ES2946083T3 - Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) - Google Patents

Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) Download PDF

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Abstract

Se describen las proteínas de unión a antígeno que interactúan con la proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9). Se describen métodos para tratar la hipercolesterolemia y otros trastornos mediante la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno a PCSK9. Se describen métodos para detectar la cantidad de PCSK9 en una muestra utilizando una proteína de unión a antígeno a PCSK9. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9)
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que se unen a la proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) y a métodos para usar y para preparar las proteínas de unión a antígeno.
Antecedentes
La proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de serina implicada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) (Horton et al., 2007; Seidah y Prat, 2007). Los experimentos in vitro han mostrado que la adición de PCSK9 a células HepG2 disminuye los niveles de LDLR de la superficie celular (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004). Los experimentos con ratones han mostrado que el incremento en los niveles de proteína PCSK9 disminuye los niveles de proteína LDLR en el hígado (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004), mientras los ratones con PCSK9 inactivada tienen niveles incrementados de LDLR en el hígado (Rashid et al., 2005). La sobreexpresión de PCSK9 en ratones causa un incremento en el colesterol plasmático total (Maxwell et al. 2004). Además, se han identificado varias mutaciones en PCSK9 humana que resultan bien en niveles incrementados o disminuidos de LDL plasmático (Kotowski et al., 2006; Zhao et al., 2006). Se ha mostrado que PCSK9 interacciona directamente con la proteína LDLR, experimentando endocitosis junto al LDLR, y con co-inmunofluorescencia con el LDLR a lo largo de la ruta endosomal (Lagace et al., 2006). Además, se descubrió que PCSK9 se une al dominio EGFa en el LDLR (Zhang et al, 2007). No se ha observado la degradación del LDLR por PCSK9 y es incierto el mecanismo mediante el cual disminuye los niveles extracelulares de proteína LDLR. La inhibición selectiva del gen PCSK9 en ratones hiperlipidémicos usando un oligonucleótido antisentido (ASO) dio como resultado reducciones significativas en los niveles de ARNm de PCSK9 hepático, con reducciones concomitantes en el colesterol total y LDL (Graham et al., 2007).
PCSK9 es una prohormona-proproteína convertasa en la familia de la subtilisina (S8 ) de proteasas de serina (Seidah et al., 2003). Los seres humanos tienen nueve prohormona-proproteína convertasas que pueden dividirse entre las subfamilias S8A y S8B (Rawlings et al., 2006). La furina, PC1/PC3, PC2, PACE4, PC4, PCS/PC6 y PC7/PC8/LPC/SPC7 se clasifican en la subfamilia S8B. Las estructuras de cristal y RMN de los diferentes dominios de furina y PC1 de ratón revelan pro-dominios y dominios catalíticos semejantes a subtilisina, y un dominio P directamente C-terminal respecto al dominio catalítico (Henrich et al., 2003; Tangrea et al., 2002 ). Tomando como base la similitud en la secuencia de aminoácidos en esta subfamilia, se predice que los siete miembros tienen estructuras similares (Henrich et al., 2005). SKI-1/S1P y PCSK9 se clasifican en la subfamilia S8A. Las comparaciones de secuencias con estas proteínas también sugieren la presencia de pro-dominios y dominios catalíticos semejantes a subtilisina (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al., 1999). En estas proteínas, la secuencia de aminoácidos C-terminal respecto al dominio catalítico es más variables y no sugiere la presencia de un dominio P.
Las prohormona-proproteína convertasas se expresan como zimógenos y maduran a lo largo de un proceso con múltiples etapas. La función del pro-dominio en este proceso es doble. El pro-dominio actúa en primer lugar como una chaperona y se requiere para el plegamiento apropiado del dominio catalítico (Ikemura et al., 1987). Una vez se pliega el dominio catalítico, se produce la autocatálisis entre el pro-dominio y el dominio catalítico. Después de esta reacción de escisión inicial, el pro-dominio permanece unido al dominio catalítico donde actúa como un inhibidor de la actividad catalítica (Fu et al., 2000). Cuando las condiciones son correctas, la maduración continúa con un segundo evento autocatalítico en un sitio en el pro-dominio (Anderson et al., 1997). Después de que ocurre este segundo evento de escisión, el pro-dominio y el dominio catalítico se disocian, dando lugar a una proteasa activa.
La autocatálisis del zimógeno de PCSK9 ocurre entre Gln152 y Ser153 (VFAQ/SIP) (Naureckiene et al., 2003), y se ha mostrado que se requiere para su secreción de las células (Seidah et al., 2003). No se ha observado un segundo evento autocatalítico en un sitio en el pro-dominio de PCSK9. PCSK9 purificada está compuesta por dos especies que pueden separarse por SDS-PAGE no reductora; el pro-dominio a 17 Kd, y los dominios catalítico más C-terminal a 65 Kd. PCSK9 no se ha aislado sin su pro-dominio inhibidor, y las medidas de la actividad catalítica de PCSK9 han sido variables (Naureckiene et al., 2003; Seidah et al., 2003).
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para s u uso en el tratamiento o la prevención de hipercolesterolemia o una enfermedad ateroesclerótica relacionada con niveles de colesterol en suero elevados, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen al dominio catalítico de una proteína PCSK9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y previenen o reducen la unión de PCSK9 a LDLR. Cualquier referencia a una proteína de unión a antígeno (aislada) mencionada en la presente memoria debe entenderse que se refiere a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Resumen de la información técnica adicional
La divulgación técnica expuesta a continuación puede, en algunos respectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la divulgación que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan para información.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une a PCSK9 que comprende: A) una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDRH) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 de una CDRH1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; (ii) una CDRH2 de una CDRH2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; (iii) una CDRH3 de una CDRH3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; y (iv) una CDRH de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 4 aminoácidos; B) una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (CDRL) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 de una CDRL1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; (ii) una CDRL2 de una CDRL2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; (iii) una CDRL3 de una CDRL3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; y (iv) una CDRL de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 4 aminoácidos; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende al menos una CDRH de A) y al menos una CDRL de B). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende al menos dos CDRH de A) y al menos dos CDRL de B). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende dichas CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3. En algunas ocasiones, la CDRH de A) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 seleccionada de la CDRH1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89, y 49; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 seleccionada de la CDRH2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89, y 49; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 seleccionada de la CDRH3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89, y 49; y (iv) una CDRH de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos. Además, la CDRL de B) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 seleccionada de la CDRL1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 35, 32, y 23; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 seleccionada de la CDRL2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 35, 32, y 23; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 seleccionada de la CDRL3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 35, 32, y 23; y (iv) una CDRL de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B. En algunas ocasiones, la CDRH de A) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de la secuencia de aminoácidos de CDRH1 en SEQ ID NO: 67; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la secuencia de aminoácidos de CDRH2 en SEQ ID NO: 67; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la secuencia de aminoácidos de CDRH3 en SEQ ID NO: 67; y (iv) una CDRH de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos; dicha CDRL de B) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de la secuencia de aminoácidos de CDRL1 en SEQ ID NO: 12; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la secuencia de aminoácidos de CDRL2 en SEQ ID NO: 12; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la secuencia de aminoácidos de CDRL3 en SEQ ID NO: 12; y (iv) una CDRL de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno comprende A) una CDRH1 de la secuencia de CDRH1 en SEQ ID NO: 67, una CDRH2 de la secuencia de CDRH2 en SEQ ID NO: 67, y una CDRH3 de la secuencia de CDRH3 en SEQ ID NO: 67, y B) una CDRL1 de la secuencia de CDRL1 en SEQ ID NO: 12, una CDRL2 de la secuencia de CDRL2 en SEQ ID NO: 12, y una CDRL3 de la secuencia de CDRL3 en SEQ ID NO: 12. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. En algunas ocasiones, la VH tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60, y/o la VL tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 3 6 , 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. En algunas ocasiones, la VH se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60, y/o la VL se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une a PCSK9, en donde la proteína de unión a antígeno comprende: A) una o más CDR de cadena pesada (CDRH) seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRH1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; (ii) una CDRH2 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRH2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; y (iii) una CDRH3 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRH3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; B) una o más CDR de cadena ligera (CDRL) seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRL1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; (ii) una CDRL2 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRL2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; y (iii) una CDRL3 con al menos 80% de identidad de secuencia con una CDRL3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno comprende: A) una o más CDRH seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRH1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; (ii) una CDRH2 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRH2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; y (iii) una CDRH3 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRH3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60; B) una o más CDRL seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRL1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; (ii) una CDRL2 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRL2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; y (iii) una CDRL3 con al menos 90% de identidad de secuencia con una CDRL3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B).
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une a PCSK9, la proteína de unión a antígeno comprende: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH3 seleccionada de la CDRH3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79 y 49, (ii) una CDRH3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH3 (i) por una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 404), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en D, A, R y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y, I, G y sin aminoácido, X3 se selecciona del grupo que consiste en D, A, G y sin aminoácido, X4 se selecciona del grupo que consiste en F, A, L y sin aminoácido, X5 se selecciona del grupo que consiste en W, L, A y sin aminoácido, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, Y, A y sin aminoácido, X7 se selecciona del grupo que consiste en A, Y, R y sin aminoácido, Xs se selecciona del grupo que consiste en Y, P y sin aminoácido, X9 se selecciona del grupo que consiste en Y, G y sin aminoácido, X10 se selecciona del grupo que consiste en D, G y sin aminoácido, X11 se selecciona del grupo que consiste en A, M y sin aminoácido, X12 se selecciona del grupo que consiste en F, D y sin aminoácido, X13 se selecciona del grupo que consiste en D, V y sin aminoácido, X14 se selecciona del grupo que consiste en V y sin aminoácido; B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL3 seleccionada de la CDRL3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 35 y 23, (ii) una CDRL3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 of (i) por una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 405), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en Q y G, X2 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y sin aminoácido, X3 se selecciona del grupo que consiste en Y sin aminoácido y W, X4 se selecciona del grupo que consiste en D y sin aminoácido, X5 se selecciona del grupo que consiste en S y sin aminoácido, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y sin aminoácido, X7 se selecciona del grupo que consiste en L, T y sin aminoácido, X8 se selecciona del grupo que consiste en sin aminoácido, A, y S, X9 se selecciona del grupo que consiste en sin aminoácido, G, A, y V, X10 se selecciona del grupo que consiste en sin aminoácido, S, Y, y V, X11 se selecciona del grupo que consiste en sin aminoácido y V.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 46 y alguna combinación de las mismas.
En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo al que se une al menos una de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende además una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 60 y alguna combinación de las mismas. En algunas ocasiones, la secuencia de aminoácidos de la ABP se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 35, 23, y alguna combinación de éstas. En algunas ocasiones, la cadena pesada de la ABP comprende una CDRH3 de SEQ ID NO: 67, una CDRH2 de SEQ ID NO: 67, y una CDRH1 de SEQ ID NO: 67, y dicha cadena ligera comprende una CDRL3 de SEQ ID NO: 12, una CDRL2 de SEQ ID NO: 12, y una CDRL1 de SEQ ID NO: 12. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de éste. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 , un fragmento Fv, un fragmento divalente, o una molécula de anticuerpo de cadena única. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo humano. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo monoclonal. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada es del tipo IgG4 o IgG2. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada se acopla a un grupo marcador. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada compite para la unión a PCSK9 con una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada reduce la unión de PCSK9 a LDLR. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada la proteína de unión a antígeno disminuye una cantidad de LDL presente en un sujeto cuando se administra al sujeto. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada disminuye una cantidad de colesterol sérico presente en un sujeto cuando se administra al sujeto. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno aislada incrementa una cantidad de LDLR presente en un sujeto cuando se administra al sujeto.
También se describe en la presente memoria un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente memoria. También se describe en la presente memoria una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente memoria.
En algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno aislada compite para la unión a PCSK9 con una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a antígeno según se describe en la presente memoria.
En algunos aspectos, una composición farmacéutica comprende al menos una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para la inhibición de la unión de PCSK9 a LDLR en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria,
En algunos casos la proteína de unión a antígeno se une selectivamente a PCSK9, en donde la proteína de unión a antígeno se une a PCSK9 con una Kd que es menor de 100 μM.
También se describe en la presente memoria un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.
También se describe en la presente memoria un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.
También se describe en la presente memoria un método para el incremento del nivel de proteína LDLR en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.
En algunos aspectos, una composición farmacéutica comprende una ABP para el uso como se describe en la presente memoria y un agente que eleva la disponibilidad de los niveles de proteína LDLR. En algunas ocasiones, el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende estatina. En algunas ocasiones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de éstas.
También se describe en el presente documento un método para preparar la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, que comprende la etapa de preparar dicha proteína de unión a antígeno a partir de una célula huésped que secreta dicha proteína de unión a antígeno.
En algunos aspectos, una composición farmacéutica comprende al menos una proteína de unión a antígeno adecuada para el uso como se describe en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas ocasiones, la composición farmacéutica comprende además un agente activo adicional. En algunas ocasiones, dicho agente activo adicional se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, radionúclido, una toxina, o un terapéutico y un grupo quimioterapéutico.
También se describe en el presente documento un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con un nivel elevado de colesterol sérico en un paciente. El método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria. En algunas ocasiones, la afección es hipercolesterolemia.
También se describe en la presente memoria un método para la inhibición de la unión de PCSK9 a LDLR en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno según se describe en la presente memoria.
En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une a PCSK9 con una Kd que es menor de 100 μM. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une con una Kd que es menor de 10 μM. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une con una Kd que es menor de 5 μM.
También se describe en la presente memoria un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas ocasiones, el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende una estatina. En algunas ocasiones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de éstas.
También se describe en la presente memoria un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto. El método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para la disminución de los niveles de colesterol sérico en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada, como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente
que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas ocasiones, el agente que eleva la disponibilidad de
la proteína LDLR comprende una estatina. En algunas ocasiones, la estatina se selecciona del grupo que
consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de éstas.
También se describe en la presente memoria un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en
un sujeto mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se proporciona en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en
un sujeto mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada, como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente
que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas ocasiones, el agente que eleva la disponibilidad de
los niveles de proteína LDLR comprende una estatina. En algunas ocasiones, la estatina se selecciona del grupo
que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de éstas.
También se describe en la presente memoria un anticuerpo neutralizante que se une a PCSK9 y reduce un
efecto de disminución del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) de PCSK9 en LDLR. En algunas ocasiones, el anticuerpo se une específicamente a PCSK9. En algunas ocasiones, el anticuerpo se une al dominio catalítico de PCSK9. En algunas ocasiones, el anticuerpo se une a un epítopo en los residuos 31-447 de
SEQ ID NO: 3. En algunas ocasiones, el anticuerpo se une a PCSK9 que tiene una secuencia de aminoácidos
que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 3.
En algunas ocasiones, cuando la proteína de unión a antígeno se une a PCSK9, el anticuerpo está posicionado 8 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9; S153, I154, P155, R194, D238,
A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229,
R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216,
H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351,
E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212,
G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346,
G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191,
D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187,
H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, o C378. En
algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 8 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380,
S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, o
Q382. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos uno de los
residuos siguientes de PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378,
F379, V380, o S381. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos
dos de los residuos siguientes de PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377,
C378, F379, V380, o S381. En algunas ocasiones, el anticuerpo está a 5 angstroms o menos de al menos cuatro de los residuos siguientes de PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, o S381. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 8 angstroms o menos de al
menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220,
S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367,
D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218,
Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, o Q387. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: W72, F150, A151,
Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347,
L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, o G384. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos dos de los residuos siguientes de PCSK9: W72,
F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317,
F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, o G384. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos cuatro de los residuos siguientes
de PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256,
G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, o G384.
En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 8 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238,
K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236,
A239, G244, M247, I369, S372, C375, o C378. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191,
D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, o F379. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos dos de los residuos siguientes de PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, o F379. En algunas ocasiones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos cuatro de los residuos siguientes de PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, o F379.
También se describe en la presente memoria un anticuerpo neutralizante que se une a PCSK9, en donde el anticuerpo se une a PCSK9 y reduce la probabilidad de que PCSK9 se una a LDLR.
Un anticuerpo aislado o molécula de unión a antígeno que bloquea que un anticuerpo se una a PCSK9 en 8 angstroms o menos un residuo de PCSK9 también se describe en la presente memoria. En algunas ocasiones, el residuo de PCSK9 se selecciona de al menos uno de los siguientes residuos de PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, o C378.
En algunas ocasiones, un anticuerpo o molécula de unión a antígeno aislado se une a PCSK9 en una localización que se superpone con una localización en donde LDLR se une a PCSK9. En algunas ocasiones, la localización en la LDLR se une a PCSK9 incluye al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, y S381.
En algunas ocasiones, el anticuerpo o molécula de unión a antígeno reduce la probabilidad de que EGFa se unirá a PCSK9 en 8 angstroms de al menos uno de los residuos siguientes en PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, 1368, G370, A371, S373, S376, o Q382.
En algunas ocasiones, un anticuerpo, proteína de unión a antígeno, o molécula de unión a antígeno se une a una superficie de PCSK9 que se superpone con una superficie a la que se une EGFa, se une Ab 21B12, y/o se une 31H4. En algunas ocasiones, un anticuerpo, proteína de unión a antígeno, o molécula de unión a antígeno se une a PCSK9 de una manera que es similar a la representada en las figuras.
En algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno aislada para el uso descrito en la presente memoria se une a una proteína PCSK9 de SEQ ID NO: 1, en donde la unión entre dicha proteína de unión a antígeno aislada y una proteína PCSK9 variante es menos del 50% de la unión entre la proteína de unión a antígeno aislada y la proteína PCSK9 de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, la proteína PCSK9 variante comprende al menos una mutación de un residuo en una posición seleccionada del grupo que consiste en o comprende 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, y 554, como se muestra en SEQ ID NO: 1. En algunas ocasiones, la al menos una mutación se selecciona del grupo que comprende o consiste en R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, y E582R. En algunas ocasiones, la al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, y Q554R.
En algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno para el uso descrito en la presente memoria se une a una proteína PCSK-9 de SEQ ID NO: 303 de una primera manera y que se une a una variante de PCSK9 de una segunda manera. La variante de PCSK9 tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que comprende o consiste en: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, y 554 de SEQ ID NO: 303 y/o SEQ ID NO: 1. En algunas ocasiones, la primera manera comprende una primera EC50, una primera Bmax, o una primera EC50 y una primera Bmax. En algunas ocasiones, la segunda manera comprende una segunda EC50, una segunda Bmax, o una segunda EC50 y una segunda Bmax. El valor para la primera manera es diferente del valor para la segunda manera. En algunas ocasiones, la primera manera comprende una primera EC50, en donde la segunda manera implica una segunda EC50, y en donde la mutación puntual se selecciona del grupo que consiste en o comprende: R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, y E582R. En algunas ocasiones, la primera EC50 es al menos 20% diferente de la segunda EC50. En algunas ocasiones, la primera EC50 es al menos 50% diferente de la segunda EC50. En algunas ocasiones, la segunda EC50 es un valor numérico mayor que la primera EC50. En algunas ocasiones, la primera EC50 se determina por un ensayo de unión a lecho múltiple. En algunas ocasiones, la segunda EC50 es mayor de 1 um. En algunas ocasiones, la primera manera comprende una primera Bmax y la segunda manera comprende una segunda Bmax que es diferente de la primera Bmax. La variante de PCSK9 tiene al menos una mutación puntual seleccionada del grupo que consiste en o comprende: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H52lR, y Q554R. En algunas ocasiones, la segunda Bmax es aproximadamente 10% de la primera Bmax. En algunas ocasiones, la primera Bmax es al menos 20% diferente de la segunda Bmax. En algunas ocasiones, la primera Bmax es al menos 50% diferente de la segunda Bmax.
En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que se une a una proteína PCSK9 de SEQ ID NO: 3 para el uso descrito en la presente memoria, en donde el epítopo de la proteína de unión a antígeno incluye al menos uno de los aminoácidos siguientes de SEQ ID NO: 1: 207, 208, 181, 185, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313 y 337.
En algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno neutralizante aislada para el uso descrito en la presente memoria se une a una proteína PCSK9 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la proteína de unión a antígeno neutralizante disminuye el efecto de disminución de LDLR de PCSK9 en LDLR. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno neutralizante de LDLR competitiva.
En algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno aislada para el uso descrito en la presente memoria comprende: A) una CDRH1 de la secuencia de CDRH1 en SEQ ID NO: 49, una CDRH2 de la secuencia de CDRH2 en SEQ ID NO: 49, y una CDRH3 de la secuencia de CDRH3 en SEQ ID NO: 49, y B) una CDRL1 de la secuencia de CDRL1 en s Eq ID NO: 23, una CDRL2 de la secuencia de CDRL2 en SEQ ID NO: 23, y una CDRL3 de la secuencia de CDRL3 en SEQ ID NO: 23.
También se describe en la presente memoria una composición que comprende una proteína PCSK9 cristalizada y una proteína de unión a antígeno que se une a PCSK9. La composición comprende la proteína PCSK9 cristalizada es tal que la estructura tridimensional de la proteína PCSK9 puede determinarse hasta una resolución de aproximadamente 2,2 angstroms o mejor. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de éste.
También se describe en la presente memoria una proteína PCSK9 cristalizada y al menos una sección EGFa de una proteína LDLR, en donde la sección EGFa de una proteína LDLR es unida por una proteína PCSK9, en donde dicha proteína PCSK9 cristalizada es tal que la estructura tridimensional de la proteína PCSK9 puede determinarse hasta una resolución de aproximadamente 2,2 angstroms o mejor. En algunas ocasiones, el modelo molecular está en un medio legible por ordenador.
También se describe en la presente memoria el uso de una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para la disminución del colesterol sérico.
También se describe en la presente memoria el uso de una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, comprendiendo la proteína de unión a antígeno: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 seleccionada de la CDRH1 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89 y 49, (ii) una CDRH1 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH1 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 (SEQ ID NO: 406), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en G, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y, F y G, X3 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X4 se selecciona del grupo que consiste en L y F, X5 se selecciona del grupo que consiste en T, S y N, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y A, X7 se selecciona del grupo que consiste en Y y F, X8 se selecciona del grupo que consiste en G, S e Y, X9 se selecciona del grupo que consiste en I, M y W, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, N y H, B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada de la CDRL1 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 32, 35 y 23, (ii) una CDRL1 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 407), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en T y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en G y S, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, T y G, X4 se selecciona del grupo que consiste en S, X5 se selecciona del grupo que consiste en S, X6 se selecciona del grupo que consiste en N, D y S, X7 se selecciona del grupo que consiste en I, V y N, X8 se selecciona del grupo que consiste en G y I, X9 se selecciona del grupo que consiste en A y G, X10 se selecciona del grupo que consiste en G, Y, S y N, X11 se selecciona del grupo que consiste en Y y N, X12 se selecciona del grupo que consiste en D, S, T y F, X13 se selecciona del grupo que consiste en V, X14 se selecciona del grupo que consiste en S, N y H. Un experto en la materia apreciará que un ABP o anticuerpo individual puede cumplir una o más de las opciones anteriores y todavía sería adecuado para el uso de acuerdo con la invención.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, comprendiendo la proteína de unión a antígeno: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en lo siguiente: (i) una CDRH2 seleccionada de la CDRH2 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89 y 49, (ii) una CDRH2 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH2 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 X15X16X17 (SEQ ID NO: 408), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en W, S, L y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en V, I y E, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, W y I, X4 se selecciona del grupo que consiste en F, S y N, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, S, D y H, X6 se selecciona del grupo que consiste en N, S y G, X7 se selecciona del grupo que consiste en S y G, X8 se selecciona del grupo que consiste en N, Y, D y R, X9 se selecciona del grupo que consiste en T, I y E, X10 se selecciona del grupo que consiste en N, S, Y y D, X11 se selecciona del grupo que consiste en Y, X12 se selecciona del grupo que consiste en A y N, X13 se selecciona del grupo que consiste en Q, D y P, X14 se selecciona del grupo que consiste en K y S, X15 se selecciona del grupo que consiste en L y V, X16 se selecciona del grupo que consiste en Q y K, X17 se selecciona del grupo que consiste en G y S, B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en lo siguiente: (i) una CDRL2 seleccionada de la CDRL3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 32, 35 y 23, (ii) una CDRL2 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 409), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en G, E, S y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en N, V e Y, X3 se selecciona del grupo que consiste en S y N, X4 se selecciona del grupo que consiste en N, Q y K, X5 se selecciona del grupo que consiste en R, X6 se selecciona del grupo que consiste en P, X7 se selecciona del grupo que consiste en S.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, comprendiendo la proteína de unión a antígeno: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en lo siguiente: (i) una CDRH3 seleccionada de la CDRH3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 67, 79, 89 y 49, (ii) una CDRH3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 410), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en D y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y, A y sin aminoácido, X3 se selecciona del grupo que consiste en D, I y sin aminoácido, X4 se selecciona del grupo que consiste en F, A y sin aminoácido, X5 se selecciona del grupo que consiste en W, A y sin aminoácido, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, L y sin aminoácido, X7 se selecciona del grupo que consiste en A, Y, G y sin aminoácido, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, Q y sin aminoácido, X9 se selecciona del grupo que consiste en G, Y y L, X10 se selecciona del grupo que consiste en Y, D y V, X11 se selecciona del grupo que consiste en G, A y P, X12 se selecciona del grupo que consiste en M y F, X13 se selecciona del grupo que consiste en D, X14 se selecciona del grupo que consiste en V e Y y B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en lo siguiente: (i) una CDRL3 seleccionada de la CDRL3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 32, 35 y 23, (ii) una CDRL3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 411), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en Q, A, G y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en S, V, T y sin aminoácido, X3 se selecciona del grupo que consiste en Y, N y W, X4 se selecciona del grupo que consiste en S y D, X5 se selecciona del grupo que consiste en S, Y y D, X6 se selecciona del grupo que consiste en S y T, X7 se selecciona del grupo que consiste en L y S, X8 se selecciona del grupo que consiste en S, T y N, X9 se selecciona del grupo que consiste en G, S y A, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, M, W e Y y X11 se selecciona del grupo que consiste en V. En algunas ocasiones, cualquiera de los aminoácidos anteriores puede reemplazarse por una sustitución de aminoácidos conservativa.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, la proteína de unión a antígeno comprende A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada de la CDRH1 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, (ii) una CDRH1 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH1 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 (SEQ ID NO: 412), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X3 se selecciona del grupo que consiste en T, P, S y A, C, V, L y I, X4 se selecciona del grupo que consiste en L, F, I, V, M, A e Y, X5 se selecciona del grupo que consiste en T, P, S y A, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X7 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, Xs se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, X9 se selecciona del grupo que consiste en I, L, V, M, A y F, X10 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 seleccionada de la CDRL1 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, (ii) una CDRL1 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO: 413), en donde, X1 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X2 se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X4 se selecciona del grupo que consiste en S N, T, A, C y Q, X5 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X6 se selecciona del grupo que consiste en D y E, X7 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A, Xs se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, X9 se selecciona del grupo que consiste en G, A, R, P, V, L, I, K, Q y N, X10 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X11 se selecciona del grupo que consiste en N y Q, X12 se selecciona del grupo que consiste en Y, S, W, F, T, A y C, X13 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A, X14 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, comprendiendo la proteína de unión a antígeno: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH2 seleccionada de la CDRH2 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 5s, (ii) una CDRH2 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH2 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 X15X16X17, (SEQ ID NO: 414), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en W, Y y F, X2 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X4 se selecciona del grupo que consiste en A, F, V, L, I, Y y M, X5 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en N y Q, X7 se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, Xs se selecciona del grupo que consiste en N y Q, X9 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X10 se selecciona del grupo que consiste en N y Q, X11 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X12 se selecciona del grupo que consiste en A, V, L y I, X13 se selecciona del grupo que consiste en Q, E, N y D, X14 se selecciona del grupo que consiste en K, R, Q y N, X15 se selecciona del grupo que consiste en L, F, V, I, M, A e Y, X16 se selecciona del grupo que consiste en Q y N, X17 se selecciona del grupo que consiste en G, P y A, B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL2 seleccionada de la CDRL3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, (ii) una CDRL2 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7 (SEQ ID NO: 415), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en E y D, X2 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A, X3 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X4 se selecciona del grupo que consiste en N y Q, X5 se selecciona del grupo que consiste en R, K, Q y N, X6 se selecciona del grupo que consiste en P y A, X7 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C.
También se describe en la presente memoria una proteína de unión a antígeno aislada que se une PCSK9, comprendiendo la proteína de unión a antígeno: A) una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en (i) una CDRH3 seleccionada de la CDRH3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, (ii) una CDRH3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRH3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 416), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en G, P, A y sin aminoácido, X2 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X3 se selecciona del grupo que consiste en G, V, P, A, I, M, L y F, X4 se selecciona del grupo que consiste en M, L, F y I, X5 se selecciona del grupo que consiste en D y E, X6 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A, B) una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (CDRl ) seleccionada de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL3 seleccionada de la CDRL3 dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, (ii) una CDRL3 que difiere en la secuencia de aminoácidos de la CDRL3 de (i) en una adición, deleción o sustitución de aminoácidos de no más de dos aminoácidos; y (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 417), en donde X1 se selecciona del grupo que consiste en S, N, T, A, C y Q, X2 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X3 se selecciona del grupo que consiste en Y, W, F, T y S, X4 se selecciona del grupo que consiste en T y S, X5 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X6 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A y C, X7 se selecciona del grupo que consiste en N, S, Q, T, A y C, X8 se selecciona del grupo que consiste en M, V, L, F, I y A, X9 se selecciona del grupo que consiste en V, I, M, L, F y A.
Descripción breve de las figuras
La FIG. 1A representa una secuencia de aminoácidos de la forma madura de la PCSK9 con el pro-dominio subrayado.
Las FIGs. 1 B1-1 B4 representan secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de PCSK9 con el pro-dominio subrayado y la secuencia señal en negrita.
Las FIGs. 2A-2D son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas ligeras de varias proteínas de unión a antígeno. La FIG. 2C continúa la secuencia iniciada en la FIG. 2A. La FIG. 2D continúa la secuencia iniciada en la FIG. 2B.
Las FIGs. 3A-3D son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas pesadas de varias proteínas de unión a antígeno. La FIG. 3C continúa la secuencia iniciada en la FIG. 3a . La FIG. 3D continúa la secuencia iniciada en la FIG. 3B.
Las FIGs. 3E-3JJ representan las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para los dominios variables de algunas ocasiones de las proteínas de unión a antígeno.
La FIG. 3KK representa las secuencias de aminoácidos para varios dominios constantes.
Las FIGs. 3LL-3BBB representan las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para los dominios variables de algunas ocasiones de las proteínas de unión a antígeno.
Las FIGs. 3CCC-3JJJ son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas pesadas y ligeras de algunas ocasiones de las proteínas de unión a antígeno.
La FIG. 4A es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 humana.
La FIG. 4B es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 humana.
La FIG. 4C es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de cynomolgus.
La FIG. 4D es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de cynomolgus.
La FIG. 4E es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de ratón.
La FIG. 4F es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de ratón.
La FIG. 5A representa los resultados de un experimento de SDS PAGE que implica PCSK9 y varias proteínas de unión a antígeno que demuestra la pureza relativa y la concentración de las proteínas.
La FIG. 5B y 5C representan gráficos de ensayos en disolución en equilibrio biacore para 21B12.
La FIG. 5D representa el gráfico de las cinéticas de un ensayo de captura biacore.
La FIG. 5E representa un gráfico de barras que representa los resultados de agrupación en clases ("binning") para tres ABP.
La FIG. 6A es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG2 a PCSK9 en un ensayo de unión in vitro PCSK9:LDLR.
La FIG. 6B es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG4 a PCSK9 en un ensayo de unión in vitro PCSK9:LDLR.
La FIG. 6C es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG2 a PCSK9 en un ensayo de unión in vitro PCSK9:LDLR.
La FIG. 6D es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG4 a PCSK9 en un ensayo de unión in vitro PCSK9:LDLR.
La FIG. 7A es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG2 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.
La FIG. 7B es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG4 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.
La FIG. 7C es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG2 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.
La FIG. 7D es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG4 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.
La FIG. 8A es un gráfico que representa la capacidad de disminuir el colesterol sérico en ratones de ABP 31H4, cambios respecto a los ratones tratados con IgG control (* p<0,01).
La FIG. 8B es un gráfico que representa la capacidad de disminuir el colesterol sérico en ratones de ABP 31H4, cambios respecto a tiempo = cero horas (# p, 0,05).
La FIG. 8C es un gráfico que representa el efecto de ABP 31H4 en los niveles de colesterol HDL en ratones C57B1/6 (* p<0,01).
La FIG. 8D es un gráfico que representa el efecto de ABP 31H4 en los niveles de colesterol HDL en ratones C57B1/6 (# p<0,05).
La FIG. 9 representa un análisis por transferencia western de la capacidad de ABP 31H4 de aumentar la cantidad de proteína LDLR hepática presente después de varios puntos de tiempo.
La FIG. 10A es un gráfico que representa la capacidad de una proteína de unión a antígeno 31H4 para disminuir el colesterol sérico total en ratones de tipo salvaje, respecto.
La FIG. 10B es un gráfico que representa la capacidad de una proteína de unión a antígeno 31H4 para disminuir HDL en ratones de tipo salvaje.
La FIG. 10C es un gráfico que representa la capacidad para disminuir el colesterol sérico de varias proteínas de unión a antígeno 31H4 y 16F12.
La FIG. 11A representa un protocolo de inyección para ensayar la duración y capacidad de proteínas de unión a antígeno para disminuir el colesterol sérico.
La FIG. 11B es un gráfico que representa los resultados del protocolo en la FIG. 11A.
La FIG. 12A representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 21B12 en células HepG2.
La FIG. 12B representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 31H4 en células HepG2.
La FIG. 12C representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 25A7.1, un anticuerpo no neutralizante, (a diferencia de "25A7", un anticuerpo neutralizante) en células HepG2.
La FIG. 12D representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 21B12 en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.
La FIG. 12E representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 31H4 en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.
La FIG. 12F representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 25A7.1, un anticuerpo no neutralizante, (a diferencia de "25A7", un anticuerpo neutralizante) en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.
La FIG. 13A representa las diferentes secuencias de aminoácidos de cadena ligera de varias ABP para PCSK9. Los puntos (.) indican no aminoácido.
La FIG. 13B representa un cladograma de cadena ligera para varias ABP para PCSK9.
La FIG. 13C representa las diferentes secuencias de aminoácidos de cadena pesada de varias ABP para PCSK9. Los puntos (.) indican no aminoácido.
La FIG. 13D representa un dendrograma de cadena pesada para varias ABP para PCSK9.
La FIG. 13E representa una comparación de CDR ligeras y pesadas y la designación de los grupos de los que derivar el consenso.
La FIG. 13F representa las secuencias consenso para los Grupos 1 y 2.
La FIG. 13G representa las secuencias consenso para los Grupos 3 y 4.
La FIG. 13H representa las secuencias consenso para los Grupos 1 y 2. Los puntos (.) indican residuos idénticos.
La FIG. 13I representa las secuencias consenso para el Grupo 2. Los puntos (.) indican residuos idénticos. La FIG. 13J representa las secuencias consenso para los Grupos 3 y 4. Los puntos (.) indican residuos idénticos.
La FIG. 14A es un gráfico que representa la capacidad para disminuir LDL in vivo de varias ABP (a 10 mg/kg).
La FIG. 14B es un gráfico que representa la capacidad para disminuir LDL in vivo de varias ABP (a 30 mg/kg).
La FIG. 15A y FIG. 15B son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas ligeras de varias ocasiones de proteínas de unión a antígeno. La FIG. 15B continúa la secuencia iniciada en la FIG. 15A. La FIG. 15C y FIG. 15D son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas ligeras de varias ocasiones de proteínas de unión a antígeno. La FIG. 15D continúa la secuencia iniciada en la FIG. 15C. La FIG. 16A es una representación de un gel usado para ensayar la capacidad de Ab 21B12 para unirse a las secciones ProCat o vD de PCSK9.
La FIG. 16B es una representación de un gel usado para ensayar la capacidad de Ab 31H4 para unirse a las secciones ProCat o vD de PCSK9.
La FIG. 17 es una representación de la estructura de PCSK9 y la sección EGFa de LDLR.
La FIG. 18A es una representación de la estructura de PCSK9 y el Ab 31H4.
La FIG. 18B es una representación de la estructura de PCSK9 y el Ab 31H4.
La FIG. 19A es una representación de la estructura de PCSK9, el Ab 31H4, y el Ab 21B12.
La FIG. 19B es una representación de la estructura de PCSK9 y el Ab 21B12.
