PL202948B1

PL202948B1 - Sposób ciągłego uzyskiwania triterpenów z roślin i/lub części roślin oraz emulsja, której fazy wodna i olejowa zemulgowane zostały za pomocą wyciągu roślinnego, który zawiera przynajmniej jeden triterpen i/lub przynajmniej jedną pochodną triterpenu

Info

Publication number: PL202948B1
Application number: PL356723A
Authority: PL
Inventors: Armin Scheffler
Original assignee: Birken Gmbh
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2009-08-31
Also published as: EE200200552A; CA2404147A1; PL356723A1; DK1267900T3; CN100518748C; US20070231418A1; US7482383B2; WO2001072315A1; TR200401400T4; EA200200983A1; NO20024591D0; EP1267900B1; EA006296B1; PT1267900E; US20030087789A1; WO2001072315A9; EA200501002A1; EP1267900A1; AU2001242517A1; DE50102055D1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotowy wynalazek dotyczy sposobu uzyskiwania triterpenów z roślin i/lub ich części składowych oraz emulsji, której fazy wodna i tłuszczowa zemulgowane zostały za pomocą wyciągu roślinnego, przy czym wyciąg roślinny zawiera przynajmniej jeden triterpen i/lub przynajmniej jedną pochodną triterpenów, a emulsja zawiera przynajmniej jeden olej i/lub tłuszcz i wodę.

Naturalne składniki, substancje zapachowe i substancje czynne wyizolowuje się od dawna z całych roślin i ich części, takich jak liście, korzenie, owoce lub kora, za pomocą różnych technik ekstrakcji. Jako jedną z pierwszych substancji naturalnych, w roku 1788 uzyskano z materiału roślinnego betulinę, materiał, który nadaje korze brzozy białą barwę (Lowitz, M., Chemische Analysen, opracowujący: Crell, L., tom 2 str. 312). Pierwszemu wyizolowaniu towarzyszyły badania naukowe, z analizą pierwiastkową betuliny włącznie, które opublikowane zostały przez Hausmann'a w roku 1876 (Hausmann, U., Annalen der Chemie, 182, str. 368).

Rośliny, które zawierają betulinę są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Należą one głównie do roślin okrytonasiennych (=rośliny Angiospermae), przy czym u pojedynczych gatunków rzędu Fagales (krewni buka) a wśród nich zwłaszcza w rodzinie Betulacea (brzozy) zawartość betuliny w zewnętrznej warstwie kory jest najwyższa (artykuł przeglądowy: Hayek, E. W., i inni, (1989), A Bicentennial of Betulin/Dwustulecie betuliny, Phytochemistry, 28(9) strony 2229-2242). Biała część kory brzozy, w szczególności gatunków Betula pendula, Betula verrucosa i Betula papyfera mogą zawierać więcej niż 30% betuliny. Dokładniejsze badania z roku 1983 przedstawione zostały przez Rainer'a Ekmana'a, zgodnie z czym, z wysuszonej zewnętrznej kory Betula verrucosa wyekstrahowano 21-40% triterpenów, względnie 16,7-34% betuliny (Ekman, R., (1983a), Holzforschung, 37, str. 205-211). Odwrotnie, kora wewnętrzna zawiera tylko ślady triterpenów w zakresie około 0,37-0,43% (Ekman, R., (1983b), Finn. Chem. Letters, str. 162).

Betulina jest pięciocyklicznym triterepenem o szkielecie lupanowym, który określany jest także betulinolem, trochotonem, kamforą brzozową i (coryli-)resinolem. Charakterystyczną cechą grupy lupanu jest pierścień z pięcioma atomami węgla wewnątrz pięcioczłonowego układu cyklicznego, który w pozycji C-19 zawiera grupę α -izopentenylową . Betulina odznacza si ę ponadto dużą trwało ś cią cieplną a jej temperatura topnienia leży między 250 a 261°C, przy czym po sublimacji przekrystalizowywanego produktu otrzymano jeszcze wyższe wartości. Jej ciężar cząsteczkowy wynosi 442,7, jest ona rozpuszczalna w pirydynie i tetrahydrofuranie, ale tylko nieznacznie rozpuszczalna w dichlorometanie, chloroformie i zimnych rozpuszczalnikach organicznych, przy czym rozpuszczalność znacznie wzrasta ze wzrostem temperatury. W wodzie i zimnym eterze naftowym (węglowodory z 5 do 8 atomami C (węglowodory C5-C8)) betulina jest praktycznie nierozpuszczalna. Badania kinetyczne wykazały ponadto bardzo małą reaktywność grup hydroksylowych betuliny (artykuł przeglądowy: Jaaskelainen, P., (1981), Paperi ja Puu- Papper och Tra 10, str. 599-603).

Już w roku 1899 J. Wheeler stwierdził antyseptyczne własności betuliny i dlatego stosowano ją do sterylizacji materiałów opatrunkowych i plastrów na rany (Wheeler, J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation/Wytwarzanie betuliny przez sublimację, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, str. 353). W medycynie naturalnej i medycynie ludowej uzyskiwano i uzyskuje się jeszcze dziś wywary z kory brzozowej, przy czym najczęściej stosuje się tylko wewnętrzną część, która zawiera jedynie resztki białej części kory i ze względu na upośledzoną rozpuszczalność prawie nie zawiera betuliny, ponieważ zawartość betuliny w wewnętrznej części kory wynosi < 0,5% a betulina jest nierozpuszczalna w wodzie lub mieszaninach woda - alkohol (do 60% alkoholu) (Ekman, R., (1983b) jak wyżej).

Tak uzyskany odwar stosuje się do leczenia zimnicy, puchliny, dny i w chorobach skóry, oraz jako krople do okładów na wrzody. Korę brzozy stosuje się ponadto do wytwarzania oleju z kory brzozy, który stosuje się także do leczenia reumatyzmu i jako substancję zapachową (Hansel, R i inni, (opracowujący), (1994), Drogen A-D, Springer Verlag, rozdział Betula, strony 502-511; Hayek, E. W., jak wyżej). Znane jest ponadto stosowanie wywarów z brzozy, jako dodatku do kąpieli, szczególnie do leczenia potliwości stóp oraz jako dodatku do szamponów, jako środka do pielęgnacji włosów (Nowak, G., (1966), Cosmetic and Medicinal Properties of the Birch/Kosmetyczne i lecznicze własności brzozy, Amer. Perfumer Cosmet., 81, strona 37). Jednak i w tym wypadku stosuje się tylko wodne wyciągi z liści brzozy, które praktycznie nie zawierają betuliny.

Nowsze badania naprowadzają na możliwość osiągania leczniczego działania betuliny i pochodnych betuliny. W badaniach na zwierzętach kwas betulinowy hamował replikację retrowirusów,

PL 202 948 B1 zwłaszcza ludzkiego wirusa braku odporności (HIV1). Opisane bakteriostatyczne i bakteriobójcze działanie betuliny przeciwko bakteriom znajdowanym w jelitach: Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri i Staphylococcus aureus nasuwa przypuszczenie co do jej szerokiej przydatności w medycynie (Chen Sun, J. i inni, (1998), Anti AIDS-Agents, 32, Synthesis and anti-HIV activity of Betulin derivates/Środki przeciwko HIV 32, Synteza i działanie anty-HIV pochodnych betuliny, Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 8, strony 1267-1272; Evers, M. i inni (1996), Betulinic acid derivates: a new class of human immunodeficiency virus type 1 specific inhibitors with a new mode of action/Pochodne kwasu betulinowego: nowa klasa specyficznych inhibitorów wirusa braku odporności typu 1 o nowym typie działania, J. Med. Chem. 39, strony 1056-1068; Hayek, E. W. i inni, jak wyżej). Ponadto betulina, jak i pochodne betuliny mogą wykazywać działanie hamujące stan zapalny, podobne do działania kortyzonu, jak też działanie cytostatyczne w zastosowaniu do różnych linii komórek nowotworowych in vitro (Carmen Recio, M. i inni (1995), Investigations on steroidal anti inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas/Badania nad działaniem przeciwzapalnym triterpenoidów z Diospyros leucomelas, Planta Med., 61, str. 9-12; Yasukawa, K. i inni (1991), Sterol and triterpene derivates from plants.../Sterol i pochodne triterpenów z roślin (...), Oncogene 48, strony 72-76).

