KR20200074262A - 전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 ９ (ｐｃｓｋ９)에 대한 항원 결합 단백질 - Google Patents

전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 ９ (ｐｃｓｋ９)에 대한 항원 결합 단백질 Download PDF

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베이 산
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채드윅 테렌스 킹
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Abstract

전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 (Subtilisin Kexin) 타입 9 (PCSK9)와 상호작용하는 항원 결합 단백질을 설명한다. 제약상 유효량의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 투여함으로써 고콜레스테롤혈증 및 다른 질환을 치료하는 방법을 설명한다. PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 사용하여 샘플 내의 PCSK9의 양을 검출하는 방법을 설명한다.

Description

전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 ９ (ＰＣＳＫ９)에 대한 항원 결합 단백질 {ANTIGEN BINDING PROTEINS TO PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN TYPE 9 (PCSK9)}
<관련 출원>
본원은 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨, 2007년 8월 23일 출원된 미국 특허 가출원 60/957,668, 2007년 12월 21일 출원된 미국 특허 가출원 61/008,965 및 2008년 1월 9일 출원된 미국 특허 가출원 61/010,630을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 (subtilisin kexin) 타입 9 (PCSK9)에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 항원 결합 단백질의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.
전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 9 (PCSK9)는 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR) 단백질의 수준을 조절하는데 관여하는 세린 프로테아제이다 ([Horton et al., 2007]; [Seidah and Prat, 2007]). 시험관내 실험에서는 HepG2 세포에 PCSK9를 첨가하면 세포 표면 LDLR의 수준이 저하됨을 보여주었다 ([Benjannet et al., 2004]; [Lagace et al., 2006]; [Maxwell et al., 2005]; [Park et al., 2004]). 마우스를 사용한 실험에서는 PCSK9 단백질 수준을 증가시키면 간에서 LDLR 단백질 수준을 감소시킨 반면 ([Benjannet et al., 2004]; [Lagace et al., 2006]; [Maxwell et al., 2005]; [Park et al., 2004]), PCSK9 녹-아웃 마우스는 간에서 LDLR 수준이 증가되었음을 보여주었다 (Rashid et al., 2005). 추가로, 증가된 또는 감소된 수준의 혈장 LDL을 일으키는 다양한 인간 PCSK9 돌연변이가 확인되었다 ([Kotowski et al., 2006]; [Zhao et al., 2006]). PCSK9는 LDLR 단백질과 직접 상호작용하고, LDLR과 함께 세포내 이입되고, 엔도좀 경로 전체에서 LDLR과 함께 동시-면역형광을 내는 것으로 나타났다 (Lagace et al., 2006). PCSK9에 의한 LDLR의 분해는 관찰되지 않았고, 그를 통해 세포외 LDLR 단백질 수준을 저하시키는 메카니즘은 불확실하다.
PCSK9는 세린 프로테아제의 섭틸리신 (S8) 패밀리 내의 프로호르몬-전구단백질 전환효소이다 (Seidah et al., 2003). 인간은 S8A 및 S8B 하위패밀리 사이에 분류될 수 있는 9개의 프로호르몬-전구단백질 전환효소를 갖는다 (Rawlings et al., 2006). 푸린 (furin), PC1/PC3, PC2, PACE4, PC4, PC5/PC6 및 PC7/PC8/LPC/SPC7은 하위패밀리 S8B 내에 분류된다. 마우스 푸린 및 PC1으로부터의 상이한 도메인의 결정 및 NMR 구조를 통해 섭틸리신-유사 프로-도메인 및 촉매 도메인, 및 촉매 도메인에 대한 직접적 C-말단의 P 도메인이 밝혀졌다 ([Henrich et al., 2003]; [Tangrea et al., 2002]). 상기 하위패밀리 내의 아미노산 서열 유사성에 기초하여, 7개의 모든 멤버는 유사한 구조를 갖는 것으로 예측된다 (Henrich et al., 2005). SKI-1/S1P 및 PCSK9는 하위패밀리 S8A 내에 분류된다. 이들 단백질을 사용한 서열 비교에서는 또한 섭틸리신-유사 프로-도메인 및 촉매 도메인의 존재를 제안한다 ([Sakai et al., 1998]; [Seidah et al., 2003]; [Seidah et al., 1999]). 이들 단백질에서, 촉매 도메인에 대해 C-말단의 아미노산 서열은 보다 가변적이고, P 도메인의 존재를 제안하지 않는다.
프로호르몬-전구단백질 전환효소는 효소원 (zymogen)으로서 발현되고, 이들은 다중 단계 과정을 통해 성숙한다. 상기 과정에서 프로-도메인의 기능은 이중이다. 프로-도메인은 먼저 샤퍼론 (chaperone)으로서 작용하고, 촉매 도메인의 적합한 폴딩을 위해 요구된다 (Ikemura et al., 1987). 일단 촉매 도메인이 접히면, 프로-도메인과 촉매 도메인 사이에 자가 촉매 반응이 일어난다. 상기 초기 절단 반응 후에, 프로-도메인은 촉매 도메인에 결합된 상태로 남아, 여기서 촉매 활성의 억제제로서 작용한다 (Fu et al., 2000). 조건이 정확하면, 성숙은 프로-도메인 내의 부위에서 제2 자가촉매 사건과 함께 진행된다 (Anderson et al., 1997). 상기 제2 절단 사건이 일어난 후, 프로-도메인 및 촉매 도메인은 해리하여, 활성 프로테아제를 생성시킨다.
PCSK9 효소원의 자가 촉매 반응은 Gln152 및 Ser153 (VFAQ｜SIP) 사이에서 일어나고 (Naureckiene et al., 2003), 세포로부터 그의 분비를 위해 요구되는 것으로 나타났다 (Seidah et al., 2003). PCSK9의 프로-도메인 내의 부위에서 제2 자가촉매 사건은 관찰되지 않았다. 정제된 PCSK9는 비-환원 SDS-PAGE에 의해 분리할 수 있는 다음과 같은 2개의 종으로 이루어진다; 17 Kd에서 프로-도메인, 및 65 Kd에서 촉매 도메인 + C-말단 도메인. PCSK9는 그의 억제성 프로-도메인 없이 단리되지 않았고, PCSK9의 촉매 활성의 측정은 가변적이었다 ([Naureckiene et al., 2003]; [Seidah et al., 2003]).
일부 실시태양에서, 본 발명은 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 A) (i) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH1로부터의 CDRH1; (ii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH2로부터의 CDRH2; (iii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH3으로부터의 CDRH3; 및 (iv) 4개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); B) (i) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL1로부터의 CDRL1; (ii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL2로부터의 CDRL2; (iii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL3으로부터의 CDRL3; 및 (iv) 4개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRL로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL); 또는 C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함하는, PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 A)의 적어도 하나의 CDRH 및 B)의 적어도 하나의 CDRL을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 A)의 적어도 2개의 CDRH 및 B)의 적어도 2개의 CDRL을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 상기 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함한다. 일부 실시태양에서, A)의 CDRH는 (i) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH1로부터 선택된 CDRH1 아미노산 서열; (ii) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH2로부터 선택된 CDRH2 아미노산 서열; (iii) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH3으로부터 선택된 CDRH3 아미노산 서열; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택된다. 또한, B)의 CDRL은 (i) 서열 12, 35, 32, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL1로부터 선택된 CDRL1 아미노산 서열; (ii) 서열 12, 35, 32, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL2로부터 선택된 CDRL2 아미노산 서열; (iii) 서열 12, 35, 32, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL3으로부터 선택된 CDRL3 아미노산 서열; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRL; 또는 C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, A)의 CDRH는 (i) 서열 67 내의 CDRH1 아미노산 서열의 CDRH1 아미노산 서열; (ii) 서열 67 내의 CDRH2 아미노산 서열의 CDRH2 아미노산 서열; (iii) 서열 67 내의 CDRH3 아미노산 서열의 CDRH3 아미노산 서열; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRH로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되고; 상기 B)의 CDRL은 (i) 서열 12 내의 CDRL1 아미노산 서열의 CDRL1 아미노산 서열; (ii) 서열 12 내의 CDRL2 아미노산 서열의 CDRL2 아미노산 서열; (iii) 서열 12 내의 CDRL3 아미노산 서열의 CDRL3 아미노산 서열; 및 (iv) 2개 이하의 아미노산의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 (i), (ii), 및 (iii)의 CDRL; 또는 C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 A) 서열 67 내의 CDRH1 서열의 CDRH1, 서열 67 내의 CDRH2 서열의 CDRH2, 및 서열 67 내의 CDRH3 서열의 CDRH3, 및 B) 서열 12 내의 CDRL1 서열의 CDRL1, 서열 12 내의 CDRL2 서열의 CDRL2, 및 서열 12 내의 CDRL3 서열의 CDRL3을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 구역 (VH), 및/또는 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 구역 (VL)을 포함한다. 일부 실시태양에서, VH는 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖고/갖거나, VL은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시태양에서, VH는 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되고/되거나, VL은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 ABP가 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 상기 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH1에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRH1; (ii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH2에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRH2; 및 (iii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH3에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRH3으로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR (CDRH); B) (i) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL1에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRL1; (ii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL2에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRL2; 및 (iii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL3에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CDRL3으로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR (CDRL); 또는 C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRH1; (ii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRH2; 및 (iii) 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRH3에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRH3으로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 하나 이상의 CDRH; B) (i) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRL1; (ii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRL2; 및 (iii) 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 중 하나 내의 CDRL3에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 CDRL3으로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 하나 이상의 CDRL; 또는 C) A)의 하나 이상의 중쇄 CDRH 및 B)의 하나 이상의 경쇄 CDRL을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 상기 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 67, 79, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH3으로부터 선택되는 CDRH3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH3과 상이한 CDRH3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (서열 404) (여기서, X1은 D, A, R 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y, I, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, A, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 F, A, L 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 W, L, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, Y, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 A, Y, R 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 Y, P 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 Y, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 D, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 A, M 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 F, D 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 D, V 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 V 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH); B) (i) 서열 12, 35, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL3으로부터 선택되는 CDRL3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL3과 상이한 CDRL3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 (서열 405) (여기서, X1은 Q 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S, T, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y, W 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 D 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 L, T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 아미노산 부재, A, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 아미노산 부재, G, A, 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 아미노산 부재, S, Y, 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 아미노산 부재 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDRL3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 46, 및 그의 일부 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 본원에 개시된 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 60, 및 그의 일부 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, ABP의 아미노산 서열은 서열 12, 35, 23, 및 그의 일부 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, ABP의 중쇄는 서열 67의 CDRH3, 서열 67의 CDRH2, 및 서열 67의 CDRH1을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 12의 CDRL3, 서열 12의 CDRL2, 및 서열 12의 CDRL1을 포함한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 그의 항체 단편이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디 (diabody), 또는 단일쇄 항체 분자이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 인간 항체이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 IgG1-, IgG2-, IgG3- 또는 IgG4-형의 것이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 IgG4- 또는 IgG2-형의 것이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 표지기에 커플링된다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하기 위해 본원에 설명되는 항원 결합 단백질과 경쟁한다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 그의 항체 단편이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아바디, 또는 단일쇄 항체 분자이다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 표지기에 커플링된다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 대상에게 투여될 때 대상 내에 존재하는 LDL의 양을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 대상에게 투여될 때 대상 내에 존재하는 혈청 콜레스테롤의 양을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 단리된 항원 결합 단백질은 대상에게 투여될 때 대상 내에 존재하는 LDLR의 양을 증가시킨다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 설명되는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 본원에 설명되는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 대한 결합에 대해 본원에 개시된 항원 결합 단백질과 경쟁하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 선택적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 100 pM보다 작은 Kd로 PCSK9에 결합한다.
일부 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 LDLR 단백질 수준을 증가시키는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 LDLR 단백질 수준을 증가시키는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 ABP, 및 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질은 스타틴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 및 이들의 몇몇 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 상기 항원 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 상기 항원 결합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 제조 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 추가의 활성 물질을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 추가의 활성 물질은 방사선 동위원소, 방사선 핵종, 독소, 또는 치료 및 화학치료군으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 환자에서 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 개시되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 병태는 고콜레스테롤혈증이다.
일부 측면에서, 본 발명은 유효량의 적어도 하나의 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 100 pM보다 작은 Kd로 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 10 pM보다 작은 Kd로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 5 pM보다 작은 Kd로 결합한다.
일부 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질은 스타틴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 및 이들의 몇몇 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에서 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함한다. 상기 방법은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에서 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질은 스타틴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 및 이들의 몇몇 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에서 제공되는 단리된 항원 결합 단백질을 투여함으로써, 대상에서 LDLR 단백질 수준을 증가시키는 방법을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본원에 설명되는 단리된 항원 결합 단백질을 LDLR 단백질의 이용률을 증가시키는 물질과 동시에 또는 순차적으로 투여함으로써, 대상에서 LDLR 단백질 수준을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, LDLR 단백질 수준의 이용률을 증가시키는 물질은 스타틴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 스타틴은 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 및 이들의 몇몇 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하고, 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR)에 대한 PCSK9의 LDLR 저하 효과를 감소시키는 중화 항체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9에 특이적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체는 서열 3의 잔기 31-447 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체는 서열 3에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 PCSK9에 결합한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 중화 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 서열 3의 잔기 31-447 내의 위치에서 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질이 PCSK9에 결합될 때, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, 또는 Q382. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, 또는 S381. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 2개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, 또는 S381. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 4개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, 또는 S381. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, 또는 Q387. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, 또는 G384. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 2개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, 또는 G384. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 4개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, 또는 G384. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, 또는 F379. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 2개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, 또는 F379. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 4개로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, 또는 F379.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하여 PCSK9가 LDLR에 결합할 가능성을 감소시키는, PCSK9에 결합하는 중화 항체를 포함한다.
일부 실시태양에서, PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 분자가 고려된다. 항체는 서열 3의 잔기 31-447 내의 위치에서 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 PCSK9에 결합될 때 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378.
일부 실시태양에서, 항체가 PCSK9의 잔기의 8 옹스트롬 이내에서 PCSK9에 결합하는 것을 차단하는 단리된 항체 또는 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시태양에서, PCSK9의 잔기는 다음의 PCSK9 잔기 중 적어도 하나로부터 선택된다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378.
일부 실시태양에서, LDLR이 PCSK9에 결합하는 위치와 겹치는 위치에서 PCSK9에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시태양에서, LDLR이 PCSK9에 결합하는 위치는 S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, 및 S381로 이루어지는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시태양에서, PCSK9에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시태양에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 EGFa가 PCSK9 상의 다음의 잔기 중 적어도 하나의 8 옹스트롬 이내에서 PCSK9에 결합할 가능성을 감소시킨다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, 또는 Q382.
일부 실시태양에서, EGFa가 결합하고/하거나 Ab 21B12가 결합하고/하거나 31H4가 결합하는 표면과 겹치는 PCSK9의 표면에 결합하는 항체, 항원 결합 단백질, 또는 항원 결합 분자를 제공한다. 일부 실시태양에서, 도면에 도시된 것과 유사한 방식으로 PCSK9에 결합하는 항체, 항원 결합 단백질, 또는 항원 결합 분자를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 실시태양은 중화 항체 또는 항원 결합 단백질이다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 LDLR 또는 그의 단편 (예를 들어 EGFa)이 아니다.
일부 측면에서, 본 발명은 단리된 중화 항체를 제공하고, 여기서 항체가 PCSK9에 결합할 때, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 8 옹스트롬 이하에 위치한다: 서열 3의 T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, E593, S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, 및 H597. 일부 실시태양에서, 항체는 PCSK9의 다음의 잔기 중 적어도 하나로부터 5 옹스트롬 이하에 위치한다: 서열 3의 T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, 및 E593.
일부 측면에서, 본 발명은 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다. 항원 결합 단백질은 A) 서열 89 내의 CDRH1 서열의 CDRH1, 서열 89 내의 CDRH2 서열의 CDRH2, 및 서열 89 내의 CDRH3 서열의 CDRH3, 및 B) 서열 32 내의 CDRL1 서열의 CDRL1, 서열 32 내의 CDRL2 서열의 CDRL2, 및 서열 32 내의 CDRL3 서열의 CDRL3 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열 1의 PCSK9 단백질에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 단리된 항원 결합 단백질과 변이체 PCSK9 단백질 사이의 결합은 단리된 항원 결합 단백질과 서열 1 및/또는 서열 303의 PCSK9 단백질 사이의 결합의 50% 미만이다. 일부 실시태양에서, 변이체 PCSK9 단백질은 서열 1에 제시된 바와 같이 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554로 이루어지거나 그를 포함하는 군 중에서 선택되는 위치에 잔기의 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 돌연변이는 R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, 및 E582R을 포함하거나 그로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 돌연변이는 D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 및 Q554R로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 제1 방식으로 서열 303의 PCSK9 단백질에 결합하고 제2 방식으로 PCSK9의 변이체에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. PCSK9 변이체는 서열 303 및/또는 서열 1의 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554를 포함하거나 그로 이루어지는 군 중에서 선택되는 위치에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 제1 방식은 제1 EC50, 제1 Bmax, 또는 제1 EC50과 제1 Bmax를 포함한다. 일부 실시태양에서, 제2 방식은 제2 EC50, 제2 Bmax, 또는 제2 EC50과 제2 Bmax를 포함한다. 제1 방식에 대한 값은 제2 방식에 대한 값과 상이하다. 일부 실시태양에서, 제1 방식은 제1 EC50을 포함하고, 제2 방식은 제2 EC50을 포함하고, 점 돌연변이는 R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, 및 E582R로 이루어지거나 그를 포함하는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 제1 EC50은 제2 EC50과 적어도 20% 상이하다. 일부 실시태양에서, 제1 EC50은 제2 EC50과 적어도 50% 상이하다. 일부 실시태양에서, 제2 EC50은 제1 EC50보다 더 큰 수치값이다. 일부 실시태양에서, 제1 EC50은 다중 비드 (bead) 결합 분석에 의해 결정된다. 일부 실시태양에서, 제2 EC50은 1 ㎛보다 더 크다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 중화 항원 결합 단백질이다. 일부 실시태양에서, 중화 항원 결합 단백질은 경쟁적 중화 항원 결합 단백질이다. 일부 실시태양에서, 중화 항원 결합 단백질은 비-경쟁적 중화 항원 결합 단백질이다. 일부 실시태양에서, 제1 방식은 제1 Bmax를 포함하고, 제2 방식은 제1 Bmax와 상이한 제2 Bmax를 포함한다. PCSK9 변이체는 D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 및 Q554R로 이루어지거나 그를 포함하는 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는다. 일부 실시태양에서, 제2 Bmax는 제1 Bmax의 약 10%이다. 일부 실시태양에서, 제1 Bmax는 제2 Bmax와 적어도 20% 상이하다. 일부 실시태양에서, 제1 Bmax는 제2 Bmax와 적어도 50% 상이하다.
일부 측면에서, 본 발명은 서열 3의 PCSK9 단백질에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질의 에피토프는 서열 1의 다음의 아미노산 중 적어도 하나를 포함한다: 207, 208, 181, 185, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554.
일부 측면에서, 본 발명은 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 PCSK9 단백질에 결합하는 단리된 중화 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 중화 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 LDLR 저하 효과를 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 LDLR 비-경쟁적 중화 항원 결합 단백질이다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 LDLR 경쟁적 중화 항원 결합 단백질이다.
일부 측면에서, 본 발명은 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 상기 항원 결합 단백질은 A) 서열 49 내의 CDRH1 서열의 CDRH1, 서열 49 내의 CDRH2 서열의 CDRH2, 및 서열 49 내의 CDRH3 서열의 CDRH3, 및 B) 서열 23 내의 CDRL1 서열의 CDRL1, 서열 23 내의 CDRL2 서열의 CDRL2 서열, 및 서열 23 내의 CDRL3 서열의 CDRL3을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 결정화된 PCSK9 단백질, 및 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 조성물은 결정화된 PCSK9 단백질을 포함하고, 여기서 PCSK9 단백질의 3차원 구조는 약 2.2 옹스트롬 이상의 해상력으로 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 항체 또는 그의 단편이다.
일부 측면에서, 본 발명은 결정화된 PCSK9 단백질 및 적어도 LDLR 단백질의 EGFa 섹션을 포함하고, 여기서 LDLR 단백질의 EGFa 섹션에는 PCSK9 단백질이 결합하고, 상기 결정화된 PCSK9 단백질은 PCSK9 단백질의 3차원 구조가 약 2.2 옹스트롬 이상의 해상력으로 결정될 수 있는 것이다. 일부 실시태양에서, 분자 모델은 컴퓨터 판독 매체 상에 존재한다.
일부 측면에서, 본 발명은 혈청 콜레스테롤 저하를 위한 의약의 제조에 있어서 본원에서 설명되는 항원 결합 단백질의 용도를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 대상에서 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 연관된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본원에 설명된 항원 결합 단백질의 용도를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH1로부터 선택되는 CDRH1, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH1과 상이한 CDRH1; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 (서열 406) (여기서, X1은 G이고, X2는 Y, F, 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 L 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, S, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 G, S, 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 I, M, 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S, N 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), B) (i) 서열 12, 32, 35, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL1로부터 선택되는 CDRL1, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL1과 상이한 CDRL1; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (서열 407) (여기서, X1은 T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S, T, 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S이고, X5는 S이고, X6은 N, D, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 I, V, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 G 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 A 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 G, Y, S, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 D, S, T, 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 V이고, X14는 S, N, 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다. 당업자는 단일 ABP 또는 항체가 하나 이상의 상기 선택사항을 만족할 수 있고 여전히 본 실시태양에 대해 설명된 발명 내에 있음을 알 것이다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH2로부터 선택되는 CDRH2, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH2와 상이한 CDRH2; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17 (서열 408) (여기서, X1은 W, S, L 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 V, I, 및 E로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S, W, 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 F, S, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 Y, S, D, 및 H로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 N, S, 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 S 및 G로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 N, Y, D, 및 R로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 T, I, 및 E로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 N, S, Y, 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y이고, X12는 A 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 Q, D, 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 K 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X15는 L 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X16은 Q 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X17은 G 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), B) (i) 서열 12, 32, 35, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL2로부터 선택되는 CDRL2, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL2와 상이한 CDRL2; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7 (서열 409) (여기서, X1은 G, E, S, 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 N, V, 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 N, Q, 및 K로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 R이고, X6은 P이고, X7은 S임)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 67, 79, 89, 및 49로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH3으로부터 선택되는 CDRH3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH3과 상이한 CDRH3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (서열 410) (여기서, X1은 D 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 D, I 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 F, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 W, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, L 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 A, Y, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 Y, Q 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 G, Y, 및 L로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 Y, D, 및 V로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 G, A, 및 P로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 M 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 D이고, X14는 V 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), 및 B) (i) 서열 12, 32, 35, 및 23으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL3으로부터 선택되는 CDRL3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL3과 상이한 CDRL3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 (서열 411) (여기서, X1은 Q, A, G 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S, V, T 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y, N, 및 W로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, Y, 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 L 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 S, T, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 G, S, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S, M, W, 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 V임)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 임의의 상기 아미노산은 보존적 아미노산 치환에 의해 교체될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH1로부터 선택되는 CDRH1, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH1과 상이한 CDRH1; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 (서열 412) (여기서, X1은 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T, P, S 및 A, C, V, L, 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 L, F, I, V, M, A, 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 T, P, S, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 I, L, V, M, A, 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH1 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), B) (i) 서열 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL1로부터 선택되는 CDRL1, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL1과 상이한 CDRL1; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (서열 413) (여기서, X1은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 S, N, T, A, C, 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 D 및 E로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 G, A, R, P, V, L, I, K, Q, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 N 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 Y, S, W, F, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL1 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH2로부터 선택되는 CDRH2, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH2와 상이한 CDRH2; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17 (서열 414) (여기서, X1은 W, Y, 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 A, F, V, L, I, Y, 및 M으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 N 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 N 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X10은 N 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X11은 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X12는 A, V, L, 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X13은 Q, E, N, 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X14는 K, R, Q, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X15는 L, F, V, I, M, A, 및 Y로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X16은 Q 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X17은 G, P, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), B) (i) 서열 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL2로부터 선택되는 CDRL2, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL2와 상이한 CDRL2; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7 (서열 415) (여기서, X1은 E 및 D로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 N 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 R, K, Q, 및 N으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 P 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL2 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 PCSK9에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서 항원 결합 단백질은 A) (i) 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 및 58로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRH3으로부터 선택되는 CDRH3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRH3과 상이한 CDRH3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6 (서열 416) (여기서, X1은 G, P, A 및 아미노산 부재로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 G, V, P, A, I, M, L, 및 F로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 M, L, F, 및 I로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 D 및 E로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRH3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 구역 (CDRH), B) (i) 서열 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열 내의 CDRL3으로부터 선택되는 CDRL3, (ii) 아미노산 서열이 2개 이하의 아미노산의 아미노산 부가, 결실 또는 치환에 의해 (i)의 CDRL3과 상이한 CDRL3; 및 (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9 (서열 417) (여기서, X1은 S, N, T, A, C, 및 Q로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X2는 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X3은 Y, W, F, T, 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X4는 T 및 S로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X5는 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X6은 S, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X7은 N, S, Q, T, A, 및 C로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X8은 M, V, L, F, I, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택되고, X9는 V, I, M, L, F, 및 A로 이루어지는 군 중에서 선택됨)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDRL3 아미노산 서열로 이루어지는 군 중의 적어도 하나로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 구역 (CDRL)을 포함한다.
도 1a는 성숙형의 PCSK9의 아미노산 서열을 도시한 것이고, 프로-도메인을 밑줄친다.
도 1b-1e는 PCSK9의 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이고, 프로-도메인을 밑줄치고 신호 서열은 굵게 도시한다.
도 2a-2d는 다양한 항원 결합 단백질의 다양한 경쇄의 서열 비교 표이다. 도 2c는 도 2a에서 시작한 서열의 계속이다. 도 2d는 도 2b에서 시작한 서열의 계속이다.
도 3a-3d는 다양한 항원 결합 단백질의 다양한 중쇄의 서열 비교 표이다. 도 3c는 도 3a에서 시작한 서열의 계속이다. 도 3d는 도 3b에서 시작한 서열의 계속이다.
도 3e-3jj는 항원 결합 단백질의 일부 실시태양의 가변 도메인에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 3kk는 다양한 불변 도메인에 대한 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 3ll-3bbb는 항원 결합 단백질의 일부 실시태양의 가변 도메인에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 3ccc-3jjj는 항원 결합 단백질의 일부 실시태양의 다양한 중쇄 및 경쇄의 서열 비교 표이다.
도 4a는 인간 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4b는 인간 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4c는 사이노몰거스 (cynomolgus) PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4d는 사이노몰거스 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4e는 마우스 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 4f는 마우스 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합 곡선이다.
도 5a는 단백질의 상대 순도 및 농도를 입증하는, PCSK9 및 다양한 항원 결합 단백질을 포함한 SDS PAGE 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 5b 및 5c는 21B12에 대한 비아코어 (biacore) 용액 평형 분석으로부터의 그래프를 도시한 것이다.
도 5d는 비아코어 포획 분석으로부터의 운동학 그래프를 도시한 것이다.
도 5e는 3개의 ABP에 대한 비닝 (binning) 결과를 도시하는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 6a는 시험관 내 PCSK9:LDLR 결합 분석에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 31H4 IgG2의 억제 곡선이다.
도 6b는 시험관 내 PCSK9:LDLR 결합 분석에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 31H4 IgG4의 억제 곡선이다.
도 6c는 시험관 내 PCSK9:LDLR 결합 분석에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 21B12 IgG2의 억제 곡선이다.
도 6d는 시험관 내 PCSK9:LDLR 결합 분석에서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 21B12 IgG4의 억제 곡선이다.
도 7a는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 보여주는, 세포 LDL 흡수 분석에서 항원 결합 단백질 31H4 IgG2의 억제 곡선이다.
도 7b는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 보여주는, 세포 LDL 흡수 분석에서 항원 결합 단백질 31H4 IgG4의 억제 곡선이다.
도 7c는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 보여주는, 세포 LDL 흡수 분석에서 항원 결합 단백질 21B12 IgG2의 억제 곡선이다.
도 7d는 PCSK9의 LDL 흡수 차단 효과를 감소시키는 ABP의 효과를 보여주는, 세포 LDL 흡수 분석에서 항원 결합 단백질 21B12 IgG4의 억제 곡선이다.
도 8a는 ABP 31H4의 마우스에서 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 도시하는 그래프이다 (IgG 대조군 처리 마우스에 상대적인 변화) (* p<0.01).
도 8b는 ABP 31H4의 마우스에서 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 도시하는 그래프이다 (시간 = 0시간에 상대적인 변화) (# p,0.05).
도 8c는 C57Bl/6 마우스에서 HDL 콜레스테롤 수준에 대한 ABP 31H4의 효과를 도시하는 그래프이다 (* p<0.01).
도 8d는 C57Bl/6 마우스에서 HDL 콜레스테롤 수준에 대한 ABP 31H4의 효과를 도시하는 그래프이다 (# p<0.05).
도 9는 다양한 시점 후에 존재하는 간 LDLR 단백질의 양을 향상시키는 ABP 31H4의 능력의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다.
도 10a는 야생형 마우스에서 총 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 항원 결합 단백질 31H4의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 10b는 야생형 마우스에서 HDL을 저하시키는 항원 결합 단백질 31H4의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 10c는 다양한 항원 결합 단백질 31H4 및 16F12의 혈청 콜레스테롤 저하 능력을 도시하는 그래프이다.
도 11a는 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 항원 결합 단백질의 지속기간 및 능력을 시험하기 위한 주입 프로토콜을 도시한 것이다.
도 11b는 도 11a의 프로토콜의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 12a는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 21B12의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 12b는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 31H4의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 12c는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 25A7.1 ("25A7" 중화 항체에 대조적인 비중화 항체)의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 12d는 PCSK9를 과다발현하는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 21B12의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 12e는 PCSK9를 과다발현하는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 31H4의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 12f는 PCSK9를 과다발현하는 HepG2 세포에서 스타틴 및 ABP 25A7.1 ("25A7" 중화 항체에 대조적인 비중화 항체)의 조합물에 반응한 LDLR 수준을 도시한 것이다.
도 13a는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 다양한 경쇄 아미노산 서열을 도시한 것이다. 점 (.)은 아미노산 부재를 나타낸다.
도 13b는 PCSK9에 대한 다양한 ABP에 대한 경쇄 분지도 (cladogram)를 도시한 것이다.
도 13c는 PCSK9에 대한 다양한 ABP의 다양한 중쇄 아미노산 서열을 도시한 것이다. 점 (.)은 아미노산 부재를 나타낸다.
도 13d는 PCSK9에 대한 다양한 ABP에 대한 중쇄 계통수 (dendrogram)를 도시한 것이다.
도 13e는 경쇄 및 중쇄 CDR의 비교, 및 그로부터 컨센서스가 유래되는 군의 지정을 도시한 것이다.
도 13f는 제1군 및 제2군에 대한 컨센서스 서열을 도시한 것이다.
도 13g는 제3군 및 제4군에 대한 컨센서스 서열을 도시한 것이다.
도 13h는 제1군 및 제2군에 대한 컨센서스 서열을 도시한 것이다. 점 (.)은 동일한 잔기를 나타낸다.
도 13i는 제2군에 대한 컨센서스 서열을 도시한 것이다. 점 (.)은 동일한 잔기를 나타낸다.
도 13j는 제3군 및 제4군에 대한 컨센서스 서열을 도시한 것이다. 점 (.)은 동일한 잔기를 나타낸다.
도 14a는 다양한 ABP (10 mg/kg에서)의 생체 내 LDL 저하 능력을 도시하는 그래프이다.
도 14b는 다양한 ABP (30 mg/kg에서)의 생체 내 LDL 저하 능력을 도시하는 그래프이다.
도 15a 및 도 15b는 항원 결합 단백질의 다양한 실시태양의 다양한 경쇄의 서열 비교 표이다. 도 15b는 도 15a에서 시작된 서열의 계속이다.
도 15c 및 도 15d는 항원 결합 단백질의 다양한 실시태양의 다양한 경쇄의 서열 비교 표이다. 도 15d는 도 15c에서 시작된 서열의 계속이다.
도 16a는 PCSK9의 ProCat 또는 VD 섹션에 결합하는 Ab 21B12의 능력을 시험하기 위해 사용된 겔의 도면이다.
도 16b는 PCSK9의 ProCat 또는 VD 섹션에 결합하는 Ab 31H4의 능력을 시험하기 위해 사용된 겔의 도면이다.
도 17은 PCSK9, 및 LDLR의 EGFa 섹션의 구조도이다.
도 18a는 PCSK9 및 31H4 Ab의 구조도이다.
도 18b는 PCSK9 및 31H4 Ab의 구조도이다.
도 19a는 PCSK9, 31H4 Ab, 및 21B12 Ab의 구조도이다.
도 19b는 PCSK9 및 21B12 Ab의 구조도이다.
도 20a는 PCSK9에 결합된 항체 31H4 및 21B12의 구조와 겹쳐놓은 PCSK9, 및 LDLR로부터의 EGFa의 구조도이다.
도 20b는 PCSK9 및 LDLR의 구조적 모델의 도면이다.
도 20c는 별도의 관점으로부터 PCSK9 및 LDLR의 구조적 모델의 도면이다.
도 20d는 PCSK9 및 LDLR의 구조적 모델의 도면이고, 여기서 31H4 및 21B12의 구조도를 포함시킨다.
도 20e는 표시된 축 둘레에 90도 회전시킨 도 20D의 구조적 모델의 도면이다.
도 20f는 표시된 축 둘레에 180도 회전시킨 도 20D의 구조적 모델의 도면이다.
도 21a는 PCSK9 및 31A4의 구조도이다.
도 21b는 PCSK9 및 31A4의 구조도이다.
도 21c는 PCSK9 및 31A4의 구조도이다.
도 21d는 전장 PCSK9 및 31A4의 구조적 모델의 도면이다.
도 22는 인간 ABP 서열과 이. 콜라이 (E. coli)에 대해 생성되고 결정 구조에 대해 사용된 ABP 서열 사이의 다양한 차이를 확인하는 ABP 서열의 세트이다.
도 23은 다양한 비닝 결과의 표이다.
도 23a는 다양한 비닝 결과를 도시하는 표의 제1 부분이다.
도 23b는 다양한 비닝 결과를 도시하는 표의 제2 부분이다.
도 23c는 다양한 비닝 결과를 도시하는 표의 제3 부분이다.
도 23d는 다양한 비닝 결과를 도시하는 표의 제4 부분이다.
도 24a는 비-환원 조건 하의 웨스턴 블롯의 도면이다.
도 24b는 환원 조건 하의 웨스턴 블롯의 도면이다.
도 25a는 PCSK9의 표면 점유율 (coverage)의 도면이다.
도 25b는 PCSK9의 표면 점유율의 도면이다.
도 25c는 PCSK9의 표면 점유율의 도면이다.
도 25d는 PCSK9의 표면 점유율의 도면이다.
도 25e는 PCSK9의 표면 점유율의 도면이다.
도 25f는 PCSK9의 표면 점유율의 도면이다.
도 26은 다양한 항체의 에피토프를 검사하기 위해 PCSK9 아미노산 서열 및 PCSK9 변이체 내에서 돌연변이된 모든 잔기의 서열 비교이다.
도 27a는 21B12를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑 (mapping)할 때, 21B12 에피토프 적중 (hit)을 도시한 것이다.
도 27b는 31H4 및 21B1을 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑할 때, 31H4 에피토프 적중을 도시한 것이다.
도 27c는 31H4 및 21B12를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑할 때, 31A4 에피토프 적중을 도시한 것이다.
도 27d는 31H4 및 21B12를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑할 때, 12H11 에피토프 적중을 도시한 것이다.
도 27e는 31H4 및 21B12를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑할 때, 3C4 에피토프 적중을 도시한 것이다.
도 28a는 PCSK9의 다양한 부분에 대한 다양한 ABP의 결합 능력을 입증하는 그래프이다.
도 28b는 PCSK9의 다양한 부분에 대한 다양한 ABP의 결합 능력을 입증하는 그래프이다.
도 28c는 2개의 ABP의 LDLR 결합 능력을 비교하는 그래프이다.
도 28d는 2개의 ABP의 세포 LDL 흡수 활성을 비교하는 그래프이다.
PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질 (예를 들어 항체 및 그의 기능적 결합 단편)을 본원에서 개시한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하고, 다양한 방식으로 PCSK9가 기능하는 것을 방지한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 다른 물질과 상호작용하는 PCSK9의 능력을 차단하거나 감소시킨다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR에 결합할 가능성을 방지하거나 감소시키는 방식으로 PCSK9에 결합한다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하지만 LDLR과 상호작용하는 PCSK9의 능력을 차단하지 않는다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 모노클로날 항체이다.
본 명세서에 비추어 당업자가 알 수 있는 바와 같이, PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 변경시키면 LDL에 결합하기 위해 이용가능한 LDLR의 양을 증가시킬 수 있고, 이는 다시 대상에서 혈청 LDL의 양을 감소시켜, 대상의 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시킨다. 따라서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 상승된 혈청 콜레스테롤 수준을 갖거나, 상승된 혈청 콜레스테롤 수준의 위험이 있거나, 그들의 혈청 콜레스테롤 수준의 감소가 유익할 수 있는 대상을 치료하기 위한 다양한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 따라서, 혈청 콜레스테롤을 저하시키거나, 유지하거나, 그의 증가를 방지하기 위한 다양한 방법 및 기술이 본원에서 설명된다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9와 LDLR 사이의 결합을 허용하지만, 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 불리한 활성을 방지하거나 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 방지하거나 감소시킨다.
편의상, 다음 섹션은 본원에서 사용되는 용어의 다양한 의미를 일반적으로 개략한다. 본 논의에 따라, 항원 결합 단백질에 관한 일반적인 측면을 논의한 후, 항원 결합 단백질의 다양한 실시태양의 특성 및 이들을 사용할 수 있는 방식을 입증하는 구체적인 예를 논의한다.
정의 및 실시태양
상기한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명이 모두 단지 예시적이고 설명적인 것이고, 청구된 발명의 제한이 아님을 이해해야 한다. 본원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 진술하지 않으면 복수를 포함한다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 진술하지 않으면 "및/또는"을 의미하다. 또한, 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예를 들어 "포함하다" 및 "포함된"의 사용은 제한하는 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 구체적으로 달리 진술하지 않으면 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분, 및 하나 초과의 하위단위를 포함하는 요소 및 성분을 모두 포함한다. 또한, 용어 "부분"의 사용은 모이어티 (moiety)의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 섹션 표제는 단지 설명의 구성을 위한 것이고, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허 출원, 기사, 책, 및 논문을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 본원에서 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적으로 그 전문을 본원에 참조로 명백하게 포함시킨다. 본원에 따라 사용될 때, 다음 용어는 달리 지시하지 않으면 다음의 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
용어 "전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 9" 또는 "PCSK9"는 서열 1 및/또는 3에 제시된 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 관련 폴리펩티드를 나타내고, 이는 대립유전자 변이체, 스플라이스 (splice) 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체, 및/또는 N-말단 메티오닌의 부가를 포함한 삽입 변이체, 융합 폴리펩티드, 및 종간 상동체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, PCSK9 폴리펩티드는 말단 잔기, 예를 들어 비제한적으로 리더 (leader) 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 라이신 잔기, 태그 (tag) 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함한다. "PCSK9"는 또한 FH3, NARC1, HCHOLA3, 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 타입 9, 및 신경 세포자멸 조절된 전환효소 1로서 언급되었다. PCSK9 유전자는 분비형 섭틸라제 패밀리의 프로테이나제 K 하위패밀리에 속하는 전구단백질 전환효소 단백질을 코딩한다. 용어 "PCSK9"는 전구단백질, 및 전구단백질의 자가 촉매 반응 후에 생성된 생성물 모두를 나타낸다. 자가촉매된 생성물만을 언급할 때 (예를 들어, 절단된 PCSK9에 선택적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 대해), 단백질은 "성숙", "절단된", "처리된 (processed)" 또는 "활성" PCSK9로서 언급할 수 있다. 비활성 형태만을 언급할 때, 단백질은 "비활성", "전구-형태 (pro-form)", 또는 "비처리된" 형태의 PCSK9로서 언급할 수 있다. 본원에서 사용될 때 용어 PCSK9는 또한 천연 발생 대립유전자, 예를 들어 돌연변이 D374Y, S127R 및 F216L을 포함한다. 용어 PCSK9는 또한 PCSK9 아미노산 서열의 번역후 변형을 포함한 PCSK9 분자, 예를 들어 글리코실화된, PEG화된 PCSK9 서열, 그로부터 그의 신호 서열이 절단된 PCSK9 서열, 그로부터 그의 전구-도메인이 촉매 도메인으로부터 절단되지만 촉매 도메인으로부터 분리되지 않은 PCSK9 서열을 포함한다 (예를 들어, 도 1a 및 1b-1e).
용어 "PCSK9 활성"은 PCSK9의 임의의 생물학적 효과를 포함한다. 특정 실시태양에서, PCSK9 활성은 기질 또는 수용체와 상호작용하거나 그에 결합하는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시태양에서, PCSK9 활성은 LDL 수용체 (LDLR)에 결합하는 PCSK9의 능력에 의해 나타내어진다. 일부 실시태양에서, PCSK9는 LDLR에 결합하여 그를 수반하는 반응을 촉매한다. 일부 실시태양에서, PCSK9 활성은 LDLR의 이용률을 변경시키는 (예를 들어, 감소시키는) PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시태양에서, PCSK9 활성은 대상에서 LDL의 양을 증가시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시태양에서, PCSK9 활성은 LDL에 결합하도록 이용가능한 LDLR의 양을 감소시키는 PCSK9의 능력을 포함한다. 일부 실시태양에서, "PCSK9 활성"은 PCSK9 신호전달로부터 생성되는 임의의 생물학적 활성을 포함한다. 예시적인 활성은 LDLR에 대한 PCSK9 결합, LDLR 또는 다른 단백질을 절단하는 PCSK9 효소 활성, PCSK9 작용을 용이하게 하는 LDLR 이외의 단백질에 대한 PCSK9 결합, APOB 분비를 변경시키는 PCSK9 ([Sun X-M et al., "Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005] 및 [Ouguerram K et al., "Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vase Biol. 24: 1448-1453, 2004]), 간 재생 및 뉴런 세포 분화에서 PCSK9의 역할 (Seidah NG et al., "The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation" PNAS 100: 928-933, 2003), 및 간 글루코스 대사에서 PCSK9의 역할 (Costet et al., "Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein Ic" J. Biol. Chem. 281(10):6211-18. 2006)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때 용어 "고콜레스테롤혈증"은 콜레스테롤 수준이 목적하는 수준을 넘어 상승된 상태를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 상기 용어는 혈청 콜레스테롤 수준이 상승된 것을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 목적하는 수준은 당업자에게 공지된 (그리고 본원에 설명되고 언급된) 다양한 "위험 인자"를 고려한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체를 모두 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 두 종류의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예를 들어 브로모유리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예를 들어 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오티드간 연결 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개 염기이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 제작에서 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석을 위한 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원성 표지를 포함한 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.