La FIG. 20A es una representación de la estructura de PCSK9 y EGFa del LDLR superpuesta con la estructura de los anticuerpos 31H4 y 21B12 unidos a PCSK9.
La FIG.20B es una representación del modelo estructural de PCSK9 y LDLR.
La FIG. 20C es una representación del modelo estructural de PCSK9 y LDLR desde una perspectiva alternativa.
La FIG. 20D es una representación del modelo estructural de PCSK9 y LDLR con representaciones estructurales de 31H4 y 21B12 incluidas.
La FIG.20E es una representación del modelo estructural en la FIG.20D, rotado 90 grados alrededor del eje indicado.
La FIG.20F es una representación del modelo estructural en la FIG.20D, rotado 180 grados alrededor del eje indicado.
La FIG.21A es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.
La FIG.21B es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.
La FIG.21C es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.
La FIG.21D es una representación del modelo estructural de PCSK9 de longitud completa y 31A4.
La FIG. 22 es un conjunto de secuencias de ABP que identifican varias diferencias entre las secuencias de ABP humana y las secuencias de ABP que se produjeron en E. coli y se usaron para las estructuras de cristal.
La FIG. 23 es una tabla de los varios resultados de agrupación en clases.
La FIG. 23A es una primera parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 23B es una segunda parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases.
La FIG. 23C es una tercera parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 23D es una cuarta parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 24A es una representación de una transferencia western en condiciones no reductoras.
La FIG. 24B es una representación de una transferencia western en condiciones reductoras.
La FIG. 25A es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 25B es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 25C es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 25D es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 25E es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 25F es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.
La FIG. 26 es una comparación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 y todos los residuos que se mutaron en variantes de PCSK9 para examinar los epítopos de los distintos anticuerpos. La FIG. 27A representa los aciertos de epítopos de 21B12, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con el 21B12.
La FIG. 27B representa los aciertos de epítopos de 31H4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.
La FIG. 27C representa los aciertos de epítopos de 31H4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.
La FIG. 27D representa los aciertos de epítopos de 12H11, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.
La FIG. 27E representa los aciertos de epítopos de 3C4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.
La FIG. 28A es un gráfico que demuestra la capacidad de unión de las varias ABP a varias partes de PCSK9. La FIG. 28B es un gráfico que demuestra la capacidad de unión de las varias ABP a varias partes de PCSK9. La FIG. 28C es un gráfico que compara la capacidad de unión a LDLR de dos ABP.
La FIG. 28D es un gráfico que compara la actividad de captación celular de LDL de dos ABP.
Descripción detallada
La descripción técnica expuesta a continuación puede, en algunos respectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la descripción que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan para información.
Como apreciará un experto en la técnica, a la luz de la presente descripción, la alteración de las interacciones entre PCSK9 y LDLR puede incrementar la cantidad de LDLR disponible para unirse a LDL, lo que a su vez disminuye la cantidad de LDL sérica en un sujeto, resultando en una reducción en el nivel de colesterol sérico del sujeto. Como tales, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 pueden usarse en diversos métodos y composiciones para tratar a sujetos con niveles elevados de colesterol sérico, que presentan riesgo de niveles elevados de colesterol sérico, o que podrían beneficiarse de una reducción en sus niveles de colesterol sérico. Así, en la presente memoria también se describen varios métodos y técnicas para disminuir, mantener, o prevenir un incremento en el colesterol sérico.
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con niveles de colesterol en suero elevados en un sujeto como se define más específicamente en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención en un aspecto se refiere a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o la prevención de hipercolesterolemia o una enfermedad ateroesclerótica relacionada con niveles de colesterol en suero elevados, o para su uso en la reducción del riesgo de un evento cardiovascular recurrente relacionado con niveles de colesterol en suero elevados, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une al dominio catalítico de una proteína PCSK9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y previene o reduce la unión de PCSK9 a LDLR. Preferentemente el sujeto a tratar es un sujeto humano.
En otro aspecto, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para el uso como se define en la presente memoria se administran junto con al menos un agente de disminución del colesterol. En algunas ocasiones, el al menos un agente de disminución del colesterol es una estatina, opcionalmente en donde la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina y simvastatina.
En algunas ocasiones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo que se une a antígeno, un anticuerpo de cadena única, un diacuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 y un anticuerpo IgG4 o un fragmento de anticuerpo de los mismos.
En ciertas ocasiones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una variante de PCSK9 que tiene una mutación puntual D374Y. En algunas ocasiones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 con una Kd que es menor que 1 nM, es menor que 100 μM, es menor que 10 μM o es menor que 5 μM. En otras ocasiones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo pueden bloquear la unión de D374Y PCSK9 a LDLR con una CI50 de menos de 1 μM, 1000 nM a 100 nM, 100 nM a 10 nM, 10 nM a 1 nM, 1000 μM a 500 μM, 500 μM a 200 μM, menos de 200 μM, 200 μM a 150 μM, 200 μM a 100 μM, 100 μM a 10 μM o 10 μM a 1 μM.
Por conveniencia, las secciones siguientes resaltan generalmente los distintos significados de los términos usados en la presente memoria. Después de esta discusión, se discuten aspectos generales respecto a las proteínas de unión a antígeno, seguido de ejemplos específicos que demuestran las propiedades de varias ocasiones de las proteínas de unión a antígeno y cómo pueden emplearse.
Definiciones
El término "proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9" o "PCSK9" se refiere a un polipéptido como se muestra en SEQ ID NO: 1 y/o 3 o fragmentos de éste, así como polipéptidos relacionados, que incluyen, pero no están limitados a, variantes alélicas, variantes de corte y empalme, variantes derivadas, variantes de sustitución, variantes de deleción, y/o variantes de inserción incluyendo la adición de una metionina N-terminal, polipéptidos de fusión, y homólogos interespecie. En determinadas ocasiones, un polipéptido PCSK9 incluye residuos terminales, tales como, pero no limitado a, residuos de secuencia líder, residuos de direccionamiento, residuos de metionina amino terminales, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión. "PCSK9" también se ha referido como FH3, NARC1, HCHOLA3, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9, y convertasa 1 neural regulada por apoptosis. El gen de PCSK9 codifica una proteína proproteína convertasa que pertenece a la subfamilia de proteinasa K de la familia subtilasa secretora. El término "PCSK9" indica tanto la proproteína como el producto generado después de la autocatálisis de la proproteína. Cuando sólo se está haciendo referencia al producto autocatalizado (tal como para una proteína de unión a antígeno que se une selectivamente a la PCSK9 escindida), la proteína puede referirse como la PCSK9 "madura", "escindida", "procesada o "activa". Cuando sólo se está haciendo referencia a la forma inactiva, la proteína puede referirse como la forma "inactiva", "pro-forma", o "no procesada" de PCSK9. El término PCSK9 tal y como se usa en la presente memoria también incluye alelos naturales, tales como las mutaciones D374Y, S127R y F216L. El término PCSK9 también engloba moléculas de PCSK9 que incorporan modificaciones posteriores a la traducción de la secuencia de aminoácidos de PCSK9, tales como secuencias de PCSK9 que han sido glicosiladas, PEGiladas, secuencias de PCSK9 de las que se ha escindido su secuencia señal, secuencia de PCSK9 de la que se ha escindido su pro dominio del dominio catalítico pero no separado del dominio catalítico (por ejemplo, FIGs. 1A y 1B).
El término "actividad de PCSK9" incluye cualquier efecto biológico de PCSK9. En determinadas ocasiones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de interaccionar con o unirse a un sustrato o receptor. En algunas ocasiones, la actividad de PCSK9 está representada por la capacidad de PCSK9 de unirse a un receptor de LDL (LDLR). En algunas ocasiones, PCSK9 se une a y cataliza una reacción que implica LDLR. En algunas ocasiones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de alterar (por ejemplo, reducir) la disponibilidad de LDLR. En algunas ocasiones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de incrementar la cantidad de LDL en un sujeto. En algunas ocasiones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de disminuir la cantidad de LDLR que está disponible para unirse a LDL. En algunas ocasiones, "actividad de PCSK9" incluye cualquier actividad biológica que resulta de la señalización de PCSK9. Las actividades ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, unión de PCSK9 a LDLR, actividad enzimática de PCSK9 que escinde LDLR u otras proteínas, unión de PCSK9 a otras proteínas distintas de LDLR que facilitan la acción de PCSK9, alteración por PCSK9 de la secreción de APOB (Sun X-M et al, "Evidence for effect of mutant PCSK9 on apolipoprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 y Ouguerram K et al, "Apolipoprotein B100 metabolism in autosomaldominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vasc Biol. 24: 1448-1453, 2004). El papel de PCSK9 en la regeneración del hígado y diferenciación de células neuronales (Seidah NG et al, "The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation" PNAS 100: 928-933, 2003), y el papel de PCSK9 en el metabolismo hepático de la glucosa (Costet et al., "Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein 1c" J. Biol. Chem. 281(10): 6211-18, 2006).
El término "hipercolesterolemia", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una afección en donde los niveles de colesterol están elevados por encima de un nivel deseado. En algunas ocasiones, esto indica que los niveles de colesterol sérico están elevados. En algunas ocasiones, el nivel deseado tiene en cuenta varios "factores de riesgo" que son conocidos para un experto en la técnica (y se describen o se hace referencia a ellos en la presente memoria).
El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye polímeros de nucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de uno de los dos tipos de nucleótidos. Dichas modificaciones incluyen modificaciones en la base tales como derivados bromouridina e inosina, modificaciones en la ribosa tales como 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones en la unión internucleotídica tales como fósforotioato, fósforoditioato, fósforoselenoato, fósforodiselenoato, fósforoanilotioato, fósforaniladato y fósforoamidato.
El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas ocasiones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases. En otras ocasiones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos con sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir un marcador, incluyendo un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.
Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc, o sintético o alguna combinación de éstos que no está asociada con todo o una parte de un polinucleótido en donde el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unida a un polinucleótido al que no está unida en la naturaleza. Para los propósitos de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no engloba cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificadoras para hasta diez o incluso hasta veinte proteínas adicionales o partes de éstas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas de forma operativa que controlan la expresión de la región codificadora de las secuencias de ácido nucleico recitadas, y/o pueden incluir secuencias de vector. A no ser que se especifique otra cosa, el extremo izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido monocatenaria discutida en la presente memoria es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótido bicatenarias se refiere como la dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se refiere como la dirección de la transcripción; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias aguas arriba"; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias aguas abajo".
El término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar la expresión y procesamiento de secuencias codificadoras a las que está ligada. La naturaleza de dichas secuencias de control puede depender del organismo huésped. En ocasiones particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión a ribosomas, y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencia potenciadoras de la transcripción, y secuencia de terminación de la transcripción. Las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias de pareja de fusión.
El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir información codificadora de proteínas en una célula huésped.
El término "vector de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (conjuntamente con la célula huésped) la expresión de una o más regiones codificadoras heterólogas unidas de forma operativa a ella. Una construcción de expresión puede incluir, pero no está limitada a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si están presentes intrones, afectan el corte y empalme del ARN de una región codificadora unida de forma operativa a ella.
Tal y como se usa en la presente memoria, "unido de forma operativa" significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora de proteína está ligada a ella de manera que la expresión de la secuencia codificadora de proteína se consigue en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control. El término "célula huésped" significa una célula que se ha transformado, o que es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y de esta manera expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, ya sea o no la progenie idéntica en morfología o en constitución genética a la célula parental original, siempre que esté presente el gen de interés.
El término "transfección" significa la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. En a técnica son muy conocidas varias técnicas de transfección y se describen en la presente memoria. Véase, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra;
Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13: 197. Dichas técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de a Dn exógeno en células huésped adecuadas.
El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente respecto a su estado nativo por la introducción de nuevo material genético mediante transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula mediante integración física en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha "transformado de forma estable" cuando el ADN transformante se replica con la división de la célula.
Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, esto es, una proteína producida por una célula natural y no recombinante; o se produce por una célula modificada genéticamente o recombinante, y comprende moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. El término también incluye polímeros de aminoácidos en donde uno o más aminoácidos son análogos químicos de un aminoácido natural correspondiente y polímeros. Los términos "polipéptido" y "proteína" engloban específicamente proteínas de unión a antígeno para PCSK9, anticuerpos, o secuencias que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de proteína de unión a antígeno. El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal, y/o una deleción interna en comparación con la proteína nativa de longitud completa. Dichos fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados comparados con la proteína nativa. En determinadas ocasiones, los fragmentos tienen una longitud de aproximadamente cinco a 500 aminoácidos. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener una longitud de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ó 450 aminoácidos. Los fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso de un anticuerpo de unión a PCSK9, los fragmentos útiles incluyen pero no están limitados a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada y/o ligera, una parte de una cadena de anticuerpo o sólo su región variable incluyendo dos CDR, y semejantes.
El término "proteína aislada" referido significa que una proteína objeto (1) carece de al menos algunas otras proteínas con las que se encontraría normalmente, (2) carece esencialmente de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) está asociada de forma operativa (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza, o (6) no aparece en la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, o al menos aproximadamente 50% de una muestra dada. El ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de éstos, puede codificar dicha proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada carece sustancialmente de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso.
El término "aminoácido" incluye su significado normal en la técnica.
Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos se insertan en, delecionan de y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos respecto a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.
El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, según se determina alineando y comparando las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula tomando como base el tamaño de la más pequeña de las moléculas que se están comparando. Para estos cálculos, los huecos en los alineamiento (si existen) se abordan preferiblemente por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.), 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se están comparando se alinean típicamente de una manera que proporciona la mayor concordancia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa informático que puede usarse para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se desea determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para concordancia óptima de sus aminoácidos o nucleótidos respectivos (el "alcance de concordancia", según se determina por el algoritmo). Conjuntamente con el algoritmo se usan una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal media, en donde la "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que se está usando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada concordancia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. En determinadas ocasiones, también es usada por el algoritmo una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).
Los ejemplos de parámetros que pueden emplearse para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP son los siguientes:
• Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453
• Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra
• Penalización por hueco: 12 (pero sin penalización para huecos terminales)
• Penalización por longitud de hueco: 4
• Umbral de similitud: 0
Determinados esquemas de alineamiento para linear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en la concordancia sólo de una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta incluso si no hay una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. De acuerdo con esto, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si se desea para resultar en un alineamiento que abarque al menos 50 u otro número de aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Tal y como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales (por ejemplo, naturales) y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Immunology—A Synthesis (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes apropiados para polipéptidos adecuados para el uso de acuerdo con de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetillisina, s-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en la presente memoria, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi terminal, según el uso y convención estándar.
De manera similar, a no ser que se especifique otra cosa, el extremo izquierdo de secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótido bicatenarias se refiere como la dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se refiere como la dirección de la transcripción; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias aguas arriba"; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se refieren como "secuencias aguas abajo".
Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden englobar residuos de aminoácidos no naturales, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Éstos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácidos.
Los residuos naturales pueden dividirse en clases tomando como base propiedades comunes de la cadena lateral:
1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutros hidrofílicos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) básicos: His, Lys, Arg;
5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en regiones no homólogas de la molécula.
Cuando se hacen cambios en la proteína de unión a antígeno o la proteína PCSK9, según determinadas ocasiones, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático tomando como base su hidrofobicidad y características de carga, Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
En la técnica se entiende la importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía retienen una actividad biológica similar. Cuando se hacen cambios tomando como base el índice hidropático, en determinadas ocasiones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ±2. En determinadas ocasiones, se incluyen aquellos que están en ±1, y en determinadas ocasiones, se incluyen aquellos que están en ±0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente tomando como base la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional creado de esta manera se pretende para uso en ocasiones inmunológicas, como en el caso presente. En determinadas ocasiones, la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Se han asignado los valores de hidroflicidad siguientes a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Cuando se hacen cambios tomando como base valores de hidrofilicidad similares, en determinadas ocasiones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están en ±2, en determinadas ocasiones, se incluyen aquellos que están en ±1, y en determinadas ocasiones, se incluyen aquellos que están en ±0,5. También se pueden identificar epítopos a partir de las secuencias primarias de aminoácidos tomando como base la hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones del núcleo epitópico".
Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
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y
(continuación)
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El término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química distinta de una inserción, deleción, o sustitución de aminoácidos (o ácidos nucleicos). En determinadas ocasiones, los derivados comprenden modificaciones covalentes, incluyendo, pero no limitado a, unión química con polímeros, lípidos, u otros restos orgánicos o inorgánicos. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno químicamente modificada puede tener una mayor vida media circulante que una proteína de unión a antígeno que no está químicamente modificada. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno químicamente modificada puede tener una capacidad de direccionamiento mejorada para células, tejidos, y/o órganos deseados. En algunas ocasiones, una proteína de unión a antígeno derivada está modificada covalentemente para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua, incluyendo, pero no limitados a, polietilen glicol, polioxietilen glicol, o polipropilen glicol. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno derivada comprende uno o más polímeros, incluyendo, pero no limitado a, monometoxi-polietilen glicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, un co-polímero óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros.
En determinadas ocasiones, un derivado se modifica covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG). En determinadas ocasiones, se unen uno o más polímeros solubles en agua a una o más posiciones específicas, por ejemplo en el extremo amino, de un derivado. En determinadas ocasiones, se unen aleatoriamente uno o más polímeros solubles en agua a una o más cadenas laterales de un derivado. En determinadas ocasiones, se usa PEG para mejorar la capacidad terapéutica para una proteína de unión a antígeno. En determinadas ocasiones, se usa PEG para mejorar la capacidad terapéutica para un anticuerpo humanizado. Algunos de estos métodos se discuten por ejemplo, en la Patente U.S. No. 6.133.426.
Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS, p. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Dichos compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computerizado. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero que tiene una o más uniones peptídicas reemplazadas opcionalmente por una unión seleccionada de: --CH2 NH--, --CH2 S--, --CH2 -CH2--, --CH=CH-(cis y trans), -COCH2- , —CH(OH)CH2—, y --CH2 SO--, por métodos muy conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en determinadas ocasiones para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61: 387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
El término "natural" tal y como se usa a lo largo de la especificación en conexión con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, y semejantes, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza o a una forma de los materiales que se encuentra en la naturaleza.
Una "proteína de unión a antígeno" ("ABP") tal y como se usa en la presente memoria significa cualquier proteína que se une a un antígeno diana especificado. En la presente solicitud, el antígeno diana especificado es la proteína PCSK9 o fragmento de ésta. "Proteína de unión a antígeno" incluye pero no está limitado a anticuerpos y partes de unión de éstos, tales como fragmentos inmunológicamente funcionales. Los pepticuerpos son otro ejemplo de proteínas de unión a antígeno. El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno con cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), tal y como se usa en la presente memoria, es una especie de proteína de unión a antígeno que comprende una parte (independientemente de cómo se obtiene o sintetiza esa parte) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que todavía es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Dichos fragmentos son biológicamente activos ya que se unen al antígeno diana y pueden competir con otras proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, para la unión a un epítopo dado. En algunas ocasiones, los fragmentos son fragmentos neutralizantes. En algunas ocasiones, los fragmentos pueden bloquear o reducir la probabilidad de la interacción entre LDLR y PCSK9. En un aspecto, dicho fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas ocasiones comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o parte de ésta. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse por escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero no están limitados a, Fab, un fragmento divalente (dominio variable de cadena pesada en el mismo polipéptido que un dominio variable de cadena ligera, conectado mediante un conector peptídico corto que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena), Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena única, y pueden derivar de cualquier fuente de mamífero, incluyendo, pero no limitado a, ser humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una parte funcional de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria, por ejemplo, una o más CDR, pueda unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una vida media sérica prolongada. Como apreciará un experto en la técnica, una proteína de unión a antígeno puede incluir componentes no proteicos. En algunas secciones de la presente descripción, los ejemplos de ABP se describen en la presente memoria en términos de "número/letra/número" (por ejemplo, 25A7). En estos casos, el nombre exacto indica un anticuerpo específico. Esto es, una ABP denominada 25A7 no es necesariamente la misma que un anticuerpo denominado 25A7.1, (a no ser que se enseñe explícitamente como el mismo en la especificación, por ejemplo, 25A7 y 25A7.3). Como apreciará un experto en la técnica, LDLR no es una proteína de unión a antígeno y las subsecciones de unión de LDLR no son proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, EGFa. Otras moléculas a través de las cuales PCSK9 produce señalización in vivo no son proteínas de unión a antígeno. Determinadas proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria son anticuerpos o derivan de anticuerpos. En determinadas ocasiones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente memoria como "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (algunas veces referidas en la presente memoria como "conjugados de anticuerpos), y fragmentos de éstos, respectivamente. En algunas ocasiones, la ABP comprende o consiste en avímeros (péptido unido fuertemente). Estas distintas proteínas de unión a antígeno se describen adicionalmente en la presente memoria.
Una región "Fc" comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3.
Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y el CH1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab'" comprende una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula (Fab')2. Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 está compuesto así por dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos por un enlace disulfuro entre dos cadenas pesadas.
La "región Fv" comprende las regiones variables tanto de cadenas pesadas como ligeras, pero carece de regiones constantes.
Los "anticuerpos de cadena única" son moléculas Fv en donde las regiones variables de cadena pesada y ligera se han conectado mediante un conector flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos de cadena única se discuten con detalle en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 88/01649 y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.946.778 y No.
5.260.203.
Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones Vh se unen covalentemente con un conector peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden estar dirigidas al mismo antígeno o a antígenos diferentes.
Una "proteína de unión a antígeno bivalente" o "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas de unión a antígeno bivalentes y anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos, véase, infra. Un anticuerpo bivalente distinto de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional", en determinadas ocasiones, se entiende típicamente que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos.
Una "proteína de unión a antígeno multiespecífica" o "anticuerpo multiespecífico" es uno que está dirigido a más de un antígeno o epítopo.
Una proteína de unión a antígeno o anticuerpo "biespecífico", "específico dual" o "bifuncional" es una proteína de unión a antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Las proteína de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo proteína de unión a antígeno multiespecífico y pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de una proteína de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma diana proteica o en diferentes dianas proteicas.
Una proteína de unión a antígeno se dice que "se une específicamente" a su antígeno diana cuando la constante de disociación (Kd) es < 10-7 M. La ABP se une específicamente a antígeno con "alta afinidad" cuando la Kd es < 5 x 10-9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la Kd es < 5 x 10-10 M. En una ocasión, la ABP tiene una Kd de < 10-9 M. En una ocasión, la velocidad de disociación es < 1 x 10-5. En otras ocasiones, las ABP se unirán a PCSK9 humana con una Kd de entre aproximadamente 10-9 M y 10-13 M, y en otra ocasión más las ABP se unirán con una Kd < 5 x 10-10. Como apreciará un experto en la técnica, en algunas ocasiones, cualquiera o todos los fragmentos de unión a antígeno pueden unirse específicamente a PCSK9.
Una proteína de unión a antígeno es "selectiva" cuando se une a una diana más fuertemente de lo que se une a una segunda diana.
"Región de unión a antígeno" significa una proteína, o una parte de una proteína, que se une específicamente a un antígeno especificado (por ejemplo, un paratopo). Por ejemplo, esa parte de una proteína de unión a antígeno que contiene los residuos de aminoácidos que interaccionan con un antígeno y confieren a la proteína de unión a antígeno su especificidad y afinidad para el antígeno se refiere como "región de unión a antígeno". Una región de unión a antígeno incluye típicamente una o más "regiones de unión complementarias" ("CDR"). Determinadas regiones de unión a antígeno también incluyen una o más regiones "marco". Una "CDR" es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de la unión a antígeno. Las regiones "marco" pueden ayudar a mantener la conformación apropiada de las CDR para estimular la unión entre la región de unión a antígeno y un antígeno. Estructuralmente, las regiones marco pueden estar localizadas en anticuerpos entre las CDR. Los ejemplos de regiones marco y CDR se muestran en las FIGs. 2A-3D, 3CCC-3JJJ, y 15A-15D. En algunas ocasiones, las secuencias para las CDR para la cadena ligera del anticuerpo 3B6 son como sigue: CDR1 TLSSGYSSYEVD (SEQ ID NO: 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (SEQ ID NO: 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (SEQ ID NO: 281), y las FR son como sigue: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (SEQ ID NO: 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (SEQ ID NO: 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (SEQ ID NO: 284); y FR4 FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 285).
En determinados aspectos, se describen en la presente memoria proteínas de unión a antígeno recombinantes que se unen a PCSK9, por ejemplo PCSK9 humana. En este contexto, una "proteína de unión a antígeno recombinante" es una proteína preparada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente memoria. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes son muy conocidos en la técnica.
El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de ésta, que puede competir con el anticuerpo intacto para la unión específica al antígeno diana, e incluye, por, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos, y biespecíficos. Un "anticuerpo" es una especie de una proteína de unión a antígeno. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas tales como anticuerpos que ocurren naturalmente en camélidos que pueden comprender sólo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivar solamente de una única fuente, o pueden ser "quiméricos", esto es, diferentes partes del anticuerpo pueden derivar de dos anticuerpos diferentes como se describe adicionalmente más adelante. Las proteínas de unión a antígeno, anticuerpos, o fragmentos de unión pueden producirse en hibridomas, por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. A no ser que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de éstos, ejemplos de los cuales se describen más adelante. Además, a no ser que se excluya explícitamente, los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente memoria como "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (algunas veces referidas en la presente memoria como "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de éstos, respectivamente. En algunas ocasiones, el término también engloba pepticuerpos.
Las unidades estructurales de anticuerpos naturales comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de dichos tetrámeros está compuesto típicamente de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, teniendo cada pareja una cadena "ligera" de longitud completa (en determinadas ocasiones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en determinadas ocasiones, aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena incluye típicamente una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi terminal de cada cadena define típicamente una región constante que puede ser responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero no limitado a, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. IgM tiene subclases incluyendo, pero no limitado a, IgM1 e IgM2. IgA se subdivide de manera similar en subclases incluyendo, pero no limitado a, IgA1 e IgA2. En las cadenas ligera y pesada de longitud completa, típicamente, las regiones variable y constante se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada incluyendo también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada pareja cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno.
Las regiones variables presentan típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones híper variables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja típicamente están alineadas por las regiones marco, que pueden permitir la unión a un epítopo específico. Desde el N terminal hasta el C terminal, tanto las regiones variables de cadena ligera como pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es típicamente según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989).
En determinadas ocasiones, una cadena pesada de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En determinadas ocasiones, una cadena ligera de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena pesada de anticuerpo. En determinadas ocasiones, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En determinadas ocasiones, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena pesada de anticuerpo. En determinadas ocasiones, una región variable individual se une específicamente a un antígeno en ausencia de otras regiones variables.
En determinadas ocasiones, la delineación definitiva de una CDR y la identificación de residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo se consigue resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-ligando. En determinadas ocasiones, esto puede conseguirse por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X. En determinadas ocasiones, pueden emplearse varios métodos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. Los ejemplos de dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición AbM y la definición de contacto.
La definición de Kabat es un estándar para la numeración de los residuos en un anticuerpo y se usa típicamente para identificar regiones CDR. Véase, por ejemplo, Johnson y Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). La definición de Chothia es similar a la definición de Kabat, pero la definición de Chothia tiene en cuenta posiciones de determinadas regiones en bucle estructurales. Véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989). La definición AbM usa una cadena integrada de programas informáticos producidos por el Oxford Molecular Group que modela la estructura de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); “AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies”, Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd. La definición AbM modela la estructura terciaria de un anticuerpo a partir de la secuencia primaria usando una combinación de bases de datos de conocimiento y métodos ab initio, tales como los descritos por Samudrala et al., “Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach”, en PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suμl., 3:194-198 (1999). La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras de cristal de complejo disponibles. Véase, por ejemplo, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).
Por convención, las regiones CDR en la cadena pesada se refieren típicamente como H1, H2, y H3 y se numeran secuencialmente en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxi. Las regiones CDR en la cadena ligera se refieren típicamente como L1, L2, y L3 y se numeran secuencialmente en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxi.
El término "cadena ligera" incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de ésta que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.
El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de ésta que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, Vh, y tres dominios de región constante, Ch1, Ch2, y Ch3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxilo, estando Ch3 lo más cerca del extremo carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo los subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.
Un anticuerpo biespecífico o bifuncional típicamente es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos parejas diferentes cadena pesada/ligera y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).
Algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que sólo tienen una única cadena pesada.
Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta típicamente por varios "dominios de inmunoglobulina", consistiendo cada uno en aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y teniendo un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que están compuestos los polipéptidos de anticuerpo. En los seres humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada comprende típicamente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen tres dominios de región C conocidos como Ch1, Ch2 y Ch3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En determinadas ocasiones, un anticuerpo anti-PCSK9 adecuado para el uso de acuerdo con la invención es del subtipo IgG2 o IgG4.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una parte de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que incluye típicamente aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos amino terminales en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos amino terminales en la cadena ligera. En determinadas ocasiones, las regiones variables de diferentes anticuerpos se diferencian extensamente en la secuencia de aminoácidos incluso entre anticuerpos de la misma especie. La región variable de un anticuerpo determina típicamente la especificidad de un anticuerpo particular por su diana.
El término "proteína de unión a antígeno neutralizante" o "anticuerpo neutralizante" se refiere a una proteína de unión a antígeno o anticuerpo, respectivamente, que se une a un ligando y evita o reduce el efecto biológico de ese ligando. Esto puede hacerse, por ejemplo, por el bloqueo directo de un sitio de unión en el ligando o por unión al ligando y alteración de la capacidad del ligando de unirse mediante un medio indirecto (tal como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas ocasiones, el término también puede indicar una proteína de unión a antígeno que evita que la proteína a la que está unida realice una función biológica. En la evaluación de la unión y/o especificidad de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de éste, un anticuerpo o fragmento puede inhibir sustancialmente la unión de un ligando a su pareja de unión cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de pareja de unión unida al ligando al menos aproximadamente un 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% o más (según se mide por un ensayo de unión competitiva in vitro). En algunas ocasiones, en el caso de proteínas de unión a antígeno de PCSK9, tales como una molécula neutralizante que disminuye la capacidad de PCSK9 de unirse al LDLR. En algunas ocasiones, la capacidad neutralizante se caracteriza y/o describe a través de un ensayo de competición. En algunas ocasiones, la capacidad neutralizante se describe en términos de un valor IC50 o EC50. Las ABP 27B2, 13H1, 13B5 y 3C4 son ABP no neutralizantes, 3B6, 9C9 y 31A4 son neutralizantes débiles, y el resto de las ABP en la Tabla 2 son neutralizantes fuertes. Los anticuerpos o proteínas de unión a antígeno adecuados para el uso de acuerdo con la invención neutralizan por unión a PCSK9 y evitando que PCSK9 se una a LDLR (o reduciendo la capacidad de PCSK9 de unirse a LDLR). También se describen en el presente documento anticuerpos o ABP que neutralizan por unión a PCSK9, y aunque todavía permiten que PCSK9 se una a LDLR, evitan o reducen la degradación mediada por PCSK9 de LDLR. Así, una ABP o anticuerpo neutralizante tal puede todavía permitir la unión PCSK9/LDLR, pero evitará (o reducirá) la degradación de LDLR posterior en donde está implicada PCSK9.
El término "diana" se refiere a una molécula o una parte de una molécula capaz de ser unida por una proteína de unión a antígeno. En determinadas ocasiones, una diana puede tener uno o más epítopos. En determinadas ocasiones, una diana es un antígeno. El uso de "antígeno" en la expresión "proteína de unión a antígeno" indica simplemente que la secuencia de la proteína que comprende el antígeno puede ser unida por un anticuerpo. En este contexto, no se requiere que la proteína sea extraña o que sea capaz de inducir una respuesta inmune.
El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno neutralizantes o anticuerpos neutralizantes) que compiten para el mismo epítopo significa competición entre proteínas de unión a antígeno según se determina por un ensayo en donde la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de éste) que se está ensayando evita o inhibe (por ejemplo, reduce) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia (por ejemplo, un ligando, o un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, PCSK9 o un fragmento de ésta). Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una proteína de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) en fase sólida directo o indirecto, inmunoensayo enzimático (EIA) en fase sólida directo o indirecto, ensayo de competición en sándwich (por ejemplo, véase, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA en fase sólida directo biotinaavidina (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA en fase sólida con marcaje directo usando marcaje con I-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de éstos, una proteína de unión a antígeno de ensayo no marcada y una proteína de unión a antígeno de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcaje unido a la superficie sólida o células en presencia de la proteína de unión a antígeno de ensayo. Habitualmente, la proteína de unión a antígeno de ensayo está presente en exceso. Las proteínas de unión a antígeno identificadas por el ensayo de competición (proteínas de unión a antígeno competidoras) incluyen proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo unido por la proteína de unión a antígeno de referencia como para que ocurra impedimento estérico. Los detalles adicionales respecto a los métodos para determinar unión competitiva se proporcionan en los ejemplos de la presente memoria. Habitualmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá (por ejemplo, reducirá) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común al menos un 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ó 75% o más. En algunos casos, la unión se inhibe al menos un 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ó 97% o más.
El término "antígeno" se refiere a una molécula o parte de una molécula que puede ser unida por un agente de unión selectivo, tal como una proteína de unión a antígeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de éste). En algunas ocasiones, el antígeno puede ser usado en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a ese antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos que pueden interaccionar con diferentes proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante que puede ser unido por una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo o a un receptor de células T. Un epítopo es una región de un antígeno que es unida por una proteína de unión a antígeno dirigida a ese antígeno, y cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que contactan directamente la proteína de unión a antígeno. Lo más frecuentemente, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otras clases de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características de estructura tridimensional específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
Tal y como se usa en la presente memoria, "sustancialmente puro" significa que la especie de molécula descrita es la especie predominante presente, esto es, en una base molar es más abundante que cualesquiera otras especies individuales en la misma mezcla. En determinadas ocasiones, una molécula sustancialmente pura es una composición en donde la especie objeto comprende al menos 50% (en una base molar) de todas las especies de macromoléculas presentes. En otras ocasiones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80%, 85%, 90%, 95%, ó 99% de todas las especies de macromoléculas presentes en la composición. En otras ocasiones, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial en donde las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y así la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.
El término "agente" se usa en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto que consiste en materiales biológicos.
Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "mareaje" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotina que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En determinadas ocasiones, el marcaje o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas y pueden usarse. Los ejemplos de marcajes para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcajes fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos a base de lantánidos), marcajes enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscente, grupos biotinilo, epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En determinadas ocasiones, los marcajes se unen por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
El término "muestra biológica", tal y como se usa en la presente memoria, incluye, pero no está limitado a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o ser vivo con anterioridad. Dichos seres vivos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, y otros animales. Dichas sustancias incluyen, pero no están limitadas a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, nódulos linfáticos, y piel.
El término "composición de agente farmacéutico" (o agente o fármaco) tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto químico, composición, agente o fármaco capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. No requiere necesariamente más de un tipo de ingrediente.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una proteína de unión a antígeno de PCSK9 determinada para producir una respuesta terapéutica en un mamífero. Dichas cantidades terapéuticamente efectivas son averiguadas fácilmente por un experto en la técnica.
El término "modulador", tal y como se usa en la presente memoria, es un compuesto que cambia o altera la actividad o función de una molécula. Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o disminución en la magnitud de una determinada actividad o función de una molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En determinadas ocasiones, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Algunas actividades y funciones ejemplares de una molécula incluyen, pero no están limitadas a, afinidad de unión, actividad enzimática, y transducción de la señal. Algunos inhibidores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 6.660.843 (correspondiente a la Solicitud PCT No. WO 01/83525).
Los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente e incluyen sujetos animales humanos y no humanos así como aquellos con trastornos formalmente diagnosticados, aquellos sin trastornos formalmente diagnosticados, aquellos que reciben atención médica, aquellos que presentan riesgo de desarrollar los trastornos, etc.
El término "tratar" y "tratamiento" incluye tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos, y aplicaciones en donde se reduce el riesgo de que un sujeto desarrollará un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la cura completa de un trastorno y engloba ocasiones en donde se reducen los síntomas o factores de riesgo subyacentes.
El término "prevenir" no requiere el 100% de eliminación de la posibilidad de un evento. En lugar de esto, indica que la probabilidad de la aparición del evento se ha reducido en presencia del compuesto o método.
Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo celular y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse según las especificaciones del fabricante o como se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente según métodos convencionales muy conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). A no ser que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son las conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y administración, y tratamiento de pacientes.