Do uzyskiwania betuliny z kory brzozy, zwłaszcza z korka brzozy, obok sublimacji (Lowitz, M., jak wyżej) wchodzi w grę przede wszystkim ekstrakcja we wrzących rozpuszczalnikach. Jako rozpuszczalnik stosuje się przy tym głównie alkohole i chlorowane węglowodory (Ukkonen, K. i Era, V. (1979), Kemia-Kemi 5, str. 217-220; Ekman, R. (1983a) jak wyżej; Eckermann, C. i Ekman R. (1985), Paperi ja Puu - Papper och Tra 3, str. 100-106; O'Connell, M. M. i inni (1988), Phytochemistry 7 str. 2175 -2176; Hua, Y. i inni (1991), Journal of Wood Chemistry and Technology, 11(4), str. 503-516).

Wadą technologii sublimacyjnej jest fakt, że zawarte substancje otrzymuje się z niewielką wydajnością, co sprawia, że konieczne staje się stosowanie dużej ilości surowca wyjściowego. Szczególnie niekorzystne w technologii sublimacyjnej jest ponadto równoczesne występowanie smolistych produktów rozkładu z innych składników korka/kory, co sprawia, że konieczna staje się wielokrotna ponowna sublimacja lub przekrystalizowywanie. Przy zastosowaniu metody ekstrakcji szczególnie niekorzystne jest, że betulina jest stosunkowo słabo rozpuszczalna w wymienionych rozpuszczalnikach i ekstrakcję można prowadzić tylko przy dużym nakładzie czasowym. Także i tu wymagane jest wielokrotne przekrystalizowywanie. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy tym za pomocą węglowodorów o wysokiej temperaturze wrzenia (Eckermann, C, i Ekman, R. (1985) patrz wyżej). Są one jednak szczególnie niekorzystne w odniesieniu do kosmetyków i środków leczniczych, ze względu na pozostawanie resztek rozpuszczalników w preparacie, które są nie do uniknięcia.

Rozpuszczalniki, w których betulina dobrze się rozpuszcza, takie przykładowo jak pirydyna i tetrahydrofuran, generalnie należą do trujących. Różnią się one pod względem ryzyka dla zdrowia, lecz różni je także nieznacznie sposób postępowania podczas ekstrakcji. Dalszą wadą wymienionych rozpuszczalników jest to, że równocześnie zostają rozpuszczone znaczne ilości brązowawych niepożądanych substancji, których późniejsze oddzielenie wymaga niezwykle dużych nakładów i jest nieekonomiczne. Z tego względu nie ma do dziś żadnego skutecznego sposobu uzyskiwania betuliny z kory brzozy, którym można by było uzyskiwać betulinę o wysokim stopniu czystości i bez stosowania rozpuszczalników, niebezpiecznych dla zdrowia.

Ze stanu techniki znane są ponadto tylko sposoby ekstrakcji lipofilowych substancji naturalnych pod wysokim ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze. W opisie patentowym USA Nr 5 843 311 opisany został przykładowo sposób izolowania organicznych materiałów za pomocą organicznych rozpuszczalników. Z pomocą tego sposobu analitycznego, który stosuje się w małej skali, można badać próbki na zawartość kontaminacji, zanieczyszczeń, lub dodatków. Ten sposób analityczny znajduje zastosowanie głównie do kontroli w przemyśle spożywczym i do używek, w przemyśle farmaceutycznym i podczas analizy próbek gleby. Niekorzystne dla tego sposobu jest jego zastosowanie, które ogranicza się do skali analitycznej.

W opisie patentowym USA 5 647 976 opisany został reaktor, który można stosować do ekstrakcji zawartych substancji za pomocą rozpuszczalnika pod wysokim ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze. Reaktor taki charakteryzuje zamknięcie, które umożliwia doprowadzanie rozpuszczalnika do reaktora i jego usuwanie z reaktora, bez konieczności zniszczenia tego zamknięcia. W ten sposób zapobiega się skutecznie kontaminacjom rozpuszczalnika. Reaktor można ponadto łatwo obsługiwać, tak, że jego stosowanie dostępne jest nawet dla niewyszkolonego personelu. W opisie patentowym USA 5 647 976 opisano jedynie wymieniony reaktor, jednak z opisu nie można wywodzić żadnych wskazówek co do sposobu realizacji ekstrakcji. Nie zawiera on także żadnych danych na temat jakości

PL 202 948 B1 i czystości zawartych substancji wyodrę bnianych w reaktorze. W opisie patentowym USA 5 660 727 opisano zastosowanie reaktora z opisu Nr 5 647 976 w automatycznej jednostce obrotowej, która umożliwia równoczesne wykonywanie analiz wielu próbek. Objętość reaktorów, które mogą być zastosowane w jednostce obrotowej, mieści się w zakresie między 10 a 30 ml. Dlatego też zastosowanie tego urządzenia jest ograniczone tylko do wykorzystania go w skali analitycznej, nie nadaje się ono natomiast do zastosowania w skali przemysłowej.

W opisie patentowym USA Nr 5 785 856, który stanowi część wydzieloną z patentu USA Nr 5 660 727, obok jednostki rotacyjnej opisany został także sposób ekstrakcji zawartych substancji z zastosowaniem rozpuszczalników. Sposób realizuje się pod zwiększonym ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze. W tym celu reaktor napełnia się próbką materiału do analizy, wprowadza do jednostki rotacyjnej i automatycznie zadaje rozpuszczalnikiem. Następnie podwyższa się ciśnienie i temperaturę do zadanych wartości. Po przeprowadzeniu ekstrakcji rozpuszczalnik odprowadza się do pojemnika odbiorczego. Reaktor wraz z przewodami doprowadzającymi i odprowadzającymi można przepłukać gazem obojętnym, takim przykładowo jak azot, w celu oczyszczenia. Niekorzystne dla tego sposobu jest w szczególności to, że nadaje się on wprawdzie do stwierdzania obecności rozpuszczalnych substancji w próbce do analizy, lecz nie nadaje się on lub nadaje się tylko z trudem do preparacyjnego wytwarzania i uzyskiwania zawartych substancji w większej ilości i o dużej czystości, ponieważ, w tym wypadku, zawarte w próbce zanieczyszczenia bardzo szkodliwie oddziałują na czystość ekstrahowanego składnika. Ponadto sposób opisany w opisie USA Nr 5 785 856, ze względu na jego istotę ogranicza się do stosowania go w skali analitycznej. Dokument nie zawiera żadnych danych na temat uzyskiwanego stopnia czystości i możliwości zastosowania w skali wielkoprzemysłowej.

Wszystkie sposoby opisane w stanie techniki pracują w sposób okresowy, to znaczy ekstrahuje się zawsze każdorazowo określoną zawartość zbiornika, który się napełnia a następnie opróżnia. Dotychczas nie zrealizowano żadnego ciągłego sposobu, zgodnie z którym materiał roślinny i świeży rozpuszczalnik doprowadzano by w sposób ciągły, prowadzono by w sposób ciągły ekstrakcję, jak też równocześnie można było odprowadzać rozpuszczalnik nasycony ekstraktem wraz z wyczerpanym całkowicie materiałem roślinnym.

W stanie techniki były także podejmowane pewne próby modyfikowania własności powierzchniowo czynnych betuliny, dla wytworzenia produktu nadającego się do wykorzystania technicznego. Tak więc już w latach 60-tych Pasich badał betulinę i jej estry, takie jak bursztynian, ftalan i tetrachloroftalan, jako emulgatory dla białej wazeliny, tranu wielorybiego i oleju z orzeszków ziemnych i doszedł do wniosku, że betulina, ze względu na swe własności emulgujące, to znaczy swą zdolność do wiązania między sobą składników wodnych i olejowych, była porównywalna ze znanymi technicznymi emulgatorami. Jego emulgatory zawierające betulinę były jednak mało trwałe. Stosował on przekrystalizowaną betulinę i nie uzyskiwał emulsji o wystarczającej trwałości. Najkorzystniejsze były ftalany i tetrachloroftalany, które wytwarzano ze względu na wyższą rozpuszczalność. Z emulsji oddzielała się w krótkim czasie warstwa olejowa, co wskazywało na niewystarczając ą trwałość. Ponadto opisane emulsje zadawano środkami konserwującymi działającymi przeciwbakteryjnie, przy czym przeważnie stosowano pochodne kwasu benzoesowego (Pasich, J., (1965), Triterpenoid emulsifiers of plant origin V. Emusifying properties of Betulin and certain of its esters/Tritepenoidowe emulgatory pochodzenia roślinnego V. Emulgujące własności betuliny i pewnych jej estrów, Farm. Polska, 21 Nr 17-18, strony 661-666).

