JP2018118974A - プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ｐｃｓｋ９）に対する抗原結合タンパク質 - Google Patents

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ｐｃｓｋ９）に対する抗原結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

【課題】プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる単離された中和抗原結合タンパク質。抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ非競合的中和抗原結合タンパク質である、あるいは抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ競合的中和抗原結合タンパク質である単離された中和抗原結合タンパク質。
【選択図】図２６

Description

関連出願
本願は、２００７年８月２３日に出願された米国仮出願６０／９５７，６６８号、２０
０７年１２月２１日に出願された６１／００８，９６５号及び２００８年１月９日に出願
された６１／０１０，６３０号（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる
。）の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）に
結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法に関す
る。
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リ
ポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアー
ゼである（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒａｔ
， ２００７）。インビトロ実験は、ＨｅｐＧ２細胞へのＰＣＳＫ９の添加は細胞表面Ｌ
ＤＬＲのレベルを低下させることを示している（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，
２００４；Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，
２００５；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。マウスを用いた実験は、ＰＣＳＫ
９タンパク質レベルを増加させることが肝臓中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを減少させ
る（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．，
２００６； Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．
， ２００４）が、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスは肝臓中のＬＤＬＲの増加したレベル
を有する（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５）ことを示した。さらに、血漿ＬＤ
Ｌの増加又は減少したレベルの何れかをもたらす様々なヒトＰＣＳＫ９変異が同定されて
いる （Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２
００６）。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲタンパク質と直接相互作用し、ＬＤＬＲとともに細胞
内に取り込まれ、エンドソーム経路全体を通じてＬＤＬＲと同時に免疫蛍光を発する（Ｌ
ａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）ことが示されている。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ
Ｒの分解は観察されておらず、細胞外ＬＤＬＲタンパク質レベルを低下させる機序は不明
である。
ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのスブチリシン（Ｓ８）ファミリー中のプロホルモ
ン−プロタンパク質コンベルターゼである（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３）
。ヒトは、Ｓ８ＡとＳ８Ｂサブファミリーに分けることができる９つのプロホルモン−プ
ロタンパク質コンベルターゼを有する（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ， ２００６）。
フューリン、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／ＰＣ６及びＰＣ７
／ＰＣ８／ＬＰＣ／ＳＰＣ７は、サブファミリーＳ８Ｂに分類される。マウスフューリン
及びＰＣ１由来の異なるドメインの結晶及びＮＭＲ構造は、スブチリシン様プロドメイン
及び触媒ドメイン並びに触媒ドメインのすぐＣ末端のＰドメインを明らかにする（Ｈｅｎ
ｏｃｈ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｔａｎｇｒｅａ ｅｔ ａｌ， ２００２）。このサ
ブファミリー内のアミノ酸配列の類似性に基づいて、７つのメンバー全てが類似の構造を
有すると予想される（Ｈｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。ＳＫＩ−１／Ｓ１
Ｐ及びＰＣＳＫ９は、サブファミリーＳ８Ａに分類される。これらのタンパク質との配列
比較は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメインの存在も示唆する（Ｓａｋａｉ
ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｓｅｉｄａ
ｈ ｅｔ ａｌ， １９９９）。これらのタンパク質では、触媒ドメインに対してＣ末端
のアミノ酸配列は、より可変的であり、Ｐドメインの存在を示唆しない。
プロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼはチモーゲンとして発現され、多段階工
程を経て成熟する。この過程におけるプロドメインの機能は２つある。まず、プロドメイ
ンはシャペロンとして作用し、触媒ドメインの適切な折り畳みのために必要とされる（Ｉ
ｋｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ， １９８７）。触媒ドメインが折り畳まれたら、プロドメイ
ンと触媒ドメインの間で自己触媒が起こる。この最初の切断反応の後に、プロドメインは
触媒ドメインに結合された状態を保ち、次いで、触媒活性の阻害剤として作用する（Ｆｕ
ｅｔ ａｌ， ２０００）。状態が正しければ、プロドメイン内の部位において、成熟
は、第二の自己触媒現象とともに進行する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７
）。この第二の切断現象が起こった後に、プロドメインと触媒ドメインは解離し、活性な
プロテアーゼを与える。
ＰＣＳＫ９チモーゲンの自己触媒がＧｌｎ１５２とＳｅｒ１５３の間で起こり（ＶＦＡ
Ｑ／ＳＩＰ）（Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００３）、細胞からのその分
泌のために必要とされることが示された（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ，２００３）。ＰＣ
ＳＫ９のプロドメイン内の部位での第二の自己触媒現象は、観察されなかった。精製され
たＰＣＳＫ９は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得る２つの種（１７Ｋｄにプ
ロドメイン及び６５Ｋｄに触媒＋Ｃ末端ドメイン）から構成される。ＰＣＳＫ９は、その
阻害的プロドメインなしに単離されておらず、ＰＣＳＫ９の触媒活性の測定は変動する（
Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ， ２
００３）。
Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒａｔ， ２００７ Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ， ２００６ Ｈｅｎｏｃｈ ｅｔ ａｌ， ２００３ Ｔａｎｇｒｅａ ｅｔ ａｌ， ２００２ Ｈｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ， １９９９ Ｉｋｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ， １９８７ Ｆｕ ｅｔ ａｌ，２０００ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７ Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００３
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む
。
幾つかの態様において、本発明は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７
、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、
６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０か
らなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ１から得られるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号
７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５
６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８
、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ２から得られる
ＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５
１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５
、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される
配列中のＣＤＲＨ３から得られるＣＤＲＨ３；並びに、（ｉｖ）４以下のアミノ酸の１つ
若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（
ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される１つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領
域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、
３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配
列中のＣＤＲＬ１から得られるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、
１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３
０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６から
なる群から選択される配列中のＣＤＲＬ２から得られるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号
５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０
、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ３から得られるＣＤＲ
Ｌ３；並びに、（ｉｖ）４以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失
若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択
される１つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）；又はＣ）Ａ）の１つ若
しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、
ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において
、単離された抗原結合タンパク質は、Ａ）の少なくとも１つのＣＤＲＨ及びＢ）の少なく
とも１つのＣＤＲＬを含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質
は、Ａ）の少なくとも２つのＣＤＲＨ及びＢ）の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む。幾つ
かの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２
、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む。幾つかの実施形態におい
て、Ａ）のＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号６７、７８、８９及び４９からなる群から選択さ
れる配列中のＣＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号６７
、７９、８９及び４９からなる群から選択される配列中のＣＤＲＨ２から選択されるＣＤ
ＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９からなる群から選択
される配列中のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列；並びに（ｉｖ）２以
下のアミノ酸の１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉ
ｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群の少なくとも１つから選択される。さらに、Ｂ
）のＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１２、３５、３２及び２３からなる群から選択される配
列中のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１２、３５
、３２及び２３からなる群から選択される配列中のＣＤＲＬ２から選択されるＣＤＲＬ２
アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号１２、３５、３２及び２３からなる群から選択される
配列中のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列；並びに（ｉｖ）２以下のア
ミノ酸の１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及
び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢの１
つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬからなる群の少なくとも１つから選択される。幾つか
の実施形態において、Ａ）のＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ１アミノ酸配
列のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ２アミノ酸配列のＣＤ
ＲＨ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号６７中のＣＤＲＨ３アミノ酸配列のＣＤＲＨ３
アミノ酸配列；並びに、（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸置
換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群
の少なくとも１つから選択され、Ｂ）の前記ＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１２中のＣＤＲ
Ｌ１アミノ酸配列のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１２中のＣＤＲＬ２アミ
ノ酸配列のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号１２中のＣＤＲＬ３アミノ酸配
列のＣＤＲＬ３アミノ酸配列；並びに、（ｉｖ）２以下のアミノ酸の１つ若しくはそれ以
上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤ
ＲＬ又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以
上の軽鎖ＣＤＲＬからなる群の少なくとも１つから選択される。幾つかの実施形態におい
て、抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号６７中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番
号６７中のＣＤＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号６７中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ
３、並びにＢ）配列番号１２中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号１２中のＣＤＲ
Ｌ２配列のＣＤＲＬ２及び配列番号１２中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。幾つか
の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、
８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６
４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０から
なる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領
域（ＶＨ）、並びに／又は配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。幾つか
の実施形態において、ＶＨは、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５
２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９
、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択
されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列
番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、
４０、４２、４４及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の
配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、ＶＨは、配列番号７４、８５、７１、
７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５
０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１
及び６０からなる群から選択され、並びに／又はＶＬは、配列番号５、７、９、１０、１
２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８
、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６
からなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているＡＢＰの何れかによっ
て結合されるエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。
幾つかの態様において、本発明は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７
、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、
６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０か
らなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ１と少なくとも８０％の配列同一性を有
するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、
５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６
５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択され
る配列の１つ中のＣＤＲＨ２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；並び
に（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、
４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８
０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される配列の１つ
中のＣＤＲＨ３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群の少なく
とも１つから選択される１つ又はそれ以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）；Ｂ）（ｉ）配列番
号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ１と少なくと
も８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、
１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３
０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６から
なる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ２と少なくとも８０％の配列同一性を有す
るＣＤＲＬ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３
３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択され
る配列の１つ中のＣＤＲＬ３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からな
る群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）；
又はＣ）Ａ）の１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の
軽鎖ＣＤＲＬを含む、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つ
かの実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号７４、８５、７１、
７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５
０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１
及び６０からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ１と少なくとも９０％の配列
同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５
８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２
、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群か
ら選択される配列の１つ中のＣＤＲＨ２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲ
Ｈ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５
１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５
、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０からなる群から選択される
配列の１つ中のＣＤＲＨ３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる
群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上のＣＤＲＨ、Ｂ）（ｉ）配列番
号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４
０、４２、４４及び４６からなる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ１と少なくと
も９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、
１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３
０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６から
なる群から選択される配列の１つ中のＣＤＲＬ２と少なくとも９０％の配列同一性を有す
るＣＤＲＬ２；並びに（ｉｉｉ）配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３
３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６からなる群から選択され
る配列の１つ中のＣＤＲＬ３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からな
る群の少なくとも１つから選択される１つ若しくはそれ以上のＣＤＲＬ；又はＣ）Ａ）の
１つ若しくはそれ以上の重鎖ＣＤＲＨ及びＢ）の１つ若しくはそれ以上の軽鎖ＣＤＲＬを
含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号６７、７９及び４９からなる
群から選択される配列内のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（ｉｉ）（ｉ）のＣＤ
ＲＨ３から得られるアミノ酸配列において、２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は
置換が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１
０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４０４）（Ｘ１はＤ、Ａ、Ｒ及びアミノ酸なしか
らなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｉ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ
３はＤ、Ａ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ａ、Ｌ及びアミノ
酸なしからなる群から選択され、Ｘ５はＷ、Ｌ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択
され、Ｘ６はＳ、Ｙ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＡ、Ｙ、Ｒ及
びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ８はＹ、Ｐ及びアミノ酸なしからなる群から
選択され、Ｘ９はＹ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１０はＤ、Ｇ及び
アミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１１はＡ、Ｍ及びアミノ酸なしからなる群から
選択され、Ｘ１２はＦ、Ｄ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１３はＤ、Ｖ及
びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ１４はＶ及びアミノ酸なしからなる群から選
択される。）からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ
）、Ｂ）（ｉ）配列番号１２、３５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ
３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）（ｉ）のＣＤＲＬ３から得られるアミノ酸配列に
おいて、２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換が異なるＣＤＲＬ３、並びに（
ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号４０５）（Ｘ１
はＱ及びＧからなる群から選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から
選択され、Ｘ３はＹ、アミノ酸なし及びＷからなる群から選択され、Ｘ４はＤ及びアミノ
酸なしからなる群から選択され、Ｘ５はＳ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ
６はＳ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＬ、Ｔ及びアミノ酸なしからな
る群から選択され、Ｘ８はアミノ酸なし、Ａ及びＳからなる群から選択され、Ｘ９はアミ
ノ酸なし、Ｇ、Ａ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１０はアミノ酸なし、Ｓ、Ｙ及びＶ
からなる群から選択され、Ｘ１１はアミノ酸なし及びＶからなる群から選択される。）か
らなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択さ
れる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
幾つかの態様において、本発明は、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、
３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、４６及びこれらの幾つかの組み合わ
せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む単離された抗原結合タンパ
ク質を含む。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書中に開示されている抗原
結合タンパク質の少なくとも１つによって結合されるエピトープに特異的に結合する。幾
つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、７４、８５、７１、７２、
６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９
１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、６０
及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を
さらに含む。幾つかの実施形態において、ＡＢＰのアミノ酸配列は、配列番号１２、３５
、２３及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰの重鎖は、配列番号６７のＣＤＲＨ３、配列番号６７のＣＤＲＨ２及び配
列番号６７のＣＤＲＨ１を含み、並びに前記軽鎖は配列番号１２のＣＤＲＬ３、配列番号
１２のＣＤＲＬ２及び配列番号１２のＣＤＲＬ１を含む。幾つかの実施形態において、単
離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体
、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である。幾
つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片
、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である。幾つかの実
施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。幾つかの実施形態
において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施
形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩ
ｇＧ４型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ
４又はＩｇＧ２型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は
、標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、
ＰＣＳＫ９への結合に関して、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質と競合す
る。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗
体又はこれらの抗体断片である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパ
ク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ又は
一本鎖抗体分子である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、
標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ
ＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を低下させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原
結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するＬＤＬの量を減少させる
。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたとき
に、対象中に存在する血清コレステロールの量を減少させる。幾つかの実施形態において
、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するＬＤＬ
Ｒの量を増加させる。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子を含むベクタ
ーを含む。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子
を含む宿主細胞を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、本明細書中に記載さ
れている抗原結合タンパク質と競合する単離された抗原結合タンパク質を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質を
コードする核酸分子を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの抗原
結合タンパク質を含む医薬組成物を含む。
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治
療又は予防を必要としている患者に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離
された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中の上昇した血清コレス
テロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの抗原
結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合
を阻害する方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質
を含み、前記抗原結合タンパク質は１００ｐＭより小さなＫＤでＰＣＳＫ９に結合する。
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治
療又は予防を必要としている対象に、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベル
を伴う症状を治療又は予防する方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離
された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステ
ロールレベルを低下させる方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを
低下させる方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離
された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のＬＤＬＲタン
パク質を増加させる方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のＬＤＬＲタンパク質レベルを
増加させる方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているＡＢＰ及びＬＤＬＲタ
ンパク質レベルの利用可能性を上昇させる薬剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施形
態において、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つ
かの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチ
ン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、
シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質を
分泌する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、本明細書中に記載
されている抗原結合タンパク質を作製する方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの抗原
結合タンパク質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施
形態において、医薬組成物は、さらなる活性因子をさらに含む。幾つかの実施形態におい
て、前記さらなる活性因子は、放射性同位体、放射性核種、毒素又は治療基及び化学療法
基からなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連
する症状を治療又は予防する方法を含む。この方法は、患者中の上昇した血清コレステロ
ールレベルと関連する症状の治療又は予防を必要としている患者へ、本明細書中に開示さ
れている少なくとも１つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む
。幾つかの実施形態において、症状は、高コレステロール血症である。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１つの抗原結
合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を
阻害する方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、１００ｐＭより小さいＫｄでＰＣＳＫ９に結合する
抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、１０ｐ
Ｍより小さいＫｄで結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、５ｐ
Ｍより小さいＫａで結合する。
幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治
療又は予防を必要としている対象に、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベル
を伴う症状を治療又は予防する方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパ
ク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタ
チンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタ
チン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの
幾つかの組み合わせからなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方
法を含む。この方法は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結
合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを
低下させる方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を
上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバス
タチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチ
ン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせ
からなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離
された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のＬＤＬＲタ
ンパク質レベルを増加させる方法を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤
と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも１つの単離された抗原結合
タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のＬＤＬＲタンパク質レベル
を増加させる方法を含む。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲタンパク質レベルの利用
可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、ア
トロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタ
バスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組
み合わせからなる群から選択される。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９
の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）低下効果を低減させる中和抗体を含む。幾つ
かの実施形態において、抗体はＰＣＳＫ９に特異的に結合する。幾つかの実施形態におい
て、抗体は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は
、配列番号３の残基３１から４４７内のエピトープに結合する。幾つかの実施形態におい
て、抗体は、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＰＣＳＫ９
に結合する。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合する中和抗原結合タンパク質を含
み、該抗原結合タンパク質は配列番号３の残基３１から４４７内の位置においてＰＣＳＫ
９に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合され
ている場合には、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストロ
ーム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８
、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９
、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５
、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１
、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、
Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、
Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、
Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、
Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８
６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２
４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９
１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６
８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８
７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９
７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７
３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９
５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３
９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形
態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム
又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ
２３９、１３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ
３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ
２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ
３７３、Ｓ３７６又はＱ３８２。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下
の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３
、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４
、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態
において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも２つから５オングストローム又
はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２
３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３
８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少な
くとも４つから５オングストローム又はそれ以下である。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５
、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７
、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０又はＳ３８１。幾つかの実施形態において、抗体は、Ｐ
ＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置して
いる。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１
７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５
７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５
１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８
４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ
２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ
２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ
３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ
３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６又はＱ３８７。幾つかの実施形態にお
いて、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそ
れ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、
Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、
Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、
Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、
Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の
少なくとも２つから５オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０
、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１
、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７
、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７
、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態
において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも４つから５オングストローム又
はそれ以下に位置している。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１
５、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５
５、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４
９、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８
２、Ｓ３８３又はＧ３８４。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残
基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ
１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ
１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ
３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ
２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ
２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形態において、抗体
は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから５オングストローム又はそれ以下に位
置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４
、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３
、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。幾つかの実施形態において、
抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも２つから５オングストローム又はそれ以下
に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１
９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２
４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。幾つかの実施形態におい
て、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも４つから５オングストローム又はそれ
以下に位置している。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、
Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、
Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７又はＦ３７９。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９に結合する中和抗体を含み、該抗体はＰ
ＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する可能性を低下させる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合分子が想定される
。抗体は、配列番号３の残基３１から４４７内の位置において、ＰＣＳＫ９に結合する。
幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９に結合されたときに、
ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングストローム又はそれ以下に位置し
ている。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ
３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ
１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ
２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ
３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２
１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２
５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３
５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３
８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、
Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、
Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、
Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、
Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、
Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、
Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、
Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、
Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、
Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の残基の８オングストローム内で、ＰＣＳＫ９
への抗体の結合を遮断する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施
形態において、ＰＣＳＫ９の残基は、以下のＰＣＳＫ９残基の少なくとも１つから選択さ
れる。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３
７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１
５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２
４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６、Ｑ３
８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１
７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５
７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５
１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３、Ｇ３８
４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ
２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ
２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ
３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ
３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ
１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ
２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ
３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ
２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ
３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置と重複する位置にお
いて、ＰＣＳＫ９に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実
施形態において、ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置には、Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１
５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３
７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０及びＳ３８１からなる群から選択される少なくとも
１つのアミノ酸残基が含まれる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が
提供される。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９上の以下
の残基の少なくとも１つの８オングストローム以内で、ＥＧＦａがＰＣＳＫ９に結合する
可能性を低下させる。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、
Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、
Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、
Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、
Ｓ３７６又はＱ３８２。
幾つかの実施形態において、ＥＧＦａが結合し、Ａｂ２１Ｂ１２が結合し、及び／又は
３１Ｈ４が結合する表面と重複するＰＣＳＫ９の表面に結合する抗体、抗原結合タンパク
質又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、図面に図示されているも
のと同様の様式でＰＣＳＫ９に結合する抗体、抗原結合タンパク質又は抗原結合分子が提
供される。
幾つかの実施形態において、上記実施形態は、中和抗体又は抗原結合タンパク質である
。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲ又はその断片（ＥＧＦａ
など）でない。
幾つかの態様において、本発明は、単離された中和抗体を含み、該抗体がＰＣＳＫ９に
結合されたときに、抗体は、ＰＣＫＳ９の以下の残基の少なくとも１つから８オングスト
ローム又はそれ以下に位置する。配列番号３のＴ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１
、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２
、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７
、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２、Ｅ５９３、Ｓ４６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３
、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４９７、Ｅ４９８、Ｍ５００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７
、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５１３、Ａ５１４、Ｇ５１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９
、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５７０、Ｌ５７１、Ｈ５９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びＨ５９
７。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９の以下の残基の少なくとも１つから
５オングストローム又はそれ以下に位置する。配列番号３のＴ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７
０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１
０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６
６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ５９２及びＥ５９３。
幾つかの態様において、本発明は、単離された抗原結合タンパク質を含む。抗原結合タ
ンパク質は、Ａ）配列番号８９中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番号８９中のＣＤ
ＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号８９中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ３、並びにＢ）
配列番号３２中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号３２中のＣＤＲＬ２配列のＣＤ
ＲＬ２及び配列番号３２中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。
幾つかの態様において、本発明は、配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離
された抗原結合タンパク質を含み、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントＰＣ
ＳＫ９タンパク質との間の結合は、単離された抗原結合タンパク質と配列番号１及び／又
は配列番号３０３のＰＣＳＫ９タンパク質との間の結合の５０％未満である。幾つかの実
施形態において、バリアントＰＣＳＫ９タンパク質は、配列番号１に示されている２０７
、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０
、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７
、５１９、５２１及び５５４からなる又はこれらを含む群から選択される位置に、残基の
少なくとも１つの変異を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変異は、Ｒ
２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ
、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒを含む
又はこれらからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変
異は、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ
３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる群から選択され
る。
幾つかの態様において、本発明は、配列番号３０３のＰＣＳＫ−９タンパク質に第一の
様式で結合し、及びＰＣＳＫ９のバリアントに第二の様式で結合する抗原結合タンパク質
を含む。ＰＣＳＫ９バリアントは、配列番号３０３及び／又は配列番号１の２０７、２０
８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１
３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１
９、５２１及び５５４を含む又はこれらからなる群から選択される位置に、残基の少なく
とも１つの点変異を有する。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のＥＣ５０、
第一のＢｍａｘ又は第一のＥＣ５０と第一のＢｍａｘを含む。幾つかの実施形態において
、第二の様式は第二のＥＣ５０、第二のＢｍａｘ又は第二のＥＣ５０と第二のＢｍａｘを
含む。第一の様式に対する値は、第二の様式に対する値とは異なる。幾つかの実施形態に
おいて、第一の様式は第一のＥＣ５０を含み、第二の様式は第二のＥＣ５０を含み、及び
点変異はＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、
Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８
２Ｒからなる又はこれらを含む群から選択される。幾つかの実施形態において、第一のＥ
Ｃ５０は第二のＥＣ５０と少なくとも２０％異なる。幾つかの実施形態において、第一の
ＥＣ５０は第二のＥＣ５０と少なくとも５０％異なる。幾つかの実施形態において、第二
のＥＣ５０は第一のＥＣ５０より大きな数値である。幾つかの実施形態において、第一の
ＥＣ５０は多重ビーズ結合アッセイによって測定される。幾つかの実施形態において、第
二のＥＣ５０は１μｍより大きい。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は中
和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は競
合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク
質は非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、第一の様式は
第一のＢｍａｘを含み、及び第二の様式は第一のＢｍａｘとは異なる第二のＢｍａｘを含
む。ＰＣＳＫ９バリアントは、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１
２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒ
からなる又はこれらを含む群から選択される少なくとも１つの点変異を有する。幾つかの
実施形態において、第二のＢｍａｘは第一のＢｍａｘの約１０％である。幾つかの実施形
態において、第一のＢｍａｘは第二のＢｍａｘと少なくとも２０％異なる。幾つかの実施
形態において、第一のＢｍａｘは第二のＢｍａｘと少なくとも５０％異なる。
幾つかの態様において、本発明は、配列番号３のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離
された抗原結合タンパク質を含み、抗原結合タンパク質のエピトープは、配列番号１の以
下のアミノ酸の少なくとも１つを含む。２０７、２０８、１８１、１８５、４３９、５１
３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６
７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４。
幾つかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパ
ク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質を含み、前記中和抗原結合タンパク質
はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。幾つかの実施形態にお
いて、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲ非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの
実施形態において、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲ競合的中和抗原結合タンパク質である
。
幾つかの態様において、本発明は単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タ
ンパク質は、Ａ）配列番号４９中のＣＤＲＨ１配列のＣＤＲＨ１、配列番号４９中のＣＤ
ＲＨ２配列のＣＤＲＨ２及び配列番号４９中のＣＤＲＨ３配列のＣＤＲＨ３、並びにＢ）
配列番号２３中のＣＤＲＬ１配列のＣＤＲＬ１、配列番号２３中のＣＤＲＬ２配列のＣＤ
ＲＬ２及び配列番号２３中のＣＤＲＬ３配列のＣＤＲＬ３を含む。
幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質及びＰＣＳＫ９
に結合する抗原結合タンパク質を含む組成物を含む。組成物は、約２．２オングストロー
ム又はそれ以上の解像度になるように、ＰＣＳＫ９タンパク質の三次元構造を決定できる
ような結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合
タンパク質は、抗体又はその断片である。
幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質及びＬＤＬＲタ
ンパク質の少なくともＥＧＦａ部分を含み、ＬＤＬＲタンパク質のＥＧＦａ部分はＰＣＳ
Ｋ９タンパク質によって結合され、前記結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質は、約２．２
オングストローム又はそれ以上の解像度になるように、ＰＣＳＫ９タンパク質の三次元構
造を決定できるような結晶化されたＰＣＳＫ９タンパク質である。幾つかの実施形態にお
いて、分子モデルは、コンピュータ読み取り可能な媒体上にある。
幾つかの態様において、本発明は、血清コレステロールを低下させるための医薬の調製
における、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の使用を含む。
幾つかの態様において、本発明は、対象中の上昇した血清コレステロールレベルと関連
する症状を治療又は予防するための医薬の調製における、本明細書中に記載されている抗
原結合タンパク質の使用を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、該抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号６７、７９、８９及び４９から
なる群から選択される配列内のＣＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）２以下の
アミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異な
るＣＤＲＨ１、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号
４０６）（Ｘ１はＧからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｆ及びＧからなる群から選択さ
れ、Ｘ３はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＬ及びＦからなる群から選択され、
Ｘ５はＴ、Ｓ及びＮからなる群から選択され、Ｘ６はＳ及びＡからなる群から選択され、
Ｘ７はＹ及びＦからなる群から選択され、Ｘ８はＧ、Ｓ及びＹからなる群から選択され、
Ｘ９はＩ、Ｍ及びＷからなる群から選択され、Ｘ１０はＳ、Ｎ及びＨからなる群から選択
される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１
つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１２、３２、３
５及び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１、（
ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミ
ノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ
１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４０７）（Ｘ１はＴ及びアミノ酸なしからなる
群から選択され、Ｘ２はＧ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｔ及びＧからなる
群から選択され、Ｘ４はＳからなる群から選択され、Ｘ５はＳからなる群から選択され、
Ｘ６はＮ、Ｄ及びＳからなる群から選択され、Ｘ７はＩ、Ｖ及びＮからなる群から選択さ
れ、Ｘ８はＧ及びＩからなる群から選択され、Ｘ９はＡ及びＧからなる群から選択され、