Proteínas de unión a antígeno para PCSK9
La proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de serina implicada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) (Horton et al., 2007; Seidah y Prat, 2007). PCSK9 es una prohormona-proproteína convertasa en la familia de la subtilisina (S8) de proteasas de serina (Seidah et al., 2003). Una secuencia de aminoácidos de PCSK9 humana ejemplar se presenta como SEQ ID NOs: 1 y 3 en la FIG. 1A (que representa el "pro" dominio de la proteína como subrayado) y la FIG. 1B (que representa la secuencia señal en negrita y el pro dominio subrayado). Una secuencia codificadora de PCSK9 humana ejemplar se presenta como SEQ ID NO: 2 (FIG. 1B). Como se describe en la presente memoria, las proteínas PCSK9 también pueden incluir fragmentos de la proteína PCSK9 de longitud completa. La estructura de la proteína PCSK9 se ha resuelto recientemente por dos grupos (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, y Piper et al., Structure, 15:1-8, 2007). PCSK9 incluye una secuencia señal, un prodominio N-terminal, un dominio catalítico semejante a subtilisina y un dominio C-terminal.
En la presente memoria se describen proteínas de unión a antígeno (ABP) que se unen a PCSK9, incluyendo PCSK9 humana. En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno descritas son polipéptidos que comprenden una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR), como se describe en la presente memoria. En algunas proteínas de unión a antígeno, las CDR están incluidas en una región "marco", que orienta la o las CDR de manera que se consiguen las propiedades de unión a antígeno apropiadas de la o las CDR. Las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria pueden interferir con, bloquear, reducir o modular la interacción entre PCSK9 y LDLR. Dichas proteínas de unión a antígeno se indican como "neutralizantes". En algunas ocasiones, la unión entre PCSK9 y LDLR todavía puede ocurrir, incluso si la proteína de unión a antígeno es neutralizante y se une a PCSK9. Por ejemplo, en algunas ocasiones, la ABP evita o reduce la influencia adversa de PCSK9 en LDLR son bloquear el sitio de unión a LDLR en PCSK9. Así, en algunas ocasiones, la ABP modula o altera la capacidad de PCSK9 para resultar en la degradación de LDLR, sin tener que evitar la interacción de unión entre PCSK9 y LDLR. Dichas ABP pueden describirse específicamente como ABP "neutralizantes no competitivamente". La ABP neutralizante adecuada para el uso de acuerdo con la presente invención se une a PCSK9 en una localización y/o manera que evita que PCSK9 se una a LDLR. Dichas ABP pueden describirse específicamente como ABP "neutralizantes competitivamente". Los dos neutralizantes anteriores pueden resultar en que esté presente una cantidad mayor de LDLR libre en un sujeto, lo que resulta en más unión de LDLR a LDL (reduciendo de esta manera la cantidad de LDL en el sujeto). A su vez, esto resulta en una reducción en la cantidad de colesterol sérico presente en un sujeto.
En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en la presente memoria son capaces de inhibir la actividad mediada por PCSK9 (incluyendo unión). En algunas ocasiones, la unión de las proteínas de unión a antígeno a estos epítopos inhibe, inter alia, las interacciones entre PCSK9 y LDLR y otros efectos fisiológicos mediados por PCSK9. En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno son humanas, tales como anticuerpos completamente humanos frente a PCSK9.
La ABP se une al dominio catalítico de PCSK9. En algunas ocasiones, la ABP se une selectivamente a la forma madura de PCSK9. La ABP se une al dominio catalítico de una manera tal que PCSK9 no puede unirse o unirse tan eficientemente a LDLR.
Las proteínas de unión a antígeno que se describen en la presente memoria tienen una variedad de utilidades. Algunas de las proteínas de unión a antígeno, por, son útiles en ensayos de unión específicos, purificación por afinidad de PCSK9, en particular PCSK9 humana o sus ligandos y en ensayos de cribado para identificar otros antagonistas de la actividad de PCSK9. Algunas de las proteínas de unión a antígeno son útiles para inhibir la unión de PCSK9 a LDLR, o inhibir las actividades mediadas por PCSK9.
Las proteínas de unión a antígeno pueden usarse en una variedad de aplicaciones terapéuticas, como se explica en la presente memoria. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de PCSK9 son útiles para tratar afecciones asociadas con PCSK9, tales como trastornos relacionados con el colesterol (o "trastornos relacionados con el colesterol sérico") tales como hipercolesterolemia, como se describe adicionalmente en la presente memoria. Otros usos para las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, el diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas con PCSK9 y ensayos de cribado para determinar la presencia o ausencia de PCSK9. Algunas de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria son útiles para tratar las consecuencias, síntomas, y/o la patología asociada con la actividad de PCSK9.
En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan comprenden una o más CDR (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDR). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una estructura de polipéptido y (b) una o más CDR que están insertadas en y/o unidas a la estructura de polipéptido. La estructura de polipéptido puede tomar una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, puede ser, o comprender, el marco de un anticuerpo natural, o fragmento o variante de éste, o puede ser de naturaleza completamente sintética. Los ejemplos de varias estructuras de polipéptido se describen adicionalmente más adelante.
En determinadas ocasiones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno descritas aquí es un anticuerpo o deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces referidos en la presente memoria como "miméticos de anticuerpo"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (algunas veces referidas como "conjugados de anticuerpos"), y partes o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab', un F(ab')2 , o un scFv). Las varias estructuras se describen y definen adicionalmente en la presente memoria.
Las proteínas de unión a antígeno adecuadas para el uso de acuerdo con la invención se unen específicamente y/o selectivamente a PCSK9 humana como se representa en la FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une específicamente y/o selectivamente a la proteína PCSK9 humana que tiene y/o consiste en los residuos 153-692 de SEQ ID NO: 3. En algunas ocasiones la ABP se une específicamente y/o selectivamente a PCSK9 humana que tiene y/o consiste en los residuos 31-152 de SEQ ID NO: 3. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une específicamente al menos a un fragmento de la proteína PCSK9 y/o una proteína PCSK9 de longitud completa, con o sin una secuencia señal.
La proteína de unión a antígeno adecuada para el uso de acuerdo con la invención puede inhibir, interferir con o modular una o más actividades biológicas de PCSK9. En una ocasión, una proteína de unión a antígeno se une específicamente a PCSK9 humana y/o inhibe sustancialmente la unión de PCSK9 humana a LDLR al menos aproximadamente un 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, o más (por ejemplo, midiendo la unión en un ensayo de unión competitiva in vitro). Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se describen en la presente memoria son anticuerpos. En algunas ocasiones, la ABP tiene una Kd de menos (unión más fuerte) de 10'7, 10'8, 10 -s, 10-10, 10-11, 10'12, 10'13 M. En algunas ocasiones, la ABP tiene una IC50 para bloquear la unión de LDLR a PCSK9 (D374Y, variante de alta afinidad) de menos de 1 microM, 1.000 nM a 100 nM, 100nM a 10 nM, 10nM a 1 nM, 1.000μM a 500μM, 500 μM a 200 μM, menos de 200 μM, 200 μM a 150 μM, 200 μM a 100 μM, 100 μM a 10 μM, 10 μM a 1 μM.
Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada de IgG2 de un anticuerpo anti-PCSK9 adecuado para el uso de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 154, FIG. 3KK.
Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 de un anticuerpo anti-PCSK9 adecuado para el uso de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 155, FIG. 3KK.
Un ejemplo de un dominio constante de cadena ligera kappa de un anticuerpo anti-PCSK9 tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 157, FIG. 3Kk .
Un ejemplo de un dominio constante de cadena ligera lambda de un anticuerpo anti-PCSK9 tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 156, FIG. 3KK.
Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulinas presentan generalmente la misma estructura global, que comprende regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas más frecuentemente "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja cadena pesada/cadena ligera mencionadas anteriormente se alinean típicamente por las regiones marco para formar una estructura que se une específicamente a un epítopo específico en la proteína diana (por ejemplo, PCSK9). Desde el N-terminal hasta el C-terminal, las regiones variables de cadena ligera y pesada naturales se ajustan ambas típicamente al orden siguiente de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha concebido un sistema de numeración para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD), o Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
En la presente memoria se describen varias regiones variables de cadena pesada y cadena ligera y se representan en las FIGs. 2A-3JJ y 3LL-3BBB. En algunas ocasiones, cada una de estas regiones variables puede estar unida a las regiones constantes de cadena pesada y ligera anteriores para formar una cadena pesada y ligera de anticuerpo completa, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generada puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa.
Los ejemplos específicos de algunas de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos que se proporcionan y sus secuencias de aminoácidos correspondientes se resumen en la TABLA 2.
TABLA 2
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De nuevo, cada una de las cadenas pesadas variables ejemplares listadas en la Tabla 2 puede combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras variables ejemplares mostradas en la Tabla 2 para formar un anticuerpo. La Tabla 2 muestra emparejamientos de cadena ligera y pesada ejemplares encontrados en varios de los anticuerpos descritos en la presente memoria. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las listadas en la Tabla 2. En otros, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo, un anticuerpo o proteína de unión a antígeno puede incluir una cadena pesada y una cadena ligera, dos cadenas pesadas, o dos cadenas ligeras. En algunas ocasiones la proteína de unión a antígeno comprende (y/o consiste en) 1, 2, y/o 3 CDR pesada y/o ligera de al menos una de las secuencias listadas en la Tabla 2 (las CDR para las secuencias se indican en las FIGs. 2A-3D, y otras ocasiones en las FIGs. 3CCC-3JJJ y 15A-15D). En algunas ocasiones, las 6 CDR (CDR1-3 de la ligera (CDRL1, CDRL2, CDRL3) y CDR1-3 de la pesada (CDRH1, CDRH2, y CDRH3)) son parte de la ABP. En algunas ocasiones, 1, 2, 3, 4, 5, o más CDR están incluidas en la ABP. En algunas ocasiones, una CDR pesada y una ligera de las CDR en las secuencias en la Tabla 2 está incluida en la ABP (las CDR para las secuencias en la tabla 2 se indican en las FIGs. 2A-3D). En algunas ocasiones, también están incluidas secciones adicionales (por ejemplo, como se representa en la FIG. 2A-2D, 3A-3D, y otras ocasiones en 3CCC-3JJJ y 15A-15D) en la ABP. Los ejemplos de CDR y FR para las cadenas pesada y ligera indicadas en la Tabla 2 se muestran en las FIGs. 2A-3D (y otras ocasiones en las FIGs. 3CCC-3JJJ y 15A-15D). Las secuencias variables de cadena ligera opcionales (incluyendo CDR1, CDR2, CDR3, FR1, Fr2, FR3, y FR4) pueden seleccionarse de los siguiente: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. Las secuencias variables de cadena pesada opcionales (incluyendo CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, y FR4) pueden seleccionarse de lo siguiente: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60. En algunas de las entradas en la FIG. 2A-3D, se identifican variaciones de las secuencias o límites alternativos de las CDR y FR. Estas alternativas se identifican con un "v1" después del nombre de la ABP. Como la mayor parte de estas alternativas son minoritarias en la naturaleza, sólo se muestran en la tabla secciones con diferencias. Se entiende que la sección restante de la cadena ligera o pesada es la misma como se muestra para la ABP base en los demás paneles. Así, por ejemplo, 19H9v1 en la FIG. 2C tiene las mismas FR1, CDR1, y FR2 que 19H9 en la FIG. 2A ya que la única diferencia se indica en la FIG. 2C. Para tres de las secuencias de ácido nucleico (ABP 26E10, 30B9, y 31B12), se proporcionan secuencias de ácido nucleico adicionales en las figuras. Como apreciará un experto en la técnica, no se necesita realmente usar más de una de dichas secuencias en la creación de un anticuerpo o ABP. De hecho, en algunas ocasiones, sólo es necesario que esté presente uno o ninguno de los ácidos nucleicos de cadena pesada o ligera específico.
En algunas ocasiones, la ABP está codificada por una secuencia de ácido nucleico que puede codificar cualquiera de las secuencias de proteína en la Tabla 2.
En algunas ocasiones, la ABP se une selectivamente a la forma de PCSK9 que se une a LDLR (por ejemplo, la forma autocatalizada de la molécula).
En algunas ocasiones, el anticuerpo se une selectivamente a proteínas PCSK9 variantes, por ejemplo, D374Y sobre PCSK9 de tipo salvaje. En algunas ocasiones, estos anticuerpos se unen a la variante al menos dos veces más fuertemente que al tipo salvaje, y preferiblemente 2-5, 5-10, 10-100, 100-1.000, 1.000-10.000 veces o más al mutante que al tipo salvaje (según se mide mediante una Kd). En algunas ocasiones, el anticuerpo inhibe selectivamente la interacción de la PCSK9 variante D374Y con LDLR sobre la capacidad de PCSK9 de tipo salvaje de interaccionar con LDLR. En algunas ocasiones, estos anticuerpos bloquean la capacidad de la variante de unirse a LDLR más fuertemente que la capacidad del tipo salvaje, por ejemplo, al menos dos veces tan fuertemente como el tipo salvaje, y preferiblemente 2-5, 5-10, 10-100, 100-1.000 veces o más al mutante que al tipo salvaje (según se mide mediante una IC50). En algunas ocasiones, el anticuerpo se une a y neutraliza tanto PCSK9 de tipo salvaje como las formas variantes de PCSK9, tales como D374Y a niveles similares. En algunas ocasiones, el anticuerpo se une a PCSK9 para evitar que las variantes de LDLR se unan a PCSK9. En algunas ocasiones, las variantes de LDLR son al menos 50% idénticas a LDLR humano. Se indica que las variantes de LDLR son conocidas para los expertos en la técnica (por ejemplo, Brown MS et al, "Calcium cages, acid baths and recycling receptors" Nature 388: 629-630, 1997). En algunas ocasiones, la ABP puede elevar el nivel de LDLR efectivo en hipercolesterolemia familiar heterocigota (donde está presente una variante de LDLR con pérdida de función).
En algunas ocasiones, la ABP se une a (pero no bloquea) variantes de PCSK9 que tienen al menos 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma de PCSK9 representada en la FIG. 1A y/o FIG. 1B. En algunas ocasiones, la ABP se une a (pero no bloquea) variantes de PCSK9 que tienen al menos 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma madura de PCSK9 representada en la FIG. 1A y/o FIG. 1B. En algunas ocasiones, la ABP se une a y evita que las variantes de PCSK9 que tienen al menos 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma de PCSK9 representada en la FIG. 1A y/o FIG. 1B interaccionen con LDLR. En algunas ocasiones, la ABP se une a y evita que las variantes de PCSK9 que tienen al menos 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma madura de PCSK9 representada en la FIG. 1B interaccionen con LDLR. En algunas ocasiones, la variante de PCSK9 es una variante humana, tal como las variantes en la posición 474, E620G, y/o E670G. En algunas ocasiones, el aminoácido en la posición 474 es valina (como en otros humanos) o treonina (como en cino y ratón). Dados los datos de reactividad cruzada presentados en la presente memoria, se cree que los presentes anticuerpos se unirán fácilmente a las variantes anteriores.
En algunas ocasiones, la ABP se une a un epítopo unido por uno de los anticuerpos descritos en la Tabla 2. En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se unen a un estado conformacional específico de PCSK9 de manera que se evita que PCSK9 interaccione con LDLR.
Proteínas de unión a antígeno humanizadas (por ejemplo, anticuerpos)
Como se describe en la presente memoria, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede comprender un anticuerpo humanizado y/o parte de éste. Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmune humoral de ratones.
En determinadas ocasiones, un anticuerpo humanizado es sustancialmente no inmunogénico en seres humanos. En determinadas ocasiones, un anticuerpo humanizado tiene sustancialmente la misma afinidad para una diana que un anticuerpo de otra especie de la que deriva el anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. 5.530.101, Patente U.S. 5.693.761; Patente U.S. 5.693.762; Patente U.S. 5.585.089.
En determinadas ocasiones, se identifican los aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo que pueden modificarse sin disminuir la afinidad nativa del dominio de unión a antígeno mientras se reduce su inmunogenicidad. Véase, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5.766.886 y 5.869.619.
En determinadas ocasiones, la modificación de un anticuerpo por métodos conocidos en la técnica se diseña típicamente para conseguir una afinidad de unión incrementada para una diana y/o para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo en el receptor. En determinadas ocasiones, los anticuerpos humanizados se modifican para eliminar sitios de glicosilación con el fin de incrementar la afinidad del anticuerpo para su antígeno cognado. Véase, por ejemplo, Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). En determinadas ocasiones, se usan técnicas tales como "remodelado," "hiperquimerización", o "recubrimiento/modificación en superficie" para producir anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol.
81:105 (1998); Roguska et al., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); y Patente U.S. No. 6.072.035. En determinadas ocasiones de dichas ocasiones, dichas técnicas reducen típicamente la inmunogenicidad del anticuerpo reduciendo el número de residuos extraños, pero no evitan respuestas anti-idiotípicas y anti-alotípicas después de la administración repetida de los anticuerpos. Algunos otros métodos para reducir la inmunogenicidad se describen, por ejemplo, en Gilliland et al., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999).
En determinados casos, la humanización de anticuerpos resulta en una pérdida de la capacidad de unión al antígeno. En determinadas ocasiones, los anticuerpos humanizados se "retro mutan". En algunas ocasiones de dichas ocasiones, el anticuerpo humanizado se muta para incluir uno o más de los residuos de aminoácidos encontrados en el anticuerpo donante. Véase, por ejemplo, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999).
En determinadas ocasiones, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para PCSK9 pueden injertarse en regiones marco (FR) de la misma, u otra, especie. En determinadas ocasiones, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para PCSK9 pueden injertarse en FR humanas consenso. Para crear FR humanas consenso, en determinadas ocasiones, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humana se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. En determinadas ocasiones, las FR de un anticuerpo para PCSK9 cadena pesada o cadena ligera se reemplazan con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En determinadas ocasiones, los aminoácidos raros en las FR de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo para PCSK9 no se reemplazan, mientras el resto de los aminoácidos de FR se reemplazan. Los aminoácidos raros son aminoácidos específicos que están en posiciones en donde no se encuentran habitualmente en las FR. En determinadas ocasiones, las regiones variables injertadas de un anticuerpo para PCSK9 pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de un anticuerpo para PCSK9. En determinadas ocasiones, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo de cadena única Fv. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 6.180.370, 6.054.297, 5.693.762, 5.859.205, 5.693.761, 5.565.332, 5.585.089, y 5.530.101, y en Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998).
Proteínas de unión a antígeno humanas (por ejemplo, anticuerpos)
Como se describe en la presente memoria, una proteína de unión a antígeno que se une a PCSK9 puede comprender un anticuerpo humano (es decir, completamente humano) y/o parte de éste. En determinadas ocasiones, se describen en la presente memoria secuencias de nucleótidos que codifican, y las secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias correspondientes a las regiones variables. En determinadas ocasiones, se describen secuencias correspondientes a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), específicamente de CDR1 a CDR3. También se describe en la presente memoria una línea celular de hibridoma que expresa dicha molécula de inmunoglobulina o un anticuerpo monoclonal. En determinadas ocasiones, una línea celular de hibridoma se selecciona de al menos una de las líneas celulares descritas en la Tabla 2, por ejemplo, 21B12, 16F12 y 31H4. En determinadas ocasiones, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano purificado para PCSK9 humana.
Se pueden preparar por ingeniería cepas de ratones deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de loci de Ig humana en anticipación de que dichos ratones producirían anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig humana largos pueden preservar la diversidad génica variable grande así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos. Mediante la explotación de la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la ausencia de tolerancia inmunológica para proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducido en estas cepas de ratones puede rendir anticuerpos completamente humanos de alta afinidad frente a cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridomas, pueden producirse y seleccionarse Mab humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Algunos métodos ejemplares se describen en WO 98/24893, Patente U.S. No. 5.545.807, EP 546073, y EP 546073.
En determinadas ocasiones, se pueden usar regiones constantes de especies distintas del ser humano junto con la o las regiones variables humanas.
La capacidad de clonar y reconstruir loci humanos con tamaño de megabases en cromosomas artificiales de levadura (YAC) y de introducirlos en la línea germinal de ratones proporciona una estrategia para elucidar los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados de forma aproximada así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, la utilización de dicha tecnología para la sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progresión de enfermedades.
Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de murino o rata puede dar lugar al aclaramiento rápido de los anticuerpos o puede dar lugar a la generación de una respuesta inmune frente al anticuerpo por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de murino o rata, pueden generarse anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal de manera que el roedor, otro mamífero o animal produce anticuerpos completamente humanos.
Los anticuerpos humanizados son aquellos anticuerpos que, mientras inicialmente empiezan conteniendo secuencias de aminoácidos de anticuerpos que no son humanos, han tenido al menos algunas de estas secuencias de aminoácidos de anticuerpos no humanos reemplazadas con secuencias de anticuerpos humanos. Esto contrasta con los anticuerpos humanos, en donde el anticuerpo está codificado (o es capaz de ser codificado) por genes presentes en un ser humano.
Variantes de proteínas de unión a antígeno
Otros anticuerpos que se describen en la presente memoria son variantes de las ABP listadas anteriormente formados por combinación o subpartes de las cadenas variable pesada y variable ligera mostradas en la Tabla 2 y comprenden cadenas variables ligera y/o variable pesada que cada una tiene al menos 50%, 50-60, 60-70, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, o por encima del 99% de identidad con las secuencias de aminoácidos de las secuencias en la Tabla 2 (bien la secuencia completa o una subparte de la secuencia, por ejemplo, una o más CDR). En algunos casos, dichos anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras en otros las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas (o subpartes de éstas). En algunas ocasiones, la comparación de secuencias en la FIG. 2A-3D (y 13A-13J y otras ocasiones en 15A-15D) puede usarse con el fin de identificar secciones de los anticuerpos que pueden modificarse observando aquellas variaciones que impactan en la unión y aquellas variaciones que no parecen impactar en la unión. Por ejemplo, comparando secuencias similares, se pueden identificar aquellas secciones (por ejemplo, aminoácidos particulares) que pueden modificarse y cómo pueden modificarse mientras todavía retienen (o mejoran) la funcionalidad de la ABP. En algunas ocasiones, las variantes de las ABP incluyen aquellos grupos consenso y secuencias representadas en las FIGs. 13A, 13C, 13F, 13G, 13H, 13I y/o 13J y se permiten variaciones en las posiciones identificadas como variables en las figuras. Las CDR mostradas en las FIGs. 13A, 13C, 13F, y 13G se definieron tomando como base una combinación híbrida del método de Chothia (basado en la localización de las regiones bucle estructurales, véase, por ejemplo, "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk y Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 de noviembre (1997)) y el método de Kabat (basado en la variabilidad de la secuencia, véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al., (1991)). Cada residuo determinado por cualquiera de los dos métodos, se incluyó en la lista final de residuos de CDR (y se presentan en las FIGs. 13A, 13C, 13F, y 13G). Las CDR en las FIGs. 13H, 13I, y 13J se obtuvieron sólo por el método de Kabat. A no ser que se especifique otra cosa, las secuencias consenso definidas, CDR, y fR en las FIGs. 13H-13J definirán y controlarán las CDR y FR indicadas para las ABP referenciadas en la FiG. 13.
Una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria puede comprender una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60.
En algunos casos, la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una secuencia que es al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a una o más CDR de las CDR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62,89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60. En algunas ocasiones, están presentes 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 CDR (siendo cada una al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a las secuencias anteriores).
En algunos casos, la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una secuencia que es al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a una o más FR de las FR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, y 60. En algunas ocasiones, están presentes 1, 2, 3, ó 4 FR (siendo cada una al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a las secuencias anteriores).
En algunos casos, una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40; 42, 44, y 46. En determinados casos, una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. En determinados casos, una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46.
En algunos casos, la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una secuencia que es al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a una o más CDR de las CDR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. En algunas ocasiones, están presentes 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 CDR (siendo cada una al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a las secuencias anteriores).
En algunos casos, la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria comprende una secuencia que es al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a una o más FR de las FR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, y 46. En algunas ocasiones, están presentes 1, 2, 3, ó 4 FR (siendo cada una al menos 90%, 90-95%, y/o 95-99% idéntica a las secuencias anteriores).
A la vista de la presente descripción, un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de las ABP como se muestra en la presente memoria usando técnicas muy conocidas. En determinadas ocasiones, un experto en la técnica puede identificar áreas de la molécula adecuadas que pueden cambiarse sin destruir la actividad tomando como diana regiones que no se cree que son importantes para la actividad. En determinadas ocasiones, se pueden identificar residuos y partes de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. En determinadas ocasiones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido.
Además, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos residuos de aminoácidos que se predice que son importantes.
Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en ABP similares. A la vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir el alineamiento de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo respecto a su estructura tridimensional. En determinadas ocasiones, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en residuos de aminoácidos que se predice que están en la superficie de la proteína, ya que dichos residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una única sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden cribarse entonces usando ensayos de actividad conocidos para los expertos en la técnica. Dichas variantes pueden usarse para recoger información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular resulta en actividad destruida, reducida de manera indeseable, o inadecuada, las variantes con dicho cambio pueden evitarse. En otras palabras, tomando como base la información recogida de dichos experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en donde deben evitarse sustituciones adicionales bien solas o en combinación con otras mutaciones.
Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, están disponibles actualmente programas informáticos para ayudar en la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor del 30%, o similitud mayor del 40% tienen frecuentemente topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción aumentada de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos en la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dada y que una vez se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá drásticamente más exacta.
Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "reconocimiento de plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1 ):15-19 (1996)), "análisis de perfiles" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), y "conexión evolutiva" (Véase Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)).
En determinadas ocasiones, las variantes de la proteína de unión a antígeno incluyen variantes de glicosilación en donde el número y/o tipo de sitios de glicosilación se ha alterado comparado con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En determinadas ocasiones, las variantes de proteína comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación unidos por N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación unido por N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde los residuos de aminoácidos designados como X pueden ser cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato unida por N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena de carbohidrato unida por N existente. También se proporciona una reorganización de cadenas de carbohidrato unidas por N en donde uno o más sitios de glicosilación unidos por N (típicamente aquellos naturales) se eliminan y se crean uno o más sitios unidos por N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en donde uno o más residuos de cisteína se delecionan de o sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) comparado con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína tienen generalmente menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y tienen típicamente un número par para minimizar las interacciones que resultan de cisteínas desemparejadas.
Según determinadas ocasiones, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales en dichos polipéptidos. Según determinadas ocasiones, las sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (en determinadas ocasiones, sustituciones de aminoácidos conservativas) pueden hacerse en la secuencia natural (en determinadas ocasiones, en la parte del polipéptido fuera del o los dominios que forman contactos intermoleculares). En determinadas ocasiones, una sustitución de aminoácidos conservativa típicamente puede no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984));
Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature, 354:105 (1991).
En algunos casos, las variantes son variantes de las secuencias de ácido nucleico de las ABP descritas en la presente memoria. Un experto en la técnica apreciará que la discusión anterior puede usarse para identificar, evaluar, y/o crear variantes de proteínas ABP y también para secuencias de ácido nucleico que pueden codificar estas variantes de proteína. Así, también se describen en el presente documento secuencias de ácido nucleico que codifican estas variantes de proteína (así como secuencias de ácido nucleico que codifican las ABP en la Tabla 2, pero que son diferentes de las descritas explícitamente en la presente memoria). Por ejemplo, una variante de ABP puede tener al menos 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99 o más de identidad con al menos una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NOs: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 o al menos una a seis (y varias combinaciones de éstas) de la o las CDR codificadas por las secuencias de ácido nucleico en SEQ ID nOs: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, y 151.
En algunos casos, el anticuerpo (o secuencia de ácido nucleico que lo codifica) es una variante si la secuencia de ácido nucleico que codifica la ABP particular (o la secuencia de ácido nucleico en sí misma) puede hibridar selectivamente con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas en la Tabla 2 (tales como, pero no limitadas a SEQ ID NO: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, y 151) en condiciones astringentes. En una, las condiciones moderadamente astringentes adecuadas incluyen prelavado en una disolución de 5XSSC; 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50°C, -65° C, 5xSSC, toda la noche o, en el evento de homología cruzada entre especies, a 45°C con 0,5xSSC; seguido de lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2x, 0,5x y 0,2xSSC que contiene 0,1% SDS. Dichas secuencias de ADN que hibridan también se describen, como lo están secuencias de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifican un polipéptido de anticuerpo que está codificado por una secuencia de ADN que hibrida y las secuencias de aminoácidos que están codificadas por estas secuencias de ácido nucleico. En algunos casos, las variantes de las CDR incluyen secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos codificadas por estas secuencias, que hibridan con una o más de las CDR en las secuencias indicadas anteriormente (las CDR individuales pueden determinarse fácilmente a la vista de las FIGs.
2A-3D, y otras ocasiones en las FIGs. 3CCC-3JJJ y 15A-15D). La expresión "hibridan selectivamente" referida en este contexto significa que se une de manera detectable y selectiva. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de éstos descritos en la presente memoria hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta astringencia para conseguir condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y discute en la presente memoria. Generalmente, la homología en la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos como se describen en la presente memoria y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos 80%, y más típicamente con homologías preferiblemente crecientes de al menos 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para concordancia máxima. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) para maximizar la concordancia; se prefieren las longitudes de hueco de 5 o menos siendo más preferida de 2 o menos. Alternativamente y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en la presente memoria, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, p. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 de este volumen, p. 1-10. Las dos secuencias o partes de éstas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son más de o igual a 50% idénticos cuando se alinean de manera óptima usando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se usa en la presente memoria para significar que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente evolutivamente) a toda o parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En contraste, el término "complementario a" se usa en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
Preparación de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos)
En determinados casos, las proteínas de unión a antígeno (tales como anticuerpos) se producen por inmunización con un antígeno (por ejemplo, PCSK9). En determinadas ocasiones, pueden producirse anticuerpos por inmunización con PCSK9 de longitud completa, una forma soluble de PCSK9, el dominio catalítico solo, la forma madura de PCSK9 mostrada en la FIG. 1A, una forma de variante de corte y empalme de PCSK9, o un fragmento de éstos. En determinadas ocasiones, los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser policlonales o monoclonales, y/o pueden ser anticuerpos recombinantes. En determinadas ocasiones, los anticuerpos como se describen en la presente memoria son anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, por inmunización de animales transgénicos capaces de producir anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Solicitud Publicada PCT No. WO 93/12227).
En determinadas ocasiones, pueden emplearse determinadas estrategias para manipular propiedades inherentes de un anticuerpo, tales como la afinidad de un anticuerpo para su diana. Dichas estrategias incluyen, pero no están limitadas a, el uso de mutagénesis específica de sitio o aleatoria de la molécula de polinucleótido que codifica un anticuerpo para generar una variante de anticuerpo. En determinadas ocasiones, dicha generación está seguida del cribado para variantes de anticuerpo que presentan el cambio deseado, por ejemplo, afinidad incrementada o disminuida.
En determinadas ocasiones, los residuos de aminoácidos diana en estrategias mutagénicas son aquellos en las CDR. En determinadas ocasiones, la diana son los aminoácidos en las regiones marco de los dominios variables. En determinadas ocasiones, se ha mostrado que dichas regiones marco contribuyen a las propiedades de unión a diana de determinados anticuerpos. Véase, por ejemplo, Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) y las referencias en ella.
En determinados casos, se producen bibliotecas de variantes de anticuerpo más pequeñas y más eficazmente cribadas por restricción de la mutagénesis aleatoria o específica de sitio a sitios de hiper-mutación en las CDR, que son sitios que corresponden a áreas tendentes a mutación durante el proceso de maduración por afinidad somática. Véase, por ejemplo, Chowdhury y Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) y las referencias en ella. En determinadas ocasiones, determinados tipos de elementos del ADN pueden usarse para identificar sitios de hiper-mutación incluyendo, pero no limitado a, determinadas repeticiones directas e invertidas, determinadas secuencias consenso, determinadas estructuras secundarias, y determinados palíndromos. Por ejemplo, dichos elementos de ADN que pueden usarse para identificar sitios de hiper-mutación incluyen, pero no están limitados a, una secuencia de tetrabase que comprende una purina (A o G), seguida de una guanina (G), seguida de una pirimidina (C o T), seguida bien de adenosina o timidina (A o T) (es decir, NG-G-C/T-NT). Otro ejemplo de un elemento de ADN que puede usarse para identificar sitios de hiper-mutación es el codón de serina, A-G-C/T.
Preparación de ABP completamente humanas (por ejemplo, anticuerpos)
En determinados casos, se usa una técnica de exposición en fago para generar anticuerpos monoclonales. En determinados casos, dichas técnicas producen anticuerpos monoclonales completamente humanos. En determinadas ocasiones, un polinucleótido que codifica un único fragmento de anticuerpo Fab o Fv se expresa en la superficie de una partícula de fago. Véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); Patente U.S. No. 5.885.793. En determinadas ocasiones, los fagos se "criban" para identificar aquellos fragmentos de anticuerpo que tienen afinidad para la diana. Así, algunos de dichos procesos mimetizan la selección inmune a través de la exposición de repertorios de fragmentos de anticuerpo en la superficie de bacteriófagos filamentosos, y posterior selección de fagos por su unión a la diana. En algunos de dichos procedimientos, se aíslan fragmentos de anticuerpo neutralizantes funcionales con alta afinidad. En algunas de dichas ocasiones (discutidas con más detalle más adelante), se crea un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos clonando genes V humanos reorganizados de forma natural de linfocitos de sangre periférica. Véase, por ejemplo, Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990).
Según determinados casos, los anticuerpos como se describen en la presente memoria se preparan a través de la utilización de un ratón transgénico que tiene una parte sustancial del genoma que produce el anticuerpo humano insertada pero que se vuelve deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Dichos ratones, son capaces entonces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para conseguir este resultado se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la especificación, en la presente memoria. En determinadas ocasiones, se pueden emplear métodos tales como los descritos en la Solicitud Publicada PCT No. WO 98/24893 o en Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).
Generalmente, las ABP monoclonales completamente humanas (por ejemplo, anticuerpos) específicas para PCSK9 pueden producirse como sigue. Se inmunizan ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, por ejemplo, PCSK9, se obtienen células linfáticas (tales como células B) de los ratones que expresan anticuerpos. Dichas células recuperadas se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En determinadas ocasiones, se proporciona la producción de una línea celular de hibridoma que produce anticuerpos específicos para PCSK9.
En determinados casos, los anticuerpos completamente humanos se producen exponiendo esplenocitos humanos (células B o T) a un antígeno in vitro, y después reconstituyendo las células expuestas en un ratón inmunocomprometido, por ejemplo, SCID o nod/SCID. Véase, por ejemplo, Brams et al., J.Immunol. 160: 2051­ 2058 (1998); Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000). En algunas de estas estrategias, el injerto de tejido fetal humano en ratones SCID (SCID-hu) resulta en hematopoyesis a largo plazo y desarrollo de células T humanas. Véase, por ejemplo, McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). En determinados casos, la respuesta inmune humoral en dichos ratones quiméricos depende del co-desarrollo de células T humanas en los animales. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994). En algunas estrategias, se trasplantan linfocitos de sangre periférica humana en ratones SCID. Véase, por ejemplo, Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988). En algunas ocasiones de dichos casos, cuando dichas células trasplantadas se tratan bien con un agente de cebado, tal como Enterotoxina A Staphylococcal (SEA), o con anticuerpos monoclonales anti-CD40 humana, se detectan niveles mayores de producción de células B. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995).
Así, en determinados casos, pueden producirse anticuerpos completamente humanos por la expresión de ADN recombinante en células huésped o por la expresión en células de hibridoma. En otras, pueden producirse anticuerpos usando las técnicas de exposición en fago descritas en la presente memoria.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria se prepararon a través de la utilización de la tecnología XenoMouse®, como se describe en la presente memoria. Dichos ratones, son capaces entonces de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para conseguir esto se describen en las patentes, solicitudes, y referencias descritas en la sección de antecedentes en la presente memoria. En particular, sin embargo, una ocasión preferida de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de éstos se describe en la Solicitud de Patente U.S. con No. de Serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre, 1996 y Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 98/24893, publicada el 11 de junio, 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre, 2000. Véase también Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).
A través del uso de dicha tecnología, se han producido anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a una variedad de antígenos. Esencialmente, las líneas de ratones XenoMouse® se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo, PCSK9), se recuperan células linfáticas (tales como células B) de los ratones hiper-inmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En la presente memoria se proporcionan métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para PCSK9a Además, en la presente memoria se proporciona la caracterización de los anticuerpos producidos por dichas líneas celulares, incluyendo análisis de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de dichos anticuerpos.
