ES2917423T3

ES2917423T3 - Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9)

Info

Publication number: ES2917423T3
Application number: ES13151375T
Authority: ES
Inventors: Simon Mark Jackson; Nigel Pelham Clinton Walker; Derek Evan Piper; Bei Shan; Wenyan Shen; Joyce Chi Yee Chan; Chadwick Terence King; Randal Robert Ketchem; Christopher Mehlin; Teresa Arazas Carabeo; Qiong Cao
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2028-08-22
Also published as: NO2016015I1; US20120213797A1; FR16C0025I1; US20140357854A1; LU93096I2; CY1117940T1; US20120020976A1; KR20100057070A; MX2020008898A; US20130085265A1; HUS1600036I1; IL252616A0; SI2215124T2; IL204013A; CN113402611A; HRP20160494T4; BRPI0816117B1; JP2016182114A; TW201500376A; US8981064B2

Abstract

Se describen proteínas de unión al antígeno que interactúan con la proproteína convertasina Kexin tipo 9 (PCSK9). Se describen métodos de tratamiento de hipercolesterolemia y otros trastornos mediante la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una proteína de unión al antígeno a PCSK9. Se describen métodos para detectar la cantidad de PCSK9 en una muestra utilizando una proteína de unión a antígeno a PCSK9. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9)

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad respecto a las solicitudes provisionales de los Estados Unidos n.° de serie 60/957.668, presentada el 23 de agosto de 2007, n.° de serie 6l/008.965, presentada el 21 de diciembre de 2007 y n.° de serie 61/010.630, presentada el 9 de enero de 2008.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que se unen a la proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) y a métodos para usar y preparar las proteínas de unión a antígeno.

Antecedentes de varias realizaciones

La proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) es una serina proteasa implicada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) (Horton et al., 2007; Seidah y Prat, 2007). Los experimentos in vitro han mostrado que la adición de PCSK9 a células HepG2 disminuye los niveles de LDLR de la superficie celular (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004). Los experimentos con ratones han mostrado que el incremento en los niveles de proteína PCSK9 disminuye los niveles de proteína LDLR en el hígado (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004), mientras los ratones con PCSK9 inactivada tienen niveles incrementados de LDLR en el hígado (Rashid et al., 2005). Además, se han identificado varias mutaciones en PCSK9 humana que resultan bien en niveles incrementados o disminuidos de LDL plasmático (Kotowski et al., 2006; Zhao et al., 2006). Se ha mostrado que PCSK9 interacciona directamente con la proteína LDLR, experimentando endocitosis junto al LDLR, y con co-inmunofluorescencia con el LDLR a lo largo de la ruta endosomal (Lagace et al., 2006). No se ha observado la degradación del LDLR por PCSK9 y es incierto el mecanismo mediante el cual disminuye los niveles extracelulares de proteína LDLR.

PCSK9 es una prohormona-proproteína convertasa en la familia de la subtilisina (S8) de serina proteasas (Seidah et al., 2003). Los seres humanos tienen nueve prohormona-proproteína convertasas que pueden dividirse entre las subfamilias S8A y S8B (Rawlings et al., 2006). La furina, PC1/PC3, PC2, PACE4, PC4, PC5/PC6 y PC7/PC8/LPC/SPC7 se clasifican en la subfamilia S8B. Las estructuras cristalinas y RMN de los diferentes dominios de furina y PCI de ratón revelan pro-dominios y dominios catalíticos semejantes a subtilisina, y un dominio P directamente C-terminal respecto al dominio catalítico (Henrich et al., 2003; Tangrea et al., 2002). Tomando como base la similitud en la secuencia de aminoácidos en esta subfamilia, se predice que los siete miembros tienen estructuras similares (Henrich et al., 2005). SKI-1/S1P y PCSK9 se clasifican en la subfamilia S8A. Las comparaciones de secuencias con estas proteínas también sugieren la presencia de pro-dominios y dominios catalíticos semejantes a subtilisina (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al., 1999). En estas proteínas, la secuencia de aminoácidos C-terminal respecto al dominio catalítico es más variable y no sugiere la presencia de un dominio P.

Las prohormona-proproteína convertasas se expresan como zimógenos y maduran a lo largo de un proceso con múltiples etapas. La función del pro-dominio en este proceso es doble. El pro-dominio actúa en primer lugar como una chaperona y se requiere para el plegamiento apropiado del dominio catalítico (Ikemura et al., 1987). Una vez se pliega el dominio catalítico, se produce la autocatálisis entre el pro-dominio y el dominio catalítico. Después de esta reacción de escisión inicial, el pro-dominio permanece unido al dominio catalítico donde actúa como un inhibidor de la actividad catalítica (Fu et al., 2000). Cuando las condiciones son correctas, la maduración continúa con un segundo evento autocatalítico en un sitio en el pro-dominio (Anderson et al., 1997). Después de que ocurre este segundo evento de escisión, el pro-dominio y el dominio catalítico se disocian, dando lugar a una proteasa activa.

La autocatálisis del zimógeno de PCSK9 ocurre entre Gln152 y Ser153 (VFAQ/SIP) (Naureckiene et al., 2003), y se ha mostrado que se requiere para su secreción de las células (Seidah et al., 2003). No se ha observado un segundo evento autocatalítico en un sitio en el pro-dominio de PCSK9. La PCSK9 purificada está compuesta por dos especies que pueden separarse por SDS-PAGE no reductora; el pro-dominio a 17 Kd, y los dominios catalítico más C-terminal a 65 Kd. PCSK9 no se ha aislado sin su pro-dominio inhibidor, y las medidas de la actividad catalítica de PCSK9 han sido variables (Naureckiene et al., 2003; Seidah et al., 2003).

Grozdanov P.N. et al., Biochemistry and Cell Biology (vol. 84(1), págs. 80-92 (2006) mostraron que PCSK9 se procesa en el RE y que la convertasa madura se secreta en el plasma. Benjannet N. et al. (J. Biol. Chem., vol.

281 (41), págs. 30561-72 (2006)) examinaron PCSK9 con respect a su procesamiento, transporte subcelular y ubicación, así como su capacidad para mejorar la degradación del LDLR.

El documento WO 2008/063382 A2 (MERCK & Co Inc.) desvela cinco anticuerpos específicos de PCSK9 o fragmentos de anticuerpos que inhibieron de forma dependiente de la dosis los efectos de la PCSK9 sobre la captación de LDL.

De modo similar, el documento WO 2009/055783 A2 (SCHERING Corp.) describe varios anticuerpos anti-PCSK9 que fueron capaces de prevenir la interacción entre PCSK9 y LDLR y reducir los niveles de LDL-C en experimentos in vitro e in vivo.

Resumen de varias realizaciones

En la parte posterior de la presente descripción, el uso de la palabra ‘invención’ y/o ‘realización’, y/o la presentación de elementos como opcionales o preferibles no deberían interpretarse de modo que se busque protección más allá del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, la invención comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que se une a PCSK9, que comprende:

A) una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (CDRH) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 de una CDRH1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; (ii) una CDRH2 de una CDRH2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SeQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; (iii) una CDRH3 de una CDRH3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; y (iv) una CDRH de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 4 aminoácidos; B) una o más regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (CDRL) seleccionadas del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 de una CDRL1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; (ii) una CDRL2 de una CDRL2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; (iii) una CDRL3 de una CDRL3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; y (iv) una CDRL de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 4 aminoácidos; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende al menos una CDRH de A) y al menos una CDRL de B). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende al menos dos CDRH de A) y al menos dos CDRL de B). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende dichas CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3. En algunas realizaciones, la CDRH de A) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 seleccionada de la CDRH1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 89; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 seleccionada de la CDRH2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 89; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 seleccionada de la CDRH3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 89; y (iv) una CDRH de (i), (ii), y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos. Además, la CDRL de B) se selecciona de al menos una del grupo que consiste en: (i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 seleccionada de la CDRL1 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32; (ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 seleccionada de la CDRL2 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32; (iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 seleccionada de la CDRL3 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos de no más de 2 aminoácidos; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91, y/o una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En algunas realizaciones, la VH tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91, y/o la VL tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En algunas realizaciones, la VH se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91, y/o la VL se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que se une específicamente a un epítopo al que se une cualquiera de las ABP descritas en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que se une a PCSK9, en la que la proteína de unión a antígeno comprende: A) una o más CDR de cadena pesada (CDRH) seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRH1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; (ii) una CDRH2 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRH2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; y (iii) una CDRH3 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRH3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; B) una o más CDR de cadena ligera (CDRL) seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRL1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; (ii) una CDRL2 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRL2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; y (iii) una CDRL3 con al menos 80 % de identidad de secuencia con una CDRL3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende: A) una o más CDRH seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRH1 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRH1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; (ii) una CDRH2 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRH2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; y (iii) una CDRH3 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRH3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91; B) una o más CDRL seleccionadas de al menos una del grupo que consiste en: (i) una CDRL1 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRL1 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; (ii) una CDRL2 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRL2 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; y (iii) una CDRL3 con al menos 90 % de identidad de secuencia con una CDRL3 en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28; o C) una o más CDRH de cadena pesada de A) y una o más CDRL de cadena ligera de B).

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 42, 7, 13, 32 y 28, y alguna combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo al que se une al menos una de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada comprende además una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: 69, 85, 87, 89, 91, y alguna combinación de estas. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de anticuerpo de estos. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un fragmento divalente, o una molécula de anticuerpo de cadena única. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es del tipo IgG4 o IgG2. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada se acopla a un grupo marcador. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada compite por la unión a PCSK9 con una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de anticuerpo de este. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un fragmento divalente, o una molécula de anticuerpo de cadena única. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada se acopla a un grupo marcador. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada la proteína de unión a antígeno disminuye una cantidad de LDL presente en un sujeto cuando se administra al sujeto. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada disminuye una cantidad de colesterol sérico presente en un sujeto cuando se administra al sujeto. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno aislada incrementa una cantidad de LDLR presente en un sujeto cuando se administra al sujeto.

En algunos aspectos, la invención comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, la invención comprende una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que compite por la unión a PCSK9 con una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a antígeno según se describe en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión a antígeno descrita en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno que se une selectivamente a PCSK9, en el que la proteína de unión a antígeno se une a PCSK9 con una Kd que es menor de 100 pM.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el incremento del nivel de proteína LDLR en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR.

En algunos aspectos, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende una ABP como se describe en la presente memoria y un agente que eleva la disponibilidad de los niveles de proteína LDLR. En algunas realizaciones, el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende estatina. En algunas realizaciones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de estas. En algún aspecto, la invención comprende un método para preparar la proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, que comprende la etapa de preparar dicha proteína de unión a antígeno a partir de una célula hospedadora que secreta dicha proteína de unión a antígeno.

En algún aspecto, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente activo adicional. En algunas realizaciones, dicho agente activo adicional se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, radionúclido, una toxina, o un terapéutico y un grupo quimioterapéutico.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con un nivel elevado de colesterol sérico en un paciente. El método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, la afección es hipercolesterolemia.

En algún aspecto, la invención comprende una proteína de unión a antígeno que se une a PCSK9 con una Kd que es menor de 100 pM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une con una Kd que es menor de 10 pM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une con una Kd que es menor de 5 pM.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada descrita en la presente memoria simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas realizaciones, el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende una estatina. En algunas realizaciones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de estas.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para la disminución del nivel de colesterol sérico en un sujeto. El método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se describe en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para la disminución de los niveles de colesterol sérico en un sujeto que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada, como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas realizaciones, el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende una estatina. En algunas realizaciones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de estas.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en un sujeto mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada como se proporciona en la presente memoria.

En algunos aspectos, la invención comprende un método para el incremento de los niveles de proteína LDLR en un sujeto mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de al menos una proteína de unión a antígeno aislada, como se describe en la presente memoria, simultáneamente o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR. En algunas realizaciones, el agente que eleva la disponibilidad de los niveles de proteína LDLR comprende una estatina. En algunas realizaciones, la estatina se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, y alguna combinación de estas.

En algunos aspectos, la invención comprende un anticuerpo neutralizante que se une a PCSK9 y reduce un efecto de disminución del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) de PCSK9 en LDLR. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a PCSK9. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a PCSK9 que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 3.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno no es LDLR o un fragmento de este (tal como EGFa). En algunos aspectos, la invención comprende un anticuerpo neutralizante aislado, en el que cuando el anticuerpo se une a PCSK9, el anticuerpo está posicionado a 8 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, E593, S465, G466, P467, A473, 1474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, y H597 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo está posicionado 5 angstroms o menos de al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, y E593 de SEQ ID NO: 3.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada. La proteína de unión a antígeno comprende: A) una CDRH1 de la secuencia de CDRH1 en SEQ ID NO: 89, una CDRH2 de la secuencia de CDRH2 en SEQ ID NO: 89, y una CDRH3 de la secuencia de CDRH3 en SEQ ID NO: 89, y B) una CDRL1 de la secuencia de CDRL1 en SEQ ID NO: 32, una CDRL2 de la secuencia de CDRL2 en SEQ ID NO: 32, y una CDRL3 de la secuencia de CDRL3 en SEQ ID NO: 32.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno aislada que se une a una proteína PCSK9 de SEQ ID NO: 1, en el que la unión entre dicha proteína de unión a antígeno aislada y una proteína PCSK9 variante es menos del 50 % de la unión entre la proteína de unión a antígeno aislada y la proteína PCSK9 de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 303. En algunas realizaciones, la proteína PCSK9 variante comprende al menos una mutación de un residuo en una posición seleccionada del grupo que consiste en o comprende 439, 513, 538, 539, 582, 519, 521 y 554, como se muestra en SEQ ID nO: 1. En algunas realizaciones, la al menos una mutación se selecciona del grupo que comprende o consiste en R439E, E513R, V538R, E539R y E582R. En algunas realizaciones, la al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en R519e, H521R y Q554R.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno que se une a una proteína PCSK-9 de SEQ ID NO: 303 de una primera manera y que se une a una variante de PCSK9 de una segunda manera. La variante de PCSK9 tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que comprende o consiste en: 439, 513, 538, 539, 519, 521 y 554 de SEQ ID NO: 303 y/o SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la primera manera comprende una primera CE50, una primera Bmax, o una primera CE50 y una primera Bmax. En algunas realizaciones, la segunda manera comprende una segunda CE50, una segunda Bmax, o una segunda CE50 y una segunda Bmax. El valor para la primera manera es diferente del valor para la segunda manera. En algunas realizaciones, la primera manera comprende una primera CE50, en la que la segunda manera implica una segunda CE50, y en la que la mutación puntual se selecciona del grupo que consiste en o comprende: R439E, E513R, V538R, E539R y E582R. En algunas realizaciones, la primera CE50 es al menos 20 % diferente de la segunda CE50. En algunas realizaciones, la primera CE50 es al menos 50 % diferente de la segunda CE50. En algunas realizaciones, la segunda CE50 es un valor numérico mayor que la primera CE50. En algunas realizaciones, la primera CE50 se determina por un ensayo de unión a perla múltiple. En algunas realizaciones, la segunda CE50 es mayor de 1 um. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno neutralizante. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno neutralizante no competitiva. En algunas realizaciones, la primera manera comprende una primera Bmax y la segunda manera comprende una segunda Bmax que es diferente de la primera Bmax. La variante de PCSK9 tiene al menos una mutación puntual seleccionada del grupo que consiste en o comprende: R519E, H521R y Q554R. En algunas realizaciones, la segunda Bmax es aproximadamente 10 % de la primera Bmax. En algunas realizaciones, la primera Bmax es al menos 20 % diferente de la segunda Bmax. En algunas realizaciones, la primera Bmax es al menos 50 % diferente de la segunda Bmax.

En algunos aspectos, la invención comprende una proteína de unión a antígeno neutralizante no competitiva aislada que se une a una proteína PCSK9 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en el que la proteína de unión a antígeno neutralizante disminuye el efecto de disminución de LDLR de PCSK9 en LDLR.

En algunos aspectos, la invención comprende una composición que comprende una proteína PCSK9 cristalizada y una proteína de unión a antígeno que se une a PCSK9. La composición comprende la proteína PCSK9 cristalizada es tal que la estructura tridimensional de la proteína PCSK9 puede determinarse hasta una resolución de aproximadamente 2,2 angstroms o mejor. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de este.

En algunos aspectos, la invención comprende el uso de una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para la disminución del colesterol sérico.

En algunos aspectos, la invención comprende el uso de una proteína de unión a antígeno como se describe en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1A representa una secuencia de aminoácidos de la forma madura de la PCSK9 con el pro-dominio subrayado.

Las FIG. ¹B¹-¹B⁴representan secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de PCSK9 con el pro-dominio subrayado y la secuencia señal en negrita.

Las FIG. 2A-2D son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas ligeras de varias proteínas de unión a antígeno. La FIG. 2C continúa la secuencia iniciada en la FIG. 2A. La FIG. 2D continúa la secuencia iniciada en la FIG. 2B.

Las FIG. 3A-3D son tablas de comparación de secuencias de varias cadenas pesadas de varias proteínas de unión a antígeno. La FIG. 3C continúa la secuencia iniciada en la FIG. 3A. La FIG. 3D continúa la secuencia iniciada en la FIG. 3B.

Las FIG. 3K, 3Y, 3BB, 3DD, 3HH y 3AAA representan las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico para los dominios variables de algunas realizaciones de las proteínas de unión a antígeno.

La FIG. 3KK representa las secuencias de aminoácidos para varios dominios constantes.

Las FIG. 3GGG-3JJJ son tablas de secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de otra realización de las proteínas de unión a antígeno.

La FIG. 4A es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 humana.

La FIG. 4B es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 humana.

La FIG. 4C es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de cynomolgus.

La FIG. 4D es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de cynomolgus.

La FIG. 4E es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de ratón.

La FIG. 4F es una curva de unión de una proteína de unión a antígeno a PCSK9 de ratón.

La FIG. 5A representa los resultados de un experimento de SDS PAGE que implica PCSK9 y varias proteínas de unión a antígeno que demuestra la pureza relativa y la concentración de las proteínas.

La FIG. 5B y 5C representan gráficos de ensayos en disolución en equilibrio biacore para 21B12.

La FIG. 5D representa el gráfico de las cinéticas de un ensayo de captura biacore.

La FIG. 5E representa un gráfico de barras que representa los resultados de agrupación en clases ("binning") para tres ABP.

La FIG. 7A es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG2 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.

La FIG. 7B es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 31H4 IgG4 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.

La FIG. 7C es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG2 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.

La FIG. 7D es una curva de inhibición de la proteína de unión a antígeno 21B12 IgG4 en el ensayo de captación celular de LDL que muestra el efecto de la ABP para reducir los efectos bloqueantes de la captación de LDL de PCSK9.

La FIG. 8A es un gráfico que representa la capacidad de disminuir el colesterol sérico en ratones de ABP 31H4, cambios respecto a los ratones tratados con IgG control (* p<0,01).

La FIG. 8B es un gráfico que representa la capacidad de disminuir el colesterol sérico en ratones de ABP 31H4, cambios respecto a tiempo = cero horas (# p, 0,05).

La FIG. 8C es un gráfico que representa el efecto de ABP 31H4 en los niveles de colesterol HDL en ratones C57B1/6 (* p<0,01).

La FIG. 8D es un gráfico que representa el efecto de ABP 31H4 en los niveles de colesterol HDL en ratones C57B1/6 (# p<0,05).

La FIG. 9 representa un análisis por transferencia western de la capacidad de ABP 31H4 de aumentar la cantidad de proteína LDLR hepática presente después de varios puntos de tiempo.

La FIG. 10A es un gráfico que representa la capacidad de una proteína de unión a antígeno 31H4 para disminuir el colesterol sérico total en ratones de tipo salvaje, relativa.

La FIG. 10B es un gráfico que representa la capacidad de una proteína de unión a antígeno 31H4 para disminuir HDL en ratones de tipo salvaje.

La FIG. 10C es un gráfico que representa la capacidad para disminuir el colesterol sérico de varias proteínas de unión a antígeno 31H4 y 16F12.

La FIG. 11A representa un protocolo de inyección para ensayar la duración y capacidad de proteínas de unión a antígeno para disminuir el colesterol sérico.

La FIG. 11B es un gráfico que representa los resultados del protocolo en la FIG. 11 A.

La FIG. 12A representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 21B12 en células HepG2.

La FIG. 12B representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 31H4 en células HepG2.

La FIG. 12C representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 25A7.1, un anticuerpo no neutralizante, (a diferencia de "25A7", un anticuerpo neutralizante) en células HepG2.

La FIG. 12D representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 21B12 en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.

La FIG. 12E representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 31H4 en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.

La FIG. 12F representa los niveles de LDLR en respuesta a la combinación de una estatina y ABP 25A7.1, un anticuerpo no neutralizante, (a diferencia de "25A7", un anticuerpo neutralizante) en células HepG2 que sobreexpresan PCSK9.

La FIG. 13A representa las diferentes secuencias de aminoácidos de cadena ligera de varias ABP para PCSK9. Los puntos (.) indican no aminoácido.

La FIG. 13C representa las diferentes secuencias de aminoácidos de cadena pesada de varias ABP para PCSK9. Los puntos (.) indican no aminoácido.

La FIG. 14A es un gráfico que representa la capacidad para disminuir LDL in vivo de varias ABP (a 10 mg/kg).

La FIG. 14B es un gráfico que representa la capacidad para disminuir LDL in vivo de varias ABP (a 30 mg/kg).

La FIG. 21A es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.

La FIG. 21B es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.

La FIG. 21C es una representación de la estructura de PCSK9 y 31A4.

La FIG. 21D es una representación del modelo estructural de PCSK9 de longitud completa y 31A4.

La FIG. 22 es un conjunto de secuencias de ABP que identifican varias diferencias entre las secuencias de ABP humana y las secuencias de ABP que se produjeron en E. coli y se usaron para las estructuras de cristal.

La FIG. 23 es una tabla de los varios resultados de agrupación en clases.

La FIG. 23A es una primera parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 23B es una segunda parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases.

La FIG. 23C es una tercera parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 23D es una cuarta parte de una tabla que representa los varios resultados de agrupación en clases. La FIG. 24A es una representación de una transferencia western en condiciones no reductoras.

La FIG. 24B es una representación de una transferencia western en condiciones reductoras.

La FIG. 25A es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 25B es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 25C es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 25D es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 25E es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 25F es una representación de la cobertura de superficie de PCSK9.

La FIG. 26 es una comparación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de PCSK9 y todos los residuos que se mutaron en variantes de PCSK9 para examinar los epítopos de los distintos anticuerpos. La FIG. 27C representa los aciertos de epítopos de 31H4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.

La FIG. 27E representa los aciertos de epítopos de 3C4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con 31H4 y 21B12.

La FIG. 28A es un gráfico que demuestra la capacidad de unión de las varias ABP a varias partes de PCSK9. La FIG. 28B es un gráfico que demuestra la capacidad de unión de las varias ABP a varias partes de PCSK9. La FIG. 28C es un gráfico que compara la capacidad de unión a LDLR de dos ABP.

La FIG. 28D es un gráfico que compara la actividad de captación celular de LDL de dos ABP.

Descripción detallada de determinadas realizaciones ejemplares

En la presente memoria se describen proteínas de unión a antígeno (tales como anticuerpos y fragmentos de unión funcionales de estos) que se unen a PCSK9. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se unen a PCSK9 y evitan que PCSK9 funcione de varias maneras. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se unen a PCSK9 pero no bloquean la capacidad de PCSK9 de interaccionar con LDLR. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno son anticuerpos monoclonales humanos.

Como apreciará un experto en la técnica, el incremento de la cantidad de LDLR disponible para unirse a LDL, a su vez, disminuye la cantidad de LDL sérica en un sujeto, resultando en una reducción en el nivel de colesterol sérico del sujeto. Como tales, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 y las composiciones para tratar a sujetos con niveles elevados de colesterol sérico, que presentan riesgo de niveles elevados de colesterol sérico, o que podrían beneficiarse de una reducción en sus niveles de colesterol sérico. Así, en la presente memoria también se describen varios métodos y técnicas para disminuir, mantener, o prevenir un incremento en el colesterol sérico. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno permite la unión entre PCSK9 y LDLR, pero la proteína de unión a antígeno previene o reduce la actividad adversa de PCSK9 en LDLR.

Por conveniencia, las secciones siguientes resaltan generalmente los distintos significados de los términos usados en la presente memoria. Después de esta discusión, se discuten aspectos generales respecto a las proteínas de unión a antígeno, seguido de ejemplos específicos que demuestran las propiedades de varias realizaciones de las proteínas de unión a antígeno y cómo pueden emplearse.

Definiciones y realizaciones

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención según se reivindica. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a no ser que se afirme específicamente otra cosa. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se afirme otra cosa. Además, el uso de la expresión "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. También, los términos tales como "elemento" o "componente" engloban tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a no ser que se afirme específicamente otra cosa. También, el uso del término "parte" puede incluir parte de un resto o el resto completo.

Los encabezamientos de las secciones usados en la presente memoria son solo para propósitos organizativos y no deben considerarse como limitantes del contenido descrito. Tal y como se utilizan según la presente descripción, debe entenderse que los términos siguientes, a no ser que se indique otra cosa, tienen los significados siguientes:

La expresión "proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9" o "PCSK9" se refiere a un polipéptido como se muestra en SEQ ID NO: 1 y/o 3 o fragmentos de este, así como polipéptidos relacionados, que incluyen, pero no están limitados a, variantes alélicas, variantes de corte y empalme, variantes derivadas, variantes de sustitución, variantes de deleción, y/o variantes de inserción incluyendo la adición de una metionina N-terminal, polipéptidos de fusión, y homólogos interespecie. En determinadas realizaciones, un polipéptido PCSK9 incluye residuos terminales, tales como, pero no limitado a, residuos de secuencia líder, residuos de direccionamiento, residuos de metionina amino terminales, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión. "PCSK9" también se ha referido como FH3, NARC1, HCHOLA3, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9, y convertasa 1 neural regulada por apoptosis. El gen de PCSK9 codifica una proteína proproteína convertasa que pertenece a la subfamilia de proteinasa K de la familia subtilasa secretora. El término "PCSK9" indica tanto la proproteína como el producto generado después de la autocatálisis de la proproteína. Cuando solo se está haciendo referencia al producto autocatalizado (tal como para una proteína de unión a antígeno que se une selectivamente a la PCSK9 escindida), la proteína puede denominarse la PCSK9 "madura", "escindida", "procesada" o "activa". Cuando solo se está haciendo referencia a la forma inactiva, la proteína puede denominarse la forma "inactiva", "pro-forma", o forma "no procesada" de PCSK9. El término PCSK9 tal y como se usa en la presente memoria también incluye alelos naturales, tales como las mutaciones D374Y, S127R y F216L. El término PCSK9 también engloba moléculas de PCSK9 que incorporan modificaciones posteriores a la traducción de la secuencia de aminoácidos de PCSK9, tales como secuencias de PCSK9 que han sido secuencias de PCSK9 glucosiladas, PEGiladas, de las que se ha escindido su secuencia señal, secuencia de PCSK9 de la que se ha escindido su pro dominio del dominio catalítico pero no separado del dominio catalítico (por ejemplo, FIG. 1A y 1B).

La expresión "actividad de PCSK9" incluye cualquier efecto biológico de PCSK9. En algunas realizaciones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de alterar la disponibilidad de LDLR. En algunas realizaciones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de incrementar la cantidad de LDL en un sujeto. En algunas realizaciones, la actividad de PCSK9 incluye la capacidad de PCSK9 de disminuir la cantidad de LDLR que está disponible para unirse a LDL. En algunas realizaciones, "actividad de PCSK9" incluye cualquier actividad biológica que resulta de la señalización de PCSK9.

El término "hipercolesterolemia", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una afección en la que los niveles de colesterol están elevados por encima de un nivel deseado. En algunas realizaciones, esto indica que los niveles de colesterol sérico están elevados. En algunas realizaciones, el nivel deseado tiene en cuenta varios "factores de riesgo" que son conocidos para un experto en la técnica (y se describen o se hace referencia a ellos en la presente memoria).

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye polímeros de nucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de uno de los dos tipos de nucleótidos. Dichas modificaciones incluyen modificaciones en la base tales como derivados bromouridina e inosina, modificaciones en la ribosa tales como 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones en la unión internucleotídica tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos con sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir un marcador, incluyendo un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de estos que no está asociada con todo o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unida a un polinucleótido al que no está unida en la naturaleza. Para los propósitos de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no engloba cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificadoras para hasta diez o incluso hasta veinte proteínas adicionales o partes de estas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas de forma operativa que controlan la expresión de la región codificadora de las secuencias de ácido nucleico enumeradas y/o pueden incluir secuencias de vector.

A no ser que se especifique otra cosa, el extremo izquierdo de cualquier secuencia polinucleotídica monocatenaria analizada en la presente memoria es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias polinucleotídicas bicatenarias se denomina la dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de la transcripción; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena arriba"; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el transcrito de ARN que están en 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena abajo".

La expresión "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar a la expresión y procesamiento de secuencias codificadoras a las que está ligada. La naturaleza de dichas secuencias de control puede depender del organismo hospedador. En realizaciones particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión a ribosomas, y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencia de terminación de la transcripción. Las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias compañeras de fusión.

El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir información codificadora de proteínas en una célula hospedadora.

La expresión "vector de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (conjuntamente con la célula hospedadora) la expresión de una o más regiones codificadoras heterólogas unidas de forma operativa a ella. Una construcción de expresión puede incluir, pero no está limitada a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción y, si están presentes intrones, afectan al corte y empalme del ARN de una región codificadora unida de forma operativa a ella.

Tal y como se usa en la presente memoria, "unido de forma operativa" significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora de proteína está ligada a ella de manera que la expresión de la secuencia codificadora de proteína se consigue en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

La expresión "célula hospedadora" significa una célula que se ha transformado, o que es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y de esta manera expresa un gen de interés. La expresión incluye la descendencia de la célula parental, ya sea o no la descendencia idéntica en morfología o en constitución genética a la célula parental original, siempre que esté presente el gen de interés.

El término "transfección" significa la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. En la técnica son muy conocidas varias técnicas de transfección y se describen en la presente memoria. Véase, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, mencionado anteriormente; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13: 197. Dichas técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas.

El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente respecto a su estado nativo por la introducción de nuevo material genético mediante transfección, transducción u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula mediante integración física en un cromosoma de la célula o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha "transformado de forma estable" cuando el ADN transformante se replica con la división de la célula.

Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, esto es, una proteína producida por una célula natural y no recombinante; o se produce por una célula modificada genéticamente o recombinante, y comprende moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. El término también incluye polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos de un aminoácido natural correspondiente y polímeros. Los términos "polipéptido" y "proteína" engloban específicamente proteínas de unión a antígeno para PCSK9, anticuerpos, o secuencias que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de proteína de unión a antígeno. La expresión "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal, y/o una deleción interna en comparación con la proteína nativa de longitud completa. Dichos fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados comparados con la proteína nativa. En determinadas realizaciones, los fragmentos tienen una longitud de aproximadamente cinco a 500 aminoácidos. Por ejemplo, los fragmentos pueden tener una longitud de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos. Los fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso de un anticuerpo de unión a PCSK9, los fragmentos útiles incluyen pero no están limitados a una región CDR, un dominio variable de una cadena pesada y/o ligera, una parte de una cadena de anticuerpo o solo su región variable incluyendo dos CDR.

La expresión "proteína aislada" a la que se hace referencia significa que una proteína objeto (1) carece de al menos algunas otras proteínas con las que se encontraría normalmente, (2) carece esencialmente de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) está asociada de forma operativa (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza, o (6) no aparece en la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 25 % o al menos aproximadamente 50 % de una muestra dada. El ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de estos, puede codificar dicha proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada carece sustancialmente de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso.

El término "aminoácido" incluye su significado normal en la técnica.

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos se insertan en, delecionan de y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos respecto a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

El término "identidad" se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, según se determina alineando y comparando las secuencias. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula tomando como base el tamaño de la más pequeña de las moléculas que se están comparando. Para estos cálculos, los huecos en los alineamiento (si existen) se abordan preferiblemente por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.), 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.

En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se están comparando se alinean típicamente de una manera que proporciona la mayor concordancia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa informático que puede usarse para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se desea determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para concordancia óptima de sus aminoácidos o nucleótidos respectivos (el "alcance de concordancia", según se determina por el algoritmo). Conjuntamente con el algoritmo se usan una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal media, en la que la "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que se está usando; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada concordancia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. En determinadas realizaciones, el algoritmo también utiliza una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).

Los ejemplos de parámetros que pueden emplearse para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP son los siguientes:

• Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453

• Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, mencionado anteriormente

• Penalización por hueco: 12 (pero sin penalización para huecos terminales)

• Penalización por longitud de hueco: 4

• Umbral de similitud: 0

Determinados esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en la concordancia solo de una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta incluso si no hay una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. De acuerdo con esto, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si se desea para dar lugar a un alineamiento que abarque al menos 50 u otro número de aminoácidos contiguos del polipéptido diana.

Tal y como se usa en la presente memoria, los veinte aminoácidos convencionales (por ejemplo, naturales) y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase, Immunology--A Synthesis (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en la presente memoria, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi terminal, según el uso y convención estándar.

De manera similar, a no ser que se especifique otra cosa, el extremo izquierdo de secuencias polinucleotídicas monocatenarias es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias polinucleotídicas bicatenarias se denomina la dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de la transcripción; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena arriba"; las regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias cadena abajo".

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden englobar residuos de aminoácidos no naturales, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácidos.

Los residuos naturales pueden dividirse en clases tomando como base propiedades comunes de la cadena lateral:

1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutros hidrofílicos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) básicos: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en regiones no homólogas de la molécula.

Cuando se hacen cambios en la proteína de unión a antígeno o la proteína PCSK9, según determinadas realizaciones, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático tomando como base su hidrofobicidad y características de carga, Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

En la técnica se entiende la importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva en una proteína. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía retienen una actividad biológica similar. Cuando se hacen cambios tomando como base el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en ±2. En determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están en ±1, y en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están en ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente tomando como base la hidrofilicidad, particularmente cuando se pretende usar la proteína o péptido biológicamente funcional creado de esta manera en realizaciones inmunológicas, como en el caso presente. En determinadas realizaciones, la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Se han asignado los valores de hidroflicidad siguientes a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Cuando se hacen cambios tomando como base valores de hidrofilicidad similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están en ±2, en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están en ±1, y en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están en ±0,5. También se pueden identificar epítopos a partir de las secuencias primarias de aminoácidos tomando como base la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan "regiones del núcleo epitópico".

Las sustituciones de aminoácidos ejemplares se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

El término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química distinta de una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos (o ácidos nucleicos). En determinadas realizaciones, los derivados comprenden modificaciones covalentes, incluyendo, pero no limitado a, unión química con polímeros, lípidos, u otros restos orgánicos o inorgánicos. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno químicamente modificada puede tener una mayor semivida circulante que una proteína de unión a antígeno que no está químicamente modificada. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno químicamente modificada puede tener una capacidad de direccionamiento mejorada para células, tejidos y/u órganos deseados. En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno derivada está modificada covalentemente para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua, incluyendo, pero no limitados a, polietilenglicol, polioxietilenglicol, o polipropilenglicol. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.°: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno derivada comprende uno o más polímeros, incluyendo, pero no limitado a, monometoxi-polietilen glicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un co-polímero óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros.

En determinadas realizaciones, un derivado se modifica covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG). En determinadas realizaciones, se unen uno o más polímeros solubles en agua a una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un derivado. En determinadas realizaciones, se unen aleatoriamente uno o más polímeros solubles en agua a una o más cadenas laterales de un derivado. En determinadas realizaciones, se usa PEG para mejorar la capacidad terapéutica para una proteína de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, se usa PEG para mejorar la capacidad terapéutica para un anticuerpo humanizado. Algunos de estos métodos se discuten, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.133.426.

Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS, pág. 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Dichos compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero que tiene una o más uniones peptídicas reemplazadas opcionalmente por una unión seleccionada de: --CH²NH--, --CH²S--, --CH²-CH²--, --CH=CH-(cis y trans), --COCH²--, --CH(OH)CH²-- y --CH²SO--, por métodos muy conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en determinadas realizaciones para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61: 387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

El término "natural" tal y como se usa a lo largo de la memoria descriptiva en conexión con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedadoras, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza o a una forma de los materiales que se encuentra en la naturaleza.

Una "proteína de unión a antígeno" ("ABP") tal y como se usa en la presente memoria significa cualquier proteína que se une a un antígeno diana especificado. En la presente solicitud, el antígeno diana especificado es la proteína PCSK9 o fragmento de esta. "Proteína de unión a antígeno" incluye pero no está limitado a anticuerpos y partes de unión de estos, tales como fragmentos inmunológicamente funcionales. Los pepticuerpos son otro ejemplo de proteínas de unión a antígeno. La expresión "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno con cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), tal y como se usa en la presente memoria, es una especie de proteína de unión a antígeno que comprende una parte (independientemente de cómo se obtiene o sintetiza esa parte) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que todavía es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Dichos fragmentos son biológicamente activos ya que se unen al antígeno diana y pueden competir con otras proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, para la unión a un epítopo dado. En algunas realizaciones, los fragmentos son fragmentos neutralizantes. En un aspecto, dicho fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas realizaciones comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o parte de esta. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse por escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero no están limitados a, Fab, un fragmento divalente (dominio variable de cadena pesada en el mismo polipéptido que un dominio variable de cadena ligera, conectado mediante un conector peptídico corto que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena), Fab', F(ab')², Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena única, y pueden derivar de cualquier fuente de mamífero, incluyendo, pero no limitado a, ser humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una parte funcional de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria, por ejemplo, una o más CDR, pueda unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una vida media sérica prolongada. Como apreciará un experto en la técnica, una proteína de unión a antígeno puede incluir componentes no proteicos. En algunas secciones de la presente descripción, los ejemplos de ABP se describen en la presente memoria en términos de "número/letra/número" (por ejemplo, 25A7). En estos casos, el nombre exacto indica un anticuerpo específico. Esto es, una ABP denominada 25A7 no es necesariamente la misma que un anticuerpo denominado 25A7.1, (a no ser que se enseñe explícitamente como el mismo en la memoria descriptiva, por ejemplo, 25A7 y 25A7.3). Como apreciará un experto en la técnica, en algunas realizaciones, LDLR no es una proteína de unión a antígeno. En algunas realizaciones, las subsecciones de unión de LDLR no son proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, EGFa. En algunas realizaciones, otras moléculas a través de las cuales PCSK9 produce señalización in vivo no son proteínas de unión a antígeno. Dichas realizaciones se identificarán explícitamente como tales.

Determinadas proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria son anticuerpos o derivan de anticuerpos. En determinadas realizaciones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces denominados en la presente memoria "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (algunas veces denominadas en la presente memoria "conjugados de anticuerpos) y fragmentos de estos, respectivamente. En algunas realizaciones, la ABP comprende o consiste en avímeros (péptido unido fuertemente). Estas distintas proteínas de unión a antígeno se describen adicionalmente en la presente memoria.

Una región "Fc" comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch1 y Ch2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y el Ch1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab'" comprende una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio C^h1 y también la región entre los dominios C^h1 y C^h2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula (Fab')². Un "fragmento F(ab')²" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')²está compuesto así por dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos por un enlace disulfuro entre dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables tanto de cadenas pesadas como ligeras, pero carece de regiones constantes.

Los "anticuerpos de cadena única" son moléculas Fv en las que las regiones variables de cadena pesada y ligera se han conectado mediante un conector flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos de cadena única se discuten con detalle en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional n.° WO 88/01649 y Patentes de los Estados Unidos n.° 4.946.778 y n.° 5.260.203.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V^hse unen covalentemente con un conector peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden estar dirigidas al mismo antígeno o a antígenos diferentes.

Una "proteína de unión a antígeno bivalente" o "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas de unión a antígeno bivalentes y anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos, véase, posteriormente. Un anticuerpo bivalente distinto de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional", en determinadas realizaciones, se entiende típicamente que tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos.

Una "proteína de unión a antígeno multiespecífica" o "anticuerpo multiespecífico" es uno que está dirigido a más de un antígeno o epítopo.

Una proteína de unión a antígeno o anticuerpo "biespecífico", "específico dual" o "bifuncional" es una proteína de unión a antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Las proteínas de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo proteína de unión a antígeno multiespecífico y pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véanse, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de unión de una proteína de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma diana proteica o en diferentes dianas proteicas.

Una proteína de unión a antígeno se dice que "se une específicamente" a su antígeno diana cuando la constante de disociación (Kd) es < 10-7 M. La ABP se une específicamente a antígeno con "alta afinidad" cuando la Kd es < 5 x 10-9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la Kd es < 5 x 10-10 M. En una realización, la ABP tiene una Kd de < 10-9 M. En una realización, la velocidad de disociación es < 1 x 10-5. En otras realizaciones, las ABP se unirán a PCSK9 humana con una Kd de entre aproximadamente 10-9 M y 10-13 M, y en otra realización más las ABP se unirán con una Kd < 5 x 10-10. Como apreciará un experto en la técnica, en algunas realizaciones, cualquiera o todos los fragmentos de unión a antígeno pueden unirse específicamente a PCSK9.

Una proteína de unión a antígeno es "selectiva" cuando se une a una diana más fuertemente de lo que se une a una segunda diana.

"Región de unión a antígeno" significa una proteína, o una parte de una proteína, que se une específicamente a un antígeno especificado (por ejemplo, un parátopo). Por ejemplo, esa parte de una proteína de unión a antígeno que contiene los residuos de aminoácidos que interaccionan con un antígeno y confieren a la proteína de unión a antígeno su especificidad y afinidad para el antígeno se denomina "región de unión a antígeno". Una región de unión a antígeno incluye típicamente una o más "regiones de unión complementarias" ("CDR"). Determinadas regiones de unión a antígeno también incluyen una o más regiones "marco". Una "CDR" es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de la unión a antígeno. Las regiones "marco" pueden ayudar a mantener la conformación apropiada de las CDR para estimular la unión entre la región de unión a antígeno y un antígeno. Estructuralmente, las regiones marco pueden estar localizadas en anticuerpos entre las CDR. Los ejemplos de regiones marco y CDR se muestran en las FIG. 2A-3D y 3GGG-3JJJ.

En determinados aspectos, se proporcionan proteínas de unión a antígeno recombinantes que se unen a PCSK9, por ejemplo, PCSK9 humana. En este contexto, una "proteína de unión a antígeno recombinante" es una proteína preparada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente memoria. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes son muy conocidos en la técnica.

El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de esta, que puede competir con el anticuerpo intacto para la unión específica al antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos. Un "anticuerpo" es una especie de una proteína de unión a antígeno. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas tales como anticuerpos que aparecen naturalmente en camélidos que pueden comprender solo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivar solamente de una única fuente, o pueden ser "quiméricos", esto es, diferentes partes del anticuerpo pueden derivar de dos anticuerpos diferentes como se describe adicionalmente más adelante. Las proteínas de unión a antígeno, anticuerpos, o fragmentos de unión pueden producirse en hibridomas, por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. A no ser que se indique otra cosa, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de estos, ejemplos de los cuales se describen más adelante. Además, a no ser que se excluya explícitamente, los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces denominados en la presente memoria "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (algunas veces denominadas en la presente memoria "conjugados de anticuerpos"),¡ y fragmentos de estos, respectivamente. En algunas realizaciones, el término también engloba pepticuerpos.

Las unidades estructurales de anticuerpos naturales comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de dichos tetrámeros está compuesto típicamente de dos parejas idénticas de cadenas polipeptídicas, teniendo cada pareja una cadena "ligera" de longitud completa (en determinadas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en determinadas realizaciones, aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena incluye típicamente una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi terminal de cada cadena define típicamente una región constante que puede ser responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero no limitado a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases incluyendo, pero no limitado a, IgM1 e IgM2. IgA se subdivide de manera similar en subclases incluyendo, pero no limitado a, IgA1 e IgA2. En las cadenas ligera y pesada de longitud completa, típicamente, las regiones variable y constante se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada pareja de cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno.

Las regiones variables presentan típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja típicamente están alineadas por las regiones marco, que pueden permitir la unión a un epítopo específico. Desde el N terminal hasta el C terminal, tanto las regiones variables de cadena ligera como pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es típicamente según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989).

En determinadas realizaciones, una cadena pesada de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En determinadas realizaciones, una cadena ligera de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena pesada de anticuerpo. En determinadas realizaciones, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena ligera de anticuerpo. En determinadas realizaciones, una región de unión de anticuerpo se une a un antígeno en ausencia de una cadena pesada de anticuerpo. En determinadas realizaciones, una región variable individual se une específicamente a un antígeno en ausencia de otras regiones variables.

En determinadas realizaciones, la delineación definitiva de una CDR y la identificación de residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo se consigue resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-ligando. En determinadas realizaciones, esto puede conseguirse por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas para los expertos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X. En determinadas realizaciones, pueden emplearse varios métodos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. Los ejemplos de dichos métodos incluyen, pero no están limitados a, la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición AbM y la definición de contacto.

La definición de Kabat es un estándar para la numeración de los residuos en un anticuerpo y se usa típicamente para identificar regiones CDR. Véase, por ejemplo, Johnson y Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). La definición de Chothia es similar a la definición de Kabat, pero la definición de Chothia tiene en cuenta posiciones de determinadas regiones en bucle estructurales. Véase, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989). La definición AbM usa una cadena integrada de programas informáticos producidos por el Oxford Molecular Group que modela la estructura de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); “AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies”, Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd. La definición AbM modela la estructura terciaria de un anticuerpo a partir de la secuencia primaria usando una combinación de bases de datos de conocimiento y métodos desde el principio, tales como los descritos por Samudrala et al., “Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach”, en PROTEINS, Structure, Function and Genetics Supl., 3:194-198 (1999). La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras de cristal de complejo disponibles. Véase, por ejemplo, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).

Por convención, las regiones CDR en la cadena pesada se denominan como H1, H2 y H3 y se numeran secuencialmente en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxi. Las regiones CDR en la cadena ligera se denominan típicamente L1, L2 y L3 y se numeran secuencialmente en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxi.

La expresión "cadena ligera" incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de esta que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, Vl, y un dominio de región constante, Cl. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de esta que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, V^h, y tres dominios de región constante, C^h1, C^h2 y C^h3. El dominio Vh está en el extremo amino del polipéptido y los dominios Ch están en el extremo carboxilo, estando CH3 lo más cerca del extremo carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluyendo IgG (incluyendo subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluyendo los subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional típicamente es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos parejas diferentes de cadena pesada/ligera y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitado a, fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).

Algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que solo tienen una única cadena pesada.

Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta típicamente por varios "dominios de inmunoglobulina", consistiendo cada uno en aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y teniendo un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que están compuestos los polipéptidos de anticuerpo. En los seres humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región C de cadena pesada comprende típicamente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen tres dominios de región C conocidos como C^h1, C^h2 y C^h3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En determinadas realizaciones de la presente invención, un anticuerpo anti-PCSK9 es del subtipo IgG2 o IgG4.

La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere a una parte de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que incluye típicamente aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos amino terminales en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos amino terminales en la cadena ligera. En determinadas realizaciones, las regiones variables de diferentes anticuerpos se diferencian extensamente en la secuencia de aminoácidos incluso entre anticuerpos de la misma especie. La región variable de un anticuerpo determina típicamente la especificidad de un anticuerpo particular por su diana.

La expresión "proteína de unión a antígeno neutralizante" o "anticuerpo neutralizante" se refiere a una proteína de unión a antígeno o anticuerpo, respectivamente, que se une a un ligando y evita o reduce el efecto biológico de ese ligando. En algunas realizaciones, la expresión puede indicar una proteína de unión a antígeno que evita que la proteína a la que está unida realice una función biológica. En algunas realizaciones, la capacidad neutralizante se describe en términos de un valor CI⁵⁰o CE⁵⁰.

El término "diana" se refiere a una molécula o una parte de una molécula con la que se puede unir una proteína de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, una diana puede tener uno o más epítopos. En determinadas realizaciones, una diana es un antígeno. El uso de "antígeno" en la expresión "proteína de unión a antígeno" indica simplemente que a la secuencia de la proteína que comprende el antígeno se puede unir un anticuerpo. En este contexto, no se requiere que la proteína sea extraña o que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria.

El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno neutralizantes o anticuerpos neutralizantes) que compiten por el mismo epítopo significa competición entre proteínas de unión a antígeno según se determina por un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de este) que se está ensayando evita o inhibe (por ejemplo, reduce) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia (por ejemplo, un ligando o un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, PCSK9 o un fragmento de esta). Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una proteína de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) en fase sólida directo o indirecto, inmunoensayo enzimático (EIA) en fase sólida directo o indirecto, ensayo de competición en sándwich (por ejemplo, véase, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA en fase sólida directo biotinaavidina (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo en sándwich marcado directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA en fase sólida con marcaje directo usando marcaje con 1-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA con biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA marcado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, una proteína de unión a antígeno de ensayo no marcada y una proteína de unión a antígeno de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcaje unido a la superficie sólida o células en presencia de la proteína de unión a antígeno de ensayo. Habitualmente, la proteína de unión a antígeno de ensayo está presente en exceso. Las proteínas de unión a antígeno identificadas por el ensayo de competición (proteínas de unión a antígeno competidoras) incluyen proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo al que se une la proteína de unión a antígeno de referencia como para que ocurra impedimento estérico. Los detalles adicionales respecto a los métodos para determinar unión competitiva se proporcionan en los ejemplos de la presente memoria. Habitualmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá (por ejemplo, reducirá) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común al menos un 40-45 %, 45-50 %, 50-55 %, 55 60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % o 75 % o más. En algunos casos, la unión se inhibe al menos un 80-85 %, 85 90 %, 90-95 %, 95-97 % o 97 % o más.

El término "antígeno" se refiere a una molécula o parte de una molécula a la que se puede unir un agente de unión selectivo, tal como una proteína de unión a antígeno (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de este). En algunas realizaciones, el antígeno se puede usar en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a ese antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos que pueden interaccionar con diferentes proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante al que se pueda unir una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo o a un receptor de linfocitos T. Un epítopo es una región de un antígeno a la que se une una proteína de unión a antígeno dirigida a ese antígeno y, cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que entrán en contacto directamente con la proteína de unión a antígeno. Lo más frecuentemente, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos pueden residir en otras clases de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características de estructura tridimensional específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Tal y como se usa en la presente memoria, "sustancialmente puro" significa que la especie de molécula descrita es la especie predominante presente, esto es, en una base molar es más abundante que cualesquiera otras especies individuales en la misma mezcla. En determinadas realizaciones, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos 50 % (en una base molar) de todas las especies de macromoléculas presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de todas las especies de macromoléculas presentes en la composición. En otras realizaciones, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial en la que las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales y así la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.

El término "agente" se usa en la presente memoria para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto que consiste en materiales biológicos.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "marcaje" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotina que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En determinadas realizaciones, el marcaje o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen y pueden usarse varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcajes para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcajes fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos a base de lantánidos), marcajes enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, pgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscente, grupos biotinilo, epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En determinadas realizaciones, los marcajes se unen por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

La expresión "muestra biológica", tal y como se usa en la presente memoria, incluye, pero no está limitado a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o ser vivo con anterioridad. Dichos seres vivos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen, pero no están limitadas a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, ganglios linfáticos y piel.

La expresión "composición de agente farmacéutico" (o agente o fármaco) tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto químico, composición, agente o fármaco capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. No requiere necesariamente más de un tipo de ingrediente.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una proteína de unión a antígeno de PCSK9 que se ha determinado que produce una respuesta terapéutica en un mamífero. Dichas cantidades terapéuticamente eficaces son averiguadas fácilmente por un experto en la técnica.

El término "modulador", tal y como se usa en la presente memoria, es un compuesto que cambia o altera la actividad o función de una molécula. Por ejemplo, un modulador puede causar un incremento o disminución en la magnitud de una determinada actividad o función de una molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En determinadas realizaciones, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Algunas actividades y funciones ejemplares de una molécula incluyen, pero no están limitadas a, afinidad de unión, actividad enzimática y transducción de la señal. Algunos inhibidores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.660.843 (correspondiente a la Solicitud PCT n.° WO 01/83525).

Los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente e incluyen sujetos animales humanos y no humanos así como aquellos con trastornos formalmente diagnosticados, aquellos sin trastornos formalmente diagnosticados, aquellos que reciben atención médica, aquellos que presentan riesgo de desarrollar los trastornos, etc.

El término "tratar" y "tratamiento" incluye tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos y aplicaciones en las que se reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la cura completa de un trastorno y engloba realizaciones en las que se reducen los síntomas o factores de riesgo subyacentes.

El término "prevenir" no requiere el 100 % de eliminación de la posibilidad de un evento. En lugar de esto, indica que la probabilidad de la aparición del evento se ha reducido en presencia del compuesto o método.

Pueden usarse técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo tisular y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse según las especificaciones del fabricante o como se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en la presente memoria. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente según métodos convencionales muy conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). A no ser que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en la presente memoria son las conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y administración, y tratamiento de pacientes.

Proteínas de unión a antígeno para PCSK9

La proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9) es una serina proteasa implicada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) (Horton et al., 2007; Seidah y Prat, 2007). PCSK9 es una prohormona-proproteína convertasa en la familia de la subtilisina (S8) de serina proteasas (Seidah et al., 2003). Una secuencia de aminoácidos de PCSK9 humana ejemplar se presenta como SEQ ID NO: 1 y 3 en la FIG. 1A (que representa el "pro" dominio de la proteína como subrayado) y la FIG. 1B (que representa la secuencia señal en negrita y el pro dominio subrayado). Una secuencia codificadora de PCSK9 humana ejemplar se presenta como SEQ ID NO: 2 (FIG. 1B). Como se describe en la presente memoria, las proteínas PCSK9 también pueden incluir fragmentos de la proteína PCSK9 de longitud completa. La estructura de la proteína PCSK9 se ha resuelto recientemente por dos grupos (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, y Piper et al., Structure, 15:1-8, 2007). PCSK9 incluye una secuencia señal, un prodominio N-terminal, un dominio catalítico semejante a subtilisina y un dominio C-terminal.

En la presente memoria se proporcionan proteínas de unión a antígeno (ABP) que se unen a PCSK9, incluyendo PCSK9 humana. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno proporcionadas son polipéptidos que comprenden una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR), como se describe en la presente memoria. En algunas proteínas de unión a antígeno, las CDR están incluidas en una región "marco", que orienta la o las CDR de manera que se consiguen las propiedades de unión a antígeno apropiadas de la o las CDR. En algunas realizaciones, la ABP modula o altera la capacidad de PCSK9 para dar lugar a la degradación de LDLR, sin tener que evitar la interacción de unión entre PCSK9 y LDLR. Dichas ABP pueden describirse específicamente como ABP "neutralizantes no competitivamente".

En algunas realizaciones, la proteínas de unión a antígeno proporcionadas en la presente memoria son capaces de inhibir la actividad mediada por PCSK9. En algunas realizaciones, la unión de las proteínas de unión a antígeno a estos epítopos inhibe, entre otras cosas, efectos fisiológicos mediados por PCSK9. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno son humanas, tales como anticuerpos completamente humanos frente a PCSK9.

En algunas realizaciones, la ABP se une a la forma madura de PCSK9. En algunas realizaciones la ABP se une en el prodominio de PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se une selectivamente a la forma madura de PCSK9. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno no se une al extremo C del dominio catalítico. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno no se une al extremo N del dominio catalítico. En algunas realizaciones, la ABP se une al extremo N o C de la proteína PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se une a uno cualquiera de los epítopos a los que se unen los anticuerpos discutidos en la presente memoria. En algunas realizaciones, esto puede determinarse por ensayos de competición entre los anticuerpos descritos en la presente memoria y otros anticuerpos. En algunas realizaciones, la ABP se une a un epítopo al que se une uno de los anticuerpos descritos en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la ABP se une al dominio V de PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se une al dominio V de PCSK9 y, aunque no evita (o reduce) la unión de PCSK9 a LDLR, la ABP evita o reduce las actividades adversas mediadas a través de PCSK9 en LDLR.

Las proteínas de unión a antígeno que se describen en la presente memoria tienen una variedad de utilidades. Algunas de las proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, son útiles en ensayos de unión específicos, purificación por afinidad de PCSK9, en particular PCSK9 humana o sus ligandos y en ensayos de cribado para identificar otros antagonistas de la actividad de PCSK9. Algunas de las proteínas de unión a antígeno son útiles para inhibir las actividades mediadas por PCSK9.

Las proteínas de unión a antígeno pueden usarse en una variedad de aplicaciones terapéuticas, como se explica en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones las proteínas de unión a antígeno de PCSK9 son útiles para tratar afecciones asociadas con PCSK9, tales como trastornos relacionados con el colesterol (o "trastornos relacionados con el colesterol sérico") tales como hipercolesterolemia, como se describe adicionalmente en la presente memoria. Otros usos para las proteínas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, el diagnóstico de enfermedades o afecciones asociadas con PCSK9 y ensayos de cribado para determinar la presencia o ausencia de PCSK9. Algunas de las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria son útiles para tratar las consecuencias, síntomas y/o la patología asociada con la actividad de PCSK9.

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan comprenden una o más CDR (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o 6 CDR). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una estructura de polipéptido y (b) una o más CDR que están insertadas en y/o unidas a la estructura de polipéptido. La estructura de polipéptido puede tomar una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, puede ser, o comprender, el marco de un anticuerpo natural, o fragmento o variante de este, o puede ser de naturaleza completamente sintética. Los ejemplos de varias estructuras de polipéptido se describen adicionalmente más adelante.

En determinadas realizaciones, la estructura de polipéptido de las proteínas de unión a antígeno es un anticuerpo o deriva de un anticuerpo, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (algunas veces denominado en la presente memoria "miméticos de anticuerpo"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (algunas veces denominadas "conjugados de anticuerpos"), y partes o fragmentos de cada uno, respectivamente. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab', un F(ab')²o un scFv). Las varias estructuras se describen y definen adicionalmente en la presente memoria.

Algunas de las proteínas de unión a antígeno como se proporcionan en la presente memoria se unen específica y/o selectivamente a PCSK9 humana. En algunas realizaciones, la ABP se une específicamente y/o selectivamente a PCSK9 humana que tiene y/o consiste en los residuos 31-152 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la ABP se une selectivamente a una proteína PCSK9 humana como se representa en la FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une específicamente al menos a un fragmento de la proteína PCSK9 y/o una proteína PCSK9 de longitud completa, con o sin una secuencia señal.

En realizaciones en las que la proteína de unión a antígeno se usa para aplicaciones terapéuticas, una proteína de unión a antígeno puede inhibir, interferir con o modular una o más actividades biológicas de PCSK9. En una realización, una proteína de unión a antígeno se une específicamente a PCSK9 humana. Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan en la presente memoria son anticuerpos. En algunas realizaciones, la ABP tiene una Kd de menos (unión más fuerte) de 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 M. Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada de IgG2 de un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 154, FIG. 3KK.

Un ejemplo de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 de un anticuerpo anti-PCSK9 de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 155, FIG. 3KK.

Un ejemplo de un dominio constante de cadena ligera kappa de un anticuerpo anti-PCSK9 tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 157, FIG. 3KK.

Un ejemplo de un dominio constante de cadena ligera lambda de un anticuerpo anti-PCSK9 tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 156, FIG. 3KK.

Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulinas presentan generalmente la misma estructura global, que comprende regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas más frecuentemente "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada pareja cadena pesada/cadena ligera mencionadas anteriormente se alinean típicamente por las regiones marco para formar una estructura que se une específicamente a un epítopo específico en la proteína diana (por ejemplo, PCSK9). Desde el N-terminal hasta el C-terminal, las regiones variables de cadena ligera y pesada naturales se ajustan ambas típicamente al orden siguiente de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha concebido un sistema de numeración para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD) o Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.

En la presente memoria se proporcionan varias regiones variables de cadena pesada y cadena ligera y se representan en las FIG. 2A-3HH y 3AAA. En algunas realizaciones, cada una de estas regiones variables puede estar unida a las regiones constantes de cadena pesada y ligera anteriores para formar una cadena pesada y ligera de anticuerpo completa, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generada puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa.

Los ejemplos específicos de algunas de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos que se proporcionan y sus secuencias de aminoácidos correspondientes se resumen en la TABLA 2.

TABLA 2

(continuación)

De nuevo, cada una de las cadenas pesadas variables ejemplares listadas en la Tabla 2 puede combinarse con cualquiera de las cadenas ligeras variables ejemplares mostradas en la Tabla 2 para formar un anticuerpo. La Tabla 2 muestra emparejamientos de cadena ligera y pesada ejemplares encontrados en varios de los anticuerpos descritos en la presente memoria. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las listadas en la Tabla 2. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo, un anticuerpo o proteína de unión a antígeno puede incluir una cadena pesada y una cadena ligera, dos cadenas pesadas, o dos cadenas ligeras. En algunas realizaciones la proteína de unión a antígeno comprende (y/o consiste en) 1, 2, y/o 3 CDR pesada y/o ligera de al menos una de las secuencias listadas en la Tabla 2 (las CDR para las secuencias se indican en las FIG. 2A-3D, y otras realizaciones en las FIG. 3GGG-3JJJ). En algunas realizaciones, las 6 CDR (CDR1-3 de la ligera (CDRL1, CDRL2, CDRL3) y CDR1-3 de la pesada (CDRH1, CDRH2, y CDRH3)) son parte de la ABP. En algunas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, o más CDR están incluidas en la ABP. En algunas realizaciones, una CDR pesada y una ligera de las CDR en las secuencias en la Tabla 2 está incluida en la ABP (las CDR para las secuencias en la tabla 2 se indican en las FIG. 2A-3D). En algunas realizaciones, también están incluidas secciones adicionales (por ejemplo, como se representa en la FIG. 2A-2D, 3A-3D, y otras realizaciones en las FIG. 3GGG-3JJJ) en la ABP. Los ejemplos de CDR y FR para las cadenas pesada y ligera indicadas en la Tabla 2 se muestran en las FIG. 2A-3D (y otras realizaciones en las FIG. 3GGG-3JJJ). Las secuencias variables de cadena ligera opcionales (incluyendo CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y FR4) pueden seleccionarse de las siguientes: 42, 7, 13, 32 y 28. Las secuencias variables de cadena pesada opcionales (incluyendo CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y FR4) pueden seleccionarse de lo siguiente: 69, 85, 87, 89 y 91. En algunas de las entradas en la FIG. 2A-3D, se identifican variaciones de las secuencias o límites alternativos de las CDR y FR. Estas alternativas se identifican con un "v1" después del nombre de la ABP. Como la mayor parte de estas alternativas son minoritarias en la naturaleza, solo se muestran en la tabla secciones con diferencias. Se entiende que la sección restante de la cadena ligera o pesada es la misma como se muestra para la ABP base en los demás paneles. Como apreciará un experto en la técnica, no se necesita realmente usar más de una de dichas secuencias en la creación de un anticuerpo o ABP. De hecho, en algunas realizaciones, solo es necesario que esté presente uno o ninguno de los ácidos nucleicos de cadena pesada o ligera específicos.

En algunas realizaciones, la ABP está codificada por una secuencia de ácido nucleico que puede codificar cualquiera de las secuencias de proteína en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno no se une al extremo C del dominio catalítico (por ejemplo, los 5. 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 aminoácidos más en el extremo C). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno no se une al extremo N del dominio catalítico (por ejemplo, los 5.

5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 aminoácidos más en el extremo N). En algunas realizaciones, la ABP se une a los aminoácidos en los aminoácidos 600-692 de la forma madura de PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se une a los aminoácidos en (y/o las secuencias de aminoácidos que consisten en) los aminoácidos 31-100, 31-152, 452-683, 500, 600 y/o 600-692. En algunas realizaciones, la A^bP neutralizante y/o no neutralizante se une al prodominio. En algunas realizaciones, las ABP se unen al surco (como se muestra en Piper et al.) en el dominio V. En algunas realizaciones, las ABP se unen a la porción rica en histidina próxima al surco en el dominio V. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos (que se unen al dominio V) no son neutralizantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen al dominio V son neutralizantes. En algunas realizaciones, las ABP neutralizantes, mientras evitan la degradación por PCSK9 de LDLR, no evitan la unión de PCSK9 a LDLR (por ejemplo, ABP 31A4).

En algunas realizaciones, la ABP se une a (pero no bloquea) variantes de PCSK9 que tienen al menos 50 %, 50 60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma de PCSK9 representada en la FIG. 1A y/o FIG. 1B. En algunas realizaciones, la ABP se une a (pero no bloquea) variantes de PCSK9 que tienen al menos 50 %, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o más de porcentaje de identidad con la forma madura de PCSK9 representada en la FIG. 1A y/o FIG. 1B. En algunas realizaciones, la variante de PCSK9 es una variante humana, tal como las variantes en la posición 474, E620G y/o E670G. En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 474 es valina (como en otros humanos) o treonina (como en cino y ratón). Dados los datos de reactividad cruzada presentados en la presente memoria, se cree que los presentes anticuerpos se unirán fácilmente a las variantes anteriores.

En algunas realizaciones, la ABP se une a un epítopo al que se une de los anticuerpos descritos en la Tabla 2. Proteínas de unión a antígeno humanizadas (por ejemplo, anticuerpos)

Como se describe en la presente memoria, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede comprender un anticuerpo humanizado y/o parte de este. Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratones.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado es sustancialmente no inmunogénico en seres humanos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado tiene sustancialmente la misma afinidad para una diana que un anticuerpo de otra especie de la que procede el anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.530.101, Patente de los Estados Unidos 5.693.761; Patente de los Estados Unidos 5.693.762; Patente de los Estados Unidos 5.585.089.

En determinadas realizaciones, se identifican los aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo que pueden modificarse sin disminuir la afinidad nativa del dominio de unión a antígeno mientras se reduce su inmunogenicidad. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.766.886 y 5.869.619.

En determinadas realizaciones, la modificación de un anticuerpo por métodos conocidos en la técnica se diseña típicamente para conseguir una afinidad de unión incrementada para una diana y/o para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo en el receptor. En determinadas realizaciones, los anticuerpos humanizados se modifican para eliminar sitios de glucosilación con el fin de incrementar la afinidad del anticuerpo para su antígeno afín. Véase, por ejemplo, Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). En determinadas realizaciones, se usan técnicas tales como "remodelado," "hiperquimerización" o "recubrimiento/modificación en superficie" para producir anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105 (1998); Roguska et al., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); y Patente de los Estados Unidos n.° 6.072.035. En determinadas de dichas realizaciones, dichas técnicas reducen típicamente la inmunogenicidad del anticuerpo reduciendo el número de residuos extraños, pero no evitan respuestas antiidiotípicas y anti-alotípicas después de la administración repetida de los anticuerpos. Algunos otros métodos para reducir la inmunogenicidad se describen, por ejemplo, en Gilliland et al., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999). En determinados casos, la humanización de anticuerpos da lugar a una pérdida de la capacidad de unión al antígeno. En determinadas realizaciones, los anticuerpos humanizados se "retro mutan". En algunas de dichas realizaciones, el anticuerpo humanizado se muta para incluir uno o más de los residuos de aminoácidos encontrados en el anticuerpo donante. Véase, por ejemplo, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999). En determinadas realizaciones, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para PCSK9 pueden injertarse en regiones marco (FR) de la misma, u otra, especie. En determinadas realizaciones, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para PCSK9 pueden injertarse en FR humanas consenso. Para crear FR humanas consenso, en determinadas realizaciones, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humana se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. En determinadas realizaciones, las FR de un anticuerpo para PCSK9 cadena pesada o cadena ligera se reemplazan con las FR de una cadena pesada o cadena ligera diferente. En determinadas realizaciones, los aminoácidos raros en las FR de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo para PCSK9 no se reemplazan, mientras el resto de los aminoácidos de FR se reemplazan. Los aminoácidos raros son aminoácidos específicos que están en posiciones en las que no se encuentran habitualmente en las FR. En determinadas realizaciones, las regiones variables injertadas de un anticuerpo para PCSK9 pueden usarse con una región constante que es diferente de la región constante de un anticuerpo para PCSK9. En determinadas realizaciones, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo de Fv de cadena sencilla. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos n.2 6.180.370, 6.054.297, 5.693.762, 5.859.205, 5.693.761, 5.565.332, 5.585.089 y 5.530.101, y en Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998).

Proteínas de unión a antígeno humanas (por ejemplo, anticuerpos)

Como se describe en la presente memoria, una proteína de unión a antígeno que se une a PCSK9 puede comprender un anticuerpo humano (es decir, completamente humano) y/o parte de este. En determinadas realizaciones, se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican, y las secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias correspondientes a las regiones variables. En determinadas realizaciones, se proporcionan secuencias correspondientes a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), específicamente de CDR1 a CDR3. Según determinadas realizaciones, se proporciona una línea celular de hibridoma que expresa dicha molécula de inmunoglobulina. Según determinadas realizaciones, se proporciona una línea celular de hibridoma que expresa dicho anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, una línea celular de hibridoma se selecciona de al menos una de las líneas celulares descritas en la Tabla 2, por ejemplo, 21B12, 16F12 y 31H4. En determinadas realizaciones, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano purificado para PCSK9 humana.

Se pueden preparar por ingeniería cepas de ratones deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de locus de Ig humana en anticipación de que dichos ratones producirían anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig humana largos pueden preservar la diversidad génica variable grande así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos. Aprovechando la maquinaria del ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la ausencia de tolerancia inmunológica para proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducido en estas cepas de ratones puede rendir anticuerpos completamente humanos de alta afinidad frente a cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridomas, pueden producirse y seleccionarse Mab humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Algunos métodos ejemplares se describen en WO 98/24893, Patente de los Estados Unidos n.° 5.545.807, EP 546073, y EP 546073.

En determinadas realizaciones, se pueden usar regiones constantes de especies distintas del ser humano junto con la o las regiones variables humanas.

La capacidad de clonar y reconstruir locus humanos con tamaño de megabases en cromosomas artificiales de levadura (YAC) y de introducirlos en la línea germinal de ratones proporciona una estrategia para dilucidar los componentes funcionales de locus muy grandes o mapeados de forma aproximada así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, la utilización de dicha tecnología para la sustitución de locus de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar conocimientos sobre la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progresión de enfermedades.

Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de murino o rata puede dar lugar al aclaramiento rápido de los anticuerpos o puede dar lugar a la generación de una respuesta inmunitaria frente al anticuerpo por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos murinos o procedentes de rata, pueden generarse anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de locus de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal de manera que el roedor, otro mamífero o animal produce anticuerpos completamente humanos.

Los anticuerpos humanizados son aquellos anticuerpos que, mientras inicialmente empiezan conteniendo secuencias de aminoácidos de anticuerpos que no son humanos, han tenido al menos algunas de estas secuencias de aminoácidos de anticuerpos no humanos reemplazadas con secuencias de anticuerpos humanos. Esto contrasta con los anticuerpos humanos, en los que el anticuerpo está codificado (o es capaz de ser codificado) por genes presentes en un ser humano.

Variantes de proteínas de unión a antígeno

Otros anticuerpos que se proporcionan son variantes de las ABP listadas anteriormente formados por combinación o subpartes de las cadenas variable pesada y variable ligera mostradas en la Tabla 2 y comprenden cadenas variables ligera y/o variable pesada que cada una tiene al menos 50 %, 50-60, 60-70, 70-80 %, 80 85 %, 85-90 %, 90-95 %, 95-97 %, 97-99 %, o por encima del 99 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de las secuencias en la Tabla 2 (bien la secuencia completa o una subparte de la secuencia, por ejemplo, una o más CDR). En algunos casos, dichos anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas (o subpartes de estas). En algunas realizaciones, la comparación de secuencias en la FIG. 2A-3D (y 13A, 13C) puede usarse con el fin de identificar secciones de los anticuerpos que pueden modificarse observando aquellas variaciones que influyen en la unión y aquellas variaciones que no parecen influir en la unión. Por ejemplo, comparando secuencias similares, se pueden identificar aquellas secciones (por ejemplo, aminoácidos particulares) que pueden modificarse y cómo pueden modificarse mientras todavía retienen (o mejoran) la funcionalidad de la ABP. En algunas realizaciones, las variantes de las ABP incluyen aquellos grupos consenso y secuencias representadas en las FIG. 13A, 13C y se permiten variaciones en las posiciones identificadas como variables en las figuras. Las CDR mostradas en las FIG. 13A, 13C se definieron tomando como base una combinación híbrida del método de Chothia (basado en la localización de las regiones bucle estructurales, véase, por ejemplo, "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk y Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927 948, 7 de noviembre (1997)) y el método de Kabat (basado en la variabilidad de la secuencia, véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. NIH Publication n.° 91-3242, Kabat et al., (1991)). Cada residuo determinado por cualquiera de los dos métodos, se incluyó en la lista final de residuos de CDR (y se presentan en las FIG. 13A, 13C).

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de las SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos 90 %, 90 95 % y/o 95-99 % idéntica a una o más CDR de las CDR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91. En algunas realizaciones, están presentes 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR (siendo cada una al menos 90 %, 90-95 % y/o 95-99 % idéntica a las secuencias anteriores).

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos 90 %, 90 95 % y/o 95-99 % idéntica a una o más FR de las FR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 69, 85, 87, 89 y 91. En algunas realizaciones, están presentes 1, 2, 3 o 4 FR (siendo cada una al menos 90 %, 90-95 % y/o 95-99 % idéntica a las secuencias anteriores).

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno comprende una cadena ligera que comprende una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos 90 %, 90 95 % y/o 95-99 % idéntica a una o más CDR de las CDR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En algunas realizaciones, están presentes 1,2, 3, 4, 5 o 6 CDR (siendo cada una al menos 90 %, 90-95 % y/o 95-99 % idéntica a las secuencias anteriores).

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia que es al menos 90 %, 90 95 % y/o 95-99 % idéntica a una o más FR de las FR en al menos una de las secuencias de SEQ ID NO: 42, 7, 13, 32 y 28. En algunas realizaciones, están presentes 1, 2, 3 o 4 FR (siendo cada una al menos 90 %, 90-95 % y/o 95-99 % idéntica a las secuencias anteriores).

A la vista de la presente descripción, un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de las ABP como se muestra en la presente memoria usando técnicas muy conocidas. En determinadas realizaciones, un experto en la técnica puede identificar áreas de la molécula adecuadas que pueden cambiarse sin destruir la actividad tomando como diana regiones que no se cree que son importantes para la actividad. En determinadas realizaciones, se pueden identificar residuos y partes de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. En determinadas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente a la estructura del polipéptido.

Además, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos residuos de aminoácidos que se predice que son importantes.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en ABP similares. A la vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir el alineamiento de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo respecto a su estructura tridimensional. En determinadas realizaciones, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en residuos de aminoácidos que se predice que están en la superficie de la proteína, ya que dichos residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una única sustitución de aminoácidos en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden cribarse entonces usando ensayos de actividad conocidos para los expertos en la técnica. Dichas variantes pueden usarse para recoger información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular da lugar a actividad destruida, reducida de manera indeseable o inadecuada, las variantes con dicho cambio pueden evitarse. En otras palabras, tomando como base la información recogida de dichos experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deben evitarse sustituciones adicionales bien solas o en combinación con otras mutaciones.

Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211 -222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, están disponibles actualmente programas informáticos para ayudar en la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor del 30 %, o similitud mayor del 40 %, tienen frecuentemente topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de proteínas (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción aumentada de estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos en la estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dada y que una vez se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá drásticamente más exacta.

Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "reconocimiento de plegamiento" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1 ):15-19 (1996)), "análisis de perfiles" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)) y "conexión evolutiva" (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999), y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).

En determinadas realizaciones, las variantes de la proteína de unión a antígeno incluyen variantes de glucosilación en las que el número y/o tipo de sitios de glucosilación se ha alterado comparado con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En determinadas realizaciones, las variantes de proteína comprenden un número mayor o menor de sitios de glucosilación unidos por N que la proteína nativa. Un sitio de glucosilación unido por N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que los residuos de aminoácidos designados como X pueden ser cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato unida por N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena de carbohidrato unida por N existente. También se proporciona una reorganización de cadenas de carbohidrato unidas por N en la que uno o más sitios de glucosilación unidos por N (típicamente los naturales) se eliminan y se crean uno o más sitios unidos por N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína se delecionan de o sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) comparado con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína tienen generalmente menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y tienen típicamente un número par para minimizar las interacciones que resultan de cisteínas desemparejadas.

Según determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales en dichos polipéptidos. Según determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) pueden hacerse en la secuencia natural (en determinadas realizaciones, en la parte del polipéptido fuera del o los dominios que forman contactos intermoleculares). En determinadas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa típicamente puede no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia parental). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature, 354:105 (1991).

En algunas realizaciones, las variantes son variantes de las secuencias de ácido nucleico de las ABP descritas en la presente memoria. Un experto en la técnica apreciará que la discusión anterior puede usarse para identificar, evaluar y/o crear variantes de proteínas ABP y también para secuencias de ácido nucleico que pueden codificar estas variantes de proteína. Así, se contemplan secuencias de ácido nucleico que codifican estas variantes de proteína (así como secuencias de ácido nucleico que codifican las ABP en la Tabla 2, pero que son diferentes de las descritas explícitamente en la presente memoria). Por ejemplo, una variante de ABP puede tener al menos 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99 o más de identidad con al menos una secuencia de ácido nucleico descrita en SEQ ID NO: 102, 103, 130, 131, 136, 137, 140, 141, 148 y 149, o al menos una a seis (y varias combinaciones de estas) de la o las CDR codificadas por las secuencias de ácido nucleico en SEQ ID NO: 102, 103, 130, 131, 136, 137, 140, 141, 148 y 149.

En algunas realizaciones, el anticuerpo (o secuencia de ácido nucleico que lo codifica) es una variante si la secuencia de ácido nucleico que codifica la ABP particular (o la secuencia de ácido nucleico en sí misma) puede hibridar selectivamente con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas en la Tabla 2 (tales como, pero no limitadas a SEQ ID NO: 102, 103, 130, 131, 136, 137, 140, 141, 148 y 149) en condiciones astringentes. En una realización, las condiciones moderadamente astringentes adecuadas incluyen prelavado en una disolución de 5XSSC; SDS 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridación a 50 0C, -65 0C, 5^xsS^c, toda la noche o, en el evento de homología cruzada entre especies, a 45 °C con 0,5xSSC; seguido de lavado dos veces a 65 0C durante 20 minutos con cada uno de 2x, 0,5x y 0,2xSSC que contiene SDS 0,1 %. Dichas secuencias de ADN que hibridan también están dentro del alcance de esta invención, como lo están secuencias de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifican un polipéptido de anticuerpo que está codificado por una secuencia de ADN que hibrida y las secuencias de aminoácidos que están codificadas por estas secuencias de ácido nucleico. En algunas realizaciones, las variantes de las CDR incluyen secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos codificadas por estas secuencias, que hibridan con una o más de las CDR en las secuencias indicadas anteriormente (las CDR individuales pueden determinarse fácilmente a la vista de las FIG. 2A-3D, y otras realizaciones en las FIG. 3GGG-3JJJ). La expresión "hibridan selectivamente" referida en este contexto significa que se une de manera detectable y selectiva. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de estos según la invención hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta astringencia para conseguir condiciones de hibridación selectiva como se conoce en la técnica y discute en la presente memoria. Generalmente, la homología en la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos 80 %, y más típicamente con homologías preferiblemente crecientes de al menos 85 %, 90 %, 95 %, 99 % y 100 %. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85 % de homología significa que el 85 % de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para concordancia máxima. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) para maximizar la concordancia; se prefieren las longitudes de hueco de 5 o menos siendo más preferida de 2 o menos. Alternativamente y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en la presente memoria, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M. O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 de este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de estas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son más de o igual a 50 % idénticos cuando se alinean de manera óptima usando el programa ALIGN. La expresión "corresponde a" se usa en la presente memoria para significar que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no relacionada de forma estrictamente evolutiva) a toda o parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En contraste, la expresión "complementario a" se usa en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Preparación de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos)

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno (tales como anticuerpos) se producen por inmunización con un antígeno (por ejemplo, PCSK9). En determinadas realizaciones, pueden producirse anticuerpos por inmunización con PCSK9 de longitud completa, una forma soluble de PCSK9, el dominio catalítico solo, la forma madura de PCSK9 mostrada en la FIG. 1 A, una forma de variante de corte y empalme de PCSK9, o un fragmento de estos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, y/o pueden ser anticuerpos recombinantes. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, por inmunización de animales transgénicos capaces de producir anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Solicitud Publicada PCT n.° WO 93/12227).

En determinadas realizaciones, pueden emplearse determinadas estrategias para manipular propiedades inherentes de un anticuerpo, tales como la afinidad de un anticuerpo para su diana. Dichas estrategias incluyen, pero no están limitadas a, el uso de mutagénesis específica de sitio o aleatoria de la molécula de polinucleótido que codifica un anticuerpo para generar una variante de anticuerpo. En determinadas realizaciones, dicha generación está seguida del cribado para variantes de anticuerpo que presentan el cambio deseado, por ejemplo, afinidad incrementada o disminuida.

En determinadas realizaciones, los residuos de aminoácidos diana en estrategias mutagénicas son aquellos en las CDR. En determinadas realizaciones, la diana son los aminoácidos en las regiones marco de los dominios variables. En determinadas realizaciones, se ha mostrado que dichas regiones marco contribuyen a las propiedades de unión a diana de determinados anticuerpos. Véase, por ejemplo, Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) y las referencias en ella.

En determinadas realizaciones, se producen bibliotecas de variantes de anticuerpo más pequeñas y más eficazmente cribadas por restricción de la mutagénesis aleatoria o específica de sitio a sitios de hiper-mutación en las CDR, que son sitios que corresponden a áreas tendentes a mutación durante el proceso de maduración por afinidad somática. Véase, por ejemplo, Chowdhury y Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) y las referencias en ella. En determinadas realizaciones, determinados tipos de elementos del ADN pueden usarse para identificar sitios de hiper-mutación incluyendo, pero no limitado a, determinadas repeticiones directas e invertidas, determinadas secuencias consenso, determinadas estructuras secundarias, y determinados palíndromos. Por ejemplo, dichos elementos de ADN que pueden usarse para identificar sitios de hiper-mutación incluyen, pero no están limitados a, una secuencia de tetrabase que comprende una purina (A o G), seguida de una guanina (G), seguida de una pirimidina (C o T), seguida bien de adenosina o timidina (A o T) (es decir, A/G-G-C/T-A/T). Otro ejemplo de un elemento de ADN que puede usarse para identificar sitios de hiper-mutación es el codón de serina, A-G-C/T.

Preparación de ABP completamente humanas (por ejemplo, anticuerpos)

En determinadas realizaciones, se usa una técnica de exposición en fago para generar anticuerpos monoclonales. En determinadas realizaciones, dichas técnicas producen anticuerpos monoclonales completamente humanos. En determinadas realizaciones, un polinucleótido que codifica un único fragmento de anticuerpo Fab o Fv se expresa en la superficie de una partícula de fago. Véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); Patente de los Estados Unidos n.° 5.885.793. En determinadas realizaciones, los fagos se "criban" para identificar aquellos fragmentos de anticuerpo que tienen afinidad para la diana. Así, algunos de dichos procesos mimetizan la selección inmune a través de la exposición de repertorios de fragmentos de anticuerpo en la superficie de bacteriófagos filamentosos, y posterior selección de fagos por su unión a la diana. En algunos de dichos procedimientos, se aíslan fragmentos de anticuerpo neutralizantes funcionales con alta afinidad. En algunas de dichas realizaciones (discutidas con más detalle más adelante), se crea un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos clonando genes V humanos reorganizados de forma natural de linfocitos de sangre periférica. Véase, por ejemplo, Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990).

Según determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se preparan a través de la utilización de un ratón transgénico que tiene una parte sustancial del genoma que produce el anticuerpo humano insertada pero que se vuelve deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Dichos ratones son capaces, entonces, de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para conseguir este resultado se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la memoria descriptiva, en la presente memoria. En determinadas realizaciones, se pueden emplear métodos tales como los descritos en la Solicitud Publicada PCT n.° WO 98/24893 o en Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

Generalmente, las ABP monoclonales completamente humanas (por ejemplo, anticuerpos) específicas para PCSK9 pueden producirse como sigue. Se inmunizan ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, por ejemplo, PCSK9, se obtienen células linfáticas (tales como linfocitos B) de los ratones que expresan anticuerpos. Dichas células recuperadas se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En determinadas realizaciones, se proporciona la producción de una línea celular de hibridoma que produce anticuerpos específicos para PCSK9.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos completamente humanos se producen exponiendo esplenocitos humanos (linfocitos B o T) a un antígeno in vitro, y después reconstituyendo las células expuestas en un ratón inmunocomprometido, por ejemplo, SCID o nod/SCID. Véase, por ejemplo, Brams et al., J.Immunol. 160: 2051 2058 (1998); Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000). En algunas de estas estrategias, el injerto de tejido fetal humano en ratones SCID (SCID-hu) da lugar a hematopoyesis a largo plazo y desarrollo de linfocitos T humanos. Véase, por ejemplo, McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). En determinados casos, la respuesta inmunitaria humoral en dichos ratones quiméricos depende del co-desarrollo de linfocitos T humanos en los animales. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994). En algunas estrategias, se trasplantan linfocitos de sangre periférica humana en ratones SCID. Véase, por ejemplo, Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988). En algunas de dichas realizaciones, cuando dichas células trasplantadas se tratan bien con un agente de cebado, tal como enterotoxina A estafilocócica (SEA), o con anticuerpos monoclonales anti-CD40 humana, se detectan niveles mayores de producción de linfocitos B. Véase, por ejemplo, Martensson et al., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995).

Así, en determinadas realizaciones, pueden producirse anticuerpos completamente humanos por la expresión de ADN recombinante en células hospedadoras o por la expresión en células de hibridoma. En otras realizaciones, pueden producirse anticuerpos usando las técnicas de exposición en fago descritas en la presente memoria.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria se prepararon a través de la utilización de la tecnología XenoMouse®, como se describe en la presente memoria. Dichos ratones son capaces, entonces, de producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para conseguir esto se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la sección de antecedentes en la presente memoria. En particular, sin embargo, una realización preferida de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de estos se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con n.° de serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y Solicitud de Patente Internacional n.° WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y el documento WO 00/76310, publicado el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

A través del uso de dicha tecnología, se han producido anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a una variedad de antígenos. Esencialmente, las líneas de ratones XenoMouse® se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo, PCSK9), se recuperan células linfáticas (tales como linfocitos B) de los ratones hiper-inmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En la presente memoria se proporcionan métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para PCSK9. Además, en la presente memoria se proporciona la caracterización de los anticuerpos producidos por dichas líneas celulares, incluyendo análisis de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de dichos anticuerpos.

La producción de las cepas de ratones XenoMouse® se discute y delinea adicionalmente en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con n.° de serie 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430.938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996, Publicación U.S.

2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y Patentes de los Estados Unidos n.° 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598 y Patentes japonesas n.23068 180 B2, 3068506 B2, y 3068507 B2. Véase también Patente Europea n.°, EP 0463151 B1, concesión publicada el 12 de junio de 1996, Solicitud de Patente Internacional n.°, WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, Solicitud de Patente Internacional n.°, WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000.

En una estrategia alternativa, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado una estrategia de "minilocus". En la estrategia de minilocus, un locus de Ig exógeno se imita a través de la inclusión de partes (genes individuales) del locus de Ig. Así, uno o más genes V^h, uno o más genes D^h, uno o más genes J^h, una región constante mu, y habitualmente una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en una construcción para inserción en un animal. Esta estrategia se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.545.807 de Surani et al. y Patentes de los Estados Unidos n.° 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 cada una de Lonberg y Kay, Patente de los Estados Unidos n.° 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Bems, Patentes de los Estados Unidos n.° 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 de Bems et al., y Patente de los Estados Unidos n.° 5.643.763 de Choi y Dunn, y Solicitudes de Patente de los Estados Unidos de GenPharm International con n.° de serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994. Véase también la Patente Europea n.° 0546 073 B1, Solicitudes de Patente Internacional n.2 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y Patente de los Estados Unidos n.° 5.981.175. Véase además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes partes de cromosomas, o cromosomas completos. Véanse las Solicitudes de Patente Europea n.° 773288 y 843961. Además, se han generado ratones KM™, que son el resultado de la fecundación cruzada de ratones Tc de Kirin con ratones de minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humana de los ratones de Kirin y el transgén de cadena kappa de los ratones Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero no están limitados a exposición en fagos (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed) exposición en ribosomas (CAT), exposición en levaduras.

En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente memoria poseen cadenas pesadas de IgG4 humana así como cadenas pesadas de IgG2. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo IgG1. Los anticuerpos poseían afinidades altas, típicamente poseían una Kd de aproximadamente 10 6 a aproximadamente 10-13 M o menor, cuando se midió por varias técnicas.

