UA125575C2 - Кон'югат, що містить антитіло проти egfr та лікарський засіб - Google Patents

Кон'югат, що містить антитіло проти egfr та лікарський засіб Download PDF

Info

Publication number
UA125575C2
UA125575C2 UAA201610588A UAA201610588A UA125575C2 UA 125575 C2 UA125575 C2 UA 125575C2 UA A201610588 A UAA201610588 A UA A201610588A UA A201610588 A UAA201610588 A UA A201610588A UA 125575 C2 UA125575 C2 UA 125575C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
esek
domain
Prior art date
Application number
UAA201610588A
Other languages
English (en)
Inventor
Едвард Б. Рейллі
Эдвард Б. Рэйлли
Ендрю К. Філліпс
Эндрю К. ФИЛЛИПС
Лоренцо Бенатуїл
Лоренцо БЕНАТУИЛ
Фриц Ґ. Буханан
Фриц Г. Буханан
Джонатан А. М'юлброк
Джонатан А. МЬЮЛБРОК
Чун-Мін Хсієх
Чун-Мин Хсиех
Дженніфер Перес
Дженнифер ПЕРЕС
Original Assignee
Еббві Інк.
Эббви Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52997522&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA125575(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Еббві Інк., Эббви Инк. filed Critical Еббві Інк.
Publication of UA125575C2 publication Critical patent/UA125575C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6847—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a hormone or a hormone-releasing or -inhibiting factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)

Abstract

Винахід стосується кон'югата, що містить антитіло проти епідермального фактора росту (hEGFR) та лікарський засіб (ADC).

Description

СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
За даною заявкою вимагається пріоритет по тимчасовій заявці США Мо 61/968819, поданій 21 березня 2014 року. Зміст вищезгаданої пріоритетної заявки включений в даний опис як посилання в повному обсязі.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Дана заявка містить список послідовностей, який наданий в електронній формі у форматі
А5СІЇ і включений у даний опис як посилання в повному обсязі. Зазначена копія АЗСІЇ, створена 12 березня 2015 року, названа 117813-06202 51 їх і має розмір 110863 байти.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОГО НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Рецептор епідермального фактора росту людини (також відомий як НЕК-1 або ЕгБ-ВІ1 і позначуваний в даному описі як "ЄСЕК") являє собою трансмембранний рецептор масою 170 кДа, кодований протоонкогеном с-егбВ, і він виявляє іманентну тирозинкіназну активність (Модіанеді еї аї., Ве. 9. Сапсег, 73:228-235 (1996); Негбові апа піп, Сапсег, 94:1593-1611 (2002)).
Послідовність ЕСЕК людини представлена в записі бази даних Бму/з5Ргої РОО533. ЕСЕ регулює численні клітинні процеси за допомогою опосередковуваних тирозинкіназою каскадів передачі сигналу, включаючи, але не обмежуючись ними, активацію каскадів передачі сигналу, що контролюють клітинну проліферацію, диференціювання, виживання клітин, апоптоз, ангіогенез, мітогенез і метастазування (Агаїау єї аї., Апп. Опсоіоду, 14:1346-1363 (2003); Твао апа Нетбзі, бідпа!. 4:4-9 (2003); Негрві апа Зпіп, Сапсег, 94:1593-1611 (2002); Моднанеді еї аї.,
Вг. у. Сапсег, 73:228-235 (1996)).
Відомі ліганди ЕСЕК включають ЕСЕ, ТОЕА/ГОБЕ-альфа, амфірегулін, епіген/ЕРОМ,
ВТС/бетацелюлін, епірегулін/ЛЕКЕС і НВЕСЕ/гепаринзв'язувальний ЕСЕ. Зв'язування ліганду за допомогою ЕСЕК запускає гомо- і/або гетеродимеризацію рецептора й аутофосфорилування ключових цитоплазматичних залишків. Фосфорилований ЕСЕ. залучає адапторні білки, такі як
СОКВ2, які у свою чергу активують комплексні нижченаведені каскади передачі сигналу, включаючи щонайменше наступні основні нижченаведені каскади передачі сигналу: КАБ-НАБЕ-
МЕК-ЕВК, РІЗ-кіназа-АКТ, РІ С-гамма-РКС і модулі ЗТАТ. Це аутофосфорилування також індукує наступну активацію і передачу сигналу декількома іншими білками, що зв'язуються з фосфорилованими тирозинами через їх власні фосфотирозинзв'язувальні ЗН2-домени. Ці нижченаведені білки передачі сигналу ініціюють декілька каскадів передачі сигналу, в основному каскади МАРК, АКІ і УМК, що приводить до проліферації клітин. Зв'язування ліганду за допомогою ЕСЕК також може активувати каскад передачі сигналу МЕ-каппа-В. Зв'язування ліганду також прямо фосфорилує інші білки, такі як КО516, активуючи їх сТРазну активність і потенційно сполучаючи передачу сигналу рецептора ЕСЕ з передачею сигналу сполученого з
Сі-білком рецептора. Зв'язування ліганду також фосфорилує МОСТІ і підвищує його взаємодію з
ЗАС і СТММВІ1/бета-катеніном.
Надекспресія ЕСЕК описана для численних злоякісних станів людини, включаючи злоякісні пухлини сечового міхура, головного мозку, голови і шиї, підшлункової залози, легені, молочної залози, яєчника, товстого кишечнику, предміхурової залози і нирки (Аваїау еї аї., Апп. Опсоїіоду, 14:1346-1363 (2003); Нетбз5і апа 5Ніп, Сапсег, 94:1593-1611 (2002); і Модканеаі еї аї., Ву. У.
Сапсег, 73:228-235 (1996)). При багатьох з цих станів надекспресія ЕСЕК корелює або асоційована з поганим прогнозом для пацієнтів (Негбзї апа зЗпіп, Сапсег, 94:1593-1611 (2002); і
Моаканеаі еї аї., Вг. 9). Сапсег, 73:228-235 (1996). ЕСЕК також експресується в клітинах нормальних тканин, зокрема в епітеліальних тканинах шкіри, печінки і шлунково-кишкового тракту, хоча і звичайно на більш низьких рівнях, ніж у злоякісних клітинах (Негб5ї апа опіп,
Сапсег, 94:1593-1611 (2002)).
Значна частина пухлин, що мають ампліфікацію гена ЕСЕК (тобто множину копій гена
ЕСЕК), також коекспресують укорочену версію рецептора (Ул/к5їгапа еї аї. (1998), 9. Меигомігої. 4, 148-158), відому як де2-7 ЕСЕВН, ДЕСЕК, ЕСЕВМІЇ або Д2-7 (ці терміни використовуються в даному описі взаємозамінно) (ОІараде-Оіаора єї аї. (2000), Ві. у. Сапсег, 82, 186-94).
Перебудова, спостережувана в де2-7 ЕСОЕК, приводить до зрілої мРНК, яка знаходиться в рамці зчитування, що позбавлена 801 нуклеотиду, який охоплює екзони 2-7 (М/опа еї аї. (1992), Ргос.
Маї!. Асай. сі. 0.5.А. 89, 2965-9; Матал?лакі єї аї. (1990), Урп. у. Сапсег Нев. 81, 773-9; Маталакі еї аІ. (1988), Мої. СеїІ. Вісі. 8, 1816-20; і Зидаула еї аїІ. (1990), Ргос. Май). Асайд. 5сі. О.5.А. 87, 8602-6). Відповідний білок ЕОЕК має делецію 267 амінокислот, яка містить залишки 6-273 позаклітинного домену і новий залишок гліцину як точку з'єднання злитої конструкції (Зидауга еї аі!., 1990). Ця делеція разом з інсерцією залишку гліцину утворює унікальний з'єднувальний пептид на поверхні контакту, на якій відбулася делеція (Зидаума еї аї., 1990).
ЕСЕРМІЇЇ був описаний при ряді типів пухлин, включаючи гліому, пухлину молочної залози, бо легені, яєчника і предміхурової залози (У/ік5ігапа еї аї. (1997), Сапсег Кевз. 57, 4130-40; ОІараде-
Оіаора єї а!. (2000), Вг. 9. Сапсег. 82, 186-94; Му/іквігапа, єї аї. (1995), Сапсег Ве. 55, 3140-8;
Сагсіа де Раїа?27о єї а). (1993), Сапсег Вевз. 53, 3217-20). Хоча цей укорочений рецептор не зв'язує ліганд, він має низьку конститутивну активність і надає значну перевагу росту клітинам гліоми, вирощуваним як ксенотрансплантати пухлин у мишей пиаде (Мізпікауча еї аї. (1994), Ргос.
Май. Асай. сі. О.5.А. 91, 7727-31), і він здатний трансформувати клітини МІНЗТЗ (Ваїга еї аї. (1995), Сеїї Столи ОійНег. 6, 1251-9) і клітини МСЕ-7. Клітинні механізми, використовувані де2-7
ЕСЕК у клітинах гліоми, не повністю визначені, однак повідомлено, що вони включають зниження апоптозу (Мадапе еї аІ. (1996), Сапсег Ке5. 56, 5079-86) і невелике посилення проліферації (Мадапе еї аї., 1996).
Кон'югати антитіло-лікарський засіб (АБС) являють собою новий клас терапевтичних засобів, що включають антитіло, кон'юговане з цитотоксичним лікарським засобом через хімічний лінкер. Терапевтична ідея АЮС полягає в комбінуванні здатностей антитіла до зв'язування і лікарського засобу, де антитіло використовують для доставки лікарського засобу в пухлину за допомогою зв'язування з поверхневим антигеном мішені.
Таким чином, у даній галузі залишається потреба в антитілах і АОС проти ЕСЕЕ, які можна використовувати для терапевтичних цілей при лікуванні злоякісної пухлини.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У деяких аспектах даний винахід стосується антитіл проти ЕСЕК і кон'югатів антитіло проти
ЕСЕВ-лікарський засіб (АОС), що специфічно зв'язуються з ЕСЕЕМІІ.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіл проти рецептора епідермального фактора росту людини (анти-пПЕСЕК) або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язуються з епітопом в амінокислотній послідовності СОСАОБЗМЕМЕЕРСОСУАКОС (ЗБЕО ІЮ МО 45) або конкурують із другим антитілом проти ПЕСЕК за зв'язування з варіантом І рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕРЕМІ) (ЗЕО ІЮО МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування, де друге антитіло проти ЕСЕК містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у ЗЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:5; зв'язується з ЕСЕК (1-525) (ЗЕО ІЮ МО:47) з константою дисоціації (Ка) приблизно 1х106 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу; і інгібує ріст пухлини в аналізі з
Зо ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (М5СІС) іп мімо з 95 інгібуванням росту пухлини (ТОЇ 95) щонайменше приблизно 5095 відносно Ідс-антитіла людини, що не є специфічним відносно ЕСЕК, де ІдбС-антитіло людини вводять в аналізі з ксенотрансплантатом МЗСЇІ С у тій же дозі і з тією же частотою, що й антитіло проти ПЕСЕРЕ. або його антигензв'язувальну частину.
У визначених варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з ЕСЕК (1-525) (5ЕО ІЮ МО:47) з Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х1079 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
В інших варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з ЕСЕРВ. (1-525) (5ЕО ІЮ МО:47) з Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х107 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
У визначених варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з ЕСЕКМИПІ (ЗЕО ІЮ МО:33) з Ка приблизно 8,2х109 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У наступних варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язується з ЕСЕЕмМІ (ЗЕО ІЮ
МО:33) з Ка від приблизно 8,2х109 М до приблизно 6,3х1079 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У деяких варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язується з ЕСЕЕМ (ЗЕО ІЮО МО:33) з Ка від приблизно 8,2х10739
М до приблизно 2,0х109 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
В інших варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини інгібують ріст пухлини щонайменше приблизно на 6095 в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (МЗС С) іп мімо відносно ІдС-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які інгібують ріст пухлини щонайменше приблизно на 7095 в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (М5СІ С) іп мімо відносно Ідс- антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини інгібують ріст пухлини щонайменше приблизно на 8095 в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (МЗС С) іп мімо 60 відносно Ідо-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК.
У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять домен
СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у 5ЕО ІЮ МО:12, домен СОК2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у ЗЕО ІЮ
МО:11, і домен СОКІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у
ЗБО ІЮ МО:10; і домен СОКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у 5ЕО ІЮ МО:8, домен СОК2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у 5ЕО ІЮ МО:7, і домен СОКІ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у 5ЕО ІО МО:6. В іншому варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:9, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕБО ІЮ МО:5. В інших варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять константну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:41, і/або константну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ХЕО ІЮ МО:43. У наступному варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:15, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО І МО:13. В іншому варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини кон'юговані з ауристатином.
У визначених варіантах здійснення винахід також стосується виділених нуклеїнових кислот, кодуючих антитіла або їх антигензв'язувальні частини, такі як антитіла або їх антигензв'язувальні частини, описані в даному документі.
У визначених варіантах здійснення винахід також стосується антитіл проти ПЕСЕК або їх антигензв'язувальних частин, які містять домен СОКкКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у ЗЕО ІЮ МО:40, домен СОК2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у ЗЕО ІЮ МО:39, і домен СОК'1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у 5ЕО ІЮ МО:38; і домен СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:37, домен СОК2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у ЗЕО ІЮО МО:З6, і домен
СОК'І важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у БЕО ІЮ МО:35.
Зо У визначених варіантах здійснення винахід стосується антитіл проти ПЕСЕК або їх антигензв'язувальних частин, які містять варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 і 78; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з 51, 53, 55, 57, 59,61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 71 і 79.
В інших варіантах здійснення винахід стосується антитіл проти ПЕСЕК або їх антигензв'язувальних частин, які містять набір СОМ важкого ланцюга (СОКІ, СОК2 і СОКЗ), вибраний із групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО:10, 11 і 12; 5ЕО ІЮ МО:16, 17 і 18; 5ЕО І
МО:10, 11 ї 19; 5ЕО ІО МО:20, 11 ї 12; 5ЕО ІЮО МО:21, З і 22; 5ЕО ІЮ МО:16, 17 і 19; 5ЕО ІЮ МО:2,
Зі4; 5ЕО ІЮО МО:10, З і 12; 5ЕО ІЮ МО:80, 11 ї 18; 5ЕО ІО МО:80, З ї 18; 5ЕО ІЮ МО:20, З і 12;
ЗЕО ІЮО МО:80, 11 і 12; ї 5ЕО ІЮ МО:81, 11 і 22; і набір СОМ легкого ланцюга (СОК1, СО? і
СОКЗ), вибраний із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:6, 7 і 8; ЗЕО ІЮО МО:23, 24 і 25; 5ЕО ІО
МО:26, 27 і 28; 5ЕО ІЮ МО:29, 30 і 31; 5ЕО ІЮ МО:6, 7 і 84; 5ЕО ІО МО:82, 83 їі 31; ії 5БЕО І
МО:82, 27 і 85, де антитіла або їх антигензв'язувальні частини не містять ні набір СОМ важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО:2, З і 4, ні набір СОК легкого ланцюга 5ЗЕО ІЮ МО:б, 7 і 8. У деяких варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять константну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:41, і/або константну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО
ІО МО:43.
У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з константного домену Ід людини, константного домену (ДМ людини, константного домену ІДЕ людини і константного домену ІДА людини. У деяких варіантах здійснення константний домен
Ід вибраний із групи, що складається з константного домену ІдДа1, константного домену Ід, константного домену ІдаЗ і константного домену Ідс4. В інших варіантах здійснення антитіло являє собою поліспецифічне антитіло.
В інших варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини містять
Раб, Рар Е(ар)», Ем, зв'язаний дисульфідним зв'язком Ем, 5сЕм, однодоменне антитіло і діантитіло. бо В інших варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні частини кон'юговані з візуалізуючим агентом. У визначених варіантах здійснення винаходу візуалізуючий агент вибраний із групи, що складається з радіоактивної мітки, ферменту, флуоресцентної мітки, люмінесцентної мітки, біолюмінесцентної мітки, магнітної мітки і біотину. В інших варіантах здійснення винаходу радіоактивна мітка являє собою індій. В інших варіантах здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить антитіло або його антигензв'язувальну частину і фармацевтично прийнятний носій.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується кон'югата антитіло-лікарський засіб (АрС), який містить антитіло або його антигензв'язувальну частину, описані в даному документі, кон'юговані щонайменше с одним лікарським засобом. У визначених варіантах здійснення антитіло являє собою антитіло проти рецептора епідермального фактора росту людини (анти-
ПЕСЕК) або його антигензв'язувальну частину, що зв'язується з епітопом в амінокислотній послідовності СЩМАЮЗМЕМЕЕрИМАКС (ЗЕО ІЮО МО:45) або конкурує із другим антитілом проти
ПЕСЕК за зв'язування з варіантом ІІЇ рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕЕМІЇЇ) (ЗЕО
ІЮ МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування, де друге антитіло проти ЕСЕК містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену у
ЗЕО ІО МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:5; зв'язується з ЕСЕК (1-525) (5ЕО ІЮ МО:47) з константою дисоціації (Ка) приблизно 1х105 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу; і інгібує ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (М5СІ С) іп мімо з 95 інгібуванням росту пухлини (ТОЇ 95) щонайменше приблизно 5095 відносно ІдсбС-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК, де Ідб-антитіло людини вводять в аналізі з ксенотрансплантатом МеСІС у тій же дозі і з тією же частотою, що й антитіло проти ПЕСЕК або його антигензв'язувальну частину. В одному варіанті здійснення винаходу щонайменше один лікарський засіб вибраний із групи, що складається з антиапоптотичного засобу, інгібітору мітозу, протипухлинного антибіотика, імуномодулюючого засобу, нуклеїнової кислоти для генної терапії, алкілувального засобу, антиангіогенного засобу, антиметаболіту, боровмісного засобу, хемопротективного засобу, гормонального засобу, антигормонального засобу, кортикостероїду, фотоактивного лікарського засобу, олігонуклеотиду, радіонуклідного засобу, радіосенсибілізатора, інгібітору топоіїзомерази й
Зо інгібітору тирозинкінази. У визначених варіантах здійснення інгібітором мітозу є доластатин, ауристатин, майтанзиноїд і рослинний алкалоїд. У визначених варіантах здійснення лікарський засіб являє собою доластатин, ауристатин, майтанзиноїд і рослинний алкалоїд. Прикладом ауристатину є монометилауристатин Е (ММАЕ) або монометилауристатин Е (ММАЕ). Приклади майтанзиноїдів включають, але не обмежуються ними, ОМ1, ЮОМ2, ЮМ3З ї ОМ4. У визначених варіантах здійснення протипухлинний антибіотик вибраний із групи, що складається з актиноміцину, антрацикліну, каліхеаміцину і дуокарміцину. У визначених варіантах здійснення актиноміцином є піролобензодіазепін (РВО).
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується АЮС, що містить антитіло проти
ЕСЕБЕ, кон'юговане з ауристатином, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:12, домен СОКО, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ І МО:11, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:10; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІЮ МО:7, і домен СОКІ, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕБЕО ІЮ МОс:9, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:5. В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:15, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:13.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується АОС, що містить антитіло проти
ЕСЕРЕ, кон'юговане щонайменше з одним лікарським засобом (включаючи, але не обмежуючись цим, ММАЄЕ), де з антитілом кон'юговані від Її до 8 молекул лікарського засобу. В одному варіанті здійснення з антитілом у АОС кон'юговані від 1 до 4 молекул лікарського засобу. В одному варіанті здійснення з антитілом у АЮС кон'юговані від 2 до 4 молекул лікарського засобу.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується АОС, що містить антитіло проти
ЕСЕРЕ, кон'юговане щонайменше з одним лікарським засобом, де лікарський засіб кон'югований через малеімідокапроїл, валін-цитруліновий лінкер. У наступному варіанті здійснення лікарський бо засіб кон'югований З антитілом через малеїімідокапроїл, валін-цитрулін, п-
амінобензилоксикарбамільний (РАВА) лінкер.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується АЮС, що містить ІдсІ1-антитіло проти ЕСЕК, ковалентно зв'язане з монометилауристатином Е (ММАЄЕ) через лінкер (наприклад, малеімідокапроїл, валін-цитруліновий). У визначених варіантах здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:9, і містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:5. У визначених варіантах здійснення з антитілом зв'язано від 1 до 4 молекул ММАЕ.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується АЮС, що містить ІдсІ1-антитіло проти ЕСЕК, ковалентно зв'язане з малеїмідокапроїлом, валін-цитруліном, п- амінобензилоксикарбаміл-монометилауристатином Е (тс-мс-РАВА-ММАЕ), де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в
ЗЕО ІО МО:с9, і містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:5, і де з антитілом зв'язано від 1 до 4 молекул ММАЕ. У визначених варіантах здійснення антитіло містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:15, і містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:13. У визначених варіантах здійснення з антитілом зв'язано від 2 до 4 молекул ММАБЕ. У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК зв'язане з то-мс-РАВА-ММАЕ, як представлено на фіг. 11.
У деяких варіантах здійснення винахід також стосується спрямованого на ЕСЕК АОС, що містить (дДСс1-антитіло, специфічне до ЕСЕК людини, ММАЕ і лінкер, що ковалентно зв'язує
ММАЕ з антитілом. У визначених варіантах здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ
МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:11, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність «ЕС ІЮ МО:10; і містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність,
Зо зазначену в ЗЕО ІЮ МО:9, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:5. В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіл або їх антигензв'язувальних частин, які містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:15, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:13.
В інших варіантах здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить суміш АЮС, що містить множину АОС, описаних у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. У визначених варіантах здійснення суміш АОС має середнє співвідношення лікарського засобу й антитіла (БАК) від 2 до 4. В інших варіантах здійснення суміш АОС містить
АОС, кожний з яких має БАК від 2 до 8. У визначених варіантах здійснення суміш АОС має середнє співвідношення лікарського засобу й антитіла (БАК) від приблизно 2,4 до приблизно 3,6.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується способів лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, який включає введення фармацевтичної композиції, описаної в даному документі, індивідууму, так щоб здійснювалося лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина вибрана з групи, що складається з раку молочної залози, раку легені, гліобластоми, раку предміхурової залози, раку підшлункової залози, раку товстого кишечнику, раку голови і шиї і раку нирки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина вибрана з групи, що складається з раку молочної залози, раку легені, гліобластоми, раку предміхурової залози, раку підшлункової залози, раку товстого кишечнику, раку ободової і прямої кишки, раку голови і шиї, мезотеліоми, раку нирки, плоскоклітинної карциноми, потрійного негативного раку молочної залози і недрібноклітинного раку легені. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак молочної залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак легені. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак предміхурової залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак підшлункової залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак товстого кишечнику. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак голови і шиї. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак нирки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак ободової і прямої кишки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою мезотеліому. В бо одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою плоскоклітинну карциному. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою потрійний негативний рак молочної залози.
В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою недрібноклітинний рак легені. У визначених варіантах здійснення плоскоклітинна карцинома являє собою плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї.
В іншому варіанті здійснення злоякісна пухлина має ампліфікацію ЕСЕЕ або надекспресує
ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення злоякісна пухлина характеризується наявністю надекспресії ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення злоякісна пухлина характеризується наявністю ампліфікації ЕСЕК.
У деяких варіантах здійснення винахід, крім того, стосується способів інгібування або зниження росту солідної пухлини у індивідуума, що має солідну пухлину, які включають введення фармацевтичної композиції, описаної в даному документі, індивідууму, що має солідну пухлину, так щоб відбувалося інгібування або зниження росту солідної пухлини. У визначених варіантах здійснення солідна пухлина характеризується наявністю надекспресії
ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення солідна пухлина характеризується наявністю ампліфікації ЕСЕРК.
В одному варіанті здійснення винахід стосується способів інгібування або зниження росту солідної пухлини у індивідуума, які включають введення індивідууму, що має солідну пухлину, ефективного кількості антитіла або АОС, описаного в даному документі, так щоб відбувалося інгібування або зниження росту солідної пухлини.
У визначених варіантах здійснення солідна пухлина являє собою експресуючу ЕСЕЕК солідну пухлину або позитивну по ЕСЕКМІІЇ солідну пухлину. В інших варіантах здійснення солідна пухлина являє собою недрібноклітинну карциному легень або гліобластому. В інших варіантах здійснення солідна пухлина являє собою плоскоклітинну карциному.
В одному варіанті здійснення винахід стосується способу лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, який включає введення ефективної кількості АОС, що містить антитіло проти
ЕСЕК або його антигензв'язувальну частину, кон'юговані щонайменше з одним ауристатином, де антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальна частина має Ідс-ізотип; містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОМКЗ, який містить амінокислотну послідовність зазначену в 5ЕБО ІЮ МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну
Ко) послідовність, зазначену в 5ЕБО ІЮ МО:11, і домен СОКІ1, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:10; і містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:8, домен СОМ2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:7, і домен
СОК', який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:6б. У визначених варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язані з тсо-мс-РАВА-
ММАЕ.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується способів лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, які включають введення індивідууму фармацевтичної композиції, описаної в даному документі, у комбінації з додатковим засобом або додатковим способом терапії. У визначених варіантах здійснення додатковий засіб вибраний із групи, що складається з антитіла проти РОЇ (наприклад, пембролізумаб (Кеуїгидаф) або ніволумаб), антитіла проти
СТІ А-4 (наприклад, іпілімумаб), ібрутиніб, дувелісиб, іделалісиб, венетоклакс і темозоломід. У визначених варіантах здійснення додатковою терапією є променева терапія. У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є антитіло проти РО1 (наприклад, пембролізумаб (Кеуїгидаф)) або ніволумаб). У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є антитіло проти СТІ А-4 (наприклад, іпілімумаб). У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є ібрутиніб. У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є дувелісиб. У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є іделалісиб. У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є венетоклакс. У визначених варіантах здійснення додатковим засобом є темозоломід.
У визначених варіантах здійснення винахід також стосується виділених нуклеїнових кислот, кодуючих антитіла або їх антигензв'язувальні частини, таких як нуклеїнові кислоти, описані в даному документі. Крім того, винахід стосується вектора, який містить нуклеїнову кислоту і клітину-хазяїна, наприклад прокаріотичну або еукаріотичну клітину (наприклад, клітину тварини, клітину найпростішого, клітину рослини і клітину гриба), що містить вектор. В одному варіанті здійснення винаходу клітина тварини вибрана з групи, що складається з клітини ссавця, клітини комахи і клітини птаха. В одному варіанті здійснення клітина ссавця вибрана з групи, що складається з клітини СНО, клітини СОЗ і клітини 5рг/0.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується кон'югатів антитіло проти ПЕСЕК- бо лікарський засіб (АОС), що містить антитіло проти ПЕСЕК, кон'юговане з ауристатином, де антитіло містить домен СОКЗ важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність зЕО
ІЮО МО:12, домен СОК2 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:11, і домен СОКІ1 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:10; і домен СОКЗ легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність 5Е0 ІЮ МО:8, домен
СОК2 легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОК!1 легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:6. В одному варіанті здійснення антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:9, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЕС ІЮ МО:5. В іншому варіанті здійснення антитіло містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну ДС. У наступному варіанті здійснення дс являє собою константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну ІЇДСс1 або Ід.
В одному варіанті здійснення винахід стосується АЮС, де ауристатин являє собою монометилауристатин Є (ММА) або монометилауристатин Е (ММАЕ). В одному варіанті здійснення винахід стосується АЮС, де ауристатин являє собою монометилауристатин ЕЕ (ММАР). В одному варіанті здійснення винахід стосується АОС, де ауристатин являє собою монометилауристатин Е (ММАЕ).
У наступному варіанті здійснення винахід включає важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:15, і включає легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:13.
У наступному варіанті здійснення винаходу антитіло проти ЕСЕК ковалентно зв'язане з ауристатином за допомогою лінкера, що містить малеїімідокапроїл, валін-цитрулін, п- амінобензиловий спирт (тс-ус-РАВА).
В одному варіанті здійснення винахід стосується АЮС, що містить антитіло проти ЕОЕК і радіоактивну мітку, наприклад індій.
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, ковалентно зв'язане щонайменше з одним піролобензодіазепіном (РВО). У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, зв'язане з РВО, як описано на фіг. 21 (тобто 5050-1882).
У деяких варіантах здійснення винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять
Зо АС, описаний у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій. У визначених варіантах здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить суміш АОС, що містить
АОС, описаний у даному документі, де середнє співвідношення лікарського засобу й антитіла (ОАК) у суміші АЮС складає від 2 до 4. У визначених варіантах здійснення середнє співвідношення лікарського засобу й антитіла (БАК) у суміші АОС складає від 2,4 до 3,6.
В одному варіанті здійснення винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять суміш АОС, що містить кон'югати антитіло проти ПЕСЕК-лікарський засіб (АОС) і фармацевтично прийнятний носій, де суміш АОС має середнє співвідношення лікарського засобу й антитіла (БАК) від 2 до 4, і де зазначений АОС містить монометилауристатин Е (ММАЕ), кон'югований з антитілом проти ПЕСЕК, що містить домен СОКЗ важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮ МО:12, домен СОК2 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:11, ії домен СОКІ важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО:10; і домен СОКЗ легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:8, домен СОК2 легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОКІ! легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність 560 1Ю МО:6.
В одному варіанті здійснення варіабельна область важкого ланцюга антитіла містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:9, і варіабельна область легкого ланцюга антитіла проти ЕСЕК містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:5.
В інших варіантах здійснення винаходу антитіло містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну да. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, що має константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну 901 або Ідс4. В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла, що має ізотип ІДИ.
В іншому варіанті здійснення винахід стосується антитіл, які містять важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:15, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:13. В одному варіанті здійснення винахід стосується ММАЕ, що кон'югований з антитілом за допомогою лінкера з малеімідокапроїлу, ма1- сії, РАВА.
В одному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину, які включають введення фармацевтичної композиції, що містить антитіло або 60 АС, описані в даному документі, індивідууму, так щоб відбувалося лікування індивідуума, що має злоякісну пухлину. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина вибрана з групи, що складається з раку молочної залози, раку легені, гліобластоми, раку предміхурової залози, раку підшлункової залози, раку товстого кишечнику, раку голови і шиї і раку нирки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина вибрана з групи, що складається з раку молочної залози, раку легені, гліобластоми, раку предміхурової залози, раку підшлункової залози, раку товстого кишечнику, раку ободової і прямої кишки, раку голови і шиї, мезотеліоми, раку нирки, плоскоклітинної карциноми, потрійного негативного раку молочної залози і недрібноклітинного раку легені. В іншому варіанті здійснення злоякісна пухлина має ампліфікацію ЕСЕК або надекспресує ЕСЕК. В одному варіанті здійснення плоскоклітинна карцинома являє собою плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою злоякісну пухлину, надекспресуючу ЕСЕК. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина характеризується наявністю ампліфікації ЕСЕК. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак молочної залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак легені. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак предміхурової залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак підшлункової залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак товстого кишечнику. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак голови і шиї. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак нирки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою рак ободової і прямої кишки. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою мезотеліому. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою плоскоклітинну карциному. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою потрійний негативний рак молочної залози. В одному варіанті здійснення злоякісна пухлина являє собою недрібноклітинний рак легені. У визначених варіантах здійснення плоскоклітинна карцинома являє собою плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї.
Крім того, у визначених варіантах здійснення винахід стосується способу інгібування або зниження росту солідної пухлини у індивідуума, що має солідну пухлину, причому зазначений спосіб включає введення фармацевтичної композиції, описаної в даному документі, індивідууму, що має солідну пухлину, так щоб відбувалося інгібування або зниження росту
Зо солідної пухлини. В одному варіанті здійснення солідна пухлина являє собою недрібноклітинну карциному легень або гліобластому. В іншому варіанті здійснення солідна пухлина являє собою позитивну по ЕСЕКмМІІ пухлину або експресуючу ЕСЕК солідну пухлину. В іншому варіанті здійснення солідна пухлина являє собою солідну пухлину, надекспресуючу ЕСЕК. В іншому варіанті здійснення солідна пухлина являє собою пухлину з ампліфікованим ЕСЕК. В одному варіанті здійснення солідна пухлина являє собою недрібноклітинну карциному легень, що має ампліфікований ЕСЕ. В одному варіанті здійснення солідна пухлина являє собою недрібноклітинну карциному легень, що має надекспресію ЕСЕК. В одному варіанті здійснення солідна пухлина являє собою гліобластому, що має ампліфікований ЕСЕК. В одному варіанті здійснення солідна пухлина являє собою гліобластому, що має надекспресію ЕСЕК.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується комбінованої терапії, у якій фармацевтичні композиції, описані в даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього (наприклад, індивідууму, що має злоякісну пухлину або солідну пухлину). Фармацевтичні композиції, описані в даному документі, можна вводити одночасно, до або після введення додаткового засобу або проведення додаткової терапії. У визначених варіантах здійснення додатковий засіб вибраний із групи, що складається з антитіла проти РОЇ, антитіла проти СТІ А- 4, темозоломіду, інгібітору Бсеі-хі і інгібітору нікотинамідфосфорибозилтрансферази (МАМРТ). В інших варіантах здійснення додатковий засіб являє собою хіміотерапевтичний засіб. У визначених варіантах здійснення додаткова терапія являє собою променеву терапію. В інших варіантах здійснення додатковий засіб являє собою ібрутиніб (ІтьгимісафФ, Рпагтасусіїс5). В
БО інших варіантах здійснення додатковий засіб являє собою дувелісиб. В інших варіантах здійснення додатковий засіб являє собою іделалісиб (7уаеїїдФт, сйеай Зсіепсев, Іпс.). В інших варіантах здійснення додатковий засіб являє собою венетоклакс (АВТ-199/2500-0199, АрБрМіє,
Іпс.). У визначених варіантах здійснення додатковий засіб являє собою антитіло проти РО1 (наприклад, пембролізумаб (КеуїгидаФ) або ніволумаб). У визначених варіантах здійснення додатковий засіб являє собою антитіло проти СТІ А-4 (наприклад, іпілімумаб). У визначених варіантах здійснення додатковий засіб являє собою темозоломід.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується химерного рецептора антигену (САК), що містить антигензв'язувальні області, наприклад СОЕ, з антитіл, описаних у даному документі, або 5сЕм, описаного в даному документі. У визначених варіантах здійснення винахід бо стосується САК, який містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ,
який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:40, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:39, і домен СОК1, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:38; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕ
ІО МО:37, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:З6, і домен СОКТ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:35.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується САК, який містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в
ЗЕО ІО МО:11, ії домен СОКТІ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ
МО:10; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОМЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО 10 МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕБО ІЮ МО:7, і домен СОКІ1, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:6.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На фіг. 1 представлені амінокислотні послідовності варіабельної області важкого ланцюга (МН) і варіабельної області легкого ланцюга (МІ) АБІ1 (ЗЕО ІЮО МО: і 5) ії АБА (З5ЕО І МО:9 і 5).
Послідовності СОРЕ. в областях МН і МІ. поміщені в рамку і відмінності між послідовністю МН АБ! і послідовністю МН АБА затемнені.
На фіг. 2 представлені повнорозмірні легкі і важкі ланцюги для АБІ1 (5ЕО ІЮ МО:13 і 14) і АБА (ЗЕО ІО МО:13 і 15). Відмінності між послідовністю АБІ1 і послідовністю АБА у важкому ланцюзі виділені кольором.
На фіг. З представлена таблиця, у якій узагальнено показані результати вимірювання афінності з використанням аналізу зв'язування для множини варіантів антитіла АБІ1 у порівнянні з АБІ і АБ2. В аналізі зв'язування використовували ЕСЕ (1-525) і ЕСЕРМІ. Ка (М.С), як представлено на фіг. 3, стосується константи швидкості асоціації антитіла з антигеном для формування комплексу антитіло/антиген, Ка (с") стосується константи швидкості дисоціації для дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген і Ка (М) стосується рівноважної константи дисоціації.
Зо На фіг. 4 представлене графічне узагальнення ГАСзЗ-аналізу, яке демонструє, що АБА мало поліпшене зв'язування з пухлинними клітинами А431 (клітини плоскоклітинної карциноми людини) відносно АБ, однак більш низьку афінність зв'язування в порівнянні з Аб2.
На фіг. 5 представлені результати конкурентного аналізу ЕАС5, які показують, що варіанти антитіл АБІ1 розпізнають той же епітоп ЕСЕК, що і АБ1.
На фіг. 6 представлене узагальнення зв'язування АБ! і варіантів антитіла АБ1І з ЕСЕК (1- 525). Зафарбовані кола відповідають АБІ або АбБ2 (контролі) і незафарбовані кола відповідають варіантам антитіла АБІ1. Колами показані група 1 і група 2, узагальнюючи дані, представлені на фіг. 7.
На фіг. 7 представлені результати аналізу з використанням вестерн-блотингу, у якому проводилося дослідження активності АБІ і варіантів антитіла АБ1 відносно різних клітинних ліній іп міго. Клітини З5СС-15 (фіг. 7А) і клітини Н292 піддавали впливу умов, як описано в прикладі 4, і аналізували з використанням вестерн-блотингу з використанням антитіл проти фосфотирозин-ЕСЕВ (ру ЕСЕ), проти ЕСЕК (Її ЕСЕК (тотальний ЕСЕК)) і проти актину (актин). На фіг. 7А представлені результати, що демонструють здатність АБІ1, АБ2 і варіантів антитіла АБІ1 інгібувати опосередковуване ЕСЕ фосфорилування тирозину ЕСЕК у клітинах
З0О-15. На фіг. 7В представлені результати, що демонструють здатність АБІ, АБ2 і варіантів антитіла АБІ інгібувати опосередковуване ЕСЕ фосфорилування тирозину ЕСЕК у клітинах
Ннаг92.
На фіг. 8 графічно представлені результати аналізу ЕГІЗА рЕСЕК, що включає АБІ, АбБ2 і варіанти АБІ (фіг. 8А), і рівень інгібування АБІ1 у порівнянні з АбБа2 їі АБР (фіг. 88) у дослідженні інгібування А431. На осі М фіг. ВА представлена оптична густина (00) при 450 нм.
На фіг.9 графічно представлене зв'язування АБІ, Ар2 і варіантів антитіла АБІ з нормальними епідермальними кератиноцитами людини, експресуючими ЕСЕК дикого типу, з використанням аналізу зв'язування ЕАС5.
На фіг. 10 графічно представлені результати аналізу інгібування ксенотрансплантата у миші в порівнянні зі здатністю АБА, Аа, АБК, АБМ і АБР інгібувати ріст пухлини ксенотрансплантата карциноми М5СІ С людини в порівнянні з АБІ, АБ2 і контролем у вигляді ЇДСї людини (пиїЇдс).
Стрілкою зазначений час введення різних антитіл.
На фіг. 11 представлена структура АОС о АБА-малеімідокапроїл-мс-РБРАВА-ММАЕ бо (позначається в даному описі "АБА-у"сСММАЕ").
На фіг.12 представлені результати аналізу очищення АБА-хссММАЕ з використанням хроматографії гідрофобної взаємодії (НІС).
На фіг. 13 представлені результати аналізу АБА-мсММАЕ з використанням ексклюзійної хроматографії (ЗЕС).
На фіг. 14 графічно представлені результати двох аналізів інгібування ксенотрансплантата у миші з використанням АОС проти ЕСЕК. На фіг. 14А представлені результати аналізу інгібування ксенотрансплантата у миші в порівнянні з інгібуванням росту пухлини в клітинах
МСІ-НІ1703 із ксенотрансплантата карциноми МЗСІС людини, що демонструють посилене інгібування у АБА-МСММАЕ у порівнянні з АБ1 ії АОС Ар1-птоММАРЕ. На фіг. 148 представлені результати аналізу ксенотрансплантата миші, що порівнює інгібування росту пухлини в клітинах
ЕВСТІ із ксенотрансплантата карциноми МЗС С людини, які демонструють посилене інгібування у АБА-мМсММАЕ у порівнянні з АБ1І ії АОС АБ1-птпсММАР. Стрілками зазначений час введення антитіла.
На фіг. 15 графічно представлені результати аналізів інгібування ксенотрансплантата у миші з використанням АОС проти ЕСЕК. На фіг. 15А представлені результати аналізу інгібування ксенотрансплантата у миші, що порівнює інгібування росту пухлини в клітинах МСІ-
Н2г92, що демонструють посилене інгібування за допомогою очищеного АБА-«СММАЕ (АБА-
МОСММАЕр) ії АБА-мсММАЕ у порівнянні з очищеним АБ1-УсСММАЕ (АБІ-«сММАЕр), АБІ1-«сММАЕ, очищеним АВС АБ1-тсММАР (АБІ-тоММАРЕр) і АБ1І-тоММАР (проти трьох контролів). На фіг. 158 представлені результати аналізу інгібування ксенотрансплантата у миші, що порівнює інгібування росту пухлини в клітинах МСІ-Н292, які демонструють посилену активність інгібування АБА-УсСММАЕ у порівнянні з очищеним АБА-«СММАЕ (АБА-«сСММАЕр) ії АБА-у«СММАЕ у порівнянні з очищеним АБІ-мсММАЄ (АБІ-«сММАЕр), АБІ-«сСММАЕ, АБ1-птпоММАЕ ії АБІ1- тоММАРр. Дози молекул на фіг. 15А і В зазначені в дужках, тобто З мг/кг або 6 мг/кг. Стрілками зазначений час введення антитіла або АЮС. Контроль 2 на фіг. 15 відповідає негативному контролю, що являє собою антитіло проти правцевого токсину, що не зв'язується з ЕСЕ.
На фіг. 16 представлені амінокислотні послідовності конструкції бібліотеки варіантів варіабельної області важкого ланцюга (МН) АБІ1 (фіг. 16А) і конструкції бібліотеки варіантів варіабельної області легкого ланцюга (МІ) АБ (фіг. 168).
Зо На фіг. 17 представлена схема ЕСЕК і областей, що зв'язуються АБ і АБ2.
На фіг. 18 графічно представлені результати аналізів інгібування ксенотранплантата у миші (з використанням клітин МСІ-Н2г92 (МЗС С)) з використанням АОС проти ЕСЕК. Дози молекул зазначені в дужках, тобто З мг/кг або 6 мг/кг. Стрілками зазначений час введення антитіла або
Ар.
На фіг.19 графічно представлені результати аналізу інгібування ксенотрансплантата гліобластоми у миші з використанням АОС з ММАЕ і ММАЕ проти ЕСЕК. Дози молекул на фіг. 19 зазначені в дужках, тобто 1 мг/кг. Стрілками зазначений час введення антитіла або АОС.
Контроль 2 на фіг. 19 відповідає негативному контролю, який являє собою антитіло проти правцевого токсину, що не зв'язується з ЕСЕК.
На фіг. 20А і В графічно представлені результати візуалізуючого аналізу з використанням однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (5РЕСТ), що порівнює ефективність захоплення антитіла пухлинами, експресуючими ЕСЕК, у двох моделях пухлини (моделі пухлини ЗМУ48 (фіг. 20А) і ЕВС1 (фіг. 208), відповідно) з використанням АБА, АБІ або контрольного антитіла, міченого "п.
На фіг. 21 представлена структура димеру РВО (5050-1882), кон'югованого з антитілом (АБ) через малеїімідокапроїл-валін-аланіновий лінкер (що у сукупності називається 5050-1910).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Різні аспекти винаходу стосуються антитіл проти ЕСЕК і фрагментів антитіл, АОС проти
ЕСЕРК і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїнів для одержання таких антитіл і фрагментів. Також винахід охоплює способи застосування антитіл і АОС, описаних у даному документі, для виявлення ЕСЕК людини, для інгібування активності ЕСЕК людини (іп міїго або іп мімо) і для лікування злоякісних пухлин, таких як епітеліальні злоякісні пухлини, рак молочної залози, рак ободової і прямої кишки, рак голови і шиї (наприклад, гліобластоми), рак легені, рак нирки, рак підшлункової залози, мезотеліома, плоскоклітинна карцинома (наприклад, плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї), потрійний негативний рак молочної залози, недрібноклітинний рак легені і рак предміхурової залози.
І. Визначення
Щоб винахід став більш зрозумілим, спочатку визначені певні терміни. Крім того, слід 60 зазначити, що, коли наведено величину або діапазон величин параметра, мається на увазі, що величини і діапазони, що є проміжними для зазначених величин, також є частиною даного винаходу.
Терміни "антитіло проти рецептора епідермального фактора росту (ЕСРЕ)" або "антитіло проти ЕСЕК", використовувані в даному описі взаємозамінно, стосуються антитіла, що специфічно зв'язується з ЕСЕК. Антитіло, "яке зв'язує" антиген, що представляє інтерес, тобто
ЕСЕК, являє собою антитіло, здатне зв'язувати цей антиген з достатньою афінністю, щоб антитіло було придатним для націлювання на клітину, експресуючу антиген. У переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з ЕСЕК людини (ПЕСЕК). Приклади антитіл проти ЕСЕК описані в прикладі 1 нижче. Якщо немає інших указань, термін "антитіло проти
ЕСЕ" стосується антитіла, що зв'язується з ЕСЕК дикого типу або будь-яким варіантом ЕСЕК, таким як ЕСЕЕМІПЇ.
Амінокислотна послідовність ЕСЕК людини дикого типу представлена нижче як 5ЕО ІЮ
МО:32, де сигнальний пептид (амінокислотні залишки 1-24) підкреслений і амінокислотні залишки позаклітинного домену (ЕСО, амінокислотні залишки 25-645) виділені напівжирним шрифтом. Укорочений ЕСО ЕСОЕК дикого типу (також позначуваний у даному описі як ЕСЕК (1- 525)) відповідає ЗЕО ІЮ МО:47 і еквівалентний амінокислотам 1-525 5ЕО ІО МО:32. Зріла форма
ЕСЕК дикого типу відповідає білку без сигнального пептиду, тобто амінокислотним залишкам 25-1210 БЕО ІЮ МО:32. 1 тірздіадаа ПаІааїЇср азгаІеекки саддізпкна ІдНеаніз Ідитіппсехм 61 мІдпіейум дгпуаїстк гдемадумі іаіпічекір Іепідікдп тууепзуаїа 121 мізпудапкі дікеїртиті дейпдауй зппраЇіспме відмжтаїймзз айзптвзтаї 181 дппІдзсакс арзсрпдзсм дадеепсакі (кКіїісаддсз5 десгуКкорза ссппдсаадс 241 їдргезасім сукітаеаєс ках(сррітіу прідудтауп редкузідаї сукКсріпум 301 мандзсуга сдадзуетее адуккскКсе дрсгКуспді дідеїказів іпаспікиік 361 псізізда!н Прмаїгдаз «пірріара еїайкіуке пУнідам реппаїнає 421 епівейгун капуаїзіам узіпії5іді гзікеізада міїздпКкпіс уапкгіпмККіІ 481 гдіздакікі ізпг'депзеКк а(уддусна!с зредсждрер гасузстпуив гдгесуаксп 541 Педергеїу епзесідспр есірдатпії сід"драпсі дсануіддари суикісрадут 601 депийумку ададпуснпіс прпсіудсід рдаІедсріпд рКірзіадт удаШмм
Зо 661 аїідідітти "пімиклїг пІдегеме рірздеарп даїпіКеї еїкКікмідв 721 дагщдімука! міредекукі рмаїКеїгеа І5рКапкеїЇ аеаумтавма примсепіді 781 сіївімаій дітрідсена умгенКапід здуПпжусмд іакдтпуїєй пімпгаІаа 841 "пмімкірдай укпагдіак ІдаєеКеуйп аєддкмрікму таїевіїнгі уїпдзаммву 901 дміммжеїтії д5Круддіра зеїззіїєка епраррісії ідмутітукс мтідаавгрк 961 їеїйеї5К тагардгуім ідддентпПір зрідзпіуга Ітаєведтадм маадеуїїра 1021 дойпезрвів пріїб5іва їІ5пп5імасі агпдідзсрі Кедзіїдгуз заріданеа 1081 зіданірмир єуіпа5урКкг радзудпрмиу ппаріпрарз тарпударнзх їаходпреуїп 1141 марісмпві га5зранутадк д5паїзідпр дудданрке акрпдіїкозв їаєпаєуїЇг 1201 ародззеїіда (5ЕО ІО МО:З32)
Амінокислотна послідовність ЕСО ЕСЕК людини представлена нижче як 5ЕО ІЮ МО:34 і включає сигнальну послідовність (підкреслена). 1 ттрздіадаа ІаІаа!ср азгаієекКм сдаїзпкид Іднеантв Ідптїппсем 61 мідпіейум дітуаївтКк тідемадумі іаІпімегір Іепідікдп тууепзуаїа 121 мізпудапкі діКеїіртті деїпдамиї зппраіспме зідмтаїме5 айвптетаї 181 дппідзсокКе арзсрпд5см дадеепсакі ІКіїсадде5 дгосгок5рза ссппдсаадс 241 їдргезасім сікітаваїйс Каїсррітіу прпудтамп редКувзідаї суККсріпум 301 мандбсуга сдадзуетеє ддмі/кскКсе дрсіКиспаї дідеїкавів іпагпікнтк 361 псівіздан Прмайтдаз пАіррідрад еічікгиКе попІіїдам реппаїнаї 421 епівїгапй Каподівіам м5іпії5іді «5ікеізада міїздпКпіс уапііпмуКккКіІ 481 гдї5оаКкіКкі ізпу'депо5сК аїддмиснаї!с зредсжодрер гасувстпми5 гудгесмаксп 541 Педергеїм епзесідспр есірдатпії сідгарапсі дсапуідори сукісрадут 601 деппіммКку ададнмстіс прписіудетд раіедсріпу рКір5 (ЗЕО ІО МО:34)
Загальна структура ЕСЕК описана на фіг. 17. ЕСО ЕСЕК має чотири домени (Соспгап еї аї. (2004), 9. Іттипої. Меїйоав5, 287, 147-158). Було передбачено, що домени І і Ш надають внесок в утворення високоафінних ділянок зв'язування для лігандів. Домени ІІ і ІМ являють собою багаті цистеїном подібні ламініну області, що стабілізують укладання білка і містять можливу поверхню димеризації ЕСЕВ.
Варіанти ЕСЕК можуть бути результатом перебудови генів, що супроводжується ампліфікацією гена ЕСЕК.
ЕСЕРМІЇ є варіантом ЕСЕК, що найбільш часто зустрічається у злоякісних пухлинах людини (Киап єї а). Епдосг Веїаї Сапсег. 8(2):83-96 (2001)). У процесі ампліфікації генів у позаклітинному домені ЕСЕРК відбувається делеція з 267 амінокислот і залишок гліцину вбудовується в ділянку злиття. Таким чином, ЕСЕКМІЇ позбавлений амінокислот 6-273 позаклітинного домену ЕСЕК дикого типу і включає інсерцію залишку гліцину в ділянці злиття. Варіант ЕСЕЕМІ містить ЕСЕК делецію 267 амінокислотних залишків у позаклітинному домені, де в ділянку делеції вбудований гліцин. Амінокислотна послідовність ЕСЕКмМІ! представлена нижче як 5ЕО ІЮ МО:33 (ЕСО виділений напівжирним шрифтом і відповідає 5ЕО ІО МО:46, сигнальна послідовність підкреслена): тгрзагадаавНаІааІсразгаїееккдпууландзсугасдадазуетеедду"КкскКседрсткуспдідідеїказіві пагпікрикпсізіздаінірматдазннирріардеакекейдй дам репнаїНнагепівікдикапдавзіамуувіпії зідІк«зікеізадауіздаКкпісуапіпи ккидіздак(Ккіїзпгдепзскаддуспаісзредстдрергасузстпизгди есуакспІедергеїмепзесідспресірдатпйсідгдрапсідсануіддарисукісрадитдепп ум куададнм спісприсіудсідрдаІедсріпдрркКкірзіаїдтуданшммаїдідієтитімикиїтіІдегемериїрздєарпааїніКеїетїккікмі дздадічукаміредекукірмаїКеІгеаїзркапКейдеаумтавмапримспідіснв ма йпдітрідсідумгенКапідзду и мсудіакдтпуїєдитмгаіаатміуКірднуУкнагтдіакідавєеКеупаєдоКурікмта!їевії пу пазаумвудхиммеїтна 5кКруадіразеі55іїекдепраррісідмутітуксутідаазгрКігеїїпеї5КтагардгуміддаєптрзріазпіутаІтаєва тадумадаадеуїїрадаї55рзівпріів5іваїзппвімасіагпаоІдзсрікеазїдгуззаріданеазідачруреуіпад5урКтрадь удпруиуппаріпрарзгтарпударнзіахдпреу!Іпіхарісип НазрапутадкознаізідпраудданрКеакКрподіїКдвіаєпа еуїгмаро5зеїїда (5ЕО ІЮ МО:33).
ЕСЕРМІІЇ надає внесок у прогресування пухлини за допомогою конститутивної передачі сигналу незалежним від ліганду чином. Відомо, що ЕСЕКМІЇЇ не експресується в нормальних тканинах (УіК5їгапа еї а. Сапсег Кезеагсі, 55(14):3140-3148 (1995); ОІараде-ОіІаора еї а!. Вг. у.
Сапсег. 82(1):186-94 (2000)), однак демонструє виражену експресію в пухлинних клітинах, включаючи рак молочної залози, гліоми, злоякісні пухлини М5СЇ, рак яєчника і рак предміхурової залози (Уміке5їгапа еї аІ. Сапсег Кезеагсі, 55(14):3140-3148 (1995); Се єї аї. Іпі. У.
Сапсег. 98(3):357-61 (2002); М/іквігапа еї аІ. Сапсег Везєагсіи, 55(14):3140-3148 (1995); МозсаїейПо еї аі. Сапсег Вев5. 55(23):5536-9 (1995); Сагсіа де Раїа?2о еї аі. Сапсег Ве5. 53(14):3217-20 (1993); Мозсаїеїйо єї аі. Сапсег Вез. 55(23):5536-9 (1995); і ОіІараде-Оіаора єї аї. 2(1):186-94
Коо) (2000)). "Біологічна активність ЕСЕК", як використовують у рамках винаходу, стосується біологічних властивостей, характерних для ЕСЕК, включаючи, але не обмежуючись ними, зв'язування з епідермальним фактором росту (ЕСЕ), зв'язування з фактором росту пухлини «а (Тага), гомодимеризацію, активацію активності УАК2-кінази, активацію активності МАР-кінази й активацію тирозинкіназної активності трансмембранного рецепторного білка.
Термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується", як використовують у рамках винаходу відносно взаємодії антитіла або АОС із другою хімічною молекулою, означає, що взаємодія залежить від наявності конкретної структури (наприклад, антигенної детермінанти або епітопа) на хімічній молекулі; наприклад антитіло розпізнає і зв'язує конкретну білкову структуру, а не білки загалом. Якщо антитіло або АОС є специфічними до епітопа "А", наявність молекули, що містить епітоп А (або вільного неміченого А), у реакційній суміші, що містить мічений "А" і антитіло, буде знижувати кількість міченого А, що зв'язався з антитілом або АОС.
Вираз "специфічно зв'язується з ПЕСЕК" або "специфічне зв'язування з ПЕСЕК", як використовують у рамках винаходу, стосується здатності антитіла або АОС проти ЕСЕВ взаємодіяти з ПЕСЕК з афінністю, що дорівнює або перевищує афінність АБ1 або АБ1 АОС.
Термін "специфічно зв'язується з ЕСЕК (1-525)" або "специфічно зв'язується з ЕСЕК (1- 525)", як використовують у рамках винаходу, стосується антитіла або АОС, що зв'язується з
ЕСРА (1-525) і має константу дисоціації (Ко) 2,3х106 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
Термін "антитіло" у широкому розумінні стосується молекули імуноглобуліну (19), що звичайно складається з чотирьох поліпептидних ланцюгів: двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (І) ланцюгів, або будь-якого функціонального фрагмента, мутанта, варіанта або їх похідного, котрі зберігають іманентні ознаки зв'язування мішені молекули Ід. Такі формати мутантів, варіантів або похідних антитіл відомі в даній галузі. Їх необмежувальні варіанти здійснення розглянуті нижче.
У повнорозмірному антитілі кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (скорочено позначувану в даному описі як НСМЕК або МН) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени: СНІ, СН2 ї СНЗ. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (скорочено позначувану в даному 60 описі як СМАК або МІ) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить один домен Сі. Області МН і МІ. далі можуть бути підрозділені на області гіперваріабельності, називані областями, що визначають комплементарність (СОК), розташовані між областями, що є більш консервативними, котрі називаються каркасними областями (ЕК). Кожна МН і МІ. складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від М- кінця до С-кінця в наступному порядку: ЕК, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4. Молекули імуноглобулінів можуть належати до будь-якого типу (наприклад, да, ЧЕ, ІМ, Ід, ІдА і ам), класу (наприклад, да, дае, ІдаЗ, Ід, ІдА1 і ІдА2) або підкласу.
Термін "антигензв'язувальна частина" антитіла (або просто "частина антитіла"), як використовують у рамках винаходу, стосується одного або декількох фрагментів антитіла, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, ПІІ -13). Було показано, що антигензв'язувальну функцію антитіла можуть виконувати один або декілька фрагментів повнорозмірного антитіла. Такі варіанти здійснення антитіл також можуть являти собою біспецифічні, з подвійною специфічністю або поліспецифічні формати, що специфічно зв'язуються з двома або більше різними антигенами. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають (ї) Гар-фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з доменів МІ, МН, СІ і СНІ; (її) Е(аб)2-фрагмент - двовалентний фрагмент, що містить два Баб-фрагменти, зв'язані дисульфідним зв'язком у шарнірній області; (ії) Ба-фрагмент, що складається з доменів МН і СНІ; (їм) Ем-фрагмент, що складається з доменів МІ і МН одного плеча антитіла, (м) ЧАБ-фрагмент (Умага еї аї. (1989),
Маїиге, 341:544-546, Уміпіег еї а!І., публікація РСТ УМО 90/05144 АТ, включена в даний опис як посилання), що містить один варіабельний домен; і (м) окрему область, що визначає комплементарність (СОК). Більше того, хоча два домени Ем-фрагмента, МІ і МН, кодуються окремими генами, їх можна зв'язувати з використанням рекомбінантних способів синтетичним лінкером, який дозволяє одержання їх як єдиного білкового ланцюга, у якому області МІ. і МН утворюють пари, формуючи одновалентні молекули (відомі як одноланцюжкові Ем (зсЕм); див., наприклад, Віга еї аї. (1988), 5сіепсе, 242:423-426; і Низіоп еї аї. (1988), Ргос. Май. Асай. 5бі.
ИБА, 85:5879-5883). Такі одноланцюжкові антитіла також охоплюються терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла. У визначених варіантах здійснення винаходу в злиту молекулу можуть бути включені молекули 5СсЕм. Також охоплюються інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як діантитіла. Діантитіла являють собою двовалентні біспецифічні антитіла, у яких домени УН і МІ. експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, що є занадто коротким, щоб забезпечувати утворення пар між двома доменами на одному ланцюзі, тим самим змушуючи домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга і формувати дві антигензв'язувальні ділянки (див. наприклад, Ноїїдег Р. еї аІ. (1993), Ргос. Май. Асай. сі. ОБА, 90:6444-6448; РоЦак В.у. єї а). (1994), фсійге, 2:1121-1123). Такі зв'язувальні ділянки антитіла відомі в даній галузі (Копіептапп апа Оиреї! едв5., Апіїбоду Епдіпеегіпа (2001), Зргіпдег-Мепад. Мем мМоїк. 790 рр. (ІБВМ 3-540-41354-5)).
Термін "конструкція антитіла", як використовують у рамках винаходу, стосується поліпептиду, що містить одну або декілька антигензв'язувальних частин за винаходом, зв'язаних з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два або більше амінокислотних залишків, зв'язаних пептидними зв'язками, і їх використовують для зв'язування однієї або декількох антигензв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Ноїїїдег Р. еї аї. (1993), Ргос.
Маїй!. Асад. сі. ОБА, 90:6444-6448; Ро|ак В... еї аї. (1994), 5іписіиге, 2:1121-1123). Константний домен імуноглобуліну стосується константного домену важкого або легкого ланцюга.
Ілюстративні амінокислотні послідовності константного домену важкого і легкого ланцюгів Ідс людини відомі в даній галузі і представлені нижче.
Послідовність константного домену важкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга
ІС людини послідовності 00007001 112345678901234567890123456789012...:С:К//.:/АА.Г.:УЬЬЧ:ШУМОУС
Константна ЗЕОІО МО41 |АЗБТКОаРОЗМУЕРІ АРЗЗКЗТЗаИаатАА ас МКЩОМЕРЕРУТУЗ область Ід гамма-1 ММЗаАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О55О01 51 55БУМТУРЗББІ ТО
ТМІСМУМНКРУЬМТКМОККУМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕ С
СРОЗМЕГ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕМКЕМ
М УУрамЕУНМАКТКРАЕЄОММЗТУАУУМІ ТМ НОВУМІ.
МОаКЕМУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРВАВЕРОММТІ РРБ
ВЕЕМТКМОМУБІ ТС УК ЕМРЗОІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТ
ТРРМ'ЮБразЕРІ ЗК ТМОКЗАМОО,СММЕЗОСЗУМНЕАЇГ
НМНУТОКБІ І Рак
Мутант ЗЕОІО МО:42 |АЗБТКОаРБЗМУЕРІ АРЗЗКЗТЗаИаатАА ас МКЩОМЕРЕРУТУЗ константної ММЗаАЇ ТЗаУНТЕРАМІ О55О01 51 55БУМТУРЗББІ ТО області Ід гамма-1 ТМІСМУМНКРУЬМТКМОККУМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕАА саРЗМЕГЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУММОУМЗНЕОРЕМКЕ
МУУУрамЕУНМАКТКРАЕЄєОУМОЗТ УАМБ МІ ТМ НОМУ
ГМаКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКЕИОРВЕРОМУТІ РР
ЗВЕЕМТКМОМУБІ ТОЇ УК ЕМ РЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУК
ТТРРМУИ О5БравзЕРІ КІ ТМОКЗАМОСОаМУЕЗСЗУМНЕА
ЕНМНУТОКБІ БІ ЗРгак
Константна ЗЕОІО МО:43 | ВТМААРЗУМРІЕРРЗОЕОЇ КЗаТАБМУМСІ І ММЕМРАЕАКМО область Ід каппа УМКУДНКСОБОМЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУБІ ЗІ ТІ ЗКАбУ
ЕКНКУМАСЕМУТНОСІ 55РУТКЗЕМАВСЕС
Константна ЗЕОІО МО:44 |ОРКААРБМТІ ЕРРЗБЗЕЕЇ ОАМКАТІ МС ІЗОЕМРИаАМТМА область Ід лямбда МКАОЗЗРУКАСМЕТТТРУКОЗММКУААБЗЗМІ ЗІ ТРЕСОМУК
ЗНАЗУЗСОМТНЕСЗТМЕКТУМАРТЕСЗ
Більше того, антитіло або його антигензв'язувальна частина може бути частиною більш великих молекул імуноадгезії, утворених шляхом ковалентного або нековалентного зв'язування антитіла або частини антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами.
Приклади таких молекул імуноадгезії включають застосування центральної області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули 5сЕм (Кіргіуапом 5.М. еї а. (1995), Нитап
Апіїродіє5 апа Нубгідотав, 6:93-101) і застосування залишку цистеїну, маркерного пептиду і С- кінцевої полігістидинової мітки для одержання двовалентних і біотинільованих молекул 5сЕм (Кірпуапом 5.М. еї аї. (1994), Мої. Іттипої. 31:1047-1058). Частини антитіл, такі як Рар- і Е(аб)»- фрагменти, можна одержувати з цілих антитіл з використанням загальноприйнятих способів, таких як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, цілих антитіл. Більше того, антитіла або частини антитіл і молекули імуноадгезії можна одержувати з використанням стандартних способів рекомбінантних ДНК, як описано в даному документі. "Виділене антитіло", як використовують у рамках даного винаходу, стосується антитіла, яке по суті вільне від інших антитіл, які мають відмінну специфічність зв'язування (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язує ЕСЕК, по суті вільне від антитіл, що специфічно зв'язують антигени, відмінні від ЕСЕК). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язує ЕСЕК, може мати перехресну реактивність до інших антигенів, таких як молекули ЕСЕК з інших видів.
Більше того, виділене антитіло може бути по суті вільне від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин.
Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіл, які містять послідовності варіабельної області важкого і легкого ланцюгів з виду, що не є людиною (наприклад, миша), але в яких щонайменше частина послідовності МН і/або МІ. змінена так, щоб вона була більш "подібною людській", тобто більш подібною з послідовностями варіабельної області людини ембріонального типу. Зокрема, термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіла або його варіанта, похідного, аналога або фрагмента, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном, що представляє інтерес, і які містять каркасну (ЕК) область, яка по суті має амінокислотну послідовність антитіла людини, і область, що визначає комплементарність (СОК), які по суті мають амінокислотну послідовність антитіла, що не є людським. Як використовують у рамках
Зо винаходу, термін "по суті" у контексті СОК стосується СОЖК, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 8095, переважно щонайменше на 8595, щонайменше на 90965, щонайменше на 9595, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичну амінокислотній послідовності СОК антитіла, що не є людським. Гуманізоване антитіло містить по суті усі з щонайменше одного і, як правило, двох варіабельних доменів (Раб, Рар', Е(аб')», габ, Ем), у яких усі або по суті усі з СОК-областей відповідають СОК-областям імуноглобуліну, що не є людським (тобто донорного антитіла), і всі або по суті всі з каркасних областей являють собою каркасні області консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. В одному з варіантів здійснення гуманізоване антитіло також містить щонайменше частину константної області (Ес) імуноглобуліну, як правило константної області імуноглобуліну людини. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить як легкий ланцюг, так і щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Антитіло також може включати СНІ1-область, шарнірну область, СН2-,
СНЗ- ії СН4-області важкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. Переважно гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга і/або гуманізований важкий ланцюг.
Гуманізоване антитіло може бути вибране з будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи
ІаМ, Іди, дО, ІдА і ЧЕ, і будь-якого ізотипу, включаючи, але не обмежуючись ними, да, Ідс2,
Ідс і 424. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більше ніж одного класу або ізотипу і конкретні константні домени можуть бути вибрані так, щоб були оптимізовані бажані ефекторні функції з використанням способів, добре відомих у даній галузі.
Терміни "нумерація по Кара" "визначення по Кара ії "позначення по Кабаї" використовують у даному описі взаємозамінно. Ці терміни, що є відомими в даній галузі, стосуються системи нумерації амінокислотних залишків, що є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних областях важкого і легкого ланцюгів антитіла або його антигензв'язувальної частини (КаБбаї еї а!. (1971), Апп. МУ Асад, 5сі. 190:382-391, і Караї Е.А. еї аї. (1991), 5едиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, БА
Еайіоп, Ш.5. ЮОераптепі ої Неайй апа Нитап Ббегмісе5, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242). Для варіабельної області важкого ланцюга гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні амінокислотних положень з 31 по 35 для СОМКІ1, амінокислотних положень з 50 по 65 для СОК2 і амінокислотних положень з 95 по 102 для СОКЗ. Для варіабельної області легкого ланцюга гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні амінокислотних положень з 24 по 34 для
СОН, амінокислотних положень з 50 по 56 для СОК2 і амінокислотних положень з 89 по 97 для
Коо) СОВ3.
Як використовують у рамках даного винаходу, термін "СОМ" стосується області, що визначає компліментарність, у варіабельних послідовностях антитіла. У кожній з варіабельних областей важкого ланцюга (НС) і легкого ланцюга (ІС) є три СОК, які позначають як СОКІ,
СОР і СОКЗ (або, зокрема, НС СОКІ, НС СОК2, НС СОК3,1С СОК1, 1 С СОКгії с СОКУ), для кожної з варіабельних областей. Термін "набір СОК", як використовують у даному описі, стосується групи з трьох СОЖК, що зустрічаються в одній варіабельної області, здатній зв'язувати антиген. Точні границі цих СОК визначаються по-різному відповідно до різних систем. Система, описана Кабаї (Кабаї еї аЇ., хедиепсев ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві;
Маїіопа! Іпоійшев ої Неакй, Веїйезаа, МО (1987) ї (1991)), не тільки забезпечує однозначну систему нумерації залишків, застосовну до будь-якої варіабельної області антитіла, але також надає точні границі залишків, що визначають три СОК. Ці СОК можуть бути позначені як СО по Кабраї. Споїіа і колеги (Споїпіа еї аї., У. Мої. Віої. 196:901-917 (1987); і Споїпіа єї аї. Майшиге, 342:877-883 (1989)) знайшли, що визначені ділянки в СОК по Караї приймають практично ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на наявність великої різноманітності на рівні амінокислотної послідовності. Ці ділянки були позначені які!1, І2 і 13 або НІ, Н2 і НЗ, де "пі "Н" позначають області легкого ланцюга і важкого ланцюга, відповідно. Ці області можуть бути позначені як СОК по Споїйіа, що мають границі, які перекривають СОК по КарБбаї. Інші границі, що визначають СОК, які перекриваються з СОК по КаБбаї, були описані Радіап (ГАБЕВ
У. 9:133-139 (1995)) ії МасСаїїшт (9. Мої. Віої. 262 (5):732-45 (1996)). Інші визначення границь
СОК можуть не точно відповідати одній із систем, але, проте, вони перекривають СОК по КаБбаї, хоча вони можуть мати більшу або меншу довжину з урахуванням прогнозування або експериментальних даних про те, що конкретні залишки або групи залишків, або навіть цілі СОК не надають значного впливу на зв'язування антигену. У способах, використовуваних у рамках винаходу, можуть бути використані СОК, визначені відповідно до будь-якої з цих систем, хоча в переважних варіантах здійснення використовуються СОК, визначені по Кабаї або Споїпіа.
Як використовують у рамках винаходу, термін "каркасна область" або "послідовність каркасної області" стосується послідовностей варіабельної області без СОК. Оскільки точне визначення послідовності СОК можна проводити за допомогою різних систем, значення каркасної послідовності піддають відповідно різним інтерпретаціям. Шість СОМ (СОК-І 1, СОВ- бо 2 ї СОК-ІЇЗ легкого ланцюга і СОК-НІ, СОВ-Н2 ї СОБК-НЗ важкого ланцюга) також розділяють каркасні області легкого ланцюга і важкого ланцюга на підобласті (ЕК!Т, ЕК2, ЕКЗ і ЕК4) на кожному ланцюзі, у яких СОКІ1 розташована між ЕК! і ЕК2, СОК2 розташована між ЕКаЗ і ЕКЗ і
СОКЗ розташована між ЕКЗ і ЕК4. Без указання конкретних підобластей як ЕК1, ЕК2, ЕКЗ або
ЕКА4, каркасна область, відповідно до інших джерел, являє собою об'єднані ЕК у варіабельній області одного ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається в природі. Як використовують у рамках винаходу, ЕК, зазначена в однині, являє собою одну з чотирьох підобластей, і ЕК, зазначені в множині, являють собою дві або більше з чотирьох підобластей, що складають каркасну область.
Каркасні області і СОР. гуманізованого антитіла не обов'язково повинні точно відповідати вихідним послідовностям, наприклад СОК донорного антитіла або консенсусну каркасну область можна піддавати мутагенезу заміщенням, вставкою і/або делецією щонайменше одного амінокислотного залишку, так щоб залишок СОМК або каркасної області в цій ділянці не відповідав ні донорному антитілу, ні консенсусній каркасній області. У переважному варіанті здійснення такі мутації, однак, не є великими. Як правило, щонайменше 8095, переважно щонайменше 8595, більш переважно щонайменше 9095 і найбільш переважно щонайменше 9595 залишків гуманізованого антитіла будуть відповідати залишкам вихідних послідовностей ЕК і
СОК. Як використовують у рамках винаходу, термін "консенсусна каркасна область" стосується каркасної області в консенсусній послідовності імуноглобуліну. Як використовують у рамках винаходу, термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" стосується послідовності, утвореної амінокислотами, що найбільш часто зустрічаються (або нуклеотидами) у сімействі споріднених послідовностей імуноглобулінів (див., наприклад, М/іппакег, Егот Сепез о Сіопе5 (Мепаодздезеїїзспай, Умеіппеїйт, Сегтапу 1987)). У сімействі імуноглобулінів кожне положення в консенсусній послідовності займає амінокислота, що зустрічається найбільш часто в цьому положенні в сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, кожна з них може бути включена в консенсусну послідовність. "Процентну (95) ідентичність амінокислотних послідовностей" відносно пептидної або поліпептидної послідовності визначають як процент амінокислотних залишків у послідовності- кандидаті що є ідентичними амінокислотним залишкам у конкретній пептидній або поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей і внесення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовностей, причому які- небудь консервативні заміни не вважаються частиною ідентичності послідовностей.
Вирівнювання для цілей визначення процентної ідентичності амінокислотних послідовностей можна проводити різними способами, що входять в обсяг кваліфікації фахівця в даній галузі, наприклад з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення ВІ А5Т, ВІ А5ЗТ-2, АПОМ або Медаїїдп (ОМА5ТАК). Фахівці в даній галузі можуть визначити відповідні параметри для проведення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. В одному варіанті здійснення винахід включає амінокислотну послідовність, що має щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895 або щонайменше 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, зазначеною в будь-якій з 562 ІЮ МО:1-31, 35-40 або 50-85.
Термін "полівалентне антитіло" використовують у даному описі для позначення антитіла, яке містить два або більше антигензв'язувальних центрів. У визначених варіантах здійснення полівалентне антитіло може бути сконструйоване так, щоб воно мало три або більше антигензв'язувальних центрів, і, як правило, воно не є антитілом, що зустрічається в природі.