Jednakże właśnie dodatek środków konserwujących, które z jednej strony mogą wywoływać działanie alergiczne i toksyczne, niweczy korzystny efekt leczniczy betuliny, szczególnie na uszkodzonej skórze, a zatem znane z literatury preparaty emulsji zawierające betulinę w nowoczesnej pielęgnacji skóry nie znajdowały zastosowania lub można je było stosować tylko w ograniczonym stopniu. Takie wady znanego stanu techniki, pomimo dużych ilości kory z brzozy, odpadającej jako produkt odpadowy podczas uzyskiwania drewna nie prowadzą do zwiększenia skali technicznej obróbki, wykorzystania lub spożytkowania triterpenów zawartych w korku brzozy, zwłaszcza zawartej w dużych ilościach betuliny.

Ilości niewykorzystanej dotychczas betuliny są ogromne. Tylko w jednej pojedynczej celulozowni w Finlandii (UPM Kymmene, Lappeenranta, Finlandia) spala się rocznie około 4000 do 5000 ton betuliny nadającej się do ekstrakcji. W Szwecji, Finlandii, Rosji i Kanadzie czynnych jest wiele celulozowni tej wielkości. Jednym z problemów wymagających rozwiązania zgodnie z niniejszym wynalazkiem stało się umożliwienie przemysłowego wykorzystania narastającej ilości surowca, nadającego się

PL 202 948 B1 do przemysłowego wykorzystania poprzez opracowanie nowego sposobu jego przetwarzania, dotychczas nieznanego.

U podstaw opracowania zgodnego z niniejszym wynalazkiem wył onił się najpierw cel zrealizowania takiego sposobu, który prowadziłby do możliwości uzyskiwania dużych ilości triterpenów o wysokim stopniu czystości z umiarkowanym zużyciem rozpuszczalnika, zarówno przy pracy ciągłej jak i przy pracy okresowej. Zadaniem wynalazku był o takż e stworzenie moż liwoś ci spoż ytkowania kory z brzozy, występującej w przemyśle drzewnym jako produkt odpadowy. Sposób powinien być prosty, ekonomiczny i szybki do przeprowadzenia. Sposób powinien także zapewnić, żeby pozostałości rozpuszczalnika w ekstrakcie odpowiadały normom Europejskiej Farmakopei, a w szczególności „Guideline for Residual Sovents/Wskazówki dla pozostałości rozpuszczalników”: ICH Q3C-Impurities (ICH = międzynarodowa konferencja dotycząca uzgodnienia wymagań technicznych dla rejestracji farmaceutyków do stosowania dla ludzi). U podstaw opracowania wynalazku leżało ponadto wytworzenie emulsji zawierających triterpeny, które wykazywałyby działanie farmaceutycznie czynne a równocześnie byłyby wystarczająco trwałe przez długi okres czasu, bez dodawania środków konserwujących. Emulsje powinny także być wytwarzane łatwym sposobem.

Pierwsze zadanie rozwiązano zgodnie z wynalazkiem dzięki temu, że sposób ciągłego uzyskiwania triterpenów z roślin i/lub ich części, prowadzi się poprzez ciągłe doprowadzanie części roślin i rozpuszczalnika, w którym rozpuszczalność triterpenów wynosi nie wię cej niż 1 g/litr oraz najpierw wymywa się części roślin rozpuszczalnikiem w przeciwprądzie w temperaturze 20°C do 70°C, a następnie triterpeny ciągle ekstrahuje się rozpuszczalnikiem w temperaturze od 50°C do 200°C i pod zwiększonym ciśnieniem 100 kPa do 30 000 kPa w przeciwprądzie. Następnie przeprowadza się ciągłe chłodzenie i równoczesne obniżenie ciśnienia roztworu zawierającego triterpeny, podczas którego to etapu triterpeny w rozpuszczalniku wykrystalizowują z rozpuszczalnika z poprzedniego etapu w postaci subtelnie rozdrobnionych czą stek, a dalsze triterpeny przy postępują cym dalej schł adzaniu, wykrystalizowują na tych cząstkach. W celu dalszego polepszenia czystości triterpenów, po odsączeniu w temperaturze pokojowej przemywa się je świeżym rozpuszczalnikiem. Dzięki takiemu sposobowi uzyskuje się w szczególności to, że triterpeny można uzyskiwać w prosty sposób w skali wielkoprzemysłowej.

W zakresie niniejszego wynalazku określenie „wymywanie w rozpuszczalniku, w którym triterpeny nie są rozpuszczalne lub mało rozpuszczalne” oznacza, że rozpuszczalność triterpenów wynosi nie więcej niż 1 g/litr. Dzięki tak przebiegającemu pierwszemu etapowi wymywania usuwa się, korzystnie, łatwiej rozpuszczalne zanieczyszczenia.

Ekstrakcję triterpenów prowadzi się rozpuszczalnikiem pod zwiększonym ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze, ewentualnie w stanie nadkrytycznym. Jako rozpuszczalniki można tu stosować, przykładowo, dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym oraz węglowodory w stanie nadkrytycznym, jak też węglowodory ciekłe pod zwiększonym ciśnieniem lub mieszaniny różnych węglowodorów.

Przed wymywaniem triterpenów rozpuszczalnikiem placek filtracyjny nie musi być, korzystnie, wysuszony w dalszym etapie. Dzięki temu sposób daje się szczególnie łatwo realizować.

Samo wymywanie triterpenów rozpuszczalnikiem można przeprowadzić ponadto w normalnych warunkach, w celu realizacji przebiegu operacji w szczególnie mało nakładowy i ekonomiczny sposób.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania wynalazku, sposób prowadzi się nieprzerwanie. W tym celu materiał roś linny i zimny rozpuszczalnik wprowadza się do rury odpornej na ciśnienie za pomocą pomp i wymywa w przeciwprądzie w temperaturach od 20°C do 70°C. Poprzez drugi układ pomp, wymyty materiał przeprowadza się ewentualnie do drugiej rury ogrzewanej i odpornej na ciśnienia i ekstrahuje w przeciwprądzie świeżym rozpuszczalnikiem podgrzanym do stanu nadkrytycznego lub ciekłym. Wyprowadzanie roztworu myjącego i po ekstrakcji prowadzi się każdorazowo przez układ filtrujący. Części roślin wprowadza się w przeciwprądzie do strumienia rozpuszczalnika, dzięki różnicy ich gęstości i wyprowadza przez śluzy na przeciwległym końcu od wylotu rozpuszczalnika. Roztwór po ekstrakcji przeprowadza się - z zachowaniem ciśnienia w układzie ekstrakcyjnym - do układu zaworów dysz rozpyłowych i najpierw odpręża.

Kora brzozy jest gromadzona w dużych ilościach, jako ekonomiczny surowiec, w szczególności jako produkt odpadowy z celulozowni. W korzystnej postaci wykonania niniejszego wynalazku triterpeny uzyskuje się z kory brzozy, korzystnie z białej części kory brzozy, którą określa się także jako korek brzozy.

„Oddzielony korek brzozy” stanowi zarówno białą zewnętrzną warstwę oddzielaną ręcznie, która jako skóra kory pokrywa pnie drzew brzozy na zewnątrz i dlatego leży na zewnątrz kory właściwej,

PL 202 948 B1 jak też jako korek brzozy, oddzielony (odseparowany) później od całej złuszczonej otoczki, przykładowo za pomocą młyna młotkowego i za pomocą flotacji.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania otrzymuje się triterpeny o stopniu czystości przynamniej 80%, korzystnie 85%, w szczególności 90% a szczególnie korzystnie ponad 90%.

Głównym składnikiem wyekstrahowanych triterpenów jest w dalszej postaci wykonania wynalazku betulina, przy czym jej zawartość wynosi przynajmniej 80%, korzystnie 85%, w szczególności 90% a szczególnie korzystnie ponad 90%.

