RS54756B2

RS54756B2 - Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)

Info

Publication number: RS54756B2
Application number: RS20160312A
Authority: RS
Inventors: Simon Mark Jackson; Nigel Pelham Clinton Walker; Derek Evan Piper; Bei Shan; Wenyan Shen; Joyce Chi Yee Chan; Chadwick Terence King; Randal Robert Ketchem; Christopher Mehlin; Teresa Arazas Carabeo; Qiong Cao
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2024-07-31
Also published as: DK3666797T5; NO2023012I1; US8871914B2; BR122018012430B8; KR101494932B1; IL252616A0; TW201500374A; LT3666797T; FR16C0025I1; US20120093818A1; ES2946083T3; IL273353B1; CY2016029I2; IL204013A; US8889834B2; TW200916481A; PE20140231A1; EP2215124A1; HUE062493T2; US20130052201A1

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak odnosi se na antigen vezujuće protein koji se vezuju za proprotein konvertazu subtilizing keksin tip 9 (PCSK9), njihovu primenu i postupke za pripremanje tih antigen vezujućih proteina.

POZADINA RAZLIČITIH OSTVARENJA

Proprotein konvertaza suntilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulisanje nivoa proteina lipoprotein receptora male gustine (LDLR) (Horton et al., 2007;

Seidah i Prat, 2007). In vitro eksperimenti pokazali su da dodavanje PCSK9 HepG2 ćelijama smanjuje nivoe LDLR na površini ćelije (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004). Eksperimenti sa miševima pokazali su da povećanje niovoa PCSK9 proteina smanjuje nivoe LDLR proteina u jetri (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004), dok PCSK9 nokaut miševi imaju povećane nivoe LDLR u jetri (Rashid et al., 2005). Preterana ekspersija PCSK9 u miševima izaziva povećanje ukupnog holesterola u plazmi (Maxwell et al.2004). Pored toga, identifikovane su različite humane PCSK9 mutacije koje rezultiraju bilo u povećanju ili u smanjenju nivoa LDL plazme (Kotowski et al., 2006; Zhao et al., 2006). Pokazano je da je PCSK9 u direktnoj iterakciji sa LDLR proteinom, putem endocitoziranja zajedno sa LDLR, i da koimunofluorescira sa LDLR putem endosomalne putanje (Lagace et al., 2006). Nije zapažena razgradnja LDLR od strane PCSK9 , a mehanizam kojim snižava vanćelijske nivoe LDLR proteina je neizvestan.

PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) familiji serin proteaza (Seidah et al., 2003). Ljudi imaju devet prohormon-proprotein konvertaza koje mogu biti podeljene između S8A i S8B podfamilije (Rawlings et al., 2006). Furin, PC1/PC3, PC2, PACE4, PC4, PC5/PC6 i PC7/PC8/LPC/SPC7 su klasifikovani u podfamiliju S8B. Kristalne NMR strukture različitih domena iz furina miševa i PC1 ukazuju na subtilizin-slične pro- i katalitičke domene, a P domen direktno C-terminala na katalitički domen (Henrich et al., 2003; Tangrea et al., 2002). Na osnovu sličnosti sekvence amino kiseline unutar ove podfamilije, predviđa se da svih sedam članova imaju iste strukture (Henrich et al., 2005). SKI-1/S1P i PCSK9 klasifikovani su u podfamiliju S8A. Upoređivanja sekvenci sa ovim proteinima takođe ukazuju na prisustvo subtilzsin-slične pro- i katalitičke domene (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al., 1999). U ovim proteinima C-terminal sekvence amino kiseline do katalitičkog domena više je promenljiv i ne ukazuje na prisustvo P domena.

Prohormon-proprotein konvertaze se iskazuju kao zimogeni i razvijaju se višefaznim postupkom. Funkcija pro-domena u ovom postupku je dvostruka. Pro-domen prvo deluje kao pratilac i neophodan je za ispravno nizanje katalitičkog domena (Ikemura et al., 1987). Kada se katalitički domen naniže, dolazi do autokatalize između prodomena i katalitičkog domena . Posle ove početne reakcije cepanja, pro-domen ostaje vezan za katalitički domen gde on zatim deluje kao inhibitor katalitičke aktivnosti (Fu et al., 2000). Kada su uslovi odgovarajući , razvijanje se odvija sa drugim katalitičkim događanjem na mestu unutar pro-domena (Anderson et al., 1997). Nakon ovog drugog događanja cepanja, dolazi do disocijacije pro-domena i katalitičkog domena, što dovodi do aktivne proteaze. PCSK9 se procesira u ER i izdvaja u plazmi (Grozdanov et al.2006). Nivoi PCSK9 su pod kontrolom puetm proteolize od strane drugih članova familije proprotein konvertaze (Benjannet et al., 2006).

Autokataliza PCSK9 zimogena odigrava se između Gln152 i Ser153 (VFAQ|SIP) (Naureckiene et al., 2003), i pokazano je da je potrebna za sopstveno lučenje iz ćelija (Seidah et al., 2003). Drugo autokatalitičko događanje na mestu unutar pro-domena PCSK9 nije zapaženo. Prečišćeni PCSK9 sastoji se od dve vrste koje mogu biti razdvojene neredukujućim SDS-PAGE; pro-domen na 17 Kd, a katalitički plus C-terminal domeni na 65 Kd. Nije izolovan PCSK9 bez svog inhibitornog pro-domena, a merenja katalitičke aktivnosti PCSK9 bila su promenljiva (Naureckiene et al., 2003; Seidah et al., 2003).

SUŠTINA RAZLIČITIH OSTVARENJA

Ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujuće proteine za PCSK9 kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

U jednom aspektu , ovaj pronalazak obuhvata antigen vezujući protein , u kojem se (A) pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za humani PCSK9 i on je neutralizujući zato što je višak pomenutog antigen vezujućeg proteina sposoban da redukuje količinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanja in vitro, gde pomenuti antigen vezujući protein obuhvata bilo:

(i)

(a) kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca odabranu iz grupe kombinacija koju čine:

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 9 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 71;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 72;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 67;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 16 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 52;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 51;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 20 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 54;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 21 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 55;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 22 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 56;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 49;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 24 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 57;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 26 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 50;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 30 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 64;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 31 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 62;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 33 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 65;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 79;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 36 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 80;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 37 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 76;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 38 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 77;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 39 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 78;

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 40 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 83;

(ii)

(a) CDRH1 koji obuhvata SEQ ID NO: 308, CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 175, i CDRH3 koji obuhvata SEQ ID NO: 180; ili

(b) CDRH1 koji obuhvata SEQ ID NO: 368, CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 175, i CDRH3 koji obuhvata SEQ ID NO: 180;

i

CDRL1 koji obuhvata SEQ ID NO: 158, CDRL2 koji obuhvata SEQ ID NO: 162, i CDRL3 koji obuhvata SEQ ID NO: 395; ili

(iii) CDRH1 koji obuhvata SEQ ID NO: 368, CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 174, i CDRH3 koji obuhvata SEQ ID NO: 180 i CDRL1 koji obuhvata SEQ ID NO: 158, CDRL2 koji obuhvata SEQ ID NO: 162, i CDRL3 koji obuhvata SEQ ID NO: 164;

ili

(B) pomenuti antigen vezujući protein obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 49.

U nekim aspketima, ovaj pronalazak obuhvata izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabranih iz grupe kombinacija koje se sastoje od: varijabilnog domena lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 72; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 67; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu izraženu u SEQ ID NO: 79.

U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerično antitelo, multispecifično antitelo, ili neki fragment tih antitela. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein jea Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul antitela sa pojedinačnim lancem. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je humano antitelo. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je IgG1-, IgG2- IgG3- ili IgG4-tipa. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je IgG4- ili IgG2-tipa. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein vezuje se za markirnu grupu. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je u kompeticiji za vezivanje za PCSK9 sa nekim ovde opisanim antigen vezujućim proteinom. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerično antitelo, multispecifično antitelo, ili neki fragment tih antitela. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein je Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul antitela sa pojedinačnim lancem. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein vezan je za markirnu grupu. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu prisutnog LDL-a u subjektu kada mu se daje. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu holesterola u serumu prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu. U nekim ostvarenjima, izolovani antigen vezujući protein povećava količinu LDLR-a prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata molekul nukleinske kiseline koji enkodira ovde obezbeđen antigen vezujući protein.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan ovde obezbeđen antigen vezujući protein.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kakav je ovde obezbeđen za upotrebu za tretiranje ili prevenciju stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu pacijenta, obuhvatajući davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kako je ovde obezbeđen za upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde upotreba obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ovde obezbeđeni AVP i agens koji podiže dostupnost nivoa LDLR proteina. U nekim ostvarenjima, agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, statin se bira iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neku njihovu kombinaciju.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata postupak pripreme ovde obezbeđenog antigen vezujućeg proteina, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja sekretuje pomenuti antigen vezujući protein.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan ovde obezbeđeni antigen vezujući protein i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens. U nekim ostvarenjima, ova farmaceutska kompozicija dalje obuhvata dodatni aktivni agens. U nekim ostvarenjima, pomenuti dodatni aktivni agens bira se iz grupe koju čine radioizotop, radionuklid, toksin, ili terapeutsku ili hemoretapeutsku grupu.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata ovde obezbeđeni AVP za primenu u tretiranju ili prevenciji stanja vezanog za povišeni nivo holesterola u serumu pacijenta. Primena obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde obezbeđenog antigen vezujućeg proteina. U nekim ostvarenjima, to stanje je hiperholesterolemija.

U nekim aspektima, antigen vezujući protein se vezuje za PCSK9 sa Kdkoja je manja od 100 pM. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se vezuje sa Kdkoja je manja 10 pM. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se sa Kdkoja je manja od 5 pM.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata AVP kakav je ovde obezbeđen za upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde pomenuta upotreba obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine namanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim ostvarenjimaagens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim ostvarenjima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neka njihova kombinacija.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9 i redukuje receptor lipoproteina niske gustine (LDLR) snižavajući efekat PCSK9 na LDLR. U nekim ostvarenjima, to antitelo se vezuje za epitop unutar ostataka 31-447 SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, to antitelo se vezuje za PCSK9 koji ima sekvencu amino kiseline koja je najmanje 90% identična SEQ ID NO: 3.

U nekim ostvarenjima, kada se antigen vezujući protein veže za PCSK9, pozicioniran je 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, 1369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, 1154, T187, H193, E195, 1196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, ili Q382. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih sotataka PCSK9: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih sotataka PCSK9: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim ostvarenjima, pozizioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: S153, t154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 8 angstrema ili manje pd najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, ili Q387. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, ili G384. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, ili G384. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383,ili G384. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, 1154, T187, H193, E195, 1196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379. U nekim ostvarenjima, pozicioniran je 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9, pri čemu se to antitelo vezuje za PCSK9 i smanjuje izglednost da se PCSK9 veže za LDLR.

U nekim ostvarenjima, izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul blokira antitelo od vezivanja za PCSK9 unutar 8 angstroma ostatka PCSK9. U nekim ostvarenjima, ostatak PCSK9, je izabran od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9 ostataka: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, 1154, T187, H193, E195, 1196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378.

U nekim ostvarenjima, izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul se vezuje za PCSK9 na lokaciji koja se preklapa sa lokacijom koja LDLR vezuje za PCSK9. U nekim ostvarenjima, pozicija na kojoj se LDLR vezuje za PCSK9 uključuje najmanje jedan amino kiselinski ostatak odabran iz grupe koju čine: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, i S381.

U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen vezujući molekul smanjuje izglednost da će se EGFa vzati za PCSK9 unutar 8 angstrema od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, ili Q382.

U nekim ostvarenjima, obezbeđeno je antitelo ili antigen vezujući protein se vezuje za površinu PCSK9 koja se preklapa sa površinom na kojoj se vezuje EGFa, vezuje Ab 21B12, i/ili vezuje 31H4. U nekim ostvarenjima, antitelo ili antigen vezujući protein se vezuje za PCSK9 na način koji je sličan onom prikazanom u priloženim crtežima.

1

U nekim ostvarenjima, gore pomenuta ostvarenja su neutralizujuća antitela ili antigen vezujući proteini. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein nije LDLR ili njegov fragment (kao što je EGFa).

U nekim aspektima, antigen vezujući protein obuhvata: A) CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEQ ID NO: 49, CDRH2 iz CDRH2 sekvence u SEQ ID NO: 49, i CDRH3 iz CDRH3 sekvence u SEQ ID NO: 49, i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO:23, CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO:23, i CDRL3 iz CDRL3 sekvence u SEQ ID NO:23.

KRATAK OPIS CTREŽA FIG. 1A prikazuje amino kiselinsku sekvencu zrele forme PCSK9 sa podvučenim pro-domenom. FIG. 1B1-1B4prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline PCSK9 sa podvučenim pro-domenom i signalnom sekvencom u podebljanoj štampi.

FIG. 2A-2D su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih antigen vezujućih proteina. FIG.2C nastavak sekvence započete na FIG.2A. FIG.2D nastavak sekvence započete na FIG.2B.

FIG. 3A-3D su tabele poređenja sekvenci različitih teških lanaca različitih antigen vezujućih proteina. FIG.3C nastavak sekvence započete na FIG.3A. FIG.3D nastavak sekvence započete na FIG.3B.

FIG. 3E-3JJ prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline za varijabilne domene nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

FIG. 3KK prikazuje amino kiselinske sekvence za različite konstantne domene.

FIG. 3LL-3BBB prikazuju sekvence amino kiseline i nukleinske kiseline varijabilnih domena nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

FIG. 3CCC-3JJJ su tabele poređenja sekvenci različitih teških i lakih lanaca nekih ostvarenja antigen vezujućih proteina.

FIG. 4A je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.

FIG. 4B je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.

FIG. 4C je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK9.

FIG. 4D je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK9.

FIG. 4E je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za mišiji PCSK9.

FIG. 4F je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za mišiji PCSK9.

FIG. 5A prikazuje rezultate SDS PAGE eksperiementa koji uključuje PCSK9 i različite antigen vezujuće proteine, koji prikazuje relativnu čistoću i koncentraciju proteina.

FIG. 5B i 5C prikazuje grafikone Biacore ogleda ravnoteže rastvora za 21B12.

FIG. 5D prikazuje grafikon kinetika iz Biacore ogleda hvatanja.

FIG. 5E prikazuje bar grafikon koji prikazuje bining rezultate za tri AVP-a.

FIG. 6A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9: LDLR ogledu vezivanja.

FIG. 6B kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.

FIG. 6C kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.

FIG. 6D kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.

FIG. 7A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.

FIG. 7B je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.

FIG. 7C je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.

FIG. 7D je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.

FIG. 8A je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 31H4 kod miševa, promene u odnosu na IgG kontrolne tretirane miševe (* p< 0,01).

FIG. 8B je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 31H4 kod miševa, promene u odnosu na vreme = nula časova (# p, 0,05).

FIG. 8C je grafikon koji prikazuje efeakt AVP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57B1/6 miševa (* p< 0,01).

FIG. 8D je grafikon koji prikazuje efekat AVP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57B1/6 miševa (# p< 0,05).

FIG. 9 prikazuje western blot analizu sposobnosti AVP 31H4 da poveća LDLR protein u jetri koji je prisutan posle različitih vremenskih tačaka.

FIG. 10A je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31H4 da smanji ukupni serum holesterol kod divljih miševa, relativno.

FIG. 10B je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31H4 da smanji HDL kod divljih miševa.

FIG. 10C je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola različitih antigen vezujućih proteina 31H4 i 16F12.

FIG. 11A pokazuje protokol unosa za testiranje trajanja i sposobnosti smanjivanja serum holesterola antigen vezujućih proteina.

FIG. 11B je grafikon koji prikazuje rezultate protokola na FIG.11A.

FIG. 12A prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21B12 u HepG2 ćelijama.

FIG. 12B prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama.

FIG. 12C prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo, (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u HepG2 ćelijama.

FIG. 12D prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21B12 u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.

FIG. 12E prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.

FIG. 12F prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo, (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.

FIG. 13A prikazuje različite lake lance amino kiselinskih sekvenci različitih AVPa za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema amino kiseline.

FIG. 13B prikazuje kladogram lakog lanca za različite AVPe za PCSK9.

FIG. 13C prikazuje različite teške lance amino kiselinskih sekvenci različitih AVPa za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema amino kiseline.

FIG. 13D prikazuje dendrogram teškog lanca za različite AVPe za PCSK9.

FIG. 13E prikazuje poređenje lakih i teških CDR-ova i oznake grupa od kojih se dobija konsenzus.

FIG. 13F prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2.

FIG. 13G prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4.

FIG. 13H prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke. FIG. 13I prikazuje konsenzus sekvence Grupe 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke.

FIG. 13J prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4. Tačke (.) označavaju identične ostatke. FIG. 14A je grafikon koji prikazuje in vivo sposobnost smanjivanja LDL različitih AVPa (pri 10 mg/kg).

FIG. 14B je grafikon koji prikazuje in vivo sposobnost smanjivanja LDL različitih AVPa (pri 30 mg/kg).

1

FIG. 15A i FIG.15B su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina. FIG.15B nastavak sekvence započete na FIG.15A.

FIG. 15C i FIG.15D su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina. FIG.15D nastavak sekvence započete na FIG.15C.

FIG. 16A je prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 21B12 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9.

FIG. 16B je prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 31H4 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9.

FIG. 17 je prikaz strukture PCSK9 i EGFa dela LDLR.

FIG. 18A je prikaz strukture PCSK9 i 31H4 Ab.

FIG. 18B je prikaz strukture PCSK9 i 31H4 Ab.

FIG. 19A je prikaz strukture PCSK9, 31H4 Ab, i 21B12 Ab.

FIG. 19B je prikaz strukture PCSK9 i 21B12 Ab.

FIG. 20A je prikaz strukture PCSK9 i EGFa iz LDLR prekrivenog strukturom antitela 31H4 i 21B12 vezanih za PCSK9.

FIG. 20B je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR.

FIG. 20C je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR iz alternativne perspektive.

FIG. 20D je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR sa uključenim strukturnim predstavljanjem 31H4 i 21B12.

FIG. 20E je prikaz strukturnog modela na FIG.20D, rotiranog za 90 stepeni oko ubeležene ose. FIG. 20F je prikaz strukturnog modela na FIG.20D, rotiranog za 180 stepeni oko ubeležene ose. FIG. 21A je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.

FIG. 21B je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.

FIG. 21C je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.

FIG. 21D je prikaz strukturnog modela cele dužine PCSK9 i 31A4.

FIG. 22 je set AVP sekvenci koje identifikuju različite razlike između humanih AVP sekvenci i AVP sekvenci koje su odgajene u E. coli i upotrebljene za kristalne strukture.

FIG. 23 je tabela različitih bining rezultata.

FIG. 23A je prvi deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

FIG. 23B je drugi deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

FIG. 23C je treći deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

FIG. 23D je četvrti deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.

FIG. 24A je prikaz western blota pod ne-redukovanim uslovima.

FIG. 24B je prikaz western blota pod redukovanim uslovima.

FIG. 25A je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 25B je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 25C je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 25D je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 25E je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 25F je prikaz pokrovne površine PCSK9.

FIG. 26 je poređenje sekvence PCSK9 amino kiselinske sekvence i svih ostataka koji su mutirali u PCSK9 varijantama radi ispitivanja epitopa različitih antitela.

FIG. 27A prikazuje 21B12 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 21B12.

FIG. 27B prikazuje 31H4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B1.

FIG. 27C prikazuje 31A4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9,00 sa 31H4 i 21B12.

FIG. 27D prikazuje 12H11 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B12.

FIG. 27E prikazuje 3C4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B12.

FIG. 28A je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVPa za različite delove PCSK9.

FIG. 28B je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVPa za različite delove PCSK9.

FIG. 28C je grafikon koji poredi sposobnost vezivanja LDLR od strane dva AVPa.

FIG. 28D je grafikon koji poredi aktivnost ćelijskog unosa LDL od strane dva AVPa.

DETALJNI OPIS ODREĐENIH PRIMERNIH OSTVARENJA

Ovde su opisani antigen vezujući proteini (kao što su antitela i njihovi funkcionalni vezujući fragmenti) koji se vezuju za PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 i sprečavaju PCSK9 da funkcioniše na različite načine. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini blokiraju ili redukuju sposobnost PCSK9 da interreaguje sa drugim supstancama. Na primer, u nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za PCSK9 na takav način da sprečava, ili redukuje, verovatnoću da će se PCSK9 vezati za LDLR. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 ali ne blokiraju

1

sposobnost PCSK9-ova da interreaguje sa LDLR. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su humana monoklonalna antitela.

Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, u svetlu ovog pronalaska, menjanje interakcija između PCSK9 i LDLR može povećati količinu LDLR koja je dostupna za vezivanje za LDL, što povratno smanjuje količinu LDL u serumu kod subjekta, rezultirajući redukcijom nivoa holesterola u serumu subjekta. Kao takvi, antigen vezujuću proteini za PCSK9 i kompozicije koje obuhvataju isti mogu se upotrebiti za tretiranje subjekata sa povišenim nivoima holesterola u serumu, koji su pod rizikom od povišenih nivoa holesterola u serumu, ili onih koji mogu imati koristi od redukcije nivoa holesterola u serumu. Prema tome, različite upotrebe i tehnike za snižavanje, održavanje, ili prevenciju povećanja holesterola u serumu su takođe ovde opisane. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein sprečava ili redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR.

Da bi bilo pogodnije, sledeća poglavlja generalno ističu različita značenja termina koji se ovde koriste. Sledeći ovu diskusiju, generalni aspekti koji razmatraju antigen vezujuće proteine su diskutovani, za kojim slede specifični primeri koji prikazuju karakteristike različitih ostvarenja antigen vezujućih proteina i kako se oni mogu upotrebiti.

Definicije i ostvarenja

Mora da se shvati da i gore pomenuti generalni opis i detaljni opisi koji slede su primerni i samo radi objašnjenja i nisu restriktivni u odnosu na pronalazak kao što je podneto u zahtevima. U ovoj prijavi, upotreba jednine uključuje množinu sem ako je specifično naznačeno drugačije. U ovoj prijavi, upotreba „ili" znači „i/ili" sem ako je naznačeno drugačije. Sem toga, upotreba termina „uključujući", kao i drugih oblika, kao što je „uključuje" i „uključeno", nije ograničavajuća. takođe, termini kao što je "element" ili "komponenta" obuhvataju i elemente i komponente obuhvatajući jednu jedinicu i elemente i komponente koji obuhvataju više od jedne podjedinice sem ako je specifično naznačeno drugačije. Takođe, upotreba termina "deo" može uključiti deo grupe ili celu grupu.

Naslovi poglavlja su ovde upotrebljeni samo radi organizacione namene i ne treba da se protumače kao ograničavajući za opisanu predmetnu materiju. Kao što se koristi prema ovom pronalasku, sledeći termini, sem ako je naznačeno drugačije, treba da se shvate tako da imaju sledeća značenja:

Termin „proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9" ili „PCSK9" odnosi se na polipeptid kao što je izneto u SEQ ID NO: 1 i/ili 3 ili njegove fragmente, kao i srodne polipeptide, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, alelske varijante, spojene varijante, izvedene varijante, supstitucione varijante, delecione varijante, i/ili insercione varijante uključujući adiciju

1

N-terminalnog metionina, fuzione polipeptide, i interspecijske homologe. U određenim ostvarenjima, PCSK9 polipeptid uključuje terminalne ostatke, kao što su, ali bez ograničenja na, ostatke vodećih sekvenci, ciljne ostatke, amino terminalne metionin ostatke, lizin ostatke, tag ostatke i/ili ostatke fuzionog proteina. „PCSK9" se takođe označava i kao FH3, NARC1, HCHOLA3, proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 9, i neuralna apoptozis regulisana konvertaseza 1. PCSK9 gen kodira proprotein konvertaza protein koji pripada podporodici proteinaze K porodice sekretorne subtilaze. Termin „PCSK9" označava i proprotein i produkt koji je generisan nakon autokatalisanja proproteina. Kada je iznet samo autokatalizovani produkt (kao što se to odnosi na antigen vezujući protein koji se selektivno vezuje za isečeni PCSK9), protein se može označiti kao "zreo", „rascepljen", „proizveden" ili „aktivn" PCSK9. Kada je izneta samo neaktivna forma, protein se može označiti kao „neaktivan", "pro-oblik", ili „neproizveden" oblik PCSK9. Termin PCSK9 onako kako se ovde koristi takođe uključuje alele koji se prirodno javljaju, kao što su mutacije D374Y, S127R i F216L. Termin PCSK9 takođe obuhvata PCSK9 molekule koji inkorporiraju post-translacione modifikacije sekvence PCSK9 amino kiseline, kao što su PCSK9 sekvence koje su glikozilirane, PEGilirane, PCSK9 sekvence iz kojih je isečena signalna sekvenca, PCSK9 sekvence iz kojih je isečen pro domen isečen iz katalitičkog domena ali nije odvojen od katalitičkog domena (npr., FIG.1A i 1B).

Termin „PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koji biološki efekt PCSK9. U određenim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da interreauguje ili se vezuje za supstrat ili receptor. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 je predstavljena sa sposobnošću PCSK9 da se vezuje za LDL receptor (LDLR). U nekim ostvarenjima, PCSK9 se vezuje za i katalizuje reakciju koja uključuje LDLR. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da izmeni (npr., redukuje) dostupnost LDLR. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da poveća količinu LDL kod subjekta. U nekim ostvarenjima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da smanji količinu LDLR koja je dostupna da se vezuje za LDL. U nekim ostvarenjima ,,PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koju biološku aktivnost koja je nastala od signaliranja PCSK9. Primerne aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na, PCSK9 vezivanje za LDLR, PCSK9 enzimsku aktivnost koja iseca LDLR ili druge proteine, PCSK9 vezivanje za druge proteine koji nisu LDLR koje olakšava PCSK9 delovanje, PCSK9 izmene APOB sekreciju (Sun X-M i sar, "Dokazi efekata mutantnog PCSK9 na sekreciju apoliproteina B kao slučaj neuobičajeno snažne dominantne hiperholesterolemije, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 i Ouguerram K i sar, "Metabolizam apolipoproteina B100 u autozomalno-dominantnoj hiperholesterolemije vezanoj za mutacije u PCSK9, Arterioscler thromb Vase Biol. 24: 1448-1453, 2004), PCSK9ovu ulogu u regeneraciji

1

jetre i diferenciranju neuronskih ćelija (Seidah NG i sar, "Sekretorni proprotein konvertaza neuralno apoptozis-regulisana konvertaza 1 (NARC-1): Regeneracija jetre i diferencijacija neurona" PNAS 100: 928-933, 2003), i PCSK9ova uloga u hepatičnom metabolizmu glukoze (Costet i sar., "Hepatična ekspresija PCSK9 je regulisana statusom ishrane preko insulina i sterol regulatornog element-vezujućeg proteina 1c" J. Biol. Chem.281(10):6211-18, 2006).

Termin „hiperholesterolemija", onako kako se ovde koristi, odnosi se na stanje u kojem su nivoi holesterola povišeni iznad željenog nivoa. U nekim ostvarenjima, to znači da su nivoi holesterola u serumu povišeni. U nekim ostvarenjima, željeni nivo uzima u obzir različite „faktore rizika“ koji su poznati stručnjaku (i koji su opisani ili izneti ovde referencom).

Termin „polinukleotid" ili „nukleinska kiselina" uključuje i pojedinačne jedno-lančane i dvo-lančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Pomenute modifikacije uključuju modifikacije baza kao što su derivati inozina, modifikacije riboze kao što je 2',3'-dideoksiriboza, i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat i fosforamidat.

Termin „oligonukleotid" označava polinukleotid koji obuhvata 200 ili manje nukleotida. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužinu. U drugim ostvarenjima, oligonukleotidi su 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 nukleotida u dužinu. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu u konstrukciji mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti sens ili antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može uključiti obeleživač, uključujući radioobeleživač, fluorescentni obeleživač, hapten ili antigeni obeleživač, za oglede detekcije. Oligonukleotidi se mogu upotrebiti, na primer, kao PCR prajmeri, prajmeri za kloniranje ili hibridizacione probe.

„Izolovani molekul nukleinske kiseline" označava genomsku DNK ili RNK, mRNK, cDNK, ili sintetičko poreko ili neku njihovu kombinaciju koja nije vezana sa svim ili delom od polinukleotida u kojem je izolovani polinukleotid nađen u prirodi, ili je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi. Za potrebe ovog pronalaska, trebalo bi da se shvati da „molekul nukleinske kiseline obuhvata" određenu nukleotidnu sekvencu koja ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovanii molekuli nukleinske kiseline „obuhvatajući" specifične sekvence nukleinske kiseline mogu uključiti, u dodatku na specifične sekvence, kodirajuće sekvence sve do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu uključiti operativno vezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu uključiti vektor sekvence.

1

Sem ako je određeno drugačije, kraj s leve strane bilo koje jedno-lančane sekvence ovde je 5' kraj; pravac sa leve strane sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nastajućih RNK transkripata je označen kao transkripcioni pravac; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 5' do 5' kraj RNK transkripta su označene kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 3' do 3' kraj RNK transkripta su označene kao „nizvodne sekvence".

Termin „kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja može uticati na ekspresiju i procesovanje kodirajućih sekvenci za koje je vezana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može zavisiti od organizma domaćina. U određenim ostvarenjima, kontrolne sekvence za prokariote mogu uključiti promotor, mesto vezivanja ribozoma, i sekvencu prekidanja transkripcije. Na primer, kontrolne sekvence za eukariote mogu uključiti promotore koji obuhvataju jedno ili mnoštvo mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence pojačivače transkripcije, i sekvencu prekidanja transkripcije. „Kontrolne sekvence" mogu uključiti vodeće sekvence i/ili fuzione partner sekvence.

Termin „vektor" označava bilo koji molekul ili entitet (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid, bakteriofag ili virus) upotrebljen da se prenese informacija koja kodira protein u ćeliju domaćina.

Termin „ekspresioni vektor" ili „ekspresioni konstrukt" odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (zajedno sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterolognih kodirajućih regiona operativno vezanih za njih. Ekspresioni konstrukt može uključiti, ali nije ograničen na, sekvence koje utiču ili kontrolišu transkripciju, translaciju, i, ako su prisutni introni, deluju na uplitanje RNK kodirajućeg regiona koji je tu operativno vezan.

Onako kako se ovde koristi, „operativno vezani" znači da su komponente na koje je termin primenjen u vezi koja im omogućuje da obave svoje bitne funkcije pod pogodnim uslovimna. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koji je „operativno vezan" za sekvencu koja kodira protein je tu vezan tako da se ekspresija sekvence koja kodira protein postigne pod uslovima koji su saglasni sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.

Termin „ćelija domaćin" označava ćeliju koja je bila transformisana, ili je sposobna da se transformiše, sa sekvencom nukleinske kiseline i na taj način eksprimira gen za koji postoji interes. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfološkom ili genetičkom smislu u odnosu na originalnu roditeljsku ćeliju, sve dok je gen za koji postoji interes prisutan.

1

Termin „transfekcija" znači uzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, i ćelija je „transfektovana" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Jedan broj tehnika transfekcije je dobro poznat u oblasti i dat je ovde u pronalasku. Vidi, npr., Graham i sar., 1973, Virology 52:456; Sambrook i sar., 2001, Molekularno kloniranje: Laboratorijski praktilum, supra; Davis i sar., 1986, Osnovni metodi u molekularnoj biologiji, Elsevier; Chu i sar., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike se mogu upotrebiti da se uvede jedan ili više egzogenih DNK grupa u pogodne ćelije domaćine.

Termin „transformacija" odnosi se na promenu u genetičkim karakteristikama ćelije i ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK ili RNK. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetički modifikovana u odnosu svoje nativno stanje putem uvođenja novog genetičkog materijala preko transfekcije, transdukcije, ili drugih tehnika. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK se može rekombinovati sa onom u ćeliji putem fizičke integracije u hromozom ćelije, ili se može održavati prolazno kao epizomalni element bez da bude replikovan, ili se može replikovati nezavisno kao plazmid. Smatra se da je ćelija „stabilno transformisana“ kada je DNK replikovana sa deobom ćelije.

Termin „polipeptid" ili „protein" označava makromolekul koji ima sekvencu amino kiseline nativnog proteina, a to je, protein produkovan od ćelije koja se javlja u prirodi i koja nije rekombinantna; ili je produkovan od strane genetički-konstrisane ili rekombinantne ćelije, i sadrži molekule koji imaju sekvencu amino kiseline nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije od, adicije na, i/ili supstitucije jedne ili više amino kiselina od nativne sekvence. Termin takođe uključuje polimere amino kiseline u kojima su jedna ili više amino kiselina hemijski analozi odgovarajućih amino kiselina ili polimera koji se javljaju u prirodi. Termini „polipeptid" i „protein" specifično obuhvataju PCSK9 antigen vezujuće proteine, antitela, ili sekvence koje imaju delecije od, adicije na, i/ili supstitucije jedne ili više amino kiselina od antigen-vezujućeg proteina. Termin „polipeptidni fragment" odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksil-terminalnu deleciju, i/ili internu deleciju u poređenju sa nativnim proteinom potpune dužine. Takvi fragmenti mogu takođe sadržati modifikovane amino kiseline u poređenju sa nativnim proteinom. U određenim ostvarenjima, fragmenti su dugački oko pet do 500 amino kiselina. Na primer, fragmenti mogu biti dugački najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 amino kiselina. Korisni polipeptidni fragmenti uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući domene vezivanja. U slučaju PCSK9-vezujućeg antitela, korisni fragmenti uključuju ali nisu ograničeni na CDR region, varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR-a, i tome slično.

2

Termin „izolovani protein" kada je upotrebljen označava da je subjektov protein (1) bez najmanje nekih drugih proteina sa kojima se uobičajeno nalazi, (2) u osnovi je bez drugih proteina iz istog izvora, npr., od iste vrste, (3) eksprimiran od strane ćelije kod različitih vrsta, (4) izdvojen od najmanje oko 50 posto od polinukleotida, lipida, ugljovodonika, ili drugih materijala sa kojima je vezan u prirodi, (5) operativno je vezan (sa kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije vezan u prirodi, ili (6) ne javlja se u prirodi. Tipično, „izolovani protein" se sastoji od najmanje oko 5%, od najmanje oko 10%, od najmanje oko 25%, od najmanje oko 50% od datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druge RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija mogu kodirati takav izolovani protein. Poželjno je izolovani protein gotovo u potpunosti bez proteina ili polipeptida ili drugih zagađivača sa kojima se nalazi u prirodnoj sredini i koji će se uplitati u njegovu terapeutsku, dijagnostčku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.

Termin „amino kiselina" uključuje njeno normalno značenje u ovoj oblasti.

„Varijanta" polipeptida (npr., antigen vezujući protein, ili antitelo) obuhvata sekvencu amino kiseline u kojoj su jedan ili više ostataka amino kiseline ubačeni u, delecirani iz i/ili supstituisani iz sekvence amino kiseline u drugu polipeptidnu sekvencu. Varijante uključuju fuzione proteine.

Termin „identičnost" odnosi se na vezu između sekvenci dva ili više polipeptidna molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kao što je određeno poklapanjem i poređenjem sekvenci. „Procenat identičnosti" označava procenat identičnih ostataka između amino kiselina ili nukleotida u poređenim molekulima i izračunat je na osnovu veličine najmanjeg molekula koji je poređen. Za ta izračunavanja, prekidi u poklapanjima (ako ih ima) su poželjno uključeni posebnim matematičkim modelom ili računarskim programom (tj., „algoritmom"). Metodi koji se mogu upotrebiti da se izračuna identičnost preklopljenih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one koji su opisani u Računarska molekularna biologija, (Lesk, A. M., izd.), 1988, New York: Oxford University Press; Bioračunarska informatika i genomski projekti, (Smith, D. W., izd.), 1993, New York: Academic Press; Računarska analiza podataka o sekvencama, Deo I, (Griffin, A. M., i Griffin, H. G., izd.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Analiza sekvence u molekularnoj biologiji, New York: Academic Press; Priručnik za analizu sekvence, (Gribskov, M. i Devereux, J., izd.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo i sar., 1988, SIAM J. Applied Math.48:1073.

U izračunavanju procenta identičnosti, sekvence koje se porede su tipično preklopljene na način koji daje najveće poklapanje između sekvenci. Jedan primer računarskog programa koji se može upotrebiti da se odredi procenat identičnosti je GCG programski paket, koji uključuje GAP (Devereux i sar., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). računarski algoritam GAP je upotrebljen da se preklope dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba da se odredi procenat identičnosti sekvence. Sekvence su preklopljene radi optimalnog poklapanja njihove odgovarajuće amino kiseline ili nukleotida („poklopljeni interval", kao što je to određeno sa algoritmom). Kazna koja nastaje zbog gapa (koja je izračunata kao 3x prosečna dijagonala, pri čemu je „prosečna dijagonala" prosek dijagonale matrice poređenja koja je upotrebljena; „dijagonala" je suma ili broj pridodat svakom savršenom poklapanju amino kiseline sa određenom matricom za poređenje) i gap proširena kazna (koja je obično 1/10 puta gap kazne otvaranja), kao i matrice za poređenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62 su upotrebljene zajedno sa algoritmom. U određenim ostvarenjima, standardna komparaciona matrica (vidi, Dayhoff i sar., 1978, Atlas sekvence proteina i struktura 5:345-352 za PAM 250 komaparacionu matricu; Henikoff i sar., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 za BLOSUM 62 komaparacionu matricu) je takođe upotreblje od strane algoritma.

Primeri parametara koji se mogu upotrebiti u određivanju procenta identičnosti za polipeptidne ili nukleotidne sekvence koristeći GAP program su sledeći:

● Algoritam: Needleman i sar., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453

● Komaparaciona matrica: BLOSUM 62 od Henikoff i sar.1992, supra

● Gap kazna: 12 (ali bez kazne za krajnje gapove)

● Kazna za dužinu gapa: 4

● Prag sličnosti: 0

Određene šeme preklapanja za poklapanje dve sekvence amino kiseline mogu rezultirati poklapanjem samo kratkog regiona dve sekvence, i taj mali poklopljeni region može imati vrlo visoku identičnost sekvence čak i ako nema značajne veze između pune dužine dve sekvence. Prema tome, odabrani metod preklapanja (GAP program) može se doterati ako se to želi da bi to rezultiralo poklapanjem koje ima interval od najmanje 50 ili drugi broj kontinuiranih amino kiselina ciljnog polipeptida.

Onako kako se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih (npr., koje se javljaju prirodno) amino kiselina i njihove skraćenice slede konvencionalnu upotrebu. Vidi Imunologija-Sinteza (2. izdanje, E. S. Golub i D. R. Gren, izd., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-amino kiseline) od dvadeset konvencionalnih amino kiselina, ne prirodne amino kiseline kao što su α-, α-disupstituisane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, laktonska kiselina, i druge nekonvencionalne amino kiseline mogu biti takođe pogodne komponente za polipeptide predmetnog pronalaska. Primeri nekonvencionalnih amino kiselina uključuju: 4hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetilizin, ε-N-acetillizn, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične amino kiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U obeležavanju polipeptida koje se ovde koristi, pravac sa leva je amino terminalni pravac a pravac s desna je karboksi-terminalni pravac, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

Slično tome, sem ako je naznačeno drugačije, pravac sa levog kraja sekvence jednolančanog polinukleotida je 5' kraj i; pravac sa leva sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nascentnog RNK transkripta je naznačeno kao pravac transkripcije; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' prema 5' kraju RNK transkripta su označeni kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence lanca DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' prema 3' kraju RNK transkripta naznačeni su kao „nizvodne sekvence."

Konzervativne supstitucije amino kiseline mogu obuhvatiti ostatke amino kiselina koje se ne javljaju prirodno, koje su tipično inkorporirane putem hemiske sinteze peptida pre nego sa sintezom u biološkim sistemima. Oni uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili invertovane oblike grupa amino kiselina.

Ostaci koji se prirodno javljaju mogu se podeliti u klase na osnovu uobičajenih karakteristika bočnog lanca:

1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, lie;

2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

3) kisele: Asp, Glu;

4) bazne: His, Lyz, Arg;

5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Na primer, ne-konzervativne supstitucije mogu uključiti razmenu jednog broja jedne od tih klasa za članove druge klase. Takvi supstituisani ostaci se mogu uvesti, na primer, u regione humanog antitela koja su homologna sa ne-humanim antitelima, ili u ne-homologe regione molekula.

U pravljenju promena antigen vezujući protein ili PCSK9 protein, prema određenim ostvarenjima, mora da se uzme u obzir hidropatični indeks aminokiseline. Svakoj amino kiselini je pripisan hidropatični indeks na osnovu njene hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja. Oni su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3);

2

prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).

Važnost hidropatičnog indeksa amino kiseline u davanju interaktivne biološke funkcije proteina je shvaćena u oblasti. Kyte i sar., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Poznato je da određene amino kiseline mogu biti supstituisane drugim amino kiselinama koje imaju sličan hidropatični indeks ili rezultat i još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. U pravljnju promena zasnovanih na hidropatičnom indeksu, u određenim ostvarenjima, supstitucija amino kiselina čiji hidropatični indeksi su u okviru ±2 je uključena. U određenim ostvarenjima, oni koji su u okviru ±1 su uključeni, i u određenim ostvarenjima, oni koji su u okviru ±0.5 su uključeni.

Takođe je shvaćeno u ovoj oblasti da supstitucija sličnih amino kiselina može efikasno da se obavi na osnovu hidrofilnosti, posebno gde je biološki funkcionalni protein ili peptid tako kreiran namenjen za upotrebu u imunološkim ostvarenjima, kao što je to u ovoj situaciji. U određenim ostvarenjima, najveća lokalna prosečna vrednost hidrofilnosti proteina, koja je vođena sa hidrofilnošćui susednih amino kiselina, u korelaciji je sa njenom imunogenošću i antigenošću, tj., sa biološkim karakteristikama proteina.

Sledeće vrednosti hidrofilnosti pridodate su tim ostacima amino kiselina: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ± 1); glutamat (+3.0 ± 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). Pri pravljenju promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u određenim ostvarenjima, supstitucija amino kiselina čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±2 su uključene, u određenim ostvarenjima, one čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±1 su uključene, u određenim ostvarenjima, one koje su u okviru ±0.5 su uključene. Neko može takođe da identifikuje epitope iz primarnih sekvenci amino kiseline na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni su takođe označeni kao „epitopni regioni jezgra."

Primerne supstitucije amino kiseline su iznete u Tabeli 1.

TABELA 1

Supstitucije amino kiseline

Termin „derivat" odnosi se na molekul koji uključuje hemijske druge modifikacije, a na insercije, delecije, ili supstitucije amino kiselina (ili nukleinskih kiselina). U određenim ostvarenjima, derivati obuhvataju kovalentne modifikacije, uključujući, ali bez ograničenja na, hemisko vezivanje sa polimerima, lipidima, ili drugim organskim ili neorganskim grupama. U određenim ostvarenjima, hemiski modifikovan antigen vezujući protein može imati veći poluživot cirkulisanja od antigen vezujućeg proteina koji nije hemiski modifikovan. U određenim ostvarenjima, hemiski modifikovan antigen vezujući protein može imati poboljšan kapacitet ciljanja za željene ćelije, tkiva, i/ili organe. U nekim ostvarenjima, izvedeni antigen vezujući protein je kovalentno modifikovan da uključi jedan ili više u vodi rastvorljivih pričvršćenja polimera, uključujući, ali bez ograničenja na, polietilen glikol, polioksietilen glikol, ili polipropilen glikol. Vidi, npr., U.S. Patent br: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417,4,791,192 i 4,179,337. U određenim ostvarenjima, izvedeni antigen vezujući protein

2

obuhvata jedan ili više polimera, uključujući, ali bez ograničenja na, monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celulozu, ili druge ugljovodonične zasnovane polimere, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer, polioksietilirane poliole (npr., glicerol) i polivinil alkohol, kao i mešavine takvih polimera.

U određenim ostvarenjima, derivat je kovalentno modifikovan polietilen glikolom (PEG) podjedinicama. U određenim ostvarenjima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je vezan na jdenoj ili više specifičnih pozicija, na primer, amino terminusu, derivata. U određenim ostvarenjima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je po principu slučajnosti pričvršćen za jedan ili više bočnih lanaca derivata. U određenim ostvarenjima, PEG je upotrebljen da poboljša terapeutski kapacitet za antigen vezujući protein. U određenim ostvarenjima, PEG je upotrebljen da poboljša terapeutski kapacitet za humanizovano antitelo. Određeni takvi metodi su diskutovani u, na primer, u U.S. Patentu br.6,133,426.

Analozi peptida se uobičajeno koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa karakteristikama analoga u odnosu na one od templet peptida. Ovi tipovi ne-peptidnih jedinjenja su označeni terminom „peptidni mimetici" ili „peptidomimetici". Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, str.392 (1985); i Evans i sar., J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Takva jedinjenja su često razvijena uz pomoć kompjuterizovanog molekularnog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se upotrebiti da se produkuje sličan terapeutski ili profilaktički efekat. Generalno su peptidomimetici strukturno slični paradigmi polipeptida (tj., polipeptida koji ima biohemisku karakteristiku ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali ima jednu ili više peptidnih veza po potrebi zamenjenih sa vezom odabranom od: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-(cis i trans),-COCH2--, --CH(OH)CH2--, i --CH2SO--, sa metodima koji su dobro poznati u oblasti. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin na mestu L-lizina) može se upotrebiti u određenim ostvarenjima da se generišu još stabilniji peptidi. Sem toga, napregnuti peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili gotovo u potpunosti identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se generisati putem metoda poznatih u praksi (Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); na primer, putem dodavanja internih ostataka cisteina sposobnih da formiraju intramolekularne disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.

Termin „koji se prirodno javlja" onako kako se koristi kroz prijavu u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije domaćina, i tome slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi ili u obliku materijala koji je nađen u prirodi.

2

„Antigen vezujući protein" („AVP") onako kako je ovde upotrebljen označava bilo koji protein koji vezuje određeni ciljni antigen. U trenutnoj prijavi, određeni ciljni antigen je PCSK9 protein ili njegov fragment. „Antigen vezujući protein" uključuje ali nije ogrničen na antitela i njegove vezujuće delove, kao što su imunološki funkcionalni fragmenti. Peptitela su drugi primer antigen vezujućih proteina. Termin „imunološki funkcionalni fragment" (ili jednostavno „fragment") antitela ili imunoglobulinski lanac (težak ili laki lanac) antigen vezujući protein, onako kako se ovde koristi, je vrsta antigen vezujućeg proteina koji obuhvata deo (bez obzira kako je taj deo dobijen ili sintetisan) antitela kojem nedostaju najmanje neke amino kiseline prisutne u lancu pune dužine ali koja su još uvek sposoba da se specifično vezuju za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni u tome što se oni vezuju za ciljni antigen i mogu biti u kompeticiji sa drugim antigen vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, za vezivanje na dati epitop. U nekim ostvarenjima, fragmenti su neutralizujući fragmenti. U nekim ostvarenjima, fragmenti mogu blokirati ili redukovati verovatnoću interakcije između LDLR i PCSK9. U jednom aspektu, takav fragment će zadržati najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, i u nekim ostvarenjima će obuhvatati pojedinačni teški lanac i/ili laki lanac ili njegov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu se produkovati pomoću tehnika rekombinantne DNK, ili se mogu produkovati enzimatskim ili hemijskim isecanjem antigen vezujućih proteina, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, dijatelo (teški lanac varijabilnog domena na istom polipeptidu kao i laki lanac varijabilnog domena, vezan preko kratkog peptidnog veznika koji je prekratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu), Fab', F(ab')2, Fv, domen antitela i pojedinačni-lanac antitela, i mogu biti izvedeni iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući ali bez ogrničenja na čoveka, miša, pacova, kamilu ili zeca. Dalje je zamišljeno da funkcionalni deo antigen vezujućih proteina otkrivenih ovde, na primer, jedan ili više CDRova, mogu biti kovalentno vezni za drugi protein ili za mali molekul da se kreira terapeutski agens usmeren na određenu metu u telu, koji poseduje bifunkcionalne terapeutske karakteristike, ili ima produženi polu-život u serumu. Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, antigen vezujući protein može uključiti neprotein komponente. U nekim poglavljima ovog pronalaska, primeri AVPa su ovde opisani u terminima „broj/slovo/broj" (npr., 25A7). U tim slučajevima, tačno ime označava specifično antitelo. A tako je, AVP nazvan 25A7 nije neophodno isti kao antitelo nazvano 25A7.1, (sem ako su oni eksplicitno izneti kao isti u specifikaciji, npr., 25A7 i 25A7.3). Kao što će to stručnjak shvatiti, u nekim ostvarenjima LDLR nije antigen vezujući protein. U nekim ostvarenjima, vezujuće podsekcije LDLR nisu antigen vezujući proteini, npr., EGFa. U

2

nekim ostvarenjima, drugi molekuli kroz koje PCSK9 signalira in vivo nisu antigen vezujući proteini. Takva ostvarenja biće eksplicitno identifikovana kao takva.

Određeni antigen vezujući proteini opisani ovde su antitela ili su izvedeni od antitela. U određenim ostvarenjima, struktura polipeptida antigen vezujućih proteina je zasnovana na antitelima, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (ponekad ovde naznačena kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde naznačena kao „konjugati antitela"), i njihovi fragmenti, respektivno. Ovi raznovrsni antigen vezujući proteini su ovde dalje opisani.

„Fc" region obuhvata dva teška lanca fragmenata obuhvatajući CH1 i CH2 domene antitela. Dva teška lanca fragmenata drže se zajedno sa dve ili više disulfidnih veza i sa hidrofobnim interakcijama CH3 domena.

„Fab fragment" obuhvata jedan laki lanac i CH1 i variablne regione jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može formirati disulfidnu vezu sa molekulom drugog teškog lanca.

„Fab' fragment" obuhvata jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i CH1 domen i takođe region između CH1 i CH2 domena, tako da međulančana disulfidna veza može da se formira između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da se formira F(ab')2molekul.

„F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da je međulančana disulfidna veza formirana između dva teška lanca. F(ab')2fragment je, prema tome, komponovan od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno sa disulfidnom vezom između dva teška lanca.

„Fv region" obuhvata varijabilne regione i od teških i od lakih lanaca, ali mu nedostaju konstantni regioni.

„Jedno-lančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teških i od lakih lanaca povezani sa fleksibilnim veznikom da formiraju pojedinačni polipeptidni lanac, koji formira antigen vezujući region. Jedno lančana antitela su detaljno diskutovana u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i Patentnoj prijavi Sjedinjenih Država br. 4,946,778 i br.

5,260,203.

„Domen antitela" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona su kovalentno vezana sa peptidnim veznikom da se kreira bivalentni domen antitela. Dva VHregiona bivalentnog domena antitela mogu ciljati isti ili različite antigene.

2

„Bivalent antigen vezujući protein" ili „bivalentno antitelo" obuhvata dva antigen vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezjujuća mesta imaju iste antigen specifikacije. Bivalent antigen vezujući proteini i bivalent antitela mogu biti bispecifična, vidi, infra. Bivalent antitelo koje nije „višestruko specifično" ili „višestruko funkcionalno" antitelo, u određenim ostvarenjima, tipično se podrazumeva da ima identično svako mesto svog vezivanja.

„Višestruko specifični antigen vezujući protein" ili „višestruko specifično antitelo" je ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa.

„Bispecifični", „dvostruko-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen vezujući protein ili antitelo je hibridni antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koje ima dva različita antigen vezujuća mesta. Bispecifični antigen vezujući proteini i antitela su vrsta višestruko specifičnih antigen vezujućih proteinskih antitela i mogu se produkovati putem mnoštva metoda uključujući, ali bez ograničenja na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Vidi, npr., Songsivilai i Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny i sar., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Dva mesta vezivanja bispecifičnog antigen vezujućeg proteina ili antitela će se vezati za dva različita epitopa, koji mogu da se nađu na istim ili različitim proteinskim metama.

Za antigen vezujući protein kaže se da „specifično vezuje" svoj ciljni antigen kada je konstanta disocijacije (Kd) ≤10-7 M. AVP specifično vezuje antigen sa „visokim afinitetom" kada je Kd≤5 x 10-9 M, i sa „vrlo visokim afinitetom" kada je Kd≤5x 10-10 M. U jednom ostvarenju, AVP ima Kdod ≤10-9 M. U jednom ostvarenju, disocijacija je <1 x 10-5. U drugim ostvarenjima, AVPi će se vezati za humani PCSK9 sa Kdod između oko 10-9 M i 10-13 M, u još jednom drugom ostvarenju AVPi će se vezati sa Kd≤5 x 10<-10>. Kao što će to biti shvaćeno od stručnjaka, u nekim ostvarenjima, neki ili svi antigen vezujući fragmenti mogu se specifično vezati za PCSK9.

Antigen vezujući protein je „selektivan" kada se vezuje za jednu metu mnogo čvršće nego što se vezuje za drugu metu.

„Antigen vezujući region" podrazumeva protein, ili deo proteina, koji specifično vezuje specifični antigen (npr., paratop). Na primer, onaj deo antigen vezujućeg proteina koji sadrži ostatke amino kiseline koji interreaguju sa antigenom i donose antigen vezujućem proteinu njegovu specifičnost i afinitet za antigen je označen kao „antigen vezujući region". Antigen vezujući region tipično uključuje jedan ili više „komplementarno vezujućih regiona" („CDRova"). Određeni antigen vezujući regioni takođe uključuju jedan ili više „skeletnih" regiona. „CDR" je sekvenca amino kiseline koja doprinosi specifičnosti vezivanja antigena i afinitetu. „Skeletni" regioni mogu doprinositi u održavanju odgovarajuće konformacije CDRova

2

da se pokrene vezivanje između antigen vezujućeg regiona i antigena. Strukturno, skeletni regioni se mogu locirati u antitelima izmđu CDRova. Primeri skeleta i CDR regiona prikazani su na FIG.. 2A-3D, 3CCC-3JJJ, i 15A-15D. Na primer, sekvence za CDRove za laki lanac antitela 3B6 su sledeće: CDR1 TLSSGYSSYEVD (SEQ ID NO: 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (SEQ ID NO: 280); CDR3 GADHGSGTNFWV (SEQ ID NO: 281), i FRove su sledeće: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (SEQ ID NO: 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (SEQ ID NO: 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (SEQ ID NO: 284); i FR4 FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 285).

U određenim aspektima, obezbeđeni su rekombinantni antigen vezujući proteini koji vezuju PCSK9, na primer humani PCSK9. U tom kontekstu, „rekombinantni antigen vezujući protein" je protein napravljen koristeći rekombinantne tehnike, tj., preko ekspresije rekombinantne nukleinske kiseline kao što je to ovde opisano. Metodi i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznate u oblasti.

Termin „antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin bilo kog izotopa, ili njegovog fragmenta koji može biti u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje za ciljni antigen, i uključuje, na primer, himerična, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. „Antitelo" je vrsta antigen vezujućeg proteina. Intaktno antitelo će generalno obuhvatati najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim slučajevima može uključiti manje lanaca kao što je kod antitela koja se prirodno javljaju kod kamelida koja mogu obuhvatati samo teške lance. Antitela mogu se izvesti samo iz jednog izvora, ili mogu biti „himerična", što znači da različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kao što je dalje opisano dole. Antigen vezujući proteini, antitela, ili vezujući fragmenti mogu se produkovati u hibridomima, tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim isecanjem intaktnih antitela. Sem ako je naznačeno drugačije, termin „antitelo" uključuje, u dodatku na antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove mutacije, čiji primeri su opisani dole. Sem toga, osim ako su eksplicitno isključena, antitela uključuju monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domene antitela, sintetička antitela (ponekad ovde označena kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde označena kao „konjugovana antitela"), i njihove fragmente, respektivno. U nekim ostvarenjima, termin takođe obuhvata peptitela.

Strukturne jedinice antitela koja se prirodno javljaju tipično obuhvataju tetramer. Svaki takav tetramer tipično je komponovan od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan pune dužine „laki“ (u nekim ostvarenjima, oko 25 kDa) i jedan pune dužine „teški“ "lanac (u odrešenim ostvarenjima, oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino kiselina koje su tipično odgovorne za prepznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantni region koji može biti odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci tipično su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotop antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali bez ograničenja na, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM ima podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljen u podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgA1 i IgA2. U okviru lakih i teških lanaca pune dužine, tipično su varijabilni i konstantni regioni spojeni sa „J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje „D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Vidi, npr., Osnovna imunologija, pog. 7 (Paul, W., izd., 2, izd. Raven Press, N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično formiraju antigen vezujuće mesto.

Varijabilni regioni tipično pokazuju neku generalnu strukturu od relativno kozerviranih skeletnih regiona (FR) spojenih zajedno sa tri hiper varijabilna regiona, takođe nazvana komplementarno determinišući regioni ili CDRovi. CDRovi od dva lanca od svakog para tipično su poravnati sa skeletnim regionima, koji mogu omogućiti vezivanje za specifični epitop. Od N-terminalnog do C-terminalnog, varijabilni regioni i lakog i teškog lanca tipično obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje amino kiselina svakom domenuje je tipično u skladu sa definicijama Kabat sekvenci proteina od imunološkog interesa (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia i sar., Nature, 342:878-883 (1989).

U određenim ostvarenjima, definitivni nacrt CDR i identifikacija ostataka koji obuhvataju vezujuće mesto antitela je obavljena putem rešavanja strukture antitela i/ili sa rešavanjem strukture kompleksa antitelo-veznik. U određenim ostvarenjima, koja mogu biti obavljena sa bilo kojom od mnoštva tehnika poznatih stručnjaku, kao što je kristalografija X-zracima. U određenim ostvarnjima, mogu se upotrebiti različiti metodi analize da se identifikuju ili učine približnim CDR regioni. Primeri takvih metoda uključuju, ali nisu ograničeni na, Kabat definiciju, Chothia definiciju, AbM definiciju i kontaktnu definiciju.

Kabat definicija je standard za numerisanje ostataka u antitelu i tipično se upotrebljava da se identifikuju CDR regioni. Vidi, npr., Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). Chothia definicija je slična Kabat definiciji, ali Chothia definicija uzima u obzir pozicije određenih strukturnih petlji regiona. Vidi, npr., Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia i sar., Nature, 342: 877-83 (1989). AbM definicija koristi integrisane nastavke

1

računarskih programa produkovanih od strane Oxford Molecular Group koja modelira strukturu antitela. Vidi, npr., Martin i sar., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, kompjuterski program za modeliranje varijabilnih regiona antitela", Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. AbM definicija modeluje tercijarnu strukturu antitela za primarnu sekvencu koristeći kombinaciju baza podataka znanja i ab initio metode, kao što su oni opisani od strane Samudrala i sar., "Ab initio predviđanje strukture proteina pomoću pristupa kombinovane hijerarhije" u PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999). Kontaktna definicija je zasnovana na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Vidi, npr., MacCallum i sar., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).

Prema konvenciji, CDR regioni u teškom lancu su tipično označeni kao H1, H2, i H3 i numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja. CDR regioni u lakom lancu su tipično označeni kao L1, L2, i L3 numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja.

Termin „laki lanac" uključuje laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijailnog regiona da obezbede specifično vezivanje. Laki lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Domen varijabilnog regiona lakog lanca je na amino-kraju polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.

Termin „teški lanac" uključuje teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog regiona da da obezbede specifično vezivanje. Teški lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, i CH3. VHdomen je na amino-kraju polipeptida, i CHdomeni su na karboksi-kraju, sa CH3 koji je najbliže karboksi-kraju polipeptida. Teški lanci mogu biti od bilo kog izotopa, uključujući IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (uključujući IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE.

Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita teška/laka para lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se produkovati mnoštvom tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Vidi, npr., Songsivilai i sar., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny i sar., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).

Neke vrste sisara takođe produkuju antitela koja imaju samo jedan teški lanac.

Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac je tipično sastavljen od nekoliko „imunoglobulinkish domena", od kojih se svaki sastoji od približno 90 do 110 amino kiselina i ima karakteristike uvijene šeme. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih su komponovana

2

antitela polipeptida. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; i IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C region teškog lanca tipično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, sadrže tri domena C regiona poznatih kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja su obezbeđena mogu imati bilo koji od tih izotipova i podtipova. U određenim ostvarenjima predmetnog pronalazka, anti-PCSK9 antitelo je od IgG2 ili IgG4 podtipa.

Termin „varijabilni region" ili „varijabilni domen" odnosi se na deo lakih i/ili teških lanaca antitela, tipično uključujući približno amino-kraj 120 do 130 amino kiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 amino terminalnih amino kiselina u lakom lancu. U određenim ostvarenjima, varijabilni regioni različitih antitela ekstenzivno se razlikuju u sekvenci amino kiseline čak i među antitelima od iste vrste. Varijabilni region antitela tipično određuje specifičnost određenog antitela za njegovu metu.

Termin „neutralizujući antigen vezujući protein" ili „neutralizujuće antitelo" odnosi se na antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koje se vezuje za veznik i sprečava ili redukuje biološki efekat tog veznika. To se može uraditi, na primer, putem direktnog blokiranja mesta vezivanja na vezniku ili putem vezivanja za veznik i menjajući sposovnost veznika da se veže putem indirektnih načina (kao što je strukturno ili energetsko menjanje u vezniku). U nekim ostvarenjima, termin može takođe označiti antigen vezujući protein koji sprečava protein za koji je vezan da obvi biološku funkciju. U procenjivanju vezivanja i/ili specifičnosti antigen vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog fragmenta, antitelo ili fragment mogu gotovo u potpunosti inhibirati vezivanje veznika za njegovog partnera vezivanja kada višak antitela redukuje količinu partnera za vezivanje za veznik za najmanje oko 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% ili više (kao što je mereno u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). U nekim ostvarenjima, u slučaju PCSK9 antigen vezujućih proteina, kao što je neutralizujući molekul može se smanjiti sposobnost PCSK9 da vezuje LDLR. U nekim ostvarenjima, sposobnost neutralizovanja je okarakterisana i/ili opisana preko ogleda kompeticije. U nekim ostvarenjima, sposobnost neutralizovanja je opisana u terminima IC50ili EC50vrednosti. AVPi 27B2, 13H1, 13B5 i 3C4 su ne-neutralizujući AVPi, 3B6, 9C9 i 31A4 su slabo neutralizujući, i preostali AVPi u Tabeli 2 su snažni neutralizatori. U nekim ostvarenjima, antitela ili antigen vezujući proteini neutralizuju putem vezivanja za PCSK9 i sprečavanja PCSK9 da se vezuje za LDLR (ili redukujući sposobnost PCSK9 da se vezuje za LDLR). Ovde su takođe opisana antitela ili AVPi koji neutralizuju putem vezuvanja za PCSK9, i dok još uvek omogućuju da se PCSK9 vezuje za LDLR, sprečavanje ili redukovanje PCSK9 je posredovalo degradaciju LDLR. Prema tome, takvi neutralizujući AVP ili antitelo može još uvek dozvoliti PCSK9/LDLR vezivanje, ali će sprečiti (ili redukovati) uzastopno PCSK9 uključeno degradiranje LDLR.

Termin „meta" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom. U nekim ostvarenjima, meta može imati jedan ili više epitopa. U određenim ostvarenjima, cilj je antigen. Upotreba „antigen" u frazi „antigen vezujući protein" jednostavno označava da sekvenca proteina koja obuhvata antigen može biti vezana sa antitelom. U tom kontekstu, ona ne zahteva da protein bude strani ili da je sposoban da indukuje imuni odgovor.

Termin „u kompeticiji" kada se koristi u kontekstu antigen vezujućih proteina (npr., neutralizujućih antigen vezujućih proteina ili neutralizujućih antitela) koja su u kompeticiji za isti epitop označava kompeticiju između antigen vezujućih proteina kao što je određeno sa ogledom u kojem je antigen vezujući protein (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment) bio testiran da li sprečava ili inhibira (npr., redukuje) specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina (npr., veznik, ili referentno antitelo) za uobičajeni antigen (npr., PCSK9 ili njegov fragment). Brojni tipovi ogleda kompetitivnog vezivanja mogu se upotrebiti da se odredi da li je neki antigen vezujući protein u kompeticiji sa drugim, na primer: direktni ili indirektni radioimuno ogled čvrste faze (RIA), direktni ili indirektni enzimski imuno ogled čvrste faze (EIA), sendvič ogled kompeticije (vidi, npr., Stahli i sar., 1983, Metodi u enzimologiji 9: 242-253); direktni biotin-avidin čvrste faze EIA (vidi, npr., Kirkland i sar., 1986, J. Immunol.

137:3614-3619) direktni ogled obeležavanja čvrste faze, direktni sendvič ogled obeležavanja čvrste faze (vidi, npr Harlow i Lane, 1988, Antitela, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktni ogled obeležavanja čvrste faze RIA koristeći I-125 obeleživač (vidi, npr., Morel i sar., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); direktnit biotin-avidin čvrste faze EIA (vidi, npr., Cheung, i sar., 1990, Virology 176:546-552); i direktni obeleženi RIA (Moldenhauer i sar., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipično, takav ogled uključuje upotrebu vezivanja prečišćenog antigena za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo šta od toga, neobeleženi test antigen vezujući protein i obeleženi referentni antigen vezujući protein. Kompetitivna inhibicija je merena putem određivanja količine vezivanja obeleživača za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test antigen vezujućeg proteina. Uobičajeno je test antigen vezujući protein prisutan u višku. Antigen vezujući proteini identifikovani sa ogledom kompeticije (kompeticija antigen vezujućih proteina) uključuje vezivanje antigen vezujućih proteina za isti epitop kao i referentni antigen vezujući proteini i vezivanje antigen vezujućih proteina za susedni epitop dovoljno proksimalno u odnosu na epitop vezan sa referentnim antigen vezujućim proteinom da se javi sterična prepreka.

4

Dodatni detalji koji se odnose na metode za određivanje kompetitivnog vezivanja su obezbeđeni ovde u primerima. Obično, kada je kompetitivni antigen vezujući protein prisutan u višku, on će inhibirati (npr., redukovati) specifično vezivanje za referentni antigen vezujući protein za uobičajeni antigen za najmanje 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ili 75% ili više. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ili 97% ili više.

Termin „antigen" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se veže sa selektivno vezujućim agensom, ko što je antigen vezujući protein (uključujući, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalni fragment). U nekim ostvarenjima, antigen je sposoban da se upotrebi u životinji da se produkuju antitela sposobna da se vezuju za taj antigen. Antigen može posedovati jedan ili više epitopa koji su sposobi da interreaguju sa različitim antigen vezujućim proteinima, npr., antitelima.

Termin „epitop" uključuje bilo koju determinantu sposobnu da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom, kao što je antitelo ili za T-ćelijski receptor. Epitop je region antigena koji je vezan sa antigen vezujućim proteinom koji cilja antigen, i kada je antigen protein, uključuje specifične amino kiseline koje direktno kontaktiraju antigen vezujući protein. Najčešće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu se smestiti na drugu vrstu molekula, kao što su nukleinske kiseline. Determinante epitopa mogu uključiti hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonile grupe, i mogu imati specifične tro dimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferentno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.

Onako kako se ovde koristi, „gotovo u potpunosti čist" znači da je opisani tip molekula preovlađujuće prisutna kod tip, a to je, na molarnoj osnovi mnogo učestaliji nego bilo koji drugi tip u istoj mešavini. U određenim ostvarenjima, gotovo u potpunosti čist molekul je kompozicija u kojoj tip objekta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj osnovi) od svih prisutnih makromolekularnih tipova. U drugim ostvarenjima, gotovo u potpunosti čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% od svih makromolekularnih tipova prisutnih u kompoziciji. U drugim ostvarenjima, ciljni tip je prečišćen do esencijalne homogenosti pri čemu kontaminirani tipovi ne mogu da se detektuju u kompoziciji putem konvencionalnih metoda detekcije i, prema tome se kompozicija sastoji od pojedinačno detektabilnih makromolekularnih tipova.

Termin „agens" se koristi ovde da naznači hemijsko jedinjenje, mešavinu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.

Onako kako se koriste ovde, termini „obeleživač" ili „obeleženi" odnosi se na inkorporaciju detektabilnog markera, npr., putem inkorporacije radioobeležene amino kiseline ili pričvršćenja za polipeptid biotin grupa koji se mogu detektovati markiranim avidinom (npr., fluorescentni marker koji sadrži streptavidin ili enzimatskom aktivnošću koja se može detektovati sa optičkim ili kolorimetrijskim metodima). U određenim ostvarenjima, obeleživač ili marker može takođe biti terapeutski. Različiti mtodi obeležavanja polipeptida i glikoproteina poznati su u oblasti i mogu se upotrebiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne obeleživače (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfor), enzimatske obeleživače (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalina fosfataza), hemiluminescentne, biotinil grupe, prethodno određene polipeptidne epitope prepoznate od strane sekundarnog reportera (npr., leucin ziper par sekvence, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni koji vezuju metal, tagovi epitopa). U određenim ostvarenjima, obeleživači su pričvršćeni sa razdvajajućim granama različitih dužina da se redukuju potencijalne sterične prepreke.

Termin „biološki uzorak", onako kako se ovde koristi, uključuje, ali bez ograničenja na, bilo koju količinu supstance od žive stvari ili prethodno žive stvari. Takve žive stvari uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve, i druge životinje. Takve supstance uključuju substance, ali bez ograničenja na, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kosti, kostnu srž, limfne čvorove, i kožu.

Termin „kompozicija farmaceutskog agensa" (ili agens ili lek) onako kako se ovde koristi odnosi se na hemijsko jedinjenje, kompoziciju, agens ili lek sposoban da indukuje željeni terapeutski efekt kada se daje na odgovarajući način pacijentu. Nije neophodan više nego jedan tip sastojka.

Termin „terapeutski efektivna količina" odnosi se na količinu PCSK9 antigen vezujućeg proteina koja je određena da produkuje terapeutski odgovor kod sisara. Takve terapeutski efektivne količine se mogu lako potvrditi od strane stručnjaka.

Termin „modulator", onako kako se ovde koristi, je jedinjenje koje menja ili zamenjuje aktivnost ili funkciju molekula. Na primer, modulator može uzrokovati povećanje ili smanjenje u magnitudi određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa magnitudom aktivnosti ili funkcije zapaženom u otsustvu modulatora. U određenim ostvarenjima, modulator je inhibitor, koji smanjuje magnitudu najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Određene primerne aktivnosti ili funkcije molekula uključuju, ali nisu ograničene na, afinitete vezivanja, enzimatsku aktivnost, i transdukciju signala. Određene primerne inhibicije uključuju, ali nisu ograničene na, proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljovodonike ili male organske molekule. Peptitela su opisana u, npr., U.S. Patent br.6,660,843 (koji odgovara PCT prijavi br. WO 01/83525).

Termini „pacijent" i "subjekt" se koriste naizmenično i uključuju humane i ne-humane životinjske subjekte kao i one sa formalno dijagnostifikovanim poremećajima, one bez formalno prepoznatih poremećaja, one koji primaju medicinsku negu, one koji su pod rizikom da razviju poremećaje, itd.

Termin „tretiranje" i „tretman" uključuju terapeutske tretmane, profilaktičke tretmane, i primene u kojima neko redukuje rizik da će subjekt razviti poremećaj ili drugi faktor rizika. Tretman ne zahteva kompletno lečenje poremećaja i obuhvata ostvarenja u kojima neko redukuje simptome ili istaknute faktore rizika.

Termin „sprečava" ne zahteva 100% eliminaciju mogućnosti ili događaja. Radije, on označava da je verovatnoća odigravanja događaja redukovana u prisustvu jedinjenja ili metoda.

Standardne tehnike se mogu upotrebiti za rekombinantnu DNK, sinteze oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporaciju, lipofekciju). Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti prema upotstvima proizvođača ili kao što se to uobičajeno obavlja u praksi ili je opisan ovde u pronalasku. Sledeće tehnike i procedure mogu se generalno izvesti prema konvencionalnim metodima dobro poznatim u praksi i kao što je opisano u različitim opštim i više specifičnim referencama koje su citirane i diskutovane kroz predmetnu prijavu. Vidi, npr., Sambrook i sar., Molekularno kloniranje: laboratirijski priručnik (2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Sem ako su obezbeđene specifične definicije, nomenklature koje su upotrebljene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hemija, sintetička organska hemija, i medicinska i farmaceutska hemija koje su opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno upotrebljene u praksi. Standardne tehnike se mogu upotrebiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije, formulacije, i isporuku, i tretman pacijenata.

Antigen vezujući proteini za PCSK9

Proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulciju nivoa niske gustine lipoproteinskog receptora (LDLR) proteina (Horton i sar., 2007; Seidah i Prat, 2007). PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) porodici serin proteaza (Seidah i sar., 2003). Primerna humana PCSK9 sekvenca amino kiseline je prezentovana kao SEQ ID NO: 1 i 3. na FIG. 1A (opisuje „pro" domen proteina kao što je podvučeno) i FIG. 1B (prikazuje signalnu sekvencu podebljano i pro domen podvučen). Primerna humana PCSK9 kodirajuća sekvenca je predstavljena kao SEQ ID NO: 2 (FIG. 1B). Onako kako je ovde opisano, PCSK9 proteini mogu takođe uključiti fragmente pune dužine PCSK9 proteina. Struktura PCSK9 proteina je nedavno bila razrešena od strane dve grupe (Cunningham i sar., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, i Piper i sar., Structure, 15:1-8, 2007). PCSK9 uključuje signalnu sekvencu, N-terminalni prodomen, subtilizin-nalik katalitički domen i C-terminalni domen.

Antigen vezujući proteini (AVPi) koji vezuju PCSK9, uključujući humani PCSK9, su obezbeđeni ovde. Antigen vezujući proteini prema ovom pronalasku kao što su ovde definisani u priloženim patentnim zahtevima. U nekim antigen vezujućim proteinima, CDRovi su ugrađeni u „skeletni" region, koji orijentiše CDR(ove) tako da je dostignuta odgovarajuća antigen vezjuća karakteristika CDR(ova). Antigen vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu interferirati sa, blokirati, redukovati ili modulisati interakciju između PCSK9 i LDLR. Takvi antigen vezujući proteini su označeni kao "neutralizujući." U nekim ostvarenjima, neutralizujući AVP se vezuje za PCSK9 na lokaciji i/ili način koji sprečava PCSK9 da se vezuje za LDLR. Takvi AVPi mogu biti specifično opisani kao „kompetitivno neutralizujući" AVPi. Ovo može rezultovatui velikom količinom slobodnog LDLR koji je prisutan u subjektu, koji rezultira sa više LDLR vezanog za LDL (redukujući na taj način količinu LDL kod subjekta). U odgovoru, to rezultira redukcijom u količini serum holesterola prisutnog kod subjekta.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obezbeđeni ovde su sposobni da inhibiraju PCSK9-posredovanu aktivnost (uključujući vezivanje). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini koji se vezuju za te epitope inhibiraju, inter alia, interakcije između PCSK9 i LDLR i druge fiziološke efekte posredovane sa PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su humani, kao što su potpuno humana antitela za PCSK9.

U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za zreli oblik PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje u prodomenu PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se selektivno vezuje za zreli oblik PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje na katalitički domen na takav način da PCSK9 ne može da se veže ili veže sa istom efikasnošću kao LDLR. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za c-terminus katalitičkog domena. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za n-terminus katalitičkog domena. U nekim ostvarenjima, AVP se ne vezuje za nili c-terminus PCSK9 proteina. U nekim ostvarenjima, to se može odrediti putem ogleda kompeticije između antitela otkrivenih ovde i drugih antitela. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za specifično konformaciono stanje PCSK9 tako da se spreči PCSK9 da interreaguje sa LDLR. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za V domen PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za V domen PCSK9 i sprečava (ili redukuje) PCSK9 od vezivanja za LDLR.

Antigen vezujući proteini koji su ovde opisani višestruko su korisni. Neki od antigen vezujućih proteina, na primer, su korisni u ogledu specifičnog vezivanja, afinitetnog prečišćavanja PCSK9, u određenim humanim PCSK9 ili njegovim veznicima i u ogledima skrininga da se identifikuju drugi antagonisti PCSK9 aktivnosti. Neki od antigen vezujućih proteina su korisni za inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR, ili inhibiranje PCSK9-posredovane aktivnosti.

Antigen vezujući proteini mogu se upotrebiti u mnoštvu terapeutskih primena, kao što je ovde objašnjeno. Na primer, u nekim ostvarenjima PCSK9 antigen vezujući proteini su korisni za tretiranje stanja vezanih sa PCSK9, kao što su poremećaji vezani sa holesterolom (ili poremećaji vezani sa serum holesterolom") kao što je hiperholesterolemija, kao što je ovde dalje opisano. Druge upotrebe antigen vezujućih proteina uključuju, na primer, dijagnozu PCSK9-vezanih bolesti ili stanja i skrining oglededa se odredi prisustvo ili otsustvo PCSK9. Neki od antigen vezujućih proteina opisanih ovde su korisni u tretiranju posledica, simptoma, i/ili patologija vezanih sa aktivnošću PCSK9.

Polipeptidna struktura može imati mnoštvo različitih oblika. Na primer, ona može biti, ili obuhvatiti, skelet antitela koja se prirodno javljaju, ili njihov fragment ili njegovu varijantu, ili mogu biti kompletno sintetičke prirode. Primeri različitih polipeptidnih struktura su opisani dalje dole.

U određenim ostvarenjima, polipeptidna struktura antigen vezujućih proteina je antitelo ili je izvedena od antitela, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domene antitela, sintetička antitela (ponekad označena ovde kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, fuziona antitela (ponekad označena ovde kao „konjugati antitela"), i delove ili fragmente od svakog, respektivno. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, ili scFv). Različite strukture su dalje ovde opisane i definisane.

Neki od antigen vezujućih proteina ovde opisanih specifično i/ili selektivno se vezuju za humani PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein specifično i/ili selektivno se vezuje za humani PCSK9 protein koji ima i/ili obuhvata ostatake 153-692 od SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima AVP se specifično i/ili selektivno vezuju za humani PCSK9 koji ima i/ili obuhvata ostatake 31-152 od SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima, AVP se selektivno vezuje za humani PCSK9 protein kao što je prikazano na FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). U nekim ostvarenjima, antigen vezjući protein specifično se vezuje za najmanje jedan fragment od PCSK9 proteina i/ili protein PCSK9 pune dužine, sa ili bez signalne sekvence.

U nekim ostvarenjima gde je antigen vezujući protein upotrebljen za terapeutske primene, antigen vezujući protein može inhibirati, interferirati sa, ili modulisati jednu ili više bioloških aktivnosti PCSK9. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se specifično za humani PCSK9 i/ili ili gotovo u potpunosti inhibira vezivanje humanog PCSK9 za LDLR za najmanje oko 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, ili više (na primer, putem merenja u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). Neki od antigen vezujućih proteina koji su ovde obezbeđeni su antitela. U nekim ostvarenjima, AVP ima Kdmanje od (vezuje se mnogo čvršće) od 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 , 10-12 , 10-13 M. U nekim ostvarenjima, AVP ima IC50za blokiranje vezivanja LDLR za PCSK9 (D374Y, varijnta visokog afiniteta) od manje od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM, 100 nM do 10 nM, 10nM do 1 nM, 1000pM do 500pM, 500 pM do 200 pM, manje od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM.

Jedan primer IgG2 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela predmetnog pronalaska ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 154, FIG.3KK.

Jedan primer IgG4 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela predmetnog pronalaska ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 155, FIG.3KK Jedan primer kapa konstantnog domena lakog lanca anti-PCSK9 antitela ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 157, FIG.3KK.

Jedan primer lambda konstantnog domena lakog lanca od anti-PCSK9 antitela ima sekvencu amino kiseline kao što je prikazana u SEQ ID NO: 156, FIG.3KK.

Varijabilni regioni imunoglobulinskih lanaca generalno pokazuju istu ukupnu strukturu, obuhvatajući relativno konzerviran region kostura (FR) spojen sa tri hipervarijabilna regiona, mnogo češće nazvana „komplemetarni determinišući regioni " ili CDRovi. CDRovi od dva lanca od svakog teškog lanca/laki lanac para spomenutih gore tipično su poravnati sa regionima kostura da formiraju strukturu koja se vezuje specifično sa specifičnim epitopom na ciljni protein (npr., PCSK9). Od N-kraja do C-kraja, varijabilni regioni lakog i teškog lanca koji se prirodno javljaju i jedni i drugi tipično konformiraju sa sledećim redosledom elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Pronađen je sistem numerisanja za dodeljivanje brojeva amino kiselinama koje zauzimaju pozicije na svakom od tih domena. Ovaj sistem numerisanja je definisan u Kabatovom Sekvence proteina od imunološkog interesa (1987 i 1991, NIH, Bethesda, MD), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia i sar., 1989, Nature 342:878-883.

Razni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca su ovde opisani na FIG. 2A-3JJ i 3LL-3BBB. U nekim ostvarenjima, svaki od tih varijabilnih regiona može se pričvrstiti za gornji teški i laki lanac konstantnog regiona da formira kompletno antitelo teškog i lakog lanca,

4

respektivno. Dalje, svaka od tako generisanih sekvenci teškog i lakog lanca može se kombinovati da formira kompletnu strukturu antitela.

Specifični primeri nekih od varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela koja su opisana i njihove odgovarauće sekvence amino kiseline su sumarizovane u TABELI 2.

TABELA 2

Primerni varijabilni regioni teškog i lakog lanaca

Ponovo, svaki od primernih varijabilnih teških lanaca nabrojan u Tabeli 2 može se kombinovati sa bilo kojim od primernih varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 da se formira antitelo. Tabela 2 prikazuje primerno sparivanje lakih i tečkih lanaca nađeno kod nekoliko antitela koja su ovde otkrivena. U nekim situacijama, antitela uključuju najmanje jedan varijabilni teški lanac i jedan varijabilni laki lanac od onih nabrojanih u Tabeli 2. U drugim slučajevima, antitelo sadrži dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Kao jedan primer, antitelo ili antigen vezujući protein može uključiti teški lanac i laki lanac, dva teška lanca, ili dva laka lanca. Primeri CDRova i FRova za teške i lake lance zabeleženi u Tabeli 2 su podvučeni na FIG. 2A-3D (i drugim ostvarenjima na FIG. 3CCC-3JJJ i 15A-15D). U nekim od zapisa na FIG. 2A-3D, varijatcije sekvenci ili alternativne veze od CDRova i FRova su identifikovane. Ove alternative su identifikovane sa "v1" sledeći AVP ime. Pošto je većina ovih alternativa minorna u prirodi, samo delovi sa razlikama su prikazani u tabeli. Shvaćeno je da je preostali deo lakog ili teškog lanca isti kao što je prikazano za osnovni AVP u drugim panelima. Prema tome, na primer, 19H9v1 na FIG. 2C ima isti FR1, CDR1, i FR2 kao 19H9 na FIG. 2A pošto je jedina razlika zabeležena na FIG.2C. Za tri sekvence nukleinske kiseline (AVPi 26E10, 30B9, i 31B12), obezbeđene su dodatne alternativne sekvence nukleinske kiseline na FIG.. Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, nije potrebno da se više nego jedna takva sekvenca upotrebi u kreiranju antitela ili AVP. I sakako, u nekim ostvarenjima, samo jedan ili nijedan od specifičnih teških ili lakih lanaca nukleinskih kiselina mora da bude prisutan.

U nekim slučajevima, AVP je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja može koditrati bilo koju sekvencu proteina iz Tabele 2.

U nekim ostvarenjima, AVP se selektivno vezuje za PCSK9 koji se vezuje za LDLR (npr., autokatalizovani oblik molekula). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za c-kraj katalitičkog domena (npr., 5. 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 većina amino kiselina u c-kraju). U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se ne vezuje za n-kraj katalitičkog domena (npr., 5.5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 većina amino kiselina u nkraju). U nekim ostvarenjima, AVP vezuje amino kiseline sa amino kiselinama 1-100 od zrelog oblika PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za amino kiseline u (i/ili sekvenca amino kiseline se sastoji od) amino kiseline 31-100, 100-200, 31-152, 153-692, 200-300, 300-400, 452-683, 400-500, 500-600, 31-692, 31-449, i/ili 600-692. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen. U nekim ostvarenjima, neutralizujući AVP se vezuje za prodomen. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje i za katalitički domen i za prodomen. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje i za katalitički domen tako da vrši opstrukciju područja na kataličkom domenu koji interreaguje sa pro domenom. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen na lokaciji ili površini ka kojoj pro domen interreaguje sa kao što je naglašeno Piper i sar. (Structure 15:1-8 (2007), uključujući strukturna predstavljanja u njima). U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen i restrikuje mobilnost pro-domena. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen bez vezivanja za pro-domen. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za katalitički domen bez vezivanja za pro-domen, dok sprečava da se pro-domen reorejentiše da omogući PCSK9 da se veže za LDLR. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za isti epitop kao oni okolni ostatci 149-152 od pro-domena u Piper i sar. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za udubljenje (kao što je istaknuto u Piper i sar.) u V domenu. U nekim ostvarenjima, AVPi se vezuje za histidin-bogati region proksimalno udubljnju na V domenu. U nekim slučajevima, takva antitela (koja se vezuju za V domen) nisu neutralizujuća. U nekim ostvarenjima, antitela koja se vezuju za V domen su neutralizujuća i sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim slučajevima, neutralizujući AVPi, dok sprečavaju PCSK9 da degradadira LDLR, ne sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR (na primer AVP 31A4). U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za, ili blokira najmanje jedan od histidina opisanih u Figuri 4 u članku Piper i sar. U nekim ostvarenjima, AVP blokira katalitičku trijadu u PCSK9.

U nekim ostvarenjima, antitelo se selektivno vezuje za varijantu PCSK9 proteina, npr., D374Y preko divljeg tipa PCSK9. U nekim ostvarenjima, ova antitela se vezuju za varijantu najmanje dva puta jaču od divljeg tipa, i poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000, 1000-10,000 puta ili više za mutantni nego za divlji tip (kao što je mereno preko Kd). U nekim ostvarenjima, antitelo selektivno inhibira varijantu D374Y PCSK9 od interreagovanja sa LDLR preko divljeg tipa PCSK9-ova sposobnost da interreaguje sa LDLR. U nekim ostvarenjima, ova antitela blokiraju sposobnost varijante da se vezuje za LDLR mnogo jače od sposobnosti divljeg tipa npr., najmanje dva puta jače od divljeg tipa, i poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 puta ili više mutant nego divlji tip (kao što je mereno preko IC50). U nekim ostvarenjima, antitelo se vezuje za i neutralizuje i divlji tip PCSK9 i varijantne oblike PCSK9, kao i D374Y na sličnim nivoima.

4

U nekim ostvarenjima, antitelo se vezuje za PCSK9 da se spreče varijante LDLR u vezivanju za PCSK9. U nekim ostvarenjima, varijante LDLR su najmanje 50% identične humanom LDLR. Napomenuto je da su varijante LDLR poznate stručnjacima (npr., Brown MS i sar., "kalcijumski kavezi, kisela kupatila i reciklirajući receptori" Nature 388: 629-630, 1997). U nekim ostvarenjima, AVP može podići nivoe efektivnosti LDLR u heterozigotnoj porodičnoj hiperholesterolemiji (gde je prisutan gubitak funkcije varijante LDLR).

U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za (ali ne blokira) varijante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom na FIG. 1A i/ili FIG. 1B. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za (ali ne blokira) variante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom na FIG. 1A i/ili FIG. 1B. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za i sprečava varijante od PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom na FIG. 1A i/ili FIG. 1B od interreagovanja sa LDLR. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje za i sprečava varijante PCSK9 koje su najmanje 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenta identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom na FIG. 1B od interreagovanja sa LDLR. U nekim ostvarenjima, varijanta PCSK9 je humana varianta, kao što je varijanta na poziciji na 474, E620G, i/ili E670G. U nekim ostvarenjima, aminokiselina na poziciji 474 je valin (kao i kod drugih ljudi) ili treonin (kao što je kod makakija i miša). Pošto su podaci unakrsne reaktivnosti ovde predstavljeni smatra se da će predmentna antitela lako da se vezuju za gornje varijante.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za specifično konformaciono stanje PCSK9 tako da spreče da PCSK9 interreaguje sa LDLR.

Humanizovani antigen vezujući proteini (npr., antitela)

Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein za PCSK9 može obuhvatiti humanizovano antitelo i/ili njegov deo. Važna praktična primena takve strategije je "humanizacija" mišjeg humoralnog imunog sistema.

U određenim ostvarenjima, a humanizovano antitelo je gotovo u potpunosti neimunogeno kod ljudi. U određenim oblicima, humanizovano antitelo ima gotovo u potpunosti isti afinitet za metu kao antitelo iz druge vrste od koje je izvedeno humanizovano antitelo. Vidi, npr., U.S. Patent 5,530,101, U.S. Patent 5,693,761; U.S. Patent 5,693,762; U.S. Patent 5,585,089.

U određenim ostvarenjima identifikovane su amino kiseline varijabilnog domena antitela koje mogu biti modifikovane bez umanjivanja prirodnog afiniteta domena vezivanja antigena dok se istovremeno redukuje njegova imunogenost. Vidi, npr., U.S. Patent br. 5,766,886 i 5,869,619.

U određenim ostvarenjima modifikacija antitela metodama poznatim u oblasti je tipično dizajnirana tako da se postigne povećani afinitet vezivanja za metu i/ili da se redukuje imunogenost antitela u primaocu. U određenim ostvarenjima humanizovana antitela su modifikovana da se eliminišu mesta glikozilacije sa ciljem da se poveća afinitet antitela za njegov srodni antigen. Vidi, npr., Co i sar., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). U određenim ostvarenjima, tehnike kao što je "ponovno oblikovanje", "hiperhimerizacija," ili "oblaganje/obnavljanje površine" su upotrebljene da se produkuju humanizovana antitela. Vidi, npr., Vaswami i sar., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105 (1998); Roguska i sar., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); i U.S. Patent br. 6,072,035. U određenim takvim ostvarenjima, takve tehnike tipično redukuju imunogenost antitela putem redukovanja broja stranih ostataka, ali ne sprečavaju anti-idiotipne i anti-alotipne odgovore praćene ponovljenim davanjem antitela. Određeni drugi metodi za redukovanje imunogenosti su opisani, npr. u Gilliland i sar., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999).

U određenim slučajevima, humanizacija antitela rezultira gubitkom kapaciteta vezivanja antigena. U određenim ostvarenjima, humanizovana antitela su „ponovo mutirana". U određenim takvim ostvarenjima, humanizovano antitelo je mutirano tako da uključi jedan ili više ostataka amino kiseline nađene u donorskom antitelu. Vidi, npr., Saldanha i sar., Mol Immunol 36:709-19 (1999).

U određenim ostvarenjima komplementarni determinišući regioni (CDRovi) varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK9 mogu se graftovati u skeletne regione (FRove) iz iste, ili druge vrste. U određenim ostvarenjima, CDRovi varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK9 mogu se graftovati u konsenzus humanih FRova. Da se kreiraju konsenzus humani FRovi, u određenim ostvarenjima, FRovi iz humanih sekvenci amino kiselina teških ili lakih lanaca su poravnati da se identifikuju sekvence konsenzus amino kiseline. U određenim ostvarenjima, FRovi antitela za PCSK9 teški ili laki lanac su zamenjeni sa FRovima iz različitog teškog ili lakog lanca. U određenim ostvarenjima, retke amino kiseline u FRovima teških i lakih lnaca antitela za PCSK9 nisu zamenjene, dok je ostatak FR amino kiselina zamenjen. Retke amino kiseline su specifične amino kiseline koje su na pozicijama na kojima se one ne nalaze uobičajeno u FRovima. U određenim ostvarenjima, graftovani varijabilni regioni od antitela za PCSK9 mogu se upotrebiti sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona od antitela za PCSK9. U određenim ostvarenjima, graftovani varijabilni regioni su deo pojedinačnog lanca Fv antitela. CDR graftovanje je opisano u, npr., u U.S. Patent br.6,180,370,

4

6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, i 5,530,101, i u Jones i sar., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i sar., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998).

Humani antigen vezujući proteini (npr., antitela)

Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 može obuhvatati humano (tj., potpuno humano) antitelo i/ili njegov deo. U određenim ostvarenjima, obezbeđne su nukleotidne sekvence koje kodiraju, sekvence amino kiseline obuhvataju, teški ili laki lanac imunoglobulinskih molekula, posebno sekvence koje odgovaraju varijabilnim regionima. U određenim ostvarenjima obezbeđene su, sekvence koje odgovaraju komplementarnom determinišućem regionu (CDRovi), specifično od CDR1 do CDR3. U određenim ostvarenjima, prečišćeno humano monoklonalno antitelo je humani PCSK9.

Neko može konstruisati mišje sojeve deficijentne za produkciju mišjeg antitela sa velikim fragmentima humanog Ig lokusa u predviđanju da će taj miš produkovati humana antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu sačuvati veliku varijabilnu gensku raznovrsnost kao i odgovarajuću regulaciju produkcije antitela i ekspresije. Putem eksploatisanja mišje mašinerije za raznovrsnost antitela i selekciju i nedostatak imunoološke tolerantnosti na humane proteine, repertoar reprodukovanih humanih antitela u tim mišjim sojevima može dati visok afinitet potpuno humanih antitela protiv bilo kog antigena za koji postoji zainteresovanost, uključujući humane antigene. Koristeći tehnologiju hibridoma, antigen-specifični humani MAbovi sa opisanom specifičnošću mogu se produkovati i odabrati. Određeni primerni metodi su opisani u WO 98/24893, U.S. Patentu br.5,545,807, EP 546073, i EP 546073.

U određenim ostvarenjima, neko može upotrebiti konstantne regione od drugih vrsta koje nisu humane zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima).

Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus megabazne veličine u veštačkim hromozomima kvasca (YACovi) i da se oni unesu u mišju germinativnu liniju obezbeđuje pristup rasvetljavanju funkcionalnih komponenti vrlo velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i generisanje korisnih modela humanih bolesti. Sem toga, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjeg lokusa sa njegovim humanim ekvivalentima može obezbediti uvid u ekspresiju i regulaciju produkata humanog gena tokom razvića, njihove komunikacije sa drugim sistemima, i njihovo uključivanje u indukciju i progresiju bolesti.