Como se apreciará, los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares distintas de líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para transformar una célula hospedadora de mamífero adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector vírico) y transducción de una célula hospedadora con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patentes de los Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del hospedador que se va a transformar. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son muy conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión son muy conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero no limitado a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células epiteliales de riñón humano 293 y varias otras líneas celulares. La líneas celulares de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a PCSK9.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos y/o ABP se producen por al menos uno de los hibridomas siguientes: 21B12, 31H4, 16F12, cualesquiera otros hibridomas listados en la Tabla 2 o descritos en los ejemplos. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se unen a PCSK9 con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 nM, por ejemplo, 1000 pM a 100 pM, 100 pM a 10 pM, 10 pM a 1 pM, y/o 1 pM a 0,1 pM o menos.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una molécula de inmunoglobulina de al menos uno de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y/o una cadena pesada humana. En determinadas realizaciones, la cadena pesada es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD o IgM. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se han clonado para expresión en células de mamíferos. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una región constante distinta de cualquiera de las regiones constantes del isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG4 humana. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera lambda humana y una cadena pesada de IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD o IgM humana. En otras realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG2 humana. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG4 humana. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD o IgM humana. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden regiones variables de anticuerpos ligadas a una región constante que no es la región constante para el isotipo IgG2, ni la región constante para el isotipo IgG4. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se han clonado para expresión en células de mamíferos.

En determinadas realizaciones, las modificaciones conservativas en las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de al menos una de las líneas de hibridoma: 21B12, 31H4 y 16F12 (y modificaciones correspondientes en los nucleótidos codificadores) producirán anticuerpos frente a PCSK9 que tienen características funcionales y químicas similares a las de los anticuerpos de las líneas de hibridoma: 21B12, 31H4 y 16F12. Al contrario, en determinadas realizaciones, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los anticuerpos frente a PCSK9 pueden conseguirse seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que se diferencian significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del núcleo molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.

Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de manera que hay poco efecto o ninguno en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis por escaneo de alanina''.

Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la técnica en el momento en el que se deseen dichas sustituciones. En determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes de los anticuerpos frente a PCSK9, o para incrementar o disminuir la afinidad de los anticuerpos frente a PCSK9 como se describe en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden expresarse en líneas celulares distintas de líneas celulares de hibridoma. En determinadas realizaciones, las secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de una célula hospedadora de mamífero adecuada. Según determinadas realizaciones, la transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo, el empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula hospedadora con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las Patente de los Estados Unidos n.° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. En determinadas realizaciones, el procedimiento de transformación usado puede depender del hospedador que se va a transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión son muy conocidas en la técnica e incluyen, pero no están limitadas a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero no limitado a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias otras líneas celulares. En determinadas realizaciones, las líneas celulares pueden seleccionarse a través de la determinación de qué líneas celulares tienen niveles altos de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a HGF. Los vectores de expresión apropiados para células hospedadoras de mamíferos son muy conocidos.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno comprenden uno o más polipéptidos. En determinadas realizaciones, puede utilizarse cualquiera de una variedad de sistemas vector de expresión/huésped para expresar moléculas de polinucleótido que codifican polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. Dichos sistemas incluyen, pero no están limitados a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN de plásmido, o cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales.

En determinadas realizaciones, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se expresa recombinantemente en levaduras. Algunas de dichas realizaciones usan sistemas de expresión disponibles comercialmente, por ejemplo, el Sistema de Expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. En determinadas realizaciones, dicho sistema se basa en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción. En determinadas realizaciones, la transcripción del inserto está dirigida por el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) después de inducción con metanol.

En determinadas realizaciones, un polipéptido secretado que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se purifica del medio de crecimiento de las levaduras. En determinadas realizaciones, los métodos usados para purificar un polipéptido del medio de crecimiento de las levaduras es el mismo que los usados para purificar el polipéptido de sobrenadantes de células bacterianas y de mamíferos.

En determinadas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se clona en un vector de expresión de baculovirus, tal como pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). En determinadas realizaciones, dicho vector puede usarse según las directrices del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio sin proteínas sF9 y para producir polipéptido recombinante. En determinadas realizaciones, un polipéptido se purifica y concentra a partir de dicho medio usando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia).

En determinadas realizaciones, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se expresa en un sistema de insectos. Algunos sistemas de insectos para la expresión de polipéptidos son muy conocidos para los expertos en la técnica. En uno de dichos sistemas, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. En determinadas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido puede insertarse en un gen no esencial del virus, por ejemplo, en el gen de la polihedrina, y ponerse bajo el control del promotor de ese gen. En determinadas realizaciones, la inserción exitosa de una molécula de ácido nucleico convertirá al gen no esencial en inactivo. En determinadas realizaciones, esta inactivación dará lugar a una característica detectable. Por ejemplo, la inactivación del gen de la polihedrina da lugar a la producción de virus que carecen de proteína de cubierta.

En determinadas realizaciones, pueden usarse virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia. Véase, por ejemplo, Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).

En determinadas realizaciones, se producen polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma preparados en células bacterianas como cuerpos de inclusión insolubles en las bacterias. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras que comprenden dichos cuerpos de inclusión se recogen por centrifugación; se lavan en NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. En determinadas realizaciones, el lisado se aclara por sonicación, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. En determinadas realizaciones, el sedimento que contiene polipéptido se resuspende en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM; se pone como una capa sobre 50 % de glicerol; y se centrifuga durante 30 minutos a 6.000 X g. En determinadas realizaciones, este sedimento puede resuspenderse en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) estándar desprovista de Mg++ y Ca++. En determinadas realizaciones, el polipéptido se purifica adicionalmente mediante fraccionamiento del sedimento resuspendido en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con SDS (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., mencionado anteriormente). En determinadas realizaciones, dicho gel puede sumergirse en KCI 0,4 M para visualizar la proteína, que puede escindirse y electroeluirse en tampón de ejecución del gel que carece de SDS. Según determinadas realizaciones, se produce una proteína de fusión con Glutatión-S-Transferasa (GST) en bacterias como una proteína soluble. En determinadas realizaciones, dicha proteína de fusión GST se purifica usando un Módulo de Purificación GST (Pharmacia).

En determinadas realizaciones, es deseable "replegar" determinados polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos que comprenden uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. En determinadas realizaciones, dichos polipéptidos se producen usando determinados sistemas recombinantes discutidos en la presente memoria. En determinadas realizaciones, los polipéptidos se "repliegan" y/u oxidan para formar la estructura terciaria deseada y/o para generar uniones disulfuro. En determinadas realizaciones, dicha estructura y/o uniones están relacionadas con una determinada actividad biológica de un polipéptido. En determinadas realizaciones, el replegamiento se consigue usando cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, exponer el agente polipéptido solubilizado a un pH típicamente por encima de 7 en presencia de un agente caotrópico. Un agente caotrópico ejemplar es guanidina. En determinadas realizaciones, la disolución de replegamiento/oxidación también contiene un agente reductor y la forma oxidada de ese agente reductor. En determinadas realizaciones, el agente reductor y su forma oxidada están presentes en una proporción que generará un potencial redox particular que permite que se produzca la reorganización de disulfuro. En determinadas realizaciones, dicha reorganización permite la formación de puentes de cisteína. Las parejas de redox ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, cisteína/cistamina, glutatión/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano ^dT^t, y 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. En determinadas realizaciones, se usa un co-disolvente para incrementar la eficiencia del replegamiento. Los codisolventes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares y arginina.

En determinadas realizaciones, se purifica sustancialmente un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma. Determinadas técnicas de purificación de proteínas son conocidas para los expertos en la técnica. En determinadas realizaciones, la purificación de la proteína implica el fraccionamiento en crudo de fraccionamientos de polipéptido de fracciones no polipeptídicas. En determinadas realizaciones, los polipéptidos se purifican usando técnicas cromatográficas y/o electroforéticas. Los métodos de purificación ejemplares incluyen, pero no están limitados a, precipitación con sulfato de amonio; precipitación con PEG; inmunoprecipitación; desnaturalización con calor seguida de centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero no limitado a, cromatografía de afinidad (por ejemplo, Proteína-A-Sepharose), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, y cromatografía en fase inversa; filtración en gel; cromatografía en hidroxiapatito; isoelectroenfoque; electroforesis en gel de poliacrilamida; y combinaciones de estas y otras técnicas. En determinadas realizaciones, un polipéptido se purifica por cromatografía líquida de proteínas rápida o por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En determinadas realizaciones, las etapas de la purificación pueden cambiarse o determinadas etapas pueden omitirse, y todavía dar lugar a un método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado.

En determinadas realizaciones, se cuantifica el grado de purificación de una preparación de polipéptido. Determinados métodos para cuantificar el grado de la purificación son conocidos por los expertos en la técnica. Determinados métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, determinar la actividad de unión específica de la preparación y evaluar la cantidad de un polipéptido en una preparación por análisis por SDS/PAGE. Determinados métodos ejemplares para evaluar la cantidad de la purificación de una preparación de polipéptido comprenden calcular la actividad de unión de una preparación y compararla con la actividad de unión de un extracto inicial. En determinadas realizaciones, los resultados de dicho cálculo se expresan como "factor de purificación". Las unidades usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependen del ensayo particular que se lleva a cabo.

En determinadas realizaciones, un polipéptido que comprende uno o más componentes de la ABP o la ABP en sí misma se purifica parcialmente. En determinadas realizaciones, la purificación parcial puede conseguirse usando menos etapas de purificación o utilizando formas diferentes del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC dará lugar generalmente a "factores de purificación" mayores que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. En determinadas realizaciones, los métodos que dan lugar a un grado menor de purificación pueden tener ventajas en la recuperación total del polipéptido, o en el mantenimiento de la actividad de unión de un polipéptido.

En determinados casos, la migración electroforética de un polipéptido puede variar, algunas veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE. Véase, por ejemplo, Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977). Se apreciará que en diferentes condiciones de electroforesis, los pesos moleculares aparentes de un polipéptido purificado o parcialmente purificado pueden ser diferentes.

Epítopos ejemplares

Se proporcionan epítopos a los que se unen los anticuerpos anti-PCSK9. En algunas realizaciones, los epítopos a los que se unen los anticuerpos descritos ahora son particularmente útiles. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno que se unen a cualquiera de los epítopos a los que se unen los anticuerpos descritos en la presente memoria son útiles. En algunas realizaciones, los epítopos a los que se unen cualquiera de los anticuerpos listados en la Tabla 2 y FIG. 2 y 3 son especialmente útiles.

En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para prevenir (por ejemplo, reducir) la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno a PCSK9. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para disminuir la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno a PCSK9. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para inhibir sustancialmente la unión de un anticuerpo anti-PCSK9 o proteína de unión a antígeno a PCSK9.

En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para aislar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para generar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 o una secuencia que comprende un epítopo de PCSK9 puede utilizarse como un inmunógeno para generar anticuerpos o proteínas de unión a antígeno que se unen a PCSK9. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 puede administrarse a un animal, y pueden obtenerse posteriormente anticuerpos que se unen a PCSK9 del animal. En determinadas realizaciones, un epítopo de PCSK9 o una secuencia que comprende un epítopo de PCSK9 puede utilizarse para interferir con la actividad normal mediada por PCSK9.

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria se unen específicamente al prodominio N-terminal y/o un dominio C-terminal.

En algunas realizaciones, el o los dominios/la o las regiones que contienen residuos que están en contacto con o están enterrados por un anticuerpo pueden identificarse mutando residuos específicos en PCSK9 (por ejemplo, un antígeno de tipo salvaje) y determinando si la proteína de unión a antígeno puede unirse a la proteína PCSK9 mutada o variante. Haciendo varias mutaciones individuales, pueden identificarse los residuos que juegan un papel directo en la unión o que están lo suficientemente próximos al anticuerpo de manera que una mutación puede afectar a la unión entre la proteína de unión a antígeno y el antígeno. A partir del conocimiento de estos aminoácidos, pueden dilucidarse el o los dominios o la o las regiones del antígeno que contienen residuos en contacto con la proteína de unión a antígeno o que están cubiertos por el anticuerpo. Dicho dominio puede incluir el epítopo de unión de una proteína de unión a antígeno. Un ejemplo específico de esta estrategia general utiliza un protocolo de escaneo de arginina/ácido glutámico (véase, por ejemplo, Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 y Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). En general, se sustituyen arginina y ácidos glutámicos (típicamente individualmente) por un aminoácido en el polipéptido de tipo salvaje porque estos aminoácidos están cargados y son voluminosos y tienen así el potencial de alterar la unión entre una proteína de unión a antígeno y un antígeno en la región del antígeno en la que se introduce la mutación. Las argininas que existen en el antígeno de tipo salvaje se reemplazan con ácido glutámico. Se obtiene una variedad de dichos mutantes individuales y los resultados de unión recogidos se analizan para determinar qué residuos afectan a la unión.

El ejemplo 39 describe uno de dichos escaneos de arginina/ácido glutámico de PCSK9 para proteínas de unión a antígeno para PCSK9 proporcionadas en la presente memoria. Se creó una serie de antígenos PCSK9 mutantes, teniendo cada antígeno mutante una única mutación. La unión de cada antígeno de PCSK9 mutante con varias ABP para PCSK9 se midió y comparó con la capacidad de las ABP seleccionadas de unirse a PCSK9 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 303).

Una alteración (por ejemplo, una reducción o incremento) en la unión entre una proteína de unión a antígeno y una PCSK9 variante según se usa en la presente memoria significa que hay un cambio en la afinidad de unión (por ejemplo, según se mide por métodos conocidos tales como ensayo Biacore o el ensayo basado en perlas descrito más adelante en los ejemplos), CE50, y/o un cambio (por ejemplo, una reducción) en la capacidad de unión total de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, según se demuestra por una disminución en Bmax en un gráfico de concentración de proteína de unión a antígeno frente a concentración de antígeno). Una alteración significativa en la unión indica que el residuo mutado está implicado directamente en la unión a la proteína de unión a antígeno o está muy cerca de la proteína de unión cuando la proteína de unión está unida al antígeno.

En algunas realizaciones, una reducción significativa en la unión significa que la afinidad de unión, CE50, y/o la capacidad entre una proteína de unión a antígeno y un antígeno de PCSK9 mutante está reducida más de 10 %, más de 20 %, más de 40 %, más de 50 %, más de 55 %, más de 60 %, más de 65 %, más de 70 %, más de 75 %, más de 80 %, más de 85 %, más de 90 % o más de 95 % respecto a la unión entre la proteína de unión a antígeno y una PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, mostrada en SEQ ID NO: 1 y/o SeQ ID NO: (303). En determinadas realizaciones, la unión se reduce por debajo de límites detectables. En algunas realizaciones, se demuestra una reducción significativa en la unión cuando la unión de una proteína de unión a antígeno a una proteína PCSK9 variante es menor de 50 % (por ejemplo, menor de 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 %) de la unión observada entre la proteína de unión a antígeno y una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, la proteína de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: (303). Dichas mediciones de la unión pueden hacerse usando una variedad de ensayos de unión conocidos en la técnica. Un ejemplo específico de uno de dichos ensayos se describe en el ejemplo 39.

En algunas realizaciones, se proporcionan proteínas de unión a antígeno que presentan una unión significativamente menor para una proteína PCSK9 variante en la que un residuo en una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303 se sustituye con arginina o ácido glutámico. En algunas realizaciones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 variante que tiene una cualquiera o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 244) de las mutaciones siguientes: R439E, E513R, V538r , E539R, e582R, r519E, H521R y Q554R comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En la notación abreviada usada aquí, el formato es: Residuo de tipo salvaje: Posición en el polipéptido: Residuo mutante, con la numeración de los residuos según se indica en s Eq ID nO: 1 o SEQ ID NO: 303.

En algunas realizaciones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 439, 513, 538, 539, 582, 519, 521 y 554, como se muestra en SEQ ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303). En algunas realizaciones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 439, 513, 538, 539, 582, 519, 521 y 554, como se muestra en SeQ ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas realizaciones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce o incrementa sustancialmente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o más) mutaciones en las posiciones siguientes: 439, 513, 538, 539, 582, 519, 521 y 554, en s Eq ID NO: 1 comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303.

En algunas realizaciones, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: R439E, E513R, V538R, E539RE582R, R519E, H521R y Q554R en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303).

En algunas realizaciones, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: R439E, E513R, V538R, e539R y E582R en SeQ ID No : 1 o SEQ ID NO: 303, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303). En algunas realizaciones, la unión se reduce. En algunas realizaciones, la reducción en la unión se observa como un cambio en CE50. En algunas realizaciones, el cambio en la CE50 es un incremento en el valor numérico de la CE50 (y así es una disminución en la unión). En algunas realizaciones, la unión de una ABP se reduce o incrementa significativamente para una proteína PCSK9 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) de las mutaciones siguientes: R519E, H521R y Q554R en SEQ ID NO: 1, comparada con una proteína PCSK9 de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303). En algunas realizaciones, la unión se reduce. En algunas realizaciones, la reducción en la unión se observa como un cambio en Bmax. En algunas realizaciones, el desplazamiento en Bmax es una reducción de la señal máxima generada por la ABP. En algunas realizaciones, para que un aminoácido sea parte de un epítopo, la Bmax se reduce en al menos 10 %, por ejemplo, reducciones de al menos cualquiera de las cantidades siguientes: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 100 por ciento pueden indicar, en algunas realizaciones, que el residuo es parte del epítopo.

Aunque las formas variantes enumeradas ahora se referencian respecto a la secuencia de tipo salvaje mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303, se apreciará que en una variante alélica de PCSK9 el aminoácido en la posición indicada podría ser diferente. También se contemplan las proteínas de unión a antígeno que muestran una unión significativamente menor para dichas formas alélicas de PCSK9. De acuerdo con esto, en algunas realizaciones, cualquiera de las realizaciones anteriores puede compararse con una secuencia alélica, en lugar de meramente la secuencia de tipo salvaje mostrada en la FIG. 1A.

En algunas realizaciones, la unión de una proteína de unión a antígeno se reduce significativamente para una proteína PCSK9 variante en la que el residuo en una posición seleccionada en la proteína PCSK9 de tipo salvaje se muta a cualquier otro residuo. En algunas realizaciones, los reemplazos descritos en la presente memoria arginina/ácido glutámico se usan para las posiciones identificadas. En algunas realizaciones, la alanina se usa para las posiciones identificadas.

Como se ha indicado anteriormente, los residuos implicados directamente en la unión o cubiertos por una proteína de unión a antígeno pueden identificarse a partir de los resultados del escaneo. Estos residuos pueden proporcionar así una indicación de los dominios o regiones de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 303 o SEQ ID NO: 3) que contienen la o las regiones de unión a las que se unen las proteínas de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno de los aminoácidos 439, 513, 538 y/o 539 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas realizaciones, más de uno (por ejemplo, 2, 3 o 4) de los residuos identificados son parte de la región a la que se une la ABP. En algunas realizaciones, la ABP compite con ABP 31A4.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se une a una región que contiene al menos uno de los aminoácidos 582, 519, 521 y/o 554 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En algunas realizaciones, más de uno (por ejemplo, 2, 3 o 4) de los residuos identificados son parte de la región a la que se une la ABP. En algunas realizaciones, la ABP compite con ABP 3C4.

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se unen a las regiones anteriores en un fragmento o la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303. En otras realizaciones, las proteínas de unión a antígeno se unen a polipéptidos que consisten en estas regiones. La referencia a "SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 303" indica que una o ambas de estas secuencias pueden emplearse o son relevantes. La expresión no indica que debe emplearse solo una.

Como se ha indicado anteriormente, la descripción anterior hace referencia a posiciones de aminoácidos específicas con referencia a SEQ ID NO: 1. Sin embargo, a lo largo de la memoria descriptiva, generalmente, se hace referencia a un dominio Pro/Cat que comienza en la posición 31, que se proporciona en SEQ ID NO: 3. Como se indica más adelante, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 303 carecen de la secuencia señal de PCSK9. Como tal, cualquier comparación entre estas varias descripciones debe tener en cuenta esta diferencia en la numeración. En particular, cualquier posición de aminoácido en SEQ ID NO: 1, corresponderá a una posición de aminoácido 30 aminoácidos más adelante en la proteína en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la posición 207 de SEQ ID NO: 1, corresponde a la posición 237 de SEQ ID NO: 3 (la secuencia de longitud completa, y el sistema de numeración usado en la presente memoria descriptiva, en general). La Tabla 39.6 muestra cómo las posiciones anteriormente indicadas, que hacen referencia a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID NO: 303), corresponden a SEQ ID NO: 3 (que incluye la secuencia señal). Así, cualquiera de las realizaciones indicadas anteriormente que se describen respecto a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID n O: 303), se describen en referencia a SEQ ID NO: 3, por las posiciones indicadas correspondientes.

Proteínas de unión a antígeno competidoras

En otro aspecto, se proporcionan proteínas de unión a antígeno que compiten con uno de los anticuerpos ejemplificados o fragmentos funcionales que se unen al epítopo descrito en la presente memoria por la unión específica a PCSK9. Dichas proteínas de unión a antígeno también pueden unirse al mismo epítopo que una de las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas en la presente memoria, o un epítopo superpuesto. Se espera que las proteínas de unión a antígeno y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno ejemplificadas muestren propiedades funcionales similares. Las proteínas de unión a antígeno y fragmentos ejemplificados incluyen los descritos anteriormente, incluyendo aquellos con las cadenas pesada y ligera, dominios de región variable y CDR incluidos en la TABLA 2 y/o FIG. 2-3. Así, como un ejemplo específico, las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan incluyen aquellas que compiten con un anticuerpo o proteína de unión a antígeno que tiene:

(a) las 6 de las CDR enumeradas para un anticuerpo enumerado en las FIG. 2-3;

(b) una VH y una VL enumeradas para un anticuerpo enumerado en la Tabla 2; o

(c) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas como se especifica para un anticuerpo enumerado en la Tabla 2.

Determinados usos terapéuticos y composiciones farmacéuticas

En determinados casos, la actividad de PCSK9 se correlaciona con varios estados patológicos humanos. Por ejemplo, en determinados casos, demasiada o demasiada poca actividad de PCSK9 se correlaciona con determinadas afecciones, tales como hipercolesterolemia. Por lo tanto, en determinados casos, la modulación de la actividad de PCSK9 puede ser terapéuticamente útil. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 neutralizante se usa para modular al menos una actividad de PCSK9. Dichos métodos pueden tratar y/o prevenir y/o reducir el riesgo de trastornos que están relacionados con niveles elevados de colesterol sérico o en los que los niveles elevados de colesterol son relevantes.

Como apreciará un experto en la técnica, a la vista de la presente descripción, los trastornos que están relacionados con, implican a, o pueden ser influidos por niveles diversos de colesterol, LDL, o LDLR pueden abordarse por varias realizaciones de las proteínas de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un "trastorno relacionado con colesterol" (que incluye "trastornos relacionados con colesterol sérico") incluye uno cualquiera o más de los siguientes: hipercolesterolemia, enfermedad cardíaca, síndrome metabólico, diabetes, enfermedad cardíaca coronaria, ictus, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Alzheimer y generalmente dislipidemias, que pueden manifestarse, por ejemplo, por un colesterol sérico total elevado, LDL elevado, triglicéridos elevados, VLDL elevado y/o HDL bajo. Algunos ejemplos no limitantes de dislipidemias primarias y secundarias que pueden tratarse usando una ABP, bien sola o en combinación con uno o más agentes adicionales incluyen el síndrome metabólico, diabetes mellitus, hiperlipidemia combinada familiar, hipertrigliceridemia familiar, hipercolesterolemias familiares, incluyendo hipercolesterolemia heterocigota, hipercolesterolemia homocigota, apoplipoproteína B-100 defectuosa familiar; hipercolesterolemia poligénica; enfermedad de eliminación de remanentes, deficiencia en lipasa hepática; dislipidemia secundaria a cualquiera de lo siguiente: dieta no adecuada, hipotiroidismo, fármacos incluyendo terapia con estrógeno y progestina, betabloqueantes y diuréticos de tiazida; síndrome nefrótico, fallo renal crónico, síndrome de Cushing, cirrosis biliar primaria, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, hepatoma, colestasis, acromegalia, insulinoma, deficiencia de la hormona de crecimiento aislada, e hipertrigliceridemia inducida por el alcohol. La ABP también puede ser útil para prevenir o tratar enfermedades ateroscleróticas, tales como, por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad arterial coronaria, enfermedad arterial periférica, ictus (isquémico y hemorrágico), angina de pecho, o enfermedad cerebrovascular y síndrome coronario agudo, infarto de miocardio. En algunas realizaciones, la ABP es útil para reducir el riesgo de: ataques cardíacos no letales, ictus letales y no letales, determinados tipos de cirugía cardíaca, hospitalización por fallo cardíaco, dolor de pecho en pacientes con enfermedad cardíaca, y/o eventos cardiovasculares debidos a enfermedad cardíaca establecida tales como ataque cardíaco previo, cirugía cardíaca previa, y/o dolor de pecho con evidencia de arterias obstruidas. En algunas realizaciones, la ABP y los métodos pueden usarse para reducir el riesgo de eventos cardiovasculares recurrentes.

Como apreciará un experto en la técnica, las enfermedades o trastornos que generalmente se pueden abordar (bien tratar o prevenir) a través del uso de estatinas también pueden beneficiarse de la aplicación de las presentes proteínas de unión a antígeno. Además, en algunas realizaciones, los trastornos o enfermedades que pueden beneficiarse de la prevención de la síntesis de colesterol o expresión incrementada de LDLR también pueden tratarse por varias realizaciones de las proteínas de unión a antígeno. Además, como apreciará un experto en la técnica, el uso de los anticuerpos anti-PCSK9 puede ser especialmente útil en el tratamiento de la diabetes. No solo es la diabetes un factor de riesgo para la enfermedad cardíaca coronaria, sino que la insulina incrementa la expresión de PCSK9. Esto es, la gente con diabetes tiene niveles elevados de lípidos plasmáticos (que puede estar relacionado con niveles altos de PCSK9) y pueden beneficiarse de la disminución de estos niveles. Esto se discute generalmente con más detalle en Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211 6218, 2006).

En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se administra a aquellos que tienen diabetes mellitus, aneurisma aórtico abdominal, aterosclerosis y/o enfermedad vascular periférica con el fin de disminuir sus niveles de colesterol sérico hasta un intervalo seguro. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno se administra a pacientes que presentan riesgo de desarrollar cualquiera de los trastornos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, las ABP se administran a sujetos que fuman, tienen hipertensión o un historial familiar de ataques cardíacos tempranos.

En algunas realizaciones, se administra a un sujeto una ABP si presenta un riesgo moderado o mayor en los objetivos de tratamiento NCEP de 2004. En algunas realizaciones, la ABP se administra a un sujeto si el nivel de colesterol LDL del sujeto es mayor de 160 mg/dl. En algunas realizaciones, la ABP se administra si el nivel de colesterol LDL de los sujetos es mayor de 130 (y tienen un riesgo moderado o moderadamente alto según los objetivos de tratamiento NCEP de 2004). En algunas realizaciones, la ABP se administra si el nivel de colesterol LDL de los sujetos es mayor de 100 (y tienen un riesgo alto o muy alto según los objetivos de tratamiento NCEP de 2004).

Un médico será capaz de seleccionar unas indicaciones de tratamiento y niveles de lípidos diana apropiados dependiendo del perfil individual de un paciente particular. Un estándar muy aceptado para guiar el tratamiento de hiperlipidemia es el Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, National Institutes of Health, Publicación del NIH n.° 02-5215 (2002).

En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se usan para disminuir la cantidad de actividad de PCSK9 desde un nivel anormalmente alto o incluso un nivel normal. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se usan para tratar o prevenir hipercolesterolemia y/o en la preparación de medicamentos de estas y/o para otros trastornos relacionados con el colesterol (tales como los indicados en la presente memoria). En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se usa para tratar o prevenir afecciones tales como hipercolesterolemia en las que la actividad de PCSK9 es normal. En dichas afecciones, por ejemplo, la reducción de la actividad de PCSK9 por debajo de lo normal puede proporcionar un efecto terapéutico.

En algunas realizaciones, se usa más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 para modular la actividad de PCSK9.

En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos para el tratamiento de un trastorno relacionado con el colesterol, tal como hipercolesterolemia que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más proteínas de unión a antígeno para PCSK9 y otro agente terapéutico.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra sola. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra antes de la administración de al menos otro agente terapéutico. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra simultáneamente con la administración de al menos otro agente terapéutico. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra posteriormente a la administración de al menos otro agente terapéutico. En otras realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se administra antes de la administración de al menos otro agente terapéutico. Los agentes terapéuticos (aparte de la proteína de unión a antígeno), incluyen, pero no están limitados a, al menos otro agente o un agente que disminuye el colesterol (colesterol sérico y/o corporal total). En algunas realizaciones, el agente incrementa la expresión de LDLR, se ha observado que incrementa los niveles de HDL sérico, disminuye los niveles de LDL o disminuye los niveles de triglicéridos. Los agentes ejemplares incluyen, pero no están limitados a, estatinas (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina), ácido nicotínico (Niacina) (NIACOR, NIASPAN (niacina de liberación lenta), SLO-NIACIN (niacina de liberación lenta)), ácido fíbrico (LOp ID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrato), secuestrantes de ácido biliar (QUESTRAN (colestiramina), colesevelam (WELCHOL), COLESTID (colestipol)), inhibidores de la absorción del colesterol (ZETIA (ezetimibe)), combinación de ácido nicotínico con estatina (ADVICOR (LOVASTATIN y NIASPAN), combinación de una estatina con un inhibidor de la absorción (VYTORIN (ZOCOR y ZETIA) y/o agentes modificadores de lípidos. En algunas realizaciones, la ABP se combina con agonistas de PPAR gamma, agonistas de PPAR alfa/gamma, inhibidores de la escualeno sintasa, inhibidores de CETP, anti-hipertensores, agentes anti-diabéticos (tales como sulfonil ureas, insulina, análogos de GLP-1, inhibidores de DDPIV), moduladores de ApoB, inhibidores de MTP y/o tratamientos de la arteriosclerosis obliterante. En algunas realizaciones, la ABP se combina con un agente que incrementa el nivel de proteína LDLR en un sujeto, tal como estatinas, determinadas citocinas como oncostatina M, estrógeno, y/o determinados ingredientes herbales tales como berberina. En algunas realizaciones, la ABP se combina con un agente que incrementa los niveles de colesterol sérico en un sujeto (tales como determinados agentes anti-psicóticos, determinados inhibidores de la proteasa de VIH, factores de la dieta tales como alta fructosa, sacarosa, colesterol o determinados ácidos grasos y determinados agonistas del receptor nuclear y antagonistas para RXR, RAR, LXR, FXR). En algunas realizaciones, la ABP se combina con un agente que incrementa el nivel de PCSK9 en un sujeto, tales como estatinas y/o insulina. La combinación de los dos puede permitir mitigar los efectos secundarios indeseables de otros agentes por la ABP. Como apreciará un experto en la técnica, en algunas realizaciones, la ABP se combina con el otro agente/compuesto. En algunas realizaciones, la ABP y el otro agente se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, la ABP y el otro agente no se administran simultáneamente, administrándose la ABP antes o después de la administración del agente. En algunas realizaciones, el sujeto recibe tanto la ABP como el otro agente (que incrementa el nivel de LDLR) durante el mismo periodo de prevención, aparición de un trastorno y/o periodo de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. En determinadas realizaciones, la terapia de combinación comprende una proteína de unión a antígeno capaz de unirse a PCSK9, en combinación con al menos un agente anti-colesterol. Los agentes incluyen, pero no están limitados a, composiciones químicas preparadas sintéticamente in vitro, anticuerpos, regiones de unión a antígeno, y combinaciones y conjugados de estos. En determinadas realizaciones, un agente puede actuar como un agonista, antagonista, modulador alostérico o toxina. En determinadas realizaciones, un agente puede actuar para inhibir o estimular su diana (por ejemplo, activación o inhibición de receptor o enzima), y de esta manera estimular la expresión incrementada de LDLR o disminuir los niveles de colesterol sérico.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse antes de, simultáneamente con, y posteriormente a, el tratamiento con un agente que disminuye el colesterol (colesterol sérico y/o total). En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse profilácticamente para prevenir o mitigar el inicio de hipercolesterolemia, enfermedad cardíaca, diabetes, y/o cualquier trastorno relacionado con el colesterol. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede administrarse para el tratamiento de una afección de hipercolesterolemia existente. En algunas realizaciones, la ABP retrasa el inicio del trastorno y/o síntomas asociados con el trastorno. En algunas realizaciones, la ABP se proporciona a un sujeto que no presenta ningún síntoma de uno cualquiera de los trastornos relacionados con el colesterol o un subconjunto de estos.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 se usa con agentes terapéuticos particulares para tratar varios trastornos relacionados con el colesterol, tales como hipercolesterolemia. En determinadas realizaciones, a la vista de la afección y el nivel deseado de tratamiento, pueden administrarse dos, tres o más agentes. En determinadas realizaciones, dichos agentes pueden proporcionarse conjuntamente por inclusión en la misma formulación. En determinadas realizaciones, dicho agente o agentes y una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden proporcionarse conjuntamente por inclusión en la misma formulación. En determinadas realizaciones, dichos agentes pueden formularse separadamente y proporcionarse conjuntamente por inclusión en un kit de tratamiento. En determinadas realizaciones, dichos agentes y una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden formularse separadamente y proporcionarse conjuntamente por inclusión en kit de tratamiento. En determinadas realizaciones, dichos agentes pueden proporcionarse separadamente. En determinadas realizaciones, cuando se administran por terapia génica, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden incluirse en el mismo vector. En determinadas realizaciones, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden estar bajo el control de la misma región promotora. En determinadas realizaciones, los genes que codifican agentes proteicos y/o una proteína de unión a antígeno para PCSK9 pueden estar en vectores separados.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno para PCSK9 junto con un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, junto con un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede usarse con al menos un agente terapéutico para la inflamación. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 puede usarse con al menos un agente terapéutico para un trastorno inmunitario. Los agentes terapéuticos ejemplares para la inflamación y trastornos inmunitarios incluyen, pero no están limitados a inhibidores de la ciclooxigenasa tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2), moduladores de molécula pequeña de la proteína cinasa activada por mitógeno de 38 kDa (p38-MAPK); moduladores de molécula pequeña de moléculas intracelulares implicadas en las rutas de la inflamación, en el que dichas moléculas intracelulares incluyen, pero no están limitadas a, jnk, IKK, NF- ^k B, ZAP70 e lck. Determinados agentes terapéuticos ejemplares para la inflamación se describen, por ejemplo, en C.A. Dinarello y L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Tercera Edición (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 diferente. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 en donde las proteínas de unión a antígeno para PCSK9 se unen a más de un epítopo. En algunas realizaciones, las varias proteínas de unión a antígeno no competirán entre sí por la unión a PCSK9. En algunas realizaciones, cualquiera de las proteínas de unión a antígeno representadas en la Tabla 2 y FIG. 2 y/o 3 pueden combinarse conjuntamente en una composición farmacéutica.

En determinadas realizaciones, los materiales de formulación aceptables son preferiblemente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. En algunas realizaciones, el o los materiales de formulación son para administración s.c. y/o I.V. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En determinadas realizaciones, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de volumen (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)); agentes de formación de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); materiales de relleno; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saporíferos y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes azúcares (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). En algunas realizaciones, la formulación comprende PBS; NaOAC 20 mM, pH 5,2, NaCl 50 mM; y/o N^aO^aC 10 mM, pH 5,2, 9 % de sacarosa.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o una molécula terapéutica se une a un vehículo que prolonga la semivida conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol, glucógeno (por ejemplo, glucosilación de la ABP) y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de los Estados Unidos con n.° de serie 09/428.082, ahora Patente de los Estados Unidos n.° 6.660.843 y Solicitud Publicada PCT n.° WO 99/25044.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta pretendida de administración, formato de administración y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente. En determinadas realizaciones, dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de los anticuerpos de la invención.

En determinadas realizaciones, el vehículo o transportador primario en una composición farmacéutica puede ser bien de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un vehículo o transportador adecuado puede ser agua para inyección, disolución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, suplementado posiblemente con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. En algunas realizaciones, la disolución salina comprende disolución salina tamponada con fosfato isotónica. En determinadas realizaciones, son vehículos adicionales ejemplares la disolución salina tamponada neutra o disolución salina mezclada con seroalbúmina. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto de este adecuado. En determinadas realizaciones, una composición que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente) en la forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, una composición que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede seleccionarse para administración parenteral. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tubo digestivo, tal como por vía oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la técnica.

En determinadas realizaciones, los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En determinadas realizaciones, se usan tampones para mantener la composición en un pH fisiológico o en un pH ligeramente menor, típicamente en un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

En determinadas realizaciones, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en la forma de una disolución acuosa sin pirógenos parenteralmente aceptable que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9 deseada, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, un vehículo para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la que una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una disolución estéril, isotónica, conservada apropiadamente. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto que puede entonces administrarse mediante una inyección de liberación lenta. En determinadas realizaciones, también puede usarse ácido hialurónico, y puede tener el efecto de estimular una duración sostenida en la circulación. En determinadas realizaciones, pueden usarse dispositivos de fármaco implantables para introducir la molécula deseada.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse como un polvo seco para inhalación. En determinadas realizaciones, una disolución de inhalación que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, puede formularse con un propulsor para administración de aerosol. En determinadas realizaciones, las disoluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT n.° PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas.

En determinadas realizaciones, se contempla que las formulaciones pueden administrarse por vía oral. En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que se administra de esta manera puede formularse con o sin aquellos vehículos usados rutinariamente en la formación de compuestos de formas de dosificación sólida tales como comprimidos y cápsulas. En determinadas realizaciones, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación pre-sistémica. En determinadas realizaciones, al menos un agente adicional puede incluirse para facilitar la absorción de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales. En determinadas realizaciones, también pueden emplearse diluyentes, saporíferos, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. En determinadas realizaciones, mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. En determinadas realizaciones, los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican proteínas de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un o unos agentes terapéuticos adicionales, en formulaciones de administración sostenida o controlada. En determinadas realizaciones, las técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos de liposomas, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación lenta, también son conocidas para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud PCT n.° PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. En determinadas realizaciones, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeables en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3.773.919 y EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetato (Langer et al., mencionado anteriormente) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). En determinadas realizaciones, las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

La composición farmacéutica que se va a usar para administración in vivo típicamente es estéril. En determinadas realizaciones, esto puede conseguirse por filtración a través de membranas de filtración estériles. En determinadas realizaciones, cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede realizarse bien antes de o después de la liofilización y reconstitución. En determinadas realizaciones, la composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolución. En determinadas realizaciones, las composiciones parenterales se ponen generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.

En determinadas realizaciones, una vez se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. En determinadas realizaciones, dichas formulaciones pueden almacenarse bien en forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administración.

En determinadas realizaciones, se proporcionan kits para producir una unidad de administración de dosis única. En determinadas realizaciones, el kit puede contener tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En determinadas realizaciones, se incluyen los kits que contienen jeringas pre-cargadas de una única cámara o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).

En determinadas realizaciones, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento, según determinadas realizaciones, variarán así, en parte, por la molécula administrada, la indicación para la que una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se está usando, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En determinadas realizaciones, el médico puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En determinadas realizaciones, una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En determinadas realizaciones, la dosificación puede variar de 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg.

En determinadas realizaciones, la frecuencia de la dosificación tendrá en cuenta los parámetros farmacocinéticos de una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales en la formulación usada. En determinadas realizaciones, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que consiga el efecto deseado. En determinadas realizaciones, la composición puede administrarse, por lo tanto, como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace rutinariamente por los expertos en la técnica y está en el ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. En determinadas realizaciones, las dosificaciones apropiadas pueden averiguarse a través del uso de datos de respuesta a la dosis apropiados. En algunas realizaciones, la cantidad y frecuencia de la administración puede tener en cuenta el nivel de colesterol deseado (sérico y/o total) que se quiere obtener y el nivel de colesterol presente del sujeto, nivel de LDL y/o niveles de LDLR, todos los cuales pueden obtenerse por métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica.

En determinadas realizaciones, la ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por vía oral, a través de inyección por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, subcutánea, intra-ocular, intraarterial, intraportal o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En determinadas realizaciones, las composiciones pueden administrarse por inyección en bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación.

En determinadas realizaciones, la composición puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En determinadas realizaciones, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por difusión, bolo con liberación con el tiempo, o administración continua.

En determinadas realizaciones, puede ser deseable usar una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, de una manera ex vivo. En dichos casos, las células, tejidos y/u órganos que se han retirado del paciente se exponen a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno para PCSK9, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, después de lo cual, las células, tejidos y/u órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a antígeno para PCSK9 y/o cualesquiera agentes terapéuticos adicionales puede administrarse implantando determinadas células que se han modificado por ingeniería genética, usando métodos tales como los descritos en la presente memoria, para expresar y secretar los polipéptidos. En determinadas realizaciones, dichas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. En determinadas realizaciones, las células pueden inmortalizarse. En determinadas realizaciones, con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. En determinadas realizaciones, los materiales de encapsulación son típicamente receptáculos poliméricos biocompatibles, semi-permeables o membranas que permiten la liberación del o de los productos proteicos pero que evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Tomando como base la capacidad de las ABP para neutralizar significativamente la actividad de PCSK9 (como se demuestra en los ejemplos siguientes), estas ABP tendrán efectos terapéuticos en el tratamiento y prevención de síntomas y afecciones que resultan de la actividad mediada por PCSK9, tales como hipercolesterolemia.

Aplicaciones en diagnóstico

En algunas realizaciones, la ABP se usa como una herramienta de diagnóstico. La ABP puede usarse para ensayar la cantidad de PCSK9 presente en una muestra y/o sujeto. Como apreciará un experto en la técnica, dichas ABP no necesitan ser ABP neutralizantes. En algunas realizaciones, la ABP de diagnóstico no es una ABP neutralizante. En algunas realizaciones, la ABP de diagnóstico se une a un epítopo diferente del que se une la ABP neutralizante. En algunas realizaciones, las dos ABP no compiten entre sí.

En algunas realizaciones, las ABP descritas en la presente memoria se usan o proporcionan en un kit y/o método de ensayo para la detección de PCSK9 en tejidos o células de mamíferos con el fin de cribar/diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de PCSK9. El kit comprende una ABP que se une a PCSK9 y medios para indicar la unión de la ABP con PCSK9, si está presente, y opcionalmente los niveles de la proteína PCSK9. Pueden usarse varios medios para indicar la presencia de una ABP. Por ejemplo, pueden unirse a la ABP fluoróforos, otras sondas moleculares, o enzimas y la presencia de la ABP puede observarse de varias maneras. El método para cribar dichos trastornos puede implicar el uso del kit, o simplemente el uso de una de las ABP descritas y la determinación de si la ABP se une a PCSK9 en una muestra. Como apreciará un experto en la técnica, los niveles altos o elevados de PCSK9 darán lugar a mayores cantidades de la ABP uniéndose a PCSK9 en la muestra. Así, el grado de la unión de la ABP puede usarse para determinar cuánta PCSK9 hay en una muestra. Los sujetos o muestras con una cantidad de PCSK9 que es mayor de una cantidad predeterminada (por ejemplo, una cantidad o intervalo que tendría una persona sin un trastorno relacionado con PCSK9) pueden caracterizarse como que tienen un trastorno mediado por PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se administra a un sujeto que toma una estatina, con el fin de determinar si la estatina ha incrementado la cantidad de PCSK9 en el sujeto.

En algunas realizaciones, la ABP es una ABP no neutralizante y se usa para determinar la cantidad de PCSK9 en un sujeto que recibe un tratamiento con ABP y/o estatina.

EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes, incluyendo los experimentos realizados y los resultados conseguidos, se proporcionan solo para propósitos ilustrativos y no deben considerarse como limitantes de la presente invención.

EJEMPLO 1

Inmunización y titulación

Generación de anticuerpos anti-PCSK9 e hibridomas

Se produjeron anticuerpos frente a la forma madura de PCSK9 (representada como la secuencia en la FIG. 1A, con el pro-dominio subrayado), en ratones XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA), que son ratones que contienen genes de inmunoglobulina humana. Se usaron dos grupos de ratones XenoMouse®, grupo 1 y 2, para producir anticuerpos frente a PCSK9. El grupo 1 incluyó ratones de la cepa XenoMouse® XMG2-KL, que producen anticuerpos IgG2^Ke IgG2A completamente humanos. Los ratones del grupo 1 se inmunizaron con PCSK9 humana. PCSK9 se preparó usando técnicas recombinantes estándar usando la secuencia de GenBank como referencia (NM_174936). El grupo 2 implicó a ratones de la cepa XenoMouse® XMG4-KL, que producen anticuerpos IgG4^Ke IgG4A completamente humanos. Los ratones del grupo 2 también se inmunizaron con PCSK9 humana.

Se inyectó a los ratones de ambos grupos antígeno once veces, según el programa en la Tabla 3. En las inmunizaciones iniciales, se inyectaron a cada ratón un total de 10 pg de antígeno administrado intraperitonealmente en el abdomen. Los refuerzos posteriores son dosis de 5 ug y el método de inyección se alternó entre inyecciones intraperitoneales en el abdomen e inyecciones subcutáneas en la base de la cola. Para las inyecciones intraperitoneales el antígeno se prepara como una emulsión con TiterMax® Gold (Sigma, n.° de Cat T2684) y para las inyecciones subcutáneas el antígeno se mezcla con Alúmina (fosfato de aluminio) y oligos CpG. En las inyecciones 2 a 8 y 10, se inyectaron a cada ratón un total de 5 pg de antígeno en el gel de alúmina adyuvante. Se administra una inyección final de 5 pg de antígeno por ratón en disolución salina tamponada con fosfato y se administra en 2 sitios 50 % IP en el abdomen y 50 % SQ en la base de la cola. Los programas de inmunización se resumen en la Tabla 3, mostrada a continuación.

TABLA 3

(continuación)

El protocolo usado para titular los animales XenoMouse fue como sigue: se recubrieron placas de unión media Costar 3368 con neutravadina a 8 ug/ml (50 ul/pocillo) y se incubaron a 4 0C en 1XPBS/0,05 % de azida toda la noche. Se lavaron usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Las placas se bloquearon usando 250 ul de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron durante al menos 30 minutos a TA. El bloqueo se eliminó por lavado usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Se capturó entonces b-PCSK9 humana a 2 ug/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM (diluyente del ensayo) 50 ul/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Se lavó entonces usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. Para el anticuerpo primario, se tituló el suero 1:3 en duplicado de 1: 100. Esto se hizo en diluyente del ensayo 50 ul/pocillo y se incubó durante 1 h a TA. Se lavó entonces usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO. El anticuerpo secundario fue Fc anti IgG Humana de cabra HRP a 400 ng/ml en diluyente del ensayo a 50 ul/pocillo. Esto se incubó durante 1 h a TA. Esto se lavó usando lavado de 3 ciclos TiterTek con agua RO y se secó con golpecitos en toallitas de papel. Para el sustrato, se usó una disolución TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 ul/pocillo) y se dejó revelar durante 30 min a TA.

Los protocolos seguidos en los ensayos ELISA fueron como sigue: Para muestras que comprenden b-PCSK9 sin etiqueta V5His se empleó el protocolo siguiente: se emplearon placas de unión media Costar 3368 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 8 pg/ml en 1XPBS/0,05 % de Azida, (50 pl/pocillo). Las placas se incubaron a 4 °C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek M384 (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 250 pl de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó una lavado de 3 ciclos. La captura fue b-hu PCSK9, sin una etiqueta V5, y se añadió a 2 pg/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM (40 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Los sueros se titularon 1:3 en duplicado de 1:100, y la fila H fue el blanco para los sueros. La titulación se hizo en diluyente del ensayo, a un volumen de 50 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se realizó un lavado de 3 ciclos. Se añadió Fc anti IgG Humana de cabra h Rp a 100 ng/ml (1:4000) en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM (50 pl/pocillo) a la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Las placas se secaron con golpecitos en toallita de papel. Finalmente, se añadió TMB de 1 etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 pl/pocillo) a la placa y se paró con ácido clorhídrico 1 N (50 pl/pocillo) después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.

Los controles positivos para detectar PCSK9 unida a las placas fueron receptor de LDL soluble (R&D Systems, Cat n.° 2148LD/CF) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-PCSK9 (Caymen Chemical n.° 10007185) titulado 1:3 en duplicado de 3 pg/ml en diluyente del ensayo. LDLR se detectó con anti LDLR de cabra (R&D Systems, Cat n.° AF2148) y Fc anti IgG de cabra de conejo HRP a una concentración de 400 ng/ml; el policlonal de conejo se detectó con Fc anti-IgG de conejo de cabra a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. El control negativo fue sueros XMG2-KL y XMG4-KL sin estimular titulados 1:3 en duplicado de 1:100 en diluyente del ensayo.

Para las muestras que comprenden b-PCSK9 con una etiqueta V5His se empleó el protocolo siguiente: se emplearon placas de unión media Costar 3368 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 8 pg/ml en 1XPBS/0,05 % de Azida; (50 pl/pocillo). Las placas se incubaron a 40C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek M384 (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 250 pl de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La captura fue b-hu PCSK9, con una etiqueta V5, y se añadió a 2 pg/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM (40 pl/pocillo). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó un lavado de 3 ciclos. Los sueros se titularon 1:3 en duplicado de 1:100, y la fila H fue el blanco para los sueros. La titulación se hizo en diluyente del ensayo, a un volumen de 50 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas M384 operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadió Fc anti IgG Humana de cabra HRP a 400 ng/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a 50 pl/pocillo a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Las placas se secaron con golpecitos con toallita de papel. Finalmente, se añadió TMB de 1 etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 pl/pocillo) a la placa y la placa se paró con ácido clorhídrico 1 N (50 pl/pocillo) después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.

El control positivo fue LDLR, anti-PCSK9 de conejo titulado 1:3 en duplicado de 3 pg/ml en diluyente del ensayo. LDLR detecta con anti-LDLR de cabra (R&D Systems, Cat n.° AF2148) y Fc de conejo anti-IgG de cabra HRp a una concentración de 400 ng/ml; poli de conejo detectado con Fc de cabra anti-IgG de conejo a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. Anti-His 1.2,3 y anti-V5 1.7.1 humano titulado 1:3 en duplicado de 1 pg/ml en diluyente del ensayo; ambos detectados con Fc de cabra anti-IgG humana HRP a una concentración de 400 ng/ml en diluyente del ensayo. El control negativo fue sueros XMG2-KL y XMG4-KL sin estimular titulados 1:3 en duplicado de 1:100 en diluyente del ensayo.

Las titulaciones del anticuerpo frente a PCSK9 humana se ensayaron por ensayo ELISA para ratones inmunizados con antígeno soluble como se describe. La Tabla 4 resume los datos de ELISA e indica que hubo algunos ratones que parecieron ser específicos para PCSK9. Véase, por ejemplo, la Tabla 4. Por lo tanto, al final del programa de inmunización, se seleccionaron 10 ratones (en negrita en la Tabla 4) para recogida, y se aislaron los esplenocitos y linfocitos de los bazos y ganglios linfáticos respectivamente, como se describe en la presente memoria.

TABLA 4

EJEMPLO 2

Recuperación de linfocitos, aislamientos de linfocitos B, fusiones y generación de hibridomas

Este ejemplo muestra cómo se recuperaron las células inmunitarias y se generaron los hibridomas. Se sacrificaron ratones inmunizados seleccionados por dislocación cervical y los ganglios linfáticos drenantes se recogieron y combinaron de cada cohorte. Los linfocitos B se disociaron del tejido linfoide moliendo en DMEM para liberar las células de los tejidos, y las células se suspendieron en DMEM. Las células se contaron, y se añadieron 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos al sedimento celular para resuspender las células suavemente pero completamente.

Los linfocitos se mezclaron con células de mieloma no secretor P3X63Ag8.653 adquiridas en la ATCC, cat. n.° CRL 1580 (Kearney et al., (1979) J. Immunol. 123, 1548-1550) a una proporción de 1:4. La mezcla de células se sedimentó suavemente por centrifugación a 400 x g 4 min. Después de decantar el sobrenadante, las células se mezclaron suavemente usando una pipeta de 1 ml. Se añadió lentamente disolución precalentada de PEG/DMSO de Sigma (cat n.° P7306) (1 ml por millón de linfocitos B) con agitación suave durante 1 min seguido de 1 min de mezclado. Se añadió IDMEM precalentado (2 ml por millón de linfocitos B) (DMEM sin glutamina, L-glutamina, pen/estrep, MEM aminoácidos no esenciales (todos de Invitrogen), durante 2 minutos con agitación suave. Finalmente, se añadió IDMEM precalentado (8 ml por 106 linfocitos B) durante 3 minutos.

Las células fusionadas se sedimentaron a 400 x g 6 min y se resuspendieron en 20 ml de medio de selección (DMEM (Invitrogen), 15 % de FBS (Hyclone), suplementado con L-glutamina, pen/estrep, MEM aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol (todos de Invitrogen), HA-Azaserina Hipoxantina y OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (ambos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim)) por millón de linfocitos B. Las células se incubaron durante 20-30 min a 37 C y se resuspendieron en 200 ml de medio de selección y se cultivaron durante 3-4 días en matraz T175 antes de la siembra en placas de 96 pocillos. Así, se produjeron hibridomas que produjeron proteínas de unión a antígeno para PCSK9.

EJEMPLO 3

Selección de anticuerpos para PCSK9

El presente ejemplo muestra cómo se caracterizaron y seleccionaron las diferentes proteínas de unión a antígeno para PCSK9. Se evaluó la unión de anticuerpos secretados (producidos a partir de los hibridomas producidos en los Ejemplos 1 y 2) a PCSK9. La unión a PCSK9 soluble se analizó por ELISA, como se describe más adelante. Se usó BIAcore® (resonancia de plasmón superficial) para cuantificar la afinidad de la unión. Cribado primario

Se realizó un cribado primario para anticuerpos que se unen a PCSK9 de tipo salvaje. El cribado primario se realizó en dos recogidas. El cribado primario comprendió un ensayo ELISA y se realizó usando el protocolo siguiente:

Se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a una concentración de 4 pg/ml en 1XPBS/0,05 % de Azida, a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron a 40C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 pl de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron. De nuevo, se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra de captura fue PCSK9 biotinilada, sin una etiqueta V5, y se añadió a 0,9 pg/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 10 pl de sobrenadante en 40 pl de 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM y se incubó 1,5 horas a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 pl/pocillo de anti-IgG Fc Humana de cabra POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a la placa y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 pl/pocillo de TMB. de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 pl/pocillo de ácido clorhídrico 1 N después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek.

El cribado primario resultó en un total de 3.104 hibridomas específicos de antígeno identificados de las dos recogidas. Tomando como base la DO más alta de ELISA, se promovieron 1.500 hibridomas por recogida para un total de 3.000 positivos.

Cribado confirmatorio

Los 3.000 positivos se volvieron a cribar para unión a PCSK9 de tipo salvaje para confirmar que se establecieron hibridomas estables. El cribado se realiza como sigue: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 3 pg/ml en 1XPBS/0,05 %Azida a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron a 40C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 pl de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas M384. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra de captura fue b-PCSK9, sin una etiqueta V5, y se añadió a 0,9 pg/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 10 pl de sobrenadante en 40 pl de 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM y se incubó 1,5 horas a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 pl/pocillo de anti-IgG Fc Humana de cabra POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a la placa, y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 pl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 pl/pocillo de ácido clorhídrico 1 N después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. Un total de 2.441 positivos se repitieron en el segundo cribado. Estos anticuerpos se usaron en los cribados posteriores.

Cribado de reactividad cruzada en ratón

El panel de hibridomas se cribó para reactividad cruzada con PCSK9 de ratón para asegurar que los anticuerpos podían unirse a PCSK9 tanto humana como de ratón. Se empleó el protocolo siguiente en el cribado de reactividad cruzada: se emplearon placas de unión media de 384 pocillos Costar 3702 (Corning Life Sciences). Las placas se recubrieron con neutravadina a 3 pg/ml en 1XPBS/0,05 % de Azida a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron a 40C toda la noche. Las placas se lavaron usando un lavador de placas Titertek (Titertek, Huntsville, AL). Se realizó un lavado de 3 ciclos. Las placas se bloquearon con 90 pl de 1XPBS/1 % de leche y se incubaron aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek. Se realizó un lavado de 3 ciclos. La muestra se captura fue PCSK9 de ratón biotinilada, y se añadió a 1 pg/ml en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a un volumen de 40 pl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron usando el lavador de placas Titertek operado usando un lavado de 3 ciclos. Se transfirieron 50 pl de sobrenadante a las placas y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. De nuevo, las placas se lavaron usando un lavado de 3 ciclos. Se añadieron 40 pl/pocillo de Fc de cabra anti-IgG humana POD a una concentración de 100 ng/ml (1:4.000) en 1XPBS/1 % de leche/Ca2+ 10 mM a la placa y la placa se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez más, usando un lavado de 3 ciclos. Finalmente, se añadieron 40 pl/pocillo de TMB de una etapa (Neogen, Lexington, Kentucky) a la placa y se paró con 40 pl/pocillo de ácido clorhídrico 1 N después de 30 minutos a temperatura ambiente. Las DO se leyeron inmediatamente a 450 nm usando un lector de placas Titertek. Se observó que 579 anticuerpos reaccionaban de manera cruzada con PCSK9 de ratón. Estos anticuerpos se usaron en los cribados posteriores.

Resultados del cribado

Tomando como base los resultados de los ensayos descritos, se identificaron varias líneas de hibridoma como productoras de anticuerpos con interacciones deseadas con PCSK9. Se usó la dilución limitante para aislar un número manejable de clones de cada línea. Los clones se designaron por el número de línea de hibridoma (por ejemplo 21B12) y número de clon (por ejemplo 21B12.1). En general, no se detectaron diferencias entre los diferentes clones de una línea particular por los ensayos funcionales descritos en la presente memoria. Los clones aislados se expandieron cada uno en 50-100 ml de medio de hibridoma y se dejó que crecieran hasta agotamiento, (es decir, menos de aproximadamente 10 % de viabilidad celular). La concentración y potencia de los anticuerpos para PCSK9 en los sobrenadantes de estos cultivos se determinaron por ELISA y por ensayo funcional in vitro, como se describe en la presente memoria. Como resultado del cribado descrito en la presente memoria, se identificaron los hibridomas con la titulación mayor de anticuerpos para PCSK9. Los hibridomas seleccionados se muestran en las FIGS 2A-3D y Tabla 2.

EJEMPLO 4.1

Producción de anticuerpos IgG431H4 humanos de hibridomas

Este ejemplo describe generalmente cómo se produjo una de las proteínas de unión a antígeno a partir de una línea de hibridoma. El trabajo de producción usó generación de 50 ml de sobrenadante agotado seguido de purificación con proteína A. La producción Integra fue para aumento de escala y se realizó posteriormente. La línea de hibridoma 31H4 se cultivó en matraces T75 en 20 ml de medio (Medio Integra, Tabla 5). Cuando el hibridoma estaba casi confluente en los matraces T75, se transfirió a un matraz Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat n.° 90005).

El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se puso un volumen de 20-30 ml de células de hibridoma en una densidad celular mínima de 1x106 células por ml de la línea de hibridoma 31H4 en la cámara pequeña de un matraz Integra en medio Integra (véase la Tabla 5 para los componentes del medio Integra). Se puso medio Integra solo (1 l) en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a células de hibridoma y a anticuerpos producidos por estas células. Así, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por estas células de hibridoma se retuvieron en la cámara pequeña.

Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. La muestra de medio recogido resultante de la línea de hibridoma se sedimentó para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000 rpm) y el sobrenadante resultante se filtró (0,22 um). El medio acondicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A-Sepharose. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como Citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sepharose Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 31H4 son Sepharose Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.

__________ TABLA 5__________

Composición del medio_________

MEDIO INTEGRA_____________

HSFM______________________

10 % suero con IgG Ultra Baja

2 mmoles/l L-glutamina_________

1 % de NEAA________________

4 g/l de glucosa_______________

EJEMPLO 4.2

Producción de anticuerpos IgG231H4 Humanos recombinantes de células transfectadas

El presente ejemplo muestra cómo se produjeron los anticuerpos IgG2 31H4 a partir de células transfectadas. Las células 293 para la expresión transitoria y las células CHO para expresión estable se transfectaron con plásmidos que codificaban las cadenas pesada y ligera de 31H4. El medio acondicionado de las células transfectadas se recuperó eliminando las células y restos celulares. El medio acondicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A-Sepharose. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tal como resina Sepharose Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 31H4 son Sepharose Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.

EJEMPLO 5

Producción de anticuerpos IgG421B12 humanos de hibridomas

El presente ejemplo muestra cómo se produjo el anticuerpo IgG4 21B12 a partir de hibridomas. La línea de hibridoma 21B12 se cultivó en matraces T75 en medio (Medio Integra, Tabla 5). Cuando los hibridomas eran casi confluentes en los matraces T75, se transfirieron a matraces Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat n.290005).

El matraz Integra es un matraz de cultivo celular que está dividido por una membrana en dos cámaras, una cámara pequeña y una cámara grande. Se puso un volumen de 20-30 ml de células de hibridoma en una densidad celular mínima de 1x106 células por ml de la línea de hibridoma 31H4 en la cámara pequeña de un matraz Integra en medio Integra (véase la Tabla 5 para los componentes del medio Integra). Se puso medio Integra solo (1 l) en las cámaras grandes de los matraces Integra. La membrana que separa las dos cámaras es permeable a nutrientes de bajo peso molecular pero es impermeable a células de hibridoma y a anticuerpos producidos por estas células. Así, las células de hibridoma y los anticuerpos producidos por estas células de hibridoma se retuvieron en la cámara pequeña. Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. La muestra de medio recogido resultante de la línea de hibridoma se sedimentó para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000 rpm) y el sobrenadante resultante se filtró (0,22 um). El medio acondicionado aclarado se cargó en una columna de Proteína A Sepharose. Opcionalmente, los medios se concentran en primer lugar y después se cargan en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (tales como Citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tal como resina Sepharose Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 21B12 son Sepharose Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.

EJEMPLO 6

Producción de anticuerpos IgG221B12 humanos de células transfectadas

El presente ejemplo muestra cómo se produjeron los anticuerpos IgG221B12 a partir de células transfectadas. Las células (células 293 para expresión transitoria y células CHO para expresión estable) se transfectaron con plásmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de 21B12. Los medios acondicionados de las células de hibridoma se recuperaron eliminando las células y restos celulares. Los medios acondicionados aclarados se cargaron en una columna de Proteína A-Sepharose. Opcionalmente, los medios pueden concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (Citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de cationes tal como resina SP-Sepharose. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 21B12 fueron SP-Sepharose HP a pH 5,2. Los anticuerpos se eluyeron con 25 volúmenes de columna de tampón que contenía un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en tampón acetato de sodio 20 mM.

EJEMPLO 7

Producción de anticuerpos IgG416F12 humanos de hibridomas

El presente ejemplo muestra cómo se produjo el anticuerpo IgG4 16F12 a partir de hibridomas. La línea de hibridoma 16F12 se cultivó en matraces T75 en medio (véase la Tabla 5). Cuando los hibridomas eran casi confluentes en los matraces T75, se transfirieron a matraces Integra (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat n.290005).

Después de una semana, se retiró el medio de ambas cámaras del matraz Integra y se reemplazó por medio Integra fresco. El medio recogido de las cámaras pequeñas se retuvo separadamente. Después de una segunda semana de crecimiento, el medio de la cámara pequeña se recogió de nuevo. El medio recogido de la semana 1 de la línea de hibridoma se combinó con el medio recogido de la semana 2 de la línea de hibridoma. Las muestras de medio recogido resultantes de la línea de hibridoma se sedimentaron para eliminar las células y restos celulares (15 minutos a 3.000 rpm) y los sobrenadantes resultantes se filtraron (0,22 um). Los medios acondicionados aclarados se cargaron en una columna de Proteína A Sepharose. Opcionalmente, el medio puede concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (Citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de aniones tales como resina Sepharose Q. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 16F12 son Sepharose Q HP a pH 7,8-8,0. El anticuerpo se eluyó con un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en 25 volúmenes de columna.

EJEMPLO 8

Producción de anticuerpos IgG216F12 humanos de células transfectadas

El presente ejemplo muestra cómo se produjeron anticuerpos IgG2 16F12 a partir de células transfectadas. Las células (células 293 para expresión transitoria y células CHO para expresión estable) se transfectaron con plásmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de 16F12. Los medios acondicionados de las células de hibridoma se recuperaron eliminando las células y restos celulares. Los medios acondicionados aclarados se cargaron en una Proteína A-Sepharose. Opcionalmente, los medios pueden concentrarse en primer lugar y después cargarse en una columna de Proteína A Sepharose. Las uniones no específicas se eliminaron por un lavado prolongado con PBS. Las proteínas de anticuerpo unidas en la columna de Proteína A se recuperaron por elución ácida estándar de anticuerpo de columnas de Proteína A (Citrato 50 mM, pH 3,0). Las proteínas de anticuerpo agregadas en el combinado de Proteína A Sepharose se retiraron por cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de intercambio iónico de unión en resina intercambiadora de cationes tales como resina Sepharose SP. Las condiciones específicas de IEX para las proteínas 16F12 son Sepharose SP HP a pH 5,2. El anticuerpo se eluye con 25 volúmenes de columna de tampón que contiene un gradiente de NaCl de 10 mM-500 mM en tampón acetato de sodio 20 mM.

EJEMPLO 9

Análisis de la secuencia de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos

Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos anteriores se determinaron por secuenciación de nucleótidos Sanger (didesoxi). Las secuencias de aminoácidos se dedujeron entonces para las secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico para los dominios variables se representan en las FIG.s 3E-3HH.

La región constante de la cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 156), y las regiones constantes de la cadena pesada de IgG2 e IgG4 (SEQ ID NO: 154 y 155) se muestran en la FiG. 3KK.

Se determinaron las secuencias de polipéptido predichas a partir de cada una de estas secuencias de ADNc. Las regiones constantes de la cadena pesada de IgG2 e IgG4 (SEQ ID NO: 154 y 155).

Las divisiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 se muestran en la FIG 2A-3D.

Tomando como base los datos de secuencia, se determinaron los genes de línea germinal a partir de los cuales se obtuvo cada región variable de cadena pesada o cadena ligera. La identidad de los genes de línea germinal se indica al lado de la línea de hibridoma correspondiente en las FIG. 2A-3D y cada uno está representado por un único SEQ ID NO. Las FIG. 2A-3D también representan las secuencias de aminoácidos determinadas para anticuerpos adicionales que se caracterizaron.

EJEMPLO 8

Determinación de los puntos isoeléctricos de tres anticuerpos

Se determinó que los pIs teóricos de los anticuerpos tomando como base la secuencia de aminoácidos eran 7,36 para 16F12; 8,47 para 21B12; y 6,84 para 31H4.

EJEMPLO 9

Caracterización de la unión de los anticuerpos a PCSK9

Habiendo identificado varios anticuerpos que se unen a PCSK9, se emplearon varias estrategias para cuantificar y caracterizar adicionalmente la naturaleza de la unión. En un aspecto del estudio, se realizó un análisis de afinidad Biacore. En otro aspecto del estudio, se realizó un análisis de afinidad KinExA®. Las muestras y tampones empelados en estos estudios se presentan en la Tabla 6 a continuación.

TABLA 6

Medidas de afinidad BIAcore®

Se realizó un análisis de afinidad BIAcore® (dispositivo de resonancia de plasmón superficial, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) de los anticuerpos 21B12 para PCSK9 descrito en este Ejemplo según las instrucciones del fabricante.

Brevemente, los experimentos de resonancia de plasmón superficial se realizaron usando biosensores ópticos Biacore 2000 (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Cada anticuerpo anti-PCSK9 individual se inmovilizó en un chip biosensor CM5 de uso en investigación por acoplamiento de amina a niveles que proporcionaron una respuesta máxima de unión de analito (Rmax) de no más de 200 unidades de resonancia (UR). La concentración de proteína PCSK9 se varió a intervalos de 2 veces (el analito) y se inyectó sobre la superficie de anticuerpo inmovilizado (a un caudal de 100 pl/min durante 1,5 minutos). Se usó tampón HBS-P fresco (pH 7,4, Hepes 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005 % de tensioactivo P-20, Biacore) suplementado con 0,01 % BSA como tampón de unión. Las afinidades de unión de cada anticuerpo anti-PCSK9 se midieron en experimentos separados frente a cada una de las proteínas PCSK9 humana, de ratón y de mono cinomolgus a pH 7,4 (las concentraciones usadas fueron 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, y 0 nM).

Además, las afinidades de unión del anticuerpo frente a PCSK9 humana también se midieron a pH 6,0 con el tampón de pH 6,0 HBS-P (pH 6,0, Hepes 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005 % de tensioactivo P-20, Biacore) suplementado con 0,01 % de BSA. La señal de unión obtenida fue proporcional a la PCSK9 libre en la disolución. La constante de disociación en el equilibrio (Kd) se obtuvo a partir del análisis de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio con curva dual (software KinExA®, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (n=1 para las ejecuciones a pH 6,0). De forma interesante, pareció que los anticuerpos presentaban una afinidad de unión más fuerte al pH más bajo (en el que la Kd fue 12,5, 7,3 y 29 pM para 31H4, 21B12 y 16F12 respectivamente).

Los parámetros cinéticos de unión de los anticuerpos incluyendo ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y K^d(constante de disociación en el equilibrio) se determinaron usando el programa informático BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). Las constantes de disociación en el equilibrio más bajas indican mayor afinidad del anticuerpo para PCSK9. Los valores de K^ddeterminados por el análisis de afinidad BIAcore® se presentan en la Tabla 7.1, mostrada a continuación.

TABLA 7.1

La Tabla 7.2 representa las velocidades kon y koff.

TABLA 7.2

Medidas de afinidad KinExA®

Se realizó un análisis de afinidad KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) de 16F12 y 31H4 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se pre-recubrió Reacti-Gel™ (6x) (Pierce) con una de las proteínas PCSK9 humana, cino etiquetada con V5 o de ratón etiquetada con His y se bloqueó con BSA. Se incubaron 10 o 100 pM del anticuerpo 16F12 o anticuerpo 31H4 y una de las proteínas PCSK9 con varias concentraciones (0,1 pM - 25 nM) de proteínas PCSK9 a temperatura ambiente durante 8 horas antes de pasarlos a través de las perlas recubiertas con PCSK9. La cantidad de 16F12 o 31H4 unido a las perlas se cuantificó por anticuerpo de cabra anti-IgG (H L) humana marcado fluorescentemente (Cy5) (Jackson Immuno Research). La señal de unión es proporcional a la concentración de 16F12 o 31H4 libre en el equilibrio de unión. La constante de disociación en el equilibrio (K^d) se obtuvo a partir de la regresión no lineal de los dos conjuntos de curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio. Se empleó el software KinExA® Pro en el análisis. Las curvas de unión generadas en este análisis se presentan como FIG. 4A-4F.

Ambos anticuerpos, 16F12 y 31H4, mostraron una afinidad similar para PCSK9 humana y de cino, pero una afinidad aproximadamente 10-250 veces menor para PCSK9 de ratón. De los dos anticuerpos ensayados usando el sistema KinExA®, el anticuerpo 31H4 mostró una mayor afinidad tanto para PCSK9 humana como de cino con 3 y 2 pM de K^d, respectivamente. 16F12 mostró una afinidad ligeramente más débil a 15 pM de K^dpara PCSK9 humana y 16 pM Kd para PCSK9 de cino.

Los resultados del análisis de afinidad KinExA® se resumen en la Tabla 8.1, mostrada a continuación.

TABLA 8.1

Además, se procesó un SDS PAGE para comprobar la calidad y cantidad de las muestras y se muestra en la FIG. 5A. cPCSK9 mostró alrededor de 50 % menos en el gel y también a partir de la concentración de unión activa calculada a partir del ensayo KinExA®. Por lo tanto, la K^dde los mAb para cPCSK9 se ajustó como 50 % de la cPCSK9 activa en el presente.

Se usó un ensayo de unión de equilibrio en disolución BIAcore para medir los valores de Kd para ABP 21B12.

21B12.1 mostró una señal pequeña usando el ensayo KinExA, por lo tanto, se aplicó el ensayo de equilibrio en disolución biacore. Como no se observó una unión significativa en la unión de los anticuerpos a superficie con PCSK9 inmovilizada, el anticuerpo 21B12 se inmovilizó en la celda de flujo 4 de un chip CM5 usando acoplamiento de amina con densidad alrededor de 7.000 UR. La celda de flujo 3 se usó como un control de fondo. Se mezclaron 0,3, 1, y 3 nM de PCSK9 humana o PCSK9 de cino con diluciones seriadas de muestras de anticuerpo 21B12.1 (que variaron de 0,001 ~ 25 nM) en PBS más 0,1 mg/ml de BSA, 0,005 % de P20. La unión de la PCSK9 libre en las disoluciones mezcladas se midió inyectando sobre la superficie del anticuerpo 21B12.1. El 100 % de la señal de unión de PCSK9 en la superficie de 21B12.1 se determinó en ausencia de mAb en la disolución. Una respuesta de unión de PCSK9 disminuida con concentraciones crecientes de mAb indicó la unión de PCSK9 al mAb en disolución, que bloqueó la unión de PCSK9 a la superficie del pepticuerpo inmovilizado. A partir de la representación de la señal de unión de PCSK9 frente a las concentraciones de mAb, se calculó KD a partir de tres conjuntos de curvas (0,3, 1 y 3 nM de concentración fijada de PCSK9) usando un modelo de unión homogéneo de un sitio en software KinExA Pro™. Aunque cPCSK9 tiene una menor concentración de proteína observada a partir del ensayo KinExA y gel con SDS, su concentración no se ajustó aquí ya que la concentración de cPCSK9 no se usó para el cálculo de K^d. Los resultados se representan en la Tabla 8.2 a continuación y en las FIG. 5B-5D. La FIG. 5B representa los resultados del ensayo de equilibrio en disolución a tres concentraciones diferentes de hPCSK9 para hPCSK9. La FIG. 5C representa un conjunto similar de resultados para mPCSK9. La FIG. 5D representa los resultados del ensayo de captura biacore anterior.

TABLA 8.2

EJEMPLO 10

Agrupación en clases de epítopos

Se usó ELISA de competición para la agrupación en clases de los anticuerpos anti-PCSK9. Brevemente, para determinar si dos anticuerpos pertenecen a la misma clase ("bin") de epítopo, uno de los anticuerpos (mAb1) se recubrió en primer lugar en una placa ELISA (NUNC) a 2 pg/ml por incubación de toda la noche. La placa se lavó y se bloqueó con 3 % de BSA. Mientras tanto, se incubaron 30 ng/ml de hPCSK9 biotinilada con el segundo anticuerpo (mAb2) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se aplicó a mAb1 recubierto y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa ELISA se lavó y se incubó con Neutravidina-HRP (Pierce) a diluciones 1:5.000 durante 1 hora. Después de otro lavado, la placa se incubó con sustrato TMB y la señal se detectó a 650 nm usando un lector de placas Titertek. Los anticuerpos con los mismos perfiles de unión se agruparon conjuntamente en la misma clase de epítopo. Los resultados de los estudios de agrupación en clases de los anticuerpos se presentan en la Tabla 8.3.

TABLA 8.3

(continuación)

Se realizó un examen adicional de la agrupación en clases de epítopos usando BIAcore. Tres mAb, 16F12, 21B12 y 31H4, se inmovilizaron en celdas de flujo 2, 3 y 4 con la densidad alrededor de 8.000 UR. Se inyectó PCSK9 5 nM de ser humano, ratón y cino sobre las superficies de mAb para alcanzar alrededor de 100 a 500 UR. Se inyectó 10 nM de los mAb sobre la superficie de PCSK9. Se registró la unión de los tres mAb a tres proteínas PCSK9 diferentes sobre los tres mAb.

Si los dos mAbs tienen un epítopo similar en el antígeno, mAb 1 no mostrará la unión al antígeno ya unido al mAb 2. Si los dos mAbs tienen el epítopo diferente en el antígeno, mAb1 mostrará la unión al antígeno unido al mAb2. La FIG. 5E representa estos resultados de la agrupación en clases de epítopos en forma de gráfico para tres mAb en PCSK9 humana. Se observó un patrón similar para mPCSK9 y cPCSK9. Como se muestra en el gráfico, 16F12 y 31H4 parecieron compartir un epítopo similar, mientras 21B12 pareció tener un epítopo diferente.

EJEMPLO 12

Ensayo de captación celular de LDL

Este ejemplo demuestra la capacidad de varias proteínas de unión a antígeno para reducir la captación de LDL por las células. Se sembraron células HepG2 humanas en placas negras, de fondo transparente de 96 pocillos (Costar) a una concentración de 5x105 células por pocillo en medio DMEM (Mediatech, Inc) suplementado con 10 % de FBS y se incubaron a 37 0C (5 % de CO2) toda la noche. Para formar el complejo PCSK9 y anticuerpo, se incubaron 2 pg/ml de PCSK9 D374Y humano con varias concentraciones de anticuerpo diluido en tampón de captación (DMEM con 1 % de FBS) o tampón de captación solo (control) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS, la mezcla PCSK9 D374Y/anticuerpo se transfirió a las células, seguido de LDL-BODIPY (Invitrogen) diluido en tampón de captación a una concentración final de 6 pg/ml. Después de incubar durante 3 horas a 37 0C (5 % de CO2), las células se lavaron concienzudamente con PBS y la señal de fluorescencia celular se detectó por Safire™ (TECAN) a 480-520 nm (excitación) y 520-600 nm (emisión).

Los resultados del ensayo de captación celular se muestran en las FIG. 7A-7D. En resumen, se determinaron los valores de CI⁵⁰para cada anticuerpo y se encontró que eran 16,7 nM para 31H4 IgG2 (FIG. 7A), 13,3 nM para 31H4 IgG4 (FIG. 7B), 13,3 nM para 21B12 IgG2 (FIG. 7C), y 18 nM para 21B12 IgG4 (FIG. 7D). Estos resultados demuestran que las proteínas de unión a antígeno aplicadas pueden reducir el efecto de PCSK9 (D374Y) para bloquear la captación de LDL por las células. Los anticuerpos también bloquearon el efecto de PCSK9 de tipo salvaje en este ensayo.

EJEMPLO 13

Efecto de disminución del colesterol sérico del anticuerpo 31H4 en un estudio de 6 días

Con el fin de evaluar la disminución de colesterol sérico total (TC) en ratones de tipo salvaje (WT) mediante terapia con anticuerpo frente a proteína PCSK9, se realizó el procedimiento siguiente.

Se alimentaron ratones WT macho (cepa C57BL/6, con edades de 9-10 semanas, 17-27 g) obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) con pienso normal (Harland-Teklad, Dieta 2918) a lo largo de la duración del experimento. Se administró a los ratones bien anticuerpo anti-PCSK9 31H4 (2 mg/ml en PBS) o IgG control (2 mg/ml en PBS) a un nivel de 10 mg/kg a través de la vena de la cola del ratón a T=0. También se reservaron ratones sin estimular como un grupo control sin estimular. Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9

Los ratones se sacrificaron por asfixia con CO2 en los puntos de tiempo pre-determinados mostrados en la Tabla 9. Se recogió sangre a través de la vena cava en tubos eppendorf y se dejó que se coagulara a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se sedimentaron en una centrífuga de mesa a 12.000xg durante 10 minutos para separar el suero. Se midieron el colesterol sérico total y HDL-C usando un analizador clínico Hitachi 912 y kits de TC y HDL-C de Roche/Hitachi.

Los resultados del experimento se muestran en las FIG. 8A-8D. En resumen, los ratones a los que se administró el anticuerpo 31H4 mostraron niveles de colesterol sérico disminuidos durante el curso del experimento (FIG. 8A y FIG. 8B). Además, se indica que los ratones también mostraron niveles disminuidos de ^hD^l(FIG. 8C y FIG.

8D). Para las FIG. 8A y FIG. 8C, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,01, # P<0,05). Para las FIG. 8B y FIG 8D, el porcentaje de cambio está relacionado con los niveles de colesterol sérico total y HDL medidos en animales sin estimular a t=0 h (*P<0,01, # P<0,05).

Respecto a los niveles de HDL disminuidos, se indica que un experto en la técnica apreciará que la disminución en HDL en ratones no es indicativa de que ocurrirá una disminución de HDL en los seres humanos y refleja meramente además que el nivel de colesterol sérico en el organismo ha disminuido. Se indica que los ratones transportan la mayoría del colesterol sérico en partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) que es diferente a los seres humanos que portan la mayor parte del colesterol sérico en partículas LDL. En los ratones, la medición de colesterol sérico total se parece mucho al nivel de HDL-C sérico. El HDL de ratones contiene apolipoproteína E (apoE) que es un ligando para el receptor de LDL (LDLR) y permite que se aclare por el LDLR. Así, el examen de HDL es un indicador apropiado para el presente ejemplo, en ratones (con el conocimiento de que no se espera una disminución en HDL en los seres humanos). Por ejemplo, el HDL humano, por el contrario, no contiene apoE y no es un ligando para el LDLR. Como los anticuerpos de PCSK9 incrementan la expresión de LDLR en ratones, el hígado puede aclarar más HDL y por lo tanto disminuye los niveles de HDL-C sérico.

EJEMPLO 14

Efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de LDLR en un estudio de 6 días

El presente ejemplo demuestra que una proteína de unión a antígeno altera el nivel de LDLR en un sujeto, como se ha predicho, con el tiempo. Se realizó un análisis por transferencia Western con el fin de averiguar el efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de LDLR. Se homogeneizaron 50-100 mg de tejido hepático obtenido de los ratones sacrificados descritos en el Ejemplo 13 en 0,3 ml de tampón RIPA (Santa Cruz Biotechnology Inc.) que contenía inhibidor de proteasa completo (Roche). El homogenado se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó para sedimentar los restos celulares. La concentración de proteína en el sobrenadante se midió usando los reactivos del ensayo de proteínas BioRad (BioRad laboratories). Se desnaturalizaron 100 pg de proteína a 70 0C durante 10 minutos y se separó en gel de SDS de gradiente 4-12 % de Bis-Tris (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,45 pm (Invitrogen) y se bloqueó en tampón de lavado (Tris 50 mM PH7,5, NaCl 150 mM, CaCl²2 mM y 0,05 % de Tween 20) que contenía 5 % de leche desnatada durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se ensayó con anticuerpo de cabra anti-LDLR de ratón (R&D system) 1:2.000 o anti-3 actina (sigma) 1:2.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia se lavó brevemente y se incubó con anti-IgG de cabra de bovino-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2.000 o anti-IgG de ratón de cabra-HRP (Upstate) 1:2.000. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, la transferencia se lavó concienzudamente y se detectaron las bandas inmunorreactivas usando el kit ECL plus (Amersham biosciences). La transferencia Western mostró un incremento en los niveles de proteína LDLR en presencia del anticuerpo 31H4, como se representa en la FIG. 9.

EJEMPLO 15

Efecto de disminución del colesterol sérico del anticuerpo 31H4 en un estudio de 13 días

Con el fin de evaluar la disminución de colesterol sérico total (TC) en ratones de tipo salvaje (WT) mediante terapia con anticuerpo frente a la proteína PCSK9 en un estudio de 13 días, se realizó el procedimiento siguiente. Se alimentaron ratones WT macho (cepa C57BL/6, con edades de 9-10 semanas, 17-27 g) obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) con pienso normal (Harland-Teklad, Dieta 2918) a lo largo de la duración del experimento. Se administró a los ratones bien anticuerpo anti-PCSK9 31H4 (2 mg/ml en PBS) o IgG control (2 mg/ml en PBS) a un nivel de 10 mg/kg a través de la vena de la cola del ratón a T=0. También se reservaron ratones sin estimular como un grupo control sin estimular.

Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 10. Los animales se sacrificaron y los hígados se extrajeron y prepararon como en el Ejemplo 13.

TABLA 10

Cuando el experimento de 6 días se prolongó a un estudio de 13 días, también se observó en el estudio de 13 días el mismo efecto de disminución del colesterol sérico observado en el estudio de 6 días. Más específicamente, los animales dosificados a 10 mg/kg demostraron una disminución del 31 % en el colesterol sérico en el día 3, que volvió gradualmente a los niveles pre-dosificación sobre el día 13. La FIG. 10A representa los resultados de este experimento. La FIG. 10C representa los resultados de la repetición del procedimiento anterior con la dosis 10 mg/kg de 31H4, y con otro anticuerpo, 16F12, también a 10 mg/kg. Los grupos de dosificación y tiempo de sacrificio se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

(continuación)

Como se muestra en la FIG. 10C tanto 16F12 como 31H4 dieron lugar a disminuciones significativas y sustanciales en el colesterol sérico total después de solo una única dosis y proporcionaron beneficios durante más de una semana (10 días o más). Los resultados del estudio de 13 días repetido fueron consistentes con los resultados del primer estudio de 13 días, observándose una disminución en los niveles de colesterol sérico de 26 % en el día 3. Para las FIG. 10A y FIG. 10B, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,01). Para la FIG. 10C, el porcentaje de cambio está relacionado con la IgG control en el mismo punto de tiempo (*P<0,05).

EJEMPLO 16

Efecto del anticuerpo 31H4 en los niveles de HDL en un estudio de 13 días

También se examinaron los niveles de HDL para los animales en el Ejemplo 15. Los niveles de HDL disminuyeron en los ratones. Más específicamente, los animales dosificados a 10 mg/kg demostraron una disminución del 33 % en los niveles de HDL en el día 3, que volvieron gradualmente a los niveles de pre dosificación sobre el día 13. La FIG. 10B representa los resultados del experimento. Hubo una disminución en los niveles de HDL del 34 % en el día 3. La FIG. 10B representa los resultados del experimento de 13 días repetido. Como apreciará un experto en la técnica, mientras los anticuerpos disminuirán el HDL de ratón, no se espera que esto ocurra en los seres humanos debido a las diferencias en HDL en los seres humanos y otros organismos (tales como ratones). Así, la disminución en HDL de ratón no es indicativa de una disminución en HDL humano.

EJEMPLO 17

La administración repetida de los anticuerpos produce beneficios continuados de los péptidos de unión a antígeno

Con el fin de verificar que los resultados obtenidos en los Ejemplos anteriores pueden prolongarse para beneficios adicionales con dosis adicionales, los Experimentos en los Ejemplos 15 y 16 se repitieron con el programa de dosificación representado en la FIG. 11A. Los resultados se representan en la FIG. 11B. Como puede observarse en el gráfico en la FIG. 11B, aunque ambos conjuntos de ratones presentaron una disminución significativa en el colesterol sérico total porque todos los ratones recibieron una inyección inicial de la proteína de unión a antígeno 31H4, los ratones que recibieron inyecciones adicionales de la ABP 31H4 presentaron una reducción continuada en colesterol sérico total, mientras aquellos ratones que solo recibieron la inyección control presentaron eventualmente un incremento en su colesterol sérico total. Para la FIG. 11, el porcentaje de cambio está relacionado con los animales sin estimular a t=0 horas (*P<0,01, **P<0,001).

Los resultados de este ejemplo demuestran que, a diferencia de otros métodos de tratamiento de colesterol, en los que las aplicaciones repetidas dan lugar a una reducción en la eficacia debido a ajustes biológicos en el sujeto, la presente estrategia no parece presentar este problema durante el periodo de tiempo examinado. Además, esto sugiere que la vuelta de los niveles de colesterol sérico total o colesterol HDL a la línea basal, observada en los ejemplos previos, no se debe al desarrollo por el sujeto de alguna resistencia al tratamiento, sino al agotamiento de la disponibilidad del anticuerpo en el sujeto.

EJEMPLO 18

Mapeo de epítopos de los anticuerpos anti PCSK9 humanos

Este ejemplo muestra métodos para determinar qué residuos en PCSK9 están implicados en formar parte del epítopo para las proteínas de unión a antígeno descritas en la presente memoria para PCSK9.

Con el fin de determinar los epítopos a los que se unen determinadas de las ABP de la presente invención, los epítopos de las ABP pueden mapearse usando péptidos sintéticos derivados de la secuencia peptídica de PCSK9 específica.

Puede usarse una matriz de péptidos SPOTs (Sigma Genosys) para estudiar la interacción molecular de los anticuerpos anti-PCSK9 humanos con su epítopo peptídico. La tecnología SPOTs se basa en la síntesis en fase sólida de péptidos en un formato adecuado para el análisis sistemático de epítopos de anticuerpos. La síntesis de oligopéptidos dispuestos en matriz a medida está disponible comercialmente en Sigma-Genosys. Puede obtenerse una matriz de péptidos de oligopéptidos superpuestos derivados de la secuencia de aminoácidos del péptido PCSK9. La matriz puede comprender una serie de péptidos 12-mer como manchas en una lámina de membrana de polipropileno. La matriz de péptidos puede abarcar la longitud completa de la secuencia madura de PCSK9. Cada péptido consecutivo puede estar desplazado por 1 residuo respecto del previo, dando lugar a una biblioteca anidada, superpuesta de oligopéptidos en matriz. La membrana que porta los péptidos puede hacerse reaccionar con diferentes anticuerpos anti-PCSK9 (1 microgramo/ml). La unión de los mAb a los péptidos unidos a la membrana puede evaluarse por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima usando un anticuerpo secundario conjugado con HRP seguido de quimioluminiscencia amplificada (ECL).

