У декількох варіантах здійснення можна отримати антитіла зі значенням рі, яке становить приблизно 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 або вище. В іншому необмежувальному варіанті здійснення можна вибрати антитіла зі значенням рі, яке становить приблизно 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 або менше. Фахівець у галузі зрозуміє, що один єдиний білок може мати багато заряджених форм. Не прив'язуючись до особливої теорії, заряд білка можна модулювати за допомогою ряду механізмів іншої дії; та, без обмежень, приклади таких механізмів включають амінокислотне заміщення (амінокислотні заміщення), утворення катіонів, дезамідування, амінокислотна гетерогенність на С-кінці, фосфорилування, глікозилування та їм подібне. рі, що застосовується в цьому описі винаходу, визначається як рі форми з головним зарядом. рі білка можна визначити різними способами, та, без обмеження, необмежувальний варіант здійснення таких способів включає ізоелектричне фокусування та різні комп'ютерні алгоритми (дивись, наприклад, ВіеїЇдмієї еї аї., ЕІесігорпогеб5і5 (1993) 14, 1023). У необмежувальному варіанті здійснення рі визначається із застосуванням системи електрофорезу Рпагтасіа Віоїесп

Мийірног 2, обладнаної циркуляційним пристроєм з охолоджувальною ванною тийі-їетр І та електропостачанням ЕР5 3501 ХІМ. Промислово виготовлений гель АтрпПоїїпе сеї (Атегзпат

Віозсіепсев, діапазон рі від 2,5 до 10) завантажується разом з 5 мкг білка. Відносну рі антитіла визначають, застосовуючи широкодіапазонний маркерний стандарт рі (АтегзПпат, діапазон рі: З - 10, 8 мкл). Електрофорез виконують в умовах 1500 В та 50 мА протягом 105 хвилин. Після цього гель фіксують, застосовуючи фіксуючий розчин 5ідта (5х), розведений до їх очищеною водою. Гель забарвлюють, застосовуючи Зітріу Віпе Зіаіїп (Іпмйгодеп), протягом ночі при кімнатній температурі. Потім гель знебарвлюють, застосовуючи розчин, що складається з 25 95 етанолу, 8 95 оцтової кислоти та 67 95 очищеної води. Ізоелектричну точку визначають на основі стандартної калібрувальної кривої із застосуванням денситометра Віо-Вад.

Для того, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, коли це є відповідним, можна здійснити амінокислотні зміни та їм подібне, під час яких відбувається видалення заряджених амінокислот в амінокислотній послідовності антитіла проти епірегуліну або додавання або вставлення заряджених амінокислот до амінокислотної

Зо послідовності антитіла проти епірегуліну. Відомо, що серед амінокислот є заряджені амінокислоти. Зазвичай, лізин (К), аргінін (К) та гістидин (Н) відомі як амінокислоти, що мають позитивний заряд (позитивно-заряджені амінокислоти). Аспарагінова кислота (0), глютамінова кислота (Е) та їм подібне відомі як амінокислоти, що мають негативний заряд (негативно- заряджені амінокислоти). Інші амінокислоти відомі як незаряджені амінокислоти.

Вищезгаданий "змінений амінокислотний залишок" - це переважно амінокислотний залишок, вибраний відповідним чином з амінокислот або групи (а), або групи (б), які зазнали додавання, вставлення або видалення, проте вони особливо не обмежуються цими амінокислотами: (а) глютамінова кислота (Е), аспарагінова кислота (0), (р) лізин (К), аргінін (К), гістидин (Н).

Коли оригінальний амінокислотний залишок (до зміни) є вже зарядженим, змінення його на незаряджений амінокислотний залишок є також переважним варіантом здійснення цього винаходу. Більш специфічно, зміни у цьому винаході включають (1) заміщення зарядженої амінокислоти незарядженою амінокислотою, (2) заміщення зарядженої амінокислоти протилежно зарядженою амінокислотою порівняно з оригінальною амінокислотою та (3) заміщення незарядженої амінокислоти зарядженою амінокислотою. Необмежувальні приклади позицій, де амінокислоти змінюються, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 13, 61, 62, 64, 65, 97 та/або 98, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за ЗЕО ІЮ МО: 38. Крім того, необмежувальні приклади позицій, де амінокислоти змінюють, щоб модулювати ізоелектричну точку антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 24, 55, 56 та/або 107, згідно з нумерацією за КаБбаї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за 5БЕО ІЮ МО: 29.

Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення Авзп (М) або Гуз (К) для амінокислоти на позиції 14, заміщення Ар (0) або Сім (Е) для амінокислоти на позиції 61, заміщення Зег (5) або СіІп (0) для амінокислоти на позиції 62, заміщення Азр (0) або Сім (Е) для амінокислоти на позиції 64, заміщення Азр (0) або Сім (Е) для амінокислоти на позиції 65, заміщення Ага (К) для амінокислоти на позиції 97 та/або заміщення Сім (Е) для амінокислоти на позиції 98, згідно з бо нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за БЕО ІЮО МО:

38. Крім того, необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення (амінокислотних заміщень) переважно включає заміщення сп (С) або 5ег (5) для амінокислоти на позиції 24, заміщення Сі (Е) для амінокислоти на позиції 55, заміщення Сі (Е) для амінокислоти на позиції 56 та/або заміщення Сім (Е) для амінокислоти на позиції 10ба, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за БЕО ІЮ МО: 23.

Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модульованою ізоелектричною точкою включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модифікованою ізоелектричною точкою включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 80-85 та 99.

Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу з модульованою ізоелектричною точкою включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 80-85 та 99.

Покращення стабільності

Переважно стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу є покращеною. Один або більше параметрів, які описують стабільність антитіла, включають значення температури точки плавлення (Тт) домена. Значення Тт антитіла - це відмінний індикатор теплової стабільності антитіла, та воно також може бути індикатором щодо періоду зберігання антитіла. Більш низьке значення Тт вказує на утворення агрегату / нижчу стабільність, проте вище значення Тт вказує на відсутність утворення агрегатів / високу стабільність. Отже, переважно отримати антитіла з високими значеннями Тт. У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вибираються антитіла зі значеннями Тт, які перебільшують попередньо визначене порогове значення. У деяких варіантах здійснення вибираються антитіла, які мають значення Тт, яке становить принаймні 50 С, 55", 60,65, 70, 75", 80", 85", 90С, 957С або 100 "С або вище.

Точку плавлення (Тт) антитіла можна виміряти за різноманітними стандартними способами,

Зо відомими у галузі. Наприклад, Мептеег еї аі. досліджували розгортання та денатурацію моноклонального мишачого дос проти щура ізотипу 265 за допомогою диференційної скануючої калориметрії (05С) та спектроскопії циркулярного дихроїзму (СО) (Віорпув5. 9. (2000) 78, 394- 404; СоПоїд5 Зипасев А: Рнузісоспет. Епа. Авресів. (2000) 161, 139-150; У. СоПоїа Іпіенасе 5сі. (2000) 225, 394-397; та 2000, Віорпувз. у. (2000) 79, 2150-2154). Як наслідок, вважають, що згортання та розгортання С можна характеризувати двома головними переходами, які перекривають один одного на різних етапах. Бімодальний розподіл, який спостерігається як в експерименті з Ю5С, так і в експерименті з СО, не залежить від швидкості сканування в експериментах. Виявилося, що два переходи є незалежними, та розгортання було незворотним.

Вторинну структуру, а також термодинамічну стабільність Раб та Ес, які були виділені шляхом перетравлення з дО, порівняли з такими ж самими параметрами первинного імуноглобуліну (Мепттеег еї аї., Віорпувз. у. (2000) 79, 2150-2154). Було продемонстровано, що два піки, які спостерігалися для первинного ДО, можна віднести до фрагмента Бар та фрагмента Ес, відповідно. Мегтеег еї а. також показали, що, окрім впливу тепла, на структурне порушення дО зазвичай може впливати зміна рН (Віорпув. 4). (2000) 78, 394-404) або взаємодія з гідрофобним оточенням, наприклад, адсорбція на тефлонові поверхні, або взаємодія з поверхнево- активними речовинами (Мегтеег еї аї., 1998, Віоспіт.Віорпуз.Асіа.(1988) 1425, 1-12; СопПоїде зЗипасез А: Рнузісоспет. Епа. Авресів.(2000) 161, 139-150; 9У.СоПоїа Іпіепасе 5сі. 225 (2000) 394- 397).

У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу Тт антитіла вимірюють, застосовуючи зразок, який містить виділені антитіла. В одному варіанті здійснення Тт антитіла вимірюється із застосуванням МР-О5ЗС (МісгоСаї!ї, 1 С) в умовах, коли швидкість сканування становить 1,0 "С/хвилину, та температурний діапазон становить від 25 "С до 120 "С. Період фільтрування, який становить 8 секунд, можна застосовувати разом з термостатичною витримкою протягом 5 хвилин до початку сканування. У специфічному прикладі зразки отримують внаслідок діалізу в 25 мМ гістидину-НСІ з використанням чашок для діалізу Ріегсе (3,5 кД). Середня концентрація антитіла становить 50 мкг/мл, що визначено внаслідок абсорбції при 280 нм. Точки плавлення визначаються згідно з процедурами виробника, застосовуючи програмне забезпечення Огідіп, яке постачається разом з системою. Стисло кажучи, численні первинні данні завантажуються з буфером як щодо зразків, так і щодо контролю, щоб вивести 60 теплове рівняння. Після того, як первинні данні віднімаються від термограми зразка, дані нормалізуються згідно з концентрацією та узгоджуються із застосуванням функції зворотного згортання. В іншому варіанті здійснення стабільність антитіла визначається за допомогою способу, описаного далі. Один або більше вихідних параметрів можуть далі включати параметри, які характеризують стабільність антитіла при одній або декількох різних умовах, вибраних з групи, що складається з різних значень рН, різних температур, різних значень напруження зсуву та різних циклів заморожування / відтаювання.

У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вимірювання методом диференційної скануючої калориметрії (05С) можна виконувати, застосовуючи прилад 5егагат

Місто-О55 І (Зе(агат, Саїмціге, Егапсе). Зразки розташовуються у калориметрі в мл комірці для зразка і порівнюються з 1 мл контрольною коміркою, яка містить відповідний холостий розчин.

Комірки стабілізують протягом 4 годин при 25 "С усередині калориметра до того, як комірки почнуть нагріватися до кінцевої температури при вибраній швидкості нагрівання. Температуру переходу та ентальпію можна визначити, застосовуючи програмне забезпечення Зеїагат (Зеїагат, Мегвіоп 1.3).

У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу криву теплової денатурації/ренатурації можна отримати, застосовуючи спектроскопію циркулярного дихроїзму (СО). Зміни у вторинній структурі Ід, як функцію від температури та/або, наприклад, рН, можна дослідити за допомогою спектроскопії СО (Рабтап сеї аї., (Сіксшаг Оіснтоїзт апа Ше

Сопіоппаїййопаї! Апаїузі5 ої Віотоїесціе5. (1996) Ріепит Рге55)). Згідно з де допо еї аІ. переваги цього способу полягають у тому, що на спектроскопічний сигнал не впливає присутність оточуючого розчину, та що добре визначені процедури є доступними для того, щоб визначити вторинну структуру на основі контрольних спектрів різних структурних елементів (Віоспетівігу (1994) 33, 14521-14528). Фракції елементів вторинної структури можна отримати зі спектрів СО.

У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу вимірювання можна здійснювати на спектрополариметрі У"АЗСО моделі 9У-715 (ФШАБСО Іпіегпайопа! Со.). Можна застосовувати кварцову кювету з довжиною шляху світла 0,1 см. Регулювання температури можна здійснювати, застосовуючи термопару "-А5СО РТСОС-348УМІ (ЧАЗСО Іпіегпайопаї!). Термограми записуються із застосуванням термопари Реїег з розрізненням 0,2 "С та часовою константою 16 секунд. Сканограми довжини хвилі у дальній ультрафіолетовій ділянці спектра (розрізнення

Зо 0,2 нм) можна отримати шляхом накопичення ряду результатів сканування з придатною швидкістю сканування.

Криву теплової денатурації / ренатурації можна також виміряти за допомогою спектроскопічного способу. Коли білок у розчині денатурується у відповідь на нагрівання, тоді молекули утворюють агрегати та розчин сильніше розсіює світло. Агрегація спричиняє зміни в оптичній прозорості зразка, та її можна вимірити шляхом спостереження змін абсорбції видимого або ультрафіолетового світла при визначеній довжині хвилі.

У необмежувальному варіанті здійснення цього винаходу флуоресцентну спектроскопію застосовують для отримання кривої теплової денатурації / ренатурації. В одному варіанті здійснення стежать за притаманною білкам флюоресценцією, наприклад, за флюоресценцією, притаманною триптофану. В іншому варіанті здійснення стежать за молекулами флуоресцентного зонда. Способи для виконання експериментів флуоресцентної спектроскопії є добре відомими для фахівців у галузі. Дивись, наприклад, Вазпгога еї а!І(Зресігорпоїотеїйгу апа зЗресігоПноготеїгу: А Ргасіїса! Арргоасі (1987) 91-114, ІВІ. Ргезз Ца.), Веїї, у. Е. (Бресігозсору іп

ВіосНеїпівігу (1981) Мої. І, 155-194, СЕС Ргез5), або Вгапа еї аї!., (Апп. Кеу. Віоспет. (1972) 41, 843).

Щодо біологічної активності композицій антитіла, можна застосовувати різні способи для визначення їх стабільності на основі фізичних та хімічних структур антитіл. Наприклад, для того, щоб дослідити денатурацію антитіл, окрім вищезгаданих способів аналізу доступні способи, такі як поглинання в результаті переносу заряду, флуоресцентна спектроскопія, ЯМР, зменшуючий капілярний гель-електрофорез (ГОСЕ) та/або високоефективна ексклюзійна хроматографія (НРЗЕС) (наприклад, Умапо еї аї. (9. Рагепієга! Зсіепсе «Тесппоїоду 42 (Зиррі.), 54-526)).

Зменшуючий капілярний гель-електрофорез та високоефективна ексклюзійна хроматографія є найбільш звичайними та найпростішими способами визначення утворення білкових агрегатів, продуктів розпаду білка та фрагментів білка. Отже, стабільність композиції, яка включає антитіло проти епірегуліну, запропоноване цим винаходом, можна також оцінити за допомогою цих способів.

Для того, щоб модифікувати стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу можна здійснити відповідні амінокислотні зміни в амінокислотній послідовності антитіл проти епірегуліну. бо Як про необмежувальний варіант здійснення модифікації стабільності антитіла проти епірегуліну цього винаходу, коли антитіло проти епірегуліну - це антитіло ІдС1, про амідування

С-кінцевої аміногрупи внаслідок видалення С-кінцевого амінокислотного залишку лізину та видалення двох С-кінцевих амінокислот гліцину та лізину, повідомляється як про гетерогенність, що походить з С-кінцевої послідовності важкого ланцюга антитіла (95 людини (51, 5ЕО ІЮ МО: 25) (АпаЇ. Віоспет. (2007) 360 (1), 75-83). Переважний спосіб для зменшення такої гетерогенності включає зміну внаслідок видалення двох С-кінцевих амінокислот важкого ланцюга, а саме видалення гліцину на позиції 446 та лізину на позиції 447, згідно з нумерацією

ЕО (МУО2009/041613). Оскільки бажано, щоб не було гетерогенності, яка походить від С-кінцевої послідовності важкого ланцюга в антитілах проти епірегуліну цього винаходу, то послідовність

ІДС1, у якій гліцин на позиції 446 та лізин на позиції 447, згідно з нумерацією ЕО, видаляються (ста, 5ЕО І МО: 26), можна застосовувати як послідовність константної ділянки.

Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з

ЗЕО ІЮО МО: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Крім того, необмежувальний варіант здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з БЕО ІЮО МО: 99, 128-130, 136 та 141.

Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу з покращеною стабільністю включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137- 140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 99, 128-130, 136 та 141.

Зменшення кількості агрегату

Кількість агрегату антитіл проти епірегуліну цього винаходу є переважно зменшеною.

Контроль кількості агрегату у білюоовому фармацевтичному засобі є дуже важливим, коли враховується контроль якості та вплив на ефективність та імуногенність ліків (Сигг. Оріп.

Віотесппої. (2009) 20 (6), 708-714). Зазвичай, на утворення агрегату впливає як колоїдна стабільність, яка зумовлюється оточенням білкового розчину, так і конформаційна стабільність, яка зумовлюється структурою білка (9. Рпапт 5бі. (2010) 100 (4), 1306-1315). Бажаних умов, що

Зо є ефективними для колоїдної стабільності, можна досягти шляхом скринінгу концентрації антитіла, рН, типу буферного розчину, іонної сили, домішок та їм подібного, звернувшись до регламентації щодо фармацевтичного складу з антитілом. З іншого боку, конформаційна стабільність частково залежить від амінокислотної послідовності, та у випадку з антитілами вважають важливим підтримувати характерні структури, такі як канонічна структура СОК, консенсусні послідовності ЕК та взаємодія МНЛ/!. та їм подібне (дипод еї аї.,.). Мої. Віої. (2001) 309 (3), 701-716; Хіапо еї аї., 9У. Мої. Віої. (1995) 253 (3), 385-390; Ємен 6ї а!., Меїпод5. (2004) 34 (2), 184-199; Магдаз5-Майга?о еї аї., 9). Мої. Несодпії. (2003) 16 (3) 113-120, Могєа 6ї аї., У. Мої.

Віо!. (1998) 275, 269-294, та Магдаз-Маайга?о еї аї!., У. Мої. Несодпії. (2003) 16 (3) 113-120).

Різні способи можна застосовувати, щоб оцінити стабільність білююових фармацевтичних складів, які містять фармацевтичні склади антитіла, на основі фізичних та хімічних структур білків, а також на основі їх біологічної активності. Наприклад, для дослідження денатурації білків доступні способи, такі як абсорбція в результаті переносу заряду, тепловий аналіз, флуоресцентна спектроскопія, циркуляційний дихроїзм (СО), ЯМР, а також НРЗЕС, тангенціальна поточна фільтрація (ТЕР), статичне світлорозсіювання (515), інфрачервона спектроскопія на основі перетворення Фур'є (ЕТІК), індукована сечовиною технологія розгортання білка, притаманна триптофану флюоресценція, диференціальна скануюча калориметрія та технологія зв'язування білка 1-аніліно-Я-нафталін сульфонату (АМ5).

Наприклад, відповідним чином можна застосовувати спосіб, вибраний зі способів, описаних у

Мапа еї а. (У. Рагепієга! Зсіепсе «Тесппоїоду (1988) 42 (Биррі), 554-526).

ГООЕ та НРЗЕС є найбільш загальними та найпростішими способами визначення утворення агрегатів білків, розпаду білків та фрагментації білків. Отже, стабільність рідких фармацевтичних складів цього винаходу можна оцінити за допомогою цих способів.

Наприклад, стабільність антитіл проти епірегуліну цього винаходу можна оцінити шляхом

НРБЕС або гОсЕ, де ділянка піку у відсотках представляє антитіло, яке не розпалося, або фрагмент антитіла, який не розпався. У необмежувальному варіанті здійснення приблизно 250 мкг антитіла (приблизно 25 мкл рідкого фармацевтичного складу, що містить 10 мг/мл вищезгаданого антитіла) впорскується до колонки То5оН Віозер Т5КОЗ0005МУХІ. (7,8 мм х 30 см), обладнаної захисною колонкою ТК БУМ хі (6,0 мм х 4,0 см). Антитіло (включаючи фрагменти антитіла) елююють ізократично 0,1 М фосфатом натрію, який містить 01 М бо сульфату натрію та 0,0595 натрію азиду, при витраті потоку від 0,8 до 1,0 мл/хвилину.

Елюйований білок виявляють із застосуванням УФ-абсорбції при 280 нм. Аналітичний стандарт застосовується в аналізі як контрольний, та результати представлено як зона піку мономеру продукту у відсотках порівняно з усіма іншими піками, за виключенням об'ємного піку, що міститься та спостерігається приблизно на 12 - 14 хвилинах. Піки, які елююють раніше ніж пік мономеру, фіксуються як відсоток агрегату.

Для того, щоб зменшити кількість агрегату антитіла проти епірегуліну цього винаходу, зменшують гідрофобну взаємодію між молекулами, що містять важкий ланцюг та легкий ланцюг антитіла проти епірегуліну. Специфічно, відповідним чином здійснюються амінокислотні зміни, які заміщують гідрофобний залишок (гідрофобні залишки) гідрофільним залишком (гідрофільними залишками) в амінокислотній послідовності важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну, та їм подібні. У переважному необмежувальному варіанті здійснення відповідним чином здійснюються амінокислотні зміни, при яких заміщують гідрофобний залишок (гідрофобні залишки) гідрофільним залишком (гідрофільними залишками) у СОК антитіла проти епірегуліну, та їм подібні. Відомо, що амінокислоти включають гідрофільні амінокислоти та гідрофобні амінокислоти. Зазвичай, Авр (0), Сім (Є), Агоу (К), Гуз (К), Ні (Н), СІУу (б), Зег (5), ТПг (Т), Суз (С), Азп (М), СіІп (С), та Туг (У) відомі як гідрофільні амінокислоти. Аїа (А), Ма! (М), Г еи (У), Пе (І), Меї (М), Тгр (М), Ре (БР), та Рго (Р) відомі як гідрофобні амінокислоти.

Переважно, вищезгадана амінокислотна зміна відповідним чином вибирається із заміщення (заміщень) однієї або більше амінокислот, вибраних серед вищезгаданих гідрофобних залишків, амінокислотами, вибраними серед вищезгаданих гідрофільних залишків, проте вони особливо не обмежуються специфічними амінокислотами.

Необмежувальні приклади позицій, які зазнають амінокислотних змін для зменшення кількості агрегату антитіла проти епірегуліну цього винаходу, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 60 та/або 98, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за зЕО ІЮ МО: 38.

Необмежувальний варіант здійснення вищезгаданого амінокислотного заміщення переважно включає заміщення Нів (Н), Гуз (К), Тпг (Т), бег (5) або Аг (К) для амінокислоти на позиції 60 та/або заміщення Зег (5) або Сі (Е) для амінокислоти на позиції 98, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за 5ЕО ІЮО МО: з8.

Необмежувальний варіант здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою кількістю агрегату включає важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150.

Необмежувальний варіант здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу зі зниженою кількістю агрегату включає антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 99, 128-130, 136 та 141.

Підтвердження міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини

Антитіла проти епірегуліну цього винаходу - це переважно антитіла проти епірегуліну, які демонструють міжвидову реактивність між тваринами, які не є людьми, та людьми. Більш специфічно, цей винахід пропонує антитіло проти епірегуліну, яке зв'язується з епітопом, який зв'язується 3з антитілом проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки легкого ланцюга за 5ЕБЕО ІЮО МО: 12, 13 та 14, де антитіло характеризується тим, що його відношення значення КО для епірегуліну мавп за 5ЕО ІЮО МО: 170 (СЕКЕС КО) до значення КО для епірегуліну людини за ЗЕО ІЮ МО: 34 (ПЕКЕС КО) (СЕКЕО

КО/ЛЕКЕС КО) є меншим, ніж відношення СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО антитіла проти епірегуліну, яке включає гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 9, 10 та 11 та гіперваріабельні ділянки (СОК) варіабельної ділянки легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 12, 13 та 14.

Більш специфічно, у цьому винаході амінокислотні послідовності СОР. варіабельної ділянки важкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 9, 10 та 11 та СОК варіабельної ділянки легкого ланцюга за МО: 12, 13 та 14 змінюють, щоб модифікувати активність зв'язування з епірегуліном мавпи антитіла проти епірегуліну, яке включає вищезгадані СОК. Оскільки структурні різниці між епірегуліном мавпи та епірегуліном людини не вивчено, то не було жодної рекомендації стосовно того, які амінокислотні залишки антитіла проти епірегуліну слід змінити, щоб підвищити активність зв'язування з епірегуліном мавпи. У цьому винаході було побудовано численні послідовності антитіл з заміщенням (заміщеннями) амінокислотних залишків на довільній ділянці (довільних бо ділянках) у гіперваріабельних ділянках. Специфічно, отримали антитіла проти епірегуліну із заміщенням залишком Ага (К) для амінокислоти у вищезгаданих послідовностях СОК.

На диво, антитіла проти епірегуліну із заміщенням залишком Аго (К) для амінокислоти у послідовностях СОМ мали підвищену активність зв'язування з епірегуліном мавпи. Тобто, заміщення залишком Агад (К) для амінокислоти у послідовностях СОК антитіла проти епірегуліну було спроможним надавати міжвидової реактивності зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини.

Значення КО для епірегуліну мавпи за 5ЕО ІЮ МО: 170 (СЕКЕС КО) можна розрахувати за способом, описаним у вищезгаданому розділі стосовно "зв'язувальної активності". Епірегулін- зв'язувальну активність антитіла проти епірегуліну можна вимірювати за допомогою способів, відомих фахівцям у галузі, та умови вимірювання відповідним чином зможуть визначити фахівці у галузі. Епірегулін-зв'язувальну активність антитіла проти епірегуліну можна визначити як КО (константа дисоціації), видима КО (константа видимої дисоціації), Ка, яка є швидкістю дисоціації (константа швидкості дисоціації), видима ка (константа видимої дисоціації) та їм подібне. Їх можна вимірити за способами, відомими фахівцям у галузі, та можна застосовувати, наприклад,

Віасоге (СЕ ПпПеакрсаге), графік Зсаїспага, РАС5 та їм подібне. Відношення значення КО для епірегуліну мавпи (СЕКЕС КО) до значення КО для епірегуліну людини (ПЕКЕС КО) (СЕКЕОС

КО/ЛЕКЕС КО) можна визначити, поділивши це значення КО на значення КО для епірегуліну людини за 5ЕО ІЮО МО: 34.

У цьому винаході СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО становить переважно менш ніж 40. Крім того, у необмежувальному варіанті здійснення СЕКНЕС КОЛЕРКЕС КО становить переважно менш ніж 10. В іншому необмежувальному варіанті здійснення СЕКЕсС КО/ЛЕКЕС КО становить переважно менш ніж 6, та в іншому необмежувальному варіанті здійснення СЕКЕС КО/ЛЕКЕС

КО становить переважно менш ніж 4.

Необмежувальні приклади позиції (позицій), де амінокислота (амінокислоти) змінюють, щоб надати міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини, запропонованим цим винаходом, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 33, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 96, 97 та/або 98, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за

ЗБО Ір МО: 38. Крім того, необмежувальні приклади позиції (позицій), де амінокислота

Зо (амінокислоти) змінюють, щоб надати міжвидової реактивності для зв'язування з епірегуліном тварини, яка не є людиною, та епірегуліном людини, запропоновані цим винаходом, переважно включають амінокислоту (амінокислоти) на позиції (позиціях) 24, 93 та/або 94, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності легкого ланцюга антитіла проти епірегуліну за БЕО ІЮ МО: 29. Переважний приклад амінокислотної зміни включає заміщення Ага (К) для однієї або більше вищезгаданих амінокислот.

Приклади необмежувального варіанта здійснення важкого ланцюга антитіла проти епірегуліну цього винаходу з наданою міжвидовою реактивністю включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 115-127, 131-135, 137-140 та 142-150. Приклади необмежувального варіанта здійснення легкого ланцюга гуманізованого антитіла проти епірегуліну цього винаходу з наданою міжвидовою реактивністю включають легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 128-130, 136 та 141.

Приклади необмежувального варіанта здійснення антитіла проти епірегуліну цього винаходу, якому було надано міжвидової реактивності, включають антитіла проти епірегуліну, які включають важкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 98, 115-127, 131- 135, 137-140 та 142-150, та легкі ланцюги, вибрані з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 29, 128-130, 136 та 141.

Нейтралізуюча активність

Антитіло проти епірегуліну цього винаходу - це переважно антитіло, яке має нейтралізуючу активність. Зазвичай, термін "нейтралізуюча активність" означає активність інгібувати біологічну активність ліганду, такого як віруси або токсини, стосовно клітин. Більш специфічно, вираз "речовини, що мають нейтралізуючу активність" означає речовини, які зв'язуються з лігандом або з рецептором, який зв'язується з лігандом, та інгібують зв'язування між лігандом та цим рецептором. Коли зв'язування рецептора з лігандом блокується завдяки нейтралізуючій активності, тоді опосередкована рецептором біологічна активність не виявляється. Антитіла, які мають таку нейтралізуючу активність, зазвичай називаються нейтралізуючими антитілами.

Нейтралізуючу активність можна вимірити шляхом порівняння біологічної активності у присутності та відсутності випробуваної речовини, нейтралізуючу активність якої слід оцінити, у присутності ліганду, який представляє інтерес.

У цьому винаході зв'язування ліганду з рецептором ЕСЕ, який вважають головним бо рецептором епірегуліну, спричиняє димеризацію рецептора та активацію внутрішньоклітинного домену тирозинкінази рецептора. Активована тирозинкіназа утворює фосфориловані пептиди, що містять тирозин, шляхом аутофосфорилування, та ці пептиди асоціюються з різними допоміжними молекулами сигнальної трансдукції. Вони є здебільшого РІ Су (фосфоліпаза Су),

ЗПС, Сгр2 та їм подібним. З цих допоміжних молекул дві попередні далі фосфорилуються тирозинкіназою рецептора ЕСЕ. Головний шлях сигнальної трансдукції від рецептора ЕСЕ - це шлях, у якому відбувається трансдукція фосфорилування у порядку 5пс, Огр2, 5о5, Каб,

КкапмАРК кіназа/МАР кіназа. Крім того, вважають, що існує альтернативний шлях, який утворює ряд від РІ Су до РКС.

Оскільки такі внутрішньоклітинні сигнальні каскади змінюються залежно від типу клітин, то придатні молекули можна націлити у клітину-«мішень, яка представляє інтерес, та цільові молекули не обмежуються вищезгаданими факторами. Можна придатним чином застосовувати комерційно доступні набори для вимірювання іп мімо активації сигналу (наприклад, систему аналізу активності С протеїнкінази (СЕ Неайсаге Віо-5сієепсев)).

Крім того, активацію сигнального шляху іп мімо можна виявити, застосовуючи як показник ефект індукування транскрипції на гені-мішені, присутньому праворуч від сигнального каскаду іп мімо. Зміни у транскрипційній активності можна помітити на основі принципу аналізу по гену- репортеру. Більш специфічно, ген-репортер, такий як білок зеленої флюоресценції (СЕР) або люцифераза, розташовується праворуч від транскрипційного фактору або промоторної ділянки гена-мішені, та вимірюється активність гена-репортера. Зміну у транскрипційній активності можна вимірити на основі активності гена-репортера.

Крім того, оскільки рецептор ЕСЕ зазвичай сприяє проліферації клітин, то активацію сигнального шляху іп мімо можна визначити шляхом вимірювання активності проліферації клітин-мішеней. У цьому винаході нейтралізуюча активність нейтралізуючого антитіла цього винаходу визначається шляхом оцінки активності проліферації клітин. Проте, цей винахід не обмежується цим способом, та нейтралізуючу активність можна визначити, придатним чином застосувавши вищезгадані способи до вибраних клітин-мішеней.

Специфічно, наприклад, шляхом визначення нижчезгаданої активності проліферації клітин, можна оцінити або вимірити нейтралізуючу активність антитіла проти епірегуліну. Наприклад, застосовується спосіб, за допомогою якого вимірюється включення живими клітинами доданого

Зо до середовища ІНІ-міченого тимідину, як показника спроможності реплікації ДНК. Як більш традиційний спосіб застосовується спосіб витиснення барвника, при якому під мікроскопом вимірюється спроможність клітини вивільняти барвник, такий як трипановий блакитний, назовні клітини, або спосіб МТТ. При останньому способі застосовується спроможність живих клітин перетворювати 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифеніл тетразолу бромід (МТТ), який є сіллю тетразолу, у продукт блакитного формазану. Більш специфічно, антитіло тесту додають до культурального розчину клітини тесту та після певного періоду часу розчин МТТ додають до культурального розчину та залишають настоюватися протягом певного періоду часу, щоб МТТ включився в клітину. Внаслідок цього МТТ, який є сполукою жовтого кольору, перетворюється у сполуку блакитного кольору внаслідок дії сукцинат дегідрогенази в мітохондріях клітини. Після розчинення цього блакитного продукту для забарвлення вимірюють абсорбцію та застосовують як індикатор для ряду життєздатних клітин.

Окрім МТ реагенти, такі як МТ5, ХТТ, УМУ5Т-1 та УУ5Т-8, є комерційно доступними (Масаїаї

Тездце та йому подібні) та їх можна придатним чином застосовувати. Крім того, відомі способи, за допомогою яких оцінюють активність проліферації клітин, застосовуючи як індикатор клітинний АТФ або імпеданс клітинної культури. Для вимірювання активності зв'язувальне антитіло, яке має такий самий ізотип, як і антитіло проти епірегуліну, проте не має нейтралізуючої активності, можна застосовувати як контрольне антитіло таким самим чином, як і антитіло проти епірегуліну, та можна визначити, що активність існує, коли антитіло проти епірегуліну має більш сильну нейтралізуючу активність порівняно з контрольним антитілом.

Цитотоксичність

Антитіло, що застосовується у цьому винаході, - це переважно антитіло, яке має цитотоксичність.

У цьому винаході цитотоксичність включає, наприклад, активність антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АЮБСС) та активність комплемент-залежної цитотоксичності (СОС). У цьому винаході активність СОС означає цитотоксичну активність, опосередковану системою комплементу. Між цим, активність АЮСС означає активність руйнування клітини-мішені, коли специфічне антитіло приєднується до антигену на її клітинній поверхні. Клітина, що утримує рецептор Есу Г(імуноцит або йому подібне), зв'язується з частиною Ес антитіла за допомогою рецептора ЕсугГ г, та клітина-мішень руйнується. Антитіло, бо яке застосовується у цьому винаході, може бути антитілом, що має активність СОС або активність АОСС, або може бути антитілом, що має як активність СОС, так і активність АОСС.

Чи має або не має антитіло проти епірегуліну активність АОСС або активність СОС, можна визначити за допомогою відомих способів (наприклад, Ситепі ргоїосої!в іп Іттипоіоду, Спаріег7.

Іпптипоїодіс їшаїез іп питапвх, Еайог, допп Е, Соїїдап еї аї., дхопп Уміеу 5 оп, Іпс., (1993) тощо).

По-перше, специфічно, отримують клітини-ефектори, розчин комплементу та клітини-мішені. (1) Отримання клітин-ефекторів

Селезінку видаляють з миші СВА/М або їй подібного та клітини селезінки виділяють у середовищі КРМІ1640 (Іпмігодеп). Після промивання клітин таким самим середовищем, що містить 1095 фетальної телячої сироватки (ЕВ5, НусСіопе), концентрацію промитих клітин селезінки можна довести до 5 х 105 /мл, щоб отримати клітини-ефектори. (2) Отримання розчину комплементу

Вабу Каррі Сотрієтепі (СЕОАКГАМЕ) десятикратно розводять у культуральному середовищі (Іпмйгодеп), яке містить 10 95 ЕВ5, щоб отримати розчин комплементу. (3) Отримання клітин-мішеней

Клітини-мішені можна мітити радіоїзотопами шляхом культивування клітин, які експресують білок епірегуліну, з 0,2 мКі (тсСі) натрію хромату-"Ст (СЕ Неайнсаге Віо-5сіепсе5) у середови щі

ОМЕМ, що містить 10 95 ЕВ5, протягом однієї години при 37 "С. Як клітини, що експресують білок епірегуліну, можна застосовувати клітини, трансформовані геном, який кодує білок епірегуліну, клітини первинного раку товстої кишки, клітини метастатичного раку товстої кишки, клітини аденокарциноми легеня, клітини раку підшлункової залози, клітини раку шлунку, клітини раку нирки, клітини раку товстої кишки, клітини раку стравоходу та їм подібні. Після радіоактивного мічення клітини промивають тричі середовищем КРМІ1640, яке містить 10 Фо

ЕВ5, та клітини-мішені можна отримати шляхом доведення концентрації клітин до 2 х 105 клітин/мл.

Активність АОСС та активність СОС можна вимірити за способом, описаним далі. У випадку з вимірюванням активності АОСС 50 мкл клітини-мішені та 50 мкл антитіла проти епірегуліну додають до кожної комірки у планшеті з 96 комірками з О-подібним дном (Весіоп ОісКіпзоп) та залишають на льоду протягом 15 хвилин. Після цього 100 мкл клітини-ефектора додається до кожної комірки планшета та планшет інкубується в СО52- інкубаторі протягом 4 годин. Кінцеву

Зо концентрацію антитіла можна довести до 0 або 10 мкг/мл. Після інкубування 100 мкл надосадової рідини збирають та вимірюють радіоактивність за допомогою лічильника гамма- випромінювання (СОВААЇ АШТО-САММА, МОЮОБЇ 05005, РасКага Іпвігитепі Сотрапу).

Отримане значення застосовують для розрахунку цитотоксичної активності (90) згідно з формулою:

Формула 2 (А-С) / (В-С) х 100. "А" представляє радіоактивність (число імпульсів/хвилину) у кожному зразку, "В" представляє радіоактивність (число імпульсів/хвилину) у зразку, до якого додали 1 95 МР-40 (Масаїаі Тездие), та "С" представляє радіоактивність (число імпульсів/хвилину) зразка, що містить тільки клітини-мішені.

Між тим, у випадку з вимірюванням активності СОС 50 мкл клітини-мішені та 50 мкл антитіла проти епірегуліну додають до кожної комірки у планшеті з 96 комірками з пласким дном (Весіоп

Оіскіпбоп) та залишають на льоду протягом 15 хвилин. Після цього 100 мкл розчину комплементу додається до кожної комірки та планшет інкубується в СО5г- інкубаторі протягом 4 годин. Кінцеву концентрацію антитіла доводять до 0 або З мкг/мл. Після інкубування 100 мкл надосадової рідини збирають та вимірюють радіоактивність за допомогою лічильника гамма- випромінювання. Цитотоксичність можна розрахувати таким самим способом, як і для визначення активності АОСС.

Антитіла проти епірегуліну з підвищеною активністю АЮОСС

Антитіла проти епірегуліну з підвищеною активністю АОСС можна також переважно застосовувати як антитіла проти епірегуліну цього винаходу. Як описано вище, активність АОСС означає активність руйнування клітини-мішені, коли специфічне антитіло прилипає до антигену на її клітинній поверхні, та клітина, що експресує рецептор Есу (імунна клітина або їй подібне), зв'язується з частиною Ес антитіла за допомогою рецептора Есу. Отже, активність АОСС, опосередковану антитілом проти епірегуліну, можна підвищити шляхом підвищення активності зв'язування рецептора Есу клітинами, що експресують рецептор Есу, такими як імунні клітини.

Як способи підвищення активності зв'язування рецептора клітинами, що експресують рецептор

Есу, такими як імунні клітини, можна застосовувати принаймні три наступні відомі способи. (1) Антитіла проти епірегуліну з амінокислотною зміною (амінокислотними змінами) у ділянці (510) Ес

Антитіла проти епірегуліну з підвищеною активністю зв'язування з рецептором Есу можна отримати шляхом змінення амінокислоти (амінокислот) на ділянці Ес, що містяться в антитілах проти епірегуліну цього винаходу. Приклади переважних ділянок Ес імуноглобулінів ЇДО для змін включають ділянки Ес до людини (ІдС1, Ідс2, ДОЗ або Ідса та їх варіанти).

Амінокислоти на будь-яких позиціях можна змінювати на інші амінокислоти, доки не підвищиться активність зв'язування антитіла з рецептором Есу. Коли антитіло проти епірегуліну цього винаходу містить ділянку Ес ЇДО1 людини як ділянку Ес, тоді переважно включити зміни, наслідком яких є підвищення зв'язування з рецептором Есу порівняно зі зв'язувальною активністю ділянки Ес, яка походить від Ї91 людини. Про амінокислотні зміни для підвищення активності зв'язування з рецептором Есу повідомлялося, наприклад у УМО 2007/024249, МО 2007/021841, МО 2006/031370, МО 2000/042072, МО 2004/029207, МО 2004/099249, МО 2006/105338, МО 2007/041635, МО 2008/092117, МО 2005/070963, МО 2006/020114, МО 2006/116260 та УМО 2006/023403.

Приклади таких амінокислот, які можна змінити, включають принаймні одну або більше амінокислот, вибраних з групи, що складається з кислот на позиціях 221, 222, 223, 224, 225, 221, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 та 440 згідно з нумерацією ЕЕ). Зміна цих амінокислот може підвищити зв'язування з рецептором Есу П ділянки Ес антитіла проти епірегуліну. Ці амінокислотні зміни можуть підвищити зв'язування з рецептором Есу ділянки Ес антитіла проти епірегуліну цього винаходу. Антитіло проти епірегуліну цього винаходу може включати принаймні одне заміщення амінокислоти, наприклад, на позиції, вибраній з групи, що складається з 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328 та 332, згідно з нумерацією БМ, у константній ділянці важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 26.

Особливо переважні приклади змін для застосування у цьому винаході включають принаймні одну або більше амінокислотних змін, вибраних з групи, що складається з

Зо наступного: амінокислоту на позиції 221 на або | уз, або Туг; амінокислоту на позиції 222 на будь-який один з Ріє, Тгр, Сім та Туг; амінокислоту на позиції 223 на будь-який один з Ре, Тгр, Сім та Гуз; амінокислоту на позиції 224 на будь-який один з Ріє, Тгр, Сім та Туг; амінокислоту на позиції 225 на будь-який один з Сім, Гуз та Тгр; амінокислоту на позиції 227 на будь-який один з Сім, Су, І уз та Туг; амінокислоту на позиції 228 на будь-який один з Сім, Су, І уз та Туг; амінокислоту на позиції 230 на будь-який один з Аа, Сім, Су та Туг; амінокислоту на позиції 231 на будь-який один з Сім, Су, І ув, Рго та Туг; амінокислоту на позиції 232 на будь-який один з Сім, Су, І у та Туг; амінокислоту на позиції 233 на будь-який один з Аа, Ар, Ре, Су, Ні, Пе, Г ув, І еи, Меї,

Азп, Сп, Агоу, Зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 234 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, Ріє, Су, Нів, Пе, Гуз, Меї, Авп,

Рго, Сп, Агоу, Зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 235 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, Ріє, Су, Нів, Пе, Гуз, Меї, Авп,

Рго, СІп, Агоу, зег, ТПг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 236 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Ре, Нів, Пе, І уз, І еи, Меї,

Азп, Рго, Сп, Аго, Зег, ТНАг, маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 237 на будь-який один з Ар, Сім, Ре, Нів, Пе, І уб, Гецй, Меї, Авп,

Рго, СІп, Агоу, зег, ТПг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 238 на будь-який один з Ар, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, Гуз, Гей, Меї,

Азп, Сп, Агоу, Зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 239 на будь-який один з А5р, Си, РПе, Су, Ні, Пе, Гуз, І ей, Меї,

Азп, Рго, Сп, Аго, ТНг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 240 на будь-який один з Айа, Пе, Меї та ТНг; амінокислоту на позиції 241 на будь-який один з Азр, Сім, І ей, Аго, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 243 на будь-який один з І еи, Сім, Гей, іп, Аго, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 244 на Нів; амінокислоту на позиції 245 на Аа; 60 амінокислоту на позиції 246 на будь-який один з Азр, Сім, Ні та Туг; ко)

амінокислоту на позиції 247 на будь-який один з Аа, Рпе, Су, Нів, Пе, Ге, Меї, ТНг, Ма! та

ТУ; амінокислоту на позиції 249 на будь-який один з Сім, Ні, Сіп та Туг; амінокислоту на позиції 250 на або Сім, або Сп; амінокислоту на позиції 251 на РНе; амінокислоту на позиції 254 на будь-який один з Ріє, Меї та Туг; амінокислоту на позиції 255 на будь-який один з Сім, І еи та Туг; амінокислоту на позиції 256 на будь-який один з Аа, Меї та Рго; амінокислоту на позиції 258 на будь-який один з Азр, Сім, Ні, Зег та Туг; амінокислоту на позиції 260 на будь-який один з Азр, Сім, Ні та Туг; амінокислоту на позиції 262 на будь-який один з Аа, Сім, Ре, Пе та ТНг; амінокислоту на позиції 263 на будь-який один з Аїа, Пе, Меї та ТНг; амінокислоту на позиції 264 на будь-який один з А5р, Си, РПе, Су, Ні, Пе, Гуз, І ей, Меї,

Азп, Рго, Сп, Аго, Зег, ТНАг, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 265 на будь-який один з АїПа, Гей, Ре, Су, Ні, Пе, Гув, І и, Меї,

Азп, Рго, Сп, Аго, Зег, ТНАг, маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 266 на будь-який один з Аїа, Пе, Меї та ТНг; амінокислоту на позиції 267 на будь-який один з Ар, Сім, Ре, Нів, Пе, І уб, Гецй, Меї, Авп,

Рго, Сп, Аго, ТНг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 268 на будь-який один з Ар, Сім, Рпе, Су, Пе, Гув, Гецй, Меї, Рго,

Сп, Аго, ТНг, маї та Тгр; амінокислоту на позиції 269 на будь-який один з РПе, су, Ні, Пе, Гу, ем, Меї, Авп, Рго,

Аго, зег, ТПпг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 270 на будь-який один з Си, Ре, Су, Нів, Пе, І ем, Меї, Рго, Сіп, Аго, зег, ТАг, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 271 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, Г ув, І ем, Меї,

Азп, Сп, Аго, зег, Тпг, маї, Тгр та Гу"; амінокислоту на позиції 272 на будь-який один з Ар, РПе, су, Ні, Пе, Гув, Гецй, Меї, Рго,

Аго, зег, ТПпг, Маї, Тгр та Туг;

Ко) амінокислоту на позиції 273 на або Ре, або Пе; амінокислоту на позиції 274 на будь-який один з А5р, Сім, Рпе, су, Ні, Пе, І єи, Меї, Авп,

Рго, Аго, зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 275 на або І еи, або Ттгр; амінокислоту на позиції 276 на будь-який один з А5р, Си, РПе, Су, Ні, Пе, Гецй, Меї, Рго,

Аго, зег, ТПпг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 278 на будь-який один з А5р, Сім, Су, Нів, Пе, Г ув, Г ем, Меї, Авп, Рго,

Сп, Аго, зег, Тпг, Ма! та Тгр; амінокислоту на позиції 279 на Аа; амінокислоту на позиції 280 на будь-який один з Аїа, Су, Нів, І ув, І ем, Рго, Сп, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 281 на будь-який один з Ар, ГІ ув, Рго та Туг; амінокислоту на позиції 282 на будь-який один з Сім, Су, І ув, Рго та Туг; амінокислоту на позиції 283 на будь-який один з Аа, Су, Нів, Пе, Гу, Гецй, Меї, Рго, Ага та

ТУ; амінокислоту на позиції 284 на будь-який один з Азр, Сім, І ей, Азп, Тпг та Туг; амінокислоту на позиції 285 на будь-який один з А5р, Сім, І ув, Сп, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 286 на будь-який один з Сім, Су, Рго та Туг; амінокислоту на позиції 288 на будь-який один з Авп, Ар, Сім та Туг; амінокислоту на позиції 290 на будь-який один з Ар, Су, Нів, І ем, Азп, Зег, ТАг, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 291 на будь-який один з А5р, Сім, Су, Нів, Пе, сіп та ТНг; амінокислоту на позиції 292 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рго, ТАг та Туг; амінокислоту на позиції 293 на будь-який один з РПе, су, Ні, Пе, Гей, Меї, Азп, Рго, Аго, зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 294 на будь-який один з РПе, су, Ні, Пе, Гу, ем, Меї, Авп, Рго,

Аго, зег, ТНпг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 295 на будь-який один з Ар, Сім, Рпе, су, Нів, Пе, Гу, Меї, Авп,

Рго, Аго, зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 296 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, СУ, Нів, Пе, І ув, Геи, Меї, Авп,

Сп, Аго, зег, Тпг та Маї; амінокислоту на позиції 297 на будь-який один з А5р, Си, РПе, Су, Ні, Пе, Гуз, І ей, Меї, 60 Рго, СІп, Агоу, зег, ТПг, Маї, Тгр та Туг;

амінокислоту на позиції 298 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, РПе, Нів, Пе, Гу, Меї, Авп,

Сп, Ага, ТНг, маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 299 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, Г ув, І ем, Меї,

Азп, Рго, Сп, Аго, Зег, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 300 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, СУ, Нів, Пе, І ув, Геи, Меї, Авп,

Рго, Сп, Аг9, Зег, ТНг, Ма! та Тгр; амінокислоту на позиції 301 на будь-який один з Азр, Сім, Ні та Туг; амінокислоту на позиції 302 на Пе; амінокислоту на позиції 303 на будь-який один з Ар, сСіу та Туг; амінокислоту на позиції 304 на будь-який один з Ар, Нів, І ем, Авп та ТНг; амінокислоту на позиції 305 на будь-який один з Сім, Пе, Тйг та Туг; амінокислоту на позиції 311 на будь-який один з Аа, Ахр, Азп, ТНг, мМаї та Туг; амінокислоту на позиції 313 на Ре; амінокислоту на позиції 315 на І! еи; амінокислоту на позиції 317 на або Сім або Сіп; амінокислоту на позиції 318 на будь-який один з Ні, І еи, Азп, Рго, Сіп, Аго, Тпг, Маї та Туг; амінокислоту на позиції 320 на будь-який один з Азр, Ре, Су, Ні, Пе, І ем, Азп, Рго, 5ег,

ТНг, Ма, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 322 на будь-який один з Аа, Ар, Ре, Су, Нів, Пе, Рго, Зег, Тпг, маї,

Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 323 на Пе; амінокислоту на позиції 324 на будь-який один з Азр, Ре, Су, Нів, Пе, І еи, Меї, Рго, Агод, ТНг, ма, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 325 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, Г ув, І ем, Меї,

Рго, СІп, Агоу, зег, ТПг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 326 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, СУ, Пе, Геи, Меї, Авп, Рго, Сп, зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 327 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, Г ув, І ем, Меї,

Азп, Рго, Аго, ТПг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 328 на будь-який один з Аа, Ар, Сім, Ріє, Су, Нів, Пе, Гуз, Меї, Авп,

Рго, Сп, Аго, Зег, ТНг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 329 на будь-який один з А5р, Си, РПе, Су, Ні, Пе, Гуз, І ей, Меї,

Азп, Сп, Агоу, Зег, ТАг, мМаї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 330 на будь-який один з Су, Сім, Рпе, Су, Ні, Пе, Гу, І ем, Меї,

Авп, Рго, Аго, зЗег, ТПАг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 331 на будь-який один з Ар, Ре, Ні, Пе, Гей, Меї, Сп, Аго, ТНг, Маї,

Тер та Туг; амінокислоту на позиції 332 на будь-який один з Аа, Авр, Сім, Ріє, Су, Ні, І ув, Геци, Меї,

Авп, Рго, Сіп, Аго, зег, Тпг, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 333 на будь-який один з Аа, Азр, Сім, Рпе, Су, Нів, Пе, І ем, Меї, Ро, зег, ТАг, маї та Туг; амінокислоту на позиції 334 на будь-який один з Аа, Сім, Ре, ПІПе, І ем, Рго та ТНг; амінокислоту на позиції 335 на будь-який один з Азр, Рпе, Су, Ні, Пе, Гей, Меї, Авп, Рго,

Аго, зег, Маї, Тгр та Туг; амінокислоту на позиції 336 на будь-який один з Сім, Гуз та Туг; амінокислоту на позиції 337 на будь-який один з Сім, Ні та Авп; амінокислоту на позиції 339 на будь-який один з Ар, РПе, Су, Пе, Гу, Меї, Ап, Сіп, Аг, Зег та ТНг; амінокислоту на позиції 376 на або Аа, або мМаї; амінокислоту на позиції 377 на або Су, або І ув; амінокислоту на позиції 378 на Ар; амінокислоту на позиції 379 на Авп; амінокислоту на позиції 380 на будь-який один з Аа, Авп та 5ег; амінокислоту на позиції 382 на або Аа, або Пе; амінокислоту на позиції 385 на Си; амінокислоту на позиції 392 на ТНг; амінокислоту на позиції 396 на І еи; амінокислоту на позиції 421 на ГГ ув; амінокислоту на позиції 427 на Авп; 60 амінокислоту на позиції 428 на або Ре, або І єи;

амінокислоту на позиції 429 на Ме; амінокислоту на позиції 434 на Тгр; амінокислоту на позиції 436 на Пе; та амінокислоту на позиції 440 на будь-який один з СУ, Нів, Пе, І еи та Туг, згідно з нумерацією ЕЄШ у ділянці Ес антитіла проти епірегуліну цього винаходу. Кількість амінокислот, які змінюються, особливо не обмежується. Може бути зміненою амінокислота на одній позиції, або можуть бути зміненими амінокислоти на двох або більше позиціях. Приклади комбінацій амінокислотних змін на двох або більше позиціях включають комбінації, наведені у

Таблицях 1-1 та 1-2.

Таблиця 1-1

ОАМІНСКИСЛОТНАКОМЕНАЦІЯ 00 АМІНОКИСЛОТНАКОМВНАЦІЯЇД 00000000

КЗТОБ/РЗОЄЬ/ВО7ОЕ 000182390/33390 .оЗ19Н/РІЗО6І/ 02706 вО67УВ/ИЗЗоЕ

СУ2ЛОАуРЗОВБЦИВОТОВ 00000000 18967БЛЗЗІЕ

КО5ЗЦІРЗОБЦИООТОК 00000010 000 кавзБп/рРЗО6БВИОаТОю 00005867 0/АЗОЯВ 00000000 Е2431, ПБО7ОБ/КЗ392М/ РЗОБІ, вЗ3І2ЯсИ1ЗЗоЕ

ОБ2азЦ/Ко55Ц/ОаТОБІРІОЮ 00833000

СЕЗ 2928/3001 УЗОБІ/РЗОБІ ГОЗОІЗЗАК 000 окдазі/коаарР/ТЗООгуРУУБЬ 0 тееБониазає 00000000

ОКОЯЗБІВО92РИЗОО 000000000000113350И33Я 00000000 сЕзЯЗЦ/воЯаРІРЗОЄ. 00000000 СУМУ

ЯЗ ВОВЯР 00000000 1 ро6БКИМаТКИЗВЗІЕ

ОВООВА/ЕЗЗЗА/КЗЗЯА 0000000...00651/ МОЗ 00000000

ОЕЗВОА/ТЗОТА 11111111 воза увяМ 11

К326М/Е3338 00000000 1 М29ТВ/АЗЗОТИІЗОЕ

ОКЗІБАЛЕЗЗВА 000000 ЖИТ ВИЗ .З3ІТА/КЗ5ВА 00000000 1М2970/Т299ЕИЗ3ЯЕ

АЗОВ 00000009

АЗЗОУИЗІЯЕ 0000000 імоотрутооециззаю 000

ОЕО5ВНИЗЗОЮ 00000000 1М2970/та99УЙЗВ

ОЕЗТОНИЗЗЯЕ 00000000 РОЗА

ОЕВТЯЦ МОТО 000 РАНИ РЯБА РЯЯИМ 0000

КОТ ВИЗ3ЯЕ. 00000000 1Б939Р/АЗЗОМИЗВЯК

ОКЗВЗНИЗЗЯЕ 00000000 18239 ПІАЗВОУ ВВ оЕООЗВИЗ3ОЮ 00000000 1Б2ЗО/НОБВБЛАЗЗОХЇ 00000001 капу Уггі і 52390/1332Б/А327А

СНООЯК/АЗЗОХ 00000000 12890

ОЗЯВИВВО 0000 ЗОЗ АЗЗО Ин 23303000 1БОЗОМАВЗОУИІВЯЄ

Газ /1332Е . 5230М/5298А/1332Е

СБа2ЗЯЖИЗЗЕ 00000000... МОЗ 12350 00000000. НИАЗЗОБИЯЯ 0000000

ОБЗЗВІИІЗЗЯЕ 00000000 ОВ 000000 12358/1332Е с Уугобр/М2970/1332Б

Таблиця 1-2 - це продовження Таблиці 1-1

Таблиця 1-2

Е2415/к2аЗУ /у2627т/у264Б/1332Е 52390/1332Е/ Н268Е/АЗЗОТ /АЗ27А 52ЗОК/У2641/8298А/АЗЗОУХ /ІЗ32Е

У цьому описі винаходу вираз "активність зв'язування з рецептором Есу ділянки Ес антитіла проти епірегуліну підвищується" означає, що активність ділянки Ес антитіла проти епірегуліну з вищезгаданими амінокислотними змінами зв'язуватися з будь-яким з рецепторів Есу людини,

ЕсуКІ, сука, ЕсукІ, ЕсукКШа та/або ЕсукПЬ, є вищою, порівняно з активністю ділянки Ес антитіла проти епірегуліну зв'язуватися з цими рецепторами Есу людини до амінокислотної зміни. Наприклад, на основі вищезгаданого способу аналізу це означає, що зв'язувальна активність антитіла проти епірегуліну після зміни складає 105 95 або більше, переважно на 11095 або більше, 11595 або більше, 12095 або більше, 12595 або більше, особливо переважно на 130 95 або більше, 135 95 або більше, 140 95 або більше, 145 95 або більше, 150 95 або більше, 155 95 або більше, 160 95 або більше, 165 95 або більше, 170 95 або більше, 175 95 або більше, 180 95 або більше, 185 95 або більше, 190 95 або більше, 195 95 або більше, є більшим у два рази або більше, у 2,5 рази або більше, у З рази або більше, у 3,5 рази або більше, у 4 рази або більше, у 4,5 рази або більше, у 5 разів або більше, у 7,5 разів або більше,

у 10 разів або більше, у 20 разів або більше, у 30 разів або більше, у 40 разів або більше, у 50 разів або більше, у 60 разів або більше, у 70 разів або більше, у 80 разів або більше, у 90 разів або більше або у 100 разів або більше, порівняно зі зв'язувальною активністю антитіла проти епірегуліну до зміни, яке застосовується як контрольне. (2) Антитіла проти епірегуліну зі зниженим вмістом фукози у цукрових ланцюгах, приєднаних до ділянки Ес

Необмежувальний варіант здійснення антитіл проти епірегуліну цього винаходу переважно включає антитіла проти епірегуліну, які було модифіковано так, щоб склад цукрових ланцюгів, приєднаних до ділянок Ес антитіл проти епірегуліну, був вищим для цукрових ланцюгів з дефіцитом фукози. Фахівці у галузі зможуть відповідним чином вибрати антитіла проти епірегуліну з високою пропорцією ділянки Ес, зв'язаної з цукровими ланцюгами з дефіцитом фукози, за допомогою наступного способу аналізу структур цукрових ланцюгів, який описано далі. Пропорцію такої ділянки Ес, зв'язаної з цукровими ланцюгами з дефіцитом фукози, фахівці у галузі можуть відповідним чином вибрати з 10 - 10095. У необмежувальному варіанті здійснення пропорцію можна вибрати серед 10 95, 20 95, 30 95, 40 95, 50 95, 60 95, 70 о, 80 Об, 90 95, 91 У, 92 Фо, 93 Ус, 94 У, 95 Уо, 96 Фо, 97 Фо, 98 Ус, 99 9о та 100 95. Відомо, що коли залишок фукози видалений з М-ацетил глюкозаміну на відновлювальному кінці цукрового ланцюга комплексного типу, зшитого з М-глікозидом, приєднаного до ділянки Ес антитіла, тоді афінітет до

ЕсукШа є підвищеним (9. ВіоЇ. Спет. (2003) 278, 3466-3473). Оскільки відомо, що антитіла Ідс1, які містять такі ділянки Ес, мають підвищену активність АОСС, як описано далі, то ці антитіла проти епірегуліну, які містять ділянку Ес, є також корисними як антитіла проти епірегуліну для включення до фармацевтичних композицій цього винаходу. Необмежувальний варіант здійснення антитіла, у якому залишок фукози видалений з М-ацетил глюкозаміну на відновлювальному кінці цукрового ланцюга комплексного типу, зшитого з М-глікозидом, приєднаного до ділянки Ес антитіла, переважно включає модифіковане глікозилуванням антитіло (М/01999/054342).

Інший необмежувальний варіант здійснення антитіла, у якому залишок фукози видалений з

М-ацетил глюкозаміну на відновлювальному кінці цукрового ланцюга комплексного типу, зшитого з М-глікозидом, приєднаного до ділянки Ес антитіла, переважно включає антитіла з

Зо дефіцитом фукози, приєднаної до цукрових ланцюгів (наприклад, МУ/02000/061739,

МО2002/031140 та УМО2006/067913). Клітини-хазяїни, які мають низьку спроможність додавати фукозу до цукрових ланцюгів внаслідок модифікації їх активності утворювати структуру цукрового ланцюга для поліпептидів, які підлягають глікозилуванню, застосовуються для отримання антитіл з дефіцитом фукози, приєднаної до цукрових ланцюгів. За допомогою експресії бажаного гена антитіла у клітинах-хазяїнах можна зібрати антитіло з дефіцитом фукози на його цукрових ланцюгах з культури клітин-хазяїнів. Необмежувальні переважні приклади активності щодо утворення структури цукрових ланцюгів поліпептиду включають активність ферменту або транспортера, вибраних з групи, що складається з фукозилтрансферази (ЕС 2.4.1.152), транспортера фукози (ЗІ С35С1), СОМО (СОР-маноза-4,6- дегідратаза) (ЕС 4.2.1.47), Ех (0ОР-Кето-6-дезоксиманоза-3,5-епімераза, 4-редуктаза) (ЕС 1.1.1.271) та СЕРР (СОР-В-І-фукоза пірофосфорилаза) (ЕС 2.7.7.30). Структури цих ферментів та транспортерів необов'язково специфікувати, доки вони демонструють свою активність. У цьому описі винаходу білки, які демонструють свою активність, називаються функціональними білками. Необмежувальний варіант здійснення способу модифікації цієї активності включає втрату цієї активності. Для того, щоб отримати клітини-хазяїни з дефіцитом цієї активності, можна відповідним чином застосовувати відомі способи, такі як руйнування генів цих функціональних білків, щоб зробити їх дисфункціональними (наприклад, УМО2000/061739,

ММО2002/031140 та УУО2006/067913). Клітини-хазяїни з дефіцитом такої активності можна отримати, наприклад, за допомогою способу, під час якого руйнуються ендогенні гени цих функціональних білків у клітинах СНО, клітинах ВНК, клітинах М50, клітинах 5Р2/0, клітинах мієломи ХО, клітинах мієломи миші РЗ х 63, клітинах РЕК, клітинах РЕК.Сб, клітинах НЕК293, гібридомах та їм подібних, так що вони не в змозі функціонувати.

Шляхом збирання антитіл з культуральних надосадових рідин вищезгаданих клітин-хазяїнів, трансформованих вектором експресії, який включає ген антитіла проти епірегуліну, збираються антитіла проти епірегуліну, у яких залишок фукози видалений з М-ацетил глюкозаміну на відновлювальному кінці цукрового ланцюга комплексного типу, зшитого з М-глікозидом, приєднаного до ділянки Ес антитіла. (3) Антитіла проти епірегуліну, які включають ділянки Ес, приєднані розділюючим навпіл М- ацетил глюкозаміном бо Необмежувальний варіант здійснення антитіл проти епірегуліну цього винаходу переважно включає антитіла проти епірегуліну, які включають ділянки Ес, приєднані за допомогою розділюючого навпіл М-ацетил глюкозаміну. Відомі антитіла, які мають цукровий ланцюг, який містить розділюючу навпіл структуру СІСМАс (МИО2002/079255 та йому подібне). Клітини-хазяїни, які мають активність утворювати цукровий ланцюг, який містить розділюючу навпіл структуру

СІСМАс, застосовуються для отримання антитіл, до яких приєднані цукрові ланцюги, що містять розділюючу навпіл структуру СІСМАс. У переважному необмежувальному варіанті здійснення отримують клітини-хазяїни, які експресують ген, що кодує функціональний білок, який має активність пт (8-1,4-манозил-глікопротеїн, 4-ВД-М-ацетилглікозамінілтрансферази) (ЕС 2.4.1.144) або активність са (В-1,4-галактозилтрансферази (ЕС 2.4.1.38). В іншому переважному необмежувальному варіанті здійснення, окрім вищезгаданих функціональних білків, отримують клітини-хазяїни, які спільно експресують ген, що кодує функціональний білок, який має активність Мапі! людини (манозидази ІІ) (3.2.1.114), ген, що кодує функціональний білок, який має активність спі (Д-1,2-ацетилглікозамінілтрансферази І) (ЕС 2.4.1.94), ген, що кодує функціональний білок, який має активність спі! (В-1,2-ацетилглікозамінілтрансферази Ії) (ЕС 2.4.1.143), ген, що кодує функціональний білок, який має активність Мапі (маннозидази) (ЕС 3.2.1.113) та а-1,6-фукозил трансферази (ЕС 2.4.1.68) (МИО2004/065540). Вищезгадані клітини- хазяїни, які мають активність утворювати цукровий ланцюг, який містить розділюючу навпіл структуру СІСМАс, можна отримати шляхом трансфекції вектора експресії, який містить ген для вищезгаданого функціонального білка, у клітинах СНО, клітинах ВНК, клітинах М50, клітинах

ЗР2/О, клітинах мієломи ХО, клітинах мієломи миші РЗ х 63, клітинах РЕК, клітинах РЕК.Сб, клітинах НЕК293, гібридомах та їм подібних.

Антитіла проти епірегуліну, які включають ділянки Ес, приєднані розділюючим навпіл М- ацетил глікозаміном, збираються шляхом узяття антитіл з культуральної надосадової рідини вищезгаданих клітин-хазяїнів, трансфектованих вектором експресії, який містить ген антитіла проти епірегуліну. Відомі способи можна застосовувати для аналізу структури цукрового ланцюга, приєднаного до антитіл. У необмежувальному варіанті здійснення дозвіл М-Глікозидазі

Е (Коспе аіадповіїс5) діяти на антитіло проти епірегуліну цього винаходу примушує цукровий ланцюг, приєднаний до антитіла проти епірегуліну, відокремитися від білка (9. Ріагт. 5сі. (1994) 83(12), 1670-1675). Після видалення білка із застосуванням етанолу (). Сііп. Іпмев5і. (2001),

Зо 108(11), 1687-95) вільний цукровий ланцюг концентрують та висушують, а потім здійснюють флуоресцентне мічення, застосовуючи 2-амінопіридин або 2-амінобензамід (Апаї. Віоспет. (1995) 230 (2), 229-238). Отриманий цукровий ланцюг, мічений 2-АР, або цукровий ланцюг, мічений 2-АВ, звільняють від реагентів шляхом твердофазної екстракції із застосуванням целюлозного картриджа, а потім концентрують шляхом центрифугування, а отриманий матеріал піддають послідовним аналізам як очищений 2-АВ-мічений цукровий ланцюг. Після цього, дозволяючи В-галактозидазі (В-СаїІасіозідазе) (Зеікадаки Согрогайоп) діяти на очищений 2-АВ- мічений цукровий ланцюг, отримують 2-АВ-мічений цукровий ланцюг галактозилу. 2-АВ-мічені цукрові ланцюги галактозилу, отримані із застосуванням цукрових ланцюгів, що відокремилися від антитіл проти епірегуліну цього винаходу як початковий матеріал, аналізуються шляхом високоефективної рідинної хроматографії (НРІС) нормальної фази із застосуванням колонки

ТеКаве! Атіде-80 (То5опП), та їх хроматограми порівнюються.

Крім того, повідомлялося, що сила взаємодії між ділянкою Ес антитіла та ЕсоК залежить від іонної концентрації 7п2я (Іттипоіоаду І ейег5 143 (2012) 60-69). Антитіло демонструє сильнішу взаємодію між ділянкою Ес та ЕсодК, коли іонна концентрація 2п- ділянки Ес є вищою.

Хелатування 7п-: залишками Ніз310 та Ніз435, присутніми у СНЗ ділянки Ес антитіла, відкриває кожний домен СНЕаО ділянки Ес на дистальній позиції. Це полегшує взаємодію між доменом СН2 та ЕсокК, та взаємодія між ділянкою Ес та ЕсудК посилюється. Необмежувальний варіант здійснення антитіла цього винаходу включає антитіло, у якому Ні: на позиції 310, Ні на позиції 435, Ні на позиції 433 та/або Ап на позиції 434 (нумерація Е)У) хелується 7п2.

