PT2331537E - Derivados de 1-((5-heteroariltiazol-2-il)aminocarbonil)pirrolidina-2-carboxamida como inibidores de fosfatidilinositol 3-quinase (pi3k) úteis no tratamento de doenças proliferativas - Google Patents

Derivados de 1-((5-heteroariltiazol-2-il)aminocarbonil)pirrolidina-2-carboxamida como inibidores de fosfatidilinositol 3-quinase (pi3k) úteis no tratamento de doenças proliferativas Download PDF

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PT2331537E
PT2331537E PT97827778T PT09782777T PT2331537E PT 2331537 E PT2331537 E PT 2331537E PT 97827778 T PT97827778 T PT 97827778T PT 09782777 T PT09782777 T PT 09782777T PT 2331537 E PT2331537 E PT 2331537E
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PT
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compound
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cancer
pharmaceutically acceptable
quot
Prior art date
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PT97827778T
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Caravatti Giorgio
Alec Fairhurst Robin
Furet Pascal
Guagnano Vito
Imbach Patricia
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Novartis Ag
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Description

DESCRIÇÃO
"DERIVADOS DE 1-((5-HETEROARILTIAZOL-2-IL)AMINOCARBONIL)PIRROLIDINA-2-CARBOXAMIDA COMO INIBIDORESDE FOSFATIDILINOSITOL 3-QÜINASE (PI3K) ÚTEIS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS PROLIFERATIVAS" A presente invenção diz respeito a um derivadoespecifico de 2-carboxamida-cicloamino-ureia, como um novocomposto inibidor de fosfatidilinositol (PI) 3-quinase,alfa-seletivo. Esta invenção diz também respeito a composições, quer isoladamente quer em combinação com pelomenos um agente terapêutico adicional, e opcionalmente emcombinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Estainvenção diz ainda respeito adicionalmente ao composto parautilização, quer isoladamente quer em combinação com pelomenos um agente terapêutico adicional, no tratamento de umasérie de doenças, em particular, aquelas que são mediadaspor uma ou mais de entre atividade anormal de fatores decrescimento, tirosina quinases recetoras, proteínaserina/heroína quinases, recetores acoplados a proteína G efosfolipído quinases e fosfatases.
Fosfatidilinositol 3-quinases (Pl3Ks) compreendemuma família de quinases lípidas que catalisam atransferência de fosfato para a posição D-3' de lípidosinositol para produzir fosfoinositol-3-fosfato (PIP), fosfoinositol-3,4-difosfato (PIP2) e fosfoinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) que, por sua vez, atuam como segundosmenssageiros na sinalização de cascatas por acoplamento deproteínas contendo homologia de pleckstrina, FYVE, Phox eoutros domínios de ligação a fosfolipídos numa variedade decomplexos de sinalização frequentemente na membranaplasmática ((Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem70:535 (2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol.17:615 (2001)). De entre as duas Classe 1 Pl3Ks, Classe IAPl3Ks são heterodímeros compostos de uma subunidade pllOcatalítica (isoformas α, β, δ) associados constitutivamentecom uma subunidade reguladora que pode ser ρ85α, p55a,ρ50α, ρ85β ou ρ55γ. A sub-classe da Classe 1B tem um membroda família, um heterodímero composto por uma subunidadeρΙΙΟγ catalítica associado a uma de duas subunidadesreguladoras, plOl ou p84 (Fruman et al., Annu Rev. Biochem.67:481 (1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566 (2005)). Osdomínios modulares das subunidades p85/55/50 incluemdomínios de Homologia Src (SH2) que se ligam a resíduos defosfotirosina num contexto de sequência específico emrecetor ativado e tirosina quinases citoplasmáticas,resultando em ativação e localização da Classe IA Pl3Ks. AClasse IB PI3K é ativada diretamente por recetoresacoplados à proteína G que se ligam a um reportóriodiversificado de ligandos péptidos e não-péptidos (Stephenset al., Cell 89:105 (1997)); Katso et al., Annu. Rev. CellDev. Biol. 17:615-675 (2001)). Consequentemente, osprodutos fosfolipídicos resultantes da class I PI3Kconectam recetores a montante com atividades celulares a jusante incluindo proliferação, sobrevivência, quimiotaxia,tráfego celular, mobilidade, metabolismo, respostasinflamatórias e alérgicas, transcrição e tradução (Cantleyet al., Cell 64:281 (1991); Escobedo e Williams, Nature335:85 (1988); Fantl et al., Cell 69:413 (1992)).
Em muitos casos, PIP2 e PIP3 recrutam Akt, oproduto do homólogo humano do oncogene viral v-Akt, para amembrana plasmática onde atua como um ponto nodal paramuitas vias de sinalização intracelulares importantes parao crescimento e sobrevivência (Fantl et al., Cell 69:413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer 5:921 (2005);Vivanco and Sawyer, Nature Rev. Cancer 2:489 (2002)).Regulação aberrante de PI3K, que frequentemente aumenta asobrevivência através da ativação de Akt, é um dos eventosmais prevalentes no cancro humano e comprovou-se que acorrea múltiplos níveis. O gene supressor do tumor PTEN, o qualdesfosforila fosfoinositidos na posição 3' do anel inositole ao fazer isso antagoniza a atividade PI3K, é funcio¬nalmente deletado numa variedade de tumores. Noutrostumores, os genes para a isoforma pllOa, PIK3CA, e paraAkt são amplificados e foi demonstrado aumento da expressãoda proteína dos seus produtos génicos em diversos cancroshumanos. Além disso, foram descritas mutações e translo-cação de p85a que servem para supra-regular o complexop85-pll0 em cancros humanos. Finalmente, mutações somáticasde sentido errado em PIK3CA que ativam vias de sinalizaçãoa jusante foram descritas em frequências significativasnuma ampla diversidade de cancros humanos (Rang et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:802 (2005); Samuels et al.,Science 304:554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell 7:561-573 (2005)) . Estas observações mostram que a desregulaçãode fosfoinositol-3 quinase e os componentes desta via desinalização a montante e a jusante é uma das mais communsdesregulações associadas aos cancros humanos e doençasproliferativas (Parsons et al., Nature 436:792 (2005);Hennessey at el., Nature Rev. Drug Disc. 4:988-1004(2005)).
Tendo em conta o que foi exposto, os inibidoresde PI3K alfa serão de especial valor no tratamento dedoença proliferativa e outros distúrbios. WO2004/096797 divulga determinados derivados detiazole enquanto inibidores de PI3K gama e a sua utilizaçãofarmacêutica, em particular no tratamento de estados inflamatórios e alérgicos. WO 2005/021519 também divulga determinados deri¬vados de tiazole enquanto inibidores de PI3K gama e suautilização farmacêutica, em particular no tratamento deestados inflamatórios e alérgicos. WO 2006/051270 divulga também determinados deri¬vados de tiazole enquanto inibidores de PI3K alfa e suautilização farmacêutica, em particular devido a atividadeanti-tumor. WO 2007/129044 divulga também determinadosderivados de tiazole enquanto inibidores de PI3K alfa e suautilização farmacêutica, em particular devido a atividadeanti-tumor.
Na perspectiva da técnica anterior, existe umanecessidade de fornecer mais compostos adequados aotratamento de doenças proliferativas, em particular parafornecer compostos que possuam seletividade melhorada e/ouatividade superior/melhorada.
Verificou-se agora que o derivado de 2-carbo-xamida-cicloamino-ureia da invenção adiante apresentadopossui propriedades farmacológicas vantajosas e inibe, porexemplo, PI3K (fosfatidilinositol 3-quinase) . Em particu¬lar, este composto mostra seletividade para PI3K alfarelativamente aos subtipos beta e/ou, delta e/ou gama.Consequentemente, o composto da invenção é adequado, porexemplo, para ser utilizado no tratamento de doenças quedependam de PI3 quinases (em particular PI3K alfa, taiscomo as que mostram sobre-expressão ou amplificação de PI3Kalfa, mutação somática de PIK3CA ou mutações na linhagerminal ou mutação somática de PTEN ou mutações etranslocação de p85a que servem para supra-regular ocomplexo p85-pll0), em especial doenças proliferativas taiscomo doenças tumorais e leucemias.
Para além disto, este composto mostra preferen¬cialmente estabilidade metabólica melhorada e consequen- temente depuração reduzida, conduzindo a perfis farmaco-cinéticos melhorados.
Num primeiro aspeto, a presente invenção propor¬ciona o composto 2-Amida 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) do áci¬do (S)-pirrolidino-1,2-dicarboxílico, com a estrutura:
na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente acei¬tável . A invenção pode ser entendida de forma maiscompleta com referência à descrição que se segue, incluindoo glossário de termos que se segue e os exemplosconclusivos. Tal como aqui são utilizados, os termos"incluindo", "contendo" e "compreendendo" são aqui utili¬zados no seu sentido aberto, não limitativo.
Qualquer fórmula aqui fornecida pretende repre¬sentar hidratos, solvatos, e polimorfos de tais compostos,e suas misturas.
Qualquer fórmula aqui fornecida pretende também representar formas não marcadas dos compostos assim comoformas marcadas isotopicamente. Os compostos isotopicamentemarcados possuem estruturas representadas pelas fórmulasaqui fornecidas exceto que um ou mais átomos sãosubstituídos por um átomo possuindo uma massa atômica ounúmero de massa selecionado. Exemplos de isótopos que podemser incorporados em compostos da invenção incluem isótoposde hidrogênio, carbono, azoto, oxigênio, fósforo, flúor, ecloro, tais como 2H, 3H, 1Χ0, 13C, 14C, 15N, 18F 31P, 32P, 35S,36C1, 125I respetivamente. A invenção inclui diversoscompostos marcados isotopicamente tal como aqui definido,por exemplo aqueles nos quais os isótopos radioativos, taiscomo 3H, 13C, e 14C, estão presentes. Tais compostosisotopicamente marcados são úteis em estudos metabólicos(preferencialmente com 14C), estudos cinéticos de reação(com, por exemplo 2H ou 3H), técnicas de deteção ouimagiologia, tais como tomografia de emissão de positrões(PET) ou tomografia computorizada por emissão de fotãoúnico (SPECT) incluindo ensaios de distribuição de fármacoou substrato nos tecidos, ou no tratamento radioativo depacientes. Em particular, um 18F ou composto marcado podeser preferido especificamente para estudos PET ou SPECT. Oscompostos desta invenção marcados isotopicamente e seuspró-fármacos podem genericamente ser preparados levando acabo os procedimentos revelados nos esquemas ou nosexemplos e preparações adiante descritos substituindo umreagente não isotopicamente marcado por um reagente marcadoisotopicamente prontamente disponível.
Para além disto, a substituição com isótopos maispesados, em particular deutério (i.e., 2H ou D) podeacarretar determinadas vantagens terapêuticas resultantesda maior estabilidade metabólica, por exemplo semividaaumentada in vivo ou requisitos de dosagem reduzidos ou umamelhoria no índice terapêutico. É tido em consideração queo deutério neste contexto é considerado um substituinte deum composto da invenção. A concentração de um tal isótopomais pesado, especificamente deutério, pode ser definidapelo fator de enriquecimento isotópico. 0 termo "fator deenriquecimento isotópico" tal como aqui é utilizadosignifica a proporção entre a abundância isotópica e aabundância natural de um isótopo especifico. Se umsubstituinte num composto desta invenção é indicado comodeutério, tal composto tem um fator de enriquecimentoisotópico por cada átomo de deutério designado de pelomenos 3500 (52,5% de incorporação de deutério em cada átomode deutério designado), pelo menos 4000 (60% de incor¬poração de deutério), pelo menos 4500 (67,5% de incor¬poração de deutério), pelo menos 5000 (75% de incorporaçãode deutério), pelo menos 5500 (82,5% de incorporação dedeutério), pelo menos 6000 (90% de incorporação de deu¬tério), pelo menos 6333,3 (95% de incorporação de deuté¬rio), pelo menos 6466,7 (97% de incorporação de deutério),pelo menos 6600 (99% de incorporação de deutério), ou pelomenos 6633,3 (99,5% de incorporação de deutério). Noscompostos desta invenção qualquer átomo não designadoespecificamente como um isótopo em particular pretenderepresentar qualquer isótopo estável desse átomo. A não ser que seja de outra forma explicitado, quando uma posição éespecificamente designada como "H" ou "hidrogênio",considera-se que a posição tem hidrogênio na sua composiçãoisotópica em abundância natural. Portanto, nos compostosdesta invenção qualquer átomo especificamente designadocomo um deutério (D) pretende representar deutério, porexemplo nas gamas anteriormente referidas.
Onde a forma plural (e.g. compostos, sais) éutilizada, isto inclui o singular (e.g. um composto único,um sal único) . "Um composto" não exclui que (e.g. numaformulação farmacêutica) mais do que um composto dainvenção (ou um seu sal) esteja presente.