La producción de las cepas de ratones XenoMouse® se discute y delinea adicionalmente en la Solicitud de Patente U.S. con No. de Serie Nos. 07/466.008, presentada el 12 de enero, 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre, 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio, 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio, 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo, 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto, 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril, 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero, 1995, 08/430.938, presentada el 27 de abril, 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio, 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio, 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio, 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio, 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio, 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre, 1996, 08/759.620, presentada el 3 de diciembre, 1996, Publicación U.S. 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre, 2001 y Patentes U.S. Nos.
6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, y 5.939.598 y Patentes japonesas Nos. 3068 180 B2, 3068 506 B2, y 3068507 B2. Véase también Patente Europea No., EP 0463 151 B1, concesión publicada el 12 de junio, 1996, Solicitud de Patente Internacional No., WO 94/02602, publicada el 3 de febrero, 1994, Solicitud de Patente Internacional No., WO 96/34096, publicada el 31 de octubre, 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio, 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre, 2000.
En una estrategia alternativa, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado una estrategia de "minilocus". En la estrategia de minilocus, un locus de Ig exógeno se imita a través de la inclusión de partes (genes individuales) del locus de Ig. Así, uno o más genes Vh, uno o más genes Dh, uno o más genes Jh, una región constante mu, y habitualmente una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en una construcción para inserción en un animal. Esta estrategia se describe en la Patente U.S. No. 5.545.807 de Surani et al. y Patentes U.S. Nos. 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299, y 6.255.458 cada una de Lonberg y Kay, Patente U.S. No. 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, Patentes U.S. Nos. 5.612.205, 5.721.367, y 5.789.215 de Berns et al., y Patente U.S. No. 5.643.763 de Choi y Dunn, y Solicitudes de Patente U.S. de GenPharm International con Nos. de Serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto, 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto, 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre, 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo, 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio, 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre, 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril, 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio, 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre, 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre, 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre, 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo, 1994. Véase también la Patente Europea No. 0 546 073 B1, Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y Patente U.S. No.
5.981.175. Véase además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).
Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en donde, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes partes de cromosomas, o cromosomas completos. Véanse las Solicitudes de Patente Europea Nos. 773288 y 843961. Además, se han generado ratones kM™, que son el resultado de la fecundación cruzada de ratones Tc de Kirin con ratones de minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humana de los ratones de Kirin y el transgén de cadena kappa de los ratones Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero no están limitados a exposición en fagos (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed) exposición en ribosomas (CAT), exposición en levaduras, y semejantes.
En algunas ocasiones, los anticuerpos descritos en la presente memoria poseen cadenas pesadas de IgG4 humana así como cadenas pesadas de IgG2. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo IgG1. Los anticuerpos poseían afinidades altas, típicamente poseían una Kd de aproximadamente 10­ 6 a aproximadamente 10-13 M o menor, cuando se midió por varias técnicas.
Como se apreciará, los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares distintas de líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para transformar una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del huésped que se va a transformar. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son muy conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son muy conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo, pero no limitado a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células epiteliales de riñón humano 293, y varias otras líneas celulares. La líneas celulares de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a PCSK9.
En determinadas ocasiones, los anticuerpos y/o ABP se producen por al menos uno de los hibridomas siguientes: 21B12, 31H4, 16F12, cualesquiera otros hibridomas listados en la Tabla 2 o descritos en los ejemplos. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se unen a PCSK9 con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 nM, por ejemplo, 1.000μM a 100 μM, 100 μM a 10 μM, 10 μM a 1 μM, y/o 1 μM a 0,1 μM o menos.
En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una molécula de inmunoglobulina de al menos uno de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD, e IgM. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y/o una cadena pesada humana. En determinadas ocasiones, la cadena pesada es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, o IgM. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se han clonado para expresión en células de mamíferos. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una región constante distinta de cualquiera de las regiones constantes del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, e IgM.
En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG4 humana. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD o IgM humana. En otras ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG4 humana. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD o IgM humana. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno comprenden regiones variables de anticuerpos ligadas a una región constante que no es la región constante para el isotipo IgG2, ni la región constante para el isotipo IgG4. En determinadas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se han clonado para expresión en células de mamíferos.
En determinadas ocasiones, las modificaciones conservativas en las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de al menos una de las líneas de hibridoma: 21B12, 31H4 y 16F12 (y modificaciones correspondientes en los nucleótidos codificadores) producirán anticuerpos frente a PCSK9 que tienen características funcionales y químicas similares a las de los anticuerpos de las líneas de hibridoma: 21B12, 31H4 y 16F12. Al contrario, en determinadas ocasiones, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los anticuerpos frente a PCSK9 pueden conseguirse seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que se diferencian significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del núcleo molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.
Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de manera que hay poco efecto o ninguno en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis por escaneo de alanina".
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la técnica en el momento en donde se deseen dichas sustituciones. En determinadas ocasiones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes de los anticuerpos frente a PCSK9, o para incrementar o disminuir la afinidad de los anticuerpos frente a PCSK9 como se describe en la presente memoria.
En determinados casos, los anticuerpos adecuados para el uso de acuerdo con la presente invención pueden expresarse en líneas celulares distintas de líneas celulares de hibridoma. En determinadas ocasiones, las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. Según determinados casos, la transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Pat. U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. En determinados casos, el procedimiento de transformación usado puede depender del huésped que se va a transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son muy conocidas en la técnica e incluyen, pero no están limitadas a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo, pero no limitado a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias otras líneas celulares. En determinadas ocasiones, las líneas celulares pueden seleccionarse a través de la determinación de qué líneas celulares tienen niveles altos de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a HGF. Los vectores de expresión apropiados para células huésped de mamíferos son muy conocidos.
En determinados casos, las proteínas de unión a antígeno como se describen en el presente documento comprenden uno o más polipéptidos. En determinados casos, puede utilizarse cualquiera de una variedad de sistemas vector de expresión/huésped para expresar moléculas de polinucleótido que codifican polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. Dichos sistemas incluyen, pero no están limitados a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN de plásmido, o cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales.
En determinados casos, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se expresa recombinantemente en levaduras. Algunas de dichas usan sistemas de expresión disponibles comercialmente, por ejemplo, el Sistema de Expresión Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En determinados casos, dicho sistema se basa en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción. En determinados casos, la transcripción del inserto está dirigida por el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) después de inducción con metanol.
En determinados casos, un polipéptido secretado que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se purifica del medio de crecimiento de las levaduras. En determinados casos, los métodos usados para purificar un polipéptido del medio de crecimiento de las levaduras es el mismo que los usados para purificar el polipéptido de sobrenadantes de células bacterianas y de mamíferos.
En determinados casos, un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se clona en un vector de expresión de baculovirus, tal como pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). En determinadas ocasiones, dicho vector puede usarse según las directrices del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio sin proteínas sF9 y para producir polipéptido recombinante. En determinadas ocasiones, un polipéptido se purifica y concentra a partir de dicho medio usando una columna de heparina-Sefarosa (Pharmacia).
En determinados casos, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se expresa en un sistema de insectos. Algunos sistemas de insectos para la expresión de polipéptidos son muy conocidos para los expertos en la técnica. En uno de dichos sistemas, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. En determinadas ocasiones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido puede insertarse en un gen no esencial del virus, por ejemplo, en el gen de la polihedrina, y ponerse bajo el control del promotor de ese gen. En determinadas ocasiones, la inserción exitosa de una molécula de ácido nucleico convertirá al gen no esencial en inactivo. En determinadas ocasiones, esta inactivación resulta en una característica detectable. Por ejemplo, la inactivación del gen de la polihedrina resulta en la producción de virus que carecen de proteína de cubierta.
En determinados casos, pueden usarse virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia. Véase, por ejemplo, Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).
En determinados casos, se producen polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma preparados en células bacterianas como cuerpos de inclusión insolubles en las bacterias. En determinados casos, las células huésped que comprenden dichos cuerpos de inclusión se recogen por centrifugación; se lavan en 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. En determinados casos, el lisado se aclara por sonicación, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. En determinados casos, el sedimento que contiene polipéptido se resuspende en 50 mM Tris, pH 8, y 10 mM EDTA; se pone como una capa sobre 50% glicerol; y se centrifuga durante 30 minutos a 6.000 X g. En determinados casos, este sedimento puede resuspenderse en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) estándar desprovista de Mg++ y Ca++. En determinados casos, el polipéptido se purifica adicionalmente mediante fraccionamiento del sedimento resuspendido en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con SDS (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). En determinadas ocasiones, dicho gel puede sumergirse en 0,4 M KCI para visualizar la proteína, que puede escindirse y electroeluirse en tampón de corrida del gel que carece de SDS. Según determinados casos, se produce una proteína de fusión con Glutatión-S-Transferasa (GST) en bacterias como una proteína soluble. En determinados casos, dicha proteína de fusión GST se purifica usando un Módulo de Purificación GST (Pharmacia).
En determinados casos, es deseable "replegar" determinados polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. En determinadas ocasiones, dichos polipéptidos se producen usando determinados sistemas recombinantes discutidos en la presente memoria. En determinadas ocasiones, los polipéptidos se "repliegan" y/u oxidan para formar la estructura terciaria deseada y/o para generar uniones disulfuro. En determinados casos, dicha estructura y/o uniones están relacionadas con una determinada actividad biológica de un polipéptido. En determinados casos, el replegamiento se consigue usando cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, exponer el agente polipéptido solubilizado a un pH típicamente por encima de 7 en presencia de un agente caotrópico. Un agente caotrópico ejemplar es guanidina. En determinados casos, la disolución de replegamiento/oxidación también contiene un agente reductor y la forma oxidada de ese agente reductor. En determinados casos, el agente reductor y su forma oxidada están presentes en una proporción que generará un potencial redox particular que permite que se produzca la reorganización de disulfuro. En determinados casos, dicha reorganización permite la formación de puentes de cisteína. Las parejas de redox ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, cisteína/cistamina, glutatión/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. En determinados casos, se usa un co-disolvente para incrementar la eficiencia del replegamiento. Los codisolventes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, glicerol, polietilen glicol de varios pesos moleculares, y arginina.
En determinados casos, se purifica sustancialmente un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. Determinadas técnicas de purificación de proteínas son conocidas para los expertos en la técnica. En determinados casos, la purificación de la proteína implica el fraccionamiento en crudo de fraccionamientos de polipéptido de fracciones no polipeptídicas. En determinadas ocasiones, los polipéptidos se purifican usando técnicas cromatográficas y/o electroforéticas. Los métodos de purificación ejemplares incluyen, pero no están limitados a, precipitación con sulfato de amonio; precipitación con PEG; inmunoprecipitación; desnaturalización con calor seguida de centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero no limitado a, cromatografía de afinidad (por ejemplo, Proteína-A-Sefarosa), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, y cromatografía en fase inversa; filtración en gel; cromatografía en hidroxiapatito; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel de poliacrilamida; y combinaciones de éstas y otras técnicas. En determinadas ocasiones, un polipéptido se purifica por cromatografía líquida de proteínas rápida o por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En determinadas ocasiones, las etapas de la purificación pueden cambiarse o determinadas etapas pueden omitirse, y todavía resultar en un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado.
En determinados casos, se cuantifica el grado de purificación de una preparación de polipéptido. Determinados métodos para cuantificar el grado de la purificación son conocidos por los expertos en la técnica. Determinados métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, determinar la actividad de unión específica de la preparación y evaluar la cantidad de un polipéptido en una preparación por análisis por SDS/PAGE. Determinados métodos ejemplares para evaluar la cantidad de la purificación de una preparación de polipéptido comprenden calcular la actividad de unión de una preparación y compararla con la actividad de unión de un extracto inicial. En determinadas ocasiones, los resultados de dicho cálculo se expresan como "veces de purificación". Las unidades usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependen del ensayo particular que se lleva a cabo.
En determinados casos, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se purifica parcialmente. En determinados casos, la purificación parcial puede conseguirse usando menos etapas de purificación o utilizando formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, en determinados casos, la cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC resultará generalmente en "veces de purificación" mayores que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. En determinados casos, los métodos que resultan en un grado menor de purificación pueden tener ventajas en la recuperación total del polipéptido, o en el mantenimiento de la actividad de unión de un polipéptido.
En determinados casos, la migración electroforética de un polipéptido puede variar, algunas veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE. Véase, por ejemplo, Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977). Se apreciará que bajo diferentes condiciones de electroforesis, los pesos moleculares aparentes de un polipéptido purificado o parcialmente purificado pueden ser diferentes.
Epítopos ejemplares
Se describen en el presente documento epítopos a los que se unen los anticuerpos anti-PCSK9. En algunos casos, los epítopos a los que se unen los anticuerpos descritos ahora son particularmente útiles. En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno que se unen a cualquiera de los epítopos a los que se unen los anticuerpos descritos en la presente memoria son útiles. En algunos casos, los epítopos a los que se unen cualquiera de los anticuerpos listados en la Tabla 2 y FIGs. 2 y 3 son especialmente útiles. En algunos casos, el epítopo está en el dominio catalítico de PCSK9.
En determinados casos, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para prevenir (por ejemplo, reducir) la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno para PCSK9. En determinadas ocasiones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para disminuir la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno para PCSK9. En determinados casos, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para inhibir sustancialmente la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno para PCSK9.
En determinados casos, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para aislar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinados casos, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para generar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinadas ocasiones, un epítopo de PCSK9 o una secuencia que comprende un epítopo de PCSK9 puede utilizarse como un inmunógeno para generar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinados casos, un epítopo de PCSK9 puede administrarse a un animal, y pueden obtenerse posteriormente anticuerpos que se unen a PCSK9 del animal. En determinados casos, un epítopo de PCSK9 o una secuencia que comprende un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para interferir con la actividad normal mediada por PCSK9, tal como asociación de PCSK9 con el LDLR.
En algunos casos, las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria se unen específicamente al prodominio N-terminal, un dominio catalítico semejante a subtilisina y/o un dominio C-terminal. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une al surco de unión a sustrato de PCSK-9 (descrito en Cunningham et al.).
En algunos casos, el o los dominios/la o las regiones que contienen residuos que están en contacto con o están enterrados por un anticuerpo pueden identificarse mutando residuos específicos en PCSK9 (por ejemplo, un antígeno de tipo salvaje) y determinando si la proteína de unión a antígeno puede unirse a la proteína PCSK9 mutada o variante. Haciendo varias mutaciones individuales, pueden identificarse los residuos que juegan un papel directo en la unión o que están lo suficientemente próximos al anticuerpo de manera que una mutación puede afectar la unión entre la proteína de unión a antígeno y el antígeno. A partir del conocimiento de estos aminoácidos, pueden elucidarse el o los dominios o la o las regiones del antígeno que contienen residuos en contacto con la proteína de unión a antígeno o que están cubiertos por el anticuerpo. Dicho dominio puede incluir el epítopo de unión de una proteína de unión a antígeno. Un ejemplo específico de esta estrategia general utiliza un protocolo de escaneo de arginina/ácido glutámico (véase, por ejemplo, Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 y Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). En general, se sustituyen arginina y ácidos glutámicos (típicamente individualmente) por un aminoácido en el polipéptido de tipo salvaje porque estos aminoácidos están cargados y son voluminosos y tienen así el potencial de alterar la unión entre una proteína de unión a antígeno y un antígeno en la región del antígeno en donde se introduce la mutación. Las argininas que existen en el antígeno de tipo salvaje se reemplazan con ácido glutámico. Se obtiene una variedad de dichos mutantes individuales y los resultados de unión recogidos se analizan para determinar qué residuos afectan la unión.
El Ejemplo 39 describe uno de dichos escaneos arginina/ácido glutámico de PCSK9 para proteínas de unión a antígeno para PCSK9 proporcionadas en la presente memoria. Se creó una serie de antígenos PCSK9 mutantes, con cada antígeno mutante teniendo una única mutación. La unión de cada antígeno de PCSK9 mutante con varias ABP para PCSK9 se midió y comparó con la capacidad de las ABP seleccionadas de unirse a PCSK9 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 303).
Una alteración (por ejemplo, una reducción o incremento) en la unión entre una proteína de unión a antígeno y una PCSK9 variante según se usa en la presente memoria significa que hay un cambio en la afinidad de unión (por ejemplo, según se mide por métodos conocidos tales como ensayo Biacore o el ensayo basado en perlas descrito más adelante en los ejemplos), EC50, y/o un cambio (por ejemplo, una reducción) en la capacidad de unión total de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, según se evidencia por una disminución en Bmax en un gráfico de concentración de proteína de unión a antígeno frente a concentración de antígeno). Una alteración significativa en la unión indica que el residuo mutado está implicado directamente en la unión a la proteína de unión a antígeno o está muy cerca de la proteína de unión cuando la proteína de unión está unida al antígeno.
En algunas ocasiones, una reducción significativa en la unión significa que la afinidad de unión, EC50, y/o la capacidad entre una proteína de unión a antígeno y un antígeno de PCSK9 mutante está reducida más de 10%, más de 20%, más de 40%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90% o más de 95% respecto a la unión entre la proteína de unión a antígeno y una PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, mostrada en s Eq ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: (303). En determinadas ocasiones, la unión se reduce por debajo de límites detectables. En algunas ocasiones, se evidencia una reducción significativa en la unión cuando la unión de una proteína de unión a antígeno a una proteína PCSK9 variante es menor de 50% (por ejemplo, menor de 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ó 10%) de la unión observada entre la proteína de unión a antígeno y una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, la proteína de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: (303). Dichas mediciones de la unión pueden hacerse usando una variedad de ensayos de unión conocidos en la técnica. Un ejemplo específico de uno de dichos ensayos se describe en el Ejemplo 39.
En algunas ocasiones, se proporcionan proteínas de unión a antígeno que presentan una unión significativamente menor para una proteína PCSK9 variante en donde un residuo en una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303 se sustituye con arginina o ácido glutámico. En algunas ocasiones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 variante que tiene una cualquiera o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ó 244) de las mutaciones siguientes: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, y Q554R comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En la notación abreviada usada aquí, el formato es: Residuo de tipo salvaje: Posición en el polipéptido: Residuo mutante, con la numeración de los residuos según se indica en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303.
En algunos casos, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, y 554, como se muestra en SEQ ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, y 554, como se muestra en SEQ ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunos casos, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa sustancialmente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, y 554, en SEQ ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303.
En algunos casos, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, y Q554R en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303).
En algunos casos, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, y E582R en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303). En algunos casos, la unión se reduce. En algunas ocasiones, la reducción en la unión se observa como un cambio en EC50. En algunos casos, el cambio en la EC50 es un incremento en el valor numérico de la EC50 (y así es una disminución en la unión).
En algunos casos, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, y Q554R en SEQ ID NO: 1, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303). En algunas ocasiones, la unión se reduce. En algunos casos, la reducción en la unión se observa como un cambio en Bmax. En algunos casos, el desplazamiento en Bmax es una reducción de la señal máxima generada por la ABP. En algunos casos, para que un aminoácido sea parte de un epítopo, la Bmax se reduce por al menos 10%, por ejemplo, reducciones de al menos cualquiera de las cantidades siguientes: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, ó 100 por ciento pueden indicar, en algunas ocasiones, que el residuo es parte del epítopo.
Aunque las formas variantes listadas ahora se referencian respecto a la secuencia de tipo salvaje mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303, se apreciará que en una variante alélica de PCSK9 el aminoácido en la posición indicada podría ser diferente. También se contemplan las proteínas de unión a antígeno que muestran una unión significativamente menor para dichas formas alélicas de PCSK9. De acuerdo con esto, en algunos casos, cualquiera de las variantes anteriores puede compararse con una secuencia alélica, en lugar de meramente la secuencia de tipo salvaje mostrada en la FIG. 1A.
En algunos casos, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce significativamente para una proteína PCSK9 variante en donde el residuo en una posición seleccionada en la proteína PCSK9 de tipo salvaje se muta a cualquier otro residuo. En algunos casos, los reemplazos descritos en la presente memoria arginina/ácido glutámico se usan para las posiciones identificadas. En algunos casos, la alanina se usa para las posiciones identificadas.
Como se ha indicado anteriormente, los residuos implicados directamente en la unión o cubiertos por una proteína de unión a antígeno pueden identificarse a partir de los resultados del escaneo. Estos residuos pueden proporcionar así una indicación de los dominios o regiones de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 303 o SEQ ID NO: 3) que contienen la o las regiones de unión a las que se unen las proteínas de unión a antígeno. Como puede verse a partir de los resultados resumidos en el Ejemplo 39, en algunas ocasiones una proteína de unión a antígeno se une a un dominio que contiene al menos uno de los aminoácidos: 207, 208, 185, 181, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313 y 337 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno de los aminoácidos 207, 208, 185, 181, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313 y 337 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno de los aminoácidos 162, 164, 167, 207 y/o 208 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, más de uno (por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5) de los residuos identificados son parte de la región a la que se une la ABP. En algunas ocasiones, la ABP compite con ABP 21B12.
En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno del aminoácido 185 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, la a Bp compite con ABP 31H4. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno de los aminoácidos 123, 129, 311, 313, 337, 132, 351, 390, y/o 413 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas ocasiones, más de uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9) de los residuos identificados son parte de la región a la que se une la ABP. En algunas ocasiones, la ABP compite con ABP 12H11.
En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se unen a las regiones anteriores en un fragmento o la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En otras ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se unen a polipéptidos que consisten en estas regiones. La referencia a "SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303" indica que una o ambas de estas secuencias pueden emplearse o son relevantes. La expresión no indica que debe emplearse sólo una.
Como se ha indicado anteriormente, la descripción anterior hace referencia a posiciones de aminoácidos específicas con referencia a SEQ ID NO: 1. Sin embargo, a lo largo de la especificación generalmente, se hace referencia a un dominio Pro/Cat que comienza en la posición 31, que se proporciona en SEQ ID NO: 3. Como se indica más adelante, SEQ ID n O: 1 y SEQ ID NO: 303 carecen de la secuencia señal de PCSK9. Como tal, cualquier comparación entre estas varias descripciones debe tener en cuenta esta diferencia en la numeración. En particular, cualquier posición de aminoácido en SEQ ID NO: 1, corresponderá a una posición de aminoácido 30 aminoácidos más adelante en la proteína en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la posición 207 de SEQ ID NO: 1, corresponde a la posición 237 de SEQ ID NO: 3 (la secuencia de longitud completa, y el sistema de numeración usado en la presente especificación generalmente). La Tabla 39.6 muestra cómo las posiciones anteriormente indicadas, cuya referencia a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID NO: 303) corresponde a SEQ ID NO: 3 (que incluye la secuencia señal). Así, cualquiera de las ocasiones indicadas anteriormente que se describen respecto a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID NO: 303), se describen en referencia a SEQ ID NO: 3, por las posiciones indicadas correspondientes.
En algunas ocasiones, ABP 21B12 se une a un epítopo que incluye los residuos 162-167 (por ejemplo, los residuos D162-E167 de SEQ ID NO: 1). En algunas ocasiones, ABP 12H11 se une a un epítopo que incluye los residuos 123-132 (por ejemplo, S123-T132 de SEQ ID NO: 1). En algunas ocasiones, ABP 12h 11 se une a un epítopo que incluye los residuos 311-313 (por ejemplo, A311-D313 de SEQ ID NO: 1). En algunas ocasiones, las ABP pueden unirse a un epítopo que incluye una cualquiera de estas cadenas de secuencias.
Proteínas de unión a antígeno competidoras
También se describen en la presente memoria proteínas de unión a antígeno que compiten con uno de los anticuerpos ejemplificados o fragmentos funcionales que se unen al epítopo descrito en la presente memoria para la unión específica a PCSK9. Dichas proteínas de unión a antígeno también pueden unirse al mismo epítopo que una de las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas en la presente memoria, o un epítopo superpuesto. Se espera que las proteínas de unión a antígeno y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas muestren propiedades funcionales similares. Las proteínas de unión a antígeno y fragmentos ejemplificados incluyen los descritos anteriormente, incluyendo aquellos con las cadenas pesada y ligera, dominios de región variable y CDR incluidos en la TABLA 2 y/o FIGs.
2-3 y 15. Así, como un ejemplo específico, las proteínas de unión a antígeno que se describen en la presente memoria incluyen aquellas que compiten con un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que tiene:
(a) las 6 de las CDR listadas para un anticuerpo listado en las FIGs. 2-3 y 15;
(b) una VH y una VL listadas para un anticuerpo listado en la Tabla 2; o
(c) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas como se especifica para un anticuerpo listado en la Tabla 2.
Determinados usos terapéuticos y composiciones farmacéuticas
En determinados casos, la actividad de PCSK9 se correlaciona con varios estados patológicos humanos. Por ejemplo, en determinados casos, demasiada o demasiada poca actividad de PCSK9 se correlaciona con determinadas afecciones, tales como hipercolesterolemia. Por lo tanto, en determinados casos, la modulación de la actividad de PCSK9 puede ser terapéuticamente útil. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 neutralizante se usa para modular al menos una actividad de PCSK9 (por ejemplo, unión a LDLR). Dichos métodos pueden tratar y/o prevenir y/o reducir el riesgo de trastornos que están relacionados con niveles elevados de colesterol sérico o en donde los niveles elevados de colesterol son relevantes.
Como apreciará un experto en la técnica, a la vista de la presente descripción, los trastornos que están relacionados con, implican a, o pueden ser influidos por niveles diversos de colesterol, LDL, o LDLR pueden abordarse por varias ocasiones de las proteínas de unión a antígeno. En algunas ocasiones, un "trastorno relacionado con colesterol" (que incluye "trastornos relacionados con colesterol sérico") incluye uno cualquiera o más de los siguientes: hipercolesterolemia, enfermedad cardiaca, síndrome metabólico, diabetes, enfermedad cardiaca coronaria, ictus, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Alzheimer y generalmente dislipidemias, que pueden manifestarse, por ejemplo, por un colesterol sérico total elevado, LDL elevado, triglicéridos elevados, VLDL elevado, y/o HDL bajo. Algunos ejemplos no limitantes de dislipidemias primarias y secundarias que pueden tratarse usando una ABP, bien sola, o en combinación con uno o más agentes adicionales incluyen el síndrome metabólico, diabetes mellitus, hiperlipidemia combinada familiar, hipertrigliceridemia familiar, hipercolesterolemias familiares, incluyendo hipercolesterolemia heterocigota, hipercolesterolemia homocigota, apoplipoproteína B-100 defectuosa familiar; hipercolesterolemia poligénica; enfermedad de eliminación de remanentes, deficiencia en lipasa hepática; dislipidemia secundaria a cualquiera de lo siguiente: dieta no adecuada, hipotiroidismo, fármacos incluyendo terapia con estrógeno y progestina, betabloqueantes, y diuréticos de tiazida; síndrome nefrótico, fallo renal crónico, síndrome de Cushing, cirrosis biliar primaria, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, hepatoma, colestasis, acromegalia, insulinoma, deficiencia de la hormona de crecimiento aislada, e hipertrigliceridemia inducida por el alcohol. La ABP también puede ser útil para prevenir o tratar enfermedades ateroscleróticas, tales como, por ejemplo, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad arterial coronaria, enfermedad arterial periférica, ictus (isquémico y hemorrágico), angina de pecho, o enfermedad cerebrovascular y síndrome coronario agudo, infarto de miocardio. En algunas ocasiones, la ABP es útil para reducir el riesgo de: ataques cardiacos no fatales, ictus fatales y no fatales, determinados tipos de cirugía cardiaca, hospitalización por fallo cardiaco, dolor de pecho en pacientes con enfermedad cardiaca, y/o eventos cardiovasculares debidos a enfermedad cardiaca establecida tales como ataque cardiaco previo, cirugía cardiaca previa, y/o dolor de pecho con evidencia de arterias obstruidas. En algunas ocasiones, la ABP y los métodos pueden usarse para reducir el riesgo de eventos cardiovasculares recurrentes.
Como apreciará un experto en la técnica, las enfermedades o trastornos que generalmente se pueden abordar (bien tratar o prevenir) a través del uso de estatinas también pueden beneficiarse de la aplicación de las presentes proteínas de unión a antígeno. Además, en algunas ocasiones, los trastornos o enfermedades que pueden beneficiarse de la prevención de la síntesis de colesterol o expresión incrementada de LDLR también pueden tratarse por varias ocasiones de las proteínas de unión a antígeno. Además, como apreciará un experto en la técnica, el uso de los anticuerpos anti-PCSK9 puede ser especialmente útil en el tratamiento de la diabetes. No sólo es la diabetes un factor de riesgo para la enfermedad cardiaca coronaria, sino que la insulina incrementa la expresión de PCSK9. Esto es, la gente con diabetes tiene niveles elevados de lípidos plasmáticos (que puede estar relacionado con niveles altos de PCSK9) y pueden beneficiarse de la disminución de estos niveles. Esto se discute generalmente con más detalle en Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006). En algunos casos, la proteína de unión a antígeno se administra a aquellos que tienen diabetes mellitus, aneurisma aórtico abdominal, aterosclerosis y/o enfermedad vascular periférica con el fin de disminuir sus niveles de colesterol sérico hasta un intervalo seguro. En algunas ocasiones, la proteína de unión a antígeno se administra a pacientes que presentan riesgo de desarrollar cualquiera de los trastornos descritos en la presente memoria. En algunas ocasiones, las ABP se administran a sujetos que fuman, tienen hipertensión o un historial familiar de ataques cardiacos tempranos.
En algunas ocasiones, se administra a un sujeto una ABP si presenta un riesgo moderado o mayor en los objetivos de tratamiento NCEP de 2004. En algunas ocasiones, la ABP se administra a un sujeto si el nivel de colesterol LDL del sujeto es mayor de 160 mg/dl. En algunas ocasiones, la ABP se administra si el nivel de colesterol LDL de los sujetos es mayor de 130 (y tienen un riesgo moderado o moderadamente alto según los objetivos de tratamiento NCEP de 2004). En algunas ocasiones, la ABP se administra si el nivel de colesterol LDL de los sujetos es mayor de 100 (y tienen un riesgo alto o muy alto según los objetivos de tratamiento NCEP de 2004).
Un médico será capaz de seleccionar unas indicaciones de tratamiento y niveles de lípidos diana apropiados dependiendo del perfil individual de un paciente particular. Un estándar muy aceptado para guiar el tratamiento de hiperlipidemia es el Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, National Institutes of Health, NIH Publication No. 02-5215 (2002).
En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se usan para disminuir la cantidad de actividad de PCSK9 desde un nivel anormalmente alto o incluso un nivel normal. En algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se usan para tratar o prevenir hipercolesterolemia y/o en la preparación de medicamentos de éstas y/o para otros trastornos relacionados con el colesterol (tales como los indicados en la presente memoria). En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se usa para tratar o prevenir afecciones tales como hipercolesterolemia en donde la actividad de PCSK9 es normal. En dichas afecciones, por ejemplo, la reducción de la actividad de PCSK9 por debajo de lo normal puede proporcionar un efecto terapéutico.
En algunas ocasiones, se usa más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 para modular la actividad de PCSK9.
En determinadas ocasiones, se describen métodos para el tratamiento de un trastorno relacionado con el colesterol, tal como hipercolesterolemia que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más proteínas de unión a antígeno para PCSK9 y otro agente terapéutico.
En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra sola. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra antes de la administración de al menos un otro agente terapéutico. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra simultáneamente con la administración de al menos un otro agente terapéutico. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra posteriormente a la administración de al menos un otro agente terapéutico. En otras ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra antes de la administración de al menos un otro agente terapéutico. Los agentes terapéuticos (aparte de la proteína de unión a antígeno), incluyen, pero no están limitados a, al menos un otro agente o un agente que disminuye el colesterol (colesterol sérico y/o corporal total). En algunas ocasiones, el agente incrementa la expresión de LDLR, se ha observado que incrementa los niveles de HDL sérico, disminuye los niveles de LDL o disminuye los niveles de triglicéridos. Los agentes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, estatinas (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina), ácido nicotínico (Niacina) (NIACOR, NIASPAN (niacina de liberación lenta), SLO-NIACIN (niacina de liberación lenta)), ácido fíbrico (LOPID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrato), secuestrantes de ácido biliar (QUESTRAN (colestiramina), colesevelam (We LCHOL), COLESTID (colestipol)), inhibidores de la absorción del colesterol (ZETIA (ezetimibe)), combinación de ácido nicotínico con estatina (ADVICOR (LOVASTATIN y NIASPAN), combinación de una estatina con un inhibidor de la absorción (VYt Or IN (ZOc Or y ZETIA) y/o agentes modificadores de lípidos. En algunas ocasiones, la ABP se combina con agonistas de PPAR gamma, agonistas de PPAR alfa/gamma, inhibidores de la escualeno sintasa, inhibidores de CETP, anti-hipertensores, agentes anti-diabéticos (tales como sulfonil ureas, insulina, análogos de GLP-1, inhibidores de DDPIV), moduladores de ApoB, inhibidores de MTP y/o tratamientos obliterantes de la arteriosclerosis. En algunas ocasiones, la ABP se combina con un agente que incrementa el nivel de proteína LDLR en un sujeto, tal como estatinas, determinadas citoquinas como oncostatina M, estrógeno, y/o determinados ingredientes herbales tales como berberina. En algunas ocasiones, la ABP se combina con un agente que incrementa los niveles de colesterol sérico en un sujeto (tales como determinados agentes anti-psicóticos, determinados inhibidores de la proteasa de VIH, factores de la dieta tales como alta fructosa, sacarosa, colesterol o determinados ácidos grasos y determinados agonistas del receptor nuclear y antagonistas para RXR, RAR, LXR, FXR). En algunas ocasiones, la ABP se combina con un agente que incrementa el nivel de PCSK9 en un sujeto, tales como estatinas y/o insulina. La combinación de los dos puede permitir mitigar los efectos secundarios indeseables de otros agentes por la ABP. Como apreciará un experto en la técnica, en algunas ocasiones, la ABP se combina con el otro agente/compuesto. En algunas ocasiones, la ABP y el otro agente se administran simultáneamente. En algunas ocasiones, la ABP y el otro agente no se administran simultáneamente, administrándose la ABP antes o después de la administración del agente. En algunas ocasiones, el sujeto recibe tanto la ABP como el otro agente (que incrementa el nivel de LDLR) durante el mismo periodo de prevención, aparición de un trastorno, y/o periodo de tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente memoria pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. En determinadas ocasiones, la terapia de combinación comprende una proteína de unión a antígeno capaz de unirse a PCSK9 adecuada para el uso de acuerdo con la invención, en combinación con al menos un agente anti-colesterol. Los agentes incluyen, pero no están limitados a, composiciones químicas preparadas sintéticamente in vitro, anticuerpos, regiones de unión a antígeno, y combinaciones y conjugados de éstos. En determinadas ocasiones, un agente puede actuar como un agonista, antagonista, modulador alostérico, o toxina. En determinadas ocasiones, un agente puede actuar para inhibir o estimular su diana (por ejemplo, activación o inhibición de receptor o enzima), y de esta manera estimular la expresión incrementada de LDLR o disminuir los niveles de colesterol sérico.
En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse antes de, simultáneamente con, y posteriormente a, el tratamiento con un agente que disminuye el colesterol (colesterol sérico y/o total). En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse profilácticamente para prevenir o mitigar el inicio de hipercolesterolemia, enfermedad cardiaca, diabetes, y/o cualquier trastorno relacionado con el colesterol. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse para el tratamiento de una afección de hipercolesterolemia existente. En algunas ocasiones, la ABP retrasa el inicio del trastorno y/o síntomas asociados con el trastorno. En algunas ocasiones, la ABP se proporciona a un sujeto que no presenta ningún síntoma de uno cualquiera de los trastornos relacionados con el colesterol o un subconjunto de éstos.
En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se usa con agentes terapéuticos particulares para tratar varios trastornos relacionados con el colesterol, tales como hipercolesterolemia. En determinadas ocasiones, a la vista de la afección y el nivel deseado de tratamiento, pueden administrarse dos, tres, o más agentes. En determinadas ocasiones, dichos agentes pueden proporcionarse conjuntamente por inclusión en la misma formulación. En determinadas ocasiones, dicho agente o agentes y una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden proporcionarse conjuntamente por inclusión en la misma formulación. En determinadas ocasiones, dichos agentes pueden formularse separadamente y proporcionarse conjuntamente por inclusión en un kit de tratamiento. En determinadas ocasiones, dichos agentes y una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden formularse separadamente y proporcionarse conjuntamente por inclusión en kit de tratamiento. En determinadas ocasiones, dichos agentes pueden proporcionarse separadamente. En determinadas ocasiones, cuando se administran por terapia génica, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden incluirse en el mismo vector. En determinadas ocasiones, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden estar bajo el control de la misma región promotora. En determinadas ocasiones, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden estar en vectores separados.
