KR101333276B1 - 항체의 제제 - Google Patents
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Abstract
항체, 완충제, 비이온성 계면활성제, 및 동결건조보호제/동결방지제를 함유하는 안정한 약학적 제제에 관한 것이다. 또한 상기 제제를 제조, 저장, 및 사용하는 방법이 개시된다.
Description
본 발명은 항체의 안정한 제제에 관한 것이다. 바람직한 안정한 제제는 하기를 함유한다: 25 - 250 mg/ml의 항체, 10 내지 30 mM의 완충제(buffering species), 1 내지 15% 폴리올(polyol), 0.001% 내지 0.05% 계면활성제 및 5 내지 7.5의 pH. 본 발명의 추가적 양태는 전술한 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
단일클론항체(Monoclonal antibody; mAbs)는 세포 표면에 발현된 생리적인 중요성이 있는 분자의 특성 해석을 가능하게 하고, 면역계의 세포 내에서 "백혈구 분화 클러스터(Leukocyte Differentiation Cluster)" 또는 항원(CD)을 밝혔다(scholossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15 (3);98). 개체발생 동안 림프구(lymphoid cell)의 분화 및 성숙, 세포 인식 및 부착의 메커니즘 및 면역 반응 동안 활성화 및 증식의 메커니즘에서 CD의 역할 정의는 진단 및 면역치료에서 이들의 각각의 mABs의 사용으로 이루어져서 유망한 결과를 얻었다(Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740
생명공학의 발전에서 최근의 진전은 약물로서 사용을 위한 충분히 큰 양으로 다양한 생물학적 활성 폴리펩티드를 제공하였다. 그러나, 폴리펩티드는 변성 및 수용성 및 비수용성 응집체의 형성을 포함한 물리적 불안정성, 및 가수분해, 산화 및 탈아민화와 같은 다양한 화학적 불안정성의 결과, 그들의 유효한 생물학적 활성을 상실할 수 있다. 액체 약학적 제제 중 폴리펩티드의 안정성은, 예를 들어, pH, 이온 강도, 온도, 동결-해동의 반복된 사이클과 같은 요인, 및 가공 동안 발생하는 것과 같은 기계적 전단력에 대한 노출에 의하여 영향받을 수 있다. 또한 응집체 형성 및 생물학적 활성의 상실은 물리적 교반(agitation) 및 용액 중 및 저장 바이알 내 액체-기체 계면에서 폴리펩티드 분자의 상호작용의 결과로 일어날 수 있다.
US20030190316은 글리신 완충제 및/또는 히스티딘 완충제 중에 항체를 함유하는 안정화된 제제(prepatation)에 관한 것이고, 단백질을 함유하는 안정화된 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 이는 염기성 아미노산 또는 염기성 아미노산 유도체 또는 이들의 염으로 pH를 조절하는 것을 포함한다.
다수의 액체 약학적 조성물이 그에 포함된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 안정화시키도록 제제화되었으나, 액체 제제 중 폴리펩티드의 분해는 의사(practitioner)에게 문제를 계속 야기한다. 결과적으로, 폴리펩티드 성분의 안정성을 촉진하는 생리학적으로 적합한 안정제를 함유하여, 그에 의해 그들의 치료상 유효성을 유지하는 추가의 약학적 조성물에 대한 요구가 존재한다.
발명의 목적(
OBJECTIVES
OF
THE
INVENTION
)
본 발명의 주된 목적은 항체, 완충제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 제제를 수득하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체 또는 그 단편, 완충제 및 동결건조보호제(lyoprotectant)를 함유하는 제제를 수득하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 항체의 안정한 제제를 수득하는 것이다.
발명의 서술(
STATEMENT
OF
THE
INVENTION
)
따라서 본 발명은 T1h 항체, 히스티딘 완충제, 트레할로스 당 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 제제로서, 상기 히스티딘 트레할로스 제제는 HMWP를 약 20% 감소시키는 것인 히스티딘-트레할로스 제제; a) 약 25 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, 및 b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제; a) 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, 및 c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제; 및 a) 약 100 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제, 및 d) 동결건조보호제 및/또는 동결방지제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제에 관한 것이다.
도 1: 연구 과정 동안 평가된 상이한 제제의 pH 변이성.
도 2: 연구 과정 동안 평가된 상이한 제제의 삼투압 값.
도 3: 상이한 조건에서 인큐베이션된 상이한 제제 중 샘플의 스펙트럼 및 람다 최대치가 다르지 않다는 것을 보여주는 정규화된 형광그래프.
도 4: 샘플의 수학력적(hydrodynamic) 반경 분석.
도 5: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 중 전하 변이체(charge variant) 분포.
도 6: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 중 전하 변이체 분포(히스티딘 트레할로스가 강조됨).
