CN102149711B - 有机化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物或其盐，其中取代基如说明书所定义，还涉及组合物和所述化合物在治疗通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶来改善的疾病中的用途。

Description

有机化合物
本发明涉及作为新的α选择性的磷脂酰肌醇(PI)3-激酶抑制剂化合物的特定的2-氨甲酰环氨基脲衍生物、它们的可药用盐、其前药以及它们的制备方法。本发明还涉及单独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物以及任选的可药用载体的组合物。本发明还涉及使用单独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物来治疗多种疾病、特别是通过一种或多种生长因子、受体酪氨酸激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、G蛋白偶联受体以及磷脂激酶和磷酸酶的异常活性所介导的那些疾病的方法。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)包括脂激酶(lipid kinases)家族，这些脂激酶可催化磷酸基团转移到肌醇脂类的D-3′位置上，产生磷酸肌醇-3-磷酸(PIP)、磷酸肌醇-3，4-二磷酸(PIP2)和磷酸肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，它们接着作为第二信使在信号级联放大中通过使含有普列克底物蛋白-同源区、FYVE、Phox和其它磷脂结合结构域的蛋白质停靠在通常位于质膜的多种信号传导复合物中而发挥作用((Vanhaesebroeck等人，Annu.Rev.Biochem70：535(2001)；Katso等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17：615(2001))。在两种1类PI3K中，1A类PI3K是由与调节亚基(它可以是p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ组成性结合的催化p110亚基(α、β、δ同工型)所组成的异二聚体。1B类亚类具有一个家族成员：由与两个调节亚基p101或p84其中之一结合的催化p110γ亚基所组成的异二聚体(Fruman等人，Annu Rev.Biochem.67：481(1998)；Suire等人，Curr.Biol.15：566(2005))。p85/55/50亚基的模块结构域包括Src同源性(SH2)结构域，它们可使特定的序列背景的磷酸酪氨酸残基结合在激活的受体和胞质酪氨酸激酶上，引起1A类PI3K的激活和定位。1B类PI3K直接被结合各种肽和非肽类配体的G蛋白偶联受体所激活(Stephens等人，Cell 89：105(1997))；Katso等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17：615-675(2001))。因此，I类PI3K产生的磷脂产物使上游受体与下游的细胞活动联系起来，所述的细胞活动包括增殖、存活、趋化性、细胞运输、运动性、代谢、炎症和过敏反应、转录和翻译(Cantley等人，Cell 64：281(1991)；Escobedo和Williams，Nature 335：85(1988)；Fantl等人，Cell 69：413(1992))。
在许多情况中，PIP2和PIP3将Akt(病毒癌基因v-Akt的人类同源物的产物)募集到质膜，在那里它充当许多对生长和存活很重要的细胞内信号传导途径的节点(Fantl等人，Cell 69：413-423(1992)；Bader等人，Nature Rev.Cancer 5：921(2005)；Vivanco和Sawyer，Nature Rev.Cancer 2：489(2002))。PI3K的异常调节通常通过Akt的激活来增加存活，这是人类癌症中最普遍的事件之一，并且已经显示出可在多种水平上发生。肿瘤抑制基因PTEN使磷酸肌醇在肌醇环的3′位上脱磷酸，从而拮抗PI3K活性，而在多种肿瘤中该基因PTEN在功能上缺失。在其它肿瘤中，p110α同工型PIK3CA和Akt的基因被扩增，并且其基因产物的蛋白表达增加，这已经在一些人类癌症中得到证实。而且，用于向上调节p85-p110复合物的p85α的突变和易位也已经在人类癌症中有描述。最后，激活下游信号传导途径的PIK3CA中的体细胞错义突变已经在各种人类癌症中非常频繁地被描述过(Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：802(2005)；Samuels等人，Science 304：554(2004)；Samuels等人，Cancer Cell 7：561-573(2005))。这些观察表明，磷酸肌醇-3激酶以及该信号传导途径的上游和下游组分的失控是与人类癌症和增殖性疾病有关的最常见的失控之一(Parsons等人，Nature 436：792(2005)；Hennessey等人，Nature Rev.Drug Disc.4：988-1004(2005))。
根据上文，PI3Kα抑制剂将在治疗增殖性疾病和其它病症中具有特殊价值。
WO2004/096797公开了作为PI3Kγ抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途，特别是用于治疗炎症和过敏病症。
WO 2005/021519也公开了作为PI3Kγ抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途，特别是用于治疗炎症和过敏病症。
WO 2006/051270也公开了作为PI3Kα抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途，特别是由于其抗肿瘤活性。
WO 2007/129044也公开了作为PI3Kα抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途，特别是由于其抗肿瘤活性。
根据现有技术，需要提供更多适合于治疗增殖性疾病的化合物，特别是提供具有增强的选择性和/或较高的/增强的活性的化合物。
目前已经发现，下文给出的式(I)的2-氨甲酰环氨基脲衍生物具有有利的药理性质且抑制例如PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)。具体而言，这些化合物优选地相对于β和/或δ和/或γ亚型而言对于PI3Kα显示出增强的选择性。因此，式I化合物适合例如用于治疗依赖PI3激酶(尤其是PI3Kα，例如那些显示PI3Kα的过表达或扩增、PIK3CA的体细胞突变或PTEN的种系突变或体细胞突变或导致上调p85-p110复合物的p85α的突变和易位的激酶)的疾病，特别是增殖性疾病，例如肿瘤疾病和白血病。
此外，这些化合物优选地显示增强的代谢稳定性，并因此降低了清除率，得到改善的药代动力学特性。
在第一方面，本发明提供了式(I)化合物
或其盐，其中
A代表杂芳基；
R1代表(1)任选被取代的烷基；(2)任选被取代的环烷基；(3)任选被取代的芳基；(4)任选被取代的胺；(5)任选被取代的磺酰基；(6)卤素；
R2代表氢、氘或如R1所定义的取代基；
R3代表氢、卤素、任选被取代的烷基；
(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(叔丁基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)除外。
本发明可以通过参考以下描述、包括以下术语汇编和总结性实例而被更完全地理解。为了简短，本说明书中引用的出版物的公开内容引入本文作为参考。如本文所用的术语“包括”、“含有”和“包含”以其开放的非限制性的意义而在本文中使用。
本文所给的任意式意欲代表具有结构式所描述的结构的化合物以及某些变体或形式。特别是本文所给的任意式的化合物可以具有不对称中心并因此以不同的对映异构形式存在。如果式(I)化合物中存在至少一个不对称碳原子，则这类化合物可以以旋光活性形式或以旋光异构体混合物的形式、例如以外消旋混合物的形式存在。所有旋光异构体及其混合物、包括外消旋混合物是本发明的一部分。因此，本文所给的任意所给式意欲代表外消旋物、一种或多种对映异构形式、一种或多种非对映异构形式、一种或多种阻转异构体形式及其混合物。而且，某些结构还可以作为几何异构体(即顺式和反式异构体)、互变异构体或阻转异构体而存在。
本文所给的任意式意欲代表这类化合物的水合物、溶剂合物和多晶型物及其混合物。
本文所给的任意式还意欲代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。除了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子所代替外，同位素标记的化合物具有本文所给的式所描述的结构。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如分别有2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、125I。本发明包含多种如本文所定义的同位素标记的化合物，例如有放射性同位素如3H、13C和14C存在的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究(优选用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、检测或显像技术、例如正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算体层摄影术(SPECT)、包括药物或底物组织分布测定，或者可用于放射治疗患者。特别是18F或标记的化合物可以特别优选用于PET或SPECT研究。通常可以通过进行在下文描述的流程图或者实施例和制备中所公开的方法，通过用容易得到的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备同位素标记的本发明的化合物及其前药。
此外，被更重的同位素、特别是氘(即2H或D)所取代还可以获得由更高的代谢稳定性引起的某些治疗益处，例如延长体内半衰期或降低剂量要求或改善治疗指数。可以理解，上下文中的氘可被看作式(I)化合物的取代基。这类更重同位素、特别是氘的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语“同位素富集因子”表示特定同位素的同位素丰度和天然丰度之间的比值。如果本发明的化合物中的取代基标有氘，则这类化合物具有的对每个指定氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定氘原子处具有52.5％氘掺入率)、至少4000(60％氘掺入率)、至少4500(67.5％氘掺入率)、至少5000(75％氘掺入率)、至少5500(82.5％氘掺入率)、至少6000(90％氘掺入率)、至少6333.3(95％氘掺入率)、至少6466.7(97％氘掺入率)、至少6600(99％氘掺入率)或至少6633.3(99.5％氘掺入率)。在本发明的化合物中，没有具体指定为特定同位素的任意原子意欲代表该原子的任意稳定同位素。除非另有说明，当位置被具体指定为“H”或“氢”时，该位置可以理解为在其天然丰度同位素组成上具有氢。因此，在本发明的化合物中，被具体指定为氘(D)的任意原子意欲代表例如在以上所给范围内的氘。
当参考本文所给的任意式时，从可能种类的名单中为规定变量选择特定部分并不表示用来定义在别处出现的变量的部分。换言之，当变量出现一次以上时，从规定名单中选择种类不依赖于为该式中别处的相同变量选择的种类(当实施方案中一个或多个直至所有更一般的表述(其特征为上文或下文所优选的)可以被更具体的定义代替时，由此分别产生本发明的更优选的实施方案)。
当使用复数形式(例如多种化合物、盐)时，其包括单数(例如一种化合物、一种盐)。“化合物”不排除(例如在药物制剂中)存在一种以上的式(I)化合物(或其盐)。
以下一般定义将适用于本说明书，除非另有说明：
卤素表示氟、溴、氯或碘，特别是氟、氯。卤素取代的基团和部分，例如被卤素取代的烷基(卤代烷基)可以被单、多或全卤代。
杂原子是除碳和氢外的原子，优选氮(N)、氧(O)或硫(S)，特别是氮。
含碳的基团、部分或分子含有1至7个、优选1至6个、更优选1至4个、最优选1或2个碳原子。具有1个以上碳原子的任意非环状含碳的基团或部分是直链或支链的。
前缀“低级”或“C1-C7”表示具有最多且包括7个、尤其是最多且包括4个碳原子的基团，所述基团是直链或者具有一个或多个分支的支链。
“烷基”指直链或支链烷基，优选代表直链或支链C1-12烷基，特别优选代表直链或支链C1-7烷基；例如甲基、乙基、正或异丙基、正、异、仲或叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基，特别优选甲基、乙基、正丙基、异丙基以及正丁基和异丁基。烷基可以是未取代的或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、羟基、烷氧基、卤素和氨基。取代的烷基的实例有三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基。这类情况的实例有部分(烷基)-环丙基或亚烷基-环丙基，如-CH2-环丙基。C1-C7-烷基优选是具有从1且包括1至7且包括7、优选从1且包括1至4且包括4的烷基，并且是直链或支链；优选低级烷基是丁基如正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、丙基如正丙基或异丙基、乙基或者优选甲基。
其它基团如“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“烷氧基羰基”、“烷氧基-羰基烷基”、“烷基磺酰基”、“烷基磺酰基(alkylsulfoxyl)”、“烷基氨基”、“卤代烷基”中的每个烷基部分将具有以上提到的“烷基”定义中描述的相同含义。
“亚烷基”指通过两个不同碳原子与部分结合的直链或支链亚烷基，它优选代表直链或支链C1-12亚烷基，特别优选代表直链或支链C1-6亚烷基；例如亚甲基(-CH2-)、1，2-亚乙基(-CH2-CH2-)、1，1-亚乙基((-CH(CH3)-)、1，1-，1，2-，1，3-亚丙基和1，1-，1，2-，1，3-，1，4-亚丁基，特别优选亚甲基、1，1-亚乙基、1，2-亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基。
“亚链烯基”指通过两个不同碳原子与分子结合的直链或支链亚链烯基，它优选代表直链或支链C2-6亚烷基；例如-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)-、-CH＝CH-CH2-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝C(CH3)-CH2-、-CH＝CH-C(CH3)H-、-CH＝CH-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)-CH＝CH-，特别优选-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-。亚链烯基可以是取代的或未取代的。
“环烷基”指饱和或部分饱和的单环、稠合多环或螺多环碳环，每个碳环具有3至12个环原子。环烷基的说明性实例包括以下部分：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可以是未取代的或取代的；示例性取代基在对烷基的定义中提供，且还包括烷基自身(如甲基)。例如-(CH3)环丙基的基团被认为是被取代的环烷基。
“芳基”指具有6个或更多个碳原子的芳香族同素环系统(即仅有碳作为成环原子)，芳基优选是具有6至14个环碳原子、更优选具有6至10个环碳原子的芳香族部分，例如苯基或萘基，优选苯基。芳基可以是未取代的或者被一个或多个、优选最多三个、更优选最多两个取代基所取代，所述的取代基独立地选自：如下描述的未取代的或取代的杂环基，尤其是吡咯烷基如吡咯烷子基、氧代吡咯烷基如氧代-吡咯烷子基、C1-C7-烷基-吡咯烷基、2，5-二-(C1-C7烷基)吡咯烷基如2，5-二-(C1-C7烷基)-吡咯烷子基、四氢呋喃基、噻吩基、C1-C7-烷基吡唑烷基、吡啶基、C1-C7-烷基哌啶基、哌啶子基、被氨基或者N-单-或N，N-二-[低级烷基、苯基、C1-C7-烷酰基和/或苯基-低级烷基)-氨基所取代的哌啶子基、未取代的或N-低级烷基取代的通过环碳原子结合的哌啶基、哌嗪子基、低级烷基哌嗪子基、吗啉代基、硫代吗啉代基、S-氧代-硫代吗啉代基或S，S-二氧代硫代吗啉代基；C1-C7-烷基、氨基-C1-C7-烷基、N-C1-C7-烷酰基氨基-C1-C7-烷基、N-C1-C7-烷基磺酰基-氨基-C1-C7-烷基、氨甲酰基-C1-C7-烷基、[N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨甲酰基]-C1-C7-烷基、C1-C7-烷基亚磺酰基-C1-C7-烷基、C1-C7-烷基磺酰基-C1-C7-烷基、苯基、萘基、单至三-[C1-C7-烷基、卤素和/或氰基]-苯基或单至三-[C1-C7-烷基、卤素和/或氰基]-萘基；C3-C8-环烷基、单至三-[C1-C7-烷基和/或羟基]-C3-C8-环烷基；卤素、羟基、低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、(低级-烷氧基)-低级烷氧基-低级烷氧基、卤代-C1-C7-烷氧基、苯氧基、萘氧基、苯基-或萘基-低级烷氧基；氨基-C1-C7-烷氧基、低级烷酰基氧基、苯甲酰基氧基、萘甲酰基氧基、甲酰基(CHO)、氨基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基、C1-C7-烷酰基氨基、C1-C7-烷基磺酰基氨基、羧基、低级烷氧基羰基，例如；苯基-或萘基-低级烷氧基羰基，例如苄基氧基羰基；C1-C7-烷酰基如乙酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、氨甲酰基、N-单-或N，N-二取代的氨甲酰基如N-单-或N，N-二-取代的氨甲酰基，其中取代基选自低级烷基、(低级-烷氧基)-低级烷基和羟基-低级烷基；脒基、胍基、脲基、巯基、低级烷硫基、苯基-或萘基硫基、苯基-或萘基-低级烷硫基、低级烷基-苯硫基、低级烷基-萘基硫基、卤素-低级烷基巯基、磺基(-SO3H)、低级烷基磺酰基、苯基-或萘基-磺酰基、苯基-或萘基-低级烷基磺酰基、烷基苯基磺酰基、卤素-低级烷基磺酰基如三氟甲磺酰基；磺酰氨基(sulfonamido)、苯磺酰氨基、叠氮基、叠氮基-C1-C7-烷基、尤其是叠氮基甲基、C1-C7-烷基磺酰基、氨磺酰基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨磺酰基、吗啉代基磺酰基、硫代吗啉代基磺酰基、氰基和硝基；其中作为取代基或作为取代的烷基(或者还有本文提到的取代的芳基、杂环基等)的取代基的一部分的以上提到的苯基或萘基(和在苯氧基或萘氧基中的)各自本身是未取代的或者被一个或多个、例如最多三个、优选1或2个取代基所取代，所述取代基独立地选自卤素、卤代-低级烷基如三氟甲基、羟基、低级烷氧基、叠氮基、氨基、N-单-或N，N-二-(低级烷基和/或C1-C7-烷酰基)-氨基、硝基、羧基、低级烷氧基羰基、氨甲酰基、氰基和/或氨磺酰基。
“杂环基”指如下定义的杂环基团：其为不饱和的(＝环中带有最高可能数目的共轭双键)、饱和或部分饱和的并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环、三环或螺环；并且具有3至24个、更优选4至16个、最优选5至10个且最优选5或6个环原子；其中一个或多个、优选1至4个、尤其是1或2个环原子是杂原子(因此剩余环原子是碳)。键合环(即与分子连接的环)优选具有4至12个、尤其是5至7个环原子。术语杂环基还包括杂芳基。杂环基团(杂环基)可以是未取代的或者被一个或多个、尤其是1至3个取代基所取代，所述的取代基独立地选自以上对取代的烷基所定义的取代基和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基。此外，杂环基尤其是选自如下的杂环基：氧杂环丙烷基、氮杂环丙烯基、吖丙啶基、1，2-氧杂硫杂环戊烷基、噻吩基、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、噻喃基、噻蒽基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、唑基、异唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、(S-氧代或S，S-二氧代)-硫代吗啉基、吲嗪基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、尤其是1，4-二氮杂环庚基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基(cumaryl)、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、啶基、菲咯啉基、呋咱基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩嗪基、色烯基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基和2，3-二氢-苯并[1，4]二烯-6-基，这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、优选最多三个取代基所取代，所述的取代基选自以上对取代的芳基提到的那些和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基。
“芳基烷基”指通过烷基如甲基或乙基与分子结合的芳基，优选苯乙基或苄基，特别是苄基。类似地，环烷基烷基和杂环基烷基代表通过烷基与分子结合的环烷基或者通过烷基与分子结合的杂环基。在每种情况中，芳基、杂环基、环烷基和烷基可以如上定义的那样被取代。
“治疗”包括预防性(防护性)和治疗性治疗以及延缓疾病或紊乱的进展。
“PI3激酶介导的疾病”(尤其是PI3Kα介导的疾病或者由PI3Kα的过表达或扩增、PIK3CA的体细胞突变或PTEN的种系突变或体细胞突变或用于正调节p85-p110复合物的p85α的突变和易位的激酶所介导的疾病)尤其是以有益的方式(例如改善一种或多种症状、延缓疾病发作、直至暂时或完全治愈疾病)对抑制PI3激酶、尤其是抑制PI3Kα或其突变形式有响应的这类病症(其中在所治疗的疾病中，增殖性疾病例如肿瘤疾病和白血病是尤其被提到的)。
“盐”(其以“或其盐”表示)可以单独或与游离式(I)化合物混合存在，并且优选是可药用盐。这类盐例如作为酸加成盐、优选与有机或无机酸从含有碱性氮原子的式(I)化合物而形成，尤其是可药用盐。适宜的无机酸例如有氢卤酸如盐酸、硫酸或磷酸。适宜的有机酸例如有羧酸或磺酸，如富马酸或甲磺酸。为了分离或纯化的目的，还可能使用不可药用的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途，仅采用可药用盐或游离化合物(其中可以以药物制剂的形式应用)，因此优选这些盐。由于游离形式的新化合物以及其盐形式(包括例如在新化合物的纯化或鉴定中可以用作中间体的那些盐)之间的密切关系，因此上下文中涉及游离化合物的地方可以适当和有利地理解为还指相应的盐。式(I)化合物的盐优选是可药用的盐；形成可药用盐的合适的抗衡离子是本领域已知的。
“组合”是指一种剂量单位形式的固定组合，或者用于组合施用的成套药盒，其中式(I)化合物和组合伙伴(例如如下解释的其它药物，还称为“治疗剂”或“共用物质”)可以同时独立施用或在时间间隔内分别施用，尤其是当这些时间间隔使组合伙伴显示出协作作用、例如协同作用时。如本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等意欲囊括将所选的组合伙伴施用于需要其的单个个体(例如患者)，并且意欲包括其中物质不必通过相同施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合产品”表示将一种以上活性成分混合或组合所得到的产品，并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术语“固定组合”表示活性成分如式I化合物和组合伙伴以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”表示活性成分如式I化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、共同或无特定时间限制地先后施用于患者，其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或更多种活性成分。
在优选的实施方案(其独立地、共同地或以任意组合或亚组合进行优选)中，本发明涉及游离碱形式或酸加成盐形式的式I化合物，其中取代基如本文所定义。
在一项有利的实施方案中，本发明涉及式IA化合物
其中，取代基如式(I)化合物所定义。
在另一项有利的实施方案中，本发明涉及式IB化合物
其中，取代基如式(I)化合物所定义。
因此，式(I)化合物还包括式(IA)和(IB)化合物。在本发明的全文中，以下定义也都适用。
A优选地代表具有一个或两个氮原子和5-10个成环原子的杂芳基。
A特别优选地代表选自以下基团的杂芳基：
A非常特别优选地代表选自以下基团的杂芳基：
A最优选代表选自以下基团的杂芳基：
R1优选地代表以下取代基之一：
(1)未取代或取代的，优选取代的C1-C7-烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至九个以下基团：氘、卤素、氰基、C3-C12-环烷基、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基、C1-C7-烷基氨基羰基、二(C1-C7-烷基)氨基羰基、C1-C7-烷氧基、苯基(其是未取代的或者被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基取代)、苯氧基(其是未取代的或者被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基)；
(2)未取代或取代的C3-C12-环烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至四个以下基团：氘、卤素、氰基、C1-C7-烷基、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基、氨基羰基、C1-C7-烷基氨基羰基、二(C1-C7-烷基)氨基羰基、C1-C7-烷氧基、苯基(其是未取代的或者被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基)、苯氧基(其是未取代的或者被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基)；
(3)未取代或取代的苯基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至两个以下基团：氘、卤素、氰基、C1-C7-烷基、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基、C1-C7-烷基氨基羰基、二(C1-C7-烷基)氨基羰基、C1-C7-烷氧基；
(4)未取代的、单-或二取代的胺；其中所述取代基独立地选自以下基团：氘、C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)、C1-C7-烷基羰基、苯基(其是未取代的或被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基取代)、苯基磺酰基(其是未取代的或被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基取代)，
(5)取代的磺酰基；其中所述取代基选自以下基团：C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)、C1-C7-烷基氨基(其中烷基部分是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)、二-C1-C7-烷基氨基(其中烷基部分是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)；
(6)氟、氯。
R1特别优选地代表以下取代基之一：
(1)未取代或取代的，优选取代的C1-C7-烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至九个以下基团：氘、氟，或者一个或两个以下基团：C3-C5-环烷基；
(2)任选被取代的C3-C5-环烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至四个以下基团：氘、C1-C4-烷基(优选甲基)、氟、氰基、氨基羰基；
(3)任选被取代的苯基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至两个以下基团：氘、卤素、氰基、C1-C7-烷基、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基、C1-C7-烷基氨基羰基、二(C1-C7-烷基)氨基羰基、C1-C7-烷氧基；
(4)任选的单-或二取代的胺；其中所述取代基独立地选自以下基团：氘、C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)、苯基磺酰基(其是未取代的或被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基取代)，
(5)取代的磺酰基；其中所述取代基选自以下基团：C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟的基团取代)、吡咯烷子基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、羟基、氧代的基团取代；特别是被一个氧代取代)，
(6)氟、氯。
R1非常特别优选地代表：
(1)环丙基甲基，或任选被取代的、支链的C3-C7-烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至九个以下基团：氘、氟；
(2)任选被取代的环丙基或环丁基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至四个以下基团：甲基、氘、氟、氰基、氨基羰基；
(3)任选被取代的苯基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至两个以下基团：氘、卤素、氰基、C1-C7-烷基、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基、C1-C7-烷基氨基羰基、二(C1-C7-烷基)氨基羰基、C1-C7-烷氧基；
(4)任选的单-或二取代的胺；其中所述取代基独立地选自以下基团：氘、C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的基团取代)、苯基磺酰基(其是未取代的或被一个或多个，优选一个C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基、二(C1-C7-烷基)氨基-C1-C7-烷氧基取代)，
(5)取代的磺酰基；其中所述取代基选自以下基团：C1-C7-烷基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、氟的基团取代)、吡咯烷子基(其是未取代的或被一个或多个选自氘、羟基、氧代的基团取代；特别是被一个氧代取代)，
(6)氟、氯。
R1非常特别优选地代表以下取代基之一：-C(CH3)2CF3、C(CD3)3、1-甲基环丙基；优选在(I-A)和(I-B)的背景中。
R2优选地代表如R1所定义的取代基。
R2进一步优选地代表氢或氘。
R2特别优选地代表氢。
R2在一项可选择的实施方案中代表甲基。
R3优选地代表(1)氢，(2)卤素，(3)任选被取代的C1-C7-烷基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至三个以下基团：氘、卤素、C1-C7-烷基氨基、二(C1-C7-烷基)氨基。
R3特别优选地代表(1)氢，(2)氟、氯，(3)任选被取代的甲基，其中所述取代基独立地选自一个或多个，优选一至三个以下基团：氘、氟、氯、二甲基氨基。
R3非常特别优选地代表氢、甲基、CD3、CH2Cl、CH2F、CH2N(CH3)3；优选甲基。
本发明还涉及如本文所定义的式(I)化合物，其中R1和/或R2代表叔丁基的化合物除外。
本发明还涉及式(I)化合物的可药用前药。
本发明还涉及式(I)化合物的可药用代谢物。
本发明尤其涉及实施例中以及本文所述制备方法中给出的式(I)化合物。