Korzystne jest przy tym, aby w pierwszym etapie wymywania, w czasie ekstrakcji właściwej i w końcowym etapie mycia stosowany był taki sam rozpuszczalnik. W ten sposób można uzyskać lepszą czystość. Ponadto sposób daje się w wyjątkowo prosty sposób zrealizować przy stosowaniu tylko jednego rozpuszczalnika.

Rozpuszczalnikami mogą być, korzystnie, węglowodory o niskiej temperaturze wrzenia lub mieszanina, zwłaszcza węglowodory o niskiej temperaturze wrzenia, ponieważ węglowodory o niskiej temperaturze wrzenia można potem w łatwy sposób usunąć. Temperatura wrzenia stosowanego węglowodoru, względnie mieszaniny węglowodorów wynosi wtedy, korzystnie, poniżej 100°C. Szczególnie korzystne jest stosowanie n-pentanu, n-heksanu lub n-heptanu, wszystkie są ekonomiczne, nie przedstawiają sobą żadnego szczególnego ryzyka dla zdrowia, stoją do dyspozycji w wystarczających ilościach i mają dobrą jakość.

Okazało się szczególnie korzystnym wykorzystanie w pierwszym etapie wymywania rozpuszczalnika, który stanowi przesącz po ekstracji głównej. W ten sposób skutecznie usuwa się najpierw zgrubne zanieczyszczenia materiału wyjściowego, bez konieczności wprowadzania dodatkowego świeżego rozpuszczalnika. Takie zanieczyszczenia lub produkty uboczne wpływałyby ujemnie na czystość podczas ekstrakcji. W celu dalszego podniesienia stopnia czystości, ekstrahowane zawarte substancje można potem wymywać świeżym rozpuszczalnikiem.

W korzystnej postaci wykonania pierwszy etap wymywania prowadzi się pod ciś nieniem w zakresie od 100 kPa do 30000 kPa, korzystnie 1000 do 3500 kPa, szczególnie korzystnie 2500 kPa. Właściwą ekstrakcję prowadzi się, korzystnie, w temperaturze od 50 do 200°C, bardziej korzystnie w temperaturze 140°C do 160°C, szczególnie korzystnie 150°C i pod ciśnieniem od 1000 kPa do 3500 kPa barów, korzystnie 2500 kPa. W tych warunkach ekstrakcji uzyskuje się duże ilości czystych triterpenów, w szczególności czystej betuliny.

Sposób według wynalazku okazał się szczególnie korzystny, gdy krystalizację triterpenów prowadzi się jako mikrokrystalizację o przeciętnej wielkości ziaren < 40 μm, zwłaszcza od 2 do 32 μm.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest emulsja, której fazy wodna i olejowa zostały zemulgowane za pomocą ekstraktu roślinnego, który zawiera przynajmniej jeden triterpen i/lub przynajmniej jedną pochodną triterpenu, oraz ma ona środki konserwujące, emulgujące i aktywne farmaceutycznie oraz zawiera dalej przynajmniej jeden olej i/lub tłuszcz i wodę, która to emulsja zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że co najmniej jeden triterpen i/lub co najmniej jedna jego pochodna jest jedynym środkiem emulgującym emulsję, jest jedyną substancją czynną farmaceutycznie i stanowi w tej emulsji jedyny środek konserwujący.

Triterpeny i/lub jego pochodne konserwują i emulgują emulsje. Są one ponadto środkiem farmaceutycznie czynnym. Uzyskuje się przez to w szczególności efekt taki, że emulsja nie musi zawierać żadnych dodatkowych środków konserwujących, przez co wykazuje szczególnie wysoki stopień czystości i dobrą tolerancję, przede wszystkim w przypadku problematycznego nakładania na uszkodzoną skórę.

Wyciąg roślinny stanowi przy tym ekstrakt z kory brzozy, korzystnie z białej części kory brzozy, określanej także jako korek brzozy.

W dalszej postaci wykonania wynalazku wyciąg roślinny zawiera przynajmniej jedną z substancji, z grupy zawierającej betulinę, kwas betulinowy, lupeol, erytrodiol, allobetulina, kwas fellonowy, hydroksylakton, aldehyd betulinowy, β-amyrynę, kwas oleanolowy, kwas ursolowy, zestryfikowaną betulinę i/lub β-sito-sterol. Takie substancje, zawarte w roślinach, można stosować w emulsji według wynalazku zarówno pojedynczo, jak też i w różnych kombinacjach ze sobą. Szczególnie dobra kombinacja składa się z > 80% betuliny, < 10% kwasu betulinowego, < 3% lupeolu, < 4% kwasu oleanolowego, < 4% erytrodiolu i < 1% wody.

Emulsja zawiera triterpeny i/lub ich pochodne, korzystnie o stężeniu w zakresie od 2 do 10%. Udział triterpenu i/lub jego pochodnej, zgodnie z wynalazkiem wynosi 2 do 10% łącznej masy emulsji i może zmieniać się w podanych granicach stężeń, w zależności od pożądanej konsystencji.

PL 202 948 B1

Do zastosowania w ciekłym płynie kosmetycznym/lotionie emulsja wykazuje, zgodnie z wynalazkiem stężenie triterpenów i/lub ich pochodnych, które zawiera się w granicach od 2 do 3,5%. Jeśli stosuje się emulsje w postaci kremu, stężenie triterpenów i/lub ich pochodnych wynosi, korzystnie, między 3,5 a 10% łącznej masy emulsji.

Olejowy i/lub tłuszczowy składnik emulsji można wybrać spośród wszystkich olejów i tłuszczów znanych w kosmetyce i dermatologii. Nadają się, zwłaszcza, tłuszcze zwierzęce i roślinne, takie jak olej jojoba, olej z orzeszków ziemnych i olej z oliwek. Szczególnie korzystne jest zastosowanie zgodnie z wynalazkiem oleju awokado i/lub oleju migdałowego.

Do regulacji konsystencji emulsji według wynalazku można dodawać zwykłe środki utrzymujące wilgoć i/lub zagęszczacze i środki zestalające, zgodnie z wynalazkiem przynajmniej jeden środek utrzymujący wilgoć i/lub przynajmniej jeden zagęszczacz. Jako środki utrzymujące wilgoć można stosować zwłaszcza glicerynę i/lub mocznik. W tym celu korzystne są każdorazowo stężenia gliceryny i/lub mocznika w zakresie 3 do 10% w stosunku do ilości emulsji, każdy z tych składników dodany korzystnie w ilości 5% w przeliczeniu na masę emulsji. Jako zagęszczacz można stosować, korzystnie, zgodnie z wynalazkiem przykładowo, polisacharyd, który dodaje się w stężeniu od 0,2 do 2%, korzystnie 0,5%, w przeliczeniu na masę wody. Nadają się tu szczególnie, naturalne polisacharydy oraz dalsze związki cukrowe i ich pochodne, ponieważ nie reagują one z innymi składnikami emulsji, w szczególności nie zmieniają się chemicznie i są zatem chemicznie oboję tne.

Dlatego, korzystne jest stosowanie polisacharydu agar-agar. Agar-agar, uzyskiwany z czerwonych alg, jest mieszaniną agarozy i agaropektyny i posiada tę zaletę, że nie jest rozkładalny przez większość mikroorganizmów. Alternatywnie można stosować polisacharyd karragenan, który w naturze występuje w błonie komórkowej alg czerwonych i brunatnych i odznacza się takimi samymi zaletami, jak agar-agar.

W dalszej postaci wykonania emulsja zawiera 2% do 10% ekstraktu z białej części kory brzozy, 20% do 30% oleju awokado, 10% do 20% oleju migdałowego i 40% do 68% wody. Najbardziej korzystne stężenia wynoszą: 4% ekstraktu z białej części kory brzozy 29,3% oleju awokado, 14,7% oleju migdałowego i 52% wody.

Inna emulsja, wykonana zgodnie z wynalazkiem, zawiera 2% do 10% ekstraktu z białej części kory brzozy, 20 do 30% oleju awokado, 10% do 20% oleju migdałowego, 5% do 10% środka utrzymującego wilgoć i 30% do 63% wody. W tym wypadku najkorzystniejsze stężenia wynoszą 4% ekstraktu z białej części kory brzozy, 29,3% oleju awokado, 14,7% oleju migdałowego, 5% gliceryny i/lub 5% mocznika i 42% do 47% wody.

Ekstrakt z białej części kory brzozy, który znajduje się we wszystkich emulsjach zgodnych z wynalazkiem, zawiera przynajmniej 80% betuliny, maksymalnie 10% kwasu betulinowego, maksymalnie 3% lupeolu i maksymalnie 4% kwasu oleanolowego.

