EA013736B1

EA013736B1 - Эмульсия, содержащая растительный экстракт, в частности экстракт берёзовой коры, и ее применение

Info

Publication number: EA013736B1
Application number: EA200501002A
Authority: EA
Inventors: Армин Шеффлер
Original assignee: Биркен Гмбх
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2010-06-30
Also published as: PL356723A1; CA2404147C; ATE264686T1; ES2218401T3; WO2001072315A9; US20030087789A1; WO2001072315A1; EE04931B1; CA2404147A1; JP4593864B2; TR200401400T4; NO20024591L; PT1267900E; EA200501002A1; CN100518748C; EP1267900B1; CN1426305A; US20070231418A1; NO20024591D0; PL202948B1

Abstract

Изобретение относится к эмульсии, водная и жирная фазы которой эмульгируются растительным экстрактом, причем этот растительный экстракт содержит по меньшей мере один тритерпен и/или по меньшей мере одно производное тритерпена, а эмульсия также содержит по меньшей мере одно масло и/или жир и воду. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанной эмульсии для изготовления косметических и лекарственных средств.

Description

Настоящее изобретение относится к эмульсии, водная и жирная фазы которой эмульгированы растительным экстрактом, причем этот растительный экстракт содержит по меньшей мере один тритерпен и/или по меньшей мере одно производное тритерпена, а эмульсия также содержит по меньшей мере одно масло и/или жир и воду. Кроме того, настоящее изобретение относится к эмульсии, а также к применению такой эмульсии для изготовления косметических и лекарственных средств.

С давних времен природные вещества, ароматические и активные вещества выделяют из целых растений или их частей, таких как листья, корни, плоды или кора, при помощи различных методов экстрагирования. Среди первых природных веществ из растительного материала в 1788 г. был получен бетулин - вещество, которое придает коре березы ее белый цвет (Ηο\νίΙζ. М., Сйетщсйе Лпа1у5сп. Нгкд. Сге11, b, том 2, с. 312). За этим первым выделением последовали научные исследования, в том числе элементарные анализы бетулина, сведения о которых опубликовал У. Хаусманн в 1876 г. (Нашшапи, и., Аппа1еп бет Сйет1е, 182, с. 368).

Бетулинсодержащие растения широко распространены в растительном мире. Они преимущественно относятся к скрытосеменным, причем у некоторых видов отряда Бада1ек (родственных буку), и в данном случае особенно в семействе ВеШ1асеае (березовые), содержание бетулина во внешней коре достигает максимума (Обзорная статья: Науек, Е.^. е1 а1., (1989), А В|сеп1епша1 οί Ве1и11п, Рйу1осйет1кДу, 28(9), с. 2229-2242). Белая часть березовой коры (береста), в частности у видов ВеШ1а репби1а (береза повислая), ВеШ1а уеписока (береза бородавчатая) и Вейба раруГега, может содержать более чем 30% бетулина. От Райнера Экмана имеются более точные данные, полученные в 1983 г., согласно которым из сухой внешней части коры березы бородавчатой было экстрагировано 21-40% тритерпенов или 16,7-34% бетулина (Ектап, г. (1983Й), Ипп. Сйет. Ьейегк, с. 162).

Бетулин является пентациклическим тритерпеном с углеродным скелетом ряда лупана, который также называют бетулинолом, трохотоном, березовой камфарой и (корили-)резинолом. Характерной особенностью ряда лупана является кольцо с пятью атомами углерода в составе пентациклической системы, которое в положении С-19 имеет α-изопентениловую группу. Бетулин также отличается высокой термостабильностью, его температура плавления находится между 250 и 261°С, причем после сублимации рекристаллизованного продукта достигаются еще более высокие значения. Его молекулярный вес составляет 442,7, он растворим в пиридине и тетрагидрофуране, но малорастворим в дихлорметане, хлороформе и холодных органических растворителях, причем с повышением температуры его растворимость значительно возрастает. В воде и холодном петролейном эфире [углеводороды с 5-8 атомами углерода (С₅-С₈)] бетулин практически нерастворим. Кроме того, кинетические исследования показали очень низкую реакционную способность гидроксильных групп бетулина (Обзорная статья: Дакке Штеп Р. (1981), Рареп _)а Рии - Раррег осй Тга 10, с. 599-603).

Уже в 1899 г. Дж. Уилер доказал антисептические свойства бетулина, поэтому он использовался для стерилизации перевязочных бинтов и пластырей (\Уйее1ег 1., (1899), Рйагт. 1., Э|е ЭагкЮПипд бек ВеШ1ш бигсй 8иЫ1таДоп, 494, КеГ. Сйет. СепП. 1900 I, с. 353). В натуропатии и народной медицине получали и получают до сих пор отвары березовой коры, причем в основном используют лишь внутреннюю часть коры, которая содержит лишь остатки белой бересты и почти не содержит бетулина вследствие его недостаточной растворимости, так как содержание бетулина во внутренней коре составляет менее 0,5%, а в воде или водно-спиртовых смесях (до 60% спирта) бетулин нерастворим (Ектап, К. (1983), упомянут выше).