Ｘ１０はＧ、Ｙ、Ｓ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１１はＹ及びＮからなる群から選
択され、Ｘ１２はＤ、Ｓ、Ｔ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１３はＶからなる群から
選択され、Ｘ１４はＳ、Ｎ及びＨからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも
１つから選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される
軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。当業者は、単一のＡＢＰ又は抗体が上記選択肢
の１つ又はそれ以上を充足することができ、この実施形態に対して記載された発明になお
属することを理解する。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、該抗原結合タンパク質は、Ａ）以下のもの：（ｉ）配列番号６７、７９、８９
及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ２から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉ
ｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ２とアミノ
酸配列が異なるＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１
０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７（配列番号４０８）（Ｘ１はＷ、Ｓ、Ｌ
及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ及びＥからなる群から選択され
、Ｘ３はＳ、Ｗ及びＩからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ｓ及びＮからなる群から選択
され、Ｘ５はＹ、Ｓ、Ｄ及びＨからなる群から選択され、Ｘ６はＮ、Ｓ及びＧからなる群
から選択され、Ｘ７はＳ及びＧからなる群から選択され、Ｘ８はＮ、Ｙ、Ｄ及びＲからな
る群から選択され、Ｘ９はＴ、Ｉ及びＥからなる群から選択され、Ｘ１０はＮ、Ｓ、Ｙ及
びＤからなる群から選択され、Ｘ１１はＹからなる群から選択され、Ｘ１２はＡ及びＮか
らなる群から選択され、Ｘ１３はＱ、Ｄ及びＰからなる群から選択され、Ｘ１４はＫ及び
Ｓからなる群から選択され、Ｘ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１６はＱ及び
Ｋからなる群から選択され、Ｘ１７はＧ及びＳからなる群から選択される。）からなる群
から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖
相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）以下のもの：（ｉ）配列番号１２、３２、３５及び２
３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉ）２
以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列
が異なるＣＤＲＬ２、及び（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４０９）
（Ｘ１はＧ、Ｅ、Ｓ及びＤからなる群から選択され、Ｘ２はＮ、Ｖ及びＹからなる群から
選択され、Ｘ３はＳ及びＮからなる群から選択され、Ｘ４はＮ、Ｑ及びＫからなる群から
選択され、Ｘ５はＲからなる群から選択され、Ｘ６はＰからなる群から選択され、Ｘ７は
Ｓからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列から
なる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）以下のもの：（ｉ）配列番号６７、７９、８
９及び４９からなる群から選択される配列内のＣＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（
ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミ
ノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号４１０）（Ｘ１はＤ及びアミノ酸なしからな
る群から選択され、Ｘ２はＹ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＤ、
Ｉ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ４はＦ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群
から選択され、Ｘ５はＷ、Ａ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ６はＳ、Ｌ及
びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ７はＡ、Ｙ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群
から選択され、Ｘ８はＹ、Ｑ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ｙ及
びＬからなる群から選択され、Ｘ１０はＹ、Ｄ及びＶからなる群から選択され、Ｘ１１は
Ｇ、Ａ及びＰからなる群から選択され、Ｘ１２はＭ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１
３はＤからなる群から選択され、Ｘ１４はＶ及びＹからなる群から選択される。）からな
る群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される
重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）以下のもの：（ｉ）配列番号１２、３２、３５及
び２３からなる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ
）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸
配列が異なるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１
０Ｘ１１（配列番号４１１）（Ｘ１はＱ、Ａ、Ｇ及びアミノ酸なしからなる群から選択さ
れ、Ｘ２はＳ、Ｖ、Ｔ及びアミノ酸なしからなる群から選択され、Ｘ３はＹ、Ｎ及びＷか
らなる群から選択され、Ｘ４はＳ及びＤからなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｙ及びＤか
らなる群から選択され、Ｘ６はＳ及びＴからなる群から選択され、Ｘ７はＬ及びＳからな
る群から選択され、Ｘ８はＳ、Ｔ及びＮからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ｓ及びＡか
らなる群から選択され、Ｘ１０は、Ｓ、Ｍ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、並びにＸ
１１はＶからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配
列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
幾つかの実施形態において、上記アミノ酸の何れもが、保存的アミノ酸置換によって置換
され得る。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５
１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣ
ＤＲＨ１から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又
は置換により、（ｉ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、並びに（ｉｉｉ
）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４１２）（Ｘ１はＧ、Ｐ及び
Ａからなる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３
はＴ、Ｐ、Ｓ及びＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ及びＩからなる群から選択され、Ｘ４はＬ、Ｆ、Ｉ、Ｖ
、Ｍ、Ａ及びＹからなる群から選択され、Ｘ５はＴ、Ｐ、Ｓ及びＡからなる群から選択さ
れ、Ｘ６はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ７はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳから
なる群から選択され、Ｘ８はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９はＩ、Ｌ、Ｖ、
Ｍ、Ａ及びＦからなる群から選択され、Ｘ１０はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択さ
れる。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つ
から選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される配列内
のＣＤＲＬ１から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠
失又は置換により、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、並びに（ｉ
ｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番
号４１３）（Ｘ１はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ２はＧ、Ｐ及びＡからなる群か
ら選択され、Ｘ３はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ４はＳ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｃ及びＱ
からなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ６はＤ及
びＥからなる群から選択され、Ｘ７はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され
、Ｘ８はＧ、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９はＧ、Ａ、Ｒ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｋ
、Ｑ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１０はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択
され、Ｘ１１はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ１２はＹ、Ｓ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ａ及び
Ｃからなる群から選択され、Ｘ１３はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され
、Ｘ１４はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つ
から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖
相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５
１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣ
ＤＲＨ２から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又
は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、並びに（ｉｉｉ）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ
１７（配列番号４１４）（Ｘ１はＷ、Ｙ及びＦからなる群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、
Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択
され、Ｘ４はＡ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ及びＭからなる群から選択され、Ｘ５はＹ、Ｗ、Ｆ
、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ６はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ７はＧ
、Ｐ及びＡからなる群から選択され、Ｘ８はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ９はＴ
及びＳからなる群から選択され、Ｘ１０はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ１１はＹ
、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ１２はＡ、Ｖ、Ｌ及びＩからなる群から
選択され、Ｘ１３はＱ、Ｅ、Ｎ及びＤからなる群から選択され、Ｘ１４はＫ、Ｒ、Ｑ及び
Ｎからなる群から選択され、Ｘ１５はＬ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ａ及びＹからなる群から選択
され、Ｘ１６はＱ及びＮからなる群から選択され、Ｘ１７はＧ、Ｐ及びＡからなる群から
選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群の少なくと
も１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ）配列番号１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される
配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付
加、欠失又は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、並びに
（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号４１５）（Ｘ１はＥ及びＤからなる
群から選択され、Ｘ２はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択され、Ｘ３はＳ、
Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ４はＮ及びＱからなる群から選択され、Ｘ５は
Ｒ、Ｋ、Ｑ及びＮからなる群から選択され、Ｘ６はＰ及びＡからなる群から選択され、Ｘ
７はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択される。）からなる群の少なくとも１つから選
択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性
決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
幾つかの態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９を結合する単離された抗原結合タンパク
質を含み、前記抗原結合タンパク質は、Ａ）（ｉ）配列番号４７、４８、４９、５０、５
１、５２、５３、５４、５５、５６、５７及び５８からなる群から選択される配列内のＣ
ＤＲＨ３から選択されるＣＤＲＨ３、（ｉｉ）２以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又
は置換だけ、（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｉｉ）
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４１６）（Ｘ１はＧ、Ｐ、Ａ及びアミノ酸なしから
なる群から選択され、Ｘ２はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ３はＧ、
Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｌ及びＦからなる群から選択され、Ｘ４はＭ、Ｌ、Ｆ及びＩからな
る群から選択され、Ｘ５はＤ及びＥからなる群から選択され、Ｘ６はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ
及びＡからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列
からなる群の少なくとも１つから選択される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、Ｂ）（ｉ
）配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４から
なる群から選択される配列内のＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲＬ３；（ｉｉ）２以下の
アミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異
なるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号４
１７）（Ｘ１はＳ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｃ及びＱからなる群から選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ａ及
びＣからなる群から選択され、Ｘ３はＹ、Ｗ、Ｆ、Ｔ及びＳからなる群から選択され、Ｘ
４はＴ及びＳからなる群から選択され、Ｘ５はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され
、Ｘ６はＳ、Ｔ、Ａ及びＣからなる群から選択され、Ｘ７はＮ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ａ及びＣか
らなる群から選択され、Ｘ８はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｉ及びＡからなる群から選択され、Ｘ９
はＶ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ及びＡからなる群から選択される。）からなる群から選択されるＣ
ＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群の少なくとも１つから選択される軽鎖相補性決定領域（
ＣＤＲＬ）を含む。
図１Ａは、ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸配列を図示しており、プロドメインに下線が付されている。 図１Ｂ１は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 図１Ｂ２は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 図１Ｂ３は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 図１Ｂ４は、ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 図２Ａは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。 図２Ｂは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。 図２Ｃは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。 図２Ｄは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。 図３Ａは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。 図３Ｂは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。 図３Ｃは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。 図３Ｄは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。 図３Ｅは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｆは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｇは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｈは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｉは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｊは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｋは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｌは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｍは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｎは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｏは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｐは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｑは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｒは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｓは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｔは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｕは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｖは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｗは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｘは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｙは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３Ｚは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＡＡは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＢＢは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＣＣは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＤＤは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＥＥは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＦＦは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＧＧは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＨＨは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＩＩは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＪＪは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＫＫは、様々な定常ドメインに対するアミノ酸配列を図示する。 図３ＬＬは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＭＭは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＮＮは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＯＯは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＰＰは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＱＱは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＲＲは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＳＳは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＴＴは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＵＵは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＶＶは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＷＷは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＸＸは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＹＹは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＺＺは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＡＡＡは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＢＢＢは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。 図３ＣＣＣは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＤＤＤは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＥＥＥは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＦＦＦは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＧＧＧは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＨＨＨは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＩＩＩは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図３ＪＪＪは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。 図４Ａは、ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図４Ｂは、ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図４Ｃは、カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図４Ｄは、カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図４Ｅは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。図４Ｆは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図４Ｆは、マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 図５Ａは、ＰＣＳＫ９及び様々な抗原結合タンパク質を用いたＳＤＳＰＡＧＥ実験の結果を図示しており、タンパク質の相対的純度及び濃度を示している。 図５Ｂは、２１Ｂ１２に対するｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。 図５Ｃは、２１Ｂ１２に対するｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。 図５Ｄは、ｂｉａｃｏｒｅ捕捉アッセイから得られた速度論のグラフを図示している。 図５Ｅは、３つのＡＢＰに対するビニングの結果を図示する棒グラフを図示している。 図６Ａは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ２の阻害曲線である。 図６Ｂは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ４の阻害曲線である。 図６Ｃは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ２の阻害曲線である。 図６Ｄは、インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ４の阻害曲線である。 図７Ａは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ２の阻害曲線である。 図７Ｂは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ＩｇＧ４の阻害曲線である。 図７Ｃは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ２の阻害曲線である。 図７Ｄは、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を低下させるＡＢＰの効果を示す細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ＩｇＧ４の阻害曲線である。 図８Ａは、マウス中でのＡＢＰ３１Ｈ４の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである（ＩｇＧ対照処理マウスと比較した変化）（＊ｐ＜０．０１）。 図８Ｂは、マウス中でのＡＢＰ３１Ｈ４の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである（時間＝ゼロ時と比較した変化）（＊ｐ＜０．０５）。 図８Ｃは、Ｃ５７Ｂ１／６マウス中でのＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ３１Ｈ４の効果を図示するグラフである（＊ｐ＜０．０１）。 図８Ｄは、Ｃ５７Ｂ１／６マウス中でのＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ３１Ｈ４の効果を図示するグラフである（＃ｐ＜０．０５）。 図９は、様々な時点後に存在する肝臓ＬＤＬＲタンパク質の量を増大させるＡＢＰ３１Ｈ４の能力のウェスタンブロット分析を図示している。 図１０Ａは、野生型マウス中で、総血清コレステロールを低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を図示するグラフである。 図１０Ｂは、野生型マウス中で、ＨＤＬを低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を図示するグラフである。 図１０Ｃは、様々な抗原結合タンパク質３１Ｈ４及び１６Ｆ１２の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである。 図１１Ａは、抗原結合タンパク質が血清コレステロールを低下させる期間及び能力を調べるための注射プロトコールを図示している。 図１１Ｂは、図１１Ａのプロトコールの結果を図示するグラフである。 図１２Ａは、スタチンとＡＢＰ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１２Ｂは、スタチンとＡＢＰ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１２Ｃは、スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは異なり）非中和抗体であるＡＢＰ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１２Ｄは、スタチンとＡＢＰ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１２Ｅは、スタチンとＡＢＰ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１２Ｆは、スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは異なり）非中和抗体であるＡＢＰ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲレベルを図示する。 図１３Ａは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの様々な軽鎖アミノ酸配列を図示する。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。 図１３Ｂは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰに対する軽鎖分岐図を図示する。 図１３Ｃは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの様々な重鎖アミノ酸配列を図示する。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。 図１３Ｄは、ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰに対する重鎖樹形図を図示する。 図１３Ｅは、軽鎖と重鎖ＣＤＲの比較及びコンセンサスを与える群の表記を示す。 図１３Ｆは、群１及び２に対するコンセンサス配列を図示する。 図１３Ｇは、群３及び４に対するコンセンサス配列を図示する。 図１３Ｈは、群１及び２に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。 図１３Ｉは、群２に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。 図１３Ｊは、群３及び４に対するコンセンサス配列を図示する。点（．）は、同一の残基を示した。 図１４Ａは、（１０ｍｇ／ｋｇでの）様々なＡＢＰのインビボでのＬＤＬ低下能を図示するグラフである。 図１４Ｂは、（３０ｍｇ／ｋｇでの）様々なＡＢＰのインビボでのＬＤＬ低下能を図示するグラフである。 図１５Ａは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。 図１５Ｂは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図１５Ｂは、図１５Ａから始まる配列の続きである。 図１５Ｃは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。 図１５Ｄは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図１５Ｄは、図１５Ｃから始まる配列の続きである。 図１６Ａは、Ａｂ２１Ｂ１２がＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ又はＶＤ部分に結合する能力を調べるために使用されるゲルの図解である。 図１６Ｂは、Ａｂ３１Ｈ４がＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ又はＶＤ部分に結合する能力を調べるために使用されるゲルの図解である。 図１７は、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲのＥＧＦａ部分の構造の図解である。 図１８Ａは、ＰＣＳＫ９及び３１Ｈ４Ａｂの構造の図解である。 図１８Ｂは、ＰＣＳＫ９及び３１Ｈ４Ａｂの構造の図解である。 図１９Ａは、ＰＣＳＫ９、３１Ｈ４Ａｂ及び２１Ｂ１２Ａｂの構造の図解である。 図１９Ｂは、ＰＣＳＫ９及び２１Ｂ１２Ａｂの構造の図解である。 図２０Ａは、ＰＣＳＫ９に結合された抗体３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の構造と重ね合わせたＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲ由来のＥＧＦａの構造の図解である。 図２０Ｂは、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。 図２０Ｃは、別の方向から得られたＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。 図２０Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２を含めた構造的表示とともに、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルを図示したものである。 図２０Ｅは、表記の軸周りに９０°回転させた図２０Ｄの構造モデルの図解である。 図２０Ｆは、表記の軸周りに１８０°回転させた図２０Ｄの構造モデルの図解である。 図２１Ａは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。 図２１Ｂは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。図２１Ｃは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。 図２１Ｃは、ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造の図解である。 図２１Ｄは、完全長ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の構造モデルの図解である。 図２２は、ヒトＡＢＰ配列とイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生され、結晶構造のために使用されたＡＢＰ配列との間での様々な差を同定する一群のＡＢＰ配列である。 図２３は、様々なビニングの結果の表である。 図２３Ａは、様々なビニングの結果を図示する表の第一の部分である。 図２３Ｂは、様々なビニングの結果を図示する表の第二の部分である。 図２３Ｃは、様々なビニングの結果を図示する表の第三の部分である。 図２３Ｄは、様々なビニングの結果を図示する表の第四の部分である。 図２４Ａは、非還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。 図２４Ｂは、還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。 図２５Ａは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２５Ｂは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２５Ｃは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２５Ｄは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２５Ｅは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２５Ｆは、ＰＣＳＫ９の表面の被覆の図解である。 図２６は、様々な抗体のエピトープを調べるための、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列とＰＣＳＫ９バリアント中の変異された残基の全ての配列比較である。 図２７Ａは、２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、２１Ｂ１２エピトープのヒットを図示する。 図２７Ｂは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ｈ４エピトープのヒットを図示する。 図２７Ｃは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３１Ｈ４エピトープのヒットを図示する。 図２７Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、１２Ｈ１１エピトープのヒットを図示する。 図２７Ｅは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングされた、３Ｃ４エピトープのヒットを図示する。 図２８Ａは、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。 図２８Ｂは、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。 図２８Ｃは、２つのＡＢＰのＬＤＬＲ結合能力を比較するグラフである。 図２８Ｄは、２つのＡＢＰの細胞ＬＤＬ取り込み活性を比較するグラフである。
ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質（抗体及びその機能的結合断片など）が、本
明細書に開示されている。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９
に結合し、様々な様式でＰＣＳＫ９が機能を発揮するのを妨げる。幾つかの実施形態にお
いて、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９が他の物質と相互作用する能力を遮断し、又は
低下させる。例えば、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９が
ＬＤＬＲに結合する可能性を妨げ、又は低下させる様式で、ＰＣＳＫ９に結合する。他の
実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９に結合するが、ＰＣＳＯがＬＤＬＲ
と相互作用する能力を遮断しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、
ヒトモノクローナル抗体である。
当業者によって理解されるように、本発明の開示に照らせば、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの
間の相互作用を変化させることは、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を増加させ
、続いて、これは、対象中の血清ＬＤＬの量を減少させ、対象の血清コレステロールレベ
ルの低下をもたらす。従って、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、上昇した血清
コレステロールレベルを有する対象、上昇した血清コレステロールレベルのリスクを有す
る対象又は血清コレステロールレベルの低下が有益であり得る対象を治療するための様々
な方法及び組成物において使用することができる。従って、血清コレステロールの増加を
低下させ、維持し、又は妨げるための様々な方法及び技術も、本明細書中に記載されてい
る。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の結合
を可能とするが、抗原結合タンパク質はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の有害な活性を妨げ
、又は低下させる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰ
ＣＳＫ９の結合を妨げ、又は低下させる。
便宜のため、以下の節は、本明細書において使用される用語の様々な意味を全般的に概
観する。この論述の後に、抗原結合タンパク質に関する一般的な態様が論述されており、
その後に、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の特性及びそれらをどのように使用する
ことができるかを示す具体例が続く。
定義及び実施形態
前記一般的な記述及び以下の詳細な説明は何れも例示的及び説明的なものに過ぎず、特
許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではないことを理解しなければなら
ない。本願において、単数形の使用は、特に別段の記載がなければ、複数形を含む。本願
において、「又は」の使用は、別段の記載がなければ、「及び／又は」を意味する。さら
に、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれた」などのその他の形式の使
用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別段の記
載がなければ、一つのユニットを含む要素及び成分並びに２以上のサブユニットを含む要
素及び成分の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、構成部分の一部又は
構成部分の全体を含み得る。
本明細書に記載されている見出しは、整理を目的とするものに過ぎず、記載されている
主題を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、論説、書物及び論文などの
（但し、これらに限定されない。）、本願に引用されている全ての文献又は文献の一部は
、あらゆる目的のために、その全体が、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。
本開示において使用される場合、以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有
するものと理解しなければならない。
「プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型」又は「ＰＣＳＫ９」とい
う用語は、配列番号１及び／又は３に記載されているポリペプチド又はその断片、並びに
対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、誘導体バリアント、置換バリアント、欠
失バリアント及び／又は挿入バリアント（Ｎ末端メチオニンの付加を含む。）、融合ポリ
ペプチド及び種間相同体を含む（但し、これらに限定されない。）関連ポリペプチドを表
す。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、リーダー配列残基、標的化
残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基
などの（但し、これらに限定されない。）末端残基を含む。「ＰＣＳＫ９」は、ＦＨ３、
ＮＡＲＣ１、ＨＣＨＯＬＡ３、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシン／ケクシン９
型及び神経アポトーシス制御コンベルターゼ１とも称されている。ＰＣＳＫ９遺伝子は、
分泌性スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク
質コンベルターゼタンパク質をコードする。「ＰＣＳＫ９」という用語は、プロタンパク
質及びプロタンパク質の自己触媒後に生成される産物の両方を表す。（例えば、切断され
たＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質に対して）自己触媒された産物のみ
が引用されている場合には、タンパク質は、「成熟」、「切断された」、「プロセッシン
グされた」又は「活性な」ＰＣＳＫ９と称され得る。非活性形態のみが引用されている場
合には、タンパク質は、ＰＣＳＫ９の「非活性」、「プロ型」又は「プロセッシングを受
けていない」形態と称され得る。本明細書において使用されるＰＣＳＫ９という用語は、
変異Ｄ３７４Ｙ、Ｓ１２７Ｒ及びＦ２１６Ｌなどの天然に存在する対立遺伝子も含む。Ｐ
ＣＳＫ９という用語は、グリコシル化、ＰＥＧ化されたＰＣＳＫ９配列、そのシグナル配
列が切断されたＰＣＳＫ９配列、触媒ドメインからそのプロドメインから切断されている
が、触媒ドメインから分離されていないＰＣＳＫ９配列（例えば、図１Ａ及び１Ｂ）など
、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾を取り込んだＰＣＳＫ９分子も包含する。
「ＰＣＳＫ９活性」という用語は、ＰＣＳＫ９のあらゆる生物学的効果を含む。ある種
の実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、基質若しくは受容体と相互作用し、又は基質若
しくは受容体に結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ
９活性は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力によって表される。幾
つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲを含む反応に結合し、触媒する。幾つ
かの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬＲの利用可能性を変化させる（例えば
、低下させる）ＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は
、対象中のＬＤＬの量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において
、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９
の能力を含む。幾つかの実施形態において、「ＰＣＳＫ９活性」は、ＰＣＳＫ９シグナル
伝達から生じるあらゆる生物活性を含む。典型的な活性には、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の
結合、ＬＤＬＲ又は他のタンパク質を切断するＰＣＳＫ９酵素活性、ＰＣＳＫ９作用を促
進するＬＤＬＲ以外のタンパク質へのＰＣＳＫ９の結合、ＡＰＯＢ分泌を変化させるＰＣ
ＳＫ９（Ｓｕｎ Ｘ−Ｍ ｅｔ ａｌ， “Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＰＣＳＫ９ ｏｎ ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｓｅｃｒｅｔ
ｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｓｅｖｅｒｅ ｄｏｍ
ｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ”， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：１１６１−１１６９， ２００５ ａｎｄ Ｏｕｇ
ｕｅｒｒａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ， “Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１００ ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅ
ｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＣＳＫ９
， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−
１４５３， ２００４）、肝臓の再生及び神経細胞の分化におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｓ
ｅｉｄａｈ ＮＧ ｅｔ ａｌ， “Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｎｅｕｒａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ １（ＮＡＲＣ−Ｉ）：Ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ” ＰＮＡＳ １００：９
２８−９３３， ２００３）及び肝臓のグルコース代謝におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｃｏ
ｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉ
ｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ ｉｎ
ｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｃ” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２１１
−１８，２００６）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「高コレステロール血症」という用語は、コレステロール
レベルが所望のレベルを上回って上昇している症状を表す。幾つかの実施形態において、
これは、血清コレステロールレベルが上昇していることを表す。幾つかの実施形態におい
て、所望のレベルは、当業者に公知である（及び、本明細書に記載され、又は引用されて
いる）様々な「リスク因子」を考慮に入れる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリ
マーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオ
キシリボヌクレオチド又はヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態であり得る。前
記修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキ
シリボースなどのリボース修飾並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホス
ホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニ
ラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００又はそれ以下のヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０から
６０塩基の長さである。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０から４０ヌクレオチド長である。オリゴヌク
レオチドは、例えば、変異体遺伝子の構築において使用するために、一本鎖又は二本鎖で
あり得る。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得
る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又
は抗原性標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプ
ライマー、クローニングプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用することが
できる。
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドがその中に本来見出されるポ
リヌクレオチドの全部若しくは一部を伴っていない、又は本来連結されていないポリヌク
レオチドに連結されているゲノムのＤＮＡ又はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成起源
又はこれらの幾つかの組み合わせを意味する。この開示において、あるヌクレオチド配列
「を含む核酸分子」は完全な状態の染色体を包含しないことを理解すべきである。指定さ
れた核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０個の
若しくは最大２０個の他のタンパク質若しくはその一部に対するコード配列を含むことが
でき、又は引用されている核酸配列のコード領域の発現を調節する作用可能に連結された
制御配列を含むことができ、及び／又はベクター配列を含むことができる。
別段の記載がなければ、本明細書中に論述されているあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド
配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の方向が５’方向
と称される。新生ＲＮＡ転写物の５‘から３’への付加の方向は、転写方向と称される。
ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’である、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖
上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’である
、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
「調節配列」という用語は、調節配列が連結されているコード配列の発現及びプロセッ
シングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の
性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に対する調節配列に
は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ得る。例えば、真核生
物に対する調節配列には、転写因子に対する認識部位の１つ又は複数を含むプロモーター
、転写強化配列及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」には、リーダー配列及び／
又は融合対配列が含まれ得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞中にタンパク質コード情報を伝達するために使用
されるあらゆる分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイ
ルス）を意味する。
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており
、並びに核酸配列に作用可能に連結された１つ又はそれ以上の異種のコード領域の発現を
（宿主細胞と一緒に）誘導し、及び／又は調節する核酸配列を含有するベクターを表す。
発現構築物には、転写、翻訳に影響を及ぼし又は調節し、イントロンが存在する場合には
、作用可能に連結されているコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含
まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「作用可能に連結された」とは、この用語が適用される成
分が、適切な条件下でその固有の機能を発揮できる関係にあることを意味する。例えば、
タンパク質のコード配列に「作用可能に連結された」ベクター中の調節配列は、調節配列
の転写活性と適合的な条件下で、タンパク質コード配列の発現が達成されるように、タン
パク質コード配列に連結されている。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、又は核酸配列で形質転換
されることができ、これにより、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、
目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的に同一であるかどうか、又は元
の親細胞と遺伝的組成が同一であるかどうかを問わず、親細胞の子孫を含む。
「形質移入」という用語は、細胞による外来又は外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外
因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入されている」。多数の形質
移入技術が本分野において周知であり、本明細書中に開示されている。例えば、「Ｇｒａ
ｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６； Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６，
Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ； Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７」を参照され
たい。このような技術は、適切な宿主細胞中に１つ又はそれ以上の外来ＤＮＡ部分を導入
するために使用することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を表し、新しいＤＮＡ又はＲＮＡ
を含有するように修飾された場合に、細胞は形質転換されている。例えば、形質移入、形
質導入又は他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによって、その固有状態から
遺伝的に修飾されている場合に、細胞は形質転換されている。形質移入又は形質導入後に
、細胞の染色体中に物理的に統合することによって、形質転換されているＤＮＡは細胞の
ＤＮＡと組み換えることができ、又は複製されずに、エピソーム要素として一過性に維持
されることができ、又はプラスミドとして独立に複製することができる。形質転換されて
いるＤＮＡが細胞分裂とともに複製されるときに、細胞は、「安定に形質転換された」と
考えられる。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、原型のタンパク質、すなわち、天
然に存在する非組換え細胞によって産生されたタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子
を意味し又は「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、遺伝子操作された細胞若しくは組
換え細胞によって産生され、原型のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子又は原型配列
の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び／又は置換を有する分子を含む
。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然に存在する対応するアミノ酸及びポリ
マーの化学的類縁体であるアミノ酸ポリマーも含む。具体的には、「ポリペプチド」及び
「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の１つ又はそれ以上のアミノ酸からの
欠失、付加及び／又は置換を有するＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質、抗体又は配列を包含
する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長の原型タンパク質と比べて、アミノ末
端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを表す。こ
のような断片は、原型のタンパク質と比べて、修飾されたアミノ酸も含有する。ある種の
実施形態において、断片は約５から５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくと
も５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５
０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片
には、抗体の免疫学的に機能的な断片（結合ドメインを含む。）が含まれる。ＰＣＳＫ９
結合抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイン、抗
体鎖の一部又は２つのＣＤＲを含むその可変領域のみなどが含まれるが、これらに限定さ
れない。
引用されている「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が（１）通常
一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ源からの（
例えば、同じ種からの）他のタンパク質を実質的に含まない、（３）異なる種からの細胞
によって発現されている、（４）自然の状態で一緒に存在するポリヌクレオチド、脂質、
炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然の状態で一
緒に存在しないポリペプチドと、（共有又は非共有的相互作用によって）作用可能に結合
されている、又は（６）自然の状態で存在しないことを意味する。典型的には、「単離さ
れたタンパク質」は、ある試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約
２５％又は少なくとも約５０％を占める。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは合
成起源の他のＲＮＡ又はこれらのあらゆる組み合わせが、このような単離されたタンパク
質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的
な研究又はその他の使用を妨害する、その天然環境中に見出されるタンパク質又はポリペ
プチド又は他のきょう雑物質を実質的に含まない。
「アミノ酸」という用語は、本分野におけるその通常の意味を含む。
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質又は抗体）の「バリアント」は、別のポリ
ペプチド配列と比べて、アミノ酸配列中に１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が挿入され、
欠失され、及び／又は置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントは、融合タンパク
質を含む。
「同一性」という用語は、配列を並置及び比較することによって決定された、２つ若し
くはそれ以上のポリペプチド分子又は２つ若しくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を
表す。「％同一性」とは、比較されている分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同じ残
基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最も小さなサイズに基づいて計算さ
れる。これらの計算のために、ある種の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すな
わち、「アルゴリズム」）によって、好ましくは、（ギャップが存在する場合）並置中の
ギャップが割り当てられる。並置された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために
使用することができる方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅ
ｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，（Ｇｒｉｆ
ｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，
Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔ
ｈ．，４８：１０７３」に記載されているものが含まれる。
％同一性を計算する際には、比較されている配列は、配列間で最大の合致を与えるよう
に通例並置される。％同一性を測定するために使用することができるコンピュータプログ
ラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅ
ｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１２：３８７； Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、％配列同一性
を測定すべき２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを併置するために使用される。配
列は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適な合致が得られるように並置される（
アルゴリズムによって決定される「合致したスパン」）。ギャップオープニングペナルテ
ィ（３×平均対角として計算される。「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の
平均である。「対角」は、この比較行列による各完全なアミノ酸の合致に対して割り当て
られるスコア又は数である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニ
ングペナルティの１／１０である。）並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比
較行列が、アルゴリズムとともに使用される。ある種の実施形態において、標準的な比較
行列も、アルゴリズムによって使用される（ＰＡＭ２５０比較行列に関して、Ｄａｙｈｏ
ｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列に関して、Ｈｅｎｉ
ｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，
８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）。
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列に対する％同一性を測定
する際に使用することができるパラメータの例は、以下のとおりである。
・アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，４８：４４３−４５３
・比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記から得られるＢＬＯＳ
ＵＭ６２
・ギャップペナルティー：１２（末端ギャップに対するペナルティーはなし）
・ギャップ長ペナルティー：４
・類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を並置するためのある種の並置スキームは、２つの配列の短い領域
の合致のみをもたらす場合があり得、２つの完全長配列の間には有意な関係が存在しなく
ても、この小さな並置された領域は極めて高い配列同一性を有し得る。従って、標的ポリ
ペプチドの連続するアミノ酸の少なくとも５０又は他の数値を包含する並置をもたらすこ
とが所望されるのであれば、選択された並置法（ＧＡＰプログラム）を調整することがで
きる。
本明細書において使用される、２０の慣用（例えば、天然に存在する）アミノ酸及びそ
れらの略号は、慣用的な用法に従う。「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ． Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｇｒｅｎ，Ｅ
ｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（
１９９１））」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参
照されたい。２０の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α、α−二置
換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸などの非天然ア
ミノ酸も、本発明のポリペプチドに対する適切な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例に
は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチ
ルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホル
ミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギ
ニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含ま
れる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法と慣習に従
って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
同様に、別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端で
あり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方法が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の
５‘から３’への方向の付加は、転写の方向と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及び
ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称
される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮ
Ａ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
保存的アミノ酸置換は、生物系内での合成ではなく、通例、化学的なペプチド合成によ
って取り込まれる天然に存在しないアミノ酸を包含することができる。これらには、ペプ
チド模倣物及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転された形態が含まれる。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＩ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つの一員を別のクラスの一員で交換する
ことを含み得る。このような置換された残基は、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗
体の領域中に、又は分子の非相同領域中に導入することができる。
抗原結合タンパク質又はＰＣＳＫ９タンパク質に対して変化を施す上で、ある種の実施
形態に従えば、アミノ酸のヒドロパチー指数を検討し得る。各アミノ酸は、その疎水性及
び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている。疎水性親水性指標は、イ
ソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニ
ン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニ
ン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）
、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチ
ジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン
酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４
．５）である。
タンパク質に対する相互作用性生物機能を付与する上での疎水性親水性アミノ酸指標の
重要性は、本分野において理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性
指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお類似の生物活
性を保持することが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、ある
実施形態において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換を含む。ある実施
形態において、±１以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±０．５
以内であるアミノ酸の置換を含む。
類似アミノ酸の置換は、本事例のように、それによって産生される生物学的に機能的な
タンパク質又はペプチドを免疫学的実施形態に用いようとする場合には特に、親水性に基
づいて効果的に実施することができることも当分野では理解されている。ある実施形態に
おいては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平
均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関があ