本发明还涉及式(I)化合物的制备方法。基本上所有已知的将两种不同的胺转化为相应的脲衍生物的方法都是适合的，且可以通过使用各自的起始原料进行应用。
因此，本发明特别涉及式(I)化合物的制备方法，其包括将式(II)化合物
与式(IIIA)化合物
其中取代基如本文所定义，且R3可以另外代表氯，在活化试剂的存在下反应(“方法A”)，或者与式(IIIB)化合物反应
其中R1和R2如本文所定义，R3如本文所定义且可以另外代表氯，且RG代表反应基团，例如咪唑基羰基，其可以直接反应或者通过形成(IIIE)的异氰酸酯中间体进行反应(“方法B”)，
其中所述取代基如(IIIB)中所定义，
在每种情况中任选在稀释剂的存在下并且任选在反应助剂的存在下反应，和回收所得的游离形式或盐形式的式(I)化合物，以及
任选将根据方法A或方法B可得到的式(I)化合物转化为不同的式(I)化合物，和/或将可得到的式(I)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将可得到的游离式(I)化合物转化为其盐，和/或从一种或多种不同的可得到的式(I)的异构体中分离可得到的式(I)化合物的异构体。
反应条件
可以根据本领域已知的方法或者按照以下实施例中公开的方法进行该方法。例如，可以使式II化合物与式III化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中、在碱、例如有机胺如三乙胺的存在下反应。
当温度在上文或下文中被给出时，应当加入“约”，因为所给数值的小偏差、例如±10％的变化是容许的。
所有反应可以在一种或多种稀释剂和/或溶剂的存在下进行。原料可以以等摩尔量使用；或者，化合物可以过量使用，例如作为溶剂而发挥作用或使平衡移动或通常加快反应速率。
可以如本领域已知的、反应所需要的那样并且按照通常已知的操作加入适宜量的反应助剂，例如酸、碱或催化剂。
保护基团
如果一个或多个其它官能团，例如羧基、羟基、氨基、巯基等在如本文描述的原料或任意其它前体中被保护或需要被保护，因为它们不应参与反应或干扰反应，则这些基团是如通常在肽化合物、头孢菌素类和青霉素类以及核酸衍生物和糖类的合成中使用的这类基团。保护基团是一旦它们被除去就不再在最终化合物中存在的这类基团，而在此处所用的意义上作为取代基保留的基团不是保护基团，保护基团是在原料或中间体阶段被加入，并且被除去以得到最终化合物的基团。此外，对于式(I)化合物转化为不同的式(I)化合物而言，如果有用或需要的话，可以加入和除去保护基团。
保护基团可以已经在前体中存在，并且应该保护有关的官能团以防止不需要的二次反应如酰化、醚化、酯化、氧化、溶剂解以及类似的反应。保护基团的特征是它们自身易于(即没有不需要的二次反应)除去，通常通过乙酰解、质子解、溶剂解、还原、光解或通过酶活性、例如在类似于生理条件的条件下除去，并且它们在终产物中不存在。专业人员知道或可以容易确定哪些保护基团适于上下文提到的反应。
这类保护基团对这些官能团的保护、保护基团本身及其去除反应例如在如下标准参考著作中有描述：例如J.F.W.McOmie，《有机化学中的保护基团》(“Protective Groups in Organic Chemistry”)，普莱姆出版社(Plenum Press)，伦敦和纽约1973，T.W.Greene，《有机合成中的保护基团》(“Protective Groups in Organic Synthesis”)，第三版，威利(Wiley)公司，纽约1999，《肽》(“The Peptides”)；第3卷(编者：E.Gross和J.Meienhofer)，学术出版社(Academic Press)，伦敦和纽约1981，“Methoden derorganischen Chemie”(有机化学方法)，Houben Weyl，第4版，第15卷/I，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974，H.-D.Jakubke和H.Jescheit，Peptide，Proteine”(氨基酸、肽、蛋白质)，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield Beach和Basel 1982，和Jochen Lehmann，“Chemieder Kohlenhydrate：Monosaccharide und Derivate”(碳水化合物化学：单糖和衍生物)，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974。
任选的反应和转化
一种式(I)化合物可以被转化为不同的式(I)化合物。
在其中R3代表氟的式(I)化合物中，可以通过将相应的氯衍生物转化为氟化合物而得到这类化合物。这类反应是已知的并且被称为取代反应。该转化可以在式(IIIA或B)的原料的步骤进行或者通过将相应的式(I)化合物转化而进行。
在其中取代基带有氨基或氨基-C1-C7-烷基取代基的式(I)化合物中，可以通过与相应的C1-C7-烷酰基卤化物或C1-C7-烷基磺酰基卤化物、例如相应的氯化物在如下条件下反应将氨基转化为酰基氨基、例如C1-C7-烷酰基氨基或C1-C7-烷基磺酰基氨基：在叔氮碱如三乙胺或吡啶的存在下，在有或没有适当溶剂如二氯甲烷的存在下，例如在-20至50℃范围内的温度下如在约室温下进行。
在其中取代基带有氰基取代基的式(I)化合物中，可以例如通过在如下条件下氢化将氰基转化为氨基甲基：在适当的金属催化剂如阮内镍或阮内钴的存在下，在适当溶剂、例如低级链烷醇如甲醇和/或乙醇中，例如在-20至50℃范围内的温度下如在约室温下进行。
具有成盐基团的式(I)化合物的盐可以按照本身已知的方式来制备。因此，式(I)化合物的酸加成盐可以通过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而得到。具有两个酸分子的盐(例如式(I)化合物的二卤化物)还可以被转化为每个化合物具有一个酸分子的盐(例如单卤化物)；这可以通过如下方法做到：加热至熔化物，或者例如作为固体在高真空下、在高温如从130至170℃下加热，此时每分子的式(I)化合物排出一分子酸。通常可以例如通过用适宜的碱性化合物、例如用碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、通常为碳酸钾或氢氧化钠处理而将盐转化为游离化合物。
可以按照本身已知的方式、通过适宜的分离方法将立体异构混合物、例如非对映异构体的混合物分离为其相应的异构体。例如可以通过分步结晶、色谱法、溶剂分配和类似方法将非对映异构混合物分离为其单独的非对映异构体。该分离可以在起始化合物的水平或者在式(I)化合物本身中进行。可以通过形成非对映异构盐、例如通过与对映异构体纯的手性酸形成盐或者通过色谱法、例如通过HPLC、使用具有手性配体的色谱基质来分离对映异构体。
应该强调，与本章中所提到的转化类似的反应也可以在适当中间体的水平进行(并且因此可用于制备相应的原料)。
原料：
式II和III的原料以及本文如下文提到的其它原料可以按照或类似于本领域已知的方法来制备，它们是本领域已知的和/或可市售获得。在对于原料的制备没有特别描述的情况下，化合物是已知的或者可以按照类似于本领域已知的方法、例如WO 05/021519或WO04/096797中的方法或者按照下文公开的方法来制备。新原料及其制备方法同样是本发明的实施方案。在优选的实施方案中，使用这类原料并选择所选反应以便能够得到优选的化合物。
在也可以适当和有利地作为盐形式使用和/或得到的原料(包括中间体)中，取代基优选如对式(I)化合物所定义。
本发明还涉及式(IIIA)化合物或其盐
其中所述取代基如式(I)化合物所定义。
本发明还涉及式(IIIA)化合物的制备方法。基本上，全部已知的将两种或芳基/杂芳基组分偶联(例如Heck型反应)成对应的脲衍生物的方法都是适合的，且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式(IIIA)的制备方法，其包括
(步骤1)将式(IV)化合物
其中R3如本文所定义且可以另外代表卤素，PG代表保护基团，例如酰基基团，与式(V)化合物
其中R1、R2、A如本文所定义，且Hal代表卤素，例如溴，在Heck条件下反应；任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应；
(步骤2)然后除去保护基团，例如在酸性条件下；任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应；并
回收所得到的游离形式或盐形式的式(IIIA)化合物，并任选地将所得的式(IIIA)化合物转化为不同的式(IIIA)化合物，和/或将所得的式(IIIA)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将所得的游离的式(IIIA)化合物转化为其盐，和/或从得到的一种或多种不同的式(IIIA)的异构体中分离式(IIIA)化合物的一种可得到的异构体。
本发明还涉及式(IIIB)化合物或其盐
其中R1、R2、A如式(I)化合物所定义，RG代表反应基团，特别是咪唑基羰基，其可以直接反应或者通过形成(IIIE)的异氰酸酯中间体进行反应，且R3如本文所定义并可以另外代表卤素。
本发明还涉及式(IIIB)化合物的制备方法。基本上，全部已知的将胺或其盐转化成对应的活化衍生物的方法都是适合的，且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式(IIIB)化合物的制备方法，其包括将式(IIIA)化合物
其中取代基如本文所定义，与活化试剂，例如1，1’-羰基二咪唑，任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应；并且
回收得到的游离形式或盐形式的式(IIIB)化合物，和任选地将所得的式(IIIB)化合物转化为不同的式(IIIB)化合物，和/或将所得的式(IIIB)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将所得的游离的式(IIIB)化合物转化为其盐，和/或从得到的一种或多种不同的式(IIIB)的异构体中分离式(IIIB)化合物的一种可得到的异构体。
本发明还涉及式(IIIC)化合物或其盐
其中取代基如式(I)化合物所定义。
本发明还涉及式(IIIC)化合物的制备方法。基本上，全部环合反应都是适合的，且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式(IIIC)化合物的制备方法，其包括将式(VI)化合物
其中R3如本文所定义且可以另外代表卤素，与式(VII)化合物
其中R1如本文所定义；任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下进行反应；并且
回收得到的游离形式或盐形式的式(IIIC)化合物，并任选地将所得的式(IIIC)化合物转化为不同的式(IIIC)化合物，和/或将所得的式(IIIC)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将所得的游离的式(IIIC)化合物转化为其盐，和/或从得到的一种或多种不同的式(IIIC)的异构体中分离式(IIIC)化合物的一种可得到的异构体。
本发明还涉及式(IIID)化合物或其盐
其中R1如本文所定义，RG代表反应基团，特别是咪唑基羰基，R3如本文所定义，且可以另外代表卤素。
本发明还涉及式(IIID)化合物的制备方法。基本上，全部已知的将胺或其盐转化成对应的活化衍生物的方法都是适合的，且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式(IIID)化合物的制备方法，其包括将式(IIIC)化合物
其中取代基如上文所定义，与活化试剂，例如1，1’-羰基二咪唑，任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应；并且
回收得到的游离形式或盐形式的式(IIID)化合物，和任选地将所得的式(IIID)化合物转化为不同的式(IIID)化合物，和/或将所得的式(IIID)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将所得的游离的式(IIID)化合物转化为其盐，和/或从得到的一种或多种不同的式(IIID)的异构体中分离式(IIID)化合物的一种可得到的异构体。
本发明还涉及式(VI)化合物或其盐
其中R3如本文所定义且可以另外代表卤素。
本发明还涉及式(VI)化合物的制备方法。基本上，全部已知的适合用于此类转化的方法都可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式(IIID)化合物的制备方法，其包括将式(IIX)化合物
其中R3如式(I)所定义且可以另外代表卤素，与二甲基甲酰胺的缩醛，例如DMF-二甲基缩醛反应，得到式(VI)化合物；
回收得到的游离形式或盐形式的式(IIID)化合物，并任选地将所得的式(IIX)化合物转化为不同的式(IIX)化合物，和/或将所得的式(IIX)化合物的盐转化为其不同的盐，和/或将所得的游离的式(IIX)化合物转化为其盐，和/或从得到的一种或多种不同的式(IIX)的异构体中分离式(IIX)化合物的一种可得到的异构体。
式(I)化合物
还包括亚式(IA)、(IB)及其可药用盐，可用作药物，其中
A代表杂芳基；
R1代表(1)任选被取代的烷基；(2)任选被取代的环烷基；(3)任选被取代的芳基；(4)任选被取代的胺；(5)任选被取代的磺酰基；(6)卤素；
R2代表氢、氘或如R1所定义的取代基；
R3代表氢、卤素、任选被取代的烷基。
因此，本发明涉及其中表明PI3K抑制的用于人类或兽用的组合物的一项实施方案。该实施方案还包含(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(叔丁基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺，但或者不包含所述化合物。
在一项实施方案中，本发明涉及治疗由PI3K介导的细胞增殖性疾病、例如肿瘤和/或癌性细胞生长。疾病包括那些显示PI3Kα的过表达或扩增、PIK3CA的体细胞突变或PTEN的种系突变或体细胞突变或用于正调节p85-p110复合物的p85α的突变和易位的激酶所介导的疾病。具体而言，化合物可用于治疗人或动物(例如鼠类)癌症，包括例如肉瘤；肺癌；支气管癌；前列腺癌；乳腺癌(包括散发的乳腺癌和考登病患者)；胰腺癌；胃肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠癌；结肠直肠腺瘤；甲状腺癌；肝癌；肝内胆管癌；肝细胞癌；肾上腺癌；胃癌；胃癌；神经胶质瘤；胶质母细胞瘤；子宫内膜癌；黑素瘤；肾癌；肾盂癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；阴道癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食管癌；白血病；急性髓性白血病；慢性髓性白血病；淋巴细胞白血病；髓性白血病；脑癌；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤；瘤形成；上皮特征的瘤形成；淋巴瘤；乳癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；肿瘤疾病，包括实体瘤；颈或头部肿瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓化生；和瓦尔登斯特伦病。
在其它实施方案中，病症或紊乱(如PI3K介导的)选自：真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化伴骨髓化生、哮喘、COPD、ARDS、勒夫勒综合征、嗜酸细胞性肺炎、寄生虫(特别是后生动物)侵染(包括热带肺嗜酸细胞增多)、支气管肺曲霉病、结节性多动脉炎(包括丘-斯综合征)、嗜酸细胞肉芽肿、由药物反应引起的影响气道的与嗜酸性细胞有关的紊乱、银屑病、接触性皮炎、特应性皮炎、斑秃、多形性红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白癜风、变应性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、天疱疮(pemphisus)、后天性大疱性表皮松解、自身免疫性血液病(例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、多发性软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、斯-琼氏综合征、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、肺泡炎、慢性过敏性肺炎、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、(前和后)眼色素层炎、肺间质纤维化、银屑病关节炎、肾小球肾炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深部静脉血栓形成、中风、心肌梗塞、不稳定心绞痛、血栓栓塞、肺栓塞、血栓溶解性疾病、急性动脉缺血、外周血栓性阻塞和冠状动脉疾病、再灌注损伤、视网膜病、例如糖尿病性视网膜病或高压氧引起的视网膜病，以及以升高眼内压或眼房水分泌为特征的病症、例如青光眼。
对于以上用途，所需的剂量当然将根据施用方式、所治疗的具体病症和所期望的作用而改变。通常，以约0.03至约100.0mg/kg体重，例如约0.03至约10.0mg/kg体重的日剂量全身施用表明可获得满意的结果。大型哺乳动物、例如人的指示日剂量的范围为约0.5mg至约3g，例如约5mg至约1.5g，其方便地例如以一天最多四次的分份剂量或以缓释形式施用。适合于口服施用的单位剂量形式包含约0.1至约500mg，例如约1.0至约500mg活性成分。
式(I)化合物可以通过任意常规途径施用，特别是经肠施用、例如口服施用，如以片剂或胶囊剂的形式施用，或经胃肠道外施用、例如以可注射的溶液或混悬液的形式施用，局部施用、例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂的形式施用，通过吸入施用，鼻内施用，或以栓剂形式施用。
式(I)化合物可以以游离形式或以可药用盐的形式、例如如上所示的那样施用。这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。
因此，本发明还提供了：
■在需要这类治疗的个体中预防或治疗通过激活PI3K(如PI3激酶α)酶所介导的病症、紊乱或疾病的方法，例如以上所示的那些疾病，该方法包括给所述个体施用有效量的式(I)化合物或其可药用盐。
■游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物，其例如在如本文所示的任意方法中作为药物。
■游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物，其例如在如本文所示的任意方法中用作药物，特别是用于一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病。
■游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物在如本文所示的任意方法中的用途，特别是用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病。
■游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物在如本文所示的任意方法中的用途，特别是用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇3-激酶介导的疾病的药物。
PI3K充当整合平行的信号传导途径的第二信使节点，有证据正在表明，PI3K抑制剂和其它途径的抑制剂的组合将可用于治疗人类癌症和增殖性疾病。
约20-30％的人乳腺癌过表达Her-2/neu-ErbB2(药物曲妥珠单抗的靶标)。虽然曲妥珠单抗在表达Her2/neu-ErbB2的一些患者中已经证明了持久的响应，但是只有部分这些患者有响应。近来的工作已经表明，该有限的响应速率可以通过曲妥珠单抗和PI3K或PI3K/AKT途径的抑制剂的组合来显著提高(Chan等人，Breast Can.Res.Treat.91：187(2005)，WoodsIgnatoski等人，Brit.J.Cancer 82：666(2000)，Nagata等人，Cancer Cell6：117(2004))。
多种人恶性瘤表达激活突变或增加Her1/EGFR水平，已经开发了许多抗体和小分子抑制剂来对抗该受体酪氨酸激酶，包括特罗凯、吉非替尼和爱必要。但是，虽然EGFR抑制剂证明在某些人肿瘤(例如NSCLC)中具有抗肿瘤活性，可是它们不能在患有表达EGFR的肿瘤的所有患者中增加总的患者存活。这可以由如下事实来合理解释：Her1/EGFR的许多下游靶点在多种恶性瘤中以高频率发生突变或失调，包括PI3K/Akt途径。例如，吉非替尼在体外试验中可抑制腺癌细胞系的生长。但是，可以挑选出对吉非替尼有抗性的这些细胞系的亚克隆，证明PI3/Akt途径的激活增加了。向下调节或抑制该途径使有抗性的亚克隆对吉非替尼敏感(Kokubo等人，Brit.J.Cancer 92：1711(2005))。而且，在具有含PTEN突变并且过表达EGFR的细胞系的乳腺癌的体外模型中，既抑制PI3K/Akt途径又抑制EGFR产生了协同作用(She等人，Cancer Cell 8：287-297(2005))。这些结果表明，吉非替尼和PI3K/Akt途径抑制剂的组合将是癌症中有吸引力的治疗策略。
AEE778(Her-2/neu/ErbB2、VEGFR和EGFR的抑制剂)和RAD001(mTOR(Akt的下游靶标)的抑制剂)的组合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生了比单独的任一物质更大的组合效能(Goudar等人，Mol.Cancer.Ther.4：101-112(2005))。
抗雌激素剂如他莫昔芬可通过诱导细胞周期停滞(其需要细胞周期抑制物p27Kip的作用)而抑制乳腺癌生长。近来，已经表明Ras-Raf-MAP激酶途径的激活可改变p27Kip的磷酸化状态，结果其在使细胞周期停滞中的抑制活性被减弱，由此引起抗雌激素抗性(Donovan等人，J.Biol.Chem.276：40888，(2001))。如Donovan等人所报道的那样，通过用MEK抑制剂处理来抑制MAPK信号传导在激素抵抗的乳腺癌细胞系中逆转了p27的异常磷酸化状态，并且由此恢复了激素敏感性。类似地，通过Akt使p27Kip磷酸化也可取消其对使细胞周期停滞的作用(Viglietto等人，Nat Med.8：1145(2002))。
因此，在另一方面，式I化合物可用于治疗激素依赖性癌症、例如乳腺和前列腺癌。该用途的目标是用常规的抗癌剂来逆转这些癌症中常见的激素抗性。
在血液癌症如慢性髓性白血病(CML)中，染色体易位负责组成性激活的BCR-Abl酪氨酸激酶。受影响的患者由于Abl激酶活性的抑制而对伊马替尼(一种小分子酪氨酸激酶抑制剂)作出响应。但是，患有晚期疾病的许多患者起初对伊马替尼有响应，可是后来由于在Abl激酶结构域中发生了给予抗性的突变而复发。体外研究已经表明，BCR-Ab1利用Ras-Raf激酶途径来引起其作用。此外，抑制相同途径中一种以上的激酶可提供另外的保护以防止给予抗性的突变。
因此，在另一方面，式I化合物与至少一种选自激酶抑制剂如的另外的物质组合使用来治疗血液癌症如慢性髓性白血病(CML)。通过该用途可知，目标是逆转或阻止对所述的至少一种另外的物质的抗性。
因为激活PI3K/Akt途径可驱动细胞存活，所以与驱动癌细胞中细胞凋亡的疗法(包括放射治疗和化学治疗)组合来抑制该途径将使响应提高(Ghobrial等人，CA Cancer J.Clin 55：178-194(2005))。作为实例，PI3激酶抑制剂和卡铂的组合表明在体外增殖和细胞凋亡试验中以及在卵巢癌的异种移植物模型的体内肿瘤效能中具有协同作用(Westfall和Skinner，Mol.Cancer Ther.4：1764-1771(2005))。
除了癌症和增殖性疾病外，有越来越多的证据表明1A和1B类PI3激酶的抑制剂将在治疗上可用于其它疾病领域。抑制p110β(PIK3CB基因的PI3K同工型产物)已经表明可参与剪切引起的血小板激活(Jackson等人，Nature Medicine 11：507-514(2005))。因此，抑制p110β的PI3K抑制剂将在抗血栓治疗中可用作单独的药物或可组合使用。同工型p110δ(PIK3CD基因的产物)在B细胞功能和分化(Clayton等人，J.Exp.Med.196：753-763(2002))、T细胞依赖性和非依赖性抗原响应(Jou等人，Mol.Cell.Biol.22：8580-8590(2002))及肥大细胞分化(Ali等人，Nature 431：1007-1011(2004))中是重要的。因此，期望p110δ抑制剂将可用于治疗B细胞驱动的自身免疫性疾病和哮喘。最后，抑制p110γ(PI3KCG基因的同工型产物)使T细胞而非B细胞的响应减少(Reif等人，J.Immunol.173：2236-2240(2004))，这种抑制证明在自身免疫性疾病的动物模型中具有效能(Camps等人，Nature Medicine 11：936-943(2005)，Barber等人，Nature Medicine11：933-935(2005))。
本发明还提供了药物组合物，其包含单独的或者与其它抗癌剂一起的至少一种式(I)化合物以及适合施用于人或动物个体的可药用赋形剂。
本发明还提供了治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物个体的方法。因此，本发明提供了治疗需要这类治疗的人或动物个体的方法，包括给该个体单独施用或者与一种或多种其它抗癌剂组合施用治疗有效量的式(I)化合物。特别是组分将被配制在一起作为组合治疗剂或者分别施用。适于与式(I)化合物使用的抗癌剂包括但不限于一种或多种选自以下所述的激酶抑制剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂、其它抑制剂、癌症化疗药物、烷化剂、螯合剂、生物效应调节剂、癌症疫苗、用于反义治疗的物质的化合物：
A.激酶抑制剂：作为抗癌剂与式(I)化合物联合使用的激酶抑制剂包括：表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂，例如小分子喹唑啉类如吉非替尼(US 5457105、US 5616582和US 5770599)、ZD-6474(WO 01/32651)、厄洛替尼(US 5,747,498和WO 96/30347)和lapatinib(US6,727,256和WO 02/02552)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制剂，包括SU-11248(WO 01/60814)、SU 5416(US 5,883,113和WO 99/61422)、SU 6668(US 5,883,113和WO 99/61422)、CHIR-258(US 6,605,617和US6,774,237)、伐他拉尼或PTK-787(US 6,258,812)、VEGF-Trap(WO02/57423)、B43-染料木黄酮(WO-09606116)、芬维A胺(维甲酸对-羟基苯胺)(US 4,323,581)、IM-862(WO 02/62826)、贝伐单抗或(WO94/10202)、KRN-951、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、AG-13736和AG-13925、吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪、ZK-304709、VMDA-3601、EG-004、CEP-701(US 5,621,100)、Cand5(WO 04/09769)；Erb2酪氨酸激酶抑制剂，例如pertuzumab(WO 01/00245)、曲妥珠单抗和利妥昔单抗；Akt蛋白激酶抑制剂，例如RX-0201；蛋白激酶C(PKC)抑制剂，例如LY-317615(WO 95/17182)和哌立福辛(US 2003171303)；Raf/Map/MEK/Ras激酶抑制剂，包括索拉非尼(BAY 43-9006)、ARQ-350RP、LErafAON、BMS-354825AMG-548，和在WO 03/82272中公开的其它化合物；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶抑制剂；细胞依赖性激酶(CDK)抑制剂，包括CYC-202或Roscovitine(WO 97/20842和WO 99/02162)；血小板衍生生长因子受体(PDGFR)激酶抑制剂，例如CHIR-258、3G3mAb、AG-13736、SU-11248和SU6668；以及Bcr-Abl激酶和融合蛋白抑制剂如STI-571或(伊马替尼)。
B.抗雌激素剂：_在抗癌治疗中与式(I)化合物联合使用的雌激素靶向的物质包括：选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，包括他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬；芳香酶抑制剂，包括或阿那曲唑；雌激素受体负调节物(ERDs)，包括或氟维司群。
C.抗雄激素剂：_在抗癌治疗中与式(I)化合物联合使用的雄激素靶向的物质包括氟他胺、比卡鲁胺、非那雄胺、氨鲁米特、酮康唑和皮质类固醇。
D.其它抑制剂：_作为抗癌剂与式(I)化合物联合使用的其它抑制剂包括：蛋白法尼基转移酶抑制剂，包括替匹法尼或R-115777(US 2003134846和WO 97/21701)、BMS-214662、AZD-3409和FTI-277；拓扑异构酶抑制剂，包括merbarone和二氟替康(BN-80915)；有丝分裂纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂，包括SB-743921和MKI-833；蛋白酶体调节剂，例如硼替佐米或(US 5,780,454)、XL-784；和环加氧酶2(COX-2)抑制剂，包括非甾体抗炎药I(NSAIDs)。
E.癌症化疗药物：作为抗癌剂与式(I)化合物联合使用的具体的癌症化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺或阿糖胞苷、阿糖胞苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪(DTIC-)、放线菌素D(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素枸橼酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸多柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-门冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌麦罗塔、紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物枸橼酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明注射用盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
F.烷化剂：_与式(I)化合物联合使用的烷化剂包括VNP-40101M或cloretizine、奥沙利铂(US 4,169,846、WO 03/24978和WO 03/04505)、葡磷酰胺、马磷酰胺、凡毕复(US 5,041,424)、泼尼莫司汀；曲奥舒凡；白消安；irofluven(酰基富烯)；penclomedine；吡唑并吖啶(PD-115934)；O6-苄基鸟嘌呤；地西他滨(5-氮杂-2-脱氧胞苷)；brostallicin；丝裂霉素C(MitoExtra)；TLK-286替莫唑胺；曲贝替定(US 5,478,932)；AP-5280(顺铂的铂酸盐制剂)；泊非霉素；和clearazide(meclorethamine)。
G.螯合剂：_与式(I)化合物联合使用的螯合剂包括四硫钼酸盐(WO01/60814)；RP-697；嵌合的T84.66(cT84.66)；钆膦维司去铁胺；以及任选与电穿孔法(EPT)组合的博来霉素。
H.生物效应调节剂：_与式(I)化合物联合使用的生物效应调节剂、例如免疫调节剂包括：星型包菌素及其大环类似物，包括UCN-01、CEP-701和米哚妥林(参见WO 02/30941、WO 97/07081、WO 89/07105、US5,621,100、WO 93/07153、WO 01/04125、WO 02/30941、WO 93/08809、WO 94/06799、WO 00/27422、WO 96/13506和WO 88/07045)；角鲨胺(WO01/79255)；DA-9601(WO 98/04541和US 6,025,387)；阿仑单抗；干扰素(例如IFN-a、IFN-b等)；白细胞介素，特别是IL-2或阿地白介素以及IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12，及具有多于70％天然人序列的氨基酸序列的其活性生物变体；六甲蜜胺SU 101或来氟米特(WO 04/06834和US 6,331,555)；咪唑并喹啉，例如瑞喹莫德和咪喹莫特(US 4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612)；以及SMIPs，包括苯并唑类、蒽醌类、缩氨基硫脲类和色胺酮类(WO 04/87153、WO 04/64759和WO 04/60308)。