Además, los epítopos funcionales pueden mapearse por escaneo de alanina combinatorio. En este proceso, puede usarse una estrategia de escaneo de alanina combinatorio para identificar aminoácidos en la proteína PCSK9 que son necesarios para la interacción con las ABP anti-PCSK9. Para conseguir esto, puede usarse un segundo conjunto de matrices SPOTs para el escaneo de alanina. Un panel de péptidos variantes con sustituciones de alanina en cada uno de los 12 residuos puede escanearse como anteriormente. Esto permitirá mapear e identificar los epítopos para las ABP para la PCSK9 humana.

En la alternativa, dado que es posible que el epítopo sea conformacional, puede emplearse una combinación de escaneo de alanina y/o escaneo de arginina, co-cristalización de anticuerpo FAB/PCSK9, y proteólisis limitada/LC-MS (cromatografía líquida espectrometría de masa) para identificar los epítopos.

Ejemplo 19

Usos de los anticuerpos de PCSK9 para el tratamiento de trastornos relacionados con el colesterol Se administra a un paciente humano que presenta un trastorno relacionado con el colesterol (en el que una reducción en el colesterol (tal como colesterol sérico) puede ser beneficiosa) una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo de PCSK9, 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 o 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoriza para determinar si los síntomas del trastorno han remitido. Después del tratamiento, se encuentra que los pacientes que han sido sometidos al tratamiento con el anticuerpo de PCSK9 tienen niveles reducidos de colesterol sérico, en comparación con pacientes que no se han tratado.

EJEMPLO 20

Usos de los anticuerpos de PCSK9 para el tratamiento de hipercolesterolemia

Se administra a un paciente humano que presenta síntomas de hipercolesterolemia una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo de PCSK9, tal como 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 o 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoriza para determinar si el nivel de colesterol sérico ha disminuido. Después del tratamiento, se encuentra que el paciente que recibe el tratamiento con los anticuerpos de PCSK9 tiene niveles reducidos de colesterol sérico en comparación con pacientes con artritis que no han recibido el tratamiento.

EJEMPLO 21

Usos de anticuerpos de PCSK9 para la prevención de enfermedad cardíaca coronaria y/o eventos cardiovasculares recurrentes

Se identifica un paciente humano que presenta riesgo de desarrollar una enfermedad cardíaca coronaria. Se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo de PCSK9, tal como 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 o 16F12), bien solo, simultáneamente o secuencialmente con una estatina, por ejemplo, simvastatina. A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoriza para determinar si cambia el nivel de colesterol sérico total del paciente. A lo largo del tratamiento preventivo, se encuentra que el paciente que recibe el tratamiento con los anticuerpos de PCSK9 tiene un colesterol sérico reducido reduciendo de esta manera el riesgo de enfermedades cardíacas coronarias o eventos cardiovasculares recurrentes en comparación con pacientes que no han recibido el tratamiento.

EJEMPLO 22

Uso de los anticuerpos de PCSK9 como un agente de diagnóstico

Puede usarse un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para la detección de antígeno PCSK9 en una muestra para diagnosticar a pacientes que presentan altos niveles de producción de PCSK9. En el ensayo, se adsorben los pocillos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 384 pocillos, durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido frente a PCSK9. El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquiera de las PCSK9 que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Los pocilios se lavan y se tratan con un agente bloqueante tal como proteína de la leche o albúmina para evitar la adsorción no específica del analito.

Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de ensayo que se sospecha que contiene la PCSK9, o con una disolución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Dicha muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados como diagnóstico de una patología.

Después de eliminar por lavado la muestra de ensayo o estándar, los pocillos se tratan con un segundo anticuerpo de PCSK9 monoclonal completamente humano que está marcado por conjugación con biotina. También puede usarse un monoclonal de ratón o con origen en otra especie. El anticuerpo de PCSK9 marcado sirve como anticuerpo de detección. Después de eliminar por lavado el exceso de segundo anticuerpo, los pocillos se tratan con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada con avidina y un sustrato cromogénico adecuado. La concentración del antígeno en las muestras de ensayo se determina por comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.

Este ensayo ELISA proporciona un ensayo altamente específico y muy sensible para la detección del antígeno PCSK9 en una muestra de ensayo.

Determinación de la concentración de la proteína PCSK9 en sujetos

Un ELISA en sándwich puede cuantificar los niveles de PCSK9 en suero humano. Dos anticuerpos de PCSK9 monoclonales completamente humanos del ELISA en sándwich reconocen diferentes epítopos en la molécula de PCSK9. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos monoclonales de ratón o con origen en otra especie. El ELISA se realiza como sigue: se recubren placas ELISA (Fisher) con 50 pl de anticuerpo de PCSK9 de captura en tampón de recubrimiento (NaHCÜ30,1 M, pH 9,6) a una concentración de 2 pg/ml. Después de incubar a 4 0C toda la noche, las placas se tratan con 200 pl de tampón de bloqueo (0,5 % de BSA, 0,1 % de Tween 20, 0,01 % de Timerosal en PBS) durante 1 hora a 25 0C. Las placas se lavan (3x) usando 0,05 % de Tween 20 en PBS (tampón de lavado, WB). Los sueros normales o de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en tampón de bloqueo que contiene 50 % de suero humano. Las placas se incuban con muestras de suero toda la noche a 4 0C, se lavan con WB, y se incuban con 100 pl/pocillo de anticuerpo de PCSK9 de detección biotinilado durante 1 hora a 25 0C. Después de lavar, las placas se incuban con HRP-Estreptavidina durante 15 minutos, se lavan como antes, y se tratan con 100 pl/pocillo de o-fenilendiamina en H²O²(disolución de revelado de Sigma) para la generación de color. La reacción se para con 50 pl/pocillo de H²SO⁴(2 M) y se analiza usando un lector de placas ELISA a 492 nm. La concentración de antígeno PCSK9 en las muestras de suero se calcula por comparación con diluciones de antígeno PCSK9 purificado usando un programa de ajuste de curvas de cuatro parámetros.

Determinación de la concentración de la proteína variante PCSK9 en sujetos

Las etapas indicadas anteriormente pueden realizarse usando anticuerpos que se indica en la presente memoria que se unen tanto a PCSK9 de tipo salvaje como a PCSK9 variante (D374Y). A continuación, pueden usarse anticuerpos que se unen al tipo salvaje pero no al mutante (de nuevo usando un protocolo similar al indicado anteriormente) para determinar si la PCSK9 presente en el sujeto es de tipo salvaje o la variante D374Y. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados que son positivos para ambas rondas serán de tipo salvaje, mientras aquellos que son positivos para la primera ronda, pero no la segunda ronda de anticuerpos, incluirán la mutación D374Y. Se sabe que hay mutaciones de alta frecuencia en la población y que se podrían beneficiar particularmente de un agente tal como las ABP descritas en la presente memoria.

EJEMPLO 23

Uso de proteína de unión a antígeno para PCSK9 para la prevención de hipercolesterolemia

Se identifica un paciente humano que presenta un riesgo de desarrollar hipercolesterolemia mediante el análisis del historial familiar y/o tipo de vida, y/o niveles presentes de colesterol. Se administra regularmente al sujeto (por ejemplo, una vez semanalmente) una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo de PCSK9, 31H4 (o, por ejemplo, 21B12 o 16F12). A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoriza para determinar si los niveles de colesterol sérico han disminuido. Después del tratamiento, se encuentra que los sujetos que han recibido tratamiento preventivo con el anticuerpo de PCSK9 tienen niveles disminuidos de colesterol sérico, en comparación con los sujetos que no se han tratado.

EJEMPLO 24

Las ABP para PCSK9 regulan al alza adicionalmente LDLR en presencia de estatinas

Este ejemplo demuestra que las ABP para PCSK9 producían incrementos adicionales en la disponibilidad de LDLR cuando se usan en presencia de estatinas, demostrando que pueden conseguirse beneficios adicionales por el uso combinado de los dos.

Se sembraron células HepG2 en DMEM con 10 % de suero fetal bovino (FBS) y se cultivaron hasta ~90 % de confluencia. Las células se trataron con cantidades indicadas de mevinolina (una estatina, Sigma) y ABP para PCSK9 (FIG. 12A-12C) en DMEM con 3 % de FBS durante 48 horas. Se prepararon lisados celulares totales. Se separaron 50 mg de proteínas totales por electroforesis en gel y se transfirieron a membrana de PVDF. Las inmunotransferencias se realizaron usando anticuerpo anti-receptor de LDL humano de conejo (Fitzgerald) o anticuerpo de conejo anti-b-actina humana. Los resultados de quimioluminiscencia amplificada se muestran en los paneles superiores de las FIG. 12A-12C. La intensidad de las bandas se cuantificó por software ImageJ y se normalizaron por b-actina. Los niveles relativos de LDLR se muestran en los paneles inferiores de las FIG. 12A-12C.

También se crearon células HepG2-PCSK9. Estas eran una línea celular HepG2 estable transfectada con PCSK9 humana. Las células se sembraron en DMEM con 10 % de suero fetal bovino (FBS) y se cultivaron hasta ~90 % de confluencia. Las células se trataron con cantidades indicadas de mevinolina (Sigma) y ABP pra PCSK9 (FIG. 12D-12F) en DMEM con 3 % de FBS durante 48 horas. Se prepararon lisados celulares totales. Se separaron 50 mg de proteínas totales por electroforesis en gel y se transfirieron a membrana de PVDF. Las inmunotransferencias se realizaron usando anticuerpo de conejo anti-receptor de LDL humano (Fitzgerald) o anticuerpo de conejo anti-b-actina humana. Los resultados de quimioluminiscencia amplificada se muestran en los paneles superiores. La intensidad de las bandas se cuantificó por software ImageJ y se normalizaron por bactina.

Como puede observarse en los resultados representados en las FIG. 12A-12F, cantidades crecientes del anticuerpo y cantidades crecientes de la estatina dieron lugar generalmente a incrementos en el nivel de LDLR. Este incremento en la eficacia para incrementar los niveles de la ABP es especialmente evidente en las FIG.

12D-12F, en las que las células también se transfectaron con PCSK9, permitiendo a las ABP demostrar su eficacia en mayor grado.

De forma interesante, como se demuestra por los resultados en la comparación de las FIG. 12D-12F con 12A-12C, la influencia de las concentraciones de ABP en los niveles de LDLR se incrementó drásticamente cuando la PCSK9 se estaba produciendo por las células. Además, está claro que las ABP (21B12 y 31H4) dieron lugar a un incremento mayor en los niveles de LDLR, incluso en presencia de estatinas, que la ABP 25A7.1 (un no neutralizante), demostrando que pueden conseguirse beneficios adicionales por el uso tanto de estatinas como de ABP para PCSK9.

EJEMPLO 25

Secuencias consenso

Las secuencias consenso se determinaron usando análisis filogénicos estándar de las CDR correspondientes a las V^hy V^lde las ABP anti-PCSK9. Las secuencias consenso se determinaron manteniendo las ^cD^rcontiguas en la misma secuencia correspondiente a una Vh o Vl. Brevemente, las secuencias de aminoácidos correspondientes a los dominios variables enteros bien de V^ho V^lse convirtieron en formato FASTA para facilitar el procesamiento de alineamientos comparativos y para inferir filogenias. A continuación, las regiones marco de estas secuencias se reemplazaron por una secuencia conectora artificial (marcadores "bbbbbbbbbb", construcción de ácido nucleico no específica) de manera que el examen de las CDR solo pudo realizarse sin introducir ningún sesgo de ponderación de posición de aminoácidos debido a eventos coincidentes (por ejemplo, tales como anticuerpos no relacionados que comparten fortuitamente una herencia de marco de línea germinal común) mientras todavía se mantienen las CDR contiguas en la misma secuencia correspondiente a una V^ho V^l. Las secuencias Vh o Vl de este formato se sometieron a análisis con alineamiento de similitud de secuencia usando un programa que emplea un algoritmo semejante a ClutalW estándar (véase, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Se empleó una penalización por creación de hueco de 8,0 junto con una penalización por extensión de hueco de 2,0. Este programa generó asimismo filogramas (ilustraciones de árbol filogenético) basados en los alineamientos de similitud de secuencia usando bien métodos UPGMA (método de agrupamiento pareado no ponderado, usando promedios aritméticos) o unión de vecinos (véase, Saitou y Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) para construir e ilustrar la similitud y distinción de grupos de secuencias mediante comparación de longitud de rama y agrupamiento. Ambos métodos produjeron resultados similares pero los árboles derivados de UPGMA se usaron finalmente ya que el método emplea un conjunto más simple y más conservativo de asunciones. Se generaron árboles derivados de UPGMA en los que se definieron grupos similares de secuencias como los que tienen menos de 15 sustituciones por 100 residuos (véase, la leyenda en las ilustraciones del árbol para escala) entre las secuencias individuales en el grupo y se usaron para definir colecciones de secuencias consenso. Los resultados de las comparaciones se representan en las FIG.

13A-13J. En la FIG. 13E, se eligieron los grupos de manera que las secuencias en la cadena ligera que son un clado también son un clado en la cadena pesada y tienen menos de 15 sustituciones.

Como apreciará un experto en la técnica, los resultados presentados en las FIG. 13A-13J presentan una gran cantidad de guía sobre la importancia de aminoácidos particulares (por ejemplo, aquellos aminoácidos que están conservados) y qué posiciones de aminoácidos pueden alterarse posiblemente (por ejemplo, aquellas posiciones que tienen aminoácidos diferentes para diferentes ABP).

EJEMPLO 26

Modelo de ratón para PCSK9 y capacidad de las ABP para disminuir LDL ^{in v iv o}

Para generar ratones que sobre-expresan PCSK9 humana, se inyectó a ratones de tres semanas WT C57B1/6 mediante administración en la vena de la cola varias concentraciones de virus adenoasociado (AAV), modificado recombinantemente para expresar PCSK9 humana, para determinar la titulación correcta que proporcionaría un incremento mensurable de LDL-colesterol en los ratones. Usando este virus particular que expresaba PCSK9 humana, se determinó que 4,5 x 10E12 ufp del virus daría lugar a un nivel de LDL-colesterol de aproximadamente 40 mg/dl en la sangre circulante (los niveles normales de LDL en un ratón WT son aproximadamente 10 mg/dl). Se encontró que los niveles de PCSK9 humana en estos animales eran aproximadamente 13 ug/ml. Se generó una colonia de ratones usando estos criterios de inyección.

Una semana después de la inyección, los ratones se evaluaron para niveles de LDL-colesterol, y se aleatorizaron en diferentes grupos de tratamiento. Se administró a los animales, mediante una inyección en la vena de la cola, una única inyección en bolo bien de 10 mg/kg o 30 mg/kg de proteínas de unión a antígeno 16F12, 21B12, o 31H4. Se administró ABP IgG2 en un grupo separado de animales como un control de dosificación. Se sacrificaron por eutanasia subgrupos de animales (n=6-7) a las 24 y 48 horas después de la administración de las ABP. No hubo efectos en los niveles de LDL-colesterol después de administración de IgG2 a ninguna dosis. Tanto 31H4 como 21B12 demostraron una disminución significativa de LDL-colesterol hasta e incluyendo 48 horas después de la administración, comparado con el control de IgG2 (mostrado en la FIG. 14A y 14B a dos dosis diferentes). 16F12 muestra una respuesta de disminución de LDL-colesterol intermedia, volviendo los niveles a la línea basal de aproximadamente 40 mg/dl sobre el punto de tiempo de 48 horas. Estos datos son consistentes con los datos de unión in vitro (Biacore y Kinexa), que muestran una afinidad de unión casi equivalente entre 31H4 y 21B12, y una afinidad menor de 16F12 para PCSK9 humana.

Como puede observarse en los resultados, el colesterol total y HDL-colesterol se redujeron por las ABP para PCSK9 en el modelo (tanto total como HDL-C están elevados por encima de los ratones WT debido a la sobreexpresión de PCSK9). Aunque la disminución de colesterol en este modelo parece ocurrir sobre un periodo de tiempo relativamente corto, se cree que esto se debe a los niveles de PCSK9 humana que están presentes, que son suprafisiológicamente altos en este modelo. Además, dado que la expresión está gobernada por AAV, no hay regulación de la expresión de PCSK9. En estas figuras, (*) indica una P<0,05, y (**) indica una P<0,005 comparado con los niveles de LDL-colesterol observados en los animales inyectados con IgG2 control en el mismo punto de tiempo. El nivel de 13 microgramos/ml de PCSK9 humana sérica en los ratones corresponde a un incremento de aproximadamente 520 veces por encima de los niveles endógenos de PCSK9 en ratones (~ 25 ng/ml), y un incremento de aproximadamente 75 veces por encima de los niveles séricos humanos promedio (~ 175 ng/ml). Así, las proteínas de unión a antígeno deberían ser incluso más eficaces en los seres humanos. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados anteriores demuestran la idoneidad del modelo de ratón para ensayar la capacidad de las proteínas de unión a antígeno para alterar el colesterol sérico en un sujeto. Un experto en la técnica también reconocerá que el uso de HDL de ratón para monitorizar los niveles de colesterol sérico en un ratón, mientras es útil para monitorizar los niveles de colesterol sérico en ratones, no es indicativo del impacto de las ABP en HDL humano en los seres humanos. Por ejemplo, Cohen et al. ("Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease", N Engl J Med, 354:1264-1272, 2006) demostraron la ausencia de cualquier efecto de las mutaciones de pérdida de función de PCSK9 en los niveles de HDL humano. Así, un experto en la técnica apreciará que la capacidad de la ABP de disminuir HDL de ratón (que carecen de LDL) no es indicativa de la capacidad de la ABP de disminuir HDL humano. De hecho, como se muestra por Cohen, es improbable que esto ocurra para anticuerpos neutralizantes en los seres humanos.

EJEMPLO 33

Expresión y purificación de muestras de proteína

El presente ejemplo describe algunas realizaciones sobre cómo las varias realizaciones de las proteínas/variantes PCSK9 se hicieron y purificaron (incluyendo el dominio EGFa de LDLR). Las proteínas/variantes PCSK9 (por ejemplo, PSCK9 31-692 N533A, PCSK9 449TEV y PCSK9 ProCat 31-454) se expresaron en células de insecto Hi-5 infectadas con baculovirus con un péptido señal de melitina de abeja de la miel N-terminal seguido de una etiqueta His6. Las proteínas PCSK9 se purificaron por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La etiqueta de melitina-His6 se eliminó durante la purificación por escisión con proteasa TEV. La construcción PCSK9 449TEV se usó para generar muestras del dominio ProCat (31-449) y V (450-692) de PCSK9. Esta construcción tenía un sitio de escisión de la proteasa TEV insertado entre los residuos de PCSK9 449 y 450. Para la variante N555A de longitud completa para cristalografía, el fragmento de PCSK9 31-454, y la variante 449TEV de PCSK9 para cristalografía, el producto proteico posterior a rTEV también incluyó una secuencia inicial GAMG. Así, posteriormente a la escisión con rTEV, estas proteínas fueron GAMG-PCSK9. Además, la proteína 449TEV PCSK9 incluyó la secuencia "ENLYFQ" (SEQ ID NO: 403) insertada entre las posiciones H449 y G450 de SEQ ID NO: 3. Después de la escisión con rTEV, la proteína ProCat PCSK9 generada a partir de esta construcción fue GAMG-PCSK9 (31-449)-ENLYFQ y el dominio V generado a partir de esta construcción fue PCSK9 (450 692) de SEQ ID NO: 3.

Los fragmentos Fab de 21B12 y 31H4 se expresaron en E. coli. Estas proteínas se purificaron por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico.

El dominio EGFa de LDLR (293-334) se expresó como una proteína de fusión con GST en E. coli. El dominio EGFa se purificó por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad en glutatión Sepharose y cromatografía de exclusión por tamaño. La proteína GST se eliminó durante la purificación por escisión con proteasa PreScission.

EJEMPLO 34

Formación de complejo y cristalización

El presente ejemplo describe cómo se hicieron los complejos y cristales usados en el examen de la estructura. El complejo PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa se hizo mezclando un exceso 1,2 molar de dominio EGFa con PCSK9 31-454. El complejo PCSK9 ProCat 31-454 / dominio EGFa cristaliza en formiato de potasio 0,2 M, 20 % de PEG 3350.

EJEMPLO 35

Recogida de datos y determinación de la estructura

El presente ejemplo describe cómo se recogieron los conjuntos de datos y se determinaron las estructuras para los Ejemplos anteriores de examen de estructura.

Los cristales de PCSK9 / dominio EGFa crecieron en el grupo espacial P6s22 con dimensiones de celda unitaria a=b=70,6, c=321,8 Á y difractan a una resolución de 2,9 Á. La estructura de PCSK9 / dominio EGFa se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP usando el PCSK9 ProCat como el modelo de búsqueda de partida. El análisis de los mapas de densidad electrónica mostró una densidad electrónica clara para el dominio EGFa. El dominio EGFa de LDLR se ajustó a mano y el modelo se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx.

Se determinó que los aminoácidos de la interfase de interacción del núcleo eran todos los residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 5 Á de la proteína pareja de PCSK9. Se eligió 5 Á como la distancia de punto de corte de la región del núcleo para permitir a los átomos en un radio de van der Waals más un posible enlace de hidrógeno mediado por agua. Se determinó que los aminoácidos en la interfase de interacción en el límite eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 8 Á de la proteína pareja de PCSK9 pero no incluidos en la lista de interacción del núcleo. Se eligió menos de o igual a 8 Á como la distancia de punto de corte de la región límite para permitir la longitud de un aminoácido arginina extendido. Los aminoácidos que cumplían estos criterios de distancia se calcularon con el programa PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)).

EJEMPLO 36

Estructura de cristal de PCSK9 y 31A4

Se determinó la estructura de cristal del complejo 31A4/PCSK9.

Expresión y purificación de muestras de proteína

Se expresó PCSK9 449TEV (una construcción de PCSK9 con un sitio de escisión de proteasa TEV insertado entre los residuos 449 y 450, numeración según SEQ ID NO: 3) en células de insecto Hi-5 infectadas con baculovirus con un péptido señal de melitina de abeja de la miel N-terminal seguido de una etiqueta His6. La proteína PCSK9 se purificó en primer lugar por cromatografía de afinidad de níquel. La proteasa TEV se usó para eliminar la etiqueta melitina-His6 y escindir la proteína PCSK9 entre el dominio catalítico y el dominio V. El dominio V se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. El fragmento 31A4 Fab se expresó en E. coli. Esta proteína se purificó por cromatografía de afinidad de níquel, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico.

Formación de complejo y cristalización

El complejo PCSK9 dominio V / 31A4 se hizo mezclando un exceso 1,5 molar de dominio V de PCSK9 con 31A4 Fab. El complejo se separó del exceso de dominio V de PCSK9 por purificación en una columna de exclusión por tamaño. El complejo dominio V de PCSK9 / 31A4 cristalizó en ácido succínico 1,1 M pH 7, 2 % de PEG MME 2000.

Recogida de datos y determinación de la estructura

El conjunto de datos para el cristal de dominio V de PCSK9 / 31A4 se recogió en una fuente de rayos X Rigaku FR-E y se procesó con denzo/scalepack (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. y Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).

Los cristales del dominio V de PCSK9 / 31A4 crecen en el grupo espacial P212121 con dimensiones de celda unitaria a=74,6, b=131,1, c=197,9 Á con dos moléculas de complejo por unidad asimétrica, y difractan a una resolución de 2,2 Á. La estructura de dominio V de PCSK9 / 31A4 se resolvió por reemplazo molecular con el programa MOLREP (CCP4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)) usando el dominio V de la estructura de PCSK9 (Piper, D.E. et al. The crystal structure of PCSK9: a regulator of plasma LDL-cholesterol. Structure 15, 545-52 (2007)) como el modelo de búsqueda de partida. Manteniendo la disolución de PCSK9 450-692 fija, se usó un dominio variable de anticuerpo como un modelo de búsqueda. Después de un refinamiento inicial, los dominios constantes del anticuerpo se ajustaron a mano. La estructura completa se mejoró con múltiples rondas de construcción de modelo con Quanta y refinamiento con cnx (Brunger, A.T. et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr54, 905-21 (1998)).

Se determinó que los aminoácidos de la interfase de interacción del núcleo eran todos los residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 5 Á de la proteína pareja PCSK9. Se eligió 5 Á como la distancia de punto de corte de la región del núcleo para permitir a los átomos en un radio de van der Waals más un posible enlace de hidrógeno mediado por agua. Se determinó que los aminoácidos en la interfase de interacción en el límite eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo menos de o igual a 8 Á de la proteína pareja PCSK9 pero no incluidos en la lista de interacción del núcleo. Se eligió menos de o igual a 8 Á como la distancia de punto de corte de la región límite para permitir la longitud de un aminoácido arginina extendido. Los aminoácidos que cumplían estos criterios de distancia se calcularon con el programa PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)). Las distancias se calcularon usando el complejo dominio V "A" y 31A4 "L1,H1".

La estructura de cristal del dominio V de PCSK9 unido al fragmento Fab de 31A4 se determinó a una resolución de 2,2 Á. Las representaciones de la estructura de cristal se proporcionan en las FIG. 21A-21D. Las FIG. 21A-21C muestran que el 31A4 Fab se une al dominio V de PCSK9 en la región de los subdominios 1 y 2.

Se hizo un modelo de PCSK9 de longitud completa unida al 31A4 Fab. La estructura de PCSK9 de longitud completa se superpuso sobre el dominio V de PCSK9 del complejo. Una figura de este modelo se muestra en la FIG. 21D. Se resalta el sitio de la interacción entre el dominio EGFa del LDLR y PCSK9.

El análisis de la estructura muestra dónde interacciona este anticuerpo con PCSK9 y demuestra que los anticuerpos que no se unen a la superficie de unión a LDLR de PCSK9 pueden todavía inhibir la degradación de LDLR que está mediada a través de PCSK9 (cuando los resultados se ven en combinación con el Ejemplo 40 y 41 a continuación). Además, el análisis de la estructura de cristal permite la identificación de aminoácidos específicos implicados en la interacción entre PCSK9 y el anticuerpo 31A4. Además, también se determinaron las regiones de núcleo y límite de la interfase en la superficie de PCSK9. Los residuos de aminoácidos de PCSK9 específicos del núcleo de la interfase de interacción con 31A4 se definieron como los residuos de PCSK9 que están en 5 Á de la proteína 31A4. Los residuos de núcleo son T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592 y E593. Los residuos de aminoácidos de PCSK9 de límite de la interfase de interacción con 31A4 se definieron como los residuos de PCSK9 que están 5-8 Á de la proteína 31A4. Los residuos de límite son como sigue: S465, G466, P467, A473, 1474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595 y H597. Los residuos de aminoácidos casi o completamente enterrados en la proteína PCSK9 están resaltados por subrayado. Como se indica en la presente memoria, la numeración hace referencia a las posiciones de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (ajustadas como se indica en la presente memoria).

Los residuos de aminoácidos específicos del núcleo de 31A4 de la interfase de interacción con PCSK9 se definieron como los residuos de 31A4 que están en 5 Á de la proteína PCSK9. Los residuos del núcleo para el anticuerpo 31A4 son como sigue: Cadena pesada: G27, S28, F29, S30, A31, Y32, Y33, E50, N52, H53, R56, D58, K76, G98, Q99, L100 y V101; Cadena Ligera: S31, N32, T33, Y50, S51, N52, N53, Q54, W92 y D94. Los residuos de aminoácidos del límite de 31A4 de la interfase de interacción con PCSK9 de definieron como los residuos de 31A4 que están 5-8 Á de la proteína PCSK9. Los residuos del límite para 31A4 son como sigue: Cadena Pesada: V2, G26, W34, N35, W47, I51, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103 y D104; Cadena Ligera: S26, S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95, N97, G98 y W99.

La estructura de cristal también presentó los requerimientos espaciales de esta ABP en su interacción con PCSK9. Como se muestra en esta estructura, sorprendentemente, los anticuerpos que se unen a PCSK9 sin evitar directamente la interacción de PCSK9 con el LDLR pueden todavía inhibir la función de PCSK9.

En algunas realizaciones, puede emplearse cualquier proteína de unión a antígeno que se une a, cubre o evita que 31A4 interaccione con cualquiera de los residuos anteriores para unirse a o neutralizar PCSK9. En algunas realizaciones, la ABP se une a o interacciona con al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9 (SEQ ID NO: 3): T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592 y E593. En algunas realizaciones, la ABP está en 5 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas realizaciones, la ABP se une a o interacciona con al menos uno de los residuos siguientes de PCSK9 (SEQ ID NO: 3): S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595 y H597. En algunas realizaciones, la ABP está 5 a 8 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas realizaciones, la ABP interacciona, bloquea, o está en 8 angstroms de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 de los residuos anteriores.

Las coordenadas para las estructuras de cristal discutidas en el Ejemplo anterior se presentan en la Tabla 35.4 (PCSK9 y 31A4). También se contemplan las proteínas y moléculas de unión a antígeno que interaccionan con las áreas o residuos relevantes de la estructura de PCSK9 (incluyendo aquellas áreas o residuos en 15, 15-8, 8, 8-5, 5, o menos angstroms de donde el anticuerpo interacciona con PCSK9) representadas en las figuras y/o sus posiciones correspondientes en las estructuras de las coordenadas.

El anticuerpo que se describe en las coordenadas se produjo en E. coli y así posee algunas diferencias de aminoácidos menores respecto a los anticuerpos completamente humanos. Además de las diferencias en la secuencia de la región variable, también hubo algunas diferencias en la región constante de los anticuerpos descritos por las coordenadas (de nuevo debido al hecho de que el anticuerpo se produjo en E. coli). La FIG. 22 resalta (mediante subrayado, sombreado o negrita) las diferencias entre las regiones constantes del Fab de 31A4 (producido en E. coli) cuando se compara con SEQ ID NO: 156 y 155. Para 31A4, la secuencia constante de la cadena ligera es similar a lambda humana (SEQ ID NO: 156).

Respecto a 31A4, aunque también tiene las mismas distinciones indicadas anteriormente, hay tres diferencias adicionales. Como se muestra en la FIG. 22, hay dos aminoácidos adicionales en el inicio, que vienen del procesamiento incompleto del péptido señal en la expresión en E. coli. Además, hay una sustitución adicional en la región constante de cadena pesada de 31A4 cuando se compara con SEQ ID NO: 155, que es el ajuste de una L (en SEQ ID NO: 155) a una H. Finalmente, 31A4 tiene una glutamina como el aminoácido inicial del Fab. También se diferencia el final de la cadena pesada (en caja en gris oscuro), pero los aminoácidos no están ordenados en la estructura de manera que no aparecen en las coordenadas. Como apreciará un experto en la técnica, las etiquetas de his no son una parte requerida de la ABP y no deberían considerarse como parte de la secuencia de la ABP, a no ser que se reclame explícitamente por referencia a una SEQ ID NO específica que incluye una etiqueta de histidina y una afirmación de que la secuencia de ABP "incluye la etiqueta de Histidina".

EJEMPLO 37

Mapeo de epítopos--Agrupación en clases

Se realizó un conjunto alternativo de experimentos de agrupación en clases además del conjunto en el Ejemplo 10. Como en el Ejemplo 10, puede pensarse que las ABP que compiten entre sí se unen al mismo sitio en la diana y en lenguaje común se dice que se "agrupan en clases" conjuntamente.

Se usó una modificación del método de Agrupación en Clases Multiplexado descrito por Jia, et al (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Se incubaron códigos de perlas individuales de perlas Luminex recubiertas con estreptavidina en 100 ul de 0,5 ug/ml de anticuerpo de ratón de captura monovalente biotinilado anti-IgG humana (BD Pharmingen, n.° 555785) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, después se lavó 3x con PBSA, disolución salina tamponada con fosfato (PBS) más 1 % de albúmina de suero bovino (BSA). Cada código de perla se incubó separadamente con 100 ul de 2 ug/ml de anticuerpo anti-PCSK9 (Anticuerpo de Recubrimiento) durante 1 hora y se lavó 3x con PBSA. Las perlas se combinaron y se dispensaron en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, #MSBVN1250). Se añadieron 100 ul de 2 ug/ml de proteína PCSK9 purificada a la mitad de los pocillos. Se añadió tampón a la otra mitad como control. La reacción se incubó durante 1 hora y se lavó. Se añadieron 100 ul de 2 ug/ml de un anticuerpo anti-PCSK9 (Ab de Detección) a todos los pocillos, se incubó durante 1 hora y se lavó. Se procesó una IgG humana irrelevante (Jackson, n.° 009-000-003) como otro control. Se añadieron 20 ul de anti-IgG humana monovalente de ratón conjugado con PE (BD Pharmingen, n.° 555787) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora y se lavó. Las perlas se resuspendieron en 100 ul de PBSA y se recogieron un mínimo de 100 eventos/código de perla en el instrumento BioPlex (BioRad).

La intensidad fluorescente media (MFI) de la pareja de anticuerpo sin PCSK9 se sustrajo de la señal de la reacción correspondiente que contenía PCSK9. Para que la pareja de anticuerpo se considere unida simultáneamente y, por lo tanto, en diferentes clases, la señal sustraída tenía que ser mayor de 3 veces la señal del anticuerpo compitiendo consigo mismo y 3 veces la señal del anticuerpo compitiendo con el anticuerpo irrelevante.

Los datos de lo anterior se representan en las FIG. 23A-23D. Las ABP se encuentran en cinco clases. Las cajas sombreadas indican las ABP que pueden unirse simultáneamente a PCSK9. Las cajas no sombreadas indican aquellas ABP que compiten entre sí por la unión. Un resumen de los resultados se muestra en la Tabla 37.1.

Tabla 37.1.

Las clases 1 (compite con ABP 21B12) y 3 (compite con 31H4) son exclusivas entre sí; la clase 2 compite con las clases 1 y 3; y la clase 4 no compite con las clases 1 y 3. La clase 5, en este ejemplo, se presenta como una clase "cajón de sastre " para describir aquellas ABP que no se ajustan en las demás clases. Así, las ABP identificadas anteriormente en cada una de las clases son representativas de diferentes tipos de localizaciones de epítopo en PCSK9, algunas de las cuales se superponen entre sí.

Como apreciará un experto en la técnica, si la ABP de referencia evita la unión de la ABP sonda entonces se dice que los anticuerpos están en la misma clase. El orden en el que se emplean las ABP puede ser importante. Si la ABP A se emplea como la ABP de referencia y bloquea la unión de la ABP B, lo contrario no siempre es cierto: La ABP B usada como la ABP de referencia no bloqueará necesariamente a la ABP A. Existen varios factores en juego aquí: la unión de una ABP puede causar cambios conformacionales en la diana que evitan la unión de la segunda ABP, o los epítopos que se superponen pero no se ocluyen completamente entre sí pueden permitir que la segunda ABP tenga todavía interacciones de alta afinidad suficientes con la diana como para permitir la unión. Las ABP con una afinidad mucho mayor pueden tener una mayor capacidad para apartar a una ABP bloqueante fuera de su camino. En general, si se observa competición en cualquier orden, se dice que las ABP se agrupan en clases conjuntamente, y si ambas ABP pueden bloquearse entre sí entonces es probable que los epítopos se superpongan más completamente.

EJEMPLO 38

Mapeo de Epítopos - Transferencia Western

El presente ejemplo demuestra si los epítopos para las ABP examinadas eran o no lineales o conformacionales. Se procesaron transferencias western reductoras desnaturalizantes y no reductoras desnaturalizantes para determinar qué anticuerpos tenían un epítopo conformacional. Los anticuerpos que se unen a una transferencia western reductora desnaturalizante tienen un epítopo lineal y no son conformacionales. Los resultados se presentan en la FIG. 24A y FIG. 24B. Para la transferencia, se procesaron 0,5 ug/carril de PCSK9 humana de longitud completa purificada en un gel al 4-12 % de Bis-Tris NuPAGE y Tampón de ejecución MES SDS. Se usó 1 ug/ml de anticuerpos anti-PCSK9, excepto 0,5 ug/ml de 31G11, para ensayar la transferencia. Se usó 1:5.000 de anticuerpo secundario de burro anti-IR700 humano y se leyó en un instrumento LiCOR. El anticuerpo 13H1 se unió a un epítopo lineal en el pro-dominio de PCSK9. Todos los demás anticuerpos presentaron resultados que fueron coherentes con epítopos conformacionales. Estos geles separan el pro-dominio del resto de la proteína, y el pro dominio corrió a aproximadamente 15 kDa. Además, 3C4 y 31A4 parecieron unirse a epítopos conformacionales que estaban conservados por enlaces disulfuro, ya que estos anticuerpos se unieron a PCSK-9 en condiciones desnaturalizantes en las que se habían conservado los enlaces disulfuro (izquierda) pero la reducción de las muestras (derecha) eliminó la unión.

EJEMPLO 39

Mapeo de Epítopos -- Escaneo de arginina / ácido glutámico

Se seleccionaron las ABP representativas de cada clase (del Ejemplo 37) para análisis adicional de epítopos. Se realizó una estrategia de escaneo de arginina/ácido glutámico para el mapeo de la unión de ABP a PCSK9. Como antecedente, este método determina si un residuo es parte del epítopo estructural, lo que significa los residuos en el antígeno que están en contacto o están enterrados por el anticuerpo. Las cadenas laterales de la arginina y ácido glutámico están cargadas y son voluminosas y pueden alterar la unión del anticuerpo incluso si el residuo mutado no está implicado directamente en la unión del anticuerpo.

Selección de residuos

La estructura de cristal de PCSK9 se usó para seleccionar los residuos que se iban a mutar para el mapeo de epítopos. El método usado para elegir los residuos que se van a mutar implicó tanto mecanismos computacionales como análisis de estructura interactivos. La estructura de PCSK9 contenía huecos de residuos ausentes y tenía 30 aminoácidos ausentes en el extremo N (es decir, la secuencia señal) y 10 aminoácidos en el extremo C. Los residuos ausentes internos se modelaron en la estructura, pero no los residuos ausentes N y C-terminales. Se calculó la proporción de exposición a disolvente para cada residuo: el área superficial de cada residuo en el contexto de la proteína (SA1) se dividió por el área superficial del residuo en un trímero con glicinas flanqueantes (SA2) con una estructura de núcleo conservada. Se seleccionaron los residuos con una proporción de exposición al disolvente mayor de 10 % (R10) así como los 40 residuos terminales ausentes. A partir de esto, las prolinas y glicinas con ángulos O positivos se excluyeron para reducir la posibilidad de plegamiento erróneo. El número de residuos que se van a mutar en el dominio V se redujo usando una proporción de exposición al disolvente de 37 % junto con una inspección visual de la proteína completa para llevar el número total de mutaciones a 285. Varias orientaciones de la superficie de PCSK9 con estas varias clases identifica se muestran en la FIG. 25A-25F. En estas figuras, el gris más claro indica áreas que no se seleccionaron o cuya selección se canceló. El gris más oscuro indica aquellos residuos seleccionados).

Clonación y expresión

Una vez se identificaron los residuos que se iban a alterar, los varios residuos se alteraron. Se clonó PCSK9 humana en el vector pTT5 con una etiqueta C-terminal Flag-His. Los mutantes se hicieron a partir de esta construcción original por mutagénesis dirigida a sitio usando un kit QuikChange II de Stratagene. Los oligonucleótidos con sentido y anti-sentido usados para la mutagénesis se diseñaron usando software MutaGenie de Amgen. Todas las construcciones de PCSK9 se expresaron en células 293-6E transfectadas de forma transitoria en placas de 24 pocillos y se volvieron a sembrar en tres placas de 96 pocillos con una PCSK9 no mutada control (de tipo salvaje, WT) en cada placa. Los niveles de expresión y la integridad de las proteínas recombinantes en el medio acondicionado se comprobaron por transferencia Western. De los 285 mutantes seleccionados originalmente, 41 fracasaron en la clonación o expresión. Se usaron 244 mutantes para el mapeo de epítopos. Un alineamiento de la secuencia de PCSK9 parental y una secuencia de PCSK9 representativa con los 244 residuos mutados se muestra en la FIG. 26. Se hicieron construcciones separadas que contenían una única mutación. Para los propósitos de las secuencias de epítopos y las invenciones basadas en epítopos que implican cambios en la unión, se proporcionan las secuencias en referencia a SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 303. Las secuencias en la FIG. 26 fueron las secuencias usadas para los presentes estudios de unión a epítopo. Un experto en la técnica apreciará que los presentes resultados también se aplican a otras variantes de PCSK9 descritas en la presente memoria (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 3, así como las demás variantes alélicas).

Se eligieron cinco anticuerpos, uno representativo de cada clase, para el mapeo de epítopos fino. Fueron 21B12, 31H4, 12H11, 31A4, 3C4. Todos anticuerpos con epítopos conformacionales. También se cristalizó 31A4 con PCSK9, como se ha descrito anteriormente.

Epítopos estructurales y funcionales

Los epítopos pueden definirse adicionalmente como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas). Los epítopos estructurales pueden pensarse como la zona de la diana que está cubierta por el anticuerpo.

La mutagénesis por escaneo empleada fue un escaneo de arginina y ácido glutámico. Estas dos cadenas laterales se eligieron debido a su gran volumen estérico y su carga, lo que permite que las mutaciones que ocurren en el epítopo estructural tengan un mayor efecto en la unión del anticuerpo. La arginina se empleó generalmente excepto cuando el residuo WT era arginina, y en estos casos el residuo se mutó a ácido glutámico para cambiar la carga.

Para el propósito del mapeo de epítopos, se usó un ensayo basado en perlas multiplexado para medir la unión del anticuerpo a PCSK9 y mutantes de PCSK9 simultáneamente. La unión del anticuerpo a los mutantes se comparó entonces con su unión al tipo salvaje en el mismo pocillo. Las variantes se dividieron en tres grupos: Grupo 1: 81 variantes 2 controles wt 1 control negativo 1 otro sobrenadante de PCSK9; Grupo 2: 81 variantes 2 controles wt 2 controles negativos; y Grupo 3: 82 variantes 2 controles wt 1 control negativo. El ensayo se corrió como sigue: 85 conjuntos de perlas LumAvidin recubiertas con estreptavidina con código de color (Luminex) se unieron con anticuerpo anti-pentaHis biotinilado (Qiagen, #1019225) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) después se lavó tres veces en PBS, 1 % de BSA, 0,1 % de Tween 20. Cada conjunto de perlas con código de color se dejó unir a un mutante de PCSK9, tipo salvaje, o control negativo en 150 ul de sobrenadante toda la noche a 4 0C.

Los conjuntos de perlas con código de color, cada uno asociado a una proteína específica, se lavaron y combinaron. En este punto, había 3 combinaciones de 85 conjuntos de perlas, una combinación para cada grupo de mutantes y controles. Las perlas de cada combinación se alicuotaron en 24 pocillos (3 columnas) de una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, #MSBVN1250). Se añadieron 100 ul de anticuerpos anti-PCSK9 en diluciones de 4 veces a nueve columnas para puntos en triplicado y se incubó durante 1 hora a TA y se lavó. Se añadieron 100 ul de una dilución 1:200 de Fc anti-IgG humano conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a TA y se lavó.

Las perlas se resuspendieron en 1 % de BSA en PBS, se agitó durante 10 min y se leyó en el instrumento BioPlex (Bio-Rad). El instrumento identifica cada perla por su código de color identificando de esta manera la proteína específica asociada con el código de color. Al mismo tiempo, mide la cantidad de anticuerpo unido a las perlas por intensidad de fluorescencia del agente de tinción PE. La unión del anticuerpo a cada mutante puede compararse entonces directamente con su unión al tipo salvaje en la misma combinación. Se usó la quimera de IL-17R E como un control negativo. Un resumen de todos los mutantes examinados se muestra en la Tabla 39.1 (con referencia a la numeración de secuencia usada en la FIG. 1A y 26).

Estudio de variabilidad de perlas

Antes de procesar el ensayo de unión de mapeo de epítopos, se realizó un experimento de validación para evaluar la variabilidad "región de perla" a "región de perla" (B-B). En el experimento de validación, todas las perlas se conjugaron con la misma proteína de tipo salvaje control. Por lo tanto, la diferencia entre las regiones de perlas se debió puramente a la varianza B-B y no se vio afectada por la diferencia entre las proteínas de tipo salvaje y mutante. La titulación de anticuerpo se procesó con doce réplicas en diferentes pocillos.

El objetivo de este análisis estadístico fue estimar la variabilidad B-B de la CE50 estimada de las curvas de unión. La desviación estándar (SD) de B-B estimada se usó entonces para construir los intervalos de confianza de CE50 de las proteínas de tipo salvaje y mutantes durante los experimentos de comparación de curvas.

Se ajustó un modelo logístico de cuatro parámetros a los datos de unión para cada región de perla. El archivo resultante, que contiene resultados del control de calidad (QC) de la curva y estimaciones de parámetros para log de CE50 superior (max), inferior (min), pendiente de Hill (pendiente) y natural (xmid) de las curvas, se usó como los datos brutos para el análisis. La variabilidad B-B para cada parámetro se estimó entonces ajustando el modelo de efecto mixto usando el procedimiento SAS PROC MIXED. Solo las curvas con "buen" estado QC se incluyeron en el análisis. El modelo de efecto mixto final incluyó solo residuales (es decir, regiones de perla individuales) como efecto aleatorio. Se estimaron las medias mínimas cuadráticas (media LS) para cada parámetro también por el modelo de efecto mixto. La SD de B-B se calculó tomando la raíz cuadrada de la varianza de B-B. También se calculó el factor de cambio entre media LS 2SD y media LS - 2SD, que representan aproximadamente el percentil 97,5 superior e inferior de la población. Los resultados se presentan en la Tabla 39.2.

Tabla 39.2 Estimaciones de la media mínima cuadrática varianza erla-a- erla

Identificación de residuos en el epítopo estructural

Un residuo se consideró parte del epítopo estructural (un "acierto") cuando si se muta a arginina o ácido glutámico altera la unión del anticuerpo. Esto se observa como un desplazamiento en la CE50 o una reducción de la señal máxima comparado con la unión de anticuerpo al tipo salvaje. Los análisis estadísticos de las curvas de unión de anticuerpo a tipo salvaje y mutantes se usaron para identificar desplazamientos de CE50 estadísticamente significativos. El análisis tiene en consideración la variación en el ensayo y el ajuste de las curvas.

Identificación de aciertos basada en comparación de CE50

Los valores CE50 y Bmax se generaron a partir de un modelo logístico de 4 parámetros ponderado ajustado a los datos de unión usando S-PLUS con software VarPower (Insightful Corporation, Seattle WA). Se compararon las CE50 de las curvas de unión de mutantes y las curvas de unión de tipo salvaje. Se identificaron diferencias estadísticamente significativas como aciertos para consideración adicional. Las curvas con indicadores "nofit" ("sin ajuste") o "badfit" ("mal ajuste") se excluyeron del análisis.

Las variaciones en las estimaciones de CE50

Se consideraron dos fuentes de variaciones en la comparación de las estimaciones de CE50, variación del ajuste de la curva y la variación perla-perla. Los tipos salvajes y mutantes se ligaron a perlas diferentes, por lo tanto su diferencia se vieron afectadas con la diferencia perla-perla (descrita anteriormente). La variación del ajuste de la curva se estimó por el error estándar de las estimaciones de log CE50. La variación perla-perla se determinó experimentalmente usando un experimento en el que los controles de tipo salvaje se ligaron a cada una de las perlas (descrito anteriormente). La variación de las perlas en las estimaciones de CE50 de la curva de unión de tipo salvaje de este experimento se usó para estimar la variación perla-perla en el experimento real de mapeo de epítopos.

Ensayo para el desplazamiento de CE50 entre mutantes y tipo salvaje

Las comparaciones de dos CE50 (en escala log) se realizó usando el ensayo de la t de Student. El estadístico t se calculó como la proporción entre delta (las diferencias absolutas entre estimaciones de CE50) y la desviación estándar de delta. La varianza de delta se estimó por la suma de los tres componentes, estimación de la varianza de CE50 para curvas muíante y de tipo salvaje en la regresión no lineal y dos veces la varianza perla-perla estimada a partir de un experimento separado. El múltiplo de dos para la varianza perla-perla se debió a la asunción de que tanto las perlas mutante como de tipo salvaje tenían la misma varianza. El grado de libertad de la desviación estándar de delta se calculó usando la aproximación de Satterthwaite (1946). Los valores p individuales y los intervalos de confianza (95 % y 99 %) se derivaron tomando como base la distribución de la t de Student para cada comparación. En el caso de múltiples controles de tipo salvaje, se tomó una estrategia conservadora eligiendo el control de tipo salvaje que era lo más similar al mutante, es decir, eligiendo los que tenían valores de p mayores.

Los ajustes de multiplicidad eran importantes para controlar el o los falsos positivos a la vez que se realizaba un gran número de ensayos simultáneamente. Se implementaron dos formas de ajuste de multiplicidad para este análisis: control del error por familia (FWE) y control de tasa de descubrimientos falsos (FDR). La estrategia FWE controla la probabilidad de que uno o más aciertos no sean reales; la estrategia FDR controla la tasa esperada de falsos positivos entre los aciertos seleccionados. La primera estrategia es más conservadora y menos potente que la última. Hay muchos métodos disponibles para ambas estrategias, para este análisis, se seleccionaron el método de Hochberg (1988) para el análisis de FWE y el método FDR de Benjamini-Hochberg (1995) para el análisis de FDR. Se calcularon los valores de p ajustados para ambas estrategias.

Resultados

Desplazamiento de CE50

Las mutaciones cuya CE50 es significativamente diferente del tipo salvaje, por ejemplo, que tienen un valor de p ajustado de tasa de descubrimientos falsos para el ensayo completo de 0,01 o menos, se consideraron parte del epítopo estructural. Todos los aciertos también tenían un valor de p ajustado de tasa de error por familia tipo I para cada anticuerpo de menos de 0,01 excepto el residuo R185E para el anticuerpo 31H4 que tenía un valor de p ajustado FWE por anticuerpo de 0,0109. Los residuos en el epítopo estructural de los varios anticuerpos determinados por el desplazamiento de CE50 se muestran en la Tabla 39.3 (las mutaciones puntuales son con referencia a s Eq ID NO: 1 y 303)

Reducción de la señal máxima

El porcentaje de señal máxima se calculó usando la señal máxima del ajuste de la curva (BmaxPorWT) y el punto de datos brutos (MaxBruPorWT). Las mutaciones que redujeron la señal máxima de la unión de anticuerpo >70 % comparado con la señal de tipo salvaje o que redujeron la señal de un anticuerpo comparada con otros anticuerpos >50 % cuando todos los demás anticuerpos son al menos 40 % del tipo salvaje se consideraron aciertos y parte del epítopo. La Tabla 39.4 presenta los residuos que están en el epítopo estructural (cursiva) según se determina por la reducción de la señal máxima.

Tabla 39.4

(Las mutaciones puntuales son con referencia a SEQ ID NO: 1 y la FIG. 26).

La Tabla 39.5 presenta un resumen de todos los aciertos para los distintos anticuerpos.

Tabla 39.5

Para examinar adicionalmente cómo estos residuos forman parte de o todos de los de los epítopos relevantes, las posiciones indicadas anteriormente se mapearon en varios modelos de estructura de cristal.

La FIG. 27C representa los aciertos de epítopo de 31A4, según se mapea en una estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica aquellos residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica aquellos residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y dio lugar a un cambio significativo en CE50 y/o Bmax. Los aciertos de epítopo se basaron en el desplazamiento de CE50. Se sabe que el anticuerpo 31A4 se une al dominio V de PCSK9, lo que parece consistente con los resultados presentados en la FIG. 27C.

La FIG. 27E representa los aciertos de epítopo de 3C4, según se mapea en la estructura de cristal de PCSK9 con los anticuerpos 31H4 y 21B12. La estructura identifica los residuos de PCSK9 como sigue: gris claro indica los residuos que no se mutaron (con la excepción de aquellos residuos que se indican explícitamente en la estructura) y gris oscuro indica los residuos mutados (una minoría de los cuales fracasó en la expresión). Los residuos que se indican explícitamente se ensayaron (independientemente del sombreado indicado en la figura) y dieron lugar a un cambio significativo en CE50 y/o Bmax.

3C4 no compite con 21B12 y 31H4 en el ensayo de agrupación en clases. 3C4 se une al dominio V en el ensayo de unión de dominio (véanse los resultados del Ejemplo 40, FIG. 28A y 28B).

Aunque había aproximadamente una docena de mutantes que se podría haber esperado que tuvieran un efecto en la unión (tomando como base la estructura de cristal), el presente experimento demostró que, sorprendentemente, no lo tuvieron. Como apreciará un experto en la técnica, los resultados presentados anteriormente están muy de acuerdo con las estructuras de cristal y unión de PCSK-9 de estos anticuerpos. Así, las variantes de las ABP que poseen la capacidad de unirse a las áreas indicadas anteriormente se proporcionan adecuadamente por la presente descripción.

Como apreciará un experto en la técnica, aunque la caída en B-max y aciertos de desplazamiento de CE50 pueden considerarse manifestaciones del mismo fenómeno, hablando estrictamente, una caída en B-max sola no refleja una pérdida de afinidad per se sino, en lugar de esto, la destrucción de algún porcentaje del epítopo de un anticuerpo. Aunque no hay superposición en los aciertos determinados por B-max y CE50, las mutaciones con un fuerte efecto en la unión pueden no permitir la generación de una curva de unión útil y, por lo tanto, no puede determinarse la CE50 para dichas variantes.

Como apreciará un experto en la técnica, las ABP en la misma clase (con la excepción de la clase 5, que como se ha indicado anteriormente, es una clase de cajón de sastre general) probablemente se unirán a sitios superpuestos en la proteína diana. Como tales, los epítopos y residuos relevantes anteriores pueden extenderse generalmente a todas dichas ABP en la misma clase.

Como se ha indicado anteriormente, los datos de unión anteriores y caracterización de epítopos hacen referencia a una secuencia de PCSK9 (SEQ ID NO: 1) que no incluye los primeros 30 aminoácidos de PCSK9. Así, el sistema de numeración de este fragmento de proteína, y las SEQ ID NO: que hacen referencia a este fragmento, están desplazados por 30 aminoácidos comparado con los datos y experimentos que usaron un sistema de numeración de PCSK9 de longitud completa (tales como los usados en los datos del estudio de cristales descritos anteriormente). Así, para comparar estos resultados, deberían añadirse 30 aminoácidos extra a las posiciones en cada uno de los resultados de mapeo de epítopo anteriores. Por ejemplo, la posición 207 de SEQ ID NO: 1 (o SEQ ID NO: 303), se correlaciona con la posición 237 de SEQ ID N^o: 3 (la secuencia de longitud completa y el sistema de numeración usado a lo largo del resto de la memoria descriptiva). La Tabla 39.6 muestra cómo las posiciones indicadas anteriormente, que hacen referencia a SEQ ID NO: 1 (y/o SEQ ID NO: 303) se correlacionan con SEQ ID NO: 3 (que incluye la secuencia señal).

TABLA 39.6

POSICIÓN DE AMINOÁCIDO EN POSICIÓN DE AMINOÁCIDO EN

SEQ ID NO: 1 (DATOS DE SEQ ID NO: 3 (DATOS DE

EPÍTOPOS) EPÍTOPOS)

207 237

208 238

185 215

181 211

439 469

513 543

538 568

539 569

132 162

351 381

390 420

413 443

582 612

162 192

164 194

167 197

123 153

129 159

311 341

313 343

337 367

519 549

521 551

554 584

Así, aquellas realizaciones descritas en la presente memoria con referencia a SEQ ID NO: 1 también pueden describirse, por su posición correspondiente indicada anteriormente, con referencia a SEQ ID NO: 3.

EJEMPLO 40

Ensayo de unión al dominio de PCSK9

El presente ejemplo examinó dónde en PCSK9 se unen las distintas ABP.

Se recubrieron placas transparentes de 96 pocillos maxisorp (Nunc) toda la noche con 2 ug/ml de varios anticuerpos anti-PCSK9 diluidos en PBS. Las placas se lavaron concienzudamente con PBS/0,05 % de Tween-20 y se bloquearon durante dos horas con 3 % de BSA/PBS. Después de lavar, las placas se incubaron durante dos horas bien con PCSK9 de longitud completa (aa 31-692 S^eQ ID NO: 3, procat PCSK9 (aa 31-449 SEQ ID NO: 3) o dominio V de PCSK9 (aa 450-692 de SEQ ID NO: 3) diluido en diluyente de ensayo general (Immunochemistry Technologies, LLC). Las placas se lavaron y se añadió un anticuerpo anti-PCSK9 policlonal biotinilado de conejo (D8774), que reconoce el dominio procat y v así como PCSK9 de longitud completa, a 1 ug/ml (en 1 %BSA/PBS). Se detectó PCSK9 de longitud completa, dominio procat o v unidos por incubación con neutravidina-HRP (Thermo Scientific) a 200 ng/ml (en 1 % de BSA/PBS) seguido de sustrato TMB (KPL) y medida de absorbancia a 650 nm. Los resultados, presentados en las FIGS. 28A y 28B, demuestran la capacidad de las distintas ABP de unirse a varias partes de PCSK9. Como se muestra en la FIG. 28B, ABP 31A4 se une al dominio V de PCSK9.

EJEMPLO 41

Proteínas de unión a antígeno neutralizantes no competitivas

El presente ejemplo demuestra cómo identificar y caracterizar una proteína de unión a antígeno que no es competitiva con LDLR para la unión con PCSK9, pero que todavía es neutralizante frente a la actividad de PCSK9. En otras palabras, dicha proteína de unión a antígeno no bloqueará la unión de PCSK9 a LDLR, pero evitará o reducirá la degradación de LDLR mediada por PCSK9.

Se recubrieron placas transparentes de 384 pocillos (Costar) con 2 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-receptor de LDL (R&D Systems) diluido en tampón A (cacodilato de sodio 100 mM, pH 7,4). Las placas se lavaron concienzudamente con tampón A y se bloquearon durante 2 horas con tampón B (1 % de leche en tampón A). Después de lavar, las placas se incubaron durante 1,5 horas con 0,4 ug/ml de receptor de LDL (R&D Systems) diluido en tampón C (tampón B suplementado con CaCl²10 mM). Simultáneamente a esta incubación, se incubaron 20 ng/ml de D374Y PCSK9 biotinilado con 100 ng/ml de anticuerpo diluido en tampón A o tampón A solo (control). Las placas que contenían receptor de LDL se lavaron y la mezcla D374Y PCSK9 biotinilado/anticuerpo se transfirió a ellas y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión del D374Y biotinilado al receptor de LDL se detectó por incubación con estreptavidina-HRP (Biosource) a 500 ng/ml en tampón C seguido de sustrato TMB (KPL). La señal se paró con HCl 1 N y la absorbancia se leyó a 450 nm. Los resultados se presentan en la FIG. 28C, que muestra que mientras ABP 31H4 inhibe la unión a LDLR, ABP 31A4 no inhibe la unión de LDLR a PCSK9. En combinación con los resultados del Ejemplo 40 y que se muestran en las FIG. 28A y 28B, está claro que la ABP 31A4 se une al dominio V de PCSK9 y que no bloquea la interacción de PCSK9 con LDLR.

A continuación, se confirmó adicionalmente la capacidad de la ABP 31A4 para servir como una ABP neutralizante mediante un ensayo de captación celular de LDL (como se describe en los ejemplos anteriormente). Los resultados de este ensayo de captación de LDL se presentan en la FIG. 28D. Como se muestra en la FIG. 28D, la ABP 31A4 presenta una capacidad neutralizante de PCSK9 significativa. Así, a la vista del Ejemplo 40 y los presentes resultados, está claro que las ABP pueden unirse a PCSK9 sin bloquear la interacción de unión de PCSK9 y LDLR, mientras todavía son útiles como ABP neutralizantes de PCSK9.

Incorporación por referencia

En la medida en la que cualquiera de las definiciones o términos proporcionados en las referencias citadas en la presente memoria se diferencien de los términos y discusión proporcionados en la presente memoria, prevalecen los presentes términos y definiciones.

Equivalentes

La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. La descripción y ejemplos anteriores detallan determinadas realizaciones preferidas de la invención. Se apreciará, sin embargo, que independientemente de lo detallado que pueda aparecer lo anterior en el texto, la invención puede ponerse en práctica de muchas maneras y la invención debe considerarse según las reivindicaciones adjuntas.

TABLA 35.4

ATOM 1 CB TRP 453 -29,096 34,072 11,297 1,00 62,90 A C ATOM 2 CG TRP 453 -28,288 34,936 10,370 1,00 64,93 A C ATOM 3 CD2 TRP 453 -27,397 34,492 9,339 1,00 66,49 A C ATOM 4 CE2 TRP 453 -26,843 35,642 8,742 1,00 67,05 A C ATOM 5 CE3 TRP 453 -27,013 33,233 8,865 _1,0067,25 A C ATOM 6 CD1 TRP 453 -28,241 36,301 10,353 1,00 65,59 A C ATOM 7 NE1 TRP 453 -27,375 36,733 9,378 1,00 65,65 A N ATOM 8 CZ2 TRP 453 -25,924 35,571 7,694 1,00 67,23 A C ATOM 9 CZ3 TRP 453 -26,100 33,165 7,824 1,00 67,18 A C (continuación)

ATOM 10 CH2 TRP 453 -25,566 34,327 7,252 1,00 67,55 A C ATOM ₁₁C TRP 453 -27,142 33,092 12,528 _1,0059,11 A C ATOM 12 O TRP 453 -26,061 33,624 12,777 1,00 59,88 A O ATOM 13 N TRP 453 -28,207 35,189 13,329 1,00 61,20 A N ATOM 14 CA TRP 453 -28,450 33,869 12,675 1,00 60,89 A C ATOM 15 N GLN 454 -27,248 31,827 12,137 1,00 55,81 A N ATOM ₁₆CA GLN 454 -26,072 30,981 11,962 _1,0052,32 A C ATOM 17 CB GLN 454 -26,117 29,821 12,962 1,00 54,31 A C ATOM 18 CG GLN 454 -25,914 28,448 12,353 1,00 57,49 A C ATOM 19 CD GLN 454 -24,637 27,773 12,827 1,00 59,72 A C ATOM 20 OE1 GLN 454 -23,617 28,430 13,055 1,00 60,00 A O ATOM 21 NE2 GLN 454 -24,688 26,450 12,973 1,00 59,65 A N ATOM ₂₂C GLN 454 _-26,01130,456 10,530 _1,0047,73 A C ATOM 23 O GLN 454 -27,041 30,329 9,867 1,00 46,06 A O ATOM 24 N LEU 455 -24,808 30,158 10,049 1,00 43,78 A N ATOM 25 CA LEU 455 -24,651 29,736 8,658 1,00 41,00 A C ATOM 26 CB LEU 455 -23,386 30,356 8,063 1,00 41,51 A C ATOM 27 CG LEU 455 -23,082 30,107 6,583 1,00 41,00 A C ATOM ₂₈CD1 LEU 455 -24,272 30,468 5,716 _1,0039,45 A C ATOM 29 CD2 LEU 455 -21,874 30,934 6,191 1,00 42,57 A C ATOM 30 C LEU 455 -24,602 28,217 8,531 1,00 38,55 A C ATOM 31 O LEU 455 -23,744 27,562 9,122 1,00 38,78 A O ATOM 32 N PHE 456 -25,540 27,665 7,766 1,00 34,53 A N ATOM 33 CA PHE 456 -25,605 26,226 7,524 1,00 32,19 A C ATOM 34 CB PHE 456 -27,039 25,715 7,711 _1,0030,96 A C ATOM 35 CG PHE 456 -27,517 25,742 9,135 1,00 30,83 A C ATOM 36 CD1 PHE 456 -27,303 24,657 9,973 1,00 29,93 A C ATOM 37 CD2 PHE 456 -28,186 26,850 9,636 1,00 30,09 A C ATOM 38 CE1 PHE 456 -27,749 24,675 11,291 1,00 30,85 A C ATOM 39 CE2 PHE 456 -28,635 26,877 10,952 1,00 31,15 A C ATOM 40 CZ PHE 456 -28,417 25,789 11,781 _1,0029,38 A C ATOM 41 C PHE 456 -25,154 25,915 6,100 1,00 30,99 A C ATOM 42 O PHE 456 -25,649 26,508 5,148 1,00 30,86 A O ATOM 43 N CYS 457 -24,222 24,981 5,957 1,00 30,33 A N ATOM 44 CA CYS 457 -23,812 24,518 4,636 1,00 29,83 A C ATOM 45 C CYS 457 -23,729 23,002 4,598 1,00 29,43 A C ATOM 46 O CYS 457 -23,477 22,357 5,617 _1,0030,24 A O ATOM 47 CB CYS 457 -22,442 25,067 4,260 1,00 30,42 A C ATOM 48 SG CYS 457 -22,270 26,868 4,126 1,00 33,48 A S ATOM 49 N ARG 458 -23,932 22,440 3,412 1,00 28,73 A N ATOM 50 CA ARG 458 -23,732 21,013 3,192 1,00 27,98 A C ATOM 51 CB ARG 458 -25,082 20,295 3,128 1,00 27,46 A C ATOM 52 CG ARG 458 -25,982 20,816 2,021 1,00 27,71 A C ATOM 53 CD ARG 458 -27,371 20,197 2,092 1,00 28,19 A C ATOM 54 NE ARG 458 -28,104 20,474 0,864 _{1,00 28,26}A N ATOM 55 CZ ARG 458 -28,211 19,619 -0,150 1,00 28,99 A C ATOM 56 NH1 ARG 458 -28,891 19,965 -1,235 1,00 28,33 A N ATOM 57 NH2 ARG 458 -27,651 18,416 -0,073 1,00 26,24 A N ATOM 58 C ARG 458 -22,969 20,809 1,889 1,00 26,26 A C ATOM 59 O ARG 458 -22,870 21,721 1,074 1,00 25,98 A O (continuación)

ATOM ₆₀N THR 459 -22,425 19,612 1,705 _1,0024,49 A N ATOM 61 CA THR 459 -21,655 19,296 0,520 1,00 24,90 A C ATOM 62 CB THR 459 -20,334 18,588 0,898 1,00 25,10 A C ATOM 63 OG1 THR 459 -19,493 19,502 1,608 1,00 25,42 A O ATOM 64 CG2 THR 459 -19,609 18,094 -0,344 1,00 22,93 A C ATOM 65 C THR 459 -22,476 18,383 -0,379 1,00 26,20 A C ATOM ₆₆O THR 459 -23,093 17,428 0,093 _1,0024,85 A O ATOM 67 N VAL 460 -22,493 18,690 -1,672 1,00 26,69 A N ATOM 68 CA VAL 460 -23,209 17,869 -2,637 1,00 27,29 A C ATOM 69 CB VAL 460 -24,313 18,676 -3,343 1,00 29,26 A C ATOM 70 CG1 VAL 460 -24,981 17,823 -4,419 1,00 26,28 A C ATOM 71 CG2 VAL 460 -25,339 19,146 -2,317 _1,0030,35 A C ATOM 72 C VAL 460 -22,264 17,321 -3,693 1,00 27,26 A C ATOM 73 O VAL 460 -21,661 18,078 -4,451 1,00 29,73 A O ATOM 74 N TRP 461 -22,140 16,001 -3,740 1,00 26,25 A N ATOM 75 CA TRP 461 -21,368 15,351 -4,788 1,00 26,76 A C ATOM 76 CB TRP 461 -20,764 14,038 -4,268 1,00 24,57 A C ATOM 77 CG TRP 461 -19,606 14,235 -3,334 _1,0024,74 A C ATOM 78 CD2 TRP 461 -18,218 13,984 -3,613 1,00 24,43 A C ATOM 79 CE2 TRP 461 -17,494 14,304 -2,447 1,00 25,75 A C ATOM 80 CE3 TRP 461 -17,520 13,521 -4,736 1,00 26,44 A C ATOM 81 CD1 TRP 461 -19,660 14,684 -2,046 1,00 23,71 A C ATOM 82 NE1 TRP 461 -18,397 14,729 -1,507 1,00 25,76 A N ATOM 83 CZ2 TRP 461 -16,103 14,176 -2,368 _1,0028,09 A C ATOM 84 CZ3 TRP 461 -16,135 13,392 -4,657 1,00 27,37 A C ATOM 85 CH2 TRP 461 -15,444 13,719 -3,480 1,00 26,66 A C ATOM 86 C TRP 461 -22,264 15,076 -5,998 1,00 27,35 A C ATOM 87 O TRP 461 -23,406 14,629 -5,850 1,00 26,99 A O ATOM 88 N SER 462 -21,745 15,364 -7,189 1,00 25,48 A N ATOM 89 CA SER 462 -22,428 15,031 -8,432 _1,0025,19 A C ATOM 90 CB SER 462 -21,732 15,698 -9,626 1,00 24,60 A C ATOM 91 OG SER 462 -20,463 15,099 -9,866 1,00 24,13 A O ATOM 92 C SER 462 -22,384 13,528 -8,627 1,00 24,96 A C ATOM 93 O SER 462 -21,641 12,835 -7,947 1,00 26,57 A O ATOM 94 N ALA 463 -23,176 13,030 -9,566 1,00 26,08 A N ATOM 95 CA ALA 463 -22,921 11,714 -10,139 _1,0027,25 A C ATOM 96 CB ALA 463 -24,042 11,351 -11,106 1,00 24,94 A C ATOM 97 C ALA 463 -21,578 11,774 -10,883 1,00 26,16 A C ATOM 98 O ALA 463 -21,131 12,849 -11,278 1,00 25,40 A O ATOM 99 N HIS 464 -20,939 10,625 -11,066 1,00 26,74 A N ATOM 100 CA HIS 464 -19,723 10,539 -11,873 1,00 29,13 A C ATOM 101 CB HIS 464 -19,297 9,073 -11,991 1,00 30,10 A C ATOM 102 CG HIS 464 -17,948 8,876 -12,610 1,00 31,56 A C ATOM 103 CD2 HIS 464 -16,713 8,823 -12,055 1,00 30,82 A C ATOM 104 NO1 HIS 464 -17,772 8,653 -13,959 1,00 32,23 A N ATOM 105 CE1 HIS 464 -16,488 8,466 -14,208 _1,0031,96 A C ATOM 106 NE2 HIS 464 -15,824 8,565 -13,068 1,00 31,64 A N ATOM 107 C 464 -19,977 11,125 -13,272 1,00 29,91 A C HIS ATOM 108 O HIS 464 -21,080 11,013 -13,804 1,00 32,59 A O ATOM 109 N SER 465 -18,959 11,738 -13,870 1,00 28,42 A N ATOM ₁₁₀CA SER 465 -19,143 12,475 -15,126 _1,0027,55 A C (continuación)

ATOM 111 CB SER 465 -17,936 13,372 -15,405 1,00 26,69 A C ATOM 112 OG SER 465 -16,774 12,600 -15,663 1,00 26,28 A O ATOM 113 C SER 465 -19,348 11,580 -16,337 1,00 27,89 A C ATOM 114 O SER 465 -19,898 12,012 -17,351 1,00 30,42 A O ATOM 115 N GLY 466 -18,890 10,340 -16,247 1,00 24,79 A N ATOM ₁₁₆CA GLY 466 -18,715 9,563 -17,457 _1,0022,23 A C ATOM 117 C GLY 466 -17,259 9,660 -17,871 1,00 25,15 A C ATOM 118 O GLY 466 -16,583 10,644 -17,547 1,00 22,33 A O ATOM 119 N PRO 467 -16,741 8,642 -18,574 1,00 25,86 A N ATOM 120 CD PRO 467 -17,448 7,387 -18,894 1,00 26,23 A C ATOM ₁₂₁CA PRO 467 -15,304 8,535 -18,831 _1,0024,52 A C ATOM 122 CB PRO 467 -15,085 7,030 -18,999 1,00 25,31 A C ATOM 123 CG PRO 467 -16,374 6,532 -19,524 1,00 24,11 A C ATOM 124 C PRO 467 -14,787 9,321 -20,029 1,00 24,85 A C ATOM 125 O PRO 467 -13,596 9,522 -20,152 1,00 25,40 A O ATOM 126 N THR 468 -15,660 9,762 -20,923 1,00 24,02 A N ATOM 127 CA THR 468 -15,174 10,270 -22,201 1,00 23,19 A C ATOM 128 CB THR 468 -16,305 10,341 -23,242 1,00 23,48 A C ATOM 129 OG1 THR 468 -17,407 11,085 -22,706 1,00 23,61 A O ATOM 130 CG2 THR 468 -16,766 8,946 -23,608 1,00 22,59 A C ATOM 131 C THR 468 -14,503 11,640 -22,087 1,00 24,90 A C ATOM 132 O THR 468 -14,594 12,310 -21,060 1,00 23,76 A O ATOM 133 N ARG 469 -13,832 12,044 -23,159 _1,0023,46 A N ATOM 134 CA ARG 469 -12,874 13,140 -23,115 1,00 24,59 A C ATOM 135 CB ARG 469 -12,178 13,250 -24,476 1,00 25,09 A C ATOM 136 CG ARG 469 -11,111 14,318 -24,558 1,00 26,25 A C ATOM 137 CD ARG 469 -10,439 14,323 -25,935 1,00 27,32 A C ATOM 138 NE ARG 469 -9,440 15,382 -26,040 1,00 27,17 A N ATOM 139 CZ ARG 469 -8,581 15,512 -27,046 _1,0025,09 A C ATOM 140 NH1 ARG 469 -7,711 16,514 -27,044 1,00 24,35 A N ATOM 141 NH2 ARG 469 -8,591 14,644 -28,047 1,00 23,06 A N ATOM 142 C ARG 469 -13,495 14,487 -22,736 1,00 25,75 A C ATOM 143 O ARG 469 -12,891 15,276 -22,009 1,00 23,47 A O ATOM 144 N MET 470 -14,698 14,759 -23,230 1,00 24,77 A N ATOM 145 CA MET 470 -15,328 16,047 -22,965 _1,0024,49 A C ATOM 146 CB MET 470 -15,904 16,621 -24,262 1,00 24,57 A C ATOM 147 CG MET 470 -15,563 18,079 -24,508 1,00 30,96 A C ATOM 148 SD MET 470 -13,788 18,409 -24,583 1,00 31,07 A S ATOM 149 CE MET 470 -13,271 17,434 -25,959 1,00 31,18 A C ATOM 150 C MET 470 -16,425 15,926 -21,908 1,00 24,68 A C ATOM 151 O MET 470 -17,226 16,848 -21,717 1,00 23,62 A O ATOM 152 N ALA 471 -16,459 14,789 -21,220 1,00 24,16 A N ATOM 153 CA ALA 471 -17,508 14,528 -20,238 1,00 24,20 A C ATOM 154 CB ALA 471 -17,371 13,119 -19,687 1,00 20,75 A C ATOM 155 C ALA 471 -17,452 15,537 -19,096 _1,0025,48 A C ATOM 156 O ALA 471 -16,372 15,975 -18,693 1,00 27,11 A O ATOM 157 N THR 472 -18,617 15,906 -18,578 1,00 24,57 A N ATOM 158 CA THR 472 -18,675 16,811 -17,437 1,00 24,16 A C ATOM 159 CB THR 472 -19,181 18,220 -17,836 1,00 24,01 A C ATOM 160 OG1 THR 472 -20,548 18,134 -18,257 1,00 21,91 A O ATOM ₁₆₁CG2 THR 472 -18,344 18,795 -18,970 _1,0018,59 A C ATOM 162 C THR 472 -19,620 16,260 -16,386 1,00 25,66 A C (continuación)

ATOM 163 O THR 472 -20,508 15,455 -16,690 1,00 24,53 A O ATOM 164 N ALA 473 -19,415 16,700 -15,147 1,00 25,24 A N ATOM 165 CA ALA 473 -20,319 16,393 -14,048 1,00 24,92 A C ATOM 166 CB ALA 473 -19,560 15,661 -12,946 1,00 24,30 A C ATOM 167 C ALA 473 -20,900 17,699 -13,513 _1,0025,27 A C ATOM 168 O ALA 473 -20,241 18,741 -13,556 1,00 24,13 A O ATOM 169 N ILE 474 -22,131 17,638 -13,012 1,00 24,89 A N ATOM 170 CA ILE 474 -22,819 18,815 -12,489 1,00 25,52 A C ATOM 171 CB ILE 474 -24,026 19,182 -13,365 1,00 29,25 A C ATOM 172 CG2 ILE 474 -24,883 _{20,220 -12,662 1,00}32,52 A C ATOM 173 CG1 ILE 474 -23,558 19,713 -14,721 1,00 33,35 A C ATOM 174 CD1 ILE 474 -22,979 21,105 -14,661 1,00 33,21 A C ATOM 175 C ILE 474 -23,336 18,571 -11,069 1,00 26,48 A C ATOM 176 O ILE 474 -24,055 17,603 -10,823 1,00 26,94 A O ATOM 177 N ALA 475 -22,974 19,451 -10,140 1,00 25,26 A N ATOM 178 CA ALA 475 -23,580 19,452 -8,811 1,00 25,92 A C ATOM 179 CB ALA 475 -22,496 19,409 -7,732 1,00 23,88 A C ATOM 180 C ALA 475 -24,459 20,695 -8,635 1,00 26,91 A C ATOM 181 O ALA 475 -24,063 21,808 -8,998 1,00 25,49 A O ATOM 182 N ARG 476 -25,655 20,490 -8,091 1,00 28,07 A N ATOM 183 CA ARG 476 -26,642 21,558 -7,932 1,00 28,54 A C ATOM 184 CB ARG 476 -27,883 21,299 -8,792 _1,0030,18 A C ATOM 185 CG ARG 476 -27,672 21,375 -10,272 1,00 35,86 A C ATOM 186 CD ARG 476 -29,005 21,304 -11,004 1,00 38,60 A C ATOM 187 NE ARG 476 -28,838 21,409 -12,452 1,00 41,19 A N ATOM 188 CZ ARG 476 -28,492 20,389 -13,231 1,00 43,32 A C ATOM 189 NH1 ARG 476 -28,277 19,191 -12,698 1,00 43,42 A N ATOM 190 NH2 ARG 476 -28,356 20,562 -14,538 _1,0044,05 A N ATOM 191 C ARG 476 -27,093 21,615 -6,488 1,00 28,17 A C ATOM 192 O ARG 476 -27,077 20,608 -5,783 1,00 27,75 A O ATOM 193 N CYS 477 -27,519 22,797 -6,064 1,00 29,00 A N ATOM 194 CA CYS 477 -28,103 22,979 -4,745 1,00 29,17 A C ATOM 195 C CYS 477 -29,620 22,952 -4,848 1,00 30,65 A C ATOM 196 O CYS 477 -30,173 23,016 -5,947 _1,0031,16 A O ATOM 197 CB CYS 477 -27,664 24,316 -4,165 1,00 27,94 A C ATOM 198 SG CYS 477 -25,866 24,479 -3,959 1,00 30,04 A S ATOM 199 N ALA 478 -30,283 22,869 -3,699 1,00 30,57 A N ATOM 200 CA ALA 478 -31,742 22,922 -3,643 1,00 31,86 A C ATOM 201 CB ALA 478 -32,228 22,484 -2,260 1,00 29,25 A C ATOM 202 C ALA 478 -32,240 24,333 -3,949 1,00 32,09 A C ATOM 203 O ALA 478 -31,494 25,306 -3,847 1,00 31,96 A O ATOM 204 N PRO 479 -33,521 24,461 -4,322 1,00 32,78 A N ATOM 205 CD PRO 479 -34,502 23,383 -4,550 1,00 31,44 A C ATOM ₂₀₆CA PRO 479 -34,054 25,778 -4,691 _1,0032,40 A C ATOM 207 CB PRO 479 -35,515 25,486 -5,061 1,00 32,72 A C ATOM 208 CG PRO 479 -35,513 24,037 -5,458 1,00 31,86 A C ATOM 209 C PRO 479 -33,933 26,834 -3,592 1,00 32,60 A C ATOM 210 O PRO 479 -33,819 28,022 -3,884 1,00 32,64 A O ATOM 211 N ASP 480 -33,954 26,416 -2,331 1,00 31,47 A N ATOM ₂₁₂CA ASP 480 -33,879 27,384 -1,241 _1,0033,46 A C ATOM 213 CB ASP 480 -34,749 26,936 -0,057 1,00 35,16 A C ATOM 214 CG ASP 480 -34,300 25,610 0,537 1,00 36,44 A C (continuación)

ATOM 215 OD1 ASP 480 -34,828 25,224 1,598 1,00 40,34 A O ATOM 216 OD2 ASP 480 -33,419 24,954 -0,053 1,00 38,40 A O ATOM 217 C ASP 480 -32,449 27,623 -0,765 1,00 33,71 A C ATOM ₂₁₈O ASP 480 -32,222 28,295 0,246 _1,0035,25 A O ATOM 219 N GLU 481 -31,482 27,076 -1,492 1,00 32,10 A N ATOM 220 CA GLU 481 -30,087 27,191 -1,086 1,00 30,90 A C ATOM 221 CB GLU 481 -29,439 25,804 -1,016 1,00 30,17 A C ATOM 222 CG GLU 481 -30,038 24,890 0,041 1,00 30,22 A C ATOM 223 CD GLU 481 -29,692 23,425 -0,191 _1,0031,87 , A C ATOM 224 OE1 GLU 481 -29,930 22,602 0,717 1,00 30,65 A O ATOM 225 OE2 GLU 481 -29,186 23,093 -1,285 1,00 33,77 A O ATOM 226 C GLU 481 -29,292 28,073 -2,031 1,00 29,33 A C ATOM 227 O GLU 481 -29,723 28,354 -3,146 1,00 30,27 A O ATOM 228 N GLU 482 -28,127 28,510 -1,569 1,00 29,51 A N ATOM 229 CA GLU 482 -27,176 29,220 -2,411 _1,0029,75 A C ATOM 230 CB GLU 482 -26,813 30,561 -1,777 1,00 30,90 A C ATOM 231 CG GLU 482 -27,965 31,542 -1,682 1,00 35,54 A C ATOM 232 CD GLU 482 -28,316 32,148 -3,031 1,00 38,85 A C ATOM 233 OE1 GLU 482 -27,426 32,200 -3,911 1,00 39,06 A O ATOM 234 OE2 GLU 482 -29,479 32,570 -3,212 1,00 39,52 A O ATOM 235 C GLU 482 -25,915 28,372 -2,558 _1,0029,76 A C ATOM 236 O GLU 482 -25,357 27,904 -1,569 1,00 28,44 A O ATOM 237 N LEU 483 -25,464 28,176 -3,790 1,00 27,98 A N ATOM 238 CA LEU 483 -24,174 27,546 -4,015 1,00 28,33 A C ATOM 239 CB LEU 483 -24,101 26,996 -5,442 1,00 27,55 A C ATOM 240 CG LEU 483 -22,796 26,296 -5,842 1,00 29,33 A C ATOM 241 CD1 LEU 483 -23,075 25,330 -6,976 _1,0029,06 A C ATOM 242 CD2 LEU 483 -21,746 27,326 -6,253 1,00 28,65 A C ATOM 243 C LEU 483 -23,078 28,585 -3,793 1,00 28,13 A C ATOM 244 O LEU 483 -22,993 29,566 -4,522 1,00 32,20 A O ATOM 245 N LEU 484 -22,240 28,367 -2,789 1,00 27,32 A N ATOM 246 CA LEU 484 -21,214 29,341 -2,437 1,00 26,58 A C ATOM 247 CB LEU 484 -21,172 29,546 -0,916 _1,0025,53 A C ATOM 248 CG LEU 484 -22,427 30,163 -0,281 1,00 27,36 A C ATOM 249 CD1 LEU 484 -22,065 30,781 1,072 1,00 27,53 A C ATOM 250 CD2 LEU 484 -23,013 31,234 -1,196 1,00 27,97 A C ATOM 251 C LEU 484 -19,829 28,953 -2,943 1,00 27,62 A C ATOM 252 O LEU 484 -18,926 29,793 -2,994 1,00 28,95 A O ATOM 253 N SER 485 -19,655 27,688 -3,317 1,00 25,70 A N ATOM 254 CA SER 485 -18,391 27,254 -3,908 1,00 27,74 A C ATOM 255 CB SER 485 -17,304 27,106 -2,836 1,00 26,49 A C ATOM 256 OG SER 485 -17,504 25,926 -2,068 1,00 28,56 A O ATOM 257 C SER 485 -18,522 25,934 -4,664 _1,0027,50 A C ATOM 258 O SER 485 -19,569 25,281 -4,643 1,00 25,09 A O ATOM 259 N CYS 486 -17,432 25,548 -5,315 1,00 26,66 A N ATOM 260 CA CYS 486 -17,457 24,490 -6,311 1,00 26,00 A C ATOM 261 C CYS 486 -16,047 23,934 -6,434 1,00 26,11 A C ATOM 262 O CYS 486 -15,097 24,677 -6,679 1,00 25,83 A O ATOM 263 CB CYS 486 -17,932 25,090 -7,632 _1,0025,13 A C ATOM 264 SG CYS 486 -17,774 24,120 -9,162 1,00 31,94 A S ATOM 265 N SER 487 -15,912 22,628 -6,243 1,00 25,42 A N ATOM 266 CA SER 487 -14,626 21,964 -6,403 1,00 24,57 A C (continuación)

ATOM 267 CB SER 487 -14,031 21,612 -5,029 1,00 24,64 A C ATOM 268 OG SER 487 -14,849 20,692 -4,324 1,00 27,88 A O ATOM 269 C SER 487 -14,828 20,704 -7,237 _1,0023,91 A C ATOM 270 O SER 487 -15,923 20,455 -7,734 1,00 22,75 A O ATOM 271 N SER 488 -13,776 19,916 -7,408 1,00 24,08 A N ATOM 272 CA SER 488 -13,883 18,706 -8,209 1,00 25,08 A C ATOM 273 CB SER 488 -13,664 19,015 -9,698 1,00 27,25 A C ATOM 274 OG SER 488 -12,416 19,654 -9,931 _1,0025,16 A O ATOM 275 C SER 488 -12,864 17,693 -7,743 1,00 27,25 A C ATOM 276 O SER 488 -11,940 18,027 -6,997 1,00 28,14 A O ATOM 277 N PHE 489 -13,033 16,453 -8,182 1,00 26,11 A N ATOM 278 CA PHE 489 -12,152 15,383 -7,757 1,00 26,68 A C ATOM 279 CB PHE 489 -12,680 14,754 -6,462 1,00 26,29 A C ATOM ₂₈₀CG PHE 489 _-11,88613,566 -5,992 _1,0028,17 A C ATOM 281 CD1 PHE 489 -10,732 13,738 -5,241 1,00 28,05 A C ATOM 282 CD2 PHE 489 -12,303 12,272 -6,291 1,00 28,40 A C ATOM 283 CE1 PHE 489 -10,004 12,637 -4,793 1,00 29,69 A C ATOM 284 CE2 PHE 489 -11,585 11,172 -5,849 1,00 29,13 A C ATOM 285 CZ PHE 489 -10,434 11,354 -5,099 1,00 30,06 A C ATOM ₂₈₆C PHE 489 _-12,02814,323 -8,837 _1,0027,40 A C ATOM 287 O PHE 489 -13,009 13,951 -9,471 1,00 28,37 A O ATOM 288 N SER 490 -10,807 13,846 -9,041 1,00 28,47 A N ATOM 289 CA SER 490 -10,561 12,663 -9,853 1,00 30,35 A C ATOM 290 CB SER 490 -9,863 13,056 -11,158 1,00 30,98 A C ATOM 291 OG SER 490 -9,257 11,933 -11,776 1,00 33,81 A O ATOM 292 C SER 490 -9,672 11,708 -9,066 _1,0031,89 A C ATOM 293 O SER 490 -8,751 12,144 -8,378 1,00 32,56 A O ATOM 294 N ARG 491 -9,941 10,412 -9,171 1,00 33,39 A N ATOM 295 CA ARG 491 -9,110 9,402 -8,515 1,00 36,40 A C ATOM 296 CB ARG 491 -9,709 8,007 -8,719 1,00 38,90 A C ATOM 297 CG ARG 491 -11,109 7,848 -8,166 1,00 45,81 A C ATOM 298 CD ARG 491 -11,268 6,514 -7,458 1,00 51,82 A C ATOM 299 NE ARG 491 -12,322 6,565 -6,448 1,00 56,98 , A N ATOM 300 CZ ARG 491 -13,621 6,548 -6,731 1,00 58,08 A C ATOM 301 NH1 ARG 491 -14,518 6,597 -5,753 1,00 58,30 A N ATOM 302 NH2 ARG 491 -14,020 6,486 -7,995 1,00 57,04 A N ATOM 303 C ARG 491 -7,677 9,407 -9,050 1,00 35,22 A C ATOM 304 O ARG 491 -6,731 9,192 -8,305 1,00 35,69 A O ATOM 305 N SER 492 -7,533 9,654 -10,347 1,00 35,60 A N ATOM 306 CA SER 492 -6,246 9,550 -11,024 1,00 34,80 A C ATOM 307 CB SER 492 -6,459 9,060 -12,452 1,00 36,97 A C ATOM 308 OG SER 492 -7,242 9,997 -13,179 _1,0038,02 A O ATOM 309 C SER 492 -5,512 10,887 -11,068 1,00 35,54 A C ATOM 310 O SER 492 -4,295 10,932 -11,258 1,00 36,68 A O ATOM 311 N GLY 493 -6,254 11,977 -10,909 1,00 34,28 A N ATOM 312 CA GLY 493 -5,654 13,292 -11,037 1,00 32,69 A C ATOM 313 C GLY 493 -5,739 13,824 -12,456 1,00 31,91 A C ATOM 314 O GLY 493 -5,287 14,929 -12,739 _1,0032,88 A O ATOM 315 N LYS 494 -6,316 13,039 -13,357 1,00 31,63 A N ATOM 316 CA LYS 494 -6,506 13,492 -14,728 1,00 32,29 A C ATOM 317 CB LYS 494 -6,442 12,304 -15,693 1,00 34,42 A C ATOM 318 CG LYS 494 -5,080 11,622 -15,758 1,00 38,00 A C (continuación)