る。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０
）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±
１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリ
シン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５
）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリ
ン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．
３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値
に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、その親水性値が±２以内であるア
ミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ
、ある実施形態において、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づ
いて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エ
ピトープコア領域」とも称される。
アミノ酸置換の例が表１に示されている。
「誘導体」という用語は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失又は置換以外の化学的修
飾を含む分子を表す。ある種の実施形態において、誘導体は、ポリマー、脂質又は他の有
機若しくは無機部分との化学的結合などの（但し、これらに限定されない。）共有修飾を
含む。ある種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、化学的に
修飾されていない抗原結合タンパク質より大きな循環半減期を有することができる。ある
種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織及
び／又は臓器に対する改善された標的誘導能力を有し得る。幾つかの実施形態において、
誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール
又はポリプロピレングリコールなど（但し、これらに限定されない。）、１つ又はそれ以
上の水溶性ポリマー付着を含むように共有的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４
０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０
，４１７号、同第４，７９１，１９２号及び同第４，１７９，３３７号を参照されたい。
ある種の実施形態において、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシ−ポリエチレン
グリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物をベースとするポリマー、ポリ
−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリ
マー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化された
ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール並びにこのようなポリマ
ーの混合物などの（但し、これらに限定されない。）１つ又はそれ以上のポリマーを含む
。
ある種の実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニッ
トで共有的に修飾されている。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポ
リマーは、１つ又はそれ以上の特定の位置で、例えば、誘導体のアミノ末端で結合されて
いる。ある種の実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の１つ
又はそれ以上の側鎖に無作為に付着されている。ある種の実施形態において、抗原結合タ
ンパク質に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある種の実施形態に
おいて、ヒト化抗体に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある種の
このような方法が、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号（参照により、あらゆる目
的のために組み込まれる。）に論述されている。
ペプチド類縁体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬と
して、医薬産業において一般的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの種類は、
「ペプチド模倣物（“ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ”又は“ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍ
ｔｉｃｓ”」と称されている。「Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．
１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．
３９２（１９８５）；及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，３０：
１２２９（１９８７）」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる
。）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借
りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の
治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト
抗体などの模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペ
プチド）と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ
２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、
−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって必要に応じて置
換された１つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ又はそれ以
上のアミノ酸を同種のＤアミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えて
Ｄ−リジン）は、ある種の実施形態において、より安定なペプチドを作製するために使用
し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変異を含む拘束
されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内
ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、
作製され得る（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．６１：３８７（１９９２）、参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込ま
れる。）。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通じて使用さ
れる「天然に存在する」という用語は、自然の状態で見出される物質又は自然の状態で見
出される物質の形態を表す。
本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、特定された標
的抗原を結合するあらゆるタンパク質を意味する。本願において、特定された標的抗原は
、ＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片である。「抗原結合タンパク質」には、抗体及びそ
の結合部分（免疫学的に機能的な断片など）が含まれるが、これらに限定されない。ペプ
チボディは、抗原結合タンパク質の別の例である。本明細書において使用される抗体又は
免疫グロブリン鎖（重鎖又は軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」（
又は単に「断片」）という用語は、完全長の鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも幾つか
を欠如するが、抗原になお特異的に結合することができる抗体の部分（当該部分がどのよ
うにして取得され、又は合成されたかを問わない。）を含む抗原結合タンパク質の種であ
る。このような断片は、標的抗原に結合し、あるエピトープへの結合に関して、完全な状
態の抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得るという点で生物学的に活性を有する
。幾つかの実施形態において、断片は、中和断片である。幾つかの実施形態において、断
片は、ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９の間の相互作用の可能性を遮断し、又は低下させることがで
きる。一態様において、このような断片は、完全長の軽鎖又は重鎖中に存在する少なくと
も１つのＣＤＲを保持し、幾つかの実施形態において、単一の重鎖及び／又は軽鎖又はそ
の一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって作製するこ
とが可能であり、又は完全な状態の抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学
的切断によって作製することが可能である。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には
、Ｆａｂ、ダイアボディ（同一鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短す
ぎる短いペプチドリンカーを介して接続された、軽鎖可変ドメインと同一のポリペプチド
上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗
体が含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科の動物又はウサ
ギなどの（但し、これらに限定されない）あらゆる哺乳動物源に由来し得る。本明細書中
に開示されている抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば、１つ又はそれ以上のＣＤＲ
は、体内の特定の標的に誘導され、二機能性治療特性を有し、又は延長された血清半減期
を有する治療剤を作製するために、第二のタンパク質又は小分子に共有結合され得る。当
業者によって理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含むことが
できる。本開示の幾つかの節において、ＡＢＰの例は、「数字／文字／数字」（例えば、
２５Ａ７）の形式で本明細書中に記載されている。これらの場合、正確な名前は特異的抗
体を表す。すなわち、２５Ａ７という名前のＡＢＰは、（本明細書において、同じである
ことが明示的に教示されていなければ（例えば、２５Ａ７及び２５Ａ７．３））、必ずし
も２５Ａ７．１という名前の抗体と同じであるとは限らない。当業者によって理解される
ように、幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲは抗原結合タンパク質ではない。幾つかの
実施形態において、ＬＤＬＲの結合サブセクションは、抗原結合タンパク質ではない（例
えば、ＥＧＦａ）。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９がそれを通じてインビボでシ
グナル伝達する他の分子は、抗原結合タンパク質でない。このような実施形態は、そのよ
うなものとして明示的に特定される。
本明細書に記載されているある種の抗原結合タンパク質は、抗体であり、又は抗体に由
来する。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノク
ローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、
「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗、ヒト抗体、抗体融合
物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、これら
の断片を含む（但し、これらに限定されない。）抗体を基礎とする。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰは、アビマー（強固に結合するペプチド）を含み、又はアビマーからなる
。これらの様々な抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されている。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１及びＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つ
の重鎖断片は、２つ又はそれ以上のジスルフィド結合によって、及びＣＨ３ドメインの疎
水的相互作用によって一緒に固定される。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖並びに１つの重鎖のＣＨ１及び可変領域を含む。Ｆａｂ
分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖とＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含有し、並びに
２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）２
分子を形成できるように、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間の領域も含有する１つの重鎖の
一部を含む。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖及び鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形
成されるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を
含有する。従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一
緒に固定された２つのＦａｂ’断片から構成される。
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠如す
る。
「一本鎖抗体」は、柔軟なリンカーによって重鎖及び軽鎖可変領域が接続されて、抗原
結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。一本鎖抗体は、国
際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９並びに米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５
，２６０，２０３号（これらの開示は、参照により組み込まれる。）に詳しく論述されて
いる。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機
能的な免疫グロブリン断片である。幾つかの事例において、二価のドメイン抗体を作製す
るために、２つ又はそれ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーを用いて共有結合される。二
価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は別異の抗原を標的とし得る。
「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価の抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。幾
つかの事例において、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパ
ク質及び二価の抗体は、二重特異的であり得る。下記を参照。「多重特異的」又は「多重
機能的」抗体以外の二価の抗体は、ある種の実施形態において、典型的には、同一のその
結合部位の各々を有するものと理解される。
「多重特異的抗原結合タンパク質」又は「多重特異的抗体」は、２以上の抗原又はエピ
トープを標的とするものである。
「二重特異的」、「デュアル特異的」又は「二重機能的」抗原結合タンパク質又は抗体
は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質又は
抗体である。二重特異的抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質
抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む（但し、これら
に限定されない。）様々な方法によって作製することができる。例えば、「Ｓｏｎｇｓｉ
ｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ， １９９０， Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．７９：３１５−３２１； Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ， １９９２， Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３」を参照されたい。二重特異的抗原結合タ
ンパク質又は抗体の２つの結合部位は、同一又は別異のタンパク質標的上に存在し得る２
つの異なるエピトープに結合する。
抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋｄ）が１０−７Ｍ以下である場合に、その標的抗
原を「特異的に結合する」と称される。ＡＢＰは、Ｋｄが５×１０−９Ｍ以下である場合
に、「高い親和性」で抗原を特異的に結合し、Ｋｄが５×１０−１０Ｍ以下である場合に
、「極めて高い親和性」で抗原を特異的に結合する。一実施形態において、ＡＢＰは、１
０−９Ｍ以下のＫｄを有する。一実施形態において、オフ速度は、１×１０−５未満であ
る。別の実施形態において、ＡＢＰは、約１０−９Ｍと１０−１３Ｍの間のＫｄでヒトＰ
ＣＳＫ９に結合し、さらに別の実施形態において、ＡＢＰは５×１０−１０以下のＫｄで
結合する。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、抗原結合断片
の何れも又は全てが、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し得る。
第二の標的への結合より、ある標的により強固に結合する場合に、抗原結合タンパク質
は「選択的」である。
「抗原結合領域」は、特定の抗原（例えば、パラトープ）を特異的に結合するタンパク
質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異
性及び親和性を抗原結合タンパク質に対して付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タ
ンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、通例、１つ又は
それ以上の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある種の抗原結合領域は、１つ又
はそれ以上の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性及び親和性
に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切な立体構造の
維持を補助して、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進することができる。構造的には、
フレームワーク領域は、抗体中においてＣＤＲ間に位置することができる。フレームワー
ク及びＣＤＲ領域の例は、図２Ａから３Ｄ、３ＣＣＣ−ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄに示
されている。幾つかの実施形態において、抗体３Ｂ６の軽鎖に対するＣＤＲの配列は以下
のとおりである。ＣＤＲ１ ＴＬＳＳＧＹＳＳＹＥＶＤ（配列番号２７９）；ＣＤＲ２
ＶＤＴＧＧＩＶＧＳＫＧＥ（配列番号２８０）；ＣＤＲ３ ＧＡＤＨＧＳＧＴＮＦＶＶＶ
（配列番号２８１）、ＦＲは、以下のとおりである。ＦＲ１ ＱＰＶＬＴＱＰＬＦＡＳＡ
ＳＬＧＡＳＶＴＬＴＣ（配列番号２８２）；ＦＲ２ ＷＹＱＱＲＰＧＫＧＰＲＦＶＭＲ（
配列番号２８３）；ＦＲ３ ＧＩＰＤＲＦＳＶＬＧＳＧＬＮＲＹＬＴＩＫＮＩＱＥＥＤＥ
ＳＤＹＨＣ（配列番号２８４）；及びＦＲ４ ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２８５）
。
ある態様において、ＰＣＳＫ９、例えば、ヒトＰＣＳＫ９を結合する組換え抗原結合タ
ンパク質が提供される。この文脈において、「組換え抗原結合タンパク質」は、組換え技
術を用いて、すなわち、本明細書中に記載されている組換え核酸の発現を通じて作製され
たタンパク質である。組換えタンパク質を作製するための方法及び技術は、本分野におい
て周知である。
「抗体」という用語は、あらゆるイソタイプの完全な免疫グロブリン又は標的抗原への
特異的結合に関して完全な状態の抗体と競合することができるその断片を表し、例えば、
キメラ、ヒト化、完全ヒト及び二重特異的抗体が含まれる。「抗体」は、抗原結合タンパ
ク質の一種である。完全な状態の抗体は、少なくとも２つの完全長重鎖及び２つの完全長
軽鎖を一般に含むが、幾つかの事例では、重鎖のみを含み得る、ラクダ科の動物中に天然
に存在する抗体などのように、より少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の源からのみ得る
ことが可能であり、又は「キメラ」であり得る（すなわち、抗体の異なる部分が、以下で
さらに記載されているように２つの異なる抗体に由来し得る。）。抗原結合タンパク質、
抗体又は結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態の抗体の酵素的若しく
は化学的切断によって、ハイブリドーマ中で製造することができる。別段の記載がなけれ
ば、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体の他に、
その誘導体、バリアント、断片及び変異タンパク質を含み、その例は以下に記載されてい
る。さらに、明示的に除外されていなければ、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異
的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、「抗体模倣物」と称
される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書にお
いて、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、これらの断片が含まれる
。幾つかの実施形態において、この用語は、ペプチボディも包含する。
天然に存在する抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。このような四量体の各々
は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から通例構成され、各対は、１つの完全長「軽」鎖（
ある種の実施形態において、約２５ｋＤａ）及び１つの完全長「重」鎖（ある種の実施形
態において、約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、通例、抗原認
識に必要とされる約１００から１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を通例含む。各
鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に必要とされ得る定常領域を通例規定する
。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として典型的に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はε
として典型的に分類され、抗体のイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ
及びＩｇＥとして規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４など
の（但し、これらに限定されない。）幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１
及びＩｇＭ２などの（但し、これらに限定されない。）サブクラスを有する。ＩｇＡは、
ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などの（但し、これらに限定されない。）サブクラスへ同様に細分
される。完全長の軽鎖及び重鎖内に、典型的には、可変及び定常領域は、約１２又はそれ
以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「
Ｄ」領域も含む。例えば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈ．
７（Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ
． （１９８９））（参照により、全ての目的のために、その全体が組み込まれる。）」
を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、通例、抗原結合部位を形成する。
可変領域は、３つの超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも称される。）によって
連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を典型的
に呈する。各対の２つの鎖から得られるＣＤＲは、フレームワーク領域によって通例並列
され、これにより、特異的なエピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端へ
、軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、通例、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２
、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、通例、免
疫学的に関心が持たれるタンパク質のＫａｂａｔ配列の定義（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９８７ ａｎ
ｄ １９９１））、又は「Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１９６：９０１−９１７ （１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３４２：８７８−８８３ （１９８９）」に従う。
ある種の実施形態において、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。あ
る種の実施形態において、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種
の実施形態において、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種
の実施形態において、抗体結合領域は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種
の実施形態において、各可変領域は、他の可変領域の不存在下で、抗原へ特異的に結合す
る。
ある種の実施形態において、ＣＤＲの確定的な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同
定は、抗体の構造を解明し、及び／又は抗体−リガンド複合体の構造を解明することによ
って達成される。ある種の実施形態において、これは、Ｘ線結晶学など、当業者に公知の
様々な技術の何れによっても達成することができる。ある種の実施形態において、ＣＤＲ
領域を同定し、又は概測するために、様々な分析の方法を使用することができる。このよ
うな方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義及び接触定義が含
まれるが、これらに限定されない。
Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基に付番するための標準であり、ＣＤＲ領域を同定する
ために典型的に使用される。例えば、「Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｗｕ， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８：２１４−８（２０００）」を参照されたい。Ｃｈｏｔｈ
ｉａ定義はＫａｂａｔ定義に類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義はある種の構造的ルー
プ領域の位置を考慮に入れている。例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１−１７ （１９８６）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａ
ｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４２：８７７−８３ （１９８９）」を参照されたい。ＡｂＭ
定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによっ
て産生されるコンピュータプログラムの一体化されたパッケージを使用する。例えば、「
Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （ＵＳＡ），
８６：９２６８−９２７２ （１９８９）；“ＡｂＭＴＭ，Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒ
ｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ； Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，
Ｌｔｄ」を参照されたい。ＡｂＭ定義は、公知のデータベースとＰＲＯＴＥＩＮＳ，
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，
３：１９４−１９８ （１９９９）中の「Ｓａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ，“Ａｂ
Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎ
ｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”によって
記載されているようなアブイニシオ法の組み合わせを用いて、一次配列から抗体の四次構
造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の解析を基礎とする。例えば
、「ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ５：７３２−４
５ （１９９６）」を参照されたい。
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は、通例、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と称され、アミノ末端
からカルボキシ末端の方向に順に付番される。軽鎖中のＣＤＲ領域は、通例、Ｌ１、Ｌ２
及びＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。
「軽鎖」という用語は、完全長の軽鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配
列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ及び定常領域ドメイ
ン、ＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽
鎖は、κ鎖及びλ鎖を含む。
「重鎖」という用語は、完全長の重鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配
列を有するその断片を含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインＶＨ及び３つの定常領域
ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に
、及びＣＨドメインはカルボキシル末端に位置し、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末
端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ
を含む。）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプを含む。）、ＩｇＭ及びＩｇＥな
どのあらゆるイソタイプのものであり得る。
二重特異的又は二重機能的抗体は、典型的には、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異
なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドー
マの融合又はＦａｂ’断片の連結などの（但し、これらに限定されない。）様々な方法に
よって産生され得る。例えば、「Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７９：３１５−３２１ （１９９０）； Ｋｏｓｔｅｌｎ
ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：１５４７−１５５３ （１９
９２）」を参照されたい。
哺乳動物の幾つかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。
それぞれの各免疫グロブリン鎖は、それぞれ概ね９０から１１０のアミノ酸からなり、
特徴的な折り畳みパターンを有する数個の「免疫グロブリンドメイン」から典型的に構成
される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトでは、
ＩｇＡ及びＩｇＤイソタイプは４つの重鎖と４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧ及びＩｇＥイソ
タイプは２つの重鎖と２つの軽鎖を含有し、並びにＩｇＭイソタイプは５つの重鎖と５つ
の軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、エフェクター機能に必要とされ得る１つ又はそれ以上
のドメインを典型的に含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。Ｉｇ
Ｇ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含
有する。提供される抗体は、これらのイソタイプ及びサブタイプの何れをも有し得る。本
発明のある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体はＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブタイプ
の抗体である。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、重鎖中にアミノ末端の約１２０から
１３０個のアミノ酸及び軽鎖中に約１００から１１０個のアミノ末端アミノ酸を通例含む
、抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部を表す。ある種の実施形態において、異なる抗体の可
変領域は、同じ種の抗体間でさえ、アミノ酸配列が大幅に異なる。抗体の可変領域は、あ
る抗体の標的に対する特異性を通例決定する。
「中和抗原結合タンパク質」又は「中和抗体」という用語は、リガンドに結合し、その
リガンドの生物学的効果を妨げ、又は低下させる、それぞれ、抗原結合タンパク質又は抗
体を表す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接封鎖することによって、又はリ
ガンドに結合し、間接的な手段（リガンド中の構造的又はエネルギー的変化など）を通じ
て、リガンドの結合能を変化させることによって行うことができる。幾つかの実施形態に
おいて、この用語は、それが結合しているタンパク質が生物学的機能を発揮するのを妨げ
る抗原結合タンパク質も表し得る。抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は免疫学的に機
能的なその断片）の結合及び／又は特異性を評価する際に、抗体の過剰が（インビトロ競
合的結合アッセイで使用された場合に）少なくとも約１から２０、２０から３０％、３０
から４０％、４０から５０％、５０から６０％、６０から７０％、７０から８０％、８０
から８５％、８５から９０％、９０から９５％、９５から９７％、９７から９８％、９８
から９９％又はそれ以上、リガンドに結合された結合対の量を低下させるときに、抗体又
は断片はその結合対へのリガンドの結合を大幅に阻害することができる。幾つかの実施形
態において、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の場合には、このような中和分子は、ＰＣＳ
Ｋ９がＬＤＬＲを結合する能力を低減させることができる。幾つかの実施形態において、
競合アッセイを介して、中和能力を性質決定し、及び／又は記載する。幾つかの実施形態
において、中和能力は、ＩＣ５０又はＥＣ５０値の観点で記載される。幾つかの実施形態
において、ＡＢＰ２７Ｂ２、１３Ｈ１、１３Ｂ５及び３Ｃ４は、非中和ＡＢＰであり、３
Ｂ６、９Ｃ９及び３１Ａ４は弱い中和物質であり、表２中の残りのＡＢＰは強い中和物質
である。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９へ結合
し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（又はＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する
能力を低下させる）ことによって中和する。幾つかの実施形態において、抗体又はＡＢＰ
は、ＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９をＬＤＬＲへ結合させながら、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ
９媒介性分解を妨げ、又は低下させることによって中和する。従って、幾つかの実施形態
において、中和ＡＢＰ又は抗体は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合をなお可能にしながら、Ｐ
ＣＳＫ９が関与するＬＤＬＲのその後の分解を妨げる（又は低下させる）。
「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合されることができる分子又は
分子の一部を表す。ある実施形態において、標的は、１つ又はそれ以上のエピトープを有
することができる。ある実施形態において、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」
という用語における「抗原」の使用は、抗原を含むタンパク質配列が抗体によって結合さ
れ得ることを単に表す。この文脈において、タンパク質は外来であること、又は免疫応答
を誘導可能であることは必要とされない。
同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク
質又は中和抗体）という文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、検査
されている抗原結合タンパク質（例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片）が共通
の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９又はその断片）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガ
ンド又は参照抗体）の特異的結合を妨げ、又は阻害する（例えば、低下させる）アッセイ
によって測定された抗原結合タンパク質間の競合を意味する。ある抗原結合タンパク質が
別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、競合的結合アッセイの多
数の種類、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間
接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ
ｅｔ ａｌ， １９８３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２
−２５３参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ， １９８６， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９参照）、固相
直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ
Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉ−１２５標識を
用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ， １９８８，Ｍｏｌｅｃ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃ
ｈｅｕｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５
２参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０，
Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２参照）を使用することができる。
典型的には、このようなアッセイは、これらの何れかを有する固体表面又はセルに結合さ
れた精製抗原、標識されていない検査抗原結合タンパク質及び標識された基準抗原結合タ
ンパク質を使用することを含む。競合的阻害は、検査抗原結合タンパク質の存在下で、固
体表面又はセルに結合された標識の量を測定することによって測定される。通常、検査抗
原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク
質（競合抗原結合タンパク質）には、基準抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合す
る抗原結合タンパク質及び立体的妨害が生じるのに、基準抗原結合タンパク質によって結
合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含
まれる。競合結合を測定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例に
提供されている。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合には、少なくとも
４０から４５％、４５から５０％、５０から５５％、５５から６０％、６０から６５％、
６５から７０％、７０から７５％又は７５％又はそれ以上、共通の抗原への基準抗原結合
タンパク質の特異的結合を阻害する（例えば、低下させる）。幾つかの事例において、少
なくとも８０から８５％、８５から９０％、９０から９５％、９５から９７％又は９７％
又はそれ以上、結合が阻害される。
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能断片
など）などの選択的結合因子によって結合され得る分子又は分子の一部を表す。幾つかの
実施形態において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を作製するために、動
物内で使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相
互作用することができる１つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質によっ
て結合され得るあらゆる決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タ
ンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合
タンパク質に直接接触する特定のアミノ酸を含む。最も頻繁には、エピトープはタンパク
質上に存在するが、幾つかの事例では、核酸などの分子の他の種類上に存在することがで
きる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基などの分子
の化学的に活性な表面基を含むことができ、特異的な三次元構造の特徴及び／又は特異的
な電荷的特長を有することができる。一般に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、
タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中において、標的抗原上のエピトープを優先
的に認識する。
本明細書において使用される「実質的に純粋な」とは、分子の記載されている種が存在
している主要な種であること、すなわち、モル濃度ベースで、同じ混合物中の他の何れの
個別の種より豊富に存在することを意味する。ある種の実施形態において、実質的に純粋
な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度を基礎とする
。）を占める組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中
に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含
む。他の実施形態において、慣用の検出法によって、きょう雑種を組成物中に検出するこ
とができず、従って、組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均一状態になる
まで対象種が精製される。
「因子」という用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生
物学的高分子又は生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。
本明細書において使用される「標識」又は「標識された」という用語は、例えば、放射
線標識されたアミノ酸の取り込み又は標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光
学的若しくは色素測定法によって検出可能な酵素活性を含有するストレプトアビジン）に
よって検出することが可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着によって、検出可能マ
ーカーを取り込むことを表す。ある実施形態において、標識又はマーカーは、治療用でも
あり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野において公知で
あり、使用することが可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含
まれるが、これらに限定されない。放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ
、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性標識
（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファター
ゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチド
エピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ド
メイン、エピトープタグ）。ある種の実施形態において、立体障害の可能性を低減するた
めに、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
本明細書において使用される「生物学的試料」という用語には、生物又は以前に生物で
あった物から得られる物質のあらゆる量が含まれるが、これらに限定されない。このよう
な生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が含まれるが、これらに
限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リ
ンパ節及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「薬剤組成物」（又は薬剤又は薬物）という用語は、患者
に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる、化学的化合物、組
成物、組成物、薬剤又は薬物を表す。薬剤組成物は、成分の２以上の種類を必ずしも必要
としない。
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物中の治療的応答を生じさせることが決定され
たＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の量を表す。このような治療的有効量は、当業者によっ
て容易に確定される。
本明細書において使用される「調節物質」という用語は、分子の活性又は機能を変化又
は改変させる化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性
又は機能の規模と比べて、分子のある種の活性又は機能の規模の増加又は減少を引き起こ
すことができる。ある種の実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性
又は機能の規模を減少させる阻害剤である。分子のある種の典型的な活性及び機能には、
結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。ある種の
典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小有機
分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、米国特許第６，６
６０，８４３号（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／８３５２５に対応する。）に記載されている。
「患者」と「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象並びに以
前に診断された疾患を有する対象、以前に認識された疾患を持たない対象、医学的な治療
を受けた対象、疾患を発症するリスクを有する対象などが含まれる。
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置及び対象が疾患又は
他のリスク因子を発症するリスクを低減する適用が含まれる。治療は、疾患の完全な治癒
を必要とするものではなく、症候又は伏在するリスク因子を低減させる実施形態を包含す
る。
「予防する」という用語は、事象の確率を１００％除去することを必要とするものでは
ない。むしろ、「予防する」という用語は、化合物又は方法の存在下で、事象の発生の確
率が低下されることを表す。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド技術及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔
、リポフェクション）のための標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製
技術は、製造業者の仕様に従って、又は本分野で一般的に実施されるように、又は本明細
書中に記載されているように実施することができる。前記技術及び手技は、本分野におい
て周知の方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な
、及びより具体的な参考文献に記載されているように、一般に実施することができる。例
えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， Ｎ． Ｙ． （１９８９））」（参照により、あらゆる目的のために本明細書中
に組み込まれる。）を参照されたい。特別な定義が与えられていなければ、本明細書中に
記載されている分析化学、合成有機化学並びに医学及び薬剤化学に関連して使用される命
名法並びにこれらの研究手技及び技術は、本分野において周知であり、一般的に使用され
るものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療のため
の標準的な技術を使用することができる。
ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リ
ポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与しているセリンプロテ
アーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ， ２００７； Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒ
ａｔ， ２００７）。ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのスブチリシン（Ｓ８）ファミ
リーのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ
．，２００３）。典型的なヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列は、図１Ａ（下線が付されている
タンパク質の「プロ」ドメインを図示する。）及び図１Ｂ（太字のシグナル配列及び下線
が付されたプロドメインを図示する。）において、配列番号１及び３として表されている
。典型的なヒトＰＣＳＫ９のコード配列が、配列番号２として表されている（図１Ｂ）。
本明細書に記載されているように、ＰＣＳＫ９タンパク質は、完全長ＰＣＳＫ９タンパク
質の断片も含むことができる。ＰＣＳＫ９タンパク質の構造は、２つのグループによって
最近解決された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， ａｎｄ Ｐｉｐｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １５：１−８， ２００７）（何れも、参
照により、全体が本明細書に組み込まれる。）。ＰＣＳＫ９は、シグナル配列、Ｎ末端プ
ロドメイン、スブチリシン様触媒ドメイン及びＣ末端ドメインを含む。
ヒトＰＣＳＫ９を含むＰＣＳＫ９を結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）は、本明細
書中に記載されている。幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、
本明細書に記載されているように、１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
ポリペプチドである。同じ抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、ＣＤＲの適切な抗原
結合特性が達成されるようにＣＤＲを方向付ける「フレームワーク」領域中に包埋されて
いる。幾つかの実施形態において、本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質は、
ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を妨害し、遮断し、低下させ、又は調節することがで
きる。このような抗原結合タンパク質は、「中和」と表される。幾つかの実施形態におい
て、抗原結合タンパク質が中和性であり、ＰＣＳＫ９に結合されている場合でさえ、ＰＣ
ＳＫ９とＬＤＬＲ間の結合はなお起こり得る。例えば、幾つかの実施形態において、ＡＢ
Ｐは、ＰＣＳＫ９上のＬＤＬＲ結合部位を封鎖することなく、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ
９の悪影響を妨げ、又は低下させる。従って、幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｐ
ＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の結合相互作用を抑制する必要なしに、ＬＤＬＲの分解をもたらす
ＰＣＳＫ９の能力を調節し、又は変化させる。このようなＡＢＰは、「非競合的に中和す
る」ＡＢＰと特に記載することができる。幾つかの実施形態において、中和ＡＢＰは、Ｐ
ＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる位置及び／又は様式で、ＰＣＳＫ９に結合する
。このようなＡＢＰは、「競合的に中和する」ＡＢＰと特に記載することができる。上記
中和物質は何れも、対象中に存在している遊離のＬＤＬＲのより大きな量をもたらすこと
ができ、これにより、ＬＤＬに結合しているより多くのＬＤＬＲがもたらされる（これに
より、対象中のＬＤＬの量を低下させる。）。続いて、これは、対象中に存在する血清コ
レステロールの量の低下をもたらす。
幾つかの実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合タンパク質は、ＰＣＳ
Ｋ９によって媒介される活性（結合を含む。）を阻害することができる。幾つかの実施形
態において、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、ＰＣＳＫ
９とＬＤＬＲの間の相互作用及びＰＣＳＫ９によって媒介される他の生理学的効果を阻害
する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫに対する完全ヒト抗
体など、ヒトである。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する。幾つか
の実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に結合する。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のプロドメイン中に結合する。幾つかの実施形態において
、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、Ａ
ＢＰは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合できない様式で、又は効率的には結合できない様式
で、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒
ドメインのＣ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触
媒ドメインのＮ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９タ
ンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、本明
細書中に論述されている抗体によって結合されるエピトープの何れか１つに結合する。幾
つかの実施形態において、これは、本明細書中に開示されている抗体と他の抗体の間の競
合アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２
に記載されている抗体の１つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形
態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合して、Ｐ
ＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、
ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９
のＶドメインに結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（低下させる）。幾
つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＬＤＬＲへのＰ
ＣＳＫ９の結合を妨げずに（又は低下させずに）、ＰＣＳＫ９を通じて媒介されるＬＤＬ
Ｒに対する有害な活性を妨げ、又は低下させる。
本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。抗原結合タ
ンパク質の幾つかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＰＣＳＫ９、特に、ヒトＰＣＳＫ９
又はそのリガンドのアフィニティー精製において、及びＰＣＳＫ９活性の他のアンタゴニ
ストを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質
の幾つかは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害し、又はＰＣＳＫ９によって媒介され
る活性を阻害するのに有用である。
抗原結合タンパク質は、本明細書中に説明されているように、様々な治療用途において
使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパ
ク質は、本明細書中にさらに記載されているように、高コレステロール血症などのコレス
テロール関連疾患（又は「血清コレステロール関連疾患」）など、ＰＣＳＫ９と関連する
症状を治療するのに有用である。抗原結合タンパク質に対する他の使用には、例えば、Ｐ
ＣＳＫ９関連疾患又は症状の診断及びＰＣＳＫ９の存在又は不存在を決定するためのスク
リーニングアッセイが含まれる。本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の幾つ
かは、ＰＣＳＫ９活性と関連する結果、症候及び／又は病変を治療する上で有用である。
幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のＣ
ＤＲ（例えば、１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲ）を含む。幾つかの実施形態におい
て、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造及び（ｂ）ポリペプチド構造中に挿
入され、及び／又は連結された１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、
様々な異なる形態を採ることができる。例えば、ポリペプチド構造は、天然に存在する抗
体のフレームワーク又はその断片若しくはバリアントであり得、若しくはこれらを含むこ
とができ、又は性質上、完全に合成であり得る。様々なポリペプチド構造の例は、以下に
さらに記載されている。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であり、
又はモノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明
細書では、「抗体模倣物」と称される場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融
合物（本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。）及びそれぞれ、各々
の一部若しくは断片を含む（但し、これらに限定されない。）抗体に由来する。幾つかの
事例において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片である（例えば、Ｆａｂ、Ｆ
ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ）。様々な構造は、本明細書中にさらに記載及び定
義されている。
本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質の幾つかは、ヒトＰＣＳＫ９に特異的
に及び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配
列番号３の残基１５３から６９２を有する及び／又はからなるヒトＰＣＳＫ９タンパク質
に、特異的に及び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、配列
番号３の残基３１から１５２を有する及び／又はからなるヒトＰＣＳＫ９に、特異的に及
び／又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａに図示されて
いるヒトＰＣＳＫ９タンパク質（配列番号１）に選択的に結合する。幾つかの実施形態に
おいて、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９タンパク質の少なくとも断片及び／又はシグ
ナル配列あり若しくはなしの完全長ＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する。
抗原結合タンパク質が治療用途のために使用される実施形態において、抗原結合タンパ
ク質は、ＰＣＳＫ９の１つ又はそれ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節する
ことができる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に
結合し、及び／又は（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおける結合を測定すること
によって）少なくとも約２０％から４０％、４０から６０％、６０から８０％、８０から
８５％又はそれ以上、ＬＤＬＲへのヒトＰＣＳＫ９の結合を実質的に阻害する。本明細書
において提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、抗体である。幾つかの実施形態にお
いて、ＡＢＰは、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２
、１０−１３Ｍより小さいＫｄを有する（より強固に結合する）。幾つかの実施形態にお
いて、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９へのＬＤＬＲの結合の遮断に関して、１μＭ未満、１０００
ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１ｎＭ、１０００ｐＭから
５００ｐＭ、５００ｐＭから２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭから１５０ｐＭ、
２００ｐＭから１００ｐＭ、１００ｐＭから１０ｐＭ、１０ｐＭから１ｐＭのＩＣ５０を
有する（Ｄ３４７Ｙ、高親和性バリアント）。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ２重鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５４、図
３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ４重鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５５、図
３ＫＫに示されているアミノ酸配列を有する。
抗ＰＣＳＫ９抗体のκ軽鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５７、図３ＫＫに示され
ているアミノ酸配列を有する。
抗ＰＣＳＫ９抗体のλ軽鎖定常ドメインの一例は、配列番号１５６、図３ＫＫに示され
ているアミノ酸配列を有する。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、３つの超可変領域（より頻繁には、「相補性決定領域
」又はＣＤＲと称される。）によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領
域（ＦＲ）を含む同一の全体構造を一般に呈する。上記各重鎖／軽鎖対の２つの鎖から得
られたＣＤＲは、標的タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９）上の特異的エピトープと特異的
に結合する構造を形成するために、フレームワーク領域によって典型的に並列される。Ｎ
末端からＣ末端へ、天然に存在する軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、これらの要素の以下
の順序と通例合致する。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦ
Ｒ４。これらの各ドメイン中の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるために、付番シ
ステムが考案されている。この付番システムは、「Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （１９
８７ ａｎｄ １９９１， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）」又は「Ｃｈｏｔｈ
ｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， １９８７， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；
Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８
３」において定義されている。
様々な重鎖及び軽鎖可変領域が本明細書中に提供されており、図２Ａから３ＪＪ及び３
ＬＬから３ＢＢＢ中に図示されている。幾つかの実施形態において、これらの可変領域の
各々は、それぞれ、完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成するために、上記重鎖及び軽鎖定常領
域に付着させることができる。さらに、完全な抗体構造を形成するために、このようにし
て作製された重鎖及び軽鎖配列の各々を組み合わせることが可能である。
提供されている抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の幾つかの具体例及びそれらの対応する
アミノ酸配列は表２中に要約されている。
同じく、表２に列記されている典型的な可変重鎖の各々は、抗体を形成するために、表
２に示されている典型的な可変軽鎖の何れとも組み合わせることができる。表２は、本明
細書中に開示されている抗体の幾つかの中に見出される典型的な軽鎖及び重鎖の対を示し
ている。幾つかの例では、抗体は、表２に列記されているものから得られる少なくとも１
つの可変重鎖と１つの可変軽鎖を含む。他の例では、抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つ
の同一の重鎖を含有する。一例として、抗体又は抗原結合タンパク質は、重鎖及び軽鎖、
２つの重鎖又は２つの軽鎖を含むことができる。幾つかの実施形態において、抗原結合タ
ンパク質は、表２に列記されている配列の少なくとも１つから得られる１、２及び／又は
３つの重及び／又は軽ＣＤＲ（これらの配列に対するＣＤＲは、図２Ａから３Ｄ並びに図
３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態中に概説されている。）を
含む（及び／又はからなる）。幾つかの実施形態において、６つのＣＤＲ（軽鎖からのＣ
ＤＲ１から３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）及び重鎖からのＣＤＲ１から３（
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）は、ＡＢＰの一部である。幾つかの実施形態に
おいて、１、２、３、４、５又はそれ以上のＣＤＲが、ＡＢＰ中に含まれている。幾つか
の実施形態において、表２中の配列中のＣＤＲから得られる１つの重及び１つの軽ＣＤＲ
が、ＡＢＰ中に含まれる（表２中の配列に対するＣＤＲは、図２Ａから３Ｄ中に概説され
ている。）。幾つかの実施形態において、（例えば、図２Ａから２Ｄ、３Ａから３Ｄ中に
、並びに３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態中に図示されてい
るような）さらなる区画も、ＡＢＰ中に含まれる。表２中に記載されている重鎖及び軽鎖
に対するＣＤＲ及びＦＲの例は、図２Ａから３Ｄ（並びに図３ＣＣＣから３ＪＪＪ及び１
５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態）中に概説されている。場合によって存在する軽鎖可変
配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。）は
、以下から選択することができる。５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３
５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６。場合によって存在する重鎖可
変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む。）
は、以下から選択することができる。７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２
、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、
６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０。図２Ａから３Ｄ中の
エントリーの幾つかでは、配列の変動又はＣＤＲ及びＦＲの別の境界が特定されている。
これらの代替物は、ＡＢＰ名の後の「ｖｌ」によって同定されている。これらの代替物の
殆どは本来僅かなので、相違を有する区画のみが表中に示されている。軽鎖又は重鎖の残
りの区画は他のパネル中の基本ＡＢＰに対して示されているものと同じであることが理解
される。従って、図２Ｃ中では、相違のみが記載されているので、例えば、図２Ｃ中の１
９Ｈ９ｖｌは、図２Ａ中の１９Ｈ９と同じＦＲ１、ＣＤＲ１及びＦＲ２を有する。核酸配
列の３つ（ＡＢＰ２６Ｅ１０、３０Ｂ９及び３１Ｂ１２）に対して、さらなる別の核酸配
列が図中に提供されている。当業者によって理解されるように、抗体又はＡＢＰの作製に
おいて、実際には、このような配列の１つ以下を使用する必要がある。実際に、幾つかの
実施形態において、特異的な重鎖又は軽鎖核酸の１つのみが存在する必要があり、又は全
く存在する必要がない。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２中のタンパク質配列の何れかをコードする
ことができる核酸配列によってコードされる。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＬＤＬＲに結合するＰＣＳＫ９の形態（例えば
、当該分子の自己触媒化された形態）へ選択的に結合する。幾つかの実施形態において、
抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｃ末端（例えば、ｃ末端中の５、５から１０、１
０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から３０、３０から４０の多くのアミノ
酸）に結合しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインの
ｎ末端（例えば、ｎ末端中の５、５から１０、１０から１５、１５から２０、２０から２
５、２５から３０、３０から４０の多くのアミノ酸）に結合しない。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸１から１００内のアミノ酸に結合す
る。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、アミノ酸３１から１００、１００から２００
、３１から１５２、１５３から６９２、２００から３００、３００から４００、４５２か
ら６８３、４００から５００、５００から６００、３１から６９２、３１から４４９及び
／又は６００から６９２内のアミノ酸（及び／又はこれらからなるアミノ酸配列）に結合
する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形