I.癌症疫苗：_与式(I)化合物联合使用的抗癌疫苗包括(Tetrahedron Lett.26：2269-70(1974))；oregovomab (STn-KLH)；黑素瘤疫苗；针对Ras蛋白中5个突变的GI-4000系列(GI-4014、GI-4015和GI-4016)；GlioVax-1；MelaVax；或INGN-201(WO 95/12660)；Sig/E7/LAMP-1，编码HPV-16E7；MAGE-3疫苗或M3TK(WO 94/05304)；HER-2VAX；刺激对肿瘤特异的T细胞的ACTIVE；GM-CSF癌症疫苗；和基于利斯特菌属(Listeria)单细胞质基因的疫苗。
J.反义治疗：_与式(I)化合物联合使用的抗癌剂还包括反义组分，例如AEG-35156(GEM-640)；AP-12009和AP-11014(TGF-β2特异性反义寡核苷酸)；AVI-4126；AVI-4557；AVI-4472；oblimersenJFS2；aprinocarsen(WO 97/29780)；GTI-2040(R2核糖核苷酸还原酶mRNA反义寡核苷酸)(WO 98/05769)；GTI-2501(WO 98/05769)；脂质体包囊的c-Raf反义寡脱氧核苷酸(LErafAON)(WO 98/43095)；和Sirna-027(基于RNAi的靶向于VEGFR-1mRNA的治疗剂)。
式(I)化合物还可以在药物组合物中与支气管扩张或抗组胺药物组合。这类支气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱剂，特别是异丙托溴铵、氧托溴铵和噻托溴铵，以及β-2-肾上腺素受体激动剂，例如沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗、卡莫特罗、milveterol以及尤其是福莫特罗和茚达特罗。共同治疗的抗组胺药物包括盐酸西替利嗪、富马酸氯马斯汀、异丙嗪、氯雷他定、地氯雷他定、苯海拉明和盐酸非索非那定。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及一种或多种可用于治疗血栓性疾病、心脏病、中风等的化合物。这类化合物包括阿司匹林、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、抗凝血剂、抗血小板药(例如PLAVIX；氯吡格雷硫酸氢盐)、他汀类化合物(例如立普妥或阿托伐他汀钙、舒降之(辛伐他汀)、可定(罗苏伐他汀)等)、β阻滞剂(例如阿替洛尔)、络活喜(苯磺酸氨氯地平)和ACE抑制剂(例如赖诺普利)。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及一种或多种可用于治疗高血压的化合物。这类化合物包括ACE抑制剂、降脂药物如他汀类、立普妥(阿托伐他汀钙)、钙通道阻滞剂如络活喜(苯磺酸氨氯地平)。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及一种或多种选自贝特类(fibrates)、β-阻滞剂、NEPI抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂和血小板聚集抑制剂的化合物。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及适于治疗炎性疾病、包括类风湿性关节炎的化合物。这类化合物可以选自TNF-α抑制剂如抗-TNF-α单克隆抗体(例如类克、CDP-870)和D2E7(HUMIRA)及TNF受体免疫球蛋白融合分子(例如依那西普)、IL-1抑制剂、受体拮抗剂或可溶性IL-1Rα(例如KINERET或ICE抑制剂)、非甾体抗炎药(NSAIDS)、吡罗昔康、双氯芬酸、萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、布洛芬、灭酸酯类(fenamates)、甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮类、保泰松、阿司匹林、COX-2抑制剂(例如西乐葆(塞来考昔)、PREXIGE(芦米考昔))、金属蛋白酶抑制剂(优选MMP-13选择性抑制剂)、p2x7抑制剂、α2α抑制剂、NEUROTIN、普瑞巴林、低剂量甲氨蝶呤、来氟米特、羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬或者胃肠道外或口服金。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及适于治疗骨关节炎的化合物。这类化合物可以选自标准的非甾体抗炎药(下文为NSAIDs)如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸类如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬和布洛芬、灭酸酯类如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮类如保泰松、水杨酸类如阿司匹林、COX-2抑制剂如塞来考昔、伐地考昔、芦米考昔和艾托考昔、镇痛药以及关节内治疗剂如皮质类固醇及透明质酸如海尔根和欣维可。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及抗病毒剂和/或抗菌化合物。所述抗病毒剂可以选自泛罗赛、AZT、阿昔洛韦和泛昔洛韦。所述抗菌化合物可以选自Valant。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及一种或多种选自如下的物质：CNS药物，例如抗抑郁药(舍曲林)、抗帕金森症药(例如地普雷尼尔、L-多巴、Requip、普拉克索；MAOB抑制剂(例如司来吉兰(selegine)和雷沙吉兰)；comP抑制剂(例如托卡朋)；A-2抑制剂；多巴胺重吸收抑制剂；NMDA拮抗剂；烟碱激动剂；多巴胺激动剂；和神经元的一氧化氮合酶抑制剂)。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及一种或多种抗阿尔茨海默病药物。所述抗阿尔茨海默病药物可以选自多奈哌齐、他克林、α2δ抑制剂、NEUROTIN、普瑞巴林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲膦酯。
在另外的方面，本发明提供了组合，其包含式(I)化合物以及抗骨质疏松症药物和/或免疫抑制剂。所述骨质疏松症药物可以选自易维特(盐酸雷洛昔芬)、屈洛昔芬、拉索昔芬或Fosomax。所述免疫抑制剂可以选自FK-506和雷帕霉素。
在优选实施方案的另一方面，提供了药盒，其包括一种或多种式(I)化合物和如本文公开的组合伙伴。代表性药盒包括PI3K抑制剂化合物(例如式(I)化合物)以及包装插页或其它标记，包括通过施用PI3K抑制量的化合物来治疗细胞增殖性疾病的说明书。
通常，式(I)化合物将以治疗有效量、通过对任何发挥类似功效的物质而言可接受的施用方式来施用。式(I)化合物、即活性成分的实际量将取决于多种因素，例如所治疗疾病的严重性、个体的年龄和相对健康、所用化合物的效能、施用的途径和形式以及其它因素。药物可以一天施用一次以上，优选一天施用一次或两次。所有这些因素都在主治医师的技能之内。式(I)化合物的治疗有效量的范围可以在约0.05至约50mg/公斤受者体重/天；优选约0.1-25mg/kg/天，更优选约0.5至10mg/kg/天。因此，对于施用于70kg的人而言，剂量范围将最优选为约35-70mg/天。
通常，式(I)化合物将作为药物组合物、通过任意一种以下途径施用：口服、全身(例如透皮、鼻内或通过栓剂)或胃肠道外(例如肌内、静脉内或皮下)施用。优选的施用方式是使用方便的日剂量方案进行口服，所述的日剂量方案可以根据病痛的程度进行调整。组合物可以采取片剂、丸剂、胶囊剂、半固体、粉末、缓释制剂、溶液、混悬液、酏剂、气雾剂的形式或任意其它适当的组合物。另一种优选的施用式I化合物的方式是吸入。这是将治疗剂直接传递到呼吸道的有效方法。
制剂的选择取决于多种因素，例如药物施用的方式和药物物质的生物利用度。对于通过吸入传递而言，化合物可以被配制成液体溶液、混悬液、气雾喷射剂或干粉，并且可以被装入适于施用的分配器中。有数种类型的药物吸入装置-喷雾器吸入器、定量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。喷雾器装置可产生高速空气流，使治疗剂(以液体形式配制)喷成薄雾，其被带入患者的呼吸道。MDI通常是用压缩气体包装的制剂。启动后，该装置通过压缩气体释放出定量的治疗剂，由此提供施用指定量的物质的可靠方法。DPI可分配自由流动的粉末形式的治疗剂，这些治疗剂可以在通过该装置进行呼吸的过程中被分散到患者的吸入气流中。为了获得自由流动的粉末，治疗剂可与赋形剂如乳糖进行配制。定量的治疗剂以胶囊形式贮存，并且用每次启动进行分配。
本发明还涉及其中式(I)化合物的粒度在10-1000nm、优选10-400nm之间的制剂。尤其对于显示出生物利用度差的药物，根据可以通过增加表面积、即减小粒度来提高生物利用度的原理，已经开发了这类药物制剂。例如，U.S.4,107,288描述了具有大小范围为10至1,000nm的颗粒的药物制剂，其中活性物质被支持在交联的大分子基质上。U.S.5,145,684描述了药物制剂的制备，其中在表面修饰剂的存在下药物物质被粉碎成纳米粒(平均粒度为400nm)，然后被分散在液体介质中，得到显示出非常高的生物利用度的药物制剂。这两篇文献均被包括在本文内作为参考。
在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含(治疗有效量)的式(I)化合物以及至少一种可药用赋形剂。可接受的赋形剂是无毒的、可帮助施用并且不会不利地影响式I化合物的治疗益处。这类赋形剂可以是任意固体、液体、半固体，或者对于气雾剂组合物而言可以是本领域技术人员通常可得到的气体赋形剂。
固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。
液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和多种油类、包括石油、动物、植物或合成来源的那些、例如花生油、大豆油、矿油、芝麻油等。特别用于可注射溶液的优选的液体载体包括水、盐水、葡萄糖水和二醇类。
压缩气体可以用于分散气雾剂形式的式(I)化合物。适于该目的的惰性气体有氮气、二氧化碳等。其它适宜的药物赋形剂及其制剂在E.W.Martin编写的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(马克(Mack)出版公司，第18版，1990)中有描述。
制剂中化合物的量可以在本领域技术人员所采用的全部范围内改变。通常，基于重量百分数(重量％)计算，制剂将含有约0.01-99.99重量％的式(I)化合物(基于总制剂计算)，而剩余物质为一种或多种适宜的药物赋形剂。优选化合物以约1-80重量％的水平存在。
本发明还涉及药物组合物，其包含(即含有或包括)至少一种式(I)化合物以及至少一种可药用赋形剂。
包含游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物以及至少一种可药用赋形剂(例如载体和/或稀释剂)的药物组合物可以按照常规方式、通过将组分混合来制备。
包含游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物并且还包含组合伙伴(作为一个剂量单位形式或作为成套药盒)以及至少一种可药用的载体和/或稀释剂的组合的药物组合物可以按照常规方式、通过将可药用的载体和/或稀释剂与所述的活性成分混合来制备。
因此，在另外的方面，本发明提供了：
■组合的药物组合物，例如用于本文描述的任意方法，其包含游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物以及可药用的稀释剂和/或载体。
■组合的药物组合物，其包含作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物；一种或多种可药用的载体物质和/或稀释剂以及任选的一种或多种另外的药物物质。这类组合的药物组合物可以是一种剂量单位形式或作为成套药盒。
■组合的药物组合物，其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式(I)化合物以及第二种药物物质，它们可同时或先后施用。
■如上定义的方法，该方法包括共同施用，例如同时或先后施用治疗有效的无毒量的式(I)化合物或其可药用盐以及至少第二种药物物质、例如如上所示的第二种药物物质。
■药物组合产品，例如药盒，其包含a)第一种物质，它是游离形式或可药用盐形式的如本文公开的式(I)化合物，和b)至少一种共用药物、例如如上所示的共用药物；其中这类药盒可以包含其施用说明书。
以下的式(I)化合物的实施例说明了本发明而非限制其范围。制备这类化合物的方法在下文有描述。
实施例1：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在氩气中将Et3N(1.54mL，11.1mmol，3当量)加入咪唑-1-甲酸[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(步骤1.1)(1.26g，3.7mmol)和L-脯氨酰胺(0.548g，4.8mmol，1.3当量)在DMF(25mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌14小时，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭，并用EtOAc萃取。将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱(DCM/MeOH，1∶0→94∶6)纯化，然后用Et2O研磨，得到1.22g标题化合物，为灰白色固体：ESI-MS：388.1[M+H]+；tR＝2.35min(系统1)；TLC：Rf＝0.36(DCM/MeOH，9∶1)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：1.32(s，9H)1.75-1.95(m，3H)1.97-2.13(m，1H)2.39(s，3H)3.38-3.50(m，1H)3.52-3.65(m.，1H)4.10-4.40(m，1H)6.94(b r.s.，1H)7.22(d，1H)7.30-7.48(m，2H)8.49(d，1H)10.87(b r.s.，1H)
步骤1.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺
将5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤1.2)(1g，4.05mmol)和1，1’-羰基二咪唑(0.984g，6.07mmol，1.5当量)在DCM(50mL)中的混合物回流搅拌4小时，并冷却。经过滤收集所得沉淀，得到1.26g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：340.2[M-H]-；tR＝2.85min(系统1)。
步骤1.2：5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
将N-[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(步骤1.3)(2g，7mmol)、6N的HCl水溶液(10mL)和EtOH(50mL)的混合物在85℃下搅拌2小时，冷却，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭并用DCM/MeOH(9∶1，v/v)萃取。将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→96∶4)得到1.21g标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：248.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.36(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤1.3：N-[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺
在氩气中将2-乙酰氨基-4-甲基噻唑(1.2g，7.7mmol，1.1当量)、碳酸铯(4.55g，14mmol，2当量)、三叔丁基四氟硼酸盐(0.406g，1.4mmol，0.2当量)、乙酸钯(II)(0.15g，0.7mmol，0.1当量)和4-溴-2-叔丁基-吡啶(步骤1.4)(1.5g，7mmol)在DMF(50mL)中的混合物在90℃下搅拌1.5小时，冷却，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭，并经硅藻土垫过滤。将滤液用EtOAc萃取。将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→97∶3)得到2.02g标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：290.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.35(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤1.4：4-溴-2-叔丁基-吡啶
将2-叔丁基-1H-吡啶-4-酮(步骤1.5)(4.25g，28mmol)和POBr3(8.88g，31mmol，1.1当量)的混合物加热至120℃，搅拌15分钟，冷却，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭，并用DCM/MeOH(9∶1，v/v)萃取。将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，95∶5)得到5.18g标题化合物，为黄色油状物：ESI-MS：214.0/216.0[M+H]+；tR＝2.49min(系统1)；TLC：Rf＝0.35(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤1.5：2-叔丁基-1H-吡啶-4-酮
将2-叔丁基-吡喃-4-酮(步骤1.6)(5.74g，37.7mmol)和30％的氢氧化铵水溶液(100mL)回流下搅拌1小时，冷却并浓缩。将残余物用MeOH(200mL)研磨并过滤。浓缩滤液并将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1→92∶7∶1)得到4.46g标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：152.0[M+H]+；tR＝1.45min(系统1)；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤1.6：2-叔丁基-吡喃-4-酮
将5-羟基-1-甲氧基-6，6-二甲基-庚-1，4-二烯-3-酮(步骤1.7)(6.8g，36.9mmol)和TFA(5.65mL，74mmol，2当量)在苯(250mL)中的混合物在室温下搅拌14小时并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→75∶25)，得到5.74g标题化合物，为黄色油状物：ESI-MS：153.1[M+H]+；tR＝3.21min(系统1)；TLC：Rf＝0.22(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤1.7：5-羟基-1-甲氧基-6，6-二甲基-庚-1，4-二烯-3-酮
将LiHMDS(1M的THF溶液，100mL，2当量)逐滴加入冷却的(-78℃)4-甲氧基-3-丁烯-2-酮(10mL，100mmol，2当量)在THF(400mL)的溶液中。在-78℃搅拌30分钟后，加入特戊酰氯(6.12mL，50mmol)在THF(100mL)中的溶液。将所得混合物历经2小时加温至室温，并通过加入饱和NH4Cl溶液猝灭。真空除去THF。将该浓缩的混合物用Et2O萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→85∶15)得到6.83g标题化合物，为黄色油状物：ESI-MS：185.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.87(Hex/EtOAc，1∶1)。
实施例2：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-环丙基-吡啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照与实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌4小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃搅拌2小时。在步骤1.3中，使用4-氯-2-(1-甲基-环丙基)-吡啶(步骤2.1)，并将反应混合物在150℃下搅拌2小时。标题化合物：ESI-MS：372.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.35(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤2.1：4-氯-2-环丙基-吡啶
按照文献[Comins，D.L.；Mantlo，N.B.，Journal of Organic Chemistry，(1985)，50，4410-4411]中所述方法的修改方法制备标题化合物。
将环丙基溴化镁(0.5M的THF溶液，100mL，50mmol，2.2当量)一次加入冷却的(-78℃)4-氯吡啶盐酸化物(3.4g，22mmol)在THF(68mL)的溶液中。在-78℃搅拌10分钟后，逐滴加入氯甲酸苯基酯(2.76mL，22mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌15分钟，加温至室温，通过加入20％的NH4Cl水溶液猝灭，并用Et2O萃取(2x100mL)。将有机相用饱和NaHCO3溶液(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。向溶于甲苯(100mL)的残余物中加入邻-氯醌(6g，24.2mmol，1.1当量)在冰醋酸(50mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌14小时，冷却至0℃，通过加入10％NaOH水溶液碱化，并经硅胶垫过滤。将滤液中的有机层用H2O(20mL)洗涤，并用10％的HCl水溶液萃取(3x25mL)。通过加入20％的NaOH水溶液将合并的酸层碱化，并用DCM萃取(3x25mL)。将有机相用H2O(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→99∶1)得到0.951g标题化合物，为无色油状物：ESI-MS：154.1[M+H]+；tR＝1.41min(系统1)；TLC：Rf＝0.85(DCM/MeOH，9∶1)。
实施例3：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-氟-苯基)-吡啶-4- 基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但在步骤1.3中使用4-氯-2-(2-氟-苯基)-吡啶(步骤3.1)，并在150℃下搅拌对应的混合物2小时：ESI-MS：426.1[M+H]+；tR＝2.60min(系统1)；TLC：Rf＝0.40(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤3.1：4-氯-2-(2-氟-苯基)-吡啶
在105℃下在氩气中将2-氟苯基硼酸(141mg，1mmol，1.2当量)在EtOH(1mL)中的混合物加入4-氯-2-碘-吡啶[Choppin，S.；Gros，P.；Fort，Y.，European Journal of Organic Chemistry(2001)，(3)，603-606](200mg，0.84mmol)，PdCl2(dPPf)(18mg，0.025mmol，0.03当量)和Na2CO3(2M的H2O溶液，1.68mL，3.36mmol，4当量)在甲苯(2mL)的混合物中。将反应混合物在105℃下搅拌1小时，冷却至室温，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭，并用EtOAc萃取。将有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→97∶3)得到127mg标题化合物，为白色固体：ESI-MS：208.1[M+H]+；tR＝4.66min(系统1)；TLC：Rf＝0.27(Hex/EtOAc，9∶1)。
实施例4：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-环丁基-吡啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌4小时，用EtOAc和H2O稀释，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物在DCM中研磨进行纯化。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌2小时，冷却，用EtOAc和H2O稀释，经硅藻土垫过滤，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物在Et2O中研磨进行纯化。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入环丁基甲酰氯的THF溶液，并将反应混合物历经18小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：386.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH，95∶5)。
实施例5：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙 基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌3小时。在步骤1.5中，将反应混合物65-70℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，使用1-甲基-环丙烷甲酰氯(步骤5.1)。
标题化合物：ESI-MS：386.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.40(DCM/MeOH，9∶1)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：0.71-0.87(m，2H)1.11-1.26(m，2H)1.47(s，3H)1.74-1.96(m，3H)2.00-2.15(m，1H)2.39(s，3H)3.35-3.52(m，1H)3.52-3.73(m，1H)4.10-4.40(m，1H)6.93(br.s.，1H)7.15(dd，1H)7.27(s，1H)7.35(s，1H)8.40(d，1H)10.99(b r.s.，1H)
步骤5.1：1-甲基-环丙烷甲酰氯
将1-甲基-环丙烷甲酸(10g，100mmol)和草酰氯(10.49ml，120mmol，1.2当量)在CHCl3(80ml)中的混合物在70℃下搅拌4小时。浓缩反应混合物得到11.8g标题化合物，为黄色油状物，其不经进一步纯化直接使用。
实施例6：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丁 基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时。在步骤1.3中，将反应混合物在100℃下搅拌3小时，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶4)。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌2小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮(50mmol)在THF(100mL)中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS(1M的THF溶液，100mL)在THF(200mL)的溶液中。30分钟后，加入1-甲基-环丁烷氯化物(步骤6.1)，并将反应混合物历经18小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：400.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.06(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤6.1：1-甲基-环丁烷甲酰氯
按照如步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-甲基-环丁烷甲酸[Cowling，S.J.；Goodby，J.W.，Chemical Communications，(2006)，(39)，4107-4109]。
实施例7：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-噻 唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌2小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时。在步骤1.3下，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃搅拌2小时，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶1)，然后在Et2O中研磨。
标题化合物：ESI-MS：374.1[M+H]+；tR＝2.16min(系统1)；TLC：Rf＝0.10(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
实施例8：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-异丙基-吡啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃搅拌2小时。在步骤1.3中，使用4-氯-2-异丙基-吡啶(步骤8.1)。将反应混合物在150℃搅拌3小时，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，25∶75)。
标题化合物：ESI-MS：374.1[M+H]+；tR＝1.99min(系统1)；TLC：Rf＝0.10(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤8.1：4-氯-2-异丙基-吡啶
按照步骤2.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用异丙基氯化镁(2M在THF中的溶液)：ESI-MS：156.0[M+H]+；TLC：Rf＝0.32(DCM)。
实施例9：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-环丁基-吡啶-4-基)-噻 唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，用DCM/H2O稀释，并用DCM萃取。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时，且粗产物不再纯化。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌3小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，2∶3)。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮(50mmol)在THF(100mL)中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS(1M的THF溶液，100mL)在THF(200mL)的溶液中。30分钟后，加入环丁基甲酰氯，并将反应混合物历经18小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：372.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.13(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