Humana antitela izbegavaju neke od problema vezanih sa antitelima koja poseduju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih mišjih ili pacovskih izvedenih proteina može dovesti do brzog ćišćenja antitela ili može voditi do generisanja imunog odgovora protiv antitela od strane pacijenta. Sa ciljem da se izbegne upotreba mišjih ili pacovskih

4

izvedenih antitela, potpunih humanih antitela može se generisati kroz uvođenjem lokusa funkcionalnog humanog antitela u glodara, drugog sisara ili životinju tako da glodar, drugi sisar ili životinja produkuju potpuna humana antitela.

Humanizovana antitela su ona antitela koja, dok inicijalno polaze od sekvenci amino kiseline koju sadrže koje nisu humane, imaju najmanje neke od tih ne humanih sekvenci amino kiseline antitela zamenjene sa sekvencama humanog antitela. To je u kontrastu sa humanim antitelima, u kojima je antitelo kodirano (ili sposobno da bude kodirano) sa genima koje poseduje čovek.

Antigen vezujuće varijante proteina

Druga antitela koja su ovde opisana su varijante AVPa nabrojanih gore formiranih sa kombinacijom ili pod delovima varijabilnih teških i varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 i obuhvataju varijabilne lake i/ili varijabilne teške lance koji imaju svaki najmanje 90-95%, 95-97%, 97-99%, ili više 99% identiteta sa sekvencama amino kiseline od sekvenci iz Tabele 2 (ili cela sekvenca ili poddeo sekvence, npr., jedan ili više CDR). U nekim slučajevima, takva antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac, dok u drugim slučajevima varijantni oblici sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca (ili njihove podelove). CDRovi prikazani na FIG.13A, 13C, 13F, i 13G su definisani na osnovu hibridne kombinacije iz Chothia metoda (zasnovanog na lokaciji strukturne petlje regiona, vidi, npr., „Standardne konformacije za kanoniske strukture imunoglobulina", Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk i Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 November (1997)) i Kabat metoda (zasnovanog na varijabilnosti sekvence, vidi, npr., Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje. NIH Publikacija br. 91-3242, Kabat i sar., (1991)). Svaki ostatak određen sa bilo kojim metodom je uključen u konačnu listu CDR ostataka (i predstavljen na FIG.. 13A, 13C, 13F, i 13G). CDRovi na FIG..13H, 13I, i 13J su dobijni sa samim Kabat metodom. Sem ako je određeno drugačije, definisane konsenzus sekvence, CDRovi, i FRovi na FIG. 13H-13J će definisati i kontrolisati zabeležene CDRove i FRove za iznete AVPove na FIG.13.

Antigen vezujući protein prema ovom pronalasku obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 90% identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 71, 72, 67, 52, 51, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 64, 62, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region, koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 95% identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 71, 72, 67, 52, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 64, 62, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata teški lanac koji obuhvata

4

varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 99% identičnu sekvenci amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 71, 72, 67, 52, 51, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 64, 62, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više CDRova od CDRova u njmanje jedenoj od sekvnci od SEQ ID NO: 71, 72, 67, 52, 51, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 64, 62, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više FRova od FRova u najmanje jednoj sekvenci od SEQ ID NO: 71, 72, 67, 52, 51, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 64, 62, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83. U nekim ostvarenjima prisutan je 1, 2, 3, ili 4 FR (svaki je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan sa gornjim sekvencama).

Antigen vezujući protein prema ovom pronalasku obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 90% identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 95% identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata sekvencu amino kiseline najmanje 99% identičnu sa sekvencom amino kiseline odabrane od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 3133, 35, 36, 37, 38, 39, 40.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više CDRova od CDRova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više FRova od FRova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 9, 10, 12, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40.

U svetlu ovog pronalaska, stručnjak će biti u stanju da odredi pogodne varijante od AVPa kao što su ovde dalje iznete koristeći dobro poznate tehnike. U određenim ostvarenjima, stručnjak može identifikovati pogodna područja molekula koja mogu biti promenjena bez

4

uništavanja aktivnosti sa ciljnim regionima za koje se ne veruje da su važni za aktivnost. U određenim ostvarenjima, neko može identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. U određenim ostvarenjima, čak i područja koja mogu biti važna za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti predmet konzervativnih supstitucija amino kiseline bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnih uticaja na polipeptidnu strukturu.

Sem toga, stručnjak može sagledati studije struktra-funkcija identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U svetlu takvih poređenja, neko može predvideti važnost ostataka amino kiseline u proteinu koji odgovaraju ostacima amino kiseline koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak može tragati za hemijski sličnim supstitucijama amino kiseline za takve predviđene važne ostatke amino kiseline.

Stručnjak može takođe analizirati tro-dimenzionalnu strukturu i sekvencu amino kiseline u odnosu na tu strukturu u sličnim AVPa. U svetlu takve informacije, stručnjak može predvideti poklapanje ostataka amino kiseline antitela u odnosu na njegovu tro-dimenzionalnu strukturu. U određenim ostvarenjima, stručnjak može izabrati da ne napravi radikalne promene ostataka amino kiseline predviđenih da budu na površini proteina, pošto takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može generisati test varijante koje sadrže supstituciju pojedinačne amino kiseline na svakom željenom ostatku amino kiseline. Varijante mogu zatim da se pregledaju koristeći oglede aktivnosti poznate stručnjku. Takve varijante se mogu upotrebit da se sakupe informacije o pogodnim varijantama. Na primer, ako neko otkrije da promena u oderđeni ostatak amino kiseline rezultira uništenjem, neželjenim redukovanjem, ili nepogodnom aktivnosti, varijante sa takvom promenom mogu se izbeći. Drgim rečima, na osnovu informationcija sakupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako odrediti amino kiseline gde dalje supstitucije treba da se izbegnu bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

Jedan broj naučnih publikacija je posvećen predviđanu sekundarne strukture. Vidi Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou i sar., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou i sar., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou i sar., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou i sar., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou i sar., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Štaviše, računarski programi su trenutno dostupni da pomognu u predviđanju sekundarne strukture. Jedan metod u predviđanju sekundarne strukture je zasnovan na modeliranju homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvence veću od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturne topologije. Skorašnji rast baze podataka za strukturne proteine (PDB) obezbedio je povećanu mogućnost predviđanja

4

sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj zavoja u strukturi polipeptida ili proteina. Vidi Holm i sar., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Sugerisano je (Brenner i sar., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničeni broj zavoja u datom polipeptidu ili proteinu i da jednom kada kritični broj struktura bude razrešen, predviđanja strukture će postati dramatično više pouzdana.

Dodatni metodi za predviđanje sekundarne strukture uključuju „zavijanje" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl i sar., Structure, 4(1):15-19 (1996)), „analizu profila" (Bowie i sar., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov i sar., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), i „evoluciono vezivanje" (Vidi Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)).

U određenim ostvarenjima, varijante antigen vezujućeg proteina uključuju glikozilaciju varijanti u kojoj je broj i/ili tip mesta glikozilacije izmenjen u poređenju sa sekvencama amino kiseline roditeljskog polipeptida. U određenim ostvarenjima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj N-vezanih mesta glikozilacije od nativnog proteina. N-vezano mesto glikozilacije je okarakterisano sa sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde ostatak amino kiseline označen kao X može biti bilo koji ostatak amino kiseline sem prolina. Supstitucija ostataka amno kiseline da se kreira ta sekvenca obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-vezanog ugljovodoničnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu tu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani ugljovodonični lanac. Takođe je obezbeđen rearanžman N-vezanih ugljovodoničnih lanaca u kojim N-vezana mesta glikozilacije (tipično ona koja se prirodno javljaju) su eliminisana i kreirano je jedno ili više novih N-vezanih mesta. Dodatne poželjne varijante antitela uključuju varijante cisteina u kojima su jedan ili više cisteinskih ostataka delecirani iz ili supstituisani sa drugom amino kiselinom (npr., serin) u poređenju sa roditeljskom sekvencom amino kiseline. Varijante cisteina mogu biti korisne kada antitela moraju da se ponovo uviju u biološki aktivnu komformaciju kao što je nakon izolacije nerastvorljivih inkluzionih tela. Varijante cisteina generalno imaju manje ostataka cisteina od nativnog proteina, i tipično imaju isti broj da minimizuju interakcije koje nastaju zbog nesparenih cisteina.

Prema određenim ostvarenjima, supstitucije amino kiselina su one koje: (1) redukuju suspektnost na proteolizu, (2) redukuju suspektnost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) donose ili modifikuju druge fizikokohemijske ili funkcionalne karakteristike takvih polipeptida. Prema određenim ostvarenjima, pojedinačne ili višestruke supstitucije amino kiseline (u određenim ostvarenjima, konzervativne supstitucije amino kiseline) mogu se napraviti u sekvenci koja se prirodno javlja (u određenim ostvarenjima, u delu polipeptida izvan domena formiranja intermolekularnih kontakata). U određenim ostvarenjima, konzervativna supstitucija amino kiseline tipično ne može da gotovo u potpunosti promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena amino kiseline ne bi trebalo da ima tendenciju da razbije spiralu koja se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili raskine druge tipove sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu). Primeri u oblasti prepoznatljivih polipeptida sekundarnih i tercijernih struktura opisani su u Proteini, strukture i molekularni principi (Creighton, Ed., W. H. Freeman i Company, New York (1984)); Uvod u strukturu proteina (C. Branden & J. Tooze, izd., Gariand Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton i sar., Nature, 354:105 (1991).

U nekim ostvarenjima, varijante su varijante sekvenci nukleinske kiseline od AVPa ovde otkrivenih. Stručnjak će prihvatiti da gornja diskusija može da se upotrebi za identifikovanje, procenu, i/kreiranje varijanti AVP proteina i takođe za sekvence nukleinske kiseline koje mogu kodirati te varijante proteina. Prema tome, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju te varijante proteina (kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju AVPe kao što su definisani u patentnim zahtevima ali se razlikuju od onih koji su eksplicitno ovde otkriveni) se uzimaju u razmatranje.

Priprema antigen vezujućih proteina (npr., antitela)

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini (kao što su antitela) produkovani su putem imunizacije sa antigenom (npr., PCSK9). U određenim ostvarenjima, antitela se mogu produkovati putem imunizacije sa PCSK9 pune dužine, rastvorljivim oblikom PCSK9, samim katalitičkim domenom, zrelim oblikom PCSK9 prikazanim na FIG.1A, rascepljenom varijantom od PCSK9, ili njegovim fragmentom. U određenim ostvarenjima, antitela pronalaska mogu biti poliklonalna ili monoklonalna, i/ili mogu biti rekombinantna antitela. U određenim ostvarenjima, antitela pronalaska su humana antitela pripremljena, na primer, putem imunizacije transgenih životinja sposobnih da produkuju humana antitela (vidi, na primer, PCT publikovanu patentnu prijavu br. WO 93/12227).

U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti određene strategije da se manipulišu bitne karakteristike antitela, kao što je afinitet antitela za njegovu metu. Takve strategije uključuju, ali nisu ograničene na, upotrebu za mesto specifične ili slučajne mutageneze polinukleotidnih molekula koji kodiraju antitelo da se generiše varijanta antitela. U određenim ostvarenjima, takvo generisanje je praćeno pregledanjem za varijante antitela koja pokazuju željenu promenu, npr., povećan ili smanjen afinitet.

U određenim ostvarenjima, amino kiseline u regionima kostura varijabilnih domena su ciljevi. U određenim ostvarenjima, pokazano je da takvi regioni kostura doprinose

1

karakteristikama vezivanja za metu u određenim antitelima. Vidi, npr., Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) i reference u njemu.

U određenim ostvarenjima, manje ili više efektivno pregledane biblioteke varijanti antitela su produkovane pomoću slučajne restrikcije ili mutageneze usmerene na mesto do hipermutacionih mesta u CDRovima, koji su mesta koja odgovaraju područjima sklonim da mutiraju tokom mutacionih procesa somatičnih afiniteta. Vidi, npr., Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) i reference koje su tu. U određenim ostvarenjima, određeni tipovi DNK elemenata mogu se upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključujući, ali bez ograničenja na, određene direktne i invertovane ponovke, određene konsenzus sekvence, određene sekundarne strukture, i određene palindrome. Na primer, takvi DNK elementi koji se mogu upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključuju, ali bez ograničenja na, tetrabazne sekvence koje sadržr purin (A ili G), praćene sa guaininom (G), praćene sa pirimidinom (C ili T), praćene sa bilo adenozinom ili timidinom (A ili T) (tj., A/G-G-C/T-A/T). Drugi primer DNK elementa koji se može upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta je serin codon, A-G-C/T.

Priprema potpuno humanih AVPa (npr., antitela)

Prema određenim ostvarenjima, antitela pronalaska su pripremljena putem upotrebe transgenog miša koji ima značajan deo humanog antitela koji produkuje genom koji je ubačen ali koji je učinjen deficijentnim u produkciji endogenih, mišjih antitela. Takvi miševi, su zatim, sposobni da produkuju humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficijentni su u produkciji mišjih molekula imunoglobulina i antitela. Tehnologije koje su upotrebljene da se dostigne taj rezultat su otkrivene u patentima, prijavama i referencama koje su prikazane ovde u specifikaciji. U određenim ostvarenjima, neko može upotrebiti metode kao što su oni otkriveni u PCT publikovanoj prijavi br. WO 98/24893 ili u Mendez i sar., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

Generalno, potpuno humani monoklonalni AVPi (npr., antitela) specifična za PCSK9 mogu se produkovati na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže gene humanog imunoglobulina su imunizovana sa antigenom za koji postoji interes, npr. PCSK9, dobijene su limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) od miševa sa određenim antitelom. Takve obnovljene ćelije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mieloidnog tipa da se pripreme besmrtne ćelijske linije hibridoma, i u takvim ćelijskim linijama hibridoma je rađen skrining i selektovane su da se identifikuju ćelijske linije hibridoma koje produkuju antitela specifična za antigen za koji postoji interes. U određenim ostvarenjima, obezbeđena je produkcija ćelijske linije hibridoma koja produkuje antitela specifična za PCSK9.

2

U određenim ostvarenjima, potpuno humana antitela produkovana su izlaganjem humanih splenocita (B ili T ćelije) antigenu in vitro, i zatim rekonstituisanjem izloženih ćelija kod imunokompromitovanog miša, npr., SCID ili nod/SCID. Vidi, npr., Brams i sar., J.Immunol.

160: 2051-2058 (1998); Carballido i sar., Nat. Med., 6: 103-106 (2000). U određenim takvim pristupima, engraftovanje humanog fetalnog tkiva u SCID miševe (SCID-hu) rezultira dogotrajnom hematopoezom i razvićem humane T-ćelije. Vidi, npr., McCune i sar., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen i sar., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). U određenim slučajevima, humoralni imuni odgovor kod takvih himeričnih miševa je zavisan od zajedničkog razvitka humanih T-ćelija u životinji. Vidi, npr., Martensson i sar., Immunol., 83:1271-179 (1994). U određenim pristupima, humani limfociti periferne krvi su transplantirani u SCID miševe. Vidi, npr., Mosier i sar., Nature, 335:256-259 (1988). U određenim takvim ostvarenjima, kada su takve transplantirane ćelije tretirane ili sa agensom za započinjanje, kao što je Staphylococcal Enterotoxin A (SEAili sa anti-humanim CD40 monoklonalnim antitelima, detektovan je viši nivo produkcije B ćelija. Vidi, npr., Martensson i sar., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy i sar., Blood, 86:1946-1953 (1995).

Prema tome, u određenim ostvarenjima, potpuna humana antitela se mogu produkovati ekspresijom rekombinantne DNK u ćeliji domaćina ili ekspresijom u hibridoma ćelijama. U drugim ostvarenjima, antitela se mogu produkovati koristeči tehnike izlaganja faga opisane ovde.

Antitela koja su ovde opisana pripremljena su kroz upotrebu XenoMouse® tehnologije, kao što je ovde opisano. Takvi miševi, onda, su sposobni da produkuju molekule humanog imunoglobulina i antitela i deficijentni su u odnosu na produkciju molekula mišjeg imunoglobulina i antitela. Za ostvarenje toga upotrebljene su tehnologije koje su otkrivene u patentima, prijavama i referencama ovde prikazanim u pozadini poglavlja. Posebno, međutim, poželjnio ostvarenje transgene produkcije miševa i njihovih antitela je otkriveno u U.S. patentnoj prijavi serijski br.08/759,620, podnetoj s decembra, 1996 i međunarodnoj patentnoj prijavi WO 98/24893, publikovanoj 11 juna, 1998 i WO 00/76310, publikovanoj 21 decembra, 2000. Vidi takođe Mendez i sar., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

Kroz upotrebu takve tehnologije, produkovana su potpuno humana monoklonalna antitela za mnoštvo antigena. U osnovi, XenoMouse<®>linije miševa su imunizovane sa antigenom za koji postoji interes (npr. PCSK9), limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su izdvojene iz hiperimunzovanih miševa, i obnovljeni limfociti su fuzionisani sa ćelijskom linijom mieloidnog-tipa da se pripremi besmrtna ćeljska linija hibridoma. Ove ćelijske linije hibridoma su skrinovane i selektovane da se identifikuje ćelijska linija hibridoma koja produkuje antitela specifična za antigen za koji postoji interes. Ovde su obezbeđeni metodi za produkciju višestrukih ćelijskih linija hibridoma koje produkuju antitela specifična za PCSK9Г. Dalje je ovde obezbeđena karakterizacija antitela produkovanih od takvih ćelijskih linija, uključujuću analizu nukleotida i sekvence amino kiseline od teškog i lakog lanca takvih antitela.

Produkcija XenoMouse® sojeva miševa je dalje diskutovana i istaknuta u U.S. Patentnoj prijavi serijski br. 07/466,008, podnetoj 12 januara, 1990, 07/610,515, podnetoj 8 novembra, 1990, 07/919,297, podnetoj 24 jula, 1992, 07/922,649, podnetoj 30 jula, 1992, 8/031,801, podnetoj 15 marta, 1993, 08/112,848, podnetoj 27 avgusta, 1993, 08/234,145, podnetoj 27 aprila, 1994, 08/376,279, podnetoj 20 januara, 1995, 08/430, 938, podnetoj 27 aprila, 1995, 08/464,584, podnetoj 5 juna, 1995, 08/464,582, podnetoj 5 juna, 1995, 08/463,191, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,837, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,853, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,857, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,859, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,513, podnetoj 5 juna, 1995, 08/724,752, podnetoj 2 oktobra, 1996, 08/759,620, podnetoj 3 decembra, 1996, U.S. publikacije 2003/0093820, podnetoj 30 novembra, 2001 i U.S. Patent br. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i Japanski Patent br. 3 068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Vidi takođe Evropski Patent br., EP 0 463 151 B1, stipendija publikovan 12 juna, 1996, Internatcionalnu patentnu prijavu br., WO 94/02602, publikovanu 3 februara, 1994, Internatcionalnu patentnu prijavu br., WO 96/34096, publikovanu 31 oktobra, 1996, WO 98/24893, publikovanu 11 juna, 1998, WO 00/76310, publikovanu 21 decembra, 2000.

U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili „minilokus" pristup. U mini lokus pristupu, egzogeni Ig lokus je mimikriran kroz inkluziju komada (individualnih gena) iz Ig lokusa. Prema tome, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i obično sekundarni konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu br. 5,545,807 od Surani i sar. i U.S. Patent br. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458 svaki od Lonberg & Kay, U.S. Patent br. 5,591,669 i 6,023.010 od Krimpenfort & Bems, U.S. Patent br. 5,612,205, 5,721,367, i 5,789,215 od Bems i sar., i U.S. Patent br.

5,643,763 od Choi & Dunn, i GenPharm International U.S. Patentna prijava serijski br.

07/574,748, podneta 29 avgusta, 1990, 07/575,962, podneta 31 avgusta, 1990, 07/810,279, podneta 17 decembra, 1991, 07/853,408, podneta 18 marta, 1992, 07/904,068, podneta 23 juna, 1992, 07/990,860, podneta 16 decembra, 1992, 08/053,131, podneta 26 aprila, 1993, 08/096,762, podneta 22 jula, 1993, 08/155,301, podneta 18 novembra, 1993, 08/161,739, podneta 3 decembra, 1993, 08/165,699, podneta 10 decembra, 1993, 08/209,741, podneta 9 marta, 1994. Vidi takođe Evropski Patent br. 0 546 073 B1, Internacionalnu patentnu prijavu br. WO

4

92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Patent br.5,981,175. Vidi dalje Taylor i sar., 1992, Chen i sar., 1993, Tuaillon i sar., 1993, Choi i sar., 1993, Lonberg i sar., (1994), Taylor i sar., (1994), i Tuaillon i sar., (1995), Fishwild i sar., (1996).

Kirin je takođe pokazao generisanje humanih antitela od miševa u kojima, kroz mikroćelijsku fuziju uvedeni veliki delovi hromozoma, ili celi hromozomi,. Vidi Evropsku patentnu prijavu br. 773288 i 843961. Sem toga generisani su KM™ miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirin's Tc miševa sa Medarex's minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju humani IgH transhromozom od Kirin miševa i kapa lanac transgena od Genpharm miševa (Ishida i sar., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

Humana antitela mogu se takođe izvesti pomoću in vitro metoda. Pogodni primeri uključuju ali nisu ograničeni na izlaganje faga (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed) ribozom displej (CAT), kvasac displej, i tome slično.

U nekim ostvarenjima, antitela koja su ovde opisana poseduju teške lance humanog IgG4 kao i teške lance IgG2. Antitela takođe mogu biti od drugih humanih izotipova uključujući IgG1. Antitela su posedovala visoke afinitete, tipično su posedovali Kd od oko 10<-6>do oko 10<-13>M ili niže, kada se meri različitim tehnikama.

Kao što će biti prihvaćeno, antitela se mogu eksprimirati u drugim ćelijskim linijama koje nisu ćelijske linije hibridoma. Sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se upotrebiti da se transformiše pogodna sisarska ćelija domaćin. Transformacija se može obaviti bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedura transfekcije poznatih u oblasti, kao što je dato u primerima u U.S. Patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji se transformiše. Metodi za uvođenje heterolognih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u oblasti i uključuju transfekciju posredovanu sa dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.

Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u praksi i uključuju mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kinskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), humane epitelijalne ćelije bubrega 293, i jedan broj drugih ćelijskih linija. Posebno poželjne ćelijske linije, koje se radije koriste, su odabrane kroz određivanje koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i produkuju antitela sa odgovarajućim PCSK9 karakteristikama vezivanja.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od približno 1 nM, npr., 1000 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM to 1 pM, i/ili I pM do 0.1 pM ili manje.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju molekul imunoglobulina od najmanje jednog od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD, i IgM izotipa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i/ili humani teški lanac. U određenim ostvarenjima, teški lanac je od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, ili IgM izotipa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su klonirani za ekspresiju u sisarskim ćelijama. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju drugi konstantni region, a ne konstantni regioni od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, i IgM izotipa.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju variabilne regione antitela vezane za konstantni region koji nije ni konstantan region za IgG2 izotip, niti je konstantni region za IgG4 izotip. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini su klonirani radi ekspresije u sisarskim ćelijama.

U određenim ostvarenjima, konzervativne modifikacije teških i lakih lanaca antitela od najmanje jednog od linija hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12 (i odgovarajuće modifikacije za kodirajuće nukleotide) će produkovati antitela za PCSK9 koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima od antitela za linije hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12. Nasuprot tome, bitne modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama antitela za PCSK9 mogu se obaviti putem selekcije supstitucija u sekvenci amino kiseline teških i lakih lanaca koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) strukture molekularnog kostura u području supstitucije, na primer, kao pločasta ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) mase bočnog lanca.

Na primer, „konzervativne supstitucije amino kiseline" mogu uključiti supstitucije nativnih ostataka amino kiseline sa ne nativnim ostatkom tako da ima malo ili nema efekta na polaritet ili naelektrisanje ostataka amino kiseline na toj poziciji. Sem toga, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu može takođe biti supstituisan sa alaninom, kao što je bilo prethodno opisano za „alanin skaning mutagenezu“.

Željene supstitucije amino kiseline (bilo da su konzervativne ili ne konzervativne) mogu se odrediti od strane stručnjaka u trenutku kada su takve supstitucije poželjne. U određenim ostvarenjima, supstitucije amino kiseline mogu se upotrebiti da se identifikuju važni ostaci od antitela za PCSK9, ili da se poveća ili smanji afinitet antitela za PCSK9 kao što je ovde opisano.

U određenim ostvarenjima, antitela ovog pronalaska mogu se eksprimirati u drugim ćelijskim linijama u odnosu na ćelijske linije hibridoma. U određenim ostvarenjima, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se uzeti za transformaciju pogodnih sisarskih ćelija domaćina. Prema određenim ostvarenjima, transformacija se može obaviti sa bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedure transfekcije poznate u oblasti, kao što je dato primerima u U.S. Pat. br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. U određenim ostvarenjima, procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji treba da se transformiše. Metodi za uvođenje heterologih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u praksi i uključuju, ali nisu ograničeni na, transfekciju posredovanu sa dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.

Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na, mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), i jedan broj drugih ćelijskih linija. U određenim ostvarenjima, ćelijske linije se mogu odabrati putem određivanja koja ćelijska linija ima više nivoe ekspresije i produkuje antitela sa konstitutivnim HGF karakteristikama vezivanja. Odgovarajući ekspresioni vektori za sisarske ćelije domaćine su dobro poznati.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući proteini obuhvataju jedan ili više polipeptida. U određenim ostvarenjima, bilo koji od mnoštva ekspresionih vektora/sistema domaćina može se upotrebiti da se eksprimiraju molekuli polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. Takvi sistemi uključuju ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane sa rekombinantnim bakteriofagom, plazmid, ili kosmid DNK ekspresione vektore; kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; ćelijske sisteme insekata inficirane sa ekspresionim vektorima virusa (npr., bakulovirus); biljne sisteme ćelija transfektovane sa ekspresionim vektorima virusa (npr., mozaični virus karfiola, CaMV, mozaični virus duvana, TMV) ili transformisan sa bakteriskim ekspresionim vektorima (npr., Ti ili pBR322 plazmid); ili životinjskim ćelijskim sistemima.

U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili sam AVP, je rekombinantno eksprimiran u kvascu. Određena, takva ostvarenja, koriste komercijalno dostupne ekspresione sisteme, npr., Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), prateći uputstva proizvođača. U određenim ostvarenjima, takav sistem se zasniva na pre- pro- alfa sekvenci da usmeri sekreciju. U određenim ostvarenjima, transkripcija inserta je vođena sa promoterom alkohol oksidaze (AOX1) nakon indukcije sa metanolom.

U određenim ostvarenjima, izlučeni polipeptid obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili je sam AVP prečišćen iz medijuma za rast kvasca. U određenim ostvarenjima, metod koji je upotrebljin da se prečiste polipeptidi iz medijuma za rast kvasca je isti kao oni koji su upotrebljeni da se prečiste polipeptidi iz bakterijskih i sisarskih supernatanta.

U određenim ostvarenjima, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili je sam AVP, je klonira u ekspresioni vektor bakulovirusa, kao što je pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). U određenim ostvarenjima, takav vektor se može upotrebiti u skladu sa uputstvima proizvođača (PharMingen) da se inficiraju ćelije Spodoptera frugiperda u sF9 medijum bez proteina i da se produkuje rekombinantni polipeptid. U određenim ostvarenjima, polipeptid je prečišćen iz takvokg medijuma upotrebom heparin-Sefaroza kolone (Pharmacia).

U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP je eksprimiran u insektskom sistemu. Određeni insektski sistemi za ekspresiju polipeptida su dobro poznati stručnjacima. U jednom takvom sistemu, Autographa californica jedari polihedrozis virus (AcNPV) je upotrebljen kao vektor da se eksprimiraju strani geni u ćelijama Spodoptera frugiperda ili u larvama Trichoplusia. U određenim ostvarenjima, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid može se ubaciti u neesencijalni gen virusa, na primer, unutar polihedrin gena, i staviti pod kontrolu promotara za taj gen. U određenim ostvarenjima, uspešne insercije molekula nukleinske kiseline učiniće neesencijalni gen inaktivnim. U određenim ostvarenjima, ta inaktivacija rezultira detektabilnim karakteristikama. Na primer, inaktivacija polihedrin gena rezultira produkcijom virusa koji nemaju proteinski omotač.

U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti rekombinantni virusi da se inficiraju ćelije S. frugiperda ili larve Trichoplusia. Vidi, npr., Smith i sar., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).

U određenim ostvarenjima, polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP napravljen u bakterijskim ćelijama produkovani su kao nerastvorljiva inkluziona tela u bakterijama. U određenim ostvarenjima, ćelije domaćini koje obuhvataju takva inkluziona tela sakupljeni su centrifugiranjem; isprani u 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA; i tretirani sa 0.1 mg/ml lizozima (Sigma, St. Louis, MO) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturei. U određenim ostvarenjima, lizat je izbistren sonikacijom, i ćelijski ostatak je istaložen centrifugiranjem tokom 10 minuta na 12,000 X g. U određenim ostvarenjima, talog koji je sadržao polipeptid je resuspendovan u 50 mM Tris, pH 8, i 10 mM EDTA; izliven preko 50% glicerola; i centrifugiran tokom 30 minuta na 6000 X g. U određenim ostvarenjima, taj talog se može resuspendovati u standardnom fosfatnom puferizovanom slanom rastvoru (PBS) bez Mg<++>i Ca<++>. U određenim ostvarenjima, polipeptid je dalje prečišćen putem frakcionisanja resuspendovanog taloga u denaturišućem-SDS poliakrilamid gelu (Vidi, npr., Sambrook i sar., supra). U određenim ostvarenjima, takav gel može se potopiti u 0.4 M KCl da se vizalizuje protein, koji se može iseći i elektroisprati u gel-tekućem puferu koji nema SDS. Prema određenim ostvarenjima, Glutamil-S-Transferaza (GST) fuzioni protein je produkovan u bakteriji kao rastvorljivi protein. U određenim ostvarenjima, takav GST fuzioni protein je prečišćen koristeći GST Purification Module (Pharmacia).

U određenim ostvarenjima, poželjno je da se „ponovo uviju" određeni polipeptidi, npr., polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. U određenim ostvarenjima, takvi polipeptidi su produkovani koristeći određene rekombinantne sisteme diskutovane ovde. U određenim ostvarenjima, polipeptidi su „ponovo uvijeni" i/ili oksidisani da formiraju željenu tercijarnu strukturu i/ili da generišu disulfidne veze. U određenim ostvarenjima, takve strukture i/ili veze su vezane sa određenim biološkim aktivnostima polipeptida. U određenim ostvarenjima, ponovno uvijanje je ostvareno koristeći bilo koju od brojnih procedura poznatih u oblasti. Primerni metodi uključuju ali nisu ograničeni na, izlaganje rastvorljivog polipeptidnog agensa do pH tipično iznad 7 u prisustvu haotropičkog agensa. Primerni haotropični agens je guanidin. U određenim ostvarenjima, ponovno uvijanje/oksidacija rastvor takođe sadrži redukcioni i oksidacioni oblik tog redukcionog agensa. U određenim ostvarenjima, redukcioni agens i njegov oksidacioni oblik prisutni su u odnosu koji će generisati određeni redoks potencijal koji omogućuje da se dogodi disulfidno pomeranje. U određenim ostvarenjima, takvo pomeranje uključuje formiranje cisteinskih mostova. Primerni redoks parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH, bakar hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U određenim ostvarenjima, upotrebljen je ko-rastvarač da se poveća efikasnost ponovnog uvrtanja. Primerni korastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina, i arginin.

U određenim ostvarenjima, neko gotovo u potpunosti prečišćava polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. Određene tehnike prečišćavanja proteina poznate su stručnjacima. U određenim ostvarenjima, prečišćavanje proteina uključuje sirovo frakcionisanje polipeptidnih frakcija iz ne-polipeptidnih frakcija. U određenim ostvarenjima, polipeptidi su prečišćeni koristeći hromatografiju i/ili elektroforetske tehnike. Primerni metodi prečišćavanja uključuju, ali nisu ograničeni na, taloženje sa amonijum sulfatom; taloženje sa PEG; imuno taloženje; toplotnu denaturaciju praćenu sa centrifugiranjem; hromatografiju, uključujući, ali bez ograničenja na, afinitetnu hromatografiju (npr., Protein-A-Sefaroza), jono izmenjivačku hromatografiju, ekskluzionu hromatografiju, i hromatografiju reverzne faze; gel filtraciju; hidroksiapatitnu hromatografiju; izoelektrično fokusiranje; poliakrilamidnu gel elektroforezu; i kombinacije takvih i drugih tehnika. U određenim ostvarenjima, polipeptid je prečišćen sa brzom hromatografijom tečnog proteina ili sa tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC). U određenim ostvarenjima, koraci prečišćavanja mogu se promeniti ili se određeni koraci mogu izostaviti, a da to rezultira još uvek pogodnim metodom za preparaciju gotovo u potpunodti prečišćenog polipeptida.

U određenim ostvarenjima, neko kvantifikuje stepen prečišćavanja preparacije polipeptida. Određeni metodi za kvantifikovanje stepena prečišćavanja poznati su stručnajku. Određeni primerni metodi uključuju, ali nisu ograničeni na, određivanje specifične aktivnosti vezivanja preparacije i procenjivanje količine polipeptida u preparaciji sa SDS/PAGE analizom. Određeni primerni metodi za procenu koliličine prečišćavanja polipeptidne preparcije obuhvataju izračunavanje aktivnosti vezivanja preparacije i poređenje aktivnosti vezivanja inicijalnog ekstrakta. U određenim ostvarenjima, rezultati takvog izračunavanja su izneti kao „savijeno prečišćavanje." Jedinice koje su upotrebljene da se predstavi količina aktivnosti vezivanja zavise od određenog ogleda koji je izveden.

U određenim ostvarenjima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP je delimično prečišćen. U određenim ostvarenjima, delimično prečišćavanje može se obaviti korišćenjem manje koraka prečišćavanja ili korišćenjem različitih oblika iste opšte šeme prečišćavanja. Na primer, u određenim ostvarenjima, katjon-izmenjivačka kolonska hromatografija izvedena koristeći HPLC aparat će generalno rezultirati u većem „savujajućem prečišćavanju" nego kad ista tehnika koristi sistem hromatografije niskog-pritiska. U određenim ostvarenjima, metodi koji rezultiraju nižim stepenom prečišćavanja mogu biti korisni u totalnom obnavljanju polipeptida, ili u održavanju aktivnosti vezivanja peptida.

U određenim slučajevima, elektroforetska migracija polipeptida može varirati, nekad značajno, u okviru različitih uslova SDS/PAGE. Vidi, npr., Capaldi i sar., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977). Biće shvaćeno da pod različitim uslovima elektroforeze, očigledne molekulske težine prečišćenog ili delimično prečišćenog polipeptida mogu biti različite.

Primerni epitopi

Obezbeđeni su epitopi za koje se anti-PCSK9 antitela vezuju. U nekim ostvarenjima, epitop je jedan od katalitičkih domena PCSK9.

U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da se spreči (npr., redukuje) vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da smanji vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da gotovo u potpunosti inhibira vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini otkriveni ovde vezuju se specifično za N-terminalni prodomen, subtilizin-nalik katalitičkom domenu i/ili a C-terminalnom domenu. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za supstrat-vezujuće udubljenje od PCSK-9 (opisano u Cunningham i sar.).

Putem pravljenja jednog broja pojedinačnih mutacija, mogu se identifikovati ostaci koji imaju direktnu ulogu u vezivanju ili koji su dovoljno blizu antitelu tako da mutacija može uticati na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena. Na osnovu znanja o tim amino kiselinama, domen(i) ili region(i) antigena koji sasdrže ostatke u kontaktu sa antigen vezujućim proteinom ili pokrivene sa antitelom mogu se razjasniti. Takvi domeni mogu uključiti vezivanje epitopa antigen vezujućeg proteina. Jedan specifični primer ovog generalnog pristupa koristi arginin/glutaminska kiselina protokol pregledanja (vidi, npr., Nanevicz, T., i sar., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 i Zupnick, A., i sar., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). Generalno, arginin i glutaminske kiseline su supstituisani sa (tipično pojedinačno) amino kiselinom u polipeptidu divljeg tipa zato što su te amino kiseline naelektrisane i ogromne i, prema tome, imaju potencijal da raskinu vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena u regionu antigena, gde je uvedena mutacija. Arginini koji postoje u antigenu divljeg tipa su

1

zamenjeni sa glutaminskom kiselinom. Dobijeno je mnoštvo takvih pojedinačnih mutanata i sakupljeni rezultati vezivanja su analizirani da se odredi koji ostaci deluju na vezivanje.

Primer 39 opisuje jedno takvo skeniranje arginin/glutaminske kiseline PCSK9 za PCSK9 antigen vezujuće proteine koji su ovde obezbeđeni. Serija mutantnih PCSK9 antigena je kreirana, tako da svaki mutantni antigen ima pojednačnu mutaciju. Vezivanje svakog mutantnog PCSK9 antigena sa različitim PCSK9 AVPom je mereno i poređeno sa sposobnosti odabranih AVPa da vezuju divlji tip PCSK9 (SEQ ID NO: 303).

Izmena (na primer, redukcija ili povećanje) u vezivanju između antigen vezujućeg proteina i varijante PCSK9, onako kako je ovde upotrebljena, znači da postoji promena u afinitetu vezivanja (npr., kao što je mereno poznatim metodama kao što je Biacore testiranje ili ogled zasnovan na perlici opisan dole u primerima), EC50, i/ili naelektrisanje (na primer, redukcija) u ukupnom kapacitetu vezivanja antigen vezujućeg proteina (na primer, kao što je evidentirano sa smanjenjem u Bmax u plotu koncentracija antigen vezujućeg proteina u odnosu na koncentraciju antigena). Značajna izmena u vezivanju označava da je mutirani ostatak direktno uključen u vezivanje za antigen vezujući protein, ili je u neposrednoj blizini vezanom proteinu, kada je vezujući protein vezan za antigen.

U nekim ostvarenjima, značajna redukcija u vezivanju znači da je afinitet vezivanja, EC50, i/ili kapacitet između antigen vezujućeg proteina i mutantnog PCSK9 antigena redukovan za više od 10%, više od 20%, više od 40 %, više od 50 %, više od 55 %, više od 60 %, više od 65 %, više od 70 %, više od 75 %, više od 80 %, više od 85 %, više od 90% ili više od 95% u odnosu na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 (npr., prikazano u SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). U određenim ostvarenjima, vezivanje je redukovano ispod detektabilnih ograničenja. U nekim ostvarenjima, značajna redukcija u vezivanju je evidentirana kada je vezivanje antigen vezujućeg proteina za varijantu PCSK9 proteina imanje od 50% (na primer, manje od 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ili 10%) od vezivanja zapaženog između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 proteina (na primer, protein od SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). Takvo merenje vezivanja može se obaviti koristeći mnoštvo ogleda vezivanja poznatih u oblasti. Specifičan primer jednog takvog ogleda je opisan u Primeru 39.

U nekim ostvarenjima, obezbeđeni su antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za varijantu PCSK9 proteina u kojem je ostatak u divljem tipu PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303 supstituisan sa argininom ili glutaminskom kiselinom. U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za varijantu PCSK9 proteina koja ima bilo koju, ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

2

10, ili 244) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U kratkoj napomeni upotrebljenoj ovde, format je: ostatak divljeg tipa: pozicija u polipeptidu: mutantni ostatak, sa numerisanjem ostataka kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano, ili povećano, za mutant PCSK9 koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je gotovo u potpunosti redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, u okviru SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303).

U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje je redukovano. U nekim ostvarenjima, zapažena je redukcija u vezivanju kao promena u EC50. U nekim ostvarenjima, promena u EC50 je povećanje numeričke vrednosti EC50 (i, prema tome, smanjenje vezivanja).

U nekim ostvarenjima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim ostvarenjima, vezivanje je redukovano. U nekim ostvarenjima, redukcija u vezivanju je zapažena kao promena u Bmax. U nekim ostvarenjima, pomak u Bmax je redukcija maksimalnog signala generisanog sa AVP. U nekim ostvarenjima, da bi amino kiselina bila deo epitopa, Bmax je redukovan za najmanje 10%, na primer, redukcija na bilo koju od sledećih količina: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, ili 100 procenata može, u nekim ostvarenjima, naznačiti da je ostatak deo epitopa.

Iako su varijantni oblici koji su samo nabrojani izneti u odnosu na divlji tip sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, biće prihvaćeno da u alelskoj varijanti PCSK9 amino kiselina na identičnoj poziciji može da se razlikuje. Antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za takve alelske oblike PCSK9 su takođe predviđeni. Shodno tome, u nekim ostvarenjima, bilo koje od gornjih ostvarenja može se uporediti sa alelskom sekvencom, pre negom sa čistom sekvencom divljeg tipa prikazanoj na FIG.1A

U nekim ostvarenjima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano za varijantu PCSK9 proteina u kojoj je ostatak na odabranoj poziciji u divljem tipu PCSK9 proteina mutiran u bilo koji drugi ostatak. U nekim ostvarenjima, ovde opisane zamene arginin/glutaminska kiselina upotrebljene su da se identifikuju pozicije. U nekim ostvarenjima, alanin je upotrebljen da se identifikuju pozicije.

Kao što je zabeleženo gore, ostaci direktno uključeni u vezivanje, ili pokriveni. sa antigen vezujućim proteinom mogu se identifikovati iz rezultata pregledanja. Ovi ostaci mogu, prema tome, obezbediti naznaku za regione domena od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303 ili SEQ ID NO: 3) koji sadrže region(e) vezivanja za koji se antigen vezujući proteini vezuju. Kao što se može videti iz rezultata sumarizovanih u Primeru 39, u nekim slučajevima antigen vezujući protein vezuje se za domen koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina; 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

U nekim slučajevima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 162, 164, 167, 207 i/ili 208 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U

4

nekim slučajevima, više nego jedan (npr., 2, 3, 4, ili 5) od identifikovanih ostataka su deo regiona koji je vezan sa AVP. U nekim slučajevima, AVP je u kompeticiji sa AVP 21B12. slučajevima

U nekim slučajevima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 185 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim slučajevima, AVP je u kompeticiji sa AVP 31H4.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od amino kiselina 439, 513, 538, i/ili 539 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim ostvarenjima, više nego jedan (npr., 2, 3, ili 4) od identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje sa AVP. U nekim ostvarenjima, AVP je u kompeticiji sa AVP 31A4.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein se vezuje za gore pomenute regione u okviru fragmenta ili pune dužine sekvence od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za polipeptide koji se sastoje od tih regiona. Pozivanje na „SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303" označava da jedan ili obe od tih sekvenci mogu biti upotrebljene ili relevantne. Fraza ne naznačava da samo jedna treba da bude upotrebljena.

Kao što je primećeno gore, gornje opisne napomene su specifične za pozicije amino kiseline za pozivom na SEQ ID NO: 1. Međutim, generalno kroz prijavu, napomene su napravljene za Pro/Cat domen koji počinje na poziciji 31, koji je obezbeđen u SEQ ID NO: 3. Kao što je dole naznačeno, SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 303 nemaju signalnu sekvencu PCSK9. Kao takvo, bilo kakvo poređenje između tih različitih otkrića mora uzeti u obzir tu razliku u numerisanju. Konkretno, bilo koja pozicija amino kiseline u SEQ ID NO: 1, će odgovarati pozicijo amino kiseline 30 amino kiselina dalje u proteinu u SEQ ID NO: 3. Na primer, pozicija 207 iz SEQ ID NO: 1, odgovara poziciji 237 iz SEQ ID NO: 3 (puna dužina sekvence, i sistem numerisanja upotrebljen u predmetnom pronalasku generalno). Tabela 39.6 ističe kako gore pomenute pozicije, koje se odnose na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) odgovaraju SEQ ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu). Prema tome, bilo koje od gore pomenutih dostignuća koja su opisana u odnosu na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303), su opisana u vezi sa SEQ ID NO: 3, prema pomenutim odgovarajućim pozicijama.

U nekim ostvarenjima, AVP 21B12 se vezuje za epitop uključujući ostatke 162-167 (npr., ostatke D162-E167 od SEQ ID NO: 1).

Određene terapeutske upotrebe i farmaceutske kompozicije

U određenim slučajevima, PCSK9 aktivnost je u korelaciji sa jednim brojem humanih bolesnih stanja. Na primer, u određenim slučajevima, previše ili premalo PCSK9 aktivnosti je u korelaciji sa određenim stanjima, kao što je hiperholesterolemija. Prema tome, u određenim slučajevima, modulirajuća aktivnost PCSK9 može biti terapeutski korisna. U određenim ostvarenjima, neutralizujući antigen vezujući protein za PCSK9 upotrebljen je da se moduliše najmanje jedna PCSK9 aktivnost (npr., vezivanje za LDLR). Takva upotreba može tretirati i/ili soprečiti i/ili redukovati rizik od poremećaja koji su u odnosu sa povišenim nivoima holesterola ili u kojima su bitni povišeni nivoi holesterola.

Kao što će biti očigledno stručnjaku, u svetlu predmetnog pronalaska, poremećaji koji se odnose na, uključuju, ili mogu biti pod uticajem variranja holesterola, LDL, ili LDLR nivoa mogu se ispitati različitim ostvarenjima antigen vezujućih proteina. U nekim ostvarenjima, „poremećaj vezan za holesterol" (koji uključuje „poremećaje vezane za serum holesterol") uključujući bilo koji ili više od sledećih: hiperholesterolemiju, srčane bolesti, metaboličke sindrome, dijabetes, koronarne srčane bolesti, šlog, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerovu bolest i generalnu dislipidemiju, koje se mogu manifestovati, na primer, sa povišenim ukupnim serum holesterolom, povišenim LDL, povišenim trigliceridima, povišenim VLDL, i/ili nižim HDL. Neki ne-ograničavajući primeri primarnih i sekundarnih dislipidemija koje se mogu tretirati koristeći AVP, bilo sam, bilo u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa uključuju metaboličke sindrome, dijabetes melitus, porodičnu kombinovanu hiperlipidemiju, porodičnu hipertrigliceridemiju, porodične hiperholesterolemije, uključujući heterozigotnu hiperholesterolemiju, homozigotnu hiperholesterolemiju, porodični defektivni apoplipoprotein B-100; poligensku hiperholesterolemiju; bolest uklanjanja ostatka, hepatičnu deficijenciju lipaze; dislipidemiju sekundarnu u odnosu na bilo koju od sledećih: dijetarnu indiscreciju, hipotiroidizam, lekove uključujući estrogensku i progestinsku terapiju, beta-blokere i tiazid diuretike; nefrotični sindrom, hronično otkazivanje bubrega, Kušing-ov sindrom, primarni biliarni cirozis, bolest čuvanja glikogena, hepatom, holestazis, akromegalija, insulinom, defincijencija izolovanog hormona rasta i alkohol-indukovanu hipertrigliceridemiju. AVP može takođe biti koristan u sprečavanju, ili tretiranju bolesti ateroskleroze, kao što su, na primer, koronarne bolesti srca, bolest koronarne arteruje, bolest periferne arterije, šlog (ishaemični i hemoragični), angina pektoris, ili cerebrovasckularne bolesti i akutni koronarni sindrom, infarkt miokarda. U nekim ostvarenjima, AVP je koristan u redukovanju rizika od: ne fatalnog srčanog napada, fatalnog i ne fatalnog šloga, određenih tipova hirurgije srca, hospitalizacije zbog otkazivanja srca, bola u grudima kod pacijenata sa bolestima srca, i/ili kardiovaskularnih događaja zbog ustanovljavanja bolesti srca kao što je pre srčanog udara, pre hirurgije srca, i/ili bola u grudima sa dokazima zapušenih arterija. U nekim ostvarenjima, AVP se može upotrebiti da se redukuje rizik od povratka kardovaskularnih događaja.

Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, bolesti ili poremećaji koji se generalno razmatraju (ili zbog tretiranja ili zbog preventive) kroz upotrebu statina mogu takođe imati koristi od primene instant antigen vezujućih proteina. Sem toga, u nekim ostvarenjima, poremećaji ili bolesti koji mogu imati koristi od prevencije sinteze holesterola ili povećne ekspresije LDLR mogu se takođe tretirati različitim ostvarenjima antigen vezujućih proteina. Sem toga, kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, upotreba anti-PCSK9 antitela može biti posebno korisna u tretmanu dijabetesa. Nije samo dijabetes faktor rizika za koronarnu bolest srca, već insulin povećava ekspresiju PCSK9. To znači da, ljudi sa dijabetesom imaju podignute nivoe lipida u plazmi (što može biti vezano sa visokim nivoima PCSK9) i mogu imati koristi od snižavanja tih nivoa. To je generalno diskutovano mnogo detaljnije u Costet i sar. („Ekspresija hepatičnog PCSK9 je regulisana putem nutricionog statusa preko sterol regulatornih elementvezujoćih proteina 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006), koja je ovde u popunosti inkorporirana referencom.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je davan onima koji imaju diabetes melitus, abdominalni aortni aneurizam, aterosklerozis i/ili perifernu vaskularnu bolest sa ciljem da se smanje nivoi holesterola u serumu do sigurnijeg raspona. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein je davan pacijentima koji su pod rizikom da razviju bilo koji od ovde pomenutih poremećaja. U nekim ostvarenjima, AVPi se daju subjektima koji puše, imaju hipetenziju ili porodičnu istoriju ranih srčanih napada.

U nekim ostvarenjima, subjektima se daje AVP ako imaju umeren rizik ili viši od 2004 NCEP ciljeva tretmana. U nekim ostvarenjima, subjektima se daje AVP ako je subjektov nivo LDL holesterola više od 160 mg/dl. U nekim ostvarenjima, AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 130 (i oni imaju umereni ili srednje visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana). U nekim ostvarenjima, AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 100 (i oni imaju visok ili vrlo visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana).

Lekar će biti u stanju da odabere odgovarajuće naznake za tretman i ciljne nivoe lipida u zavisnosti od individualnog profila određenog pacijenta. Jedan dobro-prihvaćeni standard za vođenje tretmana hiperlipidemije je Treći izveštaj nacionalnog edukacionog programa za holesterol (NCEP) Ekspertski panel na detekciji, evaluaciji, i treatmanu visokog krvnog holesterola kod odraslih (Adult Treatment Panel III) Konačni izveštaj, National Institutes of Health, NIH Publication br.02-5215 (2002), štampana publikacija koja je ovde inkorporirana sa referencom u celini.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se smanji količina aktivnosti PCSK9 od abnormalno visokog nivoa ili čak normalnog nivoa. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se tretira ili spreči hiperholesterolemija i/ili u pripremanju medikamenata za to i/ili za druge poremećeje vezane sa holesterolom (kao što su oni koji su zabeleženi ovde). U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen da se tretiraju ili spreče stanja kao što je hiperholesterolemija u kojoj je aktivnost PCSK9 normalna. U takvim stanjima, na primer, redukcija aktivnosti PCSK9 do ispod normalnog može obezbediti terapeutski efekt.

U nekim ostvarenjima, više nego jedan antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen da se moduliše aktivnost PCSK9.

U određenim ostvarenjima pronalaska, ovde su obezbeđeni antigen vezujući proteini za upotrebu u tretiranju poremećaja vezanih sa holesterolom, kao što je hiperholesterolemija obuhvatajući davanje terapeutski efektivne količine jednog ili više antigen vezujućih proteina za PCSK9 i drugog terapeutskog agensa.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje sam. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje konkurentno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje uzastopno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U drugim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. Terapeutski agensi (osim od antigen vezujućih proteina), uključuju, ali nisu ograničeni na, najmanje jedan drugi holesterolsnižavajući (serum i/ili ukupni telesni holesterol) agens ili izvesni agens. U nekim ostvarenjima, za agens koji povećava ekspresiju LDLR, zapaženo je da povišava nivoe HDL u serumu, snižava nivoe LDL ili snižava nivoe triglicerida. Primerni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, statine (atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin, simvastatin), nikotinska kiselina (Niacin) (NIACOR, NIASPAN (sporo oslobađajući niacin), SLO-NIACIN (sporo oslobađajući niacin)), Fibrična kiselina (LOPID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrat), Bile kiselina sekvestranti (QUESTRAN (holestiramin), kolesevelam (WELCHOL), COLESTID (colestipol)), inhibitori apsorpcije holesterola (ZETIA (ezetimib)), kombinovana nikotinska kiselina sa statinom (ADVICOR (LOVASTATIN i NIASPAN), kombinovani statin sa inhibitorom apsorpcije (VYTORIN (ZOCOR i ZETIA) i/ili lipid modifikujući agens. U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa PPAR gama agonstima, PPAR alfa/gama agonisti, inhibitori skvalen sintaze, CETP inhibitori, anti-hipertenzivi, antidijabetički agensi (kao što su sulfonil uree, insulin, GLP-1 analozi, DDPIV inhibitori), ApoB modulatori, MTP inhibitori i/ili tretmani obliteralne arterioskleroze. U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo LDLR proteina kod subjekta, kao što su statini, određeni citokini kao što je onkostatin M, estrogen, i/ili određeni biljni sastojci kao što je berberin. U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivoe holesterola u serumu kod subjekta (kao što su određeni anti-psihotički agensi, određeni inhibitori HIV proteaze, faktori ishrane kao što je visoka fruktoza, sukroza, holesterol ili određene masne kiseline i određeni jedarni receptor agonisti i antagonisti za RXR, RAR, LXR, FXR). U nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo PCSK9 kod subjekta, kao što su statin i/ili insulin. Kombinacija ova dva može omogućiti da neželjeni sporedni efekti drugih agensa budu umanjeni sa AVP. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, u nekim ostvarenjima, AVP je kombinovan sa drugim agensom/jedinjenjem. U nekim ostvarenjima, AVP i drugi agens se daju konkurentno. U nekim ostvarenjima, AVP i drugi agens se ne daju istovremeno, sa AVP koji se daje pre ili nakon davanja agensa. U nekim ostvarenjima, subjekt prima i AVP i drugi agens (koji povišava nivo LDLR) tokom istog perioda prevencije, javljanja poremećaja, i/ili perioda tretmana.

Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se davati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima. U određenim ostvarenjima, kombinovana terapija obuhvata antigen vezujući protein sposoban za vezivanje PCSK9, u kombinaciji sa najmanje jednim antiholesterolskim agensom. Agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, in vitro sintetički pripremljene hemijske kompozicije, antitela, antigen vezujuće regione, i njihove kombinacije i konjugate. U određenim ostvarenjima, agens može delovati kao agonist, antagonist, alosterični modulator, ili toksin. U određenim ostvarenjima, može delovati tako da inhibira ili stimuliše svoju metu (npr., aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima), i tako podstiče povećanu ekspresiju LDLR ili smanjuje nivoe serum holesterola.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati pre, u konkurenciji sa, konkurentno sa, i nakon tretmana sa agensom koji snižava holesterol (serum i/ili ukupni holesterol). U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati profilaktički da se spreči ili umanji razvoj hiperholesterolemije, bolesti srca, dijabetesa, i/ili bilo kojeg od poremećaja vezanih sa holesterolom. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati za tretman postojećeg stanja hiperholesterolemije. U nekim ostvarenjima, AVP odlaže početak poremećaja i/ili simptoma vezanih sa poremećajem. U nekim ostvarenjima, AVP je obezbeđen subjektu kojem nedostaju bilo kakvi simptomi bilo kojeg poremećaja vezanih za holesterol ili njihov podskup.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen sa određenim terapeutskim agensima da se tretiraju različiti poremećaji vezani za holesterol, kao što je hiperholesterolemija. U određenim ostvarenjima, u svetlu stanja i željenog nivoa tretmana, mogu se davati dva, tri ili više agensa. U određenim ostvarenjima, takvi agensi se mogu obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, takav agens(i) i antigen vezujući protein za PCSK9 mogu se obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, takav agens se može formulisati odvojeno i obezbediti zajedno sa inkluzijom u kitu za tretman. U određenim ostvarenjima, takvi agensi i antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu se formulisati odvojeno i obezbediti zajedno sa inkluzijom u kitu za tretman. U određenim ostvarenjima, takvi agensi se mogu obezbediti odvojeno. U određenim ostvarenjima, kada se daju putem genske terapije, geni koji kodiraju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu se uključiti u isti vektor. U određenim ostvarenjima geni koji koditaju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu biti pod kontrolom istog promotorskog regiona. U određenim ostvarenjima, geni koji koditaju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu biti u odvojenim vektorima.

U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulzifikatorom, sedstvom za čuvanje i/ili adjuvansom.

U određenim ostvarenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 i terapeutski efektivnu količinu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulzifikatorom, sedstvom za čuvanje i/ili adjuvansom.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se upotrebiti sa najmanje jednim terapeutskim agensom za zapaljenja. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se upotrebiti sa najmanje jednim terapeutskim agensom za imuni poremećaj. Primerni terapeutski agensi za zapaljenja i imune poremećaje uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklooksigenazu tipa 1 (COX-1) i ciklooksigenazu tipa 2 (COX-2) inhibitore malih molekula modulatora od 38 kDa mitogen-aktivirane protein kinaze (p38-MAPK); male molekule modulatore intraćelijskih molekula uključenih u zapaljenske puteve, pri čemu takvi intraćelijski molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, jnk, IKK, NF-κB, ZAP70, i lck. Određeni primerni terapeutski agensi za zapaljenja su opisani, npr., u C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Prozapaljenski i anti-zapaljenski citokini u reumatoidnom artritisu: Primeri za kliničare Treće izdanje (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.

U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije će uključiti više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije će uključiti više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9 pri čemu antigen vezujući proteini za PCSK9 vezuju više od jednog epitopa. U nekim ostvarenjima, različiti antigen vezujući proteini neće biti u komprticiji sa nekim drugim za vezivanja za PCSK9.

U određenim ostvarenjima, prihvatljivi materijali za formulaciju poželjno su netoksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama. U nekim ostvarenjima, formulacioni materijal(i) su za s.c. i/ili I.V. davanje. U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može sadržati formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili čuvanje, na primer, pH, osmoznost, viskoznost, bistrina, boja, izotoničnost, miris, sterilnost, stabilnost, stopa rastvaranja ili oslobađanja, apsorpcija ili prodiranje kompozicije. U određenim ostvarenjima, pogodni formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, amino kiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobijalne agense; antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); agense povećanja mase (kao što su manitol ili glicin); helatirajuće agense (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agense kompleksovanja (kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); popunjivače; monosaharide; disaharide; i druge ugljovodonike (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serum albumin, želatin ili imunoglobulini); agense za bojenje, ukus i razblaživanje; agense za emulzifikovanje; hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidon); polipeptidi niže molekulske težine; kounterioni koji formiraju soli (kao što je natrijum); sredstva za čuvanje (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoična koselina, salicilna koselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbična koselina ili vodonik peroksid); rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol); agensi za suspendovanje; površinska sredstva ili agensi za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi za pojačavanje stabilnosti (kao što su sukroza ili sorbitol); agensi za pojačanje toničnosti (kao što su alkalni metal halidi, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); nosači za isporuku; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutska pomoćna sredstva. (Remingtonove farmaceutske nauke, 18. Izdanje, A.R. Gennaro, izd., Mack Publishing Compani (1995). U nekim ostvarenjima, formulacija obuhvata PBS; 20mM NaOAC, pH 5.2, 50mM NaCl; i/ili 10mM NAOAC, pH 5.2, 9% sukrozu.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 i/ili a terapeutski molekul je vezan za nosač koji produžuje polu-život poznat u praksi. Takvi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, glikogen (npr., glikozilacija AVP), i dekstran. Takvi nosači su

1

opisani, npr., u U.S. prijavi serijski br. 09/428,082, sada US Patent br. 6,660,843 i publikovana PCT prijava br. WO 99/25044, koje su ovde radi bilo koje namene inkorporirane sa referencom.

U određenim ostvarenjima, optimalna farmaceutska kompozicija će biti određena od strane stručnjaka nakon, na primer, namenjene putanje davanja, formata isporuke i željene doze. Vidi, na primer, Remingtonove farmaceutske nauke, supra. U određenim ostvarenjima, takve kompozicije mnogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, stopu oslobađanja in vivo i stopu bistrenja in vivo antitela pronalaska.

U određenim ostvarenjima, primarno sredstvo ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti ili vodene ili ne vodene prirode. Na primer, u određenim ostvarenjima, pogodno sredstvo ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, po mogućnosti snabdevena sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralno davanje. U nekim ostvarenjima, slani rastvor obuhvata izotonični fosfatni puferizovani slani rastvor. U određenim ostvarenjima, neutralni puferizovani slani rastvori ili slani rastvori pomešani sa serum albuminom su dalje primerna sredstva. U određenim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili sirćetni pufer od oko pH 4.0-5.5, koji može dalje uključiti sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U određenim ostvarenjima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se pripremiti za čuvanje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim formulacionim agensom (Remingtonove farmakološke nauke, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim ostvarenjima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može biti formulisana kao liofilizat koristeći odgovarajući ekscipijens kao što je sukroza.

U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može se odabrati za parenteralnu isporuku. U određenim ostvarenjima, kompozicije se mogu odabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Preparacija takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru sposobnosti određenog stručnjaka.

U određenim ostvarenjima, formulacione komponente su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. U određenim ostvarenjima, koriste se puferi da se održi kompozicija na fiziološkom pH ili neznatno nižem pH, obično u rasponu pH od oko 5 do oko 8.

U određenim ostvarenjima, kada je razmatrano parenteralno davanje, terapeutska kompozicija može biti u obliku bez pirogena, parenteralno prihvatljivi vodeni rastvor obuhvata željeni antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez dodatnih terapeutskih agensa, u u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U određenim ostvarenjima, nosač za parenteralne injekcije je

2

sterilna destilovana voda u koju je antigen vezjući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, sačuvan na odgovarajući način. U određenim ostvarenjima, preparacija može uključiti formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktonska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu obezbediti kontrolisano ili odloženo oslobađanje produkta koji se onda može isporučiti preko depot injekcije. U određenim ostvarenjima, hijaluronska kiselina može takođe da se upotrebi, i može efekat pokretanja odloženog trajanja u cirkulaciji. U određenim ostvarenjima, mogu se upotrebiti implantabilne naprave za isporuku leka da se uvede željeni molekul.

U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija se može formulisati za inhalaciju. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, se može formulisati kao suvi prah za inhalaciju. U određenim ostvarenjima, inhalacioni rastvor obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se može formulisati sa propelantom za isporuku sa aerosolom. U određenim ostvarenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Plućno davanje je dalje opisano u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje plućnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

U određenim ostvarenjima, predviđeno je da se formulacija može davati oralno. U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se daje na taj način može se formulisati sa ili bez tih nosača uobičajeno koristeći pravljenje čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim ostvarenjima, kapsule se mogu dizajnirati tako da oslobode aktivni deo formulacije u određenoj tački u gastrointestinalnom traktu kada je biodostupnost maksimizovana a pre-sistemska degradacija je minimizovana. U određenim ostvarenjima, najmanje jedan dodatni agens može se uključiti da olakša apsorpciju antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koji dodatni terapeutski agens. U određenim ostvarenjima, razblaživači, agensi za ukus, voskovi za tačku topljenja, ulja povrća, lubrikanti, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta, i veziva se mogu takođe upotrebiti.

U određenim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može uključiti efektivnu količinu antigen vezujućeg proteina za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u mešavini sa ne toksičnim ekscipijensima koji su pogodni za pripremanje tableta. U određenim ostvarenjima, putem rastvaranja tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem nosaču, mogu se pripremiti rastvori u jediničnom doznom obliku. U određenim ostvarenjima, pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili agensi za vezivanje, kao što su skrob, želatin, ili akacija; ili agensi za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina, ili talk.

Dodatne farmaceutske kompozicije biće očigledne stručnjacima, uključujući formulacije koje uključuju antigen vezujuće proteine za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u formulacijama za odloženu, ili kontrolisanu ispruku. U određenim ostvarenjima, tehnike za formulisanje mnoštva drugih načina za odloženu ili kontrolisanu ispruku, kao što su nosači lipozoma, bio-razgradljive mikročestice ili porozne perlice ili depo injekcije, su takođe poznati stručnjacima. Vidi, na primer, PCT prijavu br. PCT/US93/00829 koji opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. U određenim ostvarenjima, preparacije sa odloženim oslobađanjem mogu uključiti polupropustljive matrice polimera u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula. Matrice za odloženo oslobađanje mogu uključiti poliestre, hidrogelove, polilaktide (U.S.

3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman i sar., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroksietilmetakrilat) (Langer i sar., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) i Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer i sar., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutiričnu kiselinu (EP 133,988). U određenim ostvarenjima, kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu takođe uključiti lipozome, koji se mogu pripremiti sa bilo kojim od nekoliko metoda poznatih u oblasti. Vidi, npr., Eppstein i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

Farmaceutske kompozicije koje treba da se koriste za davanje in vivo tipično su sterilne. U određenim ostvarenjima, to se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U određenim ostvarenjima, u kojima se kompozicija liofilizuje, sterilizacija koja koristi ovaj metod može se izvesti bilo pre, ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. U određenim ostvarenjima, kompozicija za parenteralno davanje može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. U određenim ostvarenjima, parenteralne kompozicije generalno su stavljene u kontejner koji ima sterilni ulazni pristup, na primer, vrećica za intravenski rastvor ili vijal koji ima zapušač koji se može probušiti hipodermalnom injekcionom iglom.

U određenim ostvarenjima, jednom kada je farmaceutska kompozicija formulisana, ona se može čuvati u sterilnim vijalima kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija ili kao dehdrirani ili liofilizirani prah. U određenim ostvarenjima, takve formulacije mogu se čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu (npr., liofiliziranom) koji se rekonstituiše pre davanja.

U određenim ostvarenjima, obezbeđeni su kompleti za produkciju pojedinačne dozne jedinice. U određenim ostvarenjima, kompletmože sadržati i prvi kontejner koji ima osušeni

4

protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U određenim ostvarenjima uključeni su kompleti koji obuhvataju pojedinačne i višekomorne prethodno napunjenen siringe (npr., tečne siringe i liosiringe).

U određenim ostvarenjima, efektivna količina farmaceutske kompozicije koja ouhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koja treba da se upotrebi terapeutski zavisiće, na primer, od terapeutskog konteksta i ciljeva. Stručnjak će shvatiti da odgovarajući dozni nivoi za tretman, prema određenim ostvarenjima, će prema tome varirati zaviseći, delom od isporučenog molekula, indikacije za koju je antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, bio upotrebljen, načina davanja, i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili kondicije (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U određenim ostvarenjima, kliničar može titrovati dozu i modifikovati način davanja moda dobije optimalni terapeutski efekat. U određenim ostvarenjima, tipična doza može biti u rasponu od oko 0.1 µg/kg pa sve do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora spomentutih gore. U određenim ostvarenjima, doziranje može biti u rasponu 0.1 µg/kg sve do 100 mg/kg; ili 1 µg/kg sve do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg sve do oko 100 mg/kg.

U određenim ostvarenjima, frekvenca doziranja će uzeti u obzir farmakokinetičke parametre antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koje dodatne terapeutske agense u upotrebljenoj formulaciji. U određenim ostvarenjima, kliničar će davati kompoziciju sve dok nije dostignuta doza koja dostiže željeni efekat. U određenim ostvarenjima, kompozicija može, prema tome, da se daje kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne mogu sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko implantacione naprave ili katetera. Dalje usavršavanje odgovarajuće doze radi se rutinski od strane stručnjaka i u obimu je zadataka koji im se rutinski zadaju. U određenim ostvarenjima, odgovarajuće doziranje može se potvrditi kroz upotrebu odgovarajućih podataka doznog odgovora. U nekim ostvarenjima, količina i frekvenca davanja može uzeti u obzir željeni nivo holesterola (serum i/ili ukupni) koji terba da se dobije i subjektove trenutne nivoe holesterola, nivoe LDL, i/ili nivoe LDLR, koji se svi mogu dobiti metodima koji su dobro poznati stručnjacima.

U određenim ostvarenjima, način davanja farmaceutske kompozicije je u skladu sa upotrebama, npr. oralno, putem intravenske injekcije, intraperitonealno, intracerebralno (intraparenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, subkutano, intra-okularno, intraarterijalno, intraportalno, ili intralezionim načinima; sa sistemima za odloženo oslobađanje ili sa implantacionim napravama. U određenim ostvarenjima, kompozicije se mogu davati sa bolus injekcijom ili kontinuirano sa infuzijom, ili sa implantacionom napravom.

U određenim ostvarenjima, kompozicija se može davati lokalno preko implantacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul bio apsorbovan ili inkapsuliran. U određenim ostvarenjima, gde se koristi naprava za implantaciju, naprava se može implantirati u bilo koje stabilno tkivo ili organ, i isporuka željenog molekula može biti preko difuzije, bolusa za vremensko oslobađanje, ili kontinuirano davanje.

U određenim ostvarenjima, može biti poželjno da se upotrebi farmaceutska kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na ex vivo način. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta su izloženi farmaceutskim kompozicijama koje sadrže antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, nakon čega ćelije, tkiva i/ili organi su uzastopno implantirani nazad u pacijenta.

U određenim ostvarenjima, antigen vezujući protein za PCSK9 i/ili ili bilo koji dodatni terapeutski agenas mogu se isporučiti putem implantiranja određenih ćelija koje su bile konstruisane genetičkim inžinjeringom, koristeči metode kao što su oni koji su ovde opisani, da se eksprimiraju i izlučuju određeni polipeptidi. U određenim ostvarenjima, takve ćelije mogu biti životinjske ili humane ćelije, i mogu biti autologne, heterologne, ili ksenogenične. U određenim ostvarenjima, ćelije mogu biti besmrtne. U određenim ostvarenjima, sa ciljem da se smanji šansa za imunološki odgovor, ćelije mogu biti inkapsulirane da se izbegne infiltracija okolnih tkiva. U određenim ostvarenjima, materijali za inkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polu-permeabilni polimerični omotači ili membrane koji omogućuju oslobađanje proteinskog produkta(ata) putem sprečavanja destrukcije ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili sa drugim štetnim faktorima iz okolnih tkiva.

Zasnovano na sposobnosti AVPa da značajno neutralizuju aktivnost PCSK9 (kao što je dole prikazano u Primerima), ovi AVPi će imati terapeutske efekte u tretiranju i prevenciji simptoma i stanja koji nastaju od PCSK9-posredovane aktivnosti, kao što je hiperholesterolemija.

Dijagnostičke primene

U nekim ostvarenjima, AVP je upotrebljen kao dijagnostičko oruđe. AVP se može upotrebiti da se proceni količina PCSK9 prisutna u uzorku i/ili subjektu.

U nekim ostvarenjima, AVPi otkriveni ovde upotrebljeni su ili su obezbeđerni u kitu za oglede i/ili metodu za detekciju PCSK9 u sisarskim tkivima ili ćelijama sa ciljem da se pregledaju/dijagnostifikuju bolesti ili poremećeji vezani sa promenama u nivoima PCSK9.

kompletobuhvata AVP koji vezuje PCSK9 i načine pokazivanje vezivanja AVP sa PCSK9, ako je prisutno, i po potrebi nivoe PCSK9 proteina. Mogu se upotrebiti različiti načini za naznačavanje prisustva AVP. Na primer, fluorofori, koji nisu molekulske probe, ili enzimi mogu biti vezani za AVP i prisustvo AVP se može zapaziti na različite načine. Metod za pregledanje takvih poremećaja može uključiti upotrebu kita, ili jednostavno upotrebu jednog od otkrivenih AVPova i određivanje da li se AVP vezuje za PCSK9 u uzorku. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, visoki ili povišeni nivoi PCSK9 će rezultirati većim količinama vezivanja AVP za PCSK9 u uzorku. Prema tome, stepen vezivanja AVP može se upotrebiti da se odredi koliko ima PCSK9 u uzorku. Subjekti ili uzorci sa određenom količinom PCSK9 koja je viša od prethodno određene količine (npr., količina ili raspon koji će imati osoba bez PCSK9 srodnog poremećaja) može se okarakterisati kao da ima PCSK9 posredovan poremećaj. U nekim ostvarenjima, AVP se daje subjektu koji uzima statin, sa ciljem da se odredi da li statin ima povećanu količinu PCSK9 kod subjekta.

PRIMERI

Primeri koji slede, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, obezbeđeni su samo sa svrhom ilustracije i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za predmentni pronalazak.

PRIMER 1

Imunizacija i titrovanje

Generisanje anti-PCSK9 antitela i hibridoma

Antitela zrele forme PCSK9 (prikazano kao sekvencа na FIG. 1A, sa podvučenim prodomenom), su odgajena u XenoMouse® miševima (Abgenix, Fremont, CA), а to su miševi koji sarže humane imunoglobulinske gene. Dve grupe XenoMouse<®>miševa, grupa 1 i 2, su korišćeni za proizvodnju antitela za PCSK9. Grupa 1 uključuje miševe XenoMouse<®>soja XMG2-KL, koji proizvode u celini humana IgG2κi IgG2λ antitela. Grupa 1 miševa je imunizovana sa humanim PCSK9. PCSK9 je pripremljn standardnim rekombinantnim tehnikama upotrebom sekvence iz GenBank sa referencom (NM_174936). Grupa 2 je uključila miševe XenoMouse<®>soja XMG4-KL, koji proizvode u celini humana IgG4κi IgG4λ antitela. Miševi grupe 2 su takođe imunizovani sa humanim PCSK9.

U miševe iz ovih grupa su ubrizgani antigeni jedanaest puta, prema protokolu iz Tabele 3. U inicijalnoj imunizaciji, u svakog miša je ubrizgano ukupno 10 µg antigena isporučenih intraperitonealno u stomak. Uzastopna povećanja su 5ug doza i metod ubrizgavanja se kolebao između intraperitonealnog ubrizgavanja u abdomen i subkutanog ubrizgavanja u bazu repa. Za intraperitonealno ubrizgavanje antigen je pripreman kao emulzija sa Titermax® Gold (Sigma, Cat # T2684) i za subkutana ubrizgavanja antigen je mešan sa Alum (aluminijum fosfatom) i CpG oligo. U ubrizgavanju 2 preko 8 i 10, u svakog miša je ukupno ubrizgano 5 µg antigena u adjuvansnom alum gelu. Finalno ubrizgavanje 5 µg antigena po mišu je isporučeno u Fosfo puferizovaomslanom rastvoru i isporučeno na 2 mesta 50% IP u stomak 50% SQ u bazu repa. Program imunizacije je sumarizovan u Tabeli 3, dole prikazanoj.

TABELA 3

Protokol korišćen za titar XenoMouse životinja je bio sledeći: Costar 3368 medijum vezujuće ploče bile su presvučene sa neutravadinom @ 8ug/ml (50ul/bunarčić) i inkubirane na 4 °C u 1XPBS/0.05% azidu preko noći. Isprane su pomoću TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Ploče su blokirane upotrebom 250ul 1XPBS/1% mleka i inkubirane tokom najmanje 30 minuta na ST. Blok je ispran korišćenjem TiterTek 3- cikusa ispiranja sa RO vodom. Neko je zatim hvatao b-humane PCSK9 @ 2ug/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ (razblaživač ogleda) 50ul/bunarčiću i inkubirao tokom 1 č na ST. Zatim su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Za primarna antitela, serum je titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100. Ovo je obavljeno u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću i inkubirano tokom 1č na ST. Potom su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Sekundarno antitelo bilo je kozije anti Humano IgG Fc HRP @ 400 ng/ml u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću. Ovo je inkubirano tokom 1č na ST. Ovo je zatim isprano korišćenjem TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom i nežno osušeno na papirnom ubrusu. Za supstrat je korišćen jedan-korak TMB rastvor (Neogen, Leksington, Kentaki) (50ul/bunarčić) i dozvoljeno je da se razvije tokom 30 min na ST.

Protokol praćen u ELISA ogledu bio je sledeći: za uzorake koji su sadržali b-PCSK9 sa ne V5His tagom primenjen je sledeći protokol: Primenjene su Costar 3368 medijum vezujuće ploče (Corning Life Sciences). Ploče su presvučene sa neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azidu, (50 µl/bunarčić). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane korišćenjem Titertek M384 ispirača ploča (Titertek, Huntsville, AL). Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Ploče su blokirane sa 250 µl 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su potom isprane upotrebom M384 ispirača ploča.

Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Hvatanje je bilo b-hu PCSK9, bez V5 taga, i dodano je 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca2+ (40 µl/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Serumi su titrovani 1:3 u duplikatu od 1:100, i sirovi H je bio slepa proba za serum. Titrovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, u zapremini od 50 µl/bunarčiću. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje je obavljeno 3-ciklusno ispiranje. Kozji i humani anti humani IgG Fc HRP na 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca2+ (50 µl/bunarčić) je dodan u ploču i inkubirano je 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći a 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 µl/bunarčić) je dodan u ploču i ugašen sa 1N hlorovodoničnom kiselinom (50 µl/bunarčić) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

Pozitivne kontrole za detekciju vezivanja PCSK9 u pločama bile su rastvorljivi LDL receptor (R&D Systems, Cat #2148LD/CF) i a poliklonalno zečije anti-PCSK9 antitelo (Caymen Chemical #10007185) titrovano 1:3 u duplikatu od 3 µg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR je detektovan sa kozjim anti LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) i zečjim anti koza IgGFc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečje polikolonalno je detektovano sa kozjim anti-zec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativne kontrole su bili čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.

Za uzorke koji su obuhvatali b-PCSK9 sa V5His tagom upotrebljen je sledeći protokol: upotrebljene su Costar 3368 ploče sa medijumom za vezivanje (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid; (50 µl/bunarčić). Ploče su bile inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek M384 ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 250 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Hvatanje je bilo b-hu PCSK9, sa V5 tagom, i dodano je na 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca2+ (40 µl/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Serum je titrovan sa 1:3 u duplikatu od 1:100, i sirovi H je bio slepa proba za serum. Titrovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, pri zapremini od 50 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći M384 ispirač ploča koji radi koristeći 3-ciklusno ispiranje. Kozji anti humani IgG Fc HRP na 400 ng/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca2+ je dodan na 50 µl/bunarčić u ploči i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo jednom isprane, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) 50 µl/bunarčiću) je dodan ploči i ploča je ugašena sa 1N hlorovodoničnom kiselinom (50 µl/ bunarčiću) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

Pozitivna kontorola LDLR, zečji anti-PCSK9 titrovan 1:3 u duplikatu iz 3 µg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR detekcija sa kozjim anti-LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) zečjim anti-koza IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečji poli detektovan sa kozjim antizec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Humani anti-His 1.2,3 i anti-V5 1.7.1 titrovani u 1:3 u duplikatu od 1 µg/ml u razblaživaču za ogled; oba detektovana sa kozjim anti-humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativna kontrola bio je čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.

Titrovi antitela protiv humanog PCSK9 testirani su sa ELISA ogledom za miševe imunizovane sa rastvorenim antigenom kao što je opisano. Tabela 4 sumarizuje podatke ELISA i ukazuje da su postojali neki miševi koji su bili specifični za PCSK9. Vidi, npr., Tabelu 4. Prema tome, na kraju programa imunizacije, 10 miševa (podebljano u Tabeli 4) su odabrani za žetvu, i izolovane su splenocite i limfociti iz slezina i limfnih čvorova respektivno, kao što je ovde opisano.

TABELA 4

Sažetak ELISA rezultata

1

PRIMER 2

Oporavak limfocita, izolacije B-ćelija, fuzije i i generisanje hibridoma Ovaj primer ističe kako su imune ćelije oporavljene i kako su generisani hibridomi. Odabrani imunizovani miševi su žrtvovani pomoću cervikalne dislokacije i drenirani limfni čvorovi su prikupljeni i sjedinjeni iz svakog kohorta. B ćelije su izdvojene iz limfnog tkiva usitnjavanjem u DMEM da se oslobode ćelije iz tkiva, i ćelije su suspendovane u DMEM. Ćelije su izbrojane, i 0.9 ml DMEM na 100 milona limfocita je dodano u talog ćelija da se ćelije lagano, ali kompletno resuspenduju.

Limfociti su pomešani sa ćelijama nesekretornog mijeloma P3X63Ag8.653 nabavljenim od ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney i sar., (1979) J. Immunol.123, 1548-1550) u odnosu od 1:4. Mešavina ćelija je lagano istaložena centrifugiranjem na 400 x g 4 min. Nakon dekantovanja supernatanta, ćelije su lagano pomešane koristeći pipetu od 1 ml. Prethodno zagrejani rastvor PEG/DMSO od Sigma (cat# P7306) (1 ml na milion B-ćelija) je dodavan polako uz nežno protresanje tokom 1 min a zatim 1 min mešanja. Prethodno zagrejani IDMEM (2 ml na milion B-ćelija) (DMEM bez glutamina, L-glutamina, pen/strep, MEM ne-esencijalne amino kiseline (sve od Invitrogena), je zatim dodavan tokom 2 minuta uz nežno mućkanje. Konačno je prethodno zagrejani IDMEM (8 ml na 106 B-ćelija) dodavan tokom 3 minuta.

Fuzionisane ćelije su oborene dole 400 x g 6 min i resuspendovane u 20 ml selektivnog medijuma (DMEM (Invitrogen), 15 % FBS (Hyclone), snabdevenim sa L-glutaminom, pen/strep, MEM ne-esencijalne amino kiselinama, natrijum piruvatom, 2-Merkaptoetanolom (sve

2

od Invitrogena), HA-Azaserine Hypoxanthine i OPI (oksalacetat, piruvat, goveđi insulin) (oba od Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannheim)) na milion B-ćelija. Ćelije su bile inkubirane tokom 20-30 min na 37 oC i zatim resuspendovane u 200 ml selekcionog medijuma i kultivisane tokom 3-4 dana u T175 flaskovima pre stavljanja u ploče sa 96 bunarčića. Prema tome, proizvedeni su hibridomi koji su produkovali antigen vezujuće proteine za PCSK9.

PRIMER 3

Selekcija PCSK9 antitela

Dati primer ističe kako su okarakterisani i odabrani različiti PCSK9 antigen vezujući proteini. Procenjeno je vezivanje odabranih antitela (produkovanih iz hibridoma proizvedenih u primerima 1 i 2) za PCSK9. Selekcija antitela je zasnovana na podacima vezivanja i inhibicije PCSK9 vezivanja za LDLR i afiniteta. Vezivanje za rastvorljivi PCSK9 je analizirano sa ELISA, kao što je opisano dole. BIAcore® (površinska plazmon rezonanca) je upotrebljen da se kvantifikuje afinitet vezivanja.

Primarni skrining

Obavljen je primarni skrining za antitela koja se vezuju za divlji tip PCSK9. Primarni skrining je izveden na dve žetve. Primarni skrining je obuhvatao ELISA ogled i bio je izveden koristeći sledeći protokol:

Upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom u koncentraciji od 4 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid, u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći . Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane. Ponovo je izvedeno 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je biotiniliran-PCSK9, bez V5 taga, i dodan je u 0.9 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko%10mM Ca2+ je dodan ploči i inkubiran 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno je ploči dodan 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) i gašenje sa 40 µl/bunarčić od 1N hlorovodonične kiseline je izvedeno nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

Primarni skrining rezultirao je sa ukupno 3104 antigen specifičnih hibridoma koji su identifikovani iz dve žetve. Na osnovu najviših ELISA OD, 1500 hibridoma po žetvi je bilo uspešno od ukupno 3000 pozitivnih.

Konfirmacioni skrining

3000 pozitivnih je ponovo skrinovano na vezivanje za to divlji tip PCSK9 da se potvrdi da su stabilni hibridomi ustanovljeli. Skrining je izveden na sledeći način: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčiča (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl/bunarčiću. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak bio je b-PCSK9, bez V5 taga, i dodan je u 0.9 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić od koza anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ je dodan ploči, i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane ponovo još jednom, koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan ploči i ugašen sa 40 µl/bunarčić od 1N hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Ukupno 2441 pozitivnih se ponovilo u drugom skriningu. Ova antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.

Skrining mišje unakrsne-reaktivnosti

Panel hibridoma je skrinovan na unakrsnu reaktivnost za mišji PCSK9 da bi bili sigurni da antitela mogu da se vezuju i za humani i za mišji PCSK9. Upotrebljen je sledeći protokol u pregledu unakrsne reaktivnosti: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-

4

ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izveden je 3-ciklus ispiranja. Uhvaćeni uzorak je biotinilran-mišji PCSK9, i dodan je u 1 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje.50 µl supernatanta je preneto u ploče i inkubirano 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim ponovo isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ je dodano ploči i ploča je inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan ploči i ugašen sa 40 µl/bunarčić 1N hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Zapaženo je da 579 antitela unakrsno reaguje sa mišjim PCSK9. Ta antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.

Skrining D374Y mutantnog vezivanja

D374Y mutacija u PCSK9 je dokumentovana u humanoj populaciji (npr., Timms KM i sar, „Mutacija PCSK9 uzrokuje autozomalno-dominantnu hiperholesterolemiju u Utah pedigreu", Hum. Genet. 114: 349-353, 2004). Sa ciljem da se odredi da li su antitela bila specifična za divlji tip ili se takođe vezuju za D374Y od PCSK9, uzorci su zatim skrinovani na vezivanje za mutantnu PCSK9 sekvencu koja obuhvata mutaciju D374Y. Protokol za skrining je bio sledeći: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezjuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 4 µg/ml u 1XPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći . Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su obavije ne sa biotinilranim humanim PCSK9 D374Y u koncentraciji od 1 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa2+ i inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Kasnije je istrošeni suprnatant kulture hibridoma razblažen sa 1:5 u PBS/mleko/Ca<2+>(10 ml plus 40 ml) i inkubiran tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje je 40 µl/bunarčić zečji anti-humani PCSK9 (Cayman Chemical) i humani anti-His 1.2.3 1:2 na 1µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa2+ titrovan na ploče, koje su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić od kozjeg anti-humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. 40 µl/bunarčić od kozjeg anti-zec IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2>+ je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan u ploču i ugašen sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Preko 96% pozitivnih hitova divljeg PCSK9 je takođe vezalo PCSK9.

Skrining velikog obima blokiranja veznika receptora

Za skrinovanje antitela koja blokiraju vezivanje PCSK9 za LDLR, razvijen je ogled koristeći D374Y PCSK9 mutant. Mutant je upotrebljen u ovom ogledu zato što ima viši nivo afiniteta vezivanja za LDLR omogućujući da se razvije mnogo osetljiviji ogled blokiranja veznika receptora. Upotrebljen je sledeći protokol u skriningu blokiranja veznika receptora: upotrebljene su Costar 3702 medijum veujuće ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences) u skriningu. Ploče su obavijene sa kozjim anti-LDLR (R&D Cat #AF2148) u 2 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je bio LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF), i dodan je u 0.4 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa i 10 minuta na sobnoj temperaturi. Istovremeno, 20 ng/ml biotiniliranog humanog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 15 mikrolitara istrošenog supernatanta hibridoma u Nunc polipropilen pločama i koncentracija istošenog supernatanta je razblažena 1:5. Ploče su zatim pre-inkubirane tokom oko 1 časa i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje.50 µl/bunarčić od preinkubirane mešaviine je preneto u LDLR obavijene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Da se detektuje LDLR-vezivanje b-PCSK9, u ploče je dodano 40 µl/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodano u ploče i ugašeno sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

Skrining je identifikovao 384 antitela koja blokiraju interakciju između PCSK9 i LDLR bunarčića, 100 antitela je snažno blokiralo interakciju (OD < 0.3). Ova antitela su inhibirala interakciju vezivanja PCSK9 i LDLR više od 90% (više od 90% inhibicije).

Ogled vezivanja veznika receptora na blokirani podskup

Ogled veznika receptora je zatim ponovljen koristeći mutantni enzim na 384 članom podskupu neutralizatora identifikovanih u prvom ogledu velikog obima inhibicije veznika receptora. Isti protokol je upotrebljen u skriningu ogleda 384 članog podskupa blokera kao što je obavljeno u skriningu velikog obima inhibicije veznika receptora. Ovaj ponovljeni skrining je potvrdio početne skrining podatke.

Ovaj skrining podskupa 384 člana identifikovao je 85 antitela koja su blokirala interakciju između PCSK9 mutantnog enzima i LDLR više od 90%.

Ogled vezivanja veznika receptora blokera koji vezuju divlji tip PCSK9 ali ne i D374Y mutant U početnom panelu 3000 supova bilo je 86 antitela za koja je pokazano da se specifično vezuju za divlji tip PCSK9 a ne za huPCSK9(D374Y) mutant. Tih 86 supova je testirano na sposobnost da blokira divlji tip PCSK9 vezivanja za LDLR receptor. Upotrebljen je sledeći protokol: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezjuće ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa anti-His 1.2.3 u 10 µg/ml u 1XPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF ili R&D Systems, #2148LD) je dodan u 5 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče bile isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Istovremeno, biotinilirani humani PCSK9 divljeg tipa je pre-inkubiran sa istošenim supernatantom hibridoma u Nunc polipropilen pločama. 22 µl sup hibridoma je preneto u 33ul od b-PCSK9 u koncentraciji od 583 ng/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa2+, dajući konačnu b-PCSK9 koncentraciju = 350 ng/ml i istrošeni supernatant u konačnom razblaženju od 1:2.5. Ploče su bile pre-inkubirane tokom približno 1 časa i 30 minuta na sobnoj temperaturi.50 µl/bunarčić od pre-inkubirane mešavine je preneto na LDLR uhvaćene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled je dodano u ploče. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča.

Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodano u ploču i ugašeno sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.

Rezultati skrininga

Na osnovu rezultata opisanih ogleda, identifikovano je nekoliko linija hibridoma koje produkuju antitela sa smanjenim interakcijama sa PCSK9. Upotrebljeno je ograničavajuće razblaživanje da se izoluje značajan broj klonova od svake linije. Klonovi su označeni prema broju linije hibridoma (npr. 21B12) i broju klona (npr. 21B12.1). Generalno nisu detektovane razlike među razlilčitim klonovima određene linije putem ovde opisanog funkcionalnog ogleda. U nekoliko slučajeva, klonovi su identifikovani od određene linije koja se ponašala drugačije u funkcionalnom ogledu, na primer, nađeno je da 25A7.1 ne blokira PCSK9/LDLR ali je bio 25A7.3 (označen ovde kao 25A7) neutralizujući. Izolovani klonovi su svaki prošireni u 50-100 ml hibridoma medija i ostavljeni da rastu do iscrpljivanja, (tj., manje od oko 10% vijabilnosti ćelija). Koncentracija i potentnost antitela za PCSK9 u supernatantima tih kultura je određena sa ELISA i sa in vitro funkcionalnim testiranjem, kao što je ovde opisano. Kao rezultat ovde opisanog skrininga, identifikovani su hibridomi sa najvišim titrom antitela za PCSK9. Odabrani hibridomi su prikazani na FIG.2A-3D i u Tabeli 2.

PRIMER 4.1

Produkcija humanog 31H4 IgG4 antitela iz hibridoma

Ovaj primer generalno opisuje kako je jedan od antigen vezujućih proteina proizveden od linije hibridoma. Produkcioni rad je upotrebio 50 ml generisanog iscrpljenog supernatanta praćenog sa prečišćavanjem proteina A. Integra produkcija je korišćena za povećanje količine i izvedena je kasnije. Linija hibridoma 31H4 je odgajena u T75 flaskovima u 20 ml medija (Integra Media, Table 5). Kada je hibridom bio gotovo tečan u T75 flaskovima, on je prenet u Integra flask (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).

Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1x106 ćelija po ml od 31 H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori.

Nakon jedne nedelje, medijum je uklonjen iz obe komore Integra flaskova i zamenjen sa svežim Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz male komore su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijumi iz 1 nedelje iz linije hibridoma su kombinovani sa sakupljenim medijumima iz 2 nedelje iz linije hibridoma. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz hibridoma linije su oboreni da se uklone ćelije i ostatak (15 minuta na 3000rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22um). Pročišćeni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijumi se mogu prvo koncentrovati a zatim napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Vezana antitela proteina na Protein A koloni su obnovljena sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM Citrat, pH 3.0). Sakupljeni antigeni proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom ekskluzije veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.

TABELA 5

Sastav medijuma

PRIMER 4.2

Produkcija rekombinantnih 31H4 humanih IgG2 antitela iz transfektovanih ćelija Ovaj primer ističe kako su 31H4 IgG2 antitela produkovana iz transfektovanih ćelija.293 ćelije za prolaznu ekspresiju CHO ćelije za stabilnu ekspresiju su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 31H4. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.

PRIMER 5

Produkcija humanih 21B12 IgG4 antitela iz hibridoma

Ovaj primer ističe kako je antitelo 21B12 IgG4 produkovano iz hibridoma. Hibridom linija 21B12 je odgajena u T75 flaskovima u medijumu (Integra Media, Tabela 5). Kada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima, oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).

Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1×106 ćelija po ml od 31 H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medija). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori. Nakon jedne nedelje, medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibridoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibridoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibridoma su oboreni da se uklone ćelije i otpad (15 minuta na 3000 rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22 µm). Izbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.

PRIMER 6

Produkcija humanih 21B12 IgG2 antitela iz transfektovanih ćelija Ovaj primer ističe kako je antitelo 21B12 IgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelija za prolaznu ekspresiju i CHO ćelija za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 21B12. Uslovni medijum iz hibridoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Nespecifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolona (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 21B12 proteine su SP-Sepharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.

PRIMER 7

Produkcija humanih 16F12 IgG4 antitela iz hibridoma

Ovaj primer ističe kako je antitelo 16F12 IgG4 produkovano iz hibridoma. Linija hibridoma 16F12 je odgajena u T75 flaskovima u mediju (vidi Tabelu 5). Kada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima, oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).

Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1×106 ćelija po ml od 31 H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori.

Nakon jedne nedelje, medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibridoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibridoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibridoma su oboreni da se uklone ćelije i

1

otpad (15 minuta na 3000 rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22 µm). Izbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su Q Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitela su isprana sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.