"단리된 핵산 분자"는 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않거나, 자연에서 그가 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 연결되는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이들의 몇몇 조합을 의미한다. 본원의 목적에서, 특정 뉴클레오티드 서열을 "구성하는 핵산 분자"는 무손상 염색체를 포함하지 않음을 이해해야 한다. 명시된 핵산 서열을 "구성하는" 단리된 핵산 분자는 명시된 서열에 추가로, 10 이하 또는 심지어 20 이하의 다른 단백질 또는 그의 일부에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 인용된 핵산 서열의 코딩 구역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나 벡터 서열을 포함할 수 있다.
달리 명시하지 않으면, 본원에서 논의되는 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 단부는 5' 단부이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로서 언급된다. 초기 (nascent) RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 부가 방향은 전사 방향으로서 언급되고; RNA 전사체의 5' 단부에 5'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 구역은 "상류 서열"로서 언급되고; RNA 전사체의 3' 단부에 3'인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 구역은 "하류 서열"로서 언급된다.
용어 "제어 서열"은 그가 라이게이팅되는 코딩 서열의 발현 및 처리에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 그러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 좌우될 수 있다. 특정 실시태양에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 (enhancer) 서열, 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 다수의 인식 부위를 포함한 프로모터를 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 또는 엔티티 (entity) (예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구성체"는 숙주 세포의 형질전환에 적합한 벡터를 나타내고, 그에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 코딩 구역의 발현을 (숙주 세포와 연관하여) 지시하고/하거나 제어하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 구성체는 그에 작동가능하게 연결된 코딩 구역의 전사, 번역에 영향을 미치거나 제어하고, 인트론이 존재하는 경우에 상기 코딩 구역의 RNA 스플라이싱 (splicing)에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때 "작동가능하게 연결된"은 용어가 적용되는 성분들이 적합한 조건 하에 그들의 고유한 기능을 수행하도록 하는 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 벡터 내의 제어 서열은 제어 서열의 전사 활성에 적합한 조건 하에 단백질 코딩 서열의 발현이 달성되도록 그에 라이게이팅된다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열을 사용하여 형질전환된 또는 형질전환될 수 있어서 관심있는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어는 관심있는 유전자가 존재하는 한 자손체가 형태학 또는 유전자 구성에서 원래의 모 세포에 동일하든지 동일하지 않든지 모 세포의 자손체를 포함한다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될 때 "형질감염된다". 많은 형질감염 기술이 당업계에 잘 공지되어 있고 본원에 개시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., 1973, Virology 52:456]; [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌]; [Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier]; [Chu et al., 1981, Gene 13:197] 참조). 그러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전자 특징을 변화시키는 것을 의미하고, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형될 때 형질전환된다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입, 또는 다른 기술을 통해 새로운 유전 물질을 도입함으로써 그의 천연 상태로부터 유전적으로 변형되는 경우에 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후에, 형질전환하는 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합함으로써 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 복제되지 않으면서 에피좀 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는 형질전환하는 DNA가 세포의 분열과 함께 복제될 때 "안정하게 형질전환된" 것으로 간주된다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질, 즉, 천연 발생 세포 및 비-재조합 세포에 의해 생산되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미하거나; 유전공학 처리된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 그에 대한 부가, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 천연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 그에 대한 부가, 및/또는 치환을 갖는 PCSK9 항원 결합 단백질, 항체, 또는 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 천연 단백질에 비해 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 그러한 단편은 또한 천연 단백질에 비해 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단편은 길이가 약 5 내지 500개 아미노산이다. 예를 들어, 단편은 길이가 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산이다. 유용한 폴리펩티드 단편은 항체의 면역학상 기능적 단편, 예를 들어 결합 도메인을 포함한다. PCSK9-결합 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 구역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 사슬의 부분 또는 단지 2개의 CDR을 포함하는 그의 가변 구역 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "단리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 정상적으로 발견될 적어도 일부의 다른 단백질이 없거나, (2) 동일한 공급원으로부터, 예를 들어, 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발견되거나, (4) 자연에서 그와 회합되는 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되거나, (5) 자연에서 회합되지 않은 폴리펩티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동가능하게 회합되거나, (6) 자연에서 발생하지 않는 것을 의미한다. 대개, "단리된 단백질"은 주어진 샘플의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 또는 합성 기원의 다른 RNA, 또는 그의 임의의 조합은 상기 단리된 단백질을 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 단백질에는 그의 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 저해할, 그의 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 없다.
용어 "아미노산"은 당업계에서 그의 일반적인 의미를 포함한다.
폴리펩티드 (예를 들어, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 비해 아미노산 서열 내로 삽입되고/되거나 그로부터 결실되고/되거나 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열들을 정렬하고 비교함으로써 결정할 때 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열들 사이의 관계를 나타낸다. "동일성 비율"은 비교된 분자 내의 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 비율을 의미하고, 비교되는 분자 중 최소의 것의 크기를 기초로 하여 계산한다. 이들 계산을 위해, 정렬 내의 갭 (gap) (존재할 경우)은 바람직하게는 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 어드레싱 (addressing)된다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위해 사용할 수 있는 방법은 문헌 ([Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press]; [Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press]; [von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press]; [Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press]; 및 [Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073])에 기재된 것을 포함한다.
동일성 비율의 계산시에, 비교되는 서열들은 대개 서열들 사이의 최대 매치 (match)를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 비율을 결정하기 위해 사용할 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GCG 프로그램 패키지이고, 이는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 위스콘신 대학교 (University of Wisconsin, 미국 위스콘신주 매디슨))를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP은 서열 동일성 비율을 결정해야할 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬시키기 위해 사용된다. 서열들은 그들의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 매칭을 위해 정렬된다 (알고리즘에 의해 결정될 때 "매칭된 스팬 (span)"). 갭 개방 패널티 (3x 평균 대각 (average diagonal)으로서 계산됨, 여기서 "평균 대각"은 사용되는 비교 행렬의 대각의 평균이고; "대각"은 특정 비교 행렬에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치에 지정된 스코어 또는 수이다) 및 갭 연장 패널티 (대체로 갭 개방 패널티의 1/10배임), 및 비교 행렬, 예를 들어 PAM 250 또는 BLOSUM 62를 알고리즘과 연관하여 사용한다. 특정 실시태양에서, 표준 비교 행렬 (PAM 250 비교 행렬에 대해 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)을 또한 알고리즘에 의해 사용한다.
GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 비율을 결정하는데 사용할 수 있는 파라미터의 예는 다음과 같다:
- 알고리즘: [Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];
- 비교 행렬: 문헌 [Henikoff et al., 1992, 상기 문헌]으로부터 BLOSUM 62;
- 갭 패널티: 12 (그러나, 단부 갭에 대해서는 패널티가 없음);
- 갭 길이 패널티: 4;
- 유사성의 역치: 0.
2개의 아미노산 서열들을 정렬하기 위한 특정 정렬 계획은 2개의 서열의 단지 짧은 구역의 매칭을 생성시킬 수 있고, 상기 작은 정렬된 구역은 2개의 전장 서열들 사이에 유의한 관계가 없는 경우에라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 또는 다른 수의 연속 아미노산에 이르는 정렬을 생성하도록 원하는 경우에 조정될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 20개의 통상적인 (예를 들어, 천연 발생) 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 관례에 따른다 (임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))] 참조). 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예를 들어 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기에서, 표준 관례 및 관습에 따라 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시-말단 방향이다.
유사하게, 달리 명시하지 않으면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 단부는 5' 단부이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로서 언급된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향으로서 언급되고; RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 단부에 5'인 DNA 가닥 상의 서열 구역은 "상류 서열"로서 언급되고; RNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 3' 단부에 3'인 DNA 가닥 상의 서열 구역은 "하류 서열"로서 언급된다.
보존적 아미노산 치환은 대개 생물학적 시스템 내의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 포함되는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 펩티드모방체 (peptidomimetic) 및 다른 역전 또는 역위 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다.
천연 발생 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기초한 종류로 나누어질 수 있다:
1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비-보존적 치환은 다른 종류의 멤버에 대한 이들 종류 중 하나의 멤버의 교환을 포함할 수 있다. 그러한 치환된 잔기는 예를 들어, 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 구역 내로, 또는 분자의 비-상동성 구역 내로 도입될 수 있다.
항원 결합 단백질 또는 PCSK9 단백질을 변화시키는데 있어서, 특정 실시태양에 따라, 아미노산의 수치 지수 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치 지수를 지정받았다. 이들은 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다.
단백질에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치 아미노산 지수의 중요성은 당업계에 알려져 있다 (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982)). 특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있음이 알려져 있다. 수치 지수에 기초한 변화를 하는데 있어서, 특정 실시태양에서, 수치 지수가 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 실시태양에서, 수치 지수가 ±1 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 실시태양에서, ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다.
유사한 아미노산의 치환은 특히 그에 의해 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드를 본 경우에서와 같이 면역학적 실시태양에서 사용하도록 의도하는 경우에 친수도에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있음이 또한 당업계에서 이해된다. 특정 실시태양에서, 그의 인접 아미노산의 친수도에 의해 지배되는 단백질의 최대 국소 평균 친수도는 그의 면역원성 및 항원성, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상호관련된다.
이들 아미노산 잔기에 다음의 친수도 값이 지정되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수도 값에 기초하여 변화를 이루는데 있어서, 특정 실시태양에서, 그의 친수도 값이 ±2 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 실시태양에서, ±1 내에 있는 아미노산의 치환이 포함되고, 특정 실시태양에서, ±0.5 내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 또한 친수도에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 구역은 또한 "에피토프 코어 구역"으로서 언급된다.
예시적인 아미노산 치환을 표 1에 기재한다.
Figure pat00001
용어 "유도체"는 아미노산 (또는 핵산)의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 화학적 변형을 포함하는 분자를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 유도체는 중합체, 지질, 또는 다른 유기 또는 무기 모이어티와의 화학 결합을 포함하고 이로 제한되지 않는 공유 변형을 포함한다. 특정 실시태양에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 화학적으로 변형되지 않은 항원 결합 단백질보다 더 큰 순환 반감기를 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 목적하는 세포, 조직, 및/또는 장기에 대해 개선된 표적화 용량을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 유도체 항원 결합 단백질은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유 변형된다. 예를 들어, 미국 특허 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 및 4,179,337을 참조한다. 특정 실시태양에서, 유도체 항원 결합 단백질은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 및 상기 중합체들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 하위단위로 공유 변형된다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 이상의 특정한 위치, 예를 들어 아미노 말단에서 결합된다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 특정 실시태양에서, PEG는 항원 결합 단백질에 대한 치료 용량을 개선하기 위해 사용된다. 특정 실시태양에서, PEG는 인간화 항체에 대한 치료 용량을 개선하기 위해 사용된다. 이러한 특정 방법은 예를 들어 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 6,133,426에 논의되어 있다.
펩티드 유사체는 제약 산업에서 주형 (template) 펩티드의 것에 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 일반적으로 사용된다. 이들 종류의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체"로 부른다 (임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 문헌 ([Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986)]; [Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985)]; 및 [Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987)]). 그러한 화합물은 종종 컴퓨터 분자 모델링을 사용하여 개발된다. 치료상 유용한 펩티드에 구조상 유사한 펩티드 모방체가 유사한 치료 또는 예방 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 패러다임 (paradigm) 폴리펩티드 (즉, 생화학적 특성 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들어 인간 항체에 구조상 유사하지만, 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 --CH2NH--, --CH2S--, -CH2-CH2--, --CH=CH-(시스 및 트란스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO-- 중에서 선택되는 연결로 임의로 교체되는 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 동일한 종류의 D-아미노산으로의 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적인 치환 (예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)은 특정 실시태양에서 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이를 포함하는 구속형 (constrained) 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는 분자내 디술피드 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다 (임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)] 참조).
생물학적 물질, 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 연관하여 본 명세서 전체에서 사용될 때 용어 "천연 발생"은 자연에서 발견되는 물질 또는 자연에서 발견되는 물질의 형태를 나타낸다.
본원에서 사용될 때 "항원 결합 단백질" ("ABP")은 명시된 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 본원에서, 명시된 표적 항원은 PCSK9 단백질 또는 그의 단편이다. "항원 결합 단백질"은 항체 및 그의 결합 부분, 예를 들어 면역학상 기능적 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 펩티바디 (peptibody)가 항원 결합 단백질의 다른 예이다. 본원에서 사용될 때 용어 항체 또는 면역글로불린 사슬 (중쇄 또는 경쇄) 항원 결합 단백질의 "면역학상 기능적 단편" (또는 간단히 "단편")은 전장 사슬 내에 존재하는 적어도 일부의 아미노산이 결여되지만 여전히 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분 (상기 부분이 얻어지거나 합성되는 방식에 무관하게)을 포함하는 항원 결합 단백질의 물질종이다. 그러한 단편은 표적 항원에 결합하고, 주어진 에피토프에 대한 결합에 대해 무손상 항체를 포함한 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있는 점에서 생물학적 활성이다. 일부 실시태양에서, 단편은 중화 단편이다. 일부 실시태양에서, 단편은 LDLR과 PCSK9 사이의 상호작용의 가능성을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 한 측면에서, 그러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 보유할 것이고, 일부 실시태양에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있거나, 무손상 항체를 포함한 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수 있다. 면역학상 기능적 면역글로불린 단편은 Fab, 디아바디 (동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단일쇄 항체를 포함하고 이로 제한되지 않고, 인간, 마우스, 래트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래할 수 있다. 본원에 개시된 항원 결합 단백질의 기능적 부분, 예를 들어, 하나 이상의 CDR이 제2 단백질에 또는 소분자에 공유 결합되어, 이중기능적 치료 특성을 갖거나 연장된 혈청 반감기를 갖는 신체 내의 특정 표적에 대해 지시된 치료제를 생성할 수 있음이 추가로 고려된다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 항원 결합 단백질은 비단백질 성분을 포함할 수 있다. 본원의 일부 섹션에서, ABP의 예들은 "숫자/문자/숫자" (예를 들어, 25A7)의 용어로 본원에 기재되어 있다. 이들 경우에, 정확한 명칭은 특이적 항체를 표시한다. 즉, 25A7로 불리는 ABP는 25A7.1로 불리는 항체와 반드시 동일하지는 않다 (이들이 명세서에서 동일한 것으로 명백하게 교시되지 않으면, 예를 들어, 25A7 및 25A7.3). 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서 LDLR은 항원 결합 단백질이 아니다. 일부 실시태양에서, LDLR의 결합 하위섹션, 예를 들어, EGFa는 항원 결합 단백질이 아니다. 일부 실시태양에서, 그를 통해 PCSK9가 생체 내에서 신호전달하는 다른 분자는 항원 결합 단백질이 아니다. 그러한 실시태양은 그 자체로서 명백하게 확인될 것이다.
본원에서 설명되는 특정 항원 결합 단백질은 항체이거나, 항체로부터 유래한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디 (minibody), 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 칭함), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 컨쥬게이트"로서 칭함), 및 그의 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체에 기초한 것이다. 일부 실시태양에서, ABP는 아비머 (avimer) (단단하게 결합하는 펩티드)를 포함하거나 이로 이루어진다. 이들 다양한 항원 결합 단백질은 본원에서 추가로 설명된다.
"Fc" 구역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 구역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄의 일부, 및 또한 CH1 및 CH2 도메인 사이의 구역을 포함하여, 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 디술피드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 구역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 구역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 구역을 포함하지만, 불변 구역이 결여된다.
"단일쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 구역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하는 Fv 분자이고, 이것은 항원 결합 구역을 형성한다. 단일쇄 항체는 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨 국제 특허 출원 공개 WO 88/01649와 미국 특허 4,946,778 및 5,260,203에 상세하게 논의되어 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 구역 및 경쇄의 가변 구역만을 함유하는 면역학상 기능적 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 구역은 펩티드 링커와 공유 연결되어 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 구역은 동일하거나 항원을 표적으로 할 수 있다.
"2가 항원 결합 단백질" 또는 "2가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 2가 항원 결합 단백질 및 2가 항체는 이중특이적일 수 있다 (아래 참조). 특정 실시태양에서, "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 2가 항체는 대개 동일한 각각의 그의 결합 부위를 갖는 것으로 생각된다.
"다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 초과의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.
"이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 각각 하이브리드 (hybrid) 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 단백질 및 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 종이고, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]) 참조). 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
항원 결합 단백질은 해리 상수 (Kd)가 ≤10-7 M인 경우에 그의 표적 항원에 "특이적으로 결합하는" 것으로 말해진다. ABP는 Kd가 ≤5 x 10-9 M인 경우에 "고 친화도"로, 및 Kd가 ≤5 x 10-10 M인 경우에 "매우 고 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시태양에서, ABP는 Kd가 ≤10-9 M이다. 한 실시태양에서, 오프율 (off-rate)은 <1 x 10-5이다. 다른 실시태양에서, ABP는 약 10-9 M 내지 10-13 M의 Kd로 인간 PCSK9에 결합할 것이고, 또다른 실시태양에서 ABP는 Kd≤5 x 10-10으로 결합할 것이다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서, 임의의 또는 모든 항원 결합 단편이 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있다.
항원 결합 단백질은 제2 표적에 결합하는 것보다 하나의 표적에 더 강하게 결합할 때 "선택적"이다.
"항원 결합 구역"은 명시된 항원 (예를 들어, 파라토프 (paratope))에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호작용하고 항원 결합 단백질에 항원에 대한 그의 특이성 및 친화도를 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원 결합 단백질의 상기 일부는 "항원 결합 구역"으로서 언급된다. 항원 결합 구역은 대개 하나 이상의 "상보성 결합 구역" ("CDR")을 포함한다. 특정 항원 결합 구역은 또한 하나 이상의 "프레임워크" 구역을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화도에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 구역은 항원 결합 구역과 항원 사이의 결합을 촉진하도록 CDR의 적합한 입체형태를 유지하는 것을 도울 수 있다. 구조적으로, 프레임워크 구역은 항체 내에서 CDR들 사이에 위치할 수 있다. 프레임워크 및 CDR 구역의 예를 도 2a-3d, 3ccc-3jjj, 및 15a-15d에 제시한다. 일부 실시태양에서, 항체 3B6의 경쇄에 대한 CDR에 대한 서열은 다음과 같고: CDR1 TLSSGYSSYEVD (서열 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (서열 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (서열 281), FR은 다음과 같다: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (서열 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (서열 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (서열 284); 및 FR4 FgggTKLTVL (서열 285).
특정 측면에서, PCSK9, 예를 들어 인간 PCSK9에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 문맥에서, "재조합 항원 결합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 즉, 본원에서 설명되는 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법 및 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 무손상 면역글로불린, 또는 그의 단편을 나타내고, 예를 들어 키메라, 인간화, 전체 인간, 및 이중특이적 항체를 포함한다. "항체"는 항원 결합 단백질의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 카멜리드 내에서 자연 발생하는 항체와 같이 보다 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 전적으로 단일 공급원으로부터 유래할 수 있거나, "키메라"일 수 있고, 즉, 항체의 상이한 부분들은 아래에 더욱 설명한 바와 같이 2개의 상이한 항체로부터 유래할 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마 내에서 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산할 수 있다. 달리 지시하지 않으면, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 추가로, 그의 유도체, 변이체, 단편, 및 돌연변이체를 포함하고, 그 예를 아래에 설명한다. 또한, 명백하게 배제하지 않으면, 항체는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 칭함), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 컨쥬게이트"로서 칭함), 및 그의 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포함한다.
천연 발생 항체 구조 단위는 대개 사량체를 포함한다. 각각의 그러한 사량체 대개 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 전장 "경쇄" (특정 실시태양에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중쇄" (특정 실시태양에서, 약 50-70 kDa)를 포함한다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 대개 항원 인식을 담당하는, 대개 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 구역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 대개 효과기 기능을 담당할 수 있는 불변 구역을 규정한다. 인간 경쇄는 대개 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 대개 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 규정한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하고 이로 제한되지 않는 몇몇 하위종류를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하고 이로 제한되지 않는 몇몇 하위종류를 갖는다. IgA는 유사하게 IgA1 및 IgA2를 포함하고 이로 제한되지 않는 하위종류로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 대개, 가변 및 불변 구역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 구역에 의해 연결되고, 여기서 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 구역을 포함한다 (예를 들어, 그 전문을 모든 목적으로 참조로 포함시킨 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조). 각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 구역은 대개 항원 결합 부위를 형성한다.
가변 구역은 일반적으로 3개의 초가변 구역 (또한 상보성 결정 구역, 즉 CDR로도 불림)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 구역 (FR)의 동일한 일반적인 구조를 보인다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 대개 프레임워크 구역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 할 수 있다. N-말단으로부터 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 구역은 모두 일반적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 대개 문헌 ([Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989)])의 정의에 따른다.
특정 실시태양에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체 결합 구역은 항체 경쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체 결합 구역은 항체 중쇄의 부재 하에 항원에 결합한다. 특정 실시태양에서, 개별 가변 구역은 다른 가변 구역의 부재 하에 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 실시태양에서, CDR의 명확한 서술 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해석함으로써 및/또는 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정 실시태양에서, 이는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예를 들어 X-선 결정학에 의해 달성할 수 있다. 특정 실시태양에서, CDR 구역을 확인하거나 어림잡기 위해 다양한 분석 방법이 사용될 수 있다. 그러한 방법의 예는 카바트 (Kabat) 정의, 코티아 (Chothia) 정의, AbM 정의 및 접촉 정의를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
카바트 정의는 항체에서 잔기를 넘버링 (numbering)하기 위한 표준이고, CDR 구역을 확인하기 위해 일반적으로 사용된다 (예를 들어, [Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000)] 참조). 코티아 정의는 카바트 정의에 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조적 루프 구역의 위치를 고려한다 (예를 들어, [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986)]; [Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)] 참조). AbM 정의에서는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 몰레큘라 그룹 (Oxford Molecular Group)에서 제조된 컴퓨터 프로그램의 통합 스위트 (integrated suite)를 사용한다 (예를 들어, [Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd] 참조). AbM 정의는 예를 들어, 문헌 [Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)]에 설명된 바와 같은 지식 데이타베이스 및 순-이론적 (ab initio) 방법의 조합을 이용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다. 접촉 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다 (예를 들어, 문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)] 참조).
관습상, 중쇄 내의 CDR 구역은 일반적으로 H1, H2, 및 H3으로 칭하고, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로의 방향으로 순차적으로 넘버링한다. 경쇄 내의 CDR 구역은 일반적으로 L1, L2, 및 L3으로 칭하고, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로의 방향으로 순차적으로 넘버링한다.
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 구역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 구역 도메인, 즉 VL, 및 불변 구역 도메인, 즉 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 구역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재한다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 구역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 구역 도메인, 즉 VH, 및 3개의 불변 구역 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재하고, CH 도메인은 카르복실-말단에 존재하고, 여기서 CH3이 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 아형 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 아형 포함), IgM 및 IgE를 포함한 임의의 이소형의 것일 수 있다.
이중특이적 또는 이중기능적 항체는 일반적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)]) 참조).
일부 종의 포유동물은 또한 단일 중쇄만을 갖는 항체를 생산한다.
각각의 개별 면역글로불린 사슬은 일반적으로 각각 대략 90 내지 110개 아미노산으로 이루어지고 특징적인 폴딩 패턴을 갖는 몇몇 "면역글로불린 도메인"으로 구성된다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드가 그로 구성되는 기초 단위이다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소형은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 함유하고; IgG 및 IgE 이소형은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하고; IgM 이소형은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 함유한다. 중쇄 C 구역은 일반적으로 효과기 기능을 담당할 수 있는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 중쇄 불변 구역 도메인의 수는 이소형에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, IgG 중쇄는 CH1, CH2 및 CH3으로 공지된 3개의 C 구역 도메인을 함유한다. 제공되는 항체는 임의의 이들 이소형 및 아형을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 항-PCSK9 항체는 IgG2 또는 IgG4 아형의 것이다.
용어 "가변 구역" 또는 "가변 도메인"은 일반적으로 중쇄 내에 약 120 내지 130개 아미노 말단 아미노산 및 경쇄 내에 약 100 내지 110개 아미노 말단 아미노산을 포함하는, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부분을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 상이한 항체의 가변 구역은 동일한 종의 항체들 사이에서도 아미노산 서열이 광범하게 상이하다. 항체의 가변 구역은 일반적으로 그의 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.
용어 "중화 항원 결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 각각 리간드에 결합하여 그 리간드의 생물학적 효과를 방지하거나 감소시키는 항원 결합 단백질 또는 항체를 나타낸다. 이것은 예를 들어, 리간드 상의 결합 부위를 직접 차단함으로써 또는 리간드에 결합하여 간접 수단을 통해 결합하는 리간드의 능력을 변경시킴으로써 이루어질 수 있다 (예를 들어, 리간드의 구조적 또는 에너지 변경). 일부 실시태양에서, 상기 용어는 또한 그가 결합하는 단백질이 생물학적 기능을 수행하는 것을 방지하는 항원 결합 단백질을 나타낼 수 있다. 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편의 결합 및/또는 특이성을 평가하는데 있어서, 항체 또는 단편은 과잉의 항체가 리간드에 결합된 결합 파트너의 양을 적어도 약 1-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% 또는 그 이상으로 (시험관 내 경쟁적 결합 분석으로 측정할 때) 감소시킬 때 그의 결합 파트너에 대한 리간드의 결합을 실질적으로 억제할 수 있다. 일부 실시태양에서, PCSK9 항원 결합 단백질의 경우에, 그러한 중화 분자는 LDLR에 결합하는 PCSK9의 능력을 감소시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 중화 능력은 경쟁 분석을 통해 특성 결정되고/되거나 설명된다. 일부 실시태양에서, 중화 능력은 IC50 또는 EC50 값의 면에서 설명된다. 일부 실시태양에서, ABP 27B2, 13H1, 13B5 및 3C4는 비-중화 ABP이고, 3B6, 9C9 및 31A4는 약한 중화제이고, 표 2 내의 나머지 ABP는 강한 중화제이다. 일부 실시태양에서, 항체 또는 항원 결합 단백질은 PCSK9에 결합하여 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 방지함으로써 (또는 LDLR에 결합하는 PCSK9의 능력을 감소시킴으로써) 중화시킨다. 일부 실시태양에서, 항체 또는 ABP는 PCSK9에 결합함으로써, 및 여전히 PCSK9가 LDLR에 결합하도록 하면서 LDLR의 PCSK9 매개된 분해를 방지 또는 감소시킴으로써 중화시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서, 중화 ABP 또는 항체는 여전히 PCSK9/LDLR 결합을 허용할 수 있지만, LDLR의 후속적인 PCSK9 관여된 분해를 방지할 (또는 감소시킬) 것이다.
용어 "표적"은 항원 결합 단백질이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 나타낸다. 특정 실시태양에서, 표적은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 표적은 항원이다. 구문 "항원 결합 단백질"에서 "항원"의 사용은 단순히 항체가 항원을 포함하는 단백질 서열에 결합할 수 있음을 나타낸다. 본 문맥에서, 단백질이 외래의 것이거나 면역 반응을 유도할 수 있음을 요구하지는 않는다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)의 상황에서 사용될 때 용어 "경쟁하는"은 시험되는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편)이 공통 항원 (예를 들어, PCSK9 또는 그의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질 (예를 들어, 리간드, 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제하는 (예를 들어 감소시키는) 분석에 의해 결정되는 항원 결합 단백질들 사이의 경쟁을 의미한다. 하나의 항원 결합 단백질이 다른 것과 경쟁하는지 결정하기 위해 많은 종류의 경쟁적 결합 분석, 예를 들어 고상의 직접 또는 간접 방사성 면역분석 (RIA), 고상의 직접 또는 간접 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (예를 들어, [Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, [Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조), 고상의 직접 표지된 분석, 고상의 직접 표지된 샌드위치 분석 (예를 들어, [Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상의 직접 표지 RIA (예를 들어, [Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고상의 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어, [Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)을 이용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 분석은 이들 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정한다. 대체로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질 (경쟁 항원 결합 단백질)은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 및 입체 장애가 일어나도록 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가의 상세내역을 본원의 실시예에 제공한다. 대체로, 경쟁 항원 결합 단백질은 과량으로 존재할 때, 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 이상 억제할 (예를 들어, 감소시킬) 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 이상 억제된다.
용어 "항원"은 선택적인 결합제, 예를 들어 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편 포함)이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 항원은 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 동물 내에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체 또는 T-세포 수용체가 결합할 수 있는 임의의 결정자를 포함한다. 에피토프는 항원을 표적으로 하는 항원 결합 단백질이 결합하는 항원의 구역이고, 항원이 단백질인 경우에, 항원 결합 단백질에 직접 접촉하는 특이적 아미노산을 포함한다. 가장 종종, 에피토프는 단백질 상에 존재하지만, 일부 경우에 다른 종류의 분자, 예를 들어 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹 (grouping)을 포함할 수 있고, 특이적인 3차원 구조 특징 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내의 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
본원에서 사용될 때 "실질적으로 순수한"은 기술된 종의 분자가 존재하는 우세한 종임을, 즉, 몰 기준으로 동일한 혼합물 내에 임의의 다른 개별 종보다 더욱 풍부함을 의미한다. 특정 실시태양에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 50% (몰 기준)를 차지하는 조성물이다. 다른 실시태양에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 차지할 것이다. 다른 실시태양에서, 대상 종은 오염 종이 통상적인 검출 방법에 의해 조성물 내에서 검출될 수 없고, 따라서, 조성물이 단일 검출가능한 거대분자 종으로 이루어지는 본질적인 균일성으로 정제된다.
용어 "물질"은 본원에서 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내도록 사용된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "표지" 또는 "표지된"은 예를 들어, 방사성표지된 아미노산의 포함, 또는 표식된 아비딘 (예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출할 수 있는 비오틴 모이어티의 폴리펩티드에의 부착에 의한 검출가능한 마커의 포함을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음의 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소적 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광물질, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 특정 실시태양에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암 (arm)에 의해 부착된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "생물학적 샘플"은 생명체 또는 이전에 생명체로부터의 임의의 양의 물질을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 생명체는 인간, 마우스, 원숭이, 래트, 토끼, 및 다른 동물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 물질은 혈액, 혈청, 소변, 세포, 장기, 조직, 뼈, 골수, 림프절, 및 피부를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "제약 물질 조성물" (또는 물질 또는 약물)은 환자에게 적절하게 투여될 때 목적하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 조성물, 물질 또는 약물을 나타낸다. 반드시 한 종류를 초과하는 성분을 필요로 하지는 않는다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 치료 반응을 생성하는 것으로 결정된 PCSK9 항원 결합 단백질의 양을 나타낸다. 그러한 치료 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확인된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "조정물질"은 분자의 활성 또는 기능을 변화 또는 변경시키는 화합물이다. 예를 들어, 조정물질은 조정물질의 부재 하에 관찰된 활성 또는 기능의 세기에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 세기를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 조정물질은 억제제이고, 이는 분자의 적어도 하나의 활성 또는 기능의 세기를 감소시킨다. 분자의 특정 예시적인 활성 및 기능은 결합 친화도, 효소적 활성, 및 신호 전달을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 예시적인 억제제는 단백질, 펩티드, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 작은 유기 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 펩티바디는 예를 들어, 미국 특허 6,660,843 (PCT 출원 WO 01/83525에 대응함)에 기재되어 있다.
용어 "환자" 및 "대상"은 교환가능하게 사용되고, 인간 및 비-인간 동물 대상뿐만 아니라 이전에 진단된 질환을 갖는 대상, 이전에 인식된 질환이 없는 대상, 의사의 치료를 받는 대상, 질환을 발병할 위험이 있는 대상 등을 포함한다.
용어 "처치하다" 및 "처치"는 치료적 처치, 예방적 처치, 및 대상이 질환을 발병할 위험 또는 다른 위험 인자를 감소시키는 용도를 포함한다. 처치는 질환의 완전한 치유를 요구하지 않고, 증상 또는 근원적인 위험 인자를 감소시키는 실시태양을 포함한다.
용어 "예방하다"는 사건의 가능성의 100% 제거를 요구하지는 않는다. 오히려, 상기 용어는 사건의 발생 가능성이 화합물 또는 방법의 존재 하에 감소된 것을 나타낸다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션 (lipofection))을 위해 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조사의 지시에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 수행할 수 있다. 상기한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라, 및 본 명세서 전체에서 인용되고 논의하는 각종 일반적인 및 보다 구체적인 참조문 (예를 들어, 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))] 참조)에 설명된 바와 같이 수행할 수 있다. 구체적인 정의를 제공하지 않으면, 본원에 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 연관하여 사용되는 명명법과 그의 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 표준 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 처치를 위해 사용될 수 있다.
PCSK9에 대한 항원 결합 단백질
전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 타입 9 (PCSK9)는 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR) 단백질의 수준을 조절하는데 관여하는 세린 프로테아제이다 ([Horton et al., 2007]; [Seidah and Prat, 2007]). PCSK9는 세린 프로테아제의 섭틸리신 (S8) 패밀리 내의 프로호르몬-전구단백질 전환효소이다 (Seidah et al., 2003). 예시적인 인간 PCSK9 아미노산 서열을 도 1a (단백질의 "프로" 도메인은 밑줄로 표시한다) 및 도 1b-1e (신호 서열을 굵게 도시하고, 프로-도메인을 밑줄친다)에서 서열 1 및 3으로서 제시한다. 예시적인 인간 PCSK9 코딩 서열은 서열 2로서 제시된다 (도 1b-1e). 본원에서 설명되는 바와 같이, PCSK9 단백질은 또한 전장 PCSK9 단백질의 단편을 포함할 수 있다. PCSK9 단백질의 구조는 최근에 2군의 집단에 의해 규명되었다 (그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007], 및 [Piper et al., Structure, 15:1-8, 2007]). PCSK9는 신호 서열, N-말단 프로도메인, 섭틸리신-유사 촉매 도메인 및 C-말단 도메인을 포함한다.
PCSK9, 예를 들어 인간 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질 (ABP)를 제공한다. 일부 실시태양에서, 제공되는 항원 결합 단백질은 본원에서 설명되는 하나 이상의 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 항원 결합 단백질에서, CDR은 "프레임워크" 구역 내로 파묻히고, 이는 CDR(들)의 적합한 항원 결합 특성이 달성되도록 CDR(들)을 배향시킨다. 일부 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 저해하거나, 차단하거나, 감소시키거나, 조정할 수 있다. 그러한 항원 결합 단백질은 "중화"로서 표시한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질이 중화성이고 PCSK9에 결합되더라도, PCSK9와 LDLR 사이의 결합은 여전히 일어날 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9 상의 LDLR 결합 부위를 차단하지 않으면서 LDLR에 대한 PCSK9의 불리한 영향을 방지하거나 감소시킨다. 따라서, 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9와 LDLR 사이의 결합 상호작용을 방지하지 않으면서 LDLR의 분해를 일으키도록 PCSK9의 능력을 조정하거나 변경시킨다. 그러한 ABP는 구체적으로 "비-경쟁적으로 중화" ABP로서 설명할 수 있다. 일부 실시태양에서, 중화 ABP는 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 방지하는 위치에서 및/또는 방식으로 PCSK9에 결합한다. 그러한 ABP는 구체적으로 "경쟁적으로 중화" ABP로서 설명할 수 있다. 상기 두 중화제는 모두 대상 내에 존재하는 유리 LDLR의 양을 보다 많도록 할 수 있고, 이는 보다 많은 LDLR을 LDL에 결합시킨다 (그에 의해 대상에서 LDL 양을 감소시킨다). 다시, 이는 대상 내에 존재하는 혈청 콜레스테롤의 양을 감소시킨다.
일부 실시태양에서, 본원에서 제공되는 항원 결합 단백질은 PCSK9-매개 활성 (결합 포함)을 억제할 수 있다. 일부 실시태양에서, 이들 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질은 특히 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용 및 PCSK9에 의해 매개되는 다른 생리학적 효과를 억제한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9에 대한 인간, 예를 들어 완전 인간 항체이다.
일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9의 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 성숙형의 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서 ABP는 PCSK9의 프로도메인 내에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 성숙형의 PCSK9에 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9가 LDLR에 결합하거나 효율적으로 결합할 수 없는 방식으로 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 c-말단에 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 n-말단에 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9 단백질의 n- 또는 c-말단에 결합하지 않는다. 일부 실시태양에서, ABP는 본원에 논의된 항체가 결합하는 임의의 하나의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 이는 본원에 개시된 항체와 다른 항체들 사이의 경쟁 분석에 의해 결정할 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 표 2에 기재된 항체 중 하나가 결합하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR과 상호작용하는 것을 방지하도록 특이적 입체형태적 상태의 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합하고, PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 방지한다 (또는 감소시킨다). 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합하고, LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 방지하지 (또는 감소시키지) 않으면서, ABP는 LDLR에 대해 PCSK9를 통해 매개된 불리한 활성을 방지하거나 감소시킨다.
본원에서 개시되는 항원 결합 단백질은 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 일부의 항원 결합 단백질은 특이적인 결합 분석, PCSK9, 특히 인간 PCSK9 또는 그의 리간드의 친화도 정제, 및 PCSK9 활성의 다른 길항제를 확인하기 위한 스크리닝 분석에서 유용하다. 일부의 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 억제하기 위해, 또는 PCSK9-매개 활성을 억제하기 위해 유용하다.
항원 결합 단백질은 본원에 설명된 바와 같이 다양한 치료 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, PCSK9 항원 결합 단백질은 본원에 추가로 설명되는 바와 같은 PCSK9와 연관된 병태, 예를 들어 콜레스테롤 관련 질환 (또는 "혈청 콜레스테롤 관련 질환"), 예를 들어 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 유용하다. 항원 결합 단백질의 다른 용도는 예를 들어, PCSK9-연관 질병 또는 병태의 진단, 및 PCSK9의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 스크리닝 분석을 포함한다. 본원에서 설명되는 일부의 항원 결합 단백질은 PCSK9 활성과 연관된 예후, 증상, 및/또는 건강 이상의 치료에 유용하다.
일부 실시태양에서, 제공되는 항원 결합 단백질은 하나 이상의 CDR (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조, 및 폴리펩티드 구조 내로 삽입되고/되거나 연결되는 (b) 하나 이상의 CDR을 포함한다. 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 상기 구조는 천연 발생 항체, 또는 그의 단편 또는 변이체의 프레임워크이거나 그를 포함할 수 있거나, 자연에서 완전히 합성될 수 있다. 다양한 폴리펩티드 구조의 예를 아래에서 추가로 설명한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 구조는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 칭함), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 컨쥬게이트"로서 칭함), 및 그의 일부 또는 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체이거나 항체로부터 유래한다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 항체의 면역학적 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv)이다. 다양한 구조는 본원에서 추가로 설명하고 규정한다.
본원에서 제공되는 특정 항원 결합 단백질은 인간 PCSK9에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 3의 잔기 153-692를 갖고/갖거나 그로 이루어지는 인간 PCSK9 단백질에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 서열 3의 잔기 31-152를 갖고/갖거나 그로 이루어지는 인간 PCSK9에 특이적으로 및/또는 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 도 1a에 도시된 인간 PCSK9 단백질 (서열 1)에 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 적어도 PCSK9 단백질의 단편 및/또는 신호 서열이 존재하거나 존재하지 않는 전장 PCSK9 단백질에 특이적으로 결합한다.
항원 결합 단백질이 치료 용도로 사용되는 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나, 저해하거나, 조정할 수 있다. 한 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 PCSK9에 특이적으로 결합하고/하거나 LDLR에 대한 인간 PCSK9의 결합을 적어도 약 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85% 이상 (예를 들어, 시험관 내 경쟁적 결합 분석으로 결합을 측정함으로써)으로 실질적으로 억제한다. 본원에서 제공되는 일부의 항원 결합 단백질은 항체이다. 일부 실시태양에서, ABP는 Kd가 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 M 미만이다 (보다 강하게 결합한다). 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9에 대한 LDLR의 결합을 차단하는데 대한 IC50 (D374Y, 고 친화도 변이체)이 1 μM 미만, 1000 nM 내지 100 nM, 100 nM 내지 10 nM, 10 nM 내지 1 nM, 1000 pM 내지 500 pM, 500 pM 내지 200 pM, 200 pM 미만, 200 pM 내지 150 pM, 200 pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM이다.
본 발명의 항-PCSK9 항체의 IgG2 중쇄 불변 도메인의 일례는 서열 154, 도 3kk에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항-PCSK9 항체의 IgG4 중쇄 불변 도메인의 일례는 서열 155, 도 3kk에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항-PCSK9 항체의 카파 경쇄 불변 도메인의 일례는 서열 157, 도 3kk에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항-PCSK9 항체의 람다 경쇄 불변 도메인의 일례는 서열 156, 도 3kk에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
면역글로불린 사슬의 가변 구역은 일반적으로 가변 구역은 일반적으로 3개의 초가변 구역 (보다 종종 "상보성 결정 구역", 즉 CDR로 불림)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 구역 (FR)을 포함하는 동일한 전체 구조를 보인다. 상기 언급된 각각의 중쇄/경쇄쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 대개 프레임워크 구역에 의해 정렬되어, 표적 단백질 (예를 들어, PCSK9) 상의 특이적 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 천연 발생 경쇄 및 중쇄 가변 구역은 모두 일반적으로 다음 순서의 이들 요소와 일치한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각각의 이들 도메인 내의 위치를 점령하는 아미노산에 숫자를 배정하기 위한 넘버링 시스템이 고안되었다. 상기 넘버링 시스템은 문헌 ([Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD)], 또는 [Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883])에 정의되어 있다.
다양한 중쇄 및 경쇄 가변 구역이 본원에서 제공되고, 도 2a-3jj 및 3ll-3bbb에 도시되어 있다. 일부 실시태양에서, 각각의 이들 가변 구역은 상기 중쇄 및 경쇄 불변 구역에 부착되어 각각 완전한 항체 중쇄 및 경쇄를 형성할 수 있다. 또한, 각각의 이렇게 생성된 중쇄 및 경쇄 서열은 조합되어 완전한 항체 구조를 형성할 수 있다.
제공되는 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 구역, 및 그들의 대응하는 아미노산 서열의 일부의 구체적인 예를 표 2에 요약한다.
