BR112012012080B1 - Formulações de histidina-trealose do anticorpo t1h - Google Patents

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Abstract

FORMULAÇÕES DE ANTICORPOS. Uma formulação farmaceuticamente estável que contém anticorpo, um tampão, um surfactante não iônico e um lioprotetor/crioprotetor. Também são divulgados métodos associados para o preparo, armazenamento e uso dessas formulações.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
(001) A presente invenção se refere a formulações estáveis de anticorpos. Uma formulação estável preferencial compreende: 25 - 250 mg/ml de anticorpo, 10 a 30 mM de espécie de tampão, 1 a 15% de poliol, 0,001 % a 0,05 % de surfactante e pH de 5 a 7,5. Um outro aspecto da invenção é o processo de preparar as referidas formulações.
HISTÓRICO E ARTE ANTERIOR DA INVENÇÃO
(002) Anticorpos monoclonais (mAbs) permitiram a caracterização de moléculas de importância fisiológica expressas na superfície celular. Definidas nas células do Sistema Imunológico, os “Clusters de Diferenciação de Leucócito” ou antígenos (CD) (scholossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15 (3);98). A definição da função dos CDs na diferenciação e maturação das células linfoides durante seu desenvolvimento ontogênico, nos mecanismos de reconhecimento celular e adesão e nos mecanismos de ativação e proliferação durante a reação imune levaram ao uso de seus respectivos mAbs no diagnóstico e na imunoterapia, com resultados promissores (Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740.
(003) Avanços recentes no desenvolvimento da biotecnologia forneceram uma grande variedade de polipeptídeos biologicamente ativos em quantidades suficientemente grandes para uso como medicamentos. No entanto, polipeptídeos podem perder sua potente atividade biológica como resultado de instabilidades físicas, incluindo desnaturação e formação de agregados solúveis e insolúveis e uma variedade de instabilidades químicas, como hidrólise, oxidação e desamidação. A estabilidade dos polipeptídeos em formulações farmacêuticas líquidas pode ser afetada, por exemplo, por fatores como pH, potência iônica, temperatura, ciclos repetidos de congelamento- descongelamento e exposição a forças mecânicas como ocorre durante o processamento. A formação de agregados e perda da atividade biológica também podem ocorrer como resultado de agitação física e interações de moléculas de polipeptídeos na solução e em interfaces líquido-ar dentro dos frascos de armazenamento.
(004) US20030190316 se refere a preparações estabilizadas que contêm um anticorpo em um tampão de glicina e/ou um tampão de histidina e também fornece processos para uma preparação estabilizada que contêm proteína, que compreende o ajuste do pH com um aminoácido básico ou um derivado de aminoácido básico ou um de seus sais.
(005) Enquanto uma quantidade de diversas composições farmacêuticas líquidas foi formulada para estabilizar a atividade biológica de polipeptídeos lá contidos, a degradação dos polipeptídeos em formulações líquidas continua a criar problemas para práticos médicos. Consequentemente, há uma necessidade de composições farmacêuticas adicionais que compreendam estabilizadores fisiologicamente compatíveis que promovem a estabilidade de componentes de polipeptídeos, mantendo assim sua eficácia terapêutica.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO
(006) O principal objetivo da presente invenção é obter uma formulação que compreenda anticorpos, tampão e excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is).
(007) Outro objetivo da presente invenção é obter uma formulação que compreenda um anticorpo de seus fragmentos, um tampão e lioprotetores.
(008) Um outro objetivo da presente invenção é obter formulações estáveis de anticorpos.
DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO
(009) De acordo, a presente invenção se refere a uma formulação de histidina- trealose, que contém: Anticorpo T1h, tampão histidina, açúcar trealose e excipiente(s) farmaceuticamente aceito(s), em que a formulação de histidina-trealose reduz HMWP em aproximadamente 20%; uma formulação de anticorpo histidina-trealose que compreende a) aproximadamente 25 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml do anticorpo T1h b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5; uma formulação de anticorpo histidina-trealose que compreende: a) aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 250mg/ml do anticorpo T1h b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5 c) aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05 % de surfactante não iônico; e uma formulação de anticorpo de histidina-trealose que compreende: a) aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 250mg/ml do anticorpo T1h b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5 c) aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05 % de surfactante não iônico e d) lioprotetor e/ou cioprotetor:
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS ACOMPANHANTES
(0010) Figura 1: variabilidade de pH durante o curso do estudo nas diferentes formulações avaliadas.
(0011) Figura 2: variabilidade de osmolalidade durante o curso do estudo nas diferentes formulações avaliadas.
(0012) Figura 3: gráfico de fluorescência normalizado que demonstra que o espectro e o máximo de lambda das amostras em diferentes formulações incubadas em condições diferentes não diferem.
(0013) Figura 4: análise de raio hidrodinâmico das amostras.
(0014) Figura 5: distribuição variante de carga nas amostras incubadas a 40°C.
(0015) Figura 6: distribuição variante de carga nas amostras incubadas a 40°C (destaque de histidina-trealose).
(0016) Figura 7: sobreposição de perfis de cromatografia de troca iônica para as formulações baseadas em histidina e fosfato que demonstram as variantes acídicas mais altas nas formulações baseadas em fosfato.
(0017) Figura 8: figura que representa a redução em % de monômero em amostras incubadas a 40°C.
(0018) Figure 9: figura que representa o aumento nos degradantes por SEC (%HMWP + % LMWP) a 40°C.
(0019) Figure 10: aumento em LMWP nas quatro formulações testadas. Todas as quatro formulações seguem a mesma tendência e os valores são bastante semelhantes, exceto a formulação de histidina-trealose, que tem fragmentação marginalmente mais baixa em comparação com as outras.
(0020) Figure 11: tendência de aumento em LMWP nas quatro formulações testadas. As formulações que contêm histidina apresentam menor agregação em comparação com as amostras de fosfato.
(0021) Figura 12: pH variabilidade das amostras de T1h em diferentes formulações.
(0022) Figura 13: concentração proteica das amostras de congelamento- descongelamento repetido.
(0023) Figura 14: perfis de SEC de amostras de 1 ml em fosfato e histidina após congelamento-descongelamento repetido.