Получаемый таким образом отвар применяют для лечения малярии, водянки, подагры и при кожных заболеваниях, а также в виде настойки для компрессов при лечении абсцессов. Березовую кору также применяют для получения винтергринового масла, которое также использовалось для лечения ревматизма, а также в качестве ароматического вещества (Напке1, К. е1 а1., (Нгкд.), (1994), Этодеп А-Ό, 8ргшдег Ует1ад, Карйе1 Ве1и1а, с. 502-511; Науек, Е.^., упомянут выше). Кроме того, известно использование березовых экстрактов в качестве добавки для ванн специально для лечения потливости стоп, а также как средство ухода за волосами в виде добавок к шампуням (Ыо^ак, О.А., (1966), СоктеДс апб Меб1сша1 РторетДек оГ 1йе В1гсй, Атег. РегГитег Соктей, 81, с. 37). Однако и здесь применялись лишь водные вытяжки из листьев березы, которые практически не содержат бетулина.

Более поздние исследования позволяют предполагать лечебное действие бетулина и его производных. В эксперименте с животными бетулиновая кислота ингибировала репликацию ретровирусов, в частности вируса иммунодефицита человека (ВИЧ1). Описанное бактериостатическое и бактерицидное действие бетулина против кишечных бактерий ЕксйепсйД сой, 8а1топе11а 1урйй 8Ыде11а Лехпет1 и 81арйу1ососсик аигеик позволяют говорить о возможности его более широкого применения в медицине (Сйеп 8ип, 1. Меб. е1 а1., (1998), АпД-А1бк АдеДк, 32, 8уп1йек1к апб апй-Н1У асДуйу оГ ВеДйп бепуа!ек, Вюотдашс & Меб1са1 СйетщДу Ьейетк 8, с. 1267-1272; Еуетк, М. е1 а1., (1996), ВеДйшс ас1б бепуа1ек: а пе\\' с1акк оГ йитап 1ттипобеДс1епсу уиик 1уре 1 кресбас шЫЬйогк νίΐΗ а пе\у тобе оГ асйоп, 1. Меб. Сйет. 39,

c. 1056-1058; Науек, Е.^. е1 а1., упомянут выше). Далее, удалось установить противовоспалительное, кортизоноподобное действие бетулина и его производных, а также их цитостатическое действие при использовании различных линий раковых клеток ш уйто (Сагтеп Кесю, М., е1 а1. (1995), 1пуекбда1юпк оп 1йе к1ето1ба1 апй-шДатта1оту асДуйу оГ Дйегрепо1бк Ггот Эюкругок 1еисоте1ак, Р1апД Меб. 61, с. 9-12;

- 1 013736

Уакика^а, К., с1 а1., (1991), 81его1 апб 1п1егрепе бспуа1с5 йот р1ап18 (...), Опсодепе 48, с. 62-76).

Ранее было предпринято несколько попыток модифицировать поверхностно-активные свойства бетулина для производства технически применимого продукта. Так, например, Пасич уже в 60-х гг. исследовал бетулин и его эфиры, такие как сукцинаты, фталаты и тетрахлорфталаты, в качестве эмульгаторов для белых вазелинов, китового жира и арахисового масла и пришел к выводу, что бетулин в отношении его эмульгирующих качеств, т.е. его способности соединять друг с другом водные и масляные компоненты, сопоставим с известными техническими эмульгаторами. Однако полученные им бетулинсодержащие эмульгаторы имели низкую стабильность. Он применил перекристаллизованный бетулин и не получил достаточной стабильности эмульсий. Лучше всего себя показали фталаты и тетрахлорфталаты, которые производились с точки зрения лучшей водорастворимости. Через короткий промежуток времени из эмульсий выделялись масляные слои, что указывает на неудовлетворительную стабильность. Кроме того, в описанные эмульсии добавлялись консерванты антимикробного действия, причем преимущественно применялись производные бензойной кислоты (Раысй, 1., (1965), Тп1егрепо1б етикШега о£ р1ап! опдш V. ЕтнЫГутд ргорегйек о£ Ве1и1т апб сенат о£ Й8 еЧегх Еагт. Ро1кка 21, №. 17-18, с. 661-666).

Но именно это добавление консервантов, которые, в свою очередь, могут вызвать токсические и аллергические явления, многократно уменьшает положительный терапевтический эффект бетулина, особенно при использовании на поврежденной коже, вследствие чего известные в литературе препараты бетулинсодержащих эмульсий вообще нельзя использовать в современных средствах ухода за кожей или можно использовать лишь в ограниченной мере.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является получение эмульсий, водная и жирная фазы которой эмульгируются растительным экстрактом, причем этот растительный экстракт содержит по меньшей мере один тритерпен и/или по меньшей мере одно производное тритерпена, а эмульсия также содержит по меньшей мере одно масло и/или жир и воду.

Этот тритерпен и/или его производное консервирует и эмульгирует эмульсию. К тому же он обладает фармацевтической активностью. Благодаря этому, в частности, достигается отсутствие в эмульсии дополнительных консервантов, за счет чего она имеет очень высокую степень чистоты и хорошую переносимость, прежде всего в проблемных случаях применения на поврежденной коже.

