CN104311666A - 针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(pcsk9)的抗原结合蛋白 - Google Patents

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D.E.皮佩尔
单倍
沈文彦
J.C.Y.陈
C.T.金
R.R.克彻姆
C.梅林
T.A.卡拉贝奥
曹琼
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Abstract

本发明阐述了与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)相互作用的抗原结合蛋白。阐述了通过给予药物有效量的针对PCSK9的抗原结合蛋白治疗高胆固醇血症及其它疾病的方法。阐述了用针对PCSK9的抗原结合蛋白检测样品中PCSK9的量的方法。

Description

针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN 9型(PCSK9)的抗原结合蛋白
本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年8月22日，申请号为200880113475.4(PCT/US2008/074097)，发明名称为“针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)的抗原结合蛋白”。
相关申请
本申请要求享有于2007年8月23日提交的美国临时申请顺序号60/957,668、于2007年12月21日提交的美国临时申请顺序号61/008,965及于2008年1月9日提交的美国临时申请顺序号61/010,630的优先权，它们以其整体在此引作参考。
发明领域
本发明涉及结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(Proproteinconvertase subtilisin kexin type9，PCSK9)的抗原结合蛋白及使用和制备所述抗原结合蛋白的方法。本申请连同电子格式的序列表一起提交。所提供的序列表文件名为APMOL-003A.txt，于2008年8月12日创建，且大小为296,639字节，其被更新为文件名为APMOL-003A_Substitute.TXT的文件，该文件于2010年10月11日星期二创建且大小为297,239字节。该电子格式的序列表中的信息以其全部内容通过引用结合到本文中。
各种实施方案背景
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)是丝氨酸蛋白酶，其参与调节低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的水平(Horton等，2007；Seidah和Prat,2007)。体外实验显示将PCSK9加到HepG2细胞能降低细胞表面LDLR水平(Benjannet等，2004；Lagace等，2006；Maxwell等，2005；Park等，2004)。对小鼠的实验显示，提高PCSK9蛋白水平能降低肝脏LDLR蛋白水平(Benjannet等，2004；Lagace等，2006；Maxwell等，2005；Park等，2004)，同时PCSK9敲除小鼠提高肝脏中LDLR水平(Rashid等，2005)。另外，业已鉴定了提高或降低血浆LDL水平的各种人PCSK9突变(Kotowski等，2006；Zhao等，2006)。业已显示PCSK9直接与LDLR蛋白作用，与LDLR一起被吞噬，在整个内体途径中与LDLR共发生免疫荧光(Lagace等，2006)。尚未观察到PCSK9降解LDLR，且未确定其降低胞外LDLR蛋白水平的机制。
PCSK9是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的激素原-前蛋白转化酶(Seidah等，2003)。人类有9种激素原-前蛋白转化酶，可将其分为S8A和S8B亚家族(Rawlings等，2006)。弗林蛋白酶、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6和PC7/PC8/LPC/SPC7被分在亚家族S8B中。来自鼠弗林蛋白酶和PC1的不同结构域的晶体结构及NMR结构显示了枯草杆菌蛋白酶样前域(pro-domain)及催化结构域，并且P结构域(P domain)直接位于催化结构域的C-末端(Henrich等，2003；Tangrea等，2002)。基于该亚家族内的氨基酸序列的相似性，预测所有7个成员都具有相似的结构(Henrich等，2005)。SKI-1/S1P和PCSK9被分在亚家族S8A中。这些蛋白之间的序列比较也提示存在枯草杆菌蛋白酶样前域及催化结构域(Sakai等，1998；Seidah等，2003；Seidah等，1999)。在这些蛋白中，位于催化结构域的C-末端的氨基酸序列更易变，且未提示存在P结构域。
激素原-前蛋白转化酶作为酶原表达，它们经过多个步骤加工成熟。在该加工中前域的功能是双重的。前域首先起分子伴侣作用，为催化结构域的适当折叠所需(Ikemura等，1987)。当催化结构域折叠后，在前域和催化结构域之间发生自身催化。在该初次裂解反应后，前域仍然与催化结构域结合，然后其起着催化活性抑制物的作用(Fu等，2000)。当条件恰当时，在前域内的位点处因第二次自身催化事件继续成熟(Anderson等，1997)。在该第二次裂解事件发生后，前域和催化结构域分离，成为活性蛋白酶。
PCSK9酶原的自身催化发生在Gln152和Ser153(VFAQ|SIP)之间(Naureckiene等，2003)，业已显示为其从细胞分泌所需(Seidah等，2003)。尚未观察到在PCSK9前域内位点处的第二自身催化事件。纯化的PCSK9由两部分构成，它们可通过非还原性SDS-PAGE分开；为17Kd的前域和为65Kd的催化结构域加上C-末端结构域。尚未分离到没有其抑制性前域的PCSK9，PCSK9的催化活性的测量值一直是不定的(Naureckiene等，2003；Seidah等，2003)。
各种实施方案概述
在某些实施方案中，本发明包括针对PCSK9的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，其包含：A)选自以下的一个或多个重链互补决定区(CDRH)：(i)来自选自以下的序列中的CDRH1的CDRH1：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；(ii)来自选自以下的序列中的CDRH2的CDRH2：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；(iii)来自选自以下的序列中的CDRH3的CDRH3：SEQ IDNO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和(iv)含有一处或多处不超过4个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH；B)选自以下的一个或多个轻链互补决定区(CDRL)：(i)来自选自以下的序列中的CDRL1的CDRL1：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；(ii)来自选自以下的序列中的CDRL2的CDRL2：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；(iii)来自选自以下的序列中的CDRL3的CDRL3：SEQID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；和(iv)含有一处或多处不超过4个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL；或C)一个或多个A)的重链CDRH和一个或多个B)的轻链CDRL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含至少一个A)的CDRH和至少一个B)的CDRL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含至少两个A)的CDRH和至少两个B)的CDRL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些实施方案中，A)的CDRH选自以下至少一种：(i)选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列中的CDRH1的CDRH1氨基酸序列；(ii)选自选自SEQID NO:67、79、89和49的序列中的CDRH2的CDRH2氨基酸序列；(iii)选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列中的CDRH3的CDRH3氨基酸序列；和(iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH。另外，B)的CDRL选自以下至少一种：(i)选自选自SEQ ID NO:12、35、32和23的序列中的CDRL1的CDRL1氨基酸序列；(ii)选自选自SEQ ID NO:12、35、32和23的序列中的CDRL2的CDRL2氨基酸序列；(iii)选自选自SEQ ID NO:12、35、32和23的序列中的CDRL3的CDRL3氨基酸序列；和(iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL；或C)一个或多个A)的重链CDRH和一个或多个B)的轻链CDRL。在某些实施方案中，A)的CDRH选自以下至少一种：(i)SEQ ID NO:67中的CDRH1氨基酸序列的CDRH1氨基酸序列；(ii)SEQ IDNO:67中的CDRH2氨基酸序列的CDRH2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO:67中的CDRH3氨基酸序列的CDRH3氨基酸序列；和(iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRH；所述B)的CDRL选自以下至少一种：(i)SEQ ID NO:12中的CDRL1氨基酸序列的CDRL1氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:12中的CDRL2氨基酸序列的CDRL2氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO:12中的CDRL3氨基酸序列的CDRL3氨基酸序列；和(iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的CDRL；或C)一个或多个A)的重链CDRH和一个或多个B)的轻链CDRL。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：A)SEQ ID NO:67中的CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO:67中的CDRH2序列的CDRH2和SEQ IDNO:67中的CDRH3序列的CDRH3；和B)SEQ ID NO:12中的CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO:12中的CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO:12中的CDRL3序列的CDRL3。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含：具有与选自以下的氨基酸序列至少80％序列同一性的重链可变区(VH)：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和/或具有与选自以下的氨基酸序列至少80％序列同一性的轻链可变区(VL)：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，VH与选自以下的氨基酸序列具有至少90％序列同一性：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、47、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和/或VL与选自以下的氨基酸序列具有至少90％序列同一性：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，VH选自SEQ IDNO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和/或VL选自SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。
在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，其特异性结合被本文公开的任何ABP结合的表位。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含：A)一个或多个选自以下至少一种的重链CDR(CDRH)：(i)具有与选自以下的序列之一中的CDRH1至少80％序列同一性的CDRH1：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；(ii)具有与选自以下的序列之一中的CDRH2至少80％序列同一性的CDRH2：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和(iii)具有与选自以下的序列之一中的CDRH3至少80％序列同一性的CDRH3：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；B)一个或多个选自以下至少一种的轻链CDR(CDRL)：(i)具有与选自以下的序列之一中的CDRL1至少80％序列同一性的CDRL1：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；(ii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL2至少80％序列同一性的CDRL2：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；和(iii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL3至少80％序列同一性的CDRL3：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；或C)一个或多个A)的重链CDRH和一个或多个B)的轻链CDRL。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)一个或多个选自以下至少一种的CDRH：(i)具有与选自以下的序列之一中的CDRH1至少90％序列同一性的CDRH1：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；(ii)具有与选自以下的序列之一中的CDRH2至少90％序列同一性的CDRH2：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；和(iii)具有与选自以下的序列之一中的CDRH3至少90％序列同一性的CDRH3：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60；B)一个或多个选自以下至少一种的CDRL：(i)具有与选自以下的序列之一中的CDRL1至少90％序列同一性的CDRL1：SEQ IDNO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；(ii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL2至少90％序列同一性的CDRL2：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；和(iii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL3至少90％序列同一性的CDRL3：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46；或C)一个或多个A)的重链CDRH和一个或多个B)的轻链CDRL。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自以下序列内的CDRH3的CDRH3：SEQ ID NO:67、79和49；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；和(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO:404)，其中X1选自D、A、R和非氨基酸；X2选自Y、I、G和非氨基酸；X3选自D、A、G和非氨基酸；X4选自F、A、L和非氨基酸；X5选自W、L、A和非氨基酸；X6选自S、Y、A和非氨基酸；X7选自A、Y、R和非氨基酸；X8选自Y、P和非氨基酸；X9选自Y、G和非氨基酸；X10选自D、G和非氨基酸；X11选自A、M和非氨基酸；X12选自F、D和非氨基酸；X13选自D、V和非氨基酸；X14选自V和非氨基酸；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自以下序列内的CDRL3的CDRL3：SEQ ID NO:12、35和23；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQID NO:405)的CDRL3氨基酸序列，其中X1选自Q和G；X2选自S、T、A和非氨基酸；X3选自Y、非氨基酸和W；X4选自D和非氨基酸；X5选自S和非氨基酸；X6选自S和非氨基酸；X7选自L、T和非氨基酸；X8选自非氨基酸、A和S；X9选自非氨基酸、G、A和V；X10选自非氨基酸、S、Y和V；X11选自非氨基酸和V。
在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含具有选自以下的氨基酸序列的轻链：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46及其某些组合。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合被本文公开的抗原结合蛋白中的至少一种结合的表位。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白进一步包含具有选自以下的氨基酸序列的重链：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60及其某些组合。在某些实施方案中，ABP的氨基酸序列选自SEQ ID NO:12、35、23及其某些组合。在某些实施方案中，ABP的重链包含SEQ ID NO:67的CDRH3、SEQ ID NO:67的CDRH2和SEQID NO:67的CDRH1，所述轻链包含SEQ ID NO:12的CDRL3、SEQ ID NO:12的CDRL2和SEQ ID NO:12的CDRL1。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为人抗体。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为单克隆抗体。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为IgG4型或IgG2型。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与标记基团偶联。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与本文所述抗原结合蛋白竞争结合PCSK9。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与标记基团偶联。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白降低PCSK9与LDLR的结合。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合蛋白给予受治疗者时，其降低受治疗者中存在的LDL的量。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合蛋白给予受治疗者时，其降低受治疗者中存在的血清胆固醇的量。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合蛋白给予受治疗者时，其降低受治疗者中存在的LDLR的量。
在某些方面，本发明包括载体，所述载体包含本文所述核酸分子。在某些实施方案中，本发明包括宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述核酸分子。
在某些方面，本发明包括与本文公开的抗原结合蛋白竞争结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括编码本文公开的抗原结合蛋白的核酸分子。
在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文所述的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括用于治疗或预防患者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括在受治疗者中抑制PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括给予有效量的至少一种本文公开的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括选择性结合PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于100pM的Kd结合PCSK9。
在某些方面，本发明包括用于治疗或预防受治疗者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予有需要的受治疗者。
在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法，所述方法包括给予受治疗者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予受治疗者。
在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括给予受治疗者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予受治疗者。
在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的ABP和提高LDLR蛋白水平的利用率的药剂。在某些实施方案中，提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他汀(statin)。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)和其某些组合。
在某些方面，本发明包括制备本文所述抗原结合蛋白的方法，所述方法包括从分泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文所述抗原结合蛋白和药用赋形剂。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的活性剂。在某些实施方案中，所述另外的活性剂选自放射性同位素、放射性核素、毒素或治疗药物及化疗药物。
在某些方面，本发明包括用于治疗或预防患者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的方法。所述方法包括给予有需要的患者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述病症为高胆固醇血症。
在某些方面，本发明包括在患者中抑制PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法给予有效量的至少一种本文所述抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括以小于100pM的Kd结合PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于10pM的Kd结合。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于5pM的Kd结合。
在某些方面，本发明包括用于治疗或预防受治疗者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予有需要的受治疗者。在某些实施方案中，所述提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及其某些组合。
在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法。所述方法包括给予受治疗者有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括在受治疗者中降低血清胆固醇水平的方法，所述方法包括同时或序贯将有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予受治疗者。在某些实施方案中，所述提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及其某些组合。
在某些方面，本发明包括通过给予受治疗者有效量的至少一种本文所提供的分离的抗原结合蛋白来提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法。
在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法通过同时或序贯地给予受治疗者有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂来实现。在某些实施方案中，所述提高LDLR蛋白水平的利用率的药剂包括他汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀和其某些组合。
在某些方面，本发明包括中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9并减少低密度脂蛋白受体(LDLR)，由此降低PCSK9对LDLR的作用。在某些实施方案中，所述抗体特异性结合PCSK9。在某些实施方案中，所述抗体结合PCSK9的催化结构域。在某些实施方案中，所述抗体结合SEQ ID NO:3的31-447位残基内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合具有与SEQ ID NO:3至少90％同一性的氨基酸序列的PCSK9。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在SEQ ID NO:3的31-447位残基内的位点结合PCSK9。在某些实施方案中，当所述抗原结合蛋白与PCSK9结合时，所述抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少两个相距5埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少4个相距5埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386或Q387。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少两个相距5埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少4个相距5埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少两个相距5埃或更近处：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少四个相距5埃或更近处：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的中和抗体，其中所述抗体结合PCSK9并降低PCSK9结合LDLR的可能性。
在某些实施方案中，涵盖结合PCSK9的抗体或抗原结合分子。所述抗体在SEQ ID NO:3的31-447位残基内的位点结合PCSK9。在某些实施方案中，当抗体或抗原结合分子结合PCSK9时，其位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在某些实施方案中，提供封阻抗体与PCSK9在PCSK9残基的8埃内结合的分离的抗体或抗原结合分子。在某些实施方案中，所述PCSK9残基选自以下PCSK9残基中的至少一个：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在某些实施方案中，提供在以下位点结合PCSK9的分离的抗体或抗原结合分子：所述位点与LDLR结合PCSK9的位点重叠。在某些实施方案中，LDLR结合PCSK9的位点包括至少一个选自以下的氨基酸残基：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380和S381。
在某些实施方案中，提供结合PCSK9的分离的抗体或抗原结合分子。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合分子降低EGFa在PCSK9的以下残基中的至少一个的8埃内结合PCSK9的可能性：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。
在某些实施方案中，提供与PCSK9的表面结合的抗体、抗原结合蛋白或抗原结合分子，所述表面与EGFa结合、Ab21B12结合和/或31H4结合的表面重叠。在某些实施方案中，提供以与在附图中所述的相似的方式结合PCSK9的抗体、抗原结合蛋白或抗原结合分子。
在某些实施方案中，以上实施方案为中和抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白不是LDLR或其片段(例如EGFa)。
在某些方面，本发明包括分离的中和抗体，其中当所述抗体与PCSK9结合时，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：SEQ IDNO:3的T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592、E593、S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595和H597。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处：SEQ ID NO:3的T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592和E593。
在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白包含：A)SEQ ID NO:89中的CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO:89中的CDRH2序列的CDRH2和SEQ ID NO:89中的CDRH3序列的CDRH3；和B)SEQ IDNO:32中的CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO:32中的CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO:32中的CDRL3序列的CDRL3。
在某些方面，本发明包括结合SEQ ID NO:1的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白与变体PCSK9蛋白之间的结合为分离的抗原结合蛋白与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:303的PCSK9蛋白之间的结合的50％。在某些实施方案中，所述变体PCSK9蛋白在选自以下位点处包含至少一个残基突变：如SEQ ID NO:1所示的207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。在某些实施方案中，所述至少一个突变选自R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R和E582R。在某些实施方案中，所述至少一个突变选自D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。
在某些方面，本发明包括抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白以第一种方式结合SEQ ID NO:303的PCSK-9蛋白并以第二种方式结合PCSK9变体。所述PCSK9变体在选自以下的位点处具有至少一个点突变：SEQ ID NO:303和/或SEQ ID NO:1的207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。在某些实施方案中，所述第一种方式包括第一EC50、第一Bmax或第一EC50及第一Bmax。在某些实施方案中，所述第二种方式包括第二EC50、第二Bmax或第二EC50及第二Bmax。第一种方式的值不同于第二种方式的值。在某些实施方案中，所述第一种方式包括第一EC50，其中所述第二种方式涉及第二EC50，其中所述点突变选自：R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R和E582R。在某些实施方案中，所述第一EC50与第二EC50相差至少20％。在某些实施方案中，所述第一EC50与第二EC50相差至少50％。在某些实施方案中，所述第二EC50比第一EC50的数值更大。在某些实施方案中，第一EC50由多珠粒结合测定法(multiplex bead binding assay)来测定。在某些实施方案中，第二EC50大于1um。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白为中和抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述中和抗原结合蛋白为竞争性中和抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述中和抗原结合蛋白为非竞争性中和抗原结合蛋白。在某些实施方案中，所述第一种方式包括第一Bmax，所述第二种方式包括不同于第一Bmax的第二Bmax。所述PCSK9变体具有选自以下的至少一个点突变：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。在某些实施方案中，所述第二Bmax为所述第一Bmax的约10％。在某些实施方案中，所述第一Bmax与所述第二Bmax至少相差20％。在某些实施方案中，所述第一Bmax与所述第二Bmax相差至少50％。
在某些方面，本发明包括结合SEQ ID NO:3的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的表位包括以下氨基酸中的至少一个：SEQID NO:1中的207、208、181、185、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。
在某些方面，本发明包括结合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的PCSK9蛋白的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低LDLR，由此降低PCSK9对LDLR的作用。在某些实施方案中，抗原结合蛋白为LDLR非竞争性中和抗原结合蛋白。在某些实施方案中，抗原结合蛋白为LDLR竞争性中和抗原结合蛋白。
在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含：A)SEQ ID NO:49中的CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO:49中的CDRH2序列的CDRH2和SEQ ID NO:49中的CDRH3序列的CDRH3；和B)SEQ ID NO:23中的CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO:23中的CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID NO:23中的CDRL3序列的CDRL3。
在某些方面，本发明包括组合物，所述组合物包含结晶的PCSK9蛋白和结合PCSK9的抗原结合蛋白。所述组合物包含结晶的PCSK9蛋白，以至于PCSK9蛋白的三维结构可测定为约2.2埃或更好的分辨率。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白为抗体或其片段。
在某些方面，本发明包括结晶的PCSK9蛋白及至少LDLR蛋白的EGFa部分，其中所述LDLR蛋白的EGFa部分被PCSK9蛋白结合，其中所述结晶的PCSK9蛋白如下：PCSK9蛋白的三维结构可测定为约2.2埃或更好的分辨率。在某些实施方案中，分子模型在计算机可读介质上。
在某些方面，本发明包括本文所述抗原结合蛋白在制备用于降低血清胆固醇药物中的用途。
在某些方面，本发明包括本文所述的抗原结合蛋白在制备用于治疗或预防受治疗者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的药物中的用途。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列内的CDRH1的CDRH1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH1差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:406)的CDRH1氨基酸序列，其中X1选自G；X2选自Y、F和G；X3选自T和S；X4选自L和F；X5选自T、S和N；X6选自S和A；X7选自Y和F；X8选自G、S和Y；X9选自I、M和W；X10选自S、N和H；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:12、32、35和23的序列内的CDRL1的CDRL1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO:407)的CDRL1氨基酸序列，其中X1选自T和非氨基酸；X2选自G和S；X3选自S、T和G；X4选自S；X5选自S；X6选自N、D和S；X7选自I、V和N；X8选自G和I；X9选自A和G；X10选自G、Y、S和N；X11选自Y和N；X12选自D、S、T和F；X13选自V；X14选自S、N和H。本领域技术人员将了解，单个ABP或抗体可满足以上一个或多个选择，并落在该实施方案的所述发明范围内。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列内的CDRH2的CDRH2；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH2差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(SEQ IDNO:408)的CDRH2氨基酸序列，其中X1选自W、S、L和非氨基酸；X2选自V、I和E；X3选自S、W和I；X4选自F、S和N；X5选自Y、S、D和H；X6选自N、S和G；X7选自S和G；X8选自N、Y、D和R；X9选自T、I和E；X10选自N、S、Y和D；X11选自Y；X12选自A和N；X13选自Q、D和P；X14选自K和S；X15选自L和V；X16选自Q和K；X17选自G和S；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:12、32、35和23的序列内的CDRL3的CDRL2；(ii)在的氨基酸序列上与(i)的CDRL3相差不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:409)的CDRL2氨基酸序列，其中X1选自G、E、S和D；X2选自N、V和Y；X3选自S和N；X4选自N、Q和K；X5选自R；X6选自P；X7选自S。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列内的CDRH3的CDRH3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO:410)的CDRH3氨基酸序列，其中X1选自D和非氨基酸；X2选自Y、A和非氨基酸；X3选自D、I和非氨基酸；X4选自F、A和非氨基酸；X5选自W、A和非氨基酸；X6选自S、L和非氨基酸；X7选自A、Y、G和非氨基酸；X8选自Y、Q和非氨基酸；X9选自G、Y和L；X10选自Y、D和V；X11选自G、A和P；X12选自M和F；X13选自D；X14选自V和Y；和B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:12、32、35和23的序列内的CDRL3的CDRL3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:411)的CDRL3氨基酸序列，其中X1选自Q、A、G和非氨基酸；X2选自S、V、T和非氨基酸；X3选自Y、N和W；X4选自S和D；X5选自S、Y和D；X6选自S和T；X7选自L和S；X8选自S、T和N；X9选自G、S和A；X10选自S、M、W和Y；和X11选自V。在某些实施方案中，任何上述氨基酸可被保守氨基酸取代所置换。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH1的CDRH1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH1差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:412)的CDRH1氨基酸序列，其中X1选自G、P和A；X2选自Y、W、F、T和S；X3选自T、P、S和A、C、V、L和I；X4选自L、F、I、V、M、A和Y；X5选自T、P、S和A；X6选自S、T、A和C；X7选自Y、W、F、T和S；X8选自G、P和A；X9选自I、L、V、M、A和F；X10选自S、T、A和C；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的CDRL1的CDRL1；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO:413)的CDRL1氨基酸序列，其中X1选自T和S；X2选自G、P和A；X3选自T和S；X4选自S、N、T、A、C和Q；X5选自S、T、A和C；X6选自D和E；X7选自V、I、M、L、F和A；X8选自G、P和A；X9选自G、A、R、P、V、L、I、K、Q和N；X10选自Y、W、F、T和S；X11选自N和Q；X12选自Y、S、W、F、T、A和C；X13选自V、I、M、L、F和A；X14选自S、T、A和C。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH2的CDRH2；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH2差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17、(SEQ ID NO:414)的CDRH2氨基酸序列，其中X1选自W、Y和F；X2选自V、I、M、L、F和A；X3选自S、T、A和C；X4选自A、F、V、L、I、Y和M；X5选自Y、W、F、T和S；X6选自N和Q；X7选自G、P和A；X8选自N和Q；X9选自T和S；X10选自N和Q；X11选自Y、W、F、T和S；X12选自A、V、L和I；X13选自Q、E、N和D；X14选自K、R、Q和N；X15选自L、F、V、I、M、A和Y；X16选自Q和N；X17选自G、P和A；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的CDRL3的CDRL2；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:415)的CDRL2氨基酸序列，其中X1选自E和D；X2选自V、I、M、L、F和A；X3选自S、T、A和C；X4选自N和Q；X5选自R、K、Q和N；X6选自P和A；X7选自S、T、A和C。
在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区(CDRH)：(i)选自选自SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH3的CDRH3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRH3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO:416)的CDRH3氨基酸序列，其中X1选自G、P、A和非氨基酸；X2选自Y、W、F、T和S；X3选自G、V、P、A、I、M、L和F；X4选自M、L、F和I；X5选自D和E；X6选自V、I、M、L、F和A；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区(CDRL)：(i)选自选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的CDRL3的CDRL3；(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；和(iii)选自X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO:417)的CDRL3氨基酸序列，其中X1选自S、N、T、A、C和Q；X2选自S、T、A和C；X3选自Y、W、F、T和S；X4选自T和S；X5选自S、T、A和C；X6选自S、T、A和C；X7选自N、S、Q、T、A和C；X8选自M、V、L、F、I和A；X9选自V、I、M、L、F和A。
