TWI633122B - 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白 - Google Patents

針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
TWI633122B
TWI633122B TW105124816A TW105124816A TWI633122B TW I633122 B TWI633122 B TW I633122B TW 105124816 A TW105124816 A TW 105124816A TW 105124816 A TW105124816 A TW 105124816A TW I633122 B TWI633122 B TW I633122B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
pcsk9
antigen
group
binding protein
seq
Prior art date
Application number
TW105124816A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201716444A (zh
Inventor
賽門 傑克森
奈吉爾 佩爾漢 柯林頓 沃克
德里克 艾凡 派普爾
單倍
沈文彥
陳志怡
恰德威克 泰倫斯 金
蘭德爾 羅伯特 凱特肯
克里斯多夫 梅琳
特麗莎 阿拉扎斯 凱洛貝
琼 曹
Original Assignee
安美基公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39951467&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI633122(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 安美基公司 filed Critical 安美基公司
Publication of TW201716444A publication Critical patent/TW201716444A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI633122B publication Critical patent/TWI633122B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

本發明描述與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(PCSK9)相互作用之抗原結合蛋白。本發明描述藉由投與醫藥學上有效量的針對PCSK9之抗原結合蛋白以治療高膽固醇血症及其他病症的方法。本發明描述使用針對PCSK9之抗原結合蛋白偵測樣品中之PCSK9之量的方法。