При этом растительным экстрактом является экстракт березовой коры, предпочтительно белой части березовой коры, которую также называют берестой.

В другом варианте изобретения растительный экстракт содержит по меньшей мере одно из следующих веществ: бетулин, бетулиновая кислота, лупеол, эритродиол, аллобетулин, феллоновая кислота, гидроксилактон, бетулинальдегид, β-амирин, олеаноловая кислота, урсоловая кислота, этерифицированный бетулин и/или β-ситостерол. Эти растительные вещества можно применять в составе предложенной эмульсии как по отдельности, так и в различных комбинациях друг с другом. Особенно подходящая комбинация состоит из более 80% бетулина, менее 10% бетулиновой кислоты, менее 3% лупеола, менее 4% олеаноловой кислоты, менее 4% эритродиола и менее 1% воды.

Эмульсия содержит тритерпен и/или его производное в концентрации 2-10%. В зависимости от желательной консистенции доля тритерпена и/или его производного может варьироваться в вышеуказанных пределах. Например, для применения в жидком лосьоне содержание тритерпена и/или его производного в предложенной эмульсии составляет 2-3,5%. Если же эмульсия используется в креме, то содержание тритерпена и/или его производного составляет предпочтительно 3,5-10%.

Масляная и/или жирная составляющая эмульсии может быть выбрана из любых известных в фармакологии и косметике масел и жиров. Особенно подходят животные и растительные жиры, такие как масло жожоба, арахисовое масло и оливковое масло. Особенно предпочтительно применение масла авокадо или миндального масла.

Для регулирования консистенции предложенной эмульсии в нее можно добавлять обычные регуляторы влажности и/или загустители и закрепители. В качестве регуляторов влажности можно применять, в частности, глицерин и мочевину. При этом наиболее подходящая концентрация глицерина и/или мочевины составляет 3-10% для каждого из этих веществ в расчете на количество эмульсии. В качестве загустителя можно использовать, например, полисахарид, добавляемый в концентрации 0,2-2%, предпочтительно 0,5%, в расчете на количество используемой воды. Особенно хорошо подходят природные полисахариды, а также другие сахарсодержащие соединения и их производные, так как они не реагируют с другими компонентами эмульсии, в особенности не изменяют их качеств, и таким образом являются химически инертными.

По этой причине очень подходит для применения в эмульсии полисахарид агар-агар. Агар-агар представляет собой смесь агарозы и агаропектина, извлекаемую из ротальгена, и обладает тем достоинством, что он не разлагается под действием большинства микроорганизмов. В качестве альтернативы ему можно использовать полисахарид каррагенан, который встречается в природе в стенках клеток красных и бурых водорослей и обладает теми же достоинствами, что агар-агар.

В еще одном варианте предложенная эмульсия содержит 2-10% экстракта белой части березовой коры, 20-30% масла авокадо, 10-20% миндального масла и 40-68% воды. Наиболее предпочтительные

- 2 013736 значения содержания ингредиентов составляют 4% экстракта белой части березовой коры, 29,3% масла авокадо, 14,7% миндального масла и 52% воды.

В другом варианте предложенная эмульсия содержит 2-10% экстракта белой части березовой коры, 20-30% масла авокадо, 10-20% миндального масла, 5-10% регулятора влажности и 30-63% воды. При этом наиболее предпочтительны следующие значения содержания ингредиентов: 4% экстракта белой части березовой коры, 29,3% масла авокадо, 14,7% миндального масла, 5% глицерина и/или 5% мочевины, а также 42-47% воды.

Экстракт белой части березовой коры, присутствующий во всех вариантах эмульсии, содержит по меньшей мере 80% бетулина, не более 10% бетулиновой кислоты, не более 3% лупеола и не более 4% олеаноловой кислоты.

Благодаря своему составу и подтвержденному отсутствию токсичности эмульсия исключительно пригодна в качестве мазевой основы для подмешивания в нее любых известных специалисту душистых, косметических и лекарственных веществ.

Способ изготовления предложенной эмульсии включает в себя следующие стадии:

(a) диспергирование тритерпена в масле и/или жире;

(b) эмульгирование воды;

(c) гомогенизирование полученной эмульсии до требуемой консистенции.

При этом диспергирование и гомогенизирование предпочтительно проводят в смесителегомогенизаторе, так как предложенный способ осуществлять таким образом особенно просто. Кроме того, можно готовить и малые количества эмульсии для индивидуального применения.

В особом варианте способа в воду, которая применяется при эмульгировании, добавляют регулятор влажности, в частности глицерин и/или мочевину, или загуститель, в частности полисахарид. Таким образом, можно достичь особенно кремоподобной консистенции.

