KR20220008313A

KR20220008313A - 퀴나졸리논계 화합물의 결정형 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20220008313A
Application number: KR1020217040713A
Authority: KR
Inventors: 징지에 후앙; 이지에 인; 팅 야오; 타오 위; 청더 우; 지아치앙 동; 빈 시; 웨이 탕; 원치안 양; 티에-린 왕
Original assignee: 뤄신 헬스케어 사이언스 앤드 테크놀로지 디벨롭먼트 (베이징) 리미티드
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2022-01-20
Also published as: EP3971175A1; JP2022533151A; US20220213060A1; CN113874362A; WO2020228729A1; EP3971175A4

Abstract

본 발명은 PI3Kα 억제제로서의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형 및 이의 제조방법에 관한 것이고, 또한 고형 종양을 치료하는 약물의 제조에서의 상기 결정형의 용도에 관한 것이다.

Description

퀴나졸리논계 화합물의 결정형 및 이의 제조방법

본 발명은 출원일이 2019년 5월 13일인 중국 특허출원 CN201910394653.5 및 출원일이 2019년 5월 21일인 중국 특허출원 CN201910423711.2의 우선권을 주장한다. 본 발명은 상기 중국 특허출원의 전문을 인용한다.

본 발명은 PI3Kα억제제로서의 결정형 및 이의 제조방법에 관한 것이고, 또한 고형 종양 치료용 약물의 제조에서의 상기 결정형의 용도에 관한 것이다.

포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)는 조절 서브유닛 p85 또는 p101 및 촉매 서브유닛 p110(또는 p110α, p110β, p110δ, p110γ의 4가지 서브 타입으로 세분화 된다)으로 구성된 지질 키나제로, 포스파티딜이노시톨4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)의 이노시톨 고리의 3'-OH의 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)로의 인산화를 촉매하여 하류의 Akt 등을 활성화시켜 세포 증식, 생존과 대사에 중요한 역할을 한다. 종양 세포 중에서는 PI3K가 과다 발현되어 종양 세포의 급속한 증식과 성장을 일으킨다

종양 억제 유전자 PTEN(Phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome 10)은 PIP3를 탈인산화시켜 PIP2를 생성함으로써, PI3K 신호전달 경로의 마이너스 피드백을 조절하여 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 촉진한다. PI3K 유전자의 돌연변이나 증폭이 암에서는 빈번하게 발생하며, 암에서의 PTEN 유전자 결실 등도 PI3K의 과다 발현이 종양의 형성과 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다.

Zhang hao 등(Bioorganic Medicinal Chemistry, 2015(23):7765 내지 7776.)은 화합물 A2 및 A10(비교예 R011 및 R012) 등이 PI3K에 대해 양호한 억제 효과가 있음을 발견하였다. 노바티스사가 개발한 PI3Kα의 선택적 억제제인 BYL-719(WO2010/029082)는 현재 사전 등록 단계에 있으며, 세계에서 같은 종류의 표적 저해제의 연구에서 가장 높은 레벨을 갖는 화합물이다.

R011

R012

BYL-719.

발명의 상세한 설명

본 발명은 X선 분말 회절 스펙트럼이 4.8±0.20°, 12.6±0.20°, 17.3±0.20°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 X선 분말 회절 스펙트럼은 4.8±0.2°, 5.7±0.2°, 6.3±0.2°, 11.5±0.2°, 12.6±0.2°, 13.5±0.2°, 17.3±0.2°, 21.5±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 X선 분말 회절 스펙트럼은 4.8±0.2°, 5.7±0.2°, 6.3±0.2°, 10.1±0.2°, 11.5±0.2°, 12.6±0.2°, 13.5±0.2°, 15.8±0.2°, 17.3±0.2°, 19.2±0.2°, 21.5±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 XRPD 스펙트럼은 도 1에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 1에 나타낸 바와 같다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 XRPD스펙트럼 분석 데이터

번호	2θ각(°)	면간거리(Å)	상대 강도(%)	번호	2θ각(°)	면간 거리(Å)	상대 강도(%)
1	4.8	18.4	11.5	15	20.3	4.4	1.4
2	5.7	15.4	3.3	16	20.6	4.3	0.7
3	6.3	14.0	3.8	17	21.5	4.1	14.6
4	8.0	11.1	1.3	18	22.8	3.9	1.6
5	9.6	9.2	1.7	19	23.1	3.8	0.7
6	10.1	8.8	2.5	20	24.0	3.7	0.9
7	10.6	8.3	1.5	21	24.3	3.6	2.5
8	11.5	7.7	3.3	22	25.4	3.5	5
9	12.6	7.0	100	23	26.7	3.3	2.7
10	13.5	6.5	4.3	24	27.2	3.3	0.8
11	15.8	5.6	2	25	29.2	3.0	2.3
12	17.3	5.1	13.4	26	32.1	2.8	0.6
13	19.2	4.6	5.3	27	33.1	2.7	0.9
14	19.7	4.5	0.8	28	33.4	2.7	1.2

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 시차 주사 열량 곡선은 195.5±3.0℃에서 흡열 피크의 개시점을 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 DSC 스펙트럼은 도 2에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 열중량 분석 곡선은 151.6±3.0℃에서 중량 손실이 0.16%에 달한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형A의 TGA 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같다.

본 발명은 X선 분말 회절 스펙트럼이 5.0±0.2°, 9.9±0.2°, 12.3±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B를 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 X선 분말 회절 스펙트럼은 5.0±0.2°, 9.9±0.2°, 12.3±0.2°, 14.9±0.2°, 20.2±0.2°, 24.4±0.2°, 27.1±0.2°, 30.1±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 XRPD 스펙트럼은 도 5에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 2에 나타낸 바와 같다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 XRPD스펙트럼 분석 데이터

번호	2θ각(°)	면간거리(Å)	상대 강도(%)	번호	2θ각(°)	면간거리(Å)	상대 강도(%)
1	5.0	17.7	93.3	15	24.8	3.6	1.2
2	9.9	8.9	100	16	25.0	3.6	1.3
3	12.3	7.2	25.1	17	25.7	3.5	2
4	13.7	6.5	3.1	18	26.0	3.4	1.3
5	14.9	5.9	14.9	19	26.3	3.4	0.6
6	15.2	5.8	5.5	20	26.5	3.4	0.6
7	18.6	4.8	4.6	21	27.1	3.3	6.9
8	19.4	4.6	0.7	22	28.9	3.1	3.2
9	19.9	4.4	19.1	23	29.4	3.0	0.5
10	20.2	4.4	27.5	24	30.1	3.0	9.9
11	22.6	3.9	1.2	25	30.7	2.9	0.9
12	23.2	3.8	0.4	26	31.6	2.8	1.4
13	23.6	3.8	1	27	33.6	2.7	1.9
14	24.4	3.6	13.3	28	33.9	2.6	0.6

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 시차 주사 열량 곡선은 178.7±3.0℃에서 흡열 피크의 개시점을 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 DSC 스펙트럼은 도 6에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 열중량 분석 곡선은 63.4±3.0℃에서 중량 손실이 1.03%에 달한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형B의 TGA 스펙트럼은 도 7에 도시된 바와 같다.

본 발명은 X선 분말 회절 스펙트럼이 4.9±0.2°, 5.8±0.2°, 6.8±0.2°, 8.4±0.2°, 12.4±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형C를 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형C의 X선 분말 회절 스펙트럼은 4.9±0.2°, 5.8±0.2°, 6.8±0.2°, 8.4±0.2°, 10.8±0.2°, 11.7±0.2°, 12.4±0.2°, 14.3±0.2°, 17.0±0.2°, 17.7±0.2°, 18.7±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형C의 XRPD 스펙트럼은 도 8에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형C의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 3에 나타낸 바와 같다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형C의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터

번호	2θ각(°)	면간거리(Å)	상대 강도(%)	번호	2θ각(°)	면간거리(Å)	상대 강도(%)
1	4.2	20.9	9.8	19	14.3	6.2	22.7
2	4.9	17.9	43.5	20	14.7	6.0	8.3
3	5.1	17.2	8.8	21	14.9	5.9	7.7
4	5.8	15.1	38.2	22	15.3	5.8	8.1
5	6.2	14.2	9.3	23	15.9	5.6	17.3
6	6.8	13.0	27.6	24	17.0	5.2	31.9
7	7.4	12.0	8.1	25	17.2	5.1	9.5
8	7.5	11.7	14.7	26	17.7	5.0	21.3
9	8.4	10.5	31.4	27	18.7	4.7	25.4
10	9.6	9.2	16.4	28	19.3	4.6	14.4
11	10.3	8.6	4.3	29	19.7	4.5	6.2
12	10.8	8.2	19.3	30	20.5	4.3	7.2
13	11.4	7.7	28.4	31	21.8	4.1	12
14	11.7	7.6	31.6	32	22.8	3.9	14.1
15	12.0	7.4	23.4	33	23.5	3.8	7.4
16	12.4	7.1	100	34	23.9	3.7	6.7
17	13.2	6.7	12.3	35	24.1	3.7	13
18	13.5	6.5	5.4	36	25.0	3.6	3.6

본 발명은 X선 분말 회절 스펙트럼이 5.1±0.2°, 7.8±0.2°, 11.8±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형D를 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형D의 X선 분말 회절 스펙트럼은 5.1±0.2°, 6.5±0.2°, 7.8±0.2°, 11.8±0.2°, 15.4±0.2°, 16.5±0.2°, 17.4±0.2°, 23.8±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가진다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형D의 XRPD 스펙트럼은 도 9에 도시된 바와 같다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 결정형D의 XRPD 스펙트럼 분석 데이터는 표 4에 나타낸 바와 같다.