PRIMER 7.1

Produkcija humanih 16F12 IgG2 antitela od transfektovanih ćelija

Ovaj primer ističe kako je antitelo 16F12 IgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelije za prolaznu ekspresiju i CHO ćelije za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 16F12. Uslovni medijum iz hibridoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Nespecifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je SP Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su SP-Sepharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.

PRIMER 7.2

Analiza sekvence teških i lakih lanaca antitela

Sekvence nukleinske kiseline i amino kiseline za lake i teške lance gornjih antitela određene su sa Sanger (dideoksi) nukleotidnim sekvenciranjem. Sekvence amino kiseline su zatim izvedene za sekvence nukleinske kiseline. Sekvence nukleinske kiseline za varijabilne regione su prikazane na FIG.3E-3JJ.

2

cDNK sekvence za lambda laki lanac varijabilnog regiona od 31 H4, 21B12, i 16F12 su određene i obelodanjne kao SEQ ID NOs: 153, 95, i 105 respektivno.

cDNK sekvence za teški lanac varijabilnog regiona od 31H4, 21B12, i 16F12 su određene i obelodanjene kao SEQ ID NOs: 152, 94, i 104 respektivno.

Lambda laki lanac konstantni region (SEQ ID NO: 156), i IgG2 i IgG4 teški lanac konstantni region (SEQ ID NOs: 154 i 155) su prikazani na FIG.3KK.

Određene su polipeptidne sekvence predviđene od svake od tih cDNK sekvenci. Predviđene polipetidne sekvence za varijabilne regione lambda lakog lanca od 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđene i obelodanjene u SEQ ID NOs: 12, 23; i 35 respektivno, konstantni region lambda lakog lanca (SEQ ID NO: 156), varijabilni regioni teškog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđeni i obelodanjeni kao (SEQ ID NOs. 67, 49, i 79 respektivno. IgG2 i IgG4 konstantni regioni lambda teškog lanca (SEQ ID NOs: 154 i 155).

FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 deobe su prikazane u FIG 2A-3D.

Na osnovu podataka o sekvenci, određeni su geni germinativne linije iz kojih su svaki varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca izvedeni. Identitet gena germinativne linije je naznačen u susedstvu odgovarajuće linije hibridoma na FIG. 2A-3D i svaka je predstavljena sa SEQ ID NO. FIG..2A-3D takođe opisuju sekvence određenih amino kiselina za dodatna antitela koja su okarakterisana.

PRIMER 8

Određivanje izoelekričnih tačaka tri antitela

Teorijski pI-ovi antitela zasnovanih na sekvenci amino kiseline su određeni da imaju vrednosti 7.36 za 16F12; 8.47 za 21B12; i 6.84 za 31H4.

PRIMER 9

Karakterizacija vezivanja antitela za PCSK9

Pošto je identifikovan broj antitela koja se vezuju za PCSK9, upotrebljeno je nekoliko pristupa da se kvantifikuje i dalje okarakteriše priroda vezivanja. U jednom aspektu studije, obavljena je Biacore analiza afiniteta. U drugom aspektu studije obaljena je KinExA® analiza afiniteta. Upotrebljeni uzorci i puferi u ovim studijama su dole prikazani u Tabeli 6.

TABELA 6

Merenje afiniteta BIAcore

BIAcore® (naprava za površinsku rezonancu plazmona, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) analiza afiniteta za 21B12 antitela za PCSK9 opisana u Primeru je izvedena prema uputstvima proizvođača.

Ukratko, eksperimenti površinske rezonance plazmona izvedeni su koristeći Biacore 2000 optičke biosenzore (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Svako pojedinačno anti-PCSK9 antitelo je imobilizirano u istraživačkom-stepenu CM5 biosenzor čipu putem aminsjedinjavanja u nivoima koji daju maksimum odgovora vezivanja komponente (Rmax) ne više od 200 jedinica rezonanse (RU). Koncentracija PCSK9 proteina je menjana u dvostrukim intervalima (komponenta) i injektovana je preko imobilizirane površine antitela (u stopi protoka od 100 µl/min tokom 1.5 minuta). Svež HBS-P pufer (pH 7.4, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20, Biacore) snabdeven sa 0.01% BSA je upotrebljen kao pufer za vezivanje. Afiniteti vezivanja svakog anti-PCSK9 antitela su izmereni u odvojenim eksperimentima protiv svakog od humanih, mišjih, i rezus majmuna PCSK9 proteina na pH 7.4 (upotrebljene koncentracije bile su 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, i 0 nM).

Sem toga, takođe su izmereni afiniteti vezivanja antitela za humani PCSK9 pri pH 6.0 sa pH 6.0 HBS-P puferom (pH 6.0, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20, Biacore) snabdevenim sa 0.01% BSA. Dobijeni signal vezivanja je proporcionalan slobodnom PCSK9 u rastvoru. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresione analize kompetitivnih krivi koristeči dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu (KinExA® softver, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (n=l za 6.0 pH tura). Interesantno je da se pokazalo da antitela pokazuju čvršći afinitet vezivanja pri nižem pH (kada je Kd bio 12.5, 7.3, i 29 pM za 31H4, 21B12, i 16F12 respektivno).

Parametri kinetike vezivanja antitela uključujući ka (konstanta stope vezivanja), kd (konstanta stope disocijacije), i KD (konstanta ravnotežne disocijacije) su određeni koristeći BIA procenu 3.1 računarski program (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). Niža konstanta ravnotežne disocijacije ukazuje na viši afinitet antitela za PCSK9. KD vrednosti određene sa BIAcore<®>analizom afiniteta predstavljene su u Tabeli 7.1, prikazanoj dole.

4

TABELA 7.1

Tabela 7.2 prikazuje koni koffstope.

TABELA 7.2

Merenje afiniteta KinExA®

KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) analiza afiniteta 16F12 i 31H4 je obavljena prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Reacti-Gel™ (6x) (Pierce) su pre-obavijene sa humanim, V5-tagovanim rezus ili His- tagovanim mišjim PCSK9 proteinima i blokirani sa BSA. 10 ili 100 pM od svakog antitela 16F12 ili antitela 31H4 i jedan od PCSK9 proteina su zatim inkubirani sa različitim koncentracijama (0.1 pM - 25 nM) od PCSK9 proteina na sobnoj temperaturi tokom 8 časova pre nego što su propušteni kroz PCSK9-obavijene perle. Količina perla-vezanih 16F12 ili 31H4 je kvantifikovana sa fluorescentno (Cy5) obeleženim kozjim antihumanim IgG (H+L) antitelom (Jackson Immuno Research). Signal vezivanja je proporcionalan koncentraciji slobodnog 16F12 ili 31H4 u ravnoteži vezivanja. Konstanta ravnotežne disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresivne analize kompetitivnih krivi koristeći dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu. KinExA® Pro softver je upotrebljen u analizi. Krive vezivanja generisane u ovoj analizi su predstavljene kao FIG.4A-4F.

I 16F12 i 31H4 antitela pokazala su sličan afinitet za humani i od rezus majmuna PCSK9, ali približno 10-250 puta manji afinitet za mišji PCSK9. Od dva testirana antitela koristeći KinExA® sistem, antitelo 31H4 je pokazalo viši afinitet i za humani i od rezus majmuna PCSK9 sa 3 i 2 pM KD, respektivno.16F12 je pokazao neznatno slabiji afinitet pri 15pM KDza humani PCSK9 i 16 pM KDza rezus majmuna PCSK9.

Rezultati KinExA® analize afiniteta sumirani su u Tabeli 8.1 prikazanoj dole.

TABELA 8.1

Sem toga, SDS PAGE je pokrenut da se proveri kvalitet i kvantitet uzoraka i prikazan je na FIG. 5A. cPCSK9 je pokazao oko 50% manje na gelu i takođe na osnovu koncentracije aktivnog vezivanja izračunate iz KinExA® ogleda. Prema tome, KD od mAbs do cPCSK9 je doterana kao 50% od aktivnog u prisutnom cPCSK9.

BIAcore rastvor ogleda ravnotežnog vezivanja je upotrebljen da se izmere Kd vrednosti za AVP 21B12.21B12.1 je pokazao mali signal koristeći KinExA ogled, prema tome, primenjen je biacore rastvor ogled ravnoteže. Pošto nije zapaženo značajno vezivanje na vezivanju antitela za imobilisanu površinu PCSK9, 21B12 antitelo je imobilisano protokom ćelija 4 od CM5 čipom koristeći amin sjedinjavanje sa gustinom oko 7000 RU. Protok ćelija 3 je upotrebljen kao pozadinska kontrola. 0.3, 1, i 3 nM od humanog PCSK9 ili od rezus majmuna PCSK9 su pomešani sa serijskim razblaženjima od 21B12.1 uzoraka antitela (u rasponu od 0.001 ~ 25 nM) u PBS plus 0.1 mg/ml BSA, 0.005% P20. Vezivanje slobodnog PCSK9 u mešanim rastvorima je mereno putem ubrizgavanja preko 21B12.1 površine antitela. 100% PCSK9 signala vezivanja na površinu 21B12.1 je određeno u otsustvu mAb u rastvoru. Smanjen PCSK9 odgovor vezivanja sa rastućim koncentracijama od mAb ukazalo je na vezivanje PCSK9 za mAb u rastvoru, što je blokiralo PCSK9 da se veže za imobilizovanu peptidnu površinu. Plotovanjem PCSK9 signala vezivanja u odnosu na koncentracije mAb, izračunat je KD iz tri seta krivih (0.3, 1 i 3nM fiksirana PCSK9 koncentracija) koristeći model homogenog vezivanja na jednom mestu u KinExA Pro™ softveru. I ako cPCSK9 ima nižu koncentraciju proteina zapaženu iz KinExA ogleda i SDS-gela, njegova koncentracija nije ovde doterana pošto koncentracija od cPCSK9 nije upotrebljena za izračunavanje KD. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.2 niže i FIG. 5B-5D. FIG.

5B prikazuje rezultate iz ogleda ravnotežnog rastvora za tri različite koncentracije hPCSK9 za hPCSK9. FIG. 5C prikazuje slični set rezultata za mPCSK9. FIG. 5D prikazuje rezultate iz gornjeg biacore ogleda hvatanja.

TABELA 8.2

PRIMER 10

Bining epitopa

Kompeticiona ELISA je upotrebljena za bining anti-PCSK9 antitela. Ukratko, da bi se odredilo da li dva antitela pripadaju istom epitop binu, jedno od antitela (mAb1) je prvo obavijeno na ELISA ploču (NUNC) u 2 µ/ml putem inkubacije preko noći. Ploča je zatim isprana i blokirana sa 3% BSA. U međuvremenu, 30 ng/ml biotiniliranog hPCSK9 je inkubirano sa drugim antitelom (mAb2) tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Mešavina je primenjena na obavijeni mAb1 i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. ELISA ploča je zatim isprana i inkubirana sa Neutravidin-HRP (Pierce) na razblaženjima od 1:5000 tokom 1 časa. Nakon drugog ispiranja, ploča je inkubirana sa TMB supstratom i signal je detektovan na 650 nm koristeći Titertek čitač ploča. Antitela sa istim profilima vezivanja su grupisana zajedno u isti epitop bin. Rezultati studija biniga antitela predstavljeni su u Tabeli 8.3.

TABELA 8.3

Dodatno ispitivanje bininga epitopa izvedeno je koristeći BIAcore. Tri mAbova, 16F12, 21B12 i 31H4, su imobilisani na protoku ćelija 2, 3 i 4 sa gustinom oko 8000 RU.5 nM PCSK9 od čoveka, miša i rezus majmuna su ubrizgani preko površina mAb da se dostigne oko 100 do 500 RU. 10nM mAbova su ubrizgani preko površine PCSK9. Zatim je zabeleženo vezivanje tri mAbova za tri različita PCSK9 proteina preko tri mAbova.

Ako dva mAbova imaju slični epitop na antigenu, mAb 1 neće pokazati vezivanje za antigen koji je već vezan za mAb 2. Ako dva mAbova imaju različite epitope na antigenu, mAb1 će pokazati vezivanje za antigen vezan za mAb2. FIG. 5E prikazuje te epitop bining rezultate u obliku grafikona za tri mAbs na humanom PCSk9. Sličan obrazac je zapažen za mPCSK9 i cPCSK9. Kao što je prikazano na grafikonu, 16F12 i 31H4 izgleda da dele sličan epitop, dok 21B12 izgleda da ima različit epitop.

PRIMER 11

Efikasnost 31H4 i 21B12 u blokiranju vezivanja D374Y PCSK9/LDLR

Ovaj primer obezbeđuje IC50 vrednosti za dva antitela u blokiranju sposobnosti PCSK9 D374Y da se vezuje za LDLR. Providne ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 mikrograma/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Systems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat, pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puferom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 mikrograma/ml od LDL receptora (R&D Systems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCl2). Istovremeno sa ovom inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 ili 21B12 IgG4 antitela, koje je razblaženo u puferu A, ili samom puferu A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo mešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano inkubacijom sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćenog sa TMB supstratom (KPL). Signal je ugašen sa 1N HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm.

Rezultati ovog vezivanja prikazani su na FIG. 6A-6D. Sumarizovano, IC50 vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 199 pM za 31H4 IgG2 (FIG. 6A), 156 pM za 31H4 IgG4 (FIG.6B), 170 pM za 21B12 IgG2 (FIG.6C), i 169 pM za 21B12 IgG4 (FIG.6D).

Antitela su takođe blokirala vezivanje divljeg tipa PCSK9 za LDLR u tom ogledu.

PRIMER 12

Ogled uzimanja LDL od strane ćelije

Ovaj primer pokazuje sposobnost različitih antigen vezjućih proteina da redukuju uzimanje LDL od strane ćelija. Humane HepG2 ćelije su zasejane u crne ploče sa prozirnim sa 96-bunarčića (Costar) u koncentraciji od 5x10<5>ćelija po bunarčiću DMEM medijumu (Mediatech, Inc) snabdevenim sa 10% FBS i inkubirane na 37 °C (5% CO2) preko noći. Da se formira kompleks PCSK9 i antitelo, 2 µg/ml od D374Y humanog PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama antitela razblaženim u puferu za uzimanje (DMEM sa 1% FBS) ili samom puferu za uzimanje (kontrola) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja ćelija sa PBS, mešavina D374Y PCSK9/antitelo je preneta u ćelije, a nakon toga u LDL-BODIPY (Invitrogen) razblaženim u puferu za uzimanje u konačnoj koncentraciji od 6 µg/ml. Nakon inkubacije tokom 3 časa na 37 °C (5% CO2), ćelije su snažno isprane sa PBS i fluorescentni signal ćelije je detektovan sa Satire™ (TECAN) na 480-520nm (ekscitacija) i 520-600nm (emisija).

Rezultati ogleda ćelijskog uzimanja prikazani su na FIG. 7A-7D. Sumarizovano, IC50 vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 16.7 nM za 31 H4 IgG2 (FIG.7A), 13.3 nM za 31H4 IgG4 (FIG.7B), 13.3 nM za 21B12 IgG2 (FIG.7C), i 18 nM za 21B12 IgG4 (FIG. 7D). Ovi rezultati pokazuju da primenjeni antigen vezujući proteini mogu redukovati efekat PCSK9 (D374Y) da blokira LDL uzimanje od strane ćelija Antitela su takođe blokirala efekat divljeg tipa PCSK9 u ovom ogledu.

PRIMER 13

Efekat snižavanja serum holesterola sa 31H4 antitelom u 6. danu studije Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog serum holesterola (TC) u divljem tipu (WT) miševa putem terapije antitelom protiv PCSK9 proteina, izvedena je sledeća procedura.

Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) hranjeni su normalnom hranom (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trjanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml u PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml u PBS) u nivoima od 10mg/kg kroz repnu venu miša pri T=0. Ne tretirani miševi su takođe postavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa. Dozirane grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 9.

TABELA 9

Miševi su žrtvovani sa CO2 asfihijacijom u prethodno određenim vremenskim tačkama prikazanim u Tabeli 9. Sakupljena je krv preko vena cava u eppendorf tube i ostavljena je da se zgrušava na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Uzorci su zatim oboreni u stonoj centrifugi na

1

12,000xg tokom 10 minuta da se razdvoji serum. Ukupni holesterol u serumu i HDL-C su mereni koristeći Hitachi 912 klinički analizator i Roche/Hitachi TC i HDL-C komplete.

Rezultati eksperimenta su prikazani na FIG. 8A-8D. Sumarizovano, miševi kojima je davano antitelo 31 H4 pokazali su smanjenje nivoa holesterola u serumu tokom trajanja eksperimenta (FIG. 8A i FIG. 8B). Sem toga, zapaženo je da su miševi takođe pokazali smanjenje nivoa HDL (FIG. 8C i FIG. 8D). Za FIG. 8A i FIG. 8C, procenat promene u odnosu na kontrolu IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.01, # P<0.05). Za FIG. 8B i FIG 8D, procenat promene u odnosu na ukupni holesterol u serumu i nivoe HDL merene kod prirodnih životinja na t=0 č (*P<0.01, # P<0.05).

U odnosu na snižavanje nivoa HDL, napomenuto je da će stručnjak shvatiti da smanjenje HDL kod miševa nije znak da će se smanjenje HDL dogoditi kod ljudi i jednostavno dalje reflektuje da su nivoi holesterola u serumu u organizmu smanjeni. Primećeno je da miševi transportuju glavninu serum holesterola u česticama lipoproteina visoke gustine (HDL) koje su različite kod ljudi koji nose glavninu serum holesterola na LDL česticama. Kod miševa merenje ukupnog serum holesterola najbliže prati nivo serum HDL-C. Mišji HDL sadrži apolipoprotein E (apoE) koji je veznik za LDL receptor (LDLR) i omogućuje mu da se očisti od LDLR. Prema tome, isptivanje HDL je odgovarajući indikator za pvaj primer, kod miševa (uz razumevanje da smanjenje u HDL nije očekivano za ljude). Na primer, humani HDL, nasuprot tome, ne sadrži apoE i nije veznik za LDLR. Pošto PCSK9 povećavaju ekspresiju LDLR kod miša, jetra može očistiti više HDL i, prema tome, sniziti nuivoe serum HDL-C.

PRIMER 14

Efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR u studiji od 6 dana

Ovaj primer pokazuje da antigen vezujući protein menja nivo LDLR kod subjekta, kao što je predviđeno, tokom vremena. Western blot analiza izvedena je sa ciljem da potvrdi efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR.50-100 mg tkiva jetre dobijenog od žrtvovanih miševa opisanih u Primeru 13 je homogenizovano u 0.3 ml RIPA pufera (Santa Cruz Biotechnology Inc.) koji je sadržao kompletan inhibitor proteaze (Roche). Homogenat je inkubiran na ledu tokom 30 minuta i centrifugiran da se istaloži ćelijski otpad. Koncentracija proteina u supernatantu je merena koristeći reagense za BioRad protein ogled (BioRad laboratorije).100µg proteina je denaturisano na 70 °C tokom 10 minuta i odvojeno na 4-12% Bis-Tris SDS gradijent gelu (Invitrogen). Proteini su preneti u 0.45 µm PVDF membrane (Invitrogen) i blokirani u puferu za ispiranje (50mM Tris PH7.5, 150mM NaCL, 2mM CaCl2 i 0.05% Tween 20) koji je sadržao 5% nemasnog mleka tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Blot je zatim proban sa kozjim anti-miš LDLR antitelom (R&D system) 1:2000 ili anti-ß aktin (sigma) 1:2000 tokom 1 časa na sobnoj

1 1

temperaturi. Blot je ispran snažno i inkubiran sa goveđim anti-koza IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2000 ili kozjim anti-miš IgG-HRP (Upstate) 1:2000. nakon 1 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, blot je potpuno ispran i imuno reaktivne trake su detektovane koristeći ECL plus komplet(Amersham biosciences). Western blot je pokazao povećanje u nivoima LDLR proteina u prisustvu antitela 31H4, kao što je prikazano na FIG.9.

PRIMER 15

Efekat snižavanja serum holesterola od antitela 31H4 u studiji od 13 dana

Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog serum holesterola (TC) u miševima divljeg tipa (WT) preko terapije antitelom protiv PCSK9 proteina u studiji od 13 dana, izvedena je sledeća procedura.

Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) normalno su hranjeni (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trajanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml in PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml in PBS) u nivou od 10 mg/kg kroz repnu venu miša na T=0. Prirodni miševi su takođe stavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa.

Grupe doza i vreme žrtvovanja prikazani su u Tabeli 10. Životinje su žrtvovane i isečene su im jetre i pripremljene kao u Primeru 13.

TABELA 10

1 2

Kada je eksperiment od 6 dana proširen do studije od 13 dana, zapažen je isti efekat snižavanja serum holesterola kao i u studiji od 6 dana takođe i u studiji od 13 dana Određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 31 % smanjenje u serum holesterolu 3 dana, što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u 13 danu. FIG.10A prikazuje rezultate ovog eksperimenta. FIG. 10C prikazuje rezultate ponavljanja gornje procedure sa 10mg/kg dozom od 31H4, i sa drugim antitelom, 16F12, takođe na 10mg/kg. Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 11.

TABELA 11

1

Kao što je prikazano na FIG.10C i 16F12 i 31H4 su rezultirali sa značajnim i suštinskim smanjenjem ukupnog serum holesterola nakon samo jedne doze i obezbedili su korist tokom preko jedne nedelje (10 dana ili više). Rezultati iznete studije od 13 dana bili su konzistentni sa rezultatima prvog od 13 dana studije, sa zapaženim smanjenjem u nivoima serum holesterola od 26% u danu 3. Za FIG. 10A i FIG. 10B, procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.01). Za FIG.10C, procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.05).

PRIMER 16

Efekat antitela 31H4 na nivoe HDL u studiji od 13 dana

Nivoi HDL za životinje u Primeru 15 su takođe ispitani. Nivoi HDL se smanjuju kod miševa. Još određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 33% smanjenje u nivoima HDL 3 dana, što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u danu13. FIG. 10B prikazuje rezultate eksperimenta. Postojalo je smanjenje u nivoima HDL od 34% u danu 3. FIG. 10B prikazuje rezultate ponovljenog eksperimenta 13 dana.

Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, iako će antitela snižavati mišji HDL, ne očekuje se da se to dešava kod ljudi zbog razlika u HDL kod ljudi i drugih organizama (kao što su miševi). Prema tome, smanjenje u mišjem HDL nije indikativno za smanjenje u humanom HDL.

PRIMER 17

Ponovljeno davanje antitela produkuje kontinuirane koristi od antigen vezujućih peptida Sa ciljem da se verifikuje da se rezultati dobijeni u Primerima gore mogu produžiti u dalje koristi sa dodatnim dozama, ponovljeni su eksperimenti iz Primera 15 i 16 sa procedurom doziranja prikazanom na FIG. 11A. Rezultati su prikazani na FIG. 11B. Kao što se može videti na grafikonu na FIG. 11B, dok su oba seta miševa pokazali značajno smanjenje u ukupnom serum holesterolu zato što su svi miševi primili početnu injekciju 31H4 antigen vezujućeg proteina, miševi koji su primili dodatnu injekciju 31H4 AVP pokazali su kontinuiranu redukciju ukupnog serum holesterola, dok su oni koji su primili samo kontrolnu injekciju eventualno pokazali povećanje ukupnog serum holesterola. Za FIG. 11, procenat promene u odnosu na prirodne životinje na t=0 časova (*P<0.01, **P<0.001).

Rezultati iz ovog primera pokazuju da, za razliku od drugih tretmana holesterola, u kojima ponovljena primena dovodi do redukcije u efikasnosti zbog bioloških doterivanja kod subjekta, predmetni pristup ne izgleda da pati od toga tokom vremena koje je ispitano. Štaviše,

1 4

ovo sugeriše da povratak nivoa ukupnog serum holesterola ili HDL holesterola na polaznu osnovu, zapažen u prethodnim primerima, nije rezultat neke otpornosti na tretman koji je razvijen od strane subjekta, već pre od iscrpljivanja dostupnosti antitela kod subjekta.

PRIMER 18

Mapiranje epitopa humanih anti PCSK9 antitela

Ovaj primer ističe metode za određivanje koji su ostaci u PCSK9 uključeni u formiranje dela epitopa za antigen vezujuće proteine ovde obelodanjene za PCSK9.

Sa ciljem da se odrede epitopi za koje se određeni AVPi predmetnog pronalaska vezuju, epitopi AVPa mogu da se mapiraju koristeći sintetičke peptide izvedene od specifične sekvence PCSK9 peptida.

Peptidna područja SPOTova (Sigma Genosys) mogu se upotrebiti da se ispituju molekularne interakcije humanih anti-PCSK9 antitela sa njihovim peptidnim epitopom. SPOT tehnologija je zasnovana na sintezi peptida čvrste faze u formatu pogodnom za sistematsku analizu epitopa antitela. Sinteza uobičajene matrice oligopeptida dostupna je komercijalno od strane Sigma-Genosys. Može se dobiti peptidna matrica preklopljenih oligopeptida izvedenih iz sekvence amino kiseline od PCSK9 peptida. Matrica može sadržati seriju od 12-mer peptida kao tačaka na polipropilenskom membranskom listu. Peptidna matrica može obuhvatiti celu dužinu zrele sekvence PCSK9. Svaki uzastopni peptid može se predstaviti sa 1 ostatkom od prethodnog, dajući uklopljenu, preklapajuću biblioteku matrica oligopeptida. Membrana koja nosi peptide može reagovati sa različitim anti-PCSK9 antitelima (1 mikrogram/ml). Vezivanje mAbova za peptide vezane za membranu može se proceniti sa imuno ogledom vezanim za enzime koristeći HRP-konjugovano sekundarno antitelo a nakon toga sa pojačanom hemiluminescencijom (ECL).

Sem toga, funkcionalni epitopi mogu se mapirati sa kombinatornim skaniranjem alanina. U tom procesu može se upotrebiti kombinatorna alanin-skening strategija da se identifikuju amino kiseline PCSK9 proteina koje su neophodne za interakciju sa anti-PCSK9 AVPa. Da se to postigne, može se upotrebiti drugi set SPOT matrica za skaniranje alanina. Panel varijantnih peptida sa supstitucijama alanina u svakom od 12 ostataka može se skanirati kao i gore. To će omogućiti da epitopi za AVPe za humani PCSK9 budu mapirani i identifikovani.

U alternativnom načinu, pod uslovom da je moguće da je epitop konformacioni, mogu se upotrebiti kombinacija skaniranja alanina i/ili skaniranja arginina, kokristalizacije antitela FAB/PCSK9, i ograničene proteolize/LC-MS (tečna hromatografija masenog spek.) da se identifikuju epitopi.

PRIMER 19

Upotreba PCSK9 antitela za tretman poremećaja vezanih sa holesterolom

1

Humani pacijent koji pokazuje poremećaj vezan za holesterol (u kojem redukcija u holesterolu (kao što je serum holesterol) može biti korisna) je primio terapeutski efektivnu količinu PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da se odredi da li su simptomi poremećaja opali. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je prolazio kroz tretman sa PCSK9 antitelom ima redukovane nivoe serum holesterola, u poređenju sa pacijentima koji nisu tretirani.

PRIMER 20

Upotreba PCSK9 antitela za tretman hiperholesterolemije

Humani pacijent koji pokazuje simptome hiperholesterolemije je tretiran sa terapeutski efektivnom količinom PCSK9 antitela, kao što je 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da se odredi da li je opao nivo serum holesterola. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovane nivoe serum holesterola u poređenju sa pacijentima sa artritisom koji nisu primili tretman.

PRIMER 21

Upotrebe PCSK9 antitela za prevenciju koronarnih srčanih bolesti i/ili povratnih kardiovaskularnih događaja

Identifikovan je humani pacijent koji je pod rizikom da razvije koronarnu srčanu bolest. Pacijentu je davana terapeutski efektivna količina PCSK9 antitela, kao što su 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12), bilo sami, konkurentno ili uzastopno sa statinom, npr., simvastatinom. U određenim periodima vremena tokom tretmana, humani pacijent je praćen da se odredi da li su se pacijentovi ukupni nivoi serum holesterola promenili. Tokom preventivnog tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovan serum holesterol smanjujući tako njegov rizik od koronarne srčane bolesti ili povratka kardiovaskularnih događaja u poređenju sa pacijentima koji nisu primili tretman.

PRIMER 22

Upotreba PCSK9 antitela kao dijagnostičkog agensa

Enzim-vezani imunosorbent ogled (ELISA) za detekciju PCSK9 antigena u uzorku može se upotrebiti da se dijagnostifikuju pacijenti koji pokazuju visoke nivoe produkcije PCSK9. U tom ogledu, bunarčići mikrotitar ploče, kao što je mikrotitar ploča sa 96-bunarčića ili mikrotitar ploča sa 384-bunarčića, su apsorbovani nekoliko časova sa prvim potpuno humanim monoklonalnim antitelom usmernim protiv PCSK9. Imobilizirano antitelo služi kao antitelo za zarobljavanje za bilo koji PCSK9 koji može biti prisutan u test uzorku. Bunarčići su isprani i

1

tretirani sa agensom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da se spreči nespecifična apsorpcija analita.

Nakon toga bunarčići su tretirani sa test uzorkom suspektnim da sadrži PCSK9, ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak može biti, na primer, uzorak seruma od pacijenta koji je pod sumnjom da ima nivoe antigena u cirkulaciji koji se smatraju dijagnostičkim za patologiju.

Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, bunarčići su tretirani sa drugim potpuno humanim monoklonalnim PCSK9 antitelom koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Takođe se može upotrebiti monoklonalno ili mišje ili poreklom od druge vrste. Obeleženo PCSK9 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nakon ispiranja viška sekundarnog antitela, bunarčići su tretirani sa avidin-konjugovanom peroksidazom rena (HRP) i pogodnim hromogenim substratom. Koncentracija antigena u test uzorcima je određena putem poređenja sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.

Ovaj ELISA ogled obezbeđuje visoku specifičnost i vrlo osetljiv ogled za detekciju PCSK9 antigena u test uzorku.

Određivanje koncentracije PCSK9 proteina kod subjekata

Sendvič ELISA može kvantifikovati nivoe PCSK9 u humanom serumu. Dva potpuno humana monoklonalna PCSK9 antitela iz sendvič ELISA, prepoznaju različite epitope na PCSK9 molekulu. Alternativno mogu da se upotrebe monoklonalna antitela miša ili ona poreklom od druge vrste. ELISA je izvedena na sledeći način: 50 µL PCSK9 antitela za hvatanje u puferu za obavijanje (0.1 M NaHCO3, pH 9.6) u koncentraciji od 2 µg/mL je obavijeno na ELISA ploče (Fisher). Nakon inkubacije na 4° C preko noći, ploče su tretirane sa 200 µL pufera za blokiranje (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% Timerosal u PBS) tokom 1 časa na 25° C. Ploče su isprane (3x) koristeći 0.05% Tween 20 u PBS puferu za ispiranje, WB). Normalni ili serumi pacijenta (Clinomics, Bioreclaimation) su razblaženi u puferu za blokiranje koji je sadržao 50% humanog seruma. Ploče su inkubirane sa uzorcima seruma preko noći na 4° C, isprane sa WB, i zatim inkubirane sa 100 µL/bunarčić od biotiniliranog detekcionog PCSK9 antitela tokom 1 časa na 25° C. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane sa HRP-Streptavidinom tokom 15 minuta, isprane kao i prethodno, i zatim tretirane sa 100 µL/bunarčić od ofenilenediamina u H2O2(Sigma rastvor za razvijanje) za generisanje boje. Reakcija je zaustavljena sa 50 µL/bunarčić od H2SO4(2M) i analizirana koristeći ELISA čitač ploča na 492 nm. Koncentracija PCSK9 antigena u uzorcima seruma je izračunata putem poređenja razblaženja prečišćenog PCSK9 antigena koristeći program fitovanja četvoro parametarske krive.

1

Određivanje koncentracije PCSK9 varijante proteina kod subjekata

Koraci istaknuti gore mogu se izvesti koristeći antitela koja su zabeležena ovde i koja se vezuju i za divlji tip PCSK9 i varijantu PCSK9 (D374Y). Dalje se mogu upotrebiti antitela koja se vezuju za divlji tip ali ne i za mutant (ponovo koristeći slični protokol kao što je istaknut gore) da se odredi da li je PCSK9 prisutan kod subjekta divlji tip ili je D374Y varianta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati koji su pozitivni za obe ture biće divlji tip, dok će oni koji su pozitivni za prvu turu, ali ne i za drugu turu antitela, uključuju D374Y mutaciju. Postoje visoke frekvence mutacija u populaciji koje su poznate i mogu imati koristi posebno od agensa kao što su AVPi obelodanjeni ovde.

PRIMER 23

Upotreba PCSK9 antigen vezujućeg proteina za prevenciju hiperholesterolemije

Humani pacijent koji je pod rizikom da razvije hiperholesterolemiju je identifikovan preko analize porodične istorije i/ili stila života, i/ili trenutnih nivoa holesterola. Subjektu je regularno davana (npr., jednom nedeljno) terapeutski efektivna količina PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim vremenskim periodima tokom tretmana, pacijent je praćen da se odredi da li su se nivoi serum holesterola smanjili. Nakon tretmana, nađeno je da subjekti koji su prošli kroz preventivni tretman sa PCSK9 antitelima imaju snižene nivoe serum holesterola, u poređenju sa subjektima koji nisu tretirani.

PRIMER 24

PCSK9 AVPi dalje regulišu LDLR u prisustvu statina

Ovaj primer pokazuje da AVPi za PCSK9 produkuju dalje povećanje dostupnosti LDLR kada se upotrebe u prisustvu statina, pokazujući da se dalje koristi mogu postići kombinovanom upotrebom ova dva.

HepG2 ćelije su zasejane u DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i odgajene do - 90% konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (statin, Sigma) i PCSK9 AVPa (FIG.. 12A-12C) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto na PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec anti-humani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humana b-aktin antitela. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima FIG. 12A-12C. Intenziteti traka su kvantifikovani sa imaged sovtverom i normalizovani sa b-aktinom. Relativni nivoi LDLR su prikazani na panelima FIGURA 12A-12C. AVPi 21B12 i 31H4 su PCSK9 neutralizujuća antitela, dok 25A7.1 nije neutralizujuće antitelo.

1

Takođe su kreairane HepG2-PCSK9 ćelije. One su bile stabilna HepG2 ćelijska linija transfektovana sa humanim PCSK9. Ćelije su zasejane u DMEM sa 10% goveđim fetalnim serumom (FBS) i rasle do -90% konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (Sigma) i PCSK9 AVPi (FIG.. 12D-12F) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto u PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec antihumani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humani b-aktin antitelo. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima. Intenziteti traka su kvantifikovani sa imaged softverom i normalizovani sa b-aktinom.

Kao što se može videti u rezultatima prikazanim na FIG. 12A-12F, povećane količine normalizujućeg antitela i povećane količine statina generalno rezultiraju povećanjem nivoa LDLR. Ovo povećanje u efektivnosti za povećane nivoe AVP je posebno evidentno na FIG.

12D-12F, u kojima su ćelije takođe bile transfektovane sa PCSK9, omogućujući AVPima da demonstriraju efektivnost u većem obimu.

Interesntno je da se, kao što je pokazano u rezultatima u poređenjna FIG.12D-12F prema 12A-12C, uticaj koncentracija AVP na nivoe LDLR povećao dramatično kada je PCSK9 bio produkovan od strane ćelija. Sem toga, jasno je da neutralizovanje AVPa (21B12 i 31H4) rezultira većim povećanjem nivoa LDLR, čak i u prisustvu statina, nego za 25A7.1 AVP (neneutralizator), pokazujući da se mogu postići dodatne koristi od uporebe i statina i AVPa za PCSK9.

PRIMER 25

Konsenzus sekvence

Konsenzus sekvence su određene koristeći standardnu filogenetsku analizu CDRova koji odgovaraju VH i VL od anti-PCSK9 AVPa. Konsenzus sekvence su određene održavajući CDRove pripojene u okviru iste sekvence koja odgovara VH ili VL. Ukratko, sekvence amino kiseline koje odgovaraju celim varijabilnim domenima ili od VH ili od VL su pretvorene u FASTA formatirajući radi jednostavnosti u procesovanju komparativnih poklapanja i predviđanja filogeneze. Dalje su regioni skeleta ovih sekvenci zamenjeni sa veštačkom veznom sekvencom ("bbbbbbbbbb" čuvara mesta, ne-specifični konstrukt nukleinske kiseline) tako da samo ispitivanje CDRova može da se obavi bez uvođenja pozicije bilo koje amino kiseline otežavajući neravnotežu zbog koincidentnih događaja (npr., kao što su ne srodna antitela koja slučajno dele uobičajeni nasledni skelet germinativne linije) održavajući još uvek CDRove zajedno u okviru iste sekvence koja odgovara VH ili VL. VH ili VL sekvence ovog formata bile su zatim podvrgnute poklapanju radi utvrđivanja sličnosti koristeći program koji koristi

1

standardni ClutalW-like algoritam (vidi, Thompson i sar., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Kazna stvaranja gapa od 8.0 je upotrebljena zajedno sa kaznom za proširivanje gapa od 2.0. Ovaj program takođe generiše filograme (ilustracije filogenetskog stabla zasnovane na poklapanjima sličnosti sekvenci koristeći ili UPGMA (neuravnotežene grupe sparivanja, koristeći aritmetičke srednje vrednosti) ili Neighbor-Joining metode (vidi, Saitou i Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) da se konstruiše i ilustruje sličnost i udaljenost grupe sekvenci preko poređenja dužine grana i grupisanja. Oba metoda su produkovala slične rezultate ali UPGMA-izvedena stabla su definitivno upotrebljena kao metod koji koristi jednostavnije i mnogo konzervativnije pretpostavke. UPGMA-izvedena stabla su generisana tamo gde je za slične grupe sekvenci definisano da imaju manje od 15 supstitucija na 100 ostataka (vidi, legendu na ilustraciji drveta radi skaliranja) među pojedinačnim sekvencama u okviru grupe i upotrebljene su da se definiše kolekcija konsenzus sekvenci. Rezultati poređenja su prikazani na FIGRAMA 13A-13J. NA FIG. 13E, grupe su bile odabrane tako da su sekvence u lakom lancu te klade takođe klade u teškom lancu i imaju manje od 15 supstitucija.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati predstavljeni na FIG. 13A-13J predstavljaju veliku količinu pokazatelja o tome koje su određe amino kiselina važne (na primer, onih amino kiselina koje su konzervirane) i za koje pozicije amino kiseline je verovatno da će biti izmenjene (na primer, one pozicije koje imaju različite amino kiseline za različite AVPe).

PRIMER 26

Mišji model za PCSK9 i AVP sposobnost snižavanja LDL in vivo Za generisanje miša koji prekomerno eksprimira humani PCSK9, tri nedelje stari WT C57B1/6 miševi su injektirani u repnu venu davanjem različitih koncentracija adeno vezanog virusa (AAV), rekombinantno modifkovani da eksprimira humani PCSK9, da odredi korektni titar koji će obezbediti povećanje LDL-holesterola koje se može meriti kod miševa. Koristeći ovaj određeni virus koji eksprimira humani PCSK9, određeno je da će 4.5 x 10E12 pfu od virusa rezultirati sa nivoom LDL-holesterola od približno 40mg/dL u cirkulišućoj krvi (normalni nivoi LDL kod WT miševa su približno 10 mg/dL). Nađeno je da su nivoi humanog PCSK9 kod tih životinja približno 13ug/mL. Generisana je kolonija miševa koristeći ove injekcione kriterijume.

Jednu nedelju nakon injekcije, miševi su procenjeni na nivoe LDL-holesterola, i po principu slučajnosti podeljeni u različite grupe za tretman. Životinje su zatim tretirane, putem injekcije u repnu venu, pojedinačne bolus injekcije ili od 10mg/kg ili 30mg/kg od 16F12, 21B12, ili 31H4 antigen vezujućih proteina. IgG2 AVP je davan u odvojenim grupama životinja kao doznih kontrola. Podgrupe životinja (n=6-7) su zatim eutanizovane 24 i 48 časova nakon AVP davanja. Nije bilo efekta na nivoe LDL-holesterola nakon IgG2 davanja u bilo kojoj dozi. I 31

11

H4 i 21B12 su pokazali značajno snižavanje LDL-holesterola do i uključujući 48 časova naknadnog davanja, u poređenju sa IgG2 kontrolom (prikazano na FIG.14A i 14B u dve različite doze). 16F12 pokazuje intermedijerne odgovore snižavanja LDL-holesterola, sa nivoima koji se vraćaju na polaznu liniju približno od 40mg/dL u 48 časovnim vremenskim tačkama. Ovi podaci su konzistentni sa podacima in vitro vezivanja (Biacore i Kinexa), koji pokazuju ekvivalentne afinitete vezivanja koji su blizu između 31H4 i 21B12, a i manji afinitet od16F12 za humani PCSK9.

Kao što se može videti u rezultatima, ukupni holesterol i HDL-holesterol su redukovani sa PCSK9 AVPima u modelu (i ukupno HDL-C su podignuti gore kod WT miševa zahvaljujući prekomernoj ekspresiji PCSK9). Dok izgleda da se snižavanje holesterola u ovom modelu dešava tokom realtivno kratkog perioda vremena, veruje se da je to zbog nivoa humanog PCSK9 koji je prisutan, što je suprafiziološki visoko u ovom modelu. Sem toga, pošto je ekspresija vođena sa AAV, ne postoji regulacija ekspresije PCSK9. U ovim figuarama, (*) označava P<0.05, i (**) označava P<0.005 u poređenju sa nivoima LDL-holesterola zapaženim u IgG2 kontroli injektovanih životinja u istoj tački vremena. Nivo od 13 mikrograma/ml u serumu humanog PCSK9 kod miševa odgovara približno 520-puta povećanju iznad endogenih nivoa kod mišjeg PCSK9 (<~>25 ng/ml), i približno 75-puta povećanje iznad prosečnog humanog nivoa u serumu (~ 175 ng/ml). Prema tome, antigen vezujući proteini bi trebalo da su čak još više efikasni kod ljudi.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, gornji rezultati pokazuju da prikladnost mišjeg modela za testiranje antigen vezujućih proteina na sposobnost da izmene serum holesterol kod subjekta. Stručnjak će takođe prepoznati da je upotreba mišjeg HDL da se prate nivoi serum holesterola kod miša, i ako korisna za praćenje nivoa serum holesterola kod miša, nije indikativna za uticaj AVPa na humani HDL kod ljudi. Na primer, Cohen i sar. („Variranje sekvence u PCSK9, niski LDL, i zaštita protiv koronarne bolesti srca", N Engl J Med, 354:1264-1272, 2006) su pokakazali da nedostatak bilo kakvog efekta od nivoa PCSK9 na gubitak funkcije mutacija na humanom HDL (od čega je većina inkorporirana sa referencom). Prema tome, stručnjak će prihvatiti da sposobnost AVP da snižava mišji HDL (kojem nedostaje LDL) nije indikativna za sposobost AVPa da snižavaju humani HDL. I ustvari, kao što je prikazano od strane Cohen-a, to nije verovatno da se dogodi za neutralizujuća antitela kod ljudi.

PRIMER 27

31H4 i 21B12 se vezuju za ProCat region PCSK9

Ovaj primer opisuje jedan metod za određivanje gde se različita antitela vezuju za PCSK9.

ProCat (31-449 od SEQ ID NO: 3) ili V domen (450-692 od SEQ ID NO: 3) od PCSK9 proteina je kombinovan bilo sa antitelom 31H4 ili sa 21B12. Uzorci su analizirani sa nativnim PAGE radi formiranja kompleksa. Kao što se može videti na FIG.16A i FIG.16B, gel pomaci su bili prisutni za ProCat / 31H4 i ProCat / 21B12 uzorke, pokazujući da se antitela vezuju za ProCat domen.

PRIMER 28

LDLR EGFa domen se vezuje za katalitički domen PCSK9

Ovaj primer predstavlja rešenu kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31-454 od SEQ ID NO: 3) vezanu za LDLR EGFa domen (293-334) na 2.9 Å rezolucije (za koju su uslovi opisani dole u Primerima).

Prikaz strukture PCSK9 vezanog za EGFa je dat na FIG. 17. kristalna struktura (i njen opis na FIG.17) otkrivaju da se EGFa domen od LDLR vezuje za katalitički domen od PCSK9. Sem toga, izgleda da se interakcija PCSK9 i EGFa dešava preko površine PCSK9 koja je između ostataka D374 i S153 u strukturi prikazanoj na FIG.17.

Specifični ostaci amino kiselina jezgra PCSK9 interakcione površine vezuju se sa LDLR EGFa domenom definisani kao PCSK9 ostaci koji su unutar 5 Å od EGFa domena. Ostaci jezgra su sledeći: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, i S381.

Granični PCSK9 ostaci amino kiseline od interakcione veze sa LDLR EGFa domenom su definisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 Å od EGFa domena: Granični ostaci su sledeći: W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, i Q382. Ostaci koji su podvučeni su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz ovog primera pokazuju gde ineterreaguju PCSK9 i EGFa. Prema tome, antitela koja ineterreaguju sa, ili blokiraju bilo koji od tih ostataka, mogu biti korisna antitela koja inhibiraju interakciju između PCSK9 i EGFa domena od LDLR (i/ili LDLR generalno). U nekim ostvarenjima, antitela koja, kada se vežu za PCSK9, ineterreaguju sa ili blokiraju bilo koji od gornjih ostataka su u okviru 15-8, 8, 8-5, ili 5 angstrema od gornjih ostataka i predviđena su da obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR.

PRIMER 29

31H4 interreaguje sa ostacima amino kiseline i od pro- i od katalitičkih domena PCSK9 Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu pune dužine PCSK9 (N533A mutant iz SEQ ID NO: 3) vezanu za Fab fragment od 31H4, određenu do rezolucije 2.3 Å (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Ova struktura, prikazana na FIG. 18A i 18B, pokazuje da se 31H4 vezuje za PCSK9 u regionu katalitičkog mesta i pravi kontakt sa ostacima amino kiseline i iz prodomena i katalitičkog domena.

Prikazana struktura takođe omogućuje nekom da identifikuje specifične ostatke amino kiseline jezgra PCSK9 za interakcionu među vezu od 31 H4 sa PCSK9. To je definisano kao ostaci koji su u okviru 5 Å od 31H4 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, i G384.

Strukture su takođe upotrebljene za identifikaciju graničnih ostataka amino kiseline PCSK9 za interakciju sa vezom sa 31H4. Ti ostaci bili su PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 Å od 31H4 proteina. Granični ostaci su sledeći: K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, i Q387. Ostaci amino kiseline koji su kompletno pokriveni u PCSK9 proteinu su podvučni.

Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, FIG. 18B prikazuje interakciju između CDRova na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da identifikuje ostatke i/ili CDRove koji su posebno važni u paratopu, i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može videti na FIG. 18B, teški lanci CDR1, CDR2, i CDR3 su najdirektnije uključeni u vezivanje antigen vezujućih proteina za epitop, sa CDRovima iz lakog lanca koji su relativno daleko od epitopa. Zbog toga, vrlo je verovatno da su moguće veće varijacije u lakim lancima CDRova bez prekomernog ometanja vezivanja antigen vezujućih proteina za PCSK9. U nekim ostvarenjima, ostaci u strukturama koji direktno iterreaguju su konzervirani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne iterreaguju direktno jedan sa drugim mogu biti zamenjeni u većem obimu. Tako, stručnjak, na osnovu datih tehnika, može predvideti koji ostaci i područja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomernog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer, oni ostaci koji su locirani bliže PCSK9 kada je antigen vezujući protein vezan za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore, ti ostaci se mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci amino kiseline jezgra 31H4 interakcione veze sa PCSK9 su definisani kao 31H4 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: T28, S30, S31, Y32, S54, S55, S56, Y57, 158, S59, Y60, N74, A75, R98, Y 100, F102, W103, S104, A105, Y106, Y107, D108, A109, i D111. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: L48, S51, Y93, i S98. Za teški lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 Å od PCSK9 proteina uključuju

11

sledeće: G26, F27, F29, W47, S50, I51, S52, S53, K65, F68, T69, I70, S71, R72, D73, K76, N77, D99, D101, F110, i V112. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju A31, G32, Y33, D34, H36, Y38, I50, G52, N55, R56, P57, S58, D94, S95, S96, L97, G99 i S100.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 29 pokazuju gde antitela za PCSK9 mogu interreagovati na PCSK9 i da pri tome još uvek blokiraju PCSK9 od interreagovanja sa EGFa (i prema tome LDLR).Prema tome, antigen vezujući proteini koji interreaguju sa bilo kojim od tih ostataka PCSK9, ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka (npr., od drugih antigen vezujućih proteina koji se vezuju za te ostatke), mogu biti korisni kao antitela koja inhibiraju interakciju PCSK9 i EGFa (i prema tome LDLR). Prema tome, antigen vezujući proteini koji interreaguju sa bilo kojim od gonjih ostataka ili interreaguju sa ostatcima koji su u okviru 5 Å od gornjih ostataka su predviđeni da obezbede korisnu inhibiciju PCSK9 vezivanja za LDLR. Slično tome, antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se mogu odrediti, na primer, preko ogleda kompeticije) takođe mogu biti korisni za inhibiciju PCSK9/LDLR interakcije.

PRIMER 30

21B12 vezuje se za katalitički domen PCSK9, ima udaljeno mesto vezivanja od 31H4 i može se vezati za PCSK9 istovremeno sa 31H4

Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31-449 od SEQ ID NO: 3) vezanu za Fab fragmente od 31H4 i 21B12, određene na rezoluciji od 2.8 Å (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Kristalna struktura, opisana na FIG. 19A i FIG. 19B, pokazuje da 31H4 i 21B12 imaju udaljena mesta vezivanja na PCSK9 i da se oba antigen vezujuća proteina mogu vezati za PCSK9 istovremeno. Struktura pokazuje da 21B12 interreaguje sa ostacima amino kiseline od katalitičkog domena PCSK9. U toj strukturi, interakcija između PCSK9 i 31H4 je slična onoj koja je zapažena gore.

Specifični ostaci amino kiseline jezgra PCSK9 interakcione veze sa 21B12 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 Å od 21B12 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: S153, S188, 1189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, i F379.

Granični ostaci amino kiseline PCSK9 interakcione veze sa 21B12 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 Å od 21B12 proteina. Granični ostaci su sledeći: 1154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, i C378. Ostaci amino kiseline koji su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su podvučeni.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, FIG. 19B prikazuje interakciju između CDRova na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da identifikuje ostatke i/ili CDRove koji su posebno važni za paratope i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može videti u strukturi, pokazuje se da teški lanac CDR2 i laki lanac CDR1 blisko intereaguju sa epitopom. Dalje, se pokazuje da teški lanac CDR1, teški lanac CDR3 i laki lanac CDR3, blisko intereaguju sa epitopom, ali ne i blisko sa prvim setom CDRova. Konačno se pokazuje da je laki lanac CDR2 na nekoj distanci od epitopa. Prema tome je vrovatno da je veća varijacija CDRova moguća bez prekomernog ometanja vezivanja sa antigen vezujućim proteinom za PCSK9. U nekim ostvarenjima, ostaci u strukturama koji direktno interreaguju su konzervisani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne intereaguju direktno jedan sa drugim mogu biti menjani u većem obimu. Prema tome, stručnjak, na osnovu prisutnih tehnika, može predvideti koji ostaci i podrčja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomernog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer, oni ostaci koji su bliže PCSK9 kada se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore, ti ostaci se mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci amino kiseline jezgra 21B12 interakcione veze sa PCSK9 su definisani kao 21B12 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: T30, S31, Y32, G33, W50, S52, F53, Y54, N55, N57, N59, R98, G99, Y100, i G101. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: G30, G31, Y32, N33, S34, E52, Y93, T94, S95, T96, i S97. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5-8 Å od PCSK9 proteina uključuju sledeće: T28, L29, I34, S35, W47, V51, G56, T58, Y60, T72, M102, i D103. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju sledeće: S26, V29, V35, Y51, N55, S92, M98, i V99.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 30 pokazuju gde antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu interreagovati na PCSK9 i još uvek blokirati PCSK9 od interreagovanja sa EGFa (i na taj način sa LDLR). Prema tome, antigen vezujući proteini koji intereaguju sa bilo kojim od ostataka PCSK9 ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka mogu biti korisni za antitela koja inhibiraju interakcije PCSK9 i EGFa (i na taj način LDLR). Prema tome, antitela koja interreaguju sa bilo kojim od gornjih ostataka ili iterreaguju sa ostacima koji su u okviru 5 Å od gornjih ostataka su predviđeni da obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR. Slično tome, antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se

11

mogu odrediti, na primer, preko ogleda inhibicije) mogu biti korisni za inhibiciju interakcije PCSK9/LDLR.

PRIMER 31

Interakcija između EGFa, PCSK9 i antitela

Struktura ternarnog kompleksa (PCSK9 / 31 H4 / 21B12) iz gornjeg primera je položena na PCSK9 / EGFa strukturu (određenu kao što je opisano u Primeru 28) i rezultirala je kombinacijom prikazanom na FIG. 20A. Ta figura pokazuje područja na PCSK9 koja se mogu uspešno naciljati da inhibiraju interakciju PCSK9 sa EGFa. Figura pokazuje da se i 31H4 i 21B12 delimično poklapaju sa pozicijom od EGFa domena od LDLR i sterično interferiraju sa njegovim vezivanjem za PCSK9. Sem toga, kao što se može videti u strukturama, 21B12 direktno intereaguje sa podsetom ostataka amino kiseline koji su specifično uključeni u vezivanje za LDLR EGFa domen.

Kao što je pomenuto gore, analiza kristalnih struktura identifikovala je specifične amino kiseline uključene u interakciju između PCSK9 i partner proteina (jezgro i granični regioni veze na PCSK9 površini) i prostornih zahteva tih partner proteina da interreaguju sa PCSK9. Strukture sugerišu načine da se inhibira interakcija između PCSK9 i LDLR. Prvo, kao što je primećeno gore, vezivanje agensa za PCSK9 gde deli ostatke zajedničke sa mestom vezivanja za EGFa domen od LDLR, inhibiraće interakciju između PCSK9 i LDLR. Drugo, agens koji se vezuje uobičajeno spolja od ostataka može sterično interferirati sa EGFa domenom ili regionima od LDLR koji su ili N- ili C-terminal prema EGFa domenu da se spriči interakcija između PCSK9 i LDLR.

U nekim ostvarenjima, ostaci koji su ukljućeni i u EGFa vezivanje i koji su blizu područja gde se gore pomenuti antigen vezujući proteini vezuju su posebno korisni za manipulisanje sa PCSK9 vezivanjem za LDLR. Na primer, ostaci amino kiseline između veza obično i u regionu jezgra i graničnom regionu za različite partnere vezivanja su nabrojani u Tabeli 12 dole. Ostaci amino kiseline kompletno pokriveni sa PCSK9 proteinom su podvučeni.

Tabela 12

11

Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, u nekim ostvarenjima, antigen vezujući proteini vezuju se za i/ili blokiraju najmanje jedan od gore pomenutih ostataka.

PRIMER 32

Strukturne interakcije LDLR i PCSK9

Model pune dužine PCSK9 vezivanja za punu dužinu predstavljenog LDLR je napravljen koristeći PCSK9 ProCat (31-454 od SEQ ID NO: 3)/EGFa kompleksne strukture. Struktura pune dužine PCSK9<1>(Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola. Structure 15, 545-52 (2007)) je položena na PCSK9 ProCat 31-454 od kompleksa i strukture LDLR u njegovoj niskoj pH konformaciji (Rudenko, G. i sar. Struktura LDL receptora izvanćelijskog domena pri endozomalnom pH. Science 298, 2353-8 (2002)) je položena na EGFa domen iz kompleksa. Prikazi modela dati su na FIG. 20B i 20C. EGFa domen je naznačen sa okruženjem na slici. FIG. pokazuju regione LDLR izvan neposrednog domena vezivanja EGFa koji leži u neposrednoj blizini PCSK9. FIG. 20D-20F prikazuju gornju interakciju, zajedno sa prezentacijom mreže površine antitela 31 H4 i 21B12 iz tri različita ugla. Kao što je jasno iz opisa, ne samo da antitela mogu da interreaguju i/ili interferiraju sa interakcijom LDLR sa PCSK9 na aktuelnom mestu vezivanja, nego izgleda da i druge sterične interakcije mogu da se takođe pojave.

U svetlu gornjih rezultata, jasno je da antigen vezujući proteini koji se vezuju za PCSK9 mogu takođe inhibirati interakciju između PCSK9 i LDLR sukobljavanjem sa različitim regionima LDLR (ne samo na mestu na kojem interreaguju LDLR i PCSK9). Na primer, može se sukobiti sa ponovkom 7 (R7), EGFb domen, i/ili (β-propeler domen.

Ostvarenja antigen vezujućih molekula koji se vezuju za ili blokiraju interakciju EGFa sa PCSK9 Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, Primeri 28-32, i njihove prateće FIG., obezbeđuju detaljan opis kako i gde EGFa iterreaguje sa PCSK9 i kako dva predstavnika neutralizujućih antigen vezujućih proteina, 21B12 i 31H4 interreaguju sa PCSK9 i produkuju njihov neutralizujući efekat. Tako će, stručnjak biti u stanju da identifikuje antigen vezujuće molekule koji mogu slično da redukuju vezivanje između EGFa (uključujući LDLR) i PCSK9 pomoću identifikovanja drugih antigen vezujućih molekula koji se vezuju na ili blizu najmanje jedne od istih lokacija na PCSK9. I dok su odgovarajuće lokcije (ili epitopi) na PCSK9

11

identifikovani na FIG. i ovom opisu, takođe može biti korisno da se opišu ta mesta kao da su u okviru seta distanci od ostataka koji su bili identifikovani toliko blizu EGFa mesta vezivanja. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više od sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, 1154, T187, H193, E195, 1196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul vezuje se u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, 1154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, ili Q382. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, ili Q387. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, 1154, T187, H193, E195, 1196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul se vezuje 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 ili manje angstrema od jednog ili više od gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul, koji se vezuje za PCSK9, je u okviru najmanje jedne od gornjih distanci, za više od jednog od gore pomenutih ostataka. Na primer, u nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od navedenih distanci (npr., 30, 30-25,

11

25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 ili manje) za najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75 ili više od gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od nabrojanih distanci za najmanje 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100% od ostataka identifikovanih u svakoj grupi od njihove podgrupe (kao što su samo oni površinski ostaci u grupi). Sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između antigen vezujućeg molekula i PCSK9 je najkraća distanca između kovalentno vezanog atoma na PCSK9 i kovalentno vezanog atoma od antigen vezujućeg molekula koji su najbliži atomu PCSK9 i antigen vezujućeg molekula. Slično tome, sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između ostatka (na antigen vezujućem molekulu ili PCSK9) i drugog proteina (bilo PCSK9 ili antigen vezujući molekul respektivno), je distanca od najbliže tačke na identifikovanom ostatku do najbližeg kovalentno vezanog dela drugog proteina. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti iz kičme lanaca amino kiseline. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti između ivice paratopa i ivice (najbliže jedna drugoj) epitopa. U nekim ostvarenjima, distanca se može meriti između centra površine paratopa i centra površine epitopa. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ovaj opis je primenjiv za svaki od pojedinačnih setova ovde popisanih ostataka. Na primer, gornji rasponi su zamišljeni generalno i specifično za ostatke od 8 angstrema pobrojane u Primerima 28-32 i ostatke 5 angstrema pobrojane u Primerima 28-32.

U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul se vezuje za površinu PCSK9 koja je vezana sa najmanje jednim od EGFa, 21B12, ili 31H4. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na lokacijama koje se preklapaju sa lokacijama interakcije između PCSK9 i EFGa, Ab 31H4, i/ili Ab 21B12 (kao što je opisano gore u primerima i crtežima).

U nekim ostvarenjima, struktura katalitičkog domena PCSK9 može se opisti kao da je bila generalno trouglasta (kao što je prikazano na FIG.19A). Prva strana trougla je prikazana kao vezana za 31 H4. Druga strana trougla je prikazana kao vezana sa 21B12, i treća strana trougla je pozicionirana prema dnu stranice, odmah iznad „FIG. 19A" obeležja. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući molekuli koji se vezuju za prvu i/ili drugu stranu katalitičkog domena od PCSK9 mogu biti korisni kao neutralizujuća antitela pošto oni mogu bilo direktno ili sterično interferirati sa EGFa koji se vezuje za PCSK9. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, kada su antigen vezujući molekuli dovoljno veliki, kao što je potpuno antitelo, antigen vezujući molekul ne mora direktno da se vezuje za mesto vezivanja EGFa sa ciljem da interferira sa vezivanjem EGFa za PCSK9.

11

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, dok je EGFa domen od LDLR bio upotrebljen u mnogo primera, modeli i strukture su još uvek primenjivi na to kako će LDLR protein pune dužine intereagovati sa PCSK9. U stvari, dodatna struktura prisutna na LDLR proteinu pune dužine predstavlja dodatni proteinski prostor koji se može dalje blokirati sa jednim od antigen vezujućih molekula. U tom slučaju, ako antigen vezujući molekul blokira ili inhibira vezivanje EGFa za PCSK9, verovatno će biti najmanje kao, ako ne i više, efektivan sa LDLR proteinom pune dužine. Slično tome, antigen vezujući molekuli koji su u okviru postavljene distance ili blokiraju različite ostatke koji su relevantni za inhibiciju EGFa vezivanja, verovatno će biti isto efektivni, ako ne i više efektivni, za LDLR pune dužine.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, bilo koji molekul koji blokira ili se vezuje za gore pomenute PCSK9 ostatke (ili u okviru pobrojanih distanci), ili koji inhibira jednu ili više interakcija zabeleženih u gornjim primerima i FIG., može se upotrebiti da inhibira interakciju EGFa (ili LDLR generalno) i PCSK9. Kao takav, molekul ne mora da bude ograničen na antigen vezujući „protein", pošto bilo koji antigen vezujući molekul može takođe poslužiti za zahtevane namene. Primeri antigen vezujućih molekula uključuju aptamere, koji mogu biti ili oligonukleinska kiselina ili peptidni molekuli. Drugi primeri antigen vezujućih molekula uključuju avimere, peptitela, male molekule i polimere, i modifikovane verzije EGFa koje mogu povećati svoj afinitet za PCSK9 i/ili polu život, kao što su mutacija amino kiselina, glikozilacija, pegilacija, fuzija Fc i fuzija avimera. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, LDLR nije antigen vezujući molekul, ili podsekcije LDLR nisu antigen vezujući molekuli, npr., EGFa. Slično tome, drugi molekuli preko kojih PCSK9 signalira in vivo nisu antigen vezujući molekuli.

PRIMER 33

Ekspresija i prečišćavanje uzoraka proteina

Ovaj primer opisuje neka ostvarenja načina kako su različita ostvarenja PCSK9 proteina/varijanti napravljena i prečišćena (uključujući LDLR EGFa domen). PCSK9 proteini/varijante (npr., PSCK931-692 N533A, PCSK9 449TEV i PCSK9 ProCat 31-454) su eksprimirani u Hi-5 ćelijama insekta inficiranim bakulovirusom sa N-terminalnim signalnim melitin proteinom od pčele praćenim sa His6 tagom. PCSK9 proteini su prečišćeni sa nikl afinitetnom hromatografijom, jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. Melittin-His6 tag je uklonjen tokom prečišćavanja putem isecanja sa TEV proteazom. Konstrukt PCSK9449TEV je upotrebljen da se generiše PCSK9 ProCat (31-449) i V domen (450-692) uzorci. Ovaj konstrukt je imao TEV mesto isecanja proteaze ubačeno između PCSK9 ostataka 449 i 450. Za kristalografiju varijante N555A pune dužine, PCSK9 31-454 fragment, i PCSK9 449TEV varijanta za kristalografiju, post rTEV protein produkt je takođe

12

uključio inicijalnu GAMG sekvencu. Prema tome, post rTEV isecanje, tih proteina bilo je GAMG-PCSK9. Sem toga, PCSK9 449TEV protein je uključen u sekvencu „ENLYFQ" (SEQ ID NO: 403) ubačenu između pozicija H449 i G450 od SEQ ID NO: 3. Nakon isecanja sa rTEV, PCSK9 ProCat protein generisan iz ovog konstrukta bio je GAMG-PCSK9 (31-449)-ENLYFQ i V domen generisan iz ovog konstrukta bio je PCSK9 (450-692) od SEQ ID NO: 3.

21B12 i 31H4 Fab fragmenti su eksprimirani u E. coli. Ovi proteini su prečišćeni sa nikl afinitetnom hromatografijom, hromatografijom izuzimanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.

LDLR EGFa domen (293-334) je eksprimiran kao GST fuzioni protein u E. coli. EGFa domen je prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom, glutation sefaroza afinitetnom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. GST protein je uklonjen tokom prečišćavanja sa isecanjem pomoću PreScission proteaze.

PRIMER 34

Formiranje kompleksa i kristalizacija

Ovaj primer opisuje kako su napravljeni kompleksi i kristali upotrebljeni u Primerima ispitivanjima gornjih strukura.

PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška 31H4 Fab sa PCSK9. Kompleks je prečišćen hromatografijom izuzimanja veličine da se ukloni višak 31H4 Fab. PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pH 8.3, 0.2 M natrijum acetatu, 15% PEG 4000, 6% soli dekstran sulfat natrijuma (Mr 5000).

PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kompleks je napravljen prvo pomoću mešanja 1.5 molarnog viška od 31H4 Fab sa PCSK9 31-449. Kompleks je razdvojen od viška 31H4 kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. 1.5 molarni višak od 21B12 Fab je zatim dodan u PCSK9 31-449 / 31H4 kompleks. Ternarni kompleks je razdvojen od viška 21B12 pomoću prečišćavanja sa kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M jedno baznom amonijum fosfatu, 50% MPD.

PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa kompleks je napravljen mešanjem 1.2 molarnog viška od EGFa domena sa PCSK931-454. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa domen kompleks kristalizuje u 0.2 M kalijum formatu, 20% PEG 3350.

PRIMER 35

Sakupljanje podataka i određivanje strukture

Ovaj primer opisuje kako su sakupljeni setovi podataka i kako su određene strukture za ispitivanje Primera gornjih struktura

Početni setovi podataka za PCSK9 31-692 N533A / 31H4 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kristale su sakupljeni na Rigaku FR-E X-zrak izvoru. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa set podataka i set podataka više rezolucije za PCSK9 31-692 N533A / 31H4 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31 H4 / 21B12 kristale su sakupljeni na Berkeley Advanced Light Source beamline 5.0.2. Svi setovi podataka su obrađeni sa denzo/scalepack ili HKL2000 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametarsko skaliranje difrakcionih intenziteta. Acta Crystallogr. A 59, 228-34 (2003)).

PCSK9 / 31 H4 kristali rastu u C2 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=264.9, b=137.4, c=69.9 Å, β=102.8° i difrakcijom do 2.3 Å rezolucije. PCSK9 / 31H4 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP (CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994) koristeći PCSK9 strukturu (Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola. Structure 15, 545-52 (2007)) kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 31-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Držeći PCSK9 31-692 / rastvor varijabilnog domena antitela fiksiran, konstantni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx. (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi softver pogodan za određivanje makromolekularne strukture. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).

PCSK9 / 31H4 / 21B12 kristali rastu u P21212 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=138.7, b=246.2, c=51.3 Å i difrakcijom do 2.8 Å rezolucije. PCSK9 / 31H4 / 21B12 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat / 31 H4 varijabilni domen kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 ProCat / 31 H4 fiksiran varijabilni domen, izvedena je pretraga za konstantni domen antitela. Držeći PCSK9 ProCat / 31 H4 / 21B12 fiksiran konstantni domen, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx.

PCSK9 / EGFa kristali domena rastu u prostornoj grupi P6522 sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=b=70.6, c=321.8 Å i difrakcijom do 2.9 Å rezolucije. PCSK9 / EGFa struktura domena je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat kao polazni istraživački model. Analiza mapa elektronske gustine pokazala je jasnu elektronsku gustinu za EGFa domen. LDLR EGFa domen je ručno fitovan i model je poboljšan sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx.

Interakcije jezgra međuveze amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 Å od PCSK9 partner proteina.5 Å je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van der Waalovog radijus plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 Å od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 Å je odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu amino kiseline arginina. Amino kiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)).

PRIMER 36

Kristalna struktura PCSK9 i 31A4

Određena je kristalna struktura 31A4/PCSK9 kompleksa.

Ekspresija i prečišćavanje uzoraka proteina

PCSK9 449TEV (PCSK9 konstrukt sa TEV mestom isecanja proteaze ubačenim između ostatka 449 i 450, numerisanje u skladu sa SEQ ID NO: 3) je eksprimiran u Hi-5 ćelijama insekta zaraženim bakulovirusom sa N-terminalnim melitin signalnim peptidom pčele praćenim sa His6tagom. PCSK9 protein je prečišćen prvo sa nikl afinitetnom hromatografijom. TEV proteaza je upotrebljena da se ukloni melitin-His6tag i iseče PCSK9 protein između katalitičkog domena i V domena. V domen was je dalje prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom isključivanja veličine. 31A4 Fab fragment je eksprimiran u E. coli. Ovaj protein je prečišćen sa nikl afinitetnom hromatografijom, hromatografijom isključivanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.

Formiranje kompleksa i kristalizacija

PCSK9 V domen / 31A4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška od PCSK9 V domena sa 31A4 Fab. Kompleks je odvojen od viška PCSK9 V domena prečišćavanjem kolonskom hromatografijom isključivanja veličine. PCSK9 V domen / 31A4 kompleks kristalizuje u 1.1 M sukcinskoj kiselini pH 7, 2% PEG MME 2000.

Sakupljanje podataka i određivanje strukture

Set podataka za PCSK9 V domen / 31A4 kristal je sakupljen na Rigaku FR-E x-zrak izvoru i obrađen sa denzo/scalepack (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametarsko skaliranje difrakcionih intenziteta. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).

PCSK9 V domen / 31A4 kristali rastu u P212121 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=74.6, b=131.1, c=197.9 Å sa dva kompleksna molekula po asimetričnoj jedinici,

12

i difrakciji na 2.2 Å rezolucije. PCSK9 V domen / 31A4 strukture je razrešen sa molekulskom zamenom sa programom MOLREP (CCP4. CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)) koristeći V domen od PCSK9 strukture (Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola. Structure 15, 545-52 (2007)) kao polazni model za traženje. Držeći PCSK9 450-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Nakon početnog usavršavanja, konstantni domeni antitela sun ručno podešeni. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usvršena sa cnx (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi sovtver nastavak za određivanje makromolekularne strukture. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).

Interakcije jezgra međuveze amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 Å od PCSK9 partner proteina.5 Å je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van der Waalovog radijus plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza amino kiselina su određene kao da su svi ostaci amino kiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 Å od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 Å je odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu amino kiseline arginina. Amino kiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL. (DeLano, W.L. PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)). Distance su izračunate koristeći V domen „A" i 31A4 „L1,H1" kompleks.

Kristalna struktura PCSK9 V domena vezana za Fab fragment od 31A4 je određena na 2.2 Å rezoluciji. Prikazi kristalne strukture obezbeđeni su na FIG. 21A-21D. FIGURAE 21A-21C pokazuju da se 31A4 Fab vezuje za PCSK9 V domen u regionu pod domena 1 i 2.

Napravljen je model pune dužine PCSK9 vezan za 31A4 Fab. Struktura pune dužine PCSK9 je položena na PCSK9 V domen iz kompleksa. Figura iz ovog modela je prikazana na FIG. 21D. Mesto interakcije između EGFa domena LDLR i PCSK9 je istaknuto.

Analiza strukture pokazuje gde antitelo interreaguje sa PCSK9 i pokazuje da antitela koja se ne vezuju za LDLR površinu vezivanja od PCSK9 mogu još uvek inhibirati interakciju LDLR koja je posredovana preko PCSK9 (kada se rezultati posmatraju u kombinaciji sa Primerom 40 i 41 dole). U dodatku, analiza kristalne strukture omogućuje identifikaciju specifičnih amino kiselina uključenih u interakciju između PCSK9 i 31A4 antitela. Sem toga, takođe su određeni jezgro i granični regioni među veze na površini PCSK9. Specifično jezgro PCSK9 ostataka amino kiseline od interakcione među veze sa 31A4 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 Å od 31A4 proteina. Ostaci jezgra su T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, i E593. Granični PCSK9 ostaci amino kiseline od interakcione među veze sa 31A4 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 Å od 31A4 proteina. Granični ostaci su sledeći: S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, i H597. Ostaci amino kiselina koji su blizu ili su potpuno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su istaknuti podvlačenjem. Kao što je ovde napomenuto, numerisanje označava pozicije amino kiselina u SEQ ID NO: 3 (doterano kao što je ovde napomenuto).

Specifični ostaci amino kiseline jezgra 31A4 interakcione međuveze sa PCSK9 su definisani kao 31A4 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Ostaci jezgra za 31A4 antitelo su sledeći: teški lanac: G27, S28, F29, S30, A31, Y32, Y33, E50, N52, H53, R56, D58, K76, G98, Q99, L100, i V101; laki lanac: S31, N32, T33, Y50, S51, N52, N53, Q54, W92, i D94. Granični ostaci amino kiseline 31A4 interakcione među veze sa PCSK9 definisani su kao 31A4 ostaci koji su 5-8 Å od PCSK9 proteina. Granični ostaci za 31A4 su sledeći: teški lanac: V2, G26, W34, N35, W47, I51, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103, i D104; laki lanac: S26, S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95, N97, G98, i W99.

Kristalna struktura takođe je pokazala prostorne zahteve tog AVP u njegovim interakcijama sa PCSK9. Kao što je pokazano u toj strukturi, na iznenađenje, antitela koja se vezuju na PCSK9 bez direktnog sprečavanja interakcije PCSK9 sa LDLR mogu još uvek inhibirati funkciju PCSK9.

U nekim ostvarenjima, bilo koji antigen vezujući protein koji se vezuje za, pokriva, ili sprečava 31A4 od interreagovanja sa bilo kojim od gornjih ostataka, može se upotrebiti da se veže ili neutralizuje PCSK9. U nekim ostvarenjima, AVP se vezuje sa, ili interreaguje sa, najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEQ ID NO: 3) ostataka: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, i E593. U nekim ostvarenjima, AVP je u okviru 5 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, AVP vezuje sa, ili interreaguje sa, najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEQ ID NO: 3) ostataka: S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, i H597. U nekim ostvarenjima, AVP je 5 do 8 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim ostvarenjima, AVP interreaguje, blokira, ili je u okviru 8 angstrema od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 od gornjih ostataka.

12

Koordinate kristalnih struktura koje su diskutovane u gornjim Primerima predstavljene su u Tabeli 35.1 (PCSK9 pune dužine i 31H4), Tabela 35.2 (PCSK9 i EGFa), Tabela 35.3 (PCSK9, 31H4, i 21B12), i Tabela 35.4 (PCSK9 i 31A4). Takođe su posmatrani antigen vezujući proteini i molekuli koji interreaguju sa odgovarajućim područjima ili ostaci od strukture od PCSK9 (uključujući ona područja ili ostatke u oviru 15, 15-8, 8, 8-5, 5, ili manje angstrema odakle EGFa, ili antitela, interreaguju sa PCSK9) opisani na FIG. i/ili njihove odgovarajuće pozicije na strukturama od kordinati.

Antitela koja su opisana u koordinatama su odgajena u E. coli i, prema tome, poseduju minorne razlike u amino kiselinama od potpuno humanih antitela. Prvi ostatak u varijabilnom regionu bio je glutaminska kiselina umesto glutamina za teške i lake lance 21B12 i za lake lance za 31H4. U dodatku na razlike u sekvenci varijabilnog regiona, postojale su takođe neke razlike u konstantnom regionu antitela opisanog sa kordinatama (ponovo zahvaljući činjenici da je antitelo odgajeno u E. coli). FIG. 22 ističe (preko istaknutog senčenja, ili podebljavanja) razlike između konstantnih regiona 21B12, 31H4, i 31A4 Fabs (odgajenih u E. coli) kada se porede sa SEQ ID NOs: 156, i 155. Za 21B12 31H4, i 31A4, laki lanac konstantne sekvence je sličan humanom lambda (SEQ ID NO: 156). Podvučeni glicin ostatak je insercija između mesta gde se 21B12 i 31 H4 varijabilne sekvence zaustavljaju i započinje lambda sekvenca.

I za 21B12 i 31H4, konstatnta teškog lanca je slična humanom IgG4 (SEQ ID NO: 155). Razlike istaknute na FIG.22 prikazane su u Tabeli 36.1:

Tabela 36.1

Kristal SEQ ID NO: 155

S C

K R

G E

G S

Q K

I T

N D

K R

P S

12

Kada se razmatra 31A4, iako on takođe ima iste razlike pobrojane gore, postoje još tri dodatne razlike. Kao što je prikazano na FIG.22, postoje dve dodatne amino kiseline na početku, koje dolaze od nekompletnog procesovanja signalnog peptida u ekspresiji kod E. coli. Sem toga, postoji jedna dodatna supstitucija u teškom lancu konstantnog regiona 31A4 kada se poredi sa SEQ ID NO: 155, koji je u susedstvu od L (u SEQ ID NO: 155) do H. Konačno, 31A4 nema glutamin kao početnu amino kiselinu od Fab, pre nego što će imati ubacivanje glutaminske kiseline pomenuto gore za 21B12 i 31H4.

Za sva tri antitela, kraj teškog lanca (zaokružen tamno sivo) razlikuje se takođe, ali amino kiseline nisu poređane u strukturi tako da se pojave u kordinatama. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, his-tagovi nisu potrebni deo AVP i ne treba da se smatraju kao deo sekvence AVP, ako to nije eksplicitno zahtevano na osnovu reference za specifični SEQ ID NO koji uključuje histidin tag i tvrdnju da sekvenca AVP „uključuje histidin tag."

PRIMER 37

Mapiranje—bining epitopa

Alternativno postavljeni eksperiment bininga izveden je u dodatku na onaj postavljen u Primeru 10. Kao i u Primeru 10, AVPi koji su u kompeticiji jedan sa drugim mogu se smatrati kao vezujući na isto mesto na meti i uobičajeno se kaže da se „binuju" zajedno.

Upotrebljena je modifikacija Multiplexed Binning metoda opisana od strane Jia, i sar. (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Pojedinačni kodovi perlica streptavidin obavijenih Luminex perlica su inkubirani u 100u1 0.5 ug/ml biotiniliranog monovalentnog miš-antihumanog IgG zarobljenog antitela (BD Pharmingen, #555785) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi u mraku, zatim isprano 3x sa PBSA, slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) plus 1% goveđi serum albumin (BSA). Svaka kod perlica je odvojeno inkubirana sa 100 ul 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (obavijajuće antitelo) tokom 1 časa a zatim isprana 3x sa PBSA. Perlice su sakupljene i zatim razdeljene u filter ploču sa 96-bunarčića (Millipore, #MSBVN1250).100ul od 2 ug/ml prečišćenog PCSK9 proteina je dodano u polovinu bunarčića. Drugoj polovini je dodan pufer kao kontrola. Reakcija je inkubirana tokom 1 časa i zatim isprana.100 ul od a 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (Detection Ab) je dodano u sve bunarčiće, inkubirano tokom 1 časa i zatim isprano. Irelevantni humani-IgG (Jackson, #009-000-003) je pušten kao druga kontrola.20ul PE-konjugovanog monovalentnog miš-anti-humanog IgG (BD Pharmingen, #555787) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 časa i zatim isprano. Perlice su resuspendovane u 100ul PBSA i minimum 100 događaja/kod perlice je sakupljeno na BioPlex instrumentu (BioRad).

Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) para antitela bez PCSK9 je oduzet od signala od odgovarajuće reakcije koja je sadržala PCSK9. Da bi se par antitela smatrao istovremeno

12

vezanim, i prema tome u različitim binovima, oduzeti signal mora biti više od 3 puta signal od antitela koje je u kompeticiji sa samim sobom i 3 puta signal antitela koje je u kompeticiji sa irelevantnim antitelom.

Gornji podaci su prikazani na FIG. 23A-23D. AVPi spadaju u pet binova. Osenčeni kvadrati naznačavaju AVPe koji se mogu vezati istovremeno za PCSK9. Ne osenčeni kvadrati naznačavaju one AVPe koji su u kompeticiji sa svakim drugim za vezivanje. Sažetak rezultata je prikazan u Tabeli 37.1.

Tabela 37.1.

12

Binovi 1 (u kompeticiji su sa AVP 21B12) i 3 (u kompeticiji su sa 31H4) su isključeni jedan od drugog; bin 2 u je kompeticiji sa binovima 1 i 3; i Bin 4 nije u kompeticiji sa binovima 1 i 3. Bin 5, u ovom primeru, je prisutan kao „uhvati sve" bin da opiše AVPe koji se ne uklapaju u druge binove. Prema tome, gore identifikovani AVPi u svakom od binova su predstavnici različitih tipova lokacija epitopa na PCSK9, od kojih se neki preklapaju jedan sa drugim.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ako pomenuti AVP sprečava vezivanje probe AVP onda se kaže da su antitela u istom binu. Redosled u kojem su AVPovi upotrebljeni može biti važan. Ako je AVP A upotrebljen kao pomenuti AVP i blokira vezivanje AVP B suprotno nije uvek tačno: AVP B upotrebljen kao pomenuti AVP neće neophodno blokirati AVP A. Postoji jedan broj faktora koji ovde imaju ulogu: vezivanje AVP može uzrokovati konformacione promene u meti što sprečava vezivanje drugog AVP, ili epitopa koji preklapaju ali ne pokalpaju potpuno jedan drugog što može omogućiti drugom AVP da još uvek ima dovoljno interakcija visokog afiniteta sa ciljem da se omogući vezivanje. AVPi sa mnogi višim afinitetom mogu imati mnogo veću sposobnost da uklone blokirajući AVP sa puta. Generalno, ako je zapažena kompeticija u bilo kom od redu AVPa kaže se da se oni binuju zajedno, a ako AVPi mogu blokirati jedan drugog onda je verovatno da će se epitopi poklapati mnogo kompletnije.

PRIMER 38

Mapiranje epitopa -western blot

Ovaj primer pokazuje da li epitopi jesu ili nisu bili linearni ili konformacioni za ispitane AVPe. Denaturišući redukovani i denaturišući ne redukovani western blot-ovi su pušteni da se odredi koja antitela imaju konformacioni epitop. Antitela koja se vezuju za denaturišući redukovani western blot imaju linearni epitop i nisu konformaciona. Rezultati su prikazani na FIG. 24A i FIG.24B. Za blot, 0.5 ug/linija prečišćenog humanog PCSK9 pune dužine je puštena na 4-12% NuPAGE Bis-Tris gelu i MES SDS puferu ciklusa. 1 ug/ml anti-PCSK9 antitela, sem 0.5 ug/ml 31G11, je upotrebljeno za, probe blota. 1:5000 sekundarni magarac-anti-humani-IR700 je upotrebljen i očitan na LiCOR instrumentu. Antitelo 13H se vezuje za linearni epitop na pro-domen od PCSK9. Sva druga antitela pokazala su rezultate koji su bili konzistentni sa konformacionim epitopima. Ovi gelovi razdvajaju pro-domen od ostatka proteina, i pro domen startuje na oko 15kDa. Sem toga, pokazalo se da se 3C4 i 31A4 vezuju za konformacione epitope koji su bili sačuvani pomoću disulfidnih veza, pošto se ta antitela vezuju za PCSK-9 pod

12

denaturišućim uslovima gde su kojima su disulfidne veze bile sačuvane (levo) ali redukujući tako uzorke (desno) eliminišući vezivanje.

PRIMER 39

Mapiranje epitopa – skeniranje arginin / glutaminska kiselina Reprezentativni AVPi iz svakog bina (na Primer 37) su odabrani iz dalje analize epitopa. Arginin/glutaminska kiselina-skaning strategija je izvedena radi mapiranja AVP vezivanja za PCSK9. Pomoću pozadine, ovaj metod determiniše da li je ostatak deo strukturnog epitopa, što znači da ti ostaci u antigenu ili kontaktiraju ili su pokriveni od strane antitela. Arginin i glutaminska kiselina bočni lanci su naelektrisani i zamašni i mogu prekinuti vezivanje antitela čak i kada mutirani ostatak nije direktno uključen u vezivanje antitela.

Selekcija ostataka

Kristalna struktura PCSK9 je upotrebljena da se odaberu ostaci koji bi trebalo da se mutiraju radi mapiranja epitopa. Metod koji je upotrebljen da se odaberu ostaci koji će se mutirati uključio je oba mehanizma za izračunavanje i interaktivnu analizu strukture. PCSK9 struktura je sadržala gapove i nedostajuće ostatke i nedostajalo joj je 30 amino kiselina u N- (tj., signalna sekvenca) i 10 amino kiselina u C-kraju. Unutrašnji nedostajući ostaci su modelirani na strukturu, ali N- i C-terminalni nedostajući ostaci nisu. Odnos izloženosti rastvarača za svaki ostatak je izračunat: područje površine svakog ostatka u kontekstu proteina (SA1) je podeljeno sa područjem površine ostatka u trimeru sa visećim glicinima (SA2) sa konzerviranom strukturom kičme. Ostaci sa odnosom izloženosti rastvarača više od 10% (R 10) su odabrani kao i 40 nedostajućih terminalnih ostataka. Od njih, prolini i glicini sa pozitivnim Φ uglovima su isključeni da se redukuje mogućnost pogrešnog savijanja. Broj ostataka koji bi trebalo da se mutira u V domenu je redukovan koristeći odnos izlaganja rastvarača od 37% duž zajedno sa vizuelnom inspekcijom celog proteina da dovede do ukupnog broja mutacija od 285. Različite orijentacije površine PCSK9 s tim različitim klasama identifikovanja su prikazane na FIG.25A-25F. Na tim FIG., najsvetlije sivo označava područja koja nisu odabrana ili su deselektovana. Tamno sivo označava one ostatke koji su odabrani).

Kloniranje i ekspresija

Onda kada su ostaci koji bi trebalo da se promene identifikovani, izmenjeni su različiti ostaci. Humani PCSK9 je kloniran u pTT5 vektor sa C-terminal Flag-His tagom. Mutanti su napravljeni iz tog originalnog konstrukta pomoću mutageneze usmerene na mesto koristeći QuikChange II kompletod Stratagene. Sens i anti-sens oligonukleotidi koji su upotrebljeni za mutagenezu označeni su koristeći Amgen's MutaGenie softver. Svi PCSK9 konstrukti su eksprimirani u prolazno-transfektovanim 293-6E ćelijama u pločama sa 24-bunarčića i ponovo

1

raspoređeni u tri ploče sa 96-bunarčića sa ne-mutiranim PCSK9 kontrolama (divlji tip, WT) u svakoj ploči. Nivoi ekspresije i integritet rekombinantnih proteina u uslovnom medijumu su provereni sa Western blot-om. Od originalno odabranih 285 mutanata, kod 41 nije uspelo kloniranje ili ekspresija. 244 mutanata je upotrebljeno za mapiranje epitopa. Poklapanje roditeljeske sekvence PCSK9 i reprezentativne sekvence PCSK9 sa 244 mutirana ostatka je prokazano na FIG.26. Napravljeni su odvojeni konstrukti koji su sadržali pojedinačnu mutaciju. Radi namene sekvenci epitopa i epitop zasnovanih pronalazaka uključujući promene u vezivanju, sekvence su obezbeđene u vezi sa SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: 303. Sekvence na FIG.26 su sekvence upotrebljene za ove studije vezivanja epitopa. Stručnjak će prihvatiti da su ovi rezultati primenjivi na druge PCSK9 varijante takođe otkrivene ovde (npr., SEQ ID NO: 1 i 3, kao i druge alelske varijante).

Pet antitela, reprezentativnih za svaki bin, je odabrano za fino mapiranje epitopa. Oni su bili 21B12, 31H4, 12H11, 31A4, 3C4. Sva konformaciona epitop antitela. Tri, 21B12, 31 H4, i 31A4 su takođe kristalizovana sa PCSK9, kao što je gore opisano.

Strukturni i funkcionalni epitopi

Epitopi se mogu dalje definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podset strukturnih epitopa i imaju takve ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcija (npr. vodonične veze, jonske interakcije). Strukturni epitopi mogu se smatrati delom mete koji je pretvoren od strane antitela.

Upotrebljena skaning mutageneza bila je skan arginina i glutaminske kiseline. Ta dva bočna lanca su odabrana zbog njihove velike sterične mase i njihovog naelektrisanja, koji omogućuju da mutacije koje se dešavaju u strukturnom epitopu imaju veći efekat na vezivanje antitela. Arginin je generalno upotrebljen sem kada je WT bio arginin, i u tim slučajevima ostatak je muiran u glutaminsku kiselinu da se promeni naelektrisanje.

Za svrhu mapiranja epitopa, multipleks ogled zasnovan na perlicama je upotrebljen da se meri vezivanje antitela PCSK9 i PCSK9 mutanata istovremeno. Vezivanje antitela za mutante je poređeno za njegovo vezivanje za divlji tip u istom bunarčiću. Varijante su razdvojene u tri grupe: grupa 1: 81 varijanta 2 wt kontrole 1 negativna kontrola 1 drugi PCSK9 supernatant; grupa 2: 81 varianta 2 wt kontrole 2 negativne kontrole; i grupa 3: 82 varujante 2 wt kontrole 1 negativna kontrola.

Ogled je tekao na sledeći način: 85 setova strepavidin-obavijenih LumAvidin perlica kodiranih bojom (Luminex) je vezano sa biotiniliranim anti-pentaHis antitelom (Qiagen, #1019225) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi (RT) zatim isprano tri puta u PBS, 1% BSA,

1 1

0.1% Tween 20. Svaki set perlica kodiran bojom je zatim ostavljen da se veže za PCSK9 mutant, divlji tip, ili negativnu kontrolu u 150 ul supernatanta preko noći na 4 °C.

Bojom kodirani setovi perlica, svaki vezan sa specifičnim proteinom, isprani su i sakupljeni. U toj tački, bila su 3 skupa od po 85 setova perlica, jedan skup za svaku grupu mutanata i kontrole. Perlice iz svakog skupa su alikvotirane u 24 bunarčića (3 kolone) od filter ploča sa 96-bunarčića (Millipore, #MSBVN 1250). 100 ul anti-PCSK9 antitela u 4-puta razblaženjima je dodano u devet kolona za utrostručene tačke i inkubirano tokom 1 časa na ST i isprano. 100ul od 1:200 razblaženja fikoeritrin (PE)-konjugovani anti-humani IgG Fc (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 časa na ST i isprano.

Perlice su resuspendovane u 1% BSA u PBS, mućkane tokom 10 minuta i očitane na BioPlex instrumentu (Bio-Rad). Instrument identifikuje svaku perlicu prema njenom kodu boje identifikujući tako specifični protein vezan sa kodom boje. U isto vreme, on meri količinu antitela vezanog za perlice preko intenziteta fluorescencije PE boje. Antitelo koje se vezuje za svaki mutant može zatim biti direktno upoređeno prema svom vezivanju za divlji tip u istom skupu. IL-17R himera E je upotrebljena kao negativna kontrola. Sažetak svih ispitanih mutanata je prikazan u Tabeli 39.1 (sa pozivom na numerisanje sekvence upotrebljeno na FIG.1A i 26).

Tabela 39.1

1 2

1

Studija varijabilnosti perlice

Pre puštanja ogleda mapiranja vezivanja epitopa, izveden je eksperiment potvrđivanja da se proceni varijabilnost „region perlice" prema „regionu perlice" (B-B). U eksperimentu potvrđivanja, sve perlice su bile konjugovane sa istim divljim tipom kontrolnog proteina. Prema tome, razlika između regiona perlica bila je isključivo zbog čiste B-B varijanse i nije bila pomešana sa razlikom između divljeg tipa i mutantnih proteina. Titracija antitela je obavljena u dvanaest ponavljanja u različitim bunarčićima.

Cilj ove statističke analize bio je da se proceni B-B varijabilnost procenjenih EC50 od vezivanja krivi. Procenjena B-B standardna devijacija (SD) je zatim upotrebljena da se naprave EC50 intervali pouzdanosti divljeg tipa i mutantnih proteina tokom poređenja krivih iz uporednih eksperimenata.

Četvorostruko-parametarski logistički model je podešen za podatke vezivanja za svaki region perlice. Nastali fajl, koji je sadžao rezultate krive kontrole kvaliteta (QC) i procenjene parametre za vrh (maks), dno (min), Hillslope (nagib), i prirodni log od EC50 (x sred) od krivih, su upotrebljeni kao sirovi podaci za analizu. B-B varijabilnost za svaki parametar je zatim procenjena pomoću podešavanja modela pomešanog efekta koristeći SAS PROC MIXED proceduru. Samo krive sa „dobrim" QC statusom su uključene u analizu. Konačni model mešanog efekta uključio je samo ostatak (tj. pojedinačne regione perlica) kao slučajni efekt. Srednja vrednost najmanjeg kvadrata (LS-srednja vrednost) za svaki parametar je takođe procenjena sa modelom mešanog efekta. B-B SD je izračunata vađenjem kvadratnog korena B-B varijanse. Takođe je izračunata promena umnožaka između LS-srednje vrednosti 2SD i LS-srednje vrednosti - 2SD, koja predstavlja približno gornji i donji 97.5 percentil populacije. Rezultati su prikazani u Tabeli 39.2

Tabela 39.2

Srednja vrednost najmanjeg kvadrata i procena

varijanse perlica-prema-perlici

1 4

* xsred je prirodni log od EC50. Promena umnoška za xsred je pretvorena ponovo u originalnu skalu.

Identifikovanje ostataka u strukturnom epitopu

Ostatak je smatran delom strukturnog epitopa („pogotka") kada mutiranje u arginin ili glutaminsku kiselinu, acid izmeni vezivanje antitela. To je viđeno kao pomak u EC50 ili redukcija maksimuma signala u poređenju sa vezivanjem antitela divljeg tipa. Statistčke analize krivih vezivanja antitela za divlji i mutant su upotrebljene da se identifikuju statistički značajni EC50 pomaci. Analiza uzima u obzir variranje u ogledu i krivu podešavanja.