Термін "мультиспецифічне антитіло" стосується антитіла, здатного зв'язувати два або більше неспоріднених антигенів. В одному варіанті здійснення мультиспецифічне антитіло являє собою біспецифічне антитіло, яке здатне зв'язуватися з двома неспорідненими антигенами, наприклад біспецифічне антитіло або його антигензв'язувальну частину, що зв'язується з ЕСЕК (наприклад, ЕСЕРЕМІЇ) ії СОЗ.
Термін "подвійний варіабельний домен" або "ОМО", як використовують у даному описі, стосується антигензв'язувальних білків, що містять два або більше антигензв'язувальних центрів і являють собою чотиривалентні або полівалентні зв'язувальні білки. Такі ОМО можуть бути моноспецифічними, тобто здатними зв'язувати один антиген, або поліспецифічними, тобто здатними зв'язувати два або більше антигенів. Зв'язувальні білою з ЮМО, що містять два поліпептиди ОМО важкого ланцюга і два поліпептиди ОМО легкого ланцюга, називають ЮОМО-19.
Кожна половина ЮМО-Ід містить поліпептид ЮОМО важкого ланцюга і поліпептид ЮОМО легкого ланцюга і два антигензв'язувальні центри. Кожна ділянка зв'язування містить варіабельний бо домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга, при цьому всього 6 СОК залучено в зв'язування антигену на антигензв'язувальний центр. В одному варіанті здійснення
СОК, описані в даному документі, використовують у ОМО проти ЕСЕК.
Термін "химерний рецептор антигену" або "САК" стосується рекомбінантного білка, який містить щонайменше (1) антигензв'язувальну область, наприклад варіабельну область важкого або легкого ланцюга антитіла, (2) трансмембранний домен для заякорювання САК на Т-клітині, і (3) один або декілька внутрішньоклітинних сигнальних доменів.
Термін "активність" включає такі види активності як специфічність/(афінність зв'язування антитіла або АЮС відносно антигену, наприклад антитіла проти ПЕСЕК, що зв'язується з антигеном ПЕСЕРЕ, і/або нейтралізуюча ефективність антитіла, наприклад антитіла проти
ПЕСРЕРЕ, зв'язування якого з ПЕСЕРЕ інгібує біологічну активність ПЕСЕР, наприклад інгібування фосфорилування ЕСЕК у експресуючій ЕСЕК клітинній лінії, наприклад клітинній лінії карциноми легені людини Н292, або інгібування проліферації експресуючих ЕСЕК клітинних ліній, наприклад клітин карциноми легені людини Н292, клітин карциноми легені людини Н1703 або клітин карциноми легені людини ЕВС1.
Термін "аналіз із ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені (МЗСІ СУ", як використовують у рамках винаходу, стосується аналізу іп мімо, використовуваного для визначення того, чи може антитіло проти ЕСЕК або АОС інгібувати ріст пухлини (наприклад, подальший ріст) або знижувати ріст пухлини в результаті трансплантації клітин МЗС С імунодефіцитній миші. Аналіз із ксенотрансплантатом М5СІ С включає трансплантацію клітин
МЗС С імунодефіцитній миші так, щоб пухлина росла до бажаного розміру, наприклад 200-250 мм, після чого миші вводять антитіло або АОС для визначення того, чи може антитіло або АОС інгібувати і/або знижувати ріст пухлини. У визначених варіантах здійснення активність антитіла або АОС визначають по процентному інгібуванню росту пухлини (95 ТОЇ) відносно контрольного антитіла, наприклад ІдсС-антитіла людини (або їх набору), що не зв'язується специфічно з пухлинними клітинами, наприклад спрямоване на антиген, не асоційований зі злоякісною пухлиною, або одержане з джерела, що є незлоякісним (наприклад, нормальна сироватка людини). У таких варіантах здійснення антитіло (або АОС) і контрольне антитіло вводять миші в дозі з однаковою частотою і тим же шляхом. В одному варіанті здійснення миша, використовувана в аналізі з ксенотрансплантатом, являє собою мишу з важким комбінованим
Зо імунодефіцитом (ЗСІЮВ) і/або безтимусну мишу СО-1 пиде. Приклади клітин МЗСІ С, які можна використовувати в аналізі з ксенотрансплантатом МЗСІ С, включають, але не обмежуються ними, клітини Н292 (наприклад, МСІН2г92 ІН2г921| (АТССО СКІ 1848 М),
Термін "епітоп" стосується області антигену, яка зв'язується антитілом або АОС. У визначених варіантах здійснення епітопні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорил або сульфоніл, і у визначених варіантах здійснення можуть мати визначені тривимірні структурні характеристики і/або визначені зарядові характеристики. У визначених варіантах здійснення антитіло називають специфічно зв'язуючим антиген, коли воно переважно розпізнає його антиген-мішень у комплексній суміші білків і/або макромолекул. У конкретному варіанті здійснення антитіла за винаходом зв'язуються 3 епітопом, визначуваним амінокислотною послідовністю
СОАОБЗУЕМЕБЕОСМУККС (5ЕБО ІО МО:45) (яка відповідає амінокислотним залишкам 287-302 зрілої форми ПЕСЕК).
Термін "поверхневий плазмонний резонанс", як використовують у рамках винаходу, стосується оптичного явища, яке дозволяє аналіз біоспецифічних взаємодій у реальному часі шляхом виявлення змін концентрацій білка на біосенсорній матриці, наприклад, з використанням системи ВіАсоге (Рпагтасіа Віозепзог АВ, Оррзаїа, зугедеп апа Різсаїажау, МУ).
Для подальшого опису див. Убп55оп И. еї аї. (1993), Апп. Віої. Сіїп. 51:19-26; Убп55оп Ш. еї аї. (1991), Віоїесппіднез5 11:620-627; Чдопп55о0п В. евї аї. (1995), У. Мої. Несодпії. 8:125-131; ії дхдоппп5оп
В. еї аї. (1991), АпаїЇ. Віоспет. 198:268-277. В одному варіанті здійснення поверхневий плазмонний резонанс визначають способами, описаними в прикладі 2.
Термін "Коп" або "Ка", як використовують у рамках винаходу, стосується константи швидкості асоціації для асоціації антитіла з антигеном з утворенням комплексу антитіло/антиген.
Термін "Ком або "Ка", як використовують у рамках винаходу, стосується константи швидкості дисоціації для дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген.
Термін "Ко", як використовують у рамках винаходу, стосується рівноважної константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіло-антиген (наприклад, антитіло АБА і ЕСЕК). Ко обчислюють як Ка/Ка.
Термін "конкурентне зв'язування", як використовують у рамках винаходу, стосується ситуації, коли перше антитіло конкурує з другим антитілом за ділянку зв'язування на третій молекулі, наприклад антигені. В одному варіанті здійснення конкурентне зв'язування між двома антитілами визначають з використанням ЕАСсз-аналізу.
Термін "конкурентний аналіз зв'язування" стосується аналізу, використовуваного для визначення того, чи зв'язують два або більше антитіл один і той же епітоп. В одному варіанті здійснення конкурентний аналіз зв'язування являє собою конкурентний аналіз з використанням сортування флуоресцентно активованих клітин (ЕАС5), який використовують для визначення того, чи зв'язують два або більше антитіл один і той же епітоп, шляхом визначення того, чи знижується флуоресцентний сигнал міченого антитіла внаслідок додавання неміченого антитіла, де конкуренція за один і той же епітоп знижує рівень флуоресценції. Приклад конкурентного аналізу зв'язування РАС5 представлений у прикладі 3, де описаний конкурентний аналіз ЕАС5 з використанням клітин О87МО (які експресують ЕСЕЕМІЇ).
Термін "мічене антитіло", як використовують у рамках винаходу, стосується антитіла або його антигензв'язувальної частини з включеною міткою, що забезпечує ідентифікацію зв'язувального білка, наприклад антитіла. Переважно, мітка являє собою маркер, що піддається виявленню, як, наприклад, включення радіоактивно міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільних частин, які можна виявляти міченим авідином (наприклад, стрептавідин, що містить флуоресцентний маркер або має ферментативну активність, яка може бути виявлена оптичними або колориметричними способами). Приклади міток поліпептидів включають, але не обмежуються ними, наступні: радіоізотопи або радіонукліди (наприклад, ЗН, 140, 855, 0, 99То, А, 125, 191), 177 у, 166Но або "535т); флуоресцентні мітки (наприклад, РІТС, родамін, лантаноїдні люмінофори), ферментні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, люцифераза, лужна фосфатаза); хемілюмінесцентні маркери; біотинільні групи; визначені поліпептидні епітопи, розпізнавані вторинним репортером (наприклад, парні послідовності "лейцинових блискавок", ділянки зв'язування для вторинних антитіл, домени, що зв'язують метал, епітопні мітки); і магнітні засоби, такі як хелати гадолінію.
Термін "кон'югат антитіло-лікарський засіб" або "АЮС" стосується зв'язувального білка, такого як антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, хімічно зв'язаного з одним або декількома хімічними засобами, що необов'язково можуть являти собою терапевтичний або цитотоксичний засіб. У переважному варіанті здійснення АОС включає антитіло, цитотоксичний
Зо або терапевтичний засіб і лінкер, який забезпечує зв'язування або кон'югацію лікарського засобу з антитіллом. АЮС, як правило, має від 1 до 8 лікарських засобів, кон'югованих з антитілом, включаючи типи, навантажені лікарськими засобами в кількості 2, 4, 6 або 8.
Необмежувальними прикладами лікарських засобів, які можуть бути включені в АОС за винаходом, є, але не обмежуються ними, інгібітори мітозу, протипухлинні антибіотики, імуномодулюючі засоби, вектори для генної терапії, алкілувальні засоби, антиангіогенні засоби, антиметаболіти, боровмісні засоби, хемопротективні засоби, гормони, антигормональні засоби, кортикостероїди, фотоактивні лікарські засоби, олігонуклеотиди, радіонуклідні засоби, інгібітори топоізомерази, інгібітори тирозинкінази і радіосенсибілізуючі засоби.
Терміни "кон'югат антитіло проти епідермального фактора росту-лікарський засіб", "кон'югат антитіло проти ЕСЕК-лікарський засіб" або "АОС проти ЕСЕК", використовувані в даному описі взаємозамінно, стосуються АОС, що містить антитіло, яке специфічно зв'язується з ЕСЕК, де антитіло кон'юговане з одним або декількома хімічними засобами. В одному варіанті здійснення
АС проти ЕСЕК являє собою антитіло АБА, кон'юговане з ауристатином, наприклад ММАЕ або
ММАР. Амінокислотні послідовності, що відповідають легкому і важкому ланцюгам антитіла
АБА, представлені в 5ЕО ІО МО:13 ії БЕО ІО МО:15, відповідно.
Термін "ауристатин", як використовують у рамках винаходу, стосується сімейства антимітотичних засобів. Також у визначення терміна "ауристатин" входять похідні ауристатину.
Приклади ауристатинів включають, але не обмежуються ними, ауристатин Е (АЕ), монометилауристатин Е (ММАЕ), монометилауристатин ЕЕ (ММА) ї синтетичні аналоги доластатину. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕЕК, описане в даному документі, кон'юговане з ауристатином з утворенням АОС проти ЕСЕК.
Як використовують у рамках винаходу, термін "АБА-МсММАЄЕ" використовують для позначення АОС, що містить антитіло АБА, зв'язане з монометилауристатином Е (ММАЕ) через малеімідокапроїл-валін-цитрулін-п-амінобензилоксикарбаміловий (РАВА) лінкер. АБА--"СММАЕ описаний на фіг. 11.
Як використовують у рамках винаходу, термін "пПсММАЕ" використовують для позначення комбінації лінкер/лікарський засіб, що являє собою малеїімідокапроїл-монометилауристатин ЕЕ (ММАР).
Термін "співвідношення лікарського засобу і антитіла" або "ОАК" стосується кількості бо лікарських засобів, наприклад ауристатину, зв'язаної з антитілом у АОС. БАК АОС може знаходитися в діапазоні від ї до 8, хоча також є можливими більш високі навантаження, наприклад 10, залежно від кількості ділянок приєднання на антитілі. Термін САК можна використовувати відносно кількості лікарських засобів, якими навантажене індивідуальне антитіло, або, альтернативно, його можна використовувати відносно усередненого або середнього ВАК групи АОС.
Термін "небажаний тип АОС", як використовують у рамках винаходу, стосується будь-якого навантаженого лікарським засобом типу, що підлягає відділенню від типів АОС, які мають інше навантаження лікарським засобом. В одному варіанті здійснення термін небажані типи АВС може стосуватися типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, тобто до АОС з рАК 6 або більше, включаючи САКб, САК?7, САКВ і БАК більше 8 (тобто типи з навантаженням лікарським засобом 6, 7, 8 або більше 8). В окремому варіанті здійснення термін небажаний тип
АОС може стосуватися типів з навантаженням лікарським засобом 8 або більше, тобто до АОС з РАК 8 або більше, у тому числі САКВ і САК більше 8 (тобто типи з навантаженням лікарським засобом 8 або більше 8).
Термін "суміш АОС", як використовують у рамках винаходу, стосується композиції, яка містить АОС з гетерогенним розподілом БАК. В одному варіанті здійснення суміш АОС містить
АОС, що мають розподіл БАК від 1 до 8, наприклад 2, 4, 6 і 8 (тобто типи з навантаженням лікарським засобом 2, 4, 6 і 8). Примітно, що продукти деградації можуть приводити до того, що в суміш також можуть бути включені АОС з БАК 1, 3, 5 і 7. Крім того, АОС у суміші також можуть мати БАК більше 8. Суміш АОС є результатом відновлення міжланцюжкового дисульфіду з наступною кон'югацією. В одному варіанті здійснення суміш АОС містить як АОС з БАК 4 або менше (тобто типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше), так і АОС з БАК 6 або більше (тобто типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше).
Термін "злоякісна пухлина" стосується або описує фізіологічний стан у ссавців, що, як правило, характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз або лімфоїдні злоякісні пухлини. Більш конкретні приклади таких злоякісних пухлин включають гліобластому, недрібноклітинний рак легені, рак легені, рак товстого кишечнику, рак ободової і прямої кишки, рак голови і шиї, рак молочної залози (наприклад, потрійний негативний рак
Зо молочної залози), рак підшлункової залози, плоскоклітинні пухлини, плоскоклітинну карциному (наприклад, плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї), рак анального каналу, рак шкіри і рак вульви. В одному варіанті здійснення антитіла або АОС за винаходом вводять пацієнту, що має пухлину(и), яка має ампліфікацію гена ЕСЕК, при цьому пухлина експресує укорочену версію ЕСЕ, ЕСЕКМІІІ. В одному варіанті здійснення антитіла або АОС за винаходом вводять пацієнту, що має солідну пухлину, яка, імовірно, надекспресує ЕСЕК. В одному варіанті здійснення антитіла або АОС за винаходом вводять пацієнту, що має плоскоклітинний недрібноклітинний рак легені (М5СІ С). В одному варіанті здійснення антитіла або АОС за винаходом вводять пацієнту, що має солідні пухлини, у тому числі розгорнуті солідні пухлини.
Термін "експресуюча ЕСЕК пухлина", як використовують у рамках винаходу, стосується пухлини, що експресує білок ЕСЕК. В одному варіанті здійснення експресію ЕСЕК у пухлині визначають з використанням імуногістохімічного забарвлення мембран клітин пухлини, де будь- яке імуногістохімічне забарвлення вище фонового рівня в зразку пухлини вказує на те, що пухлина являє собою експресуючу ЕСЕРЕ. пухлину. Способи виявлення експресії ЕСЕК у пухлині відомі в даній галузі, наприклад, з використанням набору ЕСЕК рпаптОх "м Кії (бако). Навпаки, "ЕСЕВ-негативну пухлину" визначають як пухлину, у якої відсутнє мембранне забарвлення
ЕСЕК вище фонового рівня в зразку пухлини, як визначають імуногістохімічними способами.
Термін "ЕСЕКМмМІП-позитивна пухлина", як використовують у рамках винаходу, стосується пухлини, що експресує білок ЕСЕКМмІІ. В одному варіанті здійснення експресію ЕСЕБмМІИ у пухлині визначають з використанням імуногістохімічного забарвлення мембран пухлинних клітин, де імуногістохімічне забарвлення вище фонового рівня в зразку пухлини вказує на те, що пухлина є експресуючою ЕСЕКмМІИІ пухлиною. Способи виявлення експресії ЕСЕК у пухлині відомі в даній галузі і включають імуногістохімічні аналізи. Навпаки, "ЕСЕКмІПІ-негативну пухлину" визначають як пухлину, у якої відсутнє мембранне забарвлення ЕСЕКМІЇЇ вище фонового рівня в зразку пухлини, як визначають імуногістохімічними способами.
Терміни "надекспресує", "надекспресія" або "надекспресований" взаємозамінно стосуються гена, який транскрибується або транслюється на більш високому рівні, що піддається виявленню, звичайно в злоякісній клітині, у порівнянні з нормальною клітиною. Таким чином, надекспресія стосується як надекспресії білка і РНК (унаслідок посиленої транскрипції, бо посттранскрипційного процесингу, трансляції, посттрансляцйного процесингу, зміненої стабільності і зміненої деградації білка), так і локальної надекспресії внаслідок змінених профілів транспорту білка (збільшена ядерна локалізація) і посиленої функціональної активності, наприклад, як при збільшеному ферментному гідролізі субстрату. Таким чином, надекспресія стосується рівнів або білка, або РНК. Надекспресія також може являти собою надекспресію на 5095, 6095, 7095, 8095, 9095 або більше у порівнянні з нормальною клітиною або порівняльною клітиною. У визначених варіантах здійснення антитіла проти ЕСЕК або АОС за винаходом використовують для лікування солідних пухлин, що, імовірно, надекспресують
ЕСЕВ.
Термін "введення", як використовують у рамках винаходу, стосується доставки речовини (наприклад, антитіла або АОС проти ЕСЕК) для досягнення терапевтичної мети (наприклад, лікування асоційованого з ЕСЕК порушення). Способи введення можуть бути парентеральними, ентеральними і місцевими. Парентеральне введення звичайно здійснюють за допомогою ін'єкції і воно включає, але не обмежується ними, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуглобову, субкапсулярну, субарахноїдальну, внутрішньохребетну і внутрішньогруднинну ін'єкцію і інфузію.
Термін "комбінована терапія", як використовують у рамках винаходу, стосується введення двох або більше терапевтичних речовин, наприклад антитіла або АОС проти ЕСРЕБЕ, і додаткового лікарського засобу. Додатковий лікарський засіб можна вводити одночасно, до або після введення антитіла або АОС проти ЕСЕК.
Як використовують у рамках винаходу, термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості лікарського засобу, наприклад антитіла або АС, яка є достатньою для зниження або пом'якшення тяжкості і/або тривалості порушення, наприклад злоякісної пухлини або одного або декількох її симптомів, запобігання розвитку порушення, забезпечення регресії порушення, попередження рецидиву, розвитку, виникнення або прогресування одного або декількох симптомів, асоційованих з порушенням, виявлення порушення або посилення або поліпшення профілактичного або терапевтичного ефекту(ів) іншої терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу). Ефективна кількість
Зо антитіла або АОС може, наприклад, інгібувати ріст пухлини (наприклад, інгібувати збільшення об'єму пухлини), знижувати ріст пухлини (наприклад, знижувати об'єм пухлини), зменшувати кількість злоякісних клітин і/або пом'якшувати до деякої міри один або декілька симптомів, асоційованих зі злоякісною пухлиною. Ефективна кількість може, наприклад, підвищувати виживаність без захворювання (ОЕ5), підвищувати загальну виживаність (05) або знижувати імовірність рецидиву.
Різні аспекти винаходу описані більш докладно в наступних підрозділах.
ІІ. Антитіла проти ЕСЕК
Один аспект винаходу стосується антитіл проти ЕОЕК або їх антигензв'язувальних частин, що мають поліпшені характеристики, наприклад збільшену афінність зв'язування відносно
ЕСЕБЕ, відносно АБІ і інших антитіл, відомих у даній галузі. Інший аспект винаходу стосується кон'югатів антитіло-лікарський засіб (АОС), що містить антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, і щонайменше один лікарський засіб(оби), такий як, але не обмежуючись цим, ауристатин. Антитіла або АОС за винаходом мають характеристики, що включають, але не обмежені ними, зв'язування з пухлинними клітинами, експресуючими ЕСЕЕМІЇ, зв'язування з
ЕСЕК дикого типу на пухлинних клітинах, експресуючих ЕСЕК, розпізнавання епітопа
СОАОБУЕМЕЕОСОСУВКОС (ЗЕБЕО ІЮ МО:45) на ЕСЕК, зв'язування з ЕСЕК на нормальних епітеліальних кератиноцитах людини і зниження або інгібування росту ксенотрансплантата пухлини в моделі на мишах.
АБІ1 (антитіло 1) являє собою гуманізоване антитіло проти ЕСЕК. Послідовності легкого і
БО важкого ланцюгів АБ1 представлені в 5ЕО ІЮ МО:13 і 5ЕО ІЮ МО:14, відповідно (також див. публікацію патентної заявки США Мо 20120183471, включену в даний опис як посилання).
Варіабельна область легкого ланцюга АБ1 представлена в 5ЕО ІЮ МО:5 і містить амінокислотну послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:6, амінокислотну послідовність СОК2, зазначену в
ЗЕО ІЮ МО:7, і амінокислотну послідовність СОКЗ, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:8. Варіабельна область важкого ланцюга АБ! представлена в 5ЕБО ІЮ МО:1 і містить амінокислотну послідовність СОКІ, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:2, амінокислотну послідовність СОК2, зазначену в
ЗЕО ІЮО МО:3, і амінокислотну послідовність СОКЗ, зазначену в ЗЕО ІЮ МО 4.
Як правило, варіанти антитіл АБІ1 за винаходом зберігають епітопну специфічність вихідного антитіла АБІ1. Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіла проти ЕСЕК за винаходом 60 здатні зв'язувати епітоп у ЕСЕЕ, визначуваний ЗЕО ІО МО 45, і/або здатні конкурувати з АБ1 за зв'язування з ЕСЕК. У різних варіантах здійснення зв'язування можна аналізувати відповідно до протоколу, зазначеного у прикладі З нижче. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіла проти ЕСЕК конкурують з АБІ і мають збільшену афінність зв'язування, наприклад константу дисоціації (Ка) від приблизно 1х10-6 М до приблизно 1х10-79 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу, відносно ЕСЕК (1-525) (ЗЕО ІЮ МО 47).
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіл проти ЕСЕК, що є варіантами АБІ і мають поліпшені характеристики, наприклад поліпшену афінність зв'язування і здатність інгібувати проліферацію пухлинних клітин МЗС С іп мімо, як описано в розділі "Приклади" нижче.
У сукупності, ці нові антитіла називають у даному описі "варіантами антитіла АБІ1". Як правило, варіанти антитіла АБІ зберігають ту ж епітопну специфічність, що їі АБ1. Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіла проти ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з епітопом в амінокислотній послідовності, зазначеній в ЗЕО ІЮ МО:45, і конкурують з антитілом проти ЕСЕК, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в БХЕО ІЮ МО:5, за зв'язування з ЕСЕБМІЇ у конкурентному аналізі зв'язування. На противагу АБІ1, антитіла проти ЕСЕК за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини іп мімо в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легень (МЗС С) людини Н2г92 у мишей пиде і/або зв'язуватися з ЕСЕК дикого типу на нормальних епітеліальних кератиноцитах людини. У різних варіантах здійснення антитіла проти ЕСЕР або їх антигензв'язувальні фрагменти за винаходом здатні модулювати біологічну функцію ЕСЕК. В інших варіантах здійснення зазначених вище аспектів антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує ЕСЕКМІИ!, зв'язує ЕСЕК на клітинах, надекспресуючих ЕСЕБЕ, і розпізнає епітоп СЕАОЗМЕМЕЕРрИМУАКОС (ЗЕО ІЮ МО:45) на ЕСЕЕК. У наступному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальний фрагмент зв'язує ЕСЕРЕМІІ у епітопі, що відрізняється від з'єднувального пептиду ЕСЕЕКМІЇЇ. У додаткових варіантах здійснення вищевказаних аспектів антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальний фрагмент не конкурує з цетуксимабом за зв'язування ЕСЕК. Антитіло АБА і варіанти АБІТ, описані в розділі "Приклади" нижче, мають вищевказані характеристики.
Таким чином винахід стосується антитіл проти ЕОЕК або їх антигензв'язувальних частин,
Зо що можуть конкурувати з АБІ у конкурентному аналізі зв'язування, але є більш ефективними відносно інгібування або зниження росту пухлини. В одному варіанті здійснення антитіла проти
ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні зв'язуватися з епітопом в амінокислотній послідовності СЗАОЗМЕМЕЕОРСУВКОС (5ЕО ІЮ МО':45) і конкурувати з АБІ1 (або антитіло проти ЕСЕК містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІО МО:5) за зв'язування з варіантом ІІЇ рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕЕМІЇ) (ЗЕО ІЮ МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування.
В одному варіанті здійснення антитіла проти ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з ЕСЕ (1-525) (5ЕО ІОЮО МО':47) з константою дисоціації (Ка) приблизно 1х105 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
Альтернативно антитіла або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з ЕСЕ (1-525) (ЗЕО Ір
МО:47) з Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х1079 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У наступній альтернативі антитіла або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з ЕСЕК (1-525) (ЗЕО ІЮО МО:47) з Ка від приблизно 1х106 М до приблизно 1х10-7 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Альтернативно антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з ЕСЕК (1-525) (ЗЕО ІО МО:47) з Ка від приблизно 1х106 М до приблизно 5х1079 М;
Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х10 М; Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 5х109
М; Ка від приблизно 1х105 М до приблизно 1х103 М; Ка від приблизно 1х106 М до приблизно
БО Бх1038 М; Ка від приблизно 5,9х10-77 М до приблизно 1,7х103 М; Ка від приблизно 5,9х107 М до приблизно 2,2х10- М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У визначених варіантах здійснення константа дисоціації (Ка) антитіл і антигензв'язувальних фрагментів за винаходом, в одному варіанті здійснення, є більш низкою, ніж константа дисоціації для АБІ, але більш високою, ніж константа для антитіла проти ЕСЕК цетуксимабу.
Одна з переваг антитіл проти ЕОБК і їх антигензв'язувальних частин за винаходом полягає в тому, що антитіла здатні зв'язуватися з пухлинними клітинами, експресуючими ЕСЕЕМІЇІ. У той час як ЕСЕКМІІІЇ асоційований з визначеними типами злоякісної пухлини, багато які антитіла проти ЕСЕК, відомі в даній галузі, наприклад цетуксимаб, не є ефективними відносно інгібування або зниження росту пухлини в пухлинах, експресуючих ЕСЕКМмІІ. Таким чином, в 60 одному варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з ЕСЕРМІИ! (ЗЕО ІО МО:33) з Ка приблизно 8,2х109 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Альтернативно антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом зв'язуються з ЕСЕЕМІ (ЗЕО ІЮ МО:33) з Ка від приблизно 8,2х109 М до приблизно 6,3х1079 М; Ка від приблизно 8,2х109 М до приблизно 2,0х109 М; Ка від приблизно 2,3х109 М до приблизно 1,5х1079 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
В одному варіанті здійснення антитіла за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини в моделі на мишах із ксенотранспланатом іп мімо. Наприклад, антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати ріст пухлини щонайменше приблизно на 509; в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (МЗС С) іп мімо відносно ІдсС-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (МЗС С) іп мімо відносно ІдсС-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК, щонайменше приблизно на 5595, щонайменше приблизно на 6095, щонайменше приблизно на 659565, щонайменше приблизно на 7095, щонайменше приблизно на 7595 або щонайменше приблизно на 80595, при введенні в тій же дозі і з тією ж періодичністю дозування. У визначених варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені людини (МЗС С) іп мімо відносно Ідс-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК, на від приблизно 8095 до приблизно 9095 або від приблизно 8495 до приблизно 9095, або від приблизно 8895 до приблизно 9095, при введенні в тій же дозі і з тією ж періодичністю дозування.
Термін "аналіз із ксенотрансплантатом", як використовують у рамках винаходу, стосується аналізу з ксентрансплантатом пухлини людини, де пухлинні клітини трансплантують, або під шкіру, або в тип органа, з якого пухлина походить, мишам з імунодефіцитом, у яких відсутнє відторгнення клітин людини.
Слід зазначити, що антитіла проти ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини, що мають комбінації вищезгаданих характеристик, також вважаються варіантами здійснення винаходу.
Зо Наприклад, антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з ЕСОЕК (1-525) (5ЕБЕО ІЮ МО:47) з константою дисоціації (Ка) приблизно їх105 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу, і зв'язуватися з епітопом в амінокислотній послідовності
СаАОБМЕМЕЕРОМУВКС (5ЕО ІЮО МО:45) і конкурувати з АБІ1 (або антитілом проти ЕСЕК, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕ ІЮО МО:5) за зв'язування з варіантом І! рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕЕМІЇ) (ЗЕО ІЮ МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування.
У визначених варіантах здійснення антитіла проти ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з епітопом в амінокислотній послідовності СЕАОЗМЕМЕЕРСМУАКС (ЗЕО І МО:45) і конкурують з АБІ1 (або антитіло проти ЕСЕ містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:5) за зв'язування з варіантом ПП рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕРЕМІ) (5ЕБЕО ІО МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування; і зв'язуються з ЕСЕКМІИІ (5ЕО ІЮ МО:33) з Ка приблизно 8,2х109 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
У визначених варіантах здійснення антитіла проти ЕСЕК або їх антигензв'язувальні частини зв'язуються з епітопом в амінокислотній послідовності СЕАОЗМЕМЕЕРСМУАКС (ЗЕО І МО:45) і конкурують з АБІ (або антитіло проти ЕСЕК містить варіабельний домен важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:1, і варіабельний домен легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:5) за зв'язування з варіантом ПП рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕРЕМІ) (5ЕБЕО ІО МО:33) у конкурентному аналізі зв'язування; і інгібують або знижують ріст пухлини в моделі на мишах із ксенотрансплантатом іп мімо. Більш конкретно, антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати ріст пухлини щонайменше приблизно на 5095 в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені (МЗС С) людини іп мімо відносно Ідс- антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕК, при введенні в тій же дозі і з тією ж періодичністю дозування. Альтернативно антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені (МЗС С) людини іп мімо відносно Ідб-антитіла людини, що бо не є специфічним до ЕСЕК, щонайменше приблизно на 5595, щонайменше приблизно на 6095,
щонайменше приблизно на 6595, щонайменше приблизно на 7095, щонайменше приблизно на 7595 або щонайменше приблизно на 8095, при введенні в тій же дозі і з тією ж періодичністю дозування. У визначених варіантах здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні частини за винаходом здатні інгібувати або знижувати ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом недрібноклітинної карциноми легені (МЗС С) людини іп мімо відносно Ідс-антитіла людини, що не є специфічним до ЕСЕРЕК, на від приблизно 8095 до приблизно 9095 або від приблизно 8495 до приблизно 9095 або від приблизно 8895 до приблизно 90595, при введенні в тій же дозі і з тією ж періодичністю дозування.
Антитіла, що мають комбінації будь-яких з вищезгаданих характеристик, передбачаються як аспекти винаходу. АОС за винаходом, більш докладно описані нижче, можуть також мати будь- яку з вищевказаних характеристик.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ПЕСЕК або його антигензв'язувальної частини, що містить домен СОКЗ ІС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:40, домен СОК2 ІС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:39, і домен СОКІ1 ІС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:38; і домен СОКЗ НС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:37, домен СОК2 НС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:36, і домен СОКІ НС, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ХЕО ІЮ МО:35.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ПЕСЕК або його антигензв'язувальної частини, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 і 78; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 і 79.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ПЕСЕК або його антигензв'язувальної частини, що містить набір СОК НС (СОМІ1, СОК2 і СОКУ), вибраний із групи, що складається з БЕО ІЮ МО:10, 11 ї 12; 5ЕО ІЮ МО:16, 17 ї 18; 5ЕО ІЮО МО:10, 11 ї 19;
ЗЕО ІЮ МО:20, 11 ї 12; 5ЕО ІЮО МО:21, З і 22; 5ЕО ІЮО МО:16, 17 і 19; 5ЕО ІО МО:2, З і 4; 5ЕО ІЮ
Зо МО:10, З ї 12; ЗЕО ІО МО:80, 11 і 18; 5ЕО ІЮ МО:80, З і 18; 5ЕО ІЮ МО:20, З і 12; 5ЕО ІЮ МО:80, 11ї12; ї БЕО ІО МО:81, 11 і 22; і набір СОК легкого ланцюга І С (СОМК1, СОК2 і СОКЗ), вибраний із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО:6, 7 і 8; 5ЕО ІЮО МО:23, 24 і 25; 5ЕО ІЮ МО:26, 27 і 28; 5ЕО
ІО МО:29, 30 ї 31; ЗЕО ІЮ МО:6, 7 і 84; ЗЕО ІЮ МО:82, 83 ї 31; і ЗЕО ІЮ МО:82, 27 і 85, де антитіло або його антигензв'язувальна частина не містить ні набору СОК НС 5ЕО ІЮ МОС2, З і 4, ні набору СОКІ С 5ЗЕО ІЮ МО:6, 7 і 8.
Переважно, антитіла проти ЕСЕК за винаходом виявляють високу здатність до зниження або нейтралізації активності ЕСЕК, наприклад, при оцінці за допомогою одного або декількох аналізів іп мійго і іп мімо, відомих у даній галузі. Наприклад, можна кількісно визначати інгібування фосфорилування ЕСЕК у експресуючій ЕСЕК клітинній лінії, наприклад клітинній лінії Н292. У визначених варіантах здійснення виділене антитіло або його антигензв'язувальна частина зв'язує ЕСЕК людини, де антитіло або його антигензв'язувальна частина дисоціює від
ЕСЕРК людини (ЕСЕК (1-525)) з константою Ко приблизно 5,9х107 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Альтернативно антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати від ЕСЕК (1-525) людини з константою Ко приблизно 4,2х107 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
Альтернативно антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати від ЕСЕК (1- 525) людини з константою Ко приблизно 2,5х107 М, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕВ або його антигензв'язувальна частина за винаходом має константу Ко від 5,9х1077 М до 5х1079
М.
Альтернативно антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати від
ЕСЕРМІІ людини з константою швидкості Ко приблизно 6,1х1079 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Альтернативно антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати від ЕСЕРЕМІЇЇ людини з константою швидкості Ко приблизно 3,9х109 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу. Альтернативно антитіло або його антигензв'язувальна частина може дисоціювати з
ЕСЕРМІІ людини з константою швидкості Ко приблизно 2,3х107 М або менше, при визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою бо антитіло АБА, або його антигензв'язувальної частини. АБА має поліпшену афінність зв'язування
ЕСЕК відносно АБ і також виявляє унікальні характеристики іп міїго і іп ммо відносно АБ1. АБА зв'язує ЕСЕК в аналізі зв'язування кератиноцитів іп міго з афінністю, яка значно перевищує афінність АБІ. Крім того, АБА здатне інгібувати або знижувати ріст пухлини в аналізі з ксенотрансплантатом клітин Н292. Примітно, що АБА має поліпшені характеристики іп міїго і іп мімо, які порівнянні з іншими варіантами антитіла АБІ, що мають більш високу афінність зв'язування, ніж АБА. Незважаючи на наявність більш низької афінності зв'язування в порівнянні з іншими варіантами антитіла АБІ1 (див., наприклад, АБР і АБО проти АБА на фіг. 3), АБА мало порівнянне інгібування росту клітин в аналізі іп мімо.
Термін "АрРА" включає Ідс-антитіло, що має щонайменше шість СОК АБА. Антитіло АБА має той же легкий ланцюг, що і АБІ, але має важкий ланцюг, що містить шість змін амінокислотної послідовності відносно батьківського антитіла АБІ (чотири амінокислотні зміни у варіабельній області і дві зміни в константній області важкого ланцюга). Антитіло АБА містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність «хЕО ІЮ МО':11, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:10, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮ МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:6. Варіабельна область важкого ланцюга АБА визначається амінокислотною послідовністю, зазначеною в 5ЗЕО ІЮО МО:9, і варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 562 ІЮ МО:5. Повнорозмірний важкий ланцюг антитіла АБА зазначений в амінокислотній послідовності, описаній в БЕО ІЮО МО:15, у той час як повнорозмірний легкий ланцюг антитіла АБА зазначений в амінокислотній послідовності, описаній в зЕО ІЮ МО:13 (див. фіг. 2). Послідовність нуклеїнової кислоти важкого ланцюга АБА представлена нижче: даддідсаасіссаадададсдддсссоддссісдідаадсссісісадасісідіссстасндсасюддадсодддіайссаїсадс ададасісдсаддаасіддаїссдссадссісссддіаадддасюдадодадчаддаіасаїсадсіасаасддіааіасасодсіаїса дсссісссідаадісісдсанассацадісдсдаїассіссаадаассаднсінсідааасісаасадсудідасадссодсідасассдсс ассіасіасідсдідассдссадсадддаднессНасіддддссадддсасісіддісассуашснНсідсдісдассаадддсссаїсоді снсссссддсасссіссіссаададсассісідддадсасадсдасссіддодсідссіддісааддасіасіссссдаассддіюдасоаї
Зо дісдіддаасісаддасдсссдассадсддсоадсасассісссоддсідіссіасадіссісаддасісіасісссісадсадсдідддас сдудідсссіссадсадснддосасссадассіасаїсідсаасудідааіїсасаадсссадсаасассаадаіддасаадааадідадсс саааїсндідасаааасісасасаїдсссассдідсссадсассідаасіссідддоаддассдісадісносісносссссаааасссаа ддасасссісаїдаїсісссддассссідададісасаїсддадодіддасоададссасдаадасссідаддісааднсаасідаїасоі даасдасуіддаддідсаіаа(дссаадасааадссдсдддаддадсадіасаасадсасдіассдідіддісадсдіссісассодіссі дсассаддасіддсідааддсааддадіасаадіюдсааддісіссаасааадсссісссадсссссаїсдадаааассаїсіссааад ссааадддсадссссдадаассасаддідіасасссідсссссаїсссдсдаддадаїдассаадаассаддісадссідассідссю дісаааддсіїсіаїсссадсдасаїсдссоддададщадададсааддадасадссддадаасаасіасаадассасдссісссдідсю дасіссдасудсісснсНссісіасадсаадсісассуіддасаададсаддіддсадсаддддаасдіснсісаїдсіссдідаюсаю аддсісідсасаассасіасасасадаададссісісссідісіссадаїааа (ЗЕО І МО:86).
Послідовність нуклеїнової кислоти легкого ланцюга АБА представлена нижче:
Сасаїссадаїдасссадісссссіссадіаідісічідісюідаасдассаідідассанассідссасіссісссаддасаїсааїа дсааіаіїсдоанпдднНосаасадаадссаддсаадісєснсаааддасдащшассаїдаїассаассіддасдасддадіїссіадієд Ще адсддсіссдддіссддаассдацасасісідассаїсадсадідсадссюдаддастосіассіанацодіодсадіасдсісаднсс саюдасшсддсодддддсассааасіддадаїсааасдіасддіддсідсассаїсідіснсаїсноссоссаїсідададсадідаа асіддаасідссісюгна і ідссідсідааіаасіїсіаїсссадададдссааадіасадддааддіддагаасдсссіссааїсоддіа асісссаддададідісасададсаддасадсааддасадсассіасадссісадсадсасссідасдсідадсааадсадасіасда дааасасааацдісіасдссідсдаадісасссаїсададссідадсісасссдісасааадаасіїсаасаддадачачнї (ЗЕО І
МО:87).
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБВ, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБВ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:19, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність «хЕО ІЮ МО:17, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:16, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:6. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:64, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:65.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБС, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБС містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:4, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:2, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:84, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:6. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:66, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:67.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБО, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБО містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:4, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:2, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:31, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:83, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:82. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:68, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:69.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБЕ, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБЕ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:4, домен СОМК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:2, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:85, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:27, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:82. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:50, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:51.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБЕ, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБЕ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:10, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО:7, і домен СОКІ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО:6. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:52, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:53.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АрС, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБС містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:18, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:17, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:16, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:25, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:24, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:23. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:72, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:73.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБН, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБН містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:18, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність «хЕО ІЮ МО':11, і домен 60 СОКТ, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:80, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:25, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:24, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:23. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:54, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:55.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБ), або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ
МО:18, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:3, ії домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:80, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:25, домен СОН, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:24, і домен СОЖКІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:23. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:56, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:57.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБК, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБК містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:19, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність «хЕО ІЮ МО':11, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність 560 ІЮ МО:10, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:28, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:27, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5600 ІЮ МО:26. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:74, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:75.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою
Зо антитіло АБІ,, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБІ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:18, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:11, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:80, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО:28, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:27, і домен СОЖКІ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:26. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:58, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:59.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБМ, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБМ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність «хЕО ІЮ МО':11, і домен
СОВІ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:20, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:28, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:27, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:26. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:76, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну
БО послідовність ЗЕО ІЮ МО:77.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБМ, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБМ містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:3, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:20, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕОО ІЮ МО:28, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:27, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:26. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:60, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:61.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБО, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБО містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО:11, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:80, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:28, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:27, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:26. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:62, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:63.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБР, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АБР містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО І МО:22, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:3, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО:21, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:31, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:30, і домен СОК'І1, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:29. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:78, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:79.
В одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що являє собою антитіло АБО, або його антигензв'язувальної частини. Антитіло АрО містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність
ЗЕО ІОЮ МО:22, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:11, і домен
СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:81, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:31, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:30, і домен СОК'І, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:29. У наступних варіантах здійснення винахід стосується антитіла, яке має варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:70, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:71.
Як описано в таблиці 1 у розділі "Приклади", зазначеному нижче, послідовності варіантів антитіла АБ1 забезпечують консенсусні амінокислотні послідовності, які відповідають доменам
СОК, що приводять до поліпшеного зв'язування з епітопом АБІ на ЕСЕК. Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК або його антигензв'язувальної частини, що містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як ЗЕО ІЮ МО:40, домен
СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як 5ХЕО ІЮ МО:39, і домен СОКІ1, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як ЗЕО ІЮ МО:38; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як ЗЕО ІЮ МО:37, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як ЗЕО ІЮ
МО:36, і домен СОКТ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену як хЕО ІЮ МО:35.
В одному варіанті здійснення антитіло проти рецептора епідермального фактора росту (проти ЕСЕК) або його антигензв'язувальна частина містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 50, 52, 53, 56, 58, 60, 62, 64, 66 і 68; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 51, 53, 55, 57, 59,61,63,65,67 169.
У наступному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕМК або його антигензв'язувальна частина за винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮО МО:12, 18, 19 і 22; домен СОКО, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:11 або 17; і домен СОМ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:10, 16, 20 і 21; і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:8, 25, 28 і 31; домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:7, 24, 27 і 30; ії домен СОКТ, який містить амінокислотну послідовність, 60 зазначену в ЗЕО ІО МО:6, 23, 26 і 29.
Аналізи фосфорилування і проліферації продемонстрували, що антитіла, описані в даному документі, інгібують опосередковуване ЕСЕК фосфорилування і ріст пухлинних клітин.
Наприклад, як зазначено в прикладі б, було показано, що антитіла проти ЕСЕК (як було протестовано) інгібують ріст пухлинних клітин іп мімо.
Представлені вище послідовності СОК антитіла проти ЕСЕК основують нове сімейство
ЕСЕВ-зв'язувальних білків, які виділені відповідно до даного винаходу і містять поліпептиди, що включають послідовності СОК, наведені в таблицях 1-3 нижче.
Для одержання і селекції СОК, що мають переважне зв'язування ЕСЕК і/або нейтралізуючу активність відносно ПЕСЕК, можна використовувати стандартні відомі в даній галузі способи одержання антитіл або їх антигензв'язувальних частин і оцінки зв'язування ЕСЕК і/або нейтралізуючих характеристик цих антитіл або їх антигензв'язувальних частин, включаючи, але не обмежуючись ними, антитіла або їх антигензв'язувальні частини, конкретно описані в даному документі.
У визначених варіантах здійснення антитіло містить константну область важкого ланцюга, таку як константна область Ідат1, Ідаг, ІдаЗ, да, ІДА, ІДЧЕ, ІДМ або ІдО. У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальна частина містить константний домен важкого ланцюга імуноглобуліну, вибраний із групи, що складається з константного домену Ід; людини, константного домену ЯМ людини, константного домену ДЕ людини і константного домену ІДА людини. У наступних варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язувальна частина має константну область важкого ланцюга Ідс1, константну область важкого ланцюга Ідс2, константну область ДСЗ або константну область важкого ланцюга Ідс24. Переважно, константна область важкого ланцюга являє собою константну область важкого ланцюга ДСі або константну область важкого ланцюга Ідс24. Більше того, антитіло може містити константну область легкого ланцюга або константну область легкого ланцюга каппа, або константну область легкого ланцюга лямбда. Переважно, антитіло містить константну область легкого ланцюга каппа. Альтернативно частина антитіла може являти собою, наприклад, Гар-фрагмент або одноланцюжковий Ем-фрагмент.
У визначених варіантах здійснення зв'язувальна частина антитіла проти ЕСЕК являє собою
Еаб, Раб, К(ав)», Ем, зв'язаний дисульфідним зв'язком Ем, 5сЕм, однодоменне антитіло або діантитіло.
У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальна частина являє собою мультиспецифічне антитіло, наприклад біспецифічне антитіло.
У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальна частина містить константну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮО МО:41, і/або константну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:43.
Була описана заміна амінокислотних залишків у Ес-частині для зміни ефекторної функції антитіла (М/іпіег еї аі., патенти США МоМо 5648260 і 5624821, включені в даний опис як посилання). Ес-частина антитіла опосередковує декілька важливих ефекторних функцій, наприклад індукцію цитокінів, АОСС, фагоцитоз, комплементзалежну цитотоксичність (СОС) і час напівжиття/швидкість виведення антитіла і комплексів антиген-антитіло. У деяких випадках ці ефекторні функції є бажаними для терапевтичного антитіла, однак в інших випадках вони можуть бути непотрібними або навіть шкідливими, залежно від терапевтичних задач. Визначені ізотипи ЇдСї людини, зокрема Іда1 і (ДЗ, опосередковують АЮСС і СОС через зв'язування з
Есук5 ії С1д комплементу, відповідно. Неонатальні Ес-рецептори (БоКп) є ключовими компонентами, що визначають час напівжиття антитіл у циркуляції. У наступному варіанті здійснення щонайменше один амінокислотний залишок замінений у константній області антитіла, наприклад у Ес-області антитіла, так що ефекторні функції антитіла змінюються.
Один варіант здійснення винаходу стосується рекомбінантного химерного рецептора антигену (САК), що містить зв'язувальні області антитіл, описаних у даному документі, наприклад СОК важкого і/або легкого ланцюгів АБА. Рекомбінантний САКЕ, як описано в даному документі, можна використовувати для перенацілювання специфічності Т-клітин на антиген незалежним від лейкоцитарного антигену людини (НГ А) чином. Таким чином, САК за винаходом можна використовувати в імунотерапії для модифікації власних імунних клітин людини й атаки на пухлину індивідуума (див., наприклад, патенти США МоМо 6410319; 8389282; 8822647; 8906682; 8911993; 8916381; 8975071; і публікацію патентної заявки США Мо О520140322275, усі з яких включені в даному описі як посилання відносно технології САК). Цей тип імунотерапії називають адоптивним перенесенням клітин (АСТ) і його можна використовувати для лікування індивідуума, що потребує цього.
САК проти ЕСЕК за винаходом переважно містить позаклітинний антигензв'язувальний домен, специфічний до ЕСЕК (наприклад, ЕСЕКМІІІ), трансмембранний домен, який використовують для заякорювання САК на Т-клітині, і один або декілька внутрішньоклітинних сигнальних доменів. В одному варіанті здійснення винаходу САК містить трансмембранний домен, яки включає трансмембранний домен білка, вибраного з групи, що складається з альфа- ; бета- або зета-ланцюга Т-клітинного рецептора, СО28, СОЗ-епсилон, СО45, 204, СО05, СО8, сбре, бр16, 0022, 6033, 6037, 6064, бр80, 2086, 20134, С0137 і СО154. В одному варіанті здійснення винаходу, САК містить костимулюючий домен, наприклад костимулюючий домен, що містить функціональний сигнальний домен білка, вибраного з групи, що складається з ОХ40, сбор2, 0027, 0028, СО5, ІСАМ-1, ГЕА-1 (СО11а/С018), ІСО5 (00278) і 4-188 (С0137). У визначених варіантах здійснення винаходу САК містить 5сЕм, що містить СОР. або варіабельні області, описані в даному документі, наприклад СОК або варіабельні області з антитіла АБА, трансмембранний домен, костимулюючий домен (наприклад, функціональний сигнальний домен з СО28 або 4-18В) і сигнальний домен, що містить функціональний сигнальний домен з
СОЗ (наприклад, СОЗ-зета).
У визначених варіантах здійснення винахід стосується Т-клітини (також називаної САК Т- клітиною), яка містить САК, що містить антигензв'язувальні області, наприклад СОБК, антитіл, описаних у даному документі, або 5сЕм, описаного в даному документі.
У визначених варіантах здійснення винаходу САК містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО
ІО МО:40, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:39, і домен СОКІ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:38; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність зазначену в 5ЕБО ІЮ МО:37, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕБЕО ІЮ МО:3б, і домен СОКІ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІО МО:35.
У визначених варіантах здійснення винаходу САК містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОКЗ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕ
ІО МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:11, і
Ко) домен СОКІ, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:10; і варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОМКЗ, який містить амінокислотну послідовність зазначену в ЗЕО ІЮ МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕБЕО ІЮ МО:7, і домен СОКІ!, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО:6.
Один з варіантів здійснення стосується міченого зв'язувального антитіла проти ЕСЕЕК або його частини, де антитіло дериватизоване або зв'язане з однією або декількома функціональними молекулами (наприклад, іншим пептидом або білком). Наприклад, мічений зв'язувальний білок за винаходом може бути одержаний функціональним зв'язуванням антитіла або частини антитіла за винаходом (шляхом хімічного зв'язування, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими молекулярними структурами, такими як інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або діантитіло), засіб, що піддається виявленню, фармацевтичний засіб, білок або пептид, що може опосередковувати зв'язування зв'язувального білка з іншою молекулою (такою як центральна область стрептавідину або полігістидинова мітка), або цитотоксичний засіб або лікарський засіб, вибрані з групи, що складається з |інгібітору мітозу, протипухлинного антибіотика, імуномодулюючого засобу, вектора для генної терапії, алкілувального засобу, антиангіогенного засобу, антиметаболіту, боровмісного засобу, хемопротективного засобу, гормону, антигормонального засобу, кортикостероїду, фотоактивного лікарського засобу, олігонуклеотиду, радіонуклідного засобу, інгібітору топоізомерази, інгібітору тирозинкінази, радіосенсибілізуючого засобу і їх комбінації.
Придатні засоби, що піддаються виявленню, за допомогою яких може бути дериватизоване антитіло або його антигензв'язувальна частина, включають флуоресцентні сполуки.
Ілюстративні флуоресцентні засоби, що поддаються виявленню, включають флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, 5-диметиламін-1-нафталінсульфонілхлорид, фікоеритрин і т. п. Також антитіло може бути дериватизоване ферментами, що піддаються виявленню, такими як лужна фосфатаза, пероксидаза хрону, глюкозооксидаза і т. п. Коли антитіло дериватизоване ферментом, що піддається виявленню, його виявлення проводять додаванням додаткових реагентів, які фермент використовує для утворення продукту реакції, що піддається виявленню.
Наприклад, коли є засіб, що піддається виявленню, - пероксидаза хрону, додавання пероксиду бо водню і діамінобензидину приводить до забарвленого продукту реакції, який є таким, що піддається виявленню. Також антитіло може бути дериватизоване біотином і його можна виявляти за допомогою непрямого вимірювання зв'язування авідину або стрептавідину.
В одному варіанті здійснення антитіло за винаходом кон'юговане з візуалізуючим засобом.
Приклади візуалізуючих засобів, які можна використовувати в композиціях і способах, описаних у даному документі, включають, але не обмежуються ними, радіоактивну мітку (наприклад, індій), фермент, флуоресцентну мітку, люмінесцентну мітку, біолюмінесцентну мітку, магнітну мітку і біотин.
В одному варіанті здійснення антитіла або АОС зв'язані з радіоактивною міткою, такою як, але не обмежуючись цим, індій (71п). 7 7Індій можна використовувати для мічення антитіл і
АОС, описаних у даному документі, для застосування для ідентифікації позитивних по ЕСЕК пухлин. У визначених варіантах здійснення антитіла проти ЕСЕК (або АС), описані в даному документі, є міченими за допомогою "| через біфункціональний хелатор, що являє собою біфункціональний хелат циклогексилдіетилентриамінпентаоцтової кислоти (ОТРА) (див. патенти
США МоМо 5124471; 5434287 і 5286850, кожний з яких включений у даний опис як посилання).
Інший варіант здійснення винаходу стосується глікозилованого зв'язувального білка, де антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальна частина містить один або декілька вуглеводних залишків. Білковий продукт, що утворюється іп мімо, може піддаватися подальшому процесингу, відомому як посттрансляційна модифікація. Зокрема, можуть бути ферментативно додані залишки цукру (глікозильні залишки), за допомогою процесу, відомого як глікозилування.
Утворені білки, що мають ковалентно зв'язані з ними олігосахаридні бічні ланцюги, відомі як глікозиловані білки або глікопротеїни. Антитіла являють собою глікопротеїни з одним або декількома вуглеводними залишками в Ес-домені, а також у варіабельному домені. Вуглеводні залишки в Ес-домені мають значний ефект на ефекторну функцію Ес-домену і мінімальний ефект на зв'язування антигену або час напівжиття антитіла (Чейегі5 К., Віоїесппої. Ргод. 21 (2005), рр. 11-16). На противагу цьому, глікозилування варіабельного домену може надавати ефект на активність зв'язування антигену антитілом. Глікозилування у варіабельному домені може надавати негативний ефект на афінність зв'язування антитіла, ймовірно внаслідок просторової перешкоди (Со М.5. еї аї., Мої. Іттипої. (1993), 30:1361-1367), або приводити до підвищеного афінності до антигену (УмМаїййск 5.С. еї аІ., Ехр. Мед. (1988), 168:1099-1109; УУтідні А.
Зо ега!., ЕМВО 3. (1991), 10:2717-2723).
Один з аспектів даного винаходу стосується одержання мутантів по ділянці глікозилування, у яких ділянка О- або М-зв'язаного глікозилування зв'язувального білка піддана мутації.
Фахівець у даній галузі може одержати такі мутанти з використанням стандартних добре відомих способів. Створення мутантів по ділянках глікозилування, що зберігають біологічну активність, але мають підвищену або знижену активність зв'язування, є іншою задачею даного винаходу.
В іншому варіанті здійснення глікозилування антитіла проти ЕСЕК або його антигензв'язувальної частини є модифікованим. Наприклад, можна одержувати аглікозиловане антитіло (тобто антитіло, позбавлене глікозилування). Глікозилування можна змінювати, наприклад, для підвищення афінності антитіла до антигену. Такі модифікації вуглеводів можна проводити, наприклад, за допомогою зміни однієї або декількох ділянок глікозилування в послідовності антитіла. Наприклад, можна вносити одну або декілька амінокислотних замін, що приводять до усунення однієї або декількох ділянок глікозилування варіабельної області, усуваючи тим самим глікозилування в цій ділянці. Таке аглікозилування може підвищити афінність антитіла до антигену. Такий підхід більш докладно описаний у публікації РСТ М/О 2003016466А2, і в патентах США МоМо 5714350 і 6350861, кожний з яких включений у даний опис як посилання в повному обсязі.
Додатково або альтернативно, можна одержувати модифіковане антитіло проти ЕСЕК за винаходом, що має змінений тип глікозилування, такий як гіпофукозильоване антитіло, що має знижені кількості фукозильних залишків, або антитіло, що має збільшену кількість біссекторних структур СІСМАс. Було показано, що такий змінений характер глікозилування підвищує здатність антитіл до АОСС. Такі модифікації вуглеводів можна проводити, наприклад, шляхом експресії антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим апаратом глікозилування. Клітини зі зміненим апаратом глікозилування описані в даній галузі і їх можна використовувати як клітини-хазяїни для експресії рекомбінантних антитіл за винаходом з одержанням, тим самим, антитіла зі зміненим глікозилуванням. Див., наприклад, Зпієїй5 К.Г. еї аї. (2002), 9. Віої. Спет. 277:26733-26740; тапа евї а. (1999), Маї. Віоїесин. 17:176-1, а також патент Європи Мо ЕР 1176195; публікації РСТ
УМО 03/035835; МО 99/54342 80, всі з яких включені у даний опис як посилання в повному обсязі.
Зо
Глікозилування білків залежить від амінокислотної послідовності білка, що представляє інтерес, а також від клітини-хазяїна, у якій експресується білок. Різні організми можуть продукувати різні ферменти глікозилування (наприклад, глікозилтрансферази і глікозидази) і мають різні доступні субстрати (цукри нуклеотидів). Унаслідок таких факторів, характер глікозилування білка і склад глікозильних залишків можуть відрізнятися, залежно від системи хазяїна, у якій експресується конкретний білок. Глікозильні залишки, придатні для винаходу, можуть включати, але не обмежуються ними, глюкозу, галактозу, манозу, фукозу, н- ацетилглюкозамін і сіалову кислоту. Переважно глікозилований зв'язувальний білок містить глікозильні залишки, так що характер глікозилування є людським.
Різне глікозилування білка може приводити до різних характеристик білка. Наприклад, ефективність терапевтичного білка, продукованого в мікроорганізмі-хазяїні, такому як дріжджі, і глікозилованого з використанням ендогенного каскаду дріжджів, може бути знижена в порівнянні з глікозилуванням того ж білка, експресованого в клітині ссавця, такій як клітинна лінія СНО.
Такі глікопротеїни також можуть бути імуногенними у людини і можуть демонструвати знижений час напівжиття іп мімо після введення. Визначені рецептори у людини й інших тварин можуть розпізнавати визначені глікозильні залишки і забезпечувати швидке виведення білка з кровотоку. Інші несприятливі ефекти можуть включати зміну згортання білка, його розчинності, чутливості до протеаз, кругообігу, транспорту, компартменталізації, секреції, розпізнавання іншими білками або факторами, антигенності або алергенності. Таким чином, практикуючий фахівець може віддати перевагу терапевтичному білку з визначеним складом і характером глікозилування, наприклад складом і характером глікозилування, ідентичними, або щонайменше подібними, зі складом і характером глікозилування в клітинах людини або у видоспецифічних клітинах передбачуваної тварини.
Експресії глікозилованих білків, відмінних від білків клітини-хазяїна, можна досягати генетичною модифікацією клітини-хазяїна для експресії гетерологічних ферментів глікозилування. З використанням способів, відомих у даній галузі, практикуючий фахівець може одержати антитіла або їх антигензв'язувальні частини, що виявляють глікозилування білків людини. Наприклад, штами дріжджів генетично модифікували для експресії ферментів глікозилування, що не зустрічаються в природі, так щоб глікозиловані білки (глікопротеїни), продуковані в цих штамах дріжджів, виявляли глікозилування білка, ідентичне глікозилуванню клітин тварин, особливо клітин людини (публікації патентів США МоМо 20040018590 і 20020137134 і публікація РСТ УМО 2005100584 АЗ2).
Антитіла можна одержувати будь-яким з ряду способів. Наприклад, їх можна одержувати експресією з клітин-хазяїнів, де експресуючий вектор(и), кодуючий важкий і легкий ланцюги, трансфікують у клітину-хазяїна стандартними способами. Різні форми терміна "трансфекція" охоплюють широку множину способів, звичайно використовуваних для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад електропорацію, преципітацію з фосфатом кальцію, трансфекцію з ОЕАЕ-декстраном і т. п. Хоча також є можливою експресія антитіл або в прокаріотичних, або в еукаріотичних клітинах-хазяїнах, експресія антитіл. у еукаріотичних клітинах є переважною і найбільш переважною вона є в клітинах-хазяїнах ссавців, оскільки такі еукаріотичні клітини (зокрема, клітини ссавців) більш імовірно, ніж прокаріотичні клітини, будуть збиратися і секретувати належним чином згорнуте і імунологічно активне антитіло.
Переважні клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за винаходом включають клітини яєчника китайського хом'яка (клітини СНО) (включаючи клітини апіт- СНО, описані в Огіашр апа Спавзіп (1980), Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 77:4216-4220, використовувані із селективним маркером ОНЕРЕК, наприклад, як описано в Кашїтап К..). апа Зпагр Р.А. (1982), Мої.
Віої. 159:601-621), клітини мієломи МБО, клітини СОБЗ і клітини 5Р2. Коли рекомбінантні експресуючі вектори, кодуючі гени антитіла, вводять у клітини-хазяїни ссавців, антитіла одержують культивуванням клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для забезпечення експресії антитіла в клітинах-хазяїнах або, більш переважно, секреції антитіла в культуральне середовище, у якому клітини-хазяїни вирощують. Антитіла можна виділяти з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білка.
Також клітини-хазяїни можна використовувати для одержання функціональних фрагментів антитіла, таких як габ-фрагменти або молекули 5сЕм. Зрозуміло, що варіанти зазначеного вище способу входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, може бути бажаною трансфекція клітини- хазяїна за допомогою ДНК, кодуючої функціональні фрагменти легкого ланцюга і/або важкого ланцюга антитіла за даним винаходом. Також можна використовувати технологію рекомбінантних ДНК для видалення деякої частини або всієї ДНК, кодуючої будь-який або 60 обидва з легкого ланцюга і важкого ланцюга, що не є необхідним для зв'язування антигенів, що представляють інтерес. Молекули, експресовані з таких укорочених молекул ДНК, також охоплюються антитілами за винаходом. Крім того, можна одержувати біфункціональні антитіла, у яких один важкий й один легкий ланцюг являють собою антитіло за винаходом, а інший важкий і легкий ланцюг є специфічними до антигену, відмінного від антигенів, що представляють інтерес, шляхом зшивання антитіла за винаходом з другим антитілом стандартними способами хімічного зшивання.
У переважній системі для рекомбінантної експресії антитіла або його антигензв'язувальної частини за винаходом, рекомбінантний експресуючий вектор, кодуючий як важкий ланцюг антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять у клітини айпй- СНО опосередковуваною фосфатом кальцію трансфекцією. У рекомбінантному експресуючому векторі кожний з генів важкого і легкого ланцюгів антитіла функціонально зв'язують з регуляторними елементами енхансер СММУ/промотор АаМІ Р для запуску високих рівнів транскрипції генів. Рекомбінантний експресуючий вектор також містить ген ОНЕК, що дозволяє селекцію клітин СНО, трансфікованих вектором, з використанням селекції з метотрексатом/ампліфікації. Відібрані трансформовані клітини-хазяїни культивують для забезпечення експресії важкого і легкого ланцюгів антитіла і інтактне антитіло виділяють з культурального середовища. Для одержання рекомбінантного експресуючого вектора, трансфекції клітин-хазяїнів, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїнів і виділення антитіла з культурального середовища використовують стандартні способи молекулярної біології. Крім того, винахід стосується способу синтезу рекомбінантного антитіла за винаходом шляхом культивування клітини-хазяїна за винаходом в придатному культуральному середовищі доти, поки не синтезується рекомбінантне антитіло за винаходом. Рекомбінантні антитіла за винаходом можна одержувати з використанням молекул нуклеїнової кислоти, що відповідають амінокислотним послідовностям, описаним у даному документі. В одному варіанті здійснення для одержання рекомбінантного антитіла використовують молекули нуклеїнової кислоти, зазначені в ЗЕО ІЮ
МО:86 і/або 87. Крім того, спосіб може включати виділення рекомбінантного антитіла з культурального середовища.
ІП. Кон'югати антитіло проти ЕСЕК-лікарський засіб (АОС)
Антитіла проти ЕСЕК, описані в даному документі, можна кон'югувати з лікарською
Зо частиною для одержання кон'югата антитіло проти ЕСЕК-лікарський засіб (АОС). Кон'гати антитіло-лікарський засіб (АОС) можуть підвищувати терапевтичну ефективність антитіл при лікуванні захворювання, наприклад злоякісної пухлини, унаслідок здатності АОС селективно доставляти одну або декілька лікарських частин у тканини-мішені, такі як пухлини, експресуючі асоційований з пухлиною антиген, наприклад ЕСЕК. Таким чином, у визначених варіантах здійснення винахід стосується АОС проти ЕСЕК для терапевтичного застосування, наприклад для лікування злоякісної пухлини.
АОС проти ЕСЕК за винаходом містять антитіло проти ЕСЕК, тобто антитіло, що специфічно зв'язується з ЕОЕЕК, зв'язане з однією або декількома частинами лікарського засобу.
Специфічність АОС за винаходом визначається специфічністю антитіла, тобто антитіла проти
ЕСЕК. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК зв'язане з одним або декількома цитотоксичними засобами, що доставляються усередину трансформованої злоякісної клітини, експресуючої ЕСЕК.
Приклади лікарських засобів, які можна використовувати в АОС проти ЕСЕК за винаходом, представлені нижче, також як і приклади лінкерів, які можна використовувати для кон'югації антитіла й одного або декількох лікарських засобів. Терміни "лікарський засіб", "засіб" і "лікарська частина" використовують у даному описі взаємозамінно. Терміни "зв'язаний" і "кон'югований" також використовують у даному описі взаємозамінно і вони вказують на те, що антитіло і частина ковалентно зв'язані.
У деяких варіантах здійснення АОС має наступну формулу (формула 1):
АРр-(І-О) п, (І) де Ар являє собою антитіло, наприклад антитіло проти ЕСЕК АБА, і (1-0) являє собою лінкер-лікарську частину. Лінкер-лікарська частина складається з І-, що являє собою лінкер, і - р, що являє собою лікарську частину, що має, наприклад, цитотстатичну, цитотоксичну або іншу терапевтичну активність проти клітини-мішені, наприклад клітини, експресуючої ЕСЕК; і п являє собою ціле число від 1 до 20. У деяких варіантах здійснення п знаходиться в діапазоні від 1 до 8, від 1 до 7, від 1 до 6, від 1 до 5, від 1 до 4, від 1 до 3, від 1 до 2 або дорівнює 1. ПАК у АОС еквівалентний "п", зазначеному у формулі І. В одному варіанті здійснення АОС має формулу Абр- (І-О)5, де АБ являє собою антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА, | являє собою лінкер, наприклад валін-цитрулін (мс), О являє собою лікарський засіб, наприклад ауристатин, такий як 60 ММАРЕ або ММАЕ, і п дорівнює від 2 до 4 (що еквівалентно ОАК 2-4). Додаткові деталі, що стосуються лікарських засобів (О формули І) і лінкерів (І формули І), які можна використовувати в АОС за винаходом, а також альтернативних структур АОС, описані нижче.
А. АОС проти ЕОЕЕК: ілюстративні лікарські засоби для кон'югації
Антитіла проти ЕСЕК можна використовувати в АОС для націлювання одного або декількох лікарських засобів на клітину, що представляє інтерес, наприклад злоякісну клітину, експресуючу ЕСЕК. АЮС проти ЕСЕК за винаходом забезпечують спрямовану терапію, що може, наприклад, знижувати побічні ефекти, часто спостережувані у випадку терапії злоякісної пухлини, оскільки один або декілька лікарських засобів доставляють у конкретну клітину.
Ауристатини
Антитіло проти ЕСЕК за винаходом, наприклад АБА, може бути кон'юЮговане щонайменше з одним ауристатином. Ауристатини являють собою групу аналогів доластатину, для яких показано, що вони загалом мають активність проти злоякісної пухлини, перешкоджаючи динаміці мікротрубочок і гідролізу СТР, тим самим інгібуючи поділ клітин. Наприклад, ауристатин Е (патент США Мо 5635483) являє собою синтетичний аналог морського натурального продукту доластатину 10, що є сполукою, яка інгібує полімеризацію тубуліну шляхом зв'язування з тією ж ділянкою на тубуліні, з якою зв'язується лікарський засіб проти злоякісної пухлини вінкристин (Рей (5.К., Ргод. Спет. Ог9д. Маї. Ргоа, 70:1-79 (1997).
Доластатин 10, ауристатин РЕ і ауристатин Е являють собою лінійні пептиди, що мають чотири амінокислоти, три з яких є унікальними для класу сполук-доластатинів. Ілюстративні варіанти підкласу ауристатинових інгібіторів мітозу включають, але не обмежуються ними, монометилауристатин Ю (ММАО або похідне ауристатину ОЮ), монометилауаристатин Е (ММАЕ або похідне ауристатину Е), монометилауристатин ЕЕ (ММАР або похідне ауристатину БЕ), ауристатин Е фенілендіамін (АЕР), ауристатин ЕВ (АЕВ), ауристатин ЕЕР (АЕРЕР) і складний ефір 5-бензоїлвалеріанова кислота-АЕ (АЕМВ). Синтез і структура похідних ауристатину описані в публікаціях патентних заявок США МоМо 2003-0083263, 2005-0238649 і 2005-0009751; міжнародній публікації патенту Мо МУО 04/010957, міжнародній публікації патенту Ме УМО 02/088172, і в патентах США МоМо 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444 і 4486414, усі з яких включені в даному описі як посилання.
В одному варіанті здійснення антитіла проти ЕСЕК за винаходом, наприклад АБбБА, кон'юговані щонайменше з одним ММАЕ (монометилауристатин Е). Монометилауристатин Е (ММАЕ) інгібує поділ клітин шляхом блокування полімеризації тубуліну. Унаслідок його більш високої токсичності, його не можна безпосередньо використовувати як лікарський засіб. В останніх розробках терапії злоякісної пухлини його зв'язували з моноклональним антитілом (тАБ), що розпізнає експресію специфічного маркера в злоякісних клітинах і направляє ММАЕ у злоякісні клітини. В одному варіанті здійснення лінкер, що зв'язує ММАЕ з антитілом проти
ЕСЕРЕ, є стабільним у позаклітинній рідині (тобто в середовищі або в оточенні, що є зовнішніми для клітин), однак розщеплюється катепсином після зв'язування АОС зі специфічним антигеном злоякісної клітини і входження його в пухлинну клітину, таким чином вивільняючи токсичний
ММАЕ і активуючи потужний антимітотичний механізм.
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом, наприклад АБбБА, кон'юговане щонайменше з одним ММАЕ (монометилауристатин Е). Монометилауристатин Е (ММАР) інгібує поділ клітин шляхом блокування полімеризації тубуліну. Він має заряджений С- кінцевий залишок фенілаланіну, що ослабляє його цитотоксичну активність у порівнянні з незарядженим аналогом ММАЄЕ. Унаслідок його більш високої токсичності його не можна безпосередньо використовувати як лікарський засіб, але можна зв'язувати з моноклональним антитілом (тАБ), що направляє його в злоякісні клітини. В одному варіанті здійснення лінкер для антитіла проти ЕСЕК є стабільним у позаклітинній рідині, однак розщеплюється катепсином після входження кон'югата в пухлинну клітину, таким чином активуючи антимітотичний механізм.
Структури ММАЕ і ММАЕ представлені нижче.
М що - й у о И і и - й р а а - зяйт зн с вн 1 шо Монометилауристатин Е ПИМАЕЇ
І о : од ї вв. руль р х - й у іх А р й шин ре я нан чин ни а я й Х т, Е "
Монометилауристатин Е ММА,
Приклад АБА-хсММАЄЕ також представлений на фіг. 11. Примітно, що на фіг. 11 описана ситуація, де антитіло (наприклад, АБА) зв'язане з одним лікарським засобом і, таким чином, має рАК 1. У визначених варіантах здійснення АОС має БАК від 2 до 8 або, альтернативно, від 2 до
Б 4.
Інші лікарські засоби для кон'югації
Приклади лікарських засобів, які можна використовувати в АОС, тобто лікарських засобів, які можна кон'югувати з антитілами проти ЕСЕК за винаходом, представлені нижче і включають інгібітори мітозу, протипухлинні антибіотики, імуномодулюючі засоби, вектори для генної терапії, алкілувальні засоби, антиангіогенні засоби, антиметаболіти, боровмісні засоби, хемопротективні засоби, гормональні засоби, глюкокортикоїди, фотоактивні лікарські засоби, олігонуклеотиди, радіоактивні ізотопи, радіосенсибілізатори, інгібітори топоізомерази, інгібітори тирозинкінази і їх комбінації. 1. Інгібітори мітозу
В одному аспекті антитіла проти ЕСЕК можна кон'югувати з одним або декількома інгібіторами мітозу для одержання АЮС для лікування злоякісної пухлини. Термін "інгібітор мітозу", як використовують у рамках винаходу, стосується цитотоксичного і/або лікарського засобу, що блокує мітоз або поділ клітин - біологічний процес, особливо важливий для злоякісних клітин. Інгібітор мітозу руйнує мікротрубочки, так що поділ клітин попереджується, часто за допомогою впливу на полімеризацію мікротрубочок або деполімеризацію мікротрубочок. Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕЕ. за винаходом кон'югують з одним або декількома інгібіторами мітозу, що порушує утворення мікротрубочок шляхом інгібування полімеризації тубуліну. В одному варіанті здійснення інгібітором мітозу, використовуваним у АОС за винаходом, є Ікземпра (іксабепілон). Приклади інгібіторів мітозу, які можна використовувати в АОС проти ЕСЕК за винаходом, представлені нижче. До роду інгібіторів мітозу входять ауристатини, описані вище. а. Доластатини
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним доластатином для формування АЮС. Доластатини являють собою короткі пептидні сполуки, виділені з морського зайця Індійського океану ЮоїабеїйІа ашигісшіагіа (див. Рецйії еї а1., У. Ат. Спет. зоб., 1976, 98, 4677). Приклади доластатинів включають доластатин 10 і доластатин 15.