(0024) Figura 15: comparação dos perfis de SEC das amostras de 0,5 ml em formulações de fosfato e histidina.
(0025) Figura 16: dados de SEC de amostras de 1 ml em ambas as formulações submetidas a Congelamento e Descongelamento repetido.
(0026) Figura 17: dados de SEC de amostras de 0,5 ml em ambas as formulações submetidas a Congelamento e Descongelamento repetido.
(0027) Figura 18: sobreposição dos perfis de Cromatografia de troca Iônica das amostras de 1 ml que demonstram eluição de provável agregação em 40 min. nas amostras de fosfato.
(0028) Figura 19: sobreposição das amostras de 0,5 ml que apresentam eluição agregada nas amostras de fosfato em 40 min., mas não em amostras de histidina.
(0029) Figura 20: dados de IEX de amostras de 1 ml em ambas as formulações submetidas a Congelamento e Descongelamento repetido em formulações de fosfato e histidina.
(0030) Figura 11: dados de IEX de amostras de 0,5ml submetidas a Congelamento e Descongelamento repetido em formulações de fosfato e histidina.
(0031) Figura 22: variabilidade de pH em amostra em estado congelado.
(0032) Figura 23: concentrações proteicas nas amostras de estabilidade em estado congelado.
(0033) Figura 24: sobreposições de SEC de estado congelado que demonstram aumento marginal na agregação de fosfato.
(0034) Figura 25: dados de SEC para distribuição variante em tamanho em amostras de estabilidade em estado congelado.
(0035) Figura 26: sobreposições de cromatografia de IEX de amostras de estabilidade em estado congelado.
(0036) Figura 27: dados de IEX para estabilidade em estado congelado em fosfato e histidina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
(0037) A presente invenção se refere a uma formulação de histidina-trealose que compreende o anticorpo T1h, tampão histidina, açúcar trealose e excipiente(s) farmaceuticamente aceito(s), em que a formulação de histidina-trealose reduz HMWP em aproximadamente 20%.
(0038) A presente invenção também se refere a uma formulação de histidina-trealose em que o(s) excipiente(s) farmaceuticamente aceito(s) é(são) selecionado(s) de crioprotetor, lioprotetor, surfactante e agente de volume, ou qualquer uma de suas combinações.
(0039) Em uma configuração da presente invenção, em que a formulação de histidina- trealose reduz HMWP em aproximadamente 20% em comparação com a formulação de sacarose-fosfato que aumenta HMWP em aproximadamente 90%, a formulação de fosfato-trealose que aumenta HMWP em aproximadamente 90% e a formulação de histidina-sacarose, que reduz HMWP em aproximadamente 11%.
(0040) Em outra configuração da presente invenção, em que surfactantes são selecionados de um grupo que compreende polissorbato 20 e polissorbato 80.
(0041) Ainda em outra configuração da presente invenção, em que os agentes de volume são selecionados de um grupo que compreende glicina e manitol.
(0042) A presente invenção refere-se ainda a uma formulação de anticorpos de histidina-trealose, que contém: a) de aproximadamente 25 mg/ml a aproximadamente250 mg/ml do anticorpo T1h b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5.
(0043) A presente invenção refere-se ainda a uma formulação de anticorpos de histidina-trealose, que contém: a) aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 250mg/ml do anticorpo T1h; b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5; e c) aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05 % de surfactante não iônico.
(0044) A presente invenção refere-se também a uma formulação de anticorpos de histidina-trealose, que contém: a) aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 250mg/ml do anticorpo T1h; b) tampão de histidina que fornece pH 5 a pH 7,5, c) aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,05 % de surfactante não iônico; e d) lioprotetor e/ou cioprotetor:
(0045) Em uma configuração da presente invenção, a formulação é um pó ou bolo liofilizado.
(0046) Em uma configuração da presente invenção, a formulação é posteriormente reconstituída em água estéril para injeção ou água bacteriolítica para injeção.
(0047) O objetivo primário da invenção é fornecer uma composição farmacêutica líquida estável que compreende: um anticorpo, uma espécie tampão, um poliol e um surfactante.
(0048) Foi descoberto, de forma vantajosa, que a formulação da composição de acordo com a presente invenção resulta em uma composição que é estável no armazenamento. Estável no armazenamento é interpretado como a imunoglobulina não agregar ou desagregar substancialmente e manter níveis aceitáveis de atividade in- vitro e in-vivo.
(0049) Outro aspecto da invenção se refere a um método de preparo da formulação de anticorpos.
(0050) A presente invenção é direcionada a composições farmacêuticas líquidas que compreendem um anticorpo como um composto terapeuticamente ativo e a métodos úteis em sua preparação. Para fins da presente invenção, o termo “líquido” com relação a composições ou formulações farmacêuticas deve incluir o termo “aquoso”. O termo “anticorpo” conforme usado no presente instrumento compreende proteínas e anticorpos de ocorrência natural (nativos), sintéticos e recombinantes, e suas variantes biologicamente ativas, conforme qualificados em outra parte do presente instrumento. Por “componente terapeuticamente ativo”, entende-se que o anticorpo é especificamente incorporado na composição para resultar em uma reação terapêutica desejada com relação ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição em um indivíduo quando a composição farmacêutica for administrada a esse indivíduo.
(0051) Mais particularmente, as composições da invenção são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um anticorpo que normalmente apresenta formação de agregados durante o armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. Por “formação de agregado”, entende-se uma interação física entre as moléculas de polipeptídeos que resulta na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou grandes agregados visíveis que se precipitam para fora da solução. Por “durante o armazenamento” entende-se uma formulação ou composição farmacêutica líquida que, uma vez preparada, não é administrada imediatamente a um indivíduo. Em vez disso, após o preparo, é embalada para armazenamento, seja em forma líquida, em estado congelado ou em forma seca para reconstituição posterior em forma líquida ou em outra forma adequada para administração a um indivíduo. A formação de agregados por um polipeptídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar de forma adversa a atividade biológica desse polipeptídeo, resultando em perda da eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregados pode causar outros problemas como bloqueio de tubos, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica que contém polipeptídeos for administrada com o uso de um sistema de infusão.