附图简述
图1A描述具有前域(下划线)的PCSK9成熟形式的氨基酸序列。
图1B1-1B4描述具有前域(下划线)及信号序列(粗体)的PCSK9的氨基酸和核酸序列。
图2A-2D为各种抗原结合蛋白的各种轻链的序列比较表。图2C延续了在图2A中开始的序列。图2D延续了在图2B中开始的序列。
图3A-3D为各种抗原结合蛋白的各种重链的序列比较表。图3C延续了在图3A中开始的序列。图3D延续了在图3B中开始的序列。
图3E-3JJ描述抗原结合蛋白某些实施方案的可变结构域的氨基酸和核酸序列。
图3KK描述各种恒定结构域的氨基酸序列。
图3LL-3BBB描述抗原结合蛋白某些实施方案的可变结构域的氨基酸和核酸序列。
图3CCC-3JJJ为抗原结合蛋白某些实施方案的各种重链和轻链序列比较表。
图4A为抗原结合蛋白与人PCSK9的结合曲线。
图4B为抗原结合蛋白与人PCSK9的结合曲线。
图4C为抗原结合蛋白与猕猴PCSK9的结合曲线。
图4D为抗原结合蛋白与猕猴PCSK9的结合曲线。
图4E为抗原结合蛋白与小鼠PCSK9的结合曲线。
图4F为抗原结合蛋白与小鼠PCSK9的结合曲线。
图5A描述涉及PCSK9及各种抗原结合蛋白的SDSPAGE实验的结果，其证明蛋白的相对纯度和浓度。
图5B和5C描述来自对21B12的biacore溶液平衡测定的图表。
图5D描述来自biacore捕获测定的动力学图表。
图5E描述了描绘三种ABP的分库(binning)结果的条形图。
图6A为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG2的抑制曲线。
图6B为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG4的抑制曲线。
图6C为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG2的抑制曲线。
图6D为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG4的抑制曲线。
图7A为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白31H4IgG2的抑制曲线，所述细胞LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了PCSK9的作用。
图7B为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白31H4IgG4的抑制曲线，所述细胞LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了PCSK9的作用。
图7C为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白21B12IgG2的抑制曲线，所述细胞LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了PCSK9的作用。
图7D为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白21B12IgG4抑制曲线，所述细胞LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了PCSK9的作用。
图8A为描述在ABP31H4小鼠中降低血清胆固醇的能力的图表，相对于IgG对照处理的小鼠该能力有变化(*p<0.01)。
图8B为描述在ABP31H4小鼠中降低血清胆固醇的能力的图表，相对于时间＝零小时该能力有变化(#p,0.05)。
图8C为描述在C57B1/6小鼠中ABP31H4对HDL胆固醇水平的影响的图表(*p<0.01)。
图8D为描述在C57B1/6小鼠中ABP31H4对HDL胆固醇水平的影响的图表(#p<0.05)。
图9描述ABP31H4在各个时间点后提高所存在的肝脏LDLR蛋白量的能力的蛋白印迹分析
图10A为描述抗原结合蛋白31H4在野生型小鼠中相对降低总血清胆固醇的能力的图表。
图10B为描述抗原结合蛋白31H4在野生型小鼠中降低HDL的能力的图表。
图10C为描述不同的抗原结合蛋白31H4和16F12降低血清胆固醇能力的图表。
图11A描述用于测试抗原结合蛋白降低血清胆固醇的持续时间及能力的注射方案。
图11B为描述图11A中的方案的结果的图表。
图12A描述HepG2细胞中响应他汀与ABP21B12的组合的LDLR水平。
图12B描述HepG2细胞中响应他汀与ABP31H4的组合的LDLR水平。
图12C描述HepG2细胞中响应他汀与ABP25A7.1(非中和抗体，与“25A7”中和抗体形成对照)的组合的LDLR水平。
图12D描述在过量表达PCSK9的HepG2细胞中响应他汀与ABP21B12的组合的LDLR水平。
图12E描述在过量表达PCSK9的HepG2细胞中响应他汀与ABP31H4的组合的LDLR水平。
图12F描述在过量表达PCSK9的HepG2细胞中响应他汀与ABP25A7.1(非中和抗体，与“25A7”中和抗体形成对照)的组合的LDLR水平。
图13A描述各种针对PCSK9的ABP的不同轻链氨基酸序列。点(.)表示为没有氨基酸。
图13B描述各种针对PCSK9的ABP的轻链进化树。
图13C描述各种针对PCSK9的ABP的不同重链氨基酸序列。点(.)表示为没有氨基酸。
图13D描述各种针对PCSK9的ABP的重链系统树图。
图13E描述轻链和重链CDR的比较，并指定了从其中得到共有序列的组。
图13F描述第1组和第2组的共有序列。
图13G描述第3组和第4组的共有序列。
图13H描述第1组和第2组的共有序列。点(.)表示同一残基。
图13I描述第2组的共有序列。点(.)表示同一残基。
图13J描述第3组和第4组的共有序列。点(.)表示同一残基。
图14A为描述各种ABP(以10mg/kg)在体内降低LDL的能力的图表。
图14B为描述各种ABP(以30mg/kg)在体内降低LDL的能力的图表。
图15A和图15B为抗原结合蛋白的各种实施方案的各种轻链的序列比较表。图15B延续了在图15A中开始的序列。
图15C和图15D为抗原结合蛋白的各种实施方案的各种轻链的序列比较表。图15D延续了在图15C中开始的序列。
图16A为用于测试Ab21B12结合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝胶的描述。
图16B为用于测试Ab31H4结合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝胶的描述。
图17描述PCSK9及LDLR的EGFa部分的结构。
图18A描述PCSK9及31H4Ab的结构。
图18B描述PCSK9及31H4Ab的结构。
图19A描述PCSK9、31H4Ab及21B12Ab的结构。
图19B描述PCSK9及21B12Ab的结构。
图20A描述PCSK9及来自LDLR的EGFa的结构，所述结构与已结合PCSK9的抗体31H4和21B12的结构重叠。
图20B描述PCSK9和LDLR的结构模型。
图20C描述另一角度的PCSK9和LDLR的结构模型。
图20D描述包括31H4和21B12的结构表现形式的PCSK9和LDLR的结构模型。
图20E描述图20D中的结构模型围绕所标注的轴旋转90度。
图20F描述图20D中的结构模型围绕所标注的轴旋转180度。
图21A描述PCSK9和31A4的结构。
图21B描述PCSK9和31A4的结构。
图21C描述PCSK9和31A4的结构。
图21D描述全长PCSK9和31A4的结构模型。
图22为一套确定人ABP序列与在大肠杆菌(E.coli)中产生并用于晶体结构的ABP序列之间的各种差异的ABP序列。
图23为各种分库结果的表。
图23A为描述各种分库结果的表的第一部分。
图23B为描述各种分库结果的表的第二部分。
图23C为描述各种分库结果的表的第三部分。
图23D为描述各种分库结果的表的第四部分。
图24A描述在非还原条件下的蛋白印迹。
图24B描述在还原条件下的蛋白印迹。
图25A描述PCSK9的表面覆盖。
图25B描述PCSK9的表面覆盖。
图25C描述PCSK9的表面覆盖。
图25D描述PCSK9的表面覆盖。
图25E描述PCSK9的表面覆盖。
图25F描述PCSK9的表面覆盖。
图26为PCSK9的氨基酸序列与PCSK9变体中突变的所有残基的序列比较，以调查不同抗体表位。
图27A描述21B12表位击中(epitopehit)，其根据用21B12作图到PCSK9的晶体结构上。
图27B描述31H4表位击中，其根据用31H4和21B1作图到PCSK9的晶体结构上。
图27C描述31A4表位击中，其根据用31A4和21B1作图到PCSK9的晶体结构上。
图27D描述12H11表位击中，其根据用31H4和21B12作图到PCSK9的晶体结构上。
图27E描述3C4表位击中，其根据用31H4和21B12作图到PCSK9的晶体结构上。
图28A为证明各种ABP与PCSK9的不同部分的结合能力的图表。
图28B为证明各种ABP与PCSK9的不同部分的结合能力的图表。
图28C为比较两种ABP的LDLR结合能力的图表。
图28D为比较两种ABP的细胞LDL吸收活性的图表。
某些例示性实施方案详述
本文公开了结合PCSK9的抗原结合蛋白(例如抗体及其功能结合片段)。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合PCSK9并以各种方式防止PCSK9起作用。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白封阻或降低PCSK9与其它物质相互作用的能力。例如，在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白以防止或降低PCSK9结合LDLR的可能性的方式结合PCSK9。在其它实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9但不封阻PCSK9与LDLR相互作用的能力。在某些实施方案中，抗原结合蛋白为人单克隆抗体。
如本领域技术人员所了解，根据本发明的公开内容，改变PCSK9和LDLR之间的相互作用可在受治疗者中增加可用于结合LDL的LDLR量，进而降低血清LDL的量，导致受治疗者的血清胆固醇水平降低。因此，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于各种方法和组合物中，所述方法和组合物用于治疗高血清胆固醇水平的受治疗者、处于高血清胆固醇水平风险中的受治疗者或能从降低其血清胆固醇水平获益的受治疗者。因此，本文还阐述用于降低血清胆固醇、保持血清胆固醇或预防血清胆固醇增加的各种方法和技术。在某些实施方案中，抗原结合蛋白允许PCSK9和LDLR之间结合，但该抗原结合蛋白防止或降低PCSK9对LDLR的有害活性。在某些实施方案中，抗原结合蛋白防止或降低PCSK9与LDLR结合。
为方便起见，以下章节大体上概述本文所用术语的各种含义。在讨论了这些之后，论述了关于抗原结合蛋白的大体方面，接着是证明抗原结合蛋白的各种实施方案的性质及如何使用它们的具体实施例。
定义和实施方案
应该理解，前述一般说明及以下详述仅为例示性和解释性，并非限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式例如“包含”的使用并非限制性的。此外，除非另外明确说明，否则术语例如“元件”或“组分”既包括包含一个单元的元件及组分又包括包含超过一个亚单元的元件及组分。此外，术语“部分”的使用可包括部分的一部分或整个部分。
本文所用章节标题仅用于组织目的，不能理解为限制所述的主题。为任何目的，本申请中所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)都在此以其整体引作参考。除非另外指出，否则如本发明所使用，以下术语应理解为具有以下含义：
术语“前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型”或“PCSK9”是指SEQ IDNO:1和/或3或其片段所述的多肽以及相关多肽，它们包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体(包括添加N-末端甲硫氨酸)、融合多肽和种间同源物。在某些实施方案中，PCSK9多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、标签(tag)残基和/或融合蛋白残基。“PCSK9”也被称为FH3、NARC1、HCHOLA3、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型和神经细胞凋亡调节转化酶1(neural apoptosis regulated convertase1)。PCSK9基因编码前蛋白转化酶蛋白，所述前蛋白转化酶蛋白属于分泌性枯草杆菌酶家族(secretorysubtilase family)的蛋白酶K亚家族。术语“PCSK9”表示前蛋白和前蛋白自身催化后产生的产物两者。当仅提及自身催化的产物(例如对于选择性结合裂解的PCSK9的抗原结合蛋白)时，该蛋白可称为“成熟”、“裂解的”、“经加工的”或“有活性的”PCSK9。当只提及其无活性的形式时，该蛋白可称为“无活性的”、“前形式的”或“未加工的”形式的PCSK9。本文所用术语PCSK9还包括天然存在的等位基因，例如突变体D374Y、S127R和F216L。术语PCSK9还包括结合了PCSK9氨基酸序列翻译后修饰的PCSK9分子，例如业已被糖基化、PEG化的PCSK9序列、其信号序列业已被裂解的PCSK9序列、其前域业已从催化结构域中裂解但尚未与所述催化结构域分离的PCSK9序列(例如图1A和1B)。
术语“PCSK9活性”包括PCSK9的任何生物学作用。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性由PCSK9结合LDL受体(LDLR)的能力来表示。在某些实施方案中，PCSK9结合LDLR并催化涉及LDLR的反应。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9改变(例如降低)LDLR利用率的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9增加受治疗者中的LDL量的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低可用于结合LDL的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，“PCSK9活性”包括因PCSK9信号转导而产生的任何生物学活性。例示性活性包括但不限于：PCSK9结合LDLR；裂解LDLR或其它蛋白的PCSK9酶活性；PCSK9结合除LDLR外的促进PCSK9作用的蛋白；PCSK9改变APOB分泌(SunX-M等，“Evidence for effect of mutant PCSK9on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominanthypercholesterolemia(突变的PCSK9对载脂蛋白B分泌的影响是非比寻常的严重的显性高胆固醇血症的原因的证明),Human Molecular Genetics14:1161-1169,2005和OuguerramK等，“Apolipoprotein B100metabolism inautosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9(在与PCSK9突变有关的常染色体显性高胆固醇血症中载脂蛋白B100的代谢)，ArteriosclerthrombVascBiol.24:1448-1453,2004)；PCSK9在肝脏再生和神经细胞分化中的作用(Seidah NG等，“The secretory proprotein convertase neuralapoptosis-regulated convertase1(NARC-1):Liver regeneration and neuronaldifferentiation(调节分泌性前蛋白转化酶神经细胞凋亡的转化酶1(NARC-1)：肝脏再生和神经元分化”PNAS100:928-933,2003)；和PCSK9在肝葡萄糖代谢中的作用(Costet等，“Hepatic PCSK9expression is regulated by nutritionalstatus via insulin and sterol regulatory element-binding protein 1c(经由胰岛素和固醇调节性元件结合蛋白1c通过营养状态调节肝PCSK9表达)”J.Biol.Chem.281(10):6211-18,2006)。
本文所用术语“高胆固醇血症”是指胆固醇水平提高到所需水平以上的病症。在某些实施方案中，其是指血清胆固醇水平提高。在某些实施方案中，所需水平考虑了本领域技术人员已知的各种“风险因子”(并由本文阐述或提及)。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合体二者。包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或经修饰形式的任一种类型核苷酸。所述修饰包括：碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2’,3’-二脱氧核糖；和核苷酸间连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。
术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸长10-60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因的单链或双链。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
“分离的核酸分子”意指基因组DNA或RNA、mRNA、cDNA或其合成来源(synthetic origin)或某些组合，它们不与所述分离的多核苷酸天然存在于其中的多核苷酸的全部或部分缔合，或它们被连接到在自然状态下不与其连接的多核苷酸。应该理解，为本发明目的，“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”并不包括整个染色体。“包含”特定核酸序列的分离的核酸分子除了包含所述特定序列外，还包含编码至多10个或甚至至多20个其它蛋白或其部分的序列，或可包含可操作地连接的调控所述核酸序列的编码区表达的调控序列，和/或可包含载体序列。
除非另外明确说明，否则本文所述的任何单链多核苷酸序列的左手端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’方向。将5’到3’添加新生RNA转录物的方向称为转录方向；将具有与RNA转录物相同的序列且其5’为RNA转录物的5’端的DNA链上的序列区称为“上游序列”；将具有与RNA转录物相同的序列且其3’为RNA转录物的3’端的DNA链上的序列区称为“下游序列”。
术语“调控序列”是指可影响与其连接的编码序列的表达及加工的多核苷酸序列。所述调控序列的性质可视宿主生物体而定。在特定实施方案中，用于原核生物的调控序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，用于真核生物的调控序列可包括包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“调控序列”可包括前导序列和/或融合伴侣序列。
术语“载体”意指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或调控(结合宿主细胞)一个或多个可操作地与其连接的异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括但不限于：影响或调控转录、翻译的序列；和若存在内含子，则影响可操作地与其连接的编码区的RNA剪接的序列。
本文所用“可操作地连接”意指使用该术语的组分处于允许所述组分在合适的条件下实行其固有的功能的关系中。例如，让“可操作地连接”到蛋白编码序列的载体中的调控序列与蛋白编码序列连接，以便在与调控序列的转录活性兼容的条件下完成所述蛋白编码序列的表达。
术语“宿主细胞”意指业已被或能够被核酸序列转化并藉此表达目的基因的细胞。不管后代在形态上或在遗传构成上与原始母细胞是否相同，只要后代存在目的基因，该术语就包括所述母细胞的后代。
术语“转染”意指细胞吸收外来或外源DNA，当将所述外源DNA引入到细胞膜内时所述细胞就被“转染”了。多种转染技术在本领域众所周知并公开于本文中。参见例如Graham等，1973,Virology52:456；Sambrook等，2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，见上述；Davis等，1986,Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法),Elsevier；Chu等，1981,Gene13:197。所述技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入到合适的宿主细胞中。
术语“转化”是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新DNA或RNA时，所述细胞就被转化了。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化了。转染或转导后，转化的DNA可通过在物理上整合到细胞染色体而与细胞DNA重组，或可作为染色体外元件不被复制而短暂保留，或可作为质粒独立复制。当转化的DNA随着细胞分裂复制时，认为细胞已经被“稳定地转化”了。
术语“多肽”或“蛋白”意指如下大分子：具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，所述天然蛋白即由天然存在且为非重组的细胞产生的蛋白；或所述大分子由遗传工程改造的或重组的细胞产生，所述术语包括具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有所述天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括氨基酸聚合体，其中一个或多个氨基酸为相应的天然存在的氨基酸的化学类似物及聚合体。术语“多肽”和“蛋白”特别涵盖PCSK9抗原结合蛋白、抗体或序列，其具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或中间缺失的多肽。所述片段还可含有与天然蛋白相比经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段长度为约5-500个氨基酸。例如，片段长度可为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫学功能片段，包括结合结构域。在PCSK9结合抗体情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的部分或仅其含两个CDR的可变区等。
提及的术语“分离的蛋白”意指如下主题蛋白：(1)脱离通常与其一起存在的至少某些其它蛋白的蛋白；(2)基本上脱离同一来源(例如来自同样的物种)的其它蛋白的蛋白；(3)由来自不同物种的细胞表达的蛋白；(4)已经与和其天然结合的多核苷酸、脂类、糖类或其它物质的至少约50％分开的蛋白；(5)与和其并不天然结合的多肽可操作地结合(通过共价或非共价作用)的蛋白；或(6)非天然存在的蛋白。通常“分离的蛋白”构成既定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。基因组DNA、cDNA、mRNA或合成来源或其任何组合的其它RNA可编码所述分离的蛋白。优选地，分离的蛋白基本上脱离在其天然环境中存在的干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的蛋白或多肽或其它污染物。
术语“氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。
多肽(例如抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
术语“同一性”是指通过比对和比较序列而确定的两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子序列之间的关系。“同一性百分率”意指被比较的分子内的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，其基于被比较的大小最小的分子计算。对于这些计算，优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决比对中的空位(如果存在的话)。可用于计算比对的核酸或多肽同一性的方法包括如下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology(计算机化的分子生物学)，(Lesk,A.M.编辑),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects(生物计算信息学和基因组计划),(Smith,D.W.编辑),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis ofSequence Data,Part I(序列数据的计算机分析，第I部分),(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学序列分析),New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer(序列分析引物),(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等，1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073。
在计算同一性百分率时，通常以得到序列之间的最大匹配的方式来比对待比较的序列。可用于测定同一性百分率的计算机程序的一个实例为GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984,Nucl.Acid Res.12:387；GeneticsComputer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。将计算机算法GAP用于比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。根据其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对(由算法来确定“匹配跨度(matchedspan)”)。结合所述方法使用空位开放罚分(计算为3x平均对角线(averagediagonal)，其中所述“平均对角线”为所用比较矩阵的对角线的平均值；所述“对角线”为通过特定比较矩阵分配给每一完美的氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵例如PAM250或BLOSUM62。在某些实施方案中，所述算法也使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集)，5:345-352；对于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。
在用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的参数实例以下：
·算法：Needleman等，1970,J.Mol.Biol.48:443-453
·比较矩阵：来自Henikoff等，1992，上述的BLOSUM62
·空位罚分：12(但对末端空位不罚分)
·空位长度罚分：4
·相似性阀值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对设计(alignment scheme)可导致仅两个序列的短区域匹配，即使在两个全长序列间没有显著的关系，这种小比对区也可具有极高的序列同一性。因此，如果需要产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的邻接氨基酸的比对，则可调整所选择的比对方法(GAP程序)。
本文所用的20种常规(例如天然存在的)氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology--A Synthesis(免疫学—合成)(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren,编辑，Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，为任何目的其在此引作参考。20种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽记号中，左手方向为氨基末端方向，右手方向为羧基末端方向，与标准用法和习惯一致。
同样地，除非另外说明，否则单链多核苷酸序列的左手端为5’端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。将5’到3’方向添加新生RNA转录物称为转录方向；将具有与RNA转录物相同序列且其5’为RNA转录物的5’端的DNA链上的序列区称为“上游序列”；将具有与RNA转录物相同序列且其3’为RNA转录物的3’端的DNA链上的序列区称为“下游序列”。
保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统合成而引入。它们包括肽模拟物和其它逆向或反向形式的氨基酸部分。
可基于常规侧链性质将天然存在的残基分类：
1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
3)酸性：Asp、Glu；
4)碱性：His、Lys、Arg；
5)影响链方向的残基：Gly、Pro；和
6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守取代可涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。所述被取代的残基可例如引入到与非人抗体同源的人抗体的区域内，或引入到所述分子的非同源区域内。
根据某些实施方案，在改变抗原结合蛋白或PCSK9蛋白时，可考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathic index)。基于每种氨基酸的疏水性及电荷性质指定其亲水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲水性指数在赋予蛋白相互作用生物学功能中的重要性为本领域所了解。Kyte等，J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可取代具有相似亲水性指数或分值的其它氨基酸而仍保留相似的生物学活性。在某些实施方案中，在基于亲水性指数进行改变时，包括亲水性指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括在±1内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括±0.5内的氨基酸的取代。
本领域还了解，可基于亲水性进行相似氨基酸的有效取代，尤其是当藉此形成的生物学功能蛋白或肽意欲用于如本例子一样的免疫学实施方案时。在某些实施方案中，由其邻接的氨基酸的亲水性所决定的蛋白的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性(即蛋白的生物学特性)相关。
以下为给这些氨基酸残基分配的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在某些实施方案中，在基于相似的亲水值进行改变时，包括亲水值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括在±1内的氨基酸的取代，而在某些实施方案中，包括在±0.5内的氨基酸的取代。人们还可基于亲水性由一级氨基酸序列确定表位。这些区域也被称为"表位核心区"。
例示性氨基酸取代示于表1中
表1
氨基酸取代
术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，其包括但不限于与聚合物、脂类或其它有机或无机部分化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可比未进行化学修饰的抗原结合蛋白具有更长的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可改进靶向所期需细胞、组织和/或器官的能力。在某些实施方案中，对衍生的抗原结合蛋白进行共价修饰以使其包含一种或多种水溶性聚合连接物，其包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号和第4,179,337号。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，其包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或基于其它基于糖类的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如乙二醇)和聚乙烯醇以及所述聚合物的混合物。
在某些实施方案中，用聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰衍生物。在某些实施方案中，在一个或多个特定位置(例如在衍生物的氨基末端)键合一种或多种水溶性聚合物体。在某些实施方案中，将一种或多种水溶性聚合物随机连接到衍生物的一个或多个侧链上。在某些实施方案中，将PEG用于改进抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，将PEG用于改进人源化抗体的治疗能力。某些所述方法于例如美国专利第6,133,426号中论述，其为任何目的在此引作参考。
肽类似物通常在制药工业中用作与模板肽具有类似性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetics或peptidomimetics)”。Fauchere,J.,Adv.DrugRes.,15:29(1986)；Veber&Freidinger,TINS,第392页(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.,30:1229(1987)，它们为任何目的在此引作参考。通常借助计算机分子建模开发所述化合物。可将在结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物用于产生相似的治疗或预防作用。肽模拟物在结构上通常与范例多肽(即具有生化性质或药理学活性的多肽)例如人抗体相似，但有一个或多个肽键由本领域众所周知的方法任选被选自以下的连接(linkage)取代：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH-(顺式及反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。在某些实施方案中，可使用以同一类型的D-氨基酸系统取代(systematic substitution)共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)以产生更稳定的肽。另外，可通过本领域已知方法产生包含共有序列或基本上同一的共有序列变体的限制肽(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)，为任何目的其在此引作参考)；例如，通过加入能够形成使肽环化的分子内二硫桥的内部半胱氨酸残基。
在整篇本说明书中与生物学物质例如多肽、核酸、宿主细胞等联合使用的术语“天然存在的”是指在自然界存在的物质或在自然界存在的物质的形式。
本文所用“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指结合特定靶标抗原的任何蛋白。在本申请中，所述特定靶标抗原为PCSK9蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括但不限于抗体及其结合部分，例如免疫学功能片段。肽体(peptibody)为抗原结合蛋白的另一实例。本文所用术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫学功能片段”(或简写成“片段”)，是一类包含以下抗体部分(不管该部分是如何获得或合成的)的抗原结合蛋白：所述抗体部分缺乏在全长链中存在的至少某些氨基酸但仍能够特异性结合抗原。所述片段在其结合靶抗原方面具有生物学活性，并可与其它抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合既定的表位。在某些实施方案中，所述片段为中和片段。在某些实施方案中，所述片段可封阻或降低LDLR和PCSK9之间相互作用的可能性。在一个方面，所述片段将保留在全长轻链或重链中存在的至少一个CDR，而在某些实施方案中，将包含单个重链和/或轻链或其部分。可通过重组DNA技术产生这些生物学活性片段，或可通过酶学或化学裂解抗原结合蛋白(包括完整抗体)来产生。具有免疫学功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体(重链可变结构域与轻链可变结构域在同一多肽上，它们经由短得不允许同一链上的两个结构域之间配对的短肽接头连接)、Fab’、F(ab’)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，它们可来源于任何哺乳动物来源，所述哺乳动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。进一步涵盖的是，本文公开的抗原结合蛋白的功能部分(例如一个或多个CDR)可共价连接第二蛋白或小分子，以形成针对身体内特定靶标的治疗药物，所述治疗药物拥有双功能治疗特性或具有延长的血清半衰期。如本领域技术人员所了解，抗原结合蛋白可包括非蛋白组分。在本发明某些章节中，本文以“数字/字母/数字”(例如25A7)来阐述ABP实例。在这些情况下，确切名称表示特定的抗体。也就是说，名为25A7的ABP不一定与名为25A7.1的抗体相同(除非在说明书中明确教导两者是一样的，例如25A7和25A7.3)。如本领域技术人员所了解，在某些实施方案中，LDLR不是抗原结合蛋白。在某些实施方案中，LDLR的结合亚组(subsection)不是抗原结合蛋白，例如EGFa。在某些实施方案中，其它分子不是抗原结合蛋白，在体内PCSK9通过所述其它分子转导信号。所述实施方案将明确地被如此确定。
某些本文所述的抗原结合蛋白为抗体或来源于抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，所述抗体分别包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。在某些实施方案中，ABP包含或由avimer(紧密结合的肽)组成。这些不同的抗原结合蛋白在本文中进一步阐述。
“Fc”区包含两个含抗体CH1和CH2结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的CH1及可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab’片段”包含一条轻链和含有VH结构域及CH1结构域还有CH1和CH2结构域之间的区域的一条重链的部分，因此在两个Fab’片段的两条重链间可形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。
“单链抗体”为Fv分子，其中重链和轻链可变区由弹性接头连接在一起以形成单多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详述于国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中，它们的内容在此引作参考。
“结构域抗体”为只含有重链可变区或轻链可变区的具免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的这两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在某些情况下，这两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白及二价抗体可为双特异性，参见下文。在某些实施方案中，与“多特异性”或“多功能”抗体不同，二价抗体通常意味着其各个结合位点是相同的。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”为靶向不止一种抗原或表位的抗体。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体分别为具有两个不同的抗原结合位点的杂合的抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白及抗体是一类多特异性抗原结合蛋白抗体，其可通过多种方法制备，所述方法包括但不限于杂交瘤融合或Fab’片段连接。参见例如Songsivilai和Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等，1992,J.Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两种不同的表位，所述表位可位于相同或不同的蛋白靶标上。
当解离常数(Kd)为≤10-7M时，认为抗原结合蛋白“特异性结合”其靶抗原。当Kd为≤5x10-9M时，ABP以“高亲和力”特异性结合抗原，当Kd为≤5x10-10M时，以“极高亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，ABP具有≤10-9M的Kd。在一个实施方案中，解离速率为<1x10-5。在其它实施方案中，ABP将以约10-9M-10-13M的Kd结合人PCSK9，在又一实施方案中，ABP将以≤5x10-10的Kd结合。如本领域技术人员所了解，在某些实施方案中，任何或所有抗原结合片段可特异性结合PCSK9。
当抗原结合蛋白结合一个靶标比其结合第二个靶标更紧密时，其为“选择性”抗原结合蛋白。
“抗原结合区”意指特异性结合特定抗原的蛋白或蛋白部分(例如抗原互补位)。例如，将含有与抗原作用的氨基酸残基并赋予抗原结合蛋白对该抗原的特异性及亲和力的抗原结合蛋白部分称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区也包括一个或多个“构架”区。“CDR”为提供抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架(framework)”区可有助于维持CDR的合适构象以促进抗原结合区和抗原之间的结合。构架区在结构上可位于抗体中的CDR之间。构架区和CDR区的实例示于图2A-3D、3CCC-3JJJ和15A-15D中。在某些实施方案中，抗体3B6轻链的CDR序列如下：CDR1TLSSGYSSYEVD(SEQ ID NO:279)；CDR2VDTGGIVGSKGE(SEQ ID NO:280)；CDR3GADHGSGTNFVVV(SEQ IDNO:281)，而FR如下：FR1QPVLTQPLFASASLGASVTLTC(SEQ ID NO:282)；FR2WYQQRPGKGPRFVMR(SEQ ID NO:283)；FR3GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC(SEQ ID NO:284)；和FR4FGGGTKLTVL(SEQ ID NO:285)。
在某些方面，提供结合PCSK9(例如人PCSK9)的重组抗原结合蛋白。在该情况下，“重组抗原结合蛋白”为用重组技术(即通过本文所述重组核酸表达)制备的蛋白。用于制备重组蛋白的方法和技术在本领域众所周知。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、人全抗体和双特异性抗体。“抗体”是一类抗原结合蛋白。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可为“嵌合”的，也即抗体的不同部分可来源于两种不同的抗体，其在下文作进一步阐述。可在杂交瘤中；通过重组DNA技术或通过酶学或化学裂解完整抗体，来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指出，否则术语“抗体”除包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白(mutein)，其实例如下所述。此外，除非明确将其排除在外，否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。在某些实施方案中，本术语还包括肽体。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一四聚体通常由两个同样的多肽链对组成，每一对具有一条全长“轻链”(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重链”(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义为可负责效应功能的恒定区。人轻链通常分为κ和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，并且抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA同样被再分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.编辑，第二版，Raven Press,N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或CDR。通常通过构架区定位(align)来自每对的两条链的CDR，所述CDR使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。向每一结构域的氨基酸分配通常与如下定义一致：KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学意义的Kabat蛋白序列)(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等，Nature,342:878-883(1989)。