También se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno para PCSK9 adecuada para su uso de acuerdo con la presente invención junto con un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno para PCSK9 adecuada para su uso de acuerdo con la presente invención y una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un agente terapéutico adicional, junto con un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Una proteína de unión a antígeno para PCSK9 adecuada para su uso de acuerdo con la presente invención puede usarse con al menos un agente terapéutico para la inflamación. Una proteína de unión a antígeno para PCSK9 adecuada para su uso de acuerdo con la presente invención puede usarse con al menos un agente terapéutico para un trastorno inmune. Los agentes terapéuticos ejemplares para la inflamación y trastornos inmunes incluyen, pero no están limitados a inhibidores de la ciclooxigenasa tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2), moduladores de molécula pequeña de la proteína quinasa activada por mitógeno de 38 kDa (p38-MAPK); moduladores de molécula pequeña de moléculas intracelulares implicadas en las rutas de la inflamación, en donde dichas moléculas intracelulares incluyen, pero no están limitadas a, jnk, IKK, NF-kB, ZAP70, e Ick. Determinados agentes terapéuticos ejemplares para la inflamación se describen, por ejemplo, en C.A. Dinarello y L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Tercera Edición (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, Ca .
En este contexto, en determinados casos, las composiciones farmacéuticas podrán incluir más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 diferente. En determinados casos, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 en donde las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se unen a más de un epítopo. En algunos casos, las varias proteínas de unión a antígeno no competirán entre sí para la unión a PCSK9. En algunos casos, cualquiera de las proteínas de unión a antígeno representadas en la Tabla 2 y FIGs. 2 y/o 3 pueden combinarse conjuntamente en una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria.
Los materiales de formulación aceptables son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En algunos casos, el o los materiales de formulación son para administración s.c. y/o I.V. En determinadas ocasiones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En determinadas ocasiones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de volumen (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)); agentes de formación de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); materiales de relleno; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saporíferos y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilen glicol o polietilen glicol); alcoholes azúcares (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos.
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). En algunos casos, la formulación comprende PBS; 20mM NaOAC, pH 5,2, 50mM NaCl; y/o 10mM Na Oa C, pH 5,2, 9% Sacarosa.
En determinados casos, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o una molécula terapéutica se une a un vehículo que prolonga la vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no están limitados a, polietilen glicol, glicógeno (por ejemplo, glicosilación de la ABP), y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud U.S. con No. de Serie 09/428.082, ahora Patente US No. 6.660.843 y Solicitud Publicada PCT No. WO 99/25044.
En determinadas ocasiones, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta pretendida de administración, formato de administración y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. En determinadas ocasiones, dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de los anticuerpos adecuados para el uso de acuerdo con la invención.
En determinadas ocasiones, el vehículo o transportador primario en una composición farmacéutica puede ser bien de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en determinadas ocasiones, un vehículo o transportador adecuado puede ser agua para inyección, disolución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, suplementado posiblemente con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. En algunas ocasiones, la disolución salina comprende disolución salina tamponada con fosfato isotónica. En determinadas ocasiones, son vehículos adicionales ejemplares la disolución salina tamponada neutra o disolución salina mezclada con albúmina sérica. En determinadas ocasiones, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto de éste adecuado. En determinadas ocasiones, una composición que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, en determinadas ocasiones, una composición que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.
En determinadas ocasiones, la composición farmacéutica puede seleccionarse para administración parenteral. En determinadas ocasiones, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la técnica.
En determinadas ocasiones, los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas ocasiones, se usan tampones para mantener la composición en un pH fisiológico o en un pH ligeramente menor, típicamente en un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
En determinadas ocasiones, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en la forma de una disolución acuosa sin pirógenos parenteralmente aceptable que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9 deseada, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas ocasiones, un vehículo para la inyección parenteral es agua destilada estéril en donde una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una disolución estéril, isotónica, conservada apropiadamente. En determinadas ocasiones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto que puede entonces administrarse mediante una inyección de liberación lenta. En determinadas ocasiones, también puede usarse ácido hialurónico, y puede tener el efecto de estimular una duración sostenida en la circulación. En determinadas ocasiones, pueden usarse dispositivos de fármaco implantables para introducir la molécula deseada.
En determinadas ocasiones, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un polvo seco para inhalación. En determinadas ocasiones, una disolución de inhalación que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse con un propelente para administración de aerosol. En determinadas ocasiones, las disoluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT no. PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas.
En determinadas ocasiones, se contempla que las formulaciones pueden administrarse oralmente. En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que se administra de esta manera puede formularse con o sin aquellos vehículos usados rutinariamente en la formación de compuestos de formas de dosificación sólida tales como comprimidos y cápsulas. En determinadas ocasiones, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en donde se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación pre-sistémica. En determinadas ocasiones, al menos un agente adicional puede incluirse para facilitar la absorción de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales. En determinadas ocasiones, también pueden emplearse diluyentes, saporíferos, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos, y aglutinantes.
En determinadas ocasiones, una composición farmacéutica puede implicar una cantidad efectiva de una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. En determinadas ocasiones, mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. En determinadas ocasiones, los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina, o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican proteínas de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un o unos agentes terapéuticos adicionales, en formulaciones de administración sostenida o controlada. En determinadas ocasiones, las técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación lenta, también son conocidas para los expertos en la técnica. Véase por ejemplo, la Solicitud PCT No. PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. En determinadas ocasiones, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos con forma, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3.773.919 y EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetato (Langer et al., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). En determinadas ocasiones, las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 82:3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
La composición farmacéutica que se va a usar para administración in vivo típicamente es estéril. En determinadas ocasiones, esto puede conseguirse por filtración a través de membranas de filtración estériles. En determinadas ocasiones, cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede realizarse bien antes de o después de la liofilización y reconstitución. En determinadas ocasiones, la composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. En determinadas ocasiones, las composiciones parenterales se ponen generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón que se puede puncionar con una aguja de inyección hipodérmica.
En determinadas ocasiones, una vez se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. En determinadas ocasiones, dichas formulaciones pueden almacenarse bien en forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.
En determinadas ocasiones, se proporcionan kits para producir una unidad de administración de dosis única. En determinadas ocasiones, el kit puede contener tanto un primer contenedor que tiene una proteína seca como un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En determinadas ocasiones, se incluyen los kits que contienen jeringas pre-cargadas de una única cámara o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).
En determinadas ocasiones, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento, según determinadas ocasiones, variarán así, en parte, por la molécula administrada, la indicación para la que una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se está usando, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En determinadas ocasiones, el médico puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En determinadas ocasiones, una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0,1 μg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En determinadas ocasiones, la dosificación puede variar de 0,1 μg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; ó 1 μg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; ó 5 μg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg.
En determinadas ocasiones, la frecuencia de la dosificación tendrá en cuenta los parámetros farmacocinéticos de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales en la formulación usada. En determinadas ocasiones, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. En determinadas ocasiones, la composición puede administrarse, por lo tanto, como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace rutinariamente por los expertos en la técnica y está en el ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. En determinadas ocasiones, las dosificaciones apropiadas pueden averiguarse a través del uso de datos de respuesta a la dosis apropiados. En algunas ocasiones, la cantidad y frecuencia de la administración puede tener en cuenta el nivel de colesterol deseado (sérico y/o total) que se quiere obtener y el nivel de colesterol presente del sujeto, nivel de LDL, y/o niveles de LDLR, todos los cuales pueden obtenerse por métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica.
En determinadas ocasiones, la ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo oralmente, a través de inyección por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, subcutánea, intra-ocular, intraarterial, intraportal, o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En determinadas ocasiones, las composiciones pueden administrarse por inyección en bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación.
En determinadas ocasiones, la composición puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en donde se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En determinadas ocasiones, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por difusión, bolo con liberación con el tiempo, o administración continua.
En determinadas ocasiones, puede ser deseable usar una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, de una manera ex vivo. En dichos, las células, tejidos y/o órganos que se han retirado del paciente se exponen a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, después de lo cual, las células, tejidos y/o órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.
En determinadas ocasiones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales puede administrarse implantando determinadas células que se han modificado por ingeniería genética, usando métodos tales como los descritos en la presente memoria, para expresar y secretar los polipéptidos. En determinadas ocasiones, dichas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogénicas. En determinadas ocasiones, las células pueden inmortalizarse. En determinadas ocasiones, con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. En determinadas ocasiones, los materiales de encapsulación son típicamente receptáculos poliméricos biocompatibles, semi-permeables o membranas que permiten la liberación del o de los productos proteicos pero que evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
Tomando como base la capacidad de las ABP para neutralizar significativamente la actividad de PCSK9 (como se demuestra en los Ejemplos siguientes), estas ABP tendrán efectos terapéuticos en el tratamiento y prevención de síntomas y afecciones que resultan de la actividad mediada por PCSK9, tales como hipercolesterolemia. EJEMPLOS
Los ejemplos siguientes, incluyendo los experimentos realizados y los resultados conseguidos, se proporcionan sólo para propósitos ilustrativos y no deben considerarse como limitantes de la presente invención como se define por las reivindicaciones.
EJEMPLO 1
Inmunización y titulación
Generación de anticuerpos anti-PCSK9 e hibridomas
Se produjeron anticuerpos frente a la forma madura de PCSK9 (representada como la secuencia en la FIG. 1A, con el pro-dominio subrayado), en ratones XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA), que son ratones que contienen genes de inmunoglobulina humana. Se usaron dos grupos de ratones XenoMouse®, grupo 1 y 2, para producir anticuerpos frente a PCSK9. El grupo 1 incluyó ratones de la cepa XenoMouse® XMG2-KL, que producen anticuerpos IgG2K e IgG2A completamente humanos. Los ratones del grupo 1 se inmunizaron con PCSK9 humana. PCSK9 se preparó usando técnicas recombinantes estándar usando la secuencia de GenBank como referencia (NM_174936). El grupo 2 implicó a ratones de la cepa XenoMouse® XMG4-KL, que producen anticuerpos IgG4K e IgG4A completamente humanos. Los ratones del grupo 2 también se inmunizaron con PCSK9 humana.
Se inyectó a los ratones de ambos grupos antígeno once veces, según el programa en la Tabla 3. En las inmunizaciones iniciales, se inyectaron a cada ratón un total de 10 μg de antígeno administrado intraperitonealmente en el abdomen. Los refuerzos posteriores son dosis de 5ug y el método de inyección se alternó entre inyecciones intraperitoneales en el abdomen e inyecciones subcutáneas en la base de la cola. Para las inyecciones intraperitoneales el antígeno se prepara como una emulsión con TiterMax® Gold (Sigma, Cat # T2684) y para las inyecciones subcutáneas el antígeno se mezcla con Alúmina (fosfato de aluminio) y oligos CpG. En las inyecciones 2 a 8 y 10, se inyectaron a cada ratón un total de 5 μg de antígeno en el gel de alúmina adyuvante. Se administra una inyección final de 5 μg de antígeno por ratón en disolución salina tamponada con fosfato y se administra en 2 sitios 50% IP en el abdomen y 50% SQ en la base de la cola. Los programas de inmunización se resumen en la Tabla 3, mostrada a continuación.
TABLA 3
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El protocolo usado para titular los animales XenoMouse fue como sigue: se recubrieron placas de unión media Costar 3368 con neutravadina a 8ug/ml (50ul/pocillo) y se incubaron a 4°C en 1XPBS/0,05% azida toda la noche. Se lavaron usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Las placas se bloquearon usando 250ul de 1XPBS/1% leche y se incubaron durante al menos 30 minutos a RT. El bloqueo se eliminó por lavado usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Se capturó entonces b-PCSK9 humana a 2ug/ml en 1XPBS/1% leche/10mM Ca2+ (diluyente del ensayo) 50ul/pocillo y se incubó durante 1hr a RT. Se lavó entonces usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Para el anticuerpo primario, se tituló el suero 1:3 en duplicado de 1:100. Esto se hizo en diluyente del ensayo 50ul/pocillo y se incubó durante 1hr a RT. Se lavó entonces usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. El anticuerpo secundario fue anti IgG Fc Humana de cabra HRP a 400 ng/ml en diluyente del ensayo a 50ul/pocillo. Esto se incubó durante 1hr a RT. Esto se lavó usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO y se secó con golpecitos en toallitas de papel. Para el sustrato, se usó una disolución TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50ul/pocillo) y se dejó revelar durante 30 min a RT.
Los protocolos seguidos en los ensayos ELISA fueron como sigue: Para muestras que comprenden b-PCSK9 sin etiqueta V5His se empleó el protocolo siguiente: se emplearon placas de unión media Costar 3368 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 8 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida, (50 μl/pocillo). Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek M384 (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 250 μl de 1XPBS/1% leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó una lavado de 3 ciclos. La captura fue b-hu PCSK9, sin una etiqueta V5, y se añadió a 2 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ (40 μl/pocillo). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Los sueros se titularon 1:3 en duplicado de 1:100, y la fila H fue el blanco para los sueros. La titulación se hizo en diluyente del ensayo, a un volumen de 50 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se realizó un lavado de 3 ciclos. Se añadió anti IgG Fc Humana de cabra HRP a 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ (50 μl/pocillo) a la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Las placas se secaron con golpecitos en toallita de papel. Finalmente, se añadió TMB de 1 etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 μl/pocillo) a la placa y se paró con 1N ácido clorhídrico (50 μl/pocillo) después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.
Los controles positivos para detectar PCSK9 unida a las placas fueron receptor de LDL soluble (R&D Systems, Cat #2148LD/CF) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-PCSK9 (Caymen Chemical #10007185) titulado 1:3 en duplicado de 3 μg/ml en diluyente del ensayo. LDLR se detectó con anti LDLR de cabra (R&D Systems, Cat #AF2148) y anti IgGFc de cabra de conejo h Rp a una concentración de 400 ng/ml; el policlonal de conejo se detectó con anti-IgG Fc de conejo de cabra a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. El control negativo fue sueros XMG2-KL y XMG4-KL sin estimular titulados 1:3 en duplicado de 1:100 en diluyente del ensayo.
Para las muestras que comprenden b-PCSK9 con una etiqueta V5His se empleó el protocolo siguiente: se emplearon placas de unión media Costar 3368 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 8 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida; (50 μl/pocillo). Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek M384 (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 250 μl de 1XPBS/1% leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La captura fue b-hu PCSK9, con una etiqueta V5, y se añadió a 2 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ (40 μl/pocillo). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Los sueros se titularon 1:3 en duplicado de 1:100, y la fila H fue el blanco para los sueros. La titulación se hizo en diluyente del ensayo, a un volumen de 50 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas M384 operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadió anti IgG Fc Humana de cabra HRP a 400 ng/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a 50 μl/pocillo a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Las placas se secaron con golpecitos con toallita de papel. Finalmente, se añadió TMB de 1 etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 μl/pocillo) a la placa y la placa se paró con 1N ácido clorhídrico (50 μl/pocillo) después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.
El control positivo fue LDLR, anti-PCSK9 de conejo titulado 1:3 en duplicado de 3 μg/ml en diluyente del ensayo. LDLR detecta con anti-LDLR de cabra (R&D Systems, Cat #AF2148) y anti-IgG Fc de cabra de conejo HRp a una concentración de 400 ng/ml; poli de conejo detectado con anti-IgG Fc de conejo de cabra a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. Anti-His 1.2,3 y anti-V5 1.7.1 humano titulado 1:3 en duplicado de 1 μg/ml en diluyente del ensayo; ambos detectados con anti-IgG Fc humana de cabra HRP a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. El control negativo fue sueros XMG2-KL y XMG4-KL sin estimular titulados 1:3 en duplicado de 1:100 en diluyente del ensayo.
Las titulaciones del anticuerpo frente a PCSK9 humana se ensayaron por ensayo ELISA para ratones inmunizados con antígeno soluble como se describe. La Tabla 4 resume los datos de ELISA e indica que hubo algunos ratones que parecieron ser específicos para PCSK9. Véase, por ejemplo, la Tabla 4. Por lo tanto, al final del programa de inmunización, se seleccionaron 10 ratones (en negrita en la Tabla 4) para recogida, y se aislaron los esplenocitos y linfocitos de los bazos y nódulos linfáticos respectivamente, como se describe en la presente memoria.
TABLA 4
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EJEMPLO 2
Recuperación de Linfocitos, aislamientos de células B, fusiones y generación de hibridomas
Este ejemplo muestra cómo se recuperaron las células inmunes y se generaron los hibridomas. Se sacrificaron ratones inmunizados seleccionados por dislocación cervical y los nódulos linfáticos drenantes se recogieron y combinaron de cada cohorte. Las células B se disociaron del tejido linfoide moliendo en DMEM para liberar las células de los tejidos, y las células se suspendieron en DMEM. Las células se contaron, y se añadieron 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos al sedimento celular para resuspender las células suavemente pero completamente.
Los linfocitos se mezclaron con células de mieloma no secretor P3X63Ag8.653 adquiridas en la ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney et al., (1979) J. Immunol. 123, 1548-1550) a una proporción de 1:4. La mezcla de células se sedimentó suavemente por centrifugación a 400 x g 4 min. Después de decantar el sobrenadante, las células se mezclaron suavemente usando una pipeta de 1 ml. Se añadió lentamente disolución precalentada de PEG/DMSO de Sigma (cat# P7306) (1 ml por millón de células B) con agitación suave durante 1 min seguido de 1 min de mezclado. Se añadió IDMEM precalentado (2 ml por millón de células B) (DMEM sin glutamina, L-glutamina, pen/estrep, MEM aminoácidos no esenciales (todos de Invitrogen), durante 2 minutos con agitación suave. Finalmente, se añadió IDMEM precalentado (8 ml por 106 células B) durante 3 minutos.
Las células fusionadas se sedimentaron a 400 x g 6 min y se resuspendieron en 20 ml de medio de selección (DMEM (Invitrogen), 15% FBS (Hyclone), suplementado con L-glutamina, pen/estrep, MEM aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol (todos de Invitrogen), HA-Azaserina Hipoxantina y OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (ambos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim)) por millón de células B. Las células se incubaron durante 20-30 min a 37C y se resuspendieron en 200 ml de medio de selección y se cultivaron durante 3-4 días en matraz T175 antes de la siembra en pacas de 96 pocillos. Así, se produjeron hibridomas que produjeron proteínas de unión a antígeno para PCSK9.
EJEMPLO 3
Selección de anticuerpos para PCSK9
El presente ejemplo muestra cómo se caracterizaron y seleccionaron las diferentes proteínas de unión a antígeno para PCSK9. Se evaluó la unión de anticuerpos secretados (producidos a partir de los hibridomas producidos en los Ejemplos 1 y 2) a PCSK9. La selección de anticuerpos se basó en los datos de unión e inhibición de la unión de PCSK9 a LDLR y la afinidad. La unión a PCSK9 soluble se analizó por ELISA, como se describe más adelante. Se usó BIAcore® (resonancia de plasmón superficial) para cuantificar la afinidad de la unión.
Cribado primario
Se realizó un cribado primario para anticuerpos que se unen a PCSK9 de tipo salvaje. El cribado primario se realizó en dos recogidas. El cribado primario comprendió un ensayo ELISA y se realizó usando el protocolo siguiente:
Se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a una concentración de 4 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida, a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1%leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron. De nuevo, se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra de captura fue PCSK9 biotinilada, sin una etiqueta V5, y se añadió a 0,9 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 10 μl de sobrenadante en 40 μl de 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ y se incubó 1,5 horas a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 μl/pocillo de anti-IgG Fc Humana de cabra POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche%10mM Ca2+ a la placa y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB. de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.
El cribado primario resultó en un total de 3.104 hibridomas específicos de antígeno identificados de las dos recogidas. Tomando como base la DO más alta de ELISA, se promovieron 1.500 hibridomas por recogida para un total de 3.000 positivos.
Cribado confirmatorio
Los 3.000 positivos se volvieron a cribar para unión a PCSK9 de tipo salvaje para confirmar que se establecieron hibridomas estables. El cribado se realiza como sigue: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 3 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1%leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra de captura fue b-PCSK9, sin una etiqueta V5, y se añadió a 0,9 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 10 μl de sobrenadante en 40 μl de 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ y se incubó 1,5 horas a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 μl/pocillo de anti-IgG Fc Humana de cabra POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a la placa, y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. Un total de 2.441 positivos se repitieron en el segundo cribado. Estos anticuerpos se usaron en los cribados posteriores.
Cribado de reactividad cruzada en ratón
El panel de hibridomas se cribó para reactividad cruzada con PCSK9 de ratón para asegurar que los anticuerpos podían unirse a PCSK9 tanto humana como de ratón. Se empleó el protocolo siguiente en el cribado de reactividad cruzada: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 3 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1%leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra se captura fue PCSK9 de ratón biotinilada, y se añadió a 1 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 50 μl de sobrenadante a las placas y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 μl/pocillo de anti-IgG Fc humana de cabra POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. Se observó que 579 anticuerpos reaccionaban de manera cruzada con PCSK9 de ratón. Estos anticuerpos se usaron en los cribados posteriores.
Cribado de la unión del mutante D374Y
La mutación D374Y en PCSK9 se ha documentado en la población humana (por ejemplo, Timms KM et al, "A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree", Hum. Genet. 114: 349-353, 2004). Con el fin de determinar si los anticuerpos eran específicos para el tipo salvaje o si también se unían a la forma D374Y de PCSK9, las muestras se cribaron para unión a la secuencia mutante de PCSK9 que comprende la mutación D374Y. El protocolo para el cribado fue como sigue: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences) en el cribado. Las placas se recubrieron con neutravadina a 4 μg/ml en 1XPBS/0,05% Azida a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1%leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se recubrieron con PCSK9 D374Y humana biotinilada a una concentración de 1 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mMCa2+ y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. El sobrenadante de cultivo de hibridoma tardío agotado se diluyó 1:5 en PBS/leche/Ca2+ (10 ml más 40 ml) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se titularon en las placas 40 μl/pocillo de anti-PCSK9 humana de conejo (Cayman Chemical) y anti-His 1.2.3 humana 1:2 a 1ug/ml en 1XPBS/1%leche/10mMCa2+, que se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40, μl/pocillo de anti-IgG Fc Humana de cabra HRP a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron 40 μl/pocillo de anti-IgG Fc de conejo de cabra HRP a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. Más del 96% de los aciertos positivos en la PCSK9 de tipo salvaje también se unieron a PCSK9 mutante.
Cribado de bloqueo receptor ligando a gran escala
Para cribar los anticuerpos que bloquean la unión de PCSK9 a LDLR, se desarrolló un ensayo usando el mutante PCSK9 D374Y. El mutante se usó para este ensayo porque tiene una mayor afinidad de unión a LDLR lo que permite el desarrollo de un ensayo de bloqueo receptor ligando más sensible. Se empleó el protocolo siguiente en el cribado del bloqueo receptor ligando: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences) en el cribado. Las placas se recubrieron con anti-LDLR de cabra (R&D Cat #AF2148) a 2 μg/ml en 1XPBS/0,05%Azida a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1% leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra de captura fue LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF), y se añadió a 0,4 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora y 10 minutos a temperatura ambiente. Simultáneamente, se incubaron 20 ng/ml de PCSK9 D374Y humana biotinilada con 15 microlitros de sobrenadante de hibridoma agotado en placas de polipropileno Nunc y la concentración de sobrenadante agotado se diluyó 1:5. Las placas se pre-incubaron durante aproximadamente 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 50 μl/pocillo de la mezcla pre-incubada en las placas ELISA recubiertas con LDLR y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Para detectar b-PCSK9 unido a LDLR, se añadieron 40 μl/pocillo de estreptavidina HRP a 500 ng/ml en diluyente del ensayo a las placas. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo usando un lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. El cribado identificó 384 anticuerpos que bloquearon bien la interacción entre PCSK9 y el LDLR, 100 anticuerpos bloquearon la interacción fuertemente (DO < 0,3). Estos anticuerpos inhibieron la interacción de unión de PCSK9 y LDLR más del 90% (más del 90% de inhibición).
Ensayo de unión receptor ligando en el subconjunto bloqueante
El ensayo receptor ligando se repitió usando la enzima mutante en el subconjunto de 384 miembros de neutralizantes identificado en el primer ensayo de inhibición receptor ligando a gran escala. Se empleó el mismo protocolo en el cribado del ensayo del subconjunto de 384 miembros de bloqueantes que se hizo en el cribado del bloqueo receptor ligando a gran escala. Este cribado repetido confirmó los datos iniciales de cribado.
Este cribado del subconjunto de 384 miembros identificó 85 anticuerpos que bloquearon la interacción entre la enzima mutante de PCSK9 y el LDLR más del 90%.
Ensayo de unión receptor ligando de bloqueantes que se unen a PCSK9 de tipo salvaje pero no al mutante D374Y
En el panel inicial de 3.000 sobrs había 86 anticuerpos que se mostró que se unían específicamente a la PCSK9 de tipo salvaje y no al mutante huPCSK9(D374Y). Estos 86 sobrs se ensayaron para la capacidad de bloquear la unión de PCSK9 de tipo salvaje al receptor LDLR. Se empleó el protocolo siguiente: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences) en el cribado. Las placas se recubrieron con anti-His 1.2.3 a 10 μg/ml en IXPBS/0,05% Azida a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 μl de 1XPBS/1%leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Se añadió LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF o R&D Systems, #2148LD) a 5 μg/ml en 1XPBS/1%leche/10mM Ca2+ a un volumen de 40 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Simultáneamente, se pre-incubó PCSK9 de tipo salvaje humana biotinilada con sobrenadante de hibridoma agotado en placas de polipropileno Nunc. Se transfirieron 22 μl de sob de hibridoma a 33ul de b-PCSK9 a una concentración de 583 ng/ml en 1XPBS/1%leche/10mMCa2+, proporcionando una concentración final de b-PCSK9 = 350 ng/ml y el sobrenadante agotado a una dilución final de 1:2,5. Las placas se pre-incubaron durante aproximadamente 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 50 μl/pocillo de la mezcla preincubada en placas de ELISA con LDLR capturado y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 μl/pocillo de estreptavidina HRP a 500 ng/ml en diluyente del ensayo a las placas. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 μl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 μl/pocillo de 1N ácido clorhídrico después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.
Resultados del cribado
Tomando como base los resultados de los ensayos descritos, se identificaron varias líneas de hibridoma como productoras de anticuerpos con interacciones deseadas con PCSK9. Se usó la dilución limitante para aislar un número manejable de clones de cada línea. Los clones se designaron por el número de línea de hibridoma (por ejemplo 21B12) y número de clon (por ejemplo 21B12.1). En general, no se detectaron diferencias entre los diferentes clones de una línea particular por los ensayos funcionales descritos en la presente memoria. En unos pocos casos, se identificaron clones de una línea particular que se comportaban de manera diferente en los ensayos funcionales, por ejemplo, se encontró que 25A7.1 no bloqueaba PCSK9/LDLR pero 25A7.3 (referido en la presente memoria como 25A7) era neutralizante. Los clones aislados se expandieron cada uno en 50-100 ml de medio de hibridoma y se dejó que crecieran hasta agotamiento, (es decir, menos de aproximadamente 10% de viabilidad celular). La concentración y potencia de los anticuerpos para PCSK9 en los sobrenadantes de estos cultivos se determinaron por ELISA y por ensayo funcional in vitro, como se describe en la presente memoria. Como resultado del cribado descrito en la presente memoria, se identificaron los hibridomas con la titulación mayor de anticuerpos para PCSK9. Los hibridomas seleccionados se muestran en las FIGS 2A-3D y Tabla 2. EJEMPLO 4.1
Producción de anticuerpos IgG431H4 humanos de hibridomas
Este ejemplo describe generalmente cómo se produjo una de las proteínas de unión a antígeno a partir de una línea de hibridoma. El trabajo de producción usó generación de 50ml de sobrenadante agotado seguido de purificación con proteína A. La producción Integra fue para aumento de escala y se realizó posteriormente. La línea de hibridoma 31H4 se creció en matraces T75 en 20 ml de medio (Medio Integra, Tabla 5). Cuando el hibridoma estaba casi confluente en los matraces T75, se transfirió a un matraz Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se puso un volumen de 20-30 ml de células de hibridoma en una densidad celular mínima de 1x106 células por ml de la línea de hibridoma 31H4 en la cámara pequeña de un matraz Integra en medio Integra (véase la Tabla 5 para los componentes del medio Integra). Se puso medio Integra solo (1L) en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a células de hibridoma y a anticuerpos producidos por estas células. Así, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por estas células de hibridoma se retuvieron en la cámara pequeña.
Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. La muestra de medio recogido resultante de la línea de hibridoma se sedimentó para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000rpm) y el sobrenadante resultante se filtró (0,22um). El medio condicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A-Sefarosa. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como 50 mM Citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sefarosa Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 31H4 son Sefarosa Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.
TABLA 5
Figure imgf000057_0001
_________________
EJEMPLO 4.2
Producción de anticuerpos IgG231H4 Humanos recombinantes de células transfectadas
El presente ejemplo muestra cómo se produjeron los anticuerpos IgG2 31H4 a partir de células transfectadas. Las células 293 para la expresión transitoria y las células CHO para expresión estable se transfectaron con plásmidos que codificaban las cadenas pesada y ligera de 31H4. El medio condicionado de las células transfectadas se recuperó eliminando las células y restos celulares. El medio condicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A-Sefarosa. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como 50 mM citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sefarosa Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 31H4 son Sefarosa Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna. EJEMPLO 5
Producción de anticuerpos IgG421B12 humanos de hibridomas
El presente ejemplo muestra cómo se produjo el anticuerpo IgG4 21B12 a partir de hibridomas. La línea de hibridoma 21B12 se creció en matraces T75 en medio (Medio Integra, Tabla 5). Cuando los hibridomas eran casi confluentes en los matraces T75, se transfirieron a matraces Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se puso un volumen de 20-30 ml de células de hibridoma en una densidad celular mínima de 1x106 células por ml de la línea de hibridoma 31H4 en la cámara pequeña de un matraz Integra en medio Integra (véase la Tabla 5 para los componentes del medio Integra). Se puso medio Integra solo (1L) en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a células de hibridoma y a anticuerpos producidos por estas células. Así, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por estas células de hibridoma se retuvieron en la cámara pequeña. Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. La muestra de medio recogido resultante de la línea de hibridoma se sedimentó para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000rpm) y el sobrenadante resultante se filtró (0,22um). El medio condicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A Sefarosa. Opcionalmente, los medios se concentran en primer lugar y después se cargan en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como 50 mM Citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sefarosa Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 21B12 son Sefarosa Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.
EJEMPLO 6
Producción de anticuerpos IgG221B12 humanos de células transfectadas
El presente ejemplo muestra cómo se produjeron los anticuerpos IgG221B12 a partir de células transfectadas. Las células (células 293 para expresión transitoria y células CHO para expresión estable) se transfectaron con plásmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de 21B12. Los medios condicionados de las células de hibridoma se recuperaron eliminando las células y restos celulares. Los medios condicionados aclarados se cargaron en una columna de Proteína A-Sefarosa. Opcionalmente, los medios pueden concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (50 mM Citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de cationes tales como resina SP-Sefarosa. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 21B12 fueron SP-Sefarosa HP a pH 5,2. Los anticuerpos se eluyeron con 25 volúmenes de columna de tampón que contenía un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 20 mM tampón acetato de sodio.
EJEMPLO 7
Producción de anticuerpos IgG416F12 humanos de hibridomas
El presente ejemplo muestra cómo se produjo el anticuerpo IgG4 16F12 a partir de hibridomas. La línea de hibridoma 16F12 se creció en matraces T75 en medio (véase la Tabla 5). Cuando los hibridomas eran casi confluentes en los matraces T75, se transfirieron a matraces Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se puso un volumen de 20-30 ml de células de hibridoma en una densidad celular mínima de 1x106 células por ml de la línea de hibridoma 31H4 en la cámara pequeña de un matraz Integra en medio Integra (véase la Tabla 5 para los componentes del medio Integra). Se puso medio Integra solo (1L) en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a células de hibridoma y a anticuerpos producidos por estas células. Así, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por estas células de hibridoma se retuvieron en la cámara pequeña.
Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. Las muestras de medio recogido resultantes de la línea de hibridoma se sedimentaron para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000rpm) y los sobrenadantes resultantes se filtraron (0,22um). Los medios condicionados aclarados se cargaron en una columna de Proteína A Sefarosa. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (50 mM Citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sefarosa Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 16F12 son Sefarosa Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.
EJEMPLO 8
Producción de anticuerpos IgG216F12 humanos de células transfectadas
El presente ejemplo muestra cómo se produjeron anticuerpos IgG2 16F12 a partir de células transfectadas. Las células (células 293 para expresión transitoria y células CHO para expresión estable) se transfectaron con plásmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de 16F12. Los medios condicionados de las células de hibridoma se recuperaron eliminando las células y restos celulares. Los medios condicionados aclarados se cargaron en una Proteína A-Sefarosa. Opcionalmente, los medios pueden concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sefarosa. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (50 mM Citrato, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sefarosa se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de cationes tales como resina Sefarosa SP. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 16F12 son Sefarosa SP HP a pH 5,2. El anticuerpo se eluye con 25 volúmenes de columna de tampón que contiene un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 20 mM tampón acetato de sodio.
EJEMPLO 9
Análisis de la secuencia de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos anteriores se determinaron por secuenciación de nucleótidos Sanger (didesoxi). Las secuencias de aminoácidos se dedujeron entonces para las secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico para los dominios variables se representan en las FIG.s 3E-3JJ.
Se determinaron las secuencias de ADNc para las regiones variables de la cadena ligera lambda de 31H4, 21B12, y 16F12 y se describen como SEQ ID NOs: 153, 95, y 105 respectivamente.
Se determinaron las secuencias de ADNc para las regiones variables de la cadena pesada de 31H4, 21B12, y 16F12 y se describen como SEQ ID NOs: 152, 94, y 104 respectivamente.
La región constante de la cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 156), y las regiones constantes de la cadena pesada de IgG2 e IgG4 (SEQ ID NOs: 154 y 155) se muestran en la FIG. 3KK.
Se determinaron las secuencias de polipéptido predichas a partir de cada una de estas secuencias de ADNc. Se predijeron las secuencias de polipéptido predichas para las regiones variables de la cadena ligera lambda de 31H4, 21B12, y 16F12 y se describen como SEQ ID NOs: 12, 23; y 35 respectivamente, se predijeron la región constante de la cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 156), las regiones variables de la cadena pesada de 31H4, 21B12, y 16F12 y se describen como (SEQ ID NOs. 67, 49, y 79 respectivamente. Las regiones constantes de la cadena pesada de IgG2 e IgG4 (SEQ ID NOs: 154 y 155).
Las divisiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 se muestran en la FIG 2A-3D.
Tomando como base los datos de secuencia, se determinaron los genes de línea germinal a partir de los cuales se derivó cada región variable de cadena pesada o cadena ligera. La identidad de los genes de línea germinal se indica al lado de la línea de hibridoma correspondiente en las FIGs. 2A-3D y cada uno está representado por un único SEQ ID NO. Las FIGs. 2A-3D también representan las secuencias de aminoácidos determinadas para anticuerpos adicionales que se caracterizaron.
EJEMPLO 8
Determinación de los puntos isoeléctricos de tres anticuerpos
Se determinó que los pIs teóricos de los anticuerpos tomando como base la secuencia de aminoácidos eran 7,36 para 16F12; 8,47 para 21B12; y 6,84 para 31H4.
EJEMPLO 9
Caracterización de la unión de los anticuerpos a PCSK9
Habiendo identificado varios anticuerpos que se unen a PCSK9, se emplearon varias estrategias para cuantificar y caracterizar adicionalmente la naturaleza de la unión. En un aspecto del estudio, se realizó un análisis de afinidad Biacore. En otro aspecto del estudio, se realizó un análisis de afinidad KinExA®. Las muestras y tampones empelados en estos estudios se presentan en la Tabla 6 a continuación.
TABLA 6
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Medidas de afinidad BIAcore®
Se realizó un análisis de afinidad BIAcore® (dispositivo de resonancia de plasmón superficial, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) de los anticuerpos 21B12 para PCSK9 descrito en este Ejemplo según las instrucciones del fabricante.