Description

針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型之抗原結合蛋白
本發明是關於與前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)結合之抗原結合蛋白及所述抗原結合蛋白之使用及製備方法。
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(PCSK9)為一種參與調控低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)蛋白之含量的絲胺酸蛋白酶(Horton等人，2007；Seidah及Prat,2007)。試管內(in vitro)實驗顯示向HepG2細胞中添加PCSK9會降低細胞表面LDLR之含量(Benjannet等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)。小鼠實驗顯示增加的PCSK9蛋白含量使肝中LDLR蛋白含量降低(Benjannet等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)，而PCSK9敲除小鼠肝中之LDLR含量增加(Rashid等人，2005)。另外，已鑑別多種達成血漿LDL含量增加或降低之人類PCSK9突變(Kotowski等人，2006；Zhao等人，2006)。已證實PCSK9在整個內體路徑(endosomal pathway)中直接與LDLR蛋白相互作用，與LDLR一起被內吞，且與LDLR一起經歷免疫螢光(Lagace等人，2006)。尚未觀察到PCSK9引起LDLR降解，且尚不確定PCSK9降低細胞外LDLR 蛋白含量之機理。
PCSK9為絲胺酸蛋白酶之枯草桿菌蛋白酶(S8)家族中的一種前激素-前蛋白轉化酶(Seidah等人，2003)。人類有9種前激素-前蛋白轉化酶，可將其分為S8A與S8B次家族(subfamily)(Rawlings等人，2006)。Furin、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6及PC7/PC8/LPC/SPC7歸屬於S8B次家族。小鼠furin及PC1之不同域之晶體及NMR結構展現枯草桿菌蛋白酶樣前域(subtilisin-like pro-domain)及催化域(catalytic domain)，以及緊鄰催化域C-末端之P域(Henrich等人，2003；Tangrea等人，2002)。基於所述次家族中胺基酸序列之相似性，預測7個成員都具有類似結構(Henrich等人，2005)。SK1-1/S1P及PCSK9屬於S8A次家族。所述蛋白之序列比較亦建議存在有枯草桿菌蛋白酶樣前域及催化域(Sakai等人，1998；Seidah等人，2003；Seidah等人，1999)。在所述蛋白中，催化域C-末端之胺基酸序列更具變異性且未建議有P域存在。
前激素-前蛋白轉化酶被表現為酶原(zymogen)且其經由多步過程成熟。前域在所述過程中具有雙重功能。前域首先充當伴護蛋白(chaperone)且為催化域正確摺疊所需(Ikemura等人，1987)。一旦催化域摺疊，前域與催化域之間即發生自催化(autocatalysis)。所述最初裂解反應後，前域仍與催化域結合，而其則充當催化活性抑制劑(Fu等人，2000)。當條件適當時，成熟在前域中某一位點處繼續進行第二自催化事件(Anderson等人，1997)。所述第二裂解事件發生後，前域與催化域解離，產生活性蛋白酶。
PCSK9酶原之自催化在Glnl52與Serl53(VFAQ | SIP)之間發生(Naureckiene等人，2003)，且已證實為其自細胞分泌所必需(Seidah等人，2003)。尚未觀察到第二自催化事件發生於PCSK9前域中任一位點處。利用非還原型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)可分離出組成純化PCSK9之兩種物質：即前域(於17千道爾頓(Kd)分離)及催化域加C-末端域(於65千道爾頓分離出)。尚未分離出不具有抑制性前域的PCSK9，且PCSK9之催化活性之量度變化不定(Naureckiene等人，2003；Seidah等人，2003)。
在一些實施例中，本發明包括針對PCSK9之抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離的抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)一或多個選自由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(heavy chain complementary determining region，CDRH)：(i)CDRH1來自於選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH1：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；(ii)CDRH2來自於選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH2：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；(iii)CDRH3來自於選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH3：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；及(iv)含有一或多個不超過4個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRH；B)一或多個選自由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(light chain complementary determining region，CDRL)：(i)CDRL1來自於選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL1：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；(ii)CDRL2來自於選自由 以下序列組成之族群的序列中之CDRL2：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；(iii)CDRL3來自於選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL3：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；及(iv)含有一或多個不超過4個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRL；或C)一或多個A)之重鏈CDRH及一或多個B)之輕鏈CDRL。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白包括至少一個A)之CDRH及至少一個B)之CDRL。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白包括至少兩個A)之CDRH及至少兩個B)之CDRL。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白包括所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些實施例中，A)之CDRH是選自至少一個由以下各者組成之族群：(i)CDRH1胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49所組成之族群中選出的序列中之CDRH1；(ii)CDRH2胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49組成之族群中選出的序列中之CDRH2；(iii)CDRH3胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49組成之族群中選出的序列中之CDRH3；及(iv)含有一或多個不超過2個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRH。另外，B)之CDRL是選自至少一個由以下各者組成之族群：(i)CDRL1胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：12、35、32及23組成之族群中選出的序列中之CDRL1；(ii)CDRL2胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：12、35、32及23組成之族群中選出的序列中之CDRL2；(iii)CDRL3胺基酸序列選自從由SEQ ID NO：12、35、32及23組成之族群中選出的序列中之CDRL3；及(iv)含有一或多個不超過2個胺基酸之胺基酸取 代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRL；或C)一或多個A)之重鏈CDRH及一或多個B)之輕鏈CDRL。在一些實施例中，A)之CDRH是選自至少一個由以下各者組成之族群：(i)SEQ ID NO：67中之CDRH1胺基酸序列的CDRH1胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO：67中之CDRH2胺基酸序列的CDRH2胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO：67中之CDRH3胺基酸序列的CDRH3胺基酸序列；及(iv)含有一或多個不超過2個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRH；所述B)之CDRL是選自至少一個由以下各者組成之族群：(i)SEQ ID NO：12中之CDRL1胺基酸序列的CDRL1胺基酸序列；(ii)SEQ ID NO：12中之CDRL2胺基酸序列的CDRL2胺基酸序列；(iii)SEQ ID NO：12中之CDRL3胺基酸序列的CDRL3胺基酸序列；及(iv)含有一或多個不超過2個胺基酸之胺基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)及(iii)之CDRL；或C)一或多個A)之重鏈CDRH及一或多個B)之輕鏈CDRL。在一些實施例中，抗原結合蛋白包括A)SEQ ID NO：67中之CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO：67中之CDRH2序列的CDRH2及SEQ ID NO：67中之CDRH3序列的CDRH3，及B)SEQ ID NO：12中之CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO：12中之CDRL2序列的CDRL2及SEQ ID NO：12中之CDRL3序列的CDRL3。在一些實施例中，抗原結合蛋白包括與選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區(VH)：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60，及/或與選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列具有至少80%序列一致性的輕鏈可變區(VL)：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些實施例中，VH 與選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列具有至少90%之序列一致性：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60，及/或VL與選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列具有至少90%之序列一致性：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些實施例中，VH是選自由以下序列組成之族群：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60，及/或VL是選自由以下序列組成之族群：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。
就某些方面而言，本發明包括能與由本文中所揭露之任何抗原結合蛋白(ABP)所結合之抗原決定基(epitope)呈特異性結合的經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，其中抗原結合蛋白包括：A)一或多個選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈CDR(CDRH)：(i)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH1具有至少80%序列一致性的CDRH1：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；(ii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH2具有至少80%序列一致性的CDRH2：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；及(iii)與一個選 自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH3具有至少80%序列一致性的CDRH3：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、79、80、76、77、78、83、69、81及60；B)一或多個選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈CDR(CDRL)：(i)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL1具有至少80%序列一致性的CDRL1：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；(ii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL2具有至少80%序列一致性的CDRL2：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；(iii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL3具有至少80%序列一致性的CDRL3：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；或C)一或多個A)之重鏈CDRH及一或多個B)之輕鏈CDRL。在一些實施例中，抗原結合蛋白包括：A)一或多個選自至少一個由以下各者組成之族群的CDRH：(i)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH1具有至少90%序列一致性的CDRH1：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；(ii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH2具有至少90%序列一致性的CDRH2：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；及(iii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRH3具有至少 90%序列一致性的CDRH3：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60；B)一或多個選自至少一個由以下各者組成之族群的CDRL：(i)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL1具有至少90%序列一致性的CDRL1：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；(ii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL2具有至少90%序列一致性的CDRL2：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；及(iii)與一個選自由以下序列組成之族群的序列中之CDRL3具有至少90%序列一致性的CDRL3：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46；或C)一或多個A)之重鏈CDRH及一或多個B)之輕鏈CDRL。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)選自從由SEQ ID NO：67、79及49組成之族群選出的序列中之CDRH3的CDRH3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH3不同的CDRH3；及(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：404)，其中X1是選自由D、A、R及無胺基酸組成之族群，X2是選自由Y、I、G及無胺基酸組成之族群，X3是選自由D、A、G及無胺基酸組成之族群，X4是選自由F、A、L及無胺基酸組成之族群，X5是選自由W、L、A及無 胺基酸組成之族群，X6是選自由S、Y、A及無胺基酸組成之族群，X7是選自由A、Y、R及無胺基酸組成之族群，X8是選自由Y、P及無胺基酸組成之族群，X9是選自由Y、G及無胺基酸組成之族群，X10是選自由D、G及無胺基酸組成之族群，X11是選自由A、M及無胺基酸組成之族群，X12是選自由F、D及無胺基酸組成之族群，X13是選自由D、V及無胺基酸組成之族群，X14是選自由V及無胺基酸組成之族群；B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)選自從由SEQ ID NO：12、35及23組成之族群選出的序列中之CDRL3的CDRL3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL3不同的CDRL3；(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO：405)組成之族群的CDRL3胺基酸序列，其中X1是選自由Q及G組成之族群，X2是選自由S、T、A及無胺基酸組成之族群，X3是選自由Y、無胺基酸及W組成之族群，X4是選自由D及無胺基酸組成之族群，X5是選自由S及無胺基酸組成之族群，X6是選自由S及無胺基酸組成之族群，X7是選自由L、T及無胺基酸組成之族群，X8是選自由無胺基酸、A及S組成之族群，X9是選自由無胺基酸、G、A及V組成之族群，X10是選自由無胺基酸、S、Y及V組成之族群，X11是選自由無胺基酸及V組成之族群。
就某些方面而言，本發明包括經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括具有選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列的輕鏈：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46及其組合。
在一些實施例中，所述抗原結合蛋白與由本文中所揭露之至少一個抗原結合蛋白所結合之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中， 經分離抗原結合蛋白進一步包括具有選自由以下序列組成之族群的胺基酸序列的重鏈：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60及其組合。在一些實施例中，ABP之胺基酸序列是選自由SEQ ID NO：12、35、23及其組合組成之族群。在一些實施例中，ABP之重鏈包括SEQ ID NO：67之CDRH3、SEQ ID NO：67之CDRH2及SEQ ID NO：67之CDRH1，且所述輕鏈包括SEQ ID NO：12之CDRL3、SEQ ID NO：12之CDRL2及SEQ ID NO：12之CDRL1。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人化抗體、嵌合抗體、多重特異性抗體或其抗體片段。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體(diabody)或單鏈抗體分子。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為人類抗體。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為單株抗體。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為IgG4型或IgG2型。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白與標記基團偶合。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白與本文中所述之抗原結合蛋白競爭結合PCSK9。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白與標記基團偶合。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白減弱PCSK9與LDLR之結合。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白當向個體投與時降低所述個體中所存在之LDL之量。在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白當向個體投與時降低所述個體中所存在之血清膽固醇之量。 在一些實施例中，經分離抗原結合蛋白當向個體投與時增加所述個體中所存在之LDLR之量。
就某些方面而言，本發明包括載體，所述載體包括如本文中所述之核酸分子。在一些實施例中，本發明包括宿主細胞，所述宿主細胞包括如本文中所述之核酸分子。
就某些方面而言，本發明包括與本文中所揭露之抗原結合蛋白競爭結合PCSK9的經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括編碼如本文中所揭露之抗原結合蛋白的核酸分子。
就某些方面而言，本發明包括醫藥組成物，所述醫藥組成物包括至少一種本文中所述之抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括治療或預防患者之與高血清膽固醇含量相關之病狀的方法，所述方法包括向有需要之患者投與有效量之至少一種本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括抑制個體中PCSK9與LDLR之結合的方法，所述方法包括投與有效量之至少一種本文中所揭露之抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括與PCSK9選擇性結合之抗原結合蛋白，其中抗原結合蛋白以小於100皮莫耳濃度(pM)之Kd與PCSK9結合。
就某些方面而言，本發明包括治療或預防個體之與高血清膽固醇含量相關之病狀的方法，所述方法包括與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向有需要之個體投與有效量之至少一種本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括降低個體中血清膽固醇含量之方法，所述方法包括向個體投與有效量之至少一種如本文中所揭露之經 分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括降低個體中血清膽固醇含量之方法，所述方法包括與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向個體投與有效量之至少一種如本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括增加個體中LDLR蛋白含量之方法，所述方法包括向個體投與有效量之至少一種如本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括增加個體中LDLR蛋白含量之方法，所述方法包括與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向個體投與有效量之至少一種如本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括醫藥組成物，所述醫藥組成物包括如本文中所揭露之ABP及提昇LDLR蛋白含量可用性之藥劑。在一些實施例中，所述提昇LDLR蛋白可用性之藥劑包括士他汀(statin)。在一些實施例中，士他汀是選自由以下各物組成之族群：阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及其組合。
就某些方面而言，本發明包括製備如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，所述方法包括自分泌所述抗原結合蛋白之宿主細胞來製備所述抗原結合蛋白的步驟。
就某些方面而言，本發明包括醫藥組成物，所述醫藥組成物包括至少一種如本文中所述之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組成物進一步包括其他活性劑。在一些實施例中，所述其他活性劑是選自由放射性同位素(radioisotope)、放射性核素(radionuclide)、毒素(toxin)或治療基團(therapeutic)及化 學治療基團(chemotherapeutic group)組成之族群。
就某些方面而言，本發明包括治療或預防患者之與高血清膽固醇含量相關之病狀的方法。所述方法包括向有需要之患者投與有效量之至少一種如本文中所揭露之經分離抗原結合蛋白。在一些實施例中，病狀為高膽固醇血症(hypercholesterolemia)。
就某些方面而言，本發明包括抑制患者中PCSK9與LDLR之結合的方法，所述方法包括投與有效量之至少一種如本文中所述之抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括以小於100皮莫耳濃度之Kd與PCSK9結合的抗原結合蛋白。在一些實施例中，抗原結合蛋白以小於10皮莫耳濃度之Kd結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白以小於5皮莫耳濃度之Kd結合。
就某些方面而言，本發明包括治療或預防個體之與高血清膽固醇含量相關之病狀的方法，所述方法包括與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向有需要之個體投與有效量之至少一種本文中所述之經分離抗原結合蛋白。在一些實施例中，所述提昇LDLR蛋白可用性之藥劑包括士他汀。在一些實施例中，士他汀是選自由以下各物組成之族群：阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀、辛伐他汀及其組合。
就某些方面而言，本發明包括降低個體中血清膽固醇含量之方法。所述方法包括向個體投與有效量之至少一種如本文中所述之經分離抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括降低個體中血清膽固醇含量之方法，所述方法包括與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向個體投與有效量之至少一種如本文中所述之經分離抗原結合蛋白。在一些實施例中，所述提昇LDLR蛋白可用性之藥劑包括士他汀。在一些實 施例中，士他汀是選自由以下各物組成之族群：阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀、辛伐他汀及其組合。
就某些方面而言，本發明包括藉由向個體投與有效量之至少一種如本文中所提供之經分離抗原結合蛋白來增加個體中LDLR蛋白含量的方法。
就某些方面而言，本發明包括藉由與提昇LDLR蛋白可用性之藥劑同時或相繼向個體投與有效量之至少一種如本文中所述之經分離抗原結合蛋白來增加個體中LDLR蛋白含量的方法。在一些實施例中，所述提昇LDLR蛋白含量可用性之藥劑包括士他汀。在一些實施例中，士他汀是選自由以下各物組成之族群：阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀、辛伐他汀及其組合。
就某些方面而言，本發明包括與PCSK9結合且降低PCSK9對低密度脂蛋白受體(LDLR)之LDLR降低效應(LDLR lowering effect)的中和抗體(neutralizing antibody)。在一些實施例中，抗體與PCSK9特異性結合。在一些實施例中，抗體與PCSK9之催化域結合。在一些實施例中，抗體與SEQ ID NO：3之殘基31-447中之抗原決定基結合。在一些實施例中，抗體與與SEQ ID NO：3具有至少90%胺基酸序列一致性的PCSK9結合。
就某些方面而言，本發明包括與PCSK9結合之中和抗原結合蛋白(neutralizing antigen binding protein)，其中所述抗原結合蛋白在SEQ ID NO：3之殘基31-447中之某一位置處與PCSK9結合。在一些實施例中，當抗原結合蛋白結合於PCSK9時，所述抗體與PCSK9之至少一個下述殘基相隔8埃(angstrom)或小於8埃：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、 F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在一些實施例中，抗體與PCSK9之至少一個下述殘基相隔8埃或小於8埃：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少一個下述殘基相隔5埃或小於5埃：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少兩個以下殘基相隔5埃或小於5埃：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少四個以下殘基相隔5埃或小於5埃：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、 S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少一個下述殘基相隔8埃或小於8埃：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386或Q387。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少一個下述殘基相隔5埃或小於5埃：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少兩個以下殘基相離5埃或小於5埃：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少四個以下殘基相隔5埃或小於5埃：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383或G384。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少一個下述殘基相隔8埃或小於8埃：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、 D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、HI93、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少一個下述殘基相隔5埃或小於5埃：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少兩個以下殘基相離5埃或小於5埃：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。在一些實施例中，抗體位置與PCSK9之至少四個以下殘基相隔5埃或小於5埃：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377或F379。
就某些方面而言，本發明包括與PCSK9結合之中和抗體，其中抗體與PCSK9結合且減小PCSK9與LDLR結合之概率(likelihood)。
在一些實施例中，涵蓋與PCSK9結合之抗體或抗原結合分子。抗體在SEQ ID NO：3之殘基31-447中之某一位置處與PCSK9結合。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合分子當結合於PCSK9時，位於離PCSK9之至少一個下述殘基8埃或小於8埃處：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、 S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在一些實施例中，提供經分離抗體或抗原結合分子以阻斷抗體在PCSK9之殘基8埃範圍內與PCSK9結合。在一些實施例中，PCSK9之殘基是選自至少一個下述PCSK9殘基：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、 S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在一些實施例中，提供經分離抗體或抗原結合分子，其在與LDLR結合PCSK9之位置重疊處與PCSK9結合。在一些實施例中，LDLR與PCSK9結合之位置包含至少一個選自由以下殘基組成之族群的胺基酸殘基：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380及S381。
在一些實施例中，提供與PCSK9結合之經分離抗體或抗原結合分子。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合分子降低EGFa會在PCSK9上之至少一個下述殘基8埃範圍內與PCSK9結合之概率：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。
在一些實施例中，提供與PCSK9之表面結合的抗體、抗原結合蛋白或抗原結合分子，所述表面與EGFa結合、Ab 21B12結合及/或31H4結合之表面重疊。在一些實施例中，提供以類似於圖中所描繪之方式與PCSK9結合的抗體、抗原結合蛋白或抗原結合分子。
在一些實施例中，上述實施例為中和抗體或抗原結合蛋白。在一些實施例中，抗原結合蛋白不為LDLR或其片段(諸如EGFa)。
就某些方面而言，本發明包括經分離中和抗體，其中當所述抗體結合於PCSK9時，抗體位於離PCSK9之至少一個下述殘基8埃或小於8埃處：SEQ ID NO：3之T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592、E593、S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、 T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595及H597。在一些實施例中，抗體位於離PCSK9之至少一個下述殘基5埃或小於5埃處：SEQ ID NO：3之T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592及E593。
就某些方面而言，本發明包括經分離抗原結合蛋白。抗原結合蛋白包括A)SEQ ID NO：89中之CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO：89中之CDRH2序列的CDRH2及SEQ ID NO：89中之CDRH3序列的CDRH3，及B)SEQ ID NO：32中之CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO：32中之CDRL2序列的CDRL2及SEQ ID NO：32中之CDRL3序列的CDRL3。
就某些方面而言，本發明包括與SEQ ID NO：1之PCSK9蛋白結合之經分離抗原結合蛋白，其中所述經分離抗原結合蛋白與變異PCSK9蛋白之間的結合小於經分離抗原結合蛋白與SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：303之PCSK9蛋白之間的結合的50%。在一些實施例中，變異PCSK9蛋白包括至少一個由以下位置組成或包括以下位置之族群的位置處的殘基突變：如SEQ ID NO：1中所示之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些實施例中，所述至少一個突變是選自包括以下突變或由以下突變組成之族群：R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及E582R。在一些實施例中，所述至少一個突變是選自由以下突變組成之族群：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。
就某些方面而言，本發明包括以第一種方式與SEQ ID NO：303之PCSK-9蛋白結合且以第二種方式與PCSK9之變異體結合的抗原結合蛋白。PCSK9變異體具有至少一個位於選自包括以下位置或由以下位置組成之族群的位置處的點突變：SEQ ID NO：303及/或SEQ ID NO：1之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些實施例中，第一種方式包括第一EC50、第一Bmax或第一EC50及第一Bmax。在一些實施例中，第二種方式包括第二EC50、第二Bmax或第二EC50及第二Bmax。第一種方式之值與第二種方式之值不同。在一些實施例中，第一種方式包括第一EC50，其中第二種方式包括第二EC50，且其中點突變是選自由以下突變組成或包括以下突變之族群：R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及E582R。在一些實施例中，第一EC50與第二EC50至少20%不同。在一些實施例中，第一EC50與第二EC50至少50%不同。在一些實施例中，第二EC50為比第一EC50大的數值。在一些實施例中，第一EC50由多路珠粒結合檢定(multiplex bead binding assay)測定。在一些實施例中，第二EC50大於1微米。在一些實施例中，抗原結合蛋白為中和抗原結合蛋白。在一些實施例中，中和抗原結合蛋白為競爭性中和抗原結合蛋白。在一些實施例中，中和抗原結合蛋白為非競爭性中和抗原結合蛋白。在一些實施例中，第一種方式包括第一Bmax，且第二種方式包括不同於第一Bmax之第二Bmax。PCSK9變異體具有至少一個選自由以下突變組成或包括以下突變之族群的點突變：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。在一些實施例中，第二Bmax為第一Bmax之約10%。在一些實施例中，第一Bmax與第二Bmax至少20%不同。在一些實施例 中，第一Bmax與第二Bmax至少50%不同。
就某些方面而言，本發明包括與SEQ ID NO：3之PCSK9蛋白結合之經分離抗原結合蛋白，其中抗原結合蛋白之抗原決定基包含SEQ ID NO：1之至少一個下述胺基酸：207、208、181、185、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。
就某些方面而言，本發明包括與包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列的PCSK9蛋白結合之經分離中和抗原結合蛋白，其中中和抗原結合蛋白減小PCSK9對LDLR之LDLR降低效應。在一些實施例中，抗原結合蛋白為LDLR非競爭性中和抗原結合蛋白。在一些實施例中，抗原結合蛋白為LDLR競爭性中和抗原結合蛋白。
就某些方面而言，本發明包括經分離抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包括：A)SEQ ID NO：49中之CDRH1序列的CDRH1、SEQ ID NO：49中之CDRH2序列的CDRH2及SEQ ID NO：49中之CDRH3序列的CDRH3，及B)SEQ ID NO：23中之CDRL1序列的CDRL1、SEQ ID NO：23中之CDRL2序列的CDRL2及SEQ ID NO：23中之CDRL3序列的CDRL3。
就某些方面而言，本發明包括組成物，所述組成物包括結晶PCSK9蛋白及與PCSK9結合之抗原結合蛋白。組成物包括結晶PCSK9蛋白，使得PCSK9蛋白的三維結構可經測定為達約2.2埃或更佳之解析度。在一些實施例中，抗原結合蛋白為抗體或其片段。
就某些方面而言，本發明包括結晶PCSK9蛋白及LDLR蛋白之至少EGFa區段，其中LDLR蛋白之EGFa區段與PCSK9蛋白結合，其中所述結晶PCSK9蛋白使得PCSK9蛋白之三維結構可經測定為達約2.2埃或更佳之解析度。在一些實施例中，分子模型存在電腦可讀媒體中。
就某些方面而言，本發明包括如本文中所述之抗原結合蛋白在製 備用於降低血清膽固醇之藥物中的用途。
就某些方面而言，本發明包括如本文中所述之抗原結合蛋白在製備用於治療或預防個體之與高血清膽固醇含量相關之病狀的藥物中的用途。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH1選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49組成之族群中選出的序列中之CDRH1；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH1不同的CDRH1；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO：406)組成之族群的CDRH1胺基酸序列，其中X1是選自由G組成之族群，X2是選自由Y、F及G組成之族群，X3是選自由T及S組成之族群，X4是選自由L及F組成之族群，X5是選自由T、S及N組成之族群，X6是選自由S及A組成之族群，X7是選自由Y及F組成之族群，X8是選自由G、S及Y組成之族群，X9是選自由I、M及W組成之族群，X10是選自由S、N及H組成之族群，B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL1選自從由SEQ ID NO：12、32、35及23組成之族群中選出的序列中之CDRL1；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL1不同的CDRL1；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：407)組成之族群的CDRL1胺基酸序列，其中X1是選自由T及無胺基酸組成之族群，X2是選自由G及S組成之族群，X3是選自由S、T及G組成之族群，X4是選自由S組成之族群，X5是選自由S組成之族群，X6是選自由N、D及S組成之族群，X7是選自由I、V及N組成之族群，X8是選自由G及I組成之族群，X9是選自由A及G組成之族群，X10是選自由G、Y、S及 N組成之族群，X11是選自由Y及N組成之族群，X12是選自由D、S、T及F組成之族群，X13是選自由V組成之族群，X14是選自由S、N及H組成之族群。熟習此項技術者應瞭解，單一抗原結合蛋白ABP或抗體會滿足一或多個上述選項且亦屬於就所述實施例所述之本發明。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH2選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49組成之族群中選出的序列中之CDRH2；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH2不同的CDRH2；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(SEQ ID NO：408)組成之族群的CDRH2胺基酸序列，其中X1是選自由W、S、L及無胺基酸組成之族群，X2是選自由V、I及E組成之族群，X3是選自由S、W及I組成之族群，X4是選自由F、S及N組成之族群，X5是選自由Y、S、D及H組成之族群，X6是選自由N、S及G組成之族群，X7是選自由S及G組成之族群，X8是選自由N、Y、D及R組成之族群，X9是選自由T、I及E組成之族群，X10是選自由N、S、Y及D組成之族群，X11是選自由Y組成之族群，X12是選自由A及N組成之族群，X13是選自由Q、D及P組成之族群，X14是選自由K及S組成之族群，X15是選自由L及V組成之族群，X16是選自由Q及K組成之族群，X17是選自由G及S組成之族群，B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL2選自從由SEQ ID NO：12、32、35及23組成之族群中選出的序列中之CDRL2；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL2不同的CDRL2；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO：409)組成之族群的CDRL2胺基酸序列，其中X1是選自由G、E、S及D組成之族 群，X2是選自由N、V及Y組成之族群，X3是選自由S及N組成之族群，X4是選自由N、Q及K組成之族群，X5是選自由R組成之族群，X6是選自由P組成之族群，X7是選自由S組成之族群。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH3選自從由SEQ ID NO：67、79、89及49組成之族群中選出的序列中之CDRH3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH3不同的CDRH3；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：410)組成之族群的CDRH3胺基酸序列，其中X1是選自由D及無胺基酸組成之族群，X2是選自由Y、A及無胺基酸組成之族群，X3是選自由D、I及無胺基酸組成之族群，X4是選自由F、A及無胺基酸組成之族群，X5是選自由W、A及無胺基酸組成之族群，X6是選自由S、L及無胺基酸組成之族群，X7是選自由A、Y、G及無胺基酸組成之族群，X8是選自由Y、Q及無胺基酸組成之族群，X9是選自由G、Y及L組成之族群，X10是選自由Y、D及V組成之族群，X11是選自由G、A及P組成之族群，X12是選自由M及F組成之族群，X13是選自由D組成之族群，X14是選自由V及Y組成之族群，及B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL3選自從由SEQ ID NO：12、32、35及23組成之族群中選出的序列中之CDRL3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL3不同的CDRL3；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO：411)組成之族群的CDRL3胺基酸序列，其中X1是選自由Q、A、G及無胺基酸組成之族群，X2是選自由S、V、T及無胺基酸組成之族群，X3是選自由Y、N及W組成之族群，X4是選自由S及D組成之族 群，X5是選自由S、Y及D組成之族群，X6是選自由S及T組成之族群，X7是選自由L及S組成之族群，X8是選自由S、T及N組成之族群，X9是選自由G、S及A組成之族群，X10是選自由S、M、W及Y組成之族群，及X11是選自由V組成之族群。在一些實施例中，任何以上胺基酸可由保守性胺基酸取代置換。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH1選自從由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及58組成之族群中選出的序列中之CDRH1；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH1不同的CDRH1；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO：412)組成之族群的CDRH1胺基酸序列，其中X1是選自由G、P及A組成之族群，X2是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X3是選自由T、P、S及A、C、V、L及I組成之族群，X4是選自由L、F、I、V、M、A及Y組成之族群，X5是選自由T、P、S及A組成之族群，X6是選自由S、T、A及C組成之族群，X7是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X8是選自由G、P及A組成之族群，X9是選自由I、L、V、M、A及F組成之族群，X10是選自由S、T、A及C組成之族群，B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL1選自從由SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及24組成之族群中選出的序列中之CDRL1；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL1不同的CDRL1；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO：413)組成之族群的CDRL1胺基酸序列，其中X1是選自由T及S組成之族群，X2是選自由G、P及A組成之族群，X3是選自由T及S組成之族 群，X4是選自由S、N、T、A、C及Q組成之族群，X5是選自由S、T、A及C組成之族群，X6是選自由D及E組成之族群，X7是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群，X8是選自由G、P及A組成之族群，X9是選自由G、A、R、P、V、L、I、K、Q及N組成之族群，X10是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X11是選自由N及Q組成之族群，X12是選自由Y、S、W、F、T、A及C組成之族群，X13是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群，X14是選自由S、T、A及C組成之族群。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH2選自從由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及58組成之族群中選出的序列中之CDRH2；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH2不同的CDRH2；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(SEQ ID NO：414)組成之族群的CDRH2胺基酸序列，其中X1是選自由W、Y及F組成之族群，X2是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群，X3是選自由S、T、A及C組成之族群，X4是選自由A、F、V、L、I、Y及M組成之族群，X5是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X6是選自由N及Q組成之族群，X7是選自由G、P及A組成之族群，X8是選自由N及Q組成之族群，X9是選自由T及S組成之族群，X10是選自由N及Q組成之族群，X11是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X12是選自由A、V、L及I組成之族群，X13是選自由Q、E、N及D組成之族群，X14是選自由K、R、Q及N組成之族群，X15是選自由L、F、V、I、M、A及Y組成之族群，X16是選自由Q及N組成之族群，X17是選自由G、P及A組成之族群，B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL2選自從由SEQ ID NO：14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23及24組成之族群中選出的序列中之CDRL2；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL2不同的CDRL2；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO：415)組成之族群的CDRL2胺基酸序列，其中X1是選自由E及D組成之族群，X2是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群，X3是選自由S、T、A及C組成之族群，X4是選自由N及Q組成之族群，X5是選自由R、K、Q及N組成之族群，X6是選自由P及A組成之族群，X7是選自由S、T、A及C組成之族群。
就某些方面而言，本發明包括結合PCSK9之經分離抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包括：A)選自至少一個由以下各者組成之族群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)CDRH3選自從由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及58組成之族群中選出的序列中之CDRH3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRH3不同的CDRH3；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：416)組成之族群的CDRH3胺基酸序列，其中X1是選自由G、P、A及無胺基酸組成之族群，X2是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X3是選自由G、V、P、A、I、M、L及F組成之族群，X4是選自由M、L、F及I組成之族群，X5是選自由D及E組成之族群，X6是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群，B)選自至少一個由以下各者組成之族群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)CDRL3選自從由SEQ ID NO：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及24組成之族群中選出的序列中之CDRL3；(ii)在胺基酸序列方面因不超過2個胺基酸之胺基酸添加、缺失或取代而與(i)之CDRL3不同的CDRL3；及(iii)選自由X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO：417)組成之族群的CDRL3胺基酸序列，其中X1是選自由S、N、T、A、C及Q組成之族群，X2是選自 由S、T、A及C組成之族群，X3是選自由Y、W、F、T及S組成之族群，X4是選自由T及S組成之族群，X5是選自由S、T、A及C組成之族群，X6是選自由S、T、A及C組成之族群，X7是選自由N、S、Q、T、A及C組成之族群，X8是選自由M、V、L、F、I及A組成之族群，X9是選自由V、I、M、L、F及A組成之族群。
圖1A描繪PCSK9之成熟形式之胺基酸序列，其中前域加下劃線。
圖1B1至圖1B4描繪PCSK9之胺基酸及核酸序列，其中前域加下劃線且信號序列加粗。
圖2A至圖2D為多種抗原結合蛋白之各輕鏈的序列比較表。圖2C接續圖2A中開始之序列。圖2D接續圖2B中開始之序列。
圖3A至圖3D為多種抗原結合蛋白之各重鏈的序列比較表。圖3C接續圖3A中開始之序列。圖3D接續圖3B中開始之序列。
圖3E至圖3JJ描繪本發明一些實施例之抗原結合蛋白之可變域的胺基酸及核酸序列。
圖3KK描繪多個恆定域之胺基酸序列。
圖3LL至圖3BBB描繪本發明一些實施例之抗原結合蛋白之可變域的胺基酸及核酸序列。
圖3CCC至圖3JJJ為本發明一些實施例之抗原結合蛋白之各重鏈及輕鏈的序列比較表。
圖4A為抗原結合蛋白與人類PCSK9之一結合曲線。
圖4B為抗原結合蛋白與人類PCSK9之一結合曲線。
圖4C為抗原結合蛋白與獼猴PCSK9之一結合曲線。
圖4D為抗原結合蛋白與獼猴PCSK9之一結合曲線。
圖4E為抗原結合蛋白與小鼠PCSK9之一結合曲線。
圖4F為抗原結合蛋白與小鼠PCSK9之一結合曲線。
圖5A描繪涉及PCSK9及多種抗原結合蛋白之SDS PAGE實驗之結果以證明蛋白質之相對純度及濃度。
圖5B及圖5C為描繪21B12之biacore溶液平衡檢定之圖。
圖5D為描繪biacore捕獲檢定之動力學之圖。
圖5E為描繪三種ABP之分倉結果之條形圖。
圖6A為試管內PCSK9：LDLR結合檢定中抗原結合蛋白31H4 IgG2對PCSK9之抑制曲線。
圖6B為試管內PCSK9：LDLR結合檢定中抗原結合蛋白31H4 IgG4對PCSK9之抑制曲線。
圖6C為試管內PCSK9：LDLR結合檢定中抗原結合蛋白21B12 IgG2對PCSK9之抑制曲線。
圖6D為試管內PCSK9：LDLR結合檢定中抗原結合蛋白21B12 IgG4對PCSK9之抑制曲線。
圖7A為細胞LDL吸收檢定中抗原結合蛋白31H4 IgG2之抑制曲線以顯示ABP減小PCSK9之LDL吸收阻斷效應的效應。
圖7B為細胞LDL吸收檢定中抗原結合蛋白31H4 IgG4之抑制曲線以顯示ABP減小PCSK9之LDL吸收阻斷效應的效應。
圖7C為細胞LDL吸收檢定中抗原結合蛋白21B12 IgG2之抑制曲線以顯示ABP減小PCSK9之LDL吸收阻斷效應的效應。
圖7D為細胞LDL吸收檢定中抗原結合蛋白21B12 IgG4之抑制曲線以顯示ABP減小PCSK9之LDL吸收阻斷效應的效應。
圖8A為描繪ABP 31H4在小鼠中之血清膽固醇降低能力之圖，其中變化相對於IgG對照處理小鼠(* p<0.01)。
圖8B為描繪ABP 31H4在小鼠中之血清膽固醇降低能力之圖，其中變化相對於時間=0小時(# p，0.05)。
圖8C為描繪C57B1/6小鼠中ABP 31H4對高密度脂蛋白(HDL)膽固醇含量之影響之圖(* p<0.01)。
圖8D為描繪C57B1/6小鼠中ABP 31H4對HDL膽固醇含量之影響之圖(# p<0.05)。
圖9描繪多個時間點後ABP 31H4增加所存在之肝LDLR蛋白量之能力的西方墨點分析(western blot analysis)。
圖10A為描繪抗原結合蛋白31H4降低野生型小鼠之總血清膽固醇的能力(相對)之圖。
圖10B為描繪抗原結合蛋白31H4降低野生型小鼠之HDL的能力之圖。
圖10C為描繪多種抗原結合蛋白31H4及16F12之血清膽固醇降低能力之圖。
圖11A描繪測試抗原結合蛋白降低血清膽固醇之持續時間及能力之注射方案。
圖11B為描繪圖11A之注射方案結果之圖。
圖12A描繪HepG2細胞中回應士他汀及ABP 21B12之組合的LDLR含量。
圖12B描繪HepG2細胞中回應士他汀及ABP 31H4之組合的LDLR含量。
圖12C描繪HepG2細胞中回應士他汀及ABP 25A7.1(非中和抗體)(與中和抗體“25A7”不同)之組合的LDLR含量。
圖12D描繪過表現PCSK9之HepG2細胞中回應士他汀及ABP 21B12之組合的LDLR含量。
圖12E描繪過表現PCSK9之HepG2細胞中回應士他汀及ABP 31H4之組合的LDLR含量。
圖12F描繪過表現PCSK9之HepG2細胞中回應士他汀及ABP 25A7.1(非中和抗體)(與中和抗體“25A7”不同)之組合的LDLR含量。
圖13A描繪針對PCSK9之多種ABP之各輕鏈胺基酸序列。點(.)表示無胺基酸。
圖13B描繪針對PCSK9之多種ABP之輕鏈分支圖。
圖13C描繪針對PCSK9之多種ABP之各重鏈胺基酸序列。點(.)表示無胺基酸。
圖13D描繪針對PCSK9之多種ABP之重鏈樹狀圖。
圖13E描繪衍生一致序列之組之輕鏈及重鏈CDR及名稱之比較。
圖13F描繪第1組及第2組之一致序列。
圖13G描繪第3組及第4組之一致序列。
圖13H描繪第1組及第2組之一致序列。點(.)表示相同殘基。
圖13I描繪第2組之一致序列。點(.)表示相同殘基。
圖13J描繪第3組及第4組之一致序列。點(.)表示相同殘基。
圖14A為描繪多種ABP(於10毫克/公斤)之活體內LDL降低能力之圖。
圖14B為描繪多種ABP(於30毫克/公斤)之活體內LDL降低能力之圖。
圖15A及圖15B為抗原結合蛋白之多種實施例之各輕鏈的序列比較表，圖15B接續圖15A中開始之序列。
圖15C及圖15D為抗原結合蛋白之多種實施例之各輕鏈的序列比較表，圖15D接續圖15C中開始之序列。
圖16A描繪用於測試Ab 21B12結合PCSK9之ProCat或V域部分之能力的凝膠。
圖16B描繪用於測試Ab 31H4結合PCSK9之ProCat或V域部分之能力的凝膠。
圖17描繪PCSK9及LDLR之EGFa部分之結構。
圖18A描繪PCSK9及31H4 Ab之結構。
圖18B描繪PCSK9及31H4 Ab之結構。
圖19A描繪PCSK9、31H4 Ab及21B12 Ab之結構。
圖19B描繪PCSK9及21B12 Ab之結構。
圖20A描繪PCSK9及與結合PCSK9之抗體31H4及21B12之結構重疊的LDLR之EGFa的結構。
圖20B描繪PCSK9及LDLR之結構模型。
圖20C描繪PCSK9及LDLR之結構模型的另一透視圖。
圖20D描繪PCSK9及LDLR之結構模型，其中包含31H4及21B12之結構示意圖。
圖20E描繪繞所示軸旋轉90度之圖20D中的結構模型。
圖20F描繪繞所示軸旋轉180度之圖20D中的結構模型。
圖21A描繪PCSK9及31A4之結構。
圖21B描繪PCSK9及31A4之結構。
圖21C描繪PCSK9及31A4之結構。
圖21D描繪全長PCSK9及31A4之結構模型。
圖22為一組ABP序列，其鑑別人類ABP序列與在大腸桿菌(E.coli)中產生且用於晶體結構之ABP序列之間的各不同之處。
圖23為各分倉結果之表。
圖23A為描繪各分倉結果之表之第一部分。
圖23B為描繪各分倉結果之表之第二部分。
圖23C為描繪各分倉結果之表之第三部分。
圖23D為描繪各分倉結果之表之第四部分。
圖24A描繪非還原性條件下之西方墨點法。
圖24B描繪還原性條件下之西方墨點法。
圖25A描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖25B描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖25C描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖25D描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖25E描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖25F描繪PCSK9之表面覆蓋。
圖26為PCSK9胺基酸序列與在PCSK9變異體中突變以檢測多種抗體之抗原決定基之所有殘基之序列比較。
圖27A描繪如在PCSK9與21B12之晶體結構上所定位之21B12抗原決定基打擊點。
圖27B描繪如在PCSK9與31H4及21B12之晶體結構上所定位之31H4抗原決定基打擊點。
圖27C描繪如在PCSK9與31H4及21B12之晶體結構上所定位之31A4抗原決定基打擊點。
圖27D描繪如在PCSK9與31H4及21B12之晶體結構上所定位之12H11抗原決定基打擊點。
圖27E描繪如在PCSK9與31H4及21B12之晶體結構上所定位之3C4抗原決定基打擊點。
圖28A為證明多種ABP與PCSK9之多個部分之結合能力之圖。
圖28B為證明多種ABP與PCSK9之多個部分之結合能力之圖。
圖28C為比較兩種ABP之LDLR結合能力之圖。
圖28D為比較兩種ABP之細胞LDL吸收活性之圖。
本文中揭露與PCSK9結合之抗原結合蛋白(諸如抗體及其功能性結合片段)。在一些實施例中，抗原結合蛋白與PCSK9結合且以各種方式阻止PCSK9起作用。在一些實施例中，抗原結合蛋白阻斷或減小 PCSK9與其他物質相互作用之能力。舉例而言，在一些實施例中，抗原結合蛋白以阻止或減小PCSK9將與LDLR結合之概率的方式與PCSK9結合。在其他實施例中，抗原結合蛋白與PCSK9結合但不阻斷PCSK9與LDLR相互作用之能力。在一些實施例中，抗原結合蛋白為人類單株抗體。
熟習此項技術者應瞭解，根據本揭露案，改變PCSK9與LDLR之間的相互作用可增加可用於與LDL結合之LDLR之量，而此又降低個體中血清LDL之量，從而達成降低個體之血清膽固醇含量。因而，針對PCSK9之抗原結合蛋白可用於多種治療具有高血清膽固醇含量、處於高血清膽固醇含量之風險中或可受益於血清膽固醇含量降低之個體的方法及組成物中。因此，本文中亦描述多種降低、維持或阻止血清膽固醇之增加的方法及技術。在一些實施例中，抗原結合蛋白允許PCSK9與LDLR之間結合，但抗原結合蛋白阻止或減小PCSK9對LDLR之不利活性。在一些實施例中，抗原結合蛋白阻止或減小PCSK9與LDLR之結合。
為方便起見，以下章節大體概述本文中所使用之術語的各種含義。所述討論之後，討論關於抗原結合蛋白之一般態樣，接著為證明抗原結合蛋白之多種實施例的性質及其可如何使用的具體實例。
定義及實施例
應瞭解，上文大體描述與下文詳細描述僅為例示性及說明性的且不對所主張之本發明具有限制性。在本申請案中，除非另有特定說明，否則使用的單數包含複數。在本申請案中，除非另有說明，否則使用的“或”意謂“及/或”。此外，使用的“包含”一詞不具限定性。又，除非另有特定說明，否則諸如“元件”或“組分”之術語涵蓋包括一個單元(unit)之元件及組分，與包括超過一個次單元(subunit)之元件及組分。又，使用的術語“部分(portion)”可包含部分(moiety)之 一部分(part)或整個部分。
本文中所使用之章節標題僅出於文章結構之目的，且不應理解為限定所描述之標的物。因此，本申請案中所引用之包含(但不限於)專利、專利申請案、文章、書及專題論文在內的所有文獻或文獻之部分，無論基於何種目的，其整體皆明確地以引用之方式併入本文中。除非另有說明，否則如本揭露案中所利用之以下術語應理解為具有以下含義：術語“前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型”或“PCSK9”是指如SEQ ID NO：1及/或3中所述之多肽或其片段以及相關多肽，包含(但不限於)等位基因(allelic)變異體、剪接變異體、衍生變異體、取代變異體、缺失變異體及/或插入變異體(包含添加N-末端甲硫胺酸)、融合多肽及種間同源物(interspecies homolog)。在某些實施例中，PCSK9多肽包含末端殘基，諸如(但不限於)前導序列殘基、靶向殘基、胺基末端甲硫胺酸殘基、離胺酸殘基、標籤殘基及/或融合蛋白殘基。“PCSK9”亦稱為FH3、NARC1、HCHOLA3、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/加工酶9型及神經細胞凋亡調控轉化酶1。PCSK9基因編碼屬於分泌性枯草桿菌酶(secretory subtilase)家族之蛋白酶K次家族的前蛋白轉化酶蛋白。術語“PCSK9”表示前蛋白與前蛋白自催化後所產生之產物。當僅提及自催化產物(諸如對於與裂解的PCSK9選擇性結合之抗原結合蛋白)時，蛋白可稱為“成熟”、“經裂解”、“經加工”或“活性”PCSK9。當僅提及非活性形式時，蛋白可稱為“非活性”、“前形式(pro-form)”或“未加工”形式的PCSK9。如本文中所使用，術語PCSK9亦包含天然存在之等位基因(allele)，諸如突變D374Y、S127R及F216L。術語PCSK9亦涵蓋合併有PCSK9胺基酸序列之轉譯後修飾的PCSK9分子，諸如已經醣基化、聚乙二醇化之PCSK9序列；信號序列已裂解之PCSK9序列；前域已自催化域裂解但 未與催化域分離之PCSK9序列(例如，圖1A及圖1B)。
術語“PCSK9活性”包含PCSK9之任何生物效應。在某些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9與受質或受體相互作用或結合之能力。在一些實施例中，PCSK9活性由PCSK9結合LDL受體(LDLR)之能力表示。在一些實施例中，PCSK9與LDLR結合且催化涉及LDLR之反應。在一些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9改變(例如，減小)LDLR可用性之能力。在一些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9增加個體中LDL之量的能力。在一些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9減小可用於與LDL結合之LDLR之量的能力。在一些實施例中，“PCSK9活性”包含由PCSK9信號轉導所產生之任何生物活性。例示性活性包含(但不限於)PCSK9與LDLR之結合、PCSK9裂解LDLR或其他蛋白質之酶活性、PCSK9與除LDLR以外有助於PCSK9作用之蛋白質的結合、PCSK9改變載脂蛋白B(APOB)之分泌(Sun X-M等人，“Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia”,Human Molecular Genetics 14：1161-1169,2005，及Ouguerram K等人，”Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9”,Arterioscler thromb Vase Biol.24：1448-1453,2004)、PCSK9在肝再生及神經細胞分化中之作用(Seidah NG等人，“The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1(NARC-1)：Liver regeneration and neuronal differentiation”PNAS 100：928-933,2003)，及PCSK9在肝葡萄糖代謝中之作用(Costet等人，“Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein 1c”J.Biol.Chem.281(10)：6211-18,2006)。
如本文中所使用，術語“高膽固醇血症”是指膽固醇含量高出合乎 需要之含量的病狀。在一些實施例中，其表示血清膽固醇含量升高。在一些實施例中，合乎需要的含量考慮熟習此項技術者已知(且本文中描述或提及)之多個“風險因素”。
術語“聚核苷酸”或“核酸”包含單鏈與雙鏈核苷酸聚合物。包括聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。所述修飾包含鹼基修飾，諸如溴尿苷(bromouridine)及肌苷(inosine)衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二脫氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)，二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)，二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)，苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)，苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)及磷醯胺酯(phosphoroamidate)。
術語“寡核苷酸”意謂包括200或少於200個核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為10至60個鹼基。在其他實施例中，寡核苷酸之長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單鏈或雙鏈的，例如用於構築突變基因。寡核苷酸可為有義(sense)或反義(antisense)寡核苷酸。寡核苷酸可包含用於偵測檢定之標記，包含放射性標記、螢光標記、半抗原(hapten)或抗原標記。例如，寡核苷酸可用作聚合酶鏈反應(PCR)引子、選殖引子或雜交探針。
“經分離核酸分子”意謂基因組DNA或RNA、合成來源的mRNA、cDNA或其組合，而其不與自然界中發現所述經分離聚核苷酸之整個或部分聚核苷酸締合、或反與自然界中不連接之聚核苷酸連接。出於本揭露案之目的，應理解“包括特定核苷酸序列之核酸分子”不涵蓋完整染色體。“包括指定核酸序列之經分離核酸分子”除指定序列外亦可包含高達10種或甚至高達20種其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可 包含控制所列核酸序列之編碼區之表現的可操作性連接之調控序列，及/或可包含載體序列。
除非另有規定，否則本文中所討論之任何單鏈聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙鏈聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。5'至3'添加新生(nascent)RNA轉錄物之方向稱為轉錄方向；與RNA轉錄物具有相同序列之DNA鏈上的5'至RNA轉錄物5'端之序列區稱為“上游序列”；與RNA轉錄物具有相同序列之DNA鏈上的3'至RNA轉錄物3'端之序列區稱為“下游序列”。
術語“控制序列”是指可影響其所連接之編碼序列之表現及加工的聚核苷酸序列。所述控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包含啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包含包括一或多個轉錄因子辨識位點之啟動子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列。“控制序列”可包含前導序列及/或融合搭配物序列。
術語“載體”意謂用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中的任何分子或實體(例如，核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語“表現載體”或“表現構築體”是指適合於轉殖宿主細胞且含有引導及/或控制(與宿主細胞結合)一或多個可操作性連接之異源編碼區之表現的核酸序列的載體。表現構築體可包含(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯且(若存在內含子)影響可操作性連接之編碼區之RNA剪接的序列。
如本文中所使用，“可操作性連接”意謂所述用語所應用之組分呈允許其在合適條件下執行其內在功能之關係。舉例而言，載體中與蛋白編碼序列“可操作性連接”之控制序列與蛋白編碼序列連接以使得在與控制序列之轉錄活性相適之條件下實現蛋白編碼序列之表現。
術語“宿主細胞”意謂已用核酸序列轉殖或能夠用核酸序列轉殖且 因而表現所關注之基因的細胞。術語包含母細胞之子代，不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始母細胞相同，只要存在所關注之基因。
術語“轉染”意謂細胞吸收外來或外源DNA，且當已將外源DNA引入細胞膜內部時，細胞被“轉染”。許多轉染技術為此項技術中所熟知且在本文中揭露。例如參見，Graham等人，1973,Virology 52：456；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,supra；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人，1981,Gene 13：197。所述技術可用於將一或多個外源DNA部分引入合適宿主細胞中。
術語“轉殖轉型transformation”是指細胞遺傳特性方面之變化，且當細胞經修飾而含有新的DNA或RNA時，細胞被轉殖轉型。舉例而言，當細胞藉由經轉染、轉導或其他技術引入新的遺傳物質而自其天然狀態被遺傳修飾時，細胞被轉殖轉型。轉染或轉導後，可藉由將轉殖DNA物理上整合於細胞染色體中而使其與細胞染色體重組，或者可將轉殖DNA瞬時維持為附加型元件(episomal element)而不複製，或者轉殖DNA可作為質體單獨複製。當轉殖DNA伴隨細胞分裂複製時，將細胞視為已經“穩定轉殖轉型”。
術語“多肽”或“蛋白質”意謂具有天然蛋白(native protein)(即由天然存在的非重組細胞所產生之蛋白質)之胺基酸序列的巨分子；或者其由遺傳工程改造的細胞或重組細胞產生，且包括具有所述天然蛋白之胺基酸序列的分子，或具有天然序列之一或多個胺基酸的缺失、添加及/或取代之分子。所述術語亦包含一或多個胺基酸為相應的天然存在之胺基酸之化學類似物及聚合物的胺基酸聚合物。術語“多肽”及“蛋白質”特定涵蓋具有抗原結合蛋白之一或多個胺基酸的缺失、添加及/或取代的PCSK9抗原結合蛋白、抗體或序列。術語“多肽片段” 是指與全長天然蛋白相比，具有胺基末端缺失、羧基末端缺失及/或內部缺失之多肽。與天然蛋白相比，所述片段亦可含有經修飾的胺基酸。在某些實施例中，片段之長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段之長度可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。適用的多肽片段包含抗體之免疫功能片段，包含結合域。在PCSK9結合抗體之情況下，適用的片段包含(但不限於)CDR區、重鏈及/或輕鏈可變域、抗體鏈之一部分或僅其包含兩個CDR之可變區，及其類似片段。
所提及之術語“經分離蛋白質”意謂符合以下條件之標的蛋白質：(1)不含至少某些通常與其一起發現之其他蛋白質，(2)基本上不含相同來源(例如，來自相同物種)之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%自然界中相締合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質相分離，(5)與自然界中不締合之多肽可操作性締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)自然界中不存在。“經分離蛋白質”通常構成給定樣品之至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。合成來源之基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何組合均可編碼所述經分離蛋白質。經分離蛋白質較佳實質上不含在其自然環境中所發現的會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的蛋白質或多肽或其他污染物。
術語“胺基酸”包含其在此項技術中之正常含義。
多肽(例如，抗原結合蛋白或抗體)之“變異體”包括相對於另一多肽序列，在胺基酸序列中插入、缺失及/或取代一或多個胺基酸殘基的某一胺基酸序列。變異體包含融合蛋白。
術語“一致性(identity)”是指如由比對及比較序列所確定，兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係。“一致性%”意謂所比較之分子中之胺基酸或核苷酸之間的相同殘基的 百分率且基於所比較之最小分子之尺寸計算。對於所述計算，較佳由特定數學模型或電腦程式(亦即，“算法”)來定址比對中的空位(gap)(若存在)。可用於計算所比對的核酸或多肽之一致性的方法包含以下文獻中所述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J. Applied Math. 48：1073。
在計算一致性%時，通常以在序列之間產生最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於確定一致性%之電腦程式之一個實例為GCG程式包，其包含GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。電腦算法GAP用於比對兩個待確定序列一致性%之多肽或聚核苷酸。比對序列以達相應胺基酸或核苷酸之最佳匹配(“匹配跨度(matched span)”，如由算法所確定)。與算法結合使用空位開放罰分(gap opening penalty)(以3×平均對角線計算，其中“平均對角線(average diagonal)”為所使用之比較矩陣之對角線的平均值；“對角線”為特定比較矩陣指定給各完美胺基酸匹配之評分或數值)及空位擴展罰分(gap extension penalty)(通常為1/10×空位開放罰分)以及比較矩陣(comparison matrix)(諸如PAM 250或BLOSUM 62)。在某些實施例中，算法亦使用標準比較矩陣(關於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345- 352；關於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
使用GAP程式確定多肽或核苷酸序列一致性%時可採用之參數的實例如下：
‧算法：Needleman等人，1970,J.Mol Biol.48：443-453
‧比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同上
‧空位罰分：12(但末端空位不計罰分)
‧空位長度罰分：4
‧相似性臨限值：0
某些比對兩個胺基酸序列之比對方案可能僅使兩個序列之一短區匹配，且所述小比對區可能具有極高的序列一致性，即使兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若需要，則可調節所選擇之比對方法(GAP程式)來產生跨越標靶多肽之至少50個或其他數目之相鄰胺基酸的比對。
如本文中所使用，20種常規(例如天然存在的)胺基酸及其縮寫遵循常規用法。參見Immunology--A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren編，Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中。20種常規胺基酸之立體異構體(例如，D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如，α-,α-二取代胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非常規胺基酸亦可為適用於本發明多肽之組分。非常規胺基酸之實例包含：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(imino acid)(例如，4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽表示法中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基末端方向，而右手方向為羧基未端方向。
類似地，除非另有規定，否則單鏈聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙鏈聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。5'至3'添加新生RNA轉錄物之方向稱為轉錄方向；與RNA具有相同序列之DNA鏈上的5'至RNA轉錄物5'端之序列區稱為“上游序列”；與RNA具有相同序列之DNA鏈上的3'至RNA轉錄物3'端之序列區稱為“下游序列”。
保守性胺基酸取代可涵蓋通常藉由化學肽合成而不是在生物系統中合成而併入的非天然存在之胺基酸殘基。所述取代包含擬肽(peptidomimetic)及胺基酸部分之其他反向(reversed)或反轉(inverted)形式。
根據共有的側鏈性質，可將天然存在之殘基分為以下類別：1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)鹼性：His、Lys、Arg；5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
舉例而言，非保守性取代可涉及將所述類別中之一類的成員換成另一類之成員。例如，可將所述取代殘基引入與非人類抗體同源之人類抗體區中或引入所述分子之非同源區中。
在對抗原結合蛋白或PCSK9蛋白進行改變時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親疏水指標(hydropathic index)。已根據疏水性及電荷特性給各胺基酸指定了親疏水指標。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩胺醯胺(-3.5)；天冬胺 酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中瞭解胺基酸親疏水指標在賦予蛋白質交互生物功能(interactive biological function)中之重要性。Kyte等人，J.Mol.Biol.,157：105-131(1982)。已知某些胺基酸可被取代為具有類似親疏水指標或評分且仍保留類似生物活性之其他胺基酸。在基於親疏水指標進行改變時，在某些實施例中，包含親疏水指標在±2範圍內之胺基酸的取代。在某些實施例中，包含在±1範圍內之胺基酸，且在某些實施例中，包含在±0.5範圍內之胺基酸。
在此項技術中亦瞭解，如胺基酸之取代可根據親水性有效進行，尤其，如在本發明之情況下，當由此產生之生物功能性蛋白質或肽意欲用於免疫實施例中時更可如此。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如受相鄰胺基酸之親水性所支配)，與其免疫原性及抗原性相關，亦即，與蛋白質的生物性質相關。
已指定給所述胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩胺醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值進行改變時，在某些實施例中，包含親水性值在±2範圍內之胺基酸的取代，在某些實施例中，包含在±1範圍內之胺基酸，且在某些實施例中，包含在±0.5範圍內之胺基酸。亦可根據親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。所述區亦稱為“抗原決定基核心區(epitopic core region)”。
例示性胺基酸取代陳述於表1中。
表1 胺基酸取代
術語“衍生物”是指包含除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代以外之化學修飾的分子。在某些實施例中，衍生物包括共價修飾，包含(但不限於)與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結(chemical bonding)。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可具有比未經化學修飾之抗原結合蛋白高的循環半衰期(circulating half-life)。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可具有改良之靶向合乎需要之細胞、組織及/或器官的能力。在一些實施例中，衍生性抗原結合蛋白經共價修飾而包含一或多種水溶性聚合物連接物(water soluble polymer attachment)，包含(但不限於)聚乙二醇、 聚氧乙烯二醇(polyoxyethylene glycol)或聚丙二醇。例如參見，美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號及第4,179,337號。在某些實施例中，衍生性抗原結合蛋白包括一或多種聚合物，包含(但不限於)單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(dextran)、纖維素或其他碳水化合物基聚合物、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙烯化的多元醇(例如，甘油)及聚乙烯醇以及所述聚合物之混合物。
在某些實施例中，衍生物經聚乙二醇(PEG)次單元共價修飾。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物鍵結於衍生物之一或多個特定位置，例如胺基末端。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物隨機連接於衍生物之一或多個側鏈。在某些實施例中，使用PEG改良抗原結合蛋白之治療能力。在某些實施例中，使用PEG改良人化抗體之治療能力。例如，某些所述方法討論於美國專利第6,133,426號中，因此無論基於何種目的，所述專利皆以引用之方式併入本文中參考。
肽類似物通常被作為性質與模板肽類似的非肽藥物用於製藥工業中。所述類型之非肽化合物稱為“肽模擬物”或“擬肽peptidomimetics”。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15：29(1986)；Veber及Freidinger,TINS，第392頁(1985)；及Evans等人，J.Med.Chem.,30：1229(1987)，無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中。通常藉助於電腦分子模擬來研發所述化合物。結構上與治療適用之肽類似之肽模擬物可用於產生類似治療或預防效應。通常，擬肽在結構上與範例多肽(paradigm polypeptide)(亦即，具有生物化學性質或藥理學活性之多肽)(諸如，人類抗體)類似，但具有一或多個視情況藉由此項技術熟知之方法經選自以下各鍵聯之鍵聯置換的肽鍵聯：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(順式及反式)、- COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。在某些實施例中，可使用用具有相同類型之D-胺基酸系統性取代一致序列(consensus sequence)之一或多個胺基酸(例如，D-離胺酸置換L-離胺酸)而產生更穩定的肽。另外，可藉由此項技術已知之方法產生包括一致序列或實質上相同的一致序列變異之限制肽(constrained peptide)(Rizo及Gierasch,Ann.Rev.Biochem.,61：387(1992)，無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中)；例如藉由添加能夠形成將肽環化之分子內雙硫橋鍵(intramolecular disulfide bridge)之內部半胱胺酸殘基。
如整個說明書中與諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物等生物物質相關使用之術語“天然存在”是指自然界中可見之物質或自然界中可見之物質之一種形式。