態において、中和及び／又は非中和ＡＢＰは、プロドメインに結合する。幾つかの実施形
態において、ＡＢＰは、触媒及びプロドメインの両方に結合する。幾つかの実施形態にお
いて、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合して、プロドメインと相互作用する触媒ドメイン上
の領域を塞ぐ。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他（Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ１５：１から８（２００７）（その中の立体表示も含めて、その全体が、参照により、
本明細書に組み込まれる。）に概説されているように、プロドメインが相互作用する位置
又は表面において触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは触媒ド
メインに結合し、プロドメインの移動性を制約する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ
は、プロドメインに結合することなしに、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９をＬＤＬＲに結合させるようにプロドメインが再配向する
のを妨げながら、プロドメインに結合することなしに、触媒ドメインに結合する。幾つか
の実施形態において、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他中のプロドメインの周囲の残基１４９から
１５２と同じエピトープ中に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、Ｖドメイ
ン上の（Ｐｉｐｅｒ他において概説されているような）溝に結合する。幾つかの実施形態
において、ＡＢＰは、Ｖドメイン上の溝に近いヒスチジンに富むパッチに結合する。幾つ
かの実施形態において、（Ｖドメインに結合する）このような抗体は、中和でない。幾つ
かの実施形態において、Ｖドメインに結合するこのような抗体は、中和である。幾つかの
実施形態において、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げる。幾つかの実
施形態において、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９分解を妨げながら、ＬＤＬＲへの
ＰＣＳＫの結合を妨げない（例えば、ＡＢＰ３１Ａ４）。幾つかの実施形態において、Ａ
ＢＰは、Ｐｉｐｅｒ他の論文の図４に図示されているヒスチジンの少なくとも１つに結合
し、又は遮断する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９中の触媒三連構造
を遮断する。
幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９に比べて、バリアントＰＣＳＫ
９タンパク質（例えば、Ｄ３７４Ｙ）へ選択的に結合する。幾つかの実施形態において、
これらの抗体は、（Ｋｄを介して測定した場合に）野生型より少なくとも２倍強くバリア
ントに結合し、好ましくは、２から５、５から１０、１０から１００、１００から１００
０、１０００から１０，０００倍又はそれ以上、野生型より変異体に強く結合する。幾つ
かの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用することを阻害
する能力を上回って、バリアントＤ３７４ＹＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用することを
選択的に阻害する。幾つかの実施形態において、これらの抗体は、（ＩＣ５０を介して測
定した場合に）野生型がＬＤＬＲに結合する能力より強く、バリアントがＬＤＬＲに結合
する能力を遮断する（例えば、野生型より少なくとも２倍強く、好ましくは、野生型より
２から５、５から１０、１０から１００、１００から１０００倍又はそれ以上強く変異体
に）。幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９のバリアン
ト形態（Ｄ３７４Ｙなど）の両方に同様のレベルで結合し、中和する。幾つかの実施形態
において、抗体はＰＣＳＫ９に結合して、ＬＤＬＲのバリアントがＰＣＳＫ９に結合する
のを妨げる。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲのバリアントは、ヒトＬＤＬＲと少な
くとも５０％同一である。ＬＤＬＲのバリアントは、当業者に公知であることが注目され
る（例えば、ＢｒｏｗｎＭＳ他、“Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｇｅｓ， ａｃｉｄ ｂａｔｈ
ｓ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ” Ｎａｔｕｒｅ ３８８：６２
９−６３０， １９９７）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、ヘテロ接合の家族性
高コレステロール血症（ＬＤＬＲの機能喪失バリアントが存在する。）中の有効ＬＤＬＲ
のレベルを上昇させることができる。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示されているＰ
ＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０
、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９
のバリアントに結合する（但し、遮断しない）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、
図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくとも５
０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５
から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９のバリアントに結合する（但し、遮断
しない）。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、図１Ａ及び／又は図１Ｂ中に図示され
ているＰＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０
から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰ
ＣＳＫ９のバリアントに結合し、ＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態
において、ＡＢＰは、図１Ｂ中に図示されているＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくと
も５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９
５から９９又はそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９のバリアントに結合し、ＬＤＬＲと
相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９のバリアントは、４７
４位におけるバリアント、Ｅ６２０Ｇ及び／又はＥ６７０Ｇなどのヒトバリアントである
。幾つかの実施形態において、４７４位のアミノ酸は（他のヒトにおけるように）バリン
又は（カニクイザル及びマウスにおけるように）スレオニンである。本明細書中に提示さ
れている交叉反応性のデータに鑑みれば、本抗体は上記バリアントへ容易に結合するもの
と考えられる。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、表２に記載されている抗体の１つによって結合
されるエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣ
ＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合して、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨
げる。
ヒト化された抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書において記載されているように、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、
ヒト化抗体及び／又はその一部を含むことができる。このような戦略の重要な実用的用途
は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。
ある種の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトの中で実質的に非免疫原性である。あ
る種の実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化抗体がそこから誘導された別の種由来の
抗体と、標的に対する実質的に同一の親和性を有する。例えば、米国特許第５，５３０，
１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特
許第５，５８５，０８９号を参照されたい。
ある種の実施形態において、その免疫原性を低下させながら、抗原結合ドメインの固有
の親和性を減弱させずに修飾可能な抗体可変ドメインのアミノ酸が同定される。例えば、
米国特許第５，７６６，８８６号及び米国特許第５，８６９，６１９号を参照されたい。
ある種の実施形態において、本分野において公知の方法による抗体の修飾は、標的に対
する増加された結合親和性を達成するように、及び／又はレシピエント中での抗体の免疫
原性を低下させるように典型的に設計される。ある種の実施形態において、その同族抗原
に対する抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化部位を除去するように、ヒト化
抗体が修飾される。例えば、「Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３
０：１３６１−１３６７ （１９９３）」を参照されたい。ある種の実施形態において、
「再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「超キメラ化」又は「ベニアリング／リサーフェシ
ング」などの技術が、ヒト化抗体を作製するために使用される。例えば、「Ｖａｓｗａｍ
ｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ， ＆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５（１９９８）；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔ．
Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９：８９５−９０４（１９９６）」及び米国特許第６，０７２，０
３５号を参照されたい。ある種のこのような実施形態において、このような技術は、外来
残基の数を低下させることによって、抗体の免疫原性を典型的には低下させるが、抗体の
反復投与後における抗イディオタイプ応答及び抗アロタイプ応答を妨げない。免疫原性を
低下させるためのある種の他の方法が、例えば、「Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６２（６）：３６６３−７１ （１９９９）」に記載され
ている。
ある種の事例において、ヒト化抗体は、抗原結合能の低下をもたらす。ある種の実施形
態において、ヒト化抗体は、「逆変異」される。ある種のこのような実施形態において、
ヒト化抗体は、ドナー抗体中に見出されるアミノ酸残基の１つ又はそれ以上を含むように
変異される。例えば、「Ｓａｌｄａｎｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
３６：７０９−１９ （１９９９）」を参照されたい。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の相補性
決定領域（ＣＤＲ）を同じ種又は別の種から得られるフレームワーク領域（ＦＲ）に移植
することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽鎖及び重鎖
可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒト
ＦＲを作製するために、ある種の実施形態において、コンセンサスアミノ酸配列を同定す
るために、幾つかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列から得られるＦＲが並置される。ある
種の実施形態において、ＰＣＳＫ９重鎖又は軽鎖に対する抗体のＦＲは、異なる重鎖又は
軽鎖から得られるＦＲで置換される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗
体の重鎖及び軽鎖のＦＲ中の稀なアミノ酸は置換されないのに対して、ＦＲアミノ酸の残
りが置換される。稀なアミノ酸は、ＦＲ中にそれらが通常見いだされない位置に存在する
特定のアミノ酸である。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体から得られ
る移植された可変領域は、ＰＣＳＫ９に対する抗体の定常領域と異なる定常領域とともに
使用することができる。ある種の実施形態において、移植された可変領域は、一本鎖Ｆｖ
抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許
第６，０５４，２９７号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，８５９，２
０５号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許
第５，５８５，０８９号及び米国特許第５，５３０，１０１号中に、並びにＪｏｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃ
ｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；
Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３
６ （１９８８）， Ｗｉｎｔｅｒ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．， ４３０：９２−９４
（１９９８）（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に
記載されている。
ヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載されているように、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、ヒト
（すなわち、完全ヒト）抗体及び／又はその一部を含むことができる。ある種の実施形態
において、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列並びに重鎖及
び軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、可変領域に対応する配列が提供さ
れる。ある種の実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、ＣＤＲ１からＣＤ
Ｒ３に対応する配列が提供される。ある種の実施形態によれば、このような免疫グロブリ
ン分子を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある種の実施形態によれば、この
ようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある種の実施
形態において、ハイブリドーマ細胞株は、表２中に記載されている細胞株の少なくとも１
つ、例えば、２１Ｂ１２、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４から選択される。ある種の実施形態に
おいて、ヒトＰＣＳＫ９に対する精製されたヒトモノクローナル抗体が提供される。
マウス抗体の不存在下でマウスがヒト抗体を産生することを期待して、ヒトＩｇ遺伝子
座の巨大断片を用いて、マウス抗体産生が欠損するマウス株を改変することができる。巨
大ヒトＩｇ断片は、巨大な可変遺伝子多様性並びに抗体産生及び発現の適切な制御を保存
することができる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性
の欠如のためにマウスの機構を活用することによって、これらのマウス系統中の再生され
たヒト抗体レパートリーは、目的とするあらゆる抗原（ヒト抗原を含む。）に対して、高
親和性完全ヒト抗体を与えることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性
を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを作製し、選択することができる。ある種の典型的な方法
は、ＷＯ９８／２４８９３、米国特許第５，５４５，８０７号、ＥＰ５４６０７３及びＥ
Ｐ５４６０７３に記載されている。
ある種の実施形態において、ヒト可変領域とともに、ヒト以外の種から得られる定常領
域を使用することができる。
酵母人工染色体（ＹＡＣ）中でメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構
築する能力、並びにマウス生殖系列中にそれらを導入する能力によって、極めて巨大な又
は大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的成分を解明し、及びヒト疾病の有用なモデ
ルを作製するためのアプローチが与えられる。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均
等物で置換するためのこのような技術の使用によって、発達中のヒト遺伝子産物の発現及
び制御、他の系とのそれらのやり取り並びに疾病の誘導及び進行におけるそれらの関与に
対する洞察が与えられ得る。
ヒト抗体は、マウス又はラットの可変及び／又は定常領域を有する抗体に伴う問題の幾
つかを回避する。このようなマウス又はラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速な
排除をもたらすことができ、又は患者による、抗体に対する免疫応答の生成をもたらすこ
とができる。マウス又はラットに由来する抗体の使用を回避するために、げっ歯類、他の
哺乳動物又は動物が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類、他の哺乳動物又は動物中
に機能的なヒト抗体遺伝子座の導入を通じて、完全ヒト抗体を作製することができる。
ヒト化抗体は、まずヒトでない抗体アミノ酸配列を含有することから開始しながら、ヒ
ト抗体配列で置換されたこれらの非ヒト抗体アミノ酸配列の少なくとも幾つかを有する抗
体である。これは、ヒトを有する遺伝子によって抗体がコードされる（又はコードされる
ことができる）ヒト抗体とは異なる。
抗原結合タンパク質のバリアント
提供される他の抗体は、表２中に示されている可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせ又は
サブパートによって形成され、表２中の配列（配列全体又は配列のサブパート（例えば、
１つ又はそれ以上のＣＤＲ））のアミノ酸配列に対して、それぞれ、少なくとも５０％、
５０から６０、６０から７０、７０から８０％、８０から８５％、８５から９０％、９０
から９５％、９５から９７％、９７から９９％又は９９％超の同一性を有する可変軽鎖及
び／又は可変重鎖を含む上掲のＡＢＰバリアントである。幾つかの事例において、このよ
うな抗体は、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含むのに対して、他の事例において
、バリアント形態は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖（又はこれらのサブパート
）を含有する。幾つかの実施形態において、結合に影響を及ぼす変動及び結合に影響を及
ぼさないと思われる変動を観察することによって修飾することが可能な抗体の区画を同定
するために、図２Ａから３Ｄ（並びに１３Ａから１３Ｊ及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実
施形態）中の配列比較を使用することができる。例えば、類似の配列を比較することによ
って、修飾可能な区画（例えば、特定のアミノ酸）を同定し、ＡＢＰの機能性をなお保持
しながら（又は改善しながら）、それらをどのようにして修飾することができるかを同定
することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰのバリアントは、図１３Ａ、１３
Ｃ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１３Ｉ及び／又は１３Ｊに図示されているコンセンサス基
及び配列を含み、変動は、図中に可変として同定される位置において可能である。図１３
Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ及び１３Ｇに示されているＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法（構造ループ
領域の位置に基づく。例えば、“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂ
ｕｌｉｎｓ” Ｂｉｓｓａｎ Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ， Ａｒｔｈｕｒ Ｍ． Ｌｅｓ
ｋ ａｎｄ Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２７３（４）：９２７−９４８， ７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ （１
９９７）を参照されたい。）とＫａｂａｔ法（配列変動性に基づく。例えば、Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅ
ｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１
−３２４２， Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９１）を参照されたい。）のハイブ
リッド組み合わせに基づいて定義された。何れかの方法によって決定された各残基は、Ｃ
ＤＲ残基の最終リスト中に含まれた（図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ及び１３Ｇに記載されて
いる。）。図１３Ｈ、１３Ｉ及び１３Ｊ中のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法のみによって得られ
た。別段の記載がなければ、図１３Ｈから１３Ｊ中の定義されたコンセンサス配列、ＣＤ
Ｒ及びＦＲは、図１３中において参照されているＡＢＰに対する表記ＣＤＲ及びＦＲを定
義し、調節する。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２
、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、
９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び
６０の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミ
ノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパ
ク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８
、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、
７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０の配列の少なくとも１つから選択されるア
ミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。あ
る種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６
７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１
、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び６０
の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸
配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２
、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、
９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び
６０の配列の少なくとも１つ中のＣＤＲから得られる１つ又はそれ以上のＣＤＲと少なく
とも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの
実施形態において、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ（それぞれ、上記配列と少なく
とも９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２
、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、
９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１及び
６０の配列の少なくとも１つ中のＦＲから得られる１つ又はそれ以上のＦＲと少なくとも
９０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施
形態において、１、２、３又は４つのＦＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９
０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２
、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、
３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の
配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配
列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は
、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある種の実施形
態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２
、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の配列の少なくとも
１つから選択されたアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む可変領域
を含む軽鎖を含む。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２
、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、
３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の
配列の少なくとも１つ中のＣＤＲから得られる１つ又はそれ以上のＣＤＲと少なくとも９
０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形
態において、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９
０％、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２
、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、
３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４及び４６の
配列の少なくとも１つ中のＦＲから得られる１つ又はそれ以上のＦＲと少なくとも９０％
、９０から９５％及び／又は９５から９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態に
おいて、１、２、３又は４つのＦＲ（それぞれ、上記配列と少なくとも９０％、９０から
９５％及び／又は９５から９９％同一である。）が存在する。
本開示に照らして、当業者は、周知の技術を用いて、本明細書中に記載されているよう
に、ＡＢＰの適切なバリアントを決定することができる。ある種の実施形態において、当
業者は、活性にとって重要でないと思われる領域を標的とすることによって、活性を破壊
せずに変化させ得る分子の適切な領域を同定することができる。ある種の実施形態におい
て、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる
。ある種の実施形態において、生物活性にとって又は構造にとって重要であり得る領域で
さえ、生物活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミ
ノ酸置換に供することができる。
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同
定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較に照らして、類似のタン
パク質中の活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のア
ミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なア
ミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことができる。
当業者は、三次元構造及び類似のＡＢＰ中のその構造に関連するアミノ酸配列を分析す
ることもできる。このような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、抗体
のアミノ酸残基の並置を予測することができる。ある種の実施形態において、タンパク質
の表面上に存在すると予想されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関連し得
るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化がおこらないように選択すること
ができる。さらに、当業者は、それぞれの所望されるアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換
を含有する検査バリアントを作製することができる。次いで、バリアントは、当業者に公
知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このようなバリアントは、
適切なバリアントについての情報を収集するために使用することができる。例えば、ある
アミノ酸残基への変化が、破壊された活性、望ましくないように低下された活性又は不適
切な活性をもたらすことを発見した場合には、このような変化を有するバリアントは避け
ることができる。換言すれば、このような定型的実験から収集された情報に基づいて、当
業者は、単独で、又は他の変異と組み合わせて、さらなる置換が回避されるべきアミノ酸
を容易に決定することができる。
多数の科学文献が、二次構造の予測をテーマとしている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．， Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７（４）：４２２−４２７ （１９９６），
Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３（２）：２２２−２４５
（１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１３（
２）：２１１−２２２ （１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．ＡｒｅａｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ４７：４５−１４８ （１９７
８）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２５
１−２７６ ａｎｄ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．， ２６：３６
７−３８４ （１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、
現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相
同性のモデル化に基づいている。例えば、３０％を上回る配列同一性を有する又は４０％
を上回る類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似の構造的
トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達は、ポリペプ
チド又はタンパク質の構造内に存在する可能性がある折り畳みの数など、二次構造の増大
した予測可能性をもたらした。「Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅ
ｓ．， ２７（１）：２４４−２４７ （１９９９）」を参照されたい。あるポリペプチ
ド又はタンパク質中に、折り畳みの限定された数が存在すること、及び一旦、一定のレベ
ルを超える数の構造が解明されたら、構造的な予測は、劇的により正確になることが示唆
されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ
．， ７（３）：３６９−３７６ （１９９７））。
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊ
ｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３
７７−８７ （１９９７）； Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４（
１）：１５−１９ （１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３：１６４−１７０（１９９１）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ
ａｌ， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．， １８３：１４６−１５９ （１９９０）； Ｇｒ
ｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４（
１３）：４３５５−４３５８ （１９８７））及び「進化的連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａ
ｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，上記（１９９９）， ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，
上記（１９９７）参照）が含まれる。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質バリアントには、親ポリペプチドのア
ミノ酸配列と比べて、グリコシル化合部位の数及び／又は種類が変化を受けているグリコ
シル化バリアントが含まれる。ある種の実施形態において、タンパク質バリアントは、固
有のタンパク質より多数の又は少数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコ
シル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘと表記されている
アミノ酸残基は、プロリンを除くあらゆるアミノ酸残基であり得る。）によって特徴付け
られる。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖を付加す
るための新たな候補部位を与える。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合
型炭水化物鎖を除去する。１つ又はそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、
天然に存在するもの）が除去され、１つ又はそれ以上の新しいＮ結合型部位が作製される
Ｎ結合型炭水化物鎖の再構成も提供される。さらなる好ましい抗体バリアントには、親ア
ミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のシステイン残基が欠失され、又は別のアミノ酸
（例えば、セリン）に置換されているシステインバリアントが含まれる。可溶性封入体の
単離後などに、生物学的に活性な立体構造へ抗体が再折り畳みされなければならない場合
に、システインバリアントは有用であり得る。システインバリアントは、固有のタンパク
質より少ないシステイン残基を一般に有し、対を形成していないシステインから生じた相
互作用を最大化するために、通例、偶数を有する。
ある種の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を
低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）
タンパク質複合体を形成させるために結合親和性を変化させるアミノ酸置換、（４）結合
親和性を変化させるアミノ酸置換及び／又は（４）このようなポリペプチドに対して他の
物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾するアミノ酸置換である。ある種の実
施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（ある実施形態において、保存的なアミノ
酸置換）は、天然に存在する配列中に（ある実施形態において、分子間接触を形成するド
メイン外のポリペプチドの部分中に）作製され得る。ある種の実施形態において、保存的
アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を典型的には実質的に変化させない場合があり得る
（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを切断する傾向がないはずであ
り、又は親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を崩壊させる傾向がないはずである。）
。本分野で認められるポリペプチド二次及び三次構造の例は、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ （Ｃｒｅｉ
ｇｈｔｏｎ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４））； Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｃ． Ｂｒａｎｄｅｎ ＆ Ｊ． Ｔｏｏｚｅ， ｅｄｓ．，
Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ． （１９
９１））； ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：１０
５ （１９９１）」（それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に記載さ
れている。
幾つかの実施形態において、バリアントは、本明細書中に開示されているＡＢＰの核酸
配列のバリアントである。当業者は、ＡＢＰタンパク質バリアントを同定し、評価し、及
び作製するために、また、これらのタンパク質バリアントをコードし得る核酸配列に対し
て、上記考察を使用できることを理解する。従って、タンパク質バリアントをコードする
核酸配列（及び表２中のＡＢＰをコードするが、本明細書中に明示的に開示されている核
酸配列とは異なる核酸配列）が想定される。例えば、ＡＢＰバリアントは、配列番号１５
２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０
２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１
２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２
２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３
２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４
２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１中に記
載されている少なくとも１つの核酸配列又は配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４
、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、
１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、
１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、
１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、
１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、
１４６、１４７、１４８、１４９、１５０及び１５１中の核酸配列によってコードされる
ＣＤＲの少なくとも１つから６つ（及びこれらの様々な組み合わせ）と少なくとも８０、
８０から８５、８５から９０、９０から９５、９５から９７、９７から９９若しくはそれ
以上の同一性を有することができる。
幾つかの実施形態において、厳格な条件下で、特定のＡＢＰをコードする核酸配列（又
は核酸配列そのもの）が表２中のタンパク質をコードする核酸配列の何れか（配列番号１
５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１
０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１
１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１
２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１
３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１
４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０及び１５１な
ど（但し、これらに限定されない。））に選択的にハイブリッド形成することができるの
であれば、抗体（又は抗体をコードする核酸配列）はバリアントである。一実施形態にお
いて、適切な中度に厳格な条件は、５×ＳＳＣ；０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）の溶液中での事前洗浄、５０℃、−６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリ
ッド形成、又は種間相同性の場合には、０．５×ＳＳＣでの４５℃のハイブリッド形成、
次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣの各々とともに、
２０分間、６５℃で２回の洗浄を含む。このようなハイブリッド形成ＤＮＡ配列も、コー
ド縮重のために、ハイブリッド形成ＤＮＡ配列によってコードされる抗体ポリペプチド及
びこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と
同様に、本発明の範囲に属する。幾つかの実施形態において、ＣＤＲのバリアントには、
上記配列内のＣＤＲの１つ又はそれ以上（図２Ａから３Ｄ並びに図３ＣＣＣから３ＪＪＪ
及び１５Ａから１５Ｄ中の他の実施形態に照らして、各ＣＤＲは容易に決定することがで
きる。）にハイブリッド形成する核酸配列及び核酸配列によってコードされるアミノ酸配
列が含まれる。この文脈において引用される「選択的にハイブリッド形成する」という用
語は、検出可能に及び選択的に結合することを意味する。本発明に係るポリヌクレオチド
、オリゴヌクレオチド及びこれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の多量を
最小化するハイブリッド形成及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する
。本分野において公知であるように、及び本明細書に論述されているように、選択的なハ
イブリッド形成条件を達成するために、高い厳格度条件を使用することができる。一般に
、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び断片と目的の核酸配列との間の核
酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％
、９５％、９９％及び１００％の好ましく増大する相同性を有する。２つのアミノ酸配列
の間に部分的な又は完全な同一性が存在する場合には、２つのアミノ酸配列は相同的であ
る。例えば、８５％の相同性は、最大の合致が得られるように、２つの配列が並置される
場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大化する上で（合致され
ている２つの配列の何れかの中に）ギャップが許容される。５又はそれ以下のギャップ長
が好ましく、２又はそれ以下がさらに好ましい。これに代えて及び好ましくは、本明細書
においてこの用語が使用される場合には、変異データマトリックス及び６又はそれ以上の
ギャップペナルティーを使用するプログラムＡＬＩＧＮを用いて、（標準偏差単位で）５
より多くの並置スコアを有すれば、２つのタンパク質配列（又は少なくとも３０アミノ酸
長の、これらから得られるポリペプチド配列）は相同である。「Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．
Ｏ．， ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｐ．１０１−１１０ （Ｖｏｌｕｍｅ ５， Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （１９７２））及び
この巻に対する補遺２、ｐｐ．１から１０」を参照されたい。ＡＬＩＧＮプログラムを用
いて最適に並置された場合に、２つの配列又はその一部のアミノ酸が５０％より大きい又
は５０％に等しければ、２つの配列又はその一部は、より好ましく相同的である。本明細
書において、「対応する」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列の全て若しくは一部
に対して、ポリヌクレオチド配列が相同的である（すなわち、同一であり、厳格に進化的
に関連していない。）こと、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一である
ことを意味するために使用される。これに対して、「相補的な」という用語は、本明細書
において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対して相同的である
ことを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配
列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の調製
ある種の実施形態において、（抗体などの）抗原結合タンパク質は、抗原（例えば、Ｐ
ＣＳＫ９）を用いた免疫化によって産生される。ある種の実施形態において、抗体は、完
全長ＰＣＳＫ９、ＰＣＳＫ９の可溶性形態、触媒ドメインのみ、図１Ａ中に示されている
ＰＣＳＫ９の成熟形態、ＰＣＳＫ９のスプライスバリアント形態又はこれらの断片を用い
た免疫化によって作製することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、
ポリクローナル若しくはモノクローナルであり得、及び／又は組換え抗体であり得る。あ
る種の実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生することができるト
ランスジェニック動物の免疫化によって調製されたヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開
出願ＷＯ９３／１２２２７参照）。
ある種の実施形態において、その標的に対する抗体の親和性など、抗体の固有の特性を
操作するために、ある種の戦略を使用することができる。このような戦略には、抗体バリ
アントを作製するために、抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的な又は無
作為の突然変異導入を使用することが含まれるが、これに限定されない。ある種の実施形
態において、このような作製の後には、所望の変化（例えば、増加又は減少した親和性）
を示す抗体バリアントのスクリーニングを行う。
ある種の実施形態において、突然変導入戦略中で標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ
中のアミノ酸残基である。ある種の実施形態において、可変ドメインのフレームワーク領
域中のアミノ酸が標的とされる。ある種の実施形態において、このようなフレームワーク
領域は、ある種の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、「Ｈｕｄ
ｓｏｎ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ９：３９５−４０２ （１９９９
）」及びその中の参考文献を参照されたい。
ある種の実施形態において、無作為の又は部位指定突然変異導入をＣＤＲ中の高頻度変
異部位（体細胞親和性成熟プロセスの間に変異を受けやすい領域に対応する部位）に制限
することによって、抗体バリアントのより小さく、より効果的にスクリーニングされるラ
イブラリーが作製される。例えば、「Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＆ Ｐａｓｔａｎ， Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １７：５６８−５７２ （１９９９）」及びその中の参考
文献を参照されたい。ある種の実施形態において、ある種の直接及び反転リピート、ある
種のコンセンサス配列、ある種の二次構造及びある種のパリンドロームなど（但し、これ
らに限定されない。）の高頻度変異部位を同定するために、ＤＮＡ要素のある種類を使用
することができる。例えば、高頻度変異部位を同定するために使用することができるこの
ようなＤＮＡ要素には、プリン（Ａ又はＧ）を含む四塩基配列に続くグアニン（Ｇ）に続
くピリミジン（Ｃ又はＴ）に続くアデノシン又はチミジン（Ａ又はＴ）の何れか（すなわ
ち、Ａ／Ｇ−Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ）が含まれるが、これらに限定されない。高頻度変異部
位を同定するために使用することができるＤＮＡ要素の別の例は、セリンコドンＡ−Ｇ−
Ｃ／Ｔである。
完全ヒトＡＢＰ（例えば、抗体）の調製
ある種の実施形態において、モノクローナル抗体を作製するために、ファージディスプ
レイ技術が使用される。ある種の実施形態において、このような技術は、完全ヒトモノク
ローナル抗体を作製する。ある種の実施形態において、単一のＦａｂ又はＦｖ抗体断片を
コードするポリヌクレオチドは、ファージ粒子の表面上に発現される。例えば、Ｈｏｏｇ
ｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９
９１）； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１ （１
９９１）；米国特許第５，８８５，７９３号を参照されたい。ある種の実施形態において
、標的に対する親和性を有する抗体断片を同定するために、ファージが「スクリーニング
」された。従って、ある種のこのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上へ
の抗体断片レパートリーのディスプレー及び標的への抗体断片レパートリーの結合によっ
てファージのその後の選択を通じて免疫選択を模倣する。ある種のこのような手法では、
高親和性機能的中和抗体断片が単離される。（以下により詳しく論述されている）ある種
のこのような実施形態において、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーは、末梢血リンパ
球から天然に再配置されたヒトＶ遺伝子をクローニングすることによって作製される。例
えば、「Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （
ＵＳＡ）， ８７：８０９５−８０９９ （１９９０）」を参照されたい。
ある種の実施形態によれば、挿入されたヒト抗体産生ゲノムのかなりの部分を有するが
、内在性マウス抗体の産生が欠失されたトランスジェニックマウスの使用を通じて、本発
明の抗体が調製される。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体
を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生を欠損している。この
結果を達成するために使用される技術は、本明細書中に開示されている特許、出願及び参
考文献中に開示されている。ある種の実施形態において、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／２４
８９３又は「Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １５：
１４６−１５６ （１９９７）」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み
込まれる。）に開示される方法などの方法を使用することができる。
一般に、ＰＣＳＫ９に対して特異的な完全ヒトモノクローナルＡＢＰ（例えば、抗体）
は以下のように作製することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジ
ェニックマウスは、目的の抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）で免疫化され、抗体を発現するマ
ウスからのリンパ細胞（Ｂ細胞など）が得られる。不死化ハイブリドーマ細胞株を調製す
るために、このような回収された細胞は骨髄性細胞株と融合され、目的の抗原に対して特
異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために、このようなハイブリドー
マ細胞株はスクリーニング及び選択される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対
して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の産生が提供される。
ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、ヒト脾細胞（Ｂ又はＴ細胞）をインビト
ロで抗原に曝露させ、次いで、免疫不全化されたマウス（例えば、ＳＣＩＤ又はｎｏｄ／
ＳＣＩＤ）中で曝露された細胞を再構成させることによって産生される。例えば、「Ｂｒ
ａｍｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８ （１９９８
）； Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｄ．， ６：１０３−１０
６ （２０００）」を参照されたい。ある種のこのようなアプローチにおいて、ＳＣＩＤ
マウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）中へのヒト胎児組織の移植は、長期造血及びヒトＴ細胞の成長
をもたらす。例えば、「ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：１
５３２−１６３９ （１９８８）； Ｉｆｖｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．， ８：２４３−２４８ （１９９６）」を参照されたい。ある種の事例に
おいて、このようなキメラマウス中での液性免疫応答は、動物内でのヒトＴ細胞の同時成
長に依存する。例えば、「Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
８３：１２７１−１７９ （１９９４）」を参照されたい。ある種のアプローチにおい
て、ヒト末梢血液リンパ球はＳＣＩＤマウス中に移植される。例えば、「Ｍｏｓｉｅｒ
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３５：２５６−２５９ （１９８８）」を参照され
たい。ある種のこのような実施形態において、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ
）などの刺激剤で、又は抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体の何れかで、このような移植
された細胞が処理されると、Ｂ細胞産生のより高いレベルが検出される。例えば、「Ｍａ
ｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ８４：２２４−２３０ （１
９９５）； Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， ８６：１９４６−１９５３
（１９９５）」を参照されたい。
従って、ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、宿主細胞中での組換えＤＮＡの
発現によって、又はハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。他の実施形態
において、抗体は、本明細書中に記載されているファージディスプレイ技術を用いて産生
され得る。
本明細書中に記載されている抗体は、本明細書中に記載されているように、ＸｅｎｏＭ
ｏｕｓｅ（Ｒ）技術の使用を通じて調製された。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫
グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産
生を欠損している。同じことを達成するために使用される技術は、本明細書の背景技術の
部に開示されている特許、出願及び参考文献中に開示されている。しかしながら、特に、
マウスのトランスジェニック産生及びそこから得られる抗体の好ましい実施形態は、１９
９６年１２月３日に出願された米国特許出願０８／７５９，６２０及び１９９８年６月１
１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３及び２０００年１２月２１日に公開
されたＷＯ００／７６３１０（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれてい
る。）に開示されている。「Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ， １５：１４６−１５６（１９９７）」（その開示は、参照により、本明細書に組
み込まれる。）も参照されたい。
このような技術の使用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産
生されてきた。特に、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統は、目的の抗原（例えば、
ＰＣＳＫ９）で免疫化され、リンパ細胞（Ｂ細胞など）は高度免疫化されたマウスから回
収され、回収されたリンパ球は、不死化されたハイブリドーマ細胞株を調製するために、
骨髄型細胞株と融合される。目的の抗原に対して特異的な抗体を産生されるハイブリドー
マ細胞株を同定するために、これらのハイブリドーマ細胞株は、スクリーニング及び選択
される。ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製
するための方法が本明細書において提供される。さらに、このような抗体の重鎖及び軽鎖
のヌクレオチド及びアミノ酸配列分析など、このような細胞株によって産生される抗体の
性質決定が本明細書に提供される。
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された
米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６
１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９
２年６月３０日に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願さ
れた第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８
４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月
２０日に出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０
８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１
９９５年６月５日に出願された０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願され
た第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７
号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に
出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６
，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１
０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された第
０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／０
０９３８２０号及び米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第
６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号及び日本
国特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２、３ ０６８ ５０６ Ｂ２及び３ ０６８ ５０７
Ｂ２中に論述され、記載されている。１９９６年６月１２日に許諾公表された欧州特許Ｅ
Ｐ０４６３１５１Ｂ１、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／０２６
０２、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６、１９９
８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、２０００年１２月２１日に公開され
たＷＯ００／７６３１０も参照されたい。上記特許、出願及び参考文献の各々の開示の全
体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
別のアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．な
どの他社は、「ミニローカス」アプローチを使用した。ミニローカスアプローチでは、Ｉ
ｇ遺伝子座からの片（各遺伝子）を含めることを通じて、外来Ｉｇ遺伝子座が模倣される
。従って、１つ又はそれ以上のＶＨ遺伝子、１つ又はそれ以上のＤＨ遺伝子、１つ又はそ
れ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域及び通常第二の定常領域（好ましくは、γ定常領域）が
、動物中に挿入するための構築物中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ他に
対する米国特許第５，５４５，８０７号並びにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに対す
る米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２
６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９
号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号
、同第５，８７４，２９９号及び同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及
びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号及び同第６，０２３．０１０号、
Ｂｅｒｎｓ他に他する米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号及び
同第５，７８９，２１５号並びにＣｈｏｉ ＆ Ｄｕｎｎ， ａｎｄ ＧｅｎＰｈａｒｍ
に対する米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日に出願された国際米国
特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された第０７／５７５
，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された０７／８１０，２７９号、１９９２年
３月１８日に出願された第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された
第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された第０７／９９０，８６
０号、１９９３年４月２６日に出願された第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２
２日に出願された第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された第０
８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日出願された第０８／１６１，７３９号、１
９９３年１２月１０日に出願された第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出
願された第０８／２０９，７４１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込ま
れる。）中に記載されている。欧州特許０ ５４６ ０７３ Ｂ１、国際特許出願ＷＯ９
２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０
、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１
４４３６、ＷＯ９７／１３８５２及びＷＯ９８／２４８８４並びに米国特許第５，９８１
，１７５号（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）も参照され
たい。Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９３
．， Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， １
９９３， Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａ
ｌ．， （１９９４）及びＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５）， Ｆｉｓ
ｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９６）（これらの開示全体が、参照により、本明細
書に組み込まれる。）をさらに参照されたい。
Ｋｉｒｉｎは、微小細胞融合、染色体の大きな片又は染色体全体がその中に導入された
マウスからのヒト抗体の作製も示した。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６
１号（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。さら
に、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニローカス（Ｈｕｍａｂ）マウスとの
交雑の結果であるＫＭＴＭマウスが作製されている。これらのマウスは、Ｋｉｒｉｎマウ
スのヒトＩｇＨ導入染色体及びＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖導入遺伝子を有する（Ｉｓ
ｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， （２００２）
４：９１−１０２）。
ヒト抗体は、インビトロ法によっても誘導され得る。適切な例には、ファージディスプ
レイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏ
ｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅ
ｄ）、リボソームディスプレー（ＣＡＴ）、酵母ディスプレーなどが含まれるが、これら
に限定されない。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖及び
ＩｇＧ２重鎖を有する。抗体は、ＩｇＧ１を含む他のヒトイソタイプのものでもあり得る
。様々な技術によって測定された場合に、抗体は、高い親和性を有しており、典型的には
、約１０−６から約１０−１３Ｍ又はそれ以下のＫｄを有する。
理解されているように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させるこ
とができる。適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために、特定の抗体をコードする配
列を使用することができる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（又
はウイルスベクター中に）パッケージし、ウイルス（又はベクター）で又は米国特許第４
，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４
，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により、本明細書に組み込まれる。）によっ
て例示されているような、本分野において公知の形質移入手法によって宿主細胞を形質導
入することを含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法
により得る。使用される形質転換手法は、形質転換されるべき宿主に依存する。哺乳動物
細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デ
キストランによって媒介された形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒
介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの
封入化及びＤＮＡの核内への直接的微小注入を含む。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が本分野において周知であり、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ
）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、ヒト上皮
腎臓２９３細胞及び多数の他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された
細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株は、何れの細胞が高い発現レベルを有し、恒常的
なＰＣＳＫ９結合特性を有する抗体を産生するかの決定を通じて選択され得る。
ある種の実施形態において、抗体及び／又はＡＢＰは、以下のハイブリドーマの少なく
とも１つ：２１Ｂ１２、３１Ｈ４、１６Ｆ１２、表２中に列記されている又は実施例に開
示されている他の何れかのハイブリドーマによって産生される。ある種の実施形態におい
て、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ未満、例えば、１０００ｐＭから１００ｐＭ、１０
０ｐＭから１０ｐＭ、１０ｐＭから１ｐＭ及び／又は１ｐＭから０．１ｐＭ又はそれ以下
の解離定数（ＫＤ）でＰＣＳＫ９に結合する。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、
ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭイソタイプの少なくとも１つの免疫グロブ
リン分子を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及び／
又はヒト重鎖を含む。ある種の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭイソタイプのものである。ある種の実
施形態において、哺乳動物細胞中での発現のために抗原結合タンパク質がクローニングさ
れている。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉ
ｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭイソタイプの定常領域の何れか以
外の定常領域を含む。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒトＩｇＧ２重鎖
を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒトＩｇＧ
４重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトλ軽鎖及びヒト
ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭ重鎖を含む。他の実施形態にお
いて、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある種の実施形
態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある種の
実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＭ重鎖を含む。ある種の実施形態において、抗原結合タン
パク質は、ＩｇＧ２イソタイプに対する定常領域でもなく、ＩｇＧ４イソタイプに対する
定常領域でもない定常領域に連結された抗体の可変領域を含む。ある種の実施形態におい
て、哺乳動物細胞中での発現のために抗原結合タンパク質がクローニングされている。
ある種の実施形態において、ハイブリドーマ株：２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び１６Ｆ１２
の少なくとも１つから得られた抗体の重鎖及び軽鎖に対する保存的修飾（及びコードする
ヌクレオチドに対する対応する修飾）は、ハイブリドーマ株２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び１
６Ｆ１２から得られる抗体と類似の機能的及び化学的特徴を有するＰＣＳＫ９に対する抗
体を産生する。これに対して、ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗体の機
能的及び／又は化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換の領域中の分子骨格の構造、例
えば、シート又はヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水
性又は（ｃ）側鎖のサイズの維持に対する効果が大幅に異なる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配
列中の置換を選択することによって達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、当該位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対して
殆ど又は全く効果が存在しないように、固有のアミノ酸残基を非固有の残基で置換するこ
とを含み得る。さらに、「アラニンスキャンニング突然変異導入」に対して以前に記載さ
れているように、ポリペプチド中の何れの固有の残基もアラニンで置換され得る。