Brevemente, los experimentos de resonancia de plasmón superficial se realizaron usando biosensores ópticos Biacore 2000 (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Cada anticuerpo anti-PCSK9 individual se inmovilizó en un chip biosensor CM5 de grado investigacional por acoplamiento de amina a niveles que proporcionaron una respuesta máxima de unión de analito (Rmax) de no más de 200 unidades de resonancia (RU). La concentración de proteína PCSK9 se varió a intervalos de 2 veces (el analito) y se inyectó sobre la superficie de anticuerpo inmovilizado (a una velocidad de flujo de 100 μl/min durante 1,5 minutos). Se usó tampón HBS-P fresco (pH 7,4, 0,01 M Hepes, 0,15 M NaCl, 0,005% tensioactivo P-20, Biacore) suplementado con 0,01% BSA como tampón de unión. Las afinidades de unión de cada anticuerpo anti-PCSK9 se midieron en experimentos separados frente a cada una de las proteínas PCSK9 humana, de ratón y de mono cinomolgus a pH 7,4 (las concentraciones usadas fueron 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, y 0 nM).
Además, las afinidades de unión del anticuerpo frente a PCSK9 humana también se midieron a pH 6,0 con el tampón de pH 6,0 HBS-P (pH 6,0, 0,01 M Hepes, 0,15 M NaCl, 0,005% tensioactivo P-20, Biacore) suplementado con 0,01% BSA. La señal de unión obtenida fue proporcional a la PCSK9 libre en la disolución. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio con curva dual (software KinExA®, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (n=1 para las corridas a pH 6,0). De forma interesante, pareció que los anticuerpos presentaban una afinidad de unión más fuerte al pH más bajo (en donde la Kd fue 12,5, 7,3, y 29 μM para 31H4, 21B12, y 16F12 respectivamente).
Los parámetros cinéticos de unión de los anticuerpos incluyendo ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación), y Kd (constante de disociación en el equilibrio) se determinaron usando el programa informático BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). Las constantes de disociación en el equilibrio más bajas indican mayor afinidad del anticuerpo para PCSK9. Los valores de Kd determinados por el análisis de afinidad BIAcore® se presentan en la Tabla 7.1, mostrada a continuación.
TABLA 7.1
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La Tabla 7.2 representa las velocidades kasoc y kdisoc.
TABLA 7.2
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Medidas de afinidad KinExA®
Se realizó un análisis de afinidad KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) de 16F12 y 31H4 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se pre-recubrió Reach-Gel™ (6x) (Pierce) con una de las proteínas PCSK9 humana, cino etiquetada con V5 o de ratón etiquetada con His y se bloqueó con BSA. Se incubaron 10 ó 100 μM del anticuerpo 16F12 o anticuerpo 31H4 y una de las proteínas PCSK9 con varias concentraciones (0,1 μM - 25 nM) de proteínas PCSK9 a temperatura ambiente durante 8 horas antes de pasarlos a través de las perlas recubiertas con PCSK9. La cantidad de 16F12 o 31H4 unido a las perlas se cuantificó por anticuerpo anti-IgG (H L) humana de cabra marcado fluorescentemente (Cy5) (Jackson Immuno Research). La señal de unión es proporcional a la concentración de 16F12 o 31H4 libre en el equilibrio de unión. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se obtuvo a partir de la regresión no lineal de los dos conjuntos de curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio. Se empleó el software KinExA® Pro en el análisis. Las curvas de unión generadas en este análisis se presentan como FIGs. 4A-4F.
Ambos anticuerpos, 16F12 y 31H4, mostraron una afinidad similar para PCSK9 humana y de cino, pero una afinidad aproximadamente 10-250 veces menor para PCSK9 de ratón. De los dos anticuerpos ensayados usando el sistema KinExA®, el anticuerpo 31H4 mostró una mayor afinidad tanto para PCSK9 humana como de cino con 3 y 2 μM Kd, respectivamente. 16F12 mostró una afinidad ligeramente más débil a 15μM Kd para PCSK9 humana y 16 μM KD para PCSK9 de cino.
Los resultados del análisis de afinidad KinExA® se resumen en la Tabla 8.1, mostrada a continuación.
TABLA 8.1
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Además, se corrió un SDS PAGE para comprobar la calidad y cantidad de las muestras y se muestra en la FIG.
5A. cPCSK9 mostró alrededor de 50% menos en el gel y también a partir de la concentración de unión activa calculada a partir del ensayo KinExA®. Por lo tanto, la Kd de los mAb para cPCSK9 se ajustó como 50% de la cPCSK9 activa en el presente.
Se usó un ensayo de unión de equilibrio en disolución BIAcore para medir los valores de Kd para ABP 21B12.
21B12.1 mostró una señal pequeña usando el ensayo KinExA, por lo tanto, se aplicó el ensayo de equilibrio en disolución biacore. Como no se observó una unión significativa en la unión de los anticuerpos a superficie con PCSK9 inmovilizada, el anticuerpo 21B12 se inmovilizó en la celda de flujo 4 de un chip CM5 usando acoplamiento de amina con densidad alrededor de 7.000 RU. La celda de flujo 3 se usó como un control de fondo. Se mezclaron 0,3, 1, y 3 nM de PCSK9 humana o PCSK9 de cino con diluciones seriadas de muestras de anticuerpo 21B12.1 (que variaron de 0,001 ~ 25 nM) en PBS más 0,1mg/ml BSA, 0,005% P20. La unión de la PCSK9 libre en las disoluciones mezcladas se midió inyectando sobre la superficie del anticuerpo 21B12.1. El 100% de la señal de unión de PCSK9 en la superficie de 21B12.1 se determinó en ausencia de mAb en la disolución. Una respuesta de unión de PCSK9 disminuida con concentraciones crecientes de mAb indicó la unión de PCSK9 al mAb en disolución, que bloqueó la unión de PCSK9 a la superficie del pepticuerpo inmovilizado. A partir de la representación de la señal de unión de PCSK9 frente a las concentraciones de mAb, se calculó Kd a partir de tres conjuntos de curvas (0,3, 1 y 3nM concentración fijada de PCSK9) usando un modelo de unión homogéneo de un sitio en software KinExA Pro™. Aunque cPCSK9 tiene una menor concentración de proteína observada a partir del ensayo KinExA y gel con SDS, su concentración no se ajustó aquí ya que la concentración de cPCSK9 no se usó para el cálculo de Kd. Los resultados se representan en la Tabla 8.2 a continuación y en las FIGs. 5B-5D. La FIG. 5B representa los resultados del ensayo de equilibrio en disolución a tres concentraciones diferentes de hPCSK9 para hPCSK9. La FIG. 5C representa un conjunto similar de resultados para mPCSK9. La FIG. 5D representa los resultados del ensayo de captura biacore anterior.
TABLA 8.2
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EJEMPLO 10
Agrupación en clases de epítopos
Se usó ELISA de competición para la agrupación en clases de los anticuerpos anti-PCSK9. Brevemente, para determinar si dos anticuerpos pertenecen a la misma clase ("bin") de epítopo, uno de los anticuerpos (mAb1) se recubrió en primer lugar en una placa ELISA (NUNC) a 2 p/ml por incubación de toda la noche. La placa se lavó y se bloqueó con 3% BSA. Mientras tanto, se incubaron 30 ng/ml de hPCSK9 biotinilada con el segundo anticuerpo (mAb2) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se aplicó a mAb1 recubierto y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa ELISA se lavó y se incubó con Neutravidina-HRP (Pierce) a diluciones 1:5.000 durante 1 hora. Después de otro lavado, la placa se incubó con sustrato TMB y la señal se detectó a 650 nm usando un lector de placas Titertek. Los anticuerpos con los mismos perfiles de unión se agruparon conjuntamente en la misma clase de epítopo. Los resultados de los estudios de agrupación en clases de los anticuerpos se presentan en la Tabla 8.3.
TABLA 8.3
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Se realizó un examen adicional de la agrupación en clases de epítopos usando BIAcore. Tres mAb, 16F12, 21B12 y 31H4, se inmovilizaron en celdas de flujo 2, 3 y 4 con la densidad alrededor de 8.000 RU. Se inyectó 5 nM PCSK9 de ser humano, ratón y cino sobre las superficies de mAb para alcanzar alrededor de 100 a 500 RU. Se inyectó 10nM de los mAb sobre la superficie de PCSK9. Se registró la unión de los tres mAb a tres proteínas PCSK9 diferentes sobre los tres mAb.
Si los dos mAbs tienen un epítopo similar en el antígeno, mAb 1 no mostrará la unión al antígeno ya unido al mAb 2. Si los dos mAbs tienen el epítopo diferente en el antígeno, mAb1 mostrará la unión al antígeno unido al mAb2. La FIG. 5E representa estos resultados de la agrupación en clases de epítopos en forma de gráfico para tres mAb en PCSK9 humana. Se observó un patrón similar para mPCSK9 y cPCSK9. Como se muestra en el gráfico, 16F12 y 31H4 parecieron compartir un epítopo similar, mientras 21B12 pareció tener un epítopo diferente.
EJEMPLO 11
Eficacia de 31H4 y 21B12 para bloquear la unión PCSK9 D374Y/LDLR
Este ejemplo proporciona los valores IC50 para dos de los anticuerpos en el bloqueo de la capacidad de PCSK9 D374Y de unirse a LDLR. Se recubrieron placas transparentes de 384 pocillos (Costar) con 2 microgramos/ml de anticuerpo anti-receptor de LDL de cabra (R&D Systems) diluido en tampón A (100 mM cacodilato de sodio, pH 7,4). Las placas se lavaron concienzudamente con tampón A y se bloquearon durante 2 horas con tampón B (1% leche en tampón A). Después de lavar, las placas se incubaron durante 1,5 horas con 0,4 microgramos/ml de receptor de LDL (R&D Systems) diluido en tampón C (tampón B suplementado con 10 mM CaCl2). Simultáneamente a esta incubación, se incubaron 20 ng/ml de PCSK9 D374Y biotinilado con varias concentraciones del anticuerpo 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 ó 21B12 IgG4, que se diluyó en tampón A, o tampón A solo (control). Las placas que contenían el receptor de LDL se lavaron y la mezcla PCSK9 D374Y biotinilado/anticuerpo se transfirió a ellas y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión del D374Y biotinilado al receptor de LDL se detectó por incubación con estreptavidina-HRP (Biosource) a 500 ng/ml en tampón C seguido de sustrato TMB (KPL). La señal se paró con 1N HCl y se leyó la absorbancia a 450 nm. Los resultados de este estudio de unión se muestran en las FIGs. 6A-6D. En resumen, se determinaron los valores IC50 para cada anticuerpo y se encontró que eran 199 μM para 31H4 IgG2 (FIG. 6A), 156 μM para 31H4 IgG4 (FIG. 6B), 170 μM para 21B12 IgG2 (FIG. 6C), y 169 μM para 21B12 IgG4 (FIG. 6D).
Los anticuerpos también bloquearon la unión de PCSK9 de tipo salvaje al LDLR en este ensayo.
EJEMPLO 12
Ensayo de captación celular de LDL
Este ejemplo demuestra la capacidad de varias proteínas de unión a antígeno para reducir la captación de LDL por las células. Se sembraron células HepG2 humanas en placas negras, de fondo transparente de 96 pocillos (Costar) a una concentración de 5x105 células por pocillo en medio DMEM (Mediatech, Inc) suplementado con 10% FBS y se incubaron a 37°C (5% CO2) toda la noche. Para formar el complejo PCSK9 y anticuerpo, se incubaron 2 μg/ml de PCSK9 D374Y humano con varias concentraciones de anticuerpo diluido en tampón de captación (DMEM con 1% FBS) o tampón de captación solo (control) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS, la mezcla PCSK9 D374Y/anticuerpo se transfirió a las células, seguido de LDL-BODIPY (Invitrogen) diluido en tampón de captación a una concentración final de 6 μg/ml. Después de incubar durante 3 horas a 37°C (5% CO2), las células se lavaron concienzudamente con PBS y la señal de fluorescencia celular se detectó por Safire™ (TECAN) a 480-520nm (excitación) y 520-600nm (emisión).
Los resultados del ensayo de captación celular se muestran en las FIGs. 7A-7D. En resumen, se determinaron los valores IC50 para cada anticuerpo y se encontró que eran 16,7 nM para 31H4 IgG2 (FIG. 7A), 13,3 nM para 31H4 IgG4 (FIG. 7B), 13,3 nM para 21B12 IgG2 (FIG. 7C), y 18 nM para 21B12 IgG4 (FIG. 7D). Estos resultados demuestran que las proteínas de unión a antígeno aplicadas pueden reducir el efecto de PCSK9 (D374Y) para bloquear la captación de LDL por las células. Los anticuerpos también bloquearon el efecto de PCSK9 de tipo salvaje en este ensayo.
EJEMPLO 13
Efecto de disminución del colesterol sérico del anticuerpo 31 H4 en un estudio de 6 días
Con el fin de evaluar la disminución de colesterol sérico total (TC) en ratones de tipo salvaje (WT) mediante terapia con anticuerpo frente a proteína PCSK9, se realizó el procedimiento siguiente.
Se alimentaron ratones WT macho (cepa C57BL/6, con edades de 9-10 semanas, 17-27 g) obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) con pienso normal (Harland-Teklad, Dieta 2918) a lo largo de la duración del experimento. Se administró a los ratones bien anticuerpo anti-PCSK9 31H4 (2 mg/ml en PBS) o IgG control (2 mg/ml en PBS) a un nivel de 10mg/kg a través de la vena de la cola del ratón a T=0. También se reservaron ratones sin estimular como un grupo control sin estimular. Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 9.
TABLA 9
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Los ratones se sacrificaron por asfixia con CO2 en los puntos de tiempo pre-determinados mostrados en la Tabla 9. Se recogió sangre a través de la vena cava en tubos eppendorf y se dejó que se coagulara a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se sedimentaron en una centrífuga de mesa a 12.000xg durante 10 minutos para separar el suero. Se midieron el colesterol sérico total y HDL-C usando un analizador clínico Hitachi 912 y kits de TC y HDL-C de Roche/Hitachi.
Los resultados del experimento se muestran en las FIGs. 8A-8D. En resumen, los ratones a los que se administró el anticuerpo 31H4 mostraron niveles de colesterol sérico disminuidos durante el curso del experimento (FIG. 8A y FIG. 8B). Además, se indica que los ratones también mostraron niveles disminuidos de HDL (FIG. 8C y FIG. 8D). Para las FIG. 8A y FIG. 8C, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,01, # P<0,05). Para las FIG. 8B y FIG 8D, el porcentaje de cambio está relacionado con los niveles de colesterol sérico total y HDL medidos en animales sin estimular a t=0 hrs (*P<0,01, # P<0,05).
Respecto a los niveles de HDL disminuidos, se indica que un experto en la técnica apreciará que la disminución en HDL en ratones no es indicativa de que ocurrirá una disminución de HDL en los seres humanos y refleja meramente además que el nivel de colesterol sérico en el organismo ha disminuido. Se indica que los ratones transportan la mayoría del colesterol sérico en partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) que es diferente a los seres humanos que portan la mayor parte del colesterol sérico en partículas LDL. En los ratones, la medición de colesterol sérico total se parece mucho al nivel de HDL-C sérico. El HDL de ratones contiene apolipoproteína E (apoE) que es un ligando para el receptor de LDL (LDLR) y permite que se aclare por el LDLR. Así, el examen de HDL es un indicador apropiado para el presente ejemplo, en ratones (con el conocimiento de que no se espera una disminución en HDL en los seres humanos). Por ejemplo, el HDL humano, por el contrario, no contiene apoE y no es un ligando para el LDLR. Como los anticuerpos de PCSK9 incrementan la expresión de LDLR en ratones, el hígado puede aclarar más HDL y por lo tanto disminuye los niveles de HDL-C sérico.
EJEMPLO 14
Efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de LDLR en un estudio de 6 días
El presente ejemplo demuestra que una proteína de unión a antígeno altera el nivel de LDLR en un sujeto, como se ha predicho, con el tiempo. Se realizó un análisis por transferencia Western con el fin de averiguar el efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de LDLR. Se homogeneizaron 50-100 mg de tejido hepático obtenido de los ratones sacrificados descritos en el Ejemplo 13 en 0,3 ml de tampón RIPA (Santa Cruz Biotechnology Inc.) que contenía inhibidor de proteasa completo (Roche). El homogenado se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó para sedimentar los restos celulares. La concentración de proteína en el sobrenadante se midió usando los reactivos del ensayo de proteínas BioRad (BioRad laboratories). Se desnaturalizaron 100μg de proteína a 70°C durante 10 minutos y se separó en gel de SDS de gradiente 4-12% Bis-Tris (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,45 μm (Invitrogen) y se bloqueó en tampón de lavado (50mM Tris PH7,5, 150mM NaCl, 2mM CaCl2 y 0,05% Tween 20) que contenía 5% de leche desnatada durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se ensayó con anticuerpo anti-LDLR de ratón de cabra (R&D system) 1:2.000 o anti-13 actina (sigma) 1:2.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se lavó brevemente y se incubó con anti-IgG de cabra de bovino-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2.000 o anti-IgG de ratón de cabra-HRP (Upstate) 1:2.000. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, la transferencia se lavó concienzudamente y se detectaron las bandas inmunoreactivas usando el kit ECL plus (Amersham biosciences). La transferencia Western mostró un incremento en los niveles de proteína LDLR en presencia del anticuerpo 31H4, como se representa en la FIG. 9.
EJEMPLO 15
Efecto de disminución del colesterol sérico del anticuerpo 31H4 en un estudio de 13 días
Con el fin de evaluar la disminución de colesterol sérico total (TC) en ratones de tipo salvaje (WT) mediante terapia con anticuerpo frente a la proteína PCSK9 en un estudio de 13 días, se realizó el procedimiento siguiente. Se alimentaron ratones WT macho (cepa C57BL/6, con edades de 9-10 semanas, 17-27 g) obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) con pienso normal (Harland-Teklad, Dieta 2918) a lo largo de la duración del experimento. Se administró a los ratones bien anticuerpo anti-PCSK9 31H4 (2 mg/ml en PBS) o IgG control (2 mg/ml en PBS) a un nivel de 10 mg/kg a través de la vena de la cola del ratón a T=0. También se reservaron ratones sin estimular como un grupo control sin estimular.
Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 10. Los animales se sacrificaron y los hígados se extrajeron y prepararon como en el Ejemplo 13.
TABLA 10
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g g g (continuación)
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Cuando el experimento de 6 días se prolongó a un estudio de 13 días, también se observó en el estudio de 13 días el mismo efecto de disminución del colesterol sérico observado en el estudio de 6 días. Más específicamente, los animales dosificados a 10 mg/kg demostraron una disminución del 31% en el colesterol sérico en el día 3, que volvió gradualmente a los niveles pre-dosificación sobre el día 13. La FIG. 10A representa los resultados de este experimento. La FIG. 10C representa los resultados de la repetición del procedimiento anterior con la dosis 10mg/kg de 31H4, y con otro anticuerpo, 16F12, también a 10mg/kg. Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 11.
TABLA 11
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Como se muestra en la FIG. 10C tanto 16F12 como 31H4 resultaron en disminuciones significativas y sustanciales en el colesterol sérico total después de sólo una única dosis y proporcionaron beneficios durante más de una semana (10 días o más). Los resultados del estudio de 13 días repetido fueron consistentes con los resultados del primer estudio de 13 días, observándose una disminución en los niveles de colesterol sérico de 26% en el día 3. Para las FIG. 10A y FIG. 10B, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,01). Para la FIG. 10C, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,05).
EJEMPLO 16
Efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de HDL en un estudio de 13 días
También se examinaron los niveles de HDL para los animales en el Ejemplo 15. Los niveles de HDL disminuyeron en los ratones. Más específicamente, los animales dosificados a 10 mg/kg demostraron una disminución del 33% en los niveles de HDL en el día 3, que volvieron gradualmente a los niveles de pre­ dosificación sobre el día 13. La FIG. 10B representa los resultados del experimento. Hubo una disminución en los niveles de HDL del 34% en el día 3. La FIG. 10B representa los resultados del experimento de 13 días repetido. Como apreciará un experto en la técnica, mientras los anticuerpos disminuirán el HDL de ratón, no se espera que esto ocurra en los seres humanos debido a las diferencias en HDL en los seres humanos y otros organismos (tales como ratones). Así, la disminución en HDL de ratón no es indicativa de una disminución en HDL humano.
EJEMPLO 17
La administración repetida de los anticuerpos produce beneficios continuados de los péptidos de unión a antígeno
Con el fin de verificar que los resultados obtenidos en los Ejemplos anteriores pueden prolongarse para beneficios adicionales con dosis adicionales, los Experimentos en los Ejemplos 15 y 16 se repitieron con el programa de dosificación representado en la FIG. 11a . Los resultados se representan en la FIG. 11B. Como puede observarse en el gráfico en la FIG. 11B, aunque ambos conjuntos de ratones presentaron una disminución significativa en el colesterol sérico total porque todos los ratones recibieron una inyección inicial de la proteína de unión a antígeno 31H4, los ratones que recibieron inyecciones adicionales de la ABP 31H4 presentaron una reducción continuada en colesterol sérico total, mientras aquellos ratones que sólo recibieron la inyección control presentaron eventualmente un incremento en su colesterol sérico total. Para la FIG. 11, el porcentaje de cambio está relacionado con los animales sin estimular a t=0 horas (*P<0,01, **P<0,001).
Los resultados de este ejemplo demuestran que, a diferencia de otros métodos de tratamiento de colesterol, en donde las aplicaciones repetidas dan lugar a una reducción en la eficacia debido a ajustes biológicos en el sujeto, la presente estrategia no parece presentar este problema durante el periodo de tiempo examinado. Además, esto sugiere que la vuelta de los niveles de colesterol sérico total o colesterol HDL a la línea base, observada en los ejemplos previos, no se debe al desarrollo por el sujeto de alguna resistencia al tratamiento, sino a la depleción de la disponibilidad del anticuerpo en el sujeto.
EJEMPLO 18
Mapeo de epítopos de los anticuerpos anti PCSK9 humanos
Este ejemplo muestra métodos para determinar qué residuos en PCSK9 están implicados en formar parte del epítopo para las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria para PCSK9.
Con el fin de determinar los epítopos a los que se unen determinadas de las ABP adecuadas para el uso de acuerdo con la presente invención, los epítopos de las ABP pueden mapearse usando péptidos sintéticos derivados de la secuencia peptídica de PCSK9 específica.
Puede usarse una matriz de péptidos SPOTs (Sigma Genosys) para estudiar la interacción molecular de los anticuerpos anti-PCSK9 humanos con su epítopo peptídico. La tecnología SPOTs se basa en la síntesis en fase sólida de péptidos en un formato adecuado para el análisis sistemático de epítopos de anticuerpos. La síntesis de oligopéptidos dispuestos en matriz a medida está disponible comercialmente en Sigma-Genosys. Puede obtenerse una matriz de péptidos de oligopéptidos superpuestos derivados de la secuencia de aminoácidos del péptido PCSK9. La matriz puede comprender una serie de péptidos 12-mer como manchas en una lámina de membrana de polipropileno. La matriz de péptidos puede abarcar la longitud completa de la secuencia madura de PCSK9. Cada péptido consecutivo puede estar desplazado por 1 residuo respecto del previo, dando lugar a una biblioteca anidada, superpuesta de oligopéptidos en matriz. La membrana que porta los péptidos puede hacerse reaccionar con diferentes anticuerpos anti-PCSK9 (1 microgramo/ml). La unión de los mAb a los péptidos unidos a la membrana puede evaluarse por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP seguido de quimioluminiscencia amplificada (ECL).
Además, los epítopos funcionales pueden mapearse por escaneo de alanina combinatorio. En este proceso, puede usarse una estrategia de escaneo de alanina combinatorio para identificar aminoácidos en la proteína PCSK9 que son necesarios para la interacción con las ABP anti-PCSK9. Para conseguir esto, puede usarse un segundo conjunto de matrices SPOTs para el escaneo de alanina. Un panel de péptidos variantes con sustituciones de alanina en cada uno de los 12 residuos puede escanearse como anteriormente. Esto permitirá mapear e identificar los epítopos para las ABP para la PCSK9 humana.
En la alternativa, dado que es posible que el epítopo sea conformacional, puede emplearse una combinación de escaneo de alanina y/o escaneo de arginina, co-cristalización anticuerpo FAB/PCSK9, y proteolisis limitada/LC-MS (cromatografía líquida espectrometría de masa) para identificar los epítopos.
Ejemplo 19
Usos de los anticuerpos de PCSK9 para el tratamiento de trastornos relacionados con el colesterol Se administra a un paciente humano que presenta un trastorno relacionado con el colesterol (en donde una reducción en el colesterol (tal como colesterol sérico) puede ser beneficiosa) una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo de PCSK9, 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 ó 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoriza para determinar si los síntomas del trastorno han remitido. Después del tratamiento, se encuentra que los pacientes que han sido sometidos al tratamiento con el anticuerpo de PCSK9 tienen niveles reducidos de colesterol sérico, en comparación con pacientes que no se han tratado.
EJEMPLO 20
Usos de los anticuerpos de PCSK9 para el tratamiento de hipercolesterolemia
Se administra a un paciente humano que presenta síntomas de hipercolesterolemia una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo de PCSK9, tal como 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 ó 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoriza para determinar si el nivel de colesterol sérico ha disminuido. Después del tratamiento, se encuentra que el paciente que recibe el tratamiento con los anticuerpos de PCSK9 tiene niveles reducidos de colesterol sérico en comparación con pacientes con artritis que no han recibido el tratamiento.
EJEMPLO 21
Usos de anticuerpos de PCSK9 para la prevención de enfermedad cardiaca coronaria y/o eventos cardiovasculares recurrentes
Se identifica un paciente humano que presenta riesgo de desarrollar una enfermedad cardiaca coronaria. Se administra al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo de PCSK9, tal como 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 ó 16F12), bien solo, simultáneamente o secuencialmente con una estatina, por ejemplo, simvastatina. A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoriza para determinar si cambia el nivel de colesterol sérico total del paciente. A lo largo del tratamiento preventivo, se encuentra que el paciente que recibe el tratamiento con los anticuerpos de PCSK9 tiene un colesterol sérico reducido reduciendo de esta manera el riesgo de enfermedades cardiacas coronarias o eventos cardiovasculares recurrentes en comparación con pacientes que no han recibido el tratamiento.
EJEMPLO 22
Uso de los anticuerpos de PCSK9 como un agente de diagnóstico
Puede usarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para la detección de antígeno PCSK9 en una muestra para diagnosticar a pacientes que presentan altos niveles de producción de PCSK9. En el ensayo, se adsorben los pocillos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 384 pocillos, durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido frente a PCSK9. El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquiera de las PCSK9 que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Los pocillos se lavan y se tratan con un agente bloqueante tal como proteína de la leche o albúmina para evitar la adsorción no específica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de ensayo que se sospecha que contiene la PCSK9, o con una disolución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Dicha muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados como diagnóstico de una patología.
Después de eliminar por lavado la muestra de ensayo o estándar, los pocillos se tratan con un segundo anticuerpo de PCSK9 monoclonal completamente humano que está marcado por conjugación con biotina. También puede usarse un monoclonal de ratón o con origen en otra especie. El anticuerpo de PCSK9 marcado sirve como anticuerpo de detección. Después de eliminar por lavado el exceso de segundo anticuerpo, los pocillos se tratan con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada con avidina y un sustrato cromogénico adecuado. La concentración del antígeno en las muestras de ensayo se determina por comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Este ensayo ELISA proporciona un ensayo altamente específico y muy sensible para la detección del antígeno PCSK9 en una muestra de ensayo.
Determinación de la concentración de la proteína PCSK9 en sujetos
Un ELISA en sándwich puede cuantificar los niveles de PCSK9 en suero humano. Dos anticuerpos de PCSK9 monoclonales completamente humanos del ELISA en sándwich, reconocen diferentes epítopos en la molécula de PCSK9. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos monoclonales de ratón o con origen en otra especie. El ELISA se realiza como sigue: se recubren placas ELISA (Fisher) con 50 μL de anticuerpo de PCSK9 de captura en tampón de recubrimiento (0,1 M NaHCÜ3, pH 9,6) a una concentración de 2 μg/ml. Después de incubar a 4°C toda la noche, las placas se tratan con 200 μL de tampón de bloqueo (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Timerosal en PBS) durante 1 hora a 25°C. Las placas se lavan (3x) usando 0,05% Tween 20 en PBS (tampón de lavado, WB). Los sueros normales o de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en tampón de bloqueo que contiene 50% de suero humano. Las placas se incuban con muestras de suero toda la noche a 4°C, se lavan con WB, y se incuban con 100 μL/pocillo de anticuerpo de PCSK9 de detección biotinilado durante 1 hora a 25°C. Después de lavar, las placas se incuban con HRP-Estreptavidina durante 15 minutos, se lavan como antes, y se tratan con 100 μL/pocillo de o-fenilendiamina en H2O2 (disolución de revelado de Sigma) para la generación de color. La reacción se para con 50 μL/pocillo de H2SO4 (2M) y se analiza usando un lector de placas ELISA a 492 nm. La concentración de antígeno PCSK9 en las muestras de suero se calcula por comparación con diluciones de antígeno PCSK9 purificado usando un programa de ajuste de curvas de cuatro parámetros.
Determinación de la concentración de la proteína variante PCSK9 en sujetos
Las etapas indicadas anteriormente pueden realizarse usando anticuerpos que se indica en la presente memoria que se unen tanto a PCSK9 de tipo salvaje como a PCSK9 variante (D374Y). A continuación, pueden usarse anticuerpos que se unen al tipo salvaje pero no al mutante (de nuevo usando un protocolo similar al indicado anteriormente) para determinar si la PCSK9 presente en el sujeto es de tipo salvaje o la variante D374Y. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados que son positivos para ambas rondas serán de tipo salvaje, mientras aquellos que son positivos para la primera ronda, pero no la segunda ronda de anticuerpos, incluirán la mutación D374Y. Se sabe que hay mutaciones de alta frecuencia en la población y que se podrían beneficiar particularmente de un agente tal como las ABP descritas en la presente memoria.
EJEMPLO 23
Uso de proteína de unión a antígeno para PCSK9 para la prevención de hipercolesterolemia
Se identifica un paciente humano que presenta un riesgo de desarrollar hipercolesterolemia mediante el análisis del historial familiar y/o tipo de vida, y/o niveles presentes de colesterol. Se administra regularmente al sujeto (por ejemplo, una vez semanalmente) una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo de PCSK9, 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 ó 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoriza para determinar si los niveles de colesterol sérico han disminuido. Después del tratamiento, se encuentra que los sujetos que han recibido tratamiento preventivo con el anticuerpo de PCSK9 tienen niveles disminuidos de colesterol sérico, en comparación con los sujetos que no se han tratado.
EJEMPLO 24
Las ABP para PCSK9 regulan al alza adicionalmente LDLR en presencia de estatinas
Este ejemplo demuestra que las ABP para PCSK9 producían incrementos adicionales en la disponibilidad de LDLR cuando se usan en presencia de estatinas, demostrando que pueden conseguirse beneficios adicionales por el uso combinado de los dos.
Se sembraron células HepG2 en DMEM con 10% suero fetal bovino (FBS) y se crecieron hasta ~90% de confluencia. Las células se trataron con cantidades indicadas de mevinolina (una estatina, Sigma) y ABP para PCSK9 (FIGs. 12A-12C) en DMEM con 3% FBS durante 48 horas. Se prepararon lisados celulares totales. Se separaron 50 mg de proteínas totales por electroforesis en gel y se transfirieron a membrana de PVDF. Las inmunotransferencias se realizaron usando anticuerpo anti-receptor de LDL humano de conejo (Fitzgerald) o anticuerpo anti-b-actina humana de conejo. Los resultados de quimioluminiscencia amplificada se muestran en los paneles superiores de las FIGs. 12A-12C. La intensidad de las bandas se cuantificó por software ImageJ y se normalizaron por b-actina. Los niveles relativos de LDLR se muestran en los paneles inferiores de las FIGs. 12A-12C. Las ABP 21B12 y 31H4 son anticuerpos neutralizantes para PCSK9, mientras 25A7.1 es un anticuerpo no neutralizante.
También se crearon células HepG2-PCSK9. Estas eran una línea celular HepG2 estable transfectada con PCSK9 humana. Las células se sembraron en DMEM con 10% suero fetal bovino (FBS) y se crecieron hasta ~90% de confluencia. Las células se trataron con cantidades indicadas de mevinolina (Sigma) y ABP para PCSK9 (FIGs. 12D-12F) en DMEM con 3% FBS durante 48 horas. Se prepararon lisados celulares totales. Se separaron 50 mg de proteínas totales por electroforesis en gel y se transfirieron a membrana de PVDF. Las inmunotransferencias se realizaron usando anticuerpo anti-receptor de LDL humano de conejo (Fitzgerald) o anticuerpo anti-b-actina humana de conejo. Los resultados de quimioluminiscencia amplificada se muestran en los paneles superiores. La intensidad de las bandas se cuantificó por software ImageJ y se normalizaron por bactina.
Como puede observarse en los resultados representados en las FIGs. 12A-12F, cantidades crecientes del anticuerpo neutralizante y cantidades crecientes de la estatina resultaron generalmente en incrementos en el nivel de LDLR. Este incremento en la eficacia para incrementar los niveles de la ABP es especialmente evidente en las FIGs. 12D-12F, en donde las células también se transfectaron con PCSK9, permitiendo a las ABP demostrar su eficacia en mayor grado.
De forma interesante, como se demuestra por los resultados en la comparación de las FIGs. 12D-12F con 12A-12C, la influencia de las concentraciones de ABP en los niveles de LDLR se incrementó drásticamente cuando la PCSK9 se estaba produciendo por las células. Además, está claro que las ABP neutralizantes (21B12 y 31H4) resultaron en un incremento mayor en los niveles de LDLR, incluso en presencia de estatinas, que la ABP 25A7.1 (un no neutralizante), demostrando que pueden conseguirse beneficios adicionales por el uso tanto de estatinas como de ABP para PCSK9.
EJEMPLO 25
Secuencias consenso
Las secuencias consenso se determinaron usando análisis filogénicos estándar de las CDR correspondientes a las Vh y Vl de las ABP anti-PCSK9. Las secuencias consenso se determinaron manteniendo las CDR contiguas en la misma secuencia correspondiente a una Vh o Vl. Brevemente, las secuencias de aminoácidos correspondientes a los dominios variables enteros bien de Vh o Vl se convirtieron en formato FASTA para facilitar el procesamiento de alineamientos comparativos y para inferir filogenias. A continuación, las regiones marco de estas secuencias se reemplazaron por una secuencia conectora artificial (marcadores "bbbbbbbbbb", construcción de ácido nucleico no específica) de manera que el examen de las CDR solo pudo realizarse sin introducir ningún sesgo de ponderación de posición de aminoácidos debido a eventos coincidentes (por ejemplo, tales como anticuerpos no relacionados que comparten fortuitamente una herencia de marco de línea germinal común) mientras todavía se mantienen las CDR contiguas en la misma secuencia correspondiente a una Vh o Vl. Las secuencias Vh o Vl de este formato se sometieron a análisis con alineamiento de similitud de secuencia usando un programa que emplea un algoritmo semejante a ClutalW estándar (véase, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Se empleó una penalización por creación de hueco de 8,0 junto con una penalización por extensión de hueco de 2,0. Este programa generó asimismo filogramas (ilustraciones de árbol filogenético) basados en los alineamiento de similitud de secuencia usando bien métodos UPGMA (método de agrupamiento pareado no ponderado, usando promedios aritméticos) o unión de vecinos (véase, Saitou y Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) para construir e ilustrar la similitud y distinción de grupos de secuencias mediante comparación de longitud de rama y agrupamiento. Ambos métodos produjeron resultados similares pero los árboles derivados de UPGMA se usaron finalmente ya que el método emplea un conjunto más simple y más conservativo de asunciones. Se generaron árboles derivados de UPGMA en donde se definieron grupos similares de secuencias como los que tienen menos de 15 sustituciones por 100 residuos (véase, la leyenda en las ilustraciones del árbol para escala) entre las secuencias individuales en el grupo y se usaron para definir colecciones de secuencias consenso. Los resultados de las comparaciones se representan en las FIGs.
13A-13J. En la FIG. 13E, se eligieron los grupos de manera que las secuencias en la cadena ligera que son un clado también son un clado en la cadena pesada y tienen menos de 15 sustituciones.
Como apreciará un experto en la técnica, los resultados presentados en las FIGs. 13A-13J presentan una gran cantidad de guía sobre la importancia de aminoácidos particulares (por ejemplo, aquellos aminoácidos que están conservados) y qué posiciones de aminoácidos pueden alterarse posiblemente (por ejemplo, aquellas posiciones que tienen aminoácidos diferentes para diferentes ABP).