如本文中所使用，“抗原結合蛋白”(“ABP”)意謂結合指定靶抗原之任何蛋白質。在本申請案中，指定靶抗原為PCSK9蛋白或其片段。“抗原結合蛋白”包含(但不限於)抗體及其結合部位，諸如免疫功能片段。肽體(peptibody)為抗原結合蛋白之另一實例。如本文中所使用，術語抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)抗原結合蛋白之“免疫功能片段”(或簡稱“片段”)為一類包括缺乏全長鏈中所存在之至少一些胺基酸但仍能夠與抗原特異性結合之抗體部分(不管所述部分如何獲得或合成)的抗原結合蛋白。所述片段的生物活性在於，其與靶抗原結合且可與其他抗原結合蛋白(包含完整抗體)競爭結合給定抗原決定基。在一些實施例中，片段為中和片段(neutralizing fragment)。在一些實施例中，片段可阻斷或減小LDLR與PCSK9之間相互作用之概率。在一態樣中，所述片段將保留全長輕鏈或重鏈中所存在的至少一個CDR，且在一些實施例中將包括單一重鏈及/或輕鏈或其部分。所述生物活性片段可藉由重組DNA技術產生或可藉由酶促或化學裂解抗原結合蛋白(包含完整抗體)而產生。免疫功能性免疫 球蛋白片段包含(但不限於)Fab、雙功能抗體(與輕鏈可變域相同之多肽上之重鏈可變域，經由短肽連接子(linker)連接，所述短肽連接子很短而不會使同一鏈上的兩個域之間配對)、Fab'、F(ab')2、域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物，包含(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝類動物(camelid)或兔子。進一步預期，本文中所揭露之抗原結合蛋白之功能部分(例如，一或多個CDR)可與第二蛋白質或小分子共價結合而產生針對體內特定靶標之治療劑，所述治療劑具有雙功能治療性質或具有延長之血清半衰期。熟習此項技術者應瞭解，抗原結合蛋白可包含非蛋白質組分。在本揭露案之一些章節中，ABP之實例在本文中以“數字/字母/數字”(例如，25A7)描述。在所述情況下，確切名稱表示特異性抗體。亦即，命名為25A7之ABP並非一定與命名為25A7.1之抗體相同，(除非在說明書中明確教示相同，例如，25A7與25A7.3)。熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，LDLR不為抗原結合蛋白。在一些實施例中，LDLR之結合子部不為抗原結合蛋白，例如，EGFa。在一些實施例中，PCSK9在活體內發信號所經由之其他分子不為抗原結合蛋白。所述實施例將同樣明確地鑑別。
本文中所述之某些抗原結合蛋白為抗體或衍生自抗體。在某些實施例中，抗原結合蛋白之多肽結構是基於抗體，包含(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為“抗體接合物”)及其相應片段。在一些實施例中，ABP包括高親和性多聚體(avimer)(緊密結合肽)或由高親和性多聚體組成。本文中進一步描述所述各種抗原結合蛋白。
“Fc”區包括兩個包括抗體之CH1及CH2域之重鏈片段。所述兩個重鏈片段藉由兩個或兩個以上雙硫鍵及藉由CH3域之疏水性相互作用 固持在一起。
“Fab片段”包括一個輕鏈及一個重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成雙硫鍵。
“Fab'片段”包括一個輕鏈及一個重鏈之一部分，所述重鏈部分含有VH域及CH1域以及CH1域與CH2域之間的區，如此在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間可形成鏈間雙硫鍵，從而形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有兩個輕鏈及兩個重鏈，所述重鏈含有CH1域與CH2域之間的恆定區之一部分，如此兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵。因此，F(ab')2片段由兩個經由兩個重鏈之間的雙硫鍵固持在一起之Fab'片段構成。
“Fv區”包括重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
“單鏈抗體”為重鏈及輕鏈可變區已經由可撓性連接子連接形成單一多肽鏈從而形成抗原結合區的Fv分子。單鏈抗體詳細討論於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中，所述專利之揭露內容以引用之方式併入本文中。
“域抗體”為僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區以肽連接子共價連接而產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同的抗原。
“二價抗原結合蛋白”或“二價抗體”包括兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同的抗原特異性。二價抗原結合蛋白及二價抗體可為雙特異性抗體，參見下文。在某些實施例中，通常應瞭解，不同於“多特異性”或“多功能”抗體的二價抗體的各結合位點相同。
“多特異性抗原結合蛋白”或“多特異性抗體”為靶向超過一個抗原或抗原決定基之抗體。
“雙特異性”、“雙重特定性”或“雙功能”抗原結合蛋白或抗體相應為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體為一類多特異性抗原結合蛋白抗體且可藉由多種方法產生，所述方法包含(但不限於)融合融合瘤(hybridoma)或連接Fab'片段。例如參見，Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol. 79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol. 148：1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體之兩個結合位點將與兩個不同的抗原決定基結合，所述抗原決定基可存在於相同或不同的蛋白質靶標上。
當解離常數(Kd)為10-7莫耳濃度(M)時，認為抗原結合蛋白“特異性結合”其靶抗原。當Kd為5×10-9莫耳濃度時，ABP以“高親和力”特異性結合抗原，且當Kd為5×10-10莫耳濃度時，ABP以“極高親和力”特異性結合抗原。在一實施例中，ABP具有10-9莫耳濃度之Kd。在一實施例中，解離速率為<1×10-5。在其他實施例中，ABP將以約10-9莫耳濃度與10-13莫耳濃度之間的Kd與人類PCSK9結合，且在又一實施例中ABP將以5×10-10之Kd結合。熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，任何或所有抗原結合片段皆可與PCSK9特異性結合。
當抗原結合蛋白與一個靶標結合比其與第二靶標結合緊密時，抗原結合蛋白具有“選擇性”。
“抗原結合區”意謂特異性結合指定抗原(例如，互補位(paratope))之蛋白質或蛋白質之一部分。舉例而言，抗原結合蛋白之含有與抗原相互作用且賦予抗原結合蛋白對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分稱為“抗原結合區”。抗原結合區通常包含一或多個“互補決定區”(“CDR”)。某些抗原結合區亦包含一或多個“構架”區。“CDR”為促成抗原結合特異性及親和力之胺基酸序列。“構架”區 可幫助維持CDR之正確構形(conformation)從而促進抗原結合區與抗原之間的結合。在結構上，構架區可位於抗體的CDR之間。構架區及CDR區之實例如圖2A-3D、3CCC-3JJJ及15A-15D中所示。在一些實施例中，抗體3B6之輕鏈之CDR的序列如下：CDR1 TLSSGYSSYEVD(SEQ ID NO：279)；CDR2 VDTGGIVGSKGE(SEQ ID NO：280)；CDR3 GADHGSGTNFVVV(SEQ ID NO：281)，且構架區(FR)如下：FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC(SEQ ID NO：282)；FR2 WYQQRPGKGPRFVMR(SEQ ID NO：283)；FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC(SEQ ID NO：284)；及FR4 FGGGTKLTVL(SEQ ID NO：285)。
就某些方面而言，提供結合PCSK9(例如人類PCSK9)之重組抗原結合蛋白。在此情況下，“重組抗原結合蛋白”為使用重組技術，亦即藉由如本文中所述表現重組核酸而製備之蛋白質。此項技術中熟知產生重組蛋白之方法及技術。
術語“抗體”是指具有任何同種型(isotype)之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭地與靶抗原特異性結合之片段，且包含(例如)嵌合抗體、人化抗體、完全人類及雙特異性抗體。“抗體”為一種抗原結合蛋白。完整抗體通常將包括至少兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈，但在一些情況下可包含較少的鏈，諸如駱駝類動物中天然存在的可僅包括重鏈之抗體。抗體可僅衍生自單一來源，或可為“嵌合”抗體，亦即如以下進一步描述，抗體之不同部分可衍生自兩個不同抗體。抗原結合蛋白、抗體或結合片段可在融合瘤中、藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體而產生。除非另有說明，否則術語“抗體”除包括兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈之抗體以外，亦包含其衍生物、變異體、片段及突變蛋白(mutein)，其實例在下文描述。此外，除非明確排除在外，否則抗體包含單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、 域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人化抗體、人類抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為“抗體接合物”)及其相應片段。在一些實施例中，術語亦涵蓋肽體。
天然存在之抗體結構單元通常包括四聚體。所述四聚體通常均由兩個相同的多肽鏈對構成，各對具有一個全長“輕鏈”(在某些實施例中，約25千道爾頓)及一個全長“重鏈”(在某些實施例中，約50-70千道爾頓)。各鏈之胺基末端部分通常包含一通常負責抗原辨識之具有約100至110個或更多個胺基酸的可變區。各鏈之羧基末端部分通常界定一可負責效應功能(effector function)之恆定區。人類輕鏈通常分為κ(kappa)及λ(lambda)輕鏈。重鏈通常分為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)重鏈，且相應將抗體之同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG有幾個子類，包含(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM有幾個子類，包含(但不限於)IgM1及IgM2。類似地，IgA也再分成幾個子類，包含(但不限於)IgA1及IgA2。在全長輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區通常經由具有約12個或多於12個胺基酸之“J”區連接，其中重鏈亦包含具有約10個或多於10個胺基酸之“D”區。例如參見，Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.編，第2版.Raven Press,N.Y.(1989))(無論基於何種目的，其整體皆以引用之方式併入本文中)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
可變區通常展現相同的整體結構：經由三個高可變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守的構架區(FR)。來自各對之兩個鏈的CDR通常由構架區對準，從而使得能夠與特異性抗原決定基結合。輕鏈與重鏈可變區自N-末端至C-末端通常包括域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。通常根據Kabat的“具有免疫學重要性之蛋白質序列”(Sequences of Proteins of Immunological Interest) (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and 1991))或Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342：878-883(1989)之定義給各域指定胺基酸。
在某些實施例中，在不存在抗體輕鏈之情況下，抗體重鏈與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體重鏈之情況下，抗體輕鏈與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體輕鏈之情況下，抗體結合區與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體重鏈之情況下，抗體結合區與抗原結合。在某些實施例中，在不存在其他可變區之情況下，個別可變區與抗原特異性結合。
在某些實施例中，藉由解出抗體之結構及/或解出抗體-配體複合物之結構來實現CDR之確定描繪及包括抗體之結合位點的殘基之鑑別。在某些實施例中，其可藉由熟習此項技術者已知之多種技術中之任一種(諸如X射線結晶學)來實現。在某些實施例中，可採用多種分析方法來鑑別或近似估計CDR區。所述方法之實例包含(但不限於)Kabat定義、Chothia定義、AbM定義及接觸定義(contact definition)。
Kabat定義為一種編號抗體中之殘基的標準且通常用於鑑別CDR區。例如參見，Johnson及Wu,Nucleic Acids Res.,28：214-8(2000)。Chothia定義類似於Kabat定義，但Chothia定義考慮了某些結構環區之位置。例如參見，Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901-17(1986)；Chothia等人，Nature,342：877-83(1989)。AbM定義使用由Oxford Molecular Group公司生產之模擬抗體結構之整合電腦程式套。例如參見，Martin等人，Proc Natl Acad Sci(USA),86：9268-9272(1989)；“AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定義使用知識資料庫與全始算法(ab initio method)之組合由一級序列模擬抗體之 三級結構，所述全始算法諸如Samudrala等人，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,”in PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3：194-198(1999)中所述之方法。接觸定義是基於可用之複雜晶體結構之分析。例如參見，MacCallum等人，J.Mol.Biol.,5：732-45(1996)。
按照慣例，重鏈中之CDR區通常稱為H1、H2及H3，且沿自胺基末端至羧基末端之方向相繼編號。輕鏈中之CDR區通常稱為L1、L2及L3，且沿自胺基末端至羧基末端之方向相繼編號。
術語“輕鏈”包含全長輕鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長輕鏈包含一個可變區結構域VL及一個恆定區結構域CL。輕鏈之可變區結構域在多肽之胺基末端處。輕鏈包含κ鏈及λ鏈。
術語“重鏈”包含全長重鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長重鏈包含一個可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH域在多肽之胺基末端處，而CH域在羧基末端處，其中CH3最靠近多肽之羧基末端。重鏈可具有任何同種型，包括IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包含IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
雙特異性或雙功能抗體通常為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法來製造，所述方法包含(但不限於)融合融合瘤或連接Fab'片段。例如參見，Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148：1547-1553(1992)。
一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。
各個別免疫球蛋白鏈通常由數個“免疫球蛋白域”構成，各“免疫球蛋白域”由約90至110個胺基酸組成且具有特徵摺疊模式。所述域為其所構成之抗體多肽之基本單元。在人類中，IgA及IgD同種型含有四 個重鏈及四個輕鏈；IgG及IgE同種型含有兩個重鏈及兩個輕鏈；而IgM同種型含有五個重鏈及五個輕鏈。重鏈C區通常包括一或多個可負責效應功能之域。重鏈恆定區結構域之數目將視同種型而定。例如，IgG重鏈含有三個C區結構域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有所述同種型及亞型中之任一種。在本發明之某些實施例中，抗PCSK9抗體具有IgG2或IgG4亞型。
術語“可變區”或“可變域”是指抗體之輕鏈及/或重鏈之一部分，其通常包含重鏈中之大致胺基未端120至130個胺基酸及輕鏈中之約100至110個胺基末端胺基酸。在某些實施例中，不同抗體之可變區在胺基酸序列方面亦廣泛不同，即使對於相同物種之抗體。抗體之可變區通常決定特定抗體對其靶標之特異性。
術語“中和抗原結合蛋白”或“中和抗體”相應是指與配體結合且阻止或減小所述配體之生物效應之抗原結合蛋白或抗體。舉例而言，此可藉由直接阻斷配體上之結合位點或者藉由與配體結合且經由間接方式改變配體之結合能力(諸如配體中之結構或能量改變)來實現。在一些實施例中，術語亦可表示阻止所結合之蛋白質執行生物功能之抗原結合蛋白。在評定抗原結合蛋白(例如，抗體或其免疫功能片段)之結合及/或特異性時，若過量抗體使與配體結合之結合搭配物之數量減少至少1-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或超過99%(如在試管內競爭結合檢定中所量測)，則抗體或片段可實質上抑制配體與其結合搭配物之結合。在一些實施例中，在PCSK9抗原結合蛋白之情況下，所述中和分子可減弱PCSK9結合LDLR之能力。在一些實施例中，經由競爭檢定表徵及/或描述中和能力。在一些實施例中，以IC50或最大有效濃度一半值(EC50值)描述中和能力。在一些實施例中，ABP 27B2、13H1、13B5及3C4為非中和ABP，3B6、 9C9及31A4為弱中和劑，且表2中之其餘ABP為強中和劑。在一些實施例中，抗體或抗原結合蛋白藉由與PCSK9結合且阻止PCSK9與LDLR結合(或減小PCSK9與LDLR結合之能力)而實現中和。在一些實施例中，抗體或ABP藉由與PCSK9結合且雖然仍允許PCSK9與LDLR結合，但阻止或減小由PCSK9所介導之LDLR降解而實現中和。因此，在一些實施例中，雖然中和ABP或抗體仍可允許PCSK9/LDLR結合，但將阻止(或減小)隨後由PCSK9所涉及之LDLR降解。
術語“靶標”是指能夠由抗原結合蛋白結合之分子或分子之一部分。在某些實施例中，靶標可具有一或多個抗原決定基。在某些實施例中，靶標為抗原。短語“抗原結合蛋白”中使用的“抗原”簡單地表示包括可由抗體結合之抗原的蛋白質序列。在此情況下，不要求蛋白質為外來蛋白或能夠誘導免疫反應。
在抗原結合蛋白(例如，中和抗原結合蛋白或中和抗體)競爭同一抗原決定基之情況下使用時，術語“競爭”意謂由一種檢定所測定的抗原結合蛋白之間的競爭，在檢定中，所測試之抗原結合蛋白(例如，抗體或其免疫功能片段)阻止或抑制(例如，減小)參考抗原結合蛋白(例如，配體或參考抗體)與共同抗原(例如，PCSK9或其片段)之特異結合。許多類型之競爭結合檢定可被用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一抗原結合蛋白競爭，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(radioimmunoassay，RIA)；固相直接或間接酶免疫檢定(enzyme immunoassay，EIA)；夾層競爭檢定(sandwich competition assay)(例如參見，Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白酶免疫檢定(biotin-avidin EIA)(例如參見，Kirkland等人，1986,J.Immunol. 137：3614-3619)；固相直接標記檢定(solid phase direct labeled assay)；固相直接標記夾層檢定(例如參見，Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記放射免疫檢定(例如參見，Morel等人，1988,Molec.Immunol. 25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白酶免疫檢定(例如參見，Cheung等人，1990,Virology 176：546-552)；及直接標記放射免疫檢定(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol. 32：77-82)。所述檢定通常涉及使用與固體表面或細胞結合的純化抗原，所述固體表面或細胞攜帶有未標記之測試抗原結合蛋白及經標記之參考抗原結合蛋白中的任一者。競爭性抑制藉由在測試抗原結合蛋白存在下測定與固體表面或細胞結合之標記之量來量測。測試抗原結合蛋白通常以過量存在。藉由競爭檢定所鑑別之抗原結合蛋白(競爭性抗原結合蛋白)包含與參考抗原結合蛋白結合相同的抗原決定基之抗原結合蛋白，及因存在位阻而結合與參考抗原結合蛋白所結合之抗原決定基充分接近之相鄰抗原決定基的抗原結合蛋白。關於測定競爭結合之方法之其它細節提供於本文之實例中。當競爭性抗原結合蛋白以過量存在時，其通常將使參考抗原結合蛋白與共同抗原之特異結合抑制(例如，減小)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或超過75%。在一些情況下，使結合抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或超過97%。
術語“抗原”是指能夠由選擇性結合劑結合之分子或分子之一部分，所述選擇性結合劑諸如抗原結合蛋白(包含例如，抗體或其免疫功能片段)。在一些實施例中，抗原能夠用於動物中以產生能夠與所述抗原結合之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白(例如，抗體)相互作用之抗原決定基。
術語“抗原決定基”包含任何能夠由抗原結合蛋白(諸如抗體)結合或與T細胞受體結合之決定子(determinant)。抗原決定基為抗原中由靶向所述抗原之抗原結合蛋白所結合的區，且當抗原為蛋白時，其 包含直接接觸抗原結合蛋白之特異性胺基酸。雖然最常見的是抗原決定基存在於蛋白質上，但在一些情況下，其可存在於其它種類之分子上，諸如核酸。抗原決定基決定子可包含分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定的三維結構特徵及/或特定的電荷特徵。對特定靶抗原具有特異性之抗體通常將優先辨識在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之靶抗原上的抗原決定基。
如本文中所使用，“實質上純(的)”意謂所述之分子物質為所存在之優勢物質，亦即，以莫耳濃度計，其比同一混合物中的任何其他個別物質都豐富。在某些實施例中，實質上純的分子為目標物質佔所存在之所有巨分子物質之至少50%(以莫耳濃度計)的組成物。在其他實施例中，實質上純的組成物將佔組成物中所存在之所有巨分子物質之至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，目標物質經純化至基本上同一種類，其中由常規偵測方法在組成物中不能偵測到污染物質且因此組成物由單一可偵測之巨分子物質組成。
術語“藥劑”在本文中用於表示化合物、化合物之混合物、生物巨分子或由生物材料製備之萃取物。
如本文中所使用，術語“標記”或“經標記”是指併入可偵測的標記物，例如藉由併入經放射性標記的胺基酸或與可由經標記的抗生物素蛋白(例如，可由光學或比色法偵測之具有螢光標記物或酶促活性之抗生蛋白鏈菌素(streptavidin))偵測之生物素部分之多肽連接。在某些實施例中，標記或標記物亦可為治療劑。此項技術中已知多種標記多肽及醣蛋白之方法且可加以使用。多肽之標記之實例包含(但不限於)以下各者：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光標記(例如，FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如，辣根過氧化 物酶，β-半乳糖苷酶，螢光素酶、鹼性磷酸酯酶)、化學發光物、生物素基、由二級報導體(secondary reporter)所辨識之預定多肽抗原決定基(例如，白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在某些實施例中，標記藉由具有不同長度之間隔臂連接以減小潛在位阻。
如本文中所使用，術語“生物樣品”包含(但不限於)任何數量之來自活生物或先前活之生物的物質。所述活生物包含(但不限於)人類、小鼠、猴、大鼠、兔子及其他動物。所述物質包含(但不限於)血液、血清、尿液、細胞、器官、組織、骨骼、骨髓、淋巴結及皮膚。
如本文中所使用，術語“醫藥組成物”(或藥劑或藥物)是指當向患者正確投與時能夠誘導合乎需要之治療效應之化合物、組成物、藥劑或藥物。並非一定需要超過一種類型之成分。
術語“治療有效量”是指經確定在哺乳動物中產生治療反應之PCSK9抗原結合蛋白之量。一般熟習此項技術者很容易確定所述治療有效量。
如本文中所使用，術語“調節劑”為改變分子之活性或功能之化合物。舉例而言，與在不存在調節劑的情況下所觀察到之某一活性或功能之量值相比，調節劑可引起分子之活性或功能之量值增加或減小。在某些實施例中，調節劑為抑制劑，其減小分子之至少一種活性或功能之量值。分子之某些例示性活性及功能包含(但不限於)結合親和力、酶促活性及信號轉導。某些例示性抑制劑包含(但不限於)蛋白質、肽、抗體、肽體、碳水化合物或小有機分子。舉例而言，肽體在美國專利第6,660,843號(對應於PCT申請案第WO 01/83525號)中有所描述。
術語“患者”及“個體”可互換使用且包含人類及非人類動物個體以 及患有正式診斷之病症之個體、無正式承認之病症之個體、受到醫學關注之個體、處於發展病症之風險中之個體等。
術語“治療”包含治療性治療、預防性治療及降低個體發展病症或其他風險因子之風險的應用。治療不要求完全治癒病症，且涵蓋減少症狀或潛伏風險因子之實施例。
術語“預防”不要求100%消除事件之可能性(possibility)。更確切而言，其表示在存在化合物或方法之情況下，事件發生之概率降低。
關於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉殖轉型(例如，電穿孔(electroporation)，脂質體轉染(lipofection))可使用標準技術。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如此項技術中通常所完成或如本文中所述執行。上文技術及程序通常可根據此項技術所熟知之習知方法及如整個本發明說明書中所引用及討論之各種一般及較具體參考文獻中所述執行。例如參見，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratoiy Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中。除非提供具體定義，否則與本文中所述之分析化學、合成有機化學及藥物化學相關使用之命名法及這些學科的實驗程序及技術皆為此項技術中眾所熟知且普遍使用的。關於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞及患者之治療皆可使用標準技術。
針對PCSK9之抗原結合蛋白
前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(PCSK9)為參與調控低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白之含量的絲胺酸蛋白酶(Horton等人，2007；Seidah及Prat,2007)。PCSK9為絲胺酸蛋白酶之枯草桿菌蛋白酶(S8)家族中之前激素-前蛋白轉化酶(Seidah等人，2003)。例示性人類PCSK9胺基酸序列以圖1A(以加下劃線描繪蛋白質之“前” 域)及圖1B(以粗體描繪信號序列及以加下劃線描繪前域)中之SEQ ID NO：1及3呈現。例示性人類PCSK9編碼序列以SEQ ID NO：2(圖1B)呈現。如本文中所述，PCSK9蛋白亦可包含全長PCSK9蛋白之片段。最近，兩個小組已解出PCSK9蛋白之結構(Cunningham等人，Nature Structural & Molecular Biology,2007，及Piper等人，Structure,15：1-8,2007)，兩者之整體以引用之方式併入本文中。PCSK9包含信號序列、N-末端前域、枯草桿菌蛋白酶樣催化域及C-末端域。
本文中提供結合PCSK9(包含人類PCSK9)之抗原結合蛋白(ABP)。在一些實施例中，如本文中所述，所提供之抗原結合蛋白為包括一或多個互補決定區(CDR)之多肽。在一些抗原結合蛋白中，CDR嵌入“構架”區中，所述“構架”區將CDR定位(orient)以實現CDR正確的抗原結合性質。在一些實施例中，本文中所提供之抗原結合蛋白可干擾、阻斷、減小或調節PCSK9與LDLR之間的相互作用。將所述抗原結合蛋白表示為“中和性的”。在一些實施例中，即使抗原結合蛋白為中和蛋白且與PCSK9結合，但PCSK9與LDLR之間仍可發生結合。舉例而言，在一些實施例中，ABP阻止或減小PCSK9對LDLR之不利影響而不阻斷PCSK9上之LDLR結合位點。因此，在一些實施例中，ABP調節或改變PCSK9使得LDLR降解之能力而不必阻止PCSK9與LDLR之間的結合相互作用。可將所述ABP特定描述為“非競爭性中和”ABP。在一些實施例中，中和ABP在阻止PCSK9與LDLR結合之位置處及/或以阻止PCSK9與LDLR結合之方式與PCSK9結合。可將所述ABP特定描述為“競爭性中和”ABP。以上兩種中和劑均可產生較高量之存在於個體中之游離LDLR，從而產生更多與LDL結合之LDLR(從而減小個體中LDL之量)。此又使得存在於個體中之血清膽固醇之量減小。
在一些實施例中，本文中所提供之抗原結合蛋白能夠抑制由 PCSK9所介導之活性(包含結合)。在一些實施例中，與所述抗原決定基結合之抗原結合蛋白尤其抑制PCSK9與LDLR之間的相互作用及由PCSK9所介導之其他生理效應。在一些實施例中，抗原結合蛋白為PCSK9之人類(諸如完全人類)抗體。
在一些實施例中，ABP與PCSK9之催化域結合。在一些實施例中，ABP與PCSK9之成熟形式結合。在一些實施例中，ABP結合於PCSK9之前域。在一些實施例中，ABP與PCSK9之成熟形式選擇性結合。在一些實施例中，ABP以使得PCSK9不能與LDLR結合或不能有效地與LDLR結合之方式與催化域結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白不與催化域之c-末端結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白不與催化域之n-末端結合。在一些實施例中，ABP不與PCSK9蛋白之n-末端或c-末端結合。在一些實施例中，ABP與由本文中所討論之抗體所結合之抗原決定基中之任一者結合。在一些實施例中，此可藉由本文中所揭露之抗體與其他抗體之間的競爭檢定而測定。在一些實施例中，ABP與由表2中所述之抗體中之一者所結合的抗原決定基結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白與PCSK9之特定構形狀態結合以阻止PCSK9與LDLR相互作用。在一些實施例中，ABP與PCSK9之V域結合。在一些實施例中，ABP與PCSK9之V域結合且阻止(或減小)PCSK9與LDLR結合。在一些實施例中，ABP與PCSK9之V域結合，且雖然其不阻止(或減小)PCSK9與LDLR之結合，但ABP阻止或減小經PCSK9所介導之對LDLR之不利活性。
本文中所揭露之抗原結合蛋白具有多種效用。例如，一些抗原結合蛋白適用於特定結合檢定、PCSK9(尤其人類PCSK9)或其配體之親和純化及鑑別具有PCSK9活性之其他拮抗劑之篩選檢定。一些抗原結合蛋白適用於抑制PCSK9與LDLR之結合，或抑制PCSK9所介導之活性。
如本文中所說明，抗原結合蛋白可用於多種治療應用中。舉例而言，在一些實施例中，如本文中進一步描述，PCSK9抗原結合蛋白適用於治療與PCSK9相關之病狀，諸如膽固醇相關病症(或“血清膽固醇相關病症”)，諸如高膽固醇血症。抗原結合蛋白之其他用途包含例如，PCSK9相關疾病或病狀之診斷及測定PCSK9存在與否之篩選檢定。一些本文中所述之抗原結合蛋白適用於治療與PCSK9活性相關之後果、症狀及/或病理學。
在一些實施例中，所提供之抗原結合蛋白包括一或多個CDR(例如，1、2、3、4、5或6個CDR)。在一些實施例中，抗原結合蛋白包括(a)多肽結構及(b)一或多個插入及/或連接於所述多肽結構之CDR。多肽結構可採用多種不同形式。舉例而言，其可為或包括天然存在之抗體或其片段或變異體之構架，或者在性質上可為完全合成的。多種多肽結構之實例進一步在下文描述。
在某些實施例中，抗原結合蛋白之多肽結構為抗體或衍生自抗體，包含(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人化抗體、抗體融合物(在本文中有時稱為“抗體接合物”)及各自相應之部分或片段。在一些情況下，抗原結合蛋白為抗體之免疫片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。本文中進一步描述及定義多種結構。
如本文中所提供之某些抗原結合蛋白與人類PCSK9特異性及/或選擇性結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白與具有SEQ ID NO：3之殘基153-692及/或由所述殘基組成之人類PCSK9蛋白特異性及/或選擇性結合。在一些實施例中，ABP與具有SEQ ID NO：3之殘基31-152及/或由所述殘基組成之人類PCSK9特異性及/或選擇性結合。在一些實施例中，ABP與如圖1A(SEQ ID NO：1)中所描繪之人類PCSK9蛋白 選擇性結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白與含或不含信號序列之PCSK9蛋白之片段及/或全長PCSK9蛋白特異性結合。
在抗原結合蛋白用於治療應用之實施例中，抗原結合蛋白可抑制、干擾或調節PCSK9之一或多種生物活性。在一實施例中，抗原結合蛋白與人類PCSK9特異性結合及/或使人類PCSK9與LDLR之結合實質上抑制至少約20%-40%、40-60%、60-80%、80-85%或超過85%(例如，藉由在試管內競爭結合檢定中量測結合)。一些本文中所提供之抗原結合蛋白為抗體。在一些實施例中，ABP具有小於(結合更緊密)10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13莫耳濃度之Kd。在一些實施例中，ABP具有小於1微莫耳濃度(microM)、1000奈莫耳濃度(nM)至100奈莫耳濃度、100奈莫耳濃度至10奈莫耳濃度、10奈莫耳濃度至1奈莫耳濃度、1000皮莫耳濃度至500皮莫耳濃度、500皮莫耳濃度至200皮莫耳濃度、小於200皮莫耳濃度、200皮莫耳濃度至150皮莫耳濃度、200皮莫耳濃度至100皮莫耳濃度、100皮莫耳濃度至10皮莫耳濃度、10皮莫耳濃度至1皮莫耳濃度之阻斷LDLR與PCSK9(D374Y，高親和力變異體)之結合的IC50。
本發明之抗PCSK9抗體之IgG2重鏈恆定域的一個實例具有如圖3KK SEQ ID NO：154中所示之胺基酸序列。
本發明之抗PCSK9抗體之IgG4重鏈恆定域的一個實例具有如圖3KK SEQ ID NO：155中所示之胺基酸序列。
抗PCSK9抗體之κ輕鏈恆定域的一個實例具有如圖3KK SEQ ID NO：157中所示之胺基酸序列。
抗PCSK9抗體之λ輕鏈恆定域的一個實例具有如圖3KK SEQ ID NO：156中所示之胺基酸序列。
免疫球蛋白鏈之可變區通常展現相同的整體結構，包括由三個高變區(更常稱為“互補決定區”或CDR)連接之相對保守的構架區 (FR)。來自以上所提及之各重鏈/輕鏈對之兩個鏈的CDR通常由構架區對準，從而形成與靶蛋白(例如，PCSK9)上之特定抗原決定基特異性結合之結構。天然存在之輕鏈與重鏈可變區自N-末端至C-末端通常皆符合以下次序之元件：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計出給佔據所述各域中之位置之胺基酸指定編號的編號系統。所述編號系統定義於Kabat的“具有免疫學重要性之蛋白質序列”(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883中。
本文中提供且在圖2A-3JJ及圖3LL-3BBB中描述多種重鏈及輕鏈可變區。在一些實施例中，所述各可變區可與以上重鏈及輕鏈恆定區連接以相應形成完整抗體重鏈及輕鏈。另外，所產生之各重鏈及輕鏈序列可組合形成完整抗體結構。
所提供之抗體之輕鏈及重鏈之一些可變區的具體實例及其相應的胺基酸序列概述於表2中。
又，表2中所列之例示性可變重鏈均可與表2中所示之例示性可變輕鏈中之任一者組合以形成抗體。表2顯示數種本文中所揭露之抗體中可見之例示性輕鏈與重鏈配對。在一些情況下，抗體包含來自表2中所列之重鏈及輕鏈之至少一個可變重鏈及一個可變輕鏈。在其他情況下，抗體含有兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈。例如，抗體或抗原結合蛋白可包含一個重鏈及一個輕鏈、兩個重鏈或兩個輕鏈。在一些實施例中，抗原結合蛋白包括1、2及/或3個來自表2中所列之序列中之至少一者的重鏈及/或輕鏈CDR(及/或由上述CDR組成)(圖2A至圖3D中概述所述序列之CDR，及圖3CCC-3JJJ及15A-15D中之其他實施 例)。在一些實施例中，所有6個CDR(來自輕鏈之CDR1-3(CDRL1、CDRL2、CDRL3)及來自重鏈之CDR1-3(CDRH1、CDRH2及CDRH3))是ABP之一部分。在一些實施例中，ABP中包含1、2、3、4、5或超過5個CDR。在一些實施例中，ABP中包含來自表2中之序列中之CDR的一個重鏈及一個輕鏈CDR(圖2A至圖3D中概述表2中之序列之CDR)。在一些實施例中，ABP中亦包含其他部分(例如，如圖2A至圖2D、圖3A至圖3D中所描繪，及圖3CCC-3JJJ及15A-15D中之其他實施例)。表2中所說明之重鏈及輕鏈的CDR及FR之實例概述於圖2A至圖3D中(及圖3CCC至圖3JJJ及圖15A至圖15D中之其他實施例)。可選的輕鏈可變序列(包含CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3及FR4)可選自以下序列：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。可選的重鏈可變序列(包含CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3及FR4)可選自以下序列：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在圖2A至圖3D中之一些條目中，鑑別了序列之變異或CDR及FR之替代邊界。所述替代物以ABP名稱後之“v1”鑑別。因為大多數所述替代物在自然界中極少，所以表中僅呈現不同的部分。應瞭解，輕鏈或重鏈之其餘部分與其他分圖中關於基本ABP所示相同。因此，例如，圖2C中之19H9v1具有與圖2A中之19H9相同之FR1、CDR1及FR2，因為圖2C中僅說明不同之處。圖中提供三個核酸序列(ABP 26E10、30B9及31B12)之其他替代性核酸序列。熟習此項技術者應瞭解，在建立抗體或ABP時，實際上需要使用不超過一個所述序列。的確，在一些實施例中，僅需存在特定重鏈或輕鏈核酸中之一者或兩者均不需存在。
在一些實施例中，ABP由可編碼表2中之蛋白質序列中之任一者的核酸序列來編碼。
在一些實施例中，ABP與PCSK9之與LDLR結合之形式(例如，分子之自催化形式)選擇性結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白不與催化域之c-末端(例如，c-末端中之5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40個最多胺基酸)結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白不與催化域之n-末端(例如，n-末端中之5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40個最多胺基酸)結合。在一些實施例中，ABP與PCSK9之成熟形式之胺基酸1-100中的胺基酸結合。在一些實施例中，ABP與胺基酸31-100、100-200、31-152、153-692、200-300、300-400、452-683、400-500、500-600、31-692、31-449及/或600-692(及/或由上述胺基酸組成之胺基酸序列)中的胺基酸結合。在一些實施例中，ABP與催化域結合。在一些實施例中，中和及/或非中和ABP與前域結合。在一些實施例中，ABP與催化域及前域兩者結合。在一些實施例中，ABP與催化域結合以阻塞催化域上與前域相互作用的區域。在一些實施例中，ABP在前域與之相互作用的位置或表面處(如Piper等人(Structure 15：1-8(2007)所概述，因此其整體以引用之方式併入本文中，包含其中之結構示意圖)與催化域結合。在一些實施例中，ABP與催化域結合且限制前域之移動性(mobility)。在一些實施例中，ABP與催化域結合而不與前域結合。在一些實施例中，ABP與催化域結合，而不與前域結合，同時阻止前域重新定位(reorienting)致使PCSK9與LDLR結合。在一些實施例中，ABP結合於與Piper等人一文中之前域之周圍殘基149-152相同之抗原決定基中。在一些實施例中，ABP與V域上之溝槽(groove)(如Piper等人中所概述)結合。在一些實施例中，ABP與鄰近V域上之溝槽的富組胺酸小片(histidine-rich patch)結合。在一些實施例中，所述抗體(與 V域結合)不為中和抗體。在一些實施例中，與V域結合之抗體為中和抗體。在一些實施例中，中和ABP阻止PCSK9與LDLR之結合。在一些實施例中，中和ABP雖然阻止LDLR之PCSK9降解，但不阻止PCSK9與LDLR(例如ABP 31A4)之結合。在一些實施例中，ABP與至少一個在Piper等人論文之圖4中所描繪之組胺酸結合或阻斷所述至少一個組胺酸。在一些實施例中，ABP阻斷PCSK9中之催化三元體(catalytic triad)。
在一些實施例中，抗體與變異PCSK9蛋白(例如，D374Y)選擇性結合，而勝過與野生型PCSK9結合。在一些實施例中，所述抗體與變異體之結合強度為與野生型之結合的至少兩倍，且較佳地與突變體結合為與野生型結合的2-5、5-10、10-100、100-1000、1000-10,000或超過10,000倍(如由Kd所量測)。在一些實施例中，抗體選擇性抑制變異D374Y PCSK9與LDLR相互作用，而勝過抑制野生型PCSK9與LDLR相互作用之能力。在一些實施例中，所述抗體阻斷變異體與LDLR結合之能力，而強過阻斷野生型與LDLR結合之能力，例如為野生型之至少兩倍，且較佳地對突變體能力之阻斷為對野生型的2-5、5-10、10-100、100-1000倍或超過1000倍(如由IC50所量測)。在一些實施例中，抗體以相似程度結合且中和野生型PCSK9與PCSK9之變異形式(諸如D374Y)。在一些實施例中，抗體與PCSK9結合以阻止LDLR之變異體與PCSK9結合。在一些實施例中，LDLR之變異體與人類LDLR至少50%一致。應注意，熟習此項技術者已知LDLR之變異體(例如，Brown MS等人，“Calcium cages,acid baths and recycling receptors”Nature 388：629-630,1997)。在一些實施例中，ABP可提昇異型接合子家族性高膽固醇血症(heterozygote familial hypercholesterolemia)(其中存在LDLR之功能喪失(loss-of function)變異體)中有效LDLR之含量。
在一些實施例中，ABP與圖1A及/或圖1B中所描繪之PCSK9形式有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%或超過99%的一致性%的PCSK9變異體結合(但不阻斷)。在一些實施例中，ABP與圖1A及/或圖1B中所描繪之PCSK9之成熟形式有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%或超過99%的一致性%的PCSK9變異體結合(但不阻斷)。在一些實施例中，ABP與圖1A及/或圖1B中所描繪之PCSK9形式有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%或超過99%的一致性%的PCSK9變異體結合且阻止所述PCSK9變異體與LDLR相互作用。在一些實施例中，ABP與圖1B中所描繪之PCSK9之成熟形式有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%或超過99%的一致性%的PCSK9變異體結合且阻止所述PCSK9變異體與LDLR相互作用。在一些實施例中，PCSK9變異體為人類變異體，諸如位置474處之變異體E620G及/或E670G。在一些實施例中，位置474處之胺基酸為纈胺酸(如在其他人類中)或蘇胺酸(如在犬及小鼠中)。鑒於本文中所呈現之交叉反應性資料，咸信本發明抗體將容易地與以上變異體結合。
在一些實施例中，ABP與由表2中所述之抗體中之一者所結合的抗原決定基結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白與PCSK9之特定構形狀態結合從而阻止PCSK9與LDLR相互作用。
人化抗原結合蛋白(例如，抗體)
如本文中所述，針對PCSK9之抗原結合蛋白可包括人化抗體及/或其部分。所述策略之一個重要的實際應用為“人化”小鼠體液免疫系統。
在某些實施例中，人化抗體在人類中實質上為非免疫原性的。在某些實施例中，人化抗體與來自衍生所述人化抗體之另一物種之抗體 對靶標具有實質上相同的親和力。例如參見，美國專利第5,530,101號、美國專利第5,693,761號、美國專利第5,693,762號、美國專利第5,585,089號。
在某些實施例中，鑑別了可加以修飾而在降低抗體之免疫原性的同時並不減弱抗原結合域之天然親和力的抗體可變域之胺基酸。例如參見，美國專利第5,766,886號及第5,869,619號。
在某些實施例中，通常設計藉由此項技術所已知之方法進行抗體修飾來實現對靶標之結合親和力增加及/或降低抗體在接受者中之免疫原性。在某些實施例中，人化抗體經修飾來去除醣基化位點以便增加抗體對其同源抗原(cognate antigen)之親和力。例如參見，Co等人，Mol.Immunol.,30：1361-1367(1993)。在某些實施例中，使用諸如“重塑(reshaping)”、“超嵌合(hyperchimerization)”或“飾面(veneering)/表面重塑(resurfacing)”等技術產生人化抗體。例如參見，Vaswami等人，Annals of Allergy,Asthma,& Immunol.81：105(1998)；Roguska等人，Prot.Engineer.,9：895-904(1996)；及美國專利第6,072,035號。在某些所述實施例中，所述技術通常藉由減少外來殘基之數目來降低抗體免疫原性，但重複投與抗體後並不阻止抗遺傳型(anti-idiotypic)及抗異型(anti-allotypic)反應。降低免疫原性之某些其他方法例如描述於Gilliland等人，J.Immunol.,62(6)：3663-71(1999)中。
在某些情況下，人化抗體導致抗原結合能力喪失。在某些實施例中，人化抗體經“回復突變(back mutated)”。在某些所述實施例中，人化抗體經突變而包含一或多個在供體抗體中可見之胺基酸殘基。例如參見，Saldanha等人，Mol Immunol 36：709-19(1999)。
在某些實施例中，可將針對PCSK9之抗體之輕鏈及重鏈可變區之互補決定區(CDR)移植至來自同一或另一物種之構架區(FR) 中。在某些實施例中，可將針對PCSK9之抗體之輕鏈及重鏈可變區之CDR移植至一致(consensus)人類FR中。在某些實施例中，為產生一致人類FR，比對來自數個人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR以鑑別一致胺基酸序列。在某些實施例中，用來自不同重鏈或輕鏈之FR置換針對PCSK9之抗體重鏈或輕鏈之FR。在某些實施例中，不置換針對PCSK9之抗體重鏈及輕鏈之FR中的稀有(rare)胺基酸，而置換其餘的FR胺基酸。稀有胺基酸為FR中某些位置處之特定胺基酸，其在所述位置處通常不可見。在某些實施例中，可將來自針對PCSK9之抗體之移植可變區與不同於針對PCSK9之抗體之恆定區之恆定區一起使用。在某些實施例中，所移植可變區為單鏈Fv抗體之一部分。CDR移植例如描述於以下文獻中：美國專利第6,180,370號、第6,054,297號、第5,693,762號、第5,859,205號、第5,693,761號、第5,565,332號、第5,585,089號及第5,530,101號；及Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988),Winter,FEBS Letts.,430：92-94(1998)，因此無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中參考。
人類抗原結合蛋白(例如，抗體)
如本文中所述，與PCSK9結合之抗原結合蛋白可包括人類(亦即，完全人類)抗體及/或其部分。在某些實施例中，提供編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白分子之核苷酸序列，尤其對應於可變區之序列；及包括重鏈及輕鏈免疫球蛋白分子、尤其對應於可變區之序列之胺基酸序列。在某些實施例中，提供對應於互補決定區(CDR)、尤其自CDR1至CDR3之序列。根據某些實施例，提供表現所述免疫球蛋白分子之融合瘤細胞株(cell line)。根據某些實施例，提供表現所述單株抗體之融合瘤細胞株。在某些實施例中，融合瘤細胞株選自表2中所 述之至少一個細胞株，例如21B12、16F12及31H4。在某些實施例中，提供針對人類PCSK9之純化人類單株抗體。
可用人類Ig基因座之大片段工程改造在小鼠抗體產生方面缺乏之小鼠品系(strain)，以期望所述小鼠將在不存在小鼠抗體之情況下產生人類抗體。大的人類Ig片段可保存大的可變基因多樣性以及對抗體產生及表現之正確調控。藉由利用小鼠機器(machinery)達成抗體多樣化及選擇以及對人類蛋白質之免疫耐受性(immunological tolerance)之缺乏，所述小鼠品系中再生之人類抗體譜系(repertoire)可產生針對任何所關注之抗原(包含人類抗原)的高親和力完全人類抗體。使用融合瘤技術，可產生及選擇具有合乎需要之特異性之抗原特異性人類MAb。某些例示性方法描述於WO 98/24893、美國專利第5,545,807號、EP 546073及EP 546073中。
在某些實施例中，可使用來自除人類以外之物種之恆定區以及人類可變區。
在酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)中選殖及重構百萬鹼基大小之(megabase sized)人類基因座及將所述基因座引入小鼠生殖系(germline)之能力，提供一種闡明極大或粗略定位(mapped)之基因座之功能組分以及產生人類疾病之適用模型的方法。此外，利用所述用人類同等物取代小鼠基因座之技術，可能提供對發育期間人類基因產物之表現及調控、其與其他系統之通訊及其在疾病誘發及進展中之參與情況的瞭解。
人類抗體避免了一些與具有鼠類或大鼠可變區及/或恆定區之抗體相關的問題。所述鼠類或大鼠衍生蛋白之存在可使得抗體快速清除或可使得患者產生針對抗體之免疫反應。為了避免利用鼠類或大鼠衍生抗體，可藉由將功能性人類抗體基因座引入齧齒動物、其他哺乳動物或動物中以使齧齒動物、其他哺乳動物或動物產生完全人類抗體來 獲得完全人類抗體。
人化抗體為雖然最初以含有非人類之抗體胺基酸序列開始，但已使至少部分所述非人類抗體胺基酸序列用人類抗體序列置換的抗體。這與人類抗體的不同之處在於，抗體由人類所擁有之基因所編碼(或能夠被其編碼)。
抗原結合蛋白變異體
所提供之其他抗體為藉由組合而形成之以上所列之ABP的變異體或表2中所示之可變重鏈及可變輕鏈之子部分，且包括各自與表2中之序列之胺基酸序列(整個序列或序列之子部分，例如，一或多個CDR)具有至少50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-99%或超過99%之一致性的可變輕鏈及/或可變重鏈。在一些情況下，所述抗體包含至少一個重鏈及一個輕鏈，而在其他情況下，變異形式含有兩個相同的輕鏈及兩個相同的重鏈(或其子部分)。在一些實施例中，可使用圖2A至圖3D(及圖13A至圖13J及圖15A至圖15D中之其他實施例)之序列比較，以藉由觀察彼等影響結合之變異及彼等似乎不影響結合之變異來鑑別可加以修飾之抗體之部分。舉例而言，藉由比較類似序列，可鑑別彼等可加以修飾之部分(例如，特定胺基酸)以及其可如何加以修飾而仍保留(或改良)ABP之功能性。在一些實施例中，ABP之變異體包含圖13A、圖13C、圖13F、圖13G、圖13H、圖13I及/或圖13J中所描繪之彼等一致組及序列，且允許在各圖中經鑑別為可變之位置上發生變異。圖13A、圖13C、圖13F及圖13G中所示之CDR是基於Chothia方法(基於結構環區之位置，例如參見，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,”Bissan Al-Lazikani,Arthur M.Lesk及Cyrus Chothia,Journal of Molecular Biology,273(4)：927-948,11月7日(1997))及Kabat方法(基於序列變異性，例如參見， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版號：91-3242,Kabat等人，(1991))之雜交組合而界定的。藉由任一方法所確定之各殘基均包含在CDR殘基之最終列表中(且呈現於圖13A、圖13C、圖13F及圖13G中)。圖13H、圖13I及圖13J中之CDR僅是由Kabat方法所獲得。除非另有規定，否則圖13H至圖13J中所界定之一致序列、CDR及FR將界定且控制圖13中關於參考ABP所說明之CDR及FR。
在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之重鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之重鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之重鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。
在一些實施例中，抗原結合蛋白包括與一或多個來自至少一個下述序列中之CDR之CDR至少90%、90-95%及/或95-99%一致的序列：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在一些實施例中，存在1、2、3、4、5或6個CDR (各與以上序列至少90%、90-95%及/或95-99%一致)。
在一些實施例中，抗原結合蛋白包括與一或多個來自至少一個下述序列中之FR之FR至少90%、90-95%及/或95-99%一致的序列：SEQ ID NO：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及60。在一些實施例中，存在1、2、3或4個FR(各與以上序列至少90%、90-95%及/或95-99%一致)。
在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之輕鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之輕鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括包含可變區之輕鏈，所述可變區包括與選自至少一個下述序列之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。
在一些實施例中，抗原結合蛋白包括與一或多個來自至少一個下述序列中之CDR之CDR至少90%、90-95%及/或95-99%一致的序列：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些實施例中，存在1、2、3、4、5或6個CDR(各與以上序列至少90%、90-95%及/或95-99%一致)。
在一些實施例中，抗原結合蛋白包括與一或多個來自至少一個下述序列中之FR之FR至少90%、90-95%及/或95-99%一致的序列：SEQ ID NO：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及46。在一些實施例中，存在1、2、3或4個FR(各與以上序列至少90%、90-95%及/或95-99%一致)。
根據本發明揭露案，熟習此項技術者將能夠如本文中所述使用熟知技術確定ABP之合適變異體。在某些實施例中，熟習此項技術者可藉由靶向咸信對活性而言不重要之區來鑑別分子之可加以改變而不破壞活性之合適區域。在某些實施例中，可鑑別分子在類似多肽中保守之殘基及部分。在某些實施例中，在不破壞生物活性或不對多肽結構產生不利影響之情況下，甚至是對生物活性或結構而言重要之區域亦可經受保守性胺基酸取代。
另外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對活性或結構而言重要之殘基的結構-功能研究。鑒於所述比較，可預測對應於在類似蛋白質中對活性或結構而言重要之胺基酸殘基的胺基酸殘基在某種蛋白質中的重要性。熟習此項技術者可對所預測之重要的胺基酸殘基選擇化學上類似之胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可相對於類似ABP中之結構來分析三維結構及胺基酸序列。鑒於所述資訊，熟習此項技術者可就其三維結構來預測抗體之胺基酸殘基之排列。在某些實施例中，熟習此項技術者可選擇不對經預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基進行根本改變，因為所述殘基可能參與重要的與其他分子之相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各合乎需要之胺基酸殘基處含有單個胺基酸取代之測試變異體。隨後可使用熟習此項技術者已知之活性檢定篩選變異體。所述變異體可用於收集關於合適變異體之資訊。舉例而言，若發現對特定胺 基酸殘基之改變導致活性被破壞、不希望地減小或不適合，則可避免具有所述變化之變異體。換言之，基於由所述常規實驗所收集之資訊，熟習此項技術者可容易地確定應僅避免其他取代或應避免其他取代以及其他突變之胺基酸。
許多科學出版物致力於二級結構之預測。參見Moult J.,Curr.Op.,Biotech.,7(4)：422-427(1996)；Chou等人，Biochemistry,13(2)：222-245(1974)；Chou等人，Biochemistry,113(2)：211-222(1974)；Chou等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47：45-148(1978)；Chou等人，Ann.Rev.Biochem.,47：251-276；及Chou等人，Biophys.J.,26：367-384(1979)。此外，當前可利用電腦程式來幫助預測二級結構。一種預測二級結構之方法是基於同源性模擬(homology modeling)。舉例而言，兩個具有大於30%之序列一致性或大於40%之相似性之多肽或蛋白質通常具有類似的結構拓撲學。蛋白質結構資料庫(protein structural database，PDB)之最新發展已提供增強之二級結構可預測性，包含多肽結構或蛋白質結構內摺疊之潛在數目。參見Holm等人，Nucl.Acid.Res.,27(1)：244-247(1999)。已提出(Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol,7(3)：369-376(1997))，在給定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦解析出結構之臨界值(a critical number of structures)，則結構預測將變得極其精確。
預測二級結構之其他方法包含“串線法(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3)：377-87(1997)；Sippl等人，Structure,4(1)：15-19(1996))、“輪廓分析法(profile analysis)”(Bowie等人，Science,253：164-170(1991)；Gribskov等人，Meth.Enzym.,183：146-159(1990)；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,84(13)：4355-4358(1987))及“進化鍵聯法(evolutionary linkage)”(參見Holm,同上(1999)及Brenner，同上(1997))。
在某些實施例中，抗原結合蛋白變異體包含醣基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，醣基化位點之數目及/或類型已改變。在某些實施例中，蛋白變異體包括數目多於或少於天然蛋白之N-連接醣基化位點。N-連接醣基化位點之特徵在於序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸以外之任何胺基酸殘基。產生所述序列之胺基酸殘基取代提供用於添加N-連接碳水化合物鏈之潛在新位點。或者，去除所述序列之取代將移除現有的N-連接碳水化合物鏈。亦提供N-連接碳水化合物鏈之重排，其中去除一或多個N-連接醣基化位點(通常為天然存在之彼等位點)且產生一或多個新的N-連接位點。其他較佳的抗體變異體包含半胱胺酸變異體，其中與親本胺基酸序列相比，缺失一或多個半胱胺酸殘基或一或多個半胱胺酸殘基經取代為另一胺基酸(例如，絲胺酸)。當抗體必須再摺疊為生物活性構形時(諸如在分離不可溶之包涵體(inclusion body)之後)，半胱胺酸變異體可為適用的。半胱胺酸變異體通常具有比天然蛋白少之半胱胺酸殘基，且通常具有偶數個以最小化由不成對的半胱胺酸所引起之相互作用。
根據某些實施例，胺基酸取代為以下取代：(1)減小對蛋白水解作用之感受性(susceptibility)，(2)減小對氧化作用之感受性，(3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變結合親和力，及/或(4)賦予或改進所述多肽之其他物理化學或功能性質。根據某些實施例，可在天然存在之序列中(在某些實施例中，在形成分子間接觸之域以外的多肽部分中)進行單個或多個胺基酸取代(在某些實施例中，保守性胺基酸取代)。在某些實施例中，保守性胺基酸取代通常可能不會實質上改變親本序列之結構特徵(例如，置換胺基酸不應傾向於破壞親本序列中所存在之螺旋結構，或破壞為親本序列特徵之其他類型之二級結構)。業界公認之多肽二級及三級結構之實例描述於 Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden及J.Tooze編，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；及Thornton等人，Nature,354：105(1991)中，所述文獻各自以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，變異體為本文中所揭露之ABP之核酸序列的變異體。熟習此項技術者應瞭解，以上討論可用於鑑別、評估及產生ABP蛋白變異體以及可編碼彼等蛋白變異體之核酸序列。因此，涵蓋編碼彼等蛋白變異體之核酸序列(以及編碼表2中之ABP但不同於本文中明確揭露之彼等核酸序列的核酸序列)。舉例而言，ABP變異體可與SEQ ID NO：152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151中所述之至少一個核酸序列或與由SEQ ID NO：152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150及151中之核酸序列所編碼之至少1至6個CDR(及其多種組合)具有至少80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-99%或超過99%的一致性。
在一些實施例中，若編碼特定ABP之核酸序列(或核酸序列本身)可在嚴格條件下與編碼表2中之蛋白質之任何核酸序列(諸如但 不限於SEQ ID NO：152、153、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150及151)選擇性雜交，則抗體(或編碼其之核酸序列)為變異體。在一實施例中，合適之中等嚴格條件包含以5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8：0)之溶液預洗滌；在50℃-65℃下用5×SSC雜交隔夜，或者在交叉物種同源之情況下，在45℃下用5×SSC雜交；接著在65℃下洗滌兩次歷時20分鐘，每次用含有0.1% SDS之2×、0.5×及0.2×SSC洗滌。所述雜交DNA序列亦在本發明之範圍內，歸因於密碼簡併性(code degeneracy)，編碼由雜交DNA序列所編碼之抗體多肽之核苷酸序列及由所述核酸序列編碼之胺基酸序列亦在本發明之範圍內。在一些實施例中，CDR之變異體包含核酸序列及由所述序列編碼之胺基酸序列，其與以上所說明之序列中之一或多個CDR(個別CDR可根據圖2A至圖3D容易地確定，及圖3CCC至圖3JJJ及圖15A至圖15D中之其他實施例)雜交。短語“選擇性雜交”在此情況下意謂可偵測性地及選擇性地結合。根據本發明之聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在最小化明顯量之與非特異性核酸之可偵測結合的雜交及洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交。可使用高嚴格條件實現如此項技術已知及本文中所討論之選擇性雜交條件。本發明之聚核苷酸、寡核苷酸及片段與所關注之核酸序列之間的核酸序列同源性通常應為至少80%，且更通常較佳為至少85%、90%、95%、99%及100%之增加之同源性。若兩個胺基酸序列之間存在部分或完全一致性，則其序列同源。舉例而言，85%同源性意謂當就最大匹配比對兩個序列時，85%之胺基酸相同。最大匹配中允許有空位(在所匹配之兩個序列中之任 一個中)；空位長度為5或小於5為較佳，2或小於2則更佳。或者且較佳地，若兩個蛋白質序列(或自其衍生之長度為至少30個胺基酸之多肽序列)在使用用突變資料矩陣之程式ALIGN時具有超過5(標準偏差單位)之比對評分及6或大於6之空位罰分，則其同源(如所述術語在本文中所使用)。參見Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence and Structure，第101-110頁(第5卷，National Biomedical Research Foundation(1972))及所述卷之增刊2，第1-10頁。若當使用ALIGN程式最佳比對時，兩個序列或其部分之胺基酸之一致性大於或等於50%，則其更佳同源。本文中使用的術語“對應於”意謂聚核苷酸序列與整個或部分參考聚核苷酸序列同源(亦即，一致，並不嚴格地進化相關)，或意謂多肽序列與參考多肽序列一致。對比而言，本文中使用的術語“互補於”意謂互補序列與整個或部分參考聚核苷酸序列同源。出於說明之目的，核苷酸序列“TATAC”對應於參考序列“TATAC”且互補於參考序列“GTATA”。
抗原結合蛋白(例如，抗體)之製備
在某些實施例中，藉由用抗原(例如，PCSK9)免疫來產生抗原結合蛋白(諸如，抗體)。在某些實施例中，可藉由用全長PCSK9、PCSK9之可溶性形式、僅催化域、圖1A中所示之PCSK9之成熟形式、PCSK9之剪接變異形式或其片段免疫而產生抗體。在某些實施例中，本發明抗體可為多株或單株抗體及/或可為重組抗體。在某些實施例中，本發明抗體為(例如)藉由免疫能夠產生人類抗體之轉殖基因動物而製備之人類抗體(例如參見，PCT公開申請案第WO 93/12227號)。
在某些實施例中，可採用某些策略操縱抗體之固有性質，諸如抗體對其靶標之親和力。所述策略包含(但不限於)使用編碼抗體之聚核苷酸分子之位點特異性或隨機突變誘發來產生抗體變異體。在某些 實施例中，所述產生之後為篩選顯示合乎需要之變化(例如，親和力增加或減小)之抗體變異體。
在某些實施例中，突變策略中所靶向之胺基酸殘基為CDR中之胺基酸殘基。在某些實施例中，靶向可變域之構架區中之胺基酸。在某些實施例中，已證實所述構架區促成某些抗體之靶標結合性質。例如參見，Hudson,Curr.Opin.Biotech.,9：395-402(1999)及其中之參考文獻。
在某些實施例中，藉由限制對CDR中之高突變位點(hyper-mutation site)之隨機或定點突變誘發而產生抗體變異體之更小且更有效的篩選文庫，所述高突變位點為對應於體細胞親和力成熟過程(somatic affinity maturation process)期間傾向於突變之區域之位點。例如參見，Chowdhury及Pastan,Nature Biotech.,17：568-572(1999)及其中之參考文獻。在某些實施例中，可使用某些類型之DNA元件鑑別高突變位點，包含(但不限於)某些正向及反向重複單元(direct and inverted repeat)、某些一致序列、某些二級結構及某些回文序列(palindrome)。舉例而言，可用於鑑別高突變位點之所述DNA元件包含(但不限於)四鹼基序列，其包括嘌呤(A或G)、之後鳥苷(G)、之後嘧啶(C或T)、之後腺苷或胸苷(A或T)(亦即，A/G-G-C/T-A/T)。可用於鑑別高突變位點之DNA元件之另一實例為絲胺酸密碼子A-G-C/T。
完全人類ABP(例如，抗體)之製備
在某些實施例中，使用噬菌體呈現技術產生單株抗體。在某些實施例中，所述技術產生完全人類單株抗體。在某些實施例中，在噬菌體粒子表面上表現編碼單一Fab或Fv抗體片段之聚核苷酸。例如參見，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J Mol Biol 222：581(1991)；美國專利第5,885,793號。在某些實施例 中，“篩選”噬菌體以鑑別彼等對靶標具有親和力之抗體片段。因此，某些所述過程藉由呈現抗體片段譜系於絲狀噬菌體表面上且隨後經由抗體片段譜系與靶標之結合選擇噬菌體來模擬免疫選擇。在某些所述程序中，分離出高親和力功能性中和抗體片段。在某些所述實施例(下文更詳細地討論)中，藉由選殖來自周邊血淋巴細胞之天然重排之人類V基因產生人類抗體基因之完整譜系。例如參見，Mullinax等人，Proc Natl Acad Sci(USA),87：8095-8099(1990)。
根據某些實施例，藉由利用插入產生人類抗體之基因組之實質部分但使得在產生內源性鼠類抗體方面缺乏之轉殖基因小鼠製備本發明抗體。隨後所述小鼠能夠產生人類免疫球蛋白分子及抗體，且在產生鼠類免疫球蛋白分子及抗體方面缺乏。用於實現所述結果之技術揭露於本說明書中所揭露之專利、申請案及參考文獻中。在某些實施例中，可採用諸如彼等於PCT公開申請案第WO 98/24893號或Mendez等人，Nature Genetics,15：146-156(1997)中所揭露之方法，因此無論基於何種目的，所述參考文獻皆以引用之方式併入本文中。
通常可如下產生對PCSK9具有特異性之完全人類單株ABP(例如，抗體)。用所關注之抗原(例如，PCSK9)免疫含有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠，自表現抗體之小鼠獲得淋巴細胞(諸如B細胞)。使所回收之細胞與骨髓型(myeloid-type)細胞株融合以製備永生(immortal)融合瘤細胞株，且篩選並選擇所述融合瘤細胞株以鑑別產生對所關注之抗原具有特異性之抗體的融合瘤細胞株。在某些實施例中，提供產生對PCSK9具有特異性之抗體之融合瘤細胞株的產生方法。
在某些實施例中，藉由將人類脾細胞(B或T細胞)試管內暴露於抗原，隨後在免疫受損小鼠(例如，SCID或nod/SCID)中重構所暴露細胞來產生完全人類抗體。例如參見，Brams等人，Jimmunol. 160：2051-2058(1998)；Carballido等人，Nat.Med.,6：103-106(2000)。在某些所述方法中，將人類胎兒組織移植於SCID小鼠(SCID-hu)中引起長期造血(long-term hematopoiesis)及人類T細胞發育(human T-cell development)。例如參見，McCune等人，Science,241：1532-1639(1988)；Ifversen等人，Sem.Immunol.,8：243-248(1996)。在某些情況下，所述嵌合小鼠中之體液免疫反應視動物中之人類T細胞之共發育(co-development)而定。例如參見，Martensson等人，Immunol.,83：1271-179(1994)。在某些方法中，將人類周邊血淋巴細胞移植於SCID小鼠中。例如參見，Mosier等人，Nature,335：256-259(1988)。在某些所述實施例中，當用引發劑(priming agent)(諸如，葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA))或用抗人類CD40單株抗體處理所述移植細胞時，偵測到更高水平之B細胞產生。例如參見，Martensson等人，Immunol.,84：224-230(1995)；Murphy等人，Blood,86：1946-1953(1995)。
因此，在某些實施例中，可藉由表現重組DNA於宿主細胞中或藉由表現於融合瘤細胞中來產生完全人類抗體。在其他實施例中，可使用本文中所述之噬菌體呈現技術產生抗體。
藉由利用如本文中所述之XenoMouse®技術製備本文中所述之抗體。隨後所述小鼠能夠產生人類免疫球蛋白分子及抗體，且在產生鼠類免疫球蛋白分子及抗體方面缺乏。用於實現所述結果之技術揭露於本文中先前技術部分中所揭露之專利、申請案及參考文獻中。然而，轉殖基因產生小鼠及由其產生抗體之較佳實施例揭露於1996年12月3日申請之美國專利申請案第08/759,620號及1998年6月11日公開之國際專利申請案第WO 98/24893號及2000年12月21日公開之WO 00/76310中，因此其揭露內容以引用之方式併入本文中。亦參見Mendez等 人，Nature Genetics,15：146-156(1997)，因此其揭露內容以引用之方式併入本文中。
藉由使用所述技術，已產生針對多種抗原之完全人類單株抗體。基本上，用所關注之抗原(例如，PCSK9)免疫小鼠之XenoMouse®品系，自高免疫小鼠回收淋巴細胞(諸如，B細胞)，且將所回收的淋巴細胞與骨髓型細胞株融合以製備永生融合瘤細胞株。篩選並選擇所述融合瘤細胞株以鑑別產生對所關注之抗原具有特異性之抗體的融合瘤細胞株。本文中提供獲得多個產生對PCSK9具有特異性之抗體之融合瘤細胞株的方法。另外，本文中提供由所述細胞株產生之抗體之表徵，包含所述抗體之重鏈及輕鏈之核苷酸及胺基酸序列分析。
小鼠之XenoMouse®品系之產生進一步討論且描繪於以下專利中：1990年1月12日申請之美國專利申請案第07/466,008號；1990年11月8日申請之第07/610,515號；1992年7月24日申請之第07/919,297號；1992年7月30日申請之第07/922,649號；1993年3月15日申請之第08/031,801號；1993年8月27日申請之第08/112,848號；1994年4月28日申請之第08/234,145號；1995年1月20日申請之第08/376,279號；1995年4月27日申請之第08/430,938號；1995年6月5日申請之第08/464,584號；1995年6月5日申請之第08/464,582號；1995年6月5日申請之第08/463,191號；1995年6月5日申請之第08/462,837號；1995年6月5日申請之第08/486,853號；1995年6月5日申請之第08/486,857號；1995年6月5日申請之第08/486,859號；1995年6月5日申請之第08/462,513號；1996年10月2日申請之第08/724,752號；1996年12月3日申請之第08/759,620號；2001年11月30日申請之美國公開案2003/0093820及美國專利第6,162,963號；第6,150,584號；第6,114,598號；第6,075,181號及第5,939,598號及日本專利第3 068 180 B2號；第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見1996年6月12日准許公開之 歐洲專利第EP 0 463 151 B1號；1994年2月3日公開之國際專利申請案第WO 94/02602號；1996年10月31日公開之國際專利申請案第WO 96/34096號；1998年6月11日公開之第WO 98/24893號；2000年12月21日公開之第WO 00/76310號。因此以上所引用之專利、申請案及參考文獻各自之揭露內容整體以引用之方式併入本文中。
在替代方法中，其他人(包含GenPharm International,Inc.)利用“迷你基因座(minilocus)”方法。在迷你基因座方法中，藉由包含某一外源性Ig基因座之碎片(piece)(個別基因)來模擬所述Ig基因座。因此，將一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、μ恆定區及通常一第二恆定區(較佳，γ恆定區)形成為用於插入動物中之構築體。所述方法描述於以下專利中：Surani等人之美國專利第5,545,807號及Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號；Krimpenfort及Berns之美國專利第5,591,669號及第6,023,010號；Berns等人之美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號；及Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號；及GenPharm International於1990年8月29日申請之美國專利申請案第07/574,748號、1990年8月31日申請之第07/575,962號、1991年12月17日申請之第07/810,279號、1992年3月18日申請之第07/853,408號、1992年6月23日申請之第07/904,068號、1992年12月16日申請之第07/990,860號、1993年4月26日申請之第08/053,131號、1993年7月22日申請之第08/096,762號、1993年11月18日申請之第08/155,301號、1993年12月3日申請之第08/161,739號、1993年12月10日申請之第08/165,699號、1994年3月9日申請之第08/209,741號；因此其揭露內容以引用之方式併入本文中。亦參見歐洲專利第0 546 073 B1號；國際專利申請案第WO 92/03918號；第WO 92/22645號；第WO 92/22647號；第WO 92/22670號；第WO 93/12227號；第WO 94/00569號；第WO 94/25585號；第WO 96/14436號；第WO 97/13852號及第WO 98/24884號；及美國專利第5,981,175號，因此其揭露內容整體以引用之方式併入本文中。進一步參見Taylor等人，1992；Chen等人，1993；Tuaillon等人，1993；Choi等人，1993；Lonberg等人，(1994)；Taylor等人，(1994)；及Tuaillon等人，(1995)；Fishwild等人，(1996)，因此其揭露內容整體以引用之方式併入本文中。
Kirin亦已證明由已藉由微細胞融合(microcell fusion)而引入染色體大碎片或整個染色體之小鼠產生人類抗體。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號，因此其揭露內容以引用之方式併入本文中。另外，已產生KMTM小鼠，其是由Kirin之Tc小鼠與Medarex之迷你基因座(Humab)小鼠雜交育種(cross-breeding)所產生。所述小鼠具有Kirin小鼠之人類IgH轉殖染色體(transchromosome)及Genpharm小鼠之κ鏈轉殖基因(transgene)(Ishida等人，Cloning Stem Cells,(2002)4：91-102)。
人類抗體亦可藉由試管內方法衍生得到。合適的實例包含(但不限於)噬菌體呈現(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(先前稱Proliferon)、Affimed)、核糖體呈現(CAT)、酵母呈現及其類似方法。
在一些實施例中，本文中所述之抗體具有人類IgG4重鏈以及IgG2重鏈。抗體亦可具有其他人類同種型，包含IgG1。當以多種技術量測時，抗體具有高親和力，通常具有約10-6至約10-13莫耳濃度或小於10-13莫耳濃度之Kd。
應瞭解，抗體可表現於除融合瘤細胞株以外之細胞株中。可使用編碼特定抗體之序列轉殖合適的哺乳動物宿主細胞。可藉由將聚核苷 酸引入宿主細胞中之任何已知方法來轉殖，所述方法包含(例如)封裝聚核苷酸於病毒(或病毒載體)中及用所述病毒(或載體)轉導宿主細胞；或藉由此項技術已知之轉染程序，如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號中所例示(因此所述專利以引用之方式併入本文中)。所使用之轉殖程序視待轉殖之宿主而定。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中的方法在此項技術中為熟知的且包含由葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、由聚凝胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核苷酸封裝於脂質體中及將DNA直接顯微注射(microinjection)於核中。
可作為用於表現之宿主利用之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知的且包含許多可自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得之永生化細胞株，所述細胞株包含(但不限於)中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、小倉鼠腎(baby hamster kidney，BHK)細胞、猴腎細胞(monkey kidney cell，COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類上皮腎293細胞及多種其他細胞株。藉由確定哪些細胞株具有高表現水平且產生具有組成性PCSK9結合性質之抗體來選擇尤其較佳之細胞株。
在某些實施例中，由至少一個下述融合瘤產生抗體及/或ABP：21B12、31H4、16F12、表2中所列或實例中所揭露之任何其他融合瘤。在某些實施例中，抗原結合蛋白以小於約1奈莫耳濃度(例如，1000皮莫耳濃度至100皮莫耳濃度、100皮莫耳濃度至10皮莫耳濃度、10皮莫耳濃度至1皮莫耳濃度及/或1皮莫耳濃度至0.1皮莫耳濃度或小於0.1皮莫耳濃度)之解離常數(Kd)與PCSK9結合。
在某些實施例中，抗原結合蛋白包括具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD及IgM同種型中之至少一種之免疫球蛋白分 子。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類κ輕鏈及/或一人類重鏈。在某些實施例中，所述重鏈具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同種型。在某些實施例中，已針對於哺乳動物細胞中之表現選殖抗原結合蛋白。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括除具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同種型之任何恆定區以外的恆定區。
在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類λ輕鏈及一人類IgG2重鏈。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類λ輕鏈及一人類IgG4重鏈。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類λ輕鏈及一人類IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重鏈。在其他實施例中，抗原結合蛋白包括一人類κ輕鏈及一人類IgG2重鏈。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類κ輕鏈及一人類IgG4重鏈。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一人類κ輕鏈及一人類IgG1、IgG3、IgE、IgA、IgD或IgM重鏈。在某些實施例中，抗原結合蛋白包括與一恆定區連接的抗體可變區，所述恆定區不為IgG2同種型之恆定區，亦不為IgG4同種型之恆定區。在某些實施例中，已針對於哺乳動物細胞中之表現選殖抗原結合蛋白。
在某些實施例中，對來自至少一個融合瘤細胞株21B12、31H4及16F12之抗體之重鏈及輕鏈的保守性修飾(及對編碼核苷酸之相應修飾)將產生針對PCSK9之抗體，所述抗體具有與來自融合瘤細胞株21B12、31H4及16F12之抗體相似的功能及化學特性。相反，在某些實施例中，在針對PCSK9之抗體之功能及/或化學特性方面之實質性修飾可藉由選擇重鏈及輕鏈之胺基酸序列中之取代來實現，所述取代在對維持以下情形之效應方面顯著不同：(a)取代區域內之分子主鏈之結構，例如呈摺疊(sheet)構形或螺旋(helical)構形，(b)分子於靶位點處之電荷或疏水性，或(c)側鏈之體積(bulk)。
舉例而言，“保守性胺基酸取代”可包括用非天然殘基取代天然胺基酸殘基以致幾乎不或不對所述位置處之胺基酸殘基之極性或電荷產生影響。此外，亦可用丙胺酸取代多肽中之任何天然殘基，如先前關於“丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)”所述。
當需要胺基酸取代(保守性或非保守性)時，熟習此項技術者可確定所述合乎需要之取代。在某些實施例中，可使用胺基酸取代鑑別針對PCSK9之抗體之重要殘基，或者如本文所述增加或減小抗體對PCSK9之親和力。
在某些實施例中，可將本發明抗體表現於除融合瘤細胞株以外的細胞株中。在某些實施例中，可使用編碼特定抗體之序列轉殖合適的哺乳動物宿主細胞。根據某些實施例，可藉由將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法來轉殖，所述方法包含(例如)封裝聚核苷酸於病毒(或病毒載體)中及用所述病毒(或載體)轉導宿主細胞；或藉由此項技術已知之轉染程序，如美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號中所例示(因此無論基於何種目的，所述專利皆以引用之方式併入本文中)。在某些實施例中，所使用之轉殖程序可視待轉殖之宿主而定。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中為熟知的且包含(但不限於)由葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、由聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核苷酸封裝於脂質體中及將DNA直接顯微注射於核中。
可作為用於表現之宿主利用之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知的且包含(但不限於)許多可自美國典型菌種保藏中心(ATCC)獲得之永生化細胞株，所述細胞株包含(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)及多種其他細胞株。 在某些實施例中，可藉由確定哪些細胞株具有高表現水平且產生具有組成性肝細胞生長因子(HGF)結合性質之抗體來選擇細胞株。熟知適合於哺乳動物宿主細胞的表現載體。
在某些實施例中，抗原結合蛋白包括一或多個多肽。在某些實施例中，可利用多種表現載體/宿主系統中的任一種來表現編碼包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身之聚核苷酸分子。所述系統包含(但不限於)微生物，諸如經重組噬菌體、質體或黏質體(cosmid)DNA表現載體轉殖之細菌；經酵母表現載體轉殖之酵母；經病毒表現載體(例如，桿狀病毒(baculovirus))感染之昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如，花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus)TMV)轉染或經細菌表現載體(例如，Ti或pBR322質體)轉殖之植物細胞系統；或動物細胞系統。
在某些實施例中，將包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身重組表現於酵母中。某些所述實施例按照製造商之說明書使用市售的表現系統，例如畢赤酵母表現系統(Pichia Expression System)(Invitrogen,San Diego,CA)。在某些實施例中，所述系統依賴於引導分泌之pre-pro-α序列。在某些實施例中，插入物之轉錄在經甲醇誘導後由醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX1)啟動子驅動。
在某些實施例中，自酵母生長培養基純化包括一或多個ABP組分之分泌多肽或ABP本身。在某些實施例中，用於自酵母生長培養基純化多肽之方法與用於自細菌及哺乳動物細胞上清液純化多肽之彼等方法相同。
在某些實施例中，將編碼包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身之核酸選殖於桿狀病毒表現載體(諸如pVL1393(PharMingen,San Diego,CA))中。在某些實施例中，可根據製造商之指南 (PharMingen)使用所述載體來感染在無sF9蛋白之培養基中的草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞且產生重組多肽。在某些實施例中，使用肝素-瓊脂糖管柱(Pharmacia)自所述培養基純化且濃縮多肽。