Identifikacija pogotka zasnovana na poređenju EC50

EC50 i Bmax vrednosti su generisane od Weighted 4-Parameter Logistical modela podešenog za podatke vezivanja S-PLUS sa VarPower softverom (Insightful Corporation, Seattle WA). Upoređeni su EC50-ovi od krivih vezivanja mutanta i krivih vezivanja divljeg tipa. Statistički značajne razlike su identifikovane kao pogodci radi daljeg razmatranja. Krive sa „ne podešenim" ili „loše podešenim" obeležjima su isključene iz analize.

Varijacije u procenama EC50

Razmatrana su dva izvora variranja u poređenju procena EC50, variranje od podešavanja krive i variranje perlica-prema-perlici. Divlji tipovi i mutanti su vezani za razliličite perlice, prema tome, njihove razlike su pomešane sa razlikom perlica-perlica (opisano gore). Variranje podešavanja krive je procenjeno sa standardnom greškom log EC50 procena. Variranje perlicaperlica je eksperimentalno određeno koristeći eksperiment u kojem su kontrole divljeg tipa bile vezane svaka za jednu perlicu (opisano gore). Variranje procena EC50 krive vezivanja divljeg tipa iz ovog eksperimenta je upotrebljeno da se proceni variranje perlica-perlica u aktuelnom eksperimentu mapiranja epitopa.

Testiranje za pomak EC50 između mutanta i divljeg tipa

Poređenje dva EC50 (u log skali) je izvedeno koristeći Studentov t-test. T-statistika je izračunata kao odnos između delta (apsolutne razlike između EC50 procena) i standardne devijacije delta. Varijansa delta je procenjena sabiranjem tri komponente, procene varijanse od EC50 za krive mutanta i divlji tip u nelinearnoj regresiji i dva puta varijansa perlica-perlica procenjena u odvojenom eksperimentu. Umnožak od dva za varijansu perlica-perlica je

1

upotrebljen zbog pretpostavke da perlice i mutant i divlji tip imaju istu varijansu. Stepen slobode standardne devijacije delta je izračunat koristeći Satterthwaite-ovu (1946) aproksimaciju. Individualne p-vrednosti i intervali poverenja (95% i 99%) izvedeni su na osnovu Studentove t distribucije za svako poređenje. U slučaju višestrukih kontrola divljeg tipa, upotrebljen je konzervativni pristup odabiranjem kontrole divljeg tipa koja je bila najsličnija mutantu, tj., odabiranjem onih sa najvećim p-vrednostima.

Doterivanja višestrukosti bila su važna da se kontroliše lažno pozitivna(e) dok se obavlja veliki broj testova istovremeno. Dva oblika doterivanja višestrukosti su implementirana za ovu analizu: kontrola porodične pametne greške (FWE) i kontrola lažne stope otkrića (FDR). FWE pristup kontroliše verovatnoću da jedan ili više pogodaka nisu realni; FDR pristup kontroliše verovatnoću očekivane proporcije lažno pozitivnih među odabranim pogodcima. Prvi pristup je konzervativniji i manje snažan nego onaj poslednji. Postoji mnogo dostupnih metoda za oba pristupa, za ovu analizu, odabrani su Hochberg-ov (1988) metod za FWE analizu i Benjamini-Hochberg-ov (1995) FDR metod za FDR analizu. Izračunate su doterane p-vrednosti za oba pristupa.

Rezultati

Pomak EC50

Mutacije čiji je EC50 značajno različit od divljeg tipa, npr., ima False Discovery Rate doteranu p-vrednost za ceo ogled od 0.01 ili manje, smatrane su delom strukturnog epitopa. Svi ovi pogodci takođe imaju porodično mudar tip I stope greške doteranu p-vrednost za svako antitelo manju od 0.01 sem ostatka R185E za antitelo 31H4 koje ima FWE doteranu p-vrednost po antitelu od 0.0109. Ostaci u strukturalnom epitopu različitih antitela određeni sa EC50 pomakom prikazani su u Tabeli 39.3 (tačkaste mutacije su sa pozivom na SEQ ID NO: 1 i 303).

Tabela 39.3

1

Maksimum redukcije signala

Procenat maksimuma signala je izračunat koristeći maksimum signala iz podešavanja krive (Bmaks za WT) i tačku sirovog podatka (Sirovi Max za WT). Mutacije koje su redukovale maksimum signala vezivanja antitela za ≥ 70% u poređenju sa signalom divljeg tipa ili koje su redukovale signal antitela u poređenju sa drugim antitelima za >50% kada su sva druga antitela najmanje 40% divljeg tipa smatrane su pogotkom i delom epitopa. Tabela 39.4 pokazuje ostatke koji su u strukturalnom epitopu (kurziv) kao što je određeno redukcijom maksimuma signala.

Tabela 39.4

1

(tačkaste mutacije su u okviru poziva na SEQ ID NO: 1 i FIG.26).

Tabela 39.5 prikazuje sažetak svih pogodaka za različita antitela.

Tabela 39.5

Da bi se dalje ispitalo kako ti ostaci formiraju deo ili cele odgovarajuće epitope, gore pomenute pozicije su mapirane na modele različite kristalne strukture, rezultati su prikazani na FIG. 27A do 27E. FIG. 27A prikazuje 21 B 12 epitop pogotke, kao što su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 21B12 antitelom. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogodci su zasnovani na Bmax pomaku. Na ovoj figuri, 31H4 je iza 21 B12.

1

FIG. 27B prikazuje 31H4 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. Epitop pogotka su zasnovani na EC50 pomaku.

FIG. 27C prikazuje 31A4 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. Epitop pogodci su zasnovani na EC50 pomaku. Poznato je da se 31A4 antitelo vezuje za V-domen PCSK9, za koji se pokazuje da je konzistentan sa sa rezultatima predstavljenim na FIG.27C.

FIG. 27D prikazuje 12H11 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogotka su zasnovani na Bmax pomaku. 12H11 je u kompeticiji sa 21B12 i 31 H4 u ogledu vezivanja opisanom gore.

FIG. 27E prikazuje 3C4 epitop pogotke, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na figuri) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax.

3C4 nije u kompeticiji sa 21B12 i 31H4 u ogledu vezivanja. 3C4 se vezuje za V-domen u ogledu vezivanja domena (vidi rezultate iz Primera 40, FIG..28A i 28B).

I dok je bilo približno dvanaest mutanata za koje se očekivalo da mogu imati efekat na vezivanje (zasnovano na kristalnoj strukturi), ovaj eksperiment je pokazao da, na iznenađenje,

1

oni nisu imali efekta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati prikazani gore se dobro slažu sa kristalnim strukturama i vezivanjem PCSK-9 ovih antitela. To pokazuje da obezbeđeni strukturni i odgovarajući funkcionalni podaci adekvatno identifikuju ključne ostatke i područja interakcije neutralizujućih AVPa i PCSK9. Prema tome, varijante AVPa koje poseduju sposobnost da se vezuju za gore pomenuta područja su adekvatno obezbeđena od strane predmetnog opisa.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, dok B-maks pad i EC50 pomak pogotka može da se smatra manifestacijom istog fenomena, striktno govoreći, sam B-max pad ne reflektuje gubitak afiniteta sam po sebi već, radije, destrukciju nekih procenata epitopa antitela. I ako nema preklapanja u pogodcima određenim sa B-maks i EC50, mutacije sa jakim efektom na vezivanjene moraju omogućiti generisanje korisne krive vezivanja i, prema tome, EC50 se ne može odrediti za takve varijante.

Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, AVPi u istom binu (sa izuzetkom bina 5, koji je kao što je gore primećeno, hvata sve binove) se vezuju za preklapajuća mesta na ciljnom proteinu. Kao takvi, gornji epitopi i odgovarajući ostaci mogu se generalno proširiti na sve takve AVPe u istom binu.

Da bi se dalje ispitali gornji rezultati u odnosu na AVP 31H4, poziciju E181R, za koje je, prema gornjoj kristalnoj strukturi, bilo predviđeno da interreaguju sa R 185 da formiraju deo od površine koja interreaguje sa AVP, takođe je bio izmenjen (E181R). Rezultati, i ako nisu statistički značajni sami po sebi, bili su, kada su kombinovani sa kristalnom strukturom, dokazni za interakciju 31H4 sa E181R (podaci nisu prikazani). Prema tome, izgleda da pozicija 181 takođe formira deo epitopa za 31 H4 AVP.

Kao što je napomenuto gore, gornji podaci vezivanja i karakterizacije epitopa navode PCSK9 sekvencu (SEQ ID NO: 1) koja ne uključuje prvih 30 amino kiselina od PCSK9. Prema tome, sistem numerisanja ovog fragmenta proteina, i SEQ ID NO: koji navode taj fragment, su pomereni za 30 amino kiselina u poređenju sa podacima i eksperimentima koji koriste sistem numerisanja za PCSK9 pune dužine (kao što su oni podaci koji su upotrebljeni u studiji kristala opisani gore). Prema tome, da bi se uporedili ovi rezultati, mora se dodati 30 ekstra amino kiselina na pozicije u svakom od gornjih rezultata mapiranja epitopa. Na primer, pozicija 207 od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303), je u korelaciji sa pozicijom 237 od SEQ ID NO: 3 (sekvenca pune dužine, i sistem numerisanja koji je upotrebljen kroz ostatak prijave). Tabela 39.6 istiće kako su gore pomenute pozicije, koje pominju SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) u korelaciji sa SEQ ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu).

TABELA 39.6

14

POZICIJE AMINO KISELINE U POZICIJE AMINO KISELINE U

SEQ ID NO: 1 (PODACI O EPITOPU) SEQ ID NO: 3 (PODACI O EPITOPU)

207 237

208 238

185 215

181 211

439 469

513 543

538 568

539 569

132 162

351 381

390 420

413 443

582 612

162 192

164 194

167 197

123 153

129 159

311 341

313 343

337 367

519 549

521 551

554 584

Prema tome, ta ostvarenja opisana ovde u vezi sa SEQ ID NO: 1 mogu se takođe opisati, sa njihovim gore pomenutim odgovarajućim pozicijama u vezi sa SEQ ID NO: 3.

PRIMER 40

Ogled vezivanja domena PCSK9

Ovaj ogled je ispitao gde se na PCSK9 vezuju različiti AVPi.

Prozirne, ploče maksimalne apsopcije sa 96 bunarčića (Nunc) su obavijene preko noći sa 2 ug/ml različitih anti-PCSK9 antitela razblaženih u PBS. Ploče su snažno isprane sa PBS/.05% Tween-20 i zatim blokirane tokom dva časa sa 3% BSA/PBS. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom dva časa ili sa PCSK9 pune dužine (aa 31-692 SEQ ID NO: 3, prokat PCSK9 (aa 31-449 SEQ ID NO: 3) ili v-domen PCSK9 (aa 450-692 od SEQ ID NO: 3) razblaženim u razblaživaču za opšti ogled (Immunochemistry Technologies, LLC). Ploče su isprane i zečje poliklonalno biotinilizirano anti-PCSK9 antitelo (D8774), koje prepoznaje prokat i v-domen kao i PCSK9 pune dužine, je dodano u 1 ug/ml (u 1 %BSA/PBS). Vezani pune dužine, prokat ili vdomen PCSK9 je detektovan pomoću inkubiranja sa neutravidin-HRP (Thermo Scientific) na 200 ng/ml (u 1% BSA/PBS) praćenim sa TMB substratom (KPL) i merenjem apsorbance na 650 nm. Rezultati, prikazani na FIG.28A i 28B, pokazuju sposobnost različitih ABS da se vezuju za različite delove PCSK9. Kao što je prikazano na FIG.28B, AVP 31A4 se vezuje za V domen od PCSK9.

UPOREDNI PRIMER 41

Neutralizacija, ne-kompetitivnih antigen vezujućih proteina (nije deo patenta za koji se traži zaštita)

Ovaj primer pokazuje kako da se identifikuje i okarakteriše antigen vezujući protein koji je ne-kompeptitivan sa LDLR za vezivanje sa PCSK9, ali je još uvek neutralizujući u odnosu na aktivnost PCSK9. Drugim rečima, takav antigen vezujući protein neće blokirati PCSK9 da se vezuje za LDLR, ali će sprečiti ili redukovati PCSK9 posredovanu degradaciju LDLR.

Prozirne, ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 ug/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Systems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat, pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puferom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 ug/ml od LDL receptora (R&D Systems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCl2). Konkurentno sa inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 100 ng/ml antitela razblaženog sa puferom A ili samim puferom A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo mešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 čaasa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano pomoću inkubacije sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćeno sa TMB supstratom (KPL). Signal je ugašen sa 1N HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm. Rezultati su predstavljeni na FIG. 28C, koja pokazuje da dok AVP 31H4 inhibira LDLR vezivanje, AVP 31A4 ne inhibira LDLR vezivanje za PCSK9. U kombinaciji sa rezultatima iz Primera 40 i prikazanim na FIG. 28A i 28B, i jasno je da se 31A4 AVP vezuje za V domen od PCSK9 i ne blokira interakciju PCSK9 sa LDLR.

Dalje je sposobnost AVP 31A4 da posluži kao neutralizujući AVP bila potvrđena preko ogleda uzimanja LDL od strane ćelija (kao što je opisano u primerima gore). Rezultati tog ogleda uzimanja LDL su predstavljeni na FIG. 28D. Kao što prikazano na FIG. 28D, AVP 31A4 pokazuje značajnu sposobnost neutralizacije PCSK9. Prema tome, u svetlu Primera 40 i ovih rezultata, jasno je da AVPi mogu da se vežu za PCSK9 bez blokiranja PCSK9 i LDLR interakcije vezivanja, dok su još uvek korisni kao neutralizatori PCSK9 AVPa.

Ovde citirane reference

U opsegu da bilo koja od definicija ili koji od pojmova iznetih u referencama ovde navedenim se razlikuje od pojmova i ovde iznete diskusije, ovde izneti pojmovi i definicije prevladavaju.

Ekvivalenti

Smatra se da je ovde iznet pisani opis dovoljan da omogući stručnjaku da reprodukuje pronalazak. Prethodni opis i primeri detaljno opisuju neka poželjna ostvarenja ovog pronalaska. Međutim, treba ceniti da bez obzira na to koliko prethodno izgleda detaljno u iznetom tekstu, ovaj pronalazak može biti reprodukovan na mnogo načina i pronalazak treba razmatrati u skladu sa priloženim patentnim zahtevima i bilo kojim njihovim ekvivalentima.

14

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

11

��

�

��

�

21

22

�

��

�

21

22

�

21

22

�

��

�

��

Tabela 35.2 ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM

24

2

21

22

2

24

2

21 ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM

2 2

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

ATOM 2065 CA THR 353 13.991 -17.868 12.386 1.00 23.39 B C ATOM 2066 CB THR 353 13.177 -16.565 12.446 1.00 23.46 B C ATOM 2067 O THR 353 12.050 -16.652 11.559 1.00 22.87 B O ATOM 2068 CG THR 353 14.054 -15.387 12.031 1.00 23.22 B C ATOM 2069 C THR 353 14.657 -17.954 11.020 1.00 21.85 B C ATOM 2070 C THR 353 15.659 -17.290 10.768 1.00 23.19 B O ATOM 2071 N ASN 354 14.099 -.18.776 10.142 1.00 19.78 B N ATOM 2072 CA ASN 354 14.513 -18.776 8.751 1.00 18.88 B C ATOM 2073 CB ASN 354 13.905 -19.981 8.029 1.00 19.41 B C ATOM 2074 CG ASN 354 14.733 -21.232 8.203 1.00 18.91 B C ATOM 2075 O ASN 354 15.835 -21.175 8.720 1.00 22.77 B O ATOM 2076 N ASN 354 14.211 -22.363 7.765 1.00 20.48 B N ATOM 2077 C ASN 354 14.057 -17.464 8.114 1.00 19.36 B C ATOM 2078 O ASN 354 13.425 -16.641 8.775 1.00 18.72 B O ATOM 2079 N PHE 355 14.380 -17.258 6.842 1.00 20.03 B N ATOM 2080 CA PHE 355 14.126 -15.974 6.191 1.00 22.21 B C ATOM 2081 CB PHE 355 15.174 -14.960 6.638 1.00 19.82 B C ATOM 2082 CG PHE 355 16.550 -15.546 6.737 1.00 20.47 B C ATOM 2083 CD PHE 355 17.080 -15.893 7.972 1.00 19.70 B C ATOM 2089 CD PHE 355 17.281 -15.832 5.590 1.00 19.94 B C ATOM 2085 CE PHE 355 18.305 -16.521 8.064 1.00 18.39 B C ATOM 2086 CE PHE 355 18.504 -16.457 5.676 1.00 19.14 B C ATOM 2087 CZ PHE 355 19.016 -16.804 6.918 1.00 18.75 B C ATOM 2088 C PHE 355 14.188 -16.140 4.672 1.00 24.66 B C ATOM 2089 O PHE 355 14.063 -17.254 4.154 1.00 26.20 B O ATOM 2090 N GLY 356 14.384 -15.031 3.963 1.00 25.89 B N ATOM 2091 CA GLY 356 14.478 -15.090 2.520 1.00 27.05 B C ATOM 2092 C GLY 356 13.145 -14.824 1.856 1.00 28.45 B C ATOM 2093 O GLY 356 12.172 -14.473 2.509 1.00 28.91 B O ATOM 2099 N ARG 357 13.103 -15.003 0.545 1.00 29.61 B N ATOM 2095 CA ARG 357 11.921 -14.683 -0.235 1.00 30.42 B C ATOM 2096 CB ARG 357 12.312 -14.507 -1.702 1.00 33.04 B C ATOM 2097 CG ARG 357 12.919 -15.749 -2.307 1.00 38.74 B C ATOM 2098 CD ARG 357 12.688 -15.791 -3.794 1.00 43.88 B C ATOM 2099 NE ARG 357 13.524 -14.837 -4.515 1.00 49.58 B N ATOM 2100 CZ ARG 357 14.766 -15.094 -4.921 1.00 52.78 B C ATOM 2101 NH1 ARG 357 15.456 -14.164 -5.580 1.00 53.88 B N

1

ATOM. 2102 NH ARG 357 15.322 -16.277 -4.662 1.00 53.07 B N ATOM 2103 C ARG 357. 10.802 -15.725 -0.121 1.00 29.69 B C ATOM 2104 O ARG 357 9.708 -15.518 -0.635 1.00 28.09 B O ATOM 2105 N CYS 358 11.064 -16.845 0.543 1.00 29.30 B N ATOM 2106 CA CYS 358 9.998 -17.817 0.778 1.00 28.85 B C ATOM 2107 C CYS 358 9.170 -17.473 2.017 1.00 27.26 B C ATOM 2108 O CYS 358 8.119 -18.067 2.257 1.00 27.00 B O ATOM 2109 CB CYS 358 10.570 -19.239 0.899 1.00 30.23 B C ATOM 2110 SG CYS 358 10.992 -19.934 -0.727 1.00 33.15 B S ATOM 2111 N VAL 359 9.635 -16.508 2.801 1.00 25.41 B N ATOM 2112 CA VAL 359 8.846 -16.037 3.927 1.00 24.19 B C ATOM 2113 CB VAL 359 9.747 -15.506 5.072 1.00 24.35 B C ATOM 2114 CG VAL 359 8.898 -14.934 6.197 1.00 22.54 B C ATOM 2115 CG VAL 359 10.602 -16.640 5.615 1.00 25.11 B C ATOM 2116 C VAL 359 7.903 -14.941 3.461 1.00 23.48 B C ATOM 2117 0 VAL 359 8.282 -14.058 2.693 1.00 24.15 B O ATOM 2118 N ASP 360 6.660 -15.017 3.914 1.00 22.77 B N ATOM 2119 CA ASP 360 5.648 -14.067 3.504 1.00 20.61 B C ATOM 2120 CB ASP 360 4.286 -14.766 3.445 1.00 23.47 B C ATOM 2121 CG ASP 360 4.162 -15.711 2.237 1.00 26.57 B C ATOM 2122 OD ASP 360 3.832 -15.224 1.128 1.00 25.68 B 0 ATOM 2123 OD ASP 360 4.396 -16.935 2.395 1.00 27.94 B 0 ATOM 2124 C ASP 360 5.632 -12.899 4.475 1.00 17.89 B C ATOM 2125 O ASP 360 5.638 -11.790 4.069 1.00 16.84 B 0 ATOM 2126 N LEU 361 5.639 -13.207 5.763 1.00 16.38 B N ATOM 2127 CA LEU 361 5.770 -12.171 6.777 1.00 16.17 B C ATOM 2128 CB LEU 361 9.997 -11.425 6.946 1.00 17.23 B C ATOM 2129 CG LEU 361 3.252 -12.186 7.523 1.00 16.84 B C ATOM 2130 CD LEU 361 2.087 -11.229 7.633 1.00 16.25 B C ATOM 2131 CD LEU 361 2.881 -13.374 6.643 1.00 18.27 B C ATOM 2132 C LEU 361 6.225 -12.719 8.128 1.00 15.83 B C ATOM 2133 O LEU 361 6.477 -13.913 8.278 1.00 16.68 B O ATOM 2134 N PHE 362 6.345 -11.832 9.109 1.00 15.56 B N ATOM 2135 CA PHE 362 6.792 -12.235 10.432 1.00 14.82 B C ATOM 2136 CB PHE 362 8.059 -11.474 10.814 1.00 14.14 B C ATOM 2137 PHE 362 9.259 -11.872 10.002 1.00 12.01 B C

CG

2

ATOM 2138 CD PHE 362 10.157 -12.818 10.486 1.00 9.24 B C ATOM 2139 CD PHE 362 9.464 -11.332 8.738 1.00 8.63 B C ATOM 2140 CE PHE 362 11.233 -13.218 9.726 1.00 8.18 B C ATOM 2141 CE PHE 362 10.534 -11.725 7.970 1.00 7.87 B C ATOM 2142 CZ PHE 362 11.423 -12.671 8.463 1.00 9.03 B C ATOM 2143 C PHE 362 5.710 -11.997 11.450 1.00 14.66 B C ATOM 2199 O PHE 362 4.720 -11.336 11.158 1.00 17.08 B O ATOM 2145 N ALA 363 5.891 -12.547 12.641 1.00 14.32 B N ATOM 2146 CA ALA 363 4.877 -12.453 13.674 1.00 15.69 B C ATOM 2147 CB ALA 363 3.767 -13.462 13.408 1.00 14.68 B C ATOM 2148 C ALA 363 5.509 -12.717 15.025 1.00 17.04 B C ATOM 2199 O ALA 363 6.544 -13.370 15.115 1.00 18.01 B O ATOM 2150 N PRO 364 4.894 -12.207 16.101 1.00 18.24 B N ATOM 2151 CD PRO 364 3.855 -11.163 16.138 1.00 17.59 B C ATOM 2152 CA PRO 364 5.395 -12.521 17.438 1.00 18.94 B C ATOM 2153 CB PRO 364 4.227 -12.146 18.339 1.00 18.02 B C ATOM 2154 CG PRO 369 3.597 -10.978 17.621 1.00 17.86 B C ATOM 2155 C PRO 364 5.753 -13.992 17.540 1.00 20.27 B C ATOM 2156 O PRO 369 4.962 -14.851 17.152 1.00 22.37 B O ATOM 2157 N GLY 365 6.950 -14.279 18.044 1.00 20.34 B N ATOM 2158 CA GLY 365 7.380 -15.658 18.138 1.00 22.18 B C ATOM 2159 C GLY 365 8.373 -15.948 1.9.293 1.00 25.70 B C ATOM 2160 O GLY 365 8.973 -17.018 19.270 1.00 23.16 B O ATOM 2161 N GLU 366 8.558 -15.002 20.154 1.00 25.89 B N ATOM 2162 CA GLU 366 9.998 -15.193 21.252 1.00 29.11 B C ATOM 2163 CB GLU 366 10.758 -14.359 21.023 1.00 31.40 B C ATOM 2164 CG GLU 366 11.838 -14.585 22.053 1.00 35.84 B C ATOM 2165 CD GLU 366 12.907 -13.508 22.017 1.00 40.32 B C ATOM 2166 OE GLU 366 13.931 -13.702 21.320 1.00 42.04 B O ATOM 2167 OE GLU 366 12.723 -12.462 22.685 1.00 43.30 B O ATOM 2168 C GLU 366 8.856 -14.794 22.563 1.00 28.79 B C ATOM 2169 O GLU 366 8.202 -13.753 22.642 1.00 28.23 B O ATOM 2170 N ASP 367 9.048 -15.624 23.586 1.00 29.00 B N ATOM 2171 CA ASP 367 8.400 -15.431 24.884 1.00 29.74 B C ATOM 2172 CB ASP 367 8.868 -14.145 25.549 1.00 33.33 B C ATOM 2173 CG ASP 367 10.172 -14.314 26.270 1.00 38.62 B C ATOM 2179 OD ASP 367 11.177 -13.708 25.839 1.00 42.20 B O ATOM 2175 O ASP 367 10.195 -15.057 27.272 1.00 42.52 B O ATOM 2176 C ASP 367 6.898 -15.371 24.771 1.00 28.66 B C ATOM 2177 O ASP 367 6.273 -14.473 25.327 1.00 29.35 B 0 ATOM 2178 N ILE 368 6.312 -16.316 24.047 1.00 28.05 B N ATOM 2179 CA ILE 368 4.859 -16.347 23.911 1.00 26.36 B C ATOM 2180 CB ILE 368 4.425 -16.924 22.542 1.00 24.44 B C ATOM 2181 CG ILE 368 2.921 -16.746 22.359 1.00 22.78 B C ATOM 2182 CG ILE 368 5.175 -16.208 21.414 1.00 23.14 B C ATOM 2183 CD ILE 368 4.953 -14.710 21.380 1.00 21.33 B C ATOM 2184 C ILE 368 4.233 -17.175 25.028 1.00 25.21 B C ATOM 2185 O ILE 368 4.365 -18.399 25.076 1.00 25.00 B O ATOM 2186 N ILE 369 3.561 -16.491 25.940 1.00 23.47 B N ATOM 2187 CA ILE 369 2.872 -17.179 27.007 1.00 24.06 B C ATOM 2188 CB ILE 369 2.562 -16.226 28.161 1.00 24.47 B C ATOM 2189 CG ILE 369 2.407 -14.812 27.645 1.00 24.60 B C ATOM 2190 CG ILE 369 1.328 -16.723 28.901 1.00 24.42 B C ATOM 2191 CD ILE 369 0.614 -15.646 29.639 1.00 26.06 B C ATOM 2192 C ILE 369 1.578 -17.780 26.996 1.00 23.71 B C ATOM 2193 O ILE 369 0.827 -17.129 25.783 1.00 24.50 B O ATOM 2194 N GLY 370 1.326 -19.029 26.866 1.00 24.27 B N ATOM 2195 CA GLY 370 0.172 -19.743 26.357 1.00 24.97 B C ATOM 2196 C GLY 370 -0.100 -20.957 27.214 1.00 26.60 B C ATOM 2197 O GLY 370 0.565 -21.153 28.235 1.00 27.10 B O ATOM 2198 N ALA 371 -1.063 -21.778 26.799 1.00 27.73 B N ATOM 2199 CA ALA 371 -1.526 -22.902 27.615 1.00 27.34 B C ATOM 2200 CB ALA 371 -2.705 -23.580 26.946 1.00 26.39 B C ATOM 2201 C ALA 371 -0.431 -23.922 27.880 1.00 27.36 B C ATOM 2202 O ALA 371 0.319 -24.296 26.980 1.00 28.65 B O ATOM 2203 N SER 372 -0.343 -24.371 29.126 1.00 27.77 B N ATOM 2204 CA SER 372 0.621 -25.397 29.498 1.00 28.83 B C ATOM 2205 CB SER 372 1.439 -24.952 30.706 1.00 29.82 B C ATOM 2206 O SER 372 2.034 -26.074 31.322 1.00 30.59 B 0 ATOM 2207 C SER 372 -0.076 -26.700 29.829 1.00 29.05 B C ATOM 2208 0 SER 372 -0.969 -26.741 30.665 1.00 29.97 B O ATOM 2209 N SER 373 0.349 -27.770 29.172 1.00 30.11 B N ATOM 2210 CA SER 373 -0.304 -29.060 29.310 1.00 30.04 B C ATOM 2211 CB SER 373 0.107 -29.979 28.159 1.00 30.89 B C

4

ATOM 2212 O SER 373 1.493 -30.283 28.205 1.00 33.39 B O ATOM 2213 C SER 373 0.062 -29.695 30.641 1.00 30.17 B C ATOM 2214 0 SER 373 -0.993 -30.761 30.986 1.00 29.58 B O ATOM 2215 N ASP 374 0.942 -29.030 31.385 1.00 31.28 B N ATOM 2216 CA ASP 374 1.373 -29.532 32.688 1.00 32.37 B C ATOM 2217 CB ASP 374 2.410 -28.602 33.317 1.00 32.98 B C ATOM 2218 CG ASP 374 3.832 -28.993 32.964 1.00 34.09 B C ATOM 2219 O ASP 374 4.016 -29.822 32.042 1.00 35.12 B O ATOM 2220 O ASP 374 4.763 -28.471 33.615 1.00 34.70 B 0 ATOM 2221 C ASP 374 0.187 -29.639 33.616 1.00 31.98 B C ATOM 2222 0 ASP 374 0.079 -30.578 34.403 1.00 33.02 B 0 ATOM 2223 N CYS 375 -0.696 -28.654 33.525 1.00 32.06 B N ATOM 2224 CA CYS 375 -1.976 -28.705 34.204 1.00 31.88 B C ATOM 2225 C CYS 375 -2.922 -27.755 33.477 1.00 30.87 B C ATOM 2226 O CYS 375 -2.495 -26.986 32.618 1.00 28.42 B O ATOM 2227 CB CYS 375 -1.809 -28.308 35.674 1.00 31.19 B C ATOM 2228 SG CYS 375 -2.015 -26.538 36.040 1.00 37.01 B S ATOM 2229 N SER 376 -4.207 -27.816 33.807 1.00 32.21 B N ATOM 2230 CA SER 376 -5.221 -27.206 32.954 1.00 33.14 B C ATOM 2231 CB SER 376 -6.529 -27.973 33.071 1.00 32.67 B C ATOM 2232 O SER 376 -6.680 -28.456 34.388 1.00 36.61 B O ATOM 2233 C SER 376 -5.455 -25.734 33.237 1.00 32.73 B C ATOM 2234 0 SER 376 -6.133 -25.052 32.474 1.00 33.18 B O ATOM 2235 N THR 377 -4.892 -25.245 34.335 1.00 33.07 B N ATOM 2236 CA THR 377 -4.816 -23.808 34.571 1.00 32.43 B C ATOM 2237 CB THR 377 -5.466 -23.429 35.916 1.00 32.44 B C ATOM 2238 O THR 377 -4.997 -24.310 36.947 1.00 31.10 B O ATOM 2239 CG THR 377 -6.974 -23.510 35.801 1.00 31.10 B C ATOM 2240 C THR 377 -3.366 -23.319 34.549 1.00 31.50 B C ATOM 2241 0 THR 377 -3.047 -22.242 35.061 1.00 30.92 B O ATOM 2242 N CYS 378 -2.497 -24.116 33.936 1.00 29.98 B N ATOM 2243 CA CYS 378 -1.081 -23.786 33.837 1.00 29.05 B C ATOM 2244 C CYS 378 -0.729 -23.067 32.527 1.00 26.98 B C ATOM 2245 0 CYS 378 -1.265 -23.382 31.459 1.00 25.69 B O ATOM 2246 CB CYS 378 -0.249 -25.064 33.989 1.00 29.82 B C ATOM 2247 SG CYS 378 -0.190 -25.678 35.704 1.00 33.15 B S ATOM 2248 N PHE 379 0.169 -22.090 32.627 1.00 24.89 B N ATOM 2249 379 0.663 -21.372 31.463 1.00 23.14 B C ATOM 2250 379 0.228 -19.909 31.530 1.00 21.19- B C ATOM 2251 379 -1.233 -19.730 31.289 1.00 22.53 B C ATOM 2252 379 -2.151 -19.959 32.309 1.00 22.23 B C ATOM 2253 379 -1.709 -19.409 30.019 1.00 22.19 B C ATOM 2254 379 -3.520 -19.886 32.059 1.00 22.41 B C ATOM 2255 379 -3.072 -19.335 29.764 1.00 20.69 B C ATOM 2256 379 -3.978 -19.571 30.783 1.00 21.30 B C ATOM 2257 379 2.172 -21.483 31.357 1.00 23.01 B C ATOM 2258 379 2.837 -21.948 32.285 1.00 23.48 B O ATOM 2259 380 2.710 -21.073 30.215 1.00 21.60 B N ATOM 2260 380 4.127 -21.259 29.953 1.00 21.47 B C ATOM 2261 380 4.421 -22.730 29.624 1.00 20.54 B C ATOM 2262 380 3.910 -23.050 28.235 1.00 19.96 B C ATOM 2263 380 5.895 -23.015 29.760 1.00 19.12 B C ATOM 2269 380 4.526 -20.395 28.768 1.00 21.24 B C ATOM 2265 380 3.706 -20.143 27.891 1.00 21.49 B O ATOM 2266 381 5.774 -19.937 28.737 1.00 21.07 B N ATOM 2267 381 6.242 -19.163 27.596 1.00 23.27 B C ATOM 2268 381 7.095 -17.992 28.073 1.00 24.23 B C ATOM 2269 381 7.575 -17.242 26.972 1.00 27.50 B O ATOM 2270 381 7.038 -20.022 26.603 1.00 24.40 B C ATOM 2271 381 7.786 -20.921 27.003 1.00 25.03 B O ATOM 2272 382 6.866 -19.759 25.310 1.00 22.98 B N ATOM 2273 382 7.558 -20.537 24.294 1.00 24.19 B C ATOM 2219 382 6.699 -21.731 23.851 1.00 25.69 B C ATOM 2275 382 6.625 -22.896 24.858 1.00 28.37 B C ATOM 2276 382 5.873 -24.131 24.310 1.00 31.99 B C ATOM 2277 382 5.701 -25.134 25.011 1.00 32.02 B 0 ATOM 2278 382 5.430 -24.054 23.055 1.00 33.34 B N ATOM 2279 382 7.924 -19.672 23.090 1.00 24.25 B C ATOM 2280 382 7.331 -18.621 22.869 1.00 23.92 B 0 ATOM 2281 383 8.918 -20.117 22.328 1.00 24.93 B N ATOM 2282 383 9.935 -19.366 21.186 1.00 25.23 B C ATOM 2283 383 10.741 -18.650 21.569 1.00 24.50 B C ATOM 2284 383 10.523 -17.648 22.550 1.00 21.80 B O ATOM 2285 383 9.686 -20.306 20.003 1.00 25.02 B C ATOM 2286 O SER 383 9.703 -21.521 20.165 1.00 26.23 B O ATOM 2287 N GLY 384 9.892 -19.739 18.818 1.00 25.92 B N ATOM 2288 CA GLY 384 9.975 -20.544 17.611 1.00 25.10 B C ATOM 2289 C GLY 384 9.031 -20.032 16.534 1.00 25.79 B C ATOM 2290 O GLY 384 8.130 -19.234 16.804 1.00 24.41 B O ATOM 2291 N THR 385 9.240 -20.479 15.302 1.00 26.36 B N ATOM 2292 CA THR 385 8.417 -20.030 14.185 1.00 26.63 B C ATOM 2293 CB THR 385 9.056 -20.415 12.841 1.00 25.25 B C ATOM 2294 OG THR 385 9.504 -21.777 12.890 1.00 23.96 B 0 ATOM 2295 CG THR 385 10.221 -19.506 12.541 1.00 25.37 B C ATOM 2296 C THR 385 7.003 -20.615 14.254 1.00 27.62 B C ATOM 2297 O THR 385 6.094 -20.163 13.554 1.00 28.58 B 0 ATOM 2298 N SER 386 6.820 -21.621 15.099 1.00 26.33 B N ATOM 2299 CA SER 386 5.495 -22.160 15.316 1.00 26.38 B C ATOM 2300 CB SER 386 5.572 -23.414 16.184 1.00 26.41 B C ATOM 2301 OG SER 386 5.940 -24.523 15.395 1.00 27.85 B O ATOM 2302 C SER 386 4.591 -21.125 15.978 1.00 26.58 B C ATOM 2303 O SER 386 3.444 -20.948 15.572 1.00 27.11 B O ATOM 2304 N GLN 387 5.104 -20.443 16.998 1.00 25.64 B N ATOM 2305 CA GLN 387 4.283 -19.532 17.780 1.00 23.63 B C ATOM 2306 CB GLN 387 5.064 -19.006 18.978 1.00 22.61 B C ATOM 2307 CG GLN 387 6.153 -19.938 19.464 1.00 22.42 B C ATOM 2308 CD GLN 387 5.615 -21.198 20.096 1.00 21.76 B C ATOM 2309 OE GLN 387 4.627 -21.162 20.839 1.00 21.92 B O ATOM 2310 NE GLN 387 6.263 -22.327 19.809 1.00 20.35 B N ATOM 2311 C GLN 387 3.880 -18.378 16.886 1.00 23.78 B C ATOM 2312 O GLN 387 2.777 -17.846 16.997 1.00 24.91 B O ATOM 2313 N ALA 388 4.787 -18.002 15.992 1.00 23.75 B N ATOM 2314 CA ALA 388 9.997 -17.002 14.972 1.00 23.70 B C ATOM 2315 CB ALA 388 5.740 -16.768 14.094 1.00 23.02 B C ATOM 2316 C ALA 388 3.319 -17.475 14.113 1.00 23.75 B C ATOM 2317 O ALA 388 2.242 -16.873 14.129 1.00 24.11 B O ATOM 2318 N ALA 389 3.529 -18.561 13.374 1.00 22.91 B N ATOM 2319 CA ALA 389 2.503 -19.106 12.498 1.00 21.81 B C ATOM 2320 CB ALA 389 2.887 -20.521 12.086 1.00 19.89 B C ATOM 2321 C ALA 389 1.123 -19.094 13.172 1.00 22.14 B C ATOM 2322 O ALA 389 0.135 -18.644 12.584 1.00 22.22 B 0 ATOM 2323 N ALA 390 1.057 -19.570 14.410 1.00 22.17 B N ATOM 2329 CA ALA 390 -0.215 -19.627 15.123 1.00 22.04 B C ATOM 2325 CB ALA 390 -0.026 -20.241 16.506 1.00 22.25 B C ATOM 2326 C ALA 390 -0.843 -18.241 15.249 1.00 21.51 B C

-

ATOM 2327 O ALA 390 -2.068 -18.099 15.179 1.00 21.52 B O ATOM 2328 N HIS 391 -0.012 -17.219 15.443 1.00 20.10 B N ATOM 2329 CA HIS 391 -0.526 -15.658 15.538 1.00 18.46 B C ATOM 2330 CB HIS 391 0.615 -14.857 15.771 1.00 19.36 B C ATOM 2331 CG HIS 391 0.912 -14.586 17.214 1.00 20.07 B C ATOM 2332 CD HIS 391 0.636 -13.513 17.995 1.00 19.81 B C ATOM 2333 N HIS 391 1.615 -15.467 18.010 1.00 18.44 B N ATOM 2334 CE HIS 391 1.761 -14.947 19.216 1.00 18.95 B C ATOM 2335 NE HIS 391 1.177 -13.762 19.234 1.00 18.77 B N ATOM 2336 C HIS 391 -1.241 -15.527 14.234 1.00 16.67 B C ATOM 2337 0 HIS 391 -2.274 -14.852 14.222 1.00 15.39 B O ATOM 2338 N VAL 392 -0.688 -16.027 13.136 1.00 15.23 B N ATOM 2339 CA VAL 392 -1.196 -15.632 11.815 1.00 14.91 B C ATOM 2390 CB VAL 392 0.007 -15.768 10.783 1.00 14.04 B C ATOM 2341 CG VAL 392 -0.475 -15.429 9.382 1.00 12.46 B C ATOM 2392 CG VAL 392 1.143 -14.838 11.169 1.00 12.88 B C ATOM 2343 C VAL 392 -2.369 -16.446 11.385 1.00 15.09 B C ATOM 2344 O VAL 392 -3.269 -15.929 10.722 1.00 14.21 B O ATOM 2345 N ALA 393 -2.421 -17.708 11.789 1.00 15.37 B N ATOM 2396 CA ALA 393 -3.658 -18.467 11.655 1.00 17.74 B C ATOM 2347 CB ALA 393 -3.453 -19.888 12.163 1.00 18.52 B C ATOM 2348 C ALA 393 -4.791 -17.776 12.434 1.00 17.78 B C ATOM 2349 O ALA 393 -5.936 -17.716 11.980 1.00 16.51 B 0 ATOM 2350 N GLY 394 -4.453 -17.298 13.606 1.00 18.67 B N ATOM 2351 CA GLY 399 -5.397 -16.444 14.359 1.00 19.56 B C ATOM 2352 C GLY 394 -5.878 -15.212 13.613 1.00 20.36 B C ATOM 2353 O GLY 394 -7.082 -14.986 13.501 1.00 21.22 B O ATOM 2354 N ILE 395 -4.950 -14.414 13.096 1.00 20.24 B N ATOM 2355 CA ILE 395 -5.312 -13.195 12.384 1.00 20.11 B C ATOM 2356 CB ILE 395 -4.060 -12.375 12.034 1.00 20.04 B C ATOM 2357 CG ILE 395 -4.449 -11.094 11.302 1.00 19.78 B C ATOM 2358 CG ILE 395 -3.301 -12.099 13.316 1.00 20.30 B C ATOM 2359 CD ILE 395 -2.049 -11.279 13.095 1.00 19.69 B C ATOM 2360 C ILE 395 -6.077 -13.519 11.104 1.00 21.08 B C ATOM 2361 O ILE 395 -6.974 -12.776 10.691 1.00 21.99 B 0 ATOM 2362 N ALA 396 -5.732 -14.634 10.473 1.00 20.99 B N ATOM 2363 CA ALA 396 -6.436 -15.039 9.267 1.00 20.56 B C ATOM 2364 CB ALA 396 -5.770 -16.267 8.659 1.00 20.18 B C ATOM 2365 C ALA 396 -7.885 -15.338 9.631 1.00 19.85 B C ATOM 2366 O ALA 396 -8.809 -14.845 8.995 1.00 17.95 B 0 ATOM 2367 N ALA 397 -8.071 -16.136 10.677 1.00 21.02 B N ATOM 2368 CA ALA 397 -9.402 -16.485 11.154 1.00 21.16 B C ATOM 2369 CB ALA 397 -9.305 -17.247 12.464 1.00 17.93 B C ATOM 2370 C ALA 397 -10.244 -15.233 11.342 1.00 22.61 B C ATOM 2371 O ALA 397 -11.378 -15.168 10.875 1.00 25.02 B O ATOM 2372 N MET 398 -9.686 -14.231 12.014 1.00 23.67 B N ATOM 2373 CA MET 398 -10.426 -13.008 12.282 1.00 23.20 B C ATOM 2374 CB MET 398 -9.601 -12.084 13.167 1.00 24.40 B C ATOM 2375 CG MET 398 -9.150 -12.733 14.457 1.00 29.13 B C ATOM 2376 SD MET 398 -10.147 -12.270 15.879 1.00 35.63 B S ATOM 2377 CE MET 398 -9.367 -10.694 16.357 1.00 31.39 B C ATOM 2378 C MET 398 -10.784 -12.298 10.980 1.00 23.27 B C ATOM 2379 O MET 398 -11.925 -11.889 10.782 1.00 22.16 B O ATOM 2380 N MET 399 -9.815 -12.165 10.083 1.00 22.78 B N ATOM 2381 CA MET 399 -10.059 -11.448 8.843 1.00 22.76 B C ATOM 2382 CB MET 399 -8.741 -11.202 8.118 1.00 24.23 B C ATOM 2383 CG MET 399 -7.755 -10.386 8.928 1.00 27.83 B C ATOM 2384 SD MET 399 -6.151 -10.150 8.115 1.00 32.96 B S ATOM 2385 CE MET 399 -6.680 -9.723 6.497 1.00 29.89 B C ATOM 2386 C MET 399 -11.032 -12.195 7.930 1.00 22.15 B C ATOM 2387 O MET 399 -11.828 -11.580 7.218 1.00 21.59 B O ATOM 2388 N LEU 400 -10.975 -13.522 7.957 1.00 21.52 B N ATOM 2389 CA LEU 400 -11.878 -14.320 7.140 1.00 20.75 B C ATOM 2390 CB LEU 400 -11.349 -15.745 6.962 1.00 18.56 B C ATOM 2391 CG LEU 400 -10.109 -15.930 6.085 1.00 16.86 B C ATOM 2392 CD LEU 400 -9.897 -17.411 5.826 1.00 13.64 B C ATOM 2393 CD LEU 400 -10.273 -15.166 4.770 1.00 15.30 B C ATOM 2394 C LEU 400 -13.248 -14.379 7.782 1.00 22.24 B C ATOM 2395 O LEU 400 -14.267 -14.449 7.092 1.00 23.47 B O ATOM 2396 N SER 401 -13.284 -14.352 9.108 1.00 22.69 B N ATOM 2397 CA SER 401 -14.566 -14.401 9.786 1.00 23.81 B C ATOM 2398 CB SER 401 -14.375 -14.687 11.269 1.00 25.01 B C ATOM 2399 O SER 401 -15.532 -15.304 11.804 1.00 25.44 B O ATOM 2400 C SER 401 -15.288 -13.080 9.596 1.00 23.85 B C ATOM 2401 C SER 401 -16.508 -13.006 9.696 1.00 23.69 B O ATOM 2402 N ALA 402 -14.523 -12.035 9.310 1.00 25.13 B N ATOM 2403 CA ALA 402 -15.106 -10.795 9.016 1.00 25.64 B C ATOM 2404 CB ALA 402 -14.124 -9.663 9.291 1.00 23.94 B C ATOM 2405 C ALA 402 -15.531 -10.718 7.560 1.00 28.07 B C ATOM 2406 O ALA 902 -16.724 -10.730 7.279 1.00 31.96 B O ATOM 2407 N GLU 403 -14.576 -10.696 6.631 1.00 28.99 B N ATOM 2408 CA GLU 403 -14.920 -10.756 5.204 1.00 29.12 B C ATOM 2409 CB GLU 403 -14.104 -9.769 4.382 1.00 29.99 B C ATOM 2910 CG GLU 403 -13.762 -8.509 5.092 1.00 33.22 B C ATOM 2411 CD GLU 403 -12.300 -8.220 4.979 1.00 36.14 B C ATOM 2912 CE GLU 403 -11.906 -7.640 3.941 1.00 37.63 B 0 ATOM 2913 CE GLU 403 -11.547 -8.589 5.918 1.00 38.88 B 0 ATOM 2414 C GLU 403 -14.652 -12.140 4.657 1.00 27.95 B C ATOM 2415 O GLU 403 -13.554 -12.428 4.180 1.00 26.83 B O ATOM 2416 N PRO 909 -15.661 -13.015 4.719 1.00 26.86 B N ATOM 2417 CD PRO 909 -16.921 -12.782 5.442 1.00 25.89 B C ATOM 2418 CA PRO 404 -15.499 -14.423 4.362 1.00 25.99 B C ATOM 2919 CB PRO 404 -16.769 -15.073 4.911 1.00 25.93 B C ATOM 2420 CG PRO 404 -17.237 -14.135 5.983 1.00 25.26 B C ATOM 2421 C PRO 404 -15.296 -14.682 2.868 1.00 25.55 B C ATOM 2422 C PRO 404 -14.748 -15.718 2.479 1.00 26.48 B O ATOM 2423 N GLU 405 -15.727 -13.747 2.029 1.00 25.09 B N ATOM 2424 CA GLU 405 -15.601 -13.931 0.588 1.00 25.06 B C ATOM 2425 CB GLU 405 -16.583 -13.020 -0.153 1.00 27.09 B C ATOM 2426 CG GLU 405 -18.044 -13.438 -0.031 1.00 29.66 B C ATOM 2427 CD GLU 405 -19.001 -12.496 -0.752 1.00 30.19 B C ATOM 2428 OE GLU 405 -20.212 -12.786 -0.767 1.00 31.61 B O ATOM 2929 OE GLU 405 -18.553 -11.471 -1.303 1.00 30.56 B 0 ATOM 2430 C GLU 405 -14.188 -13.693 0.056 1.00 24.86 B C ATOM 2431 O GLU 405 -13.948 -13.872 -1.132 1.00 24.99 B O ATOM 2932 N LEU 406 -13.256 -13.295 0.922 1.00 24.30 B N

1

ATOM 2433 CA LEU 406 -11.870 -13.043 0.505 1.00 23.76 B C ATOM 2434 CB LEU 406 -11.000 -12.639 1.701 1.00 21.49 B C ATOM 2435 CG LEU 406 -11.111 -11.210 2.222 1.00 20.80 B C ATOM 2436 CD LEU 406 -10.269 -11.069 3.969 1.00 18.92 B C ATOM 2437 CD LEU 406 -10.664 -10.233 1.156 1.00 18.73 B C ATOM 2438 C LEU 406 -11.234 -14.263 -0.146 1.00 23.84 B C ATOM 2439 O LEU 406 -11.275 -15.358 0.411 1.00 25.23 B O ATOM 2440 N THR 407 -10.633 -14.067 -1.315 1.00 23.77 B N ATOM 2941 CA THR 407 -9.781 -15.087 -1.918 1.00 23.47 B C ATOM 2442 CB THR 407 -9.533 -14.794 -3.395 1.00 21.81 B C ATOM 2443 OG THR 407 -8.682 -13.647 -3.517 1.00 23.22 B 0 ATOM 2999 CG THR 407 -10.827 -14.507 -4.089 1.00 19.79 B C ATOM 2445 C THR 407 -8.419 -15.138 -1.213 1.00 24.96 B C ATOM 2446 O THR 407 -8.081 -14.268 -0.399 1.00 26.81 B 0 ATOM 2447 N LEU 408 -7.630 -16.154 -1.535 1.00 24.30 B N ATOM 2448 CA LEU 408 -6.312 -16.292 -0.929 1.00 22.60 B C ATOM 2499 CB LEU 408 -5.678 -17.616 -1.355 1.00 22.93 B C ATOM 2950 CG LEU 408 -4.472 -18.043 -0.525 1.00 24.47 B C ATOM 2951 CD LEU 408 -4.7.34 -17.740 0.940 1.00 23.99 B C ATOM 2452 CD LEU 408 -4.211 -19.529 -0.732 1.00 25.90 B C ATOM 2453 C LEU 408 -5.421 -15.131 -1.344 1.00 20.03 B C ATOM 2454 O LEU 408 -4.552 -14.697 -0.592 1.00 16.95 B O ATOM 2455 N ALA 409 -5.651 -14.636 -2.553 1.00 19.32 B N ATOM 2456 CA ALA 909 -4.906 -13.506 -3.065 1.00 19.43 B C ATOM 2457 CB ALA 909 -5.280 -13.249 -4.499 1.00 20.13 B C ATOM 2458 C ALA 409 -5.248 -12.301 -2.220 1.00 20.61 B C ATOM 2459 O ALA 909 -4.368 -11.579 -1.750 1.00 20.75 B O ATOM 2460 N GLU 410 -6.540 -12.092 -2.012 1.00 21.62 B N ATOM 2961 CA GLU 410 -6.976 -10.967 -1.212 1.00 22.93 B C ATOM 2462 CB GLU 410 -8.480 -10.800 -1.324 1.00 25.38 B C ATOM 2463 CG GLU 410 -8.903 -10.285 -2.661 1.00 30.96 B C ATOM 2464 CD GLU 410 -10.208 -10.888 -3.125 1.00 34.21 B C ATOM 2465 OE GLU 410 -10.441 -10.877 -4.355 1.00 37.17 B O ATOM 2466 OE GLU 410 -10.993 -11.371 -2.269 1.00 35.26 B O ATOM 2467 C GLU 410 -6.583 -11.119 0.247 1.00 22.94 B C ATOM 2468 O GLU 410 -6.332 -10.128 0.925 1.00 23.23 B O ATOM 2469 N LEU 411 -6.532 -12.352 0.738 1.00 22.70 B N

11

ATOM 2470 CA LEU 411 -6.175 -12.552 2.129 1.00 22.90 B C ATOM 2471 CB LEU 411 -6.387 -13.998 2.542 1.00 20.63 B C ATOM 2472 CG LEU 411 -5.995 -14.204 4.009 1.00 20.39 B C ATOM 2473. CD LEU 411 -6.881 -13.338 4.906 1.00 17.47 B C ATOM 2474 CD LEU 411 -6.123 -15.670 4.375 1.00 18.76 B C ATOM 2475 C LEU 411 -4.722 -12.174 2.373 1.00 24.89 B C ATOM 2476 O LEU 411 -4.369 -11.657 3.438 1.00 24.07 B O ATOM 2477 N ARG 412 -3.877 -12.438 1.383 1.00 27.02 B N ATOM 2978 CA ARG 412 -2.471 -12.099 1.996 1.00 29.77 B C ATOM 2479 CB ARG 412 -1.683 -12.716 0.354 1.00 30.56 B C ATOM 2480 CG ARG 412 -1.384 -19.172 0.527 1.00 32.41 B C ATOM 2481 CD ARG 412 -0.517 -14.632 -0.620 1.00 36.01 B C ATOM 2482 NE ARG 412 0.598 -15.444 -0.152 1.00 38.01 B N ATOM 2983 CZ ARG 412 0.587 -16.768 -0.136 1.00 38.92 B C ATOM 2484 NH ARG 412 1.643 -17.437 0.308 1.00 38.83 B N ATOM 2485 NH ARG 412 -0.485 -17.418 -0.569 1.00 38.86 B N ATOM 2486 C ARG 412 -2.327 -10.599 1.436 1.00 30.73 B C ATOM 2487 O ARG 412 -1.628 -9.994 2.248 1.00 30.38 B O ATOM 2488 N GLN 413 -3.004 -10.005 0.461 1.00 33.11 B N ATOM 2989 CA GLN 413 -2.895 -8.581 0.221 1.00 35.39 B C ATOM 2490 CB GLN 413 3.779 8.176 -0.948 1.00 38.60 B C ATOM 2991 CG GLN 413 -3.344 -6.875 -1.596 1.00 45.86 B C ATOM 2992 CD GLN 413 -1.860 -6.872 -1.965 1.00 49.77 B C ATOM 2493 OE GLN 413 -1.485 -7.150 -3.115 1.00 52.54 B 0 ATOM 2494 NE GLN 413 -1.008 -6.552 -0.989 1.00 49.77 B N ATOM 2495 C GLN 413 -3.301 -7.805 1.456 1.00 35.24 B C ATOM 2996 O GLN 413 -2.824 -6.696 1.682 1.00 36.99 B 0 ATOM 2497 N ARG 414 -4.175 -8.405 2.256 1.00 35.12 B N ATOM 2498 CA ARG 414 -4.643 -7.806 3.500 1.00 34.96 B C ATOM 2499 CB ARG 414 -5.975 -8.422 3.901 1.00 36.59 B C ATOM 2500 CG ARG 414 -7.128 -7.989 3.043 1.00 39.95 B C ATOM 2501 CD ARG 414 -8.229 -7.397 3.892 1.00 42.16 B C ATOM 2502 NE ARG 414 -9.264 -6.704 3.125 1.00 44.38 B N ATOM 2503 CZ ARG 414 -9.560 -6.929 1.846 1.00 46.36 B C ATOM 2504 NH ARG 414 -8.909 -7.835 1.136 1.00 48.71 B N ATOM 2505 NH ARG 414 -10.541 -6.251 1.274 1.00 47.81 B N ATOM 2506 C ARG 414 -3.657 -7.972 4.646 1.00 34.00 B C

12

ATOM 2507 0 ARG 414 -3.252 -6.992 5.270 1.00 34.78 B O ATOM 2508 N LEU 415 -3.278 -9.211 4.931 1.00 32.40 B N ATOM 2509 CA LEU 415 -2.233 -9.466 5.912 1.00 31.47 B C ATOM 2510 CB LEU 415 -1.689 -10.873 5.748 1.00 31.21 B C ATOM 2511 CG LEU 415 -2.574 -11.951 6.346 1.00 31.92 B C ATOM 2512 CD LEU 415 -2.230 -13.274 5.697 1.00 33.02 B C ATOM 2513 CD LEU 415 -2.395 -11.990 7.862 1.00 30.21 B C ATOM 2514 C LEU 415 -1.091 -8.479 5.750 1.00 31.04 B C ATOM 2515 O LEU 415 -0.679 -7.823 6.711 1.00 31.86 B 0 ATOM 2516 N ILE 416 -0.580 -8.380 4.530 1.00 29.96 B N ATOM 2517 CA ILE 416 0.423 -7.378 4.230 1.00 30.82 B C ATOM 2518 CB ILE 416 0.655 -7.241 2.716 1.00 30.83 B C ATOM 2519 CG ILE 416 1.444 -5.977 2.434 1.00 29.81 B C ATOM 2520 CG ILE 416 1.374 -8.480 2.178 1.00 29.19 B C ATOM 2521 CD ILE 416 1.488 -8.503 0.678 1.00 25.78 B C ATOM 2522 C ILE 416 -0.046 -6.031 4.743 1.00 30.89 B C ATOM 2523 O ILE 416 0.545 -5.459 5.663 1.00 31.33 B O ATOM 2524 N HIS 417 -1.130 -5.548 4.145 1.00 31.24 B N ATOM 2525 CA HIS 417 -1.556 -4.166 4.300 1.00 30.14 B C ATOM 2526 CB HIS 417 -2.812 -3.907 3.969 1.00 30.66 B C ATOM 2527 CG HIS 417 -3.393 -2.548 3.679 1.00 32.44 B C ATOM 2528 CD HIS 417 -2.908 -1.318 3.388 1.00 33.19 B C ATOM 2529 ND HIS 417 -4.597 -2.345 4.319 1.00 31.59 B N ATOM 2530 CE HIS 417 -4.828 -1.048 9.917 1.00 32.26 B C ATOM 2531 NE HIS 417 -3.818 -0.403 3.860 1.00 33.69 B N ATOM 2532 C HIS 417 -1.811 -3.789 5.750 1.00 29.15 B C ATOM 2533 O HIS 417 -1.646 -2.629 6.122 1.00 29.16 B O ATOM 2534 N PHE 418 -2.210 -4.761 6.568 1.00 27.70 B N ATOM 2535 CA PHE 418 -2.394 -4.512 7.992 1.00 27.83 B C ATOM 2536 CB PHE 418 -3.595 -5.285 8.534 1.00 28.70 B C ATOM 2537 CG PHE 418 -4.895 -4.754 8.058 1.00 29.85 B C ATOM 2538 CD PHE 418 -5.677 -5.485 7.185 1.00 29.88 B C ATOM 2539 CD PHE 418 -5.285 -3.473 8.393 1.00 30.40 B C ATOM 2590 CE PHE 418 -6.822 -4.945 6.651 1.00 29.59 B C ATOM 2591 CE PHE 418 -6.426 -2.929 7.863 1.00 31.18 B C ATOM 2592 CZ PHE 418 -7.195 -3.661 6.986 1.00 30.31 B C ATOM 2593 C PHE 418 -1.164 -4.884 8.777 1.00 27.12 B C

1

ATOM 2544 O PHE 418 -1.177 -4.895 10.005 1.00 26.90 B O ATOM 2545 N SER 419 -0.094 -5.201 8.070 1.00 26.74 B N ATOM 2546 CA SER 419 1.154 -5.463 8.748 1.00 26.69 B C ATOM 2547 CB SER 419 2.006 -6.431 7.933 1.00 25.86 B C ATOM 2548 OG SER 419 1.593 -7.759 8.188 1.00 25.35 B 0 ATOM 2599 C SER 419 1.905 -4.165 8.983 1.00 26.68 B C ATOM 2550 O SER 419 1.879 -3.262 8.144 1.00 26.77 B O ATOM 2551 N ALA 420 2.544 -4.079 10.147 1.00 25.25 B N ATOM 2552 CA ALA 420 3.559 -3.072 10.412 1.00 24.13 B C ATOM 2553 CB ALA 420 4.069 -3.215 11.816 1.00 24.79 B C ATOM 2554 C ALA 420 4.675 3.321 -9.439 3.00 -29:87 -ATOM 2555 O ALA 420 5.089 -4.466 9.238 1.00 26.34 B C ATOM 2556 N LYS 421 5.172 -2.252 8.838 1.00 24.32 B O N ATOM 2557 CA LYS 421 6.132 -2.383 7.760 1.00 25.67 B C ATOM 2558 CB LYS 421 5.557 -1.747 6.497 1.00 23.67 B C ATOM 2559 CG LYS 421 4.124 -2.161 6.249 1.00 23.87 B C ATOM 2560 CD LYS 421 3.716 -2.007 4.797 1.00 23.84 B C ATOM 2561 CE LYS 421 2.331 -2.614 4.550 1.00 23.52 B C ATOM 2562 NZ LYS 421 1.363 -2.280 5.638 1.00 22.85 B N ATOM 2563 C LYS 421 7.468 -1.743 8.125 1.00 27.41 B C ATOM 2564 O LYS 421 7.510 -0.712 8.798 1.00 28.11 B O ATOM 2565 N ASP 422 8.562 -2.361 7.691 1.00 28.06 B N ATOM 2566 CA ASP 422 9.873 -1.745 7.844 1.00 27.60 B C ATOM 2567 CB ASP 422 9.979 -0.503 6.955 1.00 26.92 B C ATOM 2568 CG ASP 422 10.080 -0.856 5.489 1.00 28.56 B C ATOM 2569 OD ASP 422 10.866 -1.768 5.161 1.00 28.83 B 0 ATOM 2570 OD ASP 422 9.381 -0.234 4.663 1.00 29.17 B O ATOM 2571 C ASP 422 10.124 -1.368 9.296 1.00 26.84 B C ATOM 2572 O ASP 422 10.463 -0.227 9.607 1.00 26.99 B O ATOM 2573 N VAL 423 9.944 -2.335 10.182 1.00 25.89 B N ATOM 2574 CA VAL 423 10.196 -2.100 11.599 1.00 26.20 B C ATOM 2575 CB VAL 923 8.831 -2.292 12.396 1.00 27.67 B C ATOM 2576 CG VAL 923 7.775 -1.320 11.900 1.00 27.74 B C ATOM 2577 CG VAL 423 8.331 -3.723 12.240 1.00 28.31 B C ATOM 2578 C VAL 423 11.158 -3.110 12.075 1.00 25.50 B C ATOM 2579 O VAL 423 11.697 -3.006 13.168 1.00 25.97 B 0

14

ATOM 2580 N ILE 424 11.415 -4.101 11.239 1.00 25.87 B N ATOM 2581 CA ILE 929 12.307 -5.171 11.630 1.00 26.65 B C ATOM 2582 CB ILE 424 11.960 -6.471 10.893 1.00 26.26 B C ATOM 2583 CG ILE 424 12.495 -7.652 11.674 1.00 27.62 B C ATOM 2584 CG ILE 424 10.446 -6.635 10.784 1.00 27.06 B C ATOM 2585 CD ILE 929 10.016 -7.957 10.169 1.00 26.12 B C ATOM 2586 C ILE 929 13.759 -4.800 11.329 1.00 27.01 B C ATOM 2587 O ILE 929 14.072 -4.233 10.274 1.00 26.17 B 0 ATOM 2588 N ASN 425 14.642 -5.128 12.268 1.00 28.05 B N ATOM 2589 CA ASN 425 16.065 -4.869 12.107 1.00 29.38 B C ATOM 2590 CB ASN 425 16.741 -4.831 13.475 1.00 31.69 B C ATOM 2591 CG ASN 425 18.215 -4.485 13.385 1.00 34.14 B C ATOM 2592 OD ASN 425 18.782 -4.397 12.292 1.00 35.11 B O ATOM 2593 ND ASN 425 18.846 -4.287 14.538 1.00 34.72 B N ATOM 2594 C ASN 425 16.729 -5.933 11.241 1.00 28.62 B C ATOM 2595 O ASN 425 16.973 -7.045 11.697 1.00 29.23 B O ATOM 2596 N GLU 426 17.038 -5.576 10.001 1.00 28.49 B N ATOM 2597 CA GLU 426 17.513 -6.536 9.015 1.00 29.63 B C ATOM 2598 CB GLU 426 17.266 -5.985 7.624 1.00 31.63 B C ATOM 2599 CG GLU 426 15.815 -5.841 7.266 1.00 35.09 B C ATOM 2600 CD GLU 426 15.653 -5.209 5.905 1.00 38.74 B C ATOM 2601 OE GLU 426 19.589 -5.376 5.271 1.00 41.88 B O ATOM 2602 OE GLU 426 16.615 -4.591 5.466 1.00 40.95 B O ATOM 2603 C GLU 426 18.991 -6.913 9.148 1.00 29.25 B C ATOM 2604 O GLU 426 19.488 -7.779 8.432 1.00 28.10 B O ATOM 2605 N ALA 427 19.688 -6.258 10.065 1.00 30.10 B N ATOM 2606 CA ALA 427 21.111 -6.486 10.263 1.00 29.38 B C ATOM 2607 CB ALA 427 21.607 -5.637 11.417 1.00 28.99 B C ATOM 2608 C ALA 427 21.426 -7.947 10.525 1.00 29.99 B C ATOM 2609 O ALA 427 22.500 -8.422 10.165 1.00 29.35 B O ATOM 2610 N TRP 428 20.497 -8.661 11.153 1.00 31.00 B N ATOM 2611 CA TRP 428 20.745 -10.045 11.540 1.00 31.86 B C ATOM 2612 CB TRP 428 19.724 -10.484 12.597 1.00 39.20 B C ATOM 2613 CG TRP 428 20.016 -11.842 13.223 1.00 37.61 B C ATOM 2614 CD TRP 428 19.340 -13.084 12.952 1.00 39.01 B C ATOM 2615 CE TRP 428 19.939 -14.073 13.767 1.00 40.16 B C ATOM 2616 CE TRP 428 18.287 -13.452 12.106 1.00 38.02 B C

1

ATOM 2617 CD TRP 428 20.973 -12.129 14.161 1.00 38.36 B C ATOM 2618 NE TRP 428 20.932 -13.467 14.491 1.00 38.65 B N ATOM 2619 CZ TRP 428 19.521 -15.409 13.750 1.00 40.19 B C ATOM 2620 CZ TRP 428 17.875 -14.776 12.092 1.00 38.79 B C ATOM 2621 CH TRP 428 18.487 -15.737 12.911 1.00 39.60 B C ATOM 2622 C TRP 428 20.731 -11.020 10.353 1.00 31.48 B C ATOM 2623 O TRP 428 21.473 -12.003 10.346 1.00 31.38 B 0 ATOM 2624 N PHE 429 19.898 -10.763 9.348 1.00 31.09 B N ATOM 2625 CA PHE 429 19.884 -11.621 8.167 1.00 31.73 B C ATOM 2626 CB PHE 429 18.752 -11.254 7.220 1.00 31.93 B C ATOM 2627 CG PHE 429 17.416 -11.186 7.876 1.00 33.61 B C ATOM 2628 CD PHE 429 16.565 -10.120 7.621 1.00 32.81 B C ATOM 2629 CD PHE 429 17.011 -12.182 8.753 1.00 31.99 B C ATOM 2630 CE PHE 429 15.341 -10.047 8.233 1.00 33.79 B C ATOM 2631 CE PHE 429 15.789 -12.116 9.367 1.00 32.86 B C ATOM 2632 CZ PHE 429 14.946 -11.046 9.108 1.00 33.20 B C ATOM 2633 C PHE 429 21.179 -11.428 7.421 1.00 33.05 B C ATOM 2634 O PHE 429 21.792 -10.366 7.504 1.00 34.48 B 0 ATOM 2635 N PRO 430 21.610 -12.444 6.662 1.00 33.68 B N ATOM 2636 CD PRO 430 21.130 -13.829 6.543 1.00 34.28 B C ATOM 2637 CA PRO 430 22.700 -12.155 5.736 1.00 34.21 B C ATOM 2638 CB PRO 430 22.977 -13.501 5.066 1.00 33.97 B C ATOM 2639 CG PRO 430 21.737 -14.282 5.249 1.00 34.13 B C ATOM 2640 C PRO 430 22.294 -11.058 4.750 1.00 35.03 B C ATOM 2641 O PRO 430 21.112 -10.832 4.497 1.00 35.24 B O ATOM 2642 N GLU 431 23.293 -10.368 4.214 1.00 36.46 B N ATOM 2643 CA GLU 431 23.079 -9.141 3.475 1.00 36.94 B C ATOM 2699 CB GLU 431 24.409 -8.645 2.928 1.00 38.04 B C ATOM 2645 CG GLU 431 25.515 -8.637 3.950 1.00 39.87 B C ATOM 2646 CD GLU 431 26.828 -8.187 3.358 1.00 42.43 B C ATOM 2647 OE GLU 431 26.842 -7.845 2.152 1.00 42.43 B O ATOM 2648 OE GLU 431 27.842 -8.171 4.098 1.00 43.52 B O ATOM 2649 C GLU 431 22.125 -9.379 2.328 1.00 37.62 B C ATOM 2650 O GLU 431 21.094 -8.710 2.205 1.00 38.50 B 0 ATOM 2651 N ASP 432 22.478 -10.327 1.482 1.00 37.53 B N ATOM 2652 CA ASP 432 21.711 -10.562 0.280 1.00 37.71 B C ATOM 2653 CB ASP 432 22.396 -11.627 -0.560 1.00 41.08 B C

1

ATOM 2659 CG ASP 432 23.813 -11.258 -0.898 1.00 43.1 B C ATOM 2655 OD ASP 432 24.061 -10.058 -1.196 1.00 45.6 B 0 ATOM 2656 OD ASP 432 24.675 -12.159 -0.909 1.00 44.7 B 0 ATOM 2657 C ASP 432 20.290 -10.982 0.598 1.00 35.7 B C ATOM 2658 O ASP 432 19.910 -10.932 -0.264 1.00 37.1 B O ATOM 2659 N GLN 433 20.060 -11.395 1.835 1.00 2.85 B N ATOM 2660 CA GLN 433 18.749 -11.887 2.205 1.00 1.54 B C ATOM 2661 CB GLN 433 18.879 -12.932 3.305 1.00 9.75 B C ATOM 2662 CG GLN 433 19.423 -14.245 2.794 1.00 8.29 B C ATOM 2663 CD GLN 433 18.459 -14.955 1.850 1.00 6.47 B C ATOM 2669 OE GLN 433 18.828 -15.919 1.184 1.00 4.27 B O ATOM 2665 NE GLN 433 17.221 -14.481 1.794 1.00 6.30 B N ATOM 2666 C GLN 433 17.823 -10.769 2.645 1.00 1.04 B C ATOM 2667 O GLN 433 16.623 -10.974 2.805 1.00 2.65 B 0 ATOM 2668 N ARG 434 18.373 -9.576 2.819 1.00 0.10 B N ATOM 2669 CA ARG 434 17.588 -8.474 3.343 1.00 8.71 B C ATOM 2670 CB ARG 434 18.518 -7.369 3.845 1.00 9.04 B C ATOM 2671 CG ARG 434 19.390 -7.826 5.012 1.00 8.41 B C ATOM 2672 CD ARG 939 20.174 -6.695 5.646 1.00 6.84 B C ATOM 2673 NE ARG 434 21.266 -7.222 6.459 1.00 7.43 B N ATOM 2674 CZ ARG 434 22.538 -6.869 6.315 1.00 5.70 B C ATOM 2675 NH ARG 434 23.973 -7.399 7.088 1.00 3.11 B N ATOM 2676 NH ARG 434 22.869 -5.978 5.398 1.00 5.28 B N ATOM 2677 C ARG 434 16.569 -7.912 2.361 1.00 7.60 B C ATOM 2678 O ARG 434 15.431 -7.664 2.747 1.00 7.25 B O ATOM 2679 N VAL 435 16.951 -7.711 1.101 1.00 7.74 B N ATOM 2680 CA VAL 435 15.975 -7.213 0.128 1.00 7.86 B C ATOM 2681 CB VAL 435 16.599 -6.710 -1.199 1.00 6.45 B C ATOM 2682 CG VAL 435 17.515 -5.597 -0.943 1.00 7.10 B C ATOM 2683 CG VAL 435 17.315 -7.832 -1.890 1.00 7.00 B C ATOM 2689 C VAL 435 14.992 -8.302 -0.237 1.00 8.30 B C ATOM 2685 O VAL 435 13.890 -8.011 -0.709 1.00 0.16 B O ATOM 2686 N LEU 436 15.389 -9.554 -0.022 1.00 7.85 B N ATOM 2687 CA LEU 436 14.511 -10.686 -0.307 1.00 7.26 B C ATOM 2688 CB LEU 436 15.312 -11.975 -0.467 1.00 7.16 B C ATOM 2689 CG LEU 936 16.446 -12.004 -1.478 1.00 5.55 B C ATOM 2690 CD LEU 936 16.995 -13.421 -1.511 1.00 4.68 B C

1

ATOM 2691 CD LEU 436 15.952 -11.565 -2.849 1.00 22.51 B C ATOM 2692 C LEU 436 13.500 -10.894 0.808 1.00 27.27 B C ATOM 2693 O LEU 936 12.351 -11.262 0.551 1.00 28.79 B O ATOM 2694 N THR 437 13.936 -10.675 2.046 1.00 25.82 B N ATOM 2695 CA THR 937 13.075 -10.904 3.199 1.00 23.86 B C ATOM 2696 CB THR 437 13.887 -11.073 4.494 1.00 23.41 B C ATOM 2697 OG THR 937 14.782 -12.185 4.362 1.00 23.12 B O ATOM 2698 CG THR 437 12.949 -11.313 5.668 1.00 22.10 B C ATOM 2699 C THR 937 12.090 -9.759 3.397 1.00 22.78 B C ATOM 2700 O THR 437 12.464 -8.589 3.392 1.00 22.51 B 0 ATOM 2701 N PRO 438 10.807 -10.095 3.566 1.00 23.25 B N ATOM 2702 CD PRO 438 10.282 -11.469 3.511 1.00 24.11 B C ATOM 2703 CA PRO 438 9.731 -9.118 3.742 1.00 22.75 B C ATOM 2704 CB PRO 438 8.453 -9.957 3.639 1.00 23.28 B C ATOM 2705 CG PRO 438 8.880 -11.258 3.049 1.00 23.27 B C ATOM 2706 C PRO 438 9.847 -8.448 5.099 1.00 21.97 B C ATOM 2707 O PRO 438 9.940 -9.124 6.125 1.00 19.45 B O ATOM 2708 N ASN 939 9.837 -7.121 5.103 1.00 22.81 B N ATOM 2709 CA ASN 439 9.866 -6.388 6.353 1.00 23.40 B C ATOM 2710 CB ASN 439 10.627 -5.085 6.168 1.00 23.33 B C ATOM 2711 CG ASN 439 11.355 -4.657 7.924 1.00 25.22 B C ATOM 2712 OD ASN 439 10.869 -4.854 8.538 1.00 26.16 B O ATOM 2713 ND ASN 939 12.533 -4.066 7.252 1.00 24.91 B N ATOM 2714 C ASN 439 8.434 -6.118 6.820 1.00 24.31 B C ATOM 2715 O ASN 439 7.949 -4.983 6.781 1.00 25.14 B O ATOM 2716 N LEU 440 7.771 -7.186 7.256 1.00 24.30 B N ATOM 2717 CA LEU 440 6.378 -7.195 7.690 1.00 25.09 B C ATOM 2718 CB LEU 440 5.470 -7.703 6.589 1.00 23.69 B C ATOM 2719 CG LEU 440 5.503 -6.977 5.247 1.00 24.08 B C ATOM 2720 CD LEU 440 4.757 -7.796 4.220 1.00 21.26 B C ATOM 2721 CD LEU 440 4.883 -5.584 5.401 1.00 23.50 B C ATOM 2722 C LEU 440 6.163 -7.965 8.966 1.00 25.32 B C ATOM 2723 O LEU 440 6.447 -9.164 9.007 1.00 24.66 B 0 ATOM 2724 N VAL 441 5.647 -7.323 10.006 1.00 25.82 B N ATOM 2725 CA VAL 441 5.096 -8.067 11.128 1.00 25.14 B C ATOM 2726 CB VAL 441 5.633 -7.548 12.479 1.00 23.66 B C ATOM 2727 CG VAL 441 5.249 -8.500 13.580 1.00 21.33 B C

1

ATOM 2728 CG 441 7.139 -7.385 12.421 1.00 23.17 C ATOM 2729 C 441 3.581 -7.889 11.083 1.00 26.87 C ATOM 2730 O 441 3.078 -6.806 10.773 1.00 28.65 O ATOM 2731 N 492 2.851 -8.953 11.384 1.00 26.88 N ATOM 2732 CA 442 1.415 -8.952 11.179 1.00 27.49 C ATOM 2733 CB 442 0.938 -10.369 10.972 1.00 27.89 C ATOM 2734 C 442 0.648 -8.313 12.329 1.00 28.01 C ATOM 2735 O 442 0.863 -8.649 13.490 1.00 27.44 0 ATOM 2736 N 993 -0.260 -7.399 11.996 1.00 29.53 N ATOM 2737 CA 443 -1.259 -6.929 12.950 1.00 29.76 C ATOM 2738 CB 443 -1.135 -5.433 13.149 1.00 28.70 C ATOM 2739 C 443 -2.662 -7.265 12.467 1.00 30.98 C ATOM 2740 O 993 -2.873 -7.532 11.282 1.00 30.38 0 ATOM 2741 N 444 -3.610 -7.253 13.402 1.00 32.91 N ATOM 2742 CA 444 -5.037 -7.307 13.095 1.00 33.56 C ATOM 2743 CB 444 -5.841 -7.636 14.348 1.00 29.03 C ATOM 2749 CG 444 -5.624 -8.983 15.021 1.00 26.74 C ATOM 2745 CD 444 -6.078 -8.902 16.462 1.00 24.31 C ATOM 2746 CD 444 -6.383 -10.061 14.269 1.00 25.72 C ATOM 2747 C 444 -5.503 -5.958 12.565 1.00 37.13 C ATOM 2748 O 444 -4.915 -4.914 12.869 1.00 36.31 O ATOM 2749 N 995 -6.578 -5.967 11.766 1.00 40.64 N ATOM 2750 CD 445 -7.291 -7.151 11.267 1.00 40.97 C ATOM 2751 CA 995 -7.138 -4.733 11.216 1.00 43.51 C ATOM 2752 CB 995 -8.215 -5.217 10.252 1.00 41.99 C ATOM 2753 CG 995 -7.890 -6.645 9.998 1.00 41.69 C ATOM 2754 C 445 -7.727 -3.918 12.343 1.00 47.02 C ATOM 2755 O 445 -8.502 -4.429 13.149 1.00 47.30 0 ATOM 2756 N 996 -7.357 -2.637 12.422 1.00 50.39 N ATOM 2757 CD 996 -6.431 -1.908 11.538 1.00 52.20 C ATOM 2758 CA 996 -7.984 -1.768 13.418 1.00 52.13 C ATOM 2759 CB 996 -7.269 -0.429 13.234 1.00 52.77 C ATOM 2760 CG 996 -6.736 -0.467 11.633 1.00 53.26 C ATOM 2761 C 996 -9.471 -1.691 13.117 1.00 52.85 C ATOM 2762 O 446 -10.279 -1.732 14.075 1.00 53.37 O ATOM 2763 OX 446 -9.793 -1.603 11.911 1.00 53.26 0 TER 2769 446

1

ATOM 2765 CB 294 -8.672 -12.634 38.449 1.00 44.50 EGFA C ATOM 2766 O 294 -8.921 -13.914 39.043 1.00 46.09 EGFA O ATOM 2767 CG 294 -9.367 -12.555 37.098 1.00 44.95 EGFA C ATOM 2768 C 294 -6.483 -13.598 37.580 1.00 42.73 EGFA C ATOM 2769 O 294 -6.465 -14.703 38.105 1.00 42.87 EGFA O ATOM 2770 N 294 -6.854 -11.126 37.620 1.00 43.75 EGFA N ATOM 2771 CA 294 -7.135 -12.410 38.303 1.00 43.33 EGFA C ATOM 2772 N 295 -5.945 -13.381 36.380 1.00 40.79 EGFA N ATOM 2773 CA 295 -5.062 -14.384 35.774 1.00 38.54 EGFA C. ATOM 2774 CB 295 -5.516 -14.783 34.369 1.00 38.56 EGFA C ATOM 2775 CG 295 -4.655 -15.897 33.767 1.00 38.98 EGFA C ATOM 2776 O 295 -3.455 -15.979 34.023 1.00 39.16 EGFA O ATOM 2777 N 295 -5.271 -16.757 32.961 1.00 39.03 EGFA N ATOM 2778 C 295 -3.656 -13.823 35.711 1.00 37.61 EGFA C ATOM 2779 O 295 -3.211 -13.284 34.693 1.00 35.61 EGFA O ATOM 2780 N 296 -2.965 -13.993 36.828 1.00 36.47 EGFA N ATOM 2781 CA 296 -1.734 -13.293 37.119 1.00 36.71 EGFA C ATOM 2782 CB 296 -1.337 -13.587 -38.574 1.00 35.44 - EGFA C ATOM 2783 CG 296 -2.292 -12.988 39.619 1.00 33.45 EGFA C ATOM 2789 CD 296 -3.482 -13.882 39.915 1.00 35.35 EGFA C ATOM 2785 OE 296 -3.596 -14.933 39.248 1.00 35.30 EGFA O ATOM 2786 OE 296 -4.300 -13.540 40.804 1.00 33.34 EGFA O ATOM 2787 C 296 -0.588 -13.628 36.151 1.00 36.70 EGFA C ATOM 2788 O 296 0.499 -13.060 36.244 1.00 36.33 EGFA 0 ATOM 2789 N 297 -0.838 -14.530 35.207 1.00 36.97 EGFA N ATOM 2790 CA 297 0.228 -15.025 34.351 1.00 37.51 EGFA C ATOM 2791 C 297 0.233 -14.447 32.972 1.00 37.46 EGFA C ATOM 2792 0 297 1.110 -14.750 32.177 1.00 36.37 EGFA O ATOM 2793 CB 297 0.151 -16.521 34.243 1.00 38.66 EGFA C ATOM 2799 SG 297 0.339 -17.282 35.863 1.00 41.23 EGFA S ATOM 2795 N 298 -0.759 -13.620 32.688 1.00 38.90 EGFA N ATOM 2796 CA 298 -0.761 -12.827 31.478 1.00 38.94 EGFA C ATOM 2797 CB 298 -2.174 -12.332 31.205 1.00 38.48 EGFA C ATOM 2798 CG 298 -3.084 -13.516 30.877 1.00 39.20 EGFA C ATOM 2799 CD 298 -4.519 -13.178 31.222 1.00 38.76 EGFA C ATOM 2800 CD 298 -2.920 -13.890 29.400 1.00 37.53 EGFA C ATOM 2801 C 298 0.202 -11.667 31.660 1.00 40.24 EGFA C

2

ATOM 2802 O 298 0.430 -10.878 30.742 1.00 0.91 EGFA O ATOM 2803 N 299 0.781 -11.567 32.851 1.00 0.63 EGFA N ATOM 2804 CA 299 1.885 -10.648 33.038 1.00 1.29 EGFA C ATOM 2905 CB 299 1.615 -9.716 34.207 1.00 5.11 EGFA C ATOM 2806 CG 299 2.450 -8.461 34.133 1.00 8.48 EGFA C ATOM 2807 OD 299 2.944 -8.005 35.182 1.00 1.40 EGFA O ATOM 2808 OD 299 2.613 -7.931 33.013 1.00 0.27 EGFA 0 ATOM 2809 C 299 3.199 -11.374 33.265 1.00 0.06 EGFA C ATOM 2810 O 299 3.518 -11.759 34.383 1.00 9.62 EGFA 0 ATOM 2811 N 300 3.952 -11.557 32.187 1.00 38.77 EGFA N ATOM 2812 CA 300 5.278 -12.140 32.257 1.00 38.83 EGFA C ATOM 2813 CB 300 6.187 -11.246 33.093 1.00 40.88 EGFA C ATOM 2814 CG 300 7.613 -11.245 32.593 1.00 43.06 EGFA C ATOM 2815 OD 300 8.562 -11.252 33.378 1.00 43.69 EGFA O ATOM 2816 ND 300 7.775 -11.234 31.273 1.00 44.81 EGFA N ATOM 2817 C 300 5.256 -13.547 32.843 1.00 38.88 EGFA C ATOM 2818 O 300 6.235 -13.997 33.448 1.00 38.75 EGFA O ATOM 2819 N 301 4.136 -14.238 32.661 1.00 38.27 EGFA N ATOM 2820 CA 301 3.977 -15.602 33.153 1.00 38.98 EGFA C ATOM 2821 CB 301 5.029 -16.514 32.524 1.00 38.60 EGFA C ATOM 2822 CG 301 4.603 -17.965 32.508 1.00 39.84 EGFA C ATOM 2823 OD 301 3.431 -18.277 32.280 1.00 39.37 EGFA O ATOM 2824 ND 301 5.554 -18.866 32.748 1.00 39.66 EGFA N ATOM 2825 C 301 4.091 -15.648 34.676 1.00 39.19 EGFA C ATOM 2826 O 301 4.368 -16.697 35.265 1.00 38.65 EGFA O ATOM 2827 N 302 3.874 -14.496 35.305 1.00 38.94 EGFA N ATOM 2828 CA 302 3.929 -14.420 36.752 1.00 39.47 EGFA C ATOM 2829 C 302 5.356 -14.384 37.255 1.00 39.98 EGFA C ATOM 2830 O 302 5.620 -14.710 38.408 1.00 40.36 EGFA O ATOM 2831 N 303 6.277 -13.993 36.381 1.00 40.10 EGFA N ATOM 2832 CA 303 7.674 -13.946 36.756 1.00 41.13 EGFA C ATOM 2833 C 303 8.255 -15.337 36.912 1.00 41.77 EGFA C ATOM 2834 O 303 9.411 -15.490 37.318 1.00 43.49 EGFA O ATOM 2835 N 304 7.998 -16.347 36.582 1.00 41.53 EGFA N ATOM 2836 CA 304 7.819 -17.757 36.718 1.00 39.56 EGFA C ATOM 2837 C 304 8.848 -18.175 35.670 1.00 38.81 EGFA C ATOM 2838 O 304 8.667 -17.908 34.483 1.00 39.26 EGFA O

21

ATOM 2839 CB CYS 304 6.579 -18.636 36.564 1.00 38.73 EGFA C ATOM 2840 SG CYS 304 5.347 -18.962 37.890 1.00 37.07 EGFA S ATOM 2841 N SER 305 9.917 -18.843 36.093 1.00 37.94 EGFA N ATOM 2842 CA SER 305 10.966 -19.202 35.149 1.00 36.26 EGFA C ATOM 2843 CB SER 305 12.152 -19.862 35.870 1.00 34.90 EGFA C ATOM 2849 OG SER 305 11.790 -21.060 36.529 1.00 33.63 EGFA O ATOM 2845 C SER 305 10.398 -20.142 34.094 1.00 36.04 EGFA C ATOM 2846 O SER 305 10.667 -19.985 32.904 1.00 35.42 EGFA O ATOM 2847 N HIS 306 9.598 -21.105 34.547 1.00 36.85 EGFA N ATOM 2848 CA HIS 306 9.060 -22.156 33.689 1.00 36.68 EGFA C ATOM 2849 CB HIS 306 9.468 -23.524 34.237 1.00 37.58 EGFA C ATOM 2850 CG HIS 306 10.931 -23.805 34.109 1.00 38.79 EGFA C ATOM 2851 CD HIS 306 12.012 -23.054 34.423 1.00 38.86 EGFA C ATOM 2852 ND HIS 306 11.420 -24.974 33.567 1.00 39.47 EGFA N ATOM 2853 CE HIS 306 12.739 -24.929 33.550 1.00 39.63 EGFA C ATOM 2854 NE HIS 306 13.124 -23.774 , 34.064 1.00 39.05 EGFA N ATOM 2855 C HIS 306 7.541 -22.080 33.566 1.00 36.61 EGFA C ATOM 2856 O HIS 306 7.014 -21.231 32.842 1.00 36.74 EGFA O ATOM 2857 N VAL 307 6.839 -22.967 34.271 1.00 36.53 EGFA N ATOM 2858 CA VAL 307 5.381 -22.965 34.252 1.00 36.68 EGFA C ATOM 2859 CB VAL 307 4.793 -24.385 34.359 1.00 36.53 EGFA C ATOM 2860 CG VAL 307 3.271 -24.316 34.440 1.00 33.02 EGFA C ATOM 2861 CG VAL 307 5.210 -25.204 33.153 1.00 36.84 EGFA C ATOM 2862 C VAL 307 4.785 -22.135 35.370 1.00 37.94 EGFA C ATOM 2863 O VAL 307 5.269 -22.193 36.505 1.00 36.79 EGFA O ATOM 2864 N CYS 308 3.726 -21.413 35.019 1.00 40.08 EGFA N ATOM 2865 CA CYS 308 2.902 -20.690 35.978 1.00 41.42 EGFA C ATOM 2866 C CYS 308 1.562 -21.425 36.159 1.00 41.00 EGFA C ATOM 2867 O CYS 308 1.026 -22.009 35.211 1.00 40.92 EGFA O ATOM 2868 CB CYS 308 2.585 -19.294 35.465 1.00 42.46 EGFA C ATOM 2869 SG CYS 308 0.778 -19.184 35.372 1.00 49.21 EGFA S ATOM 2870 N ASN 309 1.016 -21.369 37.371 1.00 40.41 EGFA N ATOM 2871 CA ASN 309 -0.305 -21.909 37.647 1.00 39.28 EGFA C ATOM 2872 CB ASN 309 -0.193 -23.037 38.661 1.00 37.87 EGFA C ATOM 2873 CG ASN 309 -1.511 -23.706 38.923 1.00 37.08 EGFA C ATOM 2874 OD ASN 309 -2.383 -23.738 38.061 1.00 37.19 EGFA O ATOM 2875 ND ASN 309 -1.667 -24.249 40.116 1.00 38.27 EGFA N

22

ATOM 2876 C ASN 309 -1.244 -20.825 38.181 1.00 40.43 EGFA C ATOM 2977 O ASN 309 -1.025 -20.272 39.260 1.00 41.33 EGFA O ATOM 2878 N ASP 310 -2.291 -20.529 37.417 1.00 41.20 EGFA N ATOM 2879 CA ASP 310 -3.285 -19.531 37.801 1.00 40.90 EGFA C ATOM 2880 CB ASP 310 -4.013 -19.017 36.553 1.00 42.26 EGFA C ATOM 2881 CG ASP 310 -4.927 -17.844 36.842 1.00 42.34 EGFA C ATOM 2882 OD ASP 310 -4.822 -17.258 37.937 1.00 44.79 EGFA O ATOM 2883 OD ASP 310 -5.749 -17.507 35.968 1.00 41.66 EGFA O ATOM 2884 C ASP 310 -4.297 -20.145 38.755 1.00 41.32 EGFA C ATOM 2885 0 , ASP 310 -5.140 -20.944 38.337 1.00 41.03 EGFA O ATOM 2886 N LEU 311 -4.206 -19.767 40.031 1.00 41.42 EGFA N ATOM 2887 CA LEU 311 -5.173 -20.183 41.044 1.00 41.31 EGFA C ATOM 2886 CB LEU 311 -4.563 -20.085 42.431 1.00 38.52 EGFA C ATOM 2889 CG LEU 311 -3.108 -20.509 42.498 1.00 36.88 EGFA C ATOM 2890 CD LEU 311 -2.561 -20.187 43.872 1.00 37.89 EGFA C ATOM 2891 CD LEU 311 -2.991 -21.987 42.182 1.00 34.94 EGFA C ATOM 2892 C LEU 311 -6.398 -19.289 40.995 1.00 42.14 EGFA C ATOM 2893 O LEU 311 -6.479 -18.376 40.185 1.00 41.25 EGFA O ATOM 2894 N LYS 312 -7.360 -19.563 41.862 1.00 43.27 EGFA N ATOM 2895 CA LYS 312 -8.478 -18.658 42.005 1.00 45.45 EGFA C ATOM 2896 CB LYS 312 -9.624 -19.345 42.749 1.00 48.60 EGFA C ATOM 2897 CG LYS 312 -10.251 -20.511 41.979 1.00 53.73 EGFA C ATOM 2898 CD LYS 312 -11.599 -20.945 42.575 1.00 56.82 EGFA C ATOM 2899 CE LYS 312 -12.280 -22.005 41.700 1.00 57.14 EGFA C ATOM 2900 NZ LYS 312 -13.550 -22.527 42.291 1.00 57.99 EGFA N ATOM 2901 C LYS 312 -7.973 -17.464 42.793 1.00 44.13 EGFA C ATOM 2902 O LYS 312 -8.229 -16.315 42.434 1.00 44.64 EGFA 0 ATOM 2903 ILE 313 -7.234 -17.754 43.860 1.00 43.02 EGFA N ATOM 2904 CA ILE 313 -6.706 -16.727 44.744 1.00 41.44 EGFA C ATOM 2905 CB ILE 313 -6.987 -17.073 46.217 1.00 42.03 EGFA C ATOM 2906 CG ILE 313 -7.416 -15.833 46.978 1.00 40.16 EGFA C ATOM 2907 CG ILE 313 -8.083 -18.140 46.283 1.00 43.15 EGFA C ATOM 2908 CD ILE 313 -9.026 -17.992 47.445 1.00 43.53 EGFA C ATOM 2909 C ILE 313 -5.207 -16.672 44.521 1.00 40.70 EGFA C ATOM 2910 O ILE 313 -4.445 -17.408 45.151 1.00 42.01 EGFA O ATOM 2911 N GLY 314 -4.797 -15.805 43.605 1.00 39.39 EGFA N ATOM 2912 CA GLY 314 -3.396 -15.694 43.255 1.00 38.80 EGFA C