EJEMPLO 26
Modelo de ratón para PCSK9 y capacidad de las ABP para disminuir LDL in vivo
Para generar ratones que sobre-expresan PCSK9 humana, se inyectó a ratones de tres semanas WT C57B1/6 mediante administración en la vena de la cola varias concentraciones de virus adenoasociado (AAV), modificado recombinantemente para expresar PCSK9 humana, para determinar la titulación correcta que proporcionaría un incremento mensurable de LDL-colesterol en los ratones. Usando este virus particular que expresaba PCSK9 humana, se determinó que 4,5 x 10E12 pfu del virus resultaría en un nivel de LDL-colesterol de aproximadamente 40mg/dL en la sangre circulante (los niveles normales de LDL en un ratón WT son aproximadamente 10mg/dL). Se encontró que los niveles de PCSK9 humana en estos animales eran aproximadamente 13ug/mL. Se generó una colonia de ratones usando estos criterios de inyección.
Una semana después de la inyección, los ratones se evaluaron para niveles de LDL-colesterol, y se aleatorizaron en diferentes grupos de tratamiento. Se administró a los animales, mediante una inyección en la vena de la cola, una única inyección en bolo bien de 10mg/kg ó 30mg/kg de proteínas de unión a antígeno 16F12, 21B12, ó 31H4. Se administró ABP IgG2 en un grupo separado de animales como un control de dosificación. Se sacrificaron por eutanasia subgrupos de animales (n=6-7) a las 24 y 48 horas después de la administración de las ABP. No hubo efectos en los niveles de LDL-colesterol después de administración de IgG2 a ninguna dosis. Tanto 31H4 como 21B12 demostraron una disminución significativa de LDL-colesterol hasta e incluyendo 48 horas después de la administración, comparado con el control de IgG2 (mostrado en la FIG. 14A y 14B a dos dosis diferentes). 16F12 muestra una respuesta de disminución de LDL-colesterol intermedia, con los niveles volviendo a la línea base de aproximadamente 40mg/dL sobre el punto de tiempo de 48 horas. Estos datos son consistentes con los datos de unión in vitro (Biacore y Kinexa), que muestran una afinidad de unión casi equivalente entre 31H4 y 21B12, y una afinidad menor de 16F12 para PCSK9 humana.
Como puede observarse en los resultados, el colesterol total y HDL-colesterol se redujeron por las ABP para PCSK9 en el modelo (tanto total como HDL-C están elevados por encima de los ratones WT debido a la sobreexpresión de PCSK9). Aunque la disminución de colesterol en este modelo parece ocurrir sobre un periodo de tiempo relativamente corto, se cree que esto se debe a los niveles de PCSK9 humana que están presentes, que son suprafisiológicamente altos en este modelo. Además, dado que la expresión está gobernada por AAV, no hay regulación de la expresión de PCSK9. En estas figuras, (*) indica una P<0,05, y (**) indica una P<0,005 comparado con los niveles de LDL-colesterol observados en los animales inyectados con IgG2 control en el mismo punto de tiempo. El nivel de 13 microgramos/ml de PCSK9 humana sérica en los ratones corresponde a un incremento de aproximadamente 520 veces por encima de los niveles endógenos de PCSK9 en ratones (~ 25 ng/ml), y un incremento de aproximadamente 75 veces por encima de los niveles séricos humanos promedio (~ 175 ng/ml). Así, las proteínas de unión a antígeno deberían ser incluso más efectivas en los seres humanos. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados anteriores demuestran la idoneidad del modelo de ratón para ensayar la capacidad de las proteínas de unión a antígeno para alterar el colesterol sérico en un sujeto. Un experto en la técnica también reconocerá que el uso de HDL de ratón para monitorizar los niveles de colesterol sérico en un ratón, mientras es útil para monitorizar los niveles de colesterol sérico en ratones, no es indicativo del impacto de las ABP en HDL humano en los seres humanos. Por ejemplo, Cohen et al. ("Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease", N Engl J Med, 354:1264-1272, 2006) demostraron la ausencia de cualquier efecto de las mutaciones de pérdida de función de PCSK9 en los niveles de HDL humano. Así, un experto en la técnica apreciará que la capacidad de la ABP de disminuir HDL de ratón (que carecen de LDL) no es indicativa de la capacidad de la ABP de disminuir HDL humano. De hecho, como se muestra por Cohen, es improbable que esto ocurra para anticuerpos neutralizantes en los seres humanos.
EJEMPLO 27
31H4 y 21B12 se unen a la región ProCat de PCSK9
El presente ejemplo describe un método para determinar donde se unen varios anticuerpos a PCSK9.
El dominio ProCat (31-449 de SEQ ID NO: 3) o V (450-692 de SEQ ID NO: 3) de la proteína PCSK9 se combinó bien con anticuerpo 31H4 ó 21B12. Las muestras se analizaron por PAGE nativa para formación de complejos. Como puede observarse en la FIG. 16A y FIG. 16B, estaban presentes desplazamientos en el gel para las muestras ProCat / 31H4 y ProCat / 21B12, demostrando que los anticuerpos se unían al dominio ProCat.
EJEMPLO 28
El dominio EGFa de LDLR se une al dominio catalítico de PCSK9
El presente ejemplo presenta la estructura de cristal resuelta de ProCat de PCSK9 (31-454 de SEQ ID NO: 3) unida al dominio EGFa de LDLR (293-334) a una resolución de 2,9 A (cuyas condiciones se describen en los Ejemplos siguientes).
Una representación de la estructura de PCSK9 unida a EGFa se muestra en la FIG. 17. La estructura de cristal (y su representación en la FIG. 17) revela que el dominio EGFa de LDLR se une al dominio catalítico de PCSK9. Además, la interacción de PCSK9 y EGFa parece ocurrir a lo largo de una superficie de PCSK9 que está entre los residuos D374 y S153 en la estructura representada en la FIG. 17.
Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de PCSK9 de la interfase de interacción con el dominio EGFa de LDLR se definieron como los residuos de PCSK9 que están en 5 A del dominio EGFa. Los residuos del núcleo son como sigue: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, yS381.
Los residuos de aminoácidos del límite de PCSK9 de la interfase de interacción con el dominio EGFa de LDLR se definieron como los residuos de PCSK9 que están 5-8 A del dominio EGFa. Los residuos del límite son como sigue: W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, y Q382. Los residuos que están subrayados están casi o completamente enterrados en PCSK9.
Como apreciará un experto en la técnica, los resultados de este ejemplo demuestran donde interaccionan PCSK9 y EGFa. Así, los anticuerpos que interaccionan con o bloquean cualquiera de estos residuos pueden ser útiles como anticuerpos que inhiben la interacción entre PCSK9 y el dominio EGFa de LDLR (y/o LDLR generalmente). En algunas ocasiones, los anticuerpos que, cuando se unen a PCSK9, interaccionan con o bloquean cualquiera de los residuos anteriores o están en 15-8, 8, 8-5, ó 5 angstroms de los residuos anteriores se contemplan para proporcionar una inhibición útil de la unión de PCSK9 a LDLR.
EJEMPLO 29
31H4 interacciona con residuos de aminoácidos tanto del pro-dominio como del dominio catalítico de PCSK9
El presente ejemplo presenta la estructura de cristal de PCSK9 de longitud completa (mutante N533A de SEQ ID NO: 3) unida al fragmento Fab de 31H4, determinada hasta una resolución de 2,3 A (cuyas condiciones se describen en los Ejemplos siguientes). Esta estructura, representada en la FIG. 18A y 18B, muestra que 31H4 se une a PCSK9 en la región del sitio catalítico y hace contactos con residuos de aminoácidos tanto del prodominio como del dominio catalítico.
La estructura representada también permite identificar residuos de aminoácidos específicos del núcleo de PCSK9 para la interfase de interacción de 31H4 con PCSK9. Estos se definieron como residuos que están en 5 A de la proteína 31H4. Los residuos del núcleo son como sigue: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, y G384.
Las estructuras también se usaron para identificar residuos de aminoácidos límite de PCSK9 para la interfase de interacción con 31H4. Estos residuos fueron residuos de PCSK9 que estaban 5-8 A de la proteína 31H4. Los residuos del límite son como sigue: K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, y Q387. Los residuos de aminoácidos completamente enterrados en la proteína PCSK9 están subrayados.
Como apreciará un experto en la técnica, la FIG. 18B representa la interacción entre las CDR en la proteína de unión a antígeno y PCSK9. Como tal, el modelo permite a un experto en la técnica identificar los residuos y/o las CDR que son especialmente importantes en el paratopo, y qué residuos son menos críticos para el paratopo. Como puede observarse en la FIG. 18B, las CDR1, c DR2, y CDR3 de cadena pesada están más directamente implicadas en la unión de la proteína de unión a antígeno al epítopo, estando las CDR de la cadena ligera relativamente lejos del epítopo. Como tal, es probable que sean posibles variaciones grandes en las CDR de la cadena ligera, sin interferir excesivamente con la unión de la proteína de unión a antígeno a PCSK9. En algunas ocasiones, los residuos en las estructuras que interaccionan directamente están conservados (o alternativamente reemplazados de forma conservativa) mientras los residuos que no están interaccionando directamente entre sí pueden alterarse en mayor medida. Como tal, un experto en la técnica, dadas las presentes enseñanzas, puede predecir qué residuos y áreas de las proteínas de unión a antígeno pueden variarse sin interferir excesivamente con la capacidad de la proteína de unión a antígeno de unirse a PCSK9. Por ejemplo, aquellos residuos que están localizados muy cerca de PCSK9 cuando la proteína de unión a antígeno se une a PCSK9 son aquellos que probablemente juegan un papel más importante en la unión de la proteína de unión a antígeno a PCSK9. Como anteriormente, estos residuos pueden dividirse en aquellos que están en 5 angstroms de PCSK9 y aquellos que están entre 5 y 8 angstroms. Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de 31H4 de la interfase de interacción con PCSK9 se definieron como los residuos de 31H4 que están en 5 A de la proteína PCSK9. Para la cadena pesada, los residuos que están en 5 angstroms incluyen los siguientes: T28, S30, S31, Y32, S54, S55, S56, Y57, I58, S59, Y60, N74, A75, R98, Y 100, F102, W103, S104, A105, Y106, Y107, D108, A109, y D111. Para la cadena ligera, aquellos residuos que están en 5 angstroms incluyen los siguientes: L48, S51, Y93, y S98. Para la cadena pesada, aquellos residuos que están 5-8 A de la proteína PCSK9 incluyen los siguientes: G26, F27, F29, W47, S50, I51, S52, S53, K65, F68, T69, I70, S71, R72, D73, K76, N77, D99, D101, F110, y V112. Para la cadena ligera, aquellos residuos que están en 5-8 angstroms de PCSK9 incluyen A31, G32, Y33, D34, H36, Y38, I50, G52, N55, R56, P57, S58, D94, S95, S96, L97, G99, y S100.
Como apreciará un experto en la técnica, los resultados del Ejemplo 29 demuestran dónde pueden interaccionar en PCSK9 los anticuerpos de PCSK9 y todavía bloquear la interacción de PCSK9 con EGFa (y así LDLR). Así, las proteínas de unión a antígeno que interaccionan con cualquiera de estos residuos de PCSK9, o que bloquean cualquiera de estos residuos (por ejemplo, de otras proteínas de unión a antígeno que se unen a estos residuos), pueden ser útiles como anticuerpos que inhiben la interacción de PCSK9 y EGFa (y LDLR de acuerdo con esto). Así, en algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno que interaccionan con cualquiera de los residuos anteriores o interaccionan con residuos que están en 5 A de los residuos anteriores se contemplan para proporcionar una inhibición útil de la unión de PCSK9 a LDLR. De manera similar, las proteínas de unión a antígeno que bloquean cualquiera de los residuos anteriores (que pueden determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de competición) también pueden ser útiles para la inhibición de la interacción PCSK9/LDLR.
EJEMPLO 30
21B12 se une al dominio catalítico de PCSK9, tiene un sitio de unión distinto de 31H4 y puede unirse a PCSK9 simultáneamente con 31H4
El presente ejemplo presenta la estructura de cristal de ProCat de PCSK9 (31-449 de SEQ ID NO: 3) unido a los fragmentos Fab de 31H4 y 21B12, determinada a una resolución de 2,8 A (cuyas condiciones se describen en los Ejemplos siguientes). Esta estructura de cristal, representada en la FIG. 19A y FIG. 19B, muestra que 31H4 y 21B12 tienen sitios de unión distintos en PCSK9 y que ambas proteínas de unión a antígeno pueden unirse a PCSK9 simultáneamente. La estructura muestra que 21B12 interacciona con residuos de aminoácidos del dominio catalítico de PCSK9. En esta estructura, la interacción entre PCSK9 y 31H4 es similar a la que se ha observado anteriormente.
Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de PCSK9 de la interfase de interacción con 21B12 se definieron como los residuos de PCSK9 que están en 5 A de la proteína 21B12. Los residuos del núcleo son como sigue: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, y F379.
Los residuos de aminoácidos del límite de PCSK9 de la interfase de interacción con 21B12 se definieron como los residuos de PCSK9 que estaban 5-8 A de la proteína 21B12. Los residuos del límite son como sigue: I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, y C378. Los residuos de aminoácidos casi o completamente enterrados en la proteína PCSK9 están subrayados.
Como apreciará un experto en la técnica, la FIG. 19B representa la interacción entre las CDR en la proteína de unión a antígeno y PCSK9. Como tal, el modelo permite a un experto en la técnica identificar los residuos y/o CDR que son especialmente importantes para el paratopo y qué residuos son menos críticos para el paratopo. Como puede observarse en la estructura, la CDR2 de cadena pesada y la CDR1 de cadena ligera parecen interaccionar de cerca con el epítopo. A continuación, la CDR1 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada y CDR3 de cadena ligera, parecen estar cerca del epítopo, pero tan cerca como el primer conjunto de CDR. Finalmente, la CDR2 de cadena ligera parece estar a alguna distancia del epítopo. Como tal, es probable que sean posibles variaciones mayores en las CDR más distantes sin interferir excesivamente con la unión de la proteína de unión a antígeno a PCSK9. En algunas ocasiones, los residuos en las estructuras que interaccionan directamente están conservados (o alternativamente reemplazados de forma conservativa) mientras los residuos que no interaccionan directamente entre sí pueden alterarse en mayor medida. Como tal, un experto en la técnica, dadas las presentes enseñanzas, puede predecir qué residuos y áreas de las proteínas de unión a antígeno pueden variarse sin interferir excesivamente con la capacidad de la proteína de unión a antígeno de unirse a PCSK9. Por ejemplo, aquellos residuos que están localizados lo más cerca a PCSK9 cuando la proteína de unión a antígeno está unida a PCSK9 son aquellos que probablemente juegan un papel más importante en la unión de la proteína de unión a antígeno a PCSK9. Como anteriormente, estos residuos pueden dividirse en aquellos que están en 5 angstroms de PCSK9 y aquellos que están entre 5 y 8 angstroms. Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de 21B12 de la interfase de interacción con PCSK9 se definieron como los residuos de 21B12 que están en 5 A de la proteína PCSK9. Para la cadena pesada, los residuos que están en 5 angstroms incluyen los siguientes: T30, S31, Y32, G33, W50, S52, F53, Y54, N55, N57, N59, R98, G99, Y100, y G101. Para la cadena ligera, aquellos residuos que están en 5 angstroms incluyen los siguientes: G30, G31, Y32, N33, S34, E52, Y93, T94, S95, T96, y S97. Para la cadena pesada, aquellos residuos que están 5-8 A de la proteína PCSK9 incluyen los siguientes: T28, L29, I34, S35, W47, V51, G56, T58, Y60, T72, M102, y D103. Para la cadena ligera, aquellos residuos que están en 5-8 angstroms de PCSK9 incluyen los siguientes: S26, V29, V35, Y51, N55, S92, M98, y V99.
Como apreciará un experto en la técnica, los resultados del Ejemplo 30 demuestran dónde pueden interaccionar las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 en PCSK9 y todavía bloquear la interacción de PCSK9 con EGFa (y así LDLR). Así, las proteínas de unión a antígeno que interaccionan con cualquiera de estos residuos de PCSK9 o que bloquean cualquiera de estos residuos pueden ser útiles como anticuerpos que inhiben la interacción de PCSK9 y EGFa (y LDLR de acuerdo con esto). Así, en algunas ocasiones, los anticuerpos que interaccionan con cualquiera de los residuos anteriores o interaccionan con residuos que están en 5 A de los residuos anteriores se contemplan para proporcionar una inhibición útil de la unión de PCSK9 a LDLR. De forma similar, las proteínas de unión a antígeno que bloquean cualquiera de los residuos anteriores (que pueden determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de competición) también pueden ser útiles para la inhibición de la interacción PCSK9/LDLR.
EJEMPLO 31
Interacción entre EGFa, PCSK9, y los anticuerpos
La estructura del complejo ternario (PCSK9 / 31H4 / 21B12) del ejemplo anterior se superpuso en la estructura de PCSK9 / EGFa (determinada como se describe en el Ejemplo 28) y el resultado de esta combinación se representa en la FIG. 20A. Esta figura demuestra áreas en PCSK9 que pueden tomarse como diana de forma útil para inhibir la interacción de PCSK9 con EGFa. La figura muestra que tanto 31H4 como 21B12 se superponen parcialmente con la posición del dominio EGFa de LDLR e interfieren estéricamente con su unión a PCSK9. Además, como puede observarse en las estructuras, 21B12 interacciona directamente con un subconjunto de residuos de aminoácidos que están implicados específicamente en la unión al dominio EGFa de LDLR.
Como se ha indicado anteriormente, el análisis de las estructuras de cristal identificaron aminoácidos específicos implicados en la interacción entre PCSK9 y las proteínas pareja (las regiones núcleo y límite de la interfase en la superficie de PCSK9) y los requerimientos espaciales de estas proteínas pareja para interaccionar con PCSK9. Las estructuras sugieren maneras de inhibir la interacción entre PCSK9 y el lDlR. En primer lugar, como se ha indicado anteriormente, la unión de un agente a PCSK9 en donde comparte residuos en común con el sitio de unión del dominio EGFa del LDLR inhibiría la interacción entre PCSK9 y el LDLR. En segundo lugar, un agente que se une fuera de los residuos en común puede interferir estéricamente con el dominio EGFa o regiones del LDLR que son bien N o C-terminales respecto al dominio EGFa para evitar la interacción entre PCSK9 y el LDLR.
En algunas ocasiones, los residuos que están implicados en las uniones de EGFa y están cerca de las áreas a las que se unen las proteínas de unión a antígeno indicadas anteriormente son especialmente útiles para manipular la unión de PCSK9 a LDLR. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos de las interfases en común tanto en la región del núcleo como en la región límite para las diferentes parejas de unión se listan en la Tabla 12 a continuación. Los residuos de aminoácidos completamente enterrados en la proteína PCSK9 están subrayados.
Tabla 12
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Como apreciará un experto en la técnica, en algunas ocasiones, las proteínas de unión a antígeno se unen a y/o bloquean al menos uno de los residuos indicados anteriormente.
EJEMPLO 32
Interacción estructural de LDLR y PCSK9
Se hizo un modelo de PCSK9 de longitud completa unida a una representación de longitud completa del LDLR usando la estructura del complejo ProCat de pCs K9 (31-454 de SEQ ID NO: 3)/EGFa. La estructura de PCSK91 de longitud completa (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-cholesterol.
Structure 15, 545-52 (2007)) se superpuso sobre el ProCat de PCSK9 31-454 del complejo y la estructura del LDLR en su conformación a pH bajo (Rudenko, G. et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH. Science 298, 2353-8 (2002)) se superpuso sobre el dominio EGFa del complejo. Las representaciones del modelo se muestran en las FIGs. 20B y 20C. El dominio EGFa se indica por la caja en la figura. Las figuras muestran regiones del LDLR fuera del dominio de unión EGFa inmediato que se encuentra muy próximo a PCSK9. Las FIGs. 20D-20F muestran la interacción anterior, junto con representaciones de superficie mesh del anticuerpo 31H4 y 21B12 desde tres ángulos diferentes. Como resulta claro de las representaciones, no sólo el anticuerpo puede interaccionar y/o interferir con la interacción de LDLR con PCSK9 en el sitio de unión real, sino que también pueden ocurrir otras interacciones estéricas.
A la luz de los resultados anteriores, está claro que las proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9 también pueden inhibir la interacción entre PCSK9 y el LDLR chocando con varias regiones del LDLR (no sólo el sitio en donde interaccionan LDLR y PCSK9). Por ejemplo, puede chocar con la repetición 7 (R7), el dominio EGFb, y/o el dominio de hélice enrollada.
Ocasiones de moléculas de unión a antígeno que se unen a o bloquean la interacción de EGFa con PCSK9 Como apreciará un experto en la técnica, los Ejemplos 28-32, y sus figuras acompañantes, proporcionan una descripción detallada de cómo y dónde interacciona EGFa con PCSK9 y cómo dos proteínas de unión a antígeno neutralizantes representativas, 21B12 y 31H4, interaccionan con PCSK9 y producen su efecto neutralizante. Como tal, un experto en la técnica será capaz fácilmente de identificar las moléculas de unión a antígeno que pueden reducir de forma similar la unión entre EGFa (incluyendo LDLR) y PCSK9 mediante la identificación de otras moléculas de unión a antígeno que se unen a o cerca de al menos una de las mismas localizaciones en PCSK9. Aunque las localizaciones relevantes (o epítopos) en PCSK9 se identifican en las figuras y la presente descripción, también puede ser ventajoso describir estos sitios como situados a una distancia fijada de residuos que se han identificado como cercanos al sitio de unión de EGFa. En algunas ocasiones, una molécula de unión a antígeno se unirá a o en 30 angstroms de uno o más de los residuos siguientes (numeración en referencia a SEQ ID NO: 3): S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, o C378. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une en 30 angstroms de uno o más de los residuos siguientes (numeración en referencia a SEQ ID NO: 3): S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, o Q382. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une en 30 angstroms de uno o más de los residuos siguientes (numeración en referencia a SEQ ID NO: 3): W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, o Q387. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une en 30 angstroms de uno o más de los residuos siguientes (numeración en referencia a SEQ ID NO: 3): S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, o C378.
En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une en 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 o menos angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno, cuando se une a PCSK9, está en al menos una de las distancias anteriores, para más de uno de los residuos indicados anteriormente. Por ejemplo, en algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno está en una de las distancias recitadas (por ejemplo, 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 o menos) para al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75 o más de los residuos anteriores. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno está en una de las distancias recitadas para al menos 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100% de los residuos identificados en cada grupo de subgrupo de éstos (tales como sólo aquellos residuos de superficie en el grupo). A no ser que se afirme específicamente otra cosa, la distancia entre la molécula de unión a antígeno y PCSK9 es la distancia más corta entre el átomo unido covalentemente en PCSK9 y el átomo unido covalentemente de la molécula de unión a antígeno que son los átomos más cercanos de PCSK9 y la molécula de unión a antígeno. De forma similar, a no ser que se afirme específicamente otra cosa, la distancia entre un residuo (en la molécula de unión a antígeno o PCSK9) y otra proteína (bien PCSK9 o la molécula de unión a antígeno respectivamente), es la distancia desde el punto más cercano en el residuo identificado a la parte unida covalentemente más cercana de la otra proteína. En algunas ocasiones, la distancia puede medirse desde el núcleo de las cadenas de aminoácidos. En algunas ocasiones, la distancia puede medirse entre un borde del paratopo y un borde (los más cercanos entre sí) del epítopo. En algunas ocasiones, la distancia puede medirse entre el centro de la superficie del paratopo y el centro de la superficie del epítopo. Como apreciará un experto en la técnica, la presente descripción es aplicable para cada uno de los conjuntos individuales de residuos listados en la presente memoria. Por ejemplo, los intervalos anteriores se contemplan generalmente y específicamente para los residuos de 8 angstroms listados en los Ejemplos 28-32 y los residuos de 5 angstroms listados en los Ejemplos 28-32.
En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une a una superficie en PCSK9 que está unida por al menos uno de EGFa, 21B12, ó 31H4. En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une a PCSK9 en una localización que se superpone con las localizaciones de interacción entre PCSK9 y EFGa, Ab 31H4, y/o Ab 21B12 (como se describe en los ejemplos y figuras anteriores). En algunas ocasiones, la molécula de unión a antígeno se une a PCSK9 en una posición que está muy lejos de uno de los residuos recitados anteriormente. En algunas ocasiones, dicha molécula de unión a antígeno todavía puede ser una molécula de unión a antígeno neutralizante efectiva.
En algunas ocasiones, la estructura del dominio catalítico de PCSK9 puede describirse como que es generalmente triangular (como se muestra en la FIG. 19A). El primer lado del triángulo se muestra como que está unido por 31H4. El segundo lado del triángulo se muestra como que está unido por 21B12, y el tercer lado del triángulo está posicionado hacia la parte inferior de la página, inmediatamente por encima de la etiqueta "FIG.
19A". En algunas ocasiones, las moléculas de unión a antígeno que se unen al primer y/o segundo lados del dominio catalítico de PCSK9 pueden ser útiles como anticuerpos neutralizantes ya que pueden interferir bien directamente o estéricamente con la unión de EGFa a PCSK9. Como apreciará un experto en la técnica, cuando las moléculas de unión a antígeno son lo suficientemente grandes, tales como un anticuerpo completo, la molécula de unión a antígeno no necesita unirse directamente al sitio de unión de EGFa con el fin de interferir con la unión de EGFa a PCSK9.
Como apreciará un experto en la técnica, aunque el dominio de EGFa del LDLR se ha usado en muchos de los ejemplos, los modelos y estructuras son todavía aplicables a cómo la proteína LDLR de longitud completa interaccionará con PCSK9. De hecho, la estructura adicional presente en la proteína LDLR de longitud completa presenta un espacio de proteína adicional que puede bloquearse además por una de las moléculas de unión a antígeno. Como tal, si la molécula de unión a antígeno bloquea o inhibe la unión de EGFa a PCSK9, será probablemente al menos tan, si no más, efectiva con la proteína LDLR de longitud completa. De forma similar, las moléculas de unión a antígeno que están a una distancia fijada o bloquean varios residuos que son relevantes para inhibir la unión a EGFa, serán probablemente tan efectivas, si no más efectivas, para el LDLR de longitud completa.
Como apreciará un experto en la técnica, cualquier molécula que bloquee o se una a los residuos de PCSK9 indicados anteriormente (o en las distancias recitadas), o que inhiba una o más de las interacciones indicadas en los ejemplos y figuras anteriores, puede usarse para inhibir la interacción de EGFa (o LDLR generalmente) y PCSK9. Como tal, la molécula no necesita estar limitada a una "proteína" de unión a antígeno, ya que cualquier molécula de unión a antígeno también puede servir para el propósito requerido. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno incluyen aptámeros, que pueden ser bien moléculas de ácido oligonucleico o de péptidos. Otros ejemplos de moléculas de unión a antígeno incluyen avímeros, pepticuerpos, moléculas pequeñas y polímeros, y versiones modificadas de EGFa que pueden incrementar su afinidad para PCSK9 y/o vida media, tales como mutación de aminoácidos, glicosilación, pegilación, fusiones con Fc, y fusiones con avímeros. Como apreciará un experto en la técnica, LDLR no es una molécula de unión a antígeno o las subsecciones de unión de LDLR no son moléculas de unión a antígenos, por ejemplo, EGFa. Igualmente, otras moléculas a través de las que PCSK9 produce una señalización in vivo no son moléculas de unión a antígeno.
EJEMPLO 33
Expresión y purificación de muestras de proteína
El presente ejemplo describe cómo algunas de las varias proteínas/variantes PCSK9 se hicieron y purificaron (incluyendo el dominio EGFa de LDLR). Las proteínas/variantes PCSK9 (por ejemplo, PSCK9 31-692 N533A, PCSK9449TEV y PCSK9 ProCat 31-454) se expresaron en células de insecto Hi-5 infectadas con baculovirus con un péptido señal de melitina de abeja de la miel N-terminal seguido de una etiqueta His6. Las proteínas PCSK9 se purificaron por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La etiqueta de melitina-His6 se eliminó durante la purificación por escisión con proteasa TEV. La construcción PCSK9449TEV se usó para generar muestras del dominio ProCat (31-449) y V (450-692) de PCSK9. Esta construcción tenía un sitio de escisión de la proteasa TEV insertado entre los residuos de PCSK9 449 y 450. Para la variante N555A de longitud completa para cristalografía, el fragmento de PCSK931-454, y la variante 449TEV de PCSK9 para cristalografía, el producto proteico posterior a rTEV también incluyó una secuencia inicial GAMG. Así, posteriormente a la escisión con rTEV, estas proteínas fueron GAMG-PCSK9. Además, la proteína 449TEV Pc Sk9 incluyó la secuencia "ENLYFQ" (SEQ ID NO: 403) insertada entre las posiciones H449 y G450 de SEQ ID NO: 3. Después de la escisión con rTEV, la proteína ProCat PCSK9 generada a partir de esta construcción fue GAMG-PCSK9 (31-449)-ENLYFQ y el dominio V generado a partir de esta construcción fue PCSK9 (450-692) de SEQ ID NO: 3.
Los fragmentos Fab de 21B12 y 31H4 se expresaron en E. coli. Estas proteínas se purificaron por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico.
El dominio EGFa de LDLR (293-334) se expresó como una proteína de fusión con GST en E. coli. El dominio EGFa se purificó por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad en glutatión sefarosa y cromatografía de exclusión por tamaño. La proteína GST se eliminó durante la purificación por escisión con proteasa PreScission.
EJEMPLO 34
Formación de complejo y cristalización
El presente ejemplo describe cómo se hicieron los complejos y cristales usados en los Ejemplos anteriores de examen de la estructura.
El complejo PCSK931-692 N533A / 31H4 se hizo mezclando un exceso 1,5 molar del 31H4 Fab con PCSK9. El complejo se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar el exceso de 31H4 Fab. El complejo PCSK931-692 N533A / 31H4 cristaliza en 0,1 M Tris pH 8,3, 0,2 M acetato de sodio, 15% PEG 4000, 6% sulfato de dextrano sal de sodio (Mr 5.000).
El complejo PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 se hizo en primer lugar mezclando un exceso 1,5 molar de 31H4 Fab con PCSK9 31-449. El complejo se separó del exceso de 31H4 por purificación en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. Se añadió un exceso 1,5 molar de 21B12 Fab al complejo PCSK931­ 449 / 31H4. El complejo ternario se separó del exceso de 21B12 por purificación en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 cristaliza en 0,1 M Tris pH 8,5, 0,2 M fosfato de amonio monobásico, 50% MPD.
El complejo PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa se hizo mezclando un exceso 1,2 molar de dominio EGFa con PCSK9 31-454. El complejo PCSK9 ProCat 31-454 / dominio EGFa cristaliza en 0,2 M formato de potasio, 20% PEG 3350.
EJEMPLO 35
Recogida de datos y determinación de la estructura
El presente ejemplo describe cómo se recogieron los conjuntos de datos y se determinaron las estructuras para los Ejemplos anteriores de examen de estructura.
Los conjuntos de datos iniciales para los cristales PCSK931-692 N533A / 31H4 y PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 se recogieron en una fuente de rayos X Rigaku FR-E. El conjunto de datos de PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa y los conjuntos de datos de resolución mayor para los cristales PCSK9 31-692 N533A / 31H4 y PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 se recogieron en el Berkeley Advanced Light Source línea de haz 5.0.2. Todos los conjuntos de datos se procesaron denzo/scalepack o HKL2000 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. y Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
Los cristales de PCSK9 / 31H4 crecieron en el grupo espacial C2 con dimensiones de celda unitaria a=264,9, b=137,4, c=69,9 A, p=102,8° y difractan a una resolución de 2,3 A. La estructura de PCSK9 / 31H4 se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP (The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994) usando la estructura de PCSK9 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-cholesterol. Structure 15, 545-52 (2007)) como el modelo de búsqueda de partida. Manteniendo la disolución de PCSK931-692 fija, se usó un dominio variable de anticuerpo como un modelo de búsqueda. Manteniendo la disolución de PCSK931 -692 / dominio variable de anticuerpo fija, se usó un dominio constante de anticuerpo como un modelo de búsqueda. La estructura completa se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx. (Brunger, A.T. et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
Los cristales de PCSK9 / 31H4 / 21B12 crecieron en el grupo espacial P21212 con dimensiones de celda unitaria a=138,7, b=246,2, c=51,3 A y difractan a una resolución de 2,8 A. La estructura de PCSK9 / 31H4 / 21B12 se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP usando PCSK9 ProCat / 31H4 dominio variable como modelo de búsqueda de partida. Manteniendo el PCSK9 ProCat / 31H4 dominio variable fijo, se realizó una búsqueda para el dominio constante del anticuerpo. Manteniendo el PCSK9 ProCat / 31H4 / 21B12 dominio constante fijo, se usó un dominio variable de anticuerpo como un modelo de búsqueda. La estructura completa se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx.
Los cristales de PCSK9 / dominio EGFa crecieron en el grupo espacial P6522 con dimensiones de celda unitaria a=b=70,6, c=321,8 A y difractan a una resolución de 2,9 A. La estructura de PCSK9 / dominio EGFa se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP usando el PCSK9 ProCat como el modelo de búsqueda de partida. El análisis de los mapas de densidad electrónica mostró una densidad electrónica clara para el dominio EGFa. El dominio EGFa de LDLR se ajustó a mano y el modelo se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx.
Se determinó que los aminoácidos de la interfase de interacción del núcleo eran todos los residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 5 A de la proteína pareja de PCSK9. Se eligió 5 A como la distancia de punto de corte de la región del núcleo para permitir a los átomos en un radio de van der Waals más un posible enlace de hidrógeno mediado por agua. Se determinó que los aminoácidos en la interfase de interacción en el límite eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 8 A de la proteína pareja de PCSK9 pero no incluidos en la lista de interacción del núcleo. Se eligió menos de o igual a 8 A como la distancia de punto de corte de la región límite para permitir la longitud de un aminoácido arginina extendido. Los aminoácidos que cumplían estos criterios de distancia se calcularon con el programa PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)).
EJEMPLO COMPARATIVO 36
Estructura de cristal de PCSK9 y 31A4
Se determinó la estructura de cristal del complejo 31A4/PCSK9.
Expresión y purificación de muestras de proteína
Se expresó PCSK9 449TEV (una construcción de PCSK9 con un sitio de escisión de proteasa TEV insertado entre los residuos 449 y 450, numeración según SEQ ID NO: 3) en células de insecto Hi-5 infectadas con baculovirus con un péptido señal de melitina de abeja de la miel N-terminal seguido de una etiqueta His6. La proteína PCSK9 se purificó en primer lugar por cromatografía de afinidad de níquel. La proteasa TEV se usó para eliminar la etiqueta melitina-His6 y escindir la proteína PCSK9 entre el dominio catalítico y el dominio V. El dominio V se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. El fragmento 31A4 Fab se expresó en E. coli. Esta proteína se purificó por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico.
Formación de complejo y cristalización
El complejo PCSK9 dominio V / 31A4 se hizo mezclando un exceso 1,5 molar de dominio V de PCSK9 con 31A4 Fab. El complejo se separó del exceso de dominio V de PCSK9 por purificación en una columna de exclusión por tamaño. El complejo dominio V de PCSK9 / 31A4 cristalizó en 1,1 M ácido succínico pH 7, 2% PEG MME 2000. Recogida de datos y determinación de la estructura
El conjunto de datos para el cristal dominio V de PCSK9 / 31A4 se recogió en una fuente de rayos X Rigaku FR-E y se procesó con denzo/scalepack (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. y Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
Los cristales del dominio V de PCSK9 / 31A4 crecen en el grupo espacial P212121 con dimensiones de celda unitaria a=74,6, b=131,1, c=197,9 A con dos moléculas de complejo por unidad asimétrica, y difractan a una resolución de 2,2 A. La estructura de dominio V de PCSK9 / 31A4 se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP (CCP4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)) usando el dominio V de la estructura de PCSK9 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-cholesterol. Structure 15, 545-52 (2007)) como el modelo de búsqueda de partida. Manteniendo la disolución de PCSK9 450-692 fija, se usó un dominio variable de anticuerpo como un modelo de búsqueda. Después de un refinamiento inicial, los dominios constantes del anticuerpo se ajustaron a mano. La estructura completa se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx (Brunger, A.T. et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
Se determinó que los aminoácidos de la interfase de interacción del núcleo eran todos los residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 5 A de la proteína pareja PCSK9. Se eligió 5 A como la distancia de punto de corte de la región del núcleo para permitir a los átomos en un radio de van der Waals más un posible enlace de hidrógeno mediado por agua. Se determinó que los aminoácidos en la interfase de interacción en el límite eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 8 A de la proteína pareja PCSK9 pero no incluidos en la lista de interacción del núcleo. Se eligió menos de o igual a 8 A como la distancia de punto de corte de la región límite para permitir la longitud de un aminoácido arginina extendido. Los aminoácidos que cumplían estos criterios de distancia se calcularon con el programa PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)). Las distancias se calcularon usando el complejo dominio V "A" y 31A4 "L1,H1".