Кон'югат антитіло-ліки

Необмежувальний варіант здійснення антитіл проти епірегуліну цього винаходу переважно включає кон'югати антитіла проти епірегуліну з ліками, отримані шляхом з'єднання антитіла проти епірегуліну з ліками, які мають цитотоксичність. Далі у цьому описі винаходу кон'югат антитіла з ліками може позначатися як АОС. Більш специфічно, кон'югати антитіла проти епірегуліну з ліками, які застосовуються у цьому винаході, можуть бути відповідним чином утвореними з інгібіторами росту або цитотоксичними речовинами, такими як токсичні пептиди або радіоактивні хімічні речовини. Термін "радіоактивні хімічні речовини" у цьому винаході означають речовини, які містять радіоізотопи. Радіоїзотоп особливо не обмежується, та може застосовуватися будь-який радіоїзотоп, наприклад, ЗР, 170, 125І, ЗН, 71І, 186Де, ї88Ке та їм бо подібне. Такі кон'югати антитіла проти епірегуліну з ліками можна отримати шляхом хімічної модифікації отриманих антитіл проти епірегуліну. Більш специфічно, для того, щоб примусити інгібітор росту або цитотоксичну речовину хімічно сполучатися (наприклад, ковалентно зв'язуватися) з антитілом проти епірегуліну, застосовують молекулу-лінкер, щоб приєднати інгібітор росту або цитотоксичну речовину до антитіла за допомогою хімічних зв'язків (таких, які описано вище).

Переважно, зв'язувальний агент (лінкер) - це лінкер, який може розщеплюватися. Більш переважно, лінкер розщеплюється у м'яких умовах (тобто, умовах усередині клітини, при яких не відбувається впливу на активність ліків). Приклади придатних лінкерів, які можуть розщеплюватися, включають дисульфідні лінкери, нестійкі до кислот лінкери, нестійкі до світла лінкери, нестійкі до пептидази лінкери та нестійкі до естерази лінкери. Лінкери, що містять дисульфід - це лінкери, які можна розщепити за допомогою дисульфідного обміну, який може виникнути при фізіологічних умовах. Нестійкі до кислоти лінкери - це лінкери, які можуть розщеплюватися при кислотному рН. Наприклад, деякі внутрішньоклітинні компартменти, такі як ендосоми та лізосоми, мають кислотне рН (рн 4 - 5) та створюють умови, придатні для розщеплення нестійких до кислоти лінкерів. Нестійкі до світла лінкери є корисними на поверхні тіла та у багатьох порожнинах тіла, які можуть піддаватися впливу світла. Крім того, інфрачервоне світло може проникати у тканини. Нестійкі до пептидази лінкери можна застосовувати для розщеплення певних пептидів усередині або ззовні клітин (дивись, наприклад, Тгопцеї еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА (1982) 79, 626-629; та Штетоїю еї аї., п. У. Сапсег (1989) 43, 677-684).

Окрім вищезгаданих хімічних модифікацій такі АОС можна отримати у формі молекул біспецифічного антитіла, побудованих із застосуванням способів генної інженерії, так щоб антитіло могло розпізнавати інгібітори росту або цитотоксичні речовини, такі як токсичні пептиди або радіоактивні хімічні речовини. Термін "антитіла проти епірегуліну" цього винаходу також включає такі антитіла.

Приклади необмежувального варіанта здійснення кон'югатів антитіла проти епірегуліну з ліками, запропонованих цим винаходом, включають антитіла проти епірегуліну, які модифікували, застосовуючи токсичний пептид, такий як рицин, абрин, рибонуклеаза, онконаза,

ДНаза І, ентеротоксин А стафілококу, противірусний білок лаконосу, гелонін, токсин дифтерії, екзотоксин Рзхейдотопавх, ендотоксин Рзейдотопа»в, І -аспарагіназа або І-аспарагіназа ПЕГ. В іншому варіанті здійснення один, два або більше інгібіторів росту та цитотоксичних речовин, таких як токсичний пептид, можна поєднати та застосовувати для модифікації антитіла проти епірегуліну. Як описано вище, антитіло проти епірегуліну можна з'єднати з вищезгаданим інгібітором росту або цитотоксичною речовиною, такою як токсичний пептид, або радіоактивною хімічною речовиною за допомогою ковалентного зв'язку або нековалентного зв'язку. Способи отримання АОС, з'єднаних з таким інгібітором росту або цитотоксичною речовиною, такою як токсичний пептид, або з радіоактивною речовиною, відомі у галузі. Приклади зв'язувальних груп, коли антитіло проти епірегуліну та інгібітор росту або цитотоксична речовина, така як токсичний пептид, або радіоактивна речовина безпосередньо зв'язані разом, включають дисульфідний зв'язок, де застосовуються групи 5Н. Специфічно, внутрішньомолекулярний дисульфідний зв'язок у ділянці Ес антитіла проти епірегуліну відновлюється відновлювальним агентом, таким як дитіотреїтол, а дисульфідний зв'язок усередині молекули інгібітору росту або цитотоксичної речовини подібним чином відновлюється, так що дві молекули з'єднуються дисульфідним зв'язком. До з'єднання або антитіло, або інгібітор росту або цитотоксичну речовину, можна активувати агентом, що сприяє активації, таким як реагент Еллмана, що сприяє утворенню дисульфідного зв'язку між двома молекулами. Переважні необмежувальні приклади інших способів прямого з'єднання антитіла проти епірегуліну та інгібітору росту або цитотоксичної речовини, такої як токсичний пептид, або радіоактивної речовини включають спосіб, що застосовує шифову основу, карбодіїмідний спосіб, спосіб активного ефіру (спосіб М- гідроксисукциніміду), спосіб, який застосовує змішаний ангідрид та спосіб, який застосовує діазореакцію.

Наступне можна застосовувати як приклади токсичних пептидів, які застосовуються у цьому винаході: - ланцюг А токсину дифтерії (Гапдопе еї а. (Метод3з іп ЕпгутоїІоду (1993) 93, 307 -308)) - екзотоксин Рзейдотопаз (Раї еї аї. (Маї. Мед. (1996) 2 (3), 350-353)) - ланцюг рицину (ланцюг А рицину) (Ешюоп еї аї. (у. ВіоЇ. Спет. (1986) 261, 5314-5319); б5імат еї аІ. (Сапсег Вез. (1987) 47, 3169-3173); Сбитьег еї аї. (9. Іттипої. МеїШодз (1990) 135, 15-24);

Мамгтгупслак еї аї. (Сапсег ВНез. (1990) 50, 7519-7562); Спеейе еї аї. (9. Іттипої. Меїподз (1991) 142, 223-230)) бо - деглікозилований ланцюг А рицину (Тпогре еї аї!. (Сапсег Кев. (1987) 47, 5924-5931))

- ланцюг А абрину (Уу/ам/глупслак еї аї. (Вг. У. Сапсег (1992) 66, 361-366) Маултгупслгак еї аї. (Сапсег Вез (1990) 50, 7519-7562); бімат еї а!. (Сапсег Вез. (1987) 47, 3169-3173); Тогре вії аї. (Сапсег Вез. (1987) 47, 5924-5931)) - гелонін (Зімат еї а. (Сапсег Ке5. (1987) 47, 3169-3173); Ситрбег єї аї. (9). Іттипої. Мешодв (1990) 135, 15-24); Мамтгупслак еї аї. (Сапсег Рез. (1990) 50, 7519-7562); Воіодпевзі еї аї. (Сіїй.

Ехр. Іттипої. (1992) 89, 341-346)) - противірусний білок з насіння РАР або лаконосу (Воіодпевзі еї аї. (Сіїп. Ехр. Іттипої. (1992), 89, 341-346)) - бріодин (Воіодпеві еї аї. (Сіїп. Ехр. Іттипої. (1992) 89, 341-346)) - сапорин (Воіодпеві еї а. (Сііп. Ехр. Іттипої. (1992), 89, 341-346)) - момордин (Ситрбег еї аї. (9. Іттипої. Мейподз (1990) 135, 15-24); Мамтгупслак еї а!. (Сапсег

Вез. (1990) 50, 7519-7562); Воіоапевзі єї а!. (Сіїп. Ехр. Іттипої. (1992) 89, 341-346)) - моморкохін (тотогсоспіп) (Воіодпезі еї а. (Сііп. Ехр. Іттипої). (1992) 89, 341-346)) - діантин 32 (Воіодпевзві еї аї. (Сііп. Ехр. Іттипої. (1992) 89, 341-346)) - діантин 30 (Зіїгре еї а. (РЕВЗ5 І єї. (1986) 195, 1-8)) - модецин (5іїгре еї а. (РЕВЗ5 І єї. (1986) 195, 1-8)) - віскумін (Зігре еї а. (РЕВЗ5З І єї. (1986) 195, 1-8)) - волькезин (Зіїгре еї а!. (РЕВЗ Геї. (1986) 195, 1-8)) - додекандрин (5іїгре еї а. (РЕВЗ І єї. (1986) 195, 1-8)) - тритин (Зіїгре еї аї. (РЕВЗ5 І еї. (1986) 195, 1-8)) - люфін (Зіігре еї а. (РЕВЗ Геї. (1986) 195, 1-8)) - трихокірин (Сазеїаз еї аї. (Єшиг. У. Віоспет. (1988) 176, 581-588); Воіодпезі єї аї. (Сіїп. Ехр.

Іттипої!. (1992) 89, 341-346))

Білкові або пептидні фармацевтичні агенти або токсини можна також з'єднувати з антитілом проти епірегуліну за способами генної інженерії. Специфічно, ДНК, що кодує вищезгаданий токсичний пептид, та ДНК, що кодує антитіло проти епірегуліну цього винаходу, можна злити у рамці, щоб отримати рекомбінантну ДНК, а потім вставити у вектор експресії, щоб побудувати рекомбінантний вектор. Цей вектор потім вводять у придатні клітини-хазяїни, щоб генерувати трансформовані клітини, які культивують, щоб Кон'югат ліків з антитілом проти епірегуліну, з яким з'єднаний токсичний пептид, можна отримати шляхом виділення та очищення з культурального розчину. Коли отримують злиті білки антитіла, тоді, зазвичай, відповідні ДНК з'єднуються так, але не обмежуючись тільки цим, щоб білкові ліки або токсини розташовувалися на С-кінці антитіла. Також можливо розташувати пептидний лінкер між антитілом та білковим фармацевтичним агентом або токсином.

Інгібітори росту

У необмежувальному варіанті здійснення інгібітори росту можуть переважно включати агенти, що руйнують ДНК, антиміотичні агенти та/(або антиметаболіти. Агенти, що руйнують

ДНК, можуть бути алкілуючими агентами, інгібіторами топоізомерази та/або інтеркаляторами

ДНК. Переважні необмежувальні приклади інгібіторів росту можуть включати карбоплатин (агент, що алкілує ДНК), етопозид (інгібітор топоізомерази Ії), доксорубіцин (інтеркалятор ДНК), доцетаксель (антиміотичний агент) та Сетлаг (гемцитабін, антиметаболіт).

Принаймні одну з перелічених далі речовин можна вибрати як алкілуючий агент. Тобто, як алкілуючий агент можна застосовувати принаймні один алкілуючий агент, вибраний серед хлорамбуцилу, циклофосфаміду, іфосфаміду, мехлоретаміну, мелфалану, урацилу гірчичного, тіотепа, бусульфану, кармустину, ломустину, стрептоцину, карбоплатину, цисплатину, сатрап латину, оксаліплатину, альтретаміну, ЕТ-743, ХІІ19 (бекатекарину), дакарбазину, хлорметину, бендамустину, трофосфаміду, урамустину, фотемустину, німустину, преднімустину, ранімустину, семустину, недаплатину, триплатину тетранітрату, маносульфану, треосульфану, томозоломіду, карбоквону, триазиквону, триетиленмеламіну та прокарбазину.

Принаймні одну перелічену далі речовину можна вибрати як інгібітор топоіїзомерази. Тобто, як інгібітор топоїзомерази можна застосовувати принаймні один інгібітор топоізомерази, вибраний серед доксорубіцину (Сохії), даунорубіцину, епірубіцину, ідарубіцину, антрацендіону (Момапігтопе), мітоксантрону, мітоміцину С, блеоміцину, дактиноміцину, плікатоміцину, ілінотекану (Сатріозаг), камптотецину, рубітекану, белотекану, етопозиду, теніпозиду та топотекану (Нусатрінп).

Як інтеркалятор ДНК можна застосовувати принаймні один інтеркалятор ДНК, вибраний серед профлавіну, доксорубіцину (адріаміцину), даунорубіцину, дактиноміцину та талідоміду.

Як антиміотичний агент можна вибрати принаймні одну з перелічених далі речовин. Як антиміотичний агент можна застосовувати принаймні один антиміотичний агент, вибраний

Ге) серед паклітакселю (Абгахапе)/таксолу, доцетакселю (Тахоїеге), ВМ5-275183, Хуоїах, ТГосозаї,

вінорлебіну, вінкристину, вінбластину, віндезину, вінзолідіну, етопозиду (МР-16), теніпозиду (ММ- 26), іксабепілону, ларотакселю, ортатакселю, тезетакселю та іспінезибу.

Як антиметаболіт можна вибрати принаймні одну з перелічених далі речовин. Як антиметаболіт можна застосовувати принаймні один антиметаболіт, вибраний серед фторурацилу (5-ЕЮ), флоксуридину (5-ЕОак), метотрексату, ХеЇода, Агтапоп, лейковорину, гідроксисечовини, тіогуаніну (6-15), меркаптопурину (6-МР), цитарабіну, пентостатину, флударабіну фосфату, кладрибіну (2-СОА), аспарагінази, гемцитабіну, пеметрекседу, бортезомібу, аміноптерину, ралтитрекседу, клофарабіну, еноцитабіну, сапацитабіну, азацитадину та їм подібного.

Коли кон'югат антитіла проти епірегуліну з ліками включається у клітину, тоді з'єднаний з кон'югатом інгібітор росту або цитотоксична речовина, така як токсичний пептид, можуть спричиняти загибель клітини, у яке це антитіло було залучене. Отже, антитіло, з яким з'єднаний інгібітор росту або цитотоксична речовина, така як токсичний пептид, переважно також має активність інтерналізації. У цьому винаході вираз "антитіло, яке має активність інтерналізації", означає антитіло, яке переноситься у клітину (у цитоплазму, візикули, інші органели та їм подібне), після зв'язування з епірегуліном на клітинній поверхні. Чи має або ні антитіло активність інтерналізації можна переконатися за допомогою способів, відомих фахівцям у галузі. Наприклад, активність інтерналізації можна підтвердити за способом контактування антитіла проти епірегуліну, з'єднаного з міченою речовиною, з клітинами, що експресують епірегулін, та визначення, чи включена мічена речовина у клітини, або за допомогою способу контактування антитіла проти епірегуліну, з'єднаного з інгібітором росту або цитотоксичною речовиною, такою як токсичний пептид, з клітинами, що експресують епірегулін, та визначення, чи індукується загибель клітин, що експресують епірегулін. Більш специфічно, чи має або не має антитіло активність інтерналізації, можна переконатися, наприклад, за допомогою способу, описаному у Прикладах, які описано далі.

Після того, як антитіло, яке має цитотоксичність, таку як АОСС, зв'язується з антигеном- мішенню, експресованим на клітинній поверхні, антитіло залишається на клітинній поверхні завдяки зв'язуванню з антигеном, та клітини-ефектори, такі як клітини МК, зв'язуються з ділянками Ес антитіла, та усе це примушує клітини-ефектори індукувати цитотоксичність проти клітин, що експресують антиген-мішень. Навпаки, антитіло, яке застосовується як АОС, переважно інтерналізується у клітини після зв'язування з антигеном. Як можна визначити з вищезгаданого механізму дії, зазвичай вважають, що переважно антитіло, яке руйнує клітини- мішені цитотоксичністю, такою як АОСС, має низьку активність інтерналізації, та антитіло, яке руйнує клітини-мішені у формі АОС, має високу активність інтерналізації (Апіїісапсег Кезеагсп (1993) 13, 2207-2212). Дивно, що на відміну від цього, антитіла проти епірегуліну цієї заявки не тільки пригнічують проліферацію клітин, що експресують епірегулін, внаслідок їхньої нейтралізуючої активності, але також спричиняють загибель клітин, що експресують епірегулін, внаслідок цитотоксичності, такої як АОСС; та, між тим, також було визначено, що кон'югати антитіл з ліками, які містять антитіла проти епірегуліну цієї заявки, індукують цитотоксичність проти клітин, що експресують епірегулін.

Низькомолекулярне антитіло

У необмежувальному варіанті здійснення антитіла проти епірегуліну, включені до кон'югату антитіла проти епірегуліну з ліками цього винаходу, можуть бути низькомолекулярними антитілами. Низькомолекулярне антитіло містить фрагмент антитіла, у якому не вистачає частини цілого антитіла (наприклад, цілого до). Часткові делеції молекули антитіла дозволяються, доки воно має активність зв'язуватися з антигеном епірегуліну. Фрагменти антитіла цього винаходу переважно містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН) та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга (М). Амінокислотна послідовність МН або Мі може мати заміщення, видалення, додавання та/або вставки. Крім того, МН та/або МІ можна частково видалити, доки вона має активність зв'язуватися з антигеном епірегуліну. Варіабельну ділянку можна піддати химеризації або гуманізації. Специфічні приклади фрагментів антитіла включають Бар, Бар", Е(аб")»2 та Ем. Специфічні приклади низькомолекулярних антитіл включають Раб, Бар", Е(ар")», Ем, зом (Рм з єдиним ланцюгом), діатіло та 5с(Ем)2 (Ем)2 з єдиним ланцюгом). Мультимери цих антитіл (наприклад, димери, тримери, тетрамери та полімери) також включено до низькомолекулярних антитіл цього винаходу.

Низькомолекулярні антитіла можна отримати шляхом обробки антитіла ферментом, щоб отримати фрагменти антитіл. Відомі ферменти, які виробляють фрагменти антитіла, - це, наприклад, папаїн, пепсин та плазмін. Альтернативно, гени, що кодують ці фрагменти антитіла, можна вставити у вектори експресії; та відповідні клітини-хазяїни, у які введені вектори бо експресії, культивують, щоб вони експресували фрагмент антитіла; а потім цей фрагмент антитіла можна отримати шляхом виділення клітин з культурального середовища та очищення (дивись, наприклад, Со єї аї., (У. Іттипої. (1994) 152, 2968-2976); ВецНег єї аї., (Меїйоадвз іп

Епгуто!оду (1989) 178, 476-496); РіпесКкіпип еї аї., (Меїйодз іп Епгуто!іоду (1989) 178, 476-496);

Іатоуї (Меїнподз іп Епгутоїіоду (1989) 121, 652-663); Ноиззеаих 6ї аї., (Меїйодз іп Епгутоіоду (1989) 121, 663-669); Віка єї аї., (ТІВТЕСН (1991) 9, 132-137).

Термін "діатіло" означає фрагмент двовалентного антитіла, побудований шляхом злиття генів (Ноїйпдег еї а!., Ргос. Май. Асай. 5сі. О5А (1993) 90: 6444-6448; ЕР 404,097; МО 1993/11161 тощо). Діатіло - це димер, який складається з двох поліпептидних ланцюгів. Зазвичай, в кожному поліпептидному ланцюгу, що входить до складу димеру, МІ. та МН з'єднані лінкером у межах одного й того ж ланцюга. Лінкер в діатілі зазвичай є достатньо коротким, щоб попередити зв'язування між Мі та МН. Специфічно, амінокислотні залишки, які складають лінкер, - це зазвичай 5 залишків або біля цього. Отже, Мі та МН, які кодуються таким самим поліпептидним ланцюгом, не можуть утворювати фрагмент варіабельної ділянки з єдиним ланцюгом, та вони утворюють димер з іншим фрагментом варіабельної ділянки з єдиним ланцюгом. Внаслідок цього діатіла мають дві антиген-зв'язувальні ділянки. 57сСЕм можна отримати шляхом зшивання М- ділянки Н-ланцюга та М-ділянки І -ланцюга антитіла. Специфічно, з5сСЕм можна отримати шляхом зшивання М-ділянки Н-ланцюга та М-ділянки І-ланцюга за допомогою лінкера, переважно пептидного лінкера (Низіоп еї а!., Ргос. Маї). Асай. Зсі. 0.5.А., (1988) 85, 5879-5883). М-ділянка

Н-ланцюга та М-ділянка Ї-ланцюга фрагмента 5сЕм можуть походити від будь-яких антитіл, описаних у цьому описі винаходу як антитіла проти епірегуліну. Структура та властивості пептидного лінкера для зшивання М-ділянок особливо не обмежуються. Наприклад, як лінкер можна застосовувати будь-який одноланцюговий пептид, який складається з 3 - 25 залишків або біля цього. 5с(Ем)2 - це низькомолекулярне антитіло, отримане шляхом зшивання двох МН та двох МІ. лінкерами або їм подібним для утворення єдиного ланцюга (Ниавзоп еї аї., 9. Іттипої. Метоа5 (1999) 231, 177-189). вс(Ем)г можна отримати, наприклад, шляхом з'єднання зсЕм5 за допомогою лінкера.

Фармацевтичні композиції

В іншому аспекті цей винахід пропонує фармацевтичні композиції, які містять антитіло проти

Зо епірегуліну цього винаходу як активний інгредієнт. Крім того, цей винахід стосується інгібіторів клітинного росту, зокрема, протиракових агентів або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому вони включають антитіло проти епірегуліну цього винаходу як активний інгредієнт. Переважно, інгібітори клітинного росту та протиракові агенти або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку цього винаходу вводяться суб'єктові, який страждає на рак або може страждати на рак у майбутньому.

У цьому винаході інгібітори клітинного росту, які включають антитіло проти епірегуліну як активний інгредієнт, можуть також бути виражені як способи для пригнічення клітинного росту, при цьому ці способи включають етап введення суб'єктові антитіла проти епірегуліну; як застосування антитіла проти епірегуліну у виробництві інгібіторів клітинного росту або як антитіла проти епірегуліну для застосування для пригнічення клітинного росту.

Крім того, у цьому винаході протиракові агенти або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку, які включають антитіло проти епірегуліну як активний інгредієнт, можуть також бути виражені як способи для профілактики або лікування раку або способи для пригнічення рецидиву або метастазу раку, при цьому способи включають етап введення суб'єктові антитіла проти епірегуліну; як застосування антитіла проти епірегуліну у виробництві протиракових агентів або агентів для пригнічення рецидиву або метастазу раку або як антитіла проти епірегуліну для застосування у профілактиці або лікуванні раку або пригніченні рецидиву або метастазу раку.

У цьому винаході вираз "що включає антитіло проти епірегуліну як активний інгредієнт" означає включення антитіла проти епірегуліну як головного активного інгредієнта, та не існує обмеження щодо вмісту антитіла проти епірегуліну. Антитіла, включені у фармацевтичні композиції цього винаходу (наприклад, інгібітори клітинного росту або протиракові агенти цього винаходу; та так само далі у цьому описі винаходу), особливо не обмежуються, доки вони зв'язуються з білком епірегуліну, та вони можуть бути прикладами антитіл, описаних у цьому описі винаходу.

Фармацевтичні композиції цього винаходу можна вводити суб'єктам (пацієнтам) або перорально, або парентерально. Парентеральне введення є переважним. Такі способи введення специфічно включають введення шляхом ін'єкції, трансназальне введення, інгаляційне введення та крізьшкірне введення. Для введення шляхом ін'єкції фармацевтичну 60 композицію цього винаходу можна вводити системно або місцево, наприклад, шляхом внутрішньовенної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньочеревної ін'єкції та підшкірної ін'єкції. Спосіб введення можна вибрати відповідним чином згідно з віком та симптомами пацієнта. Дозу можна вибрати, наприклад, у діапазоні від 0,0001 мг до 1000 мг на кілограм маси тіла за одне введення. Альтернативно, дозу можна вибрати, наприклад, у діапазоні від 0,001 мг/кг маси тіла до 100000 мг/кг маси тіла для одного пацієнта. Проте, фармацевтичні композиції цього винаходу не обмежуються цими дозами.

Фармацевтичні композиції цього винаходу можна отримати шляхом змішування згідно з традиційними способами (наприклад, Кептіпдіоп'є РіаптасешісаІ бсіепсе, останнє видання,

Магк Рибіїзпіпд Сотрапу, Еавіоп, О.5.А), та вони можуть також містити фармацевтично прийнятні носії та домішки. Приклади включають поверхнево-активні речовини, ексципієнти, барвники, ароматизатори, консерванти, стабілізатори, буфери, суспендувальні агенти, агенти ізотонічності, зв'язувальні агенти, розпушувачі, змащувальні агенти, агенти, що сприяють плинності, коригуючі агенти. Не обмежуючись вище переліченим, можна придатним чином застосовувати інші загальноприйняті носії. Специфічні приклади носіїв включають легку безводну саліцилову кислоту, лактозу, кристалічну целюлозу, маніт, крохмаль, кальцію кармелозу, натрію кармелозу, гідроксипропідцделюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, полівінілацетал діетиламін ацетат, полівінілпіролідон, желатин, тригліцериди жирних кислот головного ланцюга, затверднене поліоксиетиленом касторове масло 60, сахарозу, карбоксиметилцелюлозу, кукурудзяний крохмаль, неорганічні солі тощо.

Антитіла проти епірегуліну описано вище як антитіла, що зв'язують білок епірегуліну, включені у фармацевтині композиції цього винаходу. Клітини, які зв'язуються з антитілами проти епірегуліну, особливо не обмежуються, доки ці клітини є клітинами, що експресують епірегулін.

Переважні клітини цього винаходу, які експресують епірегулін, - це ракові клітини. Біль переважно, клітини - це клітини раку товстої кишки, клітини аденокарциноми легеня, клітини раку підшлункової залози, клітини раку шлунку, клітини раку стравоходу та клітини раку нирки.

Способи цього винаходу можна застосовувати як до первинних, так і до метастатичних осередків цих видів раку. Більш переважні ракові клітини - це клітини первинного раку товстої кишки, клітини метастатичного раку товстої кишки та клітини раку підшлункової залози.

У цьому винаході "контактування" здійснюється, наприклад, шляхом додавання антитіла до

Зо культурального розчину клітин, що експресують епірегулін, у пробірці. У цьому випадку антитіло можна додати у формі, наприклад, розчину або твердої речовини, отриманої шляхом ліофілізації або їй подібного. Коли антитіло додають як водний розчин, тоді водний розчин, що застосовується, може в чистому вигляді містити тільки антитіло, або цей розчин може включати, наприклад, вищезгадані поверхнево-активні речовини, ексципієнти, барвники, ароматизатори, консерванти, стабілізатори, буфери, суспендувальні агенти, агенти ізотонічності, зв'язувальні агенти, розпушувачі, змащувальні агенти, агенти, що сприяють плинності, або смакові агенти.

Концентрація для додавання особливо не обмежується, проте кінцева концентрація у культурі, яку можна відповідним чином застосовувати, переважно становить діапазон від 1 пг/мл до 1 г/мл, більш переважно від 1 нг/мл до 1 мг/мл та навіть більш переважно від 1 мкг/мл до 1 мг/мл.

Крім того, у іншому варіанті здійснення "контактування" у цьому винаході здійснюється шляхом введення антитіла тварині, яка не є людиною, якій у тіло було трансплантовано клітину, що експресує епірегулін, або тварині, яка є носієм ракових клітин, які ендогенно експресують епірегулін. Спосіб введення може бути пероральним або парентеральним. Особливо переважним способом введення є парентеральне введення, та, специфічно, спосіб введення - це, наприклад, введення шляхом ін'єкції, трансназальне введення, інгаляційне введення або крізьшкірне введення. Приклади введення шляхом ін'єкції включають системне та місцеве введення фармацевтичних композицій, інгібіторів проліферації клітин та протиракових агентів цього винаходу шляхом внутрішньовенної ін'єкції, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньочеревної ін'єкції, підшкірної ін'єкції тощо. Придатний спосіб введення можна вибрати згідно з віком тварини тесту або симптомами. При введенні у вигляді водного розчину, водний розчин, що застосовується, може в чистому вигляді містити тільки антитіло, або цей розчин може включати, наприклад, вищезгадані поверхнево-активні речовини, ексципієнти, барвники, ароматизатори, консерванти, стабілізатори, буфери, суспендувальні агенти, агенти ізотонічності, зв'язувальні агенти, розпушувачі, змащувальні агенти, агенти, що сприяють плинності, або смакові агенти. Дозу можна вибрати, наприклад, у діапазоні від 0,0001 мг до 1000 мг на кілограм маси тіла за одне введення. Альтернативно, дозу для кожного пацієнта можна вибрати у діапазоні від 0,001 мг/кг маси тіла до 100000 мг/кг маси тіла. Проте, доза антитіла цього винаходу не обмежуються цими дозами.

Терапевтичні агенти проти раку або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку, бо які вводяться суб'єктам, які є носіями ракових клітин, що експресують білок епірегуліну

Цей винахід пропонує терапевтичні агенти проти раку або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку, де суб'єкти, яким вводяться терапевтичні агенти проти раку або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку, - це суб'єкти, які є носіями ракових клітин, які експресують білок епірегуліну та які можна виявити, застосовуючи зразок виділеної тканини.

Окрім описаних в цьому описі способів рівень експресії білка епірегуліну можна визначити за способами, відомими фахівцям у галузі. Для того, щоб визначити, чи потрібно або не потрібно вводити суб'єктові терапевтичні агенти проти раку або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку цього винаходу, рівень експресії білка епірегуліну можна визначити у зразку тканини, узятій у пацієнта-кандидата. Якщо у зразку виявляють білок епірегуліну, то суб'єкт, від якого походить зразок, може бути суб'єктом, якому слід вводити терапевтичні агенти проти раку або агенти для пригнічення рецидиву або метастазу раку цього винаходу. Рівень експресії білка епірегуліну не обмежується певним числовим значенням, проте у необмежувальному варіанті здійснення його можна відповідним чином визначити з діапазону числових значень порядку 103, 107, 105, 105, 107 та 108. Як необмежувальний варіант здійснення рівень експресії білка епірегуліну, вибраний як будь-який один з наступного: 1 х 103,2 х 109, 3 х 103,4 х 103,5 х 103, 6 х 103,7 х 103,8х 103,9 х 103,1 х 107,2 х 105,3 х 107,4 х 107,5 х 105,6 х 107,7 х 105,8х 107,9 х 105,1 х 105,2 х 105,3 х 105,4 х 105,5 х 105,6 х 105,7 х 105,8 х 105,9 х 105,1 х 105,2 х 106, З х 106,4 х 106,5 х 105,6 х 106,7 х 105,8 х 105,9 х 106,1 х 107,2 х 107,3 х 107,4 х 107,5 х 107,6 х 107,7 х 107,83х107,9х 107,1 х 108,2 х 108, 3 х 108,4 х 108,5 х 108,6 х 108,7 х 108, 8 х 108 та 9 х 108, можна представити як переважний приклад числового значення (порогового значення), яке можна запровадити як стандартне значення для вибору суб'єктів, які отримують введення антитіла. Числові значення, згадані вище, можуть бути числовими значеннями, розрахованими до одного суттєвого розряду; та у цьому випадку, наприклад, рівень експресії ЕКЕС 1 х 108, розрахований до одного суттєвого розряду, може бути рівнем експресії ЕКЕС за будь-яким одним 3 0,5 х 103, 0,6 х 103,0,7 х 103,0,8 х 103,0,9 х 103,1,0 х 103,11 х 103,1,2 х 103,1,3 х 108, 1,4 х 103, якщо рахувати до двох суттєвих розрядів.

Зразки тканини

Термін "зразок тканини", що застосовується у цьому винаході, означає будь-який біологічний зразок, який можна отримати від індивідуума, рідину тіла (наприклад, кров, сироватку, плазму та

Зо спинномозкову рідину), тканинну культуру, тканинний зріз тощо. Зразки, одержані від суб'єктів, можна застосовувати як переважні приклади біологічних зразків. Переважні приклади зразків, одержаних від суб'єктів, - це тканини, отримані від суб'єктів, та більш переважно тканини товстої кишки від суб'єктів. Біопсію, відомий спосіб, переважно застосовують як спосіб узяття тканин товстої кишки. Відомі засоби можна відповідним чином застосовувати як засоби для біопсії. Такі приклади включають отримання тканин шляхом біопсії, такої як аспіраційна біопсія, захоплююча біопсія, скарифікаційна біопсія, біопсія для цитодіагностики, ендоскопічна біопсія, тонкоголюова прицільно-аспіраційна біопсія, пункційна біопсія, крізьбронхіальна легенева біопсія, або узяття тканин під час хірургічної операції.

У цьому винаході, оскільки зразки тканини досліджуються за допомогою заломленого світла під мікроскопом, то їх розрізають до такого ступеня, що світло, яке застосовується у мікроскопі, по суті проходить крізь тканинні зразки. Перед розрізанням зразки тканини фіксують.

Специфічно, зразки тканини ущільнюють за допомогою дегідруючих або денатуруючих білків у тканинах/клітинах, щоб швидко вбити клітини, що складають цю тканину. Отримані тканини мають стабілізовану та нерозчинну структуру. По-перше, зразки тканини, які слід зафіксувати, розрізають на фрагменти, які мають розмір та форму, придатні для отримання залитих парафіном зрізів, застосовуючи ніж, такий як скальпель. Після цього фрагменти занурюють у фіксуючий розчин, реагент, який застосовується для здійснення фіксації. Фіксуючий розчин, що застосовується, - це переважно формалін або більш переважно забуферний нейтральним буфером формалін. Концентрацію забуферного нейтральним буфером формаліну відповідним чином вибирають згідно з характеристиками або фізичними властивостями зразків тканини.

Концентрацію можна відповідним чином змінювати та застосовувати у діапазоні від 1 95 до 50 95, переважно від 5 95 до 25 95 та більш переважно від 10 95 до 15 95. Фіксуючий розчин, у який занурюють тканинні препарати, відповідним чином деаерується за допомогою вакуумного насоса. Фіксацію здійснюють, залишаючи зразки тканини у фіксуючому розчині протягом декількох годин при нормальному тиску та кімнатній температурі. Час, необхідний для фіксації, можна відповідним чином вибрати у діапазоні від 1 години до 7 днів, переважно від 2 годин до З днів або переважно від З годин до 24 годин та більш переважно від 4 годин до 16 годин.

Зафіксовані зразки далі відповідним чином занурюють у фосфатний буфер або йому подібне на декілька годин (час можна відповідним чином вибрати у діапазоні від 2 годин до 48 годин, 60 переважно від З годин до 24 годин та більш переважно від 4 годин до 16 годин).

Далі, із зафіксованих тканинних зразків можна отримати зрізи за допомогою способу розрізання в замороженому стані або способу розрізання з парафіном. Переважні приклади способу розрізання в замороженому стані включають спосіб, при якому тканин заморожують внаслідок розташування їх на сполуці О.С.Т. (Міев5. Іпс.), та заморожені тканини розрізаються із застосуванням Сгуовзіаї (пристрій для отримання заморожених зрізів). У способі розрізання з парафіном зафіксовані зразки тканини занурюють в охоплюючу речовину, потім їх фіксують, щоб тим самим відрізки набули однорідності та відповідної твердості. Парафін можна переважно застосовувати як охоплюючу речовину. Фіксовані зразки тканини дегідрують, застосовуючи етанол. Специфічно, зразки тканини дегідрують шляхом послідовного занурення зразків тканини у 70 95 етанол, 80 95 етанол та 100 95 етанол. Час та кількість разів, які необхідні для занурення, можна відповідним чином вибрати у діапазоні від 1 години до декількох днів та від одного разу до трьох разів, відповідно. Крім того, занурення можна виконувати при кімнатній температурі або при 4 "С. Для занурення при 4 "С переважним є більш тривалий час занурення, наприклад, протягом ночі. Після цього рідку фазу заміщують ксиленом, а потім зразки тканини заливають парафіном. Час, необхідний для заміщення рідкої фази ксиленом, можна вибрати відповідним чином у діапазоні від 1 години до декількох годин. Під час цієї процедури заміщення можна виконувати при кімнатній температурі або при 4 "С. Для заміщення при 4 "С переважно застосовувати триваліший час заміщення, наприклад, протягом ночі. Час та кількість разів, необхідних для поміщення в парафін, можна відповідним чином вибрати у діапазоні від 1 години до декількох годин та від одного разу до трьох разів, відповідно. Під час цієї процедури поміщення можна виконувати при кімнатній температурі або при 4 "С. Для поміщення при 4 "С переважно застосовувати триваліший час поміщення, наприклад, протягом ночі. Крім того, зразки тканини можна помістити в парафін переважно за допомогою пристрою для поміщення в парафін (наприклад, ЕС1160, І еіса), який автоматично здійснює реакцію поміщення в парафін.

Поміщені в парафін зразки тканини, як описано вище, приєднуються до основи, щоб отримати "блок", який потім розрізається за допомогою мікротома до бажаної товщини, вибраної з товщин від 1 мкм до 20 мкм. Тонко нарізані зрізи тканини залишають на предметному склі, яке застосовується як прозора основа для зв'язування. У цьому випадку предметне скло, покрите 0,01 95 полі-І-лізином (бЗідта) та висушене, можна також

Зо застосовувати переважно для того, щоб попередити відшарування зрізів тканини. Зафіксовані зрізи тканини висушуються на повітрі протягом відповідного періоду часу, вибраного у діапазоні від декількох хвилин до години.

Демаскування антигену

У способі цього винаходу реактивність антигену, реактивність антитіла якого була знижена внаслідок фіксації формаліном, відновлюють. У цьому винаході спосіб індукованого протеазою демаскування епітопу (спосіб РІЕК) застосовується до одного з двох зразків тканини, у той час, коли спосіб індукованого теплом демаскування епітопу (спосіб НІЕК) застосовується до іншого зразка. Після цього різниця у ступені забарвлення між ними після реакції антитіла виражається у цифрах.

Спосіб індукованого теплом демаскування епітопу відповідним чином застосовує спосіб мікрохвильового нагрівання, спосіб нагрівання в автоклаві, спосіб нагрівання кип'ятінням або їм подібне. Коли кип'ятіння здійснюється з потужністю 780 Вт, щоб підтримувати температуру розчину при приблизно 98 "С, тоді час, необхідний для демаскування, яке включає цю обробку, відповідним чином вибирається у діапазоні між 5 та 60 хвилинами та, наприклад, становить 10 хвилин. Обробку для демаскування антигену можна виконувати у 10 мМ буфері з цитрату натрію, а також у комерційно доступному розчині для демаскування мішені (Тагдеї Кеїгіємаї зоІшіоп) (ШаКоСуюптаїййоп) тощо. У Прикладах, описаних далі, застосовується розчин Тагеї

Кеїгіема! Зоїшіоп. Будь-який буфер або водний розчин переважно застосовується, доки епітоп в антигені, який розпізнається антитілом проти епірегуліну, не набуде зв'язування з антитілом, як наслідок обробки для демаскування, так що описаний далі комплекс антигену-антитіла можна виявити.

Тип або походження протеази, яка застосовується в у способі індукованого протеазою демаскування епітопу, особливо не обмежується, та зазвичай доступну протеазу можна відповідним чином вибрати та застосовувати. Переважні приклади протеази, яку слід застосовувати, включають 0,05 95 пепсин у 0,01 М хлористоводневій кислоті, 0,1 96 трипсин, який далі містить 0,01 95 Сасі» у буфері Ттгі5 при рН 7,6, та від 1 до 50 мкг/мл протеази К у 10 мм буфері Тгіб-НСІ при рН 7,8, який містить 10 мМ ЕОТА та 0,595 505. Крім того, коли застосовується протеаза К, тоді рН її реакційного розчину відповідним чином вибирається у діапазоні від 6,5 до 9,5, та відповідним чином можна застосовувати реагент 5Н, інгібітор 60 трипсину або інгібітор хімотрипсину. Протеазу, додану до набору Нізіоїпе НЕКЗ2 Кії (МОМО)

(Міспігеії Віозсіепсе), описану у цьому описі винаходу у Прикладах, також включено до таких специфічних прикладів переважної протеази. Індуковане протеазою демаскування епітопу зазвичай виконують при 37 "С. Проте, температуру реакції можна відповідним чином змінити у діапазоні від 25 "С до 50 "С. Коли індуковане протеазою демаскування епітопу виконується при 37 "С, тоді час реакції відповідним чином вибирається у діапазоні, наприклад, від 1 хвилини до 5 годин, та, наприклад, становить 15 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 2 години, З години або 4 години. Після завершення обробки для демаскування оброблені зразки тканини промивають буфером для промивання. РВЗ (фосфатно-сольовий буферний розчин) переважно застосовують як буфер для промивання. Крім того, можна переважно застосовувати буфер Ттів5-

НС. Умови промивання зазвичай відповідають способу, при якому промивання виконується протягом 5 хвилин при кімнатній температурі З рази. Проте, час промивання та температуру можна змінити відповідним чином.

Речовини для виявлення, які застосовуються у цьому винаході, зазвичай включають антитіла, нуклеїнові кислоти тощо. Наприклад, можна (1) виявити білок ЕКЕС імунологічним способом, застосовуючи антитіла ЕКЕС, які можуть виявляти білок ЕКЕС, та (2) виявити МРНК, що кодує ЕКЕС, застосовуючи молекулу нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК, РНК або мРНК), яка є комплементарною до мРНК, що кодує ЕКЕС, яка може виявляти мРНК, або застосовуючи молекулу комплементарної нуклеїнової кислоти, де під час детекції застосовується гібридизація між залученими молекулами нуклеїнової кислоти (наприклад спосіб РІЗН). У цьому винаході переважно застосовуються імунологічні способи, особливо, спосіб імуногістологічного забарвлення.

Реакція зразків тканини з антитілом епірегуліну

Зразок тканини, який піддавався обробці для демаскування антигену на основі способу індукованого теплом демаскування епітопу, та зразок тканини, який піддавався обробці для демаскування антигену на основі способу індукованого протеазою демаскування епітопу, реагують з антитілом епірегуліну як первинним антитілом. Цю реакцію здійснюють в умовах, відповідних для розпізнавання епітопу в антигені антитілом епірегуліну та для утворення комплексу антигену-антитіла. Реакцію зазвичай здійснюють протягом ночі при 4 "С або при 37 "С протягом однієї години. Проте, умови реакції можна змінити відповідним чином у

Зо діапазоні, придатному для розпізнавання антитілом епітопу в антигені та для утворення комплексу антигену-антитіла. Наприклад, температуру реакції можна змінити у діапазоні від 4 С до 50 "С, та час реакції можна змінити у діапазоні від 1 хвилини до 7 днів. Коли реакцію здійснюють при низькій температурі, тоді переважним є подовжений час реакції. Після завершення реакції з первинним антитілом зразки тканини промивають буфером для промивання. РВЗ (фосфатно-сольовий буферний розчин) переважно застосовують як буфер для промивання. Крім того, можна переважно застосовувати буфер Тті5-НСЇ. Умови промивання зазвичай відповідають способу, при якому промивання виконується протягом 5 хвилин при кімнатній температурі З рази. Проте, час промивання та температуру можна змінити відповідним чином.

Після цього зразки тканини, які зазнали реакції з первинним антитілом, піддають реакції з вторинним антитілом, яке розпізнає первинне антитіло. Зазвичай застосовується вторинне антитіло, мічене заздалегідь речовиною для мічення для візуалізації вторинного антитіла.

Переважна речовина для мічення включає: флуоресцентні барвники, такі як флюоресцеїну ізотіоціанат (РІТС), Су2 (Атег5Ппат) та АїЇеха488 (МоїІесшіаг Ргобре5); ферменти, такі як пероксидаза та лужна фосфатаза; та колоїдне золото.

Реакцію з вторинним антитілом здійснюють при умовах, які відповідають утворенню комплексу антиген-антитіло між антитілом епірегуліну та вторинним антитілом, яке розпізнає антитіло епірегуліну. Реакцію зазвичай здійснюють при кімнатній температурі або при 37 С протягом від 30 хвилин до 1 години. Проте, умови реакції можна відповідним чином змінити у діапазоні, придатному для утворення антитілом епірегуліну та вторинним антитілом комплексу антиген-антитіло. Наприклад, температуру реакції можна змінити у діапазоні від 4 "С до 50 "С,а час реакції можна змінити у діапазоні від 1 хвилини до 7 днів. Коли реакцію здійснюють при низькій температурі, тоді переважним є подовжений час реакції. Після завершення реакції з вторинним антитілом зразки тканини промивають буфером для промивання. РВЗ (фосфатно- сольовий буферний розчин) переважно застосовують як буфер для промивання. Крім того, можна переважно застосовувати буфер Тгіз-НСІ. Умови промивання зазвичай відповідають способу, при якому промивання виконується протягом 5 хвилин при кімнатній температурі З рази. Проте, час промивання та температуру можна змінити відповідним чином.

Після цього зразки тканини, які піддавалися реакції з вторинним антитілом, піддають реакції бо з речовиною для візуалізації речовини для мічення. Коли пероксидазу застосовують як речовину для мічення для вторинного антитіла, тоді зразки тканини інкубують з реакційним розчином, отриманим шляхом змішування, безпосередньо перед інкубацією, рівних кількостей 0,02 956 водного розчину пероксиду водню та розчину САВ (діамінобензидину), концентрацію якого доведено до 0,1 95 за допомогою 0,1 М буферу Тгіб5-НСЇІ (рН 7,2). Окрім САВ відповідним чином можна вибрати хромогенні субстрати, такі як ПОАВ-Мі та АЕС-- (усі від ОАКО). Під час інкубування ступень розвитку кольору з часом спостерігають під мікроскопом. У точці, де підтверджується відповідний ступень розвитку кольору, реакція візуалізації припиняється шляхом занурення зразків тканини у РВ5.

Коли лужну фосфатазу застосовують як речовину для мічення для вторинного антитіла, тоді зразки тканини інкубують з розчином субстрату ВСІР (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл росфат)/МВтТ (нітро-блакитний тетразол) (7утеа) (МВТ у концентрації 0,4 мМ та ВСІР у концентрації 0,38 мМ розчиняють у 50 мМ буфері з карбонату натрію (рН 9,8), який містить 10 мМ Маосі» та 28 мМ масі). Крім того, окрім ВСІР та МВТ відповідним чином можна застосовувати Репгтапепі Кеа,

Базі Кей або Риспбіпя (усі від ЮОАКО). До інкубування зразки тканини можна попередньо інкубувати при кімнатній температурі протягом від 1ї хвилини до декількох годин з 0,1 М буфером Тті5-НСЇІ (рН 9,5), який містить 0,1 М хлорид натрію, 50 мМ хлорид магнію та хлорид левамізолю, який є інгібітором ендогенної лужної фосфатази (Масаїаї Тездиє), при концентрації 1 мМ. Під час інкубування зразки тканини протягом часу спостерігають під мікроскопом. У точці, коли спостерігаються відкладення пурпурного формазану, кінцевого продукту реакції, реакцію припиняють шляхом промивання зразків тканини водою або шляхом додавання ТВ5, що містить 2 Фо полівініловий спирт. Після цього зразки тканини промивають ТВ5Т (ТВ5, що містить 0,1 95

Тмееп 20). Коли колоїдне золото застосовують як мітку для вторинного антитіла, тоді колоїдне золото візуалізують шляхом приєднання металевого срібла до частинок золота шляхом збагачення сріблом. Спосіб збагачення сріблом відомий для фахівців у галузі.

Коли будь-який один з флуоресцентних барвників, такий як РІТС (флюоресцеїну ізотіоціанат), Су2 (Атегзпат) та АІеха488 (МоїІесшаг Ргобев, Іпс.), застосовується як речовина для мічення для вторинного антитіла, тоді етап реакції візуалізації речовини не є обов'язковим.

Світло, що випускається внаслідок випромінювання світлом при довжині хвилі збудження флуоресцентної речовини, можна виявити відповідним чином, застосовуючи флуоресцентний

Зо мікроскоп.

У цьому винаході білок епірегуліну, який міститься у зразках тканини, узятих від суб'єктів тесту, виявляється так, як описано вище. За допомогою показників інтенсивності забарвлення, які перетворюють у цифрову форму картини забарвлення, отримані за допомогою вищезгаданого способу імуногістологічного забарвлення, можна визначити, чи надзвичайно експресується виявлений білок епірегуліну, який міститься у зразках тканини, у тканинах, що містять ракові клітини. Наступні критерії можна навести як приклади необмежувального варіанта здійснення перетворення у цифровий формат картин забарвлення: - показник інтенсивності забарвлення 0: жодні клітини або менш ніж 10 95 пухлинних клітин у протестованій тканині - це епірегулін-позитивні клітини; - показник інтенсивності забарвлення 1: епірегулін-позитивні клітини нараховують 10 95 або більше пухлинних клітин у протестованій тканині, проте вони мають слабку інтенсивність забарвлення, яка локалізується на частині мембрани пухлинної клітини; - показник інтенсивності забарвлення 2: епірегулін-позитивні клітини нараховують 30 95 або більше пухлинних клітин у протестованій тканині, або епірегулін-позитивні клітини нараховують 1095 або більше пухлинних клітин у протестованій тканині та мають помірну інтенсивність забарвлення, яка локалізується на мембрані пухлинної клітини; та - показник інтенсивності забарвлення 3: епірегулін-позитивні клітини нараховують 60 95 або більше пухлинних клітин у протестованій тканині, або епірегулін-позитивні клітини нараховують 1095 або більше пухлинних клітин у протестованій тканині та мають сильну інтенсивність забарвлення, яка локалізується на мембрані пухлинної клітини.

Крім того, у цьому винаході при визначенні рівня експресії епірегуліну у зразках тканини, узятих у суб'єкта тесту, на основі показників інтенсивності забарвлення, які перетворюють у цифровий формат картини забарвлення, отримані за допомогою способу імуногістологічного забарвлення, який описано вище, його можна порівняти із зображеннями картин забарвлення для попередньо визначених рівнів експресії білка епірегуліну, приготованого для корекції визначення. Для того, щоб визначити рівень експресії білка епірегуліну, можна відповідним чином застосовувати відомий спосіб, при якому застосовуються флюоресцентно мічені гранули, які застосовуються для отримання кривої градуювання для кількісного аналізу антигену (наприклад, ВО Оцапіїбгіе РЕМ). 60 Можна визначити за допомогою вищезгаданого способу, чи експресується надзвичайно або не експресується епірегулін, що міститься у зразку тканини, узятому у суб'єкта тесту. Приклади "надзвичайної експресії" можна відповідним чином вибрати з діапазону 1 х 107,2 х 104, 3 х 104, 4х 107,5 х 105,6 х 107,7 х 107,8х 105,9 х 107,1 х 105,2 х 105, 3 х 105,4 х 105,5 х 105,6 х 105, 7 х 105,8 х 105,9 х 105,1 х 105,2 х 106, 3 х 105,4 х 105,5 х 106,6 х 105,7 х 106, 8 х 105,9 х 106, 1х107,2х10/,3х 107,4 х 107,5 х 107,6 х 107,7 х 107,8 х 107 та 9 х 107 у термінах кількості молекул епірегуліну, які експресуються на одній клітині.

Усі посилання з попереднього рівня техніки, процитовані у цьому описі, включено у цей опис винаходу шляхом посилання.

Приклади

Далі у цьому описі винаходу цей винахід буде більш специфічно описано за допомогою

Прикладів, проте винахід не обмежується ними.

Приклад 1. Гуманізація химерного антитіла ЕР27 1-1. Вибір каркасних послідовностей для гуманізації

Химерне антитіло ЕР27 (описане у УМО2008/047723), яке включає варіабельні ділянки миші та константні ділянки (91 людини, гуманізували. СОК та ЕК визначили згідно з визначенням за

Кабаї (нумерація за Кара).

По-перше, послідовності варіабельної ділянки антитіла людини та послідовності варіабельної ділянки ЕР27 миші порівняли на базах даних, щоб вибрати послідовності ЕВ людини, які перелічено нижче та які можна застосовувати як матрицю гуманізації. Базу даних

ІМОТ Баїаразе (пер:/Лимли.йтокого/) та МСВІ СепВапк (пЕр/Лумли.пебі.піт. пін. дом/депрапк/) застосовували як бази даних. Вибрані послідовності ЕК наведено у Таблиці 2.

Таблиця 2

Каркас 00000000 Момерлоступу 0 Назвабазадянихїо ЗБОЮ МО

Н ланицютг ЕК І Мме9642 | ІМОТ Рагаравзе 1 оНланшюгЕвО 00122583 0000 1мМатоОаєїравеїд/0200000000000с

Н ланцюг ЕКЗ АІ252274 МСВІ СепВапк ' З

Н ланцюг ЕКЯ 4002556 ІМОт Рагаравзе 4 о Бланшюг ЕК! 0 МбЯ856 00000 ІмМОтТОавравеїо005 у

Ї. ланцюг ЕКО хо1668 мот рагабаве в

Бланшює ККЗ 000 МбЯ856 000 1МОтТОаававеїд/07000000

Ї. ланцюг ЕКЯ ч00242 ІМОТ Раїабазе 8

Після цього послідовності варіабельної ділянки гуманізованого антитіла побудували шляхом з'єднання послідовностей ланцюгів СОМ (Таблиця 3, 5ЕО ІО МО: від 9 до 14) Н- та 1- варіабельної ділянки ЕР27 з вибраними вище ЕЕ людини. Їх назвали як гуманізовану НА послідовність варіабельної ділянки Н-ланцюга (ЗЕО ІО МО: 15) та гуманізовану ГА послідовність варіабельної ділянки І -ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 16).

Таблиця З ке ук пл

Н ланцює СОВІ З

Алею СВІ ТВ о Нлащшює СОКУ ТІ сбланню СОВОЇОІ В сгланню СОВЗЇД ТЯ

Зо 1-2. Побудова варіабельної ділянки Ну гуманізованого ЕР27

Повідомляється, що у послідовності ЕК! Н-ланцюга, вибраній у Таблиці 2, амінокислотні залишки на позиціях 2, 4, 24, 27 та 29, згідно з нумерацією за Кабаї, сприяють стабілізації структури антитіла внаслідок утворення верхньої серцевини (Емегі еї аїЇ., Меїпоад5. 2004 Ос

З4(2): 184-99). Згідно з визначенням Споїпіа амінокислотні залишки на позиціях від 26 до 30, згідно з нумерацією за Кабаї, включені у СОК1 (Нопеддег еї аї., У. Мої. Віої. (2001) 309, 657-670).

На основі вищезгаданої інформації для того, щоб отримати гуманізоване антитіло, яке має активність зв'язування з антигеном, еквівалентну активності зв'язування з антигеном химерного антитіла ЕР27, вищезгадані амінокислотні залишки відновили до залишків, присутніх у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27. Отже, гуманізовану ЕК1 Н-ланцюга (Таблиця 4,

ЗЕО ІО МО: 17) знов побудували шляхом відновлення амінокислотних залишків на позиціях 2, 24, 27, 28, 29 та 30, згідно з нумерацією за Кабаї, у ЕК1 Н-ланцюга людини (ЗЕО ІЮО МО: 1), вибраній у Таблиці 2, до амінокислотних залишків, присутніх у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27.

Амінокислотний залишок на позиції 93, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності ЕКЗ Н- ланцюга, вибраній у Таблиці 2, - це Аа, тоді як цей залишок у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27 - це Ма). На основі бази даних ІМСТ БОаїаразе (пир:/Лимли. тої. ога/) послідовностей зародкових ліній людини та миші переконалися, що тільки невелика кількість послідовностей містить Ма! на відповідній позиції. Вважають, що Маї на позиції 93, згідно з нумерацією за Кабраї, у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27 залучається до зв'язування антигену. Отже, гуманізовану ЕКЗ Н-ланцюга (Таблиця 4, 5ЕО ІЮО МО: 18) знов побудували шляхом заміщення амінокислотного залишку на позиції 93, згідно з нумерацією за

Кабаї, у ЕКЗ Н-ланцюга людини (ЗЕО ІЮО МО: 3), вибраній у Таблиці 2, залишком, присутнім у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27.

З гуманізованої послідовності НА варіабельної ділянки Н-ланцюга (ЗЕО ІЮО МО: 15) знов побудували гуманізовану послідовність Н.) варіабельної ділянки Н-ланцюга (ЗЕО ІЮО МО: 19), яка включає ЕКІ (Таблиця 4, ЗЕО ІЮО МО: 17) та ЕКЗ (Таблиця 4, 5ЕО ІО МО: 18), які було знов побудовано та наведено у Таблиці 4.

Таблиця 4 о Змінена ЕК. СО 5ЕОТО МО

Н ланцюг ЕКІ 117

Н ланцюг ККЗ 18 1-3. Побудова варіабельних ділянок І В та І 18 гуманізованого ЕР27

Амінокислотний залишок на позиції 49, згідно з нумерацією за Кабаї, у послідовності ЕКЗ І- ланцюга, вибраній у Таблиці 2, - це Туг, тоді як цей залишок у послідовності ЕР27 варіабельної ділянки миші - це іп. На основі бази даних ІМСТ Оаїаразе (Нир/Лумли.ітаї.ого/) послідовностей зародкових ліній людини та миші переконалися, що тільки невелика кількість

Зо послідовностей містить Сіп на відповідній позиції. Це дозволяє припустити, що Сіп на позиції 49, який міститься у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27, залучається у зв'язування з антигеном. На основі цього гуманізовану ЕК2 І-ланцюга (Таблиця 5, 5ЕО ІЮО МО: 20) знов побудували шляхом заміщення амінокислотного залишку на позиції 49, згідно з нумерацією за

Караї у ЕК2 І-ланцюга людини (5ЕО І МО: 6), вибраній у Таблиці 2, амінокислотним залишком, присутнім у послідовності ЕР27 варіабельної ділянки миші.

Повідомляється, що у послідовності ЕКЗ І -ланцюга, вибраній у Таблиці 2, амінокислотний залишок на позиції 71, згідно з нумерацією за Кабаї, сприяє стабілізації структури антитіла внаслідок утворення верхньої серцевини (Ем'егїі еї аіІ., Ме(Шоаз. 2004 Ос 34(2): 184-99). Для того, щоб отримати гуманізоване антитіло, яке має активність зв'язування з антигеном, еквівалентну активності зв'язування з антигеном химерного антитіла ЕР27, щоб замістити вищезгаданий амінокислотний залишок амінокислотним залишком послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27, знов побудували гуманізовану ЕКЗ І -ланцюга (Таблиця 5, 5ЕО ІЮО МО: 21) шляхом заміщення амінокислотного залишку на позиції 71, згідно з нумерацією за Кабаї, у ЕКЗ

Ї-ланцюга людини (5ЕО ІЮ МО: 7), вибраній у Таблиці 2, амінокислотним залишком у послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27.

З гуманізованої послідовності ГА варіабельної ділянки І-ланцюга (ЗЕБЕО ІЮ МО: 16) побудували гуманізовану послідовність І В варіабельної ділянки І -ланцюга (ЗЕО ІО МО: 22), яка включає знов побудовані ЕК2 та ЕКЗ (Таблиця 5, ЗЕО ІЮО МО: 20 та 21).

Крім того, з гуманізованої послідовності ГА варіабельної ділянки І -ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 16) побудували гуманізовану послідовність І 18 варіабельної ділянки І-ланцюга (ЗЕО ІЮ МО: 24), яка включає знов побудовані ЕК2 (Таблиця 5, ЗЕО ІЮО МО: 20) та ЕКЗ послідовності І -ланцюга антитіла людини (Таблиця 5, 5ЕО ІЮ МО: 23), наведену за номером доступу Ассевзвіоп Мо.

АВОб4134 (МСВІ СепВапк).

Таблиця 5

Н ланнюг ЕКО 2о

Н ланцюг ККЗ 21

Н ланцює ЕКЗ а 1-4. Отримання послідовності гуманізованого антитіла ЕР27

По-перше, для того, щоб отримати кКДНК варіабельної ділянки гуманізованого ЕР27, для ланцюгів Н (Н.)) та І (18) побудували синтетичні оліго-ДНК. Після цього синтетичні оліго-ДНК змішали, щоб ампліфікувати фрагмент гена, який кодує варіабельну ділянку гуманізованого антитіла ЕР27, за допомогою способу, відомого фахівцям у галузі, таким як ПЛР зборка.

Зрештою, ампліфікований фрагмент клонували у відповідний вектор експресії тваринної клітини та зшили з геном константної ділянки ЇД01 людини. Нуклеотидну послідовність отриманого вектора експресії визначили за способом, відомим фахівцям у галузі.

Для гетерогенності, яка походить від С-кінцевої послідовності (51, ЗЕО ІЮ МО: 25) Н- ланцюга антитіла (9 людини, повідомлялося про видалення залишку лізину з С-кінцевої амінокислоти та амідування С-кінцевої аміногрупи внаслідок видалення двох С-кінцевих амінокислот, гліцину та лізину (Апа! Віоспет. 2007 дап 1; 360(1): 75-83.). Як спосіб для зниження гетерогенності відомий спосіб, при якому видаляються дві амінокислоти на С-кінці Н-ланцюга, а саме, гліцин на позиції 446 та лізин на позиції 447, згідно з нумерацією БЮ (МУО 2009/041613).

Бажано, щоб гетерогенність, яка походить з С-кінцевої послідовності Н-ланцюга, була також відсутньою від гуманізованого антитіла ЕР27. Отже, послідовність ЇдСе1 (14, 5ЕО ІО МО: 26), у якій не вистачає гліцину на позиції 446 та лізину на позиції 447, згідно з нумерацією ЕЕ), в Ід1 людини можна застосовувати як послідовність константної ділянки. З іншого боку, природний ланцюг к людини (К, 5ЕО ІЮ МО: 27) можна застосовувати як послідовність константної ділянки

Ї-ланцюга. НуУ-сСтТа (ЗЕ ІЮ МО: 28) та І В-К (5ЕО ІО МО: 29) отримали відповідно як Н-ланцюг та І-ланцюг для послідовності гуманізованого антитіла ЕР27, отриманого так, як описано вище.

Повідомлялося про алотипи для константної ділянки Ідс1 (УЧеПегі5 еї аї.,, тАБ5 14, 1-7;

Зшу/АчЧдиві 2009). Окрім вищезгаданої константної ділянки типу 31т117,1 (5ЕО ІЮО МО: 26) ІдДО1, типи 51т17 (5БО ІЮ МО: 30) та с1т3 (5ЕБО ІЮ МО: 31) можна застосовувати для отримання гуманізованого антитіла ЕР27. 1-5. Оцінка гуманізованого антитіла ЕР27

Для того, щоб оцінити побудовану послідовність гуманізованого антитіла ЕР27, Н-ланцюг

Зо (НО-стТа, 5ЕО І МО: 28) та І -ланцюг (І8-К, ЗЕО ІО МО: 29) спільно експресували, щоб отримати НУ-СтТа/л В-к гуманізованого антитіла ЕР27. Специфічно, вектори експресії Н- та І1- ланцюгів, отримані так, як описано вище, довільно трансфектували у штам НЕК2ОЗН, який походить з клітин карциноми ембріональної нирки людини (Іпмйгодеп), або у клітини

Егеебзіуїе293 (Іпмігодеп), щоб експресувати антитіла. Отримані з надосадової культуральної рідини антитіла очистили за способом, відомим фахівцям у галузі, застосовуючи Ргоїевеіп А

Зерпагозе"М Разі Ріому (ЗЕ Неапйсаге) або йому подібне. Абсорбцію розчину, що містив антитіло, вимірювали при довжині хвилі 280 нм, застосовуючи спектрофотометр, та концентрацію антитіла розрахували, застосовуючи виміряну абсорбцію та коефіцієнт абсороції, визначений за способом РАСЕ (Ргоївїіп бсіепсе 1995; 4: 2411-2423). Між тим, сН-С1/сі -К, яке є химерним антитілом ЕР27, отримали як контрольне таким самим способом, застосовуючи Н- ланцюг (СН-С1, ЗЕО ІО МО: 32) та І -ланцюг (с -К, 5ЕО ІЮ МО: 33).

Спроможність гуманізованого антитіла ЕР27 зв'язуватися з епірегуліном людини (ЗЕО ІЮ

МО: 167) оцінили, застосовуючи аналіз оцінки інгібування зв'язування епірегуліну (контрольний приклад 5) для химерного антитіла ЕР27. Якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сСН-С1/сІ -К) становила 100, то значення Н.)-с1а/І В-К гуманізованого антитіла ЕР27 становило 24. 1-6. Отримання гуманізованих антитіл ЕР27 з активністю, еквівалентною активності химерного антитіла

Послідовності побудували шляхом заміщення деяких амінокислотних залишків послідовності ЕК у Н.у-Сї14 послідовності Н-ланцюга гуманізованого антитіла ЕР27 амінокислотними залишками послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27. По перше, послідовність (ЗЕО ІЮ МО: 35) побудували шляхом заміщення ТПг-Азр, які є амінокислотними залишками на позиціях 75 та 76, згідно з нумерацією за Кабаї, послідовності ЕКЗ людини,

залишками Зег-Абп, які є амінокислотними залишками, що містяться у послідовностях варіабельної ділянки миші ЕР27; та послідовність (ЗЕО І МО: 36) побудували шляхом заміщення тільки Аб5р на позиції 76 залишком Авбп, який є амінокислотним залишком послідовності варіабельної ділянки миші ЕР27 (Таблиця 6). Після цього Н5-СТа (5ЕО І МО: 37), яка є гуманізованою послідовністю варіабельної ділянки Н-ланцюга, яка має послідовність

ЕВЗ (ЗЕО ІО МО: 35), наведену у Таблиці б, отримали шляхом введення мутації у вектор експресії, який включає гуманізовану послідовність Н.)-с14 варіабельної ділянки Н-ланцюга (ЗЕО ІО МО: 28). Заміщення амінокислотного залишку ввели способом, відомим фахівцям у галузі, застосовуючи ПЛР або їй подібне. Подібно до цього, отримали НУ-ст1а (5ЕО І МО: 38), яка є гуманізованою послідовністю варіабельної ділянки Н-ланцюга, яка включає послідовність

ЕКЗ (5ЕО ІЮО МО: 36), наведену у Таблиці 6. Гуманізовані антитіла ЕР27, НЗ-СТа/І В-К, НУ-

Ста в-к та НУ-Ста/ 18-К, отримали таким самим способом, як і у Прикладі 1-4. Спроможність отриманих антитіл зв'язуватися з епірегуліном людини визначили шляхом інгібування зв'язування епірегуліну з химерним антитілом ЕР27 (контрольний приклад 5). Внаслідок цього, якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К) становила 100, то концентрація

ІС50 гуманізованих антитіл ЕР27, НЗ-СТал в-к, НУ-ста/л В-К та НУу-ста/І 18-К, становила 142, 146 та 100, відповідно.

Отже, в результаті гуманізації було визначено послідовності гуманізованого антитіла ЕР27, які мають спроможність зв'язуватися з антигеном, еквівалентну до спроможності зв'язуватися з антигеном химерного антитіла ЕР27, а також знижений ризик імуногенності порівняно з химерним антитілом ЕР27.

Таблиця 6

Н ланцюг ККЗ Зв

Н ланцюг ЕКЗ 36

Приклад 2. Введення мутацій, які пригнічують дезамідування, ізомеризацію та реакцію гідролізу

В антитілах, які застосовуються для фармацевтичних засобів, існує гетерогенність, хоча вони і є моноклональними антитілами, отриманими з клонів, які походять від єдиної клітини, яка виробляє антитіла. Відомо, що така гетерогенність антитіл виникає внаслідок модифікацій, таких як окиснення, дезамідування, ізомеризація та гідролізу, та вона підвищується, коли білки,

Зо які включають антитіла, зберігаються протягом тривалого часу або зазнають впливу критичних умов, таких як дія тепла та дія світла (Неїегодепейу ої Мопосіопа! Апііродіев: Уоигпа! ої

Ріпаптасешіса! бсіеєпсев, моіІ.97, Мо.7, 2426-2447). Проте, фізичні властивості білків, зокрема, гетерогенність та стабільність, є дуже важливими для виготовлення антитіл як фармацевтичних засобів. Бажано, щоб гетерогенність речовини, яка представляє інтерес, була зниженою, щоб отримати максимально можливий однорідний матеріал.

Реакція дезамідування виникає незалежно від ферментів у бічних ланцюгах аспарагіну та глютаміну, та вона є реакцією, яка змінює амід, присутній у бічних ланцюгах аспарагіну та глютаміну, на карбонову кислоту. Ізомеризація - це результат утворення нестабільного циклічного імідного інтермедіату внаслідок дезамідування аспарагіну або дегідрування аспарагінової кислоти, спричинених атакою електронної пари атому азоту на залишку з С- кінцевої сторони на карбонільних групах у бічних ланцюгах аспарагіну та аспарагінової кислоти.