在某些實施例中，將包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身表現於昆蟲系統中。熟習此項技術者熟知用於多肽表現之某些昆蟲系統。在一個所述系統中，使用苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)作為載體將外來基因表現於草地黏蟲細胞中或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中。在某些實施例中，可將編碼多肽之核酸分子插入病毒之非必需基因中，例如多角體蛋白(polyhedrin)基因內，且置於所述基因之啟動子控制之下。在某些實施例中，成功插入核酸分子將使非必需基因變得失活。在某些實施例中，所述失活引起可偵測的特徵。舉例而言，多角體蛋白基因之失活使得產生缺乏外殼蛋白之病毒(virus lacking coat protein)。
在某些實施例中，可使用重組病毒來感染草地黏蟲(S.frugiperda)細胞或粉紋夜蛾幼蟲。例如參見，Smith等人，J.Virol.,46：584(1983)；Engelhard等人，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),91：3224-7(1994)。
在某些實施例中，於細菌細胞中製備之包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身以細菌中之不可溶包涵體形式產生。在某些實施例中，藉由離心收集包括所述包涵體之宿主細胞；在0.15莫耳濃度氯化鈉(NaCl)、10毫莫耳濃度(mM)Tris(pH 8)、1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸(EDTA)中洗滌；且在室溫下用0.1毫克/毫升(mg/ml)溶菌酶(lysozyme)(Sigma，St.Louis，MO)處理15分鐘。在某些實施例中，藉由超音波處理使溶解產物澄清(cleared)，且藉由在 12,000×g下離心10分鐘使細胞碎片(cell debris)形成小球(pelleted)。在某些實施例中，將含多肽之小球再懸浮於50毫莫耳濃度Tris(pH 8)及10毫莫耳濃度EDTA中，經50%甘油分層；且在6000×g下離心30分鐘。在某些實施例中，可將所述小球再懸浮於不含Mg++及Ca++之標準磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液(phosphate buffered saline，PBS)中。在某些實施例中，藉由在變性SDS聚丙烯醯胺凝膠中分餾經再懸浮之小球來進一步純化多肽(例如參見，Sambrook等人，同上)。在某些實施例中，所述凝膠可用0.4莫耳濃度的氯化鉀(KCl)浸泡以觀察所述蛋白質，所述蛋白質可在跑膠的缺乏SDS之緩衝液(gel-running buffer lacking SDS)中切除且電溶離。根據某些實施例，麩胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)融合蛋白在細菌中以可溶性蛋白形式產生。在某些實施例中，使用GST純化模組(Pharmacia)純化所述GST融合蛋白。
在某些實施例中，希望“再摺疊”某些多肽，例如包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身。在某些實施例中，使用本文中所討論之某些重組系統產生所述多肽。在某些實施例中，將多肽“再摺疊”及/或氧化以形成合乎需要之三級結構及/或產生二硫鍵。在某些實施例中，所述結構及/或鍵聯與多肽之某些生物活性相關。在某些實施例中，使用此項技術已知之多種程序中之任一種實現再摺疊。例示性方法包含(但不限於)在離液劑(chaotropic agent)存在下將所溶解之多肽試劑暴露於通常高於7之pH值。例示性離液劑為胍。在某些實施例中，再摺疊/氧化溶液亦含有某一還原劑及所述還原劑之氧化形式。在某些實施例中，還原劑及其氧化形式以將會產生使得發生二硫鍵改組(disulfide shuffling)之特定氧化還原電位之比率存在。在某些實施例中，所述改組使得形成半胱胺酸橋鍵。例示性氧化還原對包含(但不限於)半胱胺酸/胱胺、麩胱甘肽(glutathione)/二硫雙麩 胱甘肽(dithiobisGSH)、氯化銅、二硫蘇糖醇DTT/二噻烷DTT及2-巰基乙醇(bME)/二硫巰基乙醇(dithio-bME)。在某些實施例中，使用輔溶劑增加再摺疊之效率。例示性輔溶劑包含(但不限於)甘油、具有不同分子量之聚乙二醇及精胺酸。
在某些實施例中，實質上純化包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身。熟習此項技術者已知某些蛋白質純化技術。在某些實施例中，蛋白質純化包括粗分餾多肽餾份與非多肽餾份。在某些實施例中，使用層析技術及/或電泳技術純化多肽。例示性純化方法包含(但不限於)以硫酸銨沈澱；以PEG沈澱；免疫沈澱；熱變性，接著離心；層析法，包含(但不限於)親和層析法(例如，蛋白質A-瓊脂糖)、離子交換層析法、排阻層析法及逆相層析法；凝膠過濾；羥基磷灰石層析法；等電聚焦；聚丙烯醯胺凝膠電泳；及所述技術及其他技術之組合。在某些實施例中，藉由快速蛋白質液相層析法或藉由高壓液相層析法(high pressure liquid chromotography，HPLC)純化多肽。在某些實施例中，可改變純化步驟或可省略某些步驟，且仍產生適合於製備實質上純之多肽的方法。
在某些實施例中，定量多肽製劑之純化度。熟習此項技術者已知某些定量純化度之方法。某些例示性方法包含(但不限於)測定製劑之特異性結合活性及藉由SDS/PAGE分析評定製劑中多肽之量。評定多肽製劑之純化之量的某些例示性方法包括計算製劑之結合活性及將其與最初萃取物之結合活性作比較。在某些實施例中，所述計算之結果以“純化倍數(fold purification)”表示。用於表示結合活性之量之單位視所執行之特定檢定而定。
在某些實施例中，部分純化包括一或多個ABP組分之多肽或ABP本身。在某些實施例中，部分純化可藉由使用較少純化步驟或藉由利用同一通用純化方案之不同形式來實現。舉例而言，在某些實施例 中，利用HPLC設備所執行之陽離子交換管柱層析法通常將產生比利用低壓層析系統之相同技術高之“純化倍數”。在某些實施例中，產生較低純化度之方法在多肽之總回收率或保持多肽之結合活性方面可能具有優勢。
在某些情況下，多肽之電泳遷移可能隨SDS/PAGE之不同條件而變化，有時顯著變化。例如參見，Capaldi等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,76：425(1977)。應瞭解，在不同的電泳條件下，經純化或部分純化之多肽之表觀分子量可能不同。
例示性抗原決定基
提供抗PCSK9抗體所結合之抗原決定基。在一些實施例中，由目前揭露之抗體所結合之抗原決定基尤其適用。在一些實施例中，與由本文中所述之抗體所結合之任何抗原決定基結合的抗原結合蛋白是適用的。在一些實施例中，由表2及圖2及圖3中所列之任何抗體所結合之抗原決定基尤其適用。在一些實施例中，抗原決定基位於PCSK9之催化域上。
在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基阻止(例如，減小)抗PCSK9抗體或抗原結合蛋白與PCSK9之結合。在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基減小抗PCSK9抗體或抗原結合蛋白與PCSK9之結合。在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基實質上抑制抗PCSK9抗體或抗原結合蛋白與PCSK9之結合。
在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基分離與PCSK9結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基產生與PCSK9結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基或包括PCSK9抗原決定基之序列作為免疫原來產生與PCSK9結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，可向動物投與PCSK9抗原決定基，且隨後可自動物獲得與PCSK9結合之抗體。在 某些實施例中，可利用PCSK9抗原決定基或包括PCSK9抗原決定基之序列干擾正常的由PCSK9介導之活性，諸如PCSK9與LDLR之締合。
在一些實施例中，本文中所揭露之抗原結合蛋白與N-末端前域、枯草桿菌蛋白酶樣催化域及/或C-末端域特異性結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白與PCSK-9之受質結合溝槽結合(描述於Cunningham等人中，其整體以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，可藉由突變PCSK9(例如，野生型抗原)中之特定殘基及確定抗原結合蛋白是否可結合突變或變異的PCSK9蛋白，來鑑別含有與抗體接觸或由抗體掩埋之殘基的域/區。藉由進行大量個別突變，可鑑別在結合中發揮直接作用或與抗體充分接近以使突變會影響抗原結合蛋白與抗原之間結合的殘基。基於對所述胺基酸之認識，可闡明抗原中含有與抗原結合蛋白接觸或由抗體覆蓋之殘基的域或區。所述域可包含抗原結合蛋白之結合抗原決定基。所述通用方法之一具體實例利用精胺酸/麩胺酸掃描方案(例如參見，Nanevicz,T.等人，1995,J.Biol.Chem.,270：37,21619-21625及Zupnick,A.等人，2006,J.Biol.Chem.,281：29,20464-20473)。大體而言，用精胺酸及麩胺酸取代(通常個別地)野生型多肽中之胺基酸，因為所述胺基酸帶電且體積大，且因此具有破壞抗原結合蛋白與抗原之間在抗原之引入突變之區中結合的潛能。存在於野生型抗原中之精胺酸用麩胺酸置換。獲得多種所述個別突變體，且分析所收集之結合結果以確定哪些殘基影響結合。
實例39描述一種針對本文中所提供之PCSK9抗原結合蛋白的PCSK9之所述精胺酸/麩胺酸掃描。產生了一系列突變PCSK9抗原，其中各突變抗原具有單一突變。量測各突變PCSK9抗原與多個PCSK9ABP之結合，且與所選擇之ABP結合野生型PCSK9(SEQ ID NO：303)之能力作比較。
抗原結合蛋白與如本文中所使用之變異PCSK9之間結合的改變(例如，減小或增加)意謂結合親和力(例如，由已知方法所量測，所述方法諸如以下實例中所述之Biacore測試或基於珠粒之檢定)、EC50改變及/或抗原結合蛋白之總結合能力(例如，由抗原結合蛋白濃度與抗原濃度之關係曲線中最大結合(Bmax)之減小所證明)改變(例如，減小)。結合之顯著改變表明當抗原結合蛋白與抗原結合時，突變的殘基直接參與與抗原結合蛋白之結合或緊密接近結合蛋白。
在一些實施例中，結合之顯著減小意謂結合親和力、EC50及/或抗原結合蛋白與突變PCSK9抗原之間的結合能力相對於抗原結合蛋白與野生型PCSK9(例如，SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：303中所示)之間的結合，減小超過10%、超過20%、超過40%、超過50%、超過55%、超過60%、超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過85%、超過90%或超過95%。在某些實施例中，結合減小至可偵測限度以下。在一些實施例中，當抗原結合蛋白與變異PCSK9蛋白之結合小於在抗原結合蛋白與野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：303之蛋白)之間所觀察到之結合的50%(例如小於40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)時，證明結合顯著減小。可使用此項技術已知之多種結合檢定進行所述結合量測。一個所述檢定之具體實例描述於實例39中。
在一些實施例中，提供顯示對一變異PCSK9蛋白之顯著較低的結合之抗原結合蛋白，在所述變異PCSK9蛋白中，野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)中之某一殘基經精胺酸或麩胺酸取代。在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，抗原結合蛋白對具有任何一或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或244個)以下突變之變異 PCSK9蛋白之結合顯著減小或增加：R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。在此處所使用之簡化符號中，格式為：野生型殘基：多肽中之位置：突變殘基，其中殘基之編號如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303中所指示。
在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，抗原結合蛋白對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個或超過5個)在以下位置的突變之突變PCSK9蛋白之結合顯著減小或增加：如SEQ ID NO：1中所示之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，抗原結合蛋白對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個或超過5個)在以下位置的突變之突變PCSK9蛋白之結合減小或增加：如SEQ ID NO：1中所示之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，抗原結合蛋白對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個或超過5個)在以下位置的突變之突變PCSK9蛋白之結合實質上減小或增加：SEQ ID NO：1中之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。
在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，ABP對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個等)以下突變之突變PCSK9蛋白之結合顯著減小或增加：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303中之R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R、E582R、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。
在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，ABP對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個等)以下突變之突變PCSK9蛋白之結合顯著減小或增加：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303中之R207E、D208R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及E582R。在一些實施例中，結合減小。在一些實施例中，隨EC50之變化觀察到結合之減小。在一些實施例中，EC50之變化為EC50數值之增加(且因此為結合之減小)。
在一些實施例中，與對野生型PCSK9蛋白(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303)相比，ABP對具有一或多個(例如，1、2、3、4、5個等)以下突變之突變PCSK9蛋白之結合顯著減小或增加：SEQ ID NO：1中之D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及Q554R。在一些實施例中，結合減小。在一些實施例中，隨Bmax之變化觀察到結合之減小。在一些實施例中，Bmax之移動為由ABP所產生之最大信號之減小。在一些實施例中，對於為抗原決定基一部分之胺基酸而言，Bmax減小至少10%，例如，在一些實施例中，以下量中之至少任一量之減小可表明殘基為抗原決定基之一部分：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%。
雖然剛才所列之變異形式是參考SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303中所示之野生型序列提及，但應瞭解在PCSK9之等位基因變異體中，所指示位置處之胺基酸可不同。亦涵蓋顯示對PCSK9之所述等位基因 形式顯著較低之結合的抗原結合蛋白。因此，在一些實施例中，可將任何以上實施例與等位基因序列而不是圖1A中所示之純粹野生型序列相比。
在一些實施例中，抗原結合蛋白對一變異PCSK9蛋白的結合顯著減小，在所述變異PCSK9蛋白中，野生型PCSK9蛋白中所選擇之位置處的殘基突變為任何其他殘基。在一些實施例中，所鑑別之位置使用本文中所述之精胺酸/麩胺酸置換。在一些實施例中，所鑑別之位置使用丙胺酸。
如上所述，可根據掃描結果鑑別直接參與結合或由抗原結合蛋白覆蓋之殘基。因此，所述殘基可指示SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：303或SEQ ID NO：3)中含有抗原結合蛋白所結合之結合區的域或區。由實例39中所概述之結果可見，在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之域結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之區結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及554。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之區結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之162、164、167、207及/或208。在一些實施例中，超過1個(例如，2、3、4或5個)所鑑別之殘基為由ABP所結合之區的一部分。在一些實施例中，ABP與ABP21B12競爭。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之胺基酸185之區結合。在一些實施例中，ABP與 ABP 31H4競爭。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之區結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之439、513、538及/或539。在一些實施例中，超過1個(例如，2、3、4或4個)所鑑別之殘基為由ABP所結合之區的一部分。在一些實施例中，ABP與ABP 31A4競爭。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之區結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之123、129、311、313、337、132、351、390及/或413。在一些實施例中，超過1個(例如，2、3、4、5、6、7、8或9個)所鑑別之殘基為由ABP所結合之區的一部分。在一些實施例中，ABP與ABP 12H11競爭。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與含有至少一個下述胺基酸之區結合：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之582、519、521及/或554。在一些實施例中，超過1個(例如，2、3、4或4個)所鑑別之殘基為由ABP所結合之區的一部分。在一些實施例中，ABP與ABP 3C4競爭。
在一些實施例中，抗原結合蛋白與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303之片段或全長序列中之上述區結合。在其他實施例中，抗原結合蛋白與由所述區組成之多肽結合。提及“SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：303”表示所述序列中之一個或兩個都可被使用或是相關的。短語不表示應僅使用一個。
如上所述，以上描述參考SEQ ID NO：1提及特定胺基酸位置。然而，在整個說明書中，通常參考SEQ ID NO：3中所提供之在位置31處開始之Pro/Cat域。如以下所說明，SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：303缺乏PCSK9之信號序列。因而，所述多個揭露內容之間的任何比較均應需考慮編號中之所述差異。詳言之，SEQ ID NO：1中之任何胺基酸位 置應對應於再伸入SEQ ID NO：3之蛋白質中30個胺基酸之胺基酸位置。舉例而言，SEQ ID NO：1之位置207對應於SEQ ID NO：3之位置237(全長序列及本發明說明書中通常使用之編號系統)。表39.6概述以上所說明之參考SEQ ID NO：1(及/或SEQ ID NO：303)之位置如何對應於SEQ ID NO：3(其包含信號序列)。因此，任何以上所說明之關於SEQ ID NO：1(及/或SEQ ID NO：303)描述之實施例參考SEQ ID NO：3藉由所說明之對應位置加以描述。
在一些實施例中，ABP 21B12與包含殘基162-167(例如，SEQ ID NO：1之殘基D162-E167)之抗原決定基結合。在一些實施例中，ABP 12H11與包含殘基123-132(例如，SEQ ID NO：1之S123-T132)之抗原決定基結合。在一些實施例中，ABP 12H11與包含殘基311-313(例如，SEQ ID NO：1之A311-D313)之抗原決定基結合。在一些實施例中，ABP可與包含所述序列鏈中之任一者的抗原決定基結合。
競爭性抗原結合蛋白
在另一態樣中，提供抗原結合蛋白，其與一種結合本文中所述之與PCSK9特異性結合之抗原決定基的例示性抗體或功能片段競爭。所述抗原結合蛋白亦可與一種本文中例示之抗原結合蛋白結合相同之抗原決定基，或重疊的抗原決定基(overlapping epitope)。預期與例示之抗原結合蛋白競爭或與之結合相同的抗原決定基之抗原結合蛋白及片段顯示類似的功能性質。例示性抗原結合蛋白及片段包含彼等上述之抗原結合蛋白及片段，包含具有表2及/或圖2A至圖3KK及圖15A至圖15D中所包含之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR之彼等抗原結合蛋白及片段。因此，作為具體實例，所提供之抗原結合蛋白包含與具有以下各者之抗體或抗原結合蛋白競爭之彼等抗原結合蛋白：(a)關於圖2A至圖3KK及圖15A至圖15D中所列之抗體所列之所 有6個CDR；(b)關於表2中所列之抗體所列之VH及VL；或(c)關於表2中所列之抗體所說明之兩個輕鏈及兩個重鏈。
某些治療用途及醫藥組成物
在某些情況下，PCSK9活性與許多人類疾病狀態相關。舉例而言，在某些情況下，太高或太低之PCSK9活性與某些病狀(諸如高膽固醇血症)相關。因此，在某些情況下，調節PCSK9活性可為治療上適用的。在某些實施例中，使用針對PCSK9之中和抗原結合蛋白調節至少一種PCSK9活性(例如，與LDLR之結合)。所述方法可治療及/或預防及/或降低與高血清膽固醇含量相關或涉及高血清膽固醇含量之病症之風險。
熟習此項技術者應瞭解，根據本揭露案，與膽固醇、LDL或LDLR含量之改變相關、涉及所述改變或會受所述改變影響的病症均可由抗原結合蛋白之多種實施例處理。在一些實施例中，“膽固醇相關病症”(包含“血清膽固醇相關病症”)包含任何一或多種以下病症：高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠心病、中風、心血管疾病、阿爾茨海默氏病(Alzheimers disease)及通常可表現為(例如)高總血清膽固醇、高LDL、高三酸甘油酯、高VLDL及/或低HDL之異常血脂症。可僅使用ABP或與一或多種其他藥劑組合使用ABP治療之原發性及繼發性異常血脂症之一些非限制性實例包含代謝症候群(metabolic syndrome)、糖尿病(diabetes mellitus)、家族性混合型高脂質血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高三酸甘油酯血症(familial hypertriglyceridemia)、家族性高膽固醇血症(familial hypercholesterolemias)，包含異型接合子高膽固醇血症、同型接合子高膽固醇血症、家族性載脂蛋白B-100缺陷症(familial defective apoplipoprotein B-100)；多基因型高膽固醇血症(polygenic hypercholesterolemia)；殘留物移除疾病(remnant removal disease)、肝脂肪酶不足(hepatic lipase deficiency)；任何以下疾病繼發之異常血脂症：飲食不慎(dietary indiscretion)、甲狀腺功能低下(hypothyroidism)、藥物(包含雌激素及孕激素療法、β-阻斷劑及噻嗪類利尿劑)、腎病症候群(nephrotic syndrome)、慢性腎衰竭(chronic renal failure)、庫欣症候群(Cushing's syndrome)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肝糖貯積症(glycogen storage disease)、肝瘤(hepatoma)、膽汁淤積症(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰島素瘤(insulinoma)、分離生長激素不足(isolated growth hormone deficiency)及酒精誘發之高三酸甘油酯血症(alcohol-induced hypertriglyceridemia)。ABP亦可適用於預防或治療動脈粥樣硬化病，諸如冠心病、冠狀動脈疾病、周邊動脈病、中風(缺血及出血)、心絞痛或腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞。在一些實施例中，ABP適用於降低以下疾病之風險：非致命性心臟病發作、致命性及非致命性中風、某些類型之心臟手術、心臟衰竭住院、患有心臟病患者之胸痛及/或由已建立之心臟病(諸如先前心臟病發作、先前心臟手術)引起之心血管事件及/或由動脈堵塞所致之胸痛。在一些實施例中，可使用所述ABP及方法降低復發性心血管事件之風險。
熟習此項技術者應瞭解，通常可藉由使用士他汀處理(可治療或可預防)之疾病或病症亦可從施用本發明抗原結合蛋白受益。另外，在一些實施例中，可從預防膽固醇合成或LDLR表現增加受益之病症或疾病亦可由抗原結合蛋白之多種實施例治療。另外，熟習此項技術者應瞭解，使用抗PCSK9抗體尤其可適用於治療糖尿病。不僅糖尿病是冠心病之風險因子，而且胰島素也增加PCSK9之表現。亦即，患有糖尿病的人具有升高的血漿脂質含量(可能與高PCSK9含量相關)且 可受益於所述含量之降低。此通常更詳細地討論於Costet等人(“Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein IC”.J.Biol.Chem.,281：6211-6218,2006)中，其整體以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，向彼等患有糖尿病、腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm)、動脈粥樣硬化及/或周邊血管疾病之人投與抗原結合蛋白以使其血清膽固醇含量減小至安全範圍。在一些實施例中，向處於患任何本文中所述之病症之風險的患者投與抗原結合蛋白。在一些實施例中，向吸煙、患有高血壓或早期心臟病發作家族性病史之個體投與ABP。
在一些實施例中，若根據2004年美國膽固醇健康教育計劃(NCEP)治療目標，個體處於中等風險或更高風險，則向其投與ABP。在一些實施例中，若個體之LDL膽固醇含量超過160毫克/分升(mg/dl)，則向個體投與ABP。在一些實施例中，若個體之LDL膽固醇含量超過130(且根據2004年NCEP治療目標，其具有中等或較高之風險)，則投與ABP。在一些實施例中，若個體之LDL膽固醇含量超過100(且根據2004年NCEP治療目標，其具有高或極高風險)，則投與ABP。
醫師將能夠選擇適當的治療適應症且靶向視特定患者之個別概況而定之脂質含量。一種引導高脂質血症治療之充分接受之標準為美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)之美國膽固醇健康教育計劃(National Cholesterol Education Program，NCEP)專家團關於成人高血液膽固醇偵測、評估及治療之第三次報告(成人治療小組III)最終報告，NIH出版號02-5215(2002)，因此其印刷出版物整體以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白使PCSK9活性之量自異常高含量或甚至正常含量減小。在一些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白治療或預防高膽固醇血症及/或製備用於所述病症及/或其他膽固醇相關病症(諸如本文中所說明之彼等病症)之藥物。在某些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白治療或預防PCSK9活性正常之病狀，諸如高膽固醇血症。例如，在所述病狀中，使PCSK9活性減小至正常值以下可提供治療效應。
在一些實施例中，使用超過一種針對PCSK9之抗原結合蛋白調節PCSK9活性。
在某些實施例中，提供治療諸如高膽固醇血症之膽固醇相關病症之方法，所述方法包括投與治療有效量之一或多種針對PCSK9之抗原結合蛋白及另一治療劑。
在某些實施例中，僅投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，在投與至少一種其他治療劑之前投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，與投與至少一種其他治療劑同時投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，在投與至少一種其他治療劑之後投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在其他實施例中，在投與至少一種其他治療劑之前投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。治療劑(除抗原結合蛋白外)包含(但不限於)至少一種其他膽固醇降低(血清及/或體內總膽固醇)劑或某種藥劑。在一些實施例中，所述藥劑增加LDLR之表現，已觀察到增加血清HDL含量、降低LDL含量或降低三酸甘油酯含量。例示性藥劑包含(但不限於)士他汀(阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀、辛伐他汀)、煙酸(Nicotinic acid/Niacin)(NIACOR、NIASPAN(緩慢釋放煙酸)、SLO-NIACIN(緩慢釋放煙酸))、纖維酸(Fibric acid)(LOPID(吉非羅齊(Gemfibrozil))、 TRICOR(非諾貝特(fenofibrate)))、膽酸錯隔劑(Bile acid sequestrant)(QUESTRAN(考來烯胺(cholestyramine)、考來維侖(colesevelam)(WELCHOL)、COLESTID(考來替泊(colestipol)))、膽固醇吸收抑制劑(ZETIA(依澤替米貝(ezetimibe)))、與士他汀組合之煙酸(ADVICOR(LOVASTATIN及NIASPAN))、與吸收抑制劑組合之士他汀(VYTORIN(ZOCOR及ZETIA))及/或脂質調節劑。在一些實施例中，使ABP與PPAR γ激動劑、PPAR α/γ激動劑、鯊烯合成酶抑制劑、CETP抑制劑、抗高血壓劑、抗糖尿病劑(諸如磺醯脲、胰島素、GLP-1類似物、DDPIV抑制劑)、ApoB調節劑、MTP抑制劑及/或阻塞性動脈硬化症治療(arteriosclerosis obliterans treatment)組合。在一些實施例中，使ABP與增加個體中之LDLR蛋白之含量的藥劑組合，所述藥劑諸如士他汀、某些細胞激素(cytokine)(如抑瘤素M(oncostatin M))、雌激素及/或某些草本成分(諸如，小檗鹼(berberine))。在一些實施例中，使ABP與增加個體中之血清膽固醇含量之藥劑(諸如某些抗精神病劑、某些HIV蛋白酶抑制劑、諸如高果糖、蔗糖、膽固醇或某些脂肪酸之膳食因子及RXR、RAR、LXR、FXR之某些核受體激動劑及拮抗劑)組合。在一些實施例中，使ABP與增加個體中之PCSK9之含量的藥劑(諸如士他汀及/或胰島素)組合。兩者之組合可使得其他藥劑之不良副作用由ABP減輕。熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，使ABP與其他藥劑/化合物組合。在一些實施例中，ABP及其他藥劑同時投與。在一些實施例中，ABP及其他藥劑不同時投與，其中在投與所述藥劑之前或之後投與ABP。在一些實施例中，個體在預防的同一時期期間、病症發病期間及/或治療期間接受ABP與其他藥劑(其增加LDLR之含量)。
可以組合療法，亦即與其他藥劑組合投與本發明之醫藥組成物。 在某些實施例中，組合療法包括能夠結合PCSK9之抗原結合蛋白與至少一種抗膽固醇劑之組合。藥劑包含(但不限於)試管內合成製備之化學組成物、抗體、抗原結合區及其組合及接合物。在某些實施例中，藥劑可充當激動劑、拮抗劑、異位調節劑(allosteric modulator)或毒素。在某些實施例中，藥劑可用於抑制或刺激其靶標(例如，受體或酶激活或抑制)，且從而促進LDLR之表現增加或減小血清膽固醇含量。
在某些實施例中，可在用膽固醇降低(血清及/或總膽固醇)劑治療之前、同時及之後投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，可預防性投與針對PCSK9之抗原結合蛋白以預防或減緩高膽固醇血症、心臟病、糖尿病及/或任何膽固醇相關病症之發作。在某些實施例中，可投與針對PCSK9之抗原結合蛋白來治療已患的高膽固醇血症病狀。在一些實施例中，ABP延遲病症及/或與所述病症相關之症狀的發作。在一些實施例中，向無任一種膽固醇相關病症之任何症狀或其子集之個體提供ABP。
在某些實施例中，與特定治療劑一起使用針對PCSK9之抗原結合蛋白以治療多種膽固醇相關病症，諸如高膽固醇血症。在某些實施例中，鑒於病狀及所希望之治療程度，可投與兩種、三種或大於三種藥劑。在某些實施例中，所述藥劑可藉由包含於同一調配物中而一起提供。在某些實施例中，所述藥劑及針對PCSK9之抗原結合蛋白可藉由包含於同一調配物中而一起提供。在某些實施例中，所述藥劑可單獨調配且藉由包含於治療套組中而一起提供。在某些實施例中，所述藥劑及針對PCSK9之抗原結合蛋白可單獨調配且藉由包含於治療套組中而一起提供。在某些實施例中，可單獨提供所述藥劑。在某些實施例中，當藉由基因療法投與時，可將編碼蛋白質藥劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白之基因包含於同一載體中。在某些實施例中，編碼蛋 白質藥劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白之基因可處在同一啟動子區控制之下。在某些實施例中，編碼蛋白質藥劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白之基因可位於獨立載體中。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組成物，所述醫藥組成物包括針對PCSK9之抗原結合蛋白以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組成物，所述醫藥組成物包括針對PCSK9之抗原結合蛋白及治療有效量之至少一種其他治療劑以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。
在某些實施例中，可與至少一種用於炎症之治療劑一起使用針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，可與至少一種用於免疫病症之治療劑一起使用針對PCSK9之抗原結合蛋白。用於炎症及免疫病症之例示性治療劑包含(但不限於)1型環加氧酶(cyclooxygenase type 1，COX-1)及2型環加氧酶(COX-2)抑制劑；38kDa絲裂原活化蛋白激酶之小分子調節劑(38kDa mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)；參與炎症路徑之細胞內分子之小分子調節劑，其中所述細胞內分子包含(但不限於)jnk、IKK、NF-κB、ZAP70及lck。某些用於炎症之例示性治療劑描述於(例如)C.A.Dinarello及L.L.Moldawer,Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis：A Primer for Clinicians第3版(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks,CA中。
在某些實施例中，醫藥組成物將包含超過一種不同的針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，醫藥組成物將包含超過一種針對PCSK9之抗原結合蛋白，其中針對PCSK9之抗原結合蛋白結合超過一個抗原決定基。在一些實施例中，各種抗原結合蛋白將不相互競爭性 地與PCSK9結合。在一些實施例中，可使表2及圖2A至圖2D及/或圖3A至圖3KK中所描繪之任何抗原結合蛋白一起組合於醫藥組成物中。
在某些實施例中，可接受之調配物質較佳在所採用之劑量及濃度下對接受者而言無毒。在一些實施例中，調配物質用於經皮下(s.c.)及/或靜脈內投與。在某些實施例中，醫藥組成物可含有用於修改、維持或保持(例如)組成物之pH值、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透作用的調配物質。在某些實施例中，合適的調配物質包含(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑(諸如泊洛尼克(pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、諸如聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80之聚山梨糖醇酯、曲拉通(triton)、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷脂(lecithin)、膽固醇、太洛派(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山 梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company(1995))。在一些實施例中，調配物包括PBS；20毫莫耳濃度乙酸鈉(NaOAC)(pH 5.2)、50毫莫耳濃度NaCl；及/或10毫莫耳濃度乙酸鈉(NAOAC)(pH 5.2)、9%蔗糖。
在某些實施例中，使針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或治療分子與此項技術已知之延長半衰期之媒劑連接。所述媒劑包含(但不限於)聚乙二醇、肝糖(glycogen)(例如ABP醣基化)及葡聚糖。所述媒劑描述於(例如)美國申請案第09/428,082號，現在之美國專利第6,660,843號及公開之PCT申請案第WO 99/25044號，因此無論基於何種目的，其皆以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，熟習此項技術者將視(例如)預期投藥途徑、傳遞格式及合乎需要之劑量而確定最佳醫藥組成物。例如參見，Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些實施例中，所述組成物可能影響本發明之抗體之物理狀態、穩定性、活體內釋放之速率及活體內清除之速率。
在某些實施例中，醫藥組成物中之主要媒劑或載劑在性質上可為水性的或非水性的。舉例而言，在某些實施例中，合適的媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，可能補充有用於非經腸投藥之組成物中常見之其他物質。在一些實施例中，生理食鹽水包括等張之磷酸鹽緩衝生理食鹽水。在某些實施例中，中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為其他例示性媒劑。在某些實施例中，醫藥組成物包括pH值約7.0-8.5之Tris緩衝液或pH值約4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，所述緩衝液可進一步包含山梨糖醇或其合適替代物。在某些實施例中，可藉由將具有合乎需要之純度之所選擇之組成物與可選調配藥劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，同 上)以凍乾餅或水性溶液形式來製備包括針對PCSK9之抗原結合蛋白的組成物(含或不含至少一種其他治療劑)以便儲存。另外，在某些實施例中，可使用諸如蔗糖之適當賦形劑以凍乾產物形式來調配包括針對PCSK9之抗原結合蛋白的組成物(含或不含至少一種其他治療劑)。
在某些實施例中，可選擇醫藥組成物用於非經腸傳遞。在某些實施例中，可選擇組成物用於吸入或經由消化道傳遞，例如經口。所述醫藥學上可接受之組成物之製備在熟習此項技術者之能力範圍內。
在某些實施例中，調配組分以投與位點可接受之濃度存在。在某些實施例中，使用緩衝液將組成物維持在生理pH值或稍低之pH值，通常在約5至約8之pH值範圍內。
在某些實施例中，當涵蓋非經腸投藥時，治療組成物可呈無熱原質、腸外可接受之水性溶液形式，其於醫藥學上可接受之媒劑中包括合乎需要之針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含其他治療劑)。在某些實施例中，用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)經調配為經適當防腐之無菌等張溶液。在某些實施例中，製備可包括與可向隨後可經由積存注射(depot injection)傳遞之產物提供受控或持續釋放之藥劑一起調配合乎需要之分子，所述藥劑諸如可注射微球、生物可蝕性粒子、聚合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸，且玻尿酸可具有促進在循環中之持續時間的效應。在某些實施例中，可使用可植入的藥物傳遞裝置引入合乎需要之分子。
在某些實施例中，可調配醫藥組成物用於吸入。在某些實施例中，可將針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)調配為用於吸入之乾粉。在某些實施例中，可將包括針對PCSK9 之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)之吸入溶液與用於氣霧劑傳遞之推進劑一起調配。在某些實施例中，可使溶液噴霧化。肺部投藥進一步描述於PCT申請案第PCT/US94/001875號中，所述申請案描述經肺部傳遞經化學改質之蛋白質。
在某些實施例中，涵蓋可經口投與之調配物。在某些實施例中，可用或不用在調配固體劑型(諸如錠劑及膠囊)中通常使用之載劑來調配以所述方式投與之針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)。在某些實施例中，可將膠囊設計成於胃腸道中生物可用性最大且體循環前降解最小之處釋放調配物之活性部分。在某些實施例中，可包含至少一種其他藥劑來促進針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或任何其他治療劑之吸收。在某些實施例中，亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
在某些實施例中，醫藥組成物可包括有效量之針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)與適合於製造錠劑之無毒賦形劑的混合物。在某些實施例中，藉由將錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可製備呈單位劑量形式之溶液。在某些實施例中，合適的賦形劑包含(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖、磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
熟習此項技術者將顯而易見其他醫藥組成物，包含於持續傳遞或受控傳遞調配物中包括針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)的調配物。在某些實施例中，熟習此項技術者亦已知調配多種其他持續傳遞或受控傳遞構件之技術，所述構件諸如脂質體載劑、生物可蝕性微粒或多孔珠粒及積存注射劑。例如參見，PCT申請案第PCT/US93/00829號，其描述用於傳遞醫藥組成物之多孔聚合 微粒的受控釋放。在某些實施例中，持續釋放製劑可包含呈成形物件(例如膜或微膠囊)形式之半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可包含聚酯、水凝膠、聚丙交酯(U.S.3,773,919及EP 058,481)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人，Biopolymers,22：547-556(1983))、聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res..15：167-277(1981)及Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。在某些實施例中，持續釋放組成物亦可包含脂質體，其可藉由此項技術已知之數種方法中之任一種製備的。例如參見，Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。
用於活體內投藥之醫藥組成物通常為無菌的。在某些實施例中，此可藉由經無菌過濾膜過濾實現。在某些實施例中，當組成物為凍乾的時，可在凍乾及復原之前或之後使用所述方法殺菌。在某些實施例中，可以凍乾或溶液形式儲存用於非經腸投藥之組成物。在某些實施例中，通常將非經腸組成物置於具有無菌存取口之容器中，所述容器例如為具有可用皮下注射針穿透之塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶。
在某些實施例中，一旦醫藥組成物經調配，則其即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體形式或以脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。在某些實施例中，可以即用型(ready-to-use)形式或以投藥之前進行復原之形式(例如凍乾)儲存所述調配物。
在某些實施例中，提供用於產生單次劑量投藥單元之套組。在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白之第一容器與具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包含含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如，液體注射器及凍乾粉末注射器(lyosyringe))之套組。
在某些實施例中，待在治療上採用之包括針對PCSK9之抗原結合 蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)的醫藥組成物的有效量將例如視治療情況及目標而定。因此，熟習此項技術者應瞭解，根據某些實施例，用於治療之適當的劑量水平將部分上視以下因素而變化：所傳遞之分子、使用針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)的適應症、投藥途徑及患者之體型(體重、體表或器官大小)及/或狀況(年齡及一般健康)。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量且修改投藥途徑以獲得最佳治療效應。在某些實施例中，視以上所提及之因素而定，典型的劑量可在約0.1微克/公斤至高達約100毫克/公斤或大於100毫克/公斤之範圍內。在某些實施例中，劑量可在0.1微克/公斤至高達約100毫克/公斤；或1微克/公斤至高達約100毫克/公斤；或5微克/公斤至高達約100毫克/公斤之範圍內。
在某些實施例中，給藥頻率應考慮針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或所使用之調配物中之任何其他治療劑的藥物動力學參數。在某些實施例中，臨床醫師應投與組成物直至達到實現合乎需要之效果之劑量。因此在某些實施例中，以單劑或隨時間以兩劑或兩劑以上(可能含有或可能不含有相同量之合乎需要之分子)或以經由植入裝置或導管之持續輸注來投與組成物。適當劑量之進一步精化通常由一般熟習此項技術者進行且在其通常執行之任務範圍內。在某些實施例中，可藉由使用適當的劑量-反應資料確定適當劑量。在一些實施例中，投藥量及投藥頻率可考慮待獲得的所希望之膽固醇含量(血清及/或總)及個體當前之膽固醇含量、LDL含量及/或LDLR含量，所有所述含量均可藉由熟習此項技術者所熟知之方法獲得。
在某些實施例中，醫藥組成物之投藥途徑與已知方法一致，例如經口，經由靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內(intra-parenchymal))、腦室內、肌肉內、皮下、眼睛內、動脈內、門靜脈內(intraportal)或病灶內途徑注射；經由持續釋放系統或經由植入 裝置。在某些實施例中，可藉由快速注射或連續輸注或藉由植入裝置投與組成物。
在某些實施例中，可通過植入上面已吸收或包裹合乎需要之分子的膜、海綿體或另一適當的物質來局部投與組成物。在某些實施例中，當使用植入裝置時，可將裝置植入任何合適的組織或器官中，且可經由擴散、定時釋放大丸劑(timed-release bolus)或持續投藥來傳遞合乎需要之分子。
在某些實施例中，可能希望以離體方式使用包括針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)的醫藥組成物。在所述情況下，將已自患者移出之細胞、組織及/或器官暴露於包括針對PCSK9之抗原結合蛋白(含或不含至少一種其他治療劑)的醫藥組成物，隨後將細胞、組織及/或器官重新植入患者中。
在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或任何其他治療劑可藉由植入某些細胞來進行傳遞，所述細胞已使用諸如本文中所述之彼等方法進行遺傳工程改造以表現且分泌所述多肽。在某些實施例中，所述細胞可為動物或人類細胞，且可為同種自體(autologous)、異源(heterologous)或異種異體(xenogeneic)細胞。在某些實施例中，細胞可為永生化細胞。在某些實施例中，為降低免疫反應之機率，可包裹細胞以避免周圍組織浸潤。在某些實施例中，包裹物質通常為生物相容性、半滲透性聚合包殼或膜，其允許釋放蛋白質產物但阻止患者免疫系統或來自周圍組織之其他有害因子破壞細胞。
基於ABP顯著中和PCSK9活性之能力(如以下實例中所證明)，所述ABP將具有治療及預防由PCSK9介導之活性所引起之症狀及病況(諸如高膽固醇血症)之治療效應。
診斷應用
在一些實施例中，使用ABP作為診斷工具。可使用ABP檢定樣品及/或個體中所存在之PCSK9之量。熟習此項技術者應瞭解，所述ABP不必為中和ABP。在一些實施例中，用於診斷的ABP不為中和ABP。在一些實施例中，用於診斷的ABP與中和ABP結合不同的抗原決定基。在一些實施例中，兩種ABP不相互競爭。
在一些實施例中，本文中所揭露之ABP用於或提供於偵測哺乳動物組織或細胞中之PCSK9以篩選/診斷與PCSK9含量變化相關之疾病或病症的檢定套組及/或方法中。套組包括結合PCSK9之ABP及用於指示ABP與PCSK9(若存在)之結合及視情況PCSK9蛋白含量之構件。可使用多種用於指示ABP之存在的構件。舉例而言，可使螢光團、其他分子探針或酶與ABP連接，且可以多種方式觀察ABP之存在。篩選所述病症之方法可包括使用所述套組，或簡單地使用所揭露之ABP中之一者及確定ABP是否與樣品中之PCSK9結合。熟習此項技術者應瞭解，PCSK9之高或升高之含量將使得較大量之ABP與樣品中之PCSK9結合。因此，可使用ABP結合之程度確定樣品中存在多少PCSK9。可將PCSK9之量超過預定量(例如，無PCSK9相關病症之人將具有之量或範圍)的個體或樣品表徵為患有由PCSK9介導之病症。在一些實施例中，向服用士他汀之個體投與ABP以確定士他汀是否增加個體中PCSK9之量。
在一些實施例中，所述ABP為非中和ABP且用於測定接受ABP及/或士他汀治療之個體中之PCSK9的量。
實例
出於說明性目的提供以下包含所進行之實驗及所達成之結果的實例，且不應解釋為限制本發明。
實例1
免疫及滴定
產生抗PCSK9抗體及融合瘤
在XenoMouse®小鼠(Abgenix,Fremont,CA)中產生針對PCSK9之成熟形式(以圖1A中之序列描繪，其中前域加下劃線)之抗體，所述XenoMouse®小鼠為含有人類免疫球蛋白基因之小鼠。使用兩組XenoMouse®小鼠(第1組及第2組)產生針對PCSK9之抗體。第1組包含XenoMouse® XMG2-KL品系小鼠，其產生完全人類IgG2κ及IgG2λ抗體。用人類PCSK9免疫第1組小鼠。使用標準重組技術使用基因庫(GenBank)序列作為參考(NM_74936)製備PCSK9。第2組包括XenoMouse® XMG4-KL品系小鼠，其產生完全人類IgG4κ及IgG4λ抗體。亦用人類PCSK9免疫第2組小鼠。
根據表3中之方案用抗原注射所述兩組小鼠11次。在最初免疫中，用總計10微克經腹膜內注射傳遞於腹部之抗原注射各小鼠。後續補強(boost)為5微克的劑量，且注射法在腹膜內注射於腹部與皮下注射於尾基部之間交替。對於腹膜內注射，抗原與TiterMax® Gold(Sigma，目錄號T2684)一起製備為乳液形式，而對於皮下注射，抗原與Alum(磷酸鋁)及CpG寡核苷酸(oligos)一起混合。在第2至第8及第10次之注射中，用總計5微克於佐劑Alum凝膠中之抗原注射各小鼠。每隻小鼠5微克抗原之最終注射在磷酸鹽緩衝生理食鹽水中傳遞，且傳遞於兩個位點，50%腹膜內(IP)注射於腹部且50%皮下(SQ)注射於尾基部。免疫計劃概述於表3中，如下所示。
用於對XenoMouse動物進行滴定之方案如下：用8微克/毫升(50微升/孔)中性鏈親和素(neutravadin)塗佈Costar 3368培養基結合板 且在4℃下在1×PBS/0.05%疊氮化物(azide)中培育隔夜。使用用反滲透水(RO water)之TiterTek 3次循環洗滌(3-cycle wash)對其加以洗滌。使用250微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育至少30分鐘。使用用反滲透水之TiterTek 3次循環洗滌洗去阻斷液。隨後捕獲2微克/毫升b-人類PCSK9於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+(檢定稀釋劑)(50微升/孔)中且在室溫下培育1小時。隨後使用用反滲透水之TiterTek 3次循環洗滌進行洗滌。對於一級抗體(primary antibody)，自1：100一式兩份1：3滴定血清。此在50微升/孔之檢定稀釋劑中進行且在室溫下培育1小時。隨後使用用反滲透水之TiterTek 3次循環洗滌進行洗滌。二級抗體(secondary antibody)為於50微升/孔之檢定稀釋劑中的400奈克/毫升之山羊抗人類IgG Fc HRP。將其在室溫下培育1小時。隨後使用用反滲透水之TiterTek 3次循環洗滌對其加以洗滌且在紙巾上輕拍乾燥。對於受質，使用單步TMB溶液(Neogen，Lexington，Kentucky)(50微升/孔)且使其在室溫下顯色30分鐘。
ELISA檢定中所遵循之方案如下：對於包括b-PCSK9而不含V5His標籤之樣品，採用以下方案：採用Costar 3368培養基結合板(Corning Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之8微克/毫升中性鏈親和素(50微升/孔)塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek M384板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用250微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用M384板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。捕獲物為b-hu PCSK9，無V5標籤，且將其以2微克/毫升於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中(40微升/孔)添加。隨後將板在室溫下培育1小時。執行3次循環洗滌。自1：100一式兩份1：3滴定血清，且H列(row)為血清之空白試驗(blank)。在體積為50微升/孔之檢定稀釋 劑中進行滴定。將板在室溫下培育1小時。接著，執行3次循環洗滌。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之100奈克/毫升(1：4000)山羊抗人類IgG Fc HRP(50微升/孔)且在室溫下培育1小時。再一次使用3次循環洗滌來洗滌板。隨後用紙巾輕拍乾燥板。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(50微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度(N)鹽酸(50微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。
用以偵測板所結合之PCSK9之陽性對照為可溶性LDL受體(R&D Systems，目錄號2148LD/CF)及於檢定稀釋劑中自3微克/毫升一式兩份1：3滴定之多株兔子抗PCSK9抗體(Caymen Chemical，目錄號10007185)。用山羊抗LDLR(R&D Systems，目錄號AF2148)及兔子抗山羊IgG Fc HRP以400奈克/毫升之濃度偵測LDLR；用於檢定稀釋劑中濃度為400奈克/毫升之山羊抗兔子IgG Fc偵測兔子多株抗體。陰性對照為於檢定稀釋劑中自1：100一式兩份1：3滴定之天然XMG2-KL及XMG4-KL血清。
對於包括b-PCSK9而有V5His標籤之樣品，採用以下方案：採用Costar 3368培養基結合板(Corning Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之8微克/毫升中性鏈親和素(50微升/孔)塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek M384板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用250微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用M384板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。捕獲物為b-hu PCSK9，含有V5標籤，且將其以2微克/毫升於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中(40微升/孔)添加。隨後將板在室溫下培育1小時。執行3次循環洗滌。自1：100一式兩份1：3滴定血清，且H列為血清之空白試驗。在體積為50微升/孔之檢定稀釋劑中進行滴定。將板在室溫下培育1小時。接 著，使用用3次循環洗滌操作之M384板洗滌器洗滌板。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之400奈克/毫升之山羊抗人類IgG Fc HRP(50微升/孔)且將板在室溫下培育1小時。再一次使用3次循環洗滌來洗滌板。隨後用紙巾輕拍乾燥板。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(50微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(50微升/孔)使板中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。
陽性對照為LDLR、於檢定稀釋劑中自3微克/毫升一式兩份1：3滴定之兔子抗PCSK9抗體。用山羊抗LDLR(R&D Systems，目錄號AF2148)及兔子抗山羊IgG Fc HRP以400奈克/毫升之濃度偵測LDLR；用於檢定稀釋劑中濃度為400奈克/毫升之山羊抗兔子IgG Fc偵測兔子多株抗體。於檢定稀釋劑中自1微克/毫升一式兩份1：3滴定人類抗His 1.2.3及抗V5 1.7.1；兩者均用於檢定稀釋劑中濃度為400奈克/毫升之山羊抗人類IgG Fc HRP偵測。陰性對照為於檢定稀釋劑中自1：100一式兩份1：3滴定之天然XMG2-KL及XMG4-KL血清。
如所述對於經可溶性抗原免疫之小鼠，藉由ELISA檢定測試抗體針對人類PCSK9之力價(titer)。表4概述ELISA資料且表明有一些小鼠似乎對PCSK9具有特異性。例如參見，表4。因此，在免疫計劃結束時，選擇10隻小鼠(在表4中呈粗體)進行收集，且如本文中所述，相應地自脾及淋巴結分離脾細胞及淋巴細胞。
實例2
回收淋巴細胞，分離B細胞，融合及產生融合瘤
本實例概述如何回收免疫細胞及如何產生融合瘤。藉由頸椎脫位術(cervical dislocation)處死所選擇之免疫小鼠且自各群組(cohort)收集及彙集引流淋巴結(draining lymph node)。藉由在杜氏改良伊氏培養基(DMEM)中研磨使B細胞自淋巴組織解離來自組織釋放細胞，且將細胞懸浮於DMEM中。計數所述細胞，且向細胞小球中添加每1億個淋巴細胞0.9毫升DMEM以使細胞輕緩但完全再懸浮。
將淋巴細胞與購自ATCC目錄號CRL 1580之非分泌性骨髓瘤 P3X63Ag8.653細胞(Kearney等人，(1979)J.Immunol 123,1548-1550)以1：4之比率混合。藉由在400×g下離心4分鐘使細胞混合物輕緩地形成小球。傾析上清液後，使用1毫升移液管輕緩混合細胞。在輕緩攪拌下經1分鐘緩慢添加來自Sigma(目錄號P7306)之預熱PEG/DMSO溶液(每百萬個B細胞1毫升)，接著混合1分鐘。隨後在輕緩攪拌下經2分鐘添加預熱之IDMEM(每百萬個B細胞2毫升)(無麩胺醯胺之DMEM、L-麩胺醯胺、青鏈黴素混合液(pen/strep)、MEM非必需胺基酸(均來自Invitrogen))。最後，經3分鐘添加預熱之IDMEM(每106個B細胞8毫升)。
將融合細胞在400×g下旋轉6分鐘且再懸浮於每百萬個B細胞20毫升選擇培養基(DMEM(Invitrogen)、補充有L-麩胺醯胺、pen/strep、MEM非必需胺基酸、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇(均來自Invitrogen)之15% FBS(Hyclone)、HA-偶氮絲胺酸次黃嘌呤(HA-Azaserine Hypoxanthine)及OPI(草醯乙酸鹽、丙酮酸鹽、牛胰島素)(兩者均來自Sigma)以及IL-6(Boehringer Mannheim))中。將細胞在37℃下培育20-30分鐘，隨後再懸浮於200毫升選擇培養基中，且在T175培養瓶中培養3-4天，之後塗鋪於96孔。由此，獲得產生針對PCSK9之抗原結合蛋白之融合瘤。
實例3
選擇PCSK9抗體
本實例概述如何表徵及選擇多種PCSK9抗原結合蛋白。評定分泌抗體(由實例1及2中所產生之融合瘤產生)與PCSK9之結合。抗體之選擇基於結合資料及對PCSK9與LDLR之結合之抑制及親和力。如下文所述，藉由ELISA分析與可溶性PCSK9之結合。使用BIAcore®(表面電漿共振)定量結合親和力。
初步篩選(Primary Screen)
針對與野生型PCSK9結合之抗體執行初步篩選。對兩份收集執行初步篩選。初步篩選包括ELISA檢定且使用以下方案執行： 採用Costar 3702培養基結合384孔板(Corning Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之濃度為4微克/毫升之中性鏈親和素以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後洗滌板。再次執行3次循環洗滌。捕獲樣品為經生物素標記之PCSK9，不含V5標籤，且將其以0.9微克/毫升於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中(體積為40微升/孔)添加。隨後將板在室溫下培育1小時。接著，使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。將10微升上清液轉移至40微升1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中且在室溫下培育1.5小時。再次使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為100奈克/毫升(1：4000)之山羊抗人類IgG Fc POD(40微升/孔)且在室溫下培育1小時。再一次使用3次循環洗滌來洗滌板。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)進行中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。
初步篩選使得自兩份收集鑑別出總計3104個抗原特異性融合瘤。基於最高ELISA OD，每份收集發展1500個融合瘤，總計3000個陽性樣本。
確認篩選(Confirmatory Screen)
隨後就與野生型PCSK9之結合對3000個陽性樣本進行再篩選以確認已建立穩定融合瘤。如下執行篩選：採用Costar 3702培養基結合384孔板(Coming Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之3 微克/毫升之中性鏈親和素以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用M384板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。捕獲樣品為b-PCSK9，不含V5標籤，且將其以0.9微克/毫升於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中(體積為40微升/孔)添加。隨後將板在室溫下培育1小時。接著，使用3次循環洗滌來洗滌板。將10微升上清液轉移至40微升1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中且在室溫下培育1.5小時。再次使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為100奈克/毫升(1：4000)之山羊抗人類IgG Fc POD(40微升/孔)且將板在室溫下培育1小時。再一次使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。在第二次篩選中重複總計2441個陽性樣本。隨後在後續篩選中使用所述抗體。
小鼠交叉反應性篩選
隨後就與小鼠PCSK9之交叉反應性篩選融合瘤組(panel)以確定抗體可與人類及小鼠PCSK9結合。交叉反應性篩選採用以下方案：採用Costar 3702培養基結合384孔板(Coming Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之3微克/毫升之中性鏈親和素以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。捕獲樣品為經生物素標記之小鼠 PCSK9，且將其以1微克/毫升於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中(體積為40微升/孔)添加。隨後將板在室溫下培育1小時。接著，使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。將50微升上清液轉移至板中且在室溫下培育1小時。再次使用3次循環洗滌來洗滌板。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為100奈克/毫升(1：4000)之山羊抗人類IgG Fc POD(40微升/孔)且將板在室溫下培育1小時。再一次使用3次循環洗滌來洗滌板。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。觀察到579個抗體與小鼠PCSK9交叉反應。隨後在後續篩選中使用所述抗體。
D374Y突變體結合篩選
PCSK9中之D374Y突變在人類群體中已有文獻記載(例如，Timms KM等人，“A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemia in a Utah pedigree”,Hum.Genet.114：349-353,2004)。為判定抗體是否對野生型具有特異性或亦與PCSK9之D374Y形式結合，隨後就與包括突變D374Y之突變PCSK9序列之結合篩選樣品。篩選方案如下：在篩選中採用Costar 3702培養基結合384孔板(Coming Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之4微克/毫升之中性鏈親和素以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。用於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為1微克/毫升之經生物素標記之人類PCSK9 D374Y塗佈板且在室溫下培育1小時。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。將晚期耗盡融合瘤培養 物上清液(late exhaust hybridoma culture supernatant)在PBS/牛乳/Ca2+中1：5稀釋(10ml加40ml)且在室溫下培育1小時。接著，將於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之1微克/亳升之兔子抗人類PCSK9(Cayman Chemical)及人類抗His 1.2.3(1：2)以40微升/孔滴定於板上，隨後將其在室溫下培育1小時。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為100奈克/毫升(1：4000)之山羊抗人類IgG Fc HRP(40微升/孔)且將板在室溫下培育1小時。向板中添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為100奈克/毫升(1：4000)之山羊抗兔子IgG Fc HRP(40微升/孔)且將板在室溫下培育1小時。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。對野生型PCSK9之陽性打擊點(positive hits)超過96%亦結合突變PCSK9。
大規模受體配體阻斷篩選
為篩選阻斷PCSK9與LDLR之結合之抗體，使用D374Y PCSK9突變體開展檢定。所述檢定使用所述突變體的原因在於，其對LDLR具有較高結合親和力從而允許開展更靈敏之受體配體阻斷檢定。在受體配體阻斷篩選中採用以下方案：在篩選中採用Costar 3702培養基結合384孔板(Coming Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之2微克/毫升之山羊抗LDLR(R&D，目錄號AF2148)以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。捕獲樣品為LDLR(R&D，目錄號 2148LD/CF)，且於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中以0.4微克/毫升添加(體積為40微升/孔)。隨後將板在室溫下培育1小時10分鐘。同時，將20奈克/毫升經生物素標記之人類D374Y PCSK9與15微升融合瘤耗盡上清液於Nunc聚丙烯板中一起培育，且將耗盡上清液濃縮物1：5稀釋。隨後將板在室溫下預培育約1小時30分鐘。接著，使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。將預培育混合物(50微升/孔)轉移至經LDLR塗佈之EL1SA板上且在室溫下培育1小時。為偵測與LDLR結合之b-PCSK9，向板中添加於檢定稀釋劑中之500奈克/毫升之抗生蛋白鏈菌素HRP(40微升/孔)。將板在室溫下培育1小時。再次使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。所述篩選鑑別出384個阻斷PCSK9與LDLR孔之間相互作用之抗體，其中100個抗體強烈阻斷所述相互作用(OD<0.3)。所述抗體將PCSK9與LDLR之結合相互作用抑制超過90%(超過90%抑制)。
阻斷劑子集之受體配體結合檢定
隨後使用突變酶對在首次大規模受體配體抑制檢定中所鑑別之中和劑之384個成員的子集重複受體配體檢定。在384個成員之阻斷劑子集檢定之篩選中採用與大規模受體配體阻斷篩選中所採用之相同方案。所述重複篩選確認最初的篩選資料。
384個成員子集之所述篩選鑑別出85個將PCSK9突變酶與LDLR之間的相互作用阻斷超過90%之抗體。
結合野生型PCSK9但不結合D374Y突變體之阻斷劑之受體配體結合檢定
在3000個上清液(sups)之最初組(panel)中有86個抗體顯示與 野生型PCSK9但不與huPCSK9(D374Y)突變體特異性結合。就阻斷野生型PCSK9與LDLR受體之結合之能力測試所述86個上清液。採用以下方案：在篩選中採用Costar 3702培養基結合384孔板(Coming Life Sciences)。用於1×PBS/0.05%疊氮化物中之10微克/毫升之抗-His 1.2.3以40微升/孔之體積塗佈板。將板在4℃下培育隔夜。隨後使用Titertek板洗滌器(Titertek，Huntsville，AL)洗滌板。執行3次循環洗滌。用90微升1×PBS/1%牛乳阻斷板且在室溫下培育約30分鐘。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。以40微升/孔之體積添加於1×PBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之5微克/毫升之LDLR(R&D Systems，目錄號2148LD/CF或R&D Systems，目錄號2148LD)。隨後將板在室溫下培育1小時。接著，使用用3次循環洗滌操作之Titertek板洗滌器洗滌板。同時，將經生物素標記之人類野生型PCSK9與融合瘤耗盡上清液於Nunc聚丙烯板中一起預培育。將22微升融合瘤上清液轉移至33微升於1XPBS/1%牛乳/10毫莫耳濃度Ca2+中之濃度為583奈克/毫升之b-PCSK9中，從而產生最終b-PCSK9濃度為350奈克/毫升且耗盡上清液最終稀釋倍數為1：2.5。將板在室溫下預培育約1小時30分鐘。將預培育混合物(50微升/孔)轉移至捕獲有LDLR之ELISA板上且在室溫下培育1小時。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。向板中添加於檢定稀釋劑中之500奈克/毫升之抗生蛋白鏈菌素HRP(40微升/孔)。將板在室溫下培育1小時。隨後使用Titertek板洗滌器洗滌板。執行3次循環洗滌。最後，向板中添加單步TMB(Neogen，Lexington，Kentucky)(40微升/孔)，且在室溫下30分鐘後，用1當量濃度鹽酸(40微升/孔)中止。立即使用Titertek板讀取器在450奈米下讀取OD。
篩選結果
基於所述檢定之結果，將數種融合瘤細胞株鑑別為產生具有合乎 需要之與PCSK9之相互作用的抗體。使用限制稀釋法(limiting dilution)自各細胞株分離可掌控數目(manageable number)之純系。純系由融合瘤細胞株編號(例如，21B12)及純系編號(例如，21B12.1)指定。大體上，藉由本文中所述之功能性檢定未偵測到特定細胞株之不同純系之間的差異。在少數幾種情況下，自特定細胞株中鑑別出在功能性檢定中表現不同之純系，例如，發現25A7.1不阻斷PCSK9/LDLR，但25A7.3(本文中稱為25A7)為中和的。使經分離的純系各自在50-100毫升融合瘤培養基中擴增且使其生長至耗盡(grow to exhaustion)(亦即，小於約10%細胞生活力(cell viability))。如本文中所述，藉由ELISA及藉由試管內功能測試，測定所述培養物之上清液中針對PCSK9之抗體的濃度及效價(potency)。作為本文中所述之篩選的結果，鑑別出具有針對PCSK9之抗體最高力價的融合瘤。所選擇之融合瘤如圖2A-3D中及表2中所示。
實例4.1
自融合瘤產生人類31H4 IgG4抗體
本實例大體描述如何自融合瘤細胞株產生一種抗原結合蛋白。所述產生操作包括50毫升耗盡上清液形成，接著為蛋白質A純化。將Integra生產進行擴大規模且稍後執行。使融合瘤細胞株31H4在T75培養瓶中生長於20毫升培養基(Integra培養基，表5)中。當融合瘤在T75培養瓶中幾乎長滿(confluent)時，將其轉移至Integra培養瓶(Integra Biosciences，Integra CL1000，目錄號90 005)中。
Integra培養瓶為用膜分成兩個腔室(一個小腔室及一個大腔室)之細胞培養瓶。將20-30毫升體積之來自31H4融合瘤細胞株之最小細胞密度為每毫升1×106個細胞的融合瘤細胞置放於Integra培養瓶之小腔室中之Integra培養基(參見表5，關於Integra培養基之組分)中。在Integra培養瓶之大腔室中僅置放Integra培養基(1公升(L))。分隔 兩個腔室之膜可使小分子量營養物透過，但不能使融合瘤細胞及由所述細胞產生之抗體透過。因此，融合瘤細胞及由所述融合瘤細胞產生之抗體保留在小腔室中。
一週後，自Integra培養瓶之兩個腔室中移出培養基且用新鮮Integra培養基置換。單獨保留自小腔室收集之培養基。第二週生長後，再次自小腔室收集培養基。組合來自融合瘤細胞株之第1週收集培養基與來自融合瘤細胞株之第2週收集培養基。旋轉所得的自融合瘤細胞株收集到之培養基樣品以移除細胞及碎片(在3000轉/分(rpm)下15分鐘)且過濾所得上清液(0.22微米)。將澄清的條件培養基(conditioned medium)加載於蛋白質A-瓊脂糖管柱上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌(extensive PBS wash)移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(諸如，50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法(於陰離子交換劑樹脂(諸如，Q瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。31H4蛋白之特定IEX條件為Q-瓊脂糖HP，pH 7.8-8.0。用25倍管柱體積之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度NaCl梯度溶離抗體。
實例4.2
自經轉染之細胞產生重組31H4人類IgG2抗體
本實例概述如何自經轉染之細胞產生31H4 IgG2抗體。用編碼31H4重鏈及輕鏈之質體轉染用於瞬時表現之293細胞及用於穩定表現之CHO細胞。藉由移除細胞及細胞碎片自轉染細胞回收條件培養基。將澄清的條件培養基加載於蛋白質A-瓊脂糖管柱上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(諸如，50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法(於陰離子交換劑樹脂(諸如，Q瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。31H4蛋白之特定IEX條件為Q-瓊脂糖HP，pH 7.8-8.0。用25倍管柱體積之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度NaCl梯度溶離抗體。
實例5
自融合瘤產生人類21B12 IgG4抗體
本實例概述如何自融合瘤產生抗體21B12 IgG4。使融合瘤細胞株21B12在T75培養瓶中生長於培養基(Integra培養基，表5)中。當融合瘤在T75培養瓶中幾乎長滿時，將其轉移至Integra培養瓶(Integra Biosciences，Integra CL1000，目錄號90 005)中。
Integra培養瓶為用膜分成兩個腔室(一個小腔室及一個大腔室)之細胞培養瓶。將20-30毫升體積之來自31H4融合瘤細胞株之最小細胞密度為每毫升1×106個細胞的融合瘤細胞置放於Integra培養瓶之小腔室中之Integra培養基(參見表5，關於Integra培養基之組分)中。在Integra培養瓶之大腔室中僅置放Integra培養基(1公升)。分隔兩個腔室之膜可使小分子量營養物透過，但不能使融合瘤細胞及由所述細 胞產生之抗體透過。因此，融合瘤細胞及由所述融合瘤細胞產生之抗體保留在小腔室中。
一週後，自Integra培養瓶之兩個腔室中移出培養基且用新鮮Integra培養基置換。單獨保留自小腔室收集之培養基。第二週生長後，再次自小腔室收集培養基。組合來自融合瘤細胞株之第1週收集培養基與來自融合瘤細胞株之第2週收集培養基。旋轉所得的自融合瘤細胞株收集到之培養基樣品以移除細胞及碎片(在3000轉/分下15分鐘)且過濾所得上清液(0.22微米)。將澄清的條件培養基加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(諸如，50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法(於陰離子交換劑樹脂(諸如，Q瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。21B12蛋白之特定IEX條件為Q-瓊脂糖HP，pH 7.8-8.0。用25倍管柱體積之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度NaCl梯度溶離抗體。
實例6
自經轉染之細胞產生人類21B12 IgG2抗體
本實例概述如何自經轉染之細胞產生21B12 IgG2抗體。用編碼21B12重鏈及輕鏈之質體轉染細胞(用於瞬時表現之293細胞及用於穩定表現之CHO細胞)。藉由移除細胞及細胞碎片自融合瘤細胞回收條件培養基。將澄清的條件培養基加載於蛋白質A-瓊脂糖管柱上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法 (於陽離子交換劑樹脂(諸如，SP-瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。21B12蛋白之特定IEX條件為SP-瓊脂糖HP，pH 5.2。用25倍管柱體積之緩衝液溶離抗體，所述緩衝液含有於20毫莫耳濃度乙酸鈉緩衝液中之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度的NaCl梯度。
實例7
自融合瘤產生人類16F12 IgG4抗體
本實例概述如何自融合瘤產生抗體16F12 IgG4。使融合瘤細胞株16F12在T75培養瓶中生長於培養基(參見表5)中。當融合瘤在T75培養瓶中幾乎長滿時，將其轉移至Integra培養瓶(Integra Biosciences，Integra CL1000，目錄號90 005)中。
Integra培養瓶為用膜分成兩個腔室(一個小腔室及一個大腔室)之細胞培養瓶。將20-30毫升體積之來自31H4融合瘤細胞株之最小細胞密度為每毫升1×106個細胞的融合瘤細胞置放於Integra培養瓶之小腔室中之Integra培養基(參見表5，關於Integra培養基之組分)中。在Integra培養瓶之大腔室中僅置放Integra培養基(1公升)。分隔兩個腔室之膜可使小分子量營養物透過，但不能使融合瘤細胞及由所述細胞產生之抗體透過。因此，融合瘤細胞及由所述融合瘤細胞產生之抗體保留在小腔室中。
一週後，自Integra培養瓶之兩個腔室中移出培養基且用新鮮Integra培養基置換。單獨保留自小腔室收集之培養基。第二週生長後，再次自小腔室收集培養基。組合來自融合瘤細胞株之第1週收集培養基與來自融合瘤細胞株之第2週收集培養基。旋轉所得的自融合瘤細胞株收集到之培養基樣品以移除細胞及碎片(在3000轉/分下15分鐘)且過濾所得上清液(0.22微米)。將澄清的條件培養基加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白 質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法(於陰離子交換劑樹脂(諸如，Q瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。16F12蛋白之特定IEX條件為Q瓊脂糖HP，pH 7.8-8.0。用25倍管柱體積之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度NaCl梯度溶離抗體。
實例8
自經轉染之細胞產生人類16F12 IgG2抗體
本實例概述如何自經轉染之細胞產生16F12 IgG2抗體。用編碼16F12重鏈及輕鏈之質體轉染細胞(用於瞬時表現之293細胞及用於穩定表現之CHO細胞)。藉由移除細胞及細胞碎片自融合瘤細胞回收條件培養基。將澄清的條件培養基加載於蛋白質A-瓊脂糖上。視情況可首先濃縮培養基，隨後加載於蛋白質A瓊脂糖管柱上。藉由PBS徹底洗滌移除非特異性結合物。藉由自蛋白質A管柱進行標準的酸性抗體溶離(50毫莫耳濃度檸檬酸鹽，pH 3.0)來回收蛋白質A管柱上結合之抗體蛋白質。藉由尺寸排阻層析法或結合離子交換層析法(於陽離子交換劑樹脂(諸如，SP瓊脂糖樹脂)上)移除蛋白質A瓊脂糖池中聚集之抗體蛋白質。16F12蛋白之特定IEX條件為SP瓊脂糖HP，pH 5.2。用25倍管柱體積之緩衝液溶離抗體，所述緩衝液含有於20毫莫耳濃度乙酸鈉緩衝液中之10毫莫耳濃度-500毫莫耳濃度的NaCl梯度。
實例9
抗體重鏈及輕鏈之序列分析
隨後藉由Sanger(雙脫氧(dideoxy))核苷酸定序法測定以上抗體之輕鏈及重鏈之核酸及胺基酸序列。隨後推導所述核酸序列之胺基酸序列。可變域之核酸序列描繪於圖3E-3JJ中。
測定31H4、21B12及16F12之λ輕鏈可變區之cDNA序列且相應揭露為SEQ ID NO：153、95及105。
測定31H4、21B12及16F12之重鏈可變區之cDNA序列且相應揭露為SEQ ID NO：152、94及104。
λ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：156)及IgG2及IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：154及155)如圖3KK中所示。
確定由各所述cDNA序列預測之多肽序列。預測31H4、21B12及16F12之λ輕鏈可變區之預測多肽序列且相應揭露為SEQ ID NO：12、23及35，(λ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：156)預測31H4、21B12及16F12之重鏈可變區且相應揭露為SEQ ID NO：67、49及79。(IgG2及IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：154及155))。
圖2A至圖3D中顯示FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4片段。
基於序列資料，確定衍生各重鏈或輕鏈可變區之生殖系基因(germline gene)。圖2A至圖3D中緊接著相應的融合瘤細胞株指示生殖系基因之身份，且各自由獨特的序列識別號(SEQ ID NO)表示。圖2A至圖3D亦描繪為經表徵之其他抗體所確定的胺基酸序列。
實例8.1
測定三種抗體之等電點
基於胺基酸序列之抗體之理論等電點(pIs)經測定如下：16F12為7.36；21B12為8.47；及31H4為6.84。
實例9.1
表徵抗體與PCSK9之結合
已鑑別出許多與PCSK9結合之抗體，採用數種方法定量及進一步表徵結合之性質。在本研究之一態樣中，執行Biacore親和力分析。在本研究之另一態樣中，執行KinExA®親和力分析。所述研究中所採 用之樣品及緩衝液如下表6中所示。
BIAcore®親和力量測
根據製造商之說明書執行本實例中所述的針對PCSK9之21B12抗體之BIAcore®(表面電漿共振裝置，Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)親和力分析。
簡言之，使用Biacore 2000光學生物傳感器(optical biosensor)(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)執行表面電漿共振實驗。藉由胺偶合(amine-coupling)以產生不超過200個共振單位(resonance unit，RU)之最大分析物結合反應(maximum analyte binding response，Rmax)之水平，將各個別抗PCSK9抗體固定於研究級CM5生物傳感器晶片上。PCSK9蛋白之濃度以2倍間隔改變(分析物)且注射於經固定之抗體表面上(流速為100微升/分鐘，歷時1.5分鐘)。使用補充有0.01% BSA之新鮮HBS-P緩衝液(pH 7.4，0.01莫耳濃度Hepes、0.15莫耳濃度NaCl、0.005%界面活性劑P-20，Biacore)作為結合緩衝液。在獨立實驗中在pH 7.4下量測各抗PCSK9抗體針對人類、小鼠及獼猴(cynomolgus monkey)PCSK9蛋白中之 每一者的結合親和力(所使用之濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125及0奈莫耳濃度)。
另外，亦在pH 6.0下用補充有0.01% BSA之pH 6.0 HBS-P緩衝液(pH 6.0，0.01莫耳濃度Hepes、0.15莫耳濃度NaCl、0.005%界面活性劑P-20，Biacore)量測抗體與人類PCSK9之結合親和力。所獲得之結合信號與溶液中之游離PCSK9成比例。使用雙曲線單位點同源結合模型(dual-curve one-site homogeneous binding model)(KinExA®軟體，Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)自競爭曲線之非線性回歸分析獲得解離平衡常數(KD)(對於6.0 pH操作而言，n=1)。引人關注地，抗體似乎在較低pH值下顯示較強結合親和力(其中對於31H4、21B12及16F12而言Kd相應為12.5、7.3及29皮莫耳濃度)。
