KR20200060543A - 세포 배양 시스템 - Google Patents

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KR20200060543A
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도날드 이. 잉버
김현정
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본원에 기술된 발명의 실시형태는 장 세포, 조직 및/또는 오르가노이드를 체외에서 배양 및/또는 유지하기 위한 시스템과 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 방법과 시스템에 따라 배양된 세포, 조직 및/또는 오르가노이드는 천연의 장 상피 구조와 거동을 모사 또는 재현할 수 있을 뿐만 아니라 장 미생물총의 공배양도 지원할 수 있다.

Description

세포 배양 시스템{CELL CULTURE SYSTEM}
<관련 출원>
본 출원은 2011년 2월 28일 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/447,540호의 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 그 출원의 내용은 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
<정부 지원>
본 발명은 부분적으로 미국 국립환경보건원으로부터의 보조금 제 ES016665-01A1 호 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일부 권리가 있다.
<기술 분야>
본원에 기술된 발명의 시스템과 방법은 체외 장 오르가노이드(intestinal organoid)의 배양 및 유지에 관한 것이다.
약물 개발은, 많은 비용이 들고, 노동 집약적이며, 시간 소모가 크고 윤리적으로 의문의 여지가 있는 동물 모델의 사용에 의존하기 때문에, 제약이 있었다.1 더 염려되는 것은 동물 모델은 종종 인간에게서 얻어지는 결과를 예측하지 못하며2-3, 이는 약물 또는 영양소의 대사, 수송 및 경구 흡수에 관한 시험을 다룰 때 특히 문제로 된다.4-5 이러한 이유로, 경상피(trans-epithelial) 장벽 및 수송 연구8-9를 가능하게 하는 Transwell 필터 인서트(filter inserts)6-7를 활용하는 세포 배양 시스템, 및 장기 배양도 지원하는 미니어쳐화 마이크로유체 모델10-14 등의, 인간 장 기능의 체외 모델의 개발에 대한 관심이 늘어났다. 다른 이들은, 인간 장 융모의 형상, 크기 및 밀도를 모사(mimic)하는 마이크로가공된 하이드로젤 기체(substrate) 상에서 인간 장 상피(예, Caco-2) 세포를 배양함으로써 체외에서 장 내벽의 정상 3차원(3D) 구조를 재생성하는 것을 시도하였다.11 그러나, 존재하는 체외 장 모델 중 어느 것도, 정상적인 기관 생리15, 뿐만 아니라 크론씨 병(Crohn's disease)이나 다른 장 장애의 발병16-17에 결정적인, 살아있는 장의 기계적으로 활성인 마이크로 환경(연동 운동과 내강(lumen) 내부의 유체 흐름)을 재현할 수 없다. 존재하는 체외 장 모델의 다른 한계는, 살아있는 장에서는 통상적으로 일어나는, 배양된 장 상피의 내강 표면 상에서 살아있는 미생물을 연장된 기간 동안 기르는 것이 가능하지 않았던 것이다. 이는 핵심적인 문제인데, 왜냐하면 미생물 공생자(microbial symbionts)는, 통상, 장 장벽 기능, 약물과 화학물질의 대사 및 흡수, 및 많은 질병에 상당한 기여를 하기 때문이다.18-22 중요한 미생물 공생자와 함께 인간 장의 기계적, 구조적, 흡수, 수송 및 병태생리학적 특성을 모사하는 장의 체외 생세포계 모델의 개발은, 의약 개발을 가속화하고, 잠재적으로는 동물 시험을 대체할 수 있을 것이다.