实施例10：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-甲基-环丙基)-吡啶 -4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺，并将反应混合物在120℃下搅拌4小时。在步骤1.5中，不再进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，使用1-甲基-环丙烷甲酰氯(步骤5.1)。
标题化合物：ESI-MS：372.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.43(DCM/MeOH，9∶1)。
实施例11：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-三氟甲基-环丙基)- 吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用2.55mL)作为溶剂。将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，使用1-三氟甲基-环丙烷甲酰氯(步骤11.1)。
标题化合物：ESI-MS：426.0[M+H]+；tR＝2.35min(系统1)；TLC：Rf＝0.25(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤11.1：1-三氟甲基-环丙烷甲酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-三氟甲基-环丙烷甲酸。
实施例12：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲 基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌5小时。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌2.5小时。在步骤1.4中，将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
标题化合物：ESI-MS：428.0[M+H]+；tR＝2.75min(系统1)；TLC：Rf＝0.21(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤12.1：3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酸。
实施例13：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-三氟甲基-环丁基)- 吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌5小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用2.26mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在室温下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF的溶液中。30分钟后，加入1-三氟甲基-环丁烷甲酰氯(步骤13.1)在THF中的溶液。将反应混合物历经18小时达到室温，并在猝灭后用EtOAc萃取。
标题化合物：ESI-MS：440.0[M+H]+；tR＝2.68min(系统1)；TLC：Rf＝0.08(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
步骤13.1：1-三氟甲基-环丁烷甲酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-三氟甲基-环丁烷甲酸，并将反应混合物在回流下搅拌2小时。
实施例14：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-三氟甲基- 环丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用2.55mL)作为溶剂。将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，使用1-三氟甲基-环丙烷甲酰氯(步骤11.1)。
标题化合物：ESI-MS：440.0[M+H]+；tR＝2.65min(系统1)；TLC：Rf＝0.36(DCM/MeOH，9∶1)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：1.41(s，4H)1.70-1.90(m，3H)2.00-2.10(m，1H)2.40(s，3H)3.36-3.52(m，1H)3.52-3.65(m，1H)4.10-4.40(m，1H)6.95(b r.s.，1H)7.37(d，2H)7.47(s，1H)8.52(d，1H)10.94(b r.s.，1H)
实施例15：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟 -1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌2.5小时。在步骤1.4中，将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
标题化合物：ESI-MS：442.0[M+H]+；tR＝3.02min(系统1)；TLC：Rf＝0.35(DCM/MeOH，9∶1)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：1.60(s，6H)1.70-1.95(m，3H)1.99-2.16(m，1H)2.40(s，3H)3.38-3.51(m，1H)3.51-3.69(m，1H)4.10-4.40(m，1H)6.95(b r.s.，1H)7.39(d，2H)7.53(s，1H)8.58(d，1H)10.93(br.s.，1H)
在一项可选择的方法中，按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行以下修改：使用N，N-二甲基乙酰胺代替DMF，并将该混合物在65℃下搅拌2小时。在步骤1.1中，使用氯甲酸苯基酯(缓慢加入)代替1，1’-羰基二咪唑，并将该反应在THF中在N，N-二乙基-异丙基胺的存在下于室温下进行(1.5h)。在步骤1.2中，将反应混合物在搅拌下加热5小时(回流)，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，该反应在甲苯中进行，使用1.1当量的POBr3和1.1当量的三丙基胺，并将该混合物在80℃下搅拌2小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，使用甲苯代替苯，且粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
实施例16：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-三氟甲基- 环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌72小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌6小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，经硅藻土垫过滤并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用2.26mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在室温下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF的溶液中。30分钟后，加入1-三氟甲基-环丁烷甲酰氯(步骤13.1)的THF溶液。将反应混合物历经18小时达到室温，并在猝灭后用EtOAc萃取。
标题化合物：ESI-MS：454.1[M+H]+；tR＝2.90min(系统1)；TLC：Rf＝0.22(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
实施例17：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-甲基-环丁基)-吡啶 -4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在100℃下搅拌3小时，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，25∶75)。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌2小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF的溶液中。30分钟后，加入1-甲基-环丁烷氯化物(步骤6.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经18小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：386.1[M+H]+；tR＝2.32min(系统1)；TLC：Rf＝0.05(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
实施例18：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-氰基-环丙基)-吡啶 -4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.1中，使用1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丙烷甲腈(步骤18.1)，并将反应混合物在回流下搅拌2小时。
标题化合物：ESI-MS：397.0[M+H]+；tR＝2.90min(系统1)；TLC：Rf＝0.08(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：1.69-1.93(m，7H)2.00-2.20(m，1H)2.42(s，3H)3.38-3.50(m，1H)3.50-3.65(m，1H)4.10-4.40(m，1H)6.94(b r.s.，1H)7.34(dd，1H)7.37(b r.s.，1H)7.47(s，1H)8.47(d，1H)
步骤18.1：1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丙烷甲腈
将{5-[2-(1-氰基-环丙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤18.2)(295mg)、DCM(4mL)和TFA(1mL)的混合物在室温下搅拌2小时，并随后浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)得到182mg标题化合物：ESI-MS：257.1[M+H]+；tR＝2.54min(系统1)；TLC：Rf＝0.30((DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤18.2：{5-[2-(1-氰基-环丙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲 酸叔丁基酯
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-(4-溴-吡啶-2-基)-环丙烷甲腈(步骤18.3)和(4-甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯(步骤18.4)。将反应混合物在100℃下搅拌2小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，并用EtOAc萃取。粗产物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶1)，得到122mg标题化合物，为白色固体：ESI-MS：357.1[M+H]+；tR＝4.86min(系统1)；TLC：Rf＝0.29(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤18.3：1-(4-溴-吡啶-2-基)-环丙烷甲腈
将LiHMDS(1M甲苯溶液，17.6mL，17.6mmol，3.1当量)逐滴加入冷却的(-5℃)4-溴-2-氟-吡啶[Marsais，F.等人，Journal of Organic Chemistry，(1992)，57，565-573](1g，5.7mmol)、环丙烷甲腈(1.25mL，17mmol，3当量)、4分子筛和甲苯(20mL)的混合物中。将反应混合物加温至室温，搅拌16小时，倒入H2O中并过滤。将滤液用EtOAc/H2O稀释并用EtOAc萃取。有机相用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，9∶1)，得到620mg标题化合物，为白色固体：ESI-MS：223.1/225.1[M+H]+；tR＝4.22min(系统1)；TLC：Rf＝0.25(Hex/EtOAc，9∶1)。
步骤18.4：(4-甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯
将二碳酸二叔丁基酯(21g，96.5mmol，1.1当量)在t-BuOH(50mL)中的溶液加入4-甲基-2-氨基噻唑(10g，87.7mmol)和DMAP(1.1g，8.8mmol，0.1当量)在t-BuOH(50mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌72小时并浓缩。将残余物用EtOAc/H2O稀释并用EtOAc萃取。有机相用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，98∶2)，得到15.2g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：215.1[M+H]+；tR＝3.43min(系统1)；TLC：Rf＝0.30(DCM/MeOH，98∶2)。
实施例19：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-氰基-环丁基)-吡啶 -4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在步骤1.1中，使用1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丁烷甲腈(步骤19.1)，并将反应混合物在回流下搅拌3小时。
标题化合物：ESI-MS：411.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.36(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤19.1：1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丁烷甲腈
将{5-[2-(1-氰基-环丁基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤19.2)(300mg)、DCM(5mL)和TFA(1mL)的混合物在室温下搅拌4小时，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭(50mL)，并用DCM萃取(3x75mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→96∶4)得到181mg标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：271.1[M+H]+；tR＝2.48min(系统1)；TLC：Rf＝0.45(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤19.2：{5-[2-(1-氰基-环丁基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲 酸叔丁基酯
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-(4-溴-吡啶-2-基)-环丁烷甲腈(步骤19.3)和(4-甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯(步骤18.4)。将反应混合物在100℃下搅拌3小时。标题化合物：ESI-MS：371.1[M+H]+；tR＝4.86min(系统1)；TLC：Rf＝0.66(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤19.3：1-(4-溴-吡啶-2-基)-环丁烷甲腈
将LiHMDS(1M甲苯溶液，17.7mL，17.7mmol，3.1当量)逐滴加入冷却的(-5℃)4-溴-2-氟-吡啶[Marsais，F.等人，Journal of Organic Chemistry，(1992)，57，565-573](1g，5.7mmol)和环丁烷甲腈(1.39g，17.1mmol，3当量)在甲苯中的溶液(20mL)。将反应混合物加温至室温，搅拌5小时，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭(50mL)，并经硅藻土垫过滤。将滤液用EtOAc萃取(3x75mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→95∶5)得到933mg标题化合物，为黄色油状物：ESI-MS：237.0/239.0[M+H]+；tR＝4.27min(系统1)；TLC：Rf＝0.30(Hex/EtOAc，9∶1)。
实施例20：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-氨基甲酰基-环丁 基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌3小时。在步骤1.1中，使用1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丁烷甲酰胺(步骤20.1)，并将反应混合物在回流下搅拌12小时。
标题化合物：ESI-MS：429.1[M+H]+；tR＝2.90min(系统1)；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤20.1：1-[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-吡啶-2-基]-环丁烷甲酰胺
将{5-[2-(1-氰基-环丁基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤19.2)(640mg，1.73mmol)和浓硫酸的混合物在0℃下搅拌40分钟，加温至室温，搅拌1小时，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭(50mL)，并用DCM萃取(3x75mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，99∶0∶1→93∶6∶1)得到35mg标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：289.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.32(DCM/MeOH，9∶1)。
实施例21：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-二甲基氨基-1，1- 二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，使用5-[2-(2-二甲基氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基胺(步骤21.1)，并将反应混合物在回流下搅拌14小时。
标题化合物：ESI-MS：431.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.12(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤21.1：5-[2-(2-二甲基氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻 唑-2-基胺
按照步骤19.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用{5-[2-(2-二甲基氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤21.2)，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。标题化合物：ESI-MS：291.1[M+H]+；tR＝2.48min(系统1)；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤21.2：{5-[2-(2-二甲基氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻 唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯
将甲醛(36％的H2O溶液，0.144mL，1.87mmol，2当量)加入{5-[2-(2-氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤21.3)(0.34g，0.94mmol)和乙酰氧基硼氢化钠(0.6g，2.82mmol，3当量)在1，2-二氯乙烷(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，99∶0∶1→97∶2∶1)得到0.222g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：391.2[M+H]+；tR＝4.27min(系统1)；TLC：Rf＝0.15(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤21.3：{5-[2-(2-氨基-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2- 基}-氨基甲酸叔丁基酯
在氩气中将LiAlH4(1M的THF溶液，3.06mL，3.06mmol，1.5当量)加入{5-[2-(氰基-二甲基-甲基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨基甲酸叔丁基酯(步骤21.4)(0.73g，2.04mmol)在THF(10mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，通过加入H2O(20mL)猝灭并用EtOAc萃取(2x75mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，99∶0∶1→94∶5∶1)得到318mg标题化合物，为褐色固体：ESI-MS：363.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤21.4：{5-[2-(氰基-二甲基-甲基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-氨 基甲酸叔丁基酯
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-(4-碘-吡啶-2-基)-2-甲基-丙腈(步骤21.5)和(4-甲基-噻唑-2-基)-氨基甲酸叔丁基酯(步骤18.4)。将反应混合物在100℃下搅拌3小时。标题化合物：ESI-MS：359.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.47(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤21.5：2-(4-碘-吡啶-2-基)-2-甲基-丙腈
按照步骤19.3中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-氟-4-碘吡啶。标题化合物：ESI-MS：273.0[M+H]+；tR＝4.22min(系统1)；TLC：Rf＝0.36(Hex/EtOAc，9∶1)。
实施例22：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-二乙基氨基-吡啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用二乙基-(4-碘-吡啶-2-基)-胺(步骤22.1)。将反应混合物在120℃下搅拌16小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，经硅藻土垫过滤，并用EtOAc萃取。
标题化合物：ESI-MS：403.2[M+H]+；tR＝2.38min(系统1)；TLC：Rf＝0.10(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
步骤22.1：二乙基-(4-碘-吡啶-2-基)-胺
将2-氟-4-碘吡啶(2g，8.97mmol)、二乙胺(2.77ml，26.9mmol，3当量)和K2CO3(2.48g，17.94mmol，2当量)在DMF(20mL)中的混合物在100℃下搅拌18小时，冷却至室温，用EtOAc/H2O稀释并用EtOAc萃取。有机相用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/Et2O，98∶2)得到2.3g标题化合物，为黄色油状物：ESI-MS：277.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.52(Hex/Et2O，98∶2)。
实施例23：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-二乙基氨基-吡啶-4- 基)-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用二乙基-(4-碘-吡啶-2-基)-胺(步骤22.1)和N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌5小时，通过加入EtOAc和H2O稀释进行猝灭，经硅藻土垫过滤，并用EtOAc萃取。
标题化合物：ESI-MS：389.2[M+H]+；tR＝2.28min(系统1)；TLC：Rf＝0.34(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
实施例24：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(3-叔丁基-3H-苯并咪唑 -5-基)-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌5小时。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用6-溴-1-叔丁基-1H-苯并咪唑(步骤24.1)和N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌7小时。
标题化合物：ESI-MS：413.2[M+H]+；tR＝2.29min(系统1)；TLC：Rf＝0.45(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤241.6-溴-1-叔丁基-1H-苯并咪唑
将4-溴-N＊2＊-叔丁基-苯-1，2-二胺(步骤24.2)(2.14g，8.80mmol)和原甲酸三乙酯(14.7mL，88mmol)的混合物在148℃下搅拌1小时，冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→99∶1)得到1.74g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：253.0/255.0[M+H]+；tR＝2.88min(系统1)；TLC：Rf＝0.54(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤24.2：4-溴-N ＊ 2 ＊ -叔丁基-苯-1，2-二胺
室温下将(5-溴-2-硝基-苯基)-叔丁基-胺(步骤24.3)(6g，21.97mmol)和兰尼镍(2g)在MeOH/THF(1∶1v/v，600mL)中的混悬液在氢气中搅拌9小时。将反应混合物经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，97∶3→3∶1)得到4.4g标题化合物，为黑色油状物：ESI-MS：243.0/245.0[M+H]+；tR＝2.75min(系统1)；TLC：Rf＝0.89(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤24.3：(5-溴-2-硝基-苯基)-叔丁基-胺
将4-溴-2-氟-硝基苯(4g，18.2mmol)和叔丁基胺(4.78mL，45.5mmol，2.5当量)在EtOH(80mL)中的溶液在85℃下搅拌15小时，冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→99∶1)得到4.8g标题化合物，为橙色固体：ESI-MS：273.0/275.0[M+H]+；tR＝5.68min(系统1)；TLC：Rf＝0.49(Hex/EtOAc，9∶1)。
实施例25：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(3-叔丁基-2-甲基-3H- 苯并咪唑-5-基)-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌14小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用6-溴-1-叔丁基-2-甲基-1H-苯并咪唑(步骤25.1)和N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌5小时。
标题化合物：ESI-MS：427.2[M+H]+；tR＝2.37min(系统1)；TLC：Rf＝0.38(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤25.1：6-溴-1-叔丁基-2-甲基-1H-苯并咪唑
将6-溴-1-叔丁基-2-乙氧基甲基-2-甲基-2，3-二氢-1H-苯并咪唑(步骤25.2)(2.04g，6.51mmol)和TFA(10ml)的混合物在室温下搅拌过夜，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭(100mL)，并用EtOAc萃取(2x150mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x50mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→98∶2)得到1.05g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：267.0/269.0[M+H]+；tR＝2.99min(系统1)；TLC：Rf＝0.58(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤25.2：6-溴-1-叔丁基-2-乙氧基甲基-2-甲基-2，3-二氢-1H-苯并咪唑
将4-溴-N＊2＊-叔丁基-苯-1，2-二胺(步骤24.2)(2.14g，8.80mmol)和原乙酸三乙酯(16.2mL，88mmol，10当量)的混合物在142℃下搅拌1小时，冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶0→95∶5)得到2.04g标题化合物，为紫色油状物：ESI-MS：313.0/315.0[M+H]+；TLC：Rf＝0.67(Hex/EtOAc，9∶1)。