Цей інтермедіат здебільшого перетворюється на ізоаспарагінову кислоту внаслідок розщеплення, проте решта перетворюється в аспарагінову кислоту. Бажано, щоб дезамідування та реакція ізомеризації, які виникають під час зберігання білків, таких як антитіла, пригнічувалися якомога сильніше, оскільки вони стають причиною вищезгаданої гетерогенності.

Повідомляється, що реакція дезамідування має тенденцію виникати особливо на ділянці, де гліцин та аспарагін є прилеглими один до одного (Азп-Сіу) (Ссїдег єї аї., 9. Віої. Спет. 1987; 262: 785-794). Крім того, повідомляється, що пептидний ланцюг аспарагінової кислоти розщеплюється внаслідок реакції гідролізу; та, зокрема, послідовність (А5р-Рго), де пролін є присутнім на С-кінцевій стороні, ймовірно буде розпадатися при кислотних умовах (Зедаїав5 єї а!І., РЕЕВ5 І ейегв 1995; 371: 171-175).

У послідовності СОК гуманізованої послідовності НУ варіабельної ділянки Н-ланцюга залишки аспарагіну та аспарагінової кислоти є присутніми на позиціях 31 (А5р), 52 (Ар), 54 (Ап), 56 (Авп) та 101 (Ар), згідно з нумерацією за Кабаї. У послідовності СОК гуманізованої послідовності І В варіабельної ділянки І -ланцюга вони є присутніми на позиціях 28 (А5р), 92

(Ар) та 93 (Авп), згідно з нумерацією за Кабраї. Було досліджено, чи можна отримати варіанти, які пригнічують дезамідування, ізомеризацію та реакцію гідролізу, внаслідок заміщення амінокислотних залишків на цих ділянках.

Для того, щоб пригнітити вищезгадані реакції розпаду шляхом заміщення амінокислотних залишків, ці амінокислотні залишки замістили різними залишками. Специфічно, Н71-41а (5ЕО

ІО МО: 49), Н57-СТа (5ЕО І МО: 50), Нб1-С1а (ЗЕО І МО: 51), Нбб5-Ста (5ЕО І МО: 52), Нбб- ста (5ЕО ІО МО: 53), Нб7-сата (5ЕО І МО: 54), Н2г3-ст1а (ЗЕО ІЮ МО: 55) та Ні40о-СТа (5ЕО І

МО: 56) отримали як гени з Н-ланцюгами, які включають послідовності СОК (ЗЕО ІЮ МО: від 39 до 46), наведені у Таблиці 7. Подібно до цього, І 30-К (5ЕО ІЮ МО: 57) та І 32-К (5ЕО ІЮО МО: 58) побудували як гени з І -ланцюгами, які включають послідовності СОМ (5ЕО ІЮ МО: 47 та 48), наведені у Таблиці 7. Застосовуючи спосіб з Прикладу 1, вектор гена Н-ланцюга, введений із заміщеним залишком, експресували спільно з вектором ЇВ-К, щоб отримати гуманізовані антитіла ЕР27: Н71-СПЯа/Л В-К, Н57-Ср!т1а/л вВ-к, Нбт1-стал в-к, нб5-ста/л в-к, Ннбб-ата/ в-к, нНе?- саталв-к, Нг3-стал в-К та Н40-СТа/І В-К. Подібно до цього, вектор гена І -ланцюга, введений із заміщеним залишком, експресували спільно з вектором НУ-с1а, щоб отримати гуманізоване антитіло ЕР27, а саме НУ-Ста //32-К. Спроможність отриманих антитіл зв'язуватися з епірегуліном людини визначили як інгібування зв'язування епірегуліну з химерним антитілом

ЕР27 (контрольний приклад 5), та цей результат наведено у Таблиці 8. Це демонструє, що антитіла, які включають послідовності, наведені у Таблиці 7, мають зв'язувальну активність, еквівалентну до зв'язувальної активності химерного антитіла ЕР27. Отже, було визначено послідовності гуманізованих антитіл ЕР27 з пригніченим хімічним розпадом, таким як дезамідування та ізомеризація.

Таблиця 7 о(ВНазваваранта СОК Змінна СОЮ 0/0 5БОЮ МО

Н71 СОКІ1 Н-ланцюга | не. нь? СОКО Н-ланцюга 40 нбі1 СОВО Н-ланнюга 41 ньо СОВК2 Н-ланнюга аг неб СрВ2 Н-ланцюга аз не? СЕЗ Н-ланцюга | 4А4

ОН 00000000 сСОБ2Нсланцюво 14500000 на СОК2 Н-ланиюга 46 зо СОР І. -ланцюта 47 132 СОКЗ Г-ланшокга а4вВ

Таблиця 8 оВазванміневогознуних: 0 Конентрамя ТС5О рекет: и ШИ С

Тео: ИН ж

НеІ-41/Ц8-К та : неможу о 00000078 11111 нвееоуввжк в не?-с1/1Ц8-к 101 Е не ля Шк ЛІ нУ-Оо1/138-К 83 ! (концентрація ІС50: концентрація ІС50 кожного антитіла, якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К) становить 100).

Приклад 3. Введення мутацій, які змінюють ізоелектричну точку

Як спосіб регулювання періоду напіврозпаду антитіла у плазмі відомий спосіб, при якому

Зо модифікують амінокислотні залишки, представлені на поверхні молекули антитіла, щоб регулювати заряд на поверхні антитіла (М/02007/114319 та М/О2009/041543). Специфічно, відомо, що період напіврозпаду антитіла у плазмі можна подовжити шляхом зниження значення ізоелектричної точки (рі) антитіла. З іншого боку, відомо, що період напіврозпаду антитіла у плазмі можна скоротити шляхом підвищення ізоелектричної точки антитіла, щоб покращити проникнення антитіла у тканину (мМаїзійі еї аї., у. Віої. Кеди. Нотеовзі.Адепів.(2005) 19 (3-4), 105- 112; Рагагідде еї а!., У. Рнагтасої. Ехр. Тег. (1998) 286 (1), 548-554).

На підставі вищевказаного очікують, що гуманізоване антитіло ЕР27, ізоелектричну точку якого було змінено, матиме більш сильну протипухлинну активність внаслідок подовження періоду напіврозпаду у плазмі та покращеного проникнення у тканину. Отже, метою авторів цього винаходу було визначити амінокислотні залишки, які дозволяють регулювати фармакокінетику антитіла шляхом регулювання заряду на поверхні молекули антитіла, при цьому не впливаючи на активність зв'язування з антигеном та конформацію гуманізованого антитіла ЕР27. Специфічно, здійснювався пошук ділянок мутації, які б дозволили знизити ізоелектричну точку гуманізованого антитіла ЕР27 НУ-СТа/ В-К (Н-ланцюг, НУ-С1а, ЗЕО ІО МО: 38; та І-ланцюг, ЇВ-К, 5ЕБЕО ІЮ МО: 29), при цьому суттєво не знижуючи його інгібіторну активність зв'язуватися з антигеном.

Тривимірну модель гуманізованого антитіла ЕР27 НУу-с14а/І В-К застосовували для скринінгу залишків, які можуть змінити ізоелектричну точку варіабельної ділянки, при цьому суттєво не знижуючи зв'язування з епірегуліном. Специфічно, НЗ-СтТа (5ЕО ІЮ МО: 72), Н5-СтТа (ЗЕО І

МО: 73), Нб-СТа (5ЕО ІО МО: 74), Н7-ста (5ЕО І МО: 75), НВ-сата (5ЕБО І МО: 76), НО-Ста (ЗЕО ІО МО: 77), НТО-СТа (ЗЕО ІО МО: 78) та НЗ1-С14 (ЗЕО ІО МО: 79) побудували як гени Н- ланцюга, які включають одну або більше послідовностей СОК (5ЕБО ІЮ МО: від 59 до 71), наведених у Таблиці 9. Подібно до цього, Ї1-К (ЗЕО ІЮ МО: 80), 12-К (5ЕО І МО: 81), 112-К (ЗЕО ІО МО: 82), 120-К (5ЕО ІС МО: 83), 121-К (5ЕО ІО МО: 84) та 123-К (5ЕО ІО МО: 85) побудували як гени І-ланцюга, які включають послідовності СОМ, наведені у Таблиці 9.

Застосовуючи спосіб з Прикладу 1, вектор гена з Н-ланцюгом, введений із заміщеними залишками, експресували спільно з вектором І В-К, щоб отримати гуманізовані антитіла ЕР27: нз-атал в-к, н5»-сстал в-к, нб-сстал/л в-к, Н7-стал в-к, нг-ста/л в-к, Нео-ста/л в-к, НтТо-стал в-к та НЗ1-сС1а/Л 8-К. Подібно до цього, вектор гена з І-ланцюгом, введений із заміщеними

Зо залишками, експресували спільно з вектором НУ-с14, щоб отримати гуманізовані антитіла

ЕР27: НУ-аталт-к, ну-сетал2-кК, НУ-стал12-К та НУ-сСта/ 63-К. Спроможність отриманих антитіл зв'язуватися з епірегуліном людини оцінювали як інгібування зв'язування епірегуліну з химерним антитілом ЕР27 (контрольний приклад 5). Як результат, наведений у Таблиці 10, спроможність гуманізованих антитіл ЕР27 зв'язуватися з антигеном була еквівалентною до такої самої спроможності химерного антитіла ЕР27. Внаслідок вищезгаданого дослідження визначили послідовності гуманізованих антитіл ЕР27, ізоелектричну точку яких можна змінити.

Таблиця 9

Назва варіанта СОКУ/ЛЕКІ Змінена СОЮЕК 5ЕО ОО МО пн чТТТТтТТТТТтТтТтТнннш книєжиничТчТнТТТТтТтннТтчвТтТТТТннннннннн нЗ СОКО Н-ланцюга 559 но СОКО Н-ланцюга бо не СОВО Н-ланцюга 61

Н7 СОКО Н-ланцюга ба на СОК2 Н-ланцюга 8 но СОК2 Н-ланнюга | ва

НІ СОКО Н-ланцюга 5

НЗІ1 СОВ2 Н-ланцюга 66

СОБІ ланшют 67

СОБІ ланшюг 68 112 Ср І -ланцюга | б 120 СОБ1,СОК21І -ланцюга 67, 69 121. СОБІ, ЕКА І сланцюга 67, 70

СОКоіслантют 71

Таблиця 10 оНазваміеногоснтннла 0 Кплентращя МС5Ю ско пе:я М в: ПИ оніІ-ОС14/ЦВ-К од насіалч н-к :99

ВО и: я ЗИМ онзралвк В поет нини ши

Оси еле НИ ОМ о НнУ-сС1а /021-ї 98 ес еке СІ (концентрація ІС50: концентрація ІС50 кожного антитіла, якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К) становить 100).

Приклад 4. Введення мутацій, які зменшують кількість агрегату

Контролювати кількість агрегату у білюоових фармацевтичних засобах дуже важливо з точки зору контролю якості та впливу на ефективність та імуногенність (Сиїгт. Оріп. Віоїесппої!. (2009) 20 (6), 708-714). Зазвичай, утворення агрегату зумовлюється як колоїдною стабільністю, на яку впливає оточення білкового розчину, так і конформаційною стабільністю, на яку впливає структура білка (У. Ріагт. сі. (2010) 100 (4), 1306-1315). Згідно з дослідженнями щодо технології виготовлення фармацевтичних складів препаратів з антитілом можна отримати бажані умови, які є ефективними для колоїдної стабільності, за допомогою скринінгу концентрації антитіла, рН, типу буферу, іонної сили, домішок тощо. З іншого боку, конформаційна стабільність частково залежить від амінокислотних послідовностей; та, отже, у випадку з антитілами її вважають важливою для підтримки характерних структур, таких як канонічна структура СОК, консенсусна структура ЕК та взаємодія МНЛ/І. (дипо еї аї., У. Мої. Віої. (2001) 309 (3), 701-716; Хіапо еї аї., У. Мої. Віої. (1995) 253 (3), 385-390; Ємеп еї а!., Метод.

(2004) 34 (2), 184-199; Магдаб5-Майга?о еї аї., У. Мої. Несодпії (2003) 16 (3), 113-120; Могеа їі аї.,

У. Мої. Віої. (1998) 275, 269-294; Магда5-Маайга?о вї аї., у). Мої. Несодпії. (2003) 16 (3), 113-120).

З точки зору вищевказаного, у цьому винаході побудову здійснювали з метою отримати гуманізовані антитіла, які структурно є більш стабільними. Внаслідок цього визначили гуманізоване антитіло ЕР27 Ну-Сс11а/І В-К. Для того, щоб далі знизити кількість агрегату, який міститься у НУ-ста/ В-К, гідрофобні залишки, що містяться у СОК НУ-СсТа/л В-К, замістили гідрофільними залишками, та досліджували ефект інгібування утворення агрегату шляхом ослаблення гідрофобних взаємодій між молекулами.

Специфічно, Н25-С14 (5ЕО І МО: 92), На1-Ст1а (ЗЕО І МО: 93), Н42-с1а (5ЕО ІЮ МО: 94), нНаз-ста (5ЕО ІО МО: 95), Н44-с14 (ЗЕО ІО МО: 96) та Ні-45-с1а4 (ЗЕО ІО МО: 97) побудували як гени Н-ланцюга, у яких будь-яку послідовність СОМ (5ЕО ІЮ МО: від 86 до 91), які наведено у

Таблиці 11, вводили у гуманізоване антитіло ЕР27 Ну-ста/ В-к (Н-ланцюг НУ-С1а/5ЕО І МО: 38; І - ланцюг І В-К/ЗЕО ІЮ МО: 29). Застосовуючи спосіб з Прикладу 1, вектор гена Н-ланцюга із заміщеними залишками експресували спільно з вектором ГВ-К, щоб отримати гуманізовані антитіла ЕР27: Н25-С11а/ В-К, Н4т-ста/л в-к, Н42-стай в-к, назЗз-сатал В-кК, Ні4-ста/ в-К та Н45- сюта/ в-к. Кількість агрегатів, що містилися у гуманізованих антитілах ЕР27, визначили шляхом хроматографії з гель-фільтрацією (контрольний приклад 9), та результат наведено у Таблиці 12.

Внаслідок цього визначили послідовності гуманізованого антитіла ЕР27 з суттєво зниженою кількістю агрегатів порівняно з химерним антитілом ЕР27 (сН-с1а/сі -К).

Таблиця 11

Назва варіанта СІЗО 1 Змінена СОВ 5БЕО І МО

ЕД тн

Н25 /СОКО Н-ланцюга 86 на1 СОБІ Н-ланцюга 87 на? /СОБ2 Н-ланцюга 88 наз СО Н-ланцюга 89 на /Срва2 Н-ланцюга 9о наз о СОБО2 Н-ланцюгад (91

Таблиця 12

Агрегат (90). 5БО ОО МО(ланцюг) БЕО 10 МОЇ ланцюг) сн-б14/сіик ну-сіа/0В-к

Н25-с14/Ц8-Кк нат-ста/08-к на2-с14/8-Кк наз-ста/лв-к наа-а14/Ц8-Кк ее 796 7777429. наб5-ста/ьвк

Спроможність отриманих антитіл зв'язуватися з епірегуліном людини визначили як інгібування зв'язування епірегуліну (контрольний приклад 5) з химерним антитілом ЕР27. Як показано у Таблиці 13, спроможність гуманізованих антитіл ЕР27 зв'язуватися з антигеном була еквівалентною до спроможності химерного антитіла ЕР2г7. Внаслідок вищезгаданого дослідження визначили послідовності гуманізованих антитіл ЕР27 зі зниженою кількістю агрегату та зі спроможністю зв'язуватися з антигеном, яка є еквівалентною до спроможності химерного антитіла ЕР27.

Зо

Таблиця 13 оНазвазмуенокознтсйня 0 Концентращя ІС5О С набік 0000068 на5-О14/ЬВ-Е 92 (концентрація ІС50: концентрація ІС50 кожного антитіла, якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К) становить 100).

Крім того, застосовуючи спосіб з Прикладу 1, отримали наступні антитіла, які побудували як гуманізовані антитіла ЕР27 шляхом довільного комбінування послідовностей, які включають заміщення амінокислотних залишків, визначених у Прикладах від 1 до 4: не?-ата/л в-кК (Н-ланцюг:5ЕО ІО МО: 98; І -ланцюг: БЕО ІЮ МО: 29), не?-атал 21-К (Н-ланцюг:5ЗЕО ІЮО МО: 98; І -ланцюг: 5ЕО ІО МО: 84), не?-ата/л 37-К (Н-ланцюг:5ЗЕО ІЮ МО: 98; І -ланцюг: 5ЕО ІЮО МО: 99).

Їх спроможність зв'язуватися з епірегуліном людини визначили як інгібування зв'язування епірегуліну з химерним антитілом ЕР27 (контрольний приклад 5). Внаслідок цього, як показано у

Таблиці 14, усі антитіла мали зв'язувальну спроможність, еквівалентну до спроможності химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К). Також кількість агрегату, що містився у гуманізованих антитілах ЕР27, визначили за допомогою хроматографії з гель-фільтрацією (контрольний приклад 9), середню температуру теплової денатурації (тт) Бар визначили за допомогою диференційного скануючого калориметру (контрольний приклад 10) та ізоелектричну точку (рі) визначили шляхом ізоелектричного фокусування (контрольний приклад 11). Як показано у

Таблиці 14, переконалися, що кількості агрегату суттєво знизилися та значення Тт підвищилися порівняно з такими ж показниками для химерного антитіла ЕР27 (сН-Сс1т1а/сі-К). Отже, були визначені послідовності гуманізованого антитіла ЕР27, які досягають знижених ризиків імуногенності, пригніченого хімічного розпаду, знижених ізоелектричних точок та зменшеної кількості агрегату внаслідок гуманізації, як показано у Прикладах від 1 до 4.

Таблиця 14 (концентрація ІС50: концентрація ІС50 кожного антитіла, якщо концентрація ІС50 химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сіІ -К) становить 100).

Приклад 5. Введення мутацій, які покращують спроможність зв'язуватися з антигеном мавпи та знижують імуногенність

Під час розробки ліків, зазвичай, визначення токсичності та безпеки у доклінічних дослідах вважають важливим для визначення дози та оцінки різних ризиків у клінічних дослідженнях. У випадку з фармацевтичними засобами з антитілами їх специфічність зв'язуватися з антигеном може обмежити вибір видів тварин, які застосовуються для доклінічнх досліджень. У багатьох випадках вибирають приматів, які є генетично близькими до людини. Проте, оцінку із застосуванням приматів іноді не вважають відповідною, якщо антитіло, яке представляє інтерес, не зв'язується з антигеном примата, або якщо зв'язувальна спроможність суттєво відрізняється від його спроможності зв'язуватися з антигеном людини. Для того, щоб подолати такі випадки, робляться спроби оцінити токсичність та безпеку у доклінічних дослідженнях, застосовуючи при цьому сурогатне антитіло, яке зв'язується з антигеном того виду тварини, який слід застосовувати, або застосовуючи трансгенних тварин з антигеном людини (Спартап еї а!., Маї. Нем. Огид Оівсом. (2007) 6, 120-126).

Вважають, що заміщення амінокислотних залишків за способами, відомими фахівцям у галузі, наприклад, шляхом дозрівання афінності із застосуванням бібліотеки фагів або рибосомного дисплею, є ефективними для зміни спроможності антитіла, яке представляє інтерес, зв'язуватися з антигеном. Крім того, на основі тривимірних структур антигенів та ділянок зв'язування варіабельної ділянки антитіла способи обчислювальної науки можна застосовувати, щоб покращити міжвидову реактивність (Рагаду єї аї., Віоогдапіс б Меаісіпаї

Спетівігу І ейегз 19 (2009) 3744-3747). Проте, не було опубліковано жодних даних щодо зміни антиген-зв'язувальної спроможності антитіла проти епірегуліну людини без великомасштабного скринінгу або способів обчислювальної науки. Крім того, жодної структурної різниці між епірегуліном мавпи та епірегуліном людини не було виявлено, та, отже, жодної рекомендації не було надано щодо того, до яких амінокислотних залишків слід модифікувати антитіло проти епірегуліну людини, щоб підвищити активність зв'язування з епірегуліном мавпи. У цьому винаході ряд послідовностей антитіла було побудовано шляхом заміщення амінокислотних залишків на довільних ділянках СОК. Застосовуючи спосіб з Прикладу 1, отримали гени антитіл з цими заміщеними залишками та ці антитіла експресували. Специфічно, побудували послідовності, у яких заміщення залишком Агуд виконується у СОК2 та СОКЗ Н-ланцюга та у

СОВЗ І-ланцюга, наведених у Таблиці 15, внаслідок чого отримали антитіла, наведені у

Таблиці 16. Афінітет стосовно епірегуліну людини та мавпи визначили із застосуванням пристрою (ВІАСОКЕ) на основі розсіювання поверхневого плазмону (контрольний приклад 6).

Внаслідок цього, порівняно з химерним антитілом ЕР2г7, визначили послідовності гуманізованих антитіл ЕР27 без зниженого афінітету стосовно епірегуліну людини, з підвищеною афінністю стосовно епірегуліну мавпи та з низьким відношенням афінностей (- значення КО для епірегуліну мавпи / значення КО для епірегуліну людини), яке є індикатором, який демонструє міжвидову реактивність для епірегуліну мавпи та епірегуліну людини (Фігури 1 та 2).

Таблиця 15 о Назваваріанта СІК 0 Змінена СІК 5ЕО ТО МО нНі11 СОБО Н-ланцюгад (100 о НІ12 СОБО Н-ланцюга (101 нНи16 СОК2 Н-ланцюга 1052 оНІ117 СОК2 Н-ланцюга 103 "НІ18 СОКО Н-ланцюга 104

НнІ19 СЕЗ Н-ланцюга 105 ! .нН1і20 СОКО Н-ланнюга 106 о НІЗ2І СОВЕ2 Н-ланцюга 107

НІ СОВБ2 Н-ланцюга 1оО8 н1і24 СО 1 Н-ланцюга 109 о НІЗ1 СОВЗ Н-лашцюга 110о

НІЗ2 СОВЕЗ Н-лаццюга 111 о НІЗЗ СОКЗ Н-ланцюга 112

АТ СОКЗ І -ланцюга 118 1АВ СОКЗ Г-ланцюга 114 !

Таблиця 16

БО 10 МО. ланшюгв) СЕБЕ КО (НМ) / і БЕНЕО КО (М сн-п1/с1 АК З З З 409 нв7-с14/ЦВ-К ав 29 35.1 ні-аідлвк 115 29 9,0 ніті-сіалА7к о 115 128 126 ні12-с14/в-к 1116 2 9 і 16.0

НІ16-014/08-к 117 2 9 61 ні17-дйіад/В-к 0118 з 79 ні18-сі4/8-к о 0119 29 7,5 ні19-014/ЛВк (120 29 9.8

НІі20-с1д/ЛВк 191 29 9.1

НІ1і21-с1д/8в-к 1192 2 9 83 ніозз-с1дЛВк 123 295 182 нігьса1йлвк 194 2 9 20.6 ніЗзі-с14/Ввк 1195 29 47 ніЗзо-сіа/В-к 1126 29 46 ніЗ33-с14/0в-кК 1127 29 641

При розробці медичних фармацевтичних засобів прояви конфлікту антитіл проти ліків після їх введення створює проблеми щодо ефективності та безпеки. Отже, важливо знизити імуногенність ліків, які представляють інтерес. Доступними є способи іп мімо, іп міо та способи комп'ютерного моделювання для передбачення імуногенності біологічних препаратів, та було опубліковано дані щодо кореляції зі ступенем впливу антитіл проти ліків у клінічній практиці (ВакКег евї аї., Сшт. Опа Заї. (2010) 5 (4), 308-313; Вгузоп вї а!., Віобгидв. (2010) 24 (1), 1-8; Сгоої еї аі., Сит.Оріп.РНаттасої. (2008) 8 (5), 620-626). У цьому винаході послідовності гуманізованого антитіла ЕР27, які знижують ризики імуногенності, не впливаючи на спроможність антитіла, яке представляє інтерес, зв'язуватися з антигеном, можна передбачити шляхом передбачення епітопу Т-клітин, застосовуючи спосіб, описаний у контрольному прикладі 13.

Для послідовностей, які включають зміни, визначені у Прикладах від 1 до 4, побудували послідовності з довільною комбінацією мутацій, які покращують афінітет щодо епірегуліну мавпи та/або знижують імуногенність. Гуманізовані антитіла ЕР27, побудовані таким чином та перелічені у Таблиці 17 (ЗЕО ІО МО: від 115 до 150), отримали, застосовуючи спосіб з Прикладу 1. Мутовані послідовності СОК гуманізованих антитіл ЕР27, перелічених у Таблиці 17, наведено у Таблиці 18. Афінітет щодо епірегуліну людини та мавпи визначили, застосовуючи пристрій (ВІАСОКЕ,), який застосовує розсіювання поверхневого плазмону (контрольний приклад 6). Як показано на Фігурі 3, афінітет кожного гуманізованого антитіла ЕР27 щодо епірегуліну людини був еквівалентним афінітету химерного антитіла ЕР27 (сН-С11/сІ -К). Відношення афінітететів (- значення КО для епірегуліну мавпи / значення КО для епірегуліну людини) порівняли як індикатор різниці в афінітеті для антигенів людини та мавпи. Було підтверджено, що різниця в афінітеті кожного гуманізованого антитіла ЕР27 для двох антигенів була суттєво знижена порівняно з химерним антитілом (Фігура 4). Отже, визначили послідовності гуманізованого антитіла ЕР27, які мають покращений афінітет для епірегуліну мавпи без погіршення афінітету для епірегуліну людини.

Таблиця 17

Назва зятитях 00000000 18БОТОМО (Плани 0 15БОЇО МО (рлавяюу

Но сля ИН ВЗ пинннннннннннння НТ лини снізі-с14/ЦВ-к 198 аз пнннннннннннннннн німе ВВ

СНІЗО бій/ЦВК 1276 ВВ віБваталаєк о ВВ сніБа-дій/ЬВ-к ие лиш пшібб атак о 00337153 Алл алЕх спе хи е АН ЕХ праски не: ша кс

Бк я ЕЕ 5 НН С назвами 00150

Таблиця 18 оНазваваріанта СОК Змінна СОК 00 5ЕОО МО С. нібо СЕЗ Н-ланцюга 151 ніза СОЕЗ Н-ланцюга 1552 нібб СОВ2, 3 Н-ланцюгаї 1583, 154 нівВ | СОВ2, З Н-ланцюга | 155, 154 нів | СРРЕ2,3 Н-ланцюга 153, 152 ніз СОК2, З Н-ланцюга | 156, 151

НІ? СОБ2,3 Н-ланцюга 157, 151 нго4 | СОКО, 3 Н-ланцюга | 158,5 152 н2г2о5 о СОБ2,З Н-ланнкюга 153, 158 нгоб о СОКО, З Н-ланцюга 153, 152

Ннг2о07 о СОКа2, З Н-ланцюга 153, 152

Н2г10 о СОК2, 3 Н-ланцюга 159, 1509

Н2г11 СОБКО, З Н-лаиюта 157, 152 н2г12 | СОКО, З Н-ланцюга | 160,.152

Нг13 о СОБ2,3 Н-ланцюга 161, 152 нг СОКО, З Н-ланцюга | 153, 15585

Нн2гЗі СОБКО, 3 Н-ланюга 153, 158 н2га4о о СОБ2, 3 Н-ланцюга 160, 158 150 о ЕКІ Г-ланцюга 162 153 СОБІ І -ланцюга | 163 173 СОБІ,З Г-ланиюга 163, 164

Крім того, кількість агрегату, що міститься у гуманізованих антитілах ЕР27, вимірили шляхом хроматографії з гель-фільтрацією (контрольний приклад 9), та середню температуру теплової денатурації (Пт) фрагментів Раб, отриманих з гуманізованих антитіл ЕР27, вимірили за допомогою диференційного скануючого калориметра (контрольний приклад 10). Як показано у

Таблиці 19, було підтверджено, що кількості агрегатів суттєво знизилися, а значення Тт підвищилися порівняно з химерним антитілом ЕР27 (сН-Сст1а/сі-К). Отже, як показано у

Прикладах від 1 до 5, внаслідок гуманізації визначили послідовності гуманізованого антитіла

ЕР27, які включають знижені ризики імуногенності, пригнічений хімічний розпад, знижені ізолелектричні точки, зменшені кількості агрегатів та покращену спроможність зв'язуватися з антигеном мавпи.

Таблиця 19

НАЗВА АНТИТІЛА 0 Агрегат | Тиз відн. КО | відн. КО сЕКЕс (М) / 0) Показник іму-

Це) (С) ГВЕВЕС І СЕКС ВЕКЕС (НМ) | ногенності (відношення КО представляє відносний коефіцієнт, коли значення для сН-(1/сі -К-1.)

Приклад 7. Активність АЮОСС кожного антитіла тесту, яка залучає мононуклеари периферійної крові людини як клітини-ефектори

Мононуклеари периферійної крові людини (далі у цьому описі винаходу позначається як

РВМС людини) застосовували як клітини-ефектори для вимірювання активності АОСС кожного антитіла тесту, способом описаним далі у цьому описі винаходу. Фракцію мононуклеарів, узяту з периферійної крові людини, застосовували як клітини-ефектори людського походження.

Внаслідок цього визначили, що усі гуманізовані антитіла ЕР27, що застосовувалися у тесті, індукують АОСС проти клітин МІА РасСа-2 (контрольний приклад 7) (Фігура 5).

Приклад 8. Вимірювання активності проти епірегуліну моноклональних антитіл нейтралізувати стимуляцію клітинного росту епірегуліном мавпи або людини

У Прикладі 5 виявили послідовності гуманізованого антитіла ЕР27 з підвищеною афінністю до епірегуліну мавпи. Для того, щоб визначити їх активність у клітинах, гуманізовані антитіла

ЕР27 вимірювали стосовно їхньої активності нейтралізувати стимуляцію клітинного росту епірегуліном мавпи та епірегуліном людини. Для клітин застосовували ВАЕ ЕСЕК. Усі гуманізовані антитіла ЕР27, які оцінюють цього разу, досліджували стосовно їхньої нейтралізуючої активності, яка інгібує ріст клітин ЕСЕК ВАБЕ, залежний від епірегуліну мавпи та людини (контрольний приклад 8), та усі гуманізовані антитіла ЕР27 демонстрували підвищену нейтралізуючу активність проти епірегуліну мавпи порівняно з химерним антитілом (Фігури 6 та 7).

Приклад 9. Тест щодо ефективності ліків для гуманізованих антитіл ЕР27 із застосуванням моделі іп мімо

Протипухлинну активність іп мімо гуманізованих антитіл ЕР27, активність яких в клітинах іп міо підтвердили у Прикладах 7 та 8, оцінювали, застосовуючи мишачу модель, якій трансплантували пухлину людини (контрольний приклад 14). Протипухлинні ефекти кожного антитіла тесту, які оцінювали на мишачих моделях, яким трансплантували ракові клітини МІА

РасСа-2 та 0 0-1 людини, оцінювали шляхом вимірювання об'єму пухлини на 7-й день після останнього введення зразка. Внаслідок цього, як показано на Фігурі 8, коли антитіло сН-с1/сі -К, антитіло Н206-с1а/І 73-К та антитіло Н240-С14а/І 73-К вводили окремо по 0,4 мг/кг та 2 мг/кг, тоді на тваринних моделях також спостерігали відмінну ефективність ліків внаслідок змінення гуманізованих антитіл ЕР27.

Приклад 10. Імуногістохімічне забарвлення із застосуванням антитіла проти епірегуліну

Застосовуючи антитіло ЕР27, запровадили спосіб імуногістохімічного забарвлення, який відображає рівень експресії антигену. Імуногістохімічне забарвлення здійснювали, застосовуючи поміщені в парафін тканинні блоки, отримані з тканин мишей всій, трансплантованих клітинними лініями, які примушені експресувати ЕКЕС на різних рівнях експресії, які відповідають 5КЕ-18 (розрахована кількість антигену становила 7,7 х 105), «КЕ-23 (розрахована кількість антигену становила 6,1 х 10У та 5КЕ-482 (розрахована кількість антигену становила 2,9 х 105), та 5БК-НЕР-1 клітини-хазяїна (кількість антигену становили 8,4 х 102). Експресію ЕКЕС у цих тонко назрізаних тканинних зрізах, отриманих з цих парафінових блоків, спостерігали візуально шляхом інкубування із застосуванням антитіла ЕР27 як первинного антитіла з наступним реагуванням поліклонального антитіла (до кроля проти миші (Часкзоп Іттипогезеагсп Іарогаїогіе5) як вторинного антитіла та антитіла (ДО козла проти кроля, зв'язаного з полімер-НКР (Оако суїотаййоп) як третинного антитіла, при цьому як субстрат застосовувався діамінобензидин. Як показано на Фігурі 10, градацію забарвлення спостерігають у забарвлених клітинах/тканинах залежно від величини експресії ЕКЕС. Крім того, підтвердили, що активність АЮОСС іп міго антитіла Н240-СТал 73-К залежить від рівня експресії у цих клітинах (Фігура 11). У вищезгаданому дослідженні антитіло з низьким вмістом фукози застосовували для антитіла Н240-С1а//73-К. Антитіло з низьким вмістом фукози отримали за способом, описаним у УМО2004/065540. Далі у цьому описі винаходу антитіло з низьким вмістом фукози також називають гуманізованим антитілом ЕР27 СіІусотарб. Активність

АРрСС іп міго антитіла Н240-С1т1а/ 73-К (гуманізованого антитіла ЕР27 СіІусотаб) підтвердили у

ЗКЕ-15 та ЗКЕ-10, які мають розрахований рівень антигену 28 х 107, на додаток до рівня у вищезгаданих чотирьох клітинних лініях примушеної експресії ЕКЕС. Способом, подібним до

Фігури 11, підтвердили активність АЮСС іп міго антитіла Н2г40-с1а/173-К згідно з рівнем експресії ЕКЕС у цих клітинах (Таблиця 20). Крім того, підтвердили активність інгібування росту пухлини іп мімо антитіла Н2г40-сСт1а/73-К (гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотаб) згідно з рівнем експресії у цих клітинах (Фігура 12). Тобто, оцінювання рівня експресії ЕКЕС шляхом імуногістохімічного забарвлення підтвердило кореляцію між рівнем експресії та ефективністю ліків.

Таблиця 20

НАЗВА КЛОНУ Концентрація антитіла (мкоми) | ДІЮСС (95) " РІВЕНЬ ЕКСПРЕСІЇ ЕВКО

ВКЕЯВа 60101438 290000)

ЗКЕ2З 041 326. 6б100о0

ЗКЕ10 249. 28000

ВК В Я 25000

ВкКк18 01 8,5. 7700

ЗКЕ1 44. 5600

ЗКА-НЕРІ 91 840

Приклад 11. Експресія ЕКЕС у клінічних випадках слабо диференційованого раку товстої кишки

Для того, щоб дослідити експресію ЕКЕС у дев'яти клінічних випадках слабо диференційованого раку товстої кишки, тонко розрізані поміщені в парафін зразки забарвили за способом забарвлення, описаним у Прикладі 10. Внаслідок цього очевидні позитивні зображення підтвердили у 7 з 9 випадків (Фігура 13).

Приклад 12. Ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотар проти онтогенезу стовбурових клітин раку товстої кишки

Зо Стовбурові клітини раку товстої кишки (1 х 105 клітин), виділені з моделі пухлини раку товстої кишки людини РІ К123 (У/002012/046797), трансплантували у пахову ділянку мишей

ЗСІЮ. З наступного дня після введення стовбурових клітин мишам 5СІО гуманізоване антитіло

Сіусотар вводили один раз на тиждень у дозі 10 мг/кг. Внаслідок цього знаковий ранговий критерій Вілкоксона (02МО рівня Т5 8,02 системи 5А5 та доклінічна упаковка ЗА Мегвіоп 5.00.010720) підтвердив, що на 29 день після трансплантації онкогенність була суттєво пригнічена у групі, якій вводили антитіло, порівняно з контрольною групою, як показано на Фігурі 14.

Приклад 13. Ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 СІусотар проти метастазу стовбурових клітин раку товстої кишки

Стовбурові клітини раку товстої кишки (2 х 105 клітин), виділені з моделі пухлини раку товстої кишки людини РІ-К123, трансплантували бежевим мишам 5СІЮО через хвостову вену. А через три дні після введення стовбурових клітин мишам гуманізоване антитіло ЕР27 Сіусотар вводили один раз на тиждень у дозі 10 мг/кг. Внаслідок цього підтвердили, що на 52-й день після трансплантації кількість пухлинних вузлів у легенях мишей (кількість метастатичних уражень) та розмір пухлинних вузлів (діаметр метастатичних уражень) суттєво знизилися в групі, якій вводили антитіло, порівняно з контрольною групою, як показано на Фігурі 15.

Приклад 14. Ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотар проти слабо диференційованого раку товстої кишки бо

Відрізок пухлинної тканини моделі СОЇ -53-УСК (Сепіга! Іпвійше бог Ехрегітепіа! Апітаї!5) пухлини слабо диференційованого раку товстої кишки людини трансплантували мишам 5СІЮ. З 14-го дня після трансплантації відрізка пухлинної тканини гуманізоване антитіло ЕР27 СіІусотар вводили один раз на тиждень по 10 мг/кг. Внаслідок цього визначення об'єму пухлини на 14 день після початку введення антитіла підтвердило, що ріст пухлини суттєво пригнічується у групі, якій вводили антитіло, порівняно з контрольною групою (Фігура 16).

Приклад 15. Ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотар проти середньо диференційованого раку товстої кишки

Пухлини у моделі РІ К379 (РСТЮР2012/072852) пухлини середньо диференційованого раку товстої кишки людини мають властивість брунькування пухлини, яке спостерігається морфологічно, проте експресію епірегуліну помітили незалежно від ділянки брунькування пухлини. Відрізок пухлинної тканини цієї Р К379 трансплантували мишам ЗСІО, та з 21-го дня після трансплантації відрізка пухлинної тканини гуманізоване антитіло ЕР27 СіІусотар вводили один раз на тиждень по 10 мг/кг. Оцінювання об'єму пухлини на 18 день після початку введення антитіла підтвердило, що ріст пухлини суттєво пригнічується у групі, якій вводили антитіло, порівняно з контрольною групою (Фігура 17).

Приклад 16. Експресія ЕКЕС при клінічній аденокарциномі легеня

Для того, щоб дослідити експресію ЕКЕС у 7 клінічних випадках аденокарциноми легеня, тонко розрізані поміщені в парафін зразки щодо цих випадків забарвили, застосовуючи спосіб забарвлення, описаний у Прикладі 10. Внаслідок цього очевидні позитивні зображення підтвердили у 4 з 7 випадків (Фігура 18).

Приклад 17. Активність АОСС гуманізованого антитіла ЕР27 СіІусотаб із застосуванням мононуклеарів периферійної крові людини як клітин-ефекторів

Активність АОСС оцінювали для лінії Саіш-3 аденокарциноми легеня людини, застосовуючи

РВМС людини як клітини-ефектори. Внаслідок цього було підтверджено, що гуманізоване антитіло ЕР27 Сіусотаб індукує АОСС проти клітин Саш-3 (Фігура 19).

Приклад 18. Ефективність ліків гуманізованого антитіла ЕР27 Сіусотар проти аденокарциноми легеня

Гуманізоване антитіло ЕР27 Сіусотар вводили мишам 5СІЮ (з суворим комбінованим

Зо імунодефіцитом) з імплантованим фрагментом пухлинної тканини моделі СаїЇн-3 аденокарциноми легеня людини один раз на тиждень по 10 мг/кг з 13-го дня після трансплантації фрагмента пухлинної тканини. Об'єм пухлини вимірювали на 28-й день після початку введення антитіла. Було підтверджено, що ріст пухлини суттєво пригнічується у групі, якій вводили антитіло, порівняно з контрольною групою (Фігура 20).

Приклад 19. Клітинна інтерналізація гуманізованого антитіла ЕР27

Клітинну інтерналізацію гуманізованого антитіла ЕР27 визначили наступним способом. Коли первинне антитіло стає інтерналізованим, сапорин, який є білком, який інактивує рибосоми та який переноситься вторинним антитілом, транспортується у клітину внаслідок зв'язування вторинного антитіла з первинним антитілом. Коли воно інтерналізується, тоді сапорин відокремлюється від кон'югату Ідс, інгібує синтез білка, а потім спричиняє загибель клітини.

Клітинну лінію 0 0-1, яка експресує ЕКЕС, або контрольну клітинну лінію 5ЗК-НЕРІ1 посіяли з щільністю клітин 1 х 103 клітин до кожної комірки мікротитраційного планшета з 96 комірками, та наступного дня додали гуманізоване антитіло ЕР27 СіІусотар як первинне антитіло, та (ДО козла, який розпізнає моноклональне антитіло людини, зв'язане з білюом Нит-2АР (Адмапсей

Тагдеййпуд Зувбіет5), який інактивує рибосому, додали як вторинне антитіло. За 4 дні після додавання життєздатність клітин оцінили за допомогою УУЗТ8 (Ропііпао). Як показано на Фіг. 21, гуманізоване антитіло ЕР27 СіІусотар спричиняло загибель клітин тільки проти клітинної лінії

РІ 0-1, яка експресує ЕКЕбО. З іншого боку, воно не спричиняло загибель клітин проти клітинної лінії «»К-НЕР'Т, яку застосовували як контрольну.

Контрольний приклад 1. Виділення генів епірегуліну людини та супотоїЇди5 (яванських макак)

КДНК повної довжини ЕКЕС людини (СК541887, 5ЕО ІО МО: 169) виділили за стандартним способом, та плазміду, отриману шляхом клонування цього генного фрагмента у вектор для експресії у клітинах ссавців (РМСМ), позначили як ПЕКЕС/рМСМ. рМоСМ може індукувати експресію стороннього гена під впливом промотора СММ мишей (номер доступу АССЕ5БІОМ

Мо. ШШ 68299), та є вектором, вставленим з геном резистентності до неоміцину. КДНК повної довжини ЕКЕС яванських макак виділили за стандартним способом з бібліотеки кКДНК яванських макак на основі інформації про послідовності кКДНК ЕКЕС макак-резус (ХМ 001102069), та плазміду, отриману шляхом клонування цього генного фрагмента (генного 60 фрагмента, що кодує послідовність 560) ІЮ МО: 165) у вектор для експресії у клітинах ссавців

(рМеСМ), позначили СУЕКЕС/рРМСМ. ПЕКЕС/рМСМ та суУЕКЕС/рМСМ ввели у штам ЮсС44 СНО (Іпмігодеп) шляхом електропорації, та внаслідок селекції з 500 мкг/мл генетицину отримали клітини СНО, які постійно експресують ЕКЕС повної довжини людини, та клітини СНО, які постійно експресують ЕКЕС повної довжини яванських макак, та їх позначили як ПЕКЕС ро та сСУЕКЕС ро, відповідно.

Контрольний приклад 2. Розробка способів для експресування зрілих форм епірегулінів людини та яванських макак

Спосіб ПЛР застосовували, щоб ампліфікувати кКкДНК для експресування послідовності повтору шести гістидинів на С-кінці зовнішньоклітинних ділянок зрілих ЕКЕС людини генів епірегуліну людини та мавпи супотоїЇди5 (поліпептиди, у яких послідовність БЕО ІЮ МО: 171 було злито з М-кінцями поліпептидів за ЗЕО ІЮ МО: 170 та 34, відповідно. Вектори експресії для застосування у клітинах ссавців, у які ці КДНК вставили окремо, лінеаризували за допомогою рестрикційних ферментів; та потім, внаслідок введення цих векторів експресії до клітин

Егеезіуе 293 із застосуванням фектину 293, випадково експресували зрілі епірегуліни людини таяванських макак.

Контрольний приклад 3. Отримання епірегуліну

Ген зрілого епірегуліну людини та ген зрілого епірегуліну яванського макака вставили окремо у вектор експресії для клітин ссавців. очистили злиті білки зрілих ЕКЕС-6НІі5х людини та

ЕВЕС-6НІі5 яванського макака, виділені з культуральних розчинів тваринних клітин, отриманих для експресування кожного з генів за способом, описаним далі.

Зовнішньоклітинну ділянку зрілого ЕКЕС людини (поліпептиду, у якому послідовність БЗЕО

ІОЮО МО: 171 злита з М-кінцем 5ЕО ІО МО: 34), злитого у рамці з ділянкою шести гістидинів, вставили у вектор експресії для тварин-ссавців, щоб побудувати вектор експресії НЗЕКЕСО-6НІ5 (далі у цьому описі винаходу експресований злитий поліпептид називається П5ЕКЕО-НІв).

Зовнішньоклітинну ділянку зрілого ЕКЕС яванського макака (поліпептиду, у якому послідовність

ЗЕО ІО МО: 171 злита з М-кінцем ЗЕО ІО МО: 170), злитого у рамці з ділянкою шести гістидинів, вставили у вектор експресії для тварин-ссавців, щоб побудувати вектор експресії СсЕКЕО-6НІів (далі у цьому описі винаходу цей експресований ЕКЕС називається сузхЕКЕО-НІів). Вектор експресії П5ЕКЕС-6Ніз та вектор експресії с5ЕКЕС-бНіх ввели у клітини Егеезіує 293

Зо (Іпмігодеп), застосовуючи фектин 293 (Іпмігодеп), та трансдуковані клітинні лінії культивували в умовах селекції з 2еосіп (500 мкг/мл) протягом 6 днів при 37 "С в інкубаторі з 8 95 СО».

Після цього Я5ЕКЕО-Нів та сузЕКЕС-НІі5 очистили від культуральних надосадових рідин. 4

М імідазол додали до культуральної надсосадової рідини до кінцевої концентрації 10 мМ імідазолу, та цю рідку суміш змішали зі смолою Мі у Ніб МісгозЗріп Ригійсайоп Букет (Атегзпат). Смолу промивали 20 мМ імідазолом та 50 мМ імідазолом, а потім НЗЕКЕС-Ні або сузЕВЕС-Ніх елюювали, застосовуючи 200 мМ імідазол (фракція елюювання 1), а потім

НЯЗЕВЕС-НІі або суБЕКЕС-НІі5х елюювали, застосовуючи 400 мМ імідазол (фракція елюювання 2). Після цього буфер, що містив елюйований Н5ЕНЕС-Ніх або суБЕКЕО-Ні5, поміняли шляхом діалізу на РВ5, застосовуючи чашку для діалізу Віо-еєспй. МУУСО8000. Очищений білок кількісно оцінили, застосовуючи спосіб РАСЕ при довжині хвилі 280 нм, та його перетворили на вміст білка.

Зразки електрофорезу очищених білків показані на Фіг. 9.

Контрольний приклад 4. Отримання системи ЕЛАЙЗА епірегуліну

Фрагмент розчинного ЕКЕС людини, який має структуру зрілого домену ЕСЕ (поліпептид за

ЗБЕО ІЮО МО: 34, який відповідає від 53МаІ до "98 ей), придбали у КУО бузіет5 (номер за каталогом 1195-ЕР/СЕ). Фрагмент розчинного ЕКЕС людини застосовували для того, щоб негайно нанести покриття на імунопланшети, та після блокування розчином, що містить ВА, проаналізували зв'язувальну реактивність очищених антитіл проти ЕКЕС. Після додавання очищених антитіл проти ЕКЕС здійснювали інкубування протягом 1 години, планшети промили, а потім додали мічене лужною фосфатазою антитіло проти ЇДб людини (2утей) до кожної комірки промитих планшетів, а потім дозволили реагувати. Кожну комірку промили, а потім кількість зв'язаного антитіла визначили шляхом додавання реагенту тесту, таблеток р- нітрофеніл фосфату від Зідта.

Контрольний приклад 5. Отримання системи для інгібування зв'язування епірегуліну за конкурентним ЕЛАЙЗА

Фрагмент розчинного ЕКЕС людини, який має структуру зрілого домену ЕСЕ (поліпептид за

ЗБЕО ІЮО МО: 34, який відповідає від 53МаІ до "98 ей), придбали у КУО бувзіет5 (номер за каталогом 1195-ЕР/СЕ). Фрагмент розчинного ЕКЕС людини застосовували для того, щоб негайно нанести покриття на імунопланшети, та після блокування розчином, що містить ВЗА, бо проаналізували реактивність конкурентного зв'язування між ЕР27, що походить від гібридоми миші, та очищеним гуманізованим антитілом проти ЕКЕОС. ЕР27, що походить від гібридоми миші, та очищене гуманізоване антитіло проти ЕКЕС додали до планшетів, та після інкубування протягом 2 годин планшети промили; та до кожної комірки планшетів додали мічене лужною фосфатазою антитіло проти дб людини (7утеа) та дозволили реагувати. Кожну комірку промили, а потім кількість зв'язаного антитіла (значення виявлення А405/655) визначили шляхом додавання реагенту тесту, таблеток р-нітрофеніл фосфату від бідта.

Контрольний приклад 6. Запровадження антиген-зв'язувальної активності (спосіб для вимірювання афінності)

Афінність та константу швидкості асоціації антитіла проти ЕКЕС для антигену вимірили одноактним кінетичним способом аналізу резонансу поверхневих плазмонів, застосовуючи

Віасоге"М-Т100 (СЕ Неаквпсаге, Японія). НВ5-ЕР- (СЕ Неайпсаге, Японія) застосовували для рухомого буферу, та набір зчеплення амінів (ЗЕ Неайсаге, Японія) застосовували щоб ковалентно зв'язати Білок А з чипом СМ5 (чипом, покритим карбоксиметил декстраном). Кожне антитіло проти ЕКЕС отримували так, щоб приблизно 350 КО захоплювалися Білком А. ЕКЕС людини або ЕКЕС яванського макака, які застосовували як аналітичний зразок, отримали при, 0,7, 1,4, 2,8, 5, та 11,2 нМ, застосовуючи НВ5З-ЕРж. Вимірювання здійснювали, спочатку дозволивши Білку А захопити розчин антитіла, а потім при швидкості потоку 30 мкл/хвилину послідовно впорскували кожний з 0, 0,7, 1,4, 2,8, 5,6 та 11,2 нМ розчинів ЕКЕС людини або

ЕКЕС яванського макака протягом З хвилин, щоб реакція відбувалася. Після цього розчин перемкнули на НВ5-ЕР», та фазу дисоціації вимірювали протягом 15 хвилин. Після завершення вимірювання фази дисоціації сенсорний чип промили 25 мМ Маон та регенерували.

Вимірювання при концентрації 0 здійснювали подібним способом, дозволяючи Білку А захоплювати розчин антитіла та виконуючи трихвилинні впорскування НВО-ЕР'ї послідовно 5 разів, щоб дозволити реакції здійснитися, а потім перемкнули на НВ5-ЕР»ж, щоб вимірювати фазу дисоціації протягом 15 хвилин. Після завершення вимірювання фази дисоціації сенсорний чип промили 25 мМ МаонН та регенерували. Програмне забезпечення для аналізу даних виключно для Віасоге, Віасоге Т100 Емаїнайоп Боймаге Мегзіоп 2.0.1, застосовували для виконання кінетичних аналізів, щоб розрахувати константу швидкості асоціації (Ка), константу швидкості дисоціації (Ка) та відношення констант швидкості з отриманих сенсограм. Результати

Зо наведено у Таблиці 21. Для того, щоб корегувати різниці між днями у значеннях вимірювання,

Фігури від 1 до 4 та Таблиці 16 та 19 наводять відношення на основі узяття значення контрольного зразка (СН-С11/сі -К), виміреного в той самий день, як і 1.

Таблиця 21

НАЗВААНТИТІЛА 0-30 фНтетдоЕКЕ; людини 00 Афінітет до ЕВЕО мавпи супотоїдої дн ЗМО ЖаИМс) 0 Бе(1ує) ОКОМ) БО /Мер і Бас ує) ос Н-бі/ськ 0 2бх1079 3) ЩМіхі0є 2.ох103 52х103 9.ох105 | Бохідз о нооБ-14а/153-к ох1079 Бахії 125105 12х107 БВХ105 ТОхюЗ

Нн2оБ5-с014/173-к ) 1ох10ло 0 3ох105 7,5х105 | б.Охі0л9 1 3,7х105 2.бхі04 о ноІОб-с1а/53к 17х1019 | бехюз 1І1х10з3 ея4хіч бахідє 0 біхіз о МОО6-014/173-К 0 13х107л9 | БбБхіоз 0 7ах108 485Бх10л9 Б5ОХІОВ 0 23хія о НоЗІ-а1а/153-к 2,3х1019 | БІО 0 11х102) 14х109 0 6ох105 ) Вехют

НОЗ1-019/173-к | 1яхібло Ї бохіоз 0 8хібз б.бхійло 42х105 2.Вхі03 поло атлоак оалхю алхнв о зіх103 0 15МОЗ блахібв вах о Нояосі/п73-к | оох1і1079 0 ЗяЯхіб5 0 7,7х103 87х1039 34х105 2охі03

НВ о1а/ЬВк 0150 1Зх1О6 | 20х105 52х109 | 8бх105 | а5х103

Контрольний приклад 7. Розробка способу для вимірювання активності АОСС

Фракцію мононуклеарів, узяту з периферійної крові людини, застосовували для похідних від людини клітин-ефекторів. Від здорового волонтера (дорослого чоловіка) узяли 50 мл периферійної крові, застосовуючи шприц, попередньо завантажений 200 мкл розчину гепарину у концентрації 1000 одиниць/мл (5000 одиниць Момо-Нерагіп Іпіесйоп, Момо Могаї5К).

Периферійну кров розвели удвічі РВ5(-), та впорснули заздалегідь Рісої-Радое РГО5, щоб виконати центрифугування. Цей продукт додали до пробірки відокремлення лімфоцитів

І еисозер (Сгеїіпег Віо-опе) та центрифугували (зі швидкістю 2150 обертів за хвилину протягом 10 хвилин при кімнатній температурі), а потім зібрали шар фракції мононуклеарів. Клітини промили один раз 10 95 ЕВ5/0О-МЕМ та суспендували у 10 95 ЕВ5/О-МЕМ зі щільністю клітин 5 х

105/мл, внаслідок чого отримали розчин суспензії клітин-ефекторів. Клітинну суспензію застосовували як розчин РВМС людини у наступному експерименті.

Розчин суспензії клітин-мішеней отримали для проведення тестування у час застосування.

Клітинну лінію раку підшлункової залози людини МІА РаСа-2 (АТСС) підтримували шляхом субкультивування у середовищі Ігла, модифікованому за Дульбекко (Оцірессо5 Моайеа Еадіє

Медіа) (Іпмігодеп), що містило 1095 ЕВ5, 2,595 сироватку коня, 4 ммоль/л І-глютаміну (Іпмігодеп), 4,5 г/л глюкози (Іпмігодеп) та 1,5 г/л бікарбонату натрію (Іпмігодеп) (далі у цьому описі винаходу називається субкультуральним середовищем). Для реагенту мічення 228 мкл 945 ЕВ5/0О-МЕМ додали до пробірки, що містила 12 мкл базового розчину Саісеіп-АМ/ОМ5О 10 (Масаїаї), приготованого при концентрації 4 мг/мл, внаслідок чого отримали розчин СаїЇсеіп-АМ у вигляді слабої суспензії. До 1 х 105 клітин клітинної лінії МІА РаСа-2, яка піддавалася центрифугуванню (зі швидкістю 1200 обертів за хвилину протягом 5 хвилин при 4 "С), додали розчин СаїЇсеіп-АМ, отриманий так, як описано вище, у концентрації 200 мкл на клітинний дебрис 1 х 106 клітин, внаслідок чого отримали клітинну суспензію. Усю кількість цього суспензійного розчину перенесли до пластикової пробірки для забору крові (Мійоп

Рпагтасецшіїсаї) та інкубували в інкубаторі з СО» при 37 "С протягом 2 годин. Клітини промили тричі 10 925 ЕВ5/О-МЕМ, та розчин суспензії клітин-мішеней отримали внаслідок суспендування промитих клітин у 10 95 ЕВБ5/О-МЕМ, внаслідок чого отримали 20 х 107 клітин/мл (1 х 10/50

МК).

Для розчину суспензії клітин-мішеней 100 мкл середовища додали до планшета з пласким дном та 96 комірками. Після цього моноклональні антитіла проти епірегуліну, (Н206-с1а/ 73-К (ЗЕО ІЮ МО: 142/141), Н2г40-С1а/ 73-К (ЗЕО ІЮ МО: 150/141), та химерне ЕР27 (5ЕО ІЮ МО: 32/33)) розвели у середовищі, а потім додали до планшета по 50 мкл/комірку. Антитіла додавали при кінцевій концентрації від 0,0001 мкг/мл до 10 мкг/мл. Після цього розчин РВМС (1 х 107 клітин/мл) додали по 50 мкл/комірку, планшет залишили в інкубаторі з 5 96 СО» при 37 "С протягом 4 годин та визначили специфічну швидкість вивільнення СаЇІсеіп-АМ. Планшет піддали центрифугуванню (зі швидкістю 1200 обертів /хвилину протягом 5 хвилин при кімнатній температурі), та інтенсивність флюоресценції (Лех-490 нм та Лет-515 нм) 100 мкл надосадової рідини, зібраної з кожної комірки планшета, вимірювали за допомогою флуорофотометра.

Зо Специфічну швидкість вивільнення кальцеїну визначили за допомогою формули, наведеної далі (Формула 3).

Формула З

Специфічна швидкість вивільнення кальцеїну (95) - (А-С) х 100 / (В-С) "А" представляє інтенсивність флюоресценції у кожній комірці; "В" представляє середню інтенсивність флюоресценції комірок, до яких додали 50 мкл 10 95 ЕВ5/О-МЕМ, 50 мкл розчину суспензії клітин-мішеней та 100 мкл розчину МР-40 та "С" представляє середню інтенсивність флюоресценції комірок, до яких додали 50 мкл 1095 ЕВ5/О-МЕМ, 50 мкл розчину суспензії клітин-мішеней та 100 мкл 1095 ЕВ5Б/О-МЕМ. Тест виконували при М-3, та специфічну швидкість вивільнення кальцеїну для кожної концентрації антитіла визначили, застосовуючи

Містозой Опісе Ехсеї! 2007.

Контрольний приклад 8. Спосіб вимірювання нейтралізуючої активності (1) Впровадження клітинної лінії Ва/є3, яка експресує химерний рецептор ЕСЕК людини (ЕСЕВ ВАБЕ)

Застосовуючи стандартні способи, виділили рецептор ЕСЕ людини, який має послідовність, наведену у 5ЕО І МО: 166 (СепВапк Асс. Мо. ММ 005228) (далі у цьому описі винаходу позначається ПЕСЕК), а потім отримали вектор, який може експресувати рецептор ЕСЕ людини (рСХ201/ЕСЕНЯЗ). 15 мкг лінеаризованого вектора експресії НЕСЕК (рСХ2О1/ЕСЕКЯЗ), отриманого внаслідок перетравлення Руці, трансфектували у клітини Ва/ЕЗ3 шляхом електропорації (Сепе Риїзег;

Віокаад) в умовах 0,33 кВ та 950 мікрофарад. Трансфектовані клітини селектували у середовищі

ЕРМІ1640, що містило 10 95 ЕВ5, 300 мкг/мл 72еосіп та рекомбінантний епірегулін людини (КУ

Зузієтв, Саї: 1195-ЕР/СЕ, 200 нг/мл); та виділили клітинну лінію ЕСЕК ВАР. (2) Активність антитіл проти епірегуліну нейтралізувати проліферацію клітин, залежну від епірегуліну людини або епірегуліну мавпи, клітинної лінії ЕБЕК ВАГ

Експерименти щодо вимірювання активності антитіл проти епірегуліну нейтралізувати проліферацію клітин, залежну від епірегуліну людини або епірегуліну мавпи, виконували, застосовуючи клітинну лінію ЕСЕК ВАЄ, виділену за способом, описаним в (1). Клітини промили, щоб видалити епірегулін людини, присутній під час культивування. Потім клітини знов суспендували у середовищі КРМІ1640, що містило 1095 ЕВ5, а також П5ЕКЕО-НІіх або бо суЗЕВЕС-НІв (кінцева концентрація 2,5 нг/мл), та клітини посіяли у планшеті з 96 комірками з щільністю 2 х 102 клітин / 100 мкл/комірку. Розведене середовищем антитіло проти епірегуліну додали до клітин у різних концентраціях (від 0,014 мкг/мл до 30 мкг/мл), та потім клітини культивували в інкубаторі з 5 95 СО» протягом трьох днів при 37 "С. Після культивування додали реагент для вимірювання з набору СеїЇ Сошпіїпуд Кії (ЮОоіїпас), та розвиток кольору здійснювали протягом 2 годин. Після цього абсорбцію реакційного розчину (450/655 нм) вимірювали, застосовуючи Вепсптагк Ріиз (Віо-Най). Значення для концентрації антитіла 0 мкг/мл застосовували як контрольне значення, щоб розрахувати швидкість пригнічення клітинного росту (значення ОО (оптичної щільності) при кожній концентрації антитіла / значення 00 контрольної концентрації х 100 (9б5)).

Контрольний приклад 9. Вимірювання кількості агрегату шляхом хроматографії з гель- фільтрацією

Застосовуючи з30005УУхі (розмір частинок 5 мкм, 7,8 І.О. (внутрішній діаметр) х 30 см, виготовлену ТОБОН) як колонку та застосовуючи 50 мМ натрій-фосфатний буфер (рн 7,0), що містив 300 нм Масі, як рухому фазу, вимірили кількість агрегату шляхом хроматографії з гель- фільтрацією. Колонку, з'єднану з системою Аїапсе (виготовленою Умаїег5), урівноважили при витраті потоку 0,5 мл/хвилину, а потім у колонку впорснули 5 - 10 мкг розчину антитіла.

Елюювання антитіла визначили, застосовуючи детектор абсорбції ультрафіолету (215 або 280 нм). З отриманої хроматограми розрахували частину пікової ділянки агрегату у загальній піковій ділянці.

Контрольний приклад 10. Вимірювання середньої температури теплової денатурації (Тт) за допомогою диференційного скануючого калориметра

Натрій-ацетатний буфер (рН 6,0) у концентрації 20 ммоль/л, який містив 150 ммоль/л хлориду натрію, отримали як зовнішній розчин для діалізу, та діаліз здійснювали протягом одного цілого дня шляхом просочування у цьому зовнішньому розчині діалізної мембрани, яка включає розчин антитіла в еквівалентній кількості від 50 до 100 мкг антитіла. Розчин антитіла, отриманий при концентрації антитіла від 50 мкг/мл до 100 мкг/мл із застосуванням зовнішнього розчину для діалізу, застосовували як зразковий розчин для вимірювання значення Тт.

Придатне обладнання для проведення диференційної скануючої калориметрії (050), наприклад, О5С-П (вироблене Саїйогітеїйу Зсіепсез Согрогайоп) або МісгоСа! МР-ЮО5С

Зо (вироблене СЕ Пеайсаге), можна застосовувати для цього експерименту. Суттєво дегазований зразковий розчин та контрольний розчин (зовнішній розчин для діалізу) окремо включили у батареї калориметра та піддали суттєвому тепловому урівноваженню при 40 "С. Після цього рЗОбС-сканування здійснювали при температурі від 40 "С до 100 С зі швидкістю сканування приблизно від 1 К до 2,5 К/хвилину. Результати вимірювання представлені як верхівка піку денатурації в залежності від температури. Середню температуру теплової денатурації зразка розрахували шляхом визначення піку домену Раб згідно з непатентним документом (Нодоїо еї а!., Іттипоіоду І ецЦегз5 (1999), р47-52).

Контрольний приклад 11. Вимірювання рі шляхом ізоелектричного фокусування

Застосовуючи РПавізузіет Сабззеце (Атегепат Віозсіепсе), збільшували об'єм гелю РПабві-

Се! Огу ІЕЕ (Атегейпат Віозсіепсе) протягом приблизно 30 хвилин у розчині набрякання, який мав склад, наведений далі.

Таблиця 22

КОМПОЗИЦІЯ | ОБЄМ

ВО ГЕРОЯ 000 В МК

МНИ-О ВОДА 0.05 мл

Віо-ідле 7/9 (ВіоБай) (10 мкл

Віо-ілле3/10 (ВіоКай) (10 мка «Ррагптпаїме 810.53 ЕЕ (АшегснатшВіовсієпсє) 000 Мк 0000

Збільшений в об'ємі гель застосовували для здійснення електрофорезу із застосуванням

РПпазізЗузієт (Атегзпат Віозсіепсе), контрольованого програмою, описаною далі. Зразок додали до гелю на Етапі 2. Набір калібрування для рі (Атегепат Віозсіепсе) застосовували для маркерів рі.

Таблиця 23

ЕТАП : Умови

АП 00 ........20008, 2,5 мА, ЗБ 15С, БУВ

ЕТАП? 00101001 2008, 25 ма, 35, І5С, 15000000

ЕТАП З 20008, 2 5Бма, 35, 150, 410 УНН

Після електрофорезу гель зафіксували 2095 ТСА, а потім здійснювали забарвлення сріблом, застосовуючи набір Зіїмег Зіаіїпіпд Кії, Ргоївіп (АтегзПпат Віобсіепсе) згідно з супроводжувальними інструкціями. Після забарвлення ізоелектричну точку зразка розрахували на основі відомих ізоелектричних точок маркерів рі.

Контрольний приклад 12. Побудова штаму, що експресує фукозильні антитіла

У клітині, де експресія обох генів-транспортерів фукози на гомологічних хромосомах штучно інгібується, інгібується функція фукозного транспортера. Застосовуючи цю клітину, можна отримати антитіло з дефіцитом фукози (М/О2006/067913 тощо). Крім того, антитіла з дефіцитом фукози можна також отримати, коли антитіла виробляються у клітинах з примушеною експресією бета 1,4-М-ацетилглюкозамінілтрансферази ПШШ та альфа-манозидази Ії Гольджі (Реітага еї аї., Віотїесппої. Віоепуд. (2006) 93 (5), 851-861). Для дослідження застосовували фукозиловані антитіла ЕКЕС, отримані за такими способами, які є відомими для фахівців у галузі.

Контрольний приклад 13. Оцінка ризику імуногенності із застосуванням інструмента комп'ютерного моделювання для передбачення імуногенності, Ерібазе

Клінічна корисність та ефективність фармацевтичних засобів з антитілами обмежуються антитілами проти ліків (АБА). АБА впливають на ефективність ліків та кінетику фармацевтичних засобів з антитілами та іноді спричиняють суворі побічні ефекти. Повідомлялося про багато факторів, які впливають на імуногенність, та, особливо важливим вважають те, що епітопи Т- клітин містяться в антигенах. Інструменти комп'ютерного моделювання, доступні для передбачення таких епітопів Т-клітин, включають Еріразе (ІГопла), ІТоре/ПСЕЮО (Апійоре) та

Ерімаїгіх (Ерімах). Повідомлялося, що можна передбачити послідовності, які містять епітопи Т- клітин, присутні у білках, які представляють інтерес, застосовуючи інструменти, описані вище (Ехреп Оріп Віо! Тег. 2007 Маг; 7(3):405-18).

Ерібазе ГідпІ (Гопга) - це інструмент комп'ютерного моделювання для розрахунку спроможності зв'язування між 9-мерним пептидом та головною алеллю ОКВІ, який застосовує алгоритм ЕАЗТЕК (Ехреп Оріп Віо! Тег. 2007 Маг; 7(3):405-18). Цей інструмент дозволяє

Зо ідентифікувати епітопи Т-клітин, які сильно або помірно зв'язуються з МНС класу ЇЇ.

Показник імуногенності при комп'ютерному моделюванні можна визначити для кожного модифікованого антитіла згідно з наступною формулою (Формула 4) у системі Ерібазхе Гідні (Гопга).

Формула 4

Показник імуногенності - Сума (частота кожної популяції алотипу ОКВІ Х кількість критичних епітопів)

Розрахунки відображають відносне розповсюдження алотипів ЮОМКВІ. Для цього можна застосовувати наступне відносне розповсюдження серед представників білої європейської раси: рАВІ71501(24,5 9), рянв10301(23,7 9), ряАв10701(23,3 9), рАВІТ70101(15,0 оо),

ОАВІ71101(11,6 9), рвАВІ171302(8,2 95), рАВІ1401/1454(4,9 р), ряв10901(2,3 95), ряАВІТи1502(0,5 95), ОНВ171202(0,1 Ов).