所望のアミノ酸置換（保存的であるか、又は非保存的であるかを問わない。）は、この
ような置換が所望される時点で、当業者によって決定することができる。ある種の実施形
態において、本明細書中に記載されているように、ＰＣＳＫ９に対する抗体の重要な残基
を同定するために、又はＰＣＳＫ９に対する抗体の親和性を増加若しくは減少させるため
に、アミノ酸置換を使用することができる。
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で
発現させることができる。ある種の実施形態において、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転
換するために、特定の抗体をコードする配列を使用することができる。ある種の実施形態
によれば、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（又はウイルスベクタ
ー中に）パッケージし、ウイルス（又はベクター）で又は米国特許第４，３９９，２１６
号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５
号（これらの特許は、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）
によって例示されているような、本分野において公知の形質移入手法によって宿主細胞を
形質導入することを含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知
の方法により得る。ある種の実施形態において、使用される形質転換手法は、形質転換さ
れるべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための
方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介される形質移入、リン酸カ
ルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔
、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入化及びＤＮＡの核内への直接的微小注入を含む
が、これらに限定されない。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が本分野において周知であり、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ
）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）及び多数の
他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株が含まれるが、これ
らに限定されない。ある種の実施形態において、細胞株は、何れの細胞が高い発現レベル
を有し、恒常的なＨＧＦ結合特性を有する抗体を産生するかの決定を通じて選択され得る
。哺乳動物宿主細胞に対する適切な発現ベクターは、周知である。
ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、１つ又はそれ以上のポリペプチド
を含む。ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰその
ものを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために、様々な
発現ベクター／宿主系の何れをも使用することができる。このような系には、組換えバク
テリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バ
キュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質移入された若し
くは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植
物細胞系；又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含むポリペプチドは、酵母中で組換え的に発現される。ある種のこのような実施形態は、
製造業者の指示書に従って、市販の発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用する
。ある種の実施形態において、このような系は、分泌を誘導するために、プレプロα配列
に依存する。ある種の実施形態において、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、
アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含む分泌されたポリペプチドは、酵母増殖培地から精製される。ある種の実施形態におい
て、酵母増殖培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌及び哺乳動
物細胞上清からポリペプチドを精製するために使用される方法と同じである。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含むポリペプチドをコードする核酸は、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされる。
ある種の実施形態において、このようなベクターは、ｓＦ９無タンパク質培地中でスポド
プテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させ
、組換えポリペプチドを作製するために、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従
って使用することができる。ある種の実施形態において、ポリペプチドは、ヘパリン−セ
ファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このような培地から精製及び濃縮さ
れる。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含むポリペプチドは、昆虫系内で発現される。ポリペプチド発現のためのある種の昆虫系
が当業者に周知である。１つのこのような系において、スポドプテラ・フルギペルダ細胞
中又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の幼虫内で外来遺伝子を発現させる
ためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ある種の実施形
態において、ポリペプチドをコードする核酸分子は、ウイルスの不可欠でない遺伝子中に
、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子に対するプロモーターの制御下に
置くことができる。ある種の実施形態において、核酸分子を首尾よく挿入することによっ
て、不可欠でない遺伝子は不活性になる。ある種の実施形態において、その不活化は検出
可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活化は、外被タンパク質を欠如
したウイルスの産生をもたらす。
ある種の実施形態において、Ｓ．フルギペルダ細胞又はトリコプルシアの幼虫を感染さ
せるために、組換えウイルスを使用することができる。例えば、「Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ４６：５８４ （１９８３）； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ
ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）， ９１：３２２４−
７ （１９９４）」を参照されたい。
ある種の実施形態において、細菌細胞中で作製された１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成
分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、細菌中で、不溶性封入体として産生される
。ある種の実施形態において、このような封入体を含む宿主細胞は、遠心によって収集さ
れ、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄され、室
温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で
処理される。ある種の実施形態において、可溶化液は音波処理によって清澄化され、細胞
破砕物は、１２，０００×ｇでの１０分間の遠心によって沈降される。ある種の実施形態
において、ポリペプチドを含有する沈降物は、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８及び１０ｍＭＥ
ＤＴＡ中に再懸濁され、５０％グリセロールに重層され、６０００×ｇで３０分間遠心さ
れる。ある種の実施形態において、その沈降物は、Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋を含まない標準
的なリン酸緩衝化生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁され得る。ある種の実施形態に
おいて、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中に再懸濁された沈降物を分画することによ
って、ポリペプチドはさらに精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上
記参照）。ある種の実施形態において、タンパク質を可視化するために、０．４ＭＫＣｌ
中にこのようなゲルを浸漬させることが可能であり、タンパク質は切り出され、ＳＤＳを
含まないゲル走行緩衝液中に電気溶出することができる。ある種の実施形態によれば、グ
ルタチオン−Ｓ−転写酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質は、細菌中で、可溶性タンパク質と
して産生される。ある種の実施形態において、このようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳ
ＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製される
。
ある種の実施形態において、ある種のポリペプチド、例えば、１つ若しくはそれ以上の
ＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを含むポリペプチドを「再折り畳み」させることが望まし
い。ある種の実施形態において、このようなポリペプチドは、本明細書中に論述されてい
るある種の組換え系を用いて産生される。ある種の実施形態において、所望の三次構造を
形成させるために、及び／又はジスルフィド結合を生成させるために、ポリペプチドは、
「再折り畳みされ」及び／又は「酸化される」。ある種の実施形態において、このような
構造及び／又は結合は、ポリペプチドのある種の生物活性に関連している。ある種の実施
形態において、再折り畳みは、本分野において公知の多数の手法の何れを用いても達成さ
れる。典型的な方法には、カオトロピック剤の存在下で、典型的には７を上回るｐＨに、
可溶化されたポリペプチド剤を曝露させることが含まれるがこれに限定されない。典型的
なカオトロピック剤は、グアニジンである。ある種の実施形態において、再折り畳み／酸
化溶液は、還元剤及びその還元剤の酸化された形態も含有する。ある種の実施形態におい
て、還元剤及びその酸化された形態は、ジスルフィドシャフリングが起こる特定の酸化還
元電位を生成する比で存在する。ある種の実施形態において、このようなシャフリングは
、システイン架橋の形成を可能とする。典型的な酸化還元対には、システイン／シスタミ
ン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチア
ンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれるが、これ
らに限定されない。ある種の実施形態において、再折り畳みの効率を増加させるために、
共溶媒が使用される。典型的な共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレン
グリコール及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含むポリペプチドを実質的に精製する。ある種のタンパク質精製技術が、当業者に公知で
ある。ある種の実施形態において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からポリペプ
チド画分を粗分画することを含む。ある種の実施形態において、ポリペプチドは、クロマ
トグラフィー技術及び／又は電気泳動技術を用いて精製される。典型的な精製法には、硫
酸アンモニウムを用いた沈殿；ＰＥＧを用いた沈殿；免疫沈降；熱変性後の遠心；アフィ
ニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換クロ
マトグラフィー、排除クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー；ゲルろ過；ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの（但し、これらに限定されない。）クロマト
グラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにこのような技術及
び他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある種の実施形態におい
て、ポリペプチドは、高速タンパク質質液体クロマトグラフィーによって、又は高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。ある種の実施形態において、精製
工程を変化させ、又はある種の工程を省略することが可能であるが、実質的に精製された
ポリペプチドを調製するための適切な方法をなおもたらす。
ある種の実施形態において、ポリペプチド調製物の精製度を定量する。精製度を定量す
るためのある種の方法が、当業者に公知である。ある種の典型的な方法は、調製物の特異
的結合活性を測定すること及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの
量を評価することを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評
価するためのある種の典型的な方法は、調製物の結合活性を計算すること、調製物の結合
活性を当初抽出物の結合活性と比較することを含む。ある種の実施形態において、このよ
うな計算の結果は、「精製倍数」と表現される。結合活性の量を表すために使用される単
位は、実施されるアッセイに依存する。
ある種の実施形態において、１つ若しくはそれ以上のＡＢＰ成分又はＡＢＰそのものを
含むポリペプチドは、部分的に精製される。ある種の実施形態において、部分的精製は、
より少ない精製工程を使用することによって、又は同じ一般的な精製スキームの異なる形
態を使用することによって達成することができる。例えば、ある種の実施形態において、
ＨＰＬＣ装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマ
トグラフィー系を用いる同じ技術より大きな「精製倍数」を一般にもたらす。ある種の実
施形態において、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの総回収において、又
はポリペプチドの結合活性の維持において利点を有し得る。
ある種の事例では、ポリペプチドの電気泳動的移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件
とともに、（時に著しく）変動し得る。例えば、「Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）」を参
照されたい。異なる電気泳動条件下において、精製された又は部分的に精製されたポリペ
プチドの見かけの分子量は異なり得ることが理解される。
典型的なエピトープ
抗ＰＣＳＫ９抗体が結合するエピトープが提供される。幾つかの実施形態において、本
明細書に開示されている抗体によって結合されるエピトープは、特に有用である。幾つか
の実施形態において、本明細書に記載されている抗体によって結合されるエピトープの何
れかに結合する抗原結合タンパク質は有用である。幾つかの実施形態において、表２並び
に図２及び３に列記されている抗体の何れかによって結合されるエピトープは特に有用で
ある。幾つかの実施形態において、エピトープは、触媒ドメインＰＣＳＫ９上に存在する
。
ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパ
ク質の結合を妨げる（例えば、低下させる）ために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用するこ
とができる。ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原
結合タンパク質の結合を減少させるために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができ
る。ある種の実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タン
パク質の結合を実質的に阻害するために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる
。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合タンパク質を単離
するために、ＰＣＳＫ９エピトープを使用することができる。ある種の実施形態において
、ＰＣＳＫ９に結合する抗体又は抗原結合タンパク質を作製するために、ＰＣＳＫ９エピ
トープを使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合する抗体
又は抗原結合タンパク質を作製するために、ＰＣＳＫ９エピトープ又はＰＣＳＫ９エピト
ープを含む配列を免疫原として使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣ
ＳＫ９エピトープを動物に投与することができ、ＰＣＳＫ９に結合する抗体を、その後動
物から取得することができる。ある種の実施形態において、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の会
合などの、正常なＰＣＳＫ９によって媒介される活性を妨害するために、ＰＣＳＫ９エピ
トープ又はＰＣＳＫ９エピトープを含む配列を使用することができる。
幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、Ｎ末
端プロドメイン、スブチリシン様触媒ドメイン及び／又はＣ末端ドメインに特異的に結合
する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ−９の基質結合溝に
結合する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ他に記載されており、参照により、その全体が本明細書
に組み込まれる。）。
幾つかの実施形態において、抗体と接触し、又は抗体によって埋没される残基を含有す
るドメイン／領域は、ＰＣＳＫ９（例えば、野生型抗原）中の特定の残基を変異させ、抗
原結合タンパク質が変異された又はバリアントＰＣＳＫ９タンパク質を結合することがで
きるかどうかを測定することによって同定することができる。多数の個別の変異を作製す
ることによって、変異が抗原結合タンパク質と抗原間の結合に影響を及ぼし得るように、
結合に直接的な役割を果たしている残基又は抗体と十分に近接している残基を同定するこ
とができる。これらのアミノ酸の知見から、抗原結合タンパク質と接触する残基又は抗体
によって被覆されている残基を含有する抗原のドメイン又は領域を解明することができる
。このようなドメインは、抗原結合タンパク質の結合エピトープを含むことができる。こ
の一般的なアプローチの１つの具体例は、アルギニン／グルタミン酸スキャニングプロト
コールを使用する（例えば、Ｎａｎｅｖｉｃｚ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５，
Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０：３７， ２１６１９−２１６２５ ａｎｄ
Ｚｕｐｎｉｃｋ， Ａ．， ｅｔ ａ ｌ， ２００６， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
， ２８Ｌ：２９， ２０４６４−２０４７３）を参照されたい）。一般に、アルギニン
及びグルタミン酸は帯電しており、嵩が大きく、従って、変異が導入されている抗原の領
域中での抗原結合タンパク質と抗原との間の結合を崩壊させる可能性を有しているので、
野生型ポリペプチド中のアミノ酸は、アルギニン及びグルタミン酸へ（典型的には、個別
に）置換される。野生型抗原中に存在するアルギニンは、グルタミン酸と置換される。こ
のような様々な個別の変異体が得られ、どの残基が結合に影響を及ぼすかを決定するため
に、収集された結合結果が分析される。
実施例３９は、本明細書に提供されているＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質に対するＰＣ
ＳＫ９の１つのこのようなアルギニン／グルタミン酸スキャニングを記載する。一連の変
異体ＰＣＳＫ９抗原が作製され、各変異体抗原が単一の変異を有する。様々なＰＣＳＫ９
ＡＢＰとの各変異体ＰＣＳＫ９抗原の結合を測定し、選択されたＡＢＰが野生型ＰＣＳＫ
９（配列番号３０３）を結合する能力と比較した。
抗原結合タンパク質及び本明細書において使用されるバリアントＰＣＳＫ９の間の結合
の変化（例えば、低下又は増加）は、（例えば、実施例中で以下に記載されているＢｉａ
ｃｏｒｅ検査又はビーズをベースとしたアッセイなどの公知の方法によって測定した場合
に）結合親和性、ＥＣ５０の変化及び／又は（例えば、抗原結合タンパク質濃度対抗原濃
度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって明らかとなる）抗原結合タンパク質の総結
合能力の変化（例えば、低下）が存在することを意味する。結合の著しい変化は、変異を
受けた残基が抗原結合タンパク質への結合に直接関与しており、又は結合タンパク質が抗
原に結合されたときに、結合タンパク質に近接していることを示唆する。
幾つかの実施形態において、結合の著しい低下は、抗原結合タンパク質と変異体ＰＣＳ
Ｋ９抗原間での結合親和性、ＥＣ５０及び／又は能力が、抗原結合タンパク質と野生型Ｐ
ＣＳＫ９（例えば、配列番号１及び／又は配列番号３０３に示されている。）間での結合
と比べて、１０％超、２０％超、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、
７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超低下していることを意
味する。ある種の実施形態において、結合は、検出可能な限界を下回って低下する。
幾つかの実施形態において、バリアントＰＣＳＫ９タンパク質への抗原結合タンパク質
の結合は、抗原結合タンパク質と野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１及び
／又は配列番号３０３のタンパク質）間で観察される結合の５０％未満（例えば、４０％
、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％）である場合に、結合の著しい低
下が証明される。このような結合の測定は、本分野において公知の様々な結合アッセイを
用いて実施され得る。１つのこのようなアッセイの具体例は、実施例３９に記載されてい
る。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配
列番号３０３）中の残基がアルギニン又はグルタミン酸で置換されているバリアントＰＣ
ＳＫ９タンパク質に対して著しくより低い結合を示す抗原結合タンパク質が提供される。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配列
番号３０３）と比べて、以下の変異：Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ
、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１
３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ
３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又は
それ以上の何れか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は２４４）を
有するバリアントＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が著しく低
下又は増加する。本明細書において使用される省略型表記において、形式は、：野生型残
基：ポリペプチド中の位置：変異体残基であり、配列番号１又は配列番号３０３に示され
ているように残基の付番が為されている。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配
列番号３０３）と比べて、配列番号１に示されているような以下の位置：２０７、２０８
、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３
、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９
、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上の
）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が低下
又は増加する。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列
番号１又は配列番号３０３）と比べて、配列番号１に示されているような以下の位置：２
０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３
９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３
３７、５１９、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又
はそれ以上の）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質
の結合が低下又は増加する。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（
例えば、配列番号１又は配列番号３０３）と比べて、配列番号１内の以下の位置：２０７
、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０
、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７
、５１９、５２１及び５５４に１つ又はそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５又はそ
れ以上の）変異を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結
合が実質的に低下又は増加する。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配
列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１又は配列番号３０３内のＲ２０７Ｅ、
Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２
Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１
６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、
Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）を有
する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく低下又は増加する。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配
列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１又は配列番号３０３内のＲ２０７Ｅ、
Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２
Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、
１、２、３、４、５など）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合
が著しく低下又は増加する。幾つかの実施形態において、結合は低下する。幾つかの実施
形態において、結合の低下は、ＥＣ５０の変化として観察される。幾つかの実施形態にお
いて、ＥＣ５０の変化は、ＥＣ５０の数値の増加（従って、結合の減少）である。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１又は配
列番号３０３）と比べて、以下の変異：配列番号１内のＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６
７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ
５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒの１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）を有す
る変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく低下又は増加する。幾つ
かの実施形態において、結合は低下する。幾つかの実施形態において、結合の低下は、Ｂ
ｍａｘの変化として観察される。幾つかの実施形態において、Ｂｍａｘのシフトは、ＡＢ
Ｐによって生じた最大シグナルの低下である。幾つかの実施形態において、エピトープの
一部であるアミノ酸に関して、Ｂｍａｘは、少なくとも１０％低下し、例えば、以下の量
、すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、８５、９８、９９又は
１００％の少なくとも何れかの低下は、幾つかの実施形態において、残基がエピトープの
一部であることを示すことができる。
直前に列記されているバリアント形態は、配列番号１又は配列番号３０３に示されてい
る野生型配列に関して引用されているが、ＰＣＳＫ９の対立遺伝子バリアントにおいて、
表記位置のアミノ酸が異なり得ることが理解される。ＰＣＳＫ９のこのような対立遺伝子
形態に対して著しくより低い結合を示す抗原結合タンパク質も想定される。従って、幾つ
かの実施形態において、上記実施形態の何れもが、図１Ａに示されている純粋に野生型の
配列ではなく、対立遺伝子配列と比較され得る。
幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質中の選択された位置における
残基が他の何れかの残基へ変異されているバリアントＰＣＳＫ９タンパク質に関して、抗
原結合タンパク質の結合は著しく低下している。幾つかの実施形態において、同定された
位置に対して、本明細書に記載されているアルギニン／グルタミン酸置換が使用される。
幾つかの実施形態において、同定された位置に対して、アラニンが使用される。
上述のように、結合に直接関与する残基又は抗原結合タンパク質によって覆われた残基
は、スキャニングの結果から同定され得る。従って、これらの残基は、抗原結合タンパク
質が結合する結合領域を含有する配列番号１（又は配列番号３０３又は配列番号３）のド
メイン又は領域の指標を提供し得る。実施例３９に要約されている結果から明らかなよう
に、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３
のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３
２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１
１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４の少なくとも１つを含有するドメインに
結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号
３０３のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９
、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９
、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４の少なくとも１つを含有する領域
に結合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
アミノ酸：１６２、１６４、１６７、２０７及び／又は２０８の少なくとも１つを含有す
る領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、
３、４又は５）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態におい
て、ＡＢＰはＡＢＰ２１Ｂ１２と競合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
アミノ酸１８５の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において
、ＡＢＰはＡＢＰ３１Ｈ４と競合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
アミノ酸：４３９、５１３、５３８及び／又は５３９の少なくとも１つを含有する領域に
結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３又は４
）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは
ＡＢＰ３１Ａ４と競合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
アミノ酸：１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、１３２、３５１、３９０及び／又
は４１３の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態において、同定
された残基の２以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９）がＡＢＰによって結
合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰはＡＢＰ１２Ｈ１１と競
合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
アミノ酸：５８２、５１９、５２１及び／又は５５４の少なくとも１つを含有する領域に
結合する。幾つかの実施形態において、同定された残基の２以上（例えば、２、３又は４
）がＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは
ＡＢＰ３Ｃ４と競合する。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号３０３の
断片又は完全長配列内の前記領域に結合する。他の実施形態において、抗原結合タンパク
質は、これらの領域からなるポリペプチドに結合する。「配列番号１又は配列番号３０３
」という表記は、これらの配列の一方又は両方が使用され得ること、又は関連し得ること
を表す。この用語は、一つのみが使用されるべきことを表さない。
上述のように、上記記述は、配列番号１を参照して特定のアミノ酸位置を引用する。し
かしながら、本明細書を通じて一般に、配列番号３に記載されている３１位で始まるＰｒ
ｏ／Ｃａｔドメインが参照される。以下に記載されているように、配列番号１及び配列番
号３０３はＰＣＳＫ９のシグナル配列を欠如する。従って、これらの様々な開示の間での
何れの比較も、付番におけるこの差を考慮すべきである。特に、配列番号１中の何れのア
ミノ酸位置も、配列番号３のタンパク質中の３０位のアミノ酸に対応する。例えば、配列
番号１の２０７位、配列番号３の２３７位に対応する（完全長配列及び一般に、本明細書
中で使用されている付番系）。表３９．６は、配列番号１（及び／又は配列番号３０３）
を参照する上記位置が、配列番号３（シグナル配列を含む。）にどのように対応するかを
要約する。従って、配列番号１（及び／又は配列番号３０３）に関して記載されている上
記実施形態の何れもが、記載されている対応する位置によって、配列番号３を参照して記
載されている。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰ２１Ｂ１２は、残基１６２から１６７（例えば、配
列番号１の残基Ｄ１６２−Ｅ１６７）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態に
おいて、ＡＢＰ１２Ｈ１１は、残基１２３から１３２（例えば、配列番号１のＳ１２３−
Ｔ１３２）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ１２Ｈ１１
は、残基３１１か３１３（例えば、配列番号１のＡ３１１−Ｄ３１３）を含むエピトープ
に結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、配列のこれらの鎖の何れか１つを含
むエピトープに結合し得る。
競合する抗原結合タンパク質
別の態様において、ＰＣＳＫ９への特異的結合に関して、本明細書中に記載されている
エピトープに結合する例示された抗体又は機能的断片の１つと競合する抗原結合タンパク
質が提供される。このような抗原結合タンパク質は、本明細書中に例示されている抗原結
合タンパク質の１つと同じエピトープ又は重複するエピトープにも結合し得る。例示され
た抗原結合タンパク質と同じエピトープと競合し、又は結合する抗原結合タンパク質及び
断片は、類似の機能的特性を示すと予想される。例示された抗原結合タンパク質及び断片
は、重鎖及び軽鎖可変領域ドメイン並びに表２及び／又は図２から３及び１５に含まれる
ＣＤＲを有するものなど、上述されているものを含む。従って、具体例として、提供され
る抗原結合タンパク質には、
（ａ）図２から３及び１５に列記されている抗体に対して列記されているＣＤＲの６つ
全て；
（ｂ）表２中に列記されている抗体に対して列記されているＶＨ及びＶＬ；又は
（ｃ）表２に列記されている抗体に対して明記されている２つの軽鎖及び２つの重鎖
を有する抗体又は抗原結合タンパク質と競合するものが含まれる。
ある種の治療的用途及び医薬組成物
ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性は、多数のヒトの病状と相関する。例えば、あ
る種の事例において、高すぎる又は低すぎるＰＣＳＫ９活性は、高コレステロール血症な
どのある種の症状と相関する。従って、ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性を調節す
ることは治療的に有用であり得る。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する中和
的抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＰＣＳＫ９活性（例えば、ＬＤＬＲへの結合
）を調節するために使用される。このような方法は、上昇した血清コレステロールレベル
と関連する、又は上昇したコレステロールレベルが関連する疾患を治療し、及び／又は予
防し、及び／又は疾患のリスクを低減することができる。
当業者によって理解されるように、本開示に照らして、変動したコレステロール、ＬＤ
Ｌ又はＬＤＬＲレベルと関連し、変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルを
伴い、又は変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルによって影響を受け得る
疾患は、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって対処することができる。幾つかの
実施形態において、（「血清コレステロール関連疾患」を含む）「コレステロール関連疾
患」には、例えば、上昇した総血清コレステロール、上昇したＬＤＬ、上昇したトリグリ
セリド、上昇したＶＬＤＬ及び／又は低ＨＤＬを呈し得る以下のもの：高コレステロール
血症、心臓病、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心臓病、卒中、心血管疾
患、アルツハイマー病及び脂質異常症全般の何れか１つ又はそれ以上が含まれる。単独で
の、又は１つ若しくはそれ以上の他の薬剤と組み合わせたＡＢＰを用いて治療することが
できる原発性及び続発性脂肪異常症の幾つかの非限定的な例には、メタボリックシンドロ
ーム、糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、家族性高コレステ
ロール血症（ヘテロ接合型高コレステロール血症、ホモ接合型高コレステロール血症、家
族性アポリポタンパク質Ｂ−１００欠損、多遺伝子性高コレステロール血症）；レムナン
ト除去病（ｒｅｍｎａｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠乏症、以
下のもの：暴食、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法を含む薬物、β
遮断薬及びチアジド利尿薬；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性
胆汁性肝硬変、糖原病、肝臓癌、胆汁鬱滞、末端肥大症、膵島細胞腫、成長ホルモン単独
欠損症並びにアルコール誘発性高トリグリセリド血症の何れかに続発する脂肪異常症が含
まれる。ＡＢＰは、例えば、冠動脈性心臓病、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、卒中（虚血性
及び出血性）、狭心症又は心血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞などのアテローム
性動脈硬化疾患を予防又は治療する上でも有用であり得る。幾つかの実施形態において、
ＡＢＰは、致命的でない心臓発作、致命的な及び致命的でない卒中、心臓手術のある種類
、心不全のための入院、心臓病を有する患者における胸部痛及び／又は以前の心臓発作、
以前の心臓手術など確立された心臓病のための心血管現象及び／又は閉塞した動脈の徴候
を有する胸部痛のリスクを低下させる上で有用である。幾つかの実施形態において、ＡＢ
Ｐ及び方法は、再発性の心血管現象のリスクを低下させるために使用することができる。
当業者に理解されるように、スタチンの使用を通じて一般に対処可能な（治療可能な又
は予防可能な）疾病又は疾患にも、本発明の抗原結合タンパク質の適用が有益であり得る
。さらに、幾つかの実施形態において、コレステロール合成の抑制又は増加したＬＤＬＲ
発現が有益であり得る疾患又は疾病も、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって治
療することができる。さらに、当業者によって理解されるように、抗ＰＣＳＫ９抗体の使
用は、糖尿病の治療に特に有用であり得る。糖尿病は冠動脈性心疾患に対するリスク因子
であるのみならず、インシュリンはＰＣＳＫ９の発現を増加させる。すなわち、糖尿病を
有する人々は、（高いＰＣＳＫ９レベルと関連し得る）上昇した血漿脂質レベルを有し、
血漿脂質レベルを低下させることが有益であり得る。これは、Ｃｏｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ
．（“Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｂｙ Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ Ｓ
ｔｅｒｏｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ １Ｃ”， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２８１：６２１１−６２１８， ２００６
）（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中にさらに詳しく、一般
的に論述されている。
幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、糖尿病、異常な大動脈瘤、アテロ
ーム性動脈硬化症及び／又は末梢血管疾患を有する者に、その血清コレステロールレベル
をより安全な範囲まで低下させるために投与される。幾つかの実施形態において、抗原結
合タンパク質は、本明細書中に記載されている疾患の何れかを発症するリスクを有する患
者に投与される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、喫煙し、高血圧を有し、又は若
年心臓発作の家族歴を有する喫煙対象に投与される。
幾つかの実施形態において、対象が２００４ＮＣＥＰ治療目標において中度のリスク又
はそれより高いリスクを有する場合に、対象にＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態に
おいて、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄＬより大きければ、ＡＢＰ
が対象に投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが
１３０より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、中度のリス
ク又はやや高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態において、
対象のＬＤＬコレステロールレベルが１００より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治
療目標に従って、対象が、高いリスク又は極めて高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与
される。
ある患者の個別の特性に応じて、医師は、適切な治療指標及び標的脂質レベルを選択す
ることができる。高脂血症の治療に指針を与えるための十分に受け入れられている１つの
基準は、「成人の高い血液コレステロールの検出、評価及び治療に関する全米コレステロ
ール教育プログラム（ＮＣＥＰ）専門部会の第三次報告」（成人治療パネルＩＩＩ）、最
終報告、国立衛生研究所、ＮＩＨ公開番号０２−５２１５（２００２）（Ｔｈｉｒｄ Ｒ
ｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔ
ｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ （ＮＣＥＰ） Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ
ｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ （Ａｄｕｌｔ Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ） Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ， Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ． ０２−５２１５ （２００２）」であり、その印刷された刊行物の全体が、参
照により、本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレ
ベル又は正常なレベルからＰＣＳＫ９活性の量を減少させるために使用される。幾つかの
実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症を
治療若しくは予防するために、並びに／又は高コレステロール血症及び／若しくは他のコ
レステロール関連疾患（本明細書中に記載されているものなど）に対する医薬の調製にお
いて使用される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は
、ＰＣＳＫ９活性が正常である高コレステロール血症などの症状を治療又は予防するため
に使用される。このような症状において、例えば、正常を下回るＰＣＳＫ９活性の低下は
、治療効果を提供することができる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する２以上の抗原結合タンパク質が、ＰＣ
ＳＫ９活性を調節するために使用される。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する１つ又はそれ以上の抗原結合タンパク
質の治療的有効量及び別の治療剤を投与することを含む、高コレステロール血症などのコ
レステロール関連疾患を治療する方法が提供される。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、単独で投与さ
れる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくと
も１つの他の治療剤の投与前に投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対
する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。あ
る種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの
他の治療剤の投与後に投与される。他の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合
タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。（抗原結合タンパク
質とは別の）治療剤は、少なくとも１つの他のコレステロール降下（血清及び／又は全身
コレステロール）剤又は薬剤を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態におい
て、薬剤は、ＬＤＬＲの発現を増加させ、血清ＨＤＬレベルを増加させ、ＬＤＬレベルを
低下させ、又はトリグリセリドレベルを低下させることが観察されている。典型的な薬剤
には、スタチン（アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、
メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、
ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ， ＮＩＡＳＰＡＮ （徐放性ナイアシン）、
ＳＬＯ−ＮＩＡＣＩＮ（徐放性ナイアシン））、フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ （ゲムフィ
ブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート）、胆汁酸封鎖剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（
コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポー
ル））、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、スタチンとニコチン
酸の組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ （ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮ及びＮＩＡＳＰＡＮ）、吸収
阻害剤とのスタチンの組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（ＺＯＣＯＲ及びＺＥＴＩＡ）及び／
又は脂質修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ＡＢ
Ｐは、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、スクアレン合成酵素阻害剤、
ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インシュリン、ＧＬＰ−１類縁
体、ＤＤＰＩＶ阻害剤など）、ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤及び／又は閉塞性動脈硬
化症治療と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチン、オンコス
タチンＭのようなある種のサイトカイン、エストロゲン及び／又はベルベリンなどのある
種の植物成分のような、対象中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合
わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、（ある種の抗精神病薬、ある種のＨＩ
Ｖプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール又はある種の脂肪
酸などの食事要因並びにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核受容体アゴ
ニスト及びアンタゴニストなど）、対象中の血清コレステロールレベルを増加させる薬剤
と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチン及び／又はインシュ
リンなどの、対象中のＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。２つの組
み合わせは、他の薬剤の望ましくない副作用をＡＢＰによって軽減させることを可能とし
得る。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、他の薬
剤／化合物と組み合わされる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰ及び他の薬剤は、同時
に投与される。幾つかの実施形態において、ＡＢＰと他の薬剤は同時に投与されず、ＡＢ
Ｐは薬剤が投与される前又は後に投与される。幾つかの実施形態において、対象は、予防
の同じ期間、疾患の発症及び／又は治療の期間の間に、ＡＢＰ及び（ＬＤＬＲのレベルを
増加させる）他の薬剤の何れをも服用する。
本発明の医薬組成物は、組み合わせ療法において（すなわち、他の薬剤と組み合わせて
）投与することができる。ある種の実施形態において、組み合わせ療法は、少なくとも１
つの抗コレステロール剤と組み合わせた、ＰＣＳＫ９を結合することができる抗原結合タ
ンパク質を含む。薬剤には、インビトロで合成的に調製された化学的組成物、抗体、抗原
結合領域並びにこれらの組み合わせ及び連結物が含まれるが、これらに限定されない。あ
る種の実施形態において、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節物
質又はトキシンとして作用することができる。ある種の実施形態において、薬剤は、その
標的（例えば、受容体又は酵素の活性化又は阻害剤）を阻害又は刺激するように作用する
ことにより、ＬＤＬＲの増加した発現を促進し、又は血清コレステロールレベルを減少さ
せることができる。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、コレステロー
ル低下（血清及び／又は総コレステロール）剤を用いた治療前、同時に及び後に投与する
ことができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、
高コレステロール血症、心臓病、糖尿病及び／又はコレステロール関連疾患の何れかの開
始を予防又は軽減するために、予防的に投与することができる。ある種の実施形態におい
て、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、既存の高コレステロール血症症状の治療
のために投与することができる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、疾患及び／又は
疾患に伴う症候の開始を遅延させる。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、コレステロ
ール関連疾患の何れか１つの何れかの症候又はその一部を欠如する対象に提供される。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロ
ール血症などの様々なコレステロール関連疾患を治療するための治療剤とともに使用され
る。ある種の実施形態において、症状及び治療の所望されるレベルに照らして、２つ、３
つ又はそれ以上の薬剤を投与することができる。ある種の実施形態において、同じ製剤中
に含めることによって、このような薬剤を一緒に与えることができる。ある種の実施形態
において、このような薬剤及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、同じ製剤中に
含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような
薬剤は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる
。ある種の実施形態において、このような薬剤及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク
質は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。
ある種の実施形態において、このような薬剤は別々に与えることができる。ある種の実施
形態において、遺伝子療法によって投与された場合に、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ
９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を同じベクター中に含めることができ
る。ある種の実施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タ
ンパク質をコードする遺伝子は、同じプロモーター領域の調節下であり得る。ある種の実
施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコー
ドする遺伝子は、別々のベクター中に存在し得る。
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤
、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を
含む医薬組成物を提供する。
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤
、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及
び少なくとも１つのさらなる治療剤の治療的有効量を含む医薬組成物を提供する。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１
つの炎症用治療剤とともに使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ
９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫疾患用治療剤とともに使用する
ことができる。炎症及び免疫疾患用の典型的な治療剤には、シクロオキシゲナーゼ１型（
ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、３８ｋＤａ分裂促進
因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節物質、炎症経路に関与
している細胞内分子の小分子調節物質（このような細胞内分子が、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ
−κＢ、ＺＡＰ７０及びｌｃｋが含まれるが、これらに限定されない。）が含まれるが、
これらに限定されない。ある種の典型的な炎症用治療剤は、例えば、「ＣＡ．Ｄｉｎａｒ
ｅｌｌｏ ＆ Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ
Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉ
ｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ Ｔｈｉｒ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１） Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ
， ＣＡ」中に記載されている。
ある種の実施形態において、薬剤組成物は、２以上の異なる、ＰＣＳＫ９に対する抗原
結合タンパク質を含む。ある種の実施形態において、医薬組成物は、２以上のエピトープ
を結合する、２以上のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態
において、様々な抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、互いと競合しな
い。幾つかの実施形態において、表２並びに図２及び／又は３に図示されている抗原結合
タンパク質の何れもが、医薬組成物中で一緒に組み合わせることができる。
ある種の実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量及
び濃度で服用者に対して有毒でない。幾つかの実施形態において、製剤材料は、皮下及び
静脈内投与用である。ある種の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ
、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出、吸着又は
浸透の速度を修飾し、維持し、又は保持するための製剤材料を含有することができる。あ
る種の実施形態において、適切な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アス
パラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナ
トリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（ボラート、バイカーボナート、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、シトラート、ホスファート又は他の有機酸）；増量剤（マニトール又はグリシ
ンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイ
ン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シク
ロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノー
ス又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン
など）；着色剤、着香剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンな
ど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（ベンズアル
コニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチ
ルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、スルビン酸又は過酸化水素など）；
溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコ
ール（マニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニッ
ク、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリ
ソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど
）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性増強剤（アルカリ金属ハ
ロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウム又はカリウム、マニトールソルビトールなど）
；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬補助剤が含まれるが、これらに限定され
ない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ （１９９５）。幾つかの実施形態において、製剤
は、ＰＢＳ、２０ｍＭＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭＮａＣｌ；及び／又は１０ｍＭ
ＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は治療分
子は、本分野において公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには
、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、ＡＢＰのグリコシル化）及びデキス
トランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許
出願第０９／４２８，０８２号（現在、米国特許第６，６６０，８４３号）及び公開ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９９／２５０４４号（これらは、あらゆる目的のために、参照により、本明細
書に組み込まれる。）に記載されている。
ある種の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達
形式及び所望の投薬量に応じて、当業者により決定される。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記」を参照されたい。あ
る種の実施形態において、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、イ
ンビボ放出の速度及びインビボ除去の速度に影響を及ぼし得る。
ある種の実施形態において、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水
性であり得る。例えば、ある種の実施形態において、非経口投与用の組成物中で一般的な
他の材料を補充することが可能な、適切なビヒクル又は担体は、注射用水、生理的食塩水
溶液又は人工脳脊髄液であり得る。幾つかの実施形態において、生理的食塩水は、等張の
リン酸緩衝化生理的食塩水を含む。ある種の実施形態において、中性の緩衝化された生理
的食塩水又は血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルで
ある。ある種の実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩
衝液又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、これらは、ソルビトール又は適切
なその代替物を含み得る。ある種の実施形態において、所望の純度を有する選択された組
成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形態の、場合によって使用される製剤化剤（
Ｒｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混
合することによって、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ
９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物を保存のために調製することができる。さら
に、ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない
、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形
剤を用いて、凍結乾燥物質として製剤化され得る。
ある種の実施形態において、医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる
。ある種の実施形態において、組成物は、吸入又は経口などの消化管を通じた送達のため
に選択され得る。医薬として許容されるこのような組成物の調製は、当業者の能力の範疇
に属する。
ある種の実施形態において、製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。
ある種の実施形態において、生理的ｐＨに又は僅かにこれより低いｐＨに、典型的には、
約５から約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液が使用される。
ある種の実施形態において、非経口投与が想定されている場合には、治療的組成物は、
医薬として許容されるビヒクル中に、さらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９
に対する所望の抗原結合タンパク質を含む、非経口的に許容される無発熱物質水溶液の形
態であり得る。ある種の実施形態において、非経口注射用ビヒクルは、少なくとも１つの
さらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が適切に
防腐された無菌等張溶液として製剤化されている無菌蒸留水である。ある種の実施形態に
おいて、調製物は、注射可能な微小球体、生物腐食可能な粒子、ポリマー性化合物（ポリ
乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなど、産物の徐放又は持続的放
出（産物は、その後、デポ注射を介して送達され得る。）を与えることができる薬剤を加
えた所望の分子の製剤を含むことができる。ある種の実施形態において、ヒアルロン酸を
使用することも可能であり、循環中での持続的な期間を促進する効果を有し得る。ある種
の実施形態において、所望の分子を導入するために、インプラント可能な薬物送達装置を
使用することができる。
ある種の実施形態において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。あ
る種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣ
ＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、乾燥した吸入用粉末として製剤化することができ
る。ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない
、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤
とともに製剤化することが可能であり、ある種の実施形態において、溶液は噴霧され得る
。経肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達を記載するＰＣＴ出願ＰＣＴ／
ＵＳ９４／００１８７５中にさらに記載されている。
ある種の実施形態において、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある種の実
施形態において、この様式で投与される、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は
加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形
の配合において慣用される担体とともに又は担体なしに製剤化され得る。ある種の実施形
態において、カプセルは、生物学的利用可能性が最大化され、及び前全身分解が最小化さ
れるときに、消化管中の点で製剤の活性な部分を放出するように設計することができる。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又はあらゆる
さらなる治療剤の吸収を促進するために、少なくとも１つの更なる薬剤を含めることがで
きる。ある種の実施形態において、希釈剤、着香剤、低融点の蝋、植物油、潤滑剤、懸濁
剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
ある種の実施形態において、医薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒の賦形剤との混合
物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗
原結合タンパク質の有効量を含むことができる。ある種の実施形態において、無菌水又は
別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、単位投薬形態で溶液を調製する
ことができる。ある種の実施形態において、適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナ
トリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース若しくはリン酸カルシウムなどの不活性
な希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムなどの結合剤、又はステアリン
酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定
されるものではない。
持続的又は制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに
、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤など、さらなる医薬組成物が当業者
に自明である。ある種の実施形態において、リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多
孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の持続的又は制御送達手段を製剤化するための技
術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマー微粒子の徐放に
ついて記載しているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。ある種の実施形態
において、徐放調製物は、成型された製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態
の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続的放出マトリックスには、ポリエステ
ル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及びＥＰ０５８，４８
１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−
ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ
．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅ
ｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，上記）及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８
８）が含まれ得る。ある種の実施形態において、徐放組成物は、リポソームも含み得、こ
れは、本分野で公知の方法の何れによっても調製することが可能である。例えば、Ｅｐｐ
ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３
６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６及びＥＰ１４
３，９４９を参照されたい。
インビボ投与のために使用されるべき医薬組成物は、通例、無菌である。ある種の実施
形態において、これは、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成することができる。ある種
の実施形態において、組成物が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた無菌化は、凍
結乾燥及び再構成の前又は後の何れかにおいて実施し得る。ある種の実施形態において、
非経口投与用組成物は、凍結乾燥された形態で、又は溶液中に保存し得る。ある種の実施
形態において、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器中に、例え
ば、皮下注射針によって突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又は容器
中に配置される。
ある種の実施形態において、医薬組成物が調合された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマル
ジョン、固体として、又は脱水若しくは凍結乾燥された粉末として、無菌容器中に保存さ