实施例26：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(3-乙基-3H-苯并咪唑-5- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌15小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌3小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用6-溴-1-乙基-1H-苯并咪唑(步骤26.1)和N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在120℃下搅拌14小时。
标题化合物：ESI-MS：399.1[M+H]+；tR＝1.73min(系统1)；TLC：Rf＝0.25(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤26.1：6-溴-1-乙基-1H-苯并咪唑
将4-溴-N＊2＊-乙基-苯-1，2-二胺(步骤26.2)(2g，9.3mmol)和原甲酸三乙酯(15.5mL，93mmol，10当量)的混合物在148℃下搅拌1小时，冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，1∶0→98∶2)得到2.05g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：225.1/227.1[M+H]+；tR＝2.31min(系统1)；TLC：Rf＝0.58(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤26.2：4-溴-N ＊ 2 ＊ -乙基-苯-1，2-二胺
在室温下将(5-溴-2-硝基-苯基)-乙基-胺(步骤26.3)(6g，24.48mmol)和兰尼镍(2g)在MeOH/THF(1∶1v/v，600mL)中的混悬液在氢气中搅拌9小时。将反应混合物经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，95∶5→85∶15)得到4.51g标题化合物，为黑色油状物：ESI-MS：213.1/215.1[M-H]-；tR＝2.53min(系统1)；TLC：Rf＝0.57(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤26.3：(5-溴-2-硝基-苯基)-乙基-胺
将4-溴-2-氟-硝基苯(6g，27.3mmol)、甲基胺(2M的MeOH溶液，34.1mL，68.2mmol，2.5当量)和EtOH(80mL)的混合物在85℃下搅拌15小时，冷却并浓缩。将残余物经研磨纯化，得到6g标题化合物，为黄色固体：tR＝5.13min(系统1)。
实施例27：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1- 甲基-乙基]-吡啶-4-基}-4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在100℃下搅拌3小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用4.3mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，倒入饱和NaHCO3溶液中，并用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌23小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌21小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF的溶液中。30分钟后，加入2-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酰氯(步骤27.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：480.0[M+H]+；tR＝3.05min(系统1)；TLC：Rf＝0.13(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤27.1：2-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酸，并将反应混合物在回流下搅拌3小时。
实施例28：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1- 甲基-乙基]-吡啶-4-基}-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌2小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在100℃下搅拌5小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用4.3mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，倒入饱和NaHCO3溶液中，并用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌23小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌21小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入2-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酰氯(步骤27.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：466.1[M+H]+；tR＝2.91min(系统1)；TLC：Rf＝0.23(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
实施例29：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)- 环丙基]-吡啶-4-基}-4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌21小时，用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌3小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在100℃下搅拌6小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用4.3mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，倒入饱和NaHCO3溶液中，并用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌18小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入1-(4-甲氧基-苯基)-环丙烷甲酰氯(步骤29.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：478.1[M+H]+；tR＝2.65min(系统1)；TLC：Rf＝0.09(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤29.1：1-(4-甲氧基-苯基)-环丙烷甲酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用1-(4-甲氧基-苯基)-环丙基甲酸，并将反应混合物在回流下搅拌3小时。
实施例30：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)- 环丙基]-吡啶-4-基}-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌16小时，用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌3小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将反应混合物在100℃下搅拌28小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用4.3mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，倒入饱和NaHCO3溶液中，并用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌18小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌18小时。在步骤1.7中，将4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入1-(4-甲氧基-苯基)-环丙烷甲酰氯(步骤29.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：464.1[M+H]+；tR＝2.90min(系统1)；TLC：Rf＝0.06(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
实施例31：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-{1-[4-(3-二甲基氨基- 丙氧基)-苯基]-1-甲基-乙基}-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌7小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用(3-{4-[1-(4-溴-吡啶-2-基)-1-甲基-乙基]-苯氧基}-丙基)-二甲基-胺(步骤31.1)。将反应混合物在120℃下搅拌2小时，通过用EtOAc/H2O稀释猝灭，并用EtOAc萃取。
标题化合物：ESI-MS：551.1[M+H]+；tR＝2.38min(系统1)；TLC：Rf＝0.05(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤31.1：(3-{4-[1-(4-溴-吡啶-2-基)-1-甲基-乙基]-苯氧基}-丙基)-二甲 基-胺
将氢氧化钠(精细研磨的颗粒，0.488g，12.2mmol，5当量)加入4-[1-(4-溴-吡啶-2-基)-1-甲基-乙基]-苯酚(步骤31.2)(0.714g，2.44mmol)在DMF(5mL)的溶液中。将该混合物在室温下搅拌20分钟。加入3-二甲基氨基-1-丙基氯化物盐酸化物(0.611g，3.87mmol，1.6当量)。将反应混合物加热至90℃，搅拌10小时，冷却，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。有机相用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)得到0.398g标题化合物，为不纯的褐色油状物，其不经进一步纯化直接使用：ESI-MS：377.1/379.0[M+H]+；TLC：Rf＝0.22(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)。
步骤31.2：4-[1-(4-溴-吡啶-2-基)-1-甲基-乙基]-苯酚
在氩气中将BBr3(1M的DCM溶液，23mmol，8当量)逐滴加入冷却的(0℃)4-溴-2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1-甲基-乙基]-吡啶(步骤31.3)(0.878g，2.87mmol)在DCM(42mL)的溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，加温至室温，搅拌18小时，冷却至0℃，并通过加入无水MeOH猝灭。浓缩该混合物，用6M的HCl水溶液稀释，搅拌1小时，中和至pH 7，并用DCM萃取。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。残余物不经纯化直接使用。
步骤31.3：4-溴-2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1-甲基-乙基]-吡啶
按照步骤1.4到1.7中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.4中，使用1，2-二氯乙烷(每mmol的吡啶-4-酮用4.3mL)作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌1小时，倒入饱和NaHCO3水溶液，并用DCM萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌23小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，将反应混合物在室温下搅拌21小时。在步骤1.7中，4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入2-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-丙酰氯(步骤27.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：306.0/308.0[M+H]+；tR＝3.94min(系统1)；TLC：Rf＝0.55(Hex/EtOAc，7∶3)。
实施例32：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-d 3 -甲基-环 丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中，并将所得混合物在120℃下搅拌1小时，用EtOAc/H2O稀释并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶4)。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌3小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入1-d3-甲基-环丁烷氯化物(步骤32.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：403.2[M+H]+；TLC：Rf＝0.22(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
步骤32.1：1-d 3 -甲基-环丁烷甲酰氯
按照步骤5.1中所述类似方法制备标题化合物，但使用1-d3-甲基-环丁烷甲酸，其按照[Cowling，S.J.；Goodby，J.W.，Chemical Communications，(2006)，(39)，4107-4109]中所述的方法制备，但使用d3-甲基-碘化物。
实施例33：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(1-d 3 -甲基-环丁基)- 吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。在步骤1.3中，使用N-噻唑-2-基-乙酰胺。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中。将所得混合物在120℃下搅拌7小时，用EtOAc/H2O稀释，经硅藻土垫过滤并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶4)。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌3小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入1-d3-甲基-环丁烷氯化物(步骤32.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：389.2[M+H]+；tR＝2.30min(系统1)；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1)。
实施例34：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-d 3 -甲基-5-[2-(1-甲基-环 丙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌8小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用2-乙酰氨基-4-d3-甲基-噻唑(步骤34.1)。将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.5中，将反应混合物在65-70℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，使用1-甲基-环丙烷甲酰氯(步骤5.1)。
标题化合物：ESI-MS：389.2[M+H]+；tR＝2.12min(系统1)；TLC：Rf＝0.35(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤34.1：2-乙酰氨基-4-d 3 -甲基-噻唑
将1-溴-丙烷-2-酮-d5[Challacombe，K.等人，Journal of the ChemicalSociety Perkin Trans.I，(1988)，2213-2218](1.25g，8.8mmol)和1-乙酰基-2-硫脲(1g，8.8mmol)在EtOH(20mL)中的混合物在85℃下搅拌2小时，冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，85∶15→1∶1)，得到1.08g标题化合物，为橙色固体：ESI-MS：160.0[M+H]+；TLC：Rf＝0.25(Hex/EtOAc，1∶1)。
实施例35：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-d 3 -甲基-5-[2-(2，2，2-三氟 -1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌8小时。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用2-乙酰氨基-4-d3-甲基-噻唑(步骤34.1)。将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
标题化合物：API-ES-MS：445.1[M+H]+；tR＝3.00min(系统1)；TLC：Rf＝0.51(DCM/MeOH，9∶1)。
实施例36：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-二甲基氨基甲基 -5-[2-(1-d 3 -甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌2小时。在步骤1.2中，使用N-{4-二甲基氨基甲基-5-[2-(1-d3-甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺(步骤36.1)。将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。
标题化合物：ESI-MS：446.1[M+H]+；TLC：Rf＝0.40(DCM/MeOH/NH3 aq，89∶10∶1)。
步骤36.1：N-{4-二甲基氨基甲基-5-[2-(1-d 3 -甲基-环丁基)-吡啶-4-基]- 噻唑-2-基}-乙酰胺
将N-{4-溴甲基-5-[2-(1-d3-甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺(步骤36.2)(150mg，0.391mmol)、二甲基胺盐酸化物(38.3mg，0.470mmol，1.2当量)和碳酸铯(293mg，0.900mmol，2.3当量)在DMF(2mL)中的混合物在室温下搅拌2小时，用EtOAc/H2O稀释，并用EtOAc萃取。有机相用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物在Et2O中研磨纯化，得到89mg标题化合物，为白色固体：ESI-MS：348.2[M+H]+。
步骤36.2：N-{4-溴甲基-5-[2-(1-d 3 -甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2- 基}-乙酰胺
将NBS(554mg，3.06mmol，1.1当量)加入N-{4-甲基-5-[2-(1-d3-甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺(步骤36.3)(846mg，2.78mmol)在CCl4(20mL)和CHCl3(16mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶4)得到572mg标题化合物，为浅黄色固体：ESI-MS：383.0/385.0[M+H]+；tR＝3.12min(系统1)；TLC：Rf＝0.45(Hex/EtOAc，1∶4)。
步骤36.3：N-{4-甲基-5-[2-(1-d 3 -甲基-环丁基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}- 乙酰胺
按照步骤1.3-1.7中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌1小时，并用EtOAc/H2O稀释猝灭。在步骤1.5中，将反应混合物在80℃下搅拌3小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.7中，4-甲氧基-3-丁烯-2-酮在THF中的溶液加入冷却的(-78℃)LiHMDS在THF中的溶液。30分钟后，加入1-d3-甲基-环丁烷氯化物(步骤32.1)在THF中的溶液，并将反应混合物历经16小时达到室温。
标题化合物：ESI-MS：305.2[M+H]+；TLC：Rf＝0.24(Hex/EtOAc，1∶4)。
实施例37：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-氯-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1- 二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
将4-氯-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基胺(步骤37.1)(100mg，0.311mmol)和光气(0.164mL，0.311mmol)在吡啶(2mL)中的混合物在105℃下搅拌1小时。加入L-脯氨酰胺(106mg，0.932mmol，3当量)。将所得混合物在105℃下搅拌30分钟，冷却，通过加入饱和NaHCO3溶液猝灭(100mL)，并用EtOAc萃取(2x100mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(100mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，99∶1→94∶6)得到46mg标题化合物，为黄色固体：ESI-MS：461.9[M+H]+；tR＝3.60min(系统1)；TLC：Rf＝0.28(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤37.1：4-氯-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2- 基胺
按照步骤1.2-1.7中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.2中，将反应混合物在85℃下搅拌3小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，使用N-(4-氯-噻唑-2-基)-乙酰胺(步骤37.2)。将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，将反应混合物在83℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
标题化合物：ESI-MS：322.1[M+H]+；tR＝3.58min(系统1)；TLC：Rf＝0.45(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤37.2：N-(4-氯-噻唑-2-基)-乙酰胺
将N-(4-氧代-4，5-二氢-噻唑-2-基)-乙酰胺(步骤37.3)(14.8g，94mmol)和POCl3(175mL，20当量)的混合物加热至105℃，搅拌15分钟，冷却并浓缩。将残余物倒在冰-H2O上，并用EtOAc萃取(2x100mL)。有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤(2x100mL)，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH，99∶1)得到13.9g标题化合物，为白色固体：ESI-MS：177.0[M+H]+；tR＝2.74min(系统1)；TLC：Rf＝0.66(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤37.3：N-(4-氧代-4，5-二氢-噻唑-2-基)-乙酰胺
将假乙内酰硫脲(16g，138mmol)和乙酸酐(16.9mL，179mmol，1.3当量)在吡啶(150mL)中的混合物加热至115℃，搅拌1小时并冷却。经过滤收集所得沉淀，得到12.64g标题化合物，为褐色固体：ESI-MS：159.0[M+H]+。
实施例38：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-氟甲基-5-[2-(2，2，2-三氟 -1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌18小时，通过用DCM/H2O稀释猝灭，并用DCM萃取。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌1小时，浓缩，且所得粗物质不经纯化直接使用。在步骤1.2中，使用N-{4-氟甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-乙酰胺(步骤38.1)。将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用DCM萃取。粗物质不经纯化。
标题化合物：ESI-MS：460.0[M+H]+；TLC：Rf＝0.44(DCM/MeOH/NH3 aq，91.5∶7.5∶1]
步骤38.1：N-{4-氟甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]- 噻唑-2-基}-乙酰胺
按照步骤1.3-1.7中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在步骤1.3中，使用N-(4-氟甲基-噻唑-2-基)-乙酰胺(步骤38.2)。将反应混合物在90℃下搅拌7小时，在100℃下搅拌5小时，并通过用EtOAc和H2O稀释猝灭。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤12.1)。
标题化合物：ESI-MS：362.1[M+H]+；tR＝4.18min(系统1)；TLC：Rf＝0.29(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤38.2：N-(4-氟甲基-噻唑-2-基)-乙酰胺
将1-氯-3-氟-丙烷-2-酮(步骤38.3)(1.14g，10.3mmol)和N-乙酰基-2-硫脲(1.22g，10.3mmol)在EtOH(10mL)中的混合物在回流下搅拌1.5小时，冷却并浓缩。将残余物溶于DCM/H2O，并用DCM萃取。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(Hex/EtOAc，1∶1)得到0.143g标题化合物：ESI-MS：173.1[M-H]-；tR＝1.98min(系统1)；TLC：Rf＝0.21(Hex/EtOAc，1∶1)。
步骤38.3：1-氯-3-氟-丙烷-2-酮
将1-氟-3-氯异丙醇(2.7mL，31.2mmol)缓慢加入装有30mL琼斯试剂(通过将230mL浓硫酸加入267g三氧化铬在700mL H2O的溶液中，并用H2O稀释至1L来制备)的冷却至5℃的烧瓶中。将反应混合物加温至室温，搅拌18小时，倒入饱和NaHCO3溶液中，并用Et2O萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM)，得到1.14g标题化合物，为不纯的黄色油状物。
实施例39：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(5-苯磺酰基氨基-6-氯- 吡啶-3-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。使用(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺](步骤39.2)和N-(5-溴-2-氯-吡啶-3-基)-苯磺酰胺(步骤39.1)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中，并将所得混合物在135℃下搅拌3小时，用EtOAc和H2O稀释，经硅藻土垫过滤并用EtOAc萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱及反相HPLC纯化。标题化合物：ESI-MS：519.0/521.1[M-H]-；tR＝3.33min(系统1)；TLC：Rf＝0.09(DCM/MeOH/NH3 aq，84∶15∶1)。
步骤39.1：N-(5-溴-2-氯-吡啶-3-基)-苯磺酰胺
在氩气中将苯磺酰氯(1.23mL，9.62mmol，2当量)在DCM(50mL)中的溶液历经15分钟逐滴加入3-氨基-5-溴-2-氯吡啶[Jouve，K.；Bergman，J.，Journal of Heterocyclic Chemistry，(2003)，40(2)，261-268](1g，4.81mmol)和吡啶(1.94ml，24mmol，5当量)在DCM(20mL)的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌20小时，浓缩，用H2O稀释，并用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM)得到163mg标题化合物，为白色固体：ESI-MS：346.9[M-H]-；tR＝4.33min(系统1)；TLC：Rf＝0.23(DCM)。
步骤39.2：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用咪唑-1-甲酸(4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺(步骤39.3)。将反应混合物在室温下搅拌18小时并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)，然后在Et2O中研磨。标题化合物：ESI-MS：253.2[M-H]-；TLC：Rf＝0.18(DCM/MeOH/NH3 aq，84∶15∶1)。
步骤39.3：咪唑-1-甲酸(4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺
按照步骤1.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-乙酰氨基-4-甲基噻唑，并将反应混合物在回流下搅拌5.5小时。
实施例40：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(5-苯磺酰基氨基-6-氯- 吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-酰胺}
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。使用(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-噻唑-2-基酰胺(步骤40.1)和N-(5-溴-2-氯-吡啶-3-基)-苯磺酰胺(步骤39.1)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中，并将所得混合物在120℃下搅拌6小时，浓缩，用DCM/MeOH稀释，经硅藻土垫过滤，并浓缩滤液。将残余物经硅胶柱色谱及反相HPLC纯化。标题化合物：ESI-MS：506.9[M+H]+；tR＝3.21min(系统1)。