Усі епітопи, які містяться у кожній послідовності модифікованого антитіла, які демонструють сильне або помірне зв'язування, визначаються за допомогою алгоритму ГАЗТЕБК, та епітопи після виключення послідовностей зародкової лінії людини та з'єднувальних послідовностей між варіабельною ділянкою та константною ділянкою застосовуються як критичні епітопи для розрахунку показників імуногенності. Коли показник є меншим, тоді це означає, що послідовність має нижчий ризик імуногенності.

Контрольний приклад 14. Випробування ефективності ліків на антитілах проти епірегуліну, застосовуючи моделі іп мімо (1) Підтримання клітинних ліній, які застосовуються для трансплантації у моделях іп мімо

Клітини МІА РаСа-2 (АТСС) та 0 0-1 (АТСС) застосовували для моделей іп мімо. Клітини

МІА РаСа-2 підтримували шляхом субкультивування у середовищі Ігла, модифікованому за

Дульбекко (ОцІрессо5 Модійеа Еадіє Медіа) (Іпийгодеп), яке містило 10 95 ЕВ5, 2,5 95 сироватку коня, 4 ммоль/л І -глютаміну (Іпмігодеп), 4,5 г/л глюкози (Іпмігодеп) та 1,5 г/л бікарбонату натрію (Іпмігодеп) (далі у цьому описі винаходу називається субкультуральним середовищем). Клітини 0Г0-1 підтримували шляхом субкультивування у середовищі КРМІ1640 (5ІСМА), яке містило 96 ЕВ5, 10 ммоль/л НЕРЕЗ (Іпміїгодеп), 4,5 г/л глюкози (Іпмігодеп), 1 ммоль/л пірувату натрію (Іпмігодеп) (далі у цьому описі винаходу називається субкультуральним середовищем). (2) Отримання мишачих моделей, трансплантованих клітинами МІА Раса-2 та 0 0-1

Застосовуючи розчин, що містив субкультуральне середовище та МАТЕІСЕЇ Маїгіх (ВО

Віозсіепсе) у відношенні 1:1, отримали суспензії клітин МІА РасСа-2 та 01 0-1 у концентрації 5 х 10 107 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії (5 х 106 клітин/мишу) трансплантували підшкірно в абдомінальну ділянку мишей 5СІЮ (самки віком 5 тижнів СІ ЕА дарап, Іпс.). Об'єм пухлини розрахували, застосовуючи Формулу 5, та коли середній об'єм пухлини досяг 130 - 330 ммуУ, тоді визначили, що отримали мишачу модель.

Формула 5

Об'єм пухлини - довгий діаметр х короткий діаметр х короткий діаметр / 2 (3) Отримання зразків для введення, кожен з яких містить антитіло тесту

Зразки для введення, кожен з яких містить антитіло сН-с1/сі-К, антитіло Н2О6-С14/ 7-3К або антитіло Н240-С11а/І 73-К, при 0,04 мг/мл (у групі введення 0,4 мг/кг) або 0,2 мг/мл (у групі введення 2 мг/кг) приготували у фізіологічному сольовому розчині у день введення. (4) Введення зразків для введення, які містять антитіло

Зразки для введення, отримані у (3), вводили через хвостову вену мишачим моделям, отриманим у (2), один раз на тиждень протягом 14 днів, починаючи з 14-го дня після трансплантації клітин МІА Раса-2, та один раз на тиждень протягом 14 днів, починаючи з 12-го дня після трансплантації клітин БІО. Як негативний контроль, вводили фізіологічний сольовий розчин подібним чином у дозі 10 мл/кг крізь хвостову вену один раз на тиждень з відповідною тривалістю. У кожній групі було по 5 тварин, та кожній групі вводили відповідний зразок для введення, який містив антитіло тесту. (5) Оцінка протипухлинного ефекту кожного антитіла тесту

Протипухлинний ефект кожного антитіла тесту оцінювали на мишачій моделі, якій було

Зо трансплантовано ракові клітини людини. Об'єм пухлини вимірювали на 3-й або 7-й день після останнього дня введення зразка.

і РОТЛРОН МОВА

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» ЧУГЕЙ СЕЙЯКУ КАБУСІКІ КАЙСЯ (СНОСАЇ БКІХАКИ КАВИБНІКІ КАКВНА) «1205 ГУМАНІЗОВАНЕ АНТИТІЛО ПРОТИ ЕПІРЕГУЛІНУ ТА ПРОТИРАКОВИЙ ТЕРАПЕВТИЧНИЙ

АГЕНТ, ЩО ВКЛЮЧАЄ ЗГАДАНИ вНТИТІЛО ЯК Активний ІНГРЕДІЄНТ «кіза» бі-А3з114У1В кава» лР 2011-287554 «151» 2011-12-28 «150У св 2Оот2-133394 «ї5І1х 8012-05-13 «Рабле 171 хі70» Ррабепьів тегаїов 3.4 «вій 1 «тіж 30 «813» РАХ «213» Щйожо варієпа «аб 1 сів Уві бів бей Уа) біз Вех сіу Аїа біз Маїі цув Пув Рго біу Аі8 1 5 30 ї5

Вех Маї пув чаї Беж Сув Був Уаі Бех СТУ Туж Тпх Бей тВЕ а5 зо «й1вх 2 «1» їж «12» РТ «213» Ношо варієпв «ах 2

Тр Маїії Ака сів Аїа Рко біу біц Щіу Бей зі) Ткр Меб 15 1 а що «вій» З «ії» 32 «12» Р «213» Ношо варієпв «00» з

Ага Уві Твх ІТ16 ТВтг Аїа Авр Твг Вех Таж АБр отТвЕ Аза тую Ме СИ ії во 16 15 їва Зек бах пев Ах Зве сіа АБр отак Аза Уві Тух Тух Сув Аїв го 2 25 зо «іх «1 11 «ві2У РЕ «213» Нощо варієнйе

2 РСТЛРЗО1284042 хай» 4

Ткр и сіжЖ бій БРу Три Бей Маї ТЕ Уа) беж бах 1 8 10 «10» 5 «оі» 23 «гай СРКТ «213» Ново варієпа «ОО» в

Авр Ії біп Має Тв: пій бек Рко Зех ВЗег їм беж Дія Бех Уві с1у 1 5 10 15

Авр.Аха Уві ТЕХ Те ТЬж Су «і» в «2112» 5 «Ра» ВВтТ «13» Нешо зархегів «00х 6

Ттр Тух сів сій Був рко бБ3іУу Біп Аза Бгто Ася Пезх Бей Ї16 Ту 1 в 10 5 «ід» 7 «і» 2 «геї» РЕ «213» Ново варієва кап 7 біу Уаї рРго Веж Асу ББе бек 5їу Бех сіу Беж біу Тік Авр РБе Тк 1 Б 19 15

Ре тах о тіє бех Бек Гео іп Рхо Зі Азр тів А1З1з ТБк Тук Тук Сув 20 же зо «10х 8 «21ї» 19 «?ігж РЕТ «213» Нощшо варієпа «Ох 8

Бе біу віу Б1у ТвВкоБуз Уаї бій Ті Цув 1 в їа 2103 8 «її» 5 «Тіз РЕЖ кбіЗ» Мив Мазепмів

3 ЕСТЛРОВІО ВА каб» 9

Ар тт Тух т16 1 ї 5 к210» 10 «ії 47 «їз» РВТ «13» Мав Мизсзївв ка00» 10

Акч Тїе Авр рко Мей Авпобіб АБа Тх Пув Тух Уаі Ро Пує Бра бій 1 5 1й 15 -51У «аж І «Ті» 7 «212» РЕтТ 2132: Мав Мавспіїца «Ох ТЕ

Век сіу Твж пем Рре Азр же ї в «гід» 13 к»ії» 11 «а ВЕТ «Бі13» Мав Мивеазїиав «оо 12 муз Аїа« Беж біп Азр ї1е Нівз був Тук К1є А1а ї 5 10 кг» 13 каїїз 7 «шій РЕТ «вії» Мов Мо;всевіве «Апо» 13

Тухк ТВк Бек ТВ Пеп сів Рко 1 З кого» 14 «11» В «12» РЕТ «213» Мав Мавезіда жав» ла

Без бій Ту Ав деп пес Аку чве 1 а

4 РОСТПЕ2ОТ2 НЯМ «210» 15 «2315 115 «8122 рат «213» Швучна «по» «23» Шкучно синтевсована пептидня послпідовийсжкь «00» 15 бів Уві Суп Печ Чаї бів Зех біу Афа бій уві Був був БРго сіу дів 1 5 10 15

Бех чаї їв Маї Бех Суз Пуз Уді Бех С1іУ Тук ТБх бво ТНх АвротТвЕ

Тук її сів Ткср Чаї Ага біп Аа ртго сіу біл о біУу Ппейп 1 Тур Ме о 45 бі Аа Хі Авр о рхо їва Ава СБУ Ав Та Бус Тух Маї Ро Був РНе ко 5Е во сій сСіу Аку Узі ЗВк її Так Аїа дер Тк Вех ТБ АвротТаж Аїд Тук б то 75 во

Мев сім Пец Бек Бех їз Аку Беж бій Авр Тк Ата Уа) бух Тут Сув

І 0 ве

Аїа Аха Вех піу Тк Ге Ре Авр рРає Тер сіу біп біу ТЬх їецй Уві

Мав 305 о

Тйг Уві Бех бех 115 «10» 16 «2112 106 «ваз ВЕ «13» Штучна «Та . «2232 Штучно синтевована пептидна послідовність. «апох 16

Ав гі 0)в0 Мех Тіт о біп бек Рко Бех бЗег їес бек Адїа Вех Чаї ШУ 1 5 10 15

АвроАго уаїі Тк ї1 ТАЖ бує пув Аів бег біп дер ї1е Ніз пув Тух го 25 30 їїе дів Тер Тук пів сів Бу Рсо сіу іп Аза Рг Аква їв пез Т1е 35 а 45

РСТАВ20 12084042

Тук Тук ТвВх бек ТвВх Беа біп Рко сіу ах Бко бек Аку Рапє Зах біу 5О 85 80 бЯек сіу бах С1у Тік Авр Ре Тих РНе ТнЕ ї16 бек бек Бей бій рго 65 76 т5 во бій Авв т1е діа Тк Туж Тук Су Пез біп Тук о Авор Авпоїес Агу Тк 85 Фо а5:

Рре с1іу сіу Сіу ТВжх Пув чаї біз їле Ццув бо 105 «ій 17 «их зо київ» рят «иа» Ново зврівав «а00х 17 сбіп о Авр бів йецп Уаї бів Зек сім Аїв бій уві пує Буз Ркбо б1у Аїа 1 5 10 15

Яех Уві Гуз Маї бек Сув Пуз Аїа бек б3у БДде Авп їі Гу | 25 За «вї0» 18 сетії» 32 кг1і22» БаЖ «КЗ» Ношжо заросла х400» 18

Ага Уаї ТЕ Їїє Тнк Аза Авр ТВк Бех ТВх Авер Тих Атїа Тук Меб сті 1 Б 10 т

Ієч Зак Зах їм Ахо бак піч Авр о Тах Аза Уві Тук Тух СЕ Уві Ах 20 25 зо «2102 19 кв115 316 «ії» РВтТ «ах Штучна. «Ох «РОЗ» Штучно синтезована пептидна послідовну сть кабо» 19

Сіп дяр бів Фей Заї бій бек Сіу Аїа сій Уа) гуя Був Рко С1у Аза 1 5 то 1 бетх Уві Був Уві бек Сув Пув Аїа Век СІу Не Авпої1іе ув Авр о тТЬЕ 270 -5 зо б ВСТЛРМИ ОВО

Тук Ії біп Ткр Уаї Ах біп біз Рко зу бів б1іу йей біз Ткр Меї

Кі 49 15 б1іу Аха тіє Авр о рха пе) Аза С1іу Аза ТБ Гуз Тук Чяії Рко ПуворНе

Ба вк 50 зіп сі дк Уві Твх їїе Тик Аїя3 Ар ТВЕ Вех Твж Аєб о Твг Ата тТух 65 7о 75 во

Мак іч йва бак бек ої) Агу ех біз Ар тв Аа Мві Тук Тук Си зо 55

Чаї Ак Бек біу Тік Тв Ре Авр тре Ттхр пі бів сСіу ТЕ рей Маз 100 105 110

ТнЕ Уві бак Зек 115 «вій» 20 «еї1їж 15 «212х РЕ «Рі3» Нощо зарієпа «400» 20

Ткр Тук бів Сів о їув Бго біу бів Діва Бхо ВкФ Бей їй Ї1їе Сіп 1 ї 10 ї5 «10» 21

Вії» ЗИ «2125 РЕЖ

К2ї3» Нощо зарізав «ой» 21

Сіу Чаї рко Вех Аху Бпе бет Сіу Бек СО1їу Бах Біу Тіт Авер Хут ТИЖ ії 5 10 15

Біа ТВ тів Бек Яке Бей біб; руз Бій Азр тзле Аза ТвкЕ Тух Тук Сув 2 25 за чаї» 22 «вії» 106 «122 ВЕТ «213» Штучна «20 «223» Штучно синтевована лептидна послідовність «Обж 92 дер Ії дій Ме Твг Сі бек орсо бег бег Бей Яех діа бек Уаї 01у і 5 10 15

7 РОСТОМ

АзроАга Чаї ть Її ТВкЕ Суз Був Аїв Бех біп Азр тів Нів пу Тук 75 за

Т1е АтТа Ткр Тут бів бів Бує« Рхо б1іу бів дів Бко Ахе їва бебз ї1е 20 4х сів Тух Те бег Тк без іп о рко біу Уаії Рко Ваг Аха Рае бек Сі 5о 25 50 ех сіу Бек шіу Тк Авв о Тук Пат Ра ТВу Тіз бак Зву їва бів ркго 65 70 75 во бій Авр їі Аз1а Твг тую Тух Сув Ппви бій о Чук АвроАвп о їз Ага Те за 5

Впе сбіу зіу сіт Тнюк Пує уві біз х1є Буз 105 105 «210» 73 киїї» 32 «212» РЕт «2і3» Ново варієдпа ка» 23 сіу Уві Рко Зех Ак Брпе о вех сіу бег сіу Бех біу Твг Авр о Тук: ТВЕ 1 5 їй ї5. їй ТВЕ Тів бек бек їз бій Рго бій Авр о Ре Аїз Тих Тук Тук Сув 20 25 30 «10» ха кит» 106 «Тих вет «еї3» Штучна «80 «223» Штучко синтевована пейтинна послідовна сть ча» 24

Авр 112 бій Меб Тк біп Вес Бко бах бет йец бас вія Шех Уві біу 1 5 хо 15

Азр Ак Маї Тпж Ті ТВ Сув Мув Аїв Бак біп АвБр Ті Нів Пбв Тук 20 25 за

Іїе Аїа Ткр Тук біп Сіп їув Ркбо біу біз Атїа Рхо Акд во Ббем Ї1їе 35 40 з сів Тух Тк бек ТБт без Сів Рко біу чаї Бхо бек Ага Ре бек сіуУ 5о 55 50

РОТЛРД ЮК

Беж стіу Веж сту ТВ: Азр тую Тк тей Трек Її Зех бет Бей Сій рко ва 7 та Е21в) бін Авр Ре Аза Тік Тух Тук Суб Те Сіп Тух Авр Аза оїез Аку ТбЕ ва що 5

Бав біу сту СЕУ Тв Був о Заї сій ї1їе їуа 100 105 «їй» 25 «ії» За «В1ї» РЕТ «13» Ното зархепа «ОО» 25

Аїа бех Трх Ццув С1іу Рко Зак Уаї рве Рез Гем Міа Рко Бек Бек Був 1 5 10 їз

Беж Тьж бек Сіу оіу їТвх Аіїз Азїа їв бЗіу Суб Бей Маї тув бзр о тТух 28 25 в)

Бе рко біс Рхо чаї ТНк Маї Бех Ткр Ав) бек 01у Аіа Те ТвЕ бек 15

Зіу уві Ніє ТЕ Рне Рко їз Уві Без Бій бек Бек сіу Пец Жук Вех 5О 55 во їє) Бек бек Уві Уді Так ай Рко бек бе бек пес бі Тв бій Тех 65 та 75 во

Тук їі був Ап очі Ав Ні Пув Ркс бек Авп ТБЕ цуб Уві Авр Шу 85 зо З5 пуз таї сін ро Був Бек Сув Ар Був ТНх Ніз Тйх був РЕ рко був 106 108 І1о

Рхо Аїа Рго сій єм Пец) 01у сіу рко беж Маії Ріе йей Рпе Рхо Ро 115 120 125 пув вхо цпув АвроТВж бей Мебє її Бех АкФ ТНжЖ Рг біс Уаї Тк Сух 130 135 150 чаї Чаї уві Авр Таї Бек Вів сій Авр о бко біз Маї Був рРНе депо Тер 145 159 155 160

Туж Уві Авр біу Уаї Бі Уаї Ні Авп А1а Ппузв ТВ ПДув ко Аку 51 65 ї1о 175

З ВЕСТЛРЗОБІВЯО4о зі біб Тук зей Бех ТБ Тук Ак Уві Маї Бек Хай Ба Твх Уаї Пей 150 185 ї50

Нів сіп Авр Тур ей Авп обіу був бій Тук Муз СОув Був Уаї беж деп 195 205 205

Гуз Аза ївч веб АТа Рко І1їе сдла пу Тпж Ії бат Пув АТа був Ту 218 235 224 бів орхо Ака біла Рко сій Уві Тук ТЕ Гей Рхо ро бек Ак Авробієй тя 230 235 245 їв ТЕ Пув Ап біпоУаї Бек їсцп Твх Сув рей Майї пуз сіж Рбе тую 245 250 255 рко Бех Авр ї11е Аза Маї Сі. Ткр сій Зах Авп о біу біп Бо сій Деть 260 765 та

Ав» тує уз Тк ТЕ Рко Рхо Маї Бей Авр Бек Азр спіу Зак ре Бе 275 299 р їейц тТук Вех пу Ген Тих Чаї Ачр їув Бек Ахч ТЕр бів 5їп спіу Авоа 289 295 за

Уві Ре бек Сув Бак Уві Меб Нів 035 АтТа їз Ні Ав Нів Тук ТЕБЕ 05 з10 315 20 іп цув бек пей бек Ппей век Ртго пХу Пув 25 330 «ТОМ 256 «шії» за «12х РЕТ «213» Ново варіпв ка0ох 6

А1та Бех ТвВк йув чіу Рго бек Ма) Ре Рко йешп АТа Рко Зех Бех Муз 1 5 16 ї5

Зех Тк бек піу Сіу ТБтг Діва А1а Шез Сіу Сух Пе Чаї мув Авв оту 20 25 Зо

Ве рко Сі рго узі Тих Уві бЗег Тур Авпобек біу Аїв Об ТВх дех аа 4 сіу Маї нів Так Рве рто Аїа Уві Бен бій Зех бек 53у без Тух Зек 5О ва 659 і0 ВСТА

Тец бек чек Уві Уві Тих Маї Рко Бех бек Зех цей йіу ТьБх Став ТБу то 75 во

Тук їз) Сув Авп ові Ази Нів Був Рго бах Авп ТЬжх о Пуз УВ1 Авропуав но 950 55 ув Маї біо рРхОо Ітув беж Сув бвр. бує Тік Ні ТЕ Сбв Вко Бхо Сув 100 138 110

Ркго АтТа рко Стіч без їєнх піу сіу Рко бех Уді ББе Пец Бе ко ро 115 120 125

Муз Ркб пу Ар оТБтх їєм Має Тіе бер Аха Твт Рго біц уві Три Суз 130 135 140 чаї Чаї Чаї Азр Ууаїі Зег Назв біз Азр рхо пі Ма) Буз РНе Авп Ткр 145 150 155 160

Тут Маї Авр Сіу Уві бій уаї нів Азп о Аів Був Тож був Во Ах бій 165 1 175 бій біб Тук ВвпобБек Тпх Тук Ах Уві Уві бЗек Уаі Бей Твх Уві Без 180 185 150

Нів стій АвротТхропеч Азпобіу Ппув с1а тує бує Су пу Уалї бех Ап 195 205 ОБ

Був А1іа Па Во Ата РКО ЇТе Січ Гуз Так Її йех Му Аїва Буг СТУ 210 зі5 220

Сіп ро Ак сіб рко біп Мві Тук ТнжЕ Тез Рко Рхо Важ Акад Авр ста 27525 230 235 245

Твшй Тит оцуз Авпобів Уві беж пем ТВж Сув це; Уві Буз біу Бе тує 245 250 255

Вкго бек Авв оІ1е АТа Уаї сіб Тсвобіч Бест Авп ШЖІУу сів Рхо Сів Авп 260 265 274

Ав Тух Буя ТвЕк оТБе Бко Рко Уаі Тен оАвр бек Авр сіу бек Ра вне 275 2ч0 85

Без Тук бек був Пес Твж Уві Авр о цув Бех Аху Тер обіп біп Су Ав 290 295 Зо

Уві Ре бек Сув Яех Уві Меб нів біз Аза Пей Нів Авіз Вів Тут ЖБЕ з05 310 зт з2о и РСТЛРОВІЗЮВЯОЇа

Зі Був Бек Цей бек Пеа бек рко

З25 «810» 27 жег1ї» 307 «812» ВЕЖ 13» Ношо варієпа «4005. 27

Ах тТвкх Узі Аїа Віз го йек Уві Рре їіз Рпе Вго Рхо Бех Авро бій 1 ї 10 15 біп цей йШув Бех Шіу Тех Аза Бек Уві Маї Сув ей ївп Аяп о Авпо Бра 2й 25 зо

Ту Рко Ака Сіп Аза Шув Уаї сСіп Ткр пув Уві Аврожеп Аза То бів 35 40 45 бек біу Аво Бек біп сій Беж Уві Тк бій бів Дер бек Іуа АвроВЗек 50 а 50

Тнх Тук Бек Гез бек Бек Тіх Без ТЬЕ їйе: бак йпуз Аі-за Ар о Туг Сіл 55 7 те а туа Нів вує Уві Тук Ала Су Сів уаї Тріж Нів бів біб ШПей Век бек о 950 з5 ро Чаї Так Ппув бек о ВБе АвпоАта Сі б3М0 був

ЕК) їОо5. «ато х 8 «ії» 454 «та» БВтТ «213» Штучна «во0х «283» Штучно Синтевована леплядна поспідовнисть «аООж 8

Сіп Азробіп їви Уві біп бек сіу Аїа бій Уві Був Пув Рко біу Аза 1 5 10 15

Бех чаї Був уаі Бек Суя Був Аіїза бек біу Ре Аво Іїїе Пує Авротах 25 За

Тух тів біп Тер Чаї Аку сіп Кїа Бгто Біу зів бБіу Бей бій тер Мей «й 45 бі1у Ага Іїз дер о Бго пез Ан бІХ дви Тих Був Тук Уві Бо ХЕ пе 0 Ба 60 їх ВСТЛеОТ2Ю84042 сіп сі Ак Чаї ТЕ Її1є Тв А1їз Азр о ТБх Бах ТЕ Ар ТІ Аїа Тут 05 79 75 Во

Меб сіа цес бет Бег Бей Ах бек б1й Азр ТЬх Аїа УВІ Тук Тук Сув 85 зо 85

Чаї Ага Бек бБіу Тек їйей Ре Авр.Рре Тхр Сіу біт Сіу Так Тейп Маї 100 ї95 о

Тье Уаї Бех Бех Аза Зак Тік Буз біу рРхо Вех Маї РНесркго цех А13 115 120 128 рко Бех Вех Пуз бек: Тах Бек сіу сіу Тк Аза Аїа пи біу Сув ву 130 1ї35 140

Чаї Був Авр ТуУух Кре РК сти Бхо Уаї Тк Уві Бех Ткр Ай беж БІ 145 150 155 160

Аїа тей ТЕ бек сіу Чаї Нів Те о РКБе Рко Аза Маї Пем біп бек бет 165 170 175 бім її Тухк бек Пецп бек бех Уаї Уві ТЕи Уві Бо Зех Бек бек 5еч 180 3185 190 зі Тх зі ТП тТух І1іє бує лап чуаї Ап Ні Був Ро бек Ап ТВХ 195 а 205 уз Уві Авр ПУ Мув чаї Сі рхо Муз Бех Сув Авр о Пув Ту Нів ТвхЕ 210 215 220

Сув рхо Рко був рго Аза Ро біо тез Тео біу біу Рко Бех уві РБе 225 230 235 7240 пес РБе Рро Рко Мув рго Був Авюр Так йо Меб Її Век о Аху Тбх ро 245 250 е55 біб Чаї Тр Сув Уві чаї Уаї Аявр Чаї Бек Ні та Ар и Бко км Чах 2850 265 270

Іув рБе Ак ГжроТух уаії Ар сіу Уві біз Уві Нів Азов Аза цу ТЕ 275 280 55

Їде Ро дк біз біз біп Тус Авп бек Тк Тує Ах Ма1ї Уві бек Уві 290 295 зо

Їви Три уаї дез ів біг Ав тер Тез Ав біу Ббуз бід Тух Був Сук 395 хо 315 З»

ВСТЛРОЛІ ЛОВ

Туз Уві Важке деп Гуз дів цей Бко Аїа Рго її сій Був ТЬж її Бех 325 330 335

Бпув Кіз цув біу бій Рго Аку сім Ро бів Уві Тук Жах Іва Рко Бко зао зі5 ЗО

Звжх Аку Авр бій ей ТЕ їув Взп сів аіїі Бех Ццев Твх був Без Уві

З55 зво Зв їв сту РБе Тук Рхо бек Авр оїіє Аїа Узі Січ Тер бій Зак дав 01У 370 375 за біп Рео біз депо Азов Тук був Те ТК Бо реко Уві Фей Авр баг Авр

ВВЕ зад 395 400 зіу Бек Ре ре Пец Тух Бек ЦцПув Беч Те Уві Авр цу беж Ак ТЕв 405 410 й18

Сів» бі біу Двп оУаї Рря Зех Сув Зех Уві Ме Ніз біз Атїв їви Ніз 420 425 430

Аза Ніз Тух Тк біп Пуз бек ей йек Пе Зехк Рго «35 440 «від» 29 «2117 213 «гій Вт «еїЗУ Жтучна «ап «923» Штучно синтезована пейптидна послідовна сть «або» 29

Авр Ії біп Меє Твх бів Зак Ро бек бек пекі Бех Азїв о бек Уві сту ї 5 10 ХВ

ВАБр. Аха Чаї Тс ТіЗіе Тих Счвз бує Алла Бех біп Аяр о тт Бів Пув о тТух зо

ІТе Аза Ттр Тук біп бій Був о БРко біу бів Азїа рко Аху Пем Геї їТе

З5 40 45 біп Тук ТЕ бек ТНх без біп орто З1у Уві Ро Зек Аха ре бек 01уУ 860

Бек біу Бек Ф1іу ТнЕ Авр о Тух Тих Ре ТВх о Тіє бек бек Мей Сію Рхо 65 79 75 во сій Авр о І1їє Аза Твх Тук Туж Суб цео бів Тух Авр Ав пай Ахо ТвВЕ

14 РОСТЛРОФІЗІВЯО42 85 за 85 тре сіу Сі с01іу ТВхоїцув Маї біз Їїєе Тує Ак Тих Уаї Аза А1а Бко 100 105 110

Беж уві Бе їїа РБе Рко Юго бек Авр біс Сіп Пед Гуз бег бї1у Тк 115 125 155

Аїа Бех Чаї Чаї Сув їв» Без Аза Авп о рБе Тук о рРхо Вже біз Аза бує ізо 135 140

Уві іп Тхр Пув уаї Авр АБИ Аїа Ген біп Вех Сіу Авв бак СІія Пій 145 ї50 155 ї5О бек Уві ТБЕ бі біп Авр бех Муз Авр бек ТБЕ Тух бек Їй Бех Явкг 155 10 ї78

ТВЕ бес Тьк о Пйез бек пуз Аза Авр о Тух біз Гу Ні Пув Маі Тук Аіа 180 ї85 180

Сув біцш мМаї Тв Яів бів Сіу мец бек бек Рко Уаї ТВт Гуз Дек Ре 1955 225 205 йет Ага біу біл Сув 210 «10» 30 «2112» ЗВ київ» БЕТ «213» Ношо зарієве «4005 30

Аха бек Так Був сСіу рЕо беж Уві РБе ржо їелі Ат Ркго Бек бех Був з 5 19 І5

Бех ТБ Бек бБіу бі Жпж Аіїз Аіїа їєо0 БІ2Уу був Пец Уві йпув вавотТує 70 25 30

Еце Еко піц Рго Чаї Тах Уві беж Ткр Авп о бек б1у АТа Пемі ТНт бек з5 «о 45 піу беїі Ні ТвЕ Ре ВБхо Аіїа Уаі Гей бів бек бак БХУ Бей Тує Бек 5О 55 50 їши Зах Зех уві Уві Тьх уві рко бат Бек бек бец бі ТЕ бів Тне бе та 75 во тує тів Сує Авп Уві АвпоНів Цув Рко бек Авпотьх ув Уаі Азро Був: 85 за 95

РОСТОВ 0. був Чаї сі Рко Ммув бек Сув Авр цу Тик Нів о Твг оСув Рко Рекс був 100 105 1195 вхо АтТа рхо біз Іва Пей біу біб Ро Бек аї пе Без РНе ро Бжо 15 120 125 туз рко уз АвротТвт: це) Мес Ті: бек Ака Тнж Рко біс Маї твж Сув 335 140 т7Таїі Чаї Уві Авр Уаї ех нів біз Авр о врхо біз Маї Був Рюье Авіа о Ттхр 145 150 ї55 а

Тук Чаї Авр сіу Уаї сій Уві Нів АвпоАтїа ув Тк Гуз РЕ ка ста 65 170 УТ біч бів Тук Ав Вес ТЬжх Тух Ак Уаї Чаї бех Маї Прес ТТН аж Шецй 80 ї85 190

Нів біз Звр ттроїва Ав» бі Муз сім Тухк цув Сув Нув Чаї Бек Ай 195 200 255 ув Ата івїий рко Аза хо бів біз був ТВ Їїї6е Бек був Аіа Був Сі 210 215 220

Сів Во вхо іа рко сів чаї Тк Твкойечп Бгто Рхо Яек Аква піп То 2858 за 235 240

Ммеї Тв цув Ав обі» Уаї Бех Без Твг о Сув Бей чаї Бук осіу Вйе Тух 245 250 355

Рго Бех Дер Іі Аів Маї бім Тр Бі бек Авп біу бів бжо Бі Ав, 250 255 879

Акті Тух Буз ТвЕ Жах ро Рго Уаї Цей Авр Бех Авзр Біу бек Ра РвБе 275 280 285 тей Тук Бек був певи тас Уаї аеро пуз бек Аку Тхробіло іп Су Ав 288 | 295 З00 чаї бра Вес Суз бек Хаї Мес Нів сій Аза зо Нів АвлоНів Жук ТЕ 05 310 ЗЕ 320

Зіп пув бак Газ бек ей Бех Рко 395 «2103 З1 «2112 328

Іб РОТЛРОВІМОВА043 «2125 РЕЖ жаі3» Бомо зарієйи «і0ох з1

Ала бек Тіт бує Шіу Ржхо Зах Уві ре Рго Бех Аіа рко Бах Ве Гуз ї Б 10 15 чек ТВх Зежх Сі бСіу ТвЕ Ата Аза пе) сі Ств їй Уві був АвроТух

Рпе Рко 014 Рко Уві ТЬк Чаї бек Тур Авп бак біу Аза Беи ТЬх бех

ЗЕ ч4а 45 сіу Чаї Нів Твг Бе Рко А1їа Маї цем бів бег бек Сіу беш Туєс бек 55. бо їво бек овес уаї Уаї Так Чаї го беж дек Вес ел Сіу Тк бів ТБх 55 7о 75 во

Тук Її Сув Авп оУаі Авп о Нів Був Рко беж Аво ТЕЖ Буз Уаї йзроБув 85 з0 за

Акта чаї хіа Бе Буз бек буз Азр Пув ТЕ Ні Те Сув рт рко Суб 100 хаБ 116

Рг Аїа ко сім їжи ез сіу Сіу ро Зак Уві РБе Бей Бе Рхо рез 155 120 ї25

Був Рхо Муз Азр ТвВх бе Мей Ізїє бек Ату Так Ржхо біз Уві Тк Сув 130 135 140

Чаї Уві Уві йлр Маії Чек Нів сій Авр о Рго біз Уаї був Ре Авп Ттр 145 50 155 169 тус Уві Авв сСіу Уаї сії Уа) Нів Ази Ата Був ТБ БПу8 о Бко Ажая сі 165 170 7 біз біп Тух еп обек Тік Тук дху Уа1 Уаї бек Уві еп ТЕ Уаї Без іво0 і85 135

Нів біп Авр Тер зи Ав біу Був Біб Туг Був Суз Пуз Уаі Бек Ав 195 290 205 пуз Аїв емо бхо А1іа Рко ї1їе 315 Пув ТЕ Т1е Бех Пув Аїв Пуз БІЖ 210 215 гий бів рхо Ака біб Рко біп Чаї Тук Твж Тед Рго Рхо Бех Акф бів іш 225 230 235 240

7 РОТЛРІЮТолЯОМО

Метс Тих Пузв Авх сій Узі бек пев Твх Сув єп Уві Був бБІУ Ве Тух 245 250 Ба рхо пак Аєр І1з Аїз Маї ста Тер бів бет Ах біу біп Бк» біз Асв 260 255 278

Ана о Тук був Тпх тиж РЕб Рко чаї Пеп Азр о Век Авр о біу Зеж ВБе Раз 275 280 285 їви Тук Зах Був йцез Твх Узі Авв був бЗех Аку Тхробів бів щ1у Авв 290 жав. зо

Чаї Ре Беж Сук дек ві Меб Ніз біб Аза цез Нів Ази Нів Тух ТЕ за5 зі 5 29 сів Був бЗех Мей бек Бе бек Рко. 325 «ійм 32 «їх 446 «Віа» ВЕВт «2ї3» Штучна «230 «235 Штучно синтезована пептидна послідовність «ОО» зо біз Авробівп Тез біп Сійп Вег біу Аїа бій пені чаї Муз Рко Б1у Аіїа 1 5 10 35

Бех чаї Був Бей Зек Сув Тих Аїя Зех СІ Рає во ї1є був с АЮ ТЕ 5 зо

Тук їі біп ТкЕр Узі Шув їец Аку Бго біп біпосіУу Гео біз Тер їМ1е 80 45 с5іу Ака її8е Ар о Бхо Її-во Ав о біу дет Тк оЇїув тТук Уві Ббко Був Ре

БІ 55 БО сіп б1у пуз Аза ТБ оті Тнх Аза Авр отв Бех Бек Ава Тк АТа Тух 65 7о 75 во

Томи бій їємі бек Яег Бей Твг о бех Суд дер Тих Ата Маі Тук Тут Сув 85 зо 95 тва де Бех буу тьх Бей Ве Азр Ре Тхр біу бів слу Твж ТВх Бей 100 155 113 тТве уаї Жек бак Аїа Бак Тихе туя біу Руб бек уз ББе вхо лемд Аза

ІВ РСТЛРІОТОЮВаЯХ 115 120 1255

Рхо Бех Зек Буч бех ТКх Бех 51 СТу Так ліз АТа Гей біу був цез 130 35 149

Мві Муз Авр Тук Ре Ехо Сію Бко Уяї Тих Уві Вех ТсроАва Бек 01уУ і45 15 155 хво

Аза їі Твк Чек сіу Маї Нія тт ре ро Аївз Узі їй бій Бех Бех ї65 ї70 ї75 сіу Теи Тук бЗвк їв бек обех Маї Уаї Твж Уаї рхо Беж Бек Яек їво їіво 185 195 біу ТБж бій Твх Тух Їїе Сув Авп Уві Авп Нів Ббуз БРкро Бех Аза отаг 195 200 зач уз чаї Азр був їуз Уві біз ро Туз бек Сув АвроБув ЯБж Нів ТВх 275 215 223

Сув Рко Рко Сув Бко Діа рРхо Сіц еп Гей біу Сіу Рус бВех уаї рБе 225 230 235 249 тен Бре Рус Бхо ЦМув Рхо Гу Аве о тТВак обо) Мебє їіїєе ех Аку ТБк о Брко 245 259 255 біс уві Тв: Суз Уві Уаї Уві Азр Уві бех Нів бі Авр рко біл чаї 250 255 ато

Їїжв Бе Ази отТгв о Тух Уві Аво біу МВі сі Маї Ніз Ай Ата Був Тпе

В. 740 г

Гуз ртго Акч Січ Січ бів Тук Ап Бек Твх Тук Агу чаї Уаї ВЗех Уві 250 295 запо їй ТЕ чаї рез Нів бій двр отр Ббеі Ав біу Був сія Тук був Сув 305 зів зів 21 ув уаї Вес Аза Був Аїа пем Рко Аїв рхо Іза б1М пу Тпгкоїів Зех 325 330 335 уз Аза Був біу біп Рго Аку сіб Ро б1п Уві Тук Хвх Гей бжо рхб 38а зЗаА5 ЗО бог вВха дав біз Це ТвВх бує Авп сій Уаї Зак БемотвЕ Сув ей ов

ЗБЕ 350 365 тує Сіу Бра Тук ро бек Авр І16 Аза узі бім Тхр Ба Бех Авзпосту

19 ЕСТЛВАО ТВА 70 75 зво

Сів Ркхо біб Авк Ав Тук о Буз Трх Тк о фхо рго уаї цей Азр бек дар з85 з90 395 400 5іу баж рне пе Без Тук Бек Пує ївои Тр Уві Авр Був Бек Ака Ткр вої 310 415 біп бін бі Ап оуаї Бе бег Сув Бек Чаї Ме Ці піп АТїа би НІВ 420 425 430

Авпонів ТУук ТВгозій ГПуя бЗеє бен бог Їїсч бек Рко біу Бу 435 440 415 кеіо» 33 хеїі» 213 «гії РВТ «213» Штучна «тей «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4005 з8 дар І1в бій Мебє Тс сСіп Зех Рго беж Бек їшт бек Аів Беж Пе СіуУ ї 5 10 15 15 цув чаї Таж оЖіє Так оСув був Аза бек сію Авротів Нів БПув Тут га 25 зо

Ізіе вів тхр Тут біп Нів уз Рко оту Буя СТі1у рРхто Аха Бей Бемо її 35 ай «5

Тук ТвжЕ беж ТИХ Без біп рко слу І1ївє ро Зек Ак ЯПе бах сі

Бо БЕ во

Зак 01у бек біу Акц Аяр Тух бек Ре бек Ії бех Авп Пем був рЕО то 75 во бів ляр І1е йла Тк Тух Тух був без бів Тух Авр Азо о Пам Акоа ТЕ 85 50 95

Ре сіу біу Сту Таж їув'бєй 010 Ії6 буз Ако Тьх Уаї діа Віа рхо 105 зок 110

Бех уаї Рів їі РБе Рго рко бек Авр біз бій Тей уз бек сіу ТИЖ 115 120 125

Ала бек Уаї Заї Су їви Гец взп о Азп о Бе Тук реко Аху сів Аза Був 130 135 1450 встлез шов

Уві бій Тер Гуз Чаї Дер Ай Аза ей бів беж Сіу Ава бок зів 15 145 ї50 155 ї5О

Звук Маї ТВЖ бін віп вро зак Гуз Аво Зеї ТвВЕ тТук Бек цей век Бек 155 їло 178

Тих беп Тахо пем бех Був АТа дар Тух бій Буя нія Був чаї Тух Аза 150 і85 150

Суз бів Уві ТЬтс Нів БІБ Б1іуУ їво Бех бек Бго МаЗ Так Був бак РБе 195 200 205

Зв овйжа біу сіна Суд 215 «210» 34 «21її» 46 12» ВАТ 13» Ново зарізав «аж З чаї Бек Її ТНЕ Буз Сув бек Бех Ар Має Аа біу Жує Сув пед Ні 1 5 10 15 со1у 51їа Суз її Тук Пес: Уві Авр Ме бек біз Ази Тук Сув Аку Суд 29 Кі Зо біч Укі б1у Тук Тік біу Уа1і Аг Сує с2із Вів РБе Ре бе

Зв 40 і15 «Ріо» 35 кжїї» 33 «війУ РЕ «2і3У Шнучна «бах «23» Штучно сиктезована пептидна. послідовність «ОО» ЗБ

Ак. Уві ТВж Ізе Тах Аіа Азр Твж бег Бек Аяю» Твх Аза Тук Меє За 1 5 10 15 цей Бех Яах їх Аху бор бій Ар Тв Аза Уві Тук Жук Суз Уві Ак4д 20 25 30 «їж 36 «23ї» 35 «2122 РЕТ «2їі3» Штучна «220»

2 вСтЛРДИЗАІВавА «273» Штучно синтевована пептидня послідовність «00х 36

Акч Уві Тих 116 ТБ Аїа Дер Так бек ТЕ Ап о ТЕ Аза Тук Меї пі ї 5 10 15

Іва Бех ех без Ага бек Сів Ар ТАх Аза уаї Тух Туж Сувобаї Агу 20 25 за «210 37 «гії 444 «212» РЕТ «2132 Штучна «г «723» Штучно синтевована пеоптидна послідсввьсте ка» 37 бій Жвр бій бе: оМаї бій Зед б3іу Аза біз Маії Був Ппув о вго бі діа 1 й 10 15

Ваг Чаї Був уаї Бек Сув Був Віз Зак бі Бе Ава їз Був АвроОтвж 20 х Зо тух Те сів Тхр о Уаі вка біб АтТа Бко йіу біб Ту Бей піз Ткр Меб 35 4 45

Сіу Аку її АвроРко Пеи Авп о біу Ап Тс опує Тух Уаї Ркз був де 3) 5 ва. сів бЗіу Ак Уві ТБу тів ТЕ Аза Авр о тТвх Бех Вех АзпотТйк Аїа Туг 65 то 75 219)

Меє бію ей бек Зек Без Аку Зет бій Азр ТВк Аія Уві Тук Тух Суз ве о 55 чаї Акад ЯЗех Сьу ТЬк їм Ре Авр Бе Тхв біу біп біу Ти їеє Ма 100 105 ї10

ТЕ Уаї бек бат Аза Зек Таж Був 01У Рхо бек Уаї Ріе Рко пет АхХа 1209 125 рко Бех беж Пуз Бех Так бех бі біу ТБх Аїа Аїа Гва буу Сув Без ї30 135 149 чаї Був Авр Тух рРіе ро шій Рко Уві ТрВж Уаї Зек ТюЕр Акй Бех Шу 145 50 155 150

Дів цей Тк обех біу узі Ні Тк Впе Рго Ата Уаї Пез біп Бех Бек 165 170 175

22 РОТОР 24042 бі ба Ту Зах Без Бех бек аз уаї Так Уві реко Важ бву Век Бей їво хВ5 150 піу Твж о біпо Чак Ту їїе Сув Авй Уаї Акп Ніз був Ржо бек дав три і55 гай 205 їув ча1 Авр Буз Був Уві Єїп РЕо був Век Сук Авр Був ТнНж Нів Трг 210 2ії ато ув Ро ко Сув Рхо біз Рюко бій Тені Гей сту сіу РКО дет Маї Бе 225 239 35 240

Бех Ре рРхо Рко ув вхо пув Аяр Таж їва Ме їЗв БесоАко Тих рев 2745 250 285 1 Уаї Те Суз Уві Уаї Уаї Авр Уаї бек Нів Сі Авр Бко ій Уаї 250 2558 270. пув рве Азпоїкр отТук Уаі Авр о сіу Уві сі бах Ні Аве Аза пує ТвЕ 275 280 285 їуз РЕо Аха іч січ сіл оТук Ав» бек Твх Тук Аха Узі Укі Бек раї 295 255 зво пев ТБх чаї Ім Ні біп Авр тТкрогеиа Ав сіу Муз бій Тук Був Св 305 За 315 329 їуз чаї бег Азп Муз Аза Гей рго біа бтго Іїв зі пув Тих о їІ1їіє Век з25 30 За іув Аїа муз буу біг ржо Аж осі Рсо біб Уві Тухс ЖОк цейц вко рхо 340 315 азо бек Ах Авробіч Пей Твк Був два Піп аз Бех їх Тих Сув рез Маї 355 зва 365

Був бБіу Рі Туг го Вех Авротіє Аїа Чаї зі Тхр ші Бек Азп сіу 370 375 зно бій Рхо Сім дДвп о АБИ Тух Гуз ТВк Так обко рко Уаі ївч Авр о Бех Азр

З 390 355 400

Сіу бех Рне Бе Гец Тух бак Туз Бої Тк Уві Авр пуз Бек Ака Ткр 405 410 415 бів біп біу двп о уа1і Ре ВЗек Су бек узі Меб нів бім Ата Пез нав 429 425 430.

3 ВЕРБОЮ ОВО

Ава Ніс Тук ТВх бі Був бех йеп Бек газ Веб сркб «35 440 «гіди ЗВ «г1їїз 444 «212» РЕТ «213» Штучна «ЗП» «2232 Штучно синтезовава пептидва послідовніств. «00» 38 бів Авр сію ПЦеп Маії шій бек СіуУу Ата біз Уаі Гу Буз Рко С1у Аій ї 5 15 15 зек уаї Ппуз ма1і бек Сув уз Ама бек біу Рпе в5потів пух Авр ТахХ 20 25 за

Туж Іїз бій Ткр Узі Аж бів А1їа Ро біу біп біу Пец біз Тер Меє 35 «0 45

Біу Ах Тїє АвроРжо Пей Авт б1у Азп Жак о був Тух Уві рРко Був Бе

БО 55 80 сіп ш-іу Ак тУаї ТВ Тіз Лв о АХа Авр отих дет ТВ Ава Твх Аїа Тут 70 5 о

Мас бій Без бак Зех їз Асу бек біч Азр Так Аза тУаії Тук Тук Сув 95 90 5 чаї Ак обех сьЬу Та пес де бар Ре Ткр сіу Бій шу Так Цей Ув3 100 105 316 тТаг Уві бес бок Аїв Бех Тк обуз біу РрРхо Зак Уаї Ре Рко Без Айїа т15 120 175 го бек бек їув бах Тнж бЗех біу Бі Тік зів Аїя без 01у Сув Сей 130 135 140

Уаі цу Авр о Тух рРре Рко Сів Рко Уві Тйк Маї бек Тер Авп бек ЗУ 145 150 155 ї6О

Аха теп Твс о бех сСіж Маї Яїв Тк орре Рко Аїа Узі Ппейп бії Вет Зек ї65 170 175 сіу Поп Тус йек Пец бек бех Чаї Уаії Тк Уві Рхо Бех Бех бек беч 180 185 90

24 ВСТАР2О12МО88083 51 Тк сія Так тує Іі Св Аза Уя1і АвпоНівз Був Ро Зак Ав о тТвЕ 195 200 205 цуз Уаї вар Муз пув Уаї сьБ РкОо Цуз бек Сув дер був Тих Нів ТвЕ 210 225 220

Сув Рхо рко Суз Рго Аїв Бо біз Бей цей сбіу сіу рко бет Мві бе о 230 235 2Аб ї-о Ре Рто ржо пув Рко Туз Авр оТах Бе; Меє ї1в бе аку Тих Бко 245 250 253 біс Чаї ТЕ Сув Ма1 Маї Уві Авр чаї бех Ні біб Авр обгбо біло Уві. 260 58 27та цув ЕБе Ав Тхв Тут Маії ар сіу Маї ССТа Уаї Нів Авполіа Був Тих 275 280 285

Був Ркз Аха біз бів; бій отут Ак Зак так Тук ага чаї узі Беж Уві 250 295 зао

Кео тих чаї їва Віз біб Агро їв оїец Ав сі Ппув бій Тух пув су 05 310 зів 320 їув Уві Бек Авп Гув Аіа Гесв Ро Авіа Ро її сі) Буз Твж Її Бех 325 330 ЗВ

Ппув Аіа мук Сі О3їп Рхо ку бі бко сіп Уаї Тук ТвВк Пец ро Рхо 340 З45 ЗБ

Заг Акт Авробіз Пе) Те їГув Авп о біт Уаї бек їйємі Тв сСув пей Уві з5Ь5 з5О зе ув сіб Ре Тух Рко бег Авр їїю Ах Маї біта Ткроб1ій; Бег Азоо сію

Зо 375 зао бів Вто піз Ап о Ав Тук о Буз Твх Тк Бжо РкЕо Удлі реч Авр о Звж Ав зв5 390 за5 дао біу бек ре Різ Ццеб Тук бек Мцув це) Ти Узі АвроБув бек Ах Тер 405 410 415 іа сіа сіу два Уві пе Вес Сув бак Мі Меє Нів біз Аза Ге Нів 529 425 435 дя йів Тух ТВ біп був бек цею Бах цен Бех Ро 435 140

ВТО ІЗЛІВ4042 «ім 38 «Вії» 5 «жійм БЕЖ «2132 Штучна «ай» «22й2» Штучно синтевована пептидна послідовність ч«айО» за

А1а Тах Тук її сбіп 1 5 «2105 40 «2112 17 «аї2» ВВ «2135 Швучна «0» «23» Штучно синтавзована пептидна послідовність «а00р» 40

АкчЧ ЇїФ Ар Ро Бен Твк Зіу Авв о Тьх дув о Тук Уаї Рко Був Ре біп ї 5 ії ії5

Іф «2105 41 ії У «отим вит «18 Штучна сайОж «23» Штучно синтезована пептидна поплідовнаі сть «ай» 41

Ага їі АБр бло еп Пув 01у Ав Тйжх Пує Тух Чаї рРкоспуз Бра бій 1 Б 10 ї5 сту «210» 425 «2115 17 «жійхМ РвРАт «2і3» Штучна к22о0х. «223» Штучно синтевована пептидна послідовність «00 42 вхо Т1їє Авр Рко без Рре 01у два ТЬх уз Тук Уаї Ркго Буа Рів БЦ ії В то 15

26 РОСТОВІ ОКО су «210» 43 «2117 17 «12» БЕТ «23» Штучна «ОЦ» «23» Штучно синтезована пелптидна послідовність «40» 43 ака Пе Аврорто ївч узі біу Авт тТЬе Був Тух Чаї вжо їу Бра сів 1 В То 15 сіУ «210» 44 «вті 17 «Віз» РЕТ «аа» Штучна «Ви «223» Штучно синтевована лпептидна послідовність жкадО» 44 вед хе авроБжо Гей пев осбіу Авп Так Був Тук уаї Рго Гу Бе бів

Кк 5 10 15 у «агвОох 45 «Ії 17 «іа» ВАТ «213» Штучна «ввох «23» Штучно сийтевзована пейтидна паолідовність «а00з 45

Ага Іїе Авр хо Її) Аяп Зіу бек Так Пув Тук уаї РКО Мує Бра. сів 1 5 о ї5 щу «2102 аб «г1їм 17 «210У ЕТ «иї3» Штучна «ких

27 РСТР20127084042 «223» Штучна смнтевзована пепйтидна послідовність «ОО» 45 ака І18 Аво Рхо Пей Авпосіу іп Тпх Був Тут Уа) Рко Був Бізе сій 1 З ї6 15 б1У «210» 47 ка» в «й12З БЕХ «813» Штечня китах кЕ235 ЩШезучно синтевована пептидна послідовність «4005 47

Пен обіп Тук біз Авп оцей Ахе Тв 1 5 «2195 48 «ії» В «212» ЕТ ккі3» Штвтучиа «йвебуУ ка23» Штучно синтазована плептидна послідовність «ОО» 48 без сів Тух січ біп ей Агу ТБеЕ 1 5 ««РіОх 48 «еї1» 4854 к212х РЕТ «213» Шеучна «вай» «3» швучно сийтезовани лептилна послідовність «ча» 45

Сів Ар бів Пем о ді бів Бах біу діва бів Уаї Шув їшв Ррко біу дів

КЗ 5 19 15

Бек тах Муз Уаї Бех Суз Цув Аїа Бек сСіу Рпе Автп тіє Був Аза Тис

Зо

Тук Іїе Сів Ткр Ув) Агч Бій Аза Рко біу біп б1іУ без бій ТкромМає

З 40 45 сіу Ахо Ті Авр Бго Пес Вк біу АепоТвх Пує Тут Уаї Рго Пув Бе 85 80

28 РСТЛЕНИ ЗОВНІ

Сів сіу Аку Маї Тв тів Твх Ата АвроТвК бех Тв Ази Тве Аза тує 65 70 т 80

Ме січ Пез Зех Зал бен Ах бек Сім Авр о Твх Аїа Уві Тут Тег був ве 90 95

Маї Ак бек біу ТвЕЖ Гей Ре Авр Ре Тер сіу біп біу так о без чаї 106 105 110

Так аі бех Бек А1а8 ех ТБг Був біу рхо Зеж Маї Ріє Рхо рей дів тії 125 125

Рхо ех Зех Пуз бЗеїх Твх Бек щу сїУ ТВжЕ А1їа Аів їви біу Сув Бей 130 ІЗ5 140

Уві Буз Авр о тТук Ей Рто біо Рхо Уві ТБЖж Уві бек ТЕр Авп бЯвх їж 145 750 155 150

Аіа бен так бежб Сіу Уаї Нів ТЬЕ бе рко Ата чаї вва Сіл бек Вех 158 Що 175 5іу їесо Тух бах їни Зех дек чаї чі Тих Чаї вхо Бек Бех Зк Бей їва і85 150 сіу Трх біп Твк оТух Ї1е Сув АвпоУМаі Аа Нів ув Ркго Зек АвпотвВх зак 290 255

Був чаї Азр йув Гуз Уві біз Ро йув ех Су АвБробув Трх Нів Тк 210 215 220 був бко Бхо Суб Рхо А1а Рхо біп Пец тен б1у біу Рко Зек Уві Бле 225 230 аз5 0

Тева Во рго Рто Гуз Ркз о їув Азр Тпгоїва Ме Ізїє Вег Акад Тк о ро 245 250 258 спа уаї тви Су Ууаї Чаї чаї Азо Чаї Бек Ніз біч Ввр Ркб О1ч Мі 260 255 2ло пув Ене Аврпоїтр Тук Уаї Авю сіу Маї "а Уві Бі Авв Аза був Тах 275 го 255 же Бто Яха бій сій бій Тух о дяп о Вех Тр Тук Ак о Маії Маї бек чаї 290 295 00 бе тТвек Уаї Цей Яія зів Авр Тр пей йо бі ув с1за Тук Був Сув 305 Зі зі 320 що ВСТИВ2О127084042.

Гуз Узі бек Авй був Азіа бе) бто Аза ро її сій дув Трьж ї1е Яеж 355 330 з35

Був Аїв Гуз біб біп Ржо Акч Зі РхХо бій Уаї Тух Тих їеп о рхб РЕ 349 345 50 бек Ака Авр о біч Гей Твж був Ап Сію Уві бот Без ЖБК оСув ев Уві 355 зва 365 пув зіу Же Тук Рго бах Авр о тїе Аїа Маї бій Тер 010 Важ Азв Сіу зт 375 ЗВО

Іа Рхо бі Аво Ав Тук їв ТВ Тих рхо Ро Уві Пец Авр Бех Авр з85 за 395 а

Сіу бек Ре Ре лес: Тух ЯЗеж Був їй Таж Маї Азроїувз Бех Ак тер 4105 41о 5 сій сів Біу Ав Уві РЬе бек Сув Бах Уві Мах Ніз бій Аза Бей Нів 420 425 439

Ав» Ніз Тую Таж біб ув Бежє Без Бех Пец Зак рко 435 «40 «вва» Бо «ії» 845 «йі22 РЕТ «213» Штучна «ага» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «аа» 50 сбіп Авросійп ва узі бів бек сіу Аза сій узі буяє Ммув Бк Сьу діа 1 5 іо і5

Зех Уаї цув Маї Бек Сув пув Аїа Зех Зіу Рие Аві І1ев Був авр ТЕЖ 29 25 зо тТух її 515 Тер Уві Аха біп Аза Ркго спі сів біу Без бій Тхр Меж з5 40 «5 сЄіу йху 118 Авр о Рко їм тах з1у АвБп Тато зуз Тух чаї ро буз ББе во 5 в5О бів сіу Аху Уаї ТВх Ії ТькоАїа Ар Так Вех ТНЕ Ав Тйх Аза Тух 65 та 78 во

36 ВСТЛРОВІЗЛІВЯОЇО

Ме біз лес бек Бек Гец Аку Бех ші: дер тТух Аза Маї Тук тую Сув 85 за 5

Уві АхаЯ Зехг С1у Твх цес Ріе Авр ре Ткр Сіу 010 С1у Тк ем уаї 1600 тав 110

Жйт уві Бек бек Аїв Веж ТБ Гуз б1іу Рко бетх Чаї Різ Ро їви Аа 315 120 125

Рхо Бех Бек Цуз Ват Ту бек Сіу сіу Твх Аїв Аїа Бач сбіу Суз цей 130 155 140

Уві Буз Аяр Тук Райе Рко Шіа Рко Узі ТВж Уві бок Тхр Авп Вех сіу 115 156 ї55 їбо діа Пец ТВЖ Бек піу уві Нів Так Ре рхо Аїї Ма) їй біп ЯЗех бек 185 170 175 сіу цей Туг бат Кен Бек Яек Уві Уі ТЬк Узі Рхо Вех Бех. бек рей 180 ів5 ї1за сСіу тТвх 010 Так Тук Ї1їє Су Два Уві Авп оНів Пув рхо Вех Авв Твх 155 200 205

Шув уаї Вар уз Пуз Маі піз Рко Був Бех Суз Авр о Пуз Тру Ніз ТБЕ 21 215 220 буз Бго Рхо буз Ркго Аїа Рко біп їемз їз зу Сіу Бко Бех Маї РБе 225 230 235 240 їв Бра о бжко Рхо йуз Вко Був зв Так ойез Меб їТіе Баг Ака ТВ ро 245 250 ав біч Маї Твж о Сув Уві Уві Маї ВЕр Та) Бек Нів Бі АвроБко зі; Уві 250 255 270 мук вве Авп оТхв Тук Маї яр бі Мі Бім Уаї Нів Авп Аза Був ТЕ 215 290 Масся

Іза рхо Ак бід бі; бій Ту дДвпоЗеко Так оТук ку уаї Маї бек уаї 250 295 зоо їни Тр Чаї йец Нів біп Авр о Тжхр їз Азп о біу Буз бін ТуУк Буг Сув 305 310 315 зай ту Маї бек Ап Бує Аіа цем рхо Аіїа Рко Іі бій Був Тк Ті 8Зек 3и5 330 з35

31 ВСТЛРап ЕМ ОВВХ їув Віз Пув оїу бів рго АкЯ4 біс Ркб бій Уаі Тух Тех тео ро рЕб 340 45 350

Зак Аха Авробіп пею Те груз Авап Сіп Уві бек Пен Тк Сук цей узі 355 зва ев їув Зіу Ре Тух Еко Зех Зер її Айа чаї пі Тюр бій Бек дз с1у 370 315 зно

Сіп хо біз Аза одно Тух Буз ТВ о Твж Рко рРхо аз пей АвробЗет Аве за 3989 395 400 біу Бек Рпе Ре їєц Туж бек Бу цей Тр уві Авр пув бвг Аху Тер 405 410 5 біп бів біу АБ Чаї Ріпа Зек Сув бвк Маї Мей Нівз бій Аїа ва Ну що 425 «30

Ази Ні Тух Тк сів Буз беж Пец бек Бей бек ркКо 435 40 кб» 1 «вві» 44 «ійе РЕТ «813» Штучна «0 «к?г3» Штучно синтевована пептидна послідовазсть «400» 51 бів двр бів їмлі Чаї сію Зех біу Аза біз баї Гув Був Рко біу Від ї 5 10 ї5

Вех Уаї Шув Чаї бек ув Був АтТа Бех бІ1Уу Рне дай ті Пув Авро Тек 20 25 30 тТук Хіє біп Тер Чаї Акч сій віз Рхо сіу бій сіУ рез Зі ТЕр Ме

І 40 45 біж вх Хі Авр о рРго Бей буз Сіу Авапотпх іа Тут Мах рхо цув Ре

Ба Б БО бів біу йо Маї Тьх ее ТЕ Аза Авр тТйх бЗет ТБ Аве ТВх Айв Тук 65 7о 75 во

Ме бій ей Заг Бех реч хо бек Пі Авр ТЕ Аіа уві Тук Тух Су 85 во З5

Уві хай Зах біу ТБх дез РБе Азр Бе Тер б1у бів біу Тс їеш Маї 100 105 110

33 ВСТА РОТ ЛЛІВЯОЯО

Тит Уві Бет Бех Аїа Бек Таж Шув сіб Бо ев Узі Ве рхо пи дів 115 120 125

Бжхо Зек бег Був Бех Тпх Яавк йіу біу Тк Аза Аза Пес біу Суб Твх 130 135 150

Чаї ув Авр Тук Рі. Ркб ОтТи Рко Уві ТБк Уаї Бек Тер АБи бех Сіу 148 159 155 1850

Аїа зей тик бек сіу Уві Нів Тк Ре Бгто Аіїа Уві їни бій Вву Ве 165 7о їз бі їжи Ту бек Бей Бех беж чаї Уаї ТЬи Уві рРхо бек Век Бех Бей ї8о іїя5 1950 біу їТвк обьпотТаг Тук їтїе Сув Ав» Уаї Авп Нів Шув Рго бех о АвпотТвЕ 1955 по 235 ув аз Азр отв Був Маї ів рго Пувз бек Суб Азропув Тпж о Нія ТаХ 219 215 220

Су Рко Рко Суб Рге Аїя рко бій Пец Тл біу біу Рхо бех Маї ВБе 225 230 235 24й їєп Рів Рхо рРхо Був Рко Був Авр Таг їв) Меє ЇТе бак АБ Те РЕо 2415 250 255 бі Уві тнЕг о Сує чаї Узі Узі йвр Уві бетг Нів Біо Аве оРго біз Уві 780 265 27а пу Ре Авп Тур Тух Уаї Авробсіф Уві йіб Узі Нів Ав о Аїа Був о ТБж 8 280 255

Був рго Бга біш Біч сів Тух Авап Бех ТВж Тук Ажа Уві Уаіїі Бек Уві 254 295 300

Іа ТВг Уві Пеом Ні іп Ар о Ткробей Авпвосту Був зі Тут був Сук 305 зу зів 320 їпуа уві беж Ав руз Віа цей РКО Аза ро ї1їе С1із Туз Тв Х1є Бех з25 330 335

Був Аїа туз Біу біп Рко Акч ОТ рЕо бів Чаї Тух Твх Бец Рхб ко. 489 345 зо бек Акад Азробіч це» ТВ пу дДвпобів Уазї Бех Бей ТЕ був Бей Уві

З55 зва за5

Бк. РОТА РІТТОВЯОМО пув слу Ре Тук Рго бек Ашр Іі Атїа Уаї 013 Ткр біч бек Авспосі у зт 375 зво бій Рко бів ДАвпоАєвоТухк Гув ТНж ТвВх Рго Рко Уаїі Печ Авр Зех Авр зв зва зя 400 5іу бек РБе рйе цез Туж Яег Ппуз без Тих Уві Авр Гук Бех Ага Тур 405 А10 415

Зп іа 51у Азп о Узі Ррє бек Сує бек Уаі Меб Нів Січ Аза ей нав 425 425 430

Акип Нів Тук Твжх бів Був Яег Тед Бех КемоВек рко аз5 440 «бійж 58 11» 445 «212» РЕ «2132» Штучна «еа» «кг3» Штучно синтезована пептидна послідовність «Ой» а2 ців Ар сів йеа Чаї біп бек біу Азїа біз Уаії Був пцуз Ро Су Ада ї 5 10 15

Зетх Уді цу Уві бЗегх був був Аза Заг біу РБе Аза ї1е Був Авр о ТвЕ 25 куе)

Тус її бів Тгтр уаї АкУ сій Аза Ро С19 бів с1у пей біч Тр Меє 35. 40 й

Сіу Аку їТе с Авройжко Бе Ре 01у АвпоТаг Пув Тук маї Рко цуз ЕпПе за 5 во бів біу Яка Уві ТЬж Ії Твжх Аза Ав о ТВк бек ТВх Ап о тТвх АТа Тук 65 7о т ва

Мас біб цені Бех бах Бей Ага Беж о сіа Ав о ЖИх АТїа Маї Тух Тук був в зо ЗБ

Уаї Аку беж Сіу Так оПей Убе Авроббе Тгр о біу 012 біу Тв бе» Уві 100 105 110 твк Уві Зег чек АТа бак ТЕ цуз сСіу ко бек Уві ВКе Рго оп Біа 115 ї20 125

34 РОСТЛВЗОТЛОЮВаВЯУ

Бхо Бек Бек Пуз бек Тих Бех біу сту Твж Аза біз цей Ф1у Сув Гей ї35 140

Маї мує Ввзр Тух Ріє Рко бій Рко Уві Тнг Уві бех Тхв Аза баг біу 145 ї5О0 155 160

Аїз їеай Тьк бек Сіу ві Нів Тах рРБе Рко Аза Уві їво біп бек Явх 165 ї70 175 біу тен Тук Бак Те бек Бек Маї Маї ТЕ Уві Ржхо бек ВЗек бат Тец во 185 189 іу ЖВк Сів Твх Тух І1е був Авп ота! Авп Нів ув ро Век Авип ТБЕ 1955 200 205 муз Чаї Аяр Був Муз Чаї біц Бто Шук бек Сув Авр о буяє Твт о Нів ТвВг 216 515 278

Сув рРхо Ро Сув рхо Аїа Рко біз бе без біу біу Ко беж Уві Рае 225 230 235 240

Бей Ріпа Рко Бко Пуз рРхо Мув Авр Тік оТєй Меї Її Беж Ага ТВЖх РКО 245 250 255 бів Маіїі ТаАх Сув Уві Уві Уві Авр Маї Бек Нів пі Авю РЕко їм Узі 260 265 а тув Біне дп Ткр Тужх Уві Ар Біу уві Сі) Уві Ні Ав Аіїа Пув ТЕ ат хво 2855

Муз Бко Аа біб біб бзій Тух Аяппобек ТВжт Тук Ах Узі тУаю бат Уаї: 290 295 зай їз ту Ууаіїі теосНів біл Ар откр Бей Алла сту Пуя піс Ту Був був зо5 зіб З15 зга їув уаї Век АБюи Пух АТа Ббейп Рко Атїа Ркго їЇіїе бій їв ТБх ї1їв Бек 355 зза 335 їує Ата цув с1іу бід Рхо Аха біз рко 012 Уаї Туг ТВЕ Іва Рхо ржо 340 345 350

ЯЗек Ак Авр обі сем ТВЕЖ пцув Ав бів Уві бек їєю Твх Сув Теб Уві 355 зво з65

Круз сіу РБе Тук Ркс Бек Авр Її18 Аіа Уаї бій Тер біз бех Азп о бБіу

Зло 75 зва

РОТАРУ ВВЯОО сів Рхо біз АвпоАвп Тук бує Твт Таж Рко Рко Уві цей Авробеако Вар зва 390 зак 00 с1у Зеє рРке Рпе Пес Тук бог Був Меп Тв» Маї Азр був Зк Ат Ткр 405 410 415 біп біп біу Ав ха! Бе бех Сув беж Уві Меб Нія бій дія Гей Нів 420 425 435

Аза Нів Тук Тс сів Шу бек Бей бет Шех бек рко 38 440 «вій» 53 ка11х 445 «вій» РЕТ «213» Штучна «20: «и» щЩручно синтезована пейтидна послідовність «або» 53. «їв Авр бів їва Уаї біт бЗек б1іу А1їа сію Уві пув Туз Рко Фіу Лів 1 5 їй 15 бек Уаї Пув Ма1 Вех Суз Пуз А1а бек біу це Аза ї1е Був Ар Те 5 30

Тухк І1е 5125 ТЕр Уві Ага біп Аза рго шіу Сіп о біу еп бій Ткр мак з 40 45 сі Ак тів Авр рко ївбя Ууаїі біу Авв о Трх Пув Тух Маї ро Був Ве 50 іп 2іУ Ага Уаї Тв їїє Тв Аіа Аяр Тпх бЗех ТБ Авп отак оАіа Ту 65 76 75 во

Ме бій Ппейз Бех бек Пец Агу Бек бій Азр о тах А1з Уаї Жук тук Сує 85 за з5 чаї вх бек біу ТЬкЕ їец Рре дер ве Ткр сіу сіп біу ТЬх їм Уві 190 305 110 тТвх Чаї Бех Бак Аїз бек Тих Бу біу ржОо Бех чаї Рве Рко без Аїа 115 120 125

Рко Вех Бех Бує Щек ТЬх баг біу біу ТЬЕ Аза Аза Тюм біу Сув їю 130 135 140 туаі уз АвроТух Ре Рго бім Рхо Увї ТБк Узі бек ТЕр Ав бех ШУ 145 150 55 160

Зв: РОТЛРІОБМОВ4042

Аїа Бебє Твх Заг бІ1Уу Уаії Нів ТВЖ Рве рРхо Аза Маї Без бій Шежк бат 165 170 75 сіу Беч Тук бек ІТ Бех йех Уві Уві Тих Ууаї Рко Бек бек Звк дай 180 кв іза

Ф1у Тнк Сів Твх Ту І16 Суз Авп оУаї Ап о Нів Бук Рко Бек Авп тЬх 1985 209 295

Бу Уві Авр уз їуз Маї сій Рко Пузв бах був Авр мує Жах Нів ТВ 210 215 220 пує Бхо Рко Сув Рхо Атїа Рхо бій бен без біу біу рхо Ваг Уві. РБе за5 2заоа 235 240

Ієм Рве Рго БЕо їуз йко Був Ар ЖБК ївц Ме їз1є Веб Ака Тв РКО 245 250 255 біл Уві Так був Уві Уаї УЖ Авр Чаї бек Нів сій Ар бро бін хмаї 269 65 27о

Був Бі ла» Ткр Тух Узі Ар віу Уаї сій Уаї Біо доп Аза БПуво Тих 275 во 285 ув оБко Ага пі) сіб біб Тук Авив Бек Твг Тук АК Уві Уві Беж Чаї 250 255 зо

Без Тив Уві Пео нів біп Ар о тур ївч Ав сіУу був бі; тую Був був кіз 319 315 320 їв Уаі Бек Ап Був Аза Бех Рго Ата рко Гі Сто Буз ТВх тів вет за З30 35

Іча Азїа муз біу біп рко Агу пі Рхо бів Уаї Жук ТЕ Пец Рхо Бко за 345 зво

Бех Ату йяр біз Бей Твх Буз Аво бів Маї бек цез ТНХ Сув Печ чаї 355 зей з пузв сіу ре Теж рсо бек дзр Ті АтТа Уві б1й Тхр біо бек Авв о СіУ зЗ7о 375 85 сів рро бід вп оаАвпоТух Був ТБЕ Так Ре БЕо Уаї еп Авр бек Авр 85 зав 95 00

Сіу Бех РіБе Ріє Пец Туг Век бує їй ТЬх Уві Агро буз Бех Акч Тгр 405 10 415

У? ЕОТАРІАМОЮВАОО бін біп біш Авзп тТаї Ре бах був бег Уві Меї Нів сій й1з гей Нів 42 325 430

Аза Ні Тук Таж сів пу Зек Бей Вег Бей бек рЕо 435 440 «5105 54 «2115 444 кегїзж РЕХ «213У Штучна ках «223» ЛЮюмучно синтезована пептидна посвідовність «ор» 54 сій Авр бій Пепй Уаї Бій чек сіу й1а бів Чаї Був був ко біУу АТа х 5 10 їв

Бек чаї був Маї бек Су їв Аза Бек ві Рюие Авп о їїє Був о Авр ТЕ 20 5 За

Тут ті Сію ТкЕр Уві Ака бів с Аїза Рко біу Сіп б5іч ей бі. Ткв Меє 35. 40 45 спі Ах тіїе вро рко пец рез С1Уу Авп Так Бу Тух уаї руб Пуз Ре

БО 5а 20

Сіп біт дк Маї ТвжЖ ї1е тьх Аїз зр ТнЕ бек Твк о Авпоївх дів тує та 78 во

Меє біс без бек бек їси Ага Бех 010 Ар те Атїа Узі Тук Тук сСув 85 9 за

Уаі Ака бет біу бТВг Гек ББе Авр ЗБе тТхр бі біп 5іу Таж пев Уві. 100 05 110

Ттвх Уаї Зех Зек Аза бек Тв Був біу Рго бек Маії Бпе Рко еп Аїа 115 15250 125 рРко ВЄї Зак їшя бек Тк бек б1іу біу Твт Аїя АТа Сеч с1у Сув Сей 130 135 140

Уаї (че Авр Тук Рпде Рко біц Рго Уві Тк Уаї Бех Ткро Ав) йех 1У 155 50 158 150

Зла Тви Трг обех сіу Уві Нів Тк РБе рхо Аїв Уві Пец Сі Бех ех ї55 170 175

38 РОСТОВІ ОЛІВОЮ, пбіу йез Тук Бех тей бех Бех УМаї Уві Теж Уаї Бхо Бех бек Бех їв 380 ІНВ 190 пу Таг осів Твх Тух Т1їє Суз Два» Маї АВ Ніє їв ро Бех деп ТЕ 195 280 225 пув Маї Авр пу Буз Мі СТ) Ро їув Шекб Сув Аяр цу ТЬьг нів ТВЕ 210 215 220

Сув Ро Рко Сув рРто Аїа РЕ біз їв Бей біу б1іУу Рхо Бех Уаї Ре 725 230 235 7549 іївй Ріпа Рко Ро ув Рхко пук Авр о Тато Беп Меб іє ех Акч Твх рха 245 250 255 сій Уві Тьх Сув Уві УМаі Уві Авр Уаї Бек Нів сій Ар о Рко бій Маї 255 270 їуз Ве Аа тТхр тух Мах Авр сіу аї біз чаї пів Авп Аза Буз ТЕ 275 280 285 пув Ртго джу Сі біо біп Тує Дап Бех Тнх Тує аку Уві Маї Бех Уві 250 2595 зо

Ме ТВ Уві цес Баз шіп Аве Ткр о іМеб Аво бі їув бій Тук пув Сув 305 з10 315 320 цує жі Зек Ази пув Аїа їєц Вхо Аіа рРго ї16 біз буз Тих І1в Бех 225 з30 З35

Ппуз Аза був С1у біп Рго Акад біп реко біп маї Тук ТЬх Гей Рко Рко 340 345 з50

Бек Ах Аву о Бій їес Тпг о КПуз Авпобів аз Бех їйед ТЕ бує цей Уві 355 360 зе

Ппув біу рБе Тук Еко бЗежк Ар о їТе АтТа Маї спра Тк бій бек АвпосСіхш зло 375 зво бів ро біч Ач о Азп о Тут Гуз ТК ТАК ро Бо Уві їм Авр. ВЕ Ар 85 зо а85 400 біу бах Бав Рбе Без тТук бек був їви Тнж Узі Авр був Бек Агу Тер 155 410 415 бів біп сіу Аза Уаї рРпе бек Сув бек Уа1! Мекж Ні сій АКа ев Ні 475 425 430 та Страва

Ази оЦіз Тук твВк біп Сув Беж цем Вег їй бег Рко 435 443 «аійМ 55 «811» 444 «пірмж РЕТ «213» Штучна «270 «23» Штучно синтезована йептидна послідовність «ОО» 55 сі Авр оса оїєй Уві бій Вех сіу дів сія Уві Був пу рює: сі АтТа 1 Б 10 15

Зех Уві цуз Уді бек Сув Був Аза бек біу Рпе АБлоїїе ПЦув Авр о ТВ 20 а зо

Ту І1в бій Ткр уаї Аку біз Аза Рхо Біу 0105 біу їни бій Тр МеЖ 35 40 45 сту АкЯа 1128 АвроРхо їй Азп оСіу Бек ТБ Буз Тут Маї рко Гув РБе 50 а5 50 біп біу йхц Уві тТьх Ії Тв АМа Авзр отТвк Бех То Аза бли бів худ 70 те во

Мав бій пен Вех бБег обев Аку бек біш Авр о ТЬЕ Аза Маі Тух Тук Сув 5 90 5

Уаї йжа Бах сі ТБж Без Ре Аврора Тер сі бівп їх Тик пе) УВА 100 195 110:

Тьжх чаї Вех бек Аза бЗех Тих Гуз БіУу ркЕо беж Уві Ра Рко їжа Аза 115 125 125

Рхбо бек Вес Пув Вех Так бек 031 бі Те Аїз Аза їй біу Су пев. 130 135 140

Чаї цув Ар оТух Бе Его бій Рхо уаї Тв Узі Вех Тгр Ава Зек ТУ 145 ко 155 168. діа їси трх бак пі Уві Нів ТБг рев Рхо Аа Уаїії йем Сіп бех Бех і658 ї70 175 с1і1у пен Тук Бек Їїва Зех Бех Уві Маї Тк Уаі Рко бек бек бак бе

Іво ІВБ5 190 сіу твх біп їй: тує ї31е був бай Уві Ав» Нів був орко Мех Ав тв 95 200 205.