2

ATOM 2913 C GLY 314 -2.928 -16.707 42.230 1.00 38.26 EGFA C ATOM 2914 O GLY 314 -3.707 -17.249 41.456 1.00 37.64 EGFA O ATOM 2915 N TYR 315 -1.625 -16.948 42.226 1.00 38.97 EGFA N ATOM 2916 CA TYR 315 -1.028 -17.987 41.405 1.00 38.95 EGFA C ATOM 2917 CB TYR 315 -0.553 -17.405 40.076 1.00 37.90 EGFA C ATOM 2918 CG TYR 315 0.616 -16.457 40.208 1.00 38.39 EGFA C ATOM 2919 CD TYR 315 1.874 -16.788 39.706 1.00 38.94 EGFA C ATOM 2920 CE TYR 315 2.942 -15.906 39.803 1.00 38.15 EGFA C ATOM 2921 CD TYR 315 0.459 -15.216 40.807 1.00 38.29 EGFA C ATOM 2922 CE TYR 315 1.517 -14.333 40.910 1.00 38.40 EGFA C ATOM 2923 CZ TYR 315 2.756 -14.675 40.405 1.00 38.57 EGFA C ATOM 2924 OH TYR 315 3.805 -13.783 40.526 1.00 37.81 EGFA O ATOM 2925 C TYR 315 0.153 -18.61.2 42.123 1.00 39.99 EGFA C ATOM 2926 O TYR 315 0.364 -18.401 43.323 1.00 40.28 EGFA 0 ATOM 2927 N GLU 316 0.933 -19.369 41.364 1.00 41.83 EGFA N ATOM 2928 CA GLU 316 2.158 -19.964 41.871 1.00 43.58 EGFA C ATOM 2929 CB GLU 316 1.819 -21.179 42.721 1.00 44.75 EGFA C ATOM 2930 CG GLU 316 1.030 -22.213 41.959 1.00 48.82 EGFA C ATOM 2931 CD GLU 316 0.823 -23.461 42.761 1.00 52.99 EGFA C ATOM 2932 OE GLU 316 1.123 -23.438 43.971 1.00 57.20 EGFA O ATOM 2933 OE GLU 316 0.381 -24.475 42.184 1.00 54.04 EGFA O ATOM 2934 C GLU 316 3.041 -20.383 40.701 1.00 42.80 EGFA C ATOM 2935 O GLU 316 2.568 -20.500 39.575 1.00 44.00 EGFA O ATOM 2936 N CYS 317 4.326 -20.592 40.957 1.00 42.14 EGFA N ATOM 2937 CA CYS 317 5.195 -21.137 39.927 1.00 41.35 EGFA C ATOM 2938 C CYS 317 5.412 -22.630 40.169 1.00 42.56 EGFA C ATOM 2939 O CYS 317 5.470 -23.079 41.316 1.00 42.57 EGFA 0 ATOM 2990 CB CYS 317 6.538 -20.413 39.925 1.00 38.97 EGFA C ATOM 2991 SG CYS 317 6.442 -18.628 39.586 1.00 35.62 EGFA S ATOM 2992 N LEU 318 5.547 -23.397 39.089 1.00 43.52 EGFA N ATOM 2943 CA LEU 318 5.832 -24.820 39.210 1.00 43.40 EGFA C ATOM 2944 CB LEU 318 4.653 -25.640 38.689 1.00 41.86 EGFA C ATOM 2945 CG LEU 318 3.328 -25.268 39.355 1.00 41.42 EGFA C ATOM 2946 CD LEU 318 2.255 -26.234 38.937 1.00 42.17 EGFA C ATOM 2947 CD LEU 318 3.481 -25.286 40.855 1.00 41.53 EGFA C ATOM 2948 C LEU 318 7.098 -25.185 38.453 1.00 44.60 EGFA C ATOM 2949 O LEU 318 7.489 -24.493 37.510 1.00 44.39 EGFA O

24

ATOM 2950 N CYS 319 7.738 -26.273 38.875 1.00 46.62 EGFA N ATOM 2951 CA CYS 319 9.002 -26.685 38.276 1.00 48.75 EGFA C ATOM 2952 C CYS 319 8.993 -28.073 37.639 1.00 48.42 EGFA C ATOM 2953 O CYS 319 8.274 -28.970 38.077 1.00 47.58 EGFA O ATOM 2954 CB CYS 319 10.123 -26.615 39.317 1.00 49.62 EGFA C ATOM 2955 SG CYS 319 10.467 -24.933 39.923 1.00 50.75 EGFA S ATOM 2956 N PRO 320 9.812 -28.263 36.593 1.00 49.01 EGFA N ATOM 2957 CD PRO 320 10.541 -27.229 35.842 1.00 48.55 EGFA C ATOM 2958 CA PRO 320 10.067 -29.605 36.060 1.00 99.92 EGFA C ATOM 2959 CB PRO 320 11.111 -29.369 34.972 1.00 48.61 EGFA C ATOM 2960 CG PRO 320 10.927 -27.948 34.582 1.00 48.27 EGFA C ATOM 2961 C PRO 320 10.600 -30.500 37.165 1.00 50.82 EGFA C ATOM 2962 O PRO 320 11.453 -30.086 37.952 1.00 50.19 EGFA 0 ATOM 2963 N ASP 321 10.096 -31.724 37.234 1.00 52.17 EGFA N ATOM 2969 CA ASP 321 10.479 -32.600 38.325 1.00 52.72 EGFA C ATOM 2965 CB ASP 321 9.810 -33.970 38.187 1.00 57.23 EGFA C ATOM 2966 CG ASP 321 9.182 -34.447 39.499 1.00 61.91 EGFA C ATOM 2967 OD ASP 321 8.807 -33.586 40.332 1.00 63.09 EGFA 0 ATOM 2968 OD ASP 321 9.064 -35.680 39.701 1.00 64.11 EGFA O ATOM 2969 C ASP 321 11.987 -32.742 38.310 1.00 51.06 EGFA C ATOM 2970 O ASP 321 12.599 -32.869 37.246 1.00 49.86 EGFA 0 ATOM 2971 N GLY 322 12.577 -32.695 39.499 1.00 49.84 EGFA N ATOM 2972 CA GLY 322 14.023 -32.681 39.619 1.00 48.51 EGFA C ATOM 2973 C GLY 322 14.592 -31.285 39.793 1.00 47.34 EGFA C ATOM 2974 O GLY 322 15.729 -31.131 40.239 1.00 47.93 EGFA 0 ATOM 2975 N PHE 323 13.807 -30.266 39.445 1.00 95.29 EGFA N ATOM 2976 CA PHE 323 14.247 -28.880 39.583 1.00 42.20 EGFA C ATOM 2977 CB PHE 323 13.607 -27.999 38.517 1.00 40.51 EGFA C ATOM 2978 CG PHE 323 14.157 -28.215 37.141 1.00 38.07 EGFA C ATOM 2979 CD PHE 323 14.250 -29.489 36.610 1.00 36.97 EGFA C ATOM 2980 CD PHE 323 14.550 -27.135 36.364 1.00 37.05 EGFA C ATOM 2981 CE PHE 323 14.723 -29.681 35.330 1.00 37.63 EGFA C ATOM 2982 CE PHE 323 15.024 -27.317 35.082 1.00 36.22 EGFA C ATOM 2983 CZ PHE 323 15.110 -28.590 34.561 1.00 37.83 EGFA C ATOM 2984 C PHE 323 13.890 -28.332 40.947 1.00 41.10 EGFA C ATOM 2985 O PHE 323 13.022 -28.857 41.631 1.00 40.98 EGFA O ATOM 2986 N GLN 324 14.567 -27.266 41.339 1.00 41.32 EGFA N

2

ATOM 2987 CA GLN 324 14.326 -26.657 42.637 1.00 42.35 EGFA C ATOM 2988 CB GLN 324 15.645 -26.527 43.393 1.00 45.11 EGFA C ATOM 2989 CG GLN 324 15.543 -26.714 44.897 1.00 48.90 EGFA C ATOM 2990 CD GLN 324 16.897 -26.588 45.584 1.00 50.71 EGFA C ATOM 2991 OE GLN 324 16.978 -26.425 46.808 1.00 51.49 EGFA O ATOM 2992 NE GLN 324 17.972 -26.660 44.793 1.00 50.40 EGFA N ATOM 2993 C GLN 324 13.729 -25.281 42.408 1.00 41.37 EGFA C ATOM 2994 O GLN 324 14.076 -24.607 41.439 1.00 41.39 EGFA O ATOM 2995 N LEU 325 12.831 -24.856 43.287 1.00 40.78 EGFA N ATOM 2996 CA LEU 325 12.250 -23.527 43.147 1.00 40.37 EGFA C ATOM 2997 CB LEU 325 10.740 -23.570 43.373 1.00 38.89 EGFA C ATOM 2998 CG LEU 325 10.036 -22.248 43.063 1.00 37.99 EGFA C ATOM 2999 CD LEU 325 10.139 -21.941 41.584 1.00 35.18 EGFA C ATOM 3000 CD LEU 325 8.592 -22.331 43.485 1.00 37.81 EGFA C ATOM 3001 C LEU 325 12.880 -22.553 44.131 1.00 40.79 EGFA C ATOM 3002 O LEU 325 12.896 -22.806 45.337 1.00 40.04 EGFA 0 ATOM 3003 N VAL 326 13.402 -21.442 43.618 1.00 41.36 EGFA N ATOM 3004 CA VAL 326 14.077 -20.477 44.476 1.00 42.53 EGFA C ATOM 3005 CB VAL 326 15.592 -20.351 44.122 1.00 41.99 EGFA C ATOM 3006 CG VAL 326 16.010 -21.475 43.201 1.00 41.24 EGFA C ATOM 3007 CG VAL 326 15.883 -19.007 43.506 1.00 41.93 EGFA C ATOM 3008 C VAL 326 13.418 -19.109 44.385 1.00 43.44 EGFA C ATOM 3009 O VAL 326 12.929 -18.716 43.332 1.00 43.12 EGFA 0 ATOM 3010 N ALA 327 13.394 -18.390 45.501 1.00 45.25 EGFA N ATOM 3011 CA ALA 327 12.751 -17.084 45.539 1.00 97.09 EGFA C ATOM 3012 CB ALA 327 13.443 -16.139 44.577 1.00 46.26 EGFA C ATOM 3013 C ALA 327 11.270 -17.201 45.185 1.00 48.01 EGFA C ATOM 3014 O ALA 327 10.567 -16.197 45.078 1.00 48.60 EGFA 0 ATOM 3015 N GLN 328 10.813 -18.435 44.997 1.00 99.99 EGFA N ATOM 3016 CA GLN 328 9.413 -18.717 44.692 1.00 51.60 EGFA C ATOM 3017 CB GLN 328 8.492 -17.860 45.563 1.00 51.40 EGFA C ATOM 3018 CG GLN 328 7.372 -18.693 46.191 1.00 53.05 EGFA C ATOM 3019 CD GLN 328 7.288 -18.392 47.666 1.00 56.41 EGFA C ATOM 3020 OE GLN 328 7.462 -19.307 48.477 1.00 58.59 EGFA 0 ATOM 3021 NE GLN 328 7.022 -17.136 48.036 1.00 57.77 EGFA N ATOM 3022 C GLN 328 9.050 -18.516 43.224 1.00 51.40 EGFA C ATOM 3023 O GLN 328 7.872 -18.574 42.863 1.00 52.05 EGFA O

2

ATOM 3024 N ARG 329 10.045 -18.278 42.376 1.00 52.02 EGFA N ATOM 3025 CA ARG 329 9.759 -18.102 40.962 1.00 53.90 EGFA C ATOM 3026 CB ARG 329 9.202 -16.710 40.719 1.00 54.36 EGFA C ATOM 3027 CG ARG 329 10.176 -15.594 40.973 1.00 55.41 EGFA C ATOM 3028 CD ARG 329 9.425 -14.289 40.909 1.00 56.46 EGFA C ATOM 3029 NE ARG 329 8.174 -14.397 41.644 1.00 57.62 EGFA N ATOM 3030 CZ ARG 329 7.271 -13.427 41.681 1.00 58.17 EGFA C ATOM 3031 NH ARG 329 7.499 -12.294 41.018 1.00 57.94 EGFA N ATOM 3032 NH ARG 329 6.159 -13.570 42.390 1.00 58.09 EGFA N ATOM 3033 C ARG 329 10.921 -18.337 40.015 1.00 54.26 EGFA C ATOM 3034 O ARG 329 10.899 -17.869 38.881 1.00 54.09 EGFA 0 ATOM 3035 N ARG 330 11.925 -19.079 40.459 1.00 55.91 EGFA N ATOM 3036 CA ARG 330 12.957 -19.541 39.545 1.00 56.83 EGFA C ATOM 3037 CB ARG 330 14.202 -18.663 39.676 1.00 59.07 EGFA C ATOM 3038 CG ARG 330 15.156 -18.777 38.494 1.00 63.56 EGFA C ATOM 3039 CD ARG 330 16.009 -17.526 38.337 1.00 67.44 EGFA C ATOM 3040 NE ARG 330 17.205 -17.544 39.183 1.00 71.71 EGFA N ATOM 3041 CZ ARG 330 18.101 -16.560 39.232 1.00 73.25 EGFA C ATOM 3042 NH ARG 330 17.931 -15.476 38.483 1.00 74.17 EGFA N ATOM 3043 NH ARG 330 19.165 -16.658 40.026 1.00 73.57 EGFA N ATOM 3044 C ARG 330 13.307 -21.007 39.805 1.00 56.14 EGFA C ATOM 3045 O ARG 330 13.624 -21.398 40.931 1.00 55.45 EGFA O ATOM 3046 N CYS 331 13.237 -21.821 38.757 1.00 55.78 EGFA N ATOM 3047 CA CYS 331 13.615 -23.219 38.876 1.00 55.78 EGFA C ATOM 3048 C CYS 331 15.046 -23.384 38.407 1.00 56.71 EGFA C ATOM 3049 O CYS 331 15.424 -22.886 37.344 1.00 54.16 EGFA O ATOM 3050 CB CYS 331 12.707 -24.105 38.024 1.00 54.71 EGFA C ATOM 3051 SG CYS 331 10.917 -23.862 38.247 1.00 52.34 EGFA S ATOM 3052 N GLU 332 15.843 -24.075 39.210 1.00 59.67 EGFA N ATOM 3053 CA GLU 332 17.181 -24.445 38.793 1.00 63.04 EGFA C ATOM 3054 CB GLU 332 18.234 -23.765 39.677 1.00 63.37 EGFA C ATOM 3055 CG GLU 332 17.872 -23.624 41.151 1.00 64.27 EGFA C ATOM 3056 CD GLU 332 18.797 -22.655 41.891 1.00 64.91 EGFA C ATOM 3057 OE GLU 332 19.367 -23.051 42.935 1.00 64.31 EGFA O ATOM 3058 OE GLU 332 18.951 -21.999 41.428 1.00 64.07 EGFA O ATOM 3059 C GLU 332 17.350 -25.953 38.811 1.00 65.33 EGFA C ATOM 3060 O GLU 332 17.082 -26.620 39.816 1.00 64.39 EGFA O

2

ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM ATOM TER ATOM TER KRAJ

2

�

41

42

�

44

�

41

42

�

44

�

41

42

�

41

42

�

44

�

44

TABELA 35.4

44

4

41

42

ATOM 125 467 -13.596 9.522 -20.152 1.00 25.40 A O ATOM 126 468 -15.660 9.762 -20.923 1.00 24.02 A N ATOM 127 468 -15.174 10.270 -22.201 1.00 23.19 A C ATOM 128 468 -16.305 10.341 -23.242 1.00 23.48 A C ATOM 129 468 -17.407 11.085 -22.706 1.00 23.61 A 0 ATOM 130 468 -16.766 8.946 -23.608 1.00 22.59 A C ATOM 131 468 -14.503 11.640 -22.087 1.00 24.90 A C ATOM 132 468 -14.594 12.310 -21.060 1.00 23.76 A 0 ATOM 133 469 -13.832 12.044 -23.159 1.00 23.46 A N ATOM 134 969 -12.874 13.140 -23.115 1.00 24.59 A C ATOM 135 469 -12.178 13.250 -24.476 1.00 25.09 A C ATOM 136 469 -11.111 14.318 -24.558 1.00 26.25 A C ATOM 137 469 -10.439 14.323 -25.935 1.00 27.32 A C ATOM 138 469 -9.440 15.382 -26.040 1.00 27.17 A N ATOM 139 469 -8.581 15.512 -27.046 1.00 25.09 A C ATOM 140 469 -7.711 16.514 -27.044 1.00 24.35 A N ATOM 141 469 -8.591 14.644 -28.047 1.00 23.06 A N ATOM 142 469 -13.495 14.487 -22.736 1.00 25.75 A C ATOM 143 469 -12.891 15.276 -22.009 1.00 23.47 A D ATOM 144 470 -14.698 14.759 -23.230 1.00 24.77 A N ATOM 145 470 -15.328 16.047 -22.965 1.00 24.49 A C ATOM 146 470 -15.904 16.621 -24.262 1.00 24.57 A C ATOM 147 470 -15.563 18.079 -24.508 1.00 30.96 A C ATOM 148 470 -13.788 18.409 -24.583 1.00 31.07 A S ATOM 149 470 -13.271 17.434 -25.959 1.00 31.18 A C ATOM 150 470 -16.425 15.926 -21.908 1.00 24.68 A C ATOM 151 470 -17.226 16.848 -21.717 1.00 23.62 A 0 ATOM 152 471 -16.459 14.789 -21.220 1.00 24.16 A N ATOM 153 471 -17.508 14.528 -20.238 1.00 24.20 A C ATOM 154 471 -17.371 13.119 -19.687 1.00 20.75 A C ATOM 155 471 -17.452 15.537 -19.096 1.00 25.48 A C ATOM 156 471 -16.372 15.975 -18.693 1.00 27.11 A O ATOM 157 472 -18.617 15.906 -18.578 1.00 24.57 A N ATOM 158 472 -18.675 16.811 -17.437 1.00 24.16 A C ATOM 159 472 -19.181 18.220 -17.836 1.00 24.01 A C ATOM 160 472 -20.548 18.134 -18.257 1.00 21.91 A O ATOM 161 472 -18.344 18.795 -18.970 1.00 18.59 A C

4

ATOM 162 472 -19.620 16.260 -16.386 1.00 25.66 A C ATOM 163 472 -20.508 15.455 -16.690 1.00 24.53 A O ATOM 164 473 -19.415 16.700 -15.147 1.00 25.24 A N ATOM 165 473 -20.319 16.393 -14.048 1.00 24.92 A C ATOM 166 473 -19.560 15.661 -12.946 1.00 24.30 A C ATOM 167 473 -20.900 17.699 -13.513 1.00 25.27 A C ATOM 168 473 -20.241 18.741 -13.556 1.00 24.13 A O ATOM 169 474 -22.'.31 17.638 -13.012 1.00 24.89 A N ATOM 170 474 -22.819 18.815 -12.489 1.00 25.52 A C ATOM 171 474 -24.026 19.182 -13.365 1.00 29.25 A C ATOM 172 474 -24.883 20.220 -12.662 1.00 32.52 A C ATOM 173 474 -23.558 19.713 -14.721 1.00 33.35 A C ATOM 174 474 -22.979 21.105 -14.661 1.00 33.21 A C ATOM 175 474 -23.336 18.571 -11.069 1.00 26.48 A C ATOM 176 474 -24.055 17.603 -10.823 1.00 26.94 A O ATOM 177 475 -22.974 19.451 -10.190 1.00 25.26 A N ATOM 178 475 -23.580 19.452 -8.811 1.00 25.92 A C ATOM 179 475 -22.496 19.409 -7.732 1.00 23.88 A C ATOM 180 475 -24.459 20.695 -8.635 1.00 26.91 A C ATOM 181 475 -24.063 21.808 -8.998 1.00 25.49 A 0 ATOM 182 476 -25.655 20.490 -8.091 1.00 28.07 A N ATOM 183 476 -26.642 21.558 -7.932 1.00 28.54 A C ATOM 184 476 -27.883 21.299 -8.792 1.00 30.18 A C ATOM 185 476 -27.672 21.375 -10.272 1.00 35.86 A C ATOM 186 476 -29.005 21.304 -11.004 1.00 38.60 A C ATOM 187 476 -28.838 21.409 -12.452 1.00 41.19 A N ATOM 188 476 -28.492 20.389 -13.231 1.00 43.32 A C ATOM 189 476 -28.277 19.191 -12.698 1.00 43.42 A N ATOM 190 476 -28.356 20.562 -14.538 1.00 44.05 A N ATOM 191 476 -27.093 21.615 -6.488 1.00 28.17 A C ATOM 192 476 -27.077 20.608 -5.783 1.00 27.75 A 0 ATOM 193 477 -27.519 22.797 -6.064 1.00 29.00 A N ATOM 194 477 -28.103 22.979 -4.745 1.00 29.17 A C ATOM 195 477 -29.620 22.952 -4.848 1.00 30.65 A C ATOM 196 477 -30.173 23.016 -5.947 1.00 31.16 A O ATOM 197 477 -27.664 24.316 -4.165 1.00 27.94 A C ATOM 198 477 -25.866 24.479 -3.959 1.00 30.04 A S

4 4

ATOM 199 478 -30.283 22.869 -3.699 1.00 30.57 A N ATOM 200 478 -31.742 22.922 -3.643 1.00 31.86 A C ATOM 201 478 -32.228 22.484 -2.260 1.00 29.25 A C ATOM 202 478 -32.240 24.333 -3.949 1.00 32.09 A C ATOM 203 478 -31.494 25.306 -3.847 1.00 31.96 A 0 ATOM 204 479 -33.521 24.461 -4.322 1.00 32.78 A N ATOM 205 479 -34.502 23.383 -4.550 1.00 31.44 A C ATOM 206 479 -34.054 25.778 -4.691 1.00 32.40 A C ATOM 207 479 -35.515 25.486 -5.061 1.00 32.72 A C ATOM 208 479 -35.513 24.037 -5.458 1.00 31.86 A C ATOM 209 479 -33.933 26.834 -3.592 1.00 32.60 A C ATOM 210 479 -33.819 28.022 -3.884 1.00 32.64 A 0 ATOM 211 480 -33.954 26.416 -2.331 1.00 31.47 A N ATOM 212 480 -33.879 27.384 -1.241 1.00 33.46 A C ATOM 213 480 -34.749 26.936 -0.057 1.00 35.16 A C ATOM 214 480 -34.300 25.610 0.537 1.00 36.44 A C ATOM 215 480 -34.B28 25.224 1.598 1.00 40.34 A 0 ATOM 216 480 -33.419 24.954 -0.053 1.00 38.40 A 0 ATOM 217 480 -32.449 27.623 -0.765 1.00 33.71 A C ATOM 218 480 -32.222 28.295 0.246 1.00 35.25 A 0 ATOM 219 481 -31.482 27.076 -1.492 1.00 32.10 A N ATOM 220 481 -30.087 27.191 -1.086 1.00 30.90 A C ATOM 221 481 -29.439 25.804 -1.016 1.00 30.17 A C ATOM 222 481 -30.038 24.890 0.041 1.00 30.22 A C ATOM 223 481 -29.692 23.425 -0.191 1.00 31.87 A C ATOM 224 481 -29.930 22.602 0.717 1.00 30.65 A 0 ATOM 225 481 -29.186 23.093 -1.285 1.00 33.77 A 0 ATOM 226 481 -29.292 28.073 -2.031 1.00 29.33 A C ATOM 227 481 -29.723 28.354 -3.146 1.00 30.27 A O ATOM 228 482 -28.127 28.510 -1.569 1.00 29.51 A N ATOM 229 482 -27.176 29.220 -2.411 1.00 29.75 A C ATOM 230 482 -26.813 30.561 -1.777 1.00 30.90 A C ATOM 231 482 -27.965 31.542 -1.682 1.00 35.54 A C ATOM 232 482 -28.316 32.148 -3.031 1.00 38.85 A C ATOM 233 482 -27.426 32.200 -3.911 1.00 39.06 A O ATOM 234 482 -29.479 32.570 -3.212 1.00 39.52 A O ATOM 235 482 -25.915 28.372 -2.558 1.00 29.76 A C

4

ATOM 236 482 -25.357 27.904 -1.569 1.00 28.44 A O ATOM 237 483 -25.464 28.176 -3.790 1.00 27.98 A N ATOM 238 483 -24.174 27.596 -4.015 1.00 28.33 A C ATOM 239 483 -24.101 26.996 -5.442 1.00 27.55 A C ATOM 240 483 -22.796 26.296 -5.842 1.00 29.33 A C ATOM 241 483 -23.075 25.330 -6.976 1.00 29.06 A C ATOM 242 483 -21.746 27.326 -6.253 1.00 28.65 A C ATOM 243 483 -23.078 28.585 -3.793 1.00 28.13 A C ATOM 244 483 -22.993 29.566 -4.522 1.00 32.20 A O ATOM 245 484 -22.240 28.367 -2.789 1.00 27.32 A N ATOM 246 484 -21.214 29.341 -2.937 1.00 26.58 A C ATOM 247 484 -21.172 29.546 -0.916 1.00 25.53 A C ATOM 248 484 -22.427 30.163 -0.281 1.00 27.36 A C ATOM 249 484 -22.065 30.781 1.072 1.00 27.53 A C ATOM 250 484 -23.013 31.234 -1.196 1.00 27.97 A C ATOM 251 484 -19.829 28.953 -2.943 1.00 27.62 A C ATOM 252 484 -18.926 29.793 -2.999 1.00 28.95 A O ATOM 253 485 -19.655 27.688 -3.317 1.00 25.70 A N ATOM 254 485 -18.391 27.254 -3.908 1.00 27.74 A C ATOM 255 485 -17.304 27.106 -2.836 1.00 26.99 A C ATOM 256 485 -17.504 25.926 -2.068 1.00 28.56 A 0 ATOM 257 485 -18.522 25.934 -4.664 1.00 27.50 A C ATOM 258 485 -19.569 25.281 -4.643 1.00 25.09 A 0 ATOM 259 486 -17.432 25.548 -5.315 1.00 26.66 A N ATOM 260 486 -17.457 24.490 -6.311 1.00 26.00 A C ATOM 261 486 -16.047 23.934 -6.434 1.00 26.11 A C ATOM 262 486 -15.097 24.677 -6.679 1.00 25.83 A 0 ATOM 263 486 -17.932 25.090 -7.632 1.00 25.13 A C ATOM 264 486 -17.774 24.120 -9.162 1.00 31.94 A S ATOM 265 487 -15.912 22.628 -6.243 1.00 25.42 A N ATOM 266 487 -14.626 21.964 -6.403 1.00 24.57 A C ATOM 267 487 -14.031 21.612 -5.029 1.00 24.64 A C ATOM 268 487 -14.849 20.692 -4.324 1.00 27.88 A 0 ATOM 269 487 -14.828 20.704 -7.237 1.00 23.91 A C ATOM 270 487 -15.923 20.455 -7.734 1.00 22.75 A 0 ATOM 271 488 -13.776 19.916 -7.408 1.00 24.08 A N ATOM 272 488 -13.883 18.706 -8.209 1.00 25.08 A C

4

ATOM 273 488 -13.664 19.015 -9.698 1.00 27.25 A C ATOM 274 488 -12.416 19.654 -9.931 1.00 25.16 A 0 ATOM 275 488 -12.864 17.693 -7.743 1.00 27.25 A C ATOM 276 488 -11.940 18.027 -6.997 1.00 28.14 A 0 ATOM 277 489 -13.033 16.453 -8.182 1.00 26.11 A N ATOM 278 489 -12.152 15.383 -7.757 1.00 26.68 A C ATOM 279 989 -12.680 14.754 -6.462 1.00 26.29 A C ATOM 280 489 -11.886 13.566 -5.992 1.00 28.17 A C ATOM 281 489 -10.732 13.738 -5.241 1.00 28.05 A C ATOM 282 489 -12.303 12.272 -6.291 1.00 28.40 A C ATOM 283 489 -10.004 12.637 -4.793 1.00 29.69 A C ATOM 284 489 -11.585 11.172 -5.849 1.00 29.13 A C ATOM 285 989 -10.434 11.354 -5.099 1.00 30.06 A C ATOM 286 489 -12.028 14.323 -8.837 1.00 27.40 A C ATOM 287 989 -13.009 13.951 -9.471 1.00 28.37 A O ATOM 288 490 -10.807 13.846 -9.041 1.00 28.47 A N ATOM 289 490 -10.561 12.663 -9.853 1.00 30.35 A C ATOM 290 490 -9.863 13.056 -11.158 1.00 30.98 A C ATOM 291 990 -9.257 11.933 -11.776 1.00 33.81 A 0 ATOM 292 990 -9.672 11.708 -9.066 1.00 31.89 A C ATOM 293 490 -8.751 12.144 -8.378 1.00 32.56 A O ATOM 294 491 -9.941 10.412 -9.171 1.00 33.39 A N ATOM 295 491 -9.110 9.402 -8.515 1.00 36.40 A C ATOM 296 491 -9.709 8.007 -8.719 1.00 38.90 A C ATOM 297 491 -11.109 7.848 -8.166 1.00 45.81 A C ATOM 298 491 -11.268 6.514 -7.458 1.00 51.82 A C ATOM 299 491 -12.322 6.565 -6.448 1.00 56.98 . A N ATOM 300 491 -13.621 6.548 -6.731 1.00 58.08 A C ATOM 301 491 -14.518 6.597 -5.753 1.00 58.30 A N ATOM 302 491 -14.020 6.486 -7.995 1.00 57.04 A N ATOM 303 491 -7.677 9.407 -9.050 1.00 35.22 A C ATOM 304 491 -6.731 9.192 -8.305 1.00 35.69 A 0 ATOM 305 492 -7.533 9.654 -10.347 1.00 35.60 A N ATOM 306 492 -6.246 9.550 -11.024 1.00 34.80 A C ATOM 307 492 -6.459 9.060 -12.452 1.00 36.97 A C ATOM 308 492 -7.242 9.997 -13.179 1.00 38.02 A O ATOM 309 492 -5.512 10.887 -11.068 1.00 35.54 A C

4

ATOM 310 492 -4.295 10.932 -11.258 1.00 36.68 A O ATOM 311 493 -6.254 11.977 -10.909 1.00 34.28 A N ATOM 312 493 -5.654 13.292 -11.037 1.00 32.69 A C ATOM 313 493 -5.739 13.824 -12.456 1.00 31.91 A C ATOM 314 993 -5.287 14.929 -12.739 1.00 32.88 A O ATOM 315 494 -6.316 13.039 -13.357 1.00 31.63 A N ATOM 316 494 -6.506 13.492 -14.728 1.00 32.29 A C ATOM 317 494 -6.442 12.304 -15.693 1.00 34.42 A C ATOM 318 494 -5.080 11.622 -15.758 1.00 38.00 A C ATOM 319 494 -5.032 10.628 -16.909 1.00 39.72 A C ATOM 320 494 -3.648 10.029 -17.078 1.00 42.01 A C ATOM 321 494 -3.585 9.143 -18.279 1.00 43.69 A N ATOM 322 494 -7.844 14.213 -14.870 1.00 29.91 A C ATOM 323 494 -8.870 13.604 -15.169 1.00 28.53 A O ATOM 324 495 -7.815 15.523 -14.659 1.00 29.57 A N ATOM 325 495 -9.025 16.341 -14.669 1.00 28.53 A C ATOM 326 495 -9.558 16.492 -13.293 1.00 29.81 A C ATOM 327 995 -8.560 17.157 -12.306 1.00 31.40 A C ATOM 328 995 -9.082 17.315 -10.881 1.00 32.62 A C ATOM 329 495 -8.125 18.089 -10.096 1.00 34.88 A N ATOM 330 995 -8.424 19.180 -9.400 1.00 34.47 A C ATOM 331 495 -7.472 19.812 -8.733 1.00 35.19 A N ATOM 332 495 -9.672 19.633 -9.355 1.00 34.89 A N ATOM 333 995 -8.661 17.710 -15.225 1.00 27.43 A C ATOM 339 995 -7.486 18.039 -15.349 1.00 27.93 A 0 ATOM 335 496 -9.660 18.513 -15.564 1.00 26.03 A N ATOM 336 496 -9.376 19.877 -15.972 1.00 24.54 A C ATOM 337 496 -9.765 20.076 -17.936 1.00 24.73 A C ATOM 338 996 -8.775 19.429 -18.396 1.00 26.29 A C ATOM 339 996 -9.064 19.789 -19.843 1.00 25.61 A C ATOM 340 496 -10.117 18.950 -20.405 1.00 24.57 A N ATOM 391 996 -10.601 19.095 -21.632 1.00 23.57 A C ATOM 342 496 -10.130 20.048 -22.429 1.00 20.57 A N ATOM 343 496 -11.555 18.287 -22.060 1.00 23.67 A N ATOM 344 496 -10.052 20.921 -15.084 1.00 25.65 A C ATOM 345 996 -10.266 22.062 -15.502 1.00 23.59 A 0 ATOM 346 497 -10.375 20.531 -13.853 1.00 25.25 A N

4

ATOM 347 497 -10.908 21.491 -12.900 1.00 25.50 A C ATOM 348 497 -12.406 21.709 -13.026 1.00 25.22 A C ATOM 349 497 -13.126 20.844 -13.524 1.00 24.92 A O ATOM 350 498 -12.880 22.867 -12.574 1.00 25.28 A N ATOM 351 498 -14.313 23.099 -12.473 1.00 25.14 A C ATOM 352 498 -14.840 22.589 -11.122 1.00 25.47 A C ATOM 353 498 -14.497 23.467 -9.924 1.00 24.08 A C ATOM 354 498 -13.039 23.373 -9.504 1.00 27.78 A C ATOM 355 498 -12.453 22.265 -9.526 1.00 27.03 A O ATOM 356 498 -12.477 24.419 -9.139 1.00 30.19 A O ATOM 357 498 -14.669 24.567 -12.640 1.00 26.99 A C ATOM 358 498 -13.817 25.445 -12.521 1.00 26.93 A O ATOM 359 499 -15.943 24.823 -12.911 1.00 27.54 A N ATOM 360 499 -16.427 26.180 -13.122 1.00 27.29 A C ATOM 361 499 -16.477 26.493 -14.615 1.00 27.26 A C ATOM 362 499 -16.999 27.879 -14.936 1.00 31.36 A C ATOM 363 499 -17.028 28.135 -16.438 1.00 29.97 A C ATOM 364 499 -17.154 29.562 -16.717 1.00 33.21 A N

ATOM 365 499 -16.543 30.183 -17.721 1.00 31.95 A C ATOM 366 499 -16.710 31.487 -17.898 1.00 33.98 A N ATOM 367 499 -15.767 29.498 -18.549 1.00 30.18 A N ATOM 368 499 -17.818 26.349 -12.526 1.00 28.46 A C ATOM 369 499 -18.652 25.445 -12.608 1.00 27.86 A 0 ATOM 370 500 -18.062 27.507 -11.921 1.00 28.00 A N ATOM 371 500 -19.405 27.868 -11.492 1.00 28.68 A C ATOM 372 500 -19.339 28.774 -10.259 1.00 29.36 A C ATOM 373 500 -18.800 28.062 -9.033 1.00 31.43 A C ATOM 374 500 -18.596 29.123 -7.599 1.00 35.65 A 5 ATOM 375 500 -17.361 29.997 -8.031 1.00 30.13 A C ATOM 376 500 -20.118 28.578 -12.633 1.00 28.47 A C ATOM 377 500 -19.589 29.527 -13.213 1.00 27.97 A D ATOM 378 501 -21.314 28.106 -12.965 1.00 29.85 A N ATOM 379 501 -22.059 28.656 -14.093 1.00 32.67 A C ATOM 380 501 -22.169 27.617 -15.222 1.00 30.99 A C ATOM 381 501 -20.816 27.155 -15.771 1.00 32.75 A C ATOM 382 501 -20.922 26.113 -16.886 1.00 32.72 A C ATOM 383 501 -21.997 25.503 -17.053 1.00 28.58 A O

4

ATOM 384 501 -19.917 25.907 -17.603 1.00 36.53 A O ATOM 385 501 -23.446 29.079 -13.633 1.00 35.03 A C ATOM 386 501 -24.072 28.399 -12.823 1.00 33.00 A O ATOM 387 502 -23.919 30.210 -14.145 1.00 39.39 A N ATOM 388 502 -25.231 30.722 -13.766 1.00 42.89 A C ATOM 389 502 -25.258 32.240 -13.896 1.00 41.99 A C ATOM 390 502 -26.305 30.104 -14.647 1.00 46.27 A C ATOM 391 502 -26.267 30.243 -15.868 1.00 47.27 A 0 ATOM 392 503 -27.251 29.414 -14.015 1.00 49.35 A N ATOM 393 503 -28.385 28.808 -14.707 1.00 53.23 A C ATOM 394 503 -28.315 27.281 -14.636 1.00 53.57 A C ATOM 395 503 -27.190 26.633 -15.425 1.00 56.31 A C ATOM 396 503 -27.325 25.113 -15.471 1.00 56.99 A C ATOM 397 503 -28.338 24.555 -15.041 1.00 57.97 A O ATOM 398 503 -26.305 24.441 -15.991 1.00 56.50 A N ATOM 399 503 -29.683 29.256 -14.048 1.00 55.13 A C ATOM 400 503 -29.988 28.845 -12.927 1.00 56.06 A O ATOM 401 504 -30.449 30.091 -14.744 1.00 56.99 A N ATOM 402 504 -31.757 30.473 -14.244 1.00 56.78 A C ATOM 403 504 -31.704 31.096 -12.863 1.00 56.53 A C ATOM 404 504 -32.463 30.711 -11.973 1.00 57.57 A O ATOM 405 505 -30.799 32.055 -12.680 1.00 55.20 A N ATOM 406 505 -30.714 32.760 -11.416 1.00 53.52 A C ATOM 407 505 -29.851 32.064 -10.381 1.00 53.23 A C ATOM 408 505 -29.381 32.699 -9.437 1.00 53.62 A O ATOM 409 506 -29.638 30.762 -10.548 1.00 50.84 A N ATOM 410 506 -28.827 29.998 -9.609 1.00 49.53 A C ATOM 411 506 -29.567 28.722 -9.183 1.00 51.74 A C ATOM 412 506 -30.536 28.905 -8.019 1.00 54.83 A C ATOM 413 506 -31.603 29.954 -8.324 1.00 59.19 A C ATOM 414 506 -32.608 30.090 -7.177 1.00 59.58 A C ATOM 415 506 -33.329 28.812 -6.895 1.00 58.69 A N ATOM 416 506 -27.464 29.627 -10.190 1.00 46.30 A C ATOM 417 506 -27.327 29.456 -11.397 1.00 46.29 A O ATOM 418 507 -26.459 29.504 -9.329 1.00 41.66 A N ATOM 419 507 -25.161 28.990 -9.749 1.00 36.60 A C ATOM 420 507 -24.042 29.594 -8.901 1.00 34.82 A C

4

ATOM 421 507 -23.892 31.114 -8.941 1.00 35.36 A C ATOM 422 507 -22.759 31.532 -8.016 1.00 35.13 A C ATOM 423 507 -23.625 31.576 -10.363 1.00 30.11 A C ATOM 424 507 -25.127 27.473 -9.623 1.00 34.72 A C ATOM 425 507 -25.651 26.910 -8.657 1.00 33.92 A O ATOM 426 508 -24.524 26.812 -10.607 1.00 31.44 A N ATOM 427 508 -24.238 25.392 -10.492 1.00 29.22 A C ATOM 428 508 -25.036 24.556 -11.505 1.00 31.89 A C ATOM 429 508 -26.513 24.933 -11.437 1.00 30.81 A C ATOM 430 508 -24.469 24.744 -12.895 1.00 29.53 A C ATOM 431 508 -22.761 25.132 -10.724 1.00 28.89 A C ATOM 432 508 -22.026 26.009 -11.192 1.00 26.69 A O ATOM 433 509 -22.344 23.913 -10.401 1.00 26.50 A N ATOM 434 509 -20.943 23.519 -10.431 1.00 26.63 A C ATOM 435 509 -20.710 22.485 -11.523 1.00 26.83 A C ATOM 436 509 -21.233 21.372 -11.446 1.00 27.38 A O ATOM 937 509 -20.572 22.924 -9.076 1.00 27.35 A C ATOM 438 509 -18.841 22.425 -8.815 1.00 29.68 A S ATOM 439 510 -19.921 22.847 -12.530 1.00 26.66 A N ATOM 440 510 -19.559 21.915 -13.600 1.00 25.83 A C ATOM 441 510 -19.838 22.546 -14.973 1.00 24.38 A C ATOM 442 510 -19.589 21.595 -16.148 1.00 26.06 A C ATOM 443 510 -19.798 22.278 -17.504 1.00 24.80 A C ATOM 444 510 -21.158 22.782 -17.661 1.00 25.36 A N ATOM 445 510 -22.193 22.037 -18.049 1.00 28.22 A C ATOM 446 510 -23.397 22.581 -18.166 1.00 26.65 A N ATOM 447 510 -22.028 20.747 -18.320 1.00 24.05 A N ATOM 448 510 -18.084 21.521 -13.518 1.00 25.64 A C ATOM 449 510 -17.207 22.389 -13.530 1.00 27.40 A O ATOM 450 511 -17.812 20.220 -13.439 1.00 24.50 A N ATOM 451 511 -16.436 19.712 -13.462 1.00 23.75 A C ATOM 452 511 -16.218 18.716 -12.321 1.00 23.65 A C ATOM 453 511 -16.131 19.033 -14.794 1.00 24.97 A C ATOM 454 511 -17.015 18.413 -15.387 1.00 23.22 A 0 ATOM 455 512 -14.872 19.135 -15.233 1.00 24.16 A N ATOM 456 512 -14.435 18.679 -16.559 1.00 24.87 A C ATOM 457 512 -13.774 19.837 -17.323 1.00 25.25 A C

4 1

ATOM 458 512 -14.711 20.953 -17.660 1.00 25.82 A C ATOM 459 512 -14.982 22.115 -17.021 1.00 26.89 A C ATOM 460 512 -15.507 20.939 -18.785 1.00 27.87 A N ATOM 461 512 -16.229 22.046 -18.825 1.00 28.93 A C ATOM 462 512 -15.929 22.776 -17.766 1.00 30.14 A N ATOM 463 512 -13.440 17.518 -16.503 1.00 25.39 A C ATOM 464 512 -12.452 17.570 -15.762 1.00 24.51 A O ATOM 465 513 -13.688 16.491 -17.313 1.00 23.79 A N ATOM 466 513 -12.757 15.378 -17.459 1.00 24.72 A C ATOM 467 513 -13.447 14.196 -18.155 1.00 21.47 A C ATOM 468 513 -12.676 12.888 -17.998 1.00 25.11 A C ATOM 469 513 -11.857 12.740 -17.087 1.00 26.09 A O ATOM 470 513 -12.943 11.927 -18.887 1.00 20.32 A N ATOM 471 513 -11.558 15.839 -18.285 1.00 23.06 A C ATOM 472 513 -11.572 16.930 -18.843 1.00 23.75 A O ATOM 473 514 -10.523 15.010 -18.359 1.00 23.46 A N ATOM 474 514 -9.342 15.331 -19.170 1.00 24.44 A C ATOM 475 514 -8.116 15.505 -18.268 1.00 21.96 A C ATOM 476 514 -9.066 14.247 -20.203 1.00 24.29 A C ATOM 477 514 -9.501 13.107 -20.041 1.00 24.54 A 0 ATOM 478 515 -8.340 14.608 -21.261 1.00 25.86 A N ATOM 479 515 -7.806 13.632 -22.218 1.00 25.71 A C ATOM 480 515 -6.761 14.313 -23.116 1.00 27.88 A C ATOM 481 515 -6.124 13.397 -24.134 1.00 28.53 A C ATOM 482 515 -6.818 13.006 -25.270 1.00 29.33 A C ATOM 483 515 -4.827 12.936 -23.956 1.00 31.17 A C ATOM 484 515 -6.234 12.171 -26.216 1.00 30.11 A C ATOM 485 515 -4.231 12.098 -24.897 1.00 32.87 A C ATOM 486 515 -4.936 11.714 -26.030 1.00 30.57 A C ATOM 487 515 -7.170 12.973 -21.446 1.00 25.67 A C ATOM 488 515 -6.333 12.692 -20.570 1.00 25.88 A 0 ATOM 489 516 -7.589 11.297 -21.745 1.00 25.26 A N ATOM 490 516 -6.993 10.089 -21.095 1.00 25.89 A C ATOM 491 516 -7.556 9.730 -19.725 1.00 28.02 A C ATOM 492 516 -7.309 8.634 -19.228 1.00 29.41 A 0 ATOM 493 517 -8.310 10.641 -19.112 1.00 27.77 A N ATOM 494 517 -8.722 10.457 -17.727 1.00 28.63 A C

4 2

ATOM 495 517 -9.994 9.571 -17.617 1.00 29.61 A C ATOM 496 517 -10.494 9.178 -18.629 1.00 29.48 A O ATOM 497 518 -10.385 9.296 -16.408 1.00 28.88 A N ATOM 498 518 -11.479 8.292 -16.278 1.00 30.08 A C ATOM 499 518 -11.096 7.152 -15.325 1.00 33.06 A C ATOM 500 518 -10.923 7.562 -13.883 1.00 41.55 A C ATOM 501 518 -9.561 8.160 -13.614 1.00 48.72 A C ATOM 502 518 -8.719 8.183 -14.546 1.00 50.19 A O ATOM 503 518 -9.332 8.607 -12.467 1.00 53.68 A 0 ATOM 504 518 -12.779 8.931 -15.818 1.00 28.72 A C ATOM 505 518 -13.720 8.233 -15.443 1.00 29.04 A O ATOM 506 519 -12.836 10.257 -15.862 1.00 26.44 A N ATOM 507 519 -19.033 10.951 -15.430 1.00 25.99 A C ATOM 508 519 -13.808 11.639 -14.099 1.00 25.37 A C ATOM 509 519 -12.808 11.386 -13.429 1.00 24.07 A 0 ATOM 510 520 -14.738 12.507 -13.715 1.00 24.24 A N ATOM 511 520 -14.545 13.374 -12.557 1.00 24.20 A C ATOM 512 520 -14.047 14.770 -12.988 1.00 25.35 A C ATOM 513 520 -12.750 14.643 -13.781 1.00 23.69 A C ATOM 514 520 -15.114 15.454 -13.824 1.00 21.19 A C ATOM 515 520 -15.852 13.561 -11.800 1.00 24.80 A C ATOM 516 520 -16.920 13.207 -12.302 1.00 25.48 A 0 ATOM 517 521 -15.754 14.121 -10.596 1.00 23.24 A N ATOM 518 521 -16.922 14.530 -9.821 1.00 23.59 A C ATOM 519 521 -16.902 13.893 -8.430 1.00 24.30 A C ATOM 520 521 -16.985 12.392 -8.457 1.00 26.30 A C ATOM 521 521 -15.833 11.620 -8.533 1.00 25.03 A C ATOM 522 521 -15.901 10.243 -8.597 1.00 29.75 A C ATOM 523 521 -18.216 11.746 -8.440 1.00 23.79 A C ATOM 524 521 -18.296 10.368 -8.505 1.00 28.16 A C ATOM 525 521 -17.133 9.624 -8.587 1.00 30.47 A C ATOM 526 521 -17.196 8.259 -8.694 1.00 35.15 A 0 ATOM 527 521 -16.945 16.037 -9.650 1.00 23.08 A C ATOM 528 521 -15.898 16.666 -9.504 1.00 22.54 A 0 ATOM 529 522 -18.142 16.611 -9.660 1.00 23.04 A N

ATOM 530 522 -18.314 18.005 -9.283 1.00 22.28 A C ATOM 531 522 -19.336 18.685 -10.201 1.00 23.30 A C

4

ATOM 532 522 -18.803 18.016 -7.843 1.00 23.52 A C ATOM 533 522 -19.561 17.132 -7.431 1.00 22.23 A 0 ATOM 534 523 -18.358 19.004 -7.074 1.00 23.79 A N ATOM 535 523 -18.714 19.078 -5.665 1.00 23.56 A C ATOM 536 523 -17.537 18.639 -4.779 1.00 26.23 A C ATOM 537 523 -17.959 18.618 -3.306 1.00 21.95 A C ATOM 538 523 -17.083 17.237 -5.193 1.00 24.93 A C ATOM 539 523 -15.614 17.139 -5.452 1.00 24.24 A C ATOM 540 523 -19.112 20.500 -5.303 1.00 26.24 A C ATOM 541 523 -18.282 21.408 -5.298 1.00 28.35 A O ATOM 542 524 -20.393 20.690 -5.013 1.00 24.72 A N ATOM 543 524 -20.902 22.004 -4.658 1.00 24.50 A C ATOM 544 524 -22.279 22.214 -5.295 1.00 23.50 A C ATOM 545 524 -20.999 22.141 -3.140 1.00 24.77 A C ATOM 596 524 -21.254 21.170 -2.435 1.00 26.27 A 0 ATOM 547 525 -20.784 23.352 -2.646 1.00 26.08 A N ATOM 598 525 -21.076 23.684 -1.259 1.00 25.79 A C ATOM 599 525 -19.931 24.513 -0.678 1.00 26.10 A C ATOM 550 525 -19.969 24.682 0.825 1.00 27.35 A C ATOM 551 525 -19.724 23.367 1.575 1.00 26.86 A C ATOM 552 525 -19.572 23.634 3.001 1.00 26.08 A N ATOM 553 525 -19.631 22.720 3.963 1.00 28.22 A C ATOM 554 525 -19.480 23.097 5.225 1.00 24.72 A N ATOM 555 525 -19.838 21.436 3.671 1.00 28.59 A N ATOM 556 525 -22.374 24.492 -1.259 1.00 26.55 A C ATOM 557 525 -22.457 25.555 -1.877 1.00 27.38 A 0 ATOM 558 526 -23.393 23.973 -0.585 1.00 27.37 A N ATOM 559 526 -24.727 24.557 -0.635 1.00 27.20 A C ATOM 560 526 -25.155 25.053 0.749 1.00 28.67 A C ATOM 561 526 -25.183 24.282 1.709 1.00 27.15 A O ATOM 562 526 -25.722 23.512 -1.124 1.00 28.62 A C ATOM 563 526 -25.404 22.884 -2.801 1.00 28.40 A S ATOM 564 527 -25.496 26.333 0.850 1.00 27.75 A N ATOM 565 527 -25.764 26.923 2.153 1.00 30.68 A C ATOM 566 527 -27.111 27.637 2.230 1.00 30.03 A C ATOM 567 527 -27.672 28.049 1.213 1.00 29.33 A O ATOM 568 527 -24.653 27.907 2.519 1.00 30.20 A C

4 4

ATOM 569 527 -22.945 27.315 2.258 1.00 34.88 A S ATOM 570 528 -27.626 27.777 3.448 1.00 31.45 A N ATOM 571 528 -28.801 28.604 3.688 1.00 33.88 A C ATOM 572 528 -29.615 28.058 4.862 1.00 31.33 A C ATOM 573 528 -30.103 26.630 4.633 1.00 31.88 A C ATOM 574 528 -30.984 26.179 5.793 1.00 28.76 A C ATOM 575 528 -30.858 26.576 3.317 1.00 29.32 A C ATOM 576 528 -28.361 30.026 3.979 1.00 36.14 A C ATOM 577 528 -27.762 30.311 5.014 1.00 36.49 A O ATOM 578 529 -28.652 30.914 3.042 1.00 40.20 A N ATOM 579 529 -28.208 32.292 3.135 1.00 45.03 A C ATOM 580 529 -26.956 32.491 2.272 1.00 43.96 A C ATOM 581 529 -26.141 33.767 2.499 1.00 45.14 A C ATOM 582 529 -25.404 33.667 3.822 1.00 45.34 A C ATOM 583 529 -25.146 33.956 1.368 1.00 45.47 A C ATOM 584 529 -29.348 33.181 2.638 1.00 48.10 A C ATOM 585 529 -29.527 33.369 1.431 1.00 48.79 A O ATOM 586 530 -30.144 33.726 3.570 1.00 48.91 A N ATOM 587 530 -29.972 33.547 5.021 1.00 48.98 A C ATOM 588 530 -31.254 34.638 3.259 1.00 50.42 A C ATOM 589 530 -31.955 34.819 4.603 1.00 49.24 A C ATOM 590 530 -30.872 34.610 5.604 1.00 50.12 A C ATOM 591 530 -30.773 35.972 2.687 1.00 49.69 A C ATOM 592 530 -29.729 36.488 3.080 1.00 48.57 A 0 ATOM 593 531 -31.544 36.527 1.759 1.00 52.50 A N ATOM 594 531 -31.225 37.830 1.182 1.00 54.58 A C ATOM 595 531 -31.325 38.929 2.247 1.00 57.89 A C ATOM 596 531 -32.722 39.160 2.811 1.00 62.33 A C ATOM 597 531 -32.754 40.294 3.831 1.00 65.19 A C ATOM 598 531 -32.220 41.381 3.590 1.00 66.51 A O ATOM 599 531 -33.378 40.043 4.978 1.00 64.89 A N ATOM 600 531 -29.820 37.843 0.586 1.00 53.73 A C ATOM 601 531 -29.021 38.734 0.882 1.00 54.88 A O ATOM 602 532 -29.518 36.858 -0.250 1.00 50.22 A N ATOM 603 532 -28.234 36.828 -0.933 1.00 48.20 A C ATOM 604 532 -27.514 35.525 -0.626 1.00 46.39 A C ATOM 605 532 -28.404 36.991 -2.993 1.00 47.17 A C

4

ATOM 606 532 -29.324 36.432 -3.043 1.00 45.39 A 0 ATOM 607 533 -27.520 37.772 -3.052 1.00 46.61 A N ATOM 608 533 -27.359 37.735 -4.500 1.00 45.24 A C ATOM 609 533 -27.689 39.097 -5.130 1.00 48.68 A C ATOM 610 533 -27.745 39.039 -6.657 1.00 52.76 A C ATOM 611 533 -27.459 38.001 -7.259 1.00 55.43 A 0 ATOM 612 533 -28.117 40.154 -7.286 1.00 54.40 A N ATOM 613 533 -25.910 37.372 -4.781 1.00 42.36 A C ATOM 614 533 -25.004 38.166 -4.540 1.00 41.25 A 0 ATOM 615 534 -25.694 36.162 -5.278 1.00 40.03 A N ATOM 616 534 -24.346 35.706 -5.572 1.00 38.85 A C ATOM 617 534 -29.139 35.637 -7.076 1.00 38.60 A C ATOM 618 534 -25.031 35.215 -7.812 1.00 38.28 A 0 ATOM 619 534 -24.104 34.322 -4.980 1.00 38.71 A C ATOM 620 534 -24.229 34.143 -3.170 1.00 39.99 A S ATOM 621 535 -22.956 36.040 -7.525 1.00 35.57 A N ATOM 622 535 -22.642 36.029 -8.943 1.00 35.87 A C ATOM 623 535 -22.807 37.438 -9.523 1.00 34.93 A C ATOM 624 535 -22.034 38.375 -8.795 1.00 37.31 A 0 ATOM 625 535 -21.220 35.528 -9.168 1.00 34.87 A C ATOM 626 535 -20.364 35.643 -8.287 1.00 34.76 A 0 ATOM 627 536 -20.975 34.966 -10.347 1.00 32.81 A N

ATOM 628 536 -19.659 34.444 -10.681 1.00 32.05 A C ATOM 629 536 -19.752 33.158 -11.524 1.00 33.02 A C ATOM 630 536 -18.353 32.630 -11.817 1.00 31.62 A C ATOM 631 536 -20.555 32.116 -10.787 1.00 37.22 A C ATOM 632 536 -18.871 35.465 -11.479 1.00 32.35 A C ATOM 633 536 -19.395 36.083 -12.406 1.00 32.68 A 0 ATOM 634 537 -17.603 35.631 -11.129 1.00 32.15 A N ATOM 635 537 -16.743 36.550 -11.854 1.00 32.62 A C ATOM 636 537 -16.430 37.757 -10.974 1.00 32.90 A C ATOM 637 537 -17.657 38.492 -10.534 1.00 38.48 A C ATOM 638 537 -18.536 38.238 -9.534 1.00 39.02 A C ATOM 639 537 -18.153 39.587 -11.211 1.00 39.06 A N ATOM 640 537 -19.285 39.973 -10.650 1.00 40.38 A C ATOM 641 537 -19.540 39.171 -9.630 1.00 41.12 A N ATOM 642 537 -15.482 35.829 -12.268 1.00 31.22 A C

4

ATOM 643 537 -14.825 35.197 -11.446 1.00 32.87 A O ATOM 644 538 -15.160 35.923 -13.553 1.00 30.02 A N ATOM 645 538 -14.130 35.092 -14.162 1.00 28.85 A C ATOM 696 538 -14.745 34.189 -15.259 1.00 30.20 A C ATOM 647 538 -15.658 33.264 -14.652 1.00 29.62 A O ATOM 648 538 -13.658 33.417 -16.011 1.00 26.80 A C ATOM 649 538 -13.027 35.934 -14.786 1.00 27.41 A C ATOM 650 538 -13.290 37.001 -15.330 1.00 26.94 A O ATOM 651 539 -11.793 35.453 -14.704 1.00 26.67 A N ATOM 652 539 -10.713 36.017 -15.502 1.00 26.84 A C ATOM 653 539 -9.722 36.757 -14.617 1.00 27.43 A C ATOM 654 539 -10.010 34.901 -16.258 1.00 27.34 A C ATOM 655 539 -9.800 33.806 -15.727 1.00 29.03 A O ATOM 656 540 -9.645 35.168 -17.518 1.00 25.34 A N ATOM 657 540 -9.835 36.482 -18.162 1.00 26.90 A C ATOM 658 540 -9.058 34.190 -18.434 1.00 25.56 A C ATOM 659 540 -9.227 34.841 -19.804 1.00 25.71 A C ATOM 660 540 -9.165 36.312 -19.505 1.00 27.40 A C ATOM 661 540 -7.595 33.907 -18.126 1.00 27.52 A C ATOM 662 540 -6.923 34.699 -17.463 1.00 27.04 A O ATOM 663 541 -7.075 32.783 -18.636 1.00 27.53 A N ATOM 664 541 -7.795 31.778 -19.435 1.00 28.31 A C ATOM 665 541 -5.650 32.969 -18.522 1.00 29.99 A C ATOM 666 541 -5.458 31.318 -19.510 1.00 26.51 A C ATOM 667 541 -6.794 30.658 -19.562 1.00 28.03 A C ATOM 668 541 -4.788 33.676 -18.875 1.00 32.23 A C ATOM 669 541 -5.053 34.382 -19.898 1.00 30.35 A 0 ATOM 670 542 -3.759 33.910 -18.070 1.00 35.43 A N ATOM 671 542 -2.864 35.034 -18.290 1.00 39.68 A C ATOM 672 542 -3.169 36.142 -17.298 1.00 41.32 A C ATOM 673 542 -1.929 34.572 -18.125 1.00 41.82 A C ATOM 674 542 -1.077 33.982 -17.108 1.00 43.83 A O ATOM 675 543 -0.603 34.838 -19.125 1.00 44.83 A N ATOM 676 543 0.816 34.523 -19.033 1.00 48.00 A C ATOM 677 543 1.461 34.625 -20.418 1.00 52.56 A C ATOM 678 543 2.492 33.547 -20.715 1.00 57.96 A C ATOM 679 543 1.858 32.227 -21.120 1.00 61.23 A C

4

ATOM 680 543 1.824 31.303 -20.277 1.00 62.99 A O ATOM 681 543 1.396 32.113 -22.283 1.00 63.66 A 0 ATOM 682 543 1.463 35.530 -18.082 1.00 47.94 A C ATOM 683 543 2.038 36.525 -18.520 1.00 49.36 A 0 ATOM 684 544 1.359 35.274 -16.781 1.00 45.85 A N ATOM 685 544 1.827 36.223 -15.780 1.00 43.79 A C ATOM 686 544 0.678 37.126 -15.346 1.00 92.96 A C ATOM 687 544 2.418 35.508 -14.564 1.00 44.20 A C ATOM 688 544 1.998 34.402 -14.210 1.00 42.82 A O ATOM 689 545 3.392 36.148 -13.926 1.00 43.11 A N ATOM 690 545 4.054 35.566 -12.767 1.00 42.80 A C ATOM 691 545 5.198 36.469 -12.297 1.00 44.06 A C ATOM 692 545 6.381 36.204 -13.028 1.00 49.18 A O ATOM 693 545 3.082 35.350 -11.621 1.00 40.92 A C ATOM 694 545 3.159 34.344 -10.917 1.00 41.59 A O ATOM 695 546 2.171 36.297 -11.435 1.00 37.26 A N ATOM 696 546 1.224 36.224 -10.337 1.00 37.49 A C ATOM 697 546 0.851 37.631 -9.869 1.00 36.04 A C ATOM 698 546 1.973 38.326 -9.119 1.00 37.71 A C ATOM 699 546 1.626 40.049 -8.851 1.00 38.80 A S ATOM 700 546 2.137 40.710 -10.406 1.00 47.70 A C ATOM 701 546 -0.028 35.451 -10.718 1.00 37.16 A C ATOM 702 546 -1.076 35.596 -10.083 1.00 37.19 A O ATOM 703 547 0.091 34.630 -11.757 1.00 36.79 A N ATOM 704 547 -0.994 33.747 -12.136 1.00 35.87 A C ATOM 705 547 -2.212 34.481 -12.659 1.00 36.73 A C ATOM 706 547 -2.119 35.599 -13.168 1.00 36.47 A O ATOM 707 548 -3.366 33.840 -12.536 1.00 35.43 A N ATOM 708 548 -4.617 34.407 -13.017 1.00 35.74 A C ATOM 709 548 -5.403 33.365 -13.841 1.00 37.13 A C ATOM 710 548 -4.580 32.892 -14.914 1.00 39.98 A O ATOM 711 548 -6.664 33.976 -14.416 1.00 38.25 A C ATOM 712 548 -5.442 34.817 -11.808 1.00 34.88 A C ATOM 713 548 -5.597 34.041 -10.866 1.00 36.02 A O ATOM 714 549 -5.971 36.033 -11.831 1.00 33.45 A N ATOM 715 549 -6.562 36.607 -10.632 1.00 34.68 A C ATOM 716 549 -5.574 37.580 -9.975 1.00 34.64 A C

4

ATOM 717 549 -4.158 37.005 -9.856 1.00 37.46 A C ATOM 718 549 -3.155 38.035 -9.350 1.00 35.98 A C ATOM 719 549 -3.201 38.159 -7.901 1.00 35.43 A N ATOM 720 549 -2.454 37.440 -7.069 1.00 34.21 A C ATOM 721 549 -2.566 37.618 -5.760 1.00 30.15 A N ATOM 722 549 -1.593 36.545 -7.546 1.00 32.58 A N ATOM 723 549 -7.859 37.329 -10.947 1.00 34.29 A C ATOM 724 549 -7.990 37.968 -11.986 1.00 34.98 A 0 ATOM 725 550 -8.818 37.221 -10.040 1.00 33.25 A N ATOM 726 550 -10.054 37.970 -10.147 1.00 33.71 A C ATOM 727 550 -11.130 37.161 -10.914 1.00 33.51 A C ATOM 728 550 -11.547 35.936 -10.103 1.00 30.56 A C ATOM 729 550 -12.329 38.043 -11.222 1.00 32.51 A C ATOM 730 550 -10.530 38.244 -8.727 1.00 36.76 A C ATOM 731 550 -10.261 37.460 -7.812 1.00 36.18 A 0 ATOM 732 551 -11.222 39.358 -8.530 1.00 38.93 A N ATOM 733 551 -11.719 39.683 -7.200 1.00 43.33 A C ATOM 734 551 -10.779 40.675 -6.506 1.00 46.64 A C ATOM 735 551 -10.856 42.067 -7.050 1.00 52.46 A C ATOM 736 551 -10.404 42.597 -8.212 1.00 54.58 A C ATOM 737 551 -11.460 43.101 -6.365 1.00 54.96 A N ATOM 738 551 -11.377 44.208 -7.082 1.00 56.62 A C ATOM 739 551 -10.741 43.930 -8.207 1.00 57.00 A N ATOM 740 551 -13.128 40.256 -7.262 1.00 43.49 A C ATOM 741 551 -13.585 40.702 -8.313 1.00 42.88 A O ATOM 742 552 -13.815 40.229 -6.128 1.00 44.34 A N ATOM 743 552 -15.158 40.771 -6.045 1.00 47.65 A C ATOM 744 552 -15.074 42.292 -5.943 1.00 51.08 A C ATOM 745 552 -14.612 42.830 -4.937 1.00 50.38 A 0 ATOM 746 552 -15.875 40.193 -4.824 1.00 44.92 A C ATOM 747 552 -15.982 38.371 -4.816 1.00 44.45 A S ATOM 748 553 -15.518 42.979 -6.990 1.00 55.41 A N ATOM 749 553 -15.266 44.410 -7.120 1.00 60.41 A C ATOM 750 553 -14.882 44.748 -8.565 1.00 63.13 A C ATOM 751 553 -15.927 44.379 -9.572 1.00 68.52 A C ATOM 752 553 -16.781 45.144 -10.294 1.00 70.80 A C ATOM 753 553 -16.187 43.073 -9.932 1.00 71.80 A N

4

ATOM 754 553 -17.155 43.049 -10.831 1.00 71.80 A C ATOM 755 553 -17.533 44.293 -11.068 1.00 72.09 A N ATOM 756 553 -16.442 45.282 -6.685 1.00 60.90 A C ATOM 757 553 -16.292 46.491 -6.524 1.00 62.29 A O ATOM 758 554 -17.609 44.677 -6.497 1.00 61.02 A N ATOM 759 554 -18.792 45.442 -6.120 1.00 61.69 A C ATOM 760 554 -20.062 44.695 -6.527 1.00 62.40 A C ATOM 761 554 -20.209 44.514 -8.030 1.00 64.68 A C ATOM 762 554 -21.696 44.278 -8.452 1.00 66.14 A C ATOM 763 554 -22.313 43.371 -7.952 1.00 66.12 A O ATOM 764 554 -22.133 45.100 -9.379 1.00 66.69 A N ATOM 765 554 -18.831 45.747 -4.628 1.00 61.75 A C ATOM 766 554 -18.285 45.002 -3.813 1.00 61.46 A 0 ATOM 767 555 -19.488 46.850 -4.281 1.00 61.73 A N ATOM 768 555 -19.517 47.338 -2.907 1.00 61.26 A C ATOM 769 555 -20.092 48.756 -2.869 1.00 64.04 A C ATOM 770 555 -19.903 49.452 -1.534 1.00 67.91 A C ATOM 771 555 -18.440 49.524 -1.132 1.00 71.48 A C ATOM 772 555 -17.700 50.401 -1.586 1.00 73.49 A O ATOM 773 555 -18.012 48.595 -0.279 1.00 71.05 A N ATOM 774 555 -20.336 46.437 -1.984 1.00 59.47 A C ATOM 775 555 -21.532 46.235 -2.199 1.00 58.75 A O ATOM 776 556 -19.683 45.907 -0.953 1.00 57.33 A N ATOM 777 556 -20.378 45.081 0.019 1.00 55.06 A C ATOM 778 556 -20.304 43.591 -0.268 1.00 53.72 A C ATOM 779 556 -20.687 42.770 0.566 1.00 53.32 A O ATOM 780 557 -19.809 43.233 -1.446 1.00 51.42 A N ATOM 781 557 -19.772 41.834 -1.841 1.00 49.50 A C ATOM 782 557 -19.655 41.721 -3.367 1.00 51.95 A C ATOM 783 557 -20.930 42.035 -4.092 1.00 56.53 A C ATOM 784 557 -21.535 41.427 -5.141 1.00 56.76 A C ATOM 785 557 -21.752 43.085 -3.733 1.00 57.67 A N ATOM 786 557 -22.807 43.110 -4.528 1.00 55.39 A C ATOM 787 557 -22.700 42.115 -5.391 1.00 58.10 A N ATOM 788 557 -18.633 41.089 -1.151 1.00 45.78 A C ATOM 789 557 -17.560 41.647 -0.920 1.00 45.56 A 0 ATOM 790 558 -18.892 39.829 -0.812 1.00 41.36 A N

4

ATOM 791 558 -17.934 38.982 -0.108 1.00 37.02 A C ATOM 792 558 -18.500 38.521 1.244 1.00 37.11 A C ATOM 793 558 -17.454 37.737 1.998 1.00 37.46 A C ATOM 794 558 -18.964 39.721 2.050 1.00 39.30 A C ATOM 795 558 -17.628 37.736 -0.930 1.00 35.05 A C ATOM 796 558 -18.538 37.112 -1.475 1.00 34.44 A O ATOM 797 559 -16.351 37.373 -1.009 1.00 33.22 A N ATOM 798 559 -15.934 36.175 -1.732 1.00 31.06 A C ATOM 799 559 -14.440 36.250 -2.039 1.00 29.73 A C ATOM 800 559 -13.822 34.965 -2.596 1.00 29.66 A C ATOM 801 559 -14.328 34.731 -4.025 1.00 27.03 A C ATOM 802 559 -12.300 35.079 -2.575 1.00 28.88 A C ATOM 803 559 -16.220 34.929 -0.892 1.00 31.01 A C ATOM 804 559 -15.760 34.829 0.245 1.00 31.89 A O ATOM 805 560 -16.976 33.984 -1.447 1.00 28.29 A N ATOM 806 560 -17.335 32.777 -0.707 1.00 27.77 A C ATOM 807 560 -18.862 32.532 -0.728 1.00 27.86 A C ATOM 808 560 -19.302 32.333 -2.080 1.00 29.50 A O ATOM 809 560 -19.602 33.721 -0.117 1.00 24.95 A C ATOM 810 560 -16.649 31.518 -1.234 1.00 27.81 A C ATOM 811 560 -16.592 30.505 -0.544 1.00 27.32 A O ATOM 812 561 -16.149 31.579 -2.465 1.00 28.51 A N ATOM 813 561 -15.529 30.415 -3.067 1.00 26.65 A C ATOM 814 561 -14.728 30.746 -4.312 1.00 28.09 A C ATOM 815 561 -15.044 31.696 -5.035 1.00 29.85 A O ATOM 816 562 -13.684 29.960 -4.555 1.00 26.78 A N ATOM 817 562 -12.860 30.109 -5.745 1.00 28.08 A C ATOM 818 562 -12.868 28.802 -6.535 1.00 28.91 A C ATOM 819 562 -12.698 27.725 -5.965 1.00 29.35 A O ATOM 820 562 -11.414 30.444 -5.358 1.00 29.31 A C ATOM 821 562 -11.177 32.043 -4.523 1.00 30.67 A S ATOM 822 563 -13.060 28.903 -7.845 1.00 27.63 A N ATOM 823 563 -12.994 27.741 -8.721 1.00 27.76 A C ATOM 824 563 -14.372 27.442 -9.321 1.00 25.87 A C ATOM 825 563 -15.267 26.932 -8.341 1.00 29.15 A 0 ATOM 826 563 -11.991 27.990 -9.839 1.00 27.56 A C ATOM 827 563 -11.673 29.137 -10.157 1.00 28.34 A 0

4 1

ATOM 828 564 -11.506 26.912 -10.440 1.00 26.93 A N ATOM 829 564 -10.543 27.019 -11.531 1.00 28.10 A C ATOM 830 564 -9.121 27.017 -10.960 1.00 28.82 A C ATOM 831 564 -8.171 27.330 -11.957 1.00 33.70 A 0 ATOM 832 564 -10.697 25.845 -12.502 1.00 26.61 A C ATOM 833 564 -10.767 24.693 -12.083 1.00 27.41 A 0 ATOM 834 565 -10.744 26.139 -13.797 1.00 26.38 A N ATOM 835 565 -10.647 25.098 -14.814 1.00 24.40 A C ATOM 836 565 -11.995 24.894 -15.510 1.00 23.27 A C ATOM 837 565 -12.271 25.882 -16.603 1.00 24.99 A C ATOM 838 565 -12.022 25.831 -17.934 1.00 25.30 A C ATOM 839 565 -12.881 27.096 -16.375 1.00 25.00 A N ATOM 840 565 -12.994 27.752 -17.517 1.00 26.14 A C ATOM 841 565 -12.480 27.006 -18.479 1.00 24.33 A N ATOM 842 565 -9.589 25.467 -15.850 1.00 24.48 A C ATOM 843 565 -9.282 26.640 -16.046 1.00 25.19 A 0 ATOM 844 566 -9.029 24.463 -16.511 1.00 24.82 A N ATOM 845 566 -8.034 24.710 -17.547 1.00 25.49 A C ATOM 846 566 -6.618 24.503 -16.989 1.00 23.96 A C ATOM 847 566 -6.428 23.185 -16.298 1.00 24.74 A C ATOM 848 566 -6.786 22.864 -14.944 1.00 24.42 A C ATOM 849 566 -6.434 21.519 -14.729 1.00 23.95 A C ATOM 850 566 -7.369 23.586 -13.896 1.00 25.18 A C ATOM 851 566 -5.886 22.051 -16.828 1.00 23.05 A C ATOM 852 566 -5.887 21.046 -15.894 1.00 23.71 A N ATOM 853 566 -6.648 20.877 -13.508 1.00 25.70 A C ATOM 854 566 -7.578 22.951 -12.688 1.00 24.87 A C ATOM 855 566 -7.220 21.608 -12.503 1.00 25.51 A C ATOM 856 566 -8.267 23.796 -18.746 1.00 25.03 A C ATOM 857 566 -8.687 22.645 -18.595 1.00 24.33 A 0 ATOM 858 567 -7.990 24.318 -19.934 1.00 24.46 A N ATOM 859 567 -8.361 23.645 -21.170 1.00 25.18 A C ATOM 860 567 -8.547 24.685 -22.274 1.00 24.46 A C ATOM 861 567 -8.779 24.101 -23.646 1.00 24.68 A C ATOM 862 567- -9.514 25.058 -24.557 1.00 25.49 A C ATOM 863 567 -10.669 25.420 -24.233 1.00 26.55 A 0 ATOM 864 567 -8.939 25.449 -25.596 1.00 28.35 A 0

4 2

ATOM 865 567 -7.333 22.608 -21.604 1.00 26.33 A C ATOM 866 567 -7.683 21.517 -22.072 1.00 25.57 A 0 ATOM 867 568 -6.063 22.953 -21.453 1.00 26.79 A N ATOM 868 568 -4.991 22.112 -21.955 1.00 29.50 A C ATOM 869 568 -3.874 22.979 -22.571 1.00 28.46 A C ATOM 870 568 -2.660 22.109 -22.901 1.00 28.66 A C ATOM 871 568 -4.402 23.646 -23.842 1.00 24.39 A C ATOM 872 568 -4.428 21.223 -20.853 1.00 32.48 A C ATOM 873 568 -3.985 21.710 -19.818 1.00 31.74 A O ATOM 874 569 -4.465 19.914 -21.080 1.00 36.29 A N ATOM 875 569 -4.108 18.953 -20.047 1.00 41.85 A C ATOM 876 569 -4.360 17.520 -20.538 1.00 36.99 A C ATOM 877 569 -5.837 17.124 -20.604 1.00 31.58 A C ATOM 878 569 -6.534 17.605 -21.868 1.00 30.99 A C ATOM 879 569 -7.728 17.286 -22.050 1.00 31.44 A O ATOM 880 569 -5.893 18.299 -22.687 1.00 28.21 A O ATOM 881 569 -2.653 19.114 -19.603 1.00 48.32 A C ATOM 882 569 -1.767 19.363 -20.424 1.00 47.22 A O ATOM 883 570 -2.439 18.957 -18.295 1.00 55.96 A N ATOM 884 570 -1.185 19.278 -17.608 1.00 63.65 A C ATOM 885 570 0.027 18.894 -18.464 1.00 66.25 A C ATOM 886 570 0.493 17.475 -18.207 1.00 69.76 A C ATOM 887 570 0.436 17.039 -17.035 1.00 72.02 A O ATOM 888 570 0.915 16.798 -19.172 1.00 69.99 A 0 ATOM 889 570 -1.107 20.757 -17.236 1.00 67.13 A C ATOM 890 570 -0.426 21.538 -17.903 1.00 68.92 A 0 ATOM 891 571 -1.802 21.130 -16.161 1.00 69.67 A N ATOM 892 571 -1.922 22.532 -15.760 1.00 72.16 A C ATOM 893 571 -2.990 22.691 -14.664 1.00 71.90 A C ATOM 899 571 -2.707 22.122 -13.265 1.00 71.59 A C ATOM 895 571 -3.756 22.633 -12.289 1.00 70.61 A C ATOM 896 571 -2.709 20.598 -13.304 1.00 72.02 A C ATOM 897 571 -0.591 23.099 -15.259 1.00 73.82 A C ATOM 898 571 -0.554 24.116 -14.566 1.00 75.52 A 0 ATOM 899 577 4.838 27.651 -10.922 1.00 57.36 A N ATOM 900 577 6.223 27.162 -11.012 1.00 59.08 A C ATOM 901 577 4.535 28.186 -9.587 1.00 56.03 A C

4

ATOM 902 577 5.864 28.077 -8.836 1.00 56.74 A C ATOM 903 577 6.621 27.019 -9.563 1.00 58.87 A C ATOM 904 577 4.057 29.627 -9.671 1.00 53.74 A C ATOM 905 577 4.654 30.445 -10.365 1.00 55.21 A O ATOM 906 578 2.983 29.931 -8.956 1.00 4-9.44 A N ATOM 907 578 2.397 31.260 -9.002 1.00 46.13 . A C ATOM 908 578 0.859 31.179 -8.897 1.00 45.53 A C ATOM 909 578 0.260 32.570 -8.892 1.00 45.46 A C ATOM 910 578 0.308 30.370 -10.057 1.00 47.41 A C ATOM 911 578 2.933 32.114 -7.859 1.00 43.82 A C ATOM 912 578 2.958 31.671 -6.707 1.00 43.37 A O ATOM 913 579 3.365 33.331 -8.180 1.00 38.55 A N ATOM 914 579 3.764 34.284 -7.150 1.00 36.58 A C ATOM 915 579 4.586 35.429 -7.753 1.00 35.06 A C ATOM 916 579 5.926 35.086 -8.408 1.00 35.00 A C ATOM 917 579 6.668 36.379 -8.730 1.00 34.09 A C ATOM 918 579 6.758 34.216 -7.480 1.00 32.12 A C ATOM 919 579 2.524 34.856 -6.475 1.00 35.58 A C ATOM 920 579 1.469 34.997 -7.101 1.00 35.13 A O ATOM 921 580 2.658 35.196 -5.198 1.00 35.00 A N ATOM 922 580 1.539 35.720 -4.426 1.00 36.48 A C ATOM 923 580 1.224 37.154 -4.863 1.00 36.24 A C ATOM 924 580 2.223 38.184 -4.355 1.00 38.98 A C ATOM 925 580 2.105 39.507 -5.099 1.00 38.47 A C ATOM 926 580 2.801 40.584 -4.399 1.00 38.42 A N ATOM 927 580 3.303 41.662 -4.993 1.00 38.63 A C ATOM 928 580 3.917 42.593 -4.272 1.00 35.39 A N ATOM 929 580 3.196 41.807 -6.311 1.00 35.21 A N ATOM 930 580 0.299 34.839 -4.585 1.00 36.61 A C ATOM 931 580 -0.789 35.326 -4.901 1.00 36.06 A O ATOM 932 581 0.453 33.528 -4.351 1.00 37.30 A N ATOM 933 581 1.638 32.925 -3.717 1.00 36.85 A C ATOM 934 581 -0.611 32.544 -4.578 1.00 39.33 A C ATOM 935 581 0.051 31.211 -4.242 1.00 40.31 A C ATOM 936 581 1.147 31.569 -3.289 1.00 39.56 A C ATOM 937 581 -1.849 32.795 -3.724 1.00 40.79 A C ATOM 938 581 -2.935 32.322 -4.048 1.00 41.03 A O

4 4

ATOM 939 582 -1.684 33.538 -2.633 1.00 41.34 A N ATOM 940 582 -2.821 33.930 -1.809 1.00 43.35 A C ATOM 991 582 -2.391 34.085 -0.346 1.00 44.09 A C ATOM 942 582 -1.819' 32.811 0.257 1.00 48.45 A C ATOM 943 582 -0.916 33.106 1.448 1.00 52.04 A C ATOM 944 582 -0.250 31.901 1.942 1.00 55.65 A N ATOM 995 582 0.862 31.392 1.419 1.00 58.45 A C ATOM 996 582 1.396 30.291 1.935 1.00 59.76 A N ATOM 947 582 1.942 31.979 0.378 1.00 59.55 A N ATOM 998 582 -3.411 35.243 -2.315 1.00 44.15 A C ATOM 949 582 -2.684 36.190 -2.612 1.00 45.85 A O ATOM 950 583 -4.731 35.301 -2.412 1.00 43.03 A N ATOM 951 583 -5.352 36.495 -2.937 1.00 44.47 A C ATOM 952 583 -5.441 37.589 -1.896 1.00 47.04 A C ATOM 953 583 -5.458 37.320 -0.696 1.00 47.38 A O ATOM 954 584 -5.491 38.833 -2.355 1.00 47.91 A N ATOM 955 584 -5.956 39.915 -1.513 1.00 50.00 A C ATOM 956 584 -5.981 41.225 -2.302 1.00 54.25 A C ATOM 957 584 -4.604 41.807 -2.565 1.00 60.44 A C ATOM 958 584 -3.902 42.226 -1.286 1.00 65.17 A C ATOM 959 584 -4.440 43.010 -0.499 1.00 68.24 A O ATOM 960 584 -2.697 41.703 -1.068 1.00 66.44 A N ATOM 961 584 -7.361 39.548 -1.057 1.00 49.41 A C ATOM 962 584 -8.005 38.675 -1.640 1.00 48.96 A O ATOM 963 585 -7.858 40.204 -0.002 1.00 49.04 A N ATOM 964 585 -7.320 41.365 0.727 1.00 48.81 A C ATOM 965 585 -9.199 39.839 0.453 1.00 47.47 A C ATOM 966 585 -9.475 40.806 1.602 1.00 48.68 A C ATOM 967 585 -8.538 41.942 1.384 1.00 49.88 A C ATOM 968 585 -10.210 39.955 -0.677 1.00 45.46 A C ATOM 969 585 -10.194 40.922 -1.441 1.00 45.47 A O ATOM 970 586 -11.073 38.953 -0.789 1.00 42.42 A N ATOM 971 586 -12.076 38.905 -1.836 1.00 39.41 A C ATOM 972 586 -12.928 40.174 -1.818 1.00 39.50 A C ATOM 973 586 -13.822 40.255 -0.595 1.00 43.25 A C ATOM 974 586 -14.272 39.236 -0.072 1.00 39.56 A 0 ATOM 975 586 -14.080 41.473 -0.128 1.00 44.78 A N

4

ATOM 976 586 -11.481 38.706 -3.226 1.00 36.56 A C ATOM 977 586 -12.121 39.032 -4.222 1.00 37.07 A 0 ATOM 978 587 -10.266 38.163 -3.287 1.00 34.14 A N ATOM 979 587 -9.629 37.824 -4.563 1.00 33.02 A C ATOM 980 587 -8.337 38.631 -4.731 1.00 34.05 A C ATOM 981 587 -7.551 38.349 -6.005 1.00 34.28 A C ATOM 982 587 -6.272 39.189 -6.099 1.00 37.58 A C ATOM 983 587 -6.142 40.061 -6.966 1.00 36.43 . A 0 ATOM 984 587 -5.328 38.927 -5.209 1.00 34.03 A N ATOM 985 587 -9.316 36.325 -4.660 1.00 32.64 A C ATOM 986 587 -8.899 35.712 -3.679 1.00 31.40 A 0 ATOM 987 588 -9.523 35.750 -5.847 1.00 29.94 A N ATOM 988 588 -9.140 34.368 -6.138 1.00 29.32 A C ATOM 989 588 -7.901 34.316 -7.018 1.00 28.74 A C ATOM 990 588 -7.692 35.196 -7.850 1.00 30.51 A O ATOM 991 588 -10.256 33.644 -6.880 1.00 28.96 A C ATOM 992 588 -11.771 33.388 -5.926 1.00 34.01 A S ATOM 993 589 -7.106 33.263 -6.866 1.00 27.74 A N ATOM 999 589 -5.879 33.123 -7.644 1.00 28.03 A C ATOM 995 589 -4.644 33.387 -6.752 1.00 28.90 A C ATOM 996 589 -3.364 33.266 -7.568 1.00 28.12 A C ATOM 997 589 -4.750 34.780 -6.123 1.00 29.60 A C ATOM 998 589 -5.761 31.728 -8.273 1.00 29.72 A C ATOM 999 589 -5.867 30.718 -7.580 1.00 29.20 A 0 ATOM 1000 590 -5.540 31.679 -9.585 1.00 29.03 A N ATOM 1001 590 -5.365 30.401 -10.255 1.00 29.41 A C ATOM 1002 590 -4.067 30.331 -11.037 1.00 30.32 A C ATOM 1003 590 -3.375 31.335 -11.179 1.00 31.55 A O ATOM 1004 591 -3.732 29.151 -11.599 1.00 31.69 A N ATOM 1005 591 -2.535 28.989 -12.367 1.00 34.04 A C ATOM 1006 591 -2.343 27.516 -12.727 1.00 36.27 A C ATOM 1007 591 -2.045 26.649 -11.546 1.00 44.11 A C ATOM 1008 591 -2.848 25.856 -10.796 1.00 46.70 A C ATOM 1009 591 -0.788 26.561 -10.986 1.00 46.49 A N ATOM 1010 591 -0.830 25.754 -9.940 1.00 46.26 A C ATOM 1011 591 -2.069 25.313 -9.803 1.00 49.17 A N ATOM 1012 591 -2.614 29.830 -13.640 1.00 34.21 A C

4

ATOM 1013 591 -3.699 30.211 -14.077 1.00 32.59 A O ATOM 1014 592 -1.464 30.125 -14.234 1.00 33.67 A N ATOM 1015 592 -1.443 31.006 -15.393 1.00 36.88 A C ATOM 1016 592 -0.004 31.430 -15.716 1.00 39.26 A C ATOM 1017 592 0.995 30.303 -15.710 1.00 45.79 A C ATOM 1018 592 2.258 30.690 -16.456 1.00 50.53 A C ATOM 1019 592 3.009 31.749 -15.787 1.00 53.30 A N ATOM 1020 592 3.575 32.773 -16.420 1.00 55.13 A C ATOM 1021 592 4.247 33.693 -15.740 1.00 55.24 A N ATOM 1022 592 3.465 32.879 -17.738 1.00 57.78 A N ATOM 1023 592 -2.112 30.410 -16.634 1.00 35.10 A C ATOM 1024 592 -2.566 31.149 -17.506 1.00 35.39 A 0 ATOM 1025 593 -2.192 29.084 -16.709 1.00 34.62 A N ATOM 1026 593 -2.877 28.428 -17.823 1.00 33.78 A C ATOM 1027 593 -2.181 27.120 -18.189 1.00 36.33 A C ATOM 1028 593 -0.983 27.299 -19.098 1.00 46.12 A C ATOM 1029 593 0.219 27.845 -18.362 1.00 52.97 A C ATOM 1030 593 0.553 27.303 -17.284 1.00 55.60 A 0 ATOM 1031 593 0.828 28.818 -18.861 1.00 57.96 A 0 ATOM 1032 593 -4.350 28.135 -17.558 1.00 32.11 A C ATOM 1033 593 -5.019 27.525 -18.388 1.00 29.63 A 0 ATOM 1034 594 -4.855 28.559 -16.406 1.00 28.88 A N ATOM 1035 599 -6.236 28.267 -16.046 1.00 28.39 A C ATOM 1036 594 -6.283 27.571 -14.687 1.00 26.56 A C ATOM 1037 594 -7.092 29.528 -16.018 1.00 28.13 A C ATOM 1038 594 -6.584 30.637 -15.843 1.00 28.06 A 0 ATOM 1039 595 -8.396 29.358 -16.197 1.00 25.46 A N ATOM 1040 595 -9.335 30.416 -15.844 1.00 25.16 A C ATOM 1041 595 -10.656 30.226 -16.588 1.00 24.79 A C ATOM 1042 595 -10.490 30.436 -17.976 1.00 27.76 A 0 ATOM 1043 595 -9.580 30.372 -14.338 1.00 24.98 A C ATOM 1044 595 -9.479 29.312 -13.720 1.00 24.48 A 0 ATOM 1045 596 -9.891 31.524 -13.752 1.00 25.25 A N ATOM 1046 596 -10.212 31.601 -12.333 1.00 25.69 A C ATOM 1047 596 -9.165 32.467 -11.577 1.00 27.15 A C ATOM 1048 596 -9.259 33.923 -12.023 1.00 29.13 A C ATOM 1049 596 -9.375 32.349 -10.067 1.00 26.07 A C

4

ATOM 1087 602 -24.081 40.418 -1.637 1.00 47.94 A C ATOM 1088 602 -24.858 41.399 -2.518 1.00 51.93 A C ATOM 1089 602 -25.222 42.674 -1.826 1.00 58.56 A C ATOM 1090 602 -24.451 43.620 -1.237 1.00 60.81 A C ATOM 1091 602 -26.526 43.095 -1.678 1.00 60.77 A N ATOM 1092 602 -26.543 44.246 -1.028 1.00 62.59 A C ATOM 1093 602 -25.297 44.587 -0.749 1.00 62.85 A N ATOM 1094 602 -25.017 39.713 -0.661 1.00 48.23 A C ATOM 1095 602 -26.025 39.129 -1.063 1.00 45.88 A 0 ATOM 1096 603 -29.661 39.746 0.619 1.00 49.87 A N ATOM 1097 603 -25.450 39.089 1.653 1.00 52.49 A C ATOM 1098 603 -25.006 37.647 1.804 1.00 50.93 A C ATOM 1099 603 -25.287 39.829 2.975 1.00 53.94 A C ATOM 1100 603 -24.183 39.934 3.507 1.00 55.03 A O ATOM 1101 604 -26.394 40.340 3.530 1.00 55.31 A N ATOM 1102 604 -27.775 40.052 3.105 1.00 56.68 A C ATOM 1103 604 -26.399 41.196 4.721 1.00 55.19 A C ATOM 1104 604 -27.808 41.600 4.931 1.00 56.90 A C ATOM 1105 604 -28.600 40.510 4.278 1.00 57.49 A C ATOM 1106 604 -25.762 40.507 5.951 1.00 53.84 A C ATOM 1107 604 -26.291 39.504 6.429 1.00 53.50 A O ATOM 1108 605 -24.664 41.058 6.459 1.00 51.66 A N ATOM 1109 605 -24.084 40.547 7.683 1.00 49.75 A C ATOM 1110 605 -23.181 39.350 7.466 1.00 49.32 A C ATOM 1111 605 -22.695 38.750 8.426 1.00 49.78 A 0 ATOM 1112 606 -22.951 38.991 6.209 1.00 47.32 A N ATOM 1113 606 -22.048 37.888 5.919 1.00 45.14 A C ATOM 1114 606 -22.319 37.334 4.516 1.00 46.10 A C ATOM 1115 606 -21.432 36.150 4.128 1.00 46.60 A C ATOM 1116 606 -21.603 35.038 5.146 1.00 45.47 A C ATOM 1117 606 -21.794 35.665 2.731 1.00 47.85 A C. ATOM 1118 606 -20.599 38.351 6.015 1.00 43.35 A C ATOM 1119 606 -20.226 39.381 5.460 1.00 42.73 A 0 ATOM 1120 607 -19.792 37.584 6.737 1.00 41.82 A N ATOM 1121 607 -18.388 37.913 6.949 1.00 41.58 A C ATOM 1122 607 -18.194 38.408 8.390 1.00 43.33 A C ATOM 1123 607 -16.751 38.685 8.788 1.00 48.75 A C

4

ATOM 1161 612 -4.726 27.624 5.099 1.00 42.41 A C ATOM 1162 612 -3.867 28.295 4.025 1.00 44.71 A C ATOM 1163 612 -2.809 29.235 4.571 1.00 49.08 A C ATOM 1164 612 -2.008 29.896 3.465 1.00 53.20 A C ATOM 1165 612 -2.592 30.697 2.699 1.00 54.07 A 0 ATOM 1166 612 -0.796 29.609 3.360 1.00 53.71 A 0 ATOM 1167 612 -3.853 26.736 5.970 1.00 42.48 A C ATOM 1168 612 -3.592 27.058 7.127 1.00 43.10 A O ATOM 1169 613 -3.414 25.613 5.415 1.00 41.33 A N ATOM 1170 613 -2.438 24.758 6.074 1.00 42.62 A C ATOM 1171 613 -3.140 23.783 7.025 1.00 44.30 A C ATOM 1172 613 -2.222 22.782 7.658 1.00 44.52 A C ATOM 1173 613 -1.137 22.941 8.453 1.00 44.27 A C ATOM 1174 613 -2.381 21.421 7.998 1.00 45.05 A N ATOM 1175 613 -1.435 20.786 8.167 1.00 43.50 A C ATOM 1176 613 -0.667 21.685 8.755 1.00 44.92 A N ATOM 1177 613 -1.677 23.994 5.003 1.00 44.32 A C ATOM 1178 613 -2.277 23.299 4.183 1.00 44.33 A O ATOM 1179 614 -0.356 24.142 5.000 1.00 45.57 A N ATOM 1180 614 0.460 23.465 4.010 1.00 46.92 A C ATOM 1181 614 1.295 22.352 4.609 1.00 48.04 A C ATOM 1182 614 1.660 22.402 5.779 1.00 98.09 A O ATOM 1183 615 1.594 21.342 3.801 1.00 50.58 A N ATOM 1184 615 2.451 20.237 4.214 1.00 53.77 A C ATOM 1185 615 1.643 18.935 4.407 1.00 55.20 A C ATOM 1186 615 2.575 17.774 4.701 1.00 54.79 A C ATOM 1187 615 0.648 19.109 5.551 1.00 55.97 A C ATOM 1188 615 1.290 19.599 6.820 1.00 58.58 A C ATOM 1189 615 3.505 19.996 3.143 1.00 55.43 A C ATOM 1190 615 3.203 20.011 1.950 1.00 55.42 A 0 ATOM 1191 616 4.762 19.778 3.559 1.00 57.06 A N ATOM 1192 616 5.226 19.885 4.952 1.00 57.57 A C ATOM 1193 616 5.878 19.575 2.627 1.00 58.08 A C ATOM 1194 616 7.100 19.486 3.541 1.00 58.83 A C ATOM 1195 616 6.684 20.196 4.792 1.00 58.90 A C ATOM 1196 616 5,717 18.322 1.768 1.00 58.68 A C ATOM 1197 616 5.755 18.392 0.540 1.00 59.30 A 0