장 오르가노이드 및/또는 장 상피 세포를 체외에서 유지 및/또는 배양하기 위한 세포 배양 시스템에 관한 시스템과 방법을 본원에 기재한다. 본원에 기술된 발명의 실시형태들은, 유체 흐름, 전단 응력, 및/또는 기계적 응력을 부여하여 장 환경을 보다 생리적으로 적절하게 재현(physiologically relevant recapitulation)할 수 있다는 발명자의 지견에 기초하는 것이다. 본원에 기술된 시스템과 방법은, 약학, 독성학, 약물 개발, 약물 전달, 약물 대사, 약물-약물 상호작용, 약물 생체이용효율, 약물 클리어런스(drug clearance), 다기관 상호작용(multi-organ interactions), 진단, 치료, 영양학적 응용, 장 장벽의 생리, 위장(GI) 질병 모델 및 그 메커니즘, 위장관 내의 질병의 병인학, 상처 치유, 조직 재생, 조직 공학, 장 항상성, 장 줄기 세포 연구, 숙주-미생물 상호 작용, 위장관내 미생물 공동체, 점액층내의 미생물 바이오필름, 및 프로바이오틱스 치료의 연구 또는 검토 목적으로 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기술된 발명은, (i) 유체 공급원(fluid source)에 연결된 유체 채널(fluid channel)을 구비하며, 상기 유체 공급원이 상기 유체 채널에 유체를 공급하는, 유체 장치; (ii) 막 지지 부재들(membrane support elements) 사이의 상기 채널 내에 위치하며, 그 적어도 일부가 유연한, 막; (iii) 상기 막 지지 부재들에 결합되며, 상기 막 지지 부재들을 움직여서 상기 막을 그 막의 적어도 1차원을 따라 신장(stretch)시킬 수 있는, 막 변형 기구(membrane strain mechanism); 및 (iv) 상기 막의 적어도 1 표면에 부착된 적어도 1층의 장 상피 세포, 을 포함하는 세포 배양 시스템으로서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 1.0 dyne/㎠ 미만인 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
일부 실시형태에서는, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 0.008∼0.08 dyne/㎠이다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 약 0.018 dyne/㎠이다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 변화할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 0∼1000 dyne/㎠ 변화할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 0.008∼0.08 dyne/㎠ 변화할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 상기 막을 0%∼50% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 5%∼15% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 약 10% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 15%를 초과하여 신장시켜서 상기 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성한다.
일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.01 Hz∼2 Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.05 Hz∼0.25 Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.15 Hz의 속도로 주기적으로 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.2 Hz를 초과한 속도로 주기적으로 신장시켜서 상기 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성한다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 불규칙적으로 또는 간헐적으로 신장시킨다.
일부 실시형태에서는, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 500 ㎕/hr 미만의 유속으로 흐른다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 100 ㎕/hr 미만의 유속으로 흐른다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 0∼50 ㎕/hr의 유속으로 흐른다. 일부 실시형태에서는, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 약 30 ㎕/hr의 유속으로 흐른다.
일부 실시형태에서는, 상기 시스템은 상기 막의 적어도 일면을 코팅하는 복수의 생 세포의 부착을 지원(support)하는 적어도 1종의 부착 분자(attachment molecule)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 적어도 1종의 부착 분자가 콜라겐; I형 콜라겐; MATRIGEL™; 세포외기질; 라미닌; 프로테오글리칸; 비트로넥틴; 피브로넥틴; 폴리-D-리신; 폴리펩티드; 올리고뉴클레오티드; DNA; 및 폴리사커라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다.
일부 실시형태에서는, 상기 장 상피 세포가 포유동물 또는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포가 Caco2 세포; HT-29 세포; 1차 소장 상피 세포; 1차 대장 상피 세포; iPS 세포; ESC 세포; 줄기 세포; 파네트 세포(paneth cell); 크립트 세포(crypt cell); 및 점액 분비 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다. 일부 실시형태에서는, 상기 시스템의 장 상피 세포가 융모 구조를 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 시스템이 상기 막의 적어도 제2 표면 상에 적어도 1층의 내피 세포를 더 포함한다.
일부 실시형태에서는, 상기 막이, 상기 유체 채널을 제1 세포 배양 채널과 제2 세포 배양 채널로 분할하도록 위치한다. 일부 실시형태에서는, 상기 제1 세포 배양 채널이 장 상피 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 제2 세포 배양 채널이 내피 세포, 면역 세포, 및 결합 조직 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서는, 상기 시스템이 미생물 세포 또는 병원체를 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 상기 시스템 내에 적어도 1일간 유지된다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 락토바칠루스(Lactobacillus); 박테로이데스(Bacteroides); 루미노콕쿠스(Ruminococcus); 펩토콕쿠스(Peptococcus); 펩토스트렙토콕쿠스(Peptostreptococcus); 비피도박테리움(Bifidobacterium); 에스케리키아(Escherichia); 아크로모박터(Achromobacter); 아시드아미노콕쿠스 페르멘탄스(Acidaminococcusfermentans); 아키네토박터 카코아세티쿠스(Acinetobactercacoaceticus); 아에로모나스(Aeromonas); 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenesfaecalis); 바칠루스(Bacillus); 부티리비베리오피브로솔벤스(Butyriviberiofibrosolvens); 