BR112014015581A2 - anticorpo antiepirregulina humanizado, seu uso, método de produção do mesmo, composição famacêutica e agente terapêutico compreendendo o referido anticorpo, bem como vetor codificando o mesmo e células hospedeiras compreendendo o referido vetor - Google Patents

Abstract

anticorpo antiepiregulina humanizado, seu uso, método de produção do mesmo, composição farmacêutica e agente terapêutico compreendendo o referido anticorpo, bem como vetor codificando o mesmo e células hospedeiras compreendendo o referido vetor. os inventores produziram com sucesso anticorpos antiepiregulina mostrando reatividade cruzada entre espécies entre macaco cinomolgo (animais não humanos) e o homem, anticorpos antiepiregulina com degradação química suprimida, e anticorpos antiepiregulina com ponto isoelétrico reduzido, anticorpos antiepiregulina com temperatura média de desnaturação térmica aumentada, e anticorpos antiepiregulina com quantidade reduzida de agregado efetuando substituições apropriadas de resíduos aminoacídicos nas sequências de região variável do anticorpo ep27 humanizado que inibe o crescimento de células cancerosas exibindo atividade citotóxica e atividade neutralizante contra células cancerosas expressando antiepiregulina humana.

Description

exemplo, em um estudo conduzido por Bugelski e outros., a avaliação pré-clínica da segurança foi efetuada no anticorpo monoclonal kelixi- mab usando camundongo transgêncios para CD4 humana para predi- zer um tratamento de longo prazo de artrite reumatoide em pacientes humanos. Keliximab é um anticorpo monocional que tem especificida- de para CD4 de seres humanos e chimpanzés. Bugelski e outros. con- cluíram que o uso de um camundongo transgênico expressando prote- ína humana proporciona um método alternativo útil para estudos con- duzidos em chimpanzés usando farmácos biológicos que tem especifi- cidade cruzada limitada entre espécies. Entretanto, a produção de animais transgênicos para fins de teste é demorada e dispendiosa uma vez que requer muito trabalho. Documentos da Técnica Anterior [Documentos Patentários] [Documento Patentário 1] WO2008/047723 [Documentos Não Patentários] [Documento Não Patentário 1] J. Med. Primatol. (1986) 15, 441-451 [Documento Não Patentário 2] J. Med. Primatol. (2001) 40, 141-147 [Documento Não Patentário 3] Cancer Immunol. Immunother. Maio de 2006; 55(5): 503-14 [Documento Não Patentário 4] Hum. Exp. Toxicol. (2000) 19, 230-243 Sumário da Invenção [Problemas a serem Resolvidos pela Invenção]

[0014] A presente invenção refere-se a anticorpos antiepirregulina mostrando reatividade cruzada entre espécies entre animais não hu- manos e seres humanos. A presente invenção refere-se ainda a anti- corpos antiepirregulina com degradação química suprimida. A presente invenção também se refere a anticorpos antiepirregulina com ponto isoelétrico reduzido. Além disso, a presente invenção refere-se a anti- corpos antiepirregulina com quantidade reduzida de agregado. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas ou agentes terapêuticos contra câncer compreendendo anticorpos antiepi- rregulina mencionados acima. A presente invenção também se refere a métodos para produzir os anticorpos antiepirregulina mencionados acima.

[Meios para Resolver os Problemas]

[0015] Os presentes inventores descobriram que a relação da ati- vidade de ligação à epirregulina isolada de macaco cinomolgo para a atividade de ligação à epirregulina humana aumenta com a substitui- ção de um resíduo aminoacídico na sequência da região variável de um anticorpo EP27 humanizado, que inibe o crescimento de células cancerosas exibindo atividade citotóxica e atividade neutralizante con- tra células cancerosas que expressam a epirregulina humana, por um resíduo arginina. Mais especificamente, os presentes inventores cons- truíram anticorpos antiepirregulina mostrando reatividade cruzada en- tre espécies entre seres humanos e macacos cinomolgos que são animais não humanos. Além disso, anticorpos antiepirregulina com de- gradação química suprimida foram construídos pela substituição apro- priada de resíduos aminoacídicos na sequência da região variável de um anticorpo EP27 humanizado. Além disso, anticorpos antiepirreguli- na com ponto isoelétrico reduzido foram construídos pela substituição apropriada de resíduos aminoacídicos na sequência da região variável de um anticorpo EP27 humanizado. Anticorpos antiepirregulina com quantidade reduzida de agregado foram construídos pela substituição apropriada de resíduos aminoacídicos na sequência da região variável de um anticorpo EP27 humanizado. Os presentes inventores revele- ram que os anticorpos antiepirregulina tendo essas propriedades apre- sentam efeitos inibitórios do crescimento através de atividade neutrali- zante e atividade citotóxica sobre linhagens de células de câncer. Além disso, a partir das descobertas mencionadas acima, os presentes in-

ventores descobriram que anticorpos antiepirregulina são eficazes pa- ra o tratamento de vários cânceres primários e metastáticos, e assim concluíram a presente invenção.

[0016] Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao seguinte:

[1] um anticorpo antiepirregulina que é um anticorpo que se liga a um epitopo ligado por um anticorpo antiepirregulina compreendendo CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID Nº: 12, 13, e 14, em que o anticorpo é caracterizado por ter uma relação do valor de KD para epirregulina de macaco de SEQ ID Nº: 170 (cEREG KD) para o valor de KD para epirregulina humana de SEQ ID NO: 34 (hnEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) menor que a relação de cEREG KD/hEREG KD do anticorpo antiepirregulina compreendendo CDRs da região va- riável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 12, 13, e 14;

[2] o anticorpo do item [1], em que ceEREG KD/hEREG KD é menor que 40;

[3] o anticorpo do item [1], em que ceEREG KD/hEREG KD é menor que 10;

[4] o anticorpo do item [1], em que ceEREG KD/hEREG KD é menor que 6;

[5] o anticorpo do item [1], em que ceEREG KD/hEREG KD é menor que 4;

[6] o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [5], que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR?2 de cadeia pesada seleci- onada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153 108 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ

ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, e 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48,47, e 14;

[7] o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [5], que compreende uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, e 115, e uma região variável da ca- deia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, e 29;

[8] um anticorpo antiepirregulina selecionado dentre qualquer um dos anticorpos abaixo: um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, e 38; um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, e 29; e um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, e 38, and uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, e 29;

[9] o anticorpo de qualquer um dos itens [6] a [8], que compreende a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26;

[10] o anticorpo de qualquer um dos itens [6] a [9], que compreende a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27;

[11] o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [10], que tem uma ativi- dade neutralizante;

[12] o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [11], que tem citotoxici- dade;

[13] o anticorpo do item [12], em que a citotoxicidade é CDC e/ou ADCC;

[14] o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [12], em que um inibi- dor do crescimento ou uma substância citotóxica é ligada ao anticorpo;

[15] o anticorpo do item [14], em que o anticorpo é um anticorpo de baixo peso molecular;

[16] o anticorpo de qualquer um dos itens [12] a [15], em que a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26 compreende pelo me- nos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, e 332 como indicado pela numeração EU;

[17] um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma re- gião variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR?2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, e 11;

[18] o vetor do item [17], que compreende um polinucleotídeo codifi-

cando a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26;

[19] um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma re- gião variável da cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48, 47, e 14;

[20] o vetor do item [19], que compreende um polinucleotídeo codifi- cando a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27;

[21] um vetor compreendendo: um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR?2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, Mo0,ei1t;e um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR?2 de cadeia le- ve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48, 47, e 14;

[22] um vetor compreendendo: um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR?2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111,

110, e 11, e um polinucleotídeo codificando a região constante de ca- deia pesada de SEQ ID NO: 26; e um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR?2 de cadeia le- ve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48, 47, e 14, e um polinucleotídeo codificando a re- gião constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27;

[23] um vetor compreendendo o polinucleotídeo do item [18] ou [22], que compreende um nucleotídeo mutado codificando uma região cons- tante de cadeia pesada com pelo menos uma substituição de aminoá- cido em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 como indicado pela numeração EU em a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26;

[24] uma célula hospedeira compreendendo os vetores dos itens [17] e

[19], os vetores dos itens [18] e [20], ou o vetor do item [21] ou [22];

[25] uma célula hospedeira compreendendo o vetor do item [23];

[26] a célula hospedeira do item [25], em que a capacidade para adici- onar fucose a uma cadeia de açúcar na célula hospedeira é baixa;

[27] a célula hospedeira do item [26], em que a célula hospedeira com baixa capacidade para adicionar fucose a uma cadeia de açúcar é uma célula hospedeira deficiente em um ou mais proteínas funcionais selecionadas do grupo que consiste em fucosiltransferase, transporta- dor de fucose, GMD (GDP-manose-4,6-desidratase), Fx(GDP-ceto-6- desoximanose-3,5-epimerase, 4-redutase), e GFPP (GDP-B-L-fucose pirofosforilase);

[28] a célula hospedeira do item [25], em que a célula hospedeira tem capacidade para formar uma estrutura N-acetilglucosamina bissecante em uma cadeia de açúcar;

[29] a célula hospedeira do item [28], em que a célula hospedeira ten- do capacidade para formar uma estrutura N-acetilglucosamina bisse- cante em uma cadeia de açúcar é uma célula hospedeira que tem ati- vidade de B(1,4)-galactosiltransferase e compreende um vetor com- preendendo um polinucleotídeo codificando o domínio de localização de Golgi funcional de um polipeptídio residente em Golgi;

[30] a célula hospedeira do item [29], compreendendo um vetor que compreende um polinucleotídeo codificando a functional Golgi localiza- tion domain selecionada do grupo que consiste no domínio de locali- zação de manosidase |l, no domínio de localização de B(1,2)-N- acetilglucosaminiltransferase |, no domínio de localização de B(1,2)-N- acetilglucosaminiltransferase Il, no domínio de localização de manosi- dase |, e no domínio de localização de a1-6 núcleo fucosiltransferase; e um polinucleotídeo codificando um polipeptídio de fusão compreen- dendo o domínio catalítico de B(1,4)-galactosiltransferase;

[31] a célula hospedeira de qualquer um dos itens [24] a [30], em que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NSO, uma célula SP2/0, uma célula YO de mieloma, uma célula P3X63 de mieloma de camundongo, uma célula PER, uma célula PER.C6, uma célula HEK293, e uma célula de hibridoma;

[32] um método para produzir o anticorpo de qualquer um dos itens [1]

a [16], que compreende coletar a célula hospedeira de qualquer um dos itens [24] a [31] a partir de uma solução de cultura;

[33] um anticorpo produzido pelo método do item [32];

[34] o anticorpo do item [33], em que um agente inibitório do cresci- mento ou uma substância citotóxica é ligada ao anticorpo;

[35] uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [16] ou [33] ou [34] como um princípio ati- vo;

[36] um agente terapêutico contra câncer ou um agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer, que compreende o anticorpo de qualquer um dos itens [1] a [16] ou [33] ou [34] como um princípio ati- vo;

[37] o agente terapêutico contra câncer ou um agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer do item [36], em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de cólon, adenocarci- noma de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de estômago, e câncer renal;

[38] o agente terapêutico contra câncer ou um agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer do item [37], em que o câncer de cólon é um câncer de cólon pobremente diferenciado, um câncer de cólon moderadamente diferenciado, ou um câncer de cólon bem dife- renciado; e

[39] o agente terapêutico contra câncer ou um agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer de qualquer um dos itens [36] a

[38], em que um indivíduo que é medicado com o agente terapêutico contra câncer é um indivíduo portador de células cancerosas expres- sando a proteína epirregulina detectada em uma amostra de tecido isolado.

[0017] A presente invenção também se refere a métodos para su- primir a proliferação celular, métodos para prevenir ou tratar câncer, e métodos para suprimir a recorrência ou metástase de câncer, que compreendem a etapa de administrar a um indivíduo um anticorpo da presente invenção ou um anticorpo produzido por um método de pro- dução da presente invenção. Além disso, a presente invenção refere- se a usos de um anticorpo da presente invenção ou de um anticorpo produzido por um método de produção da presente invenção na pro- dução de agentes para inibir a proliferação celular, agentes para pre- venir ou tratar câncer, ou agentes para suprimir a recorrência ou me- tástase de câncer. A presente invenção também se refere a anticorpos da presente invenção ou anticorpos produzidos por um método de produção da presente invenção para uso na supressão da proliferação celular, na prevenção ou no tratamento de câncer, ou na supressão de recorrência ou metástase de câncer. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para produzir agentes para inibição da prolifera- ção celular, agentes para a prevenção ou o tratamento de câncer, ou agentes para a supressão de recorrência ou metástase de câncer, que compreende a etapa de usar um anticorpo da presente invenção ou um anticorpo produzido por um método de produção da presente in- venção. Breve Descrição dos Desenhos

[0018] A Fig. 1 representa um gráfico mostrando a relação de afi- nidade de cada um dos anticorpos para epirregulina humana (valor de KD de cada anticorpo / valor de KD do anticorpo quimérico EP27). Embora a notação do nome do anticorpo esteja descrita pelo nome da região variável apenas, a figura apresenta os resultados de teste de anticorpos contendo as regiões constantes da cadeia pesada G1d e da cadeia leve capa.

[0019] A Fig. 2 representa um gráfico mostrando a relação de afi- nidade de cada um dos anticorpos (valor de KD para epirregulina de macaco / valor de KD para epirregulina humana). Embora a notação do nome do anticorpo esteja descrita pelo nome da região variável apenas, a figura apresenta os resultados de teste de anticorpos con- tendo as regiões constantes da cadeia pesada G1d e da cadeia leve capa.

[0020] A Fig. 3 representa um gráfico mostrando a relação de afi- nidade de cada um dos anticorpos para epirregulina humana (valor de KD de cada anticorpo / valor de KD do anticorpo quimérico EP27).

[0021] A Fig. 4 representa um gráfico mostrando a relação de afi- nidade de cada um dos anticorpos (valor de KD para epirregulina de macaco / valor de KD para epirregulina humana).

[0022] A Fig. 5 representa um gráfico mostrando a atividade de ADCC de cada um dos anticorpos (taxa de liberação de calceína AM específica).

[0023] A Fig. 6 representa um gráfico mostrando a atividade neu- tralizante de cada um dos anticorpos em termos da taxa de inibição da proliferação de células BAF EGFR dependente da epirregulina huma- na.

[0024] A Fig. 7 representa um gráfico mostrando a atividade neu- tralizante de cada um dos anticorpos em termos da taxa de inibição da proliferação de células BAF EGFR dependente da epirregulina de ma- Caco.

[0025] A Fig. 8 representa gráficos mostrando a atividade de cada um dos anticorpos para suprimir o crescimento de tumor humano in vivo em termos da atividade antitumoral em modelos de camundongo transplantados com células cancerosas humanas.

[0026] A Fig. 9 é uma imagem mostrando os padrões eletroforéti- cos da epirregulina humana (hsEREG-His) e da epirregulina de maca- co (cysEREG-His).

[0027] A Fig. 10 mostra os resultados da coloração fluorescente de células expressando, cada uma delas, diferentes quantidades da pro-

teína epirregulina, e da coloração imuno-histológica de camundongos transplantados com essas células.

[0028] A Fig. 11 representa gráficos mostrando a atividade de ADCC contra células expressando, cada uma delas, diferentes quanti- dades da proteína epirregulina.

[0029] A Fig. 12 representa gráficos mostrando a atividade inibitó- ria do crescimento de tumor humano in vivo em termos da atividade antitumoral em modelos de camundongo transplantado com cada uma dessas células expressando diferentes quantidades da proteína epir- regulina.

[0030] A Fig. 13 apresenta fotografias mostrando a expressão de epirregulina em casos clínicos de câncer de cólon pobremente diferen- ciado.

[0031] A Fig. 14 é um diagrama mostrando a eficácia medicamen- tosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra tumorigênese de células-tronco PLR123 de câncer de cólon, que mostra a eficácia medicamentosa contra metástase de câncer de cólon.

[0032] A Fig. 15 mostra a eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra metástase pulmonar de células- tronco PLR123 de câncer de cólon, que mostra a eficácia medicamen- tosa contra metástase de células-tronco de câncer de cólon.

[0033] A Fig. 16 é um gráfico mostrando a eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra câncer de cólon po- bremente diferenciado usando o modelo de câncer de cólon pobre- mente diferenciado COL-53-JCK.

[0034] A Fig. 17 é um gráfico mostrando a eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra câncer de cólon mo- deradamente diferenciado usando o modelo de câncer de cólon mode- raramente diferenciado PLR379.

[0035] A Fig. 18 apresenta fotografias mostrando a expressão de epirregulina em casos clínicos de adenocarcinoma de pulmão.

[0036] A Fig. 19 é um gráfico mostrando a atividade de ADCC (ta- xa de liberação de calceína AM específica) do anticorpo EP27 humani- zado Glycomab contra a linhagem celular de adenocarcinoma de pul- mão humano Calu-3.

[0037] A Fig. 20 é um gráfico mostrando a eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra adenocarcinoma de pulmão usando o modelo de adenocarcinoma de pulmão Calu-3.

[0038] A Fig. 21 mostra que o conjugado anticorpo-droga compre- endendo o anticorpo EP27 humanizado Glycomab fica internalizado nas células da linhagem celular DLD-1 que expressam epirregulina, e causam danos celulares contra a linhagem celular DLD-1. Melhor Modo para Realizar a Invenção

[0039] A presente invenção refere-se a anticorpos antiepirregulina mostrando reatividade cruzada entre espécies entre animais não hu- manos e seres humanos. A presente invenção refere-se ainda a anti- corpos antiepirregulina com degradação química suprimida. A presente invenção também se refere a anticorpos antiepirregulina com ponto isoelétrico reduzido. Além disso, a presente invenção refere-se a anti- corpos antiepirregulina com quantidade reduzida de agregado. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas ou agentes terapêuticos contra câncer compreendendo os anticorpos an- tiepirregulina mencionados acima. A presente invenção também se refere a métodos para a produção dos anticorpos antiepirregulina mencionados acima.

[0040] As definições e descrição detalhada abaixo são oferecidas para ajudar na compreensão da presente invenção ilustrada neste re- latório. Definições Aminoácidos

[0041] Neste relatório, os aminoácidos estão descritos em códigos de uma letra ou de três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, GIn/Q, Ser/S, GIlu/E, Thr/T, GIy/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, lle/l, ou Val/V. Os aminoácidos contidos nas sequências aminoacídicas da presente invenção podem ser modificados pós-translacionalmente (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piroglutâmico por piroglu- tamilação é bastante conhecida pelos versados na técnica). Natural- mente, tais aminoácidos modificados pós-translacionalmente estão incluídos nas sequências aminoacídicas da presente invenção. Antígenos

[0042] Os anticorpos oferecidos pela presente invenção ligam-se à epirregulina como um antígeno. Epirregulina é uma proteína do fator de crescimento epidérmico ligada à membrana. Sua sequência amino- acídica está apresentada sob o Número de Acesso GenBank NP 001423 (SEQ ID NO: 167). Na presente invenção, a definição de epirregulina inclui tanto a proteína de comprimento integral quanto fra- gmentos da mesma. "Fragmentos" refere-se a polipeptídios compre- endendo qualquer região da epirregulina, e podem não ter a função da epirregulina nativa. Um exemplo de fragmentos inclui um fragmento compreendendo a região extracelular da epirregulina. As posições 30 a 118 na sequência aminoacídica de SEQ ID NO: 167 correspondem à região extracelular da epirregulina. As posições 119 a 140 na sequên- cia aminoacídica de SEQ ID NO: 167 correspondem à região trans- membrana. Neste relatório, epirregulina pode ser chamada de EREG, e esses termos são usados como sinônimos.

[0043] "Epitopo" significa um determinante antigânico em um antí- geno, e refere-se ao sítio de um antígeno ao qual o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo antiepirregulina divulgado nesta invenção se liga. Assim sendo, por exemplo, o epitopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epitopo pode ser defini- do de acordo com a atividade ficadora de antígeno de um anticorpo antiepirregulina que reconhece o epitopo. Quando o antígeno é um peptídio ou polipeptídio, o epitopo pode ser especificado pelos resí- duos aminoacídicos que foram o epitopo. Alternativamente, quando o epitopo é uma cadeia de açúcar, o epitopo pode ser especificado pela estrutura de sua cadeia de açúcar.

[0044] Um epitopo linear é um epitopo cuja sequência aminoacídi- ca primária é reconhecida por tal epitopo consistindo em vários amino- ácidos consecutivos na sequência aminoacídica primária. Tal epitopo linear contém tipicamente pelo menos três e mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos nesta sequência específica.

[0045] Em constraste com o epitopo linear, "epitopo conformacio- nal" é um epitopo no qual a sequência aminoacídica primária contendo o epitopo não é o único determinante do epitopo reconhecido (por exemplo, a sequência aminoacídica primária de um epitopo conforma- cional não é necessariamente reconhecida pelo anticorpo que define um epitopo). Os epitopos conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em comparação com os epitopos lineares. Um anticorpo que reconhece um epitopo conformacional reconhece a es- trutura tridimensional de um peptídio ou proteína. Por exemplo, uma molécula de proteína se enrolada e forma uma estrutura tridimensio- nal, os aminoácidos e/ou as cadeias principais do polipeptídio que formam um epitopo conformacional ficam alinhados, e o epitopo se torna reconhecível pelo anticorpo. Métodos para determinar as con- formações de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia por raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação de spin sítio- específico, e ressonância paramagnética eletrônica, mas se limitam a estes. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in

Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.). Atividade de Ligação

[0046] Exemplos de um método para confirmar a ligação de um antígeno à epirregulina, ou mais especificamente um epitopo presente na molécula de epirregulina, estão mostrados mais adiante, mas o mé- todo não se limita aos métodos que se seguem, e o versado na técnica pode usar de forma apropriado métodos conhecidos para medir a ati- vidade fixadora de antígeno de um anticorpo.

[0047] Por exemplo, se um anticorpo antiepirregulina reconhece um epitopo linear na molécula de epirregulina pode ser confirmado, por exemplo, como mencionado abaixo. Um peptídio linear compreen- dendo uma sequência aminoacídica formando o domínio extracelular da epirregulina é sintetizado para a finalidade acima. O peptídio pode ser sintetizado quimicamente, ou obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região codificando a sequência aminoacídica correspondente ao domínio extracelular em um cDNA codificando epir- regulina (exemplos incluem CR541887 (SEQ ID NO: 169) e tal como uma sequência de cDNA e NM 001432 e tal como uma sequência de MRNA). Depois, um anticorpo antiepirregulina é avaliado quanto a sua atividade de ligação em relação a um peptídio linear compreendendo a sequência aminoacídica formando o domínio extracelular. Por exem- plo, um peptídio linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação do anticorpo em relação ao peptídio. Alternativamente, a atividade de ligação em relação a um peptídio linear pode ser avaliada com base no nível em que o peptídio linear inibe a ligação do anticorpo às células expressando epirregulina. Estes testes podem demonstrar a atividade de ligação do anticorpo em relação ao peptídio linear.

[0048] Se um anticorpo antiepirregulina reconhece um epitopo conformacional pode ser avaliado da seguinte maneira. Células ex-

pressando epirregulina são preparadas com a finalidade acima. É pos- sível determinar se um anticorpo antiepirregulina reconhece um epito- po conformacional quando ele se liga fortemente a células expressan- do epirregulina ao contato, mas não se liga substancialmente a peptí- dio linear imobilizado compreendendo uma sequência aminoacídica formando o domínio extracelular da epirregulina. Neste relatório, "não se liga substancialmente" significa a atividade de ligação é de 80% ou menos, geralmente 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente de preferência 15% ou menos em comparação com a atividade de ligação em relação a células expressando epirregulina humana.

[0049] Métodos para avaliar a atividade de ligação de um anticor- po antiepirregulina em relação a células expressando epirregulina in- cluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especificamente, a avaliação pode ser efetuada com base no princípio do ELISA ou da classificação de células ativadas por fluo- rescência (FACS) usando células expressando epirregulina como antí- geno.

[0050] No formato ELISA, a atividade de ligação de um anticorpo antiepirregulina em relação a células expressando epirregulina pode ser avaliada quantitativamente por comparação dos níveis de sinal ge- rado pela reação enzimática. Especificamente, um anticorpo de teste é adicionado a uma placa de ELISA sobre a qual células expressando epirregulina são imobilizadas. Em seguida, o anticorpo de teste ligado às células é detectado usando-se um anticorpo marcado com enzima que reconhece o anticorpo de teste. Alternativamente, quando FACS é usada, uma série de diluições de um anticorpo de teste é preparada, e o título de ligação do anticorpo para células expressando epirregulina pode ser determinado para comparar a atividade de ligação do anti-

corpo de teste em relação a células expressando epirregulina.

[0051] A ligação de um anticorpo de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspendidas em tampão ou similar pode ser detectada usando-se um citômetro de fluxo. Citômetros de fluxo conhecidos incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos: FACSCanto"" || FACSAria"M FACSArray""M FACSVantage"Y SE FACSCAalibur'M (todos são nomes comerciais da BD Biosciences) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (all are trade names of Beckman Coulter).

[0052] Métodos preferidos para analisar a atividade de ligação de um anticorpo antiepirregulina em relação à epirregulina incluem, por exemplo, o seguinte método. Primeiro, células expressando epirreguli- na são reagidas com um anticorpo de teste, e então são coloridas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece o anticor- po de teste. O anticorpo antiepirregulina de teste é apropriadamente diluído com um tampão adequado para preparar o anticorpo a uma concentração desejada. Por exemplo, o anticorpo pode ser usado a uma concentração na faixa de 10 ug/ml a 10 ng/ml. Em seguida, a in- tensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCAalibur (BD). A intensidade de fluorescência obtida por análise usando o software CELL QUEST (BD), i.e., o valor de Média Geométrica, reflete a quantidade de anticorpo ligado às células. Isto é, a atividade de ligação de um anticorpo de teste, que é representada pela quantidade do anticorpo de teste ligado, pode ser determinada medindo-se o valor de Média Geométrica.

[0053] Se um anticorpo antiepirregulina compartilha um epitopo comum com outro anticorpo pode ser avaliado com base na competi- ção entre as duas moléculas pelo mesmo epitopo. A competição entre anticorpos pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similar. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de blo- queio cruzado preferido.

[0054] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína epirregulina imobilizada nos poços de uma placa de microtitulação é pré-incubada na presença ou ausência de um anticorpo competidor candidato, e em seguida um anticorpo de teste é adicionado aos mesmos. A quantidade de anticorpo de teste ligado à proteína epirre- gulina nos poços está indiretamente correlacionada com a capacidade de ligação de um anticorpo competidor candidato que compete pela ligação ao mesmo epitopo. Isto é, quanto maior a afinidade do anticor- po competidor para o mesmo epitopo, menor a atividade de ligação do anticorpo de teste em relação aos poços revestidos com a proteína epirregulina.

[0055] A quantidade do anticorpo ligado aos poços via a proteína epirregulina pode ser facilmente determinada marcando-se antecipa- damente o anticorpo. Por exemplo, um anticorpo marcado com biotina é medido usando-se um conjugado avidina/peroxidase e um substrato apropriado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que utiliza marcadores enzimáticos tais como peroxidase é denominado "ensaio ELISA competitivo". O anticorpo também pode ser marcado com ou- tras substâncias marcadoras que permitem detecção ou medição. Es- pecificamente, radiomarcadores, marcadores fluorescentes, entre ou- tros, são conhecidos.

[0056] Quando o anticorpo competidor candidato pode bloquear a ligação por um anticorpo em relação à epirregulina em pelo menos

20%, de preferência pelo menos 20 a 50%, ae mais preferivelmente pelo menos 50% em comparação com a atividade de ligação em um experimento de controle conduzido na ausência do anticorpo competi- dor, determina-se que o anticorpo de teste se liga substancialmente ao mesmo epitopo ligado pelo anticorpo competidor, ou compete pela |i- gação ao mesmo epitopo.

[0057] Quando a estrutura de um epitopo ligado por um anticorpo antiepirregulina já fora identificada, se os anticorpos de teste e de con- trole compartilham um epitopo comum pode ser avaliado comparando- se as atividades de ligação dos dois anticorpos em relação a um pep- tídio preparado introduzindo-se mutações aminoacídicas no peptídio que forma o epitopo.

[0058] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação dos anticorpos de teste e de controle em relação a um peptídio linear no qual uma mutação é introduzida são compara- das no formato ELISA acima. Além dos métodos de ELISA, a atividade de ligação em relação ao peptídio mutante ligado a uma coluna pode ser determinada fazendo-se os anticorpos de teste e de controle circu- larem na coluna, e entãao quantificando-se o anticorpo eluído na solu- ção de eluição. Métodos para adsorver um peptídio mutante em uma coluna, por exemplo, na forma de um peptídio de fusão GST, são co- nhecidos.

[0059] Alternativamente, quando o epitopo identificado é um epito- po conformacional, se os anticorpos de teste e de controle comparti- lham um epitopo comum pode ser avaliado pelo seguinte método. Pri- meiro, células expressando epirregulina e células expressando epirre- gulina com uma mutação introduzida no epitopo são preparadas. Os anticorpos de teste e de controle são adicionados a uma suspensão de células preparada suspendendo-se essas células em um tampão apropriado tal como PBS. Em seguida, as suspensões de células são apropriadamente lavadas com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece os anticorpos de teste e de controle é adici- onado às mesmas. A intensidade de fluorescência e o número de célu- las coloridas com o anticorpo marcado são determinados usando-se FACSCAalibur (BD). Os anticorpos de teste e de controle são apropria- damente diluídos usando-se um tampão adequada, e usados nas con- centrações desejadas. Por exemplo, eles podem ser usados a uma concentração na faixa de 10 pg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluo- rescência determinada por análise usando o software CELL QUEST (BD), i.e., o valor de Média Geométrica, reflete a quantidade de anti- corpo marcado ligado às células. Isto é, as atividades de ligação dos anticorpos de teste e de controle, que são representadas pela quanti- dade de anticorpo marcado ligado, podem ser determinadas medindo- se o valor de Média Geométrica.

[0060] No método acima, se um anticorpo "não se liga substanci- almente a células expressando epirregulina mutante" pode ser avalia- do, por exemplo, pelo seguinte método. Primeiro, os anticorpos de tes- te e de controle ligados a células expressando epirregulina mutante são coloridos com um anticorpo marcado. Em seguida, a intensidade de fluorescência das células é determindada. Quando se usa FACS- Calibur para detecção de fluorescência por citometria de fluxo, a inten- sidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando-se o software CELL QUEST. A partir dos valores de Média Geométrica na presença e ausência do anticorpo, o valor de comparação (ADGeo- Mean) pode ser calculado de acordo com a fórmula a seguir (Fórmula 1) para determinar a relação de aumento na intensidade de fluores- cência como resultado da ligação pelo anticorpo. [Fórmula 1] AGeo-Mean = Geo-Mean (na presente invenção do anticorpo)/Geo- Mean (na ausência do anticorpo)

[0061] O valor de comparação de Média Geométrica (valor de AGeo-Mean para a molécula de epirregulina mutante) determinado pe- la análise acima, que reflete a quantidade de um anticorpo de teste ligado a células expressando epirregulina mutante, é comparado com o valor de comparação de AGeo-Mean que reflete a quantidade do an- ticorpo de teste ligado a células expressando epirregulina. Neste caso, as concentrações do anticorpo de teste usado para determinar os valo- res de comparação de AGeo-Mean para células expressando epirregu- lina e células expressando epirregulina mutante são particularmente de preferência ajustados de modo a serem iguais ou substancialmente iguais. Um anticorpo com confirmação de que ele reconhece um epito- po na epirregulina é usado como um anticorpo de controle.

[0062] Se o valor de comparação de AGeo-Mean de um anticorpo de teste para células expressando epirregulina mutante for menor que o valor de comparação de AGeo-Mean do anticorpo de teste para célu- las expressando epirregulina em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais preferivelmente 30%, e particularmente de preferência 15%, então o anticorpo de teste "não se liga substancialmente a célu- las expressando epirregulina mutante". A fórmula para determinar o valor de Geo-Mean (Média Geométrica) está descrito no manual do usuário do software CELL QUEST (BD biosciences). Quando a compa- ração mostra que os valores de comparação são substancialmente equivalentes, é possível determinar o epitopo para os anticorpos anti- epirregulina de teste e de controle é o mesmo. Anticorpos

[0063] Neste relatório, "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou com- pleta. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais tais como plasma e soro de ocorrência natural, ou de sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpos. Alternativamente, os anticor-

pos podem ser parcialmente ou completamente sintetizados usando- se técnicas tais como recombinação genética. Anticorpos preferidos incluem, por exemplo, anticorpos de um isótipo de imunoglobulina ou subclasse pertencente ao mesmo. Imunoglobulinas humanas conheci- das incluem anticorpos das nove classes (isótipos) a seguir: I19G1, I9G2, 1963, IGgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. Destes isótipos, os anti- corpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, 19gG3, e IgG4.

[0064] Métodos para produzir um anticorpo com atividade de liga- ção desejada são conhecidos pelos versados na técnica. Abaixo en- contra-se um exemplo não limitativo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga à epirregulina (anticorpo antiepirre- gulina).