步骤40.1：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-噻唑-2-基酰胺
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用咪唑-1-甲酸噻唑-2-基酰胺(步骤40.2)。将反应混合物在室温下搅拌18小时并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH/NH3 aq，94∶5∶1)，然后用EtOAc研磨。标题化合物：ESI-MS：239.2[M-H]-；TLC：Rf＝0.11(DCM/MeOH/NH3 aq，84∶15∶1)。
步骤40.2：咪唑-1-甲酸噻唑-2-基酰胺
按照步骤1.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用N-噻唑-2-基-乙酰胺，并将反应混合物在回流下搅拌5小时。
实施例41：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-氨基-5-三氟甲基-吡 啶-3-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。使用(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺](步骤39.2)和5-溴-3-三氟甲基-吡啶-2-基胺(WO2007095588)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中，并将所得混合物在120℃搅拌3小时，用DCM/H2O稀释，并用DCM萃取。干燥并浓缩有机相后，将残余物经硅胶柱色谱及反相HPLC纯化。标题化合物：ESI-MS：413.1[M-H]-；TLC：Rf＝0.27(DCM/MeOH/NH3 aq，89∶10∶1)。
实施例42：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙 基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
在室温下将咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺(4.0g)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(1.48g)和三乙胺(4.1ml)在DMF(46ml)的溶液中。将反应混合物在室温下放置22小时，蒸发，在用甲醇(60ml)和水(20ml)结晶后得到标题化合物，为白色固体。HPLC/MS：保留时间1.24分钟，M+H 387.1和M-H 385.2。
步骤42.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑 -2-基}-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(4.56g)加入4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺(10.5g)和三乙胺(4.28ml)在DMF(26ml)的溶液中，并随后在80℃下加热2小时。冷却后，经过滤分离标题化合物。
步骤42.2：4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺
将粉末的氢氧化钠(5.86g)加入N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(13g，如S.Wang等人J.Med.Chem.2004，47，1662-1675中所述制备)和1-甲基-环丙烷甲脒盐酸化物(7.2g，如EP0227415中所述制备)在2-甲氧基乙醇(98ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于125℃下加热1小时。将反应混合物冷却，加入水，经过滤分离标题化合物。ESI-MS：M+H 247和M-H 245。
实施例43：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-异丙基-嘧啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[5-(2-异丙基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(50mg)加入L-脯氨酰胺(19mg)和三乙胺(26μl)在DMF(152μl)的溶液中。将该混合物在40℃下搅拌2小时，并随后用制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流份用300mg的BondElut SPE、SCX柱捕获，并随后用7M的氨在甲醇(1ml)中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS：M+H 275和M-H 273。
步骤43.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰 胺
按照实施例42中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。
实施例44：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-苄基-嘧啶-4-基)-4-甲 基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-苄基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 423和M-H 421。
实施例45：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-乙基-嘧啶-4-基)-4-甲 基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-乙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 361和M-H 359。
实施例46：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-甲氧基甲基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-甲氧基甲基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 377和M-H 375。
实施例47：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2，6-二氯-苄基)-嘧啶 -4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(2，6-二氯-苄基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 491，493和M-H 489，491。
实施例48：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-异丁基-嘧啶-4-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-异丁基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 389和M-H 387。
实施例49：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(4-甲氧基-苯氧基甲 基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(4-甲氧基-苯氧基甲基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 469和M-H 467。
实施例50：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(3-甲氧基-苯氧基甲 基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(3-甲氧基-苯氧基甲基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS M-H 467。
实施例51：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4- 基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
在室温下将咪唑-1-甲酸{5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺(415mg)加入L-脯氨酰胺(137mg)和三乙胺(182μl)在DMF(1.1ml)的溶液中。将该混合物在40℃下搅拌18小时，蒸发并在甲醇(8ml)和水(2ml)中结晶，得到标题化合物，为白色固体。ESI-MS：M+H 427和M-H 425。
步骤51.1：咪唑-1-甲酸{5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2- 基}-酰胺
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。
实施例52：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-三氟甲基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将L-脯氨酰胺(9mg)加入咪唑-1-甲酸[5-(2-三氟甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(25mg)和三乙胺(12μl)在DMF(71μl)的溶液中。将该混合物在25℃下搅拌18小时，并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流份用300mg的BondElut SPE、SCX柱捕获，并随后用7M的氨在甲醇(1ml)中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS：M+H401和M-H 399。
步骤52.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-三氟甲基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}- 酰胺
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-三氟甲基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。
实施例53：(S)-吡咯烷-1，2-一甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1，1，2-三甲基- 丙基)-啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例51中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(1，1，2-三甲基-丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 417和M-H 415。
实施例54：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-[(5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1- 甲基-乙基]-嘧啶-4-基}-4-甲基-噻唑-2-基)-酰胺]
按照实施例51中所述类似的方法制备标题化合物，但使用5-{2-[1-(4-甲氧基-苯基)-1-甲基-乙基]-嘧啶-4-基}-4-甲基-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(2-氟-苯基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。E SI-MS：M+H 495和M-H 493。
实施例55：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-氟-1-氟甲基-1-甲 基-乙基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌15小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌2小时。在步骤1.4中，将反应混合物在85℃下搅拌30分钟，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在65℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酰氯(步骤55.1)。
标题化合物：ESI-MS：424.1[M+H]+；tR＝2.40min(系统1)；TLC：Rf＝0.35(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤55.1：3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酸(步骤55.2)。
步骤55.2：3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酸
按照步骤73.2中所述类似的方法制备标题化合物，但使用3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酸甲酯(制备WO 2007/053394)。ESI-MS：137.0[M-H]-。
实施例56：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1，1-二甲基- 丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(1，1-二甲基-丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 403和M-H 401。
实施例57：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-甲基-1-对 甲苯基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(1-甲基-1-对甲苯基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。E SI-MS：M+H 479和M-H 477。
实施例58：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(1-苯基-环戊 基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-(1-苯基-环戊基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。E SI-MS：M+H 477和M-H 475。
实施例59：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-环丙基-嘧啶 -4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例43中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-环丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-异丙基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 373和M-H 371。
实施例60：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-环丁基-嘧啶 -4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例52中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-甲基-5-[2-环丁基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-三氟甲基-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺。ESI-MS：M+H 387和M-H 385。
实施例61：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-d 9 -叔丁基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[5-(2-d9-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(0.82g)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(0.29g)和三乙胺(0.81ml)在DMF(5ml)的溶液中。将反应混合物在室温下放置22小时，随后蒸发，并用2∶1的甲醇：水结晶两次后得到标题化合物，为白色固体。HPLC/MS：保留时间1.27分钟，M+H 398.3和M-H 396.3。
步骤61.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-d9-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(0.77g)加入搅拌过的5-(2-d9-叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(1.11g)在DMF(4.3ml)的溶液中。随后将反应混合物在25℃下放置18小时，然后经过滤分离标题化合物。
步骤61.2：5-(2-d 9 -叔丁基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
将粉末氢氧化钠(3.71g)加入N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(5.51g)和d9-2，2-二甲基-丙脒盐酸化物(4.50g)在2-甲氧基乙醇(41ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于125℃下加热1小时。将反应混合物冷却，加入水，并经过滤分离粗产物。将粗产物经制备型HPLC纯化，并将包含标题化合物的流份在二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液之间分配。蒸发干燥过的二氯甲烷层之后得到标题化合物，为黄色固体。HPLC/MS：保留时间1.12分钟，M+H 258.4。
步骤61.3：d 9 -2，2-二甲基-丙脒盐酸化物
将2M的三甲基铝在甲苯(61ml)中的溶液逐滴加入用冰浴冷却的氯化铵(6.53g)在甲苯(46ml)的混悬液中。将反应混合物在室温下搅拌4小时，并加入d9-2，2-二甲基-丙酸丁酯(6.3g)。在80℃加热4天后，将反应混合物冷却至0℃，并逐滴加入甲醇(200ml)。在室温下搅拌并超声处理1小时后，将反应混合物经Hyflo过滤，用甲醇洗涤，并蒸发滤液，得到标题化合物，为灰白色固体。
步骤61.4：d 9 -2，2-二甲基-丙酸丁酯
将d9-叔丁基氯(5.0g)分批加入镁(1.50g)在四氢呋喃(20ml)的混悬液中，用催化量的碘活化，加热以保持稳定回流持续1小时。然后将反应混合物再加热1小时，以保证格氏试剂形成完全。随后将上述格氏试剂溶液逐滴加入用冰浴冷却的咪唑-1-甲酸丁酯(7.5g，如T.Werner和A.G.M.Barrett J.Org.Chem.2006，71，4302-4304中所述制备)在四氢呋喃(40ml)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时，加入水(200ml)，将该混合物经Hyflo过滤，滤液用乙醚萃取，并将乙醚层用硫酸钠干燥并蒸发，得到标题化合物。
实施例62：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2-甲基-环丙 基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
在室温下将咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(2-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺(50mg)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(18mg)和三乙胺(25μl)在DMF(147μl)的溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌2小时，并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流份用300mg的BondElut SPE、SCX柱捕获，并随后用7M的氨在甲醇(1ml)中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS：M+H 387和M-H 385。
步骤62.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(2-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑 -2-基}-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(487mg)加入4-甲基-5-[2-(2-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺(370mg)和三乙胺(251μl)在DMF(1.5ml)的溶液中，并随后在40℃下加热2小时。将反应混合物蒸发，并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
步骤62.2：4-甲基-5-[2-(2-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺
将粉末氢氧化钠(300mg)加入N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(1g，如S.Wang等人J.Med.Chem.2004，47，1662-1675中所述制备)和顺式/反式2-甲基-环丙烷甲脒盐酸化物(0.61g，如WO 03/087064中所述制备)在2-甲氧基乙醇(3.8ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于125℃下加热1小时。将反应混合物冷却，过滤，用水洗涤，得到标题化合物。MS：M+H 247和M-H 245。
实施例63(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-二乙基氨基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[5-(2-二乙基氨基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(40mg)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(14mg)和三乙胺(19μl)在DMF(147μl)的溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌2小时，并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流份用300mg的BondElut SPE、SCX柱捕获，并随后用7M的氨在甲醇(1ml)中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS：M+H 404和M-H 402。
步骤63.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-二乙基氨基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2- 基]-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(437mg)加入[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-嘧啶-2-基]-二乙基-胺(355mg)和三乙胺(207μl)在DMF(1.4ml)的溶液中，并随后在80℃下加热18小时。将反应混合物蒸发并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
步骤63.2：[4-(2-氨基-4-甲基-噻唑-5-基)-嘧啶-2-基]-二乙基-胺
将粉末氢氧化钠(150mg)加入N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(0.5g，如S.Wang等人J.Med.Chem.2004，47，1662-1675中所述制备)和1，1-二乙基胍(259mg)在2-甲氧基乙醇(1.9ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于125℃下加热1小时。将反应混合物真空浓缩，并经正相色谱纯化，洗脱剂；DCM/EtOAc，得到标题化合物。ESI-MS：M+H 264和M-H 262。
实施例64：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟 -1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)
在室温下将咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺(69mg)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(22mg)和三乙胺(53mg)在DMF(1ml)的溶液中。将反应混合物在室温下放置22小时，随后蒸发，并用甲醇(2ml)和水(1ml)结晶后得到标题化合物，为白色固体。HPLC/MS：保留时间1.80分钟，M+H 443.1和M-H 441.2。
步骤64.1：咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶 -4-基]-噻唑-2-基}-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(38mg)加入4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺(65mg)在DCM(1ml)和DMF(0.2ml)的溶液中，并随后在25℃下放置18小时。冷却后经过滤分离标题化合物。
步骤64.2：4-甲基-5-[2-(2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-噻唑 -2-基胺
将粉末氢氧化钠(0.42g)加入N′-[5-((E)-3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(0.93g，如S.Wang等人J.Med.Chem.2004，47，1662-1675中所述制备)和3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙脒盐酸化物(0.54g)在2-甲氧基乙醇(7ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于125℃下加热1小时。将反应混合物冷却，加入水，并将水层用10％甲醇的二氯甲烷溶液萃取4次。合并的有机层经反相色谱纯化，并将碳酸氢钠加入包含标题化合物的流份中，得到白色沉淀，其经过滤收集。HPLC/MS：保留时间1.47分钟，M+H 303.1。
步骤64.3：3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙脒盐酸化物
按照步骤61.3中所述方法合成标题化合物，并进行如下修改。使用3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酸丁酯代替d9-2，2-二甲基-丙酸丁酯，并将该混合物在80℃下搅拌3天。将粗产物溶于用少量HCl的EtOH溶液处理过的DCM中并蒸发。将残余物用DCM研磨，过滤并干燥，得到标题化合物，为灰白色固体。
步骤64.4：3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酸丁酯
将3，3，3-三氟-2，2-二甲基-丙酸(3.0g，19.2mmol)和一滴DMF溶于30mL的DCM中，并在室温下用草酰氯(1.85mL，21.1mmol)逐滴处理。2小时后，气体停止产生，并将该混合物用三乙胺(5.36mL，38.4mmol)、随后用正丁醇(2.1mL，23mmol)缓慢处理。将该混合物搅拌过夜，蒸发溶剂，并将残余物用己烷搅拌。滤出固体，并蒸发滤液得到褐-红色油状物。Kuge)rohr蒸馏(10毫巴，60-80℃炉温)，得到标题化合物，为无色液体。
实施例65(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(乙基-甲基-氨基)-嘧 啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
将(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-甲烷亚磺酰基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}(60mg)和N-乙基甲基胺(45mg)在密封的试管中于80℃下加热18小时。然后将粗产物用制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流份用300mg的BondElut SPE、SCX柱捕获，并随后用7M的氨在甲醇(1ml)中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS：M+H 390。
步骤65.1：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-甲烷亚磺酰基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在0℃下将间-氯过氧苯甲酸(0.50g)加入(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶-4-基)-噻唑-2-基]-酰胺}(1.7g)在二氯甲烷(8.5ml)的溶液中。1小时后将反应混合物蒸发，并经正相色谱纯化，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到标题化合物，为黄色固体。ESI-MS：M+H 395和M-H 393。
步骤65.2：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶 -4-基)-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶-4-基)-噻唑-2-基]-酰胺(1.0g)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(379mg)和三乙胺(0.51ml)在DMF(3ml)的溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌2小时，然后蒸发，用二氯甲烷和水沉淀后得到标题化合物，为橙色固体。ESI-MS：M+H 379和M-H377。
步骤65.3：咪唑-1-甲酸[4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶-4-基)-噻唑-2-基]- 酰胺
在室温下将羰基二咪唑(1.77g)加入4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶-4-基)-噻唑-2-基胺(1.3g)在三乙胺(0.84ml)和DMF(5.5ml)的溶液中，并在80℃下搅拌2小时。冷却后经过滤分离标题化合物。
步骤65.4：4-甲基-5-(2-甲基硫基-嘧啶-4-基)-噻唑-2-基胺