Доластатин 15, депсипептид із семи субодиниць, що походить з Юоїареїіа ашгісціагіа, являє собою сильнодіючий антимітотичний засіб, структурно споріднений з антитубуліновим засобом доластатином 10, що є пептидом з п'яти субодиниць, одержаним з того ж організму. Таким чином, в одному варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК за винаходом містить антитіло проти
ЕСЕЕК, як описано в даному документі, і щонайменше один доластатин. Ауристатини, описані нижче, являють собою синтетичні похідні доластатину 10. р. Майтанзиноїди
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним майтанзиноїдом для формування АОС. Майтанзиноїди являють собою сильнодіючі протипухлинні засоби, які спочатку були виділені з представників сімейств вищих рослин
СеїІазігасеає, Кпатпасеає і Еирпогріасеає, а також деяких видів мохів (Кирспап еї аї.,.). Ат.
Спет. 5ос. 94:1354-1356 (19721; Мапі еї аї., У. Спет. Бос. Спет. Соттип. 390: 119731); Ромеї! єї а!., У. Маї. Ргоа. 46:660-666 (19831; ЗакКаї еї аї., 9. Маї. Ргод. 51:845-850 (19881; і Зимапрбогігих еї аІ., Ехрепепіа 46:117-120 (19901). Дані вказують на те, що майтанзиноїди інгібують мітоз шляхом інгібування полімеризації білка мікротрубочок тубуліну, тим самим перешкоджаючи утворенню мікротрубочок (див., наприклад, патент США Мо 6441163 і КетійПага еї аї., Зсіепсе, 189, 1002-1005 (1975)). Було показано, що майтанзиноїди інгібують ріст пухлинних клітин іп мйго з використанням моделей на культурах клітин і іп мімо з використанням систем з лабораторними тваринами. Більше того, цитотоксичність майтанзиноїдів у 1000 разів перевищує цитотоксичність загальноприйнятих хіміотерапевтичних засобів, наприклад, таких як метотрексат, даунорубіцин і вінкристин (див., наприклад, патент США Мо 5208020).
Майтанзиноїди включають майтанзин, майтанзинол, С-3 складні ефіри майтанзинолу й інші аналоги і похідні майтанзинолу (див., наприклад, патенти США МоМо 5208020 і 6441163, усі з яких включені в даний опис як посилання). С-3 складні ефіри майтанзинолу можуть бути такими, що зустрічаються в природі, або можуть мати синтетичне походження. Більше того, як ті, що зустрічаються в природі, так і синтетичні складні ефіри С-3 майтанзинолу, можуть бути підрозділені на С-3 складний ефір з простими карбоновими кислотами або С-3 складний ефір з похідним М-метил-і! -аланіну, причому останній з них є більш цитотоксичним, ніж перший.
Синтетичні аналоги майтанзиноїдів також відомі в даній галузі й описані, наприклад, у Кирспап еї а!., ). Мед. Снет., 21, 31-37 (1978).
Придатні майтанзиноїди для застосування в АЮС за винаходом можуть бути виділені з природних джерел, продуковані синтетично або продуковані напівсинтетичним шляхом. Більше того, майтанзиноїд може бути модифікований будь-яким придатним способом, за умови, що в кінцевій молекулі кон'югата зберігається достатня цитотоксичність. У цьому відношенні, майтанзиноїди позбавлені придатних функціональних груп, з якими антитіла можуть бути зв'язані. Для зв'язування майтанзиноїду з антитілом бажано використовувати лінкерну частину для утворення кон'югата, і вона більш докладно описана в розділі ПВ. Структура ілюстративного майтанзиноїду мертансину (ОМ1), надана нижче: ях А Ше
З шн в : і ши і ї й і нує я о те тт т Шо п І їм г -к НИ -
Мертансин (НМ
Репрезентативні приклади майтанзиноїдів включають, але не обмежуються ними, ОМ1 (М2- деацетил-М-(З-меркапто-1-оксопропілумайтанзин; також позначуваний як мертансин,
лікарський засіб майтанзиноїд 1; Іттипосеп, Іпс.; також див. СпВагі еї аї. (1992), Сапсег Кезв.
Б2:127), ОМ2, ОМ3 (М-деацетил-М2-(4-меркапто-1-оксопентилумайтанзин), ОМА (4-метил-4- меркапто-1-оксопентил)-майтанзин) і майтанзинол (синтетичний аналог майтанзиноїдів). Інші приклади майтанзиноїдів описані в патенті США Мо 8142784, включеному в даний опис як посилання.
Ансамітоцини являють собою групу майтанзиноїдних антибіотиків, які були виділені з різних бактеріальних джерел. Ці сполуки мають потужну протипухлинну активність. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, ансамітоцин РІ1, ансамітоцин Рг, ансамітоцин
РЗ і ансамітоцин РА.
В одному варіанті здійснення винаходу антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним ОМ1. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним ЮОМ2. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним ОМ3. В одному варіанті здійснення антитіло проти
ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним ОМА. а. Алкалоїди рослин
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним алкалоїдом рослин, наприклад таксаном або алкалоїдом барвінку. Алкалоїди рослин являють собою хіміотерапевтичні засоби, що походять з визначених типів рослин. Алкалоїди барвінку одержують з рослин барвінку (саїпагапійизх гозеа), у той час як таксани одержують з кори тиса тихого (ахи5). Як алкалоїди барвінку, так і таксани також відомі як засоби проти мікротрубочок і вони більш докладно описані нижче.
Таксани
Антитіла проти ЕСЕК, описані в даному документі, можуть бути кон'юговані щонайменше з одним таксаном. Термін "таксан", як використовують у рамках винаходу, стосується класу антинеопластичних засобів, які мають механізм впливу на мікротрубочки й мають структуру, що включає структуру таксанового кільця і стереоспецифічний бічний ланцюг, який потрібний для цитостатичної активності. Також у термін "таксан" включені різні відомі похідні, включаючи як гідрофільні похідні, так і гідрофобні похідні. Похідні таксанів включають, але не обмежуючись ними, похідні галактози і манози, описані в міжнародній патентній заявці Мо УМО 99/18113; піперазино- і інші похідні, описані в УМО 99/14209; похідні таксанів, описані в УМО 99/09021, УМО 98/22451 і патенті США Мо 5869680; б-тіопохідні, описані в УМО 98/28288; сульфенамідні похідні, описані в патенті США Мо 5821263; і таксолове похідне, описане в патенті США Мо 5415869, усі з яких включені в даному описі як посилання. Таксанові сполуки раніше були описані в патентах
США МоМо 5641803, 5665671, 5380751, 5728687, 5415869, 5407683, 5399363, 5424073, 5157049, 5773464, 5821263, 5840929, 4814470, 5438072, 5403858, 4960790, 5433364, 4942184, 5362831, 5705503 їі 5278324, усі з яких повністю включені як посилання. Наступні приклади таксанів включають, але не обмежуються ними, доцетаксел (Таксотер; Запоїї Амепії5), паклітаксел (Абраксан або Таксол; Абгахі5 Опсоіоду) і паклітаксел у формі наночастинок (АВІ-007/Абраксен;
Аргахів Віозсієпсе).
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'говане щонайменше з однією молекулою доксетакселу. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з однією молекулою паклітакселу.
Алкалоїди барвінку
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК кон'юговане щонайменше з одним алкалоїдом барвінку. Алкалоїди барвінку являють собою клас специфічних до клітинного циклу лікарських засобів, що діють шляхом інгібування здатності злоякісних клітин поділятися шляхом впливу на тубулін і попередження утворення мікротрубочок. Приклади алкалоїдів барвінку, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, віндезину сульфат, вінкристин, вінбластин і вінорелбін. 2. Протипухлинні антибіотики
Антитіла проти ЕСЕМК за винаходом можна кон'югувати з одним або декількома протипухлинним антибіотиками для лікування злоякісної пухлини. Як використовують у рамках винаходу, термін "протипухлинний антибіотик" означає антинеопластичний лікарський засіб, який блокує ріст клітин, втручаючись в ДНК, і який одержують з мікроорганізмів. Часто протипухлинні антибіотики або руйнують нитки ДНК, або уповільнюють або зупиняють синтез
ДНК. Приклади протипухлинних антибіотиків, що можуть бути включені в АОС проти ЕСЕК за винаходом, включають, але не обмежуються ними, актиноміцини (наприклад, піролої|2,1- сІ/1,4Ібензодіазепіни), антрацикліни, каліхеаміцини і дуокарміцини, більш докладно описані нижче. бо а. Актиноміцини
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним актиноміцином. Актиноміцини являють собою підклас протипухлинних антибіотиків, виділених з бактерій роду 5Бігеріотусе5. Репрезентативні приклади актиноміцинів включають, але не обмежуються ними, актиноміцин Ю (Космеген (також відомий як актиноміцин, дактиноміцин, актиноміцин ІМ, актиноміцин С1|, Гипареск, Іпс.), антраміцин, чикаміцин А, ЮОС-18, мазетраміцин, неотраміцин А, неотраміцин В, поротраміцин, протракарцин В, 502285, сибаноміцин, сибіроміцин і томайміцин. В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним піролобензодіазепіном (РВО). Приклади РОВ включають, але не обмежуються ними, антраміцин, чикаміцин А, 0С-81, мазетраміцин, неотраміцин А, неотраміцин В, поротраміцин, протракарцин В, 5652000 (595-136), 5022202 (206-207), 522285 (270-423), сибаноміцин, сибіроміцин і томайміцин. Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним актиноміцином, наприклад актиноміцином ОО, або щонайменше одним РВО, наприклад димером піролобензодіазепіну (РВО).
Структури РВО можуть бути знайдені, наприклад, у публікаціях патентних заявок США МоМо 2013/0028917 і 2013/0028919 і в УМО 2011/130598 АТ, кожна з яких включена в даний опис як посилання в повному обсязі. Загальна структура РВО представлена нижче: іа маш а
Ян я М, й | в ов -А- 14.
Ко НА й . і їх НІ. Зою Ще ще
Я ше я Е
РВО відрізняються кількістю, типом і положенням замісників, як у їх ароматичних кільцях А, так і в піролокільцях С, і ступенем насичення С-кільця. У В-кінці, як правило, є присутнім імін (М-С), карбіноламін (МН-СН(ОН)) або метиловий ефір карбіноламіну (МН-СН(ОМЄе)) у положенні
М10-С11, що є електрофільним центром, відповідальним за алкілування ДНК. Усі з відомих природних продуктів мають (5)-конфігурацію в хіральному положенні С11а, що забезпечує їм правообертальний вигин при розгляді від С-кільця в напрямку А-кільця. Приклади РВО, описані в даному документі, можна кон'югувати з антитілами проти ЕСЕК за винаходом. Наступні приклади РВО, що можуть бути кон'юговані з антитілами проти ЕСЕК за винаходом, можуть бути знайдені, наприклад, у публікаціях патентних заявок США МоМо 2013/0028917 А! і 2013/0028919 АТ, у патенті США Мо 7741319 В2 і в УМО 2011/130598 АТ і УМО 2006/111759 А1, усі з яких включені у даний опис як посилання в повному обсязі.
Зо З антитілами проти ЕСЕК за винаходом може бути кон'югований репрезентативний димер
РВО, що має наступну формулу ІІ: ско в 7 Й КЗ Во й
Ко | Ї ро "ення р А у А. Мн хи ІЙ Ме зд зр ож у / і х р шен йч А ; і
Н М й й Кано Шк поли щи Не по с ча ї ї р НН Т Що В й ва Ше очи ж К . і ІЙ од а в: 0 Б ве б де:
В2 має формулу ПІ: в - В ко ре К в а 4 кт тех З з ку
Кі ; (ІП)
де А являє собою Св7-арильну групу, х являє собою групу, кон'юговану з лінкерним елементом, вибраним із групи, що складається з -О-, -5-, -(О)0О-, -С(0)-, -МН(С-О)- і - (АМ)-, де
А" вибраний із групи, що складається з Н, Сі-«-алкілу і (СгНаО)тСН»з, де т дорівнює 1-3 і або: () О' являє собою одинарний зв'язок і 02 вибраний із групи, що складається з одинарного зв'язку і -2-(СН?г)-, де 2 вибраний із групи, що складається з одинарного зв'язку, ОО, 5іМНіп дорівнює від 1 до 3; або (ї) СО" являє собою -СНАСН- і 02 являє собою одинарний зв'язок;
В? являє собою Св-ло-арильну групу, необов'язково заміщену одним або декількома замісниками, вибраними з групи, що складається з галогену, нітро, ціано, С.-12-алкокси, Сз-го- гетероциклоалкокси, Св-го-арилокси, гетероарилокси, алкілалкокси, арилалкокси, алкіларилокси, гетероарилалкокси, алкілгетероарилокси, С1-7-алкілу, Сз-;-гетероциклілу і бісоксі-С1-з-алкілену;
Ве ї РЕ? незалежно вибрані з групи, що складається з Н, К, ОН ОК, ЗН, 5, МНег, МНА, МАВ", нітро, Мезоп і галогену; де К і КЕ" незалежно вибрані з групи, що складається з необов'язково заміщеної Сч1-12- алкільної, Сз-го-гетероциклільної і С5-го-арильної групи;
В' вибраний із групи, що складається з Н, Б, ОН, ОК, 5Н, 5, МНг, МНЕ, МНРЕ", нітро,
Мезоп і галогену; або: (а) В"? являє собою Н і В" являє собою ОН, ОРКАУ, де Б" являє собою С.--алкіл; (б) А ї К" утворюють азот-вуглецевий подвійний зв'язок між атомами азоту і вуглецю, з якими вони зв'язані; або (с) В'Є являє собою Н і КЕ" являє собою 50;М, де 7 дорівнює 2 або 3;
КЕ" являє собою групу Сз-і2-алкілену, ланцюг якої може перериватися одним або декількома гетероатомами, вибраними з групи, що складається з 0, 5, МН і ароматичного кільця;
У ї Є вибрані з групи, що складається з 0, 5 і МН;
ВУ, ВУ, ВУ вибрані з тих же груп, що і КУ, В" і РУ, відповідно, і КЕ і В є такими ж, які ЕС і
А", і кожен М являє собою одновалентний фармацевтично прийнятний катіон, або обидві групи
М разом являють собою двовалентний фармацевтично прийнятний катіон.
Вираз "необов'язково заміщений", як використовують у рамках винаходу, стосується
Зо вихідної групи, що може бути незаміщеною або може бути заміщена.
Якщо немає інших указань, термін "заміщений", як використовують у рамках винаходу, стосується вихідної групи, що має один або декілька замісників. Термін "замісник" використовують у загальноприйнятому значенні і він стосується хімічної частини, що ковалентно зв'язана з або, у відповідних випадках, конденсована з вихідною групою. Відома широка множина замісників, а також добре відомі способи їх одержання і внесення в різні вихідні групи.
Сі-2г-алкіл. Термін "Сі-і2-алкіл", як використовують у рамках винаходу, стосується одновалентної частини, одержаної видаленням атома водню від атома вуглецю вуглеводневої сполуки, що має від 1 до 12 атомів вуглецю, які можуть бути аліфатичними або ациклічними і які можуть бути насиченими або ненасиченими (наприклад, частково ненасиченими, повністю ненасиченими). Таким чином, термін "алкіл" включає підкласи алкеніл, алкініл, циклоалкіл і т. д., розглянуті нижче.
Приклади насичених алкільних груп включають, але не обмежуються ними, метил (Сі), етил (Сг), пропіл (Сз), бутил (Са), пентил (Св), гексил (Св) і гептил (Ст).
Приклади насичених лінійних алкільних груп включають, але не обмежуються ними, метил (Сі), етил (Сг), н-пропіл (Сз), н-бутил (Са), н-пентил (аміл) (Св), н-гексил (Св) і н-гептил (Ст).
Приклади насичених розгалужених алкільних груп включають ізопропіл (Сз), ізобутил (Са), втор-бутил (Са), трет-бутил (Са), ізопентил (Св) і неопентил (Сб).
Сз-го-гетероцикліл. Термін "Сз-го-гетероцикліл", як використовують у рамках винаходу, стосується одновалентної частини, одержуваної видаленням атома водню від атома кільця гетероциклічної сполуки, що має від З до 20 атомів кільця, з яких від 1 до 10 є гетероатомами кільця. Переважно, кожне кільце має від З до 7 атомів кільця, з яких від 1 до 4 є гетероатомами кільця.
У цьому контексті приставки (наприклад, Сз-2о, Сз-7, Свв і т. д.) означають кількість атомів кільця або діапазон атомів кільця, як атомів вуглецю, так і гетероатомів. Наприклад, термін "Св. в-гетероцикліл", як використовують у рамках винаходу, стосується гетероциклільної групи, що має 5 або 6 атомів кільця.
Приклади моноциклічних гетероциклільних груп включають, але не обмежуються ними, групи, що походять 3:
Мі: азиридин (Сз), азетидин (Са), піролідин (тетрагідропірол) (Св), піролін (наприклад, 3- 60 піролін, 2,5-дигідропірол) (Св), 2Н-пірол або ЗН-пірол (ізопірол, ізоазол) (Св), піперидин (Сб),
дигідропіридин (Св), тетрагідропіридин (Св), азепін (С7); О:: оксиран (Сз), оксетан (Са), оксолан (тетрагідрофуран) (С5), оксол (дигідрофуран) (Св), оксан (тетрагідропіран) (Св), дигідропіран (Св), піран (Св), оксепін (С7); Зі: тіїран (Сз), тіетан (Са), тіолан (тетрагідротіофен) (Св), тіан (тетрагідротіопіран) (Св), тіепан (С7); О2: діоксолан (С5), діоксан (Сє) і діоксепан (С7); Оз: триоксан (Св); М: імідазолідин (С5), піразолідин (діазолідин) (С5) імідазолін (Св), піразолін (дигідропіразол) (Св), піперазин (Св); МіО:: тетрагідрооксазол (Св), дигідрооксазол (Св), тетрагідроїзоксазол (С5), дигідроїзоксазол (С5), морфолін (Св), тетрагідрооксазин (Св), дигідрооксазин (Св), оксазин (Св); Мі: тіазолін (С5), тіазолідин (С5), тіоморфолін (Св); М2Оч: оксадіазин (Св); 0151: оксатіол (Св) і оксатіан (тіоксан) (Св); і МіО15ч: оксатіазин (Св).
Приклади заміщених моноциклічних гетероциклільних груп включають групи, що походять із сахаридів, у циклічній формі, наприклад фуранози (Св), такі як арабінофураноза, ліксофураноза, рибофураноза і ксилофураноза, і піранози (Свє), такі як алопіраноза, альтропіраноза, глюкопіраноза, манопіраноза, гулопіраноза, ідопіраноза, галактопіраноза і талопіраноза.
Св-го-арил. Термін "Свго-арил", як використовують у рамках винаходу, стосується одновалентної частини, одержуваної видаленням атома водню від атома ароматичного кільця ароматичної сполуки, що має від З до 20 атомів кільця. Переважно, кожне кільце має від 5 до 7 атомів кільця.
У цьому контексті приставки (наприклад, Сз-го, Св-7, Св-в і т. д.) позначають кількість атомів кільця або діапазон кількості атомів кільця, як атомів вуглецю, так і гетероатомів. Наприклад, термін "Свв-арил", як використовують у рамках винаходу, стосується арильної групи, що має 5 або 6 атомів кільця.
В одному варіанті здійснення антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані з димером РВО, що має наступну формулу:
НМ. аа на на и -" ша, тА ї ій: Ї І Ж. сли й т тост по ше Шк м к ях а
Ями в! 9 А роти СОС де представлена вище структура описує димер РВО 5052202 (240-207) і кон'югована з антитілом проти ЕСЕК за винаходом через лінкер Г. 5052202 (20-207) описаний, наприклад, у публікації патентної заявки США Мо 2007/0173497, що включена в даний опис як посилання в повному обсязі.
В іншому варіанті здійснення димер РВО 5650-1882 кон'югований з антитілом проти ЕСЕК
Зо за винаходом через лікарський засіб-лінкер, як представлено на фіг. 21. 5250-1882 описаний у зЗйіпепапа еї а). (2013), Віосій, 122(8):1455, і в публікації патентної заявки США Мо 2013/0028919, що включена в даний опис як посилання в повному обсязі. Як описано на фіг. 21, димер РВО
За0-1882 може бути кон'югований з антитілом через тос-маІ-аїа-дипептидний лінкер (у сукупності позначуваний як 5550-1910 на фіг. 21). У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК, як описано в даному документі, кон'юговане з димером РВО, описаним на фіг. 21.
Таким чином, у наступному варіанті здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, як описано в даному документі, кон'югованого з димером РВО через тос-маІ-аїа-дипептидний лінкер, як описано на фіг. 21. У визначених варіантах здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, яке містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить домен СОМКЗ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:12, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:11, ї домен СОКТ, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:10, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить домен СОМЗ, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО:8, домен СОК2, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:7, і домен СОКТ, який містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ
МО:6, кон'югованого з РВО, включаючи, але не обмежуючись цим, димер РВО, описаний на фіг. 21. У визначених варіантах здійснення винахід стосується антитіла проти ЕСЕК, що містить варіабельну область важкого ланцюга АБА, визначувану амінокислотною послідовністю, зазначеною в ЗЕО ІЮ МО:9, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:5, де антитіло кон'юговане з РВО, таким як, але не обмежуючись цим, ілюстративний димер РВО, представлений на фіг. 21. р. Антрацикліни
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антрацикліном. Антрацикліни являють собою підклас протипухлинних антибіотиків, виділених з бактерій роду 5ігеріотусе5. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, даунорубіцин (Церубідин, Веагога І арогайфогієх), доксорубіцин (Адріаміцин, Веагога І арогайгіев; також позначуваний як доксорубіцину гідрохлорид, гідроксидаунорубіцин і Рубекс), епірубіцин (Еленс, Рії7ег) і ідарубіцин (Ідаміцин; Ріїгег Іпс.). Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним антрацикліном, наприклад доксорубіцином. с. Каліхеаміцини
Антитіла проти ЕСЕМК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним каліхеаміцином. Каліхеаміцини являють собою сімейство ендіїнових антибіотиків, що походять з грунтового організму Місготопозрога еспіпозрога. Каліхеаміцини зв'язують малу борозенку ДНК і індукують дволанцюжкові розриви ДНК, що приводить до загибелі клітин, у 100 разів більшої, ніж у випадку інших хіміотерапевтичних засобів (Юатіе еї аІ. (2003), Си. Оріп. РНаптасо!). 3:386). Одержання каліхеаміцинів, які можна використовувати як кон'югати лікарських засобів у рамках винаходу, було описане, див. патенти США МоМо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 і 5877296. Структурні аналоги каліхеаміцину, які можна використовувати, включають, але не обмежуються ними, у, 02), аз, М-ацетил-у:ї, РБАС і 61 (Ніптап єї аЇ., Сапсег Везеагсі. 53:3336-3342 (1993), І оде єї а!., Сапсег Везєагсі. 58:2925-2928 (1998), і згадані вище патенти США МоМо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 ії 5877296). Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним каліхеаміцином. а. Дуокарміцини
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним дуокарміцином. Дуокарміцини являють собою підклас протипухлинних антибіотиків, виділених з бактерій роду Зігеріотусе5 (див. Мадатига апа Зайо (1998), СПпетівігу ої Неїегосусіїс
Сотроипав5, Мої. 34, Мо. 12). Дуокарміцини зв'язуються з малою борозенкою ДНК їі алкілують нуклеотидну основу аденін у положенні МЗ (Водег (1993), Риге апа Аррі Спет. 65(6):1123; і
Водег апа Хдопп5зоп (1995), РМА5, ОА, 92:3642). Синтетичні аналоги дуокарміцинів включають, але не обмежуються ними, адозелезин, бізелезин і карзелезин. Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з одним
Зо дуокарміцином. е. Інші протипухлинні антибіотики
На доповнення до вищевказаного, додаткові протипухлинні антибіотики, які можна використовувати в АОС проти ЕСЕК за винаходом, включають блеоміцин (Віепохапе, Вгізіо1-
Муег5 Запнпірб), мітоміцин і плікаміцин (також відомий як мітраміцин). 3. Імуномодулюючі засоби
В одному аспекті антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним імуномодулюючим засобом. Як використовують у рамках винаходу, термін "імуномодулюючий засіб" стосується засобу, який може стимулювати або модифікувати імунну відповідь. В одному варіанті здійснення імуномодулюючий засіб являє собою імуностимулятор, що підсилює імунну відповідь у індивідуума. В іншому варіанті здійснення імуномодулюючий засіб являє собою імунодепресант, що запобігає або знижує імунну відповідь у індивідуума.
Імуномодулюючий засіб може модулювати мієлоїдні клітини (моноцити, макрофаги, дендритні клітини, мегакаріоцити і гранулоцити) або лімфоїдні клітини (Т-клітини, В-клітини і натуральні кілерні (МК) клітини) і будь-яку далі диференційовану їх клітину. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, бацилу Кальметта-Герена (ВСО) і левамізол (Ергамізол). Інші приклади імуномодулюючих засобів, які можна використовувати в АЮС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, вакцини проти злоякісної пухлини, цитокіни і імуномодулюючу генну терапію. а. Вакцини проти злоякісної пухлини
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані з вакциною проти злоякісної пухлини. Як використовують у рамках винаходу, термін "вакцина проти злоякісної пухлини" стосується композиції (наприклад, пухлинного антигену і цитокіну), що індукує пухлиноспецифічну імунну відповідь. Відповідь індукується власною імунною системою індивідуума при введенні вакцини проти злоякісної пухлини або, у випадку даного винаходу, при введенні АЮС, що містить антитіло проти ЕСЕК і вакцину проти злоякісної пухлини. У переважних варіантах здійснення імунна відповідь приводить до усунення пухлинних клітин в організмі (наприклад, первинні або метастатичні пухлинні клітини). Застосування вакцин проти злоякісної пухлини, як правило, включає введення конкретного антигену або групи антигенів, які, наприклад, присутні на поверхні конкретної злоякісної клітини або присутні на поверхні бо конкретного інфекційного агента, для якого показано, що він сприяє утворенню злоякісної пухлини. У деяких варіантах здійснення застосування вакцин проти злоякісної пухлини призначене для профілактичних цілей, у той час як в інших варіантах здійснення застосування призначене для терапевтичних цілей. Необмежувальні приклади вакцин проти злоякісної пухлини, які можна використовувати в АОС проти ЕСЕК за винаходом, включають рекомбінантну двовалентну вакцину проти вірусу папіломи людини (НРУ) 16 і 18 типів (Сегмагіх,
СІахоб5ІтййпКіїпе), рекомбінантну чотиривалентну вакцину проти вірусу папіломи людини (НРМ) 6, 11, 16 і 18 типів (Сагаабхії, МегоскК 5 Сотрапу) і сипулейцел-Т (Ргомепде, ЮОепагеоп). Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК за винаходом кон'юговане щонайменше з однією вакциною проти злоякісної пухлини, що є або імуностимулятором, або імунодепресантом. р. Цитокіни
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним цитокіном. Термін "цитокін", як правило, стосується білків, що вивільняються однією популяцією клітин, які діють на іншу клітину як міжклітинні медіатори. Цитокіни прямо стимулюють імунні ефекторні клітини і стромальні клітини в області пухлини і підсилюють розпізнавання пухлинних клітин цитотоксичними ефекторними клітинами (ее апа Магодоїїп (2011), Сапсеге5, 3:3856).
Численні дослідження в моделях пухлини на тваринах продемонстрували, що цитокіни мають широку протипухлинну активність, і це обумовило ряд підходів терапії злоякісної пухлини на основі цитокінів (ее апа Магооїї, вище). В останні роки почалися клінічні випробування ряду цитокінів, включаючи СЗМ-СОР, 1-7, І/-12, 1-15, 1-18 ї 1-21, для пацієнтів з розгорнутою злоякісною пухлиною (І ее апа Магооїї, вище).
Приклади цитокінів, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, паратиреоїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксин; глікопротеїнові гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон (ЕЗН), тиреостимулюючий гормон (ТЗН) і лютеїнізуючий гормон (ІН); фактор росту печінки; фібробластний фактор росту; пролактин; плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлини;
Мюллерову інгібуючу речовину; асоційований з гонадотропіном миші пептид; інгібін; активін; судинно-ендотеліальний фактор росту; інтегрин; тромбопоетин (ТРО); фактори росту нервів, такі як МО; тромбоцитарний фактор росту; трансформуючі фактори росту (ТОБ);
Зо інсуліноподібний фактор росту-І і -П; еритропоетин (ЕРО); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі як інтерферон а, ВД їі у, колонієстимулюючі фактори (С5Е); гранулоцитарно- макрофагальний С-5Е (СМ-С5БЕ) і гранулоцитарний С5Е (5-С5БЕ); інтерлейкіни (ІЇ), такі як 1-1,
І -тТе, 1-2, 1-3, 11 -4, 1-5, 1-6, 11 -7, 1-8, 1-9, 1-11, 11-12; фактор некрозу пухлини і інші поліпептидні фактори, включаючи ГІЕ і Кі-ліганд (КІ). Як використовують у рамках винаходу, термін "цитокін" включає білки з природних джерел або з рекомбінантної культури клітин і біологічно активні еквіваленти цитокінів з нативною послідовністю. Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід стосується АЮС, що містить антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, і цитокін. с. Колонієстимулюючі фактори (С5Е)
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним колонієсєтимулюючим фактором (С5Е). Колонієстимулюючі фактори (СЗЕ) являють собою фактори росту, що сприяють утворенню в кістковому мозку еритроцитів. Оскільки деякі способи лікування злоякісної пухлини (наприклад, хіміотерапія) можуть впливати на лейкоцити (які допомагають боротися з інфекцією), колонієстимулюючі фактори можна вводити для підтримання рівнів лейкоцитів і посилення імунної системи. Колонієстимулюючі фактори також можна використовувати після трансплантації кісткового мозку, щоб сприяти початку продукування новим кістковим мозком лейкоцитів. Репрезентативні приклади С5Е, які можна використовувати в АЮС проти ЕСЕК за винаходом, включають, але не обмежуються ними еритропоетин (Епоетин), філграстим (Неопоген (також відомий як гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (5-С5Е); Атдеп, Іпс.), сарграмостим (лейкін (гранулоцитарно- макрофагальний колонієстимулюючий фактор і ЗМ-С5Е); Сепгуте Согрогайоп), промегапоетин і Опрелвекін (рекомбінантний 1-11; Ріїгег, Іпс.). Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід стосується АОС, що містить антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, і СЕ. 4. Генна терапія
Антитіло проти ЕСЕК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з однією нуклеїновою кислотою (прямо або непрямо через носій) для генної терапії. Генна терапія, головним чином, стосується введення генетичного матеріалу в клітину, причому генетичний матеріал призначений для лікування захворювання. Оскільки вона стосується імуномодулюючих засобів, генну терапію використовують для стимуляції природної здатності бо індивідуума інгібувати проліферацію злоякісних клітин або знищувати злоякісні клітини. В одному варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК за винаходом містить нуклеїнову кислоту, кодуючу функціональний терапевтичний ген, який використовують для заміни мутантного або іншим чином нефункціонального (наприклад укороченого) гена, асоційованого зі злоякісною пухлиною.
В інших варіантах здійснення АОС проти ЕСЕК за винаходом містить нуклеїнову кислоту, яка кодує або іншим чином забезпечує продукцію терапевтичного білка для лікування злоякісної пухлини. Нуклеїнову кислоту, кодуючу терапевтичний ген, можна прямо кон'югувати з антитілом проти ЕСЕК або, альтернативно, її можна кон'югувати з антитілом проти ЕСЕК через носій.
Приклади носіїв, які можна використовувати для доставки нуклеїнової кислоти для генної терапії, включають, але не обмежуються ними, вірусні вектори або ліпосоми. 5. Алкілувальні засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані з одним або декількома алкілувальними засобами. Алкілувальні засоби являють собою клас антинеопластичних сполук, що зв'язують алкільну групу з ДНК. Приклади алкілувальних засобів, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, алкілсульфонати, етиленіміни, похідні метиламіну, епоксиди, азотисті іприти, нітрозосечовину, триазини і гідразини. а. Алкілеоульфонати
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним алкілсоульфонатом. Алкілсоульфонати являють собою підклас алкілувальних засобів загальної формули: В-502-0О-В', де К і ЕВ", як правило, являють собою алкільні або арильні групи.
Репрезентативний приклад алкілсульфонатів включає, але не обмежується цим, бусульфан (Мірелан, СіахозтіййКіїпе; Бусулфекс ІМ, РОГ. ВіоРпагта, Іпс.). р. Азотисті іприти
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним азотистим іпритом. Репрезентативні приклади цього підкласу сполук проти злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, хлорамбуцил (Лейкеран, СІахоЗптійНКіїпе), циклофосфамід (Цитоксан, Вгіз(оІ-Муег5 Зднпірр; Неосар, Рії2ег, Іпс.), естрамустин (естрамустин натрію фосфат або Естрацит, Рії7ег, Іпс.), іросфамід (Ваїгс, ВгієтоІ-Муег5 б5адпібб), мехлоретамін (Мустарген, Гипабреск пс.) ії мелфалан (Алкеран або і-Рат або фенілаланін-іприт;
Сіахозт ПНКІЇпе).
Зо с. Нітрозосечовина
Антитіло проти ЕСЕМК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з однією сполукою нітрозосечовини. Сполуки нітрозосечовини являють собою підклас алкілувальних засобів, що є жиророзчинними. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, кармустин (ВСМО (також відомий як ВіСМИО, М,М-біс(2-хлоретил)-М-нітрозосечовина або 1,3-біс(2- хлоретил)-І-нітрозосечовина)!, Вгіз(оІ-Муег5 Зацірр), фотемустин (також відомий як Муфоран), ломустин (ССМИО або 1-(2-хлоретил)-3З-циклогексил-1-нітрозосечовина, ВгібіоІ-Муєтв Бапірб), німустин (також відомий як АСМИ) і стрептозоцин (2апозаг, Тема Рпагтасешіса!5). й. Триазини і гідразини
Антитіло проти ЕСЕК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним триазином або гідразином. Триазини і гідразини являють собою підклас азотовмісних алкілувальних засобів. У деяких варіантах здійснення ці сполуки мимовільно розкладаються або можуть метаболізуватися з утворенням алкілдіазонієвих проміжних сполук, що сприяють перенесенню алкільної групи на нуклеїнові кислоти, пептиди і/або поліпептиди, тим самим викликаючи мутагенні, канцерогенні або цитотоксичні ефекти. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, дакарбазин (ОТІС-Юоте, Вауєї Неаййсаге РНаптасешііса!в Іпс.), прокарбазин (Муталан, бідта-Тац РПаптасешіса!є, Іпс.) ії темозоломід (Темодар, Зспегіпд
Ріоцан). е. Інші алкілувальні засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним етиленіміном, похідним метиламіну або епоксидом. Етиленіміни являють собою підклас алкілувальних засобів, які, як правило, містять щонайменше одне азиридинове кільце. Епоксиди являють собою підклас алкілувальних засобів, які охарактеризовані як циклічні прості ефіри тільки з трьома атомами кільця.
Репрезентативні приклади етиленімінів включають, але не обмежуються ними, тіотепу (Тіоплекс, Атдеп), діазиквон (також відомий як азиридинілбензохінон (А2О))) і мітоміцин С.
Мітоміцин С являє собою природний продукт, що містить азиридинове кільце і, очевидно, індукує цитотоксичність за допомогою перехресного зшивання ДНК (боїгт К.Т. еї аїЇ., Сапсег Кев. 1985:45:3510; Кеппеду К.А. еї аІ.,, Сапсег Ке5. 1985;45:3541). Репрезентативні приклади похідних метиламіну і їх аналогів включають, але не обмежуються цим, алтретамін (Гексален, 60 МО Ріапгта, Іпс.), що також відомий як гексаметиламін і гексастат. Репрезентативні приклади епоксидів цього класу сполук проти злоякісної пухлини включають, але не обмежуються цим, діангідрогалактит. Діангідрогалактит (1,2:5,6-діангідродульцит) є хімічно спорідненим азиридинам і, як правило, сприяє перенесенню алкільної групи за допомогою подібного механізму, як описано вище. Дибромдульцит гідролізується до діангідролактиту і, таким чином, являє собою проліки епоксиду (Зеїеї С. еї аІ., Сапсег СпетоїШег Кер. 1969;53:377). 6. Антиангіогенні засоби
В одному аспекті антитіла проти ЕСЕЕК, описані в даному документі, за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антиангіогенним засобом. Антиангіогенні засоби інгібують ріст нових кровоносних судин. Антиангіогенні засоби виявляють їх ефекти різними шляхами. У деяких варіантах здійснення ці засоби перешкоджають здатності фактора росту досягати своєї мішені. Наприклад, судинно-ендотеліальний фактор росту (МЕСЕ) являє собою один з основних білків, залучених в ініціацію ангіогенезу шляхом зв'язування з конкретними рецепторами на клітинній поверхні. Таким чином, визначені антиангіогенні засоби, що перешкоджають взаємодії МЕСЕ з розпізнаваним ним рецептором, перешкоджають ініціації ангіогенезу за допомогою МЕСЕ. В інших варіантах здійснення ці засоби перешкоджають каскадам внутрішньоклітинної передачі сигналу. Наприклад, після запуску конкретного рецептора на поверхні клітини ініціюється каскад інших хімічних сигналів, що забезпечують ріст кровоносних судин. Таким чином, визначені ферменти, наприклад деякі тирозинкінази, про які відомо, що вони сприяють каскадам внутрішньоклітинної передачі сигналу, які беруть участь, наприклад, у проліферації клітин, є мішенями для лікування злоякісної пухлини. В інших варіантах здійснення ці засоби перешкоджають каскадам міжклітинної передачі сигналу. Крім того, в інших варіантах здійснення ці засоби блокують конкретні мішені, що активують і стимулюють ріст клітин або прямо перешкоджають росту клітин кровоносних судин. Властивості інгібування ангіогенезу були виявлені більше ніж у 300 речовин з численними прямими і непрямими інгібіторними ефектами.
Репрезентативні приклади антиангіогенних засобів, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, ангіостатин, АВХ ЕСЕ, С1-1033, РКІ-166, вакцину проти ЕСЕ, ЕКВ-569, СМУ2016, ІСВ8А-62, ЕМО 55900, СРЗБ58, РО153035, АС1478, ІМО-
С225 (Ербітукс, 201839 (Іресса), О51І-774, Ерлотиніб (тарцева), ангіостатин, арестин,
Зо ендостатин, ВАМ 12-9566 і з фторурацилом або доксорубіцином, канстатин, карбоксіамідотриазол і з паклітакселом, ЕМО121974, 5-24, вітаксин, диметилксантеноноцтову кислоту, ІМ862, інтерлейкін-12, інтерлейкін-2, ММ-3, НимММУ833, РТК787, КпиМаб, ангіозим (рибозим), ІМСО-1С11, Неовастат, маримастат, приномастат, ВМ5-275291,001І1-3, ММ1270,
ЗИ101, 506668, 5011248, 505416, з паклітакселом, з гемцитабіном і цисплатином, і з іринотеканом і цисплатином і променевою терапією, текогалан, темозоломід і РЕС-інтерферон- а20, тетратіомолібдат, ТМР-470, талідомід, СС-5013 і з таксотером, темстатин, 2- метоксіестрадіол, пастку МЕСЕ, інгібітори ттТОК (дефоролімус, еверолімус (Афінітор, Момагіів
РПпагтасешіса! Согрогайоп) і темсиролімус (Торисел, Ріїгег, Іпс.)), інгібітори тирозинкінази (наприклад, ерлотиніб (Тарцева, Сепепіесії, Іпс.), іматиніб (Глівек, Момапіх РНаптасеціїсаї
Согрогаїйоп), гефітиніб (Іресса, Азіга/епеса РІагтасеціїсаіІ5), дасатиніб (Зргусеї, Вгубіо!-Муеєтв зЗапцібб), сунітиніб (Сутент, Рії7ег, Іпс.), нілотиніб (Тасигна, Момагібх Рпаппасешіса! Согрогаїйоп), лапатиніб (Тайкерб, СіахозЗптійпКіїпе Рпагтасеціїсаі5), сорафеніб (Нексавар, Вауег апа Опух), фосфоінозитид-3-кінази (РІЗК). 7. Антиметаболіти
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антиметаболітом. Антиметаболіти являють собою типи хіміотерапевтичних засобів, що дуже подібні з нормальними речовинами в клітині. Коли клітини включають антиметаболіт у клітинний метаболізм, результат є негативним для клітини, наприклад клітина стає нездатною поділятися.
Антиметаболіти класифікують залежно від речовин, яким вони протидіють. Приклади антиметаболітів, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, антагоніст фолієвої кислоти (наприклад, метотрексат), антагоніст піримідину (наприклад, 5-фторурацил, фоксуридин, цитарабін, капецитабін і гемцитабін), антагоніст пурину (наприклад, б-меркаптопурин і б-тіогуанін) і інгібітор аденозиндезамінази (наприклад, кладрибін, флударабін, неларабін і пентостатин), як більш докладно описано нижче. а. Антифолати
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антифолатом. Антифолати являють собою підклас антиметаболітів, що є структурно подібними з фолатом. Репрезентативні приклади включають, але не обмежуються ними, метотрексат, 4- бо амінофолієву кислоту (також відому як аміноптерин і 4-аміноптероєва кислота), лометрексол
(/МтТХ), пеметрексед (Алімпта, Еїї (Шу апа Сотрапу) і триметрексат (Нейтрексин, Веп Мепие
І арогайогієвв, Іпс.) р. Антагоністи пуринів
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антагоністом пуринів. Аналоги пуринів являють собою підклас антиметаболітів, що структурно подібні з групою сполук, відомих як пурини. Репрезентативні приклади антагоністів пуринів включають, але не обмежуються ними, азатіоприн (Азасан, Заїїх; Ітигап, сіахо5тійНКіІїпе), кладрибін (Лейстатин (також відомий як 2-СаА|, дап5зеп Віотесі, Іпс.), меркаптопурин (Пуринтол
Їгакож відомий як б-меркаптоетанолі, СіахобтіййКіІїпе), флударабін (Флудара, Сеплуте
Согрогайоп), пентостатин (Ніпент, також відомий як 2'-дезоксикоформіцин (ОСЕ)), б-тіогуанін (Ланвіс (гакож відомий як тіогуанін|, біахозптійНКІЇїпе). с. Антагоністи піримідинів
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антагоністом піримідинів. Антагоністи піримідинів являють собою підклас антиметаболітів, що структурно подібні з групою сполук, відомих як пурини. Репрезентативні приклади антагоністів піримідинів включають, але не обмежуються ними, азацитидин (Відаза, СеІдепе Согрогайоп), капецитабін (Кселода, Коспе І арогайгіє5), Цитарабін (також відомий як цитозину арабінозид і арабінозилцитозин, Веаїога І арогаїюогіе5), децитабін (Дакоген, Еїзаії РІагтасешііса!5), 5- фторурацил (Адруцил, Тема Рпаппасешіса!І5; Ефудекс, МаІеапі Рпапгтасеціїса!5, Іпс.), 5-фтор-2- дезоксіуридин 5'-фосфат (ЕЯОМР), 5-фторуридину трифосфат і гемцитабін (Гемзар, Еїї | Шу апа
Сотрапу). 8. Боровмісні засоби
Антитіло проти ЕСЕМК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним боровмісним засобом. Боровмісні засоби включають клас терапевтичних сполук проти злоякісної пухлини, що перешкоджають клітинній проліферації. Репрезентативні приклади боровмісних засобів включають, але не обмежуються ними, борфіцин їі бортезоміб (Велкада,
МіПепійт РНаптасецііса!5). 9. Хемопротективні засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним
Зо хемопротективним засобом. Хемопротективні лікарські засоби являють собою клас сполук, що допомагають захистити організм від конкретних токсичних ефектів хіміотерапії. Хемопротективні засоби можна вводити з проведенням різних способів хіміотерапії, щоб захистити здорові клітини від токсичних ефектів хіміотерапевтичних лікарських засобів, одночасно дозволяючи обробку злоякісних клітин введеним хіміотерапевтичним засобом. Репрезентативні хемопротективні засоби включають, але не обмежуються ними, аміфостин (Етіол, Медіттипе,
Іпс.), який використовують для зменшення ниркової токсичності, асоційованої із сукупними дозами цисплатину, дексразоксан (Тотект, Аргіси5 РІапта; Зинекард), для лікування екстравазації, що викликається введенням антрацикліну (Тотект), і для лікування серцевих ускладнень, що викликаються введенням протипухлинного антибіотика доксорубіцину (Зинекард) і месни (Меснекс, ВгізіоІ-Муег5 заціБр), які використовують для попередження геморагічного циститу в ході хіміотерапевтичного лікування іфосфамідом. 10. Гормональні засоби
Антитіло проти ЕСЕМК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним гормональним засобом. Гормональний засіб (що включає синтетичні гормони) являє собою сполуку, яка перешкоджає продукуванню або активності ендогенно продукованих гормонів ендокринної системи. У деяких варіантах здійснення ці сполуки перешкоджають росту клітин або викликають цитотоксичний ефект. Необмежувальні приклади включають андрогени, естрогени, медроксипрогестерону ацетат (Провера, Рії?ег, Іпс.) і прогестини. 11. Антигормональні засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним антигормональним засобом. "Антигормональний" засіб являє собою засіб, що пригнічує продукування і/або перешкоджає функції визначених ендогенних гормонів. В одному варіанті здійснення антигормональний засіб перешкоджає активності гормону, вибраного з групи, що включає андрогени, естрогени, прогестерон і рилізинг-фактор гонадотропіну, тим самим перешкоджаючи росту різних злоякісних клітин. Репрезентативні приклади антигормональних засобів включають, але не обмежуються ними, аміноглутетимід, анастрозол (Аримідекс,
Авігалепеса /РІпапгтасецшііса!5), бікалутамід (Касодекс, Авігалепеса РІагтасеціса!5), ципротерону ацетат (Ципростат, Вауег РІ С), дегарелікс (Фірмагон, Реїгтіпд РПагтасешііса!5), екземестан (Аромазин, Ріїгег Іпс.), флутамід (Дрогеніл, ЗсПпегіпа-Ріосчдй Цїа.), фулвестрант 60 (Фаслодекс, Абігалепеса Рпаптасецшіїйса!5), гозерелін (Золодекс, Авзігалепеса РПагтасецшціса!5),
лектрозол (Фемара, Момапйіб5х РВНагтасешісаі5 Согрогайоп), леупролід (Простап), люпрон, медроксипрогестерону ацетат (Провера, Рії2ег Іпс.), мегестролу ацетат (Мегейс, ВгізіоІ-Муегв5 здцірБ Сотрапу), тамоксифен (Нолвадекс, Абігалепеса РВІаптасешіса!5) і трипторелін (Декапетил, Реїтіпо). 12. Кортикостероїди
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним кортикостероїдом. Кортикостероїди можна використовувати в АОС за винаходом для зниження запалення. Приклад кортикостероїду включає, але не обмежується цим, глюкокортикоїд, наприклад преднізон (Дельтазон, Рпагтасіа 5 Оріопп Сотрапу, відділення Рії?ег, Іпос.). 13. Фотоактивні лікарські засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним фотоактивним лікарським засобом. Фотоактивні лікарські засоби включають сполуки, які можна доставляти для знищення оброблених клітин під дією електромагнітного випромінювання з конкретною довжиною хвилі. Терапевтично значимі сполуки поглинають електромагнітне випромінювання при довжинах хвиль, що проникають у тканину. У переважних варіантах здійснення сполуку вводять у нетоксичній формі, яка здатна викликати фотохімічний ефект, що є токсичним для клітин або тканини при достатній активації. В інших переважних варіантах здійснення ці сполуки затримуються злоякісною тканиною і без складностей виводяться з нормальних тканин. Необмежувальні приклади включають різні хромогени і барвники. 14. Олігонуклеотиди
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним олігонуклеотидом. Олігонуклеотиди складаються з коротких ланцюгів нуклеїнових кислот, які діють, перешкоджаючи переробці генетичної інформації. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди для застосування в АОС являють собою немодифіковані одноланцюжкові і/або дволанцюжкові молекули ДНК або РНК, у той час як в інших варіантах здійснення ці терапевтичні олігонуклеотиди являють собою хімічно модифіковані одноланцюжкові і/або дволанцюжкові молекули ДНК або РНК. В одному варіанті здійснення олігонуклеотиди, використовувані в АОС, є відносно короткими (19-25 нуклеотидів) і гібридизуються з унікальною послідовністю нуклеїнової кислоти в загальній сукупності нуклеїнових кислот-мішеней, присутніх
Зо у клітинах. Деякі з важливих оолігонуклеотидних технологій включають антисмислові олігонуклеотиди (включаючи РНК-інтерференцію (РНКІ)), аптамери, Сро-олігонуклеотиди і рибозими. а. Антисмислові олігонуклеотиди
Антитіло проти ЕСЕК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним антисмисловим олігонуклеотидом. Антисмислові олігонуклеотиди конструюють для зв'язування з РНК за допомогою гібридизації за принципом Уотсона-Кріка. У деяких варіантах здійснення антисмисловий олігонуклеотид комплементарний нуклеотиду, кодуючому область, домен, частину або сегмент ЕСЕК. У деяких варіантах здійснення антисмисловий олігонуклеотид містить від приблизно 5 до приблизно 100 нуклеотидів, від приблизно 10 до приблизно 50 нуклеотидів, від приблизно 12 до приблизно 35 і від приблизно 18 до приблизно 25 нуклеотидів.
У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид щонайменше на 5095, щонайменше на 60965, щонайменше на 7095, щонайменше на 8095, щонайменше на 9095, щонайменше на 95965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995 або щонайменше на 10095 гомологічний області, частині, домену або сегменту гена ЕСЕК. У деяких варіантах здійснення існує суттєва гомологія послідовностей на протязі щонайменше 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 або 100 послідовно розташованих нуклеотидів гена ЕСЕК. У переважних варіантах здійснення розмір цих антисмислових олігонуклеотидів знаходиться в діапазоні від 12 до 25 нуклеотидів у довжину, причому довжина більшості антисмислових олігонуклеотидів складає від 18 до 21 нуклеотидів. Існує множина механізмів, які можна використовувати для інгібування функції РНК після зв'язування олігонуклеотиду з РНК-мішенню (СтгооКе 5.Т. (1999),
Віоспіт. Віорпуз. Асіа, 1489, 30-42). Найкращим чином охарактеризований антисмисловий механізм приводить до розщеплення РНК-мішенні ендогенними клітинними нуклеазами, такими як РНКаза НН або нуклеаза, асоційована з механізмом РнНК-інтерференції. Однак олігонуклеотиди, що інгібують експресію гена-мішені за допомогою некаталітичних механізмів, таких як модулювання сплайсингу або зупинення трансляції, також можуть бути потужними і селективними модуляторами функції генів.
Іншим залежним від РНКаз антисмисловим механізмом, що нещодавно привернув суттєву увагу, є РНКІ (Ріге еї аї. (1998), Маїиге, 391, 806-811.; 7атоге Р.О. (2002), 5сієпсе, 296, 1265- 1269.). РНК-інтерференція (РНКі) являє собою посттранскрипційний процес, у якому бо дволанцюжкова РНК інгібує експресію генів специфічним для послідовності чином. У деяких варіантах здійснення ефекту РНКі досягають шляхом введення відносно більш довгої дволанцюжкової РНК (длРНК (азкМА)), у той час як у переважних варіантах здійснення цього ефекту РНКі досягають шляхом введення більш коротких дволанцюжкових РНК, наприклад малих інтерферуючих РНК (міРнНК (зікМА)) і/або мікроРНК (тікфМА). В іншому варіанті здійснення РНКі також можна досягати шляхом введення плазміди, яка продукує длРНК, комплементарну гену-мішені У кожному із зазначених вище варіантів здійснення дволанцюжкова РНК призначена для перешкоджання експресії гена з конкретною послідовністю-мішенню в клітинах. Як правило, механізм включає перетворення длРНК у короткі РНК, що направляють рибонуклеази до гомологічних мРНК-мішеней (узагальнено,
КимкКип, Зсіепсе, 2294:797 (2001)), які потім руйнують відповідну ендогенну мРНК, тим самим забезпечуючи модулювання експресії гена. Примітно, було описано, що длРНК мають антипроліферативні властивості, що дає можливість також передбачати терапевтичні застосування (Асєбеї еї аї., Ргос. Маї!. Асай. 5сі., ОБА, 88:906 (1991)). Наприклад, було показано, що синтетична длРНК інгібує ріст пухлини у мишей (І ему єї а). Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА, 62:357- 361 (1969)), є активною при лікуванні лейкозу у мишей (2еїІегпіск еї аї., Ргос. ос. Ехр. Віої. Меа. 130:126-128 (1969)) і інгібує хімічно індуковане утворення пухлини в шкірі миші (сеїроїп еї аї.,
Зсіепсе, 167:205-207 (1970)) Таким чином, у переважному варіанті здійснення винахід стосується застосування антисмислових олігонуклеотидів у АОС для лікування раку молочної залози. В інших варіантах здійснення винахід стосується композицій і способів для початку ініціації лікування антисмисловим олігонуклеотидом, де длРНК перешкоджає експресії в клітині- мішені ЕСЕК на рівні мРНК. Як використовують вище, длРНК належить до РНК, що зустрічається в природі, частково очищеної РНК, рекомбінантно продукованої РНК, синтетичної
РНК, а також зміненої РНК, що відрізняється від РНК, що зустрічається в природі, включенням нестандартних нуклеотидів, ненуклеотидного матеріалу, аналогів нуклеотидів (наприклад, замкнута нуклеїнова кислота (І МА)), дезоксирибонуклеотидів і будь-якої їх комбінації. РНК за винаходом повинна бути тільки достатньо подібною з природною РНК, щоб вона мала здатність опосередковувати модулювання на основі антисмислового олігонуклеотиду, описаного в даному документі. р. Аптамери
Зо Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним аптамером. Аптамер являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка вибрана з випадкових сукупностей молекул, виходячи з її здатності зв'язувати інші молекули. Подібно антитілам, аптамери можуть зв'язувати молекули-мішені з надзвичайною афінністю і специфічністю. У багатьох варіантах здійснення аптамери приймають комплексні, залежні від послідовності, тривимірні форми, які дозволяють їм взаємодіяти з білоом-мішенню, що приводить до міцно зв'язаного комплексу, аналогічного взаємодії антитіло-антиген, тим самим перешкоджаючи функції зазначеного білка. Конкретна здатність аптамерів міцно і специфічно зв'язуватися з їх білком-мішенню лежить в основі їх потенціалу як спрямованих молекулярних терапевтичних засобів. с. бра-олігонуклеотиди
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним Сро- олігонуклеотидом. Відомо, що бактеріальна і вірусна ДНК є потужними активаторами як уродженого, так і специфічного імунітету у людини. Ці імунологічні характеристики асоційовані з неметильованими СрО-динуклеотидними мотивами, що зустрічаються в бактеріальній ДНК.
Завдяки тому факту, що ці мотиви є рідкими у людини, в імунній системі людини розвилася здатність розпізнавати ці мотиви як ранню ознаку інфекції, а потім ініціювати імунні відповіді.
Таким чином, олігонуклеотиди, що містять цей Сро-мотив, можна використовувати для ініціації протипухлинної імунної відповіді. а. Рибозими
Антитіло проти ЕСЕК за винаходом може бути кон'юговане щонайменше з одним рибозимом. Рибозими являють собою каталітичні молекули РНК, що мають довжину в діапазоні приблизно від 40 до 155 нуклеотидів. Здатність рибозимів розпізнавати і розщеплювати визначені молекули РНК робить їх потенційними кандидатами для терапевтичних засобів.
Репрезентативний приклад включає ангіозим. 15. Радіонуклідні засоби (радіоактивні ізотопи)
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним радіонуклідним засобом. Радіонуклідні засоби включають засоби, що характеризуються нестабільним ядром, яке здатне піддаватися радіоактивному розпаду. Основа для успішного лікування радіонуклідом залежить від достатньої концентрації і тривалого утримання бо радіонукліда злоякісної клітини. Інші враховувані фактори включають час напівжиття радіонукліда, енергію випромінюваних частинок і максимальний діапазон, на який випромінювана частинка може проходити. У переважних варіантах здійснення лікарський засіб являє собою радіонуклід, вибраний із групи, що складається з п, 177 у, 212ВІі, 213ВІі, ПАЇ, 62Су, ау, 67, 9оу, і25|, І91І, згр, ззр, моб, ТА, 67(За, 142ру, 15355171, 1е1тр, іввру, 166Но, 186Де, 188Д6, 1898дДе, 212рр, 223Да, 225Дс, 59Ге, 755е, 77Ав, 895, 99Мо, 105ДАп, сера, мзру, м9рт, 169Ег, 1947, 198Ду, 199Д|| і грр. Також переважними є радіонукліди, які по суті розпадаються з частинками Оже.
Наприклад, Со-58, Са-67, Ві-8О0т, То-99т, ВН-10Зт, РІ-109, Ій-111 1, 556-119, І-125, Но-161, О5- 189т і Іг-192. Корисні випромінюючі бета-частинки нукліди з енергією розпаду переважно являють собою ру-152, Аї-211, Ві-212, Ва-223, Вп-219, Ро-215, Ві-211, Ас-225, Еі-221, Аі-217, ВІ- 213 і Бт-255. Енергія розпаду корисних випромінюючих альфа-частинки радіонуклідів переважно дорівнює 2000-10000 кеВ, більш переважно 3000-8000 кеВ і найбільш переважно 4000-7000 кеВ. Додаткові потенційні радіоїзотопи для застосування включають "С, 79М, 750, 758, 98ду, 224Дс, 126|, 133), 77Ву, 1 1Зт|п, 95Виу, 97Ви, зВиу, 195Ву, 197На, 203Н, 121т7Те,22тТе, 125т7Те, 165Тт, 67Тт, 168Тт, 197рі, 199р4, 195ДН, гру, зр, е1тр, 66Но, 199Ду, 57бо, 58Со, 51, 59Евє, 7556, 201ТІ, 225ДАс, "6Ву, І69Ур і т. п. 16. Радіосенсибілізуючі засоби
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним радіосенсибілізуючим засобом. Термін "радіосенсибілізуючий засіб", як використовують у рамках винаходу, визначають як молекулу, переважно низькомолекулярну молекулу, що вводиться тваринам в терапевтично ефективних кількостях для збільшення чутливості клітин, щоб вони стали радіосенсибілізованими до електромагнітного випромінювання і/або забезпечення лікування захворювань, що піддаються лікуванню електромагнітним випромінюванням. Радіосенсибілізатори являють собою засоби, що роблять злоякісні клітини більш чутливими до променевої терапії, одночасно, як правило, маючи значно менший ефект на нормальні клітини. Таким чином, радіосенсибілізуючий засіб можна використовувати в комбінації з радіоактивно міченим антитілом або АОС. Додавання радіосенсибілізуючого засобу може приводити до збільшеної ефективності в порівнянні з обробкою радіоактивно міченим антитілом або фрагментом антитіла окремо. Радіосенсибілізуючі засоби описані в соїдбего 0.
М. (ед.), Сапсег ТПпегару м/йп Кадіоїареіей Апіродіеєх5, СКС Ргеб55 (1995). Приклади
Зо радіосенсибілізуючих засобів включають гемцитабін, 5-фторурацил, таксан і цисплатин.
Радіосенсибілізуючі засоби можуть активуватися електромагнітним опроміненням рентгенівськими променями. Репрезентативні приклади активованих рентгенівськими променями радіосенсибілізуючих засобів включають, але не обмежуються ними, наступні засоби: метронідазол, мізонідазол, десметилмізонідазол, пімонідазол, етанідазол, німоразол, мітоміцин С, КО 1069, 5К 4233, Е09, КВ 6145, нікотинамід, 5-бромдезоксіуридин (ВР), 5- йоддезоксіуридин (ІШанвВ), бромдезоксицитидин, фтордезоксіуридин (ЕШОР), гідроксисечовину, цисплатин і терапевтично ефективні аналоги і їх похідні. Альтернативно радіосенсибілізуючі засоби можуть активуватися з використанням фотодинамічної терапії (РОТ). Репрезентативні приклади фотодинамічних радіосенсибілізуючих засобів включають, але не обмежуються ними, похідні гематопорфірину, фотофринФф, похідні бензопорфірину, МРеб, олово-етіопорфірин (ЗпЕТ2), феоборбід а, бактеріохлорофіл а, нафталоціаніни, фталоціаніни, цинк-фталоціанін і їх терапевтично ефективні аналоги і похідні. 16. Інгібітори топоіїзомерази
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним інгібітором топоізомерази. Інгібітори топоїзомерази являють собою хіміотерапевтичні засоби, призначені для перешкоджання дії ферментів топоіїзомераз (топоіїзомераза І і Ії), які являють собою ферменти, що контролюють зміни структури ДНК шляхом каталізу, а потім руйнування і повторного з'єднання фосфодіефірного кістяка ланцюгів ДНК у ході нормального клітинного циклу. Репрезентативні приклади інгібіторів ДНК-топоїзомерази | включають, але не обмежуються ними, камптотецини і їх похідні іринотекан (СРТ-11, Камптосар, Ріїег, Іпс.) і топотекан (Гікамтин, СіахозтіййКіїпе РпагтасеціїсаІ5). Репрезентативні приклади інгібіторів
ДНК-топоїзомерази ІІ включають, але не обмежуються ними, амсакрин, даунорубіцин, доксорубіцин, епіподофілотоксини, еліптицини, епірубіцин, етопозид, разоксан і теніпозид. 17. Інгібітори тирозинкінази
Антитіла проти ЕСЕК за винаходом можуть бути кон'юговані щонайменше з одним інгібітором тирозинкінази. Тирозинкінази являють собою ферменти в клітині, які функціонують, зв'язуючи фосфатні групи з амінокислотою тирозином. Шляхом блокування здатності тирозинкіназ білків функціонувати може інгібуватися ріст пухлини. Приклади тирозинкіназ, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, акситиніб,
босутиніб, цедираніб, дасатиніб, ерлотиніб, гефітиніб, іматиніб, лапатиніб, лестауртиніб, нілотиніб, семаксаніб, сунітиніб і вандетаніб. 18. Інші засоби
Приклади інших засобів, які можна використовувати в АОС за винаходом, включають, але не обмежуються ними, абрин (наприклад А-ланцюг абрину), альфа-токсин, білки АПІешгігез тогаїї, аматоксин, кротин, курцин, діантинові білки, дифтерійний токсин (наприклад, А-ланцюг дифтерійного токсину і незв'язуючі активні фрагменти дифтерійного токсину), дезоксирибонуклеазу (ДНКазу), гелонін, мітогелін, А-ланцюг модецину, інгібітор тотогаїса спагапііа, неоміцин, онконазу, феноміцин, білки Рпуїїаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ї РАР-5), антивірусний білок лаконоса, ендотоксин Рзейидотопавх, екзотоксин Рзепйдотопах (наприклад,
А-ланцюг екзотоксину (з Рбзецпдотопаб5 аегидіпоза)), рестриктоцин, А-ланцюг рицину, рибонуклеазу (РНКазу), інгібітор зараопагіа ойісіпаїйє, сапорин, альфа-сарцин, стафілококовий ентеротоксин-А, правцевий токсин, цисплатин, карбоплатин і оксаліплатин (Елоксатин, Запоїї
Амепії5), інгібітори протеасом (наприклад, Р5З-341 Ібортезоміб або Велкейді), інгібітори НОАС (вориностат (Золінза, Мегок й Сотрапу, Іпс.)), беліностат, ентиностат, моцетиностат і панобіностат, інгібітори СОХ-2, заміщені сполуки сечовини, інгібітори білків теплового шоку (наприклад, гелданаміцин і його численні аналоги), адренокортикальні супресори і трикотецени (див., наприклад, УМО 93/21232). Інші засоби також включають аспарагіназу (Еспар, І ипареск
Іпс.), гідроксисечовину, левамізол, мітотан (Лізодрен, ВгізіоІ-Муег5 Зацівбб) і третиноїн (Ренова,
МаїІвапі Рпаптасешіісаї!5 Іпс.).
Слід зазначити, що згадані вище групи частин лікарського засобу, які можна використовувати в АЮС проти ЕСЕК за винаходом, не є виключними, оскільки визначені приклади лікарських засобів можуть бути знайдені більше ніж в одній категорії, наприклад ансамітоцини є як інгібіторами мітозу, так і протипухлинними антибіотиками.
Для сполук за винаходом передбачаються всі стереоїзомери зазначених вище частин лікарського засобу, тобто будь-яка комбінація конфігурацій К і 5 у хіральних атомах вуглецю 0.
Описані вище засоби (тобто засоби в чистому вигляді, не кон'юговані з антитілом) також можна використовувати в комбінованих способах терапії з антитілами проти ЕСЕЕК, описаними в даному документі. В одному варіанті здійснення антитіла або АОС проти ЕСЕК використовують
Зо з будь-якими з зазначених вище засобів у комбінованій терапії для лікування злоякісної пухлини, де засіб вводять до, під час або після введення антитіла або АОС проти ЕСЕ індивідууму.
В. АОС проти ЕСЕК: ілюстративні лінкери
АОС проти ЕСЕК містить антитіло проти ЕСЕК і щонайменше однин лікарський засіб(оби), при цьому антитіло і щонайменше один лікарський засіб кон'юговані через лінкер. Термін "лінкер", як використовують у рамках винаходу, стосується хімічної частини, яка може бути біфункціональною або мультифункціональною, і використовується для зв'язування антитіла з частиною, що є лікарським засобом. Лінкер може включати один кон'югуючий компонент або може включати множину компонентів.
Наприклад, лінкер може включати спейсер, який являє собою частину, що подовжує зв'язок з лікарським засобом для уникнення, наприклад, екранування активного центра антитіла або для підвищення розчинності АОС. Інші приклади компонента лінкерів включають подовжувальний елемент і амінокислотний елемент.
Звичайно для кон'югації лікарських засобів з антитілами використовують два способи: алкілування відновлених міжланцюжкових цистеїнових дисульфідних зв'язків через не розщеплюваний ферментативно малеїмідо або простий і розщеплюваний дисульфідний лінкер і ацилювання залишків лізину розщеплюваними лінійними амінокислотами.
В одному аспекті лінкер ковалентно зв'язує антитіло з частиною, що є лікарським засобом.
АОС одержують з використанням лінкера, що має реакційноздатну функціональну групу для зв'язування з антитілом і лікарським засобом. Наприклад, тіол цистеїну або амін, наприклад М- кінець або бічний ланцюг амінокислоти, такий як лізин, антитіла може утворювати зв'язок з функціональною групою лінкера.
В одному аспекті лінкер має функціональну групу, що здатна реагувати з вільним залишком цистеїну, присутнім на антитілі, з утворенням ковалентного зв'язку. Необмежувальні приклади таких реакційноздатних функціональних груп включають малеїнімід, галоацетаміди, а- галоацетил, активовані складні ефіри, такі як сукцинімідні складні ефіри, 4-нітрофенілові складні ефіри, пентафторфенілові складні ефіри, тетрафторфенілові складні ефіри, ангідриди, хлорангідриди кислот, сульфонілхлориди, ізоціанати і ізотіоціанати. Див., наприклад, спосіб кон'югації на стор. 766 Кіиз5зтап еї а. (2004), Віосопіцдаїе Спетівігу, 15(4):765-773.
У деяких варіантах здійснення лінкер має функціональну групу, що здатна реагувати з електрофільною групою, присутньою на антитілі. Ілюстративні такі електрофільні групи включають, але не обмежуються ними, карбонільні групи альдегідів і кетонів. У деяких варіантах здійснення гетероатом реакційноздатної функціональної групи лінкера може реагувати з електрофільною групою на антитілі й утворювати ковалентний зв'язок з антитільним елементом.
Необмежувальні приклади таких реакційноздатних функціональних груп включають, але не обмежуються ними, гідразид, оксим, аміно, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат і арилгідразид.
Ілюстративні лінкерні компоненти включають б-малеімідокапроїл, малеімідопропаноїл ("МР"), валін-цитрулін ("ма!-сії" або "Ме", аланін-фенілаланін Саіа-рпе"), п- амінобензилоксикарбоніл. ("РАВ"), М-сукцинімідил-4-(2-піридилтіо)упентаноат (ЗРР") їі 4-(М- малеіїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат ("МСС").
В одному аспекті антитіло проти ЕСЕК кон'юговане з ауристатином, наприклад ММАЕ, через лінкер, що містить малеїімідокапроїл ("тс"), валін-цитрулін (маІ-сй або "мс" і РАВА (позначуваний як "лінкер тсо-мо-РАВА"). Малеімідокапроїл виступає як лінкер з антитілом проти
ЕСЕК і не є розщеплюваним. МаІ-сї являє собою дипептид, що є амінокислотним елементом лінкера і дозволяє розщеплення лінкера протеазою, зокрема протеазою катепсином В. Таким чином, компонент лінкера маї!-сїї забезпечує засіб для вивільнення ауристатину з АОС під дією внутрішньоклітинного середовища. У лінкері п-амінобензиловий спирт (РАВА) виступає як спейсер і є саморозщеплюваний, забезпечуючи вивільнення ММАЕ. Структура лінкера тео-мс-
РАВА-ММАЕ представлена на фіг. 11.
Придатні лінкери включають, наприклад, розщеплювані і нерозщеплювані лінкери. Лінкер може бути "розщеплюваним лінкером", який полегшує вивільнення лікарського засобу.
Необмежувальні приклади розщеплюваних лінкерів включають нестійкі до дії кислот лінкери (наприклад, що містять гідразон), чутливі до протеаз (наприклад, чутливі до пептидаз) лінкери, фотолабільні лінкери або лінкери, що містять дисульфід (Спагі єї аІ.,, Сапсег Кезеагсі, 52:127- 131 (1992); патент США Мо 5208020). Розщеплюваний лінкер, як правило, є чутливим до розщеплення у внутрішньоклітинних умовах. Придатні розщеплювані лінкери включають, наприклад, пептидний лінкер, розщеплюваний внутрішньоклітинною протеазою, такоюб як
Зо лізосомальна протеаза або ендосомальна протеаза. В ілюстративних варіантах здійснення лінкер може являти собою дипептидний лінкер, такий як лінкер валін-цитрулін (маІ-сі) або лінкер фенілаланін-лізин (рпе-іув).
Переважно лінкери є стабільними поза клітинами в достатньому ступені, щоб бути терапевтично ефективними. Перед транспортуванням або доставкою в клітину АОС переважно є стабільним і залишається інтактним, тобто антитіло залишається кон'югованим з частиною, що є лікарським засобом. Лінкери, що є стабільними поза клітиною-мішенню, можуть розщеплюватися з деякою ефективною швидкістю усередині клітини. Таким чином, ефективний лінкер: (ї) зберігає властивості специфічного зв'язування антитіла; (її) дозволяє доставку, наприклад внутрішньоклітинну доставку, частини, що є лікарським засобом; і (ії) зберігає терапевтичний ефект, наприклад цитотоксичний ефект, частини, що є лікарським засобом.
В одному варіанті здійснення лінкер є розщеплюваним у внутрішньоклітинних умовах, так що розщеплення лінкера в достатньому ступені звільняє лікарський засіб від антитіла у внутрішньоклітинне середовище, щоб воно було терапевтично ефективним. У деяких варіантах здійснення розщеплюваний лінкер є чутливим до рН, тобто є чутливим до гідролізу при визначених значеннях рН. Як правило, рН-чутливий лінкер є гідролізовним в кислотних умовах.
Наприклад, можна використовувати нестійкий до дії кислот лінкер, що гідролізується в лізосомі (наприклад, гідразон, семікарбазон, тіосемікарбазон, цис-аконітовий амід, складний отроефір, ацеталь, кеталь і т. п.) (див., наприклад, патенти США МоМо 5122368; 5824805; 5622929;
Биромснік апа У/аІКег, 1999, Рпагпт. ТПнегарешіісв 83:67-123; МеміМПе єї а!., 1989, ВіоЇ. Спет. 264:14653-14661). Такі лінкери є відносно стабільними в умовах нейтральних значеннях рн, таких як значення рН у крові, але є нестабільними при значеннях рН нижче 5,5 або 5,0, що є приблизними значеннями рн у лізосомі. У визначених варіантах здійснення гідролізовний лінкер являє собою простий тіоефірний лінкер (наприклад, такий як простий тіоефір, зв'язаний з лікарським засобом через ацилгідразоновий зв'язок (див., наприклад, патент США Мо 5622929)).
В інших варіантах здійснення лінкер є розщеплюваним у відновних умовах (наприклад, дисульфідний лінкер). Множина дисульфідних лінкерів відома в даній галузі, включаючи, наприклад, лінкери, що можуть бути утворені з використанням 5АТА (М-сукцинімідил-5- ацетилтіоацетат), 5РОР (М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат), 5Р0ОВ (М-сукцинімідил-3- (2-піридилдитіо)бутират) і ЗМРТ (М-сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2- 60 піридилдитіо)толуол), 5РОВ і 5МРТ (див., наприклад, ТПогре еї аї., 1987, Сапсег Кев5. 47:5924-
5931; Мамтгупслак еї а!., Іттипосопійдаїев: Апіїбоду Сопійдаїез іп Радіоітадегу апа Тнегару ої
Сапсег (моде! С. М. ед., Охтога Ц. Ргез5, 1987); також див. патент США Мо 4880935).