본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 제조방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:

(1) 식(I)으로 표시되는 화합물을 용매에 가하여 현탁액 또는 용액으로 하는 단계;

(2) 상기 현탁액 또는 용액을 항온 믹서에 넣고, 진탕한 후, 원심분리하고, 건조시켜, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 얻는 단계.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 상기 용매는 알코올 용매 및 에스테르 용매로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 상기 용매는 에탄올, n-부탄올, tert-부탄올, 이소프로판올, 포름산에틸 및 아세트산에틸로부터 선택된다.

본 발명은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 제조방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:

(2) 상기 현탁액 또는 용액을 항온 믹서에 넣고, 진탕한 후, 원심분리하고, 건조시켜, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B를 얻는 단계.

(1) 식(I)으로 표시되는 화합물을 용매에 가하고, 가열하여 용해시키는 단계;

(2) 상기 용액을 고체가 석출될 때까지 냉각시키고, 교반하고, 여과하여 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 얻는 단계.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 상기 용매는 메탄올-물, 에탄올-물, 아세톤-물로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 상기 용매는 메탄올-물(2:1), 에탄올-물(2:1), 아세톤-물(2:1), 에탄올-물(1:3) 로부터 선택된다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 교반온도는 25℃내지 60℃이다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 교반시간은 12시간 내지 24시간이다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 제조방법에서, 화합물과 용매의 중량-체적비는 1g:7 내지 10mL이다.

본 발명은 또한 PI3Kα억제제 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 결정형의 용도를 제공한다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 용도에 있어서, PI3Kα 억제제 관련 약물이 종양 치료 약물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 결정형 및 약학적으로 허용가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 결정형은 치료학적 유효량일 수 있다.

본 발명은 또한 PI3K 억제제의 제조에서 상기 결정형 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다. 상기 PI3K 억제제는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수의 억제제이며, 바람직하게는 PI3Kα 억제제일 수 있다.

본 발명은 또한 약물의 제조에 있어서 상기 결정형 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다. 상기 약물은 종양 치료 약물 또는 PI3K 관련 질환의 치료 약물일 수 있다. 상기 PI3K 관련 질환은 종양일 수 있다. 상기 PI3K는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수일 수 있으며, 바람직하게는 PI3Kα 억제제일 수 있다.

본 발명은 또한 치료 유효량의 상기 결정형 또는 상기 약학 조합물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 PI3K 관련 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 PI3K 관련 질환은 종양일 수 있다. 상기 PI3K는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수일 수 있으며, 바람직하게는 PI3Kα일 수 있다.

본 발명에서, 상기 종양은 유방암, 난소암, 두경부암, 식도암, 폐암, 자궁경부암, 신경내분비 전립선암, 자궁내막암, 방광암 및 결장직장암 중 한가지 또는 복수일 수 있으며, 바람직하게는 유방암 및 /또는 난소암일 수 있다.

정의 및 설명

별다른 설명이 없는 한, 본문에 사용되는 이하 용어와 짧은 문구는 하기 뜻을 구비한다. 하나의 특정된 짧은 문구 또는 용어는 특별히 정의되지 않을 경우, 불확정하거나 불명확한 것으로 이해해서는 아니되며 통상의 뜻에 따라 이해해야 한다. 본문에 상품명이 나타날 경우, 이는 이와 대응되는 상품 또는 이의 활성성분을 의미한다.

본 발명의 중간체 화합물은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 다양한 합성방법으로 제조될 수 있고, 이하 예를 든 구체적인 실시형태, 이와 기타 화학합성방법으로 결합된 실시형태 및 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하고 있는 등가적 대체방안, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시형태의 화학 반응은 적합한 용매에서 완료되고, 상기 용매는 본 발명의 화학적 변화 및 이에 필요한 시약 및 물질에 적합해야 한다. 본 발명의 화합물을 획득하기 위해, 당업자는 기존의 실시방법에 기초하여 합성 단계 또는 반응 과정을 변경하거나 또는 선택하는 것이 때로 필요하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예가 본 발명에 대해 그 어떠한 한정을 하는 것은 아니다.

본 발명에 사용되는 모든 용매는 시판되는 것이고, 추가 정제없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 용매는 시판되는 것이다. 본 발명은 하기 약어를 사용한다: DCM은 디클로로메탄을 나타내며; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내며; DMSO는 디메틸술폭시드를 나타내며; EtOH는 에탄올을 나타내며; MeOH는 메탄올을 나타내며; TFA는 트리플르오로아세트산을 나타내며; ATP는 아데노신3인산을 나타내며; HEPES는 4-하이드록시에틸피페라진에테인설폰산을 나타내며; MgCl₂ 는 염화마그네슘을 나타낸다.

발명의 효과

본 발명의 화합물의 결정형은 안정성이 양호하고 약물의 제조에 용이하며, 본 발명의 화합물은 PI3K 키나제의 활성을 잘 억제할 수 있음과 동시에 PI3Kβ/γ/δ에 대한 높은 서브타입 선택성을 가지며; 세포에서 PI3K하류의 Akt 인산화 레벨을 잘 억제할 수 있으며, 세포 수준에서 비교적 높은 서브타입 선택성을 나타내었다. 본 발명의 화합물은 생체내에서 종양 성장에 대해 현저한 억제 효과를 가지며, 또한 동물 체내에서도 PI3K 하류의 Akt 인산화 레벨에 대해 유의한 시간 의존성 및 용량 의존성 억제 효과를 나타내었다. 본 발명의 화합물은 hERG 및 CYP 효소에 대한 현저한 억제 효과가 없고, 인간, 랫트, 마우스, 견 및 원숭이의 간세포에서 대사가 안정적이다.

1.1 X선 분말 회절(X-ray powder diffractometer, XRPD)

기기 모델: Bruker D8 advance X-선 회절계

측정 방법: XRPD 검출에 약 10 내지 20 mg의 샘플이 사용된다.

상세한 XRPD 매개 변수는 다음과 같다:

X선 발생기: Cu, kα, (λ=1.54056Å).

파이프 전압：40kV, 파이프 전류：40mA.

발산 슬릿： 0.60mm

검출기 슬릿： 10.50mm

산란 방지 슬릿： 7.10mm

스캔 범위(2θ각도)： 4 내지 40도.

스텝 폭： 0.02도

속도: 0.1초

시료 플레이트 회전속도: 15rpm

1.2 시차 주사 열량 분석(Differential Scanning Calorimeter, DSC)

기기 모델: DSC Q2000 시차 주사 열량계

측정 방법: 측정을 위해 시료(0.5 내지 1mg)를 DSC 알루미늄 포트에 놓고, 50mL/min N₂의 조건 하에서, 시료를 10℃/분의 승온속도로 실온에서부터 300℃까지 가열한다.

1.3 열중량 분석(Thermal Gravimetric Analyzer, TGA)

기기 모델：TA Q5000 IR 열중량 분석기

측정 방법： 측정을 위해 시료(2 내지 5mg)를 TGA 백금 포트에 놓고, 25mL/min N₂의 조건 하에서, 시료를 10℃/분의 승온속도로 실온에서부터 300℃까지 또는, 질량 손실이 20%로 될 때까지 가열한다.

1.4 본 발명의 동적 증기흡착 분석(Dynamic Vapor Sorption, DVS)방법

기기 모델：SMS DVS Advantage 동적 증기흡착기

측정 방법: 시료(10 내지 20 mg)를 취하여 DVS 시료 플레이트에 놓고 측정한다.