在某些实施方案中，在没有抗体轻链情况下，抗体重链结合抗原。在某些实施方案中，在没有抗体重链情况下，抗体轻链结合抗原。在某些实施方案中，在没有抗体轻链情况下，抗体结合区结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在没有抗体重链情况下结合抗原。在某些实施方案中，在没有其它可变区情况下，单独的可变区特异性结合抗原。
在某些实施方案中，通过解决抗体结构和/或解决抗体-配体复合体结构，来完成CDR的明确描述及包含抗体结合位点的残基的确定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种(例如X射线晶体学)来完成。在某些实施方案中，可采用不同的分析来确定或粗略估计CDR区。所述方法实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义(contact definition)。
Kabat定义为用于在抗体中为残基编号的标准，通常用于确定CDR区。参见例如Johnson&Wu,Nucleic AcidsRes.,28:214-8(2000)。Chothia定义与Kabat定义类似，但Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如Chothia等，J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia等，Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用由Oxford Molecular Group制作的模仿抗体结构的整合的计算机程序组。参见例如Martin等，Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies(AbMTM，用于为抗体可变区建模的计算机程序”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义用已知数据库和从头开始法(ab initio method)由一级序列建立抗体三级结构的模型，所述方法例如为在以下文献中所述的方法：Samudrala等,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach(用联合的分级方法从头开始预测蛋白结构)”PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198(1999)。接触定义基于对有效的复合体晶体结构的分析。参见例如MacCallum等，J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。
按惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。
术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH结构域位于羧基末端，且CH3最接近多肽的羧基末端。重链可为任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
双特异性或双功能抗体通常为人工杂合抗体，其具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。可通过多种方法(包括但不限于融合杂交瘤或连接Fab’片段)来制备双特异性抗体，。参见例如Songsivilai等，Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。
某些哺乳动物种类还产生仅具有单一重链的抗体。
每个单独的免疫球蛋白链通常由若干个“免疫球蛋白结构域”组成，每个免疫球蛋白结构域由大约90-110个氨基酸组成并具有特有的折叠方式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单元。在人中，IgA和IgD同种型含有四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；而IgM同种型含有五条重链和五条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将视同种型而定。例如，IgG重链含有三个称为CH1、CH2和CH3的C区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。在本发明某些实施方案中，抗PCSK9抗体为IgG2或IgG4亚型。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的部分，通常包含重链的大约120-130个氨基酸的氨基末端和轻链的约100-110个氨基酸的氨基末端。在某些实施方案中，即使是在同一物种的抗体之间，不同的抗体可变区在氨基酸序列上广泛变化。抗体可变区通常决定特定抗体针对其靶标的特异性。
术语“中和抗原结合蛋白”或“中和抗体”分别指结合配体并防止或降低配体的生物学作用的抗原结合蛋白或抗体。这可例如通过直接封阻配体上的结合位点或通过结合配体并通过间接方式(例如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力来实现。在某些实施方案中，该术语也可表示以下抗原结合蛋白：所述抗原结合蛋白防止与其结合的蛋白执行生物学功能。在评估抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)的结合情况和/或特异性中，当过量的抗体降低结合到配体的结合配偶体的量至少约1-20、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-98％、98-99％或更多(根据体外竞争性结合测定所测量)时，抗体或片段可基本上抑制配体与其结合配偶体的结合。在某些实施方案中，在PCSK9抗原结合蛋白情况下，所述中和分子可降低PCSK9结合LDLR的能力。在某些实施方案中，经由竞争测定来表征和/或描述中和能力。在某些实施方案中，中和能力以IC50或EC50值来描述。在某些实施方案中，ABP27B2、13H1、13B5和3C4为非中和ABP，3B6、9C9和31A4为弱中和物(neutralizer)，表2中的其余的ABP为强中和物。在某些实施方案中，通过结合PCSK9并防止PCSK9结合LDLR(或降低PCSK9结合LDLR的能力)来实现抗体或抗原结合蛋白的中和作用。在某些实施方案中，通过结合PCSK9并同时仍使PCSK9结合LDLR来实现抗体或ABP的中和作用，从而防止或降低PCSK9介导的LDLR的降解。因此，在某些实施方案中，中和ABP或抗体可以仍然允许PCSK9/LDLR结合，但将防止(或降低)随后的涉及PCSK9的LDLR降解。
术语“靶标”是指能够被抗原结合蛋白结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标为抗原。在短语“抗原结合蛋白”中“抗原”的使用仅表示包含可被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该情况下，所述蛋白不一定是外源的或不一定能够诱导免疫反应。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如PCSK9或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983,Methods in Enzymology9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986,J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,ALaboratory Manual(抗体，实验室手册),Cold Spring HarborPress)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung,等，1990,Virology176:546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂例如抗原结合蛋白(包括例如抗体或其免疫学功能片段)结合的分子或分子的部分。在某些实施方案中，能够将抗原用于动物以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可拥有能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)作用的一个或多个表位。
术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白(例如抗体或T-细胞受体)结合的任何决定簇。表位为抗原区域，其被靶向该抗原的抗原结合蛋白结合，当抗原为蛋白时，其包含直接与抗原结合蛋白接触的特定氨基酸。大部分情况下，表位位于蛋白上，但在某些情况下，可位于其它种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可包括分子的化学活性表面簇(grouping)，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并可具有特定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。通常对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子复合混合物中的靶抗原上的表位。
本文所用“基本上纯”意指所述分子物质为所存在的占优的物质，也就是说，基于摩尔计算，它比同一混合物中的任何其它单独物质都要丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子为组合物，其中目标物质包含所有存在的大分子物质的至少50％(基于摩尔计算)。在其它实施方案中，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的所有大分子物质的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其它实施方案中，将目标物质纯化到基本上同质，其中组合物中的污染物质不能由常规检测方法检测到，因此组合物由单一的可检测的大分子物质组成。
本文所用术语“药剂”表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物学大分子或由生物学材料制备的提取物。
本文所用术语“标记”或“标记的”是指例如通过掺入放射性标记的氨基酸，或连接可通过标记的亲和素(例如含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记或酶学活性的链霉亲和素)检测的生物素部分的多肽，来掺入可检测的标记。在某些实施方案中，标记物或标记也可为治疗剂。本领域已知并可使用各种标记多肽和糖蛋白的方法。用于多肽的标记物实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、lanthanide phosphors)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光体、生物素基团、由第二报告物(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定的多肽表位。在某些实施方案中，由不同长度的间隔臂来连接标记物以减少潜在的空间障碍。
本文所用术语“生物学样品”包括但不限于来自活体生物或原来是活体生物的任何量的物质。所述活体生物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其它动物。所述物质包括但不限于血液、血清、尿液、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结及皮肤。
本文所用术语“药用物质组合物”(或药剂或药物)是指当将其适当地给予患者时能够诱导所期需的治疗效果的化学化合物、组合物、药剂或药物。其不一定需要超过一种类型的成分。
术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物中产生治疗反应的PCSK9抗原结合蛋白的量。所述治疗有效量易于由本领域一般技术人员确定。
本文所用术语“调节物”为改变或更改分子活性或功能的化合物。例如，调节物可引起分子的某些活性或功能的大小与在没有调节物时所观察到的活性或功能的大小相比增加或降低。在某些实施方案中，调节物为抑制物，其降低分子的至少一种活性或功能的大小。所述分子的某些例示性活性和功能包括但不限于结合亲和力、酶学活性和信号转导。某些例示性抑制物包括但不限于蛋白、肽、抗体、肽体、糖类或小有机分子。肽体阐述于例如美国专利第6,660,843号(对应于PCT申请第WO01/83525号)。
术语“患者”和“受治疗者”可互换使用，包括人和非人动物受治疗者以及患有正式确诊的疾病的对象、患未被正式确定的疾病的对象、接受医学治疗的对象、有发展疾病风险的对象等。
术语“治疗(treat及treatment)”包括治疗性治疗、预防性治疗及在降低受治疗者发展疾病的风险或其它风险因素中的应用。治疗不需要完全治愈疾病，而是包括在其中减轻症状或减轻潜在风险因素的实施方案。
术语“预防”不需要100％消除事件的可能性。更准确地说，它表示在所述化合物或方法存在下事件发生的可能性降低了。
可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可按照厂商说明书来实施酶学反应及纯化技术，或根据本领域通用的方法来完成或如本文所述进行。通常可按照本领域众所周知的常规方法，以及阐述于在本说明书中各处引用并讨论的各种一般性及更特定的参考文献，来实施前述技术和方法。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其为任何目的在此引作参考。除非提供明确定义，否则所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学及医药和制药化学相关的术语及实验方法和技术为本领域众所周知并在本领域常常使用。可将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送和治疗患者。
针对PCSK9的抗原结合蛋白
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)是丝氨酸蛋白酶，其参与调节低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的水平(Horton等，2007；Seidah和Prat,2007)。PCSK9是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的激素原-前蛋白转化酶(Seidah等，2003)。例示性的人PCSK9氨基酸序列示于图1A(以下划线来描述蛋白的“前”结构域)和图1B(以粗体来描述信号序列，以下划线来描述前域)中的SEQ ID NO:1和3。例示性人PCSK9编码序列如SEQ ID NO:2(图1B)所示。如本文所述，PCSK9蛋白还可包括全长PCSK9蛋白片段。最近由两个小组(Cunningham等，Nature Structural&Molecular Biology,2007，和Piper等，Structure,15:1-8,2007)解析了PCSK9蛋白的结构，两篇文章的整体内容都在此引作参考。PCSK9包括信号序列、N-末端前域、枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和C-末端结构域。
本文提供结合PCSK9(包括人PCSK9)的抗原结合蛋白(ABP)。在某些实施方案中，提供的抗原结合蛋白为本文所述包含一个或多个互补决定区(CDR)的多肽。在某些抗原结合蛋白中，CDR被包埋在“构架”区内，所述构架区定位CDR以便获得适当的CDR抗原结合特性。在某些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白可干扰、封阻、降低或调整PCSK9和LDLR之间的相互作用。可将所述抗原结合蛋白表示为“中和”。在某些实施方案中，即使抗原结合蛋白是中和蛋白并结合PCSK9，PCSK9和LDLR之间的结合仍可发生。例如，在某些实施方案中，ABP防止或降低PCSK9对LDLR的不良影响而不封阻PCSK9上的LDLR结合位点。因此，在某些实施方案中，ABP调节或改变了PCSK9导致LDLR降解的能力，而不防止PCSK9和LDLR之间的结合作用。所述ABP可被明确地阐述为“非竞争性中和”ABP。在某些实施方案中，中和性ABP以防止PCSK9与LDLR结合的位置和/或方式结合PCSK9。所述ABP可被明确地阐述为“竞争性中和”ABP。以上两种中和物都可导致在受治疗者中存在更大量的游离LDLR，其导致更多的LDLR结合LDL(藉此降低受治疗者中LDL的量)。进而导致受治疗者中血清胆固醇量降低。
在某些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白能够抑制PCSK9介导的活性(包括结合)。在某些实施方案中，结合这些表位的抗原结合蛋白抑制(还有其它作用)PCSK9和LDLR之间的相互作用及由PCSK9介导的其它生理作用。在某些实施方案中，抗原结合蛋白为针对PCSK9的人(例如全人)抗体。
在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的催化结构域。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的成熟形式。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的前域。在某些实施方案中，ABP选择性结合PCSK9的成熟形式。在某些实施方案中，ABP以使PCSK9不能结合或不能有效结合LDLR的方式结合催化结构域。在某些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的c-末端。在某些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的n-末端。在某些实施方案中，ABP不结合PCSK9蛋白的n-或c-末端。在某些实施方案中，ABP结合被本文所述抗体结合的任何一种表位。在某些实施方案中，这可通过本文公开抗体和其它抗体之间的竞争性测定来确定。在某些实施方案中，ABP结合由表2所述抗体之一结合的表位。在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9的特定构象状态以便防止PCSK9与LDLR作用。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域并防止(或减少)PCSK9与LDLR结合。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9的V结构域，同时不防止(或减少)PCSK9与LDLR结合，ABP防止或降低通过PCSK9介导的对LDLR的有害活性。
本文公开的抗原结合蛋白具有多种用途。例如，某些抗原结合蛋白可用于：特异性结合测定；PCSK9(尤其是人PCSK9或其配体)的亲和纯化；和用于鉴定PCSK9活性的其它拮抗剂的筛选测定。某些抗原结合蛋白可用于抑制PCSK9与LDLR的结合或抑制PCSK9介导的活性。
如本文所述，抗原结合蛋白可用于多种治疗应用。例如，在某些实施方案中，PCSK9抗原结合蛋白可用于治疗与PCSK9相关联的病症，例如胆固醇相关疾病(或“血清胆固醇相关疾病”)，例如高胆固醇血症，其如本文进一步所述。抗原结合蛋白的其它用途包括例如：PCSK9相关联的疾病或病症的诊断及筛选测定以确定是否存在PCSK9。本文所述的某些抗原结合蛋白用于治疗与PCSK9活性有关联的后果、症状和/或病理。
在某些实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含一个或多个CDR(例如1、2、3、4、5或6个CDR)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构和(b)被插入和/或连接到多肽结构的一个或多个CDR。多肽结构可采取多种不同的形式。例如，它可以是或包含天然存在的抗体或其片段或变体的构架，或可在性质上为完全合成的。各种多肽结构实例在下文作进一步阐述。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构为抗体，或来源于抗体，它们分别包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时被称为“抗体缀合物”)和每一种的部分或片段。在某些情况下，抗原结合蛋白为抗体的免疫片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv)。在本文中进一步阐述并定义各种结构。
本文提供的某些抗原结合蛋白特异性和/或选择性结合人PCSK9。在某些实施方案中，抗原结合蛋白特异性和/或选择性结合具有SEQ ID NO:3的153-692位残基和/或由其组成的人PCSK9蛋白。在某些实施方案中，ABP特异性和/或选择性结合具有SEQ ID NO:3的31-152位残基和/或由其组成的人PCSK9蛋白。在某些实施方案中，ABP选择性结合在图1A(SEQ ID NO:1)中描述的人PCSK9蛋白。在某些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合含或不含信号序列的PCSK9蛋白的至少片段和/或全长PCSK9蛋白。
在其中抗原结合蛋白用于治疗性应用的实施方案中，抗原结合蛋白可抑制、干扰或调节PCSK9的一种或多种生物学活性。在一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合人PCSK9，和/或基本上抑制人PCSK9与LDLR结合的至少约20％-40％、40-60％、60-80％、80-85％或更多(例如，通过测定体外竞争性结合测定中的结合情况)。本文提供的某些抗原结合蛋白为抗体。在某些实施方案中，ABP具有小于10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13M的Kd(结合更紧密)。在某些实施方案中，ABP具有用于封阻LDLR与PCSK9(D374Y，高亲和力变体)结合的以下的IC50：小于1uM、1000nM-100nM、100nM-10nM、10nM-1nM、1000pM-500pM、500pM-200pM、小于200pM、200pM-150pM、200pM-100pM、100pM-10pM、10pM-1pM。
本发明抗PCSK9抗体的IgG2重链恒定结构域的一个实例具有SEQID NO:154所示的氨基酸序列(图3KK)。
本发明抗PCSK9抗体的IgG4重链恒定结构域的一个实例具有SEQID NO:155所示的氨基酸序列(图3KK)。
抗PCSK9抗体的κ轻链恒定结构域的一个实例具有SEQ IDNO:157所示的氨基酸序列(图3KK)。
抗PCSK9抗体的λ轻链恒定结构域的一个实例具有SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列(图3KK)。
免疫球蛋白链的可变区通常表现出相同的总体结构，包含由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)，其更通常被称为“互补决定区”或CDR。来自上述每一对重链/轻链的两条链的CDR通常由构架区定位，以形成与靶标蛋白(例如PCSK9)上的特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链和重链可变区二者都通常从N-末端到C-末端符合以下这些元件的次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。设计编号系统用于给占有各个所述结构域中的位置的氨基酸分配编号。该编号系统在以下文献中定义：Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(具有免疫学意义的Kabat蛋白序列)(1987和1991,NIH,Besda,MD)或Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等，1989,Nature342:878-883。
本文提供各种重链和轻链可变区，并阐述于图2A-3JJ和3LL-3BBB中。在某些实施方案中，可将这些可变区每一个连接到上述重链和轻链恒定区以分别形成完整的抗体重链和轻链。另外，可联合每一个由此产生的重链和轻链序列以形成完整的抗体结构。
所提供的抗体的轻链和重链可变区中的某些特定实例及其相应的氨基酸序列概述于表2中。
表2
例示性重链和轻链可变区
同样，可让表2所列的每一个例示性可变重链与表2所示的任何例示性可变轻链联合，以形成抗体。表2出示了在本文公开的若干抗体中存在的例示性轻链和重链配对。在某些情况下，抗体包含来自表2所列的至少一个可变重链和一个可变轻链。在其它情况下，抗体含有两条同样的轻链和两条同样的重链。举例而言，抗体或抗原结合蛋白可包含一条重链和一条轻链、两条重链或两条轻链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含(和/或由其组成)来自表2所列序列的至少一种中的1、2和/或3条重链和/或轻链的CDR(序列的CDR概述于图2A-3D中，其它实施方案概述于图3CCC-3JJJ和15A-15D中)。在某些实施方案中，所有6个CDR(来自轻链的CDR1-3(CDRL1、CDRL2、CDRL3)和来自重链的CDR1-3(CDRH1、CDRH2和CDRH3))都为ABP的部分。在某些实施方案中，ABP中包含1、2、3、4、5或更多个CDR。在某些实施方案中，在ABP中包含来自表2的序列中的CDR的一个重链CDR和一个轻链CDR(表2的序列中的CDR概述于图2A-3D)。在某些实施方案中，ABP中也包含另外部分(例如在图2A-2D、3A-3D中所述，其它实施方案在3CCC-3JJJ和15A-15D中所述)。表2中所述重链和轻链的CDR和FR实例概述于图2A-3D中(其它实施方案概述于图3CCC-3JJJ和15A-15D中)。任选轻链可变序列(包括CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4)可选自以下：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。任选重链可变序列(包括CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4)可选自以下：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。在图2A-3D的某些条目中，确定了CDR和FR的序列变化或备选的边界。这些备选序列在ABP名称后加v1以供识别。因为这些备选序列大部分实际上很小，所以在表中仅展示了有差异的部分。应该理解，所述轻链或重链的其余部分与在其它组中所示的基本ABP相同。因此，例如图2C中的19H9v1具有与图2A中的19H9相同的FR1、CDR1和FR2，唯一的差别在图2C中指出。对于三个核酸序列(ABP26E10、30B9和31B12)而言，图中提供另外的备选核酸序列。如本领域技术人员所了解，只有一个所述序列确实需要用于产生抗体或ABP。实际上，在某些实施方案中，特定的重链或轻链核酸中仅需要一条存在，或两条都不必存在。
在某些实施方案中，由可编码表2中的任何蛋白序列的核酸序列编码ABP。
在某些实施方案中，ABP选择性结合结合LDLR的PCSK9形式(例如分子的自我催化形式)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的c-末端(例如c-末端的5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、最多30-40个氨基酸)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白不结合催化结构域的n-末端(例如n-末端的5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、最多30-40个氨基酸)。在某些实施方案中，ABP结合PCSK9成熟形式的1-100位氨基酸内的氨基酸。在某些实施方案中，ABP结合31-100、100-200、31-152、153-692、200-300、300-400、452-683、400-500、500-600、31-692、31-449和/或600-692位氨基酸内(和/或由所述氨基酸序列组成)的氨基酸。在某些实施方案中，ABP结合催化结构域。在某些实施方案中，中和ABP和/或非中和ABP结合前域。在某些实施方案中，ABP既结合催化结构域又结合前域。在某些实施方案中，ABP结合催化结构域以使与前域相互作用的催化结构域上的区域阻塞。在某些实施方案中，ABP在Piper等所述(Structure15:1-8(2007)，其整体在此引作参考，包括其中的结构描述)的与前域作用的位置或表面结合催化结构域。在某些实施方案中，ABP结合催化结构域并限制前域的移动。在某些实施方案中，ABP结合催化结构域而不结合前域。在某些实施方案中，ABP结合催化结构域，不结合前域，同时防止前域重新定位而使PCSK9与LDLR结合。在某些实施方案中，ABP结合与Piper等中的前域的149-152位残基周围的表位相同的表位。在某些实施方案中，ABP结合V结构域上的沟槽(如Piper等所述)。在某些实施方案中，ABP结合最接近V结构域上的沟槽的富组氨酸段。在某些实施方案中，所述抗体(结合V结构域)不是中和抗体。在某些实施方案中，结合V结构域的抗体是中和抗体。在某些实施方案中，中和ABP防止PCSK9与LDLR结合。在某些实施方案中，中和ABP虽然防止PCSK9降解LDLR但不防止PCSK9与LDLR结合(例如，ABP31A4)。在某些实施方案中，ABP结合或封阻至少一个Piper等论文中的图4所述组氨酸。在某些实施方案中，ABP封阻PCSK9中的催化三联体。
在某些实施方案中，相对于野生型PCSK9，抗体选择性结合变体PCSK9蛋白例如D374Y。在某些实施方案中，这些抗体结合变体的强度是结合野生型的强度的至少2倍，并优选结合突变体的强度是结合野生型的强度的2-5、5-10、10-100、100-1000、1000-10,000倍或更多倍(如经由Kd所测量)。在某些实施方案中，相对于野生型PCSK9与LDLR作用的能力，抗体选择性抑制变体D374YPCSK9与LDLR的相互作用。在某些实施方案中，这些抗体封阻变体结合LDLR的能力比封阻野生型结合LDLR的能力更强，例如前者是后者的2倍，并优选前者是后者的2-5、5-10、10-100、100-1000倍或更多(如经由IC50所测量)。在某些实施方案中，抗体以相似水平结合并中和野生型PCSK9和变体形式的PCSK9(例如D374Y)二者。在某些实施方案中，抗体结合PCSK9以防止LDLR变体与PCSK9结合。在某些实施方案中，LDLR变体与人LDLR具有至少50％同一性。应该指出，LDLR变体为本领域技术人员已知(例如Brown MS等，“Calcium cages,acid baths and recycling receptors(钙笼、酸浴和再循环受体)”Nature388:629-630,1997)。在某些实施方案中，ABP可提高异质杂合家族性高胆固醇血症(heterozygote familial hypercholesterolemia)(其中存在失去功能的LDLR变体)中有效LDLR的水平。
在某些实施方案中，ABP结合(但不封阻)具有与图1A和/或图1B所述的PCSK9形式至少50％、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99或更大同一性百分率的PCSK9变体。在某些实施方案中，ABP结合(但不封阻)具有与图1A和/或图1B所述的PCSK9成熟形式至少50％、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99或更大同一性百分率的PCSK9变体。在某些实施方案中，ABP结合并防止具有与图1A和/或图1B所述的PCSK9形式至少50％、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99或更大同一性百分率的PCSK9变体与LDLR作用。在某些实施方案中，ABP结合并防止具有与图1B所述的PCSK9的成熟形式至少50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99或更大同一性百分率的PCSK9变体与LDLR作用。在某些实施方案中，PCSK9变体为人变体，例如在474、E620G和/或E670G位置的变体。在某些实施方案中，474位的氨基酸为缬氨酸(如在另外的人中)或苏氨酸(如在猕猴和小鼠中)。根据本文提供的交叉反应数据，认为本发明抗体将易于结合以上变体。
在某些实施方案中，ABP结合被表2中所述抗体之一结合的表位。在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9的特定构象状态，以防止PCSK9与LDLR作用。
人源化抗原结合蛋白(例如抗体)
如本文所述，针对PCSK9的抗原结合蛋白可包含人源化抗体和/或其部分。所述策略的重要实际应用为小鼠体液免疫系统的“人源化”。
在某些实施方案中，人源化抗体在人中基本上无免疫原性。在某些实施方案中，人源化抗体与其所来源于的另一物种的抗体基本上有同样的对靶标的亲和力。参见例如美国专利5,530,101、美国专利5,693,761、美国专利5,693,762、美国专利5,585,089。
在某些实施方案中，鉴定了可被修饰但不降低抗原结合结构域的天然亲和力同时降低其免疫原性的抗体可变结构域的氨基酸。参见例如美国专利5,766,886和5,869,619。
在某些实施方案中，通常设计通过本领域已知方法对抗体的修饰，来实现增加对靶标的结合亲和力和/或降低抗体在受治疗者中的免疫原性。在某些实施方案中，为了提高抗体对其相关抗原的亲和力，修饰人源化抗体以消除糖基化位点。参见例如Co等，Mol.Immunol.,30:1361-1367(1993)。在某些实施方案中，将诸如“重构(reshaping)”、“嵌合(hyperchimerization)”或“覆盖(veneering)/再表面化(resurfacing)”等技术用于制备人源化抗体。参见例如Vaswami等，Annals of Allergy,Asthma,&Immunol.81:105(1998)；Roguska等，Prot.Engineer.,9:895-904(1996)；和美国专利第6,072,035号。在某些所述实施方案中，所述技术通常通过减少外源残基数目来降低抗体免疫原性，但不防止在重复给予所述抗体后的抗独特性反应和抗异型反应。用于降低免疫原性的某些其它方法阐述于例如Gilliland等，J.Immunol.,62(6):3663-71(1999)中。
在某些情况下，人源化抗体导致抗原结合能力丢失。在某些实施方案中，人源化抗体为“回复突变”。在某些所述实施方案中，让人源化抗体突变，使其包含在供体抗体中存在的一个或多个氨基酸残基。参见例如Saldanha等，Mol Immunol36:709-19(1999)。
在某些实施方案中，可将针对PCSK9的抗体的轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)移植到来自相同或另外物种的构架区(FR)。在某些实施方案中，可将针对PCSK9的抗体的轻链和重链可变区的CDR移植到人共有FR。在某些实施方案中，为了产生人共有FR，将来自若干人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对，以确定共有区氨基酸序列。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的轻链和重链FR被来自不同的重链或轻链的FR置换。在某些实施方案中，针对PCSK9的抗体的重链和轻链FR中的稀有氨基酸可不被置换，而其余的FR氨基酸被置换。稀有氨基酸为位于其在FR中通常不存在的位置的特殊氨基酸。在某些实施方案中，来自针对PCSK9的抗体的移植可变区可与不同于针对PCSK9的抗体的恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方案中，移植的可变区为单链Fv抗体的部分。CDR移植阐述于例如如下文献中：美国专利第6,180,370号、第6,054,297号、第5,693,762号、第5,859,205号、第5,693,761号、第5,565,332号、第5,585,089号和第5,530,101号；和Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988),Winter,FEBSLetts.,430:92-94(1998)，它们为任何目的在此引作参考。
人抗原结合蛋白(例如抗体)
如本文所述，结合PCSK9的抗原结合蛋白可包括人(即全人)抗体和/或其部分。在某些实施方案中，提供编码重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列及包含所述蛋白分子的氨基酸序列(特别是对应于可变区的序列)。在某些实施方案中，提供对应于互补决定区(CDR)(具体而言为CDR1到CDR3)的序列。根据某些实施方案，提供表达所述免疫球蛋白分子的杂交瘤细胞系。根据某些实施方案，提供表达所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，杂交瘤细胞系选自表2所述的至少一种细胞系，例如21B12、16F12和31H4。在某些实施方案中，提供针对人PCSK9的纯化的人单克隆抗体。
人们可用人Ig基因座大片段对不能产生小鼠抗体的小鼠品系进行遗传改造，预测所述小鼠在缺乏小鼠抗体的情况下是否将会产生人抗体。大的人Ig片段可保留大的可变基因多样性以及对抗体产生及表达的适当调节。通过利用所述小鼠作为抗体多样化和选择及缺乏对人蛋白的免疫耐受性的工具(machinery)，在这些小鼠品系中重新产生的人抗体库可产生针对任何目的抗原(包括人抗原)的高亲和力的人全抗体。可用杂交瘤技术产生并挑选具有所期需的特异性的抗原特异性人Mab。某些例示性方法阐述于WO98/24893、美国专利第5,545,807号、EP546073和EP546073中。
在某些实施方案中，人们可使用来自于不同于人的物种的恒定区以及人可变区。
在酵母菌人工染色体(YAC)中克隆并重建巨碱基大小的人基因座(megabase sized human loci)并将其引入小鼠种系的能力，提供了阐明极大型或粗略作图的基因座的功能性组分的方法，以及产生有用的人类疾病模型方法。此外，将所述技术用于用人基因座取代小鼠基因座，使得可了解发育期间人基因产物的表达及调控、其与其它系统之间的联系及其参与疾病诱导和进展。
人抗体避免了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的问题。所述来源于鼠或大鼠的蛋白的存在可导致快速清除抗体，或可导致患者产生针对抗体的免疫应答。为了避免利用来源于鼠或大鼠的抗体，可通过将功能性人抗体基因座引入到啮齿动物、其它哺乳动物或动物以使所述啮齿动物、其它哺乳动物或动物产生人全抗体来制备人全抗体。
人源化抗体为虽然从含有不属于人的抗体氨基酸序列开始但有至少若干这些非人抗体氨基酸序列被人抗体序列置换的抗体。这与人抗体形成对照，所述人抗体人的基因编码(或能够由其编码)。
抗原结合蛋白变体
提供的其它抗体为由表2所示的可变重链及可变轻链组合或亚部分形成的上文列举ABP变体，其包含各自与表2序列(全序列或序列亚部分，例如一个或多个CDR)的氨基酸序列具有以下同一性的可变轻链和/或可变重链：至少50％、50-60、60-70、70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或超过99％。在某些情况下，所述抗体包括至少一条重链和一条轻链，然而在其它情况下，变体形式含有两条同样的轻链和两条同样的重链(或其亚部分)。在某些实施方案中，为了通过观察影响结合的变化和似乎不影响结合的变化来确定可被修饰的抗体部分，可使用图2A-3D(及13A-13J和其它实施方案中的15A-15D)中的序列比较。例如，通过比较相似的序列，人们可确定那些可被修饰的部分(例如特定氨基酸)及确定如何修饰它们使其仍保留(或改进)ABP功能。在某些实施方案中，ABP变体包括那些共有簇(consensus group)及在图13A、13C、13F、13G、13H、13I和/或13J中描述的序列，在图中被确定为可变的位置处允许变化。基于以下方法的混合组合来确定图13A、13C、13F和13G所示的CDR：Chothia法(基于结构环区位置，参见例如“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins(免疫球蛋白的公认结构的标准构象),”BissanAl-Lazikani,Arthur M.Lesk和Cyrus Chothia,Journal of Molecular Biology,273(4):927-948,11月7日(1997))和Kabat法(基于序列变化性，参见例如,Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学意义的蛋白序列)，第5版。NIH PublicationNo.91-3242,Kabat等，(1991))。由任一种方法所测定的每一残基都包括在CDR残基的最后列表中(示于图13A、13C、13F和13G中)。图13H、13I和13J中的CDR仅通过Kabat法得到。除非另外说明，否则图13H-13J中确定的共有序列、CDR和FR将界定并决定图13中的所引用ABP的标示CDR和FR。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含可变区的重链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含可变区的重链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含包含可变区的重链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含与一个或多个来自以下至少一种序列中的CDR的CDR至少90％、90-95％和/或95-99％同一的序列：SEQ IDNO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。在某些实施方案中，存在1、2、3、4、5或6个CDR(每一个具有与上述序列至少90％、90-95％和/或95-99％的同一性)。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含与一个或多个来自以下至少一种序列中的FR的FR至少90％、90-95％和/或95-99％同一的序列：SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60。在某些实施方案中，存在1、2、3或4个FR(每一个具有与上述序列至少90％、90-95％和/或95-99％的同一性)。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含可变区的轻链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含可变区的轻链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少95％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含含可变区的轻链，所述可变区包含具有与选自以下的序列中的至少一种的氨基酸序列至少99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含与一个或多个来自以下至少一种序列中的CDR的CDR至少90％、90-95％和/或95-99％同一的序列：SEQ IDNO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，存在1、2、3、4、5或6个CDR(每一个具有与上述序列至少90％、90-95％和/或95-99％的同一性)。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含与一个或多个来自以下至少一种序列中的FR的FR至少90％、90-95％和/或95-99％同一的序列：SEQ ID NO:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，存在1、2、3或4个FR(每一个具有与上述序列至少90％、90-95％和/或95-99％的同一性)。
根据本发明，技术人员能用众所周知的技术测定本文所提出的合适的ABP变体。在某些实施方案中，本领域技术人员可确定合适的分子区域，所述区域可改变但不破坏活性，这通过靶向被认为对活性不重要的部位来实现。在某些实施方案中，人们可确定在相似多肽中保守的残基及分子部分。在某些实施方案中，甚至还可对对于生物学活性或对于结构可能重要的区域进行保守氨基酸取代而不破坏生物学活性或不负面影响多肽的结构。
另外，本领域技术人员可查阅关于确定对于活性或结构重要的相似多肽中的残基的结构-功能的研究。鉴于所述比较，人们可预测蛋白中的氨基酸残基的重要性，所述氨基酸残基对应于相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可选择化学上相似的氨基酸来取代所述预测为重要的氨基酸残基。
本领域技术人员还可分析与相似ABP的结构有关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这些信息，本领域技术人员可预测关于其三维结构的抗体氨基酸残基的排布。在某些实施方案中，本领域技术人员可选择不对预测位于蛋白表面的氨基酸残基作彻底改变，因为所述残基可涉及与其它分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可产生在每一个所需的氨基酸残基处含有单个氨基酸取代的试验变体。然后可用本领域技术人员已知的活性测定筛选变体。可将所述变体用于采集关于合适变体的信息。例如，如果人们发现对特定氨基酸残基的改变导致活性受破坏、不必要地降低或有不合适的活性产生，则可避免具有所述变化的变体。换言之，基于从所述常规实验收集的信息，本领域技术人员可易于测定应该避免单独或与其它突变组合的其它取代的氨基酸。