4 1

ATOM 1198 617 5.539 17.177 2.420 1.00 58.67 A N ATOM 1199 617 5.396 15.915 1.704 1.00 60.47 A C ATOM 1200 617 6.581 15.005 2.006 1.00 60.68 A C ATOM 1201 617 4.097 15.227 2.095 1.00 60.64 A C ATOM 1202 617 4.096 14.273 2.876 1.00 60.93 A 0 ATOM 1203 618 2.971 15.696 1.541 1.00 60.54 A N ATOM 1204 618 2.883 16.645 0.417 1.00 60.69 A C ATOM 1205 618 1.660 15.169 1.929 1.00 60.60 A C ATOM 1206 618 0.679 15.977 1.079 1.00 60.68 A C ATOM 1207 618 1.485 16.442 -0.093 1.00 61.12 A C ATOM 1208 618 1.557 13.669 1.673 1.00 60.54 A C ATOM 1209 618 1.962 13.178 0.621 1.00 60.46 A O ATOM 1210 619 1.017 12.947 2.647 1.00 61.08 A N ATOM 1211 619 0.972 11.493 2.585 1.00 62.08 A C ATOM 1212 619 1.260 10.902 3.963 1.00 64.75 A C ATOM 1213 619 2.736 10.820 4.294 1.00 69.13 A C ATOM 1214 619 3.405 9.620 3.650 1.00 72.41 A C ATOM 1215 619 4.597 9.381 3.844 1.00 75.41 A O ATOM 1216 619 2.636 8.855 2.879 1.00 73.28 A N ATOM 1217 619 -0.366 10.974 2.082 1.00 60.67 A C ATOM 1218 619 -0.690 9.795 2.248 1.00 61.39 A O ATOM 1219 620 -1.140 11.858 1.463 1.00 58.38 A N ATOM 1220 620 -2.412 11.446 0.902 1.00 55.08 A C ATOM 1221 620 -3.476 12.526 0.959 1.00 52.97 A C ATOM 1222 620 -4.332 12.608 0.076 1.00 52.81 A O ATOM 1223 621 -3.433 13.353 1.998 1.00 49.05 A N ATOM 1224 621 -4.334 14.486 2.084 1.00 46.66 A C ATOM 1225 621 -5.715 14.040 2.571 1.00 48.24 A C ATOM 1226 621 -5.783 13.670 4.038 1.00 50.90 A C ATOM 1227 621 -7.187 13.283 4.471 1.00 52.62 A C ATOM 1228 621 -8.035 12.943 3.645 1.00 53.23 A O ATOM 1229 621 -7.440 13.338 5.774 1.00 53.97 A N ATOM 1230 621 -3.793 15.570 2.998 1.00 44.42 A C ATOM 1231 621 -2.991 15.310 3.894 1.00 43.89 A O ATOM 1232 622 -4.230 16.795 2.742 1.00 41.31 A N ATOM 1233 622 -3.895 17.932 3.576 1.00 38.86 A C ATOM 1234 622 -3.022 18.993 2.814 1.00 37.61 A C

4 2

ATOM 1235 622 -2.539 20.029 3.759 1.00 39.32 A C ATOM 1236 622 -1.858 18.234 2.162 1.00 38.06 A C ATOM 1237 622 -5.216 18.597 3.935 1.00 38.57 A C ATOM 1238 622 -6.068 18.804 3.068 1.00 38.51 A O ATOM 1239 623 -5.392 18.926 5.207 1.00 35.77 A N ATOM 1240 623 -6.656 19.479 5.664 1.00 33.79 A C ATOM 1241 623 -7.387 18.504 6.604 1.00 34.25 A C ATOM 1242 623 -6.629 18.345 7.810 1.00 33.79 A O ATOM 1243 623 -7.559 17.148 5.932 1.00 33.56 A C ATOM 1244 623 -6.457 20.786 6.407 1.00 33.76 A C ATOM 1245 623 -5.388 21.040 6.968 1.00 33.37 A O ATOM 1246 624 -7.495 21.615 6.401 1.00 32.04 A N ATOM 1247 629 -7.583 22.747 7.310 1.00 31.45 A C ATOM 1248 624 -6.990 24.032 6.674 1.00 32.64 A C ATOM 1249 624 -7.790 24.431 5.446 1.00 31.89 A C ATOM 1250 624 -6.973 25.161 7.699 1.00 31.91 A C ATOM 1251 624 -9.058 22.959 7.630 1.00 33.28 A C ATOM 1252 624 -9.925 22.714 6.789 1.00 32.07 A 0 ATOM 1253 625 -9.346 23.392 8.852 1.00 33.71 A N ATOM 1254 625 -10.723 23.991 9.305 1.00 35.41 A C ATOM 1255 625 -10.971 22.492 10.434 1.00 33.24 A C ATOM 1256 625 -11.060 24.900 9.768 1.00 37.55 A C ATOM 1257 625 -10.185 25.646 10.200 1.00 38.33 A O ATOM 1258 626 -12.335 25.262 9.661 1.00 39.75 A N ATOM 1259 626 -12.840 26.477 10.286 1.00 41.17 A C ATOM 1260 626 -13.170 26.144 11.743 1.00 93.59 A C ATOM 1261 626 -13.781 25.110 12.024 1.00 44.60 A O ATOM 1262 626 -14.110 26.959 9.575 1.00 39.19 A C ATOM 1263 626 -13.999 27.167 7.765 1.00 41.43 A S ATOM 1264 627 -12.770 27.010 12.669 1.00 45.20 A N ATOM 1265 627 -13.077 26.793 14.085 1.00 47.32 A C ATOM 1266 627 -12.212 27.696 14.966 1.00 47.58 A C ATOM 1267 627 -12.348 29.175 14.660 1.00 99.95 A C ATOM 1268 627 -11.403 29.627 13.566 1.00 52.51 A C ATOM 1269 627 -10.990 30.804 13.592 1.00 55.13 A O ATOM 1270 627 -11.071 28.810 12.681 1.00 52.16 A O ATOM 1271 627 -14.551 27.072 14.362 1.00 47.35 A C

4

ATOM 1272 627 -15.252 27.648 13.522 1.00 96.95 A O ATOM 1273 628 -15.022 26.665 15.538 1.00 47.46 A N ATOM 1274 628 -16.438 26.788 15.857 1.00 98.96 A C ATOM 1275 628 -16.740 26.197 17.243 1.00 53.92 A C ATOM 1276 628 -16.323 27.076 18.415 1.00 59.91 A C ATOM 1277 628 -16.746 26.502 19.765 1.00 63.80 A C ATOM 1278 628 -16.934 27.291 20.719 1.00 63.78 A O ATOM 1279 628 -16.889 25.264 19.873 1.00 66.46 A O ATOM 1280 628 -16.840 28.257 15.815 1.00 46.20 A C ATOM 1281 628 -16.043 29.141 16.132 1.00 46.72 A O ATOM 1282 629 -18.077 28.513 15.410 1.00 42.69 A N ATOM 1283 629 -18.499 29.878 15.171 1.00 40.02 A C ATOM 1284 629 -18.411 30.246 13.700 1.00 39.40 A C ATOM 1285 629 -19.083 31.173 13.250 1.00 40.26 A O ATOM 1286 630 -17.582 29.526 12.947 1.00 37.59 A N ATOM 1287 630 -17.418 29.790 11.515 1.00 35.79 . A C ATOM 1288 630 -15.966 30.140 11.191 1.00 33.84 A C ATOM 1289 630 -15.498 31.408 11.807 1.00 36.54 A C ATOM 1290 630 -15.352 32.675 11.155 1.00 36.10 A C ATOM 1291 630 -14.864 33.585 12.118 1.00 38.93 A C ATOM 1292 630 -15.584 33.130 9.853 1.00 36.07 A C ATOM 1293 630 -15.104 31.595 13.105 1.00 37.06 A C ATOM 1294 630 -14.721 32.900 13.297 1.00 36.65 A N ATOM 1295 630 -14.607 34.923 11.818 1.00 36.82 A C ATOM 1296 630 -15.328 34.455 9.556 1.00 37.24 A C ATOM 1297 630 -14.844 35.338 10.535 1.00 37.91 A C ATOM 1298 630 -17.821 28.570 10.701 1.00 35.13 A C ATOM 1299 630 -17.703 27.434 11.165 1.00 35.66 A O ATOM 1300 631 -18.285 28.804 9.481 1.00 32.78 A N ATOM 1301 631 -18.715 27.711 8.626 1.00 31.14 A C ATOM 1302 631 -20.210 27.897 8.289 1.00 31.87 A C ATOM 1303 631 -20.961 27.895 9.508 1.00 28.32 A O ATOM 1304 631 -20.686 26.666 7.452 1.00 28.98 A C ATOM 1305 631 -17.900 27.686 7.337 1.00 30.23 A C ATOM 1306 631 -17.683 28.719 6.708 1.00 29.72 A O ATOM 1307 632 -17.443 26.502 6.956 1.00 29.92 A N ATOM 1308 632 -16.662 26.336 5.739 1.00 28.80 A C

4 4

ATOM 1309 632 -16.011 24.954 5.746 1.00 27.20 A C ATOM 1310 632 -15.186 24.597 4.510 1.00 30.81 A C ATOM 1311 632 -14.066 25.609 4.346 1.00 30.24 A C ATOM 1312 632 -14.624 23.184 4.657 1.00 31.20 A C ATOM 1313 632 -17.550 26.493 4.498 1.00 28.43 A C ATOM 1314 632 -18.496 25.727 4.309 1.00 28.53 A 0 ATOM 1315 633 -17.256 27.486 3.660 1.00 26.00 A N ATOM 1316 633 -18.047 27.692 2.449 1.00 27.86 A C ATOM 1317 633 -18.520 29.168 2.306 1.00 27.33 A C ATOM 1318 633 -17.382 30.024 2.156 1.00 25.74 A 0 ATOM 1319 633 -19.320 29.598 3.530 1.00 23.90 A C ATOM 1320 633 -17.271 27.309 1.188 1.00 29.32 A C ATOM 1321 633 -17.864 26.985 0.160 1.00 29.29 A O ATOM 1322 639 -15.946 27.352 1.267 1.00 29.99 A N ATOM 1323 634 -15.131 27.078 0.096 1.00 29.46 A C ATOM 1324 639 -13.850 26.344 0.437 1.00 29.50 A C ATOM 1325 639 -13.244 26.581 1.485 1.00 30.22 A O ATOM 1326 635 -13.432 25.453 -0.454 1.00 28.04 A N ATOM 1327 635 -12.296 24.581 -0.190 1.00 28.82 A C ATOM 1328 635 -11.526 24.342 -1.477 1.00 29.22 A C ATOM 1329 635 -12.107 23.936 -2.477 1.00 29.78 A O ATOM 1330 635 -12.798 23.252 0.372 1.00 27.17 A C ATOM 1331 635 -11.559 21.934 0.583 1.00 31.95 A S ATOM 1332 636 -10.222 24.593 -1.999 1.00 29.87 A N ATOM 1333 636 -9.392 24.423 -2.635 1.00 31.98 A C ATOM 1334 636 -9.557 25.623 -3.567 1.00 30.53 A C ATOM 1335 636 -9.043 26.792 -2.957 1.00 32.60 A O ATOM 1336 636 -7.916 24.274 -2.276 1.00 33.39 A C ATOM 1337 636 -7.526 24.394 -1.113 1.00 33.25 A O ATOM 1338 637 -7.099 24.011 -3.289 1.00 35.31 A N ATOM 1339 637 -5.653 23.970 -3.117 1.00 37.57 A C ATOM 1390 637 -5.063 22.828 -3.937 1.00 35.81 A C ATOM 1341 637 -5.038 25.296 -3.554 1.00 38.81 A C ATOM 1392 637 -5.468 25.899 -4.537 1.00 39.80 A O ATOM 1343 638 -4.036 25.746 -2.811 1.00 40.54 A N ATOM 1344 638 -3.236 26.893 -3.216 1.00 41.27 A C ATOM 1395 638 -2.161 27.171 -2.163 1.00 41.30 A C

4

ATOM 1346 638 -1.633 28.595 -1.974 1.00 43.45 A C ATOM 1347 638 -2.751 29.509 -1.502 1.00 43.30 A C ATOM 1348 638 -0.505 28.577 -0.952 1.00 44.32 A C ATOM 1349 638 -2.583 26.506 -4.536 1.00 43.36 A C ATOM 1350 638 -2.027 25.415 -4.665 1.00 43.89 A 0 ATOM 1351 639 -2.654 27.386 -5.541 1.00 44.54 A N ATOM 1352 639 -3.210 28.751 -5.535 1.00 42.27 A C ATOM 1353 639 -2.072 27.020 -6.838 1.00 45.55 A C ATOM 1354 639 -2.528 28.144 -7.764 1.00 44.15 A C ATOM 1355 639 -2.731 29.322 -6.849 1.00 44.46 A C ATOM 1356 639 -0.551 26.924 -6.745 1.00 48.67 A C ATOM 1357 639 0.128 27.928 -6.530 1.00 49.10 A O ATOM 1356 640 -0.021 25.714 -6.895 1.00 52.08 A N ATOM 1359 640 1.417 25.517 -6.809 1.00 55.68 A C ATOM 1360 640 1.913 24.533 -7.849 1.00 58.10 A C ATOM 1361 640 1.201 24.233 -8.802 1.00 58.79 A O ATOM 1362 641 3.129 24.025 -7.679 1.00 61.04 A N ATOM 1363 641 3.606 22.939 -8.532 1.00 64.61 A C ATOM 1364 641 5.134 22.731 -8.392 1.00 65.87 A C ATOM 1365 641 5.489 22.650 -7.006 1.00 67.03 A O ATOM 1366 641 5.888 23.877 -9.048 1.00 66.73 A C ATOM 1367 641 2.883 21.653 -6.152 1.00 66.27 A C ATOM 1368 641 3.336 20.548 -8.461 1.00 67.72 A O ATOM 1369 642 1.740 21.824 -7.492 1.00 67.29 A N ATOM 1370 642 0.977 20.732 -6.901 1.00 66.68 A C ATOM 1371 642 -0.227 21.301 -6.138 1.00 68.50 A C ATOM 1372 642 0.163 22.269 -5.174 1.00 65.92 A O ATOM 1373 642 0.480 19.719 -7.927 1.00 66.01 A C ATOM 1374 642 0.079 20.081 -9.031 1.00 66.17 A O ATOM 1375 643 0.507 18.445 -7.548 1.00 65.59 A N ATOM 1376 643 -0.260 17.419 -8.250 1.00 63.85 A C ATOM 1377 643 0.565 16.134 -8.445 1.00 68.67 A C ATOM 1378 643 2.049 16.339 -8.398 1.00 73.45 A C ATOM 1379 643 2.830 17.348 -8.853 1.00 75.15 A C ATOM 1380 643 2.905 15.923 -7.823 1.00 75.08 A N ATOM 1381 643 4.148 15.859 -7.925 1.00 76.32 A C ATOM 1382 643 4.130 17.025 -8.546 1.00 76.69 A N

4

ATOM 1383 643 -1.461 17.099 -7.368 1.00 59.62 A C ATOM 1384 643 -1.347 16.321 -6.418 1.00 61.00 A O ATOM 1385 699 -2.606 17.697 -7.672 1.00 53.01 A N ATOM 1386 644 -3.775 17.546 -6.813 1.00 47.88 A C ATOM 1387 644 -4.312 18.931 -6.395 1.00 48.74 A C ATOM 1388 644 -5.721 18.813 -5.835 1.00 46.18 A C ATOM 1389 644 -3.379 19.535 -5.359 1.00 46.52 A C ATOM 1390 644 -4.894 16.729 -7.456 1.00 44.30 A C ATOM 1391 644 -5.270 16.973 -8.605 1.00 41.49 A O ATOM 1392 645 -5.416 15.756 -6.711 1.00 39.48 A N ATOM 1393 645 -6.514 14.921 -7.198 1.00 35.69 A C ATOM 1394 645 -6.636 13.646 -6.359 1.00 34.50 A C ATOM 1395 645 -5.395 12.749 -6.310 1.00 33.63 A C ATOM 1396 645 -5.668 11.520 -5.449 1.00 29.01 A C ATOM 1397 645 -5.014 12.337 -7.722 1.00 32.25 A C ATOM 1398 645 -7.820 15.699 -7.120 1.00 33.69 A C ATOM 1399 645 -8.741 15.482 -7.911 1.00 33.63 A O ATOM 1400 646 -7.889 16.615 -6.164 1.00 30.73 A N ATOM 1401 646 -9.099 17.387 -5.980 1.00 29.59 A C ATOM 1402 646 -9.210 17.891 -4.559 1.00 29.58 A C ATOM 1403 646 -8.271 17.766 -3.767 1.00 29.39 A O ATOM 1409 647 -10.362 18.466 -4.238 1.00 27.24 A N ATOM 1405 647 -10.592 19.040 -2.927 1.00 26.99 A C ATOM 1406 647 -10.043 20.453 -2.878 1.00 23.24 A C ATOM 1407 647 -12.091 19.044 -2.660 1.00 27.99 A C ATOM 1408 647 -12.898 19.142 -3.590 1.00 26.92 A O ATOM 1409 648 -12.462 18.923 -1.391 1.00 26.93 A N ATOM 1410 648 -13.865 18.949 -1.011 1.00 28.19 A C ATOM 1411 648 -14.535 17.621 -1.373 1.00 27.10 A C ATOM 1412 648 -13.744 16.397 -0.960 1.00 29.81 A C ATOM 1413 648 -13.822 15.899 0.336 1.00 28.83 A C ATOM 1414 648 -13.090 14.788 0.725 1.00 30.03 A C ATOM 1415 648 -12.912 15.747 -1.862 1.00 29.05 A C ATOM 1416 648 -12.179 14.635 -1.486 1.00 32.30 A C ATOM 1417 648 -12.272 14.160 -0.187 1.00 31.60 A C ATOM 1418 648 -11.544 13.057 0.195 1.00 33.44 A O ATOM 1419 648 -14.021 19.210 0.477 1.00 30.20 A C

4

ATOM 1420 648 -13.126 18.905 1.272 1.00 30.34 A O ATOM 1421 649 -15.166 19.768 0.851 1.00 28.57 A N ATOM 1422 649 -15.455 20.020 2.251 1.00 29.86 A C ATOM 1423 699 -16.394 21.210 2.380 1.00 28.48 A C ATOM 1424 699 -16.083 18.783 2.884 1.00 32.30 A C ATOM 1425 649 -16.920 18.115 2.276 1.00 33.16 A O ATOM 1426 650 -15.653 18.469 4.101 1.00 33.30 A N ATOM 1427 650 -16.356 17.509 4.939 1.00 33.70 A C ATOM 1428 650 -15.487 16.269 5.234 1.00 34.68 A C ATOM 1429 650 -16.177 15.385 6.257 1.00 35.80 A C ATOM 1430 650 -15.251 15.487 3.954 1.00 33.77 A C ATOM 1431 650 -16.683 18.220 6.242 1.00 33.54 A C ATOM 1432 650 -15.784 18.580 7.005 1.00 34.44 A O ATOM 1433 651 -17.970 18.436 6.484 1.00 32.32 A N ATOM 1434 651 -18.396 19.313 7.560 1.00 33.07 A ' C ATOM 1435 651 -18.048 18.692 8.914 1.00 34.55 A C ATOM 1936 651 -18.678 17.316 9.101 1.00 37.99 A C ATOM 1437 651 -19.927 17.218 9.110 1.00 36.19 A O ATOM 1438 651 -17.925 16.328 9.235 1.00 39.42 A O ATOM 1439 651 -17.696 20.658 7.382 1.00 33.97 A C ATOM 1990 651 -17.885 21.319 6.360 1.00 34.64 A O ATOM 1441 652 -16.884 21.060 8.357 1.00 32.48 A N ATOM 1442 652 -16.196 22.346 8.273 1.00 32.00 A C ATOM 1443 652 -16.502 23.197 9.511 1.00 32.46 A C ATOM 1444 652 -17.927 23.747 9.500 1.00 35.25 A C ATOM 1995 652 -18.527 23.930 8.433 1.00 32.30 A O ATOM 1446 652 -18.474 24.010 10.687 1.00 33.95 A N ATOM 1447 652 -14.693 22.176 8.102 1.00 31.47 A C ATOM 1448 652 -13.908 23.057 8.451 1.00 30.18 A O ATOM 1499 653 -14.309 21.033 7.544 1.00 29.69 A N ATOM 1450 653 -12.921 20.746 7.225 1.00 28.78 A C ATOM 1451 653 -12.510 19.372 7.809 1.00 27.92 A C ATOM 1452 653 -12.589 19.425 9.237 1.00 29.55 A O ATOM 1453 653 -11.095 19.004 7.395 1.00 28.75 A C ATOM 1454 653 -12.712 20.726 5.707 1.00 28.67 A C ATOM 1455 653 -13.452 20.061 4.978 1.00 29.58 A O ATOM 1456 654 -11.705 21.959 5.236 1.00 28.76 A N

4

ATOM 1999 659 -1.109 12.095 -5.457 1.00 56.06 A C ATOM 1995 659 -0.700 12.236 -6.920 1.00 60.94 A C ATOM 1996 659 0.009 11.001 -7.473 1.00 66.87 A C ATOM 1497 659 -0.801 9.724 -7.244 1.00 70.25 A C ATOM 1498 659 -0.729 9.250 -5.863 1.00 73.87 A N ATOM 1499 659 -1.329 8.148 -5.418 1.00 75.97 A C ATOM 1500 659 -2.049 7.400 -6.247 1.00 76.24 A N ATOM 1501 659 -1.212 7.792 -4.144 1.00 76.11 A N ATOM 1502 659 0.091 11.633 -4.643 1.00 57.33 A C ATOM 1503 659 -0.051 10.845 -3.709 1.00 59.34 A O ATOM 1504 670 5.942 19.173 -5.234 1.00 59.80 A N ATOM 1505 670 6.378 19.330 -3.843 1.00 59.19 A C ATOM 1506 670 7.326 20.523 -3.727 1.00 60.88 A C ATOM 1507 670 8.652 20.204 -3.026 1.00 65.12 A C ATOM 1508 670 8.570 20.256 -1.508 1.00 68.07 A C ATOM 1509 670 7.987 21.220 -0.974 1.00 68.75 A O ATOM 1510 670 9.101 19.341 -0.839 1.00 70.08 A O ATOM 1511 670 5.291 19.476 -2.765 1.00 57.96 A C ATOM 1512 670 4.489 18.567 -2.544 1.00 56.88 A O ATOM 1513 671 5.273 20.628 -2.089 1.00 55.53 A N ATOM 1514 671 4.300 20.874 -1.013 1.00 52.14 A C ATOM 1515 671 4.729 22.075 -0.160 1.00 50.35 A C ATOM 1516 671 2.878 21.110 -1.532 1.00 50.50 A C ATOM 1517 671 2.685 21.547 -2.660 1.00 49.31 A O ATOM 1518 672 1.892 20.811 -0.689 1.00 48.22 A N ATOM 1519 672 0.485 21.038 -0.993 1.00 46.40 A C ATOM 1520 672 -0.264 19.700 -1.175 1.00 46.60 A C ATOM 1521 672 -1.765 19.925 -1.123 1.00 45.09 A C ATOM 1522 672 0.127 19.068 -2.500 1.00 45.84 A C ATOM 1523 672 -0.164 21.812 0.140 1.00 44.64 A C ATOM 1524 672 -0.012 21.458 1.308 1.00 44.63 A O ATOM 1525 673 -0.876 22.878 -0.205 1.00 42.97 A N ATOM 1526 673 -1.535 23.695 0.803 1.00 42.42 A C ATOM 1527 673 -1.014 25.151 0.769 1.00 41.83 A C ATOM 1528 673 0.405 25.156 0.961 1.00 43.57 A O ATOM 1529 673 -1.654 25.968 1.874 1.00 43.03 A C ATOM 1530 673 -3.052 23.693 0.609 1.00 40.73 A C

4

ATOM 1531 673 -3.554 23.941 -0.491 1.00 40.35 A O ATOM 1532 674 -3.775 23.401 1.684 1.00 37.65 A N ATOM 1533 674 -5.228 23.453 1.651 1.00 36.09 A C ATOM 1534 674 -5.809 22.404 2.589 1.00 32.65 A C ATOM 1535 674 -5.700 24.848 2.054 1.00 35.70 A C ATOM 1536 674 -5.196 25.433 3.014 1.00 35.06 A O ATOM 1537 675 -6.669 25.378 1.313 1.00 33.36 A N ATOM 1538 675 -7.155 26.732 1.554 1.00 31.12 A C ATOM 1539 675 -6.893 27.646 0.344 1.00 32.06 A C ATOM 1590 675 -7.362 29.057 0.698 1.00 30.35 A C ATOM 1541 675 -5.423 27.625 -0.015 1.00 31.11 A C ATOM 1542 675 -8.652 26.721 1.814 1.00 32.06 A C ATOM 1543 675 -9.436 26.300 0.962 1.00 33.53 A O ATOM 1599 676 -9.046 27.191 2.991 1.00 31.39 A N ATOM 1545 676 -10.446 27.210 3.369 1.00 31.28 A C ATOM 1546 676 -10.631 26.537 4.731 1.00 30.37 A C ATOM 1597 676 -10.965 28.638 3.425 1.00 32.21 A C ATOM 1548 676 -10.342 29.513 4.026 1.00 32.29 A O ATOM 1549 677 -12.112 28.871 2.799 1.00 30.97 A N ATOM 1550 677 -12.853 30.098 3.046 1.00 31.18 A C ATOM 1551 677 -13.511 30.625 1.755 1.00 30.16 A C ATOM 1552 677 -14.405 31.810 2.071 1.00 28.01 A C ATOM 1553 677 -12.424 31.014 0.749 1.00 29.28 A C ATOM 1554 677 -12.949 31.276 -0.653 1.00 31.33 A C ATOM 1555 677 -13.925 29.812 4.094 1.00 32.12 A C ATOM 1556 677 -14.759 28.916 3.925 1.00 29.55 A O ATOM 1557 678 -13.880 30.576 5.181 1.00 33.00 A N ATOM 1558 678 -14.780 30.386 6.316 1.00 34.13 A C ATOM 1559 678 -15.661 31.617 6.478 1.00 33.65 A C ATOM 1560 678 -15.180 32.744 6.384 1.00 33.63 A O ATOM 1561 678 -13.966 30.179 7.594 1.00 35.39 A C ATOM 1562 678 -12.794 28.787 7.523 1.00 37.76 A S ATOM 1563 679 -16.949 31.912 6.718 1.00 33.05 A N ATOM 1564 679 -17.842 32.547 6.892 1.00 36.46 A C ATOM 1565 679 -18.750 32.419 8.113 1.00 39.97 A C ATOM 1566 679 -18.970 31.324 8.639 1.00 37.89 A O ATOM 1567 679 -18.712 32.734 5.658 1.00 36.27 A C

4 1

ATOM 1568 79 -17.854 32.830 4.054 1.00 36.27 A S ATOM 1569 80 -19.282 33.556 8.547 1.00 43.34 A N ATOM 1570 80 -20.257 33.591 9.630 1.00 48.28 A C ATOM 1571 80 -19.547 33.641 10.983 1.00 47.10 A C ATOM 1572 80 -18.769 34.919 11.195 1.00 50.25 A C ATOM 1573 80 -18.249 35.029 12.610 1.00 50.93 A C ATOM 1574 80 -17.474 36.250 12.786 1.00 53.09 A N ATOM 1575 80 -16.716 36.504 13.846 1.00 53.83 A C ATOM 1576 80 -16.043 37.645 13.919 1.00 54.26 A N ATOM 1577 80 -16.629 35.617 14.829 1.00 53.05 A N ATOM 1578 80 -21.146 34.820 9.479 1.00 49.82 A C ATOM 1579 80 -20.924 35.657 8.600 1.00 49.14 A O ATOM 1580 81 -22.152 34.917 10.339 1.00 53.31 A N ATOM 1581 81 -23.029 36.083 10.378 1.00 58.05 A C ATOM 1582 81 -24.423 35.673 10.837 1.00 58.41 A C ATOM 1583 81 -24.392 35.272 12.195 1.00 60.93 A O ATOM 1584 81 -22.486 37.127 11.346 1.00 59.77 A C ATOM 1585 81 -21.714 36.806 12.248 1.00 60.55 A O ATOM 1586 82 -22.896 38.375 11.154 1.00 62.76 A N ATOM 1587 82 -22.616 39.429 12.122 1.00 66.03 A C ATOM 1588 82 -21.647 40.448 11.528 1.00 68.33 A C ATOM 1589 82 -20.316 39.874 11.085 1.00 71.05 A C ATOM 1590 82 -19.510 40.941 10.368 1.00 73.61 A C ATOM 1591 82 -20.383 41.861 9.641 1.00 76.11 A N ATOM 1592 82 -19.966 42.729 8.723 1.00 76.34 A C ATOM 1593 82 -20.839 43.523 8.117 1.00 74.95 A N ATOM 1594 82 -18.678 42.801 8.409 1.00 77.06 A N ATOM 1595 682 -23.909 40.138 12.514 1.00 66.85 A C ATOM 1596 682 -24.947 39.865 11.873 1.00 67.78 A O ATOM 1597 682 -23.867 40.966 13.448 1.00 68.38 A O TER 1598 682 A ATOM 3134 -2 -22.599 17.038 -50.667 1.00 30.97 L1 C ATOM 3135 -2 -20.735 18.001 -49.294 1.00 31.14 L1 C ATOM 3136 -2 -19.631 17.468 -49.156 1.00 30.83 L1 O ATOM 3137 -2 -20.438 17.670 -51.719 1.00 31.98 L1 N ATOM 3138 -2 -21.422 18.028 -50.655 1.00 32.78 L1 C ATOM 3139 -1 -21.382 18.582 -48.290 1.00 30.72 L1 N

4 2

ATOM 3140 -20.904 18.993 -46.923 1.00 31.40 L1 C ATOM 3141 -20.620 19.810 -46.300 1.00 30.42 L1 C ATOM 3142 -20.062 19.746 -44.872 1.00 32.48 L1 C ATOM 3143 -18.735 19.007 -44.874 1.00 32.58 L1 C ATOM 3144 -19.875 21.146 -44.314 1.00 31.47 L1 C ATOM 3145 -21.939 17.701 -46.090 1.00 32.90 L1 C ATOM 3146 -23.076 18.154 -45.930 1.00 31.46 L1 O ATOM 3147 -21.543 16.551 -45.565 1.00 32.45 L1 N ATOM 3148 -22.990 15.769 -44.739 1.00 36.30 L1 C ATOM 3149 -22.229 14.271- 45.006 1.00 39.00 L1 C ATOM 3150 -23.162 13.354 -44.229 1.00 46.21 L1 C ATOM 3151 -23.290 11.970 -44.857 1.00 51.70 L1 C ATOM 3152 -24.374 11.383 -44.867 1.00 55.34 L1 O ATOM 3153 -22.185 11.444 -45.384 1.00 50.89 L1 N ATOM 3154 -22.148 16.113 -43.282 1.00 36.73 L1 C ATOM 3155 -21.038 15.909 -42.801 1.00 39.33 L1 O ATOM 3156 -23.143 16.660 -42.592 1.00 34.09 L1 N ATOM 3157 -22.984 17.045 -41.200 1.00 32.26 L1 C ATOM 3158 -23.663 18.394 -40.951 1.00 33.35 L1 C ATOM 3159 -22.995 19.426 -41.660 1.00 36.24 L1 O ATOM 3160 -23.579 15.975 -40.290 1.00 31.17 L1 C ATOM 3161 -24.551 15.314 -40.651 1.00 29.93 L1 0 ATOM 3162 -22.990 15.806 -39.111 1.00 29.66 L1 N ATOM 3163 -23.345 14.692 -38.242 1.00 27.57 L1 C ATOM 3164 -22.173 14.325 -37.304 1.00 26.77 L1 C ATOM 3165 -22.604 13.235 -36.328 1.00 20.69 L1 C ATOM 3166 -20.970 13.859 -38.135 1.00 24.71 L1 C ATOM 3167 -24.573 14.995 -37.403 1.00 28.78 L1 C ATOM 3168 -25.360 14.102 -37.110 1.00 29.90 L1 O ATOM 3169 -24.736 16.256 -37.013 1.00 28.16 L1 N ATOM 3170 -25.909 16.661 -36.239 1.00 28.07 L1 C ATOM 3171 -25.540 17.780 -35.261 1.00 25.10 L1 C ATOM 3172 -24.396 17.481 -34.289 1.00 27.51 L1 C ATOM 3173 -29.060 18.739 -33.483 1.00 27.28 L1 C ATOM 3174 -24.793 16.341 -33.367 1.00 27.59 L1 C ATOM 3175 -26.996 17.146 -37.190 1.00 26.91 L1 C ATOM 3176 -26.701 17.620 -38.282 1.00 25.87 L1 O

4

ATOM 3177 -28.251 17.031 -36.777 1.00 27.45 L1 N ATOM 3178 -29.365 17.405 -37.650 1.00 29.69 L1 C ATOM 3179 -30.419 16.281 -37.709 1.00 30.65 L1 C ATOM 3180 -29.813 15.091 -38.227 1.00 32.80 L1 O ATOM 3181 -31.584 16.682 -38.615 1.00 30.25 L1 C ATOM 3182 -30.062 18.693 -37.216 1.00 29.39 L1 C ATOM 3183 -30.597 18.773 -36.113 1.00 28.74 L1 O ATOM 3184 -30.048 19.696 -38.093 1.00 27.91 L1 N ATOM 3185 -30.806 20.929 -37.885 1.00 28.70 L1 C ATOM 3186 -29.889 22.159 -37.866 1.00 26.66 L1 C ATOM 3187 -28.913 22.258 -36.721 1.00 24.05 L1 C ATOM 3188 -28.010 23.468 -36.872 1.00 25.09 L1 C ATOM 3189 -26.843 23.341 -37.243 1.00 27.47 L1 O ATOM 3190 -28.548 24.652 -36.597 1.00 22.42 L1 N ATOM 3191 -31.770 21.109 -39.044 1.00 28.56 L1 C ATOM 3192 -31.475 20.719 -40.170 1.00 27.37 L1 O ATOM 3193 -32.921 21.745 -38.789 1.00 30.02 L1 N ATOM 3199 -33.416 22.218 -37.483 1.00 30.00 L1 C ATOM 3195 -33.756 22.206 -39.904 1.00 29.84 L1 C ATOM 3196 -34.944 22.876 -39.215 1.00 30.46 L1 C ATOM 3197 -34.421 23.278 -37.859 1.00 31.08 L1 C ATOM 3198 -32.961 23.186 -40.761 1.00 30.79 L1 C ATOM 3199 -32.206 24.007 -40.242 1.00 30.95 L1 O ATOM 3200 -33.113 23.100 -42.087 1.00 29.99 L1 N ATOM 3201 -33.901 22.060 -42.767 1.00 29.60 L1 C ATOM 3202 -32.380 23.946 -43.036 1.00 30.24 . L1 C ATOM 3203 -32.755 23.369 -44.404 1.00 30.10 L1 C ATOM 3209 -33.254 21.990 -44.113 1.00 31.61 L1 C ATOM 3205 -32.747 25.428 -42.928 1.00 31.73 L1 C ATOM 3206 -31.943 26.308 -43.258 1.00 31.46 L1 O ATOM 3207 -33.960 25.707 -42.467 1.00 30.72 L1 N ATOM 3208 -34.446 27.080 -42.450 1.00 32.53 L1 C ATOM 3209 -35.043 27.456 -43.808 1.00 35.18 L1 C ATOM 3210 -36.252 26.743 -44.038 1.00 39.78 L1 O ATOM 3211 -35.494 27.298 -41.382 1.00 32.20 L1 C ATOM 3212 -36.151 26.359 -40.933 1.00 32.14 L1 O ATOM 3213 -35.637 28.556 -40.982 1.00 32.09 L1 N

4 4

ATOM 3214 -36.668 28.970 -40.049 1.00 30.01 L1 C ATOM 3215 -36.196 28.799 -38.611 1.00 29.34 L1 C ATOM 3216 -36.993 30.453 -40.294 1.00 31.41 L1 C ATOM 3217 -36.162 31.139 -40.958 1.00 31.03 L1 O ATOM 3218 -38.058 30.946 -39.770 1.00 30.95 L1 N ATOM 3219 -38.366 32.364 -39.876 1.00 33.18 L1 C ATOM 3220 -39.055 32.667 -41.205 1.00 31.83 L1 C ATOM 3221 -40.290 31.985 -41.292 1.00 34.06 L1 O ATOM 3222 -39.255 32.810 -38.731 1.00 33.60 L1 C ATOM 3223 -40.016 32.023 -38.175 1.00 34.21 L1 O ATOM 3224 -39.143 34.084 -38.379 1.00 33.24 L1 N ATOM 3225 -39.983 34.638 -37.344 1.00 34.06 L1 C ATOM 3226 -40.221 36.111 -37.594 1.00 34.78 L1 C ATOM 3227 -39.510 36.738 -38.377 1.00 35.73 L1 O ATOM 3228 -41.224 36.664 -36.926 1.00 35.43 L1 N ATOM 3229 -41.545 38.077 -37.055 1.00 35.76 L1 C ATOM 3230 -43.057 38.299 -36.915 1.00 37.03 L1 C ATOM 3231 -43.732 37.621 -37.980 1.00 40.63 L1 O ATOM 3232 -43.389 39.781 -36.959 1.00 38.80 L1 C ATOM 3233 -40.834 38.834 -35.949 1.00 34.79 L1 C ATOM 3234 -40.768 38.358 -34.817 1.00 33.06 L1 O ATOM 3235 -40.295 40.024 -36.261 1.00 33.81 L1 N ATOM 3236 -40.243 40.682 -37.579 1.00 33.59 L1 C ATOM 3237 -39.678 40.845 -35.213 1.00 35.17 L1 C ATOM 3238 -39.510 42.210 -35.881 1.00 35.17 L1 C ATOM 3239 -39.338 41.880 -37.339 1.00 32.62 L1 C ATOM 3240 -40.562 40.904 -33.970 1.00 37.04 L1 C ATOM 3241 -41.788 40.939 -34.076 1.00 36.13 L1 O ATOM 3242 -39.933 40.880 -32.798 1.00 37.53 L1 N

ATOM 3243 -40.684 40.885 -31.554 1.00 37.21 L1 C ATOM 3244 -41.091 39.514 -31.099 1.00 37.71 L1 C ATOM 3245 -41.394 39.354 -29.864 1.00 39.10 L1 O ATOM 3246 -41.101 38.515 -31.918 1.00 38.28 L1 N ATOM 3247 -41.542 37.184 -31.514 1.00 39.95 L1 C ATOM 3248 -42.263 36.488 -32.673 1.00 42.22 L1 C ATOM 3249 -43.514 37.217 -33.166 1.00 49.57 L1 C ATOM 3250 -44.608 37.318 -32.108 1.00 53.19 L1 C

4

ATOM 3251 -45.367 36.371 -31.889 1.00 55.70 L1 O ATOM 3252 -44.693 38.472 -31.449 1.00 53.13 L1 N ATOM 3253 -40.393 36.301 -31.017 1.00 39.30 L1 C ATOM 3254 -39.232 36.715 -30.998 1.00 36.61 L1 O ATOM 3255 -40.743 35.085 -30.608 1.00 39.09 L1 N ATOM 3256 -39.782 34.093 -30.142 1.00 40.32 L1 C ATOM 3257 -40.225 33.551 -28.779 1.00 40.01 L1 C ATOM 3258 -39.384 32.406 -28.239 1.00 43.34 L1 C ATOM 3259 -39.923 31.930 -26.898 1.00 41.71 L1 C ATOM 3260 -39.086 30.906 -26.277 1.00 43.61 L1 N ATOM 3261 -39.155 29.610 -26.565 1.00 43.68 L1 C ATOM 3262 -40.019 29.178 -27.471 1.00 44.38 L1 N ATOM 3263 -38.376 28.740 -25.933 1.00 43.92 L1 N ATOM 3269 -39.697 32.949 -31.148 1.00 39.25 L1 C ATOM 3265 -40.722 32.397 -31.548 1.00 40.22 L1 O ATOM 3266 -38.480 32.601 -31.562 1.00 38.21 L1 N ATOM 3267 -38.269 31.428 -32.410 1.00 36.63 L1 C ATOM 3268 -37.688 31.814 -33.790 1.00 37.42 L1 C ATOM 3269 -38.642 32.740 -39.510 1.00 37.93 L1 C ATOM 3270 -36.331 32.479 -33.624 1.00 37.49 L1 C ATOM 3271 -37.320 30.430 -31.755 1.00 36.06 L1 C ATOM 3272 -36.993 30.800 -30.918 1.00 37.18 L1 O ATOM 3273 -37.447 29.161 -32.127 1.00 34.19 L1 N ATOM 3274 -36.532 28.148 -31.635 1.00 33.85 L1 C ATOM 3275 -37.231 27.152 -30.699 1.00 34.73 L1 C ATOM 3276 -38.256 26.459 -31.422 1.00 36.14 L1 O ATOM 3277 -37.839 27.875 -29.510 1.00 36.05 L1 C ATOM 3278 -35.932 27.367 -32.788 1.00 33.77 L1 C ATOM 3279 -36.581 27.136 -33.804 1.00 34.31 L1 O ATOM 3280 -34.680 26.964 -32.627 1.00 32.67 L1 N ATOM 3281 -34.013 26.136 -33.619 1.00 30.93 L1 C ATOM 3282 -32.856 26.902 -34.267 1.00 30.89 L1 C ATOM 3283 -32.090 25.991 -35.202 1.00 32.28 L1 C ATOM 3289 -33.410 28.121 -35.010 1.00 31.02 L1 C ATOM 3285 -32.348 29.096 -35.461 1.00 29.96 L1 C ATOM 3286 -33.479 24.902 -32.912 1.00 29.12 L1 C ATOM 3287 -32.825 25.007 -31.877 1.00 27.11 L1 O

4

ATOM 3288 -33.772 23.731 -33.460 1.00 28.13 L1 N ATOM 3289 -33.416 22.493 -32.791 1.00 27.04 L1 C ATOM 3290 -34.577 21.503 -32.857 1.00 28.51 L1 C ATOM 3291 -34.646 20.916 -39.199 1.00 36.31 L1 O ATOM 3292 -32.183 21.856 -33.404 1.00 27.38 L1 C ATOM 3293 -31.850 22.087 -34.576 1.00 26.13 L1 O ATOM 3299 -31.514 21.040 -32.599 1.00 26.91 L1 N ATOM 3295 -30.300 20.349 -33.012 1.00 28.14 L1 C ATOM 3296 -30.378 18.953 -32.407 1.00 27.39 L1 C ATOM 3297 -30.982 18.805 -31.191 1.00 26.72 L1 O ATOM 3298 -29.078 21.109 -32.470 1.00 28.78 L1 C ATOM 3299 -27.428 20.365 -32.716 1.00 33.98 L1 S ATOM 3300 -30.349 17.926 -33.246 1.00 26.59 L1 N ATOM 3301 -30.434 16.574 -32.722 1.00 29.26 L1 C ATOM 3302 -31.691 15.875 -33.244 1.00 30.37 L1 C ATOM 3303 -31.715 15.896 -34.653 1.00 40.04 L1 O ATOM 3304 -29.202 15.750 -33.053 1.00 27.58 L1 C ATOM 3305 -28.689 15.783 -34.171 1.00 25.14 L1 O ATOM 3306 -28.734 15.017 -32.049 1.00 27.83 L1 N ATOM 3307 -27.548 14.204 -32.195 1.00 28.19 L1 C ATOM 3308 -27.832 12.832 -31.632 1.00 29.00 L1 C ATOM 3309 -28.902 12.268 -31.867 1.00 29.40 L1 O ATOM 3310 -26.886 12.291 -30.878 1.00 26.89 L1 N ATOM 3311 -27.045 10.942 -30.372 1.00 27.01 L1 C ATOM 3312 -26.747 9.938 -31.478 1.00 26.36 L1 C ATOM 3313 -25.400 10.061 -31.879 1.00 26.75 L1 O ATOM 3314 -26.113 10.705 -29.209 1.00 26.30 L1 C ATOM 3315 -25.447 11.629 -28.746 1.00 27.16 L1 O ATOM 3316 -26.066 9.462 -28.742 1.00 25.37 L1 N ATOM 3317 -25.345 9.137 -27.522 1.00 25.52 L1 C ATOM 3318 -25.588 7.678 -27.143 1.00 26.57 L1 C ATOM 3319 -25.038 6.804 -28.119 1.00 32.72 L1 O ATOM 3320 -23.847 9.390 -27.673 1.00 25.31 L1 C ATOM 3321 -23.153 9.613 -26.688 1.00 26.31 L1 O ATOM 3322 -23.347 9.362 -28.904 1.00 25.12 L1 N ATOM 3323 -21.916 9.549 -29.129 1.00 23.38 L1 C ATOM 3324 -21.495 8.948 -30.472 1.00 22.37 L1 C

4

ATOM 3325 -21.943 9.746 -31.551 1.00 24.28 L1 O ATOM 3326 -21.521 11.023 -29.085 1.00 24.26 L1 C ATOM 3327 -20.342 11.342 -28.959 1.00 23.93 L1 O ATOM 3328 -22.497 11.926 -29.195 1.00 23.53 L1 N ATOM 3329 -22.197 13.345 -29.020 1.00 23.52 L1 C ATOM 3330 -22.302 14.111 -30.361 1.00 21.17 L1 C ATOM 3331 -23.467 13.656 -31.228 1.00 23.34 L1 C ATOM 3332 -24.629 13.895 -30.908 1.00 23.92 L1 O ATOM 3333 -23.154 13.009 -32.345 1.00 21.27 L1 N ATOM 3334 -23.028 14.033 -27.937 1.00 23.95 L1 C ATOM 3335 -22.578 14.156 -26.799 1.00 25.36 L1 O ATOM 3336 -24.230 14.486 -28.267 1.00 24.55 L1 N ATOM 3337 -24.995 15.263 -27.300 1.00 24.06 L1 C ATOM 3338 -26.300 15.799 -27.929 1.00 26.12 L1 C ATOM 3339 -27.128 16.554 -26.883 1.00 21.66 L1 C ATOM 3390 -25.951 16.716 -29.103 1.00 21.86 L1 C ATOM 3341 -27.146 17.356 -29.766 1.00 26.70 L1 C ATOM 3342 -25.313 14.456 -26.040 1.00 25.43 L1 C ATOM 3393 -25.448 15.021 -24.956 1.00 24.34 L1 O ATOM 3344 -25.401 13.134 -26.170 1.00 25.71 L1 N ATOM 3345 -25.640 12.301 -25.000 1.00 25.17 L1 C ATOM 3346 -24.619 12.467 -23.875 1.00 28.74 L1 C ATOM 3397 -24.952 12.284 -22.702 1.00 28.98 L1 O ATOM 3348 -23.376 12.806 -24.217 1.00 26.07 L1 N ATOM 3399 -22.342 13.023 -23.207 1.00 25.52 L1 C ATOM 3350 -21.104 12.176 -23.511 1.00 25.93 L1 C ATOM 3351 -21.357 10.799 -23.314 1.00 27.84 L1 O ATOM 3352 -21.905 14.484 -23.092 1.00 26.39 L1 C ATOM 3353 -21.490 14.925 -22.022 1.00 25.97 L1 O ATOM 3359 -21.991 15.227 -24.192 1.00 25.12 L1 N ATOM 3355 -21.290 16.471 -24.316 1.00 25.92 L1 C ATOM 3356 -20.279 16.342 -25.494 1.00 22.78 L1 C ATOM 3357 -19.380 15.133 -25.362 1.00 25.36 L1 C ATOM 3358 -18.840 14.864 -24.284 1.00 24.71 L1 O ATOM 3359 -19.220 14.387 -26.451 1.00 23.92 L1 N ATOM 3360 -22.087 17.742 -24.445 1.00 26.14 L1 C ATOM 3361 -23.258 17.697 -24.833 1.00 26.61 L1 O

4

ATOM 3362 -21.477 18.873 -24.106 1.00 25.64 L1 N ATOM 3363 -22.153 20.167 -24.125 1.00 25.99 L1 C ATOM 3364 -21.272 21.272 -23.484 1.00 26.18 L1 C ATOM 3365 -20.054 21.407 -24.231 1.00 27.99 L1 O ATOM 3366 -20.937 20.925 -22.040 1.00 25.80 L1 C ATOM 3367 -22.478 20.589 -25.553 1.00 24.65 L1 C ATOM 3368 -21.778 20.220 -26.992 1.00 23.55 L1 O ATOM 3369 -23.542 21.367 -25.713 1.00 22.97 L1 N ATOM 3370 -23.901 21.889 -27.024 1.00 20.22 L1 C ATOM 3371 -25.422 21.766 -27.273 1.00 20.79 L1 C ATOM 3372 -25.765 22.309 -28.640 1.00 17.13 L1 C ATOM 3373 -25.899 20.303 -27.162 1.00 18.86 L1 C ATOM 3374 -23.497 23.349 -27.126 1.00 20.72 L1 C ATOM 3375 -23.588 24.092 -26.153 1.00 20.35 L1 O ATOM 3376 -23.062 23.760 -28.311 1.00 21.11 L1 N ATOM 3377 -22.553 25.104 -28.515 1.00 20.37 L1 C ATOM 3378 -21.028 25.068 -28.673 1.00 20.30 L1 C ATOM 3379 -20.345 24.360 -27.513 1.00 20.02 L1 C ATOM 3380 -20.061 24.968 -26.477 1.00 20.69 L1 O ATOM 3381 -20.092 23.069 -27.675 1.00 18.74 L1 N ATOM 3382 -23.190 25.664 -29.765 1.00 23.63 L1 C ATOM 3383 -23.363 24.943 -30.750 1.00 25.23 L1 O ATOM 3384 -23.535 26.950 -29.728 1.00 24.33 L1 N ATOM 3385 -24.249 27.581 -30.828 1.00 23.53 L1 C ATOM 3386 -25.637 28.023 -30.361 1.00 24.65 L1 C ATOM 3387 -26.565 26.884 -30.058 1.00 23.30 L1 C ATOM 3388 -27.466 26.254 -30.973 1.00 21.45 L1 C ATOM 3389 -28.163 25.261 -30.257 1.00 22.89 L1 C ATOM 3390 -27.754 26.436 -32.330 1.00 24.38 L1 C ATOM 3391 -26.744 26.264 -28.853 1.00 22.85 L1 C ATOM 3392 -27.706 25.284 -28.965 1.00 22.07 L1 N ATOM 3393 -29.131 24.452 -30.853 1.00 23.37 L1 C ATOM 3394 -28.718 25.630 -32.920 1.00 24.94 L1 C ATOM 3395 -29.393 24.652 -32.181 1.00 23.99 L1 C ATOM 3396 -23.492 28.783 -31.393 1.00 24.76 L1 C ATOM 3397 -22.862 29.539 -30.651 1.00 24.29 L1 O ATOM 3398 -23.580 28.950 -32.710 1.00 23.23 L1 N

4

ATOM 3399 -22.890 30.017 -33.419 1.00 25.41 L1 C ATOM 3400 -21.710 29.444 -34.223 1.00 23.97 L1 C ATOM 3401 -20.751 28.674 -33.348 1.00 24.70 L1 C ATOM 3402 -21.020 27.357 -32.993 1.00 23.14 L1 C ATOM 3403 -20.220 26.679 -32.095 1.00 24.44 L1 C ATOM 3404 -19.639 29.291 -32.789 1.00 21.55 L1 C ATOM 3405 -18.826 28.618 -31.887 1.00 23.33 L1 C ATOM 3406 -19.127 27.312 -31.541 1.00 23.69 L1 C ATOM 3407 -18.359 26.638 -30.618 1.00 20.32 L1 O ATOM 3408 -23.845 30.737 -34.360 1.00 26.66 L1 C ATOM 3409 -24.741 30.131 -34.946 1.00 27.88 L1 O ATOM 3910 -23.640 32.040 -34.492 1.00 26.80 L1 N ATOM 3411 -24.395 32.858 -35.423 1.00 28.19 L1 C ATOM 3912 -24.986 34.053 -34.674 1.00 29.55 L1 C ATOM 3413 -25.560 35.128 -35.559 1.00 29.51 L1 C ATOM 3414 -25.992 36.335 -34.764 1.00 32.32 L1 C ATOM 3415 -25.167 37.159 -34.364 1.00 32.45 L1 O ATOM 3916 -27.292 36.449 -34.526 1.00 31.43 L1 N ATOM 3417 -23.928 33.339 -36.497 1.00 27.48 L1 C ATOM 3418 -22.313 33.746 -36.181 1.00 27.04 L1 O ATOM 3919 -23.839 33.284 -37.760 1.00 27.49 L1 N ATOM 3420 -22.977 33.751 -38.838 1.00 28.01 L1 C ATOM 3921 -22.396 32.569 -39.630 1.00 28.56 L1 C ATOM 3422 -21.371 33.003 -40.684 1.00 25.91 L1 C ATOM 3423 -20.727 31.842 -41.412 1.00 26.00 L1 C ATOM 3429 -21.345 30.791 -41.602 1.00 25.62 L1 O ATOM 3425 -19.476 32.028 -41.832 1.00 22.22 L1 N ATOM 3926 -23.697 34.682 -39.800 1.00 29.88 L1 C ATOM 3427 -24.718 34.318 -40.387 1.00 28.22 L1 O ATOM 3428 -23.143 35.881 -39.957 1.00 32.04 L1 N ATOM 3429 -23.601 36.838 -40.957 1.00 34.34 L1 C ATOM 3430 -23.473 38.267 -40.418 1.00 33.92 L1 C ATOM 3431 -24.221 38.579 -39.117 1.00 37.04 L1 C ATOM 3432 -23.977 40.031 -38.729 1.00 38.63 L1 C ATOM 3433 -25.711 38.328 -39.297 1.00 37.35 L1 C ATOM 3434 -22.765 36.686 -42.226 1.00 36.40 L1, C ATOM 3435 -21.658 36.142 -42.194 1.00 35.68 L1 O ATOM 3436 -23.285 37.167 -43.366 1.00 38.85 L1 N ATOM 3437 -24.597 37.818 -43.534 1.00 38.64 L1 C ATOM 3438 -22.597 36.981 -44.651 1.00 38.77 L1 C ATOM 3439 -23.531 37.655 -45.659 1.00 40.02 L1 C ATOM 3440 -24.884 37.619 -45.000 1.00 38.99 L1 C ATOM 3941 -21.197 37.590 -44.668 1.00 38.74 L1 C ATOM 3442 -20.978 38.690 -44.162 1.00 38.74 L1 O ATOM 3443 -20.248 36.856 -45.236 1.00 38.68 L1 N ATOM 3444 -18.901 37.375 -45.382 1.00 40.14 L1 C ATOM 3445 -18.135 37.520 -44.080 1.00 40.18 L1 C ATOM 3446 -17.077 38.147 -44.042 1.00 41.17 L1 O ATOM 3997 -18.655 36.941 -43.007 1.00 37.47 L1 N ATOM 3448 -17.972 37.040 -41.732 1.00 36.70 L1 C ATOM 3449 -18.660 38.090 -40.841 1.00 38.93 L1 C ATOM 3450 -17.927 38.239 -39.619 1.00 44.97 L1 O ATOM 3451 -20.073 37.673 -40.529 1.00 40.28 L1 C ATOM 3452 -17.898 35.692 -41.007 1.00 33.58 L1 C ATOM 3453 -18.693 34.787 -41.268 1.00 32.26 L1 O ATOM 3454 -16.924 35.556 -40.114 1.00 29.37 L1 N ATOM 3455 -16.748 34.320 -39.368 1.00 29.17 L1 C ATOM 3456 -15.469 34.376 -38.542 1.00 24.98 L1 C ATOM 3457 -17.999 34.104 -38.453 1.00 28.88 L1 C ATOM 3458 -18.588 35.057 -38.022 1.00 28.39 L1 O ATOM 3459 -18.249 32.839 -38.139 1.00 28.41 L1 N ATOM 3460 -17.620 31.619 -38.670 1.00 26.65 L1 C ATOM 3461 -19.282 32.538 -37.143 1.00 27.06 L1 C ATOM 3462 -19.254 31.013 -37.036 1.00 25.83 L1 C ATOM 3463 -18.623 30.552 -38.310 1.00 27.18 L1 C ATOM 3464 -18.922 33.199 -35.818 1.00 28.11 L1 C ATOM 3465 -17.745 33.412 -35.520 1.00 29.04 L1 O ATOM 3466 -19.934 33.527 -35.029 1.00 27.77 L1 N ATOM 3467 -19.718 34.126 -33.720 1.00 29.30 L1 C ATOM 3468 -20.324 35.529 -33.693 1.00 30.36 L1 C ATOM 3469 -20.595 36.080 -32.309 1.00 35.69 L1 C ATOM 3470 -21.447 37.342 -32.398 1.00 38.46 L1 C ATOM 3471 -21.611 38.008 -31.040 1.00 41.17 L1 C ATOM 3472 -22.445 39.245 -31.131 1.00 43.66 L1 N

1

ATOM 3473 -20.366 33.249 -32.654 1.00 27.70 L1 C ATOM 3474 -21.527 32.869 -32.784 1.00 28.72 L1 O ATOM 3475 -19.611 32.927 -31.609 1.00 25.77 L1 N ATOM 3476 -20.108 32.072 -30.530 1.00 26.00 L1 C ATOM 3477 -18.971 31.738 -29.556 1.00 22.43 L1 C ATOM 3478 -19.368 30.964 -28.294 1.00 24.81 L1 C ATOM 3479 -19.762 29.550 -28.680 1.00 20.56 L1 C ATOM 3480 -18.207 30.937 -27.298 1.00 22.63 L1 C ATOM 3481 -21.233 32.770 -29.772 1.00 26.08 L1 C ATOM 3482 -21.056 33.895 -29.312 1.00 25.15 L1 O ATOM 3483 -22.376 32.097 -29.642 1.00 26.83 L1 N ATOM 3484 -23.540 32.643 -28.934 1.00 28.45 L1 C ATOM 3485 -24.814 32.464 -29.763 1.00 30.33 L1 C ATOM 3986 -25.021 33.275 -31.042 1.00 35.48 L1 C ATOM 3987 -26.383 32.926 -31.613 1.00 35.81 L1 C ATOM 3488 -24.938 34.774 -30.756 1.00 34.18 L1 C ATOM 3489 -23.757 31.955 -27.589 1.00 27.72 L1 C ATOM 3490 -24.070 32.598 -26.588 1.00 27.24 L1 O ATOM 3491 -23.608 30.636 -27.590 1.00 27.22 L1 N ATOM 3492 -23.903 29.810 -26.428 1.00 23.99 L1 C ATOM 3493 -25.270 29.109 -26.590 1.00 23.11 L1 C ATOM 3999 -25.514 28.171 -25.427 1.00 23.24 L1 C ATOM 3495 -26.383 30.153 -26.717 1.00 25.09 L1 C ATOM 3996 -26.846 30.791 -25.395 1.00 26.07 L1 C ATOM 3497 -22.830 28.738 -26.293 1.00 24.62 L1 C ATOM 3498 -22.472 28.077 -27.272 1.00 25.83 L1 O ATOM 3999 -22.314 28.558 -25.085 1.00 25.53 L1 N ATOM 3500 -21.466 27.403 -24.811 1.00 26.67 L1 C ATOM 3501 -20.003 27.833 -24.628 1.00 25.70 L1 C ATOM 3502 -19.748 28.688 -23.408 1.00 26.62 L1 C ATOM 3503 -19.874 30.068 -23.466 1.00 26.79 L1 C ATOM 3504 -19.645 30.858 -22.343 1.00 28.90 L1 C ATOM 3505 -19.383 28.110 -22.196 1.00 26.72 L1 C ATOM 3506 -19.153 28.882 -21.071 1.00 28.12 L1 C ATOM 3507 -19.288 30.258 -21.148 1.00 30.76 L1 C ATOM 3508 -19.085 31.030 -20.026 1.00 29.96 L1 O ATOM 3509 -21.976 26.697 -23.563 1.00 25.84 L1 C

2

ATOM 3510 -22.784 27.251 -22.821 1.00 24.72 L1 O ATOM 3511 -21.518 25.470 -23.343 1.00 26.19 L1 N ATOM 3512 -21.971 24.688 -22.198 1.00 26.90 L1 C ATOM 3513 -21.436 25.284 -20.896 1.00 27.94 L1 C ATOM 3514 -20.133 24.813 -20.626 1.00 31.95 L1 O ATOM 3515 -23.494 24.628 -22.129 1.00 24.91 L1 C ATOM 3516 -24.080 24.808 -21.060 1.00 22.95 L1 O ATOM 3517 -24.122 24.384 -23.275 1.00 24.45 L1 N ATOM 3518 -25.571 24.212 -23.351 1.00 25.66 L1 C ATOM 3519 -26.051 23.237 -22.270 1.00 24.57 L1 C ATOM 3520 -25.501 21.835 -22.463 1.00 25.41 L1 C ATOM 3521 -25.299 21.383 -23.589 1.00 26.77 L1 O ATOM 3522 -25.251 21.143 -21.361 1.00 25.99 L1 N ATOM 3523 -26.350 25.520 -23.224 1.00 24.22 L1 C ATOM 3524 -27.273 25.767 -23.999 1.00 24.09 L1 O ATOM 3525 -25.982 26.351 -22.251 1.00 25.59 L1 N ATOM 3526 -26.821 27.482 -21.875 1.00 27.46 L1 C ATOM 3527 -27.830 27.038 -20.811 1.00 27.71 L1 C ATOM 3528 -27.154 26.453 -19.570 1.00 33.27 L1 C ATOM 3529 -26.023 26.819 -19.226 1.00 32.11 L1 O ATOM 3530 -27.846 25.537 -18.894 1.00 32.47 L1 N ATOM 3531 -26.064 28.712 -21.374 1.00 28.20 L1 C ATOM 3532 -26.664 29.601 -20.766 1.00 26.89 L1 O ATOM 3533 -24.758 28.772 -21.625 1.00 27.94 L1 N ATOM 3534 -23.949 29.907 -21.182 1.00 26.56 L1 C ATOM 3535 -22.620 29.410 -20.599 1.00 27.00 L1 C ATOM 3536 -22.772 28.528 -19.362 1.00 26.24 L1 C ATOM 3537 -23.496 29.231 -18.222 1.00 29.69 L1 C ATOM 3538 -22.973 30.179 -17.630 1.00 28.40 L1 0 ATOM 3539 -24.708 28.774 -17.914 1.00 26.55 L1 N ATOM 3590 -23.670 30.923 -22.294 1.00 28.39 L1 C ATOM 3541 -23.343 30.557 -23.424 1.00 27.97 L1 O ATOM 3542 -23.797 32.205 -21.971 1.00 27.97 L1 N ATOM 3543 -23.526 33.247 -22.952 1.00 31:26 L1 C ATOM 3594 -24.612 34.327 -22.897 1.00 31.77 L1 C ATOM 3545 -25.921 33.916 -23.551 1.00 35.02 L1 C ATOM 3596 -27.002 34.966 -23.340 1.00 37.92 L1 C ATOM 3597 -27.466 34.997 -21.956 1.00 40.09 L1 N ATOM 3548 -27.186 35.969 -21.093 1.00 42.88 L1 C ATOM 3599 -26.442 37.003 -21.471 1.00 42.75 L1 N ATOM 3550 -27.642 35.900 -19.845 1.00 42.31 L1 N ATOM 3551 -22.160 33.892 -22.755 1.00 31.34 L1 C ATOM 3552 -21.785 34.257 -21.647 1.00 30.63 L1 O ATOM 3553 -21.396 34.041 -23.842 1.00 32.93 L1 N ATOM 3554 -21.569 33.417 -25.162 1.00 30.73 L1 C ATOM 3555 -20.205 34.891 -23.787 1.00 33.81 L1 C ATOM 3556 -19.605 34.772 -25.188 1.00 33.09 L1 C ATOM 3557 -20.196 33.528 -25.754 1.00 33.61 L1 C ATOM 3558 -20.632 36.322 -23.485 1.00 36.31 L1 C ATOM 3559 -21.763 36.721 -23.787 1.00 36.25 L1 O ATOM 3560 -19.731 37.084 -22.881 1.00 37.50 L1 N ATOM 3561 -19.946 38.507 -22.683 1.00 41.08 L1 C ATOM 3562 -18.667 39.139 -22.080 1.00 42.30 L1 C ATOM 3563 -18.841 40.537 -21.919 1.00 48.81 L1 O ATOM 3564 -20.259 39.151 -24.033 1.00 42.62 L1 C ATOM 3565 -19.583 38.883 -25.028 1.00 41.85 L1 O ATOM 3566 -21.290 39.990 -24.068 1.00 93.59 L1 N ATOM 3567 -21.639 40.665 -25.308 1.00 44.33 L1 C ATOM 3568 -22.635 39.902 -26.160 1.00 44.22 L1 C ATOM 3569 -22.762 40.154 -27.362 1.00 96.95 L1 O ATOM 3570 -23.329 38.949 -25.545 1.00 41.84 L1 N ATOM 3571 -24.456 38.284 -26.187 1.00 38.40 L1 C ATOM 3572 -24.213 36.759 -26.312 1.00 37.83 L1 C ATOM 3573 -25.456 36.073 -26.854 1.00 35.01 L1 C ATOM 3574 -23.019 36.494 -27.223 1.00 34.54 L1 C ATOM 3575 -25.710 38.523 -25.353 1.00 37.89 L1 C ATOM 3576 -25.750 38.195 -24.172 1.00 36.97 L1 O ATOM 3577 -26.753 39.099 -25.967 1.00 38.59 L1 N ATOM 3578 -26.783 39.481 -27.387 1.00 38.95 L1 C ATOM 3579 -28.000 39.460 -25.281 1.00 39.12 L1 C ATOM 3580 -28.852 40.083 -26.384 1.00 38.57 L1 C ATOM 3581 -27.881 40.495 -27.928 1.00 40.32 L1 C ATOM 3582 -28.694 38.251 -24.657 1.00 39.92 . L1 C ATOM 3583 -28.709 37.162 -25.238 1.00 40.29 L1 O

4

ATOM. 3584 -29.281 38.449 -23.482 1.00 38.79 L1 N ATOM 3585 -29.944 37.362 -22.780 1.00 39.81 L1 C ATOM 3586 -30.266 37.774 -21.339 1.00 46.00 L1 C ATOM 3587 -31.094 39.054 -21.258 1.00 50.76 L1 C ATOM 3588 -31.389 39.489 -20.123 1.00 53.85 L1 O ATOM 3589 -31.446 39.624 -22.317 1.00 52.25 L1 O ATOM 3590 -31.213 36.868 -23.467 1.00 37.81 L1 C ATOM 3591 -31.837 35.917 -23.004 1.00 39.35 L1 O ATOM 3592 -31.601 37.495 -24.571 1.00 36.57 L1 N ATOM 3593 -32.735 36.985 -25.332 1.00 35.73 L1 C ATOM 3594 -33.302 38.073 -26.248 1.00 36.98 L1 C ATOM 3595 -32.312 38.621 -27.243 1.00 40.00 L1 C ATOM 3596 -32.835 39.889 -27.898 1.00 40.98 L1 C ATOM 3597 -31.860 40.430 -28.836 1.00 38.44 L1 N ATOM 3598 -31.799 40.077 -30.111 1.00 36.96 L1 C ATOM 3599 -32.664 39.193 -30.580 1.00 37.89 L1 N ATOM 3600 -30.870 40.589 -30.905 1.00 36.03 L1 N ATOM 3601 -32.342 35.752 -26.153 1.00 34.56 L1 C ATOM 3602 -33.199 35.055 -26.687 1.00 32.53 L1 O ATOM 3603 -31.041 35.489 -26.248 1.00 34.16 L1 N ATOM 3604 -30.561 34.192 -26.738 1.00 33.82 L1 C ATOM 3605 -29.210 34.345 -27.436 1.00 31.07 L1 C ATOM 3606 -29.272 35.142 -28.706 1.00 31.60 L1 C ATOM 3607 -29.616 34.535 -29.903 1.00 30.71 L1 C ATOM 3608 -28.977 36.496 -28.703 1.00 31.31 L1 C ATOM 3609 -29.664 35.262 -31.074 1.00 32.32 L1 C ATOM 3610 -29.023 37.231 -29.875 1.00 33.14 L1 C ATOM 3611 -29.367 36.612 -31.062 1.00 33.35 L1 C ATOM 3612 -30.404 33.236 -25.564 1.00 33.18 L1 C ATOM 3613 -29.770 33.576 -24.568 1.00 34.53 L1 O ATOM 3614 -30.982 32.046 -25.676 1.00 31.90 L1 N ATOM 3615 -30.829 31.042 -24.633 1.00 31.99 L1 C ATOM 3616 -31.984 31.139 -23.627 1.00 33.55 L1 C ATOM 3617 -33.196 30.648 -24.176 1.00 34.69 L1 O ATOM 3618 -30.777 29.638 -25.226 1.00 30.65 L1 C ATOM 3619 -31.400 29.360 -26.247 1.00 32.44 L1 O ATOM 3620 -30.029 28.750 -24.581 1.00 30.08 L1 N ATOM 3621 -29.917 27.396 -25.086 1.00 28.03 L1 C ATOM 3622 -30.918 26.371 -24.097 1.00 28.41 L1 C ATOM 3623 -30.419 26.609 -22.893 1.00 28.15 L1 O ATOM 3624 -30.854 25.223 -24.603 1.00 29.78 L1 N ATOM 3625 -31.205 24.113 -23.730 1.00 29.50 L1 C ATOM 3626 -32.708 24.111 -23.439 1.00 30.04 L1 C ATOM 3627 -33.461 23.989 -24.632 1.00 33.58 L1 O ATOM 3628 -30.792 22.782 -24.337 1.00 29.31 L1 C ATOM 3629 -30.605 22.661 -25.551 1.00 28.96 L1 O ATOM 3630 -30.636 21.790 -23.472 1.00 29.49 L1 N ATOM 3631 -30.268 20.448 -23.886 1.00 31.34 L1 C ATOM 3632 -28.789 20.182 -23.587 1.00 29.79 L1 C ATOM 3633 -28.422 18.700 -23.598 1.00 30.92 L1 C ATOM 3639 -26.945 18.480 -23.271 1.00 31.59 L1 C ATOM 3635 -26.665 17.014 -22.974 1.00 31.18 L1 C ATOM 3636 -25.207 16.754 -22.808 1.00 32.99 L1 N ATOM 3637 -31.123 19.451 -23.119 1.00 32.11 L1 C ATOM 3638 -31.355 19.614 -21.921 1.00 33.29 L1 O ATOM 3639 -31.591 18.420 -23.808 1.00 32.41 L1 N ATOM 3640 -32.289 17.334 -23.137 1.00 33.97 L1 C ATOM 3691 -33.788 17.624 -23.098 1.00 35.12 L1 C ATOM 3642 -34.481 16.551 -22.492 1.00 39.24 L1 O ATOM 3643 -32.038 16.010 -23.851 1.00 32.19 L1 C ATOM 3699 -32.356 15.861 -25.027 1.00 31.42 L1 O ATOM 3695 -31.470 15.046 -23.134 1.00 31.82 L1 N ATOM 3696 -31.165 13.768 -23.750 1.00 30.65 L1 C ATOM 3647 -30.148 13.927 -24.865 1.00 31.46 L1 C ATOM 3648 -29.026 14.364 -24.623 1.00 31.98 L1 O ATOM 3649 -30.531 13.572 -26.087 1.00 30.21 L1 N ATOM 3650 -29.627 13.705 -27.221 1.00 29.79 L1 C ATOM 3651 -29.517 12.384 -28.011 1.00 31.03 L1 C ATOM 3652 -30.813 11.994 -28.972 1.00 32.35 L1 O ATOM 3653 -28.934 11.269 -27.126 1.00 26.28 L1 C ATOM 3654 -30.040 14.820 -28.179 1.00 29.23 L1 C ATOM 3655 -29.630 147837 -29.336 1.00 28.90 L1 O ATOM 3656 -30.841 15.759 -27.687 1.00 28.99 L1 N ATOM 3657 -31.244 16.908 -28.486 1.00 27.69 L1 C ATOM 3658 -32.719 16.795 -28.860 1.00 29.27 . L1 C ATOM 3659 -32.874 15.835 -29.886 1.00 38.45 L1 O ATOM 3660 -31.003 18.208 -27.745 1.00 24.99 L1 C ATOM 3661 -30.824 18.208 -26.535 1.00 25.72 L1 O ATOM 3662 -30:995 19.315 -28.480 1.00 23.99 L1 N ATOM 3663 -30.769 20.626 -27.884 1.00 26.16 L1 C ATOM 3669 -29.272 20.976 -27.903 1.00 22.79 L1 C ATOM 3665 -31.555 21.669 -28.654 1.00 26.58 L1 C ATOM 3666 -32.062 21.396 -29.742 1.00 26.75 L1 O ATOM 3667 -31.645 22.872 -28.102 1.00 28.14 L1 N ATOM 3668 -32.438 23.910 -28.745 1.00 29.91 L1 C ATOM 3669 -33.900 23.788 -28.305 1.00 30.18 L1 C ATOM 3670 -34.699 24.715 -29.010 1.00 37.35 L1 O ATOM 3671 -31.926 25.313 -28.453 1.00 28.74 L1 C ATOM 3672 -31.501 25.613 -27.337 1.00 30.53 L1 O ATOM 3673 -31.955 26.161 -29.472 1.00 29.11 L1 N ATOM 3679 -31.628 27.574 -29.321 1.00 31.29 L1 C ATOM 3675 -30.694 28.029 -30.449 1.00 28.58 L1 C ATOM 3676 -30.226 29.983 -30.412 1.00 29.48 L1 C ATOM 3677 -29.347 29.689 -29.201 1.00 29.08 L1 C ATOM 3678 -29.464 29.827 -31.694 1.00 28.89 L1 C ATOM 3679 -32.931 28.366 -29.384 1.00 32.05 L1 C ATOM 3680 -33.707 28.221 -30.327 1.00 31.82 L1 O ATOM 3681 -33.176 29.194 -28.376 1.00 31.88 L1 N ATOM 3682 -39.368 30.028 -28.374 1.00 32.47 L1 C ATOM 3683 -35.148 29.833 -27.077 1.00 32.36 L1 C ATOM 3684 -33.952 31.479 -28.520 1.00 32.90 L1 C ATOM 3685 -33.072 31.955 -27.803 1.00 33.92 L1 O ATOM 3686 -34.575 32.175 -29.462 1.00 33.40 L1 N ATOM 3687 -34.331 33.597 -29.635 1.00 34.46 L1 C ATOM 3688 -33.824 33.906 -31.058 1.00 34.25 L1 C ATOM 3689 -33.403 35.370 -31.155 1.00 32.73 L1 C ATOM 3690 -32.626 33.014 -31.393 1.00 35.86 L1 C ATOM 3691 -32.170 33.122 -32.847 1.00 35.68 L1 C ATOM 3692 -35.648 34.331 -29.410 1.00 36.20 L1 C ATOM 3693 -36.586 34.210 -30.204 1.00 35.91 L1 O ATOM 3694 -35.722 35.082 -28.319 1.00 36.94 L1 N ATOM 3695 -36.907 35.878 -28.038 1.00 38.93 L1 C ATOM 3696 -37.273 35.777 -26.555 1.00 39.60 L1 C ATOM 3697 -36.215 36.242 -25.739 1.00 42.81 L1 O ATOM 3698 -36.655 37.331 -28.424 1.00 39.07 L1 C ATOM 3699 -35.503 37.756 -28.574 1.00 37.94 L1 O ATOM 3700 -37.733 38.089 -28.600 1.00 37.57 L1 N ATOM 3701 -37.585 39.485 -28.966 1.00 35.79 L1 C ATOM 3702 -36.839 39.619 -30.276 1.00 35.60 L1 C ATOM 3703 -35.946 40.458 -30.423 1.00 33.98 L1 O ATOM 3704 -37.212 38.781 -31.236 1.00 35.78 L1 N ATOM 3705 -36.506 38.703 -32.506 1.00 35.73 L1 C ATOM 3706 -37.290 37.812 -33.468 1.00 36.94 L1 C ATOM 3707 -36.602 37.311 -34.738 1.00 37.13 L1 C ATOM 3708 -35.333 36.537 -34.392 1.00 34.89 L1 C ATOM 3709 -37.583 36.423 -35.490 1.00 37.56 L1 C ATOM 3710 -36.301 40.082 -33.124 1.00 36.83 L1 C ATOM 3711 -37.241 40.872 -33.244 1.00 36.62 L1 O ATOM 3712 -35.064 40.362 -33.519 1.00 37.09 L1 N ATOM 3713 -34.739 41.593 -34.221 1.00 38.15 L1 C ATOM 3714 -33.738 42.405 -33.403 1.00 42.19 L1 C ATOM 3715 -34.200 42.669 -31.979 1.00 49.70 L1 C ATOM 3716 -33.230 43.539 -31.213 1.00 56.13 L1 C ATOM 3717 -32.224 43.999 -31.764 1.00 58.59 L1 O ATOM 3718 -33.520 43.772 -29.932 1.00 58.28 L1 N ATOM 3719 -34.154 41.270 -35.592 1.00 38.49 L1 C ATOM 3720 -33.627 40.177 -35.811 1.00 36.48 L1 O ATOM 3721 -34.243 42.220 -36.516 1.00 36.90 L1 N ATOM 3722 -33.800 41.975 -37.881 1.00 38.24 L1 C ATOM 3723 -34.135 43.181 -38.771 1.00 37.34 L1 C ATOM 3724 -33.438 44.336 -38.346 1.00 41.79 L1 O ATOM 3725 -32.298 41.661 -37.959 1.00 38.41 L1 C ATOM 3726 -31.857 40.977 -38.876 1.00 39.41 L1 O ATOM 3727 -31.518 42.156 -37.001 1.00 37.61 L1 N ATOM 3728 -30.085 41.857 -36.964 1.00 37.59 L1 C ATOM 3729 -29.382 42.649 -35.855 1.00 41.17 L1 C ATOM 3730 -29.697 44.126 -35.838 1.00 50.54 L1 C ATOM 3731 -31.072 44.404 -35.270 1.00 53.17 L1 C ATOM 3732 -31.236 44.292 -34.036 1.00 57.55 L1 O ATOM 3733 -31.986 44.727 -36.057 1.00 56.15 L1 O ATOM 3734 -29.860 40.370 -36.706 1.00 34.12 L1 C ATOM 3735 -28.765 39.862 -36.899 1.00 31.06 L1 O ATOM 3736 -30.898 39.681 -36.250 1.00 31.15 L1 N ATOM 3737 -30.779 38.265 -35.941 1.00 30.79 L1 C ATOM 3738 -31.877 37.843 -34.962 1.00 30.65 L1 C ATOM 3739 -31.797 38.587 -33.644 1.00 32.56 L1 C ATOM 3740 -30.697 39.067 -33.289 1.00 34.97 L1 O ATOM 3741 -32.834 38.692 -32.961 1.00 31.83 L1 O ATOM 3742 -30.846 37.395 -37.194 1.00 29.63 L1 C ATOM 3743 -30.649 36.188 -37.113 1.00 28.37 L1 O ATOM 3744 -31.121 38.002 -38.348 1.00 29.00 L1 N ATOM 3745 -31.189 37.234 -39.588 1.00 30.03 L1 C ATOM 3746 -31.730 38.088 -40.741 1.00 30.22 L1 C ATOM 3747 -31.723 37.358 -42.089 1.00 31.01 L1 C ATOM 3748 -32.799 37.846 -43.050 1.00 35.95 L1 C ATOM 3749 -32.515 37.939 -44.265 1.00 37.52 L1 O ATOM 3750 -33.930 38.132 -42.598 1.00 36.88 L1 O ATOM 3751 -29.800 36.714 -39.948 1.00 30.69 L1 C ATOM 3752 -28.873 37.496 -40.160 1.00 31.59 L1 O ATOM 3753 -29.6b3 35.394 -40.021 1.00 29.97 L1 N ATOM 3754 -28.345 34.780 -40.110 1.00 28.04 L1 C ATOM 3755 -27.499 35.206 -38.915 1.00 28.83 L1 C ATOM 3756 -28.440 33.265 -40.153 1.00 27.69 L1 C ATOM 3757 -29.522 32.692 -39.988 1.00 24.83 L1 O ATOM 3758 -27.293 32.625 -40.377 1.00 28.83 L1 N ATOM 3759 -27.171 31.173 -40.263 1.00 27.36 L1 C ATOM 3760 -26.098 30.653 -41.224 1.00 30.73 L1 C ATOM 3761 -26.494 30.794 -42.683 1.00 32.29 L1 C ATOM 3762 -27.659 30.501 -43.017 1.00 36.16 L1 O ATOM 3763 -25.639 31.194 -43.497 1.00 33.33 L1 0 ATOM 3764 -26.775 30.813 -38.835 1.00 26.79 L1 C ATOM 3765 -25.899 31.451 -38.245 1.00 26.47 L1 O ATOM 3766 -27.419 29.789 -38.286 1.00 25.78 L1 N ATOM 3767 -27.113 29.317 -36.946 1.00 26.39 L1 C ATOM 3768 -28.346 29.450 -36.043 1.00 26.23 L1 C

1

ATOM 3806 -19.530 18.209 -30.487 1.00 23.31 L1 C ATOM 3807 -19.298 17.798 -31.619 1.00 24.62 L1 O ATOM 3808 -18.792 17.864 -29.436 1.00 22.18 L1 N ATOM 3809 -17.749 16.857 -29.566 1.00 21.63 L1 C ATOM 3810 -16.850 16.862 -28.331 1.00 20.72 L1 C ATOM 3811 -15.604 16.033 -28.480 1.00 24.87 L1 C ATOM 3812 -14.339 16.463 -29.011 1.00 23.79 L1 C ATOM 3813 -13.453 15.372 -28.914 1.00 24.92 L1 C ATOM 3814 -13.874 17.663 -29.556 1.00 24.00 L1 C ATOM 3815 -15.435 14.735 -28.100 1.00 24.13 L1 C ATOM 3816 -14.147 14.331 -28.356 1.00 26.35 L1 N ATOM 3817 -12.125 15.443 -29.339 1.00 25.22 L1 C ATOM 3818 -12.551 17.734 -29.981 1.00 27.22 L1 C ATOM 3819 -11.694 16.629 -29.868 1.00 26.53 L1 C ATOM 3820 -18.378 15.470 -29.739 1.00 22.42 L1 C ATOM 3821 -19.333 15.120 -29.053 1.00 21.21 L1 O ATOM 3822 -17.838 14.684 -30.661 1.00 22.63 L1 N ATOM 3823 -18.303 13.316 -30.847 1.00 22.79 L1 C ATOM 3824 -18.629 13.054 -32.312 1.00 22.67 L1 C ATOM 3825 -19.345 11.732 -32.517 1.00 24.52 L1 C ATOM 3826 -20.593 11.733 -32.528 1.00 24.55 L1 O ATOM 3827 -18.662 10.695 -32.662 1.00 24.78 L1 O ATOM 3828 -17.234 12.338 -30.393 1.00 23.59 L1 C ATOM 3829 -16.085 12.430 -30.815 1.00 21.15 L1 O ATOM 3830 -17.622 11.396 -29.541 1.00 22.22 L1 N ATOM 3831 -16.672 10.480 -28.931 1.00 23.56 L1 C ATOM 3832 -17.222 10.010 -27.579 1.00 22.41 L1 C ATOM 3833 -17.423 11.162 -26.610 1.00 25.03 L1 C ATOM 3839 -16.432 11.869 -26.310 1.00 24.18 L1 O ATOM 3835 -18.567 11.367 -26.153 1.00 23.82 L1 O ATOM 3836 -16.291 9.279 -29.803 1.00 22.66 L1 C ATOM 3837 -15.337 8.576 -29.498 1.00 23.33 L1 O ATOM 3838 -17.027 9.043 -30.885 1.00 23.45 L1 N ATOM 3839 -16.663 7.979 -31.821 1.00 22.75 L1 C ATOM 3840 -17.913 7.348 -32.444 1.00 21.53 L1 C ATOM 3841 -18.715 6.725 -31.450 1.00 19.78 L1 O ATOM 3842 -15.762 8.524 -32.918 1.00 24.04 L1 C

11

ATOM 3843 95 -14.806 7.867 -33.329 1.00 24.34 L1 O ATOM 3844 96 -16.060 9.736 -33.374 1.00 22.90 L1 N ATOM 3845 96 -15.206 10.427 -34.328 1.00 23.33 L1 C ATOM 3846 96 -16.022 11.480 -35.076 1.00 25.43 L1 C ATOM 3847 96 -17.131 10.906 -35.962 1.00 26.90 L1 C ATOM 3848 96 -18.143 11.991 -36.285 1.00 23.29 L1 C ATOM 3849 96 -16.522 10.341 -37.226 1.00 27.63 L1 C ATOM 3850 96 -14.008 11.093 -33.644 1.00 23.40 L1 C ATOM 3851 96 -13.029 11.442 -34.300 1.00 22.31 L1 0 ATOM 3852 97 -14.094 11.267 -32.327 1.00 21.76 L1 N ATOM 3853 97 -13.032 11.919 -31.564 1.00 23.62 L1 C ATOM 3859 97 -11.765 11.064 -31.594 1.00 23.22 L1 C ATOM 3855 97 -11.961 9.742 -30.897 1.00 25.99 L1 C ATOM 3856 97 -12.281 9.698 -29.701 1.00 24.63 L1 O ATOM 3857 97 -11.794 8.651 -31.637 1.00 27.24 L1 N ATOM 3858 97 -12.719 13.326 -32.054 1.00 24.97 L1 C ATOM 3859 97 -11.554 13.677 -32.290 1.00 24.92 L1 O ATOM 3860 98 -13.764 14.134 -32.199 1.00 21.90 L1 N ATOM 3861 98 -13.575 15.504 -32.632 1.00 23.01 L1 C ATOM 3862 98 -14.900 16.223 -32.796 1.00 22.94 L1 C ATOM 3863 98 -15.961 15.660 -32.516 1.00 19.38 L1 O ATOM 3869 99 -14.835 17.465 -33.258 1.00 21.48 L1 N ATOM 3865 99 -16.017 18.309 -33.354 1.00 21.80 L1 C ATOM 3866 99 -15.602 19.784 -33.485 1.00 20.41 L1 C ATOM 3867 99 -15.097 20.349 -32.201 1.00 21.29 L1 C ATOM 3868 99 -15.887 20.731 -31.070 1.00 20.83 L1 C ATOM 3869 99 -14.993 21.130 -30.052 1.00 21.78 L1 C ATOM 3870 99 -17.264 20.773 -30.819 1.00 21.01 L1 C ATOM 3871 99 -13.792 20.533 -31.838 1.00 20.69 L1 C ATOM 3872 99 -13.721 21.000 -30.548 1.00 18.42 L1 N ATOM 3873 99 -15.429 21.565 -28.797 1.00 21.72 L1 C ATOM 3874 99 -17.701 21.207 -29.572 1.00 24.75 L1 C ATOM 3875 99 -16.782 21.597 -28.575 1.00 23.40 L1 C ATOM 3876 99 -16.896 17.915 -34.530 1.00 21.60 L1 C ATOM 3877 99 -16.411 17.673 -35.640 1.00 20.77 L1 O ATOM 3878 100 -18.196 17.843 -34.280 1.00 21.15 L1 N ATOM 3879 100 -19.155 17.745 -35.366 1.00 20.99 L1 C

12

ATOM 3880 100 -19.959 16.412 -35.299 1.00 21.63 L1 C ATOM 3881 100 -19.013 15.237 -35.493 1.00 18.33 L1 C ATOM 3882 100 -20.685 16.283 -33.965 1.00 20.08 L1 C ATOM 3883 100 -20.094 18.945 -35.310 1.00 22.73 L1 C ATOM 3884 100 -20.206 19.604 -34.271 1.00 21.19 L1 O ATOM 3885 101 -20.731 19.244 -36.439 1.00 23.17 L1 N ATOM 3886 101 -21.625 20.393 -36.556 1.00 24.04 L1 C ATOM 3887 101 -21.052 21.421 -37.538 1.00 23.68 L1 C ATOM 3888 101 -19.847 22.175 -37.015 1.00 25.65 L1 C ATOM 3889 101 -18.558 21.762 -37.330 1.00 25.40 L1 C ATOM 3890 101 -20.005 23.323 -36.253 1.00 25.22 L1 C ATOM 3891 101 -17.999 22.484 -36.900 1.00 27.16 L1 C ATOM 3892 101 -18.899 24.053 -35.818 1.00 26.53 L1 C ATOM 3893 101 -17.621 23.632 -36.144 1.00 25.47 L1 C ATOM 3899 101 -22.995 19.944 -37.060 1.00 24.46 L1 C ATOM 3895 101 -23.134 18.856 -37.620 1.00 25.98 L1 O ATOM 3896 102 -24.006 20.782 -36.856 1.00 24.12 L1 N ATOM 3897 102 -25.261 20.601 -37.560 1.00 23.71 L1 C ATOM 3898 102 -25.108 21.230 -38.930 1.00 24.83 L1 C ATOM 3899 102 -24.139 21.951 -39.169 1.00 25.59 L1 O ATOM 3900 103 -26.049 20.974 -39.831 1.00 24.86 L1 N ATOM 3901 103 -25.923 21.487 -41.188 1.00 23.32 L1 C ATOM 3902 103 -26.218 22.973 -41.301 1.00 23.92 L1 C ATOM 3903 103 -26.063 23.565 -42.365 1.00 23.16 L1 O ATOM 3904 104 -26.637 23.590 -40.205 1.00 24.09 L1 N ATOM 3905 104 -26.940 25.010 -40.247 1.00 25.99 L1 C ATOM 3906 104 -28.406 25.294 -40.535 1.00 26.46 L1 C ATOM 3907 104 -29.032 24.613 -41.348 1.00 25.23 L1 O ATOM 3908 105 -28.951 26.296 -39.850 1.00 27.15 L1 N ATOM 3909 105 -30.313 26.762 -40.080 1.00 27.11 L1 C ATOM 3910 105 -31.161 26.699 -38.801 1.00 26.99 L1 C ATOM 3911 105 -31.235 25.348 -38.335 1.00 25.27 L1 O ATOM 3912 105 -32.574 27.229 -39.074 1.00 27.18 L1 C

ATOM 3913 105 -30.275 28.220 -40.511 1.00 28.67 L1 C ATOM 3914 105 -29.776 29.072 -39.770 1.00 28.70 L1 O ATOM 3915 106 -30.811 28.511 -41.693 1.00 27.94 L1 N ATOM 3916 106 -30.958 29.895 -42.132 1.00 27.78 L1 C

1

ATOM 3917 106 -31.076 29.959 -43.660 1.00 30.73 L1 C ATOM 3918 106 -31.292 31.370 -44.224 1.00 34.36 L1 C ATOM 3919 106 -31.505 31.327 -45.743 1.00 40.73 L1 C ATOM 3920 106 -32.204 32.589 -46.269 1.00 43.20 L1 C ATOM 3921 106 -31.412 33.828 -45.992 1.00 43.79 L1 N ATOM 3922 106 -32.204 30.506 -41.492 1.00 28.25 L1 C ATOM 3923 106 -33.324 30.102 -41.790 1.00 27.19 L1 O ATOM 3924 107 -32.002 31.476 -40.606 1.00 28.39 L1 N ATOM 3925 107 -33.115 32.167 -39.965 1.00 29.11 L1 C ATOM 3926 107 -32.759 32.529 -38.524 1.00 27.84 L1 C ATOM 3927 107 -33.833 33.302 -37.750 1.00 30.76 L1 C ATOM 3928 107 -35.095 32.460 -37.646 1.00 28.82 L1 C ATOM 3929 107 -33.320 33.665 -36.364 1.00 29.24 L1 C ATOM 3930 107 -33.438 33.440 -40.731 1.00 29.95 L1 C ATOM 3931 107 -32.583 34.313 -40.881 1.00 30.14 L1 O ATOM 3932 108 -34.668 33.544 -41.222 1.00 29.29 L1 N ATOM 3933 108 -35.124 34.781 -41.835 1.00 29.21 L1 C ATOM 3939 108 -35.949 34.519 -43.118 1.00 30.69 L1 C ATOM 3935 108 -35.126 33.888 -44.107 1.00 30.87 L1 O ATOM 3936 108 -36.482 35.837 -43.686 1.00 30.92 L1 C ATOM 3937 108 -35.993 35.535 -40.840 1.00 29.75 L1 C ATOM 3938 108 -36.920 34.973 -40.257 1.00 29.93 L1 O ATOM 3939 109 -35.685 36.808 -40.637 1.00 30.82 L1 N ATOM 3940 109 -36.549 37.666 -39.837 1.00 31.06 L1 C ATOM 3941 109 -35.720 38.675 -39.012 1.00 29.89 L1 C ATOM 3942 109 -36.636 39.619 -38.253 1.00 31.03 L1 C ATOM 3993 109 -34.827 37.922 -38.093 1.00 30.10 L1 C ATOM 3944 109 -37.469 38.404 -40.803 1.00 30.26 L1 C ATOM 3945 109 -37.037 39.294 -41.537 1.00 28.33 L1 O ATOM 3996 110 -38.737 38.007 -40.808 1.00 29.80 L1 N ATOM 3947 110 -39.672 38.430 -41.844 1.00 30.88 L1 C ATOM 3948 110 -41.047 37.813 -41.571 1.00 29.96 L1 C ATOM 3999 110 -41.036 36.279 -41.536 1.00 29.38 L1 C ATOM 3950 110 -42.338 35.739 -40.950 1.00 28.86 L1 C ATOM 3951 110 -40.828 35.757 -42.938 1.00 22.82 L1 C ATOM 3952 110 -39.779 39.950 -41.934 1.00 30.13 L1 C ATOM 3953 110 -40.124 40.616 -40.962 1.00 30.33 L1 O