상세한 DVS 매개 변수는 다음과 같다:

온도: 25℃

평형: dm/dt=0.01%/분(최단:10분, 최장:180분)

건조: 0% RH에서 120분간 건조한다.

RH (%) 측정 구배: 10%

RH (%) 측정 구배 범위: 0% 내지 90% 내지 0%

흡습성 판단의 기준은 하기와 같다：

주: △W%는 시험25±1℃ 및 80±2%RH하에서의 흡습에 의한 중량 증가를 나타낸다.

1.5 고성능 액체 크로마토그래피 분석 방법

시료 농도: 0.5mg/mL

고체 안정성 시험 HPLC방법의 크로마토그래피 조건은 하기의 표 5와 같다:

크로마토그래피 컬럼	Waters Xbridge Sheild RP18 3.5μm 4.6*150mm PN: 186003045
파장	210nm
컬럼 온도	35℃
유속	0.8mL/min
시료 주입 체적	10.0μL
이동상	이동상A:물(0.04%의 TFA) 이동상B:100%의 아세토니트릴
구배 단계	시간/분	A%	B%
	0.01	95	5
	5.00	95	5
	10.00	75	25
	18.00	75	25
	45.00	25	75
	50.00	5	95
	51.00	95	5
	56.00	95	5
	56.01	정지
데이터 수집 시간	56.01분
희석제	아세토니트릴:물=1:1(v/v)
니들 워시	아세토니트릴:물=1:1(v/v)

도1은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 Cu-Kα선의 XRPD 스펙트럼이다.
도2는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 DSC 스펙트럼이다.
도3은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 TGA 스펙트럼이다.
도4는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 DVS 등온선이다.
도5는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 Cu-Kα선의 XRPD 스펙트럼이다.
도6은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 DSC 스펙트럼이다.
도7은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 TGA 스펙트럼이다.
도8은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형C의 Cu-Kα선의 XRPD 스펙트럼이다.
도9는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형D의 Cu-Kα선의 XRPD 스펙트럼이다.
도10은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 BT474 종양 조직에서 투여 0.5시간, 4시간 및 24시간 후 p-AKT의 단백질의 발현 상태를 나타낸다;
여기서, P-AKT는 인산화된 Akt 단백질을 나타내고, β-actin은 β-액틴을 나타낸다.
도11은 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 DVS 등온선이다.

본 발명의 내용을 더 잘 이해하기 위하여, 아래 구체적인 실시예를 결부하여 더 한층 설명하지만, 구체적인 실시형태는 본 발명의 내용을 제한하지 않는다.

실시예1:식(I)으로 표시되는 화합물의 제조

공정1:화합물1-2의 합성.

화합물 1-1(20.00g, 176.82mmol, 18.87mL), 요오드화메틸(37.65g, 265.23mmol, 16.51mL,), 탄산칼륨(48.88g, 353.64mmol)을 DMF(100mL)에 가하고, 반응계를 25℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 감압하에 용매를 제거하고, 물(200mL)을 가하여 희석하고, 디클로로메탄(200mL)으로 추출하고, 유기상을 감압 농축하고, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여(아세트산에틸: 석유 에테르=0% 내지 15%) 화합물 1-2를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.23 - 4.34 (m, 2 H), 3.56 (q, J=7.4 Hz, 1 H), 1.61 (dd, J=7.5, 1.5 Hz, 3 H), 1.31 - 1.37 (m, 3 H)。

공정2:화합물1-3의 합성.

화합물 1-2(2.30g, 18.09mmol)를 에탄올(20.00mL)에 용해한 다음, 질소 가스의 기류하에서 라니니켈(1.55g, 18.09mmol)을 가하고, 반응계를 50Pa의 수소 가스 압력하에서, 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응계를 여과하고, 여액을 감압 농축하고, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 (메탄올:디클로로메탄=0% 내지 6%)화합물 1-3을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ : 4.01 - 4.09 (m, 2 H), 2.72 (dd, J=12.5, 7.0 Hz, 1 H), 2.55 - 2.62 (m, 1 H), 2.35 - 2.45 (m, 1 H), 1.18 (t, J=7.3 Hz, 3 H), 1.04 (d, J=7.0 Hz, 3 H)。

공정3: 화합물1-5의 합성.

화합물 1-4(1.20g, 5.55mmol), 화합물 1-3(800mg, 6.11mmol), EDCI(1.09g, 5.66mmol), 2-하이드록시피리딘-N-옥사이드(722mg, 6.49mmol), 트리에틸아민(2.25g, 22.20mmol, 3.08mL)을 디클로로메탄(120mL)에 가하고, 반응계를 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용액을 물(200mL)로 희석하고, 디클로로메탄(200mL)으로 추출하고, 유기상을 감압 농축하고, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여(메탄올:디클로로메탄=0% 내지 2%), 화합물 1-5를 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ : 8.46 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.61 (d, J=2.3 Hz, 1 H), 7.26 (dd, J=8.8, 2.3 Hz, 1 H), 6.67 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 6.52 (br s, 2 H), 4.06 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.37 - 3.45 (m, 1 H), 3.21 - 3.29 (m, 1 H), 2.67 - 2.80 (m, 1 H), 1.17 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.08 (d, J=7.0 Hz, 3 H)。

공정4: 화합물1-6의 합성

화합물 1-5(1.00g, 2.86mmol,)를 포름산(24.40g,530.09mmol,20.00mL,)에 가하고, 반응계를 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용액을 감압 농축하고, 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여(아세트산에틸:석유 에테르=0% 내지 40%), 화합물 1-6을 얻었다. MS-ESI m/z: 340.8 [M+H]⁺。

공정5: 화합물1-8의 합성

화합물 1-6(2g, 5.90mmol)을 디옥산(20mL) 및 물(4mL)에 용해시키고 여기에 화합물1-7(1.77g, 7.08mmol), Pd(dppf)Cl₂(963.06 mg, 1.18 mmol) 및 아세트산칼륨(2.31g, 23.59mmol)을 가하고, 반응 용액을 질소 가스의 보호하에서 100℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용액을 스핀 건조시켰다. 얻은 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여(용리액: 메탄올/디클로로메탄=5 내지 10%), 표적 화합물 1-8을 얻었다. MS-ESI m/z: 383.1 [M+H]⁺。

공정6: 화합물1-9의 합성

화합물1-8(2.3g, 6.01mmol)을 메틸아민 에탄올 용액(2M, 50mL)에 용해시킨 다음, 반응 용액을 80℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용액을 스핀 건조시켜 표적 화합물 1-9를 얻었다. MS-ESI m/z: 368.1 [M+H]⁺。

공정7: 화합물1-11의 합성

화합물 1-9(0.3g, 816.55μmol)를 피리딘(5mL)에 용해시키고 여기에 화합물1-10(157.82mg, 742.32μmol, 99.88μL)을 가하고, 반응 용액을 25℃에서 10시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 용액을 스핀 건조시켰다. 분취용 HPLC(TFA)로 분리하여, 표적 화합물 1-11을 얻었다. MS-ESI m/z: 544.1 [M+H]⁺。

공정8:식(I)으로 표시되는 화합물의 합성

화합물1-11을 초임계 유체 크로마토그래피(분리 조건: 컬럼: AD(250mm*30mm, 10μm), 이동상: [0.1%의 NH₃H₂O EtOH]; B(아세토니트릴)%: 55% 내지 55%）로 분리하여,식（I）으로 표시되는 화합물을 얻었다．(유지 시간 0.711분),¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.22 - 8.36 (m, 2 H), 8.18 (s, 1 H), 8.06 (dd, J=8.4, 2.1 Hz, 1 H), 7.82 - 7.93 (m, 2 H), 7.72 - 7.81 (m, 2 H), 7.50 (br t, J=9.2 Hz, 1 H), 7.16 - 7.22 (m, 1 H), 4.03 - 4.17 (m, 1 H), 3.87 - 4.02 (m, 1 H), 3.70 (s, 3 H), 2.87 (dq, J=14.5, 7.1 Hz, 1 H), 2.48 (br s, 3 H), 1.08 (d, J=7.0 Hz, 3 H)。 MS-ESI m/z: 544.1 [M+H]⁺。

실시예2：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A, B, C 및 D의 제조

시료 병에 약 50mg의 식(I)으로 표시되는 화합물을 칭량하고, 아래 표에 있는 용매를 소정량을 가하여 상이한 단일 용매 및 혼합 용매의 현탁액 또는 용액을 제조하였다.