ATOM 319 CD LYS 494 -5,032 10,628 -16,909 1,00 39,72 A C ATOM 320 CE LYS 494 -3,648 10,029 -17,078 _1,0042,01 A C ATOM 321 NZ LYS 494 -3,585 9,143 -18,279 1,00 43,69 A N ATOM 322 C LYS 494 -7,844 14,213 -14,870 1,00 29,91 A C ATOM 323 O LYS 494 -8,870 13,604 -15,169 1,00 28,53 A O ATOM 324 N ARG 495 -7,815 15,523 -14,659 1,00 29,57 A N ATOM 325 CA ARG 495 -9,025 16,341 -14,669 _1,0028,53 A C ATOM 326 CB ARG 495 -9,558 16,492 -13,243 1,00 29,81 A C ATOM 327 CG ARG 495 -8,560 17,157 -12,306 1,00 31,40 A C ATOM 328 CD ARG 495 -9,082 17,315 -10,881 1,00 32,62 A C ATOM 329 NE ARG 495 -8,125 18,089 -10,096 1,00 34,88 A N ATOM 330 CZ ARG 495 -8,424 19,180 -9,400 1,00 34,47 A C ATOM 331 NH1 ARG 495 -7,472 19,812 -8,733 _1,0035,19 A N ATOM 332 NH2 ARG 495 -9,672 19,633 -9,355 1,00 34,89 A N ATOM 333 C ARG 495 -8,661 17,710 -15,225 1,00 27,43 A C ATOM 334 O ARG 495 -7,486 18,039 -15,349 1,00 27,93 A O ATOM 335 N ARG 496 -9,660 18,513 -15,564 1,00 26,03 A N ATOM 336 CA ARG 496 -9,376 19,877 -15,972 1,00 24,54 A C ATOM 337 CB ARG 496 -9,765 20,076 -17,436 _1,0024,73 A C ATOM 338 CG ARG 496 -8,775 19,429 -18,396 1,00 26,29 A C ATOM 339 CD ARG 496 -9,064 19,789 -19,843 1,00 25,61 A C ATOM 340 NE ARG 496 -10,117 18,950 -20,405 1,00 24,57 A N ATOM 341 CZ ARG 496 -10,601 19,095 -21,632 1,00 23,57 A C ATOM 342 NH1 ARG 496 -10,130 20,048 -22,429 1,00 20,57 A N ATOM 343 NH2 ARG 496 -11,555 18,287 -22,060 1,00 23,67 A N ATOM 344 C ARG 496 -10,052 20,921 -15,084 1,00 25,65 A C ATOM 345 O ARG 496 -10,266 22,062 -15,502 1,00 23,54 A O ATOM 346 N GLY 497 -10,375 20,531 -13,853 1,00 25,25 A N ATOM 347 CA GLY 497 -10,908 21,491 -12,900 1,00 25,50 A C ATOM 348 C GLY 497 -12,406 21,709 -13,026 1,00 25,22 A C ATOM 349 O GLY 497 -13,126 20,844 -13,524 _1,0024,92 A O ATOM 350 N GLU 498 -12,880 22,867 -12,574 1,00 25,28 A N ATOM 351 CA GLU 498 -14,313 23,099 -12,473 1,00 25,14 A C ATOM 352 CB GLU 498 -14,840 22,589 -11,122 1,00 25,47 A C ATOM 353 CG GLU 498 -14,497 23,467 -9,924 1,00 24,08 A C ATOM 354 CD GLU 498 -13,039 23,373 -9,504 1,00 27,78 A C ATOM 355 OE1 GLU 498 -12,453 22,265 -9,526 1,00 27,03 A O ATOM 356 OE2 GLU 498 -12,477 24,419 -9,139 1,00 30,19 A O ATOM 357 C GLU 498 -14,669 24,567 -12,640 1,00 26,49 A C ATOM 358 O GLU 498 -13,817 25,445 -12,521 1,00 26,93 A O ATOM 359 N ARG 499 -15,943 24,823 -12,911 _1,0027,54 A N ATOM 360 CA ARG 499 -16,427 26,180 -13,122 1,00 27,29 A C ATOM 361 CB ARG 499 -16,477 26,493 -14,615 1,00 27,26 A C ATOM 362 CG ARG 499 -16,999 27,879 -14,936 1,00 31,36 A C ATOM 363 CD ARG 499 -17,028 28,135 -16,438 1,00 29,97 A C ATOM 364 NE ARG 499 -17,154 29,562 -16,717 1,00 33,21 A N ATOM 365 CZ ARG 499 -16,543 30,183 -17,721 _1,0031,95 A C ATOM 366 NH1 ARG 499 -16,710 31,487 -17,898 1,00 33,98 A N ATOM 367 NH2 ARG 499 -15,767 29,498 -18,549 1,00 30,18 A N ATOM 368 C ARG 499 -17,818 26,349 -12,526 1,00 28,46 A C ATOM 369 O ARG 499 -18,652 25,445 -12,608 1,00 27,86 A O ATOM 370 N MET 500 -18,062 27,507 -11,921 1,00 28,00 A N (continuación)

ATOM 371 CA MET 500 -19,405 27,868 -11,492 _{1,00 28,68}A C ATOM 372 CB MET 500 -19,339 28,774 -10,259 1,00 29,36 A C ATOM 373 CG MET 500 -18,800 28,062 -9,033 1,00 31,43 A C ATOM 374 SD MET 500 -18,596 29,123 -7,594 1,00 35,65 A S ATOM 375 CE MET 500 -17,061 29,997 -8,031 1,00 30,13 A C ATOM 376 C MET 500 -20,118 28,578 -12,633 1,00 28,47 A C ATOM 377 O MET 500 -19,589 29,527 -13,213 1,00 27,47 A O ATOM 378 N GLU 501 -21,314 28,106 -12,965 1,00 29,85 A N ATOM 379 CA GLU 501 -22,059 28,656 -14,093 1,00 32,67 A C ATOM 380 CB GLU 501 -22,169 27,617 -15,222 1,00 30,99 A C ATOM 381 CG GLU 501 -20,816 27,155 -15,771 1,00 32,75 A C ATOM 382 CD GLU 501 -20,922 26,113 -16,886 1,00 32,72 A C ATOM 383 OE1 GLU 501 -21,997 25,503 -17,053 1,00 28,58 A O ATOM 384 OE2 GLU 501 -19,917 25,907 -17,603 1,00 36,53 A O ATOM 385 C GLU 501 -23,446 29,079 -13,633 1,00 35,03 A C ATOM 386 O GLU 501 -24,072 28,399 -12,823 1,00 33,00 A O ATOM 387 N ALA 502 -23,919 30,210 -14,145 1,00 39,39 A N ATOM 388 CA ALA 502 -25,231 30,722 -13,766 _1,0042,89 A C ATOM 389 CB ALA 502 -25,258 32,240 -13,896 1,00 41,99 A C ATOM 390 C ALA 502 -26,305 30,104 -14,647 1,00 46,27 A C ATOM 391 O ALA 502 -26,267 30,243 -15,868 1,00 47,27 A O ATOM 392 N GLN 503 -27,251 29,414 -14,015 1,00 49,35 A N ATOM 393 CA GLN 503 -28,385 28,808 -14,707 1,00 53,23 A C ATOM 394 CB GLN 503 -28,315 27,281 -14,636 _1,0053,57 A C ATOM 395 CG GLN 503 -27,190 26,633 -15,425 1,00 56,31 A C ATOM 396 CD GLN 503 -27,325 25,113 -15,471 1,00 56,99 A C ATOM 397 OE1 GLN 503 -28,338 24,555 -15,041 1,00 57,97 A O ATOM 398 NE2 GLN 503 -26,305 24,441 -15,991 1,00 56,50 A N ATOM 399 C GLN 503 -29,683 29,256 -14,048 1,00 55,13 A C ATOM 400 O GLN 503 -29,988 28,845 -12,927 _1,0056,06 A O ATOM 401 N GLY 504 -30,449 30,091 -14,744 1,00 56,99 A N ATOM 402 CA GLY 504 -31,757 30,473 -14,244 1,00 56,78 A C ATOM 403 C GLY 504 -31,704 31,096 -12,863 1,00 56,53 A C ATOM 404 O GLY 504 -32,463 30,711 -11,973 1,00 57,57 A O ATOM 405 N GLY 505 -30,799 32,055 -12,680 1,00 55,20 A N ATOM 406 CA GLY 505 -30,714 32,760 -11,416 1,00 53,52 A C ATOM 407 C GLY 505 -29,851 32,064 -10,381 1,00 53,23 A C ATOM 408 O GLY 505 -29,381 32,699 -9,437 1,00 53,62 A O ATOM 409 N LYS 506 -29,638 30,762 -10,548 1,00 50,84 A N ATOM 410 CA LYS 506 -28,827 29,998 -9,604 _1,0049,53 A C ATOM 411 CB LYS 506 -29,567 28,722 -9,183 1,00 51,74 A C ATOM 412 CG LYS 506 -30,536 28,905 -8,019 1,00 54,83 A C ATOM 413 CD LYS 506 -31,603 29,954 -8,324 1,00 59,19 A C ATOM 414 CE LYS 506 -32,608 30,090 -7,177 1,00 59,58 A C ATOM 415 NZ LYS 506 -33,329 28,812 -6,895 1,00 58,69 A N ATOM 416 C LYS 506 -27,464 29,627 -10,190 _1,0046,30 A C ATOM 417 O LYS 506 -27,327 29,456 -11,397 1,00 46,29 A O ATOM 418 N LEU 507 -26,459 29,504 -9,329 1,00 41,66 A N ATOM 419 CA LEU 507 -25,161 28,990 -9,749 1,00 36,60 A C ATOM 420 CB LEU 507 -24,042 29,594 -8,901 1,00 34,82 A C ATOM 421 CG LEU 507 -23,892 31,114 -8,941 1,00 35,36 A C ATOM 422 CD1 LEU 507 -22,759 31,532 -8,016 1,00 35,13 A C (continuación)

ATOM 423 CD2 LEU 507 -23,625 31,576 -10,363 1,00 30,11 A C ATOM 424 C LEU 507 -25,127 27,473 -9,623 1,00 34,72 A C ATOM 425 O LEU 507 -25,651 26,910 -8,657 1,00 33,92 A O ATOM 426 N VAL 508 -24,524 26,812 -10,607 1,00 31,44 A N ATOM 427 CA VAL 508 -24,238 25,392 -10,492 _1,0029,22 A C ATOM 428 CB VAL 508 -25,036 24,556 -11,505 1,00 31,89 A C ATOM 429 CG1 VAL 508 -26,513 24,933 -11,437 1,00 30,81 A C ATOM 430 CG2 VAL 508 -24,469 24,744 -12,895 1,00 29,53 A C ATOM 431 C VAL 508 -22,761 25,132 -10,724 1,00 28,89 A C ATOM 432 O VAL 508 -22,026 26,009 -11,192 1,00 26,64 A O ATOM 433 N CYS 509 -22,344 23,913 -10,401 _1,0026,50 A N ATOM 434 CA CYS 509 -20,943 23,519 -10,431 1,00 26,63 A C ATOM 435 C CYS 509 -20,710 22,485 -11,523 1,00 26,83 A C ATOM 436 O CYS 509 -21,233 21,372 -11,446 1,00 27,38 A O ATOM 437 CB CYS 509 -20,572 22,924 -9,076 1,00 27,35 A C ATOM 438 SG CYS 509 -18,841 22,425 -8,815 1,00 29,68 A S ATOM 439 N ARG 510 -19,921 22,847 -12,530 _{1,00 26,66}A N ATOM 440 CA ARG 510 -19,559 21,915 -13,600 1,00 25,83 A C ATOM 441 CB ARG 510 -19,838 22,546 -14,973 1,00 24,38 A C ATOM 442 CG ARG 510 -19,589 21,595 -16,148 1,00 26,06 A C ATOM 443 CD ARG 510 -19,798 22,278 -17,504 1,00 24,80 A C ATOM 444 NE ARG 510 -21,158 22,782 -17,661 1,00 25,36 A N ATOM 445 CZ ARG 510 -22,193 22,037 -18,049 _{1,00 28,22}A C ATOM 446 NH1 ARG 510 -23,397 22,581 -18,166 1,00 26,65 A N ATOM 447 NH2 ARG 510 -22,028 20,747 -18,320 1,00 24,05 A N ATOM 448 C ARG 510 -18,084 21,521 -13,518 1,00 25,64 A C ATOM 449 O ARG 510 -17,207 22,389 -13,530 1,00 27,40 A O ATOM 450 N ALA 511 -17,812 20,220 -13,439 1,00 24,50 A N ATOM 451 CA ALA 511 -16,436 19,712 -13,462 _1,0023,75 , A C ATOM 452 CB ALA 511 -16,218 18,716 -12,321 1,00 23,65 A C ATOM 453 C ALA 511 -16,131 19,033 -14,794 1,00 24,97 A C ATOM 454 O ALA 511 -17,015 18,413 -15,387 1,00 23,22 A O ATOM 455 N HIS 512 -14,872 19,135 -15,233 1,00 24,16 A N ATOM 456 CA HIS 512 -14,435 18,679 -16,559 1,00 24,87 A C ATOM 457 CB HIS 512 -13,774 19,837 -17,323 1,00 25,25 A C ATOM 458 CG HIS 512 -14,711 20,953 -17,660 1,00 25,82 A C ATOM 459 CD2 HIS 512 -14,982 22,115 -17,021 1,00 26,89 A C ATOM 460 ND1 HIS 512 -15,507 20,939 -18,785 1,00 27,87 A N ATOM 461 CE1 HIS 512 -16,229 22,046 -18,825 _1,0028,93 A C ATOM 462 NE2 HIS 512 -15,929 22,776 -17,766 1,00 30,14 A N ATOM 463 C 512 -13,440 17,518 -16,503 1,00 25,39 A C HIS ATOM 464 O HIS 512 -12,452 17,570 -15,762 1,00 24,51 A O ATOM 465 N ASN 513 -13,688 16,491 -17,313 1,00 23,79 A N ATOM 466 CA ASN 513 -12,757 15,378 -17,459 _1,0024,72 A C ATOM 467 CB ASN 513 -13,447 14,196 -18,155 1,00 21,47 A C ATOM 468 CG ASN 513 -12,676 12,888 -17,998 1,00 25,11 A C ATOM 469 OD1 ASN 513 -11,857 12,740 -17,087 1,00 26,09 A O ATOM 470 ND2 ASN 513 -12,943 11,927 -18,887 1,00 20,32 A N ATOM 471 C ASN 513 -11,558 15,839 -18,285 1,00 23,06 A C ATOM 472 O ASN 513 -11,572 16,930 -18,843 _1,0023,76 A O ATOM 473 N ALA 514 -10,523 15,010 -18,359 1,00 23,46 A N (continuación)

ATOM 474 CA ALA 514 -9,342 15,331 -19,170 1,00 24,44 A C ATOM 475 CB ALA 514 -8,116 15,505 -18,268 1,00 21,96 A C ATOM 476 C ALA 514 -9,066 14,247 -20,203 1,00 24,29 A C ATOM 477 O ALA 514 -9,501 13,107 -20,041 _1,0024,54 A O ATOM 478 N PHE 515 -8,340 14,608 -21,261 1,00 25,86 A N ATOM 479 CA PHE 515 -7,806 13,632 -22,218 1,00 25,71 A C ATOM 480 CB PHE 515 -6,761 14,313 -23,116 1,00 27,88 A C ATOM 481 CG PHE 515 -6,124 13,397 -24,134 1,00 28,53 A C ATOM 482 CD1 PHE 515 -6,818 13,006 -25,270 1,00 29,33 A C ATOM 483 CD2 PHE 515 -4,827 12,936 -23,956 _1,0031,17 A C ATOM 484 CE1 PHE 515 -6,234 12,171 -26,216 1,00 30,11 A C ATOM 485 CE2 PHE 515 -4,231 12,098 -24,897 1,00 32,87 A C ATOM 486 CZ PHE 515 -4,936 11,714 -26,030 1,00 30,57 A C ATOM 487 C PHE 515 -7,170 12,473 -21,446 1,00 25,67 A C ATOM 488 O PHE 515 -6,333 12,692 -20,570 1,00 25,88 A O ATOM 489 N GLY 516 -7,589 11,247 -21,745 _1,0025,26 A N ATOM 490 CA GLY 516 -6,993 10,089 -21,095 1,00 25,89 A C ATOM 491 C GLY 516 -7,556 9,730 -19,725 1,00 28,02 A C ATOM 492 O GLY 516 -7,309 8,634 -19,228 1,00 29,41 A O ATOM 493 N GLY 517 -8,310 10,641 -19,112 1,00 27,77 A N ATOM 494 CA GLY 517 -8,722 10,457 -17,727 1,00 28,63 A C ATOM 495 C GLY 517 -9,944 9,571 -17,617 _1,0029,61 A C ATOM 496 O GLY 517 -10,494 9,178 -18,629 1,00 29,48 A O ATOM 497 N GLU 518 -10,385 9,246 -16,408 1,00 28,88 A N ATOM 498 CA GLU 518 -11,479 8,292 -16,278 1,00 30,08 A C ATOM 499 CB GLU 518 -11,096 7,152 -15,325 1,00 33,06 A C ATOM 500 CG GLU 518 -10,923 7,562 -13,883 1,00 41,55 A C ATOM 501 CD GLU 518 -9,561 _8,160-13,614 _1,0048,72 A C ATOM 502 OE1 GLU 518 -8,719 8,183 -14,546 1,00 50,19 A O ATOM 503 OE2 GLU 518 -9,332 8,607 -12,467 1,00 53,68 A O ATOM 504 C GLU 518 -12,779 8,931 -15,818 1,00 28,72 A C ATOM 505 O GLU 518 -13,720 8,233 -15,443 1,00 29,04 A O ATOM 506 N GLY 519 -12,836 10,257 -15,862 1,00 26,44 A N ATOM 507 CA GLY 519 -14,033 10,951 -15,430 1,00 25,94 A C ATOM 508 C GLY 519 -13,808 11,639 -14,099 1,00 25,37 A C ATOM 509 O GLY 519 -12,808 11,386 -13,429 1,00 24,07 A O ATOM 510 N VAL 520 -14,738 12,507 -13,715 1,00 24,24 A N ATOM 511 CA VAL 520 -14,545 13,374 -12,557 _1,0024,20 A C ATOM 512 CB VAL 520 -14,047 14,770 -12,988 1,00 25,35 A C ATOM 513 CG1 VAL 520 -12,750 14,643 -13,781 1,00 23,64 A C ATOM 514 CG2 VAL 520 -15,114 15,454 -13,824 1,00 21,19 A C ATOM 515 C VAL 520 -15,852 13,561 -11,800 1,00 24,80 A C ATOM 516 O VAL 520 -16,920 13,207 -12,302 1,00 25,48 A O ATOM 517 N TYR 521 -15,754 14,121 -10,596 _1,0023,24 A N ATOM 518 CA TYR 521 -16,922 14,530 -9,821 1,00 23,59 A C ATOM 519 CB TYR 521 -16,902 13,893 -8,430 1,00 24,30 A C ATOM 520 CG TYR 521 -16,985 12,392 -8,457 1,00 26,30 A C ATOM 521 CD1 TYR 521 -15,833 11,620 -8,533 1,00 25,03 A C ATOM 522 CE1 TYR 521 -15,901 10,243 -8,597 1,00 29,75 A C ATOM 523 CD2 TYR 521 -18,216 11,746 -8,440 1,00 23,79 A C ATOM 524 CE2 TYR 521 -18,296 10,368 -8,505 1,00 28,16 A C ATOM 525 CZ TYR 521 -17,133 9,624 -8,587 1,00 30,47 A C (continuación)

ATOM 526 OH TYR 521 -17,196 8,259 -8,694 1,00 35,15 A O ATOM 527 C TYR 521 -16,945 16,037 -9,650 1,00 23,08 A C ATOM 528 O TYR 521 -15,898 _16,666-9,504 _1,0022,54 A O ATOM 529 N ALA 522 -18,142 16,611 -9,660 1,00 23,04 A N ATOM 530 CA ALA 522 -18,314 18,005 -9,283 1,00 22,28 A C ATOM 531 CB ALA 522 -19,336 18,685 -10,201 1,00 23,30 A C ATOM 532 C ALA 522 -18,803 18,016 -7,843 1,00 23,52 A C ATOM 533 O ALA 522 -19,561 17,132 -7,431 1,00 22,23 A O ATOM 534 N ILE 523 -18,358 19,004 -7,074 _1,0023,74 A N ATOM 535 CA ILE 523 -18,714 19,078 -5,665 1,00 23,56 A C ATOM 536 CB ILE 523 -17,537 18,639 -4,779 1,00 26,23 A C ATOM 537 CG2 ILE 523 -17,959 18,618 -3,306 1,00 21,95 A C ATOM 538 CG1 ILE 523 -17,083 17,237 -5,193 1,00 24,93 A C ATOM 539 CD1 ILE 523 -15,614 17,139 -5,452 1,00 24,24 A C ATOM 540 C ILE 523 -19,112 20,500 -5,303 _1,0026,24 A C ATOM 541 O ILE 523 -18,282 21,408 -5,298 1,00 28,35 A O ATOM 542 N ALA 524 -20,393 20,690 -5,013 1,00 24,72 A N ATOM 543 CA ALA 524 -20,902 22,004 -4,658 1,00 24,50 A C ATOM 544 CB ALA 524 -22,279 22,214 -5,295 1,00 23,50 A C ATOM 545 C ALA 524 -20,999 22,141 -3,140 1,00 24,77 A C ATOM 546 O ALA 524 -21,254 21,170 -2,435 _1,0026,27 A O ATOM 547 N ARG 525 -20,784 23,352 -2,646 1,00 26,08 A N ATOM 548 CA ARG 525 -21,076 23,684 -1,259 1,00 25,79 A C ATOM 549 CB ARG 525 -19,931 24,513 -0,678 1,00 26,10 A C ATOM 550 CG ARG 525 -19,969 24,682 0,825 1,00 27,35 A C ATOM 551 CD ARG 525 -19,724 23,367 1,575 1,00 26,86 A C ATOM 552 NE ARG 525 -19,572 23,634 3,001 _{1,00 26,08}A N ATOM 553 CZ ARG 525 -19,631 22,720 3,963 1,00 28,22 A C ATOM 554 NH1 ARG 525 -19,480 23,097 5,225 1,00 24,72 A N ATOM 555 NH2 ARG 525 -19,838 21,436 3,671 1,00 28,59 A N ATOM 556 C ARG 525 -22,374 24,492 -1,259 1,00 26,55 A C ATOM 557 O ARG 525 -22,457 25,555 -1,877 1,00 27,38 A O ATOM 558 N CYS 526 -23,393 23,973 -0,585 1,00 27,37 A N ATOM 559 CA CYS 526 -24,727 24,557 -0,635 1,00 27,20 A C ATOM 560 C CYS 526 -25,155 25,053 0,749 1,00 28,67 A C ATOM 561 O CYS 526 -25,183 24,282 1,709 1,00 27,15 A O ATOM 562 CB CYS 526 -25,722 23,512 -1,124 _{1,00 28,62}A C ATOM 563 SG CYS 526 -25,404 22,884 -2,801 1,00 28,40 A S ATOM 564 N CYS 527 -25,496 26,333 0,850 1,00 27,75 A N ATOM 565 CA CYS 527 -25,764 26,923 2,153 1,00 30,68 A C ATOM 566 C CYS 527 -27,111 27,637 2,230 1,00 30,03 A C ATOM 567 O CYS 527 -27,672 28,049 1,213 1,00 29,33 A O ATOM 568 CB CYS 527 -24,653 27,907 2,519 _1,0030,20 A C ATOM 569 SG CYS 527 -22,945 27,315 2,258 1,00 34,88 A S ATOM 570 N LEU 528 -27,626 27,777 3,448 1,00 31,45 A N ATOM 571 CA LEU 528 -28,801 28,604 3,688 1,00 33,88 A C ATOM 572 CB LEU 528 -29,615 28,058 4,862 1,00 31,33 A C ATOM 573 CG LEU 528 -30,103 26,630 4,633 1,00 31,88 A C ATOM 574 CD1 LEU 528 -30,984 26,179 5,793 _1,0028,76 A C ATOM 575 CD2 LEU 528 -30,858 26,576 3,317 1,00 29,32 A C ATOM 576 C LEU 528 -28,361 30,026 3,979 1,00 36,14 A C ATOM 577 O LEU 528 -27,762 30,311 5,014 1,00 36,49 A O (continuación)

ATOM 578 N LEU 529 -28,652 30,914 3,042 1,00 40,20 A N ATOM 579 CA LEU 529 -28,208 32,292 3,135 1,00 45,03 A C ATOM 580 CB LEU 529 -26,956 32,491 2,272 1,00 43,96 A C ATOM 581 CG LEU 529 -26,141 33,767 2,499 1,00 45,14 A C ATOM 582 CD1 LEU 529 -25,404 33,667 3,822 1,00 45,34 A C ATOM 583 CD2 LEU 529 -25,146 33,956 1,368 1,00 45,47 A C ATOM 584 C LEU 529 -29,348 33,181 2,638 1,00 48,10 A C ATOM 585 O LEU 529 -29,527 33,369 1,431 _1,0048,79 A O ATOM 586 N PRO 530 -30,144 33,726 3,570 1,00 48,91 A N ATOM 587 CD PRO 530 -29,972 33,547 5,021 1,00 48,98 A C ATOM 588 CA PRO 530 -31,254 34,638 3,259 1,00 50,42 A C ATOM 589 CB PRO 530 -31,955 34,819 4,603 1,00 49,24 A C ATOM 590 CG PRO 530 -30,872 34,610 5,604 1,00 50,12 A C ATOM 591 C PRO 530 -30,773 35,972 2,687 _1,0049,69 A C ATOM 592 O PRO 530 -29,729 36,488 3,080 1,00 48,57 A O ATOM 593 N GLN 531 -31,544 36,527 1,759 1,00 52,50 A N ATOM 594 CA GLN 531 -31,225 37,830 1,182 1,00 54,58 A C ATOM 595 CB GLN 531 -31,325 38,929 2,247 1,00 57,89 A C ATOM 596 CG GLN 531 -32,722 39,160 2,811 1,00 62,33 A C ATOM 597 CD GLN 531 -32,754 40,294 3,831 _1,0065,19 A C ATOM 598 OE1 GLN 531 -32,220 41,381 3,590 1,00 66,51 A O ATOM 599 NE2 GLN 531 -33,378 40,043 4,978 1,00 64,89 A N ATOM 600 C GLN 531 -29,820 37,843 0,586 1,00 53,73 A C ATOM 601 O GLN 531 -29,021 38,734 0,882 1,00 54,88 A O ATOM 602 N ALA 532 -29,518 36,858 -0,250 1,00 50,22 A N ATOM 603 CA ALA 532 -28,234 36,828 -0,933 _1,0048,20 , A C ATOM 604 CB ALA 532 -27,514 35,525 -0,626 1,00 46,39 A C ATOM 605 C ALA 532 -28,404 36,991 -2,443 1,00 47,17 A C ATOM 606 O ALA 532 -29,324 36,432 -3,043 1,00 45,39 A O ATOM 607 N ASN 533 -27,520 37,772 -3,052 1,00 46,61 A N ATOM 608 CA ASN 533 -27,359 37,735 -4,500 1,00 45,24 A C ATOM 609 CB ASN 533 -27,689 39,097 -5,130 1,00 48,68 A C ATOM 610 CG ASN 533 -27,745 39,039 -6,657 1,00 52,76 A C ATOM 611 OD1 ASN 533 -27,459 38,001 -7,259 1,00 55,43 A O ATOM 612 ND2 ASN 533 -28,117 40,154 -7,286 1,00 54,40 A N ATOM 613 C ASN 533 -25,910 37,372 -4,781 _1,0042,36 A C ATOM 614 O ASN 533 -25,004 38,166 -4,540 1,00 41,25 A O ATOM 615 N CYS 534 -25,694 36,162 -5,278 1,00 40,03 A N ATOM 616 CA CYS 534 -24,346 35,706 -5,572 1,00 38,85 A C ATOM 617 C CYS 534 -24,139 35,637 -7,076 1,00 38,60 A C ATOM 618 O CYS 534 -25,031 35,215 -7,812 1,00 38,28 A O ATOM 619 CB CYS 534 -24,104 34,322 -4,980 _1,0038,71 A C ATOM 620 SG CYS 534 -24,229 34,143 -3,170 1,00 39,44 A S ATOM 621 N SER 535 -22,956 36,040 -7,525 1,00 35,57 A N ATOM 622 CA SER 535 -22,642 36,029 -8,943 1,00 35,87 A C ATOM 623 CB SER 535 -22,807 37,438 -9,523 1,00 34,93 A C ATOM 624 OG SER 535 -22,034 38,375 -8,795 1,00 37,31 A O ATOM 625 C SER 535 -21,220 35,528 -9,168 1,00 34,87 A C ATOM 626 O SER 535 -20,364 35,643 -8,287 1,00 34,76 A O ATOM 627 N VAL 536 -20,975 34,966 -10,347 1,00 32,81 A N ATOM 628 CA VAL 536 -19,659 34,444 -10,681 1,00 32,05 A C ATOM 629 CB VAL 536 -19,752 33,158 -11,524 1,00 33,02 A C (continuación)

ATOM 630 CG1 VAL 536 -18,353 32,630 -11,817 _1,0031,62 A C ATOM 631 CG2 VAL 536 -20,555 32,116 -10,787 1,00 37,22 A C ATOM 632 C VAL 536 -18,871 35,465 -11,479 1,00 32,35 A C ATOM 633 O VAL 536 -19,395 36,083 -12,406 1,00 32,68 A O ATOM 634 N HIS 537 -17,603 35,631 -11,129 1,00 32,15 A N ATOM 635 CA HIS 537 -16,743 36,550 -11,854 1,00 32,62 A C ATOM 636 CB HIS 537 -16,430 37,757 -10,974 _1,0032,90 A C ATOM 637 CG HIS 537 -17,657 38,492 -10,534 1,00 38,48 A C ATOM 638 CD2 HIS 537 -18,536 38,238 -9,534 1,00 39,02 A C ATOM 639 ND1 HIS 537 -18,153 39,587 -11,211 1,00 39,06 A N ATOM 640 CE1 HIS 537 -19,285 39,973 -10,650 1,00 40,38 A C ATOM 641 NE2 HIS 537 -19,540 39,171 -9,630 1,00 41,12 A N ATOM 642 C 537 -15,482 35,829 -12,268 1,00 31,22 A C HIS ATOM 643 O HIS 537 -14,825 35,197 -11,446 1,00 32,87 A O ATOM 644 N THR 538 -15,160 35,923 -13,553 1,00 30,02 A N ATOM 645 CA THR 538 -14,130 35,092 -14,162 1,00 28,85 A C ATOM 646 CB THR 538 -14,745 34,189 -15,259 1,00 30,20 A C ATOM 647 OG1 THR 538 -15,658 33,264 -14,652 _1,0029,62 A O ATOM 648 CG2 THR 538 -13,658 33,417 -16,011 1,00 26,80 A C ATOM 649 C THR 538 -13,027 35,934 -14,786 1,00 27,41 A C ATOM 650 O THR 538 -13,290 37,001 -15,330 1,00 26,94 A O ATOM 651 N ALA 539 -11,793 35,453 -14,704 1,00 26,67 A N ATOM 652 CA ALA 539 -10,713 36,017 -15,502 1,00 26,84 A C ATOM 653 CB ALA 539 -9,722 36,757 -14,617 _1,0027,43 A C ATOM 654 C ALA 539 -10,010 34,901 -16,258 1,00 27,34 A C ATOM 655 O ALA 539 -9,800 33,806 -15,727 1,00 29,03 A O ATOM 656 N PRO 540 -9,645 35,168 -17,518 1,00 25,34 A N ATOM 657 CD PRO 540 -9,835 36,482 -18,162 1,00 26,40 A C ATOM 658 CA PRO 540 -9,058 34,190 -18,434 1,00 25,56 A C ATOM 659 CB PRO 540 -9,227 34,841 -19,804 1,00 25,71 A C ATOM 660 CG PRO 540 -9,165 36,312 -19,505 1,00 27,40 A C ATOM 661 C PRO 540 -7,595 33,907 -18,126 1,00 27,52 A C ATOM 662 O PRO 540 -6,923 34,699 -17,463 1,00 27,04 A O ATOM 663 N PRO 541 -7,075 32,783 -18,636 _1,0027,53 A N ATOM 664 CD PRO 541 -7,795 31,778 -19,435 1,00 28,31 A C ATOM 665 CA PRO 541 -5,650 32,469 -18,522 1,00 29,94 A C ATOM 666 CB PRO 541 -5,458 31,318 -19,510 1,00 26,51 A C ATOM 667 CG PRO 541 -6,794 30,658 -19,562 1,00 28,03 A C ATOM 668 C PRO 541 -4,788 33,676 -18,875 1,00 32,23 A C ATOM 669 O PRO 541 -5,053 34,382 -19,848 _1,0030,35 A O ATOM 670 N ALA 542 -3,759 33,910 -18,070 1,00 35,43 A N ATOM 671 CA ALA 542 -2,864 35,034 -18,290 1,00 39,68 A C ATOM 672 CB ALA 542 -3,169 36,142 -17,298 1,00 41,32 A C ATOM 673 C ALA 542 -1,429 34,572 -18,125 1,00 41,82 A C ATOM 674 O ALA 542 -1,077 33,982 -17,108 1,00 43,83 A O ATOM 675 N GLU 543 -0,603 34,838 -19,125 _1,0044,83 A N ATOM 676 CA GLU 543 0,816 34,523 -19,033 1,00 48,00 A C ATOM 677 CB GLU 543 1,461 34,625 -20,418 1,00 52,56 A C ATOM 678 CG GLU 543 2,492 33,547 -20,715 1,00 57,96 A C ATOM 679 CD GLU 543 1,858 32,227 -21,120 1,00 61,23 , A C ATOM ₆₈₀OE1 GLU 543 1,824 31,303 -20,277 _1,0062,99 A O (continuación)

ATOM 681 OE2 GLU 543 1,396 32,113 -22,283 1,00 63,66 A O ATOM 682 C GLU 543 1,463 35,530 -18,082 1,00 47,94 A C ATOM 683 O GLU 543 2,038 36,525 -18,520 1,00 49,36 A O ATOM 684 N ALA 544 1,359 35,274 -16,781 1,00 45,85 A N ATOM 685 CA ALA 544 1,827 36,223 -15,780 1,00 43,79 A C ATOM ₆₈₆CB ALA 544 0,678 37,126 -15,346 _1,0042,96 A C ATOM 687 C ALA 544 2,418 35,508 -14,564 1,00 44,20 A C ATOM 688 O ALA 544 1,998 34,402 -14,210 1,00 42,82 A O ATOM 689 N SER 545 3,392 36,148 -13,926 1,00 43,11 A N ATOM 690 CA SER 545 4,054 35,566 -12,767 1,00 42,80 A C ATOM 691 CB SER 545 5,198 36,469 -12,297 1,00 44,06 A C ATOM 692 OG SER 545 6,381 36,204 -13,028 _1,0049,18 A O ATOM 693 C SER 545 3,082 35,350 -11,621 1,00 40,42 A C ATOM 694 O SER 545 3,159 34,344 -10,917 1,00 41,59 A O ATOM 695 N MET 546 2,171 36,297 -11,435 1,00 37,26 A N ATOM 696 CA MET 546 1,224 36,224 -10,337 1,00 37,49 A C ATOM 697 CB MET 546 0,851 37,631 -9,869 1,00 36,04 A C ATOM 698 CG MET 546 1,973 38,326 -9,119 _1,0037,71 A C ATOM 699 SD MET 546 1,626 40,049 -8,851 1,00 38,80 A S ATOM 700 CE MET 546 2,137 40,710 -10,406 1,00 47,70 A C ATOM 701 C MET 546 -0,028 35,451 -10,718 1,00 37,16 A C ATOM 702 O MET 546 -1,076 35,596 -10,083 1,00 37,19 A O ATOM 703 N GLY 547 0,091 34,630 -11,757 1,00 36,79 A N ATOM 704 CA GLY 547 -0,994 33,747 -12,136 _1,0035,87 A C ATOM 705 C GLY 547 -2,212 34,481 -12,659 1,00 36,73 A C ATOM 706 O GLY 547 -2,119 35,599 -13,168 1,00 36,47 A O ATOM 707 N THR 548 -3,366 33,840 -12,536 1,00 35,43 A N ATOM 708 CA THR 548 -4,617 34,407 -13,017 1,00 35,74 A C ATOM 709 CB THR 548 -5,403 33,365 -13,841 1,00 37,13 A C ATOM 710 OG1 THR 548 -4,580 32,892 -14,914 1,00 39,98 A O ATOM 711 CG2 THR 548 -6,664 33,976 -14,416 1,00 38,25 A C ATOM 712 C THR 548 -5,442 34,817 -11,808 1,00 34,88 A C ATOM 713 O THR 548 -5,597 34,041 -10,866 1,00 36,02 A O ATOM 714 N ARG 549 -5,971 36,033 -11,831 _1,0033,45 A N ATOM 715 CA ARG 549 -6,562 36,607 -10,632 1,00 34,68 A C ATOM 716 CB ARG 549 -5,574 37,580 -9,975 1,00 34,64 A C ATOM 717 CG ARG 549 -4,158 37,005 -9,856 1,00 37,46 A C ATOM 718 CD ARG 549 -3,155 38,035 -9,350 1,00 35,98 A C ATOM 719 NE ARG 549 -3,201 38,159 -7,901 1,00 35,43 A N ATOM 720 CZ ARG 549 -2,454 37,440 -7,069 _1,0034,21 A C ATOM 721 NH1 ARG 549 -2,566 37,618 -5,760 1,00 30,15 A N ATOM 722 NH2 ARG 549 -1,593 36,545 -7,546 1,00 32,58 A N ATOM 723 C ARG 549 -7,859 37,329 -10,947 1,00 34,29 A C ATOM 724 O ARG 549 -7,990 37,968 -11,986 1,00 34,98 A O ATOM 725 N VAL 550 -8,818 37,221 -10,040 1,00 33,25 A N ATOM 726 CA VAL 550 -10,054 37,970 -10,147 _1,0033,71 A C ATOM 727 CB VAL 550 -11,130 37,161 -10,914 1,00 33,51 A C ATOM 728 CG1 VAL 550 -11,547 35,936 -10,103 1,00 30,56 A C ATOM 729 CG2 VAL 550 -12,329 38,043 -11,222 1,00 32,51 A C ATOM 730 C VAL 550 -10,530 38,244 -8,727 1,00 36,76 A C ATOM 731 O VAL 550 -10,261 37,460 -7,812 1,00 36,18 A O ATOM 732 N HIS 551 -11,222 39,358 -8,530 1,00 38,93 A N (continuación)

ATOM 733 CA HIS 551 -11,719 39,683 -7,200 1,00 43,33 A C ATOM 734 CB HIS 551 -10,779 40,675 -6,506 1,00 46,64 A C ATOM 735 CG HIS 551 -10,856 42,067 -7,050 1,00 52,46 A C ATOM 736 CD2 HIS 551 -10,404 42,597 -8,212 1,00 54,58 A C ATOM 737 ND1 HIS 551 -11,460 43,101 -6,365 _1,0054,96 A N ATOM 738 CE1 HIS 551 -11,377 44,208 -7,082 1,00 56,62 A C ATOM 739 NE2 HIS 551 -10,741 43,930 -8,207 1,00 57,00 A N ATOM 740 C HIS 551 -13,128 40,256 -7,262 1,00 43,49 A C ATOM 741 O HIS 551 -13,585 40,702 -8,313 1,00 42,88 A O ATOM 742 N CYS 552 -13,815 40,229 -6,128 1,00 44,34 A N ATOM 743 CA CYS 552 -15,158 40,771 -6,045 _1,0047,65 A C ATOM 744 C CYS 552 -15,074 42,292 -5,943 1,00 51,08 A C ATOM 745 O CYS 552 -14,612 42,830 -4,937 1,00 50,38 A O ATOM 746 CB CYS 552 -15,875 40,193 -4,824 1,00 44,92 A C ATOM 747 SG CYS 552 -15,982 38,371 -4,816 1,00 44,45 A S ATOM 748 N HIS 553 -15,518 42,979 -6,990 1,00 55,41 A N ATOM 749 CA HIS 553 -15,266 44,410 -7,120 _1,0060,41 A C ATOM 750 CB HIS 553 -14,882 44,748 -8,565 1,00 63,13 A C ATOM 751 CG HIS 553 -15,927 44,379 -9,572 1,00 68,52 A C ATOM 752 CD2 HIS 553 -16,781 45,144 -10,294 1,00 70,80 A C ATOM 753 ND1 HIS 553 -16,187 43,073 -9,932 1,00 71,80 A N ATOM 754 CE1 HIS 553 -17,155 43,049 -10,831 1,00 71,80 A C ATOM 755 NE2 HIS 553 -17,533 44,293 -11,068 1,00 72,09 A N ATOM 756 C HIS 553 -16,442 45,282 -6,685 1,00 60,90 A C ATOM 757 O HIS 553 -16,292 46,491 -6,524 1,00 62,29 A O ATOM 758 N GLN 554 -17,609 44,677 -6,497 1,00 61,02 A N ATOM 759 CA GLN 554 -18,792 45,442 -6,120 1,00 61,69 A C ATOM 760 CB GLN 554 -20,062 44,695 -6,527 1,00 62,40 A C ATOM 761 CG GLN 554 -20,209 44,514 -8,030 1,00 64,68 A C ATOM 762 CD GLN 554 -21,646 44,278 -8,452 1,00 66,14 A C ATOM 763 OE1 GLN 554 -22,313 43,371 -7,952 1,00 66,12 A O ATOM 764 NE2 GLN 554 -22,133 45,100 -9,379 1,00 66,69 A N ATOM 765 C GLN 554 -18,831 45,747 -4,628 _1,0061,75 A C ATOM 766 O GLN 554 -18,285 45,002 -3,813 1,00 61,46 A O ATOM 767 N GLN 555 -19,488 46,850 -4,281 1,00 61,73 A N ATOM 768 CA GLN 555 -19,517 47,338 -2,907 1,00 61,26 A C ATOM 769 CB GLN 555 -20,092 48,756 -2,869 1,00 64,04 A C ATOM 770 CG GLN 555 -19,903 49,452 -1,534 1,00 67,91 A C ATOM 771 CD GLN 555 -18,440 49,524 -1,132 _1,0071,48 A C ATOM 772 OE1 GLN 555 -17,700 50,401 -1,586 1,00 73,49 A O ATOM 773 NE2 GLN 555 -18,012 48,595 -0,279 1,00 71,05 A N ATOM 774 C GLN 555 -20,336 46,437 -1,984 1,00 59,47 A C ATOM 775 O GLN 555 -21,532 46,235 -2,199 1,00 58,75 A O ATOM 776 N GLY 556 -19,683 45,907 -0,953 1,00 57,33 A N ATOM 777 CA GLY 556 -20,378 45,081 0,019 _1,0055,06 A C ATOM 778 C GLY 556 -20,304 43,591 -0,268 1,00 53,72 A C ATOM 779 O GLY 556 -20,687 42,770 0,566 1,00 53,32 A O ATOM 780 N HIS 557 -19,809 43,233 -1,446 1,00 51,42 A N ATOM 781 CA HIS 557 -19,772 41,834 -1,841 1,00 49,50 A C ATOM 782 CB HIS 557 -19,655 41,721 -3,367 _1,0051,95 A C ATOM 783 CG HIS 557 -20,930 42,035 -4,092 1,00 56,53 A C ATOM 784 CD2 HIS 557 -21,535 41,427 -5,141 1,00 56,76 A C (continuación)

ATOM 785 ND1 HIS 557 -21,752 43,085 -3,733 1,00 57,67 A N ATOM 786 CE1 HIS 557 -22,807 43,110 -4,528 1,00 55,39 A C ATOM 787 NE2 HIS 557 -22,700 42,115 -5,391 1,00 58,10 A N ATOM 788 C HIS 557 -18,633 41,089 -1,151 _1,0045,78 A C ATOM 789 O HIS 557 -17,560 41,647 -0,920 1,00 45,56 A O ATOM 790 N VAL 558 -18,892 39,829 -0,812 1,00 41,36 A N ATOM 791 CA VAL 558 -17,934 38,982 -0,108 1,00 37,02 A C ATOM 792 CB VAL 558 -18,500 38,521 1,244 1,00 37,11 A C ATOM 793 CG1 VAL 558 -17,454 37,737 1,998 1,00 37,46 A C ATOM 794 CG2 VAL 558 -18,964 39,721 2,050 _1,0039,30 A C ATOM 795 C VAL 558 -17,628 37,736 -0,930 1,00 35,05 A C ATOM 796 O VAL 558 -18,538 37,112 -1,475 1,00 34,44 A O ATOM 797 N LEU 559 -16,351 37,373 -1,009 1,00 33,22 A N ATOM 798 CA LEU 559 -15,934 36,175 -1,732 1,00 31,06 A C ATOM 799 CB LEU 559 -14,440 36,250 -2,039 1,00 29,73 A C ATOM ₈₀₀CG LEU 559 -13,822 34,965 -2,596 _1,0029,66 A C ATOM 801 CD1 LEU 559 -14,328 34,731 -4,025 1,00 27,03 A C ATOM 802 CD2 LEU 559 -12,300 35,079 -2,575 1,00 28,88 A C ATOM 803 C LEU 559 -16,220 34,929 -0,892 1,00 31,01 A C ATOM 804 O LEU 559 -15,760 34,829 0,245 1,00 31,89 A O ATOM 805 N THR 560 -16,976 33,984 -1,447 1,00 28,29 A N ATOM ₈₀₆CA THR 560 -17,335 32,777 -0,707 _1,0027,77 A C ATOM 807 CB THR 560 -18,862 32,532 -0,728 1,00 27,86 A C ATOM 808 OG1 THR 560 -19,302 32,333 -2,080 1,00 29,50 A O ATOM 809 CG2 THR 560 -19,602 33,721 -0,117 1,00 24,95 A C ATOM 810 C THR 560 -16,649 31,518 -1,234 1,00 27,81 A C ATOM 811 O THR 560 -16,592 30,505 -0,544 1,00 27,32 A O ATOM 812 N GLY 561 -16,149 31,579 -2,465 1,00 28,51 A N ATOM 813 CA GLY 561 -15,529 30,415 -3,067 1,00 26,65 A C ATOM 814 C GLY 561 -14,728 30,746 -4,312 1,00 28,04 A C ATOM 815 O GLY 561 -15,044 31,696 -5,035 1,00 29,85 A O ATOM ₈₁₆N CYS 562 -13,684 29,960 -4,555 _1,0026,78 A N ATOM 817 CA CYS 562 -12,860 30,109 -5,745 1,00 28,08 A C ATOM 818 C CYS 562 -12,868 28,802 -6,535 1,00 28,91 A C ATOM 819 O CYS 562 -12,698 27,725 -5,965 1,00 29,35 A O ATOM 820 CB CYS 562 -11,414 30,444 -5,358 1,00 29,31 A C ATOM 821 SG CYS 562 -11,177 32,043 -4,523 1,00 30,67 A S ATOM ₈₂₂N SER 563 -13,060 28,903 -7,845 _1,0027,63 A N ATOM 823 CA SER 563 -12,994 27,741 -8,721 1,00 27,76 A C ATOM 824 CB SER 563 -14,372 27,442 -9,321 1,00 25,87 A C ATOM 825 OG SER 563 -15,267 26,932 -8,341 1,00 29,15 A O ATOM 826 C SER 563 -11,991 27,990 -9,839 1,00 27,56 A C ATOM 827 O SER 563 -11,673 29,137 -10,157 1,00 28,34 A O ATOM ₈₂₈N SER 564 -11,506 26,912 -10,440 _1,0026,93 A N ATOM 829 CA SER 564 -10,543 27,014 -11,531 1,00 28,10 A C ATOM 830 CB SER 564 -9,121 27,017 -10,960 1,00 28,82 A C ATOM 831 OG SER 564 -8,171 27,330 -11,957 1,00 33,70 A O ATOM 832 C SER 564 -10,697 25,845 -12,502 1,00 26,61 A C ATOM 833 O SER 564 -10,767 24,693 -12,083 _1,0027,41 A O ATOM 834 N HIS 565 -10,744 26,139 -13,797 1,00 26,38 A N ATOM 835 CA HIS 565 -10,647 25,098 -14,814 1,00 24,40 A C ATOM 836 CB HIS 565 -11,995 24,894 -15,510 1,00 23,27 A C (continuación)

ATOM 837 CG HIS 565 -12,271 25,882 -16,603 1,00 24,99 A C ATOM 838 CD2 HIS 565 -12,022 25,831 -17,934 1,00 25,30 A C ATOM 839 ND1 HIS 565 -12,881 27,096 -16,375 1,00 25,00 A N ATOM 840 CE1 HIS 565 -12,994 27,752 -17,517 1,00 26,14 A C ATOM 841 NE2 HIS 565 -12,480 27,006 -18,479 1,00 24,33 A N ATOM 842 C HIS 565 -9,589 25,467 -15,850 1,00 24,48 A C ATOM 843 O HIS 565 -9,282 26,640 -16,046 1,00 25,19 A O ATOM 844 N TRP 566 -9,029 24,463 -16,511 1,00 24,82 A N ATOM 845 CA TRP 566 -8,034 24,710 -17,547 _1,0025,49 A C ATOM 846 CB TRP 566 -6,618 24,503 -16,989 1,00 23,96 A C ATOM 847 CG TRP 566 -6,428 23,185 -16,298 1,00 24,74 A C ATOM 848 CD2 TRP 566 -6,786 22,864 -14,944 1,00 24,42 A C ATOM 849 CE2 TRP 566 -6,434 21,519 -14,729 1,00 23,95 A C ATOM 850 CE3 TRP 566 -7,369 23,586 -13,896 1,00 25,18 A C ATOM 851 CD1 TRP 566 -5,886 22,051 -16,828 1,00 23,05 A C ATOM 852 NE1 TRP 566 -5,887 21,046 -15,894 1,00 23,71 A N ATOM 853 CZ2 TRP 566 -6,648 20,877 -13,508 1,00 25,70 A C ATOM 854 CZ3 TRP 566 -7,578 22,951 -12,688 1,00 24,87 A C ATOM 855 CH2 TRP 566 -7,220 21,608 -12,503 1,00 25,51 A C ATOM 856 C TRP 566 -8,267 23,796 -18,746 1,00 25,03 A C ATOM 857 O TRP 566 -8,687 22,645 -18,595 _1,0024,33 A O ATOM 858 N GLU 567 -7,990 24,318 -19,934 1,00 24,46 A N ATOM 859 CA GLU 567 -8,361 23,645 -21,170 1,00 25,18 A C ATOM 860 CB GLU 567 -8,547 24,685 -22,274 1,00 24,46 A C ATOM 861 CG GLU 567 -8,779 24,101 -23,646 1,00 24,68 A C ATOM 862 CD GLU 567 -9,514 25,058 -24,557 1,00 25,49 A C ATOM 863 OE1 GLU 567 -10,669 25,420 -24,233 1,00 26,55 A O ATOM 864 OE2 GLU 567 -8,939 25,449 -25,596 1,00 28,35 A O ATOM 865 C GLU 567 -7,333 22,608 -21,604 1,00 26,33 A C ATOM 866 O GLU 567 -7,683 21,517 -22,072 1,00 25,57 A O ATOM 867 N VAL 568 -6,063 22,953 -21,453 _1,0026,79 A N ATOM 868 CA VAL 568 -4,991 22,112 -21,955 1,00 29,50 A C ATOM 869 CB VAL 568 -3,874 22,974 -22,571 1,00 28,46 A C ATOM 870 CG1 VAL 568 -2,660 22,109 -22,901 1,00 28,66 A C ATOM 871 CG2 VAL 568 -4,402 23,646 -23,842 1,00 24,39 A C ATOM 872 C VAL 568 -4,428 21,223 -20,853 1,00 32,48 A C ATOM 873 O VAL 568 -3,985 21,710 -19,818 _1,0031,74 A O ATOM 874 N GLU 569 -4,465 19,914 -21,080 1,00 36,29 A N ATOM 875 CA GLU 569 -4,108 18,953 -20,047 1,00 41,85 A C ATOM 876 CB GLU 569 -4,360 17,520 -20,538 1,00 36,99 A C ATOM 877 CG GLU 569 -5,837 17,124 -20,604 1,00 31,58 A C ATOM 878 CD GLU 569 -6,534 17,605 -21,868 1,00 30,99 A C ATOM 879 OE1 GLU 569 -7,728 17,286 -22,050 _1,0031,44 A O ATOM 880 OE2 GLU 569 -5,893 18,299 -22,687 1,00 28,21 A O ATOM 881 C GLU 569 -2,653 19,114 -19,603 1,00 48,32 A C ATOM 882 O GLU 569 -1,767 19,363 -20,424 1,00 47,22 A O ATOM 883 N ASP 570 -2,439 18,957 -18,295 1,00 55,96 A N ATOM 884 CA ASP 570 -1,185 19,278 -17,608 _1,0063,65 A C ATOM 885 CB ASP 570 0,027 18,894 -18,464 1,00 66,25 A C ATOM 886 CG ASP 570 0,493 17,475 -18,207 1,00 69,76 A C ATOM 887 OD1 ASP 570 0,436 17,039 -17,035 1,00 72,02 A O ATOM 888 OD2 ASP 570 0,915 16,798 -19,172 1,00 69,99 A O (continuación)

ATOM 889 C ASP 570 -1,107 20,757 -17,236 1,00 67,13 A C ATOM 890 O ASP 570 -0,426 21,538 -17,903 _1,0068,92 A O ATOM 891 N LEU 571 -1,802 21,130 -16,161 1,00 69,67 A N ATOM 892 CA LEU 571 -1,922 22,532 -15,760 1,00 72,16 A C ATOM 893 CB LEU 571 -2,990 22,691 -14,664 1,00 71,90 A C ATOM 894 CG LEU 571 -2,707 22,122 -13,265 1,00 71,59 A C ATOM 895 CD1 LEU 571 -3,756 22,633 -12,289 1,00 70,61 A C ATOM 896 CD2 LEU 571 -2,709 20,598 -13,304 _1,0072,02 A C ATOM 897 C LEU 571 -0,591 23,094 -15,259 1,00 73,82 A C ATOM 898 O LEU 571 -0,554 24,116 -14,566 1,00 75,52 A O ATOM 899 N PRO 577 4,838 27,651 -10,922 1,00 57,36 A N ATOM 900 CD PRO 577 6,223 27,162 -11,012 1,00 59,08 A C ATOM 901 CA PRO 577 4,535 28,186 -9,587 1,00 56,03 A C ATOM 902 CB PRO 577 5,864 28,077 -8,836 _1,0056,74 A C ATOM 903 CG PRO 577 6,621 27,019 -9,563 1,00 58,87 A C ATOM 904 C PRO 577 4,057 29,627 -9,671 1,00 53,74 A C ATOM 905 O PRO 577 4,654 30,445 -10,365 1,00 55,21 A O ATOM 906 N VAL 578 2,983 29,931 -8,956 1,00 49,44 A N ATOM 907 CA VAL 578 2,397 31,260 -9,002 1,00 46,13 , A C ATOM 908 CB VAL 578 0,859 31,179 -8,897 _1,0045,53 A C ATOM 909 CG1 VAL 578 0,260 32,570 -8,892 1,00 45,46 A C ATOM 910 CG2 VAL 578 0,308 30,370 -10,057 1,00 47,41 A C ATOM 911 C VAL 578 2,933 32,114 -7,859 1,00 43,82 A C ATOM 912 O VAL 578 2,958 31,671 -6,707 1,00 43,37 A O ATOM 913 N LEU 579 3,365 33,331 -8,180 1,00 38,55 A N ATOM 914 CA LEU 579 3,764 34,284 -7,150 1,00 36,58 A C ATOM 915 CB LEU 579 4,586 35,429 -7,753 1,00 35,06 A C ATOM 916 CG LEU 579 5,926 35,086 -8,408 1,00 35,00 A C ATOM 917 CD1 LEU 579 6,668 36,379 -8,730 1,00 34,09 A C ATOM 918 CD2 LEU 579 6,758 34,216 -7,480 _1,0032,12 A C ATOM 919 C LEU 579 2,524 34,856 -6,475 1,00 35,58 A C ATOM 920 O LEU 579 1,469 34,997 -7,101 1,00 35,13 A O ATOM 921 N ARG 580 2,658 35,196 -5,198 1,00 35,00 A N ATOM 922 CA ARG 580 1,539 35,720 -4,426 1,00 36,48 A C ATOM 923 CB ARG 580 1,224 37,154 -4,863 1,00 36,24 A C ATOM 924 CG ARG 580 2,223 38,184 -4,355 _1,0038,98 A C ATOM 925 CD ARG 580 2,105 39,507 -5,099 1,00 38,47 A C ATOM 926 NE ARG 580 2,801 40,584 -4,399 1,00 38,42 A N ATOM 927 CZ ARG 580 3,303 41,662 -4,993 1,00 38,63 A C ATOM 928 NH1 ARG 580 3,917 42,593 -4,272 1,00 35,39 A N ATOM 929 NH2 ARG 580 3,196 41,807 -6,311 1,00 35,21 A N ATOM 930 C ARG 580 0,299 34,839 -4,585 _1,0036,61 A C ATOM 931 O ARG 580 -0,789 35,326 -4,901 1,00 36,06 A O ATOM 932 N PRO 581 0,453 33,528 -4,351 1,00 37,30 A N ATOM 933 CD PRO 581 1,638 32,925 -3,717 1,00 36,85 A C ATOM 934 CA PRO 581 -0,611 32,544 -4,578 1,00 39,33 A C ATOM 935 CB PRO 581 0,051 31,211 -4,242 _1,0040,31 A C ATOM 936 CG PRO 581 1,147 31,569 -3,284 1,00 39,56 A C ATOM 937 C PRO 581 -1,849 32,795 -3,724 1,00 40,74 A C ATOM 938 O PRO 581 -2,935 32,322 -4,048 1,00 41,03 A O ATOM 939 N ARG 582 -1,684 33,538 -2,633 1,00 41,34 A N ATOM 940 CA ARG 582 -2,821 33,930 -1,809 1,00 43,35 A C (continuación)

ATOM 941 CB ARG 582 -2,391 34,085 -0,346 _1,0044,09 A C ATOM 942 CG ARG 582 -1,819 32,811 0,257 1,00 48,45 A C ATOM 943 CD ARG 582 -0,916 33,106 1,448 1,00 52,04 A C ATOM 944 NE ARG 582 -0,250 31,901 1,942 1,00 55,65 A N ATOM 945 CZ ARG 582 0,862 31,392 1,419 1,00 58,45 A C ATOM 946 NH1 ARG 582 1,396 30,291 1,935 1,00 59,76 A N ATOM 947 NH2 ARG 582 1,442 31,979 0,378 _1,0059,55 A N ATOM 948 C ARG 582 -3,411 35,243 -2,315 1,00 44,15 A C ATOM 949 O ARG 582 -2,684 36,190 -2,612 1,00 45,85 A O ATOM 950 N GLY 583 -4,731 35,301 -2,412 1,00 43,03 A N ATOM 951 CA GLY 583 -5,352 36,495 -2,937 1,00 44,47 A C ATOM 952 C GLY 583 -5,441 37,589 -1,896 1,00 47,04 A C ATOM 953 O GLY 583 -5,458 37,320 -0,696 _1,0047,38 A O ATOM 954 N GLN 584 -5,491 38,833 -2,355 1,00 47,91 A N ATOM 955 CA GLN 584 -5,956 39,915 -1,513 1,00 50,00 A C ATOM 956 CB GLN 584 -5,981 41,225 -2,302 1,00 54,25 A C ATOM 957 CG GLN 584 -4,604 41,807 -2,565 1,00 60,44 A C ATOM 958 CD GLN 584 -3,902 42,226 -1,286 1,00 65,17 A C ATOM 959 OE1 GLN 584 -4,440 43,010 -0,499 _1,0068,24 A O ATOM 960 NE2 GLN 584 -2,697 41,703 -1,068 1,00 66,44 A N ATOM 961 C GLN 584 -7,361 39,548 -1,057 1,00 49,41 A C ATOM 962 O GLN 584 -8,005 38,675 -1,640 1,00 48,96 A O ATOM 963 N PRO 585 -7,858 40,204 -0,002 1,00 49,04 A N ATOM 964 CD PRO 585 -7,320 41,365 0,727 1,00 48,81 A C ATOM 965 CA PRO 585 -9,199 39,834 0,453 1,00 47,47 A C ATOM 966 CB PRO 585 -9,475 40,806 1,602 1,00 48,68 A C ATOM 967 CG PRO 585 -8,538 41,942 1,384 1,00 49,88 A C ATOM 968 C PRO 585 -10,210 39,955 -0,677 1,00 45,46 A C ATOM 969 O PRO 585 -10,194 40,922 -1,441 _1,0045,47 A O ATOM 970 N ASN 586 -11,073 38,953 -0,784 1,00 42,42 A N ATOM 971 CA ASN 586 -12,076 38,905 -1,836 1,00 39,41 A C ATOM 972 CB ASN 586 -12,928 40,174 -1,818 1,00 39,50 A C ATOM 973 CG ASN 586 -13,822 40,255 -0,595 1,00 43,25 A C ATOM 974 OD1 ASN 586 -14,272 39,236 -0,072 1,00 39,56 A O ATOM 975 ND2 ASN 586 -14,080 41,473 -0,128 1,00 44,78 A N ATOM 976 C ASN 586 -11,481 38,706 -3,226 1,00 36,56 A C ATOM 977 O ASN 586 -12,121 39,032 -4,222 1,00 37,07 A O ATOM 978 N GLN 587 -10,266 38,163 -3,287 1,00 34,14 A N ATOM 979 CA GLN 587 -9,629 37,824 -4,563 1,00 33,02 A C ATOM 980 CB GLN 587 -8,337 38,631 -4,731 1,00 34,05 A C ATOM 981 CG GLN 587 -7,551 38,349 -6,005 _1,0034,28 A C ATOM 982 CD GLN 587 -6,272 39,189 -6,099 1,00 37,58 A C ATOM 983 OE1 GLN 587 -6,142 40,061 -6,966 1,00 36,43 A O ATOM 984 NE2 GLN 587 -5,328 38,927 -5,204 1,00 34,03 A N ATOM 985 C GLN 587 -9,316 36,325 -4,660 1,00 32,64 A C ATOM 986 O GLN 587 -8,899 35,712 -3,679 _1,0031,40 A O ATOM 987 N CYS 588 -9,523 35,750 -5,847 1,00 29,94 A N ATOM 988 CA CYS 588 -9,140 34,368 -6,138 1,00 29,32 A C ATOM 989 C CYS 588 -7,901 34,316 -7,018 1,00 28,74 A C ATOM 990 O CYS 588 -7,692 35,196 -7,850 1,00 30,51 A O ATOM 991 CB CYS 588 -10,256 33,644 -6,880 1,00 28,96 A C ATOM 992 SG CYS 588 -11,771 33,388 -5,926 _1,0034,01 A S (continuación)

ATOM 993 N VAL 589 -7,106 33,263 -6,866 1,00 27,74 A N ATOM 994 CA VAL 589 -5,879 33,123 -7,644 1,00 28,03 A C ATOM 995 CB VAL 589 -4,644 33,387 -6,752 1,00 28,90 A C ATOM 996 CG1 VAL 589 -3,364 33,266 -7,568 1,00 28,12 A C ATOM 997 CG2 VAL 589 -4,750 34,780 -6,123 1,00 29,60 A C ATOM 998 C VAL 589 -5,761 31,728 -8,273 _1,0029,72 A C ATOM 999 O VAL 589 -5,867 30,718 -7,580 1,00 29,20 A O ATOM 1000 N GLY 590 -5,540 31,679 -9,585 1,00 29,03 A N ATOM 1001 CA GLY 590 -5,365 30,401 -10,255 1,00 29,41 A C ATOM 1002 C GLY 590 -4,067 30,331 -11,037 1,00 30,32 A C ATOM 1003 O GLY 590 -3,375 31,335 -11,179 1,00 31,55 A O ATOM 1004 N HIS 591 -3,732 29,151 -11,549 _1,0031,69 A N ATOM 1005 CA HIS 591 -2,535 28,989 -12,367 1,00 34,04 A C ATOM 1006 CB HIS 591 -2,343 27,516 -12,727 1,00 36,27 A C ATOM 1007 CG HIS 591 -2,045 26,649 -11,546 1,00 44,11 A C ATOM 1008 CD2 HIS 591 -2,848 25,856 -10,796 1,00 46,70 A C ATOM 1009 ND1 HIS 591 -0,788 26,561 -10,986 1,00 46,49 A N ATOM ₁₀₁₀CE1 HIS 591 -0,830 25,754 -9,940 _1,0046,26 A C ATOM 1011 NE2 HIS 591 -2,069 25,313 -9,803 1,00 49,17 A N ATOM 1012 C HIS 591 -2,614 29,830 -13,640 1,00 34,21 A C ATOM 1013 O HIS 591 -3,699 30,211 -14,077 1,00 32,59 A O ATOM 1014 N ARG 592 -1,464 30,125 -14,234 1,00 33,67 A N ATOM 1015 CA ARG 592 -1,443 31,006 -15,393 1,00 36,88 A C ATOM 1016 CB ARG 592 -0,004 31,430 -15,716 1,00 39,26 A C ATOM 1017 CG ARG 592 0,995 30,303 -15,710 1,00 45,79 A C ATOM 1018 CD ARG 592 2,258 30,690 -16,456 1,00 50,53 A C ATOM 1019 NE ARG 592 3,009 31,749 -15,787 1,00 53,30 A N ATOM ₁₀₂₀CZ ARG 592 3,575 32,773 -16,420 _1,0055,13 A C ATOM 1021 NH1 ARG 592 4,247 33,693 -15,740 1,00 55,24 A N ATOM 1022 NH2 ARG 592 3,465 32,879 -17,738 1,00 57,78 A N ATOM 1023 C ARG 592 -2,112 30,410 -16,634 1,00 35,10 A C ATOM 1024 O ARG 592 -2,566 31,149 -17,506 1,00 35,39 A O ATOM 1025 N GLU 593 -2,192 29,084 -16,709 1,00 34,62 A N ATOM ₁₀₂₆CA GLU 593 -2,877 28,428 -17,823 _1,0033,78 A C ATOM 1027 CB GLU 593 -2,181 27,120 -18,189 1,00 36,33 A C ATOM 1028 CG GLU 593 -0,983 27,299 -19,098 1,00 46,12 A C ATOM 1029 CD GLU 593 0,219 27,845 -18,362 1,00 52,97 A C ATOM 1030 OE1 GLU 593 0,553 27,303 -17,284 1,00 55,60 A O ATOM 1031 OE2 GLU 593 0,828 28,818 -18,861 1,00 57,96 A O ATOM 1032 C GLU 593 -4,350 28,135 -17,558 _1,0032,11 A C ATOM 1033 O GLU 593 -5,019 27,525 -18,388 1,00 29,63 A O ATOM 1034 N ALA 594 -4,855 28,559 -16,406 1,00 28,88 A N ATOM 1035 CA ALA 594 -6,236 28,267 -16,046 1,00 28,39 A C ATOM 1036 CB ALA 594 -6,283 27,571 -14,687 1,00 26,56 A C ATOM 1037 C ALA 594 -7,092 29,528 -16,018 1,00 28,13 A C ATOM 1038 O ALA 594 -6,584 30,637 -15,843 1,00 28,06 A O ATOM 1039 N SER 595 -8,396 29,358 -16,197 1,00 25,46 A N ATOM 1040 CA SER 595 -9,335 30,416 -15,844 1,00 25,16 A C ATOM 1041 CB SER 595 -10,656 30,226 -16,588 1,00 24,79 A C ATOM 1042 OG SER 595 -10,490 30,436 -17,976 1,00 27,76 A O ATOM 1043 C SER 595 -9,580 30,372 -14,338 _1,0024,98 A C ATOM 1044 O SER 595 -9,479 29,312 -13,720 1,00 24,48 A O (continuación)

ATOM 1045 N ILE 596 -9,891 31,524 -13,752 1,00 25,25 A N ATOM 1046 CA ILE 596 -10,212 31,601 -12,333 1,00 25,69 A C ATOM 1047 CB ILE 596 -9,165 32,467 -11,577 1,00 27,15 A C ATOM 1048 CG2 ILE 596 -9,259 33,923 -12,023 1,00 29,13 A C ATOM 1049 CG1 ILE 596 -9,375 32,349 -10,067 _1,0026,07 A C ATOM 1050 CD1 ILE 596 -8,902 31,029 -9,490 1,00 24,57 A C ATOM 1051 C ILE 596 -11,619 32,192 -12,154 1,00 24,88 A C ATOM 1052 O ILE 596 -12,005 33,135 -12,849 1,00 24,39 A O ATOM 1053 N HIS 597 -12,385 31,613 -11,235 1,00 23,51 A N ATOM 1054 CA HIS 597 -13,795 31,956 -11,062 1,00 22,95 A C ATOM 1055 CB HIS 597 -14,689 30,798 -11,522 _1,0023,62 A C ATOM 1056 CG HIS 597 -14,325 30,238 -12,863 1,00 22,44 A C ATOM 1057 CD2 HIS 597 -13,774 29,053 -13,213 1,00 25,26 A C ATOM 1058 ND1 HIS 597 -14,579 30,904 -14,042 1,00 23,06 A N ATOM 1059 CE1 HIS 597 -14,206 30,152 -15,063 1,00 23,37 A C ATOM 1060 NE2 HIS 597 -13,715 29,022 -14,588 1,00 24,84 A N ATOM ₁₀₆₁C HIS 597 -14,076 32,224 -9,586 _1,0025,18 A C ATOM 1062 O HIS 597 -13,767 31,394 -8,735 1,00 25,64 A O ATOM 1063 N ALA 598 -14,672 33,373 -9,289 1,00 25,15 A N ATOM 1064 CA ALA 598 -14,969 33,749 -7,909 1,00 26,23 A C ATOM 1065 CB ALA 598 -14,384 35,114 -7,606 1,00 23,97 A C ATOM 1066 C ALA 598 -16,472 33,778 -7,680 1,00 27,18 A C ATOM 1067 O ALA 598 -17,224 34,295 -8,508 1,00 27,20 A O ATOM 1068 N SER 599 -16,907 33,223 -6,556 1,00 26,97 A N ATOM 1069 CA SER 599 -18,286 33,395 -6,133 1,00 29,40 A C ATOM 1070 CB SER 599 -18,775 32,168 -5,376 1,00 30,19 A C ATOM 1071 OG SER 599 -20,054 32,417 -4,826 _1,0033,89 A O ATOM 1072 C SER 599 -18,387 34,618 -5,232 1,00 30,33 A C ATOM 1073 O SER 599 -17,861 34,629 -4,120 1,00 31,52 A O ATOM 1074 N CYS 600 -19,064 35,646 -5,728 1,00 32,35 A N ATOM 1075 CA CYS 600 -19,170 36,923 -5,036 1,00 35,21 A C ATOM 1076 C CYS 600 -20,606 37,142 -4,591 1,00 36,07 A C ATOM 1077 O CYS ₆₀₀-21,520 37,174 -5,413 _1,0035,83 A O ATOM 1078 CB CYS 600 -18,744 38,055 -5,971 1,00 35,88 A C ATOM 1079 SG CYS 600 -17,010 37,951 -6,513 1,00 39,28 A S ATOM 1080 N CYS 601 -20,816 37,282 -3,289 1,00 38,47 A N ATOM 1081 CA CYS 601 -22,175 37,408 -2,790 1,00 40,53 A C ATOM 1082 C CYS 601 -22,415 38,723 -2,079 1,00 42,20 A C ATOM 1083 O CYS ₆₀₁-21,636 39,141 _{-1,218 1,00}40,46 A O ATOM 1084 CB CYS 601 -22,511 36,277 -1,832 1,00 40,11 A C ATOM 1085 SG CYS 601 -22,373 34,577 -2,469 1,00 41,58 A S ATOM 1086 N HIS 602 -23,510 39,369 -2,453 1,00 44,38 A N ATOM 1087 CA HIS 602 -24,081 40,418 -1,637 1,00 47,94 A C ATOM ₁₀₈₈CB HIS ₆₀₂-24,858 41,399 -2,518 _1,0051,93 A C ATOM 1089 CG HIS 602 -25,222 42,674 -1,826 1,00 58,56 A C ATOM 1090 CD2 HIS 602 -24,451 43,620 -1,237 1,00 60,81 A C ATOM 1091 ND1 HIS 602 -26,526 43,095 -1,678 1,00 60,77 A N ATOM 1092 CE1 HIS 602 -26,543 44,246 -1,028 1,00 62,59 A C ATOM 1093 NE2 HIS 602 -25,297 44,587 -0,749 1,00 62,85 A N ATOM 1094 C 602 -25,017 39,713 -0,661 1,00 48,23 A C HIS ATOM 1095 O HIS 602 -26,025 39,129 -1,063 1,00 45,88 A O (continuación)

ATOM 1096 N ALA 603 -24,661 39,746 0,619 1,00 49,87 A N ATOM 1097 CA ALA 603 -25,450 39,089 1,653 1,00 52,49 A C ATOM 1098 CB ALA 603 -25,006 37,647 1,804 1,00 50,93 A C ATOM 1099 C ALA 603 -25,287 39,829 2,975 _1,0053,94 A C ATOM 1100 O ALA 603 -24,183 39,934 3,507 1,00 55,03 A O ATOM 1101 N PRO 604 -26,394 40,340 3,530 1,00 55,31 A N ATOM 1102 CD PRO 604 -27,775 40,052 3,105 1,00 56,68 A C ATOM 1103 CA PRO 604 -26,349 41,196 4,721 1,00 55,19 A C ATOM 1104 CB PRO 604 -27,808 41,600 4,931 1,00 56,90 A C ATOM 1105 CG PRO 604 -28,600 40,510 4,278 1,00 57,49 A C ATOM 1106 C PRO 604 -25,762 40,507 5,951 1,00 53,84 A C ATOM 1107 O PRO 604 -26,291 39,504 6,429 1,00 53,50 A O ATOM 1108 N GLY 605 -24,664 41,058 6,459 1,00 51,66 A N ATOM 1109 CA GLY 605 -24,084 40,547 7,683 1,00 49,75 A C ATOM 1110 C GLY 605 -23,181 39,350 7,466 1,00 49,32 A C ATOM ₁₁₁₁O GLY 605 -22,695 38,750 8,426 _1,0049,78 A O ATOM 1112 N LEU 606 -22,951 38,991 6,209 1,00 47,32 A N ATOM 1113 CA LEU 606 -22,048 37,888 5,914 1,00 45,14 A C ATOM 1114 CB LEU 606 -22,319 37,334 4,516 1,00 46,10 A C ATOM 1115 CG LEU 606 -21,432 36,150 4,128 1,00 46,60 A C ATOM 1116 CD1 LEU 606 -21,603 35,038 5,146 1,00 45,47 A C ATOM 1117 CD2 LEU 606 -21,794 35,665 2,731 1,00 47,85 A C ATOM 1118 C LEU 606 -20,599 38,351 6,015 1,00 43,35 A C ATOM 1119 O LEU 606 -20,226 39,381 5,460 1,00 42,73 A O ATOM 1120 N GLU 607 -19,792 37,584 6,737 1,00 41,82 A N ATOM ₁₁₂₁CA GLU 607 -18,388 37,913 6,949 _1,0041,58 A C ATOM 1122 CB GLU 607 -18,194 38,408 8,390 1,00 43,33 A C ATOM 1123 CG GLU 607 -16,751 38,685 8,788 1,00 48,75 A C ATOM 1124 CD GLU 607 -16,585 38,939 10,289 1,00 52,26 A C ATOM 1125 OE1 GLU 607 -17,466 38,528 11,082 1,00 53,24 A O ATOM 1126 OE2 GLU 607 -15,564 39,548 10,675 1,00 52,44 A O ATOM 1127 C GLU 607 -17,541 36,659 6,699 _1,0040,02 A C ATOM 1128 O GLU 607 -17,845 35,587 7,217 1,00 39,94 A O ATOM 1129 N CYS 608 -16,483 36,786 5,905 1,00 38,50 A N ATOM 1130 CA CYS 608 -15,634 35,635 5,616 1,00 38,05 A C ATOM 1131 C CYS 608 -14,154 35,926 5,793 1,00 38,09 A C ATOM 1132 O CYS 608 -13,724 37,076 5,752 1,00 38,32 A O ATOM 1133 CB CYS ₆₀₈-15,861 35,139 4,192 _1,0036,34 A C ATOM 1134 SG CYS 608 -17,584 34,811 3,711 1,00 38,54 A S ATOM 1135 N LYS 609 -13,381 34,864 5,981 1,00 37,60 , A N ATOM 1136 CA LYS 609 -11,938 34,967 6,132 1,00 37,54 A C ATOM 1137 CB LYS 609 -11,566 35,070 7,611 1,00 36,16 A C ATOM 1138 CG LYS 609 -11,789 33,783 8,375 _1,0039,02 A C ATOM 1139 CD LYS 609 -11,435 33,924 9,849 1,00 42,30 A C ATOM 1140 CE LYS 609 -11,847 32,676 10,614 1,00 42,81 A C ATOM 1141 NZ LYS 609 -11,420 32,722 12,039 1,00 44,87 A N ATOM 1142 C LYS 609 -11,309 33,710 5,538 1,00 37,29 A C ATOM 1143 O LYS 609 -12,004 32,728 5,264 1,00 37,32 A O ATOM 1144 N VAL ₆₁₀-9,995 33,742 5,351 _1,0036,83 A N ATOM 1145 CA VAL 610 -9,284 32,629 4,743 1,00 36,94 A C ATOM 1146 CB VAL 610 -8,484 33,091 3,511 1,00 37,85 A C ATOM 1147 CG1 VAL 610 -7,745 31,913 2,902 1,00 38,22 A C (continuación)

ATOM 1148 CG2 VAL 610 -9,423 33,721 2,488 1,00 37,85 A C ATOM 1149 C VAL 610 -8,323 31,984 5,729 1,00 37,80 A C ATOM 1150 O VAL ₆₁₀-7,599 32,675 6,446 _1,0038,87 A O ATOM 1151 N LYS 611 -8,330 30,655 5,761 1,00 37,56 A N ATOM 1152 CA LYS 611 -7,388 29,883 6,568 1,00 38,62 A C ATOM 1153 CB LYS 611 -8,116 29,133 7,684 1,00 38,63 A C ATOM 1154 CG LYS 611 -8,917 30,008 8,625 1,00 42,75 A C ATOM 1155 CD LYS 611 -9,432 29,193 9,793 1,00 42,52 A C ATOM 1156 CE LYS ₆₁₁-8,336 28,291 10,342 _1,0044,58 A C ATOM 1157 NZ LYS 611 -8,782 27,548 11,559 1,00 48,18 A N ATOM 1158 C LYS 611 -6,718 28,865 5,664 1,00 39,23 A C ATOM 1159 O LYS 611 -7,365 28,288 4,791 1,00 39,27 A O ATOM 1160 N GLU 612 -5,429 28,632 5,874 1,00 39,16 A N ATOM 1161 CA GLU 612 -4,726 27,624 5,094 1,00 42,41 A C ATOM ₁₁₆₂CB GLU ₆₁₂-3,867 28,295 4,025 _1,0044,71 A C ATOM 1163 CG GLU 612 -2,809 29,235 4,571 1,00 49,08 A C ATOM 1164 CD GLU 612 -2,008 29,896 3,465 1,00 53,20 A C ATOM 1165 OE1 GLU 612 -2,592 30,697 2,699 1,00 54,07 A O ATOM 1166 OE2 GLU 612 -0,796 29,609 3,360 1,00 53,71 A O ATOM 1167 C GLU 612 -3,853 26,736 5,970 1,00 42,48 A C ATOM 1168 O GLU 612 -3,592 27,058 7,127 1,00 43,10 A O ATOM 1169 N HIS 613 -3,414 25,613 5,415 1,00 41,33 A N ATOM 1170 CA HIS 613 -2,438 24,758 6,074 1,00 42,62 A C ATOM 1171 CB HIS 613 -3,140 23,783 7,025 1,00 44,30 A C ATOM 1172 CG HIS 613 -2,222 22,782 7,658 1,00 44,52 A C ATOM 1173 CD2 HIS 613 -1,137 22,941 8,453 1,00 44,27 A C ATOM 1174 ND1 HIS 613 -2,381 21,421 7,498 1,00 45,05 A N ATOM 1175 CE1 HIS 613 -1,435 20,786 8,167 1,00 43,50 A C ATOM 1176 NE2 HIS 613 -0,667 21,685 8,755 1,00 44,92 A N ATOM 1177 C HIS 613 -1,677 23,994 5,003 1,00 44,32 A C ATOM 1178 O HIS 613 -2,277 23,299 4,183 _1,0044,33 A O ATOM 1179 N GLY 614 -0,356 24,142 5,000 1,00 45,57 A N ATOM 1180 CA GLY 614 0,460 23,465 4,010 1,00 46,92 A C ATOM 1181 C GLY 614 1,295 22,352 4,609 1,00 48,04 A C ATOM 1182 O GLY 614 1,660 22,402 5,779 1,00 48,09 A O ATOM 1183 N ILE 615 1,594 21,342 3,801 1,00 50,58 A N ATOM 1184 CA ILE 615 2,451 20,237 4,214 _1,0053,77 A C ATOM 1185 CB ILE 615 1,643 18,935 4,407 1,00 55,20 A C ATOM 1186 CG2 ILE 615 2,575 17,774 4,701 1,00 54,79 A C ATOM 1187 CG1 ILE 615 0,648 19,109 5,551 1,00 55,97 A C ATOM 1188 CD1 ILE 615 1,290 19,599 6,820 1,00 58,58 A C ATOM 1189 C ILE 615 3,505 19,996 3,143 _1,0055,43 A C ATOM 1190 O ILE 615 3,203 20,011 1,950 1,00 55,42 A O ATOM 1191 N PRO 616 4,762 19,778 3,559 1,00 57,06 A N ATOM 1192 CD PRO 616 5,226 19,885 4,952 1,00 57,57 A C ATOM 1193 CA PRO 616 5,878 19,575 2,627 1,00 58,08 A C ATOM 1194 CB PRO 616 7,100 19,486 3,541 1,00 58,83 A C ATOM 1195 CG PRO ₆₁₆6,684 20,196 4,792 _1,0058,90 A C ATOM 1196 C PRO 616 5,717 18,322 1,768 1,00 58,68 A C ATOM 1197 O PRO 616 5,755 18,392 0,540 1,00 59,30 A O ATOM 1198 N ALA 617 5,539 17,177 2,420 1,00 58,67 A N ATOM 1199 CA ALA 617 5,396 15,915 1,704 1,00 60,47 A C (continuación)

ATOM 1200 CB ALA 617 6,581 15,005 2,006 1,00 60,68 A C ATOM ₁₂₀₁C ALA 617 4,097 15,227 2,095 _1,0060,64 A C ATOM 1202 O ALA 617 4,096 14,273 2,876 1,00 60,93 A O ATOM 1203 N PRO 618 2,971 15,696 1,541 1,00 60,54 A N ATOM 1204 CD PRO 618 2,883 16,645 0,417 1,00 60,69 A C ATOM 1205 CA PRO 618 1,660 15,169 1,929 1,00 60,60 A C ATOM 1206 CB PRO 618 0,679 15,977 1,079 1,00 60,68 A C ATOM 1207 CG PRO ₆₁₈1,485 16,442 -0,093 _{1,00 61,12}A C ATOM 1208 C PRO 618 1,557 13,669 1,673 1,00 60,54 A C ATOM 1209 O PRO 618 1,962 13,178 0,621 1,00 60,46 A O ATOM 1210 N GLN 619 1,017 12,947 2,647 1,00 61,08 A N ATOM 1211 CA GLN 619 0,972 11,493 2,585 1,00 62,08 A C ATOM 1212 CB GLN 619 1,260 10,902 3,963 1,00 64,75 A C ATOM 1213 CG GLN 619 2,736 _10,8204,294 _1,0069,13 A C ATOM 1214 CD GLN 619 3,405 9,620 3,650 1,00 72,41 A C ATOM 1215 OE1 GLN 619 4,597 9,381 3,844 1,00 75,41 A O ATOM 1216 NE2 GLN 619 2,636 8,855 2,879 1,00 73,28 A N ATOM 1217 C GLN 619 -0,366 10,974 2,082 1,00 60,67 A C ATOM 1218 O GLN 619 -0,690 9,795 2,248 1,00 61,39 A O ATOM 1219 N GLY 620 -1,140 11,858 1,463 1,00 58,38 A N ATOM 1220 CA GLY 620 -2,412 11,446 0,902 1,00 55,08 A C ATOM 1221 C GLY 620 -3,476 12,526 0,959 1,00 52,97 A C ATOM 1222 O GLY 620 -4,332 12,608 0,076 1,00 52,81 A O ATOM 1223 N GLN ₆₂₁-3,433 13,353 1,998 _1,0049,05 A N ATOM 1224 CA GLN 621 -4,334 14,486 2,084 1,00 46,66 A C ATOM 1225 CB GLN 621 -5,715 14,040 2,571 1,00 48,24 A C ATOM 1226 CG GLN 621 -5,783 13,670 4,038 1,00 50,90 A C ATOM 1227 CD GLN 621 -7,187 13,283 4,471 1,00 52,62 A C ATOM 1228 OE1 GLN 621 -8,035 12,943 3,645 1,00 53,23 A O ATOM 1229 NE2 GLN ₆₂₁-7,440 13,338 5,774 _1,0053,97 A N ATOM 1230 C GLN 621 -3,793 15,570 2,998 1,00 44,42 A C ATOM 1231 O GLN 621 -2,991 15,310 3,894 1,00 43,84 A O ATOM 1232 N VAL 622 -4,230 16,795 2,742 1,00 41,31 A N ATOM 1233 CA VAL 622 -3,895 17,932 3,576 1,00 38,86 A C ATOM 1234 CB VAL 622 -3,022 18,943 2,814 1,00 37,61 A C ATOM 1235 CG1 VAL ₆₂₂-2,539 20,029 3,759 _1,0039,32 A C ATOM 1236 CG2 622 -1,858 18,234 2,162 1,00 38,06 A C VAL ATOM 1237 C VAL 622 -5,216 18,597 3,935 1,00 38,57 A C ATOM 1238 O VAL 622 -6,068 18,804 3,068 1,00 38,51 A O ATOM 1239 N THR 623 -5,392 18,926 5,207 _1,0035,77 A N ATOM 1240 CA THR 623 -6,656 19,479 5,664 1,00 33,79 A C ATOM 1241 CB THR 623 -7,387 18,504 6,604 1,00 34,25 A C ATOM 1242 OG1 THR 623 -6,629 18,345 7,810 1,00 33,79 A O ATOM 1243 CG2 THR 623 -7,559 17,148 5,932 1,00 33,56 A C ATOM 1244 C THR 623 -6,457 20,786 6,407 1,00 33,76 A C ATOM 1245 O THR 623 -5,388 21,040 6,968 _1,0033,37 A O ATOM 1246 N VAL 624 -7,495 21,615 6,401 1,00 32,04 A N ATOM 1247 CA VAL 624 -7,583 22,747 7,310 1,00 31,45 A C ATOM 1248 CB VAL 624 -6,990 24,032 6,674 1,00 32,64 A C ATOM 1249 CG1 VAL 624 -7,790 24,431 5,446 1,00 31,89 A C ATOM 1250 CG2 624 -6,973 25,161 7,699 1,00 31,91 A C (continuación)