将粉末氢氧化钠(1.09g)加入N′-[5-(3-二甲基氨基-丙烯酰基)-4-甲基-噻唑-2-基]-N，N-二甲基-甲脒(2.0g，按照S.Wang等人J.Med.Chem.2004，47，1662-1675所述制备)和硫脲(0.57g)在乙醇(25ml)的溶液中，并将该混合物在搅拌中于回流下加热3小时。将反应混合物冷却至室温，并随后加入水和碘甲烷(0.47ml)。室温下1小时后，蒸发除去乙醇，并加入水，用2N的盐酸水溶液将pH调至7。经过滤得到标题化合物。ESI-MS：M+H239和M-H 237。
实施例66(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4- 甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(78mg)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(30mg)和三乙胺(83μl)在DMF(1ml)的溶液中。将反应混合物在室温下放置18小时，蒸发，并在用甲醇(1ml)和水(0，5ml)结晶后得到标题化合物，为黄/白色固体。HPLC/MS：保留时间1.40分钟，M+H 373.1和M-H 371.3。
步骤66.1：咪唑-1-甲酸[5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰 胺
在室温下将羰基二咪唑(74mg)加入5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(96mg)在DMF(2ml)的溶液中，并在室温下放置18小时。将反应混合物过滤，用二氯甲烷洗涤，得到标题化合物。
步骤66.2：5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
在室温下将浓盐酸(0.4ml)加入N-[5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(120mg)在乙醇(9ml)的溶液中，并将该混合物在回流下加热18小时。将冷却的反应混合物蒸发，用碳酸氢钠水溶液中和，并用10％甲醇的DCM溶液萃取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发，得到标题化合物。HPLC/MS：保留时间0.93分钟，M+H 233.3。
步骤66.3：N-[5-(6-环丙基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺
在室温下将氩气鼓入2-环丙基-6-氯吡嗪(154mg，按照A.Fiirstner等人J.Am.Chem.Soc.2002，214，13856-13863的方法制备)、2-乙酰氨基-4-甲基噻唑(200mg)、乙酸钯(24mg)、三叔丁基四氟硼酸盐(61mg)和碳酸铯(678mg)在DMF(3ml)的混合物中持续5分钟。将反应混合物在密封小瓶内在氩气中于150℃下在Biotage InitiatorTM微波设备中加热45分钟。将反应混合物过滤，并经制备型HPLC纯化。将包含标题化合物的流份合并，并蒸发除去乙腈，经过滤得到标题化合物，为浅褐色固体。HPLC/MS：保留时间1.65分钟，M+H 275.3。
实施例67(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[4-甲基-5-(5-三氟甲基-吡啶 -3-基)-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将羰基二咪唑(29mg)加入搅拌过的4-甲基-5-(5-三氟甲基-吡啶-3-基)-噻唑-2-基胺(42mg)和三乙胺(50μl)在DMF(1ml)的溶液中，并将该混合物在室温下放置18小时。加入L-脯氨酰胺(20mg)，并将反应混合物在室温下再放置8小时，蒸发，并在用甲醇(3ml)和水(1.5ml)结晶后得到标题化合物，为白色固体。ESI-MS：M+H 400。
步骤67.1：4-甲基-5-(5-三氟甲基-吡啶-3-基)-噻唑-2-基胺
在室温下将三甲基硅烷基氯化物(0.3ml)加入N-[4-甲基-5-(5-三氟甲基-吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-乙酰胺(44mg)在乙醇(2ml)的溶液中，并将该混合物在室温下搅拌4.5小时。然后将反应物在50℃加热18小时，冷却，蒸发，并在用乙醚研磨后经过滤得到标题化合物。
步骤67.2：N-[4-甲基-5-(5-三氟甲基-吡啶-3-基)-噻唑-2-基]-乙酰胺
在室温下将氩气鼓入5-(三氟甲基)-3-吡啶基硼酸盐酸化物(263mg，如WO 2007/134828中所述制备)、2-乙酰氨基-5-碘-4-甲基噻唑(260mg，如WO 2006/125807中所述制备)、1，1′-二-(二苯基膦基)-二茂铁二氯化钯(II)(38mg)、碳酸钠(488mg)在DME(2.3ml)的溶液和水(2.3ml)的混合物中持续5分钟。将反应混合物在密封小瓶内在氩气中于80℃下在BiotageInitiatorTM微波设备中加热30分钟，并随后在80℃下加热60分钟。冷却后将反应混合物用DCM萃取，用硅胶蒸发合并的有机层，并经正相色谱纯化(洗脱剂；从DCM到DCM：乙酸乙酯1∶1梯度洗脱)。随后将包含产物的流份用甲醇(5ml)、DMF(0.3ml)和水(1.3ml)研磨并过滤，得到标题化合物，为浅褐色固体。
实施例68(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-d 10 -二乙基氨基-吡嗪 -2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
在室温下将咪唑-1-甲酸[5-(6-d10-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺(82mg)加入搅拌过的L-脯氨酰胺(28mg)和三乙胺(78μl)在DMF(1ml)的溶液中。将反应混合物在室温下放置14小时，蒸发，并在用甲醇(1ml)和水(0.5ml)结晶后得到标题化合物，为黄/白色固体。HPLC/MS：保留时间1.41分钟，M+H 414.2和M-H 412.3。
步骤68.1：咪唑-1-甲酸[5-(6-d 10 -二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑 -2-基]-酰胺
在室温下将羰基二咪唑(78mg)加入5-(6-d10-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺(121mg)在DMF(2ml)的溶液中，并在室温下放置3.5小时。将反应混合物过滤，用二氯甲烷洗涤，得到标题化合物。
步骤68.2：5-(6-d 10 -二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
在室温下将浓盐酸(0.4ml)加入N-[5-(6-d10-二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺(140mg)在乙醇(9ml)的溶液中，并将该混合物在回流下加热40小时。将该冷却的反应混合物蒸发，用碳酸氢钠水溶液中和，并用10％甲醇的DCM溶液萃取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发，得到标题化合物。HPLC/MS：保留时间1.17分钟，M+H 274.4。
步骤68.3：N-[5-(6-d 10 -二乙基氨基-吡嗪-2-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰 胺
将氩气鼓入2-d10-二乙基氨基-6-氯吡嗪(293mg)、2-乙酰氨基-4-甲基噻唑(300mg)、乙酸钯(24mg)、三叔丁基四氟硼酸盐(61mg)和碳酸铯(1.02g)在DMF(3ml)的混合物中持续5分钟。将反应混合物在密封的小瓶内在氩气中于150℃下在Biotage InitiatorTM微波设备中加热45分钟，过滤并经制备型HPLC纯化。将包含标题化合物的流份合并，并蒸发除去乙腈，经过滤得到标题化合物，为浅褐色固体。HPLC/MS：保留时间1.68分钟，M+H 316.3。
步骤68.4：2-d 10 -二乙基氨基-6-氯吡嗪
在室温下将d10-二乙基胺(0.5g)加入搅拌过的2，6-二氯吡嗪(0.93g)和碳酸钾(1.41g)在乙腈(4ml)的溶液中。随后将反应混合物在55℃下加热60小时，冷却，加入水并随后用二氯甲烷萃取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥，蒸发并经正相色谱纯化，用DCM洗脱，得到标题化合物。HPLC/MS：保留时间2.10分钟，M+H 196.4和198.4。
实施例69(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(6-二乙基氨基-吡嗪-2- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例68中所述类似的方法制备标题化合物，但使用二乙基胺代替d10-二乙基胺。HPLC/MS：保留时间1.43分钟，M+H 404.2和402.3。
实施例70：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-环丙基甲基-嘧啶-4- 基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例42中所述类似的方法制备标题化合物，但使用咪唑-1-甲酸[5-(2-环丙基甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺代替咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺。M.p.220-222℃，ESI-MS[M+H]+387.1，TLC：Rf＝0.2(DCM/EtOH 95∶5)
步骤70.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-环丙基甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2- 基]-酰胺
按照步骤42.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用5-(2-环丙基甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺，并将反应物搅拌15小时。M.p.240-243℃，ESI-MS[M+H]+305.1，TLC：Rf＝0.35(DCM/EtOH 95∶5)。
步骤70.2：5-(2-环丙基甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
按照步骤42.2中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-环丙基-乙脒盐酸化物代替1-甲基-环丙烷甲脒盐酸化物。M.p.198-200℃，ESI-MS[M+H]+247.1，TLC：Rf＝0.25(DCM/EtOH 95∶5)。
实施例71：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙 基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例42中所述类似的方法制备标题化合物，但使用咪唑-1-甲酸{5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺代替咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺。M.p.187-190℃，ESI-MS[M+H]+407.1，TLC：Rf＝0.3(DCM/EtOH 95∶5)
步骤71.1：咪唑-1-甲酸{5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基 -噻唑-2-基}-酰胺
按照步骤42.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺，并将反应物在80℃下搅拌16小时。
步骤71.2：5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基胺
按照步骤42.2中所述类似的方法制备标题化合物，但使用3-氟-2，2-二甲基-丙脒盐酸化物代替1-甲基-环丙烷-甲脒盐酸化物。ESI-MS[M+H]+267.1，TLC：Rf＝0.4(DCM/EtOH 95∶5)。
实施例72：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-{[5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶 -4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺}
按照实施例42中所述类似的方法制备标题化合物，但使用咪唑-1-甲酸[5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-酰胺代替咪唑-1-甲酸{4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺。M.p.197-199℃，ESI-MS[M+H]+403.1，TLC：Rf＝0.3(DCM/EtOH 95∶5)
步骤72.1：咪唑-1-甲酸[5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2- 基]-酰胺
按照步骤42.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺代替4-甲基-5-[2-(1-甲基-环丙基)-嘧啶-4-基]-噻唑-2-基胺，并将反应物搅拌16小时。ESI-MS[M-H]-355.2。
步骤72.2：5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基胺
按照步骤1.2中所述类似的方法制备标题化合物，但使用N-[5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺代替N-[5-(2-叔丁基-吡啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰胺，并使用2N HCl。将反应混合物在室温下搅拌16小时，并随后在90℃下搅拌3小时。ESI-MS[M+H]+263.1。
步骤72.3：N-[5-(2-叔丁基-6-甲基-嘧啶-4-基)-4-甲基-噻唑-2-基]-乙酰 胺
按照步骤1.3中所述类似的方法制备标题化合物，但使用4-溴-2-叔丁基-6-甲基-嘧啶代替4-溴-2-叔丁基-吡啶。ESI-MS[M+H]+305.2。
步骤72.4：4-溴-2-叔丁基-6-甲基-嘧啶
按照步骤1.4中所述类似的方法制备标题化合物，但使用2-叔丁基-6-甲基-3H-嘧啶-4-酮代替2-叔丁基-1H-吡啶-4-酮。ESI-MS[M+H]+229/231.0。TLC：Rf＝0.58(己烷/DCM 7∶3)
实施例73：(S)-吡咯烷-1，2-二甲酸2-酰胺1-({5-[2-(2-氟-1，1-二甲基-乙 基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-2-基}-酰胺)
按照实施例1中所述类似的方法制备标题化合物，但进行如下修改。在实施例1中，将反应混合物在室温下搅拌6小时。在步骤1.1中，将反应混合物在回流下搅拌15小时。在步骤1.2中，将反应混合物在100℃下搅拌1小时，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.3中，将反应混合物在120℃下搅拌4小时。在步骤1.4中，将反应混合物在85℃下搅拌30分钟，并在猝灭后用EtOAc萃取。在步骤1.5中，将反应混合物在70℃下搅拌1小时，不进行在MeOH中的研磨。在步骤1.6中，粗产物不再纯化。在步骤1.7中，使用3-氟-2，2-二甲基-丙酰氯(步骤76.1)。
标题化合物：ESI-MS：406.1[M+H]+；tR＝2.20min(系统1)；TLC：Rf＝0.47(DCM/MeOH，9∶1)。
步骤73.1：3-氟-2，2-二甲基-丙酰氯
按照步骤5.1中所述类似的方法制备标题化合物，但使用3-氟-2，2-二甲基-丙酸(步骤73.2)。
步骤73.2：3-氟-2，2-二甲基-丙酸
将6.9g(38.6mmol)3-氟-2，2-二甲基-丙酸甲酯在30mL甲醇中的溶液用38.6mL(77mmol)的2N NaOH处理，并将该混合物加热至回流持续3小时。将该混合物冷却至室温，并蒸发溶剂。将残余物在水和DCM之间分配。将水相通过加入50mL的2N HCl酸化，并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发。无色残余物用己烷搅拌，过滤除去不溶物，蒸发滤液得到标题化合物，为无色固体。ESI-MS：119.0[M-H]-。
步骤73.3：3-氟-2，2-二甲基-丙酸甲酯
将27mL的1M四丁基氟化铵在THF中的溶液在冰冷却下缓慢加入7.25g(27.4mmol)的2，2-二甲基-3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸甲酯在150mL的THF中的溶液。将所得溶液在0℃下搅拌6小时，并随后在室温下搅拌10小时。小心蒸发溶剂，并将残余物在DCM和盐水之间分配。将有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并小心蒸发。将褐色油状物在Kugelrohr炉(炉温120-150℃)中蒸馏，得到标题化合物，为无色液体。
步骤73.4：2，2-二甲基-3-三氟甲磺酰基氧基-丙酸甲酯
在-70℃下在氩气中向3.64g(27.5mmol)3-羟基-2，2-二甲基-丙酸甲酯和4.82mL(41.3mmol)2，6-二甲基吡啶在50mL无水DCM的溶液中缓慢加入三氟甲磺酸酐(5.12mL，30.3mmol)。将该黄色溶液在-70℃下搅拌5分钟，随后移去冷却浴，并将该混合物在室温下搅拌3小时。颜色从黄色变为橙色再变为褐色。加入DCM(50mL)，并将该溶液用2N HCl洗涤两次，用硫酸钠干燥并蒸发至干。将该褐色残余物真空干燥，且该标题化合物不经进一步纯化直接使用。TLC：Rf＝0.72(EtOAc/己烷1∶2)。
分析型HPLC条件：
5分钟内线性梯度20-100％溶剂A+1.5分钟100％溶剂A；在215nm检测，流速1mL/min，于30℃下。柱：Nucleosil 100-3C18(70x4.0mm)。溶剂A＝CH3CN+0.1％TFA；溶剂B＝H2O+0.1％TFA。
MS条件：
仪器：Micromass Platform II，洗脱剂：15％甲醇水溶液，包含0.2％的25％氢氧化铵溶液。
1 H-NMR波谱在Varian Mercury 400波谱仪上在指定溶剂中检测。缩写：br：宽；s：单峰；d：双峰；t：三重峰；q：四重峰；ppm：百万分之
HPLC/MS条件：
仪器：Hewlett Packard Agilent 1100系列，柱：XBridgeTM C182.5微米，3.0X 30mm，温度：50℃，洗脱剂：2通道系统：通道A 5％乙腈的水溶液，通道B包含1.0％甲酸的乙腈
检测：Agilent 1100DAD 210-350nm和Waters Micromass ZQ 2000ESI+和ESI-。
制备型HPLC：
仪器：Gilson制备型HPLC系统，柱：SunfireTM Prep C18OBDTM 5微米，30X 100mm，温度：25℃，洗脱剂：20分钟内，在0.05％三氟乙酸水溶液中的5-100％乙腈梯度，流速：30ml/分钟，检测：UV 254nm。
缩写和首字母缩写：
实施例A：作为PI3激酶抑制剂的效能
PI3K KinaseGlo试验：将50nL化合物稀释液分配在黑色384孔小体积非结合苯乙烯(NBS)板(卡西达(Costar)公司，目录号NBS#3676)上。将作为10mg/ml溶液(在甲醇中)提供的L-a-磷脂酰肌醇(PI)转移到玻璃管中，在氮气流下干燥。然后通过涡旋将其重新混悬在3％辛基葡糖苷(OG)中，于4℃贮存。KinaseGlo发光激酶检测试剂盒(普洛麦格(Promega)公司，麦迪逊/WI，美国)是通过对在激酶反应后溶液中剩余的ATP的量进行定量来测定激酶活性的均一的HTS方法。
加入5μL PI/OG与PI3K亚型的混合物(表1)。加入5μl ATP混合物(在10μL终体积中含有10mM TRIS-HCl pH7.5、3mM MgCl2、50mM NaCl、0.05％CHAPS、1mM DTT和1μM ATP)使激酶反应开始，这些反应于室温进行。用10μl KinaseGlo使反应终止，10分钟后在Synergy2读数器中使用0.1秒/孔的积分时间对板进行读数。将2.5μM全种类1PI3激酶抑制剂(标准品)加入到试验板中，产生对激酶反应的100％抑制，溶剂载体(90％DMSO，在水中)给出了0％抑制。使用标准品作为参考化合物，并且在所有试验板中以16个稀释点的形式包括标准品，一式两份。
表1使用KinaseGlo的PI3K：试验条件和试剂方案
PI3K的克隆
PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ构建体是p85αiSH2结构域与各自的p110同工型的融合体。通过PCR、由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的RNA产生)按照下述方法产生了p85α片段和p110同工型基因。PI3Kγ构建体获自罗杰·威廉斯(Roger Williams)实验室(分子生物学MRC实验室，剑桥，英国)(2003年11月)，并且有描述(Pacold，MichaelE.；Suire，Sabine；Perisic，Olga；Lara-Gonzalez，Samuel；Davis，Colin T.；Walker，Edward H.；Hawkins，Phillip T.；Stephens，Len；Eccleston，JohnF.；Williams，Roger L.Crystal structure and functional analysis of Rasbinding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)，103(6)，931-943)。
PI3Kα构建体和蛋白质
PI3Kαwt   BV1075   p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-His
BV1075：用于杆状病毒BV-1075的构建体由三部分连接物产生，所述的三部分连接物由克隆到载体pBlueBac4.5中的p85片段和p110α片段组成。p85片段获自用Nhe/Spe消化的质粒p1661-2。获得的p110α片段是克隆，其通过测序被证实并且作为SpeI/HindIII片段用在LR410中。为了产生杆状病毒表达载体LR410，使用Gateway LR反应将插入物转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(英杰(Invitrogen)公司)载体中。将克隆载体pBlueBac4.5(英杰公司)用Nhe/HindIII消化。这产生了构建体PED 153.8。通过PCR、使用作为模板的ORF 318(上文所述)以及一个正向引物KAC1028(5’-GCTAGCATGCGAGAATATGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID NO：1)和两个反向引物KAC1029：(5’-GCCTCCACCAC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ IDNO：2)和KAC1039(5′-TACTAGTC-CGCCTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID NO：3)产生了p85组分(iSH2)。两个反向引物重叠，将12×Gly连接子和p110α基因的N-末端序列引入SpeI位点。12×Gly连接子取代了BV1052构建体中的一个Gly连接子。PCR片段被克隆到pCR2.1TOPO(英杰公司)中。在所得克隆中，通过测序确定了p1661-2是正确的。将该质粒用Nhe和SpeI消化，将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。
通过将克隆LR410(见上)用Spe I和HindIII进行酶消化而产生了p110α克隆片段。SpeI位点在p110α基因的编码区内。将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。通过用Nhe和HindIII进行酶消化而制得克隆载体pBlueBac4.5(英杰公司)。将切割的载体用凯杰公司(Qiagen)柱进行纯化，然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)(生物实验室公司(BioLabs))脱磷酸。CIP反应完成后，将切割的载体再次进行柱纯化，产生最终载体。使用罗氏公司(Roche)快速连接酶和销售商说明书进行了三部分连接。通过测序证实了最终质粒。
激酶结构域。
BV 1075的蛋白质序列：
   1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
  61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG
 121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
 181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
 241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
 301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
 361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
 421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
 481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
 541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV
 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQID NO：4)
PI3Kβ构建体和蛋白质
PI3Kβ   BV949   p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-His
BV949：通过重叠PCR产生和融合了用于p85PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ亚基的inter SH2结构域(iSH2)以及用于全长p110β亚基的PCR产物。由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的人RNA(克隆技术公司(Clontech)产生)，起初使用引物gwG130-p01(5’-CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO：5)和gwG130-p02(5’-TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’)(SEQ ID NO：6)获得了iSH2PCR产物。随后，在第二次PCR反应中，分别在p85iSH2片段的5’端和3’端、使用引物gwG130-p03(5-GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO：7)和gwG130-p05(5’-ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID NO：8)加入Gateway重组AttB1位点和连接子序列。通过PCR、使用作为模板的p110β克隆(来自未知来源，其序列已被证实)，使用含有连接子序列和p110β的5’端的引物gwG130-p04(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATAATGCCTCCTGCT -3’)(SEQ ID NO：9)和含有与组氨酸标记融合的p110-β的3’端序列的gwG130-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’)(SEQ ID NO：10)得到了p110β片段。通过重叠PCR、在iSH2片段的3’端和p110β片段的5’端进行的连接子反应，使用上述gwG130-p03引物以及含有重叠的组氨酸标记和AttB2重组序列的引物：(5’-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCC-3’)(SEQ ID NO：11)组建了p85-iSH2/p110β融合蛋白。该终产物在Gateway(英杰公司)OR反应中被重组到供体载体pDONR201(英杰公司)中，产生ORF253输入克隆。通过测序证实了该克隆，其用于Gateway LR反应(英杰公司)，使插入物转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(英杰公司)载体中，以产生杆状病毒表达载体LR280。该LR280具有p85序列中的氨基酸突变。
激酶结构域。
BV949的蛋白质序列：
   1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK
  61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI
 121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY
 181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI
 241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE
 301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY
 361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR
 421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK
 481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE FDINICDLPR MARLCFAVYA VLDKVKTKKS TKTINPSKYQ
 541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF DFKGQLRTGD IILHSWSSFP DELEEMLNPM GTVQTNPYTE
 601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP PFDKIIEKAA EIASSDSANV SSRGGKKFLP VLKEILDRDP
 661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR EIFPQSLPKL LLSIKWNKLE DVAQLQALLQ IWPKLPPREA
 721 LELLDFNYPD QYVREYAVGC LRQMSDEELS QYLLQLVQVL KYEPFLDCAL SRFLLERALG
 781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA VSVQFGVILE AYCRGSVGHM KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI
 841 KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL KQSAYREALS DLQSPLNPCV ILSELYVEKC KYMDSKMKPL
 901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN GDDLRQDMLT LQMLRLMDLL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD
 961 RSGLIEVVST SETIADIQLN SSNVAAAAAF NKDALLNWLK EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA
