RU96116815A

RU96116815A - Способ амплификации нуклеиновой кислоты

Info

Publication number: RU96116815A
Application number: RU96116815/13A
Authority: RU
Inventors: Эдвард Бирч Дэвид; Джозеф Лэрд Уолтер; Энтони Зокколи Майкл
Original assignee: Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 1998-11-20

Claims

1. Термостабильный фермент, который обратимо инактивируют путем химической модификации, отличающийся тем, что инкубация химически модифицированного термостабильного фермента в водном буфере при щелочном значении pH при температуре ниже приблизительно 25^oС не приводит к существенному увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 мин и где инкубация химически модифицированного фермента в водном буфере, значение рН которого доведено до приблизительно 8-9 при 25^oС, при температуре выше приблизительно 50^oС приводит по крайней мере к двукратному увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 мин.

2. Химически модифицированный термостабильный фермент по п. 1, где ферментативная активность является активностью термостабильной ДНК-полимеразы или активностью термостабильной лигазы.

3. Химически модифицированный термостабильный фермент по п. 1, где ферментативная активность является активностью термостабильной ДНК-полимеразы и что термостабильная ДНК-полимераза происходит из видов бактерий, выбранных из группы родов, состоящей из Thermus aguaticus, Thermus thermophilus и Thermotoga maritima.

4. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-3, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом.

5. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-3, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где реакцию проводят при щелочном значении рН при температуре ниже приблизительно 25^oС, где реагентом является ангидрид дикарбоновой кислоты общей формулы:

где R₁ и R₂ обозначают водород или органические радикалы, которые могут быть связаны, или общей формулы:

где R₁ и R₂ обозначают органические радикалы, которые предпочтительно связаны, и атомы водорода находятся в цис-положении, и где реакция приводит к практически полной инактивации ферментативной активности.

6. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-3, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где указанный модифицирующий реагент выбирают из группы, включающей малеиновый ангидрид, экзо-цис-3,6-эндоксо-Δ⁴-тетрагидрофталевый ангидрид, цитраконовый ангидрид, 3,4,5,6-тетрагидрофталевый ангидрид, цис-аконитовый ангидрид и 2,3-диметилмалеиновый ангидрид.

7. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-6, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где указанный модифицирующий реагент используют более чем в 20-кратном молярном избытке по отношению к термостабильному ферменту.

8. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-7, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где термостабильным ферментом является термостабильная ДНК-полимераза, происходящая из Thermus aguaticus, и где модифицирующим реагентом является цитраконовый ангидрид.

9. Химически модифицированный термостабильный фермент по любому из п.п. 1-7, который получают путем реакции смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где термостабильным ферментом является термостабильная ДНК-полимераза, происходящая из Thermus thermophilus, и где модифицирующим реагентом является цис-аконитовый ангидрид.

10. Способ получения химически модифицированного термостабильного фермента, который обратимо инактивируют, включающий взаимодействие смеси термостабильного фермента с модифицирующим реагентом, где реакцию проводят при щелочном значении рН при температуре ниже приблизительно 25^oС, где реагентом является ангидрид дикарбоновой кислоты общей формулы:

11. Способ амплификации, содержащейся в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающий следующие стадии: (а) введение образца в контакт с реакционной смесью для амплификации, содержащей праймер, комплементарный нуклеиновой кислоте-мишени, и химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-9, и (б) инкубацию образовавшейся на стадии (а) смеси при температуре выше приблизительно 50^oС в течение промежутка времени, достаточного для реактивации химически модифицированного термостабильного фермента и позволяющего образовать продукты удлинения праймера.

12. Амплификация путем полимеразной реакции синтеза цепи смеси, содержащей пару праймеров и химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-9.

13. Набор для проведения полимеразной реакции синтеза цепи, содержащий химически модифицированный термостабильный фермент по любому из пп. 1-9.

14. Изобретение, как оно описано выше.