VAL ATOM 1251 C VAL 624 -9,058 22,959 7,630 1,00 33,28 A C ATOM 1252 O VAL 624 -9,925 22,714 6,789 1,00 32,07 A O ATOM 1253 N ALA 625 -9,346 23,392 8,852 1,00 33,71 A N ATOM 1254 CA ALA 625 -10,723 23,491 9,305 1,00 35,41 A C ATOM 1255 CB ALA 625 -10,971 22,492 10,434 1,00 33,24 A C ATOM 1256 C ALA 625 -11,060 24,900 9,768 1,00 37,55 A C ATOM 1257 O ALA 625 -10,185 25,646 10,200 1,00 38,33 A O ATOM 1258 N CYS 626 -12,335 25,262 9,661 1,00 39,75 A N ATOM 1259 CA CYS 626 -12,840 26,477 10,286 1,00 41,17 A C ATOM 1260 C CYS 626 -13,170 26,144 11,743 1,00 43,54 A C ATOM 1261 O CYS 626 -13,781 25,110 12,024 1,00 44,60 A O ATOM ₁₂₆₂CB CYS ₆₂₆-14,110 26,959 9,575 _1,0039,19 A C ATOM 1263 SG CYS 626 -13,999 27,167 7,765 1,00 41,43 A S ATOM 1264 N GLU 627 -12,770 27,010 12,669 1,00 45,20 A N ATOM 1265 CA GLU 627 -13,077 26,793 14,085 1,00 47,32 A C ATOM 1266 CB GLU 627 -12,212 27,696 14,966 1,00 47,58 A C ATOM 1267 CG GLU 627 -12,348 29,175 14,660 1,00 49,95 A C ATOM 1268 CD GLU 627 -11,403 29,627 13,566 1,00 52,51 A C ATOM 1269 OE1 GLU 627 -10,990 30,804 13,592 1,00 55,13 A O ATOM 1270 OE2 GLU 627 -11,071 28,810 12,681 1,00 52,16 A O ATOM 1271 C GLU 627 -14,551 27,072 14,362 1,00 47,35 A C ATOM 1272 O GLU 627 -15,252 27,648 13,522 _1,0046,45 A O ATOM 1273 N GLU 628 -15,022 26,665 15,538 1,00 47,46 A N ATOM 1274 CA GLU 628 -16,438 26,788 15,857 1,00 48,46 A C ATOM 1275 CB GLU 628 -16,740 26,197 17,243 1,00 53,92 A C ATOM 1276 CG GLU 628 -16,323 27,076 18,415 1,00 59,91 A C ATOM 1277 CD GLU 628 -16,746 26,502 19,765 1,00 63,80 A C ATOM 1278 OE1 GLU ₆₂₈-16,934 27,291 20,719 _1,0063,78 A O ATOM 1279 OE2 GLU 628 -16,889 25,264 19,873 1,00 66,46 A O ATOM 1280 C GLU 628 -16,840 28,257 15,815 1,00 46,20 A C ATOM 1281 O GLU 628 -16,043 29,141 16,132 1,00 46,72 A O ATOM 1282 N GLY 629 -18,077 28,513 15,410 1,00 42,69 A N ATOM 1283 CA GLY 629 -18,499 29,878 15,171 1,00 40,02 A C ATOM 1284 C GLY 629 -18,411 30,246 13,700 _1,0039,40 A C ATOM 1285 O GLY 629 -19,083 31,173 13,250 1,00 40,26 A O ATOM 1286 N TRP 630 -17,582 29,526 12,947 1,00 37,59 A N ATOM 1287 CA TRP 630 -17,418 29,790 11,515 1,00 35,74 A C ATOM 1288 CB TRP 630 -15,966 30,140 11,191 1,00 33,84 A C ATOM 1289 CG TRP 630 -15,498 31,408 11,807 _1,0036,54 A C ATOM 1290 CD2 TRP 630 -15,352 32,675 11,155 1,00 36,10 A C ATOM 1291 CE2 TRP 630 -14,864 33,585 12,118 1,00 38,43 A C ATOM 1292 CE3 TRP 630 -15,584 33,130 9,853 1,00 36,07 A C ATOM 1293 CD1 TRP 630 -15,104 31,595 13,105 1,00 37,06 A C ATOM 1294 NE1 TRP 630 -14,721 32,900 13,297 1,00 36,65 A N ATOM 1295 CZ2 TRP 630 -14,607 34,923 _{11,818 1,00}36,82 A C ATOM 1296 CZ3 TRP 630 -15,328 34,455 9,556 1,00 37,24 A C ATOM 1297 CH2 TRP 630 -14,844 35,338 10,535 1,00 37,91 A C ATOM 1298 C TRP 630 -17,821 28,570 10,701 1,00 35,13 A C ATOM 1299 O TRP 630 -17,703 27,434 11,165 1,00 35,66 A O ATOM 1300 N THR 631 -18,285 28,804 9,481 1,00 32,78 A N ATOM 1301 CA THR 631 -18,715 27,711 _{8,626 1,00}31,14 A C (continuación)

ATOM 1302 CB THR 631 -20,210 27,847 8,289 1,00 31,87 A C ATOM 1303 OG1 THR 631 -20,961 27,895 9,508 1,00 28,32 A O ATOM 1304 CG2 THR 631 -20,686 26,666 7,452 1,00 28,98 A C ATOM 1305 C THR 631 -17,900 27,686 7,337 1,00 30,23 A C ATOM 1306 O THR 631 -17,683 28,714 6,708 1,00 29,72 A O ATOM 1307 N LEU 632 -17,443 26,502 6,956 _1,0029,92 A N ATOM 1308 CA LEU 632 -16,662 26,336 5,739 1,00 28,80 A C ATOM 1309 CB LEU 632 -16,011 24,954 5,746 1,00 27,20 A C ATOM 1310 CG LEU 632 -15,186 24,597 4,510 1,00 30,81 A C ATOM 1311 CD1 LEU 632 -14,066 25,609 4,346 1,00 30,24 A C ATOM 1312 CD2 LEU 632 -14,624 23,184 4,657 1,00 31,20 A C ATOM 1313 C LEU 632 -17,550 26,493 4,498 _1,0028,43 A C ATOM 1314 O LEU 632 -18,496 25,727 4,309 1,00 28,53 A O ATOM 1315 N THR 633 -17,256 27,486 3,660 1,00 26,00 A N ATOM 1316 CA THR 633 -18,047 27,692 2,449 1,00 27,86 A C ATOM 1317 CB THR 633 -18,520 29,168 2,306 1,00 27,33 A C ATOM 1318 OG1 THR 633 -17,382 30,024 2,156 1,00 25,74 A O ATOM 1319 CG2 THR 633 -19,320 29,598 3,530 1,00 23,90 A C ATOM 1320 C THR 633 -17,271 27,309 1,188 1,00 29,32 A C ATOM 1321 O THR 633 -17,864 26,985 0,160 1,00 29,29 A O ATOM 1322 N GLY 634 -15,946 27,352 1,267 1,00 29,44 A N ATOM 1323 CA GLY 634 -15,131 27,078 0,096 _1,0029,46 A C ATOM 1324 C GLY 634 -13,850 26,344 0,437 1,00 29,50 A C ATOM 1325 O GLY 634 -13,244 26,581 1,485 1,00 30,22 A O ATOM 1326 N CYS 635 -13,432 25,453 -0,454 1,00 28,04 A N ATOM 1327 CA CYS 635 -12,296 24,581 -0,190 1,00 28,82 A C ATOM 1328 C CYS 635 -11,526 24,342 -1,477 1,00 29,22 A C ATOM 1329 O CYS 635 -12,107 23,936 -2,477 _1,0029,78 A O ATOM 1330 CB CYS 635 -12,798 23,252 0,372 1,00 27,17 A C ATOM 1331 SG CYS 635 -11,559 21,934 0,583 1,00 31,95 A S ATOM 1332 N SER 636 -10,222 24,593 -1,449 1,00 29,87 A N ATOM 1333 CA SER 636 -9,392 24,423 -2,635 1,00 31,98 A C ATOM 1334 CB SER 636 -9,557 25,623 -3,567 1,00 30,53 A C ATOM 1335 OG SER 636 -9,043 26,792 -2,957 _1,0032,60 A O ATOM 1336 C SER 636 -7,916 24,274 -2,276 1,00 33,39 A C ATOM 1337 O SER 636 -7,526 24,394 -1,113 1,00 33,25 A O ATOM 1338 N ALA 637 -7,099 24,011 -3,289 1,00 35,31 A N ATOM 1339 CA ALA 637 -5,653 23,970 -3,117 1,00 37,57 A C ATOM 1340 CB ALA 637 -5,063 _22,828-3,937 _1,0035,81 A C ATOM 1341 C ALA 637 -5,038 25,296 -3,554 1,00 38,81 A C ATOM 1342 O ALA 637 -5,468 25,899 -4,537 1,00 39,80 A O ATOM 1343 N LEU 638 -4,036 25,746 -2,811 1,00 40,54 A N ATOM 1344 CA LEU 638 -3,236 26,893 -3,216 1,00 41,27 A C ATOM 1345 CB LEU 638 -2,161 27,171 -2,163 1,00 41,30 A C ATOM 1346 CG LEU 638 -1,633 28,595 -1,974 _1,0043,45 A C ATOM 1347 CD1 LEU 638 -2,751 29,509 -1,502 1,00 43,30 A C ATOM 1348 CD2 LEU 638 -0,505 28,577 -0,952 1,00 44,32 A C ATOM 1349 C LEU 638 -2,583 26,506 -4,536 1,00 43,36 A C ATOM 1350 O LEU 638 -2,027 25,415 -4,665 1,00 43,89 A O ATOM 1351 N PRO 639 -2,654 27,386 -5,541 1,00 44,54 A N ATOM 1352 CD PRO 639 -3,210 28,751 -5,535 _1,0042,27 A C ATOM 1353 CA PRO 639 -2,072 27,020 -6,838 1,00 45,55 A C (continuación)

ATOM 1354 CB PRO 639 -2,528 28,144 -7,764 1,00 44,15 A C ATOM 1355 CG PRO 639 -2,731 29,322 -6,849 1,00 44,46 A C ATOM 1356 C PRO 639 -0,551 26,924 -6,745 1,00 48,67 A C ATOM 1357 O PRO 639 0,128 27,928 -6,530 1,00 49,10 A O ATOM 1358 N GLY 640 -0,021 25,714 -6,895 1,00 52,08 A N ATOM 1359 CA GLY 640 1,417 25,517 -6,809 1,00 55,68 A C ATOM 1360 C GLY 640 1,913 24,533 -7,849 1,00 58,10 A C ATOM 1361 O GLY 640 1,201 24,233 -8,802 1,00 58,79 A O ATOM 1362 N THR 641 3,129 24,025 -7,679 1,00 61,04 A N ATOM 1363 CA THR 641 3,606 22,939 -8,532 1,00 64,61 , A C ATOM 1364 CB THR 641 5,134 22,731 -8,392 _1,0065,87 A C ATOM 1365 OG1 THR 641 5,489 22,650 -7,006 1,00 67,03 A O ATOM 1366 CG2 THR 641 5,888 23,877 -9,048 1,00 66,73 A C ATOM 1367 C THR 641 2,883 21,653 -8,152 1,00 66,27 A C ATOM 1368 O THR 641 3,336 20,548 -8,461 1,00 67,72 A O ATOM 1369 N SER 642 1,740 21,824 -7,492 1,00 67,29 A N ATOM 1370 CA SER 642 0,977 20,732 -6,901 1,00 66,68 A C ATOM 1371 CB SER 642 -0,227 21,301 -6,138 1,00 68,50 A C ATOM 1372 OG SER 642 0,163 22,269 -5,174 1,00 65,92 A O ATOM 1373 C SER 642 0,480 19,719 -7,927 1,00 66,01 A C ATOM 1374 O SER 642 0,079 _20,081-9,031 _1,0066,17 A O ATOM 1375 N HIS 643 0,507 18,445 -7,548 1,00 65,59 A N ATOM 1376 CA HIS 643 -0,260 17,419 -8,250 1,00 63,85 A C ATOM 1377 CB HIS 643 0,565 16,134 -8,445 1,00 68,67 A C ATOM 1378 CG HIS 643 2,049 16,339 -8,398 1,00 73,45 A C ATOM 1379 CD2 HIS 643 2,830 17,348 -8,853 1,00 75,15 A C ATOM 1380 ND1 HIS 643 2,905 15,423 -7,823 _1,0075,08 A N ATOM 1381 CE1 HIS 643 4,148 15,859 -7,925 1,00 76,32 A C ATOM 1382 NE2 HIS 643 4,130 17,025 -8,546 1,00 76,69 A N ATOM 1383 C HIS 643 -1,461 17,099 -7,368 1,00 59,62 A C ATOM 1384 O HIS 643 -1,347 16,321 -6,418 1,00 61,00 A O ATOM 1385 N VAL 644 -2,606 17,697 -7,672 1,00 53,01 A N ATOM 1386 CA VAL 644 -3,775 17,546 -6,813 _1,0047,88 A C ATOM 1387 CB VAL 644 -4,312 18,931 -6,395 1,00 48,74 A C ATOM 1388 CG1 VAL 644 -5,721 18,813 -5,835 1,00 46,18 A C ATOM 1389 CG2 VAL 644 -3,379 19,535 -5,359 1,00 46,52 A C ATOM 1390 C VAL 644 -4,894 16,729 -7,456 1,00 44,30 A C ATOM 1391 O VAL 644 -5,270 16,973 -8,605 _1,0041,49 A O ATOM 1392 N LEU 645 -5,416 15,756 -6,711 1,00 39,48 A N ATOM 1393 CA LEU 645 -6,514 14,921 -7,198 1,00 35,69 A C ATOM 1394 CB LEU 645 -6,636 13,646 -6,359 1,00 34,50 A C ATOM 1395 CG LEU 645 -5,395 12,749 -6,310 1,00 33,63 A C ATOM 1396 CD1 LEU 645 -5,668 11,520 -5,449 1,00 29,01 A C ATOM 1397 CD2 LEU 645 -5,014 12,337 -7,722 _1,0032,25 A C ATOM 1398 C LEU 645 -7,820 15,699 -7,120 1,00 33,69 A C ATOM 1399 O LEU 645 -8,741 15,482 -7,911 1,00 33,63 A O ATOM 1400 N GLY 646 -7,889 16,615 -6,164 1,00 30,73 A N ATOM 1401 CA GLY 646 -9,099 17,387 -5,980 1,00 29,59 A C ATOM 1402 C GLY 646 -9,210 17,891 -4,559 1,00 29,58 A C ATOM 1403 O GLY 646 -8,271 17,766 -3,767 _1,0029,34 A O ATOM 1404 N ALA 647 -10,362 18,466 -4,238 1,00 27,24 A N ATOM 1405 CA ALA 647 -10,592 19,040 -2,927 1,00 26,99 A C (continuación)

ATOM 1406 CB ALA 647 -10,043 20,453 -2,878 1,00 23,24 A C ATOM 1407 C ALA 647 -12,091 19,044 -2,660 1,00 27,99 A C ATOM 1408 O ALA 647 -12,898 19,142 -3,590 1,00 26,92 A O ATOM 1409 N TYR 648 -12,462 18,923 -1,391 1,00 26,93 A N ATOM 1410 CA TYR 648 -13,865 18,949 -1,011 1,00 28,19 A C ATOM 1411 CB TYR 648 -14,535 17,621 -1,373 1,00 27,10 A C ATOM 1412 CG TYR 648 -13,744 16,397 -0,960 1,00 29,81 A C ATOM 1413 CD1 TYR 648 -13,822 15,899 0,336 1,00 28,83 A C ATOM 1414 CE1 TYR 648 -13,090 14,788 0,725 1,00 30,03 A C ATOM 1415 CD2 TYR 648 -12,912 15,747 -1,862 1,00 29,05 A C ATOM 1416 CE2 TYR 648 -12,179 14,635 -1,486 1,00 32,30 A C ATOM 1417 CZ TYR 648 -12,272 14,160 -0,187 1,00 31,60 A C ATOM 1418 OH TYR 648 -11,544 13,057 0,195 1,00 33,44 A O ATOM 1419 C TYR 648 -14,021 19,210 0,477 1,00 30,20 A C ATOM 1420 O TYR 648 -13,126 18,905 1,272 1,00 30,34 A O ATOM 1421 N ALA 649 -15,166 19,768 0,851 1,00 28,57 A N ATOM 1422 CA ALA 649 -15,455 20,020 2,251 1,00 29,86 A C ATOM 1423 CB ALA 649 -16,394 21,210 2,380 1,00 28,48 A C ATOM 1424 C ALA 649 -16,083 18,783 2,884 1,00 32,30 A C ATOM 1425 O ALA 649 -16,920 18,115 2,276 1,00 33,16 A O ATOM 1426 N VAL 650 -15,653 18,469 4,101 1,00 33,30 A N ATOM 1427 CA VAL 650 -16,356 17,509 4,939 1,00 33,70 A C ATOM 1428 CB VAL 650 -15,487 16,269 5,234 1,00 34,68 A C ATOM 1429 CG1 VAL 650 -16,177 15,385 6,257 1,00 35,80 A C ATOM 1430 CG2 VAL 650 -15,251 15,487 3,954 1,00 33,77 A C ATOM 1431 C VAL 650 -16,683 _18,2206,242 1,00 33,54 A C ATOM 1432 O VAL 650 -15,784 18,580 7,005 1,00 34,44 A O ATOM 1433 N ASP 651 -17,970 18,436 6,484 1,00 32,32 A N ATOM 1434 CA ASP 651 -18,396 19,313 7,560 1,00 33,07 A C ATOM 1435 CB ASP 651 -18,048 18,692 8,914 1,00 34,55 A C ATOM 1436 CG ASP 651 -18,678 17,316 9,101 1,00 37,44 A C ATOM 1437 OD1 ASP 651 -19,927 17,218 9,110 1,00 36,19 A O ATOM 1438 OD2 ASP 651 -17,925 16,328 9,235 1,00 39,42 A O ATOM 1439 C ASP 651 -17,696 20,658 7,382 1,00 33,97 A C ATOM 1440 O ASP 651 -17,885 21,319 6,360 1,00 34,64 A O ATOM 1441 N ASN 652 -16,884 21,060 8,357 1,00 32,48 A N ATOM 1442 CA ASN 652 -16,196 22,346 8,273 1,00 32,00 A C ATOM 1443 CB ASN 652 -16,502 23,197 9,511 1,00 32,46 A C ATOM 1444 CG ASN 652 -17,927 23,747 9,500 1,00 35,25 A C ATOM 1445 OD1 ASN 652 -18,527 23,930 8,433 1,00 32,30 A O ATOM 1446 ND2 ASN 652 -18,474 24,010 10,687 1,00 33,95 A N ATOM 1447 C ASN 652 -14,693 22,176 8,102 1,00 31,47 A C ATOM 1448 O ASN 652 -13,908 23,057 8,451 1,00 30,18 A O ATOM 1449 N THR 653 -14,309 21,033 7,544 1,00 29,69 A N ATOM 1450 CA THR 653 -12,921 20,746 7,225 1,00 28,78 A C ATOM 1451 CB THR 653 -12,510 19,372 7,809 1,00 27,92 A C ATOM 1452 OG1 THR 653 -12,589 19,425 9,237 1,00 29,55 A O ATOM 1453 CG2 THR 653 -11,095 19,004 7,395 1,00 28,75 A C ATOM 1454 C THR 653 -12,712 20,726 5,707 1,00 28,67 A C ATOM 1455 O THR 653 -13,452 20,061 4,978 1,00 29,58 A O ATOM 1456 N CYS 654 -11,705 21,454 5,236 1,00 28,76 A N ATOM 1457 CA CYS 654 -11,330 21,421 3,827 1,00 27,76 A C (continuación)

ATOM 1458 C CYS 654 -10,320 20,324 3,598 1,00 28,97 A C ATOM 1459 O CYS 654 -9,254 20,321 4,215 1,00 31,24 A O ATOM 1460 CB CYS 654 -10,709 22,750 3,399 _1,0028,74 A C ATOM 1461 SG CYS 654 -10,081 22,798 1,685 1,00 32,18 A S ATOM 1462 N VAL 655 -10,649 19,402 2,700 1,00 28,34 A N ATOM 1463 CA VAL 655 -9,761 18,299 2,378 1,00 28,21 A C ATOM 1464 CB VAL 655 -10,500 16,944 2,459 1,00 28,71 A C ATOM 1465 CG1 VAL 655 -9,552 15,821 2,103 1,00 28,30 A C ATOM 1466 CG2 VAL 655 -11,058 16,734 3,851 _1,0029,74 A C ATOM 1467 C VAL 655 -9,187 18,455 0,971 1,00 29,61 A C ATOM 1468 O VAL 655 -9,929 18,520 -0,011 1,00 29,60 A O ATOM 1469 N VAL 656 -7,864 18,520 0,877 1,00 29,42 A N ATOM 1470 CA VAL 656 -7,199 18,432 -0,411 1,00 29,18 A C ATOM 1471 CB VAL 656 -6,140 19,550 -0,579 1,00 29,20 A C ATOM 1472 CG1 VAL 656 -5,368 19,352 -1,887 1,00 23,76 A C ATOM 1473 CG2 VAL 656 -6,827 20,915 -0,575 1,00 25,50 A C ATOM 1474 C VAL 656 -6,526 17,075 -0,522 1,00 30,76 A C ATOM 1475 O VAL 656 -5,797 16,663 0,376 1,00 29,50 A O ATOM 1476 N ARG 657 -6,787 16,378 -1,625 _1,0033,71 A N ATOM 1477 CA ARG 657 -6,201 15,062 -1,863 1,00 35,25 A C ATOM 1478 CB ARG 657 -7,260 14,100 -2,409 1,00 35,66 A C ATOM 1479 CG ARG 657 -8,393 13,791 -1,438 1,00 37,10 A C ATOM 1480 CD ARG 657 -8,058 12,606 -0,541 1,00 37,52 A C ATOM 1481 NE ARG 657 -7,781 11,393 -1,310 1,00 36,14 A N ATOM 1482 CZ ARG 657 -8,701 10,489 -1,637 _1,0039,36 A C ATOM 1483 NH1 ARG 657 -8,358 9,416 -2,339 1,00 39,27 A N ATOM 1484 NH2 ARG 657 -9,966 10,655 -1,264 1,00 38,06 A N ATOM 1485 C ARG 657 -5,048 15,166 -2,848 1,00 37,95 A C ATOM 1486 O ARG 657 -5,200 15,678 -3,960 1,00 37,69 A O ATOM 1487 N SER 658 -3,888 14,673 -2,433 1,00 41,37 A N ATOM 1488 CA SER 658 -2,685 14,742 -3,254 _1,0044,93 A C ATOM 1489 CB SER 658 -1,502 15,192 -2,397 1,00 45,44 A C ATOM 1490 OG SER 658 -1,412 14,401 -1,223 1,00 50,04 A O ATOM 1491 C SER 658 -2,392 13,378 -3,858 1,00 46,73 A C ATOM 1492 O SER 658 -2,864 12,358 -3,357 1,00 45,37 A O ATOM 1493 N ARG 659 -1,617 13,356 -4,936 _1,0050,91 A N ATOM 1494 CA ARG 659 -1,109 12,095 -5,457 1,00 56,06 A C ATOM 1495 CB ARG 659 -0,700 12,236 -6,920 1,00 60,94 A C ATOM 1496 CG ARG 659 0,009 11,001 -7,473 1,00 66,87 A C ATOM 1497 CD ARG 659 -0,801 9,724 -7,244 1,00 70,25 A C ATOM 1498 NE ARG 659 -0,729 9,250 -5,863 1,00 73,87 A N ATOM 1499 CZ ARG 659 -1,329 8,148 -5,418 _1,0075,97 A C ATOM 1500 NH1 ARG 659 -2,049 7,400 -6,247 1,00 76,24 A N ATOM 1501 NH2 ARG 659 -1,212 7,792 -4,144 1,00 76,11 A N ATOM 1502 C ARG 659 0,091 11,633 -4,643 1,00 57,33 A C ATOM 1503 O ARG 659 -0,051 10,845 -3,709 1,00 59,34 A O ATOM 1504 N GLU 670 5,942 19,173 -5,234 1,00 59,80 A N ATOM 1505 CA GLU 670 6,378 19,330 -3,843 _1,0059,19 A C ATOM 1506 CB GLU 670 7,326 20,523 -3,727 1,00 60,88 A C ATOM 1507 CG GLU 670 8,652 20,204 -3,026 1,00 65,12 A C ATOM 1508 CD GLU 670 8,570 20,256 -1,508 1,00 68,07 A C ATOM 1509 OE1 GLU 670 7,987 21,220 -0,974 1,00 68,75 A O (continuación)

ATOM 1510 OE2 GLU 670 9,101 19,341 -0,839 1,00 70,08 A O ATOM 1511 C GLU 670 5,291 19,476 -2,765 _1,0057,96 A C ATOM 1512 O GLU 670 4,489 18,567 -2,544 1,00 56,88 A O ATOM 1513 N ALA 671 5,273 20,628 -2,089 1,00 55,53 A N ATOM 1514 CA ALA 671 4,300 20,874 -1,013 1,00 52,14 A C ATOM 1515 CB ALA 671 4,729 22,075 -0,160 1,00 50,35 A C ATOM 1516 C ALA 671 2,878 21,110 -1,532 1,00 50,50 A C ATOM 1517 O ALA 671 2,685 21,547 -2,660 1,00 49,31 A O ATOM 1518 N VAL 672 1,892 20,811 -0,689 1,00 48,22 A N ATOM 1519 CA VAL 672 0,485 21,038 -0,993 1,00 46,40 A C ATOM 1520 CB VAL 672 -0,264 19,700 -1,175 1,00 46,60 A C ATOM 1521 CG1 VAL 672 -1,765 19,925 -1,123 1,00 45,09 A C ATOM 1522 CG2 VAL 672 0,127 19,068 -2,500 1,00 45,84 A C ATOM 1523 C VAL 672 -0,164 21,812 0,140 1,00 44,64 A C ATOM 1524 O VAL 672 -0,012 21,458 1,308 1,00 44,63 A O ATOM 1525 N THR 673 -0,876 22,878 -0,205 1,00 42,97 A N ATOM 1526 CA THR 673 -1,535 23,695 0,803 1,00 42,42 A C ATOM 1527 CB THR 673 -1,014 25,151 0,769 _1,0041,83 A C ATOM 1528 OG1 THR 673 0,405 25,156 0,961 1,00 43,57 A O ATOM 1529 CG2 THR 673 -1,654 25,968 1,874 1,00 43,03 A C ATOM 1530 C THR 673 -3,052 23,693 0,609 1,00 40,73 A C ATOM 1531 O THR 673 -3,554 23,941 -0,491 1,00 40,35 A O ATOM 1532 N ALA 674 -3,775 23,401 1,684 1,00 37,65 A N ATOM 1533 CA ALA 674 -5,228 23,453 1,651 _1,0036,09 A C ATOM 1534 CB ALA 674 -5,809 22,404 2,589 1,00 32,65 A C ATOM 1535 C ALA 674 -5,700 24,848 2,054 1,00 35,70 A C ATOM 1536 O ALA 674 -5,196 25,433 3,014 1,00 35,06 A O ATOM 1537 N VAL 675 -6,669 25,378 1,313 1,00 33,36 A N ATOM 1538 CA VAL 675 -7,155 26,732 1,554 1,00 31,12 A C ATOM 1539 CB VAL 675 -6,893 27,646 0,344 _1,0032,06 A C ATOM 1540 CG1 VAL 675 -7,362 29,057 0,648 1,00 30,35 A C ATOM 1541 CG2 VAL 675 -5,423 27,625 -0,015 1,00 31,11 A C ATOM 1542 C VAL 675 -8,652 26,721 1,814 1,00 32,06 A C ATOM 1543 O VAL 675 -9,436 26,300 0,962 1,00 33,53 A O ATOM 1544 N ALA 676 -9,046 27,191 2,991 _1,0031,39 A N ATOM 1545 CA ALA 676 -10,446 27,210 3,369 1,00 31,28 A C ATOM 1546 CB ALA 676 -10,631 26,537 4,731 1,00 30,37 A C ATOM 1547 C ALA 676 -10,965 28,638 3,425 1,00 32,21 A C ATOM 1548 O ALA 676 -10,342 29,513 4,026 1,00 32,29 A O ATOM 1549 N ILE 677 -12,112 28,871 2,799 1,00 30,97 A N ATOM 1550 CA ILE 677 -12,853 30,098 3,046 _1,0031,18 A C ATOM 1551 CB ILE 677 -13,511 30,625 1,755 1,00 30,16 A C ATOM 1552 CG2 ILE 677 -14,405 31,810 2,071 1,00 28,01 A C ATOM 1553 CG1 ILE 677 -12,424 31,014 0,749 1,00 29,28 A C ATOM 1554 CD1 ILE 677 -12,949 31,276 -0,653 1,00 31,33 A C ATOM 1555 C ILE 677 -13,925 29,812 4,094 1,00 32,12 A C ATOM 1556 O ILE 677 -14,759 28,916 3,925 _1,0029,55 A O ATOM 1557 N CYS 678 -13,880 30,576 5,181 1,00 33,00 A N ATOM 1558 CA CYS 678 -14,780 30,386 6,316 1,00 34,13 A C ATOM 1559 C CYS 678 -15,661 31,617 6,478 1,00 33,65 A C ATOM 1560 O CYS 678 -15,180 32,744 6,384 1,00 33,63 A O ATOM 1561 CB CYS 678 -13,966 30,179 7,594 1,00 35,39 A C (continuación)

ATOM 1562 SG CYS 678 -12,794 28,787 7,523 _1,0037,76 A S ATOM 1563 N CYS 679 -16,949 31,412 6,718 1,00 33,05 A N ATOM 1564 CA CYS 679 -17,842 32,547 6,892 1,00 36,46 A C ATOM 1565 C CYS 679 -18,750 32,419 8,113 1,00 39,97 A C ATOM 1566 O CYS 679 -18,970 31,324 8,639 1,00 37,89 A O ATOM 1567 CB CYS 679 -18,712 32,734 5,658 1,00 36,27 A ATOM 1568 SG CYS 679 -17,854 32,830 4,054 _1,0036,27 A ATOM 1569 N ARG 680 -19,282 33,556 8,547 1,00 43,34 A ATOM 1570 CA ARG 680 -20,257 33,591 9,630 1,00 48,28 A ATOM 1571 CB ARG 680 -19,547 33,641 10,983 1,00 47,10 A ATOM 1572 CG ARG 680 -18,769 34,919 11,195 1,00 50,25 A ATOM 1573 CD ARG 680 -18,249 35,029 12,610 1,00 50,93 A ATOM 1574 NE ARG 680 -17,474 36,250 12,786 1,00 53,09 A ATOM 1575 CZ ARG 680 -16,716 36,504 13,846 1,00 53,83 A ATOM 1576 NH1 ARG 680 -16,043 37,645 13,919 1,00 54,26 A ATOM 1577 NH2 ARG 680 -16,629 35,617 14,829 1,00 53,05 A ATOM 1578 C ARG ₆₈₀-21,146 34,820 9,479 _1,0049,82 A ATOM 1579 O ARG 680 -20,924 35,657 8,600 1,00 49,14 A ATOM 1580 N SER 681 -22,152 34,917 10,339 1,00 53,31 A ATOM 1581 CA SER 681 -23,029 36,083 10,378 1,00 58,05 A ATOM 1582 CB SER 681 -24,423 35,673 10,837 1,00 58,41 A ATOM 1583 OG SER 681 -24,392 35,272 12,195 1,00 60,93 A ATOM 1584 C SER ₆₈₁-22,486 37,127 11,346 _1,0059,77 A ATOM 1585 O SER 681 -21,714 36,806 12,248 1,00 60,55 A ATOM 1586 N ARG 682 -22,896 38,375 11,154 1,00 62,76 A ATOM 1587 CA ARG 682 -22,616 39,429 12,122 1,00 66,03 A ATOM 1588 CB ARG 682 -21,647 40,448 11,528 1,00 68,33 A ATOM 1589 CG ARG 682 -20,316 39,874 11,085 1,00 71,05 A ATOM 1590 CD ARG ₆₈₂-19,510 40,941 10,368 _1,0073,61 A ATOM 1591 NE ARG 682 -20,383 41,861 9,641 1,00 76,11 A ATOM 1592 CZ ARG 682 -19,966 42,729 8,723 1,00 76,34 A ATOM 1593 NH1 ARG 682 -20,839 43,523 8,117 1,00 74,95 A ATOM 1594 NH2 ARG 682 -18,678 42,801 8,409 1,00 77,06 A ATOM 1595 C ARG ₆₈₂-23,909 40,138 12,514 _1,0066,85 A ATOM 1596 O ARG 682 -24,947 39,865 11,873 1,00 67,78 A ATOM 1597 OXT ARG 682 -23,867 40,966 13,448 1,00 68,38 A TER 1598 ARG 682 A ATOM 3134 CB ALA -2 -22,599 17,038 -50,667 1,00 30,97 L1 ATOM 3135 C ALA _-2-20,735 _18,001-49,294 _1,0031,14 L1 ATOM 3136 O ALA _-2-19,631 17,468 -49,156 _1,0030,83 L1 ATOM 3137 N ALA -2 -20,438 17,670 -51,719 1,00 31,98 L1 ATOM 3138 CA ALA _-2-21,422 _18,028-50,655 _1,0032,78 L1 ATOM 3139 N LEU -1 -21,382 18,582 -48,290 1,00 30,72 L1 ATOM 3140 CA LEU -1 -20,904 18,443 -46,923 1,00 31,40 L1 ATOM 3141 CB LEU _{-1 -20,620}19,810 -46,300 _1,0030,42 L1 ATOM 3142 CG LEU -1 -20,062 19,746 -44,872 1,00 32,48 L1 ATOM 3143 CD1 LEU -1 -18,735 19,007 -44,874 1,00 32,58 L1 ATOM 3144 CD2 LEU -1 -19,875 21,146 -44,314 1,00 31,47 L1 ATOM 3145 C LEU -1 -21,939 17,701 -46,090 1,00 32,90 L1 ATOM 3146 O LEU -1 -23,076 18,154 -45,930 1,00 31,46 L1 ATOM 3147 N GLN 1 -21,543 16,551 -45,565 1,00 32,45 L1 ATOM 3148 CA GLN ₁-22,440 15,769 -44,739 _1,0036,30 L1 (continuación)

ATOM 3149 CB GLN 1 -22,229 14,271 -45,006 1,00 39,00 L1 C ATOM 3150 CG GLN 1 -23,162 13,354 -44,229 1,00 46,21 L1 C ATOM 3151 CD GLN 1 -23,290 11,970 -44,857 1,00 51,70 L1 C ATOM 3152 OE1 GLN 1 -24,374 11,383 -44,867 1,00 55,34 L1 O ATOM 3153 NE2 GLN 1 -22,185 11,444 -45,384 1,00 50,89 L1 N ATOM 3154 C GLN ₁-22,148 16,113 -43,282 _1,0036,73 L1 C ATOM 3155 O GLN 1 -21,038 15,904 -42,801 1,00 39,33 L1 O ATOM 3156 N SER 2 -23,143 16,660 -42,592 1,00 34,09 L1 N ATOM 3157 CA SER 2 -22,984 17,045 -41,200 1,00 32,26 L1 C ATOM 3158 CB SER 2 -23,663 18,394 -40,951 1,00 33,35 L1 C ATOM 3159 OG SER 2 -22,995 19,426 -41,660 1,00 36,24 L1 O ATOM 3160 C SER 2 -23,579 15,975 -40,290 1,00 31,17 L1 C ATOM 3161 O SER 2 -24,551 15,314 -40,651 1,00 29,93 L1 O ATOM 3162 N VAL 3 -22,990 15,806 -39,111 1,00 29,66 L1 N ATOM 3163 CA VAL 3 -23,345 14,692 -38,242 1,00 27,57 L1 C ATOM 3164 CB VAL 3 -22,173 14,325 -37,304 _1,0026,77 L1 C ATOM 3165 CG1 VAL 3 -22,604 13,235 -36,328 1,00 20,64 L1 C ATOM 3166 CG2 VAL 3 -20,970 13,859 -38,135 1,00 24,71 L1 C ATOM 3167 C VAL 3 -24,573 14,995 -37,403 1,00 28,78 L1 C ATOM 3168 O VAL 3 -25,360 14,102 -37,110 1,00 29,90 L1 O ATOM 3169 N LEU 4 -24,736 16,256 -37,013 1,00 28,16 L1 N ATOM 3170 CA LEU 4 -25,909 _16,661-36,239 _1,0028,07 L1 C ATOM 3171 CB LEU 4 -25,540 17,780 -35,261 1,00 25,10 L1 C ATOM 3172 CG LEU 4 -24,396 17,481 -34,289 1,00 27,51 L1 C ATOM 3173 CD1 LEU 4 -24,060 18,739 -33,483 1,00 27,28 L1 C ATOM 3174 CD2 LEU 4 -24,793 16,341 -33,367 1,00 27,59 L1 C ATOM 3175 C LEU 4 -26,996 17,146 -37,190 1,00 26,91 L1 C ATOM 3176 O LEU 4 -26,701 17,620 -38,282 _1,0025,87 L1 O ATOM 3177 N THR 5 -28,251 17,031 -36,777 1,00 27,45 L1 N ATOM 3178 CA THR 5 -29,365 17,405 -37,650 1,00 29,69 L1 C ATOM 3179 CB THR 5 -30,419 16,281 -37,709 1,00 30,65 L1 C ATOM 3180 OG1 THR 5 -29,813 15,091 -38,227 1,00 32,80 L1 O ATOM 3181 CG2 THR 5 -31,584 _16,682-38,615 _1,0030,25 L1 C ATOM 3182 C THR 5 -30,062 18,693 -37,216 1,00 29,39 L1 C ATOM 3183 O THR 5 -30,597 18,773 -36,113 1,00 28,74 L1 O ATOM 3184 N GLN 6 -30,048 19,696 -38,093 1,00 27,91 L1 N ATOM 3185 CA GLN 6 -30,806 20,929 -37,885 1,00 28,70 L1 C ATOM 3186 CB GLN 6 -29,889 22,159 -37,866 1,00 26,66 L1 C ATOM 3187 CG GLN ₆-28,913 22,258 -36,721 _1,0024,05 L1 C ATOM 3188 CD GLN 6 -28,010 23,468 -36,872 1,00 25,09 L1 C ATOM 3189 OE1 GLN 6 -26,843 23,341 -37,243 1,00 27,47 L1 O ATOM 3190 NE2 GLN 6 -28,548 24,652 -36,597 1,00 22,42 L1 N ATOM 3191 C GLN 6 -31,770 21,109 -39,044 1,00 28,56 L1 C ATOM 3192 O GLN 6 -31,475 20,719 -40,170 1,00 27,37 L1 O ATOM 3193 N PRO 7 -32,921 21,745 -38,789 _1,0030,02 L1 N ATOM 3194 CD PRO 7 -33,416 22,218 -37,483 1,00 30,00 L1 C ATOM 3195 CA PRO 7 -33,756 22,206 -39,904 1,00 29,84 L1 C ATOM 3196 CB PRO 7 -34,944 22,876 -39,215 1,00 30,46 L1 C ATOM 3197 CG PRO 7 -34,421 23,278 -37,859 1,00 31,08 L1 C ATOM 3198 C PRO 7 -32,961 23,186 -40,761 1,00 30,79 L1 C ATOM 3199 O PRO 7 -32,206 24,007 -40,242 _1,0030,95 L1 O ATOM 3200 N PRO 8 -33,113 23,100 -42,087 1,00 29,99 L1 N (continuación)

ATOM 3201 CD PRO 8 -33,901 22,060 -42,767 1,00 29,60 L1 C ATOM 3202 CA PRO 8 -32,380 23,946 -43,036 1,00 30,24 , L1 C ATOM 3203 CB PRO 8 -32,755 23,369 -44,404 1,00 30,10 L1 C ATOM 3204 CG PRO 8 -33,254 21,990 -44,113 1,00 31,61 L1 ATOM 3205 C PRO ₈-32,747 25,428 -42,928 _1,0031,73 L1 ATOM 3206 O PRO 8 -31,943 26,308 -43,258 1,00 31,46 L1 ATOM 3207 N SER 9 -33,960 25,707 -42,467 1,00 30,72 L1 ATOM 3208 CA SER 9 -34,446 27,080 -42,450 1,00 32,53 L1 ATOM 3209 CB SER 9 -35,043 27,456 -43,808 1,00 35,18 L1 ATOM 3210 OG SER 9 -36,252 26,743 -44,038 1,00 39,78 L1 ATOM 3211 C SER 9 -35,494 27,298 -41,382 1,00 32,20 L1 ATOM 3212 O SER 9 -36,151 26,359 -40,933 1,00 32,14 L1 ATOM 3213 N ALA 10 -35,637 28,556 -40,982 1,00 32,09 L1 ATOM 3214 CA ALA 10 -36,668 28,970 -40,049 1,00 30,01 L1 ATOM 3215 CB ALA ₁₀-36,196 28,744 -38,611 _1,0029,34 L1 ATOM 3216 C ALA 10 -36,943 30,453 -40,294 1,00 31,41 L1 ATOM 3217 O ALA 10 -36,162 31,139 -40,958 1,00 31,03 L1 ATOM 3218 N SER 11 -38,058 30,946 -39,770 1,00 30,95 L1 ATOM 3219 CA SER 11 -38,366 32,364 -39,876 1,00 33,18 L1 ATOM 3220 CB SER 11 -39,055 32,667 -41,205 1,00 31,83 L1 ATOM 3221 OG SER ₁₁-40,290 31,985 -41,292 _1,0034,06 L1 ATOM 3222 C SER 11 -39,255 32,810 -38,731 1,00 33,60 L1 ATOM 3223 O SER 11 -40,016 32,023 -38,175 1,00 34,21 L1 ATOM 3224 N GLY 12 -39,143 34,084 -38,379 1,00 33,24 L1 ATOM 3225 CA GLY 12 -39,983 34,638 -37,344 1,00 34,06 L1 ATOM 3226 C GLY 12 -40,221 36,111 -37,594 1,00 34,78 L1 ATOM 3227 O GLY ₁₂-39,510 36,738 -38,377 _1,0035,73 L1 ATOM 3228 N THR 13 -41,224 36,664 -36,926 1,00 35,43 L1 ATOM 3229 CA THR 13 -41,545 38,077 -37,055 1,00 35,76 L1 ATOM 3230 CB THR 13 -43,057 38,299 -36,915 1,00 37,03 L1 ATOM 3231 OG1 THR 13 -43,732 37,621 -37,980 1,00 40,63 L1 ATOM 3232 CG2 THR 13 -43,389 39,781 -36,959 _1,0038,80 L1 ATOM 3233 C THR 13 -40,834 38,834 -35,949 1,00 34,79 L1 ATOM 3234 O THR 13 -40,768 38,358 -34,817 1,00 33,06 L1 ATOM 3235 N PRO 14 -40,295 40,024 -36,261 1,00 33,81 L1 ATOM 3236 CD PRO 14 -40,243 40,682 -37,579 1,00 33,59 L1 ATOM 3237 CA PRO 14 -39,678 40,845 -35,213 1,00 35,17 L1 ATOM 3238 CB PRO 14 -39,510 42,210 -35,881 _1,0035,17 L1 ATOM 3239 CG PRO 14 -39,338 41,880 -37,339 1,00 32,62 L1 ATOM 3240 C PRO 14 -40,562 40,904 -33,970 1,00 37,04 L1 ATOM 3241 O PRO 14 -41,788 40,939 -34,076 1,00 36,13 L1 ATOM 3242 N GLY 15 -39,933 40,880 -32,798 1,00 37,53 L1 ATOM 3243 CA GLY 15 -40,684 40,885 -31,554 1,00 37,21 L1 ATOM 3244 C GLY 15 -41,091 39,514 -31,044 _1,0037,71 L1 ATOM 3245 O GLY 15 -41,394 39,354 -29,864 1,00 39,10 L1 ATOM 3246 N GLN 16 -41,101 38,515 -31,918 1,00 38,28 L1 ATOM 3247 CA GLN 16 -41,542 37,184 -31,514 1,00 39,95 L1 ATOM 3248 CB GLN 16 -42,263 36,488 -32,673 1,00 42,22 L1 ATOM 3249 CG GLN 16 -43,514 37,217 -33,166 1,00 49,57 L1 ATOM 3250 CD GLN ₁₆-44,608 37,318 -32,108 _1,0053,19 L1 ATOM 3251 OE1 GLN 16 -45,367 36,371 -31,889 1,00 55,70 L1 O ATOM 3252 NE2 GLN 16 -44,693 38,472 -31,449 1,00 53,13 L1 N (continuación)

ATOM 3253 C GLN 16 -40,393 36,301 -31,017 1,00 39,30 L1 C ATOM 3254 O GLN 16 -39,232 36,715 -30,998 1,00 36,61 L1 O ATOM 3255 N ARG 17 -40,743 35,085 -30,608 1,00 39,04 L1 N ATOM 3256 CA ARG 17 -39,782 34,093 -30,142 _1,0040,32 L1 C ATOM 3257 CB ARG 17 -40,225 33,551 -28,779 1,00 40,01 L1 C ATOM 3258 CG ARG 17 -39,384 32,406 -28,239 1,00 43,34 L1 C ATOM 3259 CD ARG 17 -39,923 31,930 -26,898 1,00 41,71 L1 C ATOM 3260 NE ARG 17 -39,086 30,906 -26,277 1,00 43,61 L1 N ATOM 3261 CZ ARG 17 -39,155 29,610 -26,565 1,00 43,68 L1 C ATOM 3262 NH1 ARG 17 -40,019 29,178 -27,471 1,00 44,38 L1 N ATOM 3263 NH2 ARG 17 -38,376 28,740 -25,933 1,00 43,92 L1 N ATOM 3264 C ARG 17 -39,697 32,949 -31,148 1,00 39,25 L1 C ATOM 3265 O ARG 17 -40,722 32,397 -31,548 1,00 40,22 L1 O ATOM 3266 N VAL ₁₈-38,480 32,601 -31,562 _1,0038,21 L1 N ATOM 3267 CA VAL 18 -38,269 31,428 -32,410 1,00 36,63 L1 C ATOM 3268 CB VAL 18 -37,688 31,814 -33,790 1,00 37,42 L1 C ATOM 3269 CG1 VAL 18 -38,642 32,740 -34,510 1,00 37,93 L1 C ATOM 3270 CG2 VAL 18 -36,331 32,479 -33,624 1,00 37,49 L1 C ATOM 3271 C VAL 18 -37,320 30,430 -31,755 1,00 36,06 L1 C ATOM 3272 O VAL ₁₈-36,493 30,800 -30,918 _1,0037,18 L1 O ATOM 3273 N THR 19 -37,447 29,161 -32,127 1,00 34,19 L1 N ATOM 3274 CA THR 19 -36,532 28,148 -31,635 1,00 33,85 L1 C ATOM 3275 CB THR 19 -37,231 27,152 -30,699 1,00 34,73 L1 C ATOM 3276 OG1 THR 19 -38,256 26,459 -31,422 1,00 36,14 L1 O ATOM 3277 CG2 THR 19 -37,839 27,875 -29,510 1,00 36,05 L1 C ATOM 3278 C THR 19 -35,932 27,367 -32,788 _1,0033,77 L1 C ATOM 3279 O THR 19 -36,581 27,136 -33,804 1,00 34,31 L1 O ATOM 3280 N ILE 20 -34,680 26,964 -32,627 1,00 32,67 L1 N ATOM 3281 CA ILE 20 -34,013 26,136 -33,619 1,00 30,93 L1 C ATOM 3282 CB ILE 20 -32,856 26,902 -34,267 1,00 30,89 L1 C ATOM 3283 CG2 ILE ₂₀-32,090 25,991 -35,202 _1,0032,28 L1 C ATOM 3284 CG1 ILE 20 -33,410 28,121 -35,010 1,00 31,02 L1 C ATOM 3285 CD1 ILE 20 -32,348 29,096 -35,461 1,00 29,96 L1 C ATOM 3286 C ILE 20 -33,479 24,902 -32,912 1,00 29,12 L1 C ATOM 3287 O ILE 20 -32,825 25,007 -31,877 1,00 27,11 L1 O ATOM 3288 N SER 21 -33,772 23,731 -33,460 1,00 28,13 L1 N ATOM 3289 CA SER ₂₁-33,418 22,493 -32,791 _1,0027,04 L1 C ATOM 3290 CB SER 21 -34,577 21,503 -32,857 1,00 28,51 L1 C ATOM 3291 OG SER 21 -34,646 20,916 -34,144 1,00 36,31 L1 O ATOM 3292 C SER 21 -32,183 21,856 -33,404 1,00 27,38 L1 C ATOM 3293 O SER 21 -31,850 22,087 -34,576 1,00 26,13 L1 O ATOM 3294 N CYS 22 -31,514 21,040 -32,599 1,00 26,91 L1 N ATOM 3295 CA CYS ₂₂-30,300 20,349 -33,012 _1,0028,14 L1 C ATOM 3296 C CYS 22 -30,378 18,953 -32,407 1,00 27,39 L1 C ATOM 3297 O CYS 22 -30,482 18,805 -31,191 1,00 26,72 L1 O ATOM 3298 CB CYS 22 -29,078 21,109 -32,470 1,00 28,78 L1 C ATOM 3299 SG CYS 22 -27,428 20,365 -32,716 1,00 33,98 L1 S ATOM 3300 N SER 23 -30,349 17,926 -33,246 1,00 26,59 L1 N ATOM 3301 CA SER 23 -30,434 16,574 -32,722 _1,0029,26 L1 C ATOM 3302 CB SER 23 -31,691 15,875 -33,244 1,00 30,37 L1 C ATOM 3303 OG SER 23 -31,715 15,896 -34,653 1,00 40,04 L1 O ATOM 3304 C SER 23 -29,202 15,750 -33,053 1,00 27,58 L1 C (continuación)

ATOM 3305 O SER 23 -28,689 15,783 -34,171 1,00 25,14 L1 O ATOM 3306 N GLY 24 -28,734 15,017 -32,049 1,00 27,83 L1 N ATOM 3307 CA GLY 24 -27,548 14,204 -32,195 _1,0028,19 L1 C ATOM 3308 C GLY 24 -27,832 12,832 -31,632 1,00 29,00 L1 C ATOM 3309 O GLY 24 -28,902 12,268 -31,867 1,00 29,40 L1 O ATOM 3310 N SER 25 -26,886 12,291 -30,878 1,00 26,84 L1 N ATOM 3311 CA SER 25 -27,045 10,942 -30,372 1,00 27,01 L1 C ATOM 3312 CB SER 25 -26,747 9,938 -31,478 1,00 26,36 L1 C ATOM 3313 OG SER 25 -25,400 10,061 -31,879 1,00 26,75 L1 O ATOM 3314 C SER 25 -26,113 10,705 -29,209 1,00 26,30 L1 C ATOM 3315 O SER 25 -25,447 11,629 -28,746 1,00 27,16 L1 O ATOM 3316 N SER 26 -26,066 9,462 -28,742 1,00 25,37 L1 N ATOM 3317 CA SER ₂₆-25,345 9,137 -27,522 _1,0025,52 L1 C ATOM 3318 CB SER 26 -25,588 7,678 -27,143 1,00 26,57 L1 C ATOM 3319 OG SER 26 -25,038 6,804 -28,119 1,00 32,72 L1 O ATOM 3320 C SER 26 -23,847 9,390 -27,673 1,00 25,31 L1 C ATOM 3321 O SER 26 -23,153 9,613 -26,688 1,00 26,31 L1 O ATOM 3322 N SER 27 -23,347 9,362 -28,904 1,00 25,12 L1 N ATOM 3323 CA SER 27 -21,916 9,549 -29,129 _1,0023,38 L1 C ATOM 3324 CB SER 27 -21,495 8,948 -30,472 1,00 22,37 L1 C ATOM 3325 OG SER 27 -21,943 9,746 -31,551 1,00 24,28 L1 O ATOM 3326 C SER 27 -21,521 11,023 -29,085 1,00 24,26 L1 C ATOM 3327 O SER 27 -20,342 11,342 -28,959 1,00 23,93 L1 O ATOM 3328 N ASN 28 -22,497 11,926 -29,195 1,00 23,53 L1 N ATOM 3329 CA ASN ₂₈-22,197 13,345 -29,020 _1,0023,52 L1 C ATOM 3330 CB ASN 28 -22,302 14,111 -30,361 1,00 21,17 L1 C ATOM 3331 CG ASN 28 -23,467 13,656 -31,228 1,00 23,34 L1 C ATOM 3332 OD1 ASN 28 -24,629 13,895 -30,908 1,00 23,92 L1 O ATOM 3333 ND2 ASN 28 -23,154 13,009 -32,345 1,00 21,27 L1 N ATOM 3334 C ASN ₂₈-23,028 14,033 -27,937 _1,0023,95 L1 C ATOM 3335 O ASN 28 -22,578 14,156 -26,799 1,00 25,36 L1 O ATOM 3336 N ILE 29 -24,230 14,486 -28,267 1,00 24,55 L1 N ATOM 3337 CA ILE 29 -24,995 15,263 -27,300 1,00 24,06 L1 C ATOM 3338 CB ILE 29 -26,300 15,799 -27,929 1,00 26,12 L1 C ATOM 3339 CG2 ILE 29 -27,128 16,554 -26,883 1,00 21,66 L1 C ATOM 3340 CG1 ILE 29 -25,951 16,716 -29,103 _{1,00 21,86}L1 C ATOM 3341 CD1 ILE 29 -27,146 17,356 -29,766 1,00 26,70 L1 C ATOM 3342 C ILE 29 -25,313 14,456 -26,040 1,00 25,43 L1 C ATOM 3343 O ILE 29 -25,448 15,021 -24,956 1,00 24,34 L1 O ATOM 3344 N GLY 30 -25,401 13,134 -26,170 1,00 25,71 L1 N ATOM 3345 CA GLY 30 -25,640 12,301 -25,000 1,00 25,17 L1 C ATOM 3346 C GLY 30 -24,619 12,467 -23,875 _1,0028,74 L1 C ATOM 3347 O GLY 30 -24,952 12,284 -22,702 1,00 28,98 L1 O ATOM 3348 N SER 31 -23,376 12,806 -24,217 1,00 26,07 L1 N ATOM 3349 CA SER 31 -22,342 13,023 -23,207 1,00 25,52 L1 C ATOM 3350 CB SER 31 -21,104 12,176 -23,511 1,00 25,93 L1 C ATOM 3351 OG SER 31 -21,357 10,799 -23,314 1,00 27,84 L1 O ATOM 3352 C SER 31 -21,905 14,484 -23,092 _1,0026,39 L1 C ATOM 3353 O SER 31 -21,490 14,925 -22,022 1,00 25,97 L1 O ATOM 3354 N ASN 32 -21,991 15,227 -24,192 1,00 25,12 , L1 N ATOM 3355 CA ASN 32 -21,240 16,471 -24,316 1,00 25,92 L1 C ATOM 3356 CB ASN 32 -20,279 16,342 -25,494 1,00 22,78 L1 C (continuación)

ATOM 3357 CG ASN 32 -19,380 15,133 -25,362 1,00 25,36 L1 C ATOM 3358 OD1 ASN 32 -18,840 14,864 -24,284 _1,0024,71 L1 O ATOM 3359 ND2 ASN 32 -19,220 14,387 -26,451 1,00 23,92 L1 N ATOM 3360 C ASN 32 -22,087 17,742 -24,445 1,00 26,14 L1 C ATOM 3361 O ASN 32 -23,258 17,697 -24,833 1,00 26,61 L1 O ATOM 3362 N THR 33 -21,477 18,873 -24,106 1,00 25,64 L1 N ATOM 3363 CA THR 33 -22,153 20,167 -24,125 1,00 25,44 L1 C ATOM 3364 CB THR 33 -21,272 21,272 -23,484 1,00 26,18 L1 C ATOM 3365 OG1 THR 33 -20,054 21,407 -24,231 1,00 27,99 L1 O ATOM 3366 CG2 THR 33 -20,937 20,925 -22,040 1,00 25,80 L1 C ATOM 3367 C THR 33 -22,478 20,589 -25,553 1,00 24,65 L1 C ATOM 3368 O THR 33 -21,778 _20,220-26,492 _1,0023,55 L1 O ATOM 3369 N VAL 34 -23,542 21,367 -25,713 1,00 22,97 L1 N ATOM 3370 CA VAL 34 -23,901 21,889 -27,024 1,00 20,22 L1 C ATOM 3371 CB VAL 34 -25,422 21,766 -27,273 1,00 20,79 L1 C ATOM 3372 CG1 VAL 34 -25,765 22,309 -28,640 1,00 17,13 L1 C ATOM 3373 CG2 VAL 34 -25,849 20,303 -27,162 1,00 18,86 L1 C ATOM 3374 C VAL 34 -23,497 23,349 -27,126 _1,0020,72 L1 C ATOM 3375 O VAL 34 -23,588 24,092 -26,153 1,00 20,35 L1 O ATOM 3376 N ASN 35 -23,062 23,760 -28,311 1,00 21,11 L1 N ATOM 3377 CA ASN 35 -22,553 25,104 -28,515 1,00 20,37 L1 C ATOM 3378 CB ASN 35 -21,028 25,068 -28,673 1,00 20,30 L1 C ATOM 3379 CG ASN 35 -20,345 24,360 -27,513 1,00 20,02 L1 C ATOM 3380 OD1 ASN 35 -20,061 24,968 -26,477 1,00 20,69 L1 O ATOM 3381 ND2 ASN 35 -20,092 23,069 -27,675 1,00 18,74 L1 N ATOM 3382 C ASN 35 -23,190 25,664 -29,765 1,00 23,63 L1 C ATOM 3383 O ASN 35 -23,363 24,943 -30,750 1,00 25,23 L1 O ATOM 3384 N TRP 36 -23,535 26,950 -29,728 1,00 24,33 L1 N ATOM 3385 CA TRP 36 -24,249 27,581 -30,828 _1,0023,53 L1 C ATOM 3386 CB TRP 36 -25,637 28,023 -30,361 1,00 24,65 L1 C ATOM 3387 CG TRP 36 -26,565 26,884 -30,058 1,00 23,30 L1 C ATOM 3388 CD2 TRP 36 -27,466 26,254 -30,973 1,00 21,45 L1 C ATOM 3389 CE2 TRP 36 -28,163 25,261 -30,257 1,00 22,89 L1 C ATOM 3390 CE3 TRP 36 -27,754 26,436 -32,330 1,00 24,38 L1 C ATOM 3391 CD1 TRP 36 -26,744 26,264 -28,853 _1,0022,85 L1 C ATOM 3392 NE1 TRP 36 -27,706 25,284 -28,965 1,00 22,07 L1 N ATOM 3393 CZ2 TRP 36 -29,131 24,452 -30,853 1,00 23,37 L1 C ATOM 3394 CZ3 TRP 36 -28,718 25,630 -32,920 1,00 24,94 L1 C ATOM 3395 CH2 TRP 36 -29,393 24,652 -32,181 1,00 23,94 L1 C ATOM 3396 C TRP 36 -23,492 28,783 -31,393 1,00 24,76 L1 C ATOM 3397 O TRP 36 -22,862 29,539 -30,651 1,00 24,29 L1 O ATOM 3398 N TYR 37 -23,580 28,950 -32,710 1,00 23,23 L1 N ATOM 3399 CA TYR 37 -22,890 30,017 -33,419 1,00 25,41 L1 C ATOM 3400 CB TYR 37 -21,710 29,444 -34,223 1,00 23,97 L1 C ATOM 3401 CG TYR 37 -20,751 28,674 -33,348 1,00 24,70 L1 C ATOM 3402 CD1 TYR 37 -21,020 27,357 -32,993 1,00 23,14 L1 C ATOM 3403 CE1 TYR 37 -20,220 26,679 -32,095 1,00 24,44 L1 C ATOM 3404 CD2 TYR 37 -19,639 29,291 -32,789 1,00 21,55 L1 C ATOM 3405 CE2 TYR 37 -18,826 28,618 -31,887 1,00 23,33 L1 C ATOM 3406 CZ TYR 37 -19,127 27,312 -31,541 1,00 23,69 L1 C ATOM 3407 OH TYR 37 -18,359 26,638 -30,618 1,00 20,32 L1 O ATOM 3408 C TYR 37 -23,845 30,737 -34,360 1,00 26,66 L1 C (continuación)

ATOM 3409 O TYR 37 -24,741 30,131 -34,946 _1,0027,88 L1 O ATOM 3410 N GLN 38 -23,640 32,040 -34,492 1,00 26,80 L1 N ATOM 3411 CA GLN 38 -24,395 32,858 -35,423 1,00 28,14 L1 C ATOM 3412 CB GLN 38 -24,986 34,053 -34,674 1,00 29,55 L1 C ATOM 3413 CG GLN 38 -25,560 35,128 -35,559 1,00 29,51 L1 C ATOM 3414 CD GLN 38 -25,992 36,335 -34,764 1,00 32,32 L1 C ATOM 3415 OE1 GLN 38 -25,167 37,159 -34,364 1,00 32,45 L1 O ATOM 3416 NE2 GLN 38 -27,292 36,449 -34,526 1,00 31,43 L1 N ATOM 3417 C GLN 38 -23,428 33,339 -36,497 1,00 27,48 L1 C ATOM 3418 O GLN 38 -22,313 33,746 -36,181 1,00 27,04 L1 O ATOM 3419 N GLN 39 -23,839 33,284 -37,760 _1,0027,49 L1 N ATOM 3420 CA GLN 39 -22,977 33,751 -38,838 1,00 28,01 L1 C ATOM 3421 CB GLN 39 -22,396 32,569 -39,630 1,00 28,56 L1 C ATOM 3422 CG GLN 39 -21,371 33,003 -40,684 1,00 25,91 L1 C ATOM 3423 CD GLN 39 -20,727 31,842 -41,412 1,00 26,00 L1 C ATOM 3424 OE1 GLN 39 -21,345 30,791 -41,602 1,00 25,62 L1 O ATOM 3425 NE2 GLN 39 -19,476 32,028 -41,832 _{1,00 22,22}L1 N ATOM 3426 C GLN 39 -23,697 34,682 -39,800 1,00 29,88 L1 C ATOM 3427 O GLN 39 -24,718 34,318 -40,387 1,00 28,22 L1 O ATOM 3428 N LEU 40 -23,143 35,881 -39,957 1,00 32,04 L1 N ATOM 3429 CA LEU 40 -23,601 36,838 -40,957 1,00 34,34 L1 C ATOM 3430 CB LEU 40 -23,473 38,267 -40,418 1,00 33,92 , L1 C ATOM 3431 CG LEU 40 -24,221 38,579 -39,117 _1,0037,04 L1 C ATOM 3432 CD1 LEU 40 -23,977 40,031 -38,729 1,00 38,63 L1 C ATOM 3433 CD2 LEU 40 -25,711 38,328 -39,297 1,00 37,35 L1 C ATOM 3434 C LEU 40 -22,765 36,686 -42,226 1,00 36,40 L1 C ATOM 3435 O LEU 40 -21,658 36,142 -42,194 1,00 35,68 L1 O ATOM 3436 N PRO 41 -23,285 37,167 -43,366 _1,0038,85 L1 N ATOM 3437 CD PRO 41 -24,597 37,818 -43,534 1,00 38,64 L1 C ATOM 3438 CA PRO 41 -22,597 36,981 -44,651 1,00 38,77 L1 C ATOM 3439 CB PRO 41 -23,531 37,655 -45,659 1,00 40,02 L1 C ATOM 3440 CG PRO 41 -24,884 37,619 -45,000 1,00 38,99 L1 C ATOM 3441 C PRO 41 -21,197 37,590 -44,668 1,00 38,74 L1 C ATOM 3442 O PRO 41 -20,978 38,690 -44,162 _1,0038,74 L1 O ATOM 3443 N GLY 42 -20,248 36,856 -45,236 1,00 38,68 L1 N ATOM 3444 CA GLY 42 -18,901 37,375 -45,382 1,00 40,14 L1 C ATOM 3445 C GLY 42 -18,135 37,520 -44,080 1,00 40,18 L1 C ATOM 3446 O GLY 42 -17,077 38,147 -44,042 1,00 41,17 L1 O ATOM 3447 N THR 43 -18,655 36,941 -43,007 1,00 37,47 L1 N ATOM 3448 CA THR 43 -17,972 37,040 -41,732 _1,0036,70 L1 C ATOM 3449 CB THR 43 -18,660 38,090 -40,841 1,00 38,93 L1 C ATOM 3450 OG1 THR 43 -17,927 38,239 -39,619 1,00 44,97 L1 O ATOM 3451 CG2 THR 43 -20,073 37,673 -40,529 1,00 40,28 L1 C ATOM 3452 C THR 43 -17,898 35,692 -41,007 1,00 33,58 L1 C ATOM 3453 O THR 43 -18,693 34,787 -41,268 1,00 32,26 L1 O ATOM 3454 N ALA 44 -16,924 35,556 -40,114 _1,0029,37 L1 N ATOM 3455 CA ALA 44 -16,748 34,320 -39,368 1,00 29,17 L1 C ATOM 3456 CB ALA 44 -15,469 34,376 -38,542 1,00 24,98 L1 C ATOM 3457 C ALA 44 -17,944 34,104 -38,453 1,00 28,88 L1 C ATOM 3458 O ALA 44 -18,588 35,057 -38,022 1,00 28,39 L1 O ATOM 3459 N PRO 45 -18,249 32,839 -38,139 1,00 28,41 L1 N ATOM 3460 CD PRO 45 -17,620 31,619 -38,670 _1,0026,65 L1 C (continuación)

ATOM 3461 CA PRO 45 -19,282 32,538 -37,143 1,00 27,06 L1 C ATOM 3462 CB PRO 45 -19,254 31,013 -37,036 1,00 25,83 L1 C ATOM 3463 CG PRO 45 -18,623 30,552 -38,310 1,00 27,18 L1 C ATOM 3464 C PRO 45 -18,922 33,199 -35,818 1,00 28,11 L1 C ATOM 3465 O PRO 45 -17,745 33,412 -35,520 1,00 29,04 L1 O ATOM 3466 N LYS 46 -19,934 33,527 -35,029 1,00 27,77 L1 N ATOM 3467 CA LYS 46 -19,718 34,126 -33,720 1,00 29,30 L1 C ATOM 3468 CB LYS 46 -20,324 35,529 -33,693 1,00 30,36 L1 C ATOM 3469 CG LYS 46 -20,595 36,080 -32,309 1,00 35,69 L1 C ATOM 3470 CD LYS 46 -21,447 37,342 -32,398 _1,0038,46 L1 C ATOM 3471 CE LYS 46 -21,611 38,008 -31,040 1,00 41,17 L1 C ATOM 3472 NZ LYS 46 -22,445 39,245 -31,131 1,00 43,66 L1 N ATOM 3473 C LYS 46 -20,366 33,249 -32,654 1,00 27,70 L1 C ATOM 3474 O LYS 46 -21,527 32,869 -32,784 1,00 28,72 L1 O ATOM 3475 N LEU 47 -19,611 32,927 -31,609 1,00 25,77 L1 N ATOM 3476 CA LEU 47 _-20,10832,072 -30,530 _{1,00 26,00}L1 C ATOM 3477 CB LEU 47 -18,971 31,738 -29,556 1,00 22,43 L1 C ATOM 3478 CG LEU 47 -19,368 30,964 -28,294 1,00 24,81 L1 C ATOM 3479 CD1 LEU 47 -19,762 29,550 -28,680 1,00 20,56 L1 C ATOM 3480 CD2 LEU 47 -18,207 30,937 -27,298 1,00 22,63 L1 C ATOM 3481 C LEU 47 -21,233 32,770 -29,772 1,00 26,08 L1 C ATOM 3482 O LEU 47 -21,056 33,895 -29,312 _1,0025,15 L1 O ATOM 3483 N LEU 48 -22,376 32,097 -29,642 1,00 26,83 L1 N ATOM 3484 CA LEU 48 -23,540 32,643 -28,934 1,00 28,45 L1 C ATOM 3485 CB LEU 48 -24,814 32,464 -29,763 1,00 30,33 L1 C ATOM 3486 CG LEU 48 -25,021 33,275 -31,042 1,00 35,48 L1 C ATOM 3487 CD1 LEU 48 -26,383 32,926 -31,613 _1,0035,81 L1 C ATOM 3488 CD2 LEU 48 -24,938 34,774 -30,756 1,00 34,18 L1 C ATOM 3489 C LEU 48 -23,757 31,955 -27,589 1,00 27,72 L1 C ATOM 3490 O LEU 48 -24,070 32,598 -26,588 1,00 27,24 L1 O ATOM 3491 N ILE 49 -23,608 30,636 -27,590 1,00 27,22 L1 N ATOM 3492 CA ILE 49 -23,903 29,810 -26,428 1,00 23,99 L1 C ATOM 3493 CB ILE 49 -25,270 29,109 -26,590 _1,0023,11 L1 C ATOM 3494 CG2 ILE 49 -25,514 28,171 -25,427 1,00 23,24 L1 C ATOM 3495 CG1 ILE 49 -26,387 30,153 -26,717 1,00 25,09 L1 C ATOM 3496 CD1 ILE 49 -26,846 30,741 -25,395 1,00 26,07 L1 C ATOM 3497 C ILE 49 -22,830 28,738 -26,293 1,00 24,62 L1 C ATOM 3498 O ILE 49 -22,472 28,077 -27,272 1,00 25,83 L1 O ATOM 3499 N TYR 50 -22,314 28,558 -25,085 _1,0025,53 L1 N ATOM 3500 CA TYR 50 -21,466 27,403 -24,811 1,00 26,67 L1 C ATOM 3501 CB TYR 50 -20,003 27,833 -24,628 1,00 25,70 L1 C ATOM 3502 CG TYR 50 -19,748 28,688 -23,408 1,00 26,62 L1 C ATOM 3503 CD1 TYR 50 -19,874 30,068 -23,466 1,00 26,79 L1 C ATOM 3504 CE1 TYR 50 -19,645 30,858 -22,343 1,00 28,90 L1 C ATOM 3505 CD2 TYR 50 -19,383 _28,110-22,196 _1,0026,72 L1 C ATOM 3506 CE2 TYR 50 -19,153 28,882 -21,071 1,00 28,12 L1 C ATOM 3507 CZ TYR 50 -19,288 30,258 -21,148 1,00 30,76 L1 C ATOM 3508 OH TYR 50 -19,085 31,030 -20,026 1,00 29,96 L1 O ATOM 3509 C TYR 50 -21,976 26,697 -23,563 1,00 25,84 L1 C ATOM 3510 O TYR 50 -22,784 27,251 -22,821 1,00 24,72 L1 O ATOM 3511 N SER 51 -21,518 25,470 -23,343 _1,0026,19 L1 N ATOM 3512 CA SER 51 -21,971 24,688 -22,198 1,00 26,90 L1 C (continuación)

ATOM 3513 CB SER 51 -21,436 25,284 -20,896 1,00 27,94 L1 C ATOM 3514 OG SER 51 -20,133 24,813 -20,626 1,00 31,95 L1 O ATOM 3515 C SER 51 -23,494 24,628 -22,129 1,00 24,91 L1 C ATOM 3516 O SER 51 -24,080 24,808 -21,060 1,00 22,95 L1 O ATOM 3517 N ASN 52 -24,122 24,384 -23,275 1,00 24,45 L1 N ATOM 3518 CA ASN 52 -25,571 24,212 -23,351 1,00 25,66 L1 C ATOM 3519 CB ASN 52 -26,051 23,237 -22,270 1,00 24,57 L1 C ATOM 3520 CG ASN 52 -25,501 21,835 -22,463 1,00 25,41 L1 C ATOM 3521 OD1 ASN 52 -25,299 21,383 -23,589 _1,0026,77 L1 O ATOM 3522 ND2 ASN 52 -25,251 21,143 -21,361 1,00 25,99 L1 N ATOM 3523 C ASN 52 -26,350 25,520 -23,224 1,00 24,22 L1 C ATOM 3524 O ASN 52 -27,273 25,767 -23,999 1,00 24,09 L1 O ATOM 3525 N ASN 53 -25,982 26,351 -22,251 1,00 25,54 L1 N ATOM 3526 CA ASN 53 -26,821 27,482 -21,875 1,00 27,46 L1 C ATOM 3527 CB ASN 53 -27,830 27,038 -20,811 1,00 27,71 L1 C ATOM 3528 CG ASN 53 -27,154 26,453 -19,570 1,00 33,27 L1 C ATOM 3529 OD1 ASN 53 -26,023 26,819 -19,226 1,00 32,11 L1 O ATOM 3530 ND2 ASN 53 -27,846 25,537 -18,894 1,00 32,47 L1 N ATOM 3531 C ASN 53 -26,064 28,712 -21,374 1,00 28,20 L1 C ATOM 3532 O ASN 53 -26,664 29,601 -20,766 1,00 26,89 L1 O ATOM 3533 N GLN 54 -24,758 28,772 -21,625 _1,0027,94 L1 N ATOM 3534 CA GLN 54 -23,949 29,907 -21,182 1,00 26,56 L1 C ATOM 3535 CB GLN 54 -22,620 29,410 -20,599 1,00 27,00 L1 C ATOM 3536 CG GLN 54 -22,772 28,528 -19,362 1,00 26,24 L1 C ATOM 3537 CD GLN 54 -23,496 29,231 -18,222 1,00 29,64 L1 C ATOM 3538 OE1 GLN 54 -22,973 30,174 -17,630 _1,0028,40 L1 O ATOM 3539 NE2 GLN 54 -24,708 28,774 -17,914 1,00 26,55 L1 N ATOM 3540 C GLN 54 -23,670 30,923 -22,294 1,00 28,39 L1 C ATOM 3541 O GLN 54 -23,343 30,557 -23,424 1,00 27,97 L1 O ATOM 3542 N ARG 55 -23,797 32,205 -21,971 1,00 27,97 L1 N ATOM 3543 CA ARG 55 -23,526 33,247 -22,952 1,00 31,26 L1 C ATOM 3544 CB ARG 55 -24,612 34,327 -22,897 _1,0031,77 L1 C ATOM 3545 CG ARG 55 -25,921 33,916 -23,551 1,00 35,02 L1 C ATOM 3546 CD ARG 55 -27,002 34,966 -23,340 1,00 37,92 L1 C ATOM 3547 NE ARG 55 -27,466 34,997 -21,956 1,00 40,09 L1 N ATOM 3548 CZ ARG 55 -27,186 35,969 -21,093 1,00 42,88 L1 C ATOM 3549 NH1 ARG 55 -26,442 37,003 -21,471 1,00 42,75 L1 N ATOM 3550 NH2 ARG 55 -27,642 35,900 -19,845 _1,0042,31 L1 N ATOM 3551 C ARG 55 -22,160 33,892 -22,755 1,00 31,34 L1 C ATOM 3552 O ARG 55 -21,785 34,257 -21,647 1,00 30,63 L1 O ATOM 3553 N PRO 56 -21,396 34,041 -23,842 1,00 32,93 L1 N ATOM 3554 CD PRO 56 -21,569 33,417 -25,162 1,00 30,73 L1 C ATOM 3555 CA PRO 56 -20,205 34,891 -23,787 1,00 33,81 L1 C ATOM 3556 CB PRO 56 -19,605 34,772 -25,188 _1,0033,09 L1 C ATOM 3557 CG PRO 56 -20,196 33,528 -25,754 1,00 33,61 L1 C ATOM 3558 C PRO 56 -20,632 36,322 -23,485 1,00 36,31 L1 C ATOM 3559 O PRO 56 -21,763 36,721 -23,787 1,00 36,25 L1 O ATOM 3560 N SER 57 -19,731 37,084 -22,881 1,00 37,50 L1 N ATOM 3561 CA SER 57 -19,946 38,507 -22,683 1,00 41,08 L1 C ATOM 3562 CB SER 57 -18,687 39,139 -22,080 1,00 42,30 L1 C ATOM 3563 OG SER 57 -18,841 40,537 -21,919 1,00 48,81 L1 O ATOM 3564 C SER 57 -20,259 39,151 -24,033 1,00 42,62 L1 C (continuación)

ATOM 3565 O SER 57 -19,583 38,883 -25,028 1,00 41,85 L1 O ATOM 3566 N GLY 58 -21,290 39,990 -24,068 1,00 43,59 L1 N ATOM 3567 CA GLY 58 -21,639 40,665 -25,308 1,00 44,33 L1 C ATOM 3568 C GLY 58 -22,635 39,902 -26,160 1,00 44,22 L1 C ATOM 3569 O GLY 58 -22,762 40,154 -27,362 1,00 46,95 L1 O ATOM 3570 N VAL 59 -23,329 38,949 -25,545 1,00 41,84 L1 N ATOM 3571 CA VAL 59 -24,456 38,284 -26,187 1,00 38,40 L1 C ATOM 3572 CB VAL 59 -24,213 36,759 -26,312 _1,0037,83 L1 C ATOM 3573 CG1 VAL 59 -25,456 36,073 -26,854 1,00 35,01 L1 C ATOM 3574 CG2 VAL 59 -23,019 36,494 -27,223 1,00 34,54 L1 C ATOM 3575 C VAL 59 -25,710 38,523 -25,353 1,00 37,89 L1 C ATOM 3576 O VAL 59 -25,750 38,195 -24,172 1,00 36,97 L1 O ATOM 3577 N PRO 60 -26,753 39,099 -25,967 1,00 38,59 L1 N ATOM 3578 CD PRO ₆₀-26,783 39,481 -27,387 _1,0038,95 L1 C ATOM 3579 CA PRO 60 -28,000 39,460 -25,281 1,00 39,12 L1 C ATOM 3580 CB PRO 60 -28,852 40,083 -26,384 1,00 38,57 L1 C ATOM 3581 CG PRO 60 -27,881 40,495 -27,428 1,00 40,32 L1 C ATOM 3582 C PRO 60 -28,694 38,251 -24,657 1,00 39,92 , L1 C ATOM 3583 O PRO 60 -28,709 37,162 -25,238 1,00 40,29 L1 O ATOM 3584 N ASP ₆₁-29,281 38,449 -23,482 _1,0038,79 L1 N ATOM 3585 CA ASP 61 -29,944 37,362 -22,780 1,00 39,81 L1 C ATOM 3586 CB ASP 61 -30,266 37,774 -21,339 1,00 46,00 L1 C ATOM 3587 CG ASP 61 -31,094 39,054 -21,258 1,00 50,76 L1 C ATOM 3588 OD1 ASP 61 -31,389 39,489 -20,123 1,00 53,85 L1 O ATOM 3589 OD2 ASP ₆₁-31,446 39,624 -22,317 _1,0052,25 L1 O ATOM 3590 C ASP 61 -31,213 36,868 -23,467 1,00 37,81 L1 C ATOM 3591 O ASP 61 -31,837 35,917 -23,004 1,00 39,35 L1 O ATOM 3592 N ARG 62 -31,601 37,495 -24,571 1,00 36,57 L1 N ATOM 3593 CA ARG 62 -32,735 36,985 -25,332 1,00 35,73 L1 C ATOM 3594 CB ARG 62 -33,302 38,073 -26,248 1,00 36,98 L1 C ATOM 3595 CG ARG ₆₂-32,312 38,621 -27,243 _1,0040,00 L1 C ATOM 3596 CD ARG 62 -32,835 39,889 -27,898 1,00 40,98 L1 C ATOM 3597 NE ARG 62 -31,860 40,430 -28,836 1,00 38,44 L1 N ATOM 3598 CZ ARG 62 -31,799 40,077 -30,111 1,00 36,96 L1 C ATOM 3599 NH1 ARG 62 -32,664 39,193 -30,580 1,00 37,84 L1 N ATOM 3600 NH2 ARG 62 -30,870 40,589 -30,905 1,00 36,03 L1 N ATOM 3601 C ARG ₆₂-32,342 35,752 -26,153 _1,0034,56 L1 C ATOM 3602 O ARG 62 -33,199 35,055 -26,687 1,00 32,53 L1 O ATOM 3603 N PHE 63 -31,041 35,489 -26,248 1,00 34,16 L1 N ATOM 3604 CA PHE 63 -30,561 34,192 -26,738 1,00 33,82 L1 C ATOM 3605 CB PHE 63 -29,210 34,345 -27,436 1,00 31,07 L1 C ATOM 3606 CG PHE 63 -29,272 35,142 -28,706 1,00 31,60 L1 C ATOM 3607 CD1 PHE 63 -29,616 34,535 -29,903 _1,0030,71 L1 C ATOM 3608 CD2 PHE 63 -28,977 36,496 -28,703 1,00 31,31 L1 C ATOM 3609 CE1 PHE 63 -29,664 35,262 -31,074 1,00 32,32 L1 C ATOM 3610 CE2 PHE 63 -29,023 37,231 -29,875 1,00 33,14 L1 C ATOM 3611 CZ PHE 63 -29,367 36,612 -31,062 1,00 33,35 L1 C ATOM 3612 C PHE 63 -30,404 33,236 -25,564 1,00 33,18 L1 C ATOM 3613 O PHE 63 -29,770 33,576 -24,568 _1,0034,53 L1 O ATOM 3614 N SER 64 -30,982 32,046 -25,676 1,00 31,90 L1 N ATOM 3615 CA SER 64 -30,829 31,042 -24,633 1,00 31,99 L1 C ATOM 3616 CB SER 64 -31,984 31,139 -23,627 1,00 33,55 L1 C (continuación)

3617 OG SER 64 -33,196 30,648 -24,176 1,00 34,69 3618 C SER 64 -30,777 29,638 -25,226 1,00 30,65 3619 O SER 64 -31,400 29,360 -26,247 1,00 32,44 3620 N GLY 65 -30,029 28,750 -24,581 1,00 30,08 3621 CA GLY 65 -29,917 27,396 -25,086 1,00 28,03 3622 C GLY 65 -30,418 26,371 -24,097 1,00 28,41 3623 O GLY 65 -30,419 26,609 -22,893 _1,0028,15 3624 N SER 66 -30,854 25,223 -24,603 1,00 29,78 3625 CA SER 66 -31,205 24,113 -23,730 1,00 29,50 3626 CB SER 66 -32,708 24,111 -23,439 1,00 30,04 3627 OG SER 66 -33,461 23,989 -24,632 1,00 33,58 3628 C SER 66 -30,792 22,782 -24,337 1,00 29,31 3629 O SER ₆₆-30,605 _22,661-25,551 _1,0028,96 3630 N LYS 67 -30,636 21,790 -23,472 1,00 29,49 3631 CA LYS 67 -30,268 20,448 -23,886 1,00 31,34 3632 CB LYS 67 -28,789 20,182 -23,587 1,00 29,79 3633 CG LYS 67 -28,422 18,700 -23,598 1,00 30,92 3634 CD LYS 67 -26,945 18,480 -23,271 1,00 31,59 3635 CE LYS 67 -26,665 17,014 -22,974 _1,0031,18 3636 NZ LYS 67 -25,207 16,754 -22,808 1,00 32,99 3637 C LYS 67 -31,123 19,451 -23,119 1,00 32,11 3638 O LYS 67 -31,355 19,614 -21,921 1,00 33,29 3639 N SER 68 -31,591 18,420 -23,808 1,00 32,41 3640 CA SER ₆₈-32,289 17,334 -23,137 _1,0033,97 3641 CB SER 68 -33,788 17,624 -23,098 1,00 35,12 3642 OG SER 68 -34,481 16,551 -22,492 1,00 39,24 3643 C SER 68 -32,038 16,010 -23,851 1,00 32,19 3644 O SER 68 -32,356 15,861 -25,027 1,00 31,42 3645 N GLY 69 -31,470 15,046 -23,134 1,00 31,82 3646 CA GLY 69 -31,165 13,768 -23,750 _1,0030,65 3647 C GLY 69 -30,148 13,927 -24,865 1,00 31,46 3648 O GLY 69 -29,026 14,364 -24,623 1,00 31,98 3649 N THR 70 -30,531 13,572 -26,087 1,00 30,21 3650 CA THR 70 -29,627 13,705 -27,221 1,00 29,74 3651 CB THR 70 -29,517 12,384 -28,011 1,00 31,03 3652 OG1 THR 70 -30,813 11,994 -28,472 _1,0032,35 3653 CG2 THR 70 -28,934 11,269 -27,126 1,00 26,28 3654 C THR 70 -30,040 14,820 -28,179 1,00 29,23 3655 O THR 70 -29,630 14,837 -29,336 1,00 28,90 3656 N SER 71 -30,841 15,759 -27,687 1,00 28,99 3657 CA SER 71 -31,244 16,908 -28,486 1,00 27,69 3658 CB SER 71 -32,719 16,795 -28,860 1,00 29,27 3659 OG SER 71 -32,874 15,835 -29,886 1,00 38,45 3660 C SER 71 -31,003 18,208 -27,745 1,00 24,99 3661 O SER 71 -30,824 18,208 -26,535 1,00 25,72 3662 N ALA 72 -30,995 19,315 -28,480 1,00 23,94 3663 CA ALA 72 -30,769 20,626 -27,884 1,00 26,16 3664 CB ALA 72 -29,272 20,976 -27,903 _1,0022,79 3665 C ALA 72 -31,555 21,669 -28,654 1,00 26,58 3666 O ALA 72 -32,062 21,396 -29,742 1,00 26,75 3667 N SER 73 -31,645 22,872 -28,102 1,00 28,14 3668 CA SER 73 -32,438 23,910 -28,745 1,00 29,91 (continuación)

3669 CB SER 73 -33,900 23,788 -28,305 1,00 30,18 3670 OG SER 73 -34,699 24,715 -29,010 1,00 37,35 3671 C SER 73 -31,926 25,313 -28,453 1,00 28,74 3672 O SER 73 -31,501 25,613 -27,337 1,00 30,53 3673 N LEU 74 -31,955 26,161 -29,472 1,00 29,11 3674 CA LEU 74 -31,628 27,574 -29,321 _1,0031,29 3675 CB LEU 74 -30,694 28,029 -30,449 1,00 28,58 3676 CG LEU 74 -30,226 29,483 -30,412 1,00 29,48 3677 CD1 LEU 74 -29,347 29,689 -29,201 1,00 29,08 3678 CD2 LEU 74 -29,464 29,827 -31,694 1,00 28,84 3679 C LEU 74 -32,931 28,366 -29,384 1,00 32,05 3680 O LEU 74 -33,707 _28,221-30,327 _1,0031,82 3681 N ALA 75 -33,176 29,194 -28,376 1,00 31,88 3682 CA ALA 75 -34,368 30,028 -28,374 1,00 32,47 3683 CB ALA 75 -35,148 29,833 -27,077 1,00 32,36 3684 C ALA 75 -33,952 31,479 -28,520 1,00 32,90 3685 O ALA 75 -33,072 31,955 -27,803 1,00 33,92 3686 N ILE 76 -34,575 32,175 -29,462 _1,0033,40 3687 CA ILE 76 -34,331 33,597 -29,635 1,00 34,46 3688 CB ILE 76 -33,824 33,906 -31,058 1,00 34,25 3689 CG2 ILE 76 -33,403 35,370 -31,155 1,00 32,73 3690 CG1 ILE 76 -32,626 33,014 -31,393 1,00 35,86 3691 CD1 ILE 76 -32,170 33,122 -32,847 _1,0035,68 3692 C ILE 76 -35,648 34,331 -29,410 1,00 36,20 3693 O ILE 76 -36,586 34,210 -30,204 1,00 35,91 3694 N SER 77 -35,722 35,082 -28,319 1,00 36,94 3695 CA SER 77 -36,907 35,878 -28,038 1,00 38,93 3696 CB SER 77 -37,273 35,777 -26,555 1,00 39,60 3697 OG SER 77 -36,215 36,242 -25,739 _1,0042,81 3698 C SER 77 -36,655 37,331 -28,424 1,00 39,07 3699 O SER 77 -35,503 37,756 -28,574 1,00 37,94 3700 N GLY 78 -37,733 38,089 -28,600 1,00 37,57 3701 CA GLY 78 -37,585 39,485 -28,966 1,00 35,79 3702 C GLY 78 -36,839 39,619 -30,276 1,00 35,60 3703 O GLY 78 -35,946 40,458 -30,423 _1,0033,98 3704 N LEU 79 -37,212 38,781 -31,236 1,00 35,78 3705 CA LEU 79 -36,506 38,703 -32,506 1,00 35,73 3706 CB LEU 79 -37,290 37,812 -33,468 1,00 36,94 3707 CG LEU 79 -36,602 37,311 -34,738 1,00 37,13 3708 CD1 LEU 79 -35,333 36,537 -34,392 1,00 34,89 3709 CD2 LEU 79 -37,583 36,423 -35,490 _1,0037,56 3710 C LEU 79 -36,301 40,082 -33,124 1,00 36,83 3711 O LEU 79 -37,241 40,872 -33,244 1,00 36,62 3712 N GLN 80 -35,064 40,362 -33,519 1,00 37,09 3713 CA GLN 80 -34,739 41,593 -34,221 1,00 38,15 3714 CB GLN 80 -33,738 42,405 -33,403 1,00 42,19 3715 CG GLN ₈₀-34,200 42,669 -31,979 _1,0049,70 3716 CD GLN 80 -33,230 43,539 -31,213 1,00 56,13 3717 OE1 GLN 80 -32,224 43,999 -31,764 1,00 58,59 3718 NE2 GLN 80 -33,520 43,772 -29,932 1,00 58,28 3719 C GLN 80 -34,154 41,270 -35,592 1,00 38,49 3720 O GLN 80 -33,627 40,177 -35,811 1,00 36,48 (continuación)