캄플리오박터(Camplyobacter); 캄필로박터콜리(Campylobactercoli); 클로스트리듐 디피칠레(Clostridiumdifficile); 클로스트리듐소르델리(Clostridiumsordelli); 엔테로박터 클로아캐(Enterobactercloacae);엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcusfaecalis); 엔테로콕쿠스패키움(Enterococcusfaecium); 대장균(Escherichiacoli); 플라보박테리움(Flavobacterium); 미코박테리움(Mycobacterium); 미코플라스마(Mycoplasma); 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonasshigelloides); 프로피오니박테리움아크네스(Propionibacteriumacnes); 슈도모나스애루기노사(Pseudomonasaeruginosa); 루미노콕쿠스브로미이(Ruminococcusbromii); 팔련구균(Sarcina); 스타필로콕쿠스아우레우스(Staphylococcusaureus); 스트렙토콕쿠스안기노수스(Streptococcusanginosus); 베요넬라(Veillonella); 비브리오(Vibrio); 예르시니아엔테로코리티카(Yersiniaenterocolitica); 락토바칠루스 람노수스(Lactobacillusrhamnosus); 락토바칠루스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG); 비피도박테리움 브레베(Bifidobacteriumbreve); 비피도박테리움 론검(Bifidobacteriumlongum); 비피도박테리움인판티스(Bifidobacteriuminfantis); 락토바칠루스아치도필루스(Lactobacillus acidophilus); 락토바칠루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); 락토바칠루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei); 락토바칠루스불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus); 및 스트렙토콕쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 병원성이다. 일부 실시형태에서는, 상기 병원체가 장관독소원성 대장균(enterotoxigenic Escherichiacoli); 빌로필라 와드스워르티아(Bilophila wadsworthia); 시겔라(Shigella); 예르시니아(Yersinia); 플레이시오모나스(Pleisiomonas); 비브리오(Vibrio); 애로모나스(Aeromonas); 캄필로박터(Campylobacter); 크리토스포리디아(Crytosporidia); 콕키도시스(Coccidosis); 살모넬라(Salmonella); 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori); 클로스트리듐 디피킬레(Clostridium difficile); 살모넬라 케도우고우(Salmonella kedougou); 박테오리데스(Bacteroides); 클로스트리듐(Clostridium); 피르미큐테스(Firmicutes); 시겔리아 디센테리애(Shigellia dysenteriae); 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica); 살모넬라 티피(Salmonella typhi); 리스테리아(Listeria); 리스테리아 모노치토게네스(Listeria monocytogenes); 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus); 프로테우스(Proteus); 비브리오 콜레래(Vibrio cholera); 엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica); 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 로타바이러스(rotavirus); 노르워크양 바이러스(norwalk-like viruses); 아데노바이러스(adenoviruses); 아스트로바이러스(astroviruses); 삿포로양 바이러스(sapporo-like viruses); 토로바이러스(toroviruses); 코로나바이러스(coronaviruses); 피코르나바이러스(picornaviruses); 헤르페스 바이러스(herpes viruses); 노로바이러스(noroviruses), 칸디다(Candida), 아스페르킬루스(Aspergillus), 칸디다알비칸스(Candida albicans), 단세포 기생충, 다세포 기생충, 아메바, 충(worms), 조충(tape worms), 원생동물, 흡충(flukes), 환형동물, 요충, 구충(hookworms), 기라디아 람블리아(Giradia lamblia), 크립토스포르디움(cryptosporidium), 및 엔타모이바 히스토리티카(Entamoeba histolytica)로 이루어지는 군에서 선택되는 것이다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 호기성이다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 혐기성이다. 일부 실시형태에서는, 상기 시스템이 호기성 및 혐기성 미생물 세포를 모두 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 미생물 세포가 상기 제1 세포 배양 채널 내에 존재한다.
일부 실시형태에서는, 상기 시스템이 상기 제1 세포 배양 채널의 적어도 일부와 접촉하는 혐기성 가스실을 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 제1 세포 배양 채널을 통해 흐르는 상기 유체에 산소 구배가 수립된다.
일부 실시형태에서는, 상기 막이 적어도 부분적으로 다공성이다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 적어도 하나의 공극 어퍼쳐가 폭 치수를 따라 0.5∼10 ㎛이다. 일부 실시형태에서는, 상기 막이 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 진공압에 기인하여 신장시킨다.
일부 실시형태에서는, 상기 시스템이, (i) 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치한 상기 장치의 제1실 벽(first chamber wall)으로서, 상기 막이 상기 제1실 벽에 장착되어 있는, 제1실 벽; (ii) 상기 제1실 벽의 반대쪽 상의, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접한 제1 조작 채널로서, 상기 제1 조작 채널과 상기 적어도 하나의 유체 채널 간에 가해지는 압력차가, 상기 제1실 벽을, 제1의 원하는 방향으로 굴곡시켜 상기 막으로 정의되는(defined) 평면을 따라 팽창 또는 수축시키는, 제1 조작 채널; 및 (iii) 상기 적어도 하나의 유체 채널과 상기 적어도 하나의 조작 채널 사이에 압력차를 부여하는 진공 시스템으로서, 상기 막이 상기 압력차에 응하여 상기 평면을 따라 신장하는, 진공 시스템, 을 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 상기 시스템은, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치한 상기 장치의 제2실 벽으로서, 상기 막의 반대쪽 단부가 상기 제2실 벽에 장착되어 있는, 제2실 벽; 및 상기 제2실 벽의 반대쪽 상의, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치하는 제2 조작 채널로서, 상기 제2 조작 채널과 상기 적어도 하나의 유체 채널 간의 압력차가, 상기 제2실 벽을, 제2의 원하는 방향으로 굴곡시켜 상기 막으로 정의되는 평면을 따라 팽창 또는 수축시키는, 제2 조작 채널, 을 더 포함한다.