れ得る。ある種の実施形態において、このような製剤は、即時使用形態で、又は投与前に
再構成される形態（例えば、凍結乾燥された形態）の何れかで保存し得る。
ある種の実施形態において、単回投薬投与単位を製造するためのキットが提供される。
ある種の実施形態において、キットは、乾燥されたタンパク質を有する第一の容器と、水
性製剤を有する第二の容器の両方を含有し得る。ある種の実施形態において、単一及び／
又は複数チャンバーの予め充填された注射器（例えば、液体注射器及び凍結乾燥注射器（
ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、
ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の治療において使用されるべき
有効量は、例えば、治療的な文脈及び目的に依存する。従って、当業者は、ある種の実施
形態に従って、送達される分子、少なくとも１つの追加の治療剤とともに又は少なくとも
１つの追加の治療剤なしに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が使用されている適
応症、投与の経路及びサイズ（体重、体表面又は臓器サイズ）及び／又は患者の症状（年
齢及び一般的な健康）に部分的に依存して、治療用の適切な投薬レベルが変動することを
理解する。ある種の実施形態において、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を
滴定し、投与の経路を修飾し得る。ある種の実施形態において、典型的な投薬量は、上述
の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲で
あり得る。ある種の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍ
ｇ／ｋｇ又は１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又は５μｇ／ｋｇから最大約１０
０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
ある種の実施形態において、投薬の頻度は、使用される製剤中のＰＣＳＫ９に対する抗
原結合タンパク質及び／又は何れかのさらなる治療剤の薬物動態学的パラメータを考慮に
入れる。ある種の実施形態において、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達する
まで、組成物を投与する。ある種の実施形態において、組成物は、従って、単回用量とし
て、又は経時的に２つ若しくはそれ以上の用量（所望の分子の同じ用量を含有してもよく
、含有しなくてもよい。）として、又はインプラント装置若しくはカテーテルを介した連
続注入として投与され得る。適切な投薬量をさらに精密化することは、当業者によって日
常的に行われており、当業者によって日常的に行われる作業の範疇に属する。ある種の実
施形態において、適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認し得る。幾
つかの実施形態において、投与の量及び頻度は、取得されるべき所望のコレステロールレ
ベル（血清及び／又は総）及び対象の現在のコレステロールレベル、ＬＤＬレベル及び／
又はＬＤＬＲレベルを考慮に入れることができ、これらの全ては当業者に周知の方法によ
って取得することができる。
ある種の実施形態において、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従い、例えば、経
口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈
内、又は病変内経路による注射を通じて、徐放システムによって又はインプラント装置に
よって行われる。ある種の実施形態において、組成物は、ボーラス注射によって、又は注
入により連続的に、又はインプラント装置によって投与され得る。
ある種の実施形態において、組成物は、その上に所望の分子が吸収又は封入されている
膜、スポンジ又は別の適切な材料の移植を介して、局所的に投与することができる。ある
種の実施形態において、インプラント装置が使用される場合、装置は、何れかの適切な組
織又は臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、時間指定放出型大量瞬
時投与又は継続的投与を介して行われ得る。
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、
ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物をエキソビボ様式で使用するこ
とが望ましい場合があり得る。このような事例では、患者から採取された細胞、組織及び
／又は臓器は、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対
する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物に曝露され、この後、細胞、組織及び／又は臓
器は、続いて、患者中に戻されて移植される。
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は何れか
のさらなる治療剤は、ポリペプチドを発現及び／又は分泌するために、本明細書に記載さ
れている方法などの方法を用いて、遺伝子操作されたある種の細胞を移植することによっ
て送達することができる。ある種の実施形態において、このような細胞は、動物又はヒト
の細胞であり得。自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）又は異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅ
ｉｃ）であり得る。ある種の実施形態において、細胞は不死化され得る。ある種の実施形
態において、免疫学的応答の確率を減少させるために、細胞を封入して、周囲組織の浸潤
を回避することができる。ある種の実施形態において、典型的には、封入材料は、タンパ
ク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によって又は周囲組織由来の他の有害な因
子によって、細胞の破壊を妨げる生態適合性の半透性ポリマー性封鎖又は膜である。
（以下の実施例に示されているように）ＰＣＳＫ９活性を著しく中和するＡＢＰの能力
に基づいて、これらのＡＢＰは、高コレステロール血症などのＰＣＳＫ９によって媒介さ
れる活性から生じる症候及び症状を治療及び予防する上で治療効果を有する。
診断用途
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、診断用ツールとして使用される。ＡＢＰは、試
料及び／又は対象中に存在するＰＣＳＫ９の量をアッセイするために使用することができ
る。当業者によって理解されるように、このようなＡＢＰは中和ＡＢＰである必要はない
。幾つかの実施形態において、診断用ＡＢＰは中和ＡＢＰでない。幾つかの実施形態にお
いて、診断用ＡＢＰは、中和ＡＢＰが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合す
る。幾つかの実施形態において、２つのＡＢＰは互いに競合しない。
幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されているＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のレベ
ルの変化を伴う疾病又は疾患をスクリーニング／診断するために、哺乳動物組織又は細胞
中のＰＣＳＫ９の検出用アッセイキット及び／又は方法において使用され、又は提供され
る。キットは、ＰＣＳＫ９を結合するＡＢＰ、存在する場合に、ＰＣＳＫ９とのＡＢＰの
結合を示し、場合によってＰＣＳＫ９タンパク質レベルを示す手段を含む。ＡＢＰの存在
を示すための様々な手段を使用することができる。例えば、蛍光色素、他の分子プローブ
又は酵素をＡＢＰに連結することができ、ＡＢＰの存在は様々な様式で観察することがで
きる。このような疾患をスクリーニングするための方法は、キットの使用、又は開示され
ているＡＢＰの１つの単に使用すること、及びＡＢＰが試料中のＰＣＳＫ９に結合するか
どうかの測定を含み得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＳＫ９の高い又は上昇
したレベルは、試料中のＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合のより多い量をもたらす。従って、試
料中にどの程度多くのＰＣＳＫ９が存在するかを測定するために、ＡＢＰ結合の程度を使
用することができる。所定の量（例えば、ＰＣＳＫ９関連疾患を持たない者が有する量又
は範囲）より多いＰＣＳＫ９の量を有する対象又は試料は、ＰＣＳＫ９によって媒介され
る疾患を有するものとして特徴付けることができる。幾つかの実施形態において、スタチ
ンが対象中のＰＣＳＫ９の量を増大させたかどうかを決定するために、スタチンを服用し
ている対象にＡＢＰが投与される。
幾つかの実施形態において、ＡＢＰは非中和ＡＢＰであり、ＡＢＰ及び／又はスタチン
治療を受けている対象中のＰＣＳＫ９の量を測定するために使用される。
実施される実験及び達成された結果を含めて、以下の実施例は、例示の目的でのみ提供
されるものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
（実施例１）
免疫化及び力価測定
抗ＰＣＫＳ９抗体及びハイブリドーマの作製
ＰＣＳＫ９の成熟形態に対する抗体（図１Ａ中の配列として図示されており、プロドメ
インに下線が付されている。）を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスであるＸ
ｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）中で作製
した。ＰＣＳＫ９に対する抗体を作製するために、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）マウスの２
つのグループ（グループ１及び２）を使用した。グループ１は、完全ヒトＩｇＧ２κ及び
ＩｇＧ２λ抗体を産生するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）系統ＸＭＧ２−ＫＬのマウスを含ん
だ。グループ１のマウスを、ヒトＰＣＳＫ９で免疫化した。ＧｅｎＢａｎｋ配列を参照と
して（ＮＭ １７４９３６）を使用する標準的組換え技術を用いて、ＰＣＳＫ９を調製し
た。グループ２は、完全ヒトＩｇＧ４κ及びＩｇＧ４λ抗体を産生するＸｅｎｏＭｏｕｓ
ｅ（Ｒ）系統ＸＭＧ４−ＫＬのマウスを含んだ。グループ２のマウスも、ヒトＰＣＳＫ９
で免疫化した。
表３中のスケジュールに従って、両グループのマウスに抗原を１１回注射した。最初の
免疫化において、腹部中に腹腔内送達された抗原計１０μｇを各マウスに注射した。その
後の強化免疫は５μｇの用量であり、注射法は、腹部内への腹腔内注射と尾の基部への皮
下注射間でずらされる。腹腔内注射のために、ＴｉｔｅｒＭａｘ（Ｒ）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇ
ｍａ， Ｃａｔ ＃ Ｔ２６８４）を加えたエマルジョンとして抗原を調製し、皮下注射
のために、抗原をＡｌｕｍ（リン酸アルミニウム）及びＣｐＧオリゴと混合する。注射２
から８及び１０において、アジュバントａｌｕｍゲル中の抗原計５μｇを各マウスに注射
した。マウス当り抗原５μｇの最終注射をリン酸緩衝化された生理的食塩水中に送達し、
２つの部位に送達する（腹部内へ５０％腹腔内及び尾の基部に５０％皮下）。免疫化プロ
グラムは、以下に示されている表３中に要約されている。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を滴定するために使用したプロトコールは、以下のとおりであ
った。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレートを８μｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）のニ
ュートラビジンで被覆し、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中において、４℃で一晩温置
する。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１×
ＰＢＳ／１％ミルク２５０μＬを用いてプレートをブロックし、室温で少なくとも３０分
間温置した。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、ブロックを洗浄除去
した。次いで、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（アッセイ希釈液）５０μＬ
／ウェル中に、２μｇ／ｍＬでｂ−ヒトＰＣＳＫ９を捕捉し、室温で１時間温置した。次
いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を使用して洗浄した。一次抗体に
関しては、１：１００から二つ組みで、血清を１：３滴定した。アッセイ希釈液５０μＬ
／ウェル中でこれを行い、室温で１時間温置した。次いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴ
ｅｋ３サイクル洗浄を使用して洗浄した。二次抗体は、５０μＬ／ウェルのアッセイ希釈
液中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰであった。室温で１時間、これを
温置した。次いで、ＲＯ水を用い、ＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を使用してこれを洗
浄し、ペーパータオル上で叩いて乾燥させた。基質に関しては、一工程のＴＭＰ溶液（Ｎ
ｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を使用し（５０μＬ／ウェル）、
室温で３０分間展開させた。
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて従ったプロトコールは、以下のとおりであった。Ｖ５Ｈｉ
ｓタグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関して、以下のプロトコールを使用した。
Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
）を使用した。１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μｇ／ｍＬ
のニュートラビジンで、プレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで
、ＴｉｔｅｒｔｅｋＭ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌ
ｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１
％ミルク２５０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｍ３
８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉は
、Ｖ５タグを持たないｂ−ｈｕＰＣＳＫ９であり、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣ
ａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１
時間温置した。３サイクルの洗浄を行った。１：１００から２つ組みで、血清を１：３滴
定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの容量で、アッセ
イ希釈液中において行った。プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクルの洗浄
を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（５０ μｌ／ウェル）中の１０
０ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰをプレートに添加し、室温
で１時間温置した。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペ
ーパータオルで叩いて、プレートを乾燥させた。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，
Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し
、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅ
ｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
ＰＣＳＫ９が結合したプレートを検出するための陽性対照は、アッセイ希釈液中で３μ
ｇ／ｍＬから２つ組みで１：３滴定された、可溶性ＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ， Ｃａｔ ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）及びポリクローナルウサギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｃ
ａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃１０００７１８５）であった。４００ｎｇ／ｍＬの濃
度でヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｔ ＃ＡＦ２１４８）及びウサギ
抗ヤギＩｇＧＦｃＨＲＰを用いて、ＬＤＬＲを検出した。アッセイ希釈液中の、４００ｎ
ｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃを用いて、ウサギポリクローナルを検出した。
陰性対照は、アッセイ希釈液中において、１：１００から２つ組みで１：３滴定されたナ
イーブＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
Ｖ５Ｈｉｓタグを有するｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関しては、以下のプロトコールを
使用した。Ｃｏｓｔａｒ ３３６８培地結合プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅ
ｎｃｅｓ）を使用した。１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μ
ｇ／ｍＬのニュートラビジンで、プレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した
。次いで、ＴｉｔｅｒｔｅｋＭ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓ
ｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×Ｐ
ＢＳ／１％ミルク２５０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次い
で、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った
。捕捉は、Ｖ５タグを有するｂ−ｈｕＰＣＳＫ９であり、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０
ｍＭＣａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室
温で１時間温置した。３サイクルの洗浄を行った。１：１００から２つ組みで、血清を１
：３滴定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの容量で、
アッセイ希釈液中において行った。プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル
洗浄を用いて作動されるＭ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×
ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨ
ＲＰを５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。３サイ
クル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペーパータオルで叩いて、プ
レートを乾燥させた。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，
Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ
塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いてプレートを消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリー
ダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
陽性対照は、ＬＤＬＲ、アッセイ希釈液中において、３μｇ／ｍＬから２つ組みで１：
３滴定されたウサギ抗ＰＣＳＫ９であった。ヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｃａｔ ＃ＡＦ２１４８）及び４００ｎｇ／ｍＬの濃度のウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃＨＲ
Ｐを用いて、ＬＤＬＲを検出する。ウサギｐｏｌｙは、アッセイ希釈液中、４００ｎｇ／
ｍＬの濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃを用いて検出された。アッセイ希釈液中で１μｇ／
ｍＬから２つ組みで、ヒト抗Ｈｉｓ１．２．３及び抗Ｖ５１．７．１を１：３滴定した。
何れも、アッセイ希釈液中、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ＩｇＧＦｃＨＲＰを用いて
検出された。陰性対照は、アッセイ希釈液中において、１：１００から２つ組みで１：３
滴定されたナイーブＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の力価は、記載されている可溶性抗原を用いて免疫化され
たマウスに対するＥＬＩＳＡアッセイによって検査した。表４は、ＥＬＩＳＡデータを要
約し、ＰＣＳＫ９に対して特異的であるように見受けられる幾つかのマウスが存在したこ
とを示す。例えば、表４を参照されたい。従って、免疫化プログラムの終わりに、１０匹
のマウス（表４中の太字）を採集のために選択し、本明細書中に記載されているように、
それぞれ、脾臓及びリンパ節から脾細胞及びリンパ球を単離した。
（実施例２）
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、融合及びハイブリドーマの作製
この実施例は、免疫細胞がどのようにして回収され、ハイブリドーマがどのようにして
作製されたかについて概説する。選択された免疫化マウスを頚椎脱臼によって屠殺し、各
コホートから流入領域リンパ節を採集し、プールした。細胞を組織から放出させるために
、ＤＭＥＭ中で磨り潰すことによって、リンパ系組織からＢ細胞を解離させ、細胞をＤＭ
ＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、穏やかに、但し、完全に細胞を再懸濁させるために、
１億のリンパ球当りＤＭＥＭ０．９ｍＬを細胞沈降物に添加した。
１：４の比で、リンパ球をＡＴＣＣ、ｃａｔ．＃ＣＲ１１５８０から購入した非分泌性
骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０）と混合した。４００×ｇで、４分の遠
心によって、細胞混合物を穏やかに沈降させた。容器を傾けて上清を除去した後、１ｍＬ
ピペットを用いて、細胞を穏やかに混合した。１分にわたって、穏やかに撹拌しながら、
Ｓｉｇｍａ（ｃａｔ＃Ｐ７３０６）から得た事前加熱されたＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液（Ｂ細
胞１００万個当り１ｍＬ）をゆっくり添加した後、１分間混合した。次いで、穏やかに撹
拌しながら、２分にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当り２ｍＬ
）（グルタミン、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミ
ノ酸なしのＤＭＥＭ）（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た）を添加した。最後に、３
分にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（１０６個のＢ細胞当り８ｍＬ）を添加した。
４００×ｇで６分、融合された細胞を遠心沈降させ、１００万個のＢ細胞当り選択培地
２０ｍＬ（Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、
ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入
手）、ＨＡ−アザセリンヒポキサンチン及びＯＰＩ（オキサロアセタート、ピルバート、
ウシインシュリン）（何れも、Ｓｉｇｍａから入手）及びＩＬ−６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が補充された、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ＦＢＳ
（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に再懸濁した。３７℃で２０から３０分間、細胞を温置し、次いで
、選択培地２００ｍＬ中に再懸濁し、９６ウェルへの播種の前に、Ｔ１７５フラスコ中で
３から４日間培養した。このようにして、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を産生
するハイブリドーマを作製した。
（実施例３）
ＰＣＳＫ９抗体の選択
本実施例は、様々なＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質をどのようにして性質決定し、選択
したかについて概説する。（実施例１及び２で産生されたハイブリドーマから産生された
）分泌された抗体のＰＣＳＫ９への結合を評価した。抗体の選択は、結合データ及びＬＤ
ＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の阻害及び親和性を基礎とした。以下に記載されているように
、ＥＬＩＳＡによって、可溶性ＰＣＳＫ９への結合を分析した。結合親和性を定量するた
めに、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）（表面プラズモン共鳴）を使用した。
一次スクリーニング
野生型ＰＣＳＫ９に結合する抗体に対する一次スクリーニングを行った。２つの採集物
に対して、一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイを
含み、以下のプロトコールを用いて行った。
Ｃｏｓｔａｒ３７−２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ
化物中、４μｇ／ｍＬの濃度のニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プ
レートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈ
ｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った
。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した
。次いで、プレートを洗浄した。再度、３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タ
グを持たないビオチン化合されたＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×Ｐ
ＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレー
トを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋ
プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣ
ａ２＋４０μＬ中に、上清１０μＬを移し、室温で１．５時間温置した。再度、３サイク
ル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄
した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００
）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で１
時間温置した。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、１工程
ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェ
ルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光を
行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取
った。
一次スクリーニングによって、２つの採集物から同定された合計３１０４の抗原特異的
ハイブリドーマが得られた。最高のＥＬＩＳＡＯＤに基づいて、合計３０００の陽性に対
して、採集物当り１５００のハイブリドーマをさらなる操作に用いた。
確認用スクリーニング
次いで、安定なハイブリドーマが確立されたことを確認するために、野生型ＰＣＳＫ９
への結合に関して、３０００の陽性を再スクリーニングした。スクリーニングは、以下の
ように行った。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０
．０５％アジ化物中、３μｇ／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一
晩、プレートを温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅ
ｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を
行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温
置した。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの
洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェ
ルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加し
た。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて、プレー
トを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋４０μＬ中に、上清１０μＬ
を移し、室温で１．５時間温置した。再度、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅ
ｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１
０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰ
ＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。３サイク
ル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートをもう
一度洗浄した。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎ
ｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４
０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０
ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。合計２４４１の陽性を、第二のスクリーニングで反復し
た。次いで、その後のスクリーニングにおいて、これらの抗体を使用した。
マウス交叉反応スクリーニング
次いで、抗体がヒト及びマウスＰＣＳＫ９の両方に結合できることを確認するために、
マウスＰＣＳＫ９に対する交叉反応性に関して、ハイブリドーマのパネルをスクリーニン
グした。交叉反応性スクリーニングでは、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ
３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、３μｇ
／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次
いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，
ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミ
ルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒ
ｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉
試料は、ビオチン化されたマウスＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの容量で、１×Ｐ
ＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に１μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを
室温で１時間温置した。次に、３サイクルの洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプ
レート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。上清５０μＬをプレートに移し、室温で
１時間温置した。再度、３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１×ＰＢＳ／１
％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒト
ＩｇＧＦｃＰＯＤ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置し
た。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎ
ｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレー
トに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔ
ｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。５７９抗
体は、マウスＰＣＳＫ９と交叉反応することが観察された。次いで、その後のスクリーニ
ングにおいて、これらの抗体を使用した。
Ｄ３７４Ｙ変異体結合スクリーニング
ＰＣＳＫ９中のＤ３７４Ｙ変異は、ヒト集団中において文献に記載されている（例えば
、Ｔｉｍｍｓ ＫＭ ｅｔ ａｌ， “Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＰＣＳＫ９ ｃａ
ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏ
ｌｅｍｉａ ｉｎ ａ Ｕｔａｈ ｐｅｄｉｇｒｅｅ”， Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４
：３４９−３５３， ２００４）。抗体が野生型に対して特異的であり、又はＰＣＳＫ９
のＤ３７４Ｙ形態に結合されているかどうかを測定するために、次いで、変異Ｄ３７４Ｙ
を含む変異体ＰＣＳＫ９配列への結合に関して、試料をスクリーニングした。スクリーニ
ングのためのプロトコールは、以下のとおりであった。スクリーニングでは、Ｃｏｓｔａ
ｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、４μ
ｇ／ｍＬのニュートラビジンでプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。
次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ
，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％
ミルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅ
ｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１
×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化されたヒ
トＰＣＳＫ９Ｄ３７４Ｙでプレートを被覆し、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅ
ｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。後
期枯渇ハイブリドーマ培養上清をＰＢＳ／ミルク／Ｃａ２＋中に１：５希釈し（１０ｍＬ
＋４０ｍＬ）、室温で１時間温置した。次に、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２
＋中、１μｇ／ｍＬで、ウサギ抗ヒトＰＣＳＫ９（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）及
びヒト抗Ｈｉｓ１．２．３（１：２）の４０μＬ／ウェルをプレート上に滴定し、次いで
、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレート
を洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中
、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ４０μＬ／ウ
ェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／
１０ｍＭＣａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦ
ｃＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間温置した。次い
で、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄
を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕ
ｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μ
Ｌ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍ
でＯＤを直ちに読み取った。野生型ＰＣＳＫ９に対する陽性ヒットの９６％以上が、変異
体ＰＣＳＫ９も結合した。
大規模受容体リガンド遮断スクリーニング
ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合を遮断する抗体をスクリーニングするために、Ｄ３７４Ｙ
ＰＣＳＫ９変異体を用いたアッセイを開発した。ＬＤＬＲに対してより高い結合親和性を
有するので、このアッセイに対して変異体を使用し、より感度が高い受容体リガンド遮断
アッセイの開発を可能とした。受容体リガンド遮断スクリーニングでは、以下のプロトコ
ールを使用した。スクリーニングでは、Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレ
ート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。４０μＬ／ウェルの
容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、２μｇ／ｍＬのヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆ＤＣ
ａｔ＃ＡＦ２１４８）でプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次いで
、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ
）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミルク
９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅ
ｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。捕捉試料
は、ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）であり、４０μＬ／ウェルの容量
で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中に０．４μｇ／ｍＬで添加した。次い
で、プレートを室温で１時間１０分間温置した。同時に、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレー
ト中のハイブリドーマ枯渇上清１５μＬとともに、ビオチン化されたヒトＤ３７４ＹＰＣ
ＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置し、枯渇上清濃度を１：５希釈した。次いで、プレートを
室温で約１時間３０分間事前温置した。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔ
ｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。事前温置された混合物５０
μＬ／ウェルを、ＬＤＬＲで被覆されたＥＬＩＳＡプレート上に移し、室温で１時間温置
した。ＬＤＬＲに結合されたｂ−ＰＣＳＫ９を検出するために、アッセイ希釈液中の５０
０ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレ
ートを室温で１時間温置した。再度、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレー
トを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌ
ｅｘｉｎｇｔｏｎ， Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温
で３０分後に、１Ｎ塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレー
トリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。スクリーニングによって、
ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲウェル間での相互作用を遮断する３８４の抗体が同定され、１００
の抗体は相互作用を強く遮断した（ＯＤ＜０．３）。これらの抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤ
ＬＲの結合相互作用を９０％超阻害した（９０％超の阻害）。
遮断物質のサブセットに対する受容体リガンド結合アッセイ
次いで、第一の大規模受容体リガンド阻害アッセイにおいて同定された中和物質の３８
４にサブセットに対して、変異体酵素を用いて受容体リガンドアッセイを反復した。３８
４の遮断物質サブセットアッセイのスクリーニングでは、大規模受容体リガンド遮断スク
リーニングにおいて行われたものと同じプロトコールを使用した。この反復スクリーニン
グによって、最初のスクリーニングデータが確認された。
この３８４メンバーのサブセットのスクリーニングによって、９０％を超えて、ＰＣＳ
Ｋ９変異体酵素とＬＤＬＲ間の相互作用を遮断する８５の抗体が同定された。
野生型ＰＣＳＫ９を結合するが、Ｄ３７４Ｙ変異体を結合しない遮断物質の受容体リガ
ンド結合アッセイ
３０００の上清の当初パネル中には、野生型ＰＣＳＫ９に特異的に結合するが、ｈｕＰ
ＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）変異体に結合しないことが示された８６の抗体が存在していた。
ＬＤＬＲ受容体への野生型ＰＣＳＫ９の結合を遮断する能力に関して、これらの８６の上
清を検査した。スクリーニングでは、以下のプロトコールを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７
０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を
使用した。４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、１０μｇ／
ｍＬの抗Ｈｉｓ１．２．３でプレートを被覆した。４℃で一晩、プレートを温置した。次
いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，
ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。１×ＰＢＳ／１％ミ
ルク９０μＬでプレートをブロックし、室温で約３０分間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒ
ｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。ＬＤ
ＬＲ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，＃２１４８ＬＤ／ＣＦ又はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，＃２１
４８ＬＤ）を、４０μＬ／ウェルの容量で、１×ＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋
中に５μｇ／ｍＬで添加した。次いで、プレートを室温で１時間温置した。次に、３サイ
クル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗
浄した。同時に、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレート中のハイブリドーマ枯渇上清とともに
、ビオチン化されたヒト野生型ＰＣＳＫ９を事前温置した。１×ＰＢＳ／１％ミルク／１
０ｍＭＣａ２＋中、５８３ｎｇ／ｍＬの濃度でｂ−ＰＣＳＫ９の３３μＬ中にハイブリド
ーマ上清２２μＬを移し、最終のｂ−ＰＣＳＫ９濃度＝３５０ｎｇ／ｍＬ及び１：２．５
の最終希釈で枯渇上清を得た。プレートを室温で約１時間３０分間事前温置した。事前温
置された混合物５０μＬ／ウェルを、ＬＤＬＲが捕捉されたＥＬＩＳＡプレート上に移し
、室温で１時間温置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレート
を洗浄した。３サイクルの洗浄を行った。アッセイ希釈液中の５００ｎｇ／ｍＬのストレ
プトアビジンＨＲＰ４０μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを室温で１時間温
置した。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いてプレートを洗浄した。３サ
イクルの洗浄を行った。最後に、１工程ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，
Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の４０μＬ／ウェルをプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ
塩酸の４０μＬ／ウェルを用いて消光した。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて
、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
スクリーニングの結果
記載されているアッセイの結果に基づいて、ＰＣＳＫ９との所望の相互作用を有する抗
体を産生するとして、幾つかのハイブリドーマ株が同定された。各株からクローンの管理
可能な数を単離するために、限外希釈を使用した。ハイブリドーマ株の数字（例えば、２
１Ｂ１２）及びクローン数（例えば、２１Ｂ１２．１）によって、クローンを表記した。
一般に、特定の株の異なるクローン間の差は、本明細書中に記載されている機能的アッセ
イによって検出された。２、３の事例では、機能的アッセイにおいて異なる挙動を示した
特定の株からクローンが同定された。例えば、２５Ａ７．１はＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲを遮
断しないが、２５Ａ７．３（本明細書において、２５Ａ７と称される。）は中和性である
ことが見出された。単離されたクローンを、ハイブリドーマ溶媒５０から１００ｍＬ中で
それぞれ増殖させ、枯渇するまで増殖させた（すなわち、約１０％未満の細胞生存率）。
これらの培養物の上清中でのＰＣＳＫ９に対する抗体の濃度及び効力を、本明細書中に記
載されているようなＥＬＩＳＡによって、及びインビトロ機能的検査によって測定した。
本明細書に記載されているスクリーニングの結果として、ＰＣＳＫ９に対する抗体の最も
高い力価を有するハイブリドーマを同定した。図２Ａから３Ｄ及び表２中に、選択された
ハイブリドーマが示されている。
（実施例４．１）
ハイブリドーマからのヒト３１Ｈ４ＩｇＧ４抗体の作製
この実施例は、ハイブリドーマ株から、抗原結合タンパク質の１つをどのようにして作
製するかについて一般的に記載する。作製作業は、枯渇上清生成５０ｍＬを使用した後、
プロテインＡ精製を行った。Ｉｎｔｅｇｒａ作製を大規模化し、その後実行した。ハイブ
リドーマ株３１Ｈ４を、培地２０ｍＬ中のＴ７５フラスコで増殖させた（Ｉｎｔｅｇｒａ
Ｍｅｄｉａ、表５）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で
、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎ
ｔｅｇｒａ ＣＬ１０００， ｃａｔ＃ ９０ ００５）。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバ
ー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得
られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬ容量
を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した（
Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を
、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔てる
膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドーマ
細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及び
そのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。
１週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇ
ｒａ培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持した。増殖の
第２週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目
に集めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ
株から得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒ
ｐｍで１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプ
ロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次い
で、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄に
よって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０
ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上に結合された抗体タンパク
質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ
排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン
交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対する特異的なＩＥＸ
条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍ
Ｍから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
（実施例４．２）
形質移入された細胞からの組換え３１Ｈ４ヒトＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、３１Ｈ４ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製され
るかを概説している。一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣＨＯ細胞
を、３１Ｈ４重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及び細胞破砕物
を除去することによって、形質移入された細胞からの馴化培地を回収した。透明になった
馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず
濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的な
ＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗
体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上の結合された
抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク
質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上
の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対する特
異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム
容量の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
（実施例５）
ハイブリドーマからのヒト２１Ｂ１２ＩｇＧ４抗体の作製
本実施例は、ハイブリドーマから抗体２１Ｂ１２ＩｇＧ４がどのようにして作製された
かを概説する。ハイブリドーマ株２１Ｂ１２を、培地中のＴ７５フラスコで増殖させた（
ＩｎｔｅｇｒａＭｅｄｉａ、表５）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態
になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ， Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００， ｃａｔ＃ ９０ ００５）。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバ
ー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得
られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬの容
量を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した
（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）
を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔て
る膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドー
マ細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及
びそのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。１
週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ
培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持された。増殖の２
週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目に集
めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ株か
ら得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒｐｍ
で１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプロテ
インＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次いで、
プロテインＡセファロースカラム上に搭載する。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的
結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、
ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上に結合された抗体タンパク質を回収した。プ
ロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラ
フィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラ
フィーによって除去した。２１Ｂ１２タンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７
．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１０ｍＭから５００ｍ
ＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
（実施例６）
形質移入された細胞からのヒト２１Ｂ１２ＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、２１Ｂ１２ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製さ
れるかを概説している。細胞（一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣ
ＨＯ細胞）を、２１Ｂ１２重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及
び細胞破砕物を除去することによって、ハイブリドーマ細胞からの馴化培地を回収した。
透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって
、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができ
る。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの
標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０など）によって、プロテインＡ上
の結合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した
抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＰ−セファロース樹脂などの陽
イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。２１Ｂ１２タ
ンパク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ５．２でＳＰ−セファロースＨＰである。
２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含有する緩
衝液の２５カラム容積で抗体を溶出した。
（実施例７）
ハイブリドーマからのヒト１６Ｆ１２ＩｇＧ４抗体の作製
本実施例は、ハイブリドーマから抗体１６Ｆ１２ＩｇＧ４がどのようにして作製された
かを概説する。ハイブリドーマ株１６Ｆ１２を、培地中のＴ７５フラスコで増殖させた（
表５参照）。ハイブリドーマはＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔ
ｅｇｒａフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１
０００，ｃａｔ＃９０ ００５）に移した。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバー（小さなチャンバー及び大きなチャンバ
ー）へ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株から得
られた１×１０６細胞／ｍＬの最小細胞密度のハイブリドーマ細胞２０から３０ｍＬの容
量を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小さなチャンバー中に配置した
（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）
を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大きなチャンバー中に配置した。２つのチャンバーを隔て
る膜は、小分子量栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞及びハイブリドー
マ細胞によって産生された抗体に対して非透過性である。従って、ハイブリドーマ細胞及
びそのハイブリドーマ細胞によって産生された抗体を小さなチャンバー中に保持した。
１週後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇ
ｒａ培地と交換した。小さなチャンバーから集められた培地は、別個に保持された。増殖
の２週後に、小さなチャンバーから得た培地を再度集めた。ハイブリドーマ株から１週目
に集めた培地を、ハイブリドーマ株から２週目に集めた培地と合わせた。ハイブリドーマ
株から得られた集められた培地試料を遠心して、細胞及び破砕物を除去して（３０００ｒ
ｐｍで１５分）、得られた上清をろ過した（０．２２μｍ）。透明になった馴化培地をプ
ロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって、培地をまず濃縮し、次い
で、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄に
よって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの標準的酸性抗体溶出（５０
ｍＭシトラート、ｐＨ３．０）によって、プロテインＡカラム上の結合された抗体タンパ
ク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイ
ズ排除クロマトグラフィー又はＱセファロース樹脂などの陰イオン交換樹脂上の結合イオ
ン交換クロマトグラフィーによって除去した。１６Ｆ１２タンパク質に対する特異的なＩ
ＥＸ条件は、ｐＨ７．８から８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム容量の１
０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
（実施例８）
形質移入された細胞からのヒト１６Ｆ１２ＩｇＧ２抗体の作製
本実施例は、１６Ｆ１２ＩｇＧ２抗体が形質移入された細胞からどのようにして作製さ
れるかを概説している。細胞（一過性発現のために２９３細胞及び安定な発現のためにＣ
ＨＯ細胞）を、１６Ｆ１２重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドで形質移入した。細胞及
び細胞破砕物を除去することによって、ハイブリドーマ細胞からの馴化培地を回収した。
透明になった馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に搭載した。場合によって
、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡセファロースカラム上に搭載することができ
る。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラムからの
標準的酸性抗体溶出（５０ｍＭシトラート、ｐＨ３．０）によって、プロテインＡ上の結
合された抗体タンパク質を回収した。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体
タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＰ−セファロース樹脂などの陽イオ
ン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。１６Ｆ１２タンパ
ク質に対する特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ５．２でＳＰ−セファロースＨＰである。２０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０ｍＭから５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含有する緩衝液
の２５カラム容積で抗体を溶出する。
（実施例９）
抗体重鎖及び軽鎖の配列分析
次いで、Ｓａｎｇｅｒ（ジデオキシ）ヌクレオチド配列決定によって、上記抗体の軽鎖
及び重鎖に対する核酸及びアミノ酸配列を決定した。次いで、核酸配列に対してアミノ酸
配列を推定した。可変ドメインに対する核酸配列が、図３Ｅから３ＪＪに図示されている
。
３１Ｈ４、２１２Ｂ１２及び１６Ｆ１２のλ軽鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定
され、それぞれ、配列１５３、９５及び１０５として開示されている。
３１Ｈ４、２１２Ｂ１２及び１６Ｆ１２の重鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定さ
れ、それぞれ、配列１５２、９４及び１０４として開示されている。
λ軽鎖定常領域（配列番号１５６）並びにＩｇＧ２及びＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番
号１５４及び１５５）が、図３ＫＫに示されている。
ｃＤＮＡ配列の各々から予想されたポリペプチド配列を決定した。３１Ｈ４、２１Ｂ１
２及び１６Ｆ１２のλ軽鎖可変領域に対する予想ポリペプチド配列が予想され、それぞれ
、配列番号１２、２３及び３５として開示されており、λ軽鎖定常領域（配列番号１５６
）、３１Ｈ４、２１Ｂ１２及び１６Ｆ１２の重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号６７、
４９及び７９として開示されている。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５
４及び１５５）。
ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４分類が、図２Ａから
３Ｄに示されている。
配列データに基づいて、それぞれの重鎖又は軽鎖可変領域が得られた生殖系列遺伝子を
決定した。図２Ａから３Ｄにおいて、生殖系列遺伝子の種類は対応するハイブリドーマ株
の隣に示されおり、それぞれ、一意的な配列番号によって表されている。図２Ａから３Ｄ
は、性質決定されたさらなる抗体に対する決定されたアミノ酸配列も図示している。
（実施例８）
３つの抗体の等電点の測定
アミノ酸配列に基づく抗体の理論的ｐＩは、１６Ｆ１２に対して７．３６、２１Ｂ１２
に対して８．４７及び３１Ｈ４に対して６．８４であることが決定された。
（実施例９）
ＰＣＳＫ９に対する抗体の結合の性質決定
ＰＣＳＫ９に結合する多数の抗原が同定されたら、結合の性質を定量し、さらに性質決
定するために、幾つかのアプローチを使用した。研究の一態様において、Ｂｉａｃｏｒｅ
アフィニティー分析を実施した。研究の別の態様において、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）アフィニ
ティー分析を実施した。これらの研究において使用された試料及び緩衝液が、下表６に示
されている。
ＢＩＡｃｏｒｅ親和性測定
本実施例に記載されているＰＣＳＫ９に対する２１Ｂ１２抗体のＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）
（表面プラズモン共鳴装置、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
親和性分析は、製造業者の指示書に従って行った。
要約すれば、表面プラズモン共鳴実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００光学的バイオセンサ
ー（Ｂｉａｃｏｒｅ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ
）を用いて行った。２００以下の共鳴単位（ＲＵ）の最大分析物結合応答（Ｒｍａｘ）を
与えるレベルで、アミン結合によって研究等級のＣＭ５バイオセンサーチップに、それぞ
れの個別の抗ＰＣＳＫ９抗体を固定化した。ＰＣＳＫ９タンパク質の濃度は２倍間隔で変
動させ（分析物）、（１．５分間、１００μＬ／分の流速で）固定化された抗体表面上に
注入した。０．０１％ＢＳＡが補充された新鮮なＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ７．４、０．０
１ＭＨｅｐｅｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒ
ｅ）を結合緩衝液として使用した。ｐＨ７．４のヒト、マウス及びカニクイザルＰＣＳＫ
９タンパク質の各々に対する別個の実験において、各抗ＰＣＳＫ９抗体の結合親和性を測
定した（使用した濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５及び０
ｎＭ）。
さらに、ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性は、０．０１％ＢＳＡが補充された
ｐＨ６．０ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（ｐＨ６．０、０．０１ＭＨｅｐｅｓ、０．１５ＭＮａＣｌ
、０．００５％界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、ｐＨ６．０でも測定し
た。得られた結合シグナルは、溶液中の遊離ＰＣＳＫ９に比例していた。解離平衡定数（
ＫＤ）は、二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）ソフトウェア、Ｓａｐｉ
ｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）（６．０ｐＨの実行
に対して、ｎ＝１）を用いて、競合曲線の非線形回帰分析から得た。興味深いことに、抗
体は、より低いｐＨで、より強固な結合親和性を示すように見受けられた（Ｋｄは、それ
ぞれ、３１Ｈ４、２１Ｂ１２及び１６Ｆ１２に対して、１２．５、７．３及び２９ｐＭで
あった。）。
ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）及びＫＤ（解離平衡定数）などの抗体結
合速度論パラメータは、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉ
ｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定した。より低い解離平衡定数は、ＰＣ
ＳＫ９に対する抗体のより大きな親和性を示す。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｒ）親和性分析によっ
て測定されたＫＤ値は、以下に示されている表７．１に表されている。
表７．２は、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度を図示する。
ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）親和性測定
１６Ｆ１２及び３１Ｈ４のＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｉｓｅ， ＩＤ）親和性分析は、製造業者の指示書に従って
行った。簡潔に述べれば、Ｒｅａｃｔｉ−ＧｅｌＴＭ（６ｘ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ヒト
Ｖ５タグ付加されたカニクイザル又はＨｉｓタグ付加されたマウスＰＣＳＫ９タンパク質
の１つで予め被覆し、ＢＳＡでブロックした。次いで、抗体１６Ｆ１２又は抗体３１Ｈ４
及びＰＣＳＫ９タンパク質の１つの何れかの１０又は１００ｐＭを、ＰＣＳＫ９が被覆さ
れたビーズを通過させる前に、室温で８時間、ＰＣＳＫ９タンパク質の様々な濃度（０．
１ｐＭから２５ｎＭ）とともに温置した。ビーズが結合された１６Ｆ１２又は３１Ｈ４の
量を、蛍光的に（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量した。結合シグナルは、結合平衡での
遊離の１６Ｆ１２又は３１Ｈ４の濃度に比例している。一部位均一結合モデルを用いて、
競合曲線の２つの組の非線形回帰から、平衡解離定数（ＫＤ）を得た。ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ
）Ｐｒｏソフトウェアを分析で使用した。この分析において作製された結合曲線が、図４
Ａから４Ｆとして表されている。
１６Ｆ１２及び３１Ｈ４抗体は何れも、ヒト及びカニクイザルＰＣＳＫ９に対して類似
の親和性を示したが、マウスＰＣＳＫ９に対して約１０から２５０倍より低い親和性を示
した。ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）システムを用いて検査された２つの抗体のうち、抗体３１Ｈ４
は、それぞれ、３及び２ｐＭのＫＤで、ヒト及びカニクイザルＰＣＳＫ９の両方に対して
より高い親和性を示した。１６Ｆ１２は、ヒトＰＣＳＫ９に対して１５ｐＭのＫＤで、及
びカイニクイザルＰＣＳＫ９に対して１６ｐＭのＫＤで、若干より弱い親和性を示した。
ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）親和性分析の結果が、以下に示されている表８．１に要約されてい
る。
さらに、試料の質及び量をチェックするために、ＳＤＳＰＡＧＥを実施し、図５Ａに示
されている。ｃＰＣＳＫ９は、ゲル上で約５０％未満を示し、ＫｉｎＥｘＡ（Ｒ）アッセ
イから計算された活性結合濃度からも示した。従って、ｃＰＣＳＫ９に対するｍＡＢのＫ
Ｄは、活性なｃＰＣＳＫ９の５０％として調整された。
ＡＢＰ２１Ｂ１２に対するＫｄ値を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ溶液平衡結合アッ
セイを使用した。２１Ｂ１２．１は、ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いてほとんどシグナルを
示さず、従って、ｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイを用いた。固定化されたＰＣＳＫ９表
面に対する抗体の結合に対して、有意な結合が観察されたので、約７０００ＲＵの密度で
のアミン結合を用いて、ＣＭ５チップのフローセル４の上に、２１Ｂ１２抗体を固定化し
た。フローセル３は、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＰＣＳＫ９又はカニク
イザルＰＣＳＫ９の０．３、１及び３ｎＭを、０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、０．００５％Ｐ
２０を加えたＰＢＳ中の２１Ｂ１２．１抗体試料（０．００１から２５ｎＭの範囲）の系
列希釈と混合した。混合された溶液中での遊離のＰＣＳＫ９の結合を、２１Ｂ１２．１抗
体表面上に注入することによって測定した。２１Ｂ１２．１表面上の１００％のＰＣＳＫ
９結合シグナルを、溶液中のｍＡｂの不存在下で測定した。ｍＡｂの増加する濃度につれ