РОСТЛРОМІ 284042 їув чаї Авр муз уз Уві біз Рто ПЦув Вех Суб Дар Пуз ТБхжх Нів Тих 5710 215 220

Сув Рко Рко Су Рхо Аза Ржо біц Бепі їеш Сіу С1у Ро бек ур ре 275 230 238 24 їец вБре Ро Ро був Рго пуя Аво» ТБ їси Ме т116 бек Аку Тву ргв 245 250 255 піз Мазі ТЬкЕ Сув Уві Уві Уаі Авр Уаї Вох Нів бій Адр Рхо бій Узі 60 265 27о

Був РБе АзпоїкроТух Чаї Азр о сіу Маї бій Уаї Ні Авв Аіїа Пуз ТНЕ 275 280 285 пу рко Аха бі: біз Сів Тук Авт бек Тс Тук дк уві Уві бах Уві 290 295 Зоо тей Тс Уаї їєс Нівз Сіп бер ТЕр їец Ап Су пуз біз Тук Муз Су зов 310 318 ЗО

Гуг Уві Беж Ав Був Аза ївш ро Віа Рекс її Сіб Муз Тс ї1в бек 325 зза з35 цув Віа мув сСіу біп Рко Ага бію Рко сів Уаї Тук ТБжх Те рхо рхо 340 345 359

Бех Аха Авробій Ппей Тк Був Аві бій Мав Бек їм. Твх Суз без Чаї 355 збо зв

Був Зіу РБе Тух Бкб Зак Авр їі Аїз Уаї біл Ткробів зек Авип СТУ ато зв зво бЗіп рез бі Авп оАша Тук Був ТВх Твк ро Рко Уаї Пво АвробБех Авр звь зо 3а5 4об сбіу бах Ріе РБе їсєїп Тужх Бек Гуз дез ТЬх Узі Авр о Гуз бек АкчЧ о Жхв 405 410 45 сів Сів біу Ав Уві Ре аж Сув бек Маф Мебє Нів сій Аїв'їей Нів 22 425 439

Ак» Нів Тут Трж біо Пув Бек оїво бек Гей век ро аз 445 «і» 56 «вії» 444 в СТАННЯ «12» РЕЖ 132 Штучна «вах 2232» Штучно синтезована чептидна послідовність «оо» 5Б6 сів Авр о біп Бей уві сів Век о сСіу Аза біз Уві Гуз Був Рко б1у Аза х 5 10 15

Вех Чаї їв Чаї веж Сув уз Ва бек біу Рів бяп ї1е Гуз Авр ТЕ а 25 зо

Тух їжте Сів Ткр Уві АкЧ біп о А1іа Рко сіу під З1іу Бех біл Тер Ме 35 о1у АхЯ Іїе Авробто їм Аза сіу сій ТЕ Був Тух М81 Бхо Бе рРБе 50 55 50 біп сіу йхо Маї Тнж Хі Тпх Аза Ар Ти беж Тих Авап Жрі Аза Тут -5 70 75 во

Мак сіб Бей беж бек їні Ко Зек сій Авр ТБт Аза Маї Тух Тук Суб 85 з 35 чаї БЕ Бек СІу Тих Пе Рів АвроРБеа Тхір сі спів зіу ТВк Кей я 500 305 ї10 тру Чаї вех вес Аза бек ТАхХ Був сіу Рхо бес Уві БКБе со дек Аїа 115 120 125 вхо Бех бах Гув Бек ТвВж бак бі бі тах Аза Аїа їйво сіу був Шви 139. 135 40

Чві Був йвр ТУух ре Рго бів ко узі ТБрх Маї Бех Тхр и Авп о бек бі 150 Х55. 15

Аіз Іва ТБх бек оСіу Чаї Нув Тпг Ре рхо Аза чаї Пец сій Бек бек 155 170 75; біу рез Тух Бех о їйво бек бВетк Уаї Уві Тк Уаї Бо бек бек веж Бей 180 185 180

Сіу Твх бій тк Тут Ііе Сув Авп оУаї Авт; бів Ду Ргто беї Зап ТНЕ 195 ой зав

Буз Уві Авр Гув Пув Уві біб ко Цує Бех Сув Авр Був тТви Нів тапх 210 215 229

43 ЕСТИРОМ 2084042

Сузв Рко Рко Сув ркго А1їа Ржо біз Бей без 01у біуУу Рко бек узі Ре 275 230 235 240

Іва Ріе Рко Рко Муз Ртхо фув АвБ Тк Пец Меї Ізїє Зежх Ака ТЕБх рей 245 БО 253 бів Маї Тахо був ваії ві Маї Авромаі Бех Ці біз Авзр Рко бій Уві 260 265 270

Ку Ре Аве отТхр Тук чаї Азр аіу Ууаї Сів Уві Нівз Беп о А1їа був Тих 275 280 285 цув Еко да см са Сів Тут Ав Бек ТАК Тук да Уаї Узі бек Уаї 290 295 300

Тез Тк Ууаї цей Ні біп Азр Тр Тез Аяв осі Ппуз біля Тук пув Суя зо5 Зо 315 за пуп чуаі Беж Авв Був АтТа пед Рто Кіа рхо їі біб Був ТБж Ізе бек 325 330 зЗа5

Кузв Аїа був сіу сій Рекс Аа біз ко сій Узі Теж Твжх пов ро РЕо за5 з50

Бек вка Аня сіл рей Тпке Був Авт біп Уві Бек цей ТБ був їі Маї 355 Зео зв

Був зіу Ре Тух РЕбо Век Авр о ЇТіе Аїіа Уві бій Тер бБМа ек Ап б1іу з7а 75 зво сів рео бі Авв Лав Тух мує ТБжЖ о ТЬк Ржо Ро Уаї Ппей Авробек дер

З85 зо зве 400 с1у Бек Ре Ре Ім Тух Бек Га ей ТБк Уві Авзр їуз Бех Ак Ткр ав іо 415 біп біп сСіу Азап уаї Кре Бех Сузв бек Уві Меб Ні сіц Аза ем Нв 470 5 430

Азп Нів Тух ТвжЖ сіп рув бек Бей Бах Го) Зек ко 435 840 «2105 57 жх2ії» 713 2195 РЕ «213х Штучна «220» : «923» Штучно синтезована пептидна послідовнаєть

43 РОСТУРаВІлІВЯОЯХ «005 57

Азр їіе Сів Має Таж бій Бек Рко Яек Бех Хо бек Аза бек Маї щ1у 1 5 10 35

Ар Ак Уві Тпт Іі Твх Сув пув Аїз Зак бій Авр ї3їе Нів Був Тух 25 зо тів Аїа Ткр Тух біт біл Буз вхо біу біз Аіз Рхго Аку Бей пен Її іп Ту ТВжЖ беж Тр без бів ово сСіу Уві Рхо Бех Аку Бйа Бех біу 60 бек біу бБет біт Тік Авр отТук ТЕБжх РБе Тк Хі бек бек Гей бів) рЕа 65 70 тв во із Авр її Аза Тк Тух Тух Су те) бій Ту біс Аа еп Аха ТНЕ 85 зо з

Рне біу біу Сіу Тьх пуб Маї 0315 І1є Був Ак Твж узі дів АЇїш ро 100 105 110

Бек Маі Рпе Тіє Рре Рко Рко бок АвробБ1) біп без рув бек бі тТвЕ 115 170 125

Аїа бек Уві Маї Сузв цей їм зв Авт Бе Тук о рко ху біз Аїа Муз їза 135 їч0 чаї біп Тер пу Укі Авр АЗвпоАїва Бей бід бе біу Бай Бех ій бі 145 ї50 ї155 ї6й ет чаї Тит біз сів дзр обЗег уз Азр о бек Тк Тух Век бен Бек Бах ї65 1790 ї75

ТЕ їй ТБж Без бек Був Аїа Авр о Туж БІ пув Нів Бук оуаї тТук діа ї189 185 150

Сув 13 Уаї ТвВх о Біз біп біу Пе) бек Бех Рго Маї тТОе Був ВЗеї ва 155 200 205

Ап о Аку сіу Бій Су їй «10» 58 «ії» 213 «212» РЕТ «гІїЗ3» Штучна. «2207

44 ЕСТЛРНН ОВО «2235 Штучно синтезована пептидиа послідовність «400» 58

Авр їі сів Меб Тр бів бек рРго бок бек Пец Бех Аїа бек чаї 0іу 1 5 їо 15

Ав Аха Уві ТЬх їЇЗе Твх Сув Був Аза Бех біп Двр о ї1іє Нів Кув Туш 0 25 за

Іва АТа Ткр Тут б5іп 012 пу рРко біу біп Ата Рхо Ак їй ем ІЇХе

З5 40 45 сСіп о Тує ТБжх бек ТЕХ Без біп Рго сзіу Чаї Ркго бек Акад Риє Зек СІіу

Бо бек сіу Век б1У ТВх Авр Тух Тик РЮе Тв їіїє Бех бек Гей бів РЕо 55 7 ть Тв) сіб Мер тїе Аїа ТБх Тут Тук Сув цей бій Тух бій біп бе; Ага ТБЕ 5 90 55

Ре біу О1у б1у тТпк був чаї бій її був Акй Тих Ув1 Аза Ада рго 100 165 130

Бек тУаї Бра їТе Бе Рко Вго Бе Аве жі: шів їв вуз бек Пі ТВж

ХЕ 120 125

Аїа Бек Майї Маі Суз Пе)» ей Ази йвп РН Тук ко Вта сій вів Гув ї30 щ35 140 чаї бів Тхр Був Узі Авр Авп Аїз пед сій Бех БІу Ав» бек Сх о 145 50 155 ї60

Зеї Уві Тв біб біп Авр ошек був Аврвобек ТЕ Тук Бех йо Бек Бех 165 170 їла

Тв їєві Твх Пе Зеш ув Аїз Авр о Тух бі) був Ні Муз Уві Жук Аїа 182 і85 їі

Сув біз уві Твж Ні сія сіу Сей беж ех ро Маї Ти Пух бак ве 125 200 205

Азп ака сіу Їх Сув 210 «10» 59 «211їз 17 «12» РВх «13» штучна

45 РОСТОВІ ЗЛО «8802 «223» Штучно синтевована пептидва послпідсовністе к100х 59

Ахо Х1в Авр Бо Бей оАви зі Ава ТВ Був Тук Чаї Дер о Пув Ре пів ї Б 10 15 б1У киії0» 60 «11» 17 ха19» РВЕ ч«гіЗ» Штучна «ах «иеЗ» Штучно синтезована пептидна послідовність «100» 60

Акту їїз Азр Рго рем Авпобіу Азп о ТЬх пув Тух Уві Рхз Бех Бе сів ї 5 15 15 б1у егзійж БЕ «віх її «2122 БЕТ «и13» Швучна «ах кге3» Штучно синтезована цпептидна послідовийоть «Зо» БЕ

Ака її АзроБсо Пец дви біу Ав Твх їв Тук Уві Рхо Сіп РБе бід 1 5 10 15 ві «і0У 62 «гії» 17 «212 ЕТ 132 Штучна «тай» «223» Штучно дивтазована пептидна послідовність «аа» 62

Аку тзіе АвроБго цей Аа біу Авп отак був ТУЄ Чаї Рко Кув Рре Авр ї В хо і5 о РОСТІ В2О1 3084042 51 «210» 3 «гії» 17 «2122 РЕЖ 213» Шеучна кад «723» Мтучно синтезована пептидна послідовність «ібо» 63 ага Іїе авр орко їей Авпобіу АвпоТВк ув Тутг аз Рго Ппуз Бпе 01 1 5 10 15 у «вій» 64 «21їх і7 «від РВТ «13» Шручна «г20» к223» Штучно синтезована пептидна послідовна сть кабоз» 64 дже ї1їа АвроБхо Гей Аза б1іу дДяпоТвЕ Пув Тук Уві Рез Пух Епе сій ї Б 10 15

Авр хіх 65 «211» 17 «12» рт «513» Штучна «й» «В2З» Штучно синтезоваіна пептидня посладовна сте «о0х 65 вт 116 Ав бхо Шан Ап обіУу Або Тк був Тух Чаї рко Муя Бре сів ї 5 10 15 іч «2102 Бе «7117 17 «12 ЕТ «2132» Штучна «20

47 РОТЛРОТТМОВЯОЯ2 «223» Штучно зинтезована пептидва послідовність ко» 86

АкЧ їЗе Авр орго без АзпоБіу Авмп Тьх Був Тук Уві бій був рве 015 1 5 І 15 біУ «?102 57 «211ї1з Лі «Ті» РЕЖ

Еі3» Штучна «Ох еЙЯУ Штучно синтавзована пептидна послідовність «ВОЗ. 57 ій А1їа бек Сів Авр о ї1е Ні Пув Тух їів А)в 1 5 10 «вій» 68 к«віїхМ 41 «ійУ РЕЖ «213» ЩШеучна «20 2232» Шеоеучно синтевованвна пептидна послідовна «4Опйж 58

Бек Аі1з беї біп Азр о Тіє Ніз Буз Тук І16в Аїг 1 5 10 «91023 55 «вії» 7Ч квіт» ВЕЖ віз Штучна «ках «23» Штучно сбинтаевзовавна попбездна послідовниіств «40о» 88

Тух Твх бек Тах Бей зі рка ії 5 «ах 70 «11» 10 «919» РЕТ «213» Штучна кага» ко3» Штучно синтезовава пептидна послідовні стх «ож та

48 РОСТИ ОДНО

ЕВе піу 51у біу ТЕ о цуз Узі віч тіє с30 ї 5 10 кій» 7і «вії» 7 «12» РЕ «2135 Штучна «ай. «ДЗ» Штучню синтезовава пептидина послідовність кара» 7

ТУЖ ТВЖжЖ беж Лк їєц Сіп ОТ 1 5 «Ох 72 «ії» 444 «ча1їйх Вт «213» Щхучна «220 «кй2З» Штучво синтезована пептидна послідовні сті кава» 72

Бієв Авр Біб Бей Мах Стій Бек б1у Атїа біз Уаї ув Був РКО біу АТа 1 5 10 5

Бек Маіїі муз Уві бек Сує ув Аївя двхк Сіу РБе Ав» І16 Мув Авр отТвЕ хто 25 за

Тук Ті біб ТЕр Маї Ага 03 Алла Рко О1Уу біп біу цей 13 хр Меє я 45 сіу Ака Ії Азр орхо Без Авп о Біу Ав Твж Гу Тук Уві Авр був РП 1) 55 Бо бів біу бкщ Маіїі ТтТнк їіе Тиж А1а А5р о Так Вес оТБх Айва ТвЕ АТа Тук що та 75 во

Ме бін ем Бех бвг Пєй Аку бег б3іий Ар Тит о Аїв Чаї Жук Тук сСув 85 5о 95

Уаі Ага Бех О1іу ТАК Іва Ре Авр Ре Тер СУ сій сіу Твж Пез чаї 100 135 о

ТвВжх улі бек бек А1їз ЯЗек Тйбж був Сі бко Бек Уві Рре Ро їец АТа 115 120 125 ко бек бек ПЦув Бех ТІ бек сіу піу Тих Аза Аїа бен Б1Уу Сув еп 130 135 540

РОТА РАВ

Уві ПУз Авр Тут ре Рко сіц Рко Уаі Тк Уві бек Тхр Авп Вах О1У 145 350 155 ї60

Аїа рей ТБх Бек Сіу Уві Нів ТВх Ре Вко Атїа Уві Без Піп Зак бек 165 170 175 сі їж Тук бек їз бек обек Уві Узі тат Уаї ро Зех беж йок Гео 180 ї85 150 бі тТвк бів тах Туг І16 Сув Авп оУаї Ай Ніз ув Рг йех йвп ТАК 195 зоб а

Іує Ма1ї Авр ув був УВА СІ Ро Пув бек Сув Ар пу ТвВЕ Ні ТвЕ 210 215 го

Суб Ето Рко Суй Рхо Аїа бхо щіб Тео їйем Сіу сіу Бо Бек Уаї Рпе 225 230 235 240 пен Ре Бо Бжо ув рко Був Авр Тпт бей Меє Ії Бек Вк Ти рго 245 250 255

Сіла Маї тТЬх Суз Уві ча3з Уві Азр Чаї БВак Нія біз Аврорго сто Уаї 259 255 70

Був Бба Ап о Ткр Тух Уві Бвр біу Узі сій Узі Нів дво Аіа Був тьІ 7 289 245

Був рго Акч бів обі сій Тут йайп о бек Так о Тук Акту чаї Уві Зах МУаї 290 295 за їй Тк Маї цезз Нів сіл АвротТЕр їх Аяпо сі Муз СХ Тук Був Св зо05 з1й 315 20 пує Чаї Вех Депо оцув АТа Гем Рго А1а Бо Ті шій Гув Тпт ї1е6 бек 325 330 335 пУуз Ата уз біу біп Рко Ак біл БКо бія Уаї Тук ТВх Пе о со Его зад 345 з50

Зої аку Аве бій пе Твж Муз дво сСіт Уаї Бек їв Тк оСуя деп Маї 355 360 зов пув щі ВБе Тух Рхо бЗет Авр тІїе Аїа уві біб Тгр біз чех Ав СІ 370 375 зо

Сів Брхо із Аза оАва Тут Бує Твх Твх рго рго Маі Пезо Авр Бек Авр 385 90 395 400

ВСТИПРОТ2О84043 с1іу век РБе РКе гео Тут бБет Гує Іви Твг уві Азро пух Зак Аха Тер: 05 410 415 біп біп біу Азп оуаї РБесбет був Бек Уаї Меб Нів бід АтТа Тв Нів 420 425 430

Аза Нів Ту Тих біп Ігра Бех Цен дет фей бек орко 435 «ай «10» 73 «гії» ага чі?» РАЖ «213» Штучна «вай» «7237 Штучно синтевована пертидна послідовністех «4005 73 біп Дер біп опе» уаї бСіп беж зу Аза сія Чаї Ів уз Во Сі Аїа ї В 10 15

Бах Уві цув Узі Баг Сув цув о Аїзвз бек б1іу Ре Аяп ої1іе Був Або ТВх

ЗО

Тук її бСіп Тер чаї Аку Сіп Аза рРко С1у Зі шіу То СІ Тр Меє 0 а5

О1у Аг Ііе АвроБхо Пей Або оЗіу Аве» ТВк Був Тук Уві Рко Вик ВКе 5О 5 що бі Сб1іУу Вжя баї Тв її ТЕ Аїа Азр Тк дех їпт о АвботТвах Аїа Тук 65 то 7 во

Мегс бій Тео Зак дес Бец Ач бек бій Ав ТрЕ Аїва уві тут Тук Сув 85 90 ч5 чаї Акч Зеж біу ТвРЕ Гей Ере Азр Ре Тор біу бів біу Тк рем Ууаз 150 105 їха тру Чаї Бех Зех Аїв бех Тосх о Пув сіу Рхо бехт Уві Ре Рко ем Аа: 115 120 125

Брко бек Бех Був Бех ТЕЖ Век бі 01 ТБ Ада Аза Шезі Фу Сув Без 130 135 140 чаї уз Вер Тух Ріе Ро зЗій Рко уві ТЕБЕ Уві Бек Ткр Ави Бек п1У 145 155 155 ї6а віз Па ТвБк бек біу Уаї Нуз Тк вБе орто Аїа Уві без бів Вех Ват 165 170 175

81 РОТА РІВІ2ЮХНЯІ ку їв Тух беж Бей бек бек Уді Уві Тр Чаї рто Бек Вес Яег Ге 180 185 ї185 щу Тржх бів Тв Тук Іі Сув Азв аз Ап Ні мує Рко Зак дей ТЕ 195 200 205 пув чаї Авр ому був Уві 14 Ро пуз Бек Сує Авворуз тиж Нів твЕ 210 215 220

Сув РЕ Рхо Сув Рхо АТїа Рхо б) Без Тен біу сіу ртбо бак Уаї Ре 225 239 235 240

Пе; Ре Ро Бко Гуз рко уз АвроОТЬж Бей; Мебє її бек Ак Твтг о рко 245 250 255 сій таз ТВх Ста узі Уві Чаї Авр узі Бех нів сі» Авр оБхб біз Маї 258 255 27

Буз Ре Ав Тжхр Тук Уші Аве с1у Уві біз Маї нів Авп о Аїа Був ТИЖ 275 250 285 їхв Рхо Ака Сів ста оз Тук Ава обек о ТБк о Тук АкУу Уві Маї бек Уувї 285 255 300 їйео Тв: Уаї їеа Ні пів Аз» о Ткроіва Ав бі Бу Бій Тук пу Суз 305 10 315 зао

Буз Уві бек Азп Пув їз Тем оРко Аїа Рхо Тіе БМ пув тк тів вет зав 30 ЗБ

Муз віз пув с1іу бій Рго АкЯ біб Рко бій Уві Тук Так ойеа Рко Ркга 340 за5 з5о

Як Аха Аве Сі Те Твжх о Був Авт. Бій Маї дек Бей ТВпт буз йео У за5 зе 355 уз бі Ріє Ту Рго Бех Авр Іі Аза Уя1ї Сі ТЕр СА Бек АБп БіУ 370 375 зво

Сів о рко біз Ава Аза Тук Був ТНК Тв Ржо Ро Уаї Пес Авр о бес дяр зве з9а 395 400 спіу Вех ВБе Ре Бес Тук бек Гуз без Тк Чаї Авробує Зах Акоа Ткр 05 10 415 іп бій біу бепв Маї Рбе бек Сув Бек Узі Меб Нія Сі Аїа Пец Нів 320 425 430

52 ВСТЛРОВТ ЛОВ

Ава нів Тук Так обіп Бує Бех Пей За: Бех бек Рхо 235 44 «вій» 74 «гї1» ад «219» ВАТ «213» Штучна «важ «223» Штучно синтезована пептидна послідовність» «ОО» 74 біп Авр біп Пес УвьЬ біо Зех біу Аіз 013 Уві Гуз Пув Бго п3іуУ Аїа ї 5 10 і5

Фех Уві Буз Уві Бех Суз луз Аїа бек біу Вбе Авп Ті Був Авр ТБЕ

Зо

Тук Іїє біп Тер Уві Ага Сів Аїв рхо 01у Сів Сіу пек пз Ткр Меб 36 40 Ах зіу АкЯч І1о Авр о вБжЖо Печ Азпоб1іу Ав Тит Був Тух Майї рко бії Рае. о 55 ва біп Біт Ажоа чаї ТвВх їіе ТвкоАіїа бер Тк Бех ТБ оАБ» ТБ о Азїа Теж 55 7о 75 во

Мет сій пе)з Бей бек Бей АкКу баг біл Авр ТЕ АТа тУуаї Тух Тук Сув 85 зо за

Чаї Ак бек біу ТВ Пе Рре Авр о ріе Ткр Б1у Зіп о шіу ТВЕ їн Уві 100 105 110

Тег Чаї век Бвжш Аза Бех ТВх Шцув о сСуу Рко ек Уві Ре Еко їв Аза 115 то 125

РЕо Бех йех їв бЗех Твх Зех сіу біу Таж Аїа Аза їз сіу Сув Беч 135 140 чаї цув Авр Тух Бмпе Рко бі: Бгто Маї Тну Уаі Бех Тр Авподек Ту 145 їво ї55 ї65 дів Бей Тнж Зег біу Уаї Ніз ТНх Ре ро Аїа Уві Бей бій Бех век ї55 170 Т75 с1у Бей Туг бетє ем бех бех Уві Уа! Тьк Уві Рко бек бек Бех їжи 180 1855 їа

53 ВСтТЛвНоВаІ сім Ту бів Тбж Ту Тіє Сув Аяп Уа) Ав Нів Їїуз Рко Беж Ава ТнНЕ 1955 2700 205 муз чаї Азр Був Був Уаї Сі Ро їв бек Сув Ар Був ТВ нів тах 210 215 киісН

Сув РКО Рко Сув рко Аїа Бко бій її їз) сіу Біу Рко бек Уаї Бе 223 230 235 240 їеч о РВе РеЕо Ро бує Ро цуз Аве Тік Пей Ме їі бек Аку ТБк Рго 248 250 255 бі Уаї Тс Сув Маі уаї Уві Авр уді Вес Нів біз Азр орко Бій вх 260 255 270 їув Фе Ава Тхр тус Маї Азр сіу уві Стів Маї Нів Ав дія пуб ТВЖ 2 280 285

Туз Рко Ак біз Бі сів Туш Аве Бах Твх тує Ака чаї чаї бек Чад 250 295 З

Іїєкй Тк Уві Гео: Нів сСіп Авр оТкр о Бей Аєп осіуУу був сіб Тук о Був ос Сув за5 10 ЗІБ за

Туз Уві ВЗек Ап обу АтТа їва вхо Аза Ркб Її бій був ТвВЕ ї1і6 Бех 325 330 335 ув віїа ув Сі біп Рго Аха сіб рго біб маї Тує ТпЖ пей Рко ро 340 з4а5 з50 ех Ажа Авр сій Тес Твг о Ппув Ави бій Уві бек обем ТЕ Сув пекйо Маї 355 60 65 уз біу Бре Тує рРко Бек Авро їїє Аїв Уві сій ТЕр Сім Бех Авап о бІіУ

З70 375 зво

Сіпорко бій йвп ойзп о Тух Бпуз ТВ ТьхЖ вхо Бко уаї Без Авробех Азр зв5 90 з 400 сіу бек Рі. рРйє її Тук беж Буя Пеп Твг Уаі Авр Був бак Агу Тхр 495 410 415 дів бів біУ Ав Уві Бе бек Суз Ваех Уві Ме Нів сій Аза Баб нів 420 225 430

Авп Нів Тук Тік Сію бує бек їй беж її Зек Рго 135 440

За РОТЛРНИ 284042 «210» ла «гії» 445 «дій» РЕтТ «213х Швучна «рад х «23» Штучно сивтевована поптидна послідовність «00» 7е сів Ар біп ва Уаї біп бек СПіу Аза біз Маї їПув Пув о Бкро бі Аїа ї З хо 15

Бех уві Дув Уаї Век був Пув Аїа Бех Сіу Ре Ап її Був Ар ТБ за

Тук Тіе біп Ттр мазі Ак біп Аіїа рго 01у біп СТУ Бей озіа Тв Меє за 40 145 сту Ага ІТе Авр око Пец АБпоСіУ АвпоТНІ ув Ту Уаї ро ПУ Бе 5О 55 «о

Ал» сіу Акч Уві Твх тліє тру А1а Авр ТЬх Зак Твх о Авп о твх Ата ТУук ев. 70 75 во

Ме ій Пец Бер Бех Гей Ака Бек о спьи Авр Тах Аїз Уаї Тую Тук о сСув 85 50 95 туаї вка бек сіу Тиж Без РБе Авр Рве Тур сіу пів Біу Твг їша Уві 109 305 310 тво Уві бетїг Бек Аіа Бех Тих був біу Рго ек уаії Ре рхо Пей ВЗ 115 120 125

Рго Бех Бех БУу5 бот ТЬг бек сіу Сіу Тнх Аїа дів пев біу Сув Пем 139 338 140

Чаї Пуз Аве отук рве Рго сія Рго Уві Трх Уві Бех Тср Акво» Бек см 145 150 їі55 ї60

Аїа бен Твг обес бСіу Уаії Ніз ТЕЖ Бе Рго Аїа Уві Пеї біп Яеж Вех ї655 170. 175

Сіу цей Тук бек тей бек Бех Узі Уві Тк Уві Рго беж бах бек цею тво і8585 мо бі Тех бів ТВ Тук Тіз був Ап Уві Аво Нів Муз Ркго бек Ап ТЕХ 195 250 205 йуз Чаї Авр Був Був чаї Сі Рео Пуг Бех Су Авр Був Тих Нів Тр 210 215 220

55 ВСТА ВМІВ був'рка Вго Сув Рко Аза рРго Сів пей ем біу біу Ро бек Уаї РВе 225 230 235 240 це) впе Еко Рто Пув Рхо Пуз Азр Тах без Меб Т1в Бек ака ТВж БЕо аа 250 255 сів Уаї ТБе Сує Уві Ма) Уві Авр Маї Яву Нів січ Авв Бк сій Уві 28 255 270

Ту Рре Ав оТер Тук чаї Азв 'сїу Уві бій УМаї Нія Азп Аза Був ТЕ 275 280 ва пу Бко Аха біз зі сіб Ту Авй Бек Тс о Тук Аку уаї Чаї бек Маї 550 295 запо їєо ТНІ Уаї їви Ніз біл Авзр о Тхр іє: Ав сту Був бій Тук Ппув Суд 305 10 315 з20

Був Чаї век Авап Був Вів твй Вк Аза Рго Т15 Фі Туз ФТвж о ж1іє Бех 325 335 35

Туз Аїв Був Бу бів Ехо Аху біч Рко сій Уаї Тук Тих Бей Рко рЕв 345 з5о

Зех Акч Авр бі без ТВх о пуз Ав о бів Ма) бек пе) Тахо Су Бепома1

ЗБ 360 зе5 їув біу Ре Тух Рко бБеїх Авр І1іє Аїа Уаії біс ТЕр 030 Бек Азп о бБ1У зт 375 зо

Сіп Рюко січ ав Ав о тук уз Ті ТВ Рхо Ро Чаї дей Азв бек Авр з5 за 395 400 сту бек вра Ре рев Тужк Бех Був сей Тик Маї Авр Му дек ба Тхр ох 419 4315 сіп сій біу дяв Уві ББе бег Сув бек Уві Ме Нія бій Аїе Пец Нів 420 425 Зо

АвпоНів Туп ТвЕ бів був бек Бех чех їв Бех БЖ 435 «40 «їх 76 «вії» 444 «ві» РЕТ «13» Штучна «ах

36 РОТЛРАМ ОЛОВО «223» Штучно синтезована пептидна послідовність к400з 76 сів Ав біб рез Уаї біб Зех біу діз Піо Уаї цув о пув РЕБ С1у Аїа ї 5 10 15

Ввк Уаї пув чаї Бек Сув пуз Аїа бек сіу Ре Ако їз Був двр ТЕХ 22 25 за ук ті біп Ткр У85і Ак с1йп Аїа ро сіу бій сіу Бей с1іс Тхр Меє -1у Ах тіє дер Рхо лем Ав біу Ав ТВах Ту Тух Чаї Рко Був ББе во За Бо січ біу Аху Уеї ТВЖ їі ТВх Аза Ази Тк беж ТБж Ав Тк Аїа Туг 65 7а 75 85

Ме 13 Пец Бек бБег їеа Аху Бех Сі Авр Так АтТа уаї Тух Тек Сув 85 з0 з уаї вк бек бі Тв Бех Рпе Авр Ре ТЕр бі бів сту ТВж Бей ча 100 Зо 110

ТвЕ Маї Зек Шах Аз Бех ТВ Ппув З1іу Вко Беж Уаі Фае Бо ївц діа 115 125 125

Рко бат бек Був Бек ТрПж дек сіу бСіу тах Ата Ата с бви біу Сув без 130 ї35 140 уві пув Авр Тук РБе Ркб бій Рго ЗМаї Те Уві бег Тер Азп БвкобіїУ 145 150 155 169 діа пйвоа тТвж Зак біу УВ1 Нівз Тви Ре Ркс АЗіа Уаіїі їм бій бек ек 155 170 175 біу гво Тух бет Без Бех Бех Маї Уві Трс Чаї Еко Зежк Заг бек Бей то 185 190

З1іу Так бій Тис тує їіє Сув Аяпоуві Авп оНів Пув о Бто ВЗежх Вво тве 195 250 295

Іув Уаї Аве уз пувз Уаї біз Рко Пув Бех Сув Акр обу Так Ні ТБе 210 215 220

Сує рго Рко був Рго Аза Рко бій Гей без 01У біу хо бек Уві Рее: 225 230 35 240 я РОСТ РІО ДШОВА043 іїво Ре рхо Рко Пуз Рко Пув АвроТах Тез Ме ІТе бек Ак ТБкорко 245 5 58 біз уаї Тр Сув Маї Маї Уві Авр Маї Яек Нів Сіх Аврора бів Уаї 250 2653 275 пув Рре Ава Тр отук Чаї Авр п1іУу Уві біч уві Нів Зап Аза Буз ТАКЕ 275 285 285

Шув о Рго Аа січ сім бів Тух Авпобек ТЬе Тук Ак Уаї Маї Бзакоуаї 250 295 Зоо їє: тах Маї Без Нів Сів Авр Тер Тез Авй сЗу мув Бім Тух Був бує зо5 10 з15 320

Був Уаі Зак Ав Пув Аїз Пейп Ро діа РКО тіє біс Був ТВх т1іе ех 325 350 з35

Був Аіз ув Сіу бі)» Рко хо біз Ро б3п Чаї Тух Твк Бен бко Рхго зо зая зва

Яєжх Атч Авр бів їез Твх Був Авй Сіп аї бех без ТвВЕ Сув є) Уаії з55 зва зва їз Сіу Рпе Тук ко Бех Ар о ї1єе Ата УМві Зіс Ткр бій баг Авпосі»

ЗО вТ5 зво сів обко бі) АвпоАва Тук Був Тк ТБкЕ го Рко Уві їі двр Вах Авр 85 390 зав «ай сіУу Заг Ріе Ре Бей Тух вах Гпуз їжа Трхт Ма1ї Авр Був бек Аха Тер 405 410 15 зів іп біУу Авпоузі ре бек Сув Бек Уаї Меї нів біз АХа Пем Бів 420 425 430 взо Нів Тук Тк бій уз Бек їні Вех Гей бек Рко 435 440 «Ві0ж 77 «її» 444 «212 РТ «2135 Штучна козам «223» Штучно синтевзована пептидна послідовність «Ой 77

Сів Азр Сів їв: Маї біп бехт Сьу Аза біз о уаї був Бпуз рго ЗУ Аза ї 5 То ї5

38 РОСТ лЛОВаЯО

Бех Уві Був Уві Бех Сує Ку А1в Бех С1У РБе Аза Ї16 Був йвр Тах

Тух Ії біо Тер аз Аху бій Аіїз ко сСіу бій бьу пев січ Тер Мей 45 -іУ Ажа їіз Азр РКО Гей вв 5іУ Аєв ТаАх Пув тус чаї Рко цу Вре -5О 55 ва чійп Ар Аго Уаї ЖНЕт її ТвжЖ Аза АвроТЬІ Бех ТІ Аве Твг вів Тух 7 75 но

Маї тб цес бе бек тес Ак Бех 015 Авр тат Аїа Уаї Тух бук 05 в5 зо з5

Уаї Ака Бех біу тТвх цей Бпе Аво Ріє Тту Сту біп Б1У Твх йвц МВТ 100 505 110 тав Маії Бетх Бек Аїз бех ТЕЖ пух Зі Бжо ВЗек Уаї КМе ВБхо Пец Аза 115 го 125

Рко беє бу Був Бех Трх беж бі Сіу Твт Аза Ата пев); СТУ Схув Без зо 135 146 чаї ув Авр Тук РНеа рко біз сврхо Чаї Тв Уаї беж Ткр.Авєп бех зі 345 150 і55 іо

Аїа й: ТВХх Бак сіу Уві Ні ТЬх Бре Ркго Аза Маї Тїей бій йех без 165 ї70 175 сії реп Тук бек Без Зек ВЗек уаї Уаї Тк о Уаї ко Вет Зеб беж Без во 185 ї50 с1у тТвх бів тиж оТух тів Сув Авп Уві Аво Вів Мув ржи ек Ави тре 155 250 ва

Був маї Ар Був Гу Уві Зі Ро пузв Зек Суз Авр Цує Тьс Ні ТвЕ зів 215 220

Су Вто Рго Св Рко Аза Рг бій ТІєй Пей біу бі Бко бек Уві Бе 228 230 235 249

Теп бе Рко Рхо їв РЕо Пуз Азр Тих Тез МебЄ її Бех Аху ТВх Рхо та 259 255 біз Чаї Так Сув уві Уві Чаї Авр Ууаї бах Ніє Бій Аврорхо Січ бах 250 255 97.

59 РСТАРОТ ЗВУ ув Бе Авзпоттр Тух Уві Авр бІу Мат бія чаї Ні Ави дів Буз ТЕ 275 280 285 пув кхо Аж 10 Січ бів Ту Ав Бек Тагр оТук Ака Заї Уаії Бех Уаї 2948 295 зво іїівза ТпЕ Уаї рей Ні біп Авр Тхр їй Аво сіу Був б1я ТукоПпув Сув за5 310 ЗІ5 320

БПув чаї бек Ав Гуз Аіїа дей РЕо Аза с БЕбБ ї3е 61 Туя Тек о Тїів бек 25 зо 335

Пуз іа Буз сіу зів реко Ака лм бо Зіп туаї Тук о ТвВжх ТГнй о Рко Кко зай 345 зо

Бес Ака Авр сій Мей Тк обув о Аяп сій Уаї Беж ем ТьЬг Сув Пез Уві 355 350 365

Був Сіу Рне Тук Рко бек Азр ІТїе Аїа Уві бі: ТЕр сій Бек Авт бі 370 375 зво сіп дже зій Аза оАва Тух Пуз Так Тахо Кко рхо Уаї Гем Авр Вех Авр зв5 950 385 300 б1іу бек РБе ре їж: Тух Бек Був Кей тТіпт Уаї дер Був Зах Дкч Тр 1405 410 15 зів бів 1) Ази Уаії Ре Зеш Суз бек Уаї Мей Вїз бін Віз бе) дів 420 425 430

Ав Біз ТужЖ Трт біб був бек Бей бек Бей Бех Ро 435 40 «вій "В «83т» яч4а «2122 РЕТ «е13» Штучна «25» «823» Шеучно синтевована пейтмндна послідовність «або» 78 біз Авр біп бес Уаї бів Зеж біу Ва Сів Уаї Буз Був Ркхбо с1іу Аїа 1 5 10 15

Звук Заї Був Чаї Бах Су Пув Аїіа беж біу РБе Авп Їїїе уз Авр о ЖвЕ за бо ВОСТІ 2до45

Тук їіїе бів Тхр чаї Ах сів А15 рко біу Сів Сіу Бей бій Ттр Меє 35 40 15 оіу Аха тів Авр о Рко Гео Аваобіу Ав ТВ Буя тує Тваі уко Гу Ве що 55 БО І зЗіп бій Ажа Уа ТБж Її Трж Аза Авр оту Бек ТВ Аза оте Аза Тух 55 70 75 ва

Меї сі) Бей бек бет Без Аж Зах бій АвротБк АТа Уві Тук тук сув ве за з5

Уві Аку ВЗек бі ТАХ їй Ре Аве Ре Тер бІУу Сіп піу Тах їв Уві 100 105 110

ТвЕ МАї бек Бек АїБ5 Бек Тк цу біу Рхо бек Маї Бве Рхо Беп Вів 115 120 125

Бкб Зес Вес Пув бек ТЕ ВЗех с1у сіу Твж Аїіа діа Сей б15У Су тез. 130 135 140

Уві пу Ави Тук Ре Рко Сіл ро Уві Трек Уаї бек Ткр Ав бек пІіУу 145 150 ї5Е уко ів Тс) Тих йвЕ піу Маї Нів тТЬКЕ Ве ро із Маї тей біп Зех бах 165 ї70 175 сбіу їец Тук бек Поп Бех Беж Уаі Уві ТЬж Ма) рРжо Бех Важ беж Тей 150 185 і90 січ жах біл твЕ Тук Ії Сув Авапоуві зп Нів уз Рхо бат Ази тТнг 155 250 205 іїзув Уві Авзро Гу Муз чаї дхйп рго Буз Бех Сув Авр пуб Тпж Нхв ТИХ 235 ТЕО

Сув Рко Рго Су Рхо Аїв Бко біз Бей Тем бі сїу Еко бат Маії ве 225 230 35 220 реп рве Бко Рко Бу Рхо ув Авр ТвВтІ Пе Меж т1іє бек Ата ЖЖ Вга 245 250 258 сід уаї Тк Суз чаї Уві Узі АвроМаї Бех Нів біз АврорХо Б1іч Уаї 259 265 270

Буз Рпе Аз тТжр о тух Уаї Авробіу таз бій Уві піз Авпо вії Був ТБЕ 275 280 285 ві РОТОР ДОК ОВУ

Туя Рко Акд січ ба бі Тук о Аво ЯЗех Тв Тух Аку Уві Уві беж Уві 250 295 за0

Іво ТвЕ Маї Бей Нів біп Авр Жхр о бес Авт бім Пув о сіа бує Пуя бух зав ЗІ 315 320

Буз Уаї Зех Авпобує Аза Пес Бко Аза Рго Іі бій Був Так її бек

З25 330 з35 ув Аіа ув о сіу бій Рко Ак бі) ко бій чаї Тух Таж без Раб Рго 340 зав 350

Бек АкЧ Авр сій Мей тах Був Ази бій Уві беж цем Тк був Ппез Маї за зво зе5 їув сіу Ре Тут рРго бек дер її Аїа Уві бій Тер біз Бех ав бу з7а 375 зво бів Ро біп АввоАви Тук пу Таж Такорхо Бхо Маї йей двю» бЗет Дер 385; Зо зе 400 оїУу бек пе Яйо лем Тук бек луз цес тТнЕ Уаї Авв Був Беж Ажч ТхЕ 405 410 45 сіз біп сСіу Ази Ууаі Бе бек Сус Вег Чаї Меє Ні сій А1а ей Нів 420 425 430

Ав оНів Тух ТЬж бій Пув бек Цей бек Бем бек бко 435 440 «?10йх 78 «211» 444 «кгійх ват «ніЗ»У Штучна «2» «223» Штучно синтєезована пепцтидна послідовність «бом 75 ів Авр Сів Бей Уві бій Бех с1у Аза біз Уаії мує Пуз РкЕо біу Аза ії 5 о 15

Жок уві Був Ууяі бек Сув мув Аів Бек Сіу рае Ази ї1е Ппуз Авротах 39

Жук Т1їє бід Тер Уві Ак СІ0 Аза Ре сіу б3іп СІу вч бім ттв Меє біт Ах її Азр о рхо тев лап сіу Ап ТВвх Був Тук Уві січ Пув РБе 5О

52 РОТЛВ2О ГЗЛІЯЯВЯО біч біу Аку Маї Тахо Її Тах АТа Авр ТЕ его ТВт АБ Твж Аїя Туж ве 70 75 во

Меїс біо їжа ЗБЖ бек рей Вже бех Сіо Авр Тс Аїв Уві Тук Тук Суб в5 зо 95 заї Ах бек Сіу ТтТвЕ дез Рье Авр пе Тур біу бів йіу твк її Уві 109 ї05 іо

Тв ча1і бек бЗех Аїа Заг Тік Му Пру Бжко Век маї Ре Вхо Бен ВІЗ 115 120 125 ко бек нех Був Бек ТБк Зек сіуУу п1іу ТІ АТїа Аза їв бі Сув Гей 130 135 140

Уві Пуз Двр Тук Ріе Рко Січ Ро маї ТЬЕ Маї бек Тер Авп Бех Щіу 145 50 155 160

Аіа без тТву деко 51у Уаї Ні Жак Бе Ржо Аїа Уаії Бей бій Бек Бех 155 Іо 175 сбІУ цей Тух Бех Мази Бак дек Уві Уві Тптї Уві Рко Бек бек Бек ПМ 150 1858 ї90 піу Жву пів тве о Тух Її16 Суз дав уаї Аза Нів Пув ко Бек оАви ТВ 195 205 205

Буз уаї Ар пев Бу аз біз рко Ппув Бех Суз Ави їв ТБ; о Нів ТКЕ 218 215 220

Сув Ро РКО Сув Рго Аза Рко біз Бе) без біу с1у Рко Бек Уаї РБе 225 239 235 240 їеа рве рко Рго Гуз Рко Муз Азр о ТБж Бем Мек тів Зеж Аку таж жо 745 255 255

Сіа уаї Тох Сув уві Уві Уаї двроМаї бек Віз бій ввр о рко бів Уві 260 25 2

Шпук Вре лап Ткр оТук Уаї Авр о б1іу Уаі біз Маї Бів Азов Аза Був ТЕ 275 280 285 ув рРтхо Ага біз бій бів Тух АвпобЗек ТБ» Тук ат Уві Уві бек Уаї ва 295 Зоо

Тез Ти Уа1 їм Нів Сів АвроТкроїєи АвпоЗЕу Гу біз Тук Муз Сув зо 310 зхї5 20

81 РОСТЛРІТОЯОЛІ

Ів. чаї Бек Дев Пув Дів Пави ро Аза орто Ті біз Буд Тих ІЗе Зеж 25 за зав їув Аїа пує піч зій Рхо АкБу бій Рхо біп Ууаї Тух тТпж Їм Бко ро зі 45 350 бат АхУ Ар сій Без Твк о Ппув дей бій Маї бек пев ТВвЕ Сув йец Уві 355 зБО 3655

Був сіу Ре Тут Рко Бех Ар І1іе Аів Уаї сій Тер обіє Бет Авп сіє 870 375 зяо бія Рхо біз Авп АБИ Тух Був Таж Твт о Рхо рхо Уаії фей йвр Вох Авр 385 за за 400

Зі Бек Ріє Ре цецш Тує Зек Був цей тТвх чаї Авр озуз бЗет Ако тгр 405 419 415 іп іп Сіу дп Маї Рре Бех Суз ет Уві Меб Нив біб Аїв Бей Нів ча 425 430

Аза оНів Тук ТвВх сій Муз Бек Бей Бек бе) беж вхо 435 А «Ф10ж ВО «211». 213 «2125 РЕЖ «7135 Шеучна «го «В23х Штучно Синжезовавна пептидна послідовна «00 Во

Ар Ії бій Меї ТАх Сів Зак ро бег бек рем бек ів Бек Уві бі ї 5 160 15

Авр вка уаї Тих Ї1е Твх Сув біп А1а Бех бів Авр о їіє Нів Із Тук 20 й5. Зо

І1їе ліз тТтр Тух бів біп був Рхо б1у 104 Аза Рко Ахя Бей Гей її

Сіп Тук Тахо Ввж ТВх рен бій Рго б1у Уа) Ро Бек Аку Ре бак біУ 55 50

Звх сії Бек сіу Тк Ар оТух Тк Бпе Тих їїієе Бех бек цем біб РЕ 55 то 75 во

54 встледи ЗВО сіло Авр Іїе Аза Тпх Тук Тук Сув Ім біп Тух АввБ Ав Пес Ага тах 85 за з5 рве 21у б1у сіт ТВх пує« Уаії сія тів Мув Агу Тк Уаї дів Аїа бхо 105 105 110 бек Уа1 Рре Ііє Ббе Рко Рко Зех Азр біз бів ей Туя бек біу Тих 115 120 125

Аїа бек Маї Узі Сує їец без Аво Авт Ра Тук орто Аа бі» Аза Був

Іо 135 140

Чаї зі Ттр Пул Уаї Авр дви Аїа їеч БЗіп Зех с1у Ав дек Сі с15 145 150 155 160 ех уаї ТтвЕ п1ій сів Авр обБек ШуБ АзроВех ТЕ Туж Беж Те; век бБетг ї65 ї175 Вт

Твж Бен тТБЕ рес Бех Му Аза Аво тТук БО Му Нів їшн Уаї Тух Аза

І80 185 1595

Сув біп уа1ї Тьвх ія пі біу Гез Бех чех Бго Уві ТВт їув бек Рре ї195 200 205 вАвп Акч о сіу 15 Су 210 «2102» 8 211» 213 «Рій» БЕЖ «213» Штучна его» «223» Штучно смитезовава пептидна послідовність капоОхм вх

Азр Іі сій Меб ТБг обіп Зек Рго Зех Зах Тем Зех діа Век жі біу 1 5 10 5

Азро' АкУ Уаї ТЕ тів тТЬкх Сук важ діа бек сів бер Ті Нів Пув Тухк 24 25 39

Ії6 Аза Тер Тук біп о Зіп бує Бгто біу шій Аїа Рхо Дхп бе лем ї1в 46 45 бій Тук ЖЕ Зех Тнк Її» біп Всо 01у Уаї Рко бек Ак КМНе Зак СУ

БО 55 во

Бек біу Бек Сіу Таж Авр Тут Твж рре тТвж їїе Бех Зах Тей бій РКО 70 тв во

65 ВСТЛРОЮТ 2054042

Сіп Авр Тіз Аіз ТЕ Тух Тух Сув Бей с1п Тут Авр Ав Беч Атха ТЕ 85 зо 55:

Ра біу сіу біу ТБх Пує Чаї сто І1їе пуз Агу Та Уві Аїа А1їа вто 100 105 19

Беж Чаї Рве ї1є Рпе рРко рго бек Аве біз бій Пец уз бек сіу Так 115 120 125

Аїа бек Чаї Уаї Сув Геї пем Ав Ап ра Тухк Рго АгЯ біз Аїв Був 130 135 140

Уві сії Тех був Уві Авр Ав оАїа без біб бек біб Аваипобех бів бій 145 155 ї55 1605 ех Чаї ТВ бі: бій Азб оЗет Гуз Аво Бек ТрЬЕ Тух Бех Шви бек Бех 155 179 175

ТЬвх їє) Тв пев Зеж Гув Аза Аер Ту сій Бу Ніє бує Уві Тух Аза ї80 і85 195

Су бій Уві ток Нів Сів сіу Без беж бек рко Узі Таж Був Бек ря. ї95 290 205

Зчп о Ака б1Уу 510 Сук 210 «210» 82 «иї1ї» ІЗ «12» РЕ «і13х Щеучнв. «20» «223» Штучно синтезована пептидна цпцослюьдовність «400»М 82

Авр оті бїр Мей ТВжх біп бек Бго Бех бек Пец: бек Аїз Жеж Уаії 0Т1У х 5 то ния

Аве о Ако Ма) тах т16 ТБ о був Був Аївз Бек іп Авроїтів Нів ШпУув тує 29 25 зо тії Аїа Тер Тук бів бій пу Вко біу біп Аїа Рко Ака Бейп йеи Хзе сів тує Тве дек Тйтх без біз Рко бі Чаї Рго Бек о Агая Ре бБег сіу

Бо 25 50

66 РСтТЛРО 12 бек 01у беж Слу Тржх Авр Тух ТНх Ре ТБх ї1іє Бах бек Бец пів рео бо то 75 во сів Авр ї1е Аза Твжх Тух Тух Суб ївиа сій ТУує АзроАвп о Бей Ат ТНЕ за 95 вве діу бі біу ТОх Пув Маї сі І11іе уз Ах Твх баії Аза Ама рко

То 305 110

Нех уУаі Рпе її Ре Ркс Бк Бек Азр осів бій Гебз Був бек пі ТЕ 115 ї20 1255

Аїа Яех уві Узі бує Пец цей Ав о дк? Рпе Тук Бко Ак біз Аза бух 135 138 155 узі піп Тхр Був Уві Ав Авп оАтТа Тїзи біп бек біу Ав беж сій Сб 145 150 155 160

Бех Маї ТЬк біо» бів Авр обех йувз двр бак ТвВж Тук дет Без Бех дек 165 ї70 ї75

Тк їв Тк пев бек муз Аза Авр о Туюк біб уз Нів муз Уаї Тук А18з 150 185 190

Суз іч Чаї Твх Ні біп Сіу без беє Зетх Рко Уві Тс Був Бек Ріє 195 208 205

Авт Акч біу біз Сув 210 «2105 ВА. «2її» 213

Жеі2» ТАТ «213» Штучна «ВО» «253 Штусно синвтезовайна пепптийвна посльдовихсть «00» ВЗ

Азр її бів Меб Тих біб бех Рко Ввх беж Поп Бех Аї8 Бек Уаі Б1У 1 З 10 15

ЯАкр Ак Чаї ТВх ї1е Твж Сув біп Аза бЯех біп Авр Ті Нів Гуз Жук 25 чо її Віз Тжр Тук бів піп Був Рхо Сіу сіп Аза Бко Ака Шев Пемх 118 10 45 сів Тук ТБЕ Шех Тюх їез Піо Ро біу Уві рхо бек Аху Ре ВЗек 01У 5 Б 80

57 ВСТА РОПТ МОВО

Зак біу Зак біу Тіх Авр Тусє Тк Рие Тнж І1є бек беж їй бій ре 65 7о та во

Сім Авр о Іїа віз Тс Ту Тук Сув Бе бій Тук Вр Ап опе: Аку ТВ 90 5

ЕБа сі 51у біу твжх уз Уяї бій І1е їуб Ату Тнх Узі Аза Ата Бко 100 105 їх нах Уві Рне Ті Ріє Бко Бго ек АврБ о с1з бій 6-3 Муз бек зву ТЕ її5 120 125

Аїе Бек Чаї Маї Сук Ге Пес Ав Авп о Ба Тут го АтЯ БІБ Аїа Був 135 135 140 чаї бів Тхр о йув уві Авр о Авп оАів цей Сів Зех с01у Авт обех сіп сій 145 150 155 ївО

Ваг Уві ТНЕ біб бій Ар Бвк уз Авробеє ТАЄ Тух Бех їви Веб Беж ї55 170 ї75

ТЕк Без Тк бе: Бех Пув Аза Авр оТук й: пу Ніз Був Уві Тук Аїв 385 185: 196

Сув піз Уві ТВ: Нів бів піу пем беж бог Рхо Уві ТБх пу Зет Бйв 155 240 205

Ази вка БІіу ста Су 21 «йі0х в «211» 7513 тт» РЕЖ «213» Штучна «вийх «223» Штучно синтєзована пейтидка песлідовність «аШох ва йзр ї36 бів о Меї Тахо піз ех рхо Бех бег Пез бек Аза Бек Уаі бБіУ ї - І9 15

Авр Ак уві Твх їїює Твх Суз 0і5 Алла чек сіп Авр їіє Нів Ппуз тує 09

Ії дія Ткр Тух сій біп Буг рго біу біп А1їа Рто Атхч їеа пев зіїе 4 45

68 РОСТІ ОАЮВАОЯ біо Тут Таж Зек ТвкК опе біб Рхо біу Уві Реб Бес Ах рРке Зак Ту 50 55 50

Бех БіУ бек бі Тпк Авр оТух ТВ Ре ТВкЕ їіє беж Вер Гєд бів Бо 55 70 75 на із Авр Т1е Аїз Тпх Тут Тук Сув бей сіп Ттух АвроАвй Пец бгя ТЕ 85 чо 5 ве сту бїіу біу Так Шув Уаї Січ тІїе 035 Ак Тах Уаї Аїз А1в РЕ 500 щО5 119

Бек уаї РБа їїе Ре РюЕо Бкго Бех Авр о бій бів рей ув беж біу Тох 115 120 125

Віз Бек Чаї мМаїі Суз Бей їйч АзЗп Ап ра Тух РКО Ака біз Аза ув 130 їЗ5 150

Уаї Бів Тер ів Узі Авор о дяв Атїа Геиа біп бек зі Авп Важ біп 3 145 150 155 БО

Бех чаї Так зі: бів К5робек пуб Авр Вет ТВх Тух бек пе бек вве 165 їт0 їт5

Тих о ївй Так о їей бек був Атїа Ав отТук б1Я Був Бівз ув уві Тук А1 8. 180 185 150

Сувз біз Узі ТВ Нів бів бі рез Бех Бех Рко Узі ТБк Був бек Рне 135 205 205

АзпИ'АкУ сіу бім Сув 210 «2105 85 «вії» із «свійм ВЖЕ «віх Штучна «ф2й» «7232 Штучно синтезована пептидна послідовність «Фо» 85

Ар їіїє сбіп Ме Трх о бій бЗех ро Бех Бек їз Зек Аїа деж Уві бі 1 5 18 15

Азр о Аха Маї Тих Жіє їх Су уз Аза Бек біп Авр о Гле Ні Пув о Тук 21 25 30

Іїв діа Ткр Тут бій біп пуз Ркго біу бів А1їв Рко Асд Гем оте! ї1в

69 ВСТАВ 27054042. бів Тує Та бак ТЕХ Бех бій бів біу Маї БРко Бех Дж Бім бах В1У 5О 5 БО

Бек сіу бек сіу Тих Авр о Тук Так Бе ТЬк Тів бек Бех пем біп ро 65 70 75 во бій Азр 118 Аза Тк Тугв Тук Сузв Га біп Тух Аву бво Бец Агу Те в5 зо за

Бле бі біу бСіу тТЬтх Пує Уаї біз Ії ув Ага Тк Чаї Азка Аза ро 100 105 110 бЗек Чаї Біе Ті Рре Рко Ркго Бех Азр о сСіз Сіп Тез Буз бек піу Тк 115 129 125

Аїа беж Уаії Маї Сув Пец йей АБю» Ав РБе Тук рхо Ажку бій Азїш Бук 130 135 149

Уві біп Ткр Шув Узі Авр Авп діа Бей бів Вех 1уУу Аква Зек біп ПТ 155 155 ІБ 160 бек о Уаі Тих Січ біп о Авр Бех Буз АБр о бБеї Тк оТух Бех Без Бер Бек 165 170 175

Тк беп Тк без Бех Ту Аза Авр оТук біб пу Ні пує Уві Тук йМа зво 185 ї50

Суз бі: аз ТВх Біз бів біу цей Бех Зет Рко Уві ТЕХ Пув баг Рае 95 200 205

Ав Аква сіу бін сСув 710 «210» 86 «її» 7 каі2хж РЕЖ чеї3» Щтучна. «22а5 «вах Штучно сиптеовзована пептидна послідовність «оо» ав

Зет бі Тк Бех Рие Авр Ре 1 Б кеїйх 87 «е11х 17 «ох ВКЕ «13» Штучна

70 СТАР О ТОВ О. к«223» Штучно синтезована пептидна посдідовність «4005 87

Ах Т1є АвроБтго їєт Вп обіу Авпотвг уз Тук Нія рр Був Ре пій 1 а 10 15 -іу «210 ве «фії» 17 дт19 ВЕЖ «213» Штучна «Тео» «23» Штучно синтазована пептидна послідов ев хіба» яв ака ч116 бар рто їв Ав о с1іу вв ТК Був Тує Був рЕОо Був Ве сій 1 р 10 35

Фіу «віФх а «ії 17 кві» РЕТ «233» Штучна «ай» «23» Штучно синтезована пептидна посльдовнаєиь жапо» 85

Ах Іі Авр Бго ей Ап о сіж Авц Так о Пує Тук йжа Ро Був Рпе 91 і в 10 15 іх «2105 80 «2115 17 «ій РЕ. «213У Штучна «кап «а3 Штучно синтезована пептидна послідовність «ай» 90

Ак тТіе вро РЕо ви Авй б1іу АзпоТвгоБуз Тук бек РКО Був Ре сій 1 Б 16 15

Ки РОСТЛРМИОЛКЯО4 «жійх 91 «вії» 17 «Від» РВЕ «135 Штучна «го» «223» Штучно синтозозана пептидних послідовність «ой» ві

Аку ї1е Авр о рхо печй Авп обіу Авп Твх Був Тут Твх Рхо був Ре Сід 1 5 10 15 сіУ «зі0» 95 «В11х 444 «219» ВЕЖ «213» Штучна «2205 «Р23х Штучно синтезована пептидна послідовність «во0х 92 біп Авропіп реп Уаї бій Век біу Аіа бій Уаї Був бує Рхо піу Аїд ї В ї0 15

Вех чаї Буз Уаї бек ПСув Мув Аїа бек біу Рреа Авп її Був АвротТве 20 25 30

Тук Ії біп Ткр чаї АжхУу бій діа Рг біу сіп Сіу йез бій Тер Меє 35 що АБ сіу Ак І1їе вро вхо Бей АзпоСіу Ав Так о бує Тук Уаї Рко Пує Вр

БО біп Біу Акч чаї ТБе Іі Тахо Аза Авр о Тих оВех Тих Ап тв АтТа тут 65 70 7в во

Меб бій Бей деї бек їва Ак бек січ АвроТНЕ Аїа Уві Ру Тук був

ВЕ ча за

Уві Аху бек Сіу Тк бек Рае Ар ВбБе Тхр Бі біп біу Твк Шеш Уаї 150 105 хо

Тв уаї бек бек діва бех Тк Був біу Рко Бех Уаї ББе Рто цем Аза 115 ї20 125 та ВСТАВ лавах

Тгоа бак бек був Бех Тпх чех С1у біУу ТВж Аа Аїа Бей Сіу Сув їв 130 155 140 чуаї уз Авор ТукК вве рхо із Рхко Ууаії ТБж Ууаї бак Жхр Ап о бВех 01У 145 31350 155 160

Зіа пе Тр оБек б1Уу Уві Ні Ток Ре бхо вів Маї тлі Пій бок бек ще 170 ї75 сіу їз Ту Зах їши бех Вех Чаї чаї Тьх Уві Рхо Зеу бек Яевх Та 180 ї85 19560 сту Тв бід Твк о Тух їїа Сув о Аз» Уві Ап Нів Бус ро бек Ави Твг 195 200 205

Туз Чаї Авр Гуз пув Маї Сі. Бо ув бек Сув Ар Був ТВх Нів ТБх 210 215 220

Сув Ржхо Рюб Сув Рхо Аза Рхо сій Тез ївиц с1у Сіу Рхо бек Уаї Би 225 730 235 240 тези Ве Рго Рхо Цув орто Бета АвроїТвЕ без Меб Тіз бек оАку ТВжЖ о бхо 248 2550 255 сі уаї тах Сув Уві Уві Маї Авр чаї Зак Нів 13 Авв о Рхо біз Уві 250 265 27о

ІУз Рпе Ави Ткр Тут Маї Азр су Уаї біб Уві Ніз АвлоАТа Буз ТАх: 275 280 285 їув Ехо Ага Біз Бій бів Тук Ая5п Бех Тах Тут Аху Уа1і Уа1ї Зех Уавї 259 235 зо тей Тв Уві Меч Ніз сій Авр'Тер Пей Авп о б1у Був біз Тук Був Сув 305 10 зі5 320

Пув баї Бек Аво цу Аїа їй Рхо Аїва Ро ї1їє біз Ппуз Трк о ї1ї6 Бек 325 зз3о ззЕ муз й1а уз біу біз Бо Аку сій Рко біп Маї Тух твЕ Пе орха бго 46 345 350

Яек Акч Агро буп Її ТвВге був Аве обіп Маї бех без Тис Сув Бей Чаї 355 з60 з85 їв січ Ве Тує Ро Бех Авр о ї1е Аза Маї бій Тер бім бек Авп Су 370 375 зво

73 РОСТЕ ВЯО42 біб Рго іп Авп Аво Тук Ппув Так Так Рго Рко Маї Гей Авр бек Авр ї8в5 зва 395 400 с1у дех Рре Ре пей Тук бек Мув цей Твх уві Авр Був бек Ака Тер 805 436 аї5 бів біо Сіу вп оуаії Ріє дек Су ВЗеж Уаї Меб Нія біз Ата Бей Ні «га 425 430 взпоБів Тук Тк сів Був Бех реп беут Бей дех Рго 435 44 «10» 53 «2112 445 «йї»2 БЕХ «5І13 Штучна «2г2а» «23» Штучно сицтезована пептидна послідовність ч«їойх 93 пів Аве біп Ппез уаї 5105 век пТ1у Аїа с10 Уаі Був Був Рко сіу АТ ї З їо 15

Бех Уві Буз Маї Бек Сув їз йїа Бех Б1іу Рів Авип тів їв Двротах а 725 36

Жук Іі біп Ткр Уаї йку бів Віа го б1іу біп Сіу цес бій Тжкр Межб 46 за сіу Акч ї1їе Авр Рко Ппеп дзп о сСіу Ава Тк пух Тук нів Рко Пух Ріє 5о 55 о віп сіу Аха Чаї Тк ІЗе Так Аїа Авр Тіх бек Тк АвпоТвк АТа Тух а 75 во

Мев біла цей бек бет бей Асу Бех біз Авро Те АзЗв Уві Тук Тук Сув я чо 55 чаї Акоу Зех біу Тс цей Бре Авюр Ріє Тр о схУу бій СТу твж без Маї 100 105 її тве чаї бек Вес Аза бех ТВвх Ппув 01у рко бат Уаї РБе Рко їПем Аза 115 129 125

Втго Вег Бек Був баг Тах Бех сіу біу тТвж Аза Аіа По СІТу Сув це. їЗ0 135 140 чаї Був Авр Тус Ре Ро сів Рго Узі Так Уаї Бех Тер Авп Зах Є1у 145 150 155 ї6О

7А ВСТЛРОВІ МОВО

А1їа бе: ТВпж Вех сіу Уві Ні Трж Ріє Рго А1а Уаї їі біп Явк Бех т65 1789 175.