[0065] Anticorpos antiepirregulina podem ser obtidos como anti- corpos policlonais ou monoclonais usando-se métodos conhecidos. Os anticorpos antiepirregulina produzidos são de preferência anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamíferos incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão car- regando um gene do anticorpo por técnicas de engenharia genética. "Anticorpos humanizados" ou "anticorpos quiméricos" estão incluídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.

[0066] Hibridomas produtores de anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando-se técnicas conhecidas, por exemplo, como as descritas abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados por mé- todos de imunização convencionais usando uma proteína epirregulina como um antígeno sensibilizador. As células imunes resultantes são fundidas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celu- lar convencionais. Em seguida, hibridomas produtores de um anticorpo antiepirregulina podem ser selecionados por rastreamento de células monoclonais que produzem um anticorpo que se liga a um epitopo em uma molécula de epirregulina usando-se métodos de rastreamento convencionais.

[0067] Especificamente, anticorpos monoclonais são preparados da maneira mencionada a seguir. Primeiro, o gene de epirregulina hu- mana cuja sequência nucleotídica está divulgada na SEQ ID NO: 169 pode ser expresso de maneira a produzir a proteína epirregulina hu- mana mostrada na SEQ ID NO: 167, que será usada como um antíge- no sensibilizador para a preparação de anticorpos. Isto é, uma se- quência genética codificando epirregulina humana é inserida em um vetor de expressão conhecido, e células hospedeiras apropriadas são transformadas com este vetor. A proteína epirregulina humana deseja- da é purificada a partir das células hospedeiras por métodos conheci- dos. Para obter epirregulina humana solúvel a partir dos sobrenadan- tes de cultura, por exemplo, um polipeptídio compreendendo os ami- noácidos nas posições 30 a 118 na sequência polipeptídica da epirre- gulina humana de SEQ ID NO: 167 ou uma proteína incluída nos ami- noácidos nas posições 30 a 108 mostrada como SEQ ID NO: 34. À proteína epirregulina humana natural também pode ser usada como um antígeno sensibilizador.

[0068] A proteína epirregulina purificada pode ser usada como um antígeno sensibilizador para imunização de mamíferos. Um peptídio de epirregulina parcial também pode ser usado como um antígeno sensi- bilizador. Neste caso, um peptídio parcial pode ser preparado por sín- tese química com base na sequência aminoacídica da epirregulina humana, ou por inserção de um gene parcial de epirregulina humana em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um pep- tídio parcial pode ser produzido por degradação de uma proteína epir- regulina humana com uma protease. O comprimento e a região do peptídio parcial de epirregulina humana não se limitam a modalidades particulares. Uma região preferida pode ser arbitrariamente seleciona-

da da sequência aminoacídica nas posições dos aminoácidos 30 a 118 ou posições 30 a 108 na sequência aminoacídica de SEQ ID NO: 167. O número de aminoácidos que formam um peptídio a ser usado como um antígeno sensibilizador é de preferência de pelo menos cinco ou mais, por exemplo, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamen- te, um peptídio de 8 a 50 resíduos, mais preferivelmente 10 a 30 resí- duos, pode ser usado como o antígeno sensibilizador.

[0069] Para o antígeno sensibilizador, alternativamente é possível usar uma proteína de fusão preparada por fusão de um polipeptídio ou peptídio parcial desejado da proteína epirregulina com um polipeptídio diferente. Por exemplo, fragmentos Fc de anticorpos e tags de peptí- dios são de preferência usados para produzir proteínas de fusão a se- rem usadas como antígenos sensibilizadores. Vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fusão de genes in frame codificando dois ou mais fragmentos polipeptídicos desejados e inserção do gene de fusão em um vetor de expressão como descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão estão descritos em Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J e outros., Molecular Cloning 2nd ed., 9,47-9,58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Métodos para preparar epirregulina a ser usada como um antígeno sensibiliza- dor, e métodos de imunização usando epirregulina estão especifica- mente descritos no documento WO 2008/047723, entre outros.

[0070] Não há qualquer limitação particular quanto aos mamíferos a serem imunizador com o antígeno sensibilizador. No entanto, é pre- ferível selecionar os mamíferos levando em consideração sua compa- tibilidade com as células parentais a serem usadas para fusão celular. Em geral, roedores tais como camundongos, ratos, e hamsters, coe- lhos, e macacos são de preferência usados.

[0071] Os mamíferos acima são imunizados com um antígeno sensibilizador por métodos conhecidos. Geralmente os métodos de imunização realizados incluem, por exemplo, injeção intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno sensibilizador em mamíferos. Especifica- mente, um antígeno sensibilizador é apropriadamente diluído com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares. Se desejado, um adjuvante convencional tal como adjuvante completo de Freund é misturado com o antígeno, e a mistura é emulsi- ficada. Em seguida, o antígeno sensibilizador é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Carreadores apropriados podem ser usados na imunização com o antígeno sensibi- lizador. Em particular, quando um peptídio parcial de baixo peso mole- cular é usado como o antígeno sensibilizador, às vezes é desejável acoplar o peptídio antígeno sensibilizador a uma proteína carreadora tal como albumina ou hemocianina de lapa com perfuração para imu- nização.

[0072] Alternativamente, hibridomas produtores de um anticorpo desejado podem ser preparados usando-se imunização com DNA co- mo mencionado a seguir. Imunização com DNA é um método de imu- nização que confere imunoestimulação pela expressão de um antíge- no sensibilizador em um animal imunizado como resultado da adminis- tração de um DNA vetor construído para permitir a expressão de um gene codificando a proteína antígeno no animal. Comparado com mé- todos de imunização convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que a imuni- zação com DNA seja superior pelo fato de que: - é possível proporcionar imunoestimulação ao mesmo tempo em que se mantém a estrutura de uma proteína membronosa tal como epirre- gulina; e - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.

[0073] Para preparar um anticorpo monoclonal da presente inven- ção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA expressando uma proteína epirregulina é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA codificador de epirregulina pode ser sintetizado por métodos conhecidos tais como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão apropriado, e em seguida este é administrado a um animal a ser imunizado. De preferência oss vetores de expressão usados in- cluem, por exemplo, vetores de expressão comercialmente disponíveis tais como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um orga- nismo usando-se métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é efetuada usando-se uma pistola de gene para introduzir partículas de ouro revestidas com o vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Anticorpos que reconhecem epir- regulina também podem ser produzidos pelos métodos descritos no documento WO 2003/104453.

[0074] Depois de imunizar um mamífero da maneira descrita aci- ma, um aumento no título de um anticorpo fixador de epirregulina é confirmado no soro. Em seguida, células imunes são coletadas do mamífero, e então submetidas à fusão celular. Em particular, esplenó- citos são de preferência usados como células imunes.

[0075] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes mencionadas acima. As células de mieloma de preferência compreendem um marcador de se- leção adequado para rastreamento. Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) em uma condição de cultura específica. Deficiência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (doravante abreviado como deficiência em HGPRT) e deficiência em timidina quinase (doravante abreviado como deficiência em TK) são conhecidas como marcadores de seleção. Cé- lulas com deficiência em HGPRT ou possuem sensibilidade à hipoxan- tina-aminopterina-timidina (doravante abreviado como sensibilidade à HAT). Células sensíveis à HAT não conseguem sintetizar DNA em um meio de seleção de HAT, e são, portanto eliminadas. Entretanto, quan- do as células são funididas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais, e portanto elas podem crescer até mesmo no meio de seleção de HAT.

[0076] As células deficientes e HGPRT e as células deficientes em TK podem ser selecionados em um meio contendo 6-tioguanina, 8- azaguanina — (doravante — abreviado — como 8AG) ou 5- bromodesoxiuridina, respectivamente. Células normais são eliminadas porque elas incorporam esses análogos de pirimidina em seu DNA. Entretanto, células que são deficientes nessas enzimas podem sobre- viver no meio de seleção, já que elas não podem incorporar esses análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção denomi- nado resistência a G418 conferida pelo gene resistente à neomicina confere resistência aos antibióticos à base de 2-desoxistreptamina (análogos de gentamicina). Vários tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos. Por exemplo, células de mieloma incluindo as células a seguir podem ser de preferência usadas: P3(P3x63Ag8,653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U,1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU,1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

[0077] Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são essencialmente realizadas usando-se métodos conhecidos, por exemplo, um método de Kohler & Milstein e outros. (Methods Enzymol.

(1981) 73: 3-46).

[0078] Mais especificamente, a fusão celular pode ser realizada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular. Os agentes promotores de fusão incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e o vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar tal como dimetil sulfóxido tam- bém é adicionada para melhorar a eficiência de fusão.

[0079] A relação de células imunes para células de mieloma pode ser determinada a critério próprio, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Os meios de cultu- ra a serem usados para fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o crescimento de linhagens de células de mi- eloma, tais como o meio RPMI1640 e o meio MEM, e outros meios de cultura convencionais usados para este tipo de cultura de células. Além disso, suplementos séricos tais como soro de bezerro fetal (FCS) podem ser de preferência acrescentados ao meio de cultura.

[0080] Para fusão celular, quantidades predeterminadas das célu- las imunes e células de mieloma acima são bem misturadas no meio de cultura acima. Em seguida, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio varia de cerca de 1.000 a 6.000) pré-aquecida até cerca de 37C é acrescentada às mesmas uma conc entração ge- ralmente variando de 30% a 60% (p/v). Esta é delicadamente mistura- da para produzir as células de fusão (hibridomas) desejadas. Em se- guida, um meio de cultura apropriado mencionado acima é gradual- mente adicionado às células, e este é repetidamente centrifugado para remover o sobrenadante. Assim sendo, os agentes de fusão celular e que aqueles que são desfavoráveis o crescimento de hibridomas po- dem ser removidos. Os hibridomas assim obtidos podem ser sele- cionados por cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, ami-

nopterina, e timidina). Células que não os hibridomas desejados (célu- las não fundidas) podem ser eliminadas com a continuação da cultura no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Tipicamente, o período varia de vários dias a várias semanas. Então, hibridomas produtores do anticorpo desejado são rastreados e invidualmente clo- nados por métodos de diluição limitante convencionais.

[0081] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando-se um meio de seleção à base do marcador de seleção conti- do no mieloma usado para a fusão celular. Por exemplo, células defici- entes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Especificamente, quando células de mieloma sensíveis à HAT são usadas para a fusão celular, as células que se fundiram com sucesso com células normais podem se proliferar de forma seletiva no meio HAT. Células que não os hibridomas desejados (células não fun- didas) podem ser eliminadas com a continuação da cultura no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura que geral- mente varia de vários dias a várias semanas. Então, hibridomas produ- tores do anticorpo desejado são rastreados e invidualmente clonados por métodos de diluição limitante convencionais.

[0082] Os anticorpos desejados podem ser de preferência selecio- nados e invidualmente clonados por métodos de rastreamento à base de uma reação conhecidea antígeno/anticorpo. Por exemplo, um anti- corpo monoclonal fixador de epirregulina pode ser ligar à epirregulina expressa na superfície celular. Tal anticorpo monocilonal pode ser ras- treado por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). FACS é um sistema que avalia a ligação de um anticorpo à superfície celular analisando células contactadas com um anticorpo fluorescente usando raio laser, e medindo a fluorescência emitida a partir de células individuais.

[0083] Para rastrear hibridomas que produzem um anticorpo mo- noclonal da presente invenção por FACS, primeiro são preparadas cé- lulas expressando epirregulina. As células de preferência usadas para rastreamento são células de mamíferos nas quais a epirregulina é for- çadamente expressa. Como controle, a atividade de um anticorpo para se ligar à epirregulina na superfície celular pode ser seletivamente de- tectada usando-se células de mamíferos não transformados como cé- lulas hospedeiras. Especificamente, hibridomas produtores de um an- ticorpo monoclonal antiepirregulina podem ser isolados selecionando- se os hibridomas que produzem um anticorpo que se liga a células for- çadas a expressar epirregulina, mas não às células hospedeiras.

[0084] Alternativamente, a atividade de um anticorpo para se ligar a células expressando epirregulina imobilizadas pode ser avaliada com base no princípio do ELISA. Por exemplo, células expressando epirre- gulina são imobilizadas nos poços de uma placa de ELISA. Sobrena- dantes da cultura de hibridomas são colocados em contato com as cé- lulas imobilizadas nos poços, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, os anticorpos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundo. Os hibridomas produzindo um anticorpo desejado tendo capacidade de ligação a antígeno são selecionados pelo rastreamento acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similar.

[0085] Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais pre- parados dessa maneira podem ser passados em um meio de cultura convencional, e armazenados em nitrogênio líquido por um longo perí- odo.

[0086] Os hibridomas acima são cultivados por um método con- vencional, e anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibridomas são administrados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anti- corpos monoclonais são preparados a partir das ascites. O primeiro método é adequado para preparar anticorpos com alta pureza.

[0087] Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clo- nados a partir de células produtoras de anticorpo tais como os hibri- domas acima também podem ser de preferência usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor apropriado, e este é introdu- zido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo ge- ne. Métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em veto- res, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme e outros. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, como descrito abaixo.

[0088] Por exemplo, um cDNA codificando a região variável (regi- ão V) de um anticorpo antiepirregulina é preparado a partir de células de hibridoma expressando o anticorpo antiepirregulina. Para tanto, RNA total é primeiro extraído dos hibridomas. Métodos usados para extrair MRNAs de células incluem, por exemplo: - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), e - o método AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159).

[0089] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando-se o kit de purificação de mMRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similar. Alter- nativamente, kits para extrair MRNA total diretamente das células, tais como o kit de purificação de MRNA QuickPrep (GE Healthcare Biosci- ence), também se encontram comercialmente disponíveis. Os MRNAs podem ser preparados a partir de hibridomas usando tais kits. cONAs codificação a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir de MRNAs preparados usando uma transcriptase reversa. CDNAs podem ser sintetizados usando o Kkit de síntese de cDNA do primeiro cordão da transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou similar. Além disso, o kit de amplificação de CcDONA SMART RACE (Clontech) e o método 5'-RACE à base de PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser usados de forma apropriada para sintetizar e amplificar cDNAs. Em tal processo de síntese de cDNA, sítios de enzimas de restrição apropria- dos descritos mais adiante podem ser intoduzidos nas duas extremi- dades de um cDNA.

[0090] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante, e então ele é ligado a um DNA vetor. Um vetor recombinante é assim construído, e introduzido em E. coli ou si- milar. Depois de seleção da colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir de E. coli formadora de colônia. Em segui- da, se o vetor recombinante tem a sequência nucleotídica de cDNA de interesse é testado por um método conhecido tal como o método de terminação de cadeia de didesoxinucleoídeos.

[0091] O método 5'-RACE que utiliza iniciadores para amplificar o gene de região variável é convenientemente usado para isolar o gene codificando a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA para 5'-RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como gabarito. Um kit comercialmente disponível tal como o kit de amplificação de cDNA SMART RACE é apropriada- mente usado para sintetizar a biblioteca de cDNA para 5'-RACE.

[0092] O gene de anticorpo é amplificado por POR usando a biblio- teca de cCDNA para 5-RACE preparada como gabarito. Iniciadores pa- ra a amplificação de gene de anticorpo de camundongo podem ser de- senhados com base nas sequências gênicas de anticorpo conhecidas. As sequências nucleotídicas dos iniciadores podem variar dependendo da subclasse da imunoglobulina. Portanto, é preferível que a subclas-

se seja determinada com antecedência usando um kit comercialmente disponível tal como o kit de isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics).

[0093] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a amplificação de genes codificando as cadeias pesadas y1, 2a, y2b, e 73 e as cadeias leves x e A são usados para isolar genes codificadores de IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que se associa a um sítio da região constante próximo à região variável é usado como um iniciador de extremidade 3' para amplificar um gene da região variável de IgG. No entanto, um iniciador preso a um kit de construção de bibli- oteca de cDNA para 5' RACE é usado como um iniciador de extremi- dade 5.

[0094] Produtos de PCR amplificados dessa maneira são usados para remocelar imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando-se a atividade de ligação à epirregulina de uma imunoglobulina remodelada como um indicador. Quando o objetivo é isolar um anti- corpo contra epirregulina, é mais preferível que a ligação do anticorpo à epirregulina seja específica. Um anticorpo fixador de epirregulina po- de ser rastreado, por exemplo, pelas seguintes etapas: contactar uma célula expressando epirregulina com um anticorpo compreendendo a região V codificada por um cDNA isolado de um hi- bridoma; detectar a ligação do anticorpo à célula expressando epirregulina; e selecionar um anticorpo que se liga à célula expressando epirregulina.

[0095] Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a células expressando epirregulina são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo a células expressando epirregulina pode ser detecta- da pelas técnicas descritas acima tais como FACS. Amostras imobili- zadas de células expressando epirregulina são apropriadamente usa-

das para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.

[0096] Métodos de rastreamento de anticorpos preferidos que usam a atividade de ligação como um indicador também incluem mé- todos de garimpagem ("panning") usando vetores de fago. Métodos de rastreamento usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados de bibliotecas da subclasse de cadeia pesa- da e de cadeia leve de uma população de células expressando anti- corpo policlonal. Genes codificando as regiões variáveis da cadeia pe- sada e da cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligadora apropriada para formar um Fv de cadeia simples (scFv). Fagos apre- sentando scFv em sua superfície podem ser produzidos inserindo-se um gene codificando scFv em um vetor de fago. Os fagos são contac- tados com um antígeno de interesse. Em seguida, um DNA codifican- do scFv tendo a atividade de ligação de interesse pode ser isolado co- letando-se os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repe- tido quantas vezes forem necessárias para enriquer o scFv tendo a atividade de ligação de interesse.

[0097] Depois de isolamento do cDNA codificando a região V do anticorpo antiepirregulina de interesse, o cDNA é digerido com enzi- mas de restrição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos nas duas extremidades do cDNA. Enzimas de restrição preferidas re- conhecem e clivam uma sequência nucleotídica que ocorre na se- quência nucleotídica do gene de anticorpo com baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremi- dade pegajosa é de preferência introduzido em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta. O cDNA codificando a região V do anticorpo antiepirregulina é digerido da ma- neira descrita acima, e este é inserido em um vetor de expressão apropriado para construir um vetor de expressão de anticorpo. Neste caso, se um gene codificando a região constante do anticorpo (região

C) e um gene codificando a região V acima são fundidos "in-frame", um anticorpo quimérico é obtido. Neste relatório, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da regi- ão variável. Por conseguinte, além dos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/humanos, anticorpos aloquiméricos humanos/humanos estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído inse- rindo-se o gene da região V acima em vetor de expressão que já tem a região constante. Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que amputa o gene da região V acima pode ser apropriadamente colocada no lado 5' de um vetor de expressão carregando um DNA codificando uma região cons- tante (região c) desejada do anticorpo. Um vetor de expressão de anti- corpo quimérico é construído por fusão "in frame" dos dois genes dige- ridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.

[0098] Para produzir um anticorpo monoclonal que se liga à epir- regulina, genes de anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região re- guladora de expressão. A região reguladora de expressão para ex- pressão do anticorpo inclui, por exemplo, intensificadores e promoto- res. Além disso, uma sequência-sinal apropriada pode ser presa ao terminal amino para que o anticorpo expresso seja secretado para fora das células. Nos exemplos descritos mais adiante, um peptídio tendo a sequência aminoacídica MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 168) é usado como uma sequência-sinal. Entretanto, outras sequências- sinal apropriadas podem ser presas. O polipeptídio expresso é clivado no terminal carboxila da sequência acima, e o polipeptídio resultante é secretado para fora das células como um polipeptídio maduro. Em se- guida, células hospedeiras apropriadas são transformadas com o vetor de expressão, e células recombinantes expressando o DNA codifican-

do o anticorpo antiepirregulina são obtidas.

[0099] DNAs codificando a cadeia pesada (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) do anticorpo são inseridos separadamente em vetores de expressão diferentes para expressar o gene de anticorpo. Uma mo- lécula de anticorpo tendo as cadeias H e L pode ser expressa por co- transfecção da mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são respectivamente inseridos. Alter- nativamente, células hospedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual DNAs codificando as cadeias H e L são inseridos (vide documento WO 1994/011523).

[00100] Existem várias combinações conhecidas de célula hospe- deira/vetor de expressão para preparação de anticorpos por introdução de genes de anticorpo isolados em hospedeiros apropriados. Todos esses sistemas de expressão aplicam-se ao isolamento dos domínios de ligação de antígeno da presente invenção. Células eucarióticas apropriadas usadas como células hospedeiras incluem células ani- mais, células vegetais, e células fúngicas. Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes células. células de mamíferos: CHO, COS, mieloma, rim de filhote de hamster (BHK), HeLa, Vero, rim embrionário humano (HEK) 293, ou similar; células de anfíbios: oócitos de Xenopus, ou similar; e células de insetos: sf9, sf21, Tn5, ou similar.

[00101] Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de ex- pressão de gene de anticorpo usando células derivadas do gênero Ni- cotiana tais como Nicotiana tabacum é conhecido. Células de calo cul- tivadas podem ser apropriadamente usadas para transformar células vegetais.

[00102] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas: leveduras: o gênero Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevi-

siae, e o gênero Pichia tal como Pichia pastoris; e fungos filamentosos: o gênero Aspergillus tal como Aspergillus niger.

[00103] Além disso, sistemas de expressão de gene de anticorpo que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Exemplo, quando são usadas células bacterianas, células de E. coli, células Ba- cillus subtilis, entre outras, podem ser adequadamente utilizadas na presente invenção. Vetores de expressão carregando os genes de an- ticorpo de intesse são introduzidos nessas células por transfecção. As células transfectadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a partir da cultura de células transformadas.

[00104] Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgênicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante. Isto é, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene codificando o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por insersão "in frame" em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente em leite. B-caseína de cabra ou similar po- de ser usada, por exemplo, como a proteína secretada em leite. Frag- mentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene de anti- corpo é injetado em um embriãao de cabra, e em seguida este em- brião é introduzido em uma cabra. Os anticorpos desejados podem ser obtidos como uma proteína de fusão com a proteína de leite a partir do leite produzido pela cabra transgência nascida da cabra receptora do embrião (ou progênie da mesma). Além disso, para aumentar o volu- me de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra trans- gênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica quando necessário (Ebert, K. M. e outros., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

[00105] Quando um anticorpo antiepirregulina descrito neste relató- rio é administrado a um ser humano, um domínio fixador de antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que fora artifi- cialmente modificado para reduzir a antigenicidade heteróloga contra humanos e outros pode ser apropriadamente usado como o domínio fixador de antígeno do anticorpo. Tais anticorpos geneticamente re- combinantes incluem, por exemplo, anticorpos humanizados. Estes anticorpos modificados são produzidos de forma apropriada por méto- dos conhecidos.

[00106] Uma região variável de anticorpo usada para produzir o domínio fixador de antígeno de um anticorpo antiepirregulina descrito nesta invenção geralmente é formada por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são separadas por quatro regiões de esqueleto (FRs). CDR é uma região que determina substancialmen- te a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências amino- acídicas das CDRs são bastante diversas. Por outro lado, as sequên- cias aminoacídicas formaddoras de FR frequentemente têm alta iden- tidade mesmo entre anticorpos com especificidades de ligação diferen- tes. Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um certo an- ticorpo pode ser introduzida em um outro anticorpo por enxerto de CDR.

[00107] Um anticorpo humanizado é também chamado de anticorpo humano remodelado. Especificamente, anticorpos humanizados pre- parados por enxerto da CDR de um anticorpo de animal não humano tal como um anticorpo de camundongo em um anticorpo humano, en- tre outros, são conhecidos. Técnicas comuns de engenharia genética para obtenção de anticorpos humanizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, a PCR de extensão sobreposta é co- nhecida como um método para o enxerto de uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana. Na PCR de extensão sobreposta, uma sequência nucleotídica codificando uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. São preparados iniciadores para cada uma das quatro FRs. Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, a seleção de uma FR humana que tenha alta identidade com uma FR de camundongo é vantajosa para manter a função da CDR. Isto é, geralmente é preferí- vel usar uma FR humana compreendendo uma sequência aminoacídi- ca que tem allta identidade com a sequência aminoacídica da FR ad- jacente à CDR de camundongo a ser enxertada.

[00108] As sequências nucleotídicas a serem ligadas são desenha- das de maneira que sejam conectadas uma à outra "in frame". FRs humanas são individualmente sintetizadas usando-se os respectivos iniciadores. Como resultado, produtos nos quais o DNA codificando CDR de camundongo é preso aos DNAs codificando FR individuais são obtidos. As sequências nucleotídicas codificando a CDR de ca- mundongo de cada produto são desenhadas de maneira a se sobrepo- rem umas às outras. Em seguida, uma reação de síntese de cordão complementar é conduzida para associar as regiões de CDR sobre- postas dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo huma- no como gabarito. FRs humanas são ligadas via as sequências de CDR de camundongos por esta reação.

[00109] O gene da região V de comprimento integral, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usan- do-se iniciadores que se associam a sua extremidade 5'- ou 3'-, que são acrescidos de sequências de reconhecimento de enzimas de res- trição adequadas. Um vetor de expressão para anticorpo humanizado pode ser produzido inserindo-se o DNA obtido da maneira descrita acima e um DNA que codifica a região C de um anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se ligem "in frame". Depois que o vetor recombinante é transfectado em um hospedeiro para estabelecer células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o

DNA codificando o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura de células (vide Publicação de Paten- te Europeia Nº EP 239400 e Publicação de Patente Internacional Nº WO 1996/002576).

[00110] Medindo e avaliando qualitativamente ou quantitativamente a atividade fixadora de antígeno do anticorpo humanizado produzido da maneira descrita acima, é possível selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que CDRs formem um sítio fixador de antígeno favorável quando ligado através de CDRs. Os resíduos aminoacídicos nas FRs podem ser substituídos conforme necessário, para que as CDRs de um anticorpo humano remodelado formem um sítio fixador de antígeno apropriado. Por exemplo, mutações de se- quências aminoacídicas podem ser introduzidos em FRs aplicando-se o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações de sequências de nucleotídeos parciais podem ser introduzidas em iniciadores que se associam à FR. Mutações de sequências nucleotídicas são introduzi- das nas FRs sintetizadas com o uso de tais iniciais. Sequências de FR mutante tendo as características desejadas podem ser selecionadas medindo-se e avaliando-se a atividade do anticorpo mutante com ami- noácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método mencionado acima (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).

[00111] É Alternativamente, anticorpos humanos desejados podem ser obtidos imunizando-se animais transgênicos tendo o repertório completo de genes de anticorpos humanos (vide os documentos WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.

[00112] Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por garimpagem usando bibliotecas de anticorpos humanos também são conhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é ex-

pressa como um anticorpo de cadeia simples (scFv) na superfície de fago pelo método de exibição de fagos. Fagos expressando um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA codificando a região V de anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada analisando-se os genes de fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado por fusão da sequência da região V "in frame" com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado, e inserção deste em um vetor de expressão apropriado. O vetor de expressão é introduzido em células apropriadas para expres- sãao tais como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene codificando anticorpo humano nas células. Estes métodos já são conhecidos (vide os documentos WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

[00113] Além das técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência codificadora de anticor- po, clonagem e seu isolamento; uso na construção de vetor de ex- pressão para preparar cada anticorpo (I9G1, IgG2, IgG3, ou IgG4 em particular); entre outros) tais como aquelas descritas em Bernasconi e outros. (Science (2002) 298: 2199-2202) ou no documento WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar genes de anticorpos. Numeração EU e numeração de Kabat

[00114] De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácidos atribuídas à CDR e FR de anticorpo estão especificadas de acordo com a numeração de Kabat (Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). Neste relatório, os aminoácidos da re- gião variável de um anticorpo antiepirregulina estão indicados de acor-

do com a numeração de Kabat, ao passo que os aminoácidos da regi- ão constante estão indicados de acordo com a numeração EU com nas posições de Kabat dos aminoácidos. Alteração de aminoácidos

[00115] Métodos conhecidos tais como mutagênese sítio- direcionada (Kunkel e outros., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão sobreposta podem ser apropriadamente empregados para modificar aminoácidos nas sequências aminoacídi- cas de anticorpos. Além disso, vários métodos conhecidos também podem ser usados como um método de alteração para substituir ami- noácidos por outros aminoácidos que não aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, é possível usar apropriadamente um sistema de translação livre de células (Clover Di- rect (Protein Express)) contendo tRNAs ligados com aminoácidos sin- téticos em tRNAs supressores de âmbar, que são complementares ao códon UAG (códon de âmbar) que é um códon de interrupção.

[00116] Conforme usado neste relatório, na descrição da posição de uma alteração de aminoácido, o significado do termo "e/ou" inclui toda combinação em que "e" e "ou" são apropriadamente combinados. Especificamente, por exemplo, "os aminoácidos nas posições 33, 55, e/ou 96 são substituídos" inclui a seguinte variação de alterações de aminoácidos: aminoácidos na (a) posição 33, (b) posição 55, (c) posi- ção 96, (d) posições 33 e 55, (e) posições 33 e 96, (f) posições 55 e 96, e (g) posições 33, 55, e 96. Redução na imunogenicidade

[00117] De preferência, a imunogenicidade prevista do anticorpo da presente invenção em um hospedeiro humano é reduzida.

[00118] "Baixa imunogenicidade" significa que em um tempo sufici- ente para atingir eficácia terapêutica, um anticorpo não induz uma res-

posta ao anticorpo em pelo menos a maioria dos indivíduos que rece- bem uma quantidade suficiente do anticorpo para reduzir a efetividade da administração continuada do anticorpo.

[00119] O nível de imunogenicidade em seres humanos pode ser previsto usando-se o programa de predição de ligação de MHC classe Il Propred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred) usando uma aná- lise de valor limiar de 1% de todos os alelos. Outras programas que podem ser usados incluem: - Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); e - Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com).

[00120] Em comparação com a molécula doadora de partida, molé- culas com imunogenicidade reduzida não contêm ou contêm um nú- mero reduzido de peptídios previstos para se ligarem a alelos de MHC classe |l que são altamente expressos na população alvo (Flower e outros., Drug Discov. Today (2004) 9(2), 82-90).

[00121] Uma análise funcional da ligação de MHC classe Il pode ser feita gerando-se peptídios sobrepostos correspondentes à proteína de interesse, e testando-se sua capacidade para provocar ativação de células T (ensaio de proliferação de células T) ou substituindo-se um petpídio fixador de MHC classe Il conhecido, que é um peptídio repór- ter (Hammer J e outros., J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358).

[00122] Diversos métodos podem ser empregados para reduzir a imunogenicidade de anticorpos antiepirregulina da presente invenção. O primeiro método é humanizar os anticorpos mencionados acima. Mais especificamente, CDRs de um anticorpo antiepirregulina isolado de um animal não humano tal como um camundongo são enxertadas em um anticorpo humano. Para manter ou aumentar a ligação à epir- regulina, resíduos aminoacídicos das FRs podem ser adicionalmente substituídos de modo que as CDRs de um anticorpo antiepirregulina humanizado formem sítios fixadores de antígeno apropriados.

[00123] Uma modalidade não limitativa de CDRs de um anticorpo antiepirregulina isolado de camundongos da presente invenção inclui a cadeia pesada CDR1 (HCDR1) de SEQ ID NO: 9, a cadeia pesada CDR2 (HCDR2) de SEQ ID NO: 10, e a cadeia pesada CDR3 (HCDR3) de SEQ ID NO: 11. Além disso, uma modalidade não limitati- va de CDRs de um anticorpo antiepirregulina isolado de camundongos da presente invenção inclui a cadeia leve CDR1 (LCDR1) de SEQ ID NO: 12, a cadeia leve CDR2 (LCDR2) de SEQ ID NO: 13, e a cadeia leve CDR3 (LCDR3) de SEQ ID NO: 14.

[00124] Uma modalidade não limitativa de FRs de um anticorpo humano da presente invenção inclui a cadeia pesada FR1 (HFR1) de SEQ ID NO: 1, a cadeia pesada FR2 (HFR2) de SEQ ID NO: 2, a ca- deia pesada FR3 (HFR3) de SEQ ID NO: 3, e a cadeia pesada FR4 (HFR4) de SEQ ID NO: 4. Além disso, uma modalidade não limitativa de FRs de um anticorpo humano da presente invenção inclui a cadeia leve FR1 (LFR1) de SEQ ID NO: 5, a cadeia leve FR2 (LFR2) de SEQ ID NO: 6, a cadeia leve FR3 (LFR3) de SEQ ID NO: 7, e a cadeia leve FR4 (LFR4) de SEQ ID NO: 8.

[00125] Uma modalidade não limitativa da região variável de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção inclui a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15. Além disso, uma modalidade não limitativa da região variável de um anticorpo antiepir- regulina humanizado da presente invenção inclui a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 16.

[00126] Além disso, uma modalidade não limitativa de FRs de um anticorpo humano da presente invenção inclui a cadeia pesada FR1 (HFR1) de SEQ ID NO: 17, e a cadeia pesada FR3 (HFR3) de SEQ ID NO: 18. Além disso, uma modalidade não limitativa de FRs de um an- ticorpo humano da presente invenção inclui a cadeia leve FR2 (LFR2) de SEQ ID NO: 20, a cadeia leve FR3 (LFR3) de SEQ ID NO: 21,e a cadeia leve FR3 (LFR3) de SEQ ID NO: 23.