使用BIA評估3.1電腦程式(BlAcore,Inc.Piscataway,NJ)測定抗體結合動力學參數，包含ka(締合速率常數)、kd(解離速率常數)及KD(解離平衡常數)。較低解離平衡常數指示抗體對PCSK9之較高親和力。藉由BIAcore®親和力分析所測定之KD值如下表7.1中所示。
表7.2描繪kon速率及koff速率。
KinExA®親和力量測
根據製造商之說明書執行16F12及31H4之KinExA®(Sapidyne Instruments,Inc.,Boise,ID)親和力分析。簡言之，用人類加V5標籤之犬PCSK9蛋白或加His標籤之小鼠PCSK9蛋白預塗佈Reacti-GelTM(6×)(Pierce)且用BSA阻斷。隨後在室溫下將10或100皮莫耳濃度抗體16F12或抗體31H4及一種PCSK9蛋白以多種濃度(0.1皮莫耳濃度-25奈莫耳濃度)之PCSK9蛋白培育8小時，之後穿過塗佈有PCSK9之珠粒。藉由螢光(Cy5)標記之山羊抗人類IgG(H+L)抗體(Jackson Immuno Research)定量與珠粒結合之16F12或31H4之量。結合信號在結合平衡下與游離16F12或31H4之濃度成比例。使用單位點同源結合模型自兩組競爭曲線之非線性回歸獲得平衡解離常數(KD)。在分析中採用KinExA® Pro軟體。所述分析中所產生之結合曲線如圖4A至圖4F所示。
16F12與31H4抗體都顯示與人類及犬PCSK9類似的親和力，但親和力比與小鼠PCSK9之親和力低約10-250倍。在使用KinExA®系統所測試之兩種抗體中，抗體31H4對人類與犬PCSK9顯示較高親和力，KD相應為3及2皮莫耳濃度。16F12顯示稍弱親和力，對人類PCSK9，KD為15皮莫耳濃度，且對犬PCSK9，KD為16皮莫耳濃度。
KinExA®親和力分析之結果概述於以下所示之表8.1中。
另外，執行SDS PAGE以檢查樣品之品質及數量且如圖5A中所示。cPCSK9顯示大約凝膠上少了50%以及與由KinExA®檢定所計算之活性結合濃度亦相差50%。因此，將mAb與cPCSK9之KD調整為當前活性cPCSK9之50%。
使用BIAcore溶液平衡結合檢定量測ABP 21B12之Kd值。使用KinExA檢定，21B12.1顯示極小信號，因此，應用biacore溶液平衡檢定。因為關於抗體與經固定之PCSK9表面之結合未觀察到顯著結合，所以使用胺偶合以約7000 RU之密度將21B12抗體固定於CM5晶片之流量池(flow cell)4上。使用流量池3作為背景對照。將0.3、1及3奈莫耳濃度的人類PCSK9或犬PCSK9與21B12.1抗體樣品於外加0.1毫克/毫升BSA、0.005% P20之PBS中之連續稀釋液(0.001~25奈莫耳濃度範圍內)混合。藉由注射於21B12.1抗體表面上量測所述混合溶液中游離PCSK9之結合。在溶液中不存在mAb之情況下測定21B12.1表面上之100% PCSK9結合信號。PCSK9結合反應隨mAb之濃度增加而減小表明PCSK9與溶液中之mAb結合，從而阻斷PCSK9與經固定之肽體表面結合。繪製PCSK9結合信號與mAb濃度之關係曲線，使用單位點同源結合模型在KinExA ProTM軟體中由三組曲線(0.3、1及3奈莫耳濃度之固定PCSK9濃度)計算KD。雖然由KinExA檢定及SDS-凝膠觀察到cPCSK9具有較低蛋白濃度，但此處不調節其濃度，因為不使用 cPCSK9之濃度計算KD。結果呈現於下表8.2及圖5B至圖5D中。圖5B描繪三種不同hPCSK9濃度下hPCSK9之溶液平衡檢定之結果。圖5C描繪mPCSK9之一組類似結果。圖5D描繪上述biacore捕獲檢定之結果。
實例10
抗原決定基分倉(Epitope Binning)
使用競爭ELISA進行抗PCSK9抗體分倉。簡言之，為確定兩種抗體是否屬於同一抗原決定基倉(bin)，首先以2微克/毫升將一種抗體(mAb1)塗佈於ELISA板(NUNC)上(藉由隔夜培育)。隨後洗滌板且用3% BSA阻斷。同時，在室溫下將30奈克/毫升經生物素標記之hPCSK9與第二種抗體(mAb2)一起培育2小時。將混合物施用於所塗佈之mAb1且在室溫下培育1小時。隨後洗滌ELISA板且在1：5000稀釋倍數下與中性鏈親和素-HRP(Pierce)一起培育1小時。再次洗滌後，將板與TMB受質一起培育，且使用Titertek板讀取器在650奈米下偵測信號。將具有相同結合概況之抗體一起分入同一抗原決定基倉。抗體分倉研究之結果如表8.3中所示。
使用BIAcore執行抗原決定基分倉之附加檢測。將三種mAb 16F12、21B12及31H4以約8000 RU之密度固定於流量池2、3及4上。將5奈莫耳濃度之人類、小鼠及犬PCSK9注射於mAb表面上以達到約100至500 RU。隨後將10奈莫耳濃度mAb注射於PCSK9表面上。隨後記錄三種mAb與三種mAb上之三種不同PCSK9蛋白之結合。
若兩種mAb在抗原上具有類似抗原決定基，則mAb1將不顯示與已與mAb2結合之抗原結合。若兩種mAb在抗原上具有不同抗原決定基，則mAb1將顯示與已與mAb2結合之抗原結合。圖5E以圖形描繪三種mAb在人類PCSk9上之抗原決定基分倉結果。關於mPCSK9及cPCSK9觀察到類似模式。如圖中所示，16F12及31H4似乎共享類似抗原決定基，而21B12似乎具有不同抗原決定基。
實例11
31H4及21B12阻斷D374Y PCSK9/LDLR結合之功效
本實例提供兩種抗體阻斷PCSK9 D374Y與LDLR結合之能力的IC50值。用稀釋於緩衝液A(100毫莫耳濃度二甲胂酸鈉(sodium cacodylate)，pH 7.4)中之2微克/毫升山羊抗LDL受體抗體(R&D Systems)塗佈透明384孔板(Costar)。用緩衝液A徹底洗滌板，隨後用緩衝液B(於緩衝液A中之1%牛乳)阻斷2小時。洗滌後，將板與稀釋於緩衝液C(補充有10毫莫耳濃度CaCl2之緩衝液B)中之0.4微克/毫升LDL受體(R&D Systems)一起培育1.5小時。與所述培育同時，將20奈克/毫升經生物素標記之D374Y PCSK9與多種濃度之稀釋於緩衝液A中之31H4 IgG2、31H4 IgG4、21B12 IgG2或21B12 IgG4抗體或僅緩衝液A(對照)一起培育。洗滌含LDL受體之板，且將經生物素標記之D374Y PCSK9/抗體混合物轉移至其中，且在室溫下培育1小時。藉由與於緩衝液C中之500奈克/毫升之抗生蛋白鏈菌素-HRP(Biosource)一起培育，接著與TMB受質(KPL)一起培育，來偵測 經生物素標記之D374Y與LDL受體之結合。用1當量濃度HCl中止信號，且在450奈米下讀取吸光度。
所述結合研究之結果如圖6A至圖6D中所示。概略地，測定各抗體之IC50值，且發現31H4 IgG2為199皮莫耳濃度(圖6A)，31H4 IgG4為156皮莫耳濃度(圖6B)，21B12 IgG2為170皮莫耳濃度(圖6C)，及21B12 IgG4為169皮莫耳濃度(圖6D)。
在所述檢定中，抗體亦阻斷野生型PCSK9與LDLR之結合。
實例12
細胞LDL吸收(uptake)檢定
本實例證明多種抗原結合蛋白減少細胞之LDL吸收之能力。以每孔5×105個細胞之濃度於補充有10% FBS之DMEM培養基(Mediatech,Inc)中將人類HepG2細胞接種於黑色、透明底的96孔板(Costar)中且在37℃(5% CO2)下培育隔夜。為形成PCSK9與抗體複合物，在室溫下將2微克/毫升D374Y人類PCSK9與稀釋於吸收緩衝液(具有1% FBS之DMEM)中之多種濃度之抗體或僅吸收緩衝液(對照)一起培育1小時。用PBS洗滌細胞後，將D374Y PCSK9/抗體混合物轉移至細胞中，接著將稀釋於吸收緩衝液中之最終濃度為6微克/毫升之LDL-BODIPY(Invitrogen)轉移至細胞中。在37℃(5% CO2)下培育3小時後，用PBS徹底洗滌細胞，且藉由SafireTM(TECAN)在480-520奈米(激發)及520-600奈米(發射)下偵測細胞螢光信號。
細胞吸收檢定之結果如圖7A至圖7D中所示。概略地，測定各抗體之IC50值，且發現31H4 IgG2為16.7奈莫耳濃度(圖7A)，31H4 IgG4為13.3奈莫耳濃度(圖7B)，21B12 IgG2為13.3奈莫耳濃度(圖7C)，及21B12 IgG4為18奈莫耳濃度(圖7D)。所述結果證明所施用之抗原結合蛋白可降低PCSK9(D374Y)之作用從而阻斷細胞之LDL吸收。在所述檢定中，所述抗體亦阻斷野生型PCSK9之作用。
實例13
6天研究中31H4抗體之血清膽固醇降低效應
為評定野生型(wild type，WT)小鼠中經由針對PCSK9蛋白之抗體療法之總血清膽固醇(total serum cholesterol，TC)降低，執行以下程序。
在整個實驗持續時間中，對獲自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)(Bar Harbor，ME)之雄性WT小鼠(C57BL/6品系，9-10週齡，17-27公克)餵食正常食物(Harland-Teklad，飼料2918)。在T=0時，經由小鼠尾靜脈以10毫克/公斤之水平向小鼠投與抗PCSK9抗體31H4(2毫克/毫升於PBS中)或對照IgG(2毫克/毫升於PBS中)。亦留出未處理小鼠(naïve mouse)作為未處理對照組。給藥組及處死時間如表9中所示。
在表9中所示之預定時間點時用CO2窒息處死小鼠。經由腔靜脈收集血液於艾本德(eppendorf)試管中，且使其在室溫下凝結30分鐘。隨後在台式離心機中在12,000×g下旋轉樣品10分鐘以分離血清。使用Hitachi 912臨床分析儀及Roche/Hitachi TC及HDL-C套組量測血清總膽固醇及HDL-C。
實驗結果如圖8A至圖8D中所示。概略地，投與抗體31H4之小鼠顯示實驗過程中血清膽固醇含量減小(圖8A及圖8B)。另外，應注意小鼠亦顯示HDL含量減小(圖8C及圖8D)。圖8A及圖8C中，百分率變化是相對於同一時間點之對照IgG(* P<0.01，# P<0.05)。圖8B及圖8D中，百分率變化是相對於t=0小時時在未處理動物中所量測之總血清膽固醇及HDL含量(* P<0.01，# P<0.05)。
關於降低之HDL含量，應注意熟習此項技術者將認識到，小鼠中HDL之減少不指示HDL減少將在人類中發生且僅僅進一步反映所述生物體中之血清膽固醇含量已減小。應注意，小鼠在高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)粒子中運輸大部分血清膽固醇，此與人類不同，人類是在LDL粒子上運載大部分血清膽固醇。在小鼠中，總血清膽固醇之量測最密切類似於血清HDL-C之含量。小鼠HDL含有載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)，apoE為LDL受體(LDLR)之配體且允許其由LDLR清除。因此，在小鼠中檢測HDL為本實例之適當指示物(應瞭解不預期人類之HDL減少)。相反，舉例而言，人類HDL不含apoE且不為LDLR之配體。當PCSK9抗體增加小鼠中之LDLR表現時，肝可清除更多HDL且因此降低血清HDL-C含量。
實例14
6天研究中抗體31H4對LDLR含量之影響
本實例證明抗原結合蛋白如所預測隨時間改變個體中之LDLR含量。執行西方墨點分析(Western blot analysis)以確定抗體31H4對LDLR含量之影響。將自實例13中所述之處死小鼠獲得之50-100毫克肝組織在含有完全蛋白酶抑制劑(complete protease inhibitor)(Roche)之0.3毫升RIPA緩衝液(Santa Cruz Biotechnology Inc.)中均質化。將勻漿在冰上培育30分鐘且離心以使細胞碎片形成小球。使 用BioRad蛋白質檢定試劑(BioRad laboratories)量測上清液中之蛋白質濃度。使100微克蛋白質在70℃下變性10分鐘且在4-12% Bis-Tris SDS梯度凝膠(Invitrogen)上分離。將蛋白質轉移至0.45微米聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)且在室溫下於含有5%脫脂乳之洗滌緩衝液(50毫莫耳濃度Tris(pH 7.5)、150毫莫耳濃度NaCl、2毫莫耳濃度CaCl2及0.05%吐溫20)中阻斷1小時。隨後在室溫下用山羊抗小鼠LDLR抗體(R&D system)1：2000或抗β-肌動蛋白(anti-β actin)(sigma)1：2000探測墨點1小時。簡略洗滌墨點且與牛抗山羊IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology Inc.)1：2000或山羊抗小鼠IgG-HRP(Upstate)1：2000一起培育。在室溫下培育1小時後，徹底洗滌墨點且使用ECL plus套組(Amersham biosciences)偵測免疫反應帶(immunoreactive band)。西方墨點法顯示，在抗體31H4存在下LDLR蛋白含量增加，如圖9中所示。
實例15
13天研究中抗體31H4之血清膽固醇降低效應
為評定13天研究中野生型(WT)小鼠中經由針對PCSK9蛋白之抗體療法之總血清膽固醇(TC)降低，執行以下程序。
在整個實驗持續時間中，對獲自傑克遜實驗室(Bar Harbor，ME)之雄性WT小鼠(C57BL/6品系，9-10週齡，17-27公克)餵食正常食物(Harland-Teklad，飼料2918)。在T=0時，經由小鼠尾靜脈以10毫克/公斤之水平向小鼠投與抗PCSK9抗體31H4(2毫克/毫升於PBS中)或對照IgG(2毫克/毫升於PBS中)。亦留出未處理小鼠作為未處理對照組。
給藥組及處死時間如表10中所示。如實例13中，處死動物且萃取並製備肝。
表10
當將6天實驗擴展為13天研究時，在13天研究中亦觀察到與6天研究中所觀察到之相同血清膽固醇降低效應。詳言之，以10毫克/公斤給藥之動物證明在第3天時血清膽固醇減少31%，截至第13天其逐步返回至給藥前含量。圖10A描繪本實驗之結果。圖10C描繪用10毫克/公斤劑量之31H4及同為10毫克/公斤之另一抗體16F12重複以上程序的結果。給藥組及處死時間如表11中所示。
如圖10C中所示，16F12與31H4在僅單次給藥後總血清膽固醇即產生顯著及實質性降低且提供超過1週(10天或大於10天)之益處。所重複的13天研究之結果與首次13天研究之結果一致，其中觀察到第3天血清膽固醇含量減小26%。圖10A及圖10B中，百分率變化是相對於同一時間點之對照IgG(* P<0.01)。圖10C中，百分率變化是相對於同一時間點之對照IgG(* P<0.05)。
實例16
13天研究中抗體31H4對HDL含量之影響
亦檢測實例15中之動物之HDL含量。小鼠中HDL含量降低。詳言之，以10毫克/公斤給藥之動物證明第3天HDL含量減小33%，截至第13天其逐步返回至給藥前含量。圖10B描繪實驗之結果。第3天HDL含量減小34%。圖10B描繪經重複之13天實驗之結果。
熟習此項技術者應瞭解，雖然抗體將降低小鼠HDL，但不預期其將在人類中發生，因為人類與其他生物體(諸如小鼠)中之HDL存在差異。因此，小鼠HDL之減少不指示人類HDL之減少。
實例17
重複投與抗體產生抗原結合肽之持續益處
為驗證以上實例中所獲得之結果可由額外劑量延伸更多益處，用圖11A中所描繪之給藥時程重複實例15及16中之實驗。結果如圖11B中所示。如圖11B之圖可見，雖然兩組小鼠因為所有小鼠均接受31H4抗原結合蛋白之最初注射而均顯示總血清膽固醇之明顯減少，但接受31H4 ABP之額外注射之小鼠顯示總血清膽固醇之持續降低，而僅接受對照注射之彼等小鼠最終顯示其總血清膽固醇增加。圖11A至圖11B中，百分率變化是相對於t=0小時時之未處理動物(* P<0.01，** P<0.001)。
本實例之結果證明不同於其他膽固醇治療方法(其中重複施用因個體中之生物調節而導致功效降低)，本方法在檢測期間似乎未遭遇所述問題。此外，此提示在先前實例中所觀察到之總血清膽固醇或HDL膽固醇含量重新回到基線並不是由於個體對治療形成了一定程度的抗性，而是由於個體中抗體可用性的耗盡。
實例18
人類抗PCSK9抗體之抗原決定基定位(mapping)
本實例概述確定PCSK9中之哪些殘基參與形成用於針對PCSK9之本文中所揭露之抗原結合蛋白的抗原決定基或為所述抗原決定基之部分的方法。
為確定本發明之某些ABP所結合之抗原決定基，可使用自特定PCSK9肽序列衍生之合成肽定位ABP之抗原決定基。
可使用SPOT肽陣列(Sigma Genosys)研究人類抗PCSK9抗體與其肽抗原決定基之分子間相互作用。SPOT技術是基於呈適用於系統分析抗體抗原決定基之格式之肽的固相合成。定製陣列之(custom arrayed)寡肽之合成可自Sigma-Genosys購得。可獲得自PCSK9肽之胺基酸序列衍生之重疊寡肽的肽陣列。陣列可在聚丙烯膜片上包括一系列12聚合體(12-mer)肽作為點。肽陣列可跨越PCSK9成熟序列之 整個長度。各連續肽可與前一個肽偏移1個殘基，從而產生陣列寡肽之嵌套、重疊文庫。可使運載肽之膜與不同的抗PCSK9抗體(1微克/毫升)反應。可藉由酶聯免疫吸附檢定使用與HRP接合之二級抗體，接著藉由增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)評定mAb與膜結合肽之結合。
另外，可藉由組合丙胺酸掃描(combinatorial alanine scanning)定位功能性抗原決定基。在此方法中，可使用組合丙胺酸掃描策略鑑別PCSK9蛋白中為與抗PCSK9 ABP相互作用所必需之胺基酸。為此，可使用第二組SPOT陣列來進行丙胺酸掃描。可如上掃描一組在12個殘基之每一者中均以丙胺酸取代之變異肽。此將使得ABP針對人類PCSK9之抗原決定基得以定位及鑑別。
在替代方法中，假定抗原決定基有可能為構形抗原決定基，則可採用丙胺酸掃描及/或精胺酸掃描、抗體FAB/PCSK9共結晶及限制蛋白水解/液相層析質譜(liquid chromatography mass spec.，LC-MS)之組合來鑑別抗原決定基。
實例19
使用PCSK9抗體治療膽固醇相關病症
向顯示膽固醇相關病症(其中膽固醇(諸如，血清膽固醇)降低可為有益)之人類患者投與治療有效量之PCSK9抗體31H4(或例如21B12或16F12)。在治療期間，定期監測患者以確定病症之症狀是否已減退。治療後，發現經受PCSK9抗體治療之患者與未經治療之患者相比，血清膽固醇含量降低。
實例20
使用PCSK9抗體治療高膽固醇血症
向顯示高膽固醇血症症狀之人類患者投與治療有效量之PCSK9抗體，諸如31H4(或例如21B12或16F12)。在治療期間，定期監測人類 患者以確定血清膽固醇含量是否已下降。治療後，發現接受PCSK9抗體治療之患者與未接受所述治療之關節炎患者相比，血清膽固醇含量降低。
實例21
使用PCSK9抗體預防冠心病及/或復發性心血管事件
鑑別處於患冠心病風險中之人類患者。向所述患者投與治療有效量之PCSK9抗體，諸如31H4(或例如21B12或16F12)，所述投與單獨進行或與例如辛伐他汀之士他汀同時或相繼投與。在治療期間，定期監測人類患者以確定患者之總血清膽固醇含量是否改變。在整個預防性治療中，發現接受PCSK9抗體治療之患者血清膽固醇減少，因此與未接受所述治療之患者相比，其患冠心病或復發性心血管事件之風險降低。
實例22
使用PCSK9抗體作為診斷劑
可使用偵測樣品中之PCSK9抗原之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)來診斷顯示PCSK9高產生量之患者。在檢定中，使微量滴定板(諸如96孔微量滴定板或384孔微量滴定板)之孔吸附針對PCSK9之第一完全人類單株抗體數小時。所固定抗體充當可能存在於測試樣品中之任何PCSK9之捕獲抗體。清洗孔且用阻斷劑(諸如牛乳蛋白或白蛋白)處理以阻止分析物非特異性吸附。
隨後用懷疑含有PCSK9之測試樣品或用含有標準量之抗原之溶液處理孔。例如，所述樣品可為來自懷疑具有視為病理學之診斷特徵之循環抗原含量的個體的血清樣品。
清洗掉測試樣品或標準品後，用經藉由與生物素接合而加標記之第二完全人類單株PCSK9抗體處理孔。亦可使用來源於小鼠或其他物種之單株抗體。經標記之PCSK9抗體充當偵測抗體。清洗掉過量第二 抗體後，用與抗生物素蛋白接合之辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)及合適的發色受質處理孔。藉由與由標準樣品獲得之標準曲線相比，確定測試樣品中抗原之濃度。
本ELISA檢定提供一種偵測測試樣品中之PCSK9抗原之高特異性及極靈敏的檢定法。
測定個體中之PCSK9蛋白濃度
夾層ELISA可定量人類血清中之PCSK9含量。來自夾層ELISA之兩種完全人類單株PCSK9抗體辨識PCSK9分子上之不同抗原決定基。或者，可使用來源於小鼠或其他物種之單株抗體。如下執行ELISA：將50微升於塗佈緩衝液(0.1莫耳濃度NaHCO3，pH 9.6)中濃度為2微克/毫升之捕獲PCSK9抗體塗佈於ELISA板(Fisher)上。在4℃下培育隔夜後，在25℃下用200微升阻斷緩衝液(於PBS中之0.5% BSA、0.1%吐溫20、0.01%硫柳汞)處理板1小時。使用於PBS中之0.05%吐溫20(洗滌緩衝液，WB)洗滌板(3次)。將正常或患者血清(Clinomics,Bioreclaimation)稀釋於含有50%人類血清之阻斷緩衝液中。在4℃下將板與血清樣品一起培育隔夜，用WB洗滌，隨後在25℃下與100微升/孔經生物素標記之偵測PCSK9抗體一起培育1小時。洗滌後，將板與HRP-抗生蛋白鏈菌素一起培育15分鐘，如前所述洗滌，隨後用100微升/孔於H2O2中之鄰苯二胺(Sigma顯色液)處理以產生顏色。用50微升/孔H2SO4(2莫耳濃度)使反應停止且使用ELISA板讀取器在492奈米下分析。藉由使用四參數曲線擬合程式與純化PCSK9抗原之稀釋液比較，計算血清樣品中PCSK9抗原之濃度。
測定個體中之PCSK9變異蛋白濃度
可使用本文中所說明之與野生型PCSK9及變異PCSK9(D374Y)都結合之抗體執行以上所概述之步驟。接著，可使用與野生型結合而不與突變體結合之抗體(再次使用以上所概述之類似方案)以確定個 體中所存在之PCSK9為野生型還是為D374Y變異體。熟習此項技術者應瞭解，兩輪均為陽性之結果應為野生型，而第一輪為陽性，但抗體之第二輪不為陽性之結果應包含D374Y突變。群體中存在已知之高頻突變，且其尤其可自諸如本文中所揭露之ABP之藥劑獲益。
實例23
使用PCSK9抗原結合蛋白預防高膽固醇血症
經由家族史分析及/或生活方式及/或當前膽固醇含量鑑別顯示患高膽固醇血症之風險之人類患者。有規律地(例如，每週一次)向個體投與治療有效量之PCSK9抗體31H4(或例如21B12或16F12)。在治療期間，定期監測患者以確定血清膽固醇含量是否已減小。治療後，發現經受PCSK9抗體預防性治療之個體與未經治療之個體相比，血清膽固醇含量降低。
實例24
在士他汀存在下PCSK9 ABP進一步上調LDLR
本實例證明針對PCSK9之ABP當在士他汀存在下使用時使LDLR可用性進一步增加，從而證明藉由組合使用兩者可實現更多益處。
將HepG2細胞接種於具有10%胎牛血清(FBS)之DMEM中且使其生長至約90%長滿。用指定量之莫維諾林(mevinolin)(一種士他汀，Sigma)及PCSK9 ABP(圖12A-12C)於具有3% FBS之DMEM中處理細胞48小時。製備總細胞溶解產物。藉由凝膠電泳分離50毫克總蛋白質且轉移至PVDF膜中。使用兔子抗人類LDL受體抗體(Fitzgerald)或兔子抗人類b-肌動蛋白抗體執行免疫墨點法。增強化學發光結果如圖12A至圖12C中之上圖所示。藉由ImageJ軟體定量帶之強度且藉由b-肌動蛋白歸一化。LDLR之相對含量如圖12A至圖12C中之下圖所示。ABP 21B12及31H4為PCSK9中和抗體，而25A7.1為非中和抗體。
亦產生HepG2-PCSK9細胞。所述細胞為經人類PCSK9轉染之穩定HepG2細胞株。將細胞接種於具有10%胎牛血清(FBS)之DMEM中且使其生長至約90%長滿。用指定量之莫維諾林(Sigma)及PCSK9 ABP(圖12D至圖12F)於具有3% FBS之DMEM中處理細胞48小時。製備總細胞溶解產物。藉由凝膠電泳分離50毫克總蛋白質且轉移至PVDF膜中。使用兔子抗人類LDL受體抗體(Fitzgerald)或兔子抗人類b-肌動蛋白抗體執行免疫墨點法。增強化學發光結果如上圖所示。藉由ImageJ軟體定量帶之強度且藉由b-肌動蛋白歸一化。
如圖12A至圖12F中所描繪之結果可見，遞增量之中和抗體及遞增量之士他汀大體使得LDLR之含量增加。所述遞增量之ABP之效力(effectiveness)增加在圖12D至圖12F中尤其明顯，其中細胞亦經PCSK9轉染，從而使ABP在更高程度上證明其效力。
引人關注地，如由比較圖12D至圖12F與圖12A至圖12C之結果所證明，當正由細胞產生PCSK9時，ABP濃度對LDLR含量之影響急劇增加。另外，很明顯，中和ABP(21B12及31H4)即使在士他汀存在下亦產生比25A7.1 ABP(非中和劑)高之LDLR含量增加，從而證明藉由使用士他汀與針對PCSK9之ABP可實現額外益處。
實例25
一致序列
使用對應於抗PCSK9 ABP之VH及VL之CDR的標準系統發生分析(phylogenic analysis)確定一致序列。藉由在對應於VH或VL之相同序列中保持CDR相鄰來確定一致序列。簡言之，使對應於VH或VL之整個可變域之胺基酸序列轉化為FASTA格式化以便於進行比較比對且推斷系統發生。接著，用人工連接子序列(“bbbbbbbbbb”佔位符，非特異性核酸構築體)置換所述序列之構架區，以使得在不引入歸因於隨機事件(例如，偶然分享共同生殖系構架遺傳質(germline framework heritage)之無關抗體)之任何胺基酸位置加權偏差，而同時仍在對應於VH或VL之相同序列中保持CDR相鄰之情況下，可僅執行CDR之檢測。隨後使用採用類似標準ClutalW之算法之程式，使所述格式之VH或VL序列經受序列相似性比對詢問(參見，Thompson等人，1994,Nucleic Acids Res. 22：4673-4680)。採用8.0之空位產生罰分以及2.0之空位擴展罰分。所述程式同樣基於序列相似性比對使用不加權算術平均組對法(unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA)或鄰接法(Neighbor-Joining method)(參見，Saitou及Nei,1987,Molecular Biology and Evolution 4：406-425)產生系統發生圖(phylogram)(系統發生樹圖解)，以經由分支長度比較及分組來構築並說明序列組之相似性及區別。兩種方法產生類似結果，但最終使用UPGMA衍生樹，因為所述方法採用一組更簡單且更保守之假設。當將類似序列組在組內之個別序列中界定為每100個殘基具有少於15個取代(參見，按比例繪製之樹圖解中之圖例)時，產生UPGMA衍生樹且使用其界定一致序列集合。比較之結果描繪於圖13A至圖13J中。在圖13E中，選擇組以使輕鏈中之序列分支(clade)亦為重鏈中之分支且具有少於15個取代。
熟習此項技術者應瞭解，圖13A至圖13J中所呈現之結果提供大量關於特定胺基酸(例如，彼等保守胺基酸)之重要性及哪些胺基酸位置可能會改變(例如，彼等對不同ABP具有不同胺基酸之位置)的指南。
實例26
PCSK9之小鼠模型及ABP活體內降低LDL之能力
為產生過表現人類PCSK9之小鼠，經由尾靜脈投藥用多種濃度之經重組修飾以表現人類PCSK9之腺相關病毒(adenoassociated virus，AAV)注射三週大之WT C57B1/6小鼠，以確定將在小鼠中提供LDL 膽固醇之可量測增加之恰當力價。使用所述表現人類PCSK9之特定病毒，確定4.5×1012空斑形成單位(pfu)之病毒將在循環血液中產生約40毫克/分升之LDL膽固醇含量(WT小鼠中LDL之正常含量為約10毫克/分升)。發現所述動物中之人類PCSK9含量為約13微克/毫升。使用所述注射標準產生一群小鼠。
注射1週後，評定小鼠之LDL膽固醇含量，且隨機分成不同處理組。隨後經由尾靜脈注射向動物投與10毫克/公斤或30毫克/公斤16F12、21B12或31H4抗原結合蛋白之單次快速注射。在單獨一組動物中投與IgG2 ABP作為給藥對照。隨後在ABP投藥後24及48小時使子組動物(n=6-7)安樂死。任一劑量IgG2投藥後，未對LDL膽固醇含量產生任何效應。與IgG2對照相比，截至且包含投藥後48小時，31H4與21B12均證明顯著的LDL膽固醇降低(兩種不同劑量如圖14A及圖14B中所示)。16F12顯示中間的LDL膽固醇降低反應，其中截至48小時時間點含量重新回到約40毫克/分升之基線。所述資料與試管內結合資料(Biacore及Kinexa)一致，其表明31H4與21B12之間的結合親和力幾乎相同，而16F12對人類PCSK9之親和力較小。
由結果可見，所述模型(歸因於PCSK9之過表現，總膽固醇與HDL膽固醇升高超出WT小鼠)中，總膽固醇及HDL膽固醇因PCSK9 ABP而降低。雖然所述模型中膽固醇降低似乎在相對較短之時間內發生，但咸信此歸因於在所述模型中存在的超生理範圍之人類PCSK9高含量。另外，假定表現由AAV支配，則不對PCSK9表現產生調控。在所述圖中，(*)表示P<0.05，且(**)表示p<0.005(與同一時間點在IgG2對照注射動物中所觀察到之LDL膽固醇含量相比)。小鼠中血清人類PCSK9之13微克/毫升含量對應於超出內源性小鼠PCSK9含量(約25奈克/毫升)約520倍之增加，及超出平均人類血清含量(約175奈克/毫升)約75倍之增加。因此，抗原結合蛋白在人類中甚至應 更有效。
熟習此項技術者應瞭解，以上結果證明所述小鼠模型用於測試抗原結合蛋白改變個體中之血清膽固醇之能力的適當性(appropriateness)。熟習此項技術者亦應認識到，使用小鼠HDL監測小鼠中之血清膽固醇含量雖然適用於監測小鼠血清膽固醇含量，但不指示ABP會對人類中之人類HDL產生影響。舉例而言，Cohen等人(“Sequence variations in PCSK9,low LDL,and protection against coronary heart disease”,N Engl J Med,354：1264-1272,2006)證明PCSK9功能喪失突變對人類HDL含量缺乏任何效應(其整體以引用之方式併入本文中)。因此，熟習此項技術者應瞭解，ABP降低小鼠HDL(缺乏LDL)之能力不指示ABP降低人類HDL之能力。實際上，如Cohen所證實，此對人類中之中和抗體而言不可能發生。
實例27
31H4及21B12與PCSK9之ProCat區結合
本實例描述一種確定多種抗體與PCSK9於何處結合之方法。
使PCSK9蛋白之ProCat域(SEQ ID NO：3之31-449)或V域(SEQ ID NO：3之450-692)與抗體31H4或21B12組合。藉由天然PAGE分析樣品之複合物形成。如圖16A及圖16B中可見，ProCat/31H4及ProCat/21B12樣品存在凝膠移動(gel shift)，從而證明抗體與ProCat域結合。
實例28
LDLR EGFa域與PCSK9之催化域結合
本實例提供2.9埃解析度(其條件描述於以下實例中)下與LDLR EGFa域(293-334)結合之PCSK9 ProCat(SEQ ID NO：3之31-454)之解出晶體結構。
與EGFa結合之PCSK9之結構示意圖如圖17中所示。晶體結構 (及其於圖17中之描繪)揭露LDLR之EGFa域與PCSK9之催化域結合。另外，在圖17中所描繪之結構中，PCSK9與EGFa之相互作用似乎跨越殘基D374與S153之間的PCSK9表面發生。
將與LDLR EGFa域之相互作用界面之特定核心PCSK9胺基酸殘基界定為EGFa域5埃範圍內之PCSK9殘基。核心殘基如下：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380及S381。
將與LDLR EGFa域之相互作用界面之邊界PCSK9胺基酸殘基界定為離EGFa域5-8埃之PCSK9殘基。邊界殘基如下：W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376及Q382。加下劃線之殘基幾乎或完全掩埋於PCSK9中。
熟習此項技術者應瞭解，本實例之結果證明PCSK9與EGFa相互作用之處。因此，與任何所述殘基相互作用或阻斷任何所述殘基之抗體可適合用作抑制PCSK9與LDLR之EGFa域(及/或通常LDLR)之間相互作用的抗體。在一些實施例中，預期當與PCSK9結合時，與任何以上殘基相互作用或阻斷任何以上殘基(或在以上殘基15-8、8、8-5或5埃範圍內之殘基)之抗體，提供對PCSK9與LDLR之結合之有效抑制。
實例29
31H4與PCSK9之前域及催化域之胺基酸殘基相互作用
本實例提供與31H4之Fab片段結合之全長PCSK9(SEQ ID NO：3之N533A突變體)的晶體結構，在2.3埃解析度下測定(其條件描述於以下實例中)。圖18A及圖18B中所描繪之所述結構顯示31H4在催化位點區與PCSK9結合且與來自前域及催化域之胺基酸殘基接觸。
所描繪之結構亦使得能夠鑑別31H4與PCSK9之相互作用界面之 特定核心PCSK9胺基酸殘基。將其界定為31H4蛋白5埃範圍內之殘基。核心殘基如下：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383及G384。
亦使用所述結構鑑別與31H4之相互作用界面之邊界PCSK9胺基酸殘基。所述殘基為離31H4蛋白5-8埃之PCSK9殘基。邊界殘基如下：K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386及Q387。完全掩埋於PCSK9蛋白中之胺基酸殘基加下劃線。
熟習此項技術者應瞭解，圖18B描繪抗原結合蛋白上之CDR與PCSK9之間的相互作用。因而，所述模型使得熟習此項技術者能夠鑑別互補位中特別重要之殘基及/或CDR及對互補位而言不太重要之殘基。如圖18B中可見，重鏈CDR1、CDR2及CDR3最直接參與抗原結合蛋白與抗原決定基之結合，其中輕鏈CDR相對遠離抗原決定基。因而，很可能，輕鏈CDR可能發生較大變異而不會過度干擾抗原結合蛋白與PCSK9之結合。在一些實施例中，結構中直接相互作用之殘基為保守殘基(或者經保守置換)，而彼此未直接相互作用之殘基可在較大程度上改變。因而，熟習此項技術者鑒於本發明之教示，可預測抗原結合蛋白之哪些殘基及區域可改變而不過度干擾抗原結合蛋白與PCSK9結合之能力。舉例而言，彼等當抗原結合蛋白與PCSK9結合時位置最靠近PCSK9之殘基為很可能在抗原結合蛋白與PCSK9之結合中發揮更重要作用之殘基。如上所述，所述殘基可分為PCSK9 5埃範圍內之殘基及5與8埃之間的殘基。將與PCSK9之相互作用界面之特定核 心31H4胺基酸殘基界定為PCSK9蛋白5埃範圍內之31H4殘基。關於重鏈，5埃範圍內之殘基包含以下殘基：T28、S30、S31、Y32、S54、S55、S56、Y57、I58、S59、Y60、N74、A75、R98、Y100、F102、W103、S104、A105、Y106、Y107、D108、A109及D111。關於輕鏈，5埃範圍內之殘基包含以下殘基：L48、S51、Y93及S98。關於重鏈，離PCSK9蛋白5-8埃之殘基包含以下殘基：G26、F27、F29、W47、S50、I51、S52、S53、K65、F68、T69、I70、S71、R72、D73、K76、N77、D99、D101、F110及V112。關於輕鏈，PCSK9 5-8埃範圍內之殘基包含A31、G32、Y33、D34、H36、Y38、I50、G52、N55、R56、P57、S58、D94、S95、S96、L97、G99及S100。
熟習此項技術者應瞭解，實例29之結果證明針對PCSK9之抗體可於何處與PCSK9相互作用且又阻斷PCSK9與EGFa(且因此LDLR)相互作用。因此，與任何所述PCSK9殘基相互作用或阻斷任何所述殘基之抗原結合蛋白(例如，來自與所述殘基結合之其他抗原結合蛋白)可適合用作抑制PCSK9與EGFa(且因此LDLR)之相互作用之抗體。因此，在一些實施例中，預期與任何以上殘基相互作用或與以上殘基5埃範圍內之殘基相互作用的抗原結合蛋白提供對PCSK9與LDLR之結合之有效抑制。類似地，阻斷任何以上殘基之抗原結合蛋白(其可例如經由競爭檢定加以確定)亦可適用於抑制PCSK9/LDLR相互作用。
實例30
21B12與PCSK9之催化域結合，具有與31H4不同之結合位點且可與31H4同時結合PCSK9
本實例提供與31H4及21B12之Fab片段結合之PCSK9 ProCat(SEQ ID NO：3之31-449)的晶體結構，在2.8埃解析度下測定(其條件描述於以下實例中)。圖19A及圖19B中所描繪之所述晶體結構顯示31H4及21B12在PCSK9上具有不同結合位點且兩種抗原結合蛋白可同 時與PCSK9結合。結構顯示21B12與來自PCSK9催化域之胺基酸殘基相互作用。在所述結構中，PCSK9與31H4之間的相互作用類似於以上所觀察到之相互作用。
將與21B12之相互作用界面之特定核心PCSK9胺基酸殘基界定為21B12蛋白5埃範圍內之PCSK9殘基。核心殘基如下：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377及F379。
將與21B12之相互作用界面之邊界PCSK9胺基酸殘基界定為離21B12蛋白5-8埃之PCSK9殘基。邊界殘基如下：I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375及C378。幾乎或完全掩埋於PCSK9蛋白中之胺基酸殘基加下劃線。
熟習此項技術者應瞭解，圖19B描繪抗原結合蛋白上之CDR與PCSK9之間的相互作用。因而，模型使得熟習此項技術者能夠鑑別對互補位而言特別重要之殘基及/或CDR及對互補位而言不太重要之殘基。如結構中可見，重鏈CDR2及輕鏈CDR1似乎與抗原決定基密切相互作用。其次，重鏈CDR1、重鏈CDR3及輕鏈CDR3似乎靠近抗原決定基，但不如第一組CDR密切。最後，輕鏈CDR2似乎離抗原決定基有一段距離。因而，很可能，相距較遠的CDR可能發生較大變異而不會過度干擾抗原結合蛋白與PCSK9之結合。在一些實施例中，結構中直接相互作用之殘基為保守殘基(或者經保守置換)，而彼此未直接相互作用之殘基可在較大程度上改變。因而，熟習此項技術者鑒於本發明之教示，可預測抗原結合蛋白之哪些殘基及區域可改變而不過度干擾抗原結合蛋白與PCSK9結合之能力。舉例而言，彼等當抗原結合蛋白與PCSK9結合時位置最靠近PCSK9之殘基為很可能在抗原結合蛋白與PCSK9之結合中發揮更重要作用之殘基。如上所述，所述殘基可 分為PCSK9 5埃範圍內之殘基及5與8埃之間的殘基。將與PCSK9之相互作用界面之特定核心21B12胺基酸殘基界定為PCSK9蛋白5埃範圍內之21B12殘基。關於重鏈，5埃範圍內之殘基包含以下殘基：T30、S31、Y32、G33、W50、S52、F53、Y54、N55、N57、N59、R98、G99、Y100及G101。關於輕鏈，5埃範圍內之殘基包含以下殘基：G30、G31、Y32、N33、S34、E52、Y93、T94、S95、T96及S97。關於重鏈，離PCSK9蛋白5-8埃之殘基包含以下殘基：T28、L29、I34、S35、W47、V51、G56、T58、Y60、T72、M102及D103。關於輕鏈，PCSK9 5-8埃範圍內之殘基包含以下殘基：S26、V29、V35、Y51、N55、S92、M98及V99。
熟習此項技術者應瞭解，實例30之結果證明針對PCSK9之抗原結合蛋白可於何處與PCSK9相互作用且又阻斷PCSK9與EGFa(且因此LDLR)相互作用。因此，與任何所述PCSK9殘基相互作用或阻斷任何所述殘基之抗原結合蛋白可適合用作抑制PCSK9與EGFa(且因此LDLR)之相互作用之抗體。因此，在一些實施例中，預期與任何以上殘基相互作用或與以上殘基5埃範圍內之殘基相互作用的抗體提供對PCSK9與LDLR之結合之有效抑制。類似地，阻斷任何以上殘基之抗原結合蛋白(其可例如經由競爭檢定加以確定)亦可適用於抑制PCSK9/LDLR相互作用。
實例31
EGFa、PCSK9與抗體之間的相互作用
將以上實例之三元複合物(PCSK9/31H4/21B12)之結構疊置於PCSK9/EGFa結構(如實例28中描述所確定)上，且將所述組合之結果描繪於圖20A中。所述圖證明PCSK9上可被有效靶向以抑制PCSK9與EGFa之相互作用的區域。圖顯示31H4及21B12與LDLR之EGFa域之位置部分重疊且空間上干擾其與PCSK9結合。另外，如結構中可見， 21B12與特異性參與與LDLR EGFa域之結合之胺基酸殘基的子集直接相互作用。
如上所述，晶體結構之分析鑑別出參與PCSK9與搭配物蛋白之間的相互作用之特定胺基酸(PCSK9表面上界面之核心區及邊界區)及所述搭配物蛋白與PCSK9相互作用之空間要求。結構提示抑制PCSK9與LDLR之間的相互作用之途徑。第一，如上所述，使針對PCSK9之藥劑在其分享與LDLR之EGFa域之結合位點的共同殘基之處結合將會抑制PCSK9與LDLR之間的相互作用。第二，在共同殘基外部結合之藥劑可在空間上干擾EGFa域或LDLR之為EGFa域之N-末端或C-末端的區，從而阻止PCSK9與LDLR之間的相互作用。
在一些實施例中，參與EGFa結合及靠近以上所述之抗原結合蛋白所結合之區域的殘基尤其適用於操縱PCSK9與LDLR之結合。舉例而言，用於不同結合搭配物之核心區與邊界區中共同之界面胺基酸殘基列於下表12中。完全掩埋於PCSK9蛋白中之胺基酸殘基加下劃線。
熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，抗原結合蛋白與至少一個上述之殘基結合及/或阻斷至少一個上述之殘基。
實例32
LDLR與PCSK9之結構相互作用
使用PCSK9 ProCat(SEQ ID NO：3之31-454)/EGFa複合結構製作與LDLR之全長代表結合之全長PCSK9的模型。將全長PCSK91之結構(Piper,D.E.等人，The crystal structure of PCSK9：a regulator of plasma LDL-cholesterol.Structure 15,545-52(2007))疊置於複合物之PCSK9 ProCat 31-454上，且將呈低pH值構形之LDLR之結構(Rudenko,G等人，Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH.Science 298,2353-8(2002))疊置於複合物之EGFa域上。模型之描繪如圖20B及圖20C中所示。EGFa域由圖中之方框指示。圖顯示LDLR之位置緊鄰PCSK9之最接近的EGFa結合域外部的區。圖20D至圖20F顯示以上相互作用，以及抗體31H4及21B12B三個不同角度之網格表面示意圖。由描繪明顯可見，不僅抗體可在實際結合位點相互作用及/或干擾LDLR與PCSK9之相互作用，而且似乎亦發生其他的空間相互作用。
根據以上結果，明顯可見與PCSK9結合之抗原結合蛋白亦可藉由與LDLR之多個區衝突(不僅在LDLR與PCSK9相互作用之位點處)而抑制PCSK9與LDLR之間的相互作用。舉例而言，其可與重複單元7(repeat 7，R7)、EGFb域及/或β-螺旋槳域衝突。
結合或阻斷EGFa與PCSK9相互作用之抗原結合分子之實施例
熟習此項技術者應瞭解，實例28-32及其附圖提供關於EGFa如何及在何處與PCSK9相互作用以及兩種代表性中和抗原結合蛋白21B12及31H4如何與PCSK9相互作用且產生其中和效應的詳細描述。因而，熟習此項技術者應能夠藉由鑑別在PCSK9上之至少一個相同位置處或附近結合之其他抗原結合分子，而容易地鑑別可類似地降低EGFa(包含LDLR)與PCSK9之間結合之抗原結合分子。雖然圖中及 本說明書中已鑑別PCSK9上之相關位置(或抗原決定基)，但將所述位點描述為位於離經鑑別靠近EGFa結合位點之殘基某一設定距離範圍內亦為有利的。在一些實施例中，抗原結合分子將與一或多個以下殘基結合或在一或多個以下殘基30埃範圍內結合(編號參考SEQ ID NO：3)：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。在一些實施例中，抗原結合分子在一或多個以下殘基30埃範圍內結合(編號參考SEQ ID NO：3)：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376或Q382。在一些實施例中，抗原結合分子在一或多個以下殘基30埃範圍內結合(編號參考SEQ ID NO：3)： W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386或Q387。在一些實施例中，抗原結合分子在一或多個以下殘基30埃範圍內結合(編號參考SEQ ID NO：3)：S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375或C378。
在一些實施例中，抗原結合分子在離一或多個上述殘基30、30-25、25-20、20-15、15-8、8、8-5、5、5-4、4埃或小於4埃的範圍內結合。在一些實施例中，抗原結合分子當與PCSK9結合時，在超過一個上述之殘基之至少一個上述距離範圍內。舉例而言，在一些實施例中，抗原結合分子在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75或大於75個上述殘基的一個所列距離(例如30、30-25、25-20、20-15、15-8、8、8-5、5、5-4、4埃或小於4埃)範圍內。在一些實施例中，抗原結合分子在子組之各組中所鑑別之殘基(諸如僅組內之彼等表面殘基)至少1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-95、95-99、99-100%的一個所列距離範圍內。除非另有特別說 明，否則抗原結合分子與PCSK9之間的距離為PCSK9上之共價鍵結原子與抗原結合分子之共價鍵結原子(即，PCSK9及抗原結合分子之最靠近原子)之間的最短距離。類似地，除非另有特別說明，否則殘基(抗原結合分子或PCSK9上)與另一蛋白質(相應為PCSK9或抗原結合分子)之間的距離為自所鑑別之殘基上之最近點至所述另一蛋白質最近之共價鍵結部分的距離。在一些實施例中，距離可由胺基酸鏈之主鏈量測。在一些實施例中，可量測互補位邊緣與抗原決定基邊緣(彼此最近)之間的距離。在一些實施例中，可量測互補位表面中心與抗原決定基表面中心之間的距離。熟習此項技術者應瞭解，本說明適用於本文中所列之各個別組殘基。舉例而言，預期以上範圍通常且尤其用於實例28-32中所列之8埃殘基及實例28-32中所列之5埃殘基。
在一些實施例中，抗原結合分子與PCSK9上由EGFa、21B12或31H4中之至少一者所結合的表面結合。在一些實施例中，抗原結合分子在與PCSK9與EFGa、Ab 31H4及/或Ab 21B12之間相互作用的位置(如以上實例及圖中所描述)重疊之位置處與PCSK9結合。在一些實施例中，抗原結合分子在更遠離一個上文所列之殘基之位置處與PCSK9結合。在一些實施例中，所述抗原結合分子仍可為有效的中和抗原結合分子。
在一些實施例中，可將PCSK9之催化域之結構描述為通常為三角形(如圖19A中所示)。顯示三角形之第一邊由31H4結合。顯示三角形之第二邊由21B12結合，且三角形之第三邊朝頁底緊接著“圖19A”標號上方定位。在一些實施例中，與PCSK9之催化域之第一邊及/或第二邊結合之抗原結合分子可適合用作中和抗體，因為其可直接或在空間上干擾EGFa與PCSK9之結合。熟習此項技術者應瞭解，當抗原結合分子足夠大(諸如完整抗體)時，抗原結合分子不必藉由直接與EGFa結合位點結合來干擾EGFa與PCSK9之結合。
熟習此項技術者應瞭解，雖然LDLR之EGFa域已用於許多實例中，但模型及結構仍對全長LDLR蛋白將如何與PCSK9相互作用適用。實際上，全長LDLR蛋白上所存在之額外結構提供了可進一步由一個抗原結合分子來阻斷之額外蛋白空間。因而，若抗原結合分子阻斷或抑制EGFa與PCSK9之結合，則其將很可能至少與全長LDLR蛋白一樣有效(若不更有效)。類似地，在某一設定距離範圍內或阻斷多個與抑制EGFa結合相關之殘基的抗原結合分子將很可能與全長LDLR一樣有效(若不更有效)。
熟習此項技術者應瞭解，阻斷或結合以上所述PCSK9殘基(或在所列距離範圍內)或抑制一或多種在以上實例及圖中所述之相互作用的任何分子，均可用於抑制EGFa(或通常LDLR)與PCSK9之相互作用。因而，分子不必侷限於抗原結合“蛋白”，因為任何抗原結合分子亦可達成所需目的。抗原結合分子之實例包含適體(aptamer)，其可為寡核酸或肽分子。抗原結合分子之其他實例包含高親和性多聚體(avimer)、肽體、小分子及聚合物及可增加EGFa與PCSK9之親和力及/或半衰期之EGFa修飾形式，諸如胺基酸突變、醣基化、聚乙二醇化、Fc融合及高親和性多聚體融合。熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，LDLR不為抗原結合分子。在一些實施例中，LDLR之結合子部不為抗原結合分子，例如，EGFa。在一些實施例中，PCSK9在活體內發信號所經由之其他分子不為抗原結合分子。所述實施例因而將明確地加以鑑別。
實例33
蛋白質樣品之表現及純化
本實例描述如何製備及純化PCSK9蛋白/變異體之多個實施例(包含LDLR EGFa域)的一些實施例。將PCSK9蛋白/變異體(例如，PSCK9 31-692 N533A、PCSK9 449TEV及PCSK9 ProCat 31-454) 表現於具有N-末端蜜蜂蜂毒素信號肽(N-terminal honeybee melittin signal peptide)繼之以His6標籤之桿狀病毒感染Hi-5昆蟲細胞中。藉由鎳親和層析法、離子交換層析法及尺寸排阻層析法純化PCSK9蛋白。純化期間藉由用TEV蛋白酶裂解移除蜂毒素-His6標籤。使用構築體PCSK9 449TEV產生PCSK9 ProCat(31-449)及V域(450-692)樣品。所述構築體具有插入於PCSK9殘基449與450之間的TEV蛋白酶裂解位點。關於用於結晶學之全長N555A變異體、PCSK9 31-454片段及用於結晶學之PCSK9 449TEV變異體，rTEV後蛋白產物(post rTEV protein product)亦包含最初GAMG序列。因此，rTEV裂解後，所述蛋白為GAMG-PCSK9。此外，PCSK9 449TEV蛋白包含插入於SEQ ID NO：3之位置H449與G450之間的序列“ENLYFQ”(SEQ ID NO：403)。經rTEV裂解後，自所述構築體產生之PCSK9 ProCat蛋白為GAMG-PCSK9(31-449)-ENLYFQ且自所述構築體產生之V域為SEQ ID NO：3之PCSK9(450-692)。
將21B12及31H4 Fab片段表現於大腸桿菌中。藉由鎳親和層析法、尺寸排阻層析法及離子交換層析法純化所述蛋白質。
將LDLR EGFa域(293-334)在大腸桿菌中表現為GST融合蛋白。藉由離子交換層析法、麩胱甘肽瓊脂糖親和層析法及尺寸排阻層析法純化EGFa域。純化期間藉由用PreScission蛋白酶裂解移除GST蛋白。
實例34
複合物形成及結晶
本實例描述如何製備在以上結構檢測實例中所使用之複合物及晶體。
藉由混合1.5莫耳濃度過量之31H4 Fab與PCSK9製備PCSK9 31-692 N533A/31H4複合物。藉由尺寸排阻層析法移除過量31H4 Fab來 純化複合物。PCSK9 31-692N533A/31H4複合物在0.1莫耳濃度Tris(pH 8.3)、0.2莫耳濃度乙酸鈉、15% PEG 4000、6%葡聚糖硫酸鈉鹽(Mr 5000)中結晶。
首先藉由混合1.5莫耳濃度過量之31H4 Fab與PCSK9 31-449製備PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12複合物。藉由在尺寸排阻層析管柱上純化來分離複合物與過量31H4。隨後向PCSK9 31-449/31H4複合物中添加1.5莫耳濃度過量之21B12 Fab。藉由在尺寸排阻層析管柱上純化來分離三元複合物與過量21B12。PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12複合物在0.1莫耳濃度Tris(pH 8.5)、0.2莫耳濃度磷酸二氫銨、50% MPD中結晶。
藉由混合1.2莫耳濃度過量之EGFa域與PCSK9 31-454製備PCSK9 ProCat 31-454/EGFa複合物。PCSK9 ProCat 31-454/EGFa域複合物在0.2莫耳濃度甲酸鉀、20% PEG 3350中結晶。
實例35
資料收集及結構確定
本實例描述如何收集資料集及如何確定用於以上結構檢測實例之結構。
在Rigaku FR-E X射線源上收集PCSK9 31-692 N533A/31H4及PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12晶體之最初資料集。在伯克利先進光源(Berkeley Advanced Light Source)光束線5.0.2下收集PCSK9 ProCat 31-454/EGFa資料集及PCSK9 31-692 N533A/31H4及PCSK9 ProCat 31-449/31H4/21B12晶體之更高解析度資料集。所有資料集均由denzo/scalepack或HKL2000處理(Otwinowski,Z.,Borek,D.,Majewski,W.及Minor,W.Multiparametric scaling of diffraction intensities.Acta Crystallogr A 59,228-34(2003))。
PCSK9/31H4晶體生長於C2空間群中，其中晶胞尺寸a=264.9 埃，b=137.4埃，c=69.9埃，β=102.8°且在2.3埃解析度下繞射。用使用PCSK9結構(Piper,D.E.等人，The crystal structure of PCSK9：a regulator of plasma LDL-cholesterol.Structure 15,545-52(2007))作為開始搜尋模型之程式MOLREP(The CCP4 suite：programs for protein crystallography.Acta Cystallogr D Biol Crystallogr 50,760-3(1994))藉由分子置換解出PCSK9/31H4結構。保持PCSK9 31-692溶液固定，使用抗體可變域作為搜尋模型。保持PCSK9 31-692/抗體可變域溶液固定，使用抗體恆定域作為搜尋模型。經多輪用Quanta建模且用cnx精化來改良完整結構(Brunger,A.T.等人，Crystallography & NMR system：A new software suite for macromolecular structure determination.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54,905-21(1998))。
PCSK9/31H4/21B12晶體生長於P21212空間群中，其中晶胞尺寸a=138.7埃，b=246.2埃，c=51.3埃且在2.8埃解析度下繞射。用使用PCSK9 ProCat/31H4可變域作為開始搜尋模型之程式MOLREP藉由分子置換解出PCSK9/31H4/21B12結構。保持PCSK9 ProCat/31H4可變域固定，執行抗體恆定域搜尋。保持PCSK9 ProCat/31H4/21B12恆定域固定，使用抗體可變域作為搜尋模型。經多輪用Quanta建模及用cnx精化來改良完整結構。
PCSK9/EGFa域晶體生長於空間群P6522中，其中晶胞尺寸a=b=70.6埃，c=321.8埃且在2.9埃解析度下繞射。用使用PCSK9 ProCat作為開始搜尋模型之程式MOLREP藉由分子置換解出PCSK9/EGFa域結構。電子密度圖之分析顯示EGFa域之清晰電子密度。手動裝配LDLR EGFa域且經多輪用Quanta建模及用cnx精化來改良模型。
將核心相互作用界面胺基酸確定為具有至少一個離PCSK9搭配物 蛋白小於或等於5埃之原子的所有胺基酸殘基。選擇5埃作為核心區界點距離以使得原子在凡得瓦爾力(van der Waals)半徑外加可能的由水介導之氫鍵範圍內。將邊界相互作用界面胺基酸確定為具有至少一個離PCSK9搭配物蛋白小於或等於8埃之原子但不包含於核心相互作用列表中之所有胺基酸殘基。選擇小於或等於8埃作為邊界區界點距離以顧及經擴展精胺酸胺基酸之長度。用程式PyMOL(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.(Palo Alto,2002))計算符合所述距離標準之胺基酸。
實例36
PCSK9及31A4之晶體結構
確定31A4/PCSK9複合物之晶體結構。
蛋白質樣品之表現及純化
將PCSK9 449TEV(具有插入於殘基449與450之間的TEV蛋白酶裂解位點之PCSK9構築體，根據SEQ ID NO：3編號)表現於具有N-末端蜜蜂蜂毒素信號肽繼之以His6標籤之桿狀病毒感染Hi-5昆蟲細胞中。首先藉由鎳親和層析法純化PCSK9蛋白。使用TEV蛋白酶移除蜂毒素-His6標籤且在催化域與V域之間裂解PCSK9蛋白。進一步藉由離子交換層析法及尺寸排阻層析法純化V域。將31A4 Fab片段表現於大腸桿菌中。藉由鎳親和層析法、尺寸排阻層析法及離子交換層析法純化所述蛋白質。
複合物形成及結晶
藉由混合1.5莫耳濃度過量之PCSK9 V域與31A4 Fab製備PCSK9 V域/31A4複合物。藉由在尺寸排阻層析管柱上純化來分離複合物與過量PCSK9 V域。PCSK9 V域/31A4複合物在1.1莫耳濃度丁二酸(pH 7)、2% PEG MME 2000中結晶。
資料收集及結構確定
在Rigaku FR-E x射線源上收集PCSK9 V域/31A4晶體之資料集且用denzo/scalepack處理(Otwinowski,Z.,Borek,D.,Majewski,W.及Minor,W.Multiparametric scaling of diffraction intensities.Acta Crystallogr A 59,228-34(2003))。
PCSK9 V域/31A4晶體生長於P212121空間群中，其中晶胞尺寸a=74.6埃，b=131.1埃，c=197.9埃，每個不對稱單元兩個複合物分子，且在2.2埃解析度下繞射。用使用PCSK9結構之V域(Piper,D.E.等人，The crystal structure of PCSK9：a regulator of plasma LDL-cholesterol.Structure 15,545-52(2007))作為開始搜尋模型之程式MOLREP(CCP4.The CCP4 suite：programs for protein crystallography.Acta Cystallogr D Biol Crystallogr 50,760-3(1994))藉由分子置換解出PCSK9 V域/31A4結構。保持PCSK9 450-692溶液固定，使用抗體可變域作為搜尋模型。最初精化後，手動裝配抗體恆定域。經多輪用Quanta建模且用cnx精化來改良完整結構(Brunger,A.T.等人，Crystallography & NMR system：A new software suite for macromolecular structure determination.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54,905-21(1998))。
將核心相互作用界面胺基酸確定為具有至少一個離PCSK9搭配物蛋白小於或等於5埃之原子的所有胺基酸殘基。選擇5埃作為核心區界點距離以使得原子在凡得瓦爾力半徑外加可能的由水介導之氫鍵範圍內。將邊界相互作用界面胺基酸確定為具有至少一個離PCSK9搭配物蛋白小於或等於8埃之原子但不包含於核心相互作用列表中之所有胺基酸殘基。選擇小於或等於8埃作為邊界區界點距離以顧及經擴展精胺酸胺基酸之長度。用程式PyMOL(DeLano,W.L.The PyMOL Molecular Graphics System.(Palo Alto,2002))計算符合所述距離標準之胺基酸。使用V域“A”及31A4“L1，H1”複合物計算距離。
在2.2埃解析度下測定與31A4之Fab片段結合之PCSK9 V域的晶體結構。晶體結構如圖21A至圖21D中所述。圖21A至圖21C顯示31A4 Fab在子域1及2之區中與PCSK9 V域結合。
製備結合31A4 Fab之全長PCSK9之模型。全長PCSK9之結構疊置於複合物之PCSK9 V域上。所述模型之圖如圖21D中所示。突出LDLR之EGFa域與PCSK9之間相互作用之位點。
結構之分析顯示所述抗體在何處與PCSK9相互作用且證明不與PCSK9之LDLR結合表面結合之抗體仍可抑制經由PCSK9介導之LDLR降解(當結合以下實例40及41來看所述結果時)。另外，晶體結構之分析使得能夠鑑別參與PCSK9與31A4抗體之間的相互作用之特定胺基酸。此外，亦確定PCSK9表面上界面之核心區及邊界區。將與31A4之相互作用界面之特定核心PCSK9胺基酸殘基界定為31A4蛋白5埃範圍內之PCSK9殘基。核心殘基為T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592及E593。將與31A4之相互作用界面之邊界PCSK9胺基酸殘基界定為離31A4蛋白5-8埃之PCSK9殘基。邊界殘基如下：S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595及H597。幾乎或完全掩埋於PCSK9蛋白中之胺基酸殘基藉由加下劃線突出。如本文中所述，編號參考SEQ ID NO：3之胺基酸位置(如本文中所述調整)。
將與PCSK9之相互作用界面之特定核心31A4胺基酸殘基界定為PCSK9蛋白5埃範圍內之31A4殘基。31A4抗體之核心殘基如下：重鏈：G27、S28、F29、S30、A31、Y32、Y33、E50、N52、H53、R56、D58、K76、G98、Q99、L100及V101；輕鏈：S31、N32、 T33、Y50、S51、N52、N53、Q54、W92及D94。將與PCSK9之相互作用界面之邊界31A4胺基酸殘基界定為離PCSK9蛋白5-8埃之31A4殘基。31A4之邊界殘基如下：重鏈：V2、G26、W34、N35、W47、I51、S54、T57、Y59、A96、R97、P102、F103及D104；輕鏈：S26、S27、N28、G30、V34、N35、R55、P56、K67、V91、D93、S95、N97、G98及W99。
晶體結構亦顯示所述ABP在其與PCSK9相互作用中之空間要求。如所述結構中所示，令人驚訝地，與PCSK9結合而不直接阻止PCSK9與LDLR相互作用之抗體仍可抑制PCSK9之功能。
在一些實施例中，可採用結合、覆蓋或阻止31A4與任何以上殘基相互作用之任何抗原結合蛋白來結合或中和PCSK9。在一些實施例中，ABP與至少一個下述PCSK9(SEQ ID NO：3)殘基結合或相互作用：T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592及E593。在一些實施例中，ABP在一或多個上述殘基5埃範圍內。在一些實施例中，ABP與至少一個下述PCSK9(SEQ ID NO：3)殘基結合或相互作用：S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595及H597。在一些實施例中，ABP離一或多個上述殘基5至8埃。在一些實施例中，ABP與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個上述殘基相互作用、阻斷所述殘基或在所述殘基8埃範圍內。
以上實例中所討論之晶體結構之座標如表35.1(全長PCSK9及31H4)、表35.2(PCSK9及EGFa)、表35.3(PCSK9、31H4及21B12) 及表35.4(PCSK9及31A4)中所示。亦預期與圖中所描繪之PCSK9之結構的相關區域或殘基(包含彼等離EGFa或抗體與PCSK9相互作用之處15埃、15-8埃、8埃、8-5埃、5埃或小於5埃範圍內之區域或殘基)相互作用的抗原結合蛋白及分子及/或其在結構上離所述座標之相應位置。
在大腸桿菌中產生座標中所述之抗體且因此與完全人類抗體具有一些微小胺基酸差異。對於21B12之重鏈及輕鏈及31H4之輕鏈，可變區中之第一殘基為麩胺酸而不是麩胺醯胺。除可變區序列之差異外，由座標所述之抗體之恆定區中亦存在一些差異(再次歸因於抗體在大腸桿菌中產生之事實)。圖22突出(經由加下劃線、加陰影或粗體)當與SEQ ID NO：156及155相比時，21B12、31H4及31A4 Fab(在大腸桿菌中產生)之恆定區之間的差異。對於21B12、31H4及31A4，輕鏈恆定序列類似於人類λ序列(SEQ ID NO：156)。加下劃線之甘胺酸殘基為21B12及31H4可變序列終止處與λ序列開始處之間的插入物。
對於21B12與31H4，重鏈恆定序列類似於人類IgG4(SEQ ID NO：155)。圖22中所突出之差異如表36.1中所示：
關於31A4，雖然其亦具有以上所述之相同區別，但還存在三個其它差異。如圖22中所示，在開始處有兩個額外胺基酸，所述胺基酸來自大腸桿菌表現中信號肽之不完全加工。另外，當與SEQ ID NO：155相比時在31A4重鏈恆定區中存在一個額外取代，所述取代將L(SEQ ID NO：155)調整為H。最後，31A4具有麩胺醯胺來作為Fab之最初胺基酸，而不是調整為以上關於21B12及31H4所述之麩胺酸。
對於所有三種抗體，重鏈之末端(於深灰色框中)亦不同，但所述胺基酸未安排(ordered)在所述結構中，故其未出現於座標中。熟習此項技術者應瞭解，his標籤不是ABP之必需部分且不應視為ABP序列之部分，除非藉由引用包含組胺酸標籤之特定SEQ ID NO且聲明ABP序列“包含組胺酸標籤”而明確提出。
實例37
抗原決定基定位一分倉
除實例10中之組外，進行一組替代分倉實驗。如實例10中，相互競爭之ABP可視為與靶標上之同一位點結合且照一般說法認為“分倉”在一起。
使用由Jia等人(J.Immunological Methods,288(2004)91-98)所述之多路分倉法(Multiplexed Binning method)之修改形式。在室溫下在黑暗中將經抗生蛋白鏈菌素塗佈之Luminex珠粒之個別珠粒代碼在100微升0.5微克/毫升經生物素標記之單價小鼠抗人類IgG捕獲抗體(BD Pharmingen，#555785)中培育1小時，隨後用PBSA磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)加1%牛血清白蛋白(BSA)洗滌3次。將各珠粒代碼單獨與100微升2微克/毫升抗PCSK9抗體(塗佈抗體)一起培育1小時，隨後用PBSA洗滌3次。彙集珠粒，隨後分配至96孔過濾板(Millipore，#MSBVN1250)中。向一半孔中添加100微升2微克/毫升純化PCSK9蛋白。向另一半中添加緩衝液作為對照。將反應培育1小 時，隨後洗滌。向所有孔中添加100微升2微克/毫升抗PCSK9抗體(偵測抗體)，培育1小時，隨後洗滌。操作不相關人類IgG(Jackson，#009-000-003)作為另一對照。向各孔中添加20微升與藻紅素(phycoerythrin，PE)接合之單價小鼠抗人類IgG(BD Pharmingen，#555787)且培育1小時，隨後洗滌。將珠粒再懸浮於100微升PBSA中，在BioPlex儀器(BioRad)上收集每個珠粒代碼最少100個事件。
將無PCSK9之抗體對之中值螢光強度(Median Fluorescent Intensity，MFI)自含有PCSK9之相應反應之信號中扣除。關於視為同時結合且因此於不同倉中之抗體對，所扣除之信號必須大於與自身競爭之抗體之信號3倍且大於與不相關抗體競爭之抗體之信號3倍。
以上資料描繪於圖23A至圖23D中。ABP分屬五個倉。陰影框指示可同時與PCSK9結合之ABP。非陰影框指示彼等相互競爭結合之ABP。結果之概述如表37.1中所示。
第1倉(與ABP 21B12競爭)及第3倉(與31H4競爭)彼此不包含；第2倉與第1倉及第3倉競爭；且第4倉不與第1倉及第3倉競爭。所述實例中，將第5倉呈現為“全包(catch all)”倉以描述彼等不符合其他倉之ABP。因此，各結合中以上所鑑別之ABP代表PCSK9上不同類型之抗原決定基位置，其中一些位置相互重疊。
熟習此項技術者應瞭解，若參考ABP阻止探測ABP之結合，則認為抗體處於同一倉中。採用ABP之次序可能很重要。若採用ABP A作為參考ABP且其阻斷ABP B之結合，則反過來就不一定成立：用作參考ABP的ABP B將未必阻斷ABP A。此處有許多因素起作用：ABP之結合可引起靶標中之構形變化從而阻止第二ABP之結合，或者重疊但不完全相互重合之抗原決定基可能允許第二ABP仍與靶標具有足夠高親和力之相互作用從而允許結合。親和力相當高的ABP可能具有將阻斷ABP撞出道路之較高能力。通常，若任一次序下均觀察到競爭，則認為ABP分倉在一起，且若兩個ABP可相互阻斷，則很可能抗原決定基較完全地重疊。
實例38
抗原決定基定位-西方墨點法
本實例證明經檢測的ABP之抗原決定基為線性抗原決定基或是構形抗原決定基。執行變性還原及變性非還原西方墨點法以確定哪些抗體具有構形抗原決定基。與變性還原西方墨點結合之抗體具有線性抗原決定基且不為構形抗體。結果如圖24A及圖24B中所示。關於墨 點，使0.5微克/泳道的純化全長人類PCSK9在4-12% NuPAGE Bis-Tris凝膠及MES SDS跑膠緩衝液上跑膠。使用1微克/毫升抗PCSK9抗體(除0.5微克/毫升31G11外)探測墨點。使用1：5000驢抗人類IR700二級抗體且在LiCOR儀器上讀數。抗體13H1與PCSK9之前域上的線性抗原決定基結合。所有其他抗體顯示與構形抗原決定基一致之結果。所述凝膠將前域與蛋白質其餘部分分開，且前域在約15千道爾頓處。另外，3C4及31A4似乎與經雙硫鍵保護之構形抗原決定基結合，因為所述抗體在雙硫鍵已受保護之變性條件下與PCSK-9結合(左)，但樣品還原使結合消除(右)。
實例39
抗原決定基定位-精胺酸/麩胺酸掃描
選擇各倉之代表性ABP(來自實例37)用於進一步的抗原決定基分析。執行精胺酸/麩胺酸掃描策略以定位與PCSK9結合之ABP。經由背景，所述方法確定某一殘基是否為結構抗原決定基之一部分，意謂抗原中接觸抗體或由抗體掩埋之彼等殘基。精胺酸及麩胺酸側鏈帶電且體積大且可破壞抗體結合，即使所述突變殘基不直接參與抗體結合。
殘基選擇
使用PCSK9之晶體結構選擇待突變之殘基進行抗原決定基定位。用於選擇待突變之殘基之方法包括計算機理(computational mechanism)與交互結構分析(interactive structure analysis)。PCSK9結構含有丟失殘基(missing residue)之空位且在N-末端丟失30個胺基酸(亦即，信號序列)而在C-末端丟失10個胺基酸。在結構上模擬內部丟失殘基，但未模擬N-末端及C-末端丟失殘基。計算各殘基之溶劑暴露比率(solvent exposure ratio)：將蛋白質情況下各殘基之表面積(SA1)除以具有保守主鏈結構之側接甘胺酸之三聚體中所述殘基 之表面積(SA2)。選擇溶劑暴露比率大於10%之殘基(R10)以及40個丟失末端殘基。由此，排除帶正Φ角之脯胺酸及甘胺酸從而降低錯誤摺疊(misfolding)之可能性。藉由使用37%之溶劑暴露比率，以及目視檢查整個蛋白質以使突變總數為285，來減小V域中待突變之殘基之數目。具有所述多種類別身份之PCSK9之表面的多個方位如圖25A至圖25F中所示。在所述圖中，最淺之灰色表示未選擇或取消選擇之區域，較深之灰色表示彼等所選擇之殘基。
選殖及表現
一旦鑑別出待改變之殘基，即改變多個殘基。將人類PCSK9選殖於具有C-末端Flag-His標籤之pTT5載體中。使用來自Stratagene之QuikChange II套組，藉由定點突變誘發，由所述原始構築體製備突變體。使用Amgen之MutaGenie軟體設計用於突變誘發之正義及反義寡核苷酸。將所有PCSK9構築體在24孔板中表現於經瞬時轉染之293-6E細胞中且再置於三個96孔板中，各板中具有未突變之PCSK9對照(野生型，WT)。藉由西方墨點法檢查條件培養基中重組蛋白之表現量及完整性。在最初選擇之285個突變體中，41個在選殖或表現中失敗。244個突變體用於抗原決定基定位。PCSK9親本序列與具有244個突變殘基之代表性PCSK9序列之比對如圖26中所示。製備含有單個突變之獨立構築體。出於抗原決定基序列及涉及結合變化之基於抗原決定基之發明的目的，參考SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：303提供序列。圖26中之序列為用於本結合抗原決定基研究之序列。熟習此項技術者應瞭解，本結果亦適用於文中所揭露之其他PCSK9變異體(例如，SEQ ID NO：1及3以及其他等位基因變異體)。
選擇5個抗體(各倉之代表)進行精細的抗原決定基定位。其為21B12、31H4、12H11、31A4、3C4。5個抗體均為構形抗原決定基抗體。如上所述，21B12、31H4及31A4三者亦與PCSK9結晶。
結構及功能性抗原決定基
抗原決定基可進一步界定為結構抗原決定基或功能性抗原決定基。功能性抗原決定基通常為結構抗原決定基之子集且具有彼等對相互作用(例如，氫鍵、離子相互作用)之親和力有直接貢獻之殘基。可認為結構抗原決定基為由抗體所覆蓋之靶標之小片。
所採用之掃描突變誘發為精胺酸及麩胺酸掃描。選擇所述兩種側鏈的原因在於其大空間體積及其電荷，此使得發生於結構抗原決定基中之突變對抗體結合產生較大影響。通常採用精胺酸，但當WT殘基為精胺酸時除外，且在所述情況下，使殘基突變為麩胺酸以轉變電荷。
出於抗原決定基定位之目的，使用基於珠粒之多路檢定來同時量測抗體與PCSK9及PCSK9突變體之結合。隨後比較抗體與突變體之結合與其與同一孔中野生型之結合。將變異體分成三組：第1組：81個變異體+2個野生型對照+1個陰性對照+1個其他PCSK9上清液；第2組：81個變異體+2個野生型對照+2個陰性對照；及第3組：82個變異體+2個野生型對照+1個陰性對照。
如下執行檢定：在室溫下(RT)使85組顏色編碼、抗生蛋白鏈菌素塗佈之LumAvidin珠粒(Luminex)與經生物素標記之抗5-His抗體(Qiagen，#1019225)結合1小時，隨後用PBS、1% BSA、0.1%吐溫20洗滌3次。隨後在150微升上清液中在4℃下使各顏色編碼珠粒組與PCSK9突變體、野生型或陰性對照結合隔夜。
洗滌且彙集各自與特異性蛋白質締合之顏色編碼珠粒組。此時，存在3池85珠粒組，突變體及對照之每一組為一池。將來自各池之珠粒等分至96孔過濾板(Millipore，#MSBVN1250)之24個孔(3行)中。向一式三份點之9行中添加100微升於4倍稀釋液中之抗PCSK9抗體，且在室溫下培育1小時並洗滌。向各孔中添加100微升1：200稀 釋、與藻紅素(phycoerythrin，PE)接合之抗人類IgG Fc(Jackson Immunoresearch，#109-116-170)且在室溫下培育1小時並洗滌。
將珠粒再懸浮於於PBS中之1% BSA中，震盪10分鐘，且在BioPlex儀器(Bio-Rad)上讀數。儀器藉由顏色代碼鑑別各珠粒，從而鑑別與所述顏色代碼締合之特異性蛋白質。同時，其藉由PE染料之螢光強度量測與珠粒結合之抗體之量。隨後可直接比較抗體與各突變體之結合與其與同一池中野生型之結合。使用IL-17R嵌合體E作為陰性對照。所檢測之所有突變體之概述如表39.1中所示(參考圖1A及圖26中所使用之序列編號)。
珠粒變化性研究
進行抗原決定基定位結合檢定之前，執行驗證實驗以評定“珠粒區”-“珠粒區”(B-B)之變化性。在驗證實驗中，使所有珠粒與相同的野生型對照蛋白接合。因此，珠粒區之間的差異完全歸因於B-B變 動且不與野生型與突變蛋白之間的差異混淆。在不同的孔中用12次複製執行抗體滴定。
所述統計分析之目標在於估算結合曲線之所估算EC50之B-B變化性。隨後在曲線比較實驗期間使用所估算之B-B標準偏差(standard deviation，SD)建立野生型及突變蛋白之EC50置信區間。
使四參數羅吉斯模型(logistic model)擬合各珠粒區之結合資料。使用所得檔案(其含有曲線品質控制(quality control，QC)結果及頂部(max)、底部(min)、斜率(Hillslope/slope)及曲線之EC50之自然對數(xmid)的參數估算值)作為分析之原始資料。隨後使用SAS PROC MIXED程序藉由擬合混合效應模型來估算各參數之B-B變化性。在分析中僅包含具有“良好”QC狀態之曲線。最終的混合效應模型僅包含殘差(residual)(亦即，個別珠粒區)作為隨機效應。亦藉由混合效應模型估算各參數之最小平方平均值(Least squares mean，LS平均值)。藉由取B-B方差之平方根計算B-B SD。亦計算LS平均值+2SD與LS平均值-2SD之間的變化倍數，LS平均值+2SD及LS平均值-2SD表示群體約向上及向下97.5百分率。結果如表39.2中所示。
xmid為EC50之自然對數。xmid之變化倍數重新轉換為原始標度。
鑑別結構抗原決定基中之殘基
當使一殘基突變為精胺酸或麩胺酸而改變抗體結合時，將其視為結構抗原決定基之一部分(一“打擊點hit”)。其可見為與抗體與野生型結合相比，EC50移動或最大信號減小。使用針對野生型及突變體之抗體結合曲線之統計分析鑑別統計上顯著之EC50移動。所述分析考慮檢定及曲線擬合中之變動。
基於EC50比較之打擊點鑑別
使用S-PLUS及VarPower軟體(Insightful Corporation，Seattle WA)由擬合結合資料之加權四參數羅吉斯模型產生最大有效濃度一半值(EC50)及最大結合(Bmax)值。比較突變體結合曲線及野生型結合曲線之EC50。將統計上顯著之差異鑑別為打擊點以作進一步考慮。自分析中排除具有“非擬合”或“不良擬合”標註之曲線。
EC50估算值之變動
比較EC50估算值時考慮兩個變動來源，亦即，曲線擬合變動及珠粒-珠粒變動。使野生型及突變體與不同珠粒連接，因此其差異不與珠粒-珠粒差異(上述)混淆。藉由對數EC50估算值之標準誤差估算曲線擬合變動。珠粒-珠粒變動使用將野生型對照與每一珠粒(上述)連接之實驗用實驗法確定。使用來自所述實驗之野生型結合曲線之EC50估算值的珠粒變動估算實際抗原決定基定位實驗中之珠粒-珠粒變動。
突變體與野生型之間EC50移動之測試
使用學生t檢驗(Student's t-test)進行兩組EC50(以對數標度)之比較。以△(delta)(EC50估算值之間的絕對差值)與△之標準偏差之間的比率計算t統計量(t-statistic)。由三個分量(亦即，突變體及野生型非線性回歸曲線之EC50之方差估算值及2×由獨立實驗估算之珠粒-珠粒方差)之和估算△之方差。2乘以珠粒-珠粒方差是因為假設突變體與野生型珠粒具有相同方差。使用Satterthwaite(1946)之近 似法計算△之標準偏差之自由度。基於各比較之學生t分佈推導個別p值及置信區間(95%及99%)。在多個野生型對照之情況下，藉由挑選與突變體最相似之野生型對照(亦即，挑選具有最大p值之野生型對照)執行保守性方法。
當同時進行大量測試時，多重調整(multiplicity adjustment)對控制正誤差(false positive)很重要。為所述分析實施兩種形式之多重調整：族誤差(family wise error，FWE)控制及錯誤發現率(false discovery rate，FDR)控制。FWE法控制一或多個打擊點不真實之機率；FDR法控制所選打擊點中正誤差之預期比例。前者方法比後者方法保守且有效。存在許多可用於兩種方法之方法，關於所述分析，FWE分析選擇Hochberg(1988)之方法而FDR分析選擇Benjamini-Hochberg(1995)之FDR方法。計算兩種方法經調整之p值。
結果
EC50移動
將EC50與野生型顯著不同之突變(例如整個檢定之錯誤發現率調整p值為0.01或小於0.01)視為結構抗原決定基之一部分。所有打擊點之各抗體之族I型誤差率調整p值亦小於0.01，其中例外為抗體31H4之殘基R185E，其每抗體之FWE調整p值為0.0109。由EC50移動確定之多種抗體之結構抗原決定基中的殘基如表39.3中所示(點突變參考SEQ ID NO：1及303)。
最大信號減小
使用來自曲線擬合(BmaxPerWT)及原始資料點(RawMaxPerWT)之最大信號計算最大信號%。將與野生型信號相比使抗體結合最大信號減小70%或與其他抗體相比使某一抗體之信號減小50%(當所有其他抗體為野生型之至少40%時)之突變視為打擊點及抗原決定基之一部分。
表39.4顯示藉由最大信號之減小所確定之結構抗原決定基中之殘基(斜體)。
(點突變參考SEQ ID NO：1及圖26)。
表39.5顯示多種抗體之所有打擊點之概述。
為進一步檢測所述殘基如何形成相關抗原決定基之一部分或整個相關抗原決定基，在多種晶體結構模型上定位以上所述之位置，結果如圖27A至圖27E中所示。圖27A描繪如在PCSK9與21B12抗體之晶體 結構上所定位之21B12抗原決定基打擊點。所述結構如下鑑別PCSK9殘基：淺灰色指示彼等未突變之殘基(彼等在結構上明確指示之殘基除外)且較深灰色指示彼等突變之殘基(少數未能表示)。測試明確指示之殘基(不考慮圖上所指示之陰影)且所述殘基對EC50及/或Bmax產生顯著變化。抗原決定基打擊點是基於Bmax移動。在所述圖中，31H4位於21B12後面。
圖27B描繪如在PCSK9與31H4及21B12抗體之晶體結構上所定位之31H4抗原決定基打擊點。結構如下鑑別PCSK9殘基：淺灰色指示彼等未突變之殘基(彼等在結構上明確指示之殘基除外)且較深灰色指示彼等突變之殘基(少數未能表示)。測試明確指示之殘基(不考慮圖上所指示之陰影)且所述殘基對EC50及/或Bmax產生顯著變化。抗原決定基打擊點基於EC50移動。
圖27C描繪如在PCSK9與31H4及21B12抗體之晶體結構上所定位之31A4抗原決定基打擊點。結構如下鑑別PCSK9殘基：淺灰色指示彼等未突變之殘基(彼等在結構上明確指示之殘基除外)且較深灰色指示彼等突變之殘基(少數未能表示)。測試明確指示之殘基(不考慮圖上所指示之陰影)且所述殘基對EC50及/或Bmax產生顯著變化。抗原決定基打擊點基於EC50移動。已知31A4抗體與PCSK9之V域結合，此似乎與圖27C中所呈現之結果一致。
圖27D描繪如在PCSK9與31H4及21B12抗體之晶體結構上所定位之12H11抗原決定基打擊點。結構如下鑑別PCSK9殘基：淺灰色指示彼等未突變之殘基(彼等在結構上明確指示之殘基除外)且較深灰色指示彼等突變之殘基(少數未能表示)。測試明確指示之殘基(不考慮圖上所指示之陰影)且所述殘基對EC50及/或Bmax產生顯著變化。在上述分倉檢定中，12H11與21B12及31H4競爭。
圖27E描繪在PCSK9與31H4及21B12抗體之晶體結構上所定位之 3C4抗原決定基打擊點。結構如下鑑別PCSK9殘基：淺灰色指示彼等未突變之殘基(彼等在結構上明確指示之殘基除外)且較深灰色指示彼等突變之殘基(少數未能表示)。測試明確指示之殘基(不考慮圖上所指示之陰影)且所述殘基對EC50及/或Bmax產生顯著變化。
在分倉檢定中，3C4不與21B12及31H4競爭。在域結合檢定中，3C4與V域結合(參見，實例40、圖28A及圖28B之結果)。
雖然存在約一打、經預期可能對結合產生影響(基於晶體結構)之突變體，但令人驚訝地，本實驗證明其未對結合產生影響。熟習此項技術者應瞭解，以上所呈現之結果與所述抗體之晶體結構及PCSK-9與所述抗體之結合具有良好的一致性。此證明所提供之結構資料及相應的功能資料足以鑑別中和ABP與PCSK9相互作用之關鍵殘基及區域。因此，本說明書足以提供具有與以上所述之區域結合之能力的ABP變異體。
熟習此項技術者應瞭解，雖然Bmax下降及EC50移動打擊點可視為相同現象之表現形式，但嚴格而言，僅Bmax下降不反映親和力實質上喪失，而是反映某百分率之抗體之抗原決定基受到破壞。雖然藉由Bmax及EC50所確定之打擊點中不存在重疊，但對結合產生強大影響之突變可能不允許產生有效的結合曲線且因此不能確定所述變異體之EC50。
熟習此項技術者應瞭解，相同倉中之ABP(其中例外為第5倉，如上所述其為一般全包倉)很可能與靶蛋白上之重疊位點結合。因而，以上抗原決定基及相關殘基通常可延伸至相同倉中之所有所述ABP。
為進一步檢測以上關於ABP 31H4之結果，亦改變位置E181R(E181R)，根據以上晶體結構預測，位置E181R與R185相互作用而形成與ABP相互作用之表面的一部分。雖然結果本身在統計上不顯 著，但當結合晶體結構時證明31H4與E181R相互作用(資料未顯示)。因此，位置181似乎亦形成31H4 ABP之抗原決定基之一部分。
如上所述，以上結合資料及抗原決定基表徵參考不包含PCSK9之頭30個胺基酸之PCSK9序列(SEQ ID NO：1)。因此，所述蛋白質片段之編號系統及指代所述片段之SEQ ID NO與使用全長PCSK9編號系統(諸如，上述晶體研究資料中所使用之編號系統)之資料及實驗相比，偏移30個胺基酸。因此，為比較所述結果，應在各以上抗原決定基定位結果之位置上再加30個胺基酸。舉例而言，SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：303)之位置207與SEQ ID NO：3(全長序列，及在說明書之整個其餘部分使用的編號系統)之位置237相關。表39.6概述以上所說明之參考SEQ ID NO：1(及/或SEQ ID NO：303)之位置如何與SEQ ID NO：3(包含信號序列)相關。
因此，本文中參考SEQ ID NO：1所述之彼等實施例亦可由其以上參考SEQ ID NO：3所述之相應位置描述。
實例40
PCSK9域結合檢定
本實例檢測多個ABP結合於PCSK9上之何處。
用2微克/毫升多種稀釋於PBS中之抗PCSK9抗體塗佈透明的96孔maxisorp板(Nunc)隔夜。用PBS/.05%吐溫20徹底洗滌板，隨後用3% BSA/PBS阻斷兩小時。洗滌後，將板與稀釋於一般檢定稀釋劑(Immunocherrustry Technologies,LLC)中之全長PCSK9(aa 31-692 SEQ ID NO：3)procat PCSK9(aa 31-449 SEQ ID NO：3)或v域PCSK9(aa 450-692 SEQ ID NO：3)一起培育兩小時。洗滌板且添加1微克/毫升(於1%BSA/PBS中)辨識procat及v域以及全長PCSK9之兔子多株經生物素標記之抗PCSK9抗體(D8774)。藉由與200奈克/毫升(於1% BSA/PBS)中性鏈親和素-HRP(Thermo Scientific)、接著與TMB受質(KPL)一起培育且在650奈米下量測吸光度，來偵測經結合之全長、procat或v域PCSK9。圖28A及圖28B中所呈現之結果證明多種ABS結合PCSK9之多個部分之能力。如圖28B中所示，ABP 31A4與PCSK9之V域結合。
實例41
中和、非競爭性抗原結合蛋白
本實例證明如何鑑別及表徵對於與PCSK9結合與LDLR呈非競爭性但仍對PCSK9活性具有中和性的抗原結合蛋白。換言之，所述抗原結合蛋白將不阻斷PCSK9與LDLR結合，但將阻止或降低由PCSK9介導之LDLR降解。
用稀釋於緩衝液A(100毫莫耳濃度二甲胂酸鈉(pH 7.4))中之2微克/毫升山羊抗LDL受體抗體(R&D Systems)塗佈透明的384孔板(Costar)。用緩衝液A徹底洗滌板，隨後用緩衝液B(於緩衝液A中之1%牛乳)阻斷2小時。洗滌後，將板與稀釋於緩衝液C(補充有10毫莫耳濃度CaCl2之緩衝液B)之0.4微克/毫升LDL受體(R&D Systems)一起培育1.5小時。與所述培育同時，將20奈克/毫升經生物素標記之D374Y PCSK9與100奈克/毫升稀釋於緩衝液A中之抗體或僅緩衝液A(對照)一起培育。洗滌含LDL受體之板，且將經生物素標記之D374Y PCSK9/抗體混合物轉移至其中，且在室溫下培育1小時。藉由與於緩衝液C中之500奈克/毫升之抗生蛋白鏈菌素-HRP(Biosource)一起培育，接著與TMB受質(KPL)一起培育，來偵測經生物素標記之D374Y與LDL受體之結合。用1當量濃度HCl中止信號，且在450奈米下讀取吸光度。結果呈現於圖28C中，其顯示雖然ABP 31H4抑制LDLR結合，但ABP 31A4並不抑制LDLR與PCSK9之結合。結合實例40及圖28A及圖28B中所示之結果，很顯然31A4 ABP與PCSK9之V域結合且不阻斷PCSK9與LDLR之相互作用。
接著，經由細胞LDL吸收檢定(如以上實例中所述)進一步確認ABP 31A4用作中和ABP之能力。所述LDL吸收檢定之結果呈現於圖28D中。如圖28D中所示，ABP 31A4顯示顯著的PCSK9中和能力。因此，根據實例40及本結果，顯然ABP可與PCSK9結合但不阻斷PCSK9與LDLR之結合相互作用，同時仍適合用作中和PCSK9 ABP。
以引用方式之併入
本文中所引用之所有參考文獻，包含專利、專利申請案、論文、教科書及其類似物以及其中所引用之參考文獻，不論之前所述及之相關程度，均以整體引用之方式併入本文中參考。在以引用之方式併入之參考文獻中所提供之任何定義或術語不同於本文中所提供之術語及討論之程度下，以本發明術語及定義為準。
同等物
前面所寫之說明書應足以使得熟習此項技術者能夠實踐本發明。前面描述及實例詳述本發明之某些較佳實施例且描述發明者所預期之最佳模式。然而，應瞭解不管前述可能如何詳細地出現於本文，本發明均可以多種方式進行實踐，且應根據附加之申請專利範圍及其任何同等物來解釋本發明。
<110> 美商安美基公司
<120> 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型PCSK9基因結合之抗原結合蛋白
<130> APMOL.003A
<150> US 61/086,133
<151> 2008-08-04
<150> US 61/010,630
<151> 2008-01-09
<150> US 61/008,965
<151> 2007-12-21
<150> US 60/957,688
<151> 2007-08-23
<160> 499
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 662
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 1
<210> 2
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 2
<210> 3
<211> 692
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 3
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 4
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 5
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 6
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 7
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 10
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 11
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 12
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 13
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 14
<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 15
<210> 16
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 16
<210> 17
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 17
<210> 18
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 18
<210> 19
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 19
<210> 20
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 20
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 21
<210> 22
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 22
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 23
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 24