て減少したＰＣＳＫ９の結合応答は、溶液中でのｍＡｂへのＰＣＳＫ９の結合を示し、こ
れによって、固定化されたペプチボディ表面へのＰＣＳＫ９の結合を遮断した。ｍＡｂ濃
度に対してＰＣＳＫ９結合シグナルをプロットして、ＫｉｎＥｘＡＰｒｏＴＭソフトウェ
ア中の一部位均一結合モデルを用いて、曲線の３つの組（０．３、１及び３ｎＭの固定さ
れたＰＣＳＫ９濃度）からＫＤを計算した。ｃＰＣＳＫ９はＫｉｎＥｘＡアッセイ及びＳ
ＤＳ−ゲルから観察されたより低いタンパク質濃度を有するが、ｃＰＣＳＫ９の濃度はＫ
Ｄの計算のために使用されなかったので、ここでは、その濃度は調整しなかった。結果は
、下表８．２及び図５Ｂから５Ｄ中に示されている。図５Ｂは、ｈＰＣＳＫ９に対する３
つの異なるｈＰＣＳＫ９濃度での溶液平衡アッセイから得られた結果を図示している。図
５Ｃは、ｍＰＣＳＫ９に対する一群の類似の結果を図示する。図５Ｄは、上記ｂｉａｃｏ
ｒｅ捕捉アッセイから得られた結果を図示する。
（実施例１０）
エピトープビニング
抗ＰＣＳＫ９抗体のビニングのために、競合ＥＬＩＳＡを使用した。要約すれば、２つ
の抗体が同じエピトープのビンに属するかどうかを決定するために、一晩の温置によって
、２μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）上に、まず抗体（ｍＡｂ１）の１つ
を被覆した。次いで、プレートを洗浄し、３％ＢＳＡでブロックした。一方、ビオチン化
されたｈＰＣＳＫ９の３０ｎｇ／ｍＬを、室温で２時間、第二の抗体（ｍＡｂ２）ととも
に温置した。混合物を被覆されたｍＡｂ１に適用し、室温で１時間温置した。次いで、Ｅ
ＬＩＳＡプレートを洗浄し、１：５０００の希釈で１時間、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−Ｈ
ＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに温置した。さらなる洗浄後、ＴＭＢ基質とともにプレート
を温置し、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、シグナルを６５０ｎｍで検出し
た。同じ結合特性を有する抗体を、同じエピトープビンの中にグループ分けした。抗体ビ
ニング研究の結果が、表８．３に示されている。
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、エピトープビニングのさらなる検査を行った。約８０００Ｒ
Ｕの密度で、３つのｍＡｂ１６Ｆ１２、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４を、フローセル２、３及
び４の上に固定化した。約１００から５００ＲＵに到達させるために、ヒト、マウス及び
カニクイザルから得られた５ｎＭＰＣＳＫ９を、ｍＡｂ表面上に注入した。次いで、ＰＣ
ＳＫ９表面上に、１０ｎＭｍＡｂを注入した。次いで、３つのｍＡｂ上で、３つの異なる
ＰＣＳＫ９タンパク質への３つのｍＡｂの結合を記録した。
２つのｍＡｂが抗原上の類似のエピトープを有するのであれば、ｍＡｂ１は、ｍＡｂ２
に既に結合された抗原への結合を示さない。２つのｍＡｂが抗原上の異なるエピトープを
有するのであれば、ｍＡｂ１は、ｍＡｂ２に結合された抗原への結合を示す。図５Ｅは、
ヒトＰＣＳｋ９に対する３つのｍＡｂに対して、グラフ形式でこれらのエピトープビニン
グの結果を図示している。ｍＰＣＳＫ９及びｃＰＣＳＫ９に対して、類似のパターンが観
察された。グラフに示されているように、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４は類似のエピトープを
共有するように見受けられるが、２１Ｂ１２は異なるエピトープを有するように見受けら
れる。
（実施例１１）
Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合を遮断する３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の効果
本実施例は、ＰＣＳＫ９Ｄ３７４ＹがＬＤＬＲに結合する能力を遮断する上での、抗体
の２つに対するＩＣ５０値を提供する。緩衝液Ａ（１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．４）中に希釈されたヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇ／
ｍＬで、透明な３８４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を被覆した。緩衝液Ａでプレート
を完全に洗浄した後、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１％ミルク）で２時間ブロックした。洗浄
後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭＣａＣｌ２が補充された緩衝液Ｂ）中に希釈されたＬＤＬ受容体
（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）０．４μｇ／ｍＬとともに、プレートを１．５時間温置した。
この温置と同時に、緩衝液Ａ中に希釈された３１Ｈ４ＩｇＧ２、３１Ｈ４ＩｇＧ４、２１
Ｂ１２ＩｇＧ２又は２１Ｂ１２ＩｇＧ４抗体の様々な濃度又は緩衝液Ａのみ（対照）とと
もに、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置した。ＬＤＬ受容
体を含有するプレートを洗浄し、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物を
プレートに移し、室温で１時間温置した。ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＤ３７４Ｙ
の結合は、緩衝液Ｃ中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｏｕ
ｒｃｅ）とともに、次いで、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置することによって検出し
た。１ＮＨＣｌを用いてシグナルを消光し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
この結合研究の結果が、図６Ａから６Ｄに示されている。要約すると、各抗体に対して
ＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ＩｇＧ２に対して１９９ｐＭ（図６Ａ）、３１Ｈ４ＩｇＧ
４に対して１５６ｐＭ（図６Ｂ）、２１Ｂ１２ＩｇＧ２に対して１７０ｐＭ（図６Ｃ）及
び２１Ｂ１２ＩｇＧ４に対して１６９ｐＭ（図６Ｄ）であることが見出された。
抗体は、このアッセイにおいて、ＬＤＬＲへの野生型ＰＣＳＫ９の結合も遮断した。
（実施例１２）
細胞ＬＤＬ取り込みアッセイ
本実施例は、様々な抗原結合タンパク質が細胞によるＬＤＬの取り込みを低下させ得る
ことを示す。１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）中
に、５×１０５細胞／ウェルの濃度で、透明な底の黒い９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ）中に、ヒトＨｅｐＧ２細胞を播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で一晩温置した。ＰＣＳ
Ｋ９と抗体複合体を形成させるために、取り込み緩衝液（１％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ）
中に希釈された抗体の様々な濃度又は取り込み緩衝液のみ（対照）とともに、室温で１時
間、Ｄ３７４ＹヒトＰＣＳＫ９の２μｇ／ｍＬを温置した。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、
Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物を細胞に移した後、６μｇ／ｍＬの最終濃度で、取り
込み緩衝液中にＬＤＬ−ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈した。３７℃（５
％ＣＯ２）で３時間の温置後、細胞をＰＢＳで完全に洗浄し、４８０から５２０ｎｍ（励
起）及び５２０から６００ｎｍ（発光）で、ＳａｆｉｒｅＴＭ（ＴＥＣＡＮ）によって、
細胞蛍光シグナルを検出した。
細胞取り込みアッセイの結果が、図７Ａから７Ｄに示されている。要約すると、各抗体
に対してＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ＩｇＧ２に対して１６．７ｎＭ（図７Ａ）、３１
Ｈ４ＩｇＧ４に対して１３．３ｎＭ（図７Ｂ）、２１Ｂ１２ＩｇＧ２に対して１３．３ｎ
Ｍ（図７Ｃ）及び２１Ｂ１２ＩｇＧ４に対して１８ｎＭ（図７Ｄ）であることが見出され
た。これらの結果は、適用された抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）の効果
を低下させて、細胞によるＬＤＬの取り込みを遮断できることを示している。抗体は、こ
のアッセイにおいて、野生型ＰＣＳＫ９の効果も遮断した。
（実施例１３）
６日の研究における３１Ｈ４抗体の血清コレステロール低下効果
ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体治療を介した野生型（ＷＴ）マウスにおける総血清
コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行った。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた
雄のＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９から１０週齢、１７−２７ｇ）には、実験の期
間を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ， Ｄｉｅｔ２９１８）を与え
た。ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ
９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ）又は対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）の
何れかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。投薬
群及び屠殺の時間が、表９に示されている。
表９に示されている所定の時点でのＣＯ２窒息を用いて、マウスを屠殺した。大静脈を
介して、エッペンドルフチューブの中に血液を集め、室温で３０分間凝固させた。次いで
、血清を分離するために、１０分間、１２，０００×ｇでの卓上遠心機中で、試料を遠心
沈降させた。Ｈｉｔａｃｈｉ９１２臨床分析装置及びＲｏｃｈｅ／ＨｉｔａｃｈｉＴＣ及
びＨＤＬ−Ｃキットを用いて、血清総コレステロール及びＨＤＬ−Ｃを測定した。
実験の結果が、図８Ａから８Ｄに示されている。要約すると、抗体３１Ｈ４が投与され
たマウスは、実験の間にわたって、減少した血清コレステロールレベルを示した（図８Ａ
及び図８Ｂ）。さらに、マウスは減少したＨＤＬレベルを示すことも注目される（図８Ｃ
及び図８Ｄ）。図８Ａ及び図８Ｃに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する
（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。図８Ｂ及び８Ｄに関して、％変化は、ｔ＝０時間
で、ナイーブ動物中において測定された総血清コレステロール及びＨＤＬレベルに対する
（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。
低下したＨＤＬレベルに関して、マウス中でのＨＤＬの減少はＨＤＬの減少がヒトで起
きることを示唆せず、この生物中での血清コレステロールが減少したことをさらに反映す
るに過ぎないことが当業者に理解されることが注目される。マウスは高密度リポタンパク
質（ＨＤＬ）粒子中に血清コレステロールの大半を輸送し、これはＬＤＬ粒子上に殆どの
血清コレステロールを有するヒトとは異なることが注目される。マウスでは、総血清コレ
ステロールの測定は、血清ＨＤＬ−Ｃのレベルを最も近似する。マウスＨＤＬは、ＬＤＬ
受容体（ＬＤＬＲ）に対するリガンドであるアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）を含有し
ており、ＬＤＬＲによるＨＤＬの排除を可能とする。従って、ＨＤＬを調べることは、マ
ウスにおける、本実施例での適切な指標である（ＨＤＬの減少は、ヒトに対しては予測さ
れないことが理解される。）。これに対して、例えば、ヒトＨＤＬは、ａｐｏＥを含有し
ておらず、ＬＤＬＲに対するリガンドではない。ＰＣＳＫ９抗体はマウス中でのＬＤＬＲ
発現を増加させるので、肝臓はより多くのＨＤＬを排除させることができ、従って、血清
ＨＤＬ−Ｃレベルを低下させる。
（実施例１４）
６日の研究における、ＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
本実施例は、予想されたように、抗原結合タンパク質が、経時的に、対象中のＬＤＬＲ
のレベルを変化させることを示す。ＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果を確認す
るために、ウェスタンブロット分析を行った。実施例１３で記載した屠殺されたマウスか
ら得られた肝臓組織５０から１００ｍｇを、完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を
含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ
．）０．３ｍＬ中において均質化した。ホモゲネートを氷上で３０分間温置し、細胞破砕
物を沈降させるために遠心した。ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ Ｒａｄ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、上清中のタンパク質濃度を測定した。７０℃で
１０分間、タンパク質１００μｇを変性させ、４から１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＳＤＳ勾配
ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。０．４５μｍＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）にタンパク質を移し、室温で１時間、５％無脂肪ミルクを含有する洗浄緩衝液（
５０ｍＭＴｒｉｓ ＰＨ７．５， １５０ｍＭＮａＣｌ， ２ｍＭＣａＣｌ２及び０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０）中でブロックした。次いで、室温で１時間、ヤギ抗マウスＬＤＬＲ
抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）１：２０００又は抗βアクチン（ｓｉｇｍａ）１：２０００
を用いて、ブロットのプローブ検査を行った。ブロットを短時間洗浄し、ウシ抗ヤギＩｇ
Ｇ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）１：２０
００又はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ）１：２０００とともに温置した
。室温で１時間の温置後、ブロットを完全に洗浄し、ＥＣＬｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。ウェスタン
ブロットは、図９に図示されているように、抗体３１Ｈ４の存在下でのＬＤＬＲタンパク
質レベルの増加を示した。
（実施例１５）
１３日の研究における抗体３１Ｈ４の血清コレステロール低下効果
１３日の研究において、ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体治療を介した野生型（ＷＴ
）マウスにおける総血清コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行
った。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた雄
のＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９から１０週齢、１７−２７ｇ）には、実験の期間
を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ， Ｄｉｅｔ ２９１８）を与え
た。ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ
９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ）又は対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）の
何れかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。
投薬群及び屠殺の時間が、表１０に示されている。動物を屠殺し、肝臓を摘出し、実施
例１３のとおりに調製した。
６日の実験を１３日の研究に延長すると、６日の研究において観察された同じ血清コレ
ステロール低下効果が、１３日の研究においても観察された。より具体的には、１０ｍｇ
／ｋｇで投薬された動物は、３日目に、血清コレステロールの３１％の減少を示し、１３
日までに、投薬前レベルまで徐々に戻った。図１０Ａは、この実験の結果を図示する。図
１０Ｃは、３１Ｈ４の１０ｍｇ／ｋｇ用量を用いた、及び同じく１０ｍｇ／ｋｇの別の抗
体１６Ｆ１２を用いた上記手順を反復した結果を図示している。投薬群及び屠殺の時間が
、表１１に示されている。
図１０Ｃに示されているように、１６Ｆ１２及び３１Ｈ４は何れも、単回投薬のみの後
に、総血清コレステロールの著しく、大幅な減少をもたらし、１週以上にわたって（１０
日又はそれ以上）有益であった。反復された１３日の研究の結果は最初の１３日の研究の
結果と合致しており、３日目における２６％の血清コレステロールレベルの減少が観察さ
れる。図１０Ａ及び図１０Ｂに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する（＊
Ｐ＜０．０１）。図１０Ｃに関して、％変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに対する（＊Ｐ
＜０．０５）。
（実施例１６）
１３日の研究における、ＨＤＬレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
実施例１５中の動物に対するＨＤＬレベルも調べた。ＨＤＬレベルは、マウスにおいて
減少していた。より具体的には、１０ｍｇ／ｋｇで投薬された動物は、３日目に、ＨＤＬ
レベルの３３％の減少を示し、１３日までに、投薬前レベルまで徐々に復帰した。図１０
Ｂは、この実験の結果を図示する。３日目に、３４％のＨＤＬレベルの減少が存在した。
図１０Ｂは、反復された１３日の実験の結果を図示する。
当業者に理解されるように、抗体はマウスＨＤＬを低下させるが、ヒト及び他の生物（
マウスなど）でのＨＤＬの差のために、これは、ヒトで起こるとは予想されない。従って
、マウスＨＤＬの減少はヒトＨＤＬの減少を示唆するものではない。
（実施例１７）
抗体の反復投与は抗原結合ペプチドの継続的な有益性をもたらす
追加の投薬によるさらなる有益性に関して、上記実施例において得られた結果を延長す
ることができるかを確認するために、実施例１５及び１６中の実験を反復した（投薬スケ
ジュールは、図１１Ａに図示されている。）。結果は、図１１Ｂに示されている。図１１
Ｂのグラフから明らかなように、全てのマウスが３１Ｈ４抗原結合タンパク質の最初の注
射を受けたので、マウスの両群は総血清コレステロールの著しい減少を示し、３１Ｈ４Ａ
ＢＰのさらなる注射を受けたマウスは、総血清コレステロールの継続した低下を示したの
に対して、対照注射を受けただけのマウスは、最終的には、総血清コレステロールの増加
を示した。図１１に関して、％変化は、ｔ＝０時間でのナイーブ動物に対する（＊Ｐ＜０
．０１， ＊＊Ｐ＜０．００１）。
本実施例から得られる結果は、対象中での生物学的調整のために、反復適用が効力の低
下をもたらす他のコレステロール治療法とは異なり、本発明のアプローチには、検査した
時間においては、この問題が存在しないように見受けられることを示している。さらに、
このことは、前実施例において観察された、ベースラインへの総血清コレステロール又は
ＨＤＬコレステロールレベルの復帰が、対象によって発達された治療に対する何らかの耐
性によるものではなく、対象中での利用可能な抗体の枯渇によるものであることを示唆し
ている。
（実施例１８）
ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体のエピトープマッピング
本実施例は、ＰＣＳＫ９中の何れの残基が、ＰＣＳＫ９に対する本明細書中に開示され
ている抗原結合タンパク質に対するエピトープの形成に関与し、又はその一部であること
を決定するための方法を概説する。
本発明のＡＢＰの幾つかが結合するエピトープを決定するために、特異的ＰＣＳＫ９ペ
プチド配列に由来する合成ペプチドを用いて、ＡＢＰのエピトープをマッピングすること
ができる。
ペプチドエピトープとのヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の分子相互作用を研究するために、ＳＰ
ＯＴｓペプチドアレイ（ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ）を使用することができる。ＳＰＯＴ
ｓ技術は、抗体エピトープの系統的分析に適したフォーマットでのペプチドの固相合成を
基礎としている。特注のアレイ化されたオリゴペプチドの合成は、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏ
ｓｙｓから市販されている。ＰＣＳＫ９ペプチドのアミノ酸配列に由来する重複するオリ
ゴペプチドのペプチドアレイを得ることができる。アレイは、ポリプロピレン膜シート上
のスポットとして、一連の１２マーのペプチドを含むことができる。ペプチドアレイは、
ＰＣＳＫ９成熟配列の完全長を包含し得る。各連続するペプチドは、前ペプチドからの１
つの残基によって埋め合わされることができ、アレイ化されたオリゴペプチドの入れ子状
の重複したライブラリーを与える。ペプチドを有する膜は、異なる抗ＰＣＳＫ９抗体（１
μｇ／ｍＬ）と反応することができる。膜に結合されたペプチドへのｍＡｂの結合は、Ｈ
ＲＰ連結された二次抗体を用いた酵素結合免疫吸着検定法に続く、強化された化学発光（
ＥＣＬ；ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって評価するこ
とができる。
さらに、機能的なエピトープは、コンビナトリアルアラニンスキャニングによってマッ
ピングすることができる。このプロセスにおいて、抗ＰＣＳＫ９ＡＢＰとの相互作用に必
要なＰＣＳＫ９タンパク質中のアミノ酸を同定するために、コンビナトリアルアラニンス
キャニング戦略を使用することができる。これを達成するために、アラニンスキャニング
のために、ＳＰＯＴｓアレイの第二の組を使用することができる。１２残基の各々の中に
アラニン置換を有するバリアントペプチドのパネルを上述のようにスキャンすることがで
きる。これによって、ヒトＰＣＳＫ９へのＡＢＰに対するエピトープのマッピング及び同
定が可能となる。
これに代えて、エピトープが立体構造であり得ることに鑑みれば、エピトープを同定す
るために、アラニンスキャニング及び／又はアルギニンスキャニング、抗体ＦＡＢ／ＰＣ
ＳＫ９共結晶化及び限定的タンパク質分解／ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分
析）の組み合わせを使用することができる。
（実施例１９）
コレステロール関連疾患を治療するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
（コレステロール（血清コレステロールなど）の低下が有益であり得る）コレステロー
ル関連疾患を示すヒト患者に、ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１２若し
くは１６Ｆ１２）の治療的有効量が投与される。治療中の定期的な時点で、疾患の症候が
沈静化したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体
を用いた治療を行っている患者は、治療されていない患者と比べて、低下した血清コレス
テロールレベルを有することが見出される。
（実施例２０）
高コレステロール血症を治療するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
高コレステロール血症の症候を呈するヒト患者に、３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１
２若しくは１６Ｆ１２）などのＰＣＳＫ９抗体の治療的有効量を投与する。治療中の定期
的な時点で、血清コレステロールレベルが低下したかどうかを測定するために、ヒト患者
をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けている患者は、治療を受
けていない関節炎患者と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出
される。
（実施例２１）
冠動脈性心臓病及び／又は再発性心血管現象を予防するためのＰＣＳＫ９抗体の使用
冠動脈性心臓病を発症するリスクを有するヒト患者を同定する。単独で、スタチン（例
えば、シンバスタチン）と同時に又は順次に、３１Ｈ４（又は、例えば、２１Ｂ１２若し
くは１６Ｆ１２）などのＰＣＳＫ９抗体の治療的有効量を患者に投与する。治療中の定期
的な時点で、患者の総血清コレステロールレベルが変化するかどうかを測定するために、
ヒト患者をモニターする。予防的処置を通じて、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けてい
る患者は低下した血清コレステロールを有することにより、処置を受けていない患者と比
べて、冠動脈性心臓病又は再発性心血管現象に対するリスクを低下させることが見出され
る。
（実施例２２）
診断剤としてのＰＣＳＫ９抗体の使用
ＰＣＳＫ９産生の高いレベルを示す患者を診断するために、試料中のＰＣＳＫ９抗原を
検出するための酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる。このア
ッセイでは、９６ウェルマイクロタイタープレート又は３８４ウェルマイクロタイタープ
レートなどのマイクロタイタープレートのウェルを、ＰＣＳＫ９に対して誘導された第一
の完全ヒトモノクローナル抗体と数時間吸着させる。固定化された抗体は、検査試料中に
存在し得るＰＣＳＫ９の何れかに対する捕捉抗体としての役割を果たす。ウェルを濯ぎ、
分析物の非特異的吸着を防ぐために、ミルクタンパク質又はアルブミンなどのブロッキン
グ剤で処理する。
続いて、ＰＣＳＫ９を含有すると疑われる検査試料で、又は抗原の標準量を含有する溶
液でウェルを処理する。例えば、このような試料は、病変を診断すると考えられる循環抗
原のレベルを有すると疑われる対象から得られた血清試料であり得る。
検査試料又は標準を濯いで除去した後、ビオチンでの連結によって標識された第二の完
全ヒトモノクローナルＰＣＳＫ９抗体でウェルを処理する。モノクローナル又はマウス又
は他の種起源も使用することができる。標識されたＰＣＳＫ９抗体は、検出抗体としての
役割を果たす。過剰な第二の抗体を濯いで除去した後、アビジン連結された西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び適切な発色性基質でウェルを処理する。検査試料中の抗原
の濃度は、標準的な試料から作成された標準曲線との比較によって決定される。
ＥＬＩＳＡアッセイは、検査試料中のＰＣＳＫ９抗原を検出するための高度に特異的で
、極めて感度が高いアッセイを提供する。
対象中のＰＣＳＫ９タンパク質濃度の測定
サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血清中のＰＣＳＫ９レベルを定量することができる。
サンドイッチＥＬＩＳＡからの２つの完全ヒトモノクローナルＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳ
Ｋ９分子上の異なるエピトープを認識する。あるいは、マウス又は他の種起源のモノクロ
ーナル抗体を使用し得る。ＥＬＩＳＡは、以下のように実施される。２μｇ／ｍＬの濃度
のコーティング緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ３， ｐＨ ９．６）中の捕捉ＰＣＳＫ９抗
体５０μＬをＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）上に被覆する。４℃で一晩の温置後、
２５℃で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０、０．０１％Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）２００μＬでプレートを処理する。ＰＢＳ（洗
浄緩衝液、ＷＢ）中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、プレートを洗浄する（３回）
。５０％ヒト血清を含有するブロッキング緩衝液中に、正常な血清又は患者の血清（Ｃｌ
ｉｎｏｍｉｃｓ，Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ）を希釈する。４℃で一晩、プレート
を血清試料とともに温置し、ＷＢで洗浄し、次いで、２５℃で１時間、ビオチン化された
検出ＰＣＳＫ９抗体の１００μＬ／ウェルとともに温置する。洗浄後、プレートをＨＲＰ
−ストレプトアビジンとともに１５分間温置し、前述のとおり洗浄し、次いで、発色させ
るために、Ｈ２Ｏ２中のｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ発色溶液）の１００μＬ／
ウェルで処理する。Ｈ２ＳＯ４（２Ｍ）の５０μＬ／ウェルで反応を停止させ、４９２ｎ
ｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて分析する。血清試料中のＰＣＳＫ９抗原の濃
度は、４パラメータ曲線フィッティングプログラムを用いて、精製されたＰＣＳＫ９抗原
の希釈物との比較によって計算される。
対象中のＰＣＳＫ９バリアントタンパク質濃度の測定
上に概説されている工程は、野生型ＰＣＳＫ９及びバリアントＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ
）の両方に結合する本明細書に記載されている抗体を用いて実施することができる。次に
、対象中に存在するＰＣＳＫ９が野生型又はＤ３７４Ｙバリアントであるかどうかを決定
するために、野生型に結合するが、変異体に結合しない抗体を使用することができる（同
じく、上に概説されているような類似のプロトコールを使用する。）。当業者によって理
解されるように、両ラウンドに対して陽性である結果は野生型であり、第一のラウンドに
対して陽性であるが、抗体の第二のラウンドに対して陽性でない結果はＤ３７４Ｙ変異を
含む。公知であり、本明細書中に開示されているＡＢＰなどの因子が特に有益である高頻
度変異が集団中に存在する。
（実施例２３）
高コレステロール血症を予防するためのＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の使用
高コレステロール血症を発症するリスクを示すヒト患者は、家族歴の分析及び／又はラ
イフスタイル及び／又は現在のコレステロールレベルを介して同定される。対象は、ＰＣ
ＳＫ９抗体、３１Ｈ４（又は例えば、２１Ｂ１２若しくは１６Ｆ１２）の治療的有効量を
定期的に投与される（例えば、週に１回）。治療中の定期的な時点で、血清コレステロー
ルレベルが減少したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳ
Ｋ９抗体を用いた予防的処置を行っている対象は、治療されていない対象と比べて、低下
した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
（実施例２４）
ＰＣＳＫ９ＡＢＰは、スタチンの存在下でＬＤＬＲをさらに上方制御した
本実施例は、スタチンの存在下で使用された場合、ＰＣＳＫ９に対するＡＢＰはＬＤＬ
Ｒの利用可能性のさらなる増加をもたらしたことを示し、２つの併用によってさらなる有
益性を達成し得ることを示す。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中でＨｅｐＧ２細胞を播種し、約９０
％の集密度になるまで増殖させた。３％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中のメビノリン（スタチ
ン、Ｓｉｇｍａ）及びＰＣＳＫ９ＡＢＰ（図１２Ａから１２Ｃ）の表記量で細胞を４８時
間処理した。全細胞可溶化液を調製した。ゲル電気泳動によって全タンパク質５０ｍｇを
分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒｌａｄ
）又はウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、イムノブロットを行った。増強された化
学発光の結果が、図１２Ａから１２Ｃの上部パネルに示されている。ＩｍａｇｅＪソフト
ウェアによって、バンドの強度を定量し、ｂ−アクチンによって標準化した。ＬＤＬＲの
相対レベルが、図１２Ａから１２Ｃの下部パネル中に示されている。ＡＢＰ２１Ｂ１２及
び３１Ｈ４はＰＣＳＫ９中和抗体であるのに対して、２５Ａ７．１は非中和抗体である。
ＨｅｐＧ２−ＰＣＳＫ９細胞も作製した。これらは、ヒトＰＣＳＫ９で形質移入された
安定なＨｅｐＧ２細胞株であった。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中に
細胞を播種し、約９０％の集密度になるまで増殖させた。３％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中
のメビノリン（Ｓｉｇｍａ）及びＰＣＳＫ９ＡＢＰ（図１２Ｄから１２Ｆ）の表記量で細
胞を４８時間処理した。全細胞可溶化液を調製した。ゲル電気泳動によって全タンパク質
５０ｍｇを分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇ
ｅｒｌａｄ）又はウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、イムノブロットを行った。増
強された化学発光の結果が、上部パネルに示されている。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによ
って、バンドの強度を定量し、ｂ−アクチンによって標準化した。
図１２Ａから１２Ｆに図示されている結果から明らかなように、中和抗体の増加する量
及びスタチンの増加する量は、ＬＤＬＲのレベルの増加を一般にもたらした。ＡＢＰの増
加するレベルの有効性のこの増加は、細胞がＰＣＳＫ９でも形質移入されており、ＡＢＰ
がより大きな程度までその有効性を示すことができる図１２Ｄから１２Ｆにおいて特に明
瞭である。
興味深いことに、図１２Ｄから１２Ｆないし１２Ａから１２Ｃの比較の結果によって示
されるように、ＬＤＬＲレベルに対するＡＢＰ濃度の影響は、ＰＣＳＫ９が細胞によって
産生された場合に劇的に増加した。さらに、中和ＡＢＰ（２１Ｂ１２及び３１Ｈ４）が２
５Ａ７．１ＡＢＰ（非中和物質）より、スタチンの存在下でさえ、ＬＤＬＲレベルのより
大きな増加をもたらしたことは明瞭であり、スタチン及びＰＣＳＫ９に対するＡＢＰの両
方を使用することによって、さらなる有益性が達成できることを示す。
（実施例２５）
コンセンサス配列
抗ＰＣＳＫ９ＡＢＰのＶＨ及びＶＬに対応するＣＤＲの標準的な系統発生分析を用いて
、コンセンサス配列を決定した。ＶＨ又はＶＬに対応する同じ配列内に隣接するＣＤＲを
保持することによって、コンセンサス配列を決定した。要約すれば、比較併置の遂行及び
系統発生の推定を容易にするために、ＶＨ又はＶＬの何れかの可変ドメイン全体に対応す
るアミノ酸配列をＦＡＳＴＡフォーマットに変換した。次に、ＶＨ又はＶＬに対応する同
じ配列内にＣＤＲをなお隣接させながら、偶発的現象（例えば、共通の生殖系列フレーム
ワークの承継を偶発的に共有する無関係の抗体など）に起因するアミノ酸位置重み付けバ
イアスを一切導入することなく、ＣＤＲのみの検査を実施できるように、これらの配列の
フレームワーク領域を、人工のリンカー配列（「ｂｂｂｂｂｂｂｂｂｂ」代用配列、非特
異的な核酸構築物）で置き換えた。次いで、標準的なＣｌｕｔａｌＷ様アルゴリズム（Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２２：４６７３−４６８０参照）を使用するプログラムを用いて、配列類似性並置検査に
、このフォーマットのＶＨ又はＶＬ配列を供した。２．０のギャップ伸長ペナルティーと
ともに、８．０のギャップ生成ペナルティーを使用した。同様に、このプログラムは、分
岐長の比較及びグループ分けを介して配列群の類似性及び相違を構築し、図解するために
、ＵＰＧＭＡ（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎ
ｇ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅｓ；非加重結合法）又は隣接結合法（Ｎｅｉ
ｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｎｅｉ， １９
８７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ４：４０
６−４２５参照）を用いる配列類似性並置に基づくフィログラム（系統発生樹の図解）を
作成した。何れの方法も、類似の結果をもたらしたが、ＵＰＧＭＡ法はより単純で、より
保守的な一群の仮説を使用するので、ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹を最終的に使用
した。ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹（グループ内の各配列のうち、１００残基当り
１５未満の置換を有するとして、配列の類似のグループ（スケールに関して、系統樹の図
解中の注釈参照）が定義された。）を作成し、コンセンサス配列集合を定義するために使
用した。比較の結果は、図１３Ａから１３Ｊ中に図示されている。図１３Ｅでは、クレー
ドを形成する軽鎖中の配列が、重鎖中でもクレードであり、１５未満の置換を有するよう
に、グループを選択した。
当業者に理解されるように、図１３Ａから１３Ｊ中に示されている結果は、あるアミノ
酸（例えば、保存されているアミノ酸）の重要性及び何れのアミノ酸位置を変化させ得る
可能性があるか（例えば、異なるＡＢＰに対して異なるアミノ酸を有する位置）ついて多
くの指針を与える。
（実施例２６）
インビボでＬＤＬを低下させるＰＣＳＫ９及びＡＢＰの能力に対するマウスモデル
ヒトＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスを作製するために、マウス中のＬＤＬ−コレステ
ロールの測定可能な増加を与える正しい力価を測定するためにヒトＰＣＳＫ９を発現する
ように組換え的に修飾されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の様々な濃度を、尾静脈投与
を介して３週齢ＷＴＣ５７Ｂ１／６マウスに注射した。ヒトＰＣＳＫ９を発現するこのウ
イルスを用いて、ウイルスの４．５×１０Ｅ１２ｐｆｕは循環血液中の約４０ｍｇ／ｄＬ
のＬＤＬ−コレステロールレベル（ＷＴマウス中のＬＤＬの正常レベルは、約１０ｍｇ／
ｄＬである。）をもたらすことが決定された。これらの動物中のヒトＰＣＳＫ９レベルは
、約１３μｇ／ｍＬであることが見出された。この注射基準を用いて、マウスのコロニー
を作製した。
注射から１週後に、ＬＤＬ−コレステロールレベルに関してマウスを評価し、異なる処
理群へ無作為に振り分けた。次いで、尾静脈注射を介して、１６Ｆ１２、２１Ｂ１２又は
３１Ｈ４抗原結合タンパク質の１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍ／ｋｇの何れかの単回大量瞬時
注射を動物に投与した。投薬対照として、動物の別個の群にＩｇＧ２ＡＢＰを投与した。
次いで、ＡＢＰ動物から２４及び４８時間後に、動物のサブグループ（ｎ＝６から７）を
安楽死させた。何れの投薬量でも、ＩｇＧ２投与後に、ＬＤＬ−コレステロールレベルに
対する影響は存在しなかった。３１Ｈ４及び２１Ｂ１２は何れも、ＩｇＧ２対照（２つの
異なる投薬量で図１４Ａ及び１４Ｂに示されている。）と比べて、投与後最大４８時間ま
で（４８時間を含む。）著しいＬＤＬ−コレステロール低下を示した。１６Ｆ１２は、４
８時間の時点までに、約４０ｍｇ／ｄＬのベースラインに復帰するレベルで、中間のＬＤ
Ｌ−コレステロール低下応答を示す。このデータは、３１Ｈ４と２１Ｂ１２の間でヒトＰ
ＣＳＫ９に対してほぼ等しい結合親和性を示し、ＰＣＳＫ９に対して１６Ｆ１２のより低
い親和性を示すインビトロ結合データ（Ｂｉａｃｏｒｅ及びＫｉｎｅｘａ）と合致してい
る。
結果から明らかなように、モデル中のＰＣＳＫ９ＡＢＰによって、総コレステロール及
びＨＤＬ−コレステロールは低下された（総コレステロール及びＨＤＬ−Ｃは何れも、Ｐ
ＣＳＫ９の過剰発現のために、ＷＴマウスを超えて上昇する。）。このモデルでのコレス
テロールの低下は、比較的短時間にわたって起こるように見受けられるが、これは、この
モデルでの生理的状態を上回る高い、存在するヒトＰＣＳＫ９のレベルによるものである
と思われる。さらに、発現がＡＡＶによって支配されることに鑑みれば、ＰＣＳＫ９発現
の制御は存在しない。これらの図面において、（＊）は、同じ時点で、ＩｇＧ２対照が注
射された動物中に観察されるＬＤＬ−コレステロールレベルと比べて、Ｐ＜０．０５を表
し、（＊＊）はＰ＜０．００５を表す。マウス中の血清ヒトＰＣＳＫ９の１３μｇ／ｍＬ
レベルは、内在マウスＰＣＳＫ９レベル（約２５ｎｇ／ｍＬ）を上回る約５２０倍の増加
に、及び平均ヒト血清レベル（約１７５ｎｇ／ｍＬ）を上回る約７５倍の増加に対応する
。従って、抗原結合タンパク質は、ヒトにおいてより有効であるはずである。
当業者によって理解されるように、上記結果は、対象中の血清コレステロールを変化さ
せる抗原結合タンパク質の能力を調べるためのマウスモデルの妥当性を示す。当業者は、
マウス血清コレステロールレベルをモニターするのに有用であるが、マウス中の血清コレ
ステロールレベルをモニターするためのマウスＨＤＬの使用は、ヒト中でのヒトＨＤＬに
対するＡＢＰの影響の指標とならないことも認識する。例えば、Ｃｏｈｅｎ他（“Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＣＳＫ９， ｌｏｗ ＬＤＬ， ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓ
ｅ”， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５４：１２６４−１２７２， ２００６）は、
ヒトＨＤＬレベルに対するＰＣＳＫ９機能喪失変異の効果が一切欠如することを示した（
その全体が、参照により組み込まれる。）。従って、当業者は、マウスＨＤＬ（ＬＤＬを
欠如する。）を低下させるＡＢＰの能力は、ヒトＨＤＬを低下させるＡＢＰの能力を示唆
するものではないことを理解する。Ｃｏｈｅｎによって示されているように、実際に、こ
れは、ヒト中の中和公知に対して起こらないと思われる。
（実施例２７）
３１Ｈ４及び２１Ｂ１２は、ＰＣＳＫ９のＰｒｏＣａｔ領域に結合する
本実施例は、様々な抗体がＰＣＳＫ９のどこに結合するかを決定するための１つの方法
を記載する。
ＰＣＳＫ９タンパク質のＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４４９）又はＶドメイン
（配列番号３の４５０から６９２）を、抗体３１Ｈ４又は２１Ｂ１２の何れかと組み合わ
せた。複合体の形成に関して、非変性ＰＡＧＥによって、試料を分析した。図１６Ａ及び
図１６Ｂから明らかなように、ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４及びＰｒｏＣａｔ／２１Ｂ１２試
料に関してゲルシフトが存在し、抗体がＰｒｏＣａｔドメインに結合したことを示す。
（実施例２８）
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する
本実施例は、２．９オングストロームの分解能で（以下の実施例に記載されている条件
）、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）に結合されたＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａ
ｔ（配列番号３の３１から４５４）の解明された結晶構造を表す。
ＥＧＦａに結合されたＰＣＳＫ９の構造の図解が、図１７に示されている。結晶構造（
及び図１７中のその図解）は、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインがＰＣＳＫ９の触媒ドメイン
に結合することを明らかにする。さらに、ＰＳＣＫ９とＥＧＦａの相互作用は、図１７に
図示されている構造中の残基Ｄ３７４とＳ１５３の間にあるＰＣＳＫ９の表面を横切って
起こるようである。
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、
ＥＧＦａドメインの５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定義された
。コア残基は、以下のとおりである。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３
８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７
９、Ｖ３８０及びＳ３８１。
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、ＥＧＦ
ａドメインの５オングストロームから８オングストロームに存在するＰＣＳＫ９残基とし
て定義された。境界残基は、以下のとおりである。Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１
５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３
６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６及びＱ３８２。下線が付された残基は、
ＰＣＳＫ９内にほぼ埋没し、又は完全に埋没している。
当業者に理解されるように、本実施例から得られた結果は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａが相
互作用することを示している。従って、これらの残基の何れかと相互作用し、又は遮断す
る抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲのＥＧＦａドメイン（及び／又はＬＤＬＲ一般）との間
の相互作用を阻害する抗体として有用であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ
９に結合された場合に、上記残基の何れかと相互作用し若しくは遮断する抗体、又は上記
残基の１５から８、８、８から５若しくは５オングストロームにある抗体は、ＬＤＬＲへ
のＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を与えるものと想定される。
（実施例２９）
３１Ｈ４は、ＰＣＳＫ９のプロドメイン及び触媒ドメインの両方に由来するアミノ酸残
基と相互作用する
本実施例は、２．３オングストロームの分解能になるように測定された（以下の実施例
に記載されている条件）、３１Ｈ４のＦａｂ断片に結合された完全長ＰＣＳＫ９（配列番
号３のＮ５３３Ａ変異体）の結晶構造を表す。図１８Ａ及び１８Ｂに図示されているこの
構造は、触媒部位の領域中において、３１Ｈ４がＰＣＳＫ９に結合し、プロドメイン及び
触媒ドメインの両方に由来するアミノ酸残基と接触することを示す。
図示されている構造によって、ＰＣＳＫ９との３１Ｈ４の相互作用界面のための特異的
コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基を同定することも可能である。これは、３１Ｈ４タンパク質
の５オングストローム内に存在する残基として定義された。コア残基は、以下のとおりで
ある。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ２１６、Ｈ２１
７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ２５６、Ｇ２５
７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ３５０、Ｌ３５
１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ３８３又はＧ３
８４。
構造は、３１Ｈ４との相互作用界面に対する境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基を同定するた
めにも使用された。これらの残基は、３１Ｈ４タンパク質から５ないし８オングストロー
ムのＰＣＳＫ９残基であった。境界残基は以下のとおりであった。Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７
１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１
８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５
９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５
２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７
９、Ｔ３８５、Ｓ３８６及びＱ３８７。ＰＣＳＫ９タンパク質内に完全に埋没されている
アミノ酸残基に、下線が付されている。
当業者によって理解されるように、図１８Ｂは、抗原結合タンパク質及びＰＣＳＫ９上
のＣＤＲ間での相互作用を図示している。従って、このモデルによって、当業者は、パラ
トープ中の特に重要な残基及び／又はＣＤＲを同定し、何れの残基がパラトープにとって
重要性が低いかを同定することが可能となる。図１８Ｂから明らかなように、重鎖ＣＤＲ
１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、エピトープへの抗原結合タンパク質の結合に最も直接に関
与しており、軽鎖からのＣＤＲは相対的にエピトープから離れている。従って、ＰＣＳＫ
９への抗原結合タンパク質の結合を過度に妨害することなく、軽鎖ＣＤＲ中のより大きな
変動が可能であると思われる。幾つかの実施形態において、直接相互作用する構造中の残
基は保存されている（あるいは、保存的に置換されている）のに対して、互いに直接相互
作用しない残基はより大規模に変化させることができる。従って、当業者は、本明細書の
教示が与えられれば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合する能力を過度に妨害する
ことなく、抗原結合タンパク質の何れの残基及び領域を変動させ得るかを予測することが
できる。例えば、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合されているときに、ＰＣＳＫ９
に最も近接して位置する残基は、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合においてより
大きな役割を果たしている可能性がある残基である。上述のように、これらの残基は、Ｐ
ＣＳＫ９の５オングストローム以内の残基と、５オングストロームと８オングストローム
の間にある残基に分けることができる。ＰＣＳＫ９との相互作用界面の特異的コア３１Ｈ
４アミノ酸残基は、ＰＣＳＫ９タンパク質の５オングストローム内にある３１Ｈ４残基と
して定義された。重鎖に関して、５オングストローム以内に存在する残基には、以下のも
のが含まれる。Ｔ２８、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｙ３２、Ｓ５４、Ｓ５５、Ｓ５６、Ｙ５７、１
５８、Ｓ５９、Ｙ６０、Ｎ７４、Ａ７５、Ｒ９８、Ｙ１００、Ｆ１０２、Ｗ１０３、Ｓ１
０４、Ａ１０５、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｄ１０８、Ａ１０９及びＤ１１１。軽鎖に関して
、５オングストローム以内の残基には、以下のものが含まれる。Ｌ４８、Ｓ５１、Ｙ９３
及びＳ９８が含まれる。重鎖に関しては、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オングス
トロームにある残基には、以下のものが含まれる。Ｇ２６、Ｆ２７、Ｆ２９、Ｗ４７、Ｓ
５０、１５１、Ｓ５２、Ｓ５３、Ｋ６５、Ｆ６８、Ｔ６９、１７０、Ｓ７１、Ｒ７２、Ｄ
７３、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｄ９９、Ｄ１０１、Ｆ１１０及びＶ１１２。軽鎖に関しては、Ｐ
ＣＳＫ９の５ないし８オングストロームにある残基には、Ａ３１、Ｇ３２、Ｙ３３、Ｄ３
４、Ｈ３６、Ｙ３８、Ｉ５０、Ｇ５２、Ｎ５５、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｄ９４、Ｓ９
５、Ｓ９６、Ｌ９７、Ｇ９９及びＳ１００が含まれる。
当業者によって理解されるように、実施例２９から得られる結果は、ＰＣＳＫ９に対す
る抗体はＰＣＳＫ９に対して相互作用できること、及びＥＧＦａとの（従って、ＬＤＬＲ
との）相互作用からＰＣＳＫ９を遮断できることを示す。従って、これらのＰＣＳＫ９残
基の何れかと相互作用し、又はこれらの残基の何れかを（例えば、これらの残基に結合す
る他の抗原結合タンパク質から）遮断する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａ
（従って、ＬＤＬＲ）の相互作用を阻害する抗体として有用であり得る。従って、幾つか
の実施形態において、上記残基の何れかと相互作用し、又は上記残基の５オングストロー
ム以内の残基と相互作用する抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用
な阻害を与えるものと想定される。同様に、上記残基の何れかを遮断する抗原結合タンパ
ク質（例えば、競合アッセイを介して測定することができる。）は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬ
Ｒ相互作用の阻害のためにも有用であり得る。
（実施例３０）
２１Ｂ１２は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合し、３１Ｈ４と異なる結合部位を有し
、３１Ｈ４と同時にＰＣＳＫ９に結合することができる。
本実施例は、２．８オングストロームの分解能で測定された（以下の実施例に記載され
ている条件）、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２のＦａｂ断片に結合されたＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａ
ｔ（配列番号３の３１から４４９）の結晶構造を表す。図１９Ａ及び１９Ｂに図示されて
いるこの結晶構造は、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２がＰＣＳＫ９上に異なる結合部位を有する
こと、両抗原結合タンパク質はＰＣＳＫ９に同時に結合できることを示す。構造は、２１
Ｂ１２はＰＣＳＫ９の触媒ドメイン由来のアミノ酸残基と相互作用することを示す。この
構造において、ＰＣＳＫ９と３１Ｈ４の間の相互作用は上に観察されたものと類似してい
る。
２１Ｂ１２との相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、２１Ｂ１２タン
パク質の５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定義された。コア残基
は、以下のとおりである。Ｓ１５３、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９
２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３
８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７及びＦ３７９。
２１Ｂ１２との相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、２１Ｂ１２タンパク質
の５オングストロームから８オングストロームに存在するＰＣＳＫ９残基として定義され
た。境界残基は、以下のとおりである。Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１
９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２
４４、Ｍ２４７、１３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５及びＣ３７８。ＰＣＳＫ９タンパク質内
に殆ど又は完全に埋没されているアミノ酸残基に、下線が付されている。
当業者によって理解されるように、図１９Ｂは、抗原結合タンパク質及びＰＣＳＫ９上
のＣＤＲ間での相互作用を図示している。従って、このモデルによって、当業者は、パラ
トープにとって特に重要な残基及び／又はＣＤＲを同定し、何れの残基がパラトープにと
って重要性が低いかを同定することが可能となる。構造から明らかなように、重鎖ＣＤＲ
２及び軽鎖ＣＤＲ１はエピトープと密接に相互作用するように見受けられる。次に、重鎖
ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ３は、エピトープと近いが、ＣＤＲの第一の組ほ
ど近くはないようである。最後に、軽鎖ＣＤＲ２はエピトープから幾らかの距離があるよ
うに見受けられる。従って、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合を過度に妨害する
ことなく、より遠くのＣＤＲ中のより大きな変動が可能であると思われる。幾つかの実施
形態において、直接相互作用する構造中の残基は保存されている（あるいは、保存的に置
換されている）のに対して、互いに直接相互作用しない残基はより大規模に変化させるこ
とができる。従って、当業者は、本明細書の教示が与えられれば、抗原結合タンパク質が
ＰＣＳＫ９に結合する能力を過度に妨害することなく、抗原結合タンパク質の何れの残基
及び領域を変動させ得るかを予測することができる。例えば、抗原結合タンパク質がＰＣ
ＳＫ９に結合されているときに、ＰＣＳＫ９に最も近接して位置する残基は、ＰＣＳＫ９
への抗原結合タンパク質の結合においてより重要な役割を果たしている可能性がある残基
である。上述のように、これらの残基は、ＰＣＳＫ９の５オングストローム以内の残基と
、５オングストロームと８オングストロームの間にある残基に分けることができる。ＰＣ
ＳＫ９との相互作用界面の特異的コア２１Ｂ１２アミノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパク質
の５オングストローム以内に存在する２１Ｂ１２残基として定義された。重鎖に関しては
、５オングストローム以内の残基には、以下のものが含まれる。Ｔ３０、Ｓ３１、Ｙ３２
、Ｇ３３、Ｗ５０、Ｓ５２、Ｆ５３、Ｙ５４、Ｎ５５、Ｎ５７、Ｎ５９、Ｒ９８、Ｇ９９
、Ｙ１００及びＧ１０１。軽鎖に関しては、５オングストローム以内の残基には、以下の
ものが含まれる。Ｇ３０、Ｇ３１、Ｙ３２、Ｎ３３、Ｓ３４、Ｅ５２、Ｙ９３、Ｔ９４、
Ｓ９５、Ｔ９６及びＳ９７。重鎖に関しては、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オン
グストロームにある残基には、以下のものが含まれる。Ｔ２８、Ｌ２９、Ｉ３４、Ｓ３５
、Ｗ４７、Ｖ５１、Ｇ５６、Ｔ５８、Ｙ６０、Ｔ７２、Ｍ１０２及びＤ１０３。軽鎖に関
しては、ＰＣＳＫ９の５ないし８オングストロームにある残基には、以下のものが含まれ
る。Ｓ２６、Ｖ２９、Ｖ３５、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｓ９２、Ｍ９８及びＶ９９が含まれる。
当業者によって理解されるように、実施例３０から得られる結果は、ＰＣＳＫ９に対す
る抗体結合タンパク質のどこがＰＣＳＫ９に対して相互作用できるか、及びＥＧＦａとの
（従って、ＬＤＬＲとの）相互作用からＰＣＳＫ９をなお遮断できることを示す。従って
、これらのＰＣＳＫ９残基の何れかと相互作用し、又はこれらの残基の何れかを遮断する
抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａ（従って、ＬＤＬＲ）の相互作用を阻害す
る抗体として有用であり得る。従って、幾つかの実施形態において、上記残基の何れかと
相互作用し、又は上記残基の５オングストローム以内の残基と相互作用する抗体は、ＬＤ
ＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を提供するものと想定される。同様に、上記残基の
何れかを遮断する抗原結合タンパク質（例えば、競合アッセイを介して測定することがで
きる。）は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ相互作用の阻害のためにも有用であり得る。
（実施例３１）
ＥＧＦａ、ＰＣＳＫ９及び抗体の間の相互作用
上例から得られた三次複合体（ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２）の構造をＰＣＳＫ
９／ＥＧＦａ構造（実施例２８に記載されているとおりに決定された。）上に重ね合わせ
、この組み合わせの結果が図２０Ａに図示されている。この図は、ＥＧＦａとのＰＣＳＫ
９相互作用を阻害するように有用に標的化することができるＰＣＳＫ９上の領域を示す。
図は、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２が何れも、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインの位置と部分的に
重複し、ＰＣＳＫ９へのその結合を立体的に妨害することを示している。さらに、構造か
ら明らかなように、２１Ｂ１２は、ＬＤＬＲＥＧＦａドメインへの結合に特異的に関与し
ているアミノ酸残基のサブセットと直接相互作用する。
上述のように、結晶構造の分析によって、ＰＣＳＫ９と対タンパク質（コア及びＰＣＳ
Ｋ９表面上の界面の境界領域）間の相互作用に関与している特異的アミノ酸及びこれらの
対タンパク質がＰＣＳＫ９と相互作用する空間的必要条件が同定された。この構造は、Ｐ
ＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を阻害する方法を示唆する。第一に、上述のように、Ｌ
ＤＬＲのＥＧＦａドメインの結合部位と共通する残基を共有しているＰＣＳＫ９への因子
の結合は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を阻害する。第二に、共通の残基の外側に
結合する因子は、ＥＧＦａドメインに対してＮ末端又はＣ末端にあるＬＤＬＲのＥＧＦａ
ドメイン又は領域を立体的に妨害して、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を妨害するこ
とができる。
幾つかの実施形態において、ＥＧＦａ結合に関与し、且つ上記抗原結合タンパク質が結
合する領域に近い残基は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を操作するのに特に有用である
。例えば、異なる結合対に対してコア領域と境界領域の両領域中の共通する界面由来のア
ミノ酸残基が、下表１２に列記されている。ＰＣＳＫ９タンパク質内に完全に埋没されて
いるアミノ酸残基に、下線が付されている。
当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は
、上記残基の少なくとも１つに結合し、及び／又は遮断する。
（実施例３２）
ＬＤＬＲ及びＰＣＳＫ９の構造的相互作用
ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（配列番号３の３１から４５４）／ＥＧＦａ複合体構造を用い
て、ＬＤＬＲの完全長状態に結合された完全長ＰＣＳＫ９のモデルを作製した。複合体か
らのＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１から４５４上に、完全長ＰＣＳＫ９１（Ｐｉｐｅｒ，
Ｄ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＰＣＳＫ
９：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５， ５４５−５２ （２００７））の構造を重ね合わせ、複合
体からのＥＧＦａドメイン上に、その低ｐＨ立体構造にあるＬＤＬＲの構造（Ｒｕｄｅｎ
ｋｏ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８， ２３５３−８ （２００２））を重ね合わせた。モデルの図
解が、図２０Ｂ及び２０Ｃに示されている。ＥＧＦａドメインは、図中の枠によって示さ
れている。図は、ＰＣＳＫ９に近接して存在する直前のＥＧＦａ結合ドメインの外側に存
在するＬＤＬＲの領域を示している。図２０Ｄから２０Ｆは、３つの異なる角度からの抗
体３１Ｈ４及び２１Ｂ１２の網目状表面表示とともに、上記相互作用を示している。図解
から明らかなように、抗体は、実際の結合部位におけるＰＣＳＫ９とのＬＤＬＲの相互作
用と相互作用し及び／又は妨害できるのみならず、他の立体的相互作用も起こるようであ
る。
上記結果に照らして、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲの様々な
領域（ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９が相互作用する部位に留まらない。）と衝突することによっ
て、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の相互作用も阻害することができる。例えば、ＰＣＳＫ９
に結合する抗原結合タンパク質は、リピート７（Ｒ７）、ＥＧＦｂドメイン及び／又はβ
−プロペラドメインと衝突し得る。
ＰＣＳＫ９とのＥＧＦａの相互作用に結合し、又は遮断する抗原結合分子の実施形態
当業者によって理解されるように、実施例２８から３２及び添付の図面は、ＥＧＦａが
ＰＣＳＫ９とどのように及びどこで相互作用するか、並びに２つの代表的な中和的抗原結
合タンパク質である２１Ｂ１２及び３１Ｈ４がどのようにしてＰＣＳＫ９と相互作用し、
それらの中和効果をもたらすかを詳細に記載している。従って、当業者は、ＰＣＳＫ９上
の同じ位置の少なくとも１つに又はその付近に結合する他の抗原結合分子を同定すること
によって、ＥＧＦａ（ＬＤＬＲを含む。）とＰＣＳＫ９の間の結合を同様に低下させるこ
とができる抗原結合分子を容易に同定することができる。ＰＣＳＫ９上の関連する位置（
又はエピトープ）が図面及び本明細書の記述中に特定されているが、ＥＧＦａ結合部位に
近いとして同定された残基からの所定の距離内に存在するとしてこれらの部位を記述する
ことも有利であり得る。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ
若しくはそれ以上の３０オングストロームに又はそれ以内に結合する（付番は、配列番号
３を基準とする。）。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、
Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、
Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、
Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、
Ｓ３７６、Ｑ３８２、Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５、Ｆ
２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５、Ｑ
２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９、Ｔ
３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２、Ｓ
３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１８７
、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２２７
、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３１６
、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３６９
、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６、Ｑ３８７、Ｓ１５３
、Ｓ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８
、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４
、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６
、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４
、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。幾つかの実施形態において、
抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストローム以内に結合
する（付番は、配列番号３に基づく。）。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ
２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ
３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ
１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｇ３７０、Ａ
３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６又はＱ３８２。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は
、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オングストローム以内に結合する（付番は、
配列番号３に基づく。）。Ｗ７２、Ｆ１５０、Ａ１５１、Ｑ１５２、Ｔ２１４、Ｒ２１５
、Ｆ２１６、Ｈ２１７、Ａ２２０、Ｓ２２１、Ｋ２２２、Ｓ２２５、Ｈ２２６、Ｃ２５５
、Ｑ２５６、Ｇ２５７、Ｋ２５８、Ｎ３１７、Ｆ３１８、Ｔ３４７、Ｌ３４８、Ｇ３４９
、Ｔ３５０、Ｌ３５１、Ｅ３６６、Ｄ３６７、Ｄ３７４、Ｖ３８０、Ｓ３８１、Ｑ３８２
、Ｓ３８３、Ｇ３８４、Ｋ６９、Ｄ７０、Ｐ７１、Ｓ１４８、Ｖ１４９、Ｄ１８６、Ｔ１
８７、Ｅ２１１、Ｄ２１２、Ｇ２１３、Ｒ２１８、Ｑ２１９、Ｃ２２３、Ｄ２２４、Ｇ２
２７、Ｈ２２９、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｇ２５９、Ｐ２８８、Ａ２９０、Ｇ２９１、Ｇ３
１６、Ｒ３１９、Ｙ３２５、Ｖ３４６、Ｇ３５２、Ｔ３５３、Ｇ３６５、Ｉ３６８、Ｉ３
６９、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｔ３８５、Ｓ３８６又はＱ３８７。幾
つかの実施形態において、抗原結合分子は、以下の残基の１つ若しくはそれ以上の３０オ
ングストローム以内に結合する（付番は、配列番号３に基づく。）。Ｓ１５３、Ｓ１８８
、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９
、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６
、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１
、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７
、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５又はＣ３７８。
幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、上記残基の１つ又はそれ以上から３０、
３０から２５、２５から２０、２０から１５、１５から８、８、８から５、５、５から４
、４オングストローム又はそれ以下のオングストローム以内に結合する。幾つかの実施形
態において、ＰＣＳＫ９に結合したときに、抗原結合分子は、上記残基の２以上に関して
、上記距離の少なくとも１つ以内にある。例えば、幾つかの実施形態において、抗原結合
分子は、上記残基の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０から２５、２５から３０、３０か
ら３５、３５から４０、４０から４５、４５から５０、５０から５５、５５から６０、６
０から６５、６５から７０、７０から７５又はそれ以上に関して、上記距離の少なくとも
１つ（例えば、３０、３０から２５、２５から２０、２０から１５、１５から８、８、８
から５、５、５から４、４又はそれ以下）以内にある。幾つかの実施形態において、抗原
結合分子は、そのサブグループ（群中の表面残基のみなど）の各群中に特定された残基の
少なくとも１から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５
０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９
、９９から１００％に関して、上記距離の１つ以内にある。別段の記載が具体的になけれ
ば、抗原結合分子とＰＣＳＫ９間の距離は、ＰＣＳＫ９上の共有結合された原子と、ＰＣ
ＳＫ９と抗原結合分子の最も近い原子である抗原結合分子の共有結合された原子との間の
最短距離である。同様に、具体的に別段の記載がなければ、（抗原結合分子又はＰＣＳＫ
９上の）残基と別のタンパク質（それぞれ、ＰＣＳＫ９又は抗原結合分子の何れか）の間
の距離は、特定された残基上の最も近い点から他のタンパク質の最も近接した共有結合部
分までの距離である。幾つかの実施形態において、距離は、アミノ酸鎖の骨格から測定す
ることができる。幾つかの実施形態において、距離は、パラトープの端とエピトープの（
互いに最も近い）端の間で測定することができる。幾つかの実施形態において、パラトー
プの表面の中心とエピトープの表面の中心間で距離を測定することができる。当業者によ
って理解されるように、本記述は、本明細書中に列記されている残基の各組のそれぞれに
対して適用可能である。例えば、上記範囲は、実施例２８から３２中に列記された８オン
グストロームの残基及び実施例２８から３２中に列記された５オングストロームの残基に
対して、一般的及び具体的に想定される。
幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、ＥＧＦａ、２１Ｂ１２又は３１Ｈ４の少
なくとも１つによって結合されているＰＣＳＫ９上の表面に結合する。幾つかの実施形態
において、抗原結合分子は、（上記実施例及び図面に記載されているように）ＰＣＳＫ９
とＥＧＦａ、Ａｂ３１Ｈ４及び／又はＡｂ２１Ｂ１２との間の相互作用位置と重複する位
置においてＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合分子は、上記残
基の１つからさらに離れた位置においてＰＣＳＫ９に結合する。幾つかの実施形態におい
て、このような抗原結合分子は、なお有効な中和的抗原結合分子であり得る。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインの構造は、一般に、（図１９Ａ
に示されているように）三角状として記載することができる。三角の第一の辺は、３１Ｈ
４によって結合されているものとして示されている。三角の第二の辺は、２１Ｂ１２によ
って結合されているものとして示されており、三角の第三の辺は、ページの下方向、「図
１９Ａ」という表示のすぐ上に位置している。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の
触媒ドメインの第一及び／又は第二の辺に結合する抗原結合分子は、ＰＣＳＫ９へのＥＧ
Ｆａの結合を直接又は立体的に妨害することができるので、中和抗体として有用であり得
る。当業者によって理解されるように、完全抗体など、抗原結合分子が十分に大きければ
、ＰＣＳＫ９へのＥＧＦａの結合を妨害するために、抗原結合分子はＥＧＦａ結合部位に
直接結合する必要はない。
当業者によって理解されるように、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインが実施例の多くにおい
て使用されているが、このモデル及び構造は、完全長ＬＤＬＲタンパク質がＰＣＳＫ９と
どのようにして相互作用するかに対してもなお適用することができる。実際、完全長ＬＤ
ＬＲタンパク質上に存在するさらなる構造は、抗原結合分子の１つによってさらに遮断さ
れ得るさらなるタンパク質スペースを与える。従って、抗原結合分子がＰＣＳＫ９へのＥ
ＧＦａの結合を遮断又は阻害すれば、完全長ＬＤＬＲタンパク質を上回らないとしても、
少なくとも同等の有効性である可能性がある。同様に、所定の距離内の抗原結合分子又は
ＥＧＦａ結合の阻害に関連する様々な残基を遮断する抗原結合分子は、さらに効果的では