(0052) As composições farmacêuticas líquidas estabilizadas da invenção compreendem ainda uma quantidade de espécie de tampão. Essa espécie de tampão inclui principalmente fosfato ou histidina. A espécie de tampão da formulação é destinada a manter o pH. O pH das formulações de fosfato foi estabelecido em 7 e o da formulação de histidina foi estabelecido em 6, visto que esses pHs ficam na faixa de tampão dessas espécies de tampão.
(0053) Uma quantidade de surfactante é adicionada à composição da invenção, que é uma quantidade suficiente para inibir a formação de agregados ou turbidez em composições que contêm anticorpos. Essa formação de agregados pode ocorrer mediante, por exemplo, armazenamento de longo prazo, agitação mecânica, congelamento e descongelamento. A inibição significativa de agregação ou turbidez é observada e a formação de turbidez/agregados é pelo menos 10% menor na composição que contêm anticorpos com surfactante do que em uma formulação comparável que não contêm surfactante, preferencialmente pelo menos 50% a menos, mais preferencialmente pelo menos 70% menos, e mais preferencialmente ainda pelo menos 90% menos. A inspeção visual de frascos e composição que contêm anticorpos com absorbância de 320 nm deve ser monitorada para determinar a capacidade de polissorbato 80 para manter as moléculas de proteína na solução. A absorbância a 320 nm, resultante principalmente do espalhamento de moléculas na solução, foi muito mais pronunciada em amostras sem polissorbato 80.
(0054) "Surfactante" conforme usado no presente instrumento é definido como se compreendesse qualquer detergente que tenha uma região hidrofílica e uma região hidrofóbica, e inclui detergentes não iônicos, catiônicos, aniônicos e zwitteriônicos. Surfactantes adequados incluem, por exemplo, monooleato de sorbitan polioxietileno (também conhecido como polissorbato 80 ou "TWEEN" 80), monolaurato de sorbitan polioxietileno (também conhecido como polissorbato 20 ou "TWEEN" 20), ou N-lauril sarcosina. Um surfactante não iônico é preferencial para as formulações descritas no presente instrumento. Esses surfactantes não iônicos podem ser escolhidos dos surfactantes seguintes como ésteres de ácidos graxos de sorbitan de polioxietileno ou poloxâmero, por exemplo, polissorbato 20 ou polissorbato 80. Polissorbato 80 é preferencial para as composições da presente invenção. O surfactante pode estar presente em uma concentração de 0,01% - 0,5% por peso.
(0055) Polipeptídeos de subunidade de imunoglobulina compreendem, cada, uma região constante e uma região variável. Na maior parte das espécies, a região variável de cadeia pesada, ou domínio VH, e a região variável de cadeia leve, ou domínio VL, se combinam para formar um domínio de ligação de antígeno composto de "regiões determinantes de complementaridade" ou CDRs, a parte de uma molécula de imunoglobulina que contribui especificamente com o local de ligação de antígeno para um epítopo particular. Geralmente, as cadeias pesadas e leves têm, cada, três CDRs, que se combinam para formar o local de ligação de antígeno da imunoglobulina. Um “domínio de ligação de antígeno” de uma molécula de imunoglobulina geralmente, mas não invariavelmente, consiste de pelo menos uma parte do domínio variável de uma cadeia pesada e pelo menos uma parte do domínio variável de uma cadeia leve, unidos por ligações dissulfeto. A região de Fc é essencial para as funções de efeito de anticorpos. As funções de efeito incluem o início de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), iniciar fagocitose e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e transferir anticorpos entre barreiras celulares por transcitose. Além disso, a região de Fc é crítica para a manutenção da meia-vida sérica de um anticorpo de classe IgG (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995).
(0056) Um aspecto posterior da presente invenção oferece um anticorpo alterado ou fragmento funcional selecionado de Fab, Fc ou parte.
(0057) Em um aspecto posterior da invenção, prevê-se uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente invenção ou um fragmento funcional junto com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceito.
(0058) A composição pode incluir uma ou mais espécies tampão, um ou mais poliois, e um ou mais surfactantes.
(0059) A composição inclui veículos farmaceuticamente aceitos. Veículos farmaceuticamente aceitos incluem, entre outros, solução salina, água estéril, solução salina com tampão de fosfato, e afins. Outros agentes de tampão, agentes de dispersão e substâncias atóxicas inertes adequadas para entrega a um paciente podem ser incluídos nas composições da presente invenção. As composições podem ser soluções adequadas para administração, e são tipicamente estéreis e livres de matéria particulada indesejável.
(0060) Os tampões usados no contexto da presente invenção são preferencialmente fosfato ou histidina. Mais preferencialmente, os tampões usados nas formulações da invenção instantânea não se limitam a acetato, succinato, histidina e fosfato, que podem ser usados como tal ou em combinação.
(0061) Desejavelmente, o pH da solução de formulação está na faixa de 5 a 7,5, e o pH da solução está preferencialmente na faixa de 5,5 a 6 com ajuste, se necessário, do pH final para o nível desejado.
(0062) O poliol usado no contexto da presente invenção é açúcar redutor, que tem diversas funções como estabilizante para anticorpos, um modificador de tonicidade, e crioprotetor e lioprotetor também são incluídos na formulação. Mais preferencialmente, o poliol usado na formulação da invenção instantânea é açúcar redutor como sacarose ou trealose.
(0063) Outros excipientes farmaceuticamente aceitos bem conhecidos dos habilidosos na arte também podem fazer parte de composições dos indivíduos. Isso inclui, por exemplo, diversos agentes de volume e quando um agente de volume é selecionado de glicina ou manitol.
(0064) Em uma configuração, o componente de açúcar da formulação (sacarose e trealose) tem finalidade multifacetada: açúcares atuam como estabilizantes para o anticorpo, protegendo-o da degradação; são crio/lioprotetores que protegem o anticorpo durante o processo de liofilização (que envolve congelamento e descongelamento); eles são também modificantes de tonicidade, cuja concentração pode ser ajustada para fornecer um produto que é isotônico. A tonicidade tem significatividade em um produto administrado subcutaneamente como este, visto que um produto isotônico é capaz de reduzir significativamente a picada no local da injeção. Sacarose e trealose foram selecionadas para avaliação por serem ambas açúcares não redutores e terem sido amplamente usadas como proteínas estabilizadoras. A concentração do açúcar foi escolhida de forma a fornecer uma solução isotônica para administração subcutânea.