Еще одним объектом настоящего изобретения является применение эмульсии для изготовления косметического средства, предпочтительно в виде мази, лосьона, крема, геля, желе, настойки, шампуня, пудры и/или порошка, в частности, для нанесения на кожу туловища или кожу головы. Благодаря своему химическому родству со стеролами тритерпены, в частности получаемый бетулин, подходят для ухода за кожей туловища и головы. Он успокаивает и смягчает кожу, уменьшает потерю влаги и предупреждает раздражения и покраснения. Так, это косметическое средство может хорошо применяться для увлажнения и разглаживания кожи, а также уменьшения старческих пятен, а также при шелушении кожи. Еще одно преимущество заключается в нерастворимости тритерпенов в воде, что обеспечивает особенно хорошую защиту кожи, находящейся под сильным и длительным воздействием воды. Благодаря антибактериальному действию особенное преимущество имеет применение в качестве дезодоранта. Сюда можно прибавить и снижение потоотделения за счет эффективной закупорки потовых желез.

Другим объектом настоящего изобретения является применение эмульсии для изготовления лекарственного средства, предпочтительно в виде мази, лосьона, крема, геля, желе, настойки, шампуня, пудры и/или порошка, в частности, для нанесения на кожу туловища, кожу головы, особенно предпочтительно при дерматологических изменениях кожи туловища и/или головы, прежде всего при нейродермите, псориазе, себорейной экземе, меланодермии, предопухолевых состояниях кожи, а также для ингаляций при астматических приступах и/или для замещения гликокортикоидов. Эмульсии также пригодны для терапевтического применения на коже, имеющей повреждения.

Предложенные эмульсии так хорошо подходят для вышеуказанного применения, потому что экстракт белой части березовой коры не имеет мутагенных свойств. Также проводились испытания на токсичность при местном применении, которые не выявили никаких сенсибилизирующих свойств.

Описываемые ниже примеры приводятся для пояснения и лучшего понимания настоящего изобретения, но они не должны толковаться как ограничивающие изобретение.

Примеры

I. Наблюдения за применением лекарственных средств.

Врачами, ведущими частную практику, а также клиническими врачами были проведены различные наблюдения за применением лекарственных средств в случаях дерматологических изменений кожи. После установления врачами диагноза проводилось лечение пациентов предложенной эмульсией, изготавливавшейся описанным способом.

Пример 1.

Пациент: мужского пола, возраст 68 лет.

Диагноз: тяжелый генерализованный псориаз обыкновенный (Рзопайз уи1дапз).

Предшествовавшее лечение: кортизоновая мазь средней силы действия.

Применение: лицо.

Лечение: многократное ежедневное нанесение предложенной эмульсии в качестве мазевого препарата на пораженные участки кожи.

Результат: применение предложенной эмульсии предотвратило появление псориатических высыпаний после прекращения использования кортизоновой мази.

- 3 013736

Пример 2.

Пациент: мужского пола, возраст 48 лет.

Диагноз: легкий псориаз обыкновенный.

Применение: голова.

Результат: применение предложенной эмульсии в течение 14 дней привело к заживлению воспалительных очагов в престернальной области на голове размером в монету 5 немецких марок; повторное обострение воспаления (рецидив) после прекращения использования эмульсии; снова заметное улучшение после возобновления лечения.

Пример 3.

Пациент: женского пола, возраст 5 месяцев.

Диагноз: нейродермит, гиперкеракотическая, преждевременно состарившаяся, растрескавшаяся кожа.

Применение: туловище.

Результат: очень заметное улучшение, отличная эффективность при одновременно хорошей переносимости.

Пример 4.

Пациент: женского пола, возраст 10 лет.

Применение: туловище.

Пример 5.

Пациент: мужского пола, возраст 5 месяцев.

Применение: туловище.

Пример 6.

Пациент: женского пола, возраст 28 лет.

Диагноз: нейродермит, нейродермитные высыпания.

Применение: область локтевого сгиба, лицо, область груди ниже шеи (декольте).

Предшествовавшее лечение: ОсгтаЮбогоп. мазь с сурьмой металлической (ШЫит те1аШеит), мазь Тор-15о1оп-Ваг1с1. мазь с текетЬгуапШетит; применение этих мазей не привело к радикальному улучшению состояния пораженных нейродермитом участков.

Результат: заметное ослабление нейродермита.

Пример 7.

Пациент: женского пола, возраст 79 лет.

Диагноз: себорейная экзема.

Применение: голова.

Результат: уменьшение образования струпьев в области головы, красноватые участки бледнели несколько медленнее.

Пример 8.

Пациент: женского пола, возраст 55 лет.

Диагноз: сильно зудящая, шелушащаяся, мокнущая экзема.

Применение: лицо, голова.

- 4 013736

Результат: видимое улучшение состояния обрабатывавшихся участков.

Пример 9.

Пациент: женского пола, возраст 33 года.

Диагноз: сухая, зудящая, лихенифицированная экзема с образованием струпьев.

Применение: голень.

Результат: еще не оценен.

II. Изготовление растительного экстракта.

Исходный материал: береста.

A) Описание и обеспечение качества.

Береста поставляется:

1) целлюлозной компанией Каикак (иРМ-Куттепе, Лаппеенранта, Финляндия).

Каиках механически отделяет кору от березовой древесины, а также механически снимает бересту с внутренней части коры;

2) собственными сотрудниками, которые срезают бересту вручную.