도 7: 인산염에 기반한 제제 중 더 높은 산성 변이체를 보여주는, 인산염 기반 제제 및 히스티딘에 기반한 제제의 이온 교환 크로마토그래피 프로파일의 오버레이(overlay).
도 8: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 내 단량체 %의 감소를 나타내는 도면.
도 9: 40℃에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의하여 분해물(degrandant) (%HMWP + % LMWP) 증가를 묘사하는 도면.
도 10: 시험된 네 가지 제제 중 LMWP의 증가. 히스티딘 트레할로스 제제가 나머지에 비해 미미하게 더 낮은 단편화(fragmentation)를 갖는다는 것을 제외하고 네 가지 제제는 모두 동일한 경향을 따르고 값이 매우 유사하다.
도 11: 시험된 네 가지 제제 중 HMWP 증가의 경향. 히스티딘을 함유하는 제제가 인산염 샘플에 비하여 더 낮은 응집을 나타낸다.
도 12: 상이한 제제 중 T1h 샘플의 pH 변이성.
도 13: 반복된 동결-해동 샘플의 단백질 농도.
도 14: 반복된 동결-해동 후 인산염 및 히스티딘 제제 중 1 ml 샘플의 SEC 프로파일.
도 15: 인산염 및 히스티딘 제제 중 0.5 ml 샘플의 SEC 프로파일의 비교.
도 16: 반복된 동결 및 해동을 거친 두 제제 중 1 ml 샘플의 SEC 데이터.
도 17: 반복된 동결 및 해동을 거친 두 제제 중 0.5 ml 샘플의 SEC 데이터.
도 18: 인산염 샘플 중 40 분에 예상되는 응집체 용출을 보여주는 1 ml 샘플의 이온 교환 크로마토그래피 프로파일의 오버레이.
도 19: 히스티딘 샘플이 아닌, 인산염 샘플 중 40 분에 응집체 용출을 보여주는 0.5 ml 샘플의 오버레이.
도 20: 인산염 및 히스티딘 제제 중 반복된 동결 및 해동을 거친 1 ml 샘플의 IEX 데이터.
도 11: 인산염 및 히스티딘 제제 내 반복된 동결 및 해동을 거친 0.5 ml 샘플의 IEX 데이터.
도 22: 동결 상태 샘플 중 pH 변이성.
도 23: 동결 상태 안정성 샘플 중 단백질 농도.
도 24: 인산염 응집의 미미한 증가를 보여주는 동결 상태 안정성의 SEC 오버레이.
도 25: 동결 상태 안정성 샘플 중 크기 변이체(variant) 분포의 SEC 데이터.
도 26: 동결 상태 샘플의 IEX 크로마토그램 오버레이.
도 27: 인산염 및 히스티딘 중 동결 상태 안정성의 IEX 데이터.
도 2: 연구 과정 동안 평가된 상이한 제제의 삼투압 값.
도 3: 상이한 조건에서 인큐베이션된 상이한 제제 중 샘플의 스펙트럼 및 람다 최대치가 다르지 않다는 것을 보여주는 정규화된 형광그래프.
도 4: 샘플의 수학력적(hydrodynamic) 반경 분석.
도 5: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 중 전하 변이체(charge variant) 분포.
도 6: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 중 전하 변이체 분포(히스티딘 트레할로스가 강조됨).
도 7: 인산염에 기반한 제제 중 더 높은 산성 변이체를 보여주는, 인산염 기반 제제 및 히스티딘에 기반한 제제의 이온 교환 크로마토그래피 프로파일의 오버레이(overlay).
도 8: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 내 단량체 %의 감소를 나타내는 도면.
도 9: 40℃에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의하여 분해물(degrandant) (%HMWP + % LMWP) 증가를 묘사하는 도면.
도 10: 시험된 네 가지 제제 중 LMWP의 증가. 히스티딘 트레할로스 제제가 나머지에 비해 미미하게 더 낮은 단편화(fragmentation)를 갖는다는 것을 제외하고 네 가지 제제는 모두 동일한 경향을 따르고 값이 매우 유사하다.
도 11: 시험된 네 가지 제제 중 HMWP 증가의 경향. 히스티딘을 함유하는 제제가 인산염 샘플에 비하여 더 낮은 응집을 나타낸다.
도 12: 상이한 제제 중 T1h 샘플의 pH 변이성.
도 13: 반복된 동결-해동 샘플의 단백질 농도.
도 14: 반복된 동결-해동 후 인산염 및 히스티딘 제제 중 1 ml 샘플의 SEC 프로파일.
도 15: 인산염 및 히스티딘 제제 중 0.5 ml 샘플의 SEC 프로파일의 비교.
도 16: 반복된 동결 및 해동을 거친 두 제제 중 1 ml 샘플의 SEC 데이터.