14

ATOM 3954 111 -39.468 40.486 -43.110 1.00 31.70 L1 N ATOM 3955 111 -39.525 41.923 -43.327 1.00 32.20 L1 C ATOM 3956 111 -40.510 42.285 -44.428 1.00 33.43 L1 C ATOM 3957 111 -40.689 43.461 -44.768 1.00 35.10 L1 O ATOM 3958 112 -41.150 41.266 -44.990 1.00 33.16 L1 N ATOM 3959 112 -42.217 41.465 -45.964 1.00 36.01 L1 C ATOM 3960 112 -41.627 41.718 -47.354 1.00 37.16 L1 C ATOM 3961 112 -40.857 40.542 -47.931 1.00 37.31 L1 C ATOM 3962 112 -40.276 40.863 -49.291 1.00 38.17 . L1 C ATOM 3963 112 -40.967 40.775 -50.306 1.00 40.76 L1 O ATOM 3964 112 -39.004 41.243 -49.320 1.00 35.15 L1 N ATOM 3965 112 -43.097 40.219 -45.984 1.00 36.50 L1 C ATOM 3966 112 -42.783 39.228 -45.333 1.00 35.56 L1 O ATOM 3967 113 -44.224 40.263 -46.714 1.00 37.98 L1 N ATOM 3968 113 -44.796 41.426 -47.415 1.00 38.99 L1 C ATOM 3969 113 -45.108 39.091 -46.789 1.00 38.56 L1 C ATOM 3970 113 -46.269 39.566 -47.669 1.00 38.32 L1 C ATOM 3971 113 -46.248 41.057 -47.550 1.00 38.11 L1 C ATOM 3972 113 -44.401 37.887 -47.403 1.00 39.28 L1 C ATOM 3973 113 -43.603 38.037 -48.330 1.00 38.01 L1 O ATOM 3974 114 -44.698 36.697 -46.891 1.00 39.70 L1 N ATOM 3975 114 -44.209 35.472 -47.515 1.00 43.10 L1 C ATOM 3976 114 -44.646 34.243 -46.708 1.00 41.99 L1 C ATOM 3977 114 -44.031 34.182 -45.310 1.00 44.06 L1 C ATOM 3978 114 -44.233 32.820 -44.646 1.00 44.49 L1 C ATOM 3979 119 -43.571 32.774 -43.276 1.00 46.38 L1 C ATOM 3980 114 -43.874 31.518 -42.529 1.00 47.56 L1 N ATOM 3981 114 -44.754 35.387 -48.937 1.00 44.55 L1 C ATOM 3982 114 -45.889 35.782 -49.192 1.00 45.57 L1 O ATOM 3983 115 -43.936 34.889 -49.861 1.00 45.01 L1 N ATOM 3989 115 -44.316 34.830 -51.267 1.00 45.57 L1 C ATOM 3985 115 -43.751 36.038 -52.015 1.00 43.32 L1 C ATOM 3986 115 -43.831 33.540 -51.920 1.00 47.27 L1 C ATOM 3987 115 -42.635 33.236 -51.918 1.00 47.27 L1 O ATOM 3988 116 -44.774 32.789 -52.478 1.00 47.90 L1 N ATOM 3989 116 -44.469 31.572 -53.213 1.00 48.80 L1 C ATOM 3990 116 -45.758 30.823 -53.533 1.00 49.49 L1 C

1

ATOM 3991 116 -43.724 31.904 -54.500 1.00 99.95 L1 C ATOM 3992 116 -43.989 32.922 -55.139 1.00 49.52 L1 O ATOM 3993 117 -42.779 31.038 -54.892 1.00 50.68 L1 N ATOM 3994 117 -42.512 29.768 -54.194 1.00 50.62 L1 C ATOM 3995 117 -41.904 31.218 -56.055 1.00 52.06 L1 C ATOM 3996 117 -40.870 30.110 -55.897 1.00 52.12 L1 C ATOM 3997 117 -41.594 29.043 -55.141 1.00 51.66 L1 C ATOM 3998 117 -42.639 31.105 -57.385 1.00 53.83 L1 C ATOM 3999 117 -43.584 30.327 -57.518 1.00 53.40 L1 O ATOM 4000 118 -42.193 31.884 -58.366 1.00 56.36 L1 N ATOM 4001 118 -42.597 31.679 -59.755 1.00 59.62 L1 C ATOM 4002 118 -42.568 33.003 -60.526 1.00 60.11 L1 C ATOM 4003 118 -43.416 33.970 -59.935 1.00 62.95 L1 O ATOM 4004 118 -41.621 30.703 -60.406 1.00 60.93 L1 C ATOM 4005 118 -40.406 30.854 -60.272 1.00 61.04 L1 O ATOM 4006 119 -42.152 29.708 -61.110 1.00 62.70 L1 N ATOM 4007 119 -41.313 28.719 -61.779 1.00 64.16 L1 C ATOM 4008 119 -41.591 27.300 -61.236 1.00 63.53 L1 C ATOM 4009 119 -40.704 26.287 -61.945 1.00 63.21 L1 C ATOM 4010 119 -41.344 27.263 -59.737 1.00 64.05 L1 C ATOM 4011 119 -41.522 28.715 -63.293 1.00 65.49 L1 C ATOM 4012 119 -42.626 28.471 -63.779 1.00 65.80 L1 O ATOM 4013 120 -40.450 28.987 -64.032 1.00 67.43 L1 N ATOM 4014 120 -40.470 28.914 -65.490 1.00 68.73 L1 C ATOM 4015 120 -40.051 30.262 -66.117 1.00 68.82 L1 C ATOM 4016 120 -40.923 31.298 -65.648 1.00 68.76 L1 O ATOM 4017 120 -40.125 30.192 -67.636 1.00 68.58 L1 C ATOM 4018 120 -39.510 27.820 -65.971 1.00 69.56 L1 C ATOM 4019 120 -38.316 27.856 -65.669 1.00 69.35 L1 O ATOM 4020 121 -40.036 26.853 -66.720 1.00 70.38 L1 N ATOM 4021 121 -39.257 25.683 -67.122 1.00 70.76 L1 C ATOM 4022 121 -39.920 24.411 -66.594 1.00 70.00 L1 C ATOM 4023 121 -39.202 23.105 -66.926 1.00 69.81 L1 C ATOM 4024 121 -37.857 23.072 -66.219 1.00 69.72 L1 C ATOM 4025 121 -40.061 21.928 -66.496 1.00 70.35 L1 C ATOM 4026 121 -39.087 25.565 -68.637 1.00 71.13 L1 C ATOM 4027 121 -40.058 25.372 -69.368 1.00 70.75 L1 O

1

ATOM 4028 122 -37.846 25.663 -69.101 1.00 71.79 L1 N ATOM 4029 122 -37.547 25.537 -70.523 1.00 73.09 L1 C ATOM 4030 122 -36.521 26.591 -70.944 1.00 72.59 L1 C ATOM 4031 122 -37.013 28.004 -70.821 1.00 72.59 L1 C ATOM 4032 122 -36.678 28.777 -69.722 1.00 72.06 L1 C ATOM 4033 122 -37.803 28.564 -71.813 1.00 72.99 L1 C ATOM 4034 122 -37.121 30.089 -69.613 1.00 73.02 L1 C ATOM 4035 122 -38.250 29.873 -71.711 1.00 72.95 L1 C ATOM 4036 122 -37.908 30.633 -70.610 1.00 72.77 L1 C ATOM 4037 122 -37.009 24.149 -70.864 1.00 74.17 L1 C ATOM 4038 122 -36.059 23.669 -70.243 1.00 74.07 L1 O ATOM 4039 123 -37.618 23.485 -71.861 1.00 74.99 L1 N ATOM 4040 123 -38.879 23.887 -72.509 1.00 75.22 L1 C ATOM 4041 123 -37.079 22.243 -72.430 1.00 74.86 L1 C ATOM 4042 123 -38.219 21.728 -73.305 1.00 74.82 L1 C ATOM 4043 123 -38.970 22.961 -73.693 1.00 75.30 L1 C ATOM 4044 123 -35.808 22.515 -73.238 1.00 74.68 L1 C ATOM 4095 123 -35.491 23.666 -73.542 1.00 74.38 L1 O ATOM 4046 124 -35.061 21.456 -73.591 1.00 75.00 L1 N ATOM 4047 124 -35.268 20.052 -73.198 1.00 74.86 L1 C ATOM 4048 124 -33.841 21.625 -74.390 1.00 74.74 L1 C ATOM 4049 124 -33.309 20.199 -74.545 1.00 74.36 L1 C ATOM 4050 124 -33.908 19.446 -73.404 1.00 74.67 L1 C ATOM 4051 124 -34.141 22.267 -75.742 1.00 74.62 L1 C ATOM 4052 124 -35.135 21.934 -76.387 1.00 74.35 L1 O ATOM 4053 125 -33.284 23.189 -76.167 1.00 74.96 L1 N ATOM 4054 125 -33.440 23.813 -77.475 1.00 75.14 L1 C ATOM 4055 125 -32.533 25.043 -77.591 1.00 73.75 L1 C ATOM 4056 125 -31.171 24.709 -77.395 1.00 72.15 L1 O ATOM 4057 125 -33.095 22.801 -78.563 1.00 76.50 L1 C ATOM 4058 125 -32.531 21.743 -78.282 1.00 76.63 L1 O ATOM 4059 126 -33.446 23.120 -79.804 1.00 77.77 L1 N ATOM 4060 126 -33.135 22.240 -80.924 1.00 78.66 L1 C ATOM 4061 126 -33.941 22.651 -82.160 1.00 79.08 L1 C ATOM 4062 126 -35.334 22.551 -81.917 1.00 79.83 L1 O ATOM 4063 126 -31.641 22.294 -81.235 1.00 78.82 L1 C ATOM 4064 126 -31.039 21.288 -81.610 1.00 78.71 L1 O

1

ATOM 4065 127 -31.051 23.474 -81.063 1.00 79.12 L1 N ATOM 4066 127 -29.627 23.677 -81.312 1.00 80.10 L1 C ATOM 4067 127 -29.247 25.144 -81.071 1.00 80.24 L1 C ATOM 4068 127 -29.826 26.127 -82.078 1.00 81.24 L1 C ATOM 4069 127 -31.272 26.496 -81.787 1.00 82.17 L1 C ATOM 4070 127 -31.928 25.788 -80.993 1.00 82.13 L1 O ATOM 4071 127 -31.754 27.499 -82.356 1.00 81.88 L1 O ATOM 4072 127 -28.763 22.786 -80.424 1.00 80.55 L1 C ATOM 4073 127 -27.606 22.516 -80.742 1.00 80.88 L1 O ATOM 4074 128 -29.326 22.335 -79.308 1.00 81.34 L1 N ATOM 4075 128 -28.570 21.553 -78.339 1.00 82.00 L1 C ATOM 4076 128 -28.967 21.953 -76.911 1.00 82.28 L1 C ATOM 4077 128 -28.026 21.427 -75.834 1.00 81.82 L1 C ATOM 4078 128 -28.481 21.778 -74.430 1.00 81.09 L1 C ATOM 4079 128 -27.643 21.730 -73.505 1.00 79.98 L1 0 ATOM 4080 128 -29.674 22.099 -74.251 1.00 81.48 L1 O ATOM 4081 128 -28.794 20.057 -78.539 1.00 82.27 L1 C ATOM 4082 128 -27.845 19.273 -78.510 1.00 81.56 L1 O ATOM 4083 129 -30.047 19.664 -78.746 1.00 82.77 L1 N ATOM 4084 129 -30.367 18.262 -78.984 1.00 83.70 L1 C ATOM 4085 129 -31.860 18.099 -79.282 1.00 83.20 L1 C ATOM 4086 129 -32.808 18.383 -78.116 1.00 83.28 L1 C ATOM 4087 129 -34.253 18.198 -78.557 1.00 82.64 L1 C ATOM 4088 129 -32.476 17.449 -76.965 1.00 83.46 L1 C ATOM 4089 129 -29.544 17.733 -80.154 1.00 84.66 L1 C ATOM 4090 129 -29.147 16.567 -80.172 1.00 84.88 L1 O ATOM. 4091 130 -29.286 18.602 -81.127 1.00 85.33 L1 N ATOM 4092 130 -28.463 18.242 -82.275 1.00 86.17 L1 C ATOM 4093 130 -28.619 19.281 -83.390 1.00 86.49 L1 C ATOM 4094 130 -28.015 20.639 -83.063 1.00 86.88 L1 C ATOM 4095 130 -28.181 21.640 -84.191 1.00 87.75 L1 C ATOM 9096 130 -27.319 22.496 -84.409 1.00 87.18 L1 O ATOM 4097 130 -29.292 21.540 -84.915 1.00 86.91 L1 N ATOM 4098 130 -26.997 18.152 -81.863 1.00 86.31 L1 C ATOM 4099 130 -26.260 17.289 -82.342 1.00 87.49 L1 O ATOM 4100 131 -26.581 19.046 -80.971 1.00 85.27 L1 N ATOM 4101 131 -25.210 19.055 -80.478 1.00 84.10 L1 C

1

ATOM 4102 131 -24.918 20.373 -79.770 1.00 83.24 L1 C ATOM 4103 131 -24.971 17.882 -79.528 1.00 83.51 L1 C ATOM 4104 131 -23.918 17.792 -78.894 1.00 83.48 L1 O ATOM 4105 132 -25.959 16.999 -79.433 1.00 82.74 L1 N ATOM 4106 132 -25.842 15.767 -78.649 1.00 82.64 L1 C ATOM 4107 132 -24.526 15.054 -78.983 1.00 82.71 L1 C ATOM 4108 132 -24.503 13.611 -78.508 1.00 82.60 L1 C ATOM 4109 132 -25.549 12.972 -78.367 1.00 81.48 L1 O ATOM 4110 132 -23.304 13.090 -78.261 1.00 81.72 L1 N ATOM 4111 132 -25.920 16.049 -77.146 1.00 82.67 L1 C ATOM 4112 132 -25.553 15.209 -76.322 1.00 82.72 L1 O ATOM 4113 133 -26.400 17.241 -76.801 1.00 82.45 L1 N ATOM 4114 133 -26.575 17.639 -75.908 1.00 81.60 . L1 C ATOM 4115 133 -25.705 18.861 -75.100 1.00 81.98 L1 C ATOM 4116 133 -24.278 18.755 -75.616 1.00 82.82 L1 C ATOM 4117 133 -23.379 18.012 -74.641 1.00 84.05 L1 C ATOM 4118 133 -22.792 18.960 -73.604 1.00 85.60 L1 C ATOM 4119 133 -21.971 20.039 -74.232 1.00 85.73 L1 N ATOM 4120 133 -28.044 17.979 -75.156 1.00 81.04 L1 C ATOM 4121 133 -28.780 18.307 -76.087 1.00 81.66 L1 O ATOM 4122 134 -28.469 17.900 -73.900 1.00 79.38 L1 N ATOM 4123 134 -29.825 18.294 -73.537 1.00 77.97 L1 -.C. ATOM 4124 134 -30.769 17.107 -73.687 1.00 77.34 L1 C ATOM 4125 134 -29.882 18.839 -72.110 1.00 77.09 L1 C ATOM 4126 134 -29.587 18.126 -71.147 1.00 76.45 L1 O ATOM 4127 135 -30.262 20.107 -71.983 1.00 75.44 L1 N ATOM 4128 135 -30.332 20.765 -70.682 1.00 73.38 L1 C ATOM 4129 135 -29.333 21.937 -70.590 1.00 72.52 L1 C ATOM 4130 135 -28.001 21.455 -70.806 1.00 71.97 L1 O ATOM 4131 135 -29.414 22.596 -69.221 1.00 71.78 L1 C ATOM 4132 135 -31.724 21.320 -70.404 1.00 72.81 L1 C ATOM 4133 135 -32.213 22.186 -31.131 1.00 72.54 L1 O ATOM 4134 136 -32.358 20.824 -69.346 1.00 71.97 L1 N ATOM 4135 136 -33.573 21.446 -68.833 1.00 71.28 L1 C ATOM 4136 136 -34.423 20.421 -68.076 1.00 70.86 L1 C ATOM 4137 136 -35.265 19.454 -68.911 1.00 70.08 L1 C ATOM 4138 136 -34.370 18.679 -69.858 1.00 70.16 L1 C

1

ATOM 4139 136 -36.016 18.507 -67.992 1.00 69.02 L1 C ATOM 4140 136 -33.208 22.601 -67.901 1.00 71.09 L1 C ATOM 9191 136 -32.394 22.991 -66.987 1.00 71.21 L1 O ATOM 4142 137 -33.808 23.764 -68.141 1.00 69.73 L1 N ATOM 4143 137 -33.551 24.943 -67.321 1.00 67.62 L1 C ATOM 4144 137 -33.154 26.153 -68.190 1.00 67.33 L1 C ATOM 4145 137 -32.921 27.370 -67.311 1.00 65.83 L1 C ATOM 4146 137 -31.901 25.830 -68.989 1.00 67.16 L1 C ATOM 9197 137 -34.783 25.317 -66.509 1.00 66.67 L1 C ATOM 4148 137 -35.820 25.671 -67.067 1.00 66.72 L1 O ATOM 4149 138 -34.662 25.230 -65.188 1.00 65.71 L1 N ATOM 4150 138 -35.747 25.611 -64.290 1.00 63.89 L1 C ATOM 4151 138 -35.386 26.893 -63.559 1.00 62.65 L1 C ATOM 4152 138 -34.407 26.939 -62.812 1.00 62.18 L1 O ATOM 4153 138 -36.011 24.507 -63.268 1.00 64.16 L1 C ATOM 4154 138 -37.540 24.736 -62.308 1.00 64.86 L1 S ATOM 4155 139 -36.182 27.933 -63.775 1.00 61.05 L1 N ATOM 4156 139 -35.925 29.224 -63.156 1.00 59.25 L1 C ATOM 4157 139 -35.920 30.313 -64.223 1.00 59.69 L1 C ATOM 4158 139 -34.894 30.039 -65.322 1.00 60.35 L1 C ATOM 4159 139 -34.880 31.188 -66.302 1.00 61.08 L1 C ATOM 4160 139 -33.518 29.850 -64.700 1.00 60.90 L1 C ATOM 4161 139 -36.957 29.540 -62.078 1.00 57.87 L1 C ATOM 4162 139 -38.167 29.469 -62.317 1.00 57.52 L1 O ATOM 4163 140 -36.462 29.888 -60.893 1.00 55.44 L1 N ATOM 4169 140 -37.306 30.104 -59.723 1.00 52.95 L1 C ATOM 4165 140 -36.927 29.123 -58.601 1.00 52.69 L1 C ATOM 4166 140 -38.000 29.115 -57.525 1.00 50.12 L1 C ATOM 4167 140 -36.764 27.717 -59.185 1.00 51.28 L1 C ATOM 4168 140 -35.977 26.778 -58.301 1.00 51.25 L1 C ATOM 4169 140 -37.097 31.531 -59.230 1.00 52.13 L1 C ATOM 4170 140 -35.985 31.912 -58.874 1.00 51.51 L1 O ATOM 4171 141 -38.165 32.321 -59.214 1.00 52.05 L1 N ATOM 4172 141 -38.045 33.739 -58.892 1.00 51.89 L1 C ATOM 4173 141 -38.136 34.569 -60.176 1.00 52.46 L1 C ATOM 4174 141 -39.277 34.202 -60.934 1.00 55.32 L1 O ATOM 4175 141 -39.086 34.235 -57.889 1.00 50.72 L1 C

2

ATOM 4176 141 -40.109 33.583 -57.661 1.00 50.55 L1 O ATOM 4177 192 -38.802 35.387 -57.285 1.00 48.87 L1 N ATOM 4178 192 -39.777 36.103 -56.470 1.00 47.69 L1 C ATOM 4179 142 -40.938 36.587 -57.342 1.00 48.13 L1 C ATOM 4180 192 -40.522 37.671 -58.310 1.00 47.87 L1 C ATOM 4181 142 -40.884 37.580 -59.500 1.00 99.98 L1 O ATOM 4182 142 -39.832 38.615 -57.879 1.00 48.34 L1 O ATOM 4183 142 -40.339 35.310 -55.298 1.00 46.46 L1 C ATOM 9189 142 -41.513 35.458 -54.958 1.00 47.09 L1 O ATOM 4185 143 -39.521 34.467 -54.678 1.00 45.07 L1 N ATOM 4186 143 -39.969 33.806 -53.462 1.00 43.57 L1 C ATOM 4187 143 -39.638 32.304 -53.483 1.00 45.13 L1 C ATOM 4188 143 -38.186 31.989 -53.738 1.00 46.48 L1 C ATOM 4189 143 -37.335 31.673 -52.686 1.00 46.51 L1 C ATOM 4190 143 -37.684 31.963 -55.032 1.00 46.16 L1 C ATOM 4191 143 -36.010 31.334 -52.919 1.00 45.94 L1 C ATOM 4192 143 -36.360 31.626 -55.273 1.00 46.80 L1 C ATOM 9193 143 -35.522 31.310 -54.217 1.00 46.20 L1 C ATOM 4194 143 -39.377 34.465 -52.230 1.00 41.63 L1 C ATOM 4195 143 -38.354 35.150 -52.311 1.00 39.99 L1 O ATOM 4196 144 -40.050 34.280 -51.098 1.00 39.96 L1 N ATOM 4197 144 -39.596 34.830 -49.827 1.00 40.17 L1 C ATOM 4198 144 -39.838 36.343 -49.777 1.00 37.41 L1 C ATOM 4199 144 -39.404 36.963 -48.468 1.00 36.24 L1 C ATOM 4200 144 -40.278 37.034 -47.386 1.00 33.84 L1 C ATOM 4201 144 -39.873 37.566 -46.176 1.00 32.19 L1 C ATOM 4202 144 -38.111 37.445 -48.300 1.00 34.26 L1 C ATOM 4203 144 -37.698 37.978 -47.095 1.00 32.36 L1 C ATOM 4204 144 -38.582 38.038 -46.038 1.00 31.01 L1 C ATOM 4205 144 -38.180 38.588 -44.844 1.00 32.81 L1 O ATOM 4206 144 -40.340 34.158 -48.680 1.00 40.52 L1 C ATOM 4207 144 -41.560 34.011 -48.728 1.00 42.86 L1 O ATOM 4208 195 -39.615 33.740 -47.633 1.00 40.04 L1 N ATOM 4209 145 -40.238 33.151 -46.436 1.00 39.62 L1 C ATOM 4210 145 -38.156 33.852 -47.500 1.00 41.17 L1 C ATOM 4211 195 -37.875 33.348 -46.080 1.00 40.22 L1 C ATOM 4212 145 -39.073 32.561 -45.692 1.00 39.21 L1 C

21

ATOM 4213 145 -37.354 33.086 -48.555 1.00 43.02 L1 C ATOM 4214 145 -37.912 32.315 -49.340 1.00 42.96 L1 O ATOM 4215 146 -36.041 33.310 -48.569 1.00 44.40 L1 N ATOM 4216 146 -35.200 32.759 -49.618 1.00 46.46 L1 C ATOM 4217 196 -34.687 31.351 -49.356 1.00 98.29 L1 C ATOM 4218 146 -33.481 31.137 -49.233 1.00 47.83 L1 O ATOM 4219 147 -35.603 30.389 -49.279 1.00 49.04 L1 N ATOM 4220 147 -35.233 28.992 -49.084 1.00 50.76 L1 C ATOM 4221 147 -35.225 28.657 -47.597 1.00 48.27 L1 C ATOM 4222 147 -36.193 28.063 -49.825 1.00 52.27 L1 C ATOM 4223 147 -37.394 28.034 -49.544 1.00 54.27 L1 O ATOM 4224 148 -35.658 27.302 -50.773 1.00 52.98 L1 N ATOM 4225 148 -36.448 26.317 -51.504 1.00 53.70 L1 C ATOM 4226 148 -36.780 26.809 -52.935 1.00 52.32 L1 C ATOM 4227 148 -37.632 28.061 -52.872 1.00 51.32 L1 C ATOM 4228 148 -35.495 27.084 -53.698 1.00 50.98 L1 C ATOM 4229 148 -35.704 24.990 -51.615 1.00 54.30 L1 C ATOM 4230 148 -34.493 24.927 -51.415 1.00 53.75 L1 O ATOM 4231 149 -36.442 23.930 -51.928 1.00 55.67 L1 N ATOM 4232 199 -35.835 22.680 -52.369 1.00 56.75 L1 C ATOM 4233 149 -36.112 21.540 -51.373 1.00 56.63 L1 C ATOM 4234 149 -37.519 21.462 -51.115 1.00 55.86 L1 O ATOM 4235 149 -35.364 21.780 -50.071 1.00 55.91 L1 C ATOM 4236 199 -36.392 22.294 -53.734 1.00 58.18 L1 C ATOM 4237 199 -37.597 22.400 -53.977 1.00 58.23 L1 O ATOM 4238 150 -35.510 21.849 -54.623 1.00 59.58 L1 N ATOM 4239 150 -35.909 21.510 -55.983 1.00 62.22 L1 C ATOM 4240 150 -35.024 22.235 -57.015 1.00 62.03 L1 C ATOM 4241 150 -35.498 21.913 -58.422 1.00 62.67 L1 C ATOM 4242 150 -35.063 23.732 -56.768 1.00 62.69 L1 C ATOM 4243 150 -35.833 20.008 -56.248 1.00 63.79 L1 C ATOM 4244 150 -34.762 19.401 -56.166 1.00 64.56 L1 O ATOM 4245 151 -36.978 19.414 -56.566 1.00 64.58 L1 N ATOM 4246 151 -37.034 18.014 -56.964 1.00 65.49 L1 C ATOM 4247 151 -38.086 17.282 -56.144 1.00 64.19 L1 C ATOM 4248 151 -37.364 17.913 -58.450 1.00 66.89 L1 C ATOM 4249 151 -38.276 18.580 -58.939 1.00 67.66 L1 O

22

ATOM 4250 152 -36.613 17.084 -59.167 1.00 67.84 L1 N ATOM 4251 152 -36.882 16.842 -60.579 1.00 69.16 L1 C ATOM 4252 152 -35.579 16.851 -61.380 1.00 67.01 L1 C ATOM 4253 152 -34.968 18.213 -61.549 1.00 64.07 L1 C ATOM 4254 152 -35.151 19.103 -62.658 1.00 62.91 L1 C ATOM 4255 152 -34.345 20.235 -62.422 1.00 62.02 L1 C ATOM 4256 152 -35.916 19.050 -63.829 1.00 62.20 L1 C ATOM 4257 152 -34.088 18.827 -60.707 1.00 62.61 L1 C ATOM 4258 152 -33.707 20.042 -61.225 1.00 61.78 L1 N ATOM 4259 152 -34.281 21.304 -63.313 1.00 61.39 L1 C ATOM 4260 152 -35.850 20.113 -64.714 1.00 61.43 L1 C ATOM 4261 152 -35.038 21.224 -64.451 1.00 61.91 L1 C ATOM 4262 152 -37.579 15.500 -60.751 1.00 71.64 L1 C ATOM 4263 152 -37.339 14.564 -59.985 1.00 71.81 L1 O ATOM 4264 153 -38.440 15.407 -61.759 1.00 73.83 L1 N ATOM 4265 153 -39.267 14.221 -61.939 1.00 76.53 L1 C ATOM 4266 153 -40.708 14.532 -61.520 1.00 77.51 L1 C ATOM 4267 153 -41.453 13.361 -60.900 1.00 78.87 L1 C ATOM 4268 153 -41.399 13.407 -59.376 1.00 79.45 L1 C ATOM 4269 153 -39.981 13.219 -58.855 1.00 80.16 L1 C ATOM 4270 153 -39.927 13.194 -57.366 1.00 79.77 L1 N ATOM 4271 153 -39.243 13.737 -63.389 1.00 77.70 L1 C ATOM 4272 153 -39.608 14.475 -64.304 1.00 77.96 L1 O ATOM 4273 154 -38.809 12.495 -63.590 1.00 79.25 L1 N ATOM 4274 154 -38.815 11.880 -64.917 1.00 80.39 L1 C ATOM 4275 154 -37.575 11.013 -65.098 1.00 79.99 L1 C ATOM 4276 154 -40.075 11.035 -65.085 1.00 81.09 L1 C ATOM 4277 154 -40.234 10.008 -64.426 1.00 80.56 L1 O ATOM 4278 155 -40.962 11.970 -65.976 1.00 82.58 L1 N ATOM 4279 155 -42.319 10.933 -66.034 1.00 84.19 L1 C ATOM 4280 155 -42.302 9.446 -66.414 1.00 85.20 L1 C ATOM 4281 155 -42.034 9.222 -67.893 1.00 86.13 L1 C ATOM 4282 155 -42.635 9.939 -68.723 1.00 85.84 L1 O ATOM 4283 155 -41.225 8.326 -68.225 1.00 86.10 L1 O ATOM 4284 155 -42.981 11.105 -69.673 1.00 84.53 L1 C ATOM 4285 155 -43.575 12.144 -64.388 1.00 84.90 L1 O ATOM 4286 156 -42.866 10.081 -63.834 1.00 84.79 L1 N

2

ATOM 4287 156 -43.383 10.136 -62.472 1.00 84.82 L1 C ATOM 4288 156 -44.545 9.154 -62.310 1.00 85.15 L1 C ATOM 4289 156 -45.527 9.358 -63.312 1.00 85.88 L1 O ATOM 4290 156 -42.270 9.777 -61.495 1.00 84.72 L1 C ATOM 4291 156 -42.374 10.029 -60.295 1.00 84.40 L1 O ATOM 4292 157 -41.205 9.182 -62.023 1.00 84.73 L1 N ATOM 4293 157 -40.101 8.708 -61.198 1.00 84.69 L1 C ATOM 4294 157 -39.301 7.635 -61.946 1.00 84.54 L1 C ATOM 4295 157 -40.079 6.469 -62.163 1.00 84.37 L1 O ATOM 4296 157 -39.169 9.843 -60.796 1.00 84.54 L1 C ATOM 4297 157 -38.933 10.776 -61.565 1.00 83.92 L1 O ATOM 4298 158 -38.631 9.773 -59.571 1.00 84.51 L1 N ATOM 4299 158 -39.055 8.832 -58.521 1.00 84.52 L1 C ATOM 4300 158 -37.633 10.728 -59.079 1.00 84.62 L1 C ATOM 4301 158 -37.393 10.286 -57.635 1.00 84.58 L1 C ATOM 4302 158 -38.625 9.522 -57.263 1.00 84.46 L1 C ATOM 4303 158 -36.352 10.680 -59.909 1.00 84.68 L1 C ATOM 4304 158 -35.918 9.607 -60.333 1.00 84.90 L1 O ATOM 4305 159 -35.753 11.844 -60.141 1.00 84.33 L1 N ATOM 4306 159 -34.479 11.919 -60.847 1.00 83.83 L1 C ATOM 4307 159 -34.463 13.086 -61.860 1.00 84.04 L1 C ATOM 4308 159 -33.084 13.210 -62.492 1.00 83.62 L1 C ATOM 4309 159 -35.516 12.857 -62.931 1.00 83.67 L1 C ATOM 4310 159 -33.328 12.110 -59.864 1.00 83.32 L1 C ATOM 4311 159 -33.329 13.042 -59.060 1.00 83.25 L1 O ATOM 4312 160 -32.345 , 11.221 -59.937 1.00 82.48 L1 N ATOM 4313 160 -31.199 11.284 -59.040 1.00 81.67 L1 C ATOM 4314 160 -30.533 9.905 -58.947 1.00 81.53 L1 C ATOM 4315 160 -31.408 8.839 -58.305 1.00 81.07 L1 C ATOM 4316 160 -31.257 7.491 -58.997 1.00 80.52 L1 C ATOM 4317 160 -32.249 6.480 -58.440 1.00 80.19 L1 C ATOM 4318 160 -32.296 5.224 -59.240 1.00 80.25 L1 N ATOM 4319 160 -30.180 12.328 -59.499 1.00 80.59 L1 C ATOM 4320 160 -30.155 13.449 -58.990 1.00 80.48 L1 O ATOM 4321 161 -29.352 11.958 -60.472 1.00 78.88 L1 N ATOM 4322 161 -28.194 12.764 -60.839 1.00 76.98 L1 C ATOM 4323 161 -27.015 11.855 -61.163 1.00 77.99 L1 C

24

ATOM 4324 161 -28.471 13.694 -62.014 1.00 75.33 L1 C ATOM 4325 161 -29.578 13.719 -62.554 1.00 74.70 L1 O ATOM 4326 162 -27.450 14.455 -62.400 1.00 73.68 L1 N ATOM 4327 162 -27.592 15.404 -63.490 1.00 71.48 L1 C ATOM 4328 162 -28.113 16.746 -63.013 1.00 70.15 L1 C ATOM 4329 162 -28.263 17.681 -63.802 1.00 69.01 L1 O ATOM 4330 163 -28.383 16.839 -61.713 1.00 69.08 L1 N ATOM 4331 163 -29.013 18.020 -61.132 1.00 67.56 L1 C ATOM 4332 163 -29.963 17.627 -59.978 1.00 67.21 L1 C ATOM 4333 163 -30.631 18.868 -59.406 1.00 66.89 L1 C ATOM 4334 163 -31.006 16.642 -60.477 1.00 66.02 L1 C ATOM 4335 163 -27.986 19.019 -60.601 1.00 66.76 L1 C ATOM 4336 163 -27.082 18.659 -59.846 1.00 65.41 L1 O ATOM 4337 164 -28.139 20.277 -61.000 1.00 66.54 L1 N ATOM 4338 164 -27.250 21.345 -60.551 1.00 66.37 L1 C ATOM 4339 164 -26.269 21.708 -61.667 1.00 67.88 L1 C ATOM 4340 164 -24.859 21.983 -61.192 1.00 69.70 L1 C ATOM 4341 164 -24.073 20.712 -60.971 1.00 70.76 L1 C ATOM 4342 164 -23.934 20.298 -59.801 1.00 71.18 . L1 O ATOM 4343 164 -23.597 20.127 -61.969 1.00 71.13 L1 O ATOM 4344 164 -28.076 22.577 -60.174 1.00 64.94 L1 C ATOM 4345 164 -28.643 23.243 -61.041 1.00 64.32 L1 O ATOM 4346 165 -28.140 22.876 -58.881 1.00 62.91 L1 N ATOM 4347 165 -28.991 23.957 -58.391 1.00 61.09 L1 C ATOM 4348 165 -30.086 23.418 -57.441 1.00 60.86 L1 C ATOM 4349 165 -30.918 22.485 -58.144 1.00 60.45 L1 O ATOM 4350 165 -30.947 24.560 -56.915 1.00 59.22 L1 C ATOM 4351 165 -28.192 25.025 -57.649 1.00 59.97 L1 C ATOM 4352 165 -27.360 24.714 -56.795 1.00 60.22 L1 O ATOM 4353 166 -28.455 26.286 -57.973 1.00 57.86 L1 N ATOM 4354 166 -27.779 27.393 -57.312 1.00 57.52 L1 C ATOM 4355 166 -27.989 28.715 -58.071 1.00 57.94 L1 C ATOM 4356 166 -29.386 29.037 -58.088 1.00 56.92 L1 O ATOM 4357 166 -27.471 28.599 -59.496 1.00 57.35 L1 C ATOM 4358 166 -28.276 27.600 -55.883 1.00 56.25 L1 C ATOM 4359 166 -29.303 27.052 -55.475 1.00 55.75 L1 O ATOM 4360 167 -27.536 28.400 -55.127 1.00 54.65 L1 N

2

ATOM 4361 167 -28.032 28.910 -53.860 1.00 54.27 L1 C ATOM 4362 167 -26.877 29.393 -52.963 1.00 54.52 L1 C ATOM 4363 167 -26.172 30.451 -53.623 1.00 53.89 L1 O ATOM 4364 167 -25.909 28.250 -52.680 1.00 54.44 L1 C ATOM 4365 167 -28,949 30.089 -54.161 1.00 53.66 L1 C ATOM 4366 167 -28.730 30.829 -55.121 1.00 52.20 L1 O ATOM 4367 168 -29.998 30.273 -53.351 1.00 54.17 L1 N ATOM 4368 168 -30.507 29.340 -52.331 1.00 53.81 L1 C ATOM 4369 168 -30.894 31.418 -53.544 1.00 53.90 L1 C ATOM 4370 168 -31.944 31.238 -52.450 1.00 53.59 L1 C ATOM 4371 168 -31.945 29.761 -52.185 1.00 54.66 L1 C ATOM 4372 168 -30.153 32.748 -53.427 1.00 53.20 L1 C ATOM 4373 168 -29.358 32.942 -52.511 1.00 54.37 L1 O ATOM 4374 169 -30.413 33.654 -54.363 1.00 52.86 L1 N ATOM 4375 169 -29.782 34.971 -54.360 1.00 52.56 L1 C ATOM 4376 169 -28.984 35.169 -55.647 1.00 51.77 L1 C ATOM 4377 169 -29.775 34.846 -56.779 1.00 53.89 L1 O ATOM 4378 169 -30.821 36.083 -54.224 1.00 52.72 L1 C ATOM 4379 169 -31.943 35.962 -54.716 1.00 51.23 L1 O ATOM 4380 170 -30.440 37.167 -53.556 1.00 53.95 L1 N ATOM 4381 170 -31.375 38.246 -53.266 1.00 55.76 L1 C ATOM 4382 170 -30.868 39.080 -52.086 1.00 57.25 L1 C ATOM 4383 170 -31.877 40.193 -51.657 1.00 59.84 L1 C ATOM 4384 170 -31.307 40.916 -50.417 1.00 60.88 L1 C ATOM 4385 170 -31.110 39.953 -49.254 1.00 63.31 L1 C ATOM 4386 170 -32.375 39.253 -48.887 1.00 65.05 L1 N ATOM 4387 170 -31.590 39.147 -54.478 1.00 55.79 L1 C ATOM 4388 170 -30.646 39.745 -54.992 1.00 56.34 L1 O ATOM 4389 171 -32.839 39.240 -54.927 1.00 55.98 L1 N ATOM 4390 171 -33.200 40.121 -56.032 1.00 56.08 L1 C ATOM 4391 171 -34.559 39.716 -56.610 1.00 54.88 L1 C ATOM 4392 171 -34.622 38.299 -57.149 1.00 55.49 L1 C ATOM 4393 171 -36.096 37.850 -57.439 1.00 56.91 L1 C ATOM 4394 171 -36.271 36.805 -58.053 1.00 56.50 L1 O ATOM 4395 171 -37.018 38.643 -56.995 1.00 56.59 L1 N ATOM 4396 171 -33.263 41.575 -55.567 1.00 57.33 L1 C ATOM 4397 171 -32.982 41.882 -54.407 1.00 58.32 L1 O

2

ATOM 4398 172 -33.637 42.465 -56.481 1.00 57.40 L1 N ATOM 4399 172 -33.736 43.889 -56.178 1.00 57.00 L1 C ATOM 4400 172 -33.911 44.682 -57.473 1.00 57.43 L1 C ATOM 4401 172 -39.998 44.123 -58.263 1.00 58.48 L1 O ATOM 4402 172 -34.900 44.183 -55.233 1.00 56.38 L1 C ATOM 4403 172 -34.776 45.001 -54.322 1.00 57.23 L1 O ATOM 4404 173 -36.026 43.511 -55.454 1.00 54.81 L1 N ATOM 4405 173 -37.207 43.684 -54.613 1.00 52.81 L1 C ATOM 9906 173 -38.442 43.191 -55.356 1.00 53.01 L1 C ATOM 4407 173 -38.286 41.770 -55.848 1.00 54.06 L1 C ATOM 4408 173 -37.432 41.027 -55.364 1.00 54.19 L1 O ATOM 4409 173 -39.108 41.383 -56.816 1.00 54.46 L1 N ATOM 4410 173 -37.062 42.919 -53.298 1.00 52.76 L1 C ATOM 4411 173 -38.020 42.770 -52.540 1.00 51.62 L1 O ATOM 4412 174 -35.858 42.423 -53.042 1.00 52.25 L1 N ATOM 9913 174 -35.560 41.753 -51.788 1.00 50.29 L1 C ATOM 9919 174 -35.930 42.661 -50.615 1.00 53.67 L1 C ATOM 4415 174 -34.994 43.848 -50.488 1.00 55.99 L1 C ATOM 4416 174 -33.839 43.694 -50.091 1.00 58.37 L1 O ATOM 4417 174 -35.483 45.037 -50.830 1.00 56.92 L1 N ATOM 9918 174 -36.253 40.402 -51.654 1.00 48.00 . L1 C ATOM 4419 174 -36.163 39.755 -50.611 1.00 45.22 L1 O ATOM 4420 175 -36.944 39.977 -52.709 1.00 46.20 L1 N ATOM 4421 175 -37.315 38.579 -52.844 1.00 45.58 L1 C ATOM 4422 175 -38.486 38.410 -53.819 1.00 44.39 L1 C ATOM 4423 175 -39.801 39.024 -53.348 1.00 44.61 L1 C ATOM 4424 175 -40.991 38.369 -54.048 1.00 44.52 L1 C ATOM 4425 175 -42.325 38.951 -53.593 1.00 44.60 L1 C ATOM 4426 175 -42.567 40.326 -54.117 1.00 43.73 L1 N ATOM 4427 175 -36.095 37.812 -53.359 1.00 46.51 L1 C ATOM 4428 175 -35.042 38.404 -53.590 1.00 46.31 L1 O ATOM 4429 176 -36.229 36.503 -53.535 1.00 47.57 L1 N ATOM 4430 176 -35.092 35.680 -53.940 1.00 49.06 L1 C ATOM 4431 176 -34.766 34.665 -52.847 1.00 47.73 L1 C ATOM 4432 176 -34.098 35.252 -51.631 1.00 98.77 L1 C ATOM 4433 176 -32.771 34.961 -51.345 1.00 49.57 L1 C ATOM 4434 176 -32.160 35.455 -50.210 1.00 51.42 L1 C

2

ATOM 4435 176 -34.799 36.066 -50.743 1.00 48.10 L1 C ATOM 4436 176 -34.193 36.568 -49.600 1.00 48.23 L1 C ATOM 4437 176 -32.871 36.255 -49.339 1.00 50.96 L1 C ATOM 4438 176 -32.247 36.721 -48.202 1.00 51.85 L1 O ATOM 4439 176 -35.296 34.936 -55.260 1.00 50.28 L1 C ATOM 4440 176 -36.421 34.615 -55.648 1.00 50.45 L1 O ATOM 4441 177 -34.186 34.658 -55.937 1.00 50.51 L1 N ATOM 4442 177 -34.201 33.888 -57.170 1.00 52.09 L1 C ATOM 4443 177 -33.899 34.784 -58.352 1.00 50.29 L1 C ATOM 4444 177 -33.212 32.731 -57.074 1.00 53.43 L1 C ATOM 4445 177 -32.246 32.784 -56.307 1.00 52.69 L1 O ATOM 4446 178 -33.459 31.689 -57.861 1.00 54.62 L1 N ATOM 4447 178 -32.601 30.513 -57.875 1.00 55.83 L1 C ATOM 4448 178 -33.021 29.550 -56.773 1.00 55.75 L1 C ATOM 4449 178 -32.690 29.825 -59.230 1.00 56.94 L1 C ATOM 4450 178 -33.667 29.995 -59.958 1.00 56.28 L1 O ATOM 4951 179 -31.662 29.052 -59.563 1.00 58.47 L1 N ATOM 4452 179 -31.650 28.281 -60.800 1.00 59.49 L1 C ATOM 4453 179 -30.569 28.812 -61.742 1.00 58.95 L1 C ATOM 4454 179 -30.847 30.142 -62.130 1.00 60.29 L1 O ATOM 4455 179 -31.395 26.805 -60.520 1.00 60.01 L1 C ATOM 4456 179 -30.626 26.455 -59.625 1.00 60.02 L1 O ATOM 4457 180 -32.050 25.943 -61.290 1.00 60.42 L1 N ATOM 4458 180 -31.746 24.520 -61.264 1.00 61.35 L1 C ATOM 4459 180 -32.836 23.755 -60.509 1.00 60.80 L1 C ATOM 4460 180 -32.458 22.909 -60.306 1.00 59.95 L1 O ATOM 4461 180 -31.637 23.994 -62.690 1.00 62.30 L1 C ATOM 4462 180 -32.556 24.150 -63.493 1.00 61.67 L1 O ATOM 4463 181 -30.505 23.376 -63.003 1.00 63.90 L1 N ATOM 4464 181 -30.283 22.822 -64.332 1.00 64.83 L1 C ATOM 4465 181 -28.971 23.354 -64.904 1.00 63.82 L1 C ATOM 4466 181 -28.972 29.899 -65.154 1.00 64.75 L1 C ATOM 4467 181 -28.789 25.744 -64.112 1.00 64.15 L1 C ATOM 4468 181 -28.756 27.107 -64.346 1.00 65.10 L1 C ATOM 4469 181 -29.127 25.350 -66.439 1.00 63.88 L1 C ATOM 4470 181 -29.096 26.708 -66.682 1.00 63.92 L1 C ATOM 4471 181 -28.908 27.583 -65.634 1.00 65.26 L1 C

2

ATOM 4472 181 -28.850 28.934 -65.881 1.00 65.71 L1 O ATOM 4473 181 -30.244 21.302 -64.290 1.00 66.15 L1 C ATOM 4474 181 -29.520 20.712 -63.486 1.00 66.57 L1 O ATOM 4475 182 -31.030 20.668 -65.152 1.00 67.55 L1 N ATOM 4476 182 -30.982 19.217 -65.284 1.00 69.82 L1 C ATOM 4477 182 -32.388 18.618 -65.181 1.00 69.84 L1 C ATOM 4478 182 -32.470 17.116 -65.479 1.00 70.75 L1 C ATOM 4479 182 -31.428 16.367 -64.653 1.00 70.11 L1 C ATOM 4480 182 -33.870 16.602 -65.179 1.00 70.49 L1 C ATOM 4481 182 -30.351 18.814 -66.613 1.00 70.96 L1 C ATOM 4482 182 -30.884 19.117 -67.683 1.00 71.15 L1 O ATOM 4483 183 -29.214 18.131 -66.536 1.00 71.50 L1 N ATOM 4484 183 -28.553 17.619 -67.728 1.00 71.86 L1 C ATOM 4485 183 -27.033 17.734 -67.584 1.00 71.20 L1 C ATOM 4486 183 -26.626 19.092 -67.550 1.00 70.56 L1 O ATOM 4487 183 -28.937 16.166 -67.964 1.00 72.44 L1 C ATOM 4488 183 -28.869 15.339 -67.057 1.00 72.17 L1 O ATOM 4489 184 -29.353 15.865 -69.188 1.00 73.34 L1 N ATOM 4490 184 -29.605 14.489 -69.591 1.00 74.57 L1 C ATOM 4491 184 -31.074 14.125 -69.346 1.00 74.23 L1 C ATOM 4992 184 -32.199 15.157 -69.697 1.00 73.95 L1 C ATOM 4493 184 -32.186 15.392 -71.194 1.00 74.22 L1 C ATOM 4494 184 -33.496 14.657 -69.211 1.00 73.72 L1 C ATOM 499. 184 -29.243 14.299 -71.060 1.00 75.82 L1 C ATOM 4496 184 -29.060 15.273 -71.791 1.00 75.56 L1 O ATOM 4497 185 -29.124 13.047 -71.489 1.00 77.26 L1 N ATOM 4498 185 -28.787 12.766 -72.878 1.00 78.90 L1 C ATOM 4499 185 -28.252 11.321 -73.056 1.00 79.12 L1 C ATOM 4500 185 -29.259 10.378 -72.664 1.00 79.12 L1 O ATOM 4501 185 -27.001 11.109 -72.210 1.00 78.20 L1 C ATOM 4502 185 -30.023 12.955 -73.748 1.00 79.76 L1 C ATOM 4503 185 -31.148 12.692 -73.313 1.00 79.50 L1 O ATOM 4504 186 -29.828 13.420 -74.992 1.00 80.66 L1 N ATOM 4505 186 -28.522 13.709 -75.608 1.00 80.61 L1 C ATOM 4506 186 -30.939 13.701 -75.908 1.00 81.88 L1 C ATOM 4507 186 -30.240 14.073 -77.215 1.00 81.41 L1 C ATOM 4508 186 -28.889 14.557 -76.788 1.00 80.92 L1 C

2

ATOM 4509 186 -31.843 12.485 -76.068 1.00 83.38 L1 C ATOM 4510 186 -33.050 12.612 -76.280 1.00 83.33 L1 O ATOM 4511 187 -31.292 11.305 -75.955 1.00 84.89 L1 N ATOM 4512 187 -31.967 10.050 -76.094 1.00 86.26 L1 C ATOM 4513 187 -30.988 8.872 -76.050 1.00 86.44 L1 C ATOM 4514 187 -29.896 8.924 -77.117 1.00 87.62 L1 C ATOM 4515 187 -28.843 9.992 -76.843 1.00 88.12 L1 C ATOM 4516 187 -28.057 9.823 -75.886 1.00 88.36 L1 O ATOM 4517 187 -28.800 10.996 -77.587 1.00 87.80 L1 O ATOM 4518 187 -33.007 9.900 -74.987 1.00 86.75 L1 C ATOM 4519 187 -34.201 9.762 -75.260 1.00 87.11 L1 O ATOM 4520 188 -32.551 9.938 -73.738 1.00 86.85 L1 N ATOM 4521 188 -33.449 9.776 -72.601 1.00 86.86 L1 C ATOM 4522 188 -32.645 9.606 -71.310 1.00 86.25 L1 C ATOM 4523 188 -31.628 10.699 -71.052 1.00 86.47 L1 C ATOM 4529 188 -30.730 10.378 -69.873 1.00 86.63 L1 C ATOM 4525 188 -29.527 10.641 -69.901 1.00 86.47 L1 O ATOM 4526 188 -31.312 9.802 -68.828 1.00 86.42 L1 N ATOM 4527 188 -34.415 10.951 -72.966 1.00 87.03 L1 C ATOM 4528 188 -35.455 10.836 -71.817 1.00 86.87 L1 O ATOM 4529 189 -34.072 12.078 -73.085 1.00 86.98 L1 N ATOM 4530 189 -34.980 13.220 -73.142 1.00 87.11 L1 C ATOM 4531 189 -34.300 14.398 -73.847 1.00 87.05 L1 C ATOM 4532 189 -35.253 15.455 -74.337 1.00 87.49 L1 C ATOM 4533 189 -36.222 16.172 -73.558 1.00 87.50 L1 C ATOM 4534 189 -36.888 17.056 -74.430 1.00 87.06 L1 C ATOM 4535 189 -36.590 16.151 -72.208 1.00 87.12 L1 C ATOM 4536 189 -35.371 15.923 -75.615 1.00 87.14 L1 C ATOM 4537 189 -36.351 16.885 -75.679 1.00 87.03 L1 N ATOM 4538 189 -37.900 17.911 -73.998 1.00 87.27 L1 C ATOM 4539 189 -37.597 17.000 -71.781 1.00 87.07 L1 C ATOM 4590 189 -38.239 17.868 -72.673 1.00 87.37 L1 C ATOM 4541 189 -36.256 12.839 -73.886 1.00 87.39 L1 C ATOM 4542 189 -37.366 13.094 -73.416 1.00 86.90 L1 O ATOM 4543 190 -36.086 12.216 -75.047 1.00 88.13 L1 N ATOM 4544 190 -37.209 11.865 -75.910 1.00 88.58 L1 C ATOM 4545 190 -36.711 11.657 -77.343 1.00 88.28 L1 C ATOM 4546 190 -35.788 12.759 -77.847 1.00 87.78 L1 C ATOM 4547 190 -36.571 13.950 -78.371 1.00 87.40 L1 C ATOM 4548 190 -37.307 13.602 -79.657 1.00 86.99 L1 C ATOM 4549 190 -38.075 14.758 -80.198 1.00 86.22 L1 N ATOM 4550 190 -37.917 10.600 -75.423 1.00 88.94 L1 C ATOM 4551 190 -39.079 10.361 -75.756 1.00 88.78 L1 O ATOM 4552 191 -37.212 9.797 -74.631 1.00 89.21 L1 N ATOM 4553 191 -37.719 8.494 -74.213 1.00 89.73 L1 C ATOM 4554 191 -36.556 7.586 -73.801 1.00 90.11 L1 C ATOM 4555 191 -35.907 8.073 -72.639 1.00 90.61 L1 O ATOM 4556 191 -38.728 8.582 -73.068 1.00 89.98 L1 C ATOM 4557 191 -39.285 7.567 -72.645 1.00 89.77 L1 O ATOM 4558 192 -38.957 9.790 -72.561 1.00 90.09 L1 N ATOM 4559 192 -39.911 9.986 -71.474 1.00 89.79 L1 C ATOM 4560 192 -39.214 10.625 -70.268 1.00 89.58 L1 C ATOM 4561 192 -38.255 9.712 -69.569 1.00 89.63 L1 C ATOM 4562 192 -36.938 9.472 -69.776 1.00 89.30 L1 C ATOM 4563 192 -38.625 8.915 -68.506 1.00 89.88 L1 N ATOM 4564 192 -37.578 8.225 -68.089 1.00 89.37 L1 C ATOM 4565 192 -36.541 8.545 -68.843 1.00 89.09 L1 N ATOM 4566 192 -41.093 10.850 -71.906 1.00 89.78 L1 C ATOM 4567 192 -40.961 11.703 -72.785 1.00 89.72 L1 O ATOM 4568 193 -42.246 10.620 -71.282 1.00 89.66 L1 N ATOM 4569 193 -43.456 11.380 -71.583 1.00 89.47 L1 C ATOM 4570 193 -44.650 10.806 -70.812 1.00 90.32 . L1 C ATOM 4571 193 -45.282 9.593 -71.468 1.00 91.88 L1 C ATOM 4572 193 -45.834 9.961 -72.836 1.00 93.71 L1 C ATOM 4573 193 -46.143 8.787 -73.648 1.00 99.98 L1 N ATOM 4574 193 -46.579 8.844 -74,904 1.00 95.50 L1 C ATOM 4575 193 -46.834 7.725 -75.570 1.00 95.39 L1 N ATOM 4576 193 -46.761 10.020 -75.492 1.00 95.47 L1 N ATOM 4577 193 -43.300 12.862 -71.251 1.00 88.54 L1 C ATOM 4578 193 -43.756 13.724 -72.004 1.00 88.43 L1 O ATOM 4579 194 -42.658 13.150 -70.121 1.00 87.52 L1 N ATOM 4580 194 -42.402 14.528 -69.707 1.00 85.86 L1 C ATOM 4581 194 -43.723 15.262 -69.446 1.00 85.32 L1 C ATOM 4582 194 -44.394 14.726 -68.318 1.00 83.93 L1 O

1

ATOM 4583 C 194 -41.537 14.584 -68.450 1.00 84.95 L1 C ATOM 4584 O 194 -41.534 13.653 -67.643 1.00 84.18 L1 O ATOM 4585 N 195 -40.803 15.684 -68.298 1.00 83.96 L1 N ATOM 4586 CA 195 -40.034 15.947 -67.085 1.00 82.58 L1 C ATOM 4587 CB 195 -38.584 16.284 -67.439 1.00 82.92 L1 C ATOM 4588 CG 195 -37.729 15.078 -67.748 1.00 83.66 L1 C ATOM 4589 CD 195 -36.938 14.495 -66.765 1.00 83.87 L1 C ATOM 4590 CE 195 -36.145 13.398 -67.042 1.00 84.28 L1 C ATOM 4591 CD 195 -37.703 14.526 -69.023 1.00 83.62 L1 C ATOM 4592 CE 195 -36.911 13.428 -69.311 1.00 83.74 L1 C ATOM 4593 CZ 195 -36.134 12.869 -68.317 1.00 84.20 L1 C ATOM 4594 OH 195 -35.332 11.786 -68.600 1.00 84.08 L1 O ATOM 4595 C 195 -40.646 17.101 -66.300 1.00 81.49 L1 C ATOM 9596 O 195 -41.169 18.050 -66.886 1.00 81.16 L1 O ATOM 4597 N 196 -40.576 17.016 -64.973 1.00 80.07 L1 N ATOM 4598 CA 196 -41.152 18.040 -64.106 1.00 78.68 L1 C ATOM 4599 CB 196 -42.303 17.454 -63.284 1.00 79.05 L1 C ATOM 4600 OG 196 -43.396 17.099 -64.113 1.00 80.30 L1 O ATOM 4601 C 196 -40.127 18.660 -63.159 1.00 77.25 L1 C ATOM 4602 O 196 -39.337 17.952 -62.530 1.00 76.71 L1 O ATOM 4603 N 197 -40.153 19.987 -63.063 1.00 75.59 L1 N ATOM 4604 CA 197 -39.390 20.701 -62.046 1.00 73.09 L1 C ATOM 4605 C 197 -40.296 21.060 -60.876 1.00 72.59 L1 C ATOM 4606 O 197 -41.221 21.859 -61.020 1.00 72.65 L1 O ATOM 4607 CB 197 -38.786 21.979 -62.628 1.00 71.16 L1 C ATOM 4608 SG 197 -37.815 22.939 -61.416 1.00 69.32 L1 S ATOM 4609 N 198 -40.027 20.466 -59.718 1.00 71.96 L1 N ATOM 4610 CA 198 -40.866 20.671 -58.542 1.00 71.74 L1 C ATOM 4611 CB 198 -41.277 19.321 -57.952 1.00 73.01 L1 C ATOM 4612 CG 198 -41.917 18.376 -58.954 1.00 74.84 L1 C ATOM 4613 CD 198 -42.165 16.997 -58.373 1.00 76.39 L1 C ATOM 4614 OE 198 -41.697 16.676 -57.277 1.00 75.67 L1 O ATOM 4615 NE 198 -42.903 16.171 -59.107 1.00 77.19 L1 N ATOM 4616 C 198 -40.140 21.493 -57.479 1.00 70.00 L1 C ATOM 4617 O 198 -39.145 21.045 -56.905 1.00 70.10 L1 O ATOM 4618 N 199 -40.647 22.694 -57.217 1.00 67.33 L1 N ATOM 4619 CA 199 -40.060 23.570 -56.210 1.00 64.63 L1 C

2

ATOM 4620 199 -39.894 25.006 -56.750 1.00 63.62 L1 C ATOM 4621 199 -39.232 25.880 -55-700 1.00 62.58 L1 C ATOM 4622 199 -39.072 24.990 -58.029 1.00 62.84 L1 C ATOM 4623 199 -40.942 23.618 -54.969 1.00 63.15 L1 C ATOM 4624 199 -42.132 23.908 -55.059 1.00 62.70 L1 O ATOM 4625 200 -40.359 23.331 -53.810 1.00 62.14 L1 N ATOM 4626 200 -41.100 23.436 -52.558 1.00 62.84 L1 C ATOM 4627 200 -40.974 22.147 -51.712 1.00 63.21 L1 C ATOM 4628 200 -41.466 21.029 -52.461 1.00 63.77 L1 O ATOM 4629 200 -41.785 22.272 -50.429 1.00 62.81 L1 C ATOM 4630 200 -40.611 24.623 -51.732 1.00 62.22 L1 C ATOM 4631 200 -39.409 24.821 -51.559 1.00 62.43 L1 O ATOM 4632 201 -41.558 25.409 -51.229 1.00 61.86 L1 N ATOM 4633 201 -41.251 26.622 -50.481 1.00 61.76 L1 C ATOM 4634 201 -41.224 27.826 -51.928 1.00 61.02 L1 C ATOM 4635 201 -41.179 29.150 -50.729 1.00 59.75 L1 C ATOM 4636 201 -40.135 29.901 -50.306 1.00 59.40 L1 C ATOM 4637 201 -42.316 29.863 -50.415 1.00 59.04 L1 N ATOM 4638 201 -41.974 30.998 -49.830 1.00 58.23 L1 C ATOM 4639 201 -40.657 31.046 -49.752 1.00 58.22 L1 N ATOM 4640 201 -42.299 26.843 -49.398 1.00 62.27 L1 C ATOM 4641 201 -43.491 26.934 -49.690 1.00 62.33 L1 O ATOM 4642 203 -41.849 26.928 -48.149 1.00 63.08 L1 N ATOM 4643 203 -42.749 27.081 -47.009 1.00 64.31 L1 C ATOM 4644 203 -43.440 28.447 -47.050 1.00 64.10 L1 C ATOM 4645 203 -42.490 29.628 -46.933 1.00 64.37 L1 C ATOM 4646 203 -41.781 29.682 -45.593 1.00 66.35 . L1 C ATOM 4647 203 -40.533 29.779 -45.584 1.00 66.23 L1 O ATOM 4648 203 -42.471 29.629 -44.549 1.00 66.40 L1 O ATOM 4649 203 -43.800 25.978 -46.978 1.00 65.33 L1 C ATOM 4650 203 -44.909 26.183 -46.490 1.00 65.44 L1 O ATOM 4651 203 -43.448 24.810 -47.507 1.00 66.98 L1 N ATOM 4652 203 -44.328 23.660 -47.415 1.00 69.40 L1 C ATOM 4653 203 -45.215 23.457 -48.631 1.00 71.29 L1 C ATOM 4659 203 -45.869 22.422 -48.761 1.00 71.55 L1 O ATOM 4655 204 -45.240 24.490 -49.523 1.00 72.19 L1 N ATOM 4656 204 -46.079 24.371 -50.711 1.00 73.00 L1 C ATOM 4657 204 -46.931 25.638 -50.821 1.00 74.04 L1 C ATOM 4668 204 -47.605 25.699 -52.068 1.00 35.31 L1 O ATOM 4659 204 -45.237 24.200 -51.974 1.00 73.53 L1 C ATOM 4660 204 -44.322 24.983 -52.231 1.00 74.09 L1 O ATOM 4661 205 -45.555 23.174 -52.760 1.00 73.50 L1 N ATOM 4662 205 -44.801 22.864 -53.971 1.00 72.84 L1 C ATOM 4663 205 -44.781 21.345 -54.243 1.00 73.16 L1 C ATOM 4664 205 -44.142 20.669 -53.153 1.00 72.97 L1 O ATOM 4665 205 -44.031 21.044 -55.533 1.00 73.27 L1 C ATOM 4666 205 -45.392 23.558 -55.193 1.00 72.59 L1 C ATOM 4667 205 -46.586 23.445 -55.465 1.00 72.07 L1 O ATOM 4668 206 -44.548 24.280 -55.923 1.00 72.50 L1 N ATOM 4669 206 -44.934 29.850 -57.208 1.00 73.02 L1 C ATOM 4670 206 -44.562 26.341 -57.302 1.00 72.13 L1 C ATOM 4671 206 -44.947 26.890 -58.666 1.00 70.61 L1 C ATOM 4672 206 -45.257 27.117 -56.201 1.00 71.61 L1 C ATOM 4673 206 -44.207 24.092 -58.310 1.00 74.77 L1 C ATOM 4674 206 -42.994 23.893 -58.240 1.00 74.80 L1 O ATOM 4675 207 -44.952 23.671 -59.326 1.00 76.39 L1 N ATOM 4676 207 -44.438 22.716 -60.298 1.00 77.74 L1 C ATOM 4677 207 -45.033 21.335 -60.011 1.00 78.83 L1 C ATOM 4678 207 -44.608 20.244 -60.973 1.00 81.28 L1 C ATOM 4679 207 -45.153 18.886 -60.579 1.00 82.80 L1 C ATOM 4680 207 -45.501 18.710 -59.386 1.00 84.12 L1 O ATOM 4681 207 -45.235 17.995 -61.945 1.00 83.95 L1 O ATOM 4682 207 -44.744 23.126 -61.735 1.00 77.99 L1 C ATOM 4683 207 -45.837 23.603 -62.040 1.00 77.18 L1 O ATOM 4684 208 -43.765 22.941 -62.615 1.00 78.59 L1 N ATOM 4685 208 -43.973 23.134 -64.043 1.00 79.79 L1 C ATOM 4686 208 -43.289 24.418 -64.515 1.00 79.80 L1 C ATOM 4687 208 -43.911 25.692 -63.961 1.00 80.02 L1 C ATOM 4688 208 -45.400 25.764 -64.266 1.00 79.10 L1 C ATOM 4689 208 -45.956 27.147 -63.964 1.00 79.03 L1 C ATOM 4690 208 -45.344 28.191 -64.835 1.00 77.78 L1 N ATOM 4691 208 -43.433 21.941 -64.823 1.00 80.92 L1 C ATOM 4692 208 -42.413 21.356 -64.454 1.00 80.76 L1 O ATOM 4693 209 -44.125 21.584 -65.900 1.00 82.27 L1 N

4

ATOM 9699 09 -43.779 20.402 -66.679 1.00 83.34 L1 C ATOM 4695 09 -44.889 19.335 -66.582 1.00 83.02 L1 C ATOM 4696 09 -45.127 19.012 -65.207 1.00 82.81 L1 O ATOM 4697 09 -44.482 18.071 -67.327 1.00 82.62 L1 C ATOM 4698 09 -43.566 20.749 -68.151 1.00 85.00 L1 C ATOM 4699 09 -44.209 21.653 -68.687 1.00 85.03 L1 O ATOM 4700 10 -42.652 20.029 -68.793 1.00 86.55 L1 N ATOM 4701 10 -42.468 20.124 -70.236 1.00 87.92 L1 C ATOM 4702 10 -41.190 20.918 -70.590 1.00 87.63 L1 C ATOM 4703 10 -41.310 22.347 -70.085 1.00 87.34 L1 C ATOM 4704 10 -39.970 20.240 -69.988 1.00 87.16 L1 C ATOM 4705 10 -42.372 18.728 -70.848 1.00 89.44 L1 C ATOM 4706 10 -41.880 17.794 -70.212 1.00 89.28 L1 O ATOM 4707 11 -42.851 18.591 -72.081 1.00 91.11 L1 N ATOM 4708 11 -42.826 17.311 -72.782 1.00 92.64 L1 C ATOM 4709 11 -44.206 17.004 -73.356 1.00 92.29 L1 C ATOM 4710 11 -41.785 17.331 -73.897 1.00 93.85 L1 C ATOM 4711 11 -41.449 18.392 -74.424 1.00 94.16 L1 O ATOM 4712 12 -41.265 16.151 -74.273 1.00 95.11 L1 N ATOM 4713 12 -41.685 14.830 -73.774 1.00 95.23 L1 C ATOM 4714 12 -40.227 16.043 -75.306 1.00 95.91 L1 C ATOM 4715 12 -39.882 14.553 -75.318 1.00 95.62 L1 C ATOM 4716 12 -41.095 13.880 -74.776 1.00 95.26 L1 C ATOM 4717 12 -40.691 16.540 -76.672 1.00 96.68 L1 C ATOM 4718 12 -39.878 16.917 -77.520 1.00 96.58 L1 O ATOM 4719 13 -42.005 16.543 -76.872 1.00 97.41 L1 N ATOM 4720 13 -42.600 16.998 -78.123 1.00 98.13 L1 C ATOM 4721 13 -44.081 16.575 -78.209 1.00 98.19 L1 C ATOM 4722 13 -44.792 17.076 -77.068 1.00 97.41 L1 O ATOM 4723 13 -44.195 15.056 -78.248 1.00 98.19 L1 C ATOM 4724 13 -42.504 18.516 -78.277 1.00 98.77 L1 C ATOM 4725 13 -41.782 19.146 -77.474 1.00 99.20 L1 O ATOM 4726 13 -43.142 19.057 -79.208 1.00 99.08 L1 O TER 4727 13 L1 ATOM 4728 1 -10.333 41.335 -26.837 1.00 58.55 H1 C ATOM 4729 1 -11.368 41.133 -27.931 1.00 61.95 H1 C ATOM 4730 1 -12.786 41.172 -27.394 1.00 64.59 H1 C

4

41

42

ATOM 4990 -5.309 31.280 -29.587 1.00 22.95 H1 C ATOM 4991 -6.530 25.048 -32.766 1.00 21.45 H1 C ATOM 4992 -5.988 23.987 -33.070 1.00 21.93 H1 O ATOM 4993 -7.578 25.556 -33.420 1.00 19.88 H1 N ATOM 4994 -8.355 24.785 -34.392 1.00 20.46 H1 C ATOM 4995 -9.841 24.803 -34.021 1.00 20.89 H1 C ATOM 4996 -10.101 24.285 -32.627 1.00 23.23 H1 C ATOM 4997 -10.302 23.087 -32.428 1.00 24.03 H1 O ATOM 4998 -10.099 25.185 -31.650 1.00 22.85 H1 N ATOM 4999 -8.236 25.315 -35.810 1.00 20.87 H1 C ATOM 5000 -8.048 26.505 -36.019 1.00 23.07 H1 O ATOM 5001 -8.377 24.418 -36.782 1.00 22.36 H1 N ATOM 5002 -8.702 24.801 -38.152 1.00 22.05 H1 C ATOM 5003 -7.658 24.246 -39.121 1.00 22.90 H1 C ATOM 5004 -6.318 24.938 -39.025 1.00 25.09 H1 C ATOM 5005 -5.956 26.193 -39.619 1.00 22.07 H1 C ATOM 5006 -4.612 26.439 -39.284 1.00 24.03 H1 C ATOM 5007 -6.639 27.129 -40.403 1.00 22.32 H1 C ATOM 5008 -5.208 24.490 -38.370 1.00 20.33 H1 C ATOM 5009 -4.179 25.385 -38.521 1.00 23.82 H1 N ATOM 5010 -3.933 27.587 -39.706 1.00 23.89 H1 C ATOM 5011 -5.968 28.266 -40.821 1.00 24.79 H1 C ATOM 5012 -4.627 28.486 -40.471 1.00 24.85 H1 C ATOM 5013 -10.087 24.261 -38.517 1.00 22.80 H1 C ATOM 5014 -10.434 23.122 -38.193 1.00 21.90 H1 O ATOM 5015 -10.871 25.094 -39.187 1.00 22.71 H1 N ATOM 5016 -12.244 24.773 -39.554 1.00 21.18 H1 C ATOM 5017 -13.232 25.478 -38.591 1.00 22.23 H1 C ATOM 5018 -14.669 25.262 -39.039 1.00 20.06 H1 C ATOM 5019 -13.024 24.950 -37.171 1.00 21.40 H1 C ATOM 5020 -13.704 25.776 -36.102 1.00 20.52 H1 C ATOM 5021 -12.445 25.310 -40.966 1.00 23.40 H1 C ATOM 5022 -11.964 26.395 -41.285 1.00 23.50 H1 O ATOM 5023 -13.134 24.571 -41.827 1.00 22.17 H1 N ATOM 5024 -13.417 25.120 -43.151 1.00 23.30 H1 C ATOM 5025 -12.680 24.328 -44.237 1.00 22.10 H1 C ATOM 5026 -13.113 22.886 -44.372 1.00 24.22 . H1 C

4

ATOM 5027 -12.272 22.174 -45.418 1.00 23.06 H1 C ATOM 5028 -12.792 20.840 -45.694 1.00 23.01 H1 N ATOM 5029 -12.283 20.000 -46.587 1.00 22.72 H1 C ATOM 5030 -11.212 20.337 -47.310 1.00 18.87 H1 N ATOM 5031 -12.875 18.832 -46.782 1.00 20.60 H1 N ATOM 5032 -14.906 25.185 -43.469 1.00 23.88 H1 C ATOM 5033 -15.720 24.482 -42.863 1.00 23.72 H1 O ATOM 5034 -15.256 26.055 -44.411 1.00 24.72 H1 N ATOM 5035 -16.638 26.222 -44.829 1.00 24.67 H1 C ATOM 5036 -17.224 27.509 -44.238 1.00 25.79 H1 C ATOM 5037 -18.684 27.793 -44.635 1.00 27.90 H1 C ATOM 5038 -19.318 28.866 -43.757 1.00 29.29 H1 C ATOM 5039 -18.788 29.966 -43.633 1.00 32.06 H1 O ATOM 5040 -20.447 28.595 -43.141 1.00 28.85 H1 N ATOM 5041 -16.690 26.288 -46.345 1.00 25.97 H1 C ATOM 5042 -16.266 27.270 -46.947 1.00 25.21 H1 O ATOM 5043 -17.213 25.233 -46.981 1.00 26.39 H1 N ATOM 5044 -17.750 24.017 -46.34.5 1.00 28.52 H1 C ATOM 5045 -17.377 25.213 -48.433 1.00 29.08 H1 C ATOM 5046 -17.779 23.768 -48.731 1.00 27.66 H1 C ATOM 5047 -18.437 23.304 -47.485 1.00 28.54 H1 C ATOM 5048 -18.448 26.219 -48.836 1.00 32.62 H1 C ATOM 5049 -19.359 26.516 -48.061 1.00 32.18 H1 O ATOM 5050 -18.345 26.766 -50.053 1.00 36.33 H1 N ATOM 5051 -17.406 26.340 -51.105 1.00 37.35 H1 C ATOM 5052 -19.204 27.872 -50.494 1.00 37.78 H1 C ATOM 5053 -18.839 28.044 -51.969 1.00 39.57 H1 C ATOM 5054 -17.449 27.484 -52.074 1.00 40.10 H1 C ATOM 5055 -20.687 27.568 -50.307 1.00 38.36 H1 C ATOM 5056 -21.165 26.510 -50.704 1.00 37.50 H1 O ATOM 5057 -21.406 28.497 -49.682 1.00 40.85 H1 N ATOM 5058 -22.837 28.332 -49.499 1.00 43.07 H1 C ATOM 5059 -23.227 27.130 -48.653 1.00 44.02 H1 C ATOM 5060 -24.360 26.657 -48.727 1.00 44.58 H1 O ATOM 5061 -22.297 26.634 -47.842 1.00 42.75 H1 N ATOM 5062 -22.551 25.440 -47.046 1.00 41.76 H1 C ATOM 5063 -21.778 24.254 -47.627 1.00 44.31 H1 C

44

ATOM 5064 -22.140 23.962 -49.074 1.00 98.96 H1 C ATOM 5065 -22.254 22.468 -49.324 1.00 51.38 H1 C ATOM 5066 -23.015 22.187 -50.617 1.00 54.57 H1 C ATOM 5067 -22.406 22.886 -51.784 1.00 54.57 H1 N ATOM 5068 -22.171 25.647 -45.590 1.00 37.71 H1 C ATOM 5069 -21.889 26.766 -45.175 1.00 40.41 H1 O ATOM 5070 -22.160 24.562 -44.823 1.00 32.46 H1 N ATOM 5071 -21.927 24.654 -43.393 1.00 28.89 H1 C ATOM 5072 -20.473 24.575 -42.949 1.00 28.33 H1 C ATOM 5073 -19.570 25.015 -43.654 1.00 28.78 H1 O ATOM 5074 -20.251 24.004 -41.770 1.00 26.37 H1 N ATOM 5075 -18.938 24.020 -41.139 1.00 24.45 H1 C ATOM 5076 -19.024 24.701 -39.766 1.00 23.45 H1 C ATOM 5077 -19.498 26.154 -39.752 1.00 24.17 H1 C ATOM 5078 -19.692 26.636 -38.323 1.00 20.49 H1 C ATOM 5079 -18.471 27.012 -40.474 1.00 23.06 H1 C ATOM 5080 -18.379 22.616 -40.965 1.00 22.98 H1 C ATOM 5081 -19.101 21.689 -40.600 1.00 21.96 H1 O ATOM 5082 -17.081 22.475 -41.208 1.00 22.29 H1 N ATOM 5083 -16.397 21.199 -41.044 1.00 22.11 H1 C ATOM 5084 -16.060 20.609 -42.416 1.00 21.07 H1 C ATOM 5085 -15.392 19.253 -42.342 1.00 23.85 H1 C ATOM 5086 -15.117 18.646 -43.711 1.00 26.12 H1 C ATOM 5087 -15.068 19.390 -44.714 1.00 25.34 H1 O ATOM 5088 -14.947 17.414 -43.779 1.00 28.37 H1 O ATOM 5089 -15.112 21.411 -40.245 1.00 22.69 H1 C ATOM 5090 -14.246 22.188 -40.643 1.00 22.85 H1 O ATOM 5091 -14.994 20.727 -39.113 1.00 23.32 H1 N ATOM 5092 -13.810 20.853 -38.271 1.00 24.50 H1 C ATOM 5093 -14.124 20.356 -36.862 1.00 23.99 H1 C ATOM 5099 -12.985 20.457 -35.899 1.00 23.86 H1 C ATOM 5095 -12.225 19.369 -35.357 1.00 23.15 H1 C ATOM 5096 -11.346 19.912 -34.401 1.00 22.05 H1 C ATOM 5097 -12.209 17.986 -35.584 1.00 22.33 H1 C ATOM 5098 -12.536 21.586 -35.276 1.00 23.05 H1 C ATOM 5099 -11.555 21.268 -34.373 1.00 23.21 H1 N ATOM 5100 -10.461 19.124 -33.665 1.00 20.75 H1 C

4

ATOM 5101 -11.326 17.200 -34.852 1.00 20.87 H1 C ATOM 5102 -10.467 17.774 -33.903 1.00 23.70 H1 C ATOM 5103 -12.687 20.020 -38.872 1.00 24.58 H1 C ATOM 5104 -12.877 18.849 -39.176 1.00 23.77 H1 O ATOM 5105 -11.519 20.626 -39.042 1.00 24.78 H1 N ATOM 5106 -10.389 19.929 -39.647 1.00 24.00 H1 C ATOM 5107 -9.526 20.913 -40.481 1.00 24.53 H1 C ATOM 5108 -8.285 20.196 -41.038 1.00 24.01 H1 C ATOM 5109 -10.383 21.502 -41.611 1.00 23.41 H1 C ATOM 5110 -9.698 22.583 -42.429 1.00 24.34 H1 C ATOM 5111 -9.530 19.259 -38.575 1.00 23.04 H1 C ATOM 5112 -9.181 18.080 -38.689 1.00 21.34 H1 O ATOM 5113 -9.207 20.011 -37.528 1.00 22.63 H1 N ATOM 5114 -8.387 19.476 -36.459 1.00 21.49 H1 C ATOM 5115 -7.929 20.562 -35.502 1.00 22.86 H1 C ATOM 5116 -8.258 21.733 -35.679 1.00 22.27 H1 O ATOM 5117 -7.166 20.164 -34.490 1.00 22.39 H1 N ATOM 5118 -6.673 21.078 -33.469 1.00 23.19 H1 C ATOM 5119 -7.577 21.023 -32.234 1.00 23.22 H1 C ATOM 5120 -7.510 19.674 -31.530 1.00 20.57 H1 C ATOM 5121 -8.512 19.538 -30.396 1.00 23.89 H1 C ATOM 5122 -9.378 20.428 -30.251 1.00 22.86 H1 O ATOM 5123 -8.438 18.533 -29.656 1.00 20.61 H1 O ATOM 5124 -5.257 20.664 -33.053 1.00 25.41 H1 C ATOM 5125 -4.799 19.559 -33.349 1.00 26.68 H1 O ATOM 5126 -4.577 21.549 -32.340 1.00 25.24 H1 N ATOM 5127 -3.275 21.223 -31.780 1.00 25.42 H1 C ATOM 5128 -2.151 21.625 -32.768 1.00 25.30 H1 C ATOM 5129 -2.110 23.145 -32.919 1.00 20.77 H1 C ATOM 5130 -0.805 21.091 -32.288 1.00 25.23 H1 C ATOM 5131 0.268 21.133 -33.364 1.00 26.63 H1 C ATOM 5132 -3.150 22.023 -30.492 1.00 25.89 H1 C ATOM 5133 -3.846 23.019 -30.318 1.00 25.01 H1 O ATOM 5134 -2.294 21.585 -29.575 1.00 27.77 H1 N ATOM 5135 -1.924 22.442 -28.456 1.00 28.51 H1 C ATOM 5136 -2.366 21.828 -27.119 1.00 31.18 H1 C ATOM 5137 -1.642 20.539 -26.785 1.00 33.23 H1 C

4

ATOM 5138 OD -0.514 20.307 -27.221 1.00 37.24 H1 O ATOM 5139 ND -2.294 19.688 -25.999 1.00 34.97 H1 N ATOM 5140 C -0.423 22.706 -28.463 1.00 29.67 H1 C ATOM 5141 O 0.293 22.205 -29.327 1.00 29.70 H1 O ATOM 5142 N 0.047 23.497 -27.505 1.00 30.65 H1 N ATOM 5143 CA 1.391 24.059 -27.565 1.00 34.02 H1 C ATOM 5144 CB 1.597 25.058 -26.431 1.00 36.59 H1 C ATOM 5145 CG 1.574 24.427 -25.077 1.00 41.39 H1 C ATOM 5196 CD 0.542 24.090 -24.268 1.00 42.73 H1 C ATOM 5147 ND 2.719 24.025 -24.425 1.00 99.09 H1 N ATOM 5148 CE 2.393 23.465 -23.273 1.00 43.74 H1 C ATOM 5199 NE 1.077 23.492 -23.154 1.00 44.27 H1 N ATOM 5150 C 2.473 22.990 -27.475 1.00 34.37 H1 C ATOM 5151 O 3.621 23.241 -27.819 1.00 34.24 H1 O ATOM 5152 N 2.115 21.805 -26.999 1.00 34.17 H1 N ATOM 5153 CA 3.103 20.752 -26.852 1.00 34.95 H1 C ATOM 5154 CB 2.728 19.819 -25.708 1.00 37.13 H1 C ATOM 5155 OG 1.673 18.955 -26.090 1.00 44.66 H1 O ATOM 5156 C 3.207 19.960 -28.140 1.00 35.47 H1 C ATOM 5157 O 4.033 19.058 -28.255 1.00 37.27 H1 O ATOM 5158 N 2.360 20.291 -29.110 1.00 33.32 H1 N ATOM 5159 CA 2.456 19.646 -30.407 1.00 33.10 H1 C ATOM 5160 C 1.537 18.459 -30.649 1.00 30.70 H1 C ATOM 5161 O 1.519 17.913 -31.799 1.00 31.90 H1 O ATOM 5162 N 0.770 18.047 -29.647 1.00 31.34 H1 N ATOM 5163 CA -0.181 16.959 -29.860 1.00 31.52 H1 C ATOM 5164 CB -0.674 16.399 -28.520 1.00 33.02 H1 C ATOM 5165 CG -1.671 15.245 -28.675 1.00 39.22 H1 C ATOM 5166 CD -1.844 14.428 -27.393 1.00 41.40 H1 C ATOM 5167 NE -2.188 15.260 -26.239 1.00 44.28 H1 N ATOM 5168 CZ -3.363 15.858 -26.069 1.00 45.93 H1 C ATOM 5169 NH -4.318 15.722 -26.983 1.00 45.10 H1 N ATOM 5170 NH -3.584 16.588 -24.980 1.00 46.47 H1 N ATOM 5171 C -1.376 17.427 -30.702 1.00 29.42 H1 C ATOM 5172 O -1.861 18.544 -30.597 1.00 29.29 H1 O ATOM 5173 N -1.844 16.560 -31.590 1.00 27.46 H1 N ATOM 5179 CA -2.908 16.912 -32.518 1.00 28.02 H1 C

4

ATOM 5175 -2.401 16.915 -33.974 1.00 26.99 H1 C ATOM 5176 -1.806 15.646 -34.267 1.00 28.13 H1 O ATOM 5177 -1.384 18.032 -39.199 1.00 24.99 H1 C ATOM 5178 -4.097 15.956 -32.442 1.00 27.51 H1 C ATOM 5179 -3.968 14.814 -31.996 1.00 24.38 H1 O ATOM 5180 -5.252 16.447 -32.882 1.00 26.49 H1 N ATOM 5181 -6.422 15.606 -33.141 1.00 26.22 H1 C ATOM 5182 -7.491 15.830 -32.064 1.00 26.18 H1 C ATOM 5183 -6.973 15.585 -30.655 1.00 25.96 H1 C ATOM 5184 -6.604 14.436 -30.349 1.00 28.58 H1 O ATOM 5185 -6.941 16.538 -29.849 1.00 25.89 H1 O ATOM 5186 -6.985 16.012 -34.506 1.00 25.72 H1 C ATOM 5187 -7.107 17.200 -34.795 1.00 24.91 H1 O ATOM 5188. -7.326 15.035 -35.339 1.00 25.29 H1 N ATOM 5189 -7.818 15.326 -36.681 1.00 25.55 H1 C ATOM 5190 -6.882 14.740 -37.743 1.00 24.54 H1 C ATOM 5191 -5.476 15.296 -37.709 1.00 27.17 H1 C ATOM 5192 -5.247 16.653 -37.827 1.00 25.11 H1 C ATOM 5193 -3.971 17.167 -37.782 1.00 28.62 H1 C ATOM 5194 -4.378 14.458 -37.550 1.00 28.77 H1 C ATOM 5195 -3.091 14.966 -37.510 1.00 29.01 H1 C ATOM 5196 -2.895 16.324 -37.622 1.00 28.28 H1 C ATOM 5197 -1.624 16.855 -37.546 1.00 29.69 H1 O ATOM 5198 -9.217 14.774 -36.912 1.00 26.93 H1 C ATOM 5199 -9.610 13.775 -36.306 1.00 25.59 H1 O ATOM 5200 -9.960 15.435 -37.795 1.00 25.64 H1 N ATOM 5201 -11.180 14.866 -38.339 1.00 27.20 H1 C ATOM 5202 -11.914 15.908 -39.193 1.00 27.87 H1 C ATOM 5203 -13.295 15.439 -39.636 1.00 29.92 H1 C ATOM 5204 -13.552 14.242 -39.734 1.00 27.12 H1 O ATOM 5205 -14.191 16.388 -39.906 1.00 27.79 H1 N ATOM 5206 -10.766 13.682 -39.211 1.00 28.06 H1 C ATOM 5207 -9.900 13.815 -40.076 1.00 26.75 H1 O ATOM 5208 -11.383 12.509 -38.988 1.00 28.60 H1 N ATOM 5209 -12.379 12.272 -37.929 1.00 28.36 H1 C. ATOM 5210 -11.103 11.288 -39.750 1.00 28.67 H1 C ATOM 5211 -12.156 10.300 -39.243 1.00 30.97 H1 C

4

1

2

ATOM 5397 -5.392 20.841 -51.400 1.00 31.90 H1 C ATOM 5398 -5.072 21.019 -53.869 1.00 31.67 H1 C ATOM 5399 -6.815 18.589 -54.164 1.00 32.60 H1 C ATOM 5400 -6.214 18.241 -55.180 1.00 34.22 H1 O ATOM 5401 -8.142 18.659 -59.090 1.00 31.22 H1 N ATOM 5402 -8.995 18.603 -55.275 1.00 31.00 H1 C ATOM 5403 -9.725 17.249 -55.400 1.00 31.98 H1 C ATOM 5909 -10.653 17.102 -54.316 1.00 34.46 H1 O ATOM 5405 -8.725 16.091 -55.368 1.00 32.26 H1 C ATOM 5406 -10.038 19.709 -55.152 1.00 30.48 H1 C ATOM 5407 -10.059 20.439 -54.162 1.00 30.01 H1 O ATOM 5408 -10.904 19.836 -56.150 1.00 28.60 H1 N ATOM 5409 -11.891 20.908 -56.145 1.00 29.42 H1 C ATOM 5410 -12.797 20.80.6 -57.386 1.00 25.14 H1 C ATOM 5411 -12.734 20.876 -54.871 1.00 27.88 H1 C ATOM 5412 -13.204 21.908 -54.415 1.00 29.57 H1 O ATOM 5413 -12.915 19.689 -54.301 1.00 26.65 H1 N ATOM 5414 -13.753 19.515 -53.115 1.00 26.47 H1 C ATOM 5415 -14.045 18.023 -52.907 1.00 22.83 H1 C ATOM 5416 -13.147 20.115 -51.834 1.00 27.55 H1 C ATOM 5417 -13.818 20.204 -50.800 1.00 25.90 H1 0 ATOM 5418 -11.879 20.514 -51.896 1.00 26.38 H1 N ATOM 5419 -11.249 21.202 -50.773 1.00 26.18 H1 C ATOM 5420 -9.752 20.899 -50.735 1.00 24.35 H1 C ATOM 5421 -9.462 19.433 -50.473 1.00 25.95 H1 C ATOM 5422 -9.997 18.882 -49.486 1.00 26.03 H1 0 ATOM 5423 -8.704 18.831 -51.262 1.00 25.18 H1 O ATOM 5424 -11.461 22.712 -50.844 1.00 25.45 H1 C ATOM 5425 -11.031 23.446 -49.960 1.00 25.56 H1 0 ATOM 5426 -12.124 23.169 -51.901 1.00 24.03 H1 N ATOM 5427 -12.500 24.572 -52.021 1.00 22.80 H1 C ATOM 5428 -13.279 24.808 -53.327 1.00 23.31 H1 C ATOM 5429 -12.440 24.464 -54.434 1.00 23.59 H1 O ATOM 5430 -13.720 26.278 -53.458 1.00 22.37 H1 C ATOM 5431 -13.363 24.994 -50.833 1.00 23.24 H1 C ATOM 5432 -14.360 24.342 -50.512 1.00 23.24 H1 O ATOM 5433 -12.975 26.083 -50.178 1.00 22.25 H1 N