Сіу їєй тТук Вех Тео бех Бек Чаї чУаві Таж Уві Бко Зах беж бек Шви ї80 ІВ 190 сіу тиж сій Тв Тук тів Сув Ави Уаї Ав оНів Був рко бек дДяп тн 195 208 205 ув Маії Взр ішв Мув Уаї бій бхо Буя бек був Др ув ТвВк Ні тах 210 215 229

Сув Бхо Рко Сув Рко Аза Ржо бій Тед їво Сіу Сі; Рео бек зії Ра 225 230 235 240

Ієї Рре РрРго рхо Був Ехо Муз АвроТит Би Меб Ії Бех Ахо Таж РЕо 245 250 255

Сів Чаї тах був уві Уві Уаі АДвр Маї бек Нів піз Авр о рРхо дій Узі 250 765 270

Гу Ріо АвпоТхр о Тут Уві Ар озіу уа1 стіп уві нія Авп Аїа Цув тиж 275 280 285 ув Рхо Агя Зі ші бів Туг АвпобВек ТБх Тух Аку Уві Уві Зех Уаї 289 295 300

Тез Тк: Ууаї Пец Кіз Сів Ар о ТЕр Тез Азов біу пуа сіб Тух Був Су 305 810 15 320

Іта Уві бек Авп Пув АТта Пец рго Аза БРжо Тів біз Був ТВт ї1єе бек 325 330 335

Тїув Аїз йув Сіу бів РкЕо Аа Сі Рко бів Уві Тут важ Та рко хо 340 з45 зо бек Акч Авр Сід Без ТЬКЕ о пув Ан бСіп Уві Бех без ТахХ Сув Бем Маї з55 зво ЗЕ5

Шув дпіу Ре Тух Рко Бах Авр Її Ліз Маї бій Ткр біз Зех Аве В1У 370 375 зно біп рко сі Аза Ав Тух Пув Те ТВт Рхо Рео Маї Без Ввр бек Авр зв зай 395 450

Сіу бек Ре Рне тей Туг Яек Пув Бей Тс чаї АБр ув бек вхо Ткр 495 310 415

75 ВСТЛРОФТОЛЩАОЯІ біп 12 Су Аза Уві Бпе бек Сув Бех Уаї Меї Ні Січ Аїї Бей Нів за 28 430

Ави Нів Тух Тк біп пу Вех Гей Вехк Гей бах Рко 435 440 «аж 94 «211» 444 «ві» РЕВЕ «213» Штучна «820» «23» Штучно синтезована пеоптидна послідовність «4002 94 сіп Азр бів Гей Маі йіп чех 01 Аїа біз Уві тує був Рхо біу Аїа ї 5 10 15 бек Уді Буз Уаї Зах Сув їша Аза бех Сіу Рва двп І16 Ів Авр о тве за тТтук Тіз біб Тер Узі Аха біз Зіва рРко сіу Бій Фу бе біс Тктро'Меє дО 45 сіу Ак ї1є Аве око Цезп Ап осіу Авп Твх бу Тук пу вто Мув Рле 5 сів б1іу йхо уаі Тк Ї15 Тігойіз АвроТвх Зекс Тс АвпотТвк діа бук 65 70 5 во

Меб іп Тем бах бек пе Ага бах біз двр о Твг Азїв оХМаї Тук Тут Сув вь зо з5 чУа1і Аку бек біу Тв їм Ріє Авр Ра Ткр сіу 1 біу Твжх Пес уві 160 165 110 тн уві бах бак А1а Бех ТВх Ппуз біу Рхз Бек чаї ре Вго Пен оАїа 115 120 125

Рко бах бах Був Бех тТЬх Зак сСіу біу Тк Атїа Аіз пе: 5іу був бей 139 135 140

Чаї пу АвротТук РБе рЕо сота рко Маї ТькомМаї)ї Явк Тер Авп беї біуУ 145 ї50 і55 ї6о0

Аза їв: твЕ бБег піу Уві Ні ТЬк Рне Рко Аїа Уві Бей їй бех Бех 165 170 175

76 ВСТА РО ТОВ сіу їви Тук бек Без Зех бБвжк уві Уві ТВї Чаї РЕс Век Яех Заг Бех: зва 185 180

З1іу Таке пів Твг оТух Її6 Су Ав Уві Авп Нів ув Рхо бах Дав ТВЕ 195 290 205

Кув Уаї Авр пув пух Уві Сім рхо пуб Вбкг о Сув Азр о пув ТБт Нів о твЕ 210 215 229

Сув РЕ Рко Суз Рко Аїа Бго сій їв Шец Сіу біу ро ВЗек Уві РвБе 225 238 235 24о

Бей вве Бко Рхб уз то Пцув АБр ТВх Бей Меб їі Бек АкФ Тіт РКО 245 250 255

Біз Маі Тих Сув Уві Узі Ууаї Авр Узі Зет Ніз біз Аврорхо бів чаї 2650 285 2то

Був Бе Аво ТкЕр Тук Уві Авр о біу Уаї сти Уаї нів вв» йіа Ппув ТЕ 275 280 285

Буз рЕо Ах ої Хо бів» Тук Азо бе ТЕХ Тух Ака Чаї Уаї бек чай 259 295 350

Ін о ТвІ Уаї цей Нів сій АвроТжр їйец Авпосіу Був со ТуУух Був Сув заБ Зо зі5 328

Куз Ма1 бах Авт був Аз1а цей Рхо Аза Рко Іі біч ув Тнж їЇзїе бек зва5 зза з35 їуз Аіа муз Сіу сів Рко АкЯ пій Рхо біп Уаї Тухк Тпжх Бех Рхо Рко

Зо зав зво бЗеїх Аг Авр ста гей ТБК Був Азвобій Уаї бек пем Тих Сув БПем Маї. зЗ55 3650 зЗ6Б тув'сіу Рне Тук Рко Зек Вар ї12 Аїа Маї біп Ткр 010 бек вп БУ 370 375 зво

Сів Бго біз Ап од) Тук цу Те ТЬБЕ рто Рго Уаії Пец Ар о Вех. Авр зв 359 55 400

Сіу бах Ре Ббе Ппей Тух бек Пув ї-о Тих Улі АзроГуя меж Ахе Тр 405 4319 415 сів біп біу Ав» Уві Рбе Яаг о Суя бек Уаї Мес Нів Січ Віз ех нів 820 425 30

77 РОТА РОВНО

АвпоНіз Тужх Тк бій Пув бек Бей ВЗек їви дех ро 435 455 «2105 95 «тії» 444 кві?» РЕТ к«иії3З» Штучна: «ах «еаі» Штучно сичтевована пептидна послідовність «або 95 іп Авр бій Пе) Уві бів бек біу Аїа біз Уві Тл пув Бко біу Аза 1 З 10 15

Бех чаї Був Уві бек Сув йШув Аіз Бех Сіу РБе Азп їїі6 Був Азр Тих

Тук Кі бів Тер Маї Аку сій Аза Рхо б2у бія бтіу Бех Шіш Тев Меє з 0 45 сі дха 11 Ар о Рго пев Азпобіу Ап отТБх Пув Тук АкЯ Рко пуб Рве

БО 55 60 біп сіу Акт Уві Трк її Тв Аза Аве Трт бегс Тнт Аве Твк Аза Тук б 78 78 во

Меє біз фей бек Вех Бен Ака бек Піо Азр отв Аза Уві Тук Тух Сув 85 50 5 чві йха бех З1у ТВж Без Ре Авр Рне Тхр Сіу біп піу ТЬх Ццеп Узі то 135 310

Твк Уаї бек Бех Аїя Чет Тік Був бі рРкго Бек Уві Ре Бго їеп Аїа 115 120 125 ко ЯЧех Чек Буз бех Так обБек сІ1У Сіу ТБт Ата Аїз Пе Су Суз Без ї50 135 140 чаї Пцуз Ар Тух РБа Рго 21 РЕо Уві Ту Уаії Бех ТЕр Ава бех ЩУ 145 150 155 ї60

Аіз іє. тТВх Беж піу Узі Нів Тйк Ре Рхо А4а Чаї пей бій бек Бех 155 170 ї75 б1у їй тух Вож би Бек бех Уаї Уві Тих Уаії Рго Бех Вех Зах їз

Мо 85 150

Су Твк бів ТиБ о Тух хі Сув Аза Уа Авй Нів був кКго Бек Авт тс 195 290 205

78 РОСТЛРЗО ТІ ОВО

Буз Уві Авр був Тув уаї сіб Рко Буз беж Суб АвроБуз ТВЕ Нів ТвЕ 215 215 220

Сує Рхо Рхо Сув рРко Аа РЕо бі їви Пез біу Сіу Рхо бек Узі Ра 225 230 235 749 їв Бе Бко Рко пу Роз Був Авр Ту їв Ме її бек Ахо Тадх Рко 245 250 255 бін Уві Тнжх Суз Чаї чаї Уаї Авр Уві бек Ні бін Аєв Ро сій Уві 250 ЕВ 270

Буя Ра Аза Тер Тух Уві Авр обіу Маї біз уаї Нів Ав дів Був ТЕ 275 280 285 їув Ехо Ака Бій біз біп Ту Ав оБех ТЬх туг Ак Мві удаі Яехк Уві 250 298- Зо їм ТЕ Уві рей Нів бій Азр Тер Бей Аво біУ Ппув ос із Тук Буз бук за8 310 зів 320

Туз Маї бек дз) Буга Аїз ївеп Бо Аїа Еко тів: сій Буш Тв ЇЗе Вес

Був А1а Був сі бій рРхо АкЯ б51ій ркбо сів Маї Тк Тах Фей Рко Ро

З4о 345 Бо ех Ага Авро обі: без Тахо Ббуз Авпошійп Уві Зек оре) Твтг був без Уві 355 зе За

ШПув Січ Рі Туж Рго бе Авр о її віза Ма1ї бій Тр о зіч Зек Авт оту 378 375 зво бів рРкоа бій йза АвпотТук пу Так о бТЬЕ РЕ Рхо Уві Беи дер Вих Авр 385 зо 95 400 біу бек Ера Ріє їшо Тук Век їув ме» Тв Уаї Авробув'бех Ак жгрв «65 419 415 біл біб біу дп таї РБе Зак Сув бек Уаї Меб НуУв біч Аїв тва НІВ 420 ля 430

АвпоНіз Тух Тік біп Ту бек їей Бек їні Зак Рко 235 440 «105» 95 «Вії» 444

79 ВСТА РОВІ ВА ВЯ «2195 РЕТ «213» Штучна «29» кг23» Штучна синтазована пептидна послідовність «00х 96

СіпоАвр осі Ппей Уаї біп бек п3іу Аза біз Уаї Ппув був РКО Сіу Ата 1 5 10 15

Зех Уаї Був Уві Веж Суз цу Атїа Бек сіу РюКе Ав Хі ув Ав; отих зо

Ту ті бів Тр Уві Аха зів Аїа Рке сіу Стів обіу Пеш біз ТкроМеє ча 5 сіу дка 116 Аве оБбго То Ав б1у Або отТвк уз Тує бех Ркбо Був Бле 55 єб сів сіу Ахку уві Твт їі Тр діа АБроТьх Бех Твг о Авп Тв Аза тує е5 то а во

Мет бій ї-м бек бех їей Ак бек біш Авр Тік За Маї Ту Туж ув 85 зо 95

Узі вка ек сСіу ТЕ тей Бе Ар Ре Тер біу Фів біу ТВе ей Мал 100 105 110

Тит Уві бек Боє Аіїа Бех Тиж уза бі Бго Бек Уаї Ре Рко бо) Дід 115 1920 ї25

Во бак Бек Шцув Важ Тк бохо біу сСіу Твж АТа діа пев біу Сув Ббею їЗо ї35 148

Уаї Ів Ав» Ту РПе Рто щі Рко Хаі Трек Уаї Бек Тер Аво бек У 345 ї595 155 ї5О

Аза фон Тк бек біу аз Ні Так Рбе о рко Віз Уаї ем біб бек бех

Т65 то 175 біу йо Ту бак рем Век бек уаї Чаї Ти Чаї Рхо Яах бек бЗег пе ї80 185 150 сіу тТнж бій Твг Тук тіє Суж Авп Уа) Два онів ув Ркро Бек Ав ТВжЕ 155 200 205

Був уаї Вер був цув Уаі Сі Бо Був Век о Сув Авр о Пув ТБх Нів Те 210 215 220

50 РОСТЛРНИ ОВ

Сув ро Еко Сув Рко Аїа Ро бій Бей Цез біу сСіу Рсо бак Уві Ра 225 230 235 74

Кей Ере Ркго рЕо Пуз Рго був АвротТЬк о Пез Мес тів бет Аку Тк го 245 5 255 бій Уві ТБх Сув Чаї Чаї Уа) Ар Уаї бек Ні біс Вер ро біз Уві 260 255 270 був Бе Аврп о Тжр о Тух Уаії АвробіУ Маії біз Чаї Нів Аво Аїа Був ТЬжЕ 215 290 2а5

Кув вхо Ажу 10 бів біп Тух Ав) оЯех Тис Тух Ак Уві Ма1і Бек Уаї 285 295 308

Ієш ТВжт Уаі Без Нівз сій Аз о Тїхр їз Авп обі пу бій Тут Був Сувз зах 310 315 380

Пуг Мві бек Авп опув Аза Гем ро А1а Его їі бі: цує ТвВх ї1є бек 325 335 35 уз А1аз дув біу біпя Рхо Акт біз Рхко біп Уві Тук Таж Пе Рко Рго 349 345 з5О

Бек Ага Авробіз їєю Тв бує Двп о сіп Уаї бех це) Таж Сув Бей Чаї

ЗБЕ 360 365

Туз пху Ре Тук Ргб бех зр ІЗіе Аїа Уві бі Тхр обі Бех Ава бі зо 375 зяй бів хо біс Аап Азп о Тук Був ТАК ТЕ Бко Рко Маі ївч Авр о бек о Авр зв5 355 за 450 іу Бех вне Ве бен Тук бек ТубБ ва Тк Уві Ар Був Зег Аква Тер 405 410 415 сіп вій сіу яю Уві Бпє Бех Сув Зех Укі Ме нів б3іш Аза осінню НЕв 4250 825 4аза

Авп нів Тує Тс бів пув бах Гей бек Бец бек Рго 440 «д10м 0857 «2т1ї1» 444 «2129 РЕТ «2139 Шеунна кг» . «233» Штучно синтезована пейптидва послідовна сть

Я РОТЛРООТІЛІВЯОЯИ

«400» 97 біп Авр біп їв Уаії бій бек ЄБу Аза біз Уві Був цує рго б1у д1а 1 5 30 15

Зек Чаї Бук таї Зек Су Гуз А1а беж Сіу Рае Аа Іі Гув Авротвх 20 25 30

Тух Іі бій ТЕр УВІ Ага бій Аїа Бо 01У 510 біу пей бій Ткр МвЕ зи 49 45 сіу Вгч її Авр РКО Пец Ази о Сіу Аво Тк Гуз Тук Так Ржо Гуз Реве

БО ів бу вкгу Маї ТВх т1їе тТнЕ Аза Ар Тик Бек Тйх Ази Тк АТа тує 55 70 78 во

Мес біз Тем Бек бех Пеш Ак Бек с1з Азроїбг Аїа Ууаії Тук Тухк був ч 90 5

Уві Акад Бех біу тах Бей Рне Ар оББе ТЕВ бі бів С1іУу ТЕ йем Уді 100 105 110

Твх Чаї бат Бек Аїяа бек Трт Гук С15 Бжго Яех Уаї РНе рхо Пем Аїх 115 120 125

Ржо Бех нак Пув бек ТЬе чес 1уУу сіу Твх Аза Аїа рей сі; Сев Бей і30 135 140

Уві Був вар Тук Ре Рго біс Рко уві Тк оУуаї вах Тр Або бек сту 145 155 155 150 ів тез Тк Беж біу уві нів Тк РНе Ро Аза Уві оп біз бек веж 165 70 175 сі1Уу їз Тух бах Бею бек бБвк Маї Чаї Тс Уві Ржо Беж бек Беж Ше 80 ї85 190 біу Тв біп ТВ Тук ІБ Сув Авп Уаї Азп Нів був Рко бек Ал ТНг 195 о ао0о 205

Тув чаї Ар Був Був Че біз Рко Був бе Сув Авр о Пув ТвЕ Нав ТЕ: 219 25 2259

Су Рго Рго Сує Бко Діа Рго бій рез без біу С1у рРко бек Маії рне 225 230 235 250

Тед Ре ро РЕо Пує Рхо Був Авр о ТВтх їс)й Мес їі Бех ах Тнх Рез 245 250 255

82 РОСТІ 2ЮВ4042 віч Уаї Тпх Сув Уві Чаї уаї Авр уаї Вах Нів с1ч Авроржо сій уві 260 288 27о

Гчасрве Авап Тер Тук Узі Ар сіу Уаї Ст Уві нів Ав й1а ув тт 275 2850 285. буз Рго Ак бі Біо біп Тух Ап бек Тит Тук Ака Уві Уаї беїх Уді 250 295 зо

Тепі ТВк Маі Пе нів бій Авр Тр цес Авпос1іу Гуз бій Ту КМув Сув 305 з1й 315 320

Із 7аї беж Ав о Буз Аїв Бей Рко Аза Рко їТїе бій був Тих Ії Зв 325 330 335 уч Аїа пу сіУ бів рРто Ату біс РЕ бів Уві Тук Таж рей Рго Ркго з45 350

Бек йху Ар 5) гей Тк о Пуз Авй бів Чаї Яеж пий Та був Її Уві 355 зво 355 цув сі Рре Тук Рксо Бек Авр їі Ала Уві бій Ткр біб Бек АБ» о1у 370 375 зно 51п о Бго сів дан ап Ту ГУБ Таж ТБговБко Рго Уаї Бей Авр Век Агр за5 з5о зав 4052 сіу Бех Рпе рве еп Тух Бек Пув рей ТВж Маї Авр Пув Бек Аку Тер 405 410 415 сів сів Сіу Авп оУаї Ре бек Суз бек Уві Меє нів Сім Дія ШЦеч Ні 420 дек зо «Ави Нів Тук Тік Сів Був Бек ва йег Мей Зек РЕс 435 440 «іх ов «711» 444 «2122» РБЕТ «213» Штучна «кітох «253» Штучно синтезована пептидна послідовність «Ох ча

Сів ввросів їв) Уві біп бех сСіу Аза біб Уаї був пу Рко С1у Аїа 1 5 10 15

313 ЕСТЛРАВ ЮНИХ

Бех чаі1 цЦув Уві бЗет Сув ув Аїа Бек Піу Рі Азп ч116 Гуя Авр о Твх за

Тух Ї1е бій Ткр Уві Ак Сіп Аза рсо 01у біп о бію рей 013 Тер Мб 4 45 іх АкУу 11е Авр рЕб Кей Тк о біу сів ТБ пу Тук біб біз Кув Бне 50

Сі біу Ас Маї Тпх ї1іе Трж Аза Авр о ТрЕ бек ТЕ лап о Твж Вів Тух

Ба 7о 75 во

Мек біс тей бек пе Гей АкФ бек сСіз Ави Трк Аіа чаї Тух Тую Су 85 80 аЕ

Уві Ах дев іх ТИЖ Зек Ріє Аяр Різ Тер біу бів сіє ТК Бец тувї оо 125 110

Твт Уві бЗег Бек АТїа бек Тк Буз Сі Рхо Век Уаї Бе Рко Бах Аїа 115 120 125 ко Вак бек цув Звик ТК бек Біу ші Тих Аза Аіа Бей бі Сув ївиа 130 135 130

Узі Був Ав» ТУ Блез ко са ро Уві ТЕх Уві бек їкр Ан бек С1У 145 5 158 хво діа поз Тахо бех піу Узі Нів Твк ВБе Еко Аїа Уві Тем біп бех зех 155 179 175 біу їєп Тух ех їм Звк о ЯЗек Уві Ууаї ТЮт Уві Рко Бах йех Чех Ге 185 185 190 іш Тих біп Тег оТук ЇТіз Суз Авп о Чаі АвпоНів пу Бго бек Азв ТИ 195 700 205

Буш Уаї Ав Був пцув чаї Січ Бо був ек СсСув'АвЬ пу ЖЕ Нав ТЕ 210 215 250

Сув РБко Рко був Ркбо Аїв рхо б) Пен оїеиа Сіу сіу Ркбо Беж Маї Рв 225 530 235 240

Без рйа рхо Бгто пу ро був бар ТБх цем Меї ЇЩе Бех Ак Трж РКО 245 250 255 сів Уві Те Сує баї Уві Заї Авр чаї бек Нів бій Авр оРрхо сій Маї 250 255 270

84 РОСТИ ОЮВІОМ

Гу Рре Ави Ттр Тук Маї Авр б1у Уві біч Уві Нів Авп Аїа Тув Тве 275 280 285 ув РЕ Бха біз Біо сів Ту Аво бек ТНК туго АкаЯ Уаї Уві ех Уві 290 255 зва

Із Тих Уаї рез Нів біб Авр Тгр їє: Ан о біу Пув бій Тук був Су заз 319 315 320

Ту Чаї бек Авя Пув Аів Бей Рко А1їа Рто їіе біб Муз Тр Кі бек 325 330 з55

Тв Аза Був Сіу сію Рко Аха бі Жто бін Уві Тую Тв їв рхо рхо 340 З45 з5о

Бех АкФ АшЮ б5а цей ТП Був двп бій уаї Бех Твй Твж був Бей уаї 358 350 з655 їув 'зіУу Ре Тук Рко Бек Авр оті Аза Уві ста Ткр бій бек Ав о 01Уу 370 35 зва біп Рко бі Ав) ойзо Тук о буз ТВбх Таж Рго Ртхо Уаї Пец Авр Зах Азр

З85 390 395 40о «1 Ве Рне Рпе пей Тух ВежЕ Бпуз Пец Тих Уві ву Муз ВзезкЕ Ак Тер 05 ахо 15 пів Сів біУу Вп уаї Рье бек Су бек Уаї Меї Нів сій АТїз ГПею Нів 420 425 430

Аза Нів Ту ТвБх біп був Явк їв бет без бек РЕо 435 440 кі 99 «ії» тії «сім ВВЖ «2135 Штучка. «вах «2732» Штучно синтевована пептидна послідовність «005 5а

Авроїіїє бій Меб ТнЕ Сіп бек Бко Беж Звх їжи Зек Аїа Бек Чаї б1їУ 1 5 10 15

Ввр Акї Уві ТВх Її Тк Сув Сів Аїа Вежх 105 Аврот1ів Нів Був Тух 29 25 зЗ0 їз діа Ткр Тує Сіп біп цув ко біу біп вза ро Ак Бей Бей її

55 ВСТАВ Оо84045

Сів Туг Твжх бех Трх їм бій Рго біу чаї Ро Беж АтЯ Рцю беж б1іу

БО

Бек біу Бек шіу ТБІ Ар Тук ЖВК Мем Твх її бех Бех Бей біб ро 55 7 75. во

Сі Азр ЕвВе Аза Твжх Тук Тух Сув йей сію Тух Ав дей без Аку Тв 85 зо з5

Рре біУ піу біу Твх бує чаї біз бів уз Дкд ТВх Уаї Азіа Аза РКО 100 то5 110

Вех Чаї Ре Іїе Рце Рхкз Рхес бек Авр оса біп о Тєй Бу беж бі ТБЕ 115 120 155 дів Зех Ууаї Маіїі Суз рез Пей Ап о Аяп Ре Тук Рко Ака біз Аїа був 130 ї35 145 уві біп Ткр о Пуз Уаї Авр Авіх Ата Без бів бек б1у Ап беж біб 615 345 150 155 350

Бех уаїі ть Зїй бій Ав; бек пув АвровВех Тнж тує зак бе Зах веж 165 ї70 175 тт рей ТвВх Бей бек Був Аза АвротТух біз цув Ніз Гуз Маї Тук дів 180 185 190 сСув біз уаї Тве Нів бів біу беш бехг бек ко Уаі ТАК Шцув беж Ре 1955 200 205

Аква Акч біу біз був 210 «210» 100 «2115 17 «вій» РВЕ «713» Штучна «22ах «223» Штучно дивтевована пептидна послідовність кФопй» її

Ака ї18е зар ро Гей ака піу Аза ТВж Бу Тук Ага біз Буг Рае сій ї 5 10 їв біу хє РСТЛРДО ТЗН «10» їщ «2112 17 «гї2 ВЕЖ «213» Штучка «Ох «кга32 Штучно бинтезована пойчидна послідовність «400» 101

Аху Ат Авр Рхо Пес Аха Сіу Авп Тих Буз Тут Ак бім Був Ре СУ 1 Б 10 ЇВ біу «210» 102 «В112 17 ктїг РЕ «213» Штучна. «Ох «в2ЗУ Штучно сминтазовдна пептидна послідовність «а» 192 вхо гів Аврокхо без Ако Ахо Азп ТЕ був о Тух жа сь Гу Ве СТ. ії В 10 15 ву «210» 103 «211 17 «дії?» РЕЖ «Ті3З» Штучна «аа «чева» Штучно синтезовзана пептеидна послідовність «0О0х їз

Аху Ті Авр орЕс їі хо Ту АЖа твЕ КУув' Тут вка Сіл Ппув РБе бій 1 Ко 10 15 су «іс 104 кеїї» ї7 «т12Уу РЕТ «ТіЗх Штучна «ей» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «Ой» 304

572 ВСТАНО

Ага Іі Зврорхо Ццез АхЧч біу Ав ах луз Тук о Ага біз був Рає бів ї 5 ї0 15 чу «війх 105 «2115 17 «512» БЕЖ кита» Штучна «В? «ах Штучно синтезована пеаптидна послівовність «00» 105

Аж ї1іе дАвр рко їео Аку біу Авт Тк Ага Тук Аке білу Був Ра сій ї З та 15 сі «ї0х 106 «2115 17 «йо» РЕЖ «ВОЗ» Штучна «220 «223» Штучно синтевована пептидна послідовність «00» 106

Аку ї115 Авр Ржо еп йку бі Авв о Твх о їув Акч о Аку бі Був ве С) ї В 10 15 у «ійз 307 «2115 47 «2482 БЕ «135 Штучна «ТО «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «каоох 307 дк Тіє Авоорхо рез Ах біу два ТНК пуз Тух Атху біч Ак Ре біб 1 В 10 15 віх «Рій» 08 «211» 17

КБ ВСТЛВоО това «ві2У ВЕЖ «213У Штучна «аа ко23У Штучно синтезована пептидна послідовність «ВОох 08

Аху ІЗе Аврорко Тез Аке Біу Авв Тк Був Тух Акч сп3а Буз Бра біо 1 В 10 ї5

АкФ «МОУ 09 «»і1х 5 «іс» ВВЕ к?Іі3У Штучна чех «ВІЗ» Штучно сиктевзована пепчидна поблідовністія «оо» 105

Авр ТНт Ах її6 іп 1 5 «ох 150 «гії 7 «912» ВЕТ «713» Шевучна «2ах «В?3х Шкучно смитенована пептидна послідовність «00» 310 бек Акч ТвЕ ей Рйе Авор Впе 1 5 «21605 11 «іх 7 «12» РЕТ «213» Штучна ках «Р?2З»У Штучно сидтезована пептидна послідовність «00» 111 бек біу Акц без Ре Авр вве ї 5 «вій» 112 «і1ї1х 7 каїах ВВт «213» Штучна «Іо

Го ВЕТО АТО «хеЗ» Штучно синтезована паптидна послідовність «а» 15 бек б1іу Твжх ато Вне Авор Ра і 5 кЕійз 313 киії» 8 «212» ВЕтТ «213» Штучив «бах «гиЗ» Штучно синтозовава пептинна послідовність «4005 113

Бе сів Тух Авр о Аку без Ак ТвЕ ї 5 «вії» 114 кж1і1їх 8 «2125 РВЕ «213» Штучна «в20х «223 Штучно синтезована пейтидна послідовні сте «400» 15 їси бів Тух Авр Азп ака Аг. ТЕ 1 5 «ФО» 115 «11 444 «гаю ВЕЖ «213». Зручна «ох «Бе3» Штучно синтезована поптидна послідовність «00 15 біз Авр сів ви Маї біп бек біу Аїа Сів Уаї Був Був рхо сту діг ї 5 10 15

Вехк Уаі пу аз Зех Суз Ммув Віва Зех сіу Епе Ав оЗ1їє ГПубБ Аве о ТБе 28 5 зо

Тук Ії бій Ткхр Уаї Аку б3іп Аза Рго сіу бів біу ей бій Ткр о Меєб

О1іу БкчЧ її дар ро їву Ака біу Аа тТвУ Був їух Ака біз дує Ріє во піп біу Ага Чаї Тне їзє Тих А1а АвротТвВж бек Тк Аби ТЕ Аза Тук 55 70 75 во зо ВСТЛРЗО ЗА.

Мек бій їм бах бег Пе: Аго беж сів Ар ТВ Аїа уаї ТУ Тук був 85 во 95

Уві АкФ Зетх біу Тр цез рпе Авр Ра Тур СІЮ бій Су Чек оїеч ах 106 105 і10 їрк Чаї Бек Бег Аїа Бех ТВж туз біу хо Зех Уаї РБе Рко їєю Аїа 115 120 325

КТЖжо Зет Беж Тув зЗек ТВ Беж сіу БІіУ ТК о Аза Аїа Тсй З1У Суя Цей 139 ї35 1445

Чаї був АвроТук Рре Рко біз ко Узі Тих Маї Вех Тер и вало обек СТУ 145 50 ї855 їБО

Аїва ем ЖЖ бек Сту Чаї Нів Ти Ре Рко Аза Уаї Тецй біп бек бек 165 170 ї75 біу без Тух бек Шви Бех бек Чаї Мі Ти Уа) Бке бек бек бек Тїесз 180 85 їва «у Тк бій ТвВк Тух ї1їе був АбБа ві АвпонНія Бу рхо Бек АБи ТНК 195 200 205

Туз Маї Авр о Цув Муз Уаї сіб Ркго буз Беж Суя Азр Пув ТНжх нія ТАК 210 25 220

Сже Бко Бкоа Сув РКО йіа Вкто сій їєза беоп біу біу Рро Бек Уаї Ре 225 230 235 240

Іво Ре Рхо Ро Пув Рхо Був Аяр ТЕ їйео Меб Хі Че Ак Тр Еко 245 250 255

Січ Уві Тс оСув Уві Уаі Маї Азр Уві Зеж Ні біз Двр око біб Чаї 250 285 270

Був Рів Азп о Ткр Тук таі Авр осіу Уві бій Уві Бівз йеп Аіа Муз ТАК 75 280 285

Туз ко Ах біб зіч сій Тух Аво бек Тих Тух Ах Чаї Уві) Бех Уві 290 285 за їм ть Уаї пем Нів іп Аве о тТтр пез Аво обі пу біз Тух був Сув 05 з1ій зів: 20 туя Чваі бек Ап Пув Аза їбБи Рхо Атїа Ре її біз Був ТВх хів Бек 325 зза за ва РОТЛРОУМТО ОКО

Був Аза Гуз біу Сів Рко АкаЯ Сіц рРхо біб Уаї Тук Так Бенц Рко Бхо 340 345 350 бек Аха Авр біб Пес Тк Гуз Ав біб Уаї Бек без Так Суз Бей чаї 355 360 зе5 уз Сіу Ріе Тух Рко бек Дкр Тіз Атїа уаї Сі) Тхр біч беж Авя 01у зт за зво біп рхго бі Авп Азп Тук Цуз ТБх Тахо Бус Ркв Уві Пец Авробект Авр 385 390 З55 400

Сіу Бек Ве Рбе Пе Тук бек Гуз Пеип Тре Уа) Авр оТув беж Ако Тер «05 410 415 сій біп сіу Авки Уаі РБе Зех Суз бех Уаї Меї Ні біч АтТа Гей Ні 420 425 439

АвпоНіз Тук тТАх сій Бпуз беж їі бек Бей бек Бко 435 440 «8310» 116 «211» 444 «21 РВТ кіз» Штучна «го» «223» Штучно синтевована пептидна поспідовність кавою тів сів Ар бів їєв Уаі біп бек С1у Аза б15 Уаї Буз Був Рко сі А1а ї 5 15 15 бак Уві уз Уві ех Сув ув Аїа Бек З1у РБе Ап оїївз пу Ар твЕ 2а 755 зо

Ттук Хі бій тТжр Уві Ага бій Аїа бто З1у бій 01у тей біз Тктр Ме 35 40 45 с1Уу Акч ак Авр о Рхо Пец Акч сСіу Ав» тах був Тук Акгу біц Був Ре а ЗВ во сій біу Ахо Маї Тис тіе Тпж Аїа АвротТнх Бек Твх Авп о Тс Аза Тук 65 то та во має пін пей Яаб бек ісп Аху бех О15 йвроїВхг Аїза Маї Тук Фут Суб за 95

92 ВСТА ВО ОВАОЯо

Уаї Ак Бек сСіу Тік Гез Ре Ар Бе Ттробіу біб біу Жвє без маї 190 ї05 та

Тих Уві Бек Бек Аїа бек ТЕ Пув Біу Руб ЯЗех чаї РНе Рго Гей 81 її5 120 125

Рхо Зет бек Був Бех ТВх Яех сіу Сіу ТЬх Аза Авіа Бей сіу Су Бей 130 їз 1545

Чаї ув Авр Тук Ре Рхо бі» Рхо Уаії Ту Уа«1 дет Тер Авп бех б1У 145 150 ї58 10 дів Теш твЕ Бек сіу Уві Нів ТЕ Рне Рхо Аза Уаї цей біп Веж беїх 185 170 175

Біу еп Тух бек Без бах Зек Уві Уві ТЬк Узі ро Вех Век бет пей ї80 185 ї90

Сі Тех бій ТВ о Тух ї1вз Сув с Аво Узі Авп о Нів Був БжОо Бек. Ав тн 195 27500 205 уз Уві яр був Му Чаї сзіа вхо був бек був Авр оТув ТЬх Нів ТВЕ 210 215 225

Сув рРко Ркго Сув Рго Аіа Бго біз цес ївх Сіу біу Рхо Бех Уі Ра 225 230 235 240

Тен Ре Рко Рко мук Рко Буя Авр Тіт Беп Ме тТ1еє ех Аха ТОК Рко за5 250 255 сій Уаї Тах був Узі Уві Маії Авр Уві Яех Нів бін Авр о Ртхо шпіц Уві 250 5 РИ

Був Різ Авпоїхкр о Тук Чаї АЗр сСіу Узі біс Майї Нів Ап Айїа Був ТВЕ 275 250 285

Був Рго Ат біз бім бів Тух Азю беєс ТПк Тує вжу Уві Уві Зежх чаї 255 285 306 тец Тих Уві пей Ні бій АвроТкр Тез Авп о біу Мув піч Тук бує Сув 395 316 315 320

Був чаї бах Аво їв Аіа пе хо Аза Ркго Ії січ Був Тк Ії Зах зи5 зза 335 пу Аз1а цу Сіу Сіпорко Акд обі хо біп Уві Ту ТВЕ ев оБтхо рРхо за 345 зво

93 ВСТЛРНОЮВЮ

Бех Акт Ар сій бра ТЬс Був Ав піп Уві Яег пец о тТнег Сув Бей Уві 355 о) зве

Буз сіу вне Тух Рко Бех Авр її Аїв Уаї біз Ткр бій бек Аз Сіх 370 375 зво біп рхо Січ Ав АвпоТук дув Ту ТТН рко Рко Уві Пеб Авробех Авр 385 399 395 4що біу бех Ріє Рбе Пес Тух Вех Пцпув ей Твт Чаї Авр оПуз бЗекгоАкаЯ Тер 405 416 415 іп сів б1Уу Ап оМаї ВБе бек: Сує Бек Уаї Меє Вів Сі віз респ Нів 429 425 4зо

Ав о нНха тТужк жЖНжЕ Сів Був бек їєй бек Гей бет реко 435 440 «хійх 317 «211» 444 «івУ РЕТ «їх Штучна «220 «2253» Штучно синтезовавна пептиднаа послідовність «оо» 117 сій Авр бій їз Уаї бі) Бех сіу Аза сів Уді Був Був Бо бі Аїа ї 5 10 15 дек Уві Був УМаї бЗетк Су Був АТ Зех сіу Ре Ав л1іє Був Авр Тих 2 25 30 тує ї1е бій Тв Уві Ажчї біп Аза Рхо бу біб бі Без ста тТкр Ме 35 40 45

Сіу дкч Іїв Азр о РБго пей Ак Аква Азп тв їув Тук дка бі пух Ве 5О 5 50 біш бтіу Ах Уаї Тих ї1є ТЕ Аіа Авр ТЬьх бек Те Авп ТВ Аїа Тух 70 т5 во

Ме сій пед бек Век йеи Аг Зег біз Авр ТВ Аза Уві Тук Тух Сув 85 о 85 чаї Ак бек бі ТьЬе ем РБе Азр Бде Тур сСіу бій біу Тах Тїєз Уві 109 105 110

Трг Уві бет бех Аіз беж Тік йув Сіу Рко Зех Уві де кхо ем Аїа 115 127 125

94. ТУТЛРІОТ2 УВО

Рхо Беж Зег Гує бах Тахо бЗех Сіу піу Твх Аза Аїа їм біу Сув ее 130 І35Б 1710

Уаї Цуз Ввр о Тух Бав Бгто сії рко Уваії ТЕ Уві Зек Тхр Аві йех біу 145 150 155 10 діа Пец Таг бек Сіу уаї Бів ТВт Вре Рко дів Уві цес бір Бек Вех 155 170 175

Фу йвм Тук беж Ге Бех Зак Уаї Уві Тнх Уаї Рхо бек бек бек Пец 180 185 190 біу Тк бів Так: Тух їі Сув Ал уві Азюи Ніз Буз ро Бех Авп о тТВж 1955 2090 27595

Іує Маї Азр Був Пув Маї біз Рхо Су Бех Сув дар Був ТВк Бів Тех 210 15 220

Сув Рко Рко Су Рекс Аїа ко сСТи ївБи Тв» Сіу Б1у рРхо Бех Уві ББе 225 230 235 240 їец Бе Рко рхо Її Ркго Буз Авр Трх Гей Меб Ії бех хо ТвВЕк Бко 245 250 255 сі Уві Тв Суз Уві баї Чаї Авр Уві бЗех Нів біз Авр Бжо сій Уві 250 255 270

Шуз Ріе Авю Тер Тух Узі Ар о біу Уві біп Уялі Нів Азп Аза Пув ТЬх: 275 280 285 їув Рг Ат іч Сів бзв о ТтУг Аза бек Тпх Тут Ава Уаї Уві Вак Уві 290 5 00

Тв ТиЕК Чаї їжи: Нів Пів Авв о Жкюр Мей Авб осі му бій Тук БУ Суб з05 ие) зх5 320 уз Уаї бек Авп о Пув Аїа йез Рго Аїворко І16 бій туз Тих Її Вех зв ззо а35

Кув Аіз їуз б1іу біп Рко Ак Сх Рко бів Май Тух Тнх пев Рго Рекс 345 зва

Вег АхЯ Авр о бій цей Твж Був Аво бів Чаї беж дей Тпк о Сув їем Уві 355 Зв 365

Був сіу Ропє тТук Рго Бех Авр тів Аза Уаї біс ТхроБ1ч Вех Авп о С1У 370 375 зво

95 ВСТЛВо012/084042 біп Рко бій Авп о йзп тує пув ТІ ТБ Рго Ребо Уаї бей дДвр Зех Авр 395 399 зав 4050

Сіу Бах Ріє Бі Кеп Тут бак Буз Бей ТВхХ Чаї Ар був Яєх Агу ТЕр 405 хо 415

Сів Сів Сіу Ава Уві Рое Бек Сув бЗех Чаї Ме: Нів бій Аза без Нів 420 425 дз

Ав нів тує ТІ біп Пув зах Пем ВЗек Тех бБевж Бго 435 440 «їй» їїа «Ух» 444 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «23» Штучно синтевована пептидна послідсвнатотжь «іо» лі8

Сів йвр бій гец уаї Сіл беж ПіУу діа біз Узі Був Пув вхо Сію Аїх 1 5 10 ї5

Зех уві Був Уді бЗех сув Пув Аїа бек сіу Рае Авп тів Був авр тах 20 5 во

Тух їіе біп Тер Уаї Ату бів Аза Рго біУу біп сту ва бу ТхроМмає з 40 45 біу АгаЯ ї1іе Авр орхо Бевз Ака Бі Ах ТБх Бпузв Тук Дхцд біз пуб Вве 5О 55 во бій б1у Аку Уві Тнх ї1Те ТЬБж Аза Авр ТвБх бех ТЬх АБапоТах Аїа Тук ба 7 т чо

Меї біо ес бек обох їз) АгФобдек біз Авр отак Вів Уаї Тук Тук Сув 0 ЗБ чаї вка Бек біу тих Шпео РВе Авіа Бое Ткр сіу бій біу Тр Пай Уаї 180 195 119 трк Маї бек Яек Аїз Зек Тк був Шіу Рхо Бех Уві Рів Жжо Пец Аіа 115 Ко 125

Рко ех Ветх Був Бех Тк Зек біу біу Тйх Аза Аза без СТУ Су Шей 130 ї35 140

96 РОСТЛР2О12084042

Уаї Був Дар Тухкх Рпе Рко біс БРжо Маії тах Маї бек Тгр Ав бек бі та5 150 БЕ: їБО

АТїа Без Тіх Зех бту Уві Ні тре бе Рго дів Уаї ппез бій бек Зех 365 170 175 біу йеи Туж Зет Гей) бек Зах таї Уаїі ТВх Узі РЕб бек беж бак їв 180 ї85 199 біу Жаж біп Тре Тух ЇТе Сув Ав) Чаї йей Нів ув рко бех Авв ТЕХ 195 200 205

Пув Маї Ар о їує уз Уаії бі Ро Ппуз бек о Суз Авб був ТЕ Нів ТЕ 215 220

Сув рРго рРеб був Рго Аїа Рко біш Пезу Бен Сіу біу реко Зех Узі Бе 225 238 235 245 ївши Ріє рхо ро в Рко Муз Аве Тк опею Мет Її1е дах Аху так ро ?4Б 259 255 іа чаї ЗБх Суб Уа)ї Чаї Уаї Ар Уві Зек Ні біб Авр охо їй Уві 260 255 ло уз Ріє Ап оТкр Тух Маї Авробіу чаї біл Уугі Нів Авт Аза Пув ТвБЕ

ТВ. 280 285

Кув Рко Аку біз бін Сіп Тух Авп обех ТЬк о Тух Аху аз Маї бек Уву 2550 35 за їєї Твх Мві цей Нів Бій АвроТкр без Дав сСіу йуз ска Тук Мув суз 3905 810 315 320 їук Уаї бек Авп Ппуз Аїа цей Рго Аза рРго Її Пій Туз Тах ї1е бек

З аз3о0 335

Буз Аїа Ппув Сіу Сію РЕс Ак сім Рко бів Уві Тухк Тк цецорхо РКО 350 345 350

Зек Ах Вар сій пев ТВЖ Був Авп бій Уві бах Ппем Тік Сув Беч Мах

ЗБ ЗО Зв5 шуб сіу Рпе Тут рхо бек Авр І)іє Аїв уві Біч Тхр біо Бек оАвп Су

Зо 375 зво дів рго бій Ава АБ отТук цуз ТВж ТЛЕ ро Рго Узі Пей Авр Зех Авр 385 3990 зав або

97 РСТЛРВІЗЮВИНМО сО1у Зех Рье Рце ей Тук бег бує 180 ТЬх Уаії Авр Був бок Ахая Тер 405 410 15 бів бів біу Авп Уві Ре бех Суз Бах Уз!з Ме Нів Січ діа ей Ні го 425 азо

Квп нів Тук ТАх біп цув Зв їй бек Бей беж рко 435 440 «2і0» 315 «гії» 444 «12» ВЕ «913» штучна «кг2о2 «23» Штучно синтавзована пептидна послідовність «1005 119 сіп зв бів їв» Маї біл бек біу Ата біз Уаї ув уз Ро бію Аїв 1 5 10 15

Япеж уаі ув Уві бек Сув Був Аїа Бех с1у Рне Ав. їіїє Шув Авб ТЕ за

Тут ї1є Сію Тер Уві Ат бів Аза хо сі бів бі Без сти тТкр: Ме 15 сіу Ак їЇїе Авворко Пец Акгу сіУ Ана о Аку їжа ТУук йка Бій був Рбе 5о біз Сіу Аа Маї Так о Тіє Тит Аза Аво Тахо оБег Твк Авп о тТвт Ата Тух. 55 70 т5 во

Мебє щі цез Зехс бах Пе Акоа ех Фіз Авр Те Аз» Маї Тук Тух Суз ве 90 зв

Уві АхФ Бек біу Твх їйей РБе дар рве Ткр бСіу бІй Сіу Твк Бей Ууаї тоб т05 з1о0

Тих Уві бЗех бак Аза Зеї ТІ уз б1Уу рго Бех Уаї ББе Рхо Пе) Аїд 1155 120 125

Ркс беж беж Гув бек ТЬк бек Сіу біу Тах дів Аха Бей б1у Сує Пец 130 135 140 уві гу Авр Тук пе Рко бів Рго Маї Тах Чаї Зежк Тер Авп бЗех Сіу 145 їБО ї55 160 діа їва Тих Бек шіу Уаї Нів ТЕЖ Ре Бго А1в Узі Бевз бів бек 5Зек 165 1770 375

98 СТАР ОЛІВО42 біу Тез Туж Зех Пен бех бех Узі Уаї Тк уаї ржо беж бек бек Гей ї8о0 185 1530 біу Твт бів Тпх ТукоїЇЗе Сув Аво оуаі Ав Ні Був Рко век Ази ТнЕ 1955 2950 205 мує Узі Авр цу Був Уві бів бхо цузв Бех Сув дар Туя ТЬЖ Нів ТБу 210 ?і15 220

Сув Рхо Рко Сув Рхо Аїа Бко Сто ївз Бейш біу сіу рко беж Уві Ре 230 235 240 іїва Ріє РЕо Рхо Був Рго ПЦув Авр ТЕ цей Меїб Її беж Вжа тТвх реко 245 250 255 сів Уві Та Сув Уві Уві Уві Авр чаї бек Вів біз Авр о Рко біц Маї 260 765 27 їх рн Авп Тхр Тут Маії Аве біу Уві бій Уві Ні Авн Аїа цує ТЕ 275 28Оо 285

Туя Рко ку бій щі бій Тук деп о бек Тах Тук Аку Уві Уаі бах Ммзї 230 235 3959 їз ТЕ Уві Ге Ніз біп Азр о ТтТЕр Ме Авп обі буяє Бій Тук Пув Сує 305 0 Зі5 320 їуз Уві Бех Ази йцув АТа Бен Рко йта Вхо Тів Бій Був ТК Ії бех з25 330 335

Був Аїа був біУ біп го АкеУ біб Ро бів Уві Тук Тв йдеа Бео ро 3410 345 зо

Бех йку йвр сій їх ТВжЖ о був Авп сій аз Зеж ем Тек Сув Бех Майї з55 ЗО зе муз пі Бе Тук Рто бет Ар її Аїз Уаї біз Ткр бій Бек Авп біу 379 зт Зч0

Сів рко біз Авп о Ач Тук дує Так Тлах Ехо Еко чїаї Пйей Авр Бек Авр зя5 3580 зЗ95 490 сіу Вах РЕБе РБе ей Ту бег уз їз Таж Маї АвроБбуя бехоАку Тер 405 410 415 сій біп Сіу Авпоуаї Ре бек був Бех Уві Меб Ніз сів Аз8 Бей Нів 429 425 439

59 РОТА ОЮВаОЮ

Аза пів Тук Тпр бів Муз беж ем беж їей бек Бк 835 ї4а «2105 1820 «ії» 444 «Бій» ВНІ 213» Штучна кггох «223» Штучно синтевована пептидва послідовність «050» 120

Сіп Ар біп їй Уві біп бек З1іу Аза бій Мазї Був цувз рго біу Аїз 1 З зо 5

Зак Уаї Туз Уаї Бех Сув Пув Аїа бек біу Рбе Авп о Хіє Був Авр ТВ 2 25 30

Тук Ії вії Тер Маї Аку Сіл Аза Бко бі біп біу Гель біз Ттр Меб за 40 45 с-іу ака ті Авб реко ем Ах 51іу Ави ТЕ Аку Тук Дка Сі» Суб РвВа

Бо 55 во

Січ бі Ва Маї Тве Тіе Тас Віа Кр ток Бек ТВ Аво Тих діа тут 70 | 75 во

Меє сі) Ієй бес Бех їеи АкЯ бєех 10 Авр Тв Аза Маї Тух Тух Суд 85 зо 95

Уві Ах бек біу ТЬх фе Ре Авр Рій Тхр б1у пів Ссіу Тахо Бей Маї 305 ОБ 110 тах Маїі бек бек Аїа Бех Три Пув Сіу Рко бек Мах ре Бкос пен Вів 155 129 125

Рхо Яех Бех був Бек Тих Бех сіу сіу Твт Аза Алла Пе сіу Сув Пец 130 135. ї4аб чаї ув Ар Тук рРре Рко бій бко Уві Тьх: Уві бек Ткр Авпобах СТУ 155 155 155 155

Аіз їєю Тнжх бек біу Маї Нів ТбБж Рре Вхо Дів Маї цей Сію Бех Беж 165 170 ї75 сім Шепх Тук бет Пен Бех Зех Уаї Узі Тбе Маі Рхо Зах бек Бек їй 180 385 150

100 РСОТЛРОО12ЮК54042 сіу тах бів Твх Тук Ті Сув Ав Уві Аяй Ні Був руб Вег АвБаотву 195 200 295 уз Уаї Авр мує Був уаї бій Рто їув Век Суз Аар був Твк нів ТЕ 710 215 220

Сув ра Ро Су рхо Ата Рго Сів Гво пезч Сіу біу Рко ЯЗех Уві РНе 225 230 235 240 їец випа Еко вхо пу Рхо Бу Двр о ТВК ей Мес Ііє Зах Ах Твг реа 245 250 а віп Чаї Тв Сув Уві Уаї Маї Авр Чаї бЗес Нізв 013 Авр рхбо піз Хаї 260 255 270

Буз Ре Авп Тер Тук Уві Авр Сіу Маї бі» Уві Нів Авп Азїа ув Тв: 275 285 2855 пу ро Ах біб біо Сів ТУук Абв о бок Тахо Тук Аку Уві Уві бек вії. 250 2955 09

Тед Тах чаї їв нів бій Авр о тТжр лей Аза У Гуз біс Жук пув Сув зо05 зіа з15 350 іїуа Чаї Бех Ава Пув АтТа Гей Ро Аза Бко Ії 615 пувз Твж їЇЗ6 Бог за 335 їув Аза їув Біу сій Рко Ака іч бто іп узі Тує Трг ей Рто Рко 350

Бак дк Авробій Без ТвЕ цув Ав біп Уаї бек їй Тс Су без чаї 355 350 зва уз бі Бе Тус рко Бех Авр її АТ Уаї сій ТЕр Сі Век Ал сТу 370 375 зво біп рРко біз Авп Авап о тТук буяє ТВЖ Тс Ржхо Еко Узі Бей Авр о бек Авр 385 зо з 4600

Сіу Векх Рде Ріє Кец Тух бек Був їз ТБ Чаї дар пуз Зек Атка ТЕр 45 19 415 біп бів о Сіу Ав Уві Ре Бех Сув Зек Уві МБ Нів. іа АЖа іем мів 420 425 4за дЕпонів Тук Те сій Був бер їви бек Гей Бек РКО 435 «40

МИ ВСТЛРОВНІОЛІВАОЯІ

«10» 121 чиї» 44 «2122 ЕТ 713» Штучна «220» «гг3» Штучно сСинтезована зчептидна послідаовВвість «400» 121 бів Авр біб Бен Маї сів Бву біу діа бій Уді був Був Рко бі Аїа 1 5 10 15 бех Уві Був Уаї бек Сув Пує Аза Зех пі Рпе Авзп ї1з пу Азр Те 28 30

Тук Ії сій ТкЕр Уві Аку бій А183 хо бі сів с1у ва бій Тжхр Мей 35 40 45 б1у Аку 118 Авр. о рко Гео Аку с1У Авіа ТЕ Буя Ата Ажхо сій Бує ва 50 ЗВ ко біз б1у дк Чаї ТЕ Іїв ТНК діа Авв ТЕ; Бек ТвЕ Двп о Трх Аза тух 65 7а 75 во меж сла паб Бех Бек Пе Ак Зах біз Авр о ТВ віа Чаї ТЕ Тук був 85 зо за

Уаї Ага бек біу ТЬх йдем Рбе Авр бе Ткр біу біп біу тк о їец Ууаї 109 що 110

Твк Ча3з Бех Зек Аза Бек ТБх цув піу Рко Зес Уві БЕде Еко Гм Аза 115 і20 125

Рго бек бек Шпук бех Твк бек 0їіу щу Тих Аїа Аіа Бпей сіу Сув ем 135 140

Уві ув Авр о Тук ВБе Бко СІ Рко уаї Тьх Мі Бех ТЕр дей Бек ту 145 ї50 155 їй

Кіа їз ТВж бек Біу Маї Ніз ТпкЕ Ре Бко Аїа Чаї цей сїі5 бек Зв ї65 179 175 піт ей оТукє Вежх Бей Бетх бех Уаї Маї Трк Уаї Ро Яех бек бек цеч ї180 КН. ї90 сіу тТьх бі Тбх тує Хіе Суб Ава Узі Авбя Ния цу ро бек АвзпоТБх 195 20о 205 пує Чаї Авро бує був Уві сій Рез Пуз бЗех Сув Авр Цуз Тих Нів ТвЕ 210 215 220

102 ВСТЛРМИООКОМО був РжО Рко Су Рхо дів Бко Бій Гей йез б1іу сіу Ро Вех Уаі бе 225 230 235 580 їей Епе рко Рко цує Ржо цув Авр ТБх Гемзм Меб їіє бек Ак ТЬх РКО 245 250 255 бій Уві ТЬкх Суз Маз МУаї Уві Авр МУаі бек Нів Сін Азр Рго сій Узі

БО 265 270

Муз рве Азп Ткр о Тут Уві Авр біу Маї Бій Уаї Нів Авп Аза Кув ТвЕ 2175 280 285

Був Рко Аку біц біс біп Тух Авп обех ТПт Ту Акч Чаї Чаї Звх Уві 290 295. 300

Бен Тртг Уві бец Нів Сів Аяр Тер їв Авп о біу Ппує бі Тук Був Сув 305 зі 3ї5 320.

Шув Маії Бех Ап Буз діа Бей Рко Аїв Рко Ії Січ Пув Тк її Век 325 330 335 туз Кіа їжв Б1іу бій Ртго Агу біб Бхо біп Ууаї Тук Тих Бей Рго Рхо зай зак 350

Бех АкЯЧ двр сій Пец Так Муз Ап піп Уаї бек пе ТЕ Сув ії-ц Уді 355 360 зов пуз бі Ре Туг рго Веж Авр оті Ата уві біз Ткр бій Ве Авп Оу 370 375 зво іп ро бій оАвйп Ав оТех мує Так оОТвЕ Бко Рг уУаї Бей с Авр Бах Аве

Зв5 590 395 400

Му бех Рье Рів їй Тук Вех Пув їммз Так уаї Авр Був Ве Ак ТЕВ 05 410 415 біз бів біу Дап Узі Рбе бВетх Сув Яйвх Узі Меє Нів бів А1їа пец Нів 422 «25 430

Авп Нія Туж Тйт біп Був бет Без Бах без Бех Рко 435 440 «10» 122 ки1ії» 444 «12х РН «213» Штучна «224 щх РСТАР2ОТО 84042 «223» Штучно синтевзована йпептидна послідовність ка005 122

Сів Аввобіп Пец Уві сів Бех Сьу Аів Сі» Узі Гуз Був рРео біу Аів 1 5 іа 15.