Ze względu na swój skład i stwierdzoną nietoksyczność, emulsje nadają się doskonale do stosowania jako podstawy maści do wmieszania wszystkich znanych fachowcom środków zapachowych, kosmetyków i środków leczniczych.

Emulsja zgodna z wynalazkiem nadaje się do wytwarzania kosmetyku, korzystnie w postaci maści, płynu kosmetycznego, kremu, żelu, galarety, lub szamponu, w szczególności do nanoszenia na skórę, skórę głowy i/lub do inhalacji. Ze względu na ich pokrewieństwo do steroli, triterpeny, w szczególności uzyskiwana betulina, nadają się do pielęgnacji skóry i skóry głowy. Uspakajają i wygładzają one skórę, zmniejszają utratę wody i zapobiegają podrażnieniom i zaczerwienieniom. Kosmetyk można więc dobrze stosować do utrzymania wilgoci i wygładzenia skóry oraz do zmniejszenia plam starczych i do łuszczącej się skóry. Dalszą korzyść stanowi nierozpuszczalność triterpenów w wodzie, tak więc skóra, która silnie i długo narażona jest na działanie wody, jest wyjątkowo dobrze chroniona. Ze względu na działanie przeciwbakteryjne szczególnie korzystne jest zastosowanie w postaci dezodorantu. Dochodzi do tego zmniejszenie potliwoś ci, ze wzglę du na skuteczne zamykanie gruczołów potowych.

Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie zgodnej z wynalazkiem emulsji do wytwarzania środka leczniczego, korzystnie w postaci maści, płynu, kremu, żelu, galarety, lub szamponu, w szczególności do nanoszenia na skórę, skórę głowy i/lub do inhalacji, szczególnie korzystnie przy zmianach dermatologicznych skóry i/lub skóry głowy, przede wszystkim przy świerzbiączce ogniskowej, łuszczycy, łojotokowym zapaleniu skóry, przebarwieniach skóry, stanach przedrakowych skóry oraz do inhalacji przy napadach astmy i/lub do zastępowania glukokortykoidów.

PL 202 948 B1

Ze względu na wysoką czystość, uzyskiwane triterpeny, zwłaszcza uzyskiwana betulina, nadają się także do leczniczego stosowania na uszkodzoną skórę.

Emulsje według wynalazku nadają się tak dobrze do wyżej wymienionego zastosowania, ponieważ ekstrakt z białej części kory brzozy nie wykazuje żadnych własności mutagennych. Przeprowadzono także testy miejscowej toksyczności, przy czym nie wykazywały one w żadnym wypadku własności uczulających.

Opisane dalej przykłady służą do objaśnienia i lepszego zrozumienia niniejszego wynalazku.

P R Z Y K Ł A D Y

Pacjent:

Diagnoza:

Leczenie wstępne:

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

I. Obserwacje z zastosowań

Miejscowi lekarze i lekarze kliniczni obserwowali dermatologiczne zmiany skórne związane z stosowaniem wynalazku. Po diagnozie dokonanej przez lekarza prowadzono leczenie pacjentów emulsjami według wynalazku, wytworzonymi zgodnie z zastrzeganym sposobem według wynalazku.

P r z y k ł a d 1 mężczyzna, 68 lat; ciężka uogólniona łuszczyca;

średnio silna maść kortyzonowa; twarz;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; przez zastosowanie emulsji według wynalazku zapobiegano występowaniu wykwitów łuszczycowych po odstawieniu maści kortyzonowej.

P r z y k ł a d 2

Pacjent:

Diagnoza:

Leczenie wstępne

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 3

Pacjent:

Diagnoza:

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 4

Pacjent:

Diagnoza:

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 5

Pacjent:

Diagnoza:

mężczyzna, 48 lat;

lekka łuszczyca;

średnio silna maść kortyzonowa;

głowa;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; wyleczenie ognisk zapalnych przedmostkowych o wielkości około 5 marek niemieckich na głowie przy stosowaniu emulsji według wynalazku przez 14 dni; ponowne pojawienie się stanu zapalnego (recydywa) po odstawieniu emulsji; ponowne znaczne polepszenie po ponownym przeprowadzeniu leczenia.

kobieta, 5 miesięcy;

świerzbiączka ogniskowa, zrogowaciała, zestarzona, bardzo spękana skóra;

tułów;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; bardzo wyraźne polepszenie, doskonała skuteczność przy równoczesnej dobrej tolerancji.

kobieta, 10 lat;

świerzbiączka ogniskowa, zrogowaciała, zestarzona, bardzo spękana skóra;

tułów;

mężczyzna, 5 miesięcy;

świerzbiączka ogniskowa, zrogowaciała, zestarzona, bardzo;

PL 202 948 B1

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 6 Pacjent: Diagnoza: Zastosowanie: Leczenie wstępne

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 7

Pacjent:

Diagnoza:

Zastosowanie:

Leczenie:

Wynik:

P r z y k ł a d 8

Pacjent:

Diagnoza:

Zastosowanie:

Leczenie:

tu łów;

kobieta, 28 lat;

świerzbiączka ogniskowa, wykwity wierzbiączkowe;

łokcie, twarz, dekolt;

Dermatodoron, maść z antymonu metalicznego, maść Top-Isolon-Bartel, maść Mesembryanthemum;

za pomocą tych maści nie dochodziło do żadnego polepszenia miejsc objętych świerzbiączką;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; znaczne zmniejszenie świerzbiączki.

kobieta, 79 lat;

łojotokowe zapalenie skóry;

głowa;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; zmniejszenie tworzenia się strupów w obszarze czaszki, czerwonawe obszary bledną trochę wolniej.

Wynik:

P r z y k ł a d 9

Pacjent:

Diagnoza:

Zastosowanie:

Leczenie:

kobieta, 55 lat;

silnie swędząca, łuszcząca się, sącząca się egzema;

podudzie;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści; jeszcze nie oceniono.

kobieta, 33 lata;

sucha, silnie swędząca, zliszajowacona, łuszcząca się egzema; podudzie;

nakładanie wielokrotne w ciągu dnia na zaatakowane miejsca skóry emulsji według wynalazku, jako preparatu w postaci maści;

Wynik: jeszcze nie oceniono.

II. Wytwarzanie ekstraktu roślinnego

Surowiec: korek brzozy

A) Opis i zabezpieczenie jakości.

Korek brzozowy dostarczało:

1. „ Przedsiębiorstwo wytwarzające miazgę drzewną Kaukas” (UPM-Kymmenne Lappeen-ranta, Finlandia).

Kaukas oddziela mechanicznie korę od drewna brzozy a korek oddzielany jest także mechanicznie od wewnętrznej kory.

2. Przez odpowiednich współpracowników, którzy ręcznie odcinają korek.

W pierwszym etapie mechanicznie oddzielony i ręcznie odcięty korek brzozowy analizowano odnośnie ich identyczności. W tym celu badano korek mikroskopowo, przy czym pokazywało się wiele poszczególnych warstw korka i komórek soczewkowych, charakterystycznych dla brzozy. Dodatkowo badano surowiec na ilość triterpenów, dających się wyekstrahować za pomocą n-heksanu w temperaturze 140 do 160°C pod wzrastającym ciśnieniem. Ilość triterpenów nadająca się do ekstrakcji, z głównym składnikiem w postaci betuliny, przekraczała 10%, ponieważ tylko w korku brzozowym z białą korą występują takie ilości. Kontrole czystości materiału zamknęły analizy, co do występowania alfatoksyn, metali ciężkich, herbicydów i pestycydów, przeprowadzone na zgodność z standardami europejskimi.

PL 202 948 B1

B) Rozdrabnianie korka

Korek mielono w tartaku (firmy Retsch) i odsiewano z maszyny przez sito o prześwicie otworów 1 mm średnicy. Do dalszej ekstrakcji pobrano tylko cząsteczki o wielkości ziaren > 1 mm.

Ekstrakcja triterpenów:

Podczas ekstrakcji wykorzystano zjawisko polegające na tym, że triterpeny z korka brzozy są praktycznie nierozpuszczalne w zimnym n-heksanie, jednak dobrze rozpuszczają się w gorącym n-heksanie (140 do 160°C), pod ciśnieniem. Sposób ten realizowano w dwóch etapach.