На первом этапе механически отделенная и нарезанная вручную береста анализируется на предмет своей идентичности. С этой целью бересту подвергают микроскопическому исследованию, при котором обнаруживается несколько отдельных слоев бересты и чечевички, характерные для березы. Дополнительно оценивают экстрагируемое количество тритерпенов п-гексаном при температуре 140-160°С и возрастающем давлении. Экстрагируемое количество тритерпенов с бетулином в качестве главного компонента превышает 10%, так как такие количества присутствуют только в бересте берез с белой корой. Исследования материала на чистоту включают в себя анализ на наличие афлатоксинов, тяжелых металлов, гербицидов и пестицидов в соответствии с европейскими стандартами.

B) Измельчение бересты.

Бересту измельчают в режущей мельнице (фирмы Ке18сй) и вытягивают из машины воздушной струей через сито с размером ячеек 1 мм в диаметре. Для последующей экстракции используют только частицы с размером зерна, меньшим или равным 1 мм.

Экстрагирование тритерпенов.

Для экстрагирования используют феномен, заключающийся в том, что тритерпены из бересты практически нерастворимы в холодном п-гексане, но хорошо растворяются в горячем п-гексане (от 140160°С) под давлением. Этот способ осуществляют в две стадии.

Бересту очищают п-гексаном (горячим, ниже температуры кипения 69°С) в аппарате для определения содержания жиров в текстильном волокне по методу Сокслета до тех пор, пока раствор п-гексана не потеряет свой желтоватый цвет. Активный компонент экстрагируют из предварительно промытого гранулята бересты п-гексаном при температуре 140-160°С и повышенном давлении (экстрагирование проводят при помощи установки Эюпех А8Е со 100-миллилитровыми емкостями). За счет высвобождения перегретого раствора, содержащего п-гексан и тритерпены, происходит непосредственная кристаллизация, в результате чего получают микрокристаллический порошок из тритерпенов прямо в холодном пгексане. Этот порошок отфильтровывают и дважды промывают в холодном п-гексане. Полученные тритерпены сушат при температуре 80-100°С.

Определение чистоты экстракта.

Чистоту экстракта проверяют посредством газовой хроматографии. Результаты представлены в обзоре, приведенном на чертеже.

Были измерены следующие значения:

бетулин - минимум 80% бетулиновая кислота - максимум 10% лупеол - максимум 3% олеаноловая кислота - максимум 4%.

В прилагаемом обзоре представлена типовая хроматограмма со значениями содержания 84-86% для бетулина, 4-5% для бетулиновой кислоты, примерно 1% для лупеола и примерно 1% для олеаноловой кислоты.

Согласно нормам Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для людей (1СН) остаточное количество растворителя п-гексана должно составлять менее 7,250 мг на килограмм экстракта, так как крем, содержащий 4% экстракта бересты, может содержать не более 290 мг/кг п-гексана. Типовые значения составляют 1,500 мг/кг п-гексана в сухом экстракта, что соответствует примерно 60 мг/кг в березовом креме.

Выходной контроль.

Каждая партия проверяется в соответствии с европейскими нормами на кислотное число (допускается менее 5) и пероксидное число (допускается менее 15) по стандартизованной методике. Содержание березового экстракта анализируют посредством газовой хроматографии. Далее следует проверка на со

- 5 013736 держание микроорганизмов (допускается менее 100 на грамм), кроме того, не допускается присутствие патогенных микроорганизмов.

III. Предложенные композиции (березовый крем).

Сведения о предложенных композициях и их составе сведены в табл. 1.

Таблица 1

Состав композиций

Активный ингредиент во всех композициях	Экстракт бересты, содержание 40+4 мг на грамм крема (4%)
Композиция	Содержание ингредиентов, %
Березовый крем А	29,3 масло авокадо 14,7 миндальное масло 52 вода
Березовый крем С	29,3 масло авокадо 14,7 миндальное масло 5 глицерин 47 вода
Березовый крем Н	29,3 масло авокадо 14,7 миндальное масло 5 мочевина 47 вода

Все три композиции содержат одинаковое количество активного ингредиента (экстракт бересты), а также масла авокадо и миндального масла. Они отличаются лишь по содержанию ингредиентов мочевины (только в березовом креме Н) и глицерина (только в березовом креме О), а березовый крем А не содержит этих двух компонентов.

Испытание на стабильность.

Березовый крем можно центрифугировать при перегрузке 500 д, и при этом он сохранит стабильность.

IV. Токсикологические исследования.

1. Острая токсичность.

Острую токсичность экстракта бересты определяли путем внутрибрюшинного и подкожного введения мышам и крысам.

Мыши.

Пяти самцам и пяти самкам подопытных мышей (СЭ-1) подкожно ввели единичные дозы экстракта бересты (номер партии: Ве1. 001) в метоцеле, использовавшемся в качестве носителя. Животные получили дозу из расчета 2000 мг/кг (миллиграмм препарата на килограмм веса тела).

Коэффициент смертности определяли через 14 дней после введения единичной дозы препарата для установления дозы половинной смертности КО₅₀. На протяжении того же периода времени за животными наблюдали для выявления признаков токсичности. В качестве таковых рассматривают местные и системные реакции непереносимости, а также изменение веса тела. В конце эксперимента животных умертвили и подвергли макроскопическому исследованию. Испытания на острую токсичность проводились в соответствии с Руководством ЕЭС Ь 383 А: В1.