Зек Уаії рує Уві Бек Сув Був дів бех біу Ре Ав» Іїє Був ДвротБЕ 29: 25 за

Тут І15 біп Тер Уаї Ак біз Віа ркс біу іп бі цес біз ТервоМеб 39 45 сіу Аху її Аврорго цей Ах сіу Авп о ТвЕ Був Тут Ак біз ка ВБе ва 55 5 біз б1у Акад Маі Тве Ї1е ТБх Аза Азр ТВ Зеє бвг о Аяп ТЬБк о біа Тухк 70 75 о

Меб см: ес Бех бек Печ Ат деб бій Авзр о ТБЕ Аїз Уаі Тук Тух Ст зе 9о З5 уві Аку Беж Сіу Тк Пез РБе Авр о вББе Тк сі пі с1у тиж рен Уаї їо 105 ї30

Те Чаї дес бек Аза бек Тс пув с1іУ рРко бет Уггі РБе Рто бйем Аза 115 о 125 рРхо бак Бегт Був Бех ТнЕ Бек біу п3іу Тих Аїа Ада Бей сіУ Сув їі ї30 ї35 540

Чаї цу пар Тух рве рЕс біз Бко уві ТНтІ Уві Бек Тхв Ап о бех 61 145 150 155 165

Аза Таз ТБк о Бек сіу Уаї Ніз Так рве рхо А1з Узі їв біп Бех Зак 55 170 175 аіу гей Тух бек рей бек Бех Ма1 Уві Твх Чаї Рко беж Бек Бех Пей 150 18585 190

Ф1іу Тк бів Твх Тук їТїе бСуз Авт Ууаї Ап нів ув рЕО бек Ап ТВЕ 195 20 295

Тв чаї Авр бує ув Уві сб1а Рго Був бех Сув Ар Шцув Тк Нів Так 210 215 га

Сув Вго Рко Сує Рго А1а Рто сій ей без С1у с1у Рко Беж чаї Рпе 225 230 235 240

194 ВСТАВ 27082042

Ген Ева го го їув РкЕо ГПув Авр Тк Пе Меб Ії6 Бех ДЕЧ ТЕ ро 285 250 255 біц таї ТБ Сув Уві Уві Уві Авр оУаї ет Ньз біз Авр обко Сіх Уві 250 255 279

Тув Ре ап оТкр оТук Узі Азр б1у уаї піз Уві Нів Ай АТа Їдя ть 275 284 285

Бу 'рко Аку біз бЗіч Біб Тух АвпоЗех ТЕ Тухє Акч Чаї М83ї Бек Уаї 290 27595 зав їй ТвЕ Уві їбБи Ні Зій Ар о Ткроїви вв Сіу Був бій Тук Ппуз Суєя зо5 зо зЗі5 зга їв чаї Вах Аза Буз АМа Бей Рже Аза рко Ії бі Пуя Тк Ті Вех з25 39. 335 пу Аїва Був бі бів Бго Акч біз Рхо бів Уві Жук Так Бей Рко РЕо 340 345 | з5о бек Аха Авзр БІ Без Твж Був Ав обій Чаї Яек Бей ТнЕ Ста Пец Уаї 355 зва зе5 ув З1іу Ре Ту рхо бек Авр їїе Аза Уві віч Тер біз чек азй біу 370 зт 380 біп Рко бій Зп Ази ТУує Був Так ТВЕ Ркб Бко Маі рей Авр бЗех Авр 385 ЗО 395 4а5а

Ст» Зах Бе Ріє Бе) Тух Бех Пув пвеи Тв Маї Авр о Гув Беє Ак Ттр зо5 410 15 сів бів біу Авпоуаі Бе бек Сув Бех Уаї Ме Нів бі» Аза Пем Нія 420 425 430 дво Пів Тук Твх біп Ппуз беж Бон Бек Тез Яек Ро 435 440 «іа» 173 «г1їх 444 «віх ВВЕ ««2і3» Щеучна кевО» «233» Штучно синоевована пейптидна послідовність «ай» 123 піз Авробів пезч Уві біп Бех с1у Аїа бій баї бує Пцув Бхо зіу Акта ї 5 10 15

105 РСТАРОВЯОЯУ

Зек Чаї Шу чаї Зех сСув уз Аза беж біу Рів о Авп Їїїє ув Дар ТЕ 28 75 зо тує Гі сій Ткр Уаії то біп Аїя Рко СУ бій піу Бе білу Тер Меє 35 40 дв сіу Ак 116 Авр Бхб пейп Ат Шіу Авй Тих Пув Тек АБУ СІЧ пуй Ввбе 50 55 519)

Бі Ас вхо Чаї ТвВЕ їіе Тит Аза Авр тах бек тьх вап о тТвк Аїз Тук кВ 70 75 80

Меж ій фен Бек Бех Іс АхЯ бек Пій Авр Тих Аїа УВІ Туг Тук був

ВЕ зо 5

Чаї Кк Зех О1у ТБЕ Пйей ре Ав Ре Ткр сіу бій бли тТвЕ їй Уві іа20 хо 119

Тьк Уві бет Бех А1їз Бах ТБкх Був біу Рко Бек Маї Ре Рко ем АТ ай 125

РКО Бак Бек ІГув бЗех Таб Бек сіу бі Те йїа Аїа їем біу Сув Без 1350 135 140 чаї Ппув Авр Тут Бре Рхо бій рко Уваї ТЬг Уві Бек Чтр Ав бЗег ПТУ 145 156 155 ї6а

Віз Бец ть дек бСіу Ууаї Нів Так Різ Рко Аїа Чаї Пе біп бех Вехк 565 175 175 сіу їв Тус бетх їеий Бех дек уві Уві ТЕХ Маї Ржо ЯвЕ Яет бек їв) 180 185 150 сі тож бів Тпи Тує їїз Су Авд Уві Ав» Ніз Був Рко Бек Авт ТЕ 155 2650 235 пу таї Азр Був Був Уві СМі Вко Був век Суз Авр о був Тіх нів ТБЕ 210 215 220

Су Вто Ро Сув рРко Аїа Ркго біз Пез це» Сіу бІУу Рко Бех ЧУаз РЕ 225 230 235 240 ївиц Віа Рго Вко Пув Рро був АвроТву печ Меб їіє бек Ак Таж рга 245 280 255 піз тву Тнкобує уві чаї Маї Авр чаї бек Нів Бій Авр орто бід Уві 250 255 270

ТОБ РОСТИ РОВІ2АВЯ

Вуз РВе Ав Тхр Тук Чаї Азр ш1у уві сій Узі Нів Авп АТ Суз ТВЕ 275 280 285

Був рхо Акя Ота біз бів Тут Авт бех Тит Тує Аха уаї Узі Бех Уві 290 295 зай їво ТвВх Чаї йезш Нія Сію Авр.ТЕр Бей Азпосіу Шу сій ТукоБуз був зо5 ЗІ 315 329 ув уві Бах о Аво пу Аза без о Рко Аїіа Рго Її біб бух Тик ті бЗег 325 335 аз туз Аза цуз біу бій Бжо Аку сіб ро Сію Уві Туг Тйк фе Рго Бхо 340 ЗІБ зво

Бек Ахоа Азр шій Бей Тк Пує йвп бЗіп Уві Бек Пей Твх був рем чаї

З55 зво зев цуз сіу Бе Тух Рко бек Авр ї11є Аза Уаї сїц Тер біс бек Азп біу 370 вт зво біп Рго біз Аєп Ази Тух Ппує Тпх Тв Рг Ббко Ма1ї Пед Авробех Авр

Зв5 358 За 490 сіу Бак РНе РБе Ген Тук йек Був Гео Тит Маї Авробув Бех Агу Тер ча5 410 415 біп бів біу Азп чаї Ріе бах Суз бок Уаії Месє нів ста Аза Пец Вів 429 425. зо

Азйп Нів Ту Тнк біб Був бЗех ЦЕ) обех Пей Век рхо 435 440 «2і0» 154 «її» А4е «251275 БнНт «213» Шеучна «ах «23» Штучно синтезована пвптидна посліловньсть «Ой» 12 сіб Авр о біп їв уаї бів бах бпіу Аза січ Уаї Був був орто ШУ Ата 1 5 10 15

Зек Уві Кує Уві Зех Сув Гуз Аїа Зех Сіу Ре йап 719 Пуз Аве чвЕ ге 25 зо

197 РОТЛРОО 20 дго Ті біп Ткр Маї Ак біп Віа Рухо біу бів бі пей 01 Тир Має біу Ака І1в Авр Вго еп Айху Ту Аво Тв Гу тує Ако біз Був рве бо 53 03у Ак хаї ТЕ Х1е Тк Аза Авр Тих Веє Так Аза Тьжк АТа Тух 55 70 7 во

Меї сіз Без Зек оЗек Без Ако Зех бій Азр тних Ата Маї Тук Тут Сув 85 зп 55

Уві АкЧ бек 1Уу тах їби Ве Ар Бе Тер біу був ЗІіу Тв їм Уві 100 05 Нв

Твр чаї Бек Веак А18 Зеж ТиЕ Ту сіУ то бек Маї Ре рБго Пез Вії 115 125 125

Рго Бек бек Був Бет Так Чек б1у Сі ТВжх Аза й1з Бей бі Суз Гей 130 135 140

Уві ув о Аво» Тук Рле Вго сти Рео Уві Тк чаї вех тТЕр о Ава бек біу 145 і50 155 во із пей Тс Бех сту Чаї Нів ТЬьу Рне Рко Аїа Маї Бен піп Зек Бак 165 170 175 сіу їси Тук Бек Пе» Беж бек Уаі Уві Трьк Уаї Еко бехє беж бЗех Бей 180 185 190 су Тих сій Теж Тук її Сув Ас) Ма) Ав Ні Був Бхга Беїг Авп тик 155 200 205 ін Уві Аз був Пує Чаї іа ро Пув бек Сув Авр Гув ТЕ Нів ТЕ 218 21і15 228

Сув Рго Рго Суз Руо Аїа Ето бій Бей Без біб сіу Рго Бек Маї РБе 225 230 235 250 їй Ре рРго ро Був Рхо був Авротвж бен Меє ї1е Ват дк Ток Рко 745 255: 255 біз уді тТЬу Сув уві Уві Маї Ар Маї бек Ні пі АБроРго біс Ма) 250 255 70

Був Ра Авп Ткр Тук Уаії Дар сі1у уах біц УвжЖ Нів Авп о АТае Був ТЕ 275 280 285

1 РОСТЛВОО1285045

Пув Рго Ахо бій біз біо Тук АБ бек Тк Тух Ахо Уаї Маї бак Уді 2350 295 00 йев Так чаї Бей Ні Фбіп Авротхр Бей Ай біу КТув о піа Тук пу Сув за5 310 315 зо

Був'уі бек Аво Буз Віз Хей рРхо Дів Рко Ті бій бує Так ої3Зв Звх 325 335 335 уз Аа уз ЗУ Сів Ржо Ахе бій ро сію Уві Тукю Трх Гей рго РІй з«о 345 350

Бек Ат Авропій Пе) Та Гує два біз Узі бек цей ТвЕ Ста Бо Маї з55 350 з65

Туз біУу РбБе Тух Рко Зак Ар оїїв ліз уаї сій Тхо бій Зех Азп сС1у зто ат5 зво біп Рго бій Алое» АвпотТух Був тних ТпжЖ рРко рко Маї еп Авр бвг Авр з 90 395 425 сіу Вес Ре Рке Гей Тук Бек Ппув Мей ТВх Узі др Гуз бет Акч Ткр за5 410 415 сій сів Су Аза Маї Бпе Векосув ЯЗек Уаї Меб Ні біз Атїа Бей Нів йо я 430

Аап оНія Тухк Те біп Ппуз Бек Пец Бех Дей бек Рко 435 140 «о» 198 к»її» 454 «ії» РЕТ «13» Штучна «В»йх «23» Штучно синтезована лептидна поспідсваихсть «а00х і25 сів'Авр бій Мей Уві бій бех сіу Аїа бі Чаї уз Му Вко сту діа і 5 їй ї5

Бек Уві цу чаї беж Сув Пув Аїа Бех Сі Ре Ав зів Бу Ар ТВт 2750 25 39

Тукс Ії біп Ткр Уві Аха бів Аза Рко бім бій біу бйез Бій Тер Меє сіу Акч ї12 Авр Бко Пе) Ак Акач Ав Так оцув Тук Аку біз Був Ре

Бо 5 бо

109 ВСТИРОВМ ЛОВУ

Сів суу Аку Уві ТЕх її8 Ток оАза Ар ТвЕ Беж ТІЇ Ав ТвЕ Аза тТух

Би 7 75 ща

Мак Бім Тец бек бек їва Ак ех 1 Ар ТвЕ Аза чаї Тук Тух був 85 за 5

Маї Ака бек Вжуш Тіх Пен Бйє Ар оба Тхр 01у пів с1у Твк оїву Уві ї00 1605 110

ТВж Уаї Бех Ввк Аїа бек Тнк цпув Фіу Рка бак Уві Ре Ре Пей Аза 115 129 125

Рко Бех бБет їув5 Бек Так бех сСіу сіу ТВх АзЗз Аза еп біу Суз Те 130 135 146

Уві був Авр Тук Ре Рко бій Рхо Узі тво Уві бех Тр Аква бетх 51Уу 145. 150 55 160

Ата бас Тит беж Сту Уві Нів Тв РБе рРхо Аїіз Ма1 Бей бій беж бех 165 170 175 бі бен» Тух бех КГез бах Бек уві чаї тТВах Уаі Бко Заж Зех Бех Кей ї180 ів5 199 сіу Тахо біп тах Тух Тіє Сув Азп Уві Авп Ні пух Рго Бех Аві Трек 195 290 285

Буз чав Азр Був Гуз Уаї Сбтз Ехо Куз Зех Сув Авр Був Тік Нів ТЕЖ 215 2х5 820

Су Рко Рко Сув Рхо Діва КЖко 013 їей іїва буу Сіу рхо бек Уві РБе 225 230 235 240 еп Вве Бко Вко Їїма рко був Авзр Те ївуа Меї її Бек Ака ТВжЖ БЕо 245 75889 255 сія Маї Тк Сув Уві Уві Чаї Аве Уаї бек Ніз бів Авр Рхо бій Увї 255 275

Був РБе Авп Ттр Тук Узі Авробіу Чаї зів Уаї Ків Аво Аза був ТБЖ 275 290 295

Був хе Аху піз біо біб Туг Аза бек Тнх Тук Агу уві хУаіз Бек Уві 230 2795 зо

Тез Так уаї Бей Ні бів Авр Тер Бех Авп біу Пугв ста Жук о їув Суз 305 330 315 з23 о ВСТА Р2О1 27085042 пу Чаї Бех Ав Був Аза їні Рко А1а Рко ЇІз1е біц Ццує« ТВж ї12 Зах 325 330 335

Туз Атїа туз СуУу бів хо Аку бі Бко іп Уаї Тух ТНгобем о бко йко 349 за5 355

Бак Адта Авр бій їч Тв пу Авх біб еф бек ей ТВх Сув Бей Укі 355 360 355 їв оїу тре Тую Ро Бек Азр тів Аїв уаї 5105 їжхр біз Зех Ави Су зт 375 зва бів Ркеб біз Авво Ап оТук Був ТВж Таж Рхб хто Уві Бей Ар Бех Ар 385 3950 зав чад

З1іу беж Рре Ре Пен Тух Яєк Пув Те Тих Уаї Авр туя бек Аку ТЕр 405 4139 «15

Сів біб Є1у Вп уві Ріє бек був бек Уаі Меб Нія Сію Аїа во НІВ 420 5 439

Ава Нік Тук ТБх сСіп Бує Бех без бек Геї Зех Рко 4135 440 «910» 126 «ії» 444 «2195 РВЖ «2132 Штучна «го. «2232 Штучно синтезована пептидна послідовніств «005 126 бів двр біз еп уаз біб бок о біу Аіа біз Уаї пуб Був Рхо біУу Аза 1 5 160 ї5

Зап уаї бу Чаї Бех Сує Був Аїа бек б0іїу бе Айва Те Був дер ТЕ за

Тук Ії біп Тхр уаї Ахч біп Аза Бко біу біп біу пес біз Ткр Ме 10 45 сіу Аж їі Авр Рко Пез йгу Аку Ав ТвВЕ бує Тух Акч о біа уз ре 0 55 0 сіє сіу Ак маї ТБт Ї1е ТвВЕ Аіїа Авр Тйк бек Трг о Авп о ТВт Аїв Тук 7о 75 во з: РОСТЛРОО1 ЗНО

Меб біз бес бек бЗех Пен Ах бег Сі Авр Тк оліа Ууа1і Тут Тук Сув в5 зо з5

Уаї Вху бек С1у Ак Пес Ре Ар Ріє Тер Бу піп с1у ТБх Ге Уві 159 105 110

Тк Узі Зах Зех Дів бех Тік ув біу Ркб бек Уаї РБе Рро їец Аза 115 120 125

Вхо Зах бек цу бВех Тржх Бех С1у Сіу ТВк Аїа Азія Без у Сув ев 130 і35 140 чаї був АБр Тук Рре Рко бін Рхо Чаї Тих Уаї бек Тхр Авп Зак 01у тав: 150 155 150

Аїа пе ТВх Закобіу Мах Нів Тиж Ре Рко Діта Уві Бей сій бех бехг 165 170 іт біу Бецп Тухк бех бе бек Бек Чаї Чаї Тих Маї Бго Яек Бек бек цей ї80 155 150 сіу ХНх Сіп Же Тух Іїе Сув Авп о Маї Ап о Нів Був Ртго Бех Ап ТиЕ 195 200 205

Ппув уаї Авр був Пув Маї бій Рко Пув бек був дер Був Тіж Ні Так 210 215 го був Бкго Бто Сув Рко Аїаз Рго 510 Гео їй О1у Сіу Рко Бек Уаї рве 225 230 28 240 їви Бе рхо Рхо ТБ о Бко Був Хар Так їй Меї ї1е заг Акч о ТБх ко 245 250 255 бій Уві лЛвх Св ай Уаії Маї Авюр УМаї бЗех Нів біз Авровбто бій Уві 250 Ба 270

Був ріж дДяп Тхр о Тух Уві Авр ос1у уаї Ст: Уві Нівз Ав Аза Бу Тах 75 в) 285 був Ро дкоа біз біз біп Тук вп бек Тік Тук Ага Чаї Маї Бех Уві

За 295 зо її Те уаї Бех Ніз біп Азр о Ткр о їзи Авпобіу букв сіа Тує Був Сув 305 310 зів 320

Був уві бек Авт Ппув Аза їз Рхо Аїа Рко Її Сім Гу Теж ІТо Бех 325 з3а 335

З ЕСТИРЗВІОЮВАВЮ ув Ата Був зіу бів Рко Ас біб Рео бі Мафі Тук Тк ово ВБро Руо 340 За5 аво бек Акад Авр о Сій Тв Тих Гуз Авп обі: Уві Бек Пемй ТБ Сув пеж Чаї 355 360 355 пуб біу Ре Тух Рго бех Авр її Аіз Уаї сій їгхр біз Зегк Ап СТУ зто 375 зво

Сіп рсо бій Авпобявз Тух Був Так ТВ Вухо Рко Чаї Цец Азр Бех Аве 385 з90 395 ад піу бек Ре Ре Бей Тук Зек пу Би Твіт Маї йвр муз бек Аха Ттр 405 410 415 біп біп СКБу Азп о Уві Ре бех Сув Бек Уві Ме Нія Січ Аза Бей Нів 420 425 439

АвьпоНів Тук ТК Сів був бек Гви бек оПез бек о Бжго 35 440 «210» 197 «311» 444 «2122 РБЕ «2135 Штучна ках «223 Штучно синтезована пептидна послідовністе «а00» 127 іп Авр о сів йдеш Уві бів бек сіу Аза сії Уаї їча Був рхо сС1іу Аа 1 5 10 І5 бах Уві пуз Чаї Бех Сує пу Аза бок біу Бре Азп о Ї1е пу Авр о ТБЕ 20 25 зо

Тук її біюй ТЕгр чаї Ак сів АТїа Ро 51У біб бїіу ей ста Тхв Ме дв сіу Акоа 116 Авр орко Бей Аку Ахч Ас о Твх Пуз Тук АгЯ 1 був ЕВе 6о

Сів йіу дхо уві Тнт ї1їв ТЬх Азїв Ар тв Бех тре Аза о Тьх оАтїа Тут 5 709 За во

Ме бів їв бах Бех Бей АажЯд бех біз Авр о Тег озАїв Уві Тук Тук Сув ва аб 95 чаї да Бех біу Тк Аку Рпе Авр Рбе Ттр ЗІКу біл сСіу ТЕ цес Уві 100 195 110

З «СТАРІ МОВЯ042 твх маї чес Век Аїз Зеїг ТювКЕ Пуз 519 рРко бек Чаї Ве Ро Бей дів 115 120 125

Рко Зак йех Буз Зек ТіК бек йпіУу біу Тс Аїа Аза це біу Суво тез і39 ї35 150 чаї Був ввроТух Ре Рко пій ро Узі Тс чаї Бех Ттр Ап ВЗек бі 145 150 155 1650

Аза пе; Тву ВЗекобіу Уві Нів ТЬк РБе Рга Аїва Уві Пец біп бег. Зак 165 ї70 ї75 бішж ін: Тут Зах їн бек Зах Уві Уаії Тих Уві Ро бок бек бек Бех і80 185 80 піт Так бхв Тв Тук Ї1ї6 Суз Авп о уаї Азп о Нів Буб Рго Зек Вей ТНХ 195 200 205 їв Чаї Авр цув Гув Уві СЕ Рсо йув бах Сув Авробув ТВАХ Нів ТЕ 218 715 22о

Суз Рха бжо був рго Аїа Рко біз Бой Без піу З1іу Бо Зех Уді вва 525 235 235 249 мес вве Рго Рхо Був Ртгбо Був яр ТНж Го Ме їі Вох Аку тв о рха 245 255 255 біч Уаї Таж Сув Уві маї Уаї Авр Уаї Бек Нів біч Авр о рко біз Уві во ої 270 муз Бе Ази отТтр Тух Уві Азр сту уаї біб Уві Нів вва) Ат Гув ТЕ 275 во 285

Був Рхо Аку бій З13 бів Тук Ав Беж ТЕ Тук Акч Уві Чаї бек Мві 290 235 зоб їси Так Уаї Ппей Нів біт; Авр Тер їв Аза су пуз біз Тук оїйуз Суз зоб зо 315 зо ув уаї бак дв Гуз АтТа гем РКО Аїіа Бко Ії біс уз Тех Іїе беж 325 335 зз5 туз Аїа цує біу сів бго Акоа бій Рг біп уві Тук Тіт Шей Рго РЕо 340 345 350 ет Ах Авр Сіп їєю Тк оЦуз вва зіп Уві бек без ТВХ Сув цем Чаї 355 збо ЗБ

1 РОТА ОВО уз бішж ре Тук ро Бек Азр І1в Аза Уаії бій Ткр бін бех двп Фу 370 375 зво

Біп Рг бій Або Ав тТух Бу Тпт ТвЕ Ро Ро Заі це АБ Бах Дер 385 зво 395 4адо сіу Бек Ре Ріе пек Тух бек Був Па ТнЕ Уві Авр огуз бек Ага ТЕР 405 4105 415 ша сіп Біу Авп оМаї Ріє Бек Судл бек Уві Ме Ні Б51п Аіїяа їв Ні 420 425 430

Азп Ні ТУук ТВх сів пу бек цей Бек їеч Зек Ркго 435 10 «2105 1268 киіїМ 13 «212» РЕ «2135 Штучна «20» «223» Штучно синтезована пептидна послідовність «4ад0» 388

АвроІіє бів Меї тТВх біп бек го беж бек Бе Бек Аїз Чех Узі Сту ї 5 10 15

Взр Ажа чаї ТЕХ Ізе ТВкх Сув Був віз беж біп Ар оті Нів Му Туг з5 зо їїє Аїа Тхр Тук біп зій йцуз Рко с1у бій А18 Рко Аку печу оБецп їїє біп Тух Та Бек Тнж лей ОХ рхо біу чаї рРко ех Акч Рі Бех 1у 59

Зек сіу Бак осіу тТвж Аво Жух ТВХ бе ТвВху Т1іе Чек беж пен бій Ро 58 7та те ва біз Авр Тїє А1а ТЬс Тух Тус Сув їз бів Тук АвроВху Тез ага ТНжЕ 85 зо ве тве п1у біу Єїу Тпжобув Уаї 013 ї1е Гуз Ахо Тв Ма) Аза Аїа Ро 100 105 110

Яах Уаї Бе їі Ррє Ехо Бхо бах Авв бій біп цей Був бек сту ТнЕ 115 150 і25

З РОТЛВЗО12854047 818 Зех уаї Чаї Сув ївій Пей Авп оАбо Ре Тук Бжо Ако Сі йіа Був 130 ї35 140 чаї бій Тжр був Уві Авр о АвпоАла Пе) бів бек біу Акп бек бів біз 45 ва 155 150

Бак Узі ТВ біз біп Авр Бех Був АвробБек Тк оТух бек реп бе» Зехг 155 179 Вт

ТЕ Тео ТВх Тем Бех був Аїз Авр Тук бій Муз Ні Був Узі Тук Мі 185 185 1980

Сув сів» уві Тих Нівз бій бі боб бек бек Рко Уаї ТБВжх Був Бек РБе 195 209 25

АвпоАху зіУ 510 Сув 210 ках 129 «гії» 213 «їй» РТ «213» Штучна ки2ох «в23» Штучно синтазована падтидна послідовність «ай» 199

АврІ1їз сій Меє Тнх Сіп Бек Рко Бек бБет Тед Звж Азїа бек ах сію ії 5 10 5

Авр о Ата Уві ТВ Схе Твх о Сув Гуз Аза Бек бів Авр Ї16 Ні Буя Тух 20 25 зо ї1е Аїа ТЕБ Тук бів бій Пув Бгто сту сій Аза Ржо Ася Пец їєю їЇ16 35 40 48 сіб Тух ТвБх Бех Тох йей бі5 Бо біУу Чаї хо Бек Агч Би Зв 1 во 5 50

Зек біу Зак біу ТвЕ Вар Тук Тівт Рне Тих її Вех Зак ПЦез сій ро 55 70 75 за іо Аврої1із Віа тах Тук Тух Су їей біп Тук Аве Аза Аха Ага ТЕ 95 рве сіу біу біу таб цув Уві бій їла Був Ак тТнж уаї Ата Аза рРхо 100 105 110

Зек Уаї РБе Тіє Ріе Рко Ржхо бек Авр бій бій йез МБув Бех б1іу ТВх 115 129 125

Нв ВОСТАЛ291284042

Аїа бах Узі Маї Сув ПЦеп Те Ап о Ава РБа Тук рха Аква бій Аїв Був 130 138 40

Уві бій Тжв уз Маї Авр Авп Аза Пез бій беж біу двп бек ЗіБ бій 145 156 І58 360

Бек Уаї Твх Сі 51 Др бек ув Авзр Яви Твж Тує бог рез Бех Зех 165 170 75

Тс пен тах Тей бЗех Гув Аза Авр о Тухк біс Ппув Нів Гув Уаї Туєю АТа 180 185 і850

Сув І: Уаї Тк Нів біл Сіу Би бак обов обго Узі ТНж Був бек Ре 195 200 2о5

Авп Ажха бі бів бузг 210 «вій 130 «811 213 «гі» РЕЖ «213» Штучна кавах «»аЗУ Штучно сиптовована пецптидна послідовність «400» 130

Ака тів Сів Меї ТБ обіп бек Рко Бег Зех ївзи бек Аіа бек Уа1ї 01У ії 5 10 ІБ

Авр ху Мві Тік хів Те Ста Ббуз Аіа бек бів дар їїє Ні Був Ту 29 25 за її ЗАІв Ткр Тух біб бія Пув ро сіу Сів Аза Рхо Агу Бей Пеп Їжа

ЗЕ 40 45 ців Тух Твх Вах Тв Бей бів ро біу уві Ро Бек Аха ЕБе бвк бі во

Зек піу бек Сіу Три оАвр Тух ТЕ Ре ТВжЖ І3Зе бек Бек Те іп йжа 65 70 15 ва зіз Азр ї1іє Аза Так Тут Тух Сув Бей біп Тух АзроАва Пец Ажку ТНЕ 85 в 95

Ве біу біу Сі Тк Пув Уаї бій їїе Був Акт Твжх Маї Аїа Аїж Рхо 100 ї05 110

17 ВЕСТАРІЮОТОІВЯО42

Зек Уаї РБе І1е Ре Рго Рко Бек Авзр біз бСіп Гей Їїув бак біу ТЕ 115 120 175

Лів Зех Уаї Уаії Суз пев Пец Аяп Ази Рре Тук Рко Аку бій Аза Був 130 зе ї40

Уві біп Ткр Був Маї Азр.Азп Атїа їй бій бек біу Авп бек сбіп уз 145 159 і155 160

Бак Уаії Таг бій Зід АвробЗех буз дер Век Тьс оТух Вех цей Вот Бек 165 170 іт

Тіх їей Тк їєю беж руб Аіа Ар Тух сій Був Нія їуз ві Тух Аїв

Іво 185 190

Сув бід Маї Три Ніє бів Сіф цей бек бех Рко Уві Тех Гуя бет Рве 155 20 205 два ке біу біз Сув іо «2105 131 «вії» 445 «12 РЕНІ «в1ізх Шеучзна «чееО» «еЗ» Штучно синтевована лептидна послідовність «400» 131

Сіп Ар сій пей Чаї бір ех сіуУу вза бій Уві був Був рРто біу Аїв ї 5 30 15

Бог Уві Був чаї Бех Су5 Пує Діаз Веб бБіу РрБе Аза» їїєс Гуз Авр о ТнЕ зо

Тух їТїе сі ТЕр "чаї Ах сію Атїа Бго б3іу бій Ху Бей сії Ткр Меб 48 б1іу Ас її йвроВто їз АкУ Ак АвпоТвх був Тух Ак біс ув Ре ко Б во сіа Біу Аа Уві ТБ їіє Твх Аіа йкр Тих Бек Та Ази ТвВж о йтв о Тук 65 7о 75 чо

Меї бій Пец Чек бе Тез АкФ бетг Сів Азр Твх Аїв Уві Тух Тух Сув 85 50 а узі Ат Бех Сіу Аг Бек Рпе Азр Бле Тхр Фіу Сів б1іу Тк Гей Уаї 100 105 110 ри КОСТЛРЗВТДЛІЯЯО

Твк Маї Бех бек Аїа бЯеж ТБж Буз біу Ртхо Бек Ма1 Бр РІ пей Аза

ЗЕ 120 123

Рго Бек бек Пух Бех Тік Зок біу біу тах Аза Аїв їбо Сію бує рей 130 135 145 чаї Муз Авр Тук Ре Рез бі: ко чаї Тік Узі бек Трр Ав бет у ї45 Бо ї55 1ї15О

Аза те Тк бек СКу Маї Ні ТБЕ Бре Рко Аза Маії Гей бій Зах Зек 185 ї70 175 біт Ппеч Тут Бек без Бех бек Уві уві Тк Уві Еко Бех Вех бек Бей 186 185 50 сіу Твх бів» Твж ТУК їіє Сув Або Уаї Ава Ніз Буз Рко Яек Ав ТЕ 195 280 205

Був Уаі Авробув Був Чаї СМ; ркЕо Бу Бех був Авр Був ТЕ Нія Тех 215 215 2525

Сув Бко рРго Сув рхо Атїа Рко Бій ей Їїва бі сзїу Ро Бек Уві Ре 225 230 235 240

Івшп Бе Рко Рхб ув Бгто Пуз АвроТвт Бей Меб тїє Бек Аку ТВК рко 745 250 255

Фі; баз Ту Сув Уві Уві Маї Авю Уаї Явх Пів біб Авр Рко ств Уві 260 285 7

Тув Рпе Акп Тер Туж Чаї Азр бу Ма1ї бів Маі Ні Аза Аза Був Тк 275 280 285

Гуз ржо Агу ша іо бів ТУук Ап Ввк Тит Тук Асу Уві Чаї Беж Узі 259 295 305

Бе: Тк оМаї їй; Ні бів Ар отТКр бен Авп осі ГПуз о бім Тук дув Сув за5 зів 15 325 ув уві бетг бзв Пув Аза їм Бо А1а Бхо Ті бій був тТвЕ її беж 325 35 335

Був о Аіа був ПіУ Сів Ро ака сій Ро біпо'Уді Тук Тк Бен Бо Ро 340 345 350

Бох Аг Авросій ївм Твкойув Аве біп Маї Бех цем ТВж Сув ес маї 355 Зо 385

119 ВСТЛРоО1974042

Вуз біу Рре Тук Еко Бек Ар» їі Аїа Уві біс Тер біп бех Авп Сіж 370 зв зво біп Бго бій ВБп о Аво тує Буз ЖЖ Тих ро рго Уві їні Ар Беж Дер за5 За зи бо

Стіу Бех Ре Ре Пей Тук Бех був Пей ТБкоуа1і Авробуз бок Ака Ткр 205 4195 415 бів Сі сіу Авп Уві Рі бег Сув Зех Узі Меб Ні бій біа цей; Ні 420 425 430

Авт Ні Тс тТбх спів їуз бек ем Бек Бей Берг рко 435 4140 к?ТО» 132 жхрі1ї5 444 «125 ТЕТ «213» Штучна «т20х «г23» Штучна синтезована пецптидна послідовність «800» 37 сій Аяв Сів їва Маї бійп Зек о сСіу Аза бій ай ув їув во О1У Акта: ї 5 10 15

Бек Уві бує уві беж Суз Буз Аіа бек 5іу Рпе йяп їБе Пух Авро ТВЕ 20 25 0 тух Тіз сій Ткхв о Уаї дха 510 Аза рЕо біш біб бі пев Бій Тер Ме о 45

Сіу ага ї1їе Авр оБго їз Авц дже Ази Твх Бпуз Тук Ах біз Був рве 5 55 во

Сбіц біу Аку Узі Три тієе ТвгоАза Авр ТЬк Бек ТВх Аа ТБж о Аів Тує 5 7 5. во

Мас бів Ббеб бек бек цес аку Беб бій Ар тах Азїз Уаїі Тук Тух СУ 5 за 5 тСаії Аг Бех сіу Ак біз вБре д5р Ре Тер біу біп щіу ТЕ Бе чаї та 105 130

Тк аі Жек Яаж Аїа бок Та Пув біу Ро бах Маї ЕБе рРхо Бей Аїд 115 120 155

120 РОСТЛРОІВІ ЗОВНІ

То бек бек був Бех Тих Векх біу сіу Тк Ала АХа пейп сі Су гви 130 135 340

Уаї їше Авр Тук Рне Рко Сі рхо Уа) Так о уаі ех Тер Ава Бек щу 145 ї50 155. 160 діа їйез Тбт бек біу Узі Нів Тк РБе Рко діа Уві рБец бій Зех Зв 165 170 175

Сіу йон Тук дек Пец беж бен Уві Ма1ї Тбт Чаї Рко Яек бек бек Пец

Іво їв 190 сіу Тих Сію ТнНж Тук хів Сув Ава Уаїі Авй Ніз був Рхо бек Дай ТЕ 195 2700 205

Був Уві Авр Буєя Пув о маї сій Рко пз беж Су Авробув ТЕ Ні Твт 210 7515 229

Суз Еко Рхо Суз Рко Аза Бко бі без без б1у сЧіу РКО Бех Уві Рре 225 з3о 235 240

Бпеїв Ре Рко РрРхо цу Ркто ув Ар о Твжх о Пез Меб Га бзк о Аку Твкх Вко 245 25 255 біз уаї Тк о Сув чаї уві Уаї Авр Уві Чек Нівз сій Авр орхо Сі Уаї

Бо 255 279

ШПуз Рме Авп Тер Тут Маї Азр сО1у Уві біш уві Ніз Ав Ата Ппуз ТЬг 275 Фо 285 ув Вхо тя Зі: біз біл Тук Ав Зеж ТП оТук Акч Муаї Маї Вехко Уві 290 295 зой їео Тіх Уаі їй Нів піп Аяр Тхр Гея Авопобіу їв Зі Тук цув Сув 05 10 315 зго

Туз уві Звж Ав Бук АіЯ Тем ргоОо Ала Рхб ї3Зе піз Ппуя Тк ї16 ЗвЕ 325 зо зЗ35 тт Аза бує біу Сію Рко Ак бі рко біт Заї Туж Твх БПеб рхо РкФ за 345 350

ВЗех Ага Двр бін бей Твк Буз Авоп біпоУаї Зех йдеш Тк Сув дез Уві з85 збо 65

Ів біу ре Тук рго бек Авр Її Аїз Маї бій Тхр біз Бех Агов біу 370 з зво

151 РСТОРІ20О120834042

Оіпо РКО біз Ап Аво Тук Був ТЕ ТвЕж Рго Бко Уві Бей Авр бек Дар з85 390 зав 1436 біу Зех Ре Рие Пец Тук бек Був Бец ТБх Уві Дар буз Бек Акад ТЕр 405 10 415 біп біп б1у двп о Уаі РБе Бек Су Зек Уві Меб Нія бі: Аїд їх Нів 425 455 430

Авап Нів Тук Тих Сів о Пуз бек Мей бек пес Бек Ро 435 440 «ій» ї33 «ії» 444 «вії» РВт «213» Штучна «зах «223» Штучно синтевована пептидна послідовність «4005. 133 іп Авробів ївч Уві бів бек сіу Аіа біч Уві БПуз ув Рхо б1у Аїз ї я 10 15

Бек Уаї муз Чаї беж Суз цуз А1а Веб Сіу Бме Аво ті. Ббуз Азр їни 72 У зо тук Ії бів Тхр аз Аху Сіп Аза рко сіу біп біуУу Бей; бів Жкро Меж 51 Акт тів дер Рхо Гей Ата АтаЯ сій ТБх о Буз Тух Ак біз Пув Ріє 80 55 5 із с01у Аку Чаї Твк Ті Тиг Аза Авр Тк Бек тТпк зва тих діа тує 70 75 во

Меб сій Ха бах бек пон Ак дек бів АвроТвх Аїз Уа) тує Тук Сув 85 зо з чаї Акч Бех ОТу ТБх Зак о Рпе Авр Ріе Тхр біу біп Сіу Тих Пес Мах 100 195 130

Тьт чаї ех бек Аїв ЗвЕ Так омув 51у Рко Бех Уаї де Рко йев обід 115 120 125

Рго бех Бех їжа Бей ТВЖХ Зек з1іу біу Тк Аза Аза цей бБіу Сув'їєз і30 | і1358 140 чаї йув Аяр Тухк РБе хо. піч Рхо Уві Те Уаї Бек Ткр Авп Бех С1У 145 150 ї55 хБО

2 РОТЛРИОТІДТЯЮТО

Аїа Тез ТПр обех О1у Уаї Нів ТЬг ББе с Брко Аїз Уаз Гей Сів бог бок 165 170 175 -іуУу Тео Ту Бех йзи бек Бех Маії Чаї ТБк Чаї Рко Явеж бат бек пах їва 185 190 сіу ЖаЕ біп Тк о Тук Іїв Суз Авп оУаі Авєп Бія Був Бжо Щек Ави ТВЕ 195 209 2705 цув чаї Авр и Буз цуз Уаї біз Рхо був Бек Сув Авр о Гув ТТН Ні ТЕ 210 218 220

Сув Рко Рко Суз Рго Азїа Рко бій їез цей Сі Сьж Рко Зех Чаї РНе 225 230 235 240

Бен рРпе Бжо БРко їв рго Був Авр Так Тец Меї Ії Зах Аку Тахо рго 245 2590 255 сто Маї Тв Сув Уві Уаї Чаї Аврв узі веж Нів бій бар о Бго зіз Уві 2655 255 275 уз Ре Ав» ТкроТук уаї Авросіу умі біш Меї Нів Аваподів Ппує Тв 275 280 вв пуз рхо АхЯ 0105 сія біп Тук Ай обек Тк оТух Ак Узі чаї Беж УВІ 290 285 300 їеай ТБх Уві Цезч Чів бів АБроТхр Гез ввп С1уУ Муз іа Тук був Сув 305 зів 315 328

Шцуз чаї Бех Ав Гуз Аза тей ртхо Аза Рко їїе біс КТув Тих ті бек 325 з30 заз

Був Аіа пув Біу бів рко бку біз Ехо шій Уаї Тух ТНж Бей ро Бко 340 345 з5О

Бех Акгу Авробій Тео Твж пу Ав» біп Маю дек Бей ТВгобув ва Уві

З55 365 зе

Буз біу РБе Тук рко Бех Азр т1є дії Маз біз Тер о бБа бек Авп Су 370 375 зво бів Рко біз деп Авп о ТУкК оБує ТВх Тх Рто Рко Уві Печ Азр бек Авр 385 зо 395 400

СІіу Зог Рів Бре без Тух бек оїув дез Тих Уі Авропув Зех Ака Ттр 405 410 415

123 РОСТАРООВНОЛВЯ042 сів сіп біУу Авпоуаї РБе бек Су бак Чаї Мей Нів схо Аза ей НіБ 420 чо 230 зва нів Тух Тпж біо був бек цей бек їй Вех БЕ» аз5 440 киїо» 134 «і1їх 444 «іо РВТ «213» Штучна «?йх «223» Щеучно сийкезована пептилна послідовкість «00» 134 іп Ар сбіп їеєа Маї сі» Бек Біу Аїа сій Маї Буз Буш вхо сху Аїв 1 5. 30 15

Бех Уві Пуя Уві бек Сув мух А1їа Зах біу ББе Ап її цуя Авротак 22 25 зо

Тук Ії Сів Тер Уві дк бів діа Рко сіу бій біу її біо Ткр Моє

ЗБ 40 45 сіу Аха Т1е бвр охо їні Аку Ахо бек Тк Тув Тук Аху біз Гуз Бе 50 55 во сів біу Аква Чаї ТБж Хі о тТвк Аза бар ТьЬх Зех ТВ яв о ТВк Ата Туш в то 75 о

Мек бій Ппей бос бек їз Аку беж бій Авр Тв А1а Уаї Тукх Тук Сув 5 уві дка бек СІу Тв бех РБа Авр Ре Ткр біу біло біу Твх їви Уві 100 105 130 тих чаї бек йек Аів Бех їТйх Пув сС1у ко Зеж Узі Ббе рРхо без Кіа ї5 120 125

Ркгос бек Бек Шпук йет Твжх бек пбіу бі ТЬж Аіа Аїа Пей біуУу Сув бец 1395 135 1230 чаї їв Авр Тух Рре бхо біз рго уві Тк Уві бек Тер Авд бек БІУ 345 150 155 150 діа пе» ТвкЕ Зех біу Уві Нів Таж Ре Рко Аїа чаї Пеєз бій бЗек беж 165 170 ко

24 ВСтТЛРІООЮЯ сіу ей Тух бек їез Бех Яек узі Уаї ТБ Узі Рхо бек бег Явкг Пей 180 185 190 біу Твк сій ТБЕ Тук ї1е Сув Ав Уаї Авап нії їше РкО бог Ав тих 155 200 205 уз чаї Авр о цуяє пув чаї сф Рто Бу дек був дво Був ТвЕ Нія ТЕ 71о 215 2

Сув Ртго Ррто Сув Рко Аза ржо 1 їєй їй Б1у біу ро бех чаї Рне 225 235 235 2452 ї-ед Ре Рко РКО буз Рюео Пуз Аяр Так Бей Меб Іїє бек Ат Типж Рко 245 250 255 бів Маї Тих Суз Чаї Уві Уаі Авр Уві Бех Нів біз Авр хо бім Маї 250 265 270

Ту о вЕпе АвпотТЕр Тух Уаї АврозіУу Чаї ста таї Ні Ав Аза Мув ТЕ та 280 295 ту РКО Ак біз біз бів Тук Аз) о йвт Тв оТух Ах Чаї чаї бек Маї 250 255 00 їз Тс ча) єв Кіз бів дер Ттр пес Аввостіу пув Стій Тук Ту Сув за5 з1о 315 з20

Буз Уві Зек Авп оБбув А1з Мем оБко діа Ржхо Т1іє біо Був Таж зХїє дес 32 30 335 ув Ма їла сіу Бій рко Ака бів ро біп Ві Тук Тюж без Рго Руб зав за5 з5о

Жах Аху Азр бій без Тьх їув Авп обі) Уві Бек дец ТВх Сув реп Уаї 355 зво Зб5. їув сії Рне бук ро Бех Авр ІЗїе Аза Мах біз ТЕр січ Беж Ази С1У зто 375 зай сів Бко Сі айва Ава тТух Був ТБт Тве оруо рхо Чаї ївоа Ар о Зедг Ар. з85 зво за5 450 сіу бег Рпе Рів йо Тухк Зек їПув без Твхоуві Авробув Бех АрЯ Ткр. 405 «10 815 сіп бзіп біу Авп уві Різ Бех Суб Зах уві меє Нів біз Ала без Нув 420 425 ЗО

125 РОТА 28404

Аза Ніз Тук Тнх 01 пуб бек бен бек Те Бек РКО 455 440 «їй» 35 «гії» аа «212» РКЕ «213» Штучна «20» «23» Штучно синтезована пептидна послідоважень «ОО» 135 бів двр бій Гей аї бід бек біу Аза бі: Уві Пуз був Рто біх Аїа ї 5 10 ї5

Век Уаї Муг Уві Яаг Сув бує дів бек біу Ре Авр ті Буз дар о ТВЕ 20 25 зо

Тут їїе біо Тхр Маз Аку Сій Аза Бго біу бБіп ШЕУ Бей обід Тер о Меб за 40 45 біу вхчЧ Тіє Авроржо Кеи АкЯ Акат бів Так ув ТУух Ах Сі Був вве 50 55 50

Сі сіу Ака УМаї Тс ї3зе ТЕ ліз Авр ТвВж бах ТьвхоАвпоТйх Аза Тух 55 70 75 во

Ме бій фей бек бек Бей йко Бек ія Азр оТг Аза Уаї Тук Тук Сув зо 35

Чаї Ак Зак піу АкЯа біз Рьє Аве Ре Тер о біу бів б1іу ТВх без Чаї оо 105 110 тв чаї бе ек Аза Бек ТрЕ ув біу Рко бе Уаї Рпє Бто їейї Ат 115 125 125

Рго ЯЗех Звх Буз Бек Тк Зах біу бі Так Аза Аїя Бей Сім був цей есте) 135 140 чаї Буз Авр о Тук Ре жо Зіз Рко Маіїі Твх Маї ВШек Ткр о Авп бек Сіхф 145 150 155 ії60

Аіїзвз теп Тв Зек Сіу Маї Нія Тит Бе Бхо Аза ча3 ГПем бій Бех Бек. 165 170 75

Сіу йец Тує Вег Пец Вех бех Уаї Маї Тах уаї Рро бек Бек Бех Шей т8о і85 ї50 сіу тТвк осів Жве Тух І1е Сув Вап Маї Ав МНів цу хо Вес Ав» ТАХ 195 200 205

126 РОСТ Р2О12 084042

Буг Чаї Авр Гуз Пув Мах біс Ро Мук Бех Суб АБр цу ТЕ Нів тТнЕ 210 5715 220

Суз Рхз рис Суз рРхто Аїва Рко Січ Тем Гб БЗіу біу рРЕо бек Уві ре. 235 230 235 240 їви Ре шко Рго Пув рко пуз АвроТбу Бей Ме Тіє Зех Аку ПЕ оБго 245 250 255 сів уві Тих Сув Уві Уві Чаї Авр Уаі ЩШех Ні біз Авр вхо сі Уудї 280. 255 270 ув РБе Авп о ТкроТух Уві дяр Сіу Уві бів Маї Ні Дап о Аїа Був тех ет 280 285

Ту ко Ак б1з біз сій Тут Авпобек ТВЕ Тух Аку Уаї Уві Бек чаї 290 295 зо їец Твт Ууаї Пец Нів сій АвроТкр ей Аспобіу Пув сія Тук пу Сув зо5 зів 315 за

Бук Уві дек Аза Був Аза їви Рко діз Ехо Їїе 51 Гуз ТЕ Ії цех 325 330 35 ув Аїа ув б1у біп Рхо Аку бій Рко бів уві Тук Так оїеп Рко рРхо зай ЗБ а5О бек йко Авробів їх Твк бує Ази біп Маї Бех Пем Тіт Сув Кей Уві зЗ55 зво зв

Ммув Я1У рве Тух Рго Бех Азр її Аза Уві бін Тер іч Зех Ава Сіу зт7а 375 во

Сів ро бій веп Аве Тух Їду ТЬк о ТвЕ Ехо РКО Уві Без Азр йзж АБр з85 зао з95 406 біу бек Рре ЕбБе йвч Тук бек ув Гез Тв Уві Авробув ех Асу Тхр 465 410 415 бій бів Сіу Ап уві Рпе бек Сув Бах Чаї Меб Ніє біз Аїа дез ЕВ 420 425 439 йви Нів Тук ТвЕ бів цує беє Ген бех Гей бек рес 535 40 «210» 136 «дії» 213 ке РОТЛРЯКОЮВАОЙ «ій» РЕЖ «ої» Штучна «аа» «ве» Штучно синтебзована пейтидна послідовність жа0о» 135

Авр їі піп Меб ТНтх бій бек Бржо бек Шек їй Бех діа Бек Уаї б1у 1 В 19 15

Вер овха Мак Тпт Тіє Тех Суз Ак Аза Бех біп В5р іє Нів КПув Ту

Зо

Тїє діа Ттр Тук сі бій Муз Бхо біу біп Віа рРго Аку Бей бец 18 біп о Тук Тнж Звх ТБ Бею біп Рко 201у Уві Рхо бех Асф Бі бек осіу 5О 5 бо

Бех біу бек біу ТвЕ Авр тТух ЖБк ББе ТБтІ тїієе бек Зах Пез біб рто 85 7а 15 во сів Аве сів Аїа ТВт о Тук Ту Сув Ів біп Тут Авродбап без Ак Таг в5 30 ЗБ ре біу біу СІіУ Так Ппує Уві біз ї1їє їв Акху ТвВк Уа1і Аза дів вко

ОО 305 115

Зех чаї рве їі РбБе Блхо Руо Бех Авр сіб біт Па був бек Сіу ТЕ 115 120 125 віз бек Уві чаї був їз Без Авт оба Бйе Тух РКО Аку бів дів пу ізо 535 140 чаї зі: Ткр пуз Уві Дер Аве Ата Іо б) бек піу Ази бех бій січ 145 Бо ї58 150

Вас Узі Тиж бій бів Дар ех цуз Авр о бБех Тк о Тух Чек Пец Бех бек 155 т7о щІ5

Тк їн Так Бей бек бує Аза Аве о Тух бі пуя Нів ру уві Тук Ата 180 зя 190

Суз біц Уві Твк Ні бів сіу Ппеп бек беж Рко Чаї ТЬЕ Шу Бек Різ 195 200 205

Авп о Ак біу Сів був 210

128 РОТЛРІТ ОВО «ід» 137 «8115. 444 «2і22 РЕТ «213» Штучна «й» «223» Штучно синтезозана пептидна послідовність ха0О» 137 біп Авробіп без Уаї біб Вех біу Аза біз Уві Пух Шув Кто сСіу Віа 1 5 10 15

Бех Чаї Мув Чаї бек Суя Муз АтТа Бек сіу Ре Ап оїзїе Був Авр о ТЬх зо

Тут Тіе біп ткр Чаї Акту іа Атїа Рхо сіу бій біу Бей Сіз Ткр Має б1іу Ага їїе Ар Рко їжи Аква біз бів ТВх Був Туг йко біз Був рве 53 55 бо сій б1у Аху Уаї Тв оїїєе Того Азїа АвроТвЕ Бех Тк о Ав ТвБк Аза тує 65 70 75 во

Меве біб Тез Бек бек цей Акад Бек біз Аве ТЬЕк Аїв Уаї Ту Тук сте 85 за З5

Уві АкУ Бек біу Акад Бек Рре Авр Ре Тер б3Уу біп ЗіуУу ТБж Сей Маї тоа 105 110 тих чаї Бах Зек Аїа бек Так Був зі Ржо дек уві рпе рко Бей: АТїа 118 130 125

Рко бах Бах Був бек тТВх Бех біу 01у ТБг Атїа АтТа їеви сіу був Кей їза І135 140 чаї ув АзроТУук ВББе Ро бій ко Фаї Тіх Уві Яех Ткр бзп бек шіу 145 150 і55 ї68 йіз пей Тк Зах бтіу Уаї Нів тТвж Во Бго Віа Уві Печ бій Бек Бек 155 179 175 сі Бео Тук Зак Ттєц бег Бек Уаї Уаї Тк Уві Ро бек бек Беж Бей 180 185 1950 сЧіу Тв Сій ТЕ Тук Зло Сув Аво Уві Авп Нів пу Ребо бех Авб тах ї95 209 205 пув узі Авр бує був баї сіз бро буз Бек Сув Авр Шує Твж Нів ТвЕ 219 2715 270

Іза ВСТА РОТОВУ

Сув Ро Рго бує Рто А1та ро сіб Ге оБбем бі бі хо Яех Уаї рве 225 230 235 240

Бей Рре Рго жо Пув Рто Пуз Авр Так Пец Мебє Іі Яех Ату ТВжЖ рхо 245. во 25а сів Уаі Твк Сув Чаї Уві Уві Авр Уаї Бех Ні бій АвроРко біл чаї 255 21 їув РНе Ав Тхр Тук ай Вар біу Уаії Сів Уаі Нів Аво А1а Цув ТЕ 275 288 285

Туз Бк Акд бМ3 бі: бій Тух Або Бех Твх Тук Ато Уві чаї бек ча) 290 255 09 їеи Тк Маі пе Нів бій Авр Жхр їй Аязпосіу Пув ім о Тук пув Суг за5 310 315 320

Із Чаї Зех АвооПув АТїа Без Ркго Аїв Рекс Ії бій ув ТьЕ Їїе бек 325 3530 335 ув Азіа Був б1у Сів рко Ахе біп БРто біп Маї Тух ТижкоБен Бхо Рко 340 зав 350

КЖек дко Авр обі Їїви ТВг Пув Аа Сів УМаф беж Бем ТакоСув Пец Маї 355 369 збе пу бі Ра Тук Рко Бек Авр Тіє Аїв Чаї іо ТЕр біз Век Ап Ту зта 375 зай сій реко Сіш Аво АвпоТух Був ТвВт о тв о Рко Бко Маї Тез оАвр бек Авр 85 390 за 500 біу бок бе Бе о бао Туг Бек їув їй те Уаї АБр о їує Бек Аку Тхр 405 410 415 бів сбіп сіу Авпоуві Рпе Бех Сує бак Уві Меб Ніз біз Аза рем Ніг 425 325 430

Ави Ніз Тук Тахо бів Ге бек Пейп Бех Пе) беж рЕб 435 440 «гій» 138 «211» 444 «війх РЕЖ «213» йтучна «220

Іо РОЛІ ТЗН -2273У Штучно синтезована пептидна послідовність «О0ох ЩТ3я бій Авр бів бей Уві б3п Зех віу Аза Сі Уві Бу був Бхо б1у дів 1 5 То 15

ЧЗек Уаї Туз Чаї Век Суз уз АЇа Звг біу Бе деп їїв Буг АвротТВЕ 25 25 за

Тут Тіз біп Тгр Уві Аху біп Аїз Рхо зЗіу сів Сіу їеи біш Тхр Мей 38 40 45 сіу Аку Їїе Авр о рхо реп аку Ак біо Твх вуз Тує Бі СБ: пуг Ре 5О 25 89 сім біу Аку Уаї тре т11є Тв Аза Авр Тих бех Таж Аза Тс Аза тує 55 та 7 во

Ме бій пе бек обех без Яку бекобіц Ар оТрж Аїа Уві Тук Тухк Сув 85 за 95

Уві Акад бЗеж Сіу Ах бек Рбе Авр Ріє Тхр бі біюв йіуУ Тік о Гех Уві 160 105 110

Так Чаї бах бек Аїа Бек ТВх їша Чіу Бо Бех У8і РВе Рко Шцез Аїа 120 125

Рхо Зех Бет Був бек Тік Бех Сіу біу Так о Ата Аїа Бей О1у Су Шйеч 130 135 140

Уві цуз АвроТук Рце Рхко Сій рго Маї Тапх чаї беж Тхр Авп бек ФУ 145 150 155 ї60 дів цей Тр» Бек Сіу уаї нів Тнк РНе Рес із Уаї Без Офа бек век 165 ї70 175 піу цем Тух Зевс Пец бас бєеї Уаї Уві Твх Чаї рхо Зежш обежт бек їй 180 їв 130 сію Твх біл тс Туг її Сув Авп Уві АвпоНів був Рко бек АвпоТве ї985 200 205 пу Уаї Авр був Пув Уві біз Рео Пув бек Сув Авр Іуа тах Ніз ТЕ 210 215 вгй

Суяз Рка Рко Суз Рго біз Рхо ша тво їв» біу біу Рго бек Увв о Бве 225 230 235 240

І КСТИВОЗО ТВО. тей Рре Ро Рто Цув рго КПуз АвроТвтІ ївзи Меб ї1з Яек Акд ТвВе Рго 745 250 255 біз Уві Твк Суз Чаї Уві Уаї Авр аї Зек Ні біс Авробхо біс уві

Ба 255 270 їув кЖБе Аз) Тхр тТук Уві Авр сіу Уві біз Уаії Нів Авподіа був Твх 2175 «во 285

Був Рко Акад бі бі сС3ю Туш Аво обак Так ТуУух Ага Уаї Чаї бек ЧУаї 290 295 00

Бей Так уаї Без Нів б1їо Авр ТхроБеєс Авпобіу бує 1 Тує був Суя зо 10 315. 320 ув Уаї Беж Авап Гуз Аїа Бей Рко Аіа Рго Ії сі Гув Так Б3іе Бех 325: 330 зз3з5 пуз Ата пуз біу біз ро Ат Ота Рхо біб Уві Тук ТВ Тех Рхо Рхб 340 345 з5О

Бек Ака Авр сій Тео Тс Пув йял біп Уаї Зеж тей тв Сув дез Уві 355 зва ЗБя

Бу сСьу Впе Тут Бкб зЗеат Авр ті Аїа Узі С10 Ткр бій бек Авпоту 370 375 а80

Сів ро бі) ВВП о Ав бук о руз ТЕ ТВХх Еко рко Уві пев Авр Зет Авур 385 90. з55 400

Сіу Бех Ре Рие Гелі Ту Беж Па Без ТБжх Уаї АвроПпув Зах Ака Ткр 405 510 15

Сіп бів піу айва Уві Бе Бех Сув Зах Уаї Меб Нів бій. Аїа Цехи Вів 420 425 430

АвпоНів Тук Тех біп Буз бек Пец; бер іж-о беж РЕ 435 «да «»10о0» ї89 «гії» 444 «2122 РЕЖ «813» Штучна «ей» «2923» Штучно синтезована пептидна послідовихсть «400» 139 біп Азр бів їеа Уві бій Зак 03у Аза біз Уаїі Цув Гуз Бко «їу Аа їі 5 13 ї5

155 ВСТА РОЗ ЗЛО

Зех Уві Бує Уаї! бек Сув Пув Аїх Зах с1у ББе Авй 116 бує АвроТБЕ 28 25 зо

Тут Ії біб Тр Маї Вку піп Аза Рхо Сіу бій біу СПез пі Ткр Ме 35 за 15

Сіу Бк Її8 дер Рко Бем вйхЯ Ажа Сів Тек Бу Тук Ага СІю руя Різ зо 55 50 сп У Акт Маї ТвВх ЇТїе Тв о Аїа Авзр ТНе бех Твх Аво Так Ата тУук 7о 75 ва

Мес бів їм Бек Бек їжи Ака Аза Сію Авр Тк Аіа Уаї Тук о Ту Сув 85 зо 95 ча) Вжа Бех сС1іу Ака біз Різ Авр Ре Тхр Щіу їй бу Твк Тел лаї іо 105 110

Тнх Уві бек бек Аля Бех Трх Пув біу Ро Зекх Маії бле Рго ей Ата 115 1270 125 го Бек Бех ПЦуз беж ТБжх Бек обі бі Тк лів Аза пе біу Сув Гей

УуУЗо ї35 140

Узі цуз Авр Ту пе рРхго бій Рго Уві Тву Маі Бех Ткр.Авоа вок біу 145 158 155 т6о

Аїа Бей твк бек біу Уаї Нів Тах Ре Ро Аза Уві Пец бів Загобеє 165 їто 175 сіу йей Тух Вес оп Бех бах Уві Ма) Твк Узі Рко бЗег беж Бек теє 180 185 1950 сію Твх біп о тТвх Тук тіє Сув двп о Уаї Ай Ніз Був Бгто Яек Ава Твх 195 290 205 ув ча1ї1 Авр дув Був узі біч Бко іїув Бех був дар ув Тк ніх Тах 210 215 229

Сує Рхо рхо Суб Рго Аїа Рго сії Гео їм біу С1у Рго Зек Маї Рве 225 230 235 249 рос бе ро ко Був Рхо Був дер ТВЕ Пем Меє І1е бек Аку Так орко 245 259 255 сію уаї Тв Сув Уаї Уаї Маї Азр Маї бек Нів сію Авр о бхо с уд 260 265 270

ВСТЛРІО12А3К204

Буг рРре Авь о Тхр Тух Уві Авр сіу Уві сі Уаі Ні АвпоАтТа пув Так 275 аво 85

Пув Рго Ага біп біз б1п Тух Аза бек ТБх Тух йсоа Маї Маї Бех Уві 290 285 зо їси Так Чаї ей Вів сіп Авр Тер Пес Авп о біу пув о сіє Тук Був Сув 05 зіб 315 329 уз Уві бак Авп оїув Аїа їйооп Рго Діа Рко ЇІ1їе 014 Був Тр т1ів бе 325 338 335

Пув Аїа бує бі бій Рго Акоа Сід о Бко бів Маї Тук ТБх цей Рко рко 340 зЗа5 зЗ5о нах Аху дар сій Мем Тк Бу Аяв сій Уві Зах їй Тйт був пев Уві 355 зво зв

Був сСіу Ріє Тує рхо Вес Авр жіє Аїа Уві із Ттр біо Бек Ав зіу 37 31715 зво біп Вго біз Азп дя» Туш Ббуя ТЬЕ ТвВкорко Рго Уві вч Авр Бех двр 385 353 395 409

Біу Зек Рпе Бпе їз тую Бех пу Ге) ТВт Маї двр цув бек Ака тТЕр 105 1410 а5; біп біп 51у Аяйп Уві РНе Бех Сук Бек уаї Меї Нів ім Аза їєцй НІВ 420 475 130

Ав Ні Тук Твг біб Був бетх пе о бег Бей бек рЕє 435 44о «210» 145 «1ї1»М 444 «Віа» РЕЖ «213» Штучна кг» «Р23» Штучно сивтазована пептидна послідсяність «ож 140

Сіп Авробів їви Уві зіп Бек с1іу Аїз ба уві був Шув Рго біу Аїава 1 5 16 15

Нех уаї Ппув узі бек Сув їз Азїв Бек біу Ре Авп тів Пуз АвротБЕ за

Із4 РОТОРОМ

Тук Іїе біп Ткр о Уві Ага біпоАїа Рко б1іу сіп біу їва бій Тер Має 40 й5 сту Аку Тіз Авр о ро їез Аку Аха сій о Твх мув Тух вка біб пув Рене

Бо 55 бо біз сСку Ака Чаї Тах Іїз Тих Аза Авр отв: Зек тн Вп ТНу А1а Тук 5 7о та о

Ме: піз їв ех бек без одйто дех біо Авр оТвг Аїв ві Тук Тук Сув 85 зо 5

Уаі Ак Бах сСіу Ак Сіз Ре Авр о Тух Ткр біу біо біу Таж Без Уві ї0о 105 16

Твх уві Вег Бек Ата Бех ТВт Був біу реко Беж Чаї Рве Рко пев одїв 115 120 125 ро Зах Баш Шуз ВЗек ТВх Зех 01у діу Тбк із Аіз Беп біу Схшя Пец 130 135 140 чаї Був Вер Тук Еве рко бій РЕ Чаї Твг Маї беж Тер Ав» бек сіуж тах 155 155 150

А1а їз ТтТБх бек біу Маї Ні.в Тих Бпе Ркгз й1з Чаї Пе 510 бек бек 155 170 їТВь біУу пес тТук Бех їецш век бЗек Уві чаї ТВвх Уаї Рко бек бек Бех їей 180 185 190

Фіу тнх бій ТБх Тук її Сув Ана Уаї Аза Ні пуз Рхо Зех Авап Тих 195 200 «о8 пувз чаї бар КПув муз ав біз Рко Був Бех Сув Авр Муз То Нів ТЕ 215 220

Суз Ро Бто Сув вго Аза Ро СО) їн їжа Зіу С1у Ето Зек Уаї РвБе 225 730 235 4 їз Рре Бжо Рко ув рхо Був Дер тах мезо Меб Хіє бек Ак Тік Рке 245 5 258 із бах Тьк був уві Ма1і Уаї Авр уві бех Нів бБіз Авр Рко Би Чаї 280 255 270

Був Рбе Азп оТкр Тух Ма1і Азр біу Уві бій уаї Нів Ага Аїа пу ТВЖ 215 285 255

135 СТО РНИОлІВ4О042 їв Рко Ах біо б3п 010 Ту Авіа бек Тато Тук Ак Уві Уаї Бех Уві 250 295 за

ШПей Твг Чаї Сїеа Ніз бір АвроТко Без деп біу ув 01; Ту Був Сук 305 з10 315 329

Гуз Уві бек Аве їує А1їа пес Рко Ада Рго Х1е бій уз їТдк Її Явх 325 335 335

Був вза уз Бу сій Рго Аку бій Ро бів Уаї Тух ТВжЕ єю Рко рхо 340 345 з5о

Бек Ака Азр бій дея ТЬг о Ббуз ййп зів Уаї Яех Бей Тпт Сув Пец уаї 355 350 355

Був сіу Рке Тут Рко Зег Авр Те Аза Уаї бію Ткр бій бек Авпопіу зо 375 зво сів Во бів йвподвп Тук Пувз Так ЖьхоРко БЕб чаї їємі Авю бек Ввю за5 з50 за 400 сту Зав Ро Ре Пам о Тук беж ув Бей ТБк Уаії Авр Муз БеБ Ага Тхр 495 410 418 сіп біз б1у Авп оУМаї Ре бек був Бет уві Мебє Ніз сій діа Геї Нів 420 425 азЗо дав нів Тук тах бій буз Бек Цей Бех рей беж во аз 440 «ій» 143 «вії» 713 «Таж РАТ «213» Штучна «Ох «?23з Шесучно синтазована падтидна послідовність «апоОохм 341

Авр Ії біп Меб Тих біп Вех Рхо Бех бек Бек Яехт Аа Бек Маї Фу ї а 10 15

ВАзр Аг Чаї ТвЕ Іїе Так Сув АкчЧ Аза бак біп Авр о ЇТтТе Ні Був тує зо

Іїв віз Ткр Тук бій біз пув РЕо біу біп Аїа ро Ак Беп Пец ТТе 30 45 бів бук Ту бек Тв її бів Бко бі уаї Рхо бек оАка РБе беж СТУ о Ба бо

136. ВОЛІ ОВаво

Бек біу бек сіу Тік Авр Тужх ТвкК ББе Трх ї1їв бек Зах пед біп ко 55 70 75 во

Сію вер Ііє Лів Тк Тух Тукс буз ем Сіп Тух Сіа бів Ге Аха ТВх 85 9а 95

Бпе сіу біу біу Твх Був Уві біз гів їує Ага тТрж Узі Віз Азія рко о 105 110 бег Уаї Бре Ті Ре рЖхо Рко Бех Авробіс біп Без Пувойеж Шіу тах 115 ї20 125

Аіїв Бех Маї Уаії Су Тез бос Ав лап Рре Тух Рко Ака б) Аїа пуз ї30 335 140

Уві бій ТЕр бує Ууаі Авр Авп Аза Бец біп бок біж Авзпобек бів бів 145 х5а 155 150 бегк баії Тьг о бСій зів Авр бег Був'АБр Зак Тах Туд беж Пем бек дек 1655 170 78

ТБ оГєк ТвВх їй бег пу віз Авр Тух бій Пує Яїв Муз Узі Тук йїа 180: ІВ 180

Сув біз Чаї Так Ні біо б1у їй Бех Бек Вко МВА ТвжЖ Пув бек Рпе

І55 2790 295

Ази Акч сіу СІ був 210 «віх 142 «1ї» 444 «гійж РЕТ «233» Штучна «гдж «РИЗУ ШуУуучно синтезовзана поптидна послідовнлоть «00» 145 бій двробіп пей Уаї біп беко сту Аїв бій Уа) дув АвпоБго сту діа ї 5 10 15

Бех уаї Цув Уві Бек Сув цув Аїа Бех біу РБе Аза Її1ї6 буз АврБ тв зо

Тут Ії бів Ткр Маї Ак біп АТа Бко С1у бів сту бен Са Тер мес. 46 5 їх РСТЛРМИОЮВаВЯ сі1у аку піз Авр Рхс Пен Ажа Зх сій ТЕ ПЦув Ту Ак біз Був Ре бо ів біу Ак Чаї Тих їі1іє ТБт Ала Азр Тйх дек Тйх АвипоТрж Аїа тТух: 65 70 75 ай

Ме біб Фа бек бек рей Ак бек біо АвроТвВх Аза ув Туг Тук о Сув

З 90 5 чаї вжа Бех сїу АхУ бі Бе Авр бе Ткр зі бів Су Тк о Бен ув 3100 105 ї10

Твк Чаї Бек бек Аза бек Тахо Був біу Рко Бек Уаї рРБе рко її Аїа 115 129 125

Рко ВЗеж Звкх Пує Звк ТБ Бех Є1у Сіу Тьг Аія віз тей біу був Бей ї30 135 140

Чаї їув Азр о Тук Рве рко бін Рхо Маї Те Уаї беж Тор овеєп бек 01Уу 145 150 155 ї650

Аїзз їм Тих бак с1у Чаї Нів тТВк Рре Рко Аза Ма) Темі сій бат обБехк 155 170 ї75 бі Без Тук Вас Гей бек бек Узі Уві Твх Уа» вркКо бак обек Бех ви і80 85 199 сіу тТвж сій ТЕ Жук ї1з Сув Авп о Уві Авв Нів Був Рхо веж Ав оте 185 246 205 їув Уаї Вар Муз Муз Уві Бій Рхо Муз Бех Сув АврогБуй Тс НІВ тп 210 тій 20

Суз Бкро Рго Су йго А1з Рко бі Бзм ви Б1у біу Ро Бет Чаї Бе ри 230 235 240

Меп Ріпа РрРго Ркго був Рко цув Авр о Тв Без Меб тів бах Ако Твровко 245 25 255 сіб уаї те Суз Уві Уві Уві Авро Ууаї бек Нів бій Авр во тн Уаї 250 265 270

Був Ре Ав Тхр Тук Уаї Авр о біу чаї сіш маї нів Ава о Аїа Був ТвЕ 275 280 285

Був Рко Ага Січ спій сію Тук Ав Бех ТЕЖ Тух АК чаї чаї Яек МУаї 2990 295 зо

138 ВСТОР201 2084049. ївм ТвЕ Уаї бе Ніз бів Азр Тжхр Пе Ав Сіу Буз бій Тук Буз Сув 305 310 Зх 320

Був Уві бех Авп Пув Аїа цеч Рго Аїа Рко Т1є бій Був ТБ Ії16 бег цув Аїа пуб сію сів» Бго Аку бій Рко біп Узі Тук Твх о Гез Рхо бо 340 за ЗБ

Зек Аху Авр обій Без Твк Був Аа Сій Уві бек рем Тех Сув лей Уві збо зв

Ту біу Вне Тук Его бБег Авр ї)1є Азїа Уві бій Ткр щі Вех Акапобіу 370 375 зво бів рхо біо дв» Авий Тук о був Тах Тк о рго Рго Уаї рей Дяр Вех Авр 385 350 95 460 зіу бек Ріе Різ Тец Жук бек Був гей ТБх Уаі Авр Муз Бек Ак Тер 405 1410 415 біп іп СЛУ Взп Уві Бре бех Суз Бак зі Мес Ні сій Аза Пед НІШ 4120 425 430

АзпоНія Тук Так бій ГПув аж Пед бек Тез бек РЖО 435 до «810» 343 «вії» 444 к212» ВЕТ «2ї32 Штузна «2» «Оз» Штучно синтевована пейтидна послідзсвність «400 143 пів дер сій їйео Уві бій бек сСіУу А1та біз Укі був Був Еко віх Аї 1 в 10 15

Жах Уві їуз Уві бех Суз пув Аза Зек бі РБе Ви їі6 Туз АвротвЕ за 25 30 тТтк її сію Ткр Уві Ака біп Аха Рхо б1у Сів бІу Пей сб Тор Меє зе 40 Яся

Піу вхо тів Авр о Ркбо їв АкФб Ату бів ТВжЖ опуз Тух Акад б30 Му вве 5О в ва піз біу Акса Узі ТБк ЇТе ТЬжЖ АТа Авробія бех Тьжх Аве Те Аїва тує 55 то 75 во

139 РОСТАРОВІДЮВЯВІО

Ме біб Те Бес Зак Пен Ахац бек сі Авр о ТВЕ Атїа Ууаї Тує Тук Сув 85 за 25

Уаї Аку бек б1у Акад біс Ре Авр Раз Ткр Зіу Сів С1іу тах бе; Уві 700 105 ца

ТВЕ Уаї Бек Бек Аїа бах ТВх о Ццуз біу Рекс бек УМаї пе Вго Пец Аїв 115 120 125

Рко Бек Бех Був Бек ТБЖ Бех піт Сіу ТЬх Аіз Аіа тей біу Сув ей 135 140 аю іже Авр Тук Рів ро Сі ро Уах Тв Уві Бек Тжр Ава Чех бТу 145 350 В 169

Віз беп ТВх Бек щ1іуУу Уві Нів тах рпє рко Аїа Чаї їем бій Бек бек 165 170 175

Оу їви Тух Зак Сей Зех Бех Узі Уа) Тато Маї Рко Бек Зеж Зет Бей 180 з85 190 сіУу ТвжЕ бів ТЕ Ту Ї185 Сув Аві Уаї АЗв Нів був о ркго Бек Авпотье 195 200 г2га5

Був Уаї Авр бує буяє Маі Сім рго Буя бек Суз АвроПЦув ТВж Вів Тах 210 235 20

Сув Бко Рко Сув БРко Аїа Рхо біб бе Без біу біу хо Зак Чаї рве 225 230 235 240 во Бе Ро Рко Пув Бкго Пуз АвроТврж Бей Меб Ті Бех Аку ТрЕ Бко 2545 250 258

Січ увазі Так Суз Уві Уві чУаі Авр Уаї Баг Ніз біз Авробко сів Удх 260 255 27 пув Ре Аба Тр Тук Уаї Авр сіУу Уві бл Уві Нів Ап одіва Був ТВХ 278 280 785 ту рхо дк біо бій біцп Тук Авпобех Тве Тук о Аку Чаї Уві бек Уаї 290 295 00

Ієй Тнх уві Печ Ні Сій Авр о Ткр Преп Авп о біу був'сїй Туш їув Сув зоб зі 315 399 їв Уаі Бех Ава Був Аїа ем РЕБ Аза Рхб Ії бій Пув Так Із Баг 325 50 зз5

140 РОТЛРІВТІОВАО уз Аза Пув бСіу біб Рхо Аху бМ3 рхо біп Уаї Тух о Тьх Їва ко Рко 340 45 359

Вех Акщч Авр о Ста ТПеб ТВЕ Був Азов біп Уві йег реа Тк був їви хмаї 355 359 зе

Був Сіу Рпе Тук Ржо Бех Аврожтіз Аїа Уві Сім Тер бі Бек Аяп о біу 370 375 380 бій го біз Азп Аво Тук пуз Так оТах ро хо Уаї їй Аяр бБег Ар зв з9й 395 400 -1іу чек Ре Ре їз Тук Бек їує їей Твх Уаїз Авр їв Век Ака Ттр 405 110 415 біп біп біу Азпо/аї Рве бек був Бек Маї Меб Нів сьо Аїз Кей Нів 420 425 430