很多科学出版物专述二级结构的预测。参见Moult J.,Curr.Op.in Biotech.,7(4):422-427(1996),Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974)；Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.,47:251-276和Chou等，Biophys.J.,26:367-384(1979)。此外，计算机程序目前可用于辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，具有大于30％序列同一性或大于40％相似性的两个多肽或蛋白通常具有相似的拓扑结构。最近蛋白结构数据库(PDB)的扩大提供了增强的预测二级结构的能力，包括在多肽或蛋白结构内潜在的折叠数量。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.,27(1):244-247(1999)。据表明(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369-376(1997))，在既定多肽或蛋白中折叠数量有限，一旦解析了关键的结构数量，结构预测将显著地更准确。
预测二级结构的另外的方法包括“穿引法(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-87(1997)；Sippl等，Structure,4(1):15-19(1996))、“概况分析(profile analysis)”(Bowie等，Science,253:164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.,183:146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,84(13):4355-4358(1987))和“进化联系(evolutionary linkage)”(参见Holm，见上述(1999)和Brenner，见上述(1997))。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白变体包括糖基化变体，其中与母体多肽的氨基酸序列相比，糖基化位点的数目和/或类型已被改变。在某些实施方案中，蛋白变体比天然蛋白包含更多或更少的N联糖基化位点数目。N联糖基化位点特征在于Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中指定为X的氨基酸残基可为除脯氨酸外的任何氨基酸残基。通过取代氨基酸残基来产生该序列，为N联糖链提供潜在的新位点。或者，消除该序列的取代将去掉已有的N联糖链。还提供的是N联糖链的重排，其中消除一个或多个N联糖基化位点(通常为天然存在的糖基化位点)，同时产生一个或多个新的N联位点。另外优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中与母体氨基酸序列相比，有一个或多个半胱氨酸残基缺失，或被另一个氨基酸(例如丝氨酸)取代。当抗体必须重折叠为有生物学活性的构象(例如在分离不溶性的包涵体后)时，半胱氨酸变体可能有用。半胱氨酸变体通常比天然蛋白具有更少的半胱氨酸残基，其数目通常为偶数以使未配对的半胱氨酸所造成的相互作用最小化。
根据某些实施方案，氨基酸取代为实现如下效果的氨基酸取代：(1)降低对蛋白水解的易感性；(2)降低对氧化的易感性；(3)改变关于形成蛋白复合体的结合亲和力；(4)改变结合亲和力和/或(4)对所述多肽赋予或更改其它物理化学或功能特性。根据某些实施方案，在天然存在的序列中(在某些实施方案中，在形成分子间联系的一个或多个结构域外部的多肽部分中)可进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，为保守氨基酸取代)。在某些实施方案中，保守氨基酸取代通常不能基本改变母体序列的结构特点(例如氨基酸的置换应该不倾向于裂解在母体序列中存在的螺旋，或不应该倾向于破坏表征母体序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级结构和三级结构实例阐述于如下文献中：Proteins,Structures and Molecular Principles(蛋白、结构和分子原理)(Creighton编辑,W.H.Freeman和Company,NewYork(1984))；Introduction to Protein Structure(蛋白结构介绍)(C.Branden&J.Tooze编辑,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature,354:105(1991)，它们各自在此用作参考。
在某些实施方案中，变体为本文公开的ABP的核酸序列的变体。本领域技术人员应了解，上面的论述内容可用于鉴定、评估并制备ABP蛋白变体，并也用于鉴定、评估并制备可编码这些蛋白变体的核酸序列。因此，涵盖编码那些蛋白变体的核酸序列(以及编码表2中的ABP但不同于本文所明确公开的那些的核酸序列)。例如，ABP变体可具有与下述至少一种核酸序列至少80、80-85、85-90、90-95、95-97、97-99或更高的同一性：SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151，或至少1-6个由如下核酸序列编码的CDR(及其各种组合)：SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150和151。
在某些实施方案中，如果编码特定ABP(或核酸序列本身)的核酸序列可在严格条件下选择性地与编码表2中的蛋白的任何核酸序列(例如但不限于SEQ ID NO:152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150和151)杂交，则抗体(或其编码核酸序列)为变体。在一个实施方案中，合适的中等严格条件包括：在5XSSC溶液中预洗涤；0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8:0)；在50℃-65℃下5xSSC中过夜杂交，或在跨物种同源性事件中用0.5xSSC在45℃下杂交；接着在65℃下洗涤20分钟两次，每次用含有0.1％SDS的2x、0.5x和0.2xSSC。所述杂交DNA序列也在本发明范围内，其如由于密码简并编码由杂交DNA序列编码的抗体多肽和由这些核酸序列编码的氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，CDR变体包括由与上述的序列中的一个或多个CDR(各别的CDR可易于根据图2A-3D和图3CCC-3JJJ和15A-15D的其它实施方案来确定)杂交的那些序列编码的核酸序列和氨基酸序列。在上下文中提及的短语"选择性杂交"意指可检测地及选择性地结合。在使与非特异性核酸可检测地结合的可估计量最小化的杂交和洗涤条件下，本发明多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链选择性杂交。可将高严格性条件用于实现选择性杂交条件，其为本领域所知并为本文所述。通常本发明多核苷酸、寡核苷酸和片段及目的核酸序列之间的核酸序列同源性至少为80％，更通常优选增加同源性到至少85％、90％、95％、99％和100％。如果两个氨基酸序列之间有部分或完全同一性，则它们同源。例如，85％同源性意指当两个序列以最大匹配进行比对时有85％的氨基酸相同。在最大匹配中允许空位(在两个被匹配的序列的任一个中)；优选空位长度为5或更小，更优选为2或更小。作为选择并优选地，如果通过使用含突变数据矩阵和6或更大的空位罚分的ALIGN程序，两个蛋白序列(或来源于所述蛋白序列的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)具有大于5(标准差单位)的比对分值，则它们同源，如同该术语在本文中所用。参见Dayhoff,M.O.,Atlas ofProtein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集)，第101-110页(第5卷，National Biomedical Research Foundation(1972))及对该卷的增补本2，第1-10页。更优选的是，当用ALIGN程序进行最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50％同一，则它们同源。本文所用术语"对应于"意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源(即同一，并不是严格的进化亲缘)，或多肽序列与参考多肽序列同一。与此不同的是，本文所用术语"互补"意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。为说明这点，核苷酸序列"TATAC"对应于参考序列"TATAC"，而与参考序列"GTATA"互补。
抗原结合蛋白(例如抗体)的制备
在某些实施方案中，通过用抗原(例如PCSK9)免疫接种来制备抗原结合蛋白(例如抗体)。在某些实施方案中，可通过用如下物质免疫接种来制备抗体：全长PCSK9、PCSK9的可溶性形式、单独的催化结构域、图1A中所示的PCSK9的成熟形式、PCSK9的剪接变体形式或其片段。在某些实施方案中，本发明抗体可为多克隆或单克隆抗体，和/或可为重组抗体。在某些实施方案中，本发明抗体为例如通过免疫接种能够产生人抗体的转基因动物制备的人抗体(参见例如PCT公开申请号W093/12227)。
在某些实施方案中，可采用某些策略以操控抗体的固有特性，例如抗体对其靶标的亲和力。所述策略包括但不限于使用编码抗体的多核苷酸分子的位点特异性突变或随机突变以产生抗体变体。在某些实施方案中，在产生抗体变体之后，接着筛选表现出所期需变化(例如增加或减少亲和力)的抗体变体。
在某些实施方案中，在诱导突变策略中针对的氨基酸残基为CDR中的氨基酸残基。在某些实施方案中，可针对的是可变结构域构架区中的氨基酸。在某些实施方案中，业已显示构架区为某些抗体提供靶标结合特性。参见例如Hudson,Curr.Opin.Biotech.,9:395-402(1999)及其中参考文献。
在某些实施方案中，通过将随机或定点诱变限制在CDR中的超突变位点来产生更小更有效的抗体变体筛选文库，所述超突变位点是对应于在体细胞亲和力成熟过程期间易于突变的区域的位点。参见例如Chowdhury&Pastan,Nature Biotech.,17:568-572(1999)及其中的参考文献。在某些实施方案中，可使用某些DNA元件类型来确定超突变位点，其包括但不限于某些直接和反向重复、某些共有序列、某些二级结构和某些回文结构。例如，可用于确定超突变位点的所述DNA元件包括但不限于四碱基(tetrabase)序列，其包含嘌呤(A或G)接着鸟苷(G)接着嘧啶(C或T)接着腺苷或胸苷(A或T)(即A/G-G-C/T-A/T)。可用于确定超突变位点的DNA元件的另一实例为丝氨酸密码子A-G-C/T。
全人ABP(例如抗体)的制备
在某些实施方案中，噬菌体展示技术用于制备单克隆抗体。在某些实施方案中，所述技术产生全人单克隆抗体。在某些实施方案中，编码单个Fab或Fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体颗粒表面表达。参见例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等，JMolBiol222:581(1991)；美国专利第5,885,793号。在某些实施方案中，“筛选”噬菌体以确定对靶标具有亲和力的抗体片段。因此，某些所述过程通过在丝状噬菌体表面上展示抗体片段库并随后通过其与靶标结合选择噬菌体来模拟免疫选择。在某些所述程序中，分离到高亲和力的功能性中和抗体片段。在某些所述实施方案(在下文中更详尽地论述)中，通过克隆来自外周血液淋巴细胞的天然重排人V基因产生完整的人抗体基因库。参见例如Mullinax等，Proc Natl Acad Sci(USA),87:8095-8099(1990)。
根据某些实施方案，通过利用转基因小鼠来制备本发明抗体，所述转基因小鼠具有插入的产生人抗体的基因组的基本部分，但不能产生内源性鼠抗体。因此，所述小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，而在产生鼠免疫球蛋白分子和抗体方面是缺陷的。用于实现该结果的技术公开于本文说明书公开的专利、申请及参考文献中。在某些实施方案中，人们可采用例如以下文献中公开的方法：PCT公开申请号WO98/24893或Mendez等，Nature Genetics,15:146-156(1997)，其为任何目的在此引作参考。
通常可如下产生特异性针对PCSK9的全人单克隆ABP(例如抗体)。用目的抗原例如PCSK9免疫接种含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，获得来自表达抗体的小鼠的淋巴细胞(例如B-细胞)。将所述回收的细胞与骨髓型细胞系融合，以制备永生化杂交瘤细胞系，筛选并选择所述杂交瘤细胞系以鉴定产生特异性针对目的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供产生特异性针对PCSK9的抗体的杂交瘤细胞系。
在某些实施方案中，通过让人脾细胞(B或T细胞)与抗原体外接触产生人全抗体，然后在无免疫应答的小鼠(例如SCID或nod/SCID)中再造所接触的细胞。参见例如Brams等，J.Immunol.160:2051-2058(1998)；Carballido等，Nat.Med.,6:103-106(2000)。在某些所述方法中，将人胎儿组织移植到SCID小鼠(SCID-hu)中导致长期造血作用和人T细胞发育。参见例如McCune等，Science,241:1532-1639(1988)；Ifversen等，Sem.Immunol.,8:243-248(1996)。在某些情况下，在所述嵌合小鼠中的体液免疫应答依赖动物中的人T细胞的共同发育。参见例如Martensson等，Immunol.,83:1271-179(1994)。在某些方法中，将人外周血液淋巴细胞移植到SCID小鼠。参见例如Mosier等，Nature,335:256-259(1988)。在某些所述实施方案中，当用初次免疫剂(priming agent)(例如葡萄球菌肠毒素A(SEA))或用抗人CD40单克隆抗体处理所述移植的细胞时，检测到较高水平的B细胞产生。参见例如Martensson等，Immunol.,84:224-230(1995)；Murphy等，Blood,86:1946-1953(1995)。
因此，在某些实施方案中，可通过在宿主细胞中表达重组DNA或通过在杂交瘤细胞中表达，来产生人全抗体。在其它实施方案中，可用本文所述噬菌体展示技术产生抗体。
通过利用本文所述的技术来制备本文所述抗体。于是，小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，而不能产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于实现同样结果的技术公开于本文背景部分公开的专利、申请及参考文献中。然而，具体而言，转基因生产小鼠及由此产生的抗体的优选实施方案公开于如下文献中：1996年12月3日提交的美国专利申请顺序号08/759,620和1998年6月11日公布的国际专利申请号WO98/24893和2000年12月21日公布的WO00/76310，它们的公开内容在此引作参考。也参见Mendez等，Nature Genetics,15:146-156(1997)，其公开内容在此引作参考。
通过使用所述技术，业已产生了针对多种抗原的人全单克隆抗体。基本上，用目的抗原(例如PCSK9)免疫接种小鼠品系；从高度免疫小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞)；将回收的细胞与骨髓型的细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系。筛选并选择这些杂交瘤细胞系以鉴定产生特异性针对目的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供产生特异性针对PCSK9的抗体的多种杂交瘤细胞系的制备方法。此外，本文进一步提供对所述细胞系产生的抗体的表征，包括对所述抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
在以下文献中进一步讨论并阐述小鼠品种的产生：1990年1月12日提交的美国专利申请顺序号07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月28日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1996年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美国公开号2003/0093820和美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,597号、第6,075,181号和第5,939,598号和日本专利第3 068 180 B2号、第3 068 506 B2号和第3 068 507 B2号。也参见1996年6月12日授权公布的欧洲专利第EP 0 463 151 B1号、1994年2月3日公布的国际专利申请号WO94/02602、1996年10月31日公布的国际专利申请号WO96/34096、1997年6月11日公布的WO98/24893、2000年12月21日公布的WO00/76310。以上列举的每一专利、申请及参考文献的公开内容以其整体在此引作参考。
在备选方法中，包括GenPharm International,Inc.在内的其他人使用“小基因座(minilocus)”法。在小基因座法中，通过包含来自Ig基因座的片段(单独的基因)来模拟外源Ig基因座。因此，使一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和通常的第二恒定区(优选γ恒定区)形成构建体用于插入到动物中。该方法阐述于如下文献中：Surani等的美国专利第5,545,807号；和Lonberg&Kay的美国专利第5,545,806号、第5,625,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318号、第5,877,397号、第5,874,299号和第6,255,458号；Krimpenfort&Berns的美国专利第5,591,669号和第6,023.010号；Berns等的美国专利第5,612,205号、第5,721,367号和第5,789,215；和Choi&Dunn的美国专利第5,643,763号；和于1990年8月29日提交的GenPharm International美国专利申请顺序号07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741；它们的公开内容在此引作参考。也参见欧洲专利号0546073B1、国际专利申请号WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884和美国专利第5,981,175号，它们的内容以其整体在此引作参考。参见furrTaylor等，1992,Chen等，1993,Tuaillon等，1993,Choi等，1993,Lonberg等，(1994),Taylor等，(1994)和Tuaillon等，(1995),Fishwild等，(1996)，它们的公开内容以其整体在此引作参考。
Kirin还证明了从小鼠产生人抗体，其中通过微细胞融合引入大片段染色体或整个染色体。参见欧洲专利申请号773288和843961，其公开内容在此引作参考。另外，产生了KMTM小鼠，其为Kirin的Tc小鼠与Medarex的小基因座(Humab)小鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转基因染色体(transchromosome)和Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等，CloningStem Cells,(2002)4:91-102)。
也可通过体外方法获得人抗体。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT,Morphosys,Dyax,Biosite/Medarex,Xoma,Symphogen,Alexion(以前为Proliferon),Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母菌展示等等。
在某些实施方案中，本文所述抗体具有人IgG4重链以及IgG2重链。抗体也可为其它人同种型，包括IgG1。抗体具有高亲和力，当通过各种技术测量时，通常具有从约10-6到约10-13M或更低的Kd。
如人们所了解，抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。可使用编码特定抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。可通过任何已知方法转化，将多核苷酸引入到宿主细胞内，包括例如将多核苷酸包装入病毒(或病毒载体)中并用所述病毒(或载体)或通过本领域已知的转染程序转导宿主细胞，如美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号(这些专利在此引作参考)所例述。所用的转化程序取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域众所周知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装在脂质体中和直接将DNA微注射到细胞核中。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域众所周知，包括很多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，所述永生化细胞系包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、人肾上皮(human epithelial kidney)293细胞和多种其它细胞系。通过测定哪一种细胞系具有高表达水平并产生具有组成型PCSK9结合特性的抗体，来挑选特定偏好的细胞系。
在某些实施方案中，由以下杂交瘤中的至少一种产生抗体和/或ABP：21B12、31H4、16F12、表2所列举的或实施例中公开的任何其它杂交瘤。在某些实施方案中，抗原结合蛋白以以下解离常数(KD)结合PCSK9：小于大约1nM，例如1000pM-100pM、100pM-10pM、10pM-1pM和/或1pM-0.1pM或更低。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型中的至少一种免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人κ轻链和/或人重链。在某些实施方案中，重链为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些实施方案中，已对抗原结合蛋白进行克隆使其在哺乳动物细胞中表达。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含不同于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型的任何恒定区的恒定区。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人λ轻链和人IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人λ轻链和人IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人λ轻链和人IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在其它实施方案中，抗原结合蛋白包含人κ轻链和人IgG2重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人κ轻链和人IgG4重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含人κ轻链和人IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含与恒定区连接的抗体可变区，所述恒定区既不是IgG2同种型的恒定区也不是IgG4同种型的恒定区。在某些实施方案中，对抗原结合蛋白进行克隆使其在哺乳动物细胞中表达。
在某些实施方案中，对来自杂交瘤细胞系21B12、31H4和16F12中至少一种的抗体的重链和轻链的保守修饰(并相应地修饰编码核苷酸)，将产生针对PCSK9的抗体，所述抗体具有与来自杂交瘤细胞系21B12、31H4和16F12的抗体相似的功能和化学特性。与此相反，在某些实施方案中，可通过选择重链和轻链的氨基酸序列的取代来完成对针对PCSK9的抗体在功能和/或化学特性上的重要修饰，所述取代在维持以下方面的作用上显著不同：(a)在取代区域中的分子骨架的结构，例如作为折叠或螺旋构象；(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。
例如，“保守氨基酸取代”可涉及用非天然残基取代天然氨基酸残基，以使对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。此外，多肽中的任何天然残基也可被丙氨酸取代，其正如先前对“丙氨酸扫描诱变”所述。
在需要所述取代时，可由本领域技术人员确定所需的氨基酸取代(不管是保守还是非保守)。在某些实施方案中，氨基酸取代可用于鉴定针对PCSK9的抗体的重要残基，或如本文所述用于提高或降低抗体与PCSK9的亲和力。
在某些实施方案中，本发明抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。在某些实施方案中，可用编码特定抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，可通过任何已知方法转化将多核苷酸引入到宿主细胞内，包括例如将多核苷酸包装入病毒(或病毒载体)中并用所述病毒(或载体)或通过本领域已知的转染程序来转导宿主细胞，如美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号(这些专利为任何目的在此引作参考)所例述。在某些实施方案中，所用的转化程序可取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域众所周知，包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装在脂质体中和直接将DNA微注射到细胞核中。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域众所周知，包括但不限于很多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，所述永生化细胞系包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)和多种其它细胞系。在某些实施方案中，可通过测定哪一种细胞系具有高表达水平并产生具有组成型HGF结合特性的抗体，来挑选细胞系。用于哺乳动物宿主细胞的合适的表达载体众所周知。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含一种或多种多肽。在某些实施方案中，可利用多种表达载体/宿主系统中的任何一种来表达编码包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽的多核苷酸分子。所述系统包括但不限于：微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母菌表达载体转化的酵母菌；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染的或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
在某些实施方案中，在酵母菌中重组表达包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽。某些所述实施方案按照厂商说明书使用市购表达系统，例如毕赤酵母(Pichia)表达系统(Invitrogen,SanDiego,CA)。在某些实施方案中，所述系统依靠前α序列原(pre-pro-alpha)指导分泌。在某些实施方案中，插入物的转录由乙醇氧化酶(AOX1)启动子在甲醇的诱导下驱动。
在某些实施方案中，从酵母菌生长培养基中纯化包含一个或多个ABP组分或ABP本身的分泌的多肽。在某些实施方案中，用于从酵母菌生长培养基中纯化多肽的方法与用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化多肽的方法相同。
在某些实施方案中，将编码包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽的核酸克隆到杆状病毒表达载体例如pVL1393(PharMingen,SanDiego,CA)中。在某些实施方案中，可按照厂商指导(PharMingen)用所述载体在无sF9蛋白培养基中感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，并产生重组多肽。在某些实施方案中，用肝素琼脂糖柱(Pharmacia)从所述培养基纯化并浓缩多肽。
在某些实施方案中，在昆虫系统中表达包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽。某些用于多肽表达的昆虫系统为本领域技术人员所熟知。在一个这样的系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾细胞或在粉纹夜蛾幼虫(Trichoplusia larvae)中表达外源基因。在某些实施方案中，可将编码多肽的核酸分子插入到病毒的非必需基因中，例如在多角体蛋白基因内，并置于调控该基因的启动子控制下。在某些实施方案中，核酸分子的成功插入将使非必需基因钝化。在某些实施方案中，所述钝化导致可检测的特性。例如，多角体蛋白基因的钝化导致产生缺乏衣壳蛋白的病毒。
在某些实施方案中，可将重组病毒用于感染草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫。参见例如Smith等，J.Virol.,46:584(1983)；Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),91:3224-7(1994)。
在某些实施方案中，在细菌细胞内制备的包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽在细菌内作为不溶性包涵体产生。在某些实施方案中，通过离心收集包含所述包涵体的宿主细胞；在0.15MNaCl、10mMTris、pH8、1mM EDTA中洗涤；用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma,St.Louis,MO)在室温下理15分钟。在某些实施方案中，由超声波清除裂解物，通过12,000Xg离心10分钟来沉淀细胞碎片。在某些实施方案中，将含有多肽的沉淀重新悬浮于50mMTris,pH8和10mMEDTA中；在50％甘油中分层；以6000Xg离心30分钟。在某些实施方案中，可让所述沉淀重新悬浮于无Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)中。在某些实施方案中，通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中使重新悬浮的沉淀分级分离来进一步纯化多肽(参见例如Sambrook等，见上述)。在某些实施方案中，可让所述凝胶浸泡在0.4M KCl中来显现蛋白，可切下蛋白并在缺乏SDS的凝胶泳动缓冲液中电洗脱。根据某些实施方案，在细菌中产生的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白作为可溶性蛋白。在某些实施方案中，用GST纯化组件(Pharmacia)纯化所述GST融合蛋白。
在某些实施方案中，期需“重折叠”某些多肽，例如包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽。在某些实施方案中，用本文所述的某些重组系统产生所述多肽。在某些实施方案中，多肽被“重折叠”和/或氧化以形成所期需的三级结构和/或产生二硫键。在某些实施方案中，所述结构和/或键与多肽的某些生物学活性有关。在某些实施方案中，用多种本领域已知的程序中的任何一种完成重折叠。例示性方法包括但不限于在离液剂存在下让已溶解的多肽物质暴露在通常高于7的pH。例示性离液剂为胍。在某些实施方案中，重折叠/氧化的溶液还含有还原剂和该还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以将产生使得二硫键缓慢形成的特定的氧化还原电位的比率存在。在某些实施方案中，所述缓慢形成使得可形成半胱氨酸桥。例示性氧化还原对包括但不限于半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫基双GSH(dithiobisGSH)、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫基-bME。在某些实施方案中，共溶剂用于提高重折叠效率。例示性共溶剂包括但不限于甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。
在某些实施方案中，人们基本上纯化包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽。某些蛋白纯化技术为本领域技术人员所知。在某些实施方案中，蛋白纯化涉及多肽分离物与非多肽部分的初级分离。在某些实施方案中，用色谱和/或电泳技术纯化多肽。例示性纯化方法包括但不限于：用硫酸铵沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性接着离心；色谱法，包括但不限于亲和色谱法(例如蛋白-A-琼脂糖)、离子交换色谱法、排阻色谱法和反相色谱法；凝胶过滤；羟磷灰石色谱法；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；和以上方法及其它技术组合。在某些实施方案中，通过快速蛋白液相色谱法或通过高压液相色谱(HPLC)纯化多肽。在某些实施方案中，可改变纯化步骤，或可省略某些步骤而仍可产生用于制备基本上纯化的多肽的合适的方法。
在某些实施方案中，人们定量测定多肽制品的纯化程度。某些用于定量纯化程度的方法为本领域技术人员所知。某些例示性方法包括但不限于测定制品的特异性结合活性，并通过SDS/PAGE分析评估制品内多肽的量。用于评估多肽制品的纯化量的某些例示性方法包括计算制品的结合活性，并将其与原始提取物的结合活性比较。在某些实施方案中，所述计算结果表示为“纯化倍数(fold purification)”。用于表示结合活性量的单位取决于所实施的具体测定。
在某些实施方案中，部分地纯化包含一个或多个ABP组分或ABP本身的多肽。在某些实施方案中，可通过使用较少的纯化步骤或通过利用同样的总纯化方案的不同的形式来实现部分纯化。例如，在某些实施方案中，利用HPLC设备实施阳离子交换柱色谱法通常将比利用低压色谱系统的同样的技术产生更大的“纯化倍数”。在某些实施方案中，产生较低纯化程度的方法可能在多肽的总回收率或在保持多肽结合活性方面有优势。
在某些情况下，多肽的电泳迁移有时可随不同的SDS/PAGE条件而显著变化。参见例如Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,76:425(1977)。应该了解，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的多肽的表观分子量可不同。
例示性表位
提供抗PCSK9抗体所结合的表位。在某些实施方案中，由本发明所公开的抗体结合的表位尤其有用。在某些实施方案中，结合被本文所述抗体结合的任何表位的抗原结合蛋白是有用的。在某些实施方案中，被表2和图2及3中所列任何抗体结合的表位尤其有用。在某些实施方案中，表位位于催化结构域PCSK9。
在某些实施方案中，可利用PCSK9表位来防止(例如降低)抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，可利用PCSK9表位来降低抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，可利用PCSK9表位来基本上抑制抗PCSK9抗体或抗原结合蛋白与PCSK9的结合。
在某些实施方案中，可利用PCSK9表位来分离结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可利用PCSK9表位来产生结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可将PCSK9表位或包含PCSK9表位的序列用作免疫原来产生结合PCSK9的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可将PCSK9表位给予动物，随后可从所述动物获得结合PCSK9的抗体。在某些实施方案中，可利用PCSK9表位或包含PCSK9表位的序列来干扰正常PCSK9-介导的活性，例如干扰PCSK9与LDLR的缔合。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白特异性结合N-末端前域、枯草杆菌蛋白酶样催化结构域和/或C-末端结构域。在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK-9的底物-结合沟槽(在Cunningham等中所述，其整体在此引作参考)。
在某些实施方案中，可通过让PCSK9(例如野生型抗原)中的特定残基突变并测定抗原结合蛋白是否可与突变的或变体PCSK9蛋白结合，来鉴定含有与抗体接触或被抗体包埋的残基的一个或多个结构域/区。通过制造多个单独的突变，可鉴定在结合中起直接作用的残基或充分接近抗体而使突变可影响抗原结合蛋白与抗原之间的结合的残基。根据对这些氨基酸的认识，可阐明含有与抗原结合蛋白接触的残基或被抗体覆盖的残基的一个或多个抗原结构域或区。所述结构域可包括抗原结合蛋白结合表位。这种一般方法的一个特殊实例利用精氨酸/谷氨酸扫描方案(参见例如Nanevicz,T.,等，1995,J.Biol.Chem.,270:37,21619-21625和Zupnick,A.,等，2006,J.Biol.Chem.,281:29,20464-20473)。一般而言，精氨酸和谷氨酸用于取代(通常单独地)野生型多肽中的氨基酸，因为这些氨基酸带有电荷并且体积较大，因此在引入突变的抗原区具有破坏抗原结合蛋白与抗原之间的结合的潜力。存在于野生型抗原中的精氨酸被谷氨酸取代。获得多种所述单独的突变体，分析所采集的结合结果以测定那些残基影响结合。
实施例39阐述了一例所述的针对本文提供的PCSK9抗原结合蛋白的PCSK9精氨酸/谷氨酸扫描。制造了一系列突变的PCSK9抗原，且每一突变抗原具有单个突变。测量每一突变PCSK9抗原与不同PCSK9ABP的结合情况，并将其与所挑选的ABP与野生型PCSK9(SEQ ID NO:303)结合的能力进行比较。
本文所用的抗原结合蛋白与变体PCSK9之间结合的变化(例如减低或提高)，意指结合亲和力变化(例如通过诸如Biacore检测或以下实施例中所述基于珠粒的测定等已知方法所测量)、EC50变化，和/或抗原结合蛋白总结合能力(例如如在抗原结合蛋白浓度对抗原浓度作图中Bmax的降低所显示)有变化(例如降低)。结合的显著变化表明，当与结合抗原的蛋白结合时，突变的残基直接参与抗原结合蛋白的结合，或紧密接近所述结合蛋白。
在某些实施方案中，结合显著降低意指：相对于所述抗原结合蛋白与野生型PCSK9(例如示于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:303)之间的结合，抗原结合蛋白与突变PCSK9抗原之间的结合亲和力、EC50和/或能力降低大于10％、大于20％、大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合降低至低于可检测限。在某些实施方案中，当抗原结合蛋白与变体PCSK9蛋白的结合小于所述抗原结合蛋白与野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:303的蛋白)之间所观察到的结合的50％(例如小于40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，表明结合显著降低。可用本领域已知的多种结合测定来进行所述结合情况的测量。一个所述测定的特别的实例阐述于实施例39中。
在某些实施方案中，提供对变体PCSK9蛋白表现出显著更低的结合的抗原结合蛋白，其中野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)的残基被精氨酸或谷氨酸取代。在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)相比，抗原结合蛋白对于具有以下突变中的任何一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或244个)的变体PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。在本文所用的简化符号中，格式为：野生型残基:在多肽中的位置:突变残基，且残基编号如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303中所示。
在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:303)相比，抗原结合蛋白对于具有在SEQ ID NO:1中所示的以下位置的一个或多个(例如1、2、3、4、5或更多)突变的突变体PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQID NO:303)相比，抗原结合蛋白对于具有在SEQ ID NO:1中所示的以下位置的一个或多个(例如1、2、3、4、5或更多)突变的突变体PCSK9蛋白的结合降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303)相比，抗原结合蛋白对于具有在SEQ ID NO:1内的以下位置的一个或多个(例如1、2、3、4、5或更多)突变的突变体PCSK9蛋白的结合基本上降低或增加：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。
在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQID NO:303)相比，ABP对于具有在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303内的以下突变中的一个或多个(例如1、2、3、4、5个等等)的突变体PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。
在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:303)相比，ABP对于具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303内的以下突变中的一个或多个(例如1、2、3、4、5等)的突变体PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R和E582R。在某些实施方案中，结合降低。在某些实施方案中，结合降低评述为EC50变化。在某些实施方案中，EC50变化是EC50在数值上增加(因此结合降低)。
在某些实施方案中，与野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:303)相比，抗原结合蛋白对于具有在SEQ ID NO:1内的以下突变中的一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)的突变体PCSK9蛋白的结合显著降低或增加：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。在某些实施方案中，结合降低了。在某些实施方案中，结合降低评述为Bmax变化。在某些实施方案中，Bmax变化是由ABP产生的最大信号降低。在某些实施方案中，对于作为表位的一部分的氨基酸，Bmax降低至少10％，例如，在某些实施方案中，降低至少以下量中的任何一个表明残基为表位的一部分：20、30、40、50、60、70、80、90、95、98、99或100％。
尽管以上所列的变体形式是参考关于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303中所示的野生型序列，但应该了解，在PCSK9的等位基因变体中，所指位置的氨基酸可不同。也涵盖对所述PCSK9的等位基因形式表现出显著低的结合的抗原结合蛋白。因此，在某些实施方案中，任何上述实施方案都可与等位基因序列比较，而不仅是示于图1A中的野生型序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白对于变体PCSK9蛋白的结合显著降低，所述PCSK9蛋白变体中野生型PCSK9蛋白中的所选位置处的残基突变为任何其它残基。在某些实施方案中，将本文所述的精氨酸/谷氨酸置换用于确定位置。在某些实施方案中，丙氨酸用于确定位置。