As definições gerais que se seguem deverão seraplicadas nesta memória descritiva, exceto se forespecificado de outro modo:
Halogéneo (ou halo) significa flúor, bromo, cloro ouiodo, em particular flúor, cloro. Grupos e porçõessubstituídos com halogéneo, tais como alquilo substi¬tuído por halogéneo (haloalquilo) podem ser mono-,poli- ou per-halogenados. "Tratamento" inclui tratamento profilático (preven¬tivo) e terapêutico assim como o retardar da pro¬gressão de uma doença ou distúrbio. "Doenças mediadas por PI3 quinase" (em especial doenças mediadas por PI3K alfa ou doenças mediadas porsobre-expressão ou amplificação de PI3K alfa, mutaçãosomática de PIK3CA ou mutações da linha germinal oumutação somática de PTEN ou mutações e translocação dep85a que servem para supra-regular o complexo p85-pllO), são especialmente os distúrbios que respondemde uma forma benéfica (e.g. melhoria de um ou maissintomas, retardar do inicio da doença, até à curatemporária ou completa de uma doença) à inibição deuma PI3 quinase, em especial inibição de PI3K alfa ouuma sua forma mutante (onde de entre as doenças a sertratadas, as doenças proliferativas tais como doençastumorais e leucemias podem ser especialmente mencio¬nadas) . "Sais" (que, quer seja na aceção de "ou seus sais" ou"ou um seu sal"), podem estar presentes isoladamenteou em mistura com o composto livre da invenção e sãopreferencialmente sais farmaceuticamente aceitáveis.Tais sais são formados, por exemplo, como sais deadição de ácido, preferencialmente com ácidosorgânicos ou inorgânicos, a partir de compostos dainvenção com um átomo de azoto básico, em especial ossais farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicosadequados são, por exemplo, ácidos halídricos, taiscomo ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ou ácidofosfórico. Ácidos orgânicos adequados são, e.g.,ácidos carboxílicos ou ácidos sulfónicos, tais comoácido fumárico ou ácido metanossulfónico. Para fins de isolamento ou purificação é também possível utilizarsais farmacêuticamente não aceitáveis, por exemplopicratos ou percloratos. Para utilização terapêutica,são empregues apenas sais farmaceuticamente aceitáveisou compostos livres (quando aplicável sob a forma depreparações farmacêuticas), e estes são por issopreferidos. Tendo em vista a relação próxima entre osnovos compostos na forma livre e aqueles que estão soba forma dos seus sais, incluindo aqueles sais quepodem ser usados como intermediários, por exemplo napurificação ou identificação dos novos compostos,qualquer referência aos compostos livres aqui usadaquer anteriormente quer daqui em diante deverá serentendida como dizendo respeito também aos saiscorrespondentes, conforme for apropriado e oportuno.Os sais de compostos da invenção são preferencialmentesais farmaceuticamente aceitáveis; contraiõesadequados formando sais farmaceuticamente aceitáveissão conhecidos neste campo. "Combinação" significa ou uma combinação fixa numaforma unitária de dosagem, ou um estojo (kit) departes para a administração combinada quando umcomposto da invenção e um parceiro de combinação (e.g.outro fármaco tal como explicado adiante, tambémreferido como "agente terapêutico" ou "co-agente")podem ser administrados independentemente ao mesmotempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo,em especial quando estes intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação mostrem um efeitocooperativo, e.g. sinérgico. Os termos "co-adminis-tração" ou "administração combinada" ou semelhantestal como aqui são utilizados pretendem enqlobar aadministração do parceiro de combinação selecionado aum sujeito único que dele necessite (e.g. umpaciente), e pretendem incluir regimes de tratamentonos quais os agentes não são necessariamenteadministrados pela mesma via de administração ou aomesmo tempo. 0 termo "combinação farmacêutica" talcomo aqui é utilizado significa um produto que resultada mistura ou combinação de mais do que um ingredienteativo e inclui combinações quer fixas quer não fixasdos ingrediente ativos. 0 termo "combinação fixa"significa que os ingredientes ativos, e.g. um compostoda invenção e um parceiro de combinação, são ambosadministrados a um paciente simultaneamente sob aforma de uma entidade ou dosagem únicas. 0 termo"combinação não fixa" significa que os ingredientesativos, e.g. um composto da invenção e um parceiro decombinação, são ambos administrados a um paciente comoentidades separadas quer simultaneamente, querconcorrentemente quer sequencialmente sem limitestemporais específicos, em que tal administraçãoproporciona níveis terapeuticamente eficazes dos doiscompostos no corpo do paciente. Esta última também seaplica à terapia de coquetel (cocktail), e.g. aadministração de três ou mais ingredientes ativos.
Em modelos de realização preferidos, que sãopreferidos independentemente, coletivamente ou em qualquercombinação ou sub-combinação, a invenção diz respeito a umcomposto da invenção, sob a forma de base livre ou sob aforma de sal de adição de ácido, em que os substituintessão tal como aqui definidos.
Podem ser proporcionados pró-fármacos farmaceu-ticamente aceitáveis de um composto da invenção.
Podem ser proporcionados metabolitos farmaceuti-camente aceitáveis de um composto da invenção. A presente invenção também diz respeito aprocessos para a produção de um composto da invenção. Emprincipio todos os processos conhecidos que convertem duasaminas diferentes num derivado de ureia correspondente sãoadequados e podem ser aplicados usando o respetivo materialde partida.
Assim, a invenção em particular diz respeito a umprocesso para fabrico de um composto da invenção, quecompreende a reação de um composto da fórmula (II)
(II) quer com um composto da fórmula (IIIA)
(MIA)
em que os substituintes e A são definidos como corres¬pondendo ao composto desta invenção e R3 pode adicio¬nalmente representar Cloro, na presença de um agente deativação ("método A"), quer com um composto da fórmula(IIIB) (MB) em que R1 e R2 são definidos como correspondendo aocomposto desta invenção, R3 é definido como correspondendoao composto desta invenção e pode adicionalmenterepresentar Cloro e RG representa um grupo reativo, talcomo imidazolilcarbonilo, que pode reagir diretamente oupela formação do intermediário isocianato da fórmula (IIIE) ("método B") ,
em que os substituintes são tal como definido em (IIIB), em cada caso opcionalmente na presença de um diluente eopcionalmente na presença de um auxiliar de reação e recuperando o composto resultante da invenção sob a formalivre ou sob a forma de um sal e, opcionalmente convertendoum composto da invenção obtenível de acordo com o método Aou método B num composto diferente, e/ou convertendo um salobtenível de um composto da invenção num seu sal diferente,e/ou convertendo um composto livre obtenível da invençãonum seu sal, e/ou separando um isómero obtenível de umcomposto da invenção de um ou mais isómeros diferentesobteníveis do composto da invenção.
Condições de reação 0 processo pode ser executado de acordo commétodos conhecidos na técnica, ou tal como revelado adiantenos Exemplos. Por exemplo um composto da fórmula II podemser sujeito a reação com um composto da fórmula III num solvente, e.g. dimetilformamida, na presença de uma basee.g. uma amina orgânica, e.g. trietilamina.
Quando as temperaturas são dadas aqui anterior¬mente e doravante, "cerca de" tem de ser adicionado, poisdesvios menores a partir dos valores numéricos dados, e.g.variações de ±10%, são toleráveis.
Todas as reações podem ocorrer na presença de umou mais diluentes e/ou solventes. Os materiais de partidapodem ser usados em quantidades equimolares; em alterna¬tiva, um composto pode ser usado em excesso, e.g. parafuncionar como um solvente ou para alterar o equilíbrio oupara genericamente acelerar as velocidades de reação.
Auxiliares de reação, tais como ácidos, bases oucatalisadores podem ser adicionados em quantidadesadequadas, tal como é sabido neste campo, requeridos poruma reação e em linha com procedimentos genericamenteconhecidos.
Grupos protetores
Se um ou mais outros grupos funcionais, porexemplo carboxi, hidroxi, amino, sulfidril ou semelhantesestão ou precisam de ser protegidos num material de partidatal como aqui descrito ou qualquer outro precursor, porquenão devem tomar parte da reação ou perturbar a reação,estes são os tais grupos que normalmente são usados na síntese de compostos péptidos, e também de cefalosporinas epenicilinas, assim como derivados de ácido nucleico eaçúcares. Grupos protetores são os grupos que já não estãopresentes nos compostos finais uma vez que são removidos,enquanto que os grupos que permanecem como substituintesnão são grupos protetores no sentido aqui usado que serefere a grupos que são adicionados a um material departida ou etapa intermédia e removidos para obter umcomposto final.
Os grupos protetores podem já estar presentes emprecursores e devem proteger os grupos funcionais emquestão face a reações secundárias indesejadas, tais comoacilações, eterificações, esterificações, oxidações, solvó-lises, e reações similares. É uma característica dos gruposprotetores que eles se prestem a eles próprios prontamente, i.e. sem reações secundárias indesejadas, a remoção,tipicamente por acetólise, protonólise, solvólise, redução,fotólise ou também por atividade enzimática, por exemplosob condições análogas às condições fisiológicas, e que nãoestejam presentes nos produtos finais. 0 especialista sabe,ou pode facilmente definir, que grupos protetores sãoadequados às reações mencionadas anteriormente e adiante. A proteção de tais grupos funcionais por taisgrupos protetores, os próprios grupos protetores, e as suasreações de remoção estão descritos por exemplo em trabalhospadrão de referência, tais como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press,Londres e Nova Iorque 1973, in T. W. Greene, "ProtectiveGroups in Organic Synthesis", Terceira edição, Wiley, NovaIorque 1999, in "The Peptides"; Volume 3 (editores: E.Gross e J. Meienhofer), Academic Press, Londres e NovaIorque 1981, in "Methoden der organischen Chemie" (Methodsof organic chemistry), Houben Weyl, 4a edição, Volume 15/1,Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, in H.-D. Jakubke e H.Jescheit, "Aminosáuren, Peptide, Proteine" (Aminoácidos,péptidos, proteínas), Verlag Chemie, Weinheim, DeerfieldBeach, e Basel 1982, e in Jochen Lehmann, "Chemie derKohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Quimica dehidratos de carbono: monossacarideos e derivados), GeorgThieme Verlag, Stuttgart 1974.
Reações e Conversões Opcionais
Sais de um composto da invenção com um grupoformador de sal podem ser preparados de uma maneiraconhecida per se. Sais de adição de ácido de compostos dainvenção podem assim ser obtidos através do tratamento comum ácido ou com reagente de permuta iónica adequado. Um salcom duas moléculas de ácido (por exemplo um di-halogenetode um composto da invenção) pode também ser convertido numsal com uma molécula de ácido por composto (por exemplo ummono-halogeneto); isto pode ser feito aquecendo até àfusão, ou por exemplo aquecendo como um sólido sob um altovácuo a temperatura elevada, por exemplo entre 130 e 170°C, sendo expelida uma molécula do ácido por molécula de umcomposto da invenção. Os sais podem normalmente serconvertidos em compostos livres, e.g. tratando comcompostos básicos adequados, por exemplo com carbonatos demetal alcalino, hidrogenocarbonatos de metal alcalino, ouhidróxidos de metal alcalino, tipicamente carbonato depotássio ou hidróxido de sódio.
Misturas estereoisoméricas, e.g. misturas dediastereómeros, podem ser separadas nos seus isómeroscorrespondentes de uma maneira conhecida per se através demétodos de separação adequados. Misturas diastereoméricaspodem por exemplo ser separadas nos seus diastereómerosindividuais através de cristalização fracionada, cromato-grafia, distribuição em solvente, e procedimentos simi¬lares. Esta separação pode ter lugar quer ao nivel de umcomposto de partida quer num composto da própria invenção.Os enantiómeros podem ser separados através da formação desais diastereoméricos, por exemplo através da formação desal com um ácido quiral enantiomericamente puro, ou atravésde cromatografia, por exemplo por HPLC, usando substratoscromatográficos com ligandos quirais.
Deve ser enfatizado que reações análogas àsconversões mencionadas neste capitulo podem também terlugar ao nivel dos intermediários apropriados (e são assimúteis na preparação dos correspondentes materiais departida).
Materiais de partida:
Os materiais de partida das fórmulas II e III,assim como outros materiais de partida aqui mencionados,e.g. adiante, podem ser preparados de acordo com ou poranalogia com métodos que são conhecidos na técnica, sãoconhecidos na técnica e/ou estão comercialmente disponíveis. Na medida em que a produção dos materiais departida não está descrita em particular, os compostos ousão conhecidos ou podem ser preparados analogamente aosmétodos conhecidos na técnica, e.g. em WO 05/021519 ouWO04/096797, ou tal como aqui mais adiante revelados. Novosmateriais de partida, assim como processos para a suapreparação, são igualmente um modelo de realização dapresente invenção. Nos modelos de realização preferidos,tais materiais de partida são usados e a reação escolhida éselecionada de forma a permitir que os compostos preferidossejam obtidos.
Nos materiais de partida (incluindo intermediá¬rios) , que também podem ser usados e/ou obtidos como saisquando apropriado e oportuno, os substituintes sãopreferencialmente tal como definido para um composto dainvenção. A presente divulgação também diz respeito acompostos da fórmula (IIIA) ou um seu sal
em que os substituintes são tal como definido para umcomposto da invenção. A presente divulgação diz respeito ainda aprocessos para a produção de um composto da fórmula (IIIA).Em principio, todos os processos conhecidos que acoplamdois componentes arilo/heteroarilo (tais como reações dotipo Heck) num derivado de ureia correspondente sãoadequados e podem ser aplicados usando o respetivo materialde partida. A invenção também diz assim respeito a umprocesso para a preparação de um composto da fórmula(IIIA), que compreende (Passo 1) a reação de um composto da fórmula (IV)
em que R3 é definido como correspondendo a um composto dainvenção aqui presente e pode adicionalmente representarhalo, PG representa um grupo protetor, tal como um grupoacilo, com um composto da fórmula (V)
em que R1, R2, A são definidos como correspondendo a umcomposto da invenção aqui presente e Hal representa halo,tal como bromo, sob condições de Heck; opcionalmente napresença de um diluente e opcionalmente na presença de umauxiliar de reação; (Passo 2) seguido de remoção do grupo protetor, e.g. sobcondições acídicas; opcionalmente na presença de umdiluente e opcionalmente na presença de um auxiliar de reação; e recuperar o composto resultante da fórmula (IIIA) na formalivre ou sob a forma de um sal e, opcionalmente converter um composto da fórmula (IIIA)obtida num composto diferente da fórmula (IIIA), e/ouconverter um sal obtido de um composto da fórmula (IIIA)num seu sal diferente, e/ou converter um composto livreobtenível da fórmula (IIIA) num seu sal, e/ou separar umisómero obtenível de um composto da fórmula (IIIA) de um oumais isómeros diferentes obtidos da fórmula (IIIA) A presente divulgação diz respeito ainda acompostos da fórmula (IIIB) ou um seu sal
em que R1, R2, A são definidos como correspondendo a um composto da invenção, RG representa um grupo reativo, emparticular imidazolilcarbonilo o qual pode reagir dire¬tamente ou através da formação do intermediário isocianatoda fórmula (IIIE), e R3 é definido como correspondendo a umcomposto da invenção aqui presente e pode adicionalmenterepresentar halo. A presente divulgação diz ainda respeito aprocessos para a produção de um composto da fórmula (IIIB).Em principio, todos os processos conhecidos que convertemuma amina ou seu sal num derivado ativado correspondentesão adequados e podem ser aplicados usando o respetivomaterial de partida. A invenção também diz assim respeito aum processo para a preparação de um composto da fórmula(IIIB), que compreende a reação de um composto da fórmula(IIIA)
em que os substituintes são tal como aqui definido, com umreagente de ativação, tal como 1,1'-carbonildi-imidazole,opcionalmente na presença de um diluente e opcionalmente napresença de um auxiliar de reação; e recuperar o composto resultante da fórmula (IIIB) sob aforma livre ou sob a forma de um sal, e opcionalmente converter um composto da fórmula (IIIB)obtido num composto diferente da fórmula (IIIB), e/ouconverter um sal obtido de um composto da fórmula (IIIB)num seu sal diferente, e/ou converter um composto livreobtenível da fórmula (IIIB) num seu sal, e/ou separar umisómero obtenível de um composto da fórmula (IIIB) de um oumais isómeros diferentes obtidos da fórmula (IIIB). A invenção diz repeito num dos modelo derealização a composições para uso humano ou veterinárioonde a inibição de PI3K é indicada. A invenção diz respeito ao tratamento de doençasproliferativas celulares tais como crescimento de tumorese/ou de células cancerígenas mediadas por PI3K. As doençaspodem incluir as que mostram sobre-expressão ouamplificação de PI3K alfa, mutação somática de PIK3CA oumutações da linha germinal ou mutação somática de PTEN oumutações e translocação de p85a que servem para supra-regular o complexo p85-pll0. Em particular, os compostossão úteis no tratamento de cancros humanos ou animais(e.g., murino), incluindo, por exemplo, sarcoma; pulmão;brônquios; próstata; mama (incluindo cancros da mama espo¬ rádicos e sofredores da Doença de Cowden); pâncreas; cancrogastrointestinal; cólon; reto; carcinoma do cólon; adenomacolorrectal; tiroide; fígado; dueto intra-hepático biliar;hepatocelular; glândula suprarrenal; estômago; gástrico;glioma; glioblastoma; endométrio; melanoma; rins; pélvisrenal; bexiga urinária; corpo uterino; colo do útero;vagina; ovários; mieloma múltiplo; esôfago; uma leucemia;leucemia mielogenosa aguda; leucemia mielogenosa crônica;leucemia linfocitária; leucemia mielóide; cérebro; umcarcinoma do cérebro; cavidade oral e faringe; laringe;intestino delgado; linfoma não-Hodgkin; melanoma; adenomado cólon viloso; uma neoplasia; uma neoplasia de carácterepitelial; linfomas; um carcinoma mamário; carcinomacelular basal; carcinoma das células escamosas; queratoseactínica; doenças tumorais, incluindo tumores sólidos; umtumor do pescoço ou cabeça; policitemia vera; trombocitemiaessencial; mielofibrose com metaplasia mielóide; e Doençade Waldenstrom. 0 estado ou distúrbio (e.g. mediado por PI3K)pode também ser selecionado a partir do grupo que consisteem: policitemia vera, trombocitemia essencial, mielofibrosecom metaplasia mielóide, asma, COPD, ARDS, Síndrome deLoffler, pneumonia eosinofílica, infestação (incluindoeosinofilia tropical) parasitica (em particular metazoá-rio) , aspergilose broncopulmonar, poliarterite nodosa(incluindo a síndrome de Churg-Strauss), granuloma eosino-fílico, distúrbios relacionados com a eosinofilia queafetam as vias aéreas causados por reação a fármacos, psoríase, dermatite de contacto, dermatite atópica, alope¬cia areata, eritema multiforme, dermatite herpetiforme,esclerodermia, vitiligo, hipersensibilidade angeíte, urti-cária, penfigoide bolhoso, lupus eritematoso, pênfigo,epidermólise bolhosa adquirida, distúrbios hematológicosautoimunes (e.g. anemia hemolítica, anemia aplástica,anemia dos glóbulos vermelhos pura e trombocitopeniaidiopática), lúpus eritematoso sistêmico, policondrite,esclerodermia, granulomatose de Wegener, dermatomiosite,hepatite ativa crônica, miastenia grave, síndrome deSteven-Johnson, espru idiopático, doença de bowel inflama-tória autoimune (e.g. colite ulcerativa e doença de Crohn),oftalmopatia endócrina, doença de Graves, sarcoidose,alveolite, pneumonite de hipersensibilidade crônica,esclerose múltipla, cirrose biliar primária, uveite (ante¬rior e posterior) , fibrose pulmonar intersticial, artritepsoriática, glomerulonefrite, doenças cardiovasculares,aterosclerose, hipertensão, trombose venosa profunda,acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, anginainstável, tromboembolia, embolia pulmonar, doençastrombolíticas, isquémia arterial aguda, oclusão trombóticaperiférica, e doença arterial coronária, lesões dereperfusão, retinopatia, tais como retinopatia diabética ouretinopatia hiperbárica induzida por oxigênio, e condiçõescaracterizadas por elevada pressão intraocular ou secreçãode humor aquoso ocular, tais como glaucoma.