현탁액을 40℃에서 3일 동안 계속 진탕한 다음, 원심분리하고, 잔여 고체를 진공 건조 오븐에 넣고, 40℃의 조건에서 밤새 진공 건조하고 잔여 용매를 제거하여 식(I)으로 표시되는 화합물의 각 결정형을 얻었다.

용액을 실온에 놓아 휘발시킨 다음, 30℃의 조건에서 1일 동안 진공 건조하고 잔여 용매를 제거하여, 식(I)으로 표시되는 화합물의 각 결정형을 얻었다.

결과는 표 6에 나타낸 바와 같다

식(I)으로 표시되는 화합물의 다양한 용매 결정형의 스크리닝 실험

번호	용매	용매 체적(mL)	상태	결정형
1	에탄올	1.00	현탁액	결정형A
2	아세톤	0.60	용매(용해 후 고체가 석출)	결정형C
3	아세트산에틸	1.00	현탁액	결정형A
4	메탄올: 물(2:1)	1.00	용매(용해 후 고체가 석출)	결정형B
5	에탄올: 물(2:1)	1.00	용매(용해 후 고체가 석출)	결정형B
6	아세톤: 물(2:1)	0.86	용매(용해 후 고체가 석출)	결정형B
7	물	1.50	현탁액	결정형D
8	에탄올: 물(1:3)	1.00	현탁액	결정형B

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 제조

식(I)으로 표시되는 화합물 조질의 생성물 1kg을 아세트산에틸(7000mL)과 함께 반응 용기에 옮기고, 60℃로 가열하여 완전히 용해될 때까지 교반한 다음 용액을 40℃로 냉각시켜 다량의 고체가 석출될 때까지 교반한 다음, 40℃에서 밤새 교반하여, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 얻었다.

실시예3：식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 고체 안정성 시험

"원약 및 제제의 안정성 시험 가이드 원칙" (중국 약전 2015판 사부 통칙 9001)에 기초하여, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 안정성을 조사하였다.

5mg의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 칭량하여 건조하고 깨끗한 유리병에 넣고 1식 2부로 하고, 얇은 층으로 전개하여, 공식 시험 시료로 하여, 영향 인자 시험조건 (60℃, 92.5% 상대습도) 및 가속 조건(30℃/65% 상대습도, 40℃/75% 상대습도 및 60℃/75% 상대습도)에서, 시료를 완전히 노출시켜, 은박지로 덮고, 작은 구멍을 뚫었다. 5일, 10일 및 1개월째에 샘플링하여 분석하였다. 광조사（총 조도=1200000 Lux*hr/근 적외선=200w*hr/m²）의 조건하에 시료를 놓고 실온에서 완전히 노출되도록 하였다 시험 결과는 하기의 표 7과 같다:

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 고체 안정성 시험 결과

시험 조건	시점	외관	결정형 (XRPD)	식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A 함유량(%)	총 불순물 함량(%)
-	0일	오프화이트 분말	결정형A	103.08	0.14
고온(60℃, 개구)	5일	오프화이트 분말	결정형A	104.39	0.14
고온(60℃, 개구)	10일	오프화이트 분말	결정형A	102.00	0.14
고습(25℃/92.5% 상대습도, 개구)	5일	오프화이트 분말	결정형A	103.08	0.14
고습(25℃/92.5% 상대습도, 개구)	10일	오프화이트 분말	결정형A	103.95	0.14
빛 차단	10일	오프화이트 분말	결정형A	102.57	0.15
광 조사（총 조도=1.2Х106Luxhr/근 적외선=200whr/m², 개구）	10일	오프화이트 분말	결정형A	103.04	0.14
40℃, 상대 습도 75%, 개구	10일	오프화이트 분말	결정형A	103.79	0.15
40℃, 상대 습도 75%, 개구	1개월	오프화이트 분말	결정형A	103.86	0.16
60℃, 상대 습도 75%, 개구	10일	오프화이트 분말	결정형A	103.63	0.14
60℃, 상대 습도 75%, 개구	1개월	오프화이트 분말	결정형A	103.30	0.14
30℃, 상대 습도 65%, 개구	10일	오프화이트 분말	결정형A	104.28	0.14
30℃, 상대 습도 65%, 개구	1개월	오프화이트 분말	결정 형A	101.64	0.14

결론:식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A는 양호한 안정성을 갖는다.

실시예4：식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 흡습성 연구

실험재료：

SMS DVS Advantage 동적 증기 흡착기

실헙방법：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A 20mg을 DVS 시료 플레이트에 취하여 측정하였다.

실험결과：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 DVS 스펙트럼은 도 4에 도시된 바와 같으며, △W=0.885%이다.

실험결론：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A가 25℃및 80%의 RH하에서의 흡습성 중량 증가는 0.885%였으며, 약간의 흡습성이 있다.

실시예5： 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 흡습성 연구

실험재료：

SMS DVS Advantage 동적 증기 흡착계

실헙방법：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B 20mg을 DVS 시료 플레이트에 취하여 측정하였다.

실험결과：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 DVS스펙트럼은 도 11에 도시된 바와 같으며, △W=2.332%이다.

실험결론：

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B가 25℃및 80%의 RH하에서의 흡습성 중량 증가는 2.332%였으며, 흡습성이 있다.

실험예 1. PI3Kα/β/γ/δ 키나제 및 세포에 대한 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 체외 활성 및 선택성 연구

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A가 야생성 및 돌연변이형 PI3Kα 키나제에 비교적 강한 억제작용을 갖는다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A가 야생성 PI3Kα 및 돌연변이형 PI3Kα(E545K), PI3Kα(H1047R)에 대한 억제작용의 IC₅₀은 각각1.80, 1.13 및 0.69nM이였다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A는 PI3K의 다른 3가지 서브타입에 대해 우수한 선택성을 가지며, PI3Kα에 대한 억제 활성은 각각 PI3Kβ/δ/γ의 149/7.44/6.61배이다. 구체적인 실험 방법은 실험예 8과 동일하다. 동일한 시험 조건에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A는 각각 PI3Kβ/δ/γ의 고발현 특이성 세포주 MDA-MB-468/Jeko-1/RAW264.7의 Akt 인산화 억제 활성에 대해 우수한 선택성을 나타내며, PI3Kα에 대한 억제 활성은 각각 PI3Kβ/δ/γ의 195/23.0/>694배이며, 구체적으로는 표 8, 표 9에 나타낸 바와 같다. 구체적인 실험 방법은 실험예 9와 동일하다.

야생형 및 돌연변이형 PI3Kα 키나제 체외 활성에 대한 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 IC₅₀(nM)

화합물	야생형 PI3Kα	돌연변이형 PI3Kα(E545K)	돌연변이형 PI3Kα(H1047R)
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A	1.80	1.13	0.69

PI3Kα/β/γ/δ 키나제에 대한 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 선택성

화합물	PI3Kα/β	PI3Kα/δ	PI3Kα/γ
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A	149	7.44	6.61

실험예2.HR+/HER2+의 BT-474(PIK3CA 증폭) 누드 마우스 인간 유방암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 체내 약효 연구

인간 유래 BT-474 유방암 세포의 표현형은 HR+/HER2+이며, 자체적으로 PIK3CA 증폭을 갖는다. 본 실험은 인간 유방암 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 약효를 평가하고, BYL-719를 참고로 하였다.

세포배양: 인간 유방암 BT474 세포의 체외 단층 배양에 있어서, 배양조건은 Hybri-Care배지에 10%의 소태아혈청을 가하여, 37℃, 5%CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 일주일에 두번 트립신-EDTA로 통상적인 소화처리를 진행하여 계대 배양하였다. 세포 포화도가 80% 내지 90%이고 수량이 요구 사항에 도달할 경우, 세포를 수확하고, 계수하여, 접종을 진행하였다.

동물: BALB/c누드 마우스, 암컷, 6 내지 8주령, 체중18 내지 20g. 합계 85마리가 필요하며, Shanghai-Bk Lab Animal Co.,Ltd.로부터 제공되었다.

종양의 접종: 에스트로겐 정제(0.36mg/정)을 각 마우스의 왼쪽 배후에 피하 접종하고, 3일 후, BT474 세포 0.2 mL (10Х106 세포) (체적비1:1로 메트리겔 첨가)를 각각 마우스의 오른쪽 배후에 피하 접종하고, 종양의 평균 체적이 약 150mm³ 내지 200 mm³에 도달하면 군을 나누어 투여하였다.