Figure pat00002
다시, 표 2에 나열된 각각의 예시적인 가변 중쇄는 표 2에 제시된 임의의 예시적인 가변 경쇄와 조합하여 항체를 형성할 수 있다. 표 2는 본원에 개시된 항체의 몇몇에서 발견되는 예시적인 경쇄 및 중쇄 쌍형성을 보여준다. 일부 경우에, 항체는 표 2에 나열된 것으로부터 적어도 하나의 가변 중쇄 및 하나의 가변 경쇄를 포함한다. 다른 경우에, 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 함유한다. 일례로서, 항체 또는 항원 결합 단백질은 중쇄와 경쇄, 2개의 중쇄, 또는 2개의 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 표 2에 나열된 적어도 하나의 서열로부터 1, 2, 및/또는 3개의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다 (및/또는 그로 이루어진다) (서열에 대한 CDR은 도 2a-3d에 개략하고, 다른 실시태양은 도 3ccc-3jjj 및 15a-15d에 개략한다). 일부 실시태양에서, 6개의 모든 CDR (경쇄로부터의 CDR1-3 (CDRL1, CDRL2, CDRL3) 및 중쇄로부터의 CDR1-3 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3))은 ABP의 일부이다. 일부 실시태양에서, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 CDR이 ABP 내에 포함된다. 일부 실시태양에서, 표 2 내의 서열 내의 CDR로부터의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 CDR이 ABP 내에 포함된다 (표 2 내의 서열에 대한 CDR은 도 2a-3d에 개략한다). 일부 실시태양에서, 추가의 선택 (예를 들어, 도 2a-2d, 3a-3d에 제시된 것, 및 3ccc-3jjj 및 15a-15d에 제시된 다른 실시태양)이 또한 ABP 내에 포함된다. 표 2에 제시된 중쇄 및 경쇄에 대한 CDR 및 FR의 예를 도 2a-3d에 개략한다 (다른 실시태양은 도 3ccc-3jjj 및 15a-15d에 개략한다). 선택적인 경쇄 가변 서열 (CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, 및 FR4 포함)은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46 중에서 선택될 수 있다. 선택적인 중쇄 가변 서열 (CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, 및 FR4 포함)은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60 중에서 선택될 수 있다. 도 2A-3D 내의 일부 엔트리 (entry)에서, CDR 및 FR의 서열 또는 대체 경계의 변이가 확인된다. 이들 대체물은 ABP 명칭 다음에 "v1"으로 확인된다. 대부분의 이들 대체물은 자연에서 소수이므로, 차이를 갖는 섹션만을 표에 표시한다. 경쇄 또는 중쇄의 나머지 섹션은 다른 패널 내의 염기 ABP에 대해 도시된 것과 동일한 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 도 2C에서 19H9v1은 도 2A의 19H9와 동일한 FR1, CDR1, 및 FR2를 갖고, 차이만을 도 2C에 표시한다. 3개의 핵산 서열 (ABP 26E10, 30B9, 및 31B12)에 대해, 추가의 대체 핵산 서열을 도면에 제시한다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 하나 이하의 그러한 서열이 항체 또는 ABP의 생성에서 실제로 사용될 필요가 있다. 실제로, 일부 실시태양에서, 특이적 중쇄 또는 경쇄 핵산 중 하나만 존재하거나 존재할 필요가 없다.
일부 실시태양에서, ABP는 표 2 내의 임의의 단백질 서열을 코딩할 수 있는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시태양에서, ABP는 LDLR에 결합하는 형태의 PCSK9 (예를 들어, 자가촉매된 형태의 분자)에 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 c-말단에 결합하지 않는다 (예를 들어, c-말단 내의 5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40개의 대부분의 아미노산). 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 n-말단에 결합하지 않는다 (예를 들어, n-말단 내의 5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40개의 대부분의 아미노산). 일부 실시태양에서, ABP는 성숙형의 PCSK9의 아미노산 1-100 내의 아미노산에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 아미노산 31-100, 100-200, 31-152, 153-692, 200-300, 300-400, 452-683, 400-500, 500-600, 31-692, 31-449, 및/또는 600-692 내의 아미노산 (및/또는 그로 이루어지는 아미노산 서열)에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, 중화 및/또는 비-중화 ABP는 프로-도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 촉매 도메인 및 프로-도메인 모두에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 프로-도메인과 상호작용하는 촉매 도메인 상의 영역을 차단하도록 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Piper et al. (Structure 15:1-8 (2007)] (그의 구조 표현 포함)에 개략된 바와 같이 프로-도메인이 상호작용하는 위치 또는 표면에서 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 촉매 도메인에 결합하고, 프로도메인의 이동성을 제한한다. 일부 실시태양에서, ABP는 프로-도메인에 결합하지 않으면서 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 프로-도메인이 PCSK9가 LDLR에 결합하도록 재배향하는 것을 방지하면서, 프로-도메인에 결합하지 않으면서 촉매 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 문헌 [Piper et al.]의 프로-도메인의 주위 잔기 149-152와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 V 도메인 상의 그루브 (groove) (문헌 [Piper et al.]에 개략된 바와 같은)에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 V 도메인 상의 그루브에 근접한 히스티딘-풍부 패치에 결합한다. 일부 실시태양에서, 그러한 항체 (V 도메인에 결합하는)는 중화성이 아니다. 일부 실시태양에서, V 도메인에 결합하는 항체는 중화성이다. 일부 실시태양에서, 중화 ABP는 LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 방지한다. 일부 실시태양에서, 중화 ABP는 LDLR의 PCSK9 분해를 방지하지만, LDLR에 대한 PCSK9의 결합을 방지하지 않는다 (예를 들어 ABP 31A4). 일부 실시태양에서, ABP는 문헌 [Piper et al. 논문]의 도 4에 도시된 적어도 하나의 히스티딘에 결합하거나 차단한다. 일부 실시태양에서, ABP는 PCSK9 내의 촉매 트리아드 (triad)를 차단한다.
일부 실시태양에서, 항체는 야생형 PCSK9에 비해 변이체 PCSK9 단백질, 예를 들어, D374Y에 선택적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 이들 항체는 야생형보다 적어도 2배 더 강하게 변이체에, 바람직하게는 야생형보다 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000, 1000-10,000배 이상으로 돌연변이체에 결합한다 (Kd를 통해 측정할 때). 일부 실시태양에서, 항체는 LDLR과 상호작용하는 야생형 PCSK9의 능력에 비해 변이체 D374Y PCSK9가 LDLR과 상호작용하는 것을 선택적으로 억제한다. 일부 실시태양에서, 이들 항체는 야생형의 능력보다 더 강하게 LDLR에 결합하는 변이체의 능력을 차단하고, 예를 들어, 야생형보다 적어도 2배 강하게, 바람직하게는 야생형보다 돌연변이체를 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000배 더 강하게 차단한다 (IC50을 통해 측정할 때). 일부 실시태양에서, 항체는 야생형 PCSK9 및 변이체 형태의 PCSK9, 예를 들어 D374Y 모두에 유사한 수준으로 결합하여 중화시킨다. 일부 실시태양에서, 항체는 LDLR의 변이체가 PCSK9에 결합하는 것을 방지하도록 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서, LDLR의 변이체는 인간 LDLR과 적어도 50% 동일하다. LDLR의 변이체는 당업자에게 공지되어 있음이 언급된다 (예를 들어, [Brown MS et al., "Calcium cages, acid baths and recycling receptors" Nature 388: 629-630, 1997]). 일부 실시태양에서, ABP는 이형접합체 가족성 고콜레스테롤혈증 (LDLR의 기능 손실 변이체가 존재함)에서 효과적인 LDLR의 수준을 상승시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, ABP는 도 1a 및/또는 도 1b-1e에 도시된 PCSK9의 형태에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99% 또는 그 이상 동일성인 PCSK9의 변이체에 결합한다 (그러나 차단하지 않는다). 일부 실시태양에서, ABP는 도 1a 및/또는 도 1b-1e에 도시된 PCSK9의 성숙형에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99% 또는 그 이상 동일성인 PCSK9의 변이체에 결합한다 (그러나 차단하지 않는다). 일부 실시태양에서, ABP는 도 1a 및/또는 도 1b-1e에 도시된 PCSK9의 형태에 적어도 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99% 또는 그 이상의 동일성인 PCSK9의 변이체에 결합하여 LDLR과 상호작용하는 것을 방지한다. 일부 실시태양에서, ABP는 도 1b-1e에 도시된 PCSK9의 성숙형에 적어도 50, 50-60, 60- 70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99% 또는 그 이상 동일성인 PCSK9의 변이체에 결합하여 LDLR과 상호작용하는 것을 방지한다. 일부 실시태양에서, PCSK9의 변이체는 인간 변이체, 예를 들어 위치 474에서 변이체, E620G, 및/또는 E670G이다. 일부 실시태양에서, 위치 474에서 아미노산은 발린 (다른 인간에서와 같이) 또는 트레오닌 (사이노 및 마우스에서와 같이)이다. 본원에 제시된 교차-반응성 데이타가 주어지면, 본 발명의 항체는 상기 변이체에 쉽게 결합할 것으로 생각된다.
일부 실시태양에서, ABP는 표 2에 기재된 항체 중 하나가 결합하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR과 상호작용하는 것을 방지하도록 PCSK9의 특이적 입체형태 상태에 결합한다.
인간화 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)
본원에서 설명되는 바와 같이, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 인간화 항체 및/또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 그러한 전략의 중요한 실용적인 용도는 마우스 체액성 면역계의 "인간화"이다.
특정 실시태양에서, 인간화 항체는 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는, 그로부터 인간화 항체가 유도되는 다른 종으로부터의 항체와 실질적으로 동일한 표적에 대한 친화도를 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 5,530,101, 미국 특허 5,693,761; 미국 특허 5,693,762; 미국 특허 5,585,089를 참조한다.
특정 실시태양에서, 그의 면역원성을 감소시키면서 항원 결합 도메인의 천연 친화도는 감소시키지 않으면서 변형될 수 있는 항체 가변 도메인의 아미노산이 확인된다. 예를 들어, 미국 특허 5,766,886 및 5,869,619를 참조한다.
특정 실시태양에서, 당업계에 공지되어 있는 방법에 의한 항체의 변형은 일반적으로 표적에 대한 결합 친화도 증가 및/또는 수여자에서 항체의 면역원성 감소를 달성하도록 설계된다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 그의 동족 항원 (cognate antigen)에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 글리코실화 부위를 제거하도록 변형된다 (예를 들어, 문헌 [Co et al., Mol. Immunol. 30:1361-1367(1993)] 참조]. 특정 실시태양에서, "재형성 (reshaping)", "과키메라화 (hyperchimerization)" 또는 "베니어링 (veneering)/재표면화 (resurfacing)"와 같은 기술이 인간화 항체 생산을 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105 (1998)]; [Roguska et al., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996)]; 및 미국 특허 6,072,035 참조). 특정한 그러한 실시태양에서, 상기 기술은 대개 외래 잔기의 수를 감소시킴으로써 항체 면역원성을 감소시키지만, 항체의 반복 투여 이후의 항-개별특이형 및 항-동종이인자형 반응을 방지하지 않는다. 면역원성을 감소시키는 특정한 다른 방법은 예를 들어 문헌 [Gilliland et al., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999)]에 기재되어 있다.
특정 예에서, 인간화 항체는 항원 결합 능력이 손실된다. 특정 실시태양에서, 인간화 항체는 "역 돌연변이 (back mutation)"된다. 특정한 그러한 실시태양에서, 인간화 항체는 공여 항체에서 발견되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하도록 돌연변이된다. 예를 들어, 문헌 [Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999)]을 참조한다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 구역의 상보성 결정 구역 (CDR)은 동일한 종 또는 다른 종으로부터의 프레임워크 구역 (FR)에 그라프팅될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 구역의 CDR은 컨센서스 인간 FR에 그라프팅될 수 있다. 컨센서스 인간 FR을 생성시키기 위해서, 특정 실시태양에서, 몇몇 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR을 컨센서스 아미노산 서열을 확인하기 위해 정렬시킨다. 특정 실시태양에서, PCSK9 중쇄 또는 경쇄에 대한 항체의 FR을 상이한 중쇄 또는 경쇄로부터의 FR로 교체한다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR 내의 희귀한 아미노산은 교체되지 않지만, 나머지 FR 아미노산은 교체된다. 희귀한 아미노산은 FR에서 보통 발견되지 않는 위치에 존재하는 특이적 아미노산이다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항체로부터의 그라프팅된 가변 구역은 PCSK9에 대한 항체의 불변 구역과 상이한 불변 구역과 함께 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 그라프팅된 가변 구역은 단일쇄 Fv 항체의 일부이다. CDR 그라프팅은 예를 들어 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, 및 5,530,101과 문헌 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)] 및 [Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998)]에 기재되어 있다.
인간 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)
본원에서 설명된 바와 같이, PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질은 인간 (즉, 완전 인간) 항체 및/또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 아미노산 서열, 특히 가변 구역에 대응하는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시태양에서, 상보성 결정 구역 (CDR), 구체적으로 CDR1 내지 CDR3에 대응하는 서열을 제공된다. 특정 실시태양에 따라, 그러한 면역글로불린 분자를 발현하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 특정 실시태양에 따라, 그러한 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 특정 실시태양에서, 하이브리도마 세포주는 표 2에 기재된 세포주, 예를 들어, 21B12, 16F12 및 31H4 중 적어도 하나로부터 선택된다. 특정 실시태양에서, 인간 PCSK9에 대한 정제된 인간 모노클로날 항체를 제공한다.
조작된 마우스는 마우스 항체의 부재 하에 인간 항체를 생산할 것으로 예상하면서, 마우스 항체 생산이 결여된 마우스 주를 인간 Ig 로커스의 큰 단편으로 조작할 수 있다. 큰 인간 Ig 단편은 큰 가변 유전자 다양성뿐만 아니라, 항체 생산 및 발현의 적합한 조절을 보존할 수 있다. 항체 다양화 및 선택에 대한 마우스 기구 (machinery), 및 인간 단백질에 대한 면역 관용의 결핍을 활용함으로써, 이들 마우스 주 내의 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함한 관심있는 임의의 항원에 대한 고 친화도의 완전 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 하이브리도마 기술을 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 MAb를 생산하고 선택할 수 있다. 예시적인 특정 방법은 WO 98/24893, 미국 특허 5,545,807, EP 546073, 및 EP 546073에 기재되어 있다.
특정 실시태양에서, 인간 가변 구역(들)과 함께 인간 이외의 다른 종으로부터의 불변 구역을 사용할 수 있다.
효모 인공 염색체 (YAC) 내에서 메가염기 크기의 인간 로커스를 클로닝하고 재구성하고, 이들을 마우스 생식계열 (germline) 내로 도입하는 능력은 매우 크거나 조잡하게 매핑된 로커스의 기능성 성분을 설명하기 위한 및 인간 질병의 유용한 모델을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 마우스 로커스를 그의 인간 동등물로 치환하기 위한 그러한 기술의 이용은 발달 동안 인간 유전자 생성물의 발현 및 조절, 그들의 다른 시스템과의 소통, 및 질병 유도 및 진행에서 그들의 관여에 대한 통찰을 제공할 수 있다.
인간 항체는 쥐 또는 래트 가변 및/또는 불변 구역을 갖는 항체와 연관된 문제의 일부를 회피한다. 그러한 쥐 또는 래트 유래된 단백질의 존재는 항체의 신속한 청소를 일으킬 수 있거나, 환자에 의한 항체에 대한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 쥐 또는 래트 유래된 항체의 이용을 피하기 위해, 설치류, 다른 포유동물 또는 동물이 완전 인간 항체를 생산하도록 설치류, 다른 포유동물 또는 동물 내로 기능적 인간 항체 로커스의 도입을 통해 완전 인간 항체를 생성할 수 있다.
인간화 항체는 인간이 아닌 항체 아미노산 서열을 함유하여 초기에 시작하지만, 이들 비-인간 항체 아미노산 서열의 적어도 일부가 인간 항체 서열로 교체된 항체이다. 이것은 항체가 인간이 갖는 유전자에 의해 코딩되는 (또는 코딩될 수 있는) 인간 항체와는 반대된다.
항원 결합 단백질 변이체
제공되는 다른 항체는 표 2에 제시된 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 조합물 또는 하위부분에 의해 형성된 상기 나열된 ABP의 변이체이고, 각각 표 2의 서열 (전체 서열 또는 서열의 하위부분, 예를 들어, 하나 이상의 CDR)의 아미노산 서열에 적어도 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 경우에, 그러한 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우에 변이체 형태는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄 (또는 그의 하위부분)를 함유한다. 일부 실시태양에서, 도 2a-3d (및 도 13a-13j과 15a-15d의 다른 실시태양)의 서열 비교는 결합에 영향을 미치는 변이 및 결합에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는 변이를 관찰함으로써 변형될 수 있는 항체의 섹션을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유사한 서열을 비교함으로써, 변형될 수 있는 섹션 (예를 들어, 특정 아미노산), 및 이들이 ABP의 기능성을 여전히 보유하면서 (또는 개선하면서) 변형될 수 있는 방식을 확인할 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP의 변이체는 도 13a, 13c, 13f, 13g, 13h, 13i 및/또는 13j에 제시된 컨센서스 군 및 서열을 포함하고, 도면에서 가변으로 확인되는 서열에서 변이가 허용된다. 도 13a, 13c, 13f, 및 13g에 제시된 CDR은 코티아 방법 (구조적 루프 구역의 위치에 기초함, 예를 들어, 문헌 ["Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk and Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 November (1997)] 참조) 및 카바트 방법 (서열 가변성에 기초함, 예를 들어, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al., (1991)] 참조)의 하이브리드 조합에 기초하여 규명되었다. 두 방법 중 하나에 의해 결정된 각각의 잔기는 CDR 잔기의 최종 목록에 포함되었다 (도 13a, 13c, 13f, 및 13g에 제시한다). 도 13h, 13i, 및 13j의 CDR은 카바트 방법만으로 얻었다. 달리 명시하지 않으면, 도 13h-13j의 규정된 컨센서스 서열, CDR, 및 FR은 도 13에서 참조된 ABP에 대한 표시된 CDR 및 FR을 규정하고 제어할 것이다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60의 서열 중 적어도 하나 내의 CDR로부터의 하나 이상의 CDR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR (각각 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일함)이 존재한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 및 60의 서열 중 적어도 하나 내의 FR로부터의 하나 이상의 FR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 FR (각각 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일함)이 존재한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46의 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 구역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46의 서열 중 적어도 하나 내의 CDR로부터의 하나 이상의 CDR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR (각각 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일함)이 존재한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 및 46의 서열 중 적어도 하나 내의 FR로부터의 하나 이상의 FR에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 FR (각각 상기 서열에 적어도 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일함)이 존재한다.
본 명세서에 비추어, 당업자는 잘 공지된 기술을 이용하여 본원에 기재된 바와 같이 ABP의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시태양에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 구역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 특정 실시태양에서, 유사한 폴리펩티드들 사이에 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시태양에서, 심지어 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역이 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 또는 폴리펩티드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환될 수 있다.
추가로, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드 내의 잔기를 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 상기 비교를 고려하여, 유사한 단백질에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 단백질 내의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 상기 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당업자는 또한 유사한 ABP 내의 해당 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 그러한 정보를 고려하여, 당업자는 그의 3차원 구조에 관하여 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 특정 실시태양에서, 당업자는 단백질의 표면 상에 있는 것으로 예측된 아미노산 잔기로의 라디칼 변화를 일으키지 않도록 선택할 수 있고, 그 이유는 그러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 또한, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성시킬 수 있다. 이어서, 변이체는 당업자에게 공지된 활성 분석을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 그러한 변이체는 적합한 변이체에 대한 정보를 모으기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기로의 변화가 활성을 파괴하거나, 바람직하지 않게 감소시키거나, 부적합하게 하는 것으로 밝혀지면, 그러한 변화를 갖는 변이체는 피할 수 있다. 즉, 그러한 일상적인 실험으로부터 모은 정보에 기초하여, 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합으로 추가의 치환을 피해야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
많은 학술 문헌에서 2차 구조의 예측이 집중적으로 보고되었다 ([Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996)], [Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974)]; [Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974)]; [Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978)]; [Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276] 및 [Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)] 참조). 또한, 2차 구조 예측을 돕기 위한 컴퓨터 프로그램이 현재 이용가능하다. 2차 구조 예측을 위한 한 방법은 상동성 모델링에 기초한다. 예를 들어, 서열 동일성이 30%를 초과하거나, 유사성이 40%를 초과하는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 토폴로지 (topology)를 갖는다. 단백질 구조 데이타베이스 (PDB)의 최근의 성장은 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내의 폴드 (fold)의 잠재적인 수를 포함하여 2차 구조의 향상된 예측가능성을 제공하였다. 예를 들어, 문헌 [Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)]을 참조한다. 제시된 폴리펩티드 또는 단백질 내에 제한된 수의 폴드가 존재하고, 중요한 수의 구조가 밝혀진 후에 구조 예측이 보다 더 정확해질 것으로 제안되었다 (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)).
2차 구조를 예측하는 추가의 방법은 "쓰레딩 (threading)" ([Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997)]; [Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)]), "프로필 분석" ([Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991)]; [Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990)]; [Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)]), 및 "진화적 연결" ([Holm, 상기 문헌 (1999)] 및 [Brenner, 상기 문헌 (1997)] 참조)을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질 변이체는 모 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 글리코실화 부위의 수 및/또는 종류가 변경된 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질 변이체는 천연 단백질보다 더 많거나 더 적은 수의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결된 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하고, 여기서, X로 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 별법으로, 상기 서열을 제거하는 치환은 존재하는 N-연결된 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 또한, 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위 (전형적으로 천연 발생하는 부위)가 제거되고 하나 이상의 새로운 N-연결된 부위가 생성된 N-연결된 탄수화물 사슬의 재배열을 제공한다. 추가의 바람직한 항체 변이체는 하나 이상의 시스테인 잔기가 모 아미노산 서열에 비해 결실되거나 또다른 아미노산 (예를 들어, 세린)으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 항체가 불용성 봉입체의 단리 후에서와 같이 생물학적 활성 입체형태로 재폴딩되어야 할 때 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 더 적은 시스테인 잔기를 갖고, 대개 비페어링된 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하기 위해 짝수의 시스테인을 갖는다.
특정 실시태양에 따라, 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고/시키거나, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고/시키거나, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경시키고/시키거나, (4) 결합 친화도를 변경시키고/시키거나, (5) 상기 폴리펩티드에 대한 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 특정 실시태양에 따라, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (특정 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환)이 천연 발생 서열에서 (특정 실시태양에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 특정 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않을 수 있다 (예를 들어, 교체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하는 경향을 갖지 않거나, 모 서열의 특징을 이루는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하지 않아야 한다). 당업계에서 인정되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 각각 본원에 참조로 포함시킨 문헌 ([Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et al., Nature, 354:105 (1991)])에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 변이체는 본원에서 개시되는 ABP의 핵산 서열의 변이체이다. 당업자는 상기 논의가 ABP 단백질 변이체의 확인, 평가 및/또는 생성을 위해 및 또한 이들 단백질 변이체를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 단백질 변이체를 코딩하는 핵산 서열 (및 표 2의 ABP를 코딩하지만, 본원에 명백하게 개시된 것과 상이한 핵산 서열)이 고려된다. 예를 들어, ABP 변이체는 서열 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151에 제시된 적어도 하나의 핵산 서열, 또는 서열 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 및 151 내의 핵산 서열에 의해 코딩되는 적어도 1 내지 6개 (및 그의 다양한 조합)의 CDR(들)에 적어도 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99% 또는 그 이상의 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시태양에서, 항체 (또는 이를 코딩하는 핵산 서열)는, 특정 ABP를 코딩하는 핵산 서열 (또는 핵산 서열 자체)이 엄격한 조건 하에 표 2 내의 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열 (예를 들어, 비제한적으로 서열 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 및 151)에 선택적으로 혼성화할 수 있다면 변이체이다. 한 실시태양에서, 적합한 중등 엄격도 조건은 5XSSC; 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액 내에서 예비세척; 50℃-65℃에서 5xSSC를 사용한 철야 혼성화 또는 종-교차 상동성의 경우에 45℃에서 0.5xSSC를 사용한 혼성화; 이어서, 20분 동안 65℃에서 각각 0.1% SDS를 함유하는 2x, 0.5x 및 0.2xSSC를 사용한 2회 세척을 포함한다. 그러한 혼성화 DNA 서열은 또한 본 발명의 범위 내에 포함되고, 코드 축퇴성으로 인해, 혼성화 DNA 서열에 의해 코딩되는 항체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 이들 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열도 포함된다. 일부 실시태양에서, CDR의 변이체는 상기한 서열 내의 하나 이상의 CDR에 혼성화하는 핵산 서열 및 이들 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다 (개별 CDR은 도 2a-3d에 비추어, 다른 실시태양은 도 3ccc-3jjj 및 15a-15d에 따라 쉽게 결정될 수 있다). 본 문맥에서 언급되는 구문 "선택적으로 혼성화하다"는 검출가능하게 및 선택적으로 결합함을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 감지가능한 양을 최소화시키는 혼성화 및 세척 조건 하에 핵산 가닥에 선택적으로 혼성화한다. 당업계에 공지되고 본원에서 논의되는 선택적 혼성화 조건을 달성하기 위해 고 엄격성 조건이 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 및 단편과 관심있는 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 적어도 80%, 보다 일반적으로 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100%일 것이다. 2개의 아미노산 서열은 그들의 서열 사이에 부분적이거나 완전한 동일성이 존재할 경우에 상동성이다. 예를 들어, 85% 상동성은 2개의 서열이 최대 매칭을 위해 정렬될 때 85%의 아미노산이 동일함을 의미한다. 갭 (매치시키는 2개의 서열 중의 어느 하나 내의)은 매칭을 최대화하는데 허용되고; 5 이하의 갭 길이가 바람직하고, 2 이하가 보다 바람직하다. 별법으로 및 바람직하게는, 2개의 단백질 서열 (또는 길이가 적어도 30개의 아미노산인 단백질로부터 유도된 폴리펩티드 서열)은 돌연변이 데이타 매트릭스 및 6 초과의 갭 페널티 (gap penalty)를 이용하는 프로그램 ALIGN을 사용할 때 5 이상의 정렬 스코어 (표준 편차 단위에서)를 갖는 경우에 본원에서 사용되는 의미의 상동성이다. 문헌 [Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)] 및 이에 대한 [Supplement 2, pp. 1-10]을 참조한다. 2개의 서열 또는 그의 일부는 보다 바람직하게는 그들의 아미노산이 ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 정렬될 때 50% 이상 동일할 경우에 상동성이다. 용어 "에 대응하다"는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 상동성이거나 (즉, 동일하지만 엄밀히 말하면 진화상 관련되지 않거나), 폴리펩티드 서열이 참조 폴리펩티드 서열과 동일함을 의미하도록 본원에서 사용된다. 이와 대조적으로, 용어 "에 상보성인"은 상보성 서열이 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대해 상동성임을 의미하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 대응하고, 참조 서열 "GTATA"에 상보성이다.
항원 결합 단백질 (예를 들어 항체)의 제조
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)은 항원 (예를 들어, PCSK9)을 사용한 면역화에 의해 생산된다. 특정 실시태양에서, 항체는 전장 PCSK9, PCSK9의 가용성 형태, 촉매 도메인 단독, 도 1a에 도시된 PCSK9의 성숙형, PCSK9의 스플라이스 변이체 형태, 또는 그의 단편을 사용한 면역화에 의해 생산할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있고/있거나 재조합 항체일 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물의 면역화에 의해 제조된 인간 항체이다 (예를 들어 PCT 특허 출원 공개 WO 93/12227 참조).
특정 실시태양에서, 항체의 고유한 특성, 예를 들어 그의 표적에 대한 항체의 친화도를 조작하기 위해 특정 전략이 사용될 수 있다. 그러한 전략은 항체 변이체를 생성하도록 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 부위-특이적 또는 무작위 돌연변이 유발의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 그러한 생성 후에, 목적하는 변화, 예를 들어 증가된 또는 감소된 친화도를 보이는 항체 변이체의 스크리닝을 수행한다.
특정 실시태양에서, 돌연변이 유발 전략에서 표적화되는 아미노산 잔기는 CDR 내의 잔기이다. 특정 실시태양에서, 가변 도메인의 프레임워크 구역 내의 아미노산이 표적화된다. 특정 실시태양에서, 상기 프레임워크 구역은 특정 항체의 표적 결합 특성에 기여하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌 [Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999)] 및 여기에 언급된 참고문헌을 참고한다.
특정 실시태양에서, 덜 효과적으로 및 더 효과적으로 스크리닝된 항체 변이체의 라이브러리는 무작위 또는 부위 지정 돌연변이 유발을, 체세포 친화도 성숙 과정 중에 돌연변이되기 쉬운 영역에 대응하는 부위인 CDR 내의 과다돌연변이 부위로 제한함으로써 생산된다. 예를 들어, 문헌 [Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999)] 및 여기에 언급된 참고문헌을 참고한다. 특정 실시태양에서, 특정한 직접 및 역위 반복서열, 특정 컨센서스 서열, 특정 2차 구조 및 특정 팔린드롬 (palindrome)을 포함하고 이로 제한되지 않는 특정 종류의 DNA 요소를 사용하여 과다돌연변이 부위를 확인할 수 있다. 예를 들어, 과다돌연변이 부위를 확인하기 위해 사용할 수 있는 그러한 DNA 요소는 퓨린 (A 또는 G), 이어서 구아닌 (G), 이어서 피리미딘 (C 또는 T), 이어서 아데노신 또는 티미딘 (A 또는 T) (즉, A/G-G-C/T-A/T)를 포함하는 4염기 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 과다돌연변이 부위를 확인하기 위해 사용할 수 있는 DNA 요소의 다른 예는 세린 코돈 A-G-C/T이다.
완전 인간 ABP (예를 들어, 항체)의 제조
특정 실시태양에서, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 생성시킨다. 특정 실시태양에서, 그러한 기술은 완전 인간 모노클로날 항체를 생산한다. 특정 실시태양에서, 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 파지 입자의 표면 상에 발현된다 (예를 들어, [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991)]; [Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991)]; 미국 특허 5,885,793 참조). 특정 실시태양에서, 파지는 표적에 대해 친화도를 갖는 항체 단편을 확인하기 위해 "스크리닝"된다. 따라서, 그러한 특정 과정은 섬유상 박테리오파지의 표면 상의 항체 단편 레퍼토리의 디스플레이를 통한 면역 선택, 및 그의 표적에 대한 결합에 의한 파지의 후속적인 선택과 흡사하다. 그러한 특정 절차에서, 고 친화도의 기능성 중화 항체 단편이 단리된다. 그러한 특정 실시태양에서 (아래에 보다 상세히 논의된), 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리는 말초 혈액 림프구로부터 자연적으로 재배열된 인간 V 유전자를 클로닝함으로써 생성된다. 예를 들어, 문헌 [Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990)]을 참조한다.
특정 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 인간 항체 생산 게놈의 실질적인 부분이 삽입되지만 내인성 쥐 항체의 생산을 결핍시킨 트랜스제닉 마우스를 이용하여 제조된다. 이어서, 그러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고, 쥐 면역글로불린 분자 및 항체의 생산은 결핍된다. 상기 결과를 달성하기 위해 사용되는 기술은 본원 명세서에 개시된 특허, 출원 및 참고문헌에 개시되어 있다. 특정 실시태양에서, 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 PCT 특허 출원 공개 WO 98/24893 또는 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997)]에 개시된 것과 같은 방법을 사용할 수 있다.
일반적으로, PCSK9에 특이적인 완전 인간 모노클로날 ABP (예를 들어, 항체)는 다음과 같이 생산할 수 있다. 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원, 예를 들어 PCSK9로 면역화시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프 세포 (예를 들어 B-세포)를 얻는다. 상기 회수된 세포를 골수-형 세포주와 융합시켜 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조하고, 상기 하이브리도마 세포주를 관심있는 항원에 대해 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 스크리닝하고 선택한다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 생산을 제공한다.
특정 실시태양에서, 완전 인간 항체는 인간 비장세포 (B 또는 T 세포)를 시험관 내에서 항원에 노출시킨 후, 노출된 세포를 면역손상시킨 마우스, 예를 들어 SCID 또는 nod/SCID 내에서 재구성함으로써 생산한다 (예를 들어, [Brams et al., J. Immunol. 160: 2051-2058 (1998)]; [Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000)] 참조). 특정한 그러한 방법에서, SCID 마우스 (SCID-hu) 내로 인간 태아 조직을 이식하면 장기간 조혈반응 및 인간 T-세포 발달을 일으킨다 (예를 들어, [McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988)]; [Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996)] 참조). 특정 예에서, 상기 키메라 마우스에서 체액성 면역 반응은 동물 내에서 인간 T-세포의 동시-발달에 의해 좌우된다 (예를 들어, [Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994)] 참조). 특정 방법에서, 인간 말초 혈액 림프구를 SCID 마우스 내로 이식한다 (예를 들어, [Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988)] 참조. 특정 그러한 실시태양에서, 상기 이식된 세포를 프라이밍제 (priming agent), 예를 들어 포도구균 내독소 A (SEA)로, 또는 항-인간 CD40 모노클로날 항체로 처리할 때, 보다 높은 수준의 B 세포 생산이 검출된다 (예를 들어, [Martensson et al., Immunol., 84:224-230 (1995)]; [Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995)] 참조).
따라서, 특정 실시태양에서, 완전 인간 항체는 숙주 세포 내에서 재조합 DNA의 발현, 또는 하이브리도마 세포 내에서 발현에 의해 생산할 수 있다. 다른 실시태양에서, 항체는 본원에서 설명되는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 본원에서 설명되는 바와 같은 XenoMouse® 기술을 이용하여 제조하였다. 이어서, 그러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고, 쥐 면역글로불린 분자 및 항체의 생산은 결핍된다. 이를 달성하기 위해 사용되는 기술은 본원의 배경 섹션에서 개시된 특허, 출원, 및 참고문헌에 개시되어 있다. 그러나, 특히, 마우스의 트랜스제닉 생산 및 그로부터 항체의 바람직한 실시태양은 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 출원 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원) 및 국제 특허 출원 WO 98/24893 (1998년 6월 11일 공개), 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일 공개)에 개시되어 있다. 또한 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997)]을 참조한다.
상기 기술을 사용하여, 다양한 항원에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생산하였다. 본질적으로, XenoMouse® 주의 마우스를 관심있는 항원 (예를 들어 PCSK9)으로 면역화시키고, 과면역처리된 마우스로부터 림프 세포 (예를 들어 B-세포)를 회수하고, 회수된 림프구를 골수-형 세포주와 융합시켜 불멸의 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이들 하이브리도마 세포주는 관심있는 항원에 특이적인 항체를 생산한 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 스크리닝 및 선택된다. PCSK9에 특이적인 항체를 생산하는 다수 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 방법을 본원에서 제공한다. 또한, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 포함한, 상기 세포주에 의해 생산된 항체의 특성 결정을 본원에서 제공한다.
마우스의 XenoMouse® 주의 생산은 미국 특허 출원 07/466,008 (1990년 1월 12일 출원), 07/610,515 (1990년 11월 8일 출원), 07/919,297 (1992년 7월 24일 출원), 07/922,649 (1992년 7월 30일 출원), 08/031,801 (1993년 3월 15일 출원), 08/112,848 (1993년 8월 27일 출원), 08/234,145 (1994년 4월 28일 출원), 08/376,279 (1995년 1월 20일 출원), 08/430,938 (1995년 4월 27일 출원), 08/464,584 (1995년 6월 5일 출원), 08/464,582 (1995년 6월 5일 출원), 08/463,191 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,837 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,853 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,857 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,859 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,513 (1995년 6월 5일 출원), 08/724,752 (1996년 10월 2일 출원), 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원), 미국 특허 공개 2003/0093820 (2001년 11월 30일 출원)과 미국 특허 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 및 5,939,598과 일본 특허 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 및 3 068 507 B2에 추가로 논의되고 서술된다. 또한, 유럽 특허 EP 0 463 151 B1 (1996년 6월 12일 등록), 국제 특허 출원 공개 WO 94/02602 (1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 공개 WO 96/34096 (1996년 10월 31일 공개), WO 98/24893 (1998년 6월 11일 공개), WO 00/76310 (2000년 12월 21일 공개)을 참조한다. 상기 인용된 특허, 출원, 및 참고문헌의 각각의 개시내용은 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨다.
대안으로, 젠팜 인터내셔널, 인크. (GenPharm International, Inc.)를 포함한 다른 이들은 "미니로커스 (minilocus)" 방법을 이용하였다. 미니로커스 방법에서, 외인성 Ig 로커스는 Ig 로커스로부터의 조각 (개별 유전자)의 포함에 의해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 구역, 및 대체로 제2 불변 구역 (바람직하게는 감마 불변 구역)은 동물 내로 삽입하기 위한 구성체로 형성된다. 상기 방법은 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 5,545,807 (Surani et al) 및 미국 특허 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, 및 6,255,458 (각각 Lonberg & Kay), 미국 특허 5,591,669 및 6,023,010 (Krimpenfort & Berns), 미국 특허 5,612,205, 5,721,367, 및 5,789,215 (Berns et al), 및 미국 특허 5,643,763 (Choi & Dunn, 및 젠팜 인터내셔널), 미국 특허 출원 07/574,748 (1990년 8월 29일 출원), 07/575,962 (1990년 8월 31일 출원), 07/810,279 (1991년 12월 17일 출원), 07/853,408 (1992년 3월 18일 출원), 07/904,068 (1992년 6월 23일 출원), 07/990,860 (1992년 12월 16일 출원), 08/053,131 (1993년 4월 26일 출원), 08/096,762 (1993년 7월 22일 출원), 08/155,301 (1993년 11월 18일 출원), 08/161,739 (1993년 12월 3일 출원), 08/165,699 (1993년 12월 10일 출원), 08/209,741 (1994년 3월 9일 출원)에 기재되어 있다. 또한, 그 개시내용을 전문을 본원에 참조로 포함시킨 유럽 특허 0 546 073 B1, 국제 특허 출원 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884와 미국 특허 5,981,175를 참조한다. 추가로 그 개시내용을 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 ([Taylor et al., 1992], [Chen et al., 1993], [Tuaillon et al., 1993], [Choi et al., 1993], [Lonberg et al., (1994)], [Taylor et al., (1994)], [Tuaillon et al., (1995)], 및 [Fishwild et al., (1996)])을 참조한다.
키린 (Kirin)은 또한 미세세포 융합을 통해, 큰 조각의 염색체 또는 전체 염색체가 도입된 마우스로부터 인간 항체의 생성을 입증하였다. 그 개시내용을 본원에 참조로 포함시킨 유럽 특허 출원 773 288 및 843 961을 참조한다. 추가로, KM™ 마우스 (키린의 Tc 마우스를 메다렉스 (Medarex)의 미니로커스 (Humab) 마우스와 교잡시킨 결과임)가 생성되었다. 이들 마우스는 키린 마우스의 인간 IgH 트랜스염색체 (transchromosome) 및 젠팜 마우스의 카파 사슬 도입 유전자 (transgene)를 보유한다 (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
인간 항체는 또한 시험관 내 방법에 의해 유도될 수 있다. 적합한 예는 파지 디스플레이 (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (이전에 Proliferon), Affimed) 리보좀 디스플레이 (CAT), 효모 디스플레이 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 본원에 기재된 항체는 인간 IgG4 중쇄뿐만 아니라 IgG2 중쇄를 갖는다. 항체는 또한 IgG1을 포함한 다른 인간 이소형의 것일 수 있다. 항체는 높은 친화도를 갖고, 다양한 기술에 의해 측정할 때 일반적으로 Kd가 약 10-6 내지 약 10-13 M 이하이다.
이해될 바와 같이, 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 다른 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 서열은 적합한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 예를 들어 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 폴리뉴클레오티드의 패키징 (packaging) 및 바이러스 (또는 벡터)를 사용한 숙주 세포의 형질도입을 포함한, 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 임의의 공지된 방법에 의해, 또는 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455에 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 형질감염 절차에 의해 수행할 수 있다. 사용되는 형질전환 절차는 형질전환시킬 숙주에 따라 결정된다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀 내 봉입, 및 핵 내로 DNA의 직접 미세주사를 포함한다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 공지되어 있고, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포, 및 많은 다른 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸화 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 세포주는 어떠한 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 구성적 PCSK9 결합 특성을 갖는 항체를 생산하는지 결정하여 선택된다.
특정 실시태양에서, 항체 및/또는 ABP는 다음의 하이브리도마 중 적어도 하나에 의해 생산된다: 21B12, 31H4, 16F12, 표 2에 나열되거나 실시예에 개시된 임의의 다른 하이브리도마. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 약 1 nM 미만, 예를 들어, 1000 pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM, 및/또는 1 pM 내지 0.1 pM 이하의 해리 상수 (KD)로 PCSK9에 결합한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 및 IgM 이소형 중 적어도 하나의 면역글로불린 분자를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및/또는 인간 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 또는 IgM 이소형의 것이다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 포유동물 세포 내에서 발현을 위해 클로닝되었다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 및 IgM 이소형의 임의의 불변 구역 이외의 불변 구역을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 IgG2 이소형에 대한 불변 구역도 아니고 IgG4 이소형에 대한 불변 구역도 아닌 불변 구역에 라이게이팅된 항체의 가변 구역을 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 포유동물 세포 내에서 발현을 위해 클로닝되었다.
특정 실시태양에서, 하이브리도마주 21B12, 31H4 및 16F12 중 적어도 하나로부터의 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 보존적 변형 (및 코딩 뉴클레오티드에 대한 대응하는 변형)은 하이브리도마주 21B12, 31H4 및 16F12로부터의 항체와 유사한 기능적 및/또는 화학적 특징을 갖는 PCSK9에 대한 항체를 생산할 것이다. 이와 대조적으로, 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항체의 기능적 및/또는 화학적 특징에서 실질적인 변형은 (a) 치환의 영역에서 분자 백본의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는데 대한 그들의 효과가 유의하게 상이한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열의 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향이 거의 또는 전혀 없도록 비천연 잔기로 천연 아미노산 잔기의 치환을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"에 대해 이전에 설명된 바와 같이 알라닌으로 치환될 수 있다.