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 25
<210> 26
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 26
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 27
<210> 28
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 28
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 29
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 30
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 31
<210> 32
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 32
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 33
<210> 34
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 34
<210> 35
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 35
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 36
<210> 37
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 37
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 38
<210> 39
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 39
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 40
<210> 41
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 41
<210> 42
<211> 110
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 42
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 43
<210> 44
<211> 106
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 44
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 45
<210> 46
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 46
<210> 47
<211> 114
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 47
<210> 48
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 48
<210> 49
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 49
<210> 50
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 50
<210> 51
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 51
<210> 52
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 52
<210> 53
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 53
<210> 54
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 54
<210> 55
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 55
<210> 56
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 56
<210> 57
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 57
<210> 58
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 58
<210> 59
<211> 113
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 59
<210> 60
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 60
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 61
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 62
<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 63
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 64
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 65
<210> 66
<211> 123
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 66
<210> 67
<211> 123
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 67
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 68
<210> 69
<211> 117
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 69
<210> 70
<211> 117
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 70
<210> 71
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 71
<210> 72
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 72
<210> 73
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 73
<210> 74
<211> 123
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 74
<210> 75
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 75
<210> 76
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 76
<210> 77
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 77
<210> 78
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 78
<210> 79
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 79
<210> 80
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 80
<210> 81
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 81
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 82
<210> 83
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 83
<210> 84
<211> 117
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 84
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 85
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 86
<210> 87
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 87
<210> 88
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 88
<210> 89
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 89
<210> 90
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 90
<210> 91
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 91
<210> 92
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 92
<210> 93
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 93
<210> 94
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 94
<210> 95
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 95
<210> 96
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 96
<210> 97
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 97
<210> 98
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 98
<210> 99
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 99
<210> 100
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 100
<210> 101
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 101
<210> 102
<211> 363
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 102
<210> 103
<211> 333
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 103
<210> 104
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 104
<210> 105
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 105
<210> 106
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 106
<210> 107
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 107
<210> 108
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 108
<210> 109
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 109
<210> 110
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 110
<210> 111
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 111
<210> 112
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 112
<210> 113
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 113
<210> 114
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 114
<210> 115
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 115
<210> 116
<211> 363
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 116
<210> 117
<211> 321
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 117
<210> 118
<211> 363
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 118
<210> 119
<211> 321
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 119
<210> 120
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 120
<210> 121
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 121
<210> 122
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 122
<210> 123
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 123
<210> 124
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 124
<210> 125
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 125
<210> 126
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 126
<210> 127
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 127
<210> 128
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 128
<210> 129
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 129
<210> 130
<211> 363
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 130
<210> 131
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 131
<210> 132
<211> 357
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 132
<210> 133
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 133
<210> 134
<211> 357
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 134
<210> 135
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 135
<210> 136
<211> 351
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 136
<210> 137
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 137
<210> 138
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 138
<210> 139
<211> 318
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 139
<210> 140
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 140
<210> 141
<211> 321
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 141
<210> 142
<211> 369
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 142
<210> 143
<211> 336
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 143
<210> 144
<211> 357
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 144
<210> 145
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 145
<210> 146
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 146
<210> 147
<211> 348
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 147
<210> 148
<211> 348
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 148
<210> 149
<211> 330
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 149
<210> 150
<211> 345
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 150
<210> 151
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 151
<210> 152
<211> 369
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 152
<210> 153
<211> 333
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 153
<210> 154
<211> 326
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 154
<210> 155
<211> 327
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 155
<210> 156
<211> 105
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 156
<210> 157
<211> 106
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 157
<210> 158
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 158
<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 159
<210> 160
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 160
<210> 161
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 161
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 162
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 163
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 164
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 165
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 166
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 167
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 168
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 169
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 170
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 171
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 172
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 173
<210> 174
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 174
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 175
<210> 176
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 176
<210> 177
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 177
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 178
<210> 179
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 179
<210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 180
<210> 181
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 181
<210> 182
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 182
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 183
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 184
<210> 185
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 185
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 186
<210> 187
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 187
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 188
<210> 189
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 189
<210> 190
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 190
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 191
<210> 192
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 192
<210> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 193
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 194
<210> 195
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 195
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 196
<210> 197
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 197
<210> 198
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 198
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 199
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 200
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 201
<210> 202
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 202
<210> 203
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 203
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 204
<210> 205
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 205
<210> 206
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 206
<210> 207
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 207
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 208
<210> 209
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 209
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 210
<210> 211
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 211
<210> 212
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 212
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 213
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 214
<210> 215
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 215
<210> 216
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 216
<210> 217
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 217
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 218
<210> 219
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 219
<210> 220
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 220
<210> 221
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 221
<210> 222
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 222
<210> 223
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 223
<210> 224
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 224
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 225
<210> 226
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 226
<210> 227
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 227
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 228
<210> 229
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 229
<210> 230
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 230
<210> 231
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 231
<210> 232
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 232
<210> 233
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 233
<210> 234
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 234
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 235
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 236
<210> 237
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 237
<210> 238
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 238
<210> 239
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 239
<210> 240
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 240
<210> 241
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 241
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 242
<210> 243
<211> 18
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 243
<210> 244
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 244
<210> 245
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 245
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 246
<210> 247
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 247
<210> 248
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 248
<210> 249
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 249
<210> 250
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 250
<210> 251
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 251
<210> 252
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 252
<210> 253
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 253
<210> 254
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 254
<210> 255
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 255
<210> 256
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 256
<210> 257
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 257
<210> 258
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 258
<210> 259
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 259
<210> 260
<211> 18
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 260
<210> 261
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 261
<210> 262
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 262
<210> 263
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 263
<210> 264
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 264
<210> 265
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 265
<210> 266
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 266
<210> 267
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 267
<210> 268
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 268
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 269
<210> 270
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 270
<210> 271
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 271
<210> 272
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 272
<210> 273
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 273
<210> 274
<211> 106
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 274
<210> 275
<211> 106
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 275
<210> 276
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 276
<210> 277
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 277
<210> 278
<211> 120
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 278
<210> 279
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 279
<210> 280
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 280
<210> 281
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 281
<210> 282
<211> 22
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 282
<210> 283
<211> 15
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 283
<210> 284
<211> 32
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 284
<210> 285
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 285
<210> 286
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 286
<210> 287
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 287
<210> 288
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 288
<210> 289
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 289
<210> 290
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 290
<210> 291
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 291
<210> 292
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 292
<210> 293
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 293
<210> 294
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 294
<210> 295
<211> 318
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 295
<210> 296
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 296
<210> 297
<211> 215
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 297
<210> 298
<211> 230
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 298
<210> 299
<211> 217
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 299
<210> 300
<211> 238
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 300
<210> 301
<211> 218
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 301
<210> 302
<211> 231
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 302
<210> 303
<211> 680
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 303
<210> 304
<211> 680
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 304
<210> 305
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 305
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 306
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 307
<210> 308
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 308
<210> 309
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 309
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 310
<210> 311
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 311
<210> 312
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 312
<210> 313
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 313
<210> 314
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 314
<210> 315
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 315
<210> 316
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 316
<210> 317
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 317
<210> 318
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 318
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 319
<210> 320
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 320
<210> 321
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 321
<210> 322
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 322
<210> 323
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 323
<210> 324
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 324
<210> 325
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 325
<210> 326
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 326
<210> 327
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 327
<210> 328
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 328
<210> 329
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 329
<210> 330
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 330
<210> 331
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 331
<210> 332
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 332
<210> 333
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 333
<210> 334
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 334
<210> 335
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 335
<210> 336
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 336
<210> 337
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 337
<210> 338
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 338
<210> 339
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 339
<210> 340
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 340
<210> 341
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 341
<210> 342
<211> 4
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 342
<210> 343
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 343
<210> 344
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 344
<210> 345
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 345
<210> 346
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 346
<210> 347
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 347
<210> 348
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 348
<210> 349
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 349
<210> 350
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 350
<210> 351
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 351
<210> 352
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 352
<210> 353
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 353
<210> 354
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 354
<210> 355
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 355
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 356
<210> 357
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 357
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 358
<210> 359
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 359
<210> 360
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 360
<210> 361
<211> 5
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 361
<210> 362
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 362
<210> 363
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 363
<210> 364
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 364
<210> 365
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 365
<210> 366
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 366
<210> 367
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 367
<210> 368
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 368
<210> 369
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 369
<210> 370
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 370
<210> 371
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 371
<210> 372
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 372
<210> 373
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 373
<210> 374
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 374
<210> 375
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 375
<210> 376
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 376
<210> 377
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 377
<210> 378
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 378
<210> 379
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 379
<210> 380
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 380
<210> 381
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 381
<210> 382
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 382
<210> 383
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 383
<210> 384
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 384
<210> 385
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 385
<210> 386
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 386
<210> 387
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 387
<210> 388
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 388
<210> 389
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 389
<210> 390
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 390
<210> 391
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 391
<210> 392
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 392
<210> 393
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 393
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 394
<210> 395
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 395
<210> 396
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 396
<210> 397
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 397
<210> 398
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 398
<210> 399
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 399
<210> 400
<211> 116
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 400
<210> 401
<211> 118
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 401
<210> 402
<211> 115
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 402
<210> 403
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 403
<210> 404
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=D,A,R or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=Y,I,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=D,A,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=F,A,L or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=W,L,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S,Y,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=A,Y,R or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=Y,P or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=Y,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=D,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=A,M or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=F,D or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=D,V or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=V or no amino acid
<400> 404
<210> 405
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=Q or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=S,T,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=Y,W or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=D or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=S or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=L,T or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=A,S or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=G,A,V or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=S,Y,V or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=V or no amino acid
<400> 405
<210> 406
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=Y,F or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=L or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=T,S or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=Y or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=G,S or Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=I,M or W
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=S,N or H
<400> 406
<210> 407
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=T or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=G or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=S,T or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=N,D or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=I,V or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=G or I
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=A or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=G,Y,S or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=Y or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=D,S,T or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=V
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=S,N or H
<400> 407
<210> 408
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=W,S,L or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=V,I or E
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=S,W or I
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=F,S or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=Y,S,D or H
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=N,S or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=S or G
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=N,Y,D or R
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=T,I or E
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=N,S,Y or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=A and N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=Q,D or P
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=K or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (15)...(15)
<223> Xaa=L or V
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (16)...(16)
<223> Xaa=Q or K
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (17)...(17)
<223> Xaa=G or S
<400> 408
<210> 409
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=G,E,S or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=N,V or Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=S or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=N,Q or K
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=R
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=P
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=S
<400> 409
<210> 410
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=D or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=Y,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=D,I or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=F,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=W,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S,L or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=A,Y,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=Y,Q or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=G,Y or L
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=Y,D or V
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=G,A or P
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=M or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=V or Y
<400> 410
<210> 411
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=Q,A,G or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=S,V,T or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=Y,N or W
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=S or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=S,Y or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S or T
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=L or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=S,T or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=G,S or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=S,M,W or Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=V
<400> 411
<210> 412
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=G,P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=T,P,S,A,C,V,L or I
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=L,F,I,V,M,A or Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=T,P,S or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=G,P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=I,L,V,M,A or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=S,T,A or C
<400> 412
<210> 413
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=G,P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=S,N,T,A,C or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=D or E
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=V,I,M,L,F or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=G,P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=G,A,R,P,V,L,I,K,Q or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=N or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=Y,S,W,F,T,S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=V,I,M,L,F,or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=S,T,A or C
<400> 413
<210> 414
<211> 17
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=W,Y or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=V,I,M,L,F or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=A,F,V,L,I,Y or M
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=N or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=G,P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=N or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (10)...(10)
<223> Xaa=N or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (11)...(11)
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (12)...(12)
<223> Xaa=A,V,L or I
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (13)...(13)
<223> Xaa=Q,E,N or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (14)...(14)
<223> Xaa=K,R,Q or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (15)...(15)
<223> Xaa=L,F,V,I,M,A or Y
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (16)...(16)
<223> Xaa=Q or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (17)...(17)
<223> Xaa=G,P or A
<400> 414
<210> 415
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=E or D
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=V,I,M,L,F or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=N or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=R,K,Q or N
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=P or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=S,T,A or C
<400> 415
<210> 416
<211> 6
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=G,P,A or no amino acid
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=G,V,P,A,I,M,L or F
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=M,L,F or I
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=D or E
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=V,I,M,L,F or A
<400> 416
<210> 417
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 1
<223> Xaa=S,N,T,A,C or Q
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 2
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 3
<223> Xaa=Y,W,F,T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 4
<223> Xaa=T or S
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 5
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> 6
<223> Xaa=S,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (7)...(7)
<223> Xaa=N,S,Q,T,A or C
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (8)...(8)
<223> Xaa=M,V,L,F,I or A
<220>
<221> 存在序列變異體(VARIANT)
<222> (9)...(9)
<223> Xaa=V,I,M,L,F or A
<400> 417
<210> 418
<211> 363
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 418
<210> 419
<211> 121
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 419
<210> 420
<211> 321
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 420
<210> 421
<211> 107
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 421
<210> 422
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 422
<210> 423
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 423
<210> 424
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 424
<210> 425
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 425
<210> 426
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 426
<210> 427
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 427
<210> 428
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 428
<210> 429
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 429
<210> 430
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 430
<210> 431
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 431
<210> 432
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 432
<210> 433
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 433
<210> 434
<211> 342
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 434
<210> 435
<211> 114
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 435
<210> 436
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 436
<210> 437
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 437
<210> 438
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 438
<210> 439
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 439
<210> 440
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 440
<210> 441
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 441
<210> 442
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 442
<210> 443
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 443
<210> 444
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 444
<210> 445
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 445
<210> 446
<211> 375
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 446
<210> 447
<211> 125
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 447
<210> 448
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 448
<210> 449
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 449
<210> 450
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 450
<210> 451
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 451
<210> 452
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 452
<210> 453
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 453
<210> 454
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 454
<210> 455
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 455
<210> 456
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 456
<210> 457
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 457
<210> 458
<211> 381
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 458
<210> 459
<211> 127
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 459
<210> 460
<211> 336
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 460
<210> 461
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 461
<210> 462
<211> 381
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 462
<210> 463
<211> 127
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 463
<210> 464
<211> 336
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 464
<210> 465
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 465
<210> 466
<211> 342
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 466
<210> 467
<211> 114
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 467
<210> 468
<211> 339
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 468
<210> 469
<211> 113
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 469
<210> 470
<211> 357
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 470
<210> 471
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 471
<210> 472
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 472
<210> 473
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 473
<210> 474
<211> 357
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 474
<210> 475
<211> 119
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 475
<210> 476
<211> 327
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 476
<210> 477
<211> 109
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 477
<210> 478
<211> 366
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 478
<210> 479
<211> 122
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 479
<210> 480
<211> 324
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 480
<210> 481
<211> 108
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 481
<210> 482
<211> 381
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 482
<210> 483
<211> 127
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 483
<210> 484
<211> 336
<212> DNA
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 484
<210> 485
<211> 112
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 485
<210> 486
<211> 100
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 486
<210> 487
<211> 98
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 487
<210> 488
<211> 98
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 488
<210> 489
<211> 93
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 489
<210> 490
<211> 94
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 490
<210> 491
<211> 89
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 491
<210> 492
<211> 87
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 492
<210> 493
<211> 49
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 493
<210> 494
<211> 98
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 494
<210> 495
<211> 98
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 495
<210> 496
<211> 88
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 496
<210> 497
<211> 90
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 497
<210> 498
<211> 87
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 498
<210> 499
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類(Homo sapiens)
<400> 499