일부 실시형태에서는, 상기 유체 장치가 마이크로유체 칩을 포함한다.
일부 실시형태에서는, 상기 시스템이, 기원이 장이 아닌 세포 또는 조직을 포함하는 제2 세포 배양 시스템에 연결(connected) 또는 결합된다(coupled). 일부 실시형태에서는, 상기 제2 세포 배양 시스템이 간(liver)의 세포 또는 조직을 포함한다.
일 양태에서, 본원에 기술된 발명은, 장 상피 세포를 유지하는데 적합한 유체를, 본원에 기술된 세포 배양 시스템에 대하여, 상기 유체가 상기 장 상피 세포에 접촉하도록 제공하는 단계; 및 상기 장 상피 세포를 체외에서 배양하는 단계를 포함하는 장 오르가노이드 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서는, 상기 방법은 적어도 융모 구조가 분명할 때까지 세포를 배양하는 것을 더 포함한다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기재된 발명은 세포 배양 시스템을 포함하는 장 효과인자 작용물질(intestinal effector agent) 평가 시스템에 관한 것이다.
일 양태에서, 본원에 기술된 발명은, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 상기 세포를 적어도 하나의 장 치료 효과인자 작용물질 후보(candidate)와 접촉시키는 단계; 및 상기 시스템에서 상기 세포의 응답(response)을 측정하여 상기 적어도 하나의 장 치료 효과인자 작용물질 후보의 효과를 결정하는 단계를 포함하는 장 치료 평가 방법에 관한 것이다.
도 1은 인간 장 융모의 구조적 재현을 묘사한다. 다공막이 장 상피와 모세혈관 내피로 둘러싸여 있다.
도 2는, 다공성 PDMS 막에 의해 분리된 위(보라색)와 아래(분홍색)의 이중층 세포 배양 마이크로채널과, 당해 이중층 세포 배양 채널 옆의 2개의 진공실(하늘색)이 강조되어 있는, 거트 온 어 칩(gut-on-a-chip)의 일 실시형태의 구조의 개요도이다.
도 3의 A∼D는, 시간의 경과에 따라 도 3의 A부터 도 D까지를 반복함에 의한, 거트 온 어 칩의 일 실시형태에서의 기계적 신장(mechanical stretching)을 나타내는 일련의 개요도이다. 거트 온 어 칩에 주기적 신장을 가하여, 진공 채널에 진공 유도된 음압에 의해, 세포 단층에 규정의 기계적 변형을 부여하였다.
도 4의 A∼D는 마이크로 채널 내의 Caco-2 단층의 수립의 확대 이미지를 나타낸다. 마이크로채널 내에 Caco-2 세포를 접종한 후(도 4의 A), 세포가 마이크로채널 내의 다공막의 표면에 부착되도록 1.5시간 동안 두고(도 4의 B), 그리고나서 배양 배지를 30 ㎕/hr의 일정한 유속으로 48시간 동안 관류시켰다. 마이크로채널 내에 약 48시간 후에 융합 단층(confluent monolayer)이 만들어졌다(도 4의 C). 다공막 상의 Caco-2 단층의 줌인(zoom-in) 이미지를 도 4의 D에 나타낸다. 반복되는 공극(pore)들은 직경이 10 ㎛에 간격이 30 ㎛이다.
도 5는 유연 다공막(직경이 10 ㎛에 간격이 30 ㎛, 두께가 30 ㎛)의 한면에는 장 상피를 다른 면에는 모세관 또는 림프관 내피를 공배양(co-culture)하기 위한 거트 온 어 칩 장치의 일 실시형태의 개요도이다.
도 6a∼6c는 거트 온 어 칩에서의 수송 실험에 대한 개요도이다. 도 6a는 일정한 흐름(constant flow)과 기계적 변형(mechanical deformation)을 나타내는 '동적 조건'(dynamic condition)의 개요도이다. 도 6b는 일정한 흐름 하에서 기계적 변형이 없는 '유동 조건'(fluidic condition)의 개요도이다. 도 6c는 기계적 변형도 흐름도 없는 통상의 Transwell 시스템을 나타내는 '정적 조건'(static condition)의 개요도이다.