도 17: 반복된 동결 및 해동을 거친 두 제제 중 0.5 ml 샘플의 SEC 데이터.
도 18: 인산염 샘플 중 40 분에 예상되는 응집체 용출을 보여주는 1 ml 샘플의 이온 교환 크로마토그래피 프로파일의 오버레이.
도 19: 히스티딘 샘플이 아닌, 인산염 샘플 중 40 분에 응집체 용출을 보여주는 0.5 ml 샘플의 오버레이.
도 20: 인산염 및 히스티딘 제제 중 반복된 동결 및 해동을 거친 1 ml 샘플의 IEX 데이터.
도 11: 인산염 및 히스티딘 제제 내 반복된 동결 및 해동을 거친 0.5 ml 샘플의 IEX 데이터.
도 22: 동결 상태 샘플 중 pH 변이성.
도 23: 동결 상태 안정성 샘플 중 단백질 농도.
도 24: 인산염 응집의 미미한 증가를 보여주는 동결 상태 안정성의 SEC 오버레이.
도 25: 동결 상태 안정성 샘플 중 크기 변이체(variant) 분포의 SEC 데이터.
도 26: 동결 상태 샘플의 IEX 크로마토그램 오버레이.
도 27: 인산염 및 히스티딘 중 동결 상태 안정성의 IEX 데이터.
본 발명은 T1h 항체, 히스티딘 완충제, 트레할로스 당 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 제제로서, 상기 히스티딘-트레할로스 제제는 HMWP를 약 20% 감소시키는 것인 히스티딘-트레할로스 제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 히스티딘-트레할로스 제제로서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 동결방지제, 동결건조보호제, 계면활성제 및 벌킹제(bulking agent) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 히스티딘-트레할로스 제제에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 수크로오스 제제, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 트레할로스 제제, 및 약 11% HMWP를 감소시키는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여, 상기 히스티딘 트레할로스 제제는 HMWP를 약 20% 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(polysorbate) 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 벌킹제는 글리신 및 만니톨을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 a) 약 25 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, 및 b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 a) 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, 및 c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항제 제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 a) 약 100 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제, 및 d) 동결건조보호제 및/또는 동결방지제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 히스티딘-트레할로스 제제로서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 동결방지제, 동결건조보호제, 계면활성제 및 벌킹제(bulking agent) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 히스티딘-트레할로스 제제에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 수크로오스 제제, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 트레할로스 제제, 및 약 11% HMWP를 감소시키는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여, 상기 히스티딘 트레할로스 제제는 HMWP를 약 20% 감소시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(polysorbate) 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 벌킹제는 글리신 및 만니톨을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 a) 약 25 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, 및 b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 a) 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, 및 c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항제 제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은 a) 약 100 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제, 및 d) 동결건조보호제 및/또는 동결방지제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제에 관한 것이다.
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본 발명의 일 구체예에서, 상기 제제는 동결건조된(lyophilized) 케이크(cake) 또는 분말(powder)이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제제는 주사용 멸균수 또는 주사용 용균수(bacteriolytic water)에서 재구성된다.
본 발명의 주된 목적은 항체, 완충제, 폴리올 및 계면활성제를 함유하는 안정한 액체 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 조성물의 제제는 유리하게 저장시 안정한 조성물을 가져오는 것으로 확인되었다. 저장시 안정함은 면역글로불린이 상당히 응집하지도 않고 분해되지도 않고 인-비트로(in-vitro) 및 인-비보(in-vivo) 활성의 허용가능한 수준을 유지함을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 다른 양태는 상기 항체 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 항체를 치료 활성 성분(therapeutically active component)으로 함유하는 액체 약학적 조성물 및 그의 제조에 유용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 약학적 조성물 또는 제제와 관련하여 용어 "액체(liquid)"는 용어 " 수성(aqueous)"을 포함하는 것으로 의미도 된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 천연(원형), 합성, 및 재조합 항체 및 단백질, 및 본 명세서의 다른 곳에서 한정하는 이들의 생물학적으로 활성인 변이체를 포함한다. "치료 활성 성분(therapeutically active component)"은 항체가 구체적으로 조성물에 통합되어, 상기 약학적 조성물이 개체에 투여되었을 경우 개체 내 질병 또는 증상의 치료, 예방, 또는 진단과 관련하여 원하는, 치료 반응을 가져옴을 의미한다.