1일 1회, 20일간 경구 투여한 후, BYL-719(40mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg) 군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p값은 각각 0.003, 0.001이다), T/C는 (상대 종양 성장율 T/C(%)=TRTV/CRTVХ100%(TRTV: 치료 군의 상대 종양 체적 평균; CRTV: 음성 대조군의 상대 종양 체적 평균)) 각각 29.39%, 21.16%이고, TGI(종양 성장 억제율, TGI(%)=[1-(특정 처리군의 투여 완료시의 평균 종양 체적-해당 처리군의 투여 개시점의 평균 종양 체적)/(용매 대조군의 치료 완료시의 평균 종양 체적-용매 대조군의 치료 개시점의 평균 종양 체적)]Х100%)는 각각 95.31%, 105.65%였다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있으며(p값은 각각 0.034, 0.007이다), 이의 T/C의 합계는 각각 50.18%, 37.92%이며, TGI는 각각 65.34%, 80.21%였다. 각 투여군의 종양 보유 마우스는 시험 화합물에 대해 우수한 내성을 나타내었다. BYL-719(40mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg)군은, 양군 모두 유의한 항종양 효과를 나타내었고, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)는 강력한 항종양 효과가 있었다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 항종양 효과는 본 실험에서 설정된 용량에서 일정한 용량 의존성을 나타내었고, 유효 용량은 10 mg/kg이였다. 구체적인 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.

투여 마지막 날 동물의 혈장 및 종양 조직을 PK 검사한 결과, PK 결과는 투여량이 증가함에 따라 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 혈장 노출량이 선형적으로 증가함을 나타내었다. 투여 후 0.5 내지 1 시간에 혈중 농도가 피크에 도달했다. 유효 용량에서의 혈장 노출량은 69300nM*h이었다.

BT-474 누드 마우스 인간 유방암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는화합물의 결정형A의 생체내 약효 연구 결과

화합물	TGI%	T/C%
BYL-719(40mpk)	95.31%	29.39%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mpk)	105.65%	21.16%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20 mpk)	80.21%	37.92%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10 mpk)	65.34%	50.18%

실험예3. HR+/HER2-의 T47D(PIK3CA H1047R 돌연변이) 누드 마우스 인간 유방암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 생체내 약효 연구

인간 T47D 유방암 세포의 표현형은 HR+/HER2-이며, 자체적으로 PIK3CA H1047R 돌연변이를 갖는다. 본 실험은 인간 유방암 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 약효를 평가하였다.

세포배양: 인간 유방암 T47D 세포의 체외 단층 배양에 있어서, 배양조건은 RPMI-1640배지에 0.2U/mL의 소 인슐린 및 10%의 소태아혈청을 가하여 37℃, 5%CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 일주일에 두번 트립신-EDTA로 통상적인 소화처리를 진행하여 계대배양하였다. 세포 포화도가 80% 내지 90%이고 수량이 요구 사항에 도달할 경우, 세포를 수확하고, 계수하여, 접종을 진행하였다.

동물: BALB/c누드 마우스, 암컷, 6 내지 8주령, 체중18 내지 20g. 합계 75마리가 필요하며, Shanghai-Bk Lab Animal Co.,Ltd.또는 자격을 갖춘 다른 공급 업체에 의해 제공되었다.

종양의 접종: 에스트로겐 정제(0.18mg/정)를 각 마우스의 왼쪽 배후에 피하 접종하고, 3일 후, T47D 세포 0.2mL(10Х106세포) (체적비1:1로 메트리겔을 첨가)를 각각 마우스의 오른쪽 배후에 피하 접종하여, 종양의 평균 체적이 약 150mm³ 내지 200mm³에 도달하면 군을 나누어 투여하였다.

1일 1회, 42일간 경구 투여한 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg) 군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p값<0.001), T/C는 37.91%, TGI는 84.71%였다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p값은 각각 0.005 및 0.002이다), T/C는 각각 50.40%, 44.70%이며, TGI는 각각 67.58%, 72.56%였다. 각 투여군의 종양 보유 마우스는 시험 화합물에 대해 모두 우수한 내성을 나타내었다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg) 군은 유의한 항종양 효과를 나타내었고, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)는 강력한 항종양 효과가 있었다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 항종양 효과는 본 실험에서 설정된 용량에서 일정한 용량 의존성을 나타내었고, 유효 용량은 10 mg/kg이였다. 구체적인 결과는 표 11에 나타낸 바와 같다.

T47D 누드 마우스 인간 유방암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 생체내 약효 연구 결과

화합물	TGI%	T/C%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40 mpk)	84.71%	37.91%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20 mpk)	72.56%	44.70%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10 mpk)	67.58%	50.40%

실험예4. SKOV-3(PIK3CA H1047R 돌연변이) 누드 마우스 인간 유래 난소암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 생체내 약효 연구

인간 유래 SKOV-3 난소암 세포의 표현형은 자체적으로 PIK3CA H1047R 돌연변이를 갖는다. 본 실험은 인간 난소암 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 약효를 평가하였다.

세포배양: 인간 난소암 SKOV-3 세포의 체외 단층 배양에 있어서, 배양조건은 RPMI-1640배지에 10%의 소태아혈청을 가하여 37℃, 5%CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 일주일에 두번 트립신-EDTA로 통상적인 소화처리를 진행하여 계대배양하였다. 세포 포화도가 80%-90%이고 수량이 요구 사항에 도달할 경우, 세포를 수확하고, 계수하여, 접종을 진행하였다.

동물: BALB/c누드 마우스, 암컷, 6 내지 8주령, 체중18 내지 20g. 합계 67마리가 필요하며, Beijing Vital River Laboratory Animal TecH Nology Co.Ltd.로부터 제공되었다.

종양의 접종: SKOV-3 세포 0.2mL(10Х106세포) (체적비1:1로 매트리겔을 첨가)를 각각 마우스의 오른쪽 배후에 피하 접종하고, 종양의 평균 체적이 약 150mm³ 내지 200 mm³에 도달하면 군을 나누어 투여하기 시작하였다.

1일 1회, 28일간 경구 투여한 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg)군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p값<0.001), T/C는 37.79%, TGI는 69.16%였다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)군은 용매 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 있었으며(p값은 각각 0.041, 0.005이다), T/C의 합계는 각각 69.17%, 60.61%이며, TGI는 각각 30.45%, 41.42%였다. 각 투여군의 종양 보유 마우스는 시험 화합물에 대해 우수한 내성을 나타내었다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40mg/kg)군은 유의한 항종양 효과를 나타내었고, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10mg/kg), 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20mg/kg)는 일정한 항종양 효과가 있었다. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 항종양 효과는 본 실험에서 설정된 용량에서 일정한 용량 의존성을 나타내었다. 구체적인 결과는 표 12에 나타낸 바와 같다.

SKOV-3 누드 마우스 인간 유래 난소암 피하 이종이식 종양 모델에서 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 생체내 약효 연구 결과

화합물	TGI%	T/C%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(40 mpk)	69.16%	37.79%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(20 mpk)	41.42%	60.61%
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A(10 mpk)	30.45%	69.17%

실험예5. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 Sprague Dawley (SD) 랫트 흡수 시험.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 SD 랫트에, 각각 1회 및 복수회 위내 경구 투여 및 1회 정맥내 주사하였으며, 각 군에 6마리, 수컷과 암컷을 각 절반으로 하였다. 약효 및 독성 시험의 결과에 따르면, 1회 위내 경구 투여량은 각각 3, 10 및 30mg/kg으로 하고; 복수회 투여량은 10mg/kg로, 1일 1회, 연속 7일간 투여하고, 1회 정맥 투여량은 1mg/kg이다. 약물의 혈중 농도-시간 곡선에 따라 약동학적 매개변수를 계산하였고, 수컷 랫트의 결과는 표 13, 암컷 랫트의 결과는 표 14에 나타낸 바와 같다. 본 실험에 사용된 SD 랫트는 Beijing Viton Leval, Experimental, Animal, TecH, Nology Co, Ltd. 에서 제공되었고, 유사한 체중에 따라 4개의 군(3/성별/군)으로 나누었다. 정맥내 투여군의 용매는 5%의 HP-betaCD/5%의 Solutol 수용액(pH=8)이었고; 경구 투여군의 용매는 0.5%의 MC/0.2%의 Tw80 수용액이었다. 혈장 샘플은 랫트의 경정맥 천자에 의해 수집되었다.

1mg/kg을 1회 정맥내 주사 투여 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 SD 수컷 랫트 및 암컷 랫트에 있어서의 혈장 제거율(CL)은 각각 1.79±0.457 및 3.12±0.431mL/min/kg이고, 정상 상태의 겉보기 분포 용적(Vdss)은 각각 0.265±0.0500 및 0.257±0.0227L/kg이며, 소실 반감기(t_1/2)는 3.26±1.13h 및 1.63±0.809h이고, 시스템 노출량(AUC_0-last)은 17400±4790nM*h 및 9890±1410nM*h이었다.