(0065) Em outra configuração da invenção, os resultados do estudo de triagem da formulação indicam que em 2-8°C e quando submetida a congelamento/descongelamento, não foram observadas diferenças significativas em HMWP ou LMWP entre as formulações. No entanto, quando incubado a 40°C, a estabilidade física do anticorpo é aprimorada em tampões que contêm histidina, em comparação com formulações baseadas em fosfato, especialmente com relação a agregação (figura 11). A amostra de T1h em formulação de histidina-trealose apresentou consistentemente a porcentagem mais alta de monômero e consequentemente a menor porcentagem degradante de todas as quatro formulações testadas.
(0066) Ainda em outra configuração da invenção, a distribuição variante de carga não foi alterada por incubação do anticorpo em 2-8°C ou em congelamento/descongelamento. No entanto, a incubação do anticorpo a 40°C realçou diferenças na medida da estabilização conferida por cada formulação. As formulações baseadas em histidina tiveram, ainda, acúmulo mais lento de variantes acídicas em comparação com as formulações de fosfato. Dentre as formulações de histidina, a de histidina-trealose apresentou consistentemente as menores variantes acídicas, e, portanto, um pico principal de % mais alto em comparação com histidina-sacarose (Figura 5: distribuição de carga variante nas amostras incubadas a 40 ° C. Figura 6: Distribuição variante de carga nas amostras incubadas a 40°C). A potência/atividade biológica do anticorpo é inalterada em qualquer formulação e/ou condição, e é comparável ao padrão. Essa conclusão pode ter sido alcançada visto que o ensaio de atividade/potência ainda não está desenvolvido o bastante para discriminar entre as diferentes formulações. Isso pode ser um aspecto importante a ser considerado, à luz do fato de que as formulações baseadas em histidina são capazes de proteger o anticorpo de degradação melhor do que a formulação de fosfato.
(0067) Ainda em outra configuração da invenção, a estabilidade conformacional do anticorpo conforme avaliada pela espectroscopia de fluorescência e DSC não passou por mudanças significativas em nenhuma das formulações testadas. Não há alterações no máximo de lambda (que pode apontar para uma alteração na conformação 3-D do anticorpo) na experiência de fluorescência (fig. 3). De forma semelhante, não há diferenças significativas nas temperaturas de derretimento observadas para as amostras de TO e as amostras de 40°C, o que indica que os diferentes domínios do anticorpo ainda se desdobram da mesma forma do início do estudo.
(0068) A presente invenção é, ainda, definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam as configurações preferenciais da invenção, são fornecidos apenas para fins ilustrativos. A partir da discussão acima e desses Exemplos, uma pessoa habilidosa na arte pode determinar as características essenciais da invenção, e sem desviar de seu espírito e escopo, pode fazer diversas alterações e modificações da invenção para adaptá-la a diversos usos e condições.
(0069) A invenção será melhor compreendida a partir dos Exemplos a seguir. No entanto, aqueles com habilidade comum na arte entenderão imediatamente que os Exemplos são meramente ilustrativos da invenção definida nas reivindicações posteriores.
(0070) A presente invenção é posteriormente elaborada pelos exemplos e figuras a seguir. No entanto, os exemplos não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo da invenção.
(0071) Os Exemplos a seguir representam as configurações preferenciais da presente invenção.
(0072) EXEMPLOS EXPERIMENTAIS
(0073) Exemplo 1 A. Formulação que contém mAB pode ser preparada como segue.
(0074) O anticorpo purificado é concentrado pelo uso de filtração de Fluxo Tangencial (TFF) ou UF/DF da concentração alta exigida e subsequentemente trocada por tampão no tampão de formulação.
(0075) O anticorpo purificado é concentrado entre 20 e 30 mg/ml pelo uso de filtração de Fluxo Tangencial (TFF) ou UF/DF, e subsequentemente trocada por tampão no tampão de formulação. A amostra é, então, submetida a liofilização e, uma vez liofilizada, o bolo é reconstituído em um volume apropriado de WFI de forma a alcançar a concentração de produto medicamentoso final exigida.
(0076) A substância medicamentosa de volume é liofilizada e então é dissolvida no tampão da formulação para a concentração exigida.
(0077) O anticorpo é concentrado para a alta concentração requisitada com o uso de técnicas de cromatografia de coluna como Cromatografia de Troca Iônica, cromatografia de Afinidade o cromatografia de Interação Hidrofóbica.
(0078) B. Estabilidade Química da Formulação Aquosa
(0079) As amostras incubadas em 2-8°C e as submetidas a desgaste de congelamento- descongelamento não demonstraram nenhuma variabilidade por troca iônica. Diferenças na degradação foram observadas apenas nas amostras incubadas a 40°C.
(0080) A cromatografia de Troca Iônica das amostras incubadas a 40°C demonstra claramente que as variantes acídicas aumentam em uma medida menor nas formulações de histidina, em comparação com as formulações baseadas em fosfato. Dentre as formulações de histidina, a formulação com trealose tem uma população variante acídica menor em comparação com a formulação de histidina-sacarose. Histidina-trealose é, portanto, a formulação superior por Cromatografia de Troca Iônica.
(0081) Por SEC, as amostras incubadas a 2-8°C e as que sofreram desgaste por congelamento-descongelamento demonstraram pouca ou nenhuma diferença no padrão de degradação entre as quatro formulações avaliadas.
(0082) No entanto, as amostras incubadas a 40°C demonstraram diferenças na taxa em que o monômero foi reduzido, o que consequentemente influenciou o acúmulo de degradantes (HMWP e LMWP), demonstrando que a formulação de histidina/trealose segue uma taxa mais lena para a degradação do monômero, enquanto as outras três formulações parecem ter degradação mais rápida. O mesmo é observado na Figura no aumento de degradantes.
(0083) Uma observação mais atenta do aumento de HMWP e LMWP demonstra que o padrão de aumento em LMWP segue uma tendência semelhante em todas as formulações (figura) e é no acúmulo de HMWP que as formulações de histidina se separam das formulações baseadas em fosfato - figura. No final de 5,5 semanas, é a formulação que contém histidina/trealose que tem o monômero mais alto remanescente, bem como a menor porcentagem de degradantes.