Para as utilizações atrás referidas a dosagemnecessária vai obviamente variar dependendo do modo de administração, da condição especifica a ser tratada e doefeito desejado. Em geral, são referidos resultadossatisfatórios obtidos sistematicamente com dosagens diáriasde entre cerca de 0,03 e cerca de 100,0 mg/kg por pesocorporal, e.g. cerca de 0,03 e cerca de 10,0 mg/kg por pesocorporal. Uma dosagem diária indicada no mamífero maior,e.g. humanos, está na gama entre cerca de 0,5 mg e cerca de3 g, e.g. cerca de 5 mg e cerca de 1,5 g, convenientementeadministrada, por exemplo, em doses divididas até quatrovezes ao dia ou em forma retardada. Formas de dosagemunitária adequadas para administração oral compreendementre ca. 0,1 e cerca de 500 mg, e.g. cerca de 1,0 e cercade 500 mg de ingrediente ativo. O composto pode ser administrado através dequalquer via convencional, em particular entericamente,e.g. oralmente, e.g. sob a forma de comprimidos oucápsulas, ou parentericamente, e.g. sob a forma de soluçõesou suspensões injetáveis, topicamente, e.g. sob a forma deloções, géis, unguentos ou cremes, através de inalação,intranasalmente, ou sob a forma de supositório. O composto pode ser administrado sob a formalivre ou sob a forma de sal f armaceuticamente aceitávele.g. tal como indicado anteriormente. Tais sais podem serpreparados de forma convencional e exibir a mesma ordem deatividade que os compostos livres.
Consequentemente, a invenção também proporciona: um composto da invenção, sob a forma livre ou sob aforma de um sal farmaceuticamente aceitável tal comoum produto farmacêutico, e.g. em qualquer um dosmétodos tal como aqui indicado. um composto da invenção sob a forma livre ou sob aforma de sal farmaceuticamente aceitável parautilização como produto farmacêutico, e.g. em qualquerum dos métodos tal como aqui indicado, em particularpara a utilização em uma ou mais doenças mediadas porfosfatidilinositol 3-quinase. a utilização de um composto da invenção sob a formalivre ou sob a forma de um sal farmaceuticamenteaceitável em qualquer um dos métodos tal como aquiindicado, para o fabrico de um medicamento para otratamento de uma ou mais doenças mediadas porfosfatidilinositol 3-quinase. A PI3K serve como um segundo nó mensageiro queintegra vias de sinalização paralela, sendo emergente aevidência de que a combinação de um inibidor de PI3K cominibidores de outras vias será útil no tratamento de cancroe doenças proliferativas em humanos.
Aproximadamente 20-30% dos cancros da mamahumanos sobre-expressam Her-2/neu-ErbB2, o alvo do fármacotrastuzumab. Apesar do trastuzumab ter demonstradorespostas duradouras em alguns pacientes que expressavamHer2/neu-ErbB2, apenas um subconjunto destes pacientes reagiu. Um trabalho recente indicou que esta taxa deresposta limitada pode ser substancialmente melhoradaatravés da combinação de trastuzumab com inibidores de PI3Kou a via PI3K/AKT (Chan et al., Breast Can. Res. Treat.91:187 (2005), Woods Ignatoski et al., Brit. J. Cancer 82:666 (2000), Nagata et al., Cancer Cell 6:117 (2004)).
Uma variedade de malignidades humanas expressammutações de ativação ou niveis aumentados de Herl/EGFR e umnúmero de inibidores de anticorpos e de pequenas moléculasfoi desenvolvido contra este recetor de tirosina quinaseincluindo tarceva, gefitinib e erbitux. Contudo, enquantoos inibidores de EGFR demonstram atividade anti-tumor emdeterminados tumores humanos (e.g., NSCLC), falham noaumento da sobrevivência global do paciente em todos ospacientes com tumores que expressam EGFR. Isto pode serracionalizado pelo facto de muitos alvos a jusante deHerl/EGFR serem mutados ou desregulados a frequênciaselevadas numa variedade de malignidades, incluindo a viaPI3K/Akt. Por exemplo, gefitinib inibe o crescimento de umalinha de células de adenocarcinoma em ensaios in vitro.Todavia, podem ser selecionados subclones destas linhas decélulas que são resistentes a gefitinib que demonstramativação aumentada da via Pl3/Akt. A infra-regulação ouinibição desta via torna os subclones resistentes sensíveisao gefitinib (Kokubo et al., Brit. J. Cancer 92:1711(2005) ) . Além disso, num modelo in vitro de cancro da mamacom uma linha de células que alberga uma mutação PTEN esobre-expressa inibição de EGFR quer da via PI3K/Akt quer de EGFR produziu um efeito sinérgico (She et al., CancerCell 8:287-297(2005)). Estes resultados indicam que acombinação de gefitinib e inibidores da via PI3K/Akt poderáser uma estratégia terapêutica atrativa para o cancro. A combinação de AEE778 (um inibidor de Her-2/neu/ErbB2, VEGFR e EGFR) e RAD001 (um inibidor de mTOR,um alvo a jusante de Akt) produziu maior eficácia combinadado que qualquer agente isoladamente num modelo dexenoenxerto de glioblastoma (Goudar et al., Mol. Cancer.Ther. 4 :101-112 (2005)) .
Anti-estrogénios, tais como tamoxifeno, inibem ocrescimento do cancro da mama através da indução dainterrupção do ciclo celular que requer a ação do inibidordo ciclo celular p27Kip. Recentemente, foi demonstrado quea ativação da via Ras-Raf-MAP Quinase altera o estado defosforilação de p27Kip de tal forma que a sua atividadeinibidora de interrupção do ciclo celular é atenuada,contribuindo assim para a resistência anti-estrogénio(Donovan, et al, J. Biol. Chem. 276:40888, (2001)). Talcomo reportado por Donovan et al., a inibição desinalização de MAPK através do tratamento com inibidor deMEK reverteu o estado de fosforilação aberrante de p27 emlinhas de células de cancro da mama refratário hormonal eao fazer isso restaurou a sensibilidade hormonal. Da mesmaforma, a fosforilação de p27Kip por Akt também anula o seupapel de interromper o ciclo celular (Viglietto et al., NatMed. 8 :1145 (2002)) .
Portanto, o composto pode ser usado no tratamentode cancros dependentes de hormonas, tais como os cancros damama e da próstata. Através desta utilização, pretende-sereverter a resistência hormonal comummente vista nestescancros com agentes anti-cancro convencionais.
Em cancros hematológicos, tais como leucemiacrônica mielogenosa (CML), a translocação cromossómica éresponsável pela tirosina quinase constitutivamente ativadaBCR-Abl. Os pacientes afetados são reativos ao imatinib, uminibidor de tirosina quinase de moléculas pequenas, emresultado da inibição da atividade de Abl quinase. Contudo,muitos pacientes com a doença em estado avançado respondemao imatinib inicialmente, mas depois reincidem posterior¬mente devido às mutações que conferem resistência nodomínio da Abl quinase. Estudos in vitro têm demonstradoque BCR-Abl emprega a via Ras-Raf quinase para desencadearos seus efeitos. Adicionalmente, inibir mais do que umaquinase na mesma via proporciona proteção adicional contramutações que conferem resistência.
Portanto, o composto pode ser usado em combinaçãocom pelo menos um agente adicional selecionado a partir dogrupo de inibidores de quinase, tais como Gleevec®, notratamento de cancros hematológicos, tais como leucemiamielogenosa crônica (CML). Através desta utilização,pretende-se reverter ou prevenir a resistência ao (s)dito(s) pelo menos um agente adicional.
Uma vez que a ativação da via PI3K/Akt leva àsobrevivência celular, a inibição da via em combinação comterapias que conduzem à apoptose em células canceriqenas,incluindo radioterapia e quimioterapia, irá resultar emrespostas melhoradas (Ghobrial et al., CA Cancer J. Clin55:178-194 (2005)). Como exemplo, combinação de inibidor dePI3 quinase com carboplatina demonstrou efeitos sinérgicosquer na proliferação in vitro quer nos ensaios de apoptoseassim como eficácia do tumor in vivo num modelo dexenoenxerto de cancro nos ovários (Westfall e Skinner, Mol.Cancer Ther. 4:1764-1771 (2005)).