4

ATOM 5439 -13.673 26.534 -48.978 1.00 22.73 H1 C ATOM 5435 -13.718 25.406 -47.943 1.00 18.43 H1 C ATOM 5436 -12.982 27.757 -48.378 1.00 24.17 H1 C ATOM 5437 -11.855 28.094 -48.755 1.00 25.58 H1 O ATOM 5438 -13.663 28.420 -47.447 1.00 23.43 H1 N ATOM 5439 -13.002 29.380 -46.575 1.00 23.10 H1 C ATOM 5440 -13.983 30.477 -46.087 1.00 24.14 H1 C ATOM 5441 -13.263 31.430 -45.147 1.00 23.43 H1 C ATOM 5442 -14.535 31.260 -47.281 1.00 23.45 H1 C ATOM 5443 -12.436 28.627 -45.372 1.00 24.98 H1 C ATOM 5444 -13.160 27.903 -44.675 1.00 26.01 H1 0 ATOM 5445 -11.137 28.779 -45.143 1.00 23.58 H1 N ATOM 5446 -10.479 28.124 -44.019 1.00 23.55 H1 C ATOM 5447 -9.135 27.537 -44.471 1.00 20.25 H1 C ATOM 5448 -9.272 26.302 -45.342 1.00 20.65 H1 C ATOM 5449 -8.895 25.048 -44.871 1.00 19.71 H1 C ATOM 5950 -9.047 23.911 -45.651 1.00 20.45 H1 C ATOM 5451 -9.804 26.385 -46.620 1.00 21.99 H1 C ATOM 5952 -9.964 25.250 -47.412 1.00 21.69 H1 C ATOM 5453 -9.583 24.020 -46.918 1.00 21.47 H1 C ATOM 5454 -9.757 22.894 -47.687 1.00 24.56 H1 0 ATOM 5455 -10.263 29.110 -42.869 1.00 24.76 H1 C ATOM 5456 -9.700 30.190 -43.064 1.00 26.10 H1 0 ATOM 5457 -10.719 28.735 -41.676 1.00 22.97 H1 N ATOM 5458 -10.583 29.576 -40.489 1.00 23.93 H1 C ATOM 5459 -11.946 29.821 -39.846 1.00 22.58 H1 C ATOM 5460 -12.952 30.548 -40.702 1.00 25.89 H1 C ATOM 5461 -12.938 31.936 -40.801 1.00 25.89 H1 C ATOM 5962 -13.908 32.614 -41.531 1.00 25.38 H1 C ATOM 5463 -13.962 29.850 -41.365 1.00 26.81 H1 C ATOM 5464 -14.935 30.516 -42.095 1.00 25.75 H1 C ATOM 5465 -14.906 31.897 -42.172 1.00 27.48 H1 C ATOM 5466 -15.889 32.561 -42.874 1.00 28.03 H1 O ATOM 5467 -9.691 28.908 -39.446 1.00 24.14 H1 C ATOM 5468 -9.695 27.681 -39.310 1.00 22.75 H1 O ATOM 5469 -8.938 29.716 -38.705 1.00 24.10 H1 N ATOM 5470 -8.466 29.294 -37.395 1.00 25.55 H1 C ATOM 5971 95 -9.410 29.829 -36.338 1.00 25.49 H1 C ATOM 5472 95 -10.104 30.819 -36.560 1.00 24.75 H1 0 ATOM 5973 95 -7.034 29.781 -37.107 1.00 27.36 H1 C ATOM 5474 95 -6.561 31.491 -37.539 1.00 31.48 H1 S ATOM 5475 96 -9.439 29.157 -35.192 1.00 24.09 H1 N ATOM 5476 96 -10.354 29.504 -34.117 1.00 22.01 H1 C ATOM 5477 96 -11.730 28.887 -34.380 1.00 20.76 H1 C ATOM 5478 96 -9.782 28.977 -32.813 1.00 22.32 H1 C ATOM 5479 96 -9.166 27.910 -32.775 1.00 22.28 H1 O ATOM 5980 97 -9.997 29.723 -31.739 1.00 22.97 H1 N ATOM 5981 97 -9.439 29.355 -30.450 1.00 22.39 H1 C ATOM 5482 97 -9.076 30.614 -29.668 1.00 22.09 H1 C ATOM 5983 97 -8.510 30.352 -28.276 1.00 21.83 H1 C ATOM 5989 97 -8.172 31.672 -27.581 1.00 23.69 H1 C ATOM 5485 97 -9.342 32.258 -26.927 1.00 23.06 H1 N ATOM 5486 97 -9.273 33.201 -25.993 1.00 26.31 H1 C ATOM 5487 97 -8.090 33.668 -25.613 1.00 26.46 H1 N ATOM 5488 97 -10.379 33.662 -25.422 1.00 23.30 H1 N ATOM 5489 97 -10.426 28.533 -29.636 1.00 24.53 H1 C ATOM 5490 97 -11.632 28.801 -29.658 1.00 22.12 H1 O ATOM 5491 98 -9.905 27.537 -28.921 1.00 22.25 H1 N ATOM 5492 98 -10.606 27.020 -27.760 1.00 23.81 H1 C ATOM 5493 98 -11.259 25.658 -27.913 1.00 23.68 H1 C ATOM 5494 98 -11.391 25.128 -29.023 1.00 23.49 H1 O ATOM 5495 99 -11.668 25.095 -26.780 1.00 22.67 H1 N ATOM 5496 99 -12.293 23.780 -26.799 1.00 23.45 H1 C ATOM 5497 99 -11.253 22.706 -26.419 1.00 22.97 H1 C ATOM 5498 99 -11.774 21.269 -26.560 1.00 20.76 H1 C ATOM 5499 99 -10.690 20.232 -26.328 1.00 22.06 H1 C ATOM 5500 99 -10.482 19.768 -25.202 1.00 22.02 H1 O ATOM 5501 99 -9.992 19.860 -27.395 1.00 21.38 H1 N ATOM 5502 99 -13.436 23.724 -25.725 1.00 24.22 H1 C ATOM 5503 99 -14.550 23.329 -26.056 1.00 24.28 H1 O ATOM 5504 100 -13.161 24.117 -24.485 1.00 23.64 H1 N ATOM 5505 100 -14.182 24.086 -23.448 1.00 24.07 H1 C ATOM 5506 100 -13.593 24.137 -22.055 1.00 23.74 H1 C ATOM 5507 100 -12.653 22.935 -21.697 1.00 23.65 H1 C ATOM 5508 100 -12.218 23.039 -20.250 1.00 21.96 H1 C ATOM 5509 100 -13.409 21.629 -21.918 1.00 22.57 H1 C ATOM 5510 100 -15.133 25.257 -23.642 1.00 26.71 H1 C ATOM 5511 100 -16.334 25.145 -23.386 1.00 27.08 H1 O ATOM 5512 101 -14.591 26.380 -24.104 1.00 26.05 H1 N ATOM 5513 101 -15.413 27.446 -24.665 1.00 26.77 H1 C ATOM 5514 101 -15.146 28.799 -23.957 1.00 25.01 H1 C ATOM 5515 101 -16.083 29.869 -24.501 1.00 25.38 H1 C ATOM 5516 101 -15.361 28.646 -22.953 1.00 24.75 H1 C ATOM 5517 101 -15.034 27.530 -26.141 1.00 26.59 H1 C ATOM 5518 101 -14.149 28.290 -26.528 1.00 26.80 H1 0 ATOM 5519 102 -15.687 26.710 -26.980 1.00 25.65 H1 N ATOM 5520 102 -16.834 25.848 -26.646 1.00 23.49 H1 C ATOM 5521 102 -15.148 26.427 -28.315 1.00 23.89 H1 C ATOM 5522 102 -15.863 25.141 -28.729 1.00 23.18 H1 C ATOM 5523 102 -17.147 25.158 -27.954 1.00 25.90 H1 C ATOM 5524 102 -15.315 27.542 -29.339 1.00 24.72 H1 C ATOM 5525 102 -16.411 28.061 -29.550 1.00 24.05 H1 O ATOM 5526 103 -14.206 27.900 -29.974 1.00 22.69 H1 N ATOM 5527 103 -14.223 28.841 -31.080 1.00 22.97 H1 C ATOM 5528 103 -15.059 28.262 -32.240 1.00 20.62 H1 C ATOM 5529 103 -14.912 26.755 -32.412 1.00 21.68 H1 C ATOM 5530 103 -16.005 25.970 -32.759 1.00 17.84 H1 C ATOM 5531 103 -13.693 26.125 -32.185 1.00 19.12 H1 C ATOM 5532 103 -15.888 24.595 -32.868 1.00 19.25 H1 C ATOM 5533 103 -13.565 24.745 -32.294 1.00 17.07 H1 C ATOM 5534 103 -14.666 23.978 -32.634 1.00 18.07 H1 C ATOM 5535 103 -14.781 30.195 -30.619 1.00 23.73 H1 C ATOM 5536 103 -15.712 30.724 -31.217 1.00 24.85 H1 0 ATOM 5537 104 -14.215 30.752 -29.548 1.00 24.65 H1 N ATOM 5538 104 -14.669 32.050 -29.069 1.00 24.76 H1 C ATOM 5539 104 -14.406 32.217 -27.563 1.00 25.91 H1 C ATOM 5540 109 -12.945 32.005 -27.175 1.00 30.36 H1 C ATOM 5541 104 -12.122 31.635 -28.036 1.00 31.12 H1 O ATOM 5542 104 -12.619 32.212 -25.987 1.00 28.71 H1 O ATOM 5543 104 -14.021 33.180 -29.856 1.00 27.29 H1 C ATOM 5544 104 -14.586 34.262 -29.971 1.00 27.52 H1 O ATOM 5545 105 -12.841 32.920 -30.911 1.00 26.93 H1 N ATOM 5546 105 -12.227 33.847 -31.355 1.00 26.35 H1 C ATOM 5547 105 -10.971 34.479 -30.743 1.00 25.73 H1 C ATOM 5548 105 -11.278 35.498 -29.675 1.00 28.28 H1 C ATOM 5549 105 -11.345 35.133 -28.334 1.00 26.26 H1 C ATOM 5550 105 -11.661 36.060 -27.359 1.00 27.70 H1 C ATOM 5551 105 -11.534 36.825 -30.012 1.00 29.38 H1 C ATOM 5552 105 -11.855 37.756 -29.044 1.00 29.45 H1 C ATOM 5553 105 -11.918 37.368 -27.722 1.00 29.50 H1 C ATOM 5554 105 -12.255 38.299 -26.766 1.00 32.67 H1 O ATOM 5555 105 -11.869 33.131 -32.657 1.00 25.43 H1 C ATOM 5556 105 -11.426 31.982 -32.641 1.00 24.81 H1 O ATOM 5557 106 -12.065 33.826 -33.779 1.00 24.15 H1 N ATOM 5558 106 -11.831 33.273 -35.106 1.00 25.25 . H1. C ATOM 5559 106 -13.145 33.160 -35.879 1.00 21.93 H1 C ATOM 5560 106 -14.111 32.140 -35.362 1.00 22.83 H1 C ATOM 5561 106 -14.605 30.995 -36.072 1.00 21.41 H1 C ATOM 5562 106 -15.566 30.379 -35.250 1.00 20.48 H1 C ATOM 5563 106 -14.328 30.437 -37.326 1.00 20.75 H1 C ATOM 5564 106 -14.767 32.164 -39.170 1.00 19.87 H1 C ATOM 5565 106 -15.646 31.112 -34.095 1.00 22.85 H1 N ATOM 5566 106 -16.258 29.229 -35.637 1.00 20.26 H1 C ATOM 5567 106 -15.015 29.297 -37.711 1.00 20.27 H1 C ATOM 5568 106 -15.970 28.705 -36.868 1.00 23.31 H1 C ATOM 5569 106 -10.902 34.181 -35.906 1.00 27.18 H1 C ATOM 5570 106 -10.923 35.400 -35.741 1.00 26.73 H1 O ATOM 5571 107 -10.114 33.587 -36.797 1.00 27.12 H1 N ATOM 5572 107 -9.418 34.377 -37.797 1.00 27.10 H1 C ATOM 5573 107 -10.379 34.963 -38.822 1.00 28.57 H1 C ATOM 5574 107 -11.583 34.686 -38.790 1.00 27.48 H1 O ATOM 5575 108 -9.852 35.771 -39.737 1.00 28.26 H1 N ATOM 5576 108 -10.680 36.424 -40.743 1.00 30.59 H1 C ATOM 5577 108 -9.980 37.684 -41.275 1.00 33.27 H1 C ATOM 5578 108 -8.939 37.432 -42.371 1.00 36.99 H1 C ATOM 5579 108 -7.566 37.046 -41.831 1.00 42.07 H1 C ATOM 5580 108 -7.395 36.782 -40.633 1.00 42.16 H1 O ATOM 5581 108 -6.577 37.012 -42.720 1.00 40.22 H1 N ATOM 5582 108 -10.976 35.464 -41.895 1.00 30.47 H1 C ATOM 5583 108 -11.868 35.710 -42.707 1.00 31.09 H1 O ATOM 5589 109 -10.223 34.369 -41.953 1.00 29.81 H1 N ATOM 5585 109 -10.492 33.323 -42.923 1.00 29.09 H1 C ATOM 5586 109 -9.718 33.498 -44.216 1.00 28.69 H1 C ATOM 5587 109 -9.425 34.618 -44.619 1.00 28.50 H1 O ATOM 5588 110 -9.386 32.389 -44.866 1.00 28.50 H1 N ATOM 5589 110 -8.682 32.431 -46.139 1.00 28.41 H1 C ATOM 5590 110 -7.285 31.793 -46.021 1.00 29:01 H1 C ATOM 5591 110 -6.522 32.494 -45.034 1.00 32.03 H1 0 ATOM 5592 110 -6.554 31.856 -47.356 1.00 29.38 H1 C ATOM 5593 110 -9.476 31.669 -47.193 1.00 29.43 H1 C ATOM 5599 110 -9.712 30.971 -47.053 1.00 27.15 H1 O ATOM 5595 111 -9.890 32.364 -48.246 1.00 29.78 H1 N ATOM 5596 111 -10.616 31.723 -49.328 1.00 29.48 H1 C ATOM 5597 111 -11.234 32.766 -50.258 1.00 31.55 H1 C ATOM 5598 111 -11.853 32.182 -51.537 1.00 36.06 H1 C ATOM 5599 111 -13.054 31.310 -51.180 1.00 35.44 H1 C ATOM 5600 111 -12.272 33.308 -52.470 1.00 33.87 H1 C ATOM 5601 111 -9.659 30.839 -50.109 1.00 30.13 H1 C ATOM 5602 111 -8.661 31.308 -50.664 1.00 30.30 H1 O ATOM 5603 112 -9.953 29.547 -50.129 1.00 28.78 H1 N ATOM 5604 112 -9.134 28.603 -50.862 1.00 27.19 H1 C ATOM 5605 112 -8.700 2-7.434 -49.964 1.00 27.32 H1 C ATOM 5606 112 -7.986 26.383 -50.793 1.00 26.80 H1 C ATOM 5607 112 -7.788 27.951 -48.857 1.00 25.55 H1 C ATOM 5608 112 -9.934 28.071 -52.039 1.00 28.91 H1 C ATOM 5609 112 -11.012 27.493 -51.867 1.00 26.37 H1 O ATOM 5610 113 -9.405 28.288 -53.2.37 1.00 28.59 H1 N ATOM 5611 113 -10.076 27.865 -54.457 1.00 31.25 H1 C ATOM 5612 113 -10.365 29.071 -55.379 1.00 30.80 H1 C ATOM 5613 113 -11.220 29.992 -54.691 1.00 33.89 H1 O ATOM 5614 113 -11.064 28.623 -56.658 1.00 32.74 H1 C ATOM 5615 113 -9.190 26.868 -55.183 1.00 31.51 H1 C ATOM 5616 113 -8.041 27.163 -55.506 1.00 32.27 H1 0 ATOM 5617 114 -9.721 25.679 -55.406 1.00 32.99 H1 N ATOM 5618 114 -8.990 24.643 -56.122 , 1.00 34.40 H1 C ATOM 5619 114 -8.865 23.356 -55.288 1.00 32.69 H1 C ATOM 5620 114 -8.002 22.346 -56.026 1.00 30.00 H1 C ATOM 5621 114 -8.294 23.671 -53.916 1.00 32.66 H1 C ATOM 5622 114 -9.745 24.305 -57.401 1.00 37.41 H1 C ATOM 5623 114 -10.881 23.828 -57.349 1.00 37.23 H1 C ATOM 5624 115 -9.119 24.564 -58.544 1.00 39.18 H1 N ATOM 5625 115 -9.668 24.115 -59.813 1.00 44.39 H1 C ATOM 5626 115 -10.785 25.059 -60.277 1.00 45.61 H1 C ATOM 5627 115 -10.365 25.884 -61.347 1.00 45.98 H1 O ATOM 5628 115 -8.586 24.014 -60.881 1.00 96.97 H1 C ATOM 5629 115 -7.543 24.667 -60.796 1.00 45.73 H1 C ATOM 5630 116 -8.841 23.177 -61.880 1.00 49.79 H1 N ATOM 5631 116 -7.891 22.949 -62.961 1.00 53.39 H1 C ATOM 5632 116 -7.763 21.450 -63.230 1.00 52.69 H1 C ATOM 5633 116 -9.040 20.871 -63.434 1.00 54.43 H1 O ATOM 5634 116 -8.348 23.658 -69.230 1.00 55.63 . H1 C ATOM 5635 116 -7.679 23.595 -65.261 1.00 57.09 H1 O ATOM 5636 117 -9.491 24.332 -64.146 1.00 57.80 H1 N ATOM 5637 117 -10.149 24.878 -65.329 1.00 60.79 H1 C ATOM 5638 117 -11.572 25.305 -64.983 1.00 60.52 H1 C ATOM 5639 117 -9.391 26.049 -65.946 1.00 62.07 H1 C ATOM 5640 117 -8.832 26.890 -65.240 1.00 62.18 H1 O ATOM 5641 118 -9.380 26.095 -67.274 1.00 64.43 H1 N ATOM 5692 118 -8.766 27.201 -67.996 1.00 65.80 H1 C ATOM 5643 118 -7.636 26.692 -68.890 1.00 66.05 H1 C ATOM 5644 118 -6.810 27.764 -69.309 1.00 68.87 H1 O ATOM 5645 118 -9.807 27.920 -68.845 1.00 65.94 H1 C ATOM 5646 118 -10.856 27.358 -69.164 1.00 65.51 H1 O ATOM 5647 119 -9.505 29.161 -69.211 1.00 66.97 H1 N ATOM 5648 119 -10.462 30.027 -69.893 1.00 67.67 H1 C ATOM 5649 119 -9.775 31.297 -70.430 1.00 67.99 H1 C ATOM 5650 119 -9.195 32.026 -69.339 1.00 68.98 H1 O ATOM 5651 119 -10.784 32.181 -71.196 1.00 67.51 H1 C ATOM 5652 119 -11.167 29.336 -71.054 1.00 67.83 H1 C ATOM 5653 119 -10.543 28.631 -71.848 1.00 67.72 H1 O ATOM 5654 120 -12.477 29.546 -71.141 1.00 67.80 H1 N ATOM 5655 120 -13.282 28.985 -72.217 1.00 68.20 H1 C ATOM 5656 120 -13.685 27.545 -71.889 1.00 67.62 H1 C ATOM 5657 120 -14.595 26.908 -72.931 1.00 67.51 H1 C ATOM 5658 120 -15.178 25.590 -72.436 1.00 69.11 H1 C ATOM 5659 120 -16.168 25.004 -73.937 1.00 69.25 H1 C ATOM 5660 120 -17.270 25.956 -73.782 1.00 70.85 H1 N ATOM 5661 120 -14.537 29.824 -72.432 1.00 69.04 H1 C ATOM 5662 120 -15.329 30.023 -71.508 1.00 69.38 H1 O ATOM 5663 121 -14.715 30.308 -73.659 1.00 69.06 H1 N ATOM 5669 121 -15.886 31.102 -73.982 1.00 68.10 H1 C ATOM 5665 121 -17.159 30.283 -73.922 1.00 68.13 H1 C ATOM 5666 121 -17.129 29.061 -74.089 1.00 67.67 H1 O ATOM 5667 122 -18.303 30.936 -73.678 1.00 67.96 H1 N ATOM 5668 122 -18.403 32.385 -73.933 1.00 67.50 H1 C ATOM 5669 122 -19.596 30.260 -73.523 1.00 68.40 H1 C ATOM 5670 122 -20.492 31.337 -72.925 1.00 68.31 H1 C ATOM 5671 122 -19.885 32.622 -73.381 1.00 68.44 H1 C ATOM 5672 122 -20.173 29.701 -74.819 1.00 69.03 H1 C ATOM 5673 122 -19.899 30.207 -75.906 1.00 69.06 H1 O ATOM 5679 123 -20.972 28.649 -74.688 1.00 69.50 H1 N ATOM 5675 123 -21.822 28.187 -75.776 1.00 70.46 H1 C ATOM 5676 123 -21.828 26.658 -75.823 1.00 70.16 H1 C ATOM 5677 123 -22.886 26.177 -76.631 1.00 70.42 H1 0 ATOM 5678 123 -23.238 28.708 -75.532 1.00 71.61 H1 C ATOM 5679 123 -23.796 28.518 -74.450 1.00 71.85 H1 0 ATOM 5680 129 -23.814 29.366 -76.536 1.00 71.93 H1 N ATOM 5681 124 -25.099 30.039 -76.368 1.00 71.46 H1 C ATOM 5682 124 -25.035 31.486 -76.898 1.00 70.79 H1 C ATOM 5683 124 -26.356 32.191 -76.640 1.00 69.89 H1 C ATOM 5684 129 -23.886 32.233 -76.236 1.00 68.40 H1 C ATOM 5685 124 -26.244 29.313 -77.073 1.00 72.64 H1 C ATOM 5686 129 -26.151 28.983 -78.255 1.00 73.01 H1 0 ATOM 5687 125 -27.324 29.071 -76.338 1.00 73.89 H1 N ATOM 5688 125 -28.510 28.431 -76.894 1.00 75.85 H1 C ATOM 5689 125 -28.723 27.062 -76.247 1.00 76.97 H1 C ATOM 5690 125 -27.641 26.071 -76.557 1.00 78.42 H1 C ATOM 5691 125 -27.704 25.293 -77.702 1.00 78.83 H1 C ATOM 5692 125 -26.560 25.916 -75.704 1.00 78.71 H1 C

1

ATOM 5693 125 -26.712 24.380 -77.992 1.00 79.99 H1 C ATOM 5699 125 -25.564 25.004 -75.987 1.00 79.38 H1 C ATOM 5695 125 -25.639 24.235 -77.134 1.00 80.12 H1 C ATOM 5696 125 -29.749 29.292 -76.671 1.00 77.12 H1 C ATOM 5697 125 -29.8C3 30.089 -75.731 1.00 76.96 H1 0 ATOM 5699 126 -30.760 29.151 -77.543 1.00 78.18 H1 N ATOM 5699 126 -30.7C5 28.371 -78.793 1.00 78.12 H1 C ATOM 5700 126 -32.048 29.838 -77.388 1.00 78.24 H1 C ATOM 5701 126 -32.641 29.793 -78.789 1.00 77.98 H1 C ATOM 5702 126 -32.099 28.522 -79.358 1.00 77.57 H1 C ATOM 5703 126 -32.951 29.136 -.76.376 1.00 78.99 H1 C ATOM 5704 126 -33.020 27.909 -76.344 1.00 78.95 H1 O ATOM 5705 127 -33.643 29.918 -75.555 1.00 80.12 H1 N ATOM 5706 127 -34.690 29.378 -74.695 1.00 81.26 H1 C ATOM 5707 127 -34.451 29.790 -73.239 1.00 80.50 H1 C ATOM 5708 127 -33.138 29.323 -72.604 1.00 79.91 H1 C ATOM 5709 127 -33.050 29.821 -71.171 1.00 79.12 H1 C ATOM 5710 127 -33.061 27.806 -72.647 1.00 79.76 H1 C ATOM 5711 127 -36.039 29.905 -75.174 1.00 82.39 H1 C ATOM 5712 127 -36.562 30.883 -74.639 1.00 82.90 H1 O

ATOM 5713 128 -36.595 29.247 -76.187 1.00 83.36 H1 N ATOM 5714 128 -37.769 29.753 -76.891 1.00 84.32 H1 C ATOM 5715 128 -37.982 28.959 -78.179 1.00 84.16 H1 C ATOM 5716 126 -39.031 29.711 -76.036 1.00 85.07 H1 C ATOM 5717 128 -39.252 28.766 -75.275 1.00 85.35 H1 O ATOM 5718 129 -39.884 30.740 -76.164 1.00 85.56 H1 N ATOM 5719 129 -39.691 31.851 -77.113 1.00 85.77 H1 C ATOM 5720 129 -41.121 30.890 -75.387 1.00 85.80 H1 C ATOM 5721 129 -41.604 32.293 -75.747 1.00 85.81 H1 C ATOM 5722 129 -41.019 32.555 -77.099 1.00 86.05 H1 C ATOM 5723 129 -42.175 29.827 -75.697 1.00 86.17 H1 C ATOM 5724 129 -42.318 29.391 -76.840 1.00 85.88 H1 O ATOM 5725 130 -42.911 29.421 -74.667 1.00 86.84 H1 N ATOM 5726 130 -43.963 28.421 -74.816 1.00 87.43 H1 C ATOM 5727 130 -44.385 27.890 -73.441 1.00 87.92 H1 C ATOM 5728 130 -43.298 27.275 -72.771 1.00 88.97 H1 O ATOM 5729 130 -45.175 29.014 -75.531 1.00 87.44 H1 C

2

ATOM 5730 130 -45.780 28.371 -76.391 1.00 87.06 H1 0 ATOM 5731 136 -50.193 39.909 -68.488 1.00 99.67 H1 N ATOM 5732 136 -51.016 34.123 -69.648 1.00 99.80 H1 C ATOM 5733 136 -51.050 35.272 -70.638 1.00 100.02 H1 C ATOM 5734 136 -51.114 35.055 -71.850 1.00 100.03 H1 0 ATOM 5735 137 -51.007 36.998 -70.123 1.00 99.85 H1 N ATOM 5736 137 -50.995 37.666 -70.986 1.00 99.13 H1 C ATOM 5737 137 -49.608 37.961 -71.527 1.00 98.66 H1 C ATOM 5738 137 -49.456 38.642 -72.542 1.00 98.56 H1 O ATOM 5739 138 -48.591 37.446 -70.842 1.00 98.05 H1 N ATOM 5740 138 -47.209 37.602 -71.282 1.00 96.71 H1 C ATOM 5791 138 -46.393 38.445 -70.280 1.00 96.65 H1 C ATOM 5742 138 -46.424 37.817 -68.991 1.00 96.53 H1 O ATOM 5743 138 -46.967 39.851 -70.175 1.00 95.98 H1 C ATOM 5744 138 -46.526 36.247 -71.444 1.00 95:56 H1 C ATOM 5745 138 -46.947 35.250 -70.853 1.00 95.36 H1 O ATOM 5746 139 -45.472 36.220 -72.253 1.00 94.21 H1 N ATOM 5747 139 -44.659 35.022 -72.418 1.00 92.92 H1 C ATOM 5748 139 -44.780 34.497 -73.846 1.00 93.04 H1 C ATOM 5749 139 -43.202 35.339 -72.095 1.00 91.71 H1 C ATOM 5750 139 -42.713 36.430 -72.395 1.00 91.15 H1 O ATOM 5751 140 -42.513 34.383 -71.480 1.00 90.37 H1 N ATOM 5752 140 -41.123 34.582 -71.092 1.00 88.70 H1 C ATOM 5753 140 -40.928 34.187 -69.634 1.00 89.09 H1 C ATOM 5754 140 -40.178 33.783 -71.982 1.00 87.42 H1 C ATOM 5755 140 -40.491 32.667 -72.400 1.00 86.82 H1 O ATOM 5756 141 -39.020 34.368 -72.267 1.00 86.13 H1 N ATOM 5757 141 -38.002 33.722 -73.084 1.00 85.33 H1 C ATOM 5758 141 -38.303 33.941 -74.572 1.00 85.25 H1 C ATOM 5759 141 -38.499 35.376 -75.081 1.00 85.32 H1 C ATOM 5760 141 -37.162 36.103 -75.165 1.00 84.61 H1 C ATOM 5761 141 -39.154 35.334 -76.453 1.00 85.35 H1 C ATOM 5762 141 -36.621 34.275 -72.741 1.00 85.01 H1 C ATOM 5763 141 -36.496 35.396 -72.247 1.00 85.36 H1 0 ATOM 5764 142 -35.587 33.484 -73.001 1.00 83.90 H1 N ATOM 5765 142 -34.233 33.941 -72.752 1.00 83.19 H1 C ATOM 5766 142 -33.231 33.175 -73.589 1.00 82.79 H1 C ATOM 5767 142 -33.609 32.991 -74.539 1.00 83.09 H1 O ATOM 5768 193 -31.952 33.289 -73.248 1.00 82.17 H1 N ATOM 5769 143 -30.940 32.465 -73.890 1.00 81.85 H1 C ATOM 5770 143 -29.954 31.864 -72.882 1.00 80.13 H1 C ATOM 5771 143 -29.537 32.518 -71.925 1.00 79.99 H1 0 ATOM 5772 193 -30.204 33.270 -74.974 1.00 83.41 H1 C ATOM 5773 143 -28.939 34.449 -74.400 1.00 87.73 H1 S ATOM 5774 144 -29.601 30.602 -73.109 1.00 78.24 H1 N ATOM 5775 144 -28.826 29.808 -72.161 1.00 75.92 H1 C ATOM 5776 144 -29.286 28.349 -72.233 1.00 75.88 H1 C ATOM 5777 144 -28.506 27.285 -71.462 1.00 76.15 H1 C ATOM 5778 144 -28:593 27.594 -69.977 1.00 76.40 H1 C ATOM 5779 144 -29.115 25.915 -71.739 1.00 75.59 H1 C ATOM 5780 144 -27.329 29.895 -72.449 1.00 74.33 H1 C ATOM 5781 144 -26.890 29.633 -73.566 1.00 74.67 H1 O ATOM 5782 145 -26.549 30.260 -71.436 1.00 72.28 H1 N ATOM 5783 145 -25.103 30.401 -71.591 1.00 70.90 H1 C ATOM 5784 145 -24.623 31.746 -71.003 1.00 69.27 H1 C ATOM 5785 145 -23.127 31.873 -71.147 1.00 69.00 H1 C ATOM 5786 145 -25.319 32.894 -71.705 1.00 68.74 H1 C ATOM 5787 145 -24.358 29.259 -70.899 1.00 71.16 H1 C ATOM 5788 145 -24.173 29.269 -69.680 1.00 71.43 H1 O

ATOM 5789 196 -23.927 28.266 -71.684 1.00 70.62 H1 N ATOM 5790 146 -23.358 27.031 -71.141 1.00 70.17 H1 C ATOM 5791 146 -23.870 25.819 -71.925 1.00 71.40 H1 C ATOM 5792 146 -25.286 25.393 -71.583 1.00 74.93 H1 C ATOM 5793 146 -25.822 24.395 -72.605 1.00 78.01 H1 C ATOM 5794 146 -24.948 23.146 -72.701 1.00 79.46 H1 C ATOM 5795 146 -25.126 22.233 -71.534 1.00 80:50 H1 N ATOM 5796 146 -21.831 26.988 -71.127 1.00 68.82 H1 C ATOM 5797 196 -21.173 27.538 -72.011 1.00 68.87 H1 O ATOM 5798 147 -21.286 26.330 -70.106 1.00 66.87 H1 N ATOM 5799 197 -19.906 25.850 -70.110 1.00 64.95 H1 C ATOM 5800 147 -19.759 24.720 -71.129 1.00 64.08 H1 C ATOM 5801 197 -20.730 23.582 -70.877 1.00 65.39 H1 C ATOM 5802 147 -20.976 23.252 -69.697 1.00 64.41 H1 O ATOM 5803 197 -21.250 23.015 -71.862 1.00 66.30 H1 O

4

ATOM 5804 147 -18.857 26.920 -70.390 1.00 64.29 H1 C ATOM 5805 147 -18.121 26.829 -71.368 1.00 64.65 H1 O ATOM 5806 148 -18.775 27.925 -69.527 1.00 63.41 H1 N ATOM 5807 148 -17.760 28.956 -69.687 1.00 63.64 H1 C ATOM 5808 198 -18.411 30.291 -70.061 1.00 63.45 H1 C ATOM 5809 148 -19.292 30.886 -68.984 1.00 62.08 H1 C ATOM 5810 148 -18.787 31.813 -68.081 1.00 61.94 H1 C ATOM 5811 148 -19.594 32.383 -67.112 1.00 61.63 H1 C ATOM 5812 198 -20.632 30.539 -68.887 1.00 62.19 H1 C ATOM 5813 198 -21.448 31.103 -67.920 1.00 62.61 H1 C ATOM 5814 148 -20.923 32.024 -67.037 1.00 61.07 H1 C ATOM 5815 148 -21.731 32.594 -66.082 1.00 61.02 H1 O ATOM 5816 198 -16.920 29.126 -68.425 1.00 64.03 H1 C ATOM 5817 198 -17.296 28.664 -67.348 1.00 63.78 H1 O ATOM 5818 149 -15.777 29.788 -68.572 1.00 64.42 H1 N ATOM 5819 199 -14.897 30.073 -67.446 1.00 65.06 H1 C ATOM 5820 149 -14.209 28.787 -66.972 1.00 63.77 H1 C ATOM 5821 199 -13.335 28.979 -65.765 1.00 62.58 H1 C ATOM 5822 149 -12.012 29.371 -65.904 1.00 61.56 H1 C ATOM 5823 199 -13.843 28.789 -64.489 1.00 62.08 H1 C ATOM 5824 149 -11.210 29.576 -64.795 1.00 60.99 H1 C ATOM 5825 149 -13.047 28.992 -63.373 1.00 62.34 H1 C ATOM 5826 199 -11.727 29.386 -63.527 1.00 61.88 H1 C ATOM 5827 149 -13.844 31.092 -67.865 1.00 66.30 H1 C ATOM 5828 199 -13.365 31.069 -68.998 1.00 67.25 H1 O ATOM 5829 150 -13.473 32.006 -66.955 1.00 67.74 H1 N ATOM 5830 150 -12.274 32.850 -67.107 1.00 67.53 H1 C ATOM 5831 150 -14.104 32.195 -65.645 1.00 68.63 H1 C ATOM 5832 150 -13.037 32.928 -64.841 1.00 67.62 H1 C ATOM 5833 150 -12.295 33.712 -65.866 1.00 67.96 H1 C ATOM 5834 150 -15.389 33.010 -65.742 1.00 70.45 H1 C ATOM 5835 150 -16.077 32.997 -66.764 1.00 71.47 H1 O ATOM 5836 151 -15.700 33.719 -69.663 1.00 71.80 H1 N ATOM 5837 151 -16.743 34.734 -69.676 1.00 72.52 H1 C ATOM 5838 151 -17.550 34.681 -63.378 1.00 72.76 H1 C ATOM 5839 151 -18.290 33.376 -63.155 1.00 74.07 H1 C ATOM 5890 151 -19.458 33.535 -62.204 1.00 74.56 H1 C ATOM 5841 151 -20.618 33.454 -62.665 1.00 74.92 H1 O ATOM 5842 151 -19.216 33.745 -60.997 1.00 73.75 H1 O ATOM 5843 151 -16.079 36.099 -64.806 1.00 73.24 H1 C ATOM 5844 151 -14.868 36.227 -64.624 1.00 72.62 H1 O ATOM 5845 152 -16.867 37.142 -65.113 1.00 74.62 H1 N ATOM 5846 152 -16.420 38.539 -64.959 1.00 74.59 H1 C ATOM 5847 152 -18.292 37.070 -65.452 1.00 75.10 H1 C ATOM 5848 152 -18.849 38.361 -64.867 1.00 75.76 H1 C ATOM 5849 152 -17.712 39.337 -65.029 1.00 75.41 H1 C ATOM 5850 152 -18.556 36.968 -66.952 1.00 75.76 H1 C ATOM 5851 152 -17.630 36.989 -67.761 1.00 75.62 H1 O ATOM 5852 153 -19.830 36.854 -67.312 1.00 76.74 H1 N ATOM 5853 153 -20.266 37.125 -68.676 1.00 78.99 H1 C ATOM 5854 153 -20.722 35.836 -69.410 1.00 78.41 H1 C ATOM 5855 153 -19.573 34.848 -,69.489 1.00 78.22 H1 C ATOM 5856 153 -21.909 35.219 -68.700 1.00 78.16 H1 C ATOM 5857 153 -21.428 38.114 -68.651 1.00 79.27 H1 C ATOM 5858 153 -22.353 37.981 -67.848 1.00 79.85 H1 O ATOM 5859 154 -21.367 39.111 -69.528 1.00 79.67 H1 N ATOM 5860 154 -22.408 40.130 -69.613 1.00 79.68 H1 C ATOM 5861 154 -21:808 41.505 -69.963 1.00 79.51 H1 C ATOM 5862 154 -21.139 41.422 -71.228 1.00 79.48 H1 O ATOM 5863 154 -20.811 41.945 -68.897 1.00 78.20 H1 C ATOM 5864 154 -23.417 39.754 -70.693 1.00 80.21 H1 C ATOM 5865 154 -23.034 39.413 -71.812 1.00 80.43 H1 O ATOM 5866 155 -24.703 39.813 -70.359 1.00 80.71 H1 N ATOM 5867 155 -25.752 39.518 -71.330 1.00 81.00 H1 C ATOM 5868 155 -26.580 38.284 -70.910 1.00 80.93 H1 C ATOM 5869 155 -27.614 37.965 -71.979 1.00 80.65 H1 C ATOM 5870 155 -25.666 37.099 -70.689 1.00 81.15 H1 C ATOM 5871 155 -26.701 40.702 -71.503 1.00 81.78 H1 C ATOM 5872 155 -27.351 41.139 -70.551 1.00 81.71 H1 O ATOM 5873 156 -26.772 41.216 -72.727 1.00 82.68 H1 N ATOM 5879 156 -27.654 42.334 -73.046 1.00 83.16 H1 C ATOM 5875 156 -26.847 43.473 -73.674 1.00 83.30 H1 C ATOM 5876 156 -27.652 44.620 -73.878 1.00 89.63 H1 O ATOM 5877 156 -28.739 41.868 -74.014 1.00 83.16 H1 C ATOM 5878 156 -28.596 40.831 -74.658 1.00 82.89 H1 O ATOM 5879 157 -29.825 42.627 -74.110 1.00 83.58 H1 N ATOM 5880 157 -30.919 42.259 -75.001 1.00 84.15 H1 C ATOM 5881 157 -32.180 41.952 -74.188 1.00 83.42 H1 C ATOM 5882 157 -32.120 40.627 -73.494 1.00 83.40 H1 C

ATOM 5883 157 -32.489 39.355 -74.042 1.00 83.53 H1 C ATOM 5884 157 -32.248 38.386 -73.047 1.00 83.19 H1 C ATOM 5885 157 -33.000 38.941 -75.277 1.00 83.42 H1 C ATOM 5986 157 -31.684 40.385 -72.224 1.00 83.06 H1 C ATOM 5887 157 -31.757 39.040 -71.947 1.00 82.93 H1 N ATOM 5888 157 -32.498 37.030 -73.250 1.00 83.39 H1 C ATOM 5889 157 -33.247 37.594 -75.476 1.00 83.62 H1 C ATOM 5890 157 -32.997 36.655 -74.468 1.00 83.39 H1 C ATOM 5891 157 -31.219 43.334 -76.041 1.00 84.76 H1 C ATOM 5892 157 -31.410 44.505 -75.706 1.00 84.03 H1 O ATOM 5893 158 -31.260 42.921 -77.306 1.00 85.58 H1 N ATOM 5899 158 -31.495 43.842 -78.411 1.00 86.37 H1 C ATOM 5895 158 -32.946 44.331 -78.389 1.00 86.40 H1 C ATOM 5896 158 -33.946 43.196 -78.553 1.00 87.21 H1 C ATOM 5897 159 -33.691 42.224 -79.268 1.00 86.86 H1 O ATOM 5898 158 -35.091 43.315 -77.889 1.00 86.97 H1 N ATOM 5899 158 -30.536 45.026 -78.315 1.00 86.98 H1 C ATOM 5900 158 -30.939 46.183 -78.439 1.00 86.86 H1 O ATOM 5901 159 -29.264 44.717 -78.077 1.00 87.36 H1 N ATOM 5902 159 -28.203 45.716 -78.013 1.00 87.62 H1 C ATOM 5903 159 -27.970 46.322 -79.398 1.00 87.30 H1 C ATOM 5904 159 -27.479 45.341 -80.297 1.00 86.83 H1 O ATOM 5905 159 -28.471 46.822 -76.999 1.00 87.96 H1 C ATOM 5906 159 -27.791 47.849 -76.998 1.00 87.94 H1 O ATOM 5907 160 -29.459 46.608 -76.136 1.00 88.50 H1 N ATOM 5908 160 -29.716 47.551 -75.062 1.00 88.84 H1 C ATOM 5909 160 -31.108 48.150 -75.103 1.00 88.98 H1 C ATOM 5910 160 -31.570 48.731 -74.120 1.00 88.61 H1 O ATOM 5911 161 -31.779 48.006 -76.242 1.00 89.24 H1 N ATOM 5912 161 -33.105 48.585 -76.430 1.00 89.63 H1 C ATOM 5913 161 -33.569 48.373 -77.868 1.00 89.23 H1 C ATOM 5914 161 -34.112 47.971 -75.461 1.00 89.76 H1 C ATOM 5915 161 -35.083 48.619 -75.067 1.00 89.81 H1 0 ATOM 5916 162 -33.874 46.718 -75.084 1.00 89.21 H1 N ATOM 5917 162 -34.769 46.006 -74.182 1.00 88.42 H1 C ATOM 5918 162 -35.189 44.673 -74.806 1.00 87.77 H1 C ATOM 5919 162 -36.018 43.738 -73.923 1.00 87.40 H1 C ATOM 5920 162 -37.267 44.456 -73.439 1.00 86.87 H1 C ATOM 5921 162 -36.384 42.491 -74.710 1.00 86.79 H1 C ATOM 5922 162 -34.106 45.753 -72.833 1.00 88.21 H1 C ATOM 5923 162 -33.176 44.954 -72.727 1.00 88.43 H1 O ATOM 5924 163 -34.591 46.441 -71.804 1.00 87.73 H1 N ATOM 5925 163 -34.069 46.270 -70.953 1.00 87.13 H1 C ATOM 5926 163 -33.414 47.569 -69.937 1.00 87.76 H1 C ATOM 5927 163 -34.374 48.634 -69.962 1.00 88.69 H1 O ATOM 5928 163 -32.218 47.946 -70.804 1.00 87.58 H1 C ATOM 5929 163 -35.194 45.880 -69.503 1.00 86.16 H1 C ATOM 5930 163 -34.957 45.286 -68.449 1.00 85.76 H1 0 ATOM 5931 164 -36.420 46.216 -69.888 1.00 84.83 H1 N ATOM 5932 164 -37.584 45.961 -69.052 1.00 83.71 H1 C ATOM 5933 164 -38.737 46.877 -69.475 1.00 84.14 H1 C ATOM 5939 164 -39.855 46.731 -68.616 1.00 84.04 H1 0 ATOM 5935 164 -38.016 44.500 -69.199 1.00 82.36 H1 C ATOM 5936 164 -38.185 43.962 -70.294 1.00 82.47 H1 O ATOM 5937 165 -38.193 43.864 -67.995 1.00 80.97 H1 N ATOM 5938 165 -38.616 42.476 -67.972 1.00 79.30 H1 C ATOM 5939 165 -37.452 41.504 -68.016 1.00 78.12 H1 C ATOM 5940 165 -37.651 40.294 -68.120 1.00 77.82 H1 0 ATOM 5941 166 -36.233 42.030 -67.935 1.00 76.72 H1 N ATOM 5992 166 -35.037 41.205 -68.040 1.00 75.81 H1 C ATOM 5993 166 -33.905 41.954 -68.770 1.00 75.90 H1 C ATOM 5999 166 -32.673 41.070 -68.856 1.00 75.62 H1 C ATOM 5995 166 -34.365 42.364 -70.161 1.00 75.64 H1 C ATOM 5946 166 -34.526 40.775 -66.670 1.00 75.14 H1 C ATOM 5947 166 -34.253 41.610 -65.809 1.00 75.37 H1 O ATOM 5998 167 -34.396 39.466 -66.480 1.00 73.47 H1 N ATOM 5999 167 -33.935 38.911 -65.214 1.00 72.00 H1 C ATOM 5950 167 -35.057 38.090 -69.569 1.00 72.27 H1 C ATOM 5951 167 -34.777 37.683 -63.155 1.00 72.47 H1 C ATOM 5952 167 -33.696 37.887 -62.363 1.00 72.15 H1 C ATOM 5953 167 -35.684 36.981 -62.390 1.00 71.80 H1 N ATOM 5954 167 -35.176 36.771 -61.189 1.00 71.72 H1 C ATOM 5955 167 -33.971 37.311 -61.147 1.00 72.50 H1 N ATOM 5956 167 -32.708 38.028 -65.438 1.00 70.88 H1 C ATOM 5957 167 -32.783 37.008 -66.121 1.00 69.91 H1 O ATOM 5958 168 -31.581 38.424 -64.855 1.00 70.00 H1 N ATOM 5959 168 -30.335 37.687 -65.027 1.00 68.86 H1 C ATOM 5960 168 -29.156 38.650 -65.269 1.00 69.61 H1 C ATOM 5961 168 -29.449 39.489 -66.394 1.00 70.62 H1 0 ATOM 5962 168 -27.878 37.867 -65.548 1.00 69.75 H1 C ATOM 5963 168 -30.026 36.826 -63.803 1.00 67.17 H1 C ATOM 5964 168 -29.731 37.344 -62.727 1.00 67.02 H1 0 ATOM 5965 169 -30.093 35.510 -63.979 1.00 64.86 H1 N ATOM 5966 169 -29.878 34.576 -62.881 1.00 62.90 H1 C ATOM 5967 169 -30.615 33.263 -63.150 1.00 62.05 H1 C ATOM 5968 169 -32.108 33.400 -63.176 1.00 62.68 H1 C ATOM 5969 169 -32.748 33.972 -64.266 1.00 62.88 H1 C ATOM 5970 169 -32.877 32.943 -62.118 1.00 62.49 H1 C ATOM 5971 169 -34.128 34.086 -64.299 1.00 62.61 H1 C ATOM 5972 169 -34.257 33.053 -62.144 1.00 62.55 H1 C ATOM 5973 169 -34.884 33.625 -63.237 1.00 62.31 H1 C ATOM 5974 169 -28.398 34.290 -62.683 1.00 61.96 H1 C ATOM 5975 169 -27.663 34.061 -63.645 1.00 61.82 H1 O ATOM 5976 170 -27.942 34.294 -61.421 1.00 60.72 H1 N ATOM 5977 170 -28.702 34.746 -60.244 1.00 60.03 H1 C ATOM 5978 170 -26.555 33.964 -61.078 1.00 59.89 H1 C ATOM 5979 170 -26.526 34.083 -59.554 1.00 59.29 H1 C ATOM 5980 170 -27.618 35.058 -59.246 1.00 59.11 H1 C ATOM 5981 170 -26.132 32.576 -61.561 1.00 59.02 H1 C ATOM 5982 170 -26.948 31.653 -61.697 1.00 57.43 H1 0 ATOM 5983 171 -24.847 32.440 -61.873 1.00 58.34 H1 N ATOM 5984 171 -24.329 31.229 -62.496 1.00 58.50 H1 C ATOM 5985 171 -22.955 31.503 -63.094 1.00 57.77 H1 C ATOM 5986 171 -24.243 30.066 -61.517 1.00 58.57 H1 C ATOM 5987 171 -24.030 30.259 -60.320 1.00 57.67 H1 O ATOM 5988 172 -24.415 28.855 -62.035 1.00 58.56 H1 N ATOM 5989 172 -24.118 27.654 -61.268 1.00 59.16 H1 C ATOM 5990 172 -25.148 26.538 -61.553 1.00 58.86 H1 C ATOM 5991 172 -25.070 26.114 -63.011 1.00 59.09 H1 C ATOM 5992 172 -24.898 25.353 -60.632 1.00 60.06 H1 C ATOM 5993 172 -22.721 27.157 -61.641 1.00 59.63 H1 C ATOM 5994 172 -22.304 27.266 -62.796 1.00 59.35 H1 O ATOM 5995 173 -21.990 26.631 -60.663 1.00 59.79 H1 N ATOM 5996 173 -20.688 26.032 -60.937 1.00 60.87 H1 C ATOM 5997 173 -19.698 26.348 -59.811 1.00 59.98 H1 C ATOM 5998 173 -18.205 26.413 -60.167 1.00 60.10 H1 C ATOM 5999 173 -17.376 26.202 -58.905 1.00 57.51 H1 C ATOM 6000 173 -17.858 25.356 -61.201 1.00 58.71 H1 C ATOM 6001 173 -20.879 24.528 -61.041 1.00 61.60 H1 C ATOM 6002 173 -21.379 23.897 -60.110 1.00 62.78 H1 0 ATOM 6003 174 -20.482 23.956 -62.172 1.00 62.51 H1 N ATOM 6004 174 -20.744 22.547 -62.446 1.00 63.92 H1 C ATOM 6005 174 -21.044 22.352 -63.929 1.00 65.18 H1 C ATOM 6006 174 -22.139 23.256 -64.450 1.00 67.24 H1 C ATOM 6007 174 -22.385 23.065 -65.928 1.00 69.04 H1 C ATOM 6008 174 -23.070 22.125 -66.337 1.00 70.60 H1 O ATOM 6009 174 -21.823 23.953 -66.741 1.00 68.01 H1 N ATOM 6010 174 -19.565 21.672 -62.050 1.00 63.96 H1 C ATOM 6011 174 -18.445 22.159 -61.895 1.00 64.54 H1 O ATOM 6012 175 -19.820 20.376 -61.896 1.00 63.64 H1 N ATOM 6013 175 -18.777 19.438 -61.501 1.00 63.62 H1 C ATOM 6014 175 -19.346 18.016 -61.407 1.00 64.57 H1 C ATOM 6015 175 -19.975 17.626 -62.616 1.00 66.59 H1 O ATOM 6016 175 -17.610 19.464 -62.481 1.00 63.00 H1 C ATOM 6017 175 -16.541 18.926 -62.197 1.00 64.06 H1 O ATOM 6018 176 -17.816 20.095 -63.632 1.00 61.79 H1 N ATOM 6019 176 -16.776 20.187 -64.650 1.00 60.10 H1 C ATOM 6020 176 -17.399 20.418 -66.025 1.00 59.94 H1 C ATOM 6021 176 -17.863 21.752 -66.150 1.00 60.80 H1 O ATOM 6022 176 -15.806 21.323 -64.355 1.00 59.39 H1 C ATOM 6023 176 -14.733 21.398 -64.951 1.00 59.39 H1 O ATOM 6024 177 -16.191 22.211 -63.443 1.00 57.70 H1 N ATOM 6025 177 -15.384 23.389 -63.176 1.00 56.90 H1 C ATOM 6026 177 -15.778 24.550 -64.068 1.00 56.87 H1 C ATOM 6027 177 -15.157 25.614 -64.043 1.00 56.89 H1 0 ATOM 6028 178 -16.822 24.345 -64.860 1.00 56.63 H1 N ATOM 6029 178 -17.298 25.370 -65.778 1.00 57.28 H1 C ATOM 6030 178 -17.436 24.786 -67.188 1.00 57.13 H1 C ATOM 6031 178 -16.115 24.423 -67.872 1.00 56.25 H1 C ATOM 6032 178 -16.387 23.798 -69.230 1.00 55.52 H1 C ATOM 6033 178 -15.268 25.675 -68.017 1.00 56.22 H1 C ATOM 6034 178 -18.631 25.959 -65.328 1.00 57.07 H1 C ATOM 6035 178 -19.428 25.295 -64.665 1.00 55.79 H1 O ATOM 6036 179 -18.864 27.213 -65.697 1.00 57.71 H1 N ATOM 6037 179 -20.064 27.921 -65.280 1.00 59.38 H1 C ATOM 6038 179 -19.725 29.378 -64.961 1.00 58.68 H1 C ATOM 6039 179 -18.831 29.558 -63.754 1.00 58.53 H1 C ATOM 6040 179 -19.346 29.979 -62.465 1.00 58.26 H1 C ATOM 6091 179 -18.540 29.680 -61.356 1.00 58.61 H1 C ATOM 6042 179 -17.482 29.849 -63.904 1.00 57.93 H1 C ATOM 6043 179 -16.667 30.058 -62.803 1.00 58.41 H1 C ATOM 6049 179 -17.200 29.979 -61.531 1.00 58.60 H1 C ATOM 6045 179 -16.394 30.195 -60.438 1.00 56.00 H1 O ATOM 6046 179 -21.174 27.877 -66.328 1.00 60.05 H1 C ATOM 6097 179 -20.914 27.891 -67.531 1.00 59.38 H1 O ATOM 6098 180 -22.413 27.819 -65.852 1.00 61.78 H1 N ATOM 6049 180 -23.589 27.990 -66.698 1.00 64.17 H1 C ATOM 6050 180 -24.290 26.646 -66.917 1.00 63.61 H1 C ATOM 6051 180 -23.501 25.775 -67.708 1.00 65.69 H1 O ATOM 6052 180 -24.554 28.960 -66.024 1.00 65.91 H1 C ATOM 6053 180 -24.671 28.979 -64.797 1.00 65.96 H1 O ATOM 6059 181 -25.242 29.768 -66.823 1.00 67.43 H1 N ATOM 6055 181 -26.293 30.625 -66.290 1.00 69.34 H1 C ATOM 6056 181 -25.689 31.850 -65.606 1.00 70.05 H1 C ATOM 6057 181 -25.966 33.009 -66.524 1.00 70.38 H1 C ATOM 6058 181 -24.413 33.336 -67.309 1.00 70.89 H1 C ATOM 6059 181 -26.387 34.023 -66.676 1.00 70.55 H1 N ATOM 6060 181 -25.909 34.927 -67.513 1.00 71.32 H1 C ATOM 6061 181 -24.713 34.533 -67.911 1.00 71.85 H1 N ATOM 6062 181 -27.264 31.075 -67.371 1.00 70.14 H1 C

1

ATOM 6063 181 -26.990 30.942 -68.564 1.00 69.87 H1 0 ATOM 6069 182 -28.402 31.609 -66.941 1.00 71.10 H1 N ATOM 6065 182 -29.458 32.010 -67.859 1.00 70.94 H1 C ATOM 6066 182 -30.702 31.146 -67.636 1.00 70.38 H1 C ATOM 6067 182 -30.418 29.774 -67.830 1.00 68.38 H1 0 ATOM 6068 182 -29.827 33.479 -67.688 1.00 71.53 H1 C ATOM 6069 182 -29.763 34.023 -66.584 1.00 71.22 H1 0 ATOM 6070 183 -30.205 34.114 -68.794 1.00 72.30 H1 N ATOM 6071 183 -30.900 35.396 -68.757 1.00 72.41 H1 C ATOM 6072 183 -30.111 36.456 -69.525 1.00 71.36 H1 C ATOM 6073 183 -30.820 37.682 -69.569 1.00 69.72 H1 0 ATOM 6074 183 -32.276 35.227 -69.388 1.00 73.63 H1 C ATOM 6075 183 -32.414 34.573 -70.421 1.00 73.54 H1 0 ATOM 6076 184 -33.294 35.809 -68.762 1.00 75.17 H1 N ATOM 6077 184 -34.658 35.702 -69.269 1.00 76.46 H1 C ATOM 6078 184 -35.491 34.712 -68.424 1.00 76.29 H1 C ATOM 6079 184 -36.999 34.751 -68.852 1.00 76.19 H1 C ATOM 6080 184 -34.941 33.311 -68.594 1.00 76.69 H1 C ATOM 6081 184 -35.378 37.045 -69.300 1.00 77.45 H1 C ATOM 6082 184 -35.375 37.793 -68.320 1.00 77.46 H1 O ATOM 6083 185 -35.992 37.345 -70.439 1.00 78.31 H1 N ATOM 6084 185 -36.816 38.538 -70.572 1.00 78.79 H1 C ATOM 6085 185 -36.362 39.400 -71.778 1.00 78.96 H1 C ATOM 6086 185 -36.360 38.566 -73.049 1.00 78.89 H1 C ATOM 6087 185 -37.281 40.601 -71.931 1.00 79.45 H1 C ATOM 6088 185 -38.281 38.151 -70.743 1.00 78.60 H1 C ATOM 6089 185 -38.632 37.366 -71.624 1.00 77.83 H1 O ATOM 6090 186 -39.132 38.696 -69.880 1.00 79.19 H1 N ATOM 6091 186 -40.571 38.999 -69.998 1.00 80.16 H1 C ATOM 6092 186 -41.244 38.482 -68.609 1.00 80.16 H1 C ATOM 6093 186 -40.924 39.689 -67.907 1.00 80.54 H1 O ATOM 6099 186 -40.761 37.290 -67.796 1.00 80.44 H1 C ATOM 6095 186 -41.172 39.627 -70.833 1.00 80.74 H1 C ATOM 6096 186 -41.107 40.798 -70.455 1.00 79.91 H1 O ATOM 6097 187 -41.750 39.268 -71.975 1.00 82.12 H1 N ATOM 6098 197 -42.248 40.258 -72.923 1.00 83.45 H1 C ATOM 6099 187 -41.451 40.210 -74.246 1.00 83.13 H1 C.

2

ATOM 6100 137 -39.975 40.456 -73.975 1.00 82.39 H1 C ATOM 6101 187 -41.662 38.869 -74.933 1.00 82.96 H1 C ATOM 6102 187 -43.726 40.048 -73.239 1.00 84.60 H1 C ATOM 6103 187 -44.303 39.012 -72.906 1.00 83.97 H1 O ATOM 6104 188 -44.357 41.041 -73.886 1.00 86.10 H1 N ATOM 6105 188 -43.802 42.380 -74.148 1.00 86.23 H1 C ATOM 6106 188 -45.756 40.939 -74.316 1.00 87.32 H1 C ATOM 6107 188 -46.050 42.313 -74.919 1.00 87.01 H1 C ATOM 6108 188 -45.028 43.220 -74.315 1.00 86.99 H1 C ATOM 6109 188 -45.950 39.825 -75.339 1.00 88.92 H1 C ATOM 6110 188 -45.245 39.772 -76.347 1.00 89.36 H1 O ATOM 6111 189 -46.908 38.940 -75.080 1.00 90.12 H1 N ATOM 6112 189 -47.239 37.889 -76.033 1.00 91.74 H1 C ATOM 6113 189 -48.429 37.067 -75.529 1.00 91.44 H1 C ATOM 6114 189 -48.108 36.379 -74.333 1.00 91.54 H1 O ATOM 6115 189 -47.584 38.513 -77.382 1.00 93.06 H1 C ATOM 6116 189 -47.261 37.962 -78.436 1.00 93.63 H1 O ATOM 6117 190 -48.233 39.673 -77.334 1.00 94.02 H1 N ATOM 6118 190 -48.654 40.386 -78.536 1.00 94.90 H1 C ATOM 6119 190 -49.228 41.754 -78.159 1.00 94.23 H1 C ATOM 6120 190 -50.258 41.630 -77.192 1.00 94.02 H1 0 ATOM 6121 190 -47.498 40.582 -79.512 1.00 95.63 H1 C ATOM 6122 190 -47.679 40.497 -80.727 1.00 95.93 H1 0 ATOM 6123 191 -46.311 40.845 -78.974 1.00 96.22 H1 N ATOM 6124 191 -45.161 41.202 -79.796 1.00 96.93 H1 C ATOM 6125 191 -44.210 42.100 -79.002 1.00 97.27 H1 C ATOM 6126 191 -44.862 43.293 -78.596 1.00 97.93 H1 0 ATOM 6127 191 -44.405 39.981 -80.314 1.00 97.19 H1 C ATOM 6128 191 -43.393 40.116 -81.003 1.00 96.64 H1 0 ATOM 6129 192 -44.895 38.792 -79.982 1.00 97.72 H1 N ATOM 6130 192 -44.297 37.561 -80.489 1.00 98.54 H1 C ATOM 6131 192 -44.718 36.367 -79.626 1.00 98.53 H1 C ATOM 6132 192 -44.246 36.361 -78.170 1.00 98.25 H1 C ATOM 6133 192 -44.734 35.095 -77.483 1.00 98.23 H1 C ATOM 6139 192 -42.727 36.446 -78.118 1.00 97.62 H1 C ATOM 6135 192 -44.719 37.323 -81.935 1.00 98.79 H1 C ATOM 6136 192 -45.907 37.187 -82.232 1.00 98.91 H1 0 ATOM 6137 193 -43.738 37.272 -82.831 1.00 98.91 H1 N ATOM 6138 193 -44.034 37.097 -84.241 1.00 99.03 H1 C ATOM 6139 193 -43.844 38.374 -85.037 1.00 98.92 H1 C ATOM 6140 193 -43.566 38.330 -86.236 1.00 98.95 H1 0 ATOM 6141 194 -43.995 39.515 -84.373 1.00 98.99 H1 N ATOM 6142 194 -43.785 40.808 -85.018 1.00 98.85 H1 C ATOM 6193 194 -45.009 41.738 -84.838 1.00 98.60 H1 C ATOM 6199 194 -45.217 41.997 -83.444 1.00 98.43 H1 0 ATOM 6145 194 -46.257 41.093 -85.424 1.00 98.99 H1 C ATOM 6146 194 -42.556 41.508 -84.446 1.00 98.79 H1 C ATOM 6147 199 -42.136 42.554 -84.944 1.00 98.84 H1 0 ATOM 6148 195 -41.986 40.928 -83.394 1.00 98.32 H1 N ATOM 6149 195 -40.809 41.500 -82.750 1.00 97.95 H1 C ATOM 6150 195 -41.181 42.046 -81.368 1.00 97.62 H1 C ATOM 6151 195 -40.009 42.597 -80.572 1.00 97.74 H1 C ATOM 6152 195 -39.320 43.757 -81.265 1.00 98.15 H1 C ATOM 6153 195 -38.732 43.594 -82.335 1.00 98.48 H1 0 ATOM 6154 195 -39.387 44.936 -80.656 1.00 97.92 H1 N ATOM 6155 195 -39.694 40.465 -82.615 1.00 97.59 H1 C ATOM 6156 195 -39.919 39.356 -82.127 1.00 97.92 H1 O ATOM 6157 196 -38.493 40.832 -83.052 1.00 96.87 H1 N ATOM 6158 196 -37.335 39.951 -82.936 1.00 96.09 H1 C ATOM 6159 196 -36.406 40.071 -84.167 1.00 96.10 H1 C ATOM 6160 196 -35.943 41.421 -84.292 1.00 96.22 H1 0 ATOM 6161 196 -37.146 39.672 -85.434 1.00 95.59 H1 C ATOM 6162 196 -36.526 40.270 -81.681 1.00 95.48 H1 C ATOM 6163 196 -36.262 41.434 -81.375 1.00 95.11 H1 0 ATOM 6164 197 -36.137 39.225 -80.958 1.00 94.60 H1 N ATOM 6165 197 -35.347 39.389 -79.745 1.00 93.36 H1 C ATOM 6166 197 -36.104 38.817 -78.545 1.00 93.41 H1 C ATOM 6167 197 -37.457 39.455 -78.317 1.00 92.83 H1 C ATOM 6168 197 -38.628 38.773 -78.621 1.00 92.54 H1 C ATOM 6169 197 -39.867 39.354 -78.419 1.00 92.56 H1 C ATOM 6170 197 -37.561 40.741 -77.801 1.00 92.54 H1 C ATOM 6171 197 -38.794 41.331 -77.596 1.00 92.67 H1 C ATOM 6172 197 -39.945 40.633 -77.907 1.00 92.86 H1 C ATOM 6173 197 -41.175 41.221 -77.710 1.00 92.25 H1 O

4

ATOM 6174 197 -34.000 38.690 -79.888 1.00 92.48 H1 C ATOM 6175 197 -33.937 37.498 -80.190 1.00 92.42 H1 O ATOM 6176 198 -32.925 39.441 -79.670 1.00 91.09 H1 N ATOM 6177 198 -31.577 38.901 -79.783 1.00 89.67 H1 C ATOM 6178 198 -30.846 39.489 -81.011 1.00 89.35 H1 C ATOM 6179 198 -29.408 38.996 -81.045 1.00 89.56 H1 C ATOM 6180 198 -31.579 39.091 -82.295 1.00 88.73 H1 C ATOM 6181 198 -30.918 39.598 -83.560 1.00 87.61 H1 C ATOM 6182 198 -30.760 39.201 -78.530 1.00 89.23 H1 C ATOM 6183 198 -30.556 40.362 -78.170 1.00 88.50 H1 0 ATOM 6189 199 -30.292 38.145 -77.870 1.00 88.78 H1 N ATOM 6185 199 -29.523 38.287 -76.640 1.00 87.96 H1 C ATOM 6186 199 -28.039 38.438 -76.971 1.00 87.57 H1 C ATOM 6187 199 -27.521 37.774 -77.868 1.00 87.15 H1 0 ATOM 6188 199 -29.752 37.069 -75.731 1.00 87.80 H1 C ATOM 6189 199 -28.628 35.661 -76.005 1.00 86.80 H1 S ATOM 6190 200 -27.363 39.323 -76.247 1.00 87.80 H1 N ATOM 6191 200 -26.000 39.714 -76.593 1.00 87.93 H1 C ATOM 6192 200 -25.917 41.235 -76.743 1.00 88.63 H1 C ATOM 6193 200 -27.051 41.801 -77.577 1.00 89.36 H1 C ATOM 6199 200 -27.673 42.794 -77.201 1.00 89.44 H1 O ATOM 6195 200 -27.326 41.171 -78.716 1.00 89.25 H1 N ATOM 6196 200 -24.999 39.254 -75.539 1.00 87.95 H1 C ATOM 6197 200 -24.758 39.948 -74.550 1.00 87.13 H1 O ATOM 6198 201 -24.408 38.086 -75.766 1.00 86.80 H1 N ATOM 6199 201 -23.438 37.526 -74.835 1.00 85.93 H1 C ATOM 6200 201 -23.413 35.987 -74.926 1.00 85.26 H1 C ATOM 6201 201 -22.441 35.421 -73.907 1.00 85.22 H1 C ATOM 6202 201 -24.809 35.933 -74.698 1.00 84.35 H1 C ATOM 6203 201 -22.038 38.062 -75.121 1.00 85.88 H1 C ATOM 6204 201 -21.636 38.188 -76.277 1.00 85.83 H1 O ATOM 6205 202 -21.302 38.382 -79.062 1.00 86.08 H1 N ATOM 6206 202 -19.929 38.856 -74.196 1.00 86.41 H1 C ATOM 6207 202 -19.897 40.388 -74.196 1.00 86.12 H1 C ATOM 6208 202 -18.503 40.945 -74.437 1.00 86.38 H1 C ATOM 6209 202 -17.597 40.226 -74.860 1.00 86.49 H1 0 ATOM 6210 202 -18.327 42.234 -74.168 1.00 86.34 H1 N ATOM 6211 202 -19.063 38.322 -73.056 1.00 86.59 H1 C ATOM 6212 202 -19.273 38.666 -71.893 1.00 86.68 H1 O ATOM 6213 203 -18.089 37.483 -73.397 1.00 87.00 H1 N ATOM 6214 203 -17.166 36.934 -72.409 1.00 87.39 H1 C ATOM 6215 203 -17.108 35.409 -72.537 1.00 88.04 H1 C ATOM 6216 203 -16.304 34.741 -71.465 1.00 89.65 H1 C ATOM 6217 203 -16.174 35.015 -70.145 1.00 90.06 H1 C ATOM 6218 203 -15.509 33.641 -71.707 1.00 89.81 H1 N ATOM 6219 203 -14.923 33.267 -70.583 1.00 89.71 H1 C ATOM 6220 203 -15.310 34.084 -69.620 1.00 90.14 H1 N ATOM 6221 203 -15.772 37.524 -72.603 1.00 87.37 H1 C ATOM 6222 203 -14.946 36.961 -73.318 1.00 87.61 H1 O ATOM 6223 209 -15.517 38.656 -71.953 1.00 87.39 H1 N ATOM 6229 204 -14.282 39.411 -72.154 1.00 87.67 H1 C ATOM 6225 204 -14.296 40.671 -71.281 1.00 87.25 H1 C ATOM 6226 204 -15.279 41.733 -71.759 1.00 88.05 H1 C ATOM 6227 209 -15.674 42.676 -70.637 1.00 88.66 H1 C ATOM 6228 204 -14.453 43.279 -69.965 1.00 89.19 H1 C ATOM 6229 204 -14.820 44.035 -68.736 1.00 90.12 H1 N ATOM 6230 204 -12.996 38.621 -71.903 1.00 87.80 H1 C ATOM 6231 204 -11.983 38.852 -72.566 1.00 88.12 H1 O ATOM 6232 205 -13.013 37.683 -70.940 1.00 87.81 H1 N ATOM 6233 205 -14.006 37.497 -69.868 1.00 87.68 H1 C ATOM 6239 205 -11.854 36.799 -70.763 1.00 87.47 H1 C ATOM 6235 205 -12.254 35.915 -69.583 1.00 87.20 H1 C ATOM 6236 205 -13.239 36.737 -68.825 1.00 86.89 H1 C ATOM 6237 205 -11.542 35.975 -72.012 1.00 87.26 H1 C ATOM 6238 205 -10.378 35.786 -72.369 1.00 86.44 H1 0 ATOM 6239 206 -12.589 35.992 -72.673 1.00 87.15 H1 N ATOM 6240 206 -12.432 34.595 -73.812 1.00 87.33 H1 C ATOM 6241 206 -13.477 33.480 -73.738 1.00 86.84 H1 C ATOM 6242 206 -13.303 32.540 -74.781 1.00 87.39 H1 O ATOM 6243 206 -12.559 35.326 -75.150 1.00 87.95 H1 C ATOM 6244 206 -12.301 34.749 -76.209 1.00 87.21 H1 0

ATOM 6245 207 -12.955 36.594 -75.095 1.00 88.68 H1 N ATOM 6246 207 -13.253 37.365 -76.299 1.00 88.90 H1 C ATOM 6247 207 -11.971 37.647 -77.088 1.00 89.10 H1 C ATOM 6248 207 -11.180 38.808 -76.515 1.00 89.83 H1 C ATOM 6249 207 -10.011 39.004 -76.850 1.00 90.22 H1 0 ATOM 6250 207 -11.816 39.587 -75.645 1.00 90.17 H1 N ATOM 6251 207 -14.260 36.641 -77.185 1.00 88.67 H1 C ATOM 6252 207 -14.192 36.717 -78.911 1.00 88.61 H1 0 ATOM 6253 208 -15.189 35.933 -76.551 1.00 88.73 H1 N ATOM 6254 208 -16.290 35.300 -77.264 1.00 88.95 H1 C ATOM 6255 208 -16.700 33.971 -76.593 1.00 88.70 H1 C ATOM 6256 208 -15.581 33.075 -76.577 1.00 88.37 H1 O ATOM 6257 208 -17.850 33.323 -77.350 1.00 87.89 H1 C ATOM 6258 208 -17.492 36.238 -77.271 1.00 89.54 H1 C ATOM 6259 208 -18.310 36.221 -76.352 1.00 89.28 H1 0 ATOM 6260 209 -17.586 37.059 -78.312 1.00 90.21 H1 N ATOM 6261 209 -18.681 38.012 -78.445 1.00 90.36 H1 C ATOM 6262 209 -18.158 39.319 -79.049 1.00 90.46 H1 C ATOM 6263 209 -18.875 40.570 -78.568 1.00 91.30 H1 C ATOM 6264 209 -20.221 40.752 -79.256 1.00 92.32 H1 C ATOM 6265 209 -20.057 41.171 -80.713 1.00 92.31 H1 C ATOM 6266 209 -21.372 41.397 -81.382 1.00 91.57 H1 N ATOM 6267 209 -19.748 37.396 -79.347 1.00 90.48 H1 C ATOM 6268 209 -19.498 37.130 -80.523 1.00 91.28 H1 0 ATOM 6269 210 -20.934 37.163 -78.790 1.00 90.31 H1 N ATOM 6270 210 -21.966 36.387 -79.474 1.00 90.33 H1 C ATOM 6271 210 -22.164 35.008 -78.792 1.00 90.01 H1 C ATOM 6272 210 -23.304 34.246 -79.450 1.00 88.87 H1 C ATOM 6273 210 -20.880 34.200 -78.879 1.00 89.86 H1 C ATOM 6274 210 -23.311 37.106 -79.519 1.00 90.85 H1 C ATOM 6275 210 -23.579 38.000 -78.715 1.00 90.85 H1 O ATOM 6276 211 -24.146 36.715 -80.477 1.00 91.03 H1 N ATOM 6277 211 -25.536 37.151 -80.526 1.00 91.23 H1 C ATOM 6278 211 -25.698 38.299 -81.532 1.00 91.67 H1 C ATOM 6279 211 -24.793 39.472 -81.228 1.00 92.43 H1 C ATOM 6280 211 -25.173 40.317 -80.391 1.00 92.57 H1 0 ATOM 6281 211 -23.699 39.552 -81.828 1.00 92.96 H1 0 ATOM 6282 211 -26.416 35.975 -80.940 1.00 91.08 H1 C ATOM 6283 211 -26.143 35.305 -81.935 1.00 91.24 H1 O ATOM 6289 212 -27.966 35.720 -80.168 1.00 90.73 H1 N ATOM 6285 CA 212 -28.407 34.659 -80.501 1.00 90.77 H1 C ATOM 6286 CB 212 -28.410 33.585 -79.410 1.00 90.14 H1 C ATOM 6287 CG 212 -29.376 32.438 -79.673 1.00 89.67 H1 C ATOM 6288 CD 212 -29.021 31.683 -80.949 1.00 89.85 H1 C ATOM 6289 CE 212 -27.672 30.983 -80.831 1.00 89.83 H1 C ATOM 6290 NZ 212 -27.417 30.051 -81.967 1.00 89.22 H1 N ATOM 6291 C 212 -29.810 35.226 -80.668 1.00 91.33 H1 C ATOM 6292 O 212 -30.237 36.091 -79.902 1.00 91.11 H1 O ATOM 6293 N 213 -30.523 34.732 -81.674 1.00 91.62 H1 N ATOM 6294 CA 213 -31.861 35.221 -81.977 1.00 92.18 H1 C ATOM 6295 CB 213 -32.032 35.352 -83.494 1.00 92.88 H1 C ATOM 6296 CG 213 -33.204 36.218 -83.933 1.00 93.56 H1 C ATOM 6297 CD 213 -33.200 36.412 -85.446 1.00 93.60 H1 C ATOM 6298 CE 213 -34.314 37.347 -85.896 1.00 93.91 H1 C ATOM 6299 NZ 213 -34.365 37.479 -87.380 1.00 92.57 H1 N ATOM 6300 C 213 -32.893 34.253 -81.415 1.00 92.17 H1 C ATOM 6301 O 213 -32.933 33.085 -81.799 1.00 92.12 H1 0 ATOM 6302 N 214 -33.723 34.739 -80.501 1.00 92.74 H1 N ATOM 6303 CA 214 -34.723 33.891 -79.869 1.00 93.76 H1 C ATOM 6304 CB 214 -34.883 34.231 -78.370 1.00 93.57 H1 C ATOM 6305 CG 214 -35.835 33.241 -77.709 1.00 92.68 H1 C ATOM 6306 CG 214 -33.524 34.212 -77.684 1.00 93.40 H1 C ATOM 6307 C 214 -36.075 34.044 -80.557 1.00 94.58 H1 C ATOM 6308 O 214 -36.666 35.126 -80.559 1.00 94.67 H1 0 ATOM 6309 N 215 -36.556 32.952 -81.141 1.00 95.50 H1 N ATOM 6310 CA 215 -37.829 32.956 -81.850 1.00 96.61 H1 C ATOM 6311 CB 215 -37.591 32.750 -83.347 1.00 97.66 H1 C ATOM 6312 CG 215 -36.659 33.777 -83.970 1.00 99.30 H1 C ATOM 6313 CD 215 -36.464 33.561 -85.458 1.00 100.39 H1 C ATOM 6314 OE 215 -35.937 34.475 -86.128 1.00 100.64 H1 0 ATOM 6315 OE 215 -36.841 32.477 -85.956 1.00 101.04 H1 0 ATOM 6316 C 215 -38.735 31.853 -81.313 1.00 96.73 H1 C ATOM 6317 O 215 -38.263 30.886 -80.717 1.00 96.90 H1 0 ATOM 6318 N 216 -40.053 31.989 -81.519 1.00 97.02 . H1 N ATOM 6319 CD 216 -40.692 33.162 -82.139 1.00 96.97 H1 C ATOM 6320 CA 216 -41.045 31.022 -81.032 1.00 97.59 H1 C ATOM 6321 CB 216 -42.376 31.602 -81.507 1.00 97.22 H1 C

LISTA SEKVENCI

<110> Jackson, Simon Mark Walker, Nigel P.C. Piper, Derek E. Shan, Bei Shen, Wenyan Chan, Joyce Chi Yee King, Chadwick Terence Ketchem, Randal Robert Mehlin, Christopher Carabeo, Teresa Cao, Qiong

<120> ANTIGEN VEZUJUĆI PROTEINI ZA PROPROTEIN KONVERTAZU SUBTILIZIN KEKSIN TIP 9 (PCSK9)

<130> APMOL.003A

<140> 12/197,093<141> 2008-08-22

<150> US 61/086,133

<151 > 2008-08-04

<150> US 61/010,630

<151 > 2008-01-09

<150> US 61/008,965

<151> 2007-12-21

<150> US 60/957,668

<151 > 2007-08-23

<160> 499

<170> FastSEQ for Windows version 4.0

<211> 662

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1

<211> 2076

<212> DNK

<213> Homo sapiens

1

<210> 3

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<400> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 10

<210> 11

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 12

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 12

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 13

<210> 14

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 15

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 15

<210> 16

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 16

<210> 17

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 18

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 18

<210> 19

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 19

<210> 20

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 21

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 21

<210> 22

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 22

<210> 23

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 24

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 24

<210> 25

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 25

<210> 26

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 27

<210> 28

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 28

<210> 29

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 30

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 30

<210> 31

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 31

<210> 32

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 33

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 33

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 34

<210> 35

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 36

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 36

<210> 37

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 37

<210> 38

<211>. 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 39

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 39

<210> 40

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 40

<210> 41

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 42

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 42

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 43

<210> 44

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 45

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 45

<210> 46

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 46

<210> 47

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 48

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 48

<210> 49

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 49

<210> 50

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 50

<210> 51

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 51

<210> 52

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 52

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 53

<210> 54

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 54

<210> 55

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 55

1

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 56

<210> 57

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 57

<210> 58

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 58

2

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 59

<210> 60

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 60

<210> 61

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 64 <211> 119

4

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 64

<210> 65

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 65

<210> 66

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 66

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 67

<210> 68

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 68

<210> 69

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 69

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 70

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 73

<210> 74

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 74

<210> 75

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 75

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 76

<210> 77

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 77

<210> 78

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 79

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 79

<210> 80

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 80

<210> 81

<211> 122

1

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 81

<210> 82

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 82

<210> 83

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 83

11

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 84

<210> 85

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 85

<210> 86

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 86

12

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 87

<210> 88

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 88

<210> 89

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 89

1

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 90

<210> 91

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 91

<210> 92

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens

14

<210> 93

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 93

<210> 94

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 94

<210> 95

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 95

<210> 96

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 96

1

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 97

<210> 98

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 98

<210> 99

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 99

<210> 100

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 100

<210> 101

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens

1

<210> 102

<211> 363

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 102

<210> 103

<211> 333

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 103

<210> 104

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 104

<210> 105

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens

1

<210> 106

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 106

<210> 107

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 107

<210> 108

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 108

<210> 109

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 109

1

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 110

<210> 111

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 111

<210> 112

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 112

<210> 113

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 113

<210> 114

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens

1

<210> 115

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 115

<210> 116

<211> 363

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 116

<210> 117

<211> 321

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 117

<210> 118

<211> 363

<212> DNK

<213> Homo-sapiens <400> 118

2

<211> 321

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 119

<210> 120

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 120

<210> 121

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 121

<210> 122

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 122

<210> 123

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens

21

<210> 124

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 124

<210> 125

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 125

<210> 126

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 126

<210> 127

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 127

22

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 128

<210> 129

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 129

<210> 130

<211> 363

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 130

<210> 131

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 131

<210> 132

<211> 357

<212> DNK

<213> Homo sapiens

2

<210> 133

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 133

<210> 134

<211> 357

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 134

<210> 135

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 135

<210> 136

<211> 351

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 136

24

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 137

<210> 138

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 138

<210> 139

<211> 318

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 139

<210> 140

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 140

<210> 141

<211> 321

<212> DNK

<213> Homo sapiens

2

<210> 142

<211> 369

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 142

<210> 143

<211> 336

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 143

<210> 144

<211> 357

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 144

<210> 145

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 145

2

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 146

<210> 147

<211> 348

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 147

<210> 148

<211> 348

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 148

<210> 149

<211> 330

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 149

<210> 150

<211> 345

<212> DNK

<213> Homo sapiens

2

<210> 151

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 151

<210> 152

<211> 369

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 152

<210> 153

<211> 333

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 153

<210> 154

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 155

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 157

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 162

<211> 7

<212-> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 163

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 164

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 165

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 166

<210> 167

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 167

<210> 168

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 169

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 169

<210> 170

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 170

<210> 171

<211> 10

<212> PRT

<213>-Homo sapiens <400> 171

<210> 172

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 172

<210> 173

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 173

<210> 174

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 175

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 175

<210> 176

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 176

<210> 177

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 177

<210> 178

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 178

<210> 179

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 180

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 180

<210> 181

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 181

<210> 182

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 182

<210> 183

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 183

<210> 184

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 184

<210> 185

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 186

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 186

<210> 187

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 187

<210> 188

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 188

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 189

<210> 190

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 190

<210> 191

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 192

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 192

<210> 193

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 193

<210> 194

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 194

<210> 195

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 195

<210> 196

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 196

<210> 197

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 197

<210> 198

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 198

<210> 199

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 199

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 200

<210> 201

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 201

<210> 202

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 202

<210> 203

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 203

<210> 204

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 204

<210> 205

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 205

<210> 206

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 206

<210> 207

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 207

<210> 208

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 208

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 209

<210> 210

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 210

<210> 211

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 211

<210> 212

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 212

<210> 213

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 213

<210> 214

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 214

4 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 215

<210> 216

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 216

<210> 217

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 217

<210> 218

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 218

<210> 219

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 219

<210> 220

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

41

<210> 221

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 221

<210> 222

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 222

<210> 223

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 223

<210> 224

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 224

<210> 225

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 225

<210> 226

<211> 12

42

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 226

<210> 227

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 227

<210> 228

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 228

<210> 229

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 229

<210> 230

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 230

<210> 231

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 231

<210> 232

<211> 7

4 <-212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 232

<210> 233

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 233

<210> 234

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 234

<210> 235

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 235

<210> 236

<211> 9

<212> PRT Homo sapiens <400> 236

<210> 237

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 237

<210> 238

<211> 11

44 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 238

<210> 239

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 239

<210> 240

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 240

<210> 241

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 241

<210> 242

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 242

<210> 243

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 243

<210> 244

<211> 10

4

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 244

<210> 245

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 245

<210> 246

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 246

<210> 247

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 247

<210> 248

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 248

<210> 249

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 249

<210> 250

<211> 10

4 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 250

<210> 251

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 251

<210> 252

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 252

<210> 253

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 253

<210> 254

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 254

<210> 255

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 255

4

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 256

<210> 257

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 257

<210> 258

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 258

<210> 259

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 259

<210> 260

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 260

<210> 261

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 262

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 262

<210> 263

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 263

<210> 264

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 264

<210> 265

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 265

<210> 266

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 266

<210> 267

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 268

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 268

<210> 269

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 269

<210> 270

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 270

<210> 271

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 272

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 272

<210> 273

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 273

<210> 274

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 275

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 275

<210> 276

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 276

<210> 277

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 281

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 282

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 282

<210> 283

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 283

<210> 284

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 284

<210> 285

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 285

<210> 286

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

4

<210> 287

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 287

<210> 288

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 288

<210> 289

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 290

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 290

<210> 291

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 291

<210> 292

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 292

<210> 293

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 293

<210> 294

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 294

<210> 295

<211> 318

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 295

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 296

<210> 297

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 297

<210> 298

<211> 230

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 299

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 299

<210> 300

<211> 238

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 300

<210> 301

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 301

<211> 231

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 302

<210> 303

<211> 680

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 303

1

<211> 680

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<400> 304

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 305

<210> 306

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 306

<210> 307

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 307

<210> 308

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 308

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 309

4

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 310

<210> 311

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 311

<210> 312

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 312

<210> 313

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 313

<210> 314

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 314

<210> 315

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 316

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 316

<210> 317

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 317

<210> 318

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 318

<210> 319

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 319

<210> 320

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 320

<210> 321

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 321

<210> 322

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 322

<210> 323

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 323

<210> 324

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 324

<210> 325

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 325

<210> 326

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 326

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 327

<210> 328

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 328

<210> 329

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 329

<210> 330

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 330

<210> 331

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 331

<210> 332

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 332

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 333

<210> 334

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 334

<210> 335

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 335

<210> 336

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 336

<210> 337

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 337

<210> 338

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 339

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 339

<210> 340

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 340

<210> 341

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 341

<210> 342

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 342

<210> 343

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 343

<210> 344

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 344

<210> 345

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 345

<210> 346

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 346

<210> 347

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 347

<210> 348

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 348

<210> 349

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 349

<210> 350

<211> 5

1

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 350

<210> 351

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 351

<210> 352

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 352

<210> 353

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 353

<210> 354

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 354

<210> 355

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 355

<210> 356

<211> 7

2 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 356

<210> 357

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 357

<210> 358

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 358

<210> 359

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 359

<210> 360

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 360

<210> 361

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 361

<210> 362

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 362

<210> 363

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 363

<210> 364

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 364

<210> 365

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 365

<210> 366

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 366

<210> 367

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 367

4

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 368

<210> 369

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 369

<210> 370

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 370

<210> 371

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 371

<210> 372

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 372

<210> 373

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 373

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 374

<210> 375

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 375

<210> 376

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 376

<210> 377

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 377

<210> 378

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 378

<210> 379

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 379

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 380

<210> 381

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 381

<210> 382

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 382

<210> 383

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 383

<210> 384

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 384

<210> 385

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 385

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 386

<210> 387

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 387

<210> 388

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 388

<210> 389

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 389

<210> 390

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 390

<210> 391

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 391

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 392

<210> 393

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 393

<210> 394

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 394

<210> 395

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 395

<210> 396

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 396

<210> 397

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 398

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 398

<210> 399

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 399

<210> 400

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 400

<210> 401

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 402

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 402

<210> 403

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 403

<210> 404

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> xaa= D, A, R ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

1

<223> Xaa=Y, I, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=D, A, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=F, A, L ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=W, L, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S, Y, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=A, Y, R ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=Y, P ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=Y, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=D, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=A, M ili bez aminokiseline

2 <221> VARIJANTA

<222> (12)...(12)

<223> Xaa=F,D ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (13)...(13)

<223> Xaa=D, V ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14)

<223> Xaa=V ili bez aminokiseline <400> 404

<210> 405

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=Q ili G

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=S, T, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=Y, W ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=D ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<223> Xaa=S ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=L, T ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=A, S ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=G, A, V ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=S, Y, V ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=V ili bez aminokiseline <400> 405

<210> 406

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=G

<220>

<221> VARIJANTA

4 <223> Xaa=Y, F ili G <220>

<221> VARIJANTA <222> 3

<223> Xaa=T ili S <220>

<221> VARIJANTA <222> 4

<223> Xaa=L ili F <220>

<221> VARIJANTA <222> 5

<223> Xaa=T, S ili N <220>

<221> VARIJANTA <222> 6

<223> Xaa=S ili A <220>

<221> VARIJANTA <222> (7)...(7) <223> Xaa=Y ili F <220>

<221> VARIJANTA <222> (8)...(8) <223> Xaa=G, S ili Y <220>

<221> VARIJANTA <222> (9)...(9) <223> Xaa=I, M ili W <220>

<221> VARIJANTA <222> (10)...(10) <223> Xaa=S, N ili H <400> 406

<210> 407

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=T ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=G ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=S, T ili G

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=5

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=5

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=N, D ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=I, V ili N

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=G ili I

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=A ili G

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=G, Y, S ili N

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=Y ili N

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (12)...(12)

<223> Xaa=D, S, T ili F

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (13)...(13)

<223> Xaa=V

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14)

<223> Xaa=S, N ili H

<400> 407

<210> 408

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=W, S, ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=V, I ili E

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=S, W ili I

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=F, S ili N <220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=Y, S, D ili H <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=N, S ili G <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=S ili G <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=N, Y, D ili R <220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=T, I ili E <220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10) <223> Xaa=N, S, Y ili D <220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11) <223> Xaa=Y

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (12)...(12) <223> Xaa=A i N

<220>

<221> VARIJANTA <222> (13)...(13) <223> Xaa=Q, D ili P <220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14) <223> Xaa=K ili S <220>

<221> VARIJANTA

<222> (15)...(15) <223> Xaa=L ili V <220>

<221> VARIJANTA

<222> (16)...(16) <223> Xaa=Q ili K <220>

<221> VARIJANTA

<222> (17)...(17) <223> Xaa=G ili S <400> 408

<210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=G, E, S ili D <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=N, VorY <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=S ili N <220>

<221> VARIJANTA

<223> Xaa=N, Q ili K

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=R

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=P

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=S

<400> 409

<210> 410

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=D ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=Y, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=D, I ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=F, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<223> Xaa=W, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S, L ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=A, Y, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=Y, Q ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=G, Y ili L

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=Y, D ili V

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=G, A ili P

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (12)...(12)

<223> Xaa=M ili F

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (13)...(13)

<223> Xaa=D

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14)

<223> Xaa=V ili Y

1

<210> 411

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=Q, A, G ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=S, V, T ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=Y, N ili W

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=S ili D

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=S, Y ili D

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S ili T

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=L ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=S, T ili N

2 <221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=G, S ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=S, M, W ili Y

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=V

<400> 411

<210> 412

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=G, P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=T, P, S, A, C, V, L ili I <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=L, F, I, V, M, A ili Y <220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=T, P, S ili A

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=G, P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=I, L, V, M, A ili F <220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=S, T, A ili C <400> 412

<210> 413

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=G, P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=T ili S

4 <221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=S, N, T, A, C ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=S, T, A ili C

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=D ili E

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=V, I, M, L, za A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=G, P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=G, A, R, P, V, L, I, K, Q ili N <220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=N ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (12)...(12)

<223> Xaa=Y, S, W, F, T, S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> (13)...(13)

<223> Xaa=V, I, M, L, F, ili A <220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14)

<223> Xaa=S, T, A ili C

<400> 413

<210> 414

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=W, Y ili F

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=V, I, M, L, za A <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=S, T, A ili C

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=A, F, V, L, I, Y ili M <220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=N ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=G, P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=N ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (10)...(10)

<223> Xaa=N ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (11)...(11)

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S <220>

<221> VARIJANTA

<222> (12)...(12)

<223> Xaa=A, V, L ili I

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (13)...(13)

<223> Xaa=Q, E, N ili D

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (14)...(14)

<223> Xaa=K, R, Q ili N

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (15)...(15)

<223> Xaa=L, F, V, I, M, A ili Y <220>

<221> VARIJANTA

<222> (16)...(16)

<223> Xaa=Q ili N

<221> VARIJANTA

<222> (17)...(17)

<223> Xaa=G, P ili A <400> 414

<210> 415

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=E ili D

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=V, I, M, L, za A <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=N ili Q

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=R, K, Q ili N <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=P ili A

<220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=S, T, A ili C

<210> 416

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 1

<223> Xaa=G, P, A ili bez aminokiseline <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=G, V, P, A, I, M, L ili F <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=M, L, za I

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=D ili E

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=V, I, M, L, za A

<400> 416

<210> 417

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIJANTA

<223> Xaa=S, N, T, A, C ili Q <220>

<221> VARIJANTA

<222> 2

<223> Xaa=S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> 3

<223> Xaa=Y, W, F, T ili S <220>

<221> VARIJANTA

<222> 4

<223> Xaa=T ili S

<220>

<221> VARIJANTA

<222> 5

<223> Xaa=S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> 6

<223> Xaa=S, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> (7)...(7)

<223> Xaa=N, S, Q, T, A ili C <220>

<221> VARIJANTA

<222> (8)...(8)

<223> Xaa=M, V, L, F, I ili A <220>

<221> VARIJANTA

<222> (9)...(9)

<223> Xaa=V, I, M, L, za A <400> 417

<210> 418

<211> 363

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 418

<210> 419

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 419

<210> 420

<211> 321

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 420

<210> 421

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 422

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 422

<210> 423

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 423

<210> 424

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 424

2

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 425

<210> 426

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 426

<210> 427

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 427

<210> 428

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens

<210> 429

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 429

<210> 430

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 430

<210> 431

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 431

4

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 432

<210> 433

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 433

<210> 434

<211> 342

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 434

<210> 435

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 436

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 436

<210> 437

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 437

<210> 438

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 438

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 439

<210> 440

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 440

<210> 441

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 441

<210> 442

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens

<210> 443

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 443

<210> 444

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 444

<210> 445

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 445

<211> 375

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 446

<210> 447

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 447

<210> 448

<211> 324

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 448

<210> 449

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 450

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 450

<210> 451

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 451

<210> 452

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 452

1

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 453

<210> 454

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 454

<210> 455

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 455

<210> 456

<211> 324

<212> DNK

11

<213> Homo sapiens

<210> 457

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 457

<210> 458

<211> 381

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 458

<210> 459

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

12

<210> 460

<211> 336

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 460

<210> 461

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 461

<210> 462

<211> 381

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 462

1

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 463

<210> 464

<211> 336

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 464

<210> 465

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 465

<210> 466

<211> 342

<212> DNK

<213> Homo sapiens

14

<210> 467

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 467

<210> 468

<211> 339

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 468

<210> 469

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 469

1

<211> 357

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 470

<210> 471

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 471

<210> 472

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 472

<210> 473

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 474

<211> 357

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 474

<210> 475

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 475

<210> 476

<211> 327

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 476

1

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 477

<210> 478

<211> 366

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 478

<210> 479

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 479

<210> 480

<211> 324

<212> DNK

1

<213> Homo sapiens

<210> 481

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 481

<210> 482

<211> 381

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 482

<210> 483

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

1

<210> 484

<211> 336

<212> DNK

<213> Homo sapiens <400> 484

<210> 485

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 485

<210> 486

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 487

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 487

<210> 488

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 488

<210> 489

<211> 93

<212> PRT

<213> Homo sapiens

21

<210> 490

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 490

<210> 491

<211> 89

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 491

<210> 492

<211> 87

<212> PRT

<213> Homo sapiens

22

<210> 493

<211> 49

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 493

<210> 494

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 494

<210> 495

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

2

<210> 496

<211> 88

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 496

<210> 497

<211> 90

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 497

<210> 498

<211> 87

<212> PRT

<213> Homo sapiens

24

<210> 499

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 499

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Antigen vezujući protein, u kojem se

(A) pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za humani PCSK9 i on je neutralizujući zato što je višak pomenutog antigen vezujućeg proteina sposoban da redukuje količinu PCSK9 vezanu za LDLR u ogledu kompetitivnog vezivanja in vitro, gde pomenuti antigen vezujući protein obuhvata bilo:

(i)

2

varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 49;

(ii)

i

(iii) CDRH1 koji obuhvata SEQ ID NO: 368, CDRH2 koji obuhvata SEQ ID NO: 174, i CDRH3 koji obuhvata SEQ ID NO: 180, i CDRL1 koji obuhvata SEQ ID NO: 158, CDRL2 koji obuhvata SEQ ID NO: 162, i CDRL3 koji obuhvata SEQ ID NO: 164

ili

(B) pomenuti antigen vezujući protein obuhvata

varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 49.

2

2. Antigen vezujući protein iz zahteva 1 (A)(i) koji obuhvata kombinaciju varijabilnog domena lakog lanca i varijabilnog domena teškog lanca, u kojoj su varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabrani iz grupe kombinacija koju čine: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 72; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 67; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 23, i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu od najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 79; pri čemu se antigen vezujući protein specifično vezuje za PCSK9.

3. Antigen vezujući protein prema zahtevu 2, u kojem su varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca odabrani iz grupe kombinacija koju čine: varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 10 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 72; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 12 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 67; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 17 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 51; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 23 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 49; varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 35 i varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu postavljenu u SEQ ID NO: 79; pri čemu se antigen vezujući protein specifično vezuje za PCSK9.

4. Antigen vezujući protein prema zahtevu 1(A)(ii) koji obuhvata:

2

5. Antigen vezujući protein prema zahtevu 1 (A)(iii) koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 17, i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID NO: 51.

6. Antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1 do 5, koji dalje obuhvata:

(a) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 156;

(b) konstantnu sekvencu lakog lanca od SEQ ID NO: 157;

(c) konstantnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 154; ili

(d) konstantnu sekvencu teškog lanca od SEQ ID NO: 155.

7. Antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kojem antitelo ili njegov fragment ili antigen vezujući protein ima najmanje jednu od sledećih karakteristika:

(a) da se vezuje za PCSK9 varijantu koja ima D374Y tačkastu mutaciju;

(b) da je odabrano iz grupe koju čine humano antitelo, humanizovano antitelo, himerično antitelo, monoklonalno antitelo, višestruko specifično antitelo, rekombinantno antitelo, antigen-vezujući fragment antitela, antitelo sa pojedinačnim lancem, dijatelo, Fab fragment, F(ab)2fragment, IgG1 antitelo, IgG2 antitelo, IgG3 antitelo i IgG4 antitelo;

(c) da se vezuje za PCSK9 sa Kdkoji je manji od 1 nM, manji od 100 pM, manji od 10 pM, ili je manji od 5 pM; ili

(d) da može blokirati vezivanje D374Y PCSK9 za LDLR sa IC50manjim od 200 pM.

8. Nukleinska kiselina koja kodira antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahteva.

9. Postupak pravljenja antigen vezujućeg proteina prema bilo kom od zahteva 1-7, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja luči pomenuti antigen vezujući protein.

10. Postupak prema zahtevu 9, gde je ćelija domaćin odabrana iz grupe koju čine ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma i humane 293 ćelije epitela bubrega.

11. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1 do 7 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, gde se farmaceutska kompozicija daje pre, istovremeno sa, ili nakon, davanja najmanje jednog terapeutskog agensa, gde je po potrebi drugi terapeutski agens statin.

13. Komplet za tretiranje poremećaja vezanih za holesterol koji obuhvata kompoziciju prema zahtevima 11 ili 12.

14. Antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za upotrebu u tretiranju ili prevenciji stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu kod subjekta.

15. Antigen vezujući protein za upotrebu prema zahtevu 14, gde je stanje odabrano između hiperholesterolemije, kardiovaskularne bolesti, metabličkog sindroma, dijabetesa, šloga i dislipidemije.

1