1. Korek oczyszczano w aparacie Soxhlett'a sposobem Soxhlett'a za pomocą n-heksanu (gorącym, < temperatury wrzenia 69°C), aż do momentu, gdy roztwór n-heksanu już nie żółknie.

2. Z wstępnie wymytego granulatu korka za pomocą n-heksanu ekstrahowano składniki czynne w temperaturze 140° do 160°C pod zwiększonym ciśnieniem (ekstrakcja za pomocą aparatury Dionex ASE 300 z naczyniami 100 ml). Przez odprężenie przegrzanego roztworu, zawierającego n-heksan i triterpeny, uzyskano bezpośrednią krystalizację tak, że bezpośrednio w zimnym n-heksanie otrzymano mikrokrystaliczny proszek triterpenów. Proszek ten odsączano i dwukrotnie przemywano zimnym n-heksanem. Triterpeny suszono w temperaturze 80° do 100°C.

Oznaczenie czystości wyciągu:

Czystość ekstraktu/wyciągu oznaczano za pomocą chromatografii gazowej (GC). Wyniki przedstawione zostały w postaci przeglądowej, zawartej w załączniku 1.

Wyniki pomiarów były następujące: betulina: minimum 80%;

kwas betulinowy: maksymalnie 10%;

lupeol: maksymalnie 3%;

kwas oleanolowy: maksymalnie 4%.

Wyniki przeglądu ilustruje, pokazany w załączniku 1 typowy chromatogram z wartościami od 84 do 86% betuliny, 4 do 5% kwasu betulinowego, około 1% lupeolu i około 1% kwasu oleanolowego.

Według wymagań ICH ilość pozostałości rozpuszczalnika n-heksanu musi wynosić < 7,250 mg/kg ekstraktu, ponieważ krem zawierający 4% ekstraktu z brzozy nie może wykazywać więcej, niż 290 mg/kg n-heksanu. Typowe wartości wynoszą 1500 mg/kg n-heksanu w suchym ekstrakcie, co odpowiada około 60 mg/kg w kremie z brzozy.

Kontrola końcowa:

Każdą szarżę badano na zgodność z europejskimi wymaganiami pod względem liczby kwasowej (< 5) i ilości nadtlenków (< 15) za pomocą standaryzowanych sposobów. Zawartość ekstraktu korkowego z brzozy analizowano metodą GC. Prowadzono dalsze badania na zanieczyszczenia mikroorganizmami (< 100/g) a ponadto nie powinny w nich były występować żadne mikroorganizmy chorobotwórcze.

III. Preparaty według wynalazku (krem z brzozy)

W tabeli 1 (Tab. 1) zostały zestawione preparaty według wynalazku. Wykazują one następujące składy:

T a b e l a 1: Skład preparatów

Składnik czynny we wszystkich preparatach	Wyciąg z korka brzozy 40±4 mg kremu (4%)
Preparat	Składnik w %
Krem z brzozy A	29,3 olej awokado 14,7 olej migdałowy 52 woda
Krem z brzozy G	29,3 olej awokado 14,7 olej migdałowy 5 gliceryna 47 woda
Krem z brzozy H	29,3 olej awokado 14,7 olej migdałowy 5 mocznik 47 woda

PL 202 948 B1

Okazało się, że wszystkie trzy preparaty zawierają taką samą ilość składnika czynnego (wyciąg z korka brzozy) oraz oleju awokado i oleju migdałowego. Róż nią się one tylko składnikiem, takim jak mocznik (tylko w kremie H) czy gliceryna (tylko w kremie G). Krem A nie zawiera obu tych składników.

Test trwałości: Stwierdzono, że krem z brzozy można odwirowywać przy 500 x g i pozostaje on trwały w tych warunkach.

IV. Badania toksykologiczne

1. Ostra toksyczność

Ostrą toksyczność wyciągu z brzozy oznacza się na myszach i szczurach przez podawanie dootrzewnowe i podskórne.

Myszy:

Poszczególne dawki wyciągu z brzozy (numer szarży: Bet. 001) w Methocel'u, jako nośniku, podaje się podskórnie pięciu męskim i pięciu żeńskim osobnikom myszy CD-1. Zwierzętom podaje się dawkę 2000 mg/kg w stosunku do masy ciała.

Określa się śmiertelność po 14 dniach od podania pojedynczej dawki, w celu określenia przeciętnej dawki śmiertelnej LD50. W tym samym czasie obserwuje się zwierzęta, aby stwierdzić oznaki toksyczności. Wchodzą w grę, jako takie, miejscowe i układowe reakcje nietolerancji oraz zmiany masy ciała. Zwierzęta na końcu okresu doświadczenia uśmierca się i bada makroskopowo. Ostrą toksyczność ustala się na podstawie Dyrektywy ECL383A:B1.

W podanych warunkach testu (2000 mg wyciągu z korka brzozy/kg masy ciała) nie zaobserwowano żadnej reakcji nietolerancji. Zwierzęta wykazywały podczas okresu prowadzenia doświadczenia oczekiwany przyrost masy. Wyniki zestawiono w tabeli 2 (Tab. 2).

T a b e l a 2: Ostra toksyczność dla myszy Przeciętna masa ciała podczas okresu trwania doświadczenia

Przeciętna masa ciała (g)
	męskie	żeńskie
początek	22,8	19,8
dzień 7	27,0	22,2
dzień 14	31,2	23,6

W badaniach makroskopowych u trzech osobników męskich i u trzech osobników żeńskich stwierdzono jedynie zmiany, które związane były z zastosowaną techniką przebiegu doświadczenia.

W teście toksyczności zakresy pierwszej nietolerancji, najniższa wartość śmiertelna, jak też wartość LD50 znajdują się powyżej dawki 2000 mg wyciągu z brzozy na kg masy ciała.

Podczas dootrzewnowego podawania myszom wyciągu z brzozy, toksyczne objawy obserwowano przy dawce powyżej 500 mg/kg masy ciała. Obserwowano tylko lekkie reakcje toksyczne, takie jak zmniejszona pasywna ruchliwość, zaburzenia koordynacji ruchowej i zmniejszony opór rozciągania mięśni. Wywnioskowano z tego, że objawy toksyczne związane były z zapaleniem błony otrzewnowej (zapaleniem otrzewnej), które zostało wywołane roztworem wyciągu. Nie można było ustalić wartości LD50, tak więc w czasie trwania obserwacji 14 dni wynosiła ona powyżej 2000 mg/kg masy ciała.

Szczury:

Poszczególne dawki wyciągu z brzozy (numer szarży: Bet. 001) w Methocel'u, jako nośniku, podaje się podskórnie pięciu męskim i pięciu żeńskim osobnikom szczurów Sprague-Dawley. Zwierzętom podaje się dawkę 2000 mg/kg w stosunku do masy ciała.

Określa się śmiertelność i objawy zatrucia w 14 dni po podaniu pojedynczej dawki. Zwierzęta na końcu okresu doświadczenia uśmierca się i bada makroskopowo. Ostra toksyczność jest określona w dyrektywie EC L 383A:B1.

W podanych warunkach testu (2000 mg wyciągu z korka brzozy/kg masy ciała) nie zaobserwowano żadnej reakcji nietolerancji. Zwierzęta wykazywały podczas okresu prowadzenia doświadczenia oczekiwany przyrost masy.

W badaniach makroskopowych u jednego osobnika męskiego i u trzech osobników żeńskich stwierdzono jedynie zmiany, które związane były z zastosowaną techniką przebiegu doświadczenia.

Wyniki zestawione zostały w tabeli 3 (tab. 3).

PL 202 948 B1

T a b e l a 3: Ostra toksyczność na szczurach

Objawy/kryteria	Szczury Sprague-Dawley (n=5/dla płci) Wyciąg z brzozy 2000 mg/kg masy ciała
męskie	żeńskie
Miejscowe oznaki nietolerancji	brak	brak
Układowe oznaki nietolerancji	brak	brak
Śmiertelność od 6/24 h	nie by ło	nie by ło
w ciągu 7/14 dno
Przeciętna masa ciała (g)
początek	187,6	174,4
dzień 7	239,8	203,8
dzień 14	280,8	218,0
Hamowanie wzrostu masy ciała	brak	brak
Stwierdzenia makroskopowe	1/5	3/5

W tym teście toksyczności zakresy pierwszej nietolerancji, najniższa wartość śmiertelna jak też wartość LD50 leżą powyżej dawki 2000 mg wyciągu z brzozy na kg masy ciała.