수컷 SD 랫트에 3mg/kg의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 1회 경구 투여한 후, 생체 이용률은 34.7%였다. 수컷 SD랫트에 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 3, 10 또는 30mg/kg을 1회 경구 투여한 후의 AUC_0-last는 각각 10300±4600, 23700±721 및 45300±10900nM*h이고, 피크에 도달하는 농도(C_max)는 각각 4770±1010, 6800±583 및 14500±4730nM이며, 피크에 도달하는 시간은 각각 0.417±0.144h, 0.500±0.000h 및 0.667±0.289h 후였다. 암컷 SD랫트에 3mg/kg의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 1회 경구 투여한 후, 생체이용률은 53.1%였다. 암컷 SD랫트에 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 3, 10 또는 30 mg/kg을 1회 경구 투여한 후의, AUC_0-last는 각각 27700±8720, 60900±10900 및 177000 ± 48000nM*h이고, 피크에 도달하는 농도(C_max)는 각각 6390±1710, 12100±3690 및 39100±7310nM이며, 피크에 도달하는 시간은 각각 0.500±0.000h, 0.667±0.289h 및 0.500±0.000h 이었다.

SD랫트에게 1일 1회, 매회 10mg/kg, 연속 7일 위내 투여 후, 수컷 랫트는 1일째와 7일째의 C_max는 각각 6800±583 및 13900±1610nM이며, AUC_0-last는 각각 23700±721 및 48500±4640nM*h이였다. 암컷 랫트는 1일째와 7일째의 C_max는 각각 12100±3690 및 20500±4600nM이고, AUC_0-last는 60900±10900 및 86000±19900nM*h이었다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 수컷 SD 랫트에 1회 또는 복수회 투여한 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 평균 약동학적 매개변수(n=3)

군	1		2		3(1일차)		3(7일차)		4
투여 경로	정맥		경구		경구		경구		경구
용량 (mg/kg)	1		3		10		10		30
약동학적 매개변수	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차
C₀또는 C_max (nM)	12700	1590	4770	1010	6800	583	13900	1610	14500	4730
T_max(h)	--	--	0.417	0.144	0.500	0.000	0.667	0.289	0.667	0.289
t_1/2(h)	1.63	0.809	2.26	0.593	2.49	0.492	3.95	1.49	2.61	0.509
Vdss(L/kg)	0.257	0.0227	--	--	--	--	--	--	--	--
CL(mL/min/kg)	3.12	0.431	--	--	--	--	--	--	--	--
AUC_0-last(nM*h)	9890	1410	10300	4600	23700	721	48500	4640	45300	10900
경구 생체 이용율(%)	--	--	34.7	/	/	/	/	/	/	/

T_max: 경구 투여 후 약물이 체내에서 최대 농도에 도달하는 시간; C₀: 정맥 내 주사 투여 후 약물의 생체내 초기 농도; "--": 해당 투여 방법에는 해당 매개변수가 없음; "/": 계산되지 않음.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 암컷 SD랫트에 1회 또는 복수회 투여한 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 평균 약동학적 매개변수(n=3)

군	1		2		3(1일차)		3(7일차)		4
투여 경로	정맥		경구		경구		경구		경구
용량 (mg/kg)	1		3		10		10		30
약동학적 매개변수	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차
C₀또는 C_max (nM)	14200	586	6390	1710	12100	3690	20500	4600	39100	7310
T_max(h)	--	--	0.500	0.000	0.667	0.289	0.500	0.000	0.500	0.000
t_1/2(h)	3.26	1.13	2.71	0.129	2.92	0.378	3.74	0.923	2.72	0.220
Vdss(L/kg)	0.265	0.0500	--	--	--	--	--	--	--	--
CL(mL/min/kg)	1.79	0.457	--	--	--	--	--	--	--	--
AUC_0-last(nM*h)	17400	4790	27700	8720	60900	10900	86000	19900	177000	48000
경구 생체 이용율(%)	--	--	53.1	/	/	/	/	/	/	/

T_max: 경구 투여 후 약물이 체내에서 최대 농도에 도달하는 시간; C₀:정맥 내 주사 투여 후 약물의 생체내 초기 농도; "--":해당 투여 방법에는 해당 매개변수가 없음; "/": 계산되지 않음.

실시예6. 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 비글견 흡수 시험

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 비글견에, 각각 1회 및 복수회 경구 투여 및 1회 정맥내 주사하고, 각 군에 6마리씩, 수컷과 암컷을 각각 절반으로 하였다. 1회 경구 투여량은 각각 0.3, 1 및 3mg/kg이고; 복수회 투여량은 1mg/kg로, 1일 1회, 연속 7일간 하고, 1회 정맥 투여량은 0.3mg/kg이다. 약물의 혈중 농도-시간 곡선에 따라 약동학적 매개변수를 계산하였고, 결과는 표 15에 나타내었다. 제1군의 약물을 제조하는 용매는 5%의 HP-beta-CD, 5%의 solutol, pH=8 수용액이고, 제2, 3 및 4군의 용매는 0.5%의 MC, 0.2%의 Tween80 수용액이다.

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 암컷 및 수컷 비글견에게 1회 또는 복수회 투여한 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 평균 약동학적 매개변수(n=6)

군	1		2		3(1일차)		3(7일차)		4
투여 경로	정맥		경구		경구		경구		경구
용량 (mg/kg 또는 mg/dog)	0.3		0.3		1		1		3
약동학적 매개변수	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차	평균치	표준 편차
C₀또는 C_max (nM)	512	215	158	68.4	656	30.7	850	106	1880	274
T_max(h)	--	--	2.00	1.10	1.67	0.516	1.33	0.516	3.08	1.50
T_1/2 (h)	6.32	1.62	6.92	3.16	5.00	1.44	5.18	0.487	6.55	1.76
Vdss(L/kg)	2.47	0.391	--	--	--	--	--	--	--	--
CL (mL/min/kg)	6.18	1.49	--	--	--	--	--	--	--	--
AUC_0-last (nM*h)	1470	353	1290	715	4980	946	5880	697	14800	2510
경구 생체 이용율(%)	--	--	87.8	/	/	/	/	/	/	/

암컷 및 수컷 비글견에게 0.3mg/kg의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 1회 정맥내 주사 투여 후, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 혈장 클리어런스(CL)는 6.18±1.49mL/min/kg이고, 정상 상태의 겉보기 분포 용적(Vdss)은 2.47±0.391L/kg이며, 소실 반감기(t_1/2) 및 0부터 마지막 정량화 가능한 시점의 시간-혈장 농도 곡선하의 면적 (AUC_0-last)은 각각 6.32 ± 1.62h 및 1470 ± 353nM * h이였다.

암컷 및 수컷 비글견에게 0.3mg/kg의 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 1회 경구 투여한 후, 생체 이용율은 87.8%였다. 암컷 및 수컷 비글견에 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 0.3, 1 및 3mg/kg을 1회 경구 투여한 후, AUC_0-last는 각각 1290±715, 4980±946 및 14800±2510nM*h이고, 피크에 도달하는 농도(C_max)는 각각 158±68.4, 656±30.7 및 1880±274nM이며, 피크에 도달하는 시간(T_max)은 투여 후 각각 2.00±1.10h, 1.67±0.516h 및 3.08±1.50h 이였다. t_1/2는 각각 6.92±3.16, 5.00±1.44 및 6.55±1.76h이였다.

암컷과 수컷 비글견에게 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A 1mg/kg을 7일간 연속으로 경구 투여하고, 투여 1일 후의 AUC_0-last는 4980±946nM*h이고, C_max는 656±30.7nM이고, T_1/2는 5.00±1.44h이다. 7일간 투여한 후, AUC_0-last는 5880±697nM*h이고, C_max는 850±106nM이고, T_1/2는 5.18±0.487h이였다.

상기 투여 방법 및 계산 방법을 참고하여, 암컷 및 수컷 비글견에 0.3mg/kg의 식(I)의 무정형체 화합물을 1회 경구 투여한 후, 생체 이용율은 71.2%였다.

결론: 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A는 두가지 동물 종속 모두에서 양호한 경구 생체 이용율을 나타내고, 낮은 제거율, 높은 시스템 노출량을 나타내고, 우수한 약동학적 특성을 갖는다.