如上所述，从扫描结果可确定直接参与结合或被抗原结合蛋白覆盖的残基。因此这些残基可提供SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:303或SEQID NO:3)的以下结构域或区的标示：所述结构域或区含有抗原结合蛋白所结合的结合区。如在实施例39所概述的结果中所观察到的，在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的结构域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303中的207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的162、164、167、207和/或208。在某些实施方案中，不止一个(例如2、3、4或5个)被确定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在某些实施方案中，ABP与ABP21B12竞争。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有SEQ ID NO:1或SEQID NO:303的至少一个第185位氨基酸的区域。在某些实施方案中，ABP与ABP31H4竞争。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的439、513、538和/或539位氨基酸。在某些实施方案中，不止一个(例如2、3或4个)被确定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在某些实施方案中，ABP与ABP31A4竞争。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的区域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的123、129、311、313、337、132、351、390、和/或413位氨基酸。在某些实施方案中，不止一个(例如2、3、4、5、6、7、8或9个)被确定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在某些实施方案中，ABP与ABP12H11竞争。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合含有至少以下一个氨基酸的结构域：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303的582、519、521和/或554位氨基酸。在某些实施方案中，不止一个(例如2、3或4个)被确定的残基为由ABP结合的区域的一部分。在某些实施方案中，ABP与ABP3C4竞争。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303片段或全长序列内的前述区域。在其它实施方案中，抗原结合蛋白结合由这些区组成的多肽。提及“SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:303”意指这些的序列中的一个或两个都可被采用或有关。该短语不指仅应该采用一个。
如上所述，上述说明提及关于SEQ ID NO:1的特定氨基酸位置。然而，在整篇本说明书中，通常提及在SEQ ID NO:3中提供的第31位开始的Pro/Cat结构域。如下所述，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:303缺乏PCSK9的信号序列。因此，这些不同内容之间的任何比较都应该考虑到这种编号上的差异。具体而言，SEQ ID NO:1中的任何氨基酸位置将对应于SEQ ID NO:3中的蛋白的30个氨基酸后的氨基酸位置。例如，SEQ ID NO:1的207位对应于SEQID NO:3的237位(全长序列，在本说明书中通常所用的编号系统)。表39.6概述了关于SEQ ID NO:1(和/或SEQ ID NO:303)的上述位置怎样对应于SEQID NO:3(其包括信号序列)。因此，关于SEQ ID NO:1(和/或SEQ ID NO:303)所述的任何上述实施方案都通过标注的对应位置得到关于SEQ ID NO:3的阐述。
在某些实施方案中，ABP21B12结合包含162-167位残基(例如SEQ IDNO:1的残基D162-E167)的表位。在某些实施方案中，ABP12H11结合包含123-132位残基(例如SEQ ID NO:1的S123-T132)的表位。在某些实施方案中，ABP12H11结合包含311-313位残基(例如SEQ ID NO:1的A311-D313)的表位。在某些实施方案中，ABP可结合包含这些序列链中的任何一个的表位。
竞争性抗原结合蛋白
在另一方面，提供以下抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与结合本文所述表位的例述的抗体或功能片段之一竞争特异性结合PCSK9。所述抗原结合蛋白也可结合与本文例述的抗原结合蛋白之一相同的表位或重叠表位。预期与例述的抗原结合蛋白的相同表位竞争或结合的抗原结合蛋白及片段显示相似的功能特性。例述的抗原结合蛋白及片段包括上述那些，它们包括含重链和轻链、可变区结构域和表2和/或图2-3和15中包括的CDR的那些抗原结合蛋白及片段。因此，作为特别的实例，提供的抗原结合蛋白包括与具有以下部分的抗体或抗原结合蛋白竞争的那些抗原结合蛋白：
(a)关于图2-3和15中所列举的抗体所列举的所有6个CDR；
(b)关于表2中所举列抗体的所列举的VH和VL；或
(c)如表2中所列举的抗体的规定的两条轻链和两条重链。
某些治疗用途及药物组合物
在某些情况下，PCSK9活性与多种人疾病状态相关。例如，在某些情况下，太高或太低的PCSK9活性都与某些病症(例如高胆固醇血症)相关。因此，在某些情况下，调节PCSK9活性可对治疗有用。在某些实施方案中，用针对PCSK9的中和抗原结合蛋白来调节至少一种PCSK9活性(例如结合LDLR)。所述方法可治疗和/或预防和/或降低与高血清胆固醇水平有关的疾病或其中高胆固醇水平有关的疾病的风险。
如本领域技术人员所了解，根据本发明，通过抗原结合蛋白的各种实施方案可解决涉及不同胆固醇、LDL或LDLR水平或与它们有关或可受它们影响的疾病。在某些实施方案中，“胆固醇相关疾病”(其包括“血清胆固醇相关疾病”)包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠心病、中风、心血管病、阿尔茨海默氏病和一般的血脂障碍，它们可由例如高的总血清胆固醇、高LDL、高甘油三酯、高VLDL和/或低HDL来表明。可用ABP单独或与一种或多种其它药物联合治疗的原发性及继发性血脂障碍的某些非限制性实例包括：代谢综合征；糖尿病；家族性混合型高脂血症；家族性高甘油三酯血症；家族性高胆固醇血症，包括杂合高胆固醇血症、纯合高胆固醇血症；家族性载脂蛋白B-100缺陷症；多基因性高胆固醇血症；残粒移去障碍病(remnant removal disease)；肝脂酶缺乏症；继发于任何以下事物的血脂障碍：乱食(dietary indiscretion)、甲状腺功能减退症、包括雌激素和孕酮治疗、β-受体阻滞药和噻嗪类利尿药等药物；肾病综合征、慢性肾衰竭、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、糖原贮积病、肝细胞瘤、胆汁郁积、肢端肥大症、胰岛瘤、单纯性生长激素缺乏症和酒精诱导的高甘油三酯血症。也可将ABP用于预防或治疗动脉粥样硬化病，例如冠心病、冠状动脉病、外周动脉病、中风(缺血性和出血性中风)、心绞痛或脑血管病和急性冠状动脉综合征、心肌梗塞。在某些实施方案中，ABP用于降低以下风险：非致命心脏病发作、致命和非致命性中风、某些类型的心脏手术、心力衰竭住院治疗、心脏病患者胸痛和/或已确诊的心脏病(例如心脏病发作前、心脏手术前)引起的心血管事件和/或有动脉阻塞证据的胸痛。在某些实施方案中，所述ABP和方法可用于降低心血管事件复发的风险。
如本领域技术人员所了解，通常可通过使用他汀(statin)类解决(治疗或预防)的疾病或病况也可从本发明抗原结合蛋白的应用中获益。另外，在某些实施方案中，可从防止胆固醇合成或提高LDLR表达中获益的病况或疾病也可通过抗原结合蛋白的各种实施方案来治疗。另外，如本领域技术人员所了解，使用抗PCSK9抗体在治疗糖尿病方面可能尤其有用。不仅仅因糖尿病是冠心病的风险因子，而且胰岛素增加PCSK9的表达。也就是说，患有糖尿病的人具有高血浆脂类水平(其可与高PCSK9水平有关)，并可从降低这些水平中获益。这一点概括性地在Costet等(“Hepatic PCSK9Expression is Regulated byNutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein 1C(通过营养状态经由胰岛素及固醇调节元件结合蛋白1C来调节肝脏PCSK9表达)”,J.Biol.Chem.,281:6211-6218,2006)中详细阐述，其整体在此引作参考。
在某些实施方案中，为了将其血清胆固醇水平降低到较为安全的范围内，将抗原结合蛋白给予患有如下疾病的患者：糖尿病、腹主动脉瘤、动脉粥样硬化和/或外周血管病。在某些实施方案中，将抗原结合蛋白给予处于发展任何本文所述疾病风险中的患者。在某些实施方案中，将ABP给予吸烟、患有高血压或有早期心脏病发作家族史性的对象。
在某些实施方案中，如果受治疗者按照2004NCEP治疗目标处于中等风险或中高风险中，则给予其ABP。在某些实施方案中，如果受治疗者的LDL胆固醇水平大于160mg/dl，则给予其ABP。在某些实施方案中，如果受治疗者的LDL胆固醇水平大于130(并按照2004NCEP治疗目标处于中等风险或较高风险中)，则给予其ABP。在某些实施方案中，如果受治疗者的LDL胆固醇水平大于100(并按照2004NCEP治疗目标处于高风险或极高风险中)，则给予其ABP。
医生将能根据对具体患者的个体概况来选择合适的治疗适应症和目标脂类水平。用于指导治疗高血脂的一个公认的标准是美国国家胆固醇教育计划(NCEP)专家组第三次报告关于检测、评估和治疗成人高血液胆固醇(成人治疗第III组)的最后报告，National Institutes of Health,NIH Publication No.02-5215(2002)，印刷发行的出版物以其整体在此引作参考。
在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白用于使PCSK9活性的量从异常高水平或甚至正常水平降低。在某些实施方案中，将针对PCSK9的抗原结合蛋白用于治疗或预防高胆固醇血症，和/或由此用于制备药物，和/或用于其它胆固醇相关疾病(例如本文所述疾病)。在某些实施方案中，将针对PCSK9的抗原结合蛋白用于治疗或预防其中PCSK9活性正常的诸如高胆固醇血症等病症。在所述病症中，例如将PCSK9活性降低到正常以下可提供治疗效果。
在某些实施方案中，将不止一种针对PCSK9的抗原结合蛋白用于调节PCSK9活性。
在某些实施方案中，提供治疗胆固醇相关疾病(例如高胆固醇血症)的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种针对PCSK9的抗原结合蛋白和另外的治疗药物。
在某些实施方案中，单独给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，在给予至少一种其它治疗药物之前给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，与给予至少一种其它治疗药物并行给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，给予至少一种其它治疗药物随后给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。在其它实施方案中，在给予至少一种其它治疗药物之前给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。治疗药物(除抗原结合蛋白以外的治疗药物)包括但不限于至少一种降低胆固醇(血清和/或总身体胆固醇)的其它药物或药物。在某些实施方案中，业已观察到的是，提高LDLR表达的所述药物能提高血清HDL水平、降低LDL水平或降低甘油三酯水平。例示性药物包括但不限于他汀类(阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他丁、罗苏伐他汀、辛伐他汀)、烟酸(Niacin)(NIACOR,NIASPAN(缓慢释放的烟酸)、SLO-NIACIN(缓慢释放的烟酸))、纤维酸(LOPID(吉非贝齐(gemfibrozil))、TRICOR(非诺贝特(fenofibrate))、胆汁酸螯合剂(QUESTRAN(消胆胺(cholestyramine))、考来维仑(colesevelam)(WELCHOL)、COLESTID(考来替泊(colestipol))、胆固醇吸收抑制剂(ZETIA(衣泽麦布(ezetimibe)))、烟酸与他汀组合(ADVICOR(洛伐他汀和NIASPAN)、他汀与吸收抑制剂组合(VYTORIN(ZOCOR和ZETIA)和/或脂质改性剂。在某些实施方案中，ABP与以下药物组合：PPARγ激动剂、PPARα/γ激动剂、角鲨烯合酶抑制剂、CETP抑制剂、抗高血压药物、抗糖尿病药物(例如磺酰脲类、胰岛素、GLP-1类似物、DDPIV抑制剂)、ApoB调节剂、MTP抑制剂和/或闭塞性动脉硬化症治疗。在某些实施方案中，ABP与提高受治疗者中LDLR蛋白水平的药物联合，所述药物例如他汀类、诸如制瘤素M等某些细胞因子、雌激素和/或某些诸如黄连素(berberine)等草药成分。在某些实施方案中，ABP与提高受治疗者血清胆固醇水平的药物(例如某些抗精神病药、某些HIV蛋白酶抑制剂、饮食因素例如高果糖、蔗糖、胆固醇或某些脂肪酸和某些核受体激动剂和RXR、RAR、LXR、FXR的拮抗剂)组合。在某些实施方案中，ABP与提高受治疗者PCSK9水平的药物组合，所述药物例如他汀和/或胰岛素。两种药物组合可使得不需要的其它药物的副作用得到ABP的减缓。如本领域技术人员所了解，在某些实施方案中，ABP与其它药物/化合物组合。在某些实施方案中，ABP与其它药物并行给予。在某些实施方案中，ABP和其它药物不同时给予，且在给予所述药物之前或之后给予ABP。在某些实施方案中，受治疗者在同一预防时期、和/或疾病发生、治疗时期接受ABP和其它药物(提高LDLR水平)二者。
本发明药物组合物可在联合疗法(即与其它药物组合)中给予。在某些实施方案中，联合疗法包含能够结合PCSK9的抗原结合蛋白与至少一种抗胆固醇药物的组合。所述药物包括但不限于在体外合成制备的化学组合物、抗体、抗原结合区及其组合和缀合物。在某些实施方案中，药物可作为激动剂、拮抗剂、别构调节剂或毒素起作用。在某些实施方案中，药物可发挥抑制或刺激其靶标作用(例如受体或酶激活或抑制)，并因此促使LDLR表达提高或降低血清胆固醇水平。
在某些实施方案中，可在用降低胆固醇(血清胆固醇和/或总胆固醇)的药物治疗之前、同时及随后给予针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可预防性给予针对PCSK9的抗原结合蛋白以防止或减轻高胆固醇血症、心脏病、糖尿病和/或任何胆固醇相关疾病的发作。在某些实施方案中，可给予针对PCSK9的抗原结合蛋白来治疗已有的高胆固醇血症病症。在某些实施方案中，ABP延迟与所述疾病有关的病况和/或症状的发作。在某些实施方案中，将ABP提供给缺乏胆固醇相关疾病的任何一种或其子集的任何症状的受治疗者。
在某些实施方案中，与特定治疗药物一起使用的针对PCSK9的抗原结合蛋白以治疗各种胆固醇相关疾病(例如高胆固醇血症)。在某些实施方案中，鉴于病症及所期需的治疗水平可给予两种、三种或多种药物。在某些实施方案中，可通过包含在同一制剂中一起给予所述药物。在某些实施方案中，可通过包含在同一制剂中一起给予所述一种或多种药物及针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可分开调配所述药物，并通过包含在治疗药盒中一起提供。在某些实施方案中，可分开调配所述药物和针对PCSK9的抗原结合蛋白，并通过包含在治疗药盒中一起提供。在某些实施方案中，可分开提供所述药物。在某些实施方案中，当通过基因疗法给予时，编码蛋白药物和/或针对PCSK9的抗原结合蛋白的基因可包含在同一载体中。在某些实施方案中，编码蛋白药物和/或针对PCSK9的抗原结合蛋白的基因可在同一启动子区的调控下。在某些实施方案中，编码蛋白药物和/或针对PCSK9的抗原结合蛋白的基因可在分开的载体中。
在某些实施方案中，本发明提供包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或助剂的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含针对PCSK9的抗原结合蛋白和治疗有效量的至少一种另外的治疗药物连同可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或助剂。
在某些实施方案中，可一起使用针对PCSK9的抗原结合蛋白与至少一种用于炎症的治疗药物。在某些实施方案中，可一起使用针对PCSK9的抗原结合蛋白和至少一种用于免疫病的治疗药物。用于炎症和免疫病的例示性治疗药物包括但不限于：38kDa的促分裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的环加氧酶1型(COX-1)和环加氧酶2型(COX-2)抑制剂小分子调节剂；参与炎症途径的细胞内分子的小分子调节剂，其中所述胞内分子包括但不限于jnk、IKK、NF-κB、ZAP70和lck。用于炎症的某些例示性治疗药物阐述于例如C.A.Dinarello&L.L.Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines inRheumatoid Arthritis:A Primer for Clinicians(风湿性关节炎中的前炎性及抗炎性细胞因子：临床医生入门)，第三版(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks,CA中。
在某些实施方案中，药物组合物将包含不止一种不同的针对PCSK9的抗原结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物将包含不止一种针对PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述针对PCSK9的抗原结合蛋白结合不止一个表位。在某些实施方案中，各种抗原结合蛋白彼此将不竞争结合PCSK9。在某些实施方案中，表2和图2和/或3中所述的任何抗原结合蛋白可在药物组合物中联合。
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施方案中，一种或多种制剂材料用于皮下和/或静脉内给药。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改性、维持或保存组合物的以下性质的制剂材料：例如pH、渗透压、粘度、清澈度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、分解或释放速率、吸收或渗透。在某些实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟基丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其它糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；盐形成反离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、双氯苯双胍己烷、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；助悬剂；表面活性剂或湿润剂(例如聚氧丙烯(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、曲通(triton)、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨醇)；渗透压增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂和/或药物助剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),第18版，A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company(1995))。在某些实施方案中，制剂包含PBS；20mM NaOAC、pH5.2、50mM NaCl；和/或10mM NAOAC、pH5.2、9％蔗糖。
在某些实施方案中，针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或治疗分子与本领域已知的半衰期延长溶媒连接。所述溶媒包括但不限于聚乙二醇、糖原(例如糖基化的ABP)和葡聚糖。所述溶媒阐述于例如美国申请顺序号09/428,082(现在为美国专利第6,660,843号)和公布的PCT申请号WO99/25044中，它们为任何目的在此引作参考。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预定的给药途径、递送方式和所需剂量来确定。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，见上述。在某些实施方案中，所述组合物可影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方案中，药物组合物中的主要溶媒或载体可以在性质上为水性或非水性。例如，在某些实施方案中，合适的溶媒或载体可为注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液，其可能补充在用于胃肠外给药的组合物中常见的其它物质。在某些实施方案中，盐水包含等渗磷酸盐缓冲的盐水。在某些实施方案中，中性缓冲的盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的例示性溶媒。在某些实施方案中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，它们可进一步包括山梨醇或为此合适的替代品。在某些实施方案中，可通过让具有所需纯度的所选择的组合物与任选制剂物质(Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，见上述)混合，来制备用于贮存的呈冻干饼或水溶液形式的包含针对PCSK9的抗原结合蛋白及含或不含至少一种另外的治疗药物的组合物。此外，在某些实施方案中，可用合适的赋形剂例如蔗糖，将包含针对PCSK9的抗原结合蛋白及含或不含至少一种另外的治疗药物的组合物调配成冻干剂。
在某些实施方案中，可选择药物组合物用于胃肠外递送。在某些实施方案中，可选择组合物用于吸入或用于通过消化道例如经口递送。所述可药用组合物的制备在本领域技术人员能力范围内。
在某些实施方案中，制剂组分以给药位点可接受的浓度存在。在某些实施方案中，用缓冲液来维持组合物的生理pH或稍低的pH，通常在约5-约8的pH范围内。
在某些实施方案中，当涵盖胃肠外给药时，治疗组合物可呈无热原、胃肠外可接受的水溶液形式，并且在可药用溶媒中包含所期需的针对PCSK9的抗原结合蛋白，含或不含另外的治疗药物。在某些实施方案中，用于胃肠外注射的溶媒为无菌蒸馏水，其中将针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不含至少一种另外的治疗药物调配为无菌等渗适当防腐的溶液。在某些实施方案中，制备可涉及用试剂调配所需的分子，所述试剂为例如可注射微球体、可生物侵蚀的粒子、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体，它们可提供控释或缓释产品，由此可经由长效注射剂给予。在某些实施方案中，还可使用透明质酸，透明质酸可具有延长循环持续时间的作用。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置来导入所需分子。
在某些实施方案中，可调配药物组合物用于吸入。在某些实施方案中，可将针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不含至少一种另外的治疗药物调配为干粉用于吸入。在某些实施方案中，可用抛射剂调配包含针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不含至少一种另外的治疗药物的吸入溶液用于气雾剂给药。在某些实施方案中，可使溶液雾化。肺部给药进一步阐述于PCT申请号PCT/US94/001875中，该文献阐述化学修饰的蛋白的肺部给药。
在某些实施方案中，涵盖经口给予制剂。在某些实施方案中，以该方式给予的针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不含至少一种另外的治疗药物，可与或不与在混合固态剂型(例如片剂及胶囊剂)中常规使用的载体一起调配。在某些实施方案中，可将胶囊设计为在胃肠道的某处释放制剂的活性部分，此时其生物利用度最大而系统降解之前的降解最小。在某些实施方案中，可包括至少一种另外的药剂以促进针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或任何另外的治疗药物的吸收。在某些实施方案中，还可采用稀释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
在某些实施方案中，药物组合物可包含与适于制备片剂的无毒赋形剂混合的有效量的针对PCSK9的抗原结合蛋白连同或不含至少一种另外的治疗药物。在某些实施方案中，可通过将药片溶解在无菌水或另一合适的溶媒中，来制备单位剂量形式的溶液。在某些实施方案中，合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，例如淀粉、白明胶或阿拉伯树胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
另外的药物组合物对本领域技术人员将显而易见，包括包含针对PCSK9的抗原结合蛋白、含或不含至少一种另外的治疗药物的制剂，它们为缓释制剂或控释制剂。在某些实施方案中，用于调配多种其它缓释或控释手段的技术也为本领域技术人员所知，所述缓释或控释手段有例如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔性珠粒和长效注射剂。参见例如PCT申请号PCT/US93/00829，其阐述用于递送药物组合物的控释多孔性聚合微粒。在某些实施方案中，缓释制剂可包括呈诸如膜或微胶囊等有形物品形式的半透性的聚合物基质。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(U.S.3,773,919和EP058,481)、L-谷氨酸/L-谷氨酸γ乙酯共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等，上述)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。在某些实施方案中，缓释组合物还可包括脂质体，所述脂质体可通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制备。参见例如Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；EP036,676；EP088,046和EP143,949。
可用于在体内给药的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可通过无菌过滤膜过滤来完成。在某些实施方案中，当组合物为冻干组合物时，可在冻干前或冻干后及复溶时用该方法除菌。在某些实施方案中，用于胃肠外给予的组合物可以以冻干形式或在溶液中贮存。在某些实施方案中，通常将胃肠外组合物置于具有无菌进口的容器(例如置于静脉内溶液袋)中或具有可由皮下注射针刺入的瓶塞的小瓶中。
在某些实施方案中，当调配药物组合物后，其可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉贮存在无菌小瓶中。在某些实施方案中，所述制剂可以以随时可用的形式或在给药前复溶的形式(例如冻干)贮存。
在某些实施方案中，提供用于形成单剂量给药单元的药盒。在某些实施方案中，药盒可含有具有干蛋白的第一容器及具有水制剂的第二容器二者。在某些实施方案中，包括含有单室和多室预装填注射器(例如液体注射器和液溶胶注射器(lyosyringes))的药盒。
在某些实施方案中，待治疗使用的包含针对PCSK9的抗原结合蛋白、含或不含至少一种另外治疗药物的有效量的药物组合物，将视例如治疗背景及目标而定。因此，本领域技术人员应了解，根据某些实施方案，用于治疗的合适的剂量水平将部分视以下情况而变化：被递送的分子、针对PCSK9的抗原结合蛋白及含或不含至少一种另外的治疗药物所用于的适应症、给药途径和患者的大小(体重、体表面或器官大小)和/或身体状况(年龄及一般健康状况)。在某些实施方案中，临床医生可滴定(titer)剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。在某些实施方案中，典型剂量可介于约0.1μg/kg-至多约100mg/kg或更多的范围内，视上述因素而定。在某些实施方案中，剂量可介于0.1μg/kg-至多约100mg/kg；或1μg/kg-至多约100mg/kg；或5μg/kg-至多约100mg/kg的范围内。
在某些实施方案中，给药频率将考虑制剂中所用的针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或任何另外的治疗药物的药代动力学参数。在某些实施方案中，临床医生将给予组合物直到剂量达到实现所需效果的剂量。因此，在某些实施方案中，组合物可作为单次剂量或两次或多次剂量(其可含有或可不含有同样量的所需分子)随时间给予，或经由植入装置或导管连续输注。合适剂量的进一步细化由本领域一般技术人员常规地进行，并且属于他们的日常工作范围。在某些实施方案中，可通过使用合适的剂量-反应数据来确定合适的剂量。在某些实施方案中，给药量和频率可考虑要获得的所需胆固醇水平(血清胆固醇水平和/或总胆固醇水平)及受治疗者中存在的胆固醇水平、LDL水平和/或LDLR水平，它们都可由本领域技术人员所熟知的方法来获得。
在某些实施方案中，药物组合物的给药途径与已知方法一致，例如：经口；通过静脉内、腹膜内、大脑内(内部实质)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过缓释系统或通过植入装置。在某些实施方案中，可通过静脉推注或通过连续输注或通过植入装置给予组合物。
在某些实施方案中，经由将需要被吸收或封装的分子植入到膜、海绵或另外合适材料来经口给予组合物。在某些实施方案中，当使用植入装置时，可将该装置植入到任何合适的组织或器官，并可经由扩散、定时释放药丸或连续给药来递送所需的分子。
在某些实施方案中，可能需要以离体方式使用包含针对PCSK9的抗原结合蛋白及含或不含至少一种另外的治疗药物的药物组合物。在所述情况下，让从患者移出的细胞、组织和/或器官与包含针对PCSK9的抗原结合蛋白及含或不含至少一种另外的治疗药物的药物组合物接触，此后接着将所述细胞、组织和/或器官移植回患者中。
在某些实施方案中，可通过移植某些细胞来递送针对PCSK9的抗原结合蛋白和/或任何另外的治疗药物，所述细胞业已用诸如本文所述方法经过遗传工程改造以表达和分泌所述多肽。在某些实施方案中，所述细胞可为动物或人细胞，并可为自体同源、异源或异种。在某些实施方案中，细胞可为永生化细胞。在某些实施方案中，为了降低免疫应答发生的可能性，可包封细胞以避免渗透到周围组织。在某些实施方案中，包封材料通常为可生物相容、半渗透的聚合封装物或膜，以使蛋白产物释放但防止由患者的免疫系统或由来自周围组织的其它有害因素破坏细胞。
基于ABP显著中和PCSK9活性的能力(如以下实施例所证明)，这些ABP将在治疗和预防因PCSK9-介导的活性引起的症状和病症(例如高胆固醇血症)中有治疗效果。
诊断应用
在某些实施方案中，ABP用作诊断工具。ABP可用于测定在样品和/或受治疗者中存在的PCSK9的量。如本领域技术人员所了解，所述ABP不必中和ABP。在某些实施方案中，诊断性ABP不是中和ABP。在某些实施方案中，诊断性ABP结合不同于中和ABP所结合的表位。在某些实施方案中，两种ABP彼此不竞争。
在某些实施方案中，为了筛选/诊断与PCSK9水平变化有关的疾病或病况，在用于检测哺乳动物组织或细胞的PCSK9的检测药盒和/或方法中使用或提供本文公开的ABP。所述药盒包含结合PCSK9的ABP和用于指示ABP与PCSK9结合情况(如果存在的话)及任选的PCSK9蛋白水平的工具。可使用用于指示ABP存在情况的各种工具。例如，可将荧光团、其它分子探针或酶连接到ABP，并且可以以多种方式观察ABP的存在情况。用于筛选所述疾病的方法可涉及药盒的使用，或仅使用所公开的ABP之一，并涉及测定样品中ABP与PCSK9是否结合。如本领域技术人员所了解，高或提高的PCSK9水平将导致较大量的ABP与样品中的PCSK9结合。因此，可将ABP结合程度用于测定样品中有多少PCSK9。具有大于预定量(例如没有PCSK9相关疾病的人应具有的量或范围)的PCSK9量的受治疗者或样品可表征为具有PCSK9介导的疾病。在某些实施方案中，为了测定他汀是否提高受治疗者PCSK9的量，将ABP给予服用他汀的受治疗者。
在某些实施方案中，ABP为非中和的ABP，并用于测定接受ABP和/或他汀治疗的受治疗者的PCSK9量。
实施例
提供以下实施例(包括所进行的实验和所获得的结果)仅用于阐明目的，不能理解为限制本发明。
实施例1
免疫和滴定
抗PCSK9抗体和杂交瘤的产生
在小鼠(Abgenix,Fremont,CA)中诱导PCSK9成熟形式的抗体(如图1A中的序列所述，且下划线为前域)，小鼠为含有人免疫球蛋白基因的小鼠。用第1组和第2组两组小鼠产生针对PCSK9的抗体。第1组包括品系XMG2-KL小鼠，其产生全人IgG2κ及IgG2λ抗体。用人PCSK9免疫接种第1组小鼠。用标准重组技术用GenBank序列作为参考(NM_174936)制备PCSK9。第2组涉及品系XMG4-KL小鼠，其产生全人IgG4κ及IgG4λ抗体。第2组小鼠也用人PCSK9免疫接种。
两组小鼠都按照表3的时间表用抗原注射11次。在初次免疫中，每只小鼠注射总共10μg的抗原，经腹膜内递送到腹部。随后的加强免疫接种为5ug剂量，注射方法为在腹膜内注射至腹部与皮下注射到尾底部之间交错。对于腹膜内注射，用Gold(Sigma,Cat#T2684)将抗原制备为乳剂；对于皮下注射，抗原与明矾(磷酸铝)和CpG寡聚物混合。在第2次到第8次及第10次注射时，每只小鼠注射总量5μg的存于明矾凝胶佐剂中的抗原。每只小鼠最后注射的5μg抗原在磷酸盐缓冲的盐水中递送，递送到2个位点，50％经腹膜内(IP)递送到腹部，50％皮下(SQ)注射到尾底部。免疫程序概述于以下所示表3中。
表3
用于滴定XenoMouse动物的方案如下：用中性链亲和素(neutravadin)8ug/ml(50ul/孔)包被Costar3368中结合力板，并在1XPBS/0.05％叠氮化物中于4℃下过夜孵育。用TiterTek以反渗透纯水对其进行3轮洗涤。用250ul的1XPBS/1％牛奶封闭所述板，并在室温下孵育至少30分钟。用TiterTek以反渗透纯水进行3轮洗涤洗掉封闭液。然后在50ul/孔的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+(测定稀释液)中捕获2ug/mlb-人PCSK9，并在室温孵育1小时。然后用TiterTek以反渗透纯水进行3轮洗涤。对于第一抗体，血清从1:100以一式二份1:3滴定。这在50ul/孔测定稀释液中进行，并在室温下孵育1小时。然后用TiterTek以反渗透纯水进行3轮洗涤。第二抗体为50ul/孔测定稀释液中的400ng/ml羊抗人IgG Fc HRP。让其在室温下孵育1小时。然后用TiterTek以反渗透纯水进行3轮洗涤，用纸巾拍干。对于底物，使用一步TMB溶液(Neogen,Lexington,Kentucky)(50ul/孔)，并让其在室温显色30分钟。
接着在ELISA测定中的方案如下：对于包含b-PCSK9且无V5His标签的样品采用以下方案：采用Costar3368中结合板(Corning Life Sciences)。用含8μg/ml中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板(50μl/孔)。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTekM384板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用250μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用M384板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。捕获物为b-huPCSK9，不含V5标签，以2μg/ml加入到1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+(40μl/孔)中。然后让板在室温下孵育1小时。进行3轮洗涤。血清从1:100以一式二份1:3滴定，H排为血清空白。在测定稀释液中以50μl/孔的体积进行滴定。让板在室温下孵育1小时。接下来进行3轮洗涤。将1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中的羊抗人IgG Fc HRP以100ng/ml(1:4000)加入板中(50μl/孔)，并在室温下孵育1小时。用3轮洗涤再次洗涤板。然后用纸巾拍干板。最后，向板中加入1步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)(50μl/孔)，并在室温下30分钟后用1N盐酸(50μl/孔)淬灭。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。
检测结合PCSK9的板的阳性对照为可溶性LDL受体(R&DSystems,货号2148LD/CF)和多克隆兔抗PCSK9抗体(Caymen Chemical#10007185)，其在测定稀释液中从3μg/ml以一式二份1:3滴定。用羊抗LDLR(R&D Systems,货号AF2148)和兔抗羊IgGFcHRP以400ng/ml的浓度检测LDLR；用羊抗兔IgGFc以在测定稀释液中400ng/ml的浓度检测兔多克隆抗体。阴性对照为天然XMG2-KL和XMG4-KL血清，其在测定稀释液中从1:100以一式二份1:3滴定。
对于包含具有V5His标签的b-PCSK9的样品采用以下方案：采用Costar3368中结合板(Corning Life Sciences)。用含8μg/ml中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物(50μl/孔)包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTekM384板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用250μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用M384板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。捕获物为b-huPCSK9，含V5标签，以2μg/ml加入到1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+(40μl/孔)中。然后让板在室温下孵育1小时。进行3轮洗涤。血清从1:100以一式二份1:3滴定，H排为血清空白。在测定稀释液中以50μl/孔的体积进行滴定。让板在室温下孵育1小时。接下来用M384板洗涤器洗涤板进行3轮洗涤。将1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中的羊抗人IgGFcHRP以400ng/ml加入板中(50μl/孔)，并在室温下孵育1小时。用3轮洗涤再次洗涤板。然后用纸巾拍干板。最后，向板中加入1步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)(50μl/孔)，并在室温下30分钟后用1N盐酸(50μl/孔)淬灭所述板。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。
阳性对照为LDLR、兔抗PCSK9，其在测定稀释液中从3μg/ml以一式二份1:3滴定。用羊抗LDLR(R&DSystems,货号AF2148)和兔抗羊IgGFcHRP以400ng/ml的浓度检测LDLR；用羊抗兔IgG Fc在测定稀释液中以400ng/ml的浓度检测兔多克隆抗体。在测定稀释液中从1μg/ml以一式二份1:3滴定人抗His1.2,3和抗V51.7.1；二者都用羊抗人IgGFcHRP在测定稀释液中以400ng/ml的浓度检测。阴性对照为天然XMG2-KL和XMG4-KL血清，其在测定稀释液中从1:100以一式二份1:3滴定。
通过ELISA测定对用所述的可溶性抗原免疫接种的小鼠检测针对人PCSK9的抗体的滴度。表4概述了ELISA数据，并表明有某些小鼠似乎对PCSK9具有特异性。参见例如表4。因此，在免疫程序结束时，选择10只小鼠(表4中的粗体)用于收获，分别如本文所述从脾脏和淋巴结分离脾细胞和淋巴细胞。
表4
ELISA结果概述
实施例2
淋巴细胞回收、B细胞分离、杂交瘤的融合及产生
本实施例概述如何回收免疫细胞及如何产生杂交瘤。通过颈脱位法处死所挑选的经免疫接种的小鼠，收获引流的淋巴结并由各组合并淋巴结。通过在DMEM中磨碎以从组织释放细胞来从淋巴组织分离B细胞，将细胞悬浮于DMEM中。计数细胞，以每1亿淋巴细胞加入0.9mlDMEM到细胞团中让细胞缓慢但完全悬浮。
让淋巴细胞与购自ATCC(货号CRL1580)的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(Kearney等，(1979)J.Immunol.123、1548-1550)以1:4比例混合。通过以400xg离心4分钟让细胞混合物缓慢沉淀。滗出上清液后，用1ml移液枪轻轻混合细胞。经1分钟轻轻搅拌缓慢加入来自Sigma(货号P7306)的预热的PEG/DMSO溶液(每百万B细胞1ml)，接着混合1分钟。然后经2分钟加入预热的IDMEM(每百万B细胞2ml)(DMEM不含谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(pen/strep)、MEM非必需氨基酸(皆来自Invitrogen)，且轻轻搅拌。最后，经3分钟加入预热的IDMEM(每106B细胞8ml)。
经6分钟以400xg让融合细胞旋转沉降，以每百万B细胞重新悬浮于20ml选择培养基(DMEM(Invitrogen)、15％FBS(Hyclone)中，所述培养基补充L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、MEM非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-巯基乙醇(皆来自Invitrogen)、HA-重氮丝氨酸次黄嘌呤和OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(二者皆来自Sigma)和IL-6(Boehringer Mannheim))。让细胞在37℃下孵育20-30分钟，然后重新悬浮于200ml选择培养基，在铺到96孔板之前于T175培养瓶中培养3-4天。因此，产生了生产针对PCSK9的抗原结合蛋白的杂交瘤。
实施例3
PCSK9抗体的选择
本实施例概述了如何表征并选择各种PCSK9抗原结合蛋白。评估了分泌的抗体(由在实施例1和2中产生的杂交瘤中产生)与PCSK9的结合情况。抗体选择基于结合数据和PCSK9与LDLR结合的抑制及亲和力。如下所述通过ELISA分析与可溶性PCSK9的结合情况。用(表面等离子共振技术)定量测定结合亲和力。
初步筛选
进行了结合野生型PCSK9的抗体的初步筛选。在两种收获物中进行初步筛选。初步筛选包含ELISA测定，用以下方案进行：
采用Costar3702中结合384孔板(CorningLifeSciences)。用含4μg/ml浓度的中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物以40μl/孔的体积包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后洗涤所述板。再次进行3轮洗涤。捕获样品为生物素化-PCSK9，不含V5标签，将其以0.9μg/ml加入到体积为40μl/孔的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+。然后让板在室温下孵育1小时。接下来用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。将10μl上清液转移到40μl的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中，并在室温下孵育1.5小时。再用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。将40μl/孔含100ng/ml(1:4000)的浓度的羊抗人IgGFcPOD的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+加入板中，并在室温下孵育1小时。对板再次进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，在室温30分钟后用40μl/孔的1N盐酸进行淬灭。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。
初步筛选导致从两种收获物中鉴定出总共3104个抗原特异性杂交瘤。基于最高ELISAOD值，对每种收获物进一步选出1500个杂交瘤，总共3000个阳性。
确认筛选