더 구체적으로, 본 발명의 조성물은 치료 활성 성분이 액체 약학적 제제 중에서 저장 동안 일반적으로 응집체 형성을 나타내는 항체를 포함하는 것인 안정화된 액체 약학적 조성물이다. "응집체 형성(aggregate formation)"은 가용성이거나 또는 용액으로부터 침전되어 큰 가시적 응집체로 존재할 수 있는 올리고머의 형성을 초래하는 폴리펩티드 분자 간의 물리적 상호작용을 의미한다. "저장 동안(during storage)"은 일단 제조된 액체 약학적 조성물 또는 제제가, 즉시 개체에 투여되지 않음을 의미한다. 오히려, 제조 후에, 액체 형태, 또는 추후에 액체 형태 또는 개체에 투여하기 적합한 다른 형태로 재구성을 위해 동결 상태, 또는 건조된 형태로 저장을 위해 포장된다. 액체 약학적 조성물의 저장 동안 폴리펩티드에 의한 응집체 형성은 폴리펩티드의 생물학적 활성에 불리한 영향을 미칠 수 있고, 약학적 조성물의 치료상 효능의 상실을 야기할 수 있다. 더욱이, 응집체 형성은 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물이 주입 시스템(infusion system)을 사용하여 투여되었을 경우 튜브(tubing), 막(membrane), 또는 펌프의 폐색과 같은 다른 문제를 유발할 수 있다.
본 발명의 안정화된 액체 약학적 조성물은 상당한 양의 완충제를 더 함유한다. 이 완충제는 주로 인산염(phosphate) 또는 히스티딘(Histidine)을 포함한다. 제제 중 완충제는 pH를 유지하도록 의도된다. 인산염 제제의 pH는 7에 맞추고 히스티딘 제제의 pH는 6에 맞추었고, 이는 이러한 pH가 이 완충제의 완충 범위 내에 있기 때문이다.
본 발명의 조성물에 첨가된 계면활성제를 안정화시키는 양은 항체 함유 조성물에서 응집체 또는 혼탁도의 형성을 억제하기에 충분한 양이다. 이러한 응집체 형성은 예를 들어, 장기간 저장, 기계 교반, 동결 및 해동에서 일어날 수 있다. 응집 또는 혼탁도의 유의적인 억제가 관찰되고 상기 혼탁도/응집체 형성은 계면활성제를 함유하지 않는 비교할만한 제제에서보다 계면활성제를 포함하는 항체 함유 조성물 에서 10% 이상 더 낮고, 바람직하게 50% 이상 더 낮고, 더욱 바람직하게 70% 이상 더 낮고, 가장 바람직하게 90% 이상 더 낮다. 용액 내 단백질 분자를 유지하는 폴리소르베이트 80의 능력을 결정하기 위하여 320 nm에서의 흡광도에 의한 항체 함유 조성물 및 바이알(vial)의 시각적 조사는 모니터링되어야 한다. 용액 내 분자의 산란 결과로서 주로 발생하는 320 nm에서의 흡광도는 폴리소르베이트 80이 결여된 샘플 내에서 더욱더 확연하다.
본 명세서에서 사용된 "계면활성제(Surfactant)"는 친수성 영역 및 소수성 영역을 갖는 디터전트(detergent)를 포함하는 것으로 정의되고, 비이온성, 양이온성, 음이온성 및 쌍성 이온성 디터전트를 포함한다. 적합한 계면활성제는 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate)(폴리소르베이트(polysorbate) 80 또는 "트윈(TWEEN)" 80으로도 알려짐), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(폴리소르베이트 20 또는 "트윈" 20으로도 알려짐), 또는 N-라우릴사르코신(N-laurylsarcosine)을 포함한다. 비이온성 계면활성제가 본 명세서에 기재된 제제를 위하여 바람직하다. 그와 같은 비이온성 계면활성제는 하기의 계면활성제, 예를 들어 폴리옥사머(polyoxamer) 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어, 폴리소르베이트(polysorbate) 20 또는 폴리소르베이트 80으로부터 선택될 수 있다. 폴리소르베이트 80이 본 발명의 조성물을 위해 바람직하다. 상기 계면활성제는 0.01 중량% - 0.5 중량%의 농도로 존재할 수 있다.
면역글로불린 서브유닛(subunit) 폴리펩티드는 각각 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 대부분의 종에서, 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region), 또는 VH 도메인, 및 경쇄 가변 영역(light chain variable region), 또는 VL 도메인이 조합되어 "상보성 결정영역(complementarity determining region)" 또는 CDR, 특정 에피토프(epitope)를 위한 항원 결합 부위에 특이적으로 기여하는 면역 글로불린 분자의 부분으로 이루어진 항원 결합 도메인을 형성한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄 각각은 3개의 CDR을 가지며, 이들이 조합되어 면역글로불린 항원 결합 부위를 형성한다. 면역글로불린 분자의 "항원 결합 도메인"은 일반적으로, 예외가 없지는 않지만, 이황화 결합에 의하여 결합된 하나의 중쇄의 가변 도메인의 적어도 일 부분과 하나의 경쇄의 가변 도메인의 적어도 일 부분으로 구성된다. Fc 영역은 항체의 효과기(effector) 기능에 필수적이다. 효과기 기능은 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)의 개시, 식세포 활동(phagocytosis) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)의 개시, 및 세포통과배출(transcytosis)에 의한 세포 장벽을 통한 항체의 이동을 포함한다. 아울러, 상기 Fc 영역은 클래스 IgG의 항체의 혈청 반감기(serum half-life)를 유지하는데 중요하다(Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2:77-94 (1995).