[00127] Uma modalidade não limitativa da região variável de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção inclui a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 19. Além disso, uma modalidade não limitativa da região variável de um anticorpo antiepir- regulina humanizado da presente invenção inclui a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 22 ou 24.

[00128] Além disso, uma modalidade não limitativa de FRs de um anticorpo humanizado da presente invenção inclui a cadeia pesada FR3 (HFR3) de SEQ ID NO: 35 e a cadeia pesada FR3 (HFR3) de SEQ ID NO: 36. Uma modalidade não limitativa da região variável de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção inclui a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 37 ou 38.

[00129] O segundo método é um método para desenhar uma se- quência alterada com imunogenicidade reduzida analisando uma se- quência alterada com alterações de aminoácidos na sequência amino- acídica de um anticorpo antiepirregulina usando o programa de predi- ção de ligação MHC classw Il mencionado acima. Exemplos não limi- tativos adequados dos sítios de alterações de aminoácidos para redu- zir a imunogenicidde de anticorpos antiepirregulina da presente inven- ção incluem os aminoácidos na posições 87 e/ou 101, como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia pesada do anticor- po antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, exemplos não limi- tativos preferidos do sítio de alteração de aminoácido para reduzir a imunogenicidade de antiepirregulina incluem o aminoácido na posição 24, como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 29.

[00130] Um exemplo preferido de uma modalidade não limitativa das substituições de aminoácidos mencionadas acima inclui substituir o aminoácido na posição 87 por Ser (S) e/ou substituir o aminoácido na posição 101 por Tyr(Y) ou Phe(F), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia pesada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, um exemplo preferido de uma modali- dade não limitativa da substituição de aminoácido mencionada acima inclui substituir o aminoácido na posição 24 por Arg(R), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 29.

[00131] O terceiro método é um método para selecionar de forma apropriada uma região constante de alótipo de IgG1 selecionado den- tre o tipo G1m3 (uma sequência produzida pela adição de GK ao ter- minal C da sequência de SEQ ID NO: 31), o tipo G1m17,1 (SEQ ID NO: 26), e o tipo G1m17 (uma sequência produzida pela adição de GK ao terminal C da sequência de SEQ ID NO: 30), ao se desenhar um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região constante de um anticorpo IgG1. A compatibilidade entre o alótipo da espécie animal humana à qual o fármaco à base de anticorpos é administrado, e o alótipo deste fármaco à base de anticorpos afetam sabidamente as respostas imunológicas na espécie animal (Genes and Immunity (2011) 12, 213-221).

[00132] Uma modalidade não limitativa de uma cadeia pesada de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção com imunogenicidade reduzida inclui cadeias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115- 127, 131-135, 137-140, e 142-150. Além disso, uma modalidade não limitativa de uma cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina humani- zado da presente invenção inclui cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136, e1l41.

[00133] Uma modalidade não limitativa de um anticorpo antiepirre- gulina humanizado da presente invenção com imunogenicidade redu-

zida inclui humanized anticorpos antiepirregulina compreendendo ca- deias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, e142-150, e cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136, e 141. Suppressão de desamidação, isomerização, e hidrólise

[00134] É preferível que a desamidação, isomerização, e hidrólise sejam suprimidas nos anticorpos antiepirregulina da presente inven- ção.

[00135] É muito importante controlar a quantidade de agregado em um fármaco à base de proteína ao se considerar o controle de quali- dade e as influências sobre a eficácia medicamentosa e imunogenici- dade (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Geralmente, a formação de agregado é afetada tanto pela estabilidade coloidal resul- tante do ambiente da solução de proteína quanto pela estabilidade conformacional resultante da estrutura da proteína (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Condições eficazes para a estabilidade coloidal podem ser obtidas rastreando-se a concentração ou pH do anticorpo, o tipo de solução tamponante, a resistência iônica, e o aditi- vo, entre outros, examinando-se a prescrição de uma formulação de anticorpo. Por outro lado, a estabilidade conformacional depende em parte da sequência aminoacídica, e no caso de anticorpos, ela é con- siderada importante para manter estruturas características tais como a estrutura canônina das CDRs, sequências de consenso de FR, e a in- terface VH/VL, entre outros (Jung e outros., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang e outros., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert e outros., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo e outros., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120; e Morea e outros., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294).

[00136] Reação de desamidação refere-se a reações que ocorrem de forma não enzimática nas cadeias laterais de asparagina e glutami- na, e transforma as amidas nas cadeias laterais de asparagina e glu- tamina em ácidos carboxílicos. Isomerização resulta da formação de um intermediário instável do tipo imida cíclica por desamidação de as- paragina ou desidratação de ácido aspártico, como resultado do ata- que do grupo carbonila presente na cadeia lateral de asparagina ou ácido aspártico por um par de elétrons de nitrogênio em um resíduo posicionado no terminal C. Este intermediário é transformado princi- palmente em ácido isoaspártico por clivagem, e o resto se transforma em ácido aspártico. No caso da glutamina, a taxa de desamidação ge- ralmente é um décimo daquela da asparagina, mas o mecanismo é essencialmente o mesmo, e só precisa de moléculas de água para que a reação progrida. Como essas reações de desamidação e isomeriza- ção que ocorrem durante o armazenamento de proteínas tais como anticorpos se tornam as causas da heterogeneidade descrita acima, elas são desejavelmente eliminadas na medida do possível. Além dis- So, já foi relatado que reações de desamidação ocorrem especialmen- te em sítios nos quais asparagina e glicina são adjacentes uma à outra (Asn-Gly) (Geiger e outros., J. Biol. Chem. (1987) 262, 785-794). Além disso, já foi reportado que clivagem da cadeia peptídica por uma rea- ção de hidrólise ocorre em ácido aspártico, e afirma-se que hidrólise ocorre facilmente em condições ácidas particularmente em uma se- quência na qual prolina está presente na extremidade C-terminal (Asp- Pro) (Segalas e outros., FEBS Letters (1995) 371, 171-175).

[00137] Para suprimir a desamidação, isomerização, e hidrólise, alterações de aminoácidos para remover resíduos glutaminil e aspara- ginil que são sítios que sofrem desaminação podem ser realizadas quando apropriado. Uma modalidade não limitativa preferida de um sítio de desamidação cuja remoção é particularmente eficaz inclui sí- tios nos quais a reação de desamidação é promovida, ou mais especi-

ficamente resíduo glicina, resíduo asparagina, ou resíduo glutamina nos motivos indicados como sequências NG e QG. A substituição de qualquer um desses resíduos aminoacídicos (N, Q, ou G) pode supri- mir acentualmente as reações de desamidação (WO 2003/057881, WO 2005/067620, entre outros). Além disso, métodos para a produção de anticorpos com reação de desamidação suprimida por controle do método para cultivar células produtoras de anticorpos podem ser usa- dos quando apropriado. Os anticorpos antiepirregulina oferecidos pela presente invenção também incluem anticorpos antiepirregulina aos quais a técnica mencionada acima de supressão da reação de desa- midação fora aplicada.

[00138] Exemplos não limitativos de sítios que sofrem desamidação de preferência incluem aminoácidos nas posições 31, 52, 54, 56, e/ou 101 como indicado pela numeração de Kabat na sequência da cadeia pesada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, exemplos não limitativos de sítios que sofrem desamidação de prefe- rência incluem aminoácidos nas posições 28, 92, e/ou 93 como indica- do pela numeração de Kabat na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 29.

[00139] Uma modalidade não limitativa das substituições de amino- ácidos mencionadas acima de preferência inclui substituições do ami- noácido na posição 31 por Ala (A) e/ou substituição do aminoácido na posição 55 por (T), Lys (K), Phe (F), Val (V), Arg (R), ou Leu (L), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia pesada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, uma modali- dade não limitativa das substituições de aminoácidos mencionadas acima de preferência inclui substituições do aminoácido na posição 92 por Glu (E) e/ou do aminoácido na posição 93 por Arg (R) ou GIn (Q), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 29.

[00140] “Modalidades não limitativas de uma cadeia pesada de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção com de- samidação, isomerização, e hidrólise suprimidas incluem cadeias pe- sadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150. Além disso, modalidades não limitativas de uma cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção com desamidação, isomerização, e hidrólise suprimidas incluem cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 58, 128, e 141.

[00141] “Modalidades não limitativas de um anticorpo antiepirreguli- na humanizado da presente invenção com desamidação, isomeriza- ção, e hidrólise suprimidas incluem anticorpos antiepirregulina huma- nizados compreendendo cadeias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150, e cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 57, 58, 128, e 141. Modulação do ponto isoelétrico

[00142] De preferência, os pontos isoelétricos dos anticorpos antie- pirregulina da presente invenção são modulados. Métodos de controle da carga superficial de uma molécula de anticorpo por meio de altera- ção de resíduos aminoacídicos expostos na superfície da molécula de anticorpo são conhecidos como um dos métodos para controlar a meia-vida plasmática de anticorpos (WO 2007/114319 e WO 2009/041543). Especificamente, já se sabe que com a redução do va- lor do ponto isoelétrico (pl) de um anticorpo é possível prolongar a meia-vida plasmática do anticorpo. Ao contrário, já se sabe que um aumento no ponto isoelétrico de um anticorpo reduz sua meia-vida plasmática, e melhora as propriedades de migração de tecido do anti- corpo (Vaisitti e outros., J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3- 4), 105-112; Pardridge e outros., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286

(1), 548-554). De um lado, sabe-se que o efeito antitumoral de um an- ticorpo cujo ponto isoelétrico foram reduzido é melhorado em relação àquele do anticorpo antes da alteração (WO 2009/041062).

[00143] O plde uma proteína tal como um anticorpo é definido co- mo o pH no qual o polipeptídio tem uma carga efetiva. Neste campo, tipicamente, sabe-se que a solubilidade da proteína é mais baixa quando o pH da solução é equivalente ao ponto isoelétrico (pl) da pro- eína. Por conseguinte, com base no pl, a solubilidade da proteína a um pH dado, por exemplo, pH 6 pode ser avaliada. O pl de uma prote- ína também é um bom indicador para a viscosidade de uma proteína em uma preparação líquida. Um pl alto mostra alta solubilidade e baixa viscosidade (que é particularmente importante para uma preparação altamente concentrada). Em uma modalidade não limitativa da presen- te invenção, domínios candidatos tendo um pl mais alto que um liminar predeterminado são selecionados. O pl do anticorpo também desem- penha um papel específico na eficácia medicamentosa e distribuição biológica do anticorpo. Por exemplo, quando o pl do anticorpo aumen- ta, sabemos que a localização nas células e/ou fora do vaso aumenta. As propriedades mais desejáveis do pl para um anticorpo particular devem ser determinadas de modo a atingir o objetivo desejado. Em várias modalidades, anticorpos com um valor de pl de aproximada- mente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 ou mais podem ser obti- dos. Em uma outra modalidade não limitativa, anticorpos com um valor de pl de aproximadamente 9,0, 8,5, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0 ou menos podem ser selecionados. O versado na técnica vai entender que uma única proteína pode ter uma pluralidade de formas carrega- das. Sem nos atermos a qualquer particular, a carga de uma proteína pode ser modulada por inúmeros mecanismos de ação diferentes; e sem limitação, exemplos de tais mecanismos incluem substituições de aminoácidos, formação de cátions, desaminação, heterogeneidade do aminoácido carboxi-terminal, fosforilação, e glicosilação, entre outros. pl conforme usado neste relatório é definido como pl da principal forma carregada.

[00144] Oplde uma proteína pode ser determinado por vários mé- todos, e sem limitação, uma modalidade não limitativa de tais métodos inclui focagem isoeléctrica, e vários outros algoritmos de computador (vide, por exemplo, Bjellgvist e outros., Electrophoresis (1993) 14, 1023). Em uma modalidade não limitativa, o pl é determinado usando um sistema de eletroforese Pharmacia Biotech Multiphor 2 equipado com uma unidade de recirculação do banho de resfriamento multi- temp Ill e uma fonte de energia EPS 3501 XL. Ampholine Gel pré- moldado (Amersham Biosciences, faixa de pl: 2,5 a 10) é carregado junto 5 ug da proteína. O pl relativo de um anticorpo é determinado usando um marcador de pl de faixa ampla (Amersham, faixa de pl: 3- 10, 8 uL). Eletroforese é realizada em condições de 1,500 V e 50 mA por 105 minutos. Em seguida, o gel é fixado uma solução fixadora da Sigma (5x) diluída 1x com água purificada. O gel é colorido usando o corante Simply Blue (Invitrogen) por uma noite à temperatura ambien- te. O gel é então descolorido usando uma solução consistindo em 25% de etanol, 8% de ácido acético e 67% de água purificada. O ponto iso- elétrico é determinado com base em uma curvão de calibração padrão usando um densitômetro Bio-Rad.

[00145] Para modular o ponto isoelétrico de um anticorpo antiepir- regulina da presente invenção, alterações de aminoácidos e outras envolvendo a remoção de aminoácidos carregados na sequência ami- noacídica de um anticorpo antiepirregulina, ou a adição ou inserção de aminoácidos carregados na sequência aminoacídica de um anticorpo antiepirregulina podem ser efetuadas quando apropriado. Sabemos que aminoácidos carregados estão presentes entre os aminoácidos. Geralmente, lisina (K), arginina (R), e histidina (H) são conhecidos co-

mo aminoácidos que têm uma carga positiva (aminoácidos positiva- mente carregados). Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), entre ou- tros, são conhecidos como aminoácidos que têm uma carga negativa (aminoácidos negativamente carregados). Os outros aminoácidos são conhecidos como aminoácidos não carregados.

[00146] O "resíduo aminoacídico alterado" mencionado acima é de preferência um resíduo aminoacídico selecionado apropriadamente dentre aminoácidos seja no grupo (a) ou no grupo (b) submetidos à adição, inserção, ou remoção, mas não estão particularmente limita- dos a esses aminoácidos.

[00147] ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D)

[00148] lisina (K), arginina (R), histidina (H).

[00149] “Quando o resíduo aminoacídico original (antes da altera- ção) já é carregado, alterá-lo para um resíduo aminoacídico não carre- gado é também uma modalidade preferida da presente invenção. Mais especificamente, as alterações na presente invenção incluem (1) subs- tituir um aminoácido carregado por um aminoácido não carregado, (2) substituir um aminoácido carregado por um aminoácido com carga oposta em relação ao aminoácido original, e (3) substituir um aminoá- cido não carregado por aminoácido carregado.

[00150] Exemplos não limitativos de posições nas quais aminoáci- dos são alterados para modular o ponto isoelétrico de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção de preferência incluem aminoá- cidos nas posições 13, 61, 62, 64, 65, 97, e/ou 98 como indicado pela numeração de Kabat na sequência da cadeia pesada do anticorpo an- tiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, exemplos não limitativos de posições nas quais aminoácidos são alterados para modular o pon- to isoelétrico de um anticorpo antiepirregulina de preferência incluem aminoácidos nas posições 24, 55, 56, e/ou 107 como indicado pela numeração de Kabat na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepi-

rregulina de SEQ ID NO: 29.

[00151] Uma modalidade não limitativa das substituições de amino- ácidos mencionadas acima de preferência inclui substituições do ami- noácido na posição 14 por Asn (N) ou Lys (K), substituição do aminoá- cido na posição 61 por Asp (D) ou Glu (E), substituição do aminoácido na posição 62 por Ser (S) ou Gln (Q), substituição do aminoácido na posição 64 por Asp (D) ou Glu (E), substituição do aminoácido na po- sição 65 por Asp (D) ou Glu (E), substituição do aminoácido na posi- ção 97 por Arg (R) e/ou substituição do aminoácido na posição 98 por Glu (E), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia pesada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, uma modalidade não limitativa das substituições de aminoáci- dos mencionadas acima de preferência inclui substituições do aminoá- cido na posição 24 por Gln (Q) ou Ser (S), substituição do aminoácido na posição 55 por Glu (E), substituição do aminoácido na posição 56 por Glu (E), e/ou substituição do aminoácido na posição 106a por Glu (E), como indicado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 29.

[00152] Uma modalidade não limitativa de uma cadeia pesada de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção com ponto isoelé- trico modulado inclui cadeias pesadas selecionadas do grupo que con- siste nas SEQ ID NOs: 72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-

150. Além disso, uma modalidade não limitativa de uma cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção com ponto isoelétrico modulado inclui cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 80-85, e 99.

[00153] Uma modalidade não limitativa de um anticorpo antiepirre- gulina da presente invenção com ponto isoelétrico modulado inclui an- ticorpos antiepirregulina compreendendo cadeias pesadas seleciona- das do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 72-79, 98, 115-127, 131-

135, 137-140, e 142-150 e cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 80-85, e 99. Melhoramento da estabilidade

[00154] De preferência, a estabilidade de anticorpos antiepirregulina da presente invenção é melhorada. Um ou mais parâmetros que des- crevem a estabilidade de um anticorpo incluem o valor da temperatura de fusão térmica (Tm) de um domínio. O valor da Tm de um anticorpo é um excelente indicador da estabilidade térmica do anticorpo, e tam- bém pode ser um indicador do período de armazenamento para o anti- corpo. Um valor mais baixo da Tm indica formação de agregados / bai- xa estabilidade, ao passo que um valor mais alto da Tm indica não formação de agregados / alta estabilidade. Assim sendo, é preferível que sejam fornecidos anticorpos com valores elevados de Tm. Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, anticorpos com valores de Tm mais altos que o limiar predeterminado são seleciona- dos. Em algumas modalidades, anticorpos tendo um valor de Tm de pelo menos 50T, 55CT, 60T, 65T, 70T, 75T, 80T —,85CT, OT, 95, ou 100% ou mais são selecionados.

[00155] Atemperatura de fusão térmica (Tm) de um anticorpo pode ser medida por vários métodos tradicionais conhecidos na literatura. Por exemplo, Vermeer e outros. estudaram o desenrolamento e a des- naturaçô de uma IgG monocional de camundongo anti-rato de isótipo 2b por calorimetria diferencial de varredura (DSC) e espectroscopia de dicroismo circular (CD) (Biophys. J. (2000) 78, 394-404; Colloids Sur- faces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J. Colloid Interface Sci. (2000) 225, 394-397; e 2000, Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Como resultado, foi considerado que o enrolamento e de- senrolamento da IgG podem ser caracterizados por duas transições principais que são a sobreposição de várias etapas. A distribuição bi- modal observada nos experimentos tanto de DSC quanto de CD não dependia da taxa de varredura nos experimentos. As duas transições pareciam ser independentes, e o desenrolamento foi irreversível. A es- trutura secundária assim como a estabilidade termodinâmica de Fab e de Fc, que foram digeridos a partir da IgG, foram comparadas com aqueles da imunoglobulina intacta (Vermeer e outros., Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). Foi mostrado que os dois picos observados para a IgG intacta podem ser atribuídos ao fragmento Fab e ao frag- mento Fc, respectivamente. Vermeer e outros. também mostraram que, além da indução por calor, a perturbação estrutural da IgG em geral também pode ser desencadeada por alteração do pH (Biophys. J. (2000) 78, 394-404) ou por interação com um ambiente hidrófobo, por exemplo, adsorção em superfícies de Teflon ou interação com ten- soativos (Vermeer e outros., 1998, Biochim. Biophys. Acta. (1988) 1425, 1-12; Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150; J. Colloid Interface Sci. 225 (2000) 394-397).

[00156] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, a Tm de um anticorpo é medida usando-se uma amostra contendo anti- corpos isolados. Em uma modalidade, a Tm de um anticorpo é medida usando-se um VP-DSC (MicroCal, LLC) em condições de uma taxa de varredura de 1,0T/minuto e uma faixa de temperatura de 25T a 120ºC. Um período de filtragem de oito segundos pod e ser usado junto com um termostato pré-varredura de cinco minutos. Em um exemplo específico, amostras são preparadas por diálise em Histidina-HCI 25 MM usando copos de diálise Pierce (3,5 kKD). A concentração média de anticorpo é de 50 ug/mL determinada por absorção a 280 nm. As tem- peraturas de fusão são determinadas de acordo com os procedimen- tos do fabricante usando o software Origin fornecido pelo sistema. Em resumo, múltiplas linhas basais são carregadas com tampão tanto nas células de amostra como nas células de referência para estabelecer o equilíbrio térmico. Depois que a linha basal é subtraída do termograma da amostra, os dados são normalizados para concentração e ajusta- dos usando a função de desconvolução. Em outra modalidade, a esta- bilidade dos anticorpos é avaliada um método descrito mais adiante. Um ou mais dados métricos podem ainda incluir dados métricos carac- terizando a estabilidade do anticorpo em uma ou mais condições dife- rentes selecionados do grupo que consiste em valores de pH diferen- tes, temperaturas diferentes, esforços de cisalhamento diferentes, e ciclos de congelamento/descongelamento diferentes.

[00157] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, as medições por DSC podem ser feitas usando o Setaram Micro-DSC Ill (Setaram, Caluire, França). As amostras são colocadas no caloríme- tro em uma célula de amostra de 1 mL contra uma célula de referência de 1 mL contendo uma solução em branco apropriada. As células são estabilizadas por quatro horas a 25ºC no interior do calorímetro antes de as células serem aquecidas até a temperatura final a uma taxa de aquecimento selecionada. A temperatura de transição e a entalpia po- dem ser determinadas usando-se o software Setaram (Setaram, Versi- on 1.3).

[00158] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, a curva de desnaturação / renaturação térmicas pode ser obtida usando- se espectroscopia de dicroismo circular (CD). Alterações na estrutura secundária da IgG em função da temperatura e/ou, por exemplo, do pH, podem ser estudadas por espectroscopia de CD (Fasman e ou- tros., (Circular Dichroism and the Confonnational Analysis of Biomole- cules. (1996) Plenum Press)). Segundo de Jongh e outros., ass vanta- gens desta técnica são que o sinal espectroscópico não é afetado pela presença da solução cirucundante e que se encontram disponíveis procedimentos bem definidos para elucidar a estrutura secundária com base em espectros de referência dos diferentes elementos da estrutu- ra (Biochemistry (1994) 33, 14521-14528). As frações dos elementos da estrutura secundária podem ser obtidas a partir dos espectros de CD.

[00159] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, as medições podem ser feitas em um espectropolarímetro JASCO, modelo J-715 (JASCO International Co.). Uma cubeta de quartzo com 0,1 cm de comprimento de percurso da luz pode ser usada. A regula- gem da temperatura pode ser efetuada usando um termopar JASCO PTC-348WI (JASCO International). As varreduras de temperatura são registradas usando-se o termopar Peltier com uma resolução de 0,2 e uma constante de tempo de 16 segundos. As varreduras de compri- mento de onda na região do ultravioleta distante (resolução 0,2 nm) podem ser obtidas por acúmulo de uma pluralidade de varreduras com uma taxa de varredura adequada.

[00160] A curva de desnaturação / renaturação térmicas também pode ser medida por um método espectroscópico. Quando uma prote- Ína em uma solução desnatura em resposta ao calor, os agregados de moléculas e a solução espalham a luz de forma mais pronunciada. À agregação leva a alterações na transparência ótica da amostra, e pode ser medida monitorando-se a alteração na absorvência de luz visível ou ultravioleta de um comprimento de onda definido.

[00161] Em uma modalidade não limitativa da presente invenção, espectroscopia de fluorescência é usada para obter a curva de desna- turação / renaturação térmicas. Em uma modalidade, a fluorescência intrínseca da proteína, por exemplo, a fluorescência intrínseca do trip- tofano é monitorada. Em uma outra modalidade, sondas moleculares fluorescentes são monitoradas. Métodos para realizar experimentos de espectroscopia de fluorescência são bastante conhecidos pelos versa- dos na técnica. Vide, por exemplo, Bashford e outros. (Spectropho- tometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987) 91-114, IRL Press Ltd.), Bell, J. E. (Spectroscopy in Biocheinistry (1981) Vol. |,

155-194, CRC Press), ou Brand e outros., (Ann. Rev. Biochem. (1972) 41, 843).

[00162] Assim como com as atividades biológicas de composições de anticorpo, vários métodos podem ser usados para avaliar sua esta- bilidade com base nas estruturas físicas e químicas dos anticorpos. Por exemplo, para estudar a desnaturação de anticorpos, métodos tais como absorcão de transferência de carga, espectroscopia de fluores- cência, RMN, eletroforese capilar em gel redutor (rCGE), e/ou croma- tografia de exclusão de tamanho de alta eficiência (HPSEC), encon- tram-se disponíveis (por exemplo, Wang e outros. (J. Parenteral Sci- ence & Technology 42 (Suppl.), S4-S26)) além dos métodos analíticos mencionados acima.

[00163] A eletroforese capilar em gel redutor e a cromatografia de exclusão de tamanho de alta eficiência são os métodos mais comuns e mais simples para avaliar a formação de agregados de proteínas, pro- dutos da degradação de proteínas, e fragmentos de proteínas. Por conseguinte, a estabilidade da composição compreendendo um anti- corpo antiepirregulina oferecido pela presente invenção também pode ser avaliada por esses métodos.

[00164] Para modificar a estabilidade dos anticorpos antiepirreguli- na da presente invenção, alterações de aminoácidos apropriadas na sequência aminoacídica de anticorpos antiepirregulina podem ser efe- tuadas.

[00165] Como uma modalidade não limitativa para modificar a esta- bilidade de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção, quan- do o anticorpo antiepirregulina é um anticorpo I9G1, amidação do gru- po amino C-terminal devido à deleção do resíduo aminoacídico lisina C-terminal e deleção de dos aminoácidos glicina e glicina C-terminais é relatada como heterogeneidade derivada da sequência C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo IgG humano (G1, SEQ ID NO: 25)

(Anal. Biochem. (2007) 360 (1), 75-83). Um método preferido para re- duzir tal heterogeneidade inclui alteração por deleção de dois aminoá- cidos C-terminais da cadeia pesada, a saber, deleção da glicina na po- sição 446 e da lisina na posição 447 como indicado pela numeração EU (WO 2009/041613). Como é desejável que heterogeneidade deri- vada da sequência C-terminal da cadeia pesada nos anticorpos antie- pirregulina da presente invenção não esteja presente, a sequência de IgG1 na qual a glicina na posição 446 e a lisina na posição 447 como indicado pela numeração EU na IgG1 humana estão deteledas (G1d, SEQ ID NO: 26) pode ser usada como a sequência da região constan- te.

[00166] Uma modalidade não limitativa de uma cadeia pesada de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção com estabilidade melhorada inclui cadeias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137- 140, e 142-150. Além disso, uma modalidade não limitativa de uma cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção com estabilidade melhorada inclui cadeias leves seleciona- das do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 99, 128-130, 136, e 141.

[00167] Uma modalidade não limitativa de um anticorpo antiepirre- gulina da presente invenção com estabilidade melhorada inclui anti- corpos antiepirregulina compreendendo cadeias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150, e cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 99, 128-130, 136, e 141. Redução na quantidade de agregados

[00168] A quantidade de agregados de anticorpos antiepirregulina da presente invenção é de preferência reduzida. O controle da quanti- dade de agregados em um fármaco à base de proteína é muito impor- tante quando se considera o controle de qualidade e as influências so-

bre a eficácia medicamentosa e imunogenicidade (Curr. Opin. Bio- technol. (2009) 20 (6), 708-714). Geralmente, a formação de agrega- dos é afetada tanto pela estabilidade coloidal resultante do ambiente da solução de proteína quanto da estabilidade conformacional resul- tante da estrutura da proteína (J. Pharm Sci. (2010) 100 (4), 1306- 1315). Condições desejáveis eficazes para a estabilidade coloidal po- dem ser obtidas rastreando-se a concentração do anticorpo, o pH, o tipo de solução tamponante, a resistência iônica, e o aditivo, entre ou- tros, examinando-se a prescrição de uma formulação de anticorpo. Por outro lado, a estabilidade conformacional depende em parte da se- quência aminoacídica, e no caso de anticorpos, ela é considerada im- portante para manter estruturas características tais como a estrutura canônina das CDRs, e sequências de consenso de FRs, e a interface VH/VL, entre outros (Jung e outros., J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701- 716; Xiang e outros., J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert e ou- tros., Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo e outros., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120; Morea e outros., J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294; e Vargas-Madrazo e outros., J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120).

[00169] Vários métodos podem ser usados para avaliar a estabili- dade de formulações de proteína contendo formulações de anticorpo, com base nas estruturas físicas e químicas das proteínas assim como em suas atividades biológicas. Para estudar a desnaturação de proteí- nas, métodos tais como absorcão de transferência de carga, análise térmica, espectroscopia de fluorescência, dicroismo circular (CD), RMN, assim como HPSEC, filtração de fluxo tangencial (TFF), espa- lhamento de luz estático (SLS), espectroscopia dw infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), tecnologia de desenrolamento de pro- téina induzido por ureia, fluorescência intrínseca de triptofano, calori- metria diferencial de varredura, tecnologia de ligação de proteínas ao

1-anilino-8-naftaleno sulfonato (ANS) encontram-se disponíveis. Por exemplo, um método selecionado dentre aqueles descritos em Wang e outros. (J. Parenteral Science & Technology (1988) 42 (Suppl), S4- S26) pode ser apropriadamente usado.

[00170] AsrCGE e HPSEC são os métodos mais comuns e mais simples para avaliar a formação de agregados de proteínas, degrada- ção de proteínas, e fragmentação de proteínas. Por conseguinte, a es- tabilidade das formulações líquidas da presente invenção pode ser avaliada por esses métodos.

[00171] Por exemplo, a estabilidade dos anticorpos antiepirregulina da presente invenção pode ser avaliada por HPSEC ou rCGE, onde a área percentual do pico representa o anticorpo não degradado ou um fragmento de anticorpo não degradado. Em uma modalidade não limi- tativa, aproximadamente 250 ug do anticorpo (aproximadamente 25 ul de uma formulação líquida contendo 10 mg/mL do anticorpo mencio- nado acima) são injetados em uma coluna TosoH Biosep TSK G3000SWXL (7,8 mm x 30 cm) equipada com uma coluna protetora TSK SW x1 (6,0 mm x 4,0 cm). O anticorpo (incluindo fragmentos de anticorpo do mesmo) é eluído isocraticamente com 0,1 M de fosfato dissódico contendo 0,1 M de sulfato de sódio e 0,05% de azida sódica, a uma taxa de fluxo de 0,8 a 1,0 mL/min. A proteína eluída é detectada usando-se absorvência de UV a 280 nm. Um padrão de referência é introduzido no ensaio como um controle, e os resultados são reporta- dos como a área percentual do pico de monômero produzido em rela- ção a todos os outros picos sendo excluído o pico de volume contido observado em aproximadamente 12 a 14 minutos. Os picos que eluem antes do pico de monômero são registrados como agregado percentu- al.

[00172] Para reduzir a quantidade de agregado de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção, a interação hidrófoba entre mo-

léculas a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo antiepirregulina é reduzida. Especificamente, alterações de aminoácidos que substituem resíduos hidrófobos por resíduos hidrófilos na sequência aminoacídica da cadeia pesada ou da cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina são apropriadamente efetudas. Em uma modalidade não limitativa pre- ferida, alterações de aminoácidos que substituem resíduos hidrófobos por resíduos hidrófilos nas CDRs de um anticorpo antiepirregulina são apropriadamente efetudas. Sabemos que os aminoácidos incluem aminoácidos hidrófilos e aminoácidos hidrófobos. Geralmente, Asp (D), Glu (E), Arg (R), Lys (K), His (H), Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Asn (N), GIn (Q), e Tyr (Y) são conhecidos como aminoácidos hidrófilos. Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (1), Met (M), Trp (W), Phe (F), e Pro (P) são conhecidos como aminoácidos hidrófobos. De preferência, a alteração de aminoácido mencionada acima é apropriadamente selecionada dentre substituições de um ou mais aminoácidos selecionados dentre os resíduos hidrófilos mencionados acima pelos resíduos hidrófilos mencionados acima, mas não estão particularmente limitados a ami- noácidos específicos.

[00173] Exemplos não limitativos de positions que sofrem altera- ções de aminoácidos para reduzir a quantidade de agregado de anti- corpo antiepirregulina aggregate da presente invenção de preferência incluem aminoácidos nas posições 60 e/ou 98 como indicado pela nu- meração de Kabat na sequência da cadeia pesada do anticorpo antie- pirregulina de SEQ ID NO: 38.

[00174] Uma modalidade não limitativa da substituição de aminoá- cido mencionada acima de preferência inclui substituir o aminoácido na posição 60 por His (H), Lys (K), Thr (T), Ser (S), ou Arg (R) e/ou substituir o aminoácido na posição 98por Ser (S) or Glu (E), como indi- cado pela numeração de Kabat, na sequência da cadeia pesada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38.

[00175] Uma modalidade não limitativa de uma cadeia pesada de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção com quantidade reduzida de agregado inclui cadeias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150.