Claims (15)

  1. 一種與人類前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(hPCSK9)結合之單株抗體，其中該單株抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含至少一個選自由以下所組成之群之特定位置的胺基酸：SEQ ID NO：67之T28、S30、S31、Y32、S54、S55、S56、Y57、I58、S59、Y60、N74、A75、R98、Y100、F102、W103、S104、A105、Y106、Y107、D108、A109及D111，該輕鏈可變區包含至少一個選自由以下所組成之群之特定位置的胺基酸：SEQ ID NO：12之L48、S51、Y93及S98。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體，其中該單株抗體與包含至少一個下述之殘基之hPCSK9抗原決定基(epitope)結合：SEQ ID NO：3之S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體，其中該單株抗體阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)之結合。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體係人類單株抗體。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體係人化單株抗體。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體與含有SEQ ID NO：1之PCSK9蛋白之D374Y變異體結合。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體係IgG。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該輕鏈可變區與人類kappa胺基酸序列連接。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體包含完整免疫球蛋白。
  10. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體包含完整免疫球蛋白之片段。
  11. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之單株抗體，其中該單株抗體進一步包含SEQ ID NO：157之胺基酸序列。
  12. 一種醫藥組成物，其包括醫藥學上可接受之載劑以及與hPCSK9結合之單株抗體，其中該單株抗體包含：重鏈可變區，其包含至少一個選自由以下所組成之群之特定位置的胺基酸：SEQ ID NO：67之T28、S30、S31、Y32、S54、S55、S56、Y57、I58、S59、Y60、N74、A75、R98、Y100、F102、W103、S104、A105、Y106、Y107、D108、A109及D111，及輕鏈可變區，其包含至少一個選自由以下所組成之群之特定位置的胺基酸：SEQ ID NO：12之L48、S51、Y93及S98。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中該單株抗體與包含至少一個下述之殘基之hPCSK9抗原決定基(epitope)結合：SEQ ID NO：3之S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。
  14. 一種如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之單株抗體之用途，其用於製備用於降低血清膽固醇之藥物。
  15. 一種如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之單株抗體之用途，其用於製備用於治療或預防與高血清膽固醇含量相關之病狀的藥物。
TW105124816A 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白 TWI633122B (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95766807P 2007-08-23 2007-08-23
US60/957,668 2007-08-23
US896507P 2007-12-21 2007-12-21
US61/008,965 2007-12-21
US1063008P 2008-01-09 2008-01-09
US61/010,630 2008-01-09
US8613308P 2008-08-04 2008-08-04
US61/086,133 2008-08-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201716444A TW201716444A (zh) 2017-05-16
TWI633122B true TWI633122B (zh) 2018-08-21