У деяких варіантах здійснення лінкер розщеплюється розщеплюючим засобом, наприклад ферментом, який присутній у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, у лізосомі або ендосомі, або кавеолі). Лінкер може являти собою, наприклад, пептидильний лінкер, який розщеплюється внутрішньоклітинним пептидазним або протеазним ферментом, включаючи, але не обмежуючись ними, лізосомальну або ендосомальну протеазу. У деяких варіантах здійснення пептидильний лінкер має довжину щонайменше дві амінокислоти або щонайменше три амінокислоти. Розщеплюючі засоби можуть включати катепсини В і О і плазмін, про усі з яких відомо, що вони гідролізують дипептидні похідні лікарського засобу, що приводить до вивільнення активного лікарського засобу усередині клітин-мішеней (див., наприклад,
Биромснік апа УаїКег, 1999, Рнагт. ТПнегареціїсв, 83:67-123). Найбільш типовими є пептидильні лінкери, які розщеплюються ферментами, що присутні в експресуючих ЕСЕК клітинах.
Приклади таких лінкерів описані, наприклад, у патенті США Мо 6214345, включеному в даний опис як посилання в повному обсязі і для всіх цілей. У конкретному варіанті здійснення пептидильний лінкер, який розщеплюється внутрішньоклітинною протеазою, являє собою лінкер
Ма!-Сії або лінкер РІе-Гуз (див., наприклад, патент США Мо 6214345, у якому описаний синтез доксорубіцину з лінкером маЇІ-сій). Однією перевагою використання внутрішньоклітинного протеолітичного вивільнення лікарського засобу є те, що засіб, як правило, ослабляється, коли він кон'югований, і стабільність кон'югатів у сироватці, як правило, є високою.
В інших варіантах здійснення лінкер являє собою малонатний лінкер (оппзоп еї аї., 1995,
Апіїсапсег Нез. 15:1387-93), малеіїмідобензоїльний лінкер (Іа еї аї., 1995, Віоога-Мед-Снет.
З3(10):1299-1304) або 3-М-амідний аналог (І аи еї аї., 1995, Віоога-Мед-Снет. З3(10): 1305-12).
В інших варіантах здійснення лінкерний елемент не є розщеплюваним і лікарський засіб вивільняється, наприклад, при деградації антитіла. Див. публікацію США Мо 20050238649, включену в даний опис як посилання в повному обсязі. АОС, що містить нерозщеплюваний лінкер, може бути сконструйований так, щоб АОС залишався по суті зовні клітини і взаємодіяв з визначеними рецепторами на поверхні клітини-мішені, щоб зв'язування АОС ініціювало (або перешкоджало) конкретний каскад клітинної передачі сигналу.
Зо У деяких варіантах здійснення лінкер являє собою по суті гідрофільний лінкер (наприклад,
РЕСАМАаї ії сульфо-5РОВ). Гідрофільний лінкер можна використовувати для зниження ступеня, з яким лікарський засіб може викачуватися зі стійких злоякісних клітин за допомогою МОК (множинна стійкість до лікарських засобів) або функціонально подібних переносників.
В інших варіантах здійснення при розщепленні лінкер, функціонує, прямо або непрямо інгібуючи ріст клітин і/або проліферацію клітин. Наприклад, у деяких варіантах здійснення лінкер при розщепленні може функціонувати як інтеркалюючий засіб, тим самим інгібуючи біосинтез макромолекул (наприклад, реплікація ДНК, транскрипція РНК і/або синтез білка).
В інших варіантах здійснення лінкер сконструйований для сприяння неспецифічному цитолізу (знищення сусідніх клітин) за допомогою дифузії лінкера-лікарського засобу і/або лікарського засобу окремо в сусідні клітини. В інших варіантах здійснення лінкер забезпечує інтерналізацію в клітини.
Присутність просторово прихованого дисульфіду може підвищувати стабільність конкретного дисульфідного зв'язку, збільшуючи ефективність АОС. Таким чином, в одному варіанті здійснення лінкер включає просторово прихований дисульфідний зв'язок. Просторово прихований дисульфід належить до дисульфідного зв'язку, присутнього у конкретному молекулярному оточенні, де оточення характеризується конкретним просторовим розташуванням або орієнтацією атомів, як правило, в одній і тій же молекулі або сполуці, що запобігають або щонайменше частково інгібують відновлення дисульфідного зв'язку. Таким чином, присутність об'ємних х (або просторово прихованих) хімічних частин і/або об'ємних бічних ланцюгів амінокислот проксимально дисульфідного зв'язку запобігає або щонайменше частково інгібує потенційні взаємодії дисульфідного зв'язку, що можуть привести до відновлення дисульфідного зв'язку.
Примітно, що згадані вище типи лінкерів не є взаємовиключними. Наприклад, в одному варіанті здійснення лінкер, використовуваний у АОС проти ЕСЕК, описаному в даному документі, являє собою нерозщеплюваний лінкер, що підсилює інтерналізацію в клітини.
У деяких варіантах здійснення АОС має наступну формулу (формула І)
АРр-(І-О) п (1) або формулу його фармацевтично прийнятної солі або сольвату; де АБ являє собою антитіло, наприклад антитіло проти ЕСЕК АБА, ії (1-0) являє собою лінкер-лікарську частину. бо Лінкер-лікарська частина складається з І-, що являє собою лінкер, і -О, що являє собою 5О0 лікарську частину, яка має, наприклад, цитотстатичну, цитотоксичну або іншу терапевтичну активність проти клітини-мішені, наприклад клітини, експресуючої ЕСЕ; і п являє собою ціле число від 1 до 20.
У деяких варіантах здійснення п знаходиться в діапазоні від 1 до 8, від 1 до 7, від 1 до 6, від 1 до 5, від 1 до 4, від 1 до 3, від 1 до 2 або дорівнює 1.
У деяких варіантах здійснення частини -0О є однаковими. В іншому варіанті здійснення частини -О відрізняються.
Як описано вище, лінкер може являти собою одиночну частину або може включати два або більше компонентів. По суті, у деяких варіантах здійснення АОС має наступну формулу (Ії)
АБ-(Аа-МУк-Ху-О) п (ІІ) або формулу його фармацевтично прийнятної солі або сольвату, де АБ являє собою антитіло, наприклад антитіло проти ЕСЕР АБА, ії -Аз-М/х-Уу- являє собою лінкер (І), що містить три або більше компонентів, включаючи
А-, що являє собою необов'язковий подовжувальний елемент, а дорівнює 0 або 1, кожний -
М/- незалежно являє собою амінокислотний елемент (або в деяких варіантах здійснення глюкуронідний елемент, також див. Публікацію США Мо 2012/0107332 АТ), м являє собою ціле число в діапазоні від 0 до 12, -У- являє собою саморозщеплюваний спейсерний елемент, у дорівнює 0, 1 або 2; -О являє собою частину, яка є лікарським засобом, що має, наприклад, цитостатичну, цитотоксичну або іншу терапевтичну активність проти клітини-мішені, наприклад клітини, експресуючої ЕСЕ; і п являє собою ціле число від 1 до 20.
У деяких варіантах здійснення лінкерний компонент містить "подовжувальний елемент" (А), що зв'язує антитіло з іншим лінкерним компонентом або з частиною, що є лікарським засобом.
Необмежувальні ілюстративні подовжувальні елементи представлена нижче (де хвиляста лінія вказує на ділянки ковалентного зв'язування з антитілом, лікарським засобом або додатковими лінкерними компонентами): г й
АК т 5 ан ве а А
М я Ї
У й с
МО.
Подовжувальний елемент (А), коли він присутній, здатний зв'язувати антитіло з амінокислотним елементом (-Му-), якщо він присутній, зі спейсерним елементом (-у-), якщо він присутній; або з лікарським засобом (-О0) (див. формулу ІЇ). Придатні функціональні групи, що
Зо можуть бути присутні на антитілах проти ЕСЕК, описаних у даному документі, або природним чином, або за допомогою хімічної маніпуляції, включають, але не обмежуються ними, сульфгідрил, аміно, гідроксил, аномерну гідроксильну групу вуглеводу і карбоксил. Придатними функціональними групами є сульфгідрил і аміно. В одному прикладі сульфгідрильні групи можна одержувати шляхом відновлення внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків антитіла проти ЕСЕК. В іншому варіанті здійснення сульфгідрильні групи можна одержувати шляхом реакції аміногрупи лізинової частини в антитілі проти ЕСЕК з 2-імінотіоланом (реагент Трота) або іншими утворюючими сульфгідрил реагентами. У визначених варіантах здійснення антитіло проти ЕСЕК являє собою рекомбінантне антитіло і його конструюють, щоб воно мало одну або декілька лізинових частин. У деяких інших варіантах здійснення рекомбінантне антитіло проти
ЕСЕК конструюють, щоб воно містило додаткові сульфгідрильні групи, наприклад додаткові залишки цистеїну.
В одному варіанті здійснення подовжувальний елемент утворює зв'язок з атомом сірки антитіла. Атом сірки може походити із сульфгідрильної групи антитіла. Репрезентативні подовжувальні елементи відповідно до цього варіанта здійснення представлені в квадратних дужках формул Па ї ПБ, як показано нижче:
! о і Ша : й : : й їх Н
В Шї ті
Тон М рі і МеВ я В ут : о :
Й о а. ЛЬ ї 4 ; де І--, -МУ/-, -У-, -О, м/ і у є такими, як визначено вище, і В'" вибраний з -С1-С:о-алкілену-, -С1-
С:іо-алкенілену-, -С1-Сто-алкінілену-, карбоцикло-, -О-(С1-Св-алкілену)-, О-(С1-Св-алкенілену)-, -О- (С1-Св-алкінілену)-, -арилену-, -С1-Сіо-алкіленарилену-, -С2-Сіо-алкеніленарилену, -С2-С10- алкініленарилену, арилен-Сі-Сто-алкілену-, -арилен-С2-Сіо-алкенілену-, -арилен-С2-С10- алкінілену-, -С1-Сто-алкілен-«(карбоцикло)-, -С2-С1о-алкенілен-(карбоцикло)-, С2-Сто-алкінілен- (карбоцикло)-, -(карбоцикло)-С1-Сто-алкілен-, -- карбоцикло)-С2-Сто-алкенілен-, - карбоцикло)-С2-
Сто-алкінілен, -гетероцикло-, -С1-Сто-алкілен-(гетероцикло)-, -С2-С1о-алкеніл-«(гетероцикло)-, -С2-
Сіо-алкінілен-(гетероцикло)-, --(гетероцикло)-С1-Сіо-алкілену-, --(гетероцикло)-С2-Сіо-алкенілену-, -«(гетероцикло)-С1-Сіо-алкінілену-, -"СНаСНегО),- або -СНгСНгО)-СнНе-, і г являє собою ціле число в діапазоні 1-10, де зазначені радикали алкілу, алкенілу, алкінілу, алкілену, алкенілену, алкінілену, арилу, карбоциклу, карбоцикло, гетероцикло й арилену, як окремо, так і як частина іншої групи, є необов'язково заміщеними. У деяких варіантах здійснення зазначені радикали алкілу, алкенілу, алкінілу, алкілену, алкенілену, алкінілену, арилу, карбоциклу, карбоцикло, гетероцикло й арилену, як окремо, так і як інша частина, є незаміщеними. У деяких варіантах здійснення К'" вибраний з -С1-С1о-алкілену-, -карбоцикло-, -О-(С1-Св-алкілену)-, -арилену-, -С1-
Сіо-алкіленарилену-, -арилен-С1-Сто-алкілену-, -С1-Сто-алкілен-(карбоцикло)-, --«карбоцикло)-С1-
Сто-алкілену-, -Сз-Св-гетероцикло-, /-С1-Сто-алкілен-(гетероцикло)-, -(гетероцикло)-С1-Сч10- алкілену-, -"СНаСНгО)- і -«"СНаСНгО)-СН»-; і г являє собою ціле число в діапазоні 1-10, де зазначені алкіленові групи є незаміщеними, а інші групи є необов'язково заміщеними.
Ілюстративний подовжувальний елемент має формулу Ша, де К'" являє собою -(СН?г)в-, як представлено нижче (також див. 0.5. 8309093).
Інший ілюстративний подовжувальний елемент має формулу Ша, де Б'" являє собою - (СНгСНгО)АСНе-; і г дорівнює 2, як представлено нижче (також див. 0.5. 8309093, включений у даний опис як посилання).
І г 5 й
У : М М Май ит ЗУ г
Шк 5 м
НЯ
Інший ілюстративний подовжувальний елемент має формулу Ша, де К'"' являє собою арилен- або арилен-С1-С1іо-алкілен-. У деяких варіантах здійснення арильна група являє собою незаміщену фенільну групу. Крім того, інший ілюстративний подовжувальний елемент має
Ко) формулу ППБ, де К'"" являє собою -(СНг)5-, як представлено нижче (також див. 0.5. 8309093, включений у даний опис як посилання).
а гей | 7. печі р нан р р ск ' в ще -ч мі - а во - вч
Н І
З
У визначених варіантах здійснення подовжувальний елемент зв'язаний з антитілом проти
ЕСЕК через дисульфідний зв'язок між атомом сірки елемента антитіла проти ЕСЕК і атомом сірки подовжувального елемента. Репрезентативний подовжувальний елемент відповідно до цього варіанта здійснення представлений у квадратних дужках формули ІМ (див. нижче і також див. 0.5. 8309093, включений у даний опис як посилання), де К 7, І -, -Му/-, -У-, -О, м/ і у є такими, як визначено вище: о вів я ім, - 8 У
ЗУ У Й І
Слід зазначити, що частина 5 у формулі, представленій нижче (також див. 00.5. 8309093, включений у даний опис як посилання), належить до атома сірки антитіла, якщо немає інших указань по контексту: і: ік: іх: п ун: ЗИ
І. Ме в з ко 7
В інших варіантах здійснення подовжувальний елемент містить реакційноздатний центр, що може утворювати зв'язок з первинною або вторинною аміногрупою антитіла. Приклади цих реакційноздатних ділянок включають, але не обмежуються ними, активовані складні ефіри, такі як сукцинімідні складні ефіри, 4-нітрофенілові складні ефіри, пентафторфенілові складні ефіри, тетрафторфенілові складні ефіри, ангідриди, хлорангідриди, сульфонілхлориди, ізоціанати і ізотіоціанати. Репрезентативні подовжувальні елементи відповідно до цього варіанта здійснення представлені в квадратних дужках формул Ма і МО (див. нижче (також див. 0.5. 8309093, включений у даний опис як посилання)), де К'", 1 -, -Му/-, -У-, -О, му, і у є такими, як визначено вище: о о.
З о
У деяких варіантах здійснення подовжувальний елемент містить реакційноздатну ділянку, що є реакційноздатною відносно модифікованої вуглеводної групи (-СНО), що може бути присутня в антитілі. Наприклад, вуглевод може бути м'яко окислений з використанням реагенту, такого як перйодат натрію, і одержаний елемент (-СНО) окисленого вуглеводу може бути конденсований з подовжувальним елементом, що містить функціональну групу, таку як гідразид, оксим, первинний або вторинний амін, гідразин, тіосемікарбазон, карбоксилат гідразину й арилгідразид, такі як групи, описані Капеко еї аї., 1991, Віосопіддаєге Спет. 2:133-41.
Репрезентативні подовжувальні елементи відповідно до цього варіанта здійснення представлені в квадратних дужках формул Міа, МІБ ї Міс (див. нижче (також див. Ш.5. 8309093, включений у даний опис як посилання)), де -В7-, 1 -, -Му/-, -У-, -О, м і у є такими, як визначено вище:
Ї
1 Мене М со Є ех ех УМ у Уїв,
Не - с й Її, Й -Як-хї,-й УЬ, - н о 0.
У деяких варіантах здійснення лінкерний компонент містить "амінокислотний елемент" (М/).
У деяких таких варіантах здійснення амінокислотний елемент дозволяє розщеплення лінкера протеазою, тим самим полегшуючи вивільнення лікарського засобу з імунокон'югата під дією внутрішньоклітинних протеаз, таких як лізосомальні ферменти (Юогопіпа еї аї. (2003), Ммаї.
ВіоїесНнпої. 21:778-784). Ілюстративні амінокислотні елементи включають, але не обмежуються ними, дипептиди, трипептиди, тетрапептиди і пентапептиди. Ілюстративні дипептиди включають, але не обмежуються ними, валін-цитрулін (мус або ма!-сі), аланін-фенілаланін (аї або аіа-рпе); фенілаланін-лізин (ЖК або рпе-іуз); фенілаланін-гомолізин (рпе-потоїув5) і М-метил- валін-цитрулін (Ме-ма!І-сі). Ілюстративні трипептиди включають, але не обмежуються ними, гліцин-валін-цитрулін (діу-маІ-сі) і гліцин-гліцин-гліцин (діу-діу-дІу). Амінокислотний елемент може містити амінокислотні залишки, що зустрічаються в природі, і/або мінорні амінокислоти, або аналоги амінокислот, що не зустрічаються в природі, такі як цитрулін. Амінокислотні елементи можна конструювати й оптимізувати для ферментативного розщеплення конкретним ферментом, наприклад асоційованою з пухлиною протеазою, катепсином В, С їі О або протеазою плазміном.
В одному варіанті здійснення амінокислотний елемент УМ являє собою валін-цитрулін (мс або ма!-сі). В іншому аспекті амінокислотний елемент являє собою фенілаланін-лізин (тобто їК).
В іншому аспекті амінокислотного елемента, амінокислотний елемент являє собою М-метил- валін-цитрулін. В іншому аспекті амінокислотний елемент являє собою 5-аміновалеріанову кислоту, гомофеніл-аланін-лізин, тетраїзохінолінкарбоксилат-лізин, циклогексил-аланін-лізин, ізоніпекотову кислоту-лізин, бета-аланін-лізин, гліцин-серин-валін-глутамін і ізоніпекотову кислоту.
Зо Альтернативно в деяких варіантах здійснення -Му- являє собою глюкуронідний елемент, що зв'язує подовжувальний елемент зі спейсерним елементом, якщо подовжувальний і спейсерний елементи присутні, зв'язує подовжувальний елемент з частиною лікарського засобу, якщо спейсерний елемент відсутній, і зв'язує лінкерний елемент із лікарським засобом, якщо подовжувальний і спейсерний елементи відсутні. Глюкуронідний елемент включає ділянку, що може розщеплюватися ферментом В-глюкуронідазою (також див. О5 2012/0107332, включений у даний опис як посилання). У деяких варіантах здійснення глюкуронідний елемент містить частину цукру (Зи), зв'язану через глікозидний зв'язок (-0'-) з саморозщеплюваною групою (7) формули, представленої нижче (також див. ОЗ 2012/0107332, включений у даний опис як посилання):
Глікозидний зв'язок (-О'-), як правило, являє собою ділянку розщеплення р-глюкуронідазою, таку як зв'язок, розщеплюваний лізосомальною В-глюкуронідазою людини. У контексті глюкуронідного елемента, термін "саморозщеплювана група" стосується ди- або трифункціональної хімічної частини, що здатна ковалентно зв'язувати дві або три хімічні частини, що знаходяться на відстані (тобто цукрова частина (через глікозидний зв'язок), частина, що є лікарським засобом (прямо або непрямо через спейсерний елемент), і в деяких варіантах здійснення лінкер (прямо або непрямо через подовжувальний елемент)) у стабільну молекулу. Саморозщеплювана група мимовільно відділяється від першої хімічної частини (наприклад, спейсерний елемент або елемент-лікарський засіб), якщо зв'язок з частиною цукру розщеплюється.
У деяких варіантах здійснення цукрова частина (Зи) являє собою циклічну гексозу, таку як піраноза, або циклічну пентозу, таку як фураноза. У деяких варіантах здійснення піраноза являє собою глюкуронід або гексозу. Частина цукру, як правило, знаходиться в конформації 8-0. У конкретному варіанті здійснення піраноза являє собою В-ЮО-глюкуронідну частину (тобто ДВ-О- глюкуронова кислота, зв'язана з саморозщеплюваною групою -2- через глікозидний зв'язок, що розщеплюється ДВ-глюкуронідазою). У деяких варіантах здійснення цукрова частина є незаміщеною (наприклад, циклічна гексоза або циклічна пентоза, що зустрічається в природі). В інших варіантах здійснення цукрова частина може являти собою заміщений В-Ю-глюкуронід (тобто глюкуронова кислота, заміщена однією або декількома групами, такими як водень, гідроксил, галоген, сірка, азот або нижчий алкіл).
У деяких варіантах здійснення глюкуронідний елемент має одну з формул, представлених нижче (також див. 05 2012/0107332 АТ, включений у даний опис як посилання): й пр ві й й пе Жди ви А й г : ни Же за Ше тв . ик р
Е в ше ве -е І ве ЯМ й т т де Зи являє собою цукрову частину, глікозидний зв'язок містить кисневий зв'язок між зи і саморозщеплюваною групою 7, і кожен К незалежно являє собою водень, галоген (наприклад, хлор, бром, фтор і т. д.), -СМ, -МО» або іншу електроноакцепторну або електронодонорну групу, за умови, що глюкуронідний елемент (зокрема, 72) піддається саморозщепленню при розщепленні глікозидного зв'язку. У деяких варіантах здійснення кожен К незалежно являє
Ко) собою водень, галоген (наприклад, хлор, бром, фтор і т. д.), -СМ або -МО».
У деяких варіантах здійснення глюкуронідний елемент має одну з формул, представлених нижче (також див. 05 2012/0107332, включений у даний опис як посилання): : й ї ванн ша
Ше ше я 7 я | І 7 зи й я ба ї Й! і ж Ше: п ну ї ог де Би являє собою цукрову частину, глікозидний зв'язок (-О'-) містить кисневий зв'язок між зи і саморозщеплюваною групою 2, і кожен ЕК незалежно являє собою водень. у 1
У деяких варіантах здійснення саморозщеплювана група (7) ковалентно зв'язана з цукровою частиною, з лікарським засобом (прямо або непрямо через спейсерний елемент(и)) і з лінкером (прямо або непрямо через подовжувальний елементі(и)). У деяких варіантах здійснення кон'югат лікарський засіб-лінкнер має формулу, представлену нижче (також див. 05 2012/0107332, включений у даний опис як посилання):
Аа де Би, 0, 2, М, у, О, А і а визначені в даному описі. Як правило, від 1 до 20 таких кон'югатів лікарський засіб-лінкер можуть бути зв'язані з лінкером.
У деяких варіантах здійснення АОС, що містить глюкуронідний елемент, має одну з формул, представлених нижче (також див. 05 2012/0107332, включений у даний опис як посилання), де
ЗИ, М, У, О, А, а і Ї визначені, як описано в даному документі: х 2 лю з Ше з ям З в пол бо - т с: - шк зо ки Мей т з щ -т . ІЙ що т к Кк, : , : й
У деяких варіантах здійснення АОС, що містить глюкуронідний елемент, має формулу, як представлено нижче (також див. 5 2012/0107332, включений у даний опис як посилання), де У, у, о, А, а і Ї визначені в даному описі: й й т м
Би її о - ч3 -7 -. и не, в за
У деяких варіантах здійснення АЮС, що містить глюкуронідний елемент, має формулу, представлену нижче (також див. ОЗ 2012/0107332, включений у даний опис як посилання), де У, у, О і Ї визначені, як описано в даному документі:
Тез у що ШАтя т р т й ї ве
УА. и я ні й нают са" бат Т н-нх к
ЗА,
Й .
У деяких варіантах здійснення АОС, що містить глюкуронідний елемент, має формулу, як представлено нижче (також див. 05 2012/0107332, описаний у даному документі), де М, У, бі. визначені, як описано в даному документі:
ск Ї ях се аа р Шин с ри нот зо7 УТ пт Ка чан
У деяких варіантах здійснення АОС, що містить глюкуронідний елемент, має формулу, як представлено нижче (також див. 05 2012/0107332, включений у даний опис), де О є таким, як описано в даному документі, ії тАб являє собою моноклональне антитіло: оч ото
НО А ці каси а їй зи а я Ве Х -й нет Теч т
Н -
НМ. аж М ета що че т оч шк Ме з як о 5 .
Спейсерний елемент (-У-), коли він присутній, зв'язує амінокислотний елемент (або глюкуронідний елемент, також див. О5 2012/0107332, включений у даний опис як посилання) з частиною, що є лікарським засобом, коли амінокислота присутня. Альтернативно, спейсерний елемент зв'язує подовжувальний елемент з частиною, що є лікарським засобом, коли амінокислотний елемент відсутній. Спейсерний елемент також зв'язує елемент лікарського засобу з елементом антитіла, коли як амінокислотний елемент, так і подовжувальний елемент відсутні.
Спейсерні елементи мають два основні типи: несаморозщеплювані і саморозщеплювані.
Несаморозщеплюваний спейсерний елемент являє собою елемент, у якому частина або весь спейсерний елемент залишається зв'язаним з частиною лікарського засобу після відщіплення, зокрема ферментативного, амінокислотного елемента (або глюкуронідного елемента) від кон'югата антитіло-лікарський засіб. Приклади несаморозщеплюваного спейсера включають, але не обмежуються ними, спейсерний елемент (гліцин-гліцин) і гліциновий спейсерний елемент (обидва представлені на схемі 1 нижче (також див. 0.5. 8309093, включений у даний опис як посилання)):
Схема ї : і й : і - Я : схе йо Ж
Моно нЙ верйеніяу пеннііу несврнО ферментативне ферментативне розщеплення і розщеплення і
ЗВУ пенні Ср ней гІДБОЛІЗ ! плроніз
Ізки Ех. Ще тях їх
Лікарський Лікарський ож е Я засів засів
Коли кон'югат, що містить гліцин-гліциновий спейсерний елемент або гліциновий спейсерний елемент, піддається ферментативному розщепленню за допомогою ферменту (наприклад, асоційована з пухлинними клітинами протеаза, асоційована зі злоякісними клітинами протеаза або асоційована з лімфоцитами ппротеаза), гліцин-гліцин-частина
Б лікарського засобу або гліцин-частина лікарського засобу відщеплюється від І -Аа-М/х-. В одному варіанті здійснення в клітині-мішені відбувається незалежна реакція гідролізу, що розщеплює частину гліцин-лікарський засіб і вивільняє лікарський засіб.
У деяких варіантах здійснення несаморозщеплюваний спейсерний елемент (-У-) являє собою -С1іу-. У деяких варіантах здійснення несаморозщеплюваний спейсерний елемент (-У-) являє собою -Спу-а1у-.
В одному варіанті здійснення передбачається кон'югат лікарський засіб-лінкер, у якому спейсерний елемент відсутній (у-:0), або його фармацевтично прийнятна сіль або сольват.
Альтернативно кон'югат, що містить саморозщеплюваний спейсерний елемент, може забезпечити вивільнення частини, що є лікарським засобом. Саморозщеплюваний спейсерний елемент мимовільно відділяється від другої хімічної частини, якщо його зв'язок з першою частиною розщеплюється.
У деяких варіантах здійснення -уУ/- являє собою елемент п-амінобензилового спирту (РАВ), феніленова частина якого заміщена за допомогою От, де 0 являє собою -С1-Св-алкіл, -С1-Св- алкеніл, -С1-Св-алкініл, -О-(С1-Св-алкіл), -О-(С1-Св-алкеніл), -О-(С1-Св-алкініл), -галоген, -нітро або -ціано; і т являє собою ціле число в діапазоні 0-4. Алкільна, алкенільна й алкінільна групи, як окремо, так і як частина іншої групи, можуть бути необов'язково заміщені.
У деяких варіантах здійснення -уУ- являє собою групу РАВ, що зв'язана з -УУх- через атом азоту аміногрупи в групі РАВ і з'єднана прямо з -О через карбонатну, карбаматну або просту ефірну групу. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією або механізмом, на схемі 2 нижче (також див. 0.5. 8309093) представлений можливий механізм вивільнення лікарського засобу з групи РАВ, що зв'язана прямо з -0 через карбаматну або карбонатну групу, як описано Токі еї а!., 2002, 9. Огу. Спет. 67:1866-1872: / а і
Н 5 й х і і вени Гоа їх
Що у ів х й ферменунтнане
КН ЕЕКОЧеННЯЄ ще ш-ко ЖЕ, : ше Щщ
Губ-відкечивюня
Лікарський зве
На схемі 2 О являє собою -С1-Св-алкіл, -С1-Св-алкеніл, -С1-Св-алкініл, -0О-(С1-Св-алкіл), -0- (С1-Св-алкеніл), -О-(С1-Св-алкініл)у, -галоген, -нітро або -ціанох; т являє собою ціле число в діапазоні 0-4; і р знаходиться в діапазоні від Її до приблизно 20. Алкільна, алкенільна й алкінільна групи, як окремо, так і як частина іншої групи, можуть бути необов'язково заміщеними.
Інші приклади саморозщеплюваних спейсерів включають, але не обмежуються ними, ароматичні сполуки, що електронно подібні з групою РАВ, такі як похідні 2-аміноїмідазол-5- метанолу (Нау еї аї., 1999, Віоогд. Мед. Спет. ГІ ей. 9:2237) і орто- або пара-амінобензилацеталі.
Можна використовувати спейсери, що піддаються циклізації при гідролізі амідного зв'язку, такі як заміщені і незаміщені аміди 4-аміномасляної кислоти (Коагідце5 еї аї., 1995, Спетівігу
Віоіоду, 2:223), відповідним чином заміщені біцикло(2.2.1| і біцикло(Ї2.2.2| кільцеві системи (Жогт еї аї., 1972, У. Атег. Спет. 5ос. 94:5815) і аміди 2-амінофенілпропіонової кислоти (Ат5рег!гу еї аї., 1990, 9. Огд. Спет. 55:5867). Відщеплення лікарських засобів, що містять амін, які заміщені в а-положенні гліцину (Кіпуд5бигу еї аї., 1984, 9. Мей. Спет. 27:1447), також є прикладом саморозщеплюваних спейсерів.
В одному аспекті спейсерні елементи (-хХу-) відповідають формулам Х-ХІЇ (див. нижче (також див. 0.5. 8309093)), де ОО являє собою -С1-Св-алкіл, -С1-Св-алкеніл, -С1-Св-алкініл, -О-(С1-Св- алкіл), -0-(С1-Св-алкеніл), -О-(С1-Св-алкініл), -галоген, -нітро або -ціано; і т являє собою ціле число в діапазоні 0-4: 5 т ти Ж й 3. х
Ши Я шт ше І ту ря , о 1 шле: ін з
Інші приклади саморозщеплюваних спейсерів включають, але не обмежуються ними, ароматичні сполуки, що електронно подібні з групою РАВ, такі як похідні 2-аміноїмідазол-5- метанолу (див., наприклад, Нау еї аї., 1999, Віоогд. Мед. Спет. І ей. 9:2237) і орто- або пара- амінобензилацеталі. Можна використовувати спейсери, що піддаються циклізації при гідролізі амідного зв'язку, такі як заміщені і незаміщені аміди 4-аміномасляної кислоти (див., наприклад,
Воаігіднев єї аї.,, 1995, Спетівігу Віоіоду, 2:223), відповідним чином заміщені біцикло|2.2.1| і біциклої|2.2.21 кільцеві системи (див., наприклад, іогт еї аї!., 1972, 9. Атег. Спет. бос. 94:5815) і аміди 2-амінофенілпропіонової кислоти (див., наприклад, Ат5бегїту еї а!., 1990, 9). Огу. Спет. 55:5867). Відщеплення лікарських засобів, що містять амін, які заміщені в «-положенні гліцину (див., наприклад, Кіпд5бигу еї аї., 1984, 9). Мей. Спет. 27:1447), також є прикладом саморозщеплюваних спейсерів.
Інші придатні спейсерні елементи описані в опублікованій патентній заявці США Мо 2005- 0238649, зміст якої включений в даний опис як посилання.
Зо Інший підхід для одержання АОС включає застосування гетеробіфункціональних зшивальних лінкерів, які зв'язують антитіло проти ЕСЕК з частиною, що є лікарським засобом.
Приклади зшивальних лінкерів, які можна використовувати, включають М-сукцинімідил-4-(5- нітро-2-піридилдитіо)пентаноат або високорозчинний у воді аналог М-сульфосукцинімідил-4-(5- нітро-2-піридилдитіо)пентаносату, М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)бутират (5РОВ), М- сукцинімідил-4-(5-нітро-2-піридилдитіо)бутират (ЗМРВБВ) і М-сульфосукцинімідил-4-(5-нітро-2- піридилдитіо)бутират (ЗЗМРВ), М-сукцинімідил-4-метил-4-(5-нітро-2-піридилдитіо)пентаноат (ЗМР), М-сукцинімідил-4-(5-М,М-диметилкарбоксамідо-2-піридилдитіо)бутират (ЗСРВ) або М- сульфосукцинімідил-4-(5-М,М-диметилкарбоксамідо-2-піридилдитіо)дбутират (З5СРВ). Антитіла за винаходом можна модифікувати зшивальними лінкерами М-сукцинімідил-4-(5-нітро-2- піридилдитіо)пентаноатом, М-сульфосукцинімідил-4-(5-нітро-2-піридилдитіо)-пентаноатом,
ЗРОВ, ЗМРВ, 55МРВ, 5ММР, ЗСРВ або 55ІСРВ, а потім їх можна піддавати реакції з невеликим надлишком конкретного лікарського засобу, що містить тіольну частину з високим виходом АОС.
Переважно, зшивальні лінксери являють собою сполуки формул, представлених нижче (також див. патент США Мо 6913748, включений у даний опис як посилання):
де т т що ан й о Ота шин и о а у ух , 8) М і кАже Кк «й хо ра ре й а ес Ше - ОЇ, шк! ще ша ши а а ШИ,
Її тат ре х х Я Її й м: ях б в; В В В х де К, Кі, В» і Кз є однаковими або відрізняються і являють собою Н, метил, етил або лінійний, розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до 6 атомів вуглецю, п дорівнює 0 або являє собою ціле число від 1 до 4, Х і М є однаковими або відрізняються і являють собою Н,
СОМААНА5 або МО», за умови, що обидва з Х і М не є Н одночасно, Ра і Б5 є однаковими або відрізняються і кожний з них являє собою Н, метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, втор- бутил, ізобутил або трет-бутил, і 7 являє собою ЗО: М" або Н, де М" означає іон металу або іон тетраалкіламонію, за умови, що, коли Х і/або М являє собою МО», 7 не є Н. Додаткові гетеробіфункціональні зшивальні лінкери і способи одержання АОС з їх використанням описані в патенті США Мо 6913748, що включений у даний опис як посилання в повному обсязі.
В одному варіанті здійснення використовують заряджені лінкери (також позначувані як прозаряджені лінкери) для кон'югації антитіл проти ЕСЕК з лікарськими засобами для одержання АОС. Заряджені лінкери включають лінкери, що стають зарядженими після процесингу в клітині. Присутність зарядженої групи (груп) у лінкері конкретного АОС або на лікарському засобі після процесингу в клітині забезпечує декілька переваг, таких як (ї) більш висока розчинність АОС у воді, (ії) здатність функціонувати при більш високій концентрації у водних розчинах, (ії) здатність зв'язувати більшу кількість молекул лікарського засобу на антитіло, що потенційно приводить до більш високої ефективності, (ім) потенціал до утримання заряджених структур кон'югатів усередині клітини, що приводить до більш високої ефективності, і (м) збільшення чутливості клітин із множинною стійкістю до лікарських засобів, що нездатні виводити заряджені структури лікарських засобів із клітини. Приклади деяких придатних або прозаряджених зшивальних лінкерів і їх синтезу представлені на фіг. 1-10 патенту США Мо 8236319 і вони включені в даний опис як посилання. Переважно, заряджені або прозаряджені зшивальні лінкери являють собою лінкери, які містять сульфонатні, фосфатні, карбоксильні замісники або замісники у вигляді четвертинних амінів, що значно збільшують розчинність АОС, особливо для АОС з 2-20 кон'югованими лікарськими засобами. Кон'югати, одержані з лінкерів, що містять прозаряджену частину, можуть продукувати одну або декілька заряджених частин після метаболізму кон'югата в клітині.
У наступному варіанті здійснення АОС за винаходом містить лінкер, що має формулу, представлену нижче (також див. патент США Мо 8236319, включений у даний опис як посилання): в. В т. В
У Й я У й
Ше У сежй б ре ши
Кк І Ск Що " Хо ях ях ях
Я. Во хо Ве ВР в де У являє собою функціональну групу, що забезпечує реакцію з антитілом; ОО являє собою функціональну групу, що забезпечує приєднання лікарського засобу через дисульфідний, простий тіоефірний, складний тіоефірний, пептидний, гідразоновий, складноефірний, простий бо ефірний, карбаматний або амідний зв'язок; К:, В», Вз, Ва, В5, Нв, В?7, Нв, Но», і Ко є однаковими або відрізняються і являють собою Н, лінійний алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до 6 атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкініл, що має від 2 до 6 атомів вуглецю, аніони, такі як, але не обмежуючись ними, 5Оз, Х-5О037, ОРОз-, Х-ОРОз-, РОзе, Х-РОз2, СО2-, катіони, такі як, але не обмежуючись ними, азотовмісний гетероцикл, МУВч1Ни2Віз або Х-МУВ11А:2Віз, або феніл, де: Кі,
Ві» і Кз є однаковими або відрізняються і являють собою Н, лінійний алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до 6 атомів вуглецю, і Х означає феніл або лінійний алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до 6 атомів вуглецю; Ї, т і п дорівнюють 0 або являють собою ціле число від 1 до 4; А являє собою феніл або заміщений феніл, де замісник являє собою лінійний алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, або розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до 6 атомів вуглецю, або заряджений замісник, вибраний з аніонів, таких як, але не обмежуючись ними, 505, Х-5О3, ОРОз-, Х-ОРОз2, РОз2, Х-РОз-е, СО»-, і катіонів, таких як, але не обмежуючись ними, азотовмісний гетероцикл, М"Ві:Ні2Віз або Х-МУВі:Аі2В:з, де Х має те ж визначення, що і вище, і де д дорівнює О або 1; 7 являє собою необов'язковий елемент поліетиленокси формули (ОСНеСНг)р, де р дорівнює 0 або являє собою ціле число від 2 до приблизно 1000, або елемент Е1-Е1-Р-Е2-Е2, у якому Е1 і Е2 є однаковими або відрізняються і являють собою С-0О, 0, або МЕч4, де К4 являє собою Н, лінійний алкіл, що має від 1 до 6 атомів вуглецю, розгалужений або циклічний алкіл, що має від З до б атомів вуглецю, лінійний, розгалужений або циклічний алкеніл або алкініл, що має від 2 до 6 атомів вуглецю; Р являє собою пептидний елемент довжиною від 2 до 20 амінокислот, де Е! або Е2 можуть бути зв'язані з пептидом через кінцевий азот, кінцевий вуглець або через бічний ланцюг амінокислот пептиду; і Е1 і Е2 є однаковими або відрізняються і являють собою необов'язковий елемент поліетиленокси формули (ОСНеСНг)р, де р дорівнює 0 або являє собою ціле число від 2 до приблизно 1000, за умови, що, коли 2 не є Е1-Е1-Р-Е2-Е2, щонайменше один з К., В», Нз, Ва, Вб5,
Ве, В?7, На, Вб» і К:о являє собою заряджений замісник, або, коли д дорівнює 1, щонайменше один з А, Кі, Р», В», Ва, Н5, Вб, В?7, Вв, Ве і К:о являє собою заряджений замісник.
Додаткові приклади лінкерів, які можна використовувати з даними композиціями і способами, включають валін-цитрулін; малеімідокапроїл; амінобензойні кислоти; /п- амінобензилкарбамоїл (РАВ); розщеплювані лізосомальними ферментами лінкери; малеімідокапроїл-поліетиленгліколь (МС(РЕС)6-ОН); М-метил-валін-цитрулін; М-сукцинімідил-4- (М-малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат (5МСС); М-сукцинімідил-4-(2- піридилдитіо)бутаноат (ЗРОВ) їі М-сукцинімідил-4-(2-піридилтіо)пентаноат (ЗРР) (також див. 05 2011/0076232). Інший лінкер для застосування в рамках винаходу включає зв'язок авідин-біотин для забезпечення АОС, що містить авідин-біотин (також див. патент США Мо 4676980, публікації
РСТ МоМо УУО 1992/022332А2, ЛО 1994/016729А1, УМО 1995/015770А1, М/О 1997/031655А2, УМО 1998/035704А1, МО 1999/019500А1, МО 2001/09785А2, М/о 2001/090198А1, Щ МО 2003/093793А2, МО 2004/050016А2, МО 2005/081898А2, МО 2006/083562А2, МО 2006/089668А1, МО 2007/150020А1, МО 2008/135237А1, МО 2010/111198А1, МО 2011/057216А1, МО 2011/058321А1, УМО 2012/027494А1 і ЕР776718В1), де деякі такі лінкери є стійкими до розщеплення біотинідазою. Додаткові лінкери, які можна використовувати в рамках винаходу, включають пари когезин/докерин для забезпечення АОС, що містить когезин-докерин (див. публікації РСТ МоМо М/О 2008/097866А2, МО 2008/097870А2, УМО 2008/103947А2 і УМО 2008/103953А2).
Додаткові лінкери для застосування в рамках винаходу можуть містити непептидні полімери (приклади включають, але не обмежуються ними, поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, поліоксіетиловані поліоли, полівініловий спирт, полісахариди, декстран, полівінілетиловий ефір,
РІА (полі(молочна кислота)), РГСА (співполімер молочна кислота-гліколева кислота) і їх комбінації, де переважним полімером є поліетиленгліколь) (також див. публікацію РСТ Мо УМО 2011/000370). Додаткові лінкери також описані в УМО 2004-010957, публікації США Мо 20060074008, публікації США Мо 20050238649 і публікації США Мо 20060024317, кожна з яких включена в даний опис як посилання в повному обсязі.
Для АОС, що містить майтанзиноїд, множина положень на майтанзиноїдах може служити як положення для хімічного приєднання лінкерної частини. В одному варіанті здійснення майтанзиноїди, які містять лінкерну частину, що містить реакційноздатну хімічну групу, являють собою С-3 складні ефіри майтанзинолу і їх аналоги, де лінкерна частина містить дисульфідний зв'язок, і хімічна реакційноздатна група містить М-сукцинімідильний або /-/М- сульфосукцинімідильний складний ефір. Наприклад, є придатними усі з положення С-3, що має 60 гідроксильну групу, положення С-14, модифікованого гідроксиметилом, положення сС-15,
модифікованого гідрокси, і положення С-20, що має гідроксигрупу. Найбільш переважно, лінкерна частина зв'язана з положенням С-3 майтанзинолу.
Кон'югацію лікарського засобу з антитілом через лінкер можна проводити будь-яким способом, відомим у даній галузі. Для ковалентного зв'язування лікарських засобів і лінкерів з антитілами доступний ряд різних реакцій. Це можна здійснювати шляхом реакції амінокислотних залишків антитіла, включаючи аміногрупи лізину, вільні групи карбонової кислоти, глутамінової і аспарагінової кислоти, сульфгідрильні групи цистеїну і різні частини ароматичних амінокислот. Одним з найбільш часто використовуваних неспецифічних способів ковалентного зв'язування є карбодіїмідна реакція для зв'язування карбокси(або аміно)групи сполуки з аміно(або карбокси)групами антитіла. Крім того, біфункціональні засоби, такі як діальдегіди і складні імідоефіри, використовують для зв'язування аміногрупи сполуки з аміногрупами антитіла. Також для зв'язування лікарських засобів з антитілами доступна реакція основи Шиффа. Цей спосіб включає окислювання перйодатом лікарського засобу, що містить групи гліколю або гідроксигрупи, таким чином утворюючи альдегід, який потім піддають реакції зі зв'язувальною сполукою. Зв'язування відбувається за допомогою утворення основи Шиффа з аміногрупами антитіла. Також як засоби для зв'язування можна використовувати ізотіоціанати для ковалентного зв'язування лікарських засобів з антитілами. Кваліфікованому фахівцю відомі інші способи і вони входять в обсяг винаходу.
У визначених варіантах здійснення проміжну сполуку, яка є попередником лінкера, піддають реакції з лікарським засобом у відповідних умовах. У визначених варіантах здійснення використовують реакційноздатні групи на лікарському засобі або проміжній сполуці. Потім продукт реакції між лікарським засобом і проміжною сполукою або дериватизованим лікарським засобом піддають реакції з антитілом проти ЕСЕ у відповідних умовах. Синтез і структура ілюстративних лінкерів, подовжувальних елементів, амінокислотних елементів, саморозщеплюваних спейсерних елементів описані в публікаціях патентних заявок США МоМо 20030083263, 20050238649 і 20050009751, кожна з яких включена в даний опис як посилання.
Стабільність АОС можна визначати стандартними аналітичними способами, такими як мас- спектроскопія, ВЕРХ і спосіб розділення/аналізу І С/М5.
ІМ. Очищення АОС проти ЕСЕК
Зо Очищення АОС можна проводити таким чином, щоб збирати АОС, що мають визначені ВАК.
Наприклад, смолу НІС можна використовувати для відділення АОС, що мають високе навантаження лікарським засобом, від АОС, що мають оптимальні співвідношення лікарського засобу й антитіла (ФАК), наприклад ЮАК, що складає 4 або менше. В одному варіанті здійснення до суміші АОС додають гідрофобну смолу, щоб небажані АОС, тобто АОС з більш високим навантаженням лікарським засобом, зв'язували смолу і могли бути селективно видалені із суміші. У визначених варіантах здійснення розділення АЮС можна проводити шляхом приведення в контакт суміші АОС (наприклад, суміш, що містить типи АОС з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи АОС з навантаженням лікарським засобом б або більше) з гідрофобною смолою, де кількість смоли є достатньою, щоб забезпечити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом, що підлягають видаленню із суміші АОС. Смолу і суміш АОС змішують разом, так щоб підлягаючі видаленню типи АОС (наприклад, типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше) зв'язувалися зі смолою і відділялися від інших типів АОС у суміші АОС. Кількість смоли, використовуваної в цьому способі, основана на співвідношенні мас між типом, що підлягає видаленню, і смолою, де використовувана кількість смоли не дозволяє значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом, що є бажаними. Таким чином, способи можна використовувати для зниження середнього ЮАК від 5,5 до менше ніж 4. Крім того, способи очищення, описані в даному документі, можна використовувати для виділення АЮС, що мають бажаний діапазон типів, навантажених лікарським засобом, наприклад типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше, типів з навантаженням лікарським засобом 3 або менше, типів з навантаженням лікарським засобом 2 або менше, типів з навантаженням лікарським засобом 1 або менше.
Визначені типи молекули (молекул) зв'язуються з поверхнею на основі гідрофобних взаємодій між типами і гідрофобною смолою. В одному варіанті здійснення спосіб за винаходом стосується процесу очищення, який оснований на змішуванні гідрофобної смоли і суміші АОС, де кількість смоли, що додається в суміш, визначає те, які типи (наприклад, АОС з ВАК 6 або більше) будуть зв'язуватися. Після одержання й очищення антитіла з експресуючої системи (наприклад, експресуюча система ссавців), антитіло відновлюють і зв'язують з лікарським засобом через реакцію кон'югації. Одержана суміш АОС часто містить АОС, що мають діапазон
БАК, наприклад, від 1 до 8. В одному варіанті здійснення суміш АОС містить типи з бо навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше. Відповідно до способів за винаходом суміш АОС можна очищати з використанням процесу, такого як, але не обмежуючись цим, періодичний процес, так щоб АОС, що мають типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше, відбирати і відділяли від АОС, що мають більш високе навантаження лікарським засобом (наприклад, АЮС, що мають типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше). Примітно, що способи очищення, описані в даному документі, можна використовувати для виділення АЮС, що мають бажаний діапазон рАК, наприклад ВАК 4 або менше, БАК З або менше, ВАК 2 або менше.
Таким чином, в одному варіанті здійснення суміш АОС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, можна приводити в контакт із гідрофобною смолою для формування суміші зі смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АОС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АОС, щоб одержати композицію, яка містить АОС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, і де
АС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином. В окремому варіанті здійснення спосіб за винаходом включає приведення в контакт суміші АЮС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, з гідрофобною смолою для формування суміші зі смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АМС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом б або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АОС, щоб одержати композицію, яка містить АОС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом б або більше, і де АЮС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином, де маса гідрофобної смоли в 3-12 разів перевищує масу типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, у суміші АОС.
Спосіб розділення АОС, описаний у даному документі, можна проводити з використанням способу періодичного очищення. Спосіб періодичного очищення включає додавання суміші АОС до гідрофобної смоли в ємності, змішування, а потім відділення смоли від супернатанту.
Зо Наприклад, у контексті періодичного очищення гідрофобну смолу можна одержувати або зрівноважувати бажаним буфером для зрівноважування. Таким чином, можна одержувати суспензію гідрофобної смоли. Потім суміш АОС можна приводити в контакт із суспензією для адсорбції конкретного типу(ів) АОС, що підлягає відділенню за допомогою гідрофобної смоли.
Потім розчин, який містить бажані АОС, що не зв'язуються з гідрофобним матеріалом смоли, можна відділяти від суспензії, наприклад, фільтрацією або наданням можливості суспензії осісти і видаленням супернатанту. Одержану суспензію можна піддавати одній або декільком стадіями промивання. Для елюювання зв'язаних АОС концентрацію солі можна знижувати. В одному варіанті здійснення процес, використовуваний у рамках винаходу, включає не більше 50 ггідрофобної смоли.
Таким чином, періодичний спосіб можна використовувати для приведення в контакт суміші
АОС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом б або більше, з гідрофобною смолою для формування суміші зі смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АОС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом б або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АЮС, так щоб одержати композицію, яка містить АЮС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином. В окремому варіанті здійснення періодичний спосіб використовують для приведення в контакт суміші АОС, що містить тип з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і тип з навантаженням лікарським засобом б або більше, з гідрофобною смолою для формування суміші зі смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АОС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом б або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АЮС, так щоб одержати композицію, яка містить АЮС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином, де маса гідрофобної смоли в 3-12 разів перевищує масу типу з навантаженням лікарським засобом б або більше, у суміші АОС. бо Альтернативно в окремому варіанті здійснення очищення можна проводити з використанням циркуляційного процесу, у якому смолу упаковують у контейнер і суміш АОС пропускають над гідрофобною смолою доти, поки не буде видалений конкретний тип(и) АОС, що підлягає відділенню. Потім супернатант (що містить бажані типи АОС) викачують з контейнера і шар смоли можна піддавати стадіям промивання.
Циркуляційний процес можна використовувати для приведення в контакт суміші, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, з гідрофобною смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АОС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АОС, так щоб одержати композицію, що містить АЮС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом б або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином. В окремому варіанті здійснення циркуляційний процес використовують для приведення в контакт суміші АОС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, з гідрофобною смолою для формування суміші зі смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю
АОС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше; і видалення гідрофобної смоли із суміші АЮС, так щоб одержати композицію, яка містить АЮС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином, де маса гідрофобної смоли в 3-12 разів перевищує масу типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, у суміші АОС.
Альтернативно для очищення суміші АОС для одержання композиції, яка містить основну частину АОС, що має визначене бажане АК, можна використовувати проточний процес. У проточному процесі смолою заповнюють контейнер, наприклад колонку, і суміш АОС пропускають через упаковану смолу, так щоб бажаний тип АОС по суті не зв'язувався зі смолою і проходив через смолу, а небажаний тип АОС зв'язувався зі смолою. Проточний процес можна проводити в режимі однократного проходження (де тип АОС, що представляє інтерес,
Зо одержують у результаті однократного проходження через смолу в контейнері) або в режимі багаторазового проходження (де тип АОС, що представляє інтерес, одержують у результаті багаторазових проходжень через смолу в контейнері). Проточний процес проводять так, щоб вибрана маса смоли зв'язалася з небажаною популяцією АОС і бажані АОС (наприклад, САКЕ 2- 4) проходили через смолу і збиралися в рідині, що вийшла, після одного або декількох проходжень.
Проточний процес можна використовувати для приведення в контакт суміші АОС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом б або більше, з гідрофобною смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АМС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом б або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше, де типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше проходять через смолу, а потім їх збирають після одного або декількох проходжень, так щоб одержати композицію, яка містить бажані АОС (наприклад, ОАЕ 2-4), де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом б або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином. В окремому варіанті здійснення проточний процес використовують для приведення в контакт суміші АОС, що містить типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше і типи з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, з гідрофобною смолою шляхом пропускання суміші АОС над смолою, де кількість гідрофобної смоли, приведеної в контакт із сумішшю АМС, є достатньою, щоб дозволити зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом б або більше зі смолою, але не дозволити значного зв'язування типів з навантаженням лікарським засобом 4 або менше, де типи з навантаженням лікарським засобом 4 або менше проходять через смолу, а потім їх збирають, так щоб одержати композицію, яка містить АОС, де композиція містить менше 1595 типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, і де АОС містить антитіло, кон'юговане з ауристатином, де маса гідрофобної смоли в 3-12 разів перевищує масу типів з навантаженням лікарським засобом 6 або більше, у суміші АОС.
Після проточного процесу смолу можна промивати за допомогою одного або декількох промивань, щоб далі виділити АЮС, які мають бажаний діапазон САК (що знаходяться у фільтраті після промивання). Наприклад, для подальшого виділення АОС, які мають САК, що 60 представляє інтерес, можна використовувати множину промивань, що мають знижувану провідність. Потім елюат, одержаний після промивання смоли, можна комбінувати з фільтратом, одержаним після проточного процесу, для підвищення виділення АОС, який має
БАК, що представляє інтерес.
Вищезгадані способи очищення за допомогою періодичного, циркуляційного і проточного процесів основані на застосуванні гідрофобної смоли для відділення типів АОС з високим навантаженням лікарським засобом проти низького. Гідрофобна смола містить гідрофобні групи, які взаємодіють з гідрофобними властивостями АОС. Гідрофобні групи на АС взаємодіють з гідрофобними групами в гідрофобній смолі. Чим більш гідрофобним є білок, тим сильніше він буде взаємодіяти з гідрофобною смолою.
Гідрофобна смола звичайно містить базову матрицю (наприклад, зшита агароза або матеріал на основі синтетичного співполімеру), з якою зв'язані гідрофобні ліганди (наприклад, алкільні або арильні групи). Багато гідрофобних смол є комерційно доступними. Приклади включають, але не обмежуються ними, Рпепу! Зерпагозе "м 6 Раві Ріом/ з низьким або високим заміщенням (Ріагтасіа І КВ ВіоїесппоІоду, АВ, Швеція); Рпепу! Зерпагозе "м Нідп Репогтапсе (Рпаптасіа І КВ Віотесппоіоду, АВ, Швеція); Ос! Зерпагозе "м Нідп Репогтапсе (Рпагтасіа І КВ
ВіотесппоІоду, АВ, Швеція); колонки Егасіоде! м ЕМО Ргоруї або Егасіоде! м ЕМО РВепуї (Метгск
Е., Німеччина); Масго-Ргер"м Меїпу!Ї або Масго-Ргер м, 1-Вщу! Зуирропіз (Віо-Вай, Саїйогпіа); МР
НІ-Ргору! (Сз)"м (ВаКег 4.Т., Мем/ ЧУегзеу) і простий ефірний, гексильний, фенільний або бутильний Тоуореагі "м (ТозоНаах, РА). В одному варіанті здійснення гідрофобна смола являє собою бутил-гідрофобну смолу. В іншому варіанті здійснення гідрофобна смола являє собою феніл-гідрофобну смолу. В іншому варіанті здійснення гідрофобна смола являє собою гексил- гідрофобну смолу, октил-гідрофобну смолу або децил-гідрофобну смолу. В одному варіанті здійснення гідрофобна смола являє собою метакриловий полімер, що має н-бутильні ліганди (наприклад, ТОМОРЕАКЦФ ВшиїуІ-600М).
Наступні способи очищення сумішей АОС для одержання композиції, яка має бажане ВАК, описані в заявці США Мо 14/210602 (публікація патентної заявки США Ме ОБ 2014/0286968), включеній як посилання в повному обсязі.
М. Застосування антитіл проти ЕСЕК і АОС проти ЕСЕК
Антитіла і частини антитіл (і АОС) за винаходом переважно здатні нейтралізовувати активність ЕСЕК людини іп мімо. Таким чином, такі антитіла і частини антитіл за винаходом можна використовувати для інгібування активності ПЕСЕК, наприклад, у культурі клітин, що містять ПЕСЕК, у людини або інших ссавців, що мають ЕСЕК, з яким антитіло за винаходом перехресно реагує. В одному варіанті здійснення винахід стосується способу інгібування активності ПЕСЕК, який включає приведення в контакт ПЕСЕК з антитілом або частиною антитіла за винаходом, так щоб відбувалося інгібування активності ПЕСЕК. Наприклад, у клітинній культурі, яка містить або передбачувано містить ПЕСЕК, антитіло або частину антитіла за винаходом можна додавати в культуральне середовище для інгібування активності
ПЕСЕК у культурі.
В іншому варіанті здійснення за винаходом передбачається спосіб зниження активності
ПЕСЕБК у індивідуума, переважно у індивідуума, що страждає на захворювання або порушення, при якому активність ЕСЕК є шкідливою. Винахід стосується способів зменшення активності
ЕСЕК у індивідуума, що страждає на таке захворювання або порушення, які включають введення індивідууму антитіла або частини антитіла за винаходом, так щоб відбувалося зниження активності ЕСЕК у індивідуума. Переважно, ЕСЕК являє собою ЕСЕК людини й індивідуумом є людина. Альтернативно індивідуумом може бути ссавець, у якого експресується
ЕСЕБЕ, з яким антитіла за винаходом здатні зв'язуватися. Крім того, індивідуумом може бути ссавець, якому був введений ЕСЕК (наприклад, за допомогою введення ЕСЕК або за допомогою експресії трансгена ЕСЕК). Антитіла за винаходом можна вводити людині для терапевтичних цілей. Більше того, антитіла за винаходом можна вводити ссавцю, що не є людиною, у якого експресується ЕСЕК, з яким антитіло здатне зв'язуватися, для ветеринарних цілей або як модель захворювання людини на тваринах. Що стосується останнього, такі моделі на тваринах можуть бути придатними для оцінки терапевтичної ефективності антитіл за винаходом (наприклад, дослідження дозувань і часу введення).
Як використовують у рамках винаходу, термін "порушення, при якому активність ЕСЕК є шкідливою," стосується захворювань і інших порушень, для яких показано або передбачається, що присутність ЕСЕК у індивідуума, що страждає на порушення, або є відповідальним за патофізіологію порушення, або є фактором, що приводить до погіршення порушення. Таким чином, порушення, при якому активність ЕСЕРК. є шкідливою, являє собою порушення, при якому очікується, що зниження активності ЕСЕК пом'якшить симптоми і/або прогресування бо порушення. Про такі порушення може свідчити, наприклад, збільшення концентрації ЕСЕК у біологічній рідині індивідуума, що страждає на порушення (наприклад, збільшення концентрації
ЕСЕК у пухлині, сироватці, плазмі, синовіальній рідині і т. д. індивідуума), яке можна виявляти, наприклад, з використанням антитіла проти ЕСЕК, як описано вище. Необмежувальні приклади порушень, які можна лікувати антитілами за винаходом, наприклад АБА або його антигензв'язувальними фрагментами, включають порушення, розглянуті нижче. Наприклад, придатні порушення включають, але не обмежуються ними, різні злоякісні пухлини, включаючи, але не обмежуючись ними, рак молочної залози, рак легені, гліому, рак предміхурової залози, рак підшлункової залози, рак товстого кишечнику, рак голови і шиї і рак нирки. Інші приклади злоякісної пухлини, яку можна лікувати з використанням композицій і способів, описаних у даному документі, включають плоскоклітинну карциному (наприклад, плоскоклітинний рак легені або плоскоклітинний рак голови і шиї), потрійний негативний рак молочної залози, недрібноклітинний рак легені, рак ободової і прямої кишки і мезотеліому. В одному варіанті здійснення антитіла і АОС, описані в даному документі, використовують для лікування солідної пухлини, наприклад для інгібування росту або зниження розміру солідної пухлини, надекспресуючої ЕСЕК або позитивної по ЕСЕК. В одному варіанті здійснення винахід спрямований на лікування плоскоклітинного раку легені з ампліфікованим ЕСЕК. В одному варіанті здійснення антитіла і АОС, описані в даному документі, використовують для лікування плоскоклітинного раку голови і шиї з ампліфікованим ЕСЕК. В іншому варіанті здійснення антитіла і АОС, описані в даному документі, використовують для лікування потрійного негативного раку молочної залози (ТМВС). Захворювання і порушення, описані в даному документі, можна лікувати антитілами або АОС проти ЕСЕК за винаходом, а також фармацевтичними композиціями, які містять такі антитіла або АОС проти ЕСЕК.
У визначених варіантах здійснення антитіла і АОС, описані в даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього, для лікування розгорнутих типів солідної пухлини, які, імовірно, мають підвищені рівні рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕК). Приклади таких пухлин включають, але не обмежуються ними, плоскоклітинну карциному голови і шиї, недрібноклітинний рак легені, потрійний негативний рак молочної залози, карциному ободової і прямої кишки і множинну гліобластому.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується способу інгібування або зниження
Зо росту солідної пухлини у індивідуума, що має солідну пухлину, причому зазначений спосіб включає введення антитіла або АОС проти ЕСЕК, описаних у даному документі, індивідууму, що має солідну пухлину, так щоб відбувалося інгібування або зниження росту солідної пухлини.
У визначених варіантах здійснення солідна пухлина являє собою недрібноклітинну карциному легень або гліобластому. У наступних варіантах здійснення солідна пухлина являє собою позитивну по ЕСЕКМІ пухлину або експресуючі ЕСЕК солідні пухлини. У наступних варіантах здійснення солідна пухлина являє собою солідну пухлину з ампліфікованим ЕСЕРЕ. або солідні пухлини, надекспресуючі ЕСЕК. У визначених варіантах здійснення антитіла або АОС проти
ЕСЕК, описані в даному документі, вводять індивідууму, що має множинну гліобластому, окремо або в комбінації з додатковим засобом, наприклад променевою терапією і/або темозоломідом.
У визначених варіантах здійснення винахід стосується способу інгібування або зниження росту солідної пухлини у індивідуума, що має солідну пухлину, яка ідентифікована як експресуюча ЕСЕ або надекспресуюча ЕСЕК пухлина (або експресуюча ЕСЕЕМІЇЇ пухлина), причому зазначений спосіб включає введення антитіла або АОС проти ЕСЕК, описаного в даному документі, індивідууму, що має солідну пухлину, так щоб відбувалося інгібування або зниження росту солідної пухлини. Способи ідентифікації експресуючих ЕСЕМК пухлин (наприклад, надекспресуючих ЕСЕК пухлин) відомі в даній галузі і включають схвалені ЕЮОА тести і підтверджувальні аналізи. Наприклад, аналіз ЕСЕК рпаптОх м (Обако Могій Атегіса, Іпс.) являє собою якісний імуногістохімічний (ІНС) набір, використовуваний для ідентифікації експресії ЕСЕК у нормальних і неопластичних тканинах, фіксованих стандартним чином для гістологічної оцінки. ЕСЕК рпагтОх специфічно виявляє білок ЕСЕК (НЕК!) у експресуючих
ЕСЕК клітинах. Крім того, також для ідентифікації пухлин, надекспресуючих ЕСЕК, можна використовувати аналізи на основі ПЛР. Наприклад, у цих аналізах можуть бути використані праймери, що є специфічними для варіанта гена і/або КДНК ЕСЕЕК (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:33) і забезпечують ампліфікацію гена/КДНК ЕСЕРЕ або їх частини. Потім ампліфіковані продукти ПЛР можна аналізувати, наприклад, гель-електрофорезом з використанням стандартних способів визначення розміру продуктів ПЛР, відомих у даній галузі. Такі тести можна використовувати для ідентифікації пухлин, які можна лікувати з використанням способів і композицій, описаних у даному документі. 60 Відповідно до даного винаходу можна використовувати будь-які способи генної терапії,
доступні в даній галузі. Для основних оглядів способів генної терапії, див. соїаз5рієї єї аї., 1993,
Сіїпіса! Рнаптасу, 12:488-505; Ми апа Ми, 1991, Віоїпегару, 3:87-95; ТоІвіозНем, 1993, Апп. Веу.
Ріпаптасої. Тохісої. 32:573-596; Миїйїдап, Зсієпсе, 260:926-932 (1993); і Могдап апа Апаегзхоп, 1993, Апп. Неу. Віоспет. 62:191-217; Мау, 1993, ТІВТЕСН, 11(5):155-215. Широко відомі в даній галузі способи технології рекомбінантних ДНК, які можна використовувати, описані в А!йзибеї еї аІ. (еа5.), Сиггепі РгоїосоїЇ5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, ЧУопп Умієу 50п5, МУ (1993); і КгіедіІег, Сепе
Тгапетег апа Ехргеззіоп, А І абогаїгу Мапиаї, (осКіоп Ргев5, МУ (1990). Докладний опис різних способів генної терапії представлений в публікації 5 20050042664 АТ, що включена в даний опис як посилання.
В іншому аспекті дана заявка стосується способу лікування (наприклад, лікування, пригнічення, пом'якшення, уповільнення або попередження виникнення або попередження рецидиву або загострення) або попередження асоційованого з ЕСЕК порушення у індивідуума.
Спосіб включає: введення індивідууму сполуки, що зв'язує ЕСЕК (зокрема, антагоніста), наприклад антитіла проти ЕСЕК або його фрагмента, як описано в даному документі, у кількості, достатній для лікування або попередження асоційованого з ЕСЕК порушення.
Антагоніст ЕСЕК, наприклад антитіло проти ЕСЕК або його фрагмент, можна вводити індивідууму окремо або в комбінації з іншими способами лікування, як описано в даному документі.
Антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можна використовувати для лікування таких захворювань окремо або в комбінації. Варто розуміти, що антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можна використовувати окремо або в комбінації з додатковим засобом, наприклад лікарським засобом, причому додатковий засіб вибирає кваліфікований фахівець для передбачуваної мети. Наприклад, додатковий засіб може являти собою лікарський засіб, визнаний у даній галузі як придатний для лікування захворювання або стану, що піддається лікуванню антитілом за винаходом. Додатковий засіб також може являти собою засіб, що надає корисну властивість терапевтичній композиції, наприклад засіб, що впливає на в'язкість композиції.
Крім того, варто розуміти, що комбінації, які включені в даний винахід, являють собою комбінації, придатні для передбачуваної для них мети. Засоби, зазначені нижче, представлені
Зо для ілюстративних цілей і не призначені для обмеження. Комбінації, що є частиною даного винаходу, можуть являти собою антитіла за даним винаходом і щонайменше один додатковий засіб, вибраний зі списків, наведених нижче. Також комбінація може включати більше одного додаткового засобу, наприклад два або три додаткових засоби, якщо комбінація є такою, що утворена композиція може виконувати передбачувану для неї функцію.
Комбінована терапія може включати один або декілька антагоністів ЕСЕК, наприклад антитіл проти ЕСЕК або їх фрагментів, складених з і/або спільно введених з одним або декількома додатковими лікарськими засобами, наприклад одним або декількома інгібіторами цитокінів і факторів росту, імунодепресантами, протизапальними засобами (наприклад, системні протизапальні засоби), протифіброзними засобами, інгібіторами метаболізму, інгібіторами ферментів і/або цитотоксичними цитостатичними засобами, інгібіторами мітозу, протипухлинними антибіотиками, імуномодулюючими засобами, векторами для генної терапії, алкілувальними засобами, антиангіогенними засобами, антиметаболітами, боровмісними засобами, хемопротективними засобами, гормонами, антигормональними засобами, кортикостероїдами, фотоактивними лікарськими засобами, олігонуклеотидами, радіонуклідними засобами, інгібіторами топоізомерази, інгібіторами тирозинкінази або радіосенсибілізуючими засобами, як більш докладно описано в даному документі.
У конкретному варіанті здійснення зв'язувальні білюи проти ЕСЕК, описані в даному документі, наприклад антитіла проти ЕСЕК, використовують у комбінації з засобом проти злоякісної пухлини або антинеопластичним засобом. Терміни "засіб проти злоякісної пухлини" і "антинеопластичний засіб" стосуються лікарських засобів, використовуваних для лікування злоякісних пухлин, таких як злоякісний ріст. Лікарську терапію можна використовувати окремо або в комбінації з іншими способами лікування, такими як хірургічна операція або променева терапія. Для лікування злоякісної пухлини можна використовувати декілька класів лікарських засобів, залежно від природи залученого органа. Наприклад, рак молочної залози звичайно стимулюється естрогенами і його можна лікувати лікарськими засобами, що інактивують статеві гормони. Аналогічно, рак предміхурової залози можна лікувати лікарськими засобами, що інактивують андрогени, чоловічі статеві гормони. Засоби проти злоякісної пухлини, які можна використовувати разом з антитілами проти ЕСЕК за даним винаходом, включають, серед інших, наступні засоби: (516)
ди 0оКометай 10000000опаялам оментарі Приклади пухлини
Антитіла Антитіла, які зв'язують ІСЕ- 195 Го повністе гуманізоване тАБ) (а) антитіла, відмінні ів (рецептор Ср751-871 (повністю гуманізоване тАб) від антитіл проти інсуліноподібного фактора Н7СІО (гуманізоване тАБ)
ЕСЕКЕК; і росту 1 типу), що аірпа!вЗ (миша) (р) антитіла проти експресується на клітинній ЗСЕМ/ЕС (химера миша/людина)
ЕСЕБЕК, що зв'язують поверхні більшості ЕМ/164 (миша) відмінні епітопи злоякісних пухлин людини
Антитіла, які зв'язують ЕСЕК Матузумаб (ЕМО72000) бакора росту) мутації, що ЕгойихвуЦетуксимаб (Ітсіопе) ' я Месііріхеу/панітумумаб (Атдеп) впливають на експресію або тАЬ 806 активність ЕСРК, можуть Ніохосумаб (Тпегасім) приводити до злоякісної пухлини
Антитіла, що зв'язують СМЕТ (фактор мезенхімно- Аме Ан епітеліального переходу); БОБ (ОА-5О5) (Сепепіесі) представник сімейства МЕТ Н2г44с11 (Рієїте Бабге) рецепторних тирозинкіназ : Ар 'ят4 (ММ 121-14) жежнем ПЕЖО ит 18403; 201012 (ОЗ Рпагта АС
ММР-АЕМУ541-А
Рецептор інсуліноподібного | ВМ5-536,924 (1Н-бензоімідазол-2-іл)-1 Н-
Низькомолекулярні фактора росту 1 типу, що піридин-2-он) сполуки, націлені на експресується на поверхні | ВМ5-554,417
ІшеТА клітин множини злоякісних | Циклоліган пухлин людини ТАЕ226
РО4О01
ІрессавуГефітиніб (Азігалепеса)
СІ-1033 (РО 183805) (Ріїгег)
Лапатиніб (БУУ-572016) (СПахозтНКІЇїпе)
ЕСЕК (рецептор Тайкерб(/Лапатинібу дитозилат (Зтійй епідермального фактора Кіїпе Вееспат)
Низькомолекулярні росту); надекспресія або ТарцевабуУЕрлотиніб НСІ. (051-774) (О8І сполуки, націлені на мутації, що впливають на Рпагта) аг експресію або активність РКІ-166 (Момапів)
ЕСЕЕК, можуть приводити до РО-158780 злоякісної пухлини ЕКВ-569
Тирфостин АС 1478 (4-(З-хлораніліно)- б,7-диметоксихіназолін)
СМЕТ (фактор мезенхімно-
Низькомолекулярні епітеліального переходу); сполуки, націлені на представник сімейства Дав
СМЕТ рецепторних тирозинкіназ
МЕТ
Фторурацил (5-ЕІ)
Капецитабін«СЕЛОДАФ (НІ К Коспе) 5-Трифторметил-2'-дезоксіуридин
Метотрексат натрію (Тгтехаї|) (Вагг)
Ралтитрексед/ГТомудексоф (Азігагепеса)
Антиметаболіти Пеметрексед/Алімтаф (І Шу)
Тегафур
Цитозину арабінозид (Цитарабін, Ага-
С)/ЛПогуаніне (СіахозтЙНКІЇїпе) 5-Азацитидин б-Меркаптопурин (Меркаптопурин, 6-МР
Засіб проти злоякісної К .
Азатіоприн/АзасанФ (ААІРНАКМА ГГ С) 6-Тіогуанін (6-ТО)/Пуринтоле (ТЕМА)
Пентостатин/НіпентФ (Нобзріга Іпс.)
Флударабіну фосфат/Флудараф (Вауег
Неайй Саге)
Кладрибін (2-СаА, 2- хлордезоксіаденозин)/ЛеустатинфФ (Огійо
Віоїтесп
Інгібітор рибонуклеотидредуктази (КМЕ)
Циклофосфамід/Цитоксан (ВМ5)
Неосар (ТЕМА)
Іфосфамід/МітоксанфФ (АЗТА Меаіса)
Алкілувальний Тіотепа (Веагога, Абгахів, Тема) антинеопластичний засіб ВСМИ-» 1,3-біс(2-хлоретил)-1- являє собою алкілувальний |нітрозосечовина засіб, що зв'язується з ССМи-» 1-(2-хлоретил)-3-циклогексил-1- алкільною групою ДНК. нітрозосечовина (метил ССМИ)
Оскільки злоякісні клітини, Гексаметилмеламін (Алтретамін, як правило, проліферують | НММ)/ГексаленфФ (МОЇ Рпагта Іпс.)