[00176] Uma modalidade não limitativa de um anticorpo antiepirre- gulina da presente invenção com quantidade reduzida de agregado inclui anticorpos antiepirregulina compreendendo cadeias pesadas se- lecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 92-98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150, e cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 99, 128-130, 136, e 141. Conferindo reatividade cruzada entre espécies para ligação à epirregu- lina de animal não humano e epirregulina humana

[00177] Os anticorpos antiepirregulina da presente invenção são de preferência anticorpos antiepirregulina mostrando reatividade cruzada entre espécies entre animais não humanos e seres humanos. Mais especificamente, a presente invenção oferece um anticorpo antiepirre- gulina que se liga a um epitopo ligado por um anticorpo antiepirreguli- na compreendendo CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 12, 13, e 14, em que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que sua relação do valor de KD para epirregulina de macaco de SEQ ID NO: 170 (cEREG KD) para o valor de KD para epirregulina humana de SEQ ID NO: 34 (hEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) é menor que a relação cEREG KD/hEREG KD do anticorpo antiepirregu- lina compreendendo CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 12, 13, e 14.

[00178] Mais especificamente, na presente invenção, as sequências aminoacídicas das CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ

ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 12, 13, e 14 foram alteradas para modificar a atividade de liga- ção à epirregulina de macaco do anticorpo antiepirregulina compreen- dendo as CDRs mencionadas acima. Como as diferenças estruturais entre a epirregulina de macaco e a epirregulina humana ainda não fo- ram elucidadas, não existe absolutamente qualquer orientação no sen- tido de quais resíduos aminoacídicos do anticorpo antiepirregulina de- vem ser alterados para melhorar a atividade de ligação à epirregulina de macaco. Na presente invenção, múltiplas sequências de anticorpo com substituições de resíduos aminoacídicos em sítios arbritários nas CDRs já foram desenhadas. Especificamente, foram produzidos anti- corpos antiepirregulina com substituição de um aminoácido por um re- síduo Arg (R) nas sequências de CDR mencionadas.

[00179] Os anticorpos antiepirregulina com substituição de um ami- noácido por um resíduo Arg (R) nas sequências de CDR apresentaram surpreendentemente um atividade de ligação melehorada à epirreguli- na de macaco. Isto é, a substituição de um aminoácido por um resíduo Arg (R) nas sequências de CDR de um anticorpo antiepirregulina foi capaz de conferir reatividade cruzada entre espécies de ligação a uma epirregulina de animal não humano e uma epirregulina humana.

[00180] O valorde KbD para epirregulina de macaco de SEQ ID NO: 170 (cEREG KD) pode ser calculado pelo método descrito na seção acima sobre "atividade fixadora". A atividade de fixadora de epirreguli- na de um anticorpo antiepirregulina pode ser medida por métodos co- nhecidos pelos versados na técnica, e as condições de medição po- dem ser apropriadamente determinadas pelos versados na técnica. À atividade fixadora de epirregulina de um anticorpo antiepirregulina po- de ser avaliada como KD (constante de dissociação), KD aparente (constante de dissociação aparente), kd que é a taxa de dissociação (constante de taxa de dissociação), kd aparente (constante de dissoci-

ação aparente), ou similar. Elas podem ser medidas por métodos co- nhecidos pelos versados na técnica, e por exemplo, Biacore (GE heal- thcare), gráfico de Scatchard, FACS, entre outros podem ser usados. À relação do valor de KD para epirregulina de macaco (cEREG KD) para o valor de KD para epirregulina humana (hEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) pode ser determinada dividindo-se este valor de KD pelo valor de KD para epirregulina humana de SEQ ID NO: 34.

[00181] Na presente invenção, ceEREG KD/hEREG KD é de prefe- rência menor que 40. Além disso, em uma modalidade não limitativa, cEREG KD/hEREG KD é de preferência menor que 10. Em uma outra modalidade não limitativa, cEREG KD/hEREG KD é de preferência menor que 6, e em uma modalidade não limitativa diferente, cEREG KD/hEREG KD é de preferência menor que 4.

[00182] Exemplos não limitativos de posições em que aminoácidos são alterados para conferir reatividade cruzada entre espécies para ligação de epirregulina de animal não humano e epirregulina humana oferecida pela presente invenção de preferência incluem aminoácidos nas posições 33, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 96, 97, e/ou 98 como indicado pela numeração de Kabat na sequência da cadeia pe- sada do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO: 38. Além disso, exemplos não limitativos de posições em que aminoácidos são altera- dos para conferir reatividade cruzada entre espécies para ligação de epirregulina de animal não humano e epirregulina humana oferecida pela presente invenção de preferência incluem aminoácidos nas posi- ções 24, 93, e/ou 94 como indicado pela numeração de Kabat na se- quência da cadeia leve do anticorpo antiepirregulina de SEQ ID NO:

29. Um exemplo preferido de alteração de aminoácido inclui substitui- ção de um ou ais dos aminoácidos mencionados acima por Arg (R).

[00183] Exemplos de uma modalidade não limitativa da cadeia pe- sada de um anticorpo antiepirregulina da presente invenção que foi conferida com reatividade cruzada entre espécies incluem cadeias pe- sadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150. Exemplos de uma modalidade não limi- tativa da cadeia leve de um anticorpo antiepirregulina humanizado da presente invenção conferidos com reatividade entre espécies incluem cadeias leves selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 128-130, 136, e 141.

[00184] Exemplos de uma modalidade não limitativa de um anticor- po antiepirregulina da presente invenção que foi conferido com reativi- dade cruzada incluem anticorpos antiepirregulina compreendendo ca- deias pesadas selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 98, 115-127, 131-135, 137-140, e 142-150, e cadeias leves seleciona- das do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29, 128-130, 136, e 141. Atividade neutralizante

[00185] Um anticorpo antiepirregulina da presente invenção é de preferência um anticorpo que tem atividade neutralizante. Geralmente, "atividade neutralizante" refere-se à atividade para inibir a atividade biológica de um ligando tais como vírus ou toxinas em relação a célu- las. Mais especificamente, "substâncias tendo atividade neutralizante" refere-se a substâncias que se ligam ao ligando ou a um receptor que se liga ao ligando, e inibem a ligação entre o ligando e o receptor. Quando a ligação do ligando de um receptor é bloqueada pela ativida- de neutralizante, a atividade biológica mediada pelo receptor não pode ser exercida. Anticorpos que possuem tal atividade neutralizante ge- ralmente são denominados anticorpos neutralizantes. A atividade neu- tralizante pode ser medida comparando-se as atividades biológicas na presença e na ausência de uma substância de teste cuja atividade neutralizante deve ser avaliada, na pesença do ligando de interesse.

[00186] Na presente invenção, a ligação do ligando do receptor de EGF, que é considerado o principal receptor de epirregulina, resulta na dimerização do receptor, e na ativação do domínio de tirosina quinase intracelular do receptor. A tirosina quinase ativada forma peptídios con- tendo tirosina fosforilada por autofosforilação, e os peptídios se asso- ciam a várias moléculas acessórias de transdução de sinal. Estas são principalmente PLC7y (fosfolipase Cy), Shc, Grb2, entre outras. Destas moléculas acessórias, as duas primeiras são ainda fosforiladas pela tirosina quinase receptora de EGF. A principal via de transdução de sinal partindo do receptor de EGF é a via na qual a fosforilação é transduzida na ordem de Shc, Grb2, Sos, Ras, quinase Raf/MAPK/quinase MAP. Além disso, é considerada a existência de uma via alternativa de PLCy para PKC.

[00187] Como tais cascatas de sinais intracelulares variam depen- dendo do tipo de célula, moléculas adequadas podem ser vetorizadas para a célula alvo de interesse, e as moléculas alvo não se limitam aos fatores mencionados acima. Kits comercialmente disponíveis para me- dir a ativação de sinal in vivo podem ser adequadamente usados (por exemplo, o sistema de ensaio de atividade da quinase proteica C (GE Healthcare Bio-Sciences)).

[00188] Além disso, a ativação de sinalização in vivo pode ser de- tectada usando-se como índice o efeito indutor de transcrição sobre o gene alvo presente a jusante da cascata de sinalização in vivo. Altera- ções na atividade transcricional podem ser detectadas com base no princípio do ensaio de repórter. Mais especificamente, um gene repór- ter tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou luciferase é posicio- nada a jusante do fator transcricional ou da região promotora do gene alvo, e a atividade do repórter é medida. A alteração na atividade transcricional pode ser medida com base na atividade do repórter.

[00189] Além disso, como o receptor de EGF usualmente funciona para promover proliferação celular, a ativação de sinalização in vivo pode ser avaliada medindo-se a atividade de proliferação das células alvo. Na presente invenção, a atividade neutralizante de um anticorpo neutralizante da presente invenção é avaliada analisando-se a ativida- de de proliferação celular. No entanto, a presente invenção não se limi- ta a este método, e a atividade neutralizante pode ser analisada apli- cando-se de forma adequada os métodos mencionados acima a célu- las alvo selecionadas.

[00190] Especificamente, por exemplo, medindo-se a atividade de proliferação celular mencionada abaixo, a atividade neutralizante de um anticorpo antiepirregulina pode ser avaliada ou medida. Por exem- plo, um método que mede a incorporação de timidina marcada com ÉH] adicionada ao meio por células vivas como um índice de capaci- dade de replicação de DNA é usado. Como um método mais conveni- ente, um método de exclusão de corante que mede, sob um microscó- pio, a capacidade de uma célula para liberar um corante tal como azul tripano para fora da célula, ou o método MTT é usado. Este último uti- lizada a capacidade de células vivas para converter brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol|-2-i1)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), que é um sal de tetrazólio, em um produto azul formazan. Mais especificamente, um anticorpo de teste é acrescentado à solução de cultura de uma célula de teste, e depois de um certo período de tempo, a solução de MTT é acrescen- tada à solução de cultura, e esta é deixada descansar por um certo tempo para que o MTT seja incorporado na célula. Como resultado, o MTT que é um composto amarelo é convertido em um composto azul pela ação da succinato desidrogenase na mitocôndria da célula. De- pois da dissolução deste produto azul para coloração, a absorvência é medida e usada como um indicador do número de células viáveis.

[00191] Além de MTT, reagentes tais como MTS, XTT, WST-1, e WST-8 encontram-se comercialmente disponíveis (Nacalai Tesque, entre outros) e podem ser adequadamente usados. Além disso, méto- dos que avaliam a atividade de proliferação celular usando ATP celular ou a impedância da cultura de células como um indicador são conhe- cidos. Para medir a atividade, um anticorpo fixador que tem o mesmo isótipo que o anticorpo antiepirregulina mas não possui a atividade neutralizante pode ser usado como um anticorpo de controle da mes- ma maneira que o anticorpo antiepirregulina, e é possível determinar que a atividade está presente quando o anticorpo antiepirregulina tem uma atividade neutralizante mais forte que o anticorpo de controle. Citotoxicidade

[00192] Um anticorpo usado na presente invenção é de preferência um anticorpo tendo citotoxicidade.

[00193] Na presente invenção, a citotoxicidade inclui, por exemplo, atividade de citotoxicidade mediada por célula anticorpo-dependente (ADCC) e atividade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC). Na presente invenção, atividade de CDC refere-se a atividade citotóxica mediada pelo sistema complemento. Entretanto, atividade de ADCC refere-se à atividade de danificar uma célula alvo quando um anticorpo específico se fixa ao antígeno de sua superfície celular. Uma célula retentora do receptor de Fcy (imunócitos ou similar) se liga à porção Fc do anticorpo via o receptor de Fcy e a célula alvo é danifica- da. Um anticorpo usado na presente invenção pode ser um anticorpo tendo atividade de CDC ou atividade de ADCC, ou pode ser um anti- corpo tendo tanto atividade de CDC quanto atividade de ADCC.

[00194] Se um anticorpo antiepirregulina tem ou não atividade de ADCC ou atividade de CDC pode ser determinado por métodos co- nhecidos (por exemplo, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan e outros., John Wiley & Sons, Inc., (1993), etc.).

[00195] Primeiro, são, especificamente, preparadas células efeto- ras, solução de complemento, e células alvo. Preparação de células efetoras

[00196] O baço é removido de um camundongo CBA/N ou similar, e células do baço são isoladas em meio RPMI1640 (Invitrogen). Depois de lavar as células com o mesmo meio contendo 10% de sero bovino fetal (FBS, HyClone), a concentração das células de baço lavadas po- de ser ajustada em 5 x 10º /mL para preparar células efetoras. Preparação da solução de complemento

[00197] Complemento de coelho Baby (CEDARLANE) é diluído 1 para 10 em um meio de cultura (Invitrogen) contendo 10% de FBS pa- ra preparar uma solução de complemento. Preparação de células alvo

[00198] As células alvo podem ser marcadas radioativamente por culturade células expressando uma proteína epirregulina com 0,2 mCi de cromato de sódio-"'Cr (GE Healthcare Bio-Sciences) em um meio DMEM contendo 10% de FBS por uma hora a 37'(C. Para células ex- pressando uma proteína epirregulina, é possível usar células transfor- madas com um gene codificando a proteína epirregulina, células de câncer de cólon primário, células de câncer de cólon metastático, célu- las de adenocarcinoma de pulmão, células de câncer de pâncreas, cé- lulas de câncer de estômago, células de câncer renal, células de cân- cer de cólon, células de câncer de esôfago, ou similar. Depois da mar- cação radioativa, as células são lavadas três vezes com meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, e as células alvo podem ser prepa- radas ajustando-se a concentração celular em 2 x 10º células/mL.

[00199] A atividade de ADCC e a atividade de CDC podem ser me- didas pelo método descrito abaixo. No caso de medição da atividade de ADCC, 50 uL da célula alvo e 50 ul de um anticorpo antiepirreguli- na são adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo em U (Becton Dickinson), e esta é deixada descansar sobre gelo por minutos. Em seguida, 100 uL da célula efetora são adicionados a cada poço da placa, e a placa é incubada em uma incubadora de dió-

o aminoácido na posição 311 por qualquer um dentre Ala, Asp, Asn, Thr, Val, e Tyr; o aminoácido na posição 313 por Phe; o aminoácido na posição 315 por Leu; o aminoácido na posição 317 seja por Glu ou Gn; o aminoácido na posição 318 por qualquer um dentre His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, e Tyr; o aminoácido na posição 320 por qualquer um dentre Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 322 por qualquer um dentre Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 323 por lle; o aminoácido na posição 324 por qualquer um dentre Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 325 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 326 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 327 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 328 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 329 por qualquer um dentre Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 330 por qualquer um dentre Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 331 por qualquer um dentre Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 332 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, e Tyr;

o aminoácido na posição 333 por qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val, e Tyr; o aminoácido na posição 334 por qualquer um dentre Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, e Thr; o aminoácido na posição 335 por qualquer um dentre Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp, e Tyr; o aminoácido na posição 336 por qualquer um dentre Glu, Lys, e Tyr; o aminoácido na posição 337 por qualquer um dentre Glu, His, e Asn; o aminoácido na posição 339 por qualquer um dentre Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, e Thr; o aminoácido na posição 376 seja por Ala ou Val; o aminoácido na posição 377 seja por Gly ou Lys; o aminoácido na posição 378 por Asp; o aminoácido na posição 379 por Asn; o aminoácido na posição 380 por qualquer um dentre Ala, Asn, e Ser; o aminoácido na posição 382 seja por Ala ou lle; o aminoácido na posição 385 por Glu; o aminoácido na posição 392 por Thr; o aminoácido na posição 396 por Leu; o aminoácido na posição 421 por Lys; o aminoácido na posição 427 por Asn; o aminoácido na posição 428 seja por Phe ou Leu; o aminoácido na posição 429 por Met; o aminoácido na posição 434 por Trp; o aminoácido na posição 436 por lle; e o aminoácido na posição 440 por qualquer um dentre Gly, His, Ile, Leu, e Tyr, de acordo com a numeração EU na região Fc de um anticorpo antiepir- regulina da presente invenção.

O número de aminoácidos que são al- terados não é particularmente limitado.

É possível alterar um aminoá-

cido em apenas uma posição, ou é possível alterar aminoácidos em duas ou mais posições.

Exemplos de combinações de alterações de aminoácidos em duas ou mais posições incluem as combinações mos- tradas nas Tabelas 1-1 e 1-2. Tabela 1-1

Combinação de aminoácido Combinação de aminoácido K370E/P396L/D270E Q419H/P396L/D270E V240A/P396L/D270E R255L/P396L/D270E R255L/P396L/D270E R255L/P396L/D270E/R292G R255L/P396L/D270E R255L/P396L/D270E/Y300L F243L/D270E/K392N/P396L F243L/R255L/D270E/P396L F243L/R292P/Y300L/V3051/P396L F243L/R292P/Y300L/P396L F243L/R292P/Y300L F243L/R292P/P396L F243L/R292P/V3051 F243L/R292P S298A/E333A/K334A E380A/T307A K326M/E333S K326A/E333A S317A/K353A A327D/1332E A330L/I1332E AS30Y/1332E E258H/1332E E272H/1332E E2721/N276D E272R/1332E E283H/1332E E293R/1332E F241L/V262] F241W/F243W F243L/V2641 H268D/A330Y H268E/A330Y K246H/1332E L234D/1332E L234E/1332E L234G/1332E L2341/1332E L2341/L235D L234Y/1332E L235D/1332E L235E/1332E L2351/1332E L2358/1332E

Tabela 1-2 A Tabela 1-2 é uma continuação da Tabela 1-1.

[00207] Neste relatório, a "atividade de ligação do receptor de Fcy da região Fc um anticorpo antiepirregulina é melhorada" significa que a ati-

vidade da região Fc de um anticorpo antiepirregulina com as alterações de aminoácidos mencionadas acima para ligar qualquer um dos recep- tores de Fcy humana, FeyRI, FeyRlla, FoyRIlb, FoyRllla, e/ou FeyRillb, é maior que a atividade da região do anticorpo antiepirregulina antes da alteração de aminoácidos para ligar esses receptores de Fcy humana. Por exemplo, com base no método de análise mencionado acima, isto significa que a atividade de ligação do anticorpo antiepirregulina depois da alteração é 105% ou mais, de preferência 110% ou mais, 115% ou mais, 120% ou mais, 125% ou mais, particularmente de preferência 130% ou mais, 135% ou mais, 140% ou mais, 145% ou mais, 150% ou mais, 155% ou mais, 160% ou mais, 165% ou mais, 170% ou mais, 175% ou mais, 180% ou mais, 185% ou mais, 190% ou mais, 195% ou mais, duas vezes ou mais, 2,5 vezes ou mais, 3 vezes ou mais, 3,5 ve- zes ou mais, 4 vezes ou mais, 4,5 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 7,5 vezes ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais, 60 vezes ou mais, 70 vezes ou mais, 80 vezes ou mais, 90 vezes ou mais, ou 100 vezes ou mais em comparação com a atividade de ligação do anticorpo antiepirregulina antes da alteração usada como o controle.

Anticorpos antiepirregulina com teor de fucose reduzido nas cadeias de açúcar presas à região Fc

[00208] Uma modalidade não limitativa de anticorpos antiepirregulina da presente invenção de preferência inclui anticorpos antiepirregulina que foram modificados para que a composição das cadeias de açúcar presas às região Fc do anticorpo antiepirregulina tenham cadeias de açúcar altamente deficientes em fucose. Os versados na técnica pode selecionar de forma apropriada anticorpos antiepirregulina com uma alta proporção da região Fc ligada a cadeias de açúcar deficientes em fuco- se seguindo o método de análise de estruturas de cadeias de açúcar descrito abaixo. A proporção de tal região Fc ligada a cadeias de açúcar deficientes em fucose pode ser apropriadamente selecionada de 10% a 100% pelos versados na técnica. Em uma modalidade não limitativa, a proporção pode ser selecionada dentre 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 290%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100%. Sabemos que quando um resíduo fucose é removido da N-acetil glucosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar do tipo complexo ligado a N-glicosídeo presa à região Fc do anticorpo, a afinidade para FceyRilla é melhorada (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466- 3473). Como anticorpos IgG1 contendo tais regiões Fc sabidamente têm uma atividade de ADCC melhorada como descrito mais adiante, esses anticorpos antiepirregulina contendo a região Fc também são úteis como anticorpos antiepirregulina a serem incluídos nas composi- ções farmacêuticas da presente invenção. Uma modalidade não limitati- va de um anticorpo do qual o resíduo fucose é removido da N-acetil glu- cosamina na extremidade redutora da cadeia de açúcar do tipo comple- xo ligado a N-glicosídeo presa à região Fc do anticorpo de preferência inclui um anticorpo modificado por glicosilação (o WO 1999/054342).

[00209] Uma outra modalidade não limitativa de um anticorpo do qual o resíduo fucose é removido da N-acetil glucosamina na extremi- dade redutora da cadeia de açúcar do tipo complexo ligado a N- glicosídeo presa à região Fc do anticorpo de preferência inclui anticor- pos que são deficientes na fucose presa a cadeias de açúcar (por exemplo, o WO 2000/061739, WO 2002/031140, e WO 2006/067913). Células hospedeiras que têm baixa capacidade para acrescentar fuco- Se a cadeias de açúcar devido a modificações de sua atividade para formar a estrutura de cadeia de açúcar para polipeptídios a serem gli- cosilados são usadas para produzir anticorpos deficientes na fucose presa a cadeias de açúcar. Ao se expressar um gene de anticorpo de- sejado nas células hospedeiras, o anticorpo que é deficiente em fuco- se em suas cadeias de açúcar pode ser coletado da cultura de células hospedeiras. Exemplos preferidos não limitativos da atividade para formar uma estrutura de cadeia de açúcar de um polipeptídio incluem a atividade de uma enzima ou transportador selecionado do grupo que consiste em fucosiltransferase (EC 2.4.1.152), transportador de fucose (SLC35C1), GMD (GDP-manose-4,6-desidratase) (EC 4.2.1.47), Fx (GDP-ceto-6-desoximanose-3,5-epimerase, 4-redutase) (EC

1.1.1.271), e GFPP (GDP-B-L-fucose pirofosforilase (EC 2.7.7.30). As estruturas dessas enzimas e transportadores não são necessariamen- te especificadas contanto que suas atividades sejam exibidas. Neste contexto, proteínas que podem exibir essas atividades são denomina- das proteínas funcionais. Uma modalidade não limitativa de um méto- do para modificar essas atividades inclui a perda dessas atividades. Para produzir células hospedeiras deficientes nessas atividades, mé- todos conhecidos tais como métodos para destruir os genes dessas proteínas funcionais para deixá-las disfuncionais podem ser apropria- damente empregados (por exemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140, e WO 2006/067913). Células hospedeiras deficientes em tais atividades podem ser produzidas, por exemplo, por um método que destroi os genes endógenos dessas proteínas funcionais em célu- las CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células YO de mi- eloma, células P3X63 de mieloma de camundongo, células PER, célu- las PER.C6, células HEK293, células de hibridoma, entre outras, para deixá-las incapazes de funcionar.

[00210] Com a coleta de anticorpos do sobrenadante de cultura das chas mencionadas acima transformadas com um vetor de expressão compreendendo um gene de anticorpo antiepirregulina, anticorpos an- tiepirregulina dos quais o resíduo fucose é removido da N-acetil gluco- samina na extremidade redutora da cadeia de açúcar do tipo complexo ligado a N-glicosídeo presa à região Fc do anticorpo são coletados. Anticorpos antiepirregulina compreendendo regiões Fc presas à N-

acetil glucosamina bissecante

[00211] Uma modalidade não limitativa de anticorpos antiepirreguli- na da presente invenção de preferência inclui anticorpos antiepirregu- lina compreendendo regiões Fc presas à N-acetil glucosamina bisse- cante. Anticorpos tendo uma cadeia de açúcar contendo uma estrutura GIcNAc bissecante (WO 2002/079255, entre outros) são conhecidos. Células hospedeiras tendo uma atividade para formar uma cadeia de açúcar contendo uma estrutura GICNAc bissecante são usadas para produzir anticorpos aos quais a cadeia de açúcar contendo uma estru- tura GIcNAc bissecante são presos. Em uma modalidade não limitativa preferida, células hospedeiras expressando um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de GnTIIl (B-1,4-manosil- glicoproteína, 4-B-N-acetilglucosaminiltransferase) (EC2.4.1.144) ou atividade de GalT (B-1,4-galactosiltransferase) (EC 2.4.1.38) são pro- duzidos. Em uma outra modalidade não limitativa preferida, células hospedeiras que coexpressam um gene codificando uma proteína fun- cional tendo atividade de Manll humana (manosidase 11) (3.2.1.114), um gene codificando uma proteína funcional atividade de tendo GnTI (B-1,2-acetilglucosaminiltransferase |) (EC 2.4.1.94), um gene codifi- cando uma proteína funcional tendo atividade de GnTIIl (B-1,2- acetilglucosaminiltransferase 11) (EC 2.4.1.143), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de Manl (manosidase) (EC

3.2.1.113), e o-1,6-fucosil transferase (EC 2.4.1.68) além das proteí- nas funcionais mencionadas acima são produzidas (o WO 2004/065540). As células hospedeiras mencionadas acima tendo a atividade para formar uma cadeia de açúcar contendo uma estrutura GIcNAc bissecante podem ser produzidas por transfecção de um vetor de expressão contendo um gene para a proteína funcional menciona- da acima em células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células YO de mieloma, células P3X63 de mieloma de camundongo,

células PER, células PER.C6, células HEK293, células de hibridoma, entre outras.

[00212] — Anticorpos antiepirregulina compreendendo regiões Fc pre- sas à N-acetil glucosamina bissecante são colhidos coletando-se anti- corpos do sobrenadante de cultura das células hospedeiras mencio- nadas acima transfectadas com um vetor de expressão contendo um gene de anticorpo antiepirregulina. Métodos conhecidos podem ser usados para analisar a estrutura da cadeia de açúcar presa aos anti- corpos. Em uma modalidade não limitativa, deixar a N-glicosidase F (Roche diagnostics) agir sobre um anticorpo antiepirregulina da pre- sente invenção faz com que a cadeia de açúcar presa ao anticorpo antiepirregulina se dissocie da proteína (J. Pharm. Sci. (1994) 83(12), 1670-1675). Depois da remoção da proteína usando etanol (J. Clin. Invest. (2001), 108(11), 1687-95), a cadeia de açúcar livre é concen- trada e secada, e em seguida efetua-se uma marcação com fluores- cência usando 2-aminopiridina ou 2-aminobenzamida (Anal. Biochem. (1995) 230 (2), 229-238). A cadeia de açúcar marcada com 2-AP oua cadeia de açúcar marcada com 2-AB obtida é liberada dos reagentes por extração da fase sólida usando um cartucho de celulose e então concentrada por centrifugação, e o material obtido é submetido a sub- sequentes análises como uma cadeia de açúcar marcada com 2-AB purificada. Em seguida, ao se deixar B-galactosidase (Seikagaku Cor- poration) agir sobre a cadeia de açúcar marcada com 2-AB purificada, uma cadeia de açúcar marcada com agalactosil 2-AB é preparada. As cadeias de açúcar marcadas com agalactosil 2-AB preparadas usando as cadeias de açúcar dissociadas de anticorpos antiepirregulina da presente invenção como materiais de partida são analisadas por HPLC de fase normal usando uma coluna de amida TSKgel Amide-80 (To- soh), e seus cromatogramas são comparados.

[00213] Além disso, já foi relatado que a resistência de interação entre a região Fc de um anticorpo e FcyR depende da concentração de íons Znº** (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). O anticorpo mostra ma interação mais forte entre a região Fc e FcyR quando a concentra- ção de íons Znº* da região Fc é maior. A quelação de Znº* por His310 e His435 presentes em CH3 da região Fc do anticorpo Fc abre cada domínio CH2 da região Fc em uma posição distal. Isto facilita a intera- ção entre o domínio CH2 e FcoyR, e a interação entre a região Fc e e FcyR é melhorada. Uma modalidade não limitativa de um anticorpo da presente invenção inclui um anticorpo no qual His na posição 310, His na posição 435, His na posição 433, e/ou Asn na posição 434 (EU numbering) é quelatado com Znº*.

Conjugado de Anticorpo-Droga

[00214] Uma modalidade não limitativa de anticorpos antiepirreguli- na da presente invenção de preferência inclui conjugados de anticorpo antiepirregulina-droga produzidos ligando-se um anticorpo antiepirre- gulina a uma droga tendo citotoxicidade. Doravante, um conjugado de anticorpo-droga pode ser chamado de ADC. Mais especificamente, os conjugados de anticorpo antiepirregulina-droga usado na presente in- venção pode ser apropriadamente ligado com inibidores de crescimen- to ou substâncias citotóxicas tais como peptídios tóxicos ou substân- cias químicas radioativas. "Substâncias químicas radioativas" na pre- sente invenção refere-se a substâncias contendo um radioisótopo. O radioisótopo não é particularmente limitado e assim qualquer radioisó- topo pode ser usado, por exemplo, *P, *%c, 11, ?H, 9, Re, e **Re, entre outros, podem ser usados. Tais conjugados de anticorpo antiepir- regulina-droga podem ser obtidos por modificação química dos anti- corpos antiepirregulina obtidos. Mais especificamente, para permitir que um inibidor de crescimento ou uma substância citotóxica conju- gue-se quimicamente (por exemplo, ligando-se covalentemente) com um anticorpo antiepirregulina, uma molécula ligadora é usada para |i-

gar um inibidor de crescimento ou uma substância citotóxica a um an- ticorpo via ligações químicas (tais como aquelas descritas acima).

[00215] De preferência, o agente ligador (ligante) é um ligante clivá- vel. Mais preferivelmente, o ligante é clivado em condições moderadas (isto é, condições em célula em que a atividade da droga não é afeta- da). Exemplos de ligantes cliváveis adequados incluem ligantes dissul- feto, ligantes lábeis em ácido, ligantes fotolábeis, ligantes lábeis em peptidase, e ligantes lábeis em esterase. Ligantes contendo dissulfeto são ligantes que podem ser clivados através da troca de dissulfeto, que pode ocorrer em condições fisiológicas. Ligantes lábeis em ácido são ligantes cliváveis em pH ácido. Por exemplo, certos compartimen- tos intracelulares tais como endossomas e lisossomas têm um pH áci- do (pH 4-5), e proporcionam condições adequadas para clivar ligantes lábeis em ácido. Ligantes fotoláveis são úteis na superfície do corpo e em muitas cavidades do corpo que podem ser expostas à luz. Além disso, a luz infravermelha pode penetrar nos tecidos. Ligantes lábeis em peptidase podem ser usados para clivar certos peptídios dentro ou fora das células (vide, por exemplo, Trouet e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 626-629; e Umemoto e outros, Int. J. Cancer (1989) 43, 677-684).

[00216] Além das modificações químicas mencionadas acima, tais ADCs podem ser obtidos na forma de moléculas de anticorpo biespe- cíficas desenhadas usando-se técnicas de engenharia genética para que o anticorpo possa reconhecer inibidores de crescimento, ou subs- tâncias citotóxicas tais como peptídios tóxicos, ou substâncias quími- cas radioativas. Os "anticorpos antiepirregulina" da presente invenção também incluem tais anticorpos.

[00217] Exemplos de uma modalidade não limitativa dos conjuga- dos de anticorpo antiepirregulina-droga oferecidos pela presente in- venção incluem anticorpos antiepirregulina que foram modificados usando-se um peptídio tóxico tal como ricina, abrina, ribonuclease, on- conase, DNase |, enterotoxina A de Staphylococcus, proteína antiviral Pokeweed, gelonina, toxina da difteria, exotoxina de Pseudomonas, endotoxina de Pseudomonas, L-asparaginase, ou PEG L- asparaginase.

Em uma outra modalidade, um, dois ou mais de um ini- bidor de crescimento e uma substância citotóxica tal como um peptídio tóxico podem ser combinados e usados para modificar o anticorpo an- tiepirregulina.

Como descrito acima, o anticorpo antiepirregulina pode ser ligado com o inibidor de crescimento mencionado acima ou uma substância citotóxica tal como um peptídio tóxico ou uma substância química radioativa através de uma ligação covalente ou de uma liga- ção não covalente.

Métodos para produzir ADCs ligados com tal inibi- dor de crescimento ou uma substância citotóxica tal como um peptídio tóxico ou uma substância radioativa são conhecidos na literatura.

Exemplos dos grupos ligadores quando um anticorpo antiepirregulina e um inibidor de crescimento ou uma substância citotóxica tal como um peptídio tóxico ou uma substância radioativa são diretamente ligados um ao outro incluem uma ligação dissulfeto usando os grupos SH.

Es- pecificamente, a ligação dissulfeto intramolecular na região Fc do anti- corpo antiepirregulina é reduzida com um agente redutor tal como diti- otreitol, e a ligação dissulfeto na molécula de inibidor de crescimento ou na substância citotóxica é igualmente reduzida para que as duas sejam ligadas pela ligação dissulfeto.

Antes da ligação, seja o anticor- po ou qualquer um dentre o inibidor de crescimento ou a substância citotóxica podem ser ativados por um agente promotor de ativação tal como o reagente de Ellman para que a formação da ligação dissulfeto entre as duas moléculas seja promovida.

Exemplos não limitativos pre- feridos de outros métodos para ligar diretamente o anticorpo antiepir- regulina e o fator de crescimento ou a substância citotóxica tal como um peptídio tóxico ou uma substância radioativa incluem um método que utiliza uma base de Schiff, o método de carbodi-imida, o método de éster ativo (método de N-hidroxissucccinimida), o método que utili- za um anidrido misto, e um método que utiliza uma reação diazoica.