ATOM 3721 N SER 81 -34,243 42,220 -36,516 1,00 36,90 L1 N ATOM 3722 CA SER 81 -33,800 41,975 -37,881 1,00 38,24 L1 C ATOM 3723 CB SER 81 -34,135 43,181 -38,771 1,00 37,34 L1 C ATOM 3724 OG SER 81 -33,438 44,336 -38,346 1,00 41,79 L1 O ATOM 3725 C SER ₈₁-32,298 41,661 -37,959 _1,0038,41 L1 C ATOM 3726 O SER 81 -31,857 40,977 -38,876 1,00 39,41 L1 O ATOM 3727 N GLU 82 -31,518 42,156 -37,001 1,00 37,61 L1 N ATOM 3728 CA GLU 82 -30,085 41,857 -36,964 1,00 37,59 L1 C ATOM 3729 CB GLU 82 -29,382 42,649 -35,855 1,00 41,17 L1 C ATOM 3730 CG GLU 82 -29,697 44,126 -35,838 1,00 50,54 L1 C ATOM 3731 CD GLU ₈₂-31,072 44,404 -35,270 _1,0053,17 L1 C ATOM 3732 OE1 GLU 82 -31,236 44,292 -34,036 1,00 57,55 L1 O ATOM 3733 OE2 GLU 82 -31,986 44,727 -36,057 1,00 56,15 L1 O ATOM 3734 C GLU 82 -29,860 40,370 -36,706 1,00 34,12 L1 C ATOM 3735 O GLU 82 -28,765 39,862 -36,899 1,00 31,06 L1 O ATOM 3736 N ASP 83 -30,898 39,681 -36,250 1,00 31,15 L1 N ATOM 3737 CA ASP 83 -30,779 38,265 -35,941 _1,0030,79 L1 C ATOM 3738 CB ASP 83 -31,877 37,843 -34,962 1,00 30,65 L1 C ATOM 3739 CG ASP 83 -31,797 38,587 -33,644 1,00 32,56 L1 C ATOM 3740 OD1 ASP 83 -30,697 39,067 -33,289 1,00 34,97 L1 O ATOM 3741 OD2 ASP 83 -32,834 38,692 -32,961 1,00 31,83 L1 O ATOM 3742 C ASP 83 -30,846 37,395 -37,194 _1,0029,63 L1 C ATOM 3743 O ASP 83 -30,649 36,188 -37,113 1,00 28,37 L1 O ATOM 3744 N GLU 84 -31,121 38,002 -38,348 1,00 29,00 L1 N ATOM 3745 CA GLU 84 -31,189 37,234 -39,588 1,00 30,03 L1 C ATOM 3746 CB GLU 84 -31,730 38,088 -40,741 1,00 30,22 L1 C ATOM 3747 CG GLU 84 -31,723 37,358 -42,089 1,00 31,01 L1 C ATOM 3748 CD GLU 84 -32,799 37,846 -43,050 _1,0035,95 L1 C ATOM 3749 OE1 GLU 84 -32,515 37,939 -44,265 1,00 37,52 L1 O ATOM 3750 OE2 GLU 84 -33,930 38,132 -42,598 1,00 36,88 L1 O ATOM 3751 C GLU 84 -29,800 36,714 -39,948 1,00 30,69 L1 C ATOM 3752 O GLU 84 -28,873 37,496 -40,160 1,00 31,59 L1 O ATOM 3753 N ALA 85 -29,663 35,394 -40,021 1,00 29,97 L1 N ATOM 3754 CA ALA 85 -28,345 34,780 -40,110 _1,0028,04 L1 C ATOM 3755 CB ALA 85 -27,499 35,206 -38,915 1,00 28,83 L1 C ATOM 3756 C ALA 85 -28,440 33,265 -40,153 1,00 27,69 L1 C ATOM 3757 O ALA 85 -29,522 32,692 -39,988 1,00 24,83 L1 O ATOM 3758 N ASP 86 -27,293 32,625 -40,377 1,00 28,83 L1 N ATOM 3759 CA ASP 86 -27,171 31,173 -40,263 1,00 27,36 L1 C ATOM 3760 CB ASP ₈₆-26,098 30,653 -41,224 _1,0030,73 L1 C ATOM 3761 CG ASP 86 -26,494 30,794 -42,683 1,00 32,29 L1 C ATOM 3762 OD1 ASP 86 -27,659 30,501 -43,017 1,00 36,16 L1 O ATOM 3763 OD2 ASP 86 -25,639 31,194 -43,497 1,00 33,33 L1 O ATOM 3764 C ASP 86 -26,775 30,813 -38,835 1,00 26,79 L1 C ATOM 3765 O ASP 86 -25,899 31,451 -38,245 1,00 26,47 L1 O ATOM 3766 N TYR 87 -27,419 29,789 -38,286 _1,0025,78 L1 N ATOM 3767 CA TYR 87 -27,113 29,317 -36,946 1,00 26,34 L1 C ATOM 3768 CB TYR 87 -28,346 29,450 -36,043 1,00 26,23 L1 C ATOM 3769 CG TYR 87 -28,702 30,888 -35,752 1,00 25,63 L1 C ATOM 3770 CD1 TYR 87 -29,451 31,636 -36,656 1,00 26,80 L1 C ATOM 3771 CE1 TYR 87 -29,708 32,973 -36,434 1,00 27,24 L1 C ATOM 3772 CD2 TYR 87 -28,228 31,520 -34,612 1,00 25,13 L1 C (continuación)

ATOM 3773 CE2 TYR 87 -28,479 32,856 -34,378 1,00 26,81 L1 C ATOM 3774 CZ TYR 87 -29,216 33,579 -35,292 1,00 27,91 L1 C ATOM 3775 OH TYR 87 -29,448 34,914 -35,069 1,00 28,02 L1 O ATOM 3776 C TYR 87 -26,642 27,870 -36,983 _1,0027,87 L1 C ATOM 3777 O TYR 87 -27,238 27,031 -37,662 1,00 28,78 L1 O ATOM 3778 N TYR 88 -25,568 27,592 -36,247 1,00 26,11 L1 N ATOM 3779 CA TYR 88 -24,955 26,271 -36,230 1,00 23,64 L1 C ATOM 3780 CB TYR 88 -23,557 26,328 -36,853 1,00 22,55 L1 C ATOM 3781 CG TYR 88 -23,532 26,659 -38,331 1,00 22,94 L1 C ATOM 3782 CD1 TYR ₈₈-23,269 27,953 -38,768 _1,0023,36 L1 C ATOM 3783 CE1 TYR 88 -23,236 28,260 -40,115 1,00 22,59 L1 C ATOM 3784 CD2 TYR 88 -23,763 25,679 -39,286 1,00 22,71 L1 C ATOM 3785 CE2 TYR 88 -23,732 25,977 -40,645 1,00 22,56 L1 C ATOM 3786 CZ TYR 88 -23,467 27,270 -41,051 1,00 23,14 L1 C ATOM 3787 OH TYR 88 -23,430 27,581 -42,399 1,00 23,24 L1 O ATOM 3788 C TYR ₈₈-24,835 25,759 -34,803 _1,0024,19 L1 C ATOM 3789 O TYR 88 -24,509 26,525 -33,887 1,00 23,05 L1 O ATOM 3790 N CYS 89 -25,087 24,466 -34,613 1,00 23,34 L1 N ATOM 3791 CA CYS 89 -24,701 23,808 -33,371 1,00 24,76 L1 C ATOM 3792 C CYS 89 -23,428 22,986 -33,551 1,00 24,26 L1 C ATOM 3793 O CYS 89 -23,127 22,513 -34,644 _1,0024,97 L1 O ATOM 3794 CB CYS 89 -25,829 22,909 -32,844 1,00 24,95 L1 C ATOM 3795 SG CYS 89 -26,482 21,652 -33,993 1,00 29,02 L1 S ATOM 3796 N ALA 90 -22,684 22,824 -32,467 1,00 22,28 L1 N ATOM 3797 CA ALA 90 -21,419 22,115 -32,511 1,00 21,93 L1 C ATOM 3798 CB ALA 90 -20,279 23,103 -32,663 1,00 21,85 L1 C ATOM 3799 C ALA 90 -21,262 21,320 -31,229 1,00 22,39 L1 C ATOM 3800 O ALA 90 -21,575 21,813 -30,139 1,00 23,97 L1 O ATOM 3801 N VAL 91 -20,790 20,087 -31,365 1,00 21,91 L1 N ATOM 3802 CA VAL 91 -20,699 19,158 -30,241 1,00 22,14 L1 C ATOM 3803 CB VAL 91 -21,992 18,315 -30,112 1,00 22,24 L1 C ATOM 3804 CG1 VAL 91 -21,908 17,407 -28,898 1,00 18,74 L1 C ATOM 3805 CG2 VAL 91 -23,211 19,238 -30,019 _1,0019,37 L1 C ATOM 3806 C VAL 91 -19,530 18,209 -30,487 1,00 23,31 L1 C ATOM 3807 O VAL 91 -19,298 17,798 -31,619 1,00 24,62 L1 O ATOM 3808 N TRP 92 -18,792 17,864 -29,436 1,00 22,18 L1 N ATOM 3809 CA TRP 92 -17,749 16,857 -29,566 1,00 21,63 L1 C ATOM 3810 CB TRP 92 -16,850 16,862 -28,331 1,00 20,72 L1 C ATOM 3811 CG TRP 92 -15,604 16,033 -28,480 _1,0024,87 L1 C ATOM 3812 CD2 TRP 92 -14,339 16,463 -29,011 1,00 23,79 L1 C ATOM 3813 CE2 TRP 92 -13,453 15,372 -28,914 1,00 24,92 L1 C ATOM 3814 CE3 TRP 92 -13,874 17,663 -29,556 1,00 24,00 L1 C ATOM 3815 CD1 TRP 92 -15,435 14,735 -28,100 1,00 24,13 L1 C ATOM 3816 NE1 TRP 92 -14,147 14,331 -28,356 1,00 26,35 L1 N ATOM 3817 CZ2 TRP 92 -12,125 15,443 -29,339 _1,0025,22 L1 C ATOM 3818 CZ3 TRP 92 -12,551 17,734 -29,981 1,00 27,22 L1 C ATOM 3819 CH2 TRP 92 -11,694 16,629 -29,868 1,00 26,53 L1 C ATOM 3820 C TRP 92 -18,378 15,470 -29,739 1,00 22,42 L1 C ATOM 3821 O TRP 92 -19,333 15,120 -29,053 1,00 21,21 L1 O ATOM 3822 N ASP 93 -17,838 14,684 -30,661 1,00 22,63 L1 N ATOM 3823 CA ASP 93 -18,303 13,316 -30,847 1,00 22,79 L1 C ATOM 3824 CB ASP 93 -18,629 13,054 -32,312 1,00 22,67 L1 C (continuación)

ATOM 3825 CG ASP 93 -19,345 11,732 -32,517 1,00 24,52 L1 C ATOM 3826 OD1 ASP 93 -20,593 11,733 -32,528 1,00 24,55 L1 O ATOM 3827 OD2 ASP 93 -18,662 10,695 -32,662 1,00 24,78 L1 O ATOM 3828 C ASP 93 -17,234 12,338 -30,393 1,00 23,59 L1 C ATOM 3829 O ASP 93 -16,085 12,430 -30,815 1,00 21,15 L1 O ATOM 3830 N ASP 94 -17,622 11,396 -29,541 1,00 22,22 L1 N ATOM 3831 CA ASP 94 -16,672 10,480 -28,931 1,00 23,56 L1 C ATOM 3832 CB ASP 94 -17,222 10,010 -27,579 1,00 22,41 L1 C ATOM 3833 CG ASP 94 -17,423 _{11,162 -26,610 1,00}25,03 L1 C ATOM 3834 OD1 ASP 94 -16,432 11,869 -26,310 1,00 24,18 L1 O ATOM 3835 OD2 ASP 94 -18,567 11,367 -26,153 1,00 23,82 L1 O ATOM 3836 C ASP 94 -16,291 9,279 -29,803 1,00 22,66 L1 C ATOM 3837 O ASP 94 -15,337 8,576 -29,498 1,00 23,33 L1 O ATOM 3838 N SER 95 -17,027 9,043 -30,885 1,00 23,45 L1 N ATOM 3839 CA SER 95 -16,663 7,979 -31,821 _1,0022,75 L1 C ATOM 3840 CB SER 95 -17,913 7,348 -32,444 1,00 21,53 L1 C ATOM 3841 OG SER 95 -18,715 6,725 -31,450 1,00 19,78 L1 O ATOM 3842 C SER 95 -15,762 8,524 -32,918 1,00 24,04 L1 C ATOM 3843 O SER 95 -14,806 7,867 -33,329 1,00 24,34 L1 O ATOM 3844 N LEU 96 -16,060 9,736 -33,374 1,00 22,90 L1 N ATOM 3845 CA LEU 96 -15,206 10,427 -34,328 1,00 23,33 L1 C ATOM 3846 CB LEU 96 -16,022 11,480 -35,076 1,00 25,43 L1 C ATOM 3847 CG LEU 96 -17,131 10,906 -35,962 1,00 26,90 L1 C ATOM 3848 CD1 LEU 96 -18,143 11,991 -36,285 1,00 23,29 L1 C ATOM 3849 CD2 LEU 96 -16,522 10,341 -37,226 1,00 27,63 L1 C ATOM 3850 C LEU 96 -14,008 11,093 -33,644 _1,0023,40 L1 C ATOM 3851 O LEU 96 -13,029 11,442 -34,300 1,00 22,31 L1 O ATOM 3852 N ASN 97 -14,094 11,267 -32,327 1,00 21,76 L1 N ATOM 3853 CA ASN 97 -13,032 11,919 -31,564 1,00 23,62 L1 C ATOM 3854 CB ASN 97 -11,765 11,064 -31,594 1,00 23,22 L1 C ATOM 3855 CG ASN 97 -11,961 9,742 -30,897 1,00 25,94 L1 C ATOM 3856 OD1 ASN 97 -12,281 9,698 -29,701 1,00 24,63 L1 O ATOM 3857 ND2 ASN 97 -11,794 8,651 -31,637 1,00 27,24 L1 N ATOM 3858 C ASN 97 -12,719 13,326 -32,054 1,00 24,97 L1 C ATOM 3859 O ASN 97 -11,554 13,677 -32,290 1,00 24,92 L1 O ATOM 3860 N GLY 98 -13,764 14,134 -32,199 1,00 21,90 L1 N ATOM 3861 CA GLY 98 -13,575 15,504 -32,632 1,00 23,01 L1 C ATOM 3862 C GLY 98 -14,900 16,223 -32,796 _1,0022,94 L1 C ATOM 3863 O GLY 98 -15,961 15,660 -32,516 1,00 19,38 L1 O ATOM 3864 N TRP 99 -14,835 17,465 -33,258 1,00 21,48 L1 N ATOM 3865 CA TRP 99 -16,017 18,309 -33,354 1,00 21,80 L1 C ATOM 3866 CB TRP 99 -15,602 19,784 -33,485 1,00 20,41 L1 C ATOM 3867 CG TRP 99 -15,097 20,349 -32,201 1,00 21,29 L1 C ATOM 3868 CD2 TRP 99 -15,887 20,731 -31,070 _1,0020,83 L1 C ATOM 3869 CE2 TRP 99 -14,993 21,130 -30,052 1,00 21,78 L1 C ATOM 3870 CE3 TRP 99 -17,264 20,773 -30,819 1,00 21,01 L1 C ATOM 3871 CD1 TRP 99 -13,792 20,533 -31,838 1,00 20,69 L1 C ATOM 3872 NE1 TRP 99 -13,721 21,000 -30,548 1,00 18,42 L1 N ATOM 3873 CZ2 TRP 99 -15,429 21,565 -28,797 1,00 21,72 L1 C ATOM 3874 CZ3 TRP 99 -17,701 21,207 -29,572 1,00 24,75 L1 C ATOM 3875 CH2 TRP 99 -16,782 21,597 -28,575 1,00 23,40 L1 C ATOM 3876 C TRP 99 -16,896 17,915 -34,530 1,00 21,60 L1 C (continuación)

ATOM 3877 O TRP 99 -16,411 17,673 -35,640 1,00 20,77 L1 O ATOM 3878 N VAL ₁₀₀-18,196 17,843 -34,280 _1,0021,15 L1 N ATOM 3879 CA VAL 100 -19,155 17,745 -35,366 1,00 20,99 L1 C ATOM 3880 CB VAL 100 -19,959 16,412 -35,299 1,00 21,63 L1 C ATOM 3881 CG1 VAL 100 -19,013 15,237 -35,493 1,00 18,33 L1 C ATOM 3882 CG2 VAL 100 -20,685 16,283 -33,965 1,00 20,08 L1 C ATOM 3883 C VAL 100 -20,094 18,945 -35,310 1,00 22,73 L1 C ATOM 3884 O VAL _{100 -20,206}19,604 -34,271 _1,0021,19 L1 O ATOM 3885 N PHE 101 -20,731 19,244 -36,439 1,00 23,17 L1 N ATOM 3886 CA PHE 101 -21,625 20,393 -36,556 1,00 24,04 L1 C ATOM 3887 CB PHE 101 -21,052 21,421 -37,538 1,00 23,68 L1 C ATOM 3888 CG PHE 101 -19,847 22,175 -37,015 1,00 25,65 L1 C ATOM 3889 CD1 PHE 101 -18,558 21,762 -37,330 1,00 25,40 L1 C ATOM 3890 CD2 PHE ₁₀₁-20,005 23,323 -36,253 _1,0025,22 L1 C ATOM 3891 CE1 PHE 101 -17,449 22,484 -36,900 1,00 27,16 L1 C ATOM 3892 CE2 PHE 101 -18,899 24,053 -35,818 1,00 26,53 L1 C ATOM 3893 CZ PHE 101 -17,621 23,632 -36,144 1,00 25,47 L1 C ATOM 3894 C PHE 101 -22,995 19,944 -37,060 1,00 24,46 L1 C ATOM 3895 O PHE ₁₀₁-23,134 18,856 -37,620 _1,0025,98 L1 O ATOM 3896 N GLY 102 -24,006 20,782 -36,856 1,00 24,12 L1 N ATOM 3897 CA GLY 102 -25,261 20,601 -37,560 1,00 23,71 L1 C ATOM 3898 C GLY 102 -25,108 21,230 -38,930 1,00 24,83 L1 C ATOM 3899 O GLY 102 -24,139 21,951 -39,169 1,00 25,59 L1 O ATOM 3900 N GLY 103 -26,049 20,974 -39,831 1,00 24,86 L1 N ATOM 3901 CA GLY 103 -25,923 21,487 -41,188 _1,0023,32 L1 C ATOM 3902 C GLY 103 -26,218 22,973 -41,301 1,00 23,92 L1 C ATOM 3903 O GLY 103 -26,063 23,565 -42,365 1,00 23,16 L1 O ATOM 3904 N GLY 104 -26,637 23,590 -40,205 1,00 24,09 L1 N ATOM 3905 CA GLY 104 -26,940 25,010 -40,247 1,00 25,44 L1 C ATOM 3906 C GLY 104 -28,406 25,294 -40,535 1,00 26,46 L1 C ATOM 3907 O GLY 104 -29,032 24,613 -41,348 _1,0025,23 L1 O ATOM 3908 N THR 105 -28,951 26,296 -39,850 1,00 27,15 L1 N ATOM 3909 CA THR 105 -30,313 26,762 -40,080 1,00 27,11 L1 C ATOM 3910 CB THR 105 -31,161 26,699 -38,801 1,00 26,94 L1 C ATOM 3911 OG1 THR 105 -31,235 25,348 -38,335 1,00 25,27 L1 O ATOM 3912 CG2 THR 105 -32,574 27,229 -39,074 1,00 27,18 L1 C ATOM 3913 C THR 105 -30,275 _28,220-40,511 _1,0028,67 L1 C ATOM 3914 O THR 105 -29,776 29,072 -39,770 1,00 28,70 L1 O ATOM 3915 N LYS 106 -30,811 28,511 -41,693 1,00 27,94 L1 N ATOM 3916 CA LYS 106 -30,958 29,895 -42,132 1,00 27,78 L1 C ATOM 3917 CB LYS 106 -31,076 29,959 -43,660 1,00 30,73 L1 C ATOM 3918 CG LYS 106 -31,292 31,370 -44,224 1,00 34,36 L1 C ATOM 3919 CD LYS ₁₀₆-31,505 31,327 -45,743 _1,0040,73 L1 C ATOM 3920 CE LYS 106 -32,204 32,589 -46,269 1,00 43,20 L1 C ATOM 3921 NZ LYS 106 -31,412 33,828 -45,992 1,00 43,79 L1 N ATOM 3922 C LYS 106 -32,204 30,506 -41,492 1,00 28,25 L1 C ATOM 3923 O LYS 106 -33,324 30,102 -41,790 1,00 27,19 L1 O ATOM 3924 N LEU 107 -32,002 31,476 -40,606 1,00 28,39 L1 N ATOM 3925 CA LEU 107 -33,115 32,167 -39,965 1,00 29,11 L1 C ATOM 3926 CB LEU 107 -32,759 32,529 -38,524 1,00 27,84 L1 C ATOM 3927 CG LEU 107 -33,833 33,302 -37,750 1,00 30,76 L1 C ATOM 3928 CD1 LEU 107 -35,095 32,460 -37,646 1,00 28,82 L1 C (continuación)

ATOM 3929 CD2 LEU 107 -33,320 33,665 -36,364 _1,0029,24 L1 C ATOM 3930 C LEU 107 -33,438 33,440 -40,731 1,00 29,95 L1 C ATOM 3931 O LEU 107 -32,583 34,313 -40,881 1,00 30,14 L1 O ATOM 3932 N THR 108 -34,668 33,544 -41,222 1,00 29,24 L1 N ATOM 3933 CA THR 108 -35,124 34,781 -41,835 1,00 29,21 L1 C ATOM 3934 CB THR 108 -35,949 34,519 -43,118 1,00 30,64 L1 C ATOM 3935 OG1 THR ₁₀₈-35,126 33,888 -44,107 _1,0030,87 L1 O ATOM 3936 CG2 THR 108 -36,482 35,837 -43,686 1,00 30,92 L1 C ATOM 3937 C THR 108 -35,993 35,535 -40,840 1,00 29,75 L1 C ATOM 3938 O THR 108 -36,920 34,973 -40,257 1,00 29,93 L1 O ATOM 3939 N VAL 109 -35,685 36,808 -40,637 1,00 30,82 L1 N ATOM 3940 CA VAL 109 -36,549 37,666 -39,837 1,00 31,06 L1 C ATOM 3941 CB VAL 109 -35,720 38,675 -39,012 _1,0029,89 L1 C ATOM 3942 CG1 VAL 109 -36,636 39,619 -38,253 1,00 31,03 L1 C ATOM 3943 CG2 VAL 109 -34,827 37,922 -38,043 1,00 30,10 L1 C ATOM 3944 C VAL 109 -37,469 38,404 -40,803 1,00 30,26 L1 C ATOM 3945 O VAL 109 -37,037 39,294 -41,537 1,00 28,33 L1 O ATOM 3946 N LEU ₁₁₀-38,737 38,007 -40,808 _1,0029,80 L1 N ATOM 3947 CA LEU 110 -39,672 38,430 -41,844 1,00 30,88 L1 C ATOM 3948 CB LEU 110 -41,047 37,813 -41,571 1,00 29,96 L1 C ATOM 3949 CG LEU 110 -41,036 36,279 -41,536 1,00 29,38 L1 C ATOM 3950 CD1 LEU 110 -42,338 35,739 -40,950 1,00 28,86 L1 C ATOM 3951 CD2 LEU 110 -40,828 35,757 -42,938 1,00 22,82 L1 C ATOM 3952 C LEU ₁₁₀-39,779 39,950 -41,934 _1,0030,13 L1 C ATOM 3953 O LEU 110 -40,124 40,616 -40,962 1,00 30,33 L1 O ATOM 3954 N GLY 111 -39,468 40,486 -43,110 1,00 31,70 L1 N ATOM 3955 CA GLY 111 -39,525 41,923 -43,327 1,00 32,20 L1 C ATOM 3956 C GLY 111 -40,510 42,285 -44,428 1,00 33,43 L1 C ATOM 3957 O GLY 111 -40,689 43,461 -44,768 1,00 35,10 L1 O ATOM 3958 N GLN ₁₁₂-41,150 41,266 -44,990 _1,0033,16 L1 N ATOM 3959 CA GLN 112 -42,217 41,465 -45,964 1,00 36,01 L1 C ATOM 3960 CB GLN 112 -41,627 41,718 -47,354 1,00 37,16 L1 C ATOM 3961 CG GLN 112 -40,857 40,542 -47,931 1,00 37,31 L1 C ATOM 3962 CD GLN 112 -40,276 40,863 -49,291 1,00 38,17 L1 C ATOM 3963 OE1 GLN 112 -40,967 40,775 -50,306 1,00 40,76 L1 O ATOM 3964 NE2 GLN ₁₁₂-39,004 41,243 -49,320 _1,0035,15 L1 N ATOM 3965 C GLN 112 -43,097 40,219 -45,984 1,00 36,50 L1 C ATOM 3966 O GLN 112 -42,783 39,228 -45,333 1,00 35,56 L1 O ATOM 3967 N PRO 113 -44,224 40,263 -46,714 1,00 37,98 L1 N ATOM 3968 CD PRO 113 -44,796 41,426 -47,415 1,00 38,44 L1 C ATOM 3969 CA PRO 113 -45,108 39,091 -46,789 1,00 38,56 L1 C ATOM 3970 CB PRO 113 -46,269 39,566 -47,669 _1,0038,32 L1 C ATOM 3971 CG PRO 113 -46,248 41,057 -47,550 1,00 38,11 L1 C ATOM 3972 C PRO 113 -44,401 37,887 -47,403 1,00 39,28 L1 C ATOM 3973 O PRO 113 -43,603 38,037 -48,330 1,00 38,01 L1 O ATOM 3974 N LYS 114 -44,698 36,697 -46,891 1,00 39,70 L1 N ATOM 3975 CA LYS 114 -44,209 35,472 -47,515 1,00 43,10 L1 C ATOM 3976 CB LYS 114 -44,646 34,243 -46,708 1,00 41,99 L1 C ATOM 3977 CG LYS 114 -44,031 34,182 -45,310 1,00 44,06 L1 C ATOM 3978 CD LYS 114 -44,233 32,820 -44,646 1,00 44,49 L1 C ATOM 3979 CE LYS 114 -43,571 32,774 -43,276 1,00 46,38 L1 C ATOM 3980 NZ LYS 114 -43,874 31,518 -42,529 _1,0047,56 L1 N (continuación)

ATOM 3981 C LYS 114 -44,754 35,387 -48,937 1,00 44,55 L1 C ATOM 3982 O LYS 114 -45,889 35,782 -49,192 1,00 45,57 L1 O ATOM 3983 N ALA 115 -43,936 34,889 -49,861 1,00 45,01 L1 N ATOM 3984 CA ALA 115 -44,316 34,830 -51,267 1,00 45,57 L1 C ATOM 3985 CB ALA 115 -43,751 36,038 -52,015 1,00 43,32 L1 C ATOM 3986 C ALA 115 -43,831 33,540 -51,920 _1,0047,27 L1 C ATOM 3987 O ALA 115 -42,635 33,236 -51,918 1,00 47,27 L1 O ATOM 3988 N ALA 116 -44,774 32,789 -52,478 1,00 47,90 L1 N ATOM 3989 CA ALA 116 -44,469 31,572 -53,213 1,00 48,80 L1 C ATOM 3990 CB ALA 116 -45,758 30,823 -53,533 1,00 49,49 L1 C ATOM 3991 C ALA 116 -43,724 31,904 -54,500 1,00 49,45 L1 C ATOM 3992 O ALA ₁₁₆-43,989 32,922 -55,139 _1,0049,52 L1 O ATOM 3993 N PRO 117 -42,779 31,038 -54,892 1,00 50,68 L1 N ATOM 3994 CD PRO 117 -42,512 29,768 -54,194 1,00 50,62 L1 C ATOM 3995 CA PRO 117 -41,904 31,218 -56,055 1,00 52,06 L1 C ATOM 3996 CB PRO 117 -40,870 30,110 -55,897 1,00 52,12 L1 C ATOM 3997 CG PRO 117 -41,594 29,043 -55,141 _1,0051,66 L1 C ATOM 3998 C PRO 117 -42,639 31,105 -57,385 1,00 53,83 L1 C ATOM 3999 O PRO 117 -43,584 30,327 -57,518 1,00 53,40 L1 O ATOM 4000 N SER 118 -42,193 31,884 -58,366 1,00 56,36 L1 N ATOM 4001 CA SER 118 -42,597 31,679 -59,755 1,00 59,62 L1 C ATOM 4002 CB SER 118 -42,568 33,003 -60,526 1,00 60,11 L1 C ATOM 4003 OG SER ₁₁₈-43,416 33,970 -59,935 _1,0062,95 L1 O ATOM 4004 C SER 118 -41,621 30,703 -60,406 1,00 60,93 L1 C ATOM 4005 O SER 118 -40,406 30,854 -60,272 1,00 61,04 L1 O ATOM 4006 N VAL 119 -42,152 29,708 -61,110 1,00 62,70 L1 N ATOM 4007 CA VAL 119 -41,313 28,719 -61,779 1,00 64,16 L1 C ATOM 4008 CB VAL 119 -41,591 27,300 -61,236 1,00 63,53 L1 C ATOM 4009 CG1 VAL 119 -40,704 26,287 -61,945 _1,0063,21 L1 C ATOM 4010 CG2 VAL 119 -41,344 27,263 -59,737 1,00 64,05 L1 C ATOM 4011 C VAL 119 -41,522 28,715 -63,293 1,00 65,49 L1 C ATOM 4012 O VAL 119 -42,626 28,471 -63,779 1,00 65,80 L1 O ATOM 4013 N THR 120 -40,450 28,987 -64,032 1,00 67,43 L1 N ATOM 4014 CA THR 120 -40,470 28,914 -65,490 1,00 68,73 L1 C ATOM 4015 CB THR ₁₂₀-40,051 30,262 -66,117 _{1,00 68,82}L1 C ATOM 4016 OG1 THR 120 -40,923 31,298 -65,648 1,00 68,76 L1 O ATOM 4017 CG2 THR 120 -40,125 30,192 -67,636 1,00 68,58 L1 C ATOM 4018 C THR 120 -39,510 27,820 -65,971 1,00 69,56 L1 C ATOM 4019 O THR 120 -38,316 27,856 -65,669 1,00 69,35 L1 O ATOM 4020 N LEU 121 -40,036 26,853 -66,720 1,00 70,38 L1 N ATOM 4021 CA LEU ₁₂₁-39,257 25,683 -67,122 _1,0070,76 L1 C ATOM 4022 CB LEU 121 -39,920 24,411 -66,594 1,00 70,00 L1 C ATOM 4023 CG LEU 121 -39,202 23,105 -66,926 1,00 69,81 L1 C ATOM 4024 CD1 LEU 121 -37,857 23,072 -66,219 1,00 69,72 L1 C ATOM 4025 CD2 LEU 121 -40,061 21,928 -66,496 1,00 70,35 L1 C ATOM 4026 C LEU 121 -39,087 25,565 -68,637 1,00 71,13 L1 C ATOM 4027 O LEU 121 -40,058 25,372 -69,368 1,00 70,75 L1 O ATOM 4028 N PHE 122 -37,846 25,663 -69,101 1,00 71,79 L1 N ATOM 4029 CA PHE 122 -37,547 25,537 -70,523 1,00 73,09 L1 C ATOM 4030 CB PHE 122 -36,521 26,591 -70,944 1,00 72,54 L1 C ATOM 4031 CG PHE ₁₂₂-37,013 28,004 -70,821 _1,0072,59 L1 C ATOM 4032 CD1 PHE 122 -36,678 28,777 -69,722 1,00 72,06 L1 C (continuación)

ATOM 4033 CD2 PHE 122 -37,803 28,564 -71,813 1,00 72,99 L1 C ATOM 4034 CE1 PHE 122 -37,121 30,084 -69,613 1,00 73,02 L1 C ATOM 4035 CE2 PHE 122 -38,250 29,873 -71,711 1,00 72,95 L1 C ATOM 4036 CZ PHE 122 -37,908 30,633 -70,610 1,00 72,77 L1 C ATOM 4037 C PHE ₁₂₂-37,009 24,149 -70,864 _1,0074,17 L1 C ATOM 4038 O PHE 122 -36,059 23,669 -70,243 1,00 74,07 L1 O ATOM 4039 N PRO 123 -37,618 23,485 -71,861 1,00 74,99 L1 N ATOM 4040 CD PRO 123 -38,879 23,887 -72,509 1,00 75,22 L1 C ATOM 4041 CA PRO 123 -37,079 22,243 -72,430 1,00 74,86 L1 C ATOM 4042 CB PRO 123 -38,219 21,728 -73,305 1,00 74,82 L1 C ATOM 4043 CG PRO 123 -38,970 22,961 -73,693 _1,0075,30 L1 C ATOM 4044 C PRO 123 -35,808 22,515 -73,238 1,00 74,68 L1 C ATOM 4045 O PRO 123 -35,491 23,666 -73,542 1,00 74,38 L1 O ATOM 4046 N PRO 124 -35,061 21,456 -73,591 1,00 75,00 L1 N ATOM 4047 CD PRO 124 -35,268 20,052 -73,198 1,00 74,86 L1 C ATOM 4048 CA PRO 124 -33,841 21,625 -74,390 _1,0074,74 L1 C ATOM 4049 CB PRO 124 -33,309 20,199 -74,545 1,00 74,36 L1 C ATOM 4050 CG PRO 124 -33,908 19,446 -73,404 1,00 74,67 L1 C ATOM 4051 C PRO 124 -34,141 22,267 -75,742 1,00 74,62 L1 C ATOM 4052 O PRO 124 -35,135 21,934 -76,387 1,00 74,35 L1 O ATOM 4053 N SER 125 -33,284 23,189 -76,167 1,00 74,96 L1 N ATOM 4054 CA SER 125 -33,440 23,813 -77,475 _1,0075,14 L1 C ATOM 4055 CB SER 125 -32,533 25,043 -77,591 1,00 73,75 L1 C ATOM 4056 OG SER 125 -31,171 24,709 -77,395 1,00 72,15 L1 O ATOM 4057 C SER 125 -33,095 22,801 -78,563 1,00 76,50 L1 C ATOM 4058 O SER 125 -32,531 21,743 -78,282 1,00 76,63 L1 O ATOM 4059 N SER 126 -33,446 23,120 -79,804 1,00 77,77 L1 N ATOM 4060 CA SER ₁₂₆-33,135 22,240 -80,924 _1,0078,66 L1 C ATOM 4061 CB SER 126 -33,941 22,651 -82,160 1,00 79,08 L1 C ATOM 4062 OG SER 126 -35,334 22,551 -81,917 1,00 79,83 L1 O ATOM 4063 C SER 126 -31,641 22,294 -81,235 1,00 78,82 L1 C ATOM 4064 O SER 126 -31,039 21,288 -81,610 1,00 78,71 L1 O ATOM 4065 N GLU 127 -31,051 23,474 -81,063 1,00 79,12 L1 N ATOM 4066 CA GLU 127 -29,627 23,677 -81,312 _{1,00 80,10}L1 C ATOM 4067 CB GLU 127 -29,247 25,144 -81,071 1,00 80,24 L1 C ATOM 4068 CG GLU 127 -29,826 26,127 -82,078 1,00 81,24 L1 C ATOM 4069 CD GLU 127 -31,272 26,496 -81,787 1,00 82,17 L1 C ATOM 4070 OE1 GLU 127 -31,928 25,788 -80,993 1,00 82,13 L1 O ATOM 4071 OE2 GLU 127 -31,754 27,499 -82,356 1,00 81,88 L1 O ATOM 4072 C GLU 127 -28,763 22,786 -80,424 _1,0080,55 L1 C ATOM 4073 O GLU 127 -27,606 22,516 -80,742 1,00 80,88 L1 O ATOM 4074 N GLU 128 -29,326 22,335 -79,308 1,00 81,34 L1 N ATOM 4075 CA GLU 128 -28,570 21,553 -78,339 1,00 82,00 L1 C ATOM 4076 CB GLU 128 -28,967 21,953 -76,911 1,00 82,28 L1 C ATOM 4077 CG GLU 128 -28,026 21,427 -75,834 1,00 81,82 L1 C ATOM 4078 CD GLU 128 -28,481 21,778 -74,430 1,00 81,09 L1 C ATOM 4079 OE1 GLU 128 -27,643 21,730 -73,505 1,00 79,98 L1 O ATOM 4080 OE2 GLU 128 -29,674 22,099 -74,251 1,00 81,48 L1 O ATOM 4081 C GLU 128 -28,794 20,057 -78,539 1,00 82,27 L1 C ATOM 4082 O GLU ₁₂₈-27,845 19,273 -78,510 _1,0081,56 L1 O ATOM 4083 N LEU 129 -30,047 19,664 -78,746 1,00 82,77 L1 N ATOM 4084 CA LEU 129 -30,367 18,262 -78,984 1,00 83,70 L1 C (continuación)

ATOM 4085 CB LEU 129 -31,860 18,099 -79,282 1,00 83,20 L1 C ATOM 4086 CG LEU 129 -32,808 18,383 -78,116 1,00 83,28 L1 C ATOM 4087 CD1 LEU 129 -34,253 18,198 -78,557 1,00 82,64 L1 C ATOM 4088 CD2 LEU 129 -32,476 17,449 -76,965 _1,0083,46 L1 C ATOM 4089 C LEU 129 -29,544 17,733 -80,154 1,00 84,66 L1 C ATOM 4090 O LEU 129 -29,147 16,567 -80,172 1,00 84,88 L1 O ATOM 4091 N GLN 130 -29,286 18,602 -81,127 1,00 85,33 L1 N ATOM 4092 CA GLN 130 -28,463 18,242 -82,275 1,00 86,17 L1 C ATOM 4093 CB GLN 130 -28,619 19,281 -83,390 1,00 86,49 L1 C ATOM 4094 CG GLN 130 -28,015 20,639 -83,063 _{1,00 86,88}L1 C ATOM 4095 CD GLN 130 -28,181 21,640 -84,191 1,00 87,75 L1 C ATOM 4096 OE1 GLN 130 -27,319 22,496 -84,409 1,00 87,18 L1 O ATOM 4097 NE2 GLN 130 -29,292 21,540 -84,915 1,00 86,91 L1 N ATOM 4098 C GLN 130 -26,997 18,152 -81,863 1,00 86,31 L1 C ATOM 4099 O GLN 130 -26,260 17,289 -82,342 1,00 87,49 L1 O ATOM 4100 N ALA 131 -26,581 19,046 -80,971 1,00 85,27 L1 N ATOM 4101 CA ALA 131 -25,210 19,055 -80,478 1,00 84,10 L1 C ATOM 4102 CB ALA 131 -24,918 20,373 -79,770 1,00 83,24 L1 C ATOM 4103 C ALA 131 -24,971 17,882 -79,528 1,00 83,51 L1 C ATOM 4104 O ALA 131 -23,918 17,792 -78,894 1,00 83,48 L1 O ATOM 4105 N ASN 132 -25,959 16,994 -79,433 _1,0082,74 L1 N ATOM 4106 CA ASN 132 -25,842 15,767 -78,649 1,00 82,64 L1 C ATOM 4107 CB ASN 132 -24,526 15,054 -78,983 1,00 82,71 L1 C ATOM 4108 CG ASN 132 -24,503 13,611 -78,508 1,00 82,60 L1 C ATOM 4109 OD1 ASN 132 -25,549 12,972 -78,367 1,00 81,48 L1 O ATOM 4110 ND2 ASN 132 -23,304 13,090 -78,261 1,00 81,72 L1 N ATOM 4111 C ASN 132 -25,920 16,049 -77,146 _1,0082,67 L1 C ATOM 4112 O ASN 132 -25,553 15,209 -76,322 1,00 82,72 L1 O ATOM 4113 N LYS 133 -26,400 17,241 -76,801 1,00 82,45 L1 N ATOM 4114 CA LYS 133 -26,575 17,639 -75,408 1,00 81,60 L1 C ATOM 4115 CB LYS 133 -25,705 18,861 -75,100 1,00 81,98 L1 C ATOM 4116 CG LYS 133 -24,278 18,755 -75,616 1,00 82,82 L1 C ATOM 4117 CD LYS 133 -23,379 _18,012-74,641 _1,0084,05 L1 C ATOM 4118 CE LYS 133 -22,792 18,960 -73,604 1,00 85,60 L1 C ATOM 4119 NZ LYS 133 -21,971 20,039 -74,232 1,00 85,73 L1 N ATOM 4120 C LYS 133 -28,044 17,979 -75,156 1,00 81,04 L1 C ATOM 4121 O LYS 133 -28,780 18,307 -76,087 1,00 81,66 L1 O ATOM 4122 N ALA 134 -28,469 17,900 -73,900 1,00 79,38 L1 N ATOM 4123 CA ALA 134 -29,825 18,294 -73,537 _1,0077,97 L1 C ATOM 4124 CB ALA 134 -30,769 17,107 -73,687 1,00 77,34 L1 C ATOM 4125 C ALA 134 -29,882 18,839 -72,110 1,00 77,09 L1 C ATOM 4126 O ALA 134 -29,587 18,126 -71,147 1,00 76,45 L1 O ATOM 4127 N THR 135 -30,262 20,107 -71,983 1,00 75,44 L1 N ATOM 4128 CA THR 135 -30,332 20,765 -70,682 1,00 73,38 L1 C ATOM 4129 CB THR 135 -29,333 21,937 -70,590 1,00 72,52 L1 C ATOM 4130 OG1 THR 135 -28,001 21,455 -70,806 1,00 71,97 L1 O ATOM 4131 CG2 THR 135 -29,414 22,596 -69,221 1,00 71,78 L1 C ATOM 4132 C THR 135 -31,724 21,320 -70,404 1,00 72,81 L1 C ATOM 4133 O THR 135 -32,213 _22,186-71,131 _1,0072,54 L1 O ATOM 4134 N LEU 136 -32,358 20,824 -69,346 1,00 71,97 L1 N ATOM 4135 CA LEU 136 -33,573 21,446 -68,833 1,00 71,28 L1 C ATOM 4136 CB LEU 136 -34,423 20,421 -68,076 1,00 70,86 L1 C (continuación)

ATOM 4137 CG LEU 136 -35,265 19,454 -68,911 1,00 70,08 L1 C ATOM 4138 CD1 LEU 136 -34,370 18,679 -69,858 1,00 70,16 L1 C ATOM 4139 CD2 LEU 136 -36,016 18,507 -67,992 _1,0069,02 L1 C ATOM 4140 C LEU 136 -33,208 22,601 -67,901 1,00 71,09 L1 C ATOM 4141 O LEU 136 -32,394 22,441 -66,987 1,00 71,21 L1 O ATOM 4142 N VAL 137 -33,808 23,764 -68,141 1,00 69,73 L1 N ATOM 4143 CA VAL 137 -33,551 24,943 -67,321 1,00 67,62 L1 C ATOM 4144 CB VAL 137 -33,154 26,153 -68,190 1,00 67,33 L1 C ATOM 4145 CG1 VAL 137 -32,927 27,370 -67,311 _1,0065,83 L1 C ATOM 4146 CG2 VAL 137 -31,901 25,830 -68,989 1,00 67,16 L1 C ATOM 4147 C VAL 137 -34,783 25,317 -66,509 1,00 66,67 L1 C ATOM 4148 O VAL 137 -35,820 25,671 -67,067 1,00 66,72 L1 O ATOM 4149 N CYS 138 -34,662 25,230 -65,188 1,00 65,71 L1 N ATOM 4150 CA CYS 138 -35,747 25,611 -64,290 _1,0063,89 L1 C ATOM 4151 C CYS 138 -35,386 26,893 -63,559 1,00 62,65 L1 C ATOM 4152 O CYS 138 -34,407 26,939 -62,812 1,00 62,18 L1 O ATOM 4153 CB CYS 138 -36,011 24,507 -63,268 1,00 64,16 L1 C ATOM 4154 SG CYS 138 -37,540 24,736 -62,308 1,00 64,86 L1 S ATOM 4155 N LEU 139 -36,182 27,933 -63,775 1,00 61,05 L1 N ATOM 4156 CA LEU 139 -35,925 29,224 -63,156 _1,0059,25 L1 C ATOM 4157 CB LEU 139 -35,920 30,313 -64,223 1,00 59,69 L1 C ATOM 4158 CG LEU 139 -34,894 30,039 -65,322 1,00 60,35 L1 C ATOM 4159 CD1 LEU 139 -34,880 31,188 -66,302 1,00 61,08 L1 C ATOM 4160 CD2 LEU 139 -33,518 29,850 -64,700 1,00 60,90 L1 C ATOM 4161 C LEU 139 -36,957 29,540 -62,078 1,00 57,87 L1 C ATOM 4162 O LEU 139 -38,167 29,469 -62,317 _1,0057,52 L1 O ATOM 4163 N ILE 140 -36,462 29,888 -60,893 1,00 55,44 L1 N ATOM 4164 CA ILE 140 -37,306 30,104 -59,723 1,00 52,95 L1 C ATOM 4165 CB ILE 140 -36,927 29,123 -58,601 1,00 52,69 L1 C ATOM 4166 CG2 ILE 140 -38,000 29,115 -57,525 1,00 50,12 L1 C ATOM 4167 CG1 140 -36,764 27,717 -59,185 1,00 51,28 L1 C ILE ATOM 4168 CD1 ILE 140 -35,977 26,778 -58,301 1,00 51,25 L1 C ATOM 4169 C ILE 140 -37,097 31,531 -59,230 1,00 52,13 L1 C ATOM 4170 O ILE 140 -35,985 31,912 -58,874 1,00 51,51 L1 O ATOM 4171 N SER 141 -38,165 32,321 -59,214 1,00 52,05 L1 N ATOM 4172 CA SER 141 -38,045 33,739 -58,892 1,00 51,89 L1 C ATOM 4173 CB SER 141 -38,136 34,569 -60,176 _1,0052,46 L1 C ATOM 4174 OG SER 141 -39,277 34,202 -60,934 1,00 55,32 L1 O ATOM 4175 C SER 141 -39,086 34,235 -57,889 1,00 50,72 L1 C ATOM 4176 O SER 141 -40,109 33,583 -57,661 1,00 50,55 L1 O ATOM 4177 N ASP 142 -38,802 35,387 -57,285 1,00 48,87 L1 N ATOM 4178 CA ASP 142 -39,777 36,103 -56,470 1,00 47,69 L1 C ATOM 4179 CB ASP 142 -40,938 36,587 -57,342 1,00 48,13 L1 C ATOM 4180 CG ASP 142 -40,522 37,671 -58,310 1,00 47,87 L1 C ATOM 4181 OD1 ASP 142 -40,884 37,580 -59,500 1,00 49,98 L1 O ATOM 4182 OD2 ASP 142 -39,832 38,615 -57,879 1,00 48,34 L1 O ATOM 4183 C ASP 142 -40,339 35,310 -55,298 _1,0046,46 L1 C ATOM 4184 O ASP 142 -41,513 35,458 -54,958 1,00 47,09 L1 O ATOM 4185 N PHE 143 -39,521 34,467 -54,678 1,00 45,07 L1 N ATOM 4186 CA PHE 143 -39,969 33,806 -53,462 1,00 43,57 L1 C ATOM 4187 CB PHE 143 -39,638 32,304 -53,483 1,00 45,13 L1 C (continuación)

ATOM 4188 CG PHE 143 -38,186 31,989 -53,738 1,00 46,48 L1 C ATOM 4189 CD1 PHE 143 -37,335 31,673 -52,686 _1,0046,51 L1 C ATOM 4190 CD2 PHE 143 -37,684 31,963 -55,032 1,00 46,16 L1 C ATOM 4191 CE1 PHE 143 -36,010 31,334 -52,919 1,00 45,94 L1 C ATOM 4192 CE2 PHE 143 -36,360 31,626 -55,273 1,00 46,80 L1 C ATOM 4193 CZ PHE 143 -35,522 31,310 -54,217 1,00 46,20 L1 C ATOM 4194 C PHE 143 -39,377 34,465 -52,230 1,00 41,63 L1 C ATOM 4195 O PHE 143 -38,354 35,150 -52,311 _1,0039,49 L1 O ATOM 4196 N TYR 144 -40,050 34,280 -51,098 1,00 39,96 L1 N ATOM 4197 CA TYR 144 -39,596 34,830 -49,827 1,00 40,17 L1 C ATOM 4198 CB TYR 144 -39,838 36,343 -49,777 1,00 37,41 L1 C ATOM 4199 CG TYR 144 -39,404 36,963 -48,468 1,00 36,24 L1 C ATOM 4200 CD1 TYR 144 -40,278 37,034 -47,386 _1,0033,84 L1 C ATOM 4201 CE1 TYR 144 -39,873 37,566 -46,176 1,00 32,19 L1 C ATOM 4202 CD2 TYR 144 -38,111 37,445 -48,300 1,00 34,26 L1 C ATOM 4203 CE2 TYR 144 -37,698 37,978 -47,095 1,00 32,36 L1 C ATOM 4204 CZ TYR 144 -38,582 38,038 -46,038 1,00 31,01 L1 C ATOM 4205 OH TYR 144 -38,180 38,588 -44,844 1,00 32,81 L1 O ATOM 4206 C TYR 144 -40,340 34,158 -48,680 _1,0040,52 L1 C ATOM 4207 O TYR 144 -41,560 34,011 -48,728 1,00 42,86 L1 O ATOM 4208 N PRO 145 -39,615 33,740 -47,633 1,00 40,04 L1 N ATOM 4209 CD PRO 145 -40,238 33,151 -46,436 1,00 39,62 L1 C ATOM 4210 CA PRO 145 -38,156 33,852 -47,500 1,00 41,17 L1 C ATOM 4211 CB PRO 145 -37,875 33,348 -46,080 1,00 40,22 L1 C ATOM 4212 CG PRO 145 -39,073 32,561 -45,692 _1,0039,21 L1 C ATOM 4213 C PRO 145 -37,354 33,086 -48,555 1,00 43,02 L1 C ATOM 4214 O PRO 145 -37,912 32,315 -49,340 1,00 42,96 L1 O ATOM 4215 N GLY 146 -36,041 33,310 -48,569 1,00 44,40 L1 N ATOM 4216 CA GLY 146 -35,200 32,759 -49,618 1,00 46,46 L1 C ATOM 4217 C GLY 146 -34,687 31,351 -49,356 1,00 48,24 L1 C ATOM 4218 O GLY 146 -33,481 31,137 -49,233 _1,0047,83 L1 O ATOM 4219 N ALA 147 -35,603 30,389 -49,279 1,00 49,04 L1 N ATOM 4220 CA ALA 147 -35,233 28,992 -49,084 1,00 50,76 L1 C ATOM 4221 CB ALA 147 -35,225 28,657 -47,597 1,00 48,27 L1 C ATOM 4222 C ALA 147 -36,193 28,063 -49,825 1,00 52,27 L1 C ATOM 4223 O ALA 147 -37,394 28,034 -49,544 1,00 54,27 L1 O ATOM 4224 N VAL 148 -35,658 27,302 -50,773 _1,0052,98 L1 N ATOM 4225 CA VAL 148 -36,448 26,317 -51,504 1,00 53,70 L1 C ATOM 4226 CB VAL 148 -36,780 26,809 -52,935 1,00 52,32 L1 C ATOM 4227 CG1 VAL 148 -37,632 28,061 -52,872 1,00 51,32 L1 C ATOM 4228 CG2 VAL 148 -35,495 27,084 -53,698 1,00 50,98 L1 C ATOM 4229 C VAL 148 -35,704 24,990 -51,615 1,00 54,30 L1 C ATOM 4230 O VAL 148 -34,493 24,927 -51,415 1,00 53,75 L1 O ATOM 4231 N THR 149 -36,442 23,930 -51,928 1,00 55,67 L1 N ATOM 4232 CA THR 149 -35,835 22,680 -52,369 1,00 56,75 L1 C ATOM 4233 CB THR 149 -36,112 21,540 -51,373 1,00 56,63 L1 C ATOM 4234 OG1 THR 149 -37,519 21,462 -51,115 _1,0055,86 L1 O ATOM 4235 CG2 THR 149 -35,364 21,780 -50,071 1,00 55,91 L1 C ATOM 4236 C THR 149 -36,392 22,294 -53,734 1,00 58,18 L1 C ATOM 4237 O THR 149 -37,597 22,400 -53,977 1,00 58,23 L1 O ATOM 4238 N VAL 150 -35,510 21,849 -54,623 1,00 59,58 L1 N ATOM 4239 CA VAL 150 -35,909 21,510 -55,983 1,00 62,22 L1 C (continuación)

ATOM 4240 CB VAL 150 -35,024 22,235 -57,015 _1,0062,03 L1 C ATOM 4241 CG1 VAL 150 -35,498 21,913 -58,422 1,00 62,67 L1 C ATOM 4242 CG2 VAL 150 -35,063 23,732 -56,768 1,00 62,69 L1 C ATOM 4243 C VAL 150 -35,833 20,008 -56,248 1,00 63,79 L1 C ATOM 4244 O VAL 150 -34,762 19,401 -56,166 1,00 64,56 L1 O ATOM 4245 N ALA 151 -36,978 19,414 -56,566 1,00 64,58 L1 N ATOM 4246 CA ALA 151 -37,034 18,014 -56,964 _1,0065,49 L1 C ATOM 4247 CB ALA 151 -38,086 17,282 -56,144 1,00 64,19 L1 C ATOM 4248 C ALA 151 -37,364 17,913 -58,450 1,00 66,84 L1 C ATOM 4249 O ALA 151 -38,276 18,580 -58,939 1,00 67,66 L1 O ATOM 4250 N TRP 152 -36,613 17,084 -59,167 1,00 67,84 L1 N ATOM 4251 CA TRP 152 -36,882 16,842 -60,579 _1,0069,16 L1 C ATOM 4252 CB TRP 152 -35,579 16,851 -61,380 1,00 67,01 L1 C ATOM 4253 CG TRP 152 -34,968 18,213 -61,549 1,00 64,07 L1 C ATOM 4254 CD2 TRP 152 -35,151 19,103 -62,658 1,00 62,91 L1 C ATOM 4255 CE2 TRP 152 -34,345 20,235 -62,422 1,00 62,02 L1 C ATOM 4256 CE3 TRP 152 -35,916 19,050 -63,829 1,00 62,20 L1 C ATOM 4257 CD1 TRP 152 -34,088 18,827 -60,707 _{1,00 62,61}L1 C ATOM 4258 NE1 TRP 152 -33,707 20,042 -61,225 1,00 61,78 L1 N ATOM 4259 CZ2 TRP 152 -34,281 21,304 -63,313 1,00 61,34 L1 C ATOM 4260 CZ3 TRP 152 -35,850 20,113 -64,714 1,00 61,43 L1 C ATOM 4261 CH2 TRP 152 -35,038 21,224 -64,451 1,00 61,91 L1 C ATOM 4262 C TRP 152 -37,579 15,500 -60,751 1,00 71,64 L1 C ATOM 4263 O TRP 152 -37,339 14,564 -59,985 _1,0071,81 L1 O ATOM 4264 N LYS 153 -38,440 15,407 -61,759 1,00 73,83 L1 N ATOM 4265 CA LYS 153 -39,267 14,221 -61,939 1,00 76,53 L1 C ATOM 4266 CB LYS 153 -40,708 14,532 -61,520 1,00 77,51 , L1 C ATOM 4267 CG LYS 153 -41,453 13,361 -60,900 1,00 78,87 L1 C ATOM 4268 CD LYS 153 -41,399 13,407 -59,376 1,00 79,45 L1 C ATOM 4269 CE LYS 153 -39,981 13,219 -58,855 _{1,00 80,16}L1 C ATOM 4270 NZ LYS 153 -39,927 13,194 -57,366 1,00 79,77 L1 N ATOM 4271 C LYS 153 -39,243 13,737 -63,389 1,00 77,70 L1 C ATOM 4272 O LYS 153 -39,608 14,475 -64,304 1,00 77,96 L1 O ATOM 4273 N ALA 154 -38,809 12,495 -63,590 1,00 79,25 L1 N ATOM 4274 CA ALA 154 -38,815 11,880 -64,917 1,00 80,39 L1 C ATOM 4275 CB ALA 154 -37,575 11,013 -65,098 _1,0079,94 L1 C ATOM 4276 C ALA 154 -40,075 11,035 -65,085 1,00 81,09 L1 C ATOM 4277 O ALA 154 -40,234 10,008 -64,426 1,00 80,56 L1 O ATOM 4278 N ASP 155 -40,962 11,470 -65,976 1,00 82,58 L1 N ATOM 4279 CA ASP 155 -42,319 10,933 -66,034 1,00 84,19 L1 C ATOM 4280 CB ASP 155 -42,302 9,446 -66,414 1,00 85,20 L1 C ATOM 4281 CG ASP 155 -42,034 9,222 -67,893 1,00 86,13 L1 C ATOM 4282 OD1 ASP 155 -42,635 9,939 -68,723 1,00 85,84 L1 O ATOM 4283 OD2 ASP 155 -41,225 8,326 -68,225 1,00 86,10 L1 O ATOM 4284 C ASP 155 -42,981 11,105 -64,673 1,00 84,53 L1 C ATOM 4285 O ASP 155 -43,575 12,144 -64,388 _1,0084,90 L1 O ATOM 4286 N SER 156 -42,866 10,081 -63,834 1,00 84,79 L1 N ATOM 4287 CA SER 156 -43,383 10,136 -62,472 1,00 84,82 L1 C ATOM 4288 CB SER 156 -44,545 9,154 -62,310 1,00 85,15 L1 C ATOM 4289 OG SER 156 -45,527 9,358 -63,312 1,00 85,88 L1 O ATOM 4290 C SER 156 -42,270 9,777 -61,495 1,00 84,72 L1 C ATOM 4291 O SER 156 -42,374 10,029 -60,295 _1,0084,40 L1 O (continuación)

ATOM 4292 N SER 157 -41,205 9,182 -62,023 1,00 84,73 L1 N ATOM 4293 CA SER 157 -40,101 8,708 -61,198 1,00 84,69 L1 C ATOM 4294 CB SER 157 -39,301 7,635 -61,946 1,00 84,54 L1 C ATOM 4295 OG SER 157 -40,079 6,469 -62,163 1,00 84,37 L1 O ATOM 4296 C SER 157 -39,169 9,843 -60,796 1,00 84,54 L1 C ATOM 4297 O SER 157 -38,933 10,776 -61,565 _1,0083,92 L1 O ATOM 4298 N PRO 158 -38,631 9,773 -59,571 1,00 84,51 L1 N ATOM 4299 CD PRO 158 -39,055 8,832 -58,521 1,00 84,52 L1 C ATOM 4300 CA PRO 158 -37,633 10,728 -59,079 1,00 84,62 L1 C ATOM 4301 CB PRO 158 -37,393 10,286 -57,635 1,00 84,58 L1 C ATOM 4302 CG PRO 158 -38,625 9,522 -57,263 _1,0084,46 L1 C ATOM 4303 C PRO 158 -36,352 10,680 -59,909 1,00 84,68 L1 C ATOM 4304 O PRO 158 -35,918 9,607 -60,333 1,00 84,90 L1 O ATOM 4305 N VAL 159 -35,753 11,844 -60,141 1,00 84,33 L1 N ATOM 4306 CA VAL 159 -34,479 11,919 -60,847 1,00 83,83 L1 C ATOM 4307 CB VAL 159 -34,463 13,086 -61,860 1,00 84,04 L1 C ATOM 4308 CG1 VAL 159 -33,084 13,210 -62,492 _1,0083,62 L1 C ATOM 4309 CG2 VAL 159 -35,516 12,857 -62,931 1,00 83,67 L1 C ATOM 4310 C VAL 159 -33,328 12,110 -59,864 1,00 83,32 L1 C ATOM 4311 O VAL 159 -33,329 13,042 -59,060 1,00 83,25 L1 O ATOM 4312 N LYS 160 -32,345 11,221 -59,937 1,00 82,48 L1 N ATOM 4313 CA LYS 160 -31,199 11,284 -59,040 1,00 81,67 L1 C ATOM 4314 CB LYS ₁₆₀-30,533 9,905 -58,947 _1,0081,53 L1 C ATOM 4315 CG LYS 160 -31,408 8,839 -58,305 1,00 81,07 L1 C ATOM 4316 CD LYS 160 -31,257 7,491 -58,997 1,00 80,52 L1 C ATOM 4317 CE LYS 160 -32,249 6,480 -58,440 1,00 80,19 L1 C ATOM 4318 NZ LYS 160 -32,296 5,224 -59,240 1,00 80,25 L1 N ATOM 4319 C LYS 160 -30,180 12,328 -59,499 1,00 80,59 L1 C ATOM 4320 O LYS ₁₆₀-30,155 13,449 -58,990 _1,0080,48 L1 O ATOM 4321 N ALA 161 -29,352 11,958 -60,472 1,00 78,88 L1 N ATOM 4322 CA ALA 161 -28,194 12,764 -60,839 1,00 76,98 L1 C ATOM 4323 CB ALA 161 -27,015 11,855 -61,163 1,00 77,49 L1 C ATOM 4324 C ALA 161 -28,471 13,694 -62,014 1,00 75,33 L1 C ATOM 4325 O ALA 161 -29,578 13,719 -62,554 1,00 74,70 L1 O ATOM 4326 N GLY ₁₆₂-27,450 14,455 -62,400 _1,0073,68 L1 N ATOM 4327 CA GLY 162 -27,592 15,404 -63,490 1,00 71,48 L1 C ATOM 4328 C GLY 162 -28,113 16,746 -63,013 1,00 70,15 L1 C ATOM 4329 O GLY 162 -28,263 17,681 -63,802 1,00 69,01 L1 O ATOM 4330 N VAL 163 -28,383 16,839 -61,713 1,00 69,08 L1 N ATOM 4331 CA VAL 163 -29,013 18,020 -61,132 1,00 67,56 L1 C ATOM 4332 CB VAL 163 -29,963 17,627 -59,978 1,00 67,21 L1 C ATOM 4333 CG1 VAL 163 -30,631 18,868 -59,406 1,00 66,89 L1 C ATOM 4334 CG2 VAL 163 -31,006 16,642 -60,477 1,00 66,02 L1 C ATOM 4335 C VAL 163 -27,986 19,019 -60,601 1,00 66,76 L1 C ATOM 4336 O VAL 163 -27,082 18,659 -59,846 _1,0065,41 L1 O ATOM 4337 N GLU 164 -28,139 20,277 -61,000 1,00 66,54 L1 N ATOM 4338 CA GLU 164 -27,250 21,345 -60,551 1,00 66,37 L1 C ATOM 4339 CB GLU 164 -26,269 21,708 -61,667 1,00 67,88 L1 C ATOM 4340 CG GLU 164 -24,859 21,983 -61,192 1,00 69,70 L1 C ATOM 4341 CD GLU 164 -24,073 20,712 -60,971 1,00 70,76 L1 C ATOM 4342 OE1 GLU 164 -23,934 20,298 -59,801 _1,0071,18 L1 O ATOM 4343 OE2 GLU 164 -23,597 20,127 -61,969 1,00 71,13 L1 O (continuación)

ATOM 4344 C GLU 164 -28,076 22,577 -60,174 1,00 64,94 L1 C ATOM 4345 O GLU 164 -28,643 23,243 -61,041 1,00 64,32 L1 O ATOM 4346 N THR 165 -28,140 22,876 -58,881 1,00 62,91 L1 N ATOM 4347 CA THR 165 -28,991 23,957 -58,391 1,00 61,09 L1 C ATOM 4348 CB THR 165 -30,086 23,418 -57,441 _{1,00 60,86}L1 C ATOM 4349 OG1 THR 165 -30,918 22,485 -58,144 1,00 60,45 L1 O ATOM 4350 CG2 THR 165 -30,947 24,560 -56,915 1,00 59,22 L1 C ATOM 4351 C THR 165 -28,192 25,025 -57,649 1,00 59,97 L1 C ATOM 4352 O THR 165 -27,360 24,714 -56,795 1,00 60,22 L1 O ATOM 4353 N THR ₁₆₆-28,455 _26,286-57,973 _1,0057,86 L1 N ATOM 4354 CA THR 166 -27,779 27,393 -57,312 1,00 57,52 L1 C ATOM 4355 CB THR 166 -27,989 28,715 -58,071 1,00 57,94 L1 C ATOM 4356 OG1 THR 166 -29,386 29,037 -58,088 1,00 56,92 L1 O ATOM 4357 CG2 THR 166 -27,471 28,599 -59,496 1,00 57,35 L1 C ATOM 4358 C THR 166 -28,276 27,600 -55,883 1,00 56,25 L1 C ATOM 4359 O THR ₁₆₆-29,303 27,052 -55,475 _1,0055,75 L1 O ATOM 4360 N THR 167 -27,536 28,400 -55,127 1,00 54,65 L1 N ATOM 4361 CA THR 167 -28,032 28,910 -53,860 1,00 54,27 L1 C ATOM 4362 CB THR 167 -26,877 29,393 -52,963 1,00 54,52 L1 C ATOM 4363 OG1 THR 167 -26,172 30,451 -53,623 1,00 53,89 L1 O ATOM 4364 CG2 THR 167 -25,909 28,250 -52,680 1,00 54,44 L1 C ATOM 4365 C THR 167 -28,949 30,089 -54,161 _1,0053,66 L1 C ATOM 4366 O THR 167 -28,730 30,829 -55,121 1,00 52,20 L1 O ATOM 4367 N PRO 168 -29,998 30,273 -53,351 1,00 54,17 L1 N ATOM 4368 CD PRO 168 -30,507 29,340 -52,331 1,00 53,81 L1 C ATOM 4369 CA PRO 168 -30,894 31,418 -53,544 1,00 53,90 L1 C ATOM 4370 CB PRO 168 -31,944 31,238 -52,450 1,00 53,59 L1 C ATOM 4371 CG PRO ₁₆₈-31,945 29,761 -52,185 _1,0054,66 L1 C ATOM 4372 C PRO 168 -30,153 32,748 -53,427 1,00 53,20 L1 C ATOM 4373 O PRO 168 -29,358 32,942 -52,511 1,00 54,37 L1 O ATOM 4374 N SER 169 -30,413 33,654 -54,363 1,00 52,86 L1 N ATOM 4375 CA SER 169 -29,782 34,971 -54,360 1,00 52,56 L1 C ATOM 4376 CB SER 169 -28,984 35,169 -55,647 1,00 51,77 L1 C ATOM 4377 OG SER 169 -29,775 34,846 -56,779 _1,0053,89 L1 O ATOM 4378 C SER 169 -30,821 36,083 -54,224 1,00 52,72 L1 C ATOM 4379 O SER 169 -31,943 35,962 -54,716 1,00 51,23 L1 O ATOM 4380 N LYS 170 -30,440 37,167 -53,556 1,00 53,95 L1 N ATOM 4381 CA LYS 170 -31,375 38,246 -53,266 1,00 55,76 L1 C ATOM 4382 CB LYS 170 -30,868 39,080 -52,086 1,00 57,25 L1 C ATOM 4383 CG LYS 170 -31,817 40,193 -51,657 1,00 59,84 L1 C ATOM 4384 CD LYS 170 -31,307 40,916 -50,417 1,00 60,88 L1 C ATOM 4385 CE LYS 170 -31,110 39,953 -49,254 1,00 63,31 L1 C ATOM 4386 NZ LYS 170 -32,375 39,253 -48,887 1,00 65,05 L1 N ATOM 4387 C LYS 170 -31,590 39,147 -54,478 _1,0055,79 L1 C ATOM 4388 O LYS 170 -30,646 39,745 -54,992 1,00 56,34 L1 O ATOM 4389 N GLN 171 -32,839 39,240 -54,927 1,00 55,98 L1 N ATOM 4390 CA GLN 171 -33,200 40,121 -56,032 1,00 56,08 L1 C ATOM 4391 CB GLN 171 -34,559 39,716 -56,610 1,00 54,88 L1 C ATOM 4392 CG GLN 171 -34,622 38,299 -57,149 1,00 55,49 L1 C ATOM 4393 CD GLN 171 -36,046 37,850 -57,439 _1,0056,91 L1 C ATOM 4394 OE1 GLN 171 -36,271 36,805 -58,053 1,00 56,50 L1 O ATOM 4395 NE2 GLN 171 -37,018 38,643 -56,995 1,00 56,59 L1 N (continuación)

ATOM 4396 C GLN 171 -33,263 41,575 -55,567 1,00 57,33 L1 C ATOM 4397 O GLN 171 -32,982 41,882 -54,407 1,00 58,32 L1 O ATOM 4398 N SER 172 -33,637 42,465 -56,481 1,00 57,40 L1 N ATOM 4399 CA SER 172 -33,736 43,889 -56,178 _1,0057,00 L1 C ATOM 4400 CB SER 172 -33,911 44,682 -57,473 1,00 57,43 L1 C ATOM 4401 OG SER 172 -34,948 44,123 -58,263 1,00 58,48 L1 O ATOM 4402 C SER 172 -34,900 44,183 -55,233 1,00 56,38 L1 C ATOM 4403 O SER 172 -34,776 45,001 -54,322 1,00 57,23 L1 O ATOM 4404 N ASN 173 -36,026 43,511 -55,454 _1,0054,81 L1 N ATOM 4405 CA ASN 173 -37,207 43,684 -54,613 1,00 52,81 L1 C ATOM 4406 CB ASN 173 -38,442 43,191 -55,356 1,00 53,01 L1 C ATOM 4407 CG ASN 173 -38,286 41,770 -55,848 1,00 54,06 L1 C ATOM 4408 OD1 ASN 173 -37,432 41,027 -55,364 1,00 54,19 L1 O ATOM 4409 ND2 ASN 173 -39,108 41,383 -56,816 1,00 54,46 L1 N ATOM 4410 C ASN 173 -37,062 42,919 -53,298 _1,0052,76 L1 C ATOM 4411 O ASN 173 -38,020 42,770 -52,540 1,00 51,62 L1 O ATOM 4412 N ASN 174 -35,858 42,423 -53,042 1,00 52,25 L1 N ATOM 4413 CA ASN 174 -35,560 41,753 -51,788 1,00 50,29 L1 C ATOM 4414 CB ASN 174 -35,930 42,661 -50,615 1,00 53,67 L1 C ATOM 4415 CG ASN 174 -34,994 43,848 -50,488 1,00 55,99 L1 C ATOM 4416 OD1 ASN 174 -33,839 43,694 -50,091 _1,0058,37 L1 O ATOM 4417 ND2 ASN 174 -35,483 45,037 -50,830 1,00 56,42 L1 N ATOM 4418 C ASN 174 -36,253 40,402 -51,654 1,00 48,00 L1 C ATOM 4419 O ASN 174 -36,163 39,755 -50,611 1,00 45,22 L1 O ATOM 4420 N LYS 175 -36,944 39,977 -52,709 1,00 46,20 L1 N ATOM 4421 CA LYS 175 -37,315 38,574 -52,844 1,00 45,58 L1 C ATOM 4422 CB LYS 175 -38,486 38,410 -53,819 _1,0044,39 L1 C ATOM 4423 CG LYS 175 -39,801 39,024 -53,348 1,00 44,61 L1 C ATOM 4424 CD LYS 175 -40,991 38,369 -54,048 1,00 44,52 L1 C ATOM 4425 CE LYS 175 -42,325 38,951 -53,593 1,00 44,60 L1 C ATOM 4426 NZ LYS 175 -42,567 40,326 -54,117 1,00 43,73 L1 N ATOM 4427 C LYS 175 -36,095 37,812 -53,359 1,00 46,51 L1 C ATOM 4428 O LYS 175 -35,042 38,404 -53,590 _1,0046,31 L1 O ATOM 4429 N TYR 176 -36,229 36,503 -53,535 1,00 47,57 L1 N ATOM 4430 CA TYR 176 -35,092 35,680 -53,940 1,00 49,06 L1 C ATOM 4431 CB TYR 176 -34,766 34,665 -52,847 1,00 47,73 L1 C ATOM 4432 CG TYR 176 -34,098 35,252 -51,631 1,00 48,77 L1 C ATOM 4433 CD1 TYR 176 -32,771 34,961 -51,345 1,00 49,57 L1 C ATOM 4434 CE1 TYR 176 -32,160 35,455 -50,210 1,00 51,42 L1 C ATOM 4435 CD2 TYR 176 -34,799 36,066 -50,743 1,00 48,10 L1 C ATOM 4436 CE2 TYR 176 -34,193 36,568 -49,600 1,00 48,23 L1 C ATOM 4437 CZ TYR 176 -32,871 36,255 -49,339 1,00 50,96 L1 C ATOM 4438 OH TYR 176 -32,247 36,721 -48,202 _1,0051,85 L1 O ATOM 4439 C TYR 176 -35,296 34,936 -55,260 1,00 50,28 L1 C ATOM 4440 O TYR 176 -36,421 34,615 -55,648 1,00 50,45 L1 O ATOM 4441 N ALA 177 -34,186 34,658 -55,937 1,00 50,51 L1 N ATOM 4442 CA ALA 177 -34,201 33,888 -57,170 1,00 52,09 L1 C ATOM 4443 CB ALA 177 -33,844 34,784 -58,352 1,00 50,29 L1 C ATOM 4444 C ALA 177 -33,212 32,731 -57,074 _1,0053,43 L1 C ATOM 4445 O ALA 177 -32,246 32,784 -56,307 1,00 52,69 L1 O ATOM 4446 N ALA 178 -33,459 31,689 -57,861 1,00 54,62 L1 N ATOM 4447 CA ALA 178 -32,601 30,513 -57,875 1,00 55,83 L1 C (continuación)

ATOM 4448 CB ALA 178 -33,021 29,550 -56,773 1,00 55,75 L1 C ATOM 4449 C ALA 178 -32,690 29,825 -59,230 1,00 56,94 L1 C ATOM 4450 O ALA 178 -33,667 29,995 -59,958 _1,0056,28 L1 O ATOM 4451 N SER 179 -31,662 29,052 -59,563 1,00 58,47 L1 N ATOM 4452 CA SER 179 -31,650 28,281 -60,800 1,00 59,49 L1 C ATOM 4453 CB SER 179 -30,569 28,812 -61,742 1,00 58,95 L1 C ATOM 4454 OG SER 179 -30,847 30,142 -62,130 1,00 60,29 L1 O ATOM 4455 C SER 179 -31,395 26,805 -60,520 _{1,00 60,01}L1 C ATOM 4456 O SER 179 -30,626 26,455 -59,625 1,00 60,02 L1 O ATOM 4457 N SER 180 -32,050 25,943 -61,290 1,00 60,42 L1 N ATOM 4458 CA SER 180 -31,746 24,520 -61,264 1,00 61,35 L1 C ATOM 4459 CB SER 180 -32,836 23,755 -60,509 1,00 60,80 L1 C ATOM 4460 OG SER 180 -32,458 22,404 -60,306 1,00 59,95 L1 O ATOM 4461 C SER ₁₈₀-31,637 23,994 -62,690 _1,0062,30 L1 C ATOM 4462 O SER 180 -32,556 24,150 -63,493 1,00 61,67 L1 O ATOM 4463 N TYR 181 -30,505 23,376 -63,003 1,00 63,90 L1 N ATOM 4464 CA TYR 181 -30,283 22,822 -64,332 1,00 64,83 L1 C ATOM 4465 CB TYR 181 -28,971 23,354 -64,904 1,00 63,82 L1 C ATOM 4466 CG TYR 181 -28,972 24,844 -65,154 1,00 64,75 L1 C ATOM 4467 CD1 TYR ₁₈₁-28,789 25,744 -64,112 _1,0064,15 L1 C ATOM 4468 CE1 TYR 181 -28,756 27,107 -64,346 1,00 65,10 L1 C ATOM 4469 CD2 TYR 181 -29,127 25,350 -66,439 1,00 63,88 L1 C ATOM 4470 CE2 TYR 181 -29,096 26,708 -66,682 1,00 63,92 L1 C ATOM 4471 CZ TYR 181 -28,908 27,583 -65,634 1,00 65,26 L1 C ATOM 4472 OH TYR 181 -28,850 28,934 -65,881 1,00 65,71 L1 O ATOM 4473 C TYR ₁₈₁-30,244 21,302 -64,290 _1,0066,15 L1 C ATOM 4474 O TYR 181 -29,520 20,712 -63,486 1,00 66,57 L1 O ATOM 4475 N LEU 182 -31,030 20,668 -65,152 1,00 67,55 L1 N ATOM 4476 CA LEU 182 -30,982 19,217 -65,284 1,00 69,82 L1 C ATOM 4477 CB LEU 182 -32,388 18,618 -65,181 1,00 69,84 L1 C ATOM 4478 CG LEU 182 -32,470 17,116 -65,479 1,00 70,75 L1 C ATOM 4479 CD1 LEU ₁₈₂-31,428 16,367 -64,653 _1,0070,11 L1 C ATOM 4480 CD2 LEU 182 -33,870 16,602 -65,179 1,00 70,49 L1 C ATOM 4481 C LEU 182 -30,351 18,814 -66,613 1,00 70,96 L1 C ATOM 4482 O LEU 182 -30,884 19,117 -67,683 1,00 71,15 L1 O ATOM 4483 N SER 183 -29,214 18,131 -66,536 1,00 71,50 L1 N ATOM 4484 CA SER 183 -28,553 17,619 -67,728 1,00 71,86 L1 C ATOM 4485 CB SER 183 -27,033 17,734 -67,584 1,00 71,20 L1 C ATOM 4486 OG SER 183 -26,626 19,092 -67,550 1,00 70,56 L1 O ATOM 4487 C SER 183 -28,937 16,166 -67,964 1,00 72,44 L1 C ATOM 4488 O SER 183 -28,869 15,339 -67,057 1,00 72,17 L1 O ATOM 4489 N LEU 184 -29,353 15,865 -69,188 _1,0073,34 L1 N ATOM 4490 CA LEU 184 -29,605 14,489 -69,591 1,00 74,57 L1 C ATOM 4491 CB LEU 184 -31,074 14,125 -69,346 1,00 74,23 L1 C ATOM 4492 CG LEU 184 -32,149 15,157 -69,697 1,00 73,95 L1 C ATOM 4493 CD1 LEU 184 -32,186 15,392 -71,194 1,00 74,22 L1 C ATOM 4494 CD2 LEU 184 -33,496 14,657 -69,211 1,00 73,72 L1 C ATOM 4495 C LEU 184 -29,243 14,299 -71,060 _1,0075,82 L1 C ATOM 4496 O LEU 184 -29,060 15,273 -71,791 1,00 75,56 L1 O ATOM 4497 N THR 185 -29,124 13,047 -71,489 1,00 77,26 L1 N ATOM 4498 CA THR 185 -28,787 12,766 -72,878 1,00 78,90 L1 C ATOM 4499 CB THR 185 -28,252 11,321 -73,056 1,00 79,12 L1 C (continuación)

ATOM 4500 OG1 THR 185 -29,259 10,378 -72,664 1,00 79,12 L1 O ATOM 4501 CG2 THR 185 -27,001 11,109 -72,210 _1,0078,20 L1 C ATOM 4502 C THR 185 -30,023 12,955 -73,748 1,00 79,76 L1 C ATOM 4503 O THR 185 -31,148 12,692 -73,313 1,00 79,50 L1 O ATOM 4504 N PRO 186 -29,828 13,420 -74,992 1,00 80,66 L1 N ATOM 4505 CD PRO 186 -28,522 13,709 -75,608 1,00 80,61 L1 C ATOM 4506 CA PRO ₁₈₆-30,939 13,701 -75,908 _{1,00 81,88}L1 C ATOM 4507 CB PRO 186 -30,240 14,073 -77,215 1,00 81,41 L1 C ATOM 4508 CG PRO 186 -28,889 14,557 -76,788 1,00 80,92 L1 C ATOM 4509 C PRO 186 -31,843 12,485 -76,068 1,00 83,38 L1 C ATOM 4510 O PRO 186 -33,050 12,612 -76,280 1,00 83,33 L1 O ATOM 4511 N GLU 187 -31,242 11,305 -75,955 1,00 84,89 L1 N ATOM 4512 CA GLU 187 -31,967 10,050 -76,094 _{1,00 86,26}L1 C ATOM 4513 CB GLU 187 -30,988 8,872 -76,050 1,00 86,44 L1 C ATOM 4514 CG GLU 187 -29,896 8,924 -77,117 1,00 87,62 L1 C ATOM 4515 CD GLU 187 -28,843 9,992 -76,843 1,00 88,12 L1 C ATOM 4516 OE1 GLU 187 -28,057 9,823 -75,886 1,00 88,36 L1 O ATOM 4517 OE2 GLU 187 -28,800 10,996 -77,587 1,00 87,80 L1 O ATOM 4518 C GLU 187 -33,007 9,900 -74,987 _1,0086,75 L1 C ATOM 4519 O GLU 187 -34,201 9,762 -75,260 1,00 87,11 L1 O ATOM 4520 N GLN 188 -32,551 9,938 -73,738 1,00 86,85 L1 N ATOM 4521 CA GLN 188 -33,449 9,776 -72,601 1,00 86,86 L1 C ATOM 4522 CB GLN 188 -32,645 9,606 -71,310 1,00 86,25 L1 C ATOM 4523 CG GLN 188 -31,628 10,699 -71,052 1,00 86,47 L1 C ATOM 4524 CD GLN ₁₈₈-30,730 10,378 -69,873 _1,0086,63 L1 C ATOM 4525 OE1 GLN 188 -29,527 10,641 -69,901 1,00 86,47 L1 O ATOM 4526 NE2 GLN 188 -31,312 9,802 -68,828 1,00 86,42 L1 N ATOM 4527 C GLN 188 -34,415 10,951 -72,466 1,00 87,03 L1 C ATOM 4528 O GLN 188 -35,455 10,836 -71,817 1,00 86,87 L1 O ATOM 4529 N TRP 189 -34,072 12,078 -73,085 1,00 86,98 L1 N ATOM 4530 CA TRP 189 -34,980 13,220 -73,142 _1,0087,11 L1 C ATOM 4531 CB TRP 189 -34,300 14,398 -73,847 1,00 87,05 L1 C ATOM 4532 CG TRP 189 -35,253 15,455 -74,337 1,00 87,49 L1 C ATOM 4533 CD2 TRP 189 -36,222 16,172 -73,558 1,00 87,50 L1 C ATOM 4534 CE2 TRP 189 -36,888 17,056 -74,430 1,00 87,06 L1 C ATOM 4535 CE3 TRP 189 -36,590 16,151 -72,208 1,00 87,12 L1 C ATOM 4536 CD1 TRP 189 -35,371 15,923 -75,615 1,00 87,14 L1 C ATOM 4537 NE1 TRP 189 -36,351 16,885 -75,679 1,00 87,03 L1 N ATOM 4538 CZ2 TRP 189 -37,900 17,911 -73,998 1,00 87,27 L1 C ATOM 4539 CZ3 TRP 189 -37,597 17,000 -71,781 1,00 87,07 L1 C ATOM 4540 CH2 TRP 189 -38,239 17,868 -72,673 _1,0087,37 L1 C ATOM 4541 C TRP 189 -36,256 12,839 -73,886 1,00 87,39 L1 C ATOM 4542 O TRP 189 -37,366 13,094 -73,416 1,00 86,90 L1 O ATOM 4543 N LYS 190 -36,086 12,216 -75,047 1,00 88,13 L1 N ATOM 4544 CA LYS 190 -37,209 11,865 -75,910 1,00 88,58 L1 C ATOM 4545 CB LYS 190 -36,711 11,657 -77,343 1,00 88,28 L1 C ATOM 4546 CG LYS 190 -35,788 12,759 -77,847 _1,0087,78 L1 C ATOM 4547 CD LYS 190 -36,571 13,950 -78,371 1,00 87,40 L1 C ATOM 4548 CE LYS 190 -37,307 13,602 -79,657 1,00 86,94 L1 C ATOM 4549 NZ LYS 190 -38,075 14,758 -80,198 1,00 86,22 L1 N ATOM 4550 C LYS 190 -37,917 10,600 -75,423 1,00 88,94 L1 C ATOM 4551 O LYS 190 -39,079 10,361 -75,756 1,00 88,78 L1 O (continuación)

ATOM 4552 N SER 191 -37,212 9,797 -74,631 _1,0089,21 L1 N ATOM 4553 CA SER 191 -37,719 8,494 -74,213 1,00 89,73 L1 C ATOM 4554 CB SER 191 -36,556 7,586 -73,801 1,00 90,11 L1 C ATOM 4555 OG SER 191 -35,907 8,073 -72,639 1,00 90,61 L1 O ATOM 4556 C SER 191 -38,728 8,582 -73,068 1,00 89,98 L1 C ATOM 4557 O SER 191 -39,285 7,567 -72,645 _1,0089,77 L1 O ATOM 4558 N HIS 192 -38,957 9,790 -72,561 1,00 90,04 L1 N ATOM 4559 CA HIS 192 -39,911 9,986 -71,474 1,00 89,79 L1 C ATOM 4560 CB HIS 192 -39,214 10,625 -70,268 1,00 89,58 L1 C ATOM 4561 CG HIS 192 -38,255 9,712 -69,569 1,00 89,63 L1 C ATOM 4562 CD2 HIS 192 -36,938 9,472 -69,776 1,00 89,30 L1 C ATOM 4563 ND1 HIS 192 -38,625 8,915 -68,506 _1,0089,88 L1 N ATOM 4564 CE1 HIS 192 -37,578 8,225 -68,089 1,00 89,37 L1 C ATOM 4565 NE2 HIS 192 -36,541 8,545 -68,843 1,00 89,09 L1 N ATOM 4566 C HIS 192 -41,093 10,850 -71,906 1,00 89,78 L1 C ATOM 4567 O HIS 192 -40,961 11,703 -72,785 1,00 89,72 L1 O ATOM 4568 N ARG 193 -42,246 10,620 -71,282 1,00 89,66 L1 N ATOM 4569 CA ARG 193 -43,456 11,380 -71,583 _1,0089,47 L1 C ATOM 4570 CB ARG 193 -44,650 10,806 -70,812 1,00 90,32 L1 C ATOM 4571 CG ARG 193 -45,282 9,593 -71,468 1,00 91,88 L1 C ATOM 4572 CD ARG 193 -45,834 9,961 -72,836 1,00 93,71 L1 C ATOM 4573 NE ARG 193 -46,143 8,787 -73,648 1,00 94,98 L1 N ATOM 4574 CZ ARG 193 -46,579 8,844 -74,904 1,00 95,50 L1 C ATOM 4575 NH1 ARG 193 -46,834 7,725 -75,570 _1,0095,39 L1 N ATOM 4576 NH2 ARG 193 -46,761 10,020 -75,492 1,00 95,47 L1 N ATOM 4577 C ARG 193 -43,300 12,862 -71,251 1,00 88,54 L1 C ATOM 4578 O ARG 193 -43,756 13,724 -72,004 1,00 88,43 L1 O ATOM 4579 N SER 194 -42,658 13,150 -70,121 1,00 87,52 L1 N ATOM 4580 CA SER 194 -42,402 14,528 -69,707 1,00 85,86 L1 C ATOM 4581 CB SER 194 -43,723 15,262 -69,446 _1,0085,32 L1 C ATOM 4582 OG SER 194 -44,394 14,726 -68,318 1,00 83,93 L1 O ATOM 4583 C SER 194 -41,537 14,584 -68,450 1,00 84,95 L1 C ATOM 4584 O SER 194 -41,534 13,653 -67,643 1,00 84,18 L1 O ATOM 4585 N TYR 195 -40,803 15,684 -68,298 1,00 83,96 L1 N ATOM 4586 CA TYR 195 -40,034 15,947 -67,085 1,00 82,58 L1 C ATOM 4587 CB TYR 195 -38,584 16,284 -67,439 1,00 82,92 L1 C ATOM 4588 CG TYR 195 -37,729 15,078 -67,748 1,00 83,66 L1 C ATOM 4589 CD1 TYR 195 -36,938 14,495 -66,765 1,00 83,87 L1 C ATOM 4590 CE1 TYR 195 -36,145 13,398 -67,042 1,00 84,28 L1 C ATOM 4591 CD2 TYR 195 -37,703 14,526 -69,023 _1,0083,62 L1 C ATOM 4592 CE2 TYR 195 -36,911 13,428 -69,311 1,00 83,74 L1 C ATOM 4593 CZ TYR 195 -36,134 12,869 -68,317 1,00 84,20 L1 C ATOM 4594 OH TYR 195 -35,332 11,786 -68,600 1,00 84,08 L1 O ATOM 4595 C TYR 195 -40,646 17,101 -66,300 1,00 81,49 L1 C ATOM 4596 O TYR 195 -41,169 18,050 -66,886 1,00 81,16 L1 O ATOM 4597 N SER 196 -40,576 17,016 -64,973 _1,0080,07 L1 N ATOM 4598 CA SER 196 -41,152 18,040 -64,106 1,00 78,68 L1 C ATOM 4599 CB SER 196 -42,303 17,454 -63,284 1,00 79,05 L1 C ATOM 4600 OG SER 196 -43,396 17,099 -64,113 1,00 80,30 L1 O ATOM 4601 C SER 196 -40,127 18,660 -63,159 1,00 77,25 L1 C ATOM 4602 O SER 196 -39,337 17,952 -62,530 1,00 76,71 L1 O ATOM 4603 N CYS 197 -40,153 19,987 -63,063 _1,0075,59 L1 N (continuación)