Podczas dootrzewnowego podawania szczurom wyciągu z brzozy toksyczne objawy zaobserwowano przy dawce powyżej 500 mg/kg masy ciała. Zaobserwowano tylko lekkie toksyczne reakcje, takie jak zmniejszona pasywna ruchliwość, zaburzenia koordynacji ruchowej i zmniejszony opór rozciągania mięśni. Wywnioskowano z tego, że objawy toksyczne związane są z zapaleniem błony otrzewnowej (zapaleniem otrzewnej), które zostało wywołane roztworem wyciągu. Nie można było ustalić wartości LD50, tak więc w czasie trwania obserwacji 14 dni wynosiła ona powyżej 2000 mg/kg masy ciała.

Wnioski końcowe:

Dyrektywy OECD stwierdzają, że nie są potrzebne żadne dalsze doświadczenia, jeśli przy podawaniu myszom i szczurom badanego produktu w ilości 2000 g/kg masy ciała w ciągu 14 dni nie występuje żadna śmiertelność, spowodowana przez badany produkt.

Chemikalia uporządkowane są pod kątem toksyczności względnej. Określa się je jako toksyczne, jeśli wartość LD50 zawiera się w zakresie między 50 a 500 mg/kg masy ciała. Przy wartości LD50 w zakresie od 5000 do 15000 mg/kg masy ciała nie występuje praktycznie żadna toksyczność.

W tym wypadku wychodzi się z wartości LD50 > 2000 mg/kg masy ciała, która leży prawdopodobnie także > 5000 mg/kg masy ciała, ponieważ już przy tak dużej wartości jak 2000 mg/kg masy ciała nie wystąpiły żadne objawy toksyczne. Jak to wynika z wyników przeprowadzonych badań, wyciąg z brzozy można określić jako nietoksyczny.

2. Toksyczność podostra

Szczury, dootrzewnowo (i.p.)

Wyciąg z brzozy (numer szarży: Bet. 009) w Methocel'u, jako nośniku, podaje się szczurom doświadczalnym (Sprague-Dawley/Crl: CD^® BR) za pomocą iniekcji dootrzewnowych przez 14 dni w ramach badania toksyczności podostrej. Protokół z doświadczeń zestawiony został w postaci tabeli 4 (Tab. 4).

T a b e l a 4: Protokół doś wiadczeń toksyczności podostrej (szczury, i.p.)

Zwierzęta:

szczurów Sprague-Dawley Crl:CD^® BR (20 osobników męskich, 20 osobników żeńskich)

Grupy zwierząt: grupa1-5 osobników męskich/5 osobników żeńskich na grupę dodatkowe 4 zwierzęta zapasowe (2 męskie/2 żeńskie) do możliwej wymiany podczas fazy dostosowawczej

Produkt badany*: wyciąg z brzozy (=składnik kremu z brzozy)

PL 202 948 B1 _cd. tabeli 4

Numer szarży Bet. 009 Materiał nośnika: olej sezamowy

Wielkości dawki:

Grupa 1: 20 ml nośnika/kg masy ciała/dzień Grupa 2: 500 mg/kg masy ciała/dzień Grupa 3: 1000 mg/kg masy ciała/dzień Grupa 4: 2000 mg/kg masy ciała/dzień

Podawana objętość:

ml/kg masy ciała/dzień

Ilość dawek: 1

Długość okresu podawania: 14 dni (dni 1-14)

Długość trwania doświadczenia: 15 dni (dni 1-15) * Triterpeny z wyciągu z brzozy są nierozpuszczalne w nośniku i występują jako jednorodnie rozproszone (mikro-krystaliczny proszek)

Takie badania toksyczności podostrej przeprowadza się w celu określenia dawki, która zostanie zastosowana w czterotygodniowych badaniach toksyczności podchronicznej. Wyniki badań toksyczności podane zostały w tabeli 5 (Tab. 5).

T a b e l a 5 Badania toksyczności podostrej na szczurach

	1	2	3	4
Śmiertelność	żadna	żadna	żadna	N=8¹⁾
Stwierdzenia kliniczne: znacznie powiększony brzuch	brak	u jednego zwierzęcia ²⁾ > 13 dnia	u wszystkich zwierząt > 10 dnia > 7 dni
Szorstkie futerko	nie	nie	u wszystkich zwierząt > 10 dnia > 7 dni
Utrata masy ciała	nie występuje	u wszystkich męskich osobników > 1 tygodniu	u obu płci > 1 tygodnia
		-18% -4% koniec 2 tygodnia -15% -12%	-15%* (męskie) -12% (żeńskie)
Zmiany pobierania pokarmu	brak	brak	brak	zmniejszenie w 1 tygodniu badania: męskie: -29% żeńskie: -31%
Zmiany hematologiczne	brak (patrz tab. 6)	brak (patrz tab. 6)	inne niż w grupie kontrolnej (patrz tab. 6)
Zmiany w biochemii klinicznej (patrz tabela 6)	brak	mocznik ASAT	mocznik ASAT LDH	mocznik ASAT LDH i wszystkie dalsze parametry u osobników żeńskich i prawie wszystkie parametry u osobników męskich

Objaśnienia do tabeli 5:

*) p < 0,01 w stosunku do grupy kontrolnej ¹) 4 osobniki męskie, 4 osobniki żeńskie (dni 11-15) ²) 4 z 5 osobników żeńskich, 2 z 5 osobników męskich

PL 202 948 B1

Zmiany klinicznej biochemii (tabela 5) w stosunku do grupy kontrolnej są znaczne tylko w grupach 3 i 4 (p < 0,01); w grupie 3 dotyczy to aktywności ASAT (+113/+132%), w grupie 4 tylko dla osobników żeńskich dotyczą następujących parametrów: białko łączne, mocznik we krwi, wapń, potas i aktywność LDH.

T a b e l a 6: Hematologiczne zmiany w badaniach toksyczności podostrej szczury, i.p.). Określenia dla grup 3 i 4 por. Tab. 5

Parametr	Grupa
	3, zmiany w %	4, zmiany w %
	męskie	żeńskie	męskie	żeńskie
Liczba płytek	-	+ 47 **	+ 80	+ 54**
Liczba retykulocytów	-	-	+ 64	+ 36**
Liczba leukocytów	-	-	-	- 34

Objaśnienia do Tab. 6:

**) p < 0,01 w stosunku do grupy kontrolnej

Zewnętrzne oględziny przed badaniem po uśmierceniu pokazywały umiarkowane do dużego powiększenie brzucha we wszystkich grupach, za wyjątkiem grupy kontrolnej, w której u wszystkich zwierząt brzuch był tylko nieznacznie powiększony. Wyniki badań makroskopowych po uśmierceniu zostały pokazane w tabeli 7 (Tab. 7).

T a b e l a 7: Stwierdzenia po uśmierceniu w badaniach toksyczności podostrej - określenie grup porównaj tabela 4

	Grupa
1	2	3	4
Biało-żółty płyn w przestrzeni brzucha¹)	+	+	+	+
Białe osady lub warstwy na ścianie pochwy (przepony) lub na narządach w brzuchu	brak	+	+	+
Zapalenie otrzewnej	brak	brak	brak	+
Przestrzeń brzucha wypełniona białą pastowatą/oleistą treścią	nie	nie	nie	+ ok. 30 ml

Objaśnienia do Tab. 7: ¹) u 4 zwierząt.

W tych dwutygodniowych badaniach określenia wielkości dawki, zakres bez wpływu znajdował się w granicach dawki < 500 mg wyciągu z brzozy/kg masy ciała. Powiększenie brzucha w granicach umiarkowanych do dużego obserwowano przy dawce 500 mg/kg masy ciała i wyższej. Stwierdzono znaczne zmniejszenie masy ciała we wszystkich badanych grupach, jednak tylko u osobników męskich. Potarganie futerka zaobserwowano przy dawce 1000 mg/kg masy ciała i wyższej. Parametry hematologiczne i/lub biochemiczne zmieniają się znacznie przy dawce 1000 mg/kg masy ciała i wyższej. Badania zwierząt po uśmierceniu wykazywały białe osady na przeponie lub na organach w brzuchu, którym częściowo towarzyszyła adhezja w przypadku dawki 500 mg/kg masy ciała i wyższej. We wszystkich grupach przestrzeń brzucha wypełniona była oleistą/wodną cieczą, co było związane z stosowaniem nośnika w postaci oleju sezamowego. Przy dawce 2000 mg/kg masy ciała zdechło 8 z 10 zwierząt. Badania pośmiertne wykazały: 1) zapalenie otrzewnej u 4 z poprzednio zdechłych zwierząt; 2) u wszystkich zwierząt przestrzeń brzucha wypełniona była miazgowatą/oleistą treścią. Do badań toksyczności podchronicznej wybrano zakres od 60 do 540 mg/kg masy ciała.