(0084) O resultado de SEC na figura 14-17 indica o aumento dos agregados na amostra de fosfato/Nacl em quatro semanas em congelamento-descongelamento repetido (80°C) e que não há aumento observável na agregação na formulação de His/Tre em quatro semanas. O aumento na agregação é de aproximadamente 1,75% na amostra de volume de enchimento de 0,5 ml e de 1,41 % nas amostras de enchimento de 1 ml.
(0085) Uma cromatografia de troca catiônica fraca na figura 18- 21 indica que a distribuição variante de carga não muda significativamente quando o mAb é repetidamente congelado (-80°C) e descongelado no período do estudo de quatro semanas em formulações de fosfato/Nacl e histidina-trealose.
(0086) No entanto, nas amostras de Fos/Nacl, o aumento nas quantidades de proteínas co-eluem com o pico de tampão a 40 minutos. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado na figura 12-13
(0087) O estudo de estabilidade em estado congelado na figura 24-27 indica que nenhuma diferença é observada no perfil variante de carga, mas que a agregação aumenta marginalmente na formulação de Fos/Nacl, e não na formulação de His/Tre. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado na figura 22-23
(0088) Exemplo 2: A. Formulação que contém mAB pode ser preparada como segue.
(0089) A formulação que contém anticorpo T1h é preparada de maneira semelhante à exibida no exemplo 1.
(0090) B. Estabilidade Química da Formulação Aquosa
(0091) As amostras incubadas em 2-8°C e as submetidas a desgaste de congelamento- descongelamento não demonstraram nenhuma variabilidade por troca iônica. Diferenças na degradação foram observadas apenas nas amostras incubadas a 40°C.
(0092) A cromatografia de Troca Iônica das amostras incubadas a 40°C demonstra claramente que as variantes acídicas aumentam em uma medida menor nas formulações de histidina, em comparação com as formulações baseadas em fosfato. Dentre as formulações de histidina, a formulação com trealose tem uma população variante acídica menor em comparação com a formulação de histidina-sacarose. As figuras 5 e 6 indicam que, quando observadas após intervalos de tempo definidos, as variantes de carga aumentaram a partir das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, a variante de carga acídica aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 57,48 para as formulações de fosfato- sacarose, enquanto aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 57,46 para formulações de fosfato-trealose.
(0093) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a variação de carga é menor em comparação com as formulações de fosfato. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, a variante de carga acídica aumenta apenas de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 49,11 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 32,63 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 45,48 para formulações de histidina-trealose.
(0094) Entende-se assim que histidina-trealose é, portanto, a formulação mais superior por Cromatografia de Troca Iônica.
(0095) Por SEC, as amostras incubadas a 2-8°C e as que sofreram desgaste por congelamento-descongelamento demonstraram pouca ou nenhuma diferença no padrão de degradação entre as quatro formulações avaliadas.
(0096) No entanto, as amostras incubadas a 40°C apresentaram diferenças na taxa em que o monômero foi reduzido conforme observado na Figura 8, que, consequentemente, influenciou o acúmulo de degradantes (HMWP e LMWP).
(0097) A Figura 8 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a redução na % de monômeros nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, a redução na % de monômero em amostras cai de 93,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 87,1 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto cai de 92,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 87,4 para formulações de fosfato-trealose.
(0098) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a redução em % de monômero nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, cai apenas de 91,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 87,9 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 93,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 90,5 para formulações de histidina-trealose.
(0099) Isso mostra que a formulação de histidina/trealose segue uma taxa mais lenta para a degradação do monômero, enquanto as outras três formulações parecem degradar mais rápido. O mesmo é observado na Figura 9 no aumento de degradantes.
(00100) A Figura 9 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % de degradantes nas amostras caiu das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, o aumento na % de degradantes nas amostras aumenta de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,9 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 7,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,6 para formulações de fosfato-trealose.
(00101) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de degradantes nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas aumenta apenas de 8,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,1 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 6,7 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 9,5 para formulações de histidina-trealose.
(00102) Conforme indicado e explicado abaixo, uma observação mais atenta do aumento em HMWP e LMWP demonstra que o padrão do aumento de LMWP segue uma tendência semelhante em todas as formulações (figura10), e é no acúmulo de HMWP que as formulações de histidina se separam das formulações baseadas em fosfato (figura 11). No fim de 5,5 semanas, é a formulação que contém histidina/trealose que tem tanto o maior monômero remanescente como a menor % de degradantes.
(00103) A Figura 10 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % LMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, o aumento na % de LMWP nas amostras aumenta de 5,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 9,6 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 5,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 9,6 para formulações de fosfato-trealose.
(00104) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de LMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas aumenta apenas de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 10,7 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 5,4 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 8,3 para formulações de histidina-trealose.
(00105) A Figura 11 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % HMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, o aumento na % de HMWP nas amostras aumenta de 2,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,3 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 2,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,0 para formulações de fosfato-trealose.
(00106) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de HMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 2 semanas, cai apenas de 1,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 1,4 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 1,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 1,2 para formulações de histidina-trealose.
(00107) O resultado de SEC na figura 14-17 indica o aumento dos agregados na amostra de fosfato/Nacl em quatro semanas em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) e que não há aumento observável na agregação na formulação de His/Tre em quatro semanas. O aumento na agregação é de aproximadamente 1,75% na amostra de volume de enchimento de 0,5 ml e de 1,41 % nas amostras de enchimento de 1 ml.
(00108) A Figura 16 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,23 [valor em PBS T4 após 4 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero caiu de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,72 [valor em His-Tre T4 após 4 semanas].
(00109) A Figura 17 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 0,5 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 95,87 [valor em PBS T4 após 4 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero caiu de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,72 [valor em His-Tre T4 após 4 semanas].
(00110) Uma cromatografia de troca catiônica fraca nas figuras 18- 21 indica que a distribuição de variante de carga não muda significativamente quando o Anticorpo monoclonal T1h é repetidamente congelado (-80°C) e descongelado no período do estudo de quatro semanas em formulações de histidina-trealose. No entanto, nas amostras de Fos/Nacl, o aumento nas quantidades de proteínas co-eluem com o pico de tampão a 40 minutos.