ATOM 4604 CA CYS 197 -39,390 20,701 -62,046 1,00 73,09 L1 C ATOM 4605 C CYS 197 -40,296 21,060 -60,876 1,00 72,59 L1 C ATOM 4606 O CYS 197 -41,221 21,859 -61,020 1,00 72,65 L1 O ATOM 4607 CB CYS 197 -38,786 21,979 -62,628 1,00 71,16 L1 C ATOM 4608 SG CYS 197 -37,815 22,934 -61,416 _1,0069,32 L1 S ATOM 4609 N GLN 198 -40,027 20,466 -59,718 1,00 71,96 L1 N ATOM 4610 CA GLN 198 -40,866 20,671 -58,542 1,00 71,74 L1 C ATOM 4611 CB GLN 198 -41,277 19,321 -57,952 1,00 73,01 L1 C ATOM 4612 CG GLN 198 -41,917 18,376 -58,954 1,00 74,84 L1 C ATOM 4613 CD GLN 198 -42,165 16,997 -58,373 1,00 76,39 L1 C ATOM 4614 OE1 GLN 198 -41,697 16,676 -57,277 _1,0075,67 L1 O ATOM 4615 NE2 GLN 198 -42,903 16,171 -59,107 1,00 77,19 L1 N ATOM 4616 C GLN 198 -40,140 21,493 -57,479 1,00 70,00 L1 C ATOM 4617 O GLN 198 -39,145 21,045 -56,905 1,00 70,10 L1 O ATOM 4618 N VAL 199 -40,647 22,694 -57,217 1,00 67,33 L1 N ATOM 4619 CA VAL 199 -40,060 23,570 -56,210 1,00 64,63 L1 C ATOM 4620 CB VAL 199 -39,894 25,006 -56,750 _1,0063,62 L1 C ATOM 4621 CG1 VAL 199 -39,232 25,880 -55,700 1,00 62,58 L1 C ATOM 4622 CG2 VAL 199 -39,072 24,990 -58,029 1,00 62,84 L1 C ATOM 4623 C VAL 199 -40,942 23,618 -54,969 1,00 63,15 L1 C ATOM 4624 O VAL 199 -42,132 23,908 -55,059 1,00 62,70 L1 O ATOM 4625 N THR 200 -40,359 23,331 -53,810 1,00 62,14 L1 N ATOM 4626 CA THR ₂₀₀-41,100 23,436 -52,558 _1,0062,84 L1 C ATOM 4627 CB THR 200 -40,974 22,147 -51,712 1,00 63,21 L1 C ATOM 4628 OG1 THR 200 -41,466 21,029 -52,461 1,00 63,77 L1 O ATOM 4629 CG2 THR 200 -41,785 22,272 -50,429 1,00 62,81 L1 C ATOM 4630 C THR 200 -40,611 24,623 -51,732 1,00 62,22 L1 C ATOM 4631 O THR 200 -39,409 24,821 -51,559 1,00 62,43 L1 O ATOM 4632 N HIS ₂₀₁-41,558 25,409 -51,229 _{1,00 61,86}L1 N ATOM 4633 CA HIS 201 -41,251 26,622 -50,481 1,00 61,76 L1 C ATOM 4634 CB HIS 201 -41,224 27,826 -51,428 1,00 61,02 L1 C ATOM 4635 CG HIS 201 -41,179 29,150 -50,729 1,00 59,75 L1 C ATOM 4636 CD2 HIS 201 -40,135 29,901 -50,306 1,00 59,40 L1 C ATOM 4637 ND1 HIS 201 -42,316 29,863 -50,415 1,00 59,04 L1 N ATOM 4638 CE1 HIS 201 -41,974 30,998 -49,830 1,00 58,23 L1 C ATOM 4639 NE2 HIS 201 -40,657 31,046 -49,752 1,00 58,22 L1 N ATOM 4640 C 201 -42,299 26,843 -49,398 1,00 62,27 L1 C HIS ATOM 4641 O HIS ₂₀₁-43,491 26,934 -49,690 _1,0062,33 L1 O ATOM 4642 N GLU 203 -41,849 26,928 -48,149 1,00 63,08 L1 N ATOM 4643 CA GLU 203 -42,749 27,081 -47,009 1,00 64,31 L1 C ATOM 4644 CB GLU 203 -43,440 28,447 -47,050 1,00 64,10 L1 C ATOM 4645 CG GLU 203 -42,490 29,628 -46,933 1,00 64,37 L1 C ATOM 4646 CD GLU 203 -41,781 29,682 -45,593 1,00 66,35 L1 C ATOM 4647 OE1 GLU 203 -40,533 29,779 -45,584 _1,0066,23 L1 O ATOM 4648 OE2 GLU 203 -42,471 29,629 -44,549 1,00 66,40 L1 O ATOM 4649 C GLU 203 -43,800 25,978 -46,978 1,00 65,33 L1 C ATOM 4650 O GLU 203 -44,909 26,183 -46,490 1,00 65,44 L1 O ATOM 4651 N GLY 203 -43,448 24,810 -47,507 1,00 66,98 L1 N ATOM 4652 CA GLY 203 -44,328 23,660 -47,415 1,00 69,40 L1 C ATOM 4653 C GLY 203 -45,215 23,457 -48,631 _1,0071,29 L1 C ATOM 4654 O GLY 203 -45,869 22,422 -48,761 1,00 71,55 L1 O (continuación)

ATOM 4655 N SER 204 -45,240 24,440 -49,523 1,00 72,19 L1 N ATOM 4656 CA SER 204 -46,079 24,371 -50,711 1,00 73,00 L1 C ATOM 4657 CB SER 204 -46,931 25,638 -50,821 1,00 74,04 L1 C ATOM 4658 OG SER 204 -47,605 25,699 -52,068 _1,0075,31 L1 O ATOM 4659 C SER 204 -45,237 24,200 -51,974 1,00 73,53 L1 C ATOM 4660 O SER 204 -44,322 24,983 -52,231 1,00 74,09 L1 O ATOM 4661 N THR 205 -45,555 23,174 -52,760 1,00 73,50 L1 N ATOM 4662 CA THR 205 -44,801 22,864 -53,971 1,00 72,84 L1 C ATOM 4663 CB THR 205 -44,781 21,345 -54,243 1,00 73,16 L1 C ATOM 4664 OG1 THR 205 -44,142 20,669 -53,153 _1,0072,97 L1 O ATOM 4665 CG2 THR 205 -44,031 21,044 -55,533 1,00 73,27 L1 C ATOM 4666 C THR 205 -45,392 23,558 -55,193 1,00 72,59 L1 C ATOM 4667 O THR 205 -46,586 23,445 -55,465 1,00 72,07 L1 O ATOM 4668 N VAL 206 -44,548 24,280 -55,923 1,00 72,50 L1 N ATOM 4669 CA VAL 206 -44,934 24,850 -57,208 1,00 73,02 L1 C ATOM 4670 CB VAL ₂₀₆-44,562 26,341 -57,302 _1,0072,13 L1 C ATOM 4671 CG1 VAL 206 -44,947 26,890 -58,666 1,00 70,61 L1 C ATOM 4672 CG2 VAL 206 -45,257 27,117 -56,201 1,00 71,61 L1 C ATOM 4673 C VAL 206 -44,207 24,092 -58,310 1,00 74,77 L1 C ATOM 4674 O VAL 206 -42,994 23,893 -58,240 1,00 74,80 L1 O ATOM 4675 N GLU 207 -44,952 23,671 -59,326 1,00 76,39 L1 N ATOM 4676 CA GLU 207 -44,438 22,716 -60,298 _1,0077,74 L1 C ATOM 4677 CB GLU 207 -45,033 21,335 -60,011 1,00 78,83 L1 C ATOM 4678 CG GLU 207 -44,608 20,244 -60,973 1,00 81,28 L1 C ATOM 4679 CD GLU 207 -45,153 18,886 -60,574 1,00 82,80 L1 C ATOM 4680 OE1 GLU 207 -45,501 18,710 -59,386 1,00 84,12 L1 O ATOM 4681 OE2 GLU 207 -45,235 17,995 -61,445 1,00 83,95 L1 O ATOM 4682 C GLU 207 -44,744 23,126 -61,735 _1,0077,99 L1 C ATOM 4683 O GLU 207 -45,837 23,603 -62,040 1,00 77,18 L1 O ATOM 4684 N LYS 208 -43,765 22,941 -62,615 1,00 78,59 L1 N ATOM 4685 CA LYS 208 -43,973 23,134 -64,043 1,00 79,79 L1 C ATOM 4686 CB LYS 208 -43,289 24,418 -64,515 1,00 79,80 L1 C ATOM 4687 CG LYS 208 -43,911 25,692 -63,961 1,00 80,02 L1 C ATOM 4688 CD LYS 208 -45,400 25,764 -64,266 1,00 79,10 L1 C ATOM 4689 CE LYS 208 -45,956 27,147 -63,964 1,00 79,03 L1 C ATOM 4690 NZ LYS 208 -45,344 28,191 -64,835 1,00 77,78 L1 N ATOM 4691 C LYS 208 -43,433 21,941 -64,823 1,00 80,92 L1 C ATOM 4692 O LYS ₂₀₈-42,413 21,356 -64,454 _1,0080,76 L1 O ATOM 4693 N THR 209 -44,125 21,584 -65,900 1,00 82,27 L1 N ATOM 4694 CA THR 209 -43,779 20,402 -66,679 1,00 83,34 L1 C ATOM 4695 CB THR 209 -44,889 19,335 -66,582 1,00 83,02 L1 C ATOM 4696 OG1 THR 209 -45,127 19,012 -65,207 1,00 82,81 L1 O ATOM 4697 CG2 THR 209 -44,482 18,071 -67,327 1,00 82,62 L1 C ATOM 4698 C THR 209 -43,566 20,749 -68,151 _1,0085,00 L1 C ATOM 4699 O THR 209 -44,209 21,653 -68,687 1,00 85,03 L1 O ATOM 4700 N VAL 210 -42,652 20,029 -68,793 1,00 86,55 L1 N ATOM 4701 CA VAL 210 -42,468 20,124 -70,236 1,00 87,92 L1 C ATOM 4702 CB VAL 210 -41,190 20,918 -70,590 1,00 87,63 L1 C ATOM 4703 CG1 VAL 210 -41,310 22,347 -70,085 1,00 87,34 L1 C ATOM 4704 CG2 VAL ₂₁₀-39,970 20,240 -69,988 _1,0087,16 L1 C ATOM 4705 C VAL 210 -42,372 18,728 -70,848 1,00 89,44 L1 C ATOM 4706 O VAL 210 -41,880 17,794 -70,212 1,00 89,28 L1 O (continuación)

ATOM 4707 N ALA 211 -42,851 18,591 -72,081 1,00 91,11 L1 N ATOM 4708 CA ALA 211 -42,826 17,311 -72,782 1,00 92,64 L1 C ATOM 4709 CB ALA ₂₁₁-44,206 17,004 -73,356 _1,0092,29 L1 C ATOM 4710 C ALA 211 -41,785 17,331 -73,897 1,00 93,85 L1 C ATOM 4711 O ALA 211 -41,449 18,392 -74,424 1,00 94,16 L1 O ATOM 4712 N PRO 212 -41,265 16,151 -74,273 1,00 95,11 L1 N ATOM 4713 CD PRO 212 -41,685 14,830 -73,774 1,00 95,23 L1 C ATOM 4714 CA PRO 212 -40,227 16,043 -75,306 1,00 95,91 L1 C ATOM 4715 CB PRO ₂₁₂-39,882 14,553 -75,318 _1,0095,62 L1 C ATOM 4716 CG PRO 212 -41,095 13,880 -74,776 1,00 95,26 L1 C ATOM 4717 C PRO 212 -40,691 16,540 -76,672 1,00 96,68 L1 C ATOM 4718 O PRO 212 -39,878 16,917 -77,520 1,00 96,58 L1 O ATOM 4719 N THR 213 -42,005 16,543 -76,872 1,00 97,41 L1 N ATOM 4720 CA THR 213 -42,600 16,998 -78,123 1,00 98,13 L1 C ATOM 4721 CB THR 213 -44,081 16,575 -78,209 _1,0098,19 L1 C ATOM 4722 OG1 THR 213 -44,792 17,076 -77,068 1,00 97,41 , L1 O ATOM 4723 CG2 THR 213 -44,195 15,056 -78,248 1,00 98,19 L1 C ATOM 4724 C THR 213 -42,504 18,516 -78,277 1,00 98,77 L1 C ATOM 4725 O THR 213 -41,782 19,146 -77,474 1,00 99,20 L1 O ATOM 4726 OXT THR 213 -43,142 19,057 -79,208 1,00 99,08 L1 O TER 4727 THR 213 L1 ATOM 4728 CB GLN 1 -10,333 41,335 -26,837 1,00 58,55 H1 C ATOM 4729 CG GLN 1 -11,368 41,133 -27,931 1,00 61,95 H1 C ATOM 4730 CD GLN 1 -12,786 41,172 -27,394 1,00 64,59 H1 C ATOM 4731 OE1 GLN 1 -13,725 40,692 -28,034 1,00 66,92 H1 O ATOM 4732 NE2 GLN 1 -12,949 41,749 -26,209 1,00 65,52 H1 N ATOM 4733 C GLN ₁-8,067 40,598 -27,611 _1,0051,02 H1 C ATOM 4734 O GLN 1 -6,978 40,491 -27,047 1,00 50,88 H1 O ATOM 4735 N GLN 1 -9,151 42,604 -28,597 1,00 56,41 H1 N ATOM 4736 CA GLN 1 -8,969 41,799 -27,352 1,00 54,79 H1 C ATOM 4737 N VAL 2 -8,528 39,693 -28,465 1,00 46,33 H1 N ATOM 4738 CA VAL 2 -7,658 38,679 -29,042 1,00 40,97 H1 C ATOM 4739 CB VAL 2 -8,026 37,266 -28,541 1,00 40,66 H1 C ATOM 4740 CG1 VAL 2 -7,187 36,223 -29,261 1,00 37,87 H1 C ATOM 4741 CG2 VAL 2 -7,800 37,175 -27,041 1,00 39,09 H1 C ATOM 4742 C VAL 2 -7,831 38,737 -30,551 1,00 40,14 H1 C ATOM 4743 O VAL ₂-8,948 38,863 -31,050 _1,0039,38 H1 O ATOM 4744 N GLN 3 -6,730 38,672 -31,285 1,00 38,15 H1 N ATOM 4745 CA GLN 3 -6,836 38,657 -32,733 1,00 37,80 H1 C ATOM 4746 CB GLN 3 -6,288 39,951 -33,340 1,00 41,11 H1 C ATOM 4747 CG GLN 3 -6,598 40,078 -34,830 1,00 48,63 H1 C ATOM 4748 CD GLN 3 -5,966 41,299 -35,480 1,00 54,48 H1 C ATOM 4749 OE1 GLN 3 -5,933 41,412 -36,710 _1,0056,23 H1 O ATOM 4750 NE2 GLN 3 -5,461 42,221 -34,658 1,00 55,22 H1 N ATOM 4751 C GLN 3 -6,097 37,475 -33,315 1,00 34,51 H1 C ATOM 4752 O GLN 3 -4,950 37,209 -32,960 1,00 34,76 H1 O ATOM 4753 N LEU 4 -6,774 36,764 -34,206 1,00 31,16 H1 N ATOM 4754 CA LEU 4 -6,152 35,706 -34,983 1,00 30,62 H1 C ATOM 4755 CB LEU 4 -7,036 34,455 -34,966 _1,0026,45 H1 C ATOM 4756 CG LEU 4 -6,920 33,556 -33,728 1,00 27,80 H1 C ATOM 4757 CD1 LEU 4 -7,145 34,374 -32,449 1,00 25,47 H1 C ATOM 4758 CD2 LEU 4 -7,930 32,423 -33,831 1,00 26,22 H1 C (continuación)

ATOM 4759 C LEU 4 -5,943 36,200 -36,419 1,00 32,23 H1 C ATOM 4760 O LEU 4 -6,899 36,554 -37,120 _1,0031,55 H1 O ATOM 4761 N GLN 5 -4,683 36,229 -36,840 1,00 31,02 H1 N ATOM 4762 CA GLN 5 -4,307 36,758 -38,144 1,00 31,99 H1 C ATOM 4763 CB GLN 5 -3,168 37,772 -37,976 1,00 35,77 H1 C ATOM 4764 CG GLN 5 -2,719 38,446 -39,262 1,00 41,14 H1 C ATOM 4765 CD GLN 5 -3,830 39,250 -39,904 1,00 45,66 H1 C ATOM 4766 OE1 GLN 5 -3,749 39,625 -41,073 _1,0048,29 H1 O ATOM 4767 NE2 GLN 5 -4,881 39,519 -39,137 1,00 48,64 H1 N ATOM 4768 C GLN 5 -3,863 35,614 -39,050 1,00 29,87 H1 C ATOM 4769 O GLN 5 -2,974 34,842 -38,690 1,00 31,50 H1 O ATOM 4770 N GLN 6 -4,482 35,509 -40,221 1,00 28,29 H1 N ATOM 4771 CA GLN 6 -4,243 34,377 -41,117 1,00 30,55 H1 C ATOM 4772 CB GLN ₆-5,564 33,740 -41,540 _1,0029,81 H1 C ATOM 4773 CG GLN 6 -6,344 33,071 -40,433 1,00 30,43 H1 C ATOM 4774 CD GLN 6 -7,562 32,345 -40,972 1,00 28,63 H1 C ATOM 4775 OE1 GLN 6 -8,691 32,631 -40,580 1,00 30,41 H1 O ATOM 4776 NE2 GLN 6 -7,336 31,408 -41,882 1,00 26,47 H1 N ATOM 4777 C GLN 6 -3,511 34,800 -42,376 1,00 30,75 H1 C ATOM 4778 O GLN ₆-3,696 35,916 -42,858 _1,0032,04 H1 O ATOM 4779 N TRP 7 -2,695 33,904 -42,918 1,00 28,95 H1 N ATOM 4780 CA TRP 7 -2,211 34,076 -44,278 1,00 28,90 H1 C ATOM 4781 CB TRP 7 -0,966 34,976 -44,301 1,00 28,68 H1 C ATOM 4782 CG TRP 7 0,236 34,402 -43,598 1,00 27,66 H1 C ATOM 4783 CD2 TRP 7 0,704 34,740 -42,286 1,00 25,98 H1 C ATOM 4784 CE2 TRP 7 _1,88834,010 -42,063 _1,0027,69 H1 C ATOM 4785 CE3 TRP 7 0,238 35,594 -41,282 1,00 26,98 H1 C ATOM 4786 CD1 TRP 7 1,128 33,499 -44,101 1,00 27,44 H1 C ATOM 4787 NE1 TRP 7 2,126 33,258 -43,185 1,00 28,36 H1 N ATOM 4788 CZ2 TRP 7 2,612 34,109 -40,880 1,00 28,83 H1 C ATOM 4789 CZ3 TRP 7 0,956 35,692 -40,111 1,00 28,53 H1 C ATOM 4790 CH2 TRP 7 2,132 34,955 -39,917 1,00 30,19 H1 C ATOM 4791 C TRP 7 -1,899 32,733 -44,923 1,00 28,22 H1 C ATOM 4792 O TRP 7 -2,070 31,681 -44,307 1,00 28,99 H1 O ATOM 4793 N GLY 8 -1,432 32,783 -46,166 1,00 28,35 H1 N ATOM 4794 CA GLY ₈-1,234 31,575 -46,945 _1,0026,37 H1 C ATOM 4795 C GLY 8 -1,920 31,683 -48,295 1,00 27,33 H1 C ATOM 4796 O GLY 8 -2,925 32,386 -48,444 1,00 27,76 H1 O ATOM 4797 N ALA 9 -1,377 30,984 -49,282 1,00 27,19 H1 N ATOM 4798 CA ALA 9 -1,887 31,057 -50,646 1,00 28,12 , H1 C ATOM 4799 CB ALA 9 -0,828 30,527 -51,619 1,00 27,62 H1 C ATOM 4800 C ALA 9 -3,179 30,253 -50,791 _1,0028,31 H1 C ATOM 4801 O ALA 9 -3,233 29,079 -50,431 1,00 28,12 H1 O ATOM 4802 N GLY 10 -4,212 30,888 -51,330 1,00 29,12 H1 N ATOM 4803 CA GLY 10 -5,493 30,222 -51,479 1,00 30,10 H1 C ATOM 4804 C GLY 10 -5,820 29,691 -52,871 1,00 32,33 H1 C ATOM 4805 O GLY 10 -6,659 28,798 -53,005 1,00 32,38 H1 O ATOM 4806 N LEU ₁₁-5,177 30,221 -53,909 _1,0031,52 H1 N ATOM 4807 CA LEU 11 -5,494 29,799 -55,275 1,00 33,59 H1 C ATOM 4808 CB LEU 11 -5,308 30,959 -56,255 1,00 36,39 H1 C ATOM 4809 CG LEU 11 -5,584 30,620 -57,725 1,00 40,88 H1 C ATOM 4810 CD1 LEU 11 -6,969 29,990 -57,844 1,00 43,73 H1 C (continuación)

ATOM 4811 CD2 LEU ₁₁-5,491 31,877 -58,586 _1,0040,70 H1 C ATOM 4812 C LEU 11 -4,626 28,629 -55,697 1,00 34,18 H1 C ATOM 4813 O LEU 11 -3,429 28,787 -55,936 1,00 35,52 H1 O ATOM 4814 N LEU 12 -5,232 27,448 -55,785 1,00 34,06 H1 N ATOM 4815 CA LEU 12 -4,470 26,219 -55,974 1,00 33,09 H1 C ATOM 4816 CB LEU 12 -4,533 25,358 -54,711 1,00 34,00 H1 C ATOM 4817 CG LEU ₁₂-4,079 25,990 -53,395 _1,0035,02 H1 C ATOM 4818 CD1 LEU 12 -4,057 24,931 -52,297 1,00 33,56 H1 C ATOM 4819 CD2 LEU 12 -2,698 26,606 -53,580 1,00 36,04 Hl C ATOM 4820 C LEU 12 -4,979 25,401 -57,147 1,00 33,61 H1 C ATOM 4821 O LEU 12 -6,129 25,542 -57,566 1,00 34,76 H1 O ATOM 4822 N LYS 13 -4,115 24,542 -57,671 1,00 33,61 H1 N ATOM 4823 CA LYS 13 -4,533 23,537 -58,638 _1,0035,02 H1 C ATOM 4824 CB LYS 13 -3,558 23,486 -59,813 1,00 35,86 H1 C ATOM 4825 CG LYS 13 -3,544 24,732 -60,671 1,00 39,05 H1 C ATOM 4826 CD LYS 13 -2,763 24,491 -61,952 0,50 41,55 H1 C ATOM 4827 CE LYS 13 -2,408 25,800 -62,627 1,00 44,69 H1 C ATOM 4828 NZ LYS 13 -1,530 26,633 -61,750 1,00 48,57 H1 N ATOM 4829 C LYS 13 -4,584 22,171 -57,967 _1,0035,21 H1 C ATOM 4830 O LYS 13 -3,887 21,924 -56,983 1,00 37,52 H1 O ATOM 4831 N PRO 14 -5,405 21,258 -58,499 1,00 34,61 H1 N ATOM 4832 CD PRO 14 -6,318 21,454 -59,638 1,00 34,09 H1 C ATOM 4833 CA PRO 14 -5,476 19,894 -57,969 1,00 34,50 H1 C ATOM 4834 CB PRO 14 -6,368 19,169 -58,974 1,00 34,26 H1 C ATOM 4835 CG PRO 14 -7,214 20,257 -59,557 _1,0033,95 H1 C ATOM 4836 C PRO 14 -4,093 19,253 -57,854 1,00 34,86 H1 C ATOM 4837 O PRO 14 -3,222 19,493 -58,690 1,00 35,81 H1 O ATOM 4838 N SER 15 -3,914 18,455 -56,803 1,00 34,00 H1 N ATOM 4839 CA SER 15 -2,684 17,718 -56,515 1,00 34,80 H1 C ATOM 4840 CB SER 15 -1,999 17,245 -57,805 1,00 35,51 H1 C ATOM 4841 OG SER 15 -1,036 18,192 -58,234 1,00 38,11 H1 O ATOM 4842 C SER 15 -1,694 18,534 -55,684 1,00 34,51 H1 C ATOM 4843 O SER 15 -0,761 17,980 -55,099 1,00 35,24 H1 O ATOM 4844 N GLU 16 -1,901 19,845 -55,622 1,00 34,15 H1 N ATOM 4845 CA GLU _{16 -1,018}20,705 -54,845 _1,0034,52 H1 C ATOM 4846 CB GLU 16 -1,183 22,164 -55,283 1,00 36,08 H1 C ATOM 4847 CG GLU 16 -0,552 22,478 -56,646 1,00 41,58 H1 C ATOM 4848 CD GLU 16 -0,918 23,864 -57,160 1,00 44,69 H1 C ATOM 4849 OE1 GLU 16 -1,573 24,626 -56,423 1,00 44,93 H1 O ATOM 4850 OE2 GLU 16 -0,555 24,193 -58,309 1,00 49,52 H1 O ATOM 4851 C GLU ₁₆-1,256 20,583 -53,338 _1,0034,67 H1 C ATOM 4852 O GLU 16 -2,252 20,008 -52,898 1,00 32,76 H1 O ATOM 4853 N THR 17 -0,319 21,120 -52,559 1,00 33,99 H1 N ATOM 4854 CA THR 17 -0,421 21,165 -51,104 1,00 32,35 H1 C ATOM 4855 CB THR 17 0,928 20,860 -50,447 1,00 31,91 H1 C ATOM 4856 OG1 THR 17 1,289 19,505 -50,722 1,00 35,50 H1 O ATOM 4857 CG2 THR 17 0,853 21,073 -48,940 _1,0031,69 H1 C ATOM 4858 C THR 17 -0,867 22,539 -50,627 1,00 31,96 H1 C ATOM 4859 O THR 17 -0,296 23,554 -51,024 1,00 31,96 H1 O ATOM 4860 N LEU 18 -1,889 22,565 -49,774 1,00 29,65 H1 N ATOM 4861 CA LEU 18 -2,355 23,812 -49,179 1,00 28,49 H1 C ATOM 4862 CB LEU ₁₈-3,841 23,720 -48,831 _1,0027,90 H1 C (continuación)

ATOM 4863 CG LEU 18 -4,387 24,865 -47,973 1,00 27,75 H1 C ATOM 4864 CD1 LEU 18 -4,433 26,133 -48,808 1,00 28,48 H1 C ATOM 4865 CD2 LEU 18 -5,784 24,520 -47,467 1,00 27,32 H1 C ATOM 4866 C LEU 18 -1,557 24,086 -47,914 1,00 29,31 H1 C ATOM 4867 O LEU 18 -1,324 23,183 -47,105 1,00 29,34 H1 O ATOM 4868 N SER 19 -1,138 25,332 -47,740 _1,0028,71 H1 N ATOM 4869 CA SER 19 -0,342 25,693 -46,580 1,00 28,95 H1 C ATOM 4870 CB SER 19 1,136 25,745 -46,969 1,00 29,72 H1 C ATOM 4871 OG SER 19 1,927 26,134 -45,861 1,00 37,84 H1 O ATOM 4872 C SER 19 -0,790 27,032 -46,000 1,00 28,99 H1 C ATOM 4873 O SER 19 -0,614 28,084 -46,611 1,00 30,84 H1 O ATOM 4874 N LEU ₂₀-1,384 26,985 -44,814 _{1,00 28,20}H1 N ATOM 4875 CA LEU 20 -1,932 28,179 -44,193 1,00 26,04 H1 C ATOM 4876 CB LEU 20 -3,447 28,056 -44,050 1,00 25,36 H1 C ATOM 4877 CG LEU 20 -4,265 27,889 -45,334 1,00 26,53 H1 C ATOM 4878 CD1 LEU 20 -5,744 27,831 -44,970 1,00 23,87 H1 C ATOM 4879 CD2 LEU 20 -3,999 29,053 -46,288 1,00 25,15 H1 C ATOM 4880 C LEU ₂₀-1,308 28,376 -42,825 _1,0025,77 H1 C ATOM 4881 O LEU 20 -0,850 27,427 -42,197 1,00 26,14 H1 O ATOM 4882 N THR 21 -1,299 29,618 -42,365 1,00 26,29 H1 N ATOM 4883 CA THR 21 -0,685 29,947 -41,093 1,00 27,57 H1 C ATOM 4884 CB THR 21 0,691 30,616 -41,314 1,00 28,87 H1 C ATOM 4885 OG1 THR 21 1,536 29,733 -42,072 1,00 30,29 H1 O ATOM 4886 CG2 THR ₂₁1,348 30,928 -39,988 _1,0026,32 H1 C ATOM 4887 C THR 21 -1,599 30,897 -40,332 1,00 27,47 H1 C ATOM 4888 O THR 21 -2,294 31,715 -40,930 1,00 26,74 H1 O ATOM 4889 N CYS 22 -1,606 30,778 -39,011 1,00 28,77 H1 N ATOM 4890 CA CYS 22 -2,393 31,675 -38,175 1,00 29,72 H1 C ATOM 4891 C CYS 22 -1,469 32,192 -37,082 1,00 30,55 H1 C ATOM 4892 O CYS 22 -0,752 31,411 -36,456 1,00 30,73 H1 O ATOM 4893 CB CYS 22 -3,564 30,899 -37,565 1,00 30,30 H1 C ATOM 4894 SG CYS 22 -4,786 31,772 -36,524 1,00 31,82 H1 S ATOM 4895 N ALA 23 -1,481 33,504 -36,864 1,00 29,76 H1 N ATOM 4896 CA ALA 23 -0,725 34,101 -35,771 _1,0031,19 H1 C ATOM 4897 CB ALA 23 0,187 35,216 -36,298 1,00 31,06 H1 C ATOM 4898 C ALA 23 -1,684 34,662 -34,732 1,00 29,91 H1 C ATOM 4899 O ALA 23 -2,677 35,300 -35,075 1,00 29,39 H1 O ATOM 4900 N VAL 24 -1,375 34,429 -33,462 1,00 29,49 H1 N ATOM 4901 CA VAL 24 -2,243 34,855 -32,375 1,00 29,62 H1 C ATOM 4902 CB VAL 24 -2,415 33,717 -31,352 _1,0028,75 H1 C ATOM 4903 CG1 VAL 24 -3,211 34,202 -30,149 1,00 28,80 H1 C ATOM 4904 CG2 VAL 24 -3,112 32,543 -32,015 1,00 26,06 H1 C ATOM 4905 C VAL 24 -1,708 36,095 -31,663 1,00 31,01 H1 C ATOM 4906 O VAL 24 -0,566 36,118 -31,206 1,00 32,54 H1 O ATOM 4907 N TYR 25 -2,543 37,124 -31,567 1,00 31,55 H1 N ATOM 4908 CA TYR 25 -2,175 38,336 -30,848 _1,0032,59 H1 C ATOM 4909 CB TYR 25 -2,177 39,527 -31,807 1,00 34,98 H1 C ATOM 4910 CG TYR 25 -1,229 39,346 -32,968 1,00 36,34 H1 C ATOM 4911 CD1 TYR 25 -1,704 39,045 -34,236 1,00 37,36 H1 C ATOM 4912 CE1 TYR 25 -0,838 38,843 -35,297 1,00 40,15 H1 C ATOM 4913 CD2 TYR 25 0,144 39,445 -32,788 _1,0038,49 H1 C ATOM 4914 CE2 TYR 25 1,020 39,243 -33,843 1,00 40,50 H1 C (continuación)

ATOM 4915 CZ TYR 25 0,523 38,942 -35,093 1,00 40,26 H1 C ATOM 4916 OH TYR 25 1,389 38,726 -36,142 1,00 44,41 H1 O ATOM 4917 C TYR 25 -3,129 38,594 -29,689 1,00 32,47 H1 C ATOM 4918 O TYR 25 -4,289 38,942 -29,896 1,00 32,98 H1 O ATOM 4919 N GLY ₂₆-2,637 38,415 -28,468 _1,0031,79 H1 N ATOM 4920 CA GLY 26 -3,465 38,647 -27,296 1,00 32,41 H1 C ATOM 4921 C GLY 26 -3,828 37,380 -26,537 1,00 32,65 H1 C ATOM 4922 O GLY 26 -3,801 36,279 -27,093 1,00 31,74 H1 O ATOM 4923 N GLY 27 -4,167 37,539 -25,259 1,00 32,32 H1 N ATOM 4924 CA GLY 27 -4,515 36,399 -24,431 1,00 30,56 H1 C ATOM 4925 C GLY 27 -3,347 35,444 -24,311 _1,0031,96 H1 C ATOM 4926 O GLY 27 -2,258 35,738 -24,791 1,00 33,98 H1 O ATOM 4927 N SER 28 -3,570 34,297 -23,677 1,00 31,00 H1 N ATOM 4928 CA SER 28 -2,546 33,261 -23,580 1,00 29,78 H1 C ATOM 4929 CB SER 28 -2,782 32,397 -22,340 1,00 27,61 H1 C ATOM 4930 OG SER 28 -2,050 31,184 -22,424 1,00 29,12 H1 O ATOM 4931 C SER ₂₈-2,535 32,367 -24,815 _1,0029,77 H1 C ATOM 4932 O SER 28 -3,569 32,152 -25,442 1,00 31,74 H1 O ATOM 4933 N PHE 29 -1,365 31,836 -25,153 1,00 28,60 H1 N ATOM 4934 CA PHE 29 -1,246 30,952 -26,301 1,00 28,86 H1 C ATOM 4935 CB PHE 29 0,048 31,229 -27,077 1,00 28,06 H1 C ATOM 4936 CG PHE 29 0,202 30,383 -28,307 1,00 26,67 H1 C ATOM 4937 CD1 PHE 29 -0,550 30,638 -29,436 _{1,00 28,66}H1 C ATOM 4938 CD2 PHE 29 1,081 29,317 -28,327 1,00 27,57 H1 C ATOM 4939 CE1 PHE 29 -0,431 29,841 -30,559 1,00 29,40 H1 C ATOM 4940 CE2 PHE 29 1,205 28,518 -29,442 1,00 27,25 H1 C ATOM 4941 CZ PHE 29 0,452 28,778 -30,560 1,00 28,48 H1 C ATOM 4942 C PHE 29 -1,260 29,506 -25,851 1,00 28,91 H1 C ATOM 4943 O PHE 29 -1,893 28,653 -26,483 1,00 31,89 H1 O ATOM 4944 N SER 30 -0,566 29,226 -24,755 1,00 27,90 H1 N ATOM 4945 CA SER 30 -0,390 27,849 -24,311 1,00 29,14 H1 C ATOM 4946 CB SER 30 0,850 27,734 -23,418 1,00 31,78 H1 C ATOM 4947 OG SER 30 0,687 28,470 -22,221 1,00 36,30 H1 O ATOM 4948 C SER 30 -1,612 27,295 -23,574 1,00 27,44 H1 C ATOM 4949 O SER 30 -1,699 26,097 -23,340 1,00 26,60 H1 O ATOM 4950 N ALA 31 -2,558 28,163 -23,227 1,00 27,53 , H1 N ATOM 4951 CA ALA 31 -3,706 27,760 -22,413 1,00 27,10 H1 C ATOM 4952 CB ALA 31 -4,175 28,937 -21,580 1,00 23,65 H1 C ATOM 4953 C ALA 31 -4,888 27,190 -23,211 _1,0027,46 H1 C ATOM 4954 O ALA 31 -5,917 26,850 -22,633 1,00 28,90 H1 O ATOM 4955 N TYR 32 -4,743 27,091 -24,527 1,00 26,48 H1 N ATOM 4956 CA TYR 32 -5,864 26,726 -25,396 1,00 25,86 H1 C ATOM 4957 CB TYR 32 -6,393 27,962 -26,132 1,00 24,51 H1 C ATOM 4958 CG TYR 32 -6,878 29,066 -25,223 1,00 27,00 H1 C ATOM 4959 CD1 TYR 32 -6,062 30,146 -24,912 1,00 27,70 H1 C ATOM 4960 CE1 TYR 32 -6,510 31,167 -24,086 1,00 27,16 H1 C ATOM 4961 CD2 TYR 32 -8,161 29,034 -24,681 1,00 25,53 H1 C ATOM 4962 CE2 TYR 32 -8,616 30,045 -23,857 1,00 25,30 H1 C ATOM 4963 CZ TYR 32 -7,790 31,109 -23,564 1,00 26,69 H1 C ATOM 4964 OH TYR 32 -8,250 32,131 -22,771 _1,0028,27 H1 O ATOM 4965 C TYR 32 -5,486 25,688 -26,440 1,00 24,12 H1 C ATOM 4966 O TYR 32 -4,327 25,601 -26,856 1,00 24,09 H1 O (continuación)

ATOM 4967 N TYR 33 -6,471 24,917 -26,887 1,00 22,70 H1 N ATOM 4968 CA TYR 33 -6,348 24,241 -28,173 1,00 22,68 H1 C ATOM 4969 CB TYR 33 -7,374 23,116 -28,298 1,00 22,31 H1 C ATOM 4970 CG TYR 33 -7,016 21,898 -27,492 _1,0021,33 H1 C ATOM 4971 CD1 TYR 33 -6,239 20,893 -28,042 1,00 20,79 H1 C ATOM 4972 CE1 TYR 33 -5,886 19,783 -27,311 1,00 22,09 H1 C ATOM 4973 CD2 TYR 33 -7,440 21,758 -26,173 1,00 22,16 H1 C ATOM 4974 CE2 TYR 33 -7,092 20,642 -25,429 1,00 23,42 H1 C ATOM 4975 CZ TYR 33 -6,311 19,659 -26,010 1,00 23,95 H1 C ATOM 4976 OH TYR 33 -5,941 18,549 -25,298 _1,0023,94 H1 O ATOM 4977 C TYR 33 -6,554 25,244 -29,299 1,00 22,45 H1 C ATOM 4978 O TYR 33 -7,292 26,218 -29,155 1,00 22,76 H1 O ATOM 4979 N TRP 34 -5,887 25,002 -30,417 1,00 22,98 H1 N ATOM 4980 CA TRP 34 -6,012 25,859 -31,582 1,00 23,60 H1 C ATOM 4981 CB TRP 34 -4,650 26,490 -31,885 1,00 23,80 H1 C ATOM 4982 CG TRP 34 -4,247 27,427 -30,790 _1,0023,49 H1 C ATOM 4983 CD2 TRP 34 -4,745 28,749 -30,577 1,00 22,41 H1 C ATOM 4984 CE2 TRP 34 -4,165 29,227 -29,385 1,00 25,04 H1 C ATOM 4985 CE3 TRP 34 -5,629 29,578 -31,280 1,00 23,05 H1 C ATOM 4986 CD1 TRP 34 -3,402 27,165 -29,752 1,00 24,44 H1 C ATOM 4987 NE1 TRP 34 -3,347 28,240 -28,900 1,00 23,72 H1 N ATOM 4988 CZ2 TRP 34 -4,442 30,495 -28,879 _1,0021,78 H1 C ATOM 4989 CZ3 TRP 34 -5,900 30,833 -30,777 1,00 21,48 H1 C ATOM 4990 CH2 TRP 34 -5,309 31,280 -29,587 1,00 22,95 H1 C ATOM 4991 C TRP 34 -6,530 25,048 -32,766 1,00 21,45 H1 C ATOM 4992 O TRP 34 -5,988 23,987 -33,070 1,00 21,93 H1 O ATOM 4993 N ASN 35 -7,578 25,556 -33,420 1,00 19,88 H1 N ATOM 4994 CA ASN 35 -8,355 24,785 -34,392 1,00 20,46 H1 C ATOM 4995 CB ASN 35 -9,841 24,803 -34,021 1,00 20,89 H1 C ATOM 4996 CG ASN 35 -10,101 24,285 -32,627 1,00 23,23 H1 C ATOM 4997 OD1 ASN 35 -10,302 23,087 -32,428 1,00 24,03 H1 O ATOM 4998 ND2 ASN 35 -10,099 25,185 -31,650 _1,0022,85 H1 N ATOM 4999 C ASN 35 -8,236 25,315 -35,810 1,00 20,87 H1 C ATOM 5000 O ASN 35 -8,048 26,505 -36,019 1,00 23,07 H1 O ATOM 5001 N TRP 36 -8,377 24,418 -36,782 1,00 22,36 H1 N ATOM 5002 CA TRP 36 -8,702 24,801 -38,152 1,00 22,05 H1 C ATOM 5003 CB TRP 36 -7,658 24,246 -39,121 1,00 22,90 H1 C ATOM 5004 CG TRP 36 -6,318 24,938 -39,025 _1,0025,04 H1 C ATOM 5005 CD2 TRP 36 -5,956 26,193 -39,619 1,00 22,07 H1 C ATOM 5006 CE2 TRP 36 -4,612 26,439 -39,284 1,00 24,03 H1 C ATOM 5007 CE3 TRP 36 -6,639 27,129 -40,403 1,00 22,32 H1 C ATOM 5008 CD1 TRP 36 -5,208 24,490 -38,370 1,00 20,33 H1 C ATOM 5009 NE1 TRP 36 -4,179 25,385 -38,521 1,00 23,82 H1 N ATOM 5010 CZ2 TRP 36 -3,933 27,587 -39,706 _1,0023,84 H1 C ATOM 5011 CZ3 TRP 36 -5,968 28,266 -40,821 1,00 24,79 H1 C ATOM 5012 CH2 TRP 36 -4,627 28,486 -40,471 1,00 24,85 H1 C ATOM 5013 C TRP 36 -10,087 24,261 -38,517 1,00 22,80 H1 C ATOM 5014 O TRP 36 -10,434 23,122 -38,193 1,00 21,90 H1 O ATOM 5015 N ILE 37 -10,871 25,094 -39,187 _1,0022,71 H1 N ATOM 5016 CA ILE 37 -12,244 24,773 -39,554 1,00 21,18 H1 C ATOM 5017 CB ILE 37 -13,232 25,478 -38,591 1,00 22,23 H1 C ATOM 5018 CG2 ILE 37 -14,669 25,262 -39,039 1,00 20,06 H1 C (continuación)

ATOM 5019 CG1 ILE 37 -13,024 24,950 -37,171 1,00 21,40 H1 C ATOM 5020 CD1 ILE 37 -13,704 25,776 -36,102 1,00 20,52 H1 C ATOM 5021 C ILE 37 -12,445 25,310 -40,966 _1,0023,40 H1 C ATOM 5022 O ILE 37 -11,964 26,395 -41,285 1,00 23,50 H1 O ATOM 5023 N ARG 38 -13,134 24,571 -41,827 1,00 22,17 H1 N ATOM 5024 CA ARG 38 -13,417 25,120 -43,151 1,00 23,30 H1 C ATOM 5025 CB ARG 38 -12,680 24,328 -44,237 1,00 22,10 H1 C ATOM 5026 CG ARG 38 -13,113 22,886 -44,372 1,00 24,22 H1 C ATOM 5027 CD ARG 38 -12,272 22,174 -45,418 _1,0023,06 H1 C ATOM 5028 NE ARG 38 -12,792 20,840 -45,694 1,00 23,01 H1 N ATOM 5029 CZ ARG 38 -12,283 20,000 -46,587 1,00 22,72 H1 C ATOM 5030 NH1 ARG 38 -11,212 20,337 -47,310 1,00 18,87 H1 N ATOM 5031 NH2 ARG 38 -12,875 18,832 -46,782 1,00 20,60 H1 N ATOM 5032 C ARG 38 -14,906 25,185 -43,469 1,00 23,88 H1 C ATOM 5033 O ARG 38 -15,720 24,482 -42,863 _1,0023,72 H1 O ATOM 5034 N GLN 39 -15,256 26,055 -44,411 1,00 24,72 H1 N ATOM 5035 CA GLN 39 -16,638 26,222 -44,829 1,00 24,67 H1 C ATOM 5036 CB GLN 39 -17,224 27,509 -44,238 1,00 25,79 H1 C ATOM 5037 CG GLN 39 -18,684 27,793 -44,635 1,00 27,90 H1 C ATOM 5038 CD GLN 39 -19,318 28,866 -43,757 1,00 29,29 H1 C ATOM 5039 OE1 GLN 39 -18,788 29,966 -43,633 _1,0032,06 H1 O ATOM 5040 NE2 GLN 39 -20,447 28,545 -43,141 1,00 28,85 H1 N ATOM 5041 C GLN 39 -16,690 26,288 -46,345 1,00 25,97 H1 C ATOM 5042 O GLN 39 -16,266 27,270 -46,947 1,00 25,21 H1 O ATOM 5043 N PRO 40 -17,213 25,233 -46,981 1,00 26,39 H1 N ATOM 5044 CD PRO 40 -17,750 24,017 -46,345 1,00 28,52 H1 C ATOM 5045 CA PRO 40 -17,377 25,213 -48,433 1,00 29,08 H1 C ATOM 5046 CB PRO 40 -17,779 23,768 -48,731 1,00 27,66 H1 C ATOM 5047 CG PRO 40 -18,437 23,304 -47,485 1,00 28,54 H1 C ATOM 5048 C PRO 40 -18,448 26,219 -48,836 1,00 32,62 H1 C ATOM 5049 O PRO 40 -19,359 26,516 -48,061 _1,0032,18 H1 O ATOM 5050 N PRO 41 -18,345 26,766 -50,053 1,00 36,33 H1 N ATOM 5051 CD PRO 41 -17,406 26,340 -51,105 1,00 37,35 H1 C ATOM 5052 CA PRO 41 -19,204 27,872 -50,494 1,00 37,78 H1 C ATOM 5053 CB PRO 41 -18,839 28,044 -51,969 1,00 39,57 H1 C ATOM 5054 CG PRO 41 -17,449 27,484 -52,074 1,00 40,10 H1 C ATOM 5055 C PRO 41 -20,687 27,568 -50,307 _1,0038,36 H1 C ATOM 5056 O PRO 41 -21,165 26,510 -50,704 1,00 37,50 H1 O ATOM 5057 N GLY 42 -21,406 28,497 -49,682 1,00 40,85 H1 N ATOM 5058 CA GLY 42 -22,837 28,332 -49,499 1,00 43,07 H1 C ATOM 5059 C GLY 42 -23,227 27,130 -48,653 1,00 44,02 H1 C ATOM 5060 O GLY 42 -24,360 26,657 -48,727 1,00 44,58 H1 O ATOM 5061 N LYS 43 -22,297 26,634 -47,842 _1,0042,75 H1 N ATOM 5062 CA LYS 43 -22,551 25,440 -47,046 1,00 41,76 H1 C ATOM 5063 CB LYS 43 -21,778 24,254 -47,627 1,00 44,31 H1 C ATOM 5064 CG LYS 43 -22,140 23,962 -49,074 1,00 48,96 H1 C ATOM 5065 CD LYS 43 -22,254 22,468 -49,324 1,00 51,38 H1 C ATOM 5066 CE LYS 43 -23,015 22,187 -50,617 _1,0054,57 H1 C ATOM 5067 NZ LYS 43 -22,406 22,886 -51,784 1,00 54,57 H1 N ATOM 5068 C LYS 43 -22,171 25,647 -45,590 1,00 37,71 H1 C ATOM 5069 O LYS 43 -21,889 26,766 -45,175 1,00 40,41 H1 O (continuación)

ATOM 5070 N GLY 44 -22,160 24,562 -44,823 1,00 32,46 H1 N ATOM 5071 CA GLY 44 -21,927 24,654 -43,393 1,00 28,89 H1 C ATOM 5072 C GLY 44 -20,473 24,575 -42,949 _1,0028,33 H1 C ATOM 5073 O GLY 44 -19,570 25,015 -43,654 1,00 28,78 H1 O ATOM 5074 N LEU 45 -20,251 24,004 -41,770 1,00 26,37 H1 N ATOM 5075 CA LEU 45 -18,938 24,020 -41,139 1,00 24,45 H1 C ATOM 5076 CB LEU 45 -19,024 24,701 -39,766 1,00 23,45 H1 C ATOM 5077 CG LEU 45 -19,498 26,154 -39,752 1,00 24,17 H1 C ATOM 5078 CD1 LEU 45 -19,692 26,636 -38,323 _1,0020,49 H1 C ATOM 5079 CD2 LEU 45 -18,471 27,012 -40,474 1,00 23,06 H1 C ATOM 5080 C LEU 45 -18,379 22,616 -40,965 1,00 22,98 H1 C ATOM 5081 O LEU 45 -19,101 21,689 -40,600 1,00 21,96 H1 O ATOM 5082 N GLU 46 -17,081 22,475 -41,208 1,00 22,29 H1 N ATOM 5083 CA GLU 46 -16,397 21,199 -41,044 1,00 22,11 H1 C ATOM 5084 CB GLU 46 -16,060 20,609 -42,416 1,00 21,07 H1 C ATOM 5085 CG GLU 46 -15,392 19,253 -42,342 1,00 23,85 H1 C ATOM 5086 CD GLU 46 -15,117 18,646 -43,711 1,00 26,12 H1 C ATOM 5087 OE1 GLU 46 -15,068 19,390 -44,714 1,00 25,34 H1 O ATOM 5088 OE2 GLU 46 -14,947 17,414 -43,779 1,00 28,37 H1 O ATOM 5089 C GLU 46 -15,112 21,411 -40,245 1,00 22,69 H1 C ATOM 5090 O GLU 46 -14,246 _22,188-40,643 _1,0022,85 H1 O ATOM 5091 N TRP 47 -14,994 20,727 -39,113 1,00 23,32 H1 N ATOM 5092 CA TRP 47 -13,810 20,853 -38,271 1,00 24,50 H1 C ATOM 5093 CB TRP 47 -14,124 20,356 -36,862 1,00 23,99 H1 C ATOM 5094 CG TRP 47 -12,985 20,457 -35,899 1,00 23,86 H1 C ATOM 5095 CD2 TRP 47 -12,225 19,369 -35,357 1,00 23,15 H1 C ATOM 5096 CE2 TRP 47 -11,346 19,912 -34,401 1,00 22,05 H1 C ATOM 5097 CE3 TRP 47 -12,209 17,986 -35,584 1,00 22,33 H1 C ATOM 5098 CD1 TRP 47 -12,536 21,586 -35,276 1,00 23,05 H1 C ATOM 5099 NE1 TRP 47 -11,555 21,268 -34,373 1,00 23,21 H1 N ATOM 5100 CZ2 TRP 47 -10,461 19,124 -33,665 _1,0020,75 H1 C ATOM 5101 CZ3 TRP 47 -11,326 17,200 -34,852 1,00 20,87 H1 C ATOM 5102 CH2 TRP 47 -10,467 17,774 -33,903 1,00 23,70 H1 C ATOM 5103 C TRP 47 -12,687 20,020 -38,872 1,00 24,58 H1 C ATOM 5104 O TRP 47 -12,877 18,849 -39,176 1,00 23,77 H1 O ATOM 5105 N ILE 48 -11,519 20,626 -39,042 1,00 24,78 H1 N ATOM 5106 CA ILE 48 -10,389 19,929 -39,647 _1,0024,00 H1 C ATOM 5107 CB ILE 48 -9,526 20,913 -40,481 1,00 24,53 H1 C ATOM 5108 CG2 ILE 48 -8,285 20,196 -41,038 1,00 24,01 H1 C ATOM 5109 CG1 ILE 48 -10,383 21,502 -41,611 1,00 23,41 H1 C ATOM 5110 CD1 ILE 48 -9,698 22,583 -42,429 1,00 24,34 H1 C ATOM 5111 C ILE 48 -9,530 19,259 -38,575 1,00 23,04 H1 C ATOM 5112 O ILE 48 -9,181 _18,080-38,689 _1,0021,34 H1 O ATOM 5113 N GLY 49 -9,207 20,011 -37,528 1,00 22,63 H1 N ATOM 5114 CA GLY 49 -8,387 19,476 -36,459 1,00 21,49 H1 C ATOM 5115 C GLY 49 -7,929 20,562 -35,502 1,00 22,86 H1 C ATOM 5116 O GLY 49 -8,258 21,733 -35,679 1,00 22,27 H1 O ATOM 5117 N GLU 50 -7,166 20,164 -34,490 _1,0022,34 H1 N ATOM 5118 CA GLU 50 -6,673 21,078 -33,469 1,00 23,19 H1 C ATOM 5119 CB GLU 50 -7,577 21,023 -32,234 1,00 23,22 H1 C ATOM 5120 CG GLU 50 -7,510 19,674 -31,530 1,00 20,57 H1 C ATOM 5121 CD GLU 50 -8,512 19,538 -30,396 1,00 23,89 H1 C (continuación)

ATOM 5122 OE1 GLU 50 -9,378 20,428 -30,251 1,00 22,86 H1 O ATOM 5123 OE2 GLU 50 -8,438 18,533 -29,656 _{1,00 20,61}H1 O ATOM 5124 C GLU 50 -5,257 20,664 -33,053 1,00 25,41 H1 C ATOM 5125 O GLU 50 -4,799 19,559 -33,349 1,00 26,68 H1 O ATOM 5126 N ILE 51 -4,577 21,549 -32,340 1,00 25,24 H1 N ATOM 5127 CA ILE 51 -3,275 21,223 -31,780 1,00 25,42 H1 C ATOM 5128 CB ILE 51 -2,151 21,625 -32,768 1,00 25,30 H1 C ATOM 5129 CG2 ILE 51 -2,110 23,145 -32,919 1,00 20,77 H1 C ATOM 5130 CG1 ILE 51 -0,805 21,091 -32,288 1,00 25,23 H1 C ATOM 5131 CD1 ILE 51 0,268 21,133 -33,364 1,00 26,63 H1 C ATOM 5132 C ILE 51 -3,150 22,023 -30,492 1,00 25,89 H1 C ATOM 5133 O ILE 51 -3,846 23,019 -30,318 1,00 25,01 H1 O ATOM 5134 N ASN 52 -2,294 21,585 -29,575 1,00 27,77 H1 N ATOM 5135 CA ASN 52 -1,924 22,442 -28,456 _1,0028,51 H1 C ATOM 5136 CB ASN 52 -2,366 21,828 -27,119 1,00 31,18 H1 C ATOM 5137 CG ASN 52 -1,642 20,539 -26,785 1,00 33,23 H1 C ATOM 5138 OD1 ASN 52 -0,514 20,307 -27,221 1,00 37,24 H1 O ATOM 5139 ND2 ASN 52 -2,294 19,688 -25,999 1,00 34,97 H1 N ATOM 5140 C ASN 52 -0,423 22,706 -28,463 1,00 29,67 H1 C ATOM 5141 O ASN 52 0,293 22,205 -29,327 _1,0029,70 H1 O ATOM 5142 N HIS 53 0,047 23,497 -27,505 1,00 30,65 H1 N ATOM 5143 CA HIS 53 1,391 24,059 -27,565 1,00 34,02 H1 C ATOM 5144 CB HIS 53 1,597 25,058 -26,431 1,00 36,59 H1 C ATOM 5145 CG HIS 53 1,574 24,427 -25,077 1,00 41,39 H1 C ATOM 5146 CD2 HIS 53 0,542 24,090 -24,268 1,00 42,73 H1 C ATOM 5147 ND1 HIS 53 2,719 24,025 -24,425 1,00 44,09 H1 N ATOM 5148 CE1 HIS 53 2,393 23,465 -23,273 1,00 43,74 H1 C ATOM 5149 NE2 HIS 53 1,077 23,492 -23,154 1,00 44,27 H1 N ATOM 5150 C 53 2,473 22,990 -27,475 1,00 34,37 H1 C HIS ATOM 5151 O HIS 53 3,621 23,241 -27,819 1,00 34,24 H1 O ATOM 5152 N SER 54 2,115 21,805 -26,999 1,00 34,17 H1 N ATOM 5153 CA SER 54 3,103 20,752 -26,852 1,00 34,95 H1 C ATOM 5154 CB SER 54 2,728 19,819 -25,708 1,00 37,13 H1 C ATOM 5155 OG SER 54 1,673 18,955 -26,090 1,00 44,66 H1 O ATOM 5156 C SER 54 3,207 19,960 -28,140 _1,0035,47 H1 C ATOM 5157 O SER 54 4,033 19,058 -28,255 1,00 37,27 H1 O ATOM 5158 N GLY 55 2,360 20,291 -29,110 1,00 33,32 H1 N ATOM 5159 CA GLY 55 2,456 19,646 -30,407 1,00 33,10 H1 C ATOM 5160 C GLY 55 1,537 18,459 -30,649 1,00 30,70 H1 C ATOM 5161 O GLY 55 1,519 17,913 -31,744 1,00 31,90 H1 O ATOM 5162 N ARG 56 0,770 18,047 -29,647 _1,0031,34 H1 N ATOM 5163 CA ARG 56 -0,181 16,959 -29,860 1,00 31,52 H1 C ATOM 5164 CB ARG 56 -0,674 16,399 -28,520 1,00 33,02 H1 C ATOM 5165 CG ARG 56 -1,671 15,245 -28,675 1,00 39,22 H1 C ATOM 5166 CD ARG 56 -1,844 14,428 -27,393 1,00 41,40 H1 C ATOM 5167 NE ARG 56 -2,188 15,260 -26,239 1,00 44,28 H1 N ATOM 5168 CZ ARG 56 -3,363 15,858 -26,069 1,00 45,93 H1 C ATOM 5169 NH1 ARG 56 -4,318 15,722 -26,983 1,00 45,10 H1 N ATOM 5170 NH2 ARG 56 -3,584 16,588 -24,980 1,00 46,47 H1 N ATOM 5171 C ARG 56 -1,376 17,427 -30,702 1,00 29,42 H1 C ATOM 5172 O ARG 56 -1,861 18,544 -30,547 1,00 29,24 H1 O (continuación)

ATOM 5173 N THR 57 -1,844 16,560 -31,590 _1,0027,46 H1 N ATOM 5174 CA THR 57 -2,908 16,912 -32,518 1,00 28,02 H1 C ATOM 5175 CB THR 57 -2,401 16,915 -33,974 1,00 26,99 H1 C ATOM 5176 OG1 THR 57 -1,806 15,646 -34,267 1,00 28,13 H1 O ATOM 5177 CG2 THR 57 -1,384 18,032 -34,194 1,00 24,99 H1 C ATOM 5178 C THR 57 -4,097 15,956 -32,442 1,00 27,51 , H1 C ATOM 5179 O THR 57 -3,968 14,814 -31,996 _1,0024,38 H1 O ATOM 5180 N ASP 58 -5,252 16,447 -32,882 1,00 26,49 H1 N ATOM 5181 CA ASP 58 -6,422 15,606 -33,141 1,00 26,22 H1 C ATOM 5182 CB ASP 58 -7,491 15,830 -32,064 1,00 26,18 H1 C ATOM 5183 CG ASP 58 -6,973 15,585 -30,655 1,00 25,96 H1 C ATOM 5184 OD1 ASP 58 -6,604 14,436 -30,349 1,00 28,58 H1 O ATOM 5185 OD2 ASP 58 -6,941 16,538 -29,849 _1,0025,89 H1 O ATOM 5186 C ASP 58 -6,985 16,012 -34,506 1,00 25,72 H1 C ATOM 5187 O ASP 58 -7,107 17,200 -34,795 1,00 24,91 H1 O ATOM 5188 N TYR 59 -7,326 15,035 -35,339 1,00 25,29 H1 N ATOM 5189 CA TYR 59 -7,818 15,326 -36,681 1,00 25,55 H1 C ATOM 5190 CB TYR 59 -6,882 14,740 -37,743 1,00 24,54 H1 C ATOM 5191 CG TYR 59 -5,476 15,296 -37,709 _1,0027,17 H1 C ATOM 5192 CD1 TYR 59 -5,247 16,653 -37,827 1,00 25,11 H1 C ATOM 5193 CE1 TYR 59 -3,971 17,167 -37,782 1,00 28,62 H1 C ATOM 5194 CD2 TYR 59 -4,378 14,458 -37,550 1,00 28,77 H1 C ATOM 5195 CE2 TYR 59 -3,091 14,966 -37,510 1,00 29,01 H1 C ATOM 5196 CZ TYR 59 -2,895 16,324 -37,622 1,00 28,28 H1 C ATOM 5197 OH TYR 59 -1,624 16,855 -37,546 1,00 29,69 H1 O ATOM 5198 C TYR 59 -9,217 14,774 -36,912 1,00 26,93 H1 C ATOM 5199 O TYR 59 -9,610 13,775 -36,306 1,00 25,54 H1 O ATOM 5200 N ASN 60 -9,960 15,435 -37,795 1,00 25,64 H1 N ATOM 5201 CA ASN _{60 -11,180}14,866 -38,339 _1,0027,20 H1 C ATOM 5202 CB ASN 60 -11,914 15,908 -39,193 1,00 27,87 H1 C ATOM 5203 CG ASN 60 -13,295 15,439 -39,636 1,00 29,92 H1 C ATOM 5204 OD1 ASN 60 -13,552 14,242 -39,734 1,00 27,12 H1 O ATOM 5205 ND2 ASN 60 -14,191 16,388 -39,906 1,00 27,79 H1 N ATOM 5206 C ASN 60 -10,766 13,682 -39,211 1,00 28,06 H1 C ATOM 5207 O ASN ₆₀-9,900 13,815 -40,076 _1,0026,75 H1 O ATOM 5208 N PRO 61 -11,383 12,509 -38,988 1,00 28,60 H1 N ATOM 5209 CD PRO 61 -12,379 12,272 -37,929 1,00 28,36 H1 C ATOM 5210 CA PRO 61 -11,103 11,288 -39,750 1,00 28,67 H1 C ATOM 5211 CB PRO 61 -12,156 10,300 -39,243 1,00 30,97 H1 C ATOM 5212 CG PRO 61 -12,471 10,774 -37,878 1,00 31,87 H1 C ATOM 5213 C PRO ₆₁-11,199 11,489 -41,254 _1,0029,49 H1 C ATOM 5214 O PRO 61 -10,505 10,830 -42,016 1,00 30,22 H1 O ATOM 5215 N SER 62 -12,064 12,402 -41,682 1,00 29,86 H1 N ATOM 5216 CA SER 62 -12,310 12,593 -43,105 1,00 30,55 H1 C ATOM 5217 CB SER 62 -13,540 13,472 -43,307 1,00 30,58 H1 C ATOM 5218 OG SER ₆₂-13,283 14,785 -42,854 _1,0031,57 H1 O ATOM 5219 C SER 62 -11,117 13,242 -43,799 1,00 31,98 H1 C ATOM 5220 O SER 62 -11,054 13,280 -45,026 1,00 32,06 H1 O ATOM 5221 N LEU 63 -10,180 13,763 -43,010 1,00 30,93 H1 N ATOM 5222 CA LEU 63 -9,039 14,489 -43,558 1,00 31,13 H1 C ATOM 5223 CB LEU 63 -9,206 15,987 -43,293 1,00 29,01 H1 C (continuación)

ATOM 5224 CG LEU 63 -10,329 16,656 -44,092 _1,0031,66 H1 C ATOM 5225 CD1 LEU 63 -10,593 18,044 -43,535 1,00 28,33 H1 C ATOM 5226 CD2 LEU 63 -9,939 16,731 -45,575 1,00 28,56 H1 C ATOM 5227 C LEU 63 -7,703 14,006 -42,988 1,00 30,49 H1 C ATOM 5228 O LEU 63 -6,640 14,416 -43,451 1,00 30,14 H1 O ATOM 5229 N LYS 64 -7,773 13,133 -41,989 1,00 30,11 H1 N ATOM 5230 CA LYS 64 -6,602 12,670 -41,257 1,00 32,57 H1 C ATOM 5231 CB LYS 64 -7,007 11,514 -40,337 1,00 36,89 H1 C ATOM 5232 CG LYS 64 -5,877 10,924 -39,511 1,00 40,28 H1 C ATOM 5233 CD LYS 64 -6,349 9,706 -38,706 1,00 44,49 H1 C ATOM 5234 CE LYS 64 -6,817 10,078 -37,290 1,00 48,41 H1 C ATOM 5235 NZ LYS 64 -8,133 10,801 -37,258 1,00 48,82 H1 N ATOM 5236 C LYS 64 -5,443 12,229 -42,153 _1,0034,71 H1 C ATOM 5237 O LYS 64 -4,282 12,504 -41,851 1,00 34,00 H1 O ATOM 5238 N SER 65 -5,753 11,547 -43,254 1,00 35,63 H1 N ATOM 5239 CA SER 65 -4,709 10,978 -44,099 1,00 38,29 H1 C ATOM 5240 CB SER 65 -5,299 9,924 -45,043 1,00 39,24 H1 C ATOM 5241 OG SER 65 -6,082 10,525 -46,065 1,00 44,72 H1 O ATOM 5242 C SER 65 -3,961 12,035 -44,916 _1,0039,01 H1 C ATOM 5243 O SER 65 -2,842 11,793 -45,378 1,00 39,10 H1 O ATOM 5244 N ARG 66 -4,573 13,204 -45,089 1,00 37,26 H1 N ATOM 5245 CA ARG 66 -3,992 14,240 -45,937 1,00 35,64 H1 C ATOM 5246 CB ARG 66 -5,018 14,691 -46,983 1,00 34,32 H1 C ATOM 5247 CG ARG 66 -5,552 13,575 -47,868 1,00 35,93 H1 C ATOM 5248 CD ARG 66 -6,867 13,993 -48,513 1,00 35,14 H1 C ATOM 5249 NE ARG 66 -6,689 15,244 -49,224 1,00 34,04 H1 N ATOM 5250 CZ ARG 66 -7,614 16,185 -49,375 1,00 32,60 H1 C ATOM 5251 NH1 ARG 66 -8,833 16,046 -48,867 1,00 24,54 H1 N ATOM 5252 NH2 ARG ₆₆-7,296 17,285 -50,040 _1,0030,85 H1 N ATOM 5253 C ARG 66 -3,495 15,462 -45,157 1,00 35,29 H1 C ATOM 5254 O ARG 66 -2,810 16,320 -45,713 1,00 36,20 H1 O ATOM 5255 N VAL 67 -3,848 15,549 -43,878 1,00 33,06 H1 N ATOM 5256 CA VAL 67 -3,663 16,787 -43,132 1,00 32,98 H1 C ATOM 5257 CB VAL 67 -4,944 17,169 -42,347 1,00 34,24 H1 C ATOM 5258 CG1 VAL 67 -4,725 18,471 -41,600 _1,0036,90 H1 C ATOM 5259 CG2 VAL 67 -6,107 17,326 -43,297 1,00 38,06 H1 C ATOM 5260 C VAL 67 -2,513 16,725 -42,137 1,00 30,38 H1 C ATOM 5261 O VAL 67 -2,260 15,693 -41,525 1,00 29,73 H1 O ATOM 5262 N THR 68 -1,824 17,847 -41,978 1,00 29,72 H1 N ATOM 5263 CA THR 68 -0,890 18,021 -40,878 1,00 31,21 H1 C ATOM 5264 CB THR ₆₈0,581 17,868 -41,333 _1,0032,80 H1 C ATOM 5265 OG1 THR 68 0,773 16,575 -41,917 1,00 36,87 H1 O ATOM 5266 CG2 THR 68 1,521 18,003 -40,141 1,00 33,68 H1 C ATOM 5267 C THR 68 -1,067 19,413 -40,291 1,00 31,32 H1 C ATOM 5268 O THR 68 -1,042 20,420 -41,011 1,00 31,21 H1 O ATOM 5269 N ILE 69 -1,255 19,466 -38,980 _1,0027,82 H1 N ATOM 5270 CA ILE 69 -1,280 20,733 -38,274 1,00 26,11 H1 C ATOM 5271 CB ILE 69 -2,548 20,844 -37,404 1,00 22,50 H1 C ATOM 5272 CG2 ILE 69 -2,490 22,088 -36,539 1,00 21,71 H1 C ATOM 5273 CG1 ILE 69 -3,786 20,862 -38,309 1,00 22,12 H1 C ATOM 5274 CD1 ILE 69 -5,111 20,739 -37,559 1,00 19,06 H1 C ATOM 5275 C ILE 69 -0,034 20,796 -37,399 _1,0026,90 H1 C (continuación)

ATOM 5276 O ILE 69 0,344 19,808 -36,763 1,00 26,17 H1 O ATOM 5277 N SER 70 0,620 21,950 -37,386 1,00 26,96 H1 N ATOM 5278 CA SER 70 1,825 22,112 -36,590 1,00 29,41 H1 C ATOM 5279 CB SER 70 3,066 22,082 -37,490 1,00 29,33 H1 C ATOM 5280 OG SER 70 2,970 23,059 -38,508 1,00 34,80 H1 O ATOM 5281 C SER 70 1,753 23,419 -35,829 _1,0029,15 H1 C ATOM 5282 O SER 70 0,891 24,257 -36,096 1,00 29,52 H1 O ATOM 5283 N VAL 71 2,647 23,588 -34,864 1,00 30,15 H1 N ATOM 5284 CA VAL 71 2,617 24,776 -34,029 1,00 30,65 H1 C ATOM 5285 CB VAL 71 1,970 24,461 -32,653 1,00 30,44 H1 C ATOM 5286 CG1 VAL 71 2,819 23,450 -31,900 1,00 28,16 H1 C ATOM 5287 CG2 VAL 71 1,804 25,744 -31,842 _1,0032,12 H1 C ATOM 5288 C VAL 71 4,026 25,320 -33,813 1,00 31,95 H1 C ATOM 5289 O VAL 71 4,994 24,564 -33,722 1,00 30,74 H1 O ATOM 5290 N ASP 72 4,134 26,639 -33,743 1,00 33,49 H1 N ATOM 5291 CA ASP 72 5,392 27,289 -33,405 1,00 35,48 H1 C ATOM 5292 CB ASP 72 5,876 28,143 -34,582 1,00 38,44 H1 C ATOM 5293 CG ASP 72 7,211 28,814 -34,310 _1,0040,69 H1 C ATOM 5294 OD1 ASP 72 7,609 28,903 -33,131 1,00 41,96 H1 O ATOM 5295 OD2 ASP 72 7,865 29,252 -35,279 1,00 43,43 H1 O ATOM 5296 C ASP 72 5,139 28,165 -32,187 1,00 35,14 H1 C ATOM 5297 O ASP 72 4,727 29,317 -32,316 1,00 33,42 H1 O ATOM 5298 N THR 73 5,376 27,614 -31,002 1,00 36,86 H1 N ATOM 5299 CA THR 73 5,012 28,306 -29,774 1,00 40,27 H1 C ATOM 5300 CB THR 73 5,158 27,390 -28,545 1,00 41,47 H1 C ATOM 5301 OG1 THR 73 6,539 27,065 -28,356 1,00 44,90 H1 O ATOM 5302 CG2 THR 73 4,360 26,103 -28,740 1,00 38,24 H1 C ATOM 5303 C THR 73 5,877 29,541 -29,569 _1,0040,62 H1 C ATOM 5304 O THR 73 5,410 30,547 -29,039 1,00 41,80 H1 O ATOM 5305 N SER 74 7,133 29,475 -29,998 1,00 41,71 H1 N ATOM 5306 CA SER 74 8,024 30,617 -29,833 1,00 42,42 H1 C ATOM 5307 CB SER 74 9,418 30,313 -30,403 1,00 42,23 H1 C ATOM 5308 OG SER 74 9,455 30,467 -31,811 1,00 45,59 H1 O ATOM 5309 C SER 74 7,423 31,820 -30,542 _1,0041,31 H1 C ATOM 5310 O SER 74 7,602 32,959 -30,111 1,00 43,56 H1 O ATOM 5311 N LYS 75 6,692 31,562 -31,622 1,00 40,07 H1 N ATOM 5312 CA LYS 75 6,081 32,635 -32,402 1,00 37,23 H1 C ATOM 5313 CB LYS 75 6,283 32,381 -33,894 1,00 40,70 H1 C ATOM 5314 CG LYS 75 7,640 32,786 -34,430 1,00 42,41 H1 C ATOM 5315 CD LYS 75 7,552 33,046 -35,925 _1,0045,61 H1 C ATOM 5316 CE LYS 75 8,933 33,131 -36,550 1,00 48,78 H1 C ATOM 5317 NZ LYS 75 9,706 31,882 -36,306 1,00 49,50 H1 N ATOM 5318 C LYS 75 4,591 32,813 -32,129 1,00 34,20 H1 C ATOM 5319 O LYS 75 3,958 33,725 -32,673 1,00 31,98 H1 O ATOM 5320 N LYS 76 4,031 31,939 -31,298 _1,0031,53 H1 N ATOM 5321 CA LYS 76 2,583 31,894 -31,099 1,00 30,16 H1 C ATOM 5322 CB LYS 76 2,129 33,120 -30,301 1,00 31,13 H1 C ATOM 5323 CG LYS 76 2,773 33,203 -28,914 1,00 32,98 H1 C ATOM 5324 CD LYS 76 2,476 34,526 -28,236 1,00 35,35 H1 C ATOM 5325 CE LYS 76 3,315 34,711 -26,976 1,00 42,53 H1 C ATOM 5326 NZ LYS 76 3,033 33,680 -25,934 _1,0045,06 H1 N ATOM 5327 C LYS 76 1,867 31,830 -32,451 1,00 28,30 H1 C (continuación)

ATOM 5328 O LYS 76 1,027 32,664 -32,773 1,00 26,79 H1 O ATOM 5329 N GLN 77 2,234 30,837 -33,248 1,00 28,03 H1 N ATOM 5330 CA GLN 77 1,610 30,613 -34,544 1,00 30,21 , H1 C ATOM 5331 CB GLN 77 2,528 31,065 -35,685 1,00 29,25 H1 C ATOM 5332 CG GLN 77 2,730 32,565 -35,778 _1,0032,24 H1 C ATOM 5333 CD GLN 77 3,757 32,963 -36,834 1,00 31,77 H1 C ATOM 5334 OE1 GLN 77 4,144 34,126 -36,922 1,00 35,74 H1 O ATOM 5335 NE2 GLN 77 4,198 32,002 -37,634 1,00 28,74 H1 N ATOM 5336 C GLN 77 1,353 29,124 -34,680 1,00 29,69 H1 C ATOM 5337 O GLN 77 2,085 28,307 -34,119 1,00 31,84 H1 O ATOM 5338 N PHE 78 0,313 28,767 -35,417 _1,0028,53 H1 N ATOM 5339 CA PHE 78 0,149 27,385 -35,817 1,00 28,21 H1 C ATOM 5340 CB PHE 78 -0,842 26,658 -34,888 1,00 28,77 H1 C ATOM 5341 CG PHE 78 -2,240 27,200 -34,928 1,00 28,71 H1 C ATOM 5342 CD1 PHE 78 -3,272 26,444 -35,469 1,00 28,64 H1 C ATOM 5343 CD2 PHE 78 -2,531 28,452 -34,412 1,00 28,33 H1 C ATOM 5344 CE1 PHE 78 -4,568 26,928 -35,494 _1,0028,19 H1 C ATOM 5345 CE2 PHE 78 -3,824 28,941 -34,434 1,00 28,05 H1 C ATOM 5346 CZ PHE 78 -4,844 28,177 -34,978 1,00 27,78 H1 C ATOM 5347 C PHE 78 -0,291 27,334 -37,267 1,00 26,74 H1 C ATOM 5348 O PHE 78 -0,746 28,329 -37,820 1,00 26,40 H1 O ATOM 5349 N SER 79 -0,121 26,173 -37,884 1,00 26,74 H1 N ATOM 5350 CA SER 79 -0,190 26,058 -39,332 1,00 28,66 H1 C ATOM 5351 CB SER 79 1,217 25,906 -39,911 1,00 26,94 H1 C ATOM 5352 OG SER 79 1,991 27,059 -39,670 1,00 37,18 H1 O ATOM 5353 C SER 79 -1,019 24,857 -39,751 1,00 27,22 H1 C ATOM 5354 O SER 79 -1,198 23,915 -38,982 _1,0028,89 H1 O ATOM 5355 N LEU 80 -1,492 24,899 -40,988 1,00 28,24 H1 N ATOM 5356 CA LEU 80 -2,221 23,797 -41,595 1,00 28,21 H1 C ATOM 5357 CB LEU 80 -3,657 24,228 -41,873 1,00 27,82 H1 C ATOM 5358 CG LEU 80 -4,499 23,249 -42,689 1,00 29,21 H1 C ATOM 5359 CD1 LEU 80 -4,684 21,959 -41,906 1,00 25,31 H1 C ATOM 5360 CD2 LEU ₈₀-5,843 23,888 -43,000 _1,0029,81 H1 C ATOM 5361 C LEU 80 -1,560 23,383 -42,910 1,00 29,34 H1 C ATOM 5362 O LEU 80 -1,283 24,224 -43,764 1,00 29,99 H1 O ATOM 5363 N LYS 81 -1,315 22,088 -43,072 1,00 30,34 H1 N ATOM 5364 CA LYS 81 -0,952 21,543 -44,372 1,00 32,50 H1 C ATOM 5365 CB LYS 81 0,433 20,888 -44,315 1,00 36,42 H1 C ATOM 5366 CG LYS ₈₁1,585 21,867 -44,454 _1,0043,74 H1 C ATOM 5367 CD LYS 81 2,892 21,145 -44,778 1,00 47,76 H1 C ATOM 5368 CE LYS 81 3,901 22,096 -45,405 1,00 48,81 H1 C ATOM 5369 NZ LYS 81 3,752 23,471 -44,859 1,00 49,14 H1 N ATOM 5370 C LYS 81 -1,976 20,514 -44,830 1,00 32,18 H1 C ATOM 5371 O LYS _{81 -2,286}19,568 -44,102 _1,0032,47 H1 O ATOM 5372 N LEU 82 -2,493 20,694 -46,041 1,00 31,45 H1 N ATOM 5373 CA LEU 82 -3,388 19,708 -46,642 1,00 31,74 H1 C ATOM 5374 CB LEU 82 -4,777 20,322 -46,853 1,00 29,16 H1 C ATOM 5375 CG LEU 82 -5,901 19,419 -47,374 1,00 29,44 H1 C ATOM 5376 CD1 LEU 82 -6,172 18,295 -46,380 1,00 26,17 H1 C ATOM 5377 CD2 LEU ₈₂-7,163 20,251 -47,579 _1,0027,84 H1 C ATOM 5378 C LEU 82 -2,815 19,252 -47,980 1,00 31,38 H1 C (continuación)

ATOM 5379 O LEU 82 -2,719 20,049 -48,913 1,00 30,59 H1 O ATOM 5380 N ASN 83 -2,439 17,976 -48,068 1,00 33,35 H1 N ATOM 5381 CA ASN 83 -1,862 17,403 -49,294 1,00 34,64 H1 C ATOM 5382 CB ASN 83 -1,143 16,079 -48,999 1,00 37,82 H1 C ATOM 5383 CG ASN 83 -0,053 16,223 -47,975 _1,0043,06 H1 C ATOM 5384 OD1 ASN 83 0,637 17,244 -47,924 1,00 45,32 H1 O ATOM 5385 ND2 ASN 83 0,114 15,198 -47,141 1,00 42,01 H1 N ATOM 5386 C ASN 83 -2,907 17,112 -50,368 1,00 34,00 H1 C ATOM 5387 O ASN 83 -4,092 16,917 -50,066 1,00 31,80 H1 O ATOM 5388 N SER 84 -2,437 17,067 -51,616 1,00 32,98 H1 N ATOM 5389 CA SER 84 -3,175 16,485 -52,733 _1,0032,51 H1 C ATOM 5390 CB SER 84 -3,226 14,963 -52,596 1,00 33,13 H1 C ATOM 5391 OG SER 84 -1,930 14,422 -52,419 1,00 37,34 H1 O ATOM 5392 C SER 84 -4,594 17,013 -52,848 1,00 32,10 H1 C ATOM 5393 O SER 84 -5,544 16,235 -52,918 1,00 32,45 H1 O ATOM 5394 N VAL 85 -4,737 18,331 -52,870 1,00 30,78 H1 N ATOM 5395 CA VAL 85 -6,054 18,939 -52,891 _1,0031,67 H1 C ATOM 5396 CB VAL 85 -5,955 20,468 -52,767 1,00 31,43 H1 C ATOM 5397 CG1 VAL 85 -5,392 20,841 -51,400 1,00 31,90 H1 C ATOM 5398 CG2 VAL 85 -5,072 21,019 -53,869 1,00 31,67 H1 C ATOM 5399 C VAL 85 -6,815 18,589 -54,164 1,00 32,60 H1 C ATOM 5400 O VAL 85 -6,214 18,241 -55,180 1,00 34,22 H1 O ATOM 5401 N THR 86 -8,142 18,659 -54,090 1,00 31,22 H1 N ATOM 5402 CA THR 86 -8,995 18,603 -55,275 1,00 31,00 H1 C ATOM 5403 CB THR 86 -9,725 17,249 -55,400 1,00 31,98 H1 C ATOM 5404 OG1 THR 86 -10,653 17,102 -54,316 1,00 34,46 H1 O ATOM 5405 CG2 THR ₈₆-8,725 16,091 -55,368 _1,0032,26 H1 C ATOM 5406 C THR 86 -10,038 19,709 -55,152 1,00 30,48 , H1 C ATOM 5407 O THR 86 -10,059 20,439 -54,162 1,00 30,01 H1 O ATOM 5408 N ALA 87 -10,904 19,836 -56,150 1,00 28,60 H1 N ATOM 5409 CA ALA 87 -11,891 20,908 -56,145 1,00 29,42 H1 C ATOM 5410 CB ALA 87 -12,797 20,806 -57,386 1,00 25,14 H1 C ATOM 5411 C ALA 87 -12,734 20,876 -54,871 _1,0027,88 H1 C ATOM 5412 O ALA 87 -13,204 21,908 -54,415 1,00 29,57 H1 O ATOM 5413 N ALA 88 -12,915 19,689 -54,301 1,00 26,65 H1 N ATOM 5414 CA ALA 88 -13,753 19,515 -53,115 1,00 26,47 H1 C ATOM 5415 CB ALA 88 -14,045 18,023 -52,907 1,00 22,83 H1 C ATOM 5416 C ALA 88 -13,147 20,115 -51,834 1,00 27,55 H1 C ATOM 5417 O ALA ₈₈-13,818 20,204 -50,800 _1,0025,90 H1 O ATOM 5418 N ASP 89 -11,879 20,514 -51,896 1,00 26,38 H1 N ATOM 5419 CA ASP 89 -11,249 21,202 -50,773 1,00 26,18 H1 C ATOM 5420 CB ASP 89 -9,752 20,899 -50,735 1,00 24,35 H1 C ATOM 5421 CG ASP 89 -9,462 19,433 -50,473 1,00 25,95 H1 C ATOM 5422 OD1 ASP 89 -9,997 _18,882-49,486 _1,0026,03 H1 O ATOM 5423 OD2 ASP 89 -8,704 18,831 -51,262 1,00 25,18 H1 O ATOM 5424 C ASP 89 -11,461 22,712 -50,844 1,00 25,45 H1 C ATOM 5425 O ASP 89 -11,031 23,446 -49,960 1,00 25,56 H1 O ATOM 5426 N THR 90 -12,124 23,169 -51,901 1,00 24,03 H1 N ATOM 5427 CA THR 90 -12,500 24,572 -52,021 1,00 22,80 H1 C ATOM 5428 CB THR 90 -13,279 24,808 -53,327 _1,0023,31 H1 C ATOM 5429 OG1 THR 90 -12,440 24,464 -54,434 1,00 23,59 H1 O ATOM 5430 CG2 THR 90 -13,720 26,278 -53,458 1,00 22,37 H1 C (continuación)

ATOM 5431 C THR 90 -13,363 24,994 -50,833 1,00 23,24 H1 C ATOM 5432 O THR 90 -14,360 24,342 -50,512 1,00 23,24 H1 O ATOM 5433 N ALA 91 -12,975 26,083 -50,178 1,00 22,25 H1 N ATOM 5434 CA ALA 91 -13,673 26,534 -48,978 _1,0022,73 H1 C ATOM 5435 CB ALA 91 -13,718 25,406 -47,943 1,00 18,43 H1 C ATOM 5436 C ALA 91 -12,982 27,757 -48,378 1,00 24,17 H1 C ATOM 5437 O ALA 91 -11,855 28,094 -48,755 1,00 25,58 H1 O ATOM 5438 N VAL 92 -13,663 28,420 -47,447 1,00 23,43 H1 N ATOM 5439 CA VAL 92 -13,002 29,380 -46,575 1,00 23,10 H1 C ATOM 5440 CB VAL 92 -13,983 30,477 -46,087 _1,0024,14 H1 C ATOM 5441 CG1 VAL 92 -13,263 31,430 -45,147 1,00 23,43 H1 C ATOM 5442 CG2 VAL 92 -14,535 31,260 -47,281 1,00 23,45 H1 C ATOM 5443 C VAL 92 -12,436 28,627 -45,372 1,00 24,98 H1 C ATOM 5444 O VAL 92 -13,160 27,903 -44,675 1,00 26,01 H1 O ATOM 5445 N TYR 93 -11,137 28,779 -45,143 1,00 23,58 H1 N ATOM 5446 CA TYR 93 -10,479 28,124 -44,019 _1,0023,55 H1 C ATOM 5447 CB TYR 93 -9,135 27,537 -44,471 1,00 20,25 H1 C ATOM 5448 CG TYR 93 -9,272 26,302 -45,342 1,00 20,65 H1 C ATOM 5449 CD1 TYR 93 -8,895 25,048 -44,871 1,00 19,71 H1 C ATOM 5450 CE1 TYR 93 -9,047 23,911 -45,651 1,00 20,45 H1 C ATOM 5451 CD2 TYR 93 -9,804 26,385 -46,620 1,00 21,99 H1 C ATOM 5452 CE2 TYR 93 -9,964 25,250 -47,412 1,00 21,69 H1 C ATOM 5453 CZ TYR 93 -9,583 24,020 -46,918 1,00 21,47 H1 C ATOM 5454 OH TYR 93 -9,757 22,894 -47,687 1,00 24,56 H1 O ATOM 5455 C TYR 93 -10,263 29,110 -42,869 1,00 24,76 H1 C ATOM 5456 O TYR 93 -9,700 30,190 -43,064 _{1,00 26,10}H1 O ATOM 5457 N TYR 94 -10,719 28,735 -41,676 1,00 22,97 H1 N ATOM 5458 CA TYR 94 -10,583 29,576 -40,489 1,00 23,93 H1 C ATOM 5459 CB TYR 94 -11,946 29,821 -39,846 1,00 22,58 H1 C ATOM 5460 CG TYR 94 -12,952 30,548 -40,702 1,00 25,89 H1 C ATOM 5461 CD1 TYR 94 -12,938 31,936 -40,801 1,00 25,89 H1 C ATOM 5462 CE1 TYR 94 -13,908 32,614 -41,531 _1,0025,38 H1 C ATOM 5463 CD2 TYR 94 -13,962 29,850 -41,365 1,00 26,81 H1 C ATOM 5464 CE2 TYR 94 -14,935 30,516 -42,095 1,00 25,75 H1 C ATOM 5465 CZ TYR 94 -14,906 31,897 -42,172 1,00 27,48 H1 C ATOM 5466 OH TYR 94 -15,889 32,561 -42,874 1,00 28,03 H1 O ATOM 5467 C TYR 94 -9,691 28,908 -39,446 1,00 24,14 H1 C ATOM 5468 O TYR 94 -9,695 27,681 -39,310 _1,0022,75 H1 O ATOM 5469 N CYS 95 -8,938 29,716 -38,705 1,00 24,10 H1 N ATOM 5470 CA CYS 95 -8,466 29,294 -37,395 1,00 25,55 H1 C ATOM 5471 C CYS 95 -9,410 29,829 -36,338 1,00 25,49 H1 C ATOM 5472 O CYS 95 -10,104 30,819 -36,560 1,00 24,75 H1 O ATOM 5473 CB CYS 95 -7,034 29,781 -37,107 _1,0027,36 H1 C ATOM 5474 SG CYS 95 -6,561 31,491 -37,539 1,00 31,48 H1 S ATOM 5475 N ALA 96 -9,439 29,157 -35,192 1,00 24,09 H1 N ATOM 5476 CA ALA 96 -10,354 29,504 -34,117 1,00 22,01 H1 C ATOM 5477 CB ALA 96 -11,730 28,887 -34,380 1,00 20,76 H1 C ATOM 5478 C ALA 96 -9,782 28,977 -32,813 1,00 22,32 H1 C ATOM 5479 O ALA 96 -9,166 27,910 -32,775 _{1,00 22,28}H1 O ATOM 5480 N ARG 97 -9,997 29,723 -31,739 1,00 22,97 H1 N ATOM 5481 CA ARG 97 -9,439 29,355 -30,450 1,00 22,39 H1 C ATOM 5482 CB ARG 97 -9,076 30,614 -29,668 1,00 22,09 , H1 C (continuación)