요망하는 아미노산 치환 (보존적이든 비-보존적이든)은 그러한 치환이 요망되는 시점에 당업자가 결정할 수 있다. 특정 실시태양에서, 아미노산 치환은 PCSK9에 대한 항체의 중요한 잔기를 확인하기 위해, 또는 본원에서 설명되는 바와 같이 PCSK9에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 실시태양에서, 특정 항체를 코딩하는 서열은 적합한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에 따라, 형질전환은 예를 들어 바이러스 내에 (또는 바이러스 벡터 내로) 폴리뉴클레오티드의 패키징, 및 바이러스 (또는 벡터)를 사용한 숙주 세포의 형질도입을 포함하는, 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 임의의 공지된 방법에 의해, 또는 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455에 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 형질감염 절차에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시태양에서, 사용되는 형질전환 절차는 형질전환시킬 숙주에 따라 결정된다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀 내 봉입, 및 핵 내로 DNA의 직접 미세주사를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 공지되어 있고, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 많은 다른 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸화 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 세포주는 어떠한 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 구성적 HGF 결합 특성을 갖는 항체를 생산하는지 결정하여 선택될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에 대한 적절한 발현 벡터는 잘 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현시키기 위해 임의의 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 사용할 수 있다. 그러한 시스템은 미생물, 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV, 담배 모자이크 바이러스 TMV)로 형질감염시키거나 세균 발현 벡터 (예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드는 효모 내에서 재조합 방식으로 발현된다. 특정 그러한 실시태양은 상업상 이용가능한 발현 시스템, 예를 들어, 피치아 (Pichia) 발현 시스템 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 제조사의 지시에 따라 사용한다. 특정 실시태양에서, 그러한 시스템은 분비를 지시하기 위해 프레-프로-알파 서열에 의존한다. 특정 실시태양에서, 삽입체의 전사는 메탄올에 의한 유도 시에 알콜 옥시다제 (AOX1) 프로모터에 의해 작동된다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 분비된 폴리펩티드는 효모 성장 배지로부터 정제된다. 특정 실시태양에서, 효모 성장 배지로부터 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용되는 방법은 세균 및 포유동물 세포 상등액으로부터 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용된 것과 동일하다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 바큘로바이러스 발현 벡터, 예를 들어 pVL1393 (파밍겐 (PharMingen, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)) 내에 클로닝된다. 특정 실시태양에서, 그러한 벡터는 sF9 단백질-미함유 배지에서 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 감염시키고 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 제조사 (파밍겐)의 지시에 따라 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 헤파린-세파로스 컬럼 (파마시아 (Pharmacia))을 사용하여 상기 배지로부터 정제되고 농축된다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드는 곤충 시스템에서 발현된다. 폴리펩티드 발현을 위한 특정 곤충 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 하나의 그러한 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드론 형성 바이러스 (AcNPV)가 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 라르바에 (Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 바이러스의 비필수 유전자 내로, 예를 들어 폴리헤드린 유전자 내에 삽입하고, 이 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓을 수 있다. 특정 실시태양에서, 핵산 분자가 성공적으로 삽입되면, 비필수 유전자는 불활성화될 것이다. 특정 실시태양에서, 불활성화는 검출가능한 특징을 생성시킨다. 예를 들어, 폴리헤드린 유전자의 불활성화는 코트 단백질의 생산이 결여된 바이러스를 생산시킨다.
특정 실시태양에서, 재조합 바이러스가 에스. 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 라르바에를 감염시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983)]; 및 [Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994)] 참조).
특정 실시태양에서, 세균 세포에서 생산된 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드는 세균 내에서 불용성 봉입체로서 생산된다. 특정 실시태양에서, 그러한 봉입체를 포함하는 숙주 세포는 원심분리에 의해 수거하고; 0.15 M NaCl, 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA 내에서 세척하고; 0.1 mg/ml 리소자임 (시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스))으로 15분 동안 실온에서 처리한다. 특정 실시태양에서, 용해액을 초음파 처리에 의해 투명하게 만들고, 세포 파쇄물을 12,000 X g에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠렛화시킨다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드-함유 펠렛을 50 mM Tris (pH 8) 및 10 mM EDTA 내에 재현탁하고; 50% 글리세롤 상에 적층하고; 6000 X g에서 30분 동안 원심분리한다. 특정 실시태양에서, 펠렛은 Mg++ 및 Ca++가 존재하지 않는 표준 포스페이트 완충 염수 용액 (PBS) 내에 재현탁시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 재현탁시킨 펠렛을 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분획화함으로써 추가로 정제된다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 특정 실시태양에서, 상기 겔은 단백질을 가시화하기 위해 0.4 M KCl에 담글 수 있고, 이를 절제하여 SDS가 결여된 겔 전개 버퍼 내에서 전기용출시킬 수 있다. 특정 실시태양에 따라, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 융합 단백질이 세균 내에서 가용성 단백질로서 생산된다. 특정 실시태양에서, 상기 GST 융합 단백질은 GST 정제 모듈 (파마시아)을 사용하여 정제된다.
특정 실시태양에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드를 "재폴딩하는" 것이 바람직하다. 특정 실시태양에서, 그러한 폴리펩티드는 본원에서 논의된 특정 재조합 시스템을 사용하여 생산된다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 목적하는 3차 구조의 형성 및/또는 디술피드 연결의 생성을 위해 "재폴딩"되고/되거나 산화된다. 특정 실시태양에서, 상기 구조 및/또는 연결은 폴리펩티드의 특정 생물학적 활성에 관련된다. 특정 실시태양에서, 재폴딩은 당업계에 공지된 임의의 많은 절차를 사용하여 달성된다. 예시적인 방법은 가용화된 폴리펩티드 물질을 무질서유발제 (chaotropic agent)의 존재 하에 대개 7을 넘는 pH에 노출시키는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예시적인 무질서유발제는 구아니딘이다. 특정 실시태양에서, 재폴딩/산화 용액은 또한 환원제 및 상기 환원제의 산화 형태를 함유한다. 특정 실시태양에서, 환원제 및 그의 산화된 형태는 디술피드 셔플링 (shuffling)이 일어나도록 하는 특정 레독스 전위를 생성시킬 비율로 존재한다. 특정 실시태양에서, 그러한 셔플링은 시스테인 다리의 형성을 가능하게 한다. 예시적인 레독스 커플은 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화제2구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT, 및 2-머캅토에탄올 (bME)/디티오-bME를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 공용매가 재폴딩의 효율을 증가시키기 위해 사용된다. 예시적인 공용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 아르기닌을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드를 실질적으로 정제한다. 특정 단백질 정제 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 실시태양에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획으로부터 폴리펩티드 분획의 조질 분획화를 포함한다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술을 이용하여 정제한다. 예시적인 정제 방법은 황산암모늄을 사용한 침전; PEG를 사용한 침전; 면역침전; 열 변성, 이어서 원심분리; 친화도 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질-A-세파로스), 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피를 포함하고 이로 제한되지 않는 크로마토그래피; 겔 여과; 히드록시아파타이트 크로마토그래피; 등전 포커싱 (isoelectric focusing); 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 및 상기 및 다른 기술의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제된다. 특정 실시태양에서, 정제 단계는 변화될 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위한 적합한 방법을 계속 수행할 수 있다.
특정 실시태양에서, 폴리펩티드 제제의 정제 정도를 정량한다. 정제 정도를 정량하기 위한 특정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특정한 예시적인 방법은 제제의 특이적 결합 활성의 결정, 및 SDS/PAGE 분석에 의한 제제 내의 폴리펩티드의 양의 평가를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 폴리펩티드 제제의 정제 양을 평가하기 위한 특정한 예시적인 방법은 제제의 결합 활성을 계산하고 이를 초기 추출물의 결합 활성에 비교하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 계산의 결과는 "정제 배수"로서 표현된다. 결합 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 단위는 수행된 특정 분석에 따라 결정된다.
특정 실시태양에서, 하나 이상의 ABP 성분 또는 ABP 자체를 포함하는 폴리펩티드는 부분적으로 정제된다. 특정 실시태양에서, 부분 정제는 보다 적은 정제 단계를 사용하거나 동일한 일반적인 정제 계획의 상이한 형태를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, HPLC 장치를 사용하여 수행되는 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 사용하는 동일한 기술보다 더 큰 "정제 배수"를 생성시킬 것이다. 특정 실시태양에서, 보다 낮은 정도의 정제를 일으키는 방법은 폴리펩티드의 총 회수, 또는 폴리펩티드의 결합 활성 유지에 있어서 잇점을 가질 수 있다.
특정 예에서, 폴리펩티드의 전기영동 이동은 상이한 조건의 SDS/PAGE를 이용하여 때때로 유의하게 변할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977)] 참조). 상이한 전기영동 조건 하에서, 정제된 또는 부분 정제된 폴리펩티드의 겉보기 분자량이 상이할 수 있음이 이해될 것이다.
예시적인 에피토프
항-PCSK9 항체가 결합하는 에피토프를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본원에 개시된 항체가 결합하는 에피토프가 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 본원에 기재된 항체가 결합하는 임의의 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질이 유용하다. 일부 실시태양에서, 표 2와 도 2 및 3에 나열된 임의의 항체가 결합하는 에피토프가 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 에피토프는 PCSK9의 촉매 도메인 상에 존재한다.
특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 항-PCSK9 항체 또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 방지하기 (예를 들어, 감소시키기) 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 항-PCSK9 항체 또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 항-PCSK9 항체 또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 실질적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프 또는 PCSK9 에피토프를 포함하는 서열은 PCSK9에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단백질을 생성하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프는 동물에게 투여될 수 있고, PCSK9에 결합하는 항체를 후속적으로 동물로부터 얻을 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9 에피토프 또는 PCSK9 에피토프를 포함하는 서열은 정상적인 PCSK9-매개 활성, 예를 들어 PCSK9와 LDLR의 회합을 저해하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본원에 개시된 항원 결합 단백질은 N-말단 프로도메인, 섭틸리신-유사 촉매 도메인 및/또는 C-말단 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 PCSK-9의 기질 결합 그루브에 결합한다 (그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Cunningham et al.]에 설명됨).
일부 실시태양에서, 항체와 접촉하거나 항체에 의해 묻히는 잔기를 함유하는 도메인(들)/구역(들)은 PCSK9 (예를 들어, 야생형 항원) 내의 특이적인 잔기를 돌연변이시키고 항원 결합 단백질이 돌연변이된 또는 변이체 PCSK9 단백질에 결합할 수 있는지 여부를 결정함으로써 확인할 수 있다. 많은 개별 돌연변이를 형성함으로써, 결합에서 직접적인 역할을 수행하거나, 돌연변이가 항원 결합 단백질과 항원 사이의 결합에 영향을 미칠 수 있도록 항체와 충분하게 근접하는 잔기를 확인할 수 있다. 이들 아미노산에 대한 정보로부터, 항원 결합 단백질과 접촉하거나 항체에 의해 덮이는 잔기를 함유하는 항원의 도메인(들) 또는 구역(들)이 설명될 수 있다. 그러한 도메인은 항원 결합 단백질의 결합 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 일반적인 방법의 하나의 특정한 예에서는 아르기닌/글루탐산 스캐닝 프로토콜을 이용한다 (예를 들어, [Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625] 및 [Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473] 참조). 일반적으로, 아르기닌 및 글루탐산은 야생형 폴리펩티드 내의 아미노산을 치환하고 (대개 개별적으로), 이는 이들 아미노산이 전하를 띄고 부피가 커서 돌연변이가 도입되는 항원의 구역에서 항원 결합 단백질과 항원 사이의 결합을 파괴할 가능성을 갖기 때문이다. 야생형 항원 내에 존재하는 아르기닌은 글루탐산으로 교체된다. 다양한 그러한 개별 돌연변이체를 얻고, 수집한 결합 결과를 결합에 영향을 미치는 잔기를 결정하기 위해 분석한다.
실시예 39에서는 본원에서 제공되는 PCSK9 항원 결합 단백질에 대한 PCSK9의 하나의 그러한 아르기닌/글루탐산 스캐닝을 설명한다. 일련의 돌연변이체 PCSK9 항원을 생성시키고, 여기서 각각의 돌연변이체 항원은 단일 돌연변이를 가졌다. 다양한 PCSK9 ABP에 대한 각각의 돌연변이체 PCSK9 항원의 결합을 측정하고, 야생형 PCSK9 (서열 303)에 결합하는 선택된 ABP의 능력에 비교하였다.
항원 결합 단백질과 변이체 PCSK9 사이의 결합의 변경 (예를 들어 감소 또는 증가)은 본원에서 사용될 때 항원 결합 단백질의 결합 친화도의 변화 (예를 들어, 하기 실시예에서 설명되는 비아코어 시험 또는 비드 기반 분석과 같은 공지의 방법에 의해 측정시에), EC50의 변화, 및/또는 총 결합 용량의 변화 (예를 들어 감소) (예를 들어, 항원 결합 단백질 농도 대 항원 농도의 그래프에서 Bmax의 감소로 입증됨)가 존재함을 의미한다. 결합의 유의한 변경은 돌연변이된 잔기가 항원 결합 단백질에 대한 결합에 직접 관여되거나, 결합 단백질이 항원에 결합될 때 결합 단백질에 근접하게 존재함을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 결합의 유의한 감소는 항원 결합 단백질과 돌연변이체 PCSK9 항원 사이의 결합 친화도, EC50, 및/또는 용량이 항원 결합 단백질과 야생형 PCSK9 (예를 들어, 서열 1 및/또는 서열 303에 제시된) 사이의 결합에 비해 10% 초과, 20% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과로 감소됨을 의미한다. 특정 실시태양에서, 결합은 검출가능한 한계 미만으로 감소된다. 일부 실시태양에서, 결합의 유의한 감소는 변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합이 항원 결합 단백질과 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 및/또는 서열 303의 단백질) 사이에서 관찰되는 결합의 50% 미만 (예를 들어, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만)일 때 입증된다. 그러한 결합 측정은 당업계에 공지된 다양한 결합 분석을 이용하여 이루어질 수 있다. 하나의 그러한 분석의 구체적인 예를 실시예 39에 설명한다.
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303) 내의 잔기가 아르기닌 또는 글루탐산으로 치환된, 변이체 PCSK9 단백질에 대한 유의하게 더 낮은 결합을 보이는 항원 결합 단백질을 제공한다. 일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해 돌연변이 R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 및 Q554R 중 임의의 하나 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 244)을 갖는 변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합은 유의하게 감소하거나 증가한다. 본원에서 사용되는 약칭 표기에서, 형식은 야생형 잔기: 폴리펩티드 내의 위치: 돌연변이체 잔기이고, 여기서 잔기의 넘버링은 서열 1 또는 서열 303에서 표시된 바와 같다.
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1에 제시된 위치 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554에서 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합은 유의하게 감소하거나 증가한다. 일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1에 제시된 위치 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554에서 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합은 감소하거나 증가한다. 일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1 내에서 위치 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554에서 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합은 실질적으로 감소하거나 증가한다.
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1 또는 서열 303 내에서 돌연변이 R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 및 Q554R 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 ABP의 결합은 유의하게 감소하거나 증가한다.
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1 또는 서열 303 내에서 돌연변이 R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, 및 E582R 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 ABP의 결합은 유의하게 감소하거나 증가한다. 일부 실시태양에서, 결합은 감소한다. 일부 실시태양에서, 결합의 감소는 EC50의 변화로서 관찰된다. 일부 실시태양에서, EC50의 변화는 EC50의 수치값의 증가이다 (따라서 결합의 감소이다).
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 (예를 들어, 서열 1 또는 서열 303)에 비해, 서열 1 내에서 돌연변이 D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, 및 Q554R 중 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 등)을 갖는 돌연변이체 PCSK9 단백질에 대한 ABP의 결합은 유의하게 감소하거나 증가한다. 일부 실시태양에서, 결합은 감소한다. 일부 실시태양에서, 결합의 감소는 Bmax의 변화로서 관찰된다. 일부 실시태양에서, Bmax의 이동은 ABP에 의해 생성된 최대 신호의 감소이다. 일부 실시태양에서, 에피토프의 일부인 아미노산에 대해, Bmax는 적어도 10% 감소하고, 예를 들어, 적어도 임의의 다음의 양: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 또는 100%의 감소는 일부 실시태양에서 잔기가 에피토프의 일부임을 나타낸다.
지금 나열한 변이체 형태는 서열 1 또는 서열 303에 제시된 야생형 서열에 관하여 언급하지만, PCSK9의 대립유전자 변이체에서 지시된 위치의 아미노산이 다를 수 있음을 알 것이다. 그러한 대립유전자 형태의 PCSK9에 대한 유의하게 보다 낮은 결합을 보이는 항원 결합 단백질이 또한 고려된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 임의의 상기 실시태양은 순수하게 도 1a에 제시된 야생형 서열보다는 대립유전자 서열에 비교될 수 있다.
일부 실시태양에서, 야생형 PCSK9 단백질 내의 선택된 위치에서 잔기가 임의의 다른 잔기로 돌연변이되는 변이체 PCSK9 단백질에 대한 항원 결합 단백질의 결합은 유의하게 감소한다. 일부 실시태양에서, 본원에 설명된 아르기닌/글루탐산 교체가 확인된 위치에 대해 사용된다. 일부 실시태양에서, 알라닌이 확인된 위치에 대해 사용된다.
상기 주지한 바와 같이, 항원 결합 단백질과의 결합에 직접 관여하거나 그에 의해 덮이는 잔기는 스캐닝 결과로부터 확인될 수 있다. 따라서, 이들 잔기는 항원 결합 단백질이 결합하는 결합 구역(들)을 함유하는 서열 1 (또는 서열 303 또는 서열 3)의 도메인 또는 구역을 표시할 수 있다. 실시예 39에 요약된 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554 중 적어도 하나를 함유하는 도메인에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, 및 554 중 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 162, 164, 167, 207 및/또는 208 중 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다. 일부 실시태양에서, 1 초과 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 확인된 잔기는 ABP가 결합하는 구역의 일부이다. 일부 실시태양에서, ABP는 ABP 21B12와 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 185의 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 ABP 31H4와 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 439, 513, 538, 및/또는 539 중 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다. 일부 실시태양에서, 1 초과 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 확인된 잔기는 ABP가 결합하는 구역의 일부이다. 일부 실시태양에서, ABP는 ABP 31A4와 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 123, 129, 311, 313, 337, 132, 351, 390, 및/또는 413 중 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다. 일부 실시태양에서, 1 초과 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개)의 확인된 잔기는 ABP가 결합하는 구역의 일부이다. 일부 실시태양에서, ABP는 ABP 12H11과 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 아미노산 582, 519, 521, 및/또는 554 중 적어도 하나를 함유하는 구역에 결합한다. 일부 실시태양에서, 1 초과 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 확인된 잔기는 ABP가 결합하는 구역의 일부이다. 일부 실시태양에서, ABP는 ABP 3C4와 경쟁한다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 서열 1 또는 서열 303의 단편 또는 전장 서열 내의 상기한 구역에 결합한다. 다른 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 이들 구역으로 이루어지는 폴리펩티드에 결합한다. "서열 1 또는 서열 303"에 대한 언급은 이들 서열 중 하나 또는 둘 모두가 사용되거나 관련될 수 있음을 나타낸다. 상기 구문은 단지 하나만이 사용되어야 함을 나타내지는 않는다.
상기 주지한 바와 같이, 상기 설명은 서열 1에 관하여 구체적인 아미노산 위치를 언급한다. 그러나, 명세서 전체에서, 일반적으로, 서열 3에 제공되는, 위치 31에서 시작하는 Pro/Cat 도메인에 대해 언급한다. 아래에서 알 수 있는 바와 같이, 서열 1 및 서열 303은 PCSK9의 신호 서열이 결여된다. 따라서, 이들 다양한 개시내용 사이의 임의의 비교는 넘버링에서의 상기 차이를 고려해야 한다. 특히, 서열 1의 임의의 아미노산 위치는 아미노산 위치 30의 아미노산, 특히 서열 3의 단백질에 대응할 것이다. 예를 들어, 서열 1의 위치 207은 서열 3의 위치 237에 대응한다 (전장 서열, 및 일반적으로 본 명세서에서 사용된 넘버링 시스템). 표 39.6에서는 서열 1 (및/또는 서열 303)을 언급하는 상기한 위치가 서열 3 (신호 서열을 포함하는)에 상응하는 방법을 개략한다. 따라서, 서열 1 (및/또는 서열 303)에 관하여 설명되는 임의의 상기한 실시태양은 표시된 대응하는 위치에 의해 서열 3에 관하여 설명된다.
일부 실시태양에서, ABP 21B12는 잔기 162-167 (예를 들어, 서열 1의 잔기 D162-E167)을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP 12H11은 잔기 123-132 (예를 들어, 서열 1의 S123-T132)를 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP 12H11은 잔기 311-313 (예를 들어, 서열 1의 A311-D313)을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, ABP는 서열의 이들 가닥 중 임의의 하나를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
경쟁성 항원 결합 단백질
다른 측면에서, PCSK9에 대한 특이적인 결합에 대해 본원에 설명된 에피토프에 결합하는 하나의 예시된 항체 또는 기능적 단편과 경쟁하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 상기 항원 결합 단백질은 또한 본원에 예시된 항원 결합 단백질 중 하나와 동일한 에피토프, 또는 겹치는 에피토프에 결합할 수 있다. 예시된 항원 결합 단백질과 경쟁하고 그와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 단편은 유사한 기능적 특성을 보일 것으로 예상된다. 예시된 항원 결합 단백질 및 단편은 표 2 및/또는 도 2-3 및 도 15에 포함된 중쇄 및 경쇄, 가변 구역 도메인 및 CDR을 갖는 것을 포함하여 상기 설명된 것을 포함한다. 따라서, 구체적인 예로서, 제공되는 항원 결합 단백질은
(a) 도 2-3 및 15에 제시된 항체에 대해 나열된 6개의 모든 CDR;
(b) 표 2에 제시된 항체에 대해 나열된 VH 및 VL; 또는
(c) 표 2에 나열된 항체에 대해 명시된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질과 경쟁하는 것을 포함한다.
특정 치료 용도 및 제약 조성물
특정 예에서, PCSK9 활성은 많은 인간 질병 상태와 상호관련된다. 예를 들어, 특정 예에서, 너무 많거나 너무 적은 PCSK9 활성은 특정 병태, 예를 들어 고콜레스테롤혈증과 상호관련된다. 따라서, 특정 예에서, PCSK9 활성을 조정하는 것이 치료상 유용할 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 중화 항원 결합 단백질이 적어도 하나의 PCSK9 활성 (예를 들어, LDLR에 대한 결합)을 조정하기 위해 사용된다. 상기 방법은 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 관련되거나, 상승된 콜레스테롤 수준이 관련되는 질환을 치료하고/하거나 예방하고/하거나 질환의 의 위험을 감소시킬 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 비추어, 변화된 콜레스테롤, LDL, 또는 LDLR 수준에 관련되거나 포함하거나 영향을 받을 수 있는 질환은 항원 결합 단백질의 다양한 실시태양에 의해 처리될 수 있다. 일부 실시태양에서, "콜레스테롤 관련 질환" ("혈청 콜레스테롤 관련 질환" 포함)은 고콜레스테롤혈증, 심장 질병, 대사 증후군, 당뇨병, 관상동맥 심장 질병, 뇌졸중, 심혈관 질병, 알츠하이머 병, 및 일반적으로 예를 들어, 상승된 총 혈청 콜레스테롤, 상승된 LDL, 상승된 트리글리세리드, 상승된 VLDL, 및/또는 적은 HDL에 의해 나타날 수 있는 이상지질혈증 중 임의의 하나 이상을 포함한다. ABP를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 물질과 조합으로 사용하여 치료할 수 있는 1차 및 2차 이상지질혈증의 일부 비-제한적인 예는 대사 증후군, 당뇨병, 가족성 복합 고지질혈증, 가족성 고중성지방혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 예를 들어 이형접합 고콜레스테롤혈증, 동형접합 고콜레스테롤혈증, 가족성 결손 아포지단백질 B-100; 다유전자성 고콜레스테롤혈증; 잔존물 제거 질병, 간 지방분해효소 결핍; 식상(dietary indiscretion), 갑상선기능저하증, 에스트로겐 및 프로게스틴 요법, 베타-차단제, 및 티아지드 이뇨제를 포함한 약물 중 임의의 것에 2차성의 이상지질혈증; 신 증후군, 만성 신부전증, 쿠싱 증후군, 원발 담즙성 간경화, 글리코겐 저장 질병, 간암, 담증울체, 말단비대증, 인슐린종, 단리된 성장 호르몬 결핍, 및 알콜-유도된 고중성지방혈증을 포함한다. ABP는 또한 죽상동맥경화성 질병, 예를 들어, 관상동맥 심장 질병, 관상 동맥 질병, 말초 동맥 질병, 뇌졸중 (허혈성 및 출혈성), 협심증, 또는 뇌혈관 질병 및 급성 관상동맥 증후군, 심근 경색을 예방 또는 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 비치명적 심장 마비, 치명적 및 비-치명적 뇌졸중, 특정 종류의 심장 수술, 심부전증으로 인한 입원, 심장 질병이 있는 환자에서 흉통, 및/또는 확립된 심장 질병, 예를 들어 이전의 심장 마비, 이전의 심장 수술으로 인한 심혈관 사건, 및/또는 막힌 동맥의 증거가 있는 흉통의 위험을 감소시키는데 유용하다. 일부 실시태양에서, ABP 및 방법은 재발성 심혈관 사건의 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 스타틴의 사용을 통해 일반적으로 처리가능한 (치료가능하거나 예방가능한) 질병 또는 질환에서 또한 본 발명의 항원 결합 단백질의 적용이 유익할 수 있다. 또한, 일부 실시태양에서, 콜레스테롤 합성의 방지 또는 증가된 LDLR 발현이 유익할 수 있는 질환 또는 질병은 또한 항원 결합 단백질의 다양한 실시태양에 의해 치료될 수 있다. 또한, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 항-PCSK9 항체의 사용은 당뇨병의 치료에서 특히 유용할 수 있다. 당뇨병은 관상동맥 심장 질병에 대한 위험 인자일 뿐만 아니라, 인슐린은 PCSK9의 발현을 증가시킨다. 즉, 당뇨병의 사람은 상승된 혈장 지질 수준 (높은 PCSK9 수준에 관련될 수 있는)을 갖고, 이들 수준을 저하시키는 것이 유익할 수 있다. 이는 일반적으로 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨 문헌 [Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006)]에 보다 상세히 논의되어 있다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 당뇨병, 복부 대동맥류, 죽상동맥경화증 및/또는 말초 혈관 질병이 있는 사람에게 그들의 혈청 콜레스테롤 수준을 보다 안정한 범위로 감소시키기 위해 투여된다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 임의의 본원에 기재된 질환을 발병할 위험이 있는 환자에게 투여된다. 일부 실시태양에서, ABP는 고혈압 또는 초기 심장 마비의 가족력이 있는 흡연자에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 대상은 2004 NCEP 치료 목표에서 중간 정도의 위험 또는 보다 큰 위험에 있으면 ABP를 투여한다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상의 LDL 콜레스테롤 수준이 160 mg/dl을 초과하는 경우에 대상에게 투여된다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상의 LDL 콜레스테롤 수준이 130을 초과하는 경우에 (그리고 2004 NCEP 치료 목표에 따라 중간 정도 또는 중간 정도로 높은 위험에 있으면) 투여된다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상의 LDL 콜레스테롤 수준이 100을 초과하는 경우에 (그리고 2004 NCEP 치료 목표에 따라 높거나 매우 높은 위험에 있으면) 투여된다.
의사는 특정 환자의 개별 프로필에 따라 적절한 치료 적응증 및 표적 지질 수준을 선택할 수 있을 것이다. 고지혈증 치료를 지도하는 널리 승인된 하나의 표준은 문헌 [Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, National Institutes of Health, NIH Publication No. 02-5215 (2002)]이고, 그의 출판 간행물의 전문을 본원에 참조로 포함시킨다.
일부 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 비정상적으로 높은 수준 또는 심지어 정상 수준으로부터 PCSK9 활성의 양을 감소시키기 위해 사용된다. 일부 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 고콜레스테롤혈증을 치료 또는 예방하기 위해, 및/또는 그를 위한 의약의 제조에서, 및/또는 다른 콜레스테롤 관련 질환 (예를 들어 본원에 나타낸 것)에 대해 사용된다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 PCSK9 활성이 정상인 고콜레스테롤혈증과 같은 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 병태에서, 정상 미만으로 PCSK9 활성의 감소는 치료 효과를 제공할 수 있다.
일부 실시태양에서, PCSK9 활성을 조정하기 위해 PCSK9에 대한 하나 초과의 항원 결합 단백질이 사용된다.
특정 실시태양에서, 치료 유효량의 PCSK9에 대한 하나 이상의 항원 결합 단백질 및 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들어 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 단독으로 투여된다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여 전에 투여된다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여 후에 투여된다. 다른 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 다른 치료제의 투여 전에 투여된다. 치료제 (항원 결합 단백질 외에)는 적어도 하나의 다른 콜레스테롤-저하제(들) (혈청 및/또는 총 체내 콜레스테롤)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 물질은 LDLR의 발현을 증가시키고, 이는 혈청 HDL 수준을 증가시키거나, LDL 수준을 저하시키거나, 트리글리세리드 수준을 저하시키는 것으로 관찰되었다. 예시적인 물질은 스타틴 (아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴), 니코틴산 (니아신) (NIACOR, NIASPAN (서방형 니아신), SLO-NIACIN (서방형 니아신)), 피브르산 (LOPID (겜피브로질), TRICOR (페노피브레이트), 담즙산 흡착제 (sequestrant) (QUESTRAN (콜레스티라민), 콜레세벨람 (WELCHOL), COLESTID (콜레스티폴)), 콜레스테롤 흡수 억제제 (ZETIA (에제티미브)), 니코틴산과 스타틴의 복합제 (ADVICOR (로바스타틴 및 NIASPAN), 스타틴과 흡수 억제제의 복합제 (VYTORIN (ZOCOR 및 ZETIA) 및/또는 지질 변형제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, ABP는 PPAR 감마 작용제, PPAR 알파/감마 작용제, 스쿠알렌 합성효소 억제제, CETP 억제제, 항-고혈압제, 당뇨병 치료제 (예를 들어 술포닐 우레아, 인슐린, GLP-1 유사체, DDPIV 억제제), ApoB 조정물질, MTP 억제제는 및/또는 폐쇄 죽상동맥경화 치료와 조합된다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상에서 LDLR 단백질 수준을 증가시키는 물질, 예를 들어 스타틴, 온코스타틴 M과 같은 특정 시토킨, 에스트로겐, 및/또는 특정 식물 성분, 예를 들어 베르베린과 조합된다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상에서 혈청 콜레스테롤 수준을 증가시키는 물질 (예를 들어 특정 항-정신병제, 특정 HIV 프로테아제 억제제, 식이 인자, 예를 들어 고 프럭토스, 수크로스, 콜레스테롤 또는 특정 지방산, 및 RXR, RAR, LXR, FXR에 대한 특정 핵 수용체 작용제 및 길항제)과 조합된다. 일부 실시태양에서, ABP는 대상에서 PCSK9 수준을 증가키는 물질, 예를 들어 스타틴 및/또는 인슐린과 조합된다. 2가지 물질의 조합에서는 다른 물질의 바람직하지 않은 부작용이 ABP에 의해 완화될 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서, ABP는 다른 물질/화합물과 조합된다. 일부 실시태양에서, ABP 및 다른 물질은 동시에 투여된다. 일부 실시태양에서, ABP 및 다른 물질은 동시에 투여되지 않고, 여기서 ABP는 다른 물질이 투여되기 전에 또는 투여된 후에 투여된다. 일부 실시태양에서, 대상은 ABP 및 다른 물질 (LDLR 수준을 증가시키는)을 동일한 예방 기간, 질환 발생, 및/또는 치료 기간 동안 투여받는다.
본 발명의 제약 조성물은 조합 요법으로, 즉, 다른 물질과 조합으로 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 조합 요법은 PCSK9에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 항-콜레스테롤제와 조합으로 포함한다. 물질은 시험관 내에서 합성된 화학 조성물, 항체, 항원 결합 구역, 및 그의 조합 및 컨쥬게이트를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 물질은 작용제, 길항제, 알로스테리 (allosteric) 조정물질, 또는 독소로서 역할을 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 물질은 그의 표적을 억제하거나 자극하는 (예를 들어, 수용체 또는 효소 활성화 또는 억제) 역할을 하여, LDLR의 증가된 발현을 촉진하거나 혈청 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 콜레스테롤-저하제 (혈청 및/또는 총 콜레스테롤)를 사용한 치료 전에, 동시에 및 치료 후에 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 고콜레스테롤혈증, 심장 질병, 당뇨병, 및/또는 임의의 콜레스테롤 관련 질환의 발현을 예방 또는 완화시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 기존의 고콜레스테롤혈증 병태의 치료를 위해 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 질환 및/또는 질환과 연관된 증상의 발현을 지연시킨다. 일부 실시태양에서, ABP는 임의의 하나의 콜레스테롤 관련 질환 또는 그의 하위세트의 임의의 증상이 결여된 대상에게 제공된다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 다양한 콜레스테롤 관련 질환, 예를 들어 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위해 특정 치료제와 함께 사용된다. 특정 실시태양에서, 병태 및 목적하는 수준의 치료를 고려하여, 2 또는 3개 이상의 물질이 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 물질들은 동일한 제형 내에 포함시킴으로써 함께 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 물질(들) 및 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 동일한 제형 내에 포함시킴으로써 함께 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 물질들은 따로 제형화되거나 치료 키트 내에 포함시킴으로써 함께 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 물질 및 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 따로 제형화되거나 치료 키트 내에 포함시킴으로써 함께 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 물질들은 따로 제공될 수 있다. 특정 실시태양에서, 유전자 요법에 의해 투여될 때, 단백질 물질을 코딩하는 유전자 및/또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 동일한 벡터 내에 포함될 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질 물질을 코딩하는 유전자 및/또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 동일한 프로모터 구역의 제어 하에 놓일 수 있다. 특정 실시태양에서, 단백질 물질을 코딩하는 유전자 및/또는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 별개의 벡터 내에 존재할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 제약상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및 치료 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제를 제약상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 염증에 대한 적어도 하나의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 면역 질환에 대한 적어도 하나의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 염증 및 면역 질환에 대한 예시적인 치료제는 시클로옥시게나제 타입 1 (COX-1) 및 시클로옥시게나제 타입 2 (COX-2) 억제제, 38 kDa 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (p38-MAPK)의 소분자 조정물질; 염증 경로에 관여하는 세포내 분자의 소분자 조정물질을 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서 상기 세포내 분자는 jnk, IKK, NF-κB, ZAP70, 및 lck를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 염증에 대한 특정 예시적인 치료제는 예를 들어, 문헌 [C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA]에 기재되어 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물은 PCSK9에 대한 하나 초과의 상이한 항원 결합 단백질을 포함할 것이다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물은 PCSK9에 대한 하나 초과의 항원 결합 단백질을 포함할 것이고, 여기서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 하나 초과의 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 다양한 항원 결합 단백질은 PCSK9에 대한 결합을 위해 서로 경쟁하지 않을 것이다. 일부 실시태양에서, 표 2와 도 2 및/또는 3에 제시된 임의의 항원 결합 단백질들은 제약 조성물 내에서 함께 조합될 수 있다.
특정 실시태양에서, 허용되는 제형화 물질은 바람직하게는 사용된 용량 및 농도에서 수여자에 대해 무독성이다. 일부 실시태양에서, 제형화 물질(들)은 피하 및/또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 몰랄 삼투압 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 해리 또는 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위해 제형화 물질을 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 적합한 제형화 물질은 아미노산 (예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제 (예를 들어 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 버퍼 (예를 들어 보레이트, 비카르보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산); 증량제 (예를 들어 만니톨 또는 글라이신); 킬레이팅제 (예를 들어 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)); 착화제 (예를 들어 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 다른 탄수화물 (예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 저 분자량 폴리펩티드; 염 형성 반대 이온 (예를 들어 나트륨); 보존제 (예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (예를 들어 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알콜 (예를 들어 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (예를 들어 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제 (예를 들어 수크로스 또는 소르비톨); 긴장성 (tonicity) 향상제 (예를 들어 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 제약상 보조제를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)). 일부 실시태양에서, 제형은 PBS; 20 mM NaOAC (pH 5.2), 50 mM NaCl; 및/또는 10 mM NAOAC (pH 5.2), 9% 수크로스를 포함한다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 치료적 분자는 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결된다. 상기 비히클은 폴리에틸렌 글리콜, 글리코겐 (예를 들어, ABP의 글리코실화), 및 덱스트란을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 비히클은 예를 들어 임의의 목적으로 본원에 참조로 포함시킨 미국 특허 출원 09/428,082 (현재 미국 특허 6,660,843) 및 공개된 PCT 출원 WO 99/25044에 설명되어 있다.
특정 실시태양에서, 최적 제약 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 방식 및 목적하는 용량에 따라 당업자가 결정할 것이다 (예를 들어, [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 문헌] 참조). 특정 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명의 항체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출율 및 생체 내 청소율에 영향을 미칠 수 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물 내의 1차 비히클 또는 담체는 성질이 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 통상적인 다른 물질을 보충한 주사용수, 생리학적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 일부 실시태양에서, 염수는 등장성 포스페이트-완충 염수를 포함한다. 특정 실시태양에서, 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 특정 실시태양에서, 제약 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 Tris 버퍼, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 버퍼를 포함하고, 이는 소르비톨 또는 그에 대한 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 조성물은 목적하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적인 제형화 물질 (Remington's pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)과 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조할 수 있다. 또한, 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 조성물은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한 전달, 예를 들어 경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 그러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 당업자의 능력 내에 있다.
특정 실시태양에서, 제형화 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 버퍼는 조성물을 생리학적 pH 또는 근소하게 더 낮은 pH에서, 대개 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하기 위해 사용된다.
특정 실시태양에서, 비경구 투여가 고려될 때, 치료 조성물은 PCSK9에 대한 목적하는 항원 결합 단백질을 제약상 허용되는 비히클 내에서 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는, 발열원이 없는 비경구로 허용되는 수용액 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 비경구 주사를 위한 비히클은 멸균 증류수이고, 여기서 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로, 적합하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제형화된다. 특정 실시태양에서, 제제는 이어서 데포 (depot) 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는 주사가능한 미세구, 생체분해성 입자, 중합체성 화합물 (예를 들어 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 물질을 갖는 목적하는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 이식가능한 약물 전달 장치가 목적하는 분자를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물은 흡입을 위해 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 흡입용 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제를 사용하여 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명하는 PCT 출원 PCT/US94/001875에 추가로 설명되어 있다.
특정 실시태양에서, 제형이 경구로 투여될 수 있음이 고려된다. 특정 실시태양에서, 상기 방식으로 투여되는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여형의 조제에서 관습적으로 사용되는 담체를 사용하거나 사용하지 않고 제형화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 전신 도입전 파괴가 최소화되는 위장관 내의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가의 치료제의 흡수를 용이하게 하기 위해 적어도 하나의 추가의 물질이 포함될 수 있다. 특정 실시태양에서, 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물은 유효량의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 정제의 제조에 적합한 무독성 부형제와의 혼합물로 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액을 단위 투여 형태로 제조할 수 있다. 특정 실시태양에서, 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 활택제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제(들)과 함께 또는 단독으로 지속- 또는 제어-전달 제형 내에 포함하는 제형을 포함한 추가의 제약 조성물이 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시태양에서, 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예를 들어 리포좀 담체, 생체분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 제약 조성물의 전달을 위한 다공성 중합성 미세입자의 제어 방출을 설명하는 PCT 출원 PCT/US93/00829를 참조한다. 특정 실시태양에서, 지속-방출 제제는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 미세캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (U.S. 3,773,919 및 EP 058,481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) ([Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)] 및 [Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., 1981, 상기 문헌) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 여러 방법에 의해 제조할 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)]; EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949를 참조한다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제약 조성물은 대개 멸균된다. 특정 실시태양에서, 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물을 동결건조할 때, 상기 방법을 이용한 멸균을 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 수행할 수 있다. 특정 실시태양에서, 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태 또는 용액으로 저장할 수 있다. 특정 실시태양에서, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트가 있는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣어진다.
특정 실시태양에서, 일단 제약 조성물이 제형화되면, 이를 멸균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 저장할 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 제형은 바로 사용되는 (ready-to-use) 형태 또는 투여 전에 재구성되는 형태 (예를 들어, 동결건조 형태)로 저장할 수 있다.
특정 실시태양에서, 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 단일 및 다수-챔버의 예비-충전된 시린지 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지 (lyosyringe))를 포함하는 키트를 제공한다.
특정 실시태양에서, 치료상 사용될 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 제약 조성물의 유효량은 예를 들어 치료 환경 및 목표에 따라 결정될 것이다. 당업자는 특정 실시태양에 따라 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 부분적으로 전달되는 분자, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질이 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체격 (체중, 체표면적 또는 장기 크기) 및/또는 상태 (연령 및 전반적인 건강)에 따라 변할 것임을 알 것이다. 특정 실시태양에서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상일 수 있다. 특정 실시태양에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다.
특정 실시태양에서, 투여 빈도는 사용된 제형 내의 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가의 치료제의 약동학 파라미터를 고려할 것이다. 특정 실시태양에서, 임상의는 목적하는 효과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 조성물은 단일 용량으로서, 또는 시간 경과에 따라 2회 이상 용량 (동일한 양의 목적하는 분자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 미세조정은 통상적으로 당업자에 의해 이루어지고, 이들이 통상적으로 수행하는 업무의 범위 내에 있다. 특정 실시태양에서, 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이타의 사용을 통해 확인할 수 있다. 일부 실시태양에서, 투여량 및 투여 빈도는 달성되는 목적하는 콜레스테롤 수준 (혈청 및/또는 총) 및 대상의 현재 콜레스테롤 수준, LDL 수준 및/또는 LDLR 수준을 고려할 수 있고, 이들은 모두 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다.
특정 실시태양에서, 제약 조성물의 투여 경로는 공지의 방법에 따르고, 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 피하, 눈내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통해; 지속 방출 시스템 또는 이식 장치에 의한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 볼러스 (bolus) 주사에 의해, 또는 주입에 의해 연속적으로 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
특정 실시태양에서, 조성물은 목적하는 분자가 그 위해 흡수되거나 봉입된 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소 투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이식 장치가 사용되는 경우에, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 장기 내로 이식될 수 있고, 목적하는 분자의 전달은 확산, 시한 (timed)-방출 볼러스 또는 연속 투여를 통할 수 있다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 제약 조성물을 생체 외 방식으로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 경우에, 환자로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 장기를 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 또는 단독으로 포함하는 제약 조성물에 노출시키고, 그 후 세포, 조직 및/또는 장기를 후속적으로 환자에게 다시 이식한다.
특정 실시태양에서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가의 치료제는 폴리펩티드를 발현하고 분비하도록 본원에 설명된 것과 같은 방법을 사용하여 유전공학 처리된 특정 세포를 이식함으로써 전달될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 자가성, 이종성 또는 이종발생성일 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포는 불멸화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 면역학적 반응 기회를 감소시키기 위해, 세포는 둘러싸는 조직의 침윤을 피하도록 봉입될 수 있다. 특정 실시태양에서, 봉입 물질은 단백질 생성물(들)의 방출을 허용하지만, 환자의 면역계에 의한 또는 둘러싸는 조직으로부터의 다른 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 방지하는, 대개 생체적합성의 반투과성 중합성 인클로져 (enclosure) 또는 막이다.
PCSK9 활성을 유의하게 중화하는 ABP의 능력에 기초하여 (하기 실시예에서 입증되는 바와 같이), 이들 ABP는 PCSK9-매개 활성에 의해 발생하는 증상 및 병태, 예를 들어 고콜레스테롤혈증의 치료 및 예방에서 치료 효과를 가질 것이다.
진단 용도
일부 실시태양에서, ABP는 진단 도구로서 사용된다. ABP는 샘플 및/또는 대상 내에 존재하는 PCSK9의 양을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 상기 ABP는 중화 ABP일 필요가 없다. 일부 실시태양에서, 진단적 ABP는 중화 ABP가 아니다. 일부 실시태양에서, 진단적 ABP는 중화 ABP가 결합하는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시태양에서, 2개의 ABP는 서로 경쟁하지 않는다.