(00111) Por outro lado, outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 12-13
(00112) O estudo de estabilidade em estado congelado nas figuras 24-27 indica que nenhuma diferença é observada no perfil variante de carga, mas que a agregação aumenta marginalmente na formulação de Fos/Nacl, e não na formulação de His/Tre. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 22-23
(00113) Exemplo 3: A. Formulação que contém mAB pode ser preparada como segue.
(00114) A formulação que contém anticorpo T1h é preparada de maneira semelhante à exibida no exemplo 1.
(00115) B. Estabilidade Química da Formulação Aquosa
(00116) As amostras incubadas em 2-8°C e as submetidas a desgaste de congelamento-descongelamento não demonstraram nenhuma variabilidade por troca iônica. Diferenças na degradação foram observadas apenas nas amostras incubadas a 40°C.
(00117) A cromatografia de Troca Iônica das amostras incubadas a 40°C demonstra claramente que as variantes acídicas aumentam em uma medida menor nas formulações de histidina, em comparação com as formulações baseadas em fosfato. Dentre as formulações de histidina, a formulação com trealose tem uma população variante acídica menor em comparação com a formulação de histidina-sacarose. As figuras 5 e 6 indicam que, quando observadas após intervalos de tempo definidos, as variantes de carga aumentaram a partir das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, a variante de carga acídica aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 63,798 para as formulações de fosfato- sacarose, enquanto aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 63,31 para formulações de fosfato-trealose.
(00118) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a variação de carga é menor em comparação com as formulações de fosfato. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, a variante de carga acídica aumenta apenas de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 54,02 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 32,63 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 49,59 para formulações de histidina- trealose.
(00119) Entende-se assim que histidina-trealose é, portanto, a formulação mais superior por Cromatografia de Troca Iônica.
(00120) Por SEC, as amostras incubadas a 2-8°C e as que sofreram desgaste por congelamento-descongelamento demonstraram pouca ou nenhuma diferença no padrão de degradação entre as quatro formulações avaliadas.
(00121) No entanto, as amostras incubadas a 40°C apresentaram diferenças na taxa em que o monômero foi reduzido conforme observado na Figura 8, que, consequentemente, influenciou o acúmulo de degradantes (HMWP e LMWP).
(00122) A Figura 8 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a redução na % de monômeros nas amostras aumentou das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, a redução na % de monômero em amostras cai de 93,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 87,4 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto cai de 92,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 85,0 para formulações de fosfato-trealose.
(00123) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a redução em % de monômero nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, cai apenas de 91,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 86,0 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 93,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 89,3 para formulações de histidina-trealose.
(00124) Isso mostra que a formulação de histidina/trealose segue uma taxa mais lenta para a degradação do monômero, enquanto as outras três formulações parecem degradar mais rápido. O mesmo é observado na Figura 9 no aumento de degradantes.
(00125) A Figura 9 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % de degradantes nas amostras caiu das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, o aumento na % de degradantes nas amostras aumenta de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,6 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 7,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 15,0 para formulações de fosfato-trealose.
(00126) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de degradantes nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas aumenta apenas de 8,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 14,0 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 6,7 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 10,7 para formulações de histidina-trealose.
(00127) Conforme indicado e explicado abaixo, uma observação mais atenta do aumento em HMWP e LMWP demonstra que o padrão do aumento de LMWP segue uma tendência semelhante em todas as formulações (figura 10), e é no acúmulo de HMWP que as formulações de histidina se separam das formulações baseadas em fosfato (figura 11). No fim de 5,5 semanas, é a formulação que contém histidina/trealose que tem tanto o maior monômero remanescente como a menor % de degradantes.
(00128) A Figura 10 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % LMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, o aumento na % de LMWP nas amostras aumenta de 5,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 9,2 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 5,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 11,5 para formulações de fosfato-trealose.
(00129) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de LMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas aumenta apenas de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,5 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 5,4 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 9,3 para formulações de histidina-trealose.
(00130) A Figura 11 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % HMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, o aumento na % de HMWP nas amostras aumenta de 2,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,3 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 2,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,5 para formulações de fosfato-trealose.
(00131) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de HMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 3 semanas, cai apenas de 1,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 1,4 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 1,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 1,5 para formulações de histidina-trealose.
(00132) O resultado de SEC na figura 14-17 indica o aumento dos agregados na amostra de fosfato/Nacl em quatro semanas em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) e que não há aumento observável na agregação na formulação de His/Tre em quatro semanas. O aumento na agregação é de aproximadamente 1,75% na amostra de volume de enchimento de 0,5 ml e de 1,41 % nas amostras de enchimento de 1 ml.
(00133) A Figura 16 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,52 [valor em PBS T4 após 4 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero aumentou de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,89 [valor em His-Tre T4 após 4 semanas].
(00134) A Figura 17 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,31 [valor em PBS T4 após 4 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero aumentou de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,90 [valor em His-Tre T4 após 4 semanas].
(00135) Uma cromatografia de troca catiônica fraca nas figuras 18- 21 indica que a distribuição de variante de carga não muda significativamente quando o Anticorpo monoclonal T1h é repetidamente congelado (-80°C) e descongelado no período do estudo de quatro semanas em formulações de histidina-trealose. No entanto, nas amostras de Fos/Nacl, o aumento nas quantidades de proteínas co-eluem com o pico de tampão a 40 minutos.
(00136) Por outro lado, outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 12-13
(00137) O estudo de estabilidade em estado congelado nas figuras 24-27 indica que nenhuma diferença é observada no perfil variante de carga, mas que a agregação aumenta marginalmente na formulação de Fos/Nacl, e não na formulação de His/Tre. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 22-23
(00138) Exemplo 4: A. Formulação que contém mAB pode ser preparada como segue.
(00139) A formulação que contém anticorpo T1h é preparada de maneira semelhante à exibida no exemplo 1.
(00140) B. Estabilidade Química da Formulação Aquosa
(00141) As amostras incubadas em 2-8°C e as submetidas a desgaste de congelamento-descongelamento não demonstraram nenhuma variabilidade por troca iônica. Diferenças na degradação foram observadas apenas nas amostras incubadas a 40°C.