АвпоНів Тукє ТПпк бів Був Бек Те Яех цей; Бех ро 435 440 «вій» 144 «вії» 444 «?12У ВРВТ «213» Штучна кг» «га» Штучно сиктезована пептидна послідовністі «дом 144 іп дво бій Пец уаї бій бек бі» Аза Сто чаї уз буа хо бтіу Аза і В 10 15 бек Уаі Муз Маі Бех Сув Був Аза бек Сіу Ре Авп о Тіз Буз Бар ТЕ 20 25 зо

Ту Ії бів Ткр Уаі Акч зів Аза Ркбо біу біп біу їй) бій Ткр о Мес 35 40 45 сіу Агу Ііе Ав» рЕо йей Аж Асу бів Тв о Був Тук Пув Сід Буя Ра

За «о січ сту дк уві ТВж Її6 ТЕ Аза Авр Тк Беє Таж Аво ТВх Ата Тут 70 78 во

Мек біб цей Зеб бек ей бхо бек сій Акр ТВх Віа Заї Тує Тук був 85 ЗО а5 п РСТПРОМОЮВАОЯО

Меі БВха Бех біу дк пім РБе Авр оБпе Тер бі бів обСіу ТБг їви Маї тай 105 110

ТЬх Уві Бех Бек Аїв Зак ТВт Пуз Сіу Рхо Бек Уві Ре Рго пемз дід 115 120 125 рко Беж Зак їуз бек ТАх Бех зі с1у Тьх Аза Аза Пес біу Сув Ше і30 135 140 ах Був Авр Тух ле РКО бій Рхо Уді Тах Маї бек Ткр Ав» бек біт 345 150 І55 Бо

Аіа її Так оЯЗек сіу Уаї Нія ТЬБк Рів Ркго Аза Уаї вс бій бетхг Бак 165 170 575

Сіу є Тук бек Пен бВег бек Уа1 Чаї ТНпж Узі рхо бот Бек бек їв 180 і 190 біу тТБж біп Твк Тух її Суз АБв Уві Азп о нів ув Его Веб Авп о ТВх 195 28 205

Кптув Маї Авр був Муз чаї біз Рко дув Зак Суа Авробуз Тк Ніз ТрЕг 210 215 220

Сув Бко Бко Сув Рго Аза Вха бін без Бе); СБУ бі рто бек ах ве оч 230 235 240 їні Рпе бго Бко Буз Ркбо Буз АвроТпх Гей МеєЄ Т1і6 бек АкЯ Тих ржо 245 250 255 бі: Уаї тТькх був Чаї Узі Уві Ввроуаї Бек Нів сфв аАвро ро піз уаї 25550 255 278 був Ріє Ази Ткр Тутє Уві йяр біу Маї біз Уві Нів Аєп Аїв Ппув ТВХ 275 280 2ва їув хо Аху сіз біз біп Тух Азп о Вех тТнх Тук Ах Уві Узі Зех Мах 295 235 зо цей Так уві їжа Нів бів Авр о Ткр пеб деп обіу Шув Сіл Тукх Був с сСув зЗо5 10 зів 320

Іза Маї Бек Авп Був Віз Пе Рко Аза Рко Ї1е бій Був Тбг о ї1е Бек 325 330 335 їуз Ліз Був сіу бів Бко Аку бі Рко біб Маї Тух ТВх Бей РЕб РЕ 340 зав зво

14 ВерІРОВТ»ОВЯВЯО

Зех Аку Аяр сій Тем ТрЬх Був АвпосСіп Чаї бШек йез ТВ Су Той уаї 355 зво зе5

Туз Сіу Ре Тук Ро бех Азр Ііз Атїа Маї Сто Тер б3)м Бек Азв о біу зла Зв зно бів Рго біз Азп Зап тую Пув Трх ТБх реко Ро Уві ївц Аво Бек Двю 385 350 395 т сСіу Бех Бе Рне Беч Тут бек Пув Бей ТЬх Уаії Азр Гуз Зех Аж Ткр 345 410 ч15 бів бів біу Аз Чаї Ре йех Суз о беє Узі Мес Нів сій Ата їец Нів їга 25 зо

АвпоНіє Тук Так Сіп їув беж їй бек Бе) бек Бк 435 440 «210» 145 «2115 444 «21»з» вВт «213» Шеучна «В2Ох «23» Штучно сивтевована пептидна паспідовніств «АООх 145 сів Авр бів Пем Чаї сі: бек с1їу Аїа бїа Уаї Муз ув Ркхо сту дів ї їй 10 15 бБег 7аїі Ппуз уаї Зех Суз Бу Віз бек бпіу Рпе Ап ої1е цу Авр отих -О 2 Ки)

Тук Т1і8 Сій Ткр уві Ако зЗій Аіз Рко сбіу біп б1у їейпостіо Тхв МеЄ сіу йха Тіз Авр о рко ГПеб Авра Акад а1іп ТвЕ уз ТУужЖ Нів сій мув вве во БЕ бо бі Б1Уу Ага Узі Тит ї3є Тахо Ата Авр Тих бек о Твк о йвпотТВх Аза Тух 85 т7а 75 о

Меб бі їецй Бек Беж їевб йка век сі) АвротТиж Аза Мав) Тух ТижЖ Сув 85 за 95

Чаї Акад Зек біу Аку біб РБе Авр РБе Ткр Сіу Сіп Сіу таж без Чаї 00 105 тб тре Уа) бек Вес Аза бас Тр Гуз біу Рго Бек Маї Рпе Рхо цес АТа 112 159 І185

13 РСТАРІО1284047

Рхо бек Бек Щув бек ТНтІ Зех біу б1у ТЕЖ Ата Акта Бей Сіу Сув Ти 130 155 150 чаї цув Авр Тух РБе Рко біч Руо Чаї ТБк Уаї беї Тгр Авп бек Сіу 145 ї50 155 160

Аїа ес Так бет біт уві Нів Тіжх Рне Рко Аїз Уві Без біп Беж Зег те5 170 ії175 біу пе Ту Зехк їей Зах бек Уаї Маї Твже Уаі РКО Беж бек бек Бец що 185 190 сіу ТвкЕ бів Тих Тук тів Сув Ази Чаї Аза Нхвз Був Р» беж АвпоТвЕ а 200 205

Був Уаї Ар о Пув був Уві Сім рРко пу Бег Сув Дер цув Тих Ків тих 210 215 229 був ро Бго Сув Рко Ала хо білої їст 51уУ ЗУ РЕо бек Уві РБе 225 230 235 240 іїва Рьва Ркбз Реб був Ртго ГУБ Аве» ТБт Без Мек Т1іе бек о Аку Тв вто 245 250 255 бі чаї Так Сув аз Уві Маї Абр Узі бак Нів 01 Ар оБхо ста уві зо зе5 та

Бпуа Рре Аза ТІр тук таї АВр сіу Уві біз Увазі Нв дв Аза був тре 215 280 285 пув вхо Аку біз біз біп Тук Аеп Бек ТЬБг Тух Агу Уаї Уаї Беж Уву 290 27535 зо їеи ТЬж Уаї Ше Нів 010 Авр Тер їем дев с1у Був біо Тут Пув Сув за5 Зі 315 320 їуз Уві Вег Авт Ппуз Аа йвцд Ро Аза Бгто тів ій пув Твіт тліє дек 325. 30 за

Був Аїа буз біу біз Еко Акад біб Бко біп Уві Тух Твж рез Рхо Рхо

Зео 345 350

Бек Акч Авр сій цей Тв цу Авп бій Уві беж гей Твх Сув цеш Уаї

ЗБЕ Зо збе

Ппув о біу Рае Тук о Рко Бех Авр Іїе Ачїа Уві бій Ткр бій чех Авпобіу

Зо 375 380

144 РОСТИ ТОВ МО сів рко ШУ» Азп АБО Тує бує ТВЕ ТВЕЖ Ро Рхо Чаї ївй Авробек Авр 385 3990 за апо

Сіу Зес Рне РНе гей; Тук Бех Туз їй Твж Уаії Азр буз бек Аа Тер 405 410 415 піп бій біу Авп Уві РБе беж Су5 Збк Уві Меє Нів сій Аїй Гей Ні 429 125 азо

Азп о Нів Тух ТЕ бій був Бет їецобек пе) Зах РЕе і35 440 «210» 146 «хії»М 444 «ві» РЕТ «Іа» щеучна «вх «-га3» Штучно синтевована пептидна послідовність ка00» 145 іп Авв Сіл о їей Уві бійп беж Сі Аїа біз Маії Був був РрРхо бі Вів 1 В 10 15

Яек узі був Уві Бех См Був Аїа Бек біу РБє Авг о ї1їє Буд Аяр ТЕ

Ка 25 зво тТуж Іі піп Ттвр Уві Акт бів Дів рго біу біп біу без бій Ткр Меє сі Ата тів йвр Рго їж Ак їдв о біпо тн Був Ту Ак Біб Був Ре 5В Бо біз біу асо Чаї ТВж о ї1а тТБт о АлЛа Авр ТБЕ Бех ТНЕ АвбБ ТвкоАїв Тує

БО 70 ТВ о

Ме бім ем бек о бех Без Ажа Бек о біз Авр Тах Аїа Уві Тут Туж Сеув 85 за ак чаї ка бах білу Вже сію Ре Авр о Бре Тхр піу сзіп біу ЖБх Пе Уві об 105 110

Ткт уаї Яес Зак Аіа Зес Ту Пув Сбіу Рко бек Уві ббе Бо Пей дів 115 120 125

Рка бек дет Шув бек Тртг Бех сіу біж ТЬх Аза Атїа Пез с3іу був Без 1330 135 140

145 РОСТУ РгО ТУ 84042

Чаї Буч« Авр Тук Ріє Рхо с1іо реко Уаї Твж Уві Вегобхр АБ Зек біу 145 150 155 160

А1а цей ТВе Вес біу уаї Вів ТвЕОсрРБе Рго Віа Маї їеп сіп Веж бог 165 ї70 178. сіу Пец Тух беж їм бек бех уаї чаї тТавх Уві ро бєтг бер Вехг Тєїй 180 185 190 1Уу ТЕ біп Твк оТук їЩ1е Сув АвпоУві Ав НіЗ був рто бек Аво ТЕБЕ 195 200 205

Хув Маї Ар ув їша Уві біх Рко Мув Зех Сув Авр Гув о Твж Нів ТЕ жо 215 220

Сув РЕ рко Сув рРхо АТа Еко пай іва інй сіу ЗіУу хо бек Уаї РБе 2725 230 235 240

Без ва Рко Рхо Пув Рко уз бар ТЕЖ Пе) Меб їі Бех Ага Тв ОоБКо 245 250 285: сій Угі Тих Суз Уві Чаї Мазі Авр уавї Зеж Нів біз АвроБкхо сій Уві 250 2558 270 їув пава Авп о Ттр тує Узі Ввр біу Чаї сі чаї Нів Авв Аза Ппув Тне 275 о 285

Був рко Ак Стій біо біб Тук Авп бек ТВЕ Тук Аха чаї Уаї бек чаї 2959 285 300 ївц тах уаї їз Нів бій Авр» о тТжр пе Авпоб1іу Пуз біз Тук був Сув 305 10 315 320

Гуз Уві бак Аз» Був АТа фік о Рро Аза Ркз ї1е біз Шуз ТБкЕ її бек 325 330 335

Був Аза уз б01у бів хо Ака бі реко біп Чаї Тук ТвВж Бей Ро РКО 540 І 385 з5о

Яах Акт Ар біз бем Тих їуя Ав» біб Маї бах Бей Таж Су пем о Уаї

З55 зво 365

Був пзу Ріє Тук ро беж Авр їїє діа Уаї біл Ттр бів Бек Авв бу

З7о 375 ЗНО. бів ро біз Ап оАвв Тут бу Тв о ТБх Рго Рко Уді Бей о Авр бек бвр

Зв 390 395 400

146 СТР мОВО сіу Бех Ре Ре Тез Тук Зеї Шуж їеи Тьт Уаї дар пув Вк йху Тур 405 їй 5 сіп біп сіу Або оУаї ББєе бег оСув бек Маї Меб Нів Сіц Аза їец Вів 420 4135 430

Ави Нів Тух Тік обів Нуз бек Пец бек Пес; Бех Рко 435 440 «віх 147 «ії» «44 «чаї РЕТ «213» Щеучна ках 223» Штучно синтевзована пептидаа послідовність «005 347 біп АБв бів Теб Чаї сію Зежх С1у Аїя біп Уаї Пух Пув Рхо біу Дів 1 5 10 ї5 век Маї їв Чаї бек Сув Мув Аїа бек Піх Рпе Аве їі пу Дер ТЕ 28 25 зо

Тук ЇІ1їе бів Жїхр Чаї Яка Сію» Аза Рко біж Біб БіУ Бей бій ТЕр Меє 35 до 45 шу Ажха пів АБр Рко без Ак Ні сів Тк буз Тук Ах Б1з пуз ББе 50 55 во біп біу дха Уві ТвкЕ Ї1є ТВг діз Авр Тпробех Твх Ави оТвВге дів тух 7 175 о

Меб зі дей Зек обег оБбей АгчЯ бак обі) Дар Тих АТа ві Тук Тук Сув 5 за з5

Уаї ака бек 21у Атг4 біз РБа Авр обБе Тер су Сів Срьу Те Без Уві 182 105 її три мах бек чЗег Аїз Бак ТБЕ був 0іу Реб бек Уві Рюе ркго Пей АТа 115 129 та бБхо Веб Бої їхуа бек Тнж бек Бі ЗУ Тйх Азіз Аза йец біу Сув пев 130 535 140

Ууаї Був Вар Тух РБе рхо сіб рко узі ТБВх Уві Зет Ткр Авип бек Сі 145 150 155 169

Віа беи Тк бе» Сіу чаї Нів ТВі Ре Рко Аїз уві ба бів Бек Вег 155 170 175

147 РСтТЛРІВТОЛВАОЇ

Сіу Пез Тух Вех їєм бек бек Уві Маіїі ТБх Узі Рко Явжх беж бет Бей во 185 150 сіу Твх бір тТнж Тує її був Авпоаї Авзп о Нів пу Рхо Чек дп Тих 125 200 255

Туз Узі Авв був Був Маї біз Рко буз бех Сув Авр о Ццув Твьх Бія ТвЕ 210 215 2725

Сув рРко Кто Сув РхтЗз Аза Рхо біз Гей Гей біу біу Рко Зак Ма) Ріє 225 230 735 240

Бей РБе Рко Рхо пу хо Сув Вар о тнх їй Маї Ті бек йкд бвх рхо 245 250 вве бі: Чаї Те Сув Уаї Уві Уві Авр Уві бек Нів Сі аБр орго іо Уаї 250 265 270

Мув Ре Аз оТкроТує Уаї Азр сіу Уві бій Уаї Нів Ав Аїв Ппув ТЕ 375 280 285 уз Ро Аг біб біз біб Тух Дві бек ЛВЕ Тух АкЯ Уаї Уаї бек чаї 290 295 390 їв Тих У«і Бе» Ні біл о Авр ото Пемй Або Сі1у пув шій Ту пуя Сув зо5 310 315 за

Буз Чві Бек Аза Пув Аза Пей рхо Ата Рхто Ті 5ію БПує ТВу т1їе Зах аза 35

Був Аїа Був О1у біп ржо Ах Зі РКО біп Уві Тух Тнж рем Ро Кто 340 зії 350

Зек Ага Авройпія Без Тк був Аз» зіп Уві беж Гей ТЬж був дез Уві зво зва

Бу Сіу Бре Тус Рко Зех Авр І1е Аїй Уаї Сіц Ткр 010 Бех вва бі 370 375 зво сіб рго біз Аяйп Ав Тук Буз Тс Тах Его Бко Уаї Боб Авр Зак Авр зя5 390 395 «90 біу бек Вде Рів пей Тук Бех Пув їез Твх Уа1ї Авробув Бех Ака Тер. 405 430 415 піп сів сФіу Аза Уві Бве бек Суз беї Маї Мес нів біб 18 Цей нів 220 425 430

1418 РСР Одна

Апо Нів Тух ТВх сій Був бек рей; Бек ШПеп Яех рко 435 440 «10» і45 «11» 444 «812» Рв? чеї3» Штучна «ел «223» Штучно синтезавана пептидна послідовність «400» 148 бСіп Авр о бів Ппеч Маії бій Бек б1У Ата бі Уаї Ппуз Авпобрко Сіу Аїа. 1 5 10 15

Бах Уаі Був Уві Бех Сув цує Аза бек біу Ре Вей Ії Цув Авр ТЕ 2а 25 за тТук їіз біп Тгр Заї Ак бів діа Ро біу бів бШіту ба бії Тхв мех 40: а бі ака Іїе АБр Рто Бей Агу Ага бів Таж о Бус Тук Ака іх Буя Ра о піч сіу Акта Уві Твж її Тв Аїа аяр Тк Зах Твх Авто Тож Аїв Тук 65 те 75 ва

Мас біз Ппез бек бБегс Гец Аху Аза біз Авр оїБх Аїа Чаї Тут Тук Сув 85 за 85

Ууаї Акоа бек С1У Ака О14 Бе Ар оЖух Ткр обіу Біб б1іу ТВ Тєм Ук 100 305 110

Чик Чаї Век бек Ліа бек Тих Пув Сі Вхо бек Уві Ре Рко Мей Аза ї15 ї20 125

Рхо беж Бех Муз пек ТБт беж бі біу ТЖбж Ахїв Аха без Бі Сув рей 130 135 140 таї був АвроТук Рі Рко бі Бко Маії Тік Уаї Зех ТЕр Азп бек б1у 345 150 155 360

Аїа пава Те бес 01у Маї Ні Твг о Бве Рго АТта Уаії без біп беж бек 165 170 175 біу їви Туєс Бех фей бех бег Уві Уві Тих: Май Рхо Век бек бек Тез 180 185 190

145 ОСТРІВ ОВО

Бі Ток біп Ток Тух Іі Суя Ав Уаї Авп нів бує Ро Бек Авт ТЕ ї95 290 хв

Тгу/в Чаї Авр Був пу Уа біб с Рко Буз бег Сув Авр о Мув Твх Нів ТЕ 210 215 225

Сув о Бко Рко був Рхо Аїа же біз Бей пе сіу с1іу Рко бек 7аї ББе 225 230 235 240

Меп Бде ко Бгто Цув Реб Ббуя Авр Трх тей Мес Ї1в Бах АКа такс ово 245 250 255 сіз Уві Тих Су Уві Увь Чаї Азр Уаї Зв нія Біч Авробго бій Уві зо 265 27то ув РБе Ав бур о Тух уаї Авр Сіу Уві сів Уаї Нів АзпоАїяа Був Тих 275 то 285

Був рко Ак сій біз біп Тук Ай Беб ТБх Тух Ах Уві Уеі бЗех уві 290 2ав 300

Тез їйкх Уві її Ніз сіп Авр Ткр Пец Двв бі ГСув біз Тух Був Сув 305 з10 15 зга їв Уві Бех Авпопувз Віва йей Рхо Аза Рко Іїє Бій Гув Таж їїе Век 325 з3з0 зав їв Азїа був б1у сів вхо Аха їз Рсо бів Узі ТУж Тахо без Ркб рхо за 345 з5а

Бех Ах Авросо1а Пем Так о Пув Ави бій Уаї беж Бей ТБж Сув Пейп Маї 355 зво 385 пув біу Рве Тук Бто Зек Ар Їїз Дів тТаї сій Тгр осіб Бек Азп С1у 379 зт зво сіп ркз біс Авап о Аве ТУук о Пуз Так ТЕ вБго Рко Маї Бо) Ар бек Аве 385 396 55 450 бі бек Ра Ріе Пцез Тує беж Буз Пец ТЬЕ Чаї АвроБбув Бек Ака Жткр 405 4195 415 сій бів Сіу Аво Уві Ре Вес буз бек Уві Мебс Нів бій Аїа СПек Ніз 420 225 439

Ап оНівз Тух ТВ біп пув Бек Гей бек бей бек Рко 435 440

150 РСТЛРАНОУОВЧОІ «210» 149 «811» 444 «9192 РЕХ «233». Штучидв «20» «823» Штучно синтезована пептидна послідовність «ща» 149 бів Ввр бів їей уаї сів бек б1у Аза Сім Уві Пйуз Авпорко Сіу Аїа ї 5 10 15

Бек Чаї пує уаі Веж Сув Був Аїа Бак біу рРрє Авпої1їе ув АвроТвБх 29 25 зо

Ту їв бій Тхр оЗаі Аже зЗім Аза рхо ту бі біу пем Сі) ТЕр Меє й 45 сіу ака т1і6 Авр Рхє Бей Ажа Акад бЗів Тьх Пуз тує Аха біз їув Ре

В 80 сти сіУу Акгу Уаї ТВкК тіє Тв Аїа Ар ТнтІ бек ТК оАво отак Аза Тук 65 та а ва

Меб їі» Тен Бек Беж Печ йга Бек бМмх Авр Твх Азїз Уві Тук Тук Сув 85 зо З5

Уві Аку бах біу їжа 5іїз3 РБе Авр Тук Тхр боту бів біу ТБВж ем чаї тра Іб5 310

Тапс чаї Бех йек Аїа бек Твх Пцув сіїу Ркб Зах чаї Бе ржо ви Азїа 115 120 25 рхо Зак обох був Бех Тих бех біу біу ТВх Аїз Аїа Геш бі Сув Мей ї30 135 149 чаї уз Азр отТужк Ріє Ро бій ко Уві Тож Уві Бек Тер. Авп Бех 01У 145 150 155 160

А1їа йес; Тіт ойех 0іу Маї Нів Тьх ре рко Аза уві пей бій беж бЗеве 185 179 175 піу їед о Тук бек Бей бек Бех Маї Уві Трт Маіїі Бхс бех Зехт Бех Пи їіво і8н5 150 піт тних біп Те Тук їі Сув Ази Маї Авп Нів Пув Рко бек Авп ТВх 135 209 205 пув Уаї Азробує був аї сі) ро Пув бех Сув Авр був Тих Нів Ти 210 215 тео

131 РОБІТ МОВИ

Сув Рко Ркто Су рже Ата с рко біб бе Бе біу біу ро Шек Уаї рве 225 230 235 540 іє: Ре Рко Рко цу Рко Пув о Авзр Тк Ге Мей Тіє бог Аква Тк Рко 245 250 255 ста Уві Тахо був уві маїі чаї Азр Уаї беж Ніз біш Авр Бо Сід Уві 2560 255 то пу РБе Азб о Тер Тух Ма«ї Авробіу Уві біп Чаї Нів Ап Аза бує Тс 275 250 2в5

Мув Его Аа зіз біз біз Тух Асп Бех Твх ух Аку Уаї Уаї ЯЗзк Уаї 250 225 зп їве Тих Уві Бей Пів бів Авр оТкробво дей 51Уу був с1б Туж був Сув зЗо5 319 315 390

Іуз Чаї Зек Авп о Гуз Аїа Бей Ржо АТа Рко ІБе буш Туя ТБ їїе Бет 325 зо з35

Бу Аїа уз біу Сів Ро Аку сій Рхс бів Маї Тух Тв Бей Ро рко за 345 350

Бек ат Ар бі: їйшжа Тпт уз Авп бів тах Бех Іза ТВх був йо Уві з з650 зба

Іра біу Ре Туг Рко бех Авр Ії Аіїз Чаї Біз Тур Сі бек Аза оіу 370 375 зва сій рхо біл Ази» дв Тук Був ТБВх ТБ о Рко Рео Уві Бей дар бек Ав зв5 аб 395 400 бі Ветг бів Рів Бей Тук Бек Кук Шез ТБ Уаї Авр о був Ве Ага Тер 405 «30 415

Сів бів біу Азп уві Ре бех Сув Бек Уаї Меї Ніз бій Аїа їви Яів 420 425 4за

Ави оНівз Тук Твх Сіп Був зак без бе їйсц Бех Рко 435 440 «2302» 150 «2112 541 «212» БАХ «13» Штучна «20

152 РСТАРНИМОКАОВІ «ваЗх Штучно сивтозована пептидна поснідовність «41005 150

Біб Авр бій Мей Уаї 12; Бех Сіу Аза бів Чаї Був ув Рко біу Аїа ї а то і5

Бех Чаї Пув Ууаї Зек Суз муз Аїз бек сїу РПе Аза її Буз АвротТвх 25 25 зо

Тук її б5ів Тхр уві Аку біб Аїа рРхо біу бів біу цец сСіз тТжр Меє зо ло 45 ту Ак Іе Авзр рез Пей Ак їм іпотек Був Тук дЕщ обі Бувоврне 5О 55 60 сів біу Аки Уві Таж Тіє Тих Ата Аве оТвт Бек Жак Авпотвх Атїа тує 55 7а те во

Ме 5Іб; Гей зу век Пес Ака Бек Сі Азр отак» Аїз Уаї ТУ Тук Суз зо 55 ччаі дк Заг бу Ах М: Ро дер Тухк Ткгв бі бі піу Те Бей чаї 160 хо5 110

Тех чаї дек Бех Аїа бек Тах Муз зЗіу Рхо ех Уаї РБе рксо Шей Аза 115 120 125

Ро Зек бек Буз Бех Три Беж біу біу Тих Аїа АХа лев сі Сув Печ їза 135 150 чаї ПЦує Аве Туюк Різ Рхо сі Ехо Уві ТВЕ уві бек Ткр деп Зех 0іу 145 150 155 150

А1з Без Тк бек бі Чаї Нівз ТБх Рре Рко Аїа Уаії іївиа біз бек Бех кеб 170 ї75 січ їй Тух Бек їй йеж Зак Уві Уві Так Уаї Ржто ет Бек Бех Пец 180 хВ5 190 сіу тн бів ТБх Тух Тіє Суз Авто Уаї ВзпоБів мук рРхо Бек АвпотТвЕ 155 200 205

Був уаї дер їув Гуз Маї біз Рко пуб бек Сує АвроПув ТБх Ніє ТБ 210 215 220

Сув БжЕєе Бго Сув рРжо Аа Рго піч пез Гем СТу біу Бко Бес чаю ве 225 230 2538 249

І РОСТЛРІ2О12084042

Тез вве Бго Рго Був Рко Буз Авр Тит Гей Меб І16є бах ку ХаАк орто «45 250 55

Стій Уві Твк Сув Уві Уаї Чаї Аво Уві Бек Нів біз Авр Рго бій Уві 2560 255 27О)

Буз Бре Ап о Ттр Тук Уві Авр Сту Чаї 03и Уаї Ніз Ав АТа їув Тв 275 280 285 уз Рко Ак біз біз Сіп Тук Аво бек Тіт Тук Аж туаї Уві Век Чаї 290 295 зов

Шецч Твг Уві пес Нів біп Вар Ттр ївц Авпобіу Був бій Тут Мпув був за5 зта 315 за

Був Уаї Бех Ава Буя Аїв їйей Бгто Ада РрРко її ОМ Був ТнЕ ІВе баг

За5 зо 335

Пув Аїа Був біу сіп Рко Ак біб: Бко бів Уаї Тух Твж Гей Бо го 340 545 350

Бех Аку Авр и бій Без ТАК Був о Аво бій Уакю беж бе ТВк оСув ем МВ: з55 360 зве пух Сіу Зайве Тук Рго бек Авр о тіє Аіз Уаї сід Тр бо Бек Ап с1іу 370 375 зво бів рхо біб Ава Авп оТук Пузв ТвЕ ТБ реко бро чаї цей Авб Бех Авзр з85 ззо0 395 100 б51у Зек РБе Бе їйво Тук бек Буз цей Тих Уві Авр був Бек Аку ТЕр. 405 «16 415 сіа 0165 сіу Ав Уві Ріє Бек Су Бех Ма1 Має Нів бій. Аза Бех Нів 420 «25 4

Ави Ні Тух Тнж Сі був Бех дев Вех їжи бек рха «35 448 «210» 151 «ії 7 «віях РЕЖ «213» Штучна «г20х «223» Штучно сикжезована пейптидна послідовність «по» 151

Зате біу Акад Бех Рпе Авр ЕвВе ї 5

154 РОТА РТВ 047 «910» 152 «ії» 7 «812» РЕТ киїЗ» Щвучна «г» «223» Шеучню синтезована пептидна послідовність «оп» 159 ех Зіу Ак бій РБе Авр Бра 1 В «210» 153 «вії» 17 «219» ввх «213»М Штучна «0965 «223» Штучно синтезована пептидиа послідовиїсть «оп» 153

АкЧ їіе Ар Рко Пец Акоа Аку бій Так Пує Тук Аха біз Гув Вре Буш 1 Б 10 15 біт «ато» 54 «її» 7 «аій» ВНТ «віз» Шхучна «Ох «сиЗ» Штучно синтезоваива пептидна послідовні стіх капо» 154 бек сбіу Твжх Век ре айзро рве ї і «210» 355 к«віїх 17 кеїйз РЕ «213» Штучна. «Ох «23» Шкучно синтезовава пептидна послідовність «йод 155

Ак І1є двр Рго їні Ака Ахо бетг Тх Пуз Тук Аква біз пуз Рре ша 1 5 10 15 сІУ

Ії ЕСТАРООІ 2 О84042 «вї0х 156 «їх 17 «гіїх РЕЖ «і» Штучна «Тай» «баЗ» Штучно синтевзована пептидна послідовність «до» 156

Акч Ііе Авр орко Бец Ак Сі) бій Твж о буз Тут Аво бів пув Ре 61 1 В 19 15 сіу «105 457 «1ї» 17 «212» РЕЖ

КРІ13» Штучна «20» «ЗУ Штучно синтовована поптидна послідовність чом 157

Аху їі Авр Бхо Без АкооАгу біл Тв Гуз фут Нів біз Пуз ВНе 03 ї 5 19 15 сі кеї0» 158 «ії» 7 «2122 ВТ «13» Шкучна «?йх «ба» Щеучно синтезована пептидна побслідоважютьв кабо» 88 бек біу ха 010 РнНе Аве Тук 1 І 5 «210» 158 «Щ1ї1ж 17 «иа» СРЕТ «2132 Штучна «ах «223» Шеучно синтезована пептидна паослідовність «8002. 155

Ака їЇїю Аво Рко цей Аку аку 035 Твг Му Тух Буг бій був Ре 19 3 5 19 її

Із6 ВЕСТЛВЦИ ІКАО -1їу «вій» 160 «211» 17 «212х вв «233 Штучна «вв» каві» Штучно синтевзована пепхидна послідовні сті» «оо» 160

Аку Ії Вврорхо Бей Ак йув бів Тк о Буз тує Аха сіб пуд Рне бІх 1 5 то 15 ву «Вій» її «в1їж Х7 «212» РЕЖ «213» Штучна «вОх «к«ва3З» Штучно синтевована пептидна послідовність жа» 161

Аку ї1е йвр орто їшна Аку Нів с305 ТК Му Тух Ага сій Буз ЕКБе щи 1 5 10 18 бі «105 155 «п1ї1 23 «вій» вет «213» Штучна. кла» «ах Штучно сиктезвовина пептидна послідовністю. «що» 167

Аку їїє бів Меї ТрЬг біп бек о Рхо Вег бек Пей Важ Азїа бек Уаї С1у 1 В 10 15

Авр о Ака Уаї Ту ї1їе Тих Суб й «їх» 163 «ч«вїїх 11 «віг» РЕЖ «Т13ж Штучна

7 РОТА РІО 2ЛВЯВЯУ «а? «273» Штучно сичтезована пептидна послідовність кадо» 163

Акч Аїв Бек бів Авр їз Нів Мув Тук ї1їє Аїа 1 5 10 «ій» 164 «-іїх 8 «ві» РЕЖ «213» Штучна «ай ки» Штучно синтезована пептидна послідовність хо» леї

Пезч Біп Тук бін біп Бе йха Таж ї 5 «105 65 «21ї» 568 «195 РЕЖ ж135 Масаса зиіакка або 1655

Мес вхо Ата зЗіу Акч АхЯ Мебє біо Мебс їв Яеж Аза сСіу Ака чаї Ргб ї рої 10 15

Аїа ей їша Без буя Бей ші Рпе Нів Пеп Ппей біп Аза Уві Пец бек 29 25 Зо

Твк Твж Узі! Ті Рхо бах Сув Іїе Ро біу бів Вот бек Авр ойвп Сув

ЗВ 45 45

Трх Ада тей Маї біп ТнЕ бів Аер Авп о Бко Аж уаї Аза бів Маї Бек

ЗБ ва

І1о Тіг Був Суб Ап бек Азр Меб Ахп о бСіу Тух був Пец Ніз біу бій 7а 75 зо

Сув їїє Тух Твйи Уві Авр Меб бек бів Азйп Тух Сув Ат Сув біц Чах ва 90 5

С1і1у Тук Трек сіу аї Аку був біл Нів РБе Тук їв Тит Уувї Ні був 300 105 110

ТБжо їби Ват фув бі: Тук Уаї Аіз тей Три Уаї Тіє Бей т1їе їїТа Тео ї15 120 155

ВНе їва тів Її Уві аї с1іу бек Тах Тух Ту Рве Су Вха Ткр Тух

1585 РСР В2О МОВО 30 135 129

Ака Азп о Аха пув о бех Буз бім Бко Пув тув біо Тух бій Аку Уві Тве 145 155 155 60

Зежк Сі Аво Ркб бій Без ко бів Уві 355 кизбх 156 «її 1510 «212» РЕтЕ 713» Неошо варьепе к400» 166

Ме Аг Бго ех Біб Тих Аїз б1у Аїа Аза їй пев й1їа Пей без Ата 1 5 То ї5

Кіа бен Став Ро АТа Бех Акуч Аіа їЦен біл біз пу Муз Уві Сує Сіп 20 25 30 сіу ЖнЕ Бех Аві Був їй ТВхг осів їва сіу ТБх РБе біб Авр Ні РНе 35 -О 45

Без) Зак йо бій Агу Меї Рне Авап оАво Суз БМ Маї Уаї Бей бБіУу Де. 5О 55 5 їеа Бім Хі Тк Тук Уві біз Ак Ай Тук Авр Без Бей Ре Бей Бу 65 79 75 во

Твик тіє бі біз Уа) Аїв сіу Тух Уві пев її Аїз це) Авпожтвх чаї я 50 З біс Акад Ті Рто ївч біб дв) Теш сій Тіз їїє Аку біу бав Мет Тує іп 105 ща

Ту 51 Ав бек Тук Аіа їжу Аза Маї Пез бек Авв Тух Ав» Аїмх Ави 120 ха

Був тТвке біу Бей Був сів рем Бкго Месє Аж Аєп ей бів біз 18 Бей 138 135 140 нів щ1іу Аїв Уві Ако Рея Беб Ава Авт Рко Аїа Бей Сув АвппоУві СТО 145 150 155 160

ЖХег її сів ТІтр.Аха Ав; їТїе Уві бек бек Азр Ріє їз Бек Азп Мек 185 170 175 бЗех Меє двр Бе біп Ави Ніз бе сбіу Зех Сув сід Був Сук Авровхо 180 185 1950

159 ВСТА РМ ЗВО

Бех Сув Рко Ав бі Бек Сув Тер б1іу Аїа б1у 015 бій АвпоСув Сів 195 200 205

Буз Пес Твж Муз Т1е Іівв Сув Аза сів біп Сув бЗех біу йо Сув'акгФф 210 215 220 шіу пу Бек Рко Бех Авр був Суз Нів Депо біп Сув Аїа Аза біу Сув 225 230 235 ав

Твж о1у вхо Ак бій бех Авр о Сув йей Уаї Суз Акад був рве Ак Авр 245 250 255

Азїа Тк Су їув АвроТнс о Сув Ро Рхо Бей Ме Тєц Тухк Аза Рго

Бо 265 «а таж тах Тук сій Меї Авв Уві Азп орто біз сЗу був Тух Зевж Брав б1у 275 280 25

Аїз Тож Сув Уаі Був Був Су РКО Аку Аваи Тух уаї Маї Тйх Авр Ні 250 225 Зоо сСіу Бех Су ЧУаї Акту Аза був біу Аза Авр бек Тук б1а Мебє бі б1 зо5 З10 215 320 двр о сіу Уві Ак Пув о сув пув Був Суз бів БХу жо Сув о дку Буз ах 225 зва 335 був Авипоб1У Іїв с1іу тів біу Сію Бе їу« Азр Зах Гей бек Іїе Авй 3495 з4х зо

Аїва Тих Аве ї16 Був Нів Ре Мув Ако» був ТЕ Бех Пе век сІУу бар 355 збо 365 їзви Нів т1іє Шєо Вхо Чаї іа вна йха сіу Авр о Зех Рювє Тйх Ні Тис 379 зт зво

Бо рго Белл Азрорко біп біб їз» Ар оті ївм Буя ТВ оМаї цу ІЧ зЗ85 за 395 400 її твс біу Бае Бей їй ї1е бій Азїа Тер оБхо бі Ап АтЯ ТВЖ Авр ка 410 415 їви Ніз діа бле біз Ав Бей біз Тіе тів АкаЯ Сіу АкЗз тТвЕ пув бій 420 425 1359

Ків біу біп рве бак їй Аіа Заї Маї Веж Тем АвпоїжХе ТБж бек їжа 4зя 440 4245 їх РОТАРУ біу їз Акту бек пей Був біз Ї1їе Бек Авробіу Авр уаї ЇІ1ї6е Іїв Бех 45О 455 Аа сіу Ап о цу Акп о ївй Суз Тух Аіа дай Тк Т1ів Аза оТхр Був Шуя Без 455 470 475 480

Ве біу ТВх беж біу біп пув ТНк Гуз Ії Іїє бек Авп о Ако сіу бі 485 а9о 195 дав Бек був Був Аіа Твк Офу бів Уві Суб Нів Аіа їєсв Сув бек рРхо 500 5О5 510 іч с1у Сув ТХхр о біу Ржо алі Рко Аку Ар о Суз Уві бек був Аку АваУ

ІВ 520 525

Маї Век Аха БІ Аку сім Суз Ма1 Авр ув Сув Аяпоїво Бей іч у

ЗО 535 БАО січ Рко Ага сіл УБе Уваї Сій Ав Бек Сі Сує ЇІ1іє бі Сув Нів РКО ав 5Бо ві БО січ Су ївм Рхоа бів Аїз Ме Ав ої1е Тк Сув Тк 1у Ак біу вхо

Ба 570 ж

Азр Аби Сук 115 бів Сук Аїа Нів Тук Ї16 Авр о сіу хо Нав Сув Уві 5ВО БО ЗО

І Твх Сує Рко Авіа сіу уаї Меї біу Бій Авп о Авйп ої Ге Уаі Тгр 5а5 50 595 цу Тук діа Ар дів Сіу Нів аз Сув Ні Без Су Нів о рго АБап був біо 5 529

ТвЕ Тук бСіу Суз Так Сіу Рко біу еп біз біу Сув Ркео Тож Ав» оБіу 63а 535 Біо

Рко Був ї1є бхо бек їіє діа Звк о йпіу Меб Мал сСіу Аїа Шейп Пвмз Гей є45 во я ієз По уаї Уві Аїва ві сіу Їз6 5Біу Пей Ре Межє Ака Ага Ака нів

БО 665 570

Іїв уві Ахсп Був бо Тв пей Ат Ако Іечй во бій біз Ак біз Без 575 бо 85

Чаї бій Вхо Без ТБх Рко бек С1у 61 Азії с рхо Депо бів Аза бах дей 590 6555 700 і8і РОТЛРЦНН ОВ

Ага ї1їе пез Був сої Так сіб Рйе Пув їув Іїе Пцув Уві реп біу Явхк 705 710 715 7209 стіу А1а Ре біу ТБк Ма) Тук Пув 53у їйва Ткр Іїе Рко бій піу сій та5 730 738

Буз Уаї ЇТув їїз Рго Уві Аїз ІЗ буз бів їзи йо біз А1з Тк Зах 7тас 745 75 вто ПЦув Аів Аза оБпуз ія Тїе беп Авр бів А1їа Тух Маї Меї Аїв Звк 755 760 755

Уві Авр АБО Рго Ніз Уві Сшжв АкФу Ге) два 01у Їіє Сув йец Тих Ве 770 Зв то

Тьг Чаї іп Бей Ії тТьж Сіп Бей Меб Рхо Рбе біу Сує Бем Тез Ар 75 750 79 но

Тух Уві Аку іч Ніз Був Азр Авп їіз сїу бах бій Тук Бей зві Ав ва5 810 815

ТЕр буз Уаї біп Ії Аза пуза біу Меб Авп Тус цей зій Авр Аху Ак го 825 83

Темні Уаї Бів АКкЧЯ Азр Бей Аза Аза Ах Ав оМаї їши Уаї Мув Тих рКо 835 540 віх біп Нів Уві Мув ї1іє ТБх Авр РБе біу пей Віа Пув' йпви Бех ську Аїа в5О 855 або ші бід був осі Тух Нів о Аїа ОТ сСіу С1у бує Уаф ржо Тіе дув Тер

Ее5 в7о 875 ва меж Аа Сез бБ)і; Беж ІЇ13е6 І-енх Нів Дкз Тіє Тук ЖЖ Нів біп чдежш Авр веб вад 8538 чаї Тхр бек Тук біу Уві ТЬж Уві Тхвр сіб Бей Меб ТнЕ бе щіх Вег зво зо5 919 їув Рко Тух Аво біу І11іе Рко Атїа Бак бі» Тіз Зах ВЗек ї1іє Шем сїш 915 920 975

Був біу біз Аха їйед о бко біб Рхо Рхо Т1е Сув Трж ІЗ Азр Узі Тук азо 935 з4о

Мебє їів Ммеє Маї Пуз Сув Тср Меї 116 Авр Аза Авр лек Акч ржо Пух з45 з50 55 зо

152 РОСТЕ ТВА

Рне АкЧ4 сі Гей її Ї16 біб Ббе Бех дув Ме діа Аха Ав орто 18 зе5 570 875

Аку ТУЖ їз Уві їїз біп бБіу Азр' бі: Аку Ме Ніє їв хо Зех Бко з80 з85 5930

Твх зо) бек Ап оре Тут Аку Ала їй Меб АвБр бі біз Авр Має Авр 95 0600 1005

Авр уаї Уаі Авр АТЗ Авр обі Тук обейп І1з рРхо бій сій біу рБе 1010 1515 1020

Ре Зех зек ро Бек тик Баг Ак Тит Ро Бецй без Бот Бек Гей 1025 та39 т035

Бек Аїа Тв бек Ав оАвп Бек Твт Уді Віа Сув т1їе Авзр Акч Аве 040 1045 хо50 с1у цей обіп бБет Сув Рго Тіє уз б1ч4 Авр бек Ре Пеп біп ЗАКО 1055 5050 065

Тук век Бех Азр о рхо Ток 9іу Аза Бей тах сій Азр беж її0 Авр 1070 10758 1088

Авр оТвх Бе Тео РКО Маі Ра біз ТУк Те Аби сів. Бек Чаї вхо 10855 5059 1095

Був Ах рго Аза біу бек уаі біп Авп Рко уаї Тут Біб Ав обіп 1106 1105 1316 вко йецп о Авпобко Аїв Ркго бего йку йвзрорго Ні Тук біб о Аврорго 1115 1120 1125

Ні бек Тит Аїа Уві Щ1у Авв о Бгто піч Тух їви Авия Жвх о Майї с о4тЕ ї5за 1135 1150

Вез Так буз Уатї Ави беж ТНх рБе АяБ бак Ро Аза біз Ткр Віа 145 1155 1155 сій Буя шіу беб Нів біп ї3є бек їєз Авр Авіи рхо Авр Тук бій 1160 1165 1570

Шу Авр о рРМа не Рхо с цув біз віз Був Рго Авт біу 18 Рбе Гуз 1175 1180 т1185

БІу бек Тнжх Аза бій Азп о Аїа БІ Тук їзи Ах туа1ї дів рхо сій 1190 1195 1ії290

183 РСТЛРОЮЦІОЮВЯОЯХ

Бех Баг бів Ре Іїв сіу Аїд 129 1216. «2105 167 «211» 169 кити» РЕТ «213» Ново зарівзив: «00» 167

Мес ТЕ Аїа сіу заго Ак Меж біб Мебс ей Сув Аїа Сі Ак Уві ржо їх 5 30 15

Кіа їши Ппей Пеа Сузв їжи: ЗіУ РБе Ніз Бей Пен бів Аза УЗ) їй Зек 20 25 36

Тіх Тйх чаї ї1їе Рго Зех Су Ії рхо 51їу зі ех беж Авр о двп о Сув 35 43 45 тТвх Азїа Без Уві біб ТЕ бій Азр оАвп Рхо Ак Уаі Атїа вію Маї беж во 55 во

Ії ТЕЖ Тує Сув беж бек Ар Має Авп бСіу Тук Сєшжв Тем Ні Сі бБїй 55 79 75 о

Сув Тіз Тує Бец Уві Дер Ме Яаж Сіп Депо Тук буз Вк Сув Ста Маз з5 біу тТух Те сту Уві Аху Сув біс нів КБе Ре ем Твх Маї Нів Шів 100 05 1310

Рко ва бек Гу біз Тух Хаї Аза їва Твг оУаї їіє їец Ії Її Щек 115 120 155

Епе цей ХіестТвкоУвї У«к1і б1ж Бек Те Тух Тух РБе Сув Аку ТЕр Тук їі 135 140

Ахс Авп Ахоа Ппув бек Гуз сім Бхо Шув Був бій Тук Бім Аг Уві Твх 145 ї50 155 160

Бек біу Авр Рто Зі Гей Рхо бів маї 165 «102 168 «шах 15 «а12з РЕТ «ї3» Штучна «т20х 2223» Штучно Ссинтевована пейтидна послідоввість

164 РСТДРМИОЮВаОЯХ «оп ї68

Меє Стьу Тер бек Сув Її І1їе Пей Рре Беп Маї аіза Те Аїзвз ТЬт Сіу 1 а 10 15

Чаї Нів Бех «ій» 169 «231» 507 «иїй» ДНК «б13х Ноюо варіяпа «00» 1659 акдасечеча счадцдасзає здачаєщесс єдкоссвдса дадбссесбада зебдеваске 50 тасесвачаве бссабсьеоЄ асвауеваїо сссвпеасва сбаабозекос аєсаєаєвес 120 зсадавовоує сезаєдасав ссасасацаї бас ссавда сацавчасав хссасува ва 180 чЧахспаввої сзахєазсваяа Чдоасзудсссе дасатоваєя дстасєсаєке дсзбуцчцасад вай

Ечсасстхасєс Каабадасає дадбсаваас гвоссосвуЧі чочЧчавгабоаца безкассаФе зо чеосуаєоєд насаскесвЕс сЄрсаасосдєс сзссавоссЕ гладсвааазча чсакдецасе З6о вЕдзссусдв Ессе сас Ба вевоМо вЕсзсзуєсЯя гсаУусссас абтавсвьесва 420 тчЧозаасуде асадаваєсх азазацєксвав дазссвавуя аадчавсавоа дача есвос 480

Єсзацадасс сачвассцос дсававо 507 «2105 70 «вії» 45 кої РЕАТ «2їЗ» Масвсов Хазвсісаівккв «ао0й». 170 чаї Бех Ії тах Гру Суа Ав оБех Аяр Мебс Ап сту Тужх Суз Без нів 1 5 19 15

З1у біл бує Ізе Тук їєтз Уаї Вар Ме Бех бід Аза Тух Суз Ак сСуз зо біс Уві біу Жук Так сіу Уаї Акч Сув бій Нія Вбе Тух Ге «вій» ілі «еїї» 34 «гів» ВЕЖ «213» Нощшо варіння каз ІТ

Меє уві ем бек Твх Тех Уаії їїе РЕ бек Суз ті Река Пфу сій бек ї 5 то І

1655 ВСТА РОТ Я042

Зех Аяр Авп о Су Тнг о Ата поем Чаї бів Тбх бір АвроАвп Рго АгФоМаї

Кі зо їз сій

Claims (7)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло проти епірегуліну, яке включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка відповідає варіабельній ділянці важкого ланцюга в 5ЕО 10 МО: 150, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка відповідає варіабельній ділянці легкого ланцюга в 5ЕО ІО МО: 141.

2. Антитіло за п. 1, яке включає константну ділянку важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 30.

3. Антитіло за п. 1 або 2, яке включає константну ділянку легкого ланцюга за ЗЕО ІЮО МО: 27.

4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, яке має нейтралізуючу активність.

5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-4, яке має цитотоксичність.

6. Антитіло за п. 5, де цитотоксичність - це СОС та/або АОСС.

7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, де інгібітор росту або цитотоксична речовина зв'язані з антитілом. сн-б1/ссК І нн нВ?-с1а/.в-к шк не НІ111-619/19-Кк Пенешенвинтня Н111-614/147-К питан ни І ' ншшшши НІ11-614/148-К Міннниивнвни сну НІ12-619/18-К Ннвнонивавеннив никами нини НІ16-С194/08-К ошнолдвввєня пшиишши НІ18-514/Л8-К нини яв НІ19-б14/.8-К їв ни НІ?1-614/68-К нема нн нини ши Н123-с14/18-К Нашев пишний Ні24-стал вк Ї нин плани винна : І ! . і НІ31-б19/185-К Іноминтненнененнкяння НІ32-614/Ц8-К пипикнвннннни і ток ни ять и МеВ син КшТЕМОТИ нн ' і НІіза-б1/18-К інншненненнни нн 00 0.5 10 15 2.0 25 3.0

Фіг. 1

Не?-в16йВ-к пен п В ВО | ши НІ11-619/147-К наплювати | нини нн о Н111-619/А8-К ення | | ши ше НІ12-61418-К пери | нини ши Н116-б19/,8-к но шин нин ши | ше НІ17-619/08-К Інша | | | ши ши ш НІ18-б19/ЬВ-К Н1і19-б14/.8-к Ї не нн | | ши Ні20-619/.8-к шення НІ21-619/18-є Пшлешщини НІ123-614/18-к ниви Н124-б14/.8-К упевнена вка ніЗзі-сіал Вк інш ши ши ніВа-вІЯЛВК | | | | | І | ще Нізз-езалвк ши

00 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Фіг 2

«Химерне ЕР? | ! ; - ; ! : : НЕ -СТаЛАВК . ние о Зож вжи тн НИВА знане еоіонвовнюннннй кооснеттиття в В - НІОЗ-В1 ВК нен нн нотами Нас ВК анна ннннмннннняя НІ54-С19Л.48-К.. нанимнатвинн нн иоотьнтевня нки нон НІОВ-СТЧД.Я-К Мини нити ння с нини пити пня НІВЗ-С14ЛАВ-К. няння нанні нон нення НІВЗ-О1ОЛ ЗК з ші нії ! ! 971 -к шви М НІОУ-О14Л 48-К.. Мнитавннкинні коник ктм дно ення нини ие рекомен тон иенинитесня ! НООХ-СЗ1ОЛВ-К.. накидати лини оон нка іти ціни фе нисанинквікн ія | . НОВ Й ни пили пив пн поп : ! і Нова 73 Ї нина нини пн | | ! НОВО ЯК. межнвнннни пнтттенн нотних нонннаннннн НІОб-СТИ 53. в зви нний Н2ОВ-519Л-73-К. пиття ЩІ прогетвливх ще НІОТ-СТал Вк ака пнннннннининниннвнні і ЗЕДКЕ СЯ Й нини пил понти нина миня НОТ2-О1ОЙВ-К ннюнклиннатнттня певним і ДЕ РАБЦ Я ЗНУ нини моно полон мом пово ковки «ПЕІЗ ОІВ К пеня ПОХНВ СОИНнн Вол спи ПУТ НЕСЕ ннававнинввннння пиши наши зпиланн сти КК І пошпннвни нання попали опти знали, НОЗІ-Б14/.53-К.- нивввваотеитнтитти нн нетканих НЯЗІ-С1 Й. 73-К.. мамонта кни | Еш НЛО 73-К.. уникнення опор нанійсовтенніенной поніс Й ПЕН КАН 0 0 4 06 ОВ. ї 12 14 168

Фіг. З

Химерна ЕР. Уинининване ен ноанонкон пла НУ ; си Ін и и Не -К Інни : ! | ! : й НІТ1-С1ОЛ.В-К. мнеиентонннюнюннниях | ! | ! НІТ6-О10 ВК | ; | ! НІ17-614Й ВК -щЩ- | ! ! НІ18-С1О ВК . | ; НІ20О-С1Л ВК | | ' : і НІС ВАК НІ23-Б19/.В-К,.- нання | | ! НІЗ32-Б19Л.В-К. ниття ше | | | я НОТ | | ' | . НІБ4-О19 АВК межи с: пен ши ши Ши ШИ щ 3-Й 21-К. пнешнннннних ! | | | І ї НІВЗ-С1ЛАВ-К мит | ! НІВЗ-14Л-53-К.. нано ! ! НІВЗ1ОЛ.В-К нати НІОЗ-С14/-В-К. ниннканвитння | : | | ! НІЗИ-СТЯА ВК 1 о ! | : НІЯТ-О1ЯЛ 484 нання | | | | ! НЯМ-С1ОЛВ-К їв | | ! | ї Нопо-с ЛВ | | | ! ' НООБ-СТ9Л73-К ишеша | | | Е | Ії ! Сх ни ни ни нн н 206-О1ОДЯВЖ. НІОВ-С19Л-53-К. Мекжожонв, ! НІОБ-ТаЛ Из Кк нянею | ! | ' НОР (О1аЛЬАдк реженнкни НІЙ -С18Л,В-К. знов | ! ! : | ! ! : Н210-С1Л.В-К зоюнюютнсня ! , | | Ї | ї НОТІ-С1ОДЯВ-х Зшежи осв ний НИ | ши ше ше НОТЗ-С10Л.АВ-К. оненеюеняни | | і ' ' і НОЇЗ-ОЇЛ ВК сени Н223-С10Л53-К менти НОРА-О1ОЛ.53-К пенаженннх | | ї ' Н2З1-С14Л.55-К. аненнюе ! | ! : ї ! | : НОЗ1-СТоЛ л3- нини. | | ! НДО СІЙ БК нижня | | | | : Хе І НГ я Й еокінінн й ПАН ПОН КАН НК Пн п нин 00 50 400 150 200 250 300 350 400 «50

Фіг. 4

50 о пен СІНА ЛУСЬ-К «сере НІВЗ-АОАЛВ-К 40 11 се норв-стіал так ше мне НОгА-С14Л.53-К ІН що -к- Н2А0-с14Л73К | й і- й о 20 В ; У лі у ул 5 ло у 0 че - -10 м / 0 0016-04 1-03 12-02 1.1Б-01 1Ез00 1ЕНИ КОНЦЕНТРАЦІЯ АНТИТІЛ (мкг/мл)

Фіг. 5 --140 ФоТ20 Ж ро неї 100 ще ве сн СНАУ ЖК їЕ | ке Я сни НІОБ-О 19.53 ово КО ; снй-- НІОБ-З19Л ВК б У сере» ЕВ (В1аН Бак во. а ! , не що ше «ек НІЯ0-З1ЯЛ-53-К жо м певне НФОВ-О1ФЕТ ВК - | "ВХ нн НІЗЛАЗОЛ ТК 2 20 | " «фе Ноо-ощтак ЕК ! Бе Тв! 0 БК овнийзми сх каноста ІЙ Влшося Ду сзатн 01 пи 1 10 100 КОНЦЕНТРАЦІЯ АНТИТІЛ (мкг/мл)

Фіг. б

В. х- 140 і 150 5-5 ди щу гу и пе ие нан сНАСТ СІК в 100 а ша ефе. НІЮВБ-ТаЙ Б3К Ь вай сен НОВБ ово М в. -к-НІОВ-С10Л.53-К О во. кА «в НОЗІ-О1аЙ 53-К щ х т с і гав НО 1. ВЗ-К що ; ШИ свя НЗОВАЗ АТ З-К Щ 20 Кк -к- НІЗІ14Л ТЗ о в. --щ св НДО ЗК ГА - в 3 ЗАД А дк о, і із 0,01 0 4 10 то КОНЦЕНТРАЦІЯ АНТИТІЛ. (мкг/мл)

Фіг. 7

А МІА РаСа-2 1000 З Б шини -воо -- НАПОВНЮВАЧ в -й- НООБ-СТЯА ЗК (б мг/кг) - 800 - і тий НІОВ-соТад ув-кіо мкг) 2 ва хе». НОДО-ст1аА УЗ3-К 04 мкг) я 400 дн й ке. НІДО-ТаД 73-К 9 мг/кг) не ал 0 | чен-сно пік (2 току) 200 Ва а 440 2835 ДНІ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ (ДНІ) і: ВВЕДЕННЯ В рі 0-1 - 1000 І а у ---- НАПОВНЮВАЧ х 800 о е-чж--Ноов-отал-т3-к (04 ме/кг) с во ФИ ий | че нодв-отал уз о мг/кг) ро б00 | Бий хо | я ного-слал уз (А МГ/КГ) Ж 400 КВ ий | ее номо-влалтах (о мог) - | МОЙ р ств. й | тчевееснов іл К (Я МоКг) ж й й їі кл Б 20 век їй ! і і о ЕВ) Ї каз окон я ру Фо в З ДНІ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ (ДНІ)

і. ВВЕДЕННЯ

Фіг. 8 12345 ЩО смуга: молеКУЛЯРНИЙ МАРКЕР й | СМУГА 2: ЗРІЛИЙ ЕВЕО ПЮДИНИ (ФРАКЦІЯ РОЗВЕДЕННЯ 1) і й СМУГА З: ЗРІЛИЙ ЕБЕб ЛЮДИНИ (ФРАКЦІЯ РОЗВЕДЕННЯ 2) 017100 смугаж: зРІЛИЙЕВЕО СУКОМОЇ 0УВ (ФРАКЦІЯ РОЗВЕДЕННЯ 1) Е -"СМУГА5: ЗРІЛИЙ ЕВЕС СУМОМО 305 (ФРАКЦІЯ РОЗВЕДЕННЯ 2)

Фіг. 9

ОА 15046 С о я Е схо ще ше. Ф т. я ї ; ї- З Ех, г: М п Є. щі Е ГЕ З нен й с о я Кей с. ще й ве еВ с се Са в зе о. «бо й В я шк. ані ко п Єву я У ВО я мо я ВОй а! Б З вк що 3. у ях хо Шк З ЖЕ Се В Же од вх ші с: й і; . З затіяв ши с не оо ст ців ну п - п З яка СН ва ша, т ок й Ї - ще ї. В б. Тен мя. т зх жо -- т Нх МК кн Ме о о. я я - 140 піожнгеннн їх я В. т о о | Е ке шо сх я со КІЛЬКЕ че а пу шо є . ї ка ся ОО се ще КА у Хо ун | шк о ох с ж рення й ою х Що» я сша г ем» Змаехя; ші я . в х і Ка ї В Гаї : ек, я до йкх . У ше Е | І Ж Ох шій но яки Е ях й е пе ок х ек ОБЖ я гай З 7 у С шк Я й я В й ху ет :

бу. Е їз. Ж ще 18 со "пуакя а ІЗ а пен я С в СИ їі -к З я ; а, є і Я й 2 «о ДІ и х я б з Е я сах і: п іс в 3 ЩІ ше ї ска м і та я - ян 2 --. Її. ек ! й | се в Ме. же я Б дну о вно косу ча і зр й І ! Ж ее. ге Я. й ЗщаЕ ме Кк. - жість 9 з Али Я . «зр Б . ж як ва я я . . З г іа ЩЕ хінійнчінн щі і Я о. і в нів - і Е кни їж кед се ща ще що ЕХ | те а я Кз! Е й. КУ г ли з ї рю ве Коля и їх с ' ДВ І-й з КЗ їв с с; ще х ша й у: се ле к. .

КЕ. й 4. Ше с еВ й ще в у в ке З и йо ла г ПЕ ж і ПА ОО я. це м З с ки : мова я щої щу ; й . м :.

ії. ве Кк А Яви ре ка, я й сем ; зерня СО ВВ рух я их -- я й й о Ка й й - В щ -- ; вх ле Же КЕ ж . : сійкавацосвоюх ій ща ДОН ДЯ Ко Ме шеон то кі тн судив Е | б к Кк аз ща У ще о ЛІ а тк Ж Е ЗИ х: й я п ев в к. КБ 5 | в ска во и. ж щі СЛ КЕ ке я ку іх Ей Но А. - х : | о дике щ во Сов що І. пе з ке с Ванні хЗз5 в в ка Яке -- я ї з . я що КО, в ве шах зшж, Що Пе пово, кВ пак їж 120 Кк ше с: інн и ; 7 ери в я ЕЕ Тк а вх Не Я Е ількість 9 З с. Бе ;

т. ке щк Я ПК ще Сх . яні т ь Ко ти сонне Б пох с. Яке :

с. З З шк су в ой ОЗ Т дах ху Ку щі я : ту Мч Фі г. 10

1001 льнавтз віжомав ВО рент щи 5КЕ-4В2: 2,0ЖЮ На 09628 ФокЕаВо В ж сЕ й й св В тання й шк щ | й си ння сина Ж 5 " сй

Й. Дт же В | ль 5КЕ ІВ й ношення НОМ 5 п, де шо р в о их В нний вк | ФеКЕР-Я Од тфннифя «КНЕРЛІВАХІЮ 0 ен кін вон ні лозвя вини 1 г! жде 1 Е нт шт, ШКТ ою юю ю концентрація антитіла (мкг/мл) ЕКСПРЕСІЯЄВЕСНКІЛЬКІСТЬ ЕКСПРЕСТИКЛІТИНА)

Фіг. 11

Ж ї а Е : Еш Ше пе ВЗ шох я ї щ- Но ! С 4 - їі х -е «- о Б ВВЕ В ж

ОБ'ЄМ ПУХЛИНИ (мм) те с з -

ї с Ж о М; ще - -е що . з З-е В вх г їх є -й в р по Б е рек чн - ше. я че З де Я -щ кі х Ге ї є -- ТЕ в ваввяваг сх

ОБ'ЄМ ПУХЛИНИ (мм) З до Бе са є фія 5 ж що іх ш ще : Ж в ча. ; Е какнняосн нанні НДО кивок М е ве с-ще в я Е В

ОБ'ЄМ ПУХЛИНИ (мм) й

Фіг 12 ру о с и и КО в : пед ек КИ Ки ек ВИ и т ОК КО Кк сн кпк КА и ку Ко НН с те щи ск с ен азни ср КК С Ж тьх МО Ан ВК Од я М их и а м По В КК по и ен В НК В Ме я М я о. - ше с ин и и кя в а ; о хо, Кк хи й Ех. ге ви ще шт ах пи Я з зк: гое пуск деко я Ки Кей их ДОВ М ния Би Кт сх ве Я ее М вк в а иа яв дк шк КК КА В СК в в СВУ СВ Иван Пов прик во НИКИ ПРАВ сих се ша ко и о ту УНК В м От не а. з В С ях КО БУ с ЗУ ВК в Уже КОН Ся Оу й дея ЖК у си и В и в о ою Бак МВ нс уки НЯ ще КК у в кв МКК п с ке вве Ат вн ВИ и. кум но Ей, ОНИ юн о м, бо куран ННН 0а ях по й А Ва а а» рт и о ШК кв БО ож и Б их не каф в я ша. ох За ро ско ой я по ех лКрЯ а суне ЗВОЙ Ко се р ж ку шко Бі пюоях Ж дж. в же я М МК т о пн с ах ДК нн ою, о пд, З де сао КК я и ЗЕ сві се М Я ве я ВО пд ОК і пи ; пен п ек А они ся ат Вх С домени а НИ Ю дн с ки о й Кн ди Мк та плани а о АЙ зркд и ие оо еВ Ко о М о КК АВ ги ра ВЗ я я о. п. ен. що Че ВІ и ее и. о и жо о Кн с, в и з ке а с он ЖЕК Си ас я ока ен ння и МНН ШЕ Ух й зх зл ааНН пен Нац Ка а ебя ти Ом ке НО я во ОО ная я ЛІ КАМ ки кт в ек ни ОН ша ОК Я МКК не о и У жде: ВКя КА КВ жи а нн шу ска опе ех дк БМК до Кутя ДК оон Вус тд с дюЖ ї5 ДК. мі пе пе Но они и ние у: о Не с Уся и Кв соя Н КК тв В втя М 1 Я Я зе Оу Ми ко . и АН их й ЕП є о А урегулін и ка с а ОВ СС Ов кл й Я М лооовтя Ол с з а ною. зі 1 З

Фіг. 1: рР«0,0001 де 500 а

5 . берединне Е г «Значення яка МЕЖА ВИЯВЛЕННЯ зенківклвактктвківкіс 8 тіннннікентння няння бухти 1

Фіг. 14

З І «а ї-

в. щ я Е - щ- ді 8 шок я. ГІ, ве І 5 У к з І ші с Б ш де : ШЕ о дллях й Га о в че Ж й с зе ш сх ЖЕ - Е е КЗ я в. 5 В - ку рай З ? щ га в ! ; в ооо ою о ЗАГАЛЬНА КІЛЬКІСТЬ МЕТАСТАТИЧНИХ ОСЕРЕДКІВ (ДЛЯ 10 МИШЕЙ) дк іч) х нон я ГУМАНІЗОВАНЕ Б ів ОО АНТИТІЛ РОТ до сСусоїлай в їх Фе еф контрогь щш й іх Я очщоюючеоа КІЛЬКІСТЬ МЕТАСТАТИЧНИХ ОСЕРЕДКІВ (ОКРЕМИХ)

Е 5ов КОНТРОЛЬ | т: СТАНДАРТНЕ ай і " ВІДХИЛЕННЯ ще ОО | Р«0,05 ке хе 400 я, - ше гуманізоване антитіло їв 200 ЕР? Сіусотар г) Г8) і. виго и пи ни в У 14 21 28 ее ВИЩ Оіусотав ДНІ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ (ДНІ)

Фіг. 16 1200 "7" 1000 ши В КОНТРОЛЬ де: - воо їі у Р«0,005 г 600 й ну у, ий 77 гуманізоване г Я и антитіло ЕРЯ? ж 400 о ча Сіусотаб З о о 00 и 21 28 35 42 гуманізоване антитіло ЕР27 А А а Сіувотар ДНІ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ (ДНІ)

Фіг. 17

Як о шо Як ня у ї соя х. В ся З се в І МК є че пок . те . ся моя г в т ННЯ стьй би ах й й ко с. вве й ож Су Бе поки І ох хе о чн зі ще де ло БЕ; щік о. Ах х сн НК й щі Сей дека 0. о - | г. х ко в о і ! ї Ії й п в о п. я їх ї З я т де й. п: | и; я г з ВЕ. - п. в. нн еезао ага те Я. и пу в іх й 5 а - » ! : К. ії | о У ва ХЕ ух з п М о ж ве во - УКХ ве ; п з о в о . о ! їх ві у - ! з С п п. А Я і По. т і. Я її в і. че. і ва в . ї х її. я о Еш я ; З Не оУ В о а о З З й а що пли пт я пе ру с. хе ХО мок ко и о о: тЕгну у сою Ко Ще ї ; З т : . її її . с кож й т й СБ кит й - га - ях ж СО з ав Ку: в шк З шо Я, и ях я КХ ех по з ее 7 5 с ї . ; і.

н. я ке оо Ох я : див х З що ; я в: ее о У. З Мой 5В о еВ с. ер и а о: їх о : ц я, аб ОК Ж ее ох а ня СК хо ех хи ХК й в, г. . я о арвл ма т . роя п о ї ЗУ ле щИНтя й ще с АаК І с о - ; ь їй . - т. 5) Горе пк й Б КЗ і: дея дек.

; . : шо, с зе ЖК, иа 2 я "Ми Що З Ко Ай в. ях Ка о о. 3: Ж. ї їх ; и о о. се я ОО ІНе лі Еж КО В, и их тк То МОЗиК ше шо с в вози іх а. т в ві го я вх у ІЗИНОМ йо с. У ги іх і 5. Ср Кок КОНЯ Я я що. Кох що ско - її. ; Заба в я рален Кв ня ЕКЕЙ 7 й й щ Фіг. 18 дк Б 740 б Ж 30 їв 0 5 20 о 1 і й ГУ й , з АНІЗОВ, я АНЕ й ; ЕА і НТИТІ Й ЛО Е й раб і Їх усо таб (мкг г/мл) '

Фіг. 19

7 КОНТРОЛЬ - 500 - Е дОО ї | р«0,05 ск ЗО 2 : -доО700 Аня с і Же Ї гуманізоване їй антитіло ЕРЯТ с 100 Сіусотар о 13 20 Д97 34 А1 гуманізоване антитіло ЕРІ? А А А А І Сіусотар ДНІ ПІСЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ (ДНІ)

Фіг. 20