При данных условиях эксперимента (2000 мг/кг) не наблюдалось никаких реакций непереносимости. На протяжении эксперимента у животных наблюдался ожидавшийся прирост веса. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Острая токсичность у мышей Средний вес тела во время эксперимента | Средний вес тела, г |

	Самцы	Самки
Начало эксперимента	22,8	19,8
7-й день	27,0	22,2
14-й день	31,2	23,5

При микроскопическом исследовании у трех самцов и трех самок были установлены лишь изменения, которые можно отнести на счет применявшейся техники проведения эксперимента.

В этом испытании на токсичность область первой реакции непереносимости, низшее летальное значение дозы, а также величина БО₅₀ находятся выше дозы 2000 мг/кг экстракта бересты.

При внутрибрюшинном введении мышам экстракта бересты токсические симптомы наблюдались выше дозы 500 мг/кг. Наблюдались лишь легкие токсические реакции, такие как сниженная пассивная подвижность, нарушения координации движений и сниженное сопротивление растяжению мышц. Отсюда был сделан вывод, что эти токсические симптомы объясняются воспалением брюшины (перитонитом), которое было вызвано раствором экстракта. Величину БЭ₅₀ установить не удалось, так что оно за время наблюдения 14 дней находится выше значения 2000 мг/кг.

- 6 013736

Крысы.

Пяти самцам и пяти самкам лабораторных крыс 8ртадие-ОаМеу подкожно ввели единичные дозы экстракта бересты (номер партии: ВеЕ 001) в метоцеле, использовавшемся в качестве носителя. Животные получили дозу из расчета 2000 мг/кг.

Коэффициент смертности и токсические симптомы определяли через 14 дней после введения единичной дозы препарата. В конце эксперимента животных умертвили и подвергли макроскопическому исследованию. Испытания на острую токсичность проводились в соответствии с Руководством ЕЭС Ь 383 А: В1.

При данных условиях эксперимента (2000 мг/кг экстракта бересты) реакции непереносимости или смертность не наблюдались. На протяжении эксперимента у животных наблюдался ожидавшийся прирост веса.

При микроскопическом исследовании у одного самца и трех самок были установлены лишь изменения, которые можно отнести на счет применявшейся техники проведения эксперимента. Результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Острая токсичность у крыс

Симптомы/критерии	Крысы 8ргадие-0а«1еу (п=5/пол) Доза: 2000 мг/кг экстракта бересты
	Самцы	Самки
Местные реакции непереносимости	нет	нет
Системные реакции непереносимости	нет	нет
Смертность: в течение 6/24 часов через 7/14 дней	нет	нет
Средний вес тела, г Начало эксперимента 7-й день 14-й день	187,6 239.8 280.8	174,4 203,8 218,0
Задержка в наборе веса тела	нет	нет
Изменения, установленные при макроскопическом исследовании	1/5	3/5

В этом эксперименте на токсичность область первых реакций непереносимости, низшее летальное значение дозы, а также величина БЭ₅₀ находятся выше дозы 2000 мг/кг экстракта бересты.

При внутрибрюшинном введении крысам экстракта бересты токсические симптомы наблюдались выше дозы 500 мг/кг. Наблюдались лишь легкие токсические реакции, такие как сниженная пассивная подвижность, нарушения координации движений и сниженное сопротивление растяжению мышц. Отсюда был сделан вывод, что эти токсические симптомы объясняются воспалением брюшины (перитонитом), которое было вызвано раствором экстракта. Величину БЭ₅₀ установить не удалось, так что оно за время наблюдения 14 дней находится выше значения 2000 мг/кг.

Вывод.

Руководство ОЕСЭ устанавливает, что если за период времени 14 дней при введении мышам и крысам (пяти самцам и пяти самкам) исследуемого продукта в количестве 2000 мг/кг отсутствует обусловленная этим продуктом смертность, то дальнейшие испытания проводить не требуется.

Химические продукты классифицируются по их относительной токсичности. Они называются токсичными, если величина БО₅₀ находится между 50 и 500 мг/кг. Когда величина ЬО₅₀ составляет от 5000 до 15000 мг/кг, то говорят о практически полном отсутствии токсичности продукта.

В данном случае можно исходить из величины ЕЭ₅₀>2000 мг/кг, которая, вероятно, превышает и значение 5000 мг/кг, так как даже при высокой величине 2000 мг/кг токсические симптомы не наблюдались. Как следует из результатов описанных выше экспериментов, экстракт бересты можно назвать нетоксичным.

2. Подострая токсичность.

Крысы, внутрибрюшинное введение.

В рамках исследования подострой токсичности подопытным крысам (8ртадие-ОаМеу/Сг1: СЭ® ВВ) на 14 дней ввели экстракт бересты (номер партии: Ве1. 009) посредством инъекции внутрибрюшинно. Протокол эксперимента приведен в табл. 4.