일부 실시태양에서, 본원에서 개시되는 ABP는 PCSK9의 수준 변화와 연관된 질병 또는 질환의 스크리닝/진단을 위해 포유동물 조직 또는 세포 내에서 PCSK9의 검출을 위한 분석 키트 및/또는 방법에서 사용되거나 제공된다. 키트는 PCSK9에 결합하는 ABP, 및 존재할 경우 PCSK9에 대한 ABP의 결합, 및 임의로 PCSK9 단백질 수준을 나타내기 위한 수단을 포함한다. ABP의 존재를 나타내기 위한 다양한 수단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 형광단, 다른 분자 프로브, 또는 효소가 ABP에 연결될 수 있고, ABP의 존재는 다양한 방법으로 관찰할 수 있다. 그러한 질환을 스크리닝하기 위한 방법은 키트의 사용, 또는 간단히 개시된 ABP 중 하나의 사용, 및 ABP가 샘플 내의 PCSK9에 결합하는지 여부의 결정을 수반할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 높은 또는 상승된 수준의 PCSK9는 샘플 내의 PCSK9에 대한 다량의 ABP 결합을 유발할 것이다. 따라서, ABP 결합 정도는 얼마나 많은 PCSK9가 샘플 내에 존재하는지 결정하기 위해 사용될 수 있다. 소정량 (예를 들어, PCSK9 관련 질환에 걸리지 않은 사람이 가질 양 또는 범위)보다 많은 양의 PCSK9가 존재하는 대상 또는 샘플은 PCSK9 매개 질환이 존재하는 것으로 특성이 결정될 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 스타틴이 대상에서 PCSK9의 양을 증가시켰는지 결정하기 위해 스타틴을 복용하는 대상에게 투여한다.
일부 실시태양에서, ABP는 비-중화 ABP이고, ABP 및/또는 스타틴 치료를 받는 대상에서 PCSK9의 양을 결정하기 위해 사용된다.
실시예
수행된 실험과 달성된 결과를 포함한 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
면역화 및 적정
항-PCSK9 항체 및 하이브리도마의 생성
PCSK9의 성숙형에 대한 항체 (도 1a에 서열을 도시하고, 프로-도메인을 밑줄친다)를 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 마우스인 XenoMouse® 마우스 (아브게닉스 (Abgenix, 미국 캘리포니아주 프레몬트))에서 생성시켰다. 2개의 군의 XenoMouse® 마우스, 즉 1군 및 2군을 사용하여 PCSK9에 대한 항체를 생성시켰다. 1군은 완전 인간 IgG2κ 및 IgG2λ 항체를 생산하는 XenoMouse® 주 XMG2-KL의 마우스를 포함하였다. 1군 마우스를 인간 PCSK9로 면역화시켰다. PCSK9는 참조로서 GenBank 서열 (NM_174936)을 사용하여 표준 재조합 기술을 이용하여 제조하였다. 2군은 완전 인간 IgG4κ 및 IgG4λ 항체를 생산하는 XenoMouse® 주 XMG4-KL의 마우스를 포함하였다. 2군 마우스를 또한 인간 PCSK9로 면역화시켰다.
두 군의 마우스에 표 3의 스케줄에 따라 항원을 11회 주사하였다. 초기 면역화시에, 각각의 마우스에 복강내 전달되는 총 10 ㎍의 항원을 복부 내로 주사하였다. 후속 추가접종 (boost)은 5 ㎍ 용량이고, 주사는 복부 내로의 복강내 주사와 꼬리 기부에서의 피하 주사를 교대로 수행하였다. 복강내 주사를 위해, 항원은 TiterMax® Gold (시그마, Cat# T2684)를 사용하여 에멀젼으로서 제조하고, 피하 주사를 위해 항원을 알룸 (Alum) (인산알루미늄) 및 CpG 올리고와 혼합한다. 주사 2 내지 8 및 10에서, 각각의 마우스에게 어주번트 알룸 겔 내의 총 5 ㎍의 항원을 주사하였다. 마우스 당 5 ㎍의 항원의 최종 주사를 Phospho 완충 염수 내에서 전달하고, 2개의 부위로, 즉 복부로 50% IP 및 꼬리 기부에서 50% SQ로 전달하였다. 면역화 프로그램을 하기 표 3에 요약한다.
Figure pat00003
XenoMouse 동물의 적정을 위해 사용된 프로토콜은 다음과 같았다: 코스타(Costar) 3368 배지 결합 플레이트를 8 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (50 ㎕/웰)으로 코팅하고, 4℃에서 1XPBS/O.05% 아지드 내에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이들을 RO 수를 사용하는 타이터테크(TiterTek) 3-사이클 세척을 이용하여 세척하였다. 플레이트를 250 ㎕의 1XPBS/1% 우유를 사용하여 차단하고, 적어도 30분 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 블록을 RO 수를 사용하는 타이터테크 3-사이클 세척을 이용하여 세척 제거하였다. 이어서, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ (분석 희석제) 중의 2 ㎍/ml의 b-인간 PCSK9 (50 ㎕/웰)를 포획하고, 1 hr 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 이어서, RO 수를 사용하는 타이터테크 3-사이클 세척을 이용하여 세척하였다. 1차 항체에 대해, 혈청을 1:100으로부터 이중으로 1:3 적정하였다. 이를 분석 희석제 (50 ㎕/웰) 내에서 수행하고, 1 hr 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 이어서, RO 수를 사용하는 타이터테크 3-사이클 세척을 이용하여 세척하였다. 2차 항체는 분석 희석제 중의 400 ng/ml의 염소 항-인간 IgG Fc HRP (50 ㎕/웰)이었다. 이것을 1 hr 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 이를 RO 수를 사용하는 타이터테크 3-사이클 세척을 이용하여 세척하고, 종이 타월 상에서 두드려서 건조시켰다. 기질에 대해, 1단계 TMB 용액 (네오겐 (Neogen, 미국 켄터키주 렉싱톤))을 사용하고 (50 ㎕/웰), 이를 30분 동안 RT에서 발색시켰다.
ELISA 분석에서 따른 프로토콜은 다음과 같았다: V5His 태그가 없는 b-PCSK.9를 포함하는 샘플에 대해, 다음 프로토콜을 사용하였다: 코스타 3368 배지 결합 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스 (Corning Life Sciences))를 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 8 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (50 ㎕/웰)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 타이터테크 M384 플레이트 세척기 (타이터테크 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌))를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 250 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 M384 플레이트 세척기로 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 V5 태그가 없는 b-hu PCSK9이고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 2 ㎍/ml (40 ㎕/웰)로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 혈청을 1:100으로부터 이중으로 1:3 적정하고, H열은 혈청에 대해 블랭크 (blank)였다. 적정은 분석 희석제 내에서 50 ㎕/웰의 부피로 수행하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 3-사이클 세척을 수행하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 염소 항-인간 IgG Fc HRP (50 ㎕/웰)를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 다시 1회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 종이 타월로 두드려서 건조시켰다. 마지막으로, 1단계 TMB (네오겐) (50 ㎕/웰)를 플레이트에 첨가하고, 1N 염산 (50 ㎕/웰)로 30분 후에 실온에서 켄칭(quenching)하였다. OD는 타이터테크 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다.
플레이트 결합된 PCSK9를 검출하기 위한 양성 대조군은 분석 희석제 내에 3 ㎍/ml로부터 이중으로 1:3 적정한 가용성 LDL 수용체 (R&D 시스템즈 (R&D Systems), Cat #2148LD/CF) 및 폴리클로날 토끼 항-PCSK9 항체 (케이멘 케미칼 (Caymen Chemical) #10007185)이었다. LDLR은 염소 항-LDLR (R&D 시스템즈, Cat #AF2148) 및 토끼 항-염소 IgGFc HRP를 400 ng/ml의 농도로 사용하여 검출하였고; 토끼 폴리클로날 항체는 염소 항-토끼 IgG Fc를 분석 희석제 중에 400 ng/ml의 농도로 사용하여 검출하였다. 음성 대조군은 분석 희석제 중에 1:100으로부터 이중으로 1:3 적정한 나이브 (naive) XMG2-KL 및 XMG4-KL 혈청이었다.
V5His 태그가 없는 b-PCSK9를 포함하는 샘플에 대해, 다음 프로토콜을 사용하였다: 코스타 3368 배지 결합 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 8 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (50 ㎕/웰)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 타이터테크 M384 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)로 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 250 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 M384 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 V5 태그가 있는 b-hu PCSK9이고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중에 2 ㎍/ml (40 ㎕/웰)로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 혈청을 1:100으로부터 이중으로 1:3 적정하였고, H열은 혈청에 대해 블랭크였다. 적정은 분석 희석제 내에서 50 ㎕/웰의 부피로 수행하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 M384 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 400 ng/ml의 염소 항-인간 IgG Fc HRP를 50 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 다시 1회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 종이 타월로 두드려서 건조시켰다. 마지막으로, 1단계 TMB (네오겐) (50 ㎕/웰)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1N 염산 (50 ㎕/웰)으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD를 타이터테크 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다.
양성 대조군은 분석 희석제 내에 3 ㎍/ml로부터 이중으로 1:3 적정한 LDLR 및 토끼 항-PCSK9이었다. LDLR은 염소 항-LDLR (R&D 시스템즈, Cat #AF2148) 및 토끼 항-염소 IgG Fc HRP를 400 ng/ml의 농도로 사용하여 검출하고; 토끼 폴리클로날 항체는 염소 항-토끼 IgG Fc를 분석 희석제 중의 400 ng/ml의 농도로 사용하여 검출하였다. 인간 항-His 1.2,3 및 항-V5 1.7.1을 분석 희석제 내에 1 ㎍/ml로부터 이중으로 1:3 적정하고; 둘 모두 염소 항-인간 IgG Fc HRP를 분석 희석제 중에 400 ng/ml의 농도로 사용하여 검출하였다. 음성 대조군은 분석 희석제 내에 1:100으로부터 이중으로 1:3 적정한 나이브 XMG2-KL 및 XMG4-KL 혈청이었다.
인간 PCSK9에 대한 항체의 역가는 기재된 바와 같은 가용성 항원으로 면역화시킨 마우스에 대한 ELISA 분석에 의해 시험하였다. 표 4에 ELISA 데이타를 요약하였고, 이는 PCSK9에 특이적인 것으로 나타난 몇몇 마우스가 존재함을 나타낸다. 예를 들어, 표 4를 참조한다. 따라서, 면역화 프로그램의 끝에, 수확을 위해 10마리의 마우스 (표 4에서 굵은 글씨체)를 선택하고, 비장세포 및 림프구를 본원에서 설명되는 바와 같이 각각 비장 및 림프절로부터 단리하였다.
Figure pat00004
실시예 2
림프구의 회수, B-세포 단리, 융합 및 하이브리도마의 생성
본 실시예에서는 면역 세포를 수확하고 하이브리도마를 생성하는 방법을 개략한다. 선택된 면역화된 마우스를 경추 탈골에 의해 희생시키고, 배액 (draining) 림프절을 수확하고 각각의 코호트 (cohort)로부터 모았다. DMEM 내에서 연마하여 조직으로부터 세포를 방출시킴으로써 B 세포를 림프 조직으로부터 분리시키고, 세포를 DMEM 내에 현탁시켰다. 세포를 계수하고, 1억개의 림프구당 0.9 ml DMEM을 세포 펠렛에 첨가하여 세포를 부드럽지만 완전히 재현탁시켰다.
림프구를 ATCC로부터 구입한 비분비형 골수종 P3X63Ag8.653 세포 (cat.# CRL 1580) (Kearney et al., (1979) J. Immunol. 123, 1548-1550)와 1:4의 비로 혼합하였다. 세포 혼합물을 400 x g에서 4 분 원심분리에 의해 부드럽게 펠렛화하였다. 상등액을 따라낸 후, 1 ml 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 혼합하였다. 예열시킨 PEG/DMSO 용액 (시그마, cat# P7306) (1백만 개의 B-세포당 1 ml)을 1 분에 걸쳐 부드럽게 교반하면서 서서히 첨가한 후, 1 분 혼합하였다. 이어서, 예열시킨 IDMEM (1백만 개의 B 세포당 2 ml) (글루타민이 없는 DMEM, L-글루타민, pen/strep, MEM 비-필수 아미노산 (모두 인비트로겐으로부터)을 부드럽게 교반하면서 2분에 걸쳐 첨가하였다. 마지막으로 예열시킨 IDMEM (106개의 B-세포당 8 ml)을 3분에 걸쳐 첨가하였다.
융합된 세포를 400 x g에서 6 분 원심분리하고, 1백만 개의 B-세포당 20 ml 선택 배지 (DMEM (인비트로겐), L-글루타민을 보충한 15% FBS (하이클론 (Hyclone)), pen/strep, MEM 비-필수 아미노산, 피루브산나트륨, 2-머캅토에탄올 (모두 인비트로겐으로부터), HA-아자세린 하이포잔틴 및 OPI (옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 인슐린) (둘 모두 시그마) 및 IL-6 (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim))) 내에 재현탁시켰다. 세포를 20-30 분 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 200 ml의 선택 배지 내에 재현탁시키고, 3-4일 동안 T175 플라스크 내에서 배양한 후 96웰 플레이팅하였다. 따라서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질을 생산하는 하이브리도마가 생산되었다.
실시예 3
PCSK9 항체의 선택
본 실시예에서는 다양한 PCSK9 항원 결합 단백질을 특성결정하고 선택하는 방법을 개략한다. PCSK9에 대한 분비형 항체 (실시예 1 및 2에서 생산된 하이브리도마로부터 생산됨)의 결합을 평가하였다. 항체의 선택은 LDLR에 대한 PCSK9 결합의 결합 데이타 및 억제, 및 친화도에 기반하였다. 가용성 PCSK9에 대한 결합은 아래 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 비아코어® (표면 플라스몬 공명)을 사용하여 결합 친화도를 정량하였다.
일차 스크린
야생형 PCSK9에 결합하는 항체에 대한 1차 스크린을 수행하였다. 1차 스크린을 2개의 수확물에 대해 수행하였다. 1차 스크린은 ELISA 분석을 포함하고, 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 4 ㎍/ml 농도의 뉴트라바딘 (40 ㎕/웰의 부피)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 타이터테크 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 다시, 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 V5 태그가 없는 비오티닐화된-PCSK9이었고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중에 0.9 ㎍/ml (40 ㎕/웰의 부피)로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 타이터테크 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 10 ㎕의 상등액을 40 ㎕의 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 내로 옮기고, 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다시, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 타이터테크 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 농도의 40 ㎕/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 다시 1회 세척하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산을 사용하는 켄칭을 30분 후에 실온에서 수행하였다. OD를 타이터테크 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다.
1차 스크린으로 총 3104개의 항원 특이적 하이브리도마를 2개의 수확물로부터 확인하였다. 가장 높은 ELISA OD에 기초하여, 수확물당 1500개의 하이브리도마를 총 3000개의 양성물에 대해 진행시켰다.
확인 스크리닝
이어서, 안정한 하이브리도마가 확립된 것을 확인하기 위해 3000개의 양성물을 야생형 PCSK9에 대한 결합에 대해 재스크리닝하였다. 스크리닝은 다음과 같이 수행하였다: 코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 3 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (40 ㎕/웰의 부피)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 타이터테크 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 M384 플레이트 세척기로 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 V5 태그가 없는 b-PCSK9이고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 0.9 ㎍/ml로 40 ㎕/웰의 부피로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 이용하여 세척하였다. 10 ㎕의 상등액을 40 ㎕의 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 내로 옮기고, 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다시, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 타이터테크 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 농도의 40 ㎕/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 다시 1회 세척하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD는 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다. 총 2441개의 양성을 제2 스크린에서 반복하였다. 이어서, 이들 항체를 후속적인 스크리닝에서 사용하였다.
마우스 교차-반응성 스크리닝
이어서, 하이브리도마의 패널을 항체가 인간 및 마우스 PCSK9 모두에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해 마우스 PCSK9에 대한 교차-반응성에 대해 스크리닝하였다. 다음 프로토콜을 교차-반응성 스크리닝에서 사용하였다: 코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 3 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (40 ㎕/웰의 부피)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 비오티닐화된-마우스 PCSK9이고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 1 ㎍/ml로 40 ㎕/웰의 부피로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 50 ㎕의 상등액을 플레이트로 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다시, 플레이트를 3-사이클 세척을 이용하여 세척하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 농도의 40 ㎕/웰의 염소 항-인간 IgG Fc POD를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 다시 1회 세척하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD를 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다. 579개의 항체가 마우스 PCSK9와 교차-반응하는 것으로 관찰되었다. 이어서, 이들 항체를 후속적인 스크리닝에서 사용하였다.
D374Y 돌연변이체 결합 스크리닝
PCSK9에서 D374Y 돌연변이는 인간 집단에서 보고되었다 (예를 들어, [Timms KM et al., "A muntation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree", Hum. Genet. 114: 349-353, 2004]). 이어서, 항체가 야생형에 특이적인지 또는 PCSK9의 D374Y 형태에 결합되는지 결정하기 위해서, 샘플을 돌연변이 D374Y를 포함하는 돌연변이체 PCSK9 서열에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝을 위한 프로토콜은 다음과 같았다: 코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 스크리닝에서 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 4 ㎍/ml의 뉴트라바딘 (40 ㎕/웰의 부피)으로 코팅하였다. 플레이트를 40℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 1 ㎍/ml 농도의 비오티닐화된 인간 PCSK9 D374Y로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 마지막의 고갈 (exhaust) 하이브리도마 배양 상등액을 PBS/우유/Ca2+ 내에 1:5 (10 ml + 40 ml)로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 1 ㎍/ml의 40 ㎕/웰의 토끼 항-인간 PCSK9 (케이만 케미칼 (Cayman Chemical)) 및 인간 항-His 1.2.3 1:2를 플레이트 상으로 적정한 후, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 농도의 40 ㎕/웰의 염소 항-인간 IgG Fc HRP를 플레이트에 첨가하고, 플레이트 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 100 ng/ml (1:4000)의 농도의 40 ㎕/웰의 염소 항-토끼 IgG Fc HRP를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD를 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다. 야생형 PCSK9에 대한 양성 적중의 96% 초과 항체가 돌연변이체 PCSK9에도 결합하였다.
대규모 수용체 리간드 차단 스크리닝
LDLR에 대한 PCSK9 결합을 차단하는 항체를 스크리닝하기 위해, D374Y PCSK9 돌연변이체를 사용하는 분석을 개발하였다. 상기 분석을 위해 돌연변이체를 사용하였고, 이는 LDLR에 대해 보다 높은 결합 친화도를 가져서 보다 예민한 수용체 리간드 차단 분석이 개발할 수 있기 때문이다. 다음 프로토콜을 수용체 리간드 차단 스크리닝에서 사용하였다: 코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 스크리닝에서 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 2 ㎍/ml의 염소 항-LDLR (R&D, Cat #AF2148) (40 ㎕/웰의 부피)로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 포획 샘플은 LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF)이었고, 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 0.4 ㎍/ml로 40 ㎕/웰의 부피로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 10분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 동시에, 20 ng/ml의 비오티닐화된 인간 D374Y PCSK9를 Nunc 폴리프로필렌 플레이트 내에서 15 마이크로리터의 하이브리도마 고갈 상등액과 함께 인큐베이팅하고, 고갈 상등액 농도를 1:5로 희석하였다. 이어서, 플레이트를 약 1시간 30분 동안 실온에서 예비-인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 50 ㎕/웰의 예비-인큐베이팅한 혼합물을 LDLR 코팅된 ELISA 플레이트 상으로 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. LDLR-결합된 b-PCSK9를 검출하기 위해, 분석 희석제 중의 500 ng/ml의 40 ㎕/웰의 스트렙타비딘 HRP를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 다시 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD를 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다. 스크리닝은 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 잘 차단한 384개의 항체를 확인하였고, 100개의 항체는 상호작용을 강하게 차단하였다 (OD<0.3). 이들 항체는 PCSK9 및 LDLR의 결합 상호작용을 90% 초과로 억제하였다 (90% 초과 억제).
차단제 하위세트에 대한 수용체 리간드 결합 분석
이어서, 제1의 대규모 수용체 리간드 억제 분석에서 확인된 중화제의 384개 멤버 하위세트에 대해 돌연변이체 효소를 사용하여 수용체 리간드 분석을 반복하였다. 대규모 수용체 리간드 차단 스크리닝에서 수행된 바와 같은 동일한 프로토콜을 384개 멤버 차단제 하위세트 분석 스크리닝에서 사용하였다. 이러한 반복 스크리닝을 통해 초기 스크리닝 데이타를 확인하였다.
상기 384개 멤버 하위세트의 스크리닝을 통해, PCSK9 돌연변이체 효소와 LDLR 사이의 상호작용을 90% 초과로 차단한 85개의 항체를 확인하였다.
D374Y 돌연변이체가 아니라 야생형 PCSK9에 결합하는 차단제에 대한 수용체 리간드 결합 분석
3000개의 sup의 초기 패널에서, 야생형 PCSK9에 특이적으로 결합하고 huPCSK9(D374Y) 돌연변이체에 결합하지 않는 것으로 나타난 86개의 항체가 존재하였다. 상기 86개의 sup를 LDLR 수용체에 대한 야생형 PCSK9의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 다음 프로토콜을 사용하였다: 코스타 3702 배지 결합 384웰 플레이트 (코닝 라이프 사이언시스)를 스크리닝에서 사용하였다. 플레이트를 1XPBS/0.05% 아지드 중의 10 ㎍/ml의 항-His 1.2.3 (40 ㎕/웰의 부피)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 타이터테크 플레이트 세척기 (Titertek, 미국 앨라배마주 헌츠빌)를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 플레이트를 90 ㎕의 1XPBS/1% 우유로 차단하고, 약 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. LDLR (R&D 시스템즈, #2148LD/CF 또는 R&D 시스템즈, #2148LD)을 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 5 ㎍/ml로 40 ㎕/웰의 부피로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 다음으로, 플레이트를 3-사이클 세척을 사용하여 작동되는 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 동시에, 비오티닐화된 인간 야생형 PCSK9를 Nunc 폴리프로필렌 플레이트 내에서 하이브리도마 고갈 상등액과 함께 예비-인큐베이팅하였다. 22 ㎕의 하이브리도마 sup를 1XPBS/1% 우유/10 mM Ca2+ 중의 583 ng/ml 농도의 33 ㎕의 b-PCSK9에 옮겨, 최종 b-PCSK9 농도 = 350 ng/ml 및 고갈 상등액을 1:2.5의 최종 희석에서 제공하였다. 플레이트를 약 1시간 30분 동안 실온에서 예비-인큐베이팅하였다. 50 ㎕/웰의 예비-인큐베이팅한 혼합물을 LDLR 포획된 ELISA 플레이트 상에 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 분석 희석제 중의 500 ng/ml의 40 ㎕/웰 스트렙타비딘 HRP를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 Titertek 플레이트 세척기를 사용하여 세척하였다. 3-사이클 세척을 수행하였다. 마지막으로, 40 ㎕/웰의 1단계 TMB (네오겐)를 플레이트에 첨가하고, 40 ㎕/웰의 1N 염산으로 30분 후에 실온에서 켄칭하였다. OD를 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 즉시 판독하였다.
스크리닝 결과
설명된 분석 결과에 기초하여, 몇 개의 하이브리도마 주가 PCSK9와 목적하는 상호작용을 보이는 항체를 생산하는 것으로 확인되었다. 제한 희석을 사용하여 각각의 주로부터 관리가능한 수의 클론을 단리하였다. 클론을 하이브리도마 주 번호 (예를 들어, 21B12) 및 클론 번호 (예를 들어, 21B12.1)로 지정하였다. 일반적으로, 본원에서 설명되는 기능성 분석에 의해 특정 주의 상이한 클론들 사이에서 어떠한 차이도 검출되지 않았다. 일부 경우에, 기능성 분석에서 상이하게 거동하는 클론을 특정 주로부터 확인하였고, 예를 들어, 25A7.1은 PCSK9/LDLR을 차단하지 않는 것으로 밝혀졌지만, 25A7.3 (본원에서 25A7로서 칭함)은 중화성이었다. 단리된 클론을 각각 50-100 ml의 하이브리도마 배지 내에서 팽창시키고, 고갈 상태 (즉, 약 10% 미만의 세포 생존률)로 성장시켰다. 이들 배양액의 상등액 내의 PCSK9에 대한 항체의 농도 및 효력을 본원에 설명되는 바와 같이 ELISA 및 시험관 내 기능성 시험에 의해 결정하였다. 본원에 설명된 스크리닝의 결과로서, PCSK9에 대한 가장 높은 역가의 항체를 갖는 하이브리도마가 확인되었다. 선택된 하이브리도마를 도 2a-3d와 표 2에 제시한다.
실시예 4.1
하이브리도마로부터 인간 31H4 IgG4 항체의 생산
본 실시예에서는 일반적으로 항원 결합 단백질 중 하나를 하이브리도마 주로부터 생산하는 방법을 설명한다. 생산 작업에서는 단백질 A 정제 후에 50 ml의 고갈 상등액 생성을 이용하였다. 인테그라 생산 규모를 확대할 것이고, 나중에 수행하였다. 하이브리도마 주 31H4를 T75 플라스크 내에서 20 ml의 배지 (인테그라 배지, 표 5) 내에서 성장시켰다. 하이브리도마가 T75 플라스크 내에서 거의 융합성이 되었을 때, 이를 인테그라 플라스크 (인테그라 바이오사이언시스 (Integra Biosciences), 인테그라 CL1000, cat# 90 005)에 옮겼다.
인테그라 플라스크는 막에 의해 2개의 챔버, 즉, 작은 챔버와 큰 챔버로 나누어진 세포 배양 플라스크이다. 31H4 하이브리도마 주로부터 1x106 세포/ml의 최소 세포 밀도의 20-30 ml의 하이브리도마 세포 부피를 인테그라 플라스크의 작은 챔버 내의 인테그라 배지에 넣었다 (인테그라 배지의 성분에 대해서는 표 5 참조). 인테그라 배지 단독 (1L)을 인테그라 플라스크의 큰 챔버에 넣었다. 2개의 챔버를 분리시키는 막은 소분자량 영양물질에 투과성이지만, 하이브리도마 세포 및 이들 세포에 의해 생산된 항체에 대해 불투과성이다. 따라서, 하이브리도마 세포 및 이들 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 작은 챔버 내에 보유되었다.
1주 후에, 배지를 인테그라 플라스크의 두 챔버로부터 제거하고, 새 인테그라 배지로 교체하였다. 작은 챔버로부터 모은 배지를 따로 보유시켰다. 2주의 성장 후에, 작은 챔버로부터의 배지를 다시 수거하였다. 하이브리도마 주로부터 제1주에 수거한 배지를 하이브리도마 주로부터 제2주에 수거한 배지와 합하였다. 하이브리도마 주로부터 생성되는 수거된 배지 샘플을 원심분리하여 세포 및 파쇄물을 제거하고 (3000 rpm에서 15분), 생성되는 상등액을 여과하였다 (0.22 ㎛). 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 Q 세파로스 수지와 같은 음이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 31H4 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 7.8-8.0의 Q-세파로스 HP이다. 항체를 25 컬럼 부피의 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 용출하였다.
Figure pat00005
실시예 4.2
형질감염된 세포로부터 재조합 31H4 인간 IgG2 항체의 생산
본 실시예에서는 31H4 IgG2 항체를 형질감염된 세포로부터 생산하는 방법을 개략한다. 일시적 발현을 위해 293 세포 및 안정한 발현을 위해 CHO 세포를 31H4 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터의 조건화 배지를 세포 및 세포 파쇄물을 제거함으로써 회수하였다. 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 Q 세파로스 수지와 같은 음이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 31H4 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 7.8-8.0의 Q-세파로스 HP이다. 항체를 25 컬럼 부피의 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 용출하였다.
실시예 5.
하이브리도마로부터 인간 21B12 IgG4 항체의 생산
본 실시예에서는 21B12 IgG4 항체를 하이브리도마로부터 생산하는 방법을 개략한다. 하이브리도마 주 21B12를 T75 플라스크 내에서 배지 (인테그라 배지, 표 5) 내에서 성장시켰다. 하이브리도마가 T75 플라스크 내에서 거의 융합성이 되었을 때, 이들을 인테그라 플라스크 (인테그라 바이오사이언시스, 인테그라 CL1000, cat# 90 005)에 옮겼다.
인테그라 플라스크는 막에 의해 2개의 챔버, 즉, 작은 챔버와 큰 챔버로 나누어진 세포 배양 플라스크이다. 21B12 하이브리도마 주로부터 1x106 세포/ml의 최소 세포 밀도의 20-30 ml의 하이브리도마 세포 부피를 인테그라 플라스크의 작은 챔버 내의 인테그라 배지에 넣었다 (인테그라 배지의 성분에 대해서는 표 5 참조). 인테그라 배지 단독 (1L)을 인테그라 플라스크의 큰 챔버에 넣었다. 2개의 챔버를 분리시키는 막은 소분자량 영양물질에 투과성이지만, 하이브리도마 세포 및 이들 세포에 의해 생산된 항체에 대해 불투과성이다. 따라서, 하이브리도마 세포 및 이들 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 작은 챔버 내에 보유되었다. 1주 후에, 배지를 인테그라 플라스크의 두 챔버로부터 제거하고, 새 인테그라 배지로 교체하였다. 작은 챔버로부터 모은 배지를 따로 보유시켰다. 2주의 성장 후에, 작은 챔버로부터의 배지를 다시 수거하였다. 하이브리도마 주로부터 제1주에 수거한 배지를 하이브리도마 주로부터 제2주에 수거한 배지와 합하였다. 하이브리도마 주로부터 생성되는 수거된 배지 샘플을 원심분리하여 세포 및 파쇄물을 제거하고 (3000 rpm에서 15분), 생성되는 상등액을 여과하였다 (0.22 ㎛). 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 Q 세파로스 수지와 같은 음이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 21B12 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 7.8-8.0의 Q-세파로스 HP이다. 항체를 25 컬럼 부피의 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 용출하였다.
실시예 6
형질감염된 세포로부터 인간 21B12 IgG2 항체의 생산
본 실시예에서는 21B12 IgG2 항체를 형질감염된 세포로부터 생산하는 방법을 개략한다. 세포 (일시적 발현을 위해 293 세포 및 안정한 발현을 위해 CHO 세포)를 21B12 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 하이브리도마 세포로부터의 조건화 배지를 세포 및 세포 파쇄물을 제거함으로써 회수하였다. 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 SP-세파로스 수지와 같은 양이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 21B12 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 5.2의 SP-세파로스 HP이었다. 항체를 20 mM 아세트산나트륨 버퍼 중에 10 mM-500 mM의 NaCl 구배를 함유하는 버퍼 25 컬럼 부피로 용출하였다.
실시예 7.
하이브리도마로부터 인간 16F12 IgG4 항체의 생산
본 실시예에서는 항체 16F12 IgG4를 하이브리도마로부터 생산하는 방법을 개략한다. 하이브리도마 주 16F12를 T75 플라스크 내에서 배지 (표 5 참조) 내에서 성장시켰다. 하이브리도마가 T75 플라스크 내에서 거의 융합성이 되었을 때, 이들을 인테그라 플라스크 (인테그라 바이오사이언시스, 인테그라 CL1000, cat# 90 005)에 옮겼다.
인테그라 플라스크는 막에 의해 2개의 챔버, 즉, 작은 챔버와 큰 챔버로 나누어진 세포 배양 플라스크이다. 16F12 하이브리도마 주로부터 1x106 세포/ml의 최소 세포 밀도의 20-30 ml의 하이브리도마 세포 부피를 인테그라 플라스크의 작은 챔버 내의 인테그라 배지에 넣었다 (인테그라 배지의 성분에 대해서는 표 5 참조). 인테그라 배지 단독 (1L)을 인테그라 플라스크의 큰 챔버에 넣었다. 2개의 챔버를 분리시키는 막은 소분자량 영양물질에 투과성이지만, 하이브리도마 세포 및 이들 세포에 의해 생산된 항체에 대해 불투과성이다. 따라서, 하이브리도마 세포 및 이들 하이브리도마 세포에 의해 생산된 항체는 작은 챔버 내에 보유되었다.
1주 후에, 배지를 인테그라 플라스크의 두 챔버로부터 제거하고, 새 인테그라 배지로 교체하였다. 작은 챔버로부터 모은 배지를 따로 보유시켰다. 2주의 성장 후에, 작은 챔버로부터의 배지를 다시 수거하였다. 하이브리도마 주로부터 제1주에 수거한 배지를 하이브리도마 주로부터 제2주에 수거한 배지와 합하였다. 하이브리도마 주로부터 생성되는 수거된 배지 샘플을 원심분리하여 세포 및 파쇄물을 제거하고 (3000 rpm에서 15분), 생성되는 상등액을 여과하였다 (0.22 ㎛). 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 Q 세파로스 수지와 같은 음이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 16F12 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 7.8-8.0의 Q 세파로스 HP이다. 항체를 25 컬럼 부피의 10 mM-500 mM의 NaCl 구배로 용출하였다.
실시예 8
형질감염된 세포로부터 인간 16F12 IgG2 항체의 생산
본 실시예에서는 16F12 IgG2 항체를 형질감염된 세포로부터 생산하는 방법을 개략한다. 세포 (일시적 발현을 위해 293 세포 및 안정한 발현을 위해 CHO 세포)를 16F12 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 하이브리도마 세포로부터의 조건화 배지를 세포 및 세포 파쇄물을 제거함으로써 회수하였다. 투명해진 조건화 배지를 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩하였다. 임의로, 배지를 먼저 농축한 후 단백질 A 세파로스 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 비특이적 결합은 광범한 PBS 세척에 의해 제거하였다. 단백질 A 컬럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 컬럼으로부터 표준 산성 항체 용출 (예를 들어 50 mM 시트레이트, pH 3.0)에 의해 회수하였다. 단백질 A 세파로스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피, 또는 SP 세파로스 수지와 같은 양이온 교환 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 16F12 단백질에 대한 특이적인 IEX 조건은 pH 5.2의 SP 세파로스 HP이다. 항체를 20 mM 아세트산나트륨 버퍼 중에 10 mM-500 mM의 NaCl 구배를 함유하는 버퍼 25 컬럼 부피로 용출하였다.
실시예 9
항체 중쇄 및 경쇄의 서열 분석
이어서, 상기 항체의 경쇄 및 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열을 Sanger (디데옥시) 뉴클레오티드 서열결정에 의해 결정하였다. 이어서, 아미노산 서열을 핵산 서열에 대해 추정하였다. 가변 도메인의 핵산 서열을 도 3e-3jj에 제시한다.
31H4, 21B12 및 16F12의 람다 경쇄 가변 구역에 대한 cDNA 서열을 결정하였고, 각각 서열 153, 95 및 105로 제시한다.
31H4, 21B12 및 16F12의 중쇄 가변 구역에 대한 cDNA 서열을 결정하였고, 각각 서열 152, 94 및 104로 제시한다.
람다 경쇄 불변 구역 (서열 156), 및 IgG2 및 IgG4 중쇄 불변 구역 (서열 154 및 155)을 도 3kk에 제시한다.
각각의 cDNA 서열로부터 예측된 폴리펩티드 서열을 결정하였다. 31H4, 21B12 및 16F12의 람다 경쇄 가변 구역에 대한 예측된 폴리펩티드 서열을 예측하고, 각각 서열 12, 23, 및 35로 제시하고, 31H4, 21B12 및 16F12의 람다 경쇄 불변 구역 (서열 156), 중쇄 가변 구역을 예측하고, 각각 서열 67, 49 및 79로 제시한다. IgG2 및 IgG4 중쇄 불변 구역 (서열 154 및 155).
FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 분할을 도 2a-3d에 제시한다.
서열 데이타에 기초하여, 그로부터 각각의 중쇄 또는 경쇄 가변 구역이 유도되는 생식계열 유전자를 결정하였다. 생식계열 유전자의 동일성은 도 2a-3d 내의 대응하는 하이브리도마 주 다음에 표시하고, 각각 특유한 서열에 의해 표시된다. 또한, 도 2a-3d에서는 특성 결정된 추가의 항체에 대한 결정된 아미노산 서열을 제시한다.
실시예 8
3개의 항체의 등전점의 결정
아미노산 서열에 기초한 항체의 이론적 pI는 16F12에 대해 7.36; 21B12에 대해 8.47; 31H4에 대해 6.84인 것으로 결정되었다.
실시예 9
PCSK9에 대한 항체의 결합의 특성결정
PCSK9에 결합하는 많은 항체를 확인한 후에, 결합을 정량하고 결합 특성을 추가로 결정하기 위해 여러 방법을 사용하였다. 연구의 한 측면에서, 비아코어 친화도 분석을 수행하였다. 연구의 다른 측면에서, KinExA® 친화도 분석을 수행하였다. 이들 연구에 사용된 샘플 및 버퍼를 하기 표 6에 제시한다.
Figure pat00006
비아코어® 친화도 측정
본 실시예에서 설명되는 PCSK9에 대한 21B12 항체의 비아코어® (표면 플라스몬 공명 장치, 비아코어, 인크. (Biacore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이)) 친화도 분석을 제조자의 지시에 따라 수행하였다.
간단히 설명하면, 표면 플라스몬 공명 실험은 비아코어 2000 광학 바이오센서 (비아코어, 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하여 수행하였다. 각각의 개별 항-PCSK9 항체를 200 이하의 공명 단위 (RU)의 최대 분석물 결합 반응 (Rmax)을 제시하는 수준으로 아민-커플링에 의해 연구 등급 CM5 바이오센서 칩에 고정하였다. PCSK9 단백질의 농도는 2배 간격으로 상이하였고 (분석물), 고정된 항체 표면 위로 (100 ㎕/min의 유속으로 1.5분 동안) 주입하였다. 0.01% BSA를 보충한 새로운 HBS-P 버퍼 (pH 7.4, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20, 비아코어)를 결합 버퍼로서 사용하였다. 각각의 항-PCSK9 항체의 결합 친화도는 pH 7.4에서 각각의 인간, 마우스, 및 사이노몰거스 원숭이 PCSK9 단백질에 대해 별개의 실험으로 측정하였다 (사용된 농도는 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 및 0 nM이었다).
또한, 인간 PCSK9에 대한 항체의 결합 친화도는 0.01% BSA를 보충한 pH 6.0의 HBS-P 버퍼 (pH 6.0, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20, 비아코어)로 pH 6.0에서 측정하였다. 수득한 결합 신호는 용액 내의 유리 PCSK9에 비례하였다. 해리 평형 상수 (KD)는 이중-곡선 단일 부위 균질 결합 모델 (KinExA® 소프트웨어, 사피다인 인스트루먼츠 인크. (Sapidyne Instruments Inc., 미국 아이다호주 보이스)) (6.0 pH 실시에 대해 n=1)을 사용하여 경쟁 곡선의 비선형 회귀 분석으로부터 얻었다. 흥미롭게도, 항체는 보다 낮은 pH에서 더 강한 결합 친화도를 보이는 것으로 나타났다 (Kd는 31H4, 21B12 및 16F12에 대해 각각 12.5, 7.3, 및 29 pM이었다).
ka (회합 속도 상수), kd (해리 속도 상수), 및 KD (해리 평형 상수)를 포함한 항체 결합 운동학 파라미터는 BIA 평가 3.1 컴퓨터 프로그램 (비아코어, 인크.)을 사용하여 결정하였다. 보다 낮은 해리 평형 상수는 PCSK9에 대한 항체의 친화도가 더 큼을 나타낸다. 비아코어® 친화도 분석에 의해 결정된 KD 값을 하기 표 7.1에 제시한다.
<표 7.1>
Figure pat00007
표 7.2에서는 kon 및 koff 율을 제시한다.
<표 7.2>
Figure pat00008
KinExA® 친화도 측정
16F12 및 31H4의 KinExA® (사피딘 인스트루먼츠 인크.) 친화도 분석을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, Reacti-Gel™ (6x) (피어스 (Pierce))을 인간, V5-태깅된 (tagged) 사이노 PCSK9 단백질 또는 His-태깅된 마우스 PCSK9 단백질 중 하나로 예비코팅하고, BSA로 차단하였다. 이어서, 10 또는 100 pM의 항체 16F12 또는 항체 31H4 및 하나의 PCSK9 단백질을 다양한 농도 (0.1 pM - 25 nM)의 PCSK9 단백질과 함께 실온에서 8시간 동안 인큐베이팅한 후, PCSK9-코팅된 비드를 통해 통과시켰다. 비드-결합된 16F12 또는 31H4의 양은 형광 (Cy5) 표지된 염소 항-인간 IgG (H+L) 항체 (잭슨 이뮤노 리서치 (Jackson Immuno Research))에 의해 정량하였다. 결합 신호는 결합 평형에서 유리 16F12 또는 31H4의 농도에 비례한다. 평형 해리 상수 (KD)는 단일 부위 균질 결합 모델을 사용하여 2개의 세트의 경쟁 곡선의 비선형 회귀로부터 얻었다. KinExA® Pro 소프트웨어를 분석에서 사용하였다. 본 분석에서 생성된 결합 곡선을 도 4a-4f에 제시한다.
16F12 및 31H4 항체는 인간 및 사이노 PCSK9에 유사한 친화도를 보였지만, 마우스 PCSK9에 약 10-250배 더 낮은 친화도를 보였다. KinExA® 시스템을 이용하여 시험한 2개의 항체 중에서, 항체 31H4는 인간 및 사이노 PCSK9 모두에 대해 각각 3 및 2 pM KD로 보다 높은 친화도를 보였다. 16F12는 인간 PCSK9에 대해 15 pM KD 및 사이노 PCSK9에 대해 16 pM KD로 근소하게 더 약한 친화도를 보였다.
KinExA® 친화도 분석의 결과를 하기 표 8.1에 요약한다.
<표 8.1>
Figure pat00009
또한, 샘플의 품질 및 양을 검토하기 위해 SDS PAGE를 실행하였고, 도 5a에 제시한다. cPCSK9는 겔 상에서 또한 KinExA® 분석으로부터 계산된 활성 결합 농도로부터 약 50% 더 적은 것으로 나타났다. 따라서, cPCSK9에 대한 mAb의 KD를 본 발명의 활성 cPCSK9의 50%로서 조정하였다.