Para além do cancro e das doenças proliferativas,existem evidências cumulativas de que os inibidores de PI3quinases da Classe IA e 1B seriam terapeuticamente úteis emoutras áreas de doença. A inibição de ρΙΙΟβ, o produtoisoforma de PI3K do gene PIK3CB, demonstrou estar envolvidona ativação de plaquetas induzidas por corte (Jackson etal., Nature Medicine 11:507-514 (2005)). Assim, um inibidorde PI3K que inibe ρΙΙΟβ seria útil como um agente isoladoou em combinação com terapia anti-trombótica. A isoformaρΙΙΟδ, o produto do gene PIK3CD, é importante na função ediferenciação da célula B (Clayton et al., J. Exp. Med.196:753-763 (2002)), respostas antigénio dependentes eindependentes da célula T (Jou et al., Mol. Cell. Biol.22:8580-8590 (2002)) e diferenciação dos mastócitos (Ali etal., Nature 431:1007-1011 (2004)). Assim, é esperado que osinibidores de ρΙΙΟδ sejam úteis no tratamento de doenças autoimunes conduzidas por célula B e asma. Finalmente, ainibição de ρΙΙΟγ, o produto isoforma do gene PI3KCG,resulta em resposta reduzida da célula T, mas não B, (Reifet al., J. Immunol. 173:2236-2240 (2004)) e a sua inibiçãodemonstra eficácia em modelos animais de doenças autoimunes(Camps et al., Nature Medicine 11:936-943 (2005), Barber etal., Nature Medicine 11:933-935 (2005)). A invenção proporciona ainda composições farma¬cêuticas compreendendo o composto, juntamente com um exci-piente farmaceuticamente aceitável adequado para adminis¬tração a um sujeito humano ou animal, quer isoladamentequer juntamente com outros agentes anti-cancro. O composto da invenção pode ser usado em métodosde tratamento de sujeitos humanos ou animais que padecem deuma doença proliferativa celular, tal como cancro. Osmétodos de tratamento de um sujeito humano ou animal queprecise de tal tratamento, compreendem a administração aosujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto da invenção quer isoladamente quer em combinaçãocom um ou mais de entre outros agentes anti-cancro. Emparticular, as composições ou serão formuladas juntamentecomo uma combinação terapêutica ou administradas separa¬damente. Agentes anti-cancro adequados para utilização comum composto da invenção incluem, mas não se limitam a, umou mais compostos selecionados a partir do grupo cons¬tituído por inibidores de quinase, anti-estrogénios, anti-androgénios, outros inibidores, fármacos quimioterapêuticos do cancro, agentes alquilantes, agentes quelantes, modifi-cadores de resposta biológica, vacinas do cancro, agentespara terapia anti-sentido tal como definido seguidamente: A. Inibidores de Quinase:_Inibidores de quinase parautilização como agentes anti-cancro em conjunção com ocomposto da invenção incluem inibidores de quinases doRecetor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) taiscomo quinazolinas de pequena molécula, por exemplogefitinib (US 5457105, US 5616582, e US 5770599), ZD-6474 (WO 01/32651), erlotinib (Tarceva®, US 5,747,498e WO 96/30347), e lapatinib (US 6,727,256 e WO02/02552); Recetor de Fator de Crescimento EndotelialVascular (VEGFR) inibidores de quinase, incluindo SU-11248 (WO 01/60814), SU 5416 (US 5,883,113 e WO99/61422), SU 6668 (US 5,883,113 e WO 99/61422), CHIR-258 (US 6, 605, 617 e US 6, 774,237), vatalanib ou PTK-787 (US 6,258,812), VEGF-Trap (WO 02/57423), B43-Genistein (WO-09606116), fenretinide (p-hidroxife-nilamina de ácido retinoico) (US 4,323,581), IM-862(WO 02/62826), bevacizumab ou Avastin® (WO 94/10202),KRN-951, 3-[5-(metilsulfonilpiperadinometil)-indolil]-quinolona, AG-13736 e AG-13925, pirrolo[2,l-f][1,2,4]triazinas, ZK-304709, Veglin®, VMDA-3601, EG-004, CEP-701 (US 5,621,100), Cand5 (WO 04/09769);inibidores de tirosina quinase Erb2 tais comopertuzumab (WO 01/00245), trastuzumab, e rituximab;inibidores de Akt proteína quinase, tais como RX-0201;Inibidores de Proteína Quinase C (PKC), tais como LY- 317615 (WO 95/17182), e perifosina (US 2003171303);Inibidores de quinase Raf/Map/MEK/Ras incluindosorafenib (BAY 43-9006), ARQ-350RP, LErafAON, BMS-354825 AMG-548, e outros revelados em WO 03/82272;Inibidores de quinase do Recetor de Fator de Cresci¬mento de Fibroblasto (FGFR); Inibidores de QuinaseDependentes da Célula (CDK), incluindo CYC-202 ouroscovitina (WO 97/20842 e WO 99/02162); inibidores dequinase do Recetor de Fator de Crescimento Derivado dePlaquetas (PDGFR) tais como CHIR-258, 3G3 mAb, AG-13736, SU-11248 e SU6668; e inibidores de quinase Bcr-Abl e proteínas de fusão tais como STI-571 ou Gleevec®(imatinib). B. Anti-Estrogénios:_Agentes direcionados para oEstrogénio para utilização em terapia anti-cancro emconjunção com o composto da invenção incluemModuladores de Recetor de Estrogénio Seletivos (SERMs)incluindo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno; inibi¬dores de aromatase incluindo Arimidex® ou anastrozole;infra-reguladores de Recetor de Estrogénio (ERDs)incluindo Faslodex® ou fulvestrant. C. Anti-Androgénios: Agentes direcionados para oandrogénio para utilização em terapia anti-cancro emconjunção com o composto da invenção incluem fluta-mida, bicalutamida, finasterida, aminoglutetimida,cetoconazole, e corticosteroides. D. Outros Inibidores:_Outros inibidores para utili¬zação como agentes anti-cancro em conjunção com ocomposto da invenção incluem inibidores de proteína farnesil transferase incluindo tipifarnib ou R-115777(US 2003134846 e WO 97/21701), BMS-214662, AZD-3409, eFTI-277; inibidores de topoisomerase incluindomerbarone e diflomotecan (BN-80915); inibidores deproteína de fuso cinesina mitótico (KSP) incluindo SB-743921 e MKI-833; Moduladores de proteassoma tais comobortezomib ou Velcade® (US 5,780,454), XL-784; e ciclo-oxigenase 2 (COX-2) inibidores incluindo fárma- cos anti-inflamatórios não esteroides I (NSAIDs). E. Fármacos Quimioterapêuticos do Cancro: Agentes quimioterapêuticos do cancro específicos para utiliza¬ção como agentes anti-cancro em conjunção com ocomposto da invenção incluem anastrozol (Arimidex®) ,bicalutamida (Casodex®) , sulfato de bleomicina (Bleno-xane®) , bussulfano (Myleran®) , injeção de bussulfano(Busulfex®) , capecitabina (Xeloda®) , N4-pentoxicar-bonil-5-deoxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Parapla-tin®) , carmustina (BiCNU®) , clorambucil (Leukeran®) ,cisplatina (Platinol®) , cladribina (Leustatin®) , ci-clofosfamida (Cytoxan® ou Neosar®) , citarabina, cito-sina arabinosideo (Cytosar-U®) , injeção de lipossomacitarabina (DepoCyt®) , dacarbazina (DTIC-Dome®) , dac-tinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), cloridrato dedaunorrubicina (Cerubidine®) , injeção de lipossoma decitrato de daunorrubicina (DaunoXome®) , dexametasona,docetaxel (Taxotere®) , cloridrato de doxorrubicina(Adriamycin®, Rubex®) , etopósido (Vepesid®) , fosfato defludarabina (Fludara®) , 5-fluorouracilo (Adrucil®,
Efudex®) , flutamida (Eulexin®) , tezacitibina, Gemcita- bina (difluorodeoxicitidina), hidroxiureia (Hydrea®) ,Idarrubicina (Idamycin®) , ifosfamida (IFEX®) , irinote-cano (Camptosar®) , L-asparaginase (ELSPAR®) , cálcioleucovorina, melfalan (Alkeran®), 6-mercaptopurina(Purinethol®) , metotrexato (Folex®) , mitoxantrona(Novantrone®) , milotarg, paclitaxel (Taxol®) , phoenix(ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 comimplante de carmustina (Gliadel®) , citrato de tamo-xifeno (Nolvadex®) , tenipósido (Vumon®) , 6-tioguanina,tiotepa, tirapazamina (Tirazone®) , cloridrato detopotecan para injeção (Hycamptin®) , vinblastina(Velban®) , vincristina (Oncovin®) , e vinorrelbina(Navelbine®) . F. Agentes alquilantes:_Agentes alquilantes para utilização em conjunção com o composto da invençãoincluem VNP-40101M ou cloretizina, oxaliplatina (US4,169,846, WO 03/24978 e WO 03/04505), glufosfamida,mafosfamida, etopofos (US 5,041,424), prednimustina;treossulfanoa; bussulfano; irofluven (acilfulveno);penclomedina; pirazoloacridina (PD-115934); 06-benzil-guanina; decitabina (5-aza-2-deoxicitidina); brostali-cina; mitomicina C (MitoExtra); TLK-286 (Telcyta®) ; temozolomida; trabectedina (US 5,478,932); AP-5280 (Formulação platinada de Cisplatina); porfiromicina; eclearazide (mecloretamina). G. Agentes quelantes :_Agentes quelantes para utili¬ zação em conjunção com o composto da invenção incluemtetratiomolibdato (WO 01/60814); RP-697; Quimérico T84, 66 (cT84, 66); gadofosveset (Vasovist®) ; defero- xamina; e bleomicina opcionalmente em combinação comeletroporação (EPT). H. Modificadores de resposta biológica:_Modificadores de resposta biológica, tais como moduladores imunes,para utilização em conjunção com o composto dainvenção incluem estaurosprina e seus análogos macro-cíclicos, incluindo UCN-01, CEP-701 e midostaurina
(ver WO 02/30941, WO 97/07081, WO 89/07105, US5,621,100, WO 93/07153, WO 01/04125, WO 02/30941, WO93/08809, WO 94/06799, WO 00/27422, WO 96/13506 e WO88/07045); squalamina (WO 01/79255); DA-9601 (WO 98/04541 e US 6,025,387); alemtuzumab; interferons(e.g. IFN-a, iFN-b etc.); interleucina, especifica¬mente IL-2 ou aldesleucina assim como IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, e suas variantes biológicas ativas possuindo sequências de aminoácidos superiores a 70% da
sequência humana nativa; altretamina (Hexalen®) ; SU101 ou leflunomida (WO 04/06834 e US 6,331,555);imidazoquinolinas tais como resiquimod e imiquimod (US 4, 689, 338, 5, 389, 640, 5,268,376, 4, 929, 624, 5,266, 575, 5, 352,784, 5, 494, 916, 5, 482, 936, 5, 346, 905, 5, 395, 937,5,238,944, e 5,525,612); e SMIPs, incluindo benza-zoles, antraquinonas, tiossemicarbazonas, e triptan-trinas (WO 04/87153, WO 04/64759, e WO 04/60308). I. Vacinas do cancro:_Vacinas anti-cancro para utili¬ zação em conjunção com o composto da invenção incluemAvicine® (Tetrahedron Lett. 26:2269-70 (1974)); orego- vomab (OvaRex®) ; Theratope® (STn-KLH); Vacinas de
Melanoma; séries GI-4000 (GI-4014, GI-4015, e GI-4016), que são dirigidas a cinco mutações na proteínaRas; GlioVax-1; MelaVax; Advexin® ou INGN-201 (WO95/12660); Sig/E7/LAMP-1, codificar HPV-16 E7; MAGE-3Vacina ou M3TK (WO 94/05304); HER-2VAX; ACTIVE, queestimula células T específicas para tumores; vacina docancro GM-CSF; e vacinas com base em Listeriamonocytogenes. J. Terapia Anti-sentido:_Agentes anti-cancro parautilização em conjunção com o composto da invençãotambém incluem composições anti-sentido, tais comoAEG-35156 (GEM-640); AP-12009 e AP-11014 (TGF-beta2-oligonucleótidos anti-sentido específicos); AVI-4126;AVI-4557; AVI-4472; oblimersen (Genasense®) ; JFS2;aprinocarsen (WO 97/29780); GTI-2040 (R2 ribonucleó-tido reductase mRNA anti-sentido oligo) (WO 98/05769);GTI-2501 (WO 98/05769); oligodeoxinucleótidos anti-sentido c-Raf encapsulado em lipossoma (LErafAON) (WO98/43095); e Sirna-027 (terapêutica com base em RNAidirecionada a VEGFR-1 mRNA). O composto pode também ser combinado numa compo¬sição farmacêutica com substâncias de fármacosbronquiodilatadores ou anti-histamínicos. Tais fármacosbronquiodilatadores incluem agentes anti-colinérgicos ouanti-muscarínicos, em particular brometo de ipratrópio,brometo de oxitrópio, e brometo de tiotrópio, e agonistasde adrenorecetor β-2 tais como salbutamol, terbutalina,salmeterol, carmoterol, milveterol e, em especial, formo- terol ou indacaterol. As substâncias de fármaco anti-histamínico co-terapêutico incluem cloridrato de cetirizi-na, fumarato de clemastina, prometazina, loratadina,desloratadina difenidramina e cloridrato de fexofenadina.
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um ou mais compostos que são úteis notratamento de uma doença trombolitica, doença do coração,acidente vascular cerebral, etc. Tais compostos incluemaspirina, uma estreptoquinase, um ativador plasminogénicode tecido, uma uroquinase, um anti-coagulante, fármacosanti-plaquetas (e.g, PLAVIX; bissulfato de clopidogrel),uma estatina (e.g., LIPITOR ou Atorvastatina cálcica),ZOCOR (Sinvastatina), CRESTOR (Rosuvastatina) , etc.), umBeta bloqueador (e.g., Atenolol), NORVASC (besilato deamlodipina), e um inibidor de ACE (e.g., lisinopril).
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um ou mais compostos que são úteis notratamento de anti-hipertensão. Tais compostos inclueminibidores ACE, agentes de redução de lípidos tais comoestatinas, LIPITOR (Atorvastatina cálcica) , bloqueadores docanal de cálcio tais como NORVASC (besilato de amlodipina).
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um ou mais compostos selecionados apartir do grupo constituído por fibratos, betabloqueadores, inibidores de NEPI, antagonistas do recetorde Angiotensina-2 e inibidores de agregação de plaquetas.
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um composto adequado no tratamento dedoenças inflamatórias, incluindo artrite reumatóide. Talcomposto podem ser selecionado a partir do grupoconstituído por inibidores de TNF-α tais como anticorposmonoclonais anti-TNF-α (tais como REMICADE, CDP-870) eD2E7 (HUMIRA) e moléculas de fusão de imunoglobulinarecetora de TNF (tais como ENBREL), inibidores de IL-1,antagonistas do recetor ou IL-lRa solúvel (e.g. inibidoresde KINERET ou ICE), agentes anti-inflamatórios não esteroi-des (NSAIDS), piroxicam, diclofenac, naproxeno, flurbipro-feno, fenoprofeno, cetoprofeno ibuprofeno, fenamatos, ácidomefenâmico, indometacina, sulindac, apazona, pirazolonas,fenilbutazona, aspirina, inibidores de COX-2 (tais comoCELEBREX (celecoxib), PREXIGE (lumiracoxib)) , de metalo-protease (preferencialmente inibidores seletivos de MMP-13) , inibidores de p2x7, inibidores de α2α, NEUROTIN,pregabalina, dose reduzida de metotrexato, leflunomida,hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina ou ouroparentérico ou oral.
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um composto adequado no tratamento deosteoartrite. Tal composto pode ser selecionado a partir dogrupo constituído por agentes anti-inflamatórios nãoesteroides padrão (de agora em diante NSAID) tais comopiroxicam, diclofenac, ácidos propiónicos tais como napro¬xeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno e ibuprofeno, fenamatos tais como ácido mefenâmico, indometacina, sulin-dac, apazona, pirazolonas tais como fenilbutazona, salici-latos tais como aspirina, COX-2 inibidores tais comocelecoxib, valdecoxib, lumiracoxib e etoricoxib, terapiasanalgésicas e intra-articulares tais como corticosteroidese ácidos hialurónicos tais como hialgan e sinvisc.
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo o composto e um agente antiviral e/ou um compostoantissético. Tal agente antiviral pode ser selecionado apartir do grupo constituído por Viracept, AZT, aciclovir efamciclovir. Tal composto antissético pode ser selecionadoa partir do grupo constituído por Valant.
Uma combinação pode também ser fornecidacompreendendo o composto e um ou mais agentes selecionadosa partir do grupo constituído por agentes CNS tais comoantidepressivos (sertralina), fármacos anti-Parkinsonianos(tais como deprenil, L-dopa, Requip, Mirapex; inibidoresMAOB (tais como selegina e rasagilina); inibidores comP(tais como Tasmar); inibidores A-2; inibidores derecaptação de dopamina; antagonistas de NMDA; agonistas deNicotina; agonistas de Dopamina; e inibidores de sintase deóxido nítrico neuronal).
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo um composto da invenção e um ou mais fármacos anti-Alzheimer. Tal fármaco anti-Alzheimer pode ser selecionadoa partir do grupo constituído por donepezil, tacrina, inibidores de α2δ, NEUROTIN, pregabalina, inibidores deCOX-2, propentofilina ou metrifonato.