[00218] Os seguintes peptídios podem ser exemplificados como o peptídio tóxico usado na presente invenção: - Cadeia A da toxina de difteria (Langone e outros (Methods in Enzymology (1993) 93, 307-308)) - Exotoxina de Pseudomonas (Pai e outros (Nat. Med. (1996) 2 (3), 350-353)) - Cadeia da ricina (Cadeia A da ricina) (Fulton e outros (J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319); Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173); Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519- 7562); Gheeite e outros (J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230)) - Cadeia A da ricina desglicosilada (Thorpe e outros (Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)) - Cadeia A da abrina (Wawrzynczak e outros (Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366); Wawrzynczak e outros (Cancer Res (1990) 50, 7519-7562); Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173); Thorpe e outros (Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)) - Gelonina (Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 3169- 3173); Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562); Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) - Proteína antiviral PAP-s ou Pokeweed de sementes (Bolog- nesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346)) - Briodina (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) - Saporina (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))

- Momordina (Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519- 7562); Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) - Momorcochina (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) - Diantina 32 (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)) - Diantina 30 (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Modeccina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Viscumina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Volkesina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Dodecandrina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Tritina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Lufina (Stirpe e outros (FEBS Let. (1986) 195, 1-8)) - Tricoquirina (Casellas e outros (Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588); Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341- 346))

[00219] Agentes farmacêuticos proteináceos ou peptídicos ou toxi- nas também podem ser ligados ao anticorpo antiepirregulina por técni- cas de engenharia genética. Especificamente, um DNA codificando o peptídio tóxico mencionado acima e um DNA codificando o anticorpo antiepirregulina da presente invenção podem ser fundidos "in frame" para produzir um DNA recombinante, e então inseridos em um vetor de expressão para construir um vetor recombinante. Este vetor é então introduzido em células hospedeiras adequadas para gerar células transformadas, que são cultivadas para expressar o DNA inserido nas células. Um conjugado de anticorpo antiepirregulina-droga ao qual o peptídio tóxico é ligado pode ser obtido por isolamento e purificação a partir da solução de cultura. Ao se obter proteínas de fusão do anticor- po, tipicamente os respectivos DNAs são ligados de maneira que as drogas proteináceas ou toxinas ficam posicionadas no terminal C do anticorpo, mas não se limitam a estes. Também é possível fazer uma interposição de um ligante peptídico entre o anticorpo e o agente far- macêutica proteináceia ou a toxina. Inibidores de crescimento

[00220] Em uma modalidade não limitativa, inibidores de crescimen- to podem de preferência incluir agentes danificadores de DNA, agen- tes antimitóticos, e/ou antimetabólitos. Agentes danificadores de DNA podem ser agentes aquilantes, inibidores da topoisomerase e/ou inter- caladores de DNA. Exemplos não limitativos preferidos dos inibidores de crescimento podem incluir carboplatina (agente alquilante de DNA), etoposida (inibidor da topoisomerase II), doxorubicina (intercalador de DNA), docetaxel (agente antimitótico), e Gemzar (gencitabina, antime- tabólito).

[00221] Pelo menos um dos agentes abaixo pode ser selecionado como o agente alquilante. Isto é, pelo menos um agente alquilante se- lecionado dentre clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida, mecloretami- na, melfalano, mostarda de uracil, tiotepa, busulfan, carmustina, lo- mustina, estreptozocina, carboplatina, cisplatina, satraplatina, oxalipla- tina, altretamina, ET-743, XLI1I9 (becatecarina), dacarbazina, clor- methina, bendamustina, trofosfamida, uramustina, fotemustina, nimus- tina, prednimustina, ranimustina, semustina, nedaplatina, tetranitrato de triplatina, mannosulfan, treosulfan, temozolomida, carboquona, tria- ziquona, trietilenomelamina, e procarbazina pode ser usado como o agente alquilante.

[00222] Pelo menos um dos agentes abaixo pode ser selecionado como o inibidor de topoisomerase. Isto é, pelo menos um inibidor de topoisomerase selecionado dentre doxorubicina (Doxil), daunorubicina, epirubicina, idarubicina, antracenediona (Novantrone), mitoxantrona, mitomicina C, bleomicina, dactinomicina, plicatomicina, ilinotecan

(Camptosar), camptotecina, rubitecan, belotecan, etoposida, teniposi- da, e topotecan (Hycamptin) pode ser usado como o inibidor de to- poisomerase.

[00223] Pelomenos um intercalador de DNA selecionado a partir de proflavina, doxorubicina (adriamicina), daunorrubicina, dactinomicina, e a talidomida pode ser utilizado como o intercalador de DNA.

[00224] Pelo menos um dos agentes abaixo pode ser selecionado como o agente antimitótico. Pelo menos um agente antimitótico seleci- onado dentre paclitaxel (Abraxane)/Taxol, docetaxel (Taxotere), BMS- 275183, Xyotax, Tocosal, vinorlebina, vincristina, vinblastina, vindesina, vinzolidina, etoposida (VP-16), teniposida (VM-26), ixabepilona, larota- xel, ortataxel, tesetaxel, e ispinesib pode ser usado como o agente an- timitótico.

[00225] Pelo menos um dos agentes abaixo pode ser selecionado como o antimetabólito. Pelo menos um antimetabólito selecionado dentre fluorouracil (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato, Xeloda, Arranon, leucovorina, hidroxiureia, tioguanina (6-TG), mercaptopurina (6-MP), citarabina, pentostatina, fosfato de fludarabina, cladribina (2- CDA), asparaginase, gencitabina, pemetrexed, bortezomib, aminopte- rina, raltitrexed, clofarabina, enocitabina, sapacitabina, azacitidina, en- tre outros, pode ser usado como o antimetabólito.

[00226] Quando um conjugado de anticorpo antiepirregulina-droga é incorporado em uma célula, o inibidor de crescimento ligado ao con- jugado ou a substância citotóxica ligada ao conjugado tal como um peptídio tóxico pode induzir a morte celular da célula que incorporou este anticorpo. Portanto, o anticorpo ao qual o inibidor de crescimento ou a substância tóxica tal como um peptídio tóxico é ligado de prefe- rência também tem atividade de internalização. Na presente invenção, "anticorpo tendo atividade internalização" refere-se a um anticorpo que transportado para dentro de uma célula (para o citoplasma, vesículas,

outras organelas, e similares) mediante a ligação à epirregulina na su- perfície celular. Se um anticorpo tem atividade de internalização ou não pode ser confirmado usando-se métodos conhecidos pelos versa- dos na técnica. Por exemplo, a atividade de internalização pode ser confirmada pelo método de contactar um anticorpo antiepirregulina |i- gado a uma subsrância marcada con células expressando epirregulina e determinar se a substância marcada está incorporada nas células, ou o método de contactar um anticorpo antiepirregulina ligado a um inibidor de crescimento ou uma substância citotóxica tal como um pep- tídio tóxico com células expressando epirregulina e determinar se a morte celular é induzida nas células expressando epirregulina. Mais especificamente, se um anticorpo tem atividade de internalização ou não pode ser confirmado, por exemplo, pelo método descrito nos Exemplos descritos mais adiante.

[00227] Depois que um anticorpo tendo citotoxicidasde tal como ADCC se liga a um antígeno alvo expresso na superfície celular, o an- ticorpo permanece na superfície celular via ligação ao antígeno, e cé- lulas efetoras tais como células NK se ligam às regiões Fc do anticor- po, e isto faz com que as células efetoras induzam citotoxicidade con- tra células expressando o antígeno alvo. Em contraste, o anticorpo que é usado como ADC é de preferência internalizado nas células depois da ligação ao antígeno. Como se pode estimar a partir do mecanismo de ação mencionado mencionado, normalmente é considerado que de preferência um anticorpo que danifica células alvo por citotoxicidade tal como ADCC tem uma baixa atividade de internalização, e um anti- corpo que danifica células alvo na forma de um ADC tem uma alta ati- vidade de internalização (Anticancer Research (1993) 13, 2207-2212). Surpreendentemente em contraste com isto, os anticorpos antiepirre- gulina do presente pedido não só suprimem a proliferação de células expressando epirregulina por sua atividade neutralizante, como tam-

bém induzem dano celular em células expressando epirregulina por citotoxicidades tais como ADCC; e entretanto foi constatado que con- jugados de anticorpo-droga contendo anticorpos antiepirregulina do presente pedido também induzem citotoxicidade contra células ex- pressando epirregulina. Anticorpo de baixo peso molecular

[00228] Em uma modalidade não limitativa, os anticorpos antiepir- regulina incluídos no conjugado de anticorpo antiepirregulina-droga da presente invenção podem ser anticorpos de baixo peso molecular. Um anticorpo de baixo peso molecular contém um fragmento de anticorpo sem uma porção de um anticorpo inteiro (por exemplo, IgG inteira). Contanto que ele tenha a atividade de se ligar ao antígeno de epirre- gulina, deleções parciais de uma molécula de anticorpo são permissí- veis. Os fragmentos de anticorpo da presente invenção de preferência contain uma região variável da cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável da cadeia leve (VL). A sequência aminoacídica da VH ou VL pode ter substituições, deleções, adições, e/ou inserções. Além disso, contanto que ela tenha a atividade de se ligar ao antígeno de epirregu- lina, a VH e/ou a VL pode ser parcialmente deletada. A região variável pode ser quimerizada ou humanizada. Exemplos específicos dos fra- gmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab'),, e Fv. Exemplos es- pecíficos de anticorpos de baixo peso molecular incluem Fab, Fab”, F(ab')», Fv, scFv (cadeia simples Fv), diacorpo, e sc(Fv)> (cadeia sim- ples (Fv)»). Multímeros desses anticorpos (por exemplo, dímeros, trí- meros, tetrâmeros, e polímeros) também estão incluídos nos anticor- pos de baixo molécula parceira da presente invenção.

[00229] — Anticorpos de baixo peso molecular podem ser obtidos por tratamento de um anticorpo com uma enzima para produzir fragmentos de anticorpo. Enzimas conhecidas que produzem fragmentos de anti- corpo são, por exemplo, papaína, pepsina, e plasmina. Alternativa-

mente, genes codificando esses fragmentos de anticorpo podem ser inseridos em vetores de expressão; células hospedeiras apropriadas que recebem a introdução dos vetores de expressão são cultivadas para expressar framento de anticorpo; e então os fragmentos de anti- corpo podem ser obtidos por isolamento a partir do meio de cultura e purificação dos mesmos (vide, por exemplo, Co e outros, (J. Imnmunol. (1994) 152, 2968-2976); Better e outros, (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496); Plueckthun e outros, (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496); Lamoyi (Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663); Rousseaux e outros, (Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669); Bird e outros, (TIBTECH (1991) 9, 132-137).

[00230] Um diacorpo refere-se a um fragmento de anticorpo biva- lente construído por fusão de genes (Hollinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448; EP 404,097; WO 1993/11161; entre outros). Um diacorpo é um dímero composto de duas cadeias polipeptídicas. Geralmente, em cada cadeia polipeptídica que constitui o dímero, a VL e a VH estão ligadas por um ligante na mesma cadeia. O ligante em um diacorpo geralmente é curto o bastante para impedir a ligação entre VL e VH. Especificamente, os resíduos aminoacídicos que constituem o ligante são, por exemplo, cinco resíduos aproxima- damente). Por conseguinte, as VL e as VH que são codificadas pela mesma cadeia polipeptídica não podem formar um fragmento da regi- ão variável de cadeia simples, e formam um dímero com um outro fra- gmento da região variável de cadeia simples. Como resultado, os dia- corpos possuem dois sítios fixadores de antígeno. scFv podem ser ob- tidos por ligação da região V da cadeia H e da região V da cadeia L de um anticorpo. Especificamente, scFv podem ser obtidos por ligação da região V da cadeia H e da região V da cadeia L via um ligante, de pre- ferência um ligante peptídico (Huston e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988) 85, 5879-5883). A região V da cadeia H e a região V da cadeia L de scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos nesta invenção como anticorpos antiepirregulina. A estrutura e a propriedade do ligante peptídico para ligar as regiões V não são particularmente limitadas. Por exemplo, qualquer peptídio de cadeia simples consistindo em 3 a 25 resíduos aproximadamente pode ser usado como o ligante.

[00231] sc(Fv), é um anticorpo de baixo peso molecular preparado pela ligação de duas VHs e duas VLs com ligantes ou similar para formar uma cadeia simples (Hudson e outros, J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189). sc(Fv),> pode ser produzido, por exemplo, por ligação de scFvs com um ligante. Composições farmacêuticas

[00232] Em um outro aspecto, a presente invenção oferece compo- sições farmacêuticas compreendendo um anticorpo antiepirregulina da presente invenção como um princípio ativo. Além disso, a presente invenção refere-se a inibidores do crescimento celular, em particular, agentes anticâncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metásta- te de câncer, que compreendem um anticorpo antiepirregulina da pre- sente invenção como um princípio ativo. De preferência, os inibidores do crescimento celular e agentes anticâncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer da presente invenção são admi- nistrados a um indivíduo que sofre de câncer ou que possa vir a sofrer de câncer no futuro.

[00233] Na presente invenção, inibidores do crescimento celular compreendendo um anticorpo antiepirregulina como um princípio ativo também podem ser expressos como métodos para suprimir o cresci- mento celular, que compreendem a etapa de administrar um anticorpo antiepirregulina a um indivíduo; usar um anticorpo antiepirregulina na produção de inibidores do crescimento celular; ou anticorpos antiepir- regulina para uso na supressão do crescimento celular.

[00234] Além disso, na presente invenção, agentes anticâncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer compre- endendo um anticorpo antiepirregulina como um princípio ativo tam- bém podem ser expressos como métodos para prevenir ou tratar cân- cer ou como métodos para suprimir a recorrência ou metástate de câncer, que compreendem a etapa de administrar um anticorpo antie- pirregulina a um indivíduo; usar um anticorpo antiepirregulina na pro- dução de agentes anticâncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer; ou anticorpos antiepirregulina para uso na prevenção ou no tratamento de câncer ou suprimir a recorrência ou metástate de câncer.

[00235] Na presente invenção, "compreendendo um anticorpo anti- epirregulina como um princípio ativo" significa compreendendo um an- ticorpo antiepirregulina como o princípio ativo principal, e não existe qualquer limitação quanto ao teor do anticorpo antiepirregulina. Os an- ticorpos incluídos nas composições farmacêuticas da presente inven- ção (por exemplo, inibidores do crescimento celular e agentes anticân- cer da presente invenção; e os mesmos daqui em diante) não são par- ticularmente limitados contanto que eles se liguem à proteína epirregu- lina, e podem ser exemplificados pelos anticorpos descritos nesta in- venção.

[00236] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser administrados aos indivíduos (pacientes) seja por via oral ou parenteral. A administração parenteral é preferida. Tais métodos de administração incluem especificamente administração por injeção, administração transnasal, administração pulmonar, e administração transdérmica. Para administração por injeção, uma composição farma- cêutica da presente invenção pode ser sistemicamente ou localmente administrada por, por exemplo, injeção intravenosa, injeção intramus- cular, injeção intraperitoneal, e injeção subcutânea. O método de ad-

ministração pode ser apropriadamente selecionado de acordo com a idade e os sintomas do paciente. A dose pode ser selecionada, por exemplo, na faixa de 0,0001 mg a 1000 mg por quilo de peso corporal por administração. Alternativamente, a dose pode ser selecionada, por exemplo, na faixa de 0,001 mg/corpo a 100000 mg/corpo por paciente. No entanto, as composições farmacêuticas não estão limitadas a es- sas doses.

[00237] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser formuladas de acordo com métodos convencionais (for exam- ple, Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publis- hing Company, Easton, EUA), e também podem conter carreadores e aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos incluem tensoativos, excipientes, agentes corantes, agentes flavorizantes, preservativos, estabilizantes, tampões, agentes suspensores, agentes isotonificantes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes promotores de flui- dez, e corretivos. Sem limitação a estes, outros carreadores comu- mente usados podem ser adequadamente usados. Exemplos especiífi- cos de carreadores incluem ácido silícico anidro leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose cálcica, carmelose sódica, hidro- xipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, polivinilacetal dietilamino- acetato, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média, óleo de rícino 60 endurecido com polioxietileno, sacaro- se, carboximetil celulose, amido de milho, e sais inorgânicos, entre ou- tros.

[00238] Os anticorpos antiepirregulina estão descritos acima anti- corpos fixadores da proteína epirregulina incluídos nas composições farmacêuticas da presente invenção. As células que são ligadas pelos anticorpos antiepirregulina não são particularmente limitadas contanto que as células sejam células expressando epirregulina. As células ex- pressando epirregulina preferidas da presente invenção são células de câncer. Mais preferivelmente, as células são células de câncer de có- lon, células de adenocarcinoma de pulmão, células de câncer de pân- creas, células de câncer de estômago, células de câncer de esôfago, e células câncer renal. Os métodos da presente invenção podem ser aplicados tanto a focos primários quanto a focos metastáticos desses cânceres. As células de câncer mais preferidas são células de câncer de cólon primário, células de metastatic câncer de cólon, e células de câncer de pâncreas.

[00239] Na presente invenção o "contato" é efetuado, por exemplo, pela adição de um anticorpo a uma solução de cultura de células ex- pressando epirregulina cultivadas em um tubo de ensaio. Neste caso, o anticorpo pode ser adicionado na forma de, por exemplo, uma solu- ção ou um sólido obtido por secagem por congelamento ou similar. Quando o anticorpo é adicionado como uma solução aquosa, a solu- ção aquosa usada pode conter o anticorpo puro, ou solução pode in- cluir, por exemplo, os tensoativos, excipientes, agentes corantes, per- fumes, preservativos, estabilizantes, tampões, agentes suspensores, agentes isotonificantes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes promotores de fluidez, ou agentes flavorizantes mencionados acima. A concentração para adição não é particularmente limitada, mas a concentração final na cultura que pode ser adequadamente usada varia de preferência na faixa de 1 pg/mL a 1 g/mL, mais preferi- velmente 1 ng/mL a 1 mg/mL, e ainda mais preferivelmente 1 ug/mL a 1 mg/mL.

[00240] Além disso, em uma outra modalidade, o "contato" na pre- sente invenção é efetuado por administração de um anticorpo a um animal não humano para o qual uma célula expressando epirregulina fora transplantada no corpo, ou a um animal portador de células can- cerosas expressando endogenamente epirregulina. O método de ad- ministração pode ser administração oral ou parenteral. O método de administração é particularmente de preferência administração parente- ral e, especificamente, o método de administração é, por exemplo, administração por injeção, administração transnasal, administração transpulmonar, ou administração transdérmica. Exemplos de adminis- tração por injeção incluem administração sistêmica e administração local de composições farmacêuticas, inibidores de proliferação celular e agentes anticâncer da presente invenção por injeção intravensa, in- jeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, ou similar. Um método de administração adequado pode ser selecionado de acordo com a idade e os sintomas do animal de teste. Quando ad- ministrado como uma solução aquosa, a solução aquosa usada pode simplesmente conter apenas o anticorpo, ou a solução pode incluir, por exemplo, os tensoativos, excipientes, agentes corantes, perfumes, preservativos, estabilizantes, tampões, agentes suspensores, agentes isotonificantes, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes promotores de fluidez, ou agentes flavoricantes mencionados acima. À dosagem pode ser selecionado, na faixa de 0,0001 a to 1000 mg por kg de peso corporal em cada administração. Alternativamente, por exemplo, a dosagem para cada paciente pode ser selecionada na fai- xa de 0,001 a 100,000 mg/corpo. No entanto, a dose de anticorpo da presente invenção não está limitada a essas doses.

Agentes terapêuticos contra câncer ou agentes para suprimir a recor- rência ou metástate de câncer que são administrados a indivíduos por- tadores de células cancerosas expressando a proteína epirregulina

[00241] A presente invenção oferece agentes terapêuticos contra câncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer, onde os indivíduos são medicados com os agentes terapêuticos contra câncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer são indivíduos portadores de células cancerosas expressando a prote- ína epirregulina, que são detectadas usando uma amostra de tecido isolado.

Além dos métodos descritos neste relatório, o nível de expres- são da proteína epirregulina pode ser determinado por métodos co- nhecidos pelo versado na técnica.

Para determinar se um indivíduo deve ser medicado ou não com agentes terapêuticos contra câncer ou agentes para suprimir a recorrência ou metástate de câncer da presen- te invenção, o nível de expressão da proteína epirregulina pode ser determinado em uma amostra de tecido isolada de um indivíduo can- didato.

Se a proteína epirregulina for detectada na amostra, o indivíduo do qual a amostra é derivada pode ser submetido à medicação com os agentes terapêuticos contra câncer ou agentes para suprimir a recor- rência ou metástate de câncer da presente invenção.

O nível de ex- pressão da proteína epirregulina não se limita a um valor numérico particular, mas em uma modalidade não limitativa, ele pode ser apro- priadamente fixado na faixa de valores numéricos da ordem de 10º, 10º, 10º, 10º, 107, e 10º.

Como uma modalidade não limitativa, o nível de expressão da proteína epirregulina selecionado dentre qualquer um de 1 x 10º, 2x 10º, 3 x 10º, 4 x 10º, 5x 10º, 6 x 10º, 7 x 10º, 8 x 10º, 9 x 10%, 1 x 10º, 2 x 10%, 3 x 10º, 4 x 10º, 5x 10º, 6 x 10%, 7 x 10%, 8 x 10º, 9 x 10%, 1 x 10º, 2x 10º, 3 x 10º, 4x 10º, 5x 105, 6 x 10º, 7 x 10º, 8x 10º, 9 x 10º, 1 x 10º, 2 x 10º, 3 x 10º, 4 x 10º, 5x 10º, 6 x 10º, 7 x 10º, 8 x 10º, 9 x 10º, 1 x 107, 2x 100, 3 x 10”, 4 x 10, 5x 10”, 6 x 10, 7x 10, 8x 10, 9x 10, 1x 10º, 2 x 10º, 3 x 10º, 4 x 10º, 5x 10º, 6 x 10º, 7 x 10º, 8 x 10º, e 9 x 10º pode ser mostrado como um exemplo preferido do valor numérico (valor limítrofe) que pode ser fixado como o padrão para selecionar indivíduos que vão receber a medicação.

Os valores numéricos mencionados acima podem ser aqueles calculados até um algarismo significativo; e neste caso, por exemplo, o nível de expressão de EREG de 1 x 10º calculado até um algarismo significati- vo pode ser um nível de expressão de EREG tendo um valor numérico dentre qualquer um de 0,5 x 10º, 0,6 x 10º, 0,7 x 10º, 0,8 x 10º, 0,9 x

10º, 1,0 x 10%, 1,1 x 10º, 1,2 x 10º, 1,3 x 10º, 1,4 x 10º se calculado até dois algarismos significativos.

Amostras de tecido

[00242] O termo "amostra de tecido" usado na presente invenção refere-se a qualquer amostra biológica que pode ser obtida de um in- divíduo, fluido corporal (por exemplo, sangue, soro, plasma, e líquido espinhal), cultura de tecido, seções de tecido, ou similar. Amostras de indivíduos podem ser usadas como exemplos preferidos de amostras biológicas. Amostras preferidas de indivíduos são tecidos obtidos de indivíduos, e mais preferivelmente tecido do cólon dos indivíduos. Bi- ópsia, um método conhecido, é de preferência usado como um método para coleta de tecidos do cólon. Meios conhecidos podem ser apropri- adamente usados como o meio para biópsia. Tais exemplos incluem a obtenção de tecidos por biópsia tal como biópsia por aspiração, bióp- sia por aperto ("clutch biopsy", biópsia por esponja, biópsia para citodi- agnóstico, biópsia endoscópica, biópsia por aspiração com agulha fina, biópsia por agulha, biópsia pulmonar transbrônquica, ou obtenção de tecidos durante uma cirurgia.

[00243] Na presente invenção, como as amostras de tecido são ob- servadas com luz transmitida sob um microscópio, elas são fatiadas até uma extensão em que a luz usada no microscópio é suficientemen- te transmitida através das amostras de tecido. Antes de serem fatia- das, as amostras de tecido são fixadas. Especificamente, as amostras de tecido são solidificadas por proteínas desidratantes ou desnaturan- tes nos tecidos/células para eliminar rapidamente as células que cons- tituem esses tecidos. Os tecidos resultantes possuem uma estrutura estabilizada e insolubilizada. Primeiro, as amostras de tecido a serem fixadas são cortadas em fragmentos tendo um tamanho e um formato adequados para preparar seções incrustadas em parafina usando um cortador tal como um escalpelo. Subsequentemente, os fragmentos são imersos em uma solução fixadora, um reagente usado para reali- zar fixação. A solução fixadora usada é de preferência formalina, ou mais preferivelmente formalina tamponada neutra. A concentração da formalina tamponada neutra é apropriadamente selecionada de acordo com as características ou propriedades físicas das amostras de tecido. A concentração pode ser apropriadamente alterada e usada entre 1% e 50%, de preferência entre 5% e 25%, e mais preferivelmente entre 10% e 15%. A solução fixadora na qual as preparações de tecido fo- ram imersas é apropriadamente desarada usando-se uma bomba de vácuo. A fixação é realizada deixando-se as amostras de tecido na so- lução fixadora por vários horas em condições de pressão normal e temperatura ambiente. O tempo requerida para a fixação pode ser apropriadamente selecionado dentro da faixa de 1 hora a 7 dias, de preferência 2 horas a 3 dias, ou de preferência 3 horas a 24 horas, e mais preferivelmente 4 horas a 16 horas. As amostras fixadas são en- tão apropriadamente imersas em um tampão fosfato ou similar por vá- rias horas (o tempo pode ser apropriadamente selecionado dentro da faixa de 2 horas a 48 horas, de preferência 3 horas a 24 horas, e mais preferivelmente 4 horas a 16 horas).

[00244] Em seguida, das amostras de tecido fixadas, as seções po- dem ser preparadas de preferência usando um método de secciona- mento congelado ou um método de seccionamento com parafina. Exemplos preferidos do método de seccionamento congelado incluem um método que envolve o congelamento dos tecidos onde os mesmos são colocados em no composto O.C.T. (Miles. Inc.), e os tecidos con- gelados são fatiados usando-se um Cryostat (aparelho para preparar seções congeladas). No método de seccionamento com parafina, as amostras de tecido fixadas são imersas em um agente incrustante, que é então fixado para assim conferir dureza uniforme e apropriada às seções. De preferência parafina pode ser usada como agente in-

crustante. As amostras de tecido fixadas são desidratadas usando-se etanol. Especificamente, as amostras de tecido são desidratadas por imersão sequencial das amostras de tecido em etanol a 70%, etanol a 80%, e etanol a 100%. O tempo e o número de vezes necessários pa- ra a imersão podem ser apropriadamente selecionados dentro das fai- xas de 1 hora a vários dias e de uma a três vezes, respectivamente. Além disso, a imersão pode ser efetuada à temperatura ambiente ou a 4ºC. Para a imersão a 4ºC, um tempo de imersão mais longo, por exemplo por uma noite, é preferível. Subsequentemente, a fase líquida é substituída por xileno, e então as amostras de tecido são incrustadas em parafina. O tempo necessário para substituição da fase líquida por xileno pode ser apropriadamente selecionado dentro da faixa de uma hora a várias horas. Neste procedimento, a substituição pode ser efe- tuada à temperatura ambiente ou a 4C. Para a substituição a 4ºC, um tempo de substituição mais longo, por exemplo por uma noite, é prefe- rível. O tempo e o número de vezes necessários para a incrustação em parafina podem ser apropriadamente selecionados dentro das fai- xas de uma hora a várias horas e de uma a quatro vezes, respectiva- mente. Neste procedimento, a incrustação pode ser efetuada à tempe- ratura ambiente ou a 4ºC. Para incrustação a 4€, um tempo de in- crustação mais longo, por exemplo, por uma noite é preferível. Além disso, as amostras de tecido podem ser incrustadas em parafina de preferência pelo uso de um aparelho para incrustação em parafina (por exemplo, EG1160, Leica) que processa automaticamente a reação de incrustação em parafina.

[00245] As amostras de tecido incrustadas em parafina como des- crito acima são presas a uma base para preparar um "bloco", que é então fatiado usando um micrótomo até uma espessura desejada se- lecionada dentre espessuras de 1 um a 20 um. As seções de tecido cortadas em fatias finas são então deixadas descansar sobre uma lâà-

mina de vidro usada como um suporte transparente para ligação. Nes- te caso, lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina a 0,01% (Sigma) e secadas também podem ser de preferência usadas para prevenir o descascamento das seções de tecido. As seções de tecido fixadas são secadas ao ar por um período de tempo apropriado selecionado entre vários minutos a uma hora.

Recuperação de antígenos

[00246] No método da presente invenção, a reatividade de um antí- geno cuja reatividade com um anticorpo fora reduzida devido à fixação em formalina é recuperada. Na presente invenção, um método de re- cuperação de epítopo induzida por protease (método PIER) é aplicado a uma das duas amostras de tecido, enquanto que um método de re- cuperação de epítopo induzida por calor (método HIER) é aplicado à outra amostra. Em seguida, a diferença no grau de coloração entre elas depois de reação com um anticorpo é digitalizada.

[00247] O método de recuperação de epítopo induzida por calor uti- liza apropriadamente um método de aquecimento via micro-ondas, um método de aquecimento em autoclave, um método de aquecimento por tratamento via ebulição, ou similar. Quando o tratamento via ebuli- ção é efetuado a uma potência de 780 W para manter a temperatura da solução em aproximadamente 98ºC, o tempo necessário para a re- cuperação incluindo o tratamento é apropriadamente selecionado en- tre cinco e 60 minutos e é, por exemplo, dez minutos. O tratamento de recuperação de antígeno pode ser realizada em um tampão citrato de sódio 10 MM assim como na Target Retrieval Solution comercialmente disponível (DakoCytomation) ou similar. Nos Exemplos descritos pos- teriormente, a Target Retrieval Solution é usada. Qualquer solução tampão ou aquosa é de preferência usada contanto que um epítopo no antígeno reconhecido por um anticorpo para epirregulina consiga liga- ção ao anticorpo como resultado do tratamento de recuperação para que um complexo antígeno-anticorpo descrito mais adiante possa ser detectado.

[00248] O tipoou origem da protease usada no método de recupe- ração de epítopo induzida por protease não é particularmente limitado, e geralmente uma protease disponível pode ser apropriadamente se- lecionada e usada. Exemplos preferidos da protease a ser usada in- cluem 0,05% de pepsina em ácido clorídrico 0,01N, 0,1% tripsina con- tendo ainda 0,01% de CaCl; em um tampão Tris a um pH 7,6,e 1 a 50 Vpg/ml de protease K em um tampão Tris-HCI 10 mM a um pH 7,8 con- tendo 10 mM de EDTA e 0,5% de SDS. Além disso, quando a protease K é usada, o pH de sua solução reacional é apropriadamente selecio- nado entre 6,5 e 9,5, e um reagente SH, um inibidor de tripsina, ou um inibidor de quimiotripsina pode ser apropriadamente usado. Protease presa ao kit Histofine HER2 Kit (MONO) (Nichirei Bioscience) descrito neste relatório nos Exemplos também está incluída em tais exemplos específicos de protease preferida. A recuperação de epítopo induzida por protease geralmente é efetuada a 37ºC. Entretanto, a temperatura de reação pode ser apropriadamente alterada dentro da faixa de 25T a 50T. Quando a recuperação de epítopo induzida por protease é efe- tuada a 37ºC, o tempo de reação é apropriadamente selecionado en- tre, por exemplo, um minuto e cinco horas e é, por exemplo, 15 minu- tos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, ou 4 horas. De- pois de terminado o tratamento de recuperação, as amostras de tecido tratadas são lavadas com tampão de lavagem. PBS (solução salina tamponada com fosfato) é de preferência usado como o tampão de lavagem. Além disso, um tampão Tris-HCI pode ser de preferência usado. As condições de lavagem geralmente adotam um método que envolve realizar lavagens de 5 minutos à temperatura ambiente três vezes. No entanto, o tempo e a temperatura de lavagem podem ser apropriadamente alterados.

[00249] As substâncias para detecção usadas na presente invenção geralmente incluem anticorpos, ácidos nucleicos, entre outros. Por exemplo, é possível (1) detectar a proteína EREG por um método imu- nológico usando anticorpos para EREG que podem detectar a proteína EREG, e (2) detectar MRNA codificando EREG usando uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA, ou mRNA) complementar ao mRNA codificando EREG que pode detectar o MRNA, ou adequa- damente uma molécula de ácido nucleico complementar, em que a de- tecção faz uso da hibridização entre as moléculas de ácido nucleico envolvidas (por exemplo o método FISH). Na presente invenção, téc- nicas imunológicas, em particular, coloração imuno-histológica é de preferência usada.