추가의 양태에서, 본 발명은 변형된 항체 또는 Fab, Fc 또는 이들의 부분으로부터 선택된 기능성 단편을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이들의 기능성 단편을 함유하는 약학적 조성물을 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent) 또는 담체(carrier)와 함께 제공한다.
상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 완충제, 하나 또는 그 이상의 폴리올, 및 하나 또는 그 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능 담체는 염수(saline), 멸균(sterile)수, 인산완충염수(phosphate buffered saline), 및 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 완충제(buffering agent), 분산제(dispersing agent), 및 환자에게 전달하기 위하여 적합한 비활성의 무독성 물질이 본 발명의 조성물 내에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 투여에 적합한 용액일 수 있고, 전형적으로 멸균이고 원치 않는 입자성 물질은 포함하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 완충제는 바람직하게는 인산염이나 히스티딘이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 제제에서 사용되는 완충제는 아세트산염(acetate), 숙신산염(succinate), 히스티딘 및 인산염에 한정되지 않고, 이들은 그 자체 또는 조합하여 사용될 수 있다.
바람직하게 제제의 용액의 pH는 5 내지 7.5의 범위에 있으며, 상기 용액의 pH는 바람직하게 5.5 내지 6의 범위에 있으며, 필요하다면, 최종 pH는 원하는 수준으로 조절된다.
본 발명에서 사용되는 폴리올은 환원당(reducing sugar)이며, 이는 항체를 위한 안정제로서 여러 역할을 하며, 또한 장성 조절제(tonicity modifier) 및 동결방지제 및 동결건조보호제가 제제에 포함된다. 가장 바람직하게 본 발명의 제제에서 사용되는 폴리올은 수크로오스 또는 트레할로스와 같은 비환원성 당이다.
또한 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 약학적으로 허용가능한 부형제가 상기 조성물의 일 부분을 형성할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 다양한 벌킹제를 포함하며, 상기 벌킹제는 글리신 또는 만니톨로부터 선택된다.
일 구체예에서, 제제의 당 성분(수크로오스 및 트레할로스)은 다면적인 목적을 갖는다: 당은 항체를 위한 안정제로서 작용하며, 항체를 분해로부터 보호한다; 이들은 동결건조 과정(동결 및 건조를 모두 포함함)동안 항체를 보호하는 동결 방지제/동결건조 보호제(cryo/lyo protectant)이며; 또한 이들은 장성 조절제로, 이들의 농도는 등장성 산물을 제공하도록 조절될 수 있다. 장성(Tonicity)은 이와 같이 피하로 투여되는 산물에서 중요하고, 등장성 산물은 주사 부위에서 자통(sting)을 유의성 있게 줄일 수 있기 때문이다. 수크로오스 및 트레할로스는 평가를 위하여 선별되는데 이들은 모두 비환원성 당이고 단백질을 안정화하는데 널리 사용되어왔기 때문이다. 당의 농도는 피하 투여를 위한 등장성 용액을 제공하도록 선택된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 제제(formulation) 스크리닝 연구의 결과는 2-8℃ 및 동결/해동을 거쳤을 때서 인큐베이션되었을 경우, 항체의 물리적 안정성은 인산염-기반한 제제에 비해, HMWP 또는 LMWP의 유의적인 차이가 제제 간에 관찰되지 않았음을 나타낸다. 그러나, 40℃에히스티딘을 함유한 완충제에서 특히 응집과 관련하여 증가한다(도 11). 히스티틴 트레할로스 제제 중 T1h 샘플은 지속적으로 단량체의 가장 높은 백분율을 나타냈고 결론적으로 네 가지 시험된 제제 중 가장 낮은 분해 백분율을 나타내었다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 전하 변이체 분포는 2-8℃에서 또는 동결/해동 하에서 항체의 인큐베이션에 의하여 변하지 않았다. 그러나, 40℃에서의 항체의 인큐베이션은 각각의 제제에 의하여 제공된 안정화의 정도에서 차이를 가져왔다. 하지만 히스티딘에 기반한 제제는 인산염 제제에 비하여 산성(acidic) 변이체를 축적하는 것이 더 느렸다. 히스티딘 제제 중에서, 히스티딘 트레할로스는 보다 낮은 산성 변이체를 지속적으로 나타냈으며, 따라서 히스티딘 수크로오스에 비하여 더 높은 주된 피크 %를 나타내었다(도 5: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 내 전하 변이체 분포. 도 6: 40℃에서 인큐베이션된 샘플 내 전하 변이체 분포). 항체의 효능/생물학적 활성은 어느 제제 및/또는 조건 내에서 변화하지 않았으며, 표준과 유사하다. 활성/효능 검사가 아직 다른 제제를 구별할 수 있을 정도로 충분히 개발되지 않았으므로 이러한 결론에 도달할 수 있었을 수 있다. 히스티딘에 기반한 제제는 인산염 제제보다 항체를 분해로부터 더 우수하게 보호할 수 있다는 사실의 관점에서, 이는 고려하기에 중요한 양태일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 형광 분석기(fluorescence spectroscopy) 및 DSC에 의하여 평가된 항체의 구조적 안정성은 시험된 제제에서 유의성 있는 변화를 겪지 않았다. 형광 실험에서 람다 최대치(항체의 3-D 구조의 변화를 가리킬 수 있음)의 변화가 없다(도 3). 유사하게, TO 샘플 및 40℃ 샘플에서 관찰된 녹는점에서 유의적인 변화가 없고, 이는 항체의 상이한 도메인은 연구의 초기와 거의 동일한 방식으로 여전히 언폴딩(unfold)되고 있음을 나타낸다.