Uma combinação pode também ser fornecida compre¬endendo um composto da invenção e agentes anosteoporosee/ou um agente imunossupressor. Tais agentes osteoporosepodem ser selecionados a partir do grupo constituído porEVISTA (cloridrato de raloxifeno), droloxifeno, lasofoxi-feno ou fosomax. Tais agentes imunossupressores podem serselecionados a partir do grupo constituído por FK-506 erapamicina.
Estojos (kits) que incluem o composto da invençãoe um parceiro de combinação tal como aqui revelado podemtambém ser fornecidos. Estojos (kits) representativosincluem um composto inibidor de PI3K (e.g., o composto dainvenção) e um inserçor de embalagem ou outra marcaçãoincluindo diretivas para tratar uma doença proliferativadas células através da administração de uma quantidade docomposto inibidor de PI3K.
Em geral, o composto da invenção será administra¬do numa quantidade terapeuticamente eficaz através dequalquer um dos modos de administração aceites para agentesque servem utilidades similares. A quantidade real docomposto da invenção, i.e., do ingrediente ativo, irádepender de numerosos fatores tais como a gravidade dadoença a ser tratada, a idade e saúde relativa do sujeito,a potência do composto usado, a via e forma de administração, e outros fatores. 0 fármaco pode seradministrado mais de uma vez ao dia, preferencialmente umaou duas vezes ao dia. Todos estes fatores se encontram noâmbito das competências do médico assistente. Quantidadesterapeuticamente eficazes de compostos da fórmulas I podemvariar entre cerca de 0,05 e cerca de 50 mg por quilogramade peso corporal do recipiente por dia; preferencialmentecerca de 0,1-25 mg/kg/dia, mais preferencialmente entrecerca de 0,5 e 10 mg/kg/dia. Assim, para administração auma pessoa com 7 0 kg, a gama de dosagem irá ser maispreferencialmente cerca de 35-70 mg por dia.
Em geral, o composto da invenção será adminis¬trado como composições farmacêuticas através de qualqueruma das seguintes vias: administração oral, sistêmica(e.g., transdérmica, intranasal ou através de supositório),ou parentérica (e.g., intramuscular, intravenosa ousubcutânea). A forma preferida de administração é oralusando um regime de dose diária conveniente que pode serajustado de acordo com o grau de sofrimento. As composiçõespodem tomar a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas,semi-sólidos, pós, formulações de libertação controlada,soluções, suspensões, elixires, aerossóis, ou quaisqueroutras composições apropriadas. Outra forma preferida deadministração do composto da invenção é inalação. Este é ummétodo eficaz para administrar um agente terapêuticodiretamente no trato respiratório. A escolha da formulação depende de diversos fatores tais como o modo de administração do fármaco e abiodisponibilidade da substância fármaco. Para administra¬ção via inalação o composto pode ser formulado como soluçãoliquida, suspensões, propulsores de aerosol ou pó seco ecarregado num distribuidor adequado para administração.Existem diversos tipos de dispositivos de inalação-inaladores nebulizadores farmacêuticos, inaladores de dosemedida (MDI) e inaladores de pó seco (DPI). Os dispositivosnebulizadores produzem uma corrente de ar a alta velocidadeque faz com que os agentes terapêuticos (que são formuladosnuma forma liquida) se pulverizem como um nevoeiro que étransportado para dentro do trato respiratório do paciente.Os MDI's são tipicamente formulações embaladas com um gáscomprimido. Quando atua, o dispositivo descarrega umaquantidade medida de agente terapêutico através de gáscomprimido, proporcionando assim um método fiável deadministrar uma quantidade de agente definida. 0 DPIdispensa agentes terapêuticos sob a forma de um pó em fluxolivre que pode ser disperso pelo dispositivo na corrente dear inspiratória do paciente durante a respiração. De formaa alcançar um pó em fluxo livre, o agente terapêutico éformulado com um excipiente tal como lactose. Umaquantidade medida do agente terapêutico é armazenada numaforma de cápsula e é distribuída com cada atuação. A invenção também diz respeito a formulações emque o tamanho das partículas de um composto da fórmula (I)está entre 10-1000 nm, preferencialmente 10-400 nm. Taisformulações farmacêuticas têm sido desenvolvidas em especial para fármacos que mostram fraca biodisponibilidadecom base no princípio de que a biodisponibilidade pode seraumentada aumentando a área da superfície i.e., reduzindo otamanho das partículas. Por exemplo, U.S. 4,107,288descreve uma formulação farmacêutica possuindo partículasna gama de tamanho entre 10 e 1,000 nm na qual o materialativo é suportado numa matriz de ligação cruzada demacromoléculas. U.S. 5,145,684 descreve a produção de umaformulação farmacêutica na qual a substância fármaco épulverizada em nanopartícuias (tamanho médio da partículade 400 nm) na presença de um modificador de superfície edepois espalhada num meio líquido para dar a formulaçãofarmacêutica que exibe acentuada biodisponibilidadeelevada. Ambos os documentos são incluídos por referência.
Ainda noutro aspeto, a invenção proporcionacomposições farmacêuticas compreendendo um (uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um) composto da invenção, e pelomenos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Osexcipientes aceitáveis são não tóxicos, auxiliam aadministração, e não afetam adversamente o benefícioterapêutico do composto da invenção. Tal excipiente podeser qualquer sólido, líquido, semi-sólido ou, no caso deuma composição de aerossol, excipiente gasoso que estágenericamente disponível para um especialista na técnica.
Excipientes sólidos farmacêuticos incluem milho,celulose, talco, glucose, lactose, sucrose, gelatina,malte, arroz, farinha, giz, gel de silica, estereato de magnésio, estereato de sódio, monoestereato de glicerol,cloreto de sódio, leite em pó magro e semelhantes.
Excipientes líquidos e semi-sólidos podem serselecionados a partir de glicerol, propilenoglicol, água,etanol e diversos óleos, incluindo os de petróleo, os deorigem animal, vegetal ou sintética, e.g., óleo deamendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo, etc.Veículos líquidos preferidos, em particular para soluçõesinjetáveis, incluem água, solução salina, dextrose aquosa,e glicóis.
Gases comprimidos podem ser usados para espalharum composto da invenção em forma de aerossol. Os gasesadequados por este propósito são azoto, dióxido de carbono,etc. Outros excipientes adequados farmaceuticamente e suasformulações são descritos em Remington's PharmaceuticalSciences, editada por E. W. Martin (Mack PublishingCompany, 18a ed., 1990). A quantidade do composto numaformulação pode variar dentro da gama total empregue pelosespecialistas na técnica. Tipicamente, a formulação iráconter, numa base de percentagem em peso (%p), entre cercade 0, 01-99, 99 p% de um composto da invenção com base naformulação total, sendo o restante um ou mais excipientesadequados farmaceuticamente. Preferencialmente, o compostoestá presente a um nível de cerca de 1-80 p%. A invenção diz respeito ainda a composiçõesfarmacêuticas compreendendo (i.e. contendo ou sendo constituídas por) pelo menos um composto da invenção e pelomenos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Composições farmacêuticas compreendendo umcomposto da invenção sob a forma livre ou sob a forma de umsal farmaceuticamente aceitável em associação com pelomenos um excipiente farmaceuticamente aceitável (tal comoum veículo e/ou diluente) podem ser fabricadas de formaconvencional misturando os componentes.
Composições farmacêuticas combinadas compreenden¬do um composto da invenção sob a forma livre ou sob a formade um sal farmaceuticamente aceitável e ainda compreendendoum parceiro de combinação (quer numa forma de dosagemunitária quer como um estojo (kit) de partes) em associaçãocom pelo menos um veículo e/ou diluente farmaceuticamenteaceitável podem ser fabricadas de forma convencionalmisturando com um veículo e/ou diluente farmaceuticamenteaceitável com os tais ingredientes ativos.
Consequentemente, a invenção proporciona em ou¬tros aspetos uma composição farmacêutica combinada, e.g. parautilização em qualquer um dos métodos aqui descritos,compreendendo um composto da invenção sob a forma livre ou sob a forma de sal farmaceuticamenteaceitável em associação com um diluente e/ou veículofarmaceuticamente aceitável. uma composição farmacêutica combinada compreendendo um composto da invenção sob a forma livre ou sob aforma de sal farmaceuticamente aceitável como ingre¬diente ativo; um ou mais veiculos material (s) e/oudiluentes farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmenteuma ou mais substâncias fármaco adicionais. Talcomposição farmacêutica combinada pode estar sob aforma de uma dosagem unitária única ou como um estojo(kit) de partes. uma composição farmacêutica combinada compreendendouma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostoda invenção sob a forma livre ou sob a forma de salfarmaceuticamente aceitável e uma segunda substânciafármaco, para administração simultânea ou sequencial. um composto da invenção para utilização num métodotal como definido anteriormente compreendendo co-administração, e.g. concomitantemente ou sequencial¬mente, de uma quantidade não tóxica terapeuticamenteeficaz de um composto da fórmula (I) ou um seu salfarmaceuticamente aceitável, e pelo menos uma segundasubstância fármaco, e.g. tal como indicado anterior¬mente . uma combinação farmacêutica, e.g. um estojo (kit),compreendendo a) um primeiro agente que é um compostoda invenção tal como aqui revelado, sob a forma livreou sob a forma de sal farmaceuticamente aceitável, eb) pelo menos um co-agente, e.g. tal como indicadoanteriormente; pelo que o tal estojo (kit) podecompreender instruções para a sua administração.
Os exemplos que se seguem ilustram a invenção. 0Exemplo 1 é proporcionado com o intuito de referência. Osmétodos para a preparação de tais compostos são descritos doravante.
Exemplo 1: 2-Amida l-{[5-(2-terfc-butil-piridin-4-il)-4- metil-tiazol-2-ill-amida} do ácido (S)-pirrolidino-1,2-dicarboxilico
Et3N (1,54 mL, 11,1 mmol, 3 eq) é adicionado auma solução de [5-(2-tert-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-amida do ácido imidazole-l-carboxílico (Passo1.1) (1,26 g, 3,7 mmol) e L-prolinamida (0,548 g, 4,8 mmol, 1,3 eq) em DMF (25 mL) , sob uma atmosfera de árgon. Amistura de reação é agitada durante 14 h à ta, temperadaatravés da adição de uma solução saturada de NaHC03, e extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com umasolução saturada de NaHCCc, seca (Na2SÜ4) , filtrada econcentrada. 0 resíduo é purificado através decromatografia de coluna em gel de silica (DCM/MeOH, 1:0 -►94:6), seguido de trituração em Et2Ü para produzir 1,22 gdo composto em epígrafe como um sólido quase branco: ESI-MS: 388,1 [M+H]+; tR 2,35 min (Sistema 1); TLC: Rf = 0,36 (DCM/MeOH, 9:1). ΧΗ RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1,32 (s,9 H) 1,75-1, 95 (m, 3 H) 1,97-2,13 (m, 1 H) 2,39 (s, 3 H) 3,38-3,50 (m, 1 H) 3,52-3,65 (m., 1 H) 4,10-4,40 (m, 1 H) 6,94 (s. lg., 1 H) 7,22 (d, 1 H) 7,30-7,48 (m, 2 H) 8,49 (d, 1 H) 10,87 (s. lg., 1 H)
Passo 1.1: [5-(2-fcerfc-Butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-amida do ácido imidazole-1-carboxilico
Uma mistura de 5-(2-tert-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-ilamina (Passo 1.2) (1 g, 4,05 mmol) e 1,1'- carbonildi-imidazole (0, 984 g, 6,07 mmol, 1,5 eq) em DCM(50 mL) é agitada durante 4 h ao refluxo e deixada aarrefecer. O precipitado resultante é recolhido através defiltração para dar 1,2 6 g do composto em epígrafe como umsólido branco: ESI-MS: 340,2 [M-H]-; tR= 2,85 min (Sistema 1) .
Passo 1.2: 5-(2-tert-Butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2- ilamina
Uma mistura de N-[5-(2-tert-butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-acetamida (Passo 1.3) (2 g, 7 mmol), uma solução aquosa de HC1 6N (10 mL) e EtOH (50 mL) éagitada durante 2 h a 85°C, deixada a arrefecer, temperadaatravés da adição de uma solução saturada de NaHCCU eextraída com DCM/MeOH (9:1, v/v) . A fase orgânica é lavadacom uma solução saturada de NaHC03, seca (Na2SO<j) , filtradae concentrada. O resíduo é purificado através de croma-tografia de coluna em gel de silica (DCM/MeOH, 1:0 -► 96:4)para produzir 1,21 g do composto em epígrafe como um sólidoamarelo: ESI-MS: 248,1 [M+H]+; TLC: Rf = 0,36 (DCM/MeOH,9:1) .
Passo 1.3: N-[5-(2-tert-Butil-piridin-4-il)-4-metil-tiazol-2-il]-acetamida
Uma mistura de 2-acetamido-4-metiltiazole (1,2 g,7,7 mmol, 1,1 eq), carbonato de césio (4,55 g, 14 mmol, 2 eq), tetrafluoroborato de tri-tert-butilfosfinio (0,406 g,1,4 mmol, 0,2 eq) , acetato de paládio (II) (0,15 g, 0,7mmol, 0,1 eq) e 4-bromo-2-tert-butil-piridina (Passo 1.4)(1,5 g, 7 mmol) em DMF (50 mL) é agitada durante 1,5 h a90°C sob uma atmosfera de árgon, deixada a arrefecer,temperada através da adição de uma solução saturada deNaHCÜ3 e filtrada através uma almofada de celite. Ofiltrado é extraído com EtOAc. A fase orgânica é lavada comuma solução saturada de NaHCÜ3, seca (Na2SÜ4) , filtrada econcentrada. O resíduo é purificado através decromatografia de coluna em gel de silica (DCM/MeOH, 1:0 -►97:3) para produzir 2,02 g do composto em epígrafe como umsólido amarelo: ESI-MS: 290,1 [M+H]+; TLC: Rf = 0,35(DCM/MeOH, 9:1).
Passo 1.4: 4-Bromo-2-tert-butil-piridina
Uma mistura de 2-tert-butil-lH-piridin-4-ona(Passo 1.5) (4,25 g, 28 mmol) e POBr3 (8,88 g, 31 mmol, 1,1 eq) é aquecida até aos 120 °C, agitada durante 15 min,deixada a arrefecer, temperada através da adição de umasolução saturada de NaHC03 e extraída com DCM/MeOH (9:1,v/v) . A fase orgânica é lavada com uma solução saturada deNaHCÜ3, seca (Na2SÜ4) , filtrada e concentrada. O resíduo épurificado através de cromatografia de coluna em gel de silica (Hex/EtOAc, 95:5) para produzir 5,18 g do compostoem epígrafe como um óleo amarelo: ESI-MS: 214,0/216,0 [M+H]+; tR 2,49 min (Sistema 1); TLC: Rf = 0,35 (Hex/EtOAc,1:1) .