Алкілувальні засоби необмежено більше, ніж Бусульфан/Мілеран (СіахобтіййКіїпе) здорові клітини, вони є Прокарбазин НСІ /Матулан (бідта Тац більш чутливими до пралласетісав, Іпс.) ушкодження ДНК, і Дакарбазин (ОТІС) алкілувальні засоби Хлорамбуцил/Лейкараф (ЗтіййКіїпе використовують для Вееспат) клінічного лікування різних | Мелфалан/Алкеранф (СіахозтіййКіїпе) пухлин Цисплатин (Цисплатинум,
СОРОР)/Платинол (Вгікто! Муегв)
Карбоплатин/Параплатин (ВМ5)
Оксаліплатин/Елокситанф (Запоїі-Амепії5
Інгібітори топоізомерази являють собою Доксорубіцин НСІ /Доксиле) (Аіга) хіміотерапевтичні засоби, . й Даунорубіцину цитрат/ДауноксомФ призначенідля (сіївас) перешкоджання дії Мітоксантрон НСІ /Новантрон (ЕМО ферментів топоізомераз вегопо) о (топоізомераза | і Ії), які Актиноміцин Ю
Інгібітори являють собою ферменти, | Топозид/Вепесиде (ВМ5)/Етопофосе топоіїзомерази що контролюють зміни Нозріга, Весіога, Тема Рагепіега!, Ес.) структури ДНК шляхом (Нозріга, й ' каталізу руйнування і Топотекан НСІ/Гікамтине повторного зв'язування (СіахозтійКіїпе) гл. й Теніпозид (ММ-26)/)ВумонфФ (ВМ5) фосфодіефірного кістяка : : ринотекан НОСІ (СРТ-І)/Камптосаре ланцюгів ДНК У ході (Рпаттасіа 5 Оріопп) нормального клітинного циклу
Мікротрубочки є одним з Вінкристин/Онковінф) (І Шу) компонентів цитоскелета. Вінбластину сульфат/Велбанф
Вони мають діаметр «24 нм і| (припинений) (І Шу) довжину, що варіює від Вінорелбіну тартрат/МамеїЇбіпет . . декількох мікрометрів до, (РієттеРарбгє)
Маки на можливо, міліметрів в Віндезину сульфат/ЕїІдізіпеф (І Шу) аксонах нервових клітин. Паклітаксел/Таксоле (ВМ5)
Мікротрубочки служать як Доцетаксел/Таксотерф (Запоїї Амепії5 ОБ) структурні компоненти у Паклітаксел у формі наночастинок (АВІ- клітинах і залучені в 007)/Абраксанф (АБбгахі5 Віозсіепсе, Іпс.) множину клітинних процесів, | Іс(забепілон/КЗЕМПРА "М (ВМ5)
Вашій ПИ ЗВНИ ПОН З:--ЗИИН
Коментарі Приклади пухлини включаючи мітоз, утворення цитокінів і везикулярний транспорт
Тирозинкінази являють собою ферменти в клітині, що функціонують, приєднуючи фосфатні групи Іматинібу мезилат/Глівек (Момапів)
Шляхом блокування Сунітинібу малат/СутентФб (Рії7ег)
Інгібітори кіназ здатності У Сорафенібу тозилат/ Нексаваре (Вауег) протеїнтирозинкіназ Нілотинібу гідрохлориду й й моногідрат/ТасигнафФ (Момагпіі5) функціонувати, ці сполуки забезпечують інструмент для контролю росту злоякісних клітин
Альфа-інтерферон
Індукують прояв у пацієнтів | Інгібітор ангіогенезу/АвастинФ
Імунні лікарські засоби зі злоякісною пухлиною (Сепепієсйі) Що здатності до імунної І/-2-- Інтерлейкін-2 відповіді (Альдеслейкін)/ПролейкінфФ (Спігоп)
І--12-- Інтерлейкін-12
Тореміфену цитрат/Фарестонф (СТУ, Іпс.)
Фулвестрант/Фаслодексфе (Азіга/епеса)
Ралоксифен НС /Евістаф (І Шу)
Гормональна терапія, Анастразол/Аримідексф) (Азіга/епеса) асоційована з менопаузою і | Лектрозол/Фемараф (Момагіів) старінням, спрямована на Фадрозол (СО5 16949А) підвищення рівня Екземестан/Аромазиное (Рпаптасіа 8. визначених гормонів в Оріопп) організмі для компенсації Леупроліду ацетат/ЕїїдагаФ (ОТ. ОА) пов'язаних зі старінням або |Люпронф (ТАР РІагт) захворюванням знижень Гозереліну ацетат/Золадекс?
Гормони рівнів гормонів. (Асіга/єпеса)
Гормональна терапія як Триптореліну памоат/Ігеїбїаге (М/аї5оп спосіб лікування злоякісної |/Іарв) пухлини або знижує рівень |Бузерелін/СуперфактФ (Запоїї Амепіїв5) специфічних гормонів, або | Нафарелін змінює здатність злоякісної | Цетрорелікс/ЦетротидФ (ЕМО Зегопо) пухлини використовувати ці | Бікалутамід/Касодексфе (Авіга/епеса) гормони для росту і Нілутамід/Ніландронф (Амепіїз Рпагт.) поширення Магестролу ацетат/МегейсФ (ВМ5)
Аналоги соматостатину (Октреотиду ацетат/
Сандостатинф) (Момагії5)
Протизапальні лікарські засоби, використовувані для Преднізолон
Глпюкокортикоїди викликає біль при злоянсній Дексаметазон/ДекадронФ (Уууеїйп) пухлині
Каскад передачі сигналу відкритий у проце Сиролімус (Рапаміцин)у/РапамунфФ (Уууеїй)
Інгібітори ТТОВ досліджень Темсиролімус (ССІ-779У/Гориселе (Уууеїйп) імунодепресивного засобу Дефоролімус (АР23573)/(Агіай Рпапгт.) : В Еверолімус (КА0ООВ)/Цертикане (Момагіів) рапаміцину. Цей висококонсервативний
Баш --новй ПН В ПОН З: ЗИ
Коментарі Приклади пухлини каскад регулює проліферацію і метаболізм клітин у відповідь на фактори зовнішнього середовища, зв'язуючи передачу сигналу рецепторів факторів росту в клітині через фосфоінозитид-3-кіназу (РІ-
ЗК) з ростом клітин, проліферацією й ангіогенезом
На доповнення до описаних вище засобів проти злоякісної пухлини, антитіла і АОС проти
ЕСЕРЕ, описані в даному документі, можна вводити в комбінації з засобами, описаними в розділі
І. Крім того, згадані вище засоби проти злоякісної пухлини також можна використовувати в АОС за винаходом.
У конкретних варіантах здійснення антитіла або АОС проти ЕСЕК можна вводити окремо або з іншим засобом проти злоякісної пухлини, що діє разом або синергічно з антитілом, для лікування захворювання, асоційованого з активністю ЕСЕК. Такі засоби проти злоякісної пухлини включають, наприклад, засоби, добре відомі в даній галузі (наприклад, цитотоксини, хіміотерапевтичні засоби, низькомолекулярні сполуки і променева терапія). Приклади засобів проти злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, Панорекс (СіІахо-Мвісоте),
Ритуксан (ІОЕС/Сепепіесп/Нойтап Іа Коспе), Мілотарг (УМууеїй), Кампат (МіПеппішт), Зевалін (ЕС їі Зспегіпд АС), Бексар (Согіха/с5К), Ербітукс (Іпсіопе/ВМ5), Авастин (Сепепієесі) і
Герцептин (Сепепіесп/Нойтап Іа Коспе). Інші засоби проти злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, засоби, описані в патенті США Мо 7598028 і міжнародній публікації Мо
МО 2008/100624, зміст яких включений в даний опис як посилання. Один або декілька засобів проти злоякісної пухлини можна вводити або одночасно, або до або після введення антитіла або його антигензв'язувальної частини за винаходом.
У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла або АОС проти ЕСЕК, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з апоптотичним засобом, таким як інгібітор рсіІ-хІ або інгібітор Всі-2 (В-клітинна лімфома 2) (наприклад, АВТ-199 (венетоклакс)), для лікування злоякісної пухлини, такої як лейкоз, у індивідуума. В одному варіанті здійснення антитіла або АЮС проти ЕСЕК, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з інгібітором БсіІ-хі для лікування злоякісної пухлини. В одному варіанті здійснення антитіла або АОС проти ЕСЕЕ, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з венетоклаксом для лікування злоякісної пухлини.
У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла або АОС проти ЕСЕК, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з інгібітором МАМРТ (див. приклади інгібіторів у 05 2013/0303509; АББМІіє, Іпс., включеній в даний опис як посилання) для
Зо лікування індивідуума, що потребує цього. МАМРТ (також відомий як фактор, що підсилює колонії пре-В-клітин (РВЕР), і вісфатин) являє собою фермент, який каталізує фосфорилування нікотинаміду і є лімітуючим швидкість ферментом в одному з двох каскадів, що реутилізують
МАЮ. В одному варіанті здійснення винаходу, антитіла проти ЕСЕК і АОС, описані в даному документі, вводять у комбінації з інгібітором МАМРТ для лікування злоякісної пухлини у індивідуума.
У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіла або АОС проти ЕСЕК, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з 5М-38, що є активним метаболітом інгібітору топоізомерази іринотекану.
В інших варіантах здійснення антитіла або АОС проти ЕОЕК, описані в даному документі, можна використовувати в комбінованій терапії з інгібітором РАКР (полі(АЮР- рибоза)полімерази), наприклад веліпарибом, для лікування злоякісної пухлини, у тому числі раку молочної залози, раку яєчника і недрібноклітинного раку легені.
Наступні приклади додаткових лікарських засобів, які можна спільно вводити і/або складати з антитілами проти ЕСЕК або АОС проти ЕСЕЕК, описаними в даному документі, включають, але не обмежуються ними, один або декілька з: інгальованих стероїдів; бета-агоністів, наприклад бета-агоністів короткої дії або тривалої дії; антагоністів лейкотриєнів або рецепторів лейкотриєнів; комбінованих лікарських засобів, таких як АЮОМАЇЕК; інгібіторів ДЕ, наприклад антитіл проти ЩЕ (наприклад, ХОГ АІКФ, омалізумаб); інгібіторів фосфодіестерази (наприклад, інгібітори РОЕ4); ксантинів; антихолінергічних лікарських засобів; стабілізаторів тучних клітин, таких як кромолін; інгібіторів 1-4; інгібіторів 1-5; інгібіторів еотаксину/ССКЗ; антагоністів гістаміну або його рецепторів, включаючи НІ, Н2, НЗ і НА, їі антагоністів простагландину О або його рецепторів (ОРІ ї СКТН2). Такі комбінації можна використовувати для лікування, наприклад, астми й інших респіраторних порушень. Інші приклади додаткових лікарських засобів, які можна спільно вводити і/або складати з антитілами проти ЕСЕК або АОС проти
ЕСЕК, описаними в даному документі, включають, але не обмежуються ними, один або декілька з: темозоломіду, ібрутинібу, дувелісибу і іделалісибу. Додаткові приклади лікарських засобів, які можна спільно вводити і/або складати з одним або декількома антитілами проти
ЕСЕК або їх фрагментами, включають один або декілька з: антагоністів ТМЕ (наприклад, розчинний фрагмент рецептора ТМЕ, наприклад р55 або р/5 рецептора ТМЕ людини або їх похідні, наприклад 75 кДа ТМЕК-Ідс (злитий білок 75 кДа рецептор ТМЕ-С, ЕНБРЕЛ)); ферментних антагоністів ТМЕ, наприклад інгібіторів ТМЕ-конвертуючого ферменту (ТАСЕ); антагоністів мускаринових рецепторів; антагоністів ТОЕ-бета; інтерферону-гамма; перфенідону; хіміотерапевтичних засобів, наприклад метотрексату, лефлуноміду або сиролімусу (рапаміцин) або їх аналогів, наприклад ССІ-779; інгібіторів СОХ2 і сРІ А2; МАЮ; імуномодуляторів; інгібіторів р38, ТРІ -2, інгібіторів МК-2 і МЕКВ, серед інших.
Інші переважні комбінації являють собою цитокінсупресивний протизапальний лікарський засіб(оби) (С5АЇІ); антитіла до або антагоністи інших цитокінів або факторів росту людини, наприклад 1-1, ІС-2, 1-3, 11 -4, 1-5, 11 -6, 1-7, 1-8, 11-15, 11-16, 1-18, 1-21, 1-31, інтерферони,
ЕМАРА-ЇЇ, СМ-СЗЕ, ЕСЕ, ЕСЕ, РОС ії ендотелін-1, а також рецептори цих цитокінів ії факторів росту. Антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальні частини можна комбінувати з антитілами до молекул клітинної поверхні, таких як СО2, СОЗ3, 204, 208, 2025, 26028, СО30,
Сраб0, бр45, С069, СОо80 (87.1), СбО86 (87.2), С090, СТА, СТІ А-4, РО-1 або їх ліганди, включаючи СО154 (др39 або СО401).
Переважні комбінації лікарських засобів можуть перешкоджати різним етапам запального каскаду; переважні приклади включають антагоністи ТМЕ, такі як химерні, гуманізовані або людські антитіла проти ТМЕ, адалімумаб (НОМІКА; 02Е7; публікація РСТ Мо УМО 97/29131 і патент США Мо 6090382, включені в даний опис як посилання), СА2 (Ремікейд"М), СОР, 571, і розчинні рецептори р55 або р75 ТМЕ, їх похідні (рР75ТМЕВІДИ (Енбрел"М) або ро5ТМЕВІДИ (Ленерцепт)), і також інгібітори ТМЕ-конвертуючого ферменту (ТАСЕ); аналогічно інгібітори 1-1 (інгібітори інтерлейкін-1-конвертуючого ферменту, ІІ-1КА і т. д.) можуть бути ефективними з тієї ж причині. Інші переважні комбінації включають інтерлейкін-4.
Фармацевтичні композиції за винаходом можуть включати "терапевтично ефективну кількість" або "профілактично ефективну кількість" антитіла або частини антитіла за винаходом. "Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості, ефективної у дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективну кількість антитіла або частини антитіла може визначити фахівець у даній галузі, і вона може варіюватися залежно від таких факторів як хворобливий стан, вік, стать і маса індивідуума і здатність зв'язувального білка викликати бажану відповідь у індивідуума. Також терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, при якій терапевтично сприятливі ефекти переважують будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла. "Профілактично ефективна кількість" стосується кількості, ефективної у дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, оскільки профілактичну дозу використовують у індивідуумів до захворювання або на ранній стадії захворювання, профілактично ефективна кількість є меншою, ніж терапевтично ефективна кількість.
Режими дозування можна змінювати для забезпечення оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної або профілактичної відповідій. Наприклад, можна проводити однократне болюсне введення, можна вводити декілька розділених доз з перебігом часу або дозу можна пропорційно знижувати або збільшувати залежно від терапевтичної ситуації.
Особливо переважним є виготовлення парентеральних композицій у вигляді одиничної дозованої форми для простоти введення й однаковості дозування. Одинична дозована форма, як використовують у рамках винаходу, належить до фізично дискретних одиниць, придатних для однократних дозувань у ссавців, що підлягають лікуванню; причому кожна одиниця містить задану кількість активної сполуки, обчислену для досягнення бажаного ефекту, разом з необхідним фармацевтичним носієм. Характеристики одиничних дозованих форм за винаходом бо визначаються і прямо залежать від (а) унікальних характеристик активної сполуки і конкретного терапевтичного або профілактичного ефекту, що має бути досягнутий, і (Б) обмежень, властивих галузі виготовлення такої активної сполуки, для лікування чутливості у індивідуумів.
Ілюстративний необмежувальний діапазон для терапевтично або профілактично ефективної кількості АЮС, антитіла або частини антитіла за винаходом складає 0,1-20 мг/кг, більш переважно 1-10 мг/кг. В одному варіанті здійснення доза антитіл і АОС, описаних у даному документі, складає від 1 до б мг/кг, включаючи окремі зазначені дози, що входять у цей діапазон, наприклад 1 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг і 6 мг/кг. В іншому варіанті здійснення доза антитіл і АОС, описаних у даному документі, складає від 1 до 200 мкг/кг, включаючи окремі зазначені дози, що входять у цей діапазон, наприклад 1 мкг/кг, 2 мкг/кг, З мкг/кг, 4 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг, 30 мкг/кг, 40 мкг/кг, 50 мкг/кг, 60 мкг/кг, 80 мкг/кг, 100 мкг/кг, 120 мкг/кг, 140 мкг/кг, 160 мкг/кг, 180 мкг/кг ії 200 мкг/кг. Слід зазначити, що величини дозувань можуть варіюватися залежно від типу і тяжкості стану, що підлягає пом'якшенню. Крім того, варто розуміти, що для конкретного індивідуума конкретні режими дозування варто коректувати відповідно до потреб індивідуума і професійних рішень особи, що вводить або спостерігає за введенням композицій, і що діапазони дозувань, зазначених у даному описі, є тільки ілюстративними і не призначені для обмеження обсягу або застосування на практиці заявленої композиції.
Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що інші придатні модифікації й адаптації способів за винаходом, описаних у даному документі, є очевидними і їх можна проводити з використанням придатних еквівалентів без відхилення від обсягу винаходу або варіантів здійснення, описаних у даному документі. Після докладного опису даного винаходу, він стане більш зрозумілим за допомогою наступних прикладів, які включені тільки для ілюстрації і не призначені для обмеження винаходу.
Слід зазначити, що дозування можуть варіюватися залежно від типу і тяжкості стану, що підлягає пом'якшенню. Крім того, варто розуміти, що для будь-якого конкретного індивідуума конкретні режими дозування потрібно коректувати з перебігом часу залежно від потреб індивідуума і професійної думки особи, що здійснює введення або контролює введення композицій, і що діапазони дозувань, зазначені в даному описі, є тільки ілюстративними і не призначені для обмеження обсягу або застосування на практиці заявленої композиції.
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, наприклад
АРрА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 0,1 до 30 мг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 1 до 15 мг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 1 до 10 мг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 2 до З мг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 1 до 4 мг/кг.
В одному варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, описане в даному документі, наприклад
АРрА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 1 до 200 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 5 до 150 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад
АРрА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 5 до 100 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 5 до 90 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 5 до 80 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 5 до 70 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад бо індивідууму, що має злоякісну пухлину, як АОС у дозі від 5 до 60 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК, наприклад АБА або його антигензв'язувальну частину, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, як
АОС у дозі від 10 до 80 мкг/кг.
В одному варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад
АрА-ус-ММАЄЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 0,1 до 6 мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мс-ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 0,5 до 4 мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мсе-ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 1,8 до 2,4 мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-ус-ММАЄЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 1 до 4 мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мо-ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі приблизно 1 мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мс-
ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від З до б мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБрА-мо-ММАЄЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі З мг/кг. В іншому варіанті здійснення
АОС проти ЕСЕРЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мс-ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 2 до З мг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, наприклад АБА-мс-
ММАЕ, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі 6 мг/кг.
В іншому варіанті здійснення антитіло проти ЕСЕК (АОС), описане в даному документі, кон'юговане з лікарським засобом, наприклад РВО, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 1 до 200 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕРК, описаний у даному документі, вводять індивідууму, що потребує
Зо цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 5 до 100 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 5 до 90 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 5 до 80 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 5 до 70 мкг/кг. В іншому варіанті здійснення АОС проти ЕСЕК, описаний у даному документі, вводять індивідууму, що потребує цього, наприклад індивідууму, що має злоякісну пухлину, у дозі від 5 до 60 мкг/кг.
Дози, описані вище, можуть бути придатними для введення або АОС, або антитіл проти
ЕСЕРЕ, описаних у даному документі.
В іншому аспекті дана заявка стосується способу виявлення присутності ЕСЕК у зразку іп міго (наприклад, у біологічному зразку, такому як сироватка, плазма, тканина, біоптат).
Розглянутий спосіб можна використовувати для діагностики порушення, наприклад злоякісної пухлини. Спосіб включає: (ї) приведення в контакт зразка або контрольного зразка з антитілом проти ЕСЕК або його фрагментом, як описано в даному документі; і (її) виявлення утворення комплексу між антитілом проти ЕСЕК або його фрагментом і зразком або контрольним зразком, де статистично значима зміна утворення комплексу в зразку відносно контрольного зразка вказує на присутність ЕСЕК у зразку.
Враховуючи їх здатність зв'язуватися з ЕОЕК людини, антитіла проти ЕСЕК людини або їх частини за винаходом (а також їх АОС) можна використовувати для виявлення ЕСЕК людини (наприклад, у біологічному зразку, такому як сироватка або плазма) з використанням загальноприйнятого імуноаналізу, такого як твердофазні імуноферментні аналізи (ЕГІЗА), радіоїмунний аналіз (КІА) або імуногістохімія тканин. В одному аспекті винахід стосується способу виявлення ЕСЕК людини в біологічному зразку, який включає приведення біологічного зразка в контакт з антитілом або частиною антитіла за винаходом і виявлення або антитіла (або частини антитіл), зв'язаного з ЕСЕК людини, або незв'язаного антитіла (або частини антитіла), щоб тим самим виявити ЕСЕК людини в біологічному зразку. Антитіло прямо або непрямо мітять речовиною, що піддається виявленню, щоб полегшити виявлення зв'язаного або 60 незв'язаного антитіла. Придатні речовини, що піддаються виявленню, включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали і радіоактивні матеріали. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, В- галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїтну ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламіну флуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклад люмінесцентного матеріалу включає люмінол; і приклади придатного радіоактивного матеріалу включають ЗН, 14055 90 99, 111, 125), 191), 177) у, 166Но або "5351т.
Альтернативно міченню антитіла, ЕСЕ людини можна аналізувати в біологічних рідинах за допомогою конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів гпЕСЕК, мічених речовиною, що піддається виявленню, і неміченого антитіла проти ЕСЕК людини. У цьому аналізі біологічний зразок, мічені стандарти ШЕСЕК і антитіло проти ЕСЕК об'єднують і визначають кількість міченого стандарту ГПЕСЕК, зв'язаного з неміченим антитілом. Кількість
ЕСЕК людини в біологічному зразку зворотно пропорційна кількості міченого стандарту ТЕСЕРК, зв'язаного з антитілом проти ЕСЕК. Аналогічно, ЕСЕК людини також можна аналізувати в біологічних рідинах за допомогою конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів
ГЕСЕК, мічених речовиною, що піддається виявленню, і неміченого антитіла проти ЕСЕК людини.
В іншому аспекті дана заявка стосується способу виявлення присутності ЕСЕК іп мімо (наприклад, візуалізація іп мімо у індивідуума). Розглянутий спосіб можна використовувати для діагностики порушення, наприклад асоційованого з ЕСЕК порушення. Спосіб включає: (Її) введення антитіла проти ЕСЕК або його фрагмента, як описано в даному документі, індивідууму або контрольному індивідууму в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла або фрагмента з ЕСЕЕ; і (ії) виявлення утворення комплексу між антитілом або фрагментом і ЕСЕК, де статистично значима зміна утворення комплексу у індивідуума відносно контрольного індивідуума вказує на присутність ЕСЕК.
МІ. Фармацевтичні композиції
Також винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять антитіло, або його антигензв'язувальну частину, або АЮС за винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції, які містять антитіла або АОС за винаходом, призначені для застосування, але не обмежуючись цим, у діагностиці, виявленні або моніторингу порушення, у профілактиці, лікуванні, керуванні перебігом або пом'якшенні порушення або одного або декількох його симптомів і/або в дослідженнях. У конкретному варіанті здійснення композиція містить одне або декілька антитіл за винаходом. В іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція містить одне або декілька антитіл або АОС за винаходом й один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів, відмінних від антитіл або АОС за винаходом, для лікування порушення, при якому активність ЕСОЕК є шкідливою. Переважно профілактичні або терапевтичні засоби являють собою засоби, які відомі як придатні або які раніше використовували або на даний час використовують для профілактики, лікування, керування перебігом або пом'якшення порушення або одного або декількох його симптомів. Відповідно до цих варіантів здійснення композиція може додатково містити носій, розріджувач або ексципієнт.
Антитіла і частини антитіл або АЮС за винаходом можна включати у фармацевтичні композиції, придатні для введення індивідууму. Як правило, фармацевтична композиція містить антитіло або частину антитіла за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. Як використовують у рамках винаходу, "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-які і всі розчинники, диспергуючі середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні і уповільнюючі всмоктування засоби і т. п., що є фізіологічно сумісними. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають одне або декілька з води, фізіологічного розчину, фосфатно-сольового буфера, декстрози, гліцерину, етанолу і т. п., а також їх комбінації. У багатьох випадках у композицію переважно включають ізотонічні засоби, наприклад цукри, поліспирти, такі як маніт, сорбіт або хлорид натрію. Крім того, фармацевтично прийнятні носії можуть містити невеликі кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні засоби або емульгатори, консерванти або буфери, що підвищують термін зберігання або ефективність антитіла, або частини антитіла, або АОС.
В одному варіанті здійснення винахід стосується ліофілізованого складу, що містить кон'югат антитіло проти ЕСЕК-лікарський засіб, сахарозу, полісорбат 80 і гістидин, де склад має рН приблизно 5-7, де кон'югат антитіло проти ЕСЕК-лікарський засіб містить антитіло проти
ЕСЕК або його антигензв'язувальну частину, кон'юговані з монометилауристатином Е (ММАЕ).
В одному варіанті здійснення винахід, крім того, стосується ліофілізованого складу, який містить бо АС проти ЕСЕЕК, що містить антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальну частину, як описано в даному документі, кон'юговані з ауристатином, наприклад ММАЕ, цукор, наприклад сахарозу, поверхнево-активну речовину, наприклад полісорбат, такий як полісорбат 80 і гістидин. В одному варіанті здійснення ліофілізований склад містить 1-20 мг гістидину, приблизно 320-410 мг цукру, приблизно від 0,1 до 0,9 мг поверхнево-активної речовини і приблизно 1-150 мг АОС проти ЕСЕК, що містить антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальну частину, як описано в даному документі, кон'юговані з ауристатином, наприклад ММАЕ. Також винахід стосується водного складу, який містить приблизно 1-100 мг/мл АОС проти ЕСЕК, що містить антитіло проти ЕСЕК або його антигензв'язувальну частину, як описано в даному документі, кон'юговані з ауристатином, наприклад ММАЕ, приблизно 1-10 мг/мл гістидину, приблизно 50-90 мг/мл цукру, наприклад сахарози, і приблизно 0,01-0,2 мг/мл поверхнево-активні речовини, наприклад полісорбату 80.
Відомі різні системи для доставки і їх можна використовувати для доставки одного або декількох антитіл або АЮС за винаходом або комбінації одного або декількох антитіл за винаходом і профілактичного засобу або терапевтичного засобу, придатного для профілактики, керування перебігом, лікування або пом'якшення порушення або одного або декількох його симптомів, наприклад інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати антитіло або фрагмент антитіла, опосередковуваний рецептором ендоцитоз (див., наприклад, Ми апа Уми, у. Віої. Спет. 262:4429-4432 (1987)), конструювання нуклеїнової кислоти як частини ретровірусного або іншого вектора і т. д. Способи введення профілактичного або терапевтичного засобу за винаходом включають, але не обмежуються ними, парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне і підшкірне), епідуральне введення, внутрішньопухлинне введення і введення на слизову оболонку (наприклад, інтраназальний і пероральний шляхи). Крім того, можна використовувати легеневе введення, наприклад, з використанням інгалятора або розпилювача і складу з утворюючим аерозоль засобом. Див., наприклад, патенти США МоМо 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 4880078; і публікації РСТ Мо УМО 92/19244, УМО 97/32572, МО 97/44013, УМО 98/31346 і УУО 99/66903, всі з яких включені у даний опис як посилання. В одному з варіантів здійснення антитіло за винаходом, комбіновану терапію або композицію за винаходом вводять з
Зо використанням технології для легеневої доставки лікарського засобу АІКеппе5 АІКФ (АїІКегтев,
Іпс., Сатбгідде, Ма55.). У конкретному варіанті здійснення профілактичні або терапевтичні засоби за винаходом вводять внутрішньом'язово, внутрішньовенно, усередину пухлини, перорально, інтраназально, через легені або підшкірно. Профілактичні або терапевтичні засоби можна вводити будь-яким зручним способом, наприклад інфузією або болюсною ін'єкцією, за допомогою усмоктування через епітеліальні або шкірно-слизові вистілки (наприклад, слизові оболонки порожнини рота, прямої кишки, кишечнику і т. д.), і їх можна вводити разом з іншими біологічно активними засобами. Введення може бути системним або місцевим.
У конкретному варіанті здійснення може бути бажаним введення профілактичних або терапевтичних засобів за винаходом локально в область, що потребує лікування; цього можна досягати, наприклад, і не обмежуючись цим, локальною інфузією, ін'єкцією або за допомогою імплантата, причому зазначений імплантат являє собою пористий або непористий матеріал, що включає мембрани і матриці, такі як силастикові мембрани, полімери, фіброзні матриці (наприклад, Тіх5цеке) або колагенові матриці. В одному з варіантів здійснення ефективну кількість одного або декількох антитіл-антагоністів за винаходом вводять локально в уражену область індивідуума для профілактики, лікування, керування перебігом і/або пом'якшення порушення або його симптому. В іншому варіанті здійснення ефективну кількість одного або декількох антитіл за винаходом вводять локально в уражену область індивідуума в комбінації з ефективною кількістю одного або декількох лікарських засобів (наприклад, одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів), відмінних від антитіла за винаходом, для профілактики, лікування, керування перебігом і/або пом'якшення порушення або одного або декількох його симптомів.
В іншому варіанті здійснення профілактичний або терапевтичний засіб за винаходом можна доставляти в системі для контрольованого вивільнення або уповільненого вивільнення. В одному з варіантів здійснення для досягнення контрольованого або уповільненого вивільнення можна використовувати насос (див. І апдег, вище; Зейоп, 1987, СКС Стії. Кеї. Віотей. Епа. 14:20; Виспума!а еї аї!., 1980, Бигоаегу, 88:507; Зацаеєк еї аї!., 1989, М. Епої. У. Меа. 321:574). В іншому варіанті здійснення для досягнення контрольованого або уповільненого вивільнення лікарських засобів за винаходом можна використовувати полімерні матеріали (див., наприклад,
Меадіса! Арріїсайопе ої СопігоПей Реїєазе, І апдег апа Муізе (єдв.), СВО Ргез., Воса Наюп, НРіа. 60 (1974); СопігоПейа Огид Віоамайарійшу, Огид Ргодисі Оеєзідп апа Репогптапсе, Зтоїеп апа Ваї!
(єдз».), М/Ієу, Мем Хоїк (1984); Вапдег апа Рерразв, 1983, 9., Мастотої. 5сі. Веу. Мастотої. Спет. 23:61; також див. І ему єї а!., 1985, бсіепсе, 228:190; Юигіпу єї аі!., 1989, Апп. Мешгої. 25:351;
Ножмага еї аї., 1989, У. Меигоб5игуд. 71:105; патент США Мо 5679377; патент США Мо 5916597; патент США Мо 5912015; патент США Мо 5989463; патент США Мо 5128326; публікацію РСТ Мо
МО 99/15154 і публікацію РСТ Мо М/О 99/20253). Приклади полімерів, використовуваних для складів з уповільненим вивільненням, включають, але не обмежуються ними, полі(2- гідроксіетилметакрилат), поліметилметакрилат, поліакрилову кислоту, співполімер етилену і вінілацетату, поліметакрилову кислоту, полігліколіди (РІ (3), поліангідриди, полі(М- вінілпіролідон), полівініловий спирт, поліакриламід, поліетиленгліколь, полілактиди (РА), співполімер лактидів і гліколідів (РА) і складні поліортоефіри. У переважному варіанті здійснення полімер, використовуваний у складі з уповільненим вивільненням, є інертним, не містить домішок, що вимиваються, є стабільним при зберіганні, стерильним і біодеградовним. В іншому варіанті здійснення поблизу профілактичної або терапевтичної мішені можна поміщати систему з контрольованим або уповільненим вивільненням, що, таким чином, робить необхідною тільки частину системної дози (див., наприклад, Соодзоп, Медіса! Арріїсайопе ої
СопігоїІєй Веїєазе, зирга, мої. 2, рр. 115-138 (1984)).
Системи з контрольованим вивільненням розглянуті в огляді Іапдег (1990, Зсіепсе, 249:1527-1533). Для одержання складів з уповільненим вивільненням, що включають один або декілька лікарських засобів за винаходом, можна використовувати будь-який спосіб, відомий фахівцю в даній галузі. Див., наприклад, патент США Мо 4526938, публікацію РСТ УМО 91/05548, публікацію РСТ УМО 96/20698, Міпод еї аї., 1996, "Іпігашштога! Кадіоіттипоїпегарйу ої а Нитап
Сооп Сапсег Хеподгай віпа а 5ивіаіпед-КеіІеазе Се!", Вадіоштегару 4 Опсоіоду 39:179-189, опо вї аї!., 1995, "Апіїроду Меадіаїей І ипд Тагодеїйпоу ої І опд-Сіксцайпа Етиївіопв", РОА ЧЧошттаї ої
Рпагтасешііса! 5сіепсе 5 Тесппоіоду, 50:372-397, СіеекК еї аї., 1997, "Віодедгадабіє Роїутегіс Сатівєгв ог а БРСЕ Апіїроду їог Сагаїомазсціаг Арріїсайоп", Рго. Іпг!. Зутр. Сопігої. Веї. Віоасі.
Маїег. 24:853-854, і Ії ат еї аї., 1997, "Місгоепсарзціайоп ої Кесотбіпапі Нитапігей Мопосіопаї
Апіїбоду їог Госа! Оеєїїмегу", Ргос. Іпг!. Бутр. Сопіго! Неї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, всі з яких включені у даний опис як посилання в повному обсязі.
У конкретному варіанті здійснення, де композиція за винаходом являє собою нуклеїнову
Зо кислоту, кодуючу профілактичний або терапевтичний засіб, нуклеїнову кислоту можна вводити іп мімо для забезпечення експресії кодованого нею профілактичного або терапевтичного засобу, за допомогою конструювання її як частини відповідного експресуючого нуклеїнову кислоту вектора і введення його так, щоб він став внутрішньоклітинним, наприклад, з використанням ретровірусного вектора (див. патент США Мо 4980286), або за допомогою прямої ін'єкції, або з використанням бомбардування мікрочастинками (наприклад, генна гармата; Віоїїсііст?, биРопу, або покривання ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами, або введення його у формі, зв'язаній з гомеобоксоподібним пептидом, що, як відомо, проникає в ядро (див., наприклад, чоїйої еї аї., 1991, Ргос. Май. Асай. Зсі. ИОБ5А, 88:1864-1868).
Альтернативно нуклеїнову кислоту для експресії можна вводити усередину клітини і вбудовувати за допомогою гомологічної рекомбінації в ДНК клітини-хазяїна.
Фармацевтичну композицію за винаходом виготовляють так, щоб вона була сумісна з передбачуваним шляхом введення. Приклади способів введення включають, але не обмежуються ними, парентеральне, наприклад внутрішньовенне, внутрішньошкірне, підшкірне, пероральне, інтраназальне (наприклад, інгаляційне), трансдермальне (наприклад, місцеве), трансмукозальне і ректальне введення. У конкретному варіанті здійснення композицію виготовляють відповідно до загальноприйнятих способів як фармацевтичну композицію, адаптовану для внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, перорального, інтраназального або місцевого введення людині. Як правило, композиції для внутрішньовенного введення являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері. Коли необхідно, композиція може включати солюбілізуючу речовину і місцевий анестетик, такий як лігнокаїн, для пом'якшення болю в області ін'єкції.
Якщо спосіб за винаходом включає інтраназальне введення композиції, композицію можна виготовляти у формі аерозолю, спрею, рідини для розпилення або у формі крапель. Зокрема, профілактичні або терапевтичні засоби для застосування відповідно до винаходу можна зручним чином доставляти у формі аерозольного спрею з пакетів, що знаходяться під тиском, або пристрою для розпилення, з використанням придатного пропеленту (наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану, діоксиду вуглецю або іншого придатного газу). У випадку аерозолю, що знаходиться під тиском, дозовану одиницю можна відміряти за допомогою надання клапана для доставки дозованої кількості. Можна 60 виготовляти капсули і касети (що складаються, наприклад, з желатину) для застосування в інгаляторі або інсуфляторі, що містить порошкову суміш сполуки і придатної порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль.
Якщо спосіб за винаходом включає пероральне введення, пероральні композиції можна виготовляти у формі таблеток, капсул, крохмальних капсул, желатинових капсул, розчинів, суспензій і т. п. Таблетки або капсули можна одержувати загальноприйнятими способами з використанням фармацевтично прийнятних ексципієнтів, таких як зв'язувальні речовини (наприклад, прежелатинізований кукурудзяний крохмаль, полівінілпіролідон або гідроксипропілметилцелюлоза); наповнювачі (наприклад, лактоза, мікрокристалічна целюлоза або гідрофосфат кальцію); мастильні речовини (наприклад, стеарат магнію, тальк або діоксид кремнію); дезінтегруючі речовини (наприклад, картопляний крохмаль або натрію крохмалю гліколят) або змочувальні речовини (наприклад, лаурилсульфат натрію). Таблетки можна покривати способами, добре відомими в даній галузі. Рідкі препарати для перорального введення можуть мати форму, але не обмежуючись ними, розчинів, сиропів або суспензій або вони можуть бути представлені як сухий продукт для розчинення водою або іншим придатним носієм перед застосуванням. Такі рідкі препарати можна одержувати загальноприйнятими способами з використанням фармацевтично прийнятних добавок, таких як суспендуючі речовини (наприклад, сироп сорбіту, похідні целюлози, гідрогенізовані або харчові жири); емульгатори (наприклад, лецитин або гуміарабік); неводні носії (наприклад, мигдальна олія, масляні складні ефіри, етиловий спирт або фракціоновані рослинні олії) і консерванти (наприклад, метил- або пропіл-п-гідроксибензоат або сорбінова кислота). Також препарати можуть містити буферні солі, смакові добавки, барвники і підсолоджувачі, у відповідних випадках. Препарати для перорального введення можуть бути придатним чином виготовлені для повільного вивільнення, контрольованого вивільнення або безперервного вивільнення профілактичного або терапевтичного засобу (засобів).
Спосіб за винаходом може включати легеневе введення, наприклад з використанням інгалятора або пристрою для розпилення, композиції, виготовленої з утворюючим аерозоль засобом. Див., наприклад, патенти США МоМо 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 і 4880078; і публікації РСТ МоМо УМО 92/19244, МО 97/32572, МО 97/44013,
УМО 98/31346 і УМО 99/66903, всі з яких включені у даний опис як посилання в повному обсязі. У
Зо конкретному варіанті здійснення антитіло за винаходом, комбінований лікарський засіб і/або композицію за винаходом вводять з використанням технології легеневої доставки лікарського засобу АІКептез АІКФ (АїІКептев, Іпс., Сатьгідде, Маз55.).
Спосіб за винаходом може включати введення композиції, виготовленої для парентерального введення, за допомогою ін'єкції (наприклад, за допомогою болюсної ін'єкції або безперервної інфузії). Склади для ін'єкції можуть бути надані в одиничній дозованій формі (наприклад, у ампулах або контейнерах для багаторазового дозування) з додаванням консерванту. Композиції можуть мати такі форми, як форми суспензій, розчинів або емульсій у масляних або водних носіях, і вони можуть містити засоби для виготовлення складу, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі засоби. Альтернативно активний інгредієнт може знаходитися у формі порошку для розчинення придатним носієм (наприклад, стерильною водою, що не містить пірогенів) перед застосуванням.
Крім того, способи за винаходом можуть включати введення композицій, виготовлених як депо-препарати. Такі склади тривалої дії можна вводити за допомогою імплантації (наприклад, підшкірної або внутрішньом'язової) або за допомогою внутрішньом'язової ін'єкції. Таким чином, наприклад, композиції можна виготовляти з використанням придатних полімерних або гідрофобних матеріалів (наприклад, таких як емульсія в прийнятній олії) або іонообмінних смол, або як малорозчинні похідні (наприклад, малорозчинна сіль).
Способи за винаходом включають введення композицій, виготовлених як нейтральна форма або форма солі. Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені з аніонами, такими як аніони хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, виннокам'яної кислот і т. д., і солі, утворені з катіонами, такими як катіони натрію, калію, амонію, кальцію, гідроксидів заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т. д.
Як правило, інгредієнти композицій надають або окремо, або в суміші один з одним в одиничній дозованій формі, наприклад, як сухий ліофілізований порошок або концентрат, що не містить води, в герметично закритому контейнері, такому як ампула або саше, із указанням кількості активної речовини. Коли способом введення є інфузія, композицію можна дозувати за допомогою бутля для інфузії, що містить стерильну воду для фармацевтичного застосування або фізіологічний розчин. Коли способом введення є ін'єкція, може бути надана ампула зі стерильною водою для ін'єкції або фізіологічним розчином, так щоб інгредієнти можна було 60 змішувати перед введенням.
Зокрема, винахід також передбачає, що один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом упаковані в герметично закритий контейнер, такий як ампула або саше, із указанням кількості активної речовини. В одному з варіантів здійснення один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом надають як сухий стерилізований ліофілізований порошок або концентрат, що не містить води, в герметично закритому контейнері і їх можна відновлювати (наприклад, водою або фізіологічним розчином) до концентрації, придатної для введення індивідууму. Переважно один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом надають як сухий стерильний ліофілізований порошок в герметично закритому контейнері в одиничному дозуванні, що складає щонайменше 5 мг, щонайменше 10 мг, щонайменше 15 мг, щонайменше 25 мг, щонайменше 35 мг, щонайменше 45 мг, щонайменше 50 мг, щонайменше 75 мг або щонайменше 100 мг. Ліофілізовані профілактичні або терапевтичні засоби або фармацевтичні композиції за винаходом потрібно зберігати при температурі від 2 "С до 8 "С у їх вихідному контейнері, і профілактичні або терапевтичні засоби або фармацевтичні композиції за винаходом повинні бути введені в межах 1 тижня, у межах 5 діб, у межах 72 годин, у межах 48 годин, у межах 24 годин, у межах 12 годин, у межах 6 годин, у межах 5 годин, у межах З годин або у межах 1 години після відновлення. В альтернативному варіанті здійснення один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій за винаходом надають у рідкій формі в герметично закритому контейнері, на якому зазначена кількість і концентрація речовини. Переважно рідку форму композиції, що вводиться, надають у герметично закритому контейнері в концентрації щонайменше 0,25 мг/мл, щонайменше 0,5 мг/мл, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2,5 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 25 мг/мл, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл або щонайменше 100 мг/мл. Рідку форму потрібно зберігати при температурі від 2 "С до 8 "С у її вихідному контейнері.
Антитіла і частини антитіл за винаходом можуть бути включені у фармацевтичну композицію, придатну для парентерального введення. Переважно антитіло або частину антитіла одержують як ін'єктований розчин, що містить 0,1-250 мг/мл антитіла. Ін'єктований
Зо розчин може складатися або з рідкої, або з ліофілізованої дозованої форми в безбарвному або бурштиновому флаконі, ампулі або попередньо заповненому шприці. Буфер може являти собою
І-гістидин 1-50 мМ (оптимально 5-10 мМ), при рН від 5,0 до 7,0 (оптимально рН 6,0). Інші придатні буфери включають, але не обмежуються ними, сукцинат натрію, цитрат натрію, фосфат натрію або фосфат калію. Для модифікації токсичності розчину можна використовувати хлорид натрію в концентрації 0-300 мМ (оптимально 150 мМ для рідкої дозованої форми). Для ліофілізованої дозованої форми можна додавати кріопротектор, головним чином 0-1095 сахарозу (оптимально 0,5-1,095). Інші придатні кріопротектори включають трегалозу і лактозу.
Для ліофілізованої дозованої форми можна додавати наповнювачі, головним чином 1-1095 маніт (оптимально 2-495). Як у рідких, так і в ліофілізованих дозованих формах можна використовувати стабілізатори, головним чином 1-50 мМ І -метіонін (оптимально 5-10 мМ). Інші придатні наповнювачі включають гліцин, аргінін, і можна додавати 0-0,0595 полісорбат-80 (оптимально 0,005-0,0195). Додаткові поверхнево-активні речовини включають, але не обмежуються ними, полісорбат 20 і поверхнево-активні речовини ВК). Фармацевтична композиція, що містить антитіла і частини антитіл за винаходом, одержана як ін'єктований розчин для парентерального введення, може додатково містити засіб, придатний як ад'ювант, такий як засоби, використовувані для підвищення усмоктування або диспергування терапевтичного білка (наприклад, антитіло). Особливо придатним ад'ювантом є гіалуронідаза, така як Нуіепехб (рекомбінантна гіалуронідаза людини). Додавання гіалуронідази в ін'єктований розчин підвищує біодоступність у людини після парентерального введення, зокрема підшкірного
БО введення. Також воно дозволяє вводити великі об'єми на область ін'єкції (тобто більше 1 мл) при зниженні болю і неприємних відчуттів і мінімальній зустрічальності реакцій області ін'єкції (див. УМО 2004/078140, 5 Мо 2006/104968, включені в даний опис як посилання).
Композиції за даним винаходом можуть мати різні форми. Вони включають, наприклад, рідкі, напівтверді і тверді дозовані форми, такі як рідкі розчини (наприклад, ін'єктовані і інфузовані розчини), дисперсії або суспензії, таблетки, пігулки, порошки, ліпосоми і супозиторії. Переважна форма залежить від передбачуваного шляху введення і терапевтичного застосування. Типові переважні композиції мають форму ін'єктованих або інфузованих розчинів, таких як композиції, подібні до композицій, використовуваних для пасивної імунізації людини іншими антитілами.
Переважним способом введення є парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, підшкірний, бо внутрішньоочеревинний, внутрішньом'язовий). У переважному варіанті здійснення антитіло вводять за допомогою внутрішньовенної інфузії або ін'єкції. В іншому переважному варіанті здійснення антитіло вводять за допомогою внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції.
Терапевтичні композиції, як правило, мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Композицію можна виготовляти як розчин, мікроемульсію, дисперсію, ліпосоми або іншу упорядковану структуру, придатну для високої концентрації лікарського засобу. Стерильні ін'єктовані розчини можна одержувати включенням активної сполуки (тобто антитіла або частини антитіла) у необхідній кількості у відповідний розчинник з одним або з комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, при необхідності, з наступною стерилізацією фільтруванням. Як правило, дисперсії одержують додаванням активної сполуки в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище й інші необхідні інгредієнти з тих, що перераховано вище. У випадку стерильних ліофілізованих порошків для приготування стерильних ін'єктованих розчинів, переважними способами виготовлення є вакуумне сушіння і розпилювальне сушіння, що приводять до порошку активного інгредієнта з будь-якими додатковими бажаними інгредієнтами з їх попередньо стерилізованого фільтрацією розчину.
Належну плинність розчину можна підтримувати, наприклад, з використанням покриття, такого як лецитин, підтриманням необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і з використанням поверхнево-активних речовин. Пролонгованого усмоктування ін'єктованих композицій можна досягати включенням у композицію засобу, що уповільнює усмоктування, наприклад солей моностеарату і желатину.
Антитіла і частини антитіл або АОС за винаходом можна вводити множиною способів, відомих у даній галузі хоча для багатьох терапевтичних застосувань переважним шляхом/способом введення є підшкірна ін'єкція, внутрішньовенна ін'єкція або інфузія. Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі, шлях і/або спосіб введення може варіювати, залежно від бажаних результатів. У визначених варіантах здійснення активну сполуку можна виготовляти з носієм, що запобігає швидкому вивільненню сполуки, таким як склад з контрольованим вивільненням, що включає імплантати, черезшкірні пластири і мікроінкапсульовані системи для доставки. Можна використовувати біодеградовні біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри і полімолочна кислота.
Для одержання таких складів запатентована або, головним чином, відома фахівцям у даній
Зо галузі множина способів. Див., наприклад, Зивіайпей апа СопігоПей Кеїєазе Огид Оеїїмегу
Зувівтзв (У. В. Вобіпзоп, єд.) (Магсеї! Оеккег", Іпс., Мему МоїКк, 1978).
У визначених варіантах здійснення антитіло, або частину антитіла, або АОС за винаходом можна вводити перорально, наприклад, з інертним розріджувачем або засвоюваним харчовим носієм. Сполуку (і інші інгредієнти, якщо бажано) також можна поміщати в желатинову капсулу з
З5 твердою або м'якою оболонкою, пресувати в таблетки або включати безпосередньо в раціон індивідуума. Для перорального терапевтичного введення сполуки можна включати з ексципієнтами і використовувати у формі проковтуваних таблеток, таблеток для трансбукального введення, коржів, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, пластинок і т. п. Для введення сполуки за винаходом способом, відмінним від парентерального введення, може бути необхідним покривання сполуки матеріалом для запобігання її інактивації або введення сполуки разом з ним.
В інших варіантах здійснення антитіло, або частина антитіла, або АОС за винаходом можуть бути кон'юговані з полімерною структурою, так що зазначена полімерна структура може надавати достатній розмір зазначеному антитілу або частині антитіла за винаходом, щоб зазначені антитіло або частина антитіло за винаходом мали перевагу збільшеної проникності й ефекту утримання (ефект ЕРК) (також див. публікацію РСТ Мо МУО 2006/0421464А2 і публікації
США МоМо 2004/0028687А1, 2009/0285757А1 і 2011/0217363А1, і патент США Мо 7695719, усі з яких включені в даному описі як посилання в повному обсязі і для всіх цілей).
Також у композиції можна включати додаткові активні сполуки. У визначених варіантах
БО здійснення антитіло, або частину антитіла, або АОС за винаходом складають і/або спільно вводять з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, які придатні для лікування порушень, при яких активність ЕСЕК є шкідливою. Наприклад, антитіло проти ПЕСЕК, або частину антитіла, або АОС за винаходом можна складати і/або спільно вводити з одним або декількома додатковими антитілами, що зв'язують інші мішені (наприклад, антитіла, які зв'язують цитокіни або які зв'язують молекули клітинної поверхні). Більше того, одне або декілька антитіл за винаходом можна використовувати в комбінації з двома або більше із зазначених вище лікарських засобів. Такі комбіновані лікарські засоби можна переважно використовувати з більш низькими дозуваннями лікарських засобів, що вводяться, таким чином, уникаючи можливої токсичності або ускладнень, асоційованих з різними способами монотерапії. бо У визначених варіантах здійснення антитіло або АОС проти ЕСЕК або його фрагмент зв'язані з носієм, що подовжує час напівжиття, відомим у даній галузі. Такі носії включають, але не обмежуються ними, Ес-домен, полієтиленгліколь і декстран. Такі носії описані, наприклад, у заявці США із серійним номером Ме 09/428082 і опублікованій заявці РСТ Мо УМО 99/25044, що включена в даний опис як посилання для будь-яких цілей.
Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що інші придатні модифікації й адаптації способів за винаходом, описаних у даному документі, є очевидними і їх можна проводити з використанням придатних еквівалентів без відхилення від обсягу винаходу або варіантів здійснення, описаних у даному документі. Після докладного опису винаходу, він стане більш зрозумілим за допомогою наступних прикладів, що включені тільки для ілюстрації і не призначені для обмеження.
Приклади
Приклад 1. Ідентифікація поліпшених антитіл проти ЕСЕК
Антитіло 1
Антитіло 1 (АБ!) являє собою гуманізоване антитіло проти ЕСЕК. Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга (МН) АБ1 представлена нижче як ЗЕО ІЮ
МО:1. Амінокислотні послідовності СОК МН АБІ підкреслені нижче і є наступними:
СаМ5ІЗБОБАМ/М (МН СОВА; 5ЕО ІЮ МО:с2); МІЗМ5ОМТАМОРБІ КК (МН СОВ2; ЗЕО І МОЗ) і
АаВагРМУ (МН СОВЗ; 5ЕО ІЮ МО 4).
Послідовність МН АбБІ1
ОМОГОЕБаРОЇ МКРОЗОТІ БІ ТСТУЗИамУБІЗЗОГАММУМІВОРРОКа! ЕУМСаХІЗУЗИМТВМОРБІ. КЗВІТІЗАОТ5КМОГРІ КІ М2ЕЄУТААОТАТУУСУТАавагРММ ОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО-1).
Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга (М) АБ1 представлена нижче як ЗЕО ІЮ МО 5. Амінокислотні послідовності СОК МІ АБІ підкреслені нижче і є наступними: НОБОВІМОМІС (МІ СОВА; 5ЕО 10 МО:6); НаТМ ОО (МІ СОВ2; 5ЕО І МО:7) і
МОУАОГРМУ/Т (МІ СОВЗ; 5ЕО І МО:8).
Послідовність МІ. АБІ1 рРІОМТО5РООЗМ5УЗУСОАВМТІТоНЗЗОВІМЗМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСИМНСТМ ВрамРБАЕ зазвавиатТомт Тіз ОРЕОРАТУУСМОМАОГРМТРасаИткі БІК (ЗЕО ІО МО:5).
Проводили скринінг для ідентифікації антитіл проти ЕСЕК, що мають поліпшені властивості відносно АБІ1. Докладна інформація про ідентифікацію варіантів АБ1 представлена нижче.
Зо Одержання бібліотек МІ. і МН варіантів АБІ1
Варіанти антитіла АБІ ідентифікували за допомогою скринінгу бібліотек одноланцюжкових антитіл (5СЕм), що містять варіанти варіабельних областей важкого або легкого ланцюга АБІ1.
Одна з бібліотек 5сЕм містила варіанти варіабельних областей важкого ланцюга АБІ1 (тобто 5СЕм, що містять варіанти варіабельних областей важкого ланцюга АБІ1 і варіабельні області легкого ланцюга АБІ), у той час як друга бібліотека 5сЕм містила варіанти варіабельних областей легкого ланцюга АБІ1 (тобто 5сЕм, що містять варіанти варіабельних областей легкого ланцюга АБ і варіабельні області важкого ланцюга АБІ1). Варіанти областей МН і МІ. АБІ1 також об'єднували в третю бібліотеку 5сЕм, яку потім піддавали скринінгу за допомогою множини раундів для селекції комбінацій варіантів МН ії МІ АБІ, що мають більш високу афінність зв'язування, ніж АбБ1. Конструкція бібліотек варіантів МН і МІ АБІ представлена на фіг. 16.
Для одержання варіантів МН-областей АБ1І було вибрано дванадцять амінокислотних залишків для внесення мутацій, основуючись, щонайменше частково, на вирівнюванні МН АБ з
МНА-4 (ЗЕО ІЮО МО:93) і послідовностями ембріонального типу МН4-Б (див. фіг. 16А, де мутантні амінокислотні залишки позначені як "Х"). Також вносили зміну Р1О01О (позначувану як "2" на фіг. 16А) на основі послідовностей ембріонального типу людини і послідовностей АБ1. Шляхом використання кодонів, описаного вище, було обчислено, що за допомогою націлювання на дванадцять залишків (залишки "Х" на фіг. 16А) бібліотека 109 може забезпечити більшість варіантів МН АБІ1 з чотирма або менше мутантними залишками на клон. Як описано на фіг. 16А, один залишок каркасної області (О1Е) також був змінений для запобігання утворенню М- кінцевого піроглутамату.
Для одержання варіантів областей МІ АБІ було вибрано одинадцять амінокислотних залишків для внесення мутацій, основуючись, щонайменше частково, на вирівнюванні області
МІ. АБІ з послідовністю ембріонального типу ІЗКМ1-12 (І 5) (див. залишки, позначені як "Х" на фіг. 168) ПС2КМ1-12 представлена як ЗЕО ІЮ МО:94). Залишки в положеннях 33 і 52 (позначені як "1" ї "2", відповідно, на фіг. 168) модифікували так, щоб вони мали обмежену різноманітність.
Залишки в положенні 33 були обмежені до І, М, І або РЕ, і залишки в положенні 52 були обмежені до З, А, Ті Р.
Дріжджові бібліотекию, виходячи з вищесказаного, одержували з використанням способів трансформації, описаних у Вепайії еї а. (2010), Ргоївіп Епо, Оезідп апа ЗеїІесіоп, 23(4):155-159. 60 Скринінг бібліотек варіантів 5сСЕм АБІ1
Одноланцюжкові варіабельні фрагменти (5СЕм), що містять варіанти областей або УН, або
МІ. АБІ, експресували з відповідних бібліотек і піддавали скринінгу, виходячи зі здатності 5сЕм зв'язувати укорочений ЕСЕК (1-525) людини дикого типу (м/) і мутантний ЕСЕК (СА). ЕСЕК (СА) являє собою варіант ЕСЕК, що містить мутації цистеїну на аланін у положеннях 295 і 307 (див. Саїтеї єї а). (2009), РМАБ5, ОБА, 106(13):5082-5087). Проводили скринінг бібліотек, що містять приблизно 1х109 клонів.
Враховуючи, що АБІ зв'язується з ЕСЕК (СА), але по суті не зв'язується з УЛЕСЕК, у початкових раундах скринінгу використовувався ЕСЕК (СА) для ідентифікації варіантів важких і легких ланцюгів АБ1, що мають поліпшену афінність зв'язування (Коп, Коє або обидві константи), стосовно ЕСЕК (СА) відносно АБІ1. Однак у більш пізніх раундах скринінгу використовували
ЕСЕВ (1-525) для ідентифікації варіантів АБ1, що мають поліпшену афінність зв'язування (Коп,
Конг або обидві константи) стосовно АБ1 відносно ЕСЕК (1-525).
Скринінг бібліотеки проводили з використанням двох способів, включаючи магнітне сортування гранул (МАСЗ (технологія магнітного поділу клітин)) і аналіз на основі ЕАС5 (для
МАСЗ5 ї ЕАС5 див., наприклад, Спао еї аї. (2006), Маїшге Ргогосої5, 1:755-765; Реднацв еї аї. (2003), Машге Віоїесп. 21:163-170; і МапАпімегр (2000), Віотесппої. Ргод. 16:31-37). Проводили щонайменше два раунди скринінгу на основі збільшення в кількості за допомогою магнітних гранул, за якими ішли щонайменше три раунди скринінгу на основі проточно-цитометричного сортування (Реїдпациз апа 5біеде!ї, Сп. 17 "Є Ріож Суїотеїйгу Ргоїосої5, 279 ей., ед. Нам/єу апа
Наулеу, мої. 263). Для ідентифікації 5сЕм, що мають поліпшене зв'язування відносно АБ, використовували селекцію як по рівноважній константі, так і по Кок.
У цілому, три бібліотеки піддавали скринінгу відносно варіантів областей МН і МІ АБІ, що мають поліпшене зв'язування відносно АБ1. Проводили від чотирьох до п'яти раундів скринінгу з використанням бібліотек варіантів МН і МІ АБ і від п'яти до шести раундів проводили для комбінованої бібліотеки варіантів МН//. АБІ. Скринінг бібліотеки варіантів М АБ, бібліотеки варіантів МН АБІ і комбінованої бібліотеки варіантів МН і МІ. АБІ1 привів до ідентифікації 5сЕм, що містять варіанти областей МН і МІ АБ, які мають більш високу афінність зв'язування стосовно ЕСЕК (ЕСЕК (1-525) і ЕСЕК (СА)) відносно АБІ1.
Ідентифікація поліпшених антитіл
П'ятнадцять варіантів 5сЕм АБІ, ідентифікованих як такі що мають поліпшені характеристики зв'язування, у тому числі специфічне зв'язування з ЕСЕ (1-525), відбирали для перетворення в Ідс-білки (зокрема, Ідс1-антитіла). П'ятнадцять варіантів антитіл АБІ описані в даному документі і включають антитіло А (позначуване в даному описі як "АБА") (див. МН 5ЕО
ІО МО:9; МІ. 5ЕО ІО МО:5), антитіло В (позначуване в даному описі як "АБВ") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:64; МІ 5ЕО І МО:65), антитіло С (позначуване в даному описі як "АБС") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:66; МІ 5ЕО ІЮО МО:67) і антитіло О (позначуване в даному описі як "АБО") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:68; МІ 5ЕО ІЮО МО:69), антитіло Е (позначуване в даному описі як "АБЕ") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:50; МІ. 5ЕО ІЮО МО:51), антитіло Е (позначуване в даному описі як "АБЕ") (див. МН 5ЕО І
МО:52; МІ 5ЕО ІЮ МО:53), антитіло С (позначуване в даному описі як "АБО") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:72; МІ 5ЕО ІО МО:73), антитіло Н (позначуване в даному описі як "АБН") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:54; М 5ЕО ІЮО МО:55), антитіло У (позначуване в даному описі як "АБУ)") (див. МН 5ЕО ІЮ
МО:56; МІ БО ІО МО:57), антитіло К (позначуване в даному описі як "АБК"), антитіло Г. (позначуване в даному описі як "АБІ") (див. МН 5ЕО ІЮ МО:58; МІ 5ЕО ІО МО:59), антитіло М (позначуване в даному описі як "АБМ") (див. МН 5ЕО ІО МО:76; МІ 5ЕО ІЮО МО:77), антитіло М (позначуване в даному описі як "АБМ") (див. МН 5ЕО ІО МО:60; МІ 5ЕО ІЮО МО:61), антитіло О (позначуване в даному описі як "АБО") (див. МН 5ЕО ІЮ МО:62; МІ 5ЕО ІЮ МО:63) і антитіло Р (позначуване в даному описі як "АБР") (див. МН ЗЕО ІЮ МО:78; МІ. ЗЕО ІЮ МО:79). Вибрані клони з бібліотек МН і МІ. спарювали з областю Мі або МН АБ, відповідно (див. АБА, АБВ, АБС, АБО,
АБЕ ії АБРЕ).
Амінокислотні послідовності областей УН варіантів антитіла АБ1 представлені нижче. СОМ підкреслені й амінокислотні зміни відносно АБІ1 виділені напівжирним шрифтом.
АрА УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗВВЕАМММІВОРРОКаї ЕУМОаХІЗУМаМГАМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕМТААОТАТУМСУТАЗВИЕРМУМ ПОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:9);
АрВ' Ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗМОЕАММУМІВОРРОКа! ЕУМОаХІЗУКаТмМГАМУОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МБЕМТААОТАТУМСУ ТАЗВОЕРММ ПОСТІ МТУ (ЗЕО ОО МО:64);
Ар Ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗЗОГАМУММІВОРРОКИа ЕМ МОамМІЗУЗСМТВМОРБІЇ. 60 / КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕУТААОТАТУМСУТАаВагРУМСОСТІ МТУ55 (ЗЕО І МО:66);
АрО Ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗЗОГАМУММІВОРРОКИа ЕМ МОамМІЗУЗСМТВМОРБІЇ.
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ ММ ТААОТАТУМСУТАаВагРМУМСОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:68);
АРЕ УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗЗОГАМУММІВОРРОКИа ЕМ МОамМІЗУЗСМТВМОРБІЇ.
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕМТААОТАТУМСУТАаВагРМУМСОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:50);
АрЕ УНН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗВВЕАМММІВОРРОКа! ЕУМОаМІЗУЗОМТАМОРБІ.
КЗВІТІЗАОТЗКМОГЕРІ КІ М5ЕМТААОТАТУМСУТАЗВИЕРУМ ПОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:52);
Ара Ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗМОЕАММУМІВОСРОаКаИгЕМУМОМмІЗУКамМТвМОРБІ.
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕМТААОТАТУМСУТАЗНСОИСРУМ ОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:72);
АрН УНН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСКОГАМУММІВОРРОКИаГ ЕУМСсамІЗУМИМТВМОРБІ КЗВІТІЗАОТ5ОКМОГРІ КІ М5ЕЄМУТААОТАТУУСУТАЗНаТсРУМСОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІО МО:54);
Ар) ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСКОГАМУММІВОРРОКаГ ЕУуМамІЗУЗОМТАМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕМТААОТАТУМСУТАЗНСОСРУМ ПОСТІ МТУ (5ЕО ІЮ МО:56);
АРК УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБЗОТІ 55І1ТСТУЗИаУ5ІЗВВЕАМММІВОРРОКаї ЕУМОаХІЗУМаМГАМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МБЕМТААОТАТУМСУ ТАЗВОЕРММ ПОСТІ МТУ (5ЕО ІЮ МО:74);
АРІ УНН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСКОГАМУММІВОРРОКИаГ ЕУМСсамІЗУМИМТВМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ МЗЕМТААОТАТУМСУТАЗНСОИСРУМ ОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:58);
АРМ УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСВОЕГАМУММІВОРРОКИаГ ЕУМСсамІЗУМИМТВМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГЕРІ КІ М5ЕМТААОТАТУМСУТАЗВИЕРМУМ ПОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:76);
АРМ УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСВОЕГАМУММІВОРРОКаГ ЕУуМамІЗУЗОМТАМОРБІ
КЗВІТІЗАОТОКМОРІ КІ М5ЕЄУТААОТАТУУСУТАЗАСЕРУМСОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІО МО:60);
АрО УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРОЬОТІ БІ ТСТУЗСУБІСКОГАМУММІВОРРОКИаГ ЕУМСсамІЗУМИМТВМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГЕРІ КІ М5ЕМТААОТАТУМСУТАЗВИЕРУМ ПОСТІ МТУ55 (5ЕО І МО:62);
АрО ун
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗНОЕАМММІВОРРОКаї ЕУМОаХІЗУМаМГАМОРБІ
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ М5М ТААОТАТУМСУТАЗМСЕРММ ОСТІ МТУ (5ЕО ІЮ МО:70);
АрР УН
ЕМОГ ОЕБОаРОЇ МКРБООТІ БІ ТСТУЗОМУБІЗНОЕАМММІВОРРОКа! ЕУМОаМІЗУЗОМТАМОРБІ.
КЗВІТІЗАОТЗКМОГРІ КІ М5ЕМТААОТАТУМСУ ТАЗ ССЕРУМ СТОСТІ МТУ (ЗЕО ІО
МО:78).Амінокислотні послідовності областей МІ варіантів антитіла АБ1 представлені нижче.
СОК підкреслені й амінокислотні зміни відносно АБІ1 виділені напівжирним шрифтом.
АрА МІ. рРІОМТО5РОЗМ5УЗУС,СОАВМТІТСНЗЗОВІМЗМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСИМНСТМ врамРЗАЕБав аБатТОмТтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМАОГРМТРИаСаИткі ЕК (ЗЕО ІЮ МО:5);
АрВ МІ. рРІОМТО5РОЗМ5УЗУС,ОАВМТІТСНЗЗОВІМЗМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСИМНСТМ врамРЗАЕБав азатТоОмтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМАОГРМТЕРИаСаИткі ЕК (ЗЕО І МО:65);
АрС М рРІОМТО5РОЗМ5УЗУС,СОАВМТІТСНЗЗОВІМЗМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСИМНСТМ врамРЗАЕБав азатТоОмтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМЕОЕРМТЕРИаСИткКІ ЕК (ЗЕО ІЮ МО:67);
АрО М
РІОМТО5РОЗМ5УЗУСОВМТІТСНЗЗОВІМЗМЕСУ ООКРОКЗЕКИ ІМНнСИад6мМІ НОСУРЗАЕЗОИа
ЗаватомтІ ТІ ОРЕОБРАТУУСМУОМАЕЕРМ/ТРССИИТКІ БІК (ЗЕО ІЮ МО:69);
АРЕ МІ.
РІОМТО5РОЗМ5УЗУС,ОВМТІТСНЗЗОВІМЗМЕСУЛ ООКРОКЗЕКСОСИ НОСОМ ОНаУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОБРАТУУСМУОМООГРМТЕРаСаИткіІ ЕК (ЗЕО ІЮ МО:51);
АБЕ МІ. рРІОМТО5РОЗМЗУЗМООВА!АМТІТоНЗЗОВІМЗМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСИМНСТМ врамРЗАЕБав азатТоОмтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМАОГРМТЕРаСаИткі ЕК (ЗЕО І МО:53); бо Ара мМ
РІОМТО5РОЗМ5УЗУС,СОВМТІТСНЗБЗОВІТУМІСУМ ООКРОКЗЕКСОСТПУНОАМІ ОрамРОАЕба аатТОмТтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМОЕЕРМУТРаСаИтТткКІ ЕК (5ЕО 10 МО:73);
АРН М.
РІОМТО5РІЗМ5УЗУС,СОВМТІТСНЗБЗОВІТУМІСУ ООКРОКЗЕКСОСТПУНОАМІ ОрамРОАЕба аатТОмТтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМОЕЕРМУТРаСаИтТткКІ ЕК (5ЕО 10 МО:55);
АБО МІ
РІОМТО5РОЗМ5УЗУС,СОВМТІТСНЗБЗОВІТУМІСУ ООКРОКЗЕКСОСТПУНОАМІ ОЮрамРОАЕба аатТОмТтІ ТЗІ ОРЕОЕАТУУСМОМОЕЕРМУТРаСаИтТткКІ ЕК (5ЕО 10 МО:57);
АРК МІ. рРІОМТО5РООЗМЗ5УЗМСОСОВМТІТоНЗЗОВІТУММОУМ ООКРОКЗЕКСОСИ МНСЗМОНаМУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУСУОМООЕРМУТРаСаИткКІ ЕК (5ЕО І МО:75);
АБІ МІ. рРІОМТО5РООЗМЗ5УЗМСОСОВМТІТоНЗЗОВІТУММОУМ ООКРОКЗЕКСОСИ МНСЗМОНаМУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУСУОМООЕРМУТРаСаИткКІ ЕК (5ЕО І МО:59);
АРМ МІ. рРІОМТО5РООЗМЗ5УЗМСОСОВМТІТоНЗЗОВІТУММОУ ООКРОКЗЕКСОСИМНнСОСМОНаМУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУСУОМООЕРМУТРаСаИткКІ ЕК (5ЕО ОО МО:77);
АРМ МІ рРІОМТО5РООЗМЗ5УЗМСОСОВМТІТоНЗЗОВІТУММОУ ООКРОКЗЕКСОСИМНнСОСМОНаМУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУСУОМООЕРМУТРаСаИткКІ ЕК (5ЕО І МО:61);
АрРО М рРІОМТО5РООЗМЗ5УЗМСОСОВМТІТоНЗЗОВІТУММОУМ ООКРОКЗЕКСОСИ МНСЗМОНаМУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІЗ5 ОРЕОРАТУУСУОМООЕРМУТРаСаИткКІ ЕК (5ЕО І МО:63);
АрО МІ
РІОМТО5РОЗМЗ5УЗУС,СОВМТІТСНЗБЗОВІММММОУ ООКРОКЗЕКСО МнСАП ВрамРОЗАЕ5О
ЗаватомтІ ТІ ОРЕОБРАТУУСМУОМАЕЕРМ/ТРССИИТКІ БІК (ЗЕО ІЮ МО-71);
АрР МІ.
РІОМТО5РОЗМ5УЗУС,СОВМТІТСНЗЗОВІММММСУЛ ООКРОКЗЕКСОСИМнНОСАП ООСУРЗАЕЗа
ЗаватомтІ ТІ ОРЕОРАТУУСМОМАЕЕРМ/ТРССИИткКІ БІК (ЗЕО ІЮ МО':79).
Послідовності нуклеїнових кислот п'ятнадцяти варіантів доменів МН і/або Мі АБІ1 субклонували в експресуючі вектори для експресії повнорозмірних Ідс-антитіл (див. вектори і способи, описані в патенті США Ме 8187836 і патенті США Мо 8455219, обидва з яких включені в даний опис як посилання). Експресуючі вектори для антитіла тимчасово трансфікували в клітини НЕК293 стандартними способами (див. Юигоспег еї аї. (2002), Мисієвїс Асіа Кев. 30(2;е9)).
Амінокислотна послідовність лідерної послідовності, використаної для експресії важкого ланцюга кожного з варіантів АБ1, являла собою МЕРІ БУУІ РІ МА КИМОС (5ЕО ІЮ МО:88), у той час як амінокислотна послідовність, використана для лідерної послідовності для експресії легкого ланцюга кожного з варіантів АБ1І, являла собою т"гурадіідімлравис (ЗЕО ІЮ МО:89).
Потім варіанти антитіла АБ1 очищали із середовища за допомогою хроматографії з білком А для оцінки афінності і функціональної оцінки.
Антитіло АБА
Одним з ідентифікованих варіантів антитіла АБ1І було АБА. АБА має ту ж послідовність варіабельної області легкого ланцюга, що і АБ1 (ЗЕО ІЮ МО:5), у тому числі ті ж амінокислотні послідовності СОК1Т, СОК2 і СОКЗ (представлені в 5ЕО ІЮ МО:6, 7 і 8, відповідно).
Амінокислотна послідовність МН АБА представлена нижче в 5ЕО ІЮО МО:9. Амінокислотні послідовності СОК МН о АБА є наступними: (СУ5ІЗАОЕБАМ/М (СОВІ; 5ЕО ІЮО МО:10);
М5УМамМТАМОРБІК5 (СОН2; ЗЕО ІЮ МО:11) і АБВОЕРУ (СОВЗ; ЗЕО І МО: 12) і підкреслені нижче. Залишки, що відрізняються у варіабельній області важкого ланцюга АБА відносно АБ, представлені нижче напівжирним шрифтом.
Амінокислотна послідовність МН АБА
ЕМО ОББОаРИЇ УКРБОТІ БІ ТСТУБЗамМ5ІЗВОБГАМУМУМІВОРРОКИаї ЕУуМСаМІЗУМОМТ МО
РБІКЗАІТІЗАОТЗКМОГЕРІ КІ МЗМТААОТАТУУСУТАЗВаЕРУМ ОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІЮ МО:9).