Reação de amostras de tecido com um anticorpo para epirregulina

[00250] A amostra de tecido submetida a tratamento de recupera- ção de antígeno baseado no método de recuperação de epítopo indu- zida por calor e a amostra de tecido submetida a tratamento de recu- peração de antígeno baseado no método de recuperação de epítopo induzida por protease são reagidas com um anticorpo para epirreguli- na como o anticorpo primário. Esta reação é realizada em condições apropriadas para o reconhecimento de um epítopo no antígeno pelo anticorpo para epirregulina e a formação de um complexo antígeno- anticorpo. A reação geralmente é realizada por uma noite a 4€ ou a 37 por uma hora. Entretanto, as condições de reação podem ser apropriadamente alteradas dentro de uma faixa adequada para reco- nhecimento de um epítopo no antígeno pelo anticorpo e formação de um complexo antígeno-anticorpo. Por exemplo, a temperatura de rea- ção pode ser alterada dentro da faixa de 4ºC a 50ºC, e o tempo de re- ação pode ser alterado entre um minuto e sete dias. Quando a reação é realizada a uma temperatura baixa, um tempo de reação mais longo é preferível. Depois de terminada a reação do anticorpo primário, as amostras de tecido são lavadas com um tampão de lavagem. PBS (so- lução salina tamponada com fosfato) é de preferência usada como o tampão de lavagem. Além disso, um tampão Tris-HCI também pode ser de preferência usado. As condições de lavagem normalmente ado- tam um método envolvendo lavagens de 5 minutos à temperatura am- biente três vezes. No entanto, o tempo e a temperatura de lavagem podem ser apropriadamente alterados.

[00251] Subsequentemente, as amostras de tecido submetidas à reação com anticorpo primária são reagidas com um anticorpo secun- dário que reconhece o anticorpo primário. Um anticorpo secundário marcado antecipadamente com uma substância marcadora para visua- lizar o anticorpo secundário é geralmente usado. Substâncias marca- doras preferidas incluem: corantes fluorescentes tais como isotiociana- to de fluoresceína (FITC), Cy2 (Amersham), e Alexa488 (Molecular Probes); enzimas tais como peroxidase e fosfatase alcalina; e ouro coloidal.

[00252] —Areação com o anticorpo secundário é realizada em condi- ções apropriadas para a formação de um complexo antígeno-anticorpo pelo anticorpo para epirregulina e o anticorpo secundário que reco- nhece o anticorpo para epirregulina. A reação geralmente é realizada à temperatura ambiente ou 37ºC por 30 minutos a uma hora. No entan- to, as condições de reação podem ser apropriadamente alteradas den- tro de uma faixa adequada para a formação de um complexo antígeno- anticorpo pelo anticorpo para epirregulina e o anticorpo secundário. Por exemplo, a temperatura de reação pode ser alterada dentro da fai- xa de 4€ a 50TC, e o tempo de reação pode ser alte rado entre um minuto e sete dias. Quando a reação é realizada a uma temperatura baixa, um tempo de reação mais longo é preferível. Depois de termi- nada a reação do anticorpo secundário, as amostras de tecido são la- vadas com um tampão de lavagem. PBS (solução salina tamponada com fosfato) é de preferência usado como a solução de lavagem. Além disso, um tampão Tris-HCI também pode ser de preferência usado. As condições de lavagem geralmente adotam um método envolvendo la- vagens de 5 minutos à temperatura ambiente três vezes. No entanto, o tempo e a temperatura de lavagem podem ser apropriadamente alte- rados.

[00253] Em seguida, as amostras de tecido submetidas à reação com o anticorpo secundário são reagidas com uma substância para visualizar a substância marcadora. Quando peroxidase é usada como a substância marcadora para o anticorpo secundário, as amostras de tecido são incubadas com uma solução de reação obtida por mistura- ção, imediatamente antes da incubação, de quantidades iguais de uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 0,02% e uma solução de DAB (diaminobenzidina) ajustada em uma concentração de 0,1% com 0,1 M de um tampão Tris-HCI (pH 7,2). Além da DAB, substratos cro- mogênicos tais como DAB-Ni e AEC+ (todos DAKO) podem ser apro- priadamente selecionados. Durante o curso da incubação, o grau de desenvolvimento de cor é observado sob um microscópio com tempo. No ponto em que desenvolvimento de cor apropriado é confirmado, a reação de visualização é interrompida por imersão das amostras de tecido em PBS.

[00254] “Quando fosfatase alcalina é usada como uma substância marcadra para o anticorpo secundário, as amostras de tecido são in- cubadas com uma solução de substrato de BCIP (5-bromo-4-cloro-3- indolil fosfato/NBT (nitroazul de tetrazólio) (Zymed) (NBT a uma con- centração de 0,4 mM e BCIP a uma concentração de 0,38 mM é dis- solvida em 50 mM de um tampão carbonato de sódio (pH 9,8) conten- do 10 mM de MgCl, e 28 mM de NaCl). Além disso, além de BCIP e NBT, Permanent Red, Fast Red, ou Fuchsin+ (todos DAKO) podem ser apropriadamente usados. Antes da incubação, as amostras de tecido podem ser pré-incubadas à temperatura ambiente por um minuto a várias horas com 0,1 M de um tampão Tris-HCI (pH 9,5) contendo 0,1 M de cloreto de sódio, 50 mM de cloreto de magnésio, e cloreto de le- vamisole que é um inibidor de fosfatase alcalina endógena (Nacalai Tesque) a uma concentração de 1 mM. Durante o curso da incubação, as amostras de tecido são observadas sob um microscópio com tem- po. No ponto em que os depósitos de formazan roxo, um produto rea- cional final, são observados, a reação é interrompida por lavagem das amostras de tecido com água ou por adição de TBS contendo 2% de álcool polivinílico. Em seguida, as amostras de tecido são lavadas com TBST (TBS contendo 0,1% de Tween 20). Quando ouro coloidal é usado como um marcador para o anticorpo secundário, o ouro coloidal é visualizado prendendo-se prata metálica às partículas de ouro por melhoramento com prata. O método de melhoramento com prata é co- nhecido pelos versados na técnica.

[00255] Quando qualquer um dos corantes fluorescentes tais como FITC (isotiocianato de fluoresceína), Cy2 (Amersham), e Alexa488 (Molecular Probes, Inc.) é usado como uma substância marcadora pa- ra o anticorpo secundário, uma etapa reacional para visualizar a subs- tância é desnecessária. Uma luz emitida por irradiação com uma luz no comprimento de onda de excitação da substância fluorescente po- de ser apropriadamente detectada por um microscópio de fluorescên- cia.

[00256] Na presente invenção, a proteína epirregulina contida nas amostras de tecido isoladas de indivíduos de teste é detectada da ma- neira descrita acima. Se a proteína epirregulina detectada contida nas amostras de tecido é altamente expressa ou não em tecidos contendo células cancerosas pode ser determinado por escores de intensidade de coloração que digitalizam os padrões de coloração obtidos pelo mé- todo de coloração imuno-histológica descrito acima. Os critérios que se seguem podem ser exemplificados como uma modalidade não limi- tativa da digitalização de padrões de coloração:

[00257] - Escore de intensidade de coloração de 0: nenhuma ou menos de 10% das células tumorais no tecido testado são células po- sitivas para epirregulina;

[00258] -Escore de intensidade de coloração de 1: células positivas para epirregulina representam 10% ou mais das células tumorais no tecido testado mas possuem uma intensidade de coloração fraca loca- lizada em uma porção da membrana da célula tumoral;

[00259] -Escore de intensidade de coloração de 2: células positivas para epirregulina representam 30% ou mais das células tumorais no tecido testado, ou células positivas para epirregulina representam 10% ou mais das células tumorais no tecido testado e possuem uma inten- sidade de coloração moderada localizada na membrana da célula tu- moral; e

[00260] - Escore de intensidade de coloração de 3: células positivas para epirregulina representam 60% ou mais das células tumorais no tecido testado, ou células positivas para epirregulina representam 10% ou mais das células tumorais no tecido testado e possuem uma inten- sidade de coloração forte localizada na membrana da célula tumoral.

[00261] Além disso, na presente invenção, ao determinar o nível de expressão de epirregulina em amostras de tecido isoladas de indiví- duos de teste com base nos escores de intesidade de coloração que digitalizam os padrões de coloração obtidos pelo método de coloração imuno-histológica descrito acima, é possível comparar o mesmo com as imagens dos padrões de coloração para níveis de expressão prede- terminados da proteína epirregulina preparada para correção de de- tecção. Para determinar o nível de expressão da proteína epirregulina, um método conhecido que utiliza contas marcadas com fluorescência usado para preparar uma curva de calibração para quantificação de antígeno (por exemplo, BD Quantibrite PE"M) pode ser apropriadamen- te usado.

[00262] Sea epirregulina contida em uma amostra de tecido isolada de um indivíduo de teste é altamente expressa ou não pode ser de- terminado pelo método mencionado acima. Exemplos de "altamente expressa" podem ser adequadamente selecionados da faixa de 1 x 10º, 2 x 10º, 3 x 10º, 4 x 10%, 5x 10º, 6 x 10º, 7 x 10%, 8 x 10º, 9 x 10º, 1x10%, 2x 10%, 3 x 10, 4 x 10, 5 x 105, 6 x 10º, 7 x 105, 8 x 10º, 9 x 10º, 1 x 10º, 2 x 10º, 3 x 10º, 4 x 10º, 5x 10º, 6 x 106, 7 x 10º, 8 x 10º, 9x10º, 1x 10”, 2x 10, 3 x 107, 4x 10, 5x 10, 6x 100, 7 x 100, 8 x 10”, e 9 x 10º em termos do número de moléculas de epirregulina ex- pressas por célula.

[00263] Todas as referências da técnica anterior citadas no presen- te relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência. Exemplos

[00264] A seguir, a presente invenção será descrita de forma mais específica por meio dos Exemplos, mas não se limita a estes. [Exemplo 1] Humanização do anticorpo quimérico EP27 Seleção das sequências de esqueleto para humanização

[00265] O anticorpo quimérico EP27 (descrito no documento WO 2008/047723) compreendendo regiões variáveis de camundongo e regiões constantes de IgG1 humana foi humanizado. As CDR e FR foram determinadas de acordo com a definição de Kabat (numeração de Kabat).

[00266] Primeiro, sequências da região variável de anticorpo huma- no e sequências da região variável de EP27 de camundongo em ba- ses de dados foram comparadas para selecionar as sequências de FR humana abaixo que podem ser usadas como um gabarito de humani- zação. O IMGT Database (http://www.imgt.org/) e NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) foram usadas como bases de dados. As sequências de FR selecionadas estão mostradas na Tabela 2 Tabela 2 | Esqueleto | númerodeacesso | nomedabasededados | = SEQIDNº | | FR1 da cadeia H | M99642 | IMGT Database = | 1 | FR2 da cadeia H L22582 IMGT Database 2 | FR3 da cadeia H | AJ252274 | NCBI GenBank 13 | FR4 da cadeia H | JO0256 . IMGT Database |A | FRIdacadeial = ——|MG64856 === |[IMGTDatabase [500555 | FR2 da cadeia L | X01668 IMGT Database 16 | FR3 da cadeia L M64856 IMGT Database 7 FR4 da cadeia L J00242 IMGT Database 8

[00267] Subsequentemente, sequências da região variável do anti- corpo humanizado foram desenhadas por ligação das sequências de CDR (Tabela 3, SEQ ID NOs: 9 a 14) das cadeias H e L da região va- riável de EP27 para a FR humana selecionada acima. Elas foram de- senhadas como a sequência HA da região variável da cadeia H huma- nizada (SEQ ID NO: 15) e a sequência LA da região variável da cadeia L humanizada (SEQ ID NO: 16). Tabela 3 CDR | SEQID NO | CDR1 da cadeia H 19 CDR?2 da cadeia H 10 É CDR3 da cadeia H | 11 CDR1 da cadeia L T12 | CDR?2 da cadeia L 113 | CDR3 da cadeia L 114 | Desenho da região variável HJ do EP27 humanizado

[00268] Já foireportado que na sequência de FR1 da cadeia H se- lecionada na Tabela 2, os resíduos aminoacídicos nas posições 2, 4, 24, 27, e 29 indicadas pela numeração de Kabat contribuem para a estabilização da estrutura do anticorpo por formação de núcleo superi- or (Ewert e outros, Methods. 2004 Oct;34(2): 184-99). Segundo a defi- nição de Chothia, os resíduos aminoacídicos nas posições 26 a 30 in- dicadas pela numeração de Kabat estão incluídos na CDR1 (Honegger e outros, J. Mol. Biol. (2001) 309, 657-670). Com base nas informa- ções acima, para preparar um anticorpo humanizado tendo uma ativi- dade fixadora de antígeno equivalente àquela do anticorpo quimérico EP27, os resíduos aminoacídicos mencionados acima foram restaura- dos para os resíduos presentes na sequência da região variável de EP27 de camundongo. Assim sendo, a FR1 da cadeia H humanizada (Tabela 4, SEQ ID NO: 17) foi novamente desenhada restaurando os resíduos aminoacídicos nas posições 2, 24, 27, 28, 29, e 30, indicadas pela numeração de Kabat, na FR1 da cadeia H humana (SEQ ID NO: 1) selecionada da Tabela 2, para os resíduos aminoacídicos presentes na sequência da região variável de EP27 de camundongo.

[00269] O resíduo aminoacídico na posição 93 indicada pela nume- ração de Kabat na sequência de FR3 da cadeia pesada selecionada na Tabela 2 é Ala, ao passo que o resíduo na sequência da região va- riável de EP27 de camundongo é Val. Com base no IMGT Database (http://Awww.imgt.org/) de sequências de linhagens germinativas de camundongo e humanas, foi confirmado que somente um pequeno número de sequências contêm Val na posição correspondente. O Val na posição 93, indicada pela numeração de Kabat, na sequência da região variável de EP27 de camundongo é considerado como estando envolvido na ligação de antígeno. Assim sendo, a FR3 da cadeia H humanizada (Tabela 4, SEQ ID NO: 18) foi novamente desenhada por substituição do resíduo aminoacídico na posição 93, indicada pela numeração de Kabat, na FR3 da cadeia H humana FR3 (SEQ ID NO: 3) selecionada na Tabela 2, pelo resíduo presente na sequência da região variável de EP27 de camundongo.

[00270] A partir da sequência HA da região variável da cadeia H humanizada (SEQ ID NO: 15), a sequência HJ da região variável da cadeia H humanizada HJ (SEQ ID NO: 19) compreendendo a FR1 (Tabela 4, SEQ ID NO: 17) e a FR3 (Tabela 4, SEQ ID NO: 18) recen-

temente desenhada e mostrada na Tabela 4, foi novamente desenha- da. Tabela 4 FR1 da cadeia H 17 18 Desenho das regiões variáveis LB e L18 humanizadas de EP27

[00271] O resíduo aminoacídico na posição 49, indicada pela nume- ração de Kabat, na sequência de FR2 da cadeia L selecionada na Ta- bela 2 é Tyr, ao passo que o resíduo na sequência da região variável de EP27 de camundongo é Glh. Com base no IMGT Database (http://www.imgt.org/) de sequências de linhagens germinativas de camundongo e humanas, foi confirmado que somente um pequeno número de sequências contêm Gln na posição correspondente. Isto sugeriu a possibilidade de que Gln na posição 49 contida na sequência da região variável de EP27 de camundongo esteja envolvida na liga- ção de antígeno. Com base nisto, a FR2 da cadeia L humanizada (Ta- bela 5, SEQ ID NO: 20) foi novamente desenhada por substituição do resíduo aminoacídico na posição 49, indicada pela numeração de Ka- bat, na FR2 da cadeia L humana (SEQ ID NO: 6) selecionada na Ta- bela 2 pelo resíduo aminoacídico presente na sequência da região va- riável de EP27 de camundongo.

[00272] Já foirelatado que na sequência de FR3 da cadeia L sele- cionada na Tabela 2, o resíduo aminoacídico na posição 71, indicada pela numeração de Kabat, contribui para a estabilização da estrutura do anticorpo por formação de núcleo superior (Ewert e outros, Me- thods. 2004 Oct; 34(2): 184-99). Para preparar um anticorpo humani- zado tendo uma atividade fixadora de antígeno equivalente àquela do anticorpo quimérico EP27, para substituir o resíduo aminoacídico aci- ma pelo resíduo aminoacídico da sequência da região variável de

EP27 de camundongo, a FR3 da cadeia L humanizada (Tabela 5, SEQ ID NO: 21) foi novamente desenhada por substituição do resíduo ami- noacídico na posição 71, indicadas pela numeração de Kabat, na FR3 da cadeia L humana (SEQ ID NO: 7) selecionada na Tabela 2 pelo re- síduo aminoacídico na sequência da região variável de EP27 de ca- mundongo.

[00273] A partir da sequência LA da região variável da cadeia L humanizada (SEQ ID NO: 16), a sequência LB da região variável da cadeia L humanizada (SEQ ID NO: 22) compreendendo as FR2 e FR3 recentemente desenhadas (Tabela 5, SEQ ID NOs: 20 e 21) foi dese- nhada.

[00274] Também, a partir da sequência LA da região variável da cadeia L humanizada (SEQ ID NO: 16), a sequência L18 da região va- riável da cadeia L humanizada (SEQ ID NO: 24) compreendendo a FR2 recentemente desenhada (Tabela 5, SEQ ID NO: 20) e a FR3 da sequência da cadeia L do anticorpo humano (Tabela 5, SEQ ID NO: 23) mostrada no Acesso Nº ABO64134 (NCBI GenBank) foi desenha- da. Tabela 5 FR2 da cadeia H 20 | FR3 da cadeia H 21 23 Preparação da sequência do anticorpo EP27 humanizado

[00275] Primeiro, para preparar um cDNA da região variável do EP27 humanizado, oligo-DNAs sintéticos foram desenhados para as cadeias H (HJ) e L (LB). Em seguida, os oligo-DNAs sintéticos foram misturados para amplificar um fragmento de gene codificando a região variável do anticorpo EP27 humanizado por um método conhecido pe- los versados na técnica, tal como PCR de reunião ("assembly PCR").

Finalmente, o fragmento amplificado foi clonado em um vetor de ex- pressão de célula animal apropriado, e foi ligado a um gene da região constante de IgG1 humana. A sequência nucleotídica do vetor de ex- pressão resultante foi determinada por um método conhecido pelos versados na técnica.

[00276] Para a heterogeneidade derivada da sequência C-terminal (G1, SEQ ID NO: 25) da cadeia H anticorpo IgG humana, já foi relata- da a deleção do resíduo lisina no aminoácido C-terminal, e amidação do grupo aminho C-terminal por deleção de dois aminoácidos C- terminais, glicina e lisina (Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1): 75-83.). Como um método para reduzir a heterogeneidade, um método que de- leta dois aminoácidos no terminal C da cadeia H, isto é, glicina na po- sição 446 e lisina na posição 447, indicadas pela numeração EU, é conhecido (WO 2009/041613). Desejavelmente, a heterogeneidade derivada da sequência C-terminal da cadeia H também está ausente no anticorpo EP27 humanizado. Assim sendo, a sequência de |IgG1 (G1d, SEQ ID NO: 26) sem glicina na posição 446 e sem lisina na po- sição 447, indicada pela numeração EU, na IgG1 humana pode ser usada como uma sequência da região constante. Por outro lado, uma cadeia x humana nativa (k, SEQ ID NO: 27) pode ser usada como a sequência da região constante da região constante da cadeia L. HJ- G1d (SEQ ID NO: 28) e LB-k (SEQ ID NO: 29) foram respectivamente preparadas como cadeia H e cadeia L para a sequência anticorpo EP27 humanizado obtida da maneira descrita acima. Alótipos foram reportados para a região constante da IgG1 (Jefferis e outros, mAbs 1: 4, 1-7; July/August 2009). Além da região constante tipo G1m17,1 mencionada acima (SEQ ID NO: 26) da IgG1, os tipos G1m17 (SEQ ID NO: 30) e G1m3 (SEQ ID NO: 31) podem ser usados para a prepara- ção do anticorpo EP27 humanizado. Avaliação do anticorpo EP27 humanizado

[00277] Para avaliar a sequência do anticorpo EP27 humanizado desenhado, a cadeia H (HJ-G1d, SEQ ID NO: 28) e a cadeia L (LB-k, SEQ ID NO: 29) foram coexpressas para obter o HJ-G1d/LB-k do anti- corpo EP27 humanizado. Especificamente, os vetores de expressão de cadeia H e L preparados da maneira mencionada acima foram transito- riamente transfectados na cepa HEK293H derivada de células de carci- noma de rim embrionário humano (Invitrogen) ou células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressar anticorpos. Do sobrenadante de cultura ob- tido, os anticorpos foram purificados por um método conhecido pelos versados na técnica usando rProtein A Sepharose"Y Fast Flow (GE Healthcare) ou similar. A absorvência de uma solução contendo anti- corpo foi medida a um comprimento de onda de 280 nm usando um es- pectrofotômetro, e a concentração de anticorpo foi calculada usando-se a absorvência medida e o coeficiente de absorvência determinado pelo método PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423). Entretanto, cH- G1/cL-k que é o anticorpo EP27 quimérico foi preparado como um con- trole pelo mesmo método usando as cadeias H (cH-G1, SEQ ID NO: 32) e L (cL-k, SEQ ID NO: 33).

[00278] A capacidade do anticorpo EP27 humanizado para se ligar à epirregulina humana (SEQ ID NO: 167) foi avaliada usando-se um ensaio de inibição de ligação da epirregulina (Exemplo de Referência 5) para o anticorpo EP27 quimérico. Se a concentração IC50 do anti- corpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) fosse fixada em 100, o valor do anticorpo EP27 humanizado HJ-G1d/LB-k seria 24. Preparação de anticorpos EP27 humanizados com atividade equiva- lente àquela do anticorpo quimérico

[00279] Sequências foram desenhadas por substituição de alguns resíduos aminoacídicos da sequência de FR na sequência da cadeia H HJ-G1d do anticorpo EP27 humanizado por resíduos aminoacídicos da sequência da região variável de EP27 de camundongo. Primeiro, uma sequência (SEQ ID NO: 35) foi desenhada por substituição de Thr- Asp, que são os resíduos aminoacídicos nas posições 75 e 76 indica- das pela numeração de Kabat da segência de FR3 humana, por Ser- Asn que são os resíduos aminoacídicos contidos na sequência da re- gião variável de EP27 de camundongos; e uma sequência (SEQ ID NO: 36) foi desenhada por substituição apenas de Asp na posição 76 por Asn que é um resíduo aminoacídico da sequência da região variá- vel de EP27 de camundongo (Tabela 6). Em seguida, HS-G1d (SEQ ID NO: 37) que é uma sequência da região variável da cadeia H hu- manizada tendo uma sequência FR3 (SEQ ID NO: 35) mostrada na Tabela 6 foi preparada por introdução de uma mutação em um vetor de expressão compreendendo a sequência HJ-G1d da região variável da cadeia H humanizada (SEQ ID NO: 28). A substituição do resíduo aminoacídico foi introduzida por um método conhecido pelos versados na técnica usando PCR ou similar. Similarmente, foi preparada a HY- G1d (SEQ ID NO: 38), que é uma sequência da região variável da ca- deia H humanizada compreendendo uma sequência de FR3 (SEQ ID NO: 36) mostrada na Tabela 6. Anticorpos EP27 humanizados, HS- G1d/LB-k, HY-G1d/LB-k, e HY-G1d/L18-k, foram obtidos da mesma maneira que no Exemplo 1-4. A capacidade dos anticorpos obtidos para se ligarem à epirregulina humana foi avaliada pela inibição da li- gação de epirregulina ao anticorpo quimérico EP27 (Exemplo de Refe- rência 5). Como resultado, se a concentração IC50 do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) fosse fixada em 100, as concentrações IC50 dos anticorpos EP27 humanizados, HS-G1d/LB-k, HY-G1d/LB-k, e HY- G1d/L18-k, seriam 142, 146, e 100, respectivamente.

[00280] Por conseguinte, foram encontradas sequências do anticor- po EP27 humanizado tendo uma capacidade fixadora de antígeno equivalente àquela do anticorpo EP27 quimérico, assim como riscos de imunogenicidade reduzidos em relação ao anticorpo quimérico

EP27 como resultado da humanização. Tabela 6 FRABSAdê SEQIDNº. | FR3 da cadeia H 35 | FR3 da cadeia H 36 [Exemplo 2] Introdução de mutações que suprimem as reações de de- samidação, isomerização, e hidrólise

[00281] Existe heterogeneidade nos anticorpos usados para fárma- cos embora eles sejam anticorpos monoclonais obtidos a partir de clo- nes derivados de uma única célula produtora de anticorpos. Tal hete- rogeneidade dos anticorpos ocorre sabidamente como resultado de modificações tais como oxidação, desamidação, isomerização, e hidró- lise, e é aumentada quando proteínas incluindo anticorpos são arma- zenados por um longo período ou submetidas a condições de estresse tais como estresse ao calor e estresse à luz (Heterogeneity of Mono- clonal Antibodies: Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 97, No. 7, 2426-2447). No entanto, as propriedades físicas das proteínas, em particular, homogeneidade e estabilidade são muito importantes para o desenvolvimento de anticorpos como fármacos. Desejavelmente, a heterogeneidade de uma substância de interesse deve ser reduzida para obtenção de um único material na máxima extensão.

[00282] A reação de desamidação ocorre de forma não enzimática nas cadeias laterais da asparagina e glutamina, e é uma reação que altera a amida presente nas cadeias laterais da asparagina e glutami- na em ácido carboxílico. A isomerização é causada pela formação de um intermediário do tipo imida cíclica instável devido à desamidação da asparagina ou à desidratação do ácido aspártico como resultado do ataque pelo par de elétrons do átomo de nitrogênio no resíduo lateral C-terminal nos grupos carbonila nas cadeias laterais da asparagina e ácido aspártico. Este intermediário é em sua maior parte transformado em ácido isoaspártico por clivagem, ao passo que o restante seja transformado em ácido aspártico. Desejavelmente, as reações de de- samidação e isomerização que ocorrem durante o armazenamento de proteínas tais como anticorpos devem ser suprimidas tanto quanto possível, porque elas causam a heterogeneidade mencionada acima. Já foi relatado que a reação de desamidação tende a ocorrer em parti- cular em um sítio onde a glicina e a asparagina são adjacentes uma à outra (Asn-Gly) (Geiger e outros, J. Biol. Chem. 1987; 262: 785-794). Além disso, já foi relatado que a cadeia peptídica do ácido aspártico é clivada por uma reação de hidrólise; e em particular, uma sequência (Asp-Pro) na qual prolina está presente na extremidade C-terminal provavlemente será degradada em condições ácidas (Segalas e ou- tros, FEBS Letters 1995; 371: 171-175).

[00283] Na sequência da CDR da sequência HY da região variável da cadeia H humanizada, os resíduos asparagina e ácido aspártico estão presentes nas posições 31 (Asp), 52 (Asp), 54 (Asn), 56 (Asn), e 101 (Asp), indicadas pela numeração de Kabat. Na sequência da CDR da sequência LB da região variável da cadeia L humanizada, eles es- tão presentes nas posições 28 (Asp), 92 (Asp), and 93 (Asn), indica- das pela numeração de Kabat. Foi examinado se era possível obter variantes que suprimem as reações de desamidação, isomerização, e hidrólise como resultado da substituição de resíduos aminoacídicos nesses sítios.

[00284] Para suprimir as reações de degradação acima por substi- tuição de resíduos aminoacíficos, os resíduos aminoacídicos foram substituídos em resíduos diferentes. Especificamente, H71-G1d (SEQ ID NO: 49), H57-G1d (SEQ ID NO: 50), H61-G1d (SEQ ID NO: 51), H65-G1d (SEQ ID NO: 52), H66-G1d (SEQ ID NO: 53), H67-G1d (SEQ ID NO: 54), H23-G1d (SEQ ID NO: 55), e H40-G1d (SEQ ID NO: 56) foram preparados como genes de cadeia H compreendendo as se-

quências de CDR (SEQ ID NOs: 39 a 46) mostradas na Tabela 7. Si- milarmente, L30-k (SEQ ID NO: 57) e L32-k (SEQ ID NO: 58) foram desenhados como genes de cadeia L compreendendo as sequências de CDR (SEQ ID NOs: 47 e 48) mostradas na Tabela 7. Usando a téc- nica do Exemplo 1, um vetor de gene de cadeia H no qual fora introdu- zido um resíduo substituído foi coexpresso com o vetor LB-k para ob- ter os anticorpos EP27 humanizados, H71-G1d/LB-k, H57-G1d/LB-k, H61-G1d/LB-k, H65-G1d/LB-k, H66-G1d/LB-k, H67-G1d/LB-k, H23- G1d/LB-k, e H40-G1d/LB-k. Similarmente, um vetor de gene de cadeia L no qual fora introduzido um resíduo substituído foi coexpresso com o vetor HY-G1d para obter o anticorpo EP27 humanizado HY-G1d /L32- k. A capacidade dos anticorpos obtidos para se ligarem à epirregulina humana foi avaliada como inibição da ligação de epirregulina ao anti- corpo EP27 quimérico (Exemplo de Referência 5), e o resultado está mostrado na Tabela 8. Isto demonstra que os anticorpos compreen- dendo as sequências mostradas na Tabela 7 têm uma atividade fixa- dora equivalente àquela do anticorpo quimérico EP27. Por conseguin- te, foram encontradas sequência do anticorpo EP27 humanizado com degradação química suprimida tal como desamidação e isomerização. Tabela 7

DE H71 CDR1 da cadeia H 39 | H57 CDR2 dacadeiaH =| 40 | H61 | GDRF da tadeiaH | 41 H65 CDR?2 da cadeia H 42 | H66 CDR?2 da cadeia H 43 | H67 CDR2 da cadeia H 44 H23 É CDR2 da cadeia H 45 | H40 CDR?2 da cadeia H 46 ] L30 CDR3 da cadeia L 47 CDR3 da cadeia L 48 Tabela 8

“nome do anticorpo alterado | concentração IC50 H71-G1/LB-k | 90 H57-G1/LB-k | 95 H61-G1/LB-k | T4 | H65-G1/LB-k | 78 | H66-G1/LB-k | 96 | | H67-G1/LB-k | 101 H23-G1/LB-k 87 H40-G1/LB-k 183 HY-G1/L30-k | 89 HY-G1/L32-k | 83 (concentração IC50: a concentração IC50 de cada anticorpo se a con- centração IC50 do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) for fixada em 100) [Exemplo 3] Introdução de mutações para alterar o ponto isolelétrico

[00285] “Como um método de controle da meia-vida plasmática de um anticorpo, um método que modifica resíduos aminoacídicos expos- tos na superfície da molécula de anticorpo para controlar a carga su- perficial da molécula (WO2007/114319 e WO2009/041543) é conheci- do. Especialmente, sabe-se que a meia-vida plasmática de um anti- corpo pode ser prolongada diminuindo-se o valor do ponto isoelétrico (pl) do anticorpo. Por outro lado, sabe-se que a meia-vida plasmática de um anticorpo pode ser reduzida aumentando-se o ponto isoelétrico do anticorpo para melhorar a transição tecidual do anticorpo (Vaisitti e outros, J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112; Par- dridge e outros, J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554).

[00286] Pelo acima exposta, espera-se que um anticorpo EP27 hu- manizado cujo ponto isoelétrico fora alterado tenha uma atividade anti- tumoral mais forte devido a sua meia-vida plasmática prolongada e transição tecidual melhorada. Portanto, os presentes inventores tinham como objetivo identificar resíduos aminoacídicos que permitem contro- lar a farmacocinética de um anticorpo por meio do ajuste da carga su- perficial da molécula de anticorpo sem afetar a atividade fixadora de antígeno e a conformação do anticorpo EP27 humanizado. Especifi- camente, foi realizada uma busca por sítios de mutação que podem abaixar o ponto isoelétrico do anticorpo EP27 humanizado HY- G1d/LB-k (cadeia H, HY-G1d, SEQ ID NO: 38; e cadeia L, LB-k, SEQ ID NO: 29) sem reduzir em grande extensão sua atividade inibitória de ligação de antígeno.