도 7은 상부 마이크로채널 내의 다공막의 표면 상에 Caco-2 단층을 함유하는 거트 온 어 칩 장치에서, 방세포 마커(paracellular marker)인 FITC-덱스트란(FD20, 20kDa)의 겉보기 투과계수(apparent permeability coefficient, Papp)의 그래프이다. 정적, 유동 및 동적 조건의 실험 스킴을 도 6a∼6c에 나타내었다. 동적 조건에서는(N=4), FD20 수송 실험 전에, 12시간 동안의 30㎕/hr의 일정 관류(constant perfusion) 하에 20% 연장(elongation)의 주기적 신장을 가했다. 유동 조건(fluidic condition)(N=4)에서는, 어떠한 신장 동작도 없이(즉, 전단 응력만) 30㎕/hr의 일정 관류를 행하였다. 동적 및 유동 조건 둘다에 있어서, 하부 마이크로 채널의 출구로부터 약 1시간 동안 샘플을 모아, 분획량(10㎕)을 희석하여 형광을 측정하였으며, 그 결과 형광 강도 대(vs.) FD20 농도의 선형 영역에 있었다. 정적 조건(N=4)에서는, Transwell 시스템에서 수송 실험을 행하였다. 에러 바는 표준 오차를 가리킨다.
도 8은 상부 마이크로채널 내의 다공막의 표면 상에 Caco-2 단층을 함유하는 거트 온 어 칩 장치에서, 방세포 마커인 루시퍼 옐로우(Lucifer yellow, LY)의 겉보기 투과계수(Papp)의 그래프이다. 정적, 유동, 및 동적 조건에 대한 실험 스킴은 도 6a∼6c에 나타내었다. 동적 조건에서는, LY 수송 실험 전에, 12시간 동안의 30㎕/hr의 일정 관류에 있어서 5%(N=1) 또는 15%(N=1) 연장(elongation)의 주기적 신장을 가했다. 유동 조건(N=2)에서는, 어떠한 신장 동작도 없이(즉, 전단 응력만) 30㎕/hr의 일정 관류를 행하였다. 동적 및 유동 조건 둘다에 있어서, 하부 마이크로 채널의 출구로부터 약 1시간 동안 샘플을 모아, 분획량(10㎕)을 희석하여 형광을 측정하였으며, 그 결과 형광 강도 대(vs.) LY 농도의 선형 영역에 있었다. 정적 조건(N=4)에서는, Transwell 시스템에서 수송 실험을 행하였다. 에러 바는 표준 오차를 가리킨다. y축에는 그래프의 바 차트의 전 범위를 요약하는 눈금 단절(scale break)이 있다.
도 9는 상부 마이크로채널 내의 다공막 표면 상의 Caco-2 단층과 하부 마이크로채널 내의 다공막의 반대면 상의 HMVEC 단층을 함유하는 거트 온 어 칩 장치에서 FD20의 겉보기 투과계수(Papp)의 그래프이다. 정적, 유동, 및 동적 조건에 대한 실험 스킴을 도 6a∼6c에 나타내었다. 동적 조건(N=2)에서는, FD20 수송 실험 전에, 12시간 동안의 30㎕/hr의 일정 관류하에서 15% 연장의 주기적 신장을 가했다. 유동 조건(N=5)에서는, 어떠한 신장 동작도 없이(즉, 전단 응력만) 30㎕/hr의 일정 관류를 행하였다. 동적 및 유동 조건 둘다에 있어서, 하부 마이크로 채널의 출구로부터 약 1시간 동안 샘플을 모아, 분획량(10㎕)을 희석하여 형광을 측정하였으며, 그 결과 형광 강도 대(vs.) FD20 농도의 선형 영역에 있었다. 정적 조건(N=3)에서, Transwell 시스템에서 수송 실험을 행하였다. 에러 바는 표준 오차를 가리킨다. y축에는 그래프의 바 차트의 전 범위를 요약하는 눈금 단절이 있다.