La estructura de cristal del dominio V de PCSK9 unido al fragmento Fab de 31A4 se determinó a una resolución de 2,2 A. Las representaciones de la estructura de cristal se proporcionan en las FIGs. 21A-21D. Las FIGs. 21A-21C muestran que el 31A4 Fab se une al dominio V de PCSK9 en la región de los subdominios 1 y 2.
Se hizo un modelo de PCSK9 de longitud completa unida al 31A4 Fab. La estructura de PCSK9 de longitud completa se superpuso sobre el dominio V de PCSK9 del complejo. Una figura de este modelo se muestra en la FIG. 21D. Se resalta el sitio de la interacción entre el dominio EGFa del LDLR y PCSK9.
El análisis de la estructura muestra dónde interacciona este anticuerpo con PCSK9 y demuestra que los anticuerpos que no se unen a la superficie de unión a LDLR de PCSK9 pueden todavía inhibir la degradación de LDLR que está mediada a través de PCSK9 (cuando los resultados se ven en combinación con el Ejemplo 40 y 41 a continuación). Además, el análisis de la estructura de cristal permite la identificación de aminoácidos específicos implicados en la interacción entre PCSK9 y el anticuerpo 31A4. Además, también se determinaron las regiones de núcleo y límite de la interfase en la superficie de PCSK9. Los residuos de aminoácidos de PCSK9 específicos del núcleo de la interfase de interacción con 31A4 se definieron como los residuos de PCSK9 que están en 5 A de la proteína 31A4. Los residuos de núcleo son T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, y E593.
Los residuos de aminoácidos de PCSK9 de límite de la interfase de interacción con 31A4 se definieron como los residuos de PCSK9 que están 5-8 A de la proteína 31A4. Los residuos de límite son como sigue: S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, y H597. Los residuos de aminoácidos casi o completamente enterrados en la proteína PCSK9 están resaltados por subrayado. Como se indica en la presente memoria, la numeración hace referencia a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (ajustadas como se indica en la presente memoria).
Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de 31A4 de la interfase de interacción con PCSK9 se definieron como los residuos de 31A4 que están en 5 A de la proteína PCSK9. Los residuos del núcleo para el anticuerpo 31A4 son como sigue: Cadena pesada: G27, S28, F29, S30, A31, Y32, Y33, E50, N52, H53, R56, D58, K76, G98, Q99, L100, y V101; Cadena Ligera: S31, N32, T33, Y50, S51, N52, N53, Q54, W92, y D94. Los residuos de aminoácidos del límite de 31A4 de la interfase de interacción con PCSK9 de definieron como los residuos de 31A4 que están 5-8 A de la proteína PCSK9. Los residuos del límite para 31A4 son como sigue: Cadena Pesada: V2, G26, W34, N35, W47, I51, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103, y D104; Cadena Ligera: S26, S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95, N97, G98, y W99.
La estructura de cristal también presentó los requerimientos espaciales de esta ABP en su interacción con PCSK9. Como se muestra en esta estructura, sorprendentemente, los anticuerpos que se unen a PCSK9 sin evitar directamente la interacción de PCSK9 con el LDLR pueden todavía inhibir la función de PCSK9.
En algunas ocasiones, puede emplearse cualquier proteína de unión a antígeno que se une a, cubre, o evita que 31A4 interaccione con cualquiera de los residuos anteriores para unirse a o neutralizar PCSK9. En algunas ocasiones, la ABP se une a o interacciona con al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9 (SEQ ID NO: 3): T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, y E593. En algunas ocasiones, la ABP está en 5 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas ocasiones, la ABP se une a o interacciona con al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9 (SEQ ID NO: 3): S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, y H597. En algunas ocasiones, la ABP está 5 a 8 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas ocasiones, la ABP interacciona, bloquea, o está en 8 angstroms de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 de los residuos anteriores.
Las coordenadas para las estructuras de cristal discutidas en los Ejemplos anteriores se presentan en la Tabla 35.1 (PCSK9 de longitud completa y 31H4), Tabla 35.2 (PCSK9 y EGFa), Tabla 35.3 (PCSK9, 31H4, y 21B12), y Tabla 35.4 (PCSK9 y 31A4). También se describen en la presente memoria las proteínas y moléculas de unión a antígeno que interaccionan con las áreas o residuos relevantes de la estructura de PCSK9 (incluyendo aquellas áreas o residuos en 15, 15-8, 8, 8-5, 5, o menos angstroms de dónde EGFa, o los anticuerpos, interaccionan con PCSK9) representadas en las figuras y/o sus posiciones correspondientes en las estructuras de las coordenadas.
Los anticuerpos que se describen en las coordenadas se produjeron en E. coli y así poseen algunas diferencias de aminoácidos menores respecto a los anticuerpos completamente humanos. El primer residuo en la región variable fue ácido glutámico en lugar de una glutamina para las cadenas pesada y ligera de 21B12 y para la cadena ligera de 31H4. Además de las diferencias en la secuencia de la región variable, también hubo algunas diferencias en la región constante de los anticuerpos descritos por las coordenadas (de nuevo debido al hecho de que el anticuerpo se produjo en E. coli). La FIG. 22 resalta (mediante subrayado, sombreado, o negrita) las diferencias entre las regiones constantes de los Fab de 21B12, 31H4, y 31A4 (producidos en E. coli) cuando se compara con SEQ ID NOs: 156, y 155. Para 21B1231H4, y 31A4, la secuencia constante de la cadena ligera es similar a lambda humana (SEQ ID NO: 156). El residuo de glicina subrayado es una inserción entre dónde se paran las secuencias variables de 21B12 y 31H4 y empieza la secuencia lambda.
Tanto para 21B12 como 31H4, la constante de cadena pesada es similar a IgG4 humana (SEQ ID NO: 155). Las diferencias resaltadas en la FIG. 22 se muestran en la Tabla 36.1:
Tabla 36.1
Figure imgf000078_0001
Respecto a 31A4, aunque también tiene las mismas distinciones indicadas anteriormente, hay tres diferencias adicionales. Como se muestra en la FIG. 22, hay dos aminoácidos adicionales en el inicio, que vienen del procesamiento incompleto del péptido señal en la expresión en E. coli. Además, hay una sustitución adicional en la región constante de cadena pesada de 31A4 cuando se compara con SEQ ID NO: 155, que es el ajuste de una L (en SEQ ID NO: 155) a una H. Finalmente, 31A4 tiene una glutamina como el aminoácido inicial del Fab, en lugar del ajuste a ácido glutámico indicado anteriormente para 21B12 y 31H4.
Para los tres anticuerpos, también se diferencia el final de la cadena pesada (en caja en gris oscuro), pero los aminoácidos no están ordenados en la estructura de manera que no aparecen en las coordenadas. Como apreciará un experto en la técnica, las etiquetas de his no son una parte requerida de la ABP y no deberían considerarse como parte de la secuencia de la ABP, a no ser que se reclame explícitamente por referencia a una SEQ ID NO específica que incluye una etiqueta de histidina y una afirmación de que la secuencia de ABP "incluye la etiqueta de Histidina".
EJEMPLO 37
Mapeo de epítopos--Agrupación en clases
Se realizó un conjunto alternativo de experimentos de agrupación en clases además del conjunto en el Ejemplo 10. Como en el Ejemplo 10, puede pensarse que las ABP que compiten entre sí se unen al mismo sitio en la diana y en lenguaje común se dice que se "agrupan en clases" conjuntamente.
Se usó una modificación del método de Agrupación en Clases Multiplexado descrito por Jia, et al (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Se incubaron códigos de perlas individuales de perlas Luminex recubiertas con estreptavidina en 100ul de 0,5 ug/ml de anticuerpo de captura monovalente biotinilado anti-IgG humana de ratón (BD Pharmingen, #555785) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, después se lavó 3x con PBSA, disolución salina tamponada con fosfato (PBS) más 1% albúmina de suero bovino (BSA). Cada código de perla se incubó separadamente con 100 ul de 2 ug/ml de anticuerpo anti-PCSK9 (Anticuerpo de Recubrimiento) durante 1 hora y se lavó 3x con PBSA. Las perlas se combinaron y se dispensaron en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, #MSBVN1250). Se añadieron 100ul de 2 ug/ml de proteína PCSK9 purificada a la mitad de los pocillos. Se añadió tampón a la otra mitad como control. La reacción se incubó durante 1 hora y se lavó. Se añadieron 100 ul de 2 ug/ml de un anticuerpo anti-PCSK9 (Ab de Detección) a todos los pocillos, se incubó durante 1 hora y se lavó. Se corrió una IgG humana irrelevante (Jackson, #009-000-003) como otro control. Se añadieron 20ul de anti-IgG humana monovalente de ratón conjugado con PE (BD Pharmingen, #555787) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora y se lavó. Las perlas se resuspendieron en 100ul PBSA y se recogieron un mínimo de 100 eventos/código de perla en el instrumento BioPlex (BioRad).
La intensidad fluorescente media (MFI) de la pareja de anticuerpo sin PCSK9 se sustrajo de la señal de la reacción correspondiente que contenía PCSK9. Para que la pareja de anticuerpo se considere unida simultáneamente, y por lo tanto en diferentes clases, la señal sustraída tenía que ser mayor de 3 veces la señal del anticuerpo compitiendo consigo mismo y 3 veces la señal del anticuerpo compitiendo con el anticuerpo irrelevante.
Los datos de lo anterior se representan en las FIGs. 23A-23D. Las ABP se encuentran en cinco clases. Las cajas sombreadas indican las ABP que pueden unirse simultáneamente a PCSK9. Las cajas no sombreadas indican aquellas ABP que compiten entre sí para la unión. Un resumen de los resultados se muestra en la Tabla 37.1.
Tabla 37.1
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Las clases 1 (compite con ABP 21B12) y 3 (compite con 31H4) son exclusivas entre sí; la clase 2 compite con las clases 1 y 3; y la clase 4 no compite con las clases 1 y 3. La clase 5, en este ejemplo, se presenta como una clase "cajón de sastre " para describir aquellas ABP que no se ajustan en las demás clases. Así, las ABP identificadas anteriormente en cada una de las clases son representativas de diferentes tipos de localizaciones de epítopo en PCSK9, algunas de las cuales se superponen entre sí.
Como apreciará un experto en la técnica, si la ABP de referencia evita la unión de la ABP sonda entonces se dice que los anticuerpos están en la misma clase. El orden en donde se emplean las ABP puede ser importante. Si la ABP A se emplea como la ABP de referencia y bloquea la unión de la ABP B la inversa no es siempre cierta: La ABP B usada como la ABP de referencia no bloqueará necesariamente a la ABP A. Existen varios factores en juego aquí: la unión de una ABP puede causar cambios conformacionales en la diana que evitan la unión de la segunda ABP, o los epítopos que se superponen pero no se ocluyen completamente entre sí pueden permitir que la segunda ABP tenga todavía interacciones de alta afinidad suficientes con la diana como para permitir la unión. Las ABP con una afinidad mucho mayor pueden tener una mayor capacidad para apartar a una ABP bloqueante fuera de su camino. En general, si se observa competición en cualquier orden, se dice que las ABP se agrupan en clases conjuntamente, y si ambas ABP pueden bloquearse entre sí entonces es probable que los epítopos se superpongan más completamente.
EJEMPLO 38
Mapeo de Epítopos - Transferencia Western
El presente ejemplo demuestra si los epítopos para las ABP examinadas eran o no lineales o conformacionales. Se corrieron transferencias western reductoras desnaturalizantes y no reductoras desnaturalizantes para determinar qué anticuerpos tenían un epítopo conformacional. Los anticuerpos que se unen a una transferencia western reductora desnaturalizante tienen un epítopo lineal y no son conformacionales. Los resultados se presentan en la FIG. 24A y FIG. 24B. Para la transferencia, se corrieron 0,5 ug/carril de PCSK9 humana de longitud completa purificada en un gel al 4-12% Bis-Tris NuPAGE y Tampón de Corrida MES SDS. Se usó 1 ug/ml de anticuerpos anti-PCSK9, excepto 0,5 ug/ml de 31G11, para ensayar la transferencia. Se usó 1:5.000 de anticuerpo secundario anti-humano de burro-IR700 y se leyó en un instrumento LiCOR. El anticuerpo 13H1 se unió a un epítopo lineal en el pro-dominio de PCSK9. Todos los demás anticuerpos presentaron resultados que fueron consistentes con epítopos conformacionales. Estos geles separan el pro-dominio del resto de la proteína, y el pro dominio corrió a aproximadamente 15kDa. Además, 3C4 y 31A4 parecieron unirse a epítopos conformacionales que estaban conservados por enlaces disulfuro, ya que estos anticuerpos se unieron a PCSK-9 en condiciones desnaturalizantes en donde se habían conservado los enlaces disulfuro (izquierda) pero la reducción de las muestras (derecha) eliminó la unión.
EJEMPLO 39
Mapeo de Epítopos -- Escaneo de arginina / ácido glutámico
Se seleccionaron las ABP representativas de cada clase (del Ejemplo 37) para análisis adicional de epítopos. Se realizó una estrategia de escaneo de arginina/ácido glutámico para el mapeo de la unión de ABP a PCSK9. Como antecedente, este método determina si un residuo es parte del epítopo estructural, lo que significa aquellos residuos en el antígeno que están en contacto o están enterrados por el anticuerpo. Las cadenas laterales de la arginina y ácido glutámico están cargadas y son voluminosas y pueden alterar la unión del anticuerpo incluso si el residuo mutado no está implicado directamente en la unión del anticuerpo.
Selección de residuos
La estructura de cristal de PCSK9 se usó para seleccionar los residuos que se iban a mutar para el mapeo de epítopos. El método usado para elegir los residuos que se van a mutar implicó tanto mecanismos computacionales como análisis de estructura interactivos. La estructura de PCSK9 contenía huecos de residuos ausentes y tenía 30 aminoácidos ausentes en el extremo N (es decir, la secuencia señal) y 10 aminoácidos en el extremo C. Los residuos ausentes internos se modelaron en la estructura, pero no los residuos ausentes N y C-terminales. Se calculó la proporción de exposición a disolvente para cada residuo: el área superficial de cada residuo en el contexto de la proteína (SA1) se dividió por el área superficial del residuo en un trímero con glicinas flanqueantes (SA2) con una estructura de núcleo conservada. Se seleccionaron los residuos con una proporción de exposición al disolvente mayor de 10% (R10) así como los 40 residuos terminales ausentes. A partir de esto, las prolinas y glicinas con ángulos O positivos se excluyeron para reducir la posibilidad de plegamiento erróneo. El número de residuos que se van a mutar en el dominio V se redujo usando una proporción de exposición al disolvente de 37% junto con una inspección visual de la proteína completa para llevar el número total de mutaciones a 285. Varias orientaciones de la superficie de PCSK9 con estas varias clases identifica se muestran en la FIG. 25A-25F. En estas figuras, el gris más claro indica áreas que no se seleccionaron o cuya selección se canceló. El gris más oscuro indica aquellos residuos seleccionados).
Clonación y expresión
Una vez se identificaron los residuos que se iban a alterar, los varios residuos se alteraron. Se clonó PCSK9 humana en el vector pTT5 con una etiqueta C-terminal Flag-His. Los mutantes se hicieron a partir de esta construcción original por mutagénesis dirigida a sitio usando un kit QuikChange II de Stratagene. Los oligonucleótidos con sentido y anti-sentido usados para la mutagénesis se diseñaron usando software MutaGenie de Amgen. Todas las construcciones de PCSK9 se expresaron en células 293-6E transfectadas de forma transitoria en placas de 24 pocillos y se volvieron a sembrar en tres placas de 96 pocillos con una PCSK9 no mutada control (de tipo salvaje, WT) en cada placa. Los niveles de expresión y la integridad de las proteínas recombinantes en el medio condicionado se comprobaron por transferencia Western. De los 285 mutantes seleccionados originalmente, 41 fracasaron en la clonación o expresión. Se usaron 244 mutantes para el mapeo de epítopos. Un alineamiento de la secuencia de PCSK9 parental y una secuencia de PCSK9 representativa con los 244 residuos mutados se muestra en la FIG. 26. Se hicieron construcciones separadas que contenían una única mutación. Para los propósitos de las secuencias de epítopos y las aplicaciones basadas en epítopos que implican cambios en la unión, se proporcionan las secuencias en referencia a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 303. Las secuencias en la FIG. 26 fueron las secuencias usadas para los presentes estudios de unión a epítopo. Un experto en la técnica apreciará que los presentes resultados también se aplican a otras variantes de PCSK9 descritas en la presente memoria (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 3, así como las demás variantes alélicas).
Se eligieron cinco anticuerpos, uno representativo de cada clase, para el mapeo de epítopos fino. Fueron 21B12, 31H4, 12H11, 31A4, 3C4. Todos anticuerpos con epítopos conformacionales. Tres, 21B12, 31 H4, y 31A4 también se cristalizaron con PCSK9, como se ha descrito anteriormente.
Epítopos estructurales y funcionales
Los epítopos pueden definirse adicionalmente como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción (por ejemplo enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas). Los epítopos estructurales pueden pensarse como la zona de la diana que está cubierta por el anticuerpo.
La mutagénesis por escaneo empleada fue un escaneo de arginina y ácido glutámico. Estas dos cadenas laterales se eligieron debido a su gran volumen estérico y su carga, lo que permite que las mutaciones que ocurren en el epítopo estructural tengan un mayor efecto en la unión del anticuerpo. La arginina se empleó generalmente excepto cuando el residuo WT era arginina, y en estos casos el residuo se mutó a ácido glutámico para cambiar la carga.
Para el propósito del mapeo de epítopos, se usó un ensayo basado en perlas multiplexado para medir la unión del anticuerpo a PCSK9 y mutantes de PCSK9 simultáneamente. La unión del anticuerpo a los mutantes se comparó entonces con su unión al tipo salvaje en el mismo pocillo. Las variantes se dividieron en tres grupos: Grupo 1: 81 variantes 2 controles wt 1 control negativo 1 otro sobrenadante de PCSK9; Grupo 2: 81 variantes 2 controles wt 2 controles negativos; y Grupo 3: 82 variantes 2 controles wt 1 control negativo. El ensayo se corrió como sigue: 85 conjuntos de perlas LumAvidin recubiertas con estreptavidina con código de color (Luminex) se unieron con anticuerpo anti-pentaHis biotinilado (Qiagen, #1019225) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) después se lavó tres veces en PBS, 1% BSA, 0,1% Tween 20. Cada conjunto de perlas con código de color se dejó unir a un mutante de PCSK9, tipo salvaje, o control negativo en 150 ul de sobrenadante toda la noche a 4°C.
Los conjuntos de perlas con código de color, cada uno asociado a una proteína específica, se lavaron y combinaron. En este punto, había 3 combinaciones de 85 conjuntos de perlas, una combinación para cada grupo de mutantes y controles. Las perlas de cada combinación se alicuotaron en 24 pocillos (3 columnas) de una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, #MSBVN 1250). Se añadieron 100 ul de anticuerpos anti-PCSK9 en diluciones de 4 veces a nueve columnas para puntos en triplicado y se incubó durante 1 hora a RT y se lavó. Se añadieron 100ul de una dilución 1:200 de anti-IgG Fc humano conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a RT y se lavó.
Las perlas se resuspendieron en 1% BSA en PBS, se agitó durante 10mins y se leyó en el instrumento BioPlex (Bio-Rad). El instrumento identifica cada perla por su código de color identificando de esta manera la proteína específica asociada con el código de color. Al mismo tiempo, mide la cantidad de anticuerpo unido a las perlas por intensidad de fluorescencia del agente de tinción PE. La unión del anticuerpo a cada mutante puede compararse entonces directamente con su unión al tipo salvaje en la misma combinación. Se usó la quimera de IL-17R E como un control negativo. Un resumen de todos los mutantes examinados se muestra en la Tabla 39.1 (con referencia a la numeración de secuencia usada en la FIG. 1A y 26).
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varianza de B-B. También se calcularon las veces de cambio entre media LS 2SD y media LS - 2SD, que representan aproximadamente el percentil 97,5 superior e inferior de la población. Los resultados se presentan en la Tabla 39.2.
Tabla 39.2 Estimaciones de la media mínimo cuadrática y varianza perla-a-perla
Figure imgf000084_0001
* xmid es el log natural de la EC50. Las veces de cambio para xmid se convirtieron de nuevo a la escala original. Identificación de residuos en el epítopo estructural
Un residuo se consideró parte del epítopo estructural (un "acierto") cuando si se muta a arginina o ácido glutámico altera la unión del anticuerpo. Esto se observa como un desplazamiento en la EC50 o una reducción de la señal máxima comparado con la unión de anticuerpo al tipo salvaje. Los análisis estadísticos de las curvas de unión de anticuerpo a tipo salvaje y mutantes se usaron para identificar desplazamientos de EC50 estadísticamente significativos. El análisis tiene en consideración la variación en el ensayo y el ajuste de las curvas.
Identificación de aciertos basada en comparación de EC50
Los valores EC50 y Bmax se generaron a partir de un modelo logístico de 4 parámetros ponderado ajustado a los datos de unión usando S-PLUS con software VarPower (Insightful Corporation, Seattle WA). Se compararon las EC50 de las curvas de unión de mutantes y las curvas de unión de tipo salvaje. Se identificaron diferencias estadísticamente significativas como aciertos para consideración adicional. Las curvas con indicadores "nofit" ("sin ajuste") o "badfit" ("mal ajuste") se excluyeron del análisis.
Las variaciones en las estimaciones de EC50
Se consideraron dos fuentes de variaciones en la comparación de las estimaciones de EC50, variación del ajuste de la curva y la variación perla-perla. Los tipos salvajes y mutantes se ligaron a perlas diferentes, por lo tanto su diferencia se vieron afectadas con la diferencia perla-perla (descrita anteriormente). La variación del ajuste de la curva se estimó por el error estándar de las estimaciones de log EC50. La variación perla-perla se determinó experimentalmente usando un experimento en donde los controles de tipo salvaje se ligaron a cada una de las perlas (descrito anteriormente). La variación de las perlas en las estimaciones de EC50 de la curva de unión de tipo salvaje de este experimento se usó para estimar la variación perla-perla en el experimento real de mapeo de epítopos.
Ensayo para el desplazamiento de EC50 entre mutantes y tipo salvaje
Las comparaciones de dos EC50 (en escala log) se realizó usando el ensayo de la t de Student. La estadística t se calculó como la proporción entre delta (las diferencias absolutas entre estimaciones de EC50) y la desviación estándar de delta. La varianza de delta se estimó por la suma de los tres componentes, estimación de la varianza de EC50 para curvas mutante y de tipo salvaje en la regresión no lineal y dos veces la varianza perla-perla estimada a partir de un experimento separado. El múltiplo de dos para la varianza perla-perla se debió a la asunción de que tanto las perlas mutante como de tipo salvaje tenían la misma varianza. El grado de libertad de la desviación estándar de delta se calculó usando la aproximación de Satterthwaite (1946). Los valores p individuales y los intervalos de confianza (95% y 99%) se derivaron tomando como base la distribución de la t de Student para cada comparación. En el caso de múltiples controles de tipo salvaje, se tomó una estrategia conservadora eligiendo el control de tipo salvaje que era lo más similar al mutante, es decir, eligiendo los que tenían valores p mayores.
Los ajustes de multiplicidad eran importantes para controlar el o los falsos positivos a la vez que se realizaba un gran número de ensayos simultáneamente. Se implementaron dos formas de ajuste de multiplicidad para este análisis: control del error por familia (FWE) y control de tasa de descubrimientos falsos (FDR). La estrategia FWE controla la probabilidad de que uno o más aciertos no sean reales; la estrategia FDR controla la tasa esperada de falsos positivos entre los aciertos seleccionados. La primera estrategia es más conservadora y menos potente que la última. Hay muchos métodos disponibles para ambas estrategias, para este análisis, se seleccionaron el método de Hochberg (1988) para el análisis de FWE y el método FDR de Benjamini-Hochberg (1995) para el análisis de FDR. Se calcularon los valores p ajustados para ambas estrategias.
Resultados
Desplazamiento de EC50
Las mutaciones cuya EC50 es significativamente diferente del tipo salvaje, por ejemplo, que tienen un valor p ajustado de tasa de descubrimientos falsos para el ensayo completo de 0,01 o menos, se consideraron parte del epítopo estructural. Todos los aciertos también tenían un valor p ajustado de tasa de error por familia tipo I para cada anticuerpo de menos de 0,01 excepto el residuo R185E para el anticuerpo 31H4 que tenía un valor p ajustado FWE por anticuerpo de 0,0109. Los residuos en el epítopo estructural de los varios anticuerpos determinados por el desplazamiento de EC50 se muestran en la Tabla 39.3 (las mutaciones puntuales son con referencia a s Eq ID NO: 1 y 303)
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Reducción de la señal máxima
El porcentaje de señal máxima se calculó usando la señal máxima del ajuste de la curva (BmaxPorWT) y el punto de datos brutos (MaxBruPorWT). Las mutaciones que redujeron la señal máxima de la unión de anticuerpo > 70% comparado con la señal de tipo salvaje o que redujeron la señal de un anticuerpo comparada con otros anticuerpos >50% cuando todos los demás anticuerpos son al menos 40% del tipo salvaje se consideraron aciertos y parte del epítopo. La Tabla 39.4 presenta los residuos que están en el epítopo estructural (itálica) según se determina por la reducción de la señal máxima.
Tabla 39.4
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(continuación)
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La Tabla 39.5 presenta un resumen de todos los aciertos para los distintos anticuerpos.
Tabla 39.5
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* disminuye EC50
Para examinar adicionalmente cómo estos residuos forman parte de o todos de los de los epítopos relevantes, las posiciones indicadas anteriormente se mapearon en varios modelos de estructura de cristal, los resultados se muestran en la FIG. 27A a 27E. La FIG. 27A representa los aciertos del epítopo de 21B12, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con el anticuerpo 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y resultó en un cambio significativo en EC50 y/o Bmax. Los aciertos de epítopo se basaron en desplazamiento de Bmax. En esta figura, 31H4 está detrás de 21B12.
La FIG. 27B representa los aciertos del epítopo de 31H4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y resultó en un cambio significativo en EC50 y/o Bmax. Los aciertos de epítopo se basaron en desplazamiento de EC50.
La FIG. 27C representa los aciertos de epítopo de 31A4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y resultó en un cambio significativo en EC50 y/o Bmax. Los aciertos de epítopo se basaron en el desplazamiento de EC50. Se sabe que el anticuerpo 31A4 se une al dominio V de PCSK9, lo que parece consistente con los resultados presentados en la FIG. 27C.
La FIG. 27D representa los aciertos de epítopo de 12H11, según se mapea en la estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y resultó en un cambio significativo en EC50 y/o Bmax. 12H11 compite con 21B12 y 31H4 en el ensayo de agrupación en clases descrito anteriormente.
La FIG. 27E representa los aciertos de epítopo de 3C4, según se mapea en la estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y resultó en un cambio significativo en EC50 y/o Bmax.
3C4 no compite con 21B12 y 31H4 en el ensayo de agrupación en clases. 3C4 se une al dominio V en el ensayo de unión de dominio (véanse los resultados del Ejemplo 40, FIGs. 28A y 28B).
Aunque había aproximadamente una docena de mutantes que se podría haber esperado que tuvieran un efecto en la unión (tomando como base la estructura de cristal), el presente experimento demostró que, sorprendentemente, no lo tuvieron. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados presentados anteriormente están muy de acuerdo con las estructuras de cristal y unión de PCSK-9 de estos anticuerpos. Esto demuestra que los datos estructurales y funcionales correspondientes proporcionados identifican adecuadamente los residuos y áreas clave de las ABP neutralizantes y PCSK9. Así, las variantes de las ABP que poseen la capacidad de unirse a las áreas indicadas anteriormente se proporcionan adecuadamente por la presente descripción.
Como apreciará un experto en la técnica, aunque la caída en B-max y aciertos de desplazamiento de EC50 pueden considerarse manifestaciones del mismo fenómeno, hablando estrictamente, una caída en B-max sola no refleja una pérdida de afinidad per se sino, en lugar de esto, la destrucción de algún porcentaje del epítopo de un anticuerpo. Aunque no hay superposición en los aciertos determinados por B-max y EC50, las mutaciones con un fuerte efecto en la unión pueden no permitir la generación de una curva de unión útil y, por lo tanto, no puede determinarse la EC50 para dichas variantes.
Como apreciará un experto en la técnica, las ABP en la misma clase (con la excepción de la clase 5, que como se ha indicado anteriormente, es una clase de cajón de sastre general) probablemente se unirán a sitios superpuestos en la proteína diana. Como tales, los epítopos y residuos relevantes anteriores pueden extenderse generalmente a todas dichas ABP en la misma clase.
Para examinar adicionalmente los resultados anteriores respecto a ABP 31H4, también se alteró la posición E181R, que, según la estructura de cristal anterior, se predijo que interacciona con R185 para formar parte de la superficie que interacciona con la ABP, (E181R). Los resultados, aunque no estadísticamente significativos por sí mismos, fueron, cuando se combinaron con la estructura de cristal, demostrativos de que 31H4 interacciona con E181R (datos no mostrados). Así, la posición 181 también parece formar parte del epítopo para la ABP 31H4. Como se ha indicado anteriormente, los datos de unión anteriores y caracterización de epítopos hacen referencia a una secuencia de PCSK9 (SEQ ID NO: 1) que no incluye los primeros 30 aminoácidos de PCSK9. Así, el sistema de numeración de este fragmento de proteína, y las SEQ ID NO:s que hacen referencia a este fragmento, están desplazados por 30 aminoácidos comparado con los datos y experimentos que usaron un sistema de numeración de PCSK9 de longitud completa (tales como los usados en los datos del estudio de cristales descritos anteriormente). Así, para comparar estos resultados, deberían añadirse 30 aminoácidos extra a las posiciones en cada uno de los resultados de mapeo de epítopo anteriores. Por ejemplo, la posición 207 de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 303), se correlaciona con la posición 237 de SEQ ID NO: 3 (la secuencia de longitud completa, y el sistema de numeración usado a lo largo del resto de la especificación). La Tabla 39.6 muestra cómo las posiciones indicadas anteriormente, que hacen referencia a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID NO: 303) se correlacionan con SEQ ID NO: 3 (que incluye la secuencia señal).
TABLA 39.6
Ó Á Ó Á
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(continuación)
Ó Á
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Así, aquellas ocasiones descritas en la presente memoria con referencia a SEQ ID NO: 1 también pueden describirse, por su posición correspondiente indicada anteriormente, con referencia a SEQ ID NO: 3.
EJEMPLO 40
Ensayo de unión al dominio de PCSK9
El presente ejemplo examinó dónde en PCSK9 se unen las distintas ABP.
Se recubrieron placas transparentes de 96 pocillos maxisorp (Nunc) toda la noche con 2 ug/ml de varios anticuerpos anti-PCSK9 diluidos en PBS. Las placas se lavaron concienzudamente con PBS/,05% Tween-20 y se bloquearon durante dos horas con 3% BSNPBS. Después de lavar, las placas se incubaron durante dos horas bien con PCSK9 de longitud completa (aa 31-692 SEQ ID NO: 3, procat PCSK9 (aa 31-449 SEQ ID NO: 3) o dominio V de PCSK9 (aa 450-692 de SEQ ID NO: 3) diluido en diluyente de ensayo general (Immunochemistry Technologies, LLC). Las placas se lavaron y se añadió un anticuerpo anti-PCSK9 policlonal biotinilado de conejo (D8774), que reconoce el dominio procat y v así como PCSK9 de longitud completa, a 1 ug/ml (en 1%BSNPBS). Se detectó PCSK9 de longitud completa, dominio procat o v unidos por incubación con neutravidina-HRP (Thermo Scientific) a 200 ng/ml (en 1% BSNPBS) seguido de sustrato TMB (KPL) y medida de absorbancia a 650 nm. Los resultados, presentados en las FIGS. 28A y 28B, demuestran la capacidad de las distintas ABP de unirse a varias partes de PCSK9. Como se muestra en la FIG. 28B, ABP 31A4 se une a el dominio V de PCSK9.
EJEMPLO COMPARATIVO 41 (no de acuerdo con la invención)
Proteínas de unión a antígeno neutralizantes no competitivas
El presente ejemplo demuestra cómo identificar y caracterizar una proteína de unión a antígeno que no es competitiva con LDLR para la unión con PCSK9, pero que todavía es neutralizante frente a la actividad de PCSK9. En otras palabras, dicha proteína de unión a antígeno no bloqueará la unión de PCSK9 a LDLR, pero evitará o reducirá la degradación de LDLR mediada por PCSK9.
Se recubrieron placas transparentes de 384 pocillos (Costar) con 2 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-receptor de LDL (R&D Systems) diluido en tampón A (100 mM cacodilato de sodio, pH 7,4). Las placas se lavaron concienzudamente con tampón A y se bloquearon durante 2 horas con tampón B (1% leche en tampón A). Después de lavar, las placas se incubaron durante 1,5 horas con 0,4 ug/ml de receptor de LDL (R&D Systems) diluido en tampón C (tampón B suplementado con 10 mM CaCh). Simultáneamente a esta incubación, se incubaron 20 ng/ml de D374Y PCSK9 biotinilado con 100 ng/ml de anticuerpo diluido en tampón A o tampón A solo (control). Las placas que contenían receptor de LDL se lavaron y la mezcla D374Y PCSK9 biotinilado/anticuerpo se transfirió a ellas y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión del D374Y biotinilado al receptor de LDL se detectó por incubación con estreptavidina-HRP (Biosource) a 500 ng/ml en tampón C seguido de sustrato TMB (KPL). La señal se paró con 1N HCl y la absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se presentan en la FIG. 28C, que muestra que mientras ABP 31H4 inhibe la unión a LDLR, ABP 31A4 no inhibe la unión de LDLR a PCSK9. En combinación con los resultados del Ejemplo 40 y que se muestran en las FIGs. 28A y 28B, está claro que la ABP 31A4 se une al dominio V de PCSK9 y que no bloquea la interacción de PCSK9 con LDLR.
A continuación, se confirmó adicionalmente la capacidad de la ABP 31A4 para servir como una ABP neutralizante mediante un ensayo de captación celular de LDL (como se describe en los ejemplos anteriormente). Los resultados de este ensayo de captación de LDL se presentan en la FIG. 28D. Como se muestra en la FIG. 28D, la ABP 31A4 presenta una capacidad neutralizante de PCSK9 significativa. Así, a la vista del Ejemplo 40 y los presentes resultados, está claro que las ABP pueden unirse a PCSK9 sin bloquear la interacción de unión de PCSK9 y LDLR, mientras todavía son útiles como ABP neutralizantes de PCSK9.
TABLA 35.1
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TABLA 35.2
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TABLA 35.3
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TABLA 35.4
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en
el tratamiento o la prevención de hipercolesterolemia o una enfermedad ateroesclerótica relacionada con niveles de colesterol en suero elevados;
o para su uso en la reducción del riesgo de un evento cardiovascular recurrente relacionado con niveles de colesterol en suero elevados, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une al dominio catalítico de una proteína PCSK9 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y previene o reduce la unión de PCSK9 a LDLR.
2. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el tratamiento o la prevención de hipercolesterolemia.
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el tratamiento o la prevención de una enfermedad ateroesclerótica relacionada con niveles de colesterol en suero elevados.
4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad ateroesclerótica relacionada se selecciona de enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad arterial coronaria, enfermedad arterial periférica, ictus isquémico o hemorrágico, angina de pecho, enfermedad cerebrovascular, síndrome coronario agudo o infarto de miocardio.
5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo es para su uso en la reducción del riesgo de un evento cardiovascular recurrente relacionado con niveles de colesterol en suero elevados.
6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra junto con al menos un agente de disminución de colesterol distinto.
7. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el al menos un agente de disminución de colesterol distinto es una estatina, opcionalmente en donde la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina y simvastatina.
8. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo de cadena única, un diacuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2 , un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 y un anticuerpo IgG4 o un fragmento de anticuerpo de los mismos.
9. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una variante de PCSK9 que tiene una mutación puntual D374Y.
10. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a PCSK9 con una Kd que es menor que 1 nM, es menor que 100 μM, es menor que 10 μM o es menor que 5 μM.
11. El anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es un paciente humano.
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