[00287] O modelo tridimensional do anticorpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k foi usado para rastrear resíduos que podem alterar o ponto isoelétrico da região variável sem reduzir significativamente a ligação à epirregulina. Especificamente, H3-G1d (SEQ ID NO: 72), H5- G1d (SEQ ID NO: 73), H6-G1d (SEQ ID NO: 74), H7-G1d (SEQ ID NO: 75), H8-G1d (SEQ ID NO: 76), H9-G1d (SEQ ID NO: 77), H10-G1d (SEQ ID NO: 78), e H31-G1d (SEQ ID NO: 79) foram desenhados co- mo genes da cadeia H compreendendo uma ou mais das sequências de CDR (SEQ ID NOs: 59 a 71) mostradas na Tabela 9. Similarmente, L1-k (SEQ ID NO: 80), L2-k (SEQ ID NO: 81), L12-k (SEQ ID NO: 82), L20-k (SEQ ID NO: 83), L21-k (SEQ ID NO: 84), e L23-k (SEQ ID NO: 85) foram desenhados como genes da cadeia L- compreendendo as sequências de CDR mostradas na Tabela 9. Usando a técnica do Exemplo 1, um vetor de gene da cadeia H no qual foram introduzidos resíduos substituídos foi coexpresso com o vetor LB-k para obter os anticorpos EP27 humanizados, H3-G1d/LB-k, H5-G1d/LB-k, H6- G1d/LB-k, H7-G1d/LB-k, H8-G1d/LB-k, H9-G1d/LB-k, H10-G1d/LB-k, e H31-G1d/LB-k. Similarmente, um vetor de gene da cadeia L no qual foram introduzidos resíduos substituídos foi coexpresso com o vetor HY-G1d para obter os anticorpos EP27 humanizados, HY-G1d/L1-k, HY-G1d/L2-k, HY-G1d/L12-k, e HY-G1d/L63-k. A capacidade dos anti- corpos obtidos para se ligarem à epirregulina humana foi avaliada co- mo inibição da ligação de epirregulina ao anticorpo EP27 quimérico (Exemplo de Referência 5). Como resultado, como mostrado na Tabe-

la 10, as capacidades fixadoras de antígeno dos anticorpos EP27 hu- manizados foram equivalentes àquela do anticorpo EP27quimérico. Por meio da investigação acima, foram encontradas sequências do anticorpo EP27 humanizado cujos pontos isoelétricos podem ser alte- rados. Tabela 9 Es corda [60 | [H31 coRrdacadeiaH = 66 ==> 2 jeoriacedeia [68 Tabela 10 | H6-G1Id/LB-kUUÚUÚjioB | H9-G1d/LB-kUÚUÚúÚúU ja ÚNÚNÚN ESTEKSTTDA:2 SA E

EYEST TES EE [HYGIA/L21k ——=—jog

(concentração IC50: a concentração IC50 de cada anticorpo se a con- centração IC50 do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) for fixada em 100) [Exemplo 4] Introdução de mutações que reduzem a quantidade de agregados

[00288] O controle da quantidade de agregados em fármacos à base de proteína é muito importante em termos do controle de qualidade e das influências sobre a eficácia e a imunogenicidade (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). Em geral, a agregação é influenciada tanto pela estabilidade coloidal devido ao ambiente da solução de proteína quanto pela estabilidade conformacional devido à estrutura da proteína (J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). Segundo as investigações quan- to a formulações de preparações à base de anticorpo, é possível obter condições desejáveis que sejam eficazes para a estabilidade coloidal por rastreamento da concentração de anticorpo, pH, tipo de tampão, resis- tência iônica, aditivo, entre outros. Por outro lado, a estabilidade confor- macional depende em parte das sequências aminoacídicas; e portanto, no caso de anticorpos, considera-se importante manter as estruturas ca- racterísticas tais como estrutura canônica das CDRs, sequência de con- senso das FRs, e interface VH/VL (Jung e outros, J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716; Xiang e outros, J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390; Ewert e outros, Methods. (2004) 34 (2), 184-199; Vargas-Madrazo e outros, J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120; Morea e outros, J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294; Vargas-Madrazo e outros, J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120).

[00289] Dos pontos de vista acima, na presente invenção, o dese- nho foi realizado como um esforço para preparar anticorpos humani- zados que sejam estruturalmente mais estáveis. Como resultado, foi encontrado o anticorpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k . Para reduzir ainda mais a quantidade de agregados contidos no HY-G1d/LB-k, re-

síduos hidrófobos contidos na CDR de HY-G1d/LB-k foram substituí- dos por resíduos hidrófilos, e o efeito inibitório sobre a agregação atra- vés da atenuação das interações hidrófobas entre moléculas foi exa- minado.

[00290] — Especificamente, H25-G1d (SEQ ID NO: 92), H41-G1d (SEQ ID NO: 93), H42-G1d (SEQ ID NO: 94), H43-G1d (SEQ ID NO: 95), H44- G1d (SEQ ID NO: 96), e H45-G1d (SEQ ID NO: 97) foram desenhados como genes da cadeia H nos quais qualquer uma das sequências de CDR (SEQ ID Nº: 86 a 91) mostradas na Tabela 11 fora introduzida no anticorpo EP27 humanizado HY-G1d/LB-k (cadeia H HY-G1d/SEQ ID NO: 38; cadeia L LB-k/SEQ ID NO: 29). Usando a técnica do Exemplo 1, um vetor de gene da cadeia H com resíduos substituídos foi coexpresso com o vetor LB-k para obter os anticorpos EP27 humanizados, H25- G1d/LB-k, H41-G1d/LB-k, H42-G1d/LB-k, H43-G1d/LB-k, H44-G1d/LB-k, e H45-G1d/LB-k. A quantidade de agregados contidos nos anticorpos EP27 humanizados foi determinada por cromatografia por filtração em gel (Exemplo de Referência 9), e o resultado está mostrado na Tabela

12. Daí, foram encontradas sequências do anticorpo EP27 humanizado com uma quantidade significativamente reduzida de agregados em rela- ção ao anticorpo EP27 quimérico (cH-G1d/cL-k). Tabela 11 | nome da variante de CDR | CDRaterada ——— [SEQIDNE H25 ' | CDR?2 da cadeia H 86. | H41 CDR?2 da cadeia H 87 H42 | CDR2 da cadeia H 88 H43 CDR?2 da cadeia H 89 H44 | CDR?2 da cadeia H 90 | [845 | ecoRdcedeaH [917 => |

Tabela 12 [H41-G1d/LB-kEU a ag [H42-G1Id/LB-kúÚúÚúÚ f1n5À"úÚúÚdeaÔÚÂÚÂÚÂÔÀS fe | |[H43-G1d/LB-kUUÚúÚú aq ÚÂÚÂÚÂÚÔÂÀfas Na [H44-G1d/LB-kUUÚUÚUÚú nó ÀÚÀÚfasÂÚÂÔNãN Nag [H45-G1d/LB-kUÚUÚUÚUÚUJagÂÚÂÚÂÚÂÚ e ag

[00291] A capacidade dos anticorpos obtidos para se ligarem à epir- regulina humana foi avaliada como inibição da ligação de epirregulina (Exemplo de Referência 5) ao anticorpo EP27 quimérico. Como mos- trado na Tabela 13, as capacidades fixadoras de antígeno dos anticor- pos EP27 humanizados foram equivalentes àquela do anticorpo EP27 quimérico. Através da investigação acima, foram encontradas sequên- cias do anticorpo EP27 humanizado com uma quantidade reduzida de agregados e uma capacidade fixadora de antígeno equivalente àquela do anticorpo quimérico EP27. Tabela 13 nome do anticorpo alterade concentração IC50 H25-G1d/LB-k H41-G1d/LB-k H42-G1d/LB-k 96 H43-G1d/LB-k 108 H44-Gld/LB-k 94 H45-G1ld/LB-k 92 (concentração IC50: a concentração IC50 de cada anticorpo se a con- centração IC50 do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) for fixada em 100)

[00292] Além disso, os seguintes anticorpos que foram desenhados como anticorpos EP27 humanizados por combinação arbitrária de se- quências compreendendo as substituições de resíduos aminoacídicos encontradas nos Exemplos 1 a 4 foram preparados usando o método do Exemplo 1:

H87-G1d/LB-k (cadeia H: SEQ ID NO: 98; cadeia L: SEQ ID NO: 29), H87-G1d/L21-k (cadeia H: SEQ ID NO: 98; cadeia L: SEQ ID NO: 84), H87-G1d/L37-k (cadeia H: SEQ ID NO: 98; cadeia L: SEQ ID NO: 99).

[00293] Sua capacidade de se ligar à epirregulina humana foi avali- ada como inibição da ligação de epirregulina ao anticorpo EP27 qui- mérico (Exemplo de Referência 5). Como resultado, como mostrado na Tabela 14, todos os anticorpos tinham uma capacidade fixadora equivalente àquela do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k). Tam- bém, a quantidade de agregados contidos nos anticorpos EP27 huma- nizados foi medida por cromatografia por filtração em gel (Exemplo de Referência 9), a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) de Fab foi medida com um calorímetro diferencial de varredura (Exemplo de Referência 10), e o ponto isoelétrico (pl) foi medido por focagem isoeléctrica (Exemplo de Referência 11). Como mostrado na Tabela 14, foi confirmado que as quantidades de agregados foram significativamente reduzidas e os valores da Tm foram aumentados, em relação ao anticorpo EP27 quimérico (cH-G1d/cL-k). Por conse- guinte, foram encontradas sequência do anticorpo EP27 humanizado que atingem riscos de imunogenicidade reduzidos, degradação quími- ca suprimida, pontos isoelétricos diminuídos, e quantidade reduzida de agregados por humanização como mostrado nos Exemplos 1 a 4. Tabela 14 (concentração IC50: a concentração IC50 de cada anticorpo se a con- centração IC50 do anticorpo EP27 quimérico (cH-G1/cL-k) for fixada em 100) [Exemplo 5] Introdução de mutações que melhoram a capacidade para se ligar a antígeno de macaco e reduzir a imunogenicidade

[00294] “Duante o desenvolvimento de drogas, em geral, avaliações quanto à toxicidade e segurança em estudos pré-clínicos são conside- radas importantes para determinação da dosagem e várias avaliações de risco em estudos clínicos. No caso de fármacos à base de anticor- po, sua especificidade para ligação de antígeno poderia limitar a sele- ção das espécies animais usadas para estudos pré-clínicos. Em mui- tos casos, primatas que são geneticamente próximos ao homem são selecionados. No entato, a avaliação usando primatas às vezes não é considerada apropriada se o anticorpo de interesse não se ligar a um antígeno do primata, ou se a capacidade de ligação for significativa- mente diferente de sua capacidade para se ligar a um antígeno huma- no. Para lidar com esses casos, foram feitas tentativas de avaliar a to- xicidade e a segurança em estudos pré-clínicos usando anticorpo sub- rogado que que se liga a um antígeno da espécie animal a ser usada, ou utilizando animais transgênicos com antígeno humano (Chapman e outros, Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6, 120-126).

[00295] Acredita-se que substituições de resíduos aminoacídicos por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, ma- turação por afinidade usando uma biblioteca de fagos ou exposição a ribossomas são eficazes para alterar a capacidade fixadora de antíge- no de um anticorpo de interesse, além disso, com base nas estruturas tridimensionais dos antígenos e sítios de ligação da cadeia variável do anticorpo, técnicas da ciência de informática podem ser usadas para melhorar a reatividade cruzada entre espécies (Farady e outros, Bio- organic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3744-3747). No en- tanto, não existe qualquer relatório publicado sobre alteração da capa- cidade fixadora de antígeno de um anticorpo antiepirregulina humana sem rastreamento em grande escala ou técnicas da ciência de infor- mática. Além disso, nenhuma diferença estrutural fora revelada entre epirregulina de macaco e epirregulina humana, e portanto, não existe qualquer orientação sobre quais resíduos aminoácidos de um anticor- po antiepirregulina humana devem ser modificados para melhorar sua atividade de ligação à epirregulina de macaco. Na presente invenção, múltiplas sequências de anticorpo foram desenhadas substituindo-se resíduos aminoácidos em sítios arbitrário da CDR. Usando a técnica do Exemplo 1, foram preparados genes de anticorpo com esses resí- duos substituídos, e os anticorpos foram expressos. Especificamente, sequências nas quais substituição por um resíduo Arg é feita na CDR2 e CDR3 da cadeia H e na CDR3 da cadeia L mostradas na Tabela 15 foram desenhadas, e os anticorpos mostrados na Tabela 16 foram preparados. As afinidades para epirregulina de macaco e humana fo- ram avaliadas utilizando um dispositivo (BIACORE) que usa espalha- mento de plasmônio de superfície (Exemplo de Referência 6).

[00296] Como resultado, em comparação com o anticorpo EP27 quimérico, foram encontradas sequências do anticorpo EP27 humani- zado sem afinidade reduzida para epirregulina humana, com afinidade melhorada para epirregulina de macaco, e com baixa relação de afini- dade ratio (= valor de KD para epirregulina de macaco/valor de KD pa- ra epirregulina humana) que é um indicador que mostra reatividade cruzada para epirregulina de macaco e epirregulina humana (Figuras 1 e2). Tabela 15

CDR alterada SEQID Nº. H111 CDR2 da cadeia H HI12 CDR?2 da cadeia H H116 CDR?2 da cadeia H H117 CDR?2 da cadeia H H118 CDR?2 da cadeia H H119 CDR? da cadeia H H120 CDR?2 da cadeia H H121 CDR?2 da cadeia H H123 CDR?2 da cadeia H H124 CDR1 da cadeia H H131 CDR3 da cadeia H H132 CDR3 da cadeia H H133 CDR3 da cadeia H CDR3 da cadeia L CDR3 da cadeia L Tabela 16 nome da variante = SEQIDN* (cadeia H) SEQ ID Nº (cadeia L)| CEREG KD (nM) / e C 1 j hEREG KD (nM) cH-G1/cLk | 32 133 140.9 à H87-GId/LBk [98 EX) 35.1 HIII-GIA/LBk [115 | 298 9.0 HIIIGId/LA7k [1165 128 12.6 HI11-GId/L48B-k 1 115 1129 84 HII2-GId/LBk 116 129 ECX H116-G1d/LB-k [17 29 6.1 HII7-GId/LBk [118 29 79 HUIS-GIG/LBk 119 29 T5 H119-GId/LBk 120 29 9.8 H120-G1d/LB-k 1121 j29 9.1 HI2LGIA/LBk (122 |29 8.3 T H1I23-GId/LBk 123 j29 8.2 HI24-GIA/LBk |124 28 20.6 HISIGIA/LBk (125 [29 a7 H132-G1d/LB-k 126 29 46 H1I33-GId/LBk 127 29 6.1

[00297] No desenvolvimento de medicamentos, o surgimento de anticorpos contra uma droga depois de sua administração suscita pro- blemas de eficácia e segurança. Assim sendo, é importante reduzir a imunogenicidade de uma droga de interesse. Técnicas in vivo, in vitro, e in silico encontram-se disponíveis para predizer a imunogenicidade de de produtos biológicos, e já foram publicados relatórios sobre a cor-

relação com a incidência de anticorpos antidrogas na prática clínica (Baker e outros, Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 308-313; Bryson e outros, BioDrugs. (2010) 24 (1), 1-8; Groot e outros, Curr. Opin. Phar- macol. (2008) 8 (5), 620-626). Na presente invenção, sequências do anticorpo EP27 humanizado que reduzem os riscos de imunogenicida- de sem prejudicar a capacidade fixadora de antígeno de um anticorpo de interesse podem ser previstas prevendo-se epítopos de células T usando-se a técnica descrita no Exemplo de Referência 13.

[00298] Paraas sequências compreendendo as alterações encon- tradas nos Exemplos 1 a 4, sequências com uma combinação arbitrá- ria de mutações que melhoram a afinidade para epirregulina de maca- co e/ou reduzem a imunogenicidade foram desenhadas. Os anticorpos EP27 humanizados assim desenhados e listados na Tabela 17 (SEQ ID NOs: 115 a 150) foram preparados usando-se o método do Exem- plo 1. Sequências de CDR mutadas dos anticorpos EP27 humaniza- dos listados na Tabela 17 estão mostrados na Tabela 18. As afinida- des para epirregulina humana e de macaco foram avaliadas usando-se um dispositivo (BIACORE) que usa espalhamento de plasmônio de superfície (Exemplo de Referência 6). Como mostrado na Fig. 3, a afi- nidade de cada um dos anticorpos EP27 humanizados para epirreguli- na humana foi equivalente àquela do anticorpo EP27 quimérico (cH- G1/cL-k). As relações de afinidade (= valor de KD para epirregulina de macaco/valor de KD para epirregulina humana) foram comparadas como um indicador da diferença nas afinidades para antígenos de ma- caco e humanos. Foi confirmado que a diferença nas afinidades de cada anticorpo EP27 humanizado para os dois antígenos foi significa- tivamente reduzida em relação àquela do do anticorpo quimérico (Fig. 4). Assim sendo, foram encontradas sequências do anticorpo EP27 humanizado que possuem afinidade melhorada para epirregulina de macaco sem reduzir a afinidade para epirregulina humana.

Tabela 17 [HUIGIA8k [115 —ji2.Q o. [HULGI/LBE — [115 j239g LHTITAGIA/EBARO aa | HITIS-GId/LBRSaa [HI20GI/LBk — [121 j[29 [HIZIGI/LBk — [122 [29 [HIZFGI/LBk — [1238 [an [HI32GI/LBk —. fJ126 j29Q EEESXSE TITE SA 5 ES O E? | | HIS4-GIA/L48B-kÀNÂ asa aa | HIS4-GId/LBkUN asa a LI66 Ga EB [HI68-G1d/LBkUSS a a | H183-G1d/L21k agr Ba [HIS3SGIA/LABk — [185 ar H183-G1d/L53-k H183-G1d/LB-k a

ME H197-G1d/LB-k aa aaa a ng | H204-G1d/LB-kKU asa [H205-GId/L58k [140 186 [H205GId/L78k [140 Ia | H205-G1d/LBa a o |H206-GId/L58k À [142 186 [H206-GId/L7T3k [142 Ido | H207-G1d/L4B-k Naa a [H207GI/LBk — fJ143 —j2Q | H210-G1d/LBRKa a a | H211-GId/L4Bde aa | H211-GIA/LBk [aas aRa [HA2GI/BEK — [aaBe fi [H212-G1d/LBRa ag [H2BGI/LBE — [147 [29 [H240-G1d/L7ad as a

Tabela 18 SEQIDNº.

H150

HISA H166 CDR2, 3 da cadeia H 153, 154 HI68 155, 154 H183 CDR2, 3 da cadeia H 153, 152 H193 H197 CDR2, 3 da cadeia H 157, 151 H204 CDR?2, 3 da cadeia H H205 CDR?2, 3 da cadeia H 153, 158 H206 [CDR2 3dacadeiaH | 153, 152 H207 H210 159, 152 H211 CDR?2, 3 da cadeia H H212 160, 152 H213 H224 CDR?2, 3 da cadeia H H231 CDR2, 3 da cadeia H 153, 158 FR1 da cadeia L 163, 164

[00299] Além disso, a quantidade de agregados contidos nos anti- corpos EP27 humanizados foi medida por cromatografia por filtração em gel (Exemplo de Referência 9), e a temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) dos Fabs preparados a partir dos anticorpos EP27 humanizados foi medida por calorimetria diferencial de varredura (Exemplo de Referência 10). Como mostrado na Tabela 19, foi confir- mado que as quantidades de agregados foram significativamente redu- zidas, e os valores da Tm foram aumentados, em relação ao anticorpo EP27 quimérico (cH-G1d/cL-k). Assim sendo, como mostrado nos Exemplos 1 a 5, foram encontradas sequências do anticorpo EP27 hu- manizado compreendendo riscos reduzidos de imunogenicidade, de- gradação química suprimida, pontos isoelétricos diminuídos, quantida-

des reduzidas de agregados, e capacidades de ligação melhoradas ao antígeno de macaco como resultado da humanização. Tabela 19 agregado Tm | relação relação | CEREG (nM escore de nome do anticorpo (%) (CO) hEREG KD| cEREG KD) hEREG ss imunogenicidade cH-G1/cL-k 800.2 H87-GId/LB-k | 10 |762| 074 [099 | 351 | 58964 | H205-G1d/L53-k | 1.0 1743] 108 [023 US ÚÁÚAd 5161 H206-G1d/L53-k 606.8 H231-G1d/L53-k | 22 733] 115 [027 | 60 | S417 H240-G1d/L53-k 515.6 H205-G1d/L73-k 519.0 H206-G1d/L73-k 609.7 H231-G1d/L73-k H240-G1d/L73-kx | 2.8 749/0691 [015 | 36 | S185 (a relação KD representa uma relação relativa quando o valor para cH- G1/cL-k=1.) [Exemplo 7] Atividade de ADCC de cada anticorpo de teste usando células mononucleares de sangue periférico humano como células efe- toras

[00300] Células mononucleares de sangue periférico humano (do- ravante denominadas PBMC humanas) foram usadas como células efetoras para medir a atividade de ADCC de cada anticorpo de teste como descrito mais adiante. Uma fração de células mononucleares coletadas de sangue periférico humano foi usada para a célula efetora de origem humana. Como resultado, foi verificado que todos os anti- corpo EP27 humanizados usados no teste induzem ADCC contra célu- las MIA PaCa-2 (Exemplo de Referência 7) (Fig. 5). [Exemplo 8] Medição da atividade de anticorpos monoclonais antiepir- regulina para neutralizar a estimulação do crescimento de células por epirregulina humana ou de macaco

[00301] Sequências do anticorpo EP27 humanizado com afinidade melhorada para epirregulina de macaco foram reveladas no Exemplo

5. Para avaliar suas atividades em células, os anticorpos EP27 huma- nizados tiveram medidas suas atividades para neutralizar a estimula-

ção do crescimento de células por epirregulina de macaco e epirregu- lina humana. BAF EGFR foi usada para as células. Todos os anticorpo EP27 humanizados avaliados nessa ocasião foram examinados quan- to as suas atividades neutralizantes que inibem o crescimento de célu- las EGFR BAF dependente de epirregulina humana e de macaco (Exemplo de Referência 8), e todos os anticorpos EP27 humanizados mostraram atividades neutralizantes melhoradas contra epirregulina de macaco em relação ao anticorpo quimérico (Figuras 6 e 7). [Exemplo 9] Teste de eficácia medicamentosa para os anticorpos EP27 humanizados usando um modelo in vivo

[00302] A atividade antitumoral in vivo para os anticorpos EP27 hu- manizados, cuja atividade em célula in vitro fora confirmada nos Exemplos 7 e 8, foi avaliada usando um modelo de camundongo com tumor humano enxertado (Exemplo de Referência 14). Os efeitos anti- tumorais de cada anticorpo de teste avaliada em modelos de camun- dongos com transplante de células cancerosas humanas MIA PaCa-2 e DLD-1 foram avaliados medindo-se o volume tumoral no dia 7 depois do último dia de administração da amostra. Como resultado, como mostrado na Fig. 8, quando o anticorpo cH-G1/cL-k, o anticorpo H206- G1d/L73-k, e o anticorpo H240-G1d/L73-k foram administrados indivi- dualmente tanto a 0,4 mg/kg quanto a 2 mg/kg, também foi observada uma excelente eficácia medicamentosa pelos anticorpos EP27 huma- nizados nos modelos animais. [Exemplo 10] Coloração imuno-histoquímica usando um anticorpo an- tiepirregulina

[00303] Foi estabelecido um método de coloração imuno- histoquímica que reflete o nível de expressão de antígeno usando um anticorpo EP27. A coloração imuno-histoquímica foi realizada usando-se blocos de tecido incrustados em parafina preparados com tecidos de camundongos scid transplantados com linhagens celulares que são for-

çadas a expressar EREG em diferentes níveis de expressão, que são SKE-18 (a quantidade estimada de antígeno foi de 7,7 x 10º), SKE-23 (a quantidade estimada de antígeno foi de 6,1 x 10º), e SKE-4B2 (a quantidade estimada de antígeno foi de 2,9 x 10%), e a célula hospedeira SK-HEP-1 (a quantidade de antígeno foi de 8,4 x 10º). A expressão de EREG nessas seções de tecido cortadas em fatias finas preparadas a partir desses blocos de parafina foi visualizada por incubação usando um anticorpo EP27 como anticorpo primário, seguido por reação de um anticorpo policlonal IgG de coelho anticcamundongo (Jackson Immuno- research Laboratories) como o anticorpo secundário, e um anticorpo IgG de cabra anti-coelho ligado a polímero-HRP (Dakocitomação) como o anticorpo terciário, e usando diaminobenzidina como substrato.

Como mostrado na Fig. 10, graduação de coloração é observada nas célu- las/tecidos manchados dependendo da quantidade de expressão de EREG.

Além disso, foi confirmado que a atividade de ADCC in vitro do anticorpo H240-G1d/L73-k depende do nível de expressão nessas célu- las (Fig. 11). Na investigação mencionada acima, um anticorpo com baixo teor de fucose foi usado para o anticorpo H240-G1d/L73-k.

O an- ticorpo com baixo teor de fucose foi produzido pelo método descrito no documento WO2004/065540. Doravante, o anticorpo com baixo teor de fucose também é denominado anticorpo EP27 humanizado Glycomab.

A atividade de ADCC in vitro do anticorpo H240-G1d/L73-k (anticorpo EP27 humanizado Glycomab) foi confirmada em SKE-15 e SKE-10 que têm um nível estimado de antígeno de 2,8 x 10º, e também nas quatro linhagens celulares mencionadas acima de expressão forçada de EREG.

De maneira similar à Fig. 11, a atividade de ADCC in vitro do anticorpo H240-G1d/L73-k de acordo com o nível de expressão de EREG nessas células foi confirmada (Tabela 20). Além disso, a ativida- de de inibição de crescimento tumoral in vivo do anticorpo H240- G1d/L73-k (anticorpo EP27 humanizado Glycomab) de acordo com o nível de expressão nessas células foi confirmada (Fig. 12). Isto é, avali- ação do nível de expressão de EREG por coloração imuno-histoquímica confirmou uma correlação entre o nível de expressão e a eficácia medi- camentosa. Tabela 20 NOMEDOCLONE — [umemenTaTen (4 g/mL) ADCC (%) — Jxíva ce PEÇO DE ERES SKE4B2 | 0.1 | 43.8 | 290000 SKE23 | 0.1 | 32.6 | 61000 SKE10 ] 0.1 ] 24.9 | 28000 SKE15 | 0.1 | 17.4 | 28000 SKEI8 ] 0.1 | 8.5 | 7700 SKE] | 0.1 | 4.4) 5600 SK-HEP] | 0.1 ] 9.1) 840 [Exemplo 11] Expressão de EREG em casos clínicos de câncer de có- lon pobremente diferenciado

[00304] Para examinar a expressão de EREG em nove casos clíni- cos de câncer de cólon pobremente diferenciado, espécimes cortados em fatias finas e incrustados em parafina dos mesmos casos foram coloridos pelo método de coloração descrito no Exemplo 10. Como resultado, imagens nitidamente positivas foram confirmadas em 7/9 casos (Fig. 13). [Exemplo 12] Eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra tumorigênese de células-tronco câncer de cólon

[00305] Células-tronco de câncer de cólon (1 x 10º células) isoladas do modelo de tumor PLR1I23 de um câncer de cólon humano (WO02012/046797) foram transplantadas na região inguinal de ca- mundongos SCID. A partir do dia seguinte ao da administração das células-tronco aos camundongos SCID, o anticorpo EP27 humanizado Glycomab foi administrado uma vez por semana a 10 mg/kg. Como resultado, o teste de Rank assinado de Wilcoxon (SAS system 8.02 TS level 02M0 e SAS preclinical package Version 5.00.010720) confirmou que no 29º dia após o transplante, a tumorigenicidade foi significativa- mente suprimida no grupo medicado com o anticorpo em relação ao grupo de controle, como mostrado na Fig. 14. [Exemplo 13] Eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra metástase de células-tronco de câncer de cólon

[00306] Células-tronco de câncer de cólon (2 x 10º células) isoladas do modelo de tumor PLR123 de um câncer de cólon humano foram transplantas em camundongos SCID-bege a partir da veia caudal. Três dias após a administração das células-tronco aos camundongos, o an- ticorpo EP27 humanizado Glycomab foi administrado uma vez por se- mana a 10 mg/kg. Como resultado, no 52ºC após o transplante, o nú- mero de nódulos tumorais nos pulmões dos camundongos (número de lesões metastáticas) e o tamanho dos nódulos tumorais (diâmetro da lesão metastástica) foram confirmados como significativamente supri- midos no grupo medicado com o anticorpo em relação ao grupo de controle como mostrado na mostrado na Fig. 15. [Exemplo 14] Eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra câncer de cólon pobremente diferenciado

[00307] Uma seção de tecido tumoral do tumor COL-53-JCK de câncer de cólon pobremente diferenciado (Central Institute for Experi- mental Animals) foi transplantada em camundongos SCID. A partir do 14º dia após o transplante da seção de tecido tumoral, o anticorpo EP27 humanizado Glycomab foi administrado uma vez por semana a mg/kg. Como resultado, avaliação do volume tumoral no 14º dia a contar da administração do anticorpo confirmou que o crescimento do tumor é significativamente suprimido no grupo medicado com o anti- corpo em relação ao grupo de controle (Fig. 16). [Exemplo 15] Eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra câncer de cólon moderadamente diferenciado

[00308] “Tumores no model de tumor PLR379 de câncer de cólon mo- deradamente diferenciado (PCT/JP2012/072852) têm um aspecto de brotamento tumoral observado morfologicamente, a expressão de epirre-

gulina foi detectada independente do sítio do brotamento tumoral. Uma seção de tecido tumoral deste PLR379 foi transplantado em camundon- gos SCID, e a partir de 21º dia após transplante da seção de tecido tu- moral, o anticorpo EP27 humanizado Glycomab foi administrado uma vez por semana a 10 mg/kg. Avaliação do volume tumoral no 18º dia a contar do início da administração do anticorpo confirmou que o crescimento tu- moral é significativamente suprimido no grupo medicado com o anticorpo em relação ao grupo de controle (Fig. 17). [Exemplo 16] Expressão de EREG em adenocarcinoma de pulmão clí- nico

[00309] Para examinar a expressão de EREG em sete casos clíni- cos de adenocarcinoma de pulmão, espécimes dos casos cortados em fatias finas e incrustados em parafina foram coloridos usando o méto- do de coloração descrito no Exemplo 10. Como resultado, imagens positivas nítidas foram confirmadas em quatro dos sete casos (Fig. 18). [Exemplo 17] Atividade de ADCC do anticorpo EP27 humanizado Glycomab usando células mononucleares de sangue periférico huma- no como células efetoras

[00310] A atividade de ADCC foi avaliada para a linhagem Calu-3 de adenocarcinoma de pulmão humano usando PBMC humanas como células efetoras. Como resultado, foi confirmado que o anticorpo EP27 humanizado Glycomab induz ADCC contra células Calu-3 (Fig. 19). [Exemplo 18] Eficácia medicamentosa do anticorpo EP27 humanizado Glycomab contra adenocarcinoma de pulmão

[00311] O anticorpo EP27 humanizado Glycomab foi administrado a camundongos SCID com um fragmento de tecido tumoroso implantado co modelo Calu-3 de adenocarcinoma de pulmão humano, uma vez por semana a 10 mg/kg a partir do 13º dia após transplante do frag- mento de tecido tumoroso. O volume tumoral foi medido no 28º dia a contar do início da administração do anticorpo. Foi confirmado que o crescimento tumoral foi significativamente suprimido no grupo medica- do com o anticorpo em relação ao grupo de controle (Fig. 20). [Exemplo 19] Internalização celular do anticorpo EP27 humanizado

[00312] A internalização celular do anticorpo EP27 humanizado foi avaliada pelo seguinte método. Quando o anticorpo primária fica inter- nalizado, saporina, que é uma proteína inativadora de ribossomas car- regada pelo anticorpo secundário, é transportada para dentro da célula via ligação do anticorpo secundário ao anticorpo primário. Uma vez internalizada, a saporina se dissocia do conjugado IgG, inibe a síntese da proteína, e então provoca morte celular. Uma linhagem celular DLD-1 expressando EREG ou a linhagem celular SK-HEP1 de controle foi semeada a uma densidade celular de 1 x 10º células em cada por- ço de microplacas de 96 poços, e no dia seguinte, o anticorpo EP27 humanizado Glycomab foi acrescentado ao anticorpo primário, e IgG de cabra reconhecendo o anticorpo monoclonal humano ligado à pro- teína inativadora de ribossomas Hum-ZAP (Advanced Targeting Sys- tems) foi acrescentado como o anticorpo secundário. Quatro dias após a adição, a viabilidade celular foi avaliada por WST8 (Donjindo). Como mostrado na Fig. 21, o anticorpo EP27 humanizado Glycomab induziu morte celular apenas contra a linhagem celular DLD-1 expressando EREG. Por outro lado, ele não induz morte celular contra a linhagem celular SK-HEP1 que foi usada como o controle. Exemplo de Referência 1 Isolamento de genes de epirregulina humana e de macaco cinomolgo

[00313] O cDNA de EREG humano de comprimento integral (CR541887, SEQ ID NO: 169) foi isolado por um método tradicional, e um plasmídio produzido por clonagem deste fragmento de gene em um vetor para expressão em células de mamíferos (pDMCN) foi deno- minado hpEREG/pMCN. O pMCN pode induzir a expressão de um gene estranho sob o promotor CMV de camundongo (ACESSO Nº U 68299), e é um vetor no qual é inserido um gene de resistência à ne- omicina. O cDNA de EREG de macaco cinomolgo de comprimento in- tegral foi isolado por um método tradicional a partir de uma biblioteca de cDNA de macaco cinomolgo com base nas informações de se- quência do cDNA de EREG de macaco rhesus (XM 001102069), e um plasmídio produzido por clonagem deste fragmento de gene (um frag- mento de gene codificando a sequência de SEQ ID NO: 165) em um vetor para expressão em células de mamíferos (pMCN) foi denomina- do cyEREG/pMCN. O hEREG/pMCN e o cyEREG/pMCN foram intro- duzidos na cepa CHO DG44 (Invitrogen) por eletroporação, e seleção com 500 ug/mL de Geneticina estabeleceu células CHO que expres- sam firmemente EREG humana de comprimento integral e células CHO que expressam firmemente EREG de macaco cinomolgo de comprimento integral, que foram denominadas hEREG DG e cyE- REG DG, respectivamente. Exemplo de Referência 2 Estabelecimento de métodos para expressar formas maduras de epirregulina humana e de macacos cinomolgos

[00314] Um método de PCR foi usado para amplificar cDNAs para expressão da sequência de seis repetições de histidina nos terminais C das regiões extracelulares de EREGs humanas maduras dos genes de epirregulina humana e de macaco cinomolgo (polipeptídios nos quais a sequência de SEQ ID NO: 171 fora fundida nos terminais N dos polipeptídios de SEQ ID NOs: 170 e 34, respectivamente). Vetores de expressão para uso em células de mamíferos nas quais esses CDNAs foram individualmente inseridos foram linearizados por enzi- mas de restrição; e em seguida por introdução daqueles em células Freestyle 293 usando 293fectina, epirregulinas humana e de macaco cinomolgo maduras foram expressas transitoriamente. Exemplo de Referência 3 Preparação de epirregulina

[00315] O da gene epirregulina humana madura e o gene da epirre- gulina de macaco cinomolgo madura foram individualmente inseridos em um vetor de expressão para células de mamífero. Proteínas de fu- são de EREG-6His humana e EREG-6His de macaco cinomolgo isola- das das soluções de cultura de células animais feitas para expressar cada um dos genes pelo método abaixo foram purificadas.