然后根据对野生型PCSK9的结合情况重新筛选这3000个阳性，以确认建立了稳定的杂交瘤。筛选如下进行：采用Costar3702中结合384孔板(Corning Life Sciences)。用体积为40μl/孔的含3μg/ml中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用M384板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。捕获样品为b-PCSK9，不含V5标签，以0.9μg/ml将其加入到体积为40μl/孔的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中。然后让板在室温下孵育1小时。接下来对板进行3轮洗涤。将10μl上清液转移到40μl的1XPBS/1％牛奶/10mM Ca2+中，并在室温下孵育1.5小时。再用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。将40μl/孔含100ng/ml(1:4000)浓度的羊抗人IgG Fc POD的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+加入板中，并在室温下孵育所述板1小时。再次用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，并在室温下30分钟后用40μl/孔的1N盐酸淬灭。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。在第二次筛选中总共有2441个阳性重复。然后将这些抗体用于随后的筛选。
小鼠交叉反应性筛选
然后根据与小鼠PCSK9的交叉反应性对全体杂交瘤进行筛选，以确定抗体能结合人和小鼠PCSK9二者。在交叉反应性筛选中采用以下方案：采用Costar3702中结合384孔板(Corning Life Sciences)。用40μl/孔体积的含3μg/ml中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板。让板在4℃下过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。捕获样品为生物素化-小鼠PCSK9，将其以1μg/ml加入到体积为40μl/孔的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中。然后让板在室温下孵育1小时。接下来用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。将50μl上清液转移到板中，并在室温下孵育1小时。再对板进行3轮洗涤。将40μl/孔的含100ng/ml(1:4000)浓度的羊抗人IgG Fc POD的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+加入板中，并在室温下孵育所述板1小时。再次对所述板进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，在室温30分钟后用40μl/孔的1N盐酸淬灭板。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。观察到579个抗体与小鼠PCSK9起交叉反应。然后将这些抗体用于随后的筛选。
D374Y突变体结合筛选
业已证明了在人群中存在PCSK9的D374Y突变(例如Timms KM等，“Amutation in PCSK9causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utahpedigree(PCSK9突变引起犹他州家系中常染色体显性高胆固醇血症)”,Hum.Genet.114:349-353,2004)。为了确定抗体是仅特异性针对野生型或还与PCSK9的D374Y形式结合，随后根据与包含D374Y突变的PCSK9突变体序列的结合情况筛选样品。筛选方案如下：在筛选中采用Costar3702中结合384孔板(Corning Life Sciences)。用40μl/孔体积的含4μg/ml中性链亲和素的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。用含1μg/ml浓度的生物素化人PCSK9D374Y的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+包被板，在室温下孵育1小时。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。用PBS/牛奶/Ca2+以1:5稀释(10ml加40ml)晚期营养耗尽的杂交瘤培养物上清液，并在室温下孵育1小时。接下来，将40μl/孔的含1ug/ml兔抗人PCSK9(Cayman Chemical)和人抗His1.2.3(1:2)的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+滴定到板上，然后在室温下孵育1小时。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。将40μl/孔的含100ng/ml(1:4000)浓度的羊抗人IgGFc POD的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+加入板中，并在室温下孵育所述板1小时。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，在室温30分钟后用40μl/孔的1N盐酸淬灭板。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。超过96％对野生型PCSK9呈阳性的抗体也结合突变体PCSK9。
大规模受体配体封阻筛选
为了筛选封阻PCSK9与LDLR结合的抗体，开发了使用D374YPCSK9突变体的测定。将突变体用于该测定是因为其对LDLR具有较高的结合亲和力，这使得待开发的受体配体封阻测定更加灵敏。在受体配体封阻筛选中采用以下方案：在筛选中采用Costar3702中结合384孔板(Corning LifeSciences)。用40μl/孔体积的含2μg/ml羊抗LDLR(R&D货号AF2148)的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。捕获样品为LDLR(R&D,货号2148LD/CF)，将其以0.4μg/ml加入到体积为40μl/孔的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+。然后让板在室温下孵育1小时10分钟。同时，让20ng/ml的生物素化的人D374YPCSK9与15微升营养耗尽的杂交瘤上清液在Nunc聚丙烯板中孵育，以1:5稀释营养耗尽的上清液浓度。然后让板在室温预孵育约1小时30分钟。接下来，用TiterTek板洗涤器对板进行3轮洗涤。将50μl/孔预孵育的混合物转移到LDLR包被的ELISA板上，并在室温下孵育1小时。为了检测结合LDLR的b-PCSK9，将40μl/孔的含500ng/ml链霉抗生物素蛋白HRP的测定稀释液加到板中。让板在室温下孵育1小时。再用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，在室温30分钟后用40μl/孔的1N盐酸淬灭所述板。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。该筛选鉴定了384个充分封阻PCSK9与LDLR之间相互作用的抗体，100个强烈封阻(OD<0.3)所述相互作用的抗体。这些抗体抑制PCSK9与LDLR之间的结合作用大于90％(大于90％抑制)。
对封阻物子集(BlockerSubset)的受体配体结合测定
然后用突变酶对在第一次大规模受体配体抑制测定中鉴定的384个中和物的子集成员重复进行受体配体测定。在筛选384个封阻物子集成员测定中采用的方案与在大规模受体配体封阻筛选中所用的一样。这种重复筛选确证了初步筛选数据。
这种对384个子集成员的筛选鉴定了85个封闭PCSK9突变酶和LDLR之间相互作用大于90％的抗体。
结合野生型PCSK9但不结合D374Y突变体的封阻物的受体配体结合测定
在上述3000个初始组中有86个抗体显示对野生型PCSK9的特异性结合而不结合huPCSK9(D374Y)突变体。测试了上述这86个抗体封阻野生型PCSK9结合LDLR受体的能力。采用以下方案：在筛选中采用Costar3702中结合384孔板(CorningLifeSciences)。用40μl/孔的体积的含10μg/ml抗His1.2.3的1XPBS/0.05％叠氮化物包被板。让板在4℃过夜孵育。然后用TiterTek板洗涤器(Titertek,Huntsville,AL)洗涤板。进行3轮洗涤。用90μl的1XPBS/1％牛奶封闭板，并在室温下孵育大约30分钟。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。将LDLR(R&D,#2148LD/CF或R&DSystems,#2148LD)以5μg/ml加入到体积为40μl/孔的1XPBS/1％牛奶/10mM Ca2+中。然后让板在室温下孵育1小时。接下来，用TiterTek板洗涤器对所述板进行3轮洗涤。同时，让生物素化的人野生型PCSK9与营养耗尽的杂交瘤上清液在Nunc聚丙烯板中预孵育。将22μl杂交瘤上清液转移到33ul含583ng/ml浓度的b-PCSK9的1XPBS/1％牛奶/10mMCa2+中，得到最终b-PCSK9浓度＝350ng/ml，营养耗尽上清液最终稀释度为1:2.5。让板在室温预孵育大约1小时30分钟。将50μl/孔预孵育的混合物转移到捕获LDLR的ELISA板，并在室温下孵育1小时。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。将40μl/孔的含500ng/ml链霉抗生物素蛋白HRP的测定稀释液加到板中。让板在室温下孵育1小时。然后用TiterTek板洗涤器洗涤板。进行3轮洗涤。最后，向板中加入40μl/孔的一步TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)，在室温30分钟后用40μl/孔的1N盐酸淬灭板。立即用TiterTek板读数器在450nm处读取OD。
筛选结果
基于所述测定结果，将几个杂交瘤细胞系鉴定为产生具有所期需的与PCSK9相互作用的抗体。用有限稀释来从各细胞系分离易处理数量的克隆。克隆由杂交瘤细胞系编号(例如21B12)和克隆编号(例如21B12.1)来命名。一般而言，通过本文所述功能测定未检测到特定细胞系的不同的克隆之间有差异。在少数情况下，鉴定了在功能测定中行为有差异的特定细胞系的克隆，例如发现25A7.1不封阻PCSK9/LDLR但25A7.3(本文称为25A7)能起中和作用。让分离的克隆各自在50-100ml杂交瘤培养基中增殖，并使其生长到营养耗尽，(即小于约10％细胞存活)。通过ELISA并通过本文所述体外功能测试测定那些培养物上清液中的针对PCSK9的抗体的浓度和效能。作为本文所述筛选结果，鉴定了具有最高的针对PCSK9的抗体滴度的杂交瘤。所挑选的杂交瘤示于图2A-3D和表2中。
实施例4.1
由杂交瘤制备人31H4IgG4抗体
本实施例概述如何由杂交瘤细胞系制备抗原结合蛋白之一。所述制备使用50ml营养耗尽的上清液产生物(generation)，后接蛋白A纯化。Integra制备用于放大规模，在稍后进行。让杂交瘤细胞系31H4在T75培养瓶中于20ml培养基(Integra培养基，表5)中生长。当杂交瘤在T75培养瓶中几乎汇合时，将其转移到Integra培养瓶(IntegraBiosciences,IntegraCL1000，货号90005)。
Integra瓶为由膜分为两个室(小室和大室)的细胞培养瓶。将来自31H4杂交瘤细胞系的最小细胞密度为1x106个细胞/ml的20-30ml体积的杂交瘤细胞置于含Integra培养基(参见表5关于Integra培养基的组份)的Integra培养瓶的小室中。将Integra培养基单独(1L)置于Integra培养瓶的大室中。分开两室的膜可让小分子量的营养物质渗透，但杂交瘤细胞及由这些细胞产生的抗体不能渗透。因此，杂交瘤细胞及由这些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小室中。
1周后，从Integra培养瓶的两个室移走培养基，用新鲜Integra培养基置换。从小室收集的培养基单独保留。在生长第2周后，再次从小室收集培养基。让第1周从杂交瘤细胞系收集的培养基与第2周从杂交瘤细胞系收集的培养基合并。离心从杂交瘤细胞系收集得到的培养基样品以除去细胞和碎片(3000rpm，15分钟)，过滤得到的上清液(0.22um)。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过大量PBS洗涤除去非特异性结合。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(例如50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如Q琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法，除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于31H4蛋白的特异性IEX条件是在pH7.8-8.0的Q-琼脂糖凝胶HP。用10mM-500mM的NaCl梯度以25个柱体积洗脱抗体。
表5
培养基组成
INTEGRA培养基
HSFM
10％超低IgG血清
2mmol/LL-谷氨酰胺
1％NEAA
4g/L葡萄糖
实施例4.2
从转染的细胞制备重组31H4人IgG2抗体
本实施例概述了如何由转染的细胞制备31H4IgG2抗体。用编码31H4重链和轻链的质粒转染用于瞬时表达的293细胞和用于稳定表达的CHO细胞。通过除去细胞和细胞碎片从转染的细胞回收条件培养基。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过充分的PBS洗涤除去非特异性结合物。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(例如50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如Q琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于31H4蛋白的特异性IEX条件是在pH7.8-8.0的Q-琼脂糖凝胶HP。用10mM-500mM的NaCl梯度以25个柱体积洗脱抗体。
实施例5
由杂交瘤制备人21B12IgG4抗体
本实施例概述了如何由杂交瘤制备21B12IgG4抗体。让杂交瘤细胞系21B12在T75培养瓶中于培养基(Integra培养基，表5)中生长。当杂交瘤在T75培养瓶中几乎汇合时，将其转移到Integra培养瓶(IntegraBiosciences,IntegraCL1000，货号90005)中。
Integra培养瓶瓶为由膜分为两个室(小室和大室)的细胞培养瓶。将来自31H4杂交瘤细胞系的最小细胞密度为1x106个细胞/ml的20-30ml体积的杂交瘤细胞置于含Integra培养基(参见表5关于Integra培养基的组份)的Integra培养瓶的小室中。将Integra培养基(1L)单独置于Integra培养瓶的大室中。分开两室的膜可让小分子量的营养物质渗透，但杂交瘤细胞及由这些细胞产生的抗体不能渗透。因此，杂交瘤细胞及由这些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小室中。
1周后，从Integra培养瓶的两个室移走培养基，用新鲜Integra培养基置换。从小室收集的培养基单独保留。在生长第2周后，再次从小室收集培养基。让第1周从杂交瘤细胞系收集的培养基与第2周从杂交瘤细胞系收集的培养基合并。离心从杂交瘤细胞系收集得到的培养基样品以除去细胞和碎片(3000rpm，15分钟)，过滤得到的上清液(0.22um)。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过充分的PBS洗涤除去非特异性结合物。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(例如50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如Q琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于21B12蛋白的特异性IEX条件是在pH7.8-8.0的Q-琼脂糖凝胶HP。用10mM-500mM的NaCl梯度以25个柱体积洗脱抗体。
实施例6
由转染的细胞制备人21B12IgG2抗体
本实施例概述了如何由转染的细胞制备21B12IgG2抗体。用编码21B12重链和轻链的质粒转染细胞(用于瞬时表达的293细胞和用于稳定表达的CHO细胞)。通过除去细胞和细胞碎片从杂交瘤细胞回收条件培养基。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过充分PBS洗涤除去非特异性结合。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如SP-琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于21B12蛋白的特异性IEX条件是在pH5.2的SP-琼脂糖凝胶HP。用含20mM乙酸钠缓冲液中的10mM-500mM的NaCl梯度的25个柱体积的缓冲液洗脱抗体。
实施例7
由杂交瘤制备人16F12IgG4抗体
本实施例概述了如何由杂交瘤制备16F12IgG4抗体。让杂交瘤细胞系16F12在T75培养瓶中于培养基(参见表5)中生长。当杂交瘤在T75培养瓶中几乎汇合时，将其转移到Integra培养瓶(IntegraBiosciences,IntegraCL1000，货号90005)。
Integra瓶为由膜分为两个室(小室和大室)的细胞培养瓶。将来自31H4杂交瘤细胞系的最小细胞密度为1x106个细胞/ml的20-30ml体积的杂交瘤细胞置于含Integra培养基(参见表5关于Integra培养基的组份)的Integra培养瓶的小室中。将Integra培养基(1L)单独置于Integra培养瓶的大室中。分开两室的膜可让小分子量的营养物质渗透，但杂交瘤细胞及由这些细胞产生的抗体不能渗透。因此，杂交瘤细胞及由这些杂交瘤细胞产生的抗体保留在小室中。
1周后，从Integra培养瓶的两个室移走培养基，用新鲜Integra培养基置换。从小室收集的培养基单独保留。在生长第2周后，再次从小室收集培养基。让第1周从杂交瘤细胞系收集的培养基与第2周从杂交瘤细胞系收集的培养基合并。离心由杂交瘤细胞系收集得到培养基样品以除去细胞和碎片(3000rpm，15分钟)，过滤得到的上清液(0.22um)。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩，然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过充分的PBS洗涤除去非特异性结合物。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如Q琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于16F12蛋白的特异性IEX条件是在pH7.8-8.0的Q-琼脂糖凝胶HP。用10mM-500mM的NaCl梯度以25个柱体积洗脱抗体。
实施例8
由转染的细胞制备人16F12IgG2抗体
本实施例概述了如何由转染的细胞制备16F12IgG2抗体。用编码16F12重链和轻链的质粒转染细胞(用于瞬时表达的293细胞和用于稳定表达的CHO细胞)。通过除去细胞和细胞碎片从杂交瘤细胞回收条件培养基。将澄清的条件培养基装载到蛋白A-琼脂糖凝胶柱。任选地可先将培养基浓缩，然后装载到蛋白A琼脂糖凝胶柱。通过充分PBS洗涤除去非特异性结合。通过从蛋白A柱的标准酸性抗体洗脱(50mM柠檬酸盐，pH3.0)回收蛋白A柱上结合的抗体蛋白。通过大小排阻色谱法或在阴离子交换剂树脂(例如SP琼脂糖凝胶树脂)上的结合离子交换色谱法除去蛋白A琼脂糖凝胶合并物中聚集的抗体蛋白。对于16F12蛋白的特异性IEX条件是在pH5.2的SP-琼脂糖凝胶HP。用含有20mM乙酸钠缓冲液中的10mM-500mM的NaCl梯度的以25个柱体积的缓冲液洗脱抗体。
实施例9
抗体重链和轻链序列分析
然后通过Sanger(双脱氧法)核苷酸测序法测定以上抗体轻链和重链的核酸及氨基酸序列。然后可从核酸序列推断出氨基酸序列。可变结构域的核酸序列描述于图3E-3JJ中。
测定了31H4、21B12和16F12的λ轻链可变区的cDNA序列并分别示于SEQ ID NO:153、95和105中。
测定了31H4、21B12和16F12重链可变区的cDNA序列，并分别示于SEQID NO:152、94和104中。
λ轻链恒定区(SEQ ID NO:156)和IgG2和IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:154和155)示于图3KK中。
测定了从这些cDNA序列中每一个所预测的多肽序列。预测了31H4、21B12和16F12的λ轻链可变区的预测的多肽序列，并分别示于SEQ ID NO:12、23和35中，预测了31H4、21B12和16F12的λ轻链恒定区(SEQ ID NO:156)、重链可变区，并分别示于SEQ.IDNO.67、49和79中。IgG2和IgG4重链恒定区(SEQ ID NO:154和155)。
FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4分组示于图2A-3D中。
基于序列数据，测定了各重链或轻链可变区所来源的种系基因。在图2A-3D中紧邻相应杂交瘤细胞系的位置指示了种系基因的身份，每一个都由唯一的SEQ ID NO来表示。图2A-3D还描述了关于被表征的另外抗体的所测定的氨基酸序列。
实施例8
三种抗体的等电点测定
测定的基于氨基酸序列的抗体理论pI如下：对于16F12为7.36；对于21B12为8.47；而对于31H4为6.84。
实施例9
抗体与PCSK9结合的表征
业已鉴定了多种与PCSK9结合的抗体，采用几种方法来定量测定并进一步表征结合特性。在研究的一方面，实施了Biacore亲和力分析。在研究的另一方面，实施了亲和力分析。在这些研究中采用的样品和缓冲液示于下表6中。
表6
亲和力测量
按照厂商说明书对本实施例所述的针对PCSK9的21B12抗体进行(表面等离子共振技术装置，Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)亲和力分析。
简言之，用Biacore2000光生物传感器(Biacore,GEHealthcare,Piscataway,NJ)实施表面等离子共振技术实验。通过胺偶联以提供不超过200个共振单位(RU)的最大分析物结合反应(Rmax)的程度将每种单独的抗PCSK9抗体固定到研究级的CM5生物传感芯片。PCSK9蛋白浓度以2倍间隔变化(被分析物)，并且被注射到固定化的抗体表面(以100μl/分钟的流速经1.5分钟)。将补充0.01％BSA的新鲜HBS-P缓冲液(pH7.4、0.01MHepes、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P-20，Biacore)用作结合缓冲液。在单独的实验中测量针对人、小鼠和猕猴PCSK9蛋白中的每一种的每种抗PCSK9抗体在pH7.4下(所用浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125和0nM)的结合亲和力。
另外，也在pH6.0下以补充有0.01％BSA的pH6.0HBS-P缓冲液(pH6.0、0.01MHepes、0.15MNaCl、0.005％表面活性剂P-20，Biacore)测量针对人PCSK9抗体的结合亲和力。所获得的结合信号与溶液中的游离PCSK9成比例。用双曲线单边同类结合模型(dual-curve one-site homogeneous bindingmodel)(软件,Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)(对于6.0pH测定n＝1)从竞争曲线的非线性回归分析获得解离平衡常数(KD)。有趣的是，在较低pH下抗体似乎表现出更紧密的结合亲和力(此时对于31H4、21B12和16F12，Kd分别为12.5、7.3和29pM)。
用BIA评估3.1计算机程序(BIAcore,Inc.Piscataway,NJ)来测定包括ka(结合速率常数)、kd(解离速率常数)和KD(解离平衡常数)在内的抗体结合动力学参数。较低的解离平衡常数表明抗体对PCSK9的亲和力较大。由亲和力分析测定的KD值出示于如下所示的表7.1中。
表7.1
抗体 hPCSK9 猕猴PCSK9 mPCSK9
31H4 210pM 190pM 6nM
21B12 190pM 360pM 460nM
16F12 470pM 870pM 6.4nM
表7.2描述kon和koff速率。
表7.2
K on (M-1s-1) K off (s-1) K D
31H4.1、pH7.4 2.45e+5 5.348e-5 210pM
31H4.1、pH6 5.536e+6 6.936e-5 12.5pM
21B12.1、pH7.4 3.4918e+4 6.634e-6 190pM
21B12.1、pH6 2.291e+6 1.676e-5 7.3pM
16F12.1、pH7.4 1.064e+5 4.983e-5 470pM
16F12.1、pH6 2.392e+6 7.007e-5 29pM
亲和力测量
按照厂商说明书对16F12和31H4进行(Sapidyne Instruments,Inc.,Boise,ID)亲和力分析。简言之，用人、V5-标记的猕猴或His-标记的小鼠的PCSK9蛋白预包被Reacti-GelTM(6x)(Pierce)，并用BSA封闭。然后在室温下，以不同的PCSK9蛋白浓度(0.1pM–25nM)，让10或100pM的抗体16F12或抗体31H4任一种与PCSK9蛋白之一孵育8小时，随后使其通过PCSK9包被的珠粒。通过荧光(Cy5)标记的羊抗人IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch)定量测定结合珠粒的16F12或31H4的量。结合信号与结合平衡时的游离16F12或31H4浓度成比例。用单边同类结合模型(one-site homogeneous)从两套竞争曲线非线性回归获得平衡解离常数(KD)。在分析中采用Pro软件。在本分析中产生的结合曲线示于图4A-4F中。
16F12和31H4抗体二者对人和猕猴PCSK9都显示出相似亲和力，但与小鼠PCSK9的亲和力大约低10-250倍。在用系统所测的两种抗体中，抗体31H4对人和猕猴PCSK9分别以3和2pM的KD显示较高的亲和力。16F12显示稍弱的亲和力，对人PCSK9为15pMKD，而对猕猴PCSK9为16pMKD。
亲和力分析结果概述于如下所示的表8.1中。
表8.1
另外，进行了SDSPAGE以检查样品的品质和量，并示于图5A中。在凝胶上显示cPCSK9减少大约50％，从测定计算的活性结合浓度亦如此。因此，将针对cPCSK9的mAb的KD调整为目前活性cPCSK9的50％。
用BIAcore溶液平衡结合测定来测量ABP21B12的Kd值。用KinExA测定21B12.1几乎不显示信号，因此，采用biacore溶液平衡测定。因为在抗体与固定化的PCSK9表面结合方面未观察到显著结合，所以用胺偶联以大约7000RU密度在CM5芯片的流式细胞(flow cell)4上固定21B12抗体。将流式细胞3用作背景对照。在PBS加0.1mg/mlBSA、0.005％P20中让0.3、1和3nM的人PCSK9或猕猴PCSK9与系列稀释的21B12.1抗体样品(介于0.001～25nM范围)混合。通过在21B12.1抗体表面注射来测量混合溶液中游离的PCSK9的结合情况。在溶液中缺乏mAb情况下测定21B12.1表面的100％PCSK9结合信号。随着mAb浓度增加而PCSK9结合反应降低表明溶液中PCSK9结合mAb，这封阻了PCSK9与固定化的肽体表面结合。PCSK9结合信号对mAb浓度作图，在KinExAProTM软件中用单边同类结合模型从3组曲线(0.3、1和3nM固定的PCSK9浓度)计算KD。尽管从KinExA测定和SDS-凝胶中观察到cPCSK9具有较低的蛋白浓度，但在此处不调整其浓度，因为cPCSK9浓度不用于计算KD。结果示于下表8.2和图5B-5D中。图5B描述了在三种不同的hPCSK9浓度下对于hPCSK9的溶液平衡测定结果。图5C描述了对于mPCSK9的相似的一组结果。图5D描述来自上述biacore捕获测定的结果。
表8.2
实施例10
表位分库(binning)
将竞争ELISA用于抗PCSK9抗体分库。简言之，为了测定两种抗体是否属于同一表位库(epitopebin)，首先将抗体之一(mAb1)以2μg/ml过夜孵育包被到ELISA板(NUNC)上。然后洗涤板，用3％BSA封闭。同时，让30ng/ml的生物素化hPCSK9与所述第二种抗体(mAb2)在室温下孵育2小时。将该混合物用于包被mAb1，并在室温下孵育1小时。然后洗涤ELISA板，并与中性链亲和素(Neutravidin)-HRP(Pierce)以1:5000稀释度孵育1小时。在再次洗涤后，让板与TMB底物孵育，用TiterTek板读数器在650nm处检测信号。将具有相同结合概况的抗体分组为同一个表位库。将抗体分库研究的结果示于表8.3中。
表8.3
克隆 库
21B12.2 1
31H4 3
20D10 1
25A7.1 2
25A7.3 1
23G1 1
26H5 1
31D1 1
16F12 3
28D6 3
27A6 3
31G11 3
27B2 ND
28B12 3
22E2 3
1A12.2 1
3B6 1
3C4 4
9C9 1
9H6 1
13B5 6
13H1 7
17C2 1
19H9.2 1
23B5 1
25G4 1
26E10 1
27E7 1
27H5 1
30A4 1
30B9 1
31A4 5
31B12 5
用BIAcore实施另外的表位分库检查。将三种mAb(16F12、21B12和31H4)以大约8000RU的密度固定到流式细胞2、3和4上。将来自人、小鼠和猕猴的5nMPCSK9注射到mAb表面上以达到大约100-500RU。然后将10nMmAb注射到PCSK9表面。然后记录三种mAb与三种mAb上的三种不同的PCSK9蛋白的结合情况。
如果两种mAb在抗原上具有相似的表位，则mAb1将不显示与已经结合mAb2的抗原结合。如果两种mAb具有抗原上的不同表位，则mAb1将显示与已结合mAb2的抗原结合。图5E以图表形式描述三种mAb对人PCSk9的这些表位分库结果。对于mPCSK9和cPCSK9观察到相似的模式。如图表所示，16F12和31H4似乎具有相似表位，而21B12似乎具有不同的表位。
实施例11
用于封阻D374YPCSK9/LDLR结合的31H4和21B12的效能
本实施例提供两种抗体在封阻PCSK9D374Y结合LDLR能力上的IC50值。用在缓冲液A(100mM卡可基酸钠、pH7.4)中稀释的2微克/ml羊抗LDL受体抗体(R&D Systems)包被透明的384孔板(Costar)。用缓冲液A彻底洗涤板，然后用缓冲液B(缓冲液A中1％牛奶)封闭2小时。洗涤后让板与在缓冲液C(补充10mM CaCl2的缓冲液B)中稀释的0.4微克/ml的LDL受体(R&DSystems)孵育1.5小时。在进行该孵育的同时，让20ng/ml的生物素化D374YPCSK9与各种浓度的31H4IgG2、31H4IgG4、21B12IgG2或21B12IgG4抗体(它们用缓冲液A稀释)或单独的缓冲液A(对照)孵育。洗涤含有LDL受体的板，将生物素化D374YPCSK9/抗体混合物转移到其中并在室温下孵育1小时。通过与含500ng/ml链霉抗生物素蛋白-HRP(Biosource)的缓冲液C孵育，接着与TMB底物(KPL)孵育，来检测生物素化D374Y与LDL受体的结合情况。用1NHCl猝灭信号，在450nm处读吸光率。
本结合研究的结果示于图6A-6D中。概括地说，测定了各抗体的IC50值，发现对于31H4IgG2为199pM(图6A)、对于31H4IgG4为156pM(图6B)、对于21B12IgG2为170pM(图6C)和对于21B12IgG4为169pM(图6D)。
在本测定中抗体还阻封野生型PCSK9与LDLR的结合。
实施例12
细胞LDL吸收测定
本实施例证明抗原结合蛋白降低细胞吸收LDL的能力。将人HepG2细胞以每孔5x105个细胞的浓度铺在黑色透明的96-孔板(Costar)中的补充有10％FBS的DMEM培养基(Mediatech,Inc)中，并于37℃(5％CO2)过夜孵育。为了形成PCSK9和抗体复合体，让2μg/ml的D374Y人PCSK9与用吸收缓冲液(含1％FBS的DMEM)稀释的各种浓度的抗体或单用缓冲液(对照)在室温下孵育1小时。在用PBS洗涤细胞后，将D374YPCSK9/抗体混合物转移到细胞中，接着加入以6μg/ml最终浓度稀释在吸收缓冲液中的LDL-BODIPY(Invitrogen)。在37℃(5％CO2)孵育3小时后，用PBS彻底洗涤细胞，通过SafireTM(TECAN)在480-520nm(激发)和520-600nm(发射)处检测细胞荧光信号。
细胞吸收测定结果示于图7A-7D中。概括地说，测定了各抗体的IC50值，发现对于31H4IgG2为16.7nM(图7A)、对于31H4IgG4为13.3nM(图7B)、对于21B12IgG2为13.3nM(图7C)和对于21B12IgG4为18nM(图7D)。这些结果证明施用的抗原结合蛋白可降低PCSK9(D374Y)的作用以阻断细胞吸收LDL。在本测定中抗体还阻封野生型PCSK9的作用。
实施例13
在6天研究中31H4抗体降低血清胆固醇的作用
为了评估接受针对PCSK9蛋白的抗体疗法的野生型(WT)小鼠总血清胆固醇(TC)的降低情况，实施以下程序。
在整个实验期间给获自Jackson实验室(Bar Harbor,ME)的雄性WT小鼠(C57BL/6品系，9-10周龄，17-27g)饲喂正常食物(Harland-Teklad,Diet2918)。在T＝0时通过小鼠尾静脉以10mg/kg量给予小鼠抗PCSK9抗体31H4(PBS中2mg/ml)或对照IgG(PBS中2mg/ml)。将未经治疗的小鼠放在一旁作为未治疗对照组。给药组和处死时间示于表9中。
表9
组别 治疗 给药后时间点 数量
1 IgG 8小时 7
2 31H4 8小时 7
3 IgG 24小时 7
4 31H4 24小时 7
5 IgG 72小时 7
6 31H4 72小时 7
7 IgG 144小时 7
8 31H4 144小时 7
9 未治疗 不适用 7
在表9中所示的预测定时间点时用CO2窒息处死小鼠。经由腔静脉将血液收集到eppendorf管，并让其在室温凝结30分钟。然后在台式离心机中以12,000xg离心样品10分钟以分离血清。用Hitachi912临床分析仪和Roche/HitachiTC和HDL-C试剂盒测量血清总胆固醇和HDL-C。
将实验结果示于图8A-8D中。概括地说，给予抗体31H4的小鼠显示在实验过程中血清胆固醇水平降低(图8A和图8B)。另外，应该注意到所述小鼠的HDL水平也显示降低(图8C和图8D)。对于图8A和图8C，在相同时间点处，变化百分率与对照IgG相关(*P<0.01，#P<0.05)。对于图8B和图8D，在t＝0小时时，变化百分率与在未处理动物中所测量的总血清胆固醇和HDL水平相关(*P<0.01，#P<0.05)。
关于降低的HDL水平，本领域技术人员显然将了解，小鼠中HDL降低不表明在人中HDL将降低，而仅另外反映该生物体中血清胆固醇水平降低。应注意的是，小鼠在高密度脂蛋白(HDL)微粒中运送大部分血清胆固醇，其不同于在LDL微粒上运送大部分血清胆固醇的人类。在小鼠中，总血清胆固醇的测量结果与血清HDL-C水平极为接近。小鼠HDL含有载脂蛋白E(apoE)，其为LDL受体(LDLR)的配体，使得其可被LDLR清除。因此，对于本发明实施例而言，在小鼠中检查HDL是合适的指示物(应理解，对于人而言不期望HDL降低)。例如，与此相反，人HDL不含apoE，因而不是LDLR的配体。因为PCSK9抗体增加了小鼠中LDLR的表达，所以肝脏可清除更多的HDL并因此降低血清HDL-C水平。
实施例14
在6天研究中抗体31H4对LDLR水平的作用
本发明实施例证明抗原结合蛋白如预期般随时间改变受治疗者LDLR水平。为了确定抗体31H4对LDLR水平的作用，实施蛋白印迹分析。在0.3ml含有完全蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(Santa Cruz Biotechnology Inc.)中，将如实施例13所述从处死的小鼠获得的50-100mg肝脏组织匀浆化。让所述匀浆在冰上孵育30分钟，离心以沉淀细胞碎片。用BioRad蛋白测定试剂(BioRad laboratories)测量上清液中的蛋白浓度。让100μg蛋白在70℃下变性10分钟，在4-12％Bis-TrisSDS梯度凝胶(Invitrogen)上分离。将蛋白转移到0.45μmPVDF膜(Invitrogen)，在含有5％脱脂牛奶的洗涤缓冲液(50mM TrisPH7.5、150mM NaCL、2mMCaCl2和0.05％Tween20)中在室温封闭1小时。然后用羊抗小鼠LDLR抗体(R&Dsystem)以1:2000或抗β肌动蛋白(sigma)以1:2000在室温下探测印迹，为期1小时。短暂洗涤印迹，与牛抗羊IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology Inc.)以1:2000或羊抗小鼠IgG-HRP(Upstate)以1:2000孵育。在室温下孵育1小时后，彻底洗涤印迹，用ECL加试剂盒(Amersham biosciences)检测免疫反应带。蛋白印迹显示在抗体31H4存在下LDLR蛋白水平提高，其如图9所示。
实施例15
在13天研究中抗体31H4降低血清胆固醇的作用
为了评估在13天研究中接受针对PCSK9蛋白的抗体疗法的野生型(WT)小鼠总血清胆固醇(TC)的降低情况，实施以下程序。
在整个实验期间给获自Jackson实验室(BarHarbor,ME)的雄性WT小鼠(C57BL/6品系，年龄9-10周，17-27g)饲喂正常食物(Harland-Teklad,Diet2918)。在T＝0时通过小鼠尾静脉以10mg/kg量给予小鼠抗PCSK9抗体31H4(PBS中2mg/ml)或对照IgG(PBS中2mg/ml)。将未经治疗的小鼠放在一旁作为未治疗对照组。
给药组和处死时间示于表10中。处死动物，提取肝脏，如实施例13制备。
表10
组别 治疗 给药后时间点 数量 剂量
1 IgG 72小时 6 10mg/kg
2 31H4 72小时 6 10mg/kg
3 31H4 72小时 6 1mg/kg
4 IgG 144小时 6 10mg/kg
5 31H4 144小时 6 10mg/kg
6 31H4 144小时 6 1mg/kg
7 IgG 192小时 6 10mg/kg
8 31H4 192小时 6 10mg/kg
9 31H4 192小时 6 1mg/kg
组别 治疗 给药后时间点 数量 剂量
10 IgG 240小时 6 10mg/kg
11 31H4 240小时 6 10mg/kg
12 31H4 240小时 6 1mg/kg
13 IgG 312小时 6 10mg/kg
14 31H4 312小时 6 10mg/kg
15 31H4 312小时 6 1mg/kg
16 未治疗 不适用 6 不适用
当将6天实验延长到13天研究时，在6天研究中观察到的降低血清胆固醇的作用同样也在13天研究中观察到。更明确地说，研究证明，给药量为10mg/kg的动物在第3天血清胆固醇降低31％，到第13天逐渐回到给药前水平。图10A描述了本实验的结果。图10C描述用10mg/kg剂量的31H4及用也是10mg/kg的另一抗体16F12重复上述程序的结果。给药组及处死时间示于表11中。
表11
组别 治疗 给药后时间点 数量 剂量
1 IgG 24小时 6 10mg/kg
2 16F12 24小时 6 10mg/kg
3 31H4 24小时 6 10mg/kg
4 IgG 72小时 6 10mg/kg
5 16F12 72小时 6 10mg/kg
6 31H4 72小时 6 10mg/kg
7 IgG 144小时 6 10mg/kg
8 16F12 144小时 6 10mg/kg
9 31H4 144小时 6 10mg/kg
组别 治疗 给药后时间点 数量 剂量
10 IgG 192小时 6 10mg/kg
11 16F12 192小时 6 10mg/kg
12 31H4 192小时 6 10mg/kg
13 IgG2 240小时 6 10mg/kg
14 16F12 240小时 6 10mg/kg
15 31H4 240小时 6 10mg/kg
16 IgG2 312小时 6 10mg/kg
17 16F12 312小时 6 10mg/kg
18 31H4 312小时 6 10mg/kg
19 未治疗 不适用 6 10mg/kg
如图10C中所示，16F12和31H4二者都仅在单次给药后就导致总血清胆固醇显著而可观的降低，并经1周(10天或更长)产生益处。重复的13天研究结果与第一个13天研究结果一致，且在第3天观察到血清胆固醇水平降低26％。对于图10A和图10B，在相同时间点处，变化百分率与对照IgG相关(*P<0.01)。对于图10C，相同时间点处，变化百分率与对照IgG相关(*P<0.05)。
实施例16
在13天研究中抗体31H4对HDL水平的作用
在实施例15中还调查了动物的HDL水平。在小鼠中HDL水平降低。更具体地说，结果表明，给药量为10mg/kg的动物在第3天HDL水平降低33％，到第13天逐渐回到给药前水平。图10B描述了本实验结果。在第3天HDL水平降低34％。图10B描述重复的13天实验的结果。
如本领域技术人员所了解，尽管抗体将降低小鼠HDL，但这不能预期在人中发生，因为人和其它生物(例如小鼠)的HDL有差异。因此，小鼠HDL的降低不表明人HDL降低。
实施例17
重复给予抗体导致抗原结合肽的连续益处
为了验证以上实施例所获得的结果可扩展至用附加剂量可获得进一步的益处，用图11A所述的给药表重复实施例15和16的实验。结果展示在图11B中。如图11B的图表中所见，在两组小鼠都因为所有小鼠接受31H4抗原结合蛋白初始注射而展示出总血清胆固醇显著降低的同时，接受31H4ABP附加注射的小鼠表现出总血清胆固醇继续降低，而仅接受对照注射的小鼠最终表现出其总血清胆固醇升高。对于图11，在t＝0小时时，变化百分率与未治疗动物相关(*P<0.01，**P<0.001)。
来自本实施例的结果证明，不象其它胆固醇治疗方法(在那些方法中因为受治疗者的生物学调节而导致重复施用效力降低)，本方法似乎不会随检查时间延长而遭受该问题。此外，这表明在先前实施例中所观察到的总血清胆固醇或HDL胆固醇水平回复到基线，不应归因于受治疗者发展了对治疗的一定抗性，而应是由于在受治疗者中耗尽了抗体的可利用性。
实施例18
对人抗PCSK9抗体表位的作图
本实施例概述了用于测定PCSK9中哪些残基参与形成本文公开的针对PCSK9的抗原结合蛋白的表位或作为其部分的方法。
为了确定本发明某些ABP所结合的表位，可用来源于特异性PCSK9肽序列的合成肽绘制ABP表位图谱。
可将SPOT肽阵列(Sigma Genosys)用于研究人抗PCSK9抗体与其肽表位之间的分子作用。SPOT技术基于肽的固相合成，所述肽的形式适用于对抗体表位的系统分析。常规阵列化寡肽的合成可购自Sigma-Genosys。可获得来源于PCSK9肽氨基酸序列的重叠寡肽的肽阵列。所述阵列可包含作为聚丙烯膜层上的点的一系列12聚体的肽。肽阵列可涵盖全长的PCSK9成熟序列。每一个连续的肽可被来自前一个肽的1个残基补偿，这产生巢式、重叠的阵列寡肽文库。携带肽的膜可与不同的抗PCSK9抗体(1微克/ml)反应。可通过酶联免疫吸附测定用缀合HRP的第二抗体接着是增强的化学发光(ECL)来评估mAb与已结合膜的肽的结合情况。
另外，可通过组合丙氨酸扫描来对功能表位作图。在该过程中，可用组合丙氨酸扫描策略鉴定与抗PCSK9ABP作用所必需的PCSK9蛋白中的氨基酸。为了完成这一点，可使用第二套SPOT阵列用于丙氨酸扫描。可如上扫描每12个残基中含有丙氨酸取代的变体肽组。这将使得可对关于针对人PCSK9的ABP的表位进行作图和鉴定。
在备选方案中，考虑到表位是构象表位的可能性，可采用丙氨酸扫描和/或精氨酸扫描、抗体FAB/PCSK9共结晶和有限的蛋白水解/LC-MS(液相色谱质谱)组合来确定表位。
实施例19
PCSK9抗体用于治疗胆固醇相关疾病的用途
将治疗有效量的PCSK9抗体31H4(或例如21B12或16F12)给予表现胆固醇相关疾病(其中胆固醇(例如血清胆固醇)降低可能有益)的人患者。在治疗周期内，监测患者以确定所述疾病的症状是否减弱。治疗后，发现与未治疗的患者相比，接受PCSK9抗体治疗的患者的血清胆固醇水平降低。
实施例20
PCSK9抗体用于治疗高胆固醇血症的用途
将治疗有效量的PCSK9抗体例如31H4(或例如21B12或16F12)给予表现高胆固醇血症症状的人患者。在治疗周期内，监测患者以确定血清胆固醇水平是否下降。治疗后，发现与未接受治疗的关节炎患者相比，接受PCSK9抗体治疗的患者的血清胆固醇水平降低。
实施例21
PCSK9抗体用于预防冠心病和/或复发性心血管事件的应用
确定有发展冠心病风险的人患者。将治疗有效量的PCSK9抗体例如31H4(或例如21B12或16F12)单独或与他汀(例如辛伐他汀)并行或序贯给予所述患者。在治疗周期内，监测所述人患者以确定其总血清胆固醇水平是否变化。通过预防性治疗，发现与未接受治疗的患者相比，接受PCSK9抗体治疗的患者血清胆固醇降低，从而其冠心病或复发性心血管事件的风险降低。
实施例22
PCSK9抗体作为诊断剂的应用
可使用用于检测样品中PCSK9抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)来诊断表现产生高PCSK9水平的患者。在测定中，用针对PCSK9的第一全人单克隆抗体使微滴板(例如96孔微滴板或384孔微滴板)的孔吸附若干小时。该固定化的抗体用作测试样品中可能存在的任何PCSK9的捕获抗体。冲洗各孔，用封闭剂(例如牛奶蛋白或白蛋白)处理以防止被分析物的非特异性吸附。
随后用怀疑含有PCSK9的试样或用含有标准抗原量的溶液处理各孔。所述样品可为例如来自怀疑具有被认作病理诊断的循环抗原水平的受治疗者的血清样品。
在洗去测试样品或标准品后，用通过生物素缀合标记的第二全人单克隆PCSK9抗体处理各孔。还可使用小鼠或其它物种来源的单克隆抗体。标记的PCSK9抗体用作检测抗体。在冲洗掉过量的第二抗体后，用抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶(HRP)和合适的发色底物处理各孔。通过与由标准样品制作的标准曲线比较，确定测试样品中的抗原浓度。
本ELISA测定提供高度特异性并极为灵敏的测定用于检测测试样品中的PCSK9抗原。
受治疗者中PCSK9蛋白浓度的测定