Passo 1.5: 2-fcerfc-Butil-lH-piridin-4-ona
Uma mistura de 2-tert-butil-piran-4-ona (Passo1.6) (5,74 g, 37,7 mmol) e uma solução aquosa de hidróxido de amónio a 30% (100 mL) é agitada durante 1 h ao refluxo, deixada a arrefecer e concentrada. O resíduo é trituradocom MeOH (200 mL) e filtrado. O filtrado é concentrado e oresíduo purificado através de cromatografia de coluna emgel de silica (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1 ^ 92:7:1) paraproduzir 4,46 g do composto em epígrafe como um sólidoamarelo: ESI-MS: 152,0 [M+H]+; tR 1,45 min (Sistema 1);TLC: Rf = 0,11 (DCM/MeOH, 9:1).
Passo 1.6: 2-tert-Butil-piran-4-ona
Uma mistura de 5-hidroxi-l-metoxi-6,6-dimetil-
hepta-1,4-dien-3-ona (Passo 1.7) (6,8 g, 36,9 mmol) e TFA
(5, 65 mL, 74 mmol, 2 eq) em benzeno (250 mL) é agitadadurante 14 h à ta e concentrada. A purificação do resíduoatravés de cromatografia de coluna em gel de silica(Hex/EtOAc, 1:0 -► 75:25) proporciona 5,74 g do composto emepígrafe como um óleo amarelo: ESI-MS: 153,1 [M+H]+; tR 3,21 min (Sistema 1); TLC: Rf = 0,22 (Hex/EtOAc, 1:1).
Passo 1.7: 5-Hidroxi-l-metoxi-6,6-dimetil-hepta-l,4-dien-3-ona
LiHMDS (1M em THF, 100 mL, 2 eq) é adicionadogota a gota a uma solução fria (-78°C) de 4-metoxi-3-buten-2-ona (10 mL, 100 mmol, 2 eq) em THF (400 mL). Depois de 30min de agitação a -78°C, é adicionada uma solução decloreto de pivaloílo (6,12 mL, 50 mmol) em THF (100 mL). Amistura resultante é deixada a aquecer até à ta ao longo de2 h e temperada através da adição de uma solução saturadade NH4CI. THF é removido sob vácuo. A mistura concentrada éextraída com Et2<3. A fase orgânica é lavada com salmoura,seca (Na2SÜ4) , filtrada e concentrada. O resíduo épurificado através de cromatografia de coluna em gel desilica (Hex/EtOAc, 1:0 -► 85:15) para produzir 6,83 g docomposto em epígrafe como um óleo amarelo: ESI-MS: 185,1 [M+H]+; TLC: Rf = 0,87 (Hex/EtOAc, 1:1).
Exemplo 15: 2-Amida 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-l,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) do ácido(S)-pirrolidino-1,2-dicarboxilico
0 composto em epígrafe é preparado em analogia aoprocedimento descrito no Exemplo 1 mas com as modificaçõesque se seguem. No Passo 1.1, a mistura de reação é agitadadurante 14 h ao refluxo. No Passo 1.2, a mistura de reaçãoé agitada durante 1 h a 85°C e extraída com EtOAc depois deser temperada. No Passo 1.3, a mistura de reação é agitadadurante 2,5 h a 120°C. No Passo 1.4, a mistura de reação éagitada durante lha 83°C e extraída com EtOAc depois deser temperada. No Passo 1.5, a mistura de reação é agitadadurante lha 65°C e não é executada trituração em MeOH. NoPasso 1.6, o produto bruto não é purificado. No Passo 1.7,é utilizado cloreto de 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propionilo (Passo 12.1).
Composto em epígrafe: ESI-MS: 442,0 [M+H]+; tR3,02 min (Sistema 1); TLC: Rf = 0,35 (DCM/MeOH, 9:1). 1HRMN (400 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 1,60 (s, 6 H) 1,70-1,95 (m,3 H) 1,99-2,16 (m, 1 H) 2,40 (s, 3 H) 3,38-3,51 (m, 1 H)3,51-3,69 (m, 1 H) 4,10-4,40 (m, 1 H) 6,95 (s. lg., 1 H) 7,39 (d, 2 Η) 7,53 (s, 1 Η) 8,58 (d, 1 Η) 10,93 (s. lg., 1H)
Num procedimento alternativo o composto emepigrafe é preparados em analogia ao procedimento descritono Exemplo 1 mas com as modificações que se seguem: N,N-
Dimetilacetamida é utilizada em vez de DMF e a mistura éagitada a 65°C durante 2 h. No Passo 1.1, é utilizadocloroformato de fenilo (lentamente adicionado) em vez de1, 1'-carbonildi-imidazole e a reação é realizada em THF napresença de N,N-dietil-isopropilamina à temperatura ambiente (1,5 h) . No Passo 1.2, a mistura de reação éaquecida sob agitação durante 5 h sob (refluxo) e extraídacom EtOAc depois de ser temperada. No Passo 1.3, a misturade reação é agitada durante 2 h a 100°C. No Passo 1.4, areação é realizada em tolueno usando 1,1 equivalentes dePOBr3 e 1,1 equivalentes de tripropilamina e a mistura éagitada durante 2 h a 80°C e extraída com EtOAc depois deser temperada. No Passo 1.5, a mistura de reação é agitadadurante 1 h a 65°C e não é executada trituração em MeOH. NoPasso 1.6, o tolueno é utilizado em vez de benzeno e oproduto bruto não é purificado. No Passo 1.7, é utilizadocloreto de 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propionilo (Passo12.1).
Passo 12.1: Cloreto de 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propi¬ onilo
0 composto em epígrafe é preparado em analogia aoprocedimento descrito no Passo 5.1 mas usando ácido 3,3,3-trifluoro-2,2-dimetil-propiónico.
Passo 5.1: Cloreto de 1-metil-ciclopropanocarbonilo
Uma mistura de ácido 1-metil-ciclopropanocarbo-xílico (10 g, 100 mmol) e cloreto de oxalilo (10,49 ml, 120mmol, 1,2 eq) em CHCI3 (80 ml) é agitada durante 4 h a70°C. A mistura de reação é concentrada para produzir 11,8g do composto em epígrafe como um óleo amarelo que éutilizado sem purificação adicional.
Condições de HPLC analíticas:
Gradiente linear 20-100% de solvente A em 5 min +1,5 min de 100% de solvente A; deteção aos 215 nm, caudalde 1 mL/min a 30°C. Coluna: Nucleosil 100-3 C18 (70 x 4,0mm) . Solvente A = CH3CN + 0,1% de TFA; Solvente B = H2O +0,1% de TFA.
Condições de MS:
Instrumento: Plataforma de Micromassa II, eluente: metanol a 15% em água contendo 0,2% de uma soluçãode hidróxido de amónio a 25%.
Espetros 1H-RMN foram medidos num EspetómetroVarian Mercury 400 nos solventes indicados. Abreviaturas:lg: largo; s: singuleto; d: dupleto; t: tripleto; q: quarteto; ppm: partes por milhão
Condições de HPLC/MS:
Instrumento: Hewlett Packard Agilent 1100 series,coluna: XBridge™ C18 2,5 microm 3,0 X 30 mm, temperatura:50°C, eluente: 2 sistemas de canal: Canal A acetonitrilo a5% em água, Canal B acetonitrilo contendo 1,0% de ácidofórmico
Tempo (minutos) % canal B Fluxo (ml/minuto) 0 5 1,4 3, 7 95 1,4 4,4 95 2,4 4,45 95 2,4 deteção: Agilent 1100 DAD 210-350 nm e Waters
Micromass ZQ 2000 ESI+ e ESI-. HPLC Preparativa:
Instrumento: sistema de HPLC preparativa Gilson,coluna: Sunfire” Prep C18 OBD” 5 microm 30 X 100 mm, temperatura: 25°C, eluente: gradiente desde 5-100% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético aquoso a 0,05% ao
longo de 20 minutos, caudal: 30 ml/minuto, deteção: UV 254 nm.
Abreviaturas e Acrônimos: BBr3 tribrometo de boro tBuP.lE^ tetrafluoroborato de tri-tert-butilfosfínio DCM diclorometano DIEA di-isopropiletilamina DMAP 4-(dimetilamino)piridina DME 1,2-dimetoxietano DMF dimetilformamida DMP 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2-(1H)- pirimidinona DMSO dimetilsulfóxido
Hex hexano L litro (s)
LiHMDS bis(trimetilsilil)amida de litio p.f. ponto de fusão MPLC cromatografia liquida de pressão média NBS N-bromossucinimida NMP l-metil-2-pirrolidona
PdCl2(dppf) [1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio(II)
Pd(PPh3) 4 tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0)
Rf proporção de frentes (TLC) ta temperatura ambiente TFA Ácido trifluoroacético THF tetra-hidrofurano TLC cromatografia de camada fina tR tempo de retenção v volume p. peso
Exemplo A: eficácia enquanto inibidores de quinase PI3
Ensaio PI3K KinaseGlo: 50 nL de diluições decomposto foram distribuídos em placas de Non Binding
Styrene (NBS) de baixo volume de 384 cavidades negras(Costar Cat. No. NBS#3676). L-a-fosfatidilinositol (PI),fornecido como 10 mg/ml de solução em metanol, foitransferido para um tubo de vidro e seco sob corrente deazoto. Foi então ressuspenso em OctilGlucósido a 3% (OG)submetendo a remoinho e armazenado a 4°C. O Ensaio deQuinase Luminescente KinaseGlo (Promega, Madison/WI, USA) éum método HTS homogêneo de medição da atividade de quinaseatravés da quantificação da quantidade de ATP remanescentena solução a seguir a uma reação de quinase.
Foram adicionados 5 μ]0 de uma mistura de PI/OG com o subtipo PI3K (Tabela 1) . As reações de Quinase foraminiciadas através da adição de 5 μΐ de mistura de ATPcontendo num volume final 10 μΐ de TRIS-HC1 10 mM pH 7,5,MgCl2 3mM, NaCl 50 mM, CHAPS a 0,05%, DTT 1 mM e ATP 1 μΜ,e decorreram à temperatura ambiente. As reações foramparadas com 10 μΐ de KinaseGlo e as placas foram lidas 10min mais tarde num leitor Synergy2 usando um tempo de integração de 0,1 segundos por cavidade. Foram adicionados2,5 μΜ de um inibidor de PI3 guinase de uma pan-classe 1(padrão) às placas de ensaio para gerar 100% de inibição dareação de quinase, e a inibição de 0% foi dada pelo veiculosolvente (DMSO a 90% em água) . O padrão foi usado como umcomposto de referência e incluído em todas as placas deensaio sob a forma de 16 pontos de diluição em duplicado.
Tabela 1 Pl3Ks através de KlnaseGlo: condições de ensaio e protocolo do reagente
Clonagem de Pl3Ks
As construções Ρΐ3Κα, Ρΐ3Κβ e PI3KÔ são fusão dodomínio de p85a iSH2 e as isoformas pllO respetivas. Ofragmento p85a e genes de isoforma pllO foram geradosatravés de PCR a partir de cDNA da primeira cadeia geradopor RT-PCR a partir de RNA comercial da placenta,testículos e cérebro, tal como descrito seguidamente. Aconstrução Ρΐ3Κγ foi obtida a partir do Roger Williams lab,MRC Laboratory de Molecular Biology, Cambridge, UK (Novembro, 2003) e é descrita (Pacold, Michael E.; Suire,Sabine; Perisic, Olga; Lara-Gonzalez, Samuel; Davis, ColinT.; Walker, Edward H.; Hawkins, Phillip T.; Stephens, Len;Eccleston, John F.; Williams, Roger L. Crystal structureand functional analysis de Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma. Cell (2000), 103(6), 931-943) .
Construções ΡΙ3Κα e proteínas
BV1075: A construção para Baculovirus BV-1075 foigerada através de uma ligação de três partes constituídapor um fragmento p85 e um fragmento pllOa clonados novetor pBlueBac4.5. 0 fragmento p85 foi derivado a partir deplasmídeo pl661-2 digerido com Nhe/Spe. O fragmento pllOaderivado a partir do seu clone foi verificado por sequenci-ação e usado num LR410 como um fragmento Spel/Hindlll. Paragerar o vetor de expressão de baculovirus LR410 foi usada areação LR gateway para transferir a inserção para o vetorpBlueBac4.5 (Invitrogen) adaptado a Gateway. O vetor declonagem pBlueBac4.5 (Invitrogen) foi digerido comNhe/HindIII. Isto resultou na construção PED 153,8. Ocomponente p85 (iSH2) foi gerado por PCR usando ORF 318(descrito anteriormente) como um modelo e uma sequênciainiciadora direta KAC1028 (5'-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC) (SEQ ID NO: 1) e duas sequências iniciadoras reversas, KAC1029 (5'-GCCTCCACCAC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC) (SEQ ID NO: 2) e KAC1039 (5' -TACTAGTC-CGCCTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC) (SEQ ID NO:3) . As duas sequências iniciadoras reversas sobrepõem-se eincorporam o elemento de ligação 12x Gly e a sequência N-terminal do gene pllOa no sitio do Spel. O elemento deligação 12x Gly substitui o elemento de ligação Gly simplesna construção BV1052. 0 fragmento PCR foi clonado no pCR2.1TOPO (Invitrogen). Dos clones resultantes, determinou-seque pl661-2 estava correto por sequenciação. Este plasmídeofoi digerido com Nhe e Spel e o fragmento resultante foiisolado com gel e purificado para subclonagem. 0 fragmento de clonagem pllOa foi gerado pordigestão enzimática do clone LR410 (ver referênciaanterior) com Spe I e HindIII. 0 sitio Spel encontra-se naregião de codificação do gene pllOa. 0 fragmento resul¬tante foi isolado com gel e purificado para subclonagem. 0vetor de clonagem, pBlueBac4.5 (Invitrogen) foi preparadopor digestão enzimática com Nhe e HindIII. 0 vetor de cortefoi purificado com coluna Qiagen e depois desfosforiladocom fosfatase alcalina Intestinal de Vitela (CIP)(BioLabs). Depois da reação CIP completa o vetor de cortefoi novamente purificado por coluna para gerar o vetorfinal. Uma ligação de três partes foi executada usandoligase Roche Rapid e as especificações do fornecedor. 0plasmídeo final foi verificado por sequenciação.
Dominio de Quinase.