- 7 013736

Таблица 4 Протокол экспериментального исследования подострой токсичности (крысы, внутрибрюшинное введение)

Животные:

крыс £ргадие-Рауу1еу Сг1: СР® ВК (20 самцов и 20 самок)________

Группы животных:

Группы 1 - 5, в каждой по пять самцов и по пять самок

Дополнительные резервные животные (2 самца и 2 самки) на случай возможной замены во время фазы адаптации___________________________

Испытываемый продукт*/

Экстракт бересты (компонент березового крема)

Номер партии: Ве1. 009

Носитель: кунжутное масло___________________________________________

Диапазоны дозировок:

Группа 1: 20 мл носителя на килограмм веса тела в сутки

Группа 2: 500 мг/кг/сутки

Группа 3: 1000 мг/кг/сутки

Группа 4: 2000 мг/кг/сутки____________________________________________________

Объем введенного препарата: 20 мг/кг/сутки _ ___________________

Число доз: 1_____________________________________________________________

Продолжительность введения: 14 дней (дни 1 - 14)________________________

Продолжительность эксперимента: 15 дней (дни 1 — 15)____________________ ^ф) в экстракте березы тритерпены нерастворимы в носителе и находятся в виде гомогенно распределенных частиц (микрокристаллический порошок).

Данное исследование на подострую токсичность использовалось для определения дозы, которая применялась в четырехнедельном исследовании субхронической токсичности. Результаты этого исследования представлены в табл. 5.

Таблица 5

Исследования на подострую токсичность у крыс

	1	2	3	4
Смертность	нет	нет	нет	Ν=8¹’
Клинически установленные изменения: умеренно увеличенный брюшной отдел	нет	У некоторых²’ животных после дня 13.	у всех животных После дня 7 после дня 10
Взъерошенная шерсть	нет	нет	у всех животных после дня 10 после дня 7
Потеря веса	нет	у всех самцов после недели 1: -18%’ -14%’ конец недели 2: -15% -12%	у обоих полов после недели 1: -15%) (у самцов) -12%) (у самок)
Изменения в количестве съедаемого корма	нет	нет	нет	уменьшение во время недели 1: у самцов· 29% у самок: - 31%
Гематологиче с-кие изменения	нет (см. табл.6)	нет (см. табл.6)	изменения по отношению к контрольной группе (см. табл.6)
Изменения в клинической биохимии	^! нет	мочевина АсАТ	мочевина АсАТ лдг	мочевина АсАТ лдг ι и все ¹ остальные показатели у самок и почти все остальные показатели у самцов
	(см. табл.6)

*) р<0,01 по сравнению с контрольной группой;

1) 4 самца, 4 самки (дни 11-15);

2) 4 из 5 самок, 2 из 5 самцов.

- 8 013736

Изменения в клинической биохимии (табл. 5) являются значительными по сравнению с контрольной группой только в группах 3 и 4 (р<0,01); в группе 3 в отношении активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) (+113/+132%), в группе 4 только у самок в отношении следующих показателей: общий белок, мочевина в крови, кальций, калий и активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Таблица 6 Гематологические изменения, установленные при исследовании подострой токсичности (крысы, внутрибрюшинно) - определение групп 3 и 4 см. в табл. 5

I I Группа |

	3	4
	изменение в %	изменение в %

	Самцы	Самки	Самцы	Самки
Тромбоциты	-	+ 47'·'	+ 80	+ 54“’
Ретикулоциты	-	-	+ 64	+ 35“’
Лейкоциты	-	-	-	-34

**) р<0,01 по сравнению с контрольной группой.

Внешний осмотр, проведенный перед вскрытием, показал во всех группах увеличение брюшного отдела, от умеренного до тяжелого, за исключением контрольной группы, в которой у всех животных было лишь незначительное увеличение брюшного отдела. Результаты макроскопического исследования после вскрытия приведены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты вскрытия при исследовании подострой токсичности определение групп см. в табл. 4

	Группа
	1	2	3	4
Бело-желтоватая жидкость в брюшной полости¹¹	+	+	+	+
Белые отложения или слои на диафрагме или органах брюшной полости	нет	+	+	+
Воспаление брюшины	нет	нет	нет	+
Брюшная полость наполнена белым пульпообразным/маслянистым содержимым	нет	нет	нет	+ « 30 мл

1) у 4 животных.

Это двухнедельное исследование, направленное на определение диапазона доз, показало, что дозы, не оказывающие воздействия, находятся ниже 500 мг/кг березового экстракта. Увеличение брюшного отдела от умеренного до сильного наблюдалось при 500 мг/кг и более высоких дозах. Значительное снижение веса тела было установлено во всех группах животных, которым вводили исследуемый препарат, однако только у самцов. Взъерошенная шерсть наблюдалась при 1000 мг/кг и более высоких дозах. Некоторые гематологические и/или биохимические параметры при 1000 мг/кг и более высоких дозах были значительно изменены. Исследование после вскрытия показало белые отложения на диафрагме или органах брюшной полости, которые при 500 мг/кг и более высоких дозах частично сопровождались прилипанием. Во всех группах брюшная полость животных была наполнена белой маслянисто/водянистой жидкостью, что можно объяснить применением носителя кунжутного масла. После введения 2000 мг/кг погибли 8 животных из десяти. Исследование после вскрытия выявило: 1) воспаление брюшины у четырех из преждевременно погибших животных; 2) у всех животных брюшная полость наполнена белым пульпообразным/маслянистым содержимым.