도 10은, Caco-2 세포 내의 투과성 글리코프로틴(permeability glycoprotein, P-gp)의 기질인, Rhodamine 123(Rho123)의 겉보기 투과계수(Papp)의 그래프를 나타내며, 이는 다공막(공극 사이즈 0.4㎛)의 표면 상에서 21일간 배양된 Caco-2 단층을 함유하는 Transwell에서 얻어졌다. Caco-2 세포에서의 유출 수송을 저해하기 위해, P-gp의 저해제인 베라파밀(verapamil)을 일부 실험 셋업에 가하였다. 이 정적 수송 분석의 실험 스킴을 도 6c에 나타내었다. 꼭대기쪽(apical side, AP)으로부터 바닥쪽(basolateral side, BL)으로의 Rho123의 수송 실험(N=6)을 위해, 배양 배지에 용해시킨 Rho123(100 μM, 최종 농도, 200 ㎕)으로 Transwell의 AP쪽을 치환하는 한편 Transwell의 BL쪽에 프레시한 배양 배지(700 ㎕)를 첨가하였다. BL쪽으로부터 AP쪽으로의 Rho123의 유출 실험(N=6)을 위해, 배양 배지에 용해한 Rho123으로(100 μM, 최종 농도, 700 ㎕) Transwell의 BL 쪽을 치환하고, 그 Transwell의 AP쪽을 프레시한 배양 배지(200 ㎕)로 대체하였다. P-gp 저해 효과를 시험하기 위해, 배양 배지에 용해시킨 베라파밀을(300 μM, 최종 농도) Transwell의 AP쪽과 BL쪽 양쪽에 가하고, AP에서 BL로(N=6), 또는 BL에서 AP로(N=6)의 방법으로 수송 실험을 행하였다. 에러 바는 표준 오차를 가리킨다.
도 11은 마이크로유체 거트 온 어 칩 장치에서의, Caco-2 세포 내의 P-gp 기질인 Rho123의 겉보기 투과계수(Papp)의 그래프이다. 유동 및 동적 조건에 대한 실험 스킴을 도 6a와 6b에 나타내었다. 유동 조건(N=1) 또는 동적 조건(N=1, 15% 연장)에서의, AP쪽으로부터 BL쪽으로의 Rho123의 수송 실험을 위해, 배양 배지에 용해시킨 Rho123(100 μM, 최종 농도)를 상부 마이크로채널에 30 ㎕/hr로 흐르게 하는 한편, 프레시한 배양 배지를 하부 마이크로채널에 30 ㎕/hr로 관류시켰다. 유동(N=1) 또는 동적(N=1, 15% 연장) 조건에서의, BL쪽으로부터 AP쪽으로의 Rho123의 수송 실험을 위해, 배양 배지에 용해한 Rho123을(100 μM, 최종 농도) 하부 마이크로채널에 30㎕/hr로 흐르게 하는 한편, 프레시한 배양 배지를 상부 마이크로채널에 30㎕/hr로 관류시켰다. 동적 및 유동 조건 둘다에 있어서, 상부 및 하부 마이크로 채널 둘다의 출구로부터 약 1시간 동안 샘플을 모아, 분획량(10㎕)을 희석하여 형광을 측정하였으며, 그 결과 형광 강도 대(vs.) Rho123 농도의 선형 영역에 있었다. 동적 조건으로, 실험 전에 15% 연장에 의한 기계적 변형을 가하였다.
도 12a∼12e는 인간 거트 온 어 칩 장치의 일 실시형태를 묘사한다. 도 12a는, 중앙의 마이크로 채널의 가운데를 수평으로 가로지르는, 장 상피 세포에 의해 라이닝(lining)된 유연 다공성 ECM 코팅막과, 양측의 풀 하이트(full-height) 진공실을 보여주는, 거트 온 어 칩 장치의 개요도이다. 도 12b는 투명 PDMS 엘라스토머로 구성된 거트 온 어 칩 장치의 사진 이미지이다. 시린지 펌프(syringe pump)를 사용하여 상부 및 하부 마이크로 채널에의 배관(tubing)을 통해 청색 및 적색 염료를 각각 관류시켜(화살표 방향), 이들 채널을 시각화한다. 도 12c는 거트 온 어 칩의 상부 및 하부 채널(둘다 높이 150 ㎛)의 단면도이며; 사각형의 삽입도는 다공막(10 ㎛ 공극; 바, 20 ㎛)의 부분의 상면도이다. 도 12d는 진공실에 흡인(suction)을 가함에 의해 가해지는 기계적 변형(30%; 화살표 방향)이 없을 때(왼쪽)와 있을 때(오른쪽)의 거트 온 어 칩 내에서 배양된 장 단층의 개요도(위)와 위상차 화상(아래)이다. 적색 및 청색 윤곽선은 기계적 변형을 가하기 전(적색)과 후(청색)의 하나의 Caco-2 세포의 형상을 나타낸다(바, 20 ㎛). 가해진 장력(tension)의 방향으로 세포가 왜곡됨(distort)에 주목하라. 도 12e는 ECM 코팅된 유연 다공성 PDMS 막(빈 원)과 부착성 장 상피 세포(채워진 원)에서 생성되는 기계적 변형의 정량을 진공 제어기에 의해 가해진 압력의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 13은 본원에 기술된 장치의 일 실시형태의 마이크로 제작 과정의 개요도이다. 거트 온 어 칩 마이크로장치는, 3개의 PDMS층들(상층, 다공막, 하층)로부터 제작할 수 있으며, 이들을 차례로 결합하고 변형(modify)함으로써, 상부(청색) 및 하부(오렌지색) 채널을 갖는 중앙 세포 배양 채널과 2개의 측면 진공실을 생성할 수 있다. 진공실(회색)에 걸친(spanned) 다공성 PDMS 막의 영역은, 풀 하이트 진공실을 생성하는 과정 동안 물리적으로 찢어낼 수 있다.