Family

ID=39951467

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107117443A TWI799416B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型之抗原結合蛋白
TW103110949A TWI675848B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW103110947A TWI675846B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW111138485A TW202330625A (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW105124816A TWI633122B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW097132236A TWI441833B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW103110948A TWI675847B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107117443A TWI799416B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型之抗原結合蛋白
TW103110949A TWI675848B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW103110947A TWI675846B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW111138485A TW202330625A (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097132236A TWI441833B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
TW103110948A TWI675847B (zh) 2007-08-23 2008-08-22 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白

Country Status (43)

Country Link
US (27) US8030457B2 (zh)
EP (3) EP3202791A1 (zh)
JP (7) JP5441905B2 (zh)
KR (9) KR20220031734A (zh)
CN (8) CN112415203A (zh)
AR (1) AR068011A1 (zh)
AU (1) AU2008288791B2 (zh)
BR (2) BR122018012430B8 (zh)
CA (1) CA2696252C (zh)
CL (1) CL2008002495A1 (zh)
CO (1) CO6230997A2 (zh)
CR (1) CR11328A (zh)
CY (3) CY1117940T1 (zh)
DE (2) DE202008018562U1 (zh)
DK (2) DK3666797T5 (zh)
EA (1) EA032106B1 (zh)
ES (3) ES2573258T5 (zh)
FI (2) FI3666797T3 (zh)
FR (1) FR16C0025I2 (zh)
HK (1) HK1143824A1 (zh)
HR (2) HRP20160494T4 (zh)
HU (4) HUE028162T2 (zh)
IL (4) IL304868A (zh)
JO (1) JOP20080381B1 (zh)
LT (3) LT3666797T (zh)
LU (2) LU93096I2 (zh)
MA (1) MA31978B1 (zh)
MX (2) MX2010001921A (zh)
MY (1) MY180102A (zh)
NL (1) NL300818I2 (zh)
NO (3) NO2016010I1 (zh)
NZ (1) NZ584101A (zh)
PE (8) PE20140231A1 (zh)
PH (2) PH12013502285A1 (zh)
PL (2) PL3666797T3 (zh)
PT (1) PT3666797T (zh)
RS (2) RS54756B2 (zh)
SG (2) SG184702A1 (zh)
SI (2) SI2215124T2 (zh)
TN (1) TN2010000063A1 (zh)
TW (7) TWI799416B (zh)
UA (1) UA127402C2 (zh)
WO (1) WO2009026558A1 (zh)

Families Citing this family (213)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2382891T3 (es) 2000-05-26 2012-06-14 Immunex Corporation Uso de anticuerpos IL-4R y sus composiciones
US7605251B2 (en) 2006-05-11 2009-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
CN101636179B (zh) 2006-11-07 2012-10-10 默沙东公司 Pcsk9拮抗剂
EP2615114B1 (en) 2007-08-23 2022-04-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
EP2641917B1 (en) 2007-08-23 2020-05-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
MX2010008394A (es) * 2008-01-31 2010-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9.
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
AR070315A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
US8357371B2 (en) 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
BRPI1010689A2 (pt) * 2009-06-15 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc "dsrna formulado por lipídios direcionados para o gene pcsk9"
WO2011028938A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9
SG178447A1 (en) * 2009-09-03 2012-03-29 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
US20120219558A1 (en) * 2009-09-25 2012-08-30 Yan Ni Antagonists of pcsk9
US8877900B2 (en) 2009-10-30 2014-11-04 Merck Sharp & Dohme Corp. AX132 PCSK9 antagonists
CA2777698A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Ax1 and ax189 pcsk9 antagonists and variants
EP2494355A4 (en) * 2009-10-30 2013-05-01 Merck Sharp & Dohme IMMUNOLOGICAL ASSAY OF PCSK9
AR079336A1 (es) * 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
US9181538B1 (en) 2010-01-12 2015-11-10 Karen A. Norris Kexin-based vaccines to prevent or treat fungal infections
US20130058891A1 (en) 2010-01-12 2013-03-07 Jay K. Kolls Kexin-Derived Vaccines to Prevent or Treat Fungal Infections
KR20120138241A (ko) * 2010-03-11 2012-12-24 화이자 인코포레이티드 ｐＨ 의존성 항원 결합을 갖는 항체
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
PL3326648T3 (pl) * 2011-01-28 2021-10-11 Sanofi Biotechnology Kompozycje farmaceutyczne zawierające ludzkie przeciwciała przeciwko PCSK9
EP2650016A1 (en) * 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
BR112013020402A2 (pt) * 2011-02-11 2018-09-25 Irm Llc antagonistas pcsk9
KR20200103845A (ko) 2011-02-25 2020-09-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
KR102112205B1 (ko) 2011-04-28 2020-06-12 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 샘플과 연관된 폴리뉴클레오티드의 식별
JP6081714B2 (ja) * 2011-04-28 2017-02-15 株式会社ビー・エム・エル 高コレステロール血症と動脈硬化の検出方法
AR088782A1 (es) * 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
US20140004122A1 (en) * 2011-05-10 2014-01-02 Amgen Inc. Methods for treating or preventing cholesterol related disorders
JOP20200043A1 (ar) * 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
WO2012168491A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
KR20140021708A (ko) * 2011-07-14 2014-02-20 화이자 인코포레이티드 항-pcsk9 항체를 사용한 치료
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
EP3536712B1 (en) * 2011-09-16 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipoprotein(a) levels by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (pcsk9)
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
EA030868B1 (ru) 2011-10-14 2018-10-31 Эмджен Инк. Инжектор и способ его сборки
US20140228539A1 (en) * 2011-10-21 2014-08-14 Tanvex Biologics Corp. Separation of acetylated proteins from unacetylated proteins
CN104080909A (zh) 2011-11-30 2014-10-01 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
JP6188681B2 (ja) 2012-04-09 2017-08-30 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
US9321681B2 (en) * 2012-04-27 2016-04-26 United States Gypsum Company Dimensionally stable geopolymer compositions and method
EA039663B1 (ru) * 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
MX352457B (es) * 2012-05-17 2017-11-24 Cyon Therapeutics Inc Metodos y usos para inhibidores de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (pcsk9).
ES2552371T3 (es) 2012-05-25 2015-11-27 Zora Biosciences Oy Biomarcadores sensibles, eficaces e inocuos, para la inhibición de la Proproteína Convertasa Subtilisina/Kexina de tipo 9 (PCSK9)
JP2013253842A (ja) 2012-06-06 2013-12-19 Univ Of Tokyo ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
WO2013188855A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
MX363213B (es) 2012-08-13 2019-03-15 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pcsk9 con características de unión dependientes del ph.
KR102273985B1 (ko) 2012-08-24 2021-07-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ영역 개변체
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP6433297B2 (ja) 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
US10287317B2 (en) * 2013-02-15 2019-05-14 Srx Cardio, Llc Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) allosteric binding ligands to modulate serum low density lipoprotein (LDL) levels
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
EP2970501A2 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Amgen, Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
WO2014149699A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
SG11201507878SA (en) 2013-03-22 2015-10-29 Amgen Inc Injector and method of assembly
KR102318483B1 (ko) 2013-04-02 2021-10-27 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
JP6417118B2 (ja) * 2013-05-31 2018-10-31 株式会社ビー・エム・エル Ｐｃｓｋ９測定用標準物質
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
TW201534324A (zh) 2013-06-07 2015-09-16 Sanofi Sa 藉由投與ｐｃｓｋ９抑制劑抑制動脈粥狀硬化的方法
CA2916259C (en) * 2013-06-28 2024-02-20 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
US20150004174A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
AU2014318017B2 (en) 2013-09-05 2020-02-06 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
ES2744837T3 (es) 2013-10-24 2020-02-26 Amgen Inc Inyector y procedimiento de ensamblaje
WO2015073494A1 (en) 2013-11-12 2015-05-21 Sanofi Dosing regimens for use with pcsk9 inhibitors
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
GB2558442B (en) * 2013-12-17 2018-10-24 Kymab Ltd Antibodies for use in treating conditions related to specific PCSK9 variants and associated diagnostic methods
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
EP2886557A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-24 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific PCSK9 variants in specific patient populations
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
WO2015092394A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
FR3014695A1 (zh) * 2013-12-17 2015-06-19 Kymab Ltd
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
EP2975058A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-20 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific PCSK9 variants in specific patient populations
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
CN106062004A (zh) * 2013-12-17 2016-10-26 科马布有限公司 人靶标
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
CN114717291A (zh) 2013-12-30 2022-07-08 阿特雷卡公司 使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
WO2015200438A1 (en) * 2014-06-24 2015-12-30 Eleven Biotherapeutics, Inc. High affinity antibodies against pcsk9
JP2017525680A (ja) * 2014-07-14 2017-09-07 アムジェン インコーポレイテッド 結晶性抗体製剤
EP3169709B1 (en) * 2014-07-14 2021-05-12 Amgen Inc. Crystalline antibody formulations
DE202015009002U1 (de) 2014-07-15 2016-08-18 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
EP3332790A1 (en) 2014-07-15 2018-06-13 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
EP4328245A3 (en) 2014-07-15 2024-06-05 Kymab Ltd. Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
KR20240017117A (ko) 2014-07-16 2024-02-06 사노피 바이오테크놀로지 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(heFH) 환자의 치료방법
US9982052B2 (en) 2014-08-05 2018-05-29 MabQuest, SA Immunological reagents
PL3177644T3 (pl) 2014-08-05 2021-06-14 MabQuest SA Immunologiczne reagenty wiążące do PD-1
EP3193928A1 (en) 2014-08-06 2017-07-26 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
WO2016020799A1 (en) 2014-08-06 2016-02-11 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
WO2016023916A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
CA2960763A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glucagon antibodies and uses thereof
US10472424B2 (en) 2014-09-23 2019-11-12 Pfizer Inc. Treatment with anti-PCSK9 antibodies
AU2015335743B2 (en) 2014-10-23 2020-12-24 Amgen Inc. Reducing viscosity of pharmaceutical formulations
WO2016071701A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
CA2963760A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Yoshinao Ruike Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CN105461809B (zh) 2015-02-11 2018-10-12 康融东方（广东）医药有限公司 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途
WO2016145139A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind psma
US10688119B2 (en) * 2015-03-20 2020-06-23 Aarhus Universitet Inhibitors of PCSK9 for treatment of lipoprotein metabolism disorders
CN107635512A (zh) * 2015-04-15 2018-01-26 康斯瓦维有限责任公司 用于抑制天然心脏瓣膜、被支撑的心脏瓣膜或生物假体的狭窄、阻塞或钙化的装置和方法
CN105037554B (zh) * 2015-06-12 2019-04-12 成都贝爱特生物科技有限公司 抗人pcsk9抗体的制备及其用途
EA201890519A1 (ru) 2015-08-18 2018-07-31 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Ингибирующие антитела против pcsk9 для лечения пациентов с гиперлипидемией, подвергающихся аферезу липопротеинов
US10358497B2 (en) 2015-09-29 2019-07-23 Amgen Inc. Methods of treating cardiovascular disease with an ASGR inhibitor
WO2017055966A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Pfizer Inc. Low viscosity antibody compositions
CN106589127A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用
CN105348390B (zh) * 2015-10-26 2018-08-28 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
US20180363000A1 (en) * 2015-12-14 2018-12-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-anti pcsk9 antibody constructs and uses thereof
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US10793643B2 (en) * 2015-12-31 2020-10-06 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. PCSK9 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
EP3401336A4 (en) 2016-01-05 2020-01-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. PCSK9 ANTIBODIES, ANTI-BINDING FRAGMENT THEREOF AND MEDICAL USES THEREOF
US11214617B2 (en) 2016-01-22 2022-01-04 MabQuest SA Immunological reagents
WO2017125815A2 (en) 2016-01-22 2017-07-27 MabQuest SA Immunological reagents
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
WO2017163049A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
US11066464B2 (en) 2016-03-21 2021-07-20 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
CN107266575B (zh) * 2016-04-07 2021-12-24 天士力生物医药股份有限公司 前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin 9型的结合蛋白及其应用
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
CN107474140B (zh) * 2016-06-08 2022-06-03 常州博嘉生物医药科技有限公司 Pcsk9特异性的结合蛋白mv072及其应用
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
CA3026050A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases
CN107840893B (zh) * 2016-09-20 2022-02-25 信立泰(成都)生物技术有限公司 新型抗-pcsk9抗体
US11111313B2 (en) 2016-09-20 2021-09-07 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-PCSK9 antibodies
JP7275027B2 (ja) 2016-10-06 2023-05-17 アムジェン インコーポレイテッド 粘度低下タンパク質医薬製剤
WO2018075792A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN106822881A (zh) * 2016-12-09 2017-06-13 四川大学 一种针对pcsk9的抗高血脂蛋白疫苗
CN108239150A (zh) 2016-12-24 2018-07-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pcsk9抗体及其用途
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
CA3221995C (en) 2017-02-08 2024-05-28 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
KR20240060739A (ko) 2017-02-20 2024-05-08 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
JP7377596B2 (ja) 2017-02-22 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JP7416624B2 (ja) 2017-03-21 2024-01-17 テレフレックス メディカル インコーポレイテッド 外科用クリップ及びクリップアプライヤ
US12023041B2 (en) 2017-03-21 2024-07-02 Teleflex Medical Incorporated Clip applier
US20210148909A1 (en) * 2017-05-31 2021-05-20 North Carolina Central University Optimization of an active pcsk9 assay
CN107029243A (zh) * 2017-06-08 2017-08-11 厦门大学 一种多肽桥连的双酰腙连接键应用于醛衍生药物的递送
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
JP6913566B2 (ja) * 2017-08-23 2021-08-04 協同油脂株式会社 グリース組成物
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
JP2021502967A (ja) 2017-11-14 2021-02-04 中外製薬株式会社 抗Ｃ１ｓ抗体および使用方法
IL273638B2 (en) 2017-11-16 2024-10-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
JP6639463B2 (ja) * 2017-12-21 2020-02-05 アムジエン・インコーポレーテツド ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療方法
US12110342B2 (en) * 2018-01-31 2024-10-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Nucleic acid monoclonal antibodies targeting PCSK9 and methods of use
MX2020008336A (es) 2018-02-08 2020-09-21 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d.
AU2019225740A1 (en) * 2018-02-20 2020-09-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting CD33, and use thereof
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
WO2019191534A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Amgen Inc. C-terminal antibody variants
MX2020013155A (es) 2018-06-05 2021-04-29 Anji Pharma Us Llc Composiciones y metodos para tratar la pancreatitis.
KR20210101235A (ko) * 2018-11-16 2021-08-18 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 뮤신-16에 대한 항체 및 이의 사용 방법
GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
CN109776680B (zh) * 2019-01-25 2020-05-12 浙江蓝盾药业有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体及其用途
JP2022532423A (ja) 2019-05-17 2022-07-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 心血管系リスクを減らすためのゲノムに基づく方法
US20220315646A1 (en) * 2019-09-13 2022-10-06 Duke University Zika antibodies and their use
WO2021058597A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of determining whether a subject is at risk of developing arterial plaques
GB201913846D0 (en) 2019-09-25 2019-11-06 King S College London Biomarker
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
BR112022010424A2 (pt) 2019-11-29 2022-08-23 Kymab Ltd Tratamento para sobrecarga de ferro fisiológica
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
JP2024511853A (ja) 2021-03-31 2024-03-15 カイマブ・リミテッド Ｇｄｆ１５シグナル伝達の治療的阻害剤
WO2022207785A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Kymab Limited Antibodies to gfral
TW202313682A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 英商凱麥博有限公司 抗icos抗體之用途
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
CN113480650B (zh) * 2021-06-30 2022-01-28 徐州医科大学 一种全人源靶向cd276的car-t细胞的制备方法及应用
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023076419A2 (en) * 2021-10-27 2023-05-04 Twist Bioscience Corporation Sars-cov-2 antibodies and methods of use
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content

Family Cites Families (206)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US896507A (en) 1908-04-06 1908-08-18 Theodore J Asch Sweat-band.
US1063008A (en) 1913-03-15 1913-05-27 William E Budd Vehicle-tire.
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5612114B2 (zh) 1974-06-07 1981-03-18
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
AU548996B2 (en) 1980-02-04 1986-01-09 Merck & Co., Inc. Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives
US4444784A (en) * 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US6066718A (en) 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1997000271A1 (en) 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
ATE352613T1 (de) 1995-08-29 2007-02-15 Kirin Brewery Chimäres tier und methode zu dessen herstellung
GB9610992D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Glaxo Group Ltd Concentrated antibody preparation
WO1998001116A1 (en) 1996-07-09 1998-01-15 Merck & Co., Inc. Therapy for combined hyperlipidemia
EP0852951A1 (de) 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
PT1500329E (pt) 1996-12-03 2012-06-18 Amgen Fremont Inc Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US20060246483A1 (en) * 1997-03-07 2006-11-02 Rosen Craig A 337 human secreted proteins
US20080103090A1 (en) * 1997-03-07 2008-05-01 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US20070224663A1 (en) * 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US7368531B2 (en) * 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US20050197285A1 (en) * 1997-03-07 2005-09-08 Rosen Craig A. Human secreted proteins
US20060223088A1 (en) * 1997-03-07 2006-10-05 Rosen Craig A Human secreted proteins
US7411051B2 (en) * 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
US20070055056A1 (en) * 1997-03-07 2007-03-08 Rosen Craig A 251 human secreted proteins
US20060223090A1 (en) * 1997-03-07 2006-10-05 Rosen Craig A Polynucleotides encoding human secreted proteins
US7968689B2 (en) 1997-03-07 2011-06-28 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HSDEK49 polypeptides
US20070015696A1 (en) * 1997-03-07 2007-01-18 Rosen Craig A 621 human secreted proteins
FR2784749B1 (fr) 1998-10-14 2000-12-29 Instruments Sa Appareil de caracterisation optique de materiau en couche mince
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
GB2343233A (en) 1998-10-28 2000-05-03 Whitnash Plc Torsional vibration damper.
NL1011069C2 (nl) 1999-01-19 2000-07-20 Well Engineering Partners B V Werkwijze en installatie voor het inbrengen van een buis in een boorgat in de aardbodem.
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
EP1514933A1 (en) * 1999-07-08 2005-03-16 Research Association for Biotechnology Secretory protein or membrane protein
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030119038A1 (en) * 1999-09-09 2003-06-26 Bingham Brendan William NARC1, novel subtilase-like homologs
US7029895B2 (en) * 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
US20100291099A1 (en) 1999-09-27 2010-11-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 27411, 23413, 22438, 23553, 25278, 26212, narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, narc 25, 86604 and 32222 molecules and uses therefor
US20020081679A1 (en) 1999-10-22 2002-06-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. NARC8 programmed cell-death-associated molecules and uses thereof
CA2388617A1 (en) 1999-10-22 2001-05-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules derived from rat brain and programmed cell death models
US20110230392A1 (en) 1999-10-22 2011-09-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, and narc 25 molecules and uses therefor
EP1257572A2 (en) 2000-02-07 2002-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
JP3753917B2 (ja) 2000-03-17 2006-03-08 茨木精機株式会社 包装体の整列搬出方法及びその装置
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
EP1292684A2 (en) 2000-06-16 2003-03-19 Incyte Genomics, Inc. Proteases
WO2002014358A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 Eli Lilly And Company Novel secreted proteins and their uses
JP4340062B2 (ja) * 2000-10-12 2009-10-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 粘度の減少した濃縮タンパク質製剤
JP2005500005A (ja) 2000-12-08 2005-01-06 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド タンパク質修飾分子とメンテナンス分子
CA2441840A1 (en) 2001-03-21 2002-11-28 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040023243A1 (en) * 2001-06-13 2004-02-05 Yue Henry Proteases
DE60233509D1 (de) 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
US20040038242A1 (en) * 2001-07-30 2004-02-26 Edmonds Brian Taylor Novel secreted proteins and their uses
WO2003076568A2 (en) 2002-02-11 2003-09-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapeutics for biodefense
US6875433B2 (en) 2002-08-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibodies and complementarity-determining regions binding to Ebola glycoprotein
AR047392A1 (es) * 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
AU2003293543A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
JP4999158B2 (ja) * 2003-05-21 2012-08-15 メダレツクス・インコーポレーテツド 炭疽菌（ｂａｃｈｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体
US20050118625A1 (en) * 2003-10-02 2005-06-02 Mounts William M. Nucleic acid arrays for detecting gene expression associated with human osteoarthritis and human proteases
JP2005130764A (ja) 2003-10-30 2005-05-26 Pharmaceuticals & Medical Devices Agency Ｎａｒｃ−１遺伝子上の多型を利用した脂質代謝異常に起因する疾患の検査方法、および創薬のための用途
ES2401114T3 (es) 2004-08-10 2013-04-17 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de apolipoproteína B
US20060147945A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-06 Edmonds Brian T Novel secreted proteins and their uses
EP1841455A1 (en) 2005-01-24 2007-10-10 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
US7682981B2 (en) * 2005-01-27 2010-03-23 Contour Semiconductor, Inc. Topography transfer method with aspect ratio scaling
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2007074880A1 (ja) 2005-12-28 2007-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体含有安定化製剤
EP2021467A4 (en) 2006-05-08 2010-01-20 Adaerata Ltd Partnership CHIMERIC PCSK9 PROTEINS, THESE INCLUDING CELLS AND TEST METHODS THEREWITH
US7605251B2 (en) * 2006-05-11 2009-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
US7572618B2 (en) * 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008042383A1 (en) 2006-10-02 2008-04-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for preparing high molecular weight polyesters
US20100068194A1 (en) * 2006-10-24 2010-03-18 Dong-Ku Kim Composition for in vivo transplantation for treatment of human cervical cancer comprising mononuclear cells derived from umbilical cord blood
EP2106261A4 (en) 2006-11-07 2010-05-26 Merck Sharp & Dohme ANTAGONISTS OF PCSK9
CN101636179B (zh) 2006-11-07 2012-10-10 默沙东公司 Pcsk9拮抗剂
US20100040611A1 (en) * 2006-11-07 2010-02-18 Sparrow Carl P Antagonists of pcsk9
EP2083860A4 (en) * 2006-11-07 2010-05-26 Merck Sharp & Dohme PCSK9 ANTAGONISTS
FR2909092B1 (fr) 2006-11-24 2012-10-19 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-proliferation
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
AU2007325767A1 (en) 2006-11-27 2008-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
JP5086618B2 (ja) * 2006-11-27 2012-11-28 オリンパス株式会社 カプセル型内視鏡
AR064826A1 (es) 2007-01-09 2009-04-29 Wyeth Corp Formulaciones de anticuerpos anti-il-13 y usos de los mismos. dispositivos, parche y jeringa
WO2008109871A2 (en) 2007-03-08 2008-09-12 Irm Llc Crystal structure of proprotein convertase 9 (pcsk9) and uses thereof
WO2008125623A2 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Novartis Ag Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
EP2185594B1 (en) 2007-08-13 2016-04-06 VasGene Therapeutics, Inc. Cancer treatment using humanized antibodies that bind to ephb4
US20130072665A1 (en) 2007-08-23 2013-03-21 Simon Mark Jackson Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
JOP20080381B1 (ar) * 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
EP2641917B1 (en) 2007-08-23 2020-05-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
EP2615114B1 (en) 2007-08-23 2022-04-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
NZ584902A (en) 2007-10-26 2012-03-30 Schering Corp Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders
MX2010008394A (es) 2008-01-31 2010-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9.
AR070315A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
EP2250199B1 (en) 2008-02-07 2015-09-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Engineered anti-tslpr antibodies
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
NO2708559T3 (zh) 2008-04-11 2018-08-25
CA2720681C (en) 2008-04-23 2016-08-02 Amgen Inc. Neutralizing proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9) variants and uses thereof
DK2982695T3 (da) 2008-07-09 2019-05-13 Biogen Ma Inc Sammensætninger, der omfatter antistoffer mod lingo eller fragmenter deraf
DE102008034203B4 (de) * 2008-07-21 2018-04-26 Airbus Helicopters Deutschland GmbH Herstellung von Faserverbundbauteilen mit Formkernen
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
US8748115B2 (en) 2008-12-12 2014-06-10 Merck Sharp & Dohme Corp. PCSK9 immunoassay
US8357371B2 (en) 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
US20130064834A1 (en) * 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
US8210622B2 (en) 2009-03-13 2012-07-03 Liberty Hardware Mfg. Corp. Adjustable product display assembly
WO2011028938A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9
US20120219558A1 (en) 2009-09-25 2012-08-30 Yan Ni Antagonists of pcsk9
NZ599323A (en) 2009-10-15 2014-06-27 Univ Monash Affinity ligands and methods for protein purification
WO2011053665A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
US8877900B2 (en) 2009-10-30 2014-11-04 Merck Sharp & Dohme Corp. AX132 PCSK9 antagonists
CA2777698A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Ax1 and ax189 pcsk9 antagonists and variants
EP2494355A4 (en) 2009-10-30 2013-05-01 Merck Sharp & Dohme IMMUNOLOGICAL ASSAY OF PCSK9
CA2781467C (en) 2009-11-20 2015-10-13 Biocon Limited Formulations of antibody
AR079336A1 (es) 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
KR20120138241A (ko) 2010-03-11 2012-12-24 화이자 인코포레이티드 ｐＨ 의존성 항원 결합을 갖는 항체
CN105175532B (zh) * 2010-04-13 2023-01-17 百时美施贵宝公司 结合pcsk9的基于纤连蛋白的支架域蛋白质
CN201712554U (zh) 2010-07-14 2011-01-19 李辉 电动汽车热管理系统
BR112013005162B1 (pt) 2010-09-01 2020-11-24 Nissan Motor Co., Ltd DISPOSITIVO DE CONTROLS PARA VEfCULO
WO2012054438A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Schering Corporation Anti-pcsk9
US9518132B2 (en) 2010-11-09 2016-12-13 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
US8613308B2 (en) 2010-12-10 2013-12-24 Uop Llc Process for transferring heat or modifying a tube in a heat exchanger
MX2013007168A (es) 2010-12-22 2013-11-04 Genentech Inc Anticuerpo anti-pcsk9 y metodos de uso.
EP2650016A1 (en) 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
EP2481758A1 (en) 2011-01-28 2012-08-01 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treating particular groups of subjects (11566)
PL3326648T3 (pl) 2011-01-28 2021-10-11 Sanofi Biotechnology Kompozycje farmaceutyczne zawierające ludzkie przeciwciała przeciwko PCSK9
BR112013020402A2 (pt) 2011-02-11 2018-09-25 Irm Llc antagonistas pcsk9
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
US20140004122A1 (en) * 2011-05-10 2014-01-02 Amgen Inc. Methods for treating or preventing cholesterol related disorders
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
JP2014519848A (ja) 2011-06-20 2014-08-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９結合ポリペプチドと使用方法
KR20140021708A (ko) 2011-07-14 2014-02-20 화이자 인코포레이티드 항-pcsk9 항체를 사용한 치료
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
EP3536712B1 (en) 2011-09-16 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipoprotein(a) levels by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (pcsk9)
EP2794661B1 (en) 2011-12-20 2019-03-06 Adaerata, Limited Partnership Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9
WO2013148284A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Genentech, Inc. Antibodies that bind to a pcsk9 cleavage site and methods of use
EA039663B1 (ru) * 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
WO2013188855A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
EP2703009A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2970501A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen, Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US20150004174A1 (en) 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
US10472424B2 (en) 2014-09-23 2019-11-12 Pfizer Inc. Treatment with anti-PCSK9 antibodies
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2006年02月， " Expression and localization of PCSK9 in rat hepatic cells", Grozdanov, PN et al，Biochem Cell Biol. 2006 Feb;84(1):80-92. *
2006年11月11日，"Secreted PCSK9 decreases the number of LDL receptors in epatocytes and in livers of parabiotic mice"， Lagace et al，J Clin Invest. 2006 Nov;116(11):2995-3005 *
2006年11月11日，"Secreted PCSK9 decreases the number of LDL receptors in epatocytes and in livers of parabiotic mice"， Lagace et al，J Clin Invest. 2006 Nov;116(11):2995-3005。
2007年08月16日，Serum proprotein convertase subtilisin kexin type 9 is correlated directly with serum LDL cholesterol，Clin Chem. 2007 Oct;53(10):1814-9 *
2007年08月16日，Serum proprotein convertase subtilisin kexin type 9 is correlated directly with serum LDL cholesterol，Clin Chem. 2007 Oct;53(10):1814-9。

Also Published As

Publication number Publication date
EP2215124B2 (en) 2023-07-19
US20140357853A1 (en) 2014-12-04
NO2016010I1 (no) 2016-06-03
DK3666797T3 (da) 2023-05-30
FR16C0025I1 (fr) 2016-07-08
US20140235830A1 (en) 2014-08-21
EA201000356A1 (ru) 2010-08-30
US8871913B2 (en) 2014-10-28
US20140235831A1 (en) 2014-08-21
TWI675847B (zh) 2019-11-01
US20120213797A1 (en) 2012-08-23
TW201906871A (zh) 2019-02-16
FR16C0025I2 (fr) 2018-06-08
BRPI0816117A2 (pt) 2015-03-10
JOP20080381B1 (ar) 2023-03-28
KR20240113594A (ko) 2024-07-22
US20120020976A1 (en) 2012-01-26
PL2215124T3 (pl) 2016-08-31
PL3666797T3 (pl) 2023-08-28
IL204013A (en) 2017-07-31
KR20100057070A (ko) 2010-05-28
IL273353A (en) 2020-05-31
TN2010000063A1 (en) 2011-09-26
LU93180I2 (fr) 2016-10-18
US20140357852A1 (en) 2014-12-04
ES2946083T3 (es) 2023-07-12
PE20221507A1 (es) 2022-10-04
ES2573258T5 (es) 2024-02-23
KR101702194B1 (ko) 2017-02-03
US8168762B2 (en) 2012-05-01
HUE062493T2 (hu) 2023-11-28
JP5441905B2 (ja) 2014-03-12
US8829165B2 (en) 2014-09-09
TW201500375A (zh) 2015-01-01
TW200916481A (en) 2009-04-16
US20110027287A1 (en) 2011-02-03
IL304868A (en) 2023-10-01
US8871914B2 (en) 2014-10-28
PE20140231A1 (es) 2014-03-08
CN101932607A (zh) 2010-12-29
PE20180173A1 (es) 2018-01-22
CY2016029I2 (el) 2017-04-26
CO6230997A2 (es) 2010-12-20
HRP20160494T4 (hr) 2023-10-27
PH12013502285A1 (en) 2016-08-08
EP2215124B1 (en) 2016-02-24
HUS1600036I1 (hu) 2016-10-28
TWI799416B (zh) 2023-04-21
SI2215124T2 (sl) 2023-11-30
NZ584101A (en) 2012-09-28
RS54756B1 (sr) 2016-10-31
US9045547B2 (en) 2015-06-02
TW202330625A (zh) 2023-08-01
IL252616B (en) 2020-05-31
TWI675848B (zh) 2019-11-01
LU93096I2 (fr) 2016-08-01
US20150031870A1 (en) 2015-01-29
CN104311666A (zh) 2015-01-28
SG184702A1 (en) 2012-10-30
DK2215124T4 (da) 2024-01-29
RS64295B1 (sr) 2023-07-31
MX2020008898A (es) 2020-10-12
CA2696252C (en) 2016-06-14
CN104311665A (zh) 2015-01-28
KR20180035947A (ko) 2018-04-06
DE202008018562U1 (de) 2015-11-02
RS54756B2 (sr) 2024-07-31
US8981064B2 (en) 2015-03-17
TW201500374A (zh) 2015-01-01
LTPA2016025I1 (lt) 2016-09-12
PE20091006A1 (es) 2009-08-14
PE20140220A1 (es) 2014-02-21
JP6638009B2 (ja) 2020-01-29
KR20140064962A (ko) 2014-05-28
MA31978B1 (fr) 2011-01-03
JP5705288B2 (ja) 2015-04-22
HUS1600029I1 (hu) 2016-09-28
TW201716444A (zh) 2017-05-16
US20140357851A1 (en) 2014-12-04
JP5906333B2 (ja) 2016-04-20
KR20210028741A (ko) 2021-03-12
US8563698B2 (en) 2013-10-22
CY2016023I2 (el) 2017-04-26
US8030457B2 (en) 2011-10-04
US9056915B2 (en) 2015-06-16
PE20140221A1 (es) 2014-02-21
TWI441833B (zh) 2014-06-21
BR122018012430B1 (pt) 2019-10-08
CN104311667A (zh) 2015-01-28
FI2215124T4 (fi) 2023-10-10
BRPI0816117B8 (pt) 2021-05-25
CL2008002495A1 (es) 2009-09-04
KR20230080496A (ko) 2023-06-07
TWI675846B (zh) 2019-11-01
IL252616A0 (en) 2017-07-31
SI3666797T1 (sl) 2023-10-30
EP2215124B9 (en) 2023-12-27
US8859741B2 (en) 2014-10-14
PH12013502286A1 (en) 2016-02-22
KR20170012592A (ko) 2017-02-02
US20130058944A1 (en) 2013-03-07
HK1143824A1 (zh) 2011-01-14
IL273353B2 (en) 2024-01-01
US20150087819A1 (en) 2015-03-26
US20130079502A1 (en) 2013-03-28
JP2018118974A (ja) 2018-08-02
MX2010001921A (es) 2010-03-11
EA032106B1 (ru) 2019-04-30
PT3666797T (pt) 2023-06-07
US20090142352A1 (en) 2009-06-04
EP3202791A1 (en) 2017-08-09
IL273353B1 (en) 2023-09-01
TW201500376A (zh) 2015-01-01
HUE028162T2 (en) 2016-12-28
JP2014043446A (ja) 2014-03-13
US9493576B2 (en) 2016-11-15
NL300818I2 (zh) 2016-07-14
CY1117940T1 (el) 2017-04-26
US8883983B2 (en) 2014-11-11
DE19207796T9 (de) 2023-02-23
SI2215124T1 (sl) 2016-09-30
ES2917423T3 (es) 2022-07-08
UA127402C2 (uk) 2023-08-16
DK2215124T3 (en) 2016-05-30
US20130245235A1 (en) 2013-09-19
CR11328A (es) 2010-07-12
ES2573258T3 (es) 2016-06-06
CN113402611A (zh) 2021-09-17
US20120020975A1 (en) 2012-01-26
EP3666797A1 (en) 2020-06-17
DE19207796T1 (de) 2022-03-10
US20140357854A1 (en) 2014-12-04
US20120251544A1 (en) 2012-10-04
JP2023071833A (ja) 2023-05-23
US20120027765A1 (en) 2012-02-02
JP2016182114A (ja) 2016-10-20
US20090326202A1 (en) 2009-12-31
US20130085265A1 (en) 2013-04-04
JP2010536384A (ja) 2010-12-02
AU2008288791B2 (en) 2014-10-30
FI3666797T3 (fi) 2023-05-25
JP2020058376A (ja) 2020-04-16
NO2023012I1 (no) 2023-03-20
CN112409489A (zh) 2021-02-26
DK3666797T5 (da) 2024-08-26
LTC2215124I2 (lt) 2023-04-25
AU2008288791A1 (en) 2009-02-26
CY2016029I1 (el) 2017-04-26
JP2015166345A (ja) 2015-09-24
WO2009026558A1 (en) 2009-02-26
CN101932607B (zh) 2014-06-25
HRP20230503T3 (hr) 2023-09-15
PL2215124T5 (pl) 2023-11-20
LT3666797T (lt) 2023-08-10
US20140357850A1 (en) 2014-12-04
US20130052201A1 (en) 2013-02-28
PE20140014A1 (es) 2014-01-31
KR20200074262A (ko) 2020-06-24
HRP20160494T1 (hr) 2016-06-03
PE20131400A1 (es) 2013-12-16
US20140228545A1 (en) 2014-08-14
US9920134B2 (en) 2018-03-20
MY180102A (en) 2020-11-22
NO2016015I1 (no) 2016-08-12
BR122018012430B8 (pt) 2021-07-27
LTPA2016021I1 (lt) 2016-06-27
SG10201710183TA (en) 2018-01-30
AR068011A1 (es) 2009-10-28
KR101494932B1 (ko) 2015-02-26
BRPI0816117B1 (pt) 2018-12-18
EP2215124A1 (en) 2010-08-11
US20140228547A1 (en) 2014-08-14
US20120093818A1 (en) 2012-04-19
CN112390889A (zh) 2021-02-23
CN112415203A (zh) 2021-02-26
EP3666797B1 (en) 2023-05-17
CY2016023I1 (el) 2017-04-26
CA2696252A1 (en) 2009-02-26
US20130079501A1 (en) 2013-03-28
KR20220031734A (ko) 2022-03-11
US20140228557A1 (en) 2014-08-14
US8889834B2 (en) 2014-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI633122B (zh) 針對前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之抗原結合蛋白
US20130072665A1 (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)