夹心ELISA可定量测定人血清中的PCSK9水平。来自夹心ELISA的两个全人单克隆PCSK9抗体识别PCSK9分子上的不同的表位。或者，可使用小鼠或其它物种来源的单克隆抗体。ELISA如下进行：用50μL含2μg/mL浓度的捕获PCSK9抗体的包被缓冲液(0.1MNaHCO3、pH9.6)包被ELISA板(Fisher)。在4℃过夜孵育后，用200μL的封闭缓冲液(PBS中的0.5％BSA、0.1％Tween20、0.01％硫柳汞)于25℃下处理板1小时。用含0.05％Tween20的PBS(洗涤缓冲液,WB)洗涤板(3x)。用含有50％人血清的封闭缓冲液稀释正常或患者血清(Clinomics,Bioreclaimation)。让板与血清样品在4℃过夜孵育，用WB洗涤，然后与100μL/孔的生物素化检测PCSK9抗体在25℃下孵育1小时。洗涤板后，让板与HRP-链霉抗生物素蛋白孵育15分钟，如前所述洗涤，然后用100μL/孔的邻苯二胺/H2O2(Sigma显色溶液)处理用于产生颜色。用50μL/孔的H2SO4(2M)终止反应，用ELISA板读数器在492nm处分析。通过用四参数曲线拟合程序与纯化的PCSK9抗原稀释液比较来计算血清样品中PCSK9抗原的浓度。
受治疗者中PCSK9变体蛋白浓度的测定
可用本文所述的既结合野生型PCSK9又结合变体PCSK9(D374Y)的抗体实施上述步骤。接下来，可使用结合野生型但不结合突变体的抗体(再次用与上述相似的方案)，来确定受治疗者中存在的PCSK9是野生型还是D374Y变体。如本领域技术人员所了解，两轮都是阳性的结果应是野生型，而那些第一轮为阳性但第二轮不是的抗体应包括D374Y突变体。已知在群体中会存在高频突变，这可能尤其得益于诸如本文公开的ABP的药剂。
实施例23
PCSK9抗原结合蛋白用于预防高胆固醇血症的应用
经由家族史分析和/或生活方式和/或目前胆固醇水平来确定表现出发展高胆固醇血症风险的人患者。将治疗有效量的PCSK9抗体31H4(或例如21B12或16F12)定期(例如每周1次)给予所述对象。在治疗周期内，监测患者以测定血清胆固醇水平是否下降。治疗后，发现与未接受治疗的对象相比，接受PCSK9抗体预防性治疗的对象血清胆固醇水平降低。
实施例24
在他汀存在下PCSK9ABP进一步下调LDLR
本实施例证明，当在他汀存在下使用时，针对产生的PCSK9的ABP进一步降低LDLR利用率，这表明通过联合使用这两种物质可获得进一步的益处。
将HepG2细胞接种在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，并使其生长到约90％汇合。用在含3％FBS的DMEM中的指定量的美维诺林(mevinolin)(一种他汀，Sigma)和PCSK9ABP(图12A-12C)处理细胞48小时。制备总细胞裂解物。通过凝胶电泳分离50mg的总蛋白并转移到PVDF膜。用兔抗人LDL受体抗体(Fitzgerald)或兔抗人b-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。在图12A-12C的上图显示增强的化学发光结果。通过ImageJ软件定量测量带的强度并由b-肌动蛋白标准化。在图12A-12C的下图显示LDLR的相对水平。ABP21B12和31H4为PCSK9中和抗体，而25A7.1为非中和抗体。
还产生了HepG2-PCSK9细胞。它们是用人PCSK9转染的稳定的HepG2细胞系。将细胞接种在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中，并生长到约90％汇合。用在含3％FBS的DMEM中的指定量的美维诺林(Sigma)和PCSK9ABP(图12D-12F)处理细胞48小时。制备总细胞裂解物。通过凝胶电泳分离50mg的总蛋白并转移到PVDF膜。用兔抗人LDL受体抗体(Fitzgerald)或兔抗人b-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。在上图显示增强的化学发光结果。通过ImageJ软件定量测定条带的强度并由b-肌动蛋白标准化。
如图12A-12F所示结果中所见，增加中和抗体的量及增加他汀的量一般导致LDLR水平提高。这种提高ABP水平的功效的增加在图12D-12F中尤其明显，其中也用PCSK9转染细胞，使得ABP可以让其功效显示到更大程度。
令人感兴趣的是，如比较图12D-12F与12A-12C的结果所显示，当由所述细胞产生PCSK9时，ABP浓度对LDLR水平的影响急剧增加。另外，很明显中和的ABP(21B12和31H4)比25A7.1ABP(非中和剂)(甚至是在他汀存在下)导致LDLR水平更大提高，这证明使用他汀和针对PCSK9的ABP二者可获得另外的益处。
实施例25
共有序列
用对应于抗PCSK9ABP的VH和VL的CDR的标准系统发生分析来确定共有序列。通过使CDR在对应于VH或VL的相同序列内邻接来测定共有序列。简言之，将对应于VH或VL完整可变结构域的氨基酸序列转换为FASTA格式，以方便进行比较性比对及推测系统发生。接下来，用人工接头序列(“bbbbbbbbbb”占位符，非特异性核酸结构(construct))置换这些序列的构架区，以使得可进行单独的CDR检查，而无需由于同时发生的事件引入任何氨基酸位置权偏误(weightingbias)(例如偶然共有共同种系构架遗传性的无关抗体)，同时仍能使CDR在对应于VH或VL的相同序列内邻接。然后用采用标准ClutalW类似算法的程序(参见Thompson等，1994,Nucleic Acids Res.22:4673-4680)对该格式的VH或VL序列进行序列相似性比对询问。使用8.0的空位创建罚分以及2.0的空位延长罚分。该程序同样基于用UPGMA(用算术平均数的非加权配对组法)或Neighbor-Joining方法(参见Saitou和Nei,1987,Molecular Biology and Evolution4:406-425)的序列相似性比对产生系统发生图(系统发生树图解)，以经由分枝长度比较及分组来构建并阐明序列组的相似性和差异。这两种方法都产生相似的结果，但来源于UPGMA的系统发生树最终作为使用较简单及更保守的一套假定的方法来使用。产生了来源于UPGMA的系统发生树(其中在相似序列组定义为组内的各别的序列之中少于15个取代/100个残基(参见系统发生树图解的比例说明))，并将所述系统发生树用于界定共有序列群集。比较结果示于图13A-13J中。在图13E中，选择组别以使分枝的轻链中的序列也是重链中的分枝，并具有少于15个取代。
如本领域技术人员所了解，图13A-13J中所示的结果提供了关于特定氨基酸(例如保守的氨基酸)重要性的大量指导，所述氨基酸位置可能被改变(例如对于不同的ABP具有不同的氨基酸的位置)。
实施例26
关于PCSK9和ABP体内降低LDL能力的小鼠模型
为了产生过量表达人PCSK9的小鼠，经由尾静脉注射给予3周龄的WTC57Bl/6小鼠各种浓度的腺伴随病毒(AAV)，以测定提供可测量的在小鼠中LDL-胆固醇增加的正确滴度，所述腺伴随病毒经过重组修饰以表达人PCSK9。通过使用这种表达人PCSK9的特定病毒，确定4.5x10E12pfu的病毒将导致循环血液中LDL-胆固醇水平为大约40mg/dL(WT小鼠的正常LDL水平为大约10mg/dL)。发现这些动物中人PCSK9水平大约为13ug/mL。用该注射标准产生小鼠的集落(colony ofmouse)。
注射1周后，评估小鼠的LDL-胆固醇水平，并随机分为不同的治疗组。然后经由尾静脉注射给予动物单次推注的10mg/kg或30mg/kg的16F12、21B12或31H4抗原结合蛋白。在分开的动物组中作为给药对照给予IgG2ABP。然后在给予ABP24小时和48小时后麻醉处死亚组动物(n＝6-7)。在给予任一种剂量的IgG2后，对LDL-胆固醇水平没有影响。与IgG2对照相比，31H4和21B12二者都显示显著的LDL-胆固醇降低，直到且包括给药后48小时(两种不同的剂量示于图14A和14B中)。16F12显示一般性的LDL-胆固醇降低应答，且在48小时时间点处水平回复到大约40mg/dL的基线。该数据与体外结合数据一致(Biacore和Kinexa)，其显示，对人PCSK9而言，31H4和21B12之间的结合亲和力接近相同，而16F12亲和力较小。
如结果中所可观察到的，在模型中由PCSK9ABP降低了总胆固醇和HDL-胆固醇(由于PCSK9过量表达，总胆固醇和HDL-C二者都高于WT小鼠)。尽管在该模型中似乎胆固醇降低仅出现了相当短的时间，但认为这是由于所存在的人PCSK9水平在该模型中高于生理学水平。另外，既然由AAV控制表达，那么无法调控PCSK9表达。在这些图中，(*)表示P<0.05，(**)表示P<0.005，它们是与在同一时间点注射IgG2对照的动物中观察到的LDL-胆固醇水平的比较。小鼠中13微克/ml的血清人PCSK9水平对应于内源性小鼠PCSK9水平(约25ng/ml)的大约520倍增加，以及平均人血清水平(约175ng/ml)的大约75倍增加。因此，抗原结合蛋白应该对人甚至更加有效。
如本领域技术人员所了解，上述结果证明小鼠模型用于测试抗原结合蛋白改变受治疗者血清胆固醇能力的适宜性。本领域技术人员还将认识到的是，虽然可用于监测小鼠血清胆固醇水平，但是应用小鼠HDL来监测小鼠血清胆固醇水平并不表明ABP对人的人HDL有影响。例如，Cohen等(“Sequencevariations in PCSK9,low LDL,and protection against coronary heart disease(PCSK9的序列变化、低LDL和对冠心病的保护”,NEnglJMed,354:1264-1272,2006)证明PCSK9失去功能的突变对人HDL水平无任何影响(其整体在此引作参考)。因此，本领域技术人员应明白，ABP降低小鼠HDL(其缺乏LDL)的能力不表示ABP降低人HDL的能力。实际上，如Cohen所示，对于中和人抗体而言，这是不可能发生的。
实施例27
31H4和21B12结合PCSK9的ProCat区
本发明实施例阐述了用于测定各种抗体在何处结合PCSK9的方法。
PCSK9蛋白的ProCat(SEQ ID NO:3的31-449位)或V结构域(SEQ ID NO:3的450-692位)与抗体31H4或21B12结合。通过天然PAGE分析样品中复合体的形成情况。如可在图16A和图16B中所见，在ProCat/31H4和ProCat/21B12样品中存在凝胶移动，这证明抗体结合ProCat结构域。
实施例28
LDLR的EGFa结构域结合PCSK9的催化结构域
本发明实施例提供与LDLR的EGFa结构域(293-334位)结合的PCSK9ProCat(SEQ ID NO:3的31-454位)的以分辨率分辨的晶体结构(所用条件阐述于以下实施例中)。
结合EGFa的代表性PCSK9结构示于图17中。晶体结构(且其描述于图17中)显示LDLR的EGFa结构域结合PCSK9的催化结构域。另外，PCSK9和EGFa的相互作用似乎发生在图17所示结构中的残基D374和S153之间的整个PCSK9表面。
与LDLREGFa结构域相互作用的界面的特定核心PCSK9氨基酸残基确定为EGFa结构域内的PCSK9残基。所述核心残基如下：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380和S381。
与LDLREGFa结构域相互作用的界面的边界PCSK9氨基酸残基确定为离EGFa结构域的PCSK9残基。所述边界残基如下：W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376和Q382。几乎或完全包埋在PCSK9内的残基为下划线的残基。
如本领域技术人员所了解，本实施例的结果表明了PCSK9和EGFa相互作用之处。因此，与任何这些残基起作用或封闭它们的抗体可用作抑制PCSK9和LDLR的EGFa结构域(和/或通常LDLR)之间相互作用的抗体。在某些实施方案中，为了提供对PCSK9结合LDLR的有用抑制，涵盖以下抗体：当所述抗体与PCSK9结合时，其与以上任何残基作用或封闭它们或位于以上残基15-8、8、8-5或5埃内。
实施例29
31H4与来自PCSK9的前域和催化结构域二者的氨基酸残基起作用
本发明实施例提供与31H4的Fab片段结合的全长PCSK9(SEQ ID NO:3的N533A突变体)的晶体结构，其以分辨率测定(所用条件阐述于以下实施例中)。在图18A和18B中所述的该结构显示，31H4在催化位点区结合PCSK9并使与来自前域和催化结构域的氨基酸残基接触。
所述结构还使人们可确定关于31H4与PCSK9相互作用界面的特定核心PCSK9氨基酸残基。其确定为在31H4蛋白内的残基。所述核心残基如下：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383和G384。
所述结构还用于确定关于与31H4相互作用的界面的边界PCSK9氨基酸残基。这些残基为与31H4蛋白相距的PCSK9残基。所述边界残基如下：K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、 G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386和Q387。在完全包埋在PCSK9蛋白中的氨基酸残基下面划线。
如本领域技术人员所了解，图18B描述抗原结合蛋白上的CDR与PCSK9之间的相互作用。因此，所述模型使得本领域技术人员可鉴定对抗原互补位尤其重要的残基和/或CDR，以及对抗原互补位较不重要的残基。如可在图18B中所见，重链CDR1、CDR2和CDR3大部分直接参与抗原结合蛋白与表位的结合，且来自轻链的CDR离表位相对较远。因此，以下情况是可能的：在轻链CDR中可能有较大的变化，但并不过分干扰抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，保留所述结构中直接起作用的残基(或作为选择地进行保守取代)，而可对那些并不彼此直接起作用的残基进行较大程度的改变。因此，根据本发明教导，本领域技术人员可预测能被改变但不过分干扰抗原结合蛋白与PCSK9结合的能力的抗原结合蛋白的残基及区域。例如，当抗原结合蛋白与PCSK9结合时，位置最靠近PCSK9的那些残基是可能在抗原结合蛋白与PCSK9结合中起更重要作用的残基。根据上述内容，可将这些残基分为位于PCSK95埃内的残基和位于在5-8埃之间的残基。与PCSK9相互作用界面的特定核心31H4氨基酸残基确定为在PCSK9蛋白内的31H4残基。对于重链而言，在5埃内的残基包括以下：T28、S30、S31、Y32、S54、S55、S56、Y57、I58、S59、Y60、N74、A75、R98、Y100、F102、W103、S104、A105、Y106、Y107、D108、A109和D111。对于轻链而言，在5埃内的那些残基包括以下：L48、S51、Y93和S98。对于重链而言，离PCSK9蛋白的那些残基包括以下：G26、F27、F29、W47、S50、I51、S52、S53、K65、F68、T69、I70、S71、R72、D73、K76、N77、D99、D101、F110和V112。对于轻链而言，在PCSK95-8埃内的那些残基包括：A31、G32、Y33、D34、H36、Y38、I50、G52、N55、R56、P57、S58、D94、S95、S96、L97、G99和S100。
如本领域技术人员所了解，实施例29的结果表明在哪些残基上针对PCSK9的抗体可作用于PCSK9并且还阻封PCSK9与EGFa(并由此LDLR)的作用。因此，与任何这些PCSK9残基起作用或封闭任何这些残基(例如封阻这些残基与结合这些残基的其它抗原结合蛋白)的抗原结合蛋白可用作抑制PCSK9和EGFa(并因此LDLR)相互作用的抗体。因此，在某些实施方案中，为了对PCSK9结合LDLR提供有用的抑制，涵盖与任何以上残基作用或与位于以上残基内的残基作用的抗原结合蛋白。同样，封闭任何以上残基(其可例如经由竞争测定来测定)的抗原结合蛋白也可用于抑制PCSK9/LDLR的互相作用。
实施例30
结合PCSK9的催化结构域的21B12具有不同于31H4的结合位点并可与31H4同时结合PCSK9
本发明实施例提供与31H4和21B12的Fab片段结合的PCSK9ProCat(SEQ ID NO:3的31-449位)的以分辨率测定的晶体结构(所用条件阐述于以下实施例中)。图19A和图19B中所示的该晶体结构显示31H4和21B12具有针对PCSK9的独特结合位点，且这两种抗原结合蛋白都可同时结合PCSK9。所述结构显示21B12与来自PCSK9催化结构域的氨基酸残基起作用。在该结构中，PCSK9和31H4之间的相互作用与以上所观察的相似。
与21B12相互作用的界面的特定核心PCSK9氨基酸残基确定为位于21B12蛋白内的PCSK9残基。所述核心残基如下：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377和F379。
与21B12相互作用的界面的边界PCSK9氨基酸残基确定为与21B12蛋白相距的PCSK9残基。所述边界残基如下：I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375和C378。几乎或完全包埋在PCSK9蛋白中的氨基酸残基为下划线的残基。
如本领域技术人员所了解，图19B描述抗原结合蛋白上的CDR与PCSK9之间的相互作用。因此，所述模型使得本领域技术人员可确定对抗原互补位尤其重要的残基和/或CDR以及对抗原互补位较不重要的残基。如可在所述结构中所见，重链CDR2和轻链CDR1似乎与表位密切作用。其次，重链CDR1、重链CDR3和轻链CDR3似乎靠近表位，但接近程度不如第一组CDR。最后，轻链CDR2似乎与表位相距一定距离。因此，以下情况是可能的：在较远的CDR中可能有较大的变化，但不过分干扰抗原结合蛋白与PCSK9的结合。在某些实施方案中，保留所述结构中直接起作用的残基(或作为选择地进行保守取代)，而可对那些并不彼此直接起作用的残基进行较大程度的改变。因此，根据本发明教导，本领域技术人员可预测能被改变但不过分干扰抗原结合蛋白与PCSK9结合的能力的抗原结合蛋白的残基及区域。例如，当抗原结合蛋白与PCSK9结合时，位置最靠近PCSK9的那些残基是可能在抗原结合蛋白与PCSK9结合中起更重要作用的残基。根据上述内容，可将这些残基分为位于PCSK9的5埃内的残基和位于在5-8埃之间的残基。与PCSK9相互作用的界面的特定核心21B12氨基酸残基确定为位于PCSK9蛋白内的21B12残基。对于重链而言，在5埃内的残基包括以下：T30、S31、Y32、G33、W50、S52、F53、Y54、N55、N57、N59、R98、G99、Y100和G101。对于轻链而言，在5埃内的那些残基包括以下：G30、G31、Y32、N33、S34、E52、Y93、T94、S95、T96和S97。对于重链而言，与PCSK9蛋白相距的那些残基包括以下：T28、L29、I34、S35、W47、V51、G56、T58、Y60、T72、M102和D103。对于轻链而言，位于PCSK95-8埃内的那些残基包括以下：S26、V29、V35、Y51、N55、S92、M98和V99。
如本领域技术人员所了解，实施例30的结果表明在哪些残基上针对PCSK9的抗原结合蛋白可作用于PCSK9并且还阻封PCSK9与EGFa(并由此LDLR)作用。因此，与任何这些PCSK9残基起作用或封闭任何这些残基的抗原结合蛋白可用作抑制PCSK9和EGFa(并因此LDLR)相互作用的抗体。因此，在某些实施方案中，为了对PCSK9结合LDLR提供有用的抑制，涵盖与任何以上残基作用或与位于以上残基内的残基作用的抗体。同样，封闭任何以上残基(其可例如经由竞争测定来测定)的抗原结合蛋白也可用于抑制PCSK9/LDLR的互相作用。
实施例31
EGFa、PCSK9与抗体之间的相互作用
来自以上实施例的三元复合体(PCSK9/31H4/21B12)的结构在PCSK9/EGFa结构(如实施例28所述测定)上重叠，该组合的结果描述于图20A中。该图表明了PCSK9上的可用于被靶向以抑制PCSK9与EGFa的互相作用的区域。该图显示31H4和21B12二者部分地与LDLR的EGFa结构域位置重叠，并在空间上干扰其与PCSK9结合。另外，如结构中所见到的，21B12与特异性参与LDLREGFa结构域结合的氨基酸残基子集直接作用。
如上所述，鉴定特定氨基酸的晶体结构分析涉及PCSK9和伴侣蛋白(在PCSK9表面上的界面的核心和边界区)之间的相互作用及这些伴侣蛋白与PCSK9作用的空间需要。所述结构提示抑制PCSK9和LDLR之间的相互作用的方式。首先，如上所述，使药物与PCSK9在PCSK9与LDLR的EGFa结构域的结合位点共有的共享残基处结合，这将抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用。其次，在共有残基外结合的药物可在空间上干扰LDLR的EGFa结构域或EGFa结构域的N-或C-末端区，以防止PCSK9和LDLR之间的相互作用。
在某些实施方案中，既参与EGFa结合又靠近上述抗原结合蛋白结合的区域的残基在操控PCSK9与LDLR结合中尤其有用。例如，用于不同的结合配偶体的来自核心区和边界区二者共同界面的氨基酸残基示于下表12中。在完全包埋在PCSK9蛋白中的氨基酸残基为下划线残基。
表12
如本领域技术人员所了解，在某些实施方案中，抗原结合蛋白结合和/或封闭至少一种上述残基。
实施例32
LDLR和PCSK9之间的结构相互作用
用PCSK9ProCat(SEQ ID NO:3的31-454位)/EGFa复合体结构制作已结合全长LDLR表现形式的全长PCSK9模型。全长PCSK91结构(Piper,D.E.等。The crystal structure of PCSK9:a regulator of plasma LDL-cholesterol(PCSK9晶体结构：血浆LDL-胆固醇调节剂).Structure15,545-52(2007))在来自复合体的PCSK9ProCat31-454位上被覆盖，在其低pH构象中的LDLR结构(Rudenko,G.等。Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH(在内体pH时的LDL受体细胞外结构域的结构).Science298,2353-8(2002))在来自所述复合体的EGFa结构域上被覆盖。模型描述示于图20B和20C中。EGFa结构域由图中方框指出。所述图显示位于接近PCSK9的直接EGFa结合结构域外的LDLR区。图20D-20F显示以上互相作用以及来自三个不同角度的抗体31H4和21B12网格表面表现形式。从描述中清楚看出，不仅抗体可在实际结合位点与PCSK9起作用和/或干扰LDLR与PCSK9的互相作用，而且似乎也发生其它空间互相作用。
根据以上结果，很明显结合PCSK9的抗原结合蛋白还可通过与LDLR的不同区(不仅仅是LDLR与PCSK9相互作用位点)的抵触作用(clash)抑制PCSK9与LDLR之间的相互作用。例如，其可与重复7(R7)、EGFb结构域和/或β-螺旋结构域起抵触作用。
结合或阻封EGFa与PCSK9互相作用的抗原结合分子的实施方案
如本领域技术人员所了解，实施例28-32及其附图提供如下详细说明：EGFa与PCSK9如何及在何处作用，以及两种代表性中和抗原结合蛋白21B12和31H4与PCSK9如何起作用并产生其中和作用。因此，本领域技术人员将通过确定在或靠近PCSK9上的相同位置中的至少一个处结合的其它抗原结合分子，能够容易地确定可类似地降低EGFa(包括LDLR)和PCSK9之间的结合的抗原结合分子。尽管在附图和本说明书中确定了PCSK9上的相关位点(或表位)，但将这些位点描述为位于已被确定为接近EGFa结合位点的残基设定距离内也可能是有利的。在某些实施方案中，抗原结合分子将结合以下残基(根据SEQ ID NO:3的编号)中的一个或多个或位于其30埃内：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在某些实施方案中，抗原结合分子在以下残基(根据SEQ ID NO:3的编号)中的一个或多个的30埃内结合：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。在某些实施方案中，抗原结合分子在以下残基(根据SEQ ID NO:3的编号)中的一个或多个的30埃内结合：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386或Q387。在某些实施方案中，抗原结合分子在以下残基(关于SEQ ID NO:3的编号)中的一个或多个或的30埃内结合：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在某些实施方案中，抗原结合分子在离以上一个或多个残基30、30-25、25-20、20-15、15-8、8、8-5、5、5-4、4或更小埃内结合。在某些实施方案中，当抗原结合分子结合PCSK9时，对于不止一种上述残基而言，所述抗原结合分子位于至少上述距离之一内处。例如，在某些实施方案中，对于以下残基而言抗原结合分子位于所记载的距离(例如30、30-25、25-20、20-15、15-8、8、8-5、5、5-4、4或更近)之一内：至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75或更多个上述残基。在某些实施方案中，对于以下残基而言抗原结合分子位于所记载的距离之一内：至少1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99、99-100％的在其亚组的每一组中确定的残基(例如仅在组中的那些表面残基)。除非另外特别说明，否则抗原结合分子与PCSK9之间的距离是PCSK9上共价键合的原子与作为PCSK9与抗原结合分子最接近的原子的抗原结合分子上共价键合的原子之间的最短距离。同样，除非另外特别说明，否则残基(在抗原结合分子或PCSK9上的残基)与另一蛋白(分别为PCSK9或抗原结合分子)之间的距离，是从经确定的残基上最近的点到另一蛋白的最近的共价键合部分的距离。在某些实施方案中，所述距离可由氨基酸链的主链测量。在某些实施方案中，所述距离可在抗原互补位边缘到表位边缘(彼此最接近处)之间测量。在某些实施方案中，所述距离可在抗原互补位表面中心和表位表面中心之间测量。如本领域技术人员所了解，本发明说明可适用于本文所列各组残基中的每一组。例如，上述范围概括并具体地涵盖实施例28-32中所列的8埃残基和实施例28-32中所列的5埃残基。
在某些实施方案中，抗原结合分子结合已被EGFa、21B12或31H4中的至少一种结合的PCSK9的表面。在某些实施方案中，抗原结合分子在与PCSK9跟EFGa、Ab31H4和/或Ab21B12之间的作用位点(如以上实施例和图中所述)重叠的位点处结合PCSK9。在某些实施方案中，抗原结合分子在进一步远离上述残基之一的位置结合PCSK9。在某些实施方案中，所述抗原结合分子可仍为有效的中和抗原结合分子。
在某些实施方案中，PCSK9催化结构域的结构可阐述为大体上三角形(如图19A所示)。所述三角形的第一边显示为被31H4结合。三角形的第二边显示为被21B12结合，三角形的第三边位于朝向页面底部紧挨“图19A”标示的上面。在某些实施方案中，结合PCSK9催化结构域的第一边和/或第二边的抗原结合分子可用作中和抗体，因为其可直接或在空间上干扰EGFa与PCSK9的结合。如本领域技术人员所了解，当抗原结合分子足够大(例如全抗体)时，为了干扰EGFa与PCSK9结合，抗原结合分子不必直接结合EGFa结合位点。
如本领域技术人员所了解，尽管LDLR的EGFa结构域已用于很多实施例中，但所述模型和结构仍适用于确定全长LDLR蛋白怎样与PCSK9作用。实际上，全长LDLR蛋白上存在的另外的结构提供了可进一步被抗原结合分子之一封闭的另外的蛋白空间。因此，如果抗原结合分子封闭或抑制EGFa与PCSK9的结合，那么其对于全长LDLR蛋白很可能同样有效(即使不是更有效)。同样，在设定距离内的抗原结合分子或封闭各种与抑制EGFa结合有关的残基的抗原结合分子对于全长LDLR很可能同样有效(即使不是更有效)。
如本领域技术人员所了解，封闭或结合上述PCSK9残基(或在所述距离内)的任何分子，或抑制以上实施例和图中所示的一种或多种作用的任何分子，可用于抑制EGFa(或通常LDLR)与PCSK9的相互作用。因此，不必将所述分子限定为抗原结合“蛋白”，因为任何抗原结合分子亦可实现所需要目的。抗原结合分子实例包括契合适配体(aptamer)，所述适配体可为寡核酸或肽分子。抗原结合分子的其它实例包括avimer、肽体、小分子和聚合物及EGFa的修改后形式，所述EGFa的修改后形式可提高其对PCSK9的亲和力和/或延长半衰期，所述修改形式例如有氨基酸突变、糖基化、聚乙二醇化、Fc融合和avimer融合。如本领域技术人员所了解，在某些实施方案中，LDLR不是抗原结合分子。在某些实施方案中，LDLR的结合分部不是抗原结合分子，例如EGFa。在某些实施方案中，其它分子(PCSK9通过所述其它分子进行体内信号转导)不是抗原结合分子。所述实施方案将明确地如此确定。
实施例33
蛋白样品的表达和纯化
本发明实施例阐述关于制备和纯化PCSK9蛋白/变体(包括LDLR EGFa结构域)的各种实施方案的某些实施方案。使具有N-末端蜜蜂蜂毒素信号肽后接His6标签的PCSK9蛋白/变体(例如PSCK931-692N533A、PCSK9449TEV和PCSK9ProCat31-454)在杆状病毒感染的Hi-5昆虫细胞中表达。通过镍亲和色谱法、离子交换色谱法和大小排阻色谱法纯化PCSK9蛋白。纯化期间通过用TEV蛋白酶裂解除去蜂毒肽-His6标签。将PCSK9449TEV构建体用于产生PCSK9ProCat(31-449位)和V结构域(450-692位)样品。该构建体具有插入到PCSK9的449和450位残基之间的TEV蛋白酶裂解位点。对于用于结晶(crystallography)的全长N555A变体、PCSK931-454片段和用于结晶的PCSK9449TEV变体，后rTEV蛋白产物也包括初始GAMG序列。因此，在rTEV裂解后，这些蛋白是GAMG-PCSK9。此外，PCSK9449TEV蛋白包括插入到SEQID NO:3的H449和G450位置之间的序列“ENLYFQ”(SEQ ID NO:403)。在用rTEV裂解后，从该构建体产生的PCSK9ProCat蛋白为GAMG-PCSK9(31-449)-ENLYFQ，从该构建体产生的V结构域为SEQ ID NO:3的PCSK9(450-692)。
使21B12和31H4Fab片段在大肠杆菌中表达。通过镍亲和色谱法、大小排阻色谱法和离子交换色谱法纯化这些蛋白。
使LDLREGFa结构域(293-334)在大肠杆菌中作为GST融合蛋白表达。通过离子交换色谱法、谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和色谱法和大小排阻色谱法纯化EGFa结构域。在纯化期间通过用PreScission蛋白酶裂解除去GST蛋白。
实施例34
复合体形成和结晶
本发明实施例阐述如何制备用于以上结构检查实施例中的复合体和晶体。
通过让1.5摩尔过量的31H4Fab与PCSK9混合来制备PCSK931-692N533A/31H4复合体。通过大小排阻色谱法纯化复合体以除去过量的31H4Fab。在0.1MTrispH8.3、0.2M乙酸钠、15％PEG4000、6％葡聚糖硫酸钠盐(Mr5000)中使PCSK931-692N533A/31H4复合体结晶。
通过首先让1.5摩尔过量的31H4Fab与PCSK931-449混合来制备PCSK9ProCat31-449/31H4/21B12复合体。通过在大小排阻色谱柱上纯化从过量31H4中分离复合体。然后将1.5摩尔过量的21B12Fab加入到PCSK931-449/31H4复合体中。通过在大小排阻色谱柱上纯化以从过量21B12中分离该三元复合体。在0.1MTrispH8.5、0.2M磷酸二氢铵、50％MPD中让PCSK9ProCat31-449/31H4/21B12复合体结晶。
通过让1.2摩尔过量EGFa结构域与PCSK931-454混合来制备PCSK9ProCat31-454/EGFa复合体。在0.2M甲酸钾、20％PEG3350中让PCSK9ProCat31-454/EGFa结构域复合体结晶。
实施例35
数据收集和结构测定
本发明实施例阐述如何收集数据集及如何测定用于以上结构检查实施例中的结构。
在Rigaku FR-EX射线源中收集PCSK931-692N533A/31H4和PCSK9ProCat31-449/31H4/21B12晶体的初始数据集。在Berkeley Advanced LightSource beamline5.0.2中收集PCSK9ProCat31-454/EGFa数据集和PCSK931-692N533A/31H4和PCSK9ProCat31-449/31H4/21B12晶体的较高分辨率的数据集。所有数据集都用denzo/scalepack或HKL2000处理(Otwinowski,Z.,Borek,D.,Majewski,W.&Minor,W.Multiparametric scaling of diffractionintensities(衍射强度多参数缩放).ActaCrystallogr A59、228-34(2003))。
PCSK9/31H4晶体以晶胞参数为a＝264.9、b＝137.4、、β＝102.8°的C2空间群生长，并以的分辨率衍射。通过用程序MOLREP(The CCP4suite:programs for protein crystallography(CCP4套件：用于蛋白晶体学的程序).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50,760-3(1994))的分子置换用PCSK9结构(Piper,D.E.等，The crystal structure of PCSK9:a regulator of plasmaLDL-cholesterol(PCSK9的晶体结构：血浆LDL-胆固醇调节剂).Structure15,545-52(2007))作为开始搜索模型解析的PCSK9/31H4结构。保持PCSK931-692溶液稳定，将抗体可变结构域用作搜索模型。保持PCSK931-692/抗体可变结构域溶液稳定，将抗体恒定结构域用作搜索模型。用以量子构建并以cnx改进的多轮模型来改善完整结构。(Brunger,A.T.等，Crystallography&NMR system:A new software suite for macromolecular structure determination(结晶学和NMR系统：用于大分子结构测定的新软件套组).Acta Crystallogr DBiol Crystallogr54,905-21(1998))。
PCSK9/31H4/21B12晶体以晶胞参数为a＝138.7、b＝246.2、的P21212空间群生长，并以的分辨率衍射。通过用程序MOLREP的分子置换用PCSK9ProCat/31H4可变结构域作为开始搜索模型解析PCSK9/31H4/21B12的结构。保持PCSK9ProCat/31H4可变结构域稳定，对抗体恒定结构域进行搜索。保持PCSK9ProCat/31H4/21B12恒定结构域稳定，将抗体可变结构域用作搜索模型。用以量子构建并以cnx改进的多轮模型来改善完整结构。
PCSK9/EGFa结构域晶体以晶胞参数为a＝b＝70.6、的空间群P6522生长，并以的分辨率衍射。通过用程序MOLREP的分子置换用PCSK9ProCat作为开始搜索模型解析PCSK9/EGFa结构域结构。电子密度图谱分析显示EGFa结构域的清晰电子密度。手动拟合LDLREGFa结构域，用以量子构建并以cnx改进的多轮模型来改善模型。
将核心作用界面氨基酸确定为所有具有至少一个与PCSK9伴侣蛋白相距小于或等于的原子的氨基酸残基。选择作为核心区截断值距离，以便允许在范德华力半径加上可能的水介导氢键内的原子。将边界作用界面氨基酸确定为所有具有至少一个与PCSK9伴侣蛋白相距小于或等于的原子的氨基酸残基，但排除核心作用名单。选择小于或等于作为边界区截断值距离，以便允许延长的精氨酸氨基酸长度。用程序PyMOL计算满足这些距离标准的氨基酸。(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.(Palo Alto,2002))。
实施例36
PCSK9和31A4的晶体结构
测定了31A4/PCSK9复合体的晶体结构。
蛋白样品的表达和纯化
使具有N-末端蜜蜂蜂毒素信号肽后接His6标签的PCSK9449TEV(具有插入到按SEQ ID NO:3编号为449和450位的残基之间的TEV蛋白酶裂解位点的PCSK9构建体)在杆状病毒感染的Hi-5昆虫细胞中表达。首先通过镍亲和色谱法纯化PCSK9蛋白。用TEV蛋白酶除去蜂毒肽-His6标签，并在催化结构域和V结构域之间裂解PCSK9蛋白。通过离子交换色谱法和大小排阻色谱法进一步纯化V结构域。在大肠杆菌中表达31A4Fab片段。通过镍亲和色谱法、大小排阻色谱法和离子交换色谱法纯化该蛋白。
复合体形成和结晶
通过让1.5摩尔过量的PCSK9V结构域与31A4Fab混合来制备PCSK9V结构域/31A4复合体。通过在大小排阻色谱柱上纯化从过量PCSK9V结构域分离复合体。在1.1M琥珀酸pH7、2％PEGMME2000中让PCSK9V结构域/31A4复合体结晶。
数据收集和结构测定
在RigakuFR-EX射线源中收集PCSK9V结构域/31A4晶体的数据集，并用denzo/scalepack(Otwinowski,Z.,Borek,D.,Majewski,W.&Minor,W.Multiparametric scaling of diffraction intensities(衍射强度多参数缩放).ActaCrystallogr A59、228-34(2003))处理。
PCSK9V结构域/31A4晶体以晶胞参数为a＝74.6、b＝131.1、的两个复合体分子/不对称单元的P212121空间群生长，并以的分辨率衍射。通过用程序MOLREP(CCP4.The CCP4suite:programs for proteincrystallography(CCP4套件：用于蛋白晶体学的程序).Acta Crystallogr D BiolCrystallogr50,760-3(1994))的分子置换用PCSK9结构的V结构域(Piper,D.E.等，The crystal structure of PCSK9:a regulator of plasma LDL-cholesterol(PCSK9的晶体结构：血浆LDL-胆固醇调节剂).Structure15,545-52(2007))作为开始搜索模型解析PCSK9V结构域/31A4结构。保持PCSK9450-692溶液稳定，将抗体可变结构域用作搜索模型。在初始改进后，通过手动拟合抗体恒定结构域。用以量子构建并以cnx改进的多轮模型来改善完整结构(Brunger,A.T.等，Crystallography&NMR system:A new software suite formacromolecular structure determination(结晶学和NMR系统：用于大分子结构测定的新软件套组).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr54,905-21(1998))。
将核心作用界面氨基酸确定为所有具有至少一个与PCSK9伴侣蛋白相距小于或等于的原子的氨基酸残基。选择为核心区截断值距离，以便允许在范德华力半径加上可能的水介导氢键内的原子。将边界作用界面氨基酸确定为所有具有至少一个与PCSK9伴侣蛋白小于或等于相距的原子的氨基酸残基，但排除核心作用名单。选择小于或等于作为边界区截断值距离，以允许延长的精氨酸氨基酸长度。用程序PyMOL计算满足这些距离标准的氨基酸(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.(Palo Alto,2002))。用V结构域"A"和31A4"L1、H1"复合体计算距离。
以的分辨率测定已结合31A4Fab片段的PCSK9V结构域的晶体结构。在图21A-21D中提供晶体结构的描述。图21A-21C显示31A4Fab结合亚结构域1和2的区域中的PCSK9V结构域。
制备了已结合31A4Fab的全长PCSK9模型。全长PCSK9结构在来自复合体的PCSK9V结构域上被覆盖。该模型图示于图21D中。突出显示LDLR的EGFa结构域与PCSK9之间的相互作用位点。
结构分析显示了该抗体与PCSK9相互作用的位点，并证明不结合PCSK9的LDLR结合表面的抗体仍可抑制由PCSK9介导的LDLR降解(结果可从以下实施例40和41的组合中观察到)。另外，晶体结构分析使得可鉴定参与PCSK9和31A4抗体之间的相互作用的特定氨基酸。此外，还确定了PCSK9表面上的界面的核心和边界区。将与31A4相互作用的界面的特定核心PCSK9氨基酸残基确定为在31A4蛋白内的PCSK9残基。核心残基为T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592和E593。将与31A4相互作用的界面的边界PCSK9氨基酸残基确定为与31A4蛋白相距的PCSK9残基。边界残基如下：S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595和H597。几乎或完全包埋在PCSK9蛋白内的氨基酸残基通过下划线来突出显示。如本文所述，编号引用SEQ ID NO:3的氨基酸位置(如本文所述作调整)。
与PCSK9相互作用的界面的特定核心31A4氨基酸残基确定为位于PCSK9蛋白内的31A4残基。31A4抗体的核心残基如下：重链:G27、S28、F29、S30、A31、Y32、Y33、E50、N52、H53、R56、D58、K76、G98、Q99、L100和V101；轻链:S31、N32、T33、Y50、S51、N52、N53、Q54、W92和D94。与PCSK9相互作用的界面的边界31A4氨基酸残基确定为与PCSK9蛋白相距的31A4残基。31A4的边界残基如下：重链:V2、G26、W34、N35、W47、I51、S54、T57、Y59、A96、R97、P102、F103和D104；轻链:S26、S27、N28、G30、V34、N35、R55、P56、K67、V91、D93、S95、N97、G98和W99。
晶体结构也显示了该ABP在其与PCSK9相互作用中的空间要求。如该结构所示，出人意料的是，结合PCSK9但不直接防止PCSK9与LDLR互相作用的抗体仍可抑制PCSK9的功能。
在某些实施方案中，可采用结合、遮盖或防止31A4与以上任何残基相互作用的任何抗原结合蛋白来结合或中和PCSK9。在某些实施方案中，ABP结合以下PCSK9(SEQ ID NO:3)残基中的至少一个或与其起作用：T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592和E593。在某些实施方案中，ABP位于以上残基中的一个或多个的5埃内。在某些实施方案中，ABP结合以下PCSK9(SEQ ID NO:3)残基中的至少一个或与其起作用：S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595和H597。在某些实施方案中，ABP与以上残基中的一个或多个相距5-8埃。在某些实施方案中，ABP与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50个上述残基起作用、封闭它们或位于其8埃内。
以上实施例所论述的晶体结构的坐标在表35.1(全长PCSK9和31H4)、表35.2(PCSK9和EGFa)、表35.3(PCSK9、31H4和21B12)和表35.4(PCSK9和31A4)中提供。还涵盖以下抗原结合蛋白及分子：所述抗原结合蛋白及分子与图中描述的PCSK9结构的相关区域或残基(包括与EGFa或抗体与PCSK9起作用的位点相距15、15-8、8、8-5、5或更小埃的区域或残基)和/或它们的来自所述坐标的结构上的对应位置起作用。
在所述坐标中描述的抗体是在大肠杆菌中产生的，因此具有与人全抗体的某些少数氨基酸差异。对于21B12的重链和轻链以及对于31H4的轻链而言，可变区中的第一个残基是谷氨酸而非谷氨酰胺。除可变区序列差异外，在由坐标所述抗体的恒定区中也存在某些差异同样是因为抗体是在大肠杆菌中产生的事实)。当与SEQ ID NO:156和155比较时，图22突出显示(经由下划线阴影或粗体)21B12、31H4和31A4Fab(在大肠杆菌中产生)的恒定区之间的差异。对于21B1231H4和31A4而言，轻链恒定序列与人λ(SEQ ID NO:156)相似。下划线甘氨酸残基为21B12和31H4可变序列终止与λ序列起始的位置之间的插入。
对于21B12和31H4二者而言，重链恒定区与人IgG4(SEQ ID NO:155)相似。图22中突出显示的差异示于表36.1中：
表36.1
关于31A4，尽管其也具有上述同样的特征，但有三个另外的差异。如图22所示，在起始处存在两个另外的氨基酸，它们来自大肠杆菌表达的信号肽的不完全加工。另外，当与SEQ ID NO:155比较时，在31A4重链恒定区存在一个另外的取代，即将L(在SEQ ID NO:155中)调整为H。最后，31A4具有谷氨酰胺作为Fab的起始氨基酸，而不是上述关于21B12和31H4的调整为谷氨酸。
对于所有3种抗体，重链的末端(灰色方框)也不同，但未在结构中指定(order)这些氨基酸，因而它们没有在坐标中出现。如本领域技术人员所了解，his标签不是ABP的必须部分并且不应该理解为ABP序列的一部分，除非通过提及包含组氨酸标签的特定SEQ ID NO及说明ABP序列“包含组氨酸标签”来明确表示。
实施例37
表位作图—分库
除实施例10中的实验组外，还进行了另一组分库实验。如实施例10，可将彼此竞争的ABP理解成结合靶标上的相同位点，通常的用语是“库集”在一起。
使用改良的Jia等(J.Immunological Methods,288(2004)91-98)所述多重分库法(Multiplexed Binning method)。让包被链霉抗生物素蛋白的Luminex珠粒的各别的编号珠粒(bead codes)在100ul0.5ug/ml生物素化的单价小鼠-抗人IgG捕获抗体(BD Pharmingen,#555785)中于室温在暗处孵育1小时，然后用PBSA、磷酸盐缓冲盐水(PBS)加1％牛血清白蛋白(BSA)洗涤3次。各编号珠粒与100ul的2ug/ml抗PCSK9抗体(包被抗体(Coating Antibody))分开孵育1小时，然后用PBSA洗涤3次。然后将珠粒合并，并分配到96孔过滤板(Millipore,#MSBVN1250)中。将100ul的2ug/ml纯化的PCSK9蛋白加到一半的孔中。另一半加入缓冲液作为对照。让反应物孵育1小时，然后洗涤。将100ul的2ug/ml抗PCSK9抗体(检测Ab(Detection Ab))加入到所有孔中，孵育1小时，然后洗涤。用无关的人-IgG(Jackson,#009-000-003)作为另一对照。将20ulPE缀合的单价小鼠-抗人IgG(BD Pharmingen,#555787)加入到各孔中，孵育1小时，然后洗涤。将珠粒重新悬浮于100ul的PBSA中，在BioPlex仪器(BioRad)中收集最少的100个事件/编号珠粒。
从含有PCSK9的相应反应信号中减去无PCSK9的抗体对的中位数荧光强度(MFI)。对于被认为同时结合因此在不同库中的抗体对而言，减去后的信号必须大于与自身竞争的抗体信号的3倍并且是与无关抗体竞争的抗体信号的3倍。
以上数据描述于图23A-23D中。ABP分成5个库。阴影方框表示可同时结合PCSK9的ABP。非阴影方框表示彼此竞争结合的ABP。结果概述示于表37.1中。
表37.1.