비아코어 용액 평형 결합 분석을 사용하여 ABP 21B12에 대한 Kd 값을 측정하였다. 21B12.1은 KinExA 분석을 사용할 때 신호를 거의 보이지 않았고, 따라서, 비아코어 용액 평형 분석을 적용하였다. 고정된 PCSK9 표면에 대한 항체의 결합에 대해 유의한 결합이 관찰되지 않았으므로, 약 7000 RU의 밀도로 아민 커플링을 사용하여 21B12 항체를 CM5 칩의 유동 셀 4에 고정시켰다. 유동 셀 3을 배경 대조군으로서 사용하였다. 0.3, 1, 및 3 nM의 인간 PCSK9 또는 사이노 PCSK9를 PBS + 0.1 mg/ml BSA, 0.005% P20 중의 21B12.1 항체 샘플의 계열 희석액 (0.001~25 nM 범위)과 혼합하였다. 혼합 용액 내의 유리 PCSK9의 결합은 21B12.1 항체 표면 위로 주입함으로써 측정하였다. 21B12.1 표면 상의 100% PCSK9 결합 신호를 용액 내에 mAb의 부재 하에 결정하였다. 증가하는 농도의 mAb에서 감소된 PCSK9 결합 반응은 PCSK9가 고정된 펩티바디 표면에 결합하는 것을 차단한 용액 내의 mAb에 대한 PCSK9 결합을 나타냈다. PCSK9 결합 신호 대 mAb 농도를 플로팅하여, KD를 KinExA Pro™ 소프트웨어에서 단일 부위 균질 결합 모델을 사용하여 3 세트의 곡선 (0.3, 1 및 3 nM의 고정된 PCSK9 농도)로부터 계산하였다. cPCSK9는 KinExA 분석 및 SDS-겔로부터 관찰된 보다 낮은 단백질 농도를 갖지만, cPCSK9의 농도는 KD의 계산에 사용되지 않으므로 여기서 그의 농도를 조정하지 않았다. 결과를 하기 표 8.2와 도 5b-5d에 제시한다. 도 5b에서는 hPCSK9에 대한 3개의 상이한 hPCSK9 농도에서 용액 평형 분석으로부터의 결과를 제시한다. 도 5c에서는 mPCSK9에 대한 유사한 세트의 결과를 제시한다. 도 5d에서는 상기 비아코어 포획 분석으로부터의 결과를 제시한다.
<표 8.2>
Figure pat00010
실시예 10
에피토프 비닝
항-PCSK9 항체 비닝을 위해 경쟁 ELISA를 사용하였다. 간단히 설명하면, 2개의 항체가 동일한 에피토프 빈 (bin)에 속하는지 결정하기 위해, 하나의 항체 (mAb1)를 먼저 ELISA 플레이트 (NUNC) 상에 2 ㎍/ml로 철야 인큐베이션에 의해 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 3% BSA로 세척하고 차단하였다. 한편, 30 ng/ml의 비오티닐화된 hPCSK9를 제2 항체 (mAb2)와 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 혼합물을 코팅된 mAb1에 적용하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, ELISA 플레이트를 세척하고, 뉴트라비딘-HRP (피어스)와 함께 1:5000 희석으로 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 추가로 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질과 함께 인큐베이팅하고, 신호를 Titertek 플레이트 판독기를 사용하여 650 nm에서 검출하였다. 동일한 결합 프로필을 갖는 항체들을 동일한 에피토프 빈으로 함께 모았다. 항체 비닝 연구의 결과를 표 8.3에 제시한다.
<표 8.3>
Figure pat00011
에피토프 비닝의 추가 검사는 비아코어를 사용하여 수행하였다. 3개의 mAb, 즉 16F12, 21B12 및 31H4를 유동 셀 2, 3 및 4 상에 약 8000 RU의 밀도로 고정시켰다. 인간, 마우스 및 사이노로부터의 5 nM PCSK9를 mAb 표면 위로 주입하여 약 100 내지 500 RU에 도달시켰다. 이어서, 10 nM mAb를 PCSK9 표면 위로 주입하였다. 이어서, 3개의 mAb 위의 3개의 상이한 PCSK9 단백질에 대한 3개의 mAb의 결합을 기록하였다.
2개의 mAb가 항원 상의 유사한 에피토프를 갖는다면, mAb1은 mAb2에 이미 결합된 항원에 대한 결합을 보이지 않을 것이다. 2개의 mAb가 항원 상의 상이한 에피토프를 갖는다면, mAb1은 mAb2에 결합된 항원에 대한 결합을 보일 것이다. 도 5e에서는 이들 에피토프 비닝 결과를 인간 PCSK9 상의 3개의 mAb에 대한 그래프 형태로 도시한다. mPCSK9 및 cPCSK9에 대해 유사한 패턴이 관찰되었다. 그래프에 제시된 바와 같이, 16F12 및 31H4는 유사한 에피토프를 공유하는 것으로 보이고, 21B12는 상이한 에피토프를 갖는 것으로 보인다.
실시예 11
D374Y PCSK9/LDLR 결합을 차단하기 위한 31H4 및 21B12의 효능
본 실시예에서는 LDLR에 결합하는 PCSK9 D374Y의 능력을 차단하는데 있어서 2개의 항체에 대한 IC50 값을 제공한다. 투명한 384웰 플레이트 (Costar)를 버퍼 A (100 mM 나트륨 카코딜레이트, pH 7.4) 내에 희석시킨 2 ㎍/ml의 염소 항-LDL 수용체 항체 (R&D 시스템즈)로 코팅하였다. 플레이트를 버퍼 A로 철저히 세척한 후, 2시간 동안 버퍼 B (버퍼 A 중의 1% 우유)로 차단하였다. 세척 후에, 플레이트를 1.5시간 동안 버퍼 C (10 mM CaCl2를 보충한 버퍼 B) 내에 희석시킨 0.4 ㎍/ml의 LDL 수용체 (R&D 시스템즈)와 함께 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이션과 동시에, 20 ng/ml의 비오티닐화된 D374Y PCSK9를 버퍼 A 내에 희석한 다양한 농도의 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 또는 21B12 IgG4 항체, 또는 버퍼 A 단독 (대조군)과 함께 인큐베이팅하였다. LDL 수용체 함유 플레이트를 세척하고, 비오티닐화된 D374Y PCSK9/항체 혼합물을 플레이트에 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. LDL 수용체에 대한 비오티닐화된 D374Y의 결합은 버퍼 C 중의 500 ng/ml의 스트렙타비딘-HRP (바이오소스 (Biosource)), 이어서 TMB 기질 (KPL)과 함께 인큐베이팅하여 검출하였다. 신호를 1N HCl로 켄칭하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.
상기 결합 연구의 결과를 도 6a-6d에 도시한다. 요약하여 설명하면, 각각의 항체에 대해 IC50 값을 결정하였고, 31H4 IgG2에 대해 199 pM (도 6a), 31H4 IgG4에 대해 156 pM (도 6b), 21B12 IgG2에 대해 170 pM (도 6c), 및 21B12 IgG4에 대해 169 pM (도 6d)인 것으로 밝혀졌다.
또한, 항체는 상기 분석에서 LDLR에 대한 야생형 PCSK9의 결합을 차단하였다.
실시예 12
세포 LDL 흡수 분석
본 실시예는 세포에 의한 LDL 흡수를 감소시키는 다양한 항원 결합 단백질의 능력을 입증한다. 인간 HepG2 세포를 흑색의 투명한 바닥의 96-웰 플레이트 (코스타) 내에 5x105 세포/웰의 농도로 10% FBS를 보충한 DMEM 배지 (미디아테크, 인크 (Mediatech, Inc)) 내에 접종하고, 37℃ (5% CO2)에서 밤새 인큐베이팅하였다. PCSK9 및 항체 복합체를 형성하기 위해, 2 ㎍/ml의 D374Y 인간 PCSK9를 흡수 버퍼 (1% FBS가 존재하는 DMEM) 내에 희석한 다양한 농도의 항체, 또는 흡수 버퍼 단독 (대조군)과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, D374Y PCSK9/항체 혼합물을 세포에, 이어서 6 ㎍/ml의 최종 농도로 흡수 버퍼 내에 희석한 LDL-BODIPY (인비트로겐)에 옮겼다. 3시간 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이팅한 후, 세포를 PBS로 철저히 세척하고, 세포 형광 신호를 480-520 nm (여기) 및 520-600 nm (방출)에서 Safire™ (TECAN)에 의해 검출하였다.
세포 흡수 분석의 결과를 도 7a-7d에 도시한다. 요약하여 설명하면, 각각의 항체에 대해 IC50 값을 결정하였고, 31H4 IgG2에 대해 16.7 nM (도 7a), 31H4 IgG4에 대해 13.3 nM (도 7b), 21B12 IgG2에 대해 13.3 nM (도 7c), 21B12 IgG4에 대해 18 nM (도 7d)인 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 적용된 항원 결합 단백질이 세포에 의한 LDL 흡수를 차단하는 PCSK9 (D374Y)의 효과를 감소시킬 수 있음을 입증한다. 항체는 또한 상기 분석에서 야생형 PCSK9의 효과를 차단하였다.
실시예 13
6일 연구에서 31H4 항체의 혈청 콜레스테롤 저하 효과
PCSK9 단백질에 대한 항체 요법을 통해 야생형 (WT) 마우스에서 총 혈청 콜레스테롤 (TC) 저하를 평가하기 위해, 다음 절차를 수행하였다.
잭슨 래보러토리 (Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버)로부터 입수한 수컷 WT 마우스 (C57BL/6 주, 9-10주령, 17-27 g)에게 실험 기간 내내 표준 먹이 (할랜드-테클라드 (Harland-Teklad), Diet 2918)를 먹였다. 마우스에게 T=0에서 마우스의 꼬리 정맥을 통해 항-PCSK9 항체 31H4 (PBS 중의 2 mg/ml) 또는 대조군 IgG (PBS 중의 2 mg/ml)를 10 mg/kg의 수준으로 투여하였다. 나이브 마우스를 또한 나이브 대조군으로서 따로 준비하였다. 투여군 및 희생 시간을 표 9에 제시한다.
Figure pat00012
마우스를 표 9에 제시된 소정의 시점에 CO2 질식에 의해 희생시켰다. 혈액을 대정맥을 통해 에펜도르프관 내로 모으고, 실온에서 30분 동안 응고시켰다. 이어서, 샘플을 10분 동안 12,000xg에서 탁상형 원심분리기로 원심분리시켜 혈청을 분리하였다. 혈청 총 콜레스테롤 및 HDL-C를 히다찌 (Hitachi) 912 임상 분석기 및 로슈 (Roche)/히다찌 TC 및 HDL-C 키트를 사용하여 측정하였다.
실험 결과를 도 8a-8d에 도시한다. 요약하여 설명하면, 항체 31H4를 투여한 마우스는 실험 과정에 걸쳐 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 보여주었다 (도 8a 및 도 8b). 또한, 마우스가 또한 감소된 HDL 수준을 보였음에 주목한다 (도 8c 및 도 8d). 도 8a 및 도 8c에 대해, 변화 백분율은 동일한 시점에서 대조군 IgG와 비교한 값이다 (*P<0.01, #P<0.05). 도 8b 및 도 8d에 대해, 변화 백분율은 t=0 hr에 나이브 동물에서 측정된 총 혈청 콜레스테롤 및 HDL 수준과 비교한 값이다 (*P<0.01, #P<0.05).
저하된 HDL 수준에 관하여, 당업자는 마우스에서 HDL의 감소가, HDL 감소가 인간에서 일어날 것임을 표시하는 것이 아니라 단지 유기체 내의 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었음을 추가로 반영함을 알 것이다. 대부분의 혈청 콜레스테롤을 LDL 입자 상에 운반하는 인간과는 상이하게, 마우스는 대부분의 혈청 콜레스테롤을 고밀도 지단백질 (HDL) 입자 내에 운송함에 주목한다. 마우스에서, 총 혈청 콜레스테롤의 측정은 혈청 HDL-C 수준과 가장 밀접하게 유사하다. 마우스 HDL은 LDL 수용체 (LDLR)에 대한 리간드인 아포지단백질 E (apoE)를 함유하고, LDLR에 의해 청소되도록 한다. 따라서, HDL 검사는 마우스에서 본 실시예에 대한 적절한 지표이다 (HDL의 감소가 인간에 대해서는 예상되지 않음을 알면서). 이와 대조적으로, 예를 들어, 인간 HDL은 apoE를 함유하지 않고 LDLR에 대한 리간드가 아니다. PCSK9 항체는 마우스에서 LDLR 발현을 증가시키므로, 간은 보다 많은 HDL을 청소하여 혈청 HDL-C 수준을 저하시킬 수 있다.
실시예 14
6일 연구에서 LDLR 수준에 대한 항체 31H4의 효과
본 실시예는 항원 결합 단백질이 예측된 바와 같이 시간 경과에 따라 대상에서 LDLR 수준을 변경함을 입증한다. LDLR 수준에 대한 항체 31H4의 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 실시예 13에 설명된 바와 같이 희생시킨 마우스로부터 얻은 50-100 mg의 간 조직을 완전 프로테아제 억제제 (로슈)를 함유하는 0.3 ml의 RIPA 버퍼 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 인크.) 내에 균질화시켰다. 균질물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 원심분리하여 세포 파쇄물을 펠렛화하였다. 상등액 내의 단백질 농도는 BioRad 단백질 분석 시약 (바이오라드 래보러토리스 (BioRad laboratories))을 사용하여 측정하였다. 100 ㎍의 단백질을 70℃에서 10분 동안 변성시키고, 4-12% Bis-Tris SDS 구배 겔 (인비트로겐) 상에서 분리시켰다. 단백질을 0.45 ㎛ PVDF 막 (인비트로겐)에 옮기고, 5% 무지방 우유를 함유하는 세척 버퍼 (50 mM Tris PH 7.5, 150 mM NaCl, 2mM CaCl2 및 0.05% Tween 20) 내에서 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 이어서, 블롯 (blot)을 염소 항-마우스 LDLR 항체 (R&D 시스템) 1:2000 또는 항-β 액틴 (시그마 (sigma)) 1:2000으로 1시간 동안 실온에서 프로빙하였다. 블롯을 잠깐 동안 세척하고, 소 항-염소 IgG-HRP (산타 크루즈 바이오테크놀로지 인크.) 1:2000 또는 염소 항-마우스 IgG-HRP (업스테이트 (Upstate)) 1:2000과 함께 인큐베이팅하였다. 실온에서 1시간의 인큐베이션 후에, 블롯을 철저히 세척하고, ECL 플러스 키트 (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham biosciences))를 사용하여 면역반응성 밴드를 검출하였다. 웨스턴 블롯에서는 도 9에 도시된 바와 같이 항체 31H4의 존재 하에 LDLR 단백질 수준의 증가를 보여주었다.
실시예 15
13일 연구에서 항체 31H4의 혈청 콜레스테롤 저하 효과
13일 연구에서 PCSK9 단백질에 대한 항체 요법을 통한 야생형 (WT) 마우스에서 총 혈청 콜레스테롤 (TC) 저하를 평가하기 위해, 다음 절차를 수행하였다.
잭슨 래보러토리로부터 입수한 수컷 WT 마우스 (C57BL/6 주, 9-10주령, 17-27 g)에게 수컷 WT 마우스 (C57BL/6 주, 9-10주령, 17-27 g)에게 실험 기간 내내 표준 먹이 (할랜드-테클라드, Diet 2918)를 먹였다. 마우스에게 T=0에서 마우스의 꼬리 정맥을 통해 항-PCSK9 항체 31H4 (PBS 중의 2 mg/ml) 또는 대조군 IgG (PBS 중의 2 mg/ml)를 10 mg/kg의 수준으로 투여하였다. 나이브 마우스를 또한 나이브 대조군으로서 따로 준비하였다.
투여군 및 희생 시간을 표 10에 제시한다. 동물을 희생시키고, 실시예 13에서와 같이 간을 추출하고 준비하였다.
Figure pat00013
6일 실험을 13일 연구로 연장할 때, 6일 연구에서 관찰된 동일한 혈청 콜레스테롤 저하 효과가 13일 연구에서도 관찰되었다. 보다 구체적으로, 10 mg/kg를 투여한 동물은 제3일에 혈청 콜레스테롤의 31% 감소를 나타냈고, 이는 13일까지 투여 전 수준으로 점차 되돌아갔다. 도 10a에서는 본 실험의 결과를 도시한다. 도 10c에서는 10 mg/kg 용량의 31H4, 및 또한 10 mg/kg에서 또다른 항체인 16F12를 사용하여 상기 절차를 반복한 결과를 도시한다. 투여군 및 희생 시간을 표 11에 제시한다.
Figure pat00014
도 10c에 도시된 바와 같이, 16F12 및 31H4는 모두 단지 단일 용량 후에 총 혈청 콜레스테롤의 유의하고 실질적인 감소를 나타냈고, 1주를 초과하여 (10일 이상) 잇점을 제공하였다. 반복된 13일 연구의 결과는 처음 13일 연구의 결과와 일치하게, 제3일에 26%의 혈청 콜레스테롤 수준의 감소가 관찰되었다. 도 10a 및 도 10b에 대해, 변화 백분율은 동일한 시점에서 대조군 IgG와 비교한 값이다 (*P<0.01). 도 10c에 대해, 변화 백분율은 동일한 시점에서 대조군 IgG와 비교한 값이다 (*P<0.05).
실시예 16
13일 연구에서 HDL 수준에 대한 항체 31H4의 효과
실시예 15의 동물에 대한 HDL 수준을 또한 검사하였다. HDL 수준은 마우스에서 감소하였다. 보다 구체적으로, 10 mg/kg를 투여한 동물은 제3일에 HDL 수준의 33% 감소를 나타냈고, 이는 13일까지 투여 전 수준으로 점차 되돌아갔다. 도 10b에 실험 결과를 도시한다. 제3일에 34%의 HDL 수준이 감소하였다. 도 10b에는 반복된 13일 실험의 결과를 도시한다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 항체는 마우스 HDL을 저하시킬 것이지만, 인간 및 다른 유기체 (예를 들어 마우스)에서 HDL의 차이로 인해 인간에서 일어날 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 마우스 HDL의 감소는 인간 HDL의 감소를 표시하지 않는다.
실시예 17
항체의 반복 투여는 항원 결합 펩티드의 잇점을 지속시킨다.
상기 실시예에서 얻어진 결과가 추가의 용량을 사용하여 추가의 잇점을 위해 연장될 수 있는지 입증하기 위해, 도 11a에 제시된 투약 스케줄을 사용하여 실시예 15 및 16의 실험을 반복하였다. 결과를 도 11b에 표시한다. 도 11b의 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 마우스가 31H4 항원 결합 단백질의 초기 주사를 받았으므로 두 세트의 마우스는 모두 총 혈청 콜레스테롤의 유의한 감소를 보였지만, 추가의 주사의 31H4 ABP를 받은 마우스는 총 혈청 콜레스테롤의 연장된 감소를 보인 한편, 대조군 주사만을 받은 마우스는 궁극적으로 그들의 총 혈청 콜레스테롤의 증가를 보였다. 도 11에 대해, 변화 백분율은 t=0시간에 나이브 동물에 대해 비교한 값이다 (*P<0.01, **P<0.001).
본 실시예의 결과는 반복된 적용이 대상에서 생물학적 조정으로 인해 효능의 감소를 일으키는 다른 콜레스테롤 처리 방법과는 달리, 본 발명의 방법은 시험 기간에 걸쳐 상기 문제를 겪지 않는 것으로 보인다. 또한, 이는 선행 실시예에서 관찰된 기준선으로의 총 혈청 콜레스테롤 또는 HDL 콜레스테롤 수준의 회복은 대상이 일으키는 처리에 대한 일부 내성으로 인한 것이 아니라, 대상에서 항체 이용률의 결핍 때문임을 제안한다.
실시예 18
인간 항-PCSK9 항체의 에피토프 매핑
본 실시예에서는 PCSK9 내의 잔기가 PCSK9에 대한 본원에 개시된 항원 결합 단백질에 대한 에피토프를 형성하거나 그의 일부인지 결정하는 방법을 개략한다.
본 발명의 특정 ABP가 결합하는 에피토프를 결정하기 위해서, ABP의 에피토프는 특이적 PCSK9 펩티드 서열로부터 유도된 합성 펩티드를 사용하여 매핑할 수 있다.
SPOT 펩티드 어레이 (시그마 제노시스 (Sigma Genosys))를 사용하여 인간 항-PCSK9 항체의 그들의 펩티드 에피토프와의 분자 상호작용을 연구할 수 있다. SPOT 기술은 항체 에피토프의 체계적 분석에 적합한 방식의 펩티드 고상 합성에 기초한다. 맞춤 정렬된 올리고펩티드의 합성품은 시그마-제노시스로부터 상업적으로 이용가능하다. PCSK9 펩티드의 아미노산 서열로부터 유도된 겹치는 올리고펩티드의 펩티드 어레이를 얻을 수 있다. 어레이는 일련의 12-mer 펩티드를 폴리프로필렌 막 시트 상의 스폿 (spot)으로서 포함할 수 있다. 펩티드 어레이는 PCSK9 성숙 서열의 전체 길이에 이를 수 있다. 각각의 연속적인 펩티드는 선행 펩티드로부터 1개의 잔기에 의해 갈라질 수 있어서, 어레이된 올리고펩티드의 포개진 겹치는 라이브러리를 생성시킨다. 펩티드를 보유하는 막을 상이한 항-PCSK9 항체들 (1 ㎍/ml)과 반응시킬 수 있다. 막-결합된 펩티드에 대한 mAb의 결합을 HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체를 사용하는 효소 연결 면역흡착 분석에 이어, 증강 화학발광 (ECL)에 의해 평가할 수 있다.
또한, 기능성 에피토프는 조합 알라닌 스캐닝에 의해 매핑할 수 있다. 상기 과정에서, 조합 알라닌-스캐닝 전략은 항-PCSK9 ABP와의 상호작용을 위해 필요한 PCSK9 단백질 내의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 제2 세트의 SPOT 어레이를 알라닌 스캐닝을 위해 사용할 수 있다. 각각의 12개 잔기에서 알라닌 치환을 갖는 변이체 펩티드의 패널을 위와 같이 스캐닝할 수 있다. 이에 의해 인간 PCSK9에 대한 ABP에 대한 에피토프가 매핑되고 확인될 수 있을 것이다.
대안에서, 에피토프가 입체형태인 것이 가능함을 가정하면, 에피토프를 확인하기 위해 알라닌 스캐닝 및/또는 아르기닌 스캐닝의 조합, 항체 FAB/PCSK9 공-결정화, 및 제한된 단백질 분해/LC-MS (액체 크로마토그래피-질량 분광 계측)을 사용할 수 있다.
실시예 19
콜레스테롤 관련 질환의 치료를 위한 PCSK9 항체의 용도
콜레스테롤 관련 질환을 보이는 인간 환자 (콜레스테롤 (예를 들어 혈청 콜레스테롤)의 감소가 유익할 수 있다)에게 치료 유효량의 PCSK9 항체 31H4 (또는 예를 들어, 21B12 또는 16F12)를 투여한다. 치료 동안 주기적으로, 질환의 증상이 감퇴되었는지 결정하기 위해 환자를 모니터링한다. 치료 후에, PCSK9 항체를 사용하여 치료를 받는 환자는 치료받지 않는 환자에 비해 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 20
고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 PCSK9 항체의 용도
고콜레스테롤혈증의 증상을 보이는 인간 환자에게 치료 유효량의 PCSK9 항체, 예를 들어 31H4 (또는 예를 들어 21B12 또는 16F12)를 투여한다. 치료 동안 주기적으로, 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었는지 결정하기 위해 인간 환자를 모니터링한다. 치료 후에, PCSK9 항체를 사용하여 치료를 받는 환자는 치료받지 않는 관절염 환자에 비해 감소된 혈청 콜레스테롤 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 21
관상동맥 심장 질병 및/또는 재발성 심혈관 사건의 예방을 위한
PCSK9 항체의 용도
관상동맥 심장 질병을 발병할 위험이 있는 인간 환자를 확인한다. 환자에게 치료 유효량의 PCSK9 항체, 예를 들어 31H4 (또는 예를 들어 21B12 또는 16F12)를 단독으로, 또는 스타틴, 예를 들어, 심바스타틴과 동시에 또는 순차적으로 투여한다. 치료 동안 주기적으로, 환자의 총 혈청 콜레스테롤 수준이 변화하는지 결정하기 위해 인간 환자를 모니터링한다. 예방 치료 내내, PCSK9 항체를 사용하여 치료를 받는 환자는 치료받지 않는 환자에 비해 감소된 혈청 콜레스테롤 갖고, 따라서 관상동맥 심장 질병 또는 재발성 심혈관 사건에 대한 위험이 감소되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 22
진단제로서 PCSK9 항체의 용도
높은 수준의 PCSK9 생산을 보이는 환자를 진단하기 위해, 샘플 내의 PCSK9 항원의 검출을 위한 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)을 사용할 수 있다. 분석에서, 미량역가 플레이트, 예를 들어 96-웰 미량역가 플레이트 또는 384-웰 미량역가 플레이트의 웰을 PCSK9에 대해 생성된 제1 완전 인간 모노클로날 항체로 수시간 동안 흡착시켰다. 고정된 항체는 시험 샘플 내에 존재할 수 있는 임의의 PCSK9에 대한 포획 항체로서 역할을 한다. 웰을 세정하고, 분석물의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 우유 단백질 또는 알부민과 같은 차단제로 처리하였다.
후속적으로, 웰을 PCSK9를 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플, 또는 표준 양의 항원을 함유하는 용액으로 처리하였다. 상기 샘플은 예를 들어, 건강 이상의 진단으로서 고려되는 수준의 순환 항원을 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터의 혈청 샘플일 수 있다.
시험 샘플 또는 표준품을 세정 제거한 후, 웰을 비오틴과 컨쥬게이션에 의해 표지한 제2 완전 인간 모노클로날 PCSK9 항체로 처리하였다. 모노클로날 또는 마우스 또는 다른 종 기원을 또한 사용할 수 있다. 표지된 PCSK9 항체는 검출 항체로서 역할을 한다. 과잉의 제2 항체를 세정 제거한 후, 웰을 아비딘-컨쥬게이팅된 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 및 적합한 발색 기질로 처리하였다. 시험 샘플 내의 항원의 농도는 표준 샘플로부터 작성한 표준 곡선과 비교하여 결정하였다.
상기 ELISA 분석은 시험 샘플 내의 PCSK9 항원의 검출을 위한 고도로 특이적이고 매우 예민한 분석을 제공한다.
대상에서 PCSK9 단백질 농도의 결정
샌드위치 ELISA에 의해 인간 혈청 내의 PCSK9 수준을 정량할 수 있다. 샌드위치 ELISA로부터의 2개의 완전 인간 모노클로날 PCSK9 항체는 PCSK9 분자 상의 상이한 에피토프를 인식한다. 별법으로, 마우스 또는 다른 종 기원의 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. ELISA는 다음과 같이 수행하였다: 코팅 버퍼 (0.1 M NaHCO3, pH 9.6) 중의 2 ㎍/mL의 농도의 50 ㎕의 포획 PCSK9 항체를 ELISA 플레이트 (피셔 (Fisher)) 상에 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이팅한 후, 플레이트를 200 ㎕의 차단 버퍼 (PBS 중 0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% 티메로살)로 1시간 동안 25℃에서 처리하였다. 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 20 (세척 버퍼, WB)를 사용하여 세척하였다 (3x). 정상 또는 환자 혈청 (클리노믹스 (Clinomics), 바이오레클레이메이션 (Bioreclaimation))을 50% 인간 혈청을 함유하는 차단 버퍼 내에 희석하였다. 플레이트를 혈청 샘플과 함께 밤새 4℃에서 인큐베이팅하고, WB로 세척한 후, 100 ㎕/웰의 비오티닐화된 검출 PCSK9 항체와 함께 1시간 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다. 세척 후에, 플레이트를 HRP-스트렙타비딘과 함께 15분 동안 인큐베이팅하고, 앞서와 같이 세척한 후, 발색을 위해 H2O2 중의 100 ㎕/웰의 o-페닐렌디아민 (시그마 현상 용액)으로 처리하였다. 반응을 50 ㎕/웰의 H2SO4 (2M)로 중지시키고, 492 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 분석하였다. 혈청 샘플 내의 PCSK9 항원의 농도는 4-파라미터 곡선 피팅 프로그램을 사용하여 정제된 PCSK9 항원의 희석액에 비교하여 계산하였다.
대상에서 PCSK9 변이체 단백질 농도의 결정
야생형 PCSK9 및 변이체 PCSK9 (D374Y) 모두에 결합하는 본원에 기재된 항체를 사용하여 상기 개략된 단계를 수행할 수 있다. 다음으로, 대상 내에 존재하는 PCSK9가 야생형인지 D374Y 변이체인지 결정하기 위해, 야생형에 결합하지만 돌연변이체에 결합하지 않는 항체를 사용할 수 있다 (다시 상기 개략된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여). 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 두 라운드 모두에 대해 양성인 결과는 야생형일 것인 반면, 제1 라운드에는 양성이지만 제2 라운드의 항체에는 양성이 아닌 결과는 D374Y 돌연변이를 포함할 것이다. 공지되어 있고 본원에서 개시되는 ABP와 같은 물질이 특히 유용할 수 있는 집단 내에 고 빈도 돌연변이가 존재한다.
실시예 23
고콜레스테롤혈증 예방을 위한 PCSK9 항원 결합 단백질의 용도
고콜레스테롤혈증을 발병할 위험을 보이는 인간 환자를 가족력 분석 및/또는 생활 방식, 및/또는 현재의 콜레스테롤 수준을 통해 확인하였다. 대상에게 치료 유효량의 PCSK9 항체 31H4 (또는 예를 들어, 21B12 또는 16F12)를 규칙적으로 (예를 들어, 매주 1회) 투여하였다. 치료 동안 주기적으로, 혈청 콜레스테롤 수준이 감소되었는지 결정하기 위해 환자를 모니터링한다. 치료 후에, PCSK9 항체를 사용하여 예방 치료를 받는 대상은 치료받지 않는 대상에 비해 저하된 혈청 콜레스테롤 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 24
PCSK9 ABP는 스타틴의 존재 하에 LDLR을 더욱 상향조절하였다.
본 실시예에서는 생산된 PCSK9에 대한 ABP가 스타틴의 존재 하에 사용될 때 LDLR 이용률을 더욱 증가시키는 것을 입증하고, 이는 2가지의 조합 사용에 의해 추가의 잇점이 달성될 수 있음을 나타낸다.
HepG2 세포를 10% 우태 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM 내에 접종하고 ~90% 융합까지 성장시켰다. 세포를 표시량의 메비놀린 (스타틴, 시그마) 및 PCSK9 ABP (도 12a-12c)로 3% FBS를 함유하는 DMEM 내에서 48시간 동안 처리하였다. 총 세포 용해액을 제조하였다. 50 mg의 총 단백질을 겔 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막에 옮겼다. 면역블롯 (Immunoblot)을 토끼 항-인간 LDL 수용체 항체 (피츠제랄드 (Fitzgerald)) 또는 토끼 항-인간 b-액틴 항체를 사용하여 수행하였다. 증강 화학발광 결과를 도 12a-12c의 상부 패널에 도시한다. 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량하고 b-액틴에 의해 정규화하였다. LDLR의 상대 수준을 도 12a-12c의 하부 패널에 도시한다. ABP 21B12 및 31H4는 PCSK9 중화 항체인 반면, 25A7.1은 비-중화 항체이다.
HepG2-PCSK9 세포를 또한 생성시켰다. 이들 세포는 인간 PCSK9로 형질감염시킨 안정한 HepG2 세포주이다. 세포를 10% 우태 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM 내에 접종하고 ~90% 융합까지 성장시켰다. 세포를 표시량의 메비놀린 (시그마) 및 PCSK9 ABP (도 12d-12f)로 3% FBS를 함유하는 DMEM 내에서 48시간 동안 처리하였다. 총 세포 용해액을 제조하였다. 50 mg의 총 단백질을 겔 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막에 옮겼다. 면역블롯을 토끼 항-인간 LDL 수용체 항체 (피츠제랄드) 또는 토끼 항-인간 b-액틴 항체를 사용하여 수행하였다. 증강 화학발광 결과를 상부 패널에 도시한다. 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어에 의해 정량하고 b-액틴에 의해 정규화하였다.
도 12a-12f에 제시된 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 증가하는 양의 중화 항체 및 증가하는 양의 스타틴은 일반적으로 LDLR 수준을 증가시켰다. 증가하는 수준의 ABP에 대한 효과에서의 상기 증가는 도 12d-12f에서 특히 명백하고, 여기서 세포를 또한 PCSK9로 형질감염시켜, ABP가 그들의 효과를 보다 높은 정도로 나타내도록 하였다.
흥미롭게도, 도 12d-12f를 12a-12c에 비교한 결과에 의해 입증되는 바와 같이, LDLR 수준에 대한 ABP 농도의 영향은 PCSK9가 세포에 의해 생산될 때 극적으로 증가하였다. 또한, 중화 ABP (21B12 및 31H4)는 25A7.1 ABP (비-중화제)보다 심지어 스타틴의 존재 하에 LDLR 수준을 더 크게 증가시키는 것이 분명하고, 이는 스타틴, 및 PCSK9에 대한 ABP 모두의 사용에 의해 추가의 이익을 달성할 수 있음을 입증한다.
실시예 25
컨센서스 서열
컨센서스 서열은 항-PCSK9 ABP의 VH 및 VL에 대응하는 CDR의 표준 계통발생학 분석을 사용하여 결정하였다. 컨센서스 서열은 CDR을 VH 또는 VL에 대응하는 동일한 서열 내에서 인접하게 유지함으로써 결정하였다. 간단히 설명하면, VH 또는 VL의 전체 가변 도메인에 대응하는 아미노산 서열을, 비교 정렬 처리 및 계통발생학 추론시의 용이함을 위해 FASTA 형식으로 전환시켰다. 이어서, 이들 서열의 프레임워크 구역을 인공 링커 서열 ("bbbbbbbbbb" 플레이스홀더 (placeholder), 비-특이적 핵산 구성체)로 교체하여, 여전히 CDR을 VH 또는 VL에 대응하는 동일한 서열 내에 인접하게 유지하면서 동시 사건 (예를 들어, 공통적인 생식 계열 프레임워크 유산을 우연히 공유하는 비관련 항체)으로 인한 편향을 가중시키는 임의의 아미노산 위치를 도입하지 않으면서 CDR 단독의 검사를 수행할 수 있도록 하였다. 이어서, 상기 형식의 VH 또는 VL 서열을 표준 ClutalW-유사 알고리즘을 사용하는 프로그램을 이용하여 서열 유사성 정렬 질의로 처리하였다 ([Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680] 참조). 8.0의 갭 (gap) 생성 페널티를 2.0의 갭 연장 페널티와 함께 사용하였다. 상기 프로그램은 마찬가지로 가지 길이 비교 및 군 분류를 통해 서열 군의 유사성 및 차이를 작성하고 설명하기 위해, UPGMA (산술 평균을 사용하는 비가중 쌍의 그룹 방법) 또는 이웃-결합 (Neighbor-Joining) 방법 ([Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425] 참조)을 이용하는 서열 유사성 정렬에 기반한 계통도 (계통발생학적 분지도 (tree))를 작성하였다. 두 방법은 유사한 결과를 생성하였지만, UPGMA-유래된 분지도를 궁극적으로 사용하였고, 이는 상기 방법이 더 간단하고 더 보존적인 가설 세트를 사용하기 때문이다. UPGMA-유래된 분지도를 생성하였고, 여기서 유사한 군의 서열들은 군 내의 개별 서열들 사이에 100개 잔기당 15개 미만의 치환을 갖는 것으로 규정되었고 (비율 (scale)에 대해서는 분지도 도면의 범례 참조), 컨센서스 서열 컬렉션 (collection)을 규정하기 위해 사용하였다. 비교 결과를 도 13a-13j에 도시하였다. 도 13e에서, 군들은 그 분기군 (clade)의 경쇄 내의 서열이 또한 중쇄 내의 분기군이고 15개 미만의 치환을 갖도록 선택되었다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 도 13a-13j에 제시된 결과는 특정 아미노산의 중요성 (예를 들어, 보존되는 아미노산), 및 어떤 아미노산 위치가 유사하게 변경될 수 있는지 (예를 들어, 상이한 ABP에 대해 상이한 아미노산을 갖는 위치)에 대한 많은 지침을 제공한다.
실시예 26
생체 내에서 LDL을 저하시키는 PCSK9 및 ABP 능력에 대한 마우스 모델
인간 PCSK9를 과다발현하는 마우스를 생성하기 위해, 3주령의 WT C57Bl/6 마우스에게, 마우스에서 LDL-콜레스테롤의 측정가능한 증가를 제공할 정확한 역가를 결정하기 위해 인간 PCSK9를 발현하도록 재조합 방식으로 변형된 다양한 농도의 아데노 연관 바이러스 (AAV)를 꼬리 정맥 투여를 통해 투여하였다. 인간 PCSK9를 발현하는 상기 특정 바이러스를 사용하여, 4.5 x 10E12 pfu의 바이러스가 순환혈 내에 약 40 mg/dL의 LDL-콜레스테롤 수준을 발생시킬 것임을 결정하였다 (WT 마우스에서 LDL의 정상 수준은 약 10 mg/dL임). 이들 동물에서 인간 PCSK9 수준은 약 13 ㎍/mL인 것으로 밝혀졌다. 상기 주사 기준을 이용하여 마우스의 콜로니를 생성하였다.
주사 1주 후에, 마우스를 LDL-콜레스테롤 수준에 대해 평가하고, 상이한 처리군 내에 무작위로 배정하였다. 이어서, 동물에게 꼬리 정맥 주사를 통해 10 mg/kg 또는 30 mg/kg의 16F12, 21B12, 또는 31H4 항원 결합 단백질의 단일 볼러스 주사를 투여하였다. IgG2 ABP를 투여 대조군으로서 별도의 군의 동물에 투여하였다. 이어서, 하위군의 동물 (n=6-7)을 ABP 투여 후 24 및 48시간에 안락사시켰다. 두 용량에서 IgG2 투여 후에 LDL-콜레스테롤 수준에 대한 효과가 없었다. 31H4 및 21B12는 모두 투여 후 48시간까지 IgG2 대조군에 비해 유의한 LDL-콜레스테롤 저하를 보였다 (2가지 상이한 용량에서 도 14a 및 14b에 제시됨). 16F12는 중간 LDL-콜레스테롤 저하 반응을 보이고, 수준은 48시간 시점에 약 40 mg/dL의 기준선으로 되돌아간다. 상기 데이타는 시험관 내 결합 데이타 (Biacore 및 Kinexa)와 일치하고, 이는 인간 PCSK9에 대해 31H4 및 21B12 사이에 거의 동등한 결합 친화도, 및 16F12의 보다 작은 친화도를 보여준다.
결과에서 알 수 있는 바와 같이, 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤은 모델에서 PCSK9 ABP에 의해 감소하였다 (PCSK9의 과다발현으로 인해 총 및 HDL-C는 모두 WT 마우스를 넘어 상승한다). 상기 모델에서 콜레스테롤 저하는 비교적 짧은 기간에 걸쳐 일어나는 것으로 보이는 한편, 이는 상기 모델에서 존재하는 인간 PCSK9의 초생리적으로 높은 수준으로 인한 것으로 생각된다. 또한, 발현이 AAV에 의해 지배되는 것을 가정하면, PCSK9 발현의 조절은 없다. 이들 도면에서, (*)는 동일한 시점에 IgG2 대조군을 주사한 동물에서 관찰된 LDL-콜레스테롤 수준에 비해 P<0.05를 나타내고, (**)는 P<0.005를 나타낸다. 마우스에서 13 ㎍/ml 수준의 혈청 인간 PCSK9는 내인성 마우스 PCSK9 수준 (~25 ng/ml)을 넘어 약 520배의 증가, 및 평균 인간 혈청 수준 (~175 ng/ml)을 넘어 약 75배의 증가에 상응한다. 따라서, 항원 결합 단백질은 인간에서 훨씬 더 효과적일 것이다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 상기 결과는 대상에서 혈청 콜레스테롤을 변경시키는 항원 결합 단백질의 능력을 시험하는데 있어서 마우스 모델의 적합성을 입증한다. 당업자는 또한 마우스에서 혈청 콜레스테롤 수준을 모니터링하기 위한 마우스 HDL의 사용은 마우스 혈청 콜레스테롤 수준을 모니터링하기 위해서는 유용하지만 인간에서 인간 HDL에 대한 ABP의 효과의 표시가 아님을 알 것이다. 예를 들어, 코헨 (Cohen) 등 ("Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease", N Engl J Med, 354:1264-1272, 2006)은 인간 HDL 수준에 대한 PCSK9 기능-상실 (loss-of-function) 돌연변이의 임의의 효과의 결핍을 입증하였다 (그 전문을 본원에 참조로 포함시킨다). 따라서, 당업자는 마우스 HDL (LDL이 결여됨)을 저하시키는 ABP의 능력이 인간 HDL을 저하시키는 ABP의 능력의 표시가 아님을 알 것이다. 실제로, 코헨에 의해 나타난 바와 같이, 이는 인간에서 중화 항체에 대해 일어나는 것 같지 않다.
실시예 27
31H4 및 21B12는 PCSK9의 ProCat 구역에 결합한다.
본 실시예에서는 다양한 항체가 PCSK9에 결합하는 위치를 결정하기 위한 한 가지 방법을 설명한다.
PCSK9 단백질의 ProCat (서열 3의 31-449) 또는 V 도메인 (서열 3의 450-692)을 항체 31H4 또는 21B12와 조합하였다. 샘플을 복합체 형성에 대해 Native PAGE에 의해 분석하였다. 도 16a 및 도 16b에서 알 수 있는 바와 같이, ProCat/31H4 및 ProCat/21B12 샘플에 대해 겔 이동이 존재하였고, 이는 항체가 ProCat 도메인에 결합함을 입증한다.
실시예 28
LDLR EGFa 도메인은 PCSK9의 촉매 도메인에 결합한다.
본 실시예에서는 2.9Å 해상력에서 LDLR EGFa 도메인 (293-334)에 결합된 PCSK9 ProCat (서열 3의 31-454)의 해석된 결정 구조를 제시한다 (이를 위한 조건은 하기 실시예에서 설명한다).
EGFa에 결합된 PCSK9의 구조의 도면을 도 17에 제시한다. 결정 구조 (및 도 17에서 그의 도면)는 LDLR의 EGFa 도메인이 PCSK9의 촉매 도메인에 결합함을 보여준다. 또한, PCSK9 및 EGFa의 상호작용은 도 17에 도시된 구조에서 잔기 D374와 S153 사이의 PCSK9의 표면을 가로질러 일어나는 것으로 보인다.
LDLR EGFa 도메인과의 상호작용 계면의 특이적인 코어 PCSK9 아미노산 잔기는 EGFa 도메인의 5Å 내에 존재하는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 코어 잔기는 다음과 같다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, 및 S381.
LDLR EGFa 도메인과의 상호작용 계면의 경계 PCSK9 아미노산 잔기는 EGFa 도메인으로부터 5-8Å에 있는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 경계 잔기는 다음과 같다: W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, 및 Q382. 밑줄친 잔기는 PCSK9 내에 거의 또는 완전히 묻히는 잔기이다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 상기 실시예의 결과는 PCSK9 및 EGFa가 상호작용하는 위치를 입증한다. 따라서, 임의의 이들 잔기와 상호작용하거나 그를 차단하는 항체는 PCSK9와 LDLR의 EGFa 도메인 (및/또는 일반적으로 LDLR) 사이의 상호작용을 억제하는 항체로서 유용할 수 있다. 일부 실시태양에서, PCSK9에 결합될 때 임의의 상기 잔기와 상호작용하거나 그를 억제하고, 상기 잔기의 15-8, 8, 8-5, 또는 5 옹스트롬 내에 존재하는 항체는 LDLR에 대한 PCSK9 결합의 유용한 억제를 제공하는 것으로 고려된다.