ないとしても、完全長ＬＤＬＲに対して有効であると思われる。
当業者によって理解されるように、上記ＰＣＳＫ９残基を封鎖し、若しくは結合する（
又は上記距離内にある）又は上記実施例及び図面中に記載されている相互作用の１つ若し
くはそれ以上を阻害する何れの分子も、ＥＧＦａ（又は一般に、ＬＤＬＲ）及びＰＣＳＫ
９の相互作用を阻害するために使用することができる。従って、何れの抗原結合分子も必
要とされる目的を果たし得るので、分子は、抗原結合「タンパク質」に限定される必要は
ない。抗原結合分子の例には、アプタマーが含まれ、アプタマーはオリゴ核酸又はペプチ
ド分子の何れかであり得る。抗原結合分子の他の例には、アビマー、ペプチボディ、小分
子及びポリマー、並びにＰＣＳＫ９へのその親和性及び／又は半減期を増加させることが
できるＥＧＦａの修飾された様式（アミノ酸の変異、グリコシル化、ＰＥＧ化、Ｆｃ融合
及びアビマー融合など）が含まれる。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形
態において、ＬＤＬＲは抗原結合分子ではない。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲの
結合サブセクションは、抗原結合分子、例えば、ＥＧＦａではない。幾つかの実施形態に
おいて、ＰＣＳＫ９がそれを通じてインビボでシグナル伝達する他の分子は、抗原結合分
子でない。このような実施形態は、それ自体明示的に同定される。
（実施例３３）
タンパク質試料の発現及び精製
本実施例は、ＰＣＳＫ９タンパク質／バリアントの様々な実施形態（ＬＤＬＲＥＧＦａ
ドメインを含む。）がどのようにして作製及び精製されるかに関する幾つかの実施形態を
記載する。ＰＣＳＫ９タンパク質／バリアント（例えば、ＰＣＳＫ９３１から６９２Ｎ５
３３Ａ、ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶ及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１から４５４）を、Ｎ末
端の蜜蜂メリチンシグナルペプチドに続くＨｉｓ６タグともに、バキュロウイルスによっ
て感染されたＨｉ−５昆虫細胞中で発現させた。ニッケルアフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＰＣ
ＳＫ９タンパク質を精製した。ＴＥＶプロテアーゼを用いた切断によって、精製の間にメ
リチンＨｉｓ６タグを除去した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ（３１から４４９）及びＶドメ
イン（４５０から６９２）試料を作製するために、構築物ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶを使用
した。この構築物は、ＰＣＳＫ９残基４４９と４５０の間に挿入されたＴＥＶプロテアー
ゼ切断部位を有していた。結晶学のための完全長Ｎ５５５Ａバリアント、ＰＣＳＫ９の３
１から４５４断片及び結晶学のためのＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶバリアント、ポストｒＴＥ
Ｖタンパク質産物は、開始ＧＡＭＧ配列も含んだ。従って、ｒＴＥＶ切断の後に、これら
のタンパク質はＧＡＭＧ−ＰＣＳＫ９であった。さらに、ＰＣＳＫ９４４９ＴＥＶタンパ
ク質は、配列番号３の位置Ｈ４４９とＧ４５０の間に挿入された配列「ＥＮＬＹＦＱ」（
配列番号４０３）を含んでいた。ｒＴＥＶでの切断後、この構築物から作製されたＰＣＳ
Ｋ９ＰｒｏＣａｔタンパク質は、ＧＡＭＧ−ＰＣＳＫ９（３１−４４９）−ＥＮＬＹＦＱ
及びこの構築物から作製されたＶドメインは、配列番号３のＰＣＳＫ９（４５０から６９
２）であった。
２１Ｂ１２及び３１Ｈ４Ｆａｂ断片をイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた。ニ
ッケルアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除
クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによって、これらのタンパク質を
精製した。
イー・コリ中において、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）をＧＳＴ融合
タンパク質として発現させた。イオン交換クロマトグラフィー、グルタチオンセファロー
スアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＥＧ
Ｆａドメインを精製した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを用いた切断によって、
ＧＳＴタンパク質は精製の間に除去した。
（実施例３４）
複合体形成及び結晶化
本実施例は、上記構造調査実施例において使用された複合体及び結晶をどのようにして
作製するかについて記載する。
３１Ｈ４Ｆａｂの１．５モル濃度過剰をＰＣＳＫ９と混合することによって、ＰＣＳＫ
９３１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４複合体を作製した。過剰な３１Ｈ４Ｆａｂを除去す
るために、サイズ排除クロマトグラフィーによって、複合体を精製した。ＰＣＳＫ９３１
から６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４複合体は、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．３、０．２Ｍ酢酸
ナトリウム、１５％ＰＥＧ４０００、６％デキストラン硫酸ナトリウム塩（分子量５００
０）中で結晶化する。
まず、３１Ｈ４Ｆａｂの１．５モル濃度過剰をＰＣＳＫ９３１−４４９と混合すること
によって、ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２複合体を作製し
た。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によって、複合体を過剰な３１Ｈ４
から分離した。次いで、２１Ｂ１２Ｆａｂの１．５モル濃度過剰を、ＰＣＳＫ９３１−４
４９／３１Ｈ４複合体に添加した。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上での精製によ
って、三重複合体を過剰な２１Ｂ１２から分離した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４
９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２複合体は、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．５、０．２Ｍ第一リン酸
アンモニウム、５０％ＭＰＤ中で結晶化する。
ＥＧＦａドメインの１．２モル濃度過剰をＰＣＳＫ９３１−４５４と混合することによ
って、ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａ複合体を作製した。ＰＣＳＫ９Ｐ
ｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａドメイン複合体は、０．２Ｍギ酸カリウム、２０％Ｐ
ＥＧ３３５０中で結晶化する。
（実施例３５）
データ収集及び構造の決定
本実施例は、データ群をどのようにして収集し、上記構造検査実施例に対してどのよう
にして構造を決定したかについて記載する。
ＰＣＳＫ９３１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４
９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２結晶に対する初期データ群を、ＲｉｇａｋｕＦＲ−ＥＸ線源上
で集めた。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４５４／ＥＧＦａデータ群並びにＰＣＳＫ９３
１−６９２Ｎ５３３Ａ／３１Ｈ４及びＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ３１−４４９／３１Ｈ４／
２１Ｂ１２結晶に対するより高解像度のデータ群を、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ ｂｅａｍｌｉｎｅ ５．０．２で収集した。全てのデー
タ群は、ｄｅｎｚｏ／ｓｃａｌｅｐａｃｋ又はＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，
Ｚ．， Ｂｏｒｅｋ， Ｄ．， Ｍａｊｅｗｓｋｉ， Ｗ． ＆ Ｍｉｎｏｒ， Ｗ．
Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ
ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ａｃｔａ ＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ５９， ２２８−３４
（２００３））を用いて処理した。
ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４結晶は、単位セルサイズａ＝２６４．９、ｂ＝１３７．４、ｃ＝
６９．９オングストローム、β＝１０２．８°を有するＣ２スペース群中で成長し、２．
３オングストロームの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＳＫ
９構造（Ｐｉｐｅｒ， Ｄ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｏｆ ＰＣＳＫ９：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＬＤＬ−
ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５， ５４５−５２ （２００７））
を使用するプログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ
ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｒｓｔａｌｌｏｇｒ ５０， ７６０−３ （１９９４
））を用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４構造を解明した。ＰＣＳＫ９３１
−６９２溶液を固定し続けながら、抗体可変ドメインを検索モデルとして使用した。ＰＣ
ＳＫ９３１−６９２／抗体可変ドメイン溶液を固定し続けながら、抗体定常ドメインを検
索モデルとして使用した。Ｑｕａｎｔａを用いたモデル構築及びｃｎｘを用いた精緻化の
複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した（Ｂｒｕｎｇｅｒ， Ａ．Ｔ． ｅｔ ａ
ｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＆ ＮＭＲ ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｎｅｗ ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４， ９０５−２１ （１９９８））。
ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２結晶は、単位セルサイズａ＝１３８．７、ｂ＝２４
６．２、ｃ＝５１．３オングストロームを有するＰ２１２１２スペース群中で成長し、２
．８オングストロームの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＫ
Ｓ９ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４可変ドメインを用いるプログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子
置換によって、ＰＣＳＫ９／３１Ｈ４／２１Ｂ１２構造を解明した。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣ
ａｔ／３１Ｈ４可変ドメインを固定し続けながら、抗体定常ドメインに対する検索を行っ
た。ＰＣＳＫ９ＰｒｏＣａｔ／３１Ｈ４／２１Ｂ１２定常ドメインを固定し続けながら、
抗体変動ドメインを検索モデルとして使用した。Ｑｕａｎｔを用いたモデル構築及びｃｎ
ｘを用いた精緻化の複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した。
ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメイン結晶は、単位セルサイズａ＝ｂ＝７０．６、ｃ＝３２１
．８オングストロームを有するスペース群Ｐ６５２２中で成長し、２．９オングストロー
ムの解像度になるように回折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＫＳ９ＰｒｏＣａｔを
使用し、プログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメ
イン構造を解明した。電子密度マップの分析によって、ＥＧＦａドメインに対する明瞭な
電子密度が示された。ＬＤＬＲＥＧＦａドメインを手動でフィッティングし、Ｑｕａｎｔ
ａを用いるモデル構築及びｃｎｘを用いる精緻化の複数ラウンドによってモデルを改善し
た。
コア相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から５オングストローム未満又
は５オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基である
ものとして決定された。ファンデルワールス半径＋生じ得る水媒介性水素結合内の原子を
考慮するために、５オングストロームをコア領域カットオフ距離として選択した。境界相
互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から８オングストローム未満又は８オン
グストロームに等しい少なくとも１つの原子を有するが、コア相互作用リスト中に含まれ
ない全てのアミノ酸残基として決定された。伸長されたアルギニンアミノ酸の長さを考慮
するために、８オングストローム未満又は８オングストロームを境界領域カットオフ距離
として選択した。プログラムＰｙＭＯＬ．（ＤｅＬａｎｏ， Ｗ．Ｌ． Ｔｈｅ ＰｙＭ
ＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
２００２））を用いて、これらの距離基準を満たすアミノ酸を計算した。
（実施例３６）
ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４の結晶構造
３１Ａ４／ＰＣＳＫ９複合体の結晶構造を決定した。
タンパク質試料の発現及び精製
Ｎ末端の蜜蜂メリチンシグナルペプチドに続くＨｉｓ６タグとともに、ＰＣＳＫ９４４
９ＴＥＶ（残基４４９と４５０の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するＰ
ＣＳＫ９構築物、付番は配列番号３を基準とする。）をバキュロウイルス感染されたＨｉ
−５昆虫細胞中で発現させた。まず、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによっ
て、ＰＣＳＫ９タンパク質を精製した。メリチン−Ｈｉｓ６タグを除去し、触媒ドメイン
とＶドメインの間でＰＣＳＫ９タンパク質を切断するために、ＴＥＶプロテアーゼを使用
した。イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、Ｖド
メインをさらに精製した。３１Ａ４Ｆａｂ断片をイー・コリ中で発現させた。ニッケルア
フィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマ
トグラフィーによって、このタンパク質を精製した。
複合体形成及び結晶化
ＰＣＳＫ９Ｖドメインの１．５モル濃度過剰を３１Ａ４Ｆａｂと混合することによって
、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４複合体を作製した。サイズ排除クロマトグラフィーカ
ラム上での精製によって、複合体を過剰なＰＣＳＫ９Ｖドメインから分離した。ＰＣＳＫ
９Ｖドメイン／３１Ａ４複合体を１．１Ｍコハク酸ｐＨ７、２％ＰＥＧＭＭＥ２０００中
で結晶化させた。
データ収集及び構造の決定
ＲｉｇａｋｕＦＲ−Ｅｘ線源上で、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４結晶に対するデー
タ群を収集し、ｄｅｎｚｏ／ｓｃａｌｅｐａｃｋを用いて処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋ
ｉ， Ｚ．， Ｂｏｒｅｋ， Ｄ．， Ｍａｊｅｗｓｋｉ， Ｗ． ＆ Ｍｉｎｏｒ，
Ｗ． Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏ
ｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ５９， ２２８
−３４ （２００３））。
ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４結晶は、非対称単位当り２つの複合体分子を有し、単
位セルサイズａ＝７４．６、ｂ＝１３１．１、ｃ＝１９７．９オングストロームを有する
Ｐ２１２１２１スペース群中で成長し、２．２オングストロームの分解能になるように回
折する。最初の検索モデルとして、ＰＣＳＫ９構造のＶドメイン（Ｐｉｐｅｒ， Ｄ．
Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＰＣＳＫ９：
ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ １５， ５４５−５２ （２００７））を使用するプログラムＭＯＬＲ
ＥＰ（ＣＣＰ４．Ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｒｒｓｔａｌｌｏｇｒ ５０， ７６０−３ （１９９４））を用いた分子置
換によって、ＰＣＳＫ９Ｖドメイン／３１Ａ４構造を解明した。ＰＣＳＫ９４５０−６９
２溶液を固定し続けながら、抗体可変ドメインを検索モデルとして使用した。最初の精緻
化の後、抗体定常ドメインを手動によってフィッティングした。Ｑｕａｎｔａを用いたモ
デル構築及びｃｎｘを用いた精緻化の複数ラウンドを用いて、完全な構造を改善した（Ｂ
ｒｕｎｇｅｒ， Ａ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＆ ＮＭＲ
ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｎｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ａｃｔａ Ｃｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４， ９０５−２１
（１９９８））。
コア相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から５オングストローム未満又
は５オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基である
ものとして決定された。ファンデルワールス半径＋生じ得る水媒介性水素結合内の原子を
考慮するために、５オングストロームをコア領域カットオフ距離として選択した。境界相
互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から８オングストローム未満又は８オン
グストロームに等しい少なくとも１つの原子を有するが、コア相互作用リスト中に含まれ
ない全てのアミノ酸残基として決定された。伸長されたアルギニンアミノ酸の長さを考慮
するために、８オングストローム未満又は８オングストロームを境界領域カットオフ距離
として選択した。プログラムＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ， Ｗ．Ｌ． Ｔｈｅ ＰｙＭＯ
Ｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
２００２））を用いて、これらの距離基準を満たすアミノ酸を計算した。距離は、Ｖドメ
イン「Ａ」及び３１Ａ４「Ｌ１，Ｈ１」複合体を用いて計算した。
３１Ａ４の断片に結合されたＰＣＳＫ９Ｖドメインの結晶構造は、２．２オングストロ
ームの解像度で決定された。結晶構造の図解は、図２１Ａから２１Ｄに提供されている。
図２１Ａから２１Ｃは、３１Ａ４Ｆａｂがサブドメイン１及び２の領域中のＰＣＳＫ９Ｖ
ドメインに結合することを示している。
３１Ａ４Ｆａｂを結合した完全長ＰＣＳＫ９のモデルが作製された。完全長ＰＣＳＫ９
の構造を、複合体からのＰＣＳＫ９Ｖドメイン上に重ね合わせた。このモデルの図は、図
２１Ｄに示されている。ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインとＰＣＳＫ９の間の相互作用の部位
が強調表示されている。
構造の分析は、この抗体がどこでＰＣＳＫ９と相互作用するかを示し、（以下の実施例
４０及び４１と組み合わせて、結果を見た場合に）ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合表面に結合
していない抗体がＰＣＳＫ９を通じて媒介されるＬＤＬＲの分解をなお阻害できることを
示した。さらに、結晶構造の分析によって、ＰＣＳＫ９と３１Ａ４抗体の間の相互作用に
関与する特異的アミノ酸の同定が可能となる。さらに、ＰＣＳＫ９表面上の界面のコア及
び境界領域も決定された。３１Ａ４との相互作用界面の特異的コアＰＣＳＫ９アミノ酸残
基が、３１Ａ４タンパク質の５オングストローム以内に存在するＰＣＳＫ９残基として定
義された。コア残基は、Ｔ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６
、Ｒ４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０
、Ｐ５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９
、Ｒ５９２及びＥ５９３である。
３１Ａ４との相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基が、３１Ａ４タンパク質から
５ないし８オングストロームであるＰＣＳＫ９残基として定義された。境界残基は、以下
のとおりである。Ｓ４６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４
９７、Ｅ４９８、Ｍ５００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５
１３、Ａ５１４、Ｇ５１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５
７０、Ｌ５７１、Ｈ５９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びｂＨ５９７である。ＰＣＳＫ９タン
パク質内に殆ど又は完全に埋没されているアミノ酸残基は、下線によって強調表示されて
いる。本明細書に記載されているように、付番は、配列番号３のアミノ酸位置を基準とす
る（本明細書に記載されているように調整されている。）。
ＰＣＳＫ９との相互作用界面の特異的コア３１Ａ４アミノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパ
ク質の５オングストローム以内に存在する３１Ａ４残基として定義された。３１Ａ４抗体
に対するコア残基は、以下のとおりである。重鎖：Ｇ２７、Ｓ２８、Ｆ２９、Ｓ３０、Ａ
３１、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｅ５０、Ｎ５２、Ｈ５３、Ｒ５６、Ｄ５８、Ｋ７６、Ｇ９８、Ｑ
９９、Ｌ１００及びＶ１０１；軽鎖：Ｓ３１、Ｎ３２、Ｔ３３、Ｙ５０、Ｓ５１、Ｎ５２
、Ｎ５３、Ｑ５４、Ｗ９２及びＤ９４。ＰＣＳＫ９との相互作用界面の境界３１Ａ４アミ
ノ酸残基が、ＰＣＳＫ９タンパク質から５ないし８オングストロームである３１Ａ４残基
として定義された。３１Ａ４に対する境界残基は、以下のとおりである。重鎖：Ｖ２、Ｇ
２６、Ｗ３４、Ｎ３５、Ｗ４７、Ｉ５１、Ｓ５４、Ｔ５７、Ｙ５９、Ａ９６、Ｒ９７、Ｐ
１０２、Ｆ１０３及びＤ１０４；軽鎖：Ｓ２６、Ｓ２７、Ｎ２８、Ｇ３０、Ｖ３４、Ｎ３
５、Ｒ５５、Ｐ５６、Ｋ６７、Ｖ９１、Ｄ９３、Ｓ９５、Ｎ９７、Ｇ９８及びＷ９９。
結晶構造は、ＰＣＳＫ９との相互作用におけるこのＡＢＰの空間的必要条件も示した。
この構造中に示されているように、驚くべきことに、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の相互作用
を直接妨害することなくＰＣＳＫ９に結合する抗体は、ＰＣＳＫ９の機能をなお阻害する
ことができる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合し、又はＰＣＳＫ９を中和するために、
３１Ａ４に結合し、３１Ａ４を覆い、３１Ａ４が上記残基の何れかと相互作用するのを妨
害するあらゆる抗原結合タンパク質を使用することができる。幾つかの実施形態において
、ＡＢＰは、以下のＰＣＳＫ９（配列番号３）残基の少なくとも１つに結合し、又はこれ
らと相互作用する。Ｔ４６８、Ｒ４６９、Ｍ４７０、Ａ４７１、Ｔ４７２、Ｒ４９６、Ｒ
４９９、Ｅ５０１、Ａ５０２、Ｑ５０３、Ｒ５１０、Ｈ５１２、Ｆ５１５、Ｐ５４０、Ｐ
５４１、Ａ５４２、Ｅ５４３、Ｈ５６５、Ｗ５６６、Ｅ５６７、Ｖ５６８、Ｅ５６９、Ｒ
５９２及びＥ５９３。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、上記残基の１つ又はそれ以
上の５オングストローム以内にある。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、以下のＰＣ
ＳＫ９（配列番号３）残基の少なくとも１つに結合し、又はこれらと相互作用する。Ｓ４
６５、Ｇ４６６、Ｐ４６７、Ａ４７３、Ｉ４７４、Ｒ４７６、Ｇ４９７、Ｅ４９８、Ｍ５
００、Ｇ５０４、Ｋ５０６、Ｌ５０７、Ｖ５０８、Ａ５１１、Ｎ５１３、Ａ５１４、Ｇ５
１６、Ｖ５３６、Ｔ５３８、Ａ５３９、Ａ５４４、Ｔ５４８、Ｄ５７０、Ｌ５７１、Ｈ５
９１、Ａ５９４、Ｓ５９５及びＨ５９７。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、上記残
基の１つ又はそれ以上から５ないし８オングストロームにある。幾つかの実施形態におい
て、ＡＢＰは、上記残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０と相互作用し、これらを
封鎖し、又はこれらの８オングストローム以内にある。
上記実施例において論述されている結晶構造に対する座標が、表３５．１（完全長ＰＣ
ＳＫ９及び３１Ｈ４）、表３５．２（ＰＣＳＫ９及びＥＧＦａ）、表３５．３（ＰＣＳＫ
９、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２）及び表３５．４（ＰＣＳＫ９及び３１Ａ４）に示されてい
る。図面に図示されているＰＣＳＫ９の構造の関連する領域又は残基（ＥＧＦａ又は抗体
がＰＣＳＫ９と相互作用する場所から１５、１５から８、８、８から５、５又はそれ以下
のオングストローム以内の領域又は残基を含む。）と相互作用する抗原結合タンパク質及
び分子並びに／又は座標からの構造上のそれらの対応する位置も想定される。
座標中に記載されている抗体は、イー・コリ中で産生され、従って、完全ヒト抗体とは
幾つか若干のアミノ酸の相違を有する。可変領域中の第一の残基は、２１Ｂ１２の重鎖及
び軽鎖並びに３１Ｈ４の軽鎖に対するグルタミンの代わるグルタミン酸であった。可変領
域の配列中の相違の他に、（同じく、抗体がイー・コリ中で産生されたという事実のため
に）座標によって記載されている抗体の定常領域中にも幾つかの相違が存在した。図２２
は、配列番号１５６及び１５５と比べた場合の、（イー・コリ中で産生された）２１Ｂ１
２、３１Ｈ４及び３１Ａ４Ｆａｂの定常領域間の相違を（下線付きの影又は太字によって
）強調表示している。２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び３１Ａ４に関して、軽鎖定常配列はヒト
λ（配列番号１５６）と類似している。下線が付されたグリシン残基は挿入であり、この
間で、２１Ｂ１２と３１Ｈ４可変領域が終結し、λ配列が開始する。
２１Ｂ１２及び３１Ｈ４の両方に関して、重鎖定常は、ヒトＩｇＧ４（配列番号１５５
）と類似している。図２２中の強調表示された相違が、表３６．１に示されている。
３１Ａ４に関して、３１Ａ４は上記されている同じ相違を有するが、３つのさらなる相
違が存在する。図２２に示されているように、先頭に２つの追加のアミノ酸が存在し、こ
れは、イー・コリ発現中でのシグナルペプチドの不完全なプロセッシングに起因する。さ
らに、配列番号１５５と比べたときに、３１Ａ４重鎖定常領域中に１つの追加の置換が存
在し、これは、（配列番号１５５中の）ＬのＨへの調整である。最後に、３１Ａ４は、２
１Ｂ１２及び３１Ｈ４に対して上述されているグルタミン酸への調整ではなく、Ｆａｂの
最初のアミノ酸としてグルタミンを有する。
３つの抗体全てに関して、（濃い灰色の枠で囲まれている）重鎖の末端も異なるが、構
造中でアミノ酸が整理されていないので、座標中には出現しない。当業者によって理解さ
れるように、ヒスチジンタグを含む特定の配列番号への参照及びＡＢＰ配列が「ヒスチジ
ンタグを含む」という記述によって明示的に言及されていなければ、ＨｉｓタグはＡＢＰ
の必要な一部でなく、ＡＢＰの配列の一部と考えるべきではない。
（実施例３７）
エピトープマッピング−ビニング
実施例１０中の組に加えて、ビニング実験の別の組を実施した。実施例１０におけると
同様に、互いに競合するＡＢＰは、標的上の同じ部位に結合するものと考えることができ
、一般的な語法では、互いに「ビン」を形成していると言われる。
Ｊｉａ他（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８８ （２００
４） ９１−９８）によって記載された多重化ビニング法の改変を使用した。室温で１時
間、暗所にて、０．５μｇ／ｍＬビオチン化一価マウス抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（ＢＤ Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５５７８５）１００μＬ中で、ストレプトアビジンによって被
覆されたＬｕｍｉｎｅｘビーズの各ビーズコードを温置し、次いで、ＰＢＳＡ（１％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄し
た。２μｇ／ｍＬ抗ＰＣＳＫ９抗体（ＣｏａｔｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ）１００μＬとと
もに、各ビーズコードを別々に１時間温置した後、ＰＢＳＡで３回洗浄した。ビーズをプ
ールした後、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，＃ＭＳＢＶＮ１２５
０）に分配した。２μｇ／ｍＬの精製されたＰＣＳＫ９タンパク質１００μＬをウェルの
半分に添加した。緩衝液を対照として他の半分に添加した。反応を１時間温置した後、洗
浄した。２μｇ／ｍＬ抗ＰＣＳＫ９抗体（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｂ）１００μＬを全ての
ウェルに添加し、１時間温置し、次いで、洗浄した。別の対象として、無関係のヒトＩｇ
Ｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃００９−０００−００３）を走行させた。各ウェルに、ＰＥ連結
された一価マウス抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５５７８７）２０μ
Ｌを添加し、１時間温置し、次いで、洗浄した。ＰＢＳＡ１００μＬ中にビーズを再懸濁
し、最低１００事象／ビーズコードをＢｉｏＰｌｅｘ装置（ＢｉｏＲａｄ）上で収集した
。
ＰＣＳＫ９を含有する対応する反応のシグナルから、ＰＣＳＫ９なしでの抗体対の中央
値蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引いた。抗体対が同時に（従って、異なるビンに）結合した
と考えられるためには、差し引かれたシグナルは、それ自身と競合する抗体のシグナルよ
り３倍大きく、且つ無関係の抗体と競合する抗体のシグナルより３倍大きくなければなら
なかった。
上記から得られたデータは、図２３Ａから２３Ｄに図示されている。ＡＢＰは、５つの
ビンに属した。影が付いた枠は、ＰＣＳＫ９へ同時に結合することができるＡＢＰを示し
ている。影が付いていない枠は、結合に関して互いに競合するＡＢＰを示している。結果
の要約が、表３７．１に示されている。
ビン１（ＡＢＰ２１Ｂ１２と競合する。）及び３（３１Ｈ４と競合する）は、互いに排
他的であり、ビン２はビン１及び３と競合し、並びにビン４はビン１及び３と競合しない
。この実施例において、ビン５は、他のビンに適合するＡＢＰを記載するために、「キャ
ッチオール」ビンとして表される。従って、ビンのそれぞれの中の上記ＡＢＰは、ＰＣＳ
Ｋ９上のエピトープ位置の異なる種類の代表であり、それらの幾つかは互いに重複する。
当業者によって理解されるように、基準ＡＢＰがプローブＡＢＰの結合を妨げるのであ
れば、抗体は同じビン中にあると称される。ＡＢＰが使用される順序が重要であり得る。
ＡＢＰＡが基準ＡＢＰとして使用され、ＡＢＰＢの結合を遮断すれば、逆は必ずしも真で
はない。基準ＡＢＰとして使用されるＡＢＰＢは必ずしもＡＢＰＡを遮断しない。ここで
役割を果たしている多数の因子が存在する。ＡＢＰの結合は、標的中の立体構造の変化を
引き起こすことができ、これは、第二のＡＢＰの結合を妨げ、又は互いに重複するが、互
いを完全に封鎖しないエピトープは、結合を可能とするのに十分な標的との高親和性相互
作用を第二のＡＢＰがなお有することを可能にし得る。ずっと高い親和性を有するＡＢＰ
は、遮断するＡＢＰを押し出すより大きな能力を有し得る。一般に、何れの順序において
も競合が観察されれば、ＡＢＰは互いにビンであると称され、両ＡＢＰが互いに遮断する
ことができれば、エピトープはより完全に重複する可能性がある。
（実施例３８）
エピトープマッピング−ウェスタンブロット
本実施例は、検査されたＡＢＰに対するエピトープが直鎖又は立体構造であるかどうか
を示す。何れの抗体が立体構造的エピトープを有するかを決定するために、変性還元及び
変性非還元ウェスタンブロットを実施した。変性還元ウェスタンブロットに結合する抗体
は、直鎖エピトープを有しており、立体構造的ではない。結果が、図２４Ａ及び２４Ｂに
示されている。ブロットに関して、４から１２％ＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル及び
ＭＥＳＳＤＳ走行緩衝液上に、精製された完全長ヒトＰＣＳＫ９の０．５μｇ／レーンを
走行させた。ブロットを探査するために、０．５μｇ／ｍＬの３１Ｇ１１を除き、抗ＰＣ
ＳＫ９抗体１μｇ／ｍＬを使用した。１：５０００のロバ抗ヒトＩＲ７００二次を使用し
、ＬｉＣＯＲ装置上で読み取った。抗体１３Ｈ１は、ＰＣＳＫ９のプロドメイン上の直鎖
エピトープに結合した。他の抗体全てが、立体構造的エピトープと合致する結果を示した
。これらのゲルは、タンパク質の残りからプロドメインを分離し、プロドメインは約１５
ｋＤａで走行した。さらに、３Ｃ４及び３１４は、ジスルフィド結合が保持されている変
性条件下でＰＣＳＫ−９に結合するが（左）、試料を還元すると（右）結合が喪失したの
で、これらの抗体は、ジスルフィド結合によって保持される立体構造的エピトープに結合
するものと思われた。
（実施例３９）
エピトープマッピング−アルギニン／グルタミン酸スキャニング
（実施例３７から得られた）各ビンからの代表的ＡＢＰをさらなるエピトープ分析のた
めに選択した。ＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合をマッピングするために、アルギニン／グルタ
ミン酸スキャニング戦略を実施した。バックグラウンドとして、この方法は、ある残基が
構造的エピトープの一部であるかどうかを決定し、抗原中の残基が抗体と接触し、又は抗
体によって埋没されていることを意味する。アルギニン及びグルタミン酸側鎖は帯電して
おり、嵩が大きく、変異された残基が抗体結合に直接関与していなくても、抗体結合を破
壊することができる。
残基の選択
エピトープマッピングのために変異すべき残基を選択するために、ＰＣＳＫ９の結晶構
造を使用した。変異させる残基を選択するために使用される方法は、数学的機序及び相互
作用構造分析の両方を含んだ。ＰＣＳＫ９構造は、喪失した残基のギャップを含有し、Ｎ
末端中の喪失した３０のアミノ酸（すなわち、シグナル配列）及びＣ末端中の１０のアミ
ノ酸であった。内部の喪失した残基を構造上にモデル化されたが、Ｎ末端及びＣ末端の喪
失した残基はモデル化されなかった。各残基に対する溶媒曝露比を計算した。タンパク質
に関連する各残基の表面積（ＳＡ１）を、保存された骨格構造とともに隣接するグリシン
を有する三量体中の残基の表面積（ＳＡ２）によって除した。１０％を上回る溶媒曝露比
（Ｒ１０）を有する残基並びに４０の喪失した末端残基を選択した。誤った折り畳みの可
能性を低下させるために、正のΦ角度を有するプロリン及びグリシンはこれらから除外し
た。変異の総数を２８５とするために、タンパク質全体の視覚的検査とともに、３７％の
溶媒曝露比を用いることによって、Ｖドメイン中の変異されるべき残基の数を減らした。
これらの様々なクラスの種類とともに、ＰＣＳＫ９の表面の様々な配向が、図２５Ａから
２５Ｆ中に示されている。これらの図面において、最も薄い灰色は、選択されなかった又
は選択から除去された領域を表し、より濃い灰色は、選択された残基を表す。
クローニング及び発現
変化させるべき残基が同定されたら、様々な残基を改変した。Ｃ末端のフラッグ−Ｈｉ
ｓタグを有するｐＴＴ５ベクター中にヒトＰＣＳＫ９をクローニングした。Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩキットを用いて、位置指定突然変異導入によって、
この原構築物から変異体を作製した。ＡｍｇｅｎのＭｕｔａＧｅｎｉｅソフトウェアを用
いて、突然変異導入のために使用されたセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを設
計した。２４ウェルプレート中の一過性に形質移入された２９３−６Ｅ細胞中で全てのＰ
ＣＳＫ９構築物を発現させ、各プレート中の非変異ＰＣＳＫ９対照（野生型、ＷＴ）とと
もに３つの９６ウェルプレート中に再度並べた。馴化培地中の組換えタンパク質の発現レ
ベル及び完全性をウェスタンブロットによってチェックした。最初に選択された２８５の
変異体のうち、４１がクローニング又は発現に失敗した。エピトープマッピングのために
、２４４の変異体を使用した。２４４の変異された残基とのＰＣＳＫ９親配列及び代表的
なＰＣＳＫ９配列の並置が、図２６に示されている。単一の変異を含有する別個の構築物
を作製した。エピトープ配列及び結合の変化を伴うエピトープベースの発明のために、配
列番号１及び／又は配列番号３０３を参照して配列が提供されている。図２６中の配列は
、本結合エピトープ研究のために使用される配列であった。当業者は、本結果が本明細書
中に開示されている他のＰＣＳＫ９バリアント（例えば、配列番号１及び並びに他の対立
遺伝子バリアント）にも当てはまることを理解する。
優れたエピトープマッピングに関して、５つの抗体（各ビンの代表）を選択した。それ
らは、２１Ｂ１２、３１Ｈ４、１２Ｈ１１、３１Ａ４、３Ｃ４であった。全て、立体構造
的エピトープ抗体である。また、３つ（２１Ｂ１２、３１Ｈ４及び３１Ａ４）は、上述の
ように、ＰＣＳＫ９と結晶化された。
構造及び機能的エピトープ
エピトープは、さらに、構造的又は機能的として定義することができる。機能的エピト
ープは、一般に、構造的エピトープの亜群であり、相互作用（例えば、水素結合、イオン
性相互作用）の親和性に直接寄与する残基を有する。構造的エピトープは、抗体によって
覆われた標的のパッチと考えることができる。
使用されるスキャニング突然変異導入は、アルギニン及びグルタミン酸スキャンであっ
た。巨大な立体的な嵩及びそれらの電荷のために（これらにより、構造的エピトープ中に
生じる変異は抗体結合に対してより大きな効果を有することが可能となる。）、これら２
つの側鎖を選択した。ＷＴ残基がアルギニンである場合（これらの場合には、電荷を入れ
替えるために、残基はグルタミン酸に変異させた。）を除いて、一般にアルギニンを使用
した。
エピトープマッピングの目的で、ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９変異体への抗体結合を同時
に測定するために、ビーズをベースとした多重化アッセイを使用した。次いで、変異体へ
の抗体結合を、同じウェル中の野生型へのその結合と比較した。バリアントは、３つのグ
ループに分けられた。グループ１：８１のバリアント＋２つのｗｔ対照＋１つの陰性対照
＋１つの他のＰＣＳＫ９上清；グループ２：８１のバリアント＋２つのｗｔ対照＋２つの
陰性対照；及びグループ３：８２のバリアント＋２つのｗｔ対照＋１つの陰性対照。
アッセイは、以下のようにして行った。色によってコードされたストレプトアビジン被
覆されたＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）の８５組にビオチン化された抗ペ
ンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１９２２５）を室温（ＲＴ）で１時間結合させ、
次いで、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄した。次いで、色に
よってコードされたそれぞれのビーズの組を、４℃で一晩、上清１５０μＬ中のＰＣＳＫ
９変異体、野生型又は陰性対照に結合させた。
それぞれ特異的タンパク質に会合された、色によってコードされたビーズの組を洗浄し
、プールした。この時点で、８５のビーズの組の３つのプール（変異体及び対照の各群に
対して１つのプール）が存在した。各プールからのビーズを９６ウェルのフィルタープレ
ート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＃ＭＳＢＶＮ１２５０）の２４ウェル（３列）に分注した
。４倍希釈した抗ＰＣＳＫ９抗体１００μＬを、３つ組みの点に対して９つの列に添加し
、室温で１時間温置し、洗浄した。１：２００希釈のフィコエリトリン（ＰＥ）連結され
た抗ヒトＩｇＧＦｃ１００μＬ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，＃１
０９−１１６−１７０）を各ウェルに添加し、室温で１時間温置し、洗浄した。
ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中にビーズを再懸濁し、１０分間振盪し、ＢｉｏＰｌｅｘ装置（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で読み取った。装置は、その色コードによって各ビーズを同定し、こ
れにより、色コードに付随する特異的タンパク質を同定する。同時に、装置は、ＰＥ色素
の蛍光強度によって、ビーズに結合された抗体の量を測定する。次いで、各変異体への抗
体結合を同じプール中の野生型へのその結合と直接比較することができる。ＩＬ−１７Ｒ
キメラＥを陰性対照として使用した。検査した変異体の全ての要約が（図１Ａ及び２６中
で使用された配列付番を参照して）表３９．１に示されている。
ビーズ変動研究
エピトープマッピング結合アッセイを実施する前に、「ビーズ領域」から「ビーズ領域
」（Ｂ−Ｂ）の変動を評価するために、検証実験を行った。検証実験では、全てのビーズ
に同じ野生型対照タンパク質を連結した。従って、ビーズ領域間の差は、純粋にＢ−Ｂ変
動によるものであり、野生型と変異体タンパク質間の差によって影響を受けない。抗体の
滴定は、異なるウェル中で１２回反復して行った。
この統計解析の目的は、結合曲線の推定ＥＣ５０のＢ−Ｂ変動性を推定することであっ
た。次いで、曲線比較実験の間に、野生型及び変異体タンパク質のＥＣ５０信頼区間を構
築するために、推定Ｂ−Ｂ標準偏差（ＳＤ）を使用した。
各ビーズ領域に対する結合データに４パラメータのロジスティックモデルをフィッティ
ングさせた。曲線品質管理（ＱＣ）の結果及び最上位（最大）、最下位（最低）、Ｈｉｌ
ｌ勾配（勾配）に対するパラメータの推定及び曲線のＥＣ５０の自然対数（×ｍｉｄ）を
含有する得られたファイルを、分析のための生データとして使用した。次いで、ＳＡＳＰ
ＲＯＣＭＩＸＥＤ手法を使用するフィッティング混合効果モデルによって、各パラメータ
に対するＢ−Ｂ変動性を推定した。「優れた」ＱＣ状態を有する曲線のみを解析に含めた
。最終の混合効果モデルは、ランダム効果として、残余（すなわち、それぞれのビーズ領
域）のみを含んだ。各パラメータに対する最小二乗平均（ＬＳ−平均）も、混合効果モデ
ルによって推定した。Ｂ−Ｂ分散の平方根を求めることによって、Ｂ−Ｂの標準偏差を計
算した。ＬＳ−平均＋２ＳＤ及びＬＳ−平均−２ＳＤ間の変化倍数（概ね、集団の上位及
び下位９７．５パーセンタイルを表す。）も計算した。結果は、表３９．２中に示されて
いる。
構造的エピトープ中の残基の同定
残基をアルギニン又はグルタミン酸に変異させたときに抗体結合を変化させる場合に、
残基を構造的エピトープの一部と考えた（「ヒット」）。これは、野生型への抗体結合と
比較したＥＣ５０のシフト又は最大シグナルの低下として観察される。統計的に有意なＥ
Ｃ５０のシフトを同定するために、野生型及び変異体への抗体結合曲線の統計解析を使用
した。解析は、アッセイ及び曲線フィッティングにおける変動を考慮に入れている。
ＥＣ５０の比較に基づくヒットの同定
ＶａｒＰｏｗｅｒソフトウェアを用いるＳ−ＰＬＵＳ（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて、結合データに対してフィッティ
ングされた重み付けされた４パラメータロジスティックモデルからＥＣ５０及びＢｍａｘ
値を求めた。変異体結合曲線と野生型結合曲線のＥＣ５０を比較した。さらなる検討のた
めに、統計学的に有意な差をヒットとして同定した。「フィットなし」又は「不良なフィ
ット」のフラッグが付いた曲線は、解析から除外した。
ＥＣ５０推定値の変動
ＥＣ５０推定値の比較において、曲線のフィッティングからの変動及びビーズ−ビーズ
変動という２つの変動源を考慮した。野生型及び変異体は異なるビーズに連結されたので
、それらの差は、ビーズ−ビーズ差の影響を受ける（上記）。曲線フィッティングの変動
は、ｌｏｇＥＣ５０推定値の標準誤差によって推定された。ビーズ−ビーズ変動は、野生
型対照がビーズの各１つに連結されている実験を用いて、実験的に測定した（上記）。実
際のエピトープマッピング実験におけるビーズ−ビーズ変動を推定するために、この実験
から得られた野生型結合曲線のＥＣ５０推定値のビーズ変動を使用した。
変異体及び野生型間でのＥＣ５０シフトの検査
Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、（対数目盛りでの）２つのＥＣ５０の比較を行った
。デルタ（ＥＣ５０推定値間の絶対差）とデルタの標準偏差間の比としてｔ統計量を計算
した。３つの成分（非線形回帰における変異体及び野生型曲線に対するＥＣ５０の分散推
定並びに別個の実験から推定されたビーズ−ビーズ分散の２倍）の合計によって、デルタ
の分散を推定した。ビーズ−ビーズ分散に対する２の乗数は、変異体及び野生型ビーズが
何れも同じ分散を有するという仮定によるものであった。デルタの標準偏差の自由度は、
Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅの（１９４６）近似を用いて計算した。それぞれのｐ値及び
信頼区間（９５％及び９９％）は、各比較のためのＳｔｕｄｅｎｔのｔ分布に基づいて得
られた。複数の野生型対照の場合には、変異体と最も似通った野生型対照を選び取ること
によって、すなわち、最大のｐ値を有するものを選び取ることによって、保守的アプロー
チを採用した。
大量の検査を同時に実施しながら偽陽性を管理するために、多重度調整が重要であった
。この解析のために、ファミリーワイズエラー（ＦＷＥ；ｆａｍｉｌｙ ｗｉｓｅ ｅｒ
ｒｏｒ）調整及び偽発見率（ＦＤＲ；ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）調整
という多重性調整の２つの形態を実行した。ＦＷＥアプローチは、１つ又はそれ以上のヒ
ットが本物でない確率を調節する。ＦＤＲアプローチは、選択されたヒット間での偽陽性
の予想割合を調節する。前者のアプローチはより保守的であり、後者のアプローチより強
力でない。この解析のために、両アプローチに対して利用可能な多くの方法が存在する。
ＦＷＥ分析に関してはＨｏｃｈｂｅｒｇの（１９８８）方法を選択し、ＦＤＲ分析に関し
ては、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの（１９９５）方法を選択した。両アプロ
ーチに対する調整されたｐ値を計算した。
結果
ＥＣ５０のシフト
そのＥＣ５０が野生型と有意に異なる（例えば、全アッセイに対して０．０１又はそれ
以下の偽発見率調整されたｐ値を有する）変異を構造的エピトープの一部と考えた。また
、０．０１０９の抗体当りＦＷＥ調整されたｐ値を有していた抗体３１Ｈ４の残基Ｒ１８
５Ｅを除いて、全てのヒットが、各抗体に対して、０．０１未満のファミリーワイズ第一
種過誤率調整されたｐ値を有していた。ＥＣ５０のシフトによって決定された様々な抗体
の構造的エピトープ中の残基が表３９．３に示されている（点変異は、配列番号１及び３
０３を基準とする。）
最大シグナル減少
曲線フィッティング（ＢｍａｘＰｅｒＷＴ）及び生データ点（ＲａｗＭａｘＰｅｒＷＴ
）から得られた最大シグナルを用いて、％最大シグナルを計算した。野生型シグナルと比
べて抗体結合最大シグナルを７０％以上低下させた変異又は他の抗体全てが野生型の少な
くとも４０％であるときに、他の抗体と比べて１つの抗体のシグナルを５０％超低下させ
る変異をヒット及びエピトープの一部と考えた。表３９．４は、最大シグナルの低下によ
って決定された構造エピトープ（斜字体）である残基を示している。
表３９．５は、様々な抗体に対するヒットの全ての要約を示している。
これらの残基が関連するエピトープの一部又は全部をどのようにして形成するかをさら
に調べるために、上記位置を様々な結晶構造モデル上にマッピングし、結果が図２７Ａか
ら２７Ｅに示されている。図２７Ａは、２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマ
ッピングされた、２１Ｂ１２エピトープのヒットを図示している。構造は、ＰＣＳＫ９残
基を以下のように同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示
されている残基を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発
現できなかった。）。明示されている残基を検査し（図の上に示されている影に関わらず
）、ＥＣ５０及び／又はＢｍａｘの著しい変化をもたらした。エピトープのヒットは、Ｂ
ｍａｘのシフトに基づいた。この図において、３１Ｈ４は、２１Ｂ１２の後ろにある。
図２７Ｂは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングさ
れた、３１Ｈ４エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同
定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除
く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。）
。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び／
又はＢｍａｘの有意な変化を得た。エピトープのヒットは、ＥＣ５０のシフトに基づいた
。
図２７Ｃは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングさ
れた、３１Ａ４エピトープヒットを図示する。この構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のよう
に同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基
を除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった
。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及
び／又はＢｍａｘの有意な変化を得た。エピトープのヒットは、ＥＣ５０のシフトに基づ
いた。３１Ａ４抗体は、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合することが知られており、これは
、図２７Ｃ中に示されている結果と合致するように見受けられる。
図２７Ｄは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングさ
れた、１２Ｈ１１エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように
同定する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を
除く。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現できなかった。
）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５０及び
／又はＢｍａｘの有意な変化を得た。１２Ｈ１１は、上に記載されているビニングアッセ
イにおいて、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４と競合する。
図２７Ｅは、３１Ｈ４及び２１Ｂ１２抗体とのＰＣＳＫ９の結晶構造上にマッピングさ
れた、３Ｃ４エピトープヒットを図示する。構造は、ＰＣＳＫ９残基を以下のように同定
する。薄い灰色は、変異を受けていない残基を示し（構造上に明示されている残基を除く
。）、より濃い灰色は変異を受けた残基を示す（それらの一部は発現することができなか
った。）。（図の上に示されている影に関わらず）明示されている残基を検査し、ＥＣ５
０及び／又はＢｍａｘの著しい変化をもたらした。
３Ｃ４はビニングアッセイにおいて、２１Ｂ１２及び３１Ｈ４と競合しない。３Ｃ４は
、ドメイン結合アッセイ中のＶドメインに結合する（実施例４０、図２８Ａ及び２８Ｂか
ら得られた結果を参照）。
（結晶構造に基づいて）結合に対して影響を有すると予想できる約１２の変異体が存在
したが、本実験は、驚くべきことに、結合に対して効果を有していないことを示した。当
業者によって理解されるように、上記結果は、これらの抗体の結晶構造及びＰＣＳＫ−９
の結合と良好に一致している。これは、提供されている構造及び対応する機能的データが
中和ＡＢＰとＰＣＳＫ９の相互作用の中心的残基及び領域を十分に同定することを示して
いる。従って、上記領域に結合する能力を有するＡＢＰのバリアントは、本記述によって
十分に提供される。
当業者によって理解されるように、Ｂ−ｍａｘの低下及びＥＣ５０シフトのヒットは、
同じ現象の現れであると考えることができるが、厳密に言えば、Ｂｍａｘの低下単独では
、それ自体、親和性の喪失を反映せず、むしろ、抗体のエピトープの幾らかのパーセント
の破壊を反映する。Ｂ−ｍａｘ及びＥｃ５０によって決定されたヒットには重複は存在し
ないが、結合に対して強い影響を有する変異は、有用な結合曲線の作成を可能にしない場
合があり得、従って、このようなバリアントに対しては、ＥＣ５０を決定することはでき
ない。
当業者によって理解されるように、（上述のように、一般的なキャチオールビンである
ビン５を除き）同じビン中のＡＢＰは、標的タンパク質上の重複する部位へ結合する可能
性がある。従って、上記エピトープ及び関連する残基は、同じビン中のこのような全ての
ＡＢＰへ一般に拡張することができる。
ＡＢＰ３１Ｈ４に関する上記結果をさらに調べるために、上記結晶構造によれば、Ｒ１
８５と相互作用して、ＡＢＰと相互作用する表面の一部を形成すると予想された位置Ｅ１
８１Ｒも変化させた（Ｅ１８１Ｒ）。単独では統計的に有意ではないが、結晶構造と組み
合わせた場合に、結果は、Ｅ１８１Ｒとの３１Ｈ４の相互作用を示す（データは図示せず
。）。従って、位置１８１も、３１Ｈ４ＡＢＰに対するエピトープの一部を形成するよう
である。
上述のように、上記結合データ及びエピトープの性質決定は、ＰＣＳＫ９の最初の３０
アミノ酸を含まないＰＣＳＫ９配列（配列番号１）を参照する。従って、このタンパク質
断片の付番系及びこの断片を参照する配列番号は、完全長ＰＣＳＫ９付番系（上記結晶研
究データにおいて使用されるものなど）を使用するデータ及び実験と比べて、３０アミノ
酸だけシフトする。従って、これらの結果を比較するためには、余分の３０アミノ酸を、
上記エピトープマッピング結果の各々の中の位置に付加すべきである。例えば、配列番号
１（又は配列番号３０３）の２０７位は、配列番号３の２３７位に相当する（完全長配列
及び本明細書の残りを通じて使用される付番系）。表３９．６は、配列番号１（及び／又
は配列番号３０３）を参照する上記位置が配列番号３（シグナル配列を含む。）とどのよ
うに相関するかを概説する。
従って、配列番号１を参照して本明細書中に記載されている実施形態は、配列番号３を
参照する上述の対応する位置によっても記載することができる。
（実施例４０）
ＰＣＳＫ９ドメイン結合アッセイ
本実施例は、様々なＡＢＰがＰＣＳＫ９上のどこに結合するかを調べた。
透明な９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中に希釈された様
々な抗ＰＣＳＫ９抗体２μｇ／ｍＬで一晩被覆した。ＰＢＳ／．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０
でプレートを完全に洗浄し、次いで、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２時間ブロックした。洗浄後
、一般的なアッセイ希釈液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ， ＬＬＣ）中に希釈された完全長ＰＣＳＫ９（ａａ３１−６９２配列番号３、ｐｒｏ
ｃａｔＰＣＳＫ９（ａａ３１−４４９配列番号３）又はｖ−ドメインＰＣＳＫ９（配列番
号３のａａ４５０−６９２）の何れかとともに、プレートを２時間温置した。プレートを
洗浄し、ｐｒｏｃａｔ及びｖ−ドメイン並びに完全長ＰＣＳＫ９を認識するウサギポリク
ローナルビオチン化抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｄ８７７４）を１μｇ／ｍＬ（１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ中）で添加した。結合された完全長、ｐｒｏｃａｔ又はｖ−ドメインＰＣＳＫ９を、２
００ｎｇ／ｍＬ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）ニュートラビジンーＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、続いて、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置し、６５０
ｎｍで吸光度を測定することによって検出した。図２８Ａ及び２８Ｂ中に示されている結
果は、ＰＣＳＫ９の様々な部分に結合する様々なＡＢＳの能力を示している。図２８Ｂに
示されているように、ＡＢＰ３１Ａ４は、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合する。
（実施例４１）
中和非競合的抗原結合タンパク質
本実施例は、ＰＣＳＫ９との結合に関して、ＬＤＬＲと非競合的であるが、なおＰＣＳ
Ｋ９活性に対して中和的である抗原結合タンパク質をどのようにして同定及び性質決定す
るかを示す。換言すれば、このような抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結
合するのを遮断しないが、ＰＣＳＫ９によって媒介されるＬＤＬＲの分解を妨げ、又は低
下させる。
緩衝液Ａ（１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中に希釈されたヤギ抗ＬＤ
Ｌ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）２μｇ／ｍＬで、透明な３８４ウェルプレート
（Ｃｓｔａｒ）を被覆した。緩衝液Ａでプレートを完全に洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ（緩
衝液Ａ中の１％ミルク）で２時間ブロックした。洗浄後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭＣａＣｌ２
が補充された緩衝液Ｂ）中に希釈されたＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）０．４
μｇ／ｍＬとともに、プレートを１．５時間温置した。この温置と同時に、緩衝液Ａ中に
希釈された抗体１００ｎｇ／ｍＬ又は緩衝液Ａのみ（対照）とともに、ビオチン化Ｄ３７
４ＹＰＣＳＫ９の２０ｎｇ／ｍＬを温置した。ＬＤＬ受容体を含有するプレートを洗浄し
、ビオチン化されたＤ３７４ＹＰＣＳＫ９／抗体混合物をプレートに移し、室温で１時間
温置した。ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＤ３７４Ｙの結合は、緩衝液Ｃ中での５０
０ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｃｏｕｒｃｅ）とともに温置した
後、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置することによって検出した。１ＮＨＣｌでシグナ
ルを消光し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。結果は、図２８Ｃに示されており、ＡＢ
Ｐ３１Ｈ４はＬＤＬＲ結合を阻害するのに対して、ＡＢＰ３１Ａ４はＰＣＳＫ９へのＬＤ
ＬＲ結合を阻害しないことを示す。実施例４０から得られた結果並びに図２８Ａ及び２８
Ｂに示されている結果と合わせると、３１Ａ４ＡＢＰはＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し
、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫの相互作用を遮断しないことが明瞭である。
次に、ＡＢＰ３１Ａ４が中和ＡＢＰとして役割を果たす能力は、（上記実施例に記載さ
れているような）細胞ＬＤＬ取り込みアッセイを介してさらに確認された。このＬＤＬ取
り込みアッセイの結果は、図２８Ｄに示されている。図２８Ｄに示されているように、Ａ
ＢＰ３１Ａ４は、有意なＰＣＳＫ９中和能を示す。従って、実施例４０及び本結果に照ら
せば、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲ結合相互作用を遮断せずにＰＣＳＫ９に結合す
ることができるが、中和ＰＣＳＫ９ＡＢＰとしてなお有用であることが明白である。
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書など、本明細書中に引用されている全ての参考文献及び
それらの中に引用されている参考文献は、それらの全体が、参照により、本明細書に組み
込まれる。参照により組み込まれた参考文献中に与えられている定義又は用語の何れもが
本明細書に与えられている用語及び論述と異なる程度まで、本発明の用語及び定義が優越
する。
均等物
前記明細書は、当業者が本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられている。
前述の記載及び実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らによ
って想定される最良の様式を記載する。しかしながら、前記述が本文中でどれほど詳細に
記載されているとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付
の特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物に従って解釈すべきであることが理解される。

Claims (38)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、ＬＤＬＲに対するＰ
    ＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる単離された中和抗原結合タンパク質。
  2. 抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範
    囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。
  3. 抗原結合タンパク質がＬＤＬＲ競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲
    の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。
  4. ＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質
    は１００ｐＭ未満であるＫｄでＰＣＳＫ９に結合する、抗原結合タンパク質。
  5. 抗原結合タンパク質が１０ｐＭ未満であるＫｄで結合する、特許請求の範囲の抗原結合
    タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  6. 抗原結合タンパク質が５ｐＭ未満であるＫｄで結合する、特許請求の範囲の抗原結合タ
    ンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  7. 配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質であって
    、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントＰＣＳＫ９タンパク質の間の結合が単
    離された抗原結合タンパク質と配列番号１のＰＣＳＫ９タンパク質の間の結合の５０％未
    満である、抗原結合タンパク質。
  8. バリアントＰＣＳＫ９タンパク質が配列番号１に示される２０７、２０８、１８５、１
    ８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１
    ６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び
    ５５４からなる群から選択される位置に残基の少なくとも１つの変異を含む、特許請求の
    範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。
  9. 少なくとも１つの変異がＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９
    Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４
    １３Ｒ及びＥ５８２Ｒからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質
    請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。
  10. 少なくとも１つの変異がＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９
    Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ及びＱ５５４Ｒから
    なる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離
    されたヒト抗原結合タンパク質。
  11. 第一の様式で配列番号３０３のＰＣＳＫ９タンパク質に結合する抗原結合タンパク質（
    該抗原結合タンパク質は、第二の様式でＰＣＳＫ９のバリアントに結合し、前記ＰＣＳＫ
    ９バリアントは、配列番号３０３の２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、
    ５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、
    １２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１及び５５４からなる群から選
    択される位置に少なくとも１つの点変異を有し、前記第一の様式が第一のＥＣ５０、第一
    のＢｍａｘ又は第一のＥＣ５０及び第一のＢｍａｘを含み、前記第二の様式は第二のＥＣ
    ５０、第二のＢｍａｘ又は第二のＥＣ５０及び第二のＢｍａｘを含み、並びに第一の様式
    に対する値は第二の様式に対する値と異なる。）。
  12. 第一の様式が第一のＥＣ５０を含み、第二の様式が第二のＥＣ５０を含み、並びに点変
    異がＲ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｅ１８１Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５
    ３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ及びＥ５８２Ｒ
    からなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の
    抗原結合タンパク質。
  13. 第一のＥＣ５０が第二のＥＣ５０と少なくとも２０％異なる、特許請求の範囲の抗原結
    合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  14. 第一のＥＣ５０が第二のＥＣ５０と少なくとも５０％異なる、特許請求の範囲の抗原結
    合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  15. 第二のＥＣ５０が第一のＥＣ５０より大きな数値である、特許請求の範囲の抗原結合タ
    ンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  16. 第一のＥＣ５０が多重ビーズ結合アッセイによって測定される、特許請求の範囲の抗原
    結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  17. 第二のＥＣ５０が１μＭより大きい、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何
    れか一項の抗原結合タンパク質。
  18. 抗原結合タンパク質が中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タン
    パク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  19. 中和抗原結合タンパク質が競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗
    原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  20. 中和抗原結合タンパク質が非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の
    抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  21. 第一の様式が第一のＢｍａｘを含み、第二の様式が第一のＢｍａｘと異なる第二のＢｍ
    ａｘを含み、並びに前記ＰＣＳＫ９バリアントがＤ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、
    Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１
    Ｒ及びＱ５５４Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの点変異を有する、特許請求
    の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  22. 第二のＢｍａｘが第一のＢｍａｘの約１０％である、特許請求の範囲の抗原結合タンパ
    ク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  23. 第一のＢｍａｘが第二のＢｍａｘと少なくとも２０％異なる、特許請求の範囲の抗原結
    合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  24. 第一のＢｍａｘが第二のＢｍａｘと少なくとも５０％異なる、特許請求の範囲の抗原結
    合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。
  25. ＬＤＬＲがＰＣＳＫ９に結合する位置と重複する位置においてＰＣＳＫ９に結合する単
    離された抗体。
  26. ＰＣＳＫ９に結合し、及びＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の低密度リポタンパク質受容体
    （ＬＤＬＲ）低下効果を低下させる中和抗体。
  27. 配列番号３の残基３１から４４７内の位置においてＰＣＳＫ９に結合する、ＰＣＳＫ９
    に結合する中和抗体。
  28. 配列番号３の残基３１から４４７内のエピトープに結合する、請求項２７に記載の抗体
    。
  29. 請求項１から２８の何れか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質及び医薬
    として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  30. 請求項１から２８の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。
  31. 抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を準備すること；及び
    抗原結合タンパク質が発現される条件下に宿主細胞を維持すること；
    を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する抗原結合タン
    パク質（該抗原結合タンパク質はＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少
    させる。）を作製する方法。
  32. 配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された中和抗原
    結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含み、前記中和抗原結合タンパク質がＬ
    ＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる、対象中の血清コレステロー
    ルレベルを低下させる方法。
  33. 上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている患者に
    、配列番号１のアミノ酸を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合する単離された中和抗原結合
    タンパク質の有効量を投与することを含む（前記中和抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲに
    対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。）、患者中の上昇した血清コレステ
    ロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。
  34. 上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に
    、ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、単離された中
    和抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む（前記単離された抗原結合タンパク
    質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９タンパク質に結合し、前記中和抗原結
    合タンパク質は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ低下効果を減少させる。）、対
    象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。
  35. ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤がスタチンを含む、請求項３１から
    ３４の一項の方法。
  36. スタチンがアトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバ
    スタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれ
    らの幾つかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１から３５の一項の方法。
  37. 血清コレステロールを低下させるための医薬の調製における、請求項１から２２の抗原
    結合タンパク質の使用。
  38. 対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防するための医薬
    の調製における、請求項１から２２の抗原結合タンパク質の使用。
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