[00316] A regão extracelular da EREG humana madura (um poli- peptídio no qual a sequência de SEQ ID Nº: 171 é fundida ao terminal N de SEQ ID NO: 34) fundida "in-frame" com uma região de seis histi- dinas foi inserida em um vetor de expressão para animais mamíferos para construir o vetor de expressão hsEREG-6His (doravante, o poli- peptídio de fusão expresso é denominado hsEREG-His). A região ex- tracelular da EREG de macaco cinomolgo madura (um polipeptídio no qual a sequência de SEQ ID Nº: 171 é fundida ao terminal N de SEQ ID NO: 170) fundida "in-frame" com uma região de seis histidinas foi inserida em um vetor de expressão para animais mamíferos para construir o vetor de expressão csEREG-6His (doravante, a EREG ex- pressa é denominada cysEREG-His). O vetor de expressão hs EREG- 6His e o vetor de expressão csEREG-6His foram introduzidos em célu- las FreeStyle 293 (Invitrogen) usando 293fectina (Invitrogen), e as |li- nhagens celulares transducidas foram cultivadas sob seleção de Zeo- cina (500 ug/mL) por seis dias a 37ºC em uma incubadora a 8% de CO,.

[00317] Em seguida, hnsEREG-His e cysEREG-His foram purificados a partir do sobrenadante da cultura. Imidazol 4 M foi adicionado ao so- brenadante da cultura a uma concentração final de 10 mM de imidazol, e esta mistura líquida foi misturada com a resina Ni no sistema de puri- ficação His MicroSpin (Amersham). A resina foi lavada com 20 mM de imidazol e 50 mM de imidazol|, e em seguida o hsEREG-His ou o cy- SEREG-His foi eluído usando-se 200 mM de imidazol (fração de elui-

ção 1), e então o hsEREG-His ou o cysEREG-His foi eluído usando-se 400 mM de imidazol (fração de eluição 2). Em seguida, o tampão con- tendo hsEREG-His ou cysEREG-His eluído foi trocado por PBS por diálise usando-se um copo de diálise MWIWVCO8000 da Bio-tech. A prote- ína purificada foi quantificada usando-se o método PACE a um com- primento de onda de 280 nm, e esta quantificação foi convertida em teor de proteína.

[00318] Os padrões eletroforéticos das proteínas purificadas estão mostrados na Fig. 9. Exemplo de Referência 4 Establelecimento de um sistema ELISA para epirregulina

[00319] Um fragmento de EREG humana solúvel tendo uma estru- tura de domínio de EGF maduro (o polipeptídio de SEQ ID NO: 34 que corresponde a º*Val a Leu) foi adquirido na R&D Systems (cat. no. 1195-EP/CF). O fragmento de EREG humana solúvel foi usado para revestir imunoplacas nunc, e depois de ser bloqueado com uma solu- ção contendo BSA, a reatividade de ligação dos anticorpos anticEREG purificados foi analisada. A adição dos anticorpos anti-EREG purifica- dos foi seguida por uma hora de incubação, as placas foram lavadas, e em seguida um anticorpo IgG anti-humana marcado com fosfatase alcalina (Zymed) foi adicionado a cada poço das placas lavadas e en- tão deixados reagirem. Cada poço foi lavado, e então a quantidade de anticorpo ligado foi determinada pela adição de um reagente de teste, p-Nitrofenil fosfato comprimidos da Sigma. Exemplo de Referência 5 Estabelecimento de um sistema para inibir a ligaçao de epirregulina por ELISA competitivo

[00320] Um fragmento de EREG humana solúvel tendo uma estrutura de domínio de EGF maduro (o polipeptídio de SEQ ID NO: 34 que cor- responde a **Val a Leu) foi adquirido na R&D Systems (cat. no. 1195- EP/CF). O fragmento de EREG humana solúvel foi usado para revestir imunoplacas nunc, e depois de ser bloqueado com uma solução conten- do BSA, a reatividade de ligação competitiva entre EP27 derivado de hi- bridoma de camundongo e o anticorpo anti-EREG humanizado purificado foi analisada. O EP27 derivado de hibridoma de camundongo e um anti- corpo antic-EREG humanizado purificado foram adicionados às placas, e depois de duas horas de incubação, as placas foram lavadas; e um anti- corpo IgG anti-humana marcado com fosfatase alcalina (Zymed) foi adi- cionado a cada poço das placas e então deixados reagirem. Cada poço foi lavado, e então a quantidade de anticorpo ligado (valor de detecção de A405/655) foi determinada pela adição de um reagente de teste, p- Nitrofenil fosfato comprimidos da Sigma.

Exemplo de Referência 6 Estabelecimento da atividade fixadora de antígeno (um método para medir a afinidade)

[00321] A afinidade e a constante da taxa de associação de um an- ticorpo anticEREG para um antígeno foram medidas pelo método da cinético de ciclo simples do ensaio de ressonância de plasmônio de superfície usando Biacore""-T100 (GE Healthcare Japan). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) foi usado como o tampão de corrida, e um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Japan) foi usado para ligar covalentemente a proteína A ao chip CM5 (chip revestido com carbo- ximetil dextrana). HBS-EP+ (GE Healthcare Japan) foi usado como o tampão de corrida, e um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare Japan) foi usado para ligar covalentemente a proteína A ao chip CM5 (chip revestido com carboximetil dextrana). Cada anticorpo anti-EREG foi preparado de modo que aproximadamente 350 RU sejam captura- dos pela poteína A. EREG humana ou EREG de cinomlgo usada como o analito foi preparada a O, 0,7, 1,4, 2,8, 5,6, e 11,2 nM usando HBS- EP+. A medição foi feita deixando-se primeiro a proteína A capturar a solução de anticorpo, e então a uma taxa de fluxo de 30 uL/min, inje- tando-se sucessivamente cada uma das soluções de EREG humana ou EREG de cinomolgo 0, 0,7, 1,4, 2,8, 5,6, e 11,2 nM por três minutos para deixar a reação ocorrer.

Em seguida, a solução foi trocada por HBS-EP+, e a fase de dissociação foi medida por 15 minutos.

Depois de terminada a medição da fase de dissociação, o chip sensor foi la- vado com 25 mM de NaOH e regenerado.

A medição na concentração zero foi feita de maneira similar deixando-se a proteína A capturar a solução de anticorpo, e efetuando-se injeções de HBS-EP+ por três minutos sucessivamente por cinco vezes para deixar a reação ocorrer, e então trocando-se por HBS-EP+ para medir a fase de dissociação por 15 minutos.

Depois de terminada a medição da fase de dissocia- ção, o chip sensor foi lavado com 25 mM de NaOH e regenerado.

Um software de análise de dados exclusivamente para Biacore, Biacore T100 Evaluation Software Version 2.0.1, foi usado para a realização de análises cinéticas para calcular a constante da taxa de associação (Ka), constante da taxa de dissociação (Kg), e a relação das constantes de taxa a partir dos sensogramas obtidos.

Os resultados estão mostrados na Tabela 21. Para corrigir as diferenças diárias nos valores de medi- ção, as Figuras 1 a 4 e Tabelas 16 e 19 mostram relações baseadas no valor da amostra de controle (cH-G1/cL-k) medido no mesmo dia como 1. Tabela 21 NOMEDO — | afiidadepara EREG humana — afinidade para EREG de macaco cinomolgo

| ANTICORPO | KDMM) | k.(1/Ms) [| ka(1/9) | KDIM) | k.(1/Ms) | Kki(1/s) | cH-G1 /cl-k 1 2.0x107º | 11x109 2.2x10% | 5.2x10º | 9.9x105 | 52x10º h H205-G1d/L53-k | 2.2x10º | S.4x105 |) 1.2x10% | 1.2x10º | S5.8x10º — 7.0x10% | H205-GId/L73-k | 1.9x10%º | 3.9x10º | 7.5x105 | 6.9x107º | 3.7x105 | 26x10º | H206-GId/LS3-k | 1.7x10%º | 6.6x105 | 11x10% | 9.4x107º | 6.4x105 | 6.1xX10% h H206-G1d/L73-k | 1.3x10%º | 5.5x105 | 7.4x105 4.5x107 | 5.0x105 | 23x104 | H231-GId/L53-k | 23x107 | 4.5x105 | LIXIO* | 1.4x10º | 6.2x105 | 86x10% | H231-GId/L73-k | 1,4x107º | 6.2x105 | 8.7x105 | 6.6x10!º | 42x105 — 2.8x10% | H240-GId/L53-k | 2.7x10%º | 42x105 | 11x10% | 1.5x10º | G6.1x105 | 89x10º | H240-G1d/L73-k | 2.2x10º | 3.4x10º — 7,7x105 | 8.7x1070 | 3.4x105 | 29x10%

H87-GId/LBk =) 1.5x107º | 1.3x10º | 2.0x10% | 5.2x10º | 8.6x105 | 4.5x10º Exemplo de Referência 7 Estabelecimento de um método para medir a atividade de ADCC

[00322] Uma fração de células mononucleares coletadas de sangue periférico humano foi usada para as células efetoras derivadas de um ser humano. De um voluntário saudável (homem adulto), 50 mL de sangue periférico foram coletados usando uma seringa pré-carregada com 200 ul de uma solução de heparina a 1000 unit/ml (Novo- Heparin Injection 5000 units, Novo Nordisk). O sangue periférico foi diluído 1 para 2 com PBS(-), e Ficoll-Paque PLUS foi antecipadamente injetado para realizar centrifugação. Este foi introduzido em um tubo de separação de linfócitos Leucosep (Greiner Bio-one), e centrifugado (a 2150 rpm por dez minutos à temperatura ambiente), seguido por coleta da camada de fração de células mononucleares. As células fo- ram lavadas uma vez com 10% de FBS/D-MEM e suspendidas em 10% de FBS/D-MEM a uma densidade celular de 5 x 10º/mL para pre- parar uma solução de suspensão de células efetoras. A suspensão de células serviu como uma solução de PBMC humanas na experiência subsequente.

[00323] A solução de suspensão de células alvo foi preparada para teste no momento de uso. A linhagem celular de câncer de pâncreas humano MIA PaCa-2 (ATCC) foi mantida por subcultura em meio de Eagle modificado da Dulbecco (Invitrogen) contendo 10% de FBS, 2,5% de soro de cavao, 4 mmol/L de L-glutamina (Invitrogen), 4,5 g/L de glicose (Invitrogen), e 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (Invitrogen) (doravante denominado meio de subcultura). Para o reagente de mar- cação, 228 ul de FBS/D-MEM a 10% foram adicionados a um tubo contendo 12 ul de uma solução de estoque de calceína-AM/DMSO (nacalai) preparada a 4 mg/mL para produzir uma solução de calceína- AM por suspensão suave. A 1 x 10º células da linhagem celular MIA PaCa-2 submetidas à centrifugação (a 1200 rpm por cinco minutos a 4), a solução de calceína-AM preparada da maneira descrita acima foi adicionada a 200 uL por pellet de células de 1 x 10º células para preparar uma suspensão de células. A quantidade total desta solução de suspensão foi transferida para tubo plástico de coleta de sangue (Nihon Pharmaceutical), e este foi incubado em uma incubadora de CO, a 37ºC por duas horas. As células foram lavadas três vezes com 10% de FBS/D-MEM, e a solução de suspensão de células alvo foi preparada suspendendo-se as células lavadas em 10% de FBS/D- MEM para dar 20 x 10º células/mL (1 x 10%/50 UL).

[00324] Paraa solução de suspensão de células alvo, 100 ul do meio foram adicionados a uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, anticorpos monocionais antiepirregulina (H206-G1d/L73-k (SEQ ID NO: 142/141), H240-G1d/L73-k (SEQ ID NO: 150/1411), e EP27 quimérico (SEQ ID NO: 32/33)) foram diluídos em um meio e em seguida adicionados à placa a 50 ul por poço. Os anticorpos foram adicionados a concentrações finais de 0,0001 ug/mL a 10 ug/mL. Em seguida, uma solução de PBMC (1 x 10” células/mL) foi adicionada a 50 uL por poço, a placa foi deixada descansar em uma incubora de 5% de gás CO, a 37 CT por quatro horas, e a taxa de liberação esp ecífica de calceína-AM foi determinada. A placa foi submetida à centrifugação (a 1200 rpm por cinco minutos à temperatura ambiente), e a intensida- de de fluorescência (le, = 490 nm e le = 515 nm) de 100 yuL do sobre- nadante coletado de cada poço da placa foi medida usando um fluorfo- tômetro. A taxa de liberação específica de calceína fois determinada a partir da fórmula abaixo (fórmula 3). [Fórmula 3] Taxa de liberação específica de calceína (%) = (A- C) x 100 /(B-C)

[00325] Arepresenta a intensidade de fluorescência em cada poço; B representa a intensidade de fluorescência média dos poços aos quais foram adicionados 50 yuL de FBS/D-MEM a 10%, 50 uL da solu- ção de suspensão de células alvo, e 100 ul de uma solução de NP-40; e C representa a intensidade de fluorescência média dos poços aos quais foram adicionados 50 ul de FBS/D-MEM a 10%, 50 uL da solu- ção de suspensão de células alvo, e 100 uL de FBS/D-MEM a 10%. O teste foi realizada a N=3, e a taxa de liberação específica de calceina para cada concentração de anticorpo foi determinada usando-se Mi- crosoft Office Excel 2007. Exemplo de Referência 8 Método para medir a atividade neutralizante (1) Estabelecimento de uma linhagem celular Ba/F3 que expressa um receptor quimérico EGFR humano (EGFR BAF)

[00326] Usando métodos tradicionais, um receptor de EGF humano tendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 166 (GenBank Acc. Nº NM 005228) (doravante denominado "hEGFR") foi isolado, e então um vetor que pode expressar um receptor de EGF humano (PpCXZD1/EGFRH3) foi preparado.

[00327] Quinze microgramas do vetor de expressão de hEGFR |i- nearizado (pCXZD1/EGFRH3) obtido por digestão com Pvul foi transfe- rido para células Ba/F3 por eletroporação (Gene Pulser; BioRad) em condições de 0,33 kV e 950 uFD. As células transfectadas foram sele- cionadas em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS, 300 pg/ml de zeocina, e epirregulina humana recombinanet (R&D Systems, Cat: 1195-EP/CF, 200 ng/mL); e a linhagem celular EGFR BAF foi isolada. (2) Atividade dos anticorpos antiepirregulina para neutralizar a prolife- ração celular dependente de epirregulina humana ou de epirregulina de macaco da linhagem celular EGFR BAF

[00328] Experiências para medir a atividade dos anticorpos antiepir- regulina para neutralizar a proliferação celular dependente de epirregu- lina humana ou de epirregulina de macaco foram realizadas usando a linhagem celular EGFR BAF isolada pelo método descrito em (1). As células foram lavadas para remover a epirregulina humana presente no momento da cultura. Em seguida as células foram ressuspendidas em um meio RPMI1640 contendo 10% de FBS assim como hsEREG-

His ou cysEREG-His (concentração final de 2,5 ng/mL), e as células foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 2 x 10º células / 100 ul/poço. Um anticorpo antiepirregulina diluído pelo meio foi adicionado às células a várias concentrações (0,014 ug/mL a pug/mL), e então as células foram cultivadas em uma incubadora a 5% de CO, por três dias a 37 T. Depois da cultura, o reagent e de me- dição do Kit de Contagem de Células (Dojindo) foi adicionado, e o de- senvolvimento de cor foi realizado por duas horas. Então, a absorvên- cia da solução reacional (450/655 nm) foi medida usando Benchmark Plus (Bio-Rad). O valor para a concentração de anticorpo de O ug/mL foi usado como o valor de controle para calcular a taxa de supressão de crescimento celular (valor OD em cada concentração de anticorpo/ valor OD do controle x 100 (%)). Exemplo de Referência 9 Medição da quantidade de agregado por cromatografia de filtração em gel

[00329] Usando G3000SWx (tamanho de partícula de 5 um, 7,8 mm 1.D. x 30 cm, produzido por TOSOH) para a coluna e usando 50 mM de tampão fosfato de sódio (pbH7,0) contendo 300 mM de NaCl como a fase móvel, a quantidade de agregados foi medida por croma- tografia de filtração em gel. Uma coluna conectada a um sistgema Alli- ance (fabricado por Waters) foi equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, e em seguida 5-10 ug de solução de anticorpo foram injetados na coluna. Eluição do anticorpo foi detectada usando-se um detector de absorção de ultravioleta (215 ou 280 nm). A partir do cromatograma obtido, a proporção da área de pico de agregados na área de pico total foi calculada. Exemplo de Referência 10 Medição da temperatura do ponto central de desnaturação térmica (Tm) por um calorímetro diferencial de varre- dura

[00330] Um tampão acetato de sódio a 20 mmol/L (pH 6,0) conten-

do 150 mmol/L de cloreto de sódio foi preparada como a solução ex- terna para diálise, e a diálise foi realizada por um dia inteiro impreg- nando-se nesta solução externa uma membrana de diálise contendo uma solução de anticorpo de uma quantidade equivalente de 50 a 100 ug de anticorpo. Uma solução de anticorpo preparada a uma concen- tração de anticorpo de 50 ug/mL a 100 ug/mL usando a solução exter- na para diálise foi usada como a solução de amostra para as medições do valor de Tm.

[00331] Um equipamento de DSC adequado, por exemplo, DSC-II (fabricado por Calorimetry Sciences Corporation) ou MicroCal VP-DSC (fabricado por GE healthcare) pode ser usado para esta experiência. Uma solução de amostra suficientemente desgaseificada e uma solu- ção de referência (solução externa para diálise) foram individualmente introduzidas nas células do calorímetro, e submetidas a equilíbrio tér- mico suficiente a 40ºC. Em seguida, um explorador de DSC foi opera- do de 40€C a 100€C com uma taxa de varredura de apr oximadamente 1K a 2,5 K/Imin. Os resultados desta medição são dados como o topo do pico de desnaturação em função da temperatura. A temperatura do ponto central de desnaturação térmica da amostra foi calculada desig- nando o pico do domínio Fab de acordo com um documento não pa- tentário (Rodolfo e outros, Immunology Letters (1999), p47-52). Exemplo de Referência 11 Medições do pl por focagem isoelétrica

[00332] “Usando Phastsystem Cassette (Amersham Bioscience), um gel Phast-Gel Dry IEF (Amersham Bioscience) foi intumescido por cer- ca de 30 minutos em uma solução intumescente tendo a composição descrita abaixo. Tabela 22

| glicerol a 20% 10.95 mL | | água Milli-Q | 0.95 mL | | Bio-Lyte 7/9 (BioRad). | 10nL | | Bio-Lyte 3/10 (BioRad) ORE | Pharmalyte 8 - 10,5 para IEF (Amersham Bioscience) 80nL

[00333] O gelintumescido foi usado para efetuar eletroforese usan- do o PhastSystem (Amersham Bioscience) controlado pelo programa descrito abaixo. A amostra foi adicionada ao gel na etapa 2. Um kit de calibração para pl (Amersham Bioscience) foi usado para os marcado- res de pl. Tabela 23 | ETAPA | CONDIÇÃO | | ETAPA 1 | 2000 V, 2.5mA, 3.5W, 15C€, 75 Vh | ETAPA 2 | 200 V, 2.5 mA, 3.5W, 15C, 15 Vh ETAPA 3 | 2000 V, 2.5mA, 3.5 W, 15C, 410 Vh |

[00334] Depois da eletroforese, o gel foi fixado com 20% de TCA e coloração com prata foi então realizada usando o Kit de Coloração com Prata, Proteína (Amersham Bioscience) de acordo com as instru- ções fornecidas junto com kit. Depois da coloração, o ponto isoelétrico da amostra foi calculado com base nos pontos isoelétricos conhecidos dos marcadores de pl. Exemplo de Referência 12 Construção de uma cepa expressando an- ticorpos afucosil

[00335] Em uma célula na qual a expressão de ambos os genes transportadore de fucose em cromossomas homólogos é inibida artifi- cialmente, a função transportadora de fucose é inibida. Usando-se es- tá célula, é possível obter um anticorpo deficiente em fucose (WO2006/067913, entre outros). Além disso, anticorpos deficientes em fucose também podem ser obtidos quando anticorpos são produzidos em células com expressão forçada de beta 1,4-N- acetilglucosaminiltransferase Ill e alfa-manosidase |l de Golgi (Ferrara e outros, Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861). Anticorpos para

EREG afucosilados preparados por essas técnicas que são conheci- das pelos versados na técnica foram usados para a investigação.

[00336] Exemplo de Referência 13 Avaliação do risco de imunoge- nicidade usando a ferramenta de predição de imunogencidade in silico, Epibase

[00337] A utilidade clínica e a eficácia de fármacos à base de anti- corpo são limitadas por anticorpos antidrogas (ADAs). Os ADAs afe- tam a eficácia medicamentosa e a cinética de fármacos à base de an- ticorpo e às vezes causam sérios efeitos colaterais. Muitos fatores que influenciam a imunogenicidade já foram reportados, e em particular acredita-se que seja importante que epítopos de células T estejam contidos nos antígenos. Ferramentas in silico disponíveis para predi- ção de tais epítopos de células T incluem Epibase (Lonza), iTo- pe/TCED (Antitope), e EpiMatrix (EpiVax). Já foi relatado que sequên- cias contendo epítopos de células T presentes nas proteínas de inte- resse poderiam ser preditas pelo uso das ferramentas descritas acima (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18).

[00338] Epibase Light (Lonza) é uma ferramenta in silico para calcu- lar a capacidade de ligação entre o peptídio 9-mer e o alelo DRB1 principal usando o algoritmo FASTER (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18). Esta ferramenta permite a identificação de epítopos de células T que se ligam fortemente ou moderadamente à MHC clas- sell.

[00339] “Um escore de imunogenicidade in silico pode ser determi- nado para cada anticorpo modificado de acordo com a fórmula a se- guir (Fórmula 4) no sistema de Epibase Light (Lonza). [Fórmula 4] Escore de imunogenicidade = Soma (frequência da população de cada alótipo de DRB1 X número de epítopos críticos)

[00340] O cálculo reflete a relação de abundância de alótipos de

DRB1. Para tanto, é possível usar a seguinte relação de abundância em caucasiano.

[00341] DRB1*1501(24,5%), DRB1*0301(23,7%), DRB1*0701(23,3%), DRB1*0101(15,0%), DRB1*1101(11,6%), DRB1*1302(8,2%), DRB1*1401/1454(4,9%), DRB1*0901(2,3%), DRB1*1502(0,5%), DRB1*1202(0,1%)

[00342] “Todos os epítopos contidos em cada sequência de anticor- po modificada que exibem ligação forte ou moderada são identificados pelo algoritmo FASTER, e então epítopos depois da exclusão de se- quências de linhagens germinativas humanas de sequências de jun- ção entre a região variável e a região constante são usados como epí- topos críticos no cálculo do escore de imunogenicidade. Quando o es- core é mais baixo, significa que uma sequência apresenta menor risco de imunogenicidade. Exemplo de Referência 14 Testes de eficácia medicamentosa em anti- corpos antiepirregulina usando modelos in vivo (1) Conservação das linhagens celulares usadas para transplante em modelos in vivo

[00343] Células MIAPaCa-2(ATCC)e DLD-1 (ATCC) foram usadas para os modelos in vivo. As células MIA PaCa-2 foram conservadas por subcultura em meio de Eagle modificado da Dulbecco (Invitrogen) contendo 10% de FBS, 2,5% de soro de cavalo, 4 mmol/L de L- glutamina (Invitrogen), 4,5 g/L de glicose (Invitrogen), e 1,5 g/L de bi- carbonato de sódio (Invitrogen) (doravante denominado meio de sub- cultura). As células DLD-1 foram conservadas por subcultura em um meio RPMII640 (SIGMA) contendo 10% de FBS, 10 mmol/L de HEPES (Invitrogen), 4,5 g/L de glicose (Invitrogen), 1 mmol/L de pi- ruvato de sódio (Invitrogen) (doravante denominado meio de subcultu- ra). (2) Produção de modelos de camundongo transplantados com células

MIA PaCa-2 e DLD-1

[00344] “Usando uma solução contendo um meio de subcultura e a Matriz MATRIGEL (BD Bioscience) a uma relação de 1:1, suspensões de células MIA PaCa-2 e DLD-1 foram preparadas a 5 x 10” célu- las/mL. 100 ul da suspensão de células (5 x 10º células/camundongo) foram transplantados por via subcutânea na região abdominal de ca- mundongos SCID (fêmeas, 5 semanas de idade, CLEA Japan, Inc.). O volume tumoral foi calculado usando-se a fórmula 5, e quando o volu- me tumoral médio atingiu 130-330 mm?, foi determinado o modelo de camundongo a ser usado. [Fórmula 5] Volume tumoral = diâmetro maior x diâmetro menor x diâmetro menos / 2 (3) Preparação de amostras de administração contendo cada anticorpo de teste

[00345] Amostras de administração contendo, cada uma, o anticor- po cH-G1/cL-k, o anticorpo H206-G1d/L7-3k, ou o anticorpo H240- G1d/L73-k a 0,04 mg/mL (grupo de administração de 0,4 mg/kg) ou 0,2 mg/mL (grupo de administração de 2 mg/kg) foram preparadas com solução salina fisiológica no dia da administração. (4) Administração das amostras de administração contendo anticorpo

[00346] As amostras de administração preparadas em (3) foram administradas através da veia caudal aos modelos de camundongo preparados em (2) uma vez por semana por 14 dias a partir do 14º dia após o transplante de células MIA PaCa-2, e uma vez por semana por 14 dias a partir do 12º dia após o transplante de células DLD. Como um controle negativo, solução salina fisiológica foi igualmente adminis- trada a uma de dose de 10 mL/kg através da veia caudal uma vez por semana pelas respectivas durações. Todos os grupos tinham cinco animais em cada grupo, e para cada grupo, a respectiva amostra de administração contendo o composto de teste foi administrada. (5) Avaliação do efeito antitumoral de cada anticorpo de teste

[00347] O efeito antitumoral de cada anticorpo de teste foi avaliado no modelo de camundongo transplantado com células cancerosas humanas. o volume tumoral foi medido no 3º dia ou no 7º dia após o último dia de administração da amostra.

Claims (49)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo antiepirregulina, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo que se liga a um epitopo ligado por um anticorpo antiepirregulina compreendendo CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID Nº: 12, 13, e 14, em que o anticorpo é tem uma relação do valor de KD para epirregulina de macaco de SEQ ID Nº: 170 (cEREG KD) para o valor de KD para epirregulina humana de SEQ ID NO: 34 (hnEREG KD) (cEREG KD/hEREG KD) menor que a relação de cEREG KD/hEREG KD do anticorpo antiepirregulina compreendendo CDRs da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e CDRs da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 12,13, e 14.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cEREG KD/hEREG KD é menor que 40.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cEREG KD/hEREG KD é menor que 10.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ceEREG KD/hEREG KD é menor que 6.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ceEREG KD/hEREG KD é menor que 4.

6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR?2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153 ,108 ,107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, e 11; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48,47, e 14.

7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, e 115, e uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, e 29.

8. Anticorpo antiepirregulina, caracterizado por ser selecionado dentre qualquer um dos itens abaixo: (1) um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, e 38; (2) um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57,0629;e (3) um anticorpo antiepirregulina compreendendo uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, e 38, e uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57, e 29.

9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por compreender a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26.

10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por compreender a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27.

11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por uma atividade neutralizante.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ter citotoxicidade.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a citotoxicidade é CDC e/ou ADCC.

14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que um inibidor do crescimento ou uma substância citotóxica é ligado ao anticorpo.

15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de baixo peso molecular.

16. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26 compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328, e 332 como indicado pela numeração EU.

17. VWVetori caracterizado por compreender um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma

CDR?2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, e 11.

18. Vetor de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26.

19. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia leve que compreende uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48, 47, e 14.

20. Vetor de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110,e 11; e (2) um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71,

69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48,47,e 14.

22. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, e 100, e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 158, 154, 152, 151, 112, 111, 110, e 11, e um polinucleotídeo codificando a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26; e (2) um polinucleotídeo codificando uma região variável da cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 163, 68, 67, e 12, uma CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 69, e 13, e uma CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 164, 48, 47, e 14, e um polinucleotídeo codificando a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27.

23. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 18 ou 22, que compreende um nucleotídeo mutado codificando uma região constante de cadeia pesada com pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo que consiste nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378,

379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436, e 440 como indicado pela numeração EU em uma região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26.

24. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende os vetores como definidos nas reivindicações 17 e 19, os vetores como definidos nas reivindicações 18 e 20, ou o vetor como definido na reivindicação 21 ou 22.

25. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor como definido na reivindicação 23.

26. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a capacidade de adicionar fucose a uma cadeia de açúcar na célula hospedeira é baixa.

27. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira com uma baixa capacidade de adicionar fucose a uma cadeia de açúcar é uma célula hospedeira deficiente em uma ou mais proteínas funcionais selecionados do grupo que consiste em fucosiltransferase, transportador de fucose, GMD (GDP-manose-4,6-desidratase), FX(GDP-ceto-6-desoximanose-3,5-epimerase, 4-redutase), e GFPP (GDP-BbB-L-fucose pirofosforilase).

28. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que tem capacidade para formar uma estrutura N-acetilglucosamina bissecante em uma cadeia de açúcar.

29. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira tendo capacidade para formar uma estrutura N-acetilglucosamina bissecante em uma cadeia de açúcar é tem atividade de B(1,4)-galactosiltransferase e compreende um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando o domínio de localização de Golgi funcional de um polipeptídio residente em Golgi.

30. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica o domínio de localização de Golgi funcional selecionado do grupo que consiste no domínio de localização de manosidase |l/ no domínio de localizaçção de B(1,2)-N- acetilglucosaminiltransferase |, no domínio de localização de B(1,2)-N- acetilglucosaminiltransferase |l, no domínio de localização de manosidase ||, e no domínio de localização de a1-6 núcleo fucosiltransferase; e um polinucleotídeo codificando um polipeptídio de fusão — compreendendo o domínio catalíico de B(1,4) galactosiltransferase.

31. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NSO, uma célula SP2/0, uma célula YO de mieloma, uma célula P3X63 de mieloma de camundongo, uma célula PER, uma célula PER.C6, uma célula HEK293, e uma célula de hibridoma.

32. Método para a produção de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende a coleta da célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 31, a partir de uma solução de cultura.

33. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido na reivindicação 32.

34. Anticorpo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que um inibidor do crescimento ou uma substância citotóxica é ligado ao anticorpo.

35. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 33 ou 34, como um princípio ativo.

36. Agente terapêutico contra câncer ou agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 33 ou 34, como um princípio ativo.

37. Agente terapêutico contra câncer ou agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de cólon, adenocarcinoma de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de estômago, e câncer renal.

38. Agente terapêutico contra câncer ou agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o câncer de cólon é um câncer de cólon pobremente diferenciado, um câncer de cólon moderadamente diferenciado, ou um câncer de cólon bem diferenciado.

39. Agente terapêutico contra câncer ou agente para suprimir a recorrência ou metástase de câncer de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que um indivíduo que é medicado com o agente terapêutico para câncer é um indivíduo portador de células cancerosas expressando a proteína epirregulina detectada em uma amostra de tecido isolado.

40. Anticorpo antiepirregulina, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO:9, uma CDR?2 de cadeia pesada de SEQ ID NO:160, e uma CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO:158; e uma CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO:163, e uma CDR?2 de cadeia leve de SEQ ID NO:13, e uma CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO:164.

41. Anticorpo antiepirregulina, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada correspondendo à região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 150 e uma região variável de cadeia leve correspondendo à região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 141.

42. Anticorpo de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que compreende a região constante de cadeia pesada de SEQ ID NO: 30.

43. Anticorpo de acordo qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende a região constante de cadeia leve de SEQ ID NO: 27.

44, Anticorpo de acordo qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato de que possui atividade neutralizante.

45. Anticorpo de acordo qualquer uma das reivindicações 40 a 44, caracterizado pelo fato de que possui citotoxicidade.

46. Anticorpo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de a citotoxicidade é CDC e/ou ADCC.

47. Anticorpo de acordo qualquer uma das reivindicações 40 a 46, caracterizado pelo fato de que um inibidor de crescimento ou substância citotóxica é ligada ao anticorpo.

48. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-16 e 40-47, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer.

49. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.