(00142) A cromatografia de Troca Iônica das amostras incubadas a 40°C demonstra claramente que as variantes acídicas aumentam em uma medida menor nas formulações de histidina, em comparação com as formulações baseadas em fosfato. Dentre as formulações de histidina, a formulação com trealose tem uma população variante acídica menor em comparação com a formulação de histidina-sacarose. As figuras 5 e 6 indicam que, quando observadas após intervalos de tempo definidos, as variantes de carga aumentaram a partir das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, a variante de carga acídica aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 68,85 para as formulações de fosfato- sacarose, enquanto aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 33,91 para formulações de fosfato-trealose.
(00143) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a variação de carga é menor em comparação com as formulações de fosfato. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, a variante de carga acídica aumenta apenas de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 58,62 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 32,63 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 53,78 para formulações de histidina- trealose.
(00144) Entende-se assim que histidina-trealose é, portanto, a formulação mais superior por Cromatografia de Troca Iônica.
(00145) Por SEC, as amostras incubadas a 2-8°C e as que sofreram desgaste por congelamento-descongelamento demonstraram pouca ou nenhuma diferença no padrão de degradação entre as quatro formulações avaliadas.
(00146) No entanto, as amostras incubadas a 40°C apresentaram diferenças na taxa em que o monômero foi reduzido conforme observado na Figura 8, que, consequentemente, influenciou o acúmulo de degradantes (HMWP e LMWP).
(00147) A Figura 8 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a redução na % de monômeros nas amostras aumentou das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, a redução na % de monômero em amostras cai de 93,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 86,4 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto cai de 92,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 85,0 para formulações de fosfato-trealose.
(00148) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a redução em % de monômero nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, cai apenas de 91,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 85,7 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 93,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 89,5 para formulações de histidina-trealose.
(00149) Isso mostra que a formulação de histidina/trealose segue uma taxa mais lenta para a degradação do monômero, enquanto as outras três formulações parecem degradar mais rápido. O mesmo é observado na Figura 9 no aumento de degradantes.
(00150) A Figura 9 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % de degradantes nas amostras caiu das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, o aumento na % de degradantes nas amostras aumenta de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 13,6 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 7,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 15,0 para formulações de fosfato-trealose.
(00151) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de degradantes nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas aumenta apenas de 8,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 14,3 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 6,7 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 10,5 para formulações de histidina-trealose.
(00152) Conforme indicado e explicado abaixo, uma observação mais atenta do aumento em HMWP e LMWP demonstra que o padrão do aumento de LMWP segue uma tendência semelhante em todas as formulações (figura 10), e é no acúmulo de HMWP que as formulações de histidina se separam das formulações baseadas em fosfato (figura 11). No fim de 5,5 semanas, é a formulação que contém histidina/trealose que tem tanto o maior monômero remanescente como a menor % de degradantes.
(00153) A Figura 10 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % LMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, o aumento na % de LMWP nas amostras aumenta de 5,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 10,1 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 5,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 11,9 para formulações de fosfato-trealose.
(00154) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de LMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas aumenta apenas de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,8 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 5,4 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 9,4 para formulações de histidina-trealose.
(00155) A Figura 11 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % HMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, o aumento na % de HMWP nas amostras aumenta de 2,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,5 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 2,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,1 para formulações de fosfato-trealose.
(00156) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de HMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 4 semanas, cai apenas de 1,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 1,5 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 1,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 1,0 para formulações de histidina-trealose.
(00157) O resultado de SEC na figura 14-17 indica o aumento dos agregados na amostra de fosfato/Nacl em quatro semanas em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) e que não há aumento observável na agregação na formulação de His/Tre em quatro semanas. O aumento na agregação é de aproximadamente 1,75% na amostra de volume de enchimento de 0,5 ml e de 1,41 % nas amostras de enchimento de 1 ml.
(00158) A Figura 16 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,81 [valor em PBS T4 após 4 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero aumentou de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,88 [valor em His-Tre T4 após 4 semanas].
(00159) A Figura 17 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,28 [valor em PBS T4 após 2 semanas], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero caiu de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,83 [valor em His-Tre T4 após 2 semanas].
(00160) Uma cromatografia de troca catiônica fraca nas figuras 18- 21 indica que a distribuição de variante de carga não muda significativamente quando o Anticorpo monoclonal T1h é repetidamente congelado (-80°C) e descongelado no período do estudo de quatro semanas em formulações de histidina-trealose. No entanto, nas amostras de Fos/Nacl, o aumento nas quantidades de proteínas co-eluem com o pico de tampão a 40 minutos.
(00161) Por outro lado, outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 12-13
(00162) O estudo de estabilidade em estado congelado nas figuras 24-27 indica que nenhuma diferença é observada no perfil variante de carga, mas que a agregação aumenta marginalmente na formulação de Fos/Nacl, e não na formulação de His/Tre. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 22-23
(00163) Exemplo 5: A. Formulação que contém mAB pode ser preparada como segue.
(00164) A formulação que contém anticorpo T1h é preparada de maneira semelhante à exibida no exemplo 1.
(00165) B. Estabilidade Química da Formulação Aquosa
(00166) As amostras incubadas em 2-8°C e as submetidas a desgaste de congelamento-descongelamento não demonstraram nenhuma variabilidade por troca iônica. Diferenças na degradação foram observadas apenas nas amostras incubadas a 40°C.
(00167) A cromatografia de Troca Iônica das amostras incubadas a 40°C demonstra claramente que as variantes acídicas aumentam em uma medida menor nas formulações de histidina, em comparação com as formulações baseadas em fosfato. Dentre as formulações de histidina, a formulação com trealose tem uma população variante acídica menor em comparação com a formulação de histidina-sacarose. As figuras 5 e 6 indicam que, quando observadas após intervalos de tempo definidos, as variantes de carga aumentaram a partir das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, a variante de carga acídica aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 73,49 para as formulações de fosfato- sacarose, enquanto aumenta de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 73,24 para formulações de fosfato-trealose.
(00168) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a variação de carga é menor em comparação com as formulações de fosfato. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, a variante de carga acídica aumenta apenas de 33,91 [valor a 40°C em T0 revisado] para 62,12 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 32,63 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 57,21 para formulações de histidina- trealose.