실시예 29
31H4는 PCSK9의 프로-도메인 및 촉매 도메인 모두로부터의 아미노산 잔기와 상호작용한다.
본 실시예에서는 2.3Å 해상력에서 결정된 31H4의 Fab 단편에 결합된 전장 PCSK9 (서열 3의 N533A 돌연변이체)의 결정 구조를 제시한다 (이를 위한 조건은 하기 실시예에서 설명한다). 도 18a 및 18b에 도시된 상기 구조는 31H4가 촉매 부위의 구역에서 PCSK9에 결합하고, 프로도메인 및 촉매 도메인 모두로부터의 아미노산 잔기와 접촉함을 보여준다.
도시된 구조에 의해 또한 PCSK9와의 31H4의 상호작용 계면의 특이적인 코어 PCSK9 아미노산 잔기를 확인할 수 있다. 이는 31H4 단백질의 5Å 내에 존재하는 잔기로서 규정된다. 코어 잔기는 다음과 같다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, 및 G384.
또한, 상기 구조를 사용하여 31H4와의 상호작용 계면에 대한 경계 PCSK9 아미노산 잔기를 확인하였다. 이들 잔기는 31H4 단백질의 5-8Å에 있는 PCSK9 잔기이다. 경계 잔기는 다음과 같다: K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, 및 Q387. PCSK9 단백질 내에 완전히 묻히는 아미노산 잔기에 밑줄친다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 도 18b는 항원 결합 단백질 상의 CDR과 PCSK9 사이의 상호작용을 도시한 것이다. 따라서, 상기 모델을 이용하여 당업자는 파라토프 (paratope) 내에서 특히 중요한 잔기 및/또는 CDR, 및 어떠한 잔기가 파라토프에 덜 중요한지 확인할 수 있다. 도 18b에서 알 수 있는 바와 같이, 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 결합에 가장 직접적으로 관여하고, 여기서 경쇄로부터의 CDR은 에피토프로부터 비교적 더 멀다. 따라서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 부당하게 저해하지 않으면서 경쇄 CDR 내에 보다 큰 변이가 가능함이 확실하다. 일부 실시태양에서, 직접 상호작용하는 구조 내의 잔기는 보존되는 (또는 별법으로 보존적으로 교체되는) 반면, 서로 직접 상호작용하지 않는 잔기는 더 큰 정도로 변경될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 교시 내용이 주어지면 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질의 능력을 부당하게 저해하지 않으면서 항원 결합 단백질의 어떠한 잔기 및 영역이 변화될 수 있는지 예측할 수 있다. 예를 들어, PCSK9에 가장 가까이 위치하는 잔기는 항원 결합 단백질이 PCSK9에 결합할 때 아마도 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합에서 보다 중요한 역할을 하는 잔기이다. 상기한 바와 같이, 이들 잔기는 PCSK9의 5 옹스트롬 내에 있는 것과 5 내지 8 옹스트롬 사이에 있는 것으로 나누어질 수 있다. PCSK9와의 상호작용 계면의 특이적인 코어 31H4 아미노산 잔기는 PCSK9 단백질의 5Å 내에 있는 31H4 잔기로서 정의하였다. 중쇄에 대해, 5 옹스트롬 내에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: T28, S30, S31, Y32, S54, S55, S56, Y57, I58, S59, Y60, N74, A75, R98, Y100, F102, W103, S104, A105, Y106, Y107, D108, A109, 및 D111. 경쇄에 대해, 5 옹스트롬 내에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: L48, S51, Y93, 및 S98. 중쇄에 대해, PCSK9 단백질로부터 5-8Å에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: G26, F27, F29, W47, S50, I51, S52, S53, K65, F68, T69, I70, S71, R72, D73, K76, N77, D99, D101, F110, 및 V112. 경쇄에 대해, PCSK9의 5-8 옹스트롬 내에 있는 잔기는 A31, G32, Y33, D34, H36, Y38, I50, G52, N55, R56, P57, S58, D94, S95, S96, L97, G99, 및 S100을 포함한다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 실시예 29로부터의 결과는 PCSK9에 대한 항체가 PCSK9와 상호작용하고, PCSK9가 EGFa (및 따라서 LDLR)와 상호작용하는 것을 여전히 차단할 수 있음을 입증한다. 따라서, 임의의 이들 PCSK9 잔기와 상호작용하거나, 임의의 이들 잔기를 차단하는 (예를 들어, 이들 잔기에 결합하는 다른 항원 결합 단백질으로부터) 항원 결합 단백질은 PCSK9 및 EGFa (및 따라서 LDLR)의 상호작용을 억제하는 항체로서 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 임의의 상기 잔기와 상호작용하거나 상기 잔기의 5Å 내에 있는 잔기와 상호작용하는 항원 결합 단백질은 LDLR에 대한 PCSK9 결합의 유용한 억제를 제공하는 것으로 고려된다. 유사하게, 임의의 상기 잔기를 차단하는 (예를 들어, 경쟁 분석을 통해 결정할 수 있는) 항원 결합 단백질은 또한 PCSK9/LDLR 상호작용의 억제를 위해 유용할 수 있다.
실시예 30
21B12는 PCSK9의 촉매 도메인에 결합하고, 31H4로부터의 특유한 결합 부위를 갖고, 31H4와 동시에 PCSK9에 결합할 수 있다.
본 실시예에서는 2.8Å 해상력에서 결정된 31H4 및 21B12의 Fab 단편에 결합된 PCSK9 ProCat (서열 3의 31-449)의 결정 구조를 제시한다 (이를 위한 조건은 하기 실시예에서 설명한다). 도 19a 및 도 19b에 도시된 상기 결정 구조는 31H4 및 21B12가 PCSK9 상에 특유한 결합 부위를 갖고, 두 항원 결합 단백질은 PCSK9에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다. 상기 구조는 21B12가 PCSK9의 촉매 도메인으로부터의 아미노산 잔기와 상호작용함을 보여준다. 상기 구조에서, PCSK9와 31H4 사이의 상호작용은 앞에서 관찰된 것과 유사하다.
21B12와의 상호작용 계면의 특이적인 코어 PCSK9 아미노산 잔기는 21B12 단백질의 5Å 내에 존재하는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 코어 잔기는 다음과 같다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, 및 F379.
21B12와의 상호작용 계면의 경계 PCSK9 아미노산 잔기는 21B12 단백질로부터의 5-8Å에 있는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 경계 잔기는 다음과 같다: I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 및 C378. PCSK9 단백질 내에 거의 또는 완전히 묻히는 아미노산 잔기를 밑줄친다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 도 19b는 항원 결합 단백질 상의 CDR과 PCSK9 사이의 상호작용을 도시한 것이다. 따라서, 상기 모델을 이용하여 당업자는 파라토프 내에서 특히 중요한 잔기 및/또는 CDR, 및 어떠한 잔기가 파라토프에 덜 중요한지 확인할 수 있다. 구조에서 알 수 있는 바와 같이, 중쇄 CDR2 및 경쇄 CDR1은 에피토프와 밀접하게 상호작용하는 것으로 보인다. 다음으로, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3은 에피토프에 가까운 것으로 보이지만, 제1 세트의 CDR만큼 가깝지는 않다. 마지막으로, 경쇄 CDR2는 에피토프로부터 일정 거리에 있는 것으로 보인다. 따라서, PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 부당하게 저해하지 않으면서 보다 먼 CDR 내에 보다 큰 변이가 가능함이 확실하다. 일부 실시태양에서, 직접 상호작용하는 구조 내의 잔기는 보존되는 (또는 별법으로 보존적으로 교체되는) 반면, 서로 직접 상호작용하지 않는 잔기는 더 큰 정도로 변경될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 교시 내용이 주어지면 PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질의 능력을 부당하게 저해하지 않으면서 항원 결합 단백질의 어떠한 잔기 및 영역이 변화될 수 있는지 예측할 수 있다. 예를 들어, PCSK9에 가장 가까이 위치하는 잔기는 항원 결합 단백질이 PCSK9에 결합할 때 아마도 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질의 결합에서 보다 중요한 역할을 하는 잔기이다. 상기한 바와 같이, 이들 잔기는 PCSK9의 5 옹스트롬 내에 있는 것과 5 내지 8 옹스트롬 사이에 있는 것으로 나누어질 수 있다. PCSK9와의 상호작용 계면의 특이적인 코어 21B12 아미노산 잔기는 PCSK9 단백질의 5Å 내에 있는 21B12 잔기로서 정의하였다. 중쇄에 대해, 5 옹스트롬 내에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: T30, S31, Y32, G33, W50, S52, F53, Y54, N55, N57, N59, R98, G99, Y100, 및 G101. 경쇄에 대해, 5 옹스트롬 내에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: G30, G31, Y32, N33, S34, E52, Y93, T94, S95, T96, 및 S97. 중쇄에 대해, PCSK9 단백질로부터 5-8Å에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: T28, L29, I34, S35, W47, V51, G56, T58, Y60, T72, M102, 및 D103. 경쇄에 대해, PCSK9의 5-8 옹스트롬 내에 있는 잔기는 다음의 것을 포함한다: S26, V29, V35, Y51, N55, S92, M98, 및 V99.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 실시예 30으로부터의 결과는 PCSK9에 대한 항원 결합 단백질이 PCSK9와 상호작용하고, PCSK9가 EGFa (및 따라서 LDLR)와 상호작용하는 것을 여전히 차단할 수 있음을 입증한다. 따라서, 임의의 이들 PCSK9 잔기와 상호작용하거나, 임의의 이들 잔기를 차단하는 항원 결합 단백질은 PCSK9 및 EGFa (및 따라서 LDLR)의 상호작용을 억제하는 항체로서 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 임의의 상기 잔기와 상호작용하거나 상기 잔기의 5Å 내에 있는 잔기와 상호작용하는 항체는 LDLR에 대한 PCSK9 결합의 유용한 억제를 제공하는 것으로 고려된다. 유사하게, 임의의 상기 잔기를 차단하는 (예를 들어, 경쟁 분석을 통해 결정할 수 있는) 항원 결합 단백질은 또한 PCSK9/LDLR 상호작용의 억제를 위해 유용할 수 있다.
실시예 31
EGFa, PCSK9, 및 항체 사이의 상호작용
상기 실시예로부터의 3원 복합체 (PCSK9/31H4/21B12)의 구조를 PCSK9/EGFa 구조 (실시예 28에 설명된 바와 같이 결정됨) 상에 덮고, 상기 조합의 결과를 도 20a에 도시한다. 상기 도면은 EGFa와의 PCSK9 상호작용을 억제하기 위해 유용하게 표적화될 수 있는 PCSK9 상의 영역을 입증한다. 도면은 31H4 및 21B12가 LDLR의 EGFa 도메인의 위치와 부분적으로 겹치고, PCSK9에 대한 그의 결합을 입체적으로 저해함을 보여준다. 또한, 구조에서 알 수 있는 바와 같이, 21B12는 LDLR EGFa 도메인에 대한 결합에 특이적으로 관여하는 하위세트의 아미노산 잔기와 직접적으로 상호작용한다.
상기한 바와 같이, 결정 구조의 분석으로 PCSK9와 파트너 단백질 (PCSK9 표면 상의 계면의 코어 및 경계 구역) 사이의 상호작용에 관여하는 특이적 아미노산, 및 PCSK9와 상호작용하기 위한 이들 파트너 단백질의 공간 요건을 확인하였다. 구조는 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 억제하는 방법을 제안한다. 먼저, 상기한 바와 같이, LDLR의 EGFa 도메인의 결합 부위와 공동으로 잔기를 공유하는 경우에 PCSK9에 물질을 결합시키면 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 억제할 것이다. 두 번째로, 공통으로 잔기의 외부에 결합하는 물질은 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 방지하도록 LDLR의 EGFa 도메인 또는 EGFa 도메인에 대한 N- 또는 C-말단인 구역을 입체적으로 저해할 수 있다.
일부 실시태양에서, 두 EGFa 결합에 모두 관여하고 상기한 항원 결합 단백질이 결합하는 영역에 가까운 잔기는 LDLR에 대한 PCSK9 결합을 조작하기 위해 특히 유용하다. 예를 들어, 상이한 결합 파트너에 대한 코어 구역 및 경계 구역 모두에서 공통인 계면으로부터 아미노산 잔기를 아래 표 12에 나열한다. PCSK9 단백질 내에 완전히 묻히는 아미노산 잔기를 밑줄친다.
Figure pat00015
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 상기한 잔기에 결합하고/하거나 그를 차단한다.
실시예 32
LDLR 및 PCSK9의 구조적 상호작용
PCSK9 ProCat (서열 3의 31-454)/EGFa 복합체 구조를 사용하여 LDLR의 전장 표시에 결합된 전장 PCSK9의 모델을 제조하였다. 전장 PCSK91의 구조 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-cholesterol, Structure 15, 545-52 (2007))를 복합체로부터의 PCSK9 ProCat 31-454 위로 덮고, 저 pH 입체형태의 LDLR의 구조 (Rudenko, G. et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH. Science 298, 2353-8 (2002))를 복합체로부터의 EGFa 도메인 위로 덮었다. 모델의 도면을 도 20b 및 20c에 도시한다. EGFa 도메인은 도면에서 글상자로 표시한다. 도면은 PCSK9에 근접하게 놓이는 바로 EGFa 결합 도메인의 외부의 LDLR의 구역을 보여준다. 도 20d-20f는 상기 상호작용을, 3개의 상이한 각으로부터 항체 31H4 및 21B12의 메시 (mesh) 표면 표시와 함께 보여준다. 도면으로부터 명백한 바와 같이, 항체는 실제 결합 부위에서 PCSK9와의 LDLR의 상호작용을 저해하고/하거나 그와 상호작용할 수 있을 뿐만 아니라, 입체 상호작용이 또한 일어나는 것으로 보인다.
상기 결과에 비추어, PCSK9에 결합하는 항원 결합 단백질은 또한 (LDLR 및 PCSK9가 상호작용하는 부위만이 아닌) LDLR의 다양한 구역과 충돌함으로써 PCSK9와 LDLR 사이의 상호작용을 억제할 수 있음이 명백하다. 예를 들어, 이는 리피트 (repeat) 7 (R7), EGFb 도메인, 및/또는 β-프로펠러 도메인과 충돌할 수 있다.
PCSK9와 EGFa 상호작용을 차단하거나 그에 결합하는 항원 결합 분자의 실시태양
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 실시예 28-32 및 그의 첨부 도면은 EGFa가 PCSK9와 상호작용하는 방법과 위치, 및 2개의 대표적인 중화 항원 결합 단백질인 21B12 및 31H4가 PCSK9와 상호작용하고 그들의 중화 효과를 나타내는 방법의 상세한 설명을 제공한다. 따라서, 당업자는 PCSK9 상의 적어도 하나의 동일한 위치에서 또는 그 부근에서 결합하는 다른 항원 결합 분자를 확인함으로써 EGFa (LDLR 포함)과 PCSK9 사이의 결합을 유사하게 감소시킬 수 있는 항원 결합 분자를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. PCSK9 상의 관련 위치 (또는 에피토프)는 도면 및 본 발명의 설명에서 확인되지만, 이들 부위를 EGFa 결합 부위에 가까운 것으로 확인된 잔기로부터 설정된 거리 내에 있는 것으로 설명하는 것이 또한 유리할 수 있다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 다음 잔기 (서열 3과 관련하여 넘버링됨)에 결합하거나 그로부터 30 옹스트롬 내에 있을 것이다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 다음 잔기 (서열 3과 관련하여 넘버링됨)의 30 옹스트롬 내에 결합한다: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, 또는 Q382. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 다음 잔기 (서열 3과 관련하여 넘버링됨)의 30 옹스트롬 내에 결합한다: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, 또는 Q387. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 다음 잔기 (서열 3과 관련하여 넘버링됨)의 30 옹스트롬 내에 결합한다: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, 또는 C378.
일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 상기 잔기로부터 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 옹스트롬 이하 내에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 PCSK9에 결합될 때, 하나 초과의 상기한 잔기에 대해 적어도 하나의 상기 거리 내에 존재한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75개 이상의 상기 잔기에 대해 하나의 열거한 거리 (예를 들어, 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 이하) 내에 존재한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 그의 하위군의 각각의 군에서 확인된 적어도 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100%의 잔기 (예를 들어, 단지 군 내의 표면 잔기)에 대해 하나의 열거한 거리 내에 존재한다. 달리 구체적으로 진술하지 않으면, 항원 결합 분자와 PCSK9 사이의 거리는 PCSK9 및 항원 결합 분자의 가장 가까운 원자들인, PCSK9 상의 공유 결합된 원자와 항원 결합 분자의 공유 결합된 원자 사이의 최단 거리이다. 유사하게, 달리 구체적으로 진술하지 않으면, 잔기 (항원 결합 분자 또는 PCSK9 상의)와 또다른 단백질 (각각 PCSK9 또는 항원 결합 분자) 사이의 거리는 확인된 잔기 상의 가장 가까운 위치로부터 다른 단백질의 가장 가까운 공유 결합된 부분까지의 거리이다. 일부 실시태양에서, 거리는 아미노산 사슬의 백본으로부터 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 거리는 파라토프와 가장자리와 에피토프의 가장자리 (서로 가장 가까운) 사이에서 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 거리는 파라토프의 표면의 중심과 에피토프의 표면의 중심 사이에서 측정할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 설명은 각각의 개별 세트의 본원에 나열된 잔기에 적용가능하다. 예를 들어, 상기 범위는 일반적으로 고려되고, 실시예 28-32에 나열된 8 옹스트롬 잔기 및 실시예 28-32에 나열된 5 옹스트롬 잔기에 대해 구체적으로 고려된다.
일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 EGFa, 21B12, 또는 31H4 중 적어도 하나가 결합하는 PCSK9 상의 표면에 결합한다. 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 PCSK9와 EFGa, Ab 31H4, 및/또는 Ab 21B12 사이의 상호작용 위치와 겹치는 위치에서 PCSK9에 결합한다 (상기 실시예 및 도면에서 설명한 바와 같이). 일부 실시태양에서, 항원 결합 분자는 상기 열거한 잔기 중 하나로부터 더욱 떨어진 위치에서 PCSK9에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 항원 결합 분자는 여전히 효과적인 중화 항원 결합 분자일 수 있다.
일부 실시태양에서, PCSK9의 촉매 도메인의 구조는 전체적으로 삼각형 (도 19a에 도시된 바와 같이)인 것으로 설명할 수 있다. 삼각형의 제1 변에는 31H4가 결합하는 것으로 도시된다. 삼각형의 제2 변에는 21B12가 결합하는 것으로 도시되고, 삼각형의 제3 변은 페이지의 저변을 향해, "도 19a" 표지 바로 위로 위치한다. 일부 실시태양에서, PCSK9의 촉매 도메인의 제1 및/또는 제2 변에 결합하는 항원 결합 분자는 PCSK9에 대한 EGFa의 결합을 직접적으로 또는 입체적으로 저해할 수 있으므로 중화 항체로서 유용할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 항원 결합 분자가 너무 큰 경우, 예를 들어 전체 항체인 경우, 항원 결합 분자는 PCSK9에 대한 EGFa의 결합을 저해하기 위해 EGFa 결합 부위에 직접 결합할 필요가 없다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, LDLR의 EGFa 도메인이 많은 예에서 사용되었지만, 모델 및 구조는 전장 LDLR 단백질이 PCSK9와 상호작용할 방법에 여전히 적용가능하다. 실제로, 전장 LDLR 단백질 상에 존재하는 추가의 구조는 항원 결합 분자들 중 하나에 의해 추가로 차단될 수 있는 추가의 단백질 공간을 제시한다. 따라서, 항원 결합 분자가 PCSK9에 대한 EGFa의 결합을 차단하거나 억제하면, 아마도 그 이상은 아니더라도 적어도 전장 LDLR 단백질만큼 효과적일 것이다. 유사하게, EGFa 결합을 억제하기 위해 관련되는 다양한 잔기를 차단하거나 설정된 거리 내에 있는 항원 결합 분자는 아마도 그 이상은 아니더라도 전장 LDLR만큼 효과적일 것이다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 상기한 PCSK9 잔기를 차단하거나 그에 결합하는 (또는 열거한 거리 내에 있는), 또는 상기 실시예 및 도면에 기재한 하나 이상의 상호작용을 억제하는 임의의 분자는 EGFa (또는 일반적으로 LDLR) 및 PCSK9의 상호작용을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 임의의 항원 결합 분자가 또한 요구되는 목적을 만족할 수 있으므로, 분자는 항원 결합 "단백질"로 제한될 필요가 없다. 항원 결합 분자의 예는 올리고핵산 또는 펩티드 분자일 수 있는 앱타머 (aptamer)를 포함한다. 항원 결합 분자의 다른 예는 아비머, 펩티바디, 소분자 및 중합체, 및 PCSK9에 대한 그의 친화도 및/또는 반감기를 증가시킬 수 있는 EGFa의 변형된 버전, 예를 들어 아미노산의 돌연변이, 글리코실화, peg화, Fc 융합체, 및 아비머 융합체를 포함한다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 일부 실시태양에서, LDLR은 항원 결합 분자가 아니다. 일부 실시태양에서, LDLR의 결합 하위섹션, 예를 들어, EGFa는 항원 결합 분자가 아니다. 일부 실시태양에서, 그를 통해 PCSK9가 생체 내에서 신호전달하는 다른 분자는 항원 결합 분자가 아니다. 그러한 실시태양은 그 자체로서 명백하게 확인될 것이다.
실시예 33
단백질 샘플의 발현 및 정제
본 실시예에서는 PCSK9 단백질/변이체의 다양한 실시태양을 제조하고 정제하는 (LDLR EGFa 도메인 포함) 방법에 대한 일부 실시태양을 설명한다. PCSK9 단백질/변이체 (예를 들어, PCSK9 31-692 N533A, PCSK9 449TEV 및 PCSK9 ProCat 31-454)를 바큘로바이러스로 감염된 Hi-5 곤충 세포 내에서 N-말단 꿀벌 멜리틴 신호 펩티드에 이어 His6 태그와 함께 발현시켰다. PCSK9 단백질은 니켈 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 멜리틴-His6 태그는 정제하는 동안 TEV 프로테아제를 사용하는 절단에 의해 제거하였다. 구성체 PCSK9 449TEV를 사용하여 PCSK9 ProCat (31-449) 및 V 도메인 (450-692) 샘플을 생성하였다. 상기 구성체는 PCSK9 잔기 449와 450 사이에 삽입된 TEV 프로테아제 절단 부위를 가졌다. 결정학을 위한 전장 N555A 변이체에 대해, PCSK9 31-454 단편, 및 결정학을 위한 PCSK9 449TEV 변이체, rTEV 후 단백질 생성물은 또한 초기 GAMG 서열을 포함하였다. 따라서, rTEV 절단 후에, 이들 단백질은 GAMG-PCSK9이었다. 또한, PCSK9 449TEV 단백질은 서열 3의 H449와 G450 사이에 삽입된 서열 "ENLYFQ" (서열 403)을 포함하였다. rTEV를 사용한 절단 후에, 상기 구성체로부터 생성된 PCSK9 ProCat 단백질은 GAMG-PCSK9 (31-449)-ENLYFQ이고, 상기 구성체로부터 생성된 V 도메인은 서열 3의 PCSK9 (450-692)이었다.
21B12 및 31H4 Fab 단편을 이. 콜라이 내에서 발현시켰다. 이들 단백질은 니켈 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
LDLR EGFa 도메인 (293-334)을 GST 융합 단백질로서 이. 콜라이 내에서 발현시켰다. EGFa 도메인은 이온 교환 크로마토그래피, 글루타티온 세파로스 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. GST 단백질은 정제하는 동안 PreScission 프로테아제를 사용한 절단에 의해 제거하였다.
실시예 34
복합체 형성 및 결정화
본 실시예에서는 상기 구조 검사 실시예에서 사용된 복합체 및 결정을 제조하는 방법을 설명한다
PCSK9 31-692 N533A/31H4 복합체는 1.5 몰 과량의 31H4 Fab를 PCSK9와 혼합함으로써 제조하였다. 복합체는 과잉의 31H4 Fab를 제거하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. PCSK9 31-692 N533A/31H4 복합체는 0.1 M Tris pH 8.3, 0.2 M 아세트산나트륨, 15% PEG 4000, 6% 덱스트란 술페이트 나트륨염 (Mr 5000) 내에서 결정화한다.
PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12 복합체는 먼저 1.5 몰 과량의 31H4 Fab를 PCSK9 31-449와 혼합함으로써 제조하였다. 복합체를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 상의 정제에 의해 과잉의 31H4로부터 분리하였다. 이어서, 1.5 몰 과량의 21B12 Fab를 PCSK9 31-449/31H4 복합체에 첨가하였다. 3원 복합체는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 상의 정제에 의해 과잉의 21B12로부터 분리하였다. PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12 복합체는 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M 제1인산암모늄, 50% MPD 내에서 결정화한다.
PCSK9 ProCat 31-454/EGFa 복합체는 1.2 몰 과량의 EGFa 도메인을 PCSK9 31-454와 혼합함으로써 제조하였다. PCSK9 ProCat 31-454/EGFa 도메인 복합체는 0.2 M 포름산칼륨, 20% PEG 3350 내에서 결정화한다.
실시예 35
데이타 수집 및 구조 결정
본 실시예에서는 데이타세트를 수집하고 상기 구조 검사 실시예를 위한 구조를 결정하는 방법을 설명한다.
PCSK9 31-692 N533A/31H4 및 PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12 결정에 대한 초기 데이타세트를 Rigaku FR-E X-선원 상에서 수집하였다. PCSK9 ProCat 31-454/EGFa 데이타세트, 및 PCSK9 31-692 N533A/31H4 및 PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12 결정에 대한 보다 고 해상력 데이타세트를 Berkeley Advanced Light Source 빔라인 (beamline) 5.0.2에서 수집하였다. 모든 데이타세트는 denzo/scalepack 또는 HKL2000을 사용하여 처리하였다 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
PCSK9/31H4 결정은 단위 셀 치수 a=264.9, b=137.4, c=69.9Å, β=102.8°인 C2 공간군 (space group)으로 성장하고, 2.3Å 해상력으로 회절한다. PCSK9/31H4 구조는 출발 탐색 모델로서 PCSK9 구조 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-colesterol. Structure 15, 545-52 (2007))를 사용하여 프로그램 MOLREP (The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994))를 사용하는 분자 교체에 의해 밝혔다. PCSK9 31-692 용액을 고정시켜 유지하면서, 항체 가변 도메인을 탐색 모델로서 사용하였다. PCSK9 31-692/항체 가변 도메인 용액을 고정시켜 유지하면서, 항체 불변 도메인을 탐색 모델로서 사용하였다. 완전한 구조는 Quanta를 사용한 다수 라운드의 모델 구축 (building) 및 cnx를 사용한 세부조정 (refinement)을 이용하여 개선하였다 (Brunger, A.T. et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
PCSK9/31H4/21B12 결정은 단위 셀 치수 a=138.7, b=246.2, c=51.3Å인 P21212 공간군으로 성장하고 2.8Å 해상력으로 회절한다. PCSK9/31H4/21B12 구조는 출발 탐색 모델로서 PCSK9 ProCat/31H4 가변 도메인을 사용하여 프로그램 MOLREP를 사용하는 분자 교체에 의해 밝혔다. PCSK9 ProCat/31H4 가변 도메인을 고정시켜 유지하면서, 항체 불변 도메인에 대한 탐색을 수행하였다. PCSK9 ProCat/31H4/21B12 불변 도메인을 고정시켜 유지하면서, 항체 가변 도메인을 탐색 모델로서 사용하였다. 완전한 구조는 Quanta를 사용한 다수 라운드의 모델 구축 및 cnx를 사용한 세부조정을 이용하여 개선하였다.
PCSK9/EGFa 도메인 결정은 단위 셀 치수 a=b=70.6, c=321.8Å인 공간군 P6522으로 성장하고, 2.9Å 해상력으로 회절한다. PCSK9/EGFa 도메인 구조는 출발 탐색 모델로서 PCSK9 ProCat을 사용하여 프로그램 MOLREP를 사용하는 분자 교체에 의해 밝혔다. 전자 밀도 지도의 분석으로 EGFa 도메인에 대한 분명한 전자 밀도를 보여주었다. LDLR EGFa 도메인은 수동으로 피팅하고, 모델을 Quanta를 사용한 다수 라운드의 모델 구축 및 cnx를 사용한 세부조정을 이용하여 개선하였다.
코어 상호작용 계면 아미노산은 PCSK9 파트너 단백질로부터 5Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖는 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다. 5Å은 원자들이 반 데어 발스 (van der Waals) 반경 + 가능한 물-매개 수소 결합 내에 있도록 하기 위해 코어 구역 컷오프 (cutoff) 거리로서 선택되었다. 경계 상호작용 계면 아미노산은 PCSK9 파트너 단백질로부터 8Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖지만 코어 상호작용 목록에 포함되지 않은 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다. 8Å 이하는 연장된 아르기닌 아미노산의 길이를 허용하기 위해 경계 구역 컷오프 거리로서 선택되었다. 이들 거리 기준을 만족하는 아미노산은 프로그램 PyMOL (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002))을 사용하여 계산하였다.
실시예 36
PCSK9 및 31A4의 결정 구조
31A4/PCSK9 복합체의 결정 구조를 결정하였다.
단백질 샘플의 발현 및 정제
PCSK9 449TEV (잔기 449와 450 사이에 삽입된 TEV 프로테아제 절단 부위를 갖는 PCSK9 구성체, 서열 3에 따라 넘버링됨)를 바큘로바이러스로 감염된 Hi-5 곤충 세포 내에서 N-말단 꿀벌 멜리틴 신호 펩티드에 이어 His6 태그와 함께 발현시켰다. PCSK9 단백질은 먼저 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 멜리틴-His6 태그를 제거하고 촉매 도메인과 V 도메인 사이에서 PCSK9 단백질을 절단하기 위해 TEV 프로테아제를 사용되었다. V 도메인은 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 31A4 Fab 단편을 이. 콜라이 내에서 발현시켰다. 상기 단백질은 니켈 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
복합체 형성 및 결정화
PCSK9 V 도메인/31A4 복합체는 1.5 몰 과량의 PCSK9 V 도메인을 31A4 Fab와 혼합함으로써 제조하였다. 복합체를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 상의 정제에 의해 과잉의 PCSK9 V 도메인으로부터 분리하였다. PCSK9 V 도메인/31A4 복합체는 1.1 M 숙신산 pH 7, 2% PEG MME 2000 내에서 결정화하였다.
데이타 수집 및 구조 결정
PCSK9 V 도메인/31A4 결정에 대한 데이타세트를 Rigaku FR-E x-선원 상에서 수집하고 denzo/scalepack으로 처리하였다 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
PCSK9 V 도메인/31A4 결정은 비대칭 단위당 2개의 복합체 분자를 갖는, 단위 셀 치수 a=74.6, b=131.1, c=197.9Å인 P212121 공간군으로 성장하고, 2.2Å 해상력으로 회절한다. PCSK9 V 도메인/31A4 구조는 출발 탐색 모델로서 PCSK9 구조의 V 도메인 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-colesterol. Structure 15, 545-52 (2007))을 사용하여 프로그램 MOLREP (CCP4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994))를 사용하는 분자 교체에 의해 밝혔다. PCSK9 450-692 용액을 고정시켜 유지하면서, 항체 가변 도메인을 탐색 모델로서 사용하였다. 초기 세부조정 후에, 항체 불변 도메인을 수동으로 피팅하였다. 완전한 구조는 Quanta를 사용한 다수 라운드의 모델 구축 및 cnx를 사용한 세부조정을 이용하여 개선하였다 (Brunger, A.T. et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
코어 상호작용 계면 아미노산은 PCSK9 파트너 단백질로부터 5Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖는 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다. 5Å은 원자들이 반 데어 발스 반경 + 가능한 물-매개 수소 결합 내에 있도록 하기 위해 코어 구역 컷오프 거리로서 선택되었다. 경계 상호작용 계면 아미노산은 PCSK9 파트너 단백질로부터 8Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖지만 코어 상호작용 목록에 포함되지 않은 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다. 8Å 이하는 연장된 아르기닌 아미노산의 길이를 허용하기 위해 경계 구역 컷오프 거리로서 선택되었다. 이들 거리 기준을 만족하는 아미노산은 프로그램 PyMOL (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002))을 사용하여 계산하였다. 거리는 V 도메인 "A" 및 31A4 "L1,Hl" 복합체를 사용하여 계산하였다.
31A4의 Fab 단편에 결합된 PCSK9 V 도메인의 결정 구조를 2.2Å 해상력에서 결정하였다. 결정 구조의 도면을 도 21a-21d에 제공한다. 도 21a-21c는 31A4 Fab가 PCSK9 V 도메인에 서브도메인 1 및 2의 구역에서 결합함을 보여준다.
31A4 Fab에 결합된 전장 PCSK9의 모델을 제조하였다. 전장 PCSK9의 구조를 복합체로부터의 PCSK9 V 도메인 위로 덮었다. 상기 모델의 도면을 도 21d에 도시한다. LDLR의 EGFa 도메인과 PCSK9 사이의 상호작용의 부위를 강조한다.
구조의 분석으로 상기 항체가 PCSK9와 상호작용하는 위치를 보여주고, PCSK9의 LDLR 결합 표면에 결합하지 않은 항체가 여전히 PCSK9를 통해 매개되는 LDLR의 분해를 억제할 수 있음을 입증하였다 (결과를 하기 실시예 40 및 41과 조합하여 살펴볼 때). 또한, 결정 구조의 분석으로 PCSK9와 31A4 항체 사이의 상호작용에 관여하는 특이적 아미노산의 확인할 수 있다. 또한, PCSK9 표면 상의 계면의 코어 및 경계 구역을 또한 결정하였다. 31A4와의 상호작용 계면의 특이적인 코어 PCSK9 아미노산 잔기는 31A4 단백질의 5Å 내에 존재하는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 코어 잔기는 T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, 및 E593이다. 31A4와의 상호작용 계면의 경계 PCSK9 아미노산 잔기는 31A4 단백질로부터의 5-8Å에 있는 PCSK9 잔기로서 정의하였다. 경계 잔기는 다음과 같다: S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, 및 H597. PCSK9 단백질 내에 거의 또는 완전히 묻히는 아미노산 잔기는 밑줄로 강조한다. 본원에서 나타낸 바와 같이, 넘버링은 서열 3의 아미노산 위치를 나타낸다 (본원에서 나타낸 바와 같이 조정됨).
PCSK9와의 상호작용 계면의 특이적인 코어 31A4 아미노산 잔기는 PCSK9 단백질의 5Å 내에 존재하는 31A4 잔기로서 정의하였다. 31A4 항체에 대한 코어 잔기는 다음과 같다: 중쇄: G27, S28, F29, S30, A31, Y32, Y33, E50, N52, H53, R56, D58, K76, G98, Q99, L100, 및 V101; 경쇄: S31, N32, T33, Y50, S51, N52, N53, Q54, W92, 및 D94. PCSK9와의 상호작용 계면의 경계 31A4 아미노산 잔기는 PCSK9 단백질로부터 5-8Å에 있는 31A4 잔기로서 정의하였다. 31A4에 대한 경계 잔기는 다음과 같다: 중쇄: V2, G26, W34, N35, W47, I51, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103, 및 D104; 경쇄: S26, S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95, N97, G98, 및 W99.
결정 구조는 또한 PCSK9와의 그의 상호작용의 상기 ABP의 공간 요건을 표시하였다. 상기 구조에서 볼 수 있는 바와 같이, 놀랍게도, LDLR과의 PCSK9의 상호작용을 직접 방지하지 않으면서 PCSK9에 결합하는 항체는 여전히 PCSK9의 기능을 억제할 수 있다.
일부 실시태양에서, 31A4에 결합하거나, 덮거나, 31A4와 임의의 상기 잔기와의 상호작용을 억제하는 임의의 항원 결합 단백질을 사용하여 PCSK9에 결합하거나 중화시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 적어도 하나의 다음 PCSK9 (서열 3) 잔기에 결합하거나 상호작용한다: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, 및 E593. 일부 실시태양에서, ABP는 하나 이상의 상기 잔기의 5 옹스트롬 내에 존재한다. 일부 실시태양에서, ABP는 적어도 하나의 다음 PCSK9 (서열 3) 잔기에 결합하거나 상호작용한다: S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, 및 H597. 일부 실시태양에서, ABP는 하나 이상의 상기 잔기의 5 내지 8 옹스트롬에 있다. 일부 실시태양에서, ABP는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 상기 잔기와 상호작용하거나, 차단하거나, 그로부터 8 옹스트롬 내에 있다.
상기 실시예들에서 논의된 결정 구조에 대한 좌표를 표 35.1 (전장 PCSK9 및 31H4), 표 35.2 (PCSK9 및 EGFa), 표 35.3 (PCSK9, 31H4, 및 21B12), 및 표 35.4 (PCSK9 및 31A4)에 제시한다. 도면 및/또는 좌표로부터 구조 상의 그들의 대응하는 위치에 도시된 PCSK9의 구조의 관련 영역 또는 잔기 (EGFa, 또는 항체가 PCSK9와 상호작용하는 위치로부터 15, 15-8, 8, 8-5, 5 옹스트롬 이하 내의 영역 또는 잔기 포함)와 상호작용하는 항원 결합 단백질 및 분자가 또한 고려된다.
좌표에 기재된 항체를 이. 콜라이 내에서 생성시켰고, 따라서 완전 인간 항체와 일부 소수 아미노산 차이를 갖는다. 21B12의 중쇄와 경쇄 및 31H4에 대한 경쇄에 대해 가변 구역의 제1 잔기는 글루타민 대신 글루탐산이었다. 가변 구역의 서열의 차이에 추가로, 좌표로 기재된 항체의 불변 구역에서 일부 차이가 또한 존재하였다 (또한 항체를 이. 콜라이 내에서 생성시켰다는 사실에 기인함). 도 22에서는 서열 156 및 155에 비교한 21B12, 31H4, 및 31A4 Fab (이. 콜라이 내에서 생성시킨)의 불변 구역의 차이를 강조한다 (밑줄친 음영, 또는 굵은 글씨체를 통해). 21B12 31H4, 및 31A4에 대해, 경쇄 불변 서열은 인간 람다 (서열 156)와 유사하다. 밑줄친 글라이신 잔기는 21B12 및 31H4 가변 서열이 중지하고 람다 서열이 시작하는 위치 사이의 삽입이다.
21B12 및 31H4 모두에 대해, 중쇄 불변 구역은 인간 IgG4 (서열 155)와 유사하다. 도 22에서 강조된 차이를 표 36.1에 제시한다:
<표 36.1>
Figure pat00016
31A4에 관하여 상기한 바와 동일한 구별을 또한 갖지만, 3개의 추가의 차이가 존재한다. 도 22에 도시된 바와 같이, 시작부에 2개의 추가의 아미노산이 존재하고, 이는 이. 콜라이 발현에서 신호 펩티드의 불완전 처리에서 기인한다. 또한, 서열 155에 비해 31A4 중쇄 불변 구역 내에 하나의 추가의 치환이 존재하고, 이는 L (서열 155에서)의 H로의 조정이다. 마지막으로, 31A4는 21B12 및 31H4에 대한 상기한 글루탐산에 대한 조정보다는 Fab의 초기 아미노산으로서 글루타민을 갖는다.
3개의 모든 항체에 대해, 중쇄의 말단 (암회색의 글상자)이 또한 상이하지만, 아미노산은 구조 내에서 질서정연하지 않기 때문에 좌표에 나타나지 않는다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, his-태그는 ABP의 요구되는 부분이 아니고, 히스티딘 태그를 포함하는 구체적인 서열 번호를 언급하면서 ABP 서열이 "히스티딘 태그를 포함한다"는 진술에 의해 명백하게 주장되지 않으면 ABP의 서열의 일부로서 간주되지 않아야 한다.
실시예 37
에피토프 매핑 - 비닝
실시예 10의 세트에 추가로 별도의 세트의 비닝 실험을 수행하였다. 실시예 10에서와 같이, 서로 경쟁하는 ABP는 표적 상의 동일한 부위에 결합하는 것으로서 생각될 수 있고, 통상적인 용어로 함께 "비닝하는" 것으로 말해진다.
문헌 [Jia, et al., J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98]에 기재된 다중화 비닝 방법의 변형을 이용하였다. 스트렙타비딘-코팅된 루미넥스 (Luminex) 비드의 개별 비드 코드를 100 ㎕ 0.5 ㎍/ml 비오티닐화된 일가 마우스-항-인간 IgG 포획 항체 (비디 파밍겐 (BD Pharmingen), #555785)와 함께 1시간 동안 실온에서 암소에서 인큐베이팅한 후, PBSA (포스페이트 완충 염수 (PBS) + 1% 소 혈청 알부민 (BSA))로 3x 세척하였다. 각각의 비드 코드를 100 ㎕ 2 ㎍/ml 항-PCSK9 항체 (코팅 항체)와 함께 1시간 동안 따로 인큐베이팅한 후, PBSA로 3x 세척하였다. 비드를 모인 후 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어 (Millipore), #MSBVN1250)로 분배하였다. 100 ㎕의 2 ㎍/ml 정제된 PCSK9 단백질을 절반의 웰에 첨가하였다. 버퍼를 대조군으로서 다른 절반에 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 인큐베이팅한 후 세척하였다. 100 ㎕의 2 ㎍/ml 항-PCSK9 항체 (검출 Ab)를 모든 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이팅한 후 세척하였다. 무관련 인간-IgG (잭슨 (Jackson), #009-000-003)를 또다른 대조군으로서 실행하였다. 20 ㎕의 PE-컨쥬게이팅된 일가 마우스-항-인간 IgG (비디 파밍겐, #555787)를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이팅한 후 세척하였다. 비드를 100 ㎕ PBSA에 재현탁하고, 최소 100 이벤트 (event)/비드 코드를 BioPlex 기기 (바이오라드) 상에서 수집하였다.
PCSK9가 없는 항체 쌍의 중간 형광 강도 (MFI)를 PCSK9를 함유하는 대응하는 반응물의 신호로부터 공제하였다. 동시에 결합되는 것으로 간주되고, 따라서 상이한 빈 내의 항체 쌍에 대해, 공제된 신호는 그 자신과 경쟁하는 항체의 신호보다 3배 더 크고 무관련 항체와 경쟁하는 항체의 신호의 3배이어야 한다.
이로부터의 데이타를 도 23a-23d에 도시한다. ABP는 5개의 빈으로 나누어진다. 음영진 글상자는 PCSK9에 동시에 결합할 수 있는 ABP를 나타낸다. 음영지지 않은 글상자는 결합에 대해 서로 경쟁하는 ABP를 나타낸다. 결과의 요약을 표 37.1에 제시한다.