Psy (Beagle), i.p.

Badania toksyczności podostrej prowadzono przez dwa tygodnie na psach Beagle, jako psach doświadczalnych, w celu ustalenia dawki i przez 4 tygodnie w badaniach subchronicznej toksyczności.

PL 202 948 B1

Wyciąg z korka brzozy (numer szarży: bet 009) podawano dootrzewnowo z olejem sezamowym jako nośnikiem. Wyniki zostały zestawione w tabeli 8 (Tab. 8)

T a b e l a 8: Badania toksyczności podostrej na psach (Beagle), i.p.

Wielkości dawki:

1. Czas dla MTD*

50, 150, 250, 500 mg/kg masy ciała/dzień

2. Czas dla dawki stałej

100, 300 mg/kg masy ciała/dzień Zwierzęta: 8 psów Beagle 2 osobniki tej samej płci na grupę

Objaśnienia do tab. 8:

* MTD : maksymalna dobrze znoszona dawka

Wyniki zostały pokazane w tabeli 9 (Tab. 9).

T a b e l a 9: Badania toksyczności podostrej na psach (Beagle), i.p.

Bez wpływu:

< 50 mg/kg masy ciała/dzień podczas okresu MTD Dawka śmiertelna:

500 mg/kg masy ciała/dzień

Oznaki zatrucia podczas okresu stałej dawki:

(100, 300 mg/kg masy ciała/dzień)

Zmniejszenie masy ciała

Zmniejszenie pobierania pokarmu

Zmiany parametrów biochemicznych i hematologicznych

Ciężkie zapalenie otrzewnej u 3 spośród 8 zwierząt*

Objaśnienia do Tab. 9:

Zwierzęta te, ze względu na ich zły stan, uśmiercono w jeden tydzień po ostatnim podaniu dawki.

Claims

1. Sposób ciągłego uzyskiwania triterpenów z roślin i/lub części roślin, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(a) ciągłego doprowadzania części roślin i rozpuszczalnika, w którym rozpuszczalność triterpenów wynosi nie więcej niż 1 g/litr oraz wymywania części roślin rozpuszczalnikiem w przeciwprądzie w temperaturze 20°C do 70°C;

(b) ciągłego ekstrahowania triterpenów rozpuszczalnikiem w temperaturze od 50°C do 200°C i pod ciśnieniem 100 kPa do 30000 kPa w przeciwprądzie;

(c) ciągłego schładzania i odprężania roztworu zawierającego triterpeny, przez co triterpeny wykrystalizowywują z rozpuszczalnika z etapu (b);

(d) odsączenia triterpenów w temperaturze pokojowej;

(e) wymywania triterpenów rozpuszczalnikiem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że triterpeny uzyskuje się z kory brzozy, korzystnie z białej części kory brzozy (z korka brzozy).

3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że uzyskuje się triterpeny o czystości przynajmniej 80%, korzystnie 85%, w szczególności 90% a szczególnie korzystnie ponad 90%.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że główną część wyekstrahowanych triterpenów stanowi betulina.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawartość betuliny wynosi przynajmniej 80%, korzystnie 85%, w szczególności 85% a szczególnie korzystnie ponad 90%.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapach (a), (b) i (e) stosuje się taki sam rozpuszczalnik.

PL 202 948 B1

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem jest rozpuszczalnik wybrany z grupy zawierającej CO2 w stanie nadkrytycznym, węglowodór o niskiej temperaturze wrzenia lub mieszaninę, zawierającą węglowodory o niskiej temperaturze wrzenia.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnikiem jest n-pentan, n-heksan lub n-heptan.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) uzyskiwania triterpenów jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik odpadowy z etapu (b).

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymywanie w etapie (a) uzyskiwania triterpenów prowadzi się pod ciśnieniem 100 kPa do 30000 kPa, korzystnie 1000 do 3500 kPa, szczególnie korzystnie 2500 kPa.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję w etapie (b) uzyskiwania triterpenów prowadzi się w temperaturze od 50 do 200°C, korzystnie w temperaturze od 140 do 160°C, bardziej korzystnie w temperaturze 150°C i pod ciśnieniem 1000 do 3500 kPa, korzystnie 2500 kPa.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krystalizację w etapie (c) uzyskiwania triterpenów prowadzi się jako proces mikrokrystalizacji z przeciętną wielkością cząstek < 40 μm, w szczególności od 2 do 32 μm.

13. Emulsja, której fazy wodna i olejowa zemulgowane zostały za pomocą wyciągu roślinnego, który zawiera przynajmniej jeden triterpen i/lub przynajmniej jedną pochodną triterpenu, oraz ma środki konserwujące, emulgujące i aktywne farmaceutycznie oraz przynajmniej jeden olej i/lub tłuszcz i wodę, znamienna tym, że co najmniej jeden triterpen i/lub co najmniej jedna jego pochodna jest jedynym środkiem emulgującym emulsję, jest jedyną substancją czynną farmaceutycznie i stanowi w tej emulsji jedyny środek konserwujący.

14. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że wyciąg roślinny jest wyciągiem z kory brzozy, korzystnie z białej części kory brzozy (z korka brzozy).

15. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że wyciąg roślinny zawiera przynajmniej jedną z substancji z grupy zawierającej: betulinę, kwas betulinowy, lupeol, erytrodiol, allobetulinę, kwas fellonowy, hydroksylakton, aldehyd betulinowy, β-amyrynę, kwas oleanolowy, kwas ursolowy, zestryfikowaną betulinę i/lub β-sitosterol.

16. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że udział triterpenu i/lub jego pochodnej wynosi 2 do 10% łącznej masy emulsji.

17. Emulsja według zastrz. 16, znamienna tym, że udział triterpenu i/lub jego pochodnej wynosi 2 do 3,5% lub 3,5 do 10% łącznej masy emulsji.

18. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że olejem jest olej awokado i/lub olej migdałowy.

19. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera dodatkowo przynajmniej jeden środek utrzymujący wilgoć i/lub przynajmniej jeden zagęszczacz.

20. Emulsja według zastrz. 19, znamienna tym, że środkiem utrzymującym wilgoć jest gliceryna i/lub mocznik, który jest dodany w stężeniu od 3 do 10%, każdy z tych składników dodany korzystnie w ilości 5% w przeliczeniu na masę emulsji.

21. Emulsja według zastrz. 19, znamienna tym, że środkiem zagęszczającym jest polisacharyd, który dodawany jest w stężeniu od 0,2 do 2%, korzystnie 0,5% w przeliczeniu na masę emulsji.

22. Emulsja według zastrz. 21, znamienna tym, że polisacharyd stanowi agar-agar lub karagenan.

23. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera 2% do 10% wyciągu z białej części kory brzozy, 20% do 30% oleju awokado, 10% do 20% oleju migdałowego i 40% do 68% wody.

24. Emulsja według zastrz. 23, znamienna tym, że zawiera 4% wyciągu z białej części kory brzozy 29,3% oleju awokado, 14,7% oleju migdałowego i 52% wody.

25. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera 2% do 10% wyciągu z białej części kory brzozy, 20% do 30% % oleju awokado, 10% do 20% oleju migdałowego, 5% do 10% środka utrzymującego wilgoć i 30% do 63% wody.

26. Emulsja według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera 4% wyciągu z białej części kory brzozy, 29,3% oleju awokado, 14,7% oleju migdałowego, 5% gliceryny i/lub 5% mocznika i 42% do 47% wody.

27. Emulsja według zastrz. 13, znamienna tym, że wyciąg z białej części kory brzozy zawiera przynajmniej 80% betuliny, maksymalnie 10% kwasu betulinowego, maksymalnie 3% lupeolu i maksymalnie 4% kwasu oleanolowego.