본 발명은 하기의 실시예에서 더 정의된다. 이러한 실시예는 상기 발명의 바람직한 구체예를 나타내는 반면, 오직 예시(illustration)로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 전술된 검토 및 이러한 실시예로부터, 통상의 기술자는 본 발명의 필수적 특징을 알아낼 수 있으며, 이들의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 맞게 개조하기 위해 다양한 변형 및 수정을 수행할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예로부터 더 잘 이해될 수 있다. 그러나, 통상의 기술자는 이러한 실시예가 단지 그 후에 따르는 청구항에서 정의된 본 발명의 예시라는 것을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에 의하여 상세히 설명된다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타낸다.
실시예(
EXPERIMENTAL
EXAMPLE
)
A. 하기의 방식으로 mAB를 함유하는 제제를 제조할 수 있다.
정제된 항체를 접선 유동 여과(Tangential Flow filtration; TFF) 또는 UF/DF를 이용하여 요구되는 높은 농도로 농축시키고 그 이후에 완충제를 제제 완충제(formulation buffer)로 교환한다.
상기 정제된 항체를 접선 유동 여과(TFF) 또는 UF/DF를 이용하여 20 내지 30 mg/ml까지 농축하고, 그 이후에 완충제를 제제 완충제로 교환한다. 그 후 이 샘플을 동결건조시키고, 동결건조시킨, 케이크(cake)를 요구되는 최종 의약 산물 농도를 달성하기 위하여 주사용 수(WFI)의 적절한 부피로 재구성한다.
벌크 의약 물질을 동결건조시키고, 그 후 요구되는 농도로 제제 완충제에 용해시킨다.
항체를 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 상호반응 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction chromatography)와 같은 칼럼크로마토그래피 기법을 사용하여 요구되는 높은 농도까지 농축시킨다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제이다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤고, 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도면에서 마찬가지로 관찰된다.
HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도면), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다 - 도면. 5.5 주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 mAB가 인산염/Nacl 및 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다.