На фіг. 1 ї 2 представлене вирівнювання амінокислотних послідовностей областей МН і М. (фіг. 1) і повних важких і легких ланцюгів (фіг. 2) АБІ і АБА. Амінокислотні послідовності легких ланцюгів АБІ ї АБА є однаковими (ЗЕО ІЮ МО:13). Однак амінокислотні послідовності важких ланцюгів АБІ і АБА мають шість амінокислотних відмінностей між двома послідовностями, три з яких знаходяться в СОМ. Відмінності між амінокислотною послідовністю МН АбБІ1 і амінокислотною послідовністю УН АБА затемнені на фіг. 1 ї зустрічаються в кожній з СОК УН.
Домен СОКІ варіабельної області важкого ланцюга АБА включав амінокислотну заміну серину бо (АБІ) на аргінін. Домен СОК2 варіабельної області важкого ланцюга включав амінокислотну заміну серину в АБІ на аспарагін у АБА. Нарешті, домен СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга включав амінокислотну заміну гліцину в АБ1 на серин АБА. Дві з амінокислотних замін у АБА знаходяться в константній області важкого ланцюга (0354Е і І 356М). Мутації амінокислот
Ес-області в АБА відповідають змінам алотипу Ідс людини з алотипу 7,а на алотип 7, не а. На доповнення до інших змін, першу амінокислоту заміняли з глутаміну (0) на глутамінову кислоту (Е), як описано, наприклад, на фіг. 1.
Порівняння послідовностей варіантів антитіл АБ з послідовністю АбБ1
У таблиці 1 представлене вирівнювання амінокислотних послідовностей СОК важкого і легкого ланцюгів для варіантів антитіл АБ1: АБА, Аа, АВК, АБМ і АБР, у порівнянні з АБІ1. У таблиці 2 представлене порівняння антитіла проти консенсусних послідовностей СОК антитіл проти ЕСЕК АБІ, АБА, Аа, АБК, АБМ і АВР. Порожні простори в таблицях 1 і З указують на те, що залишок є таким же, як і в АБ1.
Таблиця 1
Порівняння послідовностей СОК важкого і легкого ланцюгів АБ1 відносно варіантів АБА, АБИ,
АРК, АВМ і АБР
СОМ варіабельної області ня сов ун ня сОовВЗ ун га важкого ланцюга (МН) МО: МО: МО:
Арі тем |5 11151510 |РТАЇМІМІ 2 МП 51М 5 Мт в Мо РІЗІ ЦІКІ5| з | | ГАГев се РМ, 4
АКА ГГ В 7 С ло 1 ДУ м 11111111 11151 1717171
Ас 1/1 471711 1017161 717171 11111117 1 7117151 17 1 тв петанк шк шо ни Сх НО НИ НИ НЯ КО НО КН НОЯ НО НН ННЯ КСО НН ННЯ КАК ННЯ КОНЯ НЯ КОНЯ КОНЯ НО ННЯ КОКНЯ КО НО НО НН ННЯ НЕ ННЯ НОЯ НОЯ НА КМ НЕТ
Ам / са 7/7 | 7 го 71 СІЧ 1 1 11111111 1115 17 11 а ДТ ім ДН м гг
СОМ варіабельної області легкого га Мі совВо га Мі сов ня ланцюга (МО) МО: МО: МО:
Амін|З оо 11|м|5|М 1 |с| 6 |нІс!т м! стогоу 7 ІМІО МАО ГРІМ в
АКА | ЇЇ ЇЇ 7 71 1 1 71 7161 1 1 71 17 7117717 71771 1 17171171, 8
АБа| | | | | / /Гт7/М/! 7 7 23 | ТАЇ | /Ї | 724 | | (ГЕ | ОЇ 125
Ак | | | 7 | тм)! ТМ)! 26 | 5)! | | (н/277| Її (оо, 7 1. |. ..1гв
Ам! | ЇЇ | | /т7/М| ЇМ! 261 | 5 | (н/27Ї | 1 оо ЇЇ 7171111
АРІ І | | 77 | 0м/ м. 2) | А 7 0 з І ДДєЇ ДОГ! | з
Таблиця 2
Консенсусні послідовності СОК для варіантів АБ з таблиці 1
Область СОВ ЗЕО ІЮ МО: Консенсусні послідовності СОК для варіантів АБ1
СОВ1 Ун ЗЕО І МО:35 а м 5 (5/2/Н)(5/В/Ю0О Є А Му М
СОов2 Ун ЗЕО ІЮ МО:36 1 5УБЗ/МЮ,СМАМОРБЗІК
СОоВвЗ3 УНН ЗЕО ІО МО:37 А Б(ВЛМ)С(Р/Л)Р(УЛИ
СОВІ1 М. ЗЕО І МО:З38 Н 55:00 (М/ГХУ/М/ЗУЩІЛМ а
СОова2 М. ЗЕО ІЮ МО:39 Н е(Т/А/ЗуМЛ)І (Б/Н
СОВЗ МІ. ЗЕО І МО:40 М О ЖА/ФХО/Е/О)Е Р. М Т
Як описано в таблиці 2, кожний з варіантів антитіла АБ1: АБА, АрО, АВК, АВМ, АБР, має залишок серину у варіабельній області важкого ланцюга СОМКЗ замість гліцину (показано напівжирним шрифтом/підкресленням у таблиці 2).
Порівняння послідовностей СОК МН і МІ. АБІ проти антитіл АБВ, АБС, АБО, АБЕ, АБЕ, АБН,
Ар), АБ, АВМ, АБО і АБО представлене в таблиці 3. На доповнення до змін СОЕ, описаних у таблиці 3, Арс має зміну амінокислотних залишків в областях каркасної області 2 МН.
Таблиця З
Порівняння послідовностей СОК важкого і легкого ланцюгів Аб1 відносно визначених варіантів АБ1 оре важкого ланцюга (МН) ІО ІО ІО
МО: МО: МО:
Ас ТУ |5 1515 ГОГЕТАТММу 2 ТП 51 5Іс М тв ТМ ОРІ УКІ5І з | | ТАГТе Ас г РІМ, 4
АБ 11 11170116, 77 7 лк 7 17 11717171 7071 117151 171 тв
Ас 11717111 711171121 17 7 77771711 11 1711111
АлоГ Г1 11111112 11711111 11113111 11111171
АєЕ ГГ 77111117 2117 7 77171111 11 1711111
Ак! 11010: 71110071 71 717 17711711 11111131, 01 11 Те
АНІ ак! 1 7 во, 7 7 7 1 1 1 1 17 17117100, 15 1 1-7, тві
АшШІ ак! 1 7 во, 7 7 7 71 1 71 1 17 17171173 1717151 1 1-7, тві
А ак! 7 | во ДУМІ 7 717711 7171011, 5 1712 гтв
Ам ав! / 1 7 12071 71 7 71 7117 1711 1 1717 1171171131 171151 1111
А ек 7 1 Іво 0 Ду 71 1 17117111,
А | 01117181 177947 11711717 11751
Таблиця З продовження
Шов НЕ ЗННОЕ НННССЗНН ланцюга (МІ) МО: МО: МО:
А ІНн|ІЗ 50 1|М 5 ІМ 1 |с/| 6 ІнІс|т м/с 701017 МГОЇМГАТО|ЕГРІМ т 8
АВ ЇЇ 11171171 7116їЇ | її 7111 1 171 11118
Ас 11117111 171161 1 1 1 1 11711717 1ЕЇ ЇЇ 1 17718
А Її 71 1 17117101 182 | ТАЇ | |н/І 83 | | | ТЕ | | 7 5
А ЇЇ ЇЇ 17711117 1821 | 51 | | (ніг | | (01 | 1 71 71 185
Аг 11711711 171161 1 її 1 1 11711111 111118
Ан ЇЇ 7 1 17 0177! 7 77 123 | ТАЇ | | | /24ї | | (ОТЕЇ | | 1 25
А ЇЇ 11 0171М 1 7 1231 | ТАЇ ЇЇ ЇЇ (241 | | (ОТЕД Ї ЇЇ ОЇ 125
АБ ЇЇ 1 1077 ЇМ 1256 | 57 | | |н/ 27 | | (оо | | | 28.
Ам | ЇЇ 1 17 71М! ТМ 126ї1 | 5! | | (ніг | | (о10| | | 1 уггі
А ЇЇ 1 170177 ТМ (256 | 5, | | |н/ 27 | | (ор | | 1 28. о ЇЇ 7177 01м! ТМ 729, | ТАТІ! Її | зо. | | ТЕ! ЇЇ 7 7 5
Охарактеризація варіантів антитіла АБ1 описана в Прикладах 2-8 нижче.
Приклад 2. Аналіз зв'язування антитіл проти ЕСЕК
Аналіз Віасоге
Аналіз Віасоге проводили для порівняння афінності АБІ1, АБ2 (антитіло, що має ті ж шість амінокислотних послідовностей СОК, що і цетуксимаб) і антитіл проти ЕСЕЕК, ідентифікованих відповідно до прикладу 1, до трьох форм рекомбінантного ЕСЕК, зокрема до позаклітинного домену ЕСЕК дикого типу (ЕСО) (ЕСЕ (1-645) (5ЕО ІЮ МО:34)), ЕСЕВМН (ЕСЕВ (1-29)-а-(298- 645) (ЗЕО ІЮ МО:46)) і укороченого ЕСЕК (1-525) дикого типу (ЕСЕКІ1 (1-525) (5ЕО ІЮО МО:А7)).
Ар2 включає амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюгів АБ2, як описано в 5ЕО ІЮ
МО:48 і 49, відповідно, і його одержували стандартними способами.
Хоча як АБІ, так і Ар2 є антитілами проти ЕСЕК, вони мають відмінні властивості і зв'язуються з унікальними епітопами. Ар2 зв'язується з І! 2-доменом ЕОЕК (бап еї аї. (2012),
Сапсег Вез. 72(12)1-7; її еї аІ. (2005), Сапсег СеїЇ, 7:301), у той час як АБІ зв'язується з амінокислотними залишками 287-302 домену СКІ1 (домен Ії) ЕСЕК (Сап еї аї. (2012), 72(12)1-7; щдонпз еї аї. (2004), 9. Віо!. Снет. 279:30375-30384). Домен Ії ЕСЕК експресується в подовженій конформації ЕСЕК (їі еї аїЇ. (2005), Сапсег СеїЇ, 7:301). На фіг. 17 представлена діаграма загальної організації структурного домену ЕСЕК і в загальному показано, де розташовуються епітопи АБ2 і АБІ1. На відміну від АБ2, АБІ не зв'язується (або має дуже слабке зв'язування) з
ЕСО ЕСЕК (5ЕО ІЮО МО:34). У той же час АБІ може зв'язуватися з активованим ЕСЕК дикого типу і має більш високу афінність зв'язування ЕСЕЕМІІ відносно АбБа2 іп мімо. Таким чином, АбБ2 використовували як контроль в експериментах, описаних у даному документі, як друге антитіло проти ЕСЕК, що зв'язується з відмінним епітопом і має відмінні від АБ1 характеристики афінності зв'язування.
Аналіз Віасоге проводили з використанням Віасоге Т100 із сенсорним чипом СМ5 і досліджувані антитіла уловлювали за допомогою антитіл проти Ес людини, що були зв'язані через аміногрупу з чипом з використанням стандартного набору для приєднання амінів відповідно до інструкцій виготовлювача (ЗЕ пеайпсаге). У короткому викладі, поверхню чипа
СМ5 активували за допомогою ЕОС/МН5. Поліклональне антитіло кози проти антитіл людини, специфічне до Ес (Тпепто Різхпег Зсієепійіс Іпс., Коскіога, І), розбавляли до 25 мкг/мл у 10 мМ ацетаті натрію (рН 4,5) і інжектували над активованою поверхнею для забезпечення іммобілізації. Частини, що не вступили в реакцію, на поверхні біосенсора блокували етаноламіном. Віасоге Т100 являє собою біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу для виявлення, охарактеризації і кількісного визначення біомолекулярних взаємодій, у тому числі взаємодій між антитілом і його антигеном. Антиген інжектували при 80 мкл/хв. протягом З хвилин, і після цього йшла дисоціація протягом 15 хвилин. Досліджуваний ЕСО
ЕСЕК включав амінокислоти 1-645 ЕСЕК, злиті з тус і гістидиновою міткою (ЕСЕВ (1-645)-
ГЕЗНОаРЕ-Мус-ЯМНТа-в6бНів (" ЕБАВОИРЕ" (ЗЕО ІЮ МО:90); "ЄНів" (ЗЕО 10 МО':91)). Також варіант
ЕСЕРЕМІІ піддавали злиттю з тус і гістидиновою міткою (ЕСЕ (1-29)-0-(298-645)- ЕЗБВО РЕ-
Мус-ММНтТа-6Нів), так само, як ЕСО ЕСЕВ (1-525) (ЕСЕНВІ1 (1-525)-58 а РЕ-Мус-ММНнТта-6нНів ("ЗВОРЕ" (ЗЕО ІЮ МО:92)). Рухомий буфер, використаний в аналізі Віасоге, являв собою НВ5-
ЕР: 10 мМ Нерез, рН 7,5, 150 мМ Масі, З мМ ЄЕОТА, 0,05 95 Тжеєп 20.
Результати аналізу зв'язування Віасоге представлені на фіг. 3. Серед досліджених варіантів антитіла АБ1 АБК мало найбільш високу афінність зв'язування відносно укороченого ЕСЕ (1- 525) з Ко 1,7х109 М, що більше ніж у 1300 разів перевищувала Ко АБІ1. Як описано на фіг. З,
АрРЕ продемонструвало найбільш низьку афінність, що піддається визначенню, відносно укороченого ЕСЕ (1-525) з Ко 5,9х107 М, що відповідає підвищенню афінності тільки приблизно в 4 рази відносно Ко АБІ. АБА продемонструвало десятикратне поліпшення Ко відносно укороченого ЕСЕ (1-525) (Ко 2,2х107 М (АБА) проти Ко 2,3х105 М (АБІ1)).
Співвідношення Ко для АБВ, АБС, АБО, АБЕ, Аа, АБН, АБ), АБІ, АБМ, АБМ, АБО і АБР відносно
АРІ також представлені на фіг. З відносно укороченого ЕСЕК (1-525).
Також досліджували афінність зв'язування варіантів антитіла АБІ1: АБІ їі АБ2, у відношенні
ЕСЕРМІЇ. Як показано на фіг. 3, усі з варіантів АБ1 продемонстрували більш високу афінність зв'язування відносно ЕСЕЕМІЇ, ніж АБ1. Наприклад, АБА дисоціював від ЕСЕВЕМІІ з Ко 2,3х1079
М, У той час як АБІ1 мав константу дисоціації Ко 9,4х109 М. Таким чином, АБА мав чотирикратне підвищення афінності (визначене за допомогою констант дисоціації) відносно АБІ1.
Варіанти антитіла АБ1, що продемонстрували більш високу константу дисоціації стосовно укороченого ЕСЕК (1-525) відносно АБІ1І, не обов'язково демонстрували те ж підвищення афінності відносно ЕСЕЕМИ. Наприклад, у той час як АБО продемонструвало найбільше підвищення (у 63 рази) афінності стосовно ЕСЕМКМІЇ відносно АБІ, АВК продемонструвало найбільше збільшення (більше ніж у 1300 разів) афінності стосовно укороченого ЕСЕК (1-525) відносно АБ, як описано на фіг. 3. В іншому прикладі АрСї продемонструвало друге з найбільш високих збільшення афінності зв'язування з ЕСЕМмМІІ серед варіантів антитіла АБІ (зі збільшенням більше ніж у 47 разів), але, проте, воно було ранжоване шостим по збільшенню афінності стосовно укороченого ЕСЕК (1-525) відносно АБІ1 (зі збільшенням у 263 разів), як описано на фіг. 3.
У дослідженні Віасоге було визначено, що багато які з варіантів АБ1 мають більш низьку афінність відносно як ЕСЕВ. (1-525), так і ЕСЕЕМІЇ, ніж АБ2, що мало, наприклад, Ко 4,0х109 М відносно укороченого ЕСЕК (1-525).
Аналіз Віасоге показав, що ні АбБІ, ні варіанти антитіла АБІ, не зв'язувалися з повнорозмірним ЕСО ЕСЕК (амінокислоти 1-645 ЕСЕК). Навпаки, АБ2 зв'язувалося з ЕСО
ЕСЕК. Таким чином, незважаючи на спостереження, що зв'язування варіантів АБ1 з ЕСО ЕСЕК дикого типу було відсутнє або було незначним, як також спостерігали для АБ, відбувалося збільшення афінності зв'язування з укороченим рецептором ЕСЕК (1-525) у варіантів АБІ1.
Аналіз ЕАС5 (активоване флуоресценцією сортування клітин)
ЕАС5-аналіз проводили для визначення характеристик зв'язування АБА з пухлинними клітинами (клітини А431) у порівнянні з АБІ і АБ2. З використанням ЕГАСз-аналізу визначали інтенсивність флуоресценції і кількість клітин, де кількість антитіла, зв'язаного з клітинами, відображувалася в інтенсивності флуоресценції (тобто величині геометричного середнього значення), одержаній шляхом аналізу з використанням програмного забезпечення для проточно-цитометричного аналізу. Зокрема, активність зв'язування антитіла, якій відповідає кількість антитіла, що зв'язалося, оцінювали шляхом визначення величини геометричного середнього значення. бо Клітини А431 збирали з флаконів, що мали приблизно 8095 змикання моношару, з використанням буфера для дисоціації клітин. Зібрані клітини А431 промивали один раз РВЗ/ 95
ЕВ5 (ембріональна теляча сироватка) (буфер ЕАСФ5Б), а потім ресуспендували в кількості 2,5х106 клітин/мл у буфері ЕАС5. 100 мкл клітин/ямку додавали в круглодонний 96-ямковий планшет.
Використовували 10 мкл 10х концентрації антитіла (кінцеві концентрації зазначені на фіг. 4).
Ямки промивали два рази буфером БАСЗ і ресуспендували в 50 мкл вторинного антитіла (Аіехагісог 488), розведеного буфером ГАС5. Планшет інкубували при 4 "С протягом однієї години і промивали два рази буфером БАС5. Клітини ресуспендували в 100 мкл РВЗ/Л 95 формальдегіді й аналізували на проточному цитометрі Весіоп бісКіпзоп І ЗКІЇ. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення для проточно-цитометричного аналізу УМіпі іві.
Результати РГАСоз-аналізу зв'язування АБІ, АБ2 і АБА з пухлинними клітинами А431 представлені на фіг. 4, на якій показане геометричне середнє значення проти концентрації антитіла, інкубованого з клітинами. Як описано на фіг. 4, АБА мало більш високе зв'язування
ЕСЕРК на пухлинних клітинах А431, ніж АБ1, однак АБА мало більш низьку афінність зв'язування в порівнянні з АБ2. Дані, представлені на фіг. 4 відображують пряме зв'язування кожного антитіла з його антигеном.
Як описано на фіг З і 4, АБА мало збільшену афінність зв'язування з ЕСЕЕК і продемонструвало збільшене зв'язування з клітинами з високими рівнями ЕСЕК (пухлинні клітини А431) відносно АБ1. Також було визначено, що АБА виявляло більш помірне підвищення зв'язування з клітинами з більш низькими рівнями ЕСЕК (дані не представлені), відносно зв'язування з клітинами А431.
Приклад 3. Аналіз епітопа антитіл проти ЕСЕК
Проводили тести для визначення того, чи мали антитіла проти ЕСЕК, ідентифіковані в прикладі 1, той же епітоп, що й антитіло АБІ1, або чи впливають амінокислотні зміни у варіантах антитіла АБІ1: АБА, Ара, АБК, АБМ і АрР, на зв'язування епітопа.
Конкурентний аналіз
Конкурентний аналіз зв'язування ЕБАС5 використовували для визначення епітопної специфічності серед поліпшених антитіл проти ЕСЕК у порівнянні з АБІ, АБ2 ї контрольним антитілом 1 (антитіло проти СО20 (ритуксимаб (Коспе)), використане як негативний контроль).
Використовували клітини О87МО (клітинна лінія гліобластоми людини (одержана від А. 5СОЙ,
Зо І чам/ід Іпбзійше тог Сапсег Кезеагсі) (клітини Ш87МО доступні від АТТС як АТСС НТВ-14 м; також див., наприклад, лінію клітин людини Ш87МО, Зідта-Аїйайгісп), що експресують ЕСЕЕМІЇ.
Клітини ШВ7МО збирали з флаконів при змиканні моношару приблизно 80 95 з використанням буфера для дисоціації клітин. Клітини промивали один раз у РВ5Б/1 95 ЕВ5 (ембріональна теляча сироватка) (буфер ЕАСЗ5), а потім ресуспендували в кількості 2,5х105 клітин/мл у буфері
ЕАС5. 100 мкл клітин/ямку додавали в круглодонний 96-ямковий планшет. Для конкурентного
ЕАС5 АБІ о оконюгували з флуоресцентною міткою за допомогою додавання флуоресцеїнізотіоціанату (РІТС) у кінцевій концентрації 100 нМ (з конкуруючими антитілами або без них), а потім ямки промивали два рази в буфері ЕАС5, суспендували в 100 мкл РВЗ/ 95 формальдегіду й аналізували на проточному цитометрі Весіоп бісКіпзоп І ЗК. Флуоресценцію вимірювали при 488 нм.
Результати конкурентного аналізу описані на фіг. 5 і показують, що досліджені варіанти антитіла АБІ (тобто АБА, Ара, АВК, АВМ і АБР) розпізнавали той же епітоп, що і АБІ1 (домен ЇЇ
ЕСЕК, що є експонованим у "подовженій" конформації ЕСЕК), враховуючи, що обчислене геометричне середнє значення флуоресценції знижувалося при збільшенні концентрації неміченого варіанта антитіла АБІ. Результати також показують, що епітоп
АРТ/АБА/Ара/АЬК/АВМ/АрР відрізняється від епітопа АБ2, оскільки не спостерігали конкуренції між Ар2 ії АБІ або між Ар2 і варіантами антитіла АБ1І. Контрольне антитіло 1 також не продемонструвало зв'язування, що піддається виявленню, з епітопом АБІ1 у конкурентному аналізі, оскільки контрольне антитіло 1 не конкурувало з АБІ, міченим РІТС, за зв'язування з клітинами.
Візуалізуючий аналіз
Для оцінки ефективності захоплення антитіла експресуючими ЕСЕК пухлинами проводили візуалізуючий аналіз БРЕСТ з використанням АБА, міченого "п (див., наприклад, Кпаїї еї аї.,
Іптетаїййопаї! дошитаї ої Моіесшціаг Ітадіпд, Мої. 2011, Апісіє 10 796025, р. 1-15). Було вибрано дві моделі пухлини: клітини 5УМ48 (клітини пухлини товстого кишечнику; АТСС Мо. ССІ -231 М) і клітини ЕВС1 (клітини ЕВС1 походять з лінії плоскоклітинної карциноми легені людини від
У9арапезе Кезеагсп Кезоцгсез Вапк (4 Мо. КСВ1965) (Токуо, Японія)), унаслідок їх помірних рівнів експресії ЕСЕК на основі імуногістохімічного аналізу. Після ін'єкції пухлинних клітин мишам і наступного введення міченого антитіла АБА, міченого АБІ1 або міченого негативного 60 контролю (Ід, що не зв'язує ЕСЕК), одержували зображення 5РЕСТ/СТ мишей через 4, 12, 24,
48, 72, 120 ї 168 годин після ін'єкції з використанням папоЗРЕСТ/СТ. Усі мічені антитіла дозували за допомогою ін'єкції в хвостову вену. Для врахування відмінностей у виведенні антитіл із крові, дані представлені як співвідношення пухлини до крові. Результати, представлені як на фіг. 20А, так і на фіг. 208, демонструють більш високе захоплення АБА як клітинами 5УМ48 (фіг. 20А), так і клітинами ЕВСІ (фіг. 2083 у мишей у порівнянні з АБІ і контрольним Ід. У моделі ЕВСІ1 (фіг. 208), що є моделлю з більш низьким рівнем експресії
ЕСРЕРЕ, захоплення АБІ1 було подібним з Ідо-контролем, у той час як захоплення АБА було більш високим, ніж як у АБІ, так і у негативного контролю. Результати, представлені на фіг. 20, демонструють, що АБА здатне націлюватися на визначені ЕСЕК-експресуючі пухлини. Подібні результати візуалізації АБА також спостерігали з використанням пухлинних клітин А431 (що походять із солідної пухлини - епідермоїдної карциноми (АТСС Мо СКІ -1555), відомої тим, що вона має високі рівні експресії ЕСЕК).
Приклад 4. Аналіз іп міго активності антитіла проти ЕСЕК у пухлинних клітинних лініях
Аналіз передачі сигналу ЕСЕК іп міїго у пухлинних клітинних лініях 5СС-15 і Н292
Здатність АБІ, Ар2, АБА, АБВ, АБС, АБО, АОС, АВК, АБМ і АрРР інгібувати опосередковуване
ЕСЕ фосфорилування тирозину ЕСЕК у пухлинних клітинних лініях іп міго оцінювали за допомогою вестерн-блотингу з використанням клітин плоскоклітинної карциноми (5СС)-15 (АТССФ СТІ -1623 М) їі клітин Н292 (клітинна лінія карциноми легені; АТССФ СТІ -18487М), Як клітини 5СС-15, так і клітини Н292 експресують ЕСЕК дикого типу. Пригнічення РЕСЕК у пухлинних клітинах, експресуючих ЕСЕРЕ дикого типу, індуковане обробкою антитілом, указує на те, що ці антитіла щонайменше частково функціонують шляхом інгібування передачі сигналу через рецептор. Клітини 5С2С-15 (плоскоклітинна карцинома язика людини) являють собою трансформовані кератиноцити і вони є чутливими до АБ іп мімо. У той час як клітини 5СС-15 є чутливими до АБІ іп мімо, клітини Н292 (недрібноклітинний рак легені людини (МС С)) є стійкими до інгібування за допомогою АБ1 опосередковуваного ЕСЕ фосфорилування тирозину
ЕСЕК як іп мйго, так і іп мімо. Таким чином, обидві клітинні лінії використовували для дослідження здатності АБА, АВ, АБС, АБО, Аа, АК, АБМ ії АБРР інгібувати передачу сигналу
ЕСЕК у пухлинних клітинах іп міїго.
Клітини або висівали в кількості 60000-80000 на ямку в 24-ямковому планшеті, або висівали
Зо в кількості 100000-200000 на ямку в б-ямкових планшетах для культивування тканин. Клітини інкубували протягом ночі в середовищі для росту. Після сироваткового голодування протягом 24 годин при 37 "С, у відповідних випадках, клітини інкубували з антитілам протягом однієї години при 37 "С, а потім стимулювали рекомбінантним ЕСЕ людини (КУО Зувіетв5) протягом 10 хвилин при 37 "С. Потім клітини промивали два рази льодяним РВЗ2 і лізували за допомогою 100-200 мкл/ямку буфера для лізису клітин (СеїЇ Зідпаїйпуд ТесппоїЇду), доповненого коктейлем інгібіторів протеаз Сотрієїе Міпі Ргоїеазе Іппірйог СосКіаї! (Коспе) і 0,1 95 МРАО (Тегойо!--уре МР- 40; нонілфеноксиполіетоксилетанол). Після швидкого заморожування при -80 "С протягом щонайменше 20 хвилин, клітинні лізати очищали центрифугуванням при 14000 об./хв. протягом 10 хвилин при 4 "С. Концентрації білка в очищених лізатах зразків визначали за допомогою аналізу білка з ВСА (Ріегсе Тпепто Зсіепіййс). Клітинні лізати (10 мкг) розділяли за допомогою
ЗО5-РАСЕ з використанням 4-12 95 гелів біс-Тгіє Міді (Ійе Тесппоіодіе5) і переносили на нітроцелюлозні мембрани з використанням системи іВіої Огу Тгапетег зузіет (І Те Тесппоіодіев).
Блоти блокували 5 95 молоком/забуференим сольовим розчином Тмееп-Ттгі5 (ТТВ5) протягом однієї години при кімнатній температурі, промивали три рази за допомогою ТТВ5, а потім інкубували протягом ночі з відповідними первинними антитілами (кон'югат антитіло проти фосфотирозину (4010) з біотином, Мійроге, розведення 1:1000 для виявлення фосфорилованого ЕСЕК; антитіло кролика проти ЕСЕК, І Пезрап Віоб5сіепсе5, розведення 122000 для виявлення загального ЕСЕК; антитіло кролика проти загального актину, СеїЇ зідпаїйпуд ТесппоЇоду, розведення 1:1000 для виявлення внутрішнього контрольного актину) при 4 "С. Після інкубації протягом ночі з первинними антитілами блоти промивали три рази за допомогою ТТВ5 протягом п'яти хвилин, а потім інкубували протягом однієї години при кімнатній температурі або з антитілом осла проти антитіл кролика (Часкбхоп І арогайогієв, розведення 1:2000) для виявлення тотального ЕСЕК і актину, або з кон'югатом стрептавідин-
НЕР (КРІ, розведення 1:1000) для виявлення фосфорилованого ЕСЕК. Потім блоти промивали три рази ТТВ5 і обробляли хемілюмінесцентним субстратом УМезі Юига Спетіштіпезсепі зцирзігаєе (Тпегпто зЗсіепійіс). Блоти візуалізували за допомогою сканування з використанням сканера ГАЗ 4000 (Рції).
Ар2 використовували як позитивний контроль (тобто інгібітор фосфорилування ЕСЕБК) і контрольне антитіло 1 використовували як негативний контроль (тобто не зв'язує ЕСЕК і, таким бо чином, не впливає на фосфорилований ЕСЕК).
Результати аналізу за допомогою вестерн-блотингу в дослідженні іп міго з використанням клітин 5СС-15 представлені на фіг. 7А і вони вказують, що АБ і антитіла АБА, АБВ, АБС і АБО не були здатні значно інгібувати передачу сигналу ЕСЕК у клітинах 5СС-15, на що указує відсутність значного пригнічення фосфорилованого СЕК. Навпаки, зниження рівня фосфорилованого ЕСЕЕК, як показано на фіг. 7А, показало, що антитіла Арс, АВК, АБР ії АВМ знижували активність ЕСЕК у клітинах 5СС-15 іп мійго, враховуючи, що рівень фосфорилованого ЕСЕК був більш низьким, ніж у випадку негативного контролю і АБ, і порівнянним з рівнями у випадку позитивного контролю (Арг). Таким чином, у ряді варіантів АБ1 збільшувалася активність іп міго відносно АБІ1.
Результати аналізу вестерн-блотингом у дослідженні іп міго з використанням клітин Н292 представлені на фіг. 7В. Результати на фіг. 7В указують на те, що АБ! і антитіла АБА, АБВ, АБС і АБО продемонстрували невелике інгібування передачі сигналу ЕСЕК у клітинах Н292 іп міго без значного зниження фосфорилованого ЕСЕ у порівнянні з АБ2 і антитілами АВС, АБК, АБМ і
АрР. Антитіла Ар, АВК, АБМ і АБР були більш ефективними відносно інгібування фосфорилування тирозину ЕСЕК у клітинах Н2г92 (див. фіг. 7В), ніж АБІ. АБ2 (позитивний контроль) також інгібувало фосфорилування ЕСЕК, як описано на фіг. 7В, у той час як негативний контроль (контрольне антитіло 1) продемонстрував відсутність інгібування фосфоритування, що піддається виявленню, при розгляді результатів у порівнянні з Аб2.
Як описано нижче, у той час як було виявлено, що АБА є відносно неактивним стосовно інгібування фосфорилування ЕСЕК у позитивних по ЕСЕРЕ. клітинах дикого типу (Н292) іп міїго,
АрА було здатне інгібувати фосфорилування цих клітин іп мімо у порівнянні з антитілом АБІ1, дослідженим у тих же умовах.
Таким чином, результати іп міго, представлені на фіг. 7А і 7В, указують на те, що, незважаючи на збільшене зв'язування АБА, АБВ, АБС, АБО, АрО, АВК, АВМ і АБР з ЕСЕВ (відносно АБ), тільки деякі з варіантів антитіла АБІ1 (тобто АрС, АБК, АБМ їі АБР) були здатні значно інгібувати або знижувати опосередковувану ЕСЕ передачу сигналу іп міго у досліджених лініях пухлинних клітин. Як правило, здатність досліджених варіантів антитіла АБІ1 інгібувати опосередковуване ЕСЕ фосфорилування тирозину ЕСЕК у клітинах 5СС-15 і Н2г92 іп міо корелювала зі збільшеною афінністю відносно як ЕСЕКМІЇПЇ, так і укороченого ЕСЕК (1-525), при
Зо визначенні з використанням поверхневого плазмонного резонансу.
На фіг. 6 представлене узагальнення афінності зв'язування АБ, АбБа і варіантів антитіла АБ1 з ЕСЕ (1-525). Два кругових контури на фіг. 6 відображують результати іп міго, описані вище (або результати подібних тестів) відносно здатності антитіла інгібувати фосфорилування ЕСЕ (що вказує на інгібування активності ЕСЕК) або в клітинах Н2г92, або в клітинах 50-15. Як описано на фіг. б, варіанти антитіла АБЇ можна було розподілити на дві групи (групи 1 і 2): варіанти, що не інгібують передачу сигналу ЕСЕК іп міго у досліджених пухлинних лініях, виходячи з результатів, представлених на фіг. 7 (включаючи АБІ, АБА, АБВ, АБО, АБЕ і АБЕ; позначувані як група 1 на фіг. б), і варіанти, що інгібують передачу сигналу ЕСЕК іп міго у досліджених пухлинних клітинних лініях (включаючи Аа, АБН, АБІ., АВК, АБУ, АВМ, АБМ, АБО і
АрР; позначувані як група 2 на фіг. 6), як описано на фіг. 7. Порівняння, наведене на фіг. 6, указує на те, що усі з варіантів антитіла АБ1 мали більш високу афінність відносно ЕСЕК (1-525) у порівнянні з АБ, і що варіанти з Ка менше 1х107 с" (група 2) були здатні значно інгібувати передачу сигналу ЕСЕК іп міїго, як описано в результатах, представлених на фіг. 7. Як описано на фіг. 6, процес дозрівання АБ1 забезпечив в основному варіанти АБІ, що мають збільшені константи швидкості дисоціації.
Аналіз пухлинної клітинної лінії А431 іп міко
Здатність АБІ і варіантів антитіла АБІ1 інгібувати опосередковуване ЕСЕ фосфорилування
ЕСЕК також досліджували з використанням епітеліальних клітин карциноми людини А431 з використанням аналізу фосфо-ЕСЕК ЕГІЗА. Клітини А431 експресують ЕСЕК дикого типу.
Клітини висівали в кількості 20000 на ямку в покритих колагеном 96-ямкових планшетах у середовищі для росту. Через двадцять чотири години клітини промивали безсироватковим середовищем і піддавали сироватковому голодуванню протягом чотирьох годин. Коли це було доцільно, клітини попередньо обробляли моноклональним антитілом протягом однієї години, а потім стимулювали рекомбінантним ЕСЕ протягом 10 хвилин при 37 "С. Після стимуляції за допомогою ЕСЕ клітини промивали два рази льодяним РВ5З і лізували за допомогою 100 мкл/ямку буфера для лізису клітин, доповненого інгібіторами протеаз, і швидко заморожували при -80 "С протягом щонайменше 20 хвилин. Планшети для уловлювання одержували шляхом попереднього покривання ямок 50 мкл антитіла проти ЕСЕК (КО Зузіет5, партія номер 841402, у концентрації 0,8 мкг/мл), а потім проводили блокування за допомогою обробки бо РВБЛ 95 ВБА протягом однієї години і промивали три рази забуференим сольовим розчином
Тмееп-Ттіз (ТТВ5). У планшети для культивування додавали клітинні лізати і інкубували протягом 4 "С. Планшети промивали п'ять разів ТТВ5 і інкубували з рТгу-пероксидазою хрону (Кк8О 5Зузіет5, ЮУС1095) протягом однієї години. Планшети промивали п'ять разів ТТВ5 і в кожну ямку додавали 100 мкл 3,3,5,5-тетраметилбензидину (ТМВ) і інкубували при кімнатній температурі до розвитку забарвлення. Реакції зупиняли додаванням 1Н НСЇІ і 00 зчитували при 450 нм.
Результати дослідження інгібування А431 представлені на фіг. ВА і 8В і показують, що варіанти антитіла АБ1І продемонстрували діапазон здатності інгібувати активність ЕСЕК у клітинах А431. Як показано на фіг. 8А, АБІ і варіанти АБА, АБВ, АБС, АБО, АБЕ ї АБЕ були неефективними відносно інгібування передачі сигналу ЕСЕЕ у клітинах А431 (при визначенні по опосередковуваному ЕСЕ фосфорилуванню ЕСЕК), навіть при концентраціях антитіла 1333 НМ.
На противагу АБІ, варіанти антитіла АБС, АБН, АБУ, АВК, АБ, АВМ, АБМ, АБО, АБРР і АБО були більш ефективними відносно блокування фосфорилування ЕСЕК, ніж АБІ, хоча і при більш високій концентрації, ніж АБ2. Контрольне антитіло 1, що не зв'язується з ЕСЕК, не мало ефекту на інгібування ЕСЕБК у клітинах А431.
На фіг. 88 розширені дані, представлені на фіг. 8А, для антитіл АБІ, АБР і Ар2. Як описано на фіг. 88, АБ1 продемонструвало низькі рівні інгібування, тобто в середньому 10 95 або менше, у порівнянні з Ар2 або АРрР. У той час як було визначено, що АБ1 має величину ІСзо більше 1333
НМ відносно інгібування передачі сигналу ЕСЕК у клітинах А431, АБР мало величину ІСво більше 40 нМ, що було поліпшенням відносно АБІ1. АБ2 мало величину ІСзо більше 2,3 НМ.
Приклад 5. ЕАСзЗ-аналіз антитіл проти ЕОСЕК в аналізі зв'язування кератиноцитів іп міго
ЕАС5-аналіз зв'язування кератиноцитів проводили для визначення афінності зв'язування варіантів антитіла АБІ з нормальними епідермальними кератиноцитами людини (МНЕК).
Клітини МНЕК експресують ЕСЕК дикого типу.
Клітини збирали приблизно при 8095 змиканні моношару з використанням трипсину, нейтралізували і промивали один раз РВЗ/1 95 ЕВ5 (буфер ЕАСЗ5), а потім ресусендували в кількості 2,5х1056 клітин/мл у буфері РАС5. 100 мкл клітин/'ямку додавали в круглодонний 96- ямковий планшет. Додавали 10 мкл 10х концентрації антитіла (кінцеві концентрації зазначені на фігурах) і планшет інкубували при 4 "С протягом однієї години. Ямки промивали два рази
Зо буфером ЕАСЗ5, а потім ресуспендували в 50 мкл вторинного АБ (АіІехаРіцог 488), розведеного буфером ГАС5. Планшет інкубували при 42С протягом однієї години і промивали два рази буфером ЕГАС5. Клітини ресуспендували в 100 мкл РВБ/1 95 формальдегіді й аналізували на проточному цитометрі Весіоп ОісКіпзоп І 5КІІ. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення для проточно-цитометричного аналізу М/іп/ івї.
Результати аналізу зв'язування кератиноцитів іп міго представлені на фіг. 9, на якій показано, що в міру збільшення концентрації міченого антитіла АБА, Арс, АБК, АБМ і АБР, виміряна флуоресценція збільшувалася внаслідок зв'язування ЕСЕК на кератиноцитах. АБ2 використовували як позитивний контроль і воно приводило до збільшення флуоресценції при додаванні антитіла до клітин МНЕК. АБ продемонструвало значно більш низькі рівні зв'язування навіть при високих концентраціях антитіла.
Результати, представлені на фіг. 9, указують на те, що досліджені варіанти антитіла АБ1 зв'язують ЕСЕК дикого типу на кератиноцитах і мають афінність відносно нормальних епідермальних кератиноцитів людини, що перевищує афінність АБІ1 (ії негативного контролю, контрольного антитіла 1). Результати на фіг. 9 також показують, що антитіла АБА, Ас, АБК,
АрМ їі АРР мають більш низьке зв'язування з нормальними епідермальними кератиноцитами людини в порівнянні з АБ2. Ці результати вказують на те, що варіанти антитіла АБІ здатні зв'язувати ЕСЕК дикого типу на кератиноцитах краще, ніж АБ1.
Приклад 6. Аналіз іп мімо антитіл проти ЕСЕК на пухлинах
Ефект варіантів антитіла АБІ на ріст пухлин іп мімо оцінювали з використанням аналізу з ксенотрансплантатом миції.
Мишей ЗСІО і безтимусних мишей СО-1 пиде одержували від Спагпев Кімег (Мітіпдїоп, МА).
Мишей утримували по десять на клітку. Маса тіла мишей при надходженні складала 18-20 г. Всі експерименти проводили відповідно до керівництва Маїйопаї Іпзійшев ої Неайп Сиціде їог Саге апа О5е ої ІГарогагу Апітаї5 у віварії, акредитованому Авб5зосіайоп їТог Ше Ав55ез5тепі апа
Ассгеаіайоп ої Іарогаїгу Апіта! Саге. Для кожного підшкірного дослідження життєздатні клітини інокулювали підшкірно в правий бік мишей на 0 добу. Об'єм ін'єкції складав 0,2 мл і містив суміш 1:11 5-МЕМ і матригелю (ВО, ЕгапкКіїп І аке5, МУ). Пухлини підбирали за розміром приблизно 200-250 мм3. Терапію починали на ту ж добу або через 24 години після підбору пухлин за розміром. Як негативний контроль використовували контрольну суміш ЇдДСї людини бо (очищений ІдСсї людини, аналогічний сироватці людини; Іппомаїме Кезеагсі). На початку терапії миші важили приблизно 25 г. Розмір пухлини оцінювали від двох до трьох разів на тиждень.
Вимірювання довжини (Г) і ширини (М/) пухлини проводили з використанням електронного товщиноміра, і об'єм обчислювали за наступною формулою: М-(ІхМу2)/2. Мишей умертвляли, коли об'єм пухлини досягав 3000 мм? або коли виникало укривання виразками шкіри. Відповідні кількості вихідного розчину антитіла розбавляли перед введенням у фосфатно-сольовому буфері. Лікарські засоби вводили внутрішньоочеревинно, як зазначено на кресленнях. Клітини
Нг92 (недрібноклітинна карцинома легень людини (МЗСІ С)) використовували в дослідженні з ксенотрансплантатом.
Результати експерименту іп мімо показують, що варіанти антитіла АБ1: АБА, Аа, АБК, АВМ і
АРрР, були здатні значно інгібувати ріст пухлини відносно АБІ1 (див. фіг. 10). Варіанти антитіла
АБІ1І також були здатні збільшувати тривалість відповіді в порівнянні АБ1І, наприклад АБА підтримувало об'єм пухлини на рівні менш 500 мм протягом 29 діб на противагу АБІ, що підтримувало об'єм пухлини менше 500 мм3 протягом приблизно 18 діб після ін'єкції пухлинних клітин (у тій же дозі і при тій же схемі введення). Як показано на фіг. 10, на 20 добу миші, яким ін'єктували АБА, продемонстрували приблизний об'єм пухлини 300 ммуУ, у той час як миші на 20 добу, ін'єктовані АБ1, продемонстрували пухлину, що має приблизний об'єм 700 мм3. До 29 доби, миші, яким ін'єктували АБА, продемонстрували пухлину, що має подібний об'єм з об'ємом на 20 добу (тобто приблизно 300 мм3), у той час як миші, яким ін'єктували АБ, мали збільшення об'єму пухлини до приблизно 1000 мм.
Процентне інгібування росту пухлини (95 ТОЇ) обчислювали для кількісного аналізу результатів, описаних на фіг. 10. 906 ТОЇ для антитіл, описаних на фіг. 10, є наступним:
АрА-74, дра-88,
АрК-90,
АрМ-84,
АрР-86,
Ар1-31,
Арг-73.
Величини 95 ТОЇ наведені відносно об'ємів пухлин у мишей, яких лікували контрольним Ідс людини. Як описано вище, АБ1 приводило до 31 95 ТО відносно контрольного ЇДС людини, у той час як АБА мало обчислений ТО 7495. Примітно, що варіанти антитіла АбБ1 продемонстрували 95 ТОЇ, що дорівнює або перевищує 95 ТОЇ для АбБ2.
АРрА було здатне збільшувати тривалість відповіді і знижувати об'єм пухлини іп мімо у моделі з ксенотрансплантатом пухлини Н292 (як описано на фіг.10), і, проте, не |інгібувало фосфорилування ЕСЕК іп мійго у тій же клітинній лінії, як описано в прикладі 4 ії на фіг. 7.
Активність антитіла АБА іп мімо також була порівнянною з антитілами Ас, АБК, АБМ їі АБР, незважаючи на наявність більш низької афінності зв'язування відносно ЕСЕ (1-525) і ЕСЕЕМІІ (див. фіг. 3). Таким чином, незважаючи на той факт, що АБА продемонструвало від невеликого до відсутності інгібування передачі сигналу іп міго, АБА знижувало або інгібувало ріст пухлинних клітин Н292 іп ммо аналогічно іншим варіантам антитіл проти ЕСЕК, що мають більш високі значення афінності, наприклад АБК, АБМ і АрБР.
Приклад 7. Аналіз інгібування росту пухлини іп мімо з використанням АОС з АБА
Здатність АОС АБА-У«сММАЕ інгібувати ріст пухлини визначали з використанням аналізу на мишах із ксенотрансплантатом іп мімо. АОС з АБА, використаний у цьому прикладі, кон'югували способом, описаним у прикладі 8, але не очищали способом періодичного очищення, описаним у ньому. Середнє БАК для композиції АОС з АБА, використаної в цьому прикладі, складало 3,7.
Аналізи на мишах із ксенотрансплантатами (аналогічні аналізам, описаним у прикладі 6) проводили з використанням двох різних клітинних ліній М5СІ С: МСІ-НІ1703 ії ЕВС1. Результати для двох різних клітинних ліній представлені на фіг. 14.
Як показано на фіг. 14А, АБА-уУсСММАЄЕ (у дозі 1 мг/кг маси тіла) був кращим відносно зменшення об'єму пухлини і збільшення тривалості відповіді в клітинах МСІ-Н1703, ніж АБІ1 (у дозі 10 мг/кг маси тіла), і в порівнянні з АОС з АБІТ, що містить АБІ і ММАЕ з лінкером тс. Ар окремо (у дозі 10 мг/кг) приводило до загальної відсутності інгібування збільшення об'єму пухлини аналогічно негативному контролю - контрольному антитілу 2 (антитіло проти правцевого токсину), що не інгібувало ріст пухлини в дозі 10 мг/кг.
Ефективність АОС АБА-МсСММАЄЕ також досліджували в моделі на мишах |із ксенотрансплантатами з використанням клітин ЕВС1. Результати дослідження представлені на фіг. 148 і вказують на те, що АОС АрРА-псММАЕ (у дозі З мг/кг маси тіла) був більш ефективним відносно зниження об'єму пухлини і збільшення тривалості відповіді в порівнянні з АБ (у дозі З бо мг/кг маси тіла) і в порівнянні з АОС з АБІ, що містить АБІ і ММАЕ з лінкером те (у дозі З мг/кг маси тіла).
У цілому, результати, представлені на фіг. 14, показують, що два різні АОС з АБА і ауристатином (АБА-уУсСММАєЕ і АБА-тоММАР) були ефективними відносно зменшення об'єму пухлини і збільшення тривалості відповіді іп мімо відносно АБ1 окремо або АОС АБ1-ММАБЕ.
Приклад 8. Очищені кон'югати антитіло проти ЕСЕЕ-лікарський засіб (АОС)
Одержували кон'югат антитіло-лікарський засіб (АОС), що містив антитіло АБА, зв'язане з монометилауристатином Е (ММАЕ) через лінкер валін-цитрулін (мс). Діаграма для цього АОС, що позначається як АБА-«СММАЕ, представлена на фіг. 11.
Кон'югацію антитіла АБА з мсСмММАЕ починали з часткового відновлення АБА, за яким йшла реакція з Маі-СИ-ММАЕ ("сММАЕ). Антитіло АБА (20 мг/мл) частково відновлювали додаванням
ТСЕР (молярний еквівалент ТСЕР:тАБ дорівнює 2,1), після чого проводили інкубацію при 0 С протягом ночі. Потім реакційну суміш для відновлення нагрівали до 20 "С. Для кон'югації всіх груп тіолу додавали мхсмММАЕ до кінцевого молярного співвідношення мсмММАЕ:відновлений Су 1,15. Реакцію кон'югації проводили в присутності 10 95 об./06. ОМ5О і дозволяли їй протікати при 20 "С протягом 60 хвилин.
Після реакції кон'югації додавали надлишок вільного М(ацетил)цистеїну (2 еквіваленти проти заряду «сСММАЕ) для гасіння мсмММАЕ, що не вступило в реакцію, з одержанням аддукту Суз-
МаІ-СП-ММАЕ. Реакції гасіння Сух дозволяли протікати при 20"С протягом приблизно 30 хвилин. Реакційну суміш після гасіння Су5 очищали, як описано нижче.
Описаний вище спосіб кон'югації також можна використовувати для кон'югації тоММАЕ з антитілом.
Періодичне очищення
АрсС з АБА очищали з використанням способу періодичного очищення. Реакційну суміш обробляли відповідною кількістю промитої водою смоли Ви-НІС (ТоуоРеаг!; Тозоп Віозсіепсев), тобто до суміші додавали в сім разів перевищуючу масу смоли. Смолу/реакційну суміш перемішували протягом відповідного періоду часу і проводили моніторинг за допомогою аналітичної хроматографії гідрофобної взаємодії для видалення продуктів кон'югата лікарського засобу, фільтрували через грубий поліпропіленовий фільтр і промивали буфером у кількості, що дорівнює двом об'ємам шару (0,28М хлорид натрію, 7 мМ фосфат калію, рН 7). Об'єднаний
Зо фільтрат і промивну рідину об'єднували й аналізували відносно профілю продукту за допомогою
НІС-ВЕРХ. Об'єднаний фільтрат і промивну рідину піддавали заміні буфера за допомогою ультрафільтрації/діафільтрації (ОШЕ/ОБЄ) на 15 мМ гістидин, рн 6, з 10 діалізними об'ємами 15 нм гістидинового буфера.
Після кон'югації й очищення проводили аналітичне дослідження одержаної суміші АОС.
Зразки відбирали й аналізували з використанням хроматографії гідрофобної взаємодії- високоефективної рідинної хроматографії (НІС-ВЕРХ). Використана колонка являв собою колонку ТЗКде! Вшїуі-МРЕК соїштп (4,6 мм ІЮх3,5 см, 2,5 мкм, 302С; Тозоп Віозсіепсе ГІ С,
Японія), і її використовували при швидкості потоку 0,8 мл/хв. Рухомі фази включали А: 25 мМ
МагНРО», рН 7, 1,5М (МНаІ250О; і В: від 25 мМ МагНРО», рн 7, (75 9в) до ІРА (25 95). Використаний градієнт являв собою 0 95 фазу В протягом 2 хвилин, від 0 до 100 95 В протягом 12 хвилин і утримання протягом 1 хвилини.
Вміст білка аналізували з використанням УфФф-аналізу. Слідовий аналіз НІС показав, що одержане співвідношення лікарського засобу й антитіла (БАК) для АБА-хсСММАЕ склало 3,1, як описано нижче в таблиці 4 і на фіг. 12. Середнє БАК визначали шляхом підсумовування 0, 1, 2,
З, 4, 5, 6, 7 і 8 продуктів АОС, множення на РАЗФо (РАЗдо являє собою процент площі піка при визначенні по площі, виміряній під піком при Агво при необхідному навантаженні лікарським засобом) і ділення на 100.
Таблиця 4
Результати аналізу НІС (РАФо) АБА-МсСММАЕ з використанням періодичного очищення нинпхлиншни шини лиш пиши я ст 12867112 2474 11111111 3427 нини: о о По ЛИ: Я ПО Я: У т
Таблиця 4
Результати аналізу НІС (РАФо) АБА-МсСММАЕ з використанням періодичного очищення нин ЕЕ: п о С ПО ЛЕ У: То я ПО Я по них пиши: пиши пи Ж Р ол ПО 1111 вУв | 14777 11111113 111111 рАнА ЇЇ 777717141111171 11111111
Як можна бачити з таблиці 4 і фіг. 12, періодичне очищення АБА-УСММАЕ приводило до ОАК 2-4. Початкове середнє значення БАК складало 4,1, де кінцеве середнє значення БАК після очищення складало 3,1.
Суміш АОС АрА-мсММАЄЕ також аналізували ексклюзійною хроматографією (ЗЕС). 5ЕС-
ВЕРХ проводили з використанням колонки Тозхопй ТеКаде! з5ЗО0ОБМУХІ (7,58х30 см, 5 мкм).
Використовували швидкість потоку 0,3 мл/хв. Рухомі фази включали 92,5 95 при 25 мМ МагРоОх, рН 6,8, 350 мМ Масі і 7,5 95 ізопропіловий спирт (ІРА). Розріджувач являв собою рухому фазу й аналіз проводили при УФ 214 нм. Результати РАдо 5ЕС при 214 нм представлені нижче в таблиці 5. Результати ЗЕС представлені на фіг. 13.
Таблиця 5
Результати ЕС (РАФо) для АБА--СММАЕ
ПИ ССЗ НСС Бі ай
Широкийрозподіл.///| ( З2 | 7777/9681 Ї1111111111111сСс2С
Очищений. ЇЇ 777771717172211111111111111119781Ї1111111111111111 рАВ2 7777777 Ї777171717171717л041111Ї711717171717178996 11111111 нюЬиирчККНШНШИІиНИиТниниИянинннннининнишшшшш тАБАБА7СЇ777771717171717171111111111Ї11117171719591 11111111
Результати РАЗФЬ ЗЕС при 214 нм
Таким чином, періодичне очищення АБА-мМсММАЄЕ привело до ОАК 2-4 із середнім значенням 3,1.
Приклад 9. Аналіз інгібування росту пухлини іп мімо з використанням АОС АБА-ММАЕ
Як описано в прикладі 8, одержували очищені композиції АБА-УСММАЕ, так щоб середнє значення БАК АОС у композиції складало 3,1. Потім очищені АЮС досліджували для визначення того, чи є очищена композиція АОС з АБА ефективною відносно інгібування росту пухлини іп мімо, з використанням моделі з ксенотрансплантатом раку легені. Більш конкретно, проводили аналізи інгібування росту пухлини для оцінки ефекту очищеного АБА-УСММАЕ (АБІ1-
МСММАЕрР) на клітини МСІ-Н292 (клітинна лінія карциноми МЗС С людини).
Результати, представлені на фіг. 15А, демонструють, що АБА-хсСММАЕрР (у дозі З мг/кг маси тіла) був більш ефективним відносно зменшення об'єму пухлини і продовження відповіді (збільшення тривалості відповіді) у клітинах МСІ-Н292 у порівнянні з неочищеним АБА-у"СММАЕ.
Аналогічно, на фіг. 158 продемонстровано, що очищений АБА-мЖсММАЕр (у дозі 6 мг/кг маси тіла) також був більш ефективним відносно інгібування росту пухлини в порівнянні з неочищеною формою АБА-«ксСММАЕ. Як описано як на фіг. 15А, так і на фіг. 158, очищений АБА-
МеММАЄЕ також був більш ефективним відносно зменшення об'єму пухлини і збільшення
Зо тривалості відповіді, ніж негативне контрольне антитіло 2 (окремо або кон'юговане з ММАЕ),
АБІ, кон'Юговане з ММАЕ або ММАРЕ, або в очищеній, або в неочищеній формі. Контрольне антитіло 2 являє собою антитіло проти правцевого токсину, що не зв'язується з ЕСЕ.
У наступному дослідженні, що оцінює ефект очищеного АБА-уУсСММАЕ (АБ1-мМсММАЕр) на клітини МСІ-Н292 (клітинна лінія карциноми легені; АТССФ СІ -18487М), очищений АБА-
МеММАЄЕ досліджували в дозі З мг/кг ії б мг/кг відносно АБ1І-тсоММАЕ у подібних дозах.
Результати цього другого дослідження в моделі пухлини М5СІС представлені на фіг. 18 і демонструють, що очищений АБА-хсСММАЕр був більш ефективним відносно інгібування росту пухлини в порівнянні з АБА-УСММАЕ.
Приклад 10. Очищення АБА-МсСММАЕ за допомогою проточного процесу
Композиції, що містять АОС АБА-«сММАЕ зі зниженим навантаженням лікарським засобом, що являє собою молекули мо-ММАЕ, на антитіло одержували з використанням проточного процесу. Одержання АОС АБА-мМсММАЕ описане вище в прикладі 7.
Проточний процес очищення композиції АБА-МСММАЄЕ, що має АОС з діапазоном БАК 1-8, проводили наступним чином. 5-мл колонку зі смолою Ви-НІС спочатку зрівноважували за допомогою приблизно 28 мМ Масі, 7 мМ фосфату калію, рН 7. Потім реакційну суміш розбавляли за допомогою 1/6 її об'єму з використанням 1,95М Масі, 50 мМ фосфату калію, рн 7, і наносили на смолу при приблизному співвідношенні 100 мг білка/мл смоли при швидкості потоку 1 мл/хв. (час знаходження приблизно 5 хв. або лінійний потік 36 см/год.). Як промивну рідину використовували рідину, що складалася з 1 частини ізопропанолу і 10 частин (по об'єму) 28 ММ Масі, 7 мМ фосфату калію, рН 7, для приблизно 12 об'ємів колонки. Продукт збирали, починаючи приблизно після 1 об'єму колонки доти, поки УФ-сигнал не зрівноважувався (що також можна було збирати фракціями). Фракції аналізували за допомогою НІС-ВЕРХ і бажані аліквоти об'єднували і концентрували за допомогою ТЕР (проточна фільтрація уздовж потоку) і заміняли на 15 мМ гістидин, рН 6, за допомогою 10 діалізних об'ємів гістидинового буфера. У таблиці 6, нижче, представлені результати чистоти реакційної суміші до і після очищення.
Таблиця 6
Результати аналізу НІС (РАЗУо) АБА-МсСММАЕ з використанням проточного очищення (швидкість потоку) 7117171764 17 Ї17777111111011111111171171111111389171111111525. ЖД: 272 Ї777777171711711111111171171177111111067 | 77771099 2 2щ- 2481117 Г1711111171761111111117111111111 152 | 77711142 11111291 Ї111111781111117111111111707 | 777 11011111 | 77/18 нини о ГТ: Я Поет ПО ПО УР
У порівнянні з періодичним очищенням, описаним в прикладі 8, навантаження білком відносно смоли було порівнянним для кожного режиму очищення (періодичне очищення і проточне очищення). У процесі періодичного очищення використовували 2,26 маси смоли відносно АОС, виходячи з корекції ефективності. Густина смоли складала приблизно 0,23 г/мл.
Таким чином, наприклад, якщо використовували 10 г АОС, то використовували 98,2 мл смоли.
Використане навантаження являло собою (10 гх1000 мл/л)/98,2 мл-102 г/л. Експерименти з
Зо проточним очищенням мали цільове навантаження 100 г/л. У кожному випадку навантажувальний розчин і промивні розчини були однаковими за винятком того, що промивний розчин для проточного очищення являв собою 10 95 ІРА об./о6.
Порівняння між очищеною композицією АБА-МсММАЕ, одержаною з використанням періодичного способу очищення, описаного в прикладі 8, і очищеною композицією АБА-УСММАЕ, одержаною з використанням проточного процесу, описаного нижче, представлене в таблиці 7.
Таблиця 7
Результати аналізу НІС (РАЗФо) періодичного очищення АБА-х«сСММАЕ відносно проточного очищення (періодичний) (проточний) 71117164 Ї1711111111011171711111111489911111111111525сСщС 271 Ї777111111711111117117711111111ьог111711111111в899772 ши: и ПО п ПО Я ПО ОО ТЕтЕ о 12311177 -111111117111111111о6с21С 1111 У | 7777/7167 |! нн ши ши шишшшш пишии пиши У пиши
У цілому, як проточні, так і періодичні процеси очищення були успішними при одержанні композиції, що містить приблизно 80 95 АОС, що мають РАК 2-4, де кількість АОС, що мають рАВ 0-1 або 5-8, була обмежена до менше ніж приблизно 20 95 від загальної популяції АОС у композиції, як показано, наприклад, у таблиці 7.
Приклад 11. Аналіз інгібування росту пухлини іп мімо з використанням АОС з АБА і ММАЕ
Здатність АБА-УсММАЄЕ АОС інгібувати ріст гліобластоми визначали з використанням аналізу на мишах із ксенотрансплантатами іп мімо. Аналізи на мишах із ксенотрансплантатами (аналогічні аналізам, проведеним у прикладі б), проводили з використанням клітин ОВ7Маавг-7 (які експресують ЕСЕЕМІ). Клітини 087 походять зі злоякісних гліом людини (АТС Мо. НТВ- 14 м), Для дослідження пухлинні клітини змішували з 50 95 матригелем (ВО Віозсіепсев5, ЕгапкКіїп
Іакев, МУ) і Зх105 клітин інокулювали підшкірно в бік самок мишей Ми/Ми у віці 6-8 тижнів на 0 добу (самок мишей Ми/Ми одержували від СПпагіез Кімег (УмМітіпдп, МА)). Вимірювання довжини (І) і ширини (МУ) пухлини проводили з використанням електронного товщиноміра й об'єм обчислювали за наступним рівнянням: М-(ІхУу23/2. Мишей умертвляли, коли об'єм пухлини досягав 3000 мм" або коли виникало укривання виразками шкіри. Результати, представлені на фіг. 19, демонструють, що АБА-єММАЕр був більш ефективним, ніж негативний контроль (контрольне антитіло 2; антитіло проти правця), відносно інгібування росту клітин гліобластоми.
УЗАГАЛЬНЕННЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
6 АмінокислотнапослідовністьСОВІ МІ АРІ, АрА, АВ, АВСіАВЕ.Л//:/:еЧ 8 АмінокислотнапослідовністьСОВЗ МІ АРІ, АрА, АВІА: 19 Амінокислотнапослідовнсть МНАВА.ДГ-/:/ СС людини (ПЕСЕЕМІ) 60 Амінокислотнапослідовнсть МНАВМ 77777711 66 Амінокислотнапослідовнсть МНАВС.С/::/С777777711111111сСс1С 68 Амінокислотнапослідовнсть МНАВО ДГ -::/ 77771111 69 Амінокислотнапослідовнсть МЕ АБО д/с
80 АмінокислотнапослідовністьСОВІ МНАБН, АБУ, АБГІАВОЇ/:.1 86 Послідовністьнуклеїновоїкислотиважкоголанцюга ДБА.Д-/:/:/ССС:пОСС7 89 Амінокислотналідернапослідовністьлегкого ланцюгадГ/-:/:::////:(/63о//://С(О
ВКЛЮЧЕННЯ ЯК ПОСИЛАННЯ
Зміст усіх посилань, патентів, розглянутих патентних заявок і опублікованих патентів, цитованих у даному описі, включений в даний опис як посилання.
ЕКВІВАЛЕНТИ
Фахівцям у даній галузі будуть зрозумілі або вони будуть здатні установити з використанням не більше ніж стандартного експериментування багато еквівалентів конкретних варіантів здійснення винаходу, описаних у даному документі. Такі еквіваленти охоплюються представленою нижче формулою винаходу.