Sequência da Proteína de BV 1075: 1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 4)
Construções ΡΙ3Κβ e proteínas
BV949: produtos PCR para o domínio inter SH2 (iSH2) das subunidades Ρΐ3Κα, Ρΐ3Κβ e PI3KÔ p85 e para asubunidade ρΙΙΟβ de comprimento total foram gerados efundidos através de PCR de sobreposição. O produto PCR iSH2foi obtido a partir de cDNA da primeira cadeia gerado porRT-PCR a partir de RNA humano comercial de placenta,
testículos e cérebro (Clontech), usando inicialmentesequências iniciadoras gwG130-p01 (5'-CGAGAATATGATAGATTATA-TGAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 5) e gwG130-p02 (5' -TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3') (SEQ ID NO: 6). Subsequente¬mente, numa reação de PCR secundária foram adicionadossítios AttBl de recombinação de Gateway e sequências deelemento de ligação na extremidade 5' e na extremidade 3'do fragmento p85 iSH2 respetivamente, usando sequênciasiniciadoras gwG130-p03 (5'-GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTA-CGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATG AAGAAT-3') (SEQID NO: 7) e gwG130-p05 (5'-ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3') (SEQ ID NO: 8). O fra¬gmento ρΙΙΟβ foi obtido por PCR usando como modelo um cloneρΙΙΟβ (a partir de origem desconhecida que foi verificadapor sequenciação) usando sequências iniciadoras gwG130-p04(5'-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTTCAGTTTCATAATGCCTCCTGCT-3') (SEQ ID NO: 9) que contém sequências de elemento deligação e a extremidade 5' de ρΙΙΟβ e gwG130-p06 (5' —AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAACTGTGTG-3') (SEQ ID NO: 10) que contém sequências da extremidade 3'de pllO-β fundido com uma marca de Histidina. A proteína defusão p85-iSH2/ ρΙΙΟβ foi reunida, por um PCR desobreposição, uma reação dos elementos de ligação naextremidade 3' do fragmento iSH2 e a extremidade 5' dofragmento ρΙΙΟβ, usando a já anteriormente mencionadasequência iniciadora gwG130-p03 e uma sequência iniciadoracontendo uma marca de Histidina de sobreposição e assequências de recombinação de AttB2 (5'-GGGACCACTTTGTACAAG-AAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCT CC-3') (SEQ ID NO: 11). Este produto final foi recombinado numa reação ORGateway (Invitrogen) no vetor dador pDONR201 (Invitrogen)para gerar o clone de entrada ORF253. Este clone foiverificado por sequenciação e usado numa reação LR Gateway(Invitrogen) para transferir a inserção para o vetorpBlueBac4.5 (Invitrogen) adaptado a Gateway para gerar ovetor de expressão de baculovirus LR280. Este LR280 tem umamutação de aminoácido na sequência p85.
Domínio de Quinase.
Sequência da Proteína de BV949:
1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE FDINICDLPR MARLCFAVYA VLDKVKTKKS TKTINPSKYQ541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF DFKGQLRTGD IILHSWSSFP DELEEMLNPM GTVQTNPYTE601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP PFDKIIEKAA EIASSDSANV SSRGGKKFLP VLKEILDRDP661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR EIFPQSLPKL LLSIKWNKLE DVAQLQALLQ IWPKLPPREA721 LELLDFNYPD QYVREYAVGC LRQMSDEELS QYLLQLVQVL KYEPFLDCAL SRFLLERALG781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA VSVQFGVILE AYCRGSVGHM KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI841 KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL KQSAYREALS DLQSPLNPCV ILSELYVEKC KYMDSKMKPL901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN GDDLRQDMLT LQMLRLMDLL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD961 RSGLIEWST SETIADIQLN SSNVAAAAAF NKDALLNWLK EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM VKKTGQLFHI DFGHILGNFK SKFGIKRERV PFILTYDFIH1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC EDAYLILRRH GNLFITLFAL MLTAGLPELT SVKDIQYLKD1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD EALRESWTTK VNWMAHTVRK DYRSGAHHHH HHGA (SEQ ID NO: 12)
Domínio de Quinase.
Construção ΡΙ3Κγ e proteína
Construção obtida a partir de Roger Williams lab,MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK(Novembro, 2003). Descrição da construção em (Pacold,Michael E.; Suire, Sabine; Perisic, Olga; Lara-Gonzalez,Samuel; Davis, Colin T.; Walker, Edward H.; Hawkins,Phillip T.; Stephens, Len; Eccleston, John F.; Williams,Roger L. Crystal structure and functional analysis of Rasbinding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell (2000), 103(6), 931-943). Construções às quais falta ο144 aa N-terminal.
Sequência da Proteína de BV950:
1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHWLDTPPD PALDEVRKEE181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA 9 61 HHHHHH (SEQ ID NO: 13)
Construção ΡΙ3Κδ e proteína
BV1060: produtos PCR para o domínio inter SH2 (iSH2) da subunidade p85 e para a subunidade ρΙΙΟδ de com¬primento total foram gerados e fundidos por PCR de sobre¬posição. 0 produto PCR iSH2 foi gerado usando como modelo oORF318 (ver anteriormente) e as sequências iniciadorasgwG130-p03 (5'-GGGACAAG-TTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATAT- ACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3') (SEQ ID NO: 7) e gwG154-p04 (5'-TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTT- GTC-3') (SEQ ID NO: 14). 0 fragmento ρΙΙΟδ foi obtido a
partir de cDNA da primeira cadeia gerado através de RT-PCRa partir de RNA humano comercial da placenta, testículos ecérebro (Clontech), usando inicialmente sequências inicia¬doras gwG154-p01 (5'-ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3') (SEQ ID NO: 15) e gwG154-p02 (5'-CTACTGCCTGT-TGTCTTTGGACACGT-3') (SEQ ID NO: 16). Numa reação de PCR subsequente sequênciasde elemento de ligação e uma marca de Histidina foram adi¬cionadas na extremidade 5' e na extremidade 3' do fragmentoρΙΙΟδ respetivamente, usando sequências iniciadoras gwl54-p03 (5'-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT- GGA-3') (SEQ ID NO: 17) e gwG154-p06 (5'-AGCTCCGTGATGGTGAT-GGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3') (SEQ ID NO:18) . A p85-iSH2/proteína de fusão ρΙΙΟδ foi reunida numaterceira reação de PCR através dos elementos de ligação desobreposição na extremidade 3' do fragmento iSH2 e na ex- tremidade 5' do fragmento ρΙΙΟδ, usando a já anteriormentemencionada sequência iniciadora gwG130-p03 e uma sequênciainiciadora contendo uma marca de Histidina de sobreposiçãoe as sequências de recombinação AttB2 de Gateway (Invi-trogen) (5'-GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGT-GATGGTGAGTGCTCC-3') (SEQ ID NO: 19). Este produto final foirecombinado numa reação OR Gateway para o vetor dadorpDONR201 (Invitrogen) para gerar o clone de entrada ORF319.Este clone foi verificado por sequenciação e usado numareação LR Gateway (Invitrogen) para transferir a inserçãopara o vetor pBlueBac4.5 (Invitrogen) adaptado a Gatewaypara gerar o vetor de expressão de baculovirus LR415.
Sequência da Proteína de BV1060: 1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD121 CPMEFWTKEE NQSWVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP301 NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLWQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE WLRSDTIAN IQLNKSNMAA961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH (SEQ ID NO: 20)
Purificação de construções ΡΙ3Κα, ΡΙ3Κβ e ΡΙ3Κγ Ρΐ3Κα, Ρΐ3Κβ e Ρΐ3Κγ foram purificadas em doispassos cromatográficos: cromatografia de afinidade do metalimobilizado (IMAC) numa resina Ni sepharose (GE Healthcare)e filtração com gel utilizando uma coluna Superdex 26/60200 (GE Healthcare). Todos os tampões foram arrefecidos atéaos 4°C a lise foi realizada arrefecida em gelo. 0 fracio-namento na coluna foi executado à temperatura ambiente.Todos os tampões usados para purificar Ρΐ3Κβ continham0,05% de Triton X100 em adição aquilo que é de seguidadescrito.
Tipicamente células congeladas a partir de 10 Lde cultura de células Tn5 foram ressuspensas em "Tampão deLise" Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol a 5%,imidazole 5 mM, NaF 1 mM, 0,1 ug/mL de ácido ocadáico(OAA) , 5 mM de BME, 1 x Coquetel (cocktail) inibidor deprotease completo - livre de EDTA (20 comprimidos/1 L detampão, Roche Applied Sciences), benzonase (25U/mL tampão,EMD Biosciences) numa proporção de 1:6 v/v de pélete paraTampão de Lise, e mecanicamente lisado dando 20 golpesusando um pilão de ajustamento apertado. O lisado foicentrifugado a 45000 g durante 30 minutos, e o sobrenadantefoi carregado numa coluna IMAC pré-equilibrada (3 mL deresina/100 mL de lisado) . A coluna foi lavada com 3-5volumes de coluna de Tampão de Lise, seguido-se uma segundalavagem de 3-5 volumes de coluna com Tris-Cl 20 mM, pH 7,5,
NaCl 500 mM, glicerol a 5%, imidazole 45 mM, NaF 1 mM,0,lμg/mL de OAA, BME 5 mM, lx Coquetel (cocktail) inibidorde protease completo - livre de EDTA. A proteína foi eluídacom Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, glicerol a 5%,imidazole 250 mM, NaF 1 mM, 0,^g/mL de OAA, BME 5 mM, lxCoquetel (cocktail) inibidor de protease completo - livrede EDTA. As frações pertinentes foram analisadas através deSDS-PAGE e agrupadas em conformidade. A proteína foipurificada adicionalmente através de filtração com gel numacoluna Superdex 26/60 200 equilibrada em Tris-Cl 20 mM, pH7,5, NaCl 0,5 M, glicerol a 5%, NaF 1 mM, DTT 5 mM, lxCoquetel (cocktail) inibidor de protease completo - livrede EDTA. Frações pertinentes foram analisadas através deSDS-PAGE e agrupadas em conformidade. Um volume igual deTampão de Diálise (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM,glicerol a 50%, NaF 5 mM, DTT 5 mM) foi adicionado aoproduto agrupado e depois dialisado contra duas alteraçõesdo Tampão de Diálise (uma alteração de um dia para ooutro). A proteína foi armazenada a -20°C.
Purificação de ΡΙ3Κδ PI3KÔ foi purificada em três passos cromatográ-ficos: cromatografia de afinidade do metal imobilizado numaresina Ni Sepharose (GE Healthcare), filtração por gelutilizando uma coluna Superdex 26/60 200 (GE Healthcare), efinalmente um passo de permuta iónica numa coluna Q-HP (GEHealthcare). Todos os tampões foram arrefecidos até aos 4°Ce foi realizada lise arrefecida em gelo. 0 fracionamento dacoluna foi executado à temperatura ambiente.
Tipicamente as células congeladas a partir de 10L de cultura de células Tn5 foram ressuspensas em "Tampãode Lise" Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol a 5%,imidazole 5 mM, NaF 1 mM, 0,^g/mL de ácido ocadáico (OAA) ,BME 5 mM, 1 x Coquetel (cocktail) inibidor de proteasecompleto - livre de EDTA (20 comprimidos/1 L de tampão,Roche Applied Sciences), benzonase (25U/mL de tampão delise, EMD Biosciences) numa proporção de 1:10 v/v de péletepara Tampão de Lise, e mecanicamente lisado dando 20 golpesusando um pilão de ajustamento apertado. O lisado foicentrifugado a 45000 g durante 30 minutos, e o sobrenadantefoi carregado numa coluna IMAC pré-equilibrada (5 mL deresina/100 mL de lisado) . A coluna foi lavada com 3-5volumes de coluna de Tampão de Lise, seguidos de umasegunda lavagem de 3-5 volumes de coluna com Tris-Cl 20 mM,pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol a 5%, 40 mM de imidazole, NaF1 mM, 0,1 ug/mL de OAA, BME 5 mM, 1 x Coquetel (cocktail)inibidor de protease completo - livre de EDTA. A proteínafoi eluída com Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerola 5%, imidazole 250 mM, NaF 1 mM, 0,^g/mL de OAA, BME 5mM, 1 x Coquetel (cocktail) inibidor de protease completo -livre de EDTA. Frações pertinentes foram analisadas atravésde SDS-PAGE e agrupadas em conformidade. A proteína foipurificada adicionalmente através de filtração por gel numaSuperdex 200 equilibrada em Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500mM, glicerol a 5%, NaF 1 mM, 0,1 ug/mL de OAA, DTT 5 mM, 1x Coquetel (cocktail) inibidor de protease completo - livrede EDTA. Frações pertinentes foram analisadas através de SDS-PAGE e agrupadas em conformidade. Estas frações foramdiluídas em 1:10 v/v proporção de volume de produtoagrupado para tampão com "Tampão A" Tris-Cl 20 mM, pH 8,2,glicerol a 5%, NaF 1 mM, 0,1 μρ/ηΛ de OAA, DTT 5 mM ecarregadas numa coluna Q-HP preparada. Depois docarregamento da amostra estar completo lava-se com Tampão Ae 5% de "Tampão B" Tris-Cl 20 mM, pH 8,2, NaCl 1 M,glicerol a 5%, NaF 1 mM, 0,1 ug/mL de OAA, DTT 5 mM para 3-5 volumes de coluna. Elui-se a proteína usando um gradientede 5%-30% de Tampão B. Tipicamente a proteína elui em NaCl-200 mM. As frações pertinentes foram analisadas através deSDS-PAGE e agrupadas em conformidade. Um volume igual deTampão de Diálise (Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM,glicerol a 50%, NaF 1 mM, 0,^g/mL de OAA, DTT 5 mM) foiadicionado ao produto agrupado e depois dialisado contra asduas alterações do Tampão de Diálise (uma alteração de umdia para o outro). A proteína foi armazenada a -20°C.
Os resultados que se seguem foram obtidos usandoos ensaios descritos anteriormente.
O composto da presente invenção mostra sele¬tividade para PI3K alfa respeitante aos subtipos beta e/oudelta e/ou gama e.g. tal como medido num ensaio bioquímico.