그러나, Phos/Nacl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/Nacl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
A. 하기의 방식으로 mAB를 함유하는 제제를 제조할 수 있다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 57.48까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 57.46까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 49.11까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 45.48까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.1까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.4까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 87.9까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 90.5까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.9까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.6까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.1까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.5까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 9.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.6까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 10.7까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 8.3까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.3까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.4까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.2까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.23[PBS T4 - 4주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.72[T4-4주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 95.87[PBS T4 - 4주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.82[T4-4주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 57.48까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 57.46까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 49.11까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 45.48까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.1까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.4까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 87.9까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 90.5까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.9까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.6까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.1까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.5까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 9.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.6까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 10.7까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 8.3까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.3까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 2주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.4까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.2까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.23[PBS T4 - 4주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.72[T4-4주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 95.87[PBS T4 - 4주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.82[T4-4주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
A. 하기의 방식으로 mAB를 함유하는 제제를 제조할 수 있다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 63.79까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 63.31까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 54.02까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 49.59까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.4까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 85.0까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 86.0까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 89.3까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 14.0까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 10.7까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 9.2까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.5까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.5까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.3까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.3까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.5까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.4까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 증가한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.52[PBS T3 - 3주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.89[T3-3주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.31[PBS T3 - 3주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.90[T3-3주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 63.79까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 63.31까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 54.02까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 49.59까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.4까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 85.0까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 86.0까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 89.3까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 14.0까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 10.7까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 9.2까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.5까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.5까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.3까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 3주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.3까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.5까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 3주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.4까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 증가한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.52[PBS T3 - 3주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.89[T3-3주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.31[PBS T3 - 3주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.90[T3-3주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
A. 하기의 방식으로 mAB를 함유하는 제제를 제조할 수 있다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 68.85까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 68.95까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 58.62까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 53.78까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 86.4까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 85.0까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 85.7까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 89.5까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 13.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 14.3까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 10.5까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 10.1까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.9까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.8까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.4까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.5까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.1까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.0까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.81[PBS T2 - 2주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.88[T2-2주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.28[PBS T2 - 2주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.83[T2-2주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 68.85까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 68.95까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 58.62까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 53.78까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 86.4까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 85.0까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 85.7까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 89.5까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 13.6까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.0까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 14.3까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 10.5까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 10.1까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.9까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.8까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 9.4까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 4주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.5까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.1까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 4주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.0까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.81[PBS T2 - 2주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.88[T2-2주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.28[PBS T2 - 2주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.83[T2-2주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
A. 하기의 방식으로 mAB를 함유하는 제제를 제조할 수 있다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 73.49까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 73.24까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 62.12까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 57.21까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 84.1까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 84.1까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 83.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.1까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 15.9까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.9까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 16.5까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.9까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.1까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.1까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 15.0까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.8까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.8까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.8까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.1까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.88[PBS T1 - 1주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.91[T1-1주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 97.42[PBS T1 - 1주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 98.02[T1-1주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
항체 T1h를 함유하는 제제는 실시예 1에 개시된 내용과 유사한 방식으로 제조된다.
B. 수성 제제의 화학적 안정성
2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결(freeze)-해동(thaw) 스트레스를 거친 샘플은 이온 교환에 의하여 어떤 변이성도 보이지 않았다. 분해의 차이는 40℃에서 인큐베이션된 샘플에서만 관찰하였다.
40℃에서 인큐베이션된 샘플의 이온 교환 크로마토그래피는 명확하게 인산염에 기반한 제제에 비하여, 산성(acidic) 변이체가 히스티딘 제제에서 더 낮은 정도로 증가함을 보여준다. 히스티딘 제제 중에서, 트레할로스 함유 제제는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여 더 낮은 산성 변이체 집단을 갖는다. 도 5 및 6은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5 주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 인산염-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 73.49까지 증가하고, 인산염-트레할로스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 73.24까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우 전하 변이는 인산염 제제에 비하여 더 낮다. 이것을 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제를 관찰하는 경우, 산성 전하 변이체가 히스티딘-수크로오스 제제에서 33.91[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 62.12까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 32.63[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 57.21까지만 증가한다.
따라서 히스티딘 트레할로스는 이온 교환 크로마토그래피 기준으로 탁월한 제제임이 이해된다.
SEC에 의하여, 2-8℃에서 인큐베이션된 샘플 및 동결-해동에 의한 스트레스를 거친 샘플은 평가된 네 가지 제제 중에서 분해 패턴에서 거의 또는 전혀 차이가 없었다.
그러나, 40℃에서 인큐베이션된 샘플은 도 8에서 관찰된 것처럼 단량체가 감소하는 속도에서 차이를 보여주었으며, 이는 결론적으로 분해물(HMWP 및 LMWP)의 축적에 영향을 미쳤다.
도 8은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 단량체 %의 감소가 인산염-수크로오스 제제에서 93.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 84.1까지 감소하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 92.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 84.1까지 감소한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 단량체 %의 감소는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 91.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 83.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 93.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 87.1까지만 감소한다.
이는 히스티딘/트레할로스 제제는 단량체의 분해에 대하여 더 낮은 속도를 따름을 보이고 나머지 세가지 제제는 더 신속하게 분해된다는 것을 보여준다. 분해물의 증가가 도 9에서 마찬가지로 관찰된다.
도 9는 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 감소하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 분해물 %의 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 15.9까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 7.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 15.9까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 분해물 %의 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 8.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 16.5까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 6.7[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.9까지만 증가한다.
하기 표시되고 설명된 바와 같이, HMWP 및 LMWP의 증가의 보다 세밀한 관찰은 LMWP 증가의 패턴이 모든 제제에서 유사한 경향을 따름을 보여주고(도 10), 히스티딘 제제가 이들을 인산염에 기반한 제제로부터 구별되게 하는 것은 HMWP의 축적이다(도 11). 5.5주(week)의 종료시, 이는 잔존하는 단량체에의 가장 높은 비율 및 아울러 가장 낮은 분해물 %를 갖는 것은 히스티딘/트레할로스 함유 제제이다.