х жу нова кни КЕЖх список ПОСЛІДОВНО ТЕИ ва ШЕ Ех Я у куУркх ех а У «Шо» АВВУТЕ, МС. пробку т пита Кр ти у У ТИ Чом вузу г беж Хот трону ЗЕ Ха Ки «Те ВНТМЙТІЛа ПРОТИ БОЖКО Ї КОЗ'ЮГБАТИ АНТИТІЛОУНІКАРСЬКМИМ ЗАСТВ за сут ж хкщ утро «130» ТІі78І13евейО а. мет кру и ой в «Їй Вот Оогі184о
Я ТЕ Не «14ї- 8085-03 - по» і т сх 5 «150» Б5БІ/ЗАВ,ІЗ сша я кот «Зі» 8014-03 «іх 54 ве як ФМ угуйч Яе тех же я ча хо «їси» Басевств гтеквісй 3.5 сват «і0» 4 «11» 315 сту отрут «1» БІЛОК т, з, гук пи о я «ії» ШеУчна послідовна ств «ях а ак ли сх «ше джерело с шаль Е кужчжкжш хутх В тен сто хх зх хи со яю г: чаю К- с жо сж чех сок ік ук о пе «вай /пюММмітказ спвс штучноеї послідовності: синтєТнчний поліпвнтни" «айв 1 г ху Ку» хх. ВК ку бю ія КЕ ж У ку їх Ж кує Сб Я сів таї Зі Ови Зіп З3Зі Бех Пі Бо біу Без Уві Був Бхо Бек бі ї В 18 15
Ух под її як К Ст м Умка чн Ху ех ва в и и чне НИ фс А су тВх Пец Бек обец ТЕ о Сув ТВ Уаі бек біьу Ту йек о Тів беж беж Авю ко жито м о й Кк т 7 - Уляех о жи Є мо ту хх хе, Зак же тю жу Ток СЗТ 34 Сп учх
Бе дів Тїр зв) Тв їіа Зко дів ро Бо піУу був пі їж бін Тр 35 ЕН 35
Меї Зі ТуУужш Кі йех Тух швхо зі Авл ТВ й ТУЮ Сію БЕо бюх Бяща
За БО т. в нн ЩІ Тк Же ЄрУую ин «п ем ле я т вл я
Був Бех Акоа Ті ТВХ Тіз бек Ася АвБр отв беж Бу АВ бій о бра вра 7 та во
Код З У сх, ге ж її су з ха ях сх ти їв); Су без дв цех Уві Ту вів лів бю ТПХ вів ТтВЖ ТУЮ ТУЖХ Сув
В ЗО 5 ще Нр то кю Яодяу ЛЬ я я плеч до Пежтуь И- УМ мя Жов су оку й
Увазі З вза сіу вк Бу Біне Рхо ТСуУує Ткр ЗУ Сію Шу ТБХ Бевз За 159 ї55 115 тп а) Зах бЗекх чек
М
«ВМ» й «-81ї2 31 «вія БІЛОК «вій» Штучна лослідовність пу і лк,
Ам «віх джерела ек М учуєчЖ жк Х сітку хх деки зма уки па и о п стакана ьо оку сзужауа «ва» примітка" спис пдрууУЧі ПОСЛІДОВНОСТІ: синтевичний пептид «Зх 8 жі ТУукК йех її чек беж Ав рве Аа тТкв дяв 4 «в 1 5 15
«а» З «т1їз 16 «іш БІЛОЮ «54» Штучна поспідсвність сх «ві» джерело «ва» "примітка" Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «400» 3
ТУх їі Бех Тухк Бек сіУу Ашви ТІ дк Тух Бі) рко бах їі Був Бех ї 5 10 15 «1» 4 са «14» БІЛЕЮОК «233» Шегучна послідевність «ех «вві» джерело «ві» /поиміткає" Опис штучної послідовності: синтетичний пептид" «ЗО» 4 зіва 0іу Ака біУу рРНе рРХхОо тТУуЖ 1 В «вій» З «й1їз 07 «пійх БІДОК еї13з ШтУчна песлідовність «аВйх
«иві» джерела «Ви3» /приміткає"пМмс штучної послідсвності: синтетичмий поліпенйтид" «ай» 5
Ащо їі сій Меї Тих біб бек рРко бех бЗех Меб Бех Уві Зек Уві Іі 1 5 ії за ввю вхо Уві ТИХ їЗе Тпх Сув Нів бех бех бій дяю їі дзюи бех дв їй м 3
Ії 31і1у Тс Пес) бів бів бу Бо пі Був ех Ре був З1У їм шТ1е за зо 45
Тух Ні СІі1у Тих Ава Сеч Ар дзр піу чаї Бо дех дху це ех ЩІУ ва ва 5
Зек іу дек Ціу їЮх Авр о Тук Твх Пе) Так ї1е Зек бек без бій РЕ ва 7 75 що піз Аво» о гпе із Тахо тТужх Тук Сув Уві біо ТуУук їв Сі бе беб Тео ак зо Мас
ТвВх в пе сіу Сіу Зі Твт їув бе Сів тї3З8 Був що 105 «йїійж в «ії» її «ій БІЛОК «вій» ЩтУузЗзна послідовність вас «ді» джерела «аа» «примітка«сОпис штуУчнаї послідовності; синтетичний пептид! «Ох в
Вів бах Зах іп йЕю Кі Авю Зах бю сів у і: З То «Вік «Ві» У «ій» ВІЛОЖ сей» Цена песлідевнусть «ай хваї» джефнеяло «аа» "/приміткатесино штучної песлідовності: симтетичний вепема" «а ів За ТВу Ав без Ав Аа 1 в. «ЯМ» В «аж З «ій БІЛО «аа» ЦЕУЧНа послідовність «вх» джере «пай» гпримітнає спис птгучної песлідсвиозсті: сннтетиечний пептид" «Ой» В
Уві ЗВ Тк йів біз Бїве Бк тре Тв ї кі
«ій» З «тії» 16 кеїй» БЕЛИК «жі» еучна зеслідевність «ах «ві джерела шежів гприміткае спис штучної послідовності синтетичним помііпяелтнях «ап» З піш уві вів без пів щі щех Зі» Бе ім без Уві ге Ро Як іп 1 5 18 15 тах пен бет Бе тн Су тТвК чаї бек фу тук Неж їі дек а АВ
В 5 3
БТпе ліва жор вн То їі ха бів ржза ро са був сі Бев бій тЕр ї5 48 Ак
Меб бБіу Кжх зі бек Тух вав пі Ве о тТВЕ Вже тую бів вує Бек Тому жа 55 о їУє Бек АК Хі ТвЕ Х18 бах дк дво їн бах був Ава бів Ве вве ща КИ ТВ що бе Був ін Ав Бек Чаї їх Аїз віз Адю тиж Азів ТИЖ Ту ТуЖ Сув - зо ЗЕ
Уві та віз пек ах бр Бе ре ТУ Тв БіУ БІ бі Тих Бе чаї 1по 5 119
ТЕ УВА беж бек 315 «Вій 16 «ії» «Ай БІЛОК «УК» Штучна послідовність. «ли «ай джерела «АЗх епримітваж сит: шееуєчної послідовності: свнтетиений певтиде «ВИ ЩО сі Туж Зак Іі Бек Ма дао вле діа ТХЮ Дав і В ід «Ей» 1 «я БЕ «іа БІЛОК «Віз БМучна послідовність «вий «и-і» деерело «ей» гпришіткає" Опис штучної послідовності: свити пепвете «аз ВЕ
Тук іш Яек Сук ЯБп обі Аня СБУ дтча ТуУухк бій Бо Бек Ген бує дес 1 З з ї5 каш З «ії я «ій» БІЛОК «313» Штучна поспідовністеь «ек «айїх джерела «ий примітках Сни зУднаї послідшвності: сянтетьуняй спелема" «00» 18
Віз Бек йку щіу ВВа Бкз тТух х 5 чаї» 5 чаіїїз 514 «іде БІЙОК «ій» Штучна песлідсвність «й ж «вії» джерело «ай» гпуемісках Опис штУучнеї поолідовнаста: свнитетнзнниа подінененя" «ПО» 13 ввр їі Зі Меє тТБжх Сів бек ршО Беж бек Меж Бех ті Яек а Оіу
Ко Бо їб 15 зав ве Уві Сак Сів ТБ Сув Нів Зак бек бів бер ті: двБин бек дев ку ке: й її 5 Тїтрвр ін бів біз» був вко іт Був бек Ве був іх ев ТІВ
Кия а С а
Тк Вів іх ТВ Аа на дер йо ЗіУу таі РКО Бек вка вще Бек слу
БТ а Б цех діу Бех бі ТВ дер Тук Тох рез ТО ї1іє Бех бек ау бів Бко в то їЗ ва сій дао ве діа Вк Ту ТУК Су ТВі бів тує ів Зі Же ре ТЖе 5 тТвЕ Бе пі пі бі Таж Був Се; бю Хі бух бе Тих Заі ів ія 110 15 135
РКО бек Уві Ре Кі Ре РКО реє Бек Яше біз Бій ев цу Бек Оу 115 ї30 125
ТПж Віза Бак бві маї Св бБеб ей де Ав ве Тук реє ака бів вада їх ї35 я був Уві ша Ткробтув ав Арон Аів їжи Зів бек біу два бек Св 145 їі50 їз5 ї60 сів Мак чаї) ЗЕ Бій ба ВЕ БЖ Був Авр о Бах таж ТУук Беж Пе; бек їв Її 175
ЄХеак Таж Бо ТВх їй бек був ів вяю тую бі) ГУ Ні був Мі Ту
ЕВ 185 190 їа 13 Суз піз Маії ТЕЖ Ні сій 03 їз Бех Бек Рго Уві ЖЕ був ВЕ 135 Зп 5 гве АБАя Ажа Біт іа сСуВ 21 «Ві» 34 «13 445 «їй БІЛОК «кі1їз Штучна маслідевнікть «ай» «ві» джерело «аа» «примі жках СН штучне мослійевнеет: мети сний оче петеня" «й 14
Зівз таі Зі Бей 018 біс Бек Зіу Бо ОБУ їжі Уя1 мує Бро Зек ців 3 5 5 Ма твЕж пев беж ес тб Сув Тс Узі бек сі Ту бек тів чек бек лев ке З Зо вне вів ТЖжр аво ТЕр о хіє дху вів Вже Еко сіу т бі Сей ба тео
З ст 45 мех Зіу Тух гів Бех Тух Бек Бім дБ Тк вка Тух Зіп Бгто) беж ей
За 5 БО ув Беж Ак їі ТБх ті Зег АкУ Аве ТВ Бек Гув бвв Під бе Бе в та 5 ЩО їв був ев дви Бех уві тТвх Аба ліз вяр тк вва тк ТУЮ ТУ Суб 85 0 5 чі їх Дів Сі вт Бі Баш Бко Тух Тхр Бі сів біу Твж Ббем ся 190 1955 ЩЕ тек Уві Зек ЯЗет Аіз Бех ТІ Буя Зіх Бхо вк Уяі Бе БО Без йвіа 115 150 175
РЕЗ Бек Зак ув бек ТВх Бек Січ бі БВж А1із діа Бей сіу Сую їж 130 135 140 чаї Бу Авр оТух Ва го біз Бко Уаії Тж Уві йех ТтІр о Ави бЗвт їх 145 ї5 155 їй
Афа спец Тк бек біу баі Нів Твх РвВе Бгто Аза уаї Шев бій Яек шег 165 170 175 -іу Пе Тук Бек ео бек Бек тТаії Маї ТВ Уаі Рко ЯЗег Вет Зет їв 180 І185 130
СЕ Тег ів ТЕ Жук Тіз Св Авп о уйаі АБю нів ув РІО Бек Аа ТЕ їз5 ай -05
Був Ча5 АБр оїув тує мМаї За ре ує бак Сув дер був тик нів тцЕ
ЗО 215 а пу Вко ржо Су Бко Аїа рЕбовіцй Іямі ее бі біт Рює бек аї Ре 235 5 46 їн Ейе Рко то Був Бко МПув йвр о їх Кез Меє бів бак о дко Тк РКО 4 ап 355 б5із Уві Тбж Су Уві чаї тузі дир уаі Бех Мія сій йяюв шко біз УдЕ 26о 5 ІВ їв Ре Анпоттр оТух Уві Вир бі уві біюш Уві Нів даю дів Був ТЕ авта во їйя їв Бко вже сіб аа ал отУк АвБвобек ТвЕ ТУхХ дес Уві Уві Бек чаї 5 ах ЗСНЕ бен ТЕ уяї їв: Нів ій вер тео їй БВ обі буяє бів бух Був Сув 305 Зо Зі5 КРИ
Був ві бек аши пуя діа Без РтЗ Аз Бгто Ті Злий ув ТвжЖ їзе Зек 185 КЗ 35 їжа дів був бі Зі Бко Ага бфи о бко бів тузі Тек ТЕ Фо фркб ЕКО 345 345 З
Зет Ах Ав Бій Пез ТУ пу дяв біз тТаі бек Їхні вк о сСую Беюво уві 355 Б ЗЕ йуз піуУ ББе тут вк Бет Ар Кі віз чаї бій тр бів бег два ЗЕу 370 З ЗВ дів Рго біз два Ав оТУЄ Був Тк Тк Рко ко Уві йсз Ав бек ввр за5 зай 355 й біу Явах Бе Бе їй Ту бек бух йец ТВх баі дар їв бек дк бр 805 450 415 біп бів бі бяп оУаїії бе дак о Сув бЗак Узі Меб Нів бій Аза бсві Вів 0 5 3 дав Ні ї;к ТВ бі Був бек їжи Баг це бек БЖо піу 4135 а аз «іх 15 «вії» й «ай» БІДЮК «її» Штечна поспідсвнасттех «Вих «ДИї» джеренео «ваза» г7приміткаєОпво штУучнаї послілевнясті: синтетичний поліпептид" «ап» 35 сі) маї сів рез біз бій бес біж фко фу Бевз Узі був ко бек ціп і 5 15 і5 тТвВг рез бек Пец ТЕ Сує Тв уві Бек бі Туж Бек їі Бек Акф Ар 2 5 за тре йія ТТ два Ттр Тіе дже Зіп Рко ро БіУу ув С1У Па бій те йо 5
Ме Бі ТУ Ті ех Тук авг СіуУ де Тік Ам ТУух бів ко Яее Бе
БО 55 ва
Був Бак Акт Ії ТЕЖ Її Яег АкФч Авр отих ех Був Авжвобій Ве Ре
БА та ть о них ЦУуЯ Ше Авиа беж уаї Тис Аіа Аіїв дар Тк Аів Твх Тух Туж Сув в 90 5 ті так дія Бак Ач ЗіЖж Ра РКО ТУХ Тхв Щі Зій іу тих ей Уві 100 ісп5 110
ТЕБЕ Уві Зет Бек Аіа Бек так Був Сі рко цех Уві Ре Ехо пеу діа 115 150 125
Его Бек Нет Був бек ТІ бак обіу бі ЖК АТа Аз Іва Біу ув шо 139 135 і140
Тв1ї Шев Ар Тут Ева Рто під рго уві ЖВЕ ба Бех: Ткр Ана бек 01У 145 ї50 їі55 ї5 іа без ТВх бвЕ бі Уі Нів ТВЕ Ре Бгто діа чаї без бів бах Заж ї155 ЕТО то пі пе ТУх Бек пез Зех Бек уві зві Тих ТВі го ек бех бек Бец 158 1855 ЕВ
СіУ Тнж ьо ТБНЕ ТуУук Ті Сув яв Уа) бвБИ Мій Був БкО Зах АБ ТЕ 135 «00 25
Був уві йвр був Пен Чі бій рюо Був Зак Су йнр о був ЖВх Нів їх їй 215 КК
Су Во Бхо Сув кс дів Вухо біб Б оз З1у бі РКО Бк Уві ве ж. за КК ай іні Ре Ре Ра цу БРко Був Ав ТВХ Кі Мес їі ех Ася їТвх РЖО
КЕ 251 а піл чаї Тв Суз Уві ві аз йяр Уві Бек нів ЗіБ дяр ро бів чаї ака за ТО
Бу Бе айви о Ткр о бух Уві во бі Уві біз Уві нів Ашм діва бува так
ІВ КЕ «85
Був Бхо вка Бізч січ сів Тух дя бек Тих Тук ки Укі бі Зек Уві)
Кс 35 3050 й ві Тк Увь Бей: нів бій Аве Тв вм Ай Сі Бе ол Жук Був Су 305 310 315 За був Уві Зех Ав був Аза пев БЕо діа Рез Іі 51) Був Таж І4є Бех аз ки 335 мує Аія МЗув ШЕУ зЗій вже дкКЧ й во ій УБі Тс ТЕ Оеи бо то 340 345 350 бер Ак Зівз Сію Меб Тйх Був ки Зі тя бек їн ЖВк Сув бах баї 355 ЗБ Зб5
УЗ ПіУ Ре тУК РКО Зек або Тіє Аза Уа біз Тр» Зіб Зех Ап ой1х 370 315 зво іп ро Зій деп Аяй ТУК бує ТВЖ ТЕХ вБко Вже Уві Гнмі Вар бек Вр : яв КЕ 295 о
Сіу дек Ра Ре Ілмі Тук беж Буш пей ТВж Уві яю був бек Ач ТгВ 45 13 415 з ін фа іу дев Та) Бе Зет Суб Зех тТаї Меєс нів Сі діз тей нів 420 425 338 два Нів Тут ЖЕ Сб1іп гу беж тт Бек їі бек вка 01» 440 ч45
«А» 16 «841» 1 «дій» БІДОК «ії» Штучна побслілевність «аа» «ивіж джерел «паї» "приміткас Овес штучної послівовності: синтетичний пекпеня" хай» 16 пі ТК Бек Кі бек деп Аве РЕ дів ТЕ дЕп 1 5 10 «а М «я МВ «іл» БІДОК «КІ14» Шеучна МОЛ ленні ств «ад жі» джерел чів "примітках" Спис штучної послідовності: сМмнтетичний пенер"и «Й ВУ
Тук Іі Яег ТУух ув 1Уу вже Тк йо Тк Зі Рго бек беб був бек 1 5 10 15 «підж 18 «її «ай» БІЛОК «й1З» Штучна послі дені єть «ВД» ай дЕюврене «ЕЙ3» л/приміжжат Опис штучної послідовності: свнтетичний педтии"
«Ох 18
Аіа Бах АКЯ У пев рРЕО ТУХ 3 КЗ «від» 19 «її «вки БІЛЕ «вій» ЩШучна песвідевнієть «и «ії» джереле ейші» «примітка смс ШТУЧНО песлішевнесть: смнитевяичнив мете"
Аїз Бех Айку іму БПе Бо тер ії в «ей» 0 «кїіїв 11 «їй» БІЛОК «213» Штечна послідовність ярах живі» джереде «ай» оприміткае"Слиє штучної послідсвнесті: смнтежнчвий пептид" «Ой 30
Біу їж бек Хі Сі вже двр Ба Я1а Жжр ал ї 5 о «щі0» 21 «Вії» 11
«ії» БІЛОК «Зі Штучна послідовність «Уж» «ах джерело «Й Примітка очне: Штечнеї нОосжідюевненеї: свіч е петечед «400 81
Зі" туУкК вес Кіє нів чех Ав Не Аїа ТК АВ 1 ї 15 «ій» Х5 са1ї «вій» БІНОК «213 Штучна послідовність «ваше «Вії» джерел «вай» иприміхаие" сти штучної послідовності: скине пепева" «о» ях від век Стр зу пен Бго Тер 1 5 «Я» 4 «аіїж 31 «візж БІЛОК «її Штучна послідовність «ак «ийї» джерела «ша» /Приміткаж слис певучнаї послідеовнеоєтії: синтетичний пептид" «а» я
Нів чек бек піп Аве Кіє ТВх Тук дви лів су 1 5 10 «ій 26 «йіїз 7 «віях БІЛЮХЄ «иїї2 Штучна пеослідаЗанькшчь ей «ййї» пджереда «ваїз "примітках" Онис швтечнох послідебевності: сиктетичний пептид «ЗО» 4
Нів біє йів вів йеє Явр ВЕР ї У «вії Я «ії» З «вій БІЛО «їж» Штучна послідовність «аа «аа» джерена «віт примітка Опмс штучної послідовності: синтетичний пептиде «а» 85
Ууаь спі Тех авр бі Ве ро Тв ХЕ 1 5 «Ві Же «йії» 11 «аа» БІК «ЗЕ» Штучна послідовність
«ик «ажаіх Джеренле «Жйї» сприміткат"срлно штучної послідовності: синтетичний пептид" «ОО» В
НівБ Бек Бех біл йшо (За Твж тек йди Ма3 БУ 4 5 їй «10» 57 «і її «Вій» БІЛО «їі» Штучна Послідовність «ад» «аж джерела «чавіх /приміткаш" Спас штТУЗчНОХ послідовності: синтетичний леюмжид" «й» Ж
Ні Зіу беж бий їхні йшю Нів 1 5 «ай» В «вії З «вій» БІЛОК «щії» Штучна послідевність «дх «яЖі харч «ихі» гпримітказ"сОпно штучної послідовності: синтетичний зептиде «ОО» ЗВ
Чаї 0 Тух вар Авю Бе бхо тТюкВ о тТВЕ і 5
«ХО» 5 «5» ВІВОК ев» Вбучна зослідоввість
СВІ
«УЖ дюн ло «ай» о" понмізка Ониє вечнеї носно новнОєті: ємне нчнниа пе ей я
Нін бег бах бів яр ї1е йо Мес яви ув їж 1. 5 їв ее З аа З хі БІК «її» Шсучна послідовність «ай кві» шерело «ай» привітна спис штучної Веслевовносеї: снезевичний пепенея аа ЗЕ йіз бі аія Ще бей бер лаяв «й» «і Я «іде ВЕДОХ 313» вена восхівеаніссть еВ
«Жй1» дюврела «3» /приміткає Опис штучної послідовності: снижетичний пептид" «ад ЗЕ у бал ТУЮ дів са ве вт ТЕ ТЕ 1 в «їй» 35 «Ії» 1530 «12» БІЛОК «іїіз НОшжо вЕЮОфЄНХЯ. «ШИ» 33
Мас ате го Зак Зі Тк Аівн піу діє йта Беб пец Аів Гб ев вів ї 5 18 ї5 ів Їм: Сув Рко діа Бек Аа Аїв Бе са бів Був ув Уа Сує (Ла в 45 За сі тТвж бек Ввип ув її їВк о пія їй)» бі Тк Бре бів йво Вів Ре
КЕ 42 а їмо бех ви бів Ахо Ме Вії Ано Авп був біз ні Маї бе Біу дя кВ БО їва біз її ЖЕ тує уві бів вк Ав Тех Ане пе Бек ре їв Був їй в БО
ТНК діє шій біс Уа: Аівз фі Тук Чаї їв-о ЇЗв А1а їси два Ту Уві 5 БТ 5 ще Аж ї1а Вхо їхні бів вай без ів їі Хфе дк ЗУ АБв Ме тує 103 105 іа тТук іп дв Бек тує Віз ви дів Уві їв; Беж ава Жухт АБИ Азія Аве 315 125 їх5
Бук Тнж СІЖ Бєб Був біз Бе рко Меб джу йвка б бів біб ТТе Сей
ЗА 5 14550 нів іу Дів Уві джд Бпе Бех дво янв орхо ліз їжі Сев пи Уві біб аа ї5З8 Зк ї855
Зак їі біз Тжр Яке АБО Ї3а Увь Яех Бек дар Бе цей Зак деп Меб 165 ів їт8 бек Ме Авр Ра Пій аеа Ні Без іж Бех Сув бів Муз Су вар РКО 188 185 199
Бех Сун роз Аа Сіу Бек Су ттн сСіу дів бі» біз біо див о сСую 518 і5 00 ап ув ре) ЖЕ ПУЕ сів Ї1іє Сув вів ЗЕп бів Смв Бек Фіу ака Смв ВІв «10 25 4
Бі Був Зек ко бек вро Суя Су Мія Зшйа Є Сув дів вів щу Суд за8 3 Жук зай
Так біт ро Ажц сів вес аБО Суб ямі Уві Су Аа ув Ра АкУ АЕр 245 В за ще Ат Таж Сув ув де ТВ Сув Во ро Сео Неї б) ТУук Адв рЕе
Б жа ай їх Між Тує іп Меб йзро Ві йшп Рез біз С3У був ТУх ВвкЕ Бе У ки ящо 25 віз Жйжх Су баї Був був Сув Рко Аа дви ТУ Уві Увазі ТЕ ве ів 290 хЗ5 зай іт Беж Су уві жа дів Суб О01уУу Аза Ля зех тує Зі: Ме бів Б 305 За ЗБЕ дл вв цпіу чаї й пув Сув був буя Сув піз бі Бко Сув ЗкЯ їв уві 325 330 335
Су ави СТУ їв 01У їі біб ів Бе був Маю Зак еп бек Її Ява за За 355
Аів ївх вп о їі ув нів Ре Буш дет; Суд ТВЖжЖ Бак тзів Бек пу вез зва ЗО 355 їні нів Хі Кеш ркЕо ча3 дів рве аку бі йяр Зак Ве тве Вів тВжЕ кю їт5 380 рю хо ач бр Бте бій із без йвр о ї18 їй бує ТВж Уві Са дів 85 355 зз5 чо їі таж Біт Ве Бей Па Іїзе Зі Аіа Тр ро ід дн вже ТВ Ер «05 ЗО 18 їж Ні дія Рве біц ап Бе: б» бі тів Ах біУ Ах тТвЕ Був бів аа а 839
Ньв біУ бів Бе беє а Аза Уві Уві беж Бею Здай їїе ТНж бек пев ч35 40 зап шщіу Кей дже Беж Бей Ген бій Т1ів Бак йвр Бі дно Уі їі їі бек 455 що йьу вип ув йят їв»; Сун Туг віз Ав Тв її вяй Ттр був був їй
ЖЕ зт ат За
Бе сіу Тк дек шіу біз Сус ТЕ був тіж Хі Бех ви ак Оу БІ 85 о ач ваза Чек Су бук вія ТЕ бі бів Уві Сує Нів ів ву Сує беж РЕ ав ет 510
Фі бі Сув ТЕ і1у РгОо піз Бго йо АвроСув Маї Зех Су: Яке дн ій ай ЗВ баїі Бех хе Зі дк ОМ; Су Уві Авар Був Суж Ав о бей бешж о бію Му 535 а бій вто ага Сі Бе баї бів дві Зек бій Су Хі бій Су Ні Ре 55 В за ко пін Су пец о вБто піп Аіз Меї йни її Тк Стув ТБк 031 Аз Бі БЕЗ 55 та БІВ
Аею йяп оСже Т1ів Біп Сув йія Вів Тег їі Ар о біж Рко Ні Су ча
БІТ 55 5 цу Тк Сув Ро Афа бію уУі Меж бі» іа Авт йша Тв Бе Уві ТЕ вч БОЮ БО
Пуа Тух Аїа вжр Аза ЗіУ Нів таї Сув Нів бе Суз Ні Его вЕ а Сує
БІ вай бпх Тчх Зі Суз ТвЕ сі ро бсіу пев біо сбіу уз рРЕОо Тпж вне ТУ 5І5 53 ва І
РЕО УЖ 114 РКО Беж їзе діва ТЕ сСьуУу Ме чаї СьшУ йза їні С Бей
Бах БО БЕ оба їн Узі уві ліз зво сі їі сім бе) Ре Ме ре Вкз Асе Бій
Вей БЕ та
Їїє гУві йхч був вгу ТБжх їєк Аго дк Пен їв бір біз йге біз Бей
Та ВО 85 чі бів ко це) Тих Бо Бек Зі Зій Аіїя ВБКО АБЕЮ Обі ів пев Бей
Ба БУя 70
Акч їі бе Був бі Же обі) Ра бує Був їі Був УВА Бей ціУу БЕЖ ту 750 715 780 діу діа ва 015 Тпж Ууаї Тк Був СТУ Бей Ту їі ЕКО Щі біж ШИ та ТЗ 735 ту чаї Був їі ро ді дів жів Був зЗіб пе) да бій йза тв Беж та КЕ Т5О
Рго Був аїза дви був сій тів Без вно зів Аїа жук УВЕ мес дів беж та 7 т7е5 та Ар Ав РЕЄ Ні Уві Су Ат шез Сей сі хів Сув мео ТвВкК Щек 7 75 7
Тих Уаї сіб Сей їі Теж біз І Мас БО вве Бір Сув єп їжез АД
ТБ 75 ТУ ШО їуУух маїі Акоа біз нія бує джу йвп їів Зі Звк сСійп Тут тра їй ЗВ вп вій І тв Су уві бів 112 їз був бім ШМеб АБИ Тух Сех С АВ ач ягу ва вия яз їси Уві Ні йхе Зо ес дів А3а Ач о Акв чаї бе: Чаї бує ТНжх Рго дав Вій 845 вів нів Уві Був їі ТЕ Ве Бе Зі Бе Віа Був ей Бей Сі вів я Бе ЕВ із із уз зма. тТук нів віз зЗіз бі Зіу ук Уаіф вжо тів був ТВ
Ба я БУВ вва
Ме аіз їєв бів ЯЗ-к тіж пев Мів Ака їІїе Тк Таж Вів бів бек бер
КВ зо 5
Таі Тер дет ТУук біу Уві ТБжх Мві бтр бі бев Меє ТЕ Ре Зіу бек за ДН в
ПУ вБгОо Тух яве пі їі Без бів бек іч їі Зех бек Хі Бев 01
ЗІ5 ЗВ за та іт іш боб іні Бхо біп Бко Рг Із1е Сув ТВЕ тіє див Уві ТЕ 3 жа щас
Мас гів Мес Узі Був Сув ТВ Ме Ті Авр біз бр оЗек ко ККЗ Сув 45 з За за
Бе дка пів пе) ї1іе її бів Бе бек Су Меб дів дха АвБр вКОо бів 85 7 Тв
Яке Тук їми Уві Хі пів спі дав біс ду Ме ія Гей Рто бех бЕо зво Фа за
ЯМ Ав; оЗег Ано Ве Тк йхй Азв Бе) Мес дез січ ій йяр Ме аво 395 МО 005
Зввотні ві зво; Аза Ер бі Туюк реб Ті Рез Бій бів бі Бе їі510 Ащі15 о
ТВе бек беж реко цех Тв бек вка ТВвІ ро Ген Тязи Бех беж Ге п 3035 135 пек Аіа ЖІ бек вав ойам Бех тк ві віз був Кі Ажор вк деп
ОО Мне тю бір інш бій бег Сув го Хі Був Зі: дар о бехг ВБе їжи бій й 10555 х0Б5о 1665
Жук бек Бех двр Бко тв січ вів їже Те бів дез беж х3е Аве ща МВ їпно зар їж Ре без Ре Увь хо бію бух їі два бів бек уві вКо
Та85 1095 дах
Кт. вкц вхо віз б1у бек Уві бій два Ро ува) ТУЮ нія дя пав 1159 і1105 33435 бТ5хо ва) без Ро від Бо ех лк вер рко нія ТЕ Сів дер Вухо 1115 120 1155 нів бек Тих дів уві ші аяи рго Фів тую Ббев ям тв чаї їв 1138 1135 1195 еко ТНК Су уві Ай бек таж о РБе ав бе рко дід нів Тв Аїд 1155 1150 1155 зЗій мув іу бек Мі ціп піє Бек Іжа дер АяюО РЕФО Ар отТУуЮ ФВ зЗї15п 1858 Іо біп дев о Бе Ре рЕб Пув бід дія Ммув Бко яв біб Іі РБе пив 1175 зво 1155 біу бек їйЕ Аізя піз АвопоАївн бів Тк без Ака о чаі Аїа ро сій 1135 1195 їх98
Зег ек бБів Бе ї1ів сім А1а 1505 1518 «ай 33 «їх 343
«вій» БІЛОК «513» Нащо яарівтя «ЩО» Зі
Меб дкц Бо дак біт тк діа Зі Аїяа бів її без Лія То епі від вів їв) Сув Бго Аіа бек АжЯ Аіа ії біз бій їув був 01їуУу Ав оТУЕ за аа за чаї чаї тах дер Ніз бі Беж Суя чаї важке Аіа Сув Бі А13 Анр Бек зя ай зе
Тух бви Мет сій бій АБО Біу УА вжхч ее Суя ув був Су вів Б1У и; Б 0 то був йго ув Уві Сув Авпопіу ЇТіє Сіу ї18 Сіу бі: Ре їв бер ай то Те во
Беж їн Зах ї1з лап АтТа Твг одап о їі їв йів б Бу Ав Су ТЕ в за 5 чек т1іє Бет сіу йвзБ и нія Т1іє їні Рхо чаї віта Ре КО щіх дер 100 Ох хо
Шек ве Ти: Ні ТМ Бто Бо пев Яйвр о Бко бів осі їжи Ашр її Бей 115 ї28 їй іїча тв Узі Був сій Ї1іе Твг о біу Ре їз без тів бів Аза тТкр вВКе 130 135 ее іс авп овжо ТВх аБр йез Нів Аа вна 30 Аяп о Бей бів Хіз ів АЄШ 145 156 їв ів сіє йкс ТЕ був пів Ніз бі біз Ре бек Бей дів баз Уві Бех ей 155 Аа і75 ашв оТіе Тпх Як іі Біб їв Зату бек бо) Був «Кіз бів Меє Авросіх зве 185 з
Звоа обаії Тіз бів Зех бі й пев ам їв СУБ бек віз АявоТНЮЕ ве 135 ай ЗВ
Мав їхв цу буб без Бе Зі Та Бек сі 1 БУЄ ТВх Ба Ї138е а
Ко жі ча
Бек вЕшВ АкЯ Сіу спів ЛЕВ Беж Сув бу Аза тв іУ біб Уві Су Ні
КК о 35 а віз Без Су Жех Бхо бін біт Сув ТКр обіу Вко сій рхе Акеш вав о СуВ чаї Бек Сув Ака Аяв таії дек вже ЗіУ АК ів бух з аї Вер о шдя Сжа
Ми а ав
Ав їні ї-ча бі Зі бін Его джч біз Ре таї біз Авт обет біб Сув 18 НО 285 їів іп Суя Нію вто біз був Ієпть Ркео біп Авя Меб Ап оїїш Таж Суб 290 235 зва .
Тис біу АкЧ піУ РКО Ар о АЖо Суд о Іза біл Сув А1я нів Тут ї1а Авр зве з10 зі5 320 і ра ія Сує уві реж таж Су Ро Аїв шіу ува мМек сім біз дей ч25 330 315
Анпотнт Ілні чані ТЕр Буш Тут Аїа АвроАїв су Ні Уві Суш Нію Би 340 345 а5О
Суа нів рго Ай Суб Тит Тук Сіу Сеув ТЕ Сіу вка біу іш біз бід
Зах 36 385
Ста БРго тТвкК йо бі ко уж тія Ро бак ті Лія Тйх сі Мек таї1 370 375 зва
ОЕч йіїв Баш Сині їдлю тмі Елі чаї ві дів тез біз Іі біз тявні ра
Зя З 195 ген)
Меб Аг Агш вАгу Ні І16є чі дхЧ Шу Аке Тк без дгу вт їй Бей 405 410 415 біп біб Агч бід Пе чаї бів реко Вем Тк бко бек біу іп Аіяа Рхо 42 аз 30
Авт бів вів Ге; на Вйге Зі без ие біс Тк Зію Бе бує уз Хе 435 4430 445
Іме МВі їні Су Шек Сі діа Ббв о сі ТВЕ уаї Тук с біу їй; Тр 455 Я) тів Ро сів Б3іУ 0155 був чаї БУ Ті РжО чі віз та Буш Сій ев ве 470 ат5 Зо
Атя біз ліз тт бек Бо Був Аз АвпоБлувж СЕ тТ1е бен о днрв осів дів 485 5 4235 тус чні Меї ія бек чі дер дап о вЕКео Нів тазі Сув Ак Бе їм: піч
ОО 5 51
І1е Суч її Те ет Те Ма1ї бі їні хів ТВх Бій бе Маб ке Ра 515 щаО вав біт Су еп їєп АвроТух уаії йку сів нія їж Авр о дяв Кіз біу Заг 3 5 БТ
Зіп Тук Геї ев Ашв тв Суа Чаї бів іє Аза їв Зі Меє дви о теє
Аа; 550 Ба 5 ївви Бін Аве Ага АкЯ Ба: Уві нів Аж Аво їжа Аза Акта Ак Аяв Уві.
ЕІ ЕВ «75 ев Уві Був ТЕ рРко бів Нів Уві Був сіє Бк йже Бе бу без дів а зх зай
Мув рей Бей біт Аїа біз Сів бує бів Тух нів АвБа січ Сву ЗТуУ Був вн во Бо
Уяі ро їіє Су ТІВ Меї діа їжи біз Бек іє ви нів Аж Т1е Тух 5ї0 БІ ва
Тих нів бів Зек Авр слі тТЕр Зах Тук сСіу Уві ТЕ Уві тТжвр бія Там я 50 віз 540
Меє ТВж Бе біу Зег бує Вко їТуг даю біт їїе бто йів бек біз їїв 545 БО 555 дек БЕЖ їі пев бій уз БіУу ОЦ ака Го РКО Ей БКо Бра ї1е Суд
БО Б БТ
ТМЕ Мі йшр Уві тТух Мас о тїіе Ме Узі Пт Су ТЕЖв Мей Ті Ав 18 ат вва «5 авр зак вВжч рРто БПув ве дя біз бе її Сів бій Бе бах Був Меї
За о топа
Аіа йгу Авр Бго бію Ахе ТУЮ ев чаї Хі біп бім Авр Зі Аку Меє 705 З ті Тай
Нів Гео вхо ет вКко тк ВЗяр Зак вп о Бе Тк Ася Аза ес МеЄ АЖр тав 73 та дів іш Аде Ме Ав Ар Уві Уві дер айїв Авробію Тут Пе тів ркб та тав 75
Сьв Сів сьу Ре Рпе Бек Бак ро бек Тож Бек акЯ ТВт Бко Б їж т хв) та дек Бек єси) Бек Аза Тк Явк вет Авт Яеж Твк Чаї й1іа Св ї11в вяр я тих тво
Дж Ап обі іні Бій Зек Су Бкб їів був іє Аву хек Бе бив ія ча таза 785 вай лдкц ТУЄ Бек Бек ер РКО ТЕ бі Азія» іні ТВЕ 010 бер о Зек її дяр вп вій 815
АвротбЕ Ре їез Ро Маі Бто Зіз Тут їі Ази сі Бек Уві РгО Був нд наз вза аку РКО Віва біу бек чеі ЯЧіп йем КБЕо Чаї Тух Нів двп Сію вжОЗ Сбев
ЗІ ад ВА дна орто дів хо Зак бйку йшов Бхо Ні Ту бів ав о Рко Нія бек ТК як вак ВО
Віа таі Фу Ввп рРЕО ОБ ТУЮ Гей дай тн ві бів Бко вк оСув Маї
ВЕ ВТО 75 вай дп обек ТОх Бе дво бек вго йіа Мія їж дів бів Був зі ех Бія
Ех чо 535
Сів Її бах ей вве Ав) ко Бер ТУК ПУ бій АВо Ре Рбе рЕЄ Був зЗ00 з05 935 пів вів г Уув рко ав оЗіг їі Ве ев Зі Беж ТОЖ Аза бів Ав дів
За за Зих5 бі тУукК ей дсп с аії Віа рез бів беж Беж Сі: рве тів б1іу Аза з3 35 що «їй» 34 «Віїж 55 «ій БІЛОК «Ха» Нота варів «й» 36
Мек ле Кко бек бБіу ТЕЖ дів сі вів Аза Бев бо дів пе) пев дів ї 5 іа 15
Лів Без Ст РЕО Аія Бас Ат вія іо ЗІЗ Сію Був був Заії Сув ій
КЕ 25 Кт бі ївк бек Ав був їжи ТВ сів ову Біт їж Ве бі Аве Ні Ве 45 о 5 ей Яек їв; біп ду Меб ЕВе вав» Аз Сув біз Зак Уа) пев Бі Аз 50 За БО
Інна піц тів ТбЕ Тужх УМаії Зі Ак Ав Тут Ав Ті Бет Ре їі Буй 85 76 т во
Тк Ті іп біз Маї АТ і ТУух Уаї без Хі йів ев йзяи ТВт Маї за 85 пів ах ге Ро пе Зі авй Бев пів Тіє КЗ вАкч Зіу вла Меє Туг 1650 їде 110
Тук біз Ап ех тТук діа ії» Аїз Уаї гей Бек АБО» Туш АЖе вія два їв КК 835
Му ТВвеЕ бЖуУ Ба Був Зіц їі вхо Меє ДКЗ Ап пев С1й пів І1іє Бей 138 135 140
НізЗ біу А1а Ов) А: Бе Зех дяп жа ре діа Бе був зві Уві СЕ 145 ї50 а МБ ек їі бів ТЕО АгяЯ Аве їіа Уві баг бек АвІ РО їжа бе йхп Мас 165 їй їт5 дек Меї авр Впе біп Ана Мі Бевз біуУу Бак Су За цеУв сСув дев РКО і1859 185 190 цех Сув жо Ав осі Бе Став Тв обіє дів Бі біз 310 Ап оСув СІЙ ї95 що 295 ух їм Тис Був хі Гіе Су іа Зів іп Сув Бек шіу люк. Су АКу м) 315 ей сім т ех Еко щех дев Су сСуя Ні Авп біз Суя Афів Аіа біж Кув ка о 45 БЕ
Тк біж Бгто вка Сі; бек дер о Сув бе Чаї Сув З їв Бпе Яга Ар а БИ КЕ іс вів Тйж Сув Пув Анор Твт був Бго Во Без Ме без Тут дяв БЖо а ки
ТВЕ ТВ Тук Бі МОЄ дар а) Ав Ро пі 03Уу Був Тук бек Ве їх тя ай Кв із Тв сСув Чаї їв Був Сув Руо Аку Аня тую узі узі ТЕ дао нів 5 «з КЕКЕЮ сіру Бек Су чі вда іа Су бі ліз Авробех Тк Сі Меє кій Зі за 10 18 ЗЯО
Зяр біт Чаі до був був був цув Суб б3в ЗІу Вко Су вхо пев чаї 355 33 335
Су« вав спі Кі пі іє пі ші Бе був ввор о чех Пе) бек 1 Ав
ВЕНУ За 50 віз ТВх Аа ів Бу Нів БВе Буз дя СуУуз ТВХх Бу Біє Беж сщіу ВВЕ 355 зо Зк їв: нів іє цей Ро Уві іа Бе ак сі йо Бек вББе тк нія ТЕ
ЗО т ЗВ
БКОо ЕК ей вхо вхо ців Бій Без дви іє їм Був Те чаї був Б вх ЕВ! ЗБ ЗО
Ті Жвх бі Бе би їв Іі піз Аза ТК Ро са Ав Ахч ТБЕ йяБ 405 СЮ 545
Без Нів Аіз Бе біз зяб іє З1м їіе їі вує бі Аж ТВЖ був бів
ЕНН 485 аа нів бі бСіп ре Беж пе) зів Уяі Уві бек їжи Ада її їх бех Шев 415 ай 45 сі Га ку Зет бю пу сія ІХе бек дер пі Бер Ууяні Хіє її18 Зах 455 УНН
Сі Авт Їлєв АнвоїЇммлі Су Тух бів ляб ТВ хів АвИа тр обу пуб Бек ії СУК 5 що ве піу ТВ Бек пі Зі пуз ТОЖ тв тів їі Вес йап Ак біУ 485 З З вази бек Су пуб ів ТЕ бі бію Уві Сує нів йія їв; був бет БКко
ТК вх БО ів біУу СУув ТК щіУ во пів рже АК дае о Сує Чаї бек Сув Ат дви ща БЕЗ
Уві бек Ак ші Ату сі Сув Маї вшО був Суя дат їжа Мель баз їж
За БІВ 5СО
Січ Бкго йхе біз Бе уві біз Явт бек із був їів бів Сув Вів Бжо вав БО 555 55 пів сує Бей ре Бі Аза Ме ваш їз т Су Тих 01У ВЕ Я бі БКОо
Б о 5
Авр Авт Сун їі біп Суд Аза із ТУЖ Ті ар Зі жо ів Су УВІ пак ав БЕ ув Твх СУ РО дія бі Заї Меї бі біз ляб дев Тпх їв Ууді ТЕр «ВЕ БО ви
Був Тук діа дев дія піу Міз чві Сув нів без Сув Ні Рхо дей суб вій 5185 вий
Тк бух йіу Сув Тк бїу Бго біу беи 01 біу Суз ро Твх зва с1у виз 53 Б ай
Еко ПСув хів Бко бек 6545 вій» 35 «ЗАї» 35 «аз БІЛОК «й Зісечна поЄєлідавністьь я Ще «ВМЕ» джернеде «Ва» гприміткюзе" Опрс штучної послідовності: синтетичний пептид" «Кай «віз ВАРІАНТ пане ж (5. (5 «із азамінаш чі» яме зщще вки «21» ВАРІВНУ «аа» (БІ..ї1Б «аййх гЗамінає" дже" ай "Дай" «КО» «икі» додатюсва ознака
«аа» 11.81 «Ві» оприніткхзз"Вавівнтні ЗалищшеЕМ. наведені в о песєвідсовності, ме є мереж женми війноске залешеїв, мазеленнх - анотаціях для вавзантних полиженвь" «490» 35 бі Тук Зет ї1ї-е Зєжх бек Аве ВВ Аа ТЕБВ ав і 5 іп «ЕД» Зб «УК» Ще «Рід» БІЛО «ФІЗ» ручна послідовні ст» «аа «ші» джере «дж по ажмажиоиє птУучноай спеслеІдсвномі: спенжетижниМ пеостиде «ДАО «ах ВАРІАНЕ «аййх БІ, 5 ча «заміна вяи ща «грувх «ай» «жі» додаєкава занака ей» (1. 135 ева3» примітка Варійнені аалищшкМ, наведені во послідовності, ве є переважними відносно залишків, наведених в азвеаціях ия варіантних положень" «4» ЗЕ
Тк ів Зех Тух Бек Сіу Авв тТвЖж Аа ТУК ЯМ Бо Вех їжи був ву 1 5 10 5
«ій» 37 жаїїж 7 «ій» БІЛО жа НЕеремна земні дові «ай «ЕІ» джерела тай» гпримісквезз сис штучної послідовності: синтетичний пентид «пай» «иЖів ВАРІВНЕ «ай» Зк..131 еВ бпамі мае сте «а» «ийі» ПАБІАНЕ «аз (5... я Комажиі вела З Бавду х «ОО» «лі» ВАБІйНЕ «ака СТИ «аж /земінаж ти «ев «паї» додажисова озвака «ай» (47 «жів примітка" Варівивні зЗайишкв,. наведені в послідовності, не г переважно війднасно жалпеюжів, наведених а акотавіяжх дв заріантних мполовень" «а» 3
Аїа зехж вага йіу Бпе го Тук ї 5
«ві З «ції» її «із БЕНОЖ «вії» Штучна поспідевніств
Ук «і джерене сна» «примітках Се шумно вісн овнеМюхІ синтетичний мент" «ай «ййї» ВАТІВНІ «дай» ТЕ... раї» гзаміназ Ви" «ее» «Каїн ВАКІАНТ «Ва» «ВК... (8 ех «Заміна Ме" або "ВЗеже еЯйшх «ваїх БАКІАНЕ «вай» а... «аа» «Замінвя уки «Яд «шаї» додатвнсва сзнаюма «айва» КТ... 453 «Ума» гпримітказ'бавіяйнтні смУлешим, наведені во послідовності, ва є переважними відносно зелишеів, наведених в знотаціли дик вБарізнтних положень «пе ЗЯ
Нів Бех Бех пів аАвОо їі ап о ТУж йвж ї1е пі ї ія кт; «і» 35 каїії» 7 жаі4з БІЛОЮ «213» Їбвучна посплідовніств я «Ві» дженю «КЗ» примітках зетучної посялідовностії скнтетечний пелет" «аа» «із ВАРІАНТ «вай 3. .3 «аа» /Замінає"АТа збо "Важ" «ад «айіїх БАБІ «ай» (41.44 «аа» гзамінаже хів" «аа «їі» ВВЕТАНТ «ай (71, СТ «ааЗ» /замінає"нНів «ах ч«авї» додатисна ознака «йди 11. . «ФЕЯ» саримієказ Варіантві зЗалушии, маведлені Б послідовності, не є переважними відносно залишків, наведених в анотавіях для зварішнеиних паеложень" «0» 39 нів ві тах Віва без Аве АБ ії н «аїйх 40 «еиіїз «142 БЕЛОК хаії» Шеучна послідовні сте каш» хай джеерено «Ай3» тупу тихе про штучної Колі дОовионІжі: синтетизняй певтея «дО» «жі ВВРІДНТ «ака» 541.14 «Я» гани вв «ах «іх ВВРІВНТ «й 15..45) «ай3е заміна" и" збо "заАвре «ах «вії х Бодатезва ззнака хай (1. «а-ї» гпримітказ'раріантні залишки, наведені В дослідавності, ме є переважними відносно залишків, наведених й авотацаіяни для Беарвізниних поко ен" «Ф00х 85 чаї зів Туж Аїв зів Ріше Вжхоз ТкщвотТвК ї В
«ий» 8 «вії» 338 «йійх ВІЛОК «ії» Боте варієвв «00» 81 й1з ех ЖБх був Бі Бто дек уві Бе рхо їжа вів жо Зек Зах був ї а чо Кк ех ТнІ бек бі бін ТВх Аза дів пей зі Се Без Уві) Був дар отує
КУ З а
ЕВе ро бі; Бгто Чаї ТВ чаї бек Тв дяип деї біу від ец ТБ ЯвЕ 35 З 8 піу Таї Ніз ТЕ Бе РЕОо Аіа Уві Пре бів Бех Бек біу Бевз ТуХ Бек
За БО ївв беж бек Уві Чаї ЄТвЕ Уві Бго беж бек беж Бевз і ТВк СбЕо ТвЕ
КІ 5 Зо
ТУЖ Ії Су дяв та) бат Ніз Б РЕО ех Аза Таж ув Уві бар був
Зв ща за ев УВЬ Бо Вко Був Чек Сув йвробув їТВу мів тв Су ргто ро Єжв 100 ї05 115 ко вів Бжо Сів Бевз ви бі СЕУ Рео беж жі Бе рез Ббе рю ре 115 12О їж мув рхО Був др оїйк іш Меб іє бек дуб ТЕЖ вто біч Уві тТВЕ Сув 135 З 148 чаї уві чі дев уві деї нів пів двБ о ро Січ Уві хв РО АяпоТтр 135 І 55 160 тТУук Уві аю щі Уві сії Уві Нів ав ліз Пу« Тк їла рко АжЯ ші 185 іа їть їі бів Тух Аві; дек ТИЖ Тук Ага Уаї Уві чеж УВзі їз Так Уаї Без 159 їна 15
Нів'яї Вар обер ої Баоп о йім був о шін Тук Гув Су БУВ о Зві бек Бл 155 а КУ пуб лів ев Роз дів рез їіе Бій Суя ТК їі Бек ев йія Муз ЗМУ
В вій ай
ОМ Еко йкз бі рко вів уві ух ТВХ Без) обко го Зеш Вагя бій 5 ий Хо 848 8
Мес тт БУ ап бій зві бюжк їм) ТЕ Сув їз Уаі Гу пі ре ТУЮ 345 50 85
Бус сек Ввр тіж Аза Уві пів тир оЗ)ів Бех айви о біу бЗіп Бко бі: вда зво р та вай ТУЖ Пув ТЕ Тж Рго Вко Маї їв йяр бек бяр Зіу Бех Ве Ба 15 ав 285
Сх Туж Зак був ее) вк Уві йяю бує Бек дхч Тв зів бів бу Ан 295 ЗО таї Ейе бек Суб Бек уві мех нів Зі аіа без Ні вез нів тує ТЕ 305 Зо 315 З
Пій Іл бег їні Бек їж Бек рее П1іУ Був 325 336 «Зі» а «КК З «аій» БІЛИХ «вій» Нота варена «ОО» 45 дів Баш ТВ бує ан рЕз Бех Узі ББа ркб без із ко беж бек гуд 1 а їі ї5
Бак тк шежх Зіу Сі тах Віа ів Бе бЗіУ Су без Уві був бвротує о Кк З
Ре рус сів Бо Чаі ТИ Уві бек Тюкр Ав Бек бі Аїа ве ТВХ бак.
Б; ав
Зі зві мів их Бе Бкз Вів Уві зи Зій бек Зак біу їжа Тчуж Ба в 5 в їжи Век бах чаї чаї ТБ баї ко Зех Беж Беж ес і ТВ б ВЕ то т до
Туш Хі МУ Яви Маі йшеи Вів був РКоа шк Ана ЗБЕ був Уві Аяюр Дж 85 о «5 їтув Тві пі Бго Був бетх був дев Глюка ЯВНІ Ні ВЕ Сув рго рЕо Сув ї29 105 ї1о хо дів Бгто ща дів Аа Ві Біж бго дек баі КНе їви Бе Бк БЕ 115 1505 125 ув рхе ув ав ТВх пе) Меї Ті Зак Аке Твж Ро бі Уві Тк Сув 130 35 140
ЧУаі Уві чаї Аво Чаї Бек Ні Злий йо ре Зі Уві дув Бі ди ТЕд 145 щ5 і ї58 тук уаї йор ОіУ Чаї Сів: Чаї мів Аза Аза Бу Ту Був ко Аго бів 1655 їта ї75 біз сів тує Вп ожБек Те Тек бує баї ді Зеє Ууаії пе) ТВЕ бі Бен їв 185 їав із іп йо ТЕ а ев Б3)іУу Му бій ТУЄ Був Су пу ві Зек яви їа5 ри 05
Муз Аів зви вко йів ро ї1е СРО Бу ТнжЖ І1ює бах був Віа Шу ГУ
Му 215 і пів ро да біз ро бів уві Ту ТЗж їм ро Бо Бек ду бів піз ай а 45 240
Мас тиж Ст ашл пів уві Бек ва ТВ Су бе) чаї був Беу рив ту 245 ай з
Бго бет зво гів Аіа туаї сів тЕжр о бів бев дяй пі сів Ржо Зі дах о а ай вв бух Був ТБ ТМйжЖ РКО Кто Уві Пе» ляю Бех вар піт беє Ре Ре
РН ав ав во тую Бек ув Без ТвХ чаї Аве був Мак дту їв бів біп пі ВЕБ шо дк ЗО чаї бе бек Сув беж маії Мес нія пі дів я Ні Ав Вів Тух їнЕ
ТК 318 ЗВ Зо ів цув Бек їі Бек Із) бак ра бі Був за 438
«ак 43 «еаВіз ЗШ «иа ВІЛОК. «Зі3» Шо арія «ад ЯЗ
Атго ТВк Уві Аза А1а РюЕФ бас Таі Ре іє РВе Рко РКО ех Аве ПТО
Е 5 10 15
Сіп рез ру беє біу ТВ Аіа Шех уві чаї Сув їжу Бей Ап оба БЩе 70 25 зо
Тук РкЕО Аха сіє Аз Пцує Чаї бій ТЕО Бу Уві АБр дав Аза Бей бів яв щі 45 бек Біу Авп Щек сів бів Бек уві ТЕ бій біб йшр бег був Авр Заг ще 5 в
Так Тук бек їв бет бет Тйт пен тТнт ей бек цув АїВа дДЕЮ Тук бів а за те во цув Нін пує уаї Тух Аїа Сув Сіш Чаї Тнг Нів біп З1у печ дек Бек аб зе руо чні ТВЖ Був Шек Кіе Авм дея бі б Су тав 105 «З1йх 44 «Влї» 305
«аж БІЛОК «аійх Мото «ареувлє «пох 4 зів во їж віз від БЖО Шек Уа3 ВЕ Бе; Ве Без р Зак Беж є ії З 18 15 піз зе; біп ліз ап обу вів Вк їн Маі Суз пеш іє бах аБв вве о КА За
ТУук рРЖО біу віз туві ТВ чаї Аїа то Сує аів дер беж Бек рхе чУді за що а їув віз пі Заії піз Твк ок пт ркз Бек Був Зі ех Ав ЗвБп о був ще 55 БО тТух йіа Лів щаж Бак Тух без бах бен ТБх хо діє біб хр був ВЖЕ ве Би те БО нів АкЯ бек ТУуХ Бек Сув ів Уві ТВ нів іо бі Бет тво У сій не Зо же був ТК чЧаЗ віз вх тпЕ осі Су ВеЕ іс0о 645 «їз 45 «ЗБЕ» Х6 «аж БЕЛЮК «ії» Нощо варієвв
«й» 5
Сув Зіу дів Бшо ек Ту біс: Меє бів ЗХ) Авр о сзУу Мі Ату був Сув ї 5 ях; 15 «Важ ве ейіїв 350 «іже БЕНЮК «вії» НЮОЩе зарієва «щі» 4В їв бів біз був бує біу деп Тук Уві уві Тйг Аве Ні бі беж Сув ї 5 15 ї5 уві вка йіа Суй Сіу А1а зво бек Тут Пів Меє біз ОЇ Аве Бім уві зо 25 30 вкчЧ був Су ув уз Ст щі бі рює СУ Ах Був УЗ) Су дав Зі
Ка КУ ав
Іїв шЩіу ІЗе піу біз Бе Був Ав бе ев о дек ІЗе вв дів ТВЖ АВ я 5
Ііе Пує нів Ре БУ АнпоЄчя ТБ бах бів бек бі йяр бе: нів Ії 5 то а Во бе) рто Уві дів Бе вата біуУу Авр бек Бе тТВвх Нів Те РТ РЕ Бе в зо 5 вАво фо бів ла бе; АБ Хі Сей Бу ТВх Уві пув бій їі тв о сіУ 105 1055 113 не без бою Їзе бів віз Тхр охо 515 йвп о Асч ТБ двр ей нів А1В ж 158 ве зії аа спец бів Ба їі дЖч Бі Аж ТЕ Був бів Нія бі іл із 135 346
Бае бек ев Аза Уві Уві беж рев дез Ті ТУ ех без .ЩіУ ев деЗ 145 58 155 169
Бек Беж мпув Сів тів бах вЕр піж ав; чаї Іі ї1їе Беж сіуУу вшМ Був 185 ї7о 8
Аво Ба: Сув тус Кіа Аеп їМЕ хів Аво тТтр був був Без вне с1у тах
КО їй Мо
Бех Біт бів Су ТВЕ був Хіз їі бек ап аг ці бів ввп о бек був 155 2 Кв їже Віа твх бі бів чві Су Нів Авіа мн Сув чає Кто бі Біу Сув 51й А ЖИ ткЕв сіУ РО піз РЕО йреО ар Сув Уа Зех Сув дкз дав Уві бат йхй за 230 тав о іт вха піз Сув Уві вар обув Сув ап обес без Біб 0біу «іш Ре дЕщ па как 55 пи Бе ті Січ дай бав Яма Су хів бів Сув Нів вро б Сув й ей а БЕ
Вко бБіп Атїя Меї Зеа ї1в Бех Су ТЄТБк ціУ вка ау Бк ДЕ Авий Су хі за а
Ії піп Сує йій Ні ТУЄ Її бр Б3Уу БЕО Нів Сув ві бує Жвк СУБ а 235 ЗО
РкЕо Аів бу Уві Ме Бі бу АБИ да ТВЖ о Бец УвЬ тре був Тух МВ
ЗО5 315 І За
Авр Аіва сі Нів Чаї Св Нів Ов) був ів ра дав Сув Тх бук 1
Зо 38
Су тк бі рго 01у й бій біж Су Бгто їх дяк піу Вго 38 45 35 «ій» 47 зії ЕВ «азам БІЖИ «ії» Мета Барієвв «МП ГУ
Мек Ат БКОо Бек мі ТВЕ за З1іу віз Аїв її Без Аза бе баз дів 1 з іа ІЗ діва ви був рто діа Бех аку із без Бій Сі Був був Уді Су ОІВ 2 25 за діт Тйх Яех вай ув пео та пів їв б3у тТбж вйе 01 вав Нів Ба 35 «о 45 їев бек їви бів аку Має Ре лаяв дя СУ сі Чаї уаї без біж АБ
БИ БЕ со їв: Біо бів Тк Туг Таі бів аку зви тує дер ви бек Ре Пец Був 7 75 ва тн їі бі бій Уві віз біу Тух Уві Іляї тів Аїя би Ав ТЕ Уві
Вк, БЕ 95 сів жа тів во Без бБ) двтВ оре; Зіп о їі їі Ага Зіу веб Меб тує 100 195 116
Жук Зів Ашп Зет Тух Вій йо дів ба Сей Беж дз ТУ вер дів йо 115 148 138
Був ТВЕ ші Бев муя палю ей Все мес дж Дно оїжеаз піп ЗіБ Ті Бех 138 ві 150 ніз і аа ма джу БВе йег АВ Аяо Бго Аза без Су Ай Уві 15 ї48 ВО 155 ів
Бех їіз бів ТжхЮ АтЯ Анр о біє чЧаі Зек Зек Ар БВ цем бек Авт Мак їО КЕ
Бех Щеї дже Равз сій ва нів ре) біу Беж Сув біт був Су бр рко 1850 В їз
Бек Сув рго Ав біу Бех Сув тс» зі діа сіу Бій біз яви Су СК 155 Кг! «95
Пн ої; тТвЕ Був ків Іі Сув зів зів о сіл Сув Беж бі Ажха Сув вЕЯ
КВ) ії ша сь Був шщех Ко Зк йвр о сСув Сув Нів аБп бів Сув Вів в3За біт сСув
КУ ий За ай
Тк слу вхо вах Зі ес ашо Су Сб ві Суб йке Був Баш бге ва я Й Ух біз вів жхкж Сув їувє Авю тиж Су Бто вжО Без Ме Се) тую ав Вко
КЕ 28 я три тож тТух бій Мебї бар уві давп о рко біс пЕу пуш Тух Беж Епе 01У ат ав ЗВ ів Тіиж Суб Уві був Пув Сув хо дха АвВа ТУЖ Уві Уа тв АвБр нів й 35 хо бір бек був узі вхо авіа Сув спі Аїва авр беж ТтЖ ЗБ Меб ів біз 305 КН: ЗІ З
АвБВ о іУ та) бхщ МУЗ СУв Був цу Сув біз зі БЕ був ку був Уві
За 330 35
Су Збшп ЗіуУу їі у ті бЗіє бів Бе бух де Бек їх Беж Хе дев 34 345 350 дів те Ап жів Був нів Ре Був Зайва СуУув ТВж ЯЗех Її бек бат дяв 35О за5 ї-с: Нів Ті ге) Кхо Жві бів Бе джо бі двр дек Бе тТвх ів ТЕ 335 зт Зо
РХО РО і йно РКО ік біз їе йшро їі їз був їж Мві був ів це КН за ЕТ
Їїе Тк бі ББе їво Пец ті З505 йіз Тер Бхо бів вай Яся ТВг Ав ах СУКА 415 їви Ніз вів Бе За ай Сеє біз ї18 хіє де пі ака тТВЕ ув пів
ОБ с с нів 0іУу бів Ра бек без дів чші Чаї беж їли дей 1 ТВх Чеїх ев жі 3453 445 біт їве йо ех бер був бів бів Зех Аа 0біу вв За Хі Ті Бех 453 455 Бу
Сіу йяюм Гуз бат Беч су Ту дія айви вк Хієб аа ТЕО Беж бує ев 47 ат зва тва Бі тах Зак біх бів був ТБК був хів їі безе лю ака бі піц 485 43 5
Звеш Бек сСтею бев вів СБУ Зі сі баі Су Бі вів пе; Су За рев вза ЗИ 5ій
Зі ЗіУу Суя ЖЕрв ошіУ тжто біз вта ву вБО Сув Чаї беж
ЕВ 58 ва «Бе 48
Мій зи «ші» БІЛОК «ВАХ» гучна пеоплідовніствь «ай» «вай двжрало «аж» примітка соспне штучної послідовності: сннтетизний вовіденених «пом 48 біп тбаі зі Сею ев бів Бек біу ко пі бев тузі ЗіБ рЕе бек бів і Ба 1 35
«зу ев Бек Тіє ТЕ Су ТВ уеяі дек б3іУ Бе Яер їв тиж ав ТУЖ о 25 36
Зі баї Вів тр Уві Ако Бі Зехк ро бі був ЗіуУ їв Щ3іб ТЕв ей 35 ТО 8 бЗіт чаї тіє ТР бес 3у пі Аво тах Аз Тух Аве таж о вКо Бе тах
КО же. б
Бех йжц їні Зак Ї1е Ав Буш Авр ба ках Був дек зів зві Ве рве в То В во
Сбув Меб Як Зек пе із бек дя жо ВХ Аза їів ТуУуЖ Ттк Суж ВІЗ
ОО Зк дкЕш дів Бе) Так ТеЖ Туш дЕЮ тТУж ім РБе віз Тк Хр бі б обі
З НЕ 155 315
ТІ їм Уві Тк Уві бек фа дів Бех ТЕ цув біу Бо Жак уаї Ра 115 15 135 тжЕО из; Вів хе Зах Бех був Яйшж ТНЖ Зак бЕу зЗіуУ Тйж дів віз ад 138 135 158
ЗіУу Сув ім Уві Був Авр от Беж ржо зЗіз вхо уві ТВ Укі Чек ТВ їх ІБ Б ї5а ан: Зах пі вія без ТВ бе Зі Уві Ніз ТЕ кЗе ро йзіа УВІ Бе 1655 175 МВ
Зій Бек бек піт без ТУР бес пе) беж Бек Уві зві Ве Уві хе ще 180 185 1988 дек бек їж бі ТНЖ бів Тв Тух Хі Суб яп Уві йяп Вів Був БІО 155 а а
Яес ВБи ТВх був ЗМаі Вар обу ге Уві біз Бко був Вехк бо був Я
ЖІ КН аа
Су Бр їув Тк Вів Тк Ся ко Вто Суб Бро бі Бгто Лю фета Бе а 30 235 40 діУу ЗіУу Бо бек у Бе о Ве Бхо РКО Му Ре Бу дер тТйаж ев аа Б 5 мес іє щек аж тих РО Бі Уві ТВж Стув таз Уві Чаї Авр заі щеж
ЕВ 25 «т
Ні Зів Аве Ртха бій Уаї ГУ бне йвя бтв о тТуУук Уві Аве» йіУу Уві 1
ЖІ ав 5 тУаї ЩБів Ап аія Був Те їУуя рко Ахш 53 ів ів ТУ ла бах ТВЕ 298 а З
Тут Ах Уві узі Яек Уві Її: ТОЖ узі бер Нів біп Авр отже Бе; Ав 305 за 35 за іт Був дів бує ув Су був ЧЯі бек вав бе Дів ви Бк іа та 355 3380 3135 їїв бій їй: Тк Хі Зек цу дів Був Бу бій Бко йга біз бто бій 340 365 ЗО тУвЕ беж бмпжЕ їм) Бе Ббхо Зет вх дн Січ Бев о їне був дат БІВ Уві 355 їй 365
Яак ге Твжх Сув Бе Уя1 Му 2іу Бе Тук бто Жак йнр о Т165 йїа Уві 37 Куй Зо піч ТЕО Пій Зак бшиа бі бій ФК біз Ада АВ Тек ув ЗБК о ТВу бхо
ЗВ 3958 395 за
РЕЗз ві Мей Аве Беї Вр 0іУу Бех ве Ра Бей ТК Бех Був м ТЕ па 318 15
Чаї вв БУВ Зах Вк Жтройінй Зібв бі двб зві РБе бек Сув бек маі 850 25 838
Має Ні бій Аза бе) Ні деп о нів тТуУх Тк Зав БУ Бех Ше; Зак Се 440 445 шеж вхо іх був
ЕВ) «Вій» 45 «иїії» 514 «Вій» БЕНОК «Між» Штучна послпідсовмісте» «ВД «иЖїЇ» джерела «Хі» «примітка опис штучної послідовності: сМмитетичний поліпептид «40» 49
Вже біз іш без ЇТВк Зі беж Бк ЧУаї Ті Без бек чві беж Ех бІУ 1 5 18 15 іх Ахч Чаі бек БО Зекск Сув дез Аіа пек бів бек тів бі так ав 5 зп їі нів тже ту цій зів аж їв АввобзіУ бек БК Ат ізн би Се о 45 їув бук ія Зак ій Зек Хі Зеюк 01уУ ЇТе Бк бек ку БНе Зак бі во 58 й дек щі бек бі ТВж Аве рае Те Без пах ї18 Ав чек уаї З3в бек 7о т5 во
Зіз йяюв їі біз йо Ттх Тжт Сув біз йбіп АБ АБ дви Тквр Вко тВЕ
ВА За 5
Чек Бе бі Аіа ЗіуУу ЖЕ був іа 01 ев баля йеа ах Маї йів Віа
З 155 Ж
Бко дек чі Ре Ті Біеже Рхо Ро Бех бер бів За їн. Буг беж ЦІ Ж 115 120 125 їй віз бек чні чві сСув ев бе АшИ Авіа Бапе Бук Бже Аж біз ДЕ 130 135 140 їх Уві сію ТО Був маії вер вав Аів а 1 ЯЗех бі Аве явж БІВ 345 ї150 155 1650 бін Бех вії Тв сю бій дев бет Буш Ав бек тах тує Бет Бей бЗег 155 ї170 175
Бет ТЕ Ге) ТІ іо Бетї Буш Аза дю Тк Пій гув Мія Був туаї Тук
ІВ 5 155
Ата Став бів мМаі Тек Нів бів сі бен бек бек Вуз Уві Тв був беж 155 ЯЩ ап
Зва дни Бех Сі дій 16 «ів» 50 «ех 115
212» БІЛОК «вії» ЕВУЧчЧНЯ посліді ств ек «жі» джерело «ай» /приміткажсютиєс штучної послідовності: сМнтетичний пелідепйтня" «й 50
Зійш базі бій без бів Бі Зек спа ркб біу їжа Уві Був вхо Беж іп 1 5 Хо 15 їнНЕ цей аж Се ТВх Ста Так о Уді бек біу ТУК БЕ Тіз Беж беж АВІ
КУ З 30
Бе діа Ткр Авп ТІр Ї18 Акч біл овге фго біу їув біу дей їй тр 35 С: а
Має віт ТуК Хбє бах Тук бек шШБуУ ляи СВЖ й Тук Щі)0 КЕО Щек Пи ве БО тує пек АтТЯ Іі ТИЖ Іів вк ВкЗ Авротаж беж Був Ас За Ба ве
Бе та т ВО
Без му сей дей бек чаї тп віз Азія дер ТВ дія Тв Тук ту Сує 5 зо зв
Уві Їх Аїз сіу ака сі Бе рез ТУЄ Те бБу біп Шіу тБж Бей уві 100 105 1 та уваі Беж Бе «ік БІ «її» 10 «ій» ВІН «аі3» Штучна послідствність «й ЦО» «із» джерене «ай» гприщієткає"СмІс штучної дпосліловності: сентетичний поліпептни" «ВО БІ вар іє Зішв Меї тТвжх бів беж рЕо бек Бак Ме: бек чаї Бес чаї БіЖХ ї Кі їс 15 вч ато Уаі ТІ ї1ієе ту Сув нія бек вет біт дяр Іі Бех Бех вяз
КУ 25 30 їв; Бі Ткроїєз бію Бій Був Бо іш їв о бек біше Ідля ім Тюрі Кіа ай 45
ТУух Ні Зі йеж Ав їжі АвВО Нів 21у Маї1 Рко беж йку ВБе бек Сім
БЕ їх БІ
Чек Зі дет пі Тк йБоб Тут Тит Бе о тнж Ії6 Шев Зеб їн бію Бко
БА та тв во із Ар Ра яів ТЬт о Ттє Ту Сув Уві бід Тек двр бів Бе вро тТко 85 за За
ТІ Бе бБіУу З31Уу біу ТВ був Ббев біз її Був 150 105 «Ж ВЕ «ії Х1й «ві» БІНОК «13» Штучна послідсвність «ий чад Джо «вві» /примітказ' спис штучної послідовності: смнинтетичний поліпептид" «аж БЕ
Зіз чві ща Бей бій біз бе щі ко Зі Гей чаї Бу вКкео Вех Зів і 5 ЯЇО 15 тТВж Бек пек беш Так СУ ТОЖ Уві бек сіу ТК Бе» ті бек йка аАвЕ а ша З те йів ТЕр ваш ТЕр хз дгч сів рЕб рко Сі ув сіє бе) біб ткр ке 4О 45
Має ці ТЕ КІФ бек Тк бек біУ йяв Ск йку бух біп Рго бах Бей 5О вк в
Гуз бак дкЕч Гі ТВу Т1є Бех дхЯ4 аБе тп Бех цу два бів Бе Бе
С ТЗ а БО
Те цу рей лез Бек зві тах дів дія вв Таж дів ВЕЖ Ту тек Сув
ІК ТУ 5
Уві Ттвх Аза бек аж З1і1У Бе РКО ТУ ТЕВ 51 бій БЕЖ ТВЕЖ Го Уві 150 105 їі тв Уаї ее беке 135 «а» БІ «її 3 «віх ВІЛОК «еіїз ШккУчна послілевність ж ох «їі» дюередя «ваЗ» гпримітюаж' Опис штучної послідовностік сМметатичний полівеленя" «800» 53 аа тів Бів Мек твх іа бек вЖОо Бек ет Меп бек чві Зв Уві сіє ї ї їй ї5 зар Агу Уві Тнк Ї1іє Тню Сув Нійв Зак дет біп Яр ої1е йвп оЗех вп щі 5 а
Іів зі Тв ев Зі біза Бу хо бізк бує бек Ре фев У їли ЖМе 4 й тТУух Вів Бі ТнНж Ап оїєеи бар одяр бі Уві Ро Беж де Ре Зак Бі
Бах 55 БО
БЕШЕ бЗічу Зехт біу ТВі лАяроТутк Жпк бо ТБх Її16 Зег бек пев біл БРкб 85 то 75 о ої) АВ Рпе Лів Та Тук Тук Су зві Зі тух ів Сів ве РЕб тЕр
Ко вх 95
ТЕХ рве піт» щі 01» Твх буяє пев сім ків губ іп 105 «і» 54 «ії» 115 «із БІВОК «іі» Штучна послідовність чик «вії» джевело «ааї» л/приміткає"ОписКштучної послідловнкостії сяинтєтичний поліпептид" «400» 54
Сі уві сіп без бін біс ЗекК о біє Вооз бі їжи Ущі був БЕЗ Зек зів ї іх. їв 15
ТВг Без бек Сец; ТЕ Ст ТЕ тТаі бет біу Тужх Зак Кі Віу жа АБр жо жа за тЕмНе Аза Тжф Авпоїкю» ЇЗв Аке Ей Вжо реко о сС1іуУу їв Б1іу Ббец сід тжр й аб -іУ Тух її ек Тук Вп оЗ1У АБ їБЕ ве Тух ія БЕ Зв Без
БІ 5 о
Бу ех йо їЗе ТВх їі Чех Вкч йаю їж бех Був ба бів ж пе зо за ВХ іа Був би ше Я-у Уві ТБ вів вія йер СЄБжЖ о Аів Жак Тук Жую ув
ВЕ За 5
Уві тк віз Зех вху біу пе рЕЄ Тух ТЕроціх зЗіп б3У ТЕ Бей Уві їща 305 ії15 тн Уві Бек Бех 345 «ВАМ 55 «ії ВЕ «ті2» БІНОЮ «їх Штухма послідовні жимі джерела «Ех пені Емі ЦКУ чНеХ послідовному Ю:І: смт чме пихлідвентьих" аж в вв тів ій Меї ТВж бів бек фко Зах Зех Меє Зех чді Бек уві Щі ня а їіЗ їз ше Ак Уві ТКБЕ їзе ТВтІ Сув Ніж Жехс бек сію АБО СЕіє ТЕ ТукК дяд
Кк «5 5
Тіз ці жо» ев ОІВ осів бу рко бі Був жек Бе ув О1у Пец Ті з чо Ж їук ній біуУу діа АБ без яв ваше ау Уві Бо беж вка Ббпе бек біт й 55 А
Бех ПіУу бек Сіу Тлйт Вир о Тук Тйк їша Кит їі бЕБх Зек іс б1в БЖ» 7о 5 ЕВ!