도 14의 A∼D는 서로 다른 세포 배양 장치에서의 Caco-2 상피 세포의 몰폴로지를 나타낸다. 도 14의 A는 정적 Transwell 시스템에서 21일간 배양된 Caco-2 상피 세포의 몰폴로지를 나타낸다. 도 14의 B∼C는 마이크로유체 흐름(30 ㎕/hr; μF)이 있는 거트 온 어 칩에서 주기적 기계적 변형(10%; 0.15Hz; μF+St)을 3일간 가하지 않은 때(도 14의 B)와 가한 때(도 14의 C)의 Caco-2 상피 세포의 몰폴로지를 나타낸다. 개요도(좌측)는 시스템 레이아웃을 보여주고; 형광 관찰(중앙)은 상피세포 단층에서의 밀착 연접 단백질인 오클루딘(occludin)의 분포를 보여주며; 공초점 형광 관찰(우측)은 세포의 형상과 극성(핵은 청색 F-액틴은 녹색)을 강조하는 상피 세포의 수직 단면을 보여준다. 도 14의 B와 도 14의 C에서의 작은 흰 원의 규칙적 배열은 상피세포 단층 아래에 보이는 공극들이고; 백색 점선은 앵커링 기체의 상부를 가리킨다(바, 20 ㎛). 도 14의 D는, 정적 Transwell 배양에서, 또는 기계적 변형이 없는 경우(μF)와 있는 경우(μF+St) 마이크로유체 거트 온 어 칩에서 길러진 Caco-2 세포의 평균 키(height)의 그래프이다(* p<0.001).
도 15의 A∼B는 거트 온 어 칩에서 배양된 Caco-2 세포에 의한 장 융모의 자발적 형성을 나타낸다. 도 15의 A는 흐름과 주기적 변형(30 ㎕/hr, 10% 변형, 0.15Hz)의 존재 하에서의 58, 132, 및 170시간 배양에서의 Caco-2 세포 단층의 위상차도이다. 초기에 보이는 평면적 상피 단층이, 후기에는 초점이 맞거나 맞지 않는 영역을 갖는 기복 있는(undulating) 품질을 나타내며, 이는 융모 형성을 시사함에 주목하라. 도 15의 B는, 크립트(crypt)에 의해 분리된, 바닥의 핵(청색)과 꼭대기의 뮤신 발현(마젠타색)을 갖는 F-액틴(녹색)으로 표지된 정연하게(consistently) 극성화된 원주형 상피 세포에 의해 라이닝된, 장 융모의 존재를 확인시켜주는, 170시간에서의 기복 있는 상피세포 영역의 수직 단면의 공초점 형광 관찰도이다. 작은 흰 원의 규칙적 배열은 상피 단층 아래에 보이는 공극들이다; 바, 20 ㎛.
도 16의 A∼C는 Transwell(정적) 또는 마이크로유체 거트 온 어 칩에서 주기적 변형의 부재(μF) 또는 존재(μF+St) 하에 배양된 Caco-2 단층의 장 장벽 기능과 분화의 평가를 나타낸다. 도 16의 A는 Caco-2 단층의 TEER 를 측정함으로써 정량된 상피의 밀착 연접 완전성(tight junctional integrity)을 나타낸다. 도 16의 B는 5일 또는 21일동안 정적 조건 하에 배양된, 또는 5일간 주기적 변형의 부재(μF) 또는 존재(μF+St) 하에 마이크로유체 거트 온 어 칩에서 배양된, Caco-2 단층을 통한 형광 덱스트란 수송의 정량에 의해 측정된 겉보기 방세포 투과계수(Papp)를 나타낸다 (*** p<0.05). 도 16의 C는 5일 또는 21일 동안 정적 조건 하에 배양된, 또는 5일간 주기적 변형의 부재(μF) 또는 존재(μF+St) 하에 마이크로유체 거트 온 어 칩에서 배양된, Caco-2 세포에서 쇄자연 아미노펩티다제(brush border aminopeptidase) 활성의 측정에 의해 평가된 장 세포 분화를 나타낸다 (* p<0.001, ** p<0.01).