도 10은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제로부터 인산염 트레할로스 제제까지 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 LMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 5.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 12.1까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 5.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 12.1까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 LMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 7.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 15.0까지만 증가하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 5.4[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 11.8까지만 증가한다.
도 11은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제 내지 인산염 트레할로스 제제에서 증가하였음을 나타낸다. 이것을 5주의 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제에서 관찰하는 경우, 샘플 내 HMWP % 증가가 인산염-수크로오스 제제에서 2.0[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 3.8까지 증가하고, 반면에 인산염-트레할로스 제제에서 2.2[보정된 T0에서 40℃에서의 값]로부터 3.8까지 증가한다.
반면에, 히스티딘 제제를 관찰하는 경우, 5주 기간 동안 40℃에서 인큐베이션된 제제의 샘플 내 HMWP % 증가는, 히스티딘-수크로오스 제제에서 1.6[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.5까지만 감소하고, 반면에 히스티딘-트레할로스 제제에서 1.3[보정된 T0에서 40℃에서의 값]으로부터 1.1까지만 감소한다.
도 14-17의 SEC 결과는 4주에 걸쳐 반복된 동결 해동(-80℃)하에서 인산염(Phosphate; Phos)/Nacl 샘플 내 응집체가 증가하고 4주에 걸쳐 His/Tre 제제에서 응집의 증가는 관찰되지 않음을 나타낸다. 응집의 증가는 0.5 ml 충진(fill) 부피 샘플에서 약 1.75%이고, 1 ml 충진 샘플에서 1.41%이다.
도 16은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 1 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 96.88[PBS T1 - 1주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 97.91[T1-1주 후 His-Tre에서의 값]까지 증가하였다.
도 17은 정해진 시간 간격 후 관찰하는 경우, 인산염 완충제 염수 중 단량체 %의 경우 반복된 동결 해동(-80℃) 하에 0.5 ml 샘플 내 크기 변이체 분포가 97.67[PBS T0에서의 값]로부터 97.42[PBS T1 - 1주 후에서의 값]까지 감소하였고, 히스티딘-트레할로스 제제 중 단량체 %는 97.86[T0에서 His-Tre에서의 값]으로부터 98.02[T1-1주 후 His-Tre에서의 값]까지 감소하였다.
도 18-21의 약한(weak) 양이온 교환 크로마토그래피는 T1h 단일클론항체가 히스티딘 트레할로스 제제에서 4주 연구 기간에 걸쳐 반복적으로 동결(-80℃) 및 해동되는 경우 전하 변이체 분포가 유의적으로 변하지 않음을 나타낸다. 그러나, Phos/NaCl 샘플에서, 증가되는 양의 단백질이 40분에서 완충제 피크와 함께 동시-용출된다.
반면에, pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 12-13에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
도 24-27의 동결된 상태 안정성 연구는 전하 변이체 프로파일(profile)에서 관찰되는 차이가 없고, 그러나 응집은 Phos/NaCl 제제에서 미미하게 증가하고 His/Tre 제제에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. pH, 농도와 같은 다른 파라미터는 도 22-23에서 표시된 바와 같이 다른 것 대비 하나의 제제의 탁월함을 나타내지 않는다.
Claims (17)
- T1h 항체, 히스티딘 완충제, 트레할로스 당 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 제제로서, 상기 히스티딘 트레할로스 제제는 HWMP를 약 20% 감소시키는 것인 히스티딘-트레할로스 제제.
- 청구항 1에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 동결방지제, 동결건조보호제, 계면활성제 및 벌킹제(bulking agent) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 히스티딘-트레할로스 제제.
- 청구항 1에 있어서, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 수크로오스 제제, HMWP를 약 90% 증가시키는 인산염 트레할로스 제제, 및 HMWP를 약 11% 감소시키는 히스티딘 수크로오스 제제에 비하여, 상기 히스티딘 트레할로스 제제는 HMWP를 약 20% 감소시키는 것인 히스티딘-트레할로스 제제.
- 청구항 2에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(polysorbate) 20 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 히스티딘-트레할로스 제제.
- 청구항 2에 있어서, 상기 벌킹제는 글리신 및 만니톨을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 히스티딘-트레할로스 제제.
- a) 약 25 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체, 및
b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제. - a) 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체,
b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제, 및
c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제. - a) 약 100 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 T1h 항체,
b) pH 5 내지 pH 7.5를 제공하는 히스티딘 완충제,
c) 약 0.001% 내지 약 0.05%의 비이온성 계면활성제, 및
d) 동결건조보호제 또는 동결방지제를 함유하는 히스티딘-트레할로스 항체 제제. - 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 동결건조된 케이크(cake) 또는 분말(powder)인 것인 제제.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 주사용 멸균수 또는 주사용 용균수(bacteriolytic water)에서 더 재구성되는 것인 제제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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