Сі); вв обвБе діа чу тує Тук Су Уаї ЗіБ їУЄ ев Зі це Бо ТВ чаї ЗО Зк тих Ра ві зіуУу Біу Тж бля їм: З1з ЇІ5а Бу
Іо іп «ей» б «Вії» 115 «їй ВБЕНОК «вії» Штучна послідовність» «Я» кий пжеарнахли «ваі» «пюмміскажх олис втучнех послідовності: смнитетичний поліпененя" «ЩО» яв пі Уві бів їви біл б3з Бек Зіу Рке піу цец чаї Був РКО бек бів ї во 10 15 їх Ге дек ето Тк був їТйк Уві бек С3у ТуУє Яак Її піу Був йар
Ж 45 Зо
ЕцБе діа то вав Ттже хЗв дКчЧ бів ро Рез бі Був піт рей бів то 38 30 й5
Меб йпіу їТтук їі Зет Тут Дек йіу дяп ТвЕ Ах Тук ій ко бах Гей 53 55 5
Був ек лу їі ТНЖж о їЇ1е Зв Аку бар ТБ Зек Був йвп бів Бе ВБа да 7 75 ВИ їй їуж Їм» яю беж чаї ТнНж діа йАїя бек Тк йів ТК Тух Туж Сув ва зе а чаї тв діа Беж ахч біУ ен рге тУЖ ТЕВ бі зів пі ТВК бяза Уві 1 ня 113
Так Уві Чек бет 515 еаійв 57 «Лі» 187 «віх» БІЛОК «из» Штучна послідовність «Зах «иаїх кер ча» «примітках Ориє штучної послідовниссті: снинтетичний поліпедтня"
«це У
АвроІїе біп Мес Тнх бів бек Рко бек Зак Меє Зетгх Уві Зех чаї Фу зво аха чаї Тйх хі Тйж Сув Нів бек Бек бів Ар Іі Тік Тук Вп за 5 з
Їів 21 То йо бів 003 Був Ро 91іУу Був Бех Бе пу і Пе їв за «й я5
ТуУк нів ПкЖ дів вай Без Бер лер Чу Уві рхо Бек йга КВе бек СТУ ща 5 що бек п1іУ бек Зіу Тк Аве тую ТВвх Пец ТЕ Тіє Бек бек Геч Оїю Бко
ЕВ ме ЩЕ во
Пів йвроббе дів Тнх Тух Тук був Уві біл Тук Анр бів Вбе Бге їЖВ а5 зо 15
Тне Ще Бі бі 035У ТК був Без Щі: Ї1е БУ ї0а іп «із ЗВ «ії» 116 «їй» ВІЛЮК «ИАЗ» Штучна послідовність «Й Ше
«ві» джередо «аа» «примітюваєе сис штучної послідовності: сивтатичниМй поліпептид" «а» 58
Сів Мві бів ей біз Бій бек СЕУ ВкЕо біт Їхні Уяі був БтОо бек БЕ ї 5 МО 15
ТвЖ нях беж Ге Твк Суб тлх Уві бек щі» Тук ех сіє Зішж буя Авр
Ки жа З
Те із тр Ана тк хів ака бів РЖХО ркоа сі Був йпіж ев СЕ тур 48 З 45
Ме ві Туж Кі Бек тує аБИ Біє ши ТЕ Аа ТУук бій Ве Зек Бель виш їв бек вже їїе Тйх їіе Зах бгеа Ар о ТвВх бе був Ав обі Бе Ве ща "а 75 во ївц Був ер Ав обер Маі ТВ Аза Азія Авв о ТАКЕ вів Таж Тук ТЕ СЖВ 85 В ЗЕ чаі тТНЕ Аіа Зек яке іт гей ро тТухХ ТЕ БОЇ бій піжж тТвЕ пе хаї
Об їп5 118
ТЕ Уяі беж беж
Вик
«їй» 5 «віїв «вій БІЛОК «їх Штучна послідовність «ЯМ» «ай» дювреле «За3» "примітка" опис штучної песлідавності: сеететичний поліпептий" «ах Ба див тів пів меї Тнх Сів бек рго Бех Вау Меб бек ча) Беж узі Оу 4 В 10 15 ване дкоа чаї Тв тів тТвк Сув НібБ ат Зак бів Фр Ка ТВЖ КУуж Ав а Кк за чаї бі ТЕр Си бій бів Сув Бтго балу Бує чех ве бує бі їв т1є 35 о 85
ЇУЕ МНів Бі Бек вав їні йно Нів Сіу Уві рРхо Беж ву Бе Бек У ва НЯ. БО цех пі бак пі Тк явр о Бук ТЯ Бе отнж тіє шеж Бек Пап осів БКо 7 75 Во піз Вже Ре ліва ТИЖ Тук Тук Сує чаї СЬьй Тух Аво АЕе Епе рЕо ТЕО а зо 5
ТІ Бін є) БІГУ іш Тк Бе ої 1. тів ЕлУв ї00 185
«М» БО єЕІ1з ї16 ій» БІЛОК «аз Шеучна послідовність «В чав дешраено «аз» лпримітказ" Оопно втучнОЇ послідовності: синтетичний поліпепжнаи" «абз» БО
С;плочуаї бів без бів бі бвж і Вко бу без уві Буй Бто Зах бів ії 5 Іо 15
Жнж без Зек без ТЕ Сув їх а3 бек Зіу Тук Бех Тіз ПіУ вву ве 20 25 30
Бе вів ТЕр йзп ТгВ тів КУ Пій РЖО вЕКОо і їшв У ев сів тТтв 15 Ер: а
Ммеє піУу Тук ІВ Бек ТУух Бек бБіу дви ТІ жу ТУкК іп Рг бек и
Б ща БО
Бу Беж Ак Бі ТБЕ зів о баж Акш Авр ТЕ беж їв яп обів Ре Ре 7 та во їз Був без Авт Зек Уві їв діз Аіа аю Тих дів ТЕ ТУХ Ту СуВ 5 в Зв чаї твх Аа бек важча бі Ре РЕо Тух їжи БУ біп бі ТВе їм чаї
МО 105 115 тиж ак бек бак 315 ей» БІ «вії» 3 «їй БІЛОК «і3» Штучна послідов ють «а «аа джерело «аа» гприміскаж"Онис шеранеОї послізовновті сивмтетинней поліпеття" «ОО» Бі вяр І1е бів Мес твжх бів бек Бко Зет Зеїх Меє шах Уві Беж Маі щіу 1 5 10 їв йвр аж чаї Тйх бів ТЕ Се Ні дес беж біб зар ліє Тх Тує Зав
КО 25 ЗО чаї біуУу Тв їв Сівювй біб Був БЕОо сіє буя ет Бйае був ОЇ ГП їїа 35 48 с тую нів бі бек Айва Лев Ав нів Зі Уві Ре Бек АКОо ве ех 03У
БЕ ви
Яет бі Зек бі Ттвх вшротух ТВЕЖ Пео ТНжХ хів дек жЖек ша ція РЕ
Се то те о бі: ав Ре аія Три тую тує Сув уві сіп Тух Ар вБр Ре Рко Ткр да 5 35 їВк пе біу Ш3у сі Жвж 3 би б1ю кіб Був зав ї85 «Ві» БІ «иії ЦЕ «Вій БЕНО «жі» ЦЕвучна поелідевність «аа чжеївк ржереляо «Іі» гпримітка Опно штучної послідовності: сннтетичний поліпептиде «й ви пів уві піп дез сій бів Бек біж ро 01У пеи уві цув рто БЕЖ ОЗ
Н 5 18 5
ТвкЕ їі йех пе: ТВ Суя Так уві ет біу Тут йех Її піу їув Авр зо 25 зо
Рве аіа Ткр деп ТЕВ її Ака бів Бго РКО біу ув Сіу їн біз їтв «о 45
Має сту Тух Її Бек Тух Авп біт Анп Тк джу тую бів вхо бек цем й 55 ща
Був Зак ако їїе ТЕ їівс бек Аку авр ТЕ Беж БУ Аша З впе Рпе
КО т5 ВЕК ївм Су Їж Ан ек Маі ТВ дів вія Ар ота Аів ТМ Тек Тух Сув
КІЗ. 5 чаї тп Азїа Звк ах бБ1іУ Бів Ро Тут Тк Бі бін зу ТЕ Пец ук
Кия 195 Во то чаї «ек как 115 «ех «3 «із її «ийах БІЛО «У» реужна послівсвнікь жах «Вів джерала «ай гпримітках Оперс втучної послідавнеж: сметани леліпенйтиед" «ЦБ» Бі ави тів іп Ме їй бів Бех Бко Вес Бек Ме Зак аі Зак ЗАЗ СЬУ 1 5 16 15 дар дк аі Тв їі ТЕ СуУуз Кі Зек Як бій а Гі ТВЕоОтТУЮ дя м 5 3 чі ж Жежк Їїняї іп бів був бко Сі був бдех Ре їде біУу Бевз тів ї5 о 48
Тут Нів йіу Ше зни Пе вро нія піт уві рко ех йкчЯ Бе Бех 1у ща о
Бах піуУу Бех піу ТВх Авротух їМкЕ їди ТВЕ їЇїфа бек Бек ев Бій вКо ва т 75 я цчіз дво Ее дів ТВ Тук Тужк був Уві сів Бук дя; др бе рРко ТЕ
ВЕ Ж я5 тТвЕ ве пі ші Біу тк був зи біб Їія Був іп 195 «й ва «ЗБіз 115 «Вій» БІЛОК «Кі» Беучна послідовність. «ах їх «ії» щжеремеа ха» гпоримітшаексиюо втичнеї поссвідсовності: синтетичний поліпептид «а: са ті Чаї бів ії) ів Біо Бек Сі Бо біУ бев о уаї Був го бек цій ї їЖ о 15 тож рей Бек іні ТИХ Суз Так Ті бек 01У Ту беж її Заг два дЕр кю а ЗО
Ббе діз Тр вай ТЕр їі ак 03 Бхо РО піУ Був ОіУ ев шьи Тр 35 ай аа
Ммек піт ТЕ с1е Бек ТУЮ Був Зі яв ТбЕ ач ТУЄ б рЕОо бек цей ка а во
Був Зак Ах 36 ТЕ ї1а Зеє Ах бар ТВ бес був Ва бі Бе Бе 55 7 т ВЕ іец був їжі Ба бек Уві їТВх 318 Віз абр ТВху Зів бу Жук Тк був за 85 тії ТЕЖ Аза Бех ку біу Бе Рго ЖЕр Твв бін бій Б3У ТЖБх їі Уві
ЕВ 115 118 тТнЕ чі Беж бех 115 «ій» Б «аа ЩО «дій» ВІЛЮЖ «вії» Штучна послідовність шк «їв джерел» «і» примітка ' Орис втуУучної послідовності: симтотичннй поліпевтий" «ВВ» КВ и їі біз МеЄ ТЮх біп Бек Бхо бек Зек Мей бег Уві бек уві Щі ї в їб 15
Аяо Вко чаї ті ї1е ТБ Суд Нів беж бек Ел дар їі бяв бек й о 5 й їів і Тор Бей біо бій Був ко бій бує же Ре ув Зі Мі Їїе 33 5 жук Ні 03уУ ТВ АХ Се Ар Алю БІ Уві ко бак ака Ре Яею БУ 5 5
Зак 01» дак Бі ТИХ Вер ТУК ТВ Без ТЕ Ті бек ЯвЕ без іп РЕ та КЗ 5о пів аяр те іа ТВ Ту Жук Суя ві бів тТук ів сів Вб БО ТЕЕ
КЗ ЗО З
Тк о Епе Зіж бу ЗВУ ТОЖ Му їммі іш Ті Бує 185 Зп «Щій» 66 «ії» 116 «йій» БЛЕК чаї Шекучна послідовність «Ех «айім вжашале жа гпримітках опис штУчНОїХ послідовності: снитежичний поліпи" «й» ек
Зів уві бів ма, чів біо чех ім РКО біу Без чаЗї Був ЕКО БЕК бій гі сі 10 ї5 тиж І Беж Бе їй Су ТВву уві вк бі Бук Звжх т18 Бак Зак яр за 5 30 тце Аза ттр яви Тхв Ії Ак бій вхо РКО бі БУ ЗіУ Ба Біч ТЕО ї5 4 ї5
Має біу тТук сіє Бак Таж Бек бі де Бах АЕч ТУ ЗІЗ Бк БШЕ БО чо БВ Бо цує бек вхо ті ТВ їі Бак ач Аве Тих Бек У дв пів Рбе РВЕ та та во іїєи ув бес йшп дат Уві ТЕ вія дів дер Твх Аа тТВХ тТУуХ ТУЄ СУух ве за як чі ЖЕ дів Сі Атч бі ББа вхо Тк тер обі сів бі ТВ Бев уві їй Ма 116 тТВж сві Бех бас 115 «Ох В екії-» ШТ «йіжв ВСЕ «Вії» Штучна послідовність
Бе «ваїк джерело «иа лпримітназз снис шучнаї послівовності: синтетичний поліпептид «00 67 двр сіє зів меж ТБх сів Бек Ро бек Бех Мах бех Уві Бех ві СБУ і 5 18 15
Ваз; ажа Маі ТИЖ їїіє ТВХ Су Нів бек Бу бій бр о їі бвп о Зак Ав жи 35 30
Тіе щі Тк без Біп бі Був ко біу Бу бек Бе був бі бе Тв
Я 45
ТУЮ Нія Зі» ТК Ав паб дае АБО Бі Уві го Яву дк Ра бек Пі
Бе є
Зех Сіу Беж Сі ТВж Ар тую Тих рео ТУ хів бек бек пев Зі ре ка Я т БЕ дів або Бе дів Тк Тук Тук Сув маі бів Тук піз бій ве рко Тев 85 За а
ТЕ ва му сіу СіуУ ТБк Був бОещ Бій їзж ув і08 3105 «их БВ «ії ЩЕ
«й1йх ВІЛОЖ еаї3» Штучна послідовніств «Ва» иі» джере жа грін ниє меучної песліденвноюєті: синтетичний поліе л "и «400 ве бій уві біп пн піп бі) бек біу рко біє гені чаї тує фВто пеж бій і 5 ЗО 15 тТНЖ їви Беж ре Тк о сСуюв Таж Чаї Бех Зі Тут Бек їі Бет Бах ЗО
МТ 45 ЕТ
Ева Аіа тЕр оЯдп тТІр о тів аг біл Бео БО біу цуя З1у Гямі бах ТЕЖ 45 40 45
Меє Ші1у Тук І1е Заг Тух Яег біу Авпотітх Ак Тух Зі рко бек о пез віх ую Бек ажа ї1їє ТЕ їіє Бек дач АВо їТйх Беж Був вам осі ев Ре 65 та зх ЕСВ
Ія-зв їж ев деп бет Уві ТБЕ вів ліз аяр ТНЕ Аза Тв бук Ту був 85 БЕК ЗЕ
Уві тк Аза бі Ажча бйіу Бра рко бух Тткр обі бів 19 ЖЖ пе: уві 100 105 110
ТНЖХ і ек 8еж лм «105 8 «11» ЗП «дій» БЕНОК «ії» Штучна послідовність «й» «аз» дже «Ва3» лприміткаж спис штучної пОСсліЩОеВНсСтА: синтевнчнмй пелітентияе «йо» 89
Аве ТТе бСтд Мес тк ші Бех рт Бах Беж Ве Бек Че бек чат сті ї 5 іо ня аАБИ гу Уаї ТВЖ Їїте ТВ Сув нів Зо Бу бій Яви Еіз АБ бек Баш
ЗЕ а 3 аа Зі Тер они ій Зі Був вко піуУ Бує Бех Ра Суд ЗіуУ їі Кі
ЗВ ж а
Тут нія сту Кіа яви Ін; Кія Вяр бі Уві РЕЖ ех Акч кПа Бах біу
В БЕ бак Зі Зет З3іу ТОЖ Аве ТуУук тк їні тв ї)а Зак Зах Ба іп ро 7 та во іп ляр Беж Азя ТЕ ТуУук Ту Схя Укі Біп Тук Аів біз Ве Бкго Тяр
ЩЕ Зо ях тТЕВХ Ре бів ау Зі ТВО Був зе); біз ве їде
Іо 105 «ай» а «ії 115 «аа» ШтрУна песпідсвність «ее «ж ДЖОН «3» гпримівкатеснмс шеУучмОої послідовності: симтевзичний поміпженеиде «БИЧ ТЕ ій чві і Ба ів Щі пек Сі БЕ ім бен заз уз БЕ бек БЕ ї їй 35 тик ге бек Бе) ТВ СУ ТВЕ Уї3 Бех ОіУу Тех бе бів Беж Ні ар
Ере аізіа тк Ана тТуУВ Гі яка Зі РКО Рхо піУу Гу З1іу Бей бів; ЖЕр чо 55
Мес іу Тук Ті бек Тух йев обі два» тних Ас тТУукК Зів врКО беж Бед 5а ч5 во
Гу Бек Аже їі ТЕЖ Кіз Беж дк Аве ТвжЖ бек їв Звюв осів Бце Ре а ьтУв юю вва бек Уві Ти дів вів Ав ТВ азів ТП тух ТуЖЮ Сук
Б 55
ЗаЇ ТВ дів Бех тТхв біу бе) ро тТгр Ко бі пів бі ТВХ Зв УВА
НВ 125 138 тих таі бек ща 115 «ве 3. «Ії МОУ «вій БІЛОЮ «ії» Штучна послідовність «аа «ааї» Вжерейе «паїв» гприміткажсОпвис штучнаї песєплідовшості: синтетичимй подіпеттиде ем зі лаб іє бій Бе ТБ щі бек Ро бек бек Меї бех Та) бек Уві ЗКУ ї Би 10 15
Авр вату чаї тн Іі тт Су Нія Бех беж ЗіБ баб тіе лай Ме АВ
КЕ 5 Кл чаї іу тТЕр єго зів біз Бе5 Ро бі Суж беж Бе Бу БЕ» їла Ії
З5 48 45
Тух Ні біу Аів Тіе без авор дво бі уві Бут Зак ака Ве ек 01у
Зек біу Бак пі Тйх Аво тк ТпЖ Без ТХ І16 Беж бек Пі бів вхо вх 79 а 80 біш АБИ Бе Аа ТІ Тух Тут Сув уві сал; Тутк АБа бій Ра РЕ Ттр ць За 5
Твт Бе іх С1У Ту тт Був еп біш тів Був
Зо і195 «Ж» «211» її6 «18» ВІВ «213» Штечна глеслідозанісів «ай» «ва1» джераля «ЯЗ» «примітка "Опис штечнех послідевнесті: синтетичний поліпевтни" «400
Зі чаї бі без Зіп Зі Яех Бі Ркб бі Пес Маї Був Рго Зек Щіп 1 5 30 15
Так пез бек гелю Та Су Те уаї бек о сіу Тек Яег Іів бег дяк Авт хо ав 3
Ра дів Ткр йди фер їів вкд сСіп Ер; ро бі1іу тв Бі пед біч тер з 42 45 мес біу Тук їі Бех Тук Ццуш ші вна тп дка Тут біп Еко Бак їжу ве 50
Іун ек АтЯ І1е ТБжЖ ї1е ет Ак др отж аг Був Ап обБіп бю Ре ва чи та ВО
Іа тн ка дЕП Бех Уві ТЕ дів дів дяр Так діа тк тТуУук ТК сСує ої зо в чаї Твжх Аів Бах АтхЧ бі Ба Бко Тк ТЕ бі СЕ бі ТК Баш тай 100 105 118
Ти Маї Бак Баш 115 «ій» 73 «йіїз ДК «кій» БІЛОК «13» Штучна послідовність «ТЕО жипіж джере чиї» "/приміткавзч'сдисштучнаї песлідовнесті: смнееетнннЯ теле е я «апп ж та
Авр тів іп мМеє тнж о біп Бек РЕ бет Бек Меб бет уві Бек уві сІіУу 1 5 іш 15 анровку чаї ЖЕ тів ТЕЖ Сув Ні дає Заг сіп дер о тів тк тує деп а а 30 тів беж тк їй ЗіБ спіж бу ро сі Був шеє Бе Був ПіУ Бен Ше
СЕ а
Тж Ні Зі Ві Ав обесй бер во Зіу У5і Бго бек Ако Ве бек пі зо З ай
Веї БіУу дет ОЖу ТЕ Вшю Тек ТВЖ баб Те їі бек важ їжі шів ВЕ «5 а 5 що
Сіз Авор ве віз ТБу Тук Тк Су Маії Сіп ТУ яр іс ЕПе ка ТЕв й За 85
Тк а бі фу бі тах Сув їі ЯЗ 1 дув 1 105 «хів й «ії» 316 «щійе БІДОК «шїї» ШбуУчна послідовність «ие жах ДЖЕК «хі» гпримітках" Опис штУчнеї послідовності: синтетичний поліпептид" «ОО 78 бів лі бів Без бій біб Бех 01 БК Пі їй Уаї Гув ро бдех бів ї 5 15 15 тах рей Бек Бей ТЕ був ТК Уві беж БІіУ тТУух Бек Іі Бек Акч Ар ко х5 Зб
ЕБа лів ттв ав тер Іі дкчЯ іп рго ргао біу ув бі ев Сі те о ах
Має пі ТУжЖ їі бек Тук Ля ЗіУ Ави Те АКа Тук ів рко дак Бей вет) 55 Бо їуй Бак ва їів Тйх їів Явтх Аха йшр бек бас бує дви осів Бе Бра 53 7 7 во їаш пув ей Ав бек чаї Тв Аза Аїв Аве тах Аїа Те ТУуК ТУК Суд за 5 чаї Твж вів бек лкч біУ Рйе рРто ТжЖе Те бі бів бі УВК Ге чаї ії їО05 о
Тв Уві Жек ББЖ 115 «їй 75 «ії» МУ «1ї» ВІЛОК «і3» Штучна послідаевннасть «й» «1 джере «важ примітна "Огнеє вжежнеї тзевідевності: симитатичнй поліперстяд?
ПО» т5
Я Ж ху жаху СКК зх. хх уж 5 г : Зк соку ЧЕ ШК двЕ бів бат Ме ТВ Зів Бетгт РО Бек дер Меє Зек Уа) Бек УВУ се ї в: їй 15 дв; вся Уві ТВЕ Ті ТОК СуБ Ні бек бе бібБ Або ї3е ТЕ Тужю ВВп а ше З г Коен яке У кі кі ; сх же Со ИН де зд
Зах Ам ТЕ Бер о сзій Осі вуз РЕ і цу БВ БВ Су ЗУ Пе; їв тиме ські мах дтан Ж ще ша кс з З - ї п Аня Шок ук хх
ТЕЖ Ні Зі КЖек деп оСе) дабБ нів бі Зваі го Вех Ак РОв беж ге
ЗИ а ви
Бет бСьжк бек о Піж Тл йБю Тут ТНК дев Тв бле бер йекКк Без б го в т 5 ни сій бер опе вів ТВ Бук Тує Сув Уа1Ї сій ТУЮ Азов вв о БМе Бо тТЕв йЗ зо 35 пня швах стю 1 бу тьж бе Їм; біє Те Бад їз ТТ «БІ» те «Фк» 5 екішдшк БІВ «кій» темна Роеслідавність ч«иів диерела «нах зпримітиве" Опис штучної послідовноті: синетнчний полалецпев" «ПИ» Б
Зі Уа бів Без СК біє Бек ШіУ ро бі За: Зі їв вхо бек бів ї З їі 15
ТїБЖЕ п ео бек без ТИХ Су Тк Заі бак бі ТК ес Зі пі вх яю ве пів тЕр вяУ Тр їі ВЕ сСав вхо Рхб Біт Бтв СОУ їн; За ТЕ
Жес Су Бук їіз Беж Тек дяв осі аввотае Акш о ТУкК Зп о рРЕОЇ Явж пев ж К- Я Е м цу беж БУ їіб Тх Хівз Бек вич Авр ота бек Бев лай бів БВе Ба їні Му Се ваш Бек УА ТК дії вів йаеор ЛК діва тиж туш тую Суб
Ж КУ че У
Уві Ті ліва Бек дк 03» рів рЕо гух ТКО пін бів 03Уу ТВ Без Ущі
Тнж Уві яеж аж
«Ві ТТ «шіїх 107 «иа» БІЛОК «вії» Щерчма пролійсвмість
С НКЯ
«вай» джерела «ваї» гпримітказ'бнис штучної послідовно: симтетений пелізепемм" ей 77 взр їі Бів Мек тву Бів бек рко Бех Бек Мек Жеу зві бек уві щу 3 5 18 в: йно йхтч Уві їВи Тіє ТБ оСув Нів Бех Зк обіп йвр їз ЖЕ Тук Ява
Ж 5 Кт чаі іу тв їв бів ЗіБ ПУБ Во бі був беж Бе пев Сі Бе іє
З 45
ТУухк Ні біу Зак бамп їни йвю Ні Сі Маі рко Явк йху Бе шек піу а 55 ВО
Зек Бі ЗвкЕ Біу Так вро оїУк ТВ Без бе ТТ) бБаж Жак тез ЗБ вко 7 75 що їхіз вер Бе Аіа ТВХ Тут Тук Сук Мні ОБО Тек дар АБО Ве то бер ї5 З За таж Ба У Зі піу ТВЕ Гук Тем 3 16 був кто їі
«кл Штучна лосів ітв «ам «їі» джерела «і» «примітка опис шетучуєі послідовності: сммтетмчнй гезніпеттид «а В паз Уві біз бен сСаю біз беж СЬфУу Бо бі їхні: Уві був жо Бах біяЮ з 5 18 15
Тйх реа Бех ев; БО Суб ТК Уві Бек бу Тук Беж їзЗе ех із Мр
М В ЗЕ
Кпе вів Ткв йавю Ткор їз1е ха бів хо ко іх Був Зі Бемй З Тк 35 4 45 мех Сі тТуЖ Гіє Зех ТУ Бек шіУ дво ТВж дує ТУЖ Зі вже Беж пев ща ЕЕ
МУЖ Веб АХ її ТИЖ Зі бек ЯЖЧ вБо Тжх Бек му йББ Опік Кіа ВБе ії) ув їв Вей бах Уві Те аїа віз авротвБк віз тн тек тую Суб 85 зо 55
Чаї ТЕ ів Зах Тр 01 Бе ко Тв о їЖхв бі бів б1іу їх Ббни Уві що 105 їх жвк уві Кек Важ 115 «ЛК Я «йі1іїз 107 «віх БІЛО «13» Штучна послідевнієсть «ВУЖ «йві» джевелю «вайк «пряЯиміткав' спис штучної послідовності: синтетичний поліпептид а 8 дав їі бів Мес Тпт бій Бех то бек бак Меб Яет Чаї бек Уа щ1уУ 1 З 16 15 авр и Ако чаї ТВк Ттівз Тих Су Ні бек бек біз Зяр їі Аа Меб шию ку 45 3
Уві зу тр Без бів іш Бу Рез іУ Був бек Бе був Сіу бец її
КІ ЕЕ 45
Ту Нія Сі Аза ї1іе ї-й АБр йшр о Сіу узі хо Век вже Бівв Шек біж ку БО
Бек пі Беж 0іу їВЕ дЕЮ Тут Ти Іо ТВ ті бек беж їм Дій Вго ва то Тт5 о бів ажр ре азів Тнж ТУ ТУЮ СУ Уві іп БУК дів б4й ре вже ТКе ве ЗО 55 тех гне сту ЦЕ ші ТВ БУ пез бів хів щує по їа5 «Кі Я «и М. «йійх» ВІЛОК «іі» Штучна поєлідевність «ай» «ийї» дженале «аййз гприміткав'спнс штучної послідсвностіх: синтетичний пепжна" «400» Во
Піт Тут бек ї1іе біу був лавр Бре дія їжр йвБв і З КЗ, «ій» НІ «Ві» 11 «їй» БІЛОК «ії» Штучна послідевнісямв «ай» «и3і» джерело чайй» гпримітнкає" сне ШТУЧНО йоспілевняттії: синжетичней пептиду «б» ВІ
Су Тух бек І1е Жек нів дир Ре дів ТК Ави 1 5 10
«ий» ВУ «Вії» 15 «вл» БІЛОК «Еїв Щеучна послідсвніств
СЕК
«наї» дикредо «аа гпримітказ'Опис штучної поспідовноєстії синтетичний пептид «ЩО» 8
Нів Бек бек бій йо тів дев Бет Ави Гі Сію
КЗ 5 10 ж» ВЗ
Си «Віа БІЛОК жа» Штучна послідовні єть «Ва чиїх йжереле «аваі» «примітказз Опис штечнах послідовності: синтетичний пептиде «ЯК 3
Нів сіє Аіїз дви Іі Ні Ав
Ії 5 «ЕП» Ва. «МЕ «їі» БІЛОК ж Бо Вергун прі. донної єрвх «й»
«йаї» джерела -йваі» примітка" сви вузу леслійовності: синтетичний еле «ап» 8 чаї біп тут щі ій вве реа ТЕр оте 1 я «їі» 85 «її» З «ій» ВІЛОК «Ж Шкучна поставі «Ж «ййї» вжереле «Я Я впрешекї ев СН арею вееуквкееяЯ. лендіі денні шсинеаакиткІвМ пев «аоож 85 чаї іп тує Ар о бЗ1іп вів рго Тер ТБг 1 5 «3» 86 «21» 1358 «Міг» ДНК «ВХ» Штучний лослідеавність о» «йЯі» джерене «аж йпримітиюаж сти азштучникі вет ухва с еоеквнч а ТБ ннужтююни я «аю Б салитесвас сссаауачуао сушеасссв ссссваде сесссевдає єссвсеесец 59 вствсасси гспассутаса ессабесвас ачадчассься сабоцаастя часссоютає їіза севсеєвзнса зввврассопа «Сосшееч басзковзеєї зосзаочекна свсзсзсває 1855 савуссстсосс єдаацсстосд састаєсакк вохсдецака сессссвацая сова ЕевЕе 240 седвааєсся асвдевсувє апсодестас вссуссасєсь ассаскеасєає сассусевує Зп авпочессс сесассодяя ссваочасвсї сощесвосо стссссссгас дссовесвах ЗО чздсссассуч Секкессссії сдсвсесесс сссвадачса сскскозчава сзсвасччее ч50 стцшистосс сууксвавва ссасстссос дуавссзеєдча спрокассаЯею давотовае о дссссовося Зобасвінся сасссссосю зссоавескас вегостсадв ассессвекос Бе; сЕсвасасеч БеФдеувссак чессесеаяє песо єаса сссвавосей сабебеєває БЕК дісваєсвса зусссадсав сассляпасо дасааоевач Сбпвосесла авеггсубове вай завастісвсв секчсссасс чешессвоса сссдеаскоєс бедозаавес десвоевее Тай сіввБсессосо одявасєссвяя спасавсссос асзасевесс зддасесссеза зЗУусєсасакує 7
Зешеосає весессавшеса суне Е сдваопсовває Ссаястосеа сода євеє вай шісчастуєос збавсвшссва Часавачесу сечаасоувоє ачкасаасає сасасвосяє 00 челчссацев гссесясожь сскосасову дасспеєскоз асопзсваце: зквасавевоє за ваписксса всввадесех сесаусессє акедаєсвайа сезіссссва ваессааваоот ізо соащессеопаа васосаєачи шрасассств сосссвесос дспаФгаваа: чассвавває ТОва сазсессаєсос сзаесгтессе явссазваас скссакссса дусдасас сус сода 1149 часеценися песецсесча саишсваєссвс зазвосвеце стосстсосе часова є 1555 дескассвее ЕссесБасас Савоссесвесє човна срсесобосюя ксаокясте із зЗескесксве Зссссвсовс зсесосаостех срдсвсвасс васкасвсяса чавдашесье 350 жксесевксес сазчквав їа38 «210 47 «іі» Баш «ій» ДНХ «аіі» Штучна послідовність «ік «ейі» джерена «вай» гприміткає"сиис штучної послідовності: синтетичний полімуклезтид «В Я часабесвий бсяссеваеєс сеесесеваує всесосесеь себсзцчсй боро сдвсс й акгтасстдсе вскесвссесв сзасассаат зеававса зседеєкосв всадавосьа 155 дчевацієст Бевзаасосс дествассвк одЕВвссвасс Кодасчвояє зас сосяцЕ 153
СекЕЕсСяшОов чибесовшее ссподввсєснат бвсасестев ссевсбсядоза сегесацеесї ай
Чаздчассеке сбасстаєта ссяїасасва сзсусесацс ссссаєсоввс семою за ш-ечсвоесавас сечанвссва васосвозустш зссосассяає сраксвессає сссосссоасса зво сседаєсзаос ацесзававс кедавнесо веб дессястява бавссссєае 28 сесевуваває ссалацшьоя сіоснночее пасааочесс сесваєсоза сзасьсссау за дадеусессв сачасосвача сасавочає зфшсасокаєв чсобсвосає сассессдвоу 58 сецвссалває сесаєсвстя девняєсвсявя Фессвсесєв дедвачесає ссабрсавоеєгає во екапесспе сеуссасааа чацесєсавас задоданавє че віх «ЯК» ВВ «13» 39 «ій» БІЛОК «іЗ3» Штучна послідевніств «ех «е1» джереня «ай /приміткає" Опис шУУчнОої послідовності: синтетичний вентиде «00» В
Мей бів Бе З5ж беж За їв о бяз Бе без Уві Азїа Ті би був 1У ї З 10 15 ві сів Су «ії» каві» й «мій» ВЕЛО «іі» Шручна послідовність ев «і» джерене «наї» /примітках Опис шеУЧчЧНОЇ послідовності: синтетичний певтиде «Ой» 85
Ме дах Чаї рез Аїв бів Без бе Сію фена фе Кеди Їїжзіа Тхр Ва вхо ї З 15 15 сіу Баг дта Сув
Ж
«аа 0 «811з 7 «ій» БІЛОК «13» Штучна послідовність «лек «і» джерела «наїх гприміткае"Опис штучної послідовность: синтетичний певтми" «ОО» 90
Ппеш біз Бек лк біт ро вне
Ж 5 «ці» ЗІ «ві» 1 «вій» БІЛОК «вій» Штучна послідовність як «і» йжереле «ак» фприміткавсснтес штучної послішовнеста: сентетичний пептидт «ай» ЗЕ дев Мей Нів ТБх С51уУу Нія Нів нів Нів нів Вів 1 Ех, 19 «шій» 95 ях В «вій» БІЛОК «ії» БеУЧчЧНа Послідовність
«вх «Ж Ек дОКеуМалту «Ж» Пюмиб тка ОВнс шетичної Меслідсовноєті: синтТевичник пененд" «а» ЗУ ек Айхч Сі Боб Бе ї КУ «Же Я «Ії» ВВ «вам БІЛОК єю Шеучна поспідевнастев «ах «ВаЮх джерела «Ей» /приміткатє"ОпМс фручнеї послідовності: смнеетеичннй поліпептид" «о» З ів уві бів ей бій біб беж бу Бео біУ а УВі БУ РО БЕ ту ї х 18 15
Так о їве Зек їв ТВт Сув Аза уві ех бі біу бек ї11їе Бек Бех Беж
КВ 5 55
АвпоїТкв о ТкроЗех Тр о уві Ахе бів рко ро бі ув сіу р бів ТЕ
І 5 їж Зіу біс ї1е Ттух Нівз бек СЕУ Беж ТІ бами Тух вп ово бек бе яв Ба а «Ей джерела «а» «гпюнміхкав' сонна вкучнаї послідовно: сентееичний певна «По» 85
Зак Ажхч бі Роз Бе 1 во «0» 5 «її» ЗВ «ий» БІЛО «вій» Штучна посміїдавність «Ди» «айіх джерела «Тай» г/пронміткак" Опис штучної песлідовності: сннеетичний поліпептид" «й» 53 сів Узі сів з Зі сів бек сіу Бо бу о Чаї ву гео Бех бі 1 Кс) їз 15
ТнЕ Пе бек Її КВК оСую із ві ех спі сіє ек тів Бех Яшк цех 2 Ка 30
Ав Ттгр о їтр Зек їюр уві ажу бів РК БО у ев ду а ЗБ ТЕ а Фо ч5
Тих Зі Зі: ті Ту нів Бек сі Беж Тит АБО Тух йвп о рхз Зеж Бей 5 БО
«В» «й ДЖеТчеМ «ЖИ» пряимісткаж Ом втучнаї пОослодовності: смнеееичн гетнжмая «ВНІ» ЧУ дак йжч іч вто пе 1 В «ій» ВХ «ії» ЗВ «вій БІЛОК «ІЗ» еучна послідовність «яд «Ей джерело «айв пряимішкат"Слмо меч пснні денно тії «вижетнчний поліпептид" «4вос» ЗХ пів Уві бін ом) зів біз Бек біт ре біУ їі ві сує Бо бек біх ї З КК 15
ТВЕ їй; беж їжею ТБ Сув Аїз Уві ЯЗет Пі Сі бек Ті бек Бек чає да ва ХО
Авпоттр о їхр зак Тр о Маі аж сію Бко Ро біУу був Зіу ма бів Тк
З я 35
ЖК Бі біс їі Тжж нія Бек сі Бек Тбг Ави Тук АввоБко Звж пе ва
Бек шу Бек СьжЖ тВж дев ОМ ТБЖ реа ЗВХ жі беж дек іже ба фев сій АБО Бе лів ТВУ ТУ Тук Су Зі 016 Бі айви Зк Бе Бе

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Кон'югат антитіла проти рецептора епідермального фактора росту людини (проти ПЕСЕБК) і лікарського засобу (АОС), що містить антитіло проти ПЕСЕК, кон'юговане з ауристатином, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮО МО: 9, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 5; де антитіло має Ідс-ізотип, і антитіло ковалентно зв'язане з ауристатином лінкером; і де ауристатином є монометилауристатин Е (ММАЕ).
2. АОС за п. 1, де лінкер являє собою малеїімідокапроїл-валін-цитруліновий лінкер.
3. АОС за п. 1, де антитіло має Ідс1-ізотип.
4. Кон'югат антитіла проти рецептора епідермального фактора росту людини (проти ПЕСЕБК) і лікарського засобу (АОС) для лікування раку, що містить антитіло проти ПЕСЕК, яке має ІдСс1- ізотип, кон'юговане з монометилауристатином Е (ММАЕ) через малеїімідокапроїл-валін- цитруліновий лінкер, де антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга, яка містить ЗЕО ІО МО: 9, і варіабельну область легкого ланцюга, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 5.
5. АОС за будь-яким із пп. 1-4, де антитіло містить важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 15, і легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, представлену ЗЕО ІЮ МО: 13. Домени КН; шле Що М и нн в поп по є Ко но то СООО СВУ ши в в Б ОО ЕДЕБО КВК ВВ ОВК КЕ УК АВК О У ТВ й й пон улкюскюккккю Моне Димеви УРОКА АВ вить одНиКову пекліжкен те У ЕЕ не и в НН и Ен НК ее Я В ЯН ВЕ ВЕНУ РЕНЕ УВК НЕ вве ОК ОООТ РЕК ЕОВеОТТЬТА ЯВОРОВІ ОТАОеТ КВ ОВК В СО СК СОНЯ
Фіг. 3 пе ПІКОВІ У НВК КОВІ ВИ ВІКИ ях ВУ ІВ ВЕКАКИВКТККОМІКТИААРЕЕК УК О В ПВо КНУ уСНЕ закик же КАБАКУЦМК УМІВ МК КВК КЕ ВЕ ЗТ КК ВККС ВОВК ЖВОЕС ЕВ НК 33 а я В киев ввюнотння ІМ КАМ КОКО КВТ ТЕТ: КІ КАК КК кто НН не КК КК НК КІ Яд вНОТКюХЖ ВІ ВМТ АСУ КТ КОВПАК УК: РОН ЕА БЕ ее КИ ВК ЗВ СК ВЕН ОК Ка ЗК КУ МЛЮЗЕКОТУКО ТУКА КВУ ІК УКВ. ЗБА ВОВСІК КЮВЕТУ ТВ МКК ЕН Я зБжи 8; БА МУ КНВКТ ТРЕКУ КОВІ ІКТ ОУЕН і ОУЕН У ОВ ХА НК АК ВХІ ЖЕ ФУНТ КН ВИКО ТВ КК МК ККУ КВ АКТІВ АКВА АВ КЕЕЕМ ВЕ КК ВТ МВ УВІ ВЖИ КК КК СЕ ВЕК ЕК кН АНА кМеиВНВМ ЕК КВК АУ КАК УКХ КОКО ВК МБІ ПЕОРЕСЕУКВНАХ НМ КЕ НМУ ККУ ВОВК Ві пев ке Кв окива ЗБ ВІКО їх
«ік. 2 нини и птн ттітутую т т ж ж ж ж ж ж я ж я ж/ж-ж ж ж ж ж ж т тт ту твттт ж ж ж ж ж ж тт ж тя тяж ж ж/ж ж ж ж ж тн ттутувт т ж тю сжжнжт тт тт ж ж ж ж жк я ж жк ж ж ж ж жк жк ж ж ж'ж ж ж ж ж жжжж и и ню ях я я жк ж кс ж ж ж ж ж ж ж ж ж/ж ж ж ж ж жжжжні Е реж КА Шен я за ноя Н ЕОКК У й ши с НИ соти нини нини нн нн нн і тонн нн нн тич КЕ НЕК; ЖІ й їх ви М ВЕ у деки ку, и не Ви ЯКУ га де КВ сало са АВС ! Кк ЦО я і ЖЕ і З: З ТАНСВОЮНЕ АВК Ку іш 1 ї В КЕ я Ко ЩО ПММ ванну і їх В ц ох ї жо ун Ол. Ух ок М, ся с ж УЗИ 2 ТО А о ЗБЕНВ Ор 235 | ВАМ ааЕЯЯ здчю Божа ОБЛ МН Я за МЕЧ З х я ОБО ШЕ Блю ЕТ Важно ЗЕ ВОЮ 155 ОЇ ко мож х 4 як у, Зх ук теж пут я мо лючия ух -- ї аа ЗЕ ЗБ ОБУ ач фо ще гу що ОБОВ БО ЗБ ка ре БУВ БІК 32 КУ Е мВ ух ся ке у. ОКУ -- У мч БК Б ї ОЗча НЕ БІО зо ЗУБНА Бе ка шосе 5 ще ше ще 5 НЄ КК ходу; й оз КОХ З : Зо т а КК годе о БАБУ оЗаЯБОБ ЗБ ОО о6Б6О 0 ЯН ТНЕЯВ 0 ЖОБО а а ї 353 ЗЕ ЖК НВ МЕН БаМЯМ 3505 У ЖОУХА Є хе ВЕ нена дви не лю ше лу й КУ з оаещеОУ ВОВК ВАН 05 Ве За АВ ЕК Ба ії али ЗБЕ БУ не ТЗН БЕ БОБ СНО ща ВМ ЕН я Те зЕї БЖЯМ ОО Ею Зі Ко ІЗ ж ик ме кож де г НИ з У м 8 | 15 Баян Я 0 5Я БЕН ЗЕ ЗБ а З х Я зу мив ЖОБЕОТКЖ яз го УЗ х коки ЖЕ вва БЖ МОБ 55 оОЛА0Ню ББЕЯМ БЛЕЮ 0015 КЕ ОБІТИ ЗУ ЗчУ їй о ВяЗмЕ 1585434 0 БОБ 134 я ї ; й Що й й ож ТЯМ Бу. З Ве ЕМІЄЛяКєВ ВТ ДУКИВЕЯАЯЬ, маю ЗВфм вимі) зр КІВеЕНКЕ ов З -о а КК НК ИН КН НК НК НК КК КК НК НК НМТ ИН ИТОНТОТИТТ ТММ НКТ М КК НИМ ТИН МКК ТК М НТТМОТИТ ТНК КАМ АК ИАОМОИОХИМІІЛІОТОАОКОАОТМОХНОАОІОЛІОТВВОВОООВООТВОООСТОЛТОТОСОСОООООТВООТООТТОООООВН зміг. д
Зв наван х хх нУ КЗ епемами в КАС В ше! й в / М я АВ в / й в Ав їУ - Р ; БЮ, / е денно ср с п ВИНИ шк ПТ і 109 юю АБінм)
Чнг. Я ЦЕЛЯ біе5-7 АВЛЬЕНС прог варіантів щ тя що жає я АВІ ШЕ шо і ще ШО БЖД КА АБ чо Я ще з щЖ Бо ахох ки т Зо р шоб» їх в АР - тах Й в На а а ВВ го іа» в. щи . не що. а ЧИ У Контраве Гезв зн інн інн нання нн ЯКлтхЯ МИ З: ві З НО ЕС ню ЕК М а «Фіг. Х
Бінетнка зв азування ВОВК І- А) Скбнроовані кола А АНЯ (не звіалінквані коле) с: варі Е це. кн нин пі і ін зн і ПИВ У ІШвидка 4 5 У - оо Ко КК ТЕ ож КЗ ї ше з о де т | й о й ! м Е ' о о М : рю м К піно, шини нн Ям ви че і й їх м ОДА Ж ши: ше же ши ЖК о ск кни СМ знй/ : Повія ; х з. ЗАВЕ ех. щі - А Еш; тн ке з ;. : й я не ні НН. оешш м еНИ Зфрочечнене педийнньн о ен не зн с о Те Му ь кас ї Генія ка І і Евупа і Групи З
Фіг.
6 СЧукляві да АВ) - Е АВ сах ханівов пззню 58555335 ше Актин ТА
НО ЧУєливі до АВ) те РКя 5 А 5555533 253 пззню За ВО М во ЕЕ В Дктнно НК ект неентеттннне
Фр. В за- ЩІЗЗ3НМ і візззнМ ? чи с Я33нМ і ще тв ЩЕ м х 5: шини ши ше ше щі ші ше іс нини АК З Е В КК І ШИ З ШЕ і що Ве ВЕК ше ЕЕ СЕ ше її що ишииші. ше и: ши ннининиші. БК МКУ. ВЕ НЯ ВЕУ ЩО БЕ В Х ЩОБ ЗШ ЕІ: ТА: ДУХ ВЕБ ів . повік й; ши: Кк ше ши ши й ше Що Б Б 5 ин й: кеш ше вч ші шо ше і І т щі | КЕ. в КК. и 0 о | й ПІКИ І усе ше а нове и ж а. НН я й: . З в не В Б ве ж НО В ВО г. Як СТ жк и Я Фе ще м р ж н до 3 сне , й я нн
Фі. А. 12 Й реа їв | і й Кв» 1333 НМ В як і й а АОВ м | ї й са нм о в т Ва Нед: шви А СМ: кн кнчуечнвчннтннчнсянн соску текеснееоресес як ЕЕ З ЕКО ща кю ою АВвіНМІ
Фіг. яв
НЕК МОВ а й й в сяк й що г Бе хв г ЛІ З я ЗЕМ у Ж х В - Б За і в 5 Аа ш ш : Її Ж НК ШОВ зБою і ги дек й В мк» і Ху я ВЖ хо) /й м г ж / в вве Ку ше / й « ВІ вищ 3 за ню обо яю вен
Чиг. Я Ксенотрансплантат карциноми МУСТ С людини МСВНОВІ ба ІеееАвА З х зни АК В Іще ДМ Ї ?2 яння АВ , х зо кн -ї у Контрольний НеївО в, й ф-т ж ї й к 4 й Б Би ки й Ж 1 са он стен 19 ій; ; зо ше не и Я Доба після ін ск пухлинних КА
Фе. 10
Мідледні де Ваші. жавлцнх. пи'єрулін РАВА ММА Повне нини пив еннввававв аланін Пана гЗ Її її во 0 Не - - ЯМ ва І в н о у й! й і ах я дання я ау ; їй р ва оч Я. Воззвревслюввня катер
З. Сеатерозеветленеся хх очей Я Їх3 Е Се і й й р Ї 4 4 М СНУ їх МАЕ ІКСЕІЯ ННЯ лебВолврнтянювя й зай чик. 11 па дАнжнзіво Бой | Ж й . аж їе не вк ЗО рухи ння титттяттт трлн нн тт дитинки тет КАК АКАД АННИ Ер ге г: й в В 10 ї2 І їй хв. ях | Нвний 13 т «у Пеюв лівої в Що Бінрокий розподі атья МАЕ у - ле сіяв БК р що ЗА ев шкеи Я як ЕК рез й ЛЕН сан я ШИ З о- М шЕВОє ее о пев ОЗ САНЯ Не ШЕ яе їй ши ей Плов ЖЕО і В ПИКА сть. ЯМИ «ще нн и нн В ОК КОВІ З Ж Кс Зх з за 12 тя 15 хш ; г А Ткемее ІВ, 5 Га Мой Кчевізврвкій С гррукіххнерьени ззрхиуе і ке 1453 далее ні 100 Левзазорода Ге св я ш 00 тіеь до щи М байдазі З - щШясж бвоще ЗБАНЮ Б: ці 1 ВИКО. 0 пз ау з пиши с с АК я оон У ТВ, й БЕК вовною ню нем нн пен нн мн ни нин нн и ни и І НО Кк ма кн ЩЕ кі ся їй В то ТЕ Ен їж хв. «ріг. 12-1 жк шо й 1 рано й. ЗВ. лраче о ЗВО пеечезує МИ пе «5 мий чу пореетропр рос рт пи ун го й й ге З 16 12 14 тв хв Ще А Е тій ТР орривца окжез ву що пАВА Вівенвя сваха ї Грона, заЯе ЦО Збораїь ф ово Плоше ЗЯ2677 | , Пл» 128435 її вів З й . БІБ Я, се НА и Ки У У а нні пи нки мово поло о лома мамо мо ма нев мав ней ав ін а аа нс а вва вьнььй гоенеен А усесяе на в СЕС о 2 З г 5 1 ЕК І Тв -.
Фіг. 12-3 УА З украй вскткинз в: я хї зо М вузєнвнії рекегюі В Ж 3 Бра й зво оо зн ні о о сенс я В В я ЕТ Ясні ре 18 а З що ХВ. АВ З Очищений ум: в не (неріоднаний У т ЗЕ звуки зр : прснис С г з шо кі Е 1 з писана м, зі о повних зви нини пон пив пиву п п по п зи З й Н й 19 «а Е Я Дос зо юрАНЯ соді Покнах хво Ї Не ра Ме жна 535 Щ г З А но СОЦ оенангогогесеаос Вон В оон 5 І Ру; Зо Я «МВ. «ріг. ої гри МА з | і : я М, площше зкеюааЮ зи БАНЯ Шк х ї Д- як х мас у і: я не ДІ; «М 1бкназ 109923 це я Нова З Я Кк й ї пе них нь ЗОНА дл "МкдннляляялжннкАлллотикнх о ю хо 30 о Ж. ЩЕ ак 30 Розріджу вач ЯК в ві - Даня кт А фату ЕВ; І 2 за 40 ХВ,
фіг. 13-93 СНО АБС зо! т зе КоНТВОлЛЬ о ПО Мо гої «7 заш Бон АВЕО НКЮ, Й ВЕ с-м ув ну МЕЕАКІ лев ва ЖЖ се АБАЗСММАКО МГУ люба)
"ж. й 5 3800 жу т т ІЗ ЕХ їх во Зщ ї Ві Е мл х і КУ 1205 Кк ї 8 ще Є ши ше й г КДБ ух те вм де с ом т щу му мо іде я я Я ЗБ БК МЕ УУ ВОНО ВНІ Зеза після інбєкці пухлинних нена чнр. лА : ЕВСТ ОМС ММОЛЬ, КН ТОВ лем і рі а А 000 З давейня тн я МКК ; Її хе» АВ живе ОС НВЯ мНКМ є ЩІ | ТКУ тес АрАвеММАЮ х 0) і зоною. й ред І ТЕ ї Ж ІЗ КО -ш : х как Х що ВОО- Ку Я Ку щі Б , ша й Б й: Бруд орати» с М ЕЕ С ЛЕ ВНЗ «Б кісля і'єКЦіЇ пуУжлНННИХ Кох Фіг 15В схо Мох - ах щу ле КИХН ТОМ У ТЕ СНІ Й зва твоф у ниь Я СВАВААЄ ТВ плити З сек в -- ЗОВ сендні МВ за Кровь х пСОЖАК І х їм Вії зЕВВКААКО Я «о АВ НКММАК В хе КН се» ва МАЕ ті» ВОК ВНААРВ и ЖЕ у щі щі ЗВ з ЖІ - : - х І тах ї я х Б остяі ж НУ во ЗщЖК ши : З УК щ я Ж уж хх та я ї Бу УМЯ м ї ак б Я і Х її Х КОС 5 0 ВхМ З и х : КО ча зх де ще З Зх КУ Есе Й че ще ЗДА Шо ; ши ше а У КУ в ння х. ТОЖ року - теж їз а а о о В о о в ка ин КЕ НН Арка після не єккі зорях КИЯН п їй Фі 15А о зидуфння щі КИ ЗСЬНІВІ схе Нонна Я Нй ди Я 7 зх дув иа жо Лу» Ж щ я Ух я ЗНЖИ се Кенцмиво УСМАВІВЬ зе КОмерать Я ВАЄ С х те» АВ ЯЕАНКОВЕ ЦО -- дві кІВ по ВМ сез Ав УсМАВВМ 00000» дБ ртюМНАВВ В х: ї шк. з ї Бу як іс Е п АЖЖМ се АвА ММА ї: Коса ї х НЕ; я й : 3 й КЕ ра мхЕ ї т РУ що Я ї І щ теці - і щ ві з вк чу ШЕ зе Пе гз : ке БЖ ек но пої и ЩЕ ж Со З їх ї Ху г щі їх й, З Я З ї Е х Же У ККЯ Ж и Я о ж ми їх а ш ВЖК їй У ще БЯ Її КИНЕ нау шк Як В : жк У Й 3 Б ї в Зк уз ЖЖ г се В о ї ЖЖ ї ся ен зе ЯН. МЖК ММК нн З ВЕЛЕ М М 5 А ЗВ Бо ТЯ ВО З Я ЕН Дів вюзя В ЖИ пря вва Же еВ що -- че В
А. Ковекзукнія пику УК варінехя АВЕКАВТУХ і ЕЯ В ї Е х З Е ї ІЗ Х НЕ НВ ВЕУ КЕ НЕ У КН ЗК ЕН КН В КК З КЕН М-ВО ВОК КИНЕ ТК КК ТВ ТАКЕ й ВЕ ОМ З НА ВК КІМ ЖЕТУУК КОКО о КК ОРЕ ОКЛОВ: КОЗИ В ЕКВ А СВ З ВК КД ХХ ай кг СК
В. Кунасрилкиуья назістени У. варізнтйв АБ АВК і 5 В с х З В ї З З ПОВНУ Ве Ко ЕНН КК ЗО КЕ В КОН ЯК ІК й ни в и Й ЖІ, ВЕЖЕНВУЕ Ооаня ВО ши а СІК Се СЕ
Фк. 16 овен я ; іі ШЕ пасок ятевинНтя ліан Видвленнй в; Е | доменійлі те ! Е БОБНУШ ше 13 І, соляні п еДнвернзанія рецетора За о даченіск ши й К 1 ді зування ліганих В ше домен НО) я І В і Димернзаця пецептеуха судна я срезатря везепттора шо ен М СВ ЗЗОВНІ КЕ ях дом ККУ М дня ранечеморанний щи І ВСЕРЕДИНІ й ї на навколо мезбранний З Бітов АН лес се ї У ТЕ сбзаєть що ї І тирочникінаха розпізнається ДНЗ х й ен ней є хе ВегУЛЯТОрнНе власть ре ЩІ З ен
Фіг. ГУ МС (МОСС «а Контроль 4 (0 -а-Контволь З пюММАЕ ГО зер ебонгровь ММА 00 тоАБІ-ТоММАЄ (3) я АБА-ЕММАКВ ОЇ за Віа (в ке о -АВА ММА М. Не їж я 5 АХ Ше 54 й г. сю Я ОК і и МЕЖІ Е Ку х й " К. щі Вк ЕсЯ Бр Кк Е га ва ня за Зно. нн ними е-- ВОК днем ння вк я я як що ВИ ння и Кк ВО ЕС ЕК В ВК Додалсля ін єкий пуУхХаннНиХх ЕТ
Чиг. І
UAA201610588A 2014-03-21 2015-03-20 Кон'югат, що містить антитіло проти egfr та лікарський засіб UA125575C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461968819P 2014-03-21 2014-03-21
PCT/US2015/021849 WO2015143382A1 (en) 2014-03-21 2015-03-20 Anti-egfr antibodies and antibody drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125575C2 true UA125575C2 (uk) 2022-04-27

Family

ID=52997522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201610588A UA125575C2 (uk) 2014-03-21 2015-03-20 Кон'югат, що містить антитіло проти egfr та лікарський засіб

Country Status (23)

Country Link
US (6) US9493568B2 (uk)
EP (2) EP4218929A1 (uk)
JP (5) JP2017511376A (uk)
KR (3) KR20220123560A (uk)
CN (5) CN106459200B (uk)
AR (2) AR099812A1 (uk)
AU (3) AU2015231001A1 (uk)
BR (1) BR112016021717A2 (uk)
CA (1) CA2942101A1 (uk)
CL (3) CL2016002359A1 (uk)
CR (2) CR20210097A (uk)
DO (2) DOP2016000252A (uk)
EC (1) ECSP16082556A (uk)
IL (2) IL295906A (uk)
MX (2) MX2016012207A (uk)
PE (2) PE20161211A1 (uk)
PH (1) PH12016501828A1 (uk)
RU (2) RU2020124944A (uk)
SG (3) SG10201808837RA (uk)
TW (4) TWI684600B (uk)
UA (1) UA125575C2 (uk)
UY (1) UY36041A (uk)
WO (1) WO2015143382A1 (uk)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8193182B2 (en) 2008-01-04 2012-06-05 Intellikine, Inc. Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof
KR101897881B1 (ko) 2008-01-04 2018-09-12 인텔리카인, 엘엘씨 특정 화학 물질, 조성물 및 방법
ES2637113T3 (es) 2011-01-10 2017-10-10 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Procedimientos para preparar isoquinolinonas y formas sólidas de isoquinolinonas
US8828998B2 (en) 2012-06-25 2014-09-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors
DK2970378T3 (da) 2013-03-15 2021-08-23 Biogen Ma Inc Hydrofob interaktionsproteinkromatografi under saltfrie betingelser
TWI684600B (zh) 2014-03-21 2020-02-11 美商艾伯維有限公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及抗體藥物結合物
US20150320755A1 (en) 2014-04-16 2015-11-12 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
GB2541599B (en) * 2014-05-14 2020-05-20 Carsgen Therapeutics Ltd Nucleic acid for coding chimeric antigen receptor protein and T lymphocyte for expression of chimeric antigen receptor protein
CA2944085C (en) * 2014-09-16 2018-04-10 Ease Charm Limited Anti-egfr antibody and uses of same
SG10201913762QA (en) 2015-05-04 2020-03-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof
KR101776238B1 (ko) * 2015-06-12 2017-09-12 사회복지법인 삼성생명공익재단 교모세포종 환자에서 이브루티닙 감수성과 관련된 유전자 및 그 용도
CN116059395A (zh) * 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
WO2017131911A1 (en) * 2016-01-26 2017-08-03 Raghoottama Pandurangi Compositions and methods for sensitizing low responsive tumors to cancer therapy
WO2017136486A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Jinsong Ni Antibody-drug synergism technology for treating diseases
US20190153107A1 (en) * 2016-06-08 2019-05-23 Abbvie Inc. Anti-egfr antibody drug conjugates
EP3468616A1 (en) * 2016-06-08 2019-04-17 AbbVie Inc. Anti-egfr antibody drug conjugates
CN109563168A (zh) * 2016-06-08 2019-04-02 艾伯维公司 抗egfr抗体药物偶联物
LT3458479T (lt) 2016-06-08 2021-02-25 Abbvie Inc. Anti-b7-h3 antikūnai ir antikūnų vaisto konjugatai
CN107522785B (zh) * 2016-06-22 2020-05-08 北京大学 抗egfr突变体iii单克隆抗体、制备方法及其应用
EP3474856B1 (en) 2016-06-24 2022-09-14 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
CN108472371B (zh) * 2016-07-05 2022-05-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 Egfr抗体-药物偶联物及其在医药上的应用
KR102561356B1 (ko) 2016-09-14 2023-08-03 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. 항-pd-1 항체 및 이의 용도
EP3555137A1 (en) * 2016-12-14 2019-10-23 Development Center for Biotechnology Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2019005756A1 (en) * 2017-06-28 2019-01-03 The Rockefeller University CONJUGATES AGONIST ANTIBODY ANTI-MERTK-MEDICINE
AU2018316343A1 (en) * 2017-08-11 2020-02-13 Genentech, Inc. Anti-CD8 antibodies and uses thereof
MX2020002268A (es) * 2017-09-02 2021-01-08 Abbvie Inc Conjugados de fármaco-anticuerpo (adc) anti-egfr y sus usos.
EP3675908A4 (en) * 2017-09-02 2021-05-12 AbbVie Inc. ANTI-EGFR-DRUG (ADC) ANTIBODY CONJUGATES AND ASSOCIATED USES
JP7429639B2 (ja) 2017-11-18 2024-02-08 マガリャエス，ンゾラ デ 抗体薬物複合体またはその薬学的に許容される塩
WO2019114804A1 (zh) * 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
WO2019114793A1 (zh) * 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种egfr抗体及其制备方法和应用
KR20200108002A (ko) * 2018-01-08 2020-09-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 스테로이드 및 이의 항체-접합체
WO2019149637A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-08 Bayer Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (adcs) with nampt inhibitors
CN111886243A (zh) * 2018-02-11 2020-11-03 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 非-hla限制性t细胞受体及其用途
MX2020009275A (es) * 2018-03-07 2021-01-08 Pfizer Composiciones de anticuerpo anti-pd-1.
EP3773633A4 (en) 2018-04-06 2022-01-26 The Regents of The University of California GLIOBLASTOMA TREATMENT METHODS
AR114789A1 (es) * 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
WO2019211708A1 (en) * 2018-05-04 2019-11-07 Kashiv Biosciences, Llc Stable pharmaceutical compositions of dianhydrogalactitol
AU2019275737A1 (en) 2018-06-01 2021-01-21 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and uses thereof for treating disease or condition
MX2021000421A (es) 2018-07-15 2021-05-12 Enochian Biopharma Inc Métodos y composiciones que usan células dendríticas recombinantes para el tratamiento del cáncer.
WO2020019232A1 (en) * 2018-07-26 2020-01-30 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and methods for imaging
CN109200291B (zh) * 2018-10-24 2021-06-08 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种靶向于egfr的抗体偶联药物及其制备方法和其用途
JP7232925B2 (ja) 2019-02-15 2023-03-03 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 改善された均一性を有する抗体薬物コンジュゲートの調製するプロセス
US12109273B2 (en) 2019-02-15 2024-10-08 Wuxi Xdc Singapore Private Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
EP3952885A4 (en) * 2019-04-12 2023-01-18 The Trustees of The University of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING A HIGH AFFINITY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) HAVING CROSS-REACTIVITY TO CLINICALLY RELEVANT EGFR MUTETED PROTEINS
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
CN110845623B (zh) * 2019-10-11 2021-07-09 厦门大学 一种egfr特异性嵌合抗原受体及其应用
EP4086281A4 (en) * 2019-12-30 2024-02-14 China Immunotech (Beijing) Biotechnology Co., Ltd IMPROVED T-CELL RECEPTOR STAR AND ITS USE
MX2022013455A (es) * 2020-04-28 2022-11-16 Sinocelltech Ltd Molecula truncada en el dominio extracelular de tgfbr2, proteina de fusion de molecula truncada en el dominio extracelular de tgfbr2 y anticuerpo anti-egfr, y uso antitumoral de la proteina de fusion.
IL300246A (en) 2020-08-05 2023-03-01 Dragonfly Therapeutics Inc Antibodies directed to EGFR and their use
CN116601176A (zh) 2020-09-30 2023-08-15 中国科学院动物研究所 靶向egfr的嵌合抗原受体
CN112442355B (zh) * 2020-11-28 2022-04-05 江西师范大学 一种稀土-透明质酸配位聚合物包覆的vs2纳米结构及其制备方法和应用
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
WO2022240757A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Entrada Therapeutics, Inc. Antigen-binding and antigen degradation constructs
CN114044826B (zh) * 2021-10-12 2023-11-17 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用
US20230220106A1 (en) 2021-12-08 2023-07-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
CN117659203B (zh) * 2023-12-06 2024-08-13 科弈(浙江)药业科技有限公司 一种抗met/egfr双特异性抗体及其药物偶联物

Family Cites Families (180)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8236A (en) 1851-07-22 Hanging cakriage-body
US319A (en) 1837-07-31 Improvement in machines for breaking and dressing hemp and flax
US4526A (en) 1846-05-16 Improvement in the mode o
US938A (en) 1838-09-22 Improvement in paddle-wheels for propelling boats
US4434150A (en) 1981-10-19 1984-02-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
FR2601675B1 (fr) 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Derives du taxol, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US5157049A (en) 1988-03-07 1992-10-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Method of treating cancers sensitive to treatment with water soluble derivatives of taxol
US4942184A (en) 1988-03-07 1990-07-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water soluble, antineoplastic derivatives of taxol
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4960790A (en) 1989-03-09 1990-10-02 University Of Kansas Derivatives of taxol, pharmaceutical compositions thereof and methods for the preparation thereof
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US5124471A (en) 1990-03-26 1992-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Bifunctional dtpa-type ligand
WO1991016350A1 (en) 1990-04-20 1991-10-31 Ludwig Institute For Cancer Research Aberrant, epidermal growth factor receptor dna, rna and protein forms and method
US5407683A (en) 1990-06-01 1995-04-18 Research Corporation Technologies, Inc. Pharmaceutical solutions and emulsions containing taxol
US5278324A (en) 1990-08-28 1994-01-11 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Water soluble derivatives of taxol
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
DK0628639T3 (da) 1991-04-25 2000-01-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rekonstitueret humant antistof mod human interleukin-6-receptor
JPH06507404A (ja) 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法
US6287792B1 (en) 1991-06-17 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Drug delivery of antisense oligonucleotides and peptides to tissues in vivo and to cells using avidin-biotin technology
FR2678833B1 (fr) 1991-07-08 1995-04-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles compositions pharmaceutiques a base de derives de la classe des taxanes.
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
DK0706373T3 (da) 1992-03-23 2000-09-18 Univ Georgetown Liposomindkapslet taxol og en fremgangsmåde til anvendelse heraf
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
GB9213077D0 (en) 1992-06-19 1992-08-05 Erba Carlo Spa Polymerbound taxol derivatives
CA2086874E (en) 1992-08-03 2000-01-04 Renzo Mauro Canetta Methods for administration of taxol
FR2696458B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation de dérivés du taxane.
FR2697752B1 (fr) 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
FR2698543B1 (fr) 1992-12-02 1994-12-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelles compositions à base de taxoides.
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5380751A (en) 1992-12-04 1995-01-10 Bristol-Myers Squibb Company 6,7-modified paclitaxels
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1994016729A1 (en) 1993-01-28 1994-08-04 Neorx Corporation Targeted nitric oxide pathway or nitric oxide synthase modulation
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5433364A (en) 1993-02-19 1995-07-18 Dynetics Engineering Corporation Card package production system with burster and carrier verification apparatus
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
WO1995015770A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
IT1275043B (it) 1994-07-21 1997-07-29 Agerbioss Snc Di Zanin R & C Metodo e relativo prodotto per la difesa delle piante dai parassiti vegetali
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
CA2206343C (en) 1994-11-28 2009-04-07 Thomas Jefferson University Reagents and processes for targeting mutant epidermal growth factor receptors
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5840929A (en) 1995-04-14 1998-11-24 Bristol-Myers Squibb Company C4 methoxy ether derivatives of paclitaxel
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5705503A (en) 1995-05-25 1998-01-06 Goodall; Brian Leslie Addition polymers of polycycloolefins containing functional substituents
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
CA2230494A1 (en) 1995-08-31 1997-03-06 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Composition for sustained release of an agent
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
EP0871490B1 (en) 1995-12-22 2003-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
NZ512006A (en) 1996-02-09 2005-05-27 Abbott Biotech Ltd Medical treatment with human TNF-alpha antibodies
IT1282692B1 (it) 1996-02-27 1998-03-31 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per l'uso in terapia
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
WO1998008833A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Bristol-Myers Squibb Company Sulfenamide taxane derivatives
US5773464A (en) 1996-09-30 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company C-10 epoxy taxanes
WO1998022451A1 (fr) 1996-11-19 1998-05-28 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Derives taxol
US5977386A (en) 1996-12-24 1999-11-02 Bristol-Myers Squibb Company 6-thio-substituted paclitaxels
WO1998031346A1 (en) 1997-01-16 1998-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
JP2001511811A (ja) 1997-02-13 2001-08-14 ボーン ケア インターナショナル インコーポレイテッド ビタミンｄ化合物の標的治療放出
DE69832158T2 (de) 1997-02-25 2006-08-10 Arizona Board Of Regents, Tempe Isolierung und strukturelle aufklärung der kryostatischen linearen und cyclo-depsipeptide dolastatin 16, dolastatin 17, und dolastatin 18
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
JPH1192468A (ja) 1997-09-17 1999-04-06 Yakult Honsha Co Ltd 新規なタキサン誘導体
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
WO1999018113A1 (fr) 1997-10-08 1999-04-15 Bio Research Corporation Of Yokohama Derives taxoides et leur procede de production
US6555367B1 (en) 1997-10-10 2003-04-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
AU6186900A (en) 1999-07-31 2001-02-19 Kyu Jin Park Study method and apparatus using digital audio and caption data
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
AU2001271273A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Ludwig Institute For Cancer Research Multicomponent conjugates which bind to target molecules and stimulate cell lysis
DK1522590T3 (da) 2000-06-28 2009-12-21 Glycofi Inc Fremgangsmåde til fremstilling af modificerede glykoproteiner
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20110313230A1 (en) 2001-05-11 2011-12-22 Terrance Grant Johns Specific binding proteins and uses thereof
US7589180B2 (en) 2001-05-11 2009-09-15 Abbott Laboratories Inc. Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
WO2003016466A2 (en) 2001-08-17 2003-02-27 Eli Lilly And Company ANTI-Aβ ANTIBODIES
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040028687A1 (en) 2002-01-15 2004-02-12 Waelti Ernst Rudolf Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutic substances to specific cells and tissues
JP2005538049A (ja) 2002-05-01 2005-12-15 トレリス バイオサイエンス、インク． ２元的ないし多元的ターゲティング及びその使用
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US7659241B2 (en) 2002-07-31 2010-02-09 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
AU2003259163B2 (en) 2002-08-16 2008-07-03 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
US7388079B2 (en) 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
CN1942588B (zh) 2003-03-05 2013-06-12 海洋酶公司 可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、制备它们的方法、它们的用途和包含它们的药物组合物
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
EP1639092B1 (en) * 2003-06-27 2016-01-06 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
JP2007528723A (ja) 2003-08-22 2007-10-18 メディミューン，インコーポレーテッド 抗体のヒト化
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
WO2005081898A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Binding peptidomimetics and uses of the same
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
SI2270010T1 (sl) 2004-03-01 2012-05-31 Spirogen Ltd hidroksi H pirolo c benzodiazepin onski derivati kot ključni intermediati za pripravo C substituiranih pirolobenzodiazepinov
US20050226882A1 (en) 2004-04-08 2005-10-13 Awdalla Essam T Method and multicomponent conjugates for treating cancer
CN104611245A (zh) 2004-04-15 2015-05-13 格利科菲公司 在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
CN101438252A (zh) 2004-10-07 2009-05-20 爱莫里大学 多功能纳米粒子共轭体及其应用
US7263946B2 (en) 2004-11-01 2007-09-04 Craig Worthy System for measuring chain or rope deployment
EP1695717A1 (en) 2005-02-23 2006-08-30 Ludwig-Maximilians-Universität Transport of nano-and macromolecular structures into cytoplasm and nucleus of cells
PT1879901E (pt) 2005-04-21 2010-03-29 Spirogen Ltd Pirrolobenzodiazepinas
US7447597B2 (en) 2005-05-06 2008-11-04 Exxonmobil Research And Engineering Company Data processing/visualization method for two (multi) dimensional separation gas chromatography xmass spectrometry (GCxMS) technique with a two (multiply) dimensional separation concept as an example
US8039273B2 (en) 2005-07-18 2011-10-18 Seattle Genetics, Inc. β-glucuronide-linker drug conjugates
EP2041175A4 (en) 2006-06-23 2011-03-16 Augmenta Biolog Llc TARGETED IMMUNOJUGATE
EP2068929A4 (en) 2006-09-15 2010-04-28 Life Science Pharmaceuticals METHOD OF DETECTING AND TREATING SKIN DISORDERS
US7598028B2 (en) 2006-11-28 2009-10-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for detecting and treating prostate disorders
CN104013956B (zh) * 2007-01-25 2018-12-18 达娜-法勃肿瘤研究所公司 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
NZ593450A (en) 2007-02-02 2012-08-31 Baylor Res Inst Vaccines based on targeting antigen to dcir expressed on antigen-presenting cells
TWI422594B (zh) 2007-02-02 2014-01-11 Baylor Res Inst 經由樹狀細胞去唾液酸糖蛋白受體（ｄｃ-ａｓｇｐｒ）接合抗原呈現細胞之藥劑
DK2129396T3 (da) 2007-02-16 2013-11-25 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antistoffer mod ErbB3 og anvendelser deraf
US8481314B2 (en) 2007-02-23 2013-07-09 Baylor Research Institute Activation of human antigen-presenting cells through dendritic cell lectin-like oxidized LDL receptor-1 (LOX-1)
KR20090118981A (ko) 2007-02-23 2009-11-18 베일러 리서치 인스티튜트 Ｃｌｅｃ-6을 통한 사람 항원제시세포의 활성화
AU2008227123B2 (en) 2007-03-15 2014-03-27 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Treatment method using EGFR antibodies and src inhibitors and related formulations
JP5394246B2 (ja) * 2007-03-30 2014-01-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートとこれらの使用方法
WO2008121420A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
EP1985633A1 (en) * 2007-04-26 2008-10-29 LFB Biotechnologies Kit of parts for the treatment of cancer or infectious diseases
DK2208737T3 (en) 2007-05-03 2017-09-18 Lysomab Gmbh Complement factor H-derived short-consensus repeat antibody constructs
CA2696360C (en) 2007-08-14 2018-11-20 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibody targeting the egfr receptor and uses thereof
JP5635912B2 (ja) 2008-01-15 2014-12-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 改善された哺乳動物発現ベクター及びその使用
FR2931243A1 (fr) 2008-05-14 2009-11-20 Inst Francais Du Petrole Procede pour determiner des proprietes physico-chimiques d'un echantillon petrolier a partir de chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle
US20090285757A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Northeastern University Methods of targeting cells for diagnosis and therapy
JP2012501180A (ja) 2008-08-26 2012-01-19 シティ・オブ・ホープ Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能増進のための方法および組成物
AU2010229192A1 (en) 2009-03-06 2011-09-29 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to 24P4C12 proteins
WO2010111198A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compounds compositions and methods of treating cancer and fibrotic diseases
DE102009026075A1 (de) 2009-06-30 2011-01-05 Röhm Gmbh Bohrvorrichtung
US20110076232A1 (en) 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
WO2011057216A1 (en) 2009-11-06 2011-05-12 The Pennsylvania State Research Foundation Bioconjugation of calcium phosphosilicate nanoparticles for selective targeting of cells in vivo
GB0919751D0 (en) 2009-11-11 2009-12-30 King S College Hospital Nhs Fo Conjugate molecule
US20110217363A1 (en) 2010-03-05 2011-09-08 Bionanox Two-step targeted tumor therapy with prodrug encapsulated in nanocarrier
JP5972864B2 (ja) 2010-04-15 2016-08-17 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン及びそれらのコンジュゲート
KR101671360B1 (ko) 2010-04-15 2016-11-01 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
EP2582728B1 (en) * 2010-06-15 2017-08-23 Genmab A/S Human antibody drug conjugates against tissue factor
WO2012027494A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Regents Of The University Of Minnesota Bispecific targeting reagents
ES2874306T3 (es) * 2010-09-29 2021-11-04 Agensys Inc Conjugados de anticuerpos y fármacos (CAF) que se unen a las proteínas 191P4D12
CA2815277A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Immunogen, Inc. Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
KR102243575B1 (ko) 2010-12-09 2021-04-22 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
RU2014121820A (ru) * 2011-11-21 2015-12-27 Иммьюноджен, Инк. Способ лечения опухолей, устойчивых к анти-egfr терапиям, с помощью конъюгата антитела egfr с цитотоксическим средством
AR091023A1 (es) 2012-05-11 2014-12-30 Abbvie Inc Inhibidores del nampt
KR102313997B1 (ko) 2013-02-20 2021-10-20 노파르티스 아게 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
PT2968552T (pt) * 2013-03-14 2020-05-18 Scripps Research Inst Anticorpo dos agentes alvo, combinações e uso para os mesmos
BR112015023520A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-24 Abbvie Inc purificação do conjugado de anticorpo-fármaco (adc)
TWI689313B (zh) 2013-03-15 2020-04-01 德商艾伯維德國有限及兩合公司 抗-ｅｇｆｒ抗體藥物結合物調配物
WO2015057852A1 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 The California Institute For Biomedical Research Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
TWI684600B (zh) 2014-03-21 2020-02-11 美商艾伯維有限公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及抗體藥物結合物

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016012207A (es) 2017-04-06
DOP2016000252A (es) 2016-11-15
PH12016501828A1 (en) 2016-12-19
EP4218929A1 (en) 2023-08-02
US20150337042A1 (en) 2015-11-26
US20200405878A1 (en) 2020-12-31
MX2021010471A (es) 2021-10-01
AR121749A2 (es) 2022-07-06
JP2024102229A (ja) 2024-07-30
IL295906A (en) 2022-10-01
CN106459200A (zh) 2017-02-22
RU2020124944A (ru) 2020-08-27
CN110845616A (zh) 2020-02-28
TW201623332A (zh) 2016-07-01
CN110841074A (zh) 2020-02-28
CR20210097A (es) 2022-04-27
RU2016141267A (ru) 2018-04-24
US20220288221A1 (en) 2022-09-15
CL2016002359A1 (es) 2017-05-12
US20180125999A1 (en) 2018-05-10
KR20160138177A (ko) 2016-12-02
AU2023203573A1 (en) 2023-07-06
SG11201607746QA (en) 2016-10-28
JP2020039360A (ja) 2020-03-19
KR20220123560A (ko) 2022-09-07
CA2942101A1 (en) 2015-09-24
TWI731535B (zh) 2021-06-21
ECSP16082556A (es) 2018-05-31
CN106459200B (zh) 2019-12-06
BR112016021717A2 (pt) 2018-07-10
CL2021000458A1 (es) 2021-07-19
DOP2021000023A (es) 2021-03-15
NZ724184A (en) 2023-12-22
EP3126006A1 (en) 2017-02-08
SG10201908460YA (en) 2019-11-28
US9493568B2 (en) 2016-11-15
AR099812A1 (es) 2016-08-17
JP2017511376A (ja) 2017-04-20
CR20160487A (es) 2017-04-26
SG10201808837RA (en) 2018-11-29
CN111378041A (zh) 2020-07-07
US20170072065A1 (en) 2017-03-16
US20190134216A1 (en) 2019-05-09
CL2018001000A1 (es) 2018-12-21
PE20161211A1 (es) 2016-11-27
US9827330B2 (en) 2017-11-28
IL247936A0 (en) 2016-11-30
TWI684600B (zh) 2020-02-11
CN110845615B (zh) 2023-10-20
AU2015231001A1 (en) 2016-09-29
AU2020250319A1 (en) 2020-11-12
PE20211798A1 (es) 2021-09-13
RU2016141267A3 (uk) 2018-11-14
US10098968B2 (en) 2018-10-16
TW202214691A (zh) 2022-04-16
JP2021104030A (ja) 2021-07-26
WO2015143382A1 (en) 2015-09-24
TW202330606A (zh) 2023-08-01
CN111378041B (zh) 2024-08-02
CN110845615A (zh) 2020-02-28
KR20220025946A (ko) 2022-03-03
UY36041A (es) 2015-09-30
CN110841074B (zh) 2023-07-18
NZ762843A (en) 2023-12-22
TW202039576A (zh) 2020-11-01
JP2023062162A (ja) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125575C2 (uk) Кон'югат, що містить антитіло проти egfr та лікарський засіб
JP2021006527A (ja) 抗ｂ７−ｈ３抗体及び抗体薬物コンジュゲート
US20230135723A1 (en) Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
AU2022259796A1 (en) Antibody drug conjugates comprising STING agonists
EP3612567B1 (en) Anti-vtcn1 antibodies and antibody drug conjugates
US20200147235A1 (en) Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
CA3027103A1 (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
CA3027044A1 (en) Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
CA3027178A1 (en) Anti-egfr antibody drug conjugates
US20200002432A1 (en) Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
CA2990300A1 (en) Site specific homogeneous conjugates with ksp inhibitors
KR20210033470A (ko) 효소에 의해 절단 가능한 링커 및 개선된 활성 프로파일을 갖는, cxcr5에 대해 유도된 결합제-약물 접합체
JP2020527332A (ja) 抗−ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
TW202039007A (zh) 荷伯希二烯(herboxidiene)剪接調節抗體-藥物結合物及其使用方法