Exemplo B: Determinação de depuração metabólica in vitroAbreviaturas ACN Acetonitrilo ADME Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção ALP Posicionador de material de laboratório automatizado
%B % de solvente B de HPLC BT Biotransformação (ou estabilidade metabólica ou estabilidade microssomal) [C]t=0 Inicial (tempo zero) concentração de TA In vitroCLh Depuração hepática (mL/min/kg) CLint Taxa de depuração intrínseca (μΙ, de volume de reação/min/mg de proteína microssomal) CLint,s Taxa de depuração intrínseca dimensionada para amassa do fígado (μΕ de volume de reação/min/g de fígado)Cyno Cinomólogo CYP(s) Citocromo P450(s)
DiH20 Água Desionizada ERh Proporção de extração Hepática ESI Ionização por eletropulverização fub Fração livre de fármaco no sangue ou plasma fum Fração livre de fármaco em microssomas IS Padrão interno kmic Taxa de eliminação em microssomas KPi Tampão de fosfato de potássio 0,05 M, pH 7,4 LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada com tandem de espetrometria de massa LOD Limite de deteção M Conteúdo de proteína microssomal na incubação (mg/mL) NADPH Fosfato de β-Nicotinamida adenina dinucleótido, forma reduzida NCE Nova entidade química NSB Ligação não específica
Qh Fluxo de sangue do portal (mL/min/kg) RPM Rotações por minuto SD Desvio Padrão S-D Sprague-Dawley SFl Fator de escala: mg de proteína microssomal por grama do fígado SF2 Fator de escala: grama de fígado por kg de peso corporal de animal tl/2 Semivida da depuração de in vitro (min) TA Artigo de teste UDPGA Ácido uridina 5'difosfoglucurónico UGT Uridina 5'difosfato de glucuronosiltransferases V Volume de incubação da reação (μΕ)
Artigo de teste final e concentrações de proteí¬na, assim como duração da incubação, são mostradas emseguida (Tabela 1). Foram selecionadas concentrações deartigo de teste reduzidas de modo a concordar com aassunção de que a cinética da reação é avaliada a umaconcentração menor que (ou aproximadamente igual a) .Km.DMSO é conhecido por ter um efeito inibidor sobre aatividade CYP. Por conseguinte, a concentração de DMSO no meio de incubação foi restrita a 0,01% (v/v) de forma a queser minimizada a interferência com o processo metabólico.
Tabela 1 Componentes e concentrações da reação final emincubações de depuração metabólica
Um experiência típica é executada em formato de96 cavidades com incubação com sacudimento a 37°C. A taxade depuração metabólica in vitro é derivada a partir dosdados recolhidos em quatro momentos (e.g. 0, 5 , 15 e 30 minutos) numa reação que inclui cofator(es) (NADPH e/ouUDPGA). Uma incubação de controlo negativo de 30 minutos(menos o cofator) é também executada para avaliar problemasde estabilidade não relacionados com CYP (e.g.,instabilidade química, metabolismo independente de CYP).
Em geral, TA em DMSO 10 mM são diluídos 1:1000 emACN a 0,6% (v/v) em DiH20 até 10 μΜ. Imediatamente antes doinício da experimentação são suspensas 1,25 mg/mL deproteína microssomal em KPi 50 mM. Para avaliação dometabolismo mediado por UGT, a suspensão podem ser primeiropré-tratada através de 5 min de incubação em gelo comalameticina (25 μg/mg de proteína microssomal). Éadicionado TA (35 μΐι) a 140 μΐι das suspensões microssomaispara 175 de mistura enzima-substrato. Esta misturaenzima·substrato é pré-incubada durante 15 min a 37°C. Aincubação de controlo negativo de 30 min é processadacombinando 25 μΐι de mistura de enzima· substrato com umvolume igual de 50 mM de KPi contendo MgC12 4 mM. Depoisdos 30 minutos de incubação a 37°C, a mistura é temperadaadicionando 50 pL de ACN contendo o padrão interno MS(alprenolol 2 μΜ) . 0 momento T=0 min é processado
combinando 25 da mistura de enzima·substrato diretamentecom 50 pL de ACN contendo o padrão interno MS (alprenolol 2μΜ) . São adicionados 25 μ]1 da solução do cofator (NADPH 2 mM em KPi 50 mM mais MgC12 4 mM; incluindo opcionalmenteUDPGA 2 mM para ensaios CYP+UGT) para simular a mistura dereação temperada completa.
As reações em volume de massa para os restantesmomentos são iniciadas através da adição de 125 μΐι desolução de cofator (NADPH 2 mM em KPi 50 mM mais MgC12 4mM) aos restantes 125 μΐι de mistura de enzima· substrato.
Para o metabolismo de UGT, UDPGA 2 mM, é também incluída nasolução de cofator. Em momentos específicos da reação (e.g.5 , 15, 30 minutos) , partes alíquotas da reação (50 μ]0) sãoremovidas e as reações são terminadas através da adição deacetonitrilo (50 μ]0 contendo padrão interno deespetrometria de massa (alprenolol 2 μΜ). Todas as amostrassão centrifugadas a ~3400xg a 4°C durante 10 min e ossobrenadantes são analisados através de LC-MS/MS paraquantificação do restante TA. A percentagem de TAremanescente, relativa a 0 minutos, é utilizada paraestimar a constante da taxa de eliminação in vitro (Jcmic)que pode ser usada para calcular as taxas de depuraçãometabólica in vitro. A análise de amostras é executada num sistema decromatografia líquida de alta resolução - espetrometria demassa tandem (LC/MS) constituído por um espetómetro demassa Waters Quattro Premiere, uma fonte iónica ESI, uminjetor automático CTC-HTS Pal, e uma Bomba Agilent LC. Asamostras são separadas numa coluna Atlantic C18, 2,1 x 30mm, 3,5 micron usando o gradiente de fase móvel rápidodestacado na Tabela 2. A fase móvel A consiste em águapurificada contendo formato de amónio 10 mM. A fase móvel Bconsiste em acetonitrilo contendo 0,01% de ácido fórmico. Ocaudal é 1 mL/min. O volume de injeção é 10 μ]0. Osprimeiros 30 segundos de eluição são eliminados paralimpeza da amostra. Os compostos são detetados usando osoftware MassLynx/QuanLynx que recolhe dados sobre a intensidade para todos os fragmentos relacionados com opeso molecular do composto de teste. Após a recolha dosdados em bruto, o software pode combinar os perfis de até 3qualidades de fragmentos se necessário. Genericamente, opico de fragmento de intensidade mais forte é integrado.
Tabela 2 Gradiente da fase móvel para HPLC
Tempo (min) %B 0,0 5 0,2 5 0,85 95 1,02 95 1,05 5
Cada taxa de eliminação microssomal, A:mic, ébaseada numa curva de eliminação de 4 pontos testada emsinguleto. Dados em bruto da LC-MS/MS para uma placa dereação são devolvidos como áreas de pico de analitointegradas para o TA e IS. Estes valores podem serconvertidos em proporções de áreas de pico de analito:ISpara padronizar comparações de dados. O momento da reação (e.g. 0, 5, 20 ou 30 min) é representado graficamente versus o logaritmo natural dapercentagem de TA restante relativa aos 0 minutos (baseadana proporção de área de pico relativa) . 0 declive deste gráfico de depuração, Amic, é utilizado para calcular a semivida in vitro, t1/2, tal como mostrado na Eq. (1). Deforma a focar na cinética da reação linear, sempre quepossível, pontos de dados representando <10% de TAremanescente são genericamente excluídos da definição dodeclive do gráfico da depuração. A reação tl/2 é o valorexperimental central usado para calcular CLint (Eq. 2)
Eq. (1): VA = 0.693/-km,cEq (2): Clint = 0.693/-km/c · V/M
Os resultados que se seguem foram obtidos usandoo procedimento descrito anteriormente:
Exemplo C: Inibição de mutantes de PI3K alfa E545K e H1047Rdeterminada num ensaio de luminescência de luciferase A luminescência é uma forma de leitura bemestabelecida para determinar concentrações de ATP e podepor isso ser usada para seguir a atividade de muitasquinases independentemente dos seus substratos. O Ensaio deQuinase de Luminescência KinaseGlo (Promega, Madison/WI, USA) é um método HTS homogêneo de medição da atividade daquinase quantificando a quantidade de ATP remanescente nasolução a seguir à reação da quinase.
Fosfoinositido 3-quinase foi incubada à tempera¬tura ambiente em 50- μΐ de meio contendo ATP 1 μΜ, MgC12 5mM, NaCl 50 mM, 5 μg/ml de fosfatidilinositol de soja(Avanti Polar lipids, Cat. Nr 840044C), octoglucósido a0,015% (Sigma, Cat. Nr 09882), CHAPS a 0,01%, DTT 1 mM,DMSO a 2,5%, e Tris-HCl 10 mM pH 7,5. A reação da quinasefoi iniciada através da adição de ATP (15 min de pré-incubação de enzima com inibidor) e interrompida após 1 hcom 50 μΐ de KinaseGlo® (Promega, cat. Nr V6714) e aluminescência foi medida através de um leitor Victor II(integração de 0,1 s) . As curvas foram ajustadas porregressão não linear usando a equação logística (model 205de XLfit®, ID Business Solutions, Guildford, UK).
Princípio do Ensaio de Luminescência do Ensaio (Quina-seGlo):
Usando o sistema do ensaio anterior e usandoproteínas PI3K obtidas a partir das construçõesapresentadas na tabela que se segue
foi aferida a atividade inibidora contra PI3K alfa tiposelvagem e mutante. Os resultados são mostrados na tabelaque se segue.
Inibição de PI3K alfa tipo selvagem e mutante:
BV1147: A mutação ativadora de E545K encontrada em muitos cancros foi introduzida no ORF318 através demutagéneses dirigidas ao sítio com o estojo (kit) demutagéneses QuickChange XL (Stratagene). Usando o métodorecomendado pelo fabricante e as sequências iniciadorasmutagénicas gwG152-pl5 (5'-CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATT-TT-3') (SEQ ID NO: 21) e gwG152-pl6 (5'-AAAATCTTTCTCCTGCT-TAGTGATTTCAGAGAG-3') (SEQ ID NO: 22) foi gerado ORF544.
Este clone foi verificado por sequenciação e usado numareação LR Gateway (Invitrogen) para transferir a inserçãono vetor de pBlueBac4.5 adaptado a Gateway (Invitrogen)para gerar o vetor de expressão de baculovírus LR561.
Dominio de Quinase.
Sequência da proteína de BV 1147: 1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 23). BV1097: A mutação ativadora H1047R encontrada emmuitos cancros foi introduzida no ORF318 através de muta-géneses dirigidas ao sitio com o estojo (kit) demutagéneses QuickChange XL (Stratagene).
Usando o método recomendado pelo fabricante e assequências iniciadoras mutagénicas gwG152-p07 (5'- CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3') (SEQ ID NO: 24) e
gwG152-pll (5'-TGTCCAGCCA-CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3') (SEQ ID NO: 25) ORF396 foi gerado. Este clone foi verificado porsequenciação e usado na reação LR Gateway (Invitrogen) paratransferir a inserção para o vetor pBlueBac4.5 adaptado aGateway (Invitrogen) para gerar o vetor de expressão debaculovirus LR480.
Domínio de Quinase.
Sequência de Proteína de BV 1097: 1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIWIWVIVS301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSWKFPDM SVIEEHANWS601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE WRNSHTIMQ961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF1141 MKQMNDARHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO: 26).
Lisboa, 26 de janeiro de 2016

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. 0 composto
  2. 2-Amida 1-({4-metil-5-[2-(2,2,2- trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il}-amida) do ácido (S)-pirrolidino-1,2-dicarboxílico, de estrutura:
    sob a forma livre ou sob a forma de sal farmaceuticamenteaceitável. 2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1 ,sob a forma livre ou sob a forma de sal farmaceuticamenteaceitável, para utilização como um produto farmacêutico.
  3. 3. Utilização do composto de acordo com areivindicação 1 , sob a forma livre ou sob a forma de salfarmaceuticamente aceitável, para o fabrico de ummedicamento para o tratamento de cancro.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3,em que o cancro é selecionado a partir de sarcoma; pulmão;brônquios; próstata; mama; pâncreas; cancro gastrointes¬ tinal; cólon; reto; carcinoma do cólon; adenomacolorrectal; tiroide; fígado; dueto intra-hepático biliar;hepatocelular; glândula suprarrenal; estômago; gástrico;glioma; glioblastoma; endométrio; melanoma; rins; pélvisrenal; bexiga urinária; corpo uterino; colo do útero;vagina; ovários; mieloma múltiplo; esôfago; uma leucemia;leucemia mielogenosa aguda; leucemia mielogenosa crônica;leucemia linfocitária; leucemia mielóide; cérebro; umcarcinoma do cérebro; cavidade oral e faringe; laringe;intestino delgado; linfoma não-Hodgkin; melanoma; adenomado cólon viloso; uma neoplasia; uma neoplasia de carácterepitelial; linfomas; um carcinoma mamário; carcinoma celu¬lar basal; carcinoma das células escamosas; queratoseactínica; doenças tumorais, incluindo tumores sólidos; umtumor do pescoço ou cabeça; policitemia vera; trombocitemiaessencial; mielofibrose com metaplasia mielóide; e doençade Waldenstrom.
  5. 5. Uma composição farmacêutica compreendendouma quantidade terapeuticamente eficaz do composto deacordo com a reivindicação 1, sob a forma livre ou sob aforma de sal f armaceuticamente aceitável e um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis.
  6. 6. Uma composição farmacêutica combinada,adaptada para administração simultânea ou sequencial,compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz docomposto de acordo com a reivindicação 1 sob a forma livre ou sob a forma de sal f armaceuticamente aceitável e umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais parceirosde combinação; e um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis .
  7. 7. Uma composição farmacêutica de acordo com areivindicação 5 ou uma composição farmacêutica combinada deacordo com a reivindicação 6 para utilização no tratamentode cancro.
  8. 8. Um composto de acordo com a reivindicação 1ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilizaçãono tratamento de cancro.
  9. 9. Um composto de acordo com a reivindicação 8ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilizaçãono tratamento de um cancro selecionado a partir de sarcoma;pulmão; brônquios; próstata; mama; pâncreas; cancrogastrointestinal; cólon; reto; carcinoma do cólon; adenomacolorrectal; tiroide; fígado; dueto intra-hepático biliar;hepatocelular; glândula suprarrenal; estômago; gástrico;glioma; glioblastoma; endométrio; melanoma; rins; pélvisrenal; bexiga urinária; corpo uterino; colo do útero;vagina; ovários; mieloma múltiplo; esôfago; uma leucemia;leucemia mielogenosa aguda; leucemia mielogenosa crônica;leucemia linfocitária; leucemia mielóide; cérebro; umcarcinoma do cérebro; cavidade oral e faringe; laringe;intestino delgado; linfoma não-Hodgkin; melanoma; adenoma do cólon viloso; uma neoplasia; uma neoplasia de carácterepitelial; linfomas; um carcinoma mamário; carcinomacelular basal; carcinoma das células escamosas; queratoseactínica; doenças tumorais, incluindo tumores sólidos; umtumor do pescoço ou cabeça; policitemia vera; trombocitemiaessencial; mielofibrose com metaplasia mielóide; e doençade Waldenstrom. Lisboa, 26 de janeiro de 2016 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas paraconveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patenteEuropéia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar asreferências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEPdeclina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * WO 2G04Q987Q7 A * US 5041424 A * WQ 2805021519 A * US 5478332 A * WO 2086051270 A # WO 0230841 A * W0 2QQ7128044 A * WO 9797081A * WOOSG21518A % WQ 8907105  * WQ 04096797 A * .WO 9307153 A * US 5*57105 A * WO 0104125 A * US 5616682 A * WO 9008809. 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