Для исследования препарата на субхроническую токсичность был выбран диапазон доз от 60 до 540 мг/кг.

Собаки (гончие), внутрибрюшинно.

Было проведено исследование на подострую токсичность с гончими в течение двух недель в качестве эксперимента по определению доз в течение 4 недель в качестве исследования на субхроническую токсичность. Экстракт бересты (номер партии Ве1. 009) вводили внутрибрюшинно с кунжутным маслом в качестве носителя. Результаты приведены в табл. 8.

Таблица 8 Исследования на подострую токсичность у собак (гончие), внутрибрюшинно

Диапазон доз:

1. Период введения МПД*’

50, 150, 250, 500 мг/кг/сутки

2. Фиксированный период введения дозы

100, 300 мг/кг/сутки__________________________________________________________

Животные: 8 гончих

По два кобеля и две суки на группу___________________________________¹

*) МПД - максимально переносимая доза.

- 9 013736

Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9 Исследования на субхроническую токсичность у собак (гончие), внутрибрюшинно

Отсутствие воздействия:

менее 50 мг/кг/сутки в период введения МПД

Летальная доза:

500 мг/кг/сутки

Признаки интоксикации в фиксированный период введения дозы:

(100, 300 мг/кг/сутки) сниженный вес тела сниженное количество съедаемого корма изменения гематопоэтических и биохимических показателей тяжелый перитонит у трех из 8 животных*¹______________________________

*) Эти животные были умерщвлены через неделю после последнего введения препарата из-за их плохого состояния.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Эмульсия для изготовления косметических средств, включающая в себя растительный экстракт, содержащий по меньшей мере один тритерпен, по меньшей мере одно масло и/или жир и воду, причем тритерпен, обладающий фармацевтической активностью, одновременно является в эмульсии единственным эмульгатором и единственным консервантом и его содержание в эмульсии составляет 2-10 мас.%.
2. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что растительным экстрактом является экстракт березовой коры, предпочтительно белой части березовой коры (бересты).
3. Эмульсия по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что растительный экстракт содержит по меньшей мере одно из следующих веществ: бетулин, бетулиновая кислота, лупеол, эритродиол, аллобетулин, феллоновая кислота, гидроксилактон, бетулинальдегид, β-амирин, олеаноловая кислота, урсоловая кислота, этерифицированный бетулин и/или β-ситостерол.
4. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что содержание в ней тритерпена составляет 2-3,5 или 3,510 мас.%.
5. Эмульсия по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что маслом является масло авокадо и/или миндальное масло.
6. Эмульсия по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере один регулятор влажности и/или по меньшей мере один загуститель.
7. Эмульсия по п.6, отличающаяся тем, что регулятором влажности является глицерин и/или мочевина, добавляемые в концентрации 3-10%, предпочтительно 5% для каждого из указанных веществ, в расчете на количество эмульсии.
8. Эмульсия по п.6, отличающаяся тем, что загустителем является полисахарид, добавляемый в концентрации 0,2-2%, предпочтительно 0,5%, в расчете на количество воды.
9. Эмульсия по п.8, отличающаяся тем, что полисахаридом является агар-агар или каррагенан.
10. Эмульсия по любому из пп.2-9, отличающаяся тем, что она содержит 2-10% экстракта бересты, 20-30% масла авокадо, 10-20% миндального масла и 40-68% воды.
11. Эмульсия по п.10, отличающаяся тем, что она содержит 4% экстракта бересты, 29,3% масла авокадо, 14,7% миндального масла и 52% воды.
12. Эмульсия по любому из пп.2-9, отличающаяся тем, что она содержит 2-10% экстракта бересты, 20-30% масла авокадо, 10-20% миндального масла, 5-10% регулятора влажности и 30-63% воды.
13. Эмульсия по п.12, отличающаяся тем, что она содержит 4% экстракта бересты, 29,3% масла авокадо, 14,7% миндального масла, 5% глицерина и/или 5% мочевины и 42-47% воды.
14. Эмульсия по любому из пп.2-13, отличающаяся тем, что экстракт бересты содержит по меньшей мере 80% бетулина, не более 10% бетулиновой кислоты, не более 3% лупеола и не более 4% олеаноловой кислоты.
15. Применение эмульсии по любому из пп.1-14 для изготовления косметического средства предпочтительно в виде мази, лосьона, крема, геля, желе, настойки, шампуня, пудры и/или порошка, в частности, для нанесения на кожу туловища или кожу головы.
16. Применение эмульсии по любому из пп.1-14 для изготовления лекарственного средства предпочтительно в виде мази, лосьона, крема, геля, желе, настойки, шампуня, пудры и/или порошка, в частности, для нанесения на кожу туловища, кожу головы, особенно предпочтительно при дерматологических изменениях кожи туловища и/или головы, в частности при нейродермите, псориазе, себорейной экземе, меланодермии, предопухолевых состояниях кожи, а также для ингаляций при астматических приступах и/или для замещения гликокортикоидов.