(00169) Entende-se assim que histidina-trealose é, portanto, a formulação mais superior por Cromatografia de Troca Iônica.
(00170) Por SEC, as amostras incubadas a 2-8°C e as que sofreram desgaste por congelamento-descongelamento demonstraram pouca ou nenhuma diferença no padrão de degradação entre as quatro formulações avaliadas.
(00171) No entanto, as amostras incubadas a 40°C apresentaram diferenças na taxa em que o monômero foi reduzido conforme observado na Figura 8, que, consequentemente, influenciou o acúmulo de degradantes (HMWP e LMWP).
(00172) A Figura 8 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a redução na % de monômeros nas amostras aumentou das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, a redução na % de monômero em amostras cai de 93,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 84,1 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto cai de 92,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 84,1 para formulações de fosfato-trealose.
(00173) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, a redução em % de monômero nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, cai apenas de 91,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 83,5 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 93,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 87,1 para formulações de histidina-trealose.
(00174) Isso mostra que a formulação de histidina/trealose segue uma taxa mais lenta para a degradação do monômero, enquanto as outras três formulações parecem degradar mais rápido. O mesmo é observado na Figura 9 no aumento de degradantes.
(00175) A Figura 9 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % de degradantes nas amostras caiu das formulações de fosfato-sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, o aumento na % de degradantes nas amostras aumenta de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 15,9 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 7,4 [valor a 40°C em T0 revisado] para 15,9 para formulações de fosfato-trealose.
(00176) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de degradantes nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas aumenta apenas de 8,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 16,5 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 6,7 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 12,9 para formulações de histidina-trealose.
(00177) Conforme indicado e explicado abaixo, uma observação mais atenta do aumento em HMWP e LMWP demonstra que o padrão do aumento de LMWP segue uma tendência semelhante em todas as formulações (figura 10), e é no acúmulo de HMWP que as formulações de histidina se separam das formulações baseadas em fosfato (figura 11). No fim de 5,5 semanas, é a formulação que contém histidina/trealose que tem tanto o maior monômero remanescente como a menor % de degradantes.
(00178) A Figura 10 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % LMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, o aumento na % de LMWP nas amostras aumenta de 5,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,1 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 5,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 12,1 para formulações de fosfato-trealose.
(00179) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de LMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas aumenta apenas de 7,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 15,0 para formulações de histidina-sacarose, enquanto aumenta de 5,4 [valor a 40°C a T0 revisado] para apenas 11,8 para formulações de histidina-trealose.
(00180) A Figura 11 indica que, quando observado após intervalos de tempo definidos, o aumento na % HMWP nas amostras aumentou das formulações de fosfato- sacarose para a formulação de fosfato-trealose. Caso isso seja observado para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, o aumento na % de HMWP nas amostras aumenta de 2,0 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,8 para as formulações de fosfato-sacarose, enquanto aumenta de 2,2 [valor a 40°C em T0 revisado] para 3,8 para formulações de fosfato-trealose.
(00181) Por outro lado, quando as formulações de histidina são observadas, o aumento na % de HMWP nas amostras para as formulações incubadas a 40°C por um período de 5 semanas, cai apenas de 1,6 [valor a 40°C em T0 revisado] para 1,5 para as formulações de histidina-sacarose, enquanto cai de 1,3 [valor a 40°C em T0 revisado] para apenas 1,1 para formulações de histidina-trealose.
(00182) O resultado de SEC na figura 14-17 indica o aumento dos agregados na amostra de fosfato/Nacl em quatro semanas em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) e que não há aumento observável na agregação na formulação de His/Tre em quatro semanas. O aumento na agregação é de aproximadamente 1,75% na amostra de volume de enchimento de 0,5 ml e de 1,41 % nas amostras de enchimento de 1 ml.
(00183) A Figura 16 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 96,52 [valor em PBS T1 após 1 semana], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero aumentou de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 97,91 [valor em His-Tre T1 após 1 semana].
(00184) A Figura 17 indica que, quando observada após intervalos de tempo definidos, a distribuição de variantes de tamanho em amostras de 1 ml em congelamento-descongelamento repetido (-80°C) para % de monômero em solução salina de tampão de fosfato caiu de 97,67 [valor em PBS T0] para 97,42 [valor em PBS T1 após 1 semana], enquanto na formulação de histidina-trealose a % de monômero aumentou de 97,86 [valor em His-Tre em T0] para 98,02 [valor em His-Tre T1 após 1 semana].
(00185) Uma cromatografia de troca catiônica fraca nas figuras 18- 21 indica que a distribuição de variante de carga não muda significativamente quando o Anticorpo monoclonal T1h é repetidamente congelado (-80°C) e descongelado no período do estudo de quatro semanas em formulações de histidina-trealose. No entanto, nas amostras de Fos/Nacl, o aumento nas quantidades de proteínas co-eluem com o pico de tampão a 40 minutos.
(00186) Por outro lado, outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 12-13 (00187) O estudo de estabilidade em estado congelado nas figuras 24-27 indica que nenhuma diferença é observada no perfil variante de carga, mas que a agregação aumenta marginalmente na formulação de Fos/Nacl, e não na formulação de His/Tre. Outros parâmetros como pH, concentração, não indicam a superioridade de uma formulação sobre outra como indicado nas figuras 22-23.

Claims (8)

1. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE COMPREENDENDO O ANTICORPO T1h”, caracterizada por compreender uma quantidade de 25 mg/ml a 250 mg/ml de anticorpo, 10 mM a 30 mM de tampão de histidina, 1 a 15% de trealose, 0,001% a 0,05% de surfactante e pH de 5 a 7,5.
2. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação de histidina-trealose compreende ainda um crioprotetor.
3. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação de histidina-trealose compreende ainda um lioprotetor.
4. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado de um grupo que compreende polissorbato 20 e polissorbato 80.
5. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação de histidina-trealose compreende ainda um agente de volume.
6. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os agentes de volume são selecionados de um grupo que compreende glicina e manitol.
7. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a formulação de histidina- trealose é um bolo ou pó liofilizado.
8. “FORMULAÇÃO DE HISTIDINA-TREALOSE”, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a formulação de histidina- trealose é ainda reconstituída em água estéril para injeção ou água bacteriolítica para injeção.
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