ATOM 5483 CG ARG 97 -8,510 30,352 -28,276 1,00 21,83 H1 C ATOM 5484 CD ARG 97 -8,172 31,672 -27,581 1,00 23,69 H1 C ATOM 5485 NE ARG 97 -9,342 32,258 -26,927 _1,0023,06 H1 N ATOM 5486 CZ ARG 97 -9,273 33,201 -25,993 1,00 26,31 H1 C ATOM 5487 NH1 ARG 97 -8,090 33,668 -25,613 1,00 26,46 H1 N ATOM 5488 NH2 ARG 97 -10,379 33,662 -25,422 1,00 23,30 H1 N ATOM 5489 C ARG 97 -10,426 28,533 -29,636 1,00 24,53 H1 C ATOM 5490 O ARG 97 -11,632 28,801 -29,658 1,00 22,12 H1 O ATOM 5491 N GLY 98 -9,905 27,537 -28,921 _1,0022,25 H1 N ATOM 5492 CA GLY 98 -10,606 27,020 -27,760 1,00 23,81 H1 C ATOM 5493 C GLY 98 -11,259 25,658 -27,913 1,00 23,68 H1 C ATOM 5494 O GLY 98 -11,391 25,128 -29,023 1,00 23,49 H1 O ATOM 5495 N GLN 99 -11,668 25,095 -26,780 1,00 22,67 H1 N ATOM 5496 CA GLN 99 -12,293 23,780 -26,749 1,00 23,45 H1 C ATOM 5497 CB GLN 99 -11,253 22,706 -26,419 _1,0022,97 H1 C ATOM 5498 CG GLN 99 -11,774 21,269 -26,560 1,00 20,76 H1 C ATOM 5499 CD GLN 99 -10,690 20,232 -26,328 1,00 22,06 H1 C ATOM 5500 OE1 GLN 99 -10,482 19,768 -25,202 1,00 22,02 H1 O ATOM 5501 NE2 GLN 99 -9,992 19,860 -27,395 1,00 21,38 H1 N ATOM 5502 C GLN 99 -13,436 23,724 -25,725 1,00 24,22 H1 C ATOM 5503 O GLN 99 -14,550 23,329 -26,056 1,00 24,28 H1 O ATOM 5504 N LEU 100 -13,161 24,117 -24,485 1,00 23,64 H1 N ATOM 5505 CA LEU 100 -14,182 24,086 -23,448 1,00 24,07 H1 C ATOM 5506 CB LEU 100 -13,543 24,137 -22,055 1,00 23,74 H1 C ATOM 5507 CG LEU ₁₀₀-12,653 22,935 -21,697 _1,0023,65 H1 C ATOM 5508 CD1 LEU 100 -12,218 23,039 -20,250 1,00 21,96 H1 C ATOM 5509 CD2 LEU 100 -13,409 21,629 -21,918 1,00 22,57 H1 C ATOM 5510 C LEU 100 -15,133 25,257 -23,642 1,00 26,71 H1 C ATOM 5511 O LEU 100 -16,334 25,145 -23,386 1,00 27,08 H1 O ATOM 5512 N VAL 101 -14,591 26,380 -24,104 1,00 26,05 H1 N ATOM 5513 CA VAL ₁₀₁-15,413 27,446 -24,665 _1,0026,77 H1 C ATOM 5514 CB VAL 101 -15,146 28,799 -23,957 1,00 25,01 H1 C ATOM 5515 CG1 VAL 101 -16,083 29,869 -24,501 1,00 25,38 H1 C ATOM 5516 CG2 VAL 101 -15,361 28,646 -22,453 1,00 24,75 H1 C ATOM 5517 C VAL 101 -15,034 27,530 -26,141 1,00 26,59 H1 C ATOM 5518 O VAL 101 -14,149 28,290 -26,528 1,00 26,80 H1 O ATOM 5519 N PRO ₁₀₂-15,687 26,710 -26,980 _1,0025,65 H1 N ATOM 5520 CD PRO 102 -16,834 25,848 -26,646 1,00 23,49 H1 C ATOM 5521 CA PRO 102 -15,148 26,427 -28,315 1,00 23,89 H1 C ATOM 5522 CB PRO 102 -15,863 25,141 -28,729 1,00 23,18 H1 C ATOM 5523 CG PRO 102 -17,147 25,158 -27,954 1,00 25,40 H1 C ATOM 5524 C PRO ₁₀₂-15,315 27,542 -29,339 _1,0024,72 H1 C ATOM 5525 O PRO 102 -16,411 28,061 -29,550 1,00 24,05 H1 O ATOM 5526 N PHE 103 -14,206 27,900 -29,974 1,00 22,69 H1 N ATOM 5527 CA PHE 103 -14,223 28,841 -31,080 1,00 22,97 H1 C ATOM 5528 CB PHE 103 -15,059 28,262 -32,240 1,00 20,62 H1 C ATOM 5529 CG PHE 103 -14,912 26,755 -32,412 1,00 21,68 H1 C ATOM 5530 CD1 PHE 103 -16,005 25,970 -32,759 _1,0017,84 H1 C ATOM 5531 CD2 PHE 103 -13,693 26,125 -32,185 1,00 19,12 H1 C ATOM 5532 CE1 PHE 103 -15,888 24,595 -32,868 1,00 19,25 H1 C ATOM 5533 CE2 PHE 103 -13,565 24,745 -32,294 1,00 17,07 H1 C ATOM 5534 CZ PHE 103 -14,666 23,978 -32,634 1,00 18,07 H1 C (continuación)

ATOM 5535 C PHE 103 -14,781 30,195 -30,619 1,00 23,73 H1 C ATOM 5536 O PHE 103 -15,712 30,724 -31,217 _1,0024,85 H1 O ATOM 5537 N ASP 104 -14,215 30,752 -29,548 1,00 24,65 H1 N ATOM 5538 CA ASP 104 -14,669 32,050 -29,069 1,00 24,76 H1 C ATOM 5539 CB ASP 104 -14,406 32,217 -27,563 1,00 25,91 H1 C ATOM 5540 CG ASP 104 -12,945 32,005 -27,175 1,00 30,36 H1 C ATOM 5541 OD1 ASP 104 -12,122 31,635 -28,036 1,00 31,12 H1 O ATOM 5542 OD2 ASP 104 -12,619 32,212 -25,987 _1,0028,71 H1 ₀ATOM 5543 C ASP 104 -14,021 33,180 -29,856 1,00 27,29 H1 C ATOM 5544 O ASP 104 -14,586 34,262 -29,971 1,00 27,52 H1 O ATOM 5545 N TYR 105 -12,841 32,920 -30,411 1,00 26,93 H1 N ATOM 5546 CA TYR 105 -12,227 33,847 -31,355 1,00 26,35 H1 C ATOM 5547 CB TYR 105 -10,971 34,479 -30,743 1,00 25,73 H1 C ATOM 5548 CG TYR 105 -11,278 35,498 -29,675 _{1,00 28,28}H1 C ATOM 5549 CD1 TYR 105 -11,345 35,133 -28,334 1,00 26,26 H1 C ATOM 5550 CE1 TYR 105 -11,661 36,060 -27,359 1,00 27,70 H1 C ATOM 5551 CD2 TYR 105 -11,534 36,825 -30,012 1,00 29,38 H1 C ATOM 5552 CE2 TYR 105 -11,855 37,756 -29,044 1,00 29,45 H1 C ATOM 5553 CZ TYR 105 -11,918 37,368 -27,722 1,00 29,50 H1 C ATOM 5554 OH TYR 105 -12,255 38,299 -26,766 1,00 32,67 H1 O ATOM 5555 C TYR 105 -11,869 33,131 -32,657 1,00 25,43 H1 C ATOM 5556 O TYR 105 -11,426 31,982 -32,641 1,00 24,81 H1 O ATOM 5557 N TRP 106 -12,065 33,826 -33,774 1,00 24,15 H1 N ATOM 5558 CA TRP ₁₀₆-11,831 33,273 -35,106 _1,0025,25 H1 C ATOM 5559 CB TRP 106 -13,145 33,160 -35,879 1,00 21,93 H1 C ATOM 5560 CG TRP 106 -14,111 32,140 -35,362 1,00 22,83 H1 C ATOM 5561 CD2 TRP 106 -14,605 30,995 -36,072 1,00 21,41 H1 C ATOM 5562 CE2 TRP 106 -15,566 30,379 -35,250 1,00 20,48 H1 C ATOM 5563 CE3 TRP 106 -14,328 30,437 -37,326 1,00 20,75 H1 C ATOM 5564 CD1 TRP ₁₀₆-14,767 32,164 -34,170 _1,0019,87 H1 C ATOM 5565 NE1 TRP 106 -15,646 31,112 -34,095 1,00 22,85 H1 N ATOM 5566 CZ2 TRP 106 -16,258 29,229 -35,637 1,00 20,26 H1 C ATOM 5567 CZ3 TRP 106 -15,015 29,297 -37,711 1,00 20,27 H1 C ATOM 5568 CH2 TRP 106 -15,970 28,705 -36,868 1,00 23,31 H1 C ATOM 5569 C TRP 106 -10,902 34,181 -35,906 1,00 27,18 H1 C ATOM 5570 O TRP ₁₀₆-10,923 35,400 -35,741 _1,0026,73 H1 O ATOM 5571 N GLY 107 -10,114 33,587 -36,797 1,00 27,12 H1 N ATOM 5572 CA GLY 107 -9,418 34,377 -37,797 1,00 27,10 H1 C ATOM 5573 C GLY 107 -10,379 34,963 -38,822 1,00 28,57 H1 C ATOM 5574 0 GLY 107 -11,583 34,686 -38,790 1,00 27,48 H1 O ATOM 5575 N GLN ₁₀₈-9,852 35,771 -39,737 _{1,00 28,26}H1 N ATOM 5576 CA GLN 108 -10,680 36,424 -40,743 1,00 30,59 H1 C ATOM 5577 CB GLN 108 -9,980 37,684 -41,275 1,00 33,27 H1 C ATOM 5578 CG GLN 108 -8,939 37,432 -42,371 1,00 36,99 H1 C ATOM 5579 CD GLN 108 -7,566 37,046 -41,831 1,00 42,07 H1 C ATOM 5580 OE1 GLN 108 -7,395 36,782 -40,633 1,00 42,16 H1 O ATOM 5581 NE2 GLN ₁₀₈-6,577 37,012 -42,720 _1,0040,22 H1 N ATOM 5582 C GLN 108 -10,976 35,464 -41,895 1,00 30,47 H1 C ATOM 5583 O GLN 108 -11,868 35,710 -42,707 1,00 31,09 H1 O ATOM 5584 N GLY 109 -10,223 34,369 -41,953 1,00 29,81 H1 N ATOM 5585 CA GLY 109 -10,492 33,323 -42,923 1,00 29,09 H1 C (continuación)

ATOM 5586 C GLY 109 -9,718 33,498 -44,216 1,00 28,69 H1 C ATOM 5587 O GLY 109 -9,425 34,618 -44,619 _1,0028,50 H1 O ATOM 5588 N THR 110 -9,386 32,389 -44,866 1,00 28,50 H1 N ATOM 5589 CA THR 110 -8,682 32,431 -46,139 1,00 28,41 H1 C ATOM 5590 CB THR 110 -7,285 31,793 -46,021 1,00 29,01 H1 C ATOM 5591 OG1 THR 110 -6,522 32,494 -45,034 1,00 32,03 H1 O ATOM 5592 CG2 THR 110 -6,554 31,856 -47,356 1,00 29,38 H1 C ATOM 5593 C THR ₁₁₀-9,476 31,669 -47,193 _1,0029,43 H1 C ATOM 5594 O THR 110 -9,712 30,471 -47,053 1,00 27,15 H1 O ATOM 5595 N LEU 111 -9,890 32,364 -48,246 1,00 29,78 H1 N ATOM 5596 CA LEU 111 -10,616 31,723 -49,328 1,00 29,48 H1 C ATOM 5597 CB LEU 111 -11,234 32,766 -50,258 1,00 31,55 H1 C ATOM 5598 CG LEU 111 -11,853 32,182 -51,537 1,00 36,06 H1 C ATOM 5599 CD1 LEU ₁₁₁-13,054 31,310 -51,180 _1,0035,44 H1 C ATOM 5600 CD2 LEU 111 -12,272 33,308 -52,470 1,00 33,87 H1 C ATOM 5601 C LEU 111 -9,659 30,839 -50,109 1,00 30,13 H1 C ATOM 5602 O LEU 111 -8,661 31,308 -50,664 1,00 30,30 H1 O ATOM 5603 N VAL 112 -9,953 29,547 -50,129 1,00 28,78 H1 N ATOM 5604 CA VAL 112 -9,134 28,603 -50,862 1,00 27,19 H1 C ATOM 5605 CB VAL 112 -8,700 27,434 -49,964 1,00 27,32 H1 C ATOM 5606 CG1 VAL 112 -7,986 26,383 -50,793 1,00 26,80 H1 C ATOM 5607 CG2 VAL 112 -7,788 27,951 -48,857 1,00 25,55 H1 C ATOM 5608 C VAL 112 -9,934 28,071 -52,039 1,00 28,91 H1 C ATOM 5609 O VAL _{112 -11,012}27,493 -51,867 _1,0026,37 H1 O ATOM 5610 N THR 113 -9,405 28,288 -53,237 1,00 28,59 H1 N ATOM 5611 CA THR 113 -10,076 27,865 -54,457 1,00 31,25 H1 C ATOM 5612 CB THR 113 -10,365 29,071 -55,379 1,00 30,80 H1 C ATOM 5613 OG1 THR 113 -11,220 29,992 -54,691 1,00 33,89 H1 O ATOM 5614 CG2 THR 113 -11,064 28,623 -56,658 1,00 32,74 H1 C ATOM 5615 C THR 113 -9,190 _26,868-55,183 _1,0031,51 H1 C ATOM 5616 O THR 113 -8,041 27,163 -55,506 1,00 32,27 H1 O ATOM 5617 N VAL 114 -9,721 25,674 -55,406 1,00 32,99 H1 N ATOM 5618 CA VAL 114 -8,990 24,643 -56,122 1,00 34,40 H1 C ATOM 5619 CB VAL 114 -8,865 23,356 -55,288 1,00 32,69 H1 C ATOM 5620 CG1 VAL 114 -8,002 22,346 -56,026 1,00 30,00 H1 C ATOM 5621 CG2 VAL 114 -8,294 23,671 -53,916 _1,0032,66 H1 C ATOM 5622 C VAL 114 -9,745 24,305 -57,401 1,00 37,41 H1 C ATOM 5623 O VAL 114 -10,881 23,828 -57,349 1,00 37,23 H1 O ATOM 5624 N SER 115 -9,119 24,564 -58,544 1,00 39,18 H1 N ATOM 5625 CA SER 115 -9,668 24,115 -59,813 1,00 44,39 H1 C ATOM 5626 CB SER 115 -10,785 25,059 -60,277 _1,0045,61 H1 C ATOM 5627 OG SER 115 -10,365 25,884 -,61,347 1,00 45,98 H1 O ATOM 5628 C SER 115 -8,586 24,014 -60,881 1,00 46,47 H1 C ATOM 5629 0 SER 115 -7,543 24,667 -60,796 1,00 45,73 H1 O ATOM 5630 N SER 116 -8,841 23,177 -61,880 1,00 49,79 H1 N ATOM 5631 CA SER 116 -7,891 22,949 -62,961 1,00 53,39 H1 C ATOM 5632 CB SER ₁₁₆-7,763 21,450 -63,230 _1,0052,69 H1 C ATOM 5633 OG SER 116 -9,040 20,871 -63,434 1,00 54,43 H1 O ATOM 5634 C SER 116 -8,348 23,658 -64,230 1,00 55,63 , H1 C ATOM 5635 O SER 116 -7,679 23,595 -65,261 1,00 57,09 H1 O ATOM 5636 N ALA 117 -9,491 24,332 -64,146 1,00 57,80 H1 N ATOM 5637 CA ALA 117 -10,149 24,878 -65,329 1,00 60,79 H1 C (continuación)

ATOM 5638 CB ALA 117 -11,572 25,305 -64,983 _1,0060,52 H1 C ATOM 5639 C ALA 117 -9,391 26,049 -65,946 1,00 62,07 H1 C ATOM 5640 O ALA 117 -8,832 26,890 -65,240 1,00 62,18 H1 O ATOM 5641 N SER 118 -9,380 26,095 -67,274 1,00 64,43 H1 N ATOM 5642 CA SER 118 -8,766 27,201 -67,996 1,00 65,80 H1 C ATOM 5643 CB SER 118 -7,636 26,692 -68,890 1,00 66,05 H1 C ATOM 5644 OG SER _{118 -6,810}27,764 -69,309 _1,0068,87 H1 O ATOM 5645 C SER 118 -9,807 27,920 -68,845 1,00 65,94 H1 C ATOM 5646 O SER 118 -10,856 27,358 -69,164 1,00 65,51 H1 O ATOM 5647 N THR 119 -9,505 29,161 -69,211 1,00 66,97 H1 N ATOM 5648 CA THR 119 -10,462 30,027 -69,893 1,00 67,67 H1 C ATOM 5649 CB THR 119 -9,775 31,297 -70,430 1,00 67,99 H1 C ATOM 5650 OG1 THR 119 -9,195 32,026 -69,339 _1,0068,98 H1 O ATOM 5651 CG2 THR 119 -10,784 32,181 -71,146 1,00 67,51 H1 C ATOM 5652 C THR 119 -11,167 29,336 -71,054 1,00 67,83 H1 C ATOM 5653 O THR 119 -10,543 28,631 -71,848 1,00 67,72 H1 O ATOM 5654 N LYS 120 -12,477 29,546 -71,141 1,00 67,80 H1 N ATOM 5655 CA LYS 120 -13,282 28,985 -72,217 1,00 68,20 H1 C ATOM 5656 CB LYS 120 -13,685 27,545 -71,889 1,00 67,62 H1 C ATOM 5657 CG LYS 120 -14,595 26,908 -72,931 1,00 67,51 H1 C ATOM 5658 CD LYS 120 -15,178 25,590 -72,436 1,00 69,11 H1 C ATOM 5659 CE LYS 120 -16,168 25,004 -73,437 1,00 69,25 H1 C ATOM 5660 NZ LYS ₁₂₀-17,270 25,956 -73,782 _1,0070,85 H1 N ATOM 5661 C LYS 120 -14,537 29,824 -72,432 1,00 69,04 H1 C ATOM 5662 O LYS 120 -15,329 30,023 -71,508 1,00 69,38 H1 O ATOM 5663 N GLY 121 -14,715 30,308 -73,659 1,00 69,06 H1 N ATOM 5664 CA GLY 121 -15,886 31,102 -73,982 1,00 68,10 H1 C ATOM 5665 C GLY 121 -17,159 30,283 -73,922 1,00 68,13 H1 C ATOM 5666 O GLY ₁₂₁-17,129 29,061 -74,089 _1,0067,67 H1 O ATOM 5667 N PRO 122 -18,303 30,936 -73,678 1,00 67,96 H1 N ATOM 5668 CD PRO 122 -18,403 32,385 -73,433 1,00 67,50 H1 C ATOM 5669 CA PRO 122 -19,596 30,260 -73,523 1,00 68,40 H1 C ATOM 5670 CB PRO 122 -20,492 31,337 -72,925 1,00 68,31 H1 C ATOM 5671 CG PRO 122 -19,885 32,622 -73,381 1,00 68,44 H1 C ATOM 5672 C PRO ₁₂₂-20,173 29,701 -74,819 _1,0069,03 H1 C ATOM 5673 O PRO 122 -19,899 30,207 -75,906 1,00 69,06 H1 O ATOM 5674 N SER 123 -20,972 28,649 -74,688 1,00 69,50 H1 N ATOM 5675 CA SER 123 -21,822 28,187 -75,776 1,00 70,46 H1 C ATOM 5676 CB SER 123 -21,828 26,658 -75,823 1,00 70,16 H1 C ATOM 5677 OG SER 123 -22,886 26,177 -76,631 1,00 70,42 H1 O ATOM 5678 C SER 123 -23,238 28,708 -75,532 1,00 71,61 H1 C ATOM 5679 O SER 123 -23,796 28,518 -74,450 1,00 71,85 H1 O ATOM 5680 N VAL 124 -23,814 29,366 -76,536 1,00 71,93 H1 N ATOM 5681 CA VAL 124 -25,099 30,039 -76,368 1,00 71,46 H1 C ATOM 5682 CB VAL 124 -25,035 31,486 -76,898 1,00 70,79 H1 C ATOM 5683 CG1 VAL 124 -26,356 32,191 -76,640 _1,0069,89 H1 C ATOM 5684 CG2 VAL 124 -23,886 32,233 -76,236 1,00 68,40 H1 C ATOM 5685 C VAL 124 -26,244 29,313 -77,073 1,00 72,64 H1 C ATOM 5686 O VAL 124 -26,151 28,983 -78,255 1,00 73,01 H1 O ATOM 5687 N PHE 125 -27,324 29,071 -76,338 1,00 73,89 H1 N ATOM 5688 CA PHE 125 -28,510 28,431 -76,894 1,00 75,85 H1 C ATOM 5689 CB PHE 125 -28,723 27,062 -76,247 _1,0076,97 H1 C (continuación)

ATOM 5690 CG PHE 125 -27,641 26,071 -76,557 1,00 78,42 H1 C ATOM 5691 CD1 PHE 125 -27,704 25,293 -77,702 1,00 78,83 H1 C ATOM 5692 CD2 PHE 125 -26,560 25,916 -75,704 1,00 78,71 H1 C ATOM 5693 CE1 PHE 125 -26,712 24,,380 -77,992 1,00 79,49 H1 C ATOM 5694 CE2 PHE 125 -25,564 25,004 -75,987 1,00 79,38 H1 C ATOM 5695 CZ PHE 125 -25,639 24,235 -77,134 _{1,00 80,12}H1 C ATOM 5696 C PHE 125 -29,749 29,292 -76,671 1,00 77,12 H1 C ATOM 5697 O PHE 125 -29,803 30,084 -75,731 1,00 76,96 H1 O ATOM 5698 N PRO 126 -30,760 29,151 -77,543 1,00 78,18 H1 N ATOM 5699 CD PRO 126 -30,705 28,371 -78,793 1,00 78,12 H1 C ATOM 5700 CA PRO 126 -32,048 29,838 -77,388 1,00 78,24 H1 C ATOM 5701 CB PRO ₁₂₆-32,641 29,793 -78,789 _1,0077,98 H1 C ATOM 5702 CG PRO 126 -32,099 28,522 -79,358 1,00 77,57 H1 C ATOM 5703 C PRO 126 -32,951 29,136 -76,376 1,00 78,94 H1 C ATOM 5704 O PRO 126 -33,020 27,909 -76,344 1,00 78,95 H1 O ATOM 5705 N LEU 127 -33,643 29,918 -75,555 1,00 80,12 H1 N ATOM 5706 CA LEU 127 -34,690 29,378 -74,695 1,00 81,26 H1 C ATOM 5707 CB LEU 127 -34,451 29,790 -73,239 1,00 80,50 H1 C ATOM 5708 CG LEU 127 -33,138 29,323 -72,604 1,00 79,91 H1 C ATOM 5709 CD1 LEU 127 -33,050 29,821 -71,171 1,00 79,12 H1 C ATOM 5710 CD2 LEU 127 -33,061 27,806 -72,647 1,00 79,76 H1 C ATOM 5711 C LEU 127 -36,039 29,905 -75,174 _1,0082,39 H1 C ATOM 5712 0 LEU 127 -36,562 30,883 -74,639 1,00 82,90 H1 O ATOM 5713 N ALA 128 -36,595 29,247 -76,187 1,00 83,36 H1 N ATOM 5714 CA ALA 128 -37,769 29,753 -76,891 1,00 84,32 H1 C ATOM 5715 CB ALA 128 -37,982 28,959 -78,174 1,00 84,16 H1 C ATOM 5716 C ALA 128 -39,031 29,711 -76,036 1,00 85,07 H1 C ATOM 5717 ₀ALA ₁₂₈-39,252 28,766 -75,275 _1,0085,35 H1 O ATOM 5718 N PRO 129 -39,884 30,740 -76,164 1,00 85,56 H1 N ATOM 5719 CD PRO 129 -39,691 31,851 -77,113 1,00 85,77 H1 C ATOM 5720 CA PRO 129 -41,121 30,890 -75,387 1,00 85,80 H1 C ATOM 5721 CB PRO 129 -41,604 32,293 -75,747 1,00 85,81 H1 C ATOM 5722 CG PRO 129 -41,019 32,555 -77,094 1,00 86,05 H1 C ATOM 5723 C PRO 129 -42,175 29,827 -75,697 _1,0086,17 H1 C ATOM 5724 O PRO 129 -42,318 29,391 -76,840 1,00 85,88 H1 O ATOM 5725 N SER 130 -42,911 29,421 -74,667 1,00 86,84 H1 N ATOM 5726 CA SER 130 -43,963 28,421 -74,816 1,00 87,43 H1 C ATOM 5727 CB SER 130 -44,385 27,890 -73,441 1,00 87,92 H1 C ATOM 5728 OG SER 130 -43,298 27,275 -72,771 _1,0088,97 H1 O ATOM 5729 C SER 130 -45,175 29,014 -75,531 1,00 87,44 H1 C ATOM 5730 O SER 130 -45,780 28,371 -76,391 1,00 87,06 H1 O ATOM 5731 N GLY 136 -50,193 34,409 -68,488 1,00 99,67 H1 N ATOM 5732 CA GLY 136 -51,016 34,123 -69,648 1,00 99,80 H1 C ATOM 5733 C GLY 136 -51,050 35,272 -70,638 1,00100,02 H1 C ATOM 5734 O GLY 136 -51,114 35,055 -71,850 1,00100,03 H1 O ATOM 5735 N GLY 137 -51,007 36,498 -70,123 1,00 99,85 H1 N ATOM 5736 CA GLY 137 -50,995 37,666 -70,986 1,00 99,13 H1 C ATOM 5737 C GLY 137 -49,608 37,961 -71,527 1,00 98,66 H1 C ATOM 5738 O GLY 137 -49,456 38,642 -72,542 1,00 98,56 H1 O ATOM 5739 N THR 138 -48,591 37,446 -70,842 1,00 98,05 H1 N ATOM 5740 CA THR 138 -47,209 37,602 -71,282 _1,0096,71 H1 C ATOM 5741 CB THR 138 -46,393 38,445 -70,280 1,00 96,65 H1 C (continuación)

ATOM 5742 OG1 THR 138 -46,424 37,817 -68,991 1,00 96,53 H1 O ATOM 5743 CG2 THR 138 -46,967 39,851 -70,175 1,00 95,98 H1 C ATOM 5744 C THR 138 -46,526 36,247 -71,444 1,00 95,56 H1 C ATOM 5745 O THR 138 -46,947 35,250 -70,853 1,00 95,36 H1 O ATOM 5746 N ALA 139 -45,472 36,220 -72,253 1,00 94,21 H1 N ATOM 5747 CA ALA 139 -44,659 35,022 -72,418 1,00 92,92 H1 C ATOM 5748 CB ALA 139 -44,780 34,497 -73,846 1,00 93,04 H1 C ATOM 5749 C ALA 139 -43,202 35,339 -72,095 1,00 91,71 H1 C ATOM 5750 O ALA 139 -42,713 36,430 -72,395 1,00 91,15 H1 O ATOM 5751 N ALA 140 -42,513 34,383 -71,480 1,00 90,37 H1 N ATOM 5752 CA ALA 140 -41,123 34,582 -71,092 1,00 88,70 H1 C ATOM 5753 CB ALA 140 -40,928 34,187 -69,634 1,00 89,09 H1 C ATOM 5754 C ALA 140 -40,178 33,783 -71,982 1,00 87,42 H1 C ATOM 5755 O ALA 140 -40,491 32,667 -72,400 1,00 86,82 H1 O ATOM 5756 N LEU 141 -39,020 34,368 -72,267 1,00 86,13 H1 N ATOM 5757 CA LEU 141 -38,002 33,722 -73,084 1,00 85,33 H1 C ATOM 5758 CB LEU 141 -38,303 33,941 -74,572 1,00 85,25 H1 C ATOM 5759 CG LEU 141 -38,499 35,376 -75,081 1,00 85,32 H1 C ATOM 5760 CD1 LEU 141 -37,162 36,103 -75,165 1,00 84,61 H1 C ATOM 5761 CD2 LEU 141 -39,154 35,334 -76,453 1,00 85,35 H1 C ATOM 5762 C LEU 141 -36,621 34,275 -72,741 1,00 85,01 H1 C ATOM 5763 O LEU 141 -36,496 35,396 -72,247 1,00 85,36 H1 O ATOM 5764 N GLY 142 -35,587 33,484 -73,001 1,00 83,90 H1 N ATOM 5765 CA GLY 142 -34,233 33,941 -72,752 1,00 83,19 H1 C ATOM 5766 C GLY 142 -33,231 33,175 -73,589 1,00 82,79 H1 C ATOM 5767 O GLY 142 -33,609 32,491 -74,539 1,00 83,09 H1 O ATOM 5768 N CYS 143 -31,952 33,289 -73,248 1,00 82,17 H1 N ATOM 5769 CA CYS 143 -30,940 32,465 -73,890 1,00 81,85 H1 C ATOM 5770 C CYS 143 -29,954 31,864 -72,882 1,00 80,13 H1 C ATOM 5771 O CYS 143 -29,537 32,518 -71,925 1,00 79,94 H1 O ATOM 5772 CB CYS 143 -30,204 33,270 -74,974 1,00 83,41 H1 C ATOM 5773 SG CYS 143 -28,939 34,449 -74,400 1,00 87,73 H1 S ATOM 5774 N LEU 144 -29,601 30,602 -73,109 1,00 78,24 H1 N ATOM 5775 CA LEU 144 -28,826 29,808 -72,161 1,00 75,92 H1 C ATOM 5776 CB LEU 144 -29,286 28,349 -72,233 1,00 75,88 H1 C ATOM 5777 CG LEU 144 -28,506 27,285 -71,462 1,00 76,15 H1 C ATOM 5778 CD1 LEU 144 -28,543 27,594 -69,977 1,00 76,40 H1 C ATOM 5779 CD2 LEU 144 -29,115 25,915 -71,739 1,00 75,59 H1 C ATOM 5780 C LEU 144 -27,329 29,895 -72,449 1,00 74,33 H1 C ATOM 5781 O LEU 144 -26,890 29,633 -73,566 1,00 74,67 H1 O ATOM 5782 N VAL 145 -26,549 30,260 -71,436 1,00 72,28 H1 N ATOM 5783 CA VAL 145 -25,103 30,401 -71,591 1,00 70,90 H1 C ATOM 5784 CB VAL 145 -24,623 31,746 -71,003 1,00 69,27 H1 C ATOM 5785 CG1 VAL 145 -23,127 31,873 -71,147 1,00 69,00 H1 C ATOM 5786 CG2 VAL 145 -25,319 32,894 -71,705 1,00 68,74 H1 C ATOM 5787 C VAL 145 -24,358 29,254 -70,899 1,00 71,16 H1 C ATOM 5788 O VAL 145 -24,173 29,269 -69,680 1,00 71,43 H1 O ATOM 5789 N LYS 146 -23,927 28,266 -71,684 1,00 70,62 H1 N ATOM 5790 CA LYS 146 -23,358 27,031 -71,141 1,00 70,17 H1 C ATOM 5791 CB LYS 146 -23,870 25,819 -71,925 1,00 71,40 H1 C ATOM 5792 CG LYS 146 -25,286 25,393 -71,583 1,00 74,93 H1 C ATOM 5793 CD LYS 146 -25,822 24,395 -72,605 1,00 78,01 H1 C (continuación)

ATOM 5794 CE LYS 146 -24,948 23,146 -72,701 1,00 79,46 H1 C ATOM 5795 NZ LYS 146 -25,126 22,233 -71,534 1,00 80,50 H1 N ATOM 5796 C LYS 146 -21,831 26,988 -71,127 1,00 68,82 H1 C ATOM 5797 O LYS 146 -21,173 27,538 -72,011 _1,0068,87 H1 O ATOM 5798 N ASP 147 -21,286 26,330 -70,106 1,00 66,87 H1 N ATOM 5799 CA ASP 147 -19,906 25,850 -70,110 1,00 64,95 H1 C ATOM 5800 CB ASP 147 -19,759 24,720 -71,129 1,00 64,08 H1 C ATOM 5801 CG ASP 147 -20,730 23,582 -70,877 1,00 65,39 H1 C ATOM 5802 OD1 ASP 147 -20,976 23,252 -69,697 1,00 64,41 H1 O ATOM 5803 OD2 ASP 147 -21,250 23,015 -71,862 _1,0066,30 H1 O ATOM 5804 C ASP 147 -18,857 26,920 -70,390 1,00 64,29 H1 C ATOM 5805 O ASP 147 -18,121 26,829 -71,368 1,00 64,65 H1 O ATOM 5806 N TYR 148 -18,775 27,925 -69,527 1,00 63,41 H1 N ATOM 5807 CA TYR 148 -17,760 28,956 -69,687 1,00 63,64 H1 C ATOM 5808 CB TYR 148 -18,411 30,291 -70,061 1,00 63,45 H1 C ATOM 5809 CG TYR 148 -19,292 30,886 -68,984 1,00 62,08 H1 C ATOM 5810 CD1 TYR 148 -18,787 31,813 -68,081 1,00 61,94 H1 C ATOM 5811 CE1 TYR 148 -19,594 32,383 -67,112 1,00 61,63 H1 C ATOM 5812 CD2 TYR 148 -20,632 30,539 -68,887 1,00 62,19 H1 C ATOM 5813 CE2 TYR 148 -21,448 31,103 -67,920 _{1,00 62,61}H1 C ATOM 5814 CZ TYR 148 -20,923 32,024 -67,037 1,00 61,07 H1 C ATOM 5815 OH TYR 148 -21,731 32,594 -66,082 1,00 61,02 H1 O ATOM 5816 C TYR 148 -16,920 29,126 -68,425 1,00 64,03 H1 C ATOM 5817 O TYR 148 -17,296 28,664 -67,348 1,00 63,78 H1 O ATOM 5818 N PHE 149 -15,777 29,788 -68,572 1,00 64,42 H1 N ATOM 5819 CA PHE 149 -14,897 30,073 -67,446 _1,0065,06 H1 C ATOM 5820 CB PHE 149 -14,209 28,787 -66,972 1,00 63,77 H1 C ATOM 5821 CG PHE 149 -13,335 28,979 -65,765 1,00 62,58 H1 C ATOM 5822 CD1 PHE 149 -12,012 29,371 -65,904 1,00 61,56 H1 C ATOM 5823 CD2 PHE 149 -13,843 28,789 -64,489 1,00 62,08 H1 C ATOM 5824 CE1 PHE 149 -11,210 29,576 -64,795 1,00 60,99 H1 C ATOM 5825 CE2 PHE 149 -13,047 28,992 -63,373 _1,0062,34 H1 C ATOM 5826 CZ PHE 149 -11,727 29,386 -63,527 1,00 61,88 H1 C ATOM 5827 C PHE 149 -13,844 31,092 -67,865 1,00 66,30 H1 C ATOM 5828 O PHE 149 -13,365 31,069 -68,998 1,00 67,25 H1 O ATOM 5829 N PRO 150 -13,473 32,006 -66,955 1,00 67,74 H1 N ATOM 5830 CD PRO 150 -12,274 32,850 -67,107 _1,0067,53 H1 C ATOM 5831 CA PRO 150 -14,104 32,195 -65,645 1,00 68,63 H1 C ATOM 5832 CB PRO 150 -13,037 32,928 -64,841 1,00 67,62 H1 C ATOM 5833 CG PRO 150 -12,295 33,712 -65,866 1,00 67,46 H1 C ATOM 5834 C PRO 150 -15,389 33,010 -65,742 1,00 70,45 H1 C ATOM 5835 O PRO 150 -16,077 32,997 -66,764 1,00 71,47 H1 O ATOM 5836 N GLU 151 -15,700 33,719 -64,663 _1,0071,80 H1 N ATOM 5837 CA GLU 151 -16,743 34,734 -64,676 1,00 72,52 H1 C ATOM 5838 CB GLU 151 -17,550 34,681 -63,378 1,00 72,76 H1 C ATOM 5839 CG GLU 151 -18,290 33,376 -63,155 1,00 74,07 H1 C ATOM 5840 CD GLU 151 -19,458 33,535 -62,204 1,00 74,56 H1 C ATOM 5841 OE1 GLU 151 -20,618 33,454 -62,665 1,00 74,92 H1 O ATOM 5842 OE2 GLU 151 -19,216 33,745 -60,997 _1,0073,75 H1 O ATOM 5843 C GLU 151 -16,079 36,099 -64,806 1,00 73,24 H1 C ATOM 5844 O GLU 151 -14,868 36,227 -64,624 1,00 72,62 H1 O ATOM 5845 N PRO 152 -16,867 37,142 -65,113 1,00 74,62 H1 N (continuación)

ATOM 5846 CD PRO 152 -16,420 38,539 -64,959 1,00 74,59 H1 C ATOM 5847 CA PRO 152 -18,292 37,070 -65,452 1,00 75,10 H1 C ATOM 5848 CB PRO 152 -18,849 38,361 -64,867 _1,0075,76 H1 C ATOM 5849 CG PRO 152 -17,712 39,337 -65,029 1,00 75,41 H1 C ATOM 5850 C PRO 152 -18,556 36,968 -66,952 1,00 75,76 H1 C ATOM 5851 O PRO 152 -17,630 36,989 -67,761 1,00 75,62 H1 O ATOM 5852 N VAL 153 -19,830 36,854 -67,312 1,00 76,74 H1 N ATOM 5853 CA VAL 153 -20,266 37,125 -68,676 1,00 78,44 H1 C ATOM 5854 CB VAL 153 -20,722 35,836 -69,410 _1,0078,41 H1 C ATOM 5855 CG1 VAL 153 -19,573 34,848 -69,489 1,00 78,22 H1 C ATOM 5856 CG2 VAL 153 -21,909 35,219 -68,700 1,00 78,16 H1 C ATOM 5857 C VAL 153 -21,428 38,114 -68,651 1,00 79,27 H1 C ATOM 5858 O VAL 153 -22,353 37,981 -67,848 1,00 79,85 H1 O ATOM 5859 N THR 154 -21,367 39,111 -69,528 1,00 79,67 H1 N ATOM 5860 CA THR 154 -22,408 40,130 -69,613 1,00 79,68 H1 C ATOM 5861 CB THR 154 -21,808 41,505 -69,963 1,00 79,51 H1 C ATOM 5862 OG1 THR 154 -21,139 41,422 -71,228 1,00 79,48 H1 O ATOM 5863 CG2 THR 154 -20,811 41,945 -68,897 1,00 78,20 H1 C ATOM 5864 C THR 154 -23,417 39,754 -70,693 _{1,00 80,21}H1 C ATOM 5865 O THR 154 -23,034 39,413 -71,812 1,00 80,43 H1 O ATOM 5866 N VAL 155 -24,703 39,813 -70,359 1,00 80,71 H1 N ATOM 5867 CA VAL 155 -25,752 39,518 -71,330 1,00 81,00 H1 C ATOM 5868 CB VAL 155 -26,580 38,284 -70,910 1,00 80,93 H1 C ATOM 5869 CG1 VAL 155 -27,614 37,965 -71,979 1,00 80,65 H1 C ATOM 5870 CG2 VAL 155 -25,666 37,094 -70,689 _1,0081,15 H1 C ATOM 5871 C VAL 155 -26,701 40,702 -71,503 1,00 81,78 H1 C ATOM 5872 O VAL 155 -27,351 41,139 -70,551 1,00 81,71 H1 O ATOM 5873 N SER 156 -26,772 41,216 -72,727 1,00 82,68 H1 N ATOM 5874 CA SER 156 -27,654 42,334 -73,046 1,00 83,16 H1 C ATOM 5875 CB SER 156 -26,847 43,473 -73,674 1,00 83,30 H1 C ATOM 5876 OG SER 156 -27,652 44,620 -73,878 _1,0084,63 H1 O ATOM 5877 C SER 156 -28,739 41,868 -74,014 1,00 83,16 H1 C ATOM 5878 O SER 156 -28,596 40,831 -74,658 1,00 82,89 H1 O ATOM 5879 N TRP 157 -29,825 42,627 -74,110 1,00 83,58 H1 N ATOM 5880 CA TRP 157 -30,919 42,259 -75,001 1,00 84,15 H1 C ATOM 5881 CB TRP 157 -32,180 41,952 -74,188 _1,0083,42 H1 C ATOM 5882 CG TRP 157 -32,120 40,627 -73,494 1,00 83,40 H1 C ATOM 5883 CD2 TRP 157 -32,489 39,355 -74,042 1,00 83,53 H1 C ATOM 5884 CE2 TRP 157 -32,248 38,386 -73,047 1,00 83,19 H1 C ATOM 5885 CE3 TRP 157 -33,000 38,941 -75,277 1,00 83,42 H1 C ATOM 5886 CD1 TRP 157 -31,684 40,385 -72,224 1,00 83,06 H1 C ATOM 5887 NE1 TRP 157 -31,757 39,040 -71,947 _1,0082,93 H1 N ATOM 5888 CZ2 TRP 157 -32,498 37,030 -73,250 1,00 83,39 H1 C ATOM 5889 CZ3 TRP 157 -33,247 37,594 -75,476 1,00 83,62 H1 C ATOM 5890 CH2 TRP 157 -32,997 36,655 -74,468 1,00 83,34 H1 C ATOM 5891 C TRP 157 -31,219 43,334 -76,041 1,00 84,76 H1 C ATOM 5892 O TRP 157 -31,410 44,505 -75,706 1,00 84,03 H1 O ATOM 5893 N ASN 158 -31,260 42,921 -77,306 _1,0085,58 H1 N ATOM 5894 CA ASN 158 -31,495 43,842 -78,411 1,00 86,37 H1 C ATOM 5895 CB ASN 158 -32,946 44,331 -78,389 1,00 86,40 H1 C ATOM 5896 CG ASN 158 -33,946 43,196 -78,553 1,00 87,21 H1 C ATOM 5897 OD1 ASN 158 -33,691 42,224 -79,268 1,00 86,86 H1 O (continuación)

ATOM 5898 ND2 ASN 158 -35,091 43,315 -77,889 1,00 86,97 H1 N ATOM 5899 C ASN 158 -30,536 45,026 -78,315 _1,0086,98 H1 C ATOM 5900 O ASN 158 -30,939 46,183 -78,439 1,00 86,86 H1 O ATOM 5901 N SER 159 -29,264 44,717 -78,077 1,00 87,36 H1 N ATOM 5902 CA SER 159 -28,203 45,716 -78,013 1,00 87,62 H1 C ATOM 5903 CB SER 159 -27,970 46,322 -79,398 1,00 87,30 H1 C ATOM 5904 OG SER 159 -27,479 45,341 -80,297 1,00 86,83 H1 O ATOM 5905 C SER 159 -28,471 46,822 -76,999 _1,0087,96 H1 C ATOM 5906 O SER 159 -27,791 47,849 -76,998 1,00 87,94 H1 O ATOM 5907 N GLY 160 -29,459 46,608 -76,136 1,00 88,50 H1 N ATOM 5908 CA GLY 160 -29,716 47,551 -75,062 1,00 88,84 H1 C ATOM 5909 C GLY 160 -31,108 48,150 -75,103 1,00 88,98 H1 C ATOM 5910 O GLY 160 -31,570 48,731 -74,120 1,00 88,61 H1 O ATOM 5911 N ALA 161 -31,779 48,006 -76,242 1,00 89,24 H1 N ATOM 5912 CA ALA 161 -33,105 48,585 -76,430 1,00 89,63 H1 C ATOM 5913 CB ALA 161 -33,569 48,373 -77,868 1,00 89,23 H1 C ATOM 5914 C ALA 161 -34,112 47,971 -75,461 1,00 89,76 H1 C ATOM 5915 O ALA ₁₆₁-35,083 48,619 -75,067 _1,0089,81 H1 O ATOM 5916 N LEU 162 -33,874 46,718 -75,084 1,00 89,21 H1 N ATOM 5917 CA LEU 162 -34,769 46,006 -74,182 1,00 88,42 H1 C ATOM 5918 CB LEU 162 -35,189 44,673 -74,806 1,00 87,77 H1 C ATOM 5919 CG LEU 162 -36,018 43,738 -73,923 1,00 87,40 H1 C ATOM 5920 CD1 LEU 162 -37,267 44,456 -73,439 1,00 86,87 H1 C ATOM 5921 CD2 LEU ₁₆₂-36,384 42,491 -74,710 _1,0086,79 H1 C ATOM 5922 C LEU 162 -34,106 45,753 -72,833 1,00 88,21 H1 C ATOM 5923 O LEU 162 -33,176 44,954 -72,727 1,00 88,43 H1 O ATOM 5924 N THR 163 -34,591 46,441 -71,804 1,00 87,73 H1 N ATOM 5925 CA THR 163 -34,069 46,270 -70,453 1,00 87,13 H1 C ATOM 5926 CB THR 163 -33,414 47,569 -69,937 1,00 87,76 H1 C ATOM 5927 OG1 THR 163 -34,374 48,634 -69,962 _1,0088,69 H1 O ATOM 5928 CG2 THR 163 -32,218 47,946 -70,804 1,00 87,58 H1 C ATOM 5929 C THR 163 -35,194 45,880 -69,503 1,00 86,16 H1 C ATOM 5930 O THR 163 -34,957 45,286 -68,449 1,00 85,76 H1 O ATOM 5931 N SER 164 -36,420 46,216 -69,888 1,00 84,83 H1 N ATOM 5932 CA SER 164 -37,584 45,961 -69,052 _1,0083,71 H1 C ATOM 5933 CB SER 164 -38,737 46,877 -69,475 1,00 84,14 H1 C ATOM 5934 OG SER 164 -39,855 46,731 -68,616 1,00 84,04 H1 O ATOM 5935 C SER 164 -38,016 44,500 -69,149 1,00 82,36 H1 C ATOM 5936 O SER 164 -38,185 43,962 -70,244 1,00 82,47 H1 O ATOM 5937 N GLY 165 -38,193 43,864 -67,995 1,00 80,97 H1 N ATOM 5938 CA GLY 165 -38,616 42,476 -67,972 _1,0079,30 H1 C ATOM 5939 C GLY 165 -37,452 41,504 -68,016 1,00 78,12 H1 C ATOM 5940 O GLY 165 -37,651 40,294 -68,120 1,00 77,82 H1 O ATOM 5941 N VAL 166 -36,233 42,030 -67,935 1,00 76,72 H1 N ATOM 5942 CA VAL 166 -35,037 41,205 -68,040 1,00 75,81 H1 C ATOM 5943 CB VAL 166 -33,905 41,954 -68,770 1,00 75,90 H1 C ATOM 5944 CG1 VAL ₁₆₆-32,673 41,070 -68,856 _1,0075,62 H1 C ATOM 5945 CG2 VAL 166 -34,365 42,364 -70,161 1,00 75,64 H1 C ATOM 5946 C VAL 166 -34,526 40,775 -66,670 1,00 75,14 H1 C ATOM 5947 O VAL 166 -34,253 41,610 -65,809 1,00 75,37 H1 O ATOM 5948 N HIS 167 -34,396 39,466 -66,480 1,00 73,47 H1 N ATOM 5949 CA HIS 167 -33,935 38,911 -65,214 1,00 72,00 H1 C (continuación)

ATOM 5950 CB HIS 167 -35,057 38,090 -64,569 _1,0072,27 H1 C ATOM 5951 CG HIS 167 -34,777 37,683 -63,155 1,00 72,47 H1 C ATOM 5952 CD2 HIS 167 -33,696 37,887 -62,363 1,00 72,15 H1 C ATOM 5953 ND1 HIS 167 -35,684 36,981 -62,390 1,00 71,80 H1 N ATOM 5954 CE1 HIS 167 -35,176 36,771 -61,189 1,00 71,72 H1 C ATOM 5955 NE2 HIS 167 -33,971 37,311 -61,147 1,00 72,50 H1 N ATOM 5956 C 167 -32,708 38,028 -65,438 1,00 70,88 H1 C HIS ATOM 5957 O HIS 167 -32,783 37,008 -66,121 1,00 69,91 H1 O ATOM 5958 N THR 168 -31,581 38,424 -64,855 1,00 70,00 H1 N ATOM 5959 CA THR 168 -30,335 37,687 -65,027 1,00 68,86 H1 C ATOM 5960 CB THR 168 -29,156 38,650 -65,269 1,00 69,61 H1 C ATOM 5961 OG1 THR 168 -29,449 39,489 -66,394 1,00 70,62 H1 O ATOM 5962 CG2 THR 168 -27,878 37,867 -65,548 1,00 69,75 H1 C ATOM 5963 C THR 168 -30,026 36,826 -63,803 1,00 67,17 H1 C ATOM 5964 O THR 168 -29,731 37,344 -62,727 1,00 67,02 H1 O ATOM 5965 N PHE 169 -30,093 35,510 -63,979 _1,0064,86 H1 N ATOM 5966 CA PHE 169 -29,878 34,576 -62,881 1,00 62,90 H1 C ATOM 5967 CB PHE 169 -30,615 33,263 -63,150 1,00 62,05 H1 C ATOM 5968 CG PHE 169 -32,108 33,400 -63,176 1,00 62,68 H1 C ATOM 5969 CD1 PHE 169 -32,748 33,972 -64,266 1,00 62,88 H1 C ATOM 5970 CD2 PHE 169 -32,877 32,943 -62,118 1,00 62,49 H1 C ATOM 5971 CE1 PHE 169 -34,128 34,086 -64,299 _{1,00 62,61}H1 C ATOM 5972 CE2 PHE 169 -34,257 33,053 -62,144 1,00 62,55 H1 C ATOM 5973 CZ PHE 169 -34,884 33,625 -63,237 1,00 62,31 H1 C ATOM 5974 C PHE 169 -28,398 34,290 -62,683 1,00 61,96 H1 C ATOM 5975 O PHE 169 -27,663 34,061 -63,645 1,00 61,82 H1 O ATOM 5976 N PRO 170 -27,942 34,294 -61,421 1,00 60,72 H1 N ATOM 5977 CD PRO 170 -28,702 34,746 -60,244 _1,0060,03 H1 C ATOM 5978 CA PRO 170 -26,555 33,964 -61,078 1,00 59,89 H1 C ATOM 5979 CB PRO 170 -26,526 34,083 -59,554 1,00 59,29 H1 C ATOM 5980 CG PRO 170 -27,618 35,058 -59,246 1,00 59,11 H1 C ATOM 5981 C PRO 170 -26,132 32,576 -61,561 1,00 59,02 H1 C ATOM 5982 O PRO 170 -26,948 31,653 -61,647 _1,0057,43 H1 O ATOM 5983 N ALA 171 -24,847 32,440 -61,873 1,00 58,34 H1 N ATOM 5984 CA ALA 171 -24,329 31,229 -62,496 1,00 58,50 H1 C ATOM 5985 CB ALA 171 -22,955 31,503 -63,094 1,00 57,77 H1 C ATOM 5986 C ALA 171 -24,243 30,066 -61,517 1,00 58,57 H1 C ATOM 5987 O ALA 171 -24,030 30,259 -60,320 1,00 57,67 H1 O ATOM 5988 N VAL 172 -24,415 28,855 -62,035 _1,0058,56 H1 N ATOM 5989 CA VAL 172 -24,118 27,654 -61,268 1,00 59,16 H1 C ATOM 5990 CB VAL 172 -25,148 26,538 -61,553 1,00 58,86 H1 C ATOM 5991 CG1 VAL 172 -25,070 26,114 -63,011 1,00 59,09 H1 C ATOM 5992 CG2 VAL 172 -24,898 25,353 -60,632 1,00 60,06 H1 C ATOM 5993 C VAL 172 -22,721 27,157 -61,641 1,00 59,63 H1 C ATOM 5994 O VAL 172 -22,304 27,266 -62,796 _1,0059,35 H1 O ATOM 5995 N LEU 173 -21,990 26,631 -60,663 1,00 59,79 H1 N ATOM 5996 CA LEU 173 -20,688 26,032 -60,937 1,00 60,87 H1 C ATOM 5997 CB LEU 173 -19,698 26,348 -59,811 1,00 59,98 H1 C ATOM 5998 CG LEU 173 -18,205 26,413 -60,167 1,00 60,10 H1 C ATOM 5999 CD1 LEU 173 -17,376 26,202 -58,905 1,00 57,51 H1 C ATOM ₆₀₀₀CD2 LEU 173 -17,858 25,356 _{-61,201 1,00}58,71 H1 C (continuación)

ATOM 6001 C LEU 173 -20,879 24,528 -61,041 1,00 61,60 H1 C ATOM 6002 O LEU 173 -21,379 23,897 -60,110 1,00 62,78 H1 O ATOM 6003 N GLN 174 -20,482 23,956 -62,172 1,00 62,51 H1 N ATOM 6004 CA GLN 174 -20,744 22,547 -62,446 1,00 63,92 H1 C ATOM 6005 CB GLN 174 -21,044 22,352 -63,929 1,00 65,18 H1 C ATOM ₆₀₀₆CG GLN 174 -22,139 23,256 -64,450 _1,0067,24 H1 C ATOM 6007 CD GLN 174 -22,385 23,065 -65,928 1,00 69,04 H1 C ATOM 6008 OE1 GLN 174 -23,070 22,125 -66,337 1,00 70,60 H1 O ATOM 6009 NE2 GLN 174 -21,823 23,953 -66,741 1,00 68,01 H1 N ATOM 6010 C GLN 174 -19,565 21,672 -62,050 1,00 63,96 H1 C ATOM 6011 O GLN 174 -18,445 22,159 -61,895 1,00 64,54 H1 O ATOM 6012 N SER 175 -19,820 20,376 -61,896 1,00 63,64 H1 N ATOM 6013 CA SER 175 -18,777 19,438 -61,501 1,00 63,62 H1 C ATOM 6014 CB SER 175 -19,346 18,016 -61,407 1,00 64,57 H 1 C ATOM 6015 OG SER 175 -19,975 17,626 -62,616 1,00 66,59 H1 O ATOM ₆₀₁₆C SER 175 -17,610 19,464 -62,481 _1,0063,00 H1 C ATOM 6017 O SER 175 -16,541 18,926 -62,197 1,00 64,06 H1 O ATOM 6018 N SER 176 -17,816 20,095 -63,632 1,00 61,79 H1 N ATOM 6019 CA SER 176 -16,776 20,187 -64,650 1,00 60,10 H1 C ATOM 6020 CB SER 176 -17,399 20,418 -66,025 1,00 59,94 H1 C ATOM 6021 OG SER 176 -17,863 21,752 -66,150 1,00 60,80 H1 O ATOM ₆₀₂₂C SER 176 -15,806 21,323 -64,355 _1,0059,39 H1 C ATOM 6023 O SER 176 -14,733 21,398 -64,951 1,00 59,39 H1 O ATOM 6024 N GLY 177 -16,191 22,211 -63,443 1,00 57,70 H1 N ATOM 6025 CA GLY 177 -15,384 23,389 -63,176 1,00 56,90 H1 C ATOM 6026 C GLY 177 -15,778 24,550 -64,068 1,00 56,87 H1 C ATOM 6027 O GLY 177 -15,157 25,614 -64,043 1,00 56,89 H1 O ATOM ₆₀₂₈N LEU 178 _-16,82224,345 -64,860 _1,0056,63 H1 N ATOM 6029 CA LEU 178 -17,298 25,370 -65,778 1,00 57,28 H1 C ATOM 6030 CB LEU 178 -17,436 24,786 -67,188 1,00 57,13 H1 C ATOM 6031 CG LEU 178 -16,115 24,423 -67,872 1,00 56,25 H1 C ATOM 6032 CD1 LEU 178 -16,387 23,798 -69,230 1,00 55,52 H1 C ATOM 6033 CD2 LEU 178 -15,268 25,675 -68,017 _1,0056,22 H1 C ATOM 6034 C LEU 178 -18,631 25,959 -65,328 1,00 57,07 H1 C ATOM 6035 O LEU 178 -19,428 25,295 -64,665 1,00 55,79 H1 O ATOM 6036 N TYR 179 -18,864 27,213 -65,697 1,00 57,71 H1 N ATOM 6037 CA TYR 179 -20,064 27,921 -65,280 1,00 59,38 H1 C ATOM 6038 CB TYR 179 -19,725 29,378 -64,961 1,00 58,68 H1 C ATOM 6039 CG TYR 179 -18,831 29,558 -63,754 _1,0058,53 H1 C ATOM 6040 CD1 TYR 179 -19,346 29,474 -62,465 1,00 58,26 H1 C ATOM 6041 CE1 TYR 179 -18,540 29,680 -61,356 1,00 58,61 H1 C ATOM 6042 CD2 TYR 179 -17,482 29,849 -63,904 1,00 57,93 H1 C ATOM 6043 CE2 TYR 179 -16,667 30,058 -62,803 1,00 58,41 H1 C ATOM 6044 CZ TYR 179 -17,200 29,974 -61,531 1,00 58,60 H1 C ATOM 6045 OH TYR 179 -16,394 30,195 -60,438 _1,0056,00 H1 O ATOM 6046 C TYR 179 -21,174 27,877 -66,328 1,00 60,05 H1 C ATOM 6047 O TYR 179 -20,914 27,891 -67,531 1,00 59,38 H1 O ATOM 6048 N SER 180 -22,413 27,819 -65,852 1,00 61,78 H1 N ATOM 6049 CA SER 180 -23,589 27,990 -66,698 1,00 64,17 H1 C ATOM 6050 CB SER 180 -24,290 26,646 -66,917 1,00 63,61 H1 C ATOM 6051 OG SER ₁₈₀-23,501 25,775 -67,708 _1,0065,69 H1 O ATOM 6052 C SER 180 -24,554 28,960 -66,024 1,00 65,91 H1 C (continuación)

ATOM 6053 O SER 180 -24,671 28,979 -64,797 1,00 65,96 H1 O ATOM 6054 N HIS 181 -25,242 29,768 -66,823 1,00 67,43 H1 N ATOM 6055 CA HIS 181 -26,293 30,625 -66,290 1,00 69,34 H1 C ATOM 6056 CB HIS 181 -25,689 31,850 -65,606 1,00 70,05 H1 C ATOM 6057 CG HIS ₁₈₁-25,466 33,009 -66,524 _1,0070,38 H1 C ATOM 6058 CD2 HIS 181 -24,413 33,336 -67,309 1,00 70,89 H1 C ATOM 6059 ND1 HIS 181 -26,387 34,023 -66,676 1,00 70,55 H1 N ATOM 6060 CE1 HIS 181 -25,909 34,927 -67,513 1,00 71,32 H1 C ATOM 6061 NE2 HIS 181 -24,713 34,533 -67,911 1,00 71,85 H1 N ATOM 6062 C HIS 181 -27,264 31,075 -67,371 1,00 70,14 H1 C ATOM 6063 O HIS 181 -26,990 30,942 -68,564 1,00 69,87 H1 O ATOM 6064 N SER 182 -28,402 31,609 -66,941 1,00 71,10 H1 N ATOM 6065 CA SER 182 -29,458 32,010 -67,859 1,00 70,94 H1 C ATOM 6066 CB SER 182 -30,702 31,146 -67,636 1,00 70,38 H1 C ATOM 6067 OG SER ₁₈₂-30,418 29,774 -67,830 _1,0068,38 H1 O ATOM 6068 C SER 182 -29,827 33,479 -67,688 1,00 71,53 H1 C ATOM 6069 O SER 182 -29,763 34,023 -66,584 1,00 71,22 H1 O ATOM 6070 N SER 183 -30,205 34,114 -68,794 1,00 72,30 H1 N ATOM 6071 CA SER 183 -30,900 35,396 -68,757 1,00 72,41 H1 C ATOM 6072 CB SER 183 -30,111 36,456 -69,525 1,00 71,36 H1 C ATOM 6073 OG SER 183 -30,820 37682 -69,569 _1,0069,72 H1 O ATOM 6074 C SER 183 -32,276 35,227 -69,388 1,00 73,63 H1 C ATOM 6075 O SER 183 -32,414 34,573 -70,421 1,00 73,54 H1 O ATOM 6076 N VAL 184 -33,294 35,809 -68,762 1,00 75,17 H1 N ATOM 6077 CA VAL 184 -34,658 35,702 -69,269 1,00 76,46 H1 C ATOM 6078 CB VAL 184 -35,491 34,712 -68,424 1,00 76,29 H1 C ATOM 6079 CG1 VAL 184 -36,949 34,751 -68,852 _1,0076,19 H1 C ATOM 6080 CG2 VAL 184 -34,941 33,311 -68,594 1,00 76,69 H1 C ATOM 6081 C VAL 184 -35,378 37,045 -69,300 1,00 77,45 H1 C ATOM 6082 O VAL 184 -35,375 37,793 -68,320 1,00 77,46 H1 O ATOM 6083 N VAL 185 -35,992 37,345 -70,439 1,00 78,31 H1 N ATOM 6084 CA VAL 185 -36,816 38,538 -70,572 _1,0078,79 H1 C ATOM 6085 CB VAL 185 -36,362 39,400 -71,778 1,00 78,96 H1 C ATOM 6086 CG1 VAL 185 -36,360 38,566 -73,049 1,00 78,89 H1 C ATOM 6087 CG2 VAL 185 -37,281 40,601 -71,931 1,00 79,45 H1 C ATOM 6088 C VAL 185 -38,281 38,151 -70,743 1,00 78,60 H1 C ATOM 6089 O VAL 185 -38,632 37,366 -71,624 1,00 77,83 H1 O ATOM 6090 N THR ₁₈₆-39,132 38,696 -69,880 _1,0079,19 H1 N ATOM 6091 CA THR 186 -40,571 38,499 -69,998 1,00 80,16 H1 C ATOM 6092 CB THR 186 -41,244 38,482 -68,609 1,00 80,16 H1 C ATOM 6093 OG1 THR 186 -40,924 39,689 -67,907 1,00 80,54 H1 O ATOM 6094 CG2 THR 186 -40,761 37,290 -67,796 1,00 80,44 H1 C ATOM 6095 C THR 186 -41,172 39,627 -70,833 1,00 80,74 H1 C ATOM 6096 O THR ₁₈₆-41,107 40,798 -70,455 _1,0079,91 H1 O ATOM 6097 N VAL 187 -41,750 39,268 -71,975 1,00 82,12 H1 N ATOM 6098 CA VAL 187 -42,248 40,258 -72,923 1,00 83,45 H1 C ATOM 6099 CB VAL 187 -41,451 40,210 -74,246 1,00 83,13 H1 C ATOM 6100 CG1 VAL 187 -39,975 40,456 -73,975 1,00 82,39 H1 C ATOM 6101 CG2 VAL 187 -41,662 38,869 -74,933 1,00 82,96 H1 C ATOM ₆₁₀₂C VAL 187 -43,726 40,048 -73,239 _1,0084,60 H1 C ATOM 6103 O VAL 187 -44,303 39,012 -72,906 1,00 83,97 H1 O (continuación)

ATOM 6104 N PRO 188 -44,357 41,041 -73,886 1,00 86,10 H1 N ATOM 6105 CD PRO 188 -43,802 42,380 -74,148 1,00 86,23 H1 C ATOM 6106 CA PRO 188 -45,756 40,939 -74,316 1,00 87,32 H1 C ATOM 6107 CB PRO 188 -46,050 42,313 -74,919 1,00 87,01 H1 C ATOM ₆₁₀₈CG PRO ₁₈₈-45,028 43,220 -74,315 _1,0086,99 H1 C ATOM 6109 C PRO 188 -45,950 39,825 -75,339 1,00 88,92 H1 C ATOM 6110 O PRO 188 -45,245 39,772 -76,347 1,00 89,36 H1 O ATOM 6111 N SER 189 -46,908 38,940 -75,080 1,00 90,12 H1 N ATOM ₆₁₁₂CA SER 189 -47,239 37,889 -76,033 _1,0091,74 H1 C ATOM 6113 CB SER 189 -48,429 37,067 -75,529 1,00 91,44 H1 C ATOM 6114 OG SER 189 -48,108 36,379 -74,333 1,00 91,54 H1 O ATOM 6115 C SER 189 -47,584 38,513 -77,382 1,00 93,06 H1 C ATOM 6116 O SER 189 -47,261 37,962 -78,436 1,00 93,63 H1 O ATOM 6117 N SER 190 -48,233 39,673 -77,334 1,00 94,02 H1 N ATOM ₆₁₁₈CA SER 190 -48,654 40,386 -78,536 _1,0094,90 H1 C ATOM 6119 CB SER 190 -49,228 41,754 -78,159 1,00 94,23 H1 C ATOM 6120 OG SER 190 -50,258 41,630 -77,192 1,00 94,02 H1 O ATOM 6121 C SER 190 -47,498 40,582 -79,512 1,00 95,63 H1 C ATOM 6122 O SER 190 -47,679 40,497 -80,727 1,00 95,93 H1 O ATOM 6123 N SER 191 -96,311 40,845 -78,974 1,00 96,22 H1 N ATOM 6124 CA SER 191 -45,161 41,202 -79,796 _1,0096,93 H1 C ATOM 6125 CB SER 191 -44,210 42,100 -79,002 1,00 97,27 H1 C ATOM 6126 OG SER 191 -44,862 43,293 -78,596 1,00 97,43 H1 O ATOM 6127 C SER 191 -44,405 39,981 -80,314 1,00 97,19 H1 C ATOM 6128 O SER 191 -43,393 40,116 -81,003 1,00 96,64 H1 O ATOM 6129 N LEU 192 -44,895 38,792 -79,982 1,00 97,72 H1 N ATOM 6130 CA LEU 192 -44,297 37,561 -80,489 _1,0098,54 H1 C ATOM 6131 CB LEU 192 -44,718 36,367 -79,626 1,00 98,53 H1 C ATOM 6132 CG LEU 192 -44,246 36,361 -78,170 1,00 98,25 H1 C ATOM 6133 CD1 LEU 192 -44,734 35,095 -77,483 1,00 98,23 H1 C ATOM 6134 CD2 LEU 192 -42,727 36,446 -78,118 1,00 97,62 H1 C ATOM 6135 C LEU 192 -44,719 37,323 -81,935 _1,0098,79 H1 C ATOM 6136 O LEU 192 -45,907 37,187 -82,232 1,00 98,91 H1 O ATOM 6137 N GLY 193 -43,738 37,272 -82,831 1,00 98,91 H1 N ATOM 6138 CA GLY 193 -44,034 37,097 -84,241 1,00 99,03 H1 C ATOM 6139 C GLY 193 -43,844 38,374 -85,037 1,00 98,92 H1 C ATOM 6140 O GLY 193 -43,566 38,330 -86,236 1,00 98,95 H1 O ATOM 6141 N THR 194 -43,995 39,515 -84,373 _1,0098,94 H1 N ATOM 6142 CA THR 194 -43,785 40,808 -85,018 1,00 98,85 H1 C ATOM 6143 CB THR 194 -45,009 41,738 -84,838 1,00 98,60 H1 C ATOM 6144 OG1 THR 194 -45,217 41,997 -83,444 1,00 98,43 H1 O ATOM 6145 CG2 THR 194 -46,257 41,093 -85,424 1,00 98,49 H1 C ATOM 6146 C THR 194 -42,556 41,508 -84,446 1,00 98,74 H1 C ATOM 6147 O THR 194 -42,136 42,554 -84,944 _1,0098,84 H1 O ATOM 6148 N GLN 195 -41,986 40,928 -83,394 1,00 98,32 H1 N ATOM 6149 CA GLN 195 -40,809 41,500 -82,750 1,00 97,95 H1 C ATOM 6150 CB GLN 195 -41,181 42,046 -81,368 1,00 97,62 H1 C ATOM 6151 CG GLN 195 -40,009 42,597 -80,572 1,00 97,74 H1 C ATOM 6152 CD GLN 195 -39,320 43,757 -81,265 1,00 98,15 H1 C ATOM 6153 OE1 GLN 195 -38,732 43,594 -82,335 _1,0098,48 H1 O ATOM 6154 NE2 GLN 195 -39,387 44,936 -80,656 1,00 97,92 H1 N (continuación)

ATOM 6155 C GLN 195 -39,694 40,465 -82,615 1,00 97,59 H1 C ATOM 6156 O GLN 195 -39,919 39,356 -82,127 1,00 97,42 H1 O ATOM 6157 N THR 196 -38,493 40,832 -83,052 1,00 96,87 H1 N ATOM 6158 CA THR 196 -37,335 39,951 -82,936 1,00 96,09 H1 C ATOM 6159 CB THR 196 -36,406 40,071 -84,167 _1,0096,10 H1 C ATOM 6160 OG1 THR 196 -35,943 41,421 -84,292 1,00 96,22 H1 O ATOM 6161 CG2 THR 196 -37,146 39,672 -85,434 1,00 95,59 H1 C ATOM 6162 C THR 196 -36,526 40,270 -81,681 1,00 95,48 H1 C ATOM 6163 O THR 196 -36,262 41,434 -81,375 1,00 95,11 H1 O ATOM 6164 N TYR 197 -36,137 39,225 -80,958 1,00 94,60 H1 N ATOM 6165 CA TYR 197 -35,347 39,389 -79,745 1,00 93,36 H1 C ATOM 6166 CB TYR 197 -36,104 38,817 -78,545 1,00 93,41 , H1 C ATOM 6167 CG TYR 197 -37,457 39,455 -78,317 1,00 92,83 H1 C ATOM 6168 CD1 TYR 197 -38,628 38,773 -78,621 1,00 92,54 H1 C ATOM 6169 CE1 TYR 197 -39,867 39,354 -78,419 _1,0092,56 H1 C ATOM 6170 CD2 TYR 197 -37,561 40,741 -77,801 1,00 92,54 H1 C ATOM 6171 CE2 TYR 197 -38,794 41,331 -77,596 1,00 92,67 H1 C ATOM 6172 CZ TYR 197 -39,945 40,633 -77,907 1,00 92,86 H1 C ATOM 6173 OH TYR 197 -41,175 41,221 -77,710 1,00 92,25 H1 O ATOM 6174 C TYR 197 -34,000 38,690 -79,888 1,00 92,48 H1 C ATOM 6175 O TYR 197 -33,937 37,498 -80,190 _1,0092,42 H1 O ATOM 6176 N ILE 198 -32,925 39,441 -79,670 1,00 91,09 H1 N ATOM 6177 CA ILE 198 -31,577 38,901 -79,783 1,00 89,67 H1 C ATOM 6178 CB ILE 198 -30,846 39,489 -81,011 1,00 89,35 H1 C ATOM 6179 CG2 ILE 198 -29,408 38,996 -81,045 1,00 89,56 H1 C ATOM 6180 CG1 ILE 198 -31,579 39,091 -82,295 1,00 88,73 H1 C ATOM ₆₁₈₁CD1 ILE 198 -30,918 39,598 -83,560 _1,0087,61 H1 C ATOM 6182 C ILE 198 -30,760 39,201 -78,530 1,00 89,23 H1 C ATOM 6183 O ILE 198 -30,556 40,362 -78,170 1,00 88,50 H1 O ATOM 6184 N CYS 199 -30,292 38,145 -77,870 1,00 88,78 H1 N ATOM 6185 CA CYS 199 -29,523 38,287 -76,640 1,00 87,96 H1 C ATOM ₆₁₈₆C CYS 199 -28,039 38,438 -76,971 _1,0087,57 H1 C ATOM 6187 O CYS 199 -27,521 37,774 -77,868 1,00 87,15 H1 O ATOM 6188 CB CYS 199 -29,752 37,069 -75,731 1,00 87,80 H1 C ATOM 6189 SG CYS 199 -28,628 35,661 -76,005 1,00 86,80 H1 S ATOM 6190 N ASN 200 -27,363 39,323 -76,247 1,00 87,80 H1 N ATOM 6191 CA ASN 200 -26,000 39,714 -76,593 1,00 87,93 H1 C ATOM 6192 CB ASN ₂₀₀-25,917 41,235 -76,743 _1,0088,63 H1 C ATOM 6193 CG ASN 200 -27,051 41,801 -77,577 1,00 89,36 H1 C ATOM 6194 OD1 ASN 200 -27,673 42,794 -77,201 1,00 89,44 H1 O ATOM 6195 ND2 ASN 200 -27,326 41,171 -78,716 1,00 89,25 H1 N ATOM 6196 C ASN 200 -24,999 39,254 -75,539 1,00 87,45 H1 C ATOM 6197 O ASN 200 -24,758 39,948 -74,550 1,00 87,13 H1 O ATOM 6198 N VAL ₂₀₁-24,408 38,086 -75,766 _{1,00 86,80}H1 N ATOM 6199 CA VAL 201 -23,438 37,526 -74,835 1,00 85,93 H1 C ATOM 6200 CB VAL 201 -23,413 35,987 -74,926 1,00 85,26 H1 C ATOM 6201 CG1 VAL 201 -22,441 35,421 -73,907 1,00 85,22 H1 C ATOM 6202 CG2 VAL 201 -24,809 35,433 -74,698 1,00 84,35 H1 C ATOM 6203 C VAL 201 -22,038 38,062 -75,121 1,00 85,88 H1 C ATOM 6204 O VAL ₂₀₁-21,636 38,188 -76,277 _1,0085,83 H1 O ATOM 6205 N ASN 202 -21,302 38,382 -74,062 1,00 86,08 H1 N ATOM 6206 CA ASN 202 -19,929 38,856 -74,196 1,00 86,41 H1 C (continuación)

ATOM 6207 CB ASN 202 -19,897 40,388 -74,196 1,00 86,12 H1 C ATOM 6208 CG ASN 202 -18,503 40,945 -74,437 1,00 86,38 H1 C ATOM 6209 OD1 ASN 202 -17,597 40,226 -74,860 1,00 86,49 H1 O ATOM ₆₂₁₀ND2 ASN ₂₀₂-18,327 42,234 -74,168 _1,0086,34 H1 N ATOM 6211 C ASN 202 -19,063 38,322 -73,056 1,00 86,59 H1 C ATOM 6212 O ASN 202 -19,273 38,666 -71,893 1,00 86,68 H1 O ATOM 6213 N HIS 203 -18,089 37,483 -73,397 1,00 87,00 H1 N ATOM 6214 CA HIS 203 -17,166 36,934 -72,409 1,00 87,34 H1 C ATOM 6215 CB HIS 203 -17,108 35,409 -72,537 1,00 88,04 H1 C ATOM 6216 CG HIS 203 -16,304 34,741 -71,465 1,00 89,65 H1 C ATOM 6217 CD2 HIS 203 -16,174 35,015 -70,145 1,00 90,06 H1 C ATOM 6218 ND1 HIS 203 -15,509 33,641 -71,707 1,00 89,81 H1 N ATOM 6219 CE1 HIS 203 -14,923 33,267 -70,583 1,00 89,71 H1 C ATOM ₆₂₂₀NE2 HIS 203 -15,310 34,084 -69,620 _1,0090,14 H1 N ATOM 6221 C 203 -15,772 37,524 -72,603 1,00 87,37 H1 C HIS ATOM 6222 O HIS 203 -14,946 36,961 -73,318 1,00 87,61 H1 O ATOM 6223 N LYS 204 -15,517 38,656 -71,953 1,00 87,39 H1 N ATOM 6224 CA LYS 204 -14,282 39,411 -72,154 1,00 87,67 H1 C ATOM 6225 CB LYS 204 -14,296 40,671 -71,281 _1,0087,25 H1 C ATOM 6226 CG LYS 204 -15,279 41,733 -71,759 1,00 88,05 H1 C ATOM 6227 CD LYS 204 -15,674 42,676 -70,637 1,00 88,66 H1 C ATOM 6228 CE LYS 204 -14,453 43,279 -69,965 1,00 89,19 H1 C ATOM 6229 NZ LYS 204 -14,820 44,035 -68,736 1,00 90,12 H1 N ATOM 6230 C LYS 204 -12,996 38,621 -71,903 1,00 87,80 H1 C ATOM 6231 O LYS 204 -11,983 38,852 -72,566 _{1,00 88,12}H1 O ATOM 6232 N PRO 205 -13,013 37,683 -70,940 1,00 87,81 H1 N ATOM 6233 CD PRO 205 -14,006 37,497 -69,868 1,00 87,68 H1 C ATOM 6234 CA PRO 205 -11,854 36,799 -70,763 1,00 87,47 H1 C ATOM 6235 CB PRO 205 -12,254 35,915 -69,583 1,00 87,20 H1 C ATOM 6236 CG PRO 205 -13,239 36,737 -68,825 _1,0086,89 H1 C ATOM 6237 C PRO 205 -11,542 35,975 -72,012 1,00 87,26 H1 C ATOM 6238 O PRO 205 -10,378 35,786 -72,369 1,00 86,44 H1 O ATOM 6239 N SER 206 -12,589 35,492 -72,673 1,00 87,15 H1 N ATOM 6240 CA SER 206 -12,432 34,595 -73,812 1,00 87,33 H1 C ATOM 6241 CB SER 206 -13,477 33,480 -73,738 1,00 86,84 H1 C ATOM 6242 OG SER ₂₀₆-13,303 32,540 -74,781 _1,0087,39 , H1 O ATOM 6243 C SER 206 -12,559 35,326 -75,150 1,00 87,95 H1 C ATOM 6244 O SER 206 -12,301 34,749 -76,209 1,00 87,21 H1 O ATOM 6245 N ASN 207 -12,955 36,594 -75,095 1,00 88,68 H1 N ATOM 6246 CA ASN 207 -13,253 37,365 -76,299 1,00 88,90 H1 C ATOM 6247 CB ASN 207 -11,971 37,647 -77,088 1,00 89,10 H1 C ATOM 6248 CG ASN 207 -11,180 38,808 -76,515 1,00 89,83 H1 C ATOM 6249 OD1 ASN 207 -10,011 39,004 -76,850 1,00 90,22 H1 O ATOM 6250 ND2 ASN 207 -11,816 39,587 -75,645 1,00 90,17 H1 N ATOM 6251 C ASN 207 -14,260 36,641 -77,185 1,00 88,67 H1 C ATOM 6252 O ASN 207 -14,192 36,717 -78,411 1,00 88,61 H1 O ATOM 6253 N THR 208 -15,189 35,933 -76,551 1,00 88,73 H1 N ATOM 6254 CA THR ₂₀₈-16,290 35,300 -77,264 _1,0088,95 H1 C ATOM 6255 CB THR 208 -16,700 33,971 -76,593 1,00 88,70 H1 C ATOM 6256 OG1 THR 208 -15,581 33,075 -76,577 1,00 88,37 H1 O ATOM 6257 CG2 THR 208 -17,850 33,323 -77,350 1,00 87,89 H1 C (continuación)

ATOM 6258 C THR 208 -17,492 36,238 -77,271 1,00 89,54 H1 C ATOM 6259 O THR 208 -18,310 36,221 -76,352 1,00 89,28 H1 O ATOM ₆₂₆₀N LYS 209 -17,586 37,059 -78,312 _1,0090,21 H1 N ATOM 6261 CA LYS 209 -18,681 38,012 -78,445 1,00 90,36 H1 C ATOM 6262 CB LYS 209 -18,158 39,319 -79,049 1,00 90,46 H1 C ATOM 6263 CG LYS 209 -18,875 40,570 -78,568 1,00 91,30 H1 C ATOM 6264 CD LYS 209 -20,221 40,752 -79,256 1,00 92,32 H1 C ATOM 6265 CE LYS 209 -20,057 41,171 -80,713 1,00 92,31 H1 C ATOM 6266 NZ LYS 209 -21,372 41,397 -81,382 1,00 91,57 H1 N ATOM 6267 C LYS 209 -19,748 37,396 -79,347 1,00 90,48 H1 C ATOM 6268 O LYS 209 -19,498 37,130 -80,523 1,00 91,28 H1 O ATOM 6269 N VAL 210 -20,934 37,163 -78,790 1,00 90,31 H1 N ATOM 6270 CA VAL ₂₁₀-21,966 36,387 -79,474 _1,0090,33 H1 C ATOM 6271 CB VAL 210 -22,164 35,008 -78,792 1,00 90,01 H1 C ATOM 6272 CG1 VAL 210 -23,304 34,246 -79,450 1,00 88,87 H1 C ATOM 6273 CG2 VAL 210 -20,880 34,200 -78,879 1,00 89,86 H1 C ATOM 6274 C VAL 210 -23,311 37,106 -79,519 1,00 90,85 H1 C ATOM 6275 O VAL 210 -23,579 38,000 -78,715 1,00 90,85 H1 O ATOM 6276 N ASP ₂₁₁-24,146 36,715 -80,477 _1,0091,03 H1 N ATOM 6277 CA ASP 211 -25,536 37,151 -80,526 1,00 91,23 H1 C ATOM 6278 CB ASP 211 -25,698 38,294 -81,532 1,00 91,67 H1 C ATOM 6279 CG ASP 211 -24,793 39,472 -81,228 1,00 92,43 H1 C ATOM 6280 OD1 ASP 211 -25,173 40,317 -80,391 1,00 92,57 H1 O ATOM 6281 OD2 ASP 211 -23,699 39,552 -81,828 1,00 92,96 H1 O ATOM ₆₂₈₂C ASP ₂₁₁-26,416 35,975 -80,940 _1,0091,08 H1 C ATOM 6283 O ASP 211 -26,143 35,305 -81,935 1,00 91,24 H1 O ATOM 6284 N LYS 212 -27,466 35,720 -80,168 1,00 90,73 H1 N ATOM 6285 CA LYS 212 -28,407 34,659 -80,501 1,00 90,77 H1 C ATOM 6286 CB LYS 212 -28,410 33,585 -79,410 1,00 90,14 H1 C ATOM 6287 CG LYS ₂₁₂-29,376 32,438 -79,673 _1,0089,67 H1 C ATOM 6288 CD LYS 212 -29,021 31,683 -80,949 1,00 89,85 H1 C ATOM 6289 CE LYS 212 -27,672 30,983 -80,831 1,00 89,83 H1 C ATOM 6290 NZ LYS 212 -27,417 30,051 -81,967 1,00 89,22 H1 N ATOM 6291 C LYS 212 -29,810 35,226 -80,668 1,00 91,33 H1 C ATOM 6292 O LYS 212 -30,237 36,091 -79,902 1,00 91,11 H1 O ATOM 6293 N LYS 213 -30,523 34,732 -81,674 _1,0091,62 H1 N ATOM 6294 CA LYS 213 -31,861 35,221 -81,977 1,00 92,18 H1 C ATOM 6295 CB LYS 213 -32,032 35,352 -83,494 1,00 92,88 H1 C ATOM 6296 CG LYS 213 -33,204 36,218 -83,933 1,00 93,56 H1 C ATOM 6297 CD LYS 213 -33,200 36,412 -85,446 1,00 93,60 H1 C ATOM 6298 CE LYS 213 -34,314 37,347 -85,896 1,00 93,91 H1 C ATOM 6299 NZ LYS 213 -34,365 37,479 -87,380 _1,0092,57 H1 N ATOM 6300 C LYS 213 -32,893 34,253 -81,415 1,00 92,17 H1 C ATOM 6301 O LYS 213 -32,933 33,085 -81,799 1,00 92,12 H1 O ATOM 6302 N VAL 214 -33,723 34,739 -80,501 1,00 92,74 H1 N ATOM 6303 CA VAL 214 -34,723 33,891 -79,869 1,00 93,76 H1 C ATOM 6304 CB VAL 214 -34,883 34,231 -78,370 1,00 93,57 H1 C ATOM 6305 CG1 VAL 214 -35,835 33,241 -77,709 _1,0092,68 H1 C ATOM 6306 CG2 VAL 214 -33,524 34,212 -77,684 1,00 93,40 H1 C ATOM 6307 C VAL 214 -36,075 34,044 -80,557 1,00 94,58 H1 C ATOM 6308 O VAL 214 -36,666 35,126 -80,559 1,00 94,67 H1 O ATOM 6309 N GLU 215 -36,556 32,952 -81,141 1,00 95,50 H1 N (continuación)

ATOM 6310 CA GLU 215 -37,829 32,956 -81,850 1,00 96,61 H1 C ATOM 6311 CB GLU 215 -37,591 32,750 -83,347 _1,0097,66 H1 C ATOM 6312 CG GLU 215 -36,659 33,777 -83,970 1,00 99,30 H1 C ATOM 6313 CD GLU 215 -36,464 33,561 -85,458 1,00100,39 H1 C ATOM 6314 OE1 GLU 215 -35,937 34,475 -86,128 1,00100,64 H1 O ATOM 6315 OE2 GLU 215 -36,841 32,477 -85,956 1,00101,04 H1 O ATOM 6316 C GLU 215 -38,735 31,853 -81,313 1,00 96,73 H1 C ATOM 6317 O GLU 215 -38,263 30,886 -80,717 1,00 96,90 H1 O ATOM 6318 N PRO 216 -40,053 31,989 -81,519 1,00 97,02 , H1 N ATOM 6319 CD PRO 216 -40,692 33,162 -82,139 1,00 96,97 H1 C ATOM 6320 CA PRO 216 -41,045 31,022 -81,032 1,00 97,59 H1 C ATOM 6321 CB PRO ₂₁₆-42,376 31,602 -81,507 _1,0097,22 H1 C ATOM 6322 CG PRO 216 -42,109 33,068 -81,652 1,00 97,02 H1 C ATOM 6323 C PRO 216 -40,819 29,603 -81,553 1,00 98,15 H1 C ATOM 6324 O PRO 216 -40,189 29,404 -82,591 1,00 97,93 H1 O ATOM 6325 N LYS 217 -41,343 28,624 -80,821 1,00 99,25 H1 N ATOM 6326 CA LYS 217 -41,133 27,213 -81,137 1,00100,54 H1 C ATOM 6327 CB LYS 217 -41,567 26,340 -79,954 1,00100,87 H1 C ATOM 6328 CG LYS 217 -40,832 26,634 -78,652 1,00101,66 H1 C ATOM 6329 CD LYS 217 -41,398 25,815 -77,496 1,00101,93 H1 C ATOM 6330 CE LYS 217 -40,737 26,185 -76,173 1,00102,31 H1 C ATOM 6331 NZ LYS 217 -41,369 25,499 -75,006 1,00101,76 H1 N ATOM 6332 C LYS 217 -41,892 26,784 -82,392 1,00100,93 H1 C ATOM 6333 O LYS 217 -42,770 25,901 -82,277 _1,00101,08H1 O ATOM 6334 OXT LYS 217 -41,600 27,333 -83,476 1,00101,13 H1 O TER 6335 LYS 217 H1 FIN

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno que se une a una proteína PCSK9 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, en donde la proteína de unión a antígeno disminuye el efecto reductor de LDLR de PCSK9 en LDLR, y

(i) en donde la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno neutralizante no competitiva de LDLR; y/o

(ii) en donde la proteína de unión a antígeno comprende:

un polipéptido de cadena pesada que comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):

una CDR1 de cadena pesada que es una CDR1 en la SEQ ID NO: 89;

una CDR2 de cadena pesada que es una CDR2 en la SEQ ID NO: 89;

una CDR3 de cadena pesada que es una CDR3 en la SEQ ID NO: 89;

y un polipéptido de cadena ligera que comprende las siguientes CDR:

una CDR1 de cadena ligera que es una CDR1 en la SEQ ID NO: 32;

una CDR2 de cadena ligera que es una CDR2 en la SEQ ID NO: 32;

una CDR3 de cadena ligera que es una CDR3 en la SEQ ID NO: 32;

en donde las CDR se identifican por la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición de AbM o la definición de contacto.

2. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia con al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 89 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia con al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 32.

3. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 89 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 32.

4. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además:

(a) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 156;

(b) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 157;

(c) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 154;

(d) la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 155;

(e) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 156 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 154,

(f) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 157 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 154;

(g) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 156 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 155; o

(h) la secuencia constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 157 y la secuencia constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 155.

5. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de unión a antígeno se une específicamente al dominio V de PCSK9.

6. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de unión a antígeno se une en los aminoácidos 600-692 de la SEQ ID NO: 3.

7. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde, cuando está unida a PCSK9, la proteína de unión a antígeno se sitúa a 8 angstroms o menos de al menos uno de los siguientes residuos: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, E593, S465, G466, P467, A473, I474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595 y H597 de la SEQ ID NO: 3.

8. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 7, en donde, cuando está unida a PCSK9, la proteína de unión a antígeno se sitúa a 5 angstroms o menos de al menos uno de los siguientes residuos: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592 y E593, de la SEQ ID NO: 3.

9. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la unión entre dicha proteína de unión a antígeno y una proteína PCSK9 variante es menor del 50 % de la unión entre la proteína de unión a antígeno y la proteína PCSK9 de la SEQ ID NO: 1, como se determina midiendo la afinidad de unión, la CE⁵⁰y/o la capacidad de unión total.

10. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 9, en donde la proteína PCSK9 comprende al menos una mutación de un residuo en una posición seleccionada del grupo que consiste en 439, 513, 538, 539, 582, 519, 521 y 554, como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

11. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde la al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en R439E, E513R, V538R, E539R y E582R.

12. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en R519E, H521R y Q554R.

13. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de unión a antígeno tiene al menos una de las características siguientes:

(a) se une a una variante de PCSK9 que tiene una mutación puntual D374Y;

(b) se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo que se une a antígeno, un anticuerpo de cadena única, un fragmento divalente, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo lgG3 y un anticuerpo lgG4; o

(c) se une a PCSK9 con una Kd que es menor de 1 nM, es menor de 100 pM, es menor de 10 pM o es menor de 5 pM.

14. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que, cuando se une a la PCSK9:

(a) se une a PCSK9 con la misma Kd que un anticuerpo de referencia; o

(b) compite con dicho anticuerpo de referencia por la unión a PCSK9,

en donde dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se establece en SEQ ID NO: 32 y un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 89.

15. Una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

17. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.

18. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 17.

19. Un hibridoma capaz de producir la proteína de unión a antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, en donde la composición farmacéutica se administra antes de, simultáneamente con o posteriormente a la administración de al menos otro agente terapéutico, en donde opcionalmente el otro agente terapéutico es una estatina.

21. Un kit para el tratamiento de trastornos relacionados con el colesterol que comprende la composición de las reivindicaciones 15 o 20.

22. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para uso para el tratamiento o prevención de una afección asociada con niveles elevados de colesterol sérico en un sujeto.

23. La proteína de unión a antígeno para el uso según la reivindicación 22, en donde la afección se selecciona de hipercolesterolemia, enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico, diabetes, ictus, enfermedad de Alzheimer y dislipidemia.