1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM VKKTGQLFHI DFGHILGNFK SKFGIKRERV PFILTYDFIH
1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC EDAYLILRRH GNLFITLFAL MLTAGLPELT SVKDIQYLKD
1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD EALRESWTTK VNWMAHTVRK DYRSGAHHHH HHGA
(SEQ ID NO：12)
激酶结构域。
PI3Kγ构建体和蛋白质
PI3Kγ   BV950   p110γ(Δ143-[Met144-1102])-His
构建体获自罗杰·威廉斯实验室(分子生物学MRC实验室，剑桥，英国)(2003年11月)。构建体在(Pacold，Michael E.；Suire，Sabine；Perisic，Olga；Lara-Gonzalez，Samuel；DaVis，Colin T.；Walker，Edward H.；Hawkins，Phillip T.；Stephens，Len；Eccleston，John F.；Williams，Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)，103(6)，931-943)中有描述。构建体缺少N-末端144氨基酸。
BV950的蛋白质序列：
  1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV
 61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP
121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE
181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF
241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS
301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL
361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD
421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL
481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL
541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML
601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK
661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL
721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ
781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER
841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL
901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA
961 HHHHHH
(SEQ ID NO：13)
PI3Kδ构建体和蛋白质
PI3Kδ   BV1060   p55iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-His
BV1060：通过重叠PCR产生和融合了用于p85亚基的inter SH2结构域(iSH2)以及用于全长p110δ亚基的PCR产物。通过使用作为模板的ORF318(见上)以及引物gwG130-p03(5’-GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’)(SEQ ID NO：7)和gwG154-p04(5’-TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC-3’)(SEQ ID NO：14)产生iSH2PCR产物。由第一链cDNA(通过RT-PCR由市售的来自胎盘、睾丸和脑的人RNA(克隆技术公司)产生)、首先使用引物gwG154-p01(5’-ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’)(SEQ ID NO：15)和gwG154-p02(5’-CTACTGCCTGT-TGTCTTTGGACACGT-3’)(SEQ ID NO：16)获得p110δ片段。在随后PCR反应中，分别在p110δ片段的5’端和3’端、用引物gw154-p03(5’-ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCC CTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’)(SEQ ID NO：17)和gwG154-p06(5’-AGCTCCGTGATGGTGATGGTGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’)(SEQ ID NO：18)加入连接子序列和组氨酸标记。在第三次PCR反应中，通过iSH2片段的3’端和p110δ片段的5’端的重叠连接子、使用以上提到的gwG130-p03引物以及含有重叠的组氨酸标记和Gateway(英杰公司)AttB2重组序列的引物(5’-GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGTGAGTGCTCC-3’)(SEQ ID NO：19)组装了p85-iSH2/p110δ融合蛋白。该终产物在Gateway OR反应中被重组到供体载体pDONR201(英杰公司)中，产生ORF319输入克隆。通过测序证实了该克隆，其用于Gateway LR反应(英杰公司)中，使插入物转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(英杰公司)载体中，以产生杆状病毒表达载体LR415。
BV1060的蛋白质序列：
   1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
  61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD
 121 CPMEFWTKEE NQSVVVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE
 181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH
 241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP
 301 NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR
 361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI
 421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC
 481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF
 541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP
 601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL
 661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD
 721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL
 781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE
 841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ
 901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA
 961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ
1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI
1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES
1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH
(SEQ ID NO：20)
PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ构建体的纯化
以两个色谱步骤纯化了PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kγ：在Ni琼脂糖树脂(通用电气公司医疗保健部(GE Healthcare))上进行固定化金属亲和层析(IMAC)以及采用Superdex 20026/60柱(通用电气公司医疗保健部)进行凝胶过滤。将所有缓冲液冷却至4℃，在冰上冷却下进行裂解。于室温进行柱分级分离。除了以下描述的那些外，用于纯化PI3Kβ的所有缓冲液还含有0.05％Triton X100。
通常，将来自10L Tn5细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在“裂解缓冲液”(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，5mM咪唑，1mM NaF，0.1ug/mL冈田酸(OAA)，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA(20片/1L缓冲液，罗氏应用科学公司(Roche Applied Sciences))，benzonase(25U/mL缓冲液，EMD生物科学公司(EMD Biosciences))(片状物(pellet)与裂解缓冲液的比例为1：6v/v))中，通过使用紧密契合的研棒冲击20次而进行机械裂解。于45,000g将裂解物离心30分钟，将上清液装到预平衡的IMAC柱上(3mL树脂/100mL裂解物)。将柱用3-5个柱体积的裂解缓冲液冲洗，然后用3-5个柱体积的20mM Tris-Cl，pH7.5，500mMNaCl，5％甘油，45mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行第二次冲洗。将蛋白质用20mMTris-Cl，pH7.5，0.5M NaCl，5％甘油，250mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mLOAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行洗脱。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。通过在Superdex20026/60柱(用20mM Tris-Cl，pH7.5，0.5M NaCl，5％甘油，1mM NaF，5mM DTT，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行平衡)上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将等体积的透析缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，50％甘油，5mM NaF，5mM DTT)加入到合并物中，然后通过透析缓冲液进行透析，其间更换两次(一次更换过夜)。将蛋白质于-20℃贮存。
PI3Kδ的纯化
以三个色谱步骤纯化了PI3Kδ：在Ni琼脂糖树脂(通用电气公司医疗保健部)上进行固定化金属亲和层析，采用Superdex 20026/60柱(通用电气公司医疗保健部)进行凝胶过滤，最后在Q-HP柱(通用电气公司医疗保健部)上进行离子交换步骤。将所有缓冲液冷却至4℃，在冰上冷却进行裂解。于室温进行柱分级分离。
通常，将来自10L Tn5细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在“裂解缓冲液”(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，5mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL冈田酸(OAA)，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA(20片/1L缓冲液，罗氏应用科学公司)，benzonase(25U/mL裂解缓冲液，EMD生物科学公司)(片状物与裂解缓冲液的比例为1∶10v/v))中，通过使用紧密契合的研棒冲击20次进行机械裂解。于45,000g将裂解物离心30分钟，将上清液装到预平衡的IMAC柱上(5mL树脂/100mL裂解物)。将柱用3-5个柱体积的裂解缓冲液冲洗，然后用3-5个柱体积的20mMTris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，40mM咪唑，1mM NaF，0.1ug/mLOAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行第二次冲洗。将蛋白质用20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，250mM咪唑，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM BME，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行洗脱。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。通过在Superdex 200(用20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，5％甘油，1mM NaF，0.1ug/mL OAA，5mM DTT，1×完全蛋白酶抑制剂混合物-不含EDTA进行平衡)上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将这些流分用“缓冲液A”(20mM Tris-Cl，pH8.2，5％甘油，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM DTT)稀释(合并物体积与缓冲液的比例为1∶10v/v)，装到制备的Q-HP柱上。样品装载完成后，我们用3-5个柱体积的缓冲液A和5％“缓冲液B”(20mMTris-Cl，pH8.2，1M NaCl，5％甘油，1mM NaF，0.1ug/mL OAA，5mM DTT)进行了冲洗。我们使用缓冲液B的5％-30％梯度洗脱了蛋白质。通常，以～200mM NaCl洗脱出蛋白质。将有关流分通过SDS-PAGE进行分析，从而将其合并。将等体积的透析缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.5，500mM NaCl，50％甘油，1mM NaF，0.1μg/mL OAA，5mM DTT)加入到合并物中，然后通过透析缓冲液进行透析，其间更换两次(一次更换过夜)。将蛋白质于-20℃贮存。
使用上述试验得到以下结果。
本发明化合物，特别是本发明优选的化合物对PI3Kα相对于β和/或δ和/或γ亚型(例如在生化实验中检测的亚型)而言显示出增强的选择性。如细胞实验中所检测的，这些化合物还优选地对PI3Kα相对于β和/或δ和/或γ亚型而言显示出选择性。
实施例B：体外代谢清除率检测
缩写
最终的检品和蛋白浓度以及孵育时间如下所示(表1)。选择低检品浓度以符合下述假设：在低于(或约等于)Km的浓度下评价反应动力学。
已知DMSO对CYP活性有抑制作用。因此，在孵育介质中的DMSO浓度被限制为0.01％(v/v)，以使其对代谢过程的干扰最小化。
表1在代谢清除孵育液中的最终的反应组分和浓度
a用来重建UGT(尿苷5’二磷酸葡糖醛酸基转移酶)活性所需的最佳成分。
通常的试验在96孔板上在37℃振荡孵育下进行。体外代谢清除速率根据在4个时间点(例如0、5、15和30分钟)在含有辅因子(NADPH和/或UDPGA)的反应中收集的数据获得。还进行了30分钟的阴性对照孵育(不含辅因子)来评价与CYP不相关的稳定性问题(例如化学不稳定性、不依赖CYP的代谢)。
一般而言，在10mM DMSO中的检品被0.6％ACN(v/v)的DiH2O溶液1∶1000倍稀释到10μM。在即将开始试验之前，将1.25mg/mL的微粒体蛋白悬浮在50mM KPi中。为了评价UGT-介导的代谢，悬浮液可以首先在冰上用阿拉霉素(25μg/mg微粒体蛋白)孵育5分钟来进行预处理。将检品(35μL)加入140μL的微粒体混悬液中得到175μL酶-底物混合物。该酶-底物混合物在37℃预孵育15分钟。通过将25μL酶-底物混合物与等体积的含有4mM MgCl2的50mM KPi合并来进行30分钟的阴性对照孵育。在37℃孵育30分钟后，向混合物加入50μL含有MS内标(2μM阿普洛尔)的ACN来猝灭。T＝0分钟的时间点通过将25μL酶-底物混合物直接与50μL含有MS内标(2μM阿普洛尔)的ACN合并来进行。将25μL的辅因子加入(2mM NADPH，在50mM KPi中，添加4mM MgCl2；任选含有2mM UDPGA用于CYP+UGT测定)，以刺激完全猝灭的反应混合物。
对其余时间点的全部反应，通过将125μL辅因子溶液(2mM NADPH，在50mM KPi中，添加4mM MgCl2)加入到剩余125μL酶-底物混合物中。对于UGT代谢，辅因子溶液中包含2mM UDPGA。在特定的反应时间点(例如5、15、30分钟)上，取出反应的等份试样(50μL)，并加入含有质谱内标(2μM阿普洛尔)的乙腈(50μL)来终止反应。所有样品都在～3400xg、在4℃下离心10分钟，上清液用LC-MS/MS分析，对剩余的检品进行定量。剩余的TA相对于0分钟的百分比被用来估计体外消除速率常数(kmic)，该常数可用于计算体外代谢清除率。
在高效液相色谱-串联质谱(LC/MS)系统上进行样品分析，该系统包括Waters Quattro Premiere质谱仪、ESI离子源、CTC-HTS Pal自动进样器和安捷伦LC泵。样品在Atlantic C18柱(2.1x30mm，3.5微米)上分离，使用表2中所概述的快速流动相。流动相A由含有10mM甲酸铵的纯水组成。流动相B由含有0.01％甲酸的乙腈组成。流速为1mL/min。进样体积为10μL。最初30秒的洗脱液被弃去，用于样品净化。化合物使用软件MassLynx/QuanLynx检测，其收集所有与供试化合物分子量相关的碎片的强度数据。在收集原始数据后，如果需要，该软件可将最多3个质量碎片的曲线合并。通常，对最大强度的碎片峰进行积分。
表2HPLC的流动相梯度
每个微粒体消除速率kmic是基于单峰形式测试的4-个点的消除曲线。反应板的LC-MS/MS原始数据以对于检品和内标的积分的分析物峰面积形式返回。这些数值可以转换为分析物：内标的峰面积之比，以使数据的比较达到标准化。
将反应时间点(例如0、5、20或30分钟)相对于剩余检品相对0分钟的百分比(基于相对的峰面积之比)的自然对数作图。清除曲线的斜率kmic用来计算体外半衰期t1/2，如方程(1)所示。为了集中于线性的反应动力学，如果可能的话，一般将代表剩余检品＜10％的数据点排除在清除曲线的斜率限定之外。该反应的t1/2是核心的试验数值，用于计算CLint(方程2)
方程(1)：t1/2＝0.693/-kmic
方程(2)：Clint＝0.693/-kmic·V/M
使用上述方法获得以下结果：
实施例C：在荧光素酶发光试验中测定的PI3Kα突变体E545K和 H1047R的抑制
发光值是早已确立的用来测定ATP浓度的读数，因此可以用来在不考虑其底物的情况下追踪多种激酶的活性。KinaseGlo发光激酶检测试剂盒(Promega，Madison/WI，USA)是在激酶反应后通过对溶液中剩余的ATP定量来测定激酶活性的均一的HTS方法。
磷酸肌醇3-激酶在室温下在50-μi含有1μM ATP、5mM MgCl2、50mM NaCl、5μg/ml大豆磷脂酰肌醇(Avanti Polar lipids，目录号840044C)、0.015％八葡糖苷(Sigma，目录号O9882)、0.01％CHAPS、1mM DTT、2.5％DMSO和10mM Tris-HCl pH 7.5的介质中孵育。激酶反应通过加入ATP(酶与抑制剂预孵育15分钟)启动，1小时后用50μl Kinase(Promega，目录号V6714)终止，用Victor II读数器(0.1秒积分)测定发光度。使用逻辑方程通过非线性回归来拟合曲线(X的模式205，IDBusiness Solutions，Guildford，英国)。
发光试验的测定原理(KinaseGlo)：
使用上述试验系统和使用来自下表显示的构建体的PI3K蛋白，评价了对野生型和突变型PI3Kα的抑制活性。
结果显示在下表中。
野生型和突变型PI3Kα的抑制：
BV1147：将在许多癌症中发现的激活突变E545K使用QuickChangeXL诱变试剂盒(Stratagene)通过定点诱变引入ORF318。使用生产商推荐的方法和突变引物：gwG152-p15(5’-CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATTTT-3’)(SEQ ID NO：21)，和gwG152-p16(5’-AAAATCTTTCT-CCTGCTTAGTGATTTCAGAGAG-3’)(SEQ ID NO：22)，产生ORF544。该克隆经测序验证后，用于Gateway LR反应(Invitrogen)，以便将插入片段转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(Invitrogen)载体中，用于生成杆状病毒表达载体LR561。
激酶结构域
BV 1147的蛋白序列：
   1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
  61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
 121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
 181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
 241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
 301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
 361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
 421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
 481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
 541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV
 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MEMIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO：23).
BV1097：将许多癌症中发现的激活突变H1047R用QuickChange XL诱变试剂盒(Stratagene)通过定点诱变引入ORF318。使用生产商推荐方法和突变引物：gwG152-p07(5’-CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3’)(SEQ ID NO：24)，和gwG152-p11(5’-TGTCCAGCCA-CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3’)(SE Q ID NO：25)，产生ORF396。该克隆经测序验证后，用于Gateway LR反应(Invitrogen)，以便将插入片段转移到Gateway接头的pBlueBac4.5(Invitrogen)载体中，用于生成杆状病毒表达载体LR480。
激酶结构域
BV 1097的蛋白序列：
   1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
  61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
 121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
 181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
 241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
 301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
 361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
 421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
 481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
 541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV
 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFIVEQM
 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
1141 MKQMNDARHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO：26).

Claims (33)

1.游离形式或可药用盐形式的化合物(S)-吡咯烷-1,2-二甲酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)，其为以下结构：
2.游离形式或可药用盐形式的权利要求1所述的化合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤；肺癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃肠癌；结肠直肠腺瘤；甲状腺癌；肝癌；肾上腺癌；神经胶质瘤；子宫内膜癌；黑素瘤；肾癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；阴道癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食管癌；白血病；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；瘤形成；淋巴瘤；乳癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓化生；和瓦尔登斯特伦病。
4.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为实体瘤。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为颈或头部肿瘤。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为直肠癌、结肠癌、胃癌或小肠癌。
7.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为淋巴细胞白血病或髓性白血病。
8.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
9.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为上皮特征的瘤形成。
10.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤。
11.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为散发的乳腺癌或考登病。
12.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为支气管癌。
13.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为肝内胆管癌或肝细胞癌。
14.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
15.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为绒毛状结肠腺瘤。
16.如权利要求2所述的用途，其中所述癌症为肾盂癌。
17.药物组合物，其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的权利要求1所述的化合物和一种或多种可药用赋形剂。
18.适合于同时或先后施用的组合的药物组合物，其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的权利要求1所述的化合物和治疗有效量的一种或多种组合伙伴；以及一种或多种可药用赋形剂。
19.如权利要求17所述的药物组合物或者权利要求18所述的组合的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤；肺癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃肠癌；结肠直肠腺瘤；甲状腺癌；肝癌；肾上腺癌；神经胶质瘤；子宫内膜癌；黑素瘤；肾癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；阴道癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食管癌；白血病；脑癌；口腔和咽癌；喉癌；瘤形成；淋巴瘤；乳癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纤维化伴骨髓化生；和瓦尔登斯特伦病。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为实体瘤。
22.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为颈或头部肿瘤。
23.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为直肠癌、结肠癌、胃癌或小肠癌。
24.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为淋巴细胞白血病或髓性白血病。
25.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为急性髓性白血病或慢性髓性白血病。
26.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为上皮特征的瘤形成。
27.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤。
28.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为散发的乳腺癌或考登病。
29.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为支气管癌。
30.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为肝内胆管癌或肝细胞癌。
31.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为胶质母细胞瘤。
32.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为绒毛状结肠腺瘤。
33.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为肾盂癌。
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