실험예7. BT474 종양 조직 샘플에서 p-AKT 단백질 발현 레벨의 웨스턴 블롯 분석

실헙방법

7.1 단백질 추출 및 정량

1）-80℃의 냉장고에서 급속 냉동된 조직 샘플을 꺼냈다

2)드라이 아이스에서 조작하고, 조직의 일부(약 30mg)를 잘라내어, 스틸 볼을 넣은 2mL의 원심 튜브에 넣고, 500μL의 세포 용해액 RIPA를 가하였다(1%의 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제를 새로 가하였다).

3)Tissuelyser LT는 최고 주파수를 사용하여 5 분 동안 조직을 파괴하였다.

4)조직 용해액을 얼음 위에 놓고 30분 동안 용해시켰다.

5)12000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 취하여 새로운 1.5mL 원심분리 튜브에 넣었다.

6)BCA 정량 키트를 사용하여 단백질을 정량하였다.

7)정량 결과에 따라, 로딩용 단백질 시료를 제조하고, 시료의 단백질 농도를 2μg/μL로 통일하고, LDS 샘플링 완충액(4X)과 시료 환원제(10X)를 가하여, 100℃에서 시료를 10분간 항온 가열하였다.

8)웨스턴 블롯 또는 변성된 시료를 -80℃의 냉장고에 보관하였다.

7.2 웨스턴 블롯

1)로딩된 시료를 해동하였다.

2)시료의 로딩:SDS-PAGE겔에 웰당 10μL를 로딩하였다 (샘플 로딩의 양은 필요에 따라 다르다).

3)전기영동: 80볼트, 30분, 이어서 120볼트, 90분.

4)전사: iBlot2 전사 세트 및 전사 장치를 사용하고, P3 프로그램을 7분 동안 실행하였다.

5)전사 완료 후, 검출하고자 하는 단백질의 분자량의 크기에 따라 멤브레인을 절단하고, 1xTBST로 3회, 각 회 5분간, 실온에서, 진탕하면서 세척하였다.

6)밀봉: 멤브레인을 밀봉 용액(1xTBST로 제조된 5%의 탈지유)로 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다.

7)1xTBST로 멤브레인을 회당 5분씩 3회 세척하고 실온에서 진탕시켰다.

8)1차 항체의 인큐베이션: 적절하게 희석된 1차 항체(1xTBST로 5% 탈지유 또는 소 혈청 알부민으로 희석)를 가하고, 4℃에서 밤새 천천히 진탕시켰다.

9)1xTBST로 멤브레인을 회당 10분씩 3회 세척하고 실온에서 진탕시켰다.

10)2차 항체의 인큐베이션: 적절하게 희석된 2차 항체를 가하고 실온에서 1시간 동안 천천히 진탕시켰다.

11)1xTBST로 멤브레인을 회당 10분씩 3 회 세척하고 실온에서 진탕시켰다.

12)화학 발광: West Femto 초고감도 화학 발광 키트의 HRP기질을 멤브레인에 가하였다.

13)Tanon 5200 multi 기기로 화학 발광을 검출하고 사진을 찍었다.

결과는 표 10에 나타내었다. PD(생체내 약효 바이오 마커 검출)의 결과는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A가 BT-474누드 마우스 이종이식 종양 모델에서 PI3K 하류의 Akt의 인산화 수준을 유의하게 억제할 수 있음을 나타내었고, 또한 일정한 시간 및 투여량의 의존성을 나타내었다.

실시예 8. 식(I)으로 표시되는 화합물의 체외 효소 활성 측정

지질 키나제 반응은 적절한 기질 및 ATP 조건에서 진행한 다음, ADP-Glo™ 키트를 사용하여 두 단계로 키나제 활성을 측정하였다. 공정1: 키나제 반응을 종료시키고, 남은 ATP를 완전히 제거하고, ADP만을 남겼다; 공정2: 키나제 검출 시약을 가하여 ADP를 ATP로 전환시키고 루시페린/루시퍼라제 반응을 동반하였다. 마지막으로, 형광 값의 산출값으로 키나제 활성으로 전환하였다. PI3K 효소 활성을 시험하는 조건은 표 16에 나타낸 바와 같다.

실험재료 및 기기:

1)효소:

PI3Kα Millipore #14-602-K

PI3Kβ Promega #V1751

PI3K δ Millipore #14-604-K

PI3K γ Millipore #14-558-K

2）키트: ADP-Glo™?? 지질 키나제 및 PIP2:3PS 키트(Promega#V1792)

키트에는: 1mM PIP2:3PS, 10Х지질 희석 완충액, 1M 염화마그네슘, 10mM ATP, 10mM ADP, ADP-Glo 시약, 검출 완충액 및 검출 기질이 포함된다.

3）반응 웰 플레이트:OptiPlate-384, 흰색 투명(PerkinElmer#6007299)

시약 준비:

1)10Х반응 완충액: 500mM HEPES, pH7.5, 500mM NaCl, 9mM MgCl2; BSA: 10%의 스톡 용액, 직접 제조.

2)최종 측정계의 조건: 1Х반응계:50mM HEPES, 50mM NaCl, 3mM MgCl₂, 0.01%의 BSA(실험 당일 새로 제조), 1%의 DMSO(v/v)+/-화합물

3)반응계: 3μL의 효소 및 기질의 혼합물(1:1)+2μL의 ATP/MgCl₂ 혼합물+5μL의 ADP-Glo시약+10μL의 검출 시약.

구체적인 실험 조작은 다음과 같다:

1)화합물의 희석: Echo를 사용하여 50nL의 100Х화합물/DMSO를 측정 웰 플레이트에 옮겼다.

-PI3Kα의 경우, 화합물을 최고 농도의 0.111mM에서 3배로 희석하여 총 10의 농도로 하였다.

-PI3Kβ/PI3Kδ/PI3Kβ의 경우, 화합물을 최고 농도인 1.11mM에서 3 배로 희석하여 총 10개의 농도로 하였다.

2)키나제 반응:

(1)시험 화합물을 준비하고 50nL의 100화합물 용액 또는 DMSO를 상응한 웰 플레이트에 가하였다.

(2)3.33Х반응 완충액을 준비하였다.

(3)3.33ХPIP2:3PS를 준비하고 사용하기 전에 PIP2:3PS를 볼텍스로 적어도 1분간 해동시켰다.

(4)5.25mM의 MgCl₂를 포함하는 2.5mM을 준비하였다.

(5)3.33ХPI3Kα/PI3Kβ/PI3Kδ/PI3Kγ 용액을 준비하였다

(6)지질 키나제 용액과 PIP2:3PS 용액을 1:1의 체적 비율로 혼합하였다.

(7)3.33Х지질 키나제 완충액과 PIP2:3PS 용액을 1:1의 체적 비율로 혼합하였다.

(8)웰 플레이트의 제1 및 두 제2열에 3μL의 완충액과 PIP2:3PS를 혼합 용액을 가하였다.

(9)웰 플레이트의 제1 및 제2열을 제외한 웰에 3μL의 효소와 PIP2:3PS의 혼합 용액을 가하고, 10초간 원심분리하였다(1000rpm). 23℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.

(10)2μL의 2.5n1000rpm2를 가하고 균일하게 진탕시켰다.

(11)웰 플레이트를 덮고, 약 30초 동안 균일하게 진탕시키고, 23℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

(12)5μL의 10mM MgCl₂를 함유하는 ADP-Glo 시약을 가하였다.

(13)1000rpm으로 10초간 원심분리하고, 웰 플레이트를 덮고, 약 30초간 균일하게 진탕하고, 23℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.

(14)10μL의 키나제 검출 시약을 가하였다.

(15)1000rpm으로 10초간 원심분리한 다음, 23℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.

(16)Envision 기기로 형광값을 측정하였다.

실시예 9. 식(I)으로 표시되는 화합물의 체외 세포 활성 측정

ELISA 방법에 의해, MCF7 세포주에서 시험 화합물이 신호 전달 경로 중 PI3K하류 단백질 Akt의 인산화를 측정하여 화합물의 세포 활성을 반영하였다.

세포 배양 배지:세포 완전 배지(RPMI1640+10%의 혈청+1%의 L-글루타민+1%의 이중 항체)

무혈청 배양(무혈청, RPMI1640+1%의 L-세르타민+1%의 이중 항체)

구체적인 조작 절차는 다음과 같다:

(1)MCF7 세포(ATCC® HTB-22™)를 96웰 플레이트에 접종하고, 웰당 100μL (웰당 2.5 10⁴개 세포)의 세포 완전 배지로 하고, 37℃ 5%CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

(2)세포 완전 배지를 100μL의 무혈청 배지로 대체하고 밤새 기아 배양하였다.