库1(与ABP21B12竞争)和3(与31H4竞争)彼此相斥；库2与库1和3竞争；库4不与库1和3竞争。本实施例中的库5表示为“杂类(catch all)”库以阐述不适合其它库的ABP。因此，在每种结合中的上述ABP代表PCSK9上的不同类型的表位位置，它们某些彼此重叠。
如本领域技术人员所了解，如果参考ABP防止探针ABP结合，那么认为所述抗体在同一个库中。其中所采用的ABP次序并不重要重要。如果采用AB PA作为参考ABP并封闭ABPB的结合，那么反过来并不总是正确的：ABP B用作参考ABP将不一定封闭ABP A。有很多因素在其中起作用：ABP的结合可引起靶标构象变化，这会防止所述第二种ABP结合；或者重叠但并不完全彼此阻塞的表位可使得所述第二种ABP与所述靶标仍有足够高的互相作用亲和力，因而允许结合。具有更高亲和力的ABP可具有较大的撞开封阻ABP的能力。一般而言，如果无论以哪一种次序都观察到竞争，那么认为ABP库集在一起，如果两种ABP都能彼此封闭，那么很可能表位更完全地重叠。
实施例38
表位作图—蛋白印迹
本发明实施例证明所检查的ABP的表位到底是线性还是立体构象。进行变性还原和变性非还原性蛋白印迹以测定哪些抗体具有构象表位。结合变性还原蛋白印迹的抗体具有线性表位并为非构象的。结果示于图24A和图24B中。对于印迹，在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶及MES SDS泳动缓冲液中进行0.5ug/道纯化的全长人PCSK9电泳。将1ug/ml抗PCSK9抗体(不包含0.5ug/ml31G11)用于探测印迹。用1:5000驴-抗人-IR700第二抗体，在LiCOR仪器上读数。抗体13H1结合PCSK9前域上的线性表位。所有其它抗体表现出符合构象表位的结果。这些凝胶将前域与蛋白的其余部分分开，前域泳动到约15kDa处。另外，3C4和31A4似乎结合由二硫键维持的构象表位，因为这些抗体在保留二硫键的变性条件下结合PCSK-9(左边)但在还原样品(右边)条件下结合消除。
实施例39
表位作图-精氨酸/谷氨酸扫描
选择来自每一库的代表性ABP(来自实施例37)用于进一步表位分析。进行精氨酸/谷氨酸扫描策略以对结合PCSK9的ABP作图。根据背景，本方法测定了残基是否为结构表位的部分，即与抗体接触或被抗体包埋的那些抗原残基。即使突变的残基不直接参与抗体结合，但精氨酸和谷氨酸侧链带有电荷并体积庞大，因此可破坏抗体结合。
残基选择
用PCSK9晶体结构来选择待突变用于表位作图的残基。用于选择残基以进行突变的方法涉及计算机制及相互作用结构分析二者。PCSK9结构含有失去残基的空位，其在N-端失去30个氨基酸(即信号序列)并在C-端失去10个氨基酸。将在内部失去的残基建模(model)到结构上，但N-和C-末端失去的残基则不如此处理。计算每一残基的溶剂暴露比例(solvent exposure ratio)：蛋白中的每一残基的表面积(SA1)除以具有保守主链结构的含侧翼甘氨酸的三聚体中的残基表面积(SA2)。选择溶剂暴露比例大于10％(R10)的残基以及40个失去的末端残基。从这些残基中排除具有正Φ角的脯氨酸和甘氨酸以降低错误折叠的可能性。通过用37％的溶剂暴露比例以及视觉检查整个蛋白来降低V结构域中待突变的残基数，以使突变总数为285。具有这些不同类标识的PCSK9表面的各种方位示于图25A-25F中。在这些图中，最淡的灰色表示未被选择或被放弃的区域，深一些的灰色表示所选择的残基。
克隆和表达
确定了待改变的残基后，改变各种残基。将人PCSK9克隆到含C-末端Flag-His标签的pTT5载体中。用Stratagene的QuikChange II试剂盒通过定点诱变由该初始构建体制备突变体。用Amgen的MutaGenie软件设计用于突变的有义和反义寡核苷酸。在24-孔板中使所有的PCSK9构建体在瞬时转染的293-6E细胞中表达，并重新注入(rerack)到3块96孔板中，在每块板中用非突变的PCSK9(野生型，WT)作为对照。通过蛋白印迹检查条件培养基中的表达水平和重组蛋白的完整性。在最初选定的285个突变体中，有41个克隆失败或表达失败。将244个突变体用于表位作图。PCSK9母本序列和代表性的具244个突变残基的PCSK9序列的比对示于图26中。制备含有单一突变的单独的构建体。为基于本发明的涉及结合变化的表位序列和表位的目的，提供关于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:303的序列。图26的序列是用于本发明结合表位研究的序列。本领域技术人员应了解，本研究的结果也可应用于本文公开的其它PCSK9变体(例如SEQ ID NO:1和3以及其它等位基因变体)。
选择代表每个库的5种抗体用于精细表位作图。它们是21B12、31H4、12H11、31A4、3C4。所有都是构象表位抗体。21B12、31H4和31A4这三种如上所述还与PCSK9结晶。
结构和功能表位
可将表位进一步确定为结构性或功能性表位。功能表位通常是结构表位的子集，具有直接有助于相互作用(例如氢键、离子互相作用)亲和力的残基。可认为结构表位是由抗体遮盖的靶标片区。
采用的扫描诱变是精氨酸和谷氨酸扫描。选择这两种侧链是由于其空间体积大及其电荷，这使得在结构表位中发生的突变对抗体结合具有更大的影响。除了当WT残基为精氨酸时外，通常采用精氨酸，当WT残基为精氨酸时，让所述残基突变为谷氨酸来转换电荷。
为了表位作图的目的，使用基于珠粒的多元测定来测量同时结合PCSK9和PCSK9突变体的抗体。然后在同一孔中比较所述抗体结合突变体的情况与抗体结合野生型的情况。将变体分为3组：第1组：81个变体+2个wt对照+1个阴性对照+1个其它PCSK9上清液；第2组：81个变体+2个wt对照+2个阴性对照；和第3组：82个变体+2个wt对照+1个阴性对照。
测定如下进行：让85组经颜色编号的包被链霉亲和素的LumAvidin珠粒(Luminex)与生物素化的抗五His抗体(Qiagen,#1019225)在室温(RT)结合1小时，然后在PBS、1％BSA、0.1％Tween20中洗涤3次。然后让每一种经颜色编号的珠粒组与PCSK9突变体、野生型或阴性对照在150ul上清液中于4℃下结合过夜。
洗涤并合并每一与特定蛋白缔合的经颜色编码的珠粒组。此时有3份85种珠粒组的集合(pool)，每一份集合对应每组突变体及对照。将来自每份集合的珠粒等份分到96孔过滤板(Millipore,#MSBVN1250)的24孔(3列)中。将100ul的抗PCSK9抗体以4倍稀释度加入到9列中作为三个重复，在室温下孵育1小时并洗涤。将100ul的1:200稀释的藻红蛋白(PE)缀合的抗人IgGFc(Jackson Immunoresearch,#109-116-170)加入到各孔中，并在室温下孵育1小时和洗涤。
让珠粒重新悬浮于1％BSA/PBS中，振荡10分钟并在BioPlex仪器(Bio-Rad)上读数。仪器通过珠粒颜色代码识别各种珠粒，藉此识别与颜色代码相关的特定蛋白。同时，通过PE染料的荧光强度测量已结合珠粒的抗体的量。然后可在同一份集合中直接比较抗体结合每种突变体的情况抗体与结合结合野生型的情况。将IL-17R嵌合体E用作阴性对照。所有检查的突变体概述示于表39.1(根据在图1A和26中使用的序列编号)中。
表39.1
珠粒变化性研究
在进行表位作图结合测定之前，进行了验证实验来评估“珠粒区”到“珠粒区”(B-B)的变化性。在验证实验中，所有珠粒都与相同野生型对照蛋白缀合。因此，珠粒区之间的差异完全是由于B-B差异，不会与野生型和突变体蛋白之间的差异混淆。在不同孔中用12个重复进行了抗体滴定。
该统计学分析的目标是评估估计的结合曲线EC50的B-B变化性。然后在曲线比较实验期间用估计的B-B标准差(SD)来构建野生型和突变体蛋白之间的EC50置信区间。
让四参数逻辑模型拟合关于每一珠粒区的结合数据。将含有曲线质量控制(QC)结果及对曲线顶端(最大)、底端(最小)、斜坡(斜率)和EC50自然对数(xmid)的参数估值的结果记录用作分析的原始数据。然后通过拟合混合效应模型用SAS PROC MIXED程序来评估关于每个参数的B-B变化性。只有具有“好”QC程度的曲线被包括在分析中。最终混合效应模型仅包括作为随机效应的残差(residual)(即单独的珠粒区)。还通过混合效应模型来评估各参数的最小二乘方均值(LS均值)。通过采用B-B差异的平方根计算B-BSD。还计算了最小二乘方均值+2SD和最小二乘方均值-2SD之间的倍数变化，其代表总体的大约百分之97.5上下。结果示于表39.2中。
表39.2最小二乘方均值和珠粒到珠粒的偏差估测
*xmid是EC50的自然对数。将xmid的倍数变化转回为原始标度。
鉴定结构表位残基
当让残基突变为精氨酸或谷氨酸改变抗体结合时，认为该残基为结构表位的一部分(“击中(hit)”)。这可视为在与抗体结合野生型相比下EC50变化或最大信号降低。用对野生型和突变体的抗体结合曲线的统计学分析来确定统计学显著的EC50变化。该分析考虑到测定中的差异和曲线拟合。
基于EC50比较的击中的确定
从用带有VarPower软件的S-PLUS(Insightful Corporation,Seattle WA)拟合结合数据的加权的4-参数逻辑模型产生EC50和Bmax值。比较突变体结合曲线和野生型结合曲线的EC50。将统计学显著差异确定为用于进一步考虑的击中。具有“不适合(nofit)”或“适合不良(badfit)”标示的曲线排除在该分析之外。
EC50估测值的差异
在比较EC50估测值时考虑两个差异来源：来自曲线拟合的差异和珠粒之间的差异。将野生型和突变体与不同的珠粒连接，因此它们之间的差异与珠粒之间的差异混淆(上述)。由logEC50估测值的标准误差来评估曲线拟合变化。用其中将野生型对照连接到每一种珠粒之一(上述)的实验实验性测定珠粒间的差异。用来自本实验的野生型结合曲线的EC50估测值中的珠粒差异来评估在实际表位作图实验中来评估珠粒间的差异。
测试突变体和野生型之间的EC50变化
用学生t-检验进行两种EC50(对数标度)的比较。t-统计计算为δ(EC50估测值之间的绝对差别)和δ标准差之比。通过3个分量之和、非线性回归曲线中突变体和野生型的EC50差异估测值和来自独立实验的2倍珠粒间差异估测值来评估δ差异。珠粒间差异的两倍归因于突变体和野生型珠粒二者具有同样差异的假定。用Satterthwaite(1946)近似值计算δ标准差的自由度。基于每一比较的学生t分布获得各别的p-值和置信区间(95％和99％)。在多个野生型对照情况下，通过挑选与突变体最相似的野生型对照(即挑选具有最大p-值者)采取保守方法。
在同时进行大量测试时，为控制假阳性进行多次调整很重要。为该分析实施两种形式的多次调整：家族模样差别率(FEW,family wise error)控制和错误发现率(FDR,false discovery rate)控制。FEW法控制一个或多个击中不真实的可能性；FDR法控制在所选择的击中之间的假阳性的预计比例。前一方法比后一方法更保守且效果更差。对于两种方法都有多种方法可用，对于本分析，对于FWE分析挑选Hochberg(1988)的方法，对于FDR分析挑选Benjamini-Hochberg(1995)FDR法。计算了关于两种方法的经调整的p-值。
结果
EC50变化
考虑如下突变为结构表位的一部分：其EC50与野生型显著不同，例如具有为0.01或更小的整个试验的经错误发现率调整的p-值。除了具有经FEW调整的p-值/抗体为0.0109的抗体31H4的残基R185E外，所有击中还具有小于0.01的关于每种抗体的经家族模样I型误差率(Familywise type I error rate)调整的p-值。通过EC50变化测定的各种抗体的结构表位中的残基示于表39.3(点突变是根据SEQ ID NO:1和303)中。
表39.3
最大信号减少
用来自曲线拟合(BmaxPerWT)和原始数据点(RawMaxPerWT)的最大信号计算百分率最大信号。考虑以下突变为击中和表位的一部分：与野生型信号相比，抗体结合最大信号降低≥70％的突变；或当所有其它抗体为野生型的至少40％时，与其它抗体相比一种抗体信号降低>50％的突变。表39.4显示通过最大信号的降低测定的在结构表位中的残基(斜体)。
表39.4
(点突变参考SEQ ID NO:1和图26)。
表39.5显示关于各种抗体的所有击中的概述。
表39.5
为了进一步调查这些残基是如何形成有关表位的一部分或全部，将上述位置作图到各种晶体结构模型中，结果示于图27A到27E中。图27A描述21B12表位击中，其根据用21B12抗体作图到PCSK9晶体结构上。结构确定PCSK9残基如下：淡灰色表示没有突变的残基(除那些在结构上明确指出的残基外)，深灰色表示那些突变的残基(少量不能表现出来)。测试了明确指出的残基(无论在图中是否用阴影表示)，所述残基导致EC50和/或Bmax显著变化。表位击中基于Bmax变化。在本图中，31H4在21B12后面。
图27B描述31H4表位击中，其根据用31H4和21B12抗体作图到PCSK9晶体结构上。结构确定PCSK9残基如下：淡灰色表示没有突变的残基(除那些在结构上明确指出的残基外)，深灰色表示那些突变的残基(少量不能表现出来)。测试了明确指出的残基(无论在图中是否用阴影表示)，所述残基导致EC50和/或Bmax显著变化。表位击中基于EC50变化。
图27C描述31A4表位击中，其根据用31H4和21B12抗体作图到PCSK9晶体结构上。结构确定PCSK9残基如下：淡灰色表示没有突变的残基(除那些在结构上明确指出的残基外)，深灰色表示那些突变的残基(少量不能表现出来)。测试了明确指出的残基(无论在图中是否用阴影表示)，所述残基导致EC50和/或Bmax显著变化。表位击中基于EC50变化。已知31A4抗体结合PCSK9的V-结构域，其表现出与图27C所示结果一致。
图27D描述12H11表位击中，其根据用31H4和21B12抗体作图到PCSK9晶体结构。结构确定PCSK9残基如下：淡灰色表示没有突变的残基(除那些在结构上明确指出的残基外)，深灰色表示那些突变的残基(少量不能表现出来)。测试了明确指出的残基(无论在图中是否用阴影表示)，所述残基导致EC50和/或Bmax显著变化。在上述分库测定中12H11与21B12和31H4竞争。
图27E描述3C4表位击中，其根据用31H4和21B12抗体作图到PCSK9晶体结构上。结构确定PCSK9残基如下：淡灰色表示没有突变的残基(除那些在结构上明确指出的残基外)，深灰色表示那些突变的残基(少量不能表现出来)。测试了明确指出的残基(无论在图中是否用阴影表示)，所述残基导致EC50和/或Bmax显著变化。
在分库测定中3C4不与21B12和31H4竞争。在结构域结合测定中3C4结合V-结构域(参见实施例40、图28A和28B的结果)。
尽管大约有十二个突变体被预期可对结合有影响(基于晶体结构)，但本实验出人意外地证明它们并非如此。如本领域技术人员所了解，以上提供的结果与晶体结构及这些抗体与PCSK-9的结合有良好的一致性。这证明所提供的结构和相应的功能数据注意确定中和ABP和PCSK9互相作用的关键残基及区域。因此，由本说明书适当地提供了具有结合上述区域能力的ABP变体。
如本领域技术人员所了解，尽管可认为B-max下降和EC50变化的击中是同一现象的表现，但严格地说，单独的B-max下降本身不能反映亲和力丧失，而是破坏某些百分比的抗体表位。尽管由B-max和EC50测定的击中没有重叠，但对结合有强烈影响的突变使得不能产生有用的结合曲线，因此对于这样的变体不能测定EC50。
如本领域技术人员所了解，同一个库(除如上所述的库5外，其为一般的杂类库)中的ABP很可能结合靶标蛋白上的重叠位点。因此，通常可将以上表位和相关残基扩展至同一个库中的所有这样的ABP。
为了进一步调查以上关于ABP31H4的结果，还改变E181R位置(E181R)，依照以上晶体结构预测所述E181R位置与R185作用形成与ABP作用的表面的一部分。尽管对其自身而言结果统计学不显著，但当与晶体结构联合时，结果表明31H4与E181R相互作用(数据未列出)。因此，位置181似乎也形成31H4ABP表位的一部分。
如上所述，以上结合数据和表位表征引用了不包含PCSK9的前面30个氨基酸的PCSK9序列(SEQ ID NO:1)。因此，与使用全长PCSK9编号系统(例如在上述晶体研究数据中所用的编号系统)的数据和实验相比，该蛋白片段和提及该片段的SEQ ID NO:的编号系统有30个氨基酸的变化。因此，与这些结果比较，应该将额外的30个氨基酸加到每一个以上表位作图结果的位置中。例如，SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:303)的位置207与SEQ ID NO:3(全长序列和在本说明书其余部分各处所用的编号系统)位置237相关。表39.6概述了关于SEQ ID NO:1(和/或SEQ ID NO:303)的上述位置如何与SEQ ID NO:3(包含信号序列)关联。
表39.6
因此，本文所述关于SEQ ID NO:1的那些实施方案也可通过它们关于SEQ ID NO:3的上述对应位置来阐述。
实施例40
PCSK9结构域结合测定
本发明实施例调查了各种ABP在PCSK9上的何处结合。
用2ug/ml在PBS中稀释的各种抗PCSK9抗体对透明的96孔maxisorp板(Nunc)进行过夜包被。用PBS/.05％Tween-20彻底洗涤板，然后用3％BSA/PBS封闭板2小时。洗涤后，让板与在通用测定稀释液(ImmunochemistryTechnologies,LLC)中稀释的全长PCSK9(SEQ ID NO:3中的31-692位氨基酸)、procat PCSK9(SEQ ID NO:3中的31-449位氨基酸)或v-结构域PCSK9(SEQ ID NO:3中的450-692位氨基酸)孵育2小时。洗涤板，以1ug/ml(在1％BSA/PBS中)加入识别procat和v-结构域以及全长PCSK9的兔多克隆生物素化抗PCSK9抗体(D8774)。通过与200ng/ml(在1％BSA/PBS中)的中性链亲和素-HRP(Thermo Scientific)接着是TMB底物(KPL)孵育来检测结合的全长、procat或v-结构域PCSK9，在650nm处测量吸光度。图28A和28B中提供的结果证明各种ABS结合PCSK9的各个部分的能力。如图28B所示，ABP31A4结合PCSK9的V结构域。
实施例41
中和性的非竞争性抗原结合蛋白
本发明实施例证明如何鉴定和表征以下抗原结合蛋白：所述抗原结合蛋白对于与PCSK9结合而言为与LDLR非竞争性，但仍能中和PCSK9活性。换言之，所述抗原结合蛋白将不封闭PCSK9与LDLR结合，但将防止或降低PCSK9介导的LDLR降解。
用在缓冲液A(100mM卡可基酸钠,pH7.4)中稀释的2ug/ml的羊抗LDL受体抗体(R&DSystems)包被透明的384孔板(Costar)。用缓冲液A充分洗涤板，然后用缓冲液B(缓冲液A中的1％牛奶)封闭2小时。洗涤后，让板与在缓冲液C(补充10mMCaCl2的缓冲液B)中稀释的0.4ug/ml的LDL受体(R&DSystems)孵育1.5小时。在该孵育的同时，让20ng/ml的生物素化D374YPCSK9与在缓冲液A中稀释的100ng/ml的抗体或单独的缓冲液A(对照)孵育。洗涤含有LDL受体的板，将生物素化D374YPCSK9/抗体混合物转移到其中，并在室温下孵育1小时。通过与缓冲液C中的500ng/ml的链霉抗生物素蛋白-HRP(Biosource)接着是TMB底物(KPL)孵育来检测生物素化D374Y与LDL受体的结合情况。用1NHCl猝灭信号，在450nm处读取吸光度。结果在图28C中提供，其显示尽管ABP31H4抑制LDLR结合，但ABP31A4不抑制LDLR与PCSK9的结合。与来自实施例40并示于图28A和28B中的结果联合起来看，很明显31A4ABP结合PCSK9的V结构域，并且不封闭PCSK9与LDLR的相互作用。
接下来，经由细胞LDL吸收测定(如以上实施例所述)进一步确认ABP31A4用作中和ABP的能力。本LDL吸收测定的结果在图28D中提供。如图28D所示，ABP31A4表现出显著的PCSK9中和能力。因此，根据实施例40及现在的结果，很明显ABP可结合PCSK9而不阻封PCSK9和LDLR结合的相互作用，因此其仍能用作中和PCSK9的ABP。
通过参考引用
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的参考文献(对所述参考文献的引用程度高于它们已经被引用的程度)在此以其整体引作参考。引用程度为当通过引用并入的参考文献中提供的任何定义或术语和本文提供的术语及论述不同时，以本文的术语和定义为准。
等同内容
前述说明书被认为足以能够使本领域技术人员实施本发明。前述说明书和实施例详述了本发明某些优选实施方案，并阐述了本发明人涵盖的最佳方式。然而，应该了解，不管前述内容在本文中可以多么详尽，本发明可以以很多方式来实施，本发明应该按照所附权利要求及其任何等同内容来理解。
表35.1
表35.2
表35.3
表35.4

Claims (38)

1. 分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
2. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为LDLR非竞争性中和抗原结合蛋白。
3. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为LDLR竞争性中和抗原结合蛋白。
4. 选择性结合PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于100 pM的Kd结合PCSK9。
5. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于10 pM的Kd结合。
6. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于5 pM的Kd结合。
7. 结合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白，其中在所述分离的抗原结合蛋白与PCSK9蛋白变体之间的结合小于所述分离的抗原结合蛋白与SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白之间的结合的50%。
8. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述变体PCSK9蛋白包含选自SEQ ID NO: 1所示的以下位置的残基的至少一个突变：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554。
9. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少一个突变选自R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R和E582R。
10. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少一个突变选自D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。
11. 以第一种方式结合SEQ ID NO: 303的PCSK 9蛋白的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以第二种方式结合PCSK9变体，其中所述PCSK9变体具有在选自SEQ ID NO: 303的以下位置处的至少一个点突变：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和554，其中所述第一种方式包含第一EC50、第一Bmax或第一EC50和第一Bmax，其中所述第二种方式包含第二EC50、第二Bmax或第二EC50和第二Bmax，其中所述第一种方式的值不同于所述第二种方式的值。
12. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一种方式包含第一EC50，其中所述第二种方式包含第二EC50，其中所述点突变选自：R207E、D208R、E181R, R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R和E582R。
13. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一EC50与所述第二EC50至少有20%不同。
14. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一EC50与所述第二EC50至少有50%不同。
15. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二EC50在数值上大于所述第一EC50。
16. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一EC50由多元珠粒结合测定来测定。
17. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二EC50大于1 uM。
18. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为中和抗原结合蛋白。
19. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白为竞争性中和抗原结合蛋白。
20. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白为非竞争性中和抗原结合蛋白。
21. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一种方式包含第一Bmax，其中所述第二种方式包含不同于所述第一Bmax的第二Bmax，并且其中所述PCSK9变体具有选自以下的至少一个点突变：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。
22. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二Bmax为所述第一Bmax的约10%。
23. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一Bmax与所述第二Bmax相差至少20%。
24. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一Bmax与所述第二Bmax相差至少50%。
25. 分离的抗体，所述分离的抗体在与LDLR结合PCSK9的位点重叠的位点处结合PCSK9。
26. 中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9并降低PCSK9对低密度脂蛋白受体(LDLR)的降低LDLR的作用。
27. 中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9，其中所述抗体在SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的位点处结合PCSK9。
28. 权利要求27的抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的表位。
29. 药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-28中任何一项的至少一种抗原结合蛋白和可药用赋形剂。
30. 编码权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白的核酸分子。
31. 制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用，所述方法包括：
提供包含编码所述抗原结合蛋白的核酸序列的宿主细胞；和
使所述宿主细胞保持在其中表达所述抗原结合蛋白的条件下。
32. 降低受治疗者血清胆固醇水平的方法，所述方法包括给予所述受治疗者有效量的分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
33. 用于治疗或预防与患者中的高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括给予需要治疗或预防的患者有效量的分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
34. 用于治疗或预防与受治疗者中的高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括给予需要治疗或预防的受治疗者有效量的分离的中和抗原结合蛋白，并同时或序贯地给予提高LDLR蛋白的利用率的药剂，其中所述分离的抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
35. 权利要求31-34中任一项的方法，其中所述提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他汀。
36. 权利要求31-35中任一项的方法，其中所述他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及它们的某些组合。
37. 权利要求1-22的抗原结合蛋白在制备用于降低血清胆固醇的药物中的用途。
38. 权利要求1-22的抗原结合蛋白在制备用于治疗或预防与受治疗者中的高血清胆固醇水平有关的病症的药物中的用途。
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