<표 37.1>
Figure pat00017
빈 1 (ABP 21B12와 경쟁한다) 및 빈 3 (31H4와 경쟁한다)은 서로 배타적이고; 빈 2는 빈 1 및 3과 경쟁하고; 빈 4는 빈 1 및 3과 경쟁하지 않는다. 본 실시예에서 빈 5는 다른 빈에는 맞지 않는 ABP를 설명하는 "포괄 (catch all)" 빈으로서 제시된다. 따라서, 각각의 빈 내의 상기 확인된 ABP는 PCSK9 상의 상이한 종류의 에피토프 위치를 대표하고, 그 일부는 서로 겹친다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 참조 ABP가 프로브 ABP의 결합을 방지하면, 항체는 동일한 빈 내에 있는 것으로 말해진다. ABP가 사용되는 순서가 중요할 수 있다. ABP A가 참조 ABP로서 사용되고 ABP B의 결합을 차단하면, 그 반대는 항상 사실인 것이 아니고: 참조 ABP로서 사용된 ABP B가 반드시 ABP A를 차단하지는 않을 것이다. 여기서 역할을 하는 많은 인자가 존재한다: ABP의 결합은 제2 ABP의 결합을 방지하는, 표적에서 입체형태의 변화를 일으킬 수 있거나, 겹치지만 서로 완전히 가리지는 않는 에피토프들은 제2 ABP가 여전히 결합을 허용하도록 표적과 충분히 높은-친화도 상호작용을 갖도록 할 수 있다. 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 ABP는 차단 ABP를 밀어내는 능력이 보다 클 수 있다. 일반적으로, 경쟁이 어느 하나의 순서로 관찰되면, ABP는 함께 비닝하는 것으로 말해지고, 두 ABP가 서로 차단할 수 있으면 아마도 에피토프가 보다 완전히 겹치는 것으로 보인다.
실시예 38
에피토프 매핑 - 웨스턴 블롯
본 실시예에서는 검사한 ABP에 대한 에피토프가 선형인지 입체형태적인지 여부를 입증한다. 어떠한 항체가 입체형태적 에피토프를 갖는지 결정하기 위해, 변성 환원 및 변성 비-환원 웨스턴 블롯을 실행하였다. 변성 환원 웨스턴 블롯에 결합하는 항체는 선형 에피토프를 갖고, 입체형태적이지 않다. 결과를 도 24a 및 도 24b에 제시한다. 블롯에 대해, 0.5 ㎍/레인 (lane)의 정제된 전장 인간 PCSK9를 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔 및 MES SDS 전개 버퍼에서 전개시켰다. 1 ㎍/ml 항-PCSK9 항체 (0.5 ㎍/ml 31G11을 제외)를 사용하여 블롯을 프로빙하였다. 1:5000 원숭이-항-인간-IR700 2차 항체를 사용하고, LiCOR 기기 상에서 판독하였다. 항체 13H1은 PCSK9의 프로-도메인 상에 결합하였다. 다른 모든 항체는 입체형태적 에피토프와 일치하는 결과를 보였다. 이들 겔을 나머지 단백질로부터 프로-도메인을 떼어내고, 프로도메인을 약 15 kDa에서 전개하였다. 추가로, 3C4 및 31A4는 디술피드 결합에 의해 보존된 입체형태적 에피토프에 결합하는 것으로 나타났고, 이는 이들 항체가 디술피드 결합은 보존되는 변성 조건 하에 PCSK-9에 결합하지만 (좌측), 샘플을 환원시키면 (우측) 결합을 제거하기 때문이다.
실시예 39
에피토프 매핑 - 아르기닌/글루탐산 스캐닝
(실시예 37의) 각각의 빈으로부터 대표적인 ABP를 추가의 에피토프 분석을 위해 선택하였다. PCSK9에 결합하는 ABP를 매핑하기 위해 아르기닌/글루탐산-스캐닝 전략을 수행하였다. 배경으로서, 상기 방법은 잔기가 항체와 접촉하거나 항체에 의해 묻히는 항원 내의 잔기를 의미하는 구조적 에피토프의 일부인지 결정한다. 아르기닌 및 글루탐산 측쇄는 전하를 띄고 부피가 크고, 돌연변이된 잔기가 항체 결합에 직접 관여되지 않더라도 항체 결합을 파괴할 수 있다.
잔기 선택
PCSK9의 결정 구조를 사용하여 에피토프 매핑을 위해 돌연변이시킬 잔기를 선택하였다. 돌연변이시킬 잔기를 선택하기 위해 사용된 방법은 전산 (computational) 메카니즘 및 상호작용 구조 분석을 모두 포함하였다. PCSK9 구조는 실종 잔기의 갭을 함유하였고, N-(즉, 신호 서열)말단에서 30개의 아미노산 및 C-말단에서 10개의 아미노산이 실종되었다. 내부 실종 잔기는 구조 상에 모델링되었지만, N- 및 C-말단 실종 잔기는 그렇지 않았다. 각각의 잔기에 대한 용매 노출비를 계산하였다: 단백질의 면에서 각각의 잔기의 표면적 (SA1)을 보존된 백본 구조를 갖는, 측면에 위치하는 (flanking) 글라이신이 존재하는 삼량체 내의 잔기의 표면적 (SA2)으로 나누었다. 용매 노출비가 10%를 초과하는 잔기 (R10), 및 40개의 실종 말단 잔기를 선택하였다. 이들로부터, 미스폴딩의 가능성을 감소시키기 위해 양성 Φ 각을 갖는 프롤린 및 글라이신을 제외하였다. V 도메인 내에서 돌연변이시킬 잔기의 수는, 돌연변이의 총수를 285로 하도록 전체 단백질의 시각 검사와 함께 37%의 용매 노출비를 사용함으로써 감소시켰다. 이들 다양한 종류를 확인하는 PCSK9의 표면의 다양한 배향을 도 25a-25f에 도시한다. 이들 도면에서, 가장 연회색은 선택되지 않거나 선택에서 제외된 영역을 나타내고, 보다 진회색은 선택된 잔기를 나타낸다.
클로닝 및 발현
변경시킬 잔기가 일단 확인되면, 다양한 잔기를 변경시켰다. 인간 PCSK9를 pTT5 벡터 내로 C-말단 Flag-His 태그와 함께 클로닝하였다. 상기 원래의 구성체로부터 QuikChange II 키트 (스트라타젠 (Stratagene))를 사용하는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 돌연변이체를 제조하였다. 돌연변이 유발을 위해 사용되는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암젠 (Amgen)의 MutaGenie 소프트웨어를 사용하여 설계하였다. 모든 PCSK9 구성체를 일시적으로-형질감염시킨 293-6E 세포 내에서 24-웰 플레이트에서 발현시키고, 각각의 플레이트 내에 비-돌연변이된 PCSK9 대조군 (야생형, WT)과 함께 3개의 96-웰 플레이트 내로 다시 설치하였다. 조건화 배지 내의 재조합 단백질의 발현 수준 및 통합성을 웨스턴 블롯에 의해 검토하였다. 원래 선택된 285개의 돌연변이체 중에서, 41개는 클로닝 또는 발현에서 실패하였다. 244개의 돌연변이체를 에피토프 매핑을 위해 사용하였다. PCSK9 모 서열, 및 244개의 돌연변이된 잔기를 갖는 대표적인 PCSK9 서열의 정렬을 도 26에 도시한다. 단일 돌연변이를 함유하는 별도의 구성체를 제조하였다. 결합에서 변화를 포함하는 에피토프 서열 및 에피토프에 기초한 발명을 위해, 서열 1 및/또는 서열 303을 참조하여 서열을 제공한다. 도 26의 서열은 본 결합 에피토프 연구를 위해 사용된 서열이었다. 당업자는 본 연구의 결과가 본원에서 개시되는 다른 PCSK9 변이체 (예를 들어, 서열 1 및 3, 및 다른 대립유전자 변이체)에도 적용됨을 알 것이다.
정밀한 에피토프 매핑을 위해 각각의 빈을 대표하는 5개의 항체를 선택하였다. 이들은 21B12, 31H4, 12H11, 31A4, 3C4이었다. 모든 입체형태적 에피토프 항체. 3개, 즉, 21B12, 31H4, 및 31A4를 또한 상기한 바와 같이 PCSK9와 함께 결정화하였다.
구조적 및 기능적 에피토프
에피토프는 구조적 또는 기능적으로서 추가로 정의할 수 있다. 기능성 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위세트이고, 상호작용 (예를 들어 수소 결합, 이온성 상호작용)의 친화도에 직접 기여하는 잔기를 갖는다. 구조적 에피토프는 항체에 의해 덮이는 표적의 패치 (patch)로서 생각될 수 있다.
사용된 스캐닝 돌연변이 유발은 아르기닌 및 글루탐산 스캔이었다. 이들 2개의 측쇄는 그들의 큰 입체 부피와 전하 때문에 선택되었고, 항체 결합에 대해 보다 큰 효과를 갖도록 돌연변이가 구조적 에피토프 내에 일어나도록 한다. 아르기닌은 WT 잔기가 아르기닌인 경우를 제외하고 일반적으로 사용되고, 이들 경우에 전하를 바꾸기 위해 잔기는 글루탐산으로 돌연변이된다.
에피토프 매핑의 목적에서, 비드-기반 다중화 분석을 이용하여 PCSK9 및 PCSK9 돌연변이체에 대한 항체 결합을 동시에 측정하였다. 이어서, 돌연변이체에 대한 항체 결합을 동일한 웰에서 야생형에 대한 그의 결합에 비교하였다. 변이체를 3개의 군으로 나누었다: 1군: 81 변이체 + 2 wt 대조군 + 1 음성 대조군 + 1 다른 PCSK9 상등액; 2군: 81 변이체 + 2 wt 대조군 + 2 음성 대조군; 및 3군: 82 변이체 + 2 wt 대조군 + 1 음성 대조군.
분석을 다음과 같이 실행하였다: 85 세트의 색상 코드 (color-coded)의 스트렙타비딘-코팅된 LumAvidin 비드 (루미넥스)를 비오티닐화된 항-펜타His 항체 (퀴아젠 (Qiagen), #1019225)와 1시간 동안 실온에서 (RT) 결합시킨 후, PBS, 1% BSA, 0.1% Tween 20 내에서 3회 세척하였다. 이어서, 각각의 색상 코드의 비드 세트를 150 ㎕ 상등액 내에서 PCSK9 돌연변이체, 야생형, 또는 음성 대조군에 밤새 4℃에서 결합시켰다.
색상 코드의 비드 세트 (각각 특이적 단백질과 회합됨)를 세척하고 모았다. 이 시점에, 85 비드 세트의 3개 풀 (pool)이 존재하였고, 여기서 하나의 풀은 돌연변이체 및 대조군의 각각의 군에 대한 것이다. 각각의 풀로부터의 비드를 96-웰 필터 플레이트 (밀리포어, #MSBVN1250)의 24웰 (3 컬럼)에 분취하였다. 4-배 희석액 내의 100 ㎕의 항-PCSK9 항체를 삼중점을 위해 9개 컬럼에 첨가하고 1시간 동안 RT에서 인큐베이팅하고 세척하였다. 100 ㎕의 1:200 희석액 피코에리트린 (PE)-컨쥬게이팅된 항-인간 IgG Fc (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch), #109-116-170)를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 RT에서 인큐베이팅하고 세척하였다.
비드를 PBS 중의 1% BSA 내에 재현탁하고, 10분 동안 진탕하고, BioPlex 기기 (바이오라드) 상에서 판독하였다. 기기는 각각의 비드를 그의 색상-코드에 의해 확인하여, 색상-코드와 회합된 특이적 단백질을 확인한다. 동시에, 기기는 PE 염료의 형광 강도에 의해 비드에 결합된 항체의 양을 측정한다. 이어서, 각각의 돌연변이체에 대한 항체 결합을 동일한 풀 내의 야생형에 대한 그의 결합에 직접 비교할 수 있다. IL-17R 키메라 E를 음성 대조군으로서 사용하였다. 검사한 모든 돌연변이체를 표 39.1에 제시한다 (도 1a 및 도 26에 사용된 서열 넘버링을 참조함).
<표 39.1>
Figure pat00018
비드 가변성 연구
에피토프 매핑 결합 분석을 실행하기 전에, "비드 구역" 대 "비드 구역" (B-B) 가변성을 평가하기 위해 확인 실험을 수행하였다. 확인 실험에서, 모든 비드를 동일한 야생형 대조군 단백질로 컨쥬게이팅하였다. 따라서, 비드 구역들 사이의 차이는 순수하게 B-B 분산 (variance)으로 인한 것이고, 야생형과 돌연변이체 단백질 사이의 차이에 의해 혼동되지 않는다. 항체의 적정은 상이한 웰에서 12중으로 실행하였다.
상기 통계학적 분석의 목적은 결합 곡선의 추정된 EC50의 B-B 가변성을 추정하기 위한 것이었다. 이어서, 추정된 B-B 표준 편차 (SD)를 사용하여, 곡선 비교 실험 동안 야생형 및 돌연변이체 단백질의 EC50 신뢰 구간을 구축하였다.
4 파라미터 로지스틱 (logistic) 모델을 각각의 비드 구역에 대한 결합 데이타에 피팅하였다. 곡선 품질 관리 (QC) 결과, 및 곡선의 Top (max), Bottom (min), Hillslope (기울기) 및 EC50의 자연 로그 (xmid)에 대한 파라미터 추정치를 포함한 생성되는 파일을 분석을 위한 미가공 데이타로서 사용하였다. 이어서, 각각의 파라미터에 대한 B-B 가변성을 SAS PROC MIXED 절차를 이용하여 혼합형 효과 모델을 피팅함으로써 추정하였다. "우수한" QC 상태를 갖는 곡선만을 분석에 포함시켰다. 최종 혼합형 효과 모델은 무작위 효과로서 잔류 (즉, 개별 비드 구역)만을 포함하였다. 각각의 파라미터에 대한 최소 제곱 평균 (LS-평균)을 혼합형 효과 모델에 의해 또한 추정하였다. B-B SD는 B-B 분산의 제곱근을 취함으로써 계산하였다. LS-평균 + 2SD와 LS-평균 - 2SD (집단의 대략 상부 및 하부 97.5 백분위수를 나타냄) 사이의 변화 배수를 또한 계산하였다. 결과를 표 39.2에 나타낸다.
<표 39.2>
Figure pat00019
구조적 에피토프 내의 잔기 확인
잔기는 그를 아르기닌 또는 글루탐산으로 돌연변이시킬 때 항체 결합을 변경시키면 구조적 에피토프의 일부로서 간주되었다 ("적중"). 이것은 야생형에 대한 항체 결합에 비해 EC50의 이동 또는 최대 신호의 감소로서 보인다. 야생형 및 돌연변이체에 대한 항체 결합 곡선의 통계학적 분석을 이용하여 통계학상 유의한 EC50 이동을 확인하였다. 분석에서는 분석 및 곡선 피팅에서 분산을 고려한다.
EC50 비교에 기초한 적중 확인
EC50 및 Bmax 값은 VarPower 소프트웨어가 있는 S-PLUS (인사이트풀 코퍼레이션 (Insightful Corporation, 미국 워싱톤주 시애틀))를 사용하여 결합 데이타에 피팅된 가중된 4-파라미터 로지스틱 모델로부터 생성하였다. 돌연변이체 결합 곡선 및 야생형 결합 곡선의 EC50을 비교하였다. 통계학상 유의한 차이는 추가의 고려를 위한 적중으로서 확인하였다. "피트없음 (nofit)" 또는 "불량 피트 (badfit)" 플래그 (flag)를 갖는 곡선은 분석에서 제외하였다.
EC50 추정치의 분산
2개의 분산원, 즉, 곡선 피트로부터의 분사 및 비드-비드 분산이 EC50 추정치의 비교에서 고려되었다. 야생형 및 돌연변이체는 그들의 차이가 비드-비드 차이 (상기 설명됨)와 혼동되기 때문에 상이한 비드에 연결시켰다. 곡선 피트 분산은 로그 EC50 추정치의 표준 오차에 의해 추정하였다. 비드-비드 분산은 야생형 대조군을 각각의 하나의 비드에 연결시키는 실험 (상기 설명됨)을 이용하여 실험적으로 결정하였다. 상기 실험으로부터의 야생형 결합 곡선의 EC50 추정치의 비드 분산을 사용하여 실제 에피토프 매핑 실험에서 비드-비드 분산을 추정하였다.
돌연변이체와 야생형 사이의 EC50 이동에 대한 시험
2개의 EC50 (로그 규모)의 비교는 스튜던트 (Student) t-검정을 이용하여 수행하였다. t-통계학은 델타 (EC50 추정치들 사이의 절대적 차이) 및 델타의 표준 편차 사이의 비로서 계산하였다. 델타의 분산은 3개의 성분, 즉, 비선형 회귀에서 돌연변이체 및 야생형 곡선에 대한 EC50의 분산 추정치, 및 별도의 실험으로부터 추정된 비드-비드 분산의 2배의 합에 의해 추정하였다. 비드-비드 분산에 대한 배수 2는 돌연변이체 및 야생형 비드가 모두 동일한 분산을 가졌다는 가정에 기인하였다. 델타의 표준 편차의 자유도는 새터스웨이트 (Satterthwaite's (1946)) 근사법을 이용하여 계산하였다. 개별 p-값 및 신뢰 구간 (95% 및 99%)은 각각의 비교를 위하여 스튜던트 t 분포에 기초하여 유도되었다. 다수의 야생형 대조군의 경우에, 돌연변이체에 가장 유사한 야생형 대조군를 선별함으로써, 즉, 최대 p-값을 갖는 것을 선별함으로써 보존적 방법을 취하였다.
다수의 시험을 동시에 수행하면서 가양성(들)을 조절하기 위해 다중도 조정이 중요하였다. 본 분석을 위해 2가지 형태의 다중도 조정을 실행하였다: 족적 오류 (family wise error; FWE) 조절 및 거짓 발견율 (false discovery rate; FDR) 조절. FWE 방법은 하나 이상의 적중이 실제가 아닐 가능성을 조절하고; FDR 방법은 선택된 적중 중에서 가양성의 예상된 비율을 조절한다. 전자의 방법은 후자의 방법보다 더 보존적이고 덜 강력하다. 분석을 위해 두 방법 모두에 대해 이용가능한 많은 방법이 존재하고; FWE 분석을 위해 호크버그 (Hochberg's (1988)) 방법, 및 FDR 분석을 위해 벤자미니-호크버그 (Benjamini-Hochberg's (1995)) FDR 방법을 선택하였다. 두 방법에 대한 조정된 p-값을 계산하였다.
결과
EC50 이동
그의 EC50이 야생형과 유의하게 상이한, 예를 들어, 전체 분석에 대한 거짓 발견율 조정된 p-값이 0.01 이하인 돌연변이는 구조적 에피토프의 일부인 것으로 고려된다. 모든 적중은 또한 항체당 FWE 조정된 p-값이 0.0109인 항체 31H4에 대한 잔기 R185E를 제외하고는, 각각의 항체에 대한 가족단위 (Familywise) 타입 I 오류율 조정된 p-값이 0.01 미만이었다. EC50 이동에 의해 결정된 다양한 항체의 구조적 에피토프 내의 잔기를 표 39.3에 제시한다 (점 돌연변이는 서열 1 및 303을 참조한 것이다).
<표 39.3>
Figure pat00020
최대 신호 감소
최대 신호%는 곡선 피팅 (BmaxPerWT) 및 미가공 데이타점 (RawMaxPerWT)으로부터의 최대 신호를 사용하여 계산하였다. 야생형 신호에 비해 항체 결합 최대 신호를 ≥70% 감소시키거나, 모든 다른 항체가 야생형의 적어도 40%일 때 다른 항체에 비해 하나의 항체의 신호를 >50% 감소시킨 돌연변이가 적중이고 에피토프의 일부인 것으로 고려되었다. 표 39.4에서는 최대 신호의 감소에 의해 결정될 때 구조적 에피토프 내의 잔기를 표시한다 (이탤릭체).
<표 39.4>
Figure pat00021
표 39.5는 다양한 항체에 대한 모든 적중의 요약을 나타낸다.
<표 39.5>
Figure pat00022
이들 잔기가 관련 에피토프의 일부 또는 전부를 형성하는 방법을 추가로 검사하기 위해, 상기한 위치를 다양한 결정 구조 모델 내로 매핑하였고, 결과를 도 27a 내지 27e에 도시한다. 도 27a는 21B12 항체를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑될 때, 21B12 에피토프 적중을 도시한 것이다. 구조는 PCSK9 잔기를 다음과 같이 확인한다: 연회색은 돌연변이되지 않은 잔기를 나타내고 (구조 상에 명백하게 지시된 잔기를 제외함), 보다 진회색은 돌연변이된 잔기를 나타낸다 (그 중 소수는 표현되지 않았다). 명백하게 지시되는 잔기를 시험하였고 (도면에 지시된 음영에 무관하게), EC50 및/또는 Bmax의 유의한 변화를 일으켰다. 에피토프 적중은 Bmax 이동에 기초하였다. 본 도면에서, 31H4는 21B12 뒤에 있다.
도 27b는 31H4 및 21B12 항체를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑될 때, 31H4 에피토프 적중을 도시한 것이다. 구조는 PCSK9 잔기를 다음과 같이 확인한다: 연회색은 돌연변이되지 않은 잔기를 나타내고 (구조 상에 명백하게 지시된 잔기를 제외함), 보다 진회색은 돌연변이된 잔기를 나타낸다 (그 중 소수는 표현되지 않았다). 명백하게 지시되는 잔기를 시험하였고 (도면에 지시된 음영에 무관하게), EC50 및/또는 Bmax의 유의한 변화를 일으켰다. 에피토프 적중은 EC50 이동에 기초하였다.
도 27c는 31H4 및 21B12 항체를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑될 때, 31A4 에피토프 적중을 도시한 것이다. 구조는 PCSK9 잔기를 다음과 같이 확인한다: 연회색은 돌연변이되지 않은 잔기를 나타내고 (구조 상에 명백하게 지시된 잔기를 제외함), 보다 진회색은 돌연변이된 잔기를 나타낸다 (그 중 소수는 표현되지 않았다). 명백하게 지시되는 잔기를 시험하였고 (도면에 지시된 음영에 무관하게), EC50 및/또는 Bmax의 유의한 변화를 일으켰다. 에피토프 적중은 EC50 이동에 기초하였다. 31A4 항체는 PCSK9의 V-도메인에 결합하는 것으로 알려져 있고, 이는 도 27c에 제시된 결과와 일치하는 것으로 나타난다.
도 27d는 31H4 및 21B12 항체를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑될 때, 12H11 에피토프 적중을 도시한 것이다. 구조는 PCSK9 잔기를 다음과 같이 확인한다: 연회색은 돌연변이되지 않은 잔기를 나타내고 (구조 상에 명백하게 지시된 잔기를 제외함), 보다 진회색은 돌연변이된 잔기를 나타낸다 (그 중 소수는 표현되지 않았다). 명백하게 지시되는 잔기를 시험하였고 (도면에 지시된 음영에 무관하게), EC50 및/또는 Bmax의 유의한 변화를 일으켰다. 12H11은 상기 설명된 비닝 분석에서 21B12 및 31H4와 경쟁한다.
도 27e는 31H4 및 21B12 항체를 사용하여 PCSK9의 결정 구조 상으로 매핑될 때, 3C4 에피토프 적중을 도시한 것이다. 구조는 PCSK9 잔기를 다음과 같이 확인한다: 연회색은 돌연변이되지 않은 잔기를 나타내고 (구조 상에 명백하게 지시된 잔기를 제외함), 보다 진회색은 돌연변이된 잔기를 나타낸다 (그 중 소수는 표현되지 않았다). 명백하게 지시되는 잔기를 시험하였고 (도면에 지시된 음영에 무관하게), EC50 및/또는 Bmax의 유의한 변화를 일으켰다.
3C4는 비닝 분석에서 21B12 및 31H4와 경쟁하지 않는다. 3C4는 도메인 결합 분석에서 V-도메인에 결합한다 (실시예 40의 결과, 도 28a 및 28b 참조).
(결정 구조에 기초하여) 결합에 영향을 미치는 것으로 예상된 대략 12개의 돌연변이체가 존재하지만, 본 실험에서는 놀랍게도 이들이 영향을 미치지 않았음을 입증하였다. 당업자가 알 바와 같이, 상기 제시된 결과는 이들 항체의 결정 구조 및 PCSK9의 결합과 잘 일치한다. 이것은 제공된 구조 데이타 및 대응하는 기능 데이타가 중화 ABP 및 PCSK9의 상호작용의 핵심 잔기 및 영역을 적합하게 확인함을 입증한다. 따라서, 상기한 영역에 결합할 수 있는 능력을 갖는 ABP의 변이체는 본 발명의 설명에 의해 적합하게 제공된다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, B-max 하락 및 EC50 이동 적중은 동일한 현상을 제시하는 것으로 여겨질 수 있지만, 엄격하게 말하면, B-max 하락은 단독으로 친화도 손실 자체를 반영하지 않고, 대신 일부 비율의 항체의 에피토프의 파괴를 반영한다. B-max 및 EC50에 의해 결정된 적중에는 겹침이 없지만, 결합에 대해 강한 효과를 갖는 돌연변이는 유용한 결합 곡선의 생성을 허용하지 않을 수 있고, 따라서 상기 변이체에 대해 EC50이 결정될 수 없다.
당업자가 알 수 있는 바와 같이, 동일한 빈 내의 ABP (상기한 바와 같이, 일반적인 포괄 빈인 빈 5 제외)는 아마도 표적 단백질 상의 겹치는 부위에 결합한다. 따라서, 상기 에피토프 및 관련 잔기는 일반적으로 동일한 빈 내의 모든 그러한 ABP에 연장될 수 있다.
ABP 31H4에 관하여 상기 결과를 추가로 검사하기 위해, 상기 결정 구조에 따라, R185와 상호작용하여 ABP와 상호작용하는 표면의 일부를 형성하는 것으로 예측된 위치 E181R을 또한 변경시켰다 (E181R). 결과는 그 자체로는 통계학상 유의하지 않지만 결정 구조와 조합될 때, E181R과 상호작용하는 31H4를 입증하였다 (데이타를 제시하지 않음). 따라서, 위치 181은 또한 31H4 ABP에 대한 에피토프의 일부를 형성하는 것으로 보인다.
상기한 바와 같이, 상기 결합 데이타 및 에피토프 특성결정에서는 PCSK9의 처음 30개 아미노산을 포함하지 않는 PCSK9 서열 (서열 1)을 참조한다. 따라서, 상기 단백질 단편의 넘버링 시스템, 및 상기 단편을 나타내는 서열 번호는 전장 PCSK9 넘버링 시스템을 사용한 데이타 및 실험 (예를 들어, 상기 설명된 결정 연구 데이타에서 사용된 것)에 비해 30개 아미노산이 이동되었다. 따라서, 이들 결과를 비교하기 위해, 여분의 30개 아미노산이 각각의 상기 에피토프 매핑 결과 내의 위치에 부가되어야 한다. 예를 들어, 서열 1 (또는 서열 303)의 위치 207은 서열 3 (전장 서열, 및 나머지 명세서 전체에서 사용되는 넘버링 시스템)의 위치 237에 상호관련된다. 표 39.6에서는 서열 1 (및/또는 서열 303)을 언급하는 상기한 위치가 서열 3 (신호 서열을 포함하는)과 상호관련되는 방법을 개략한다.
<표 39.6>
Figure pat00023
따라서, 서열 1을 참조하여 본원에 설명되는 실시태양은 또한 서열 3을 참조한 상기한 그들의 대응하는 위치에 의해 설명할 수 있다.
실시예 40
PCSK9 도메인 결합 분석
본 실시예에서는 다양한 ABP가 결합하는 PCSK9 상의 위치를 검사하였다.
투명한 96웰 maxisorp 플레이트 (NUNC)를 PBS 중에 희석한 2 ㎍/ml의 다양한 항-PCSK9 항체로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS/0.05% Tween-20으로 철저히 세척한 후, 2시간 동안 3% BSA/PBS로 차단시켰다. 세척 후에, 플레이트를 2시간 동안 일반적 분석 희석제 (이뮤노케미스트리 테크놀로지스, 엘엘씨 (Immunochemistry Technologies, LLC)) 내에 희석시킨 전장 PCSK9 (서열 3의 aa 31-692), procat PCSK9 (서열 3의 aa 31-449) 또는 v-도메인 PCSK9 (서열 3의 aa 450-692)와 함께 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척하고, procat 및 v-도메인 및 전장 PCSK9를 인식하는 토끼 폴리클로날 비오티닐화된 항-PCSK9 항체 (D8774)를 1 ㎍/ml (1% BSA/PBS 중)로 첨가하였다. 결합된 전장, procat 또는 v-도메인 PCSK9를 뉴트라비딘-HRP (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)) 200 ng/ml (1% BSA/PBS 중), 이어서 TMB 기질 (KPL)과 함께 인큐베이션한 후, 650 nm에서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 도 28a 및 28b에 제시된 결과는 PCSK9의 다양한 부분에 결합하는 다양한 ABS의 능력을 입증한다. 도 28b에 도시된 바와 같이, ABP 31A4는 PCSK9의 V 도메인에 결합한다.
실시예 41
중화, 비-경쟁적 항원 결합 단백질
본 실시예에서는 PCSK9와의 결합에 대해 LDLR과 비-경쟁적이지만, 여전히 PCSK9 활성에 대해 중화성인 항원 결합 단백질을 확인하고 특성결정하는 방법을 입증한다. 즉, 상기 항원 결합 단백질은 PCSK9가 LDLR에 결합하는 것을 차단하지 않을 것이지만, PCSK9 매개된 LDLR 분해를 방지하거나 감소시킬 것이다.
투명한 384웰 플레이트 (Costar)를 버퍼 A (100 mM 나트륨 카코딜레이트, pH 7.4) 내에 희석시킨 2 ㎍/ml의 염소 항-LDL 수용체 항체 (R&D 시스템즈)로 코팅하였다. 플레이트를 버퍼 A로 철저히 세척한 후, 2시간 동안 버퍼 B (버퍼 A 중의 1% 우유)로 차단하였다. 세척 후에, 플레이트를 1.5시간 동안 버퍼 C (10 mM CaCl2를 보충한 버퍼 B) 내에 희석시킨 0.4 ㎍/ml의 LDL 수용체 (R&D 시스템즈)와 함께 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이션과 동시에, 20 ng/ml의 비오티닐화된 D374Y PCSK9를 버퍼 A 내에 희석한 100 ng/ml의 항체, 또는 버퍼 A 단독 (대조군)과 함께 인큐베이팅하였다. LDL 수용체 함유 플레이트를 세척하고, 비오티닐화된 D374Y PCSK9/항체 혼합물을 플레이트에 옮기고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. LDL 수용체에 대한 비오티닐화된 D374Y의 결합은 버퍼 C 중의 500 ng/ml의 스트렙타비딘-HRP (바이오소스), 이어서 TMB 기질 (KPL)과 함께 인큐베이팅하여 검출하였다. 신호를 1N HCl로 켄칭하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 결과를 도 28c에 제시하고, 이는 ABP 31H4가 LDLR 결합을 억제하는 반면, ABP 31A4가 PCSK9에 대한 LDLR 결합을 억제하지 않음을 보여준다. 실시예 40의 결과와 도 28a 및 28b에 도시된 것과 조합하면, 31A4 ABP는 PCSK9의 V 도메인에 결합하고, LDLR과의 PCSK9의 상호작용을 차단하지 않음이 분명하다.
다음으로, 중화 ABP로서 역할을 하는 ABP 31A4의 능력은 세포 LDL 흡수 분석 (상기 실시예에 설명된 바와 같이)를 통해 추가로 확인하였다. 상기 LDL 흡수 분석의 결과를 도 28d에 제시한다. 도 28d에 제시된 바와 같이, ABP 31A4는 유의한 PCSK9 중화 능력을 나타낸다. 따라서, 실시예 40 및 본 결과에 비추어, ABP는 PCSK9 및 LDLR 결합 상호작용을 차단하지 않으면서 여전히 중화 PCSK9 ABP로서 유용하여 PCSK9에 결합할 수 있음이 분명하다.
참고 문헌의 포함
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등 및 이들에서 언급된 참고문헌을 포함하여 본원에서 언급된 모든 참고문헌은 이들이 존재하지 않지만 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨다. 참조로 포함된 참고문헌에 제시된 임의의 정의 또는 용어가 본원에서 제공되는 용어 및 논의와 상이한 경우에는, 본원의 용어 및 정의가 적용된다.
균등물
상기 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있을 정도로 충분한 것으로 간주된다. 상기한 설명 및 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시태양을 상세히 제시하는 것이고, 본 발명자들에 의해 고려되는 최량의 방식을 설명한다. 그러나, 본원 명세서에서 본 발명이 아무리 상세히 설명된 것으로 보일 수 있더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 균등물에 따라 해석되어야 함을 이해할 것이다.
<표 35.1>
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<표 35.3>
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<표 35.4>
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SEQUENCE LISTING <110> Jackson, Simon Mark Walker, Nigel P.C. Piper, Derek E. Shen, Wenyan King, Chadwick Terence Ketchem, Randal Robert Mehlin, Christopher Carabeo, Teresa <120> ANTIGEN BINDING PROTEINS TO PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN TYPE (PCSK9) <130> APMOL.003C10 <140> US 13/860,016 <141> 2013-04-10 <150> US 13/655,984 <151> 2012-10-19 <150> US 12/474,176 <151> 2009-05-28 <150> US 12/197,093 <151> 2008-08-22 <150> US 61/086,133 <151> 2008-08-04 <150> US 61/010,630 <151> 2008-01-09 <150> US 61/008,965 <151> 2007-12-21 <150> US 60/957,668 <151> 2007-08-23 <160> 575 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Glu Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg 1 5 10 15 Ser Glu Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala 20 25 30 Thr Phe His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr 35 40 45 Val Val Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr 50 55 60 Ala Arg Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ile Leu His Val Phe His Gly Leu 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tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagtctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt atttctgtgc gagaggttac 300 ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 99 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact ctgtctcgtg gtaccaacag 120 cacccaggca aaccccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttatttctgc agctcatata caagcaccag catggtcttc 300 ggcggaggga ccaagctggc cgtccta 327 <210> 100 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta caccttaacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gtcagttttt ataatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag aggcaccatg accacagacc catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggctac 300 ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 101 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact ctgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca ctaatcggcc ctcaggggtt 180 tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc aactcatata caagcaccag catggtgttc 300 ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 102 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatat ataacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagag 300 gatacagcta tggttcctta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 103 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 cagtctgtac tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcacattatg atgtgcactg gtaccagcag 120 gttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca cctatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaacagcct gagtggtgtg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 104 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaac agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atctggtctg atggaagtga tgaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagccata 300 gcagccctct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 105 <211> 330 <212> DNA <213> 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caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattttg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gactataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagtctgag tggttatgtc 300 ttcggaactg ggaccagggt caccgtccta 330 <210> 108 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaac agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggtctg atggaagtga taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagccata 300 gcagccctct actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 109 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagttc caacattggg 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DNA <213> Homo sapiens <400> 144 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact cacctttagt aacttttgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attcctgtac gagagagtca 300 aactggggat ttgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357 <210> 145 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaaaactg taaactggta ccagcagttc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc ggcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa ttgggtgttc 300 ggcgcaggga ccaagctgac cgtccta 327 <210> 146 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagg tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgttt attactgtgc gagagggtat 300 actcgggact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 147 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 cagcctgtgc tgactcagcc actttttgca tcagcctccc tgggagcctc ggtcacactc 60 acctgcaccc tgagcagcgg ctacagtagt tatgaagtgg actggtatca gcagagacca 120 gggaagggcc cccggtttgt catgcgagtg gacactggtg ggattgtggg atccaagggg 180 gaaggcatcc ctgatcgctt ctcagttttg ggctcaggcc tgaatcggta tctgaccatc 240 aagaacatcc aggaagagga tgagagtgac taccactgtg gggcagacca tggcagtggg 300 accaacttcg tggtggtatt cggcggaggg accaagctga ccgtccta 348 <210> 148 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt gcgtactact ggaactggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagaac cgactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaagca gttctccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agggcagctc 300 gtcccctttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcttca 348 <210> 149 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaattggta tcagcaactc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 150 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttccc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcagagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggaggtga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt tttactgtgc gagaggctac 300 gttatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctct 345 <210> 151 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt cgttataatt ctgtctcctg gtaccaacac 120 cacccaggca aagcccccaa agtcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctactcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cgttgtattc 300 ggcggaggga ccaaactgac cgtccta 327 <210> 152 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catttcctac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt atttctgtgc gagagattac 300 gatttttgga gtgcttacta tgatgctttt gatgtctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 153 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tctggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 154 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr 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327 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 328 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 329 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Leu Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 330 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Ala Ile Ala Ala Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 331 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Asp Ser Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 332 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 333 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 334 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Leu Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 335 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Gly Ile Ala Val Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 336 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 337 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 338 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 339 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val Asn 1 5 10 <210> 340 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Ser Asn Asn Arg Arg Pro Ser 1 5 <210> 341 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Trp Val 1 5 10 <210> 342 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 342 Tyr Trp Met Ser 1 <210> 343 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 343 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 344 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 344 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 345 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 345 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 346 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 346 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 347 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 347 Asn Ile Lys His Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 348 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 348 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Val 1 5 10 <210> 349 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 349 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Leu 1 5 <210> 350 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 350 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 351 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 351 Asn Phe Trp Met Ser 1 5 <210> 352 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 352 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 353 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 353 Ala Ala Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 354 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 354 Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 355 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 355 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 356 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 356 Ala Ala Ala Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 357 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 357 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Ile Thr 1 5 <210> 358 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 358 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 359 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 359 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 360 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 360 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 361 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 361 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 362 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 362 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 363 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 363 Lys Phe Val Leu Met Val Tyr Ala Met Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 364 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 364 Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 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Homo sapiens <400> 382 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 383 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 383 Leu Ile Trp Ser Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 384 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 384 Leu Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 385 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 386 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 386 Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Val 1 5 10 <210> 387 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Gly Tyr Val Met Asp Val 1 5 <210> 388 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 389 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 389 Thr Gly Thr Asn Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 390 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 390 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 391 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 391 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 392 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 392 Arg Asn Asn Gln Arg Pro Leu 1 5 <210> 393 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 393 Ala Ala Ala Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 394 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 394 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Ile Thr 1 5 <210> 395 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 395 Asn Ser Tyr Thr Ser Thr Ser Met Val 1 5 <210> 396 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 396 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Val Val 1 5 <210> 397 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 397 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Trp Val 1 5 10 <210> 398 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 398 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 399 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 399 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 400 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 400 Gln Val Gln Leu Gln 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Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asn Trp Gly Phe Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser 115 <210> 402 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 402 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 <210> 403 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 403 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 404 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa= D, A, R or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, I, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=D, A, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, A, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=W, L, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, Y, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=A, Y, R or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=Y, P or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=Y, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=D, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=A, M or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=F,D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=D, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=V or no amino acid <400> 404 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 405 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Q or G <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, T, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, W or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=L, T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=A, S or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, A, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, Y, V or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=V or no amino acid <400> 405 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 406 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, F or G <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=L or F <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=T, S or N <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or A <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=Y or F <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, S or Y <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=I, M or W <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, N or H <400> 406 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 407 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=G or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T or G <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N, D or S <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=I, V or N <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G or I <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=A or G <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=G, Y, S or N <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y or N <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=D, S, T or F <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=V <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=S, N or H <400> 407 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 408 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=W, S, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I or E <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, W or I <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, S or N <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Y, S, D or H <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N, S or G <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S or G <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=N, Y, D or R <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=T, I or E <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=N, S, Y or D <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=A and N <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=Q, D or P <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=K or S <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa=L or V <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa=Q or K <220> <221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa=G or S <400> 408 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 409 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, E, S or D <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=N, V or Y <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S or N <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=N, Q or K <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=R <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=P <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S <400> 409 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 410 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=D or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=D, I or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=F, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=W, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, L or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=A, Y, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=Y, Q or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, Y or L <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=Y, D or V <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=G, A or P <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=M or F <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=D <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=V or Y <400> 410 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 411 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=Q, A, G or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, V, T or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, N or W <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S or D <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, Y or D <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S or T <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=L or S <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, S or A <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, M, W or Y <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=V <400> 411 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 412 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T, P, S, A, C, V, L or I <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=L, F, I, V, M, A or Y <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=T, P, S or A <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=I, L, V, M, A or F <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 412 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 413 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=S, N, T, A, C or Q <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=D or E <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=G, A, R, P, V, L, I, K, Q or N <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=Y, S, W, F, T, S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=V, I, M, L, F, or A <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 413 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 414 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=W, Y or F <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=A, F, V, L, I, Y or M <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=G, P or A <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> (11)...(11) <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa=A, V, L or I <220> <221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa=Q, E, N or D <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa=K, R, Q or N <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa=L, F, V, I, M, A or Y <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa=Q or N <220> <221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa=G, P or A <400> 414 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 415 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=E or D <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=N or Q <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=R, K, Q or N <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=P or A <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=S, T, A or C <400> 415 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 416 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=G, P, A or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=G, V, P, A, I, M, L or F <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=M, L, F or I <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=D or E <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <400> 416 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 417 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa=S, N, T, A, C or Q <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa=Y, W, F, T or S <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa=T or S <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa=S, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa=N, S, Q, T, A or C <220> <221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa=M, V, L, F, I or A <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa=V, I, M, L, F or A <400> 417 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 418 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 418 caggtgcagg tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctc acagtggtgg cgcaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggcaac 300 tggaactacg actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 419 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 419 Gln Val Gln Val Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro His Ser Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asn Tyr Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 420 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 420 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240 gaagatgttg caacttattt ctgtcaaagg tatcagattg ccccattcac tttcggccct 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321 <210> 421 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 421 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Arg Tyr Gln Ile Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 422 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 422 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atctggtatg atggaagtac taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggtcagtg 300 gctggttacc actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 423 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 423 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Ala Gly Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 424 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 424 tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60 acatgccaag gagacagcct cagaggctat tatgcaacct ggtaccagca gaagccaaga 120 caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aactaccggc cctcagggat cccagaccga 180 ttctctggct ccacctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240 gatgaggctg actattactg taactcccgg gacagcattg gtaaccatct ggtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 425 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 425 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Gly Tyr Tyr Ala 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ile Gly Asn His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 426 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 426 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggct tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggttag atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg atccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc 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tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 ctcactttcg gcggagggac caaggtagag atcaaa 336 <210> 461 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 461 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 462 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 462 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aactattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc ataaaacaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcgccatc tccagagaca acgccaagaa 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catagtaatg ggtacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cacatcttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgca tgcaaactct acaaactccg 300 ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336 <210> 465 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 465 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Leu Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 466 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 466 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggcccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 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Claims (1)

  1. 인간에 대한 치료 방법.
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