(3)화합물을 준비하고(화합물의 초기 농도는 1mM이며, 10개 농도를 3배 희석하였다. 각 농도의 화합물을 무혈청 배지로 100배로 희석하였다), 희석한 화합물 25μL를 세포를 포함하는 웰 플레이트에 가하였다.

(4)37℃,5%CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

(5)웰 플레이트 내의 세포를 10μL/mL 인슐린(Sigma#I9278-5mL)으로 자극하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, 1000rpm에서 5분간 실온에서 원심분리하였다.

(6)각 웰에 250μL의 1Х균형염 용액(Invitrogen, #14065-056, 4℃ 1mM/L Na3VO4를 포함)을 가하고 세포를 1회 세척하였다.

(7)각 웰에 100μL의 용해 완충액(트리하이드록시메틸아미노메탄염산염, Invitrogen, #15567-1000ml)을 가하여, 4℃에서 60분 동안 진탕시킨 후, 4℃4000rpm에서 10분간 원심분리하였다.

(8)후속 조작 단계는 ELISA 키트 (TGR BioSciences#EKT002)의 설명서에 따라 진행되었다.

결과는 표 17에 나타낸 바와 같다

식(I)으로 표시되는 화합물의 체외 스크리닝 시험 결과

화합물	PI3Kα IC50(nM)	PI3Kβ IC50(nM)	PI3Kδ IC50(nM)	PI3Kγ IC₅₀(nM)	MCF7 Cell IC₅₀ (nM)
R011（A2）	74.5	168	/	/	230
R012（A10）	13.9	67.9	/	/	>1000
식(I)으로 표시되는 화합물	1.75	192	25.3	19.8	35.3

"/": 계산되지 않음을 나타낸다.

결론: 식(I)으로 표시되는 화합물은 PI3K 키나제의 활성을 잘 억제할 수 있고, 동시에 PI3Kβ/γ/δ에 대해 높은 서브타입 선택성을 나타내었다. 또한, 세포 내 PI3K의 하류에 있는 Akt의 인산화 레벨도 충분히 억제할 수 있다.

Claims

식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A:

X선 분말 회절 스펙트럼이 4.8±0.20°, 12.6±0.2°, 17.3±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 4.8±0.2°, 5.7±0.2°, 6.3±0.2°, 11.5±0.2°, 12.6±0.2°, 13.5±0.2°, 17.3±0.2°, 21.5±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 4.8±0.2°, 5.7±0.2°, 6.3±0.2°, 10.1±0.2°, 11.5±0.2°, 12.6±0.2°, 13.5±0.2°, 15.8±0.2°, 17.3±0.2°, 19.2±0.2°, 21.5±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼에서, 2θ값은 하기의 표에 나타내는 바와 같다.
제1항에 있어서,
XRPD 스펙트럼이 도 1에 도시된 바와 같고；
및/또는, 시차 주사 열량 곡선이 195.5±3.0℃에서 하나의 흡열 피크의 개시점을 가지고；
및/또는, DSC스펙트럼은 도 2에 도시된 바와 같고；
및/또는, 열중량 분석 곡선은 151.6±3.0℃에서 중량 손실이 0.16%에 달하고
및/또는, TGA스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같은 결정형A.
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B:

X선 분말 회절 스펙트럼이 5.0±0.2°, 9.9±0.2°, 12.3±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 5.0±0.2°, 9.9±0.2°, 12.3±0.2°, 14.9±0.2°, 20.2±0.2°, 24.4±0.2°, 27.1±0.2°, 30.1±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼에서, 2θ값은 하기의 표에 나타내는 바와 같다..
제3항에 있어서,
및/또는, 시차 주사 열량 곡선이 178.7±3.0℃에서 하나의 흡열 피크의 개시점을 가지고；
및/또는, DSC 스펙트럼은 도 6에 도시된 바와 같고；
및/또는, 열중량 분석 곡선은 63.4±3.0℃에서 중량 손실이1.03%에 달하고；
및/또는, TGA 스펙트럼은 도 7에 도시된 바와 같은 결정형B
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형C:

X선 분말 회절 스펙트럼이 4.9±0.2°, 5.8±0.2°, 6.8±0.2°, 8.4±0.2°, 12.4±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 4.9±0.2°, 5.8±0.2°, 6.8±0.2°, 8.4±0.2°, 10.8±0.2°, 11.7±0.2°, 12.4±0.2°, 14.3±0.2°, 17.0±0.2°, 17.7±0.2°, 18.7±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼에서, 2θ값은 하기의 표에 나타내는 바와 같다.
제5항에 있어서,
XRPD 스펙트럼이 도 8에 도시된 바와 같은 결정형C
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형D

X선 분말 회절 스펙트럼이 5.1±0.2°, 7.8±0.2°, 11.8±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 5.1±0.2°, 6.5±0.2°, 7.8±0.2°, 11.8±0.2°, 15.4±0.2°, 16.5±0.2°, 17.4±0.2°, 23.8±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼이 5.1±0.2°, 6.5±0.2°, 7.8±0.2°, 11.8±0.2°, 12.0±0.2°, 15.4±0.2°, 16.5±0.2°, 17.4±0.2°, 19.5±0.2°, 23.8±0.2°인 2θ값에서 특징적 회절 피크를 가지고;
또는, X선 분말 회절 스펙트럼에서, 2θ값은 하기의 표에 나타내는 바와 같다.
제7항에 있어서,
XRPD 스펙트럼이 도 9에 도시된 바와 같은 결정형D
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 제조방법으로서,
상기 제조방법은 방법1 또는 방법2이며,
방법1은:
(1) 식(I)으로 표시되는 화합물을 용매에 가하여 현탁액 또는 용액으로 하는 단계;
(2) 상기 현탁액 또는 용액을 항온 믹서에 넣고, 진탕한 후, 원심분리하고, 건조시켜, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 얻는 단계; 를 포함하며
방법2는:
(1) 식(I)으로 표시되는 화합물을 용매에 가하여 가열하여 용해시키는 단계;
(2) 상기 용액을 고체가 석출될 때까지 냉각시키고, 교반하고, 여과하여 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A를 얻는 단계; 를 포함하는 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형A의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 용매는 알코올 용매 및 에스테르 용매로부터 선택되고;
및/또는, 상기 용매는 에탄올, n-부탄올, tert-부탄올, 이소프로판올, 포름산에틸 및 아세트산에틸로부터 선택되는 제조방법.
(1) 식(I)으로 표시되는 화합물을 용매에 가하여 현탁액 또는 용액으로 하는 단계;
(2) 상기 현탁액 또는 용액을 항온 믹서에 넣고, 진탕한 후, 원심분리하고, 건조시켜, 식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B를 얻는 단계를 포함하는
식(I)으로 표시되는 화합물의 결정형B의 제조방법
제11항에 있어서,
상기 용매는 메탄올-물, 에탄올-물 및 아세톤-물로부터 선택되고;
및/또는, 상기 용매는 메탄올-물(2:1), 에탄올-물(2:1), 아세톤-물(2:1) 및 에탄올-물(1:3) 로부터 선택되는 제조방법.제11항에 있어서,
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
교반온도는25℃내지 60℃이고;
및/또는, 교반시간은 12시간 내지 24시간이고;
및/또는, 화합물과 용매의 중량-체적비는 1g:7 내지 10mL인 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
PI3Kα 억제제 관련 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서의 상기 결정형의 용도.
제14항에 있어서,
PI3Kα 억제제 관련 약물이 종양 치료 약물인 것을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 상기 결정형 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약물 조성물.
PI3K 억제제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 따른 결정형 또는 제16항에 따른 약학 조성물의 용도로서,
상기 PI3K 억제제는 바람직하게는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수이고, 더 바람직하게는 PI3Kα 억제제인 용도
약물의 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 결정형 또는 제16항에 따른 약학 조성물의 용도로서;
상기 약물은 바람직하게는 종양 치료 또는 PI3K 관련 질환을 치료하는데 사용되는 약물이고;
상기 PI3K 관련 질환은 바람직하게 종양이고;
상기 PI3K는 바람직하게는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수이고, 더 바람직하게는 PI3Kα인 용도.
환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 결정형 또는 제16항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는PI3K 관련 질환의 치료방법으로서;
상기PI3K 관련 질환은 바람직하게는 종양이고;
상기 PI3K는 바람직하게는 PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 중 한가지 또는 복수이고, 더 바람직하게는 PI3Kα인 종양 또는 PI3K 관련 질환의 치료방법.