도 17의 A∼E는 거트 온 어 칩 내의 인간 장 상피 단층 상에서의 장기 미생물 공배양의 결과를 나타낸다. 기원적으로 인간 장에서 분리된 박테리아인 락토바실러스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG)(LGG)를 거트 온 어 칩 내에서 길러진 Caco-2 단층의 표면 상에서 배양하였다. 도 17의 A는 96시간 동안 공배양된 LGG 및 Caco-2 세포의, 저배율(좌측) 및 고배율(우측)로 본, 위로부터의 위상차도로서, 연속적 유체 흐름에 노출시킨 후에 Caco-2 세포 단층의 꼭대기 면에 밀착하여 부착한 채로 있는 LGG 세포(백색 화살표)의 마이크로 콜로니를 나타낸다(바, 모든 도에서 20 ㎛). 도 17의 B는 96시간 동안 LGG와 함께 공배양된 Caco-2 단층의 동시 생/사 염색을 나타내며 거의 모든 상피 세포가 생존하여 있음을 증명한다(녹색). 도 17의 C는 Transwell(정적) 또는 주기적 변형(μF+St; 40 ㎕/hr, 10% 세포 변형, 0.15 Hz)되는 마이크로유체 거트 온 어 칩에서 LGG 세포의 부재(백색 원) 또는 존재(흑색 원) 하에 배양된 Caco-2 단층의 장벽 기능을 나타낸다. 에러 바들이 심벌 크기보다 작았음에 주목해야 한다 (* p<0.01, ** p<0.05). 도 17의 D는 기계적 변형과 함께 거트 온 어 칩에서 Caco-2 세포와 함께 공배양된 LGG 세포(+LGG; 40 ㎕/hr, 10% 세포 변형, 0.15 Hz), 또는 대조구로서 단독으로 배양된 Caco-2 세포에서, β-갈락토시다아제의 촉매 활성을 측정하여 행한, 96시간 동안 Caco-2 세포와 함께 공배양된 살아있는 LGG 세포의 기능성의 평가를 나타낸다(*p < 0.01). 도 17의 E는 다양한 조건 하에 검출된, 형광량, 칼세인 AM 절단(calcein AM cleavage)의 측정값의 그래프를 나타내며, 도 17의 B에서의 형광 염색이 생 LGG 세포의 소산이 아니라 생 Caco-2 세포에 기인한 것을 증명한다.
도 18의 A∼C는 유체 흐름이 Caco-2 세포에서의 세포 형상과 극성의 제어의 임계 인자(critical factor)임을 증명한다. 유속 10 ㎕/hr(도 18의 A) 또는 100 ㎕/hr (도 18의 B)를 사용하여 주기적 변형의 부재 하에 20시간 동안 거트-온-어-칩에서 배양된 Caco-2 단층을 통한 수직단면의 공초점 형광도는, 더 빠른 유속(30∼100 ㎕/hr)일수록 원주상 상피의 극성화와 형성을 특이적으로 유도함을 확인시켜준다. 도 18의 C는 기계적 변형 없이 10 ㎕/hr 또는 100 ㎕/hr에서 배양된 Caco-2 세포의 평균 키의 정량을 나타낸다(*, p<0.0001; 바, 20 ㎛).
도 19는 독립적으로 배양된 생 LGG 세포와 Caco-2 세포에서의 β-갈락토시다아제 활성의 평가를 나타낸다. 생 LGG 세포는 β-갈락토시다아제 기질인 ONPG를 활발하게 절단하여, O-니트로페놀 생성물(흑색 원)의 광학 밀도를 점진적으로 증가시킨 반면, 인간 Caco-2 상피 세포는 어떠한 특이적 β-갈락토시다아제도 나타내지 않았다(흑색 사각형). LGG 대 Caco-2세포에 의해 발현되는 활성의 차이는 모든 시점에서 유의한(p < 0.001) 것이었다.
도 20은 본원에 기술된 시스템의 자동 제어에 적합한 컴퓨터 시스템의 개요도이다. 도 21은 본원에 기술된 시스템의 일 실시형태의 다이어그램을 나타낸다.
도 22의 A∼D는 본원에 기술된 시스템의 막에 변형을 가하는데 사용 가능한 대안적 기구의 일부 예를 나타낸다.
도 23은 본원에 기술된 시스템의 일 실시형태의 개요도이다. 점선 원 내의 숫자는 명시된 부분들의 ㎛ 단위 측정값이다.
편의를 위해, 본 명세서, 실시예, 및 첨부의 청구범위에 사용된 일부 용어를 여기에 모아놓는다. 별도의 언급이 없거나 문맥으로부터 내포되지 않는 한, 다음의 용어 및 문구는 아래에 제공된 의미를 포함한다. 명백히 언급되지 않았거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 아래의 용어와 문구는 그 용어 또는 문구가 그것이 관련된 분야에서 획득한 의미를 배제하지 않는다. 정의는 특정 실시형태를 기술하는 데 도움을 주고자 제공하는 것이며, 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 제한되므로 청구된 발명을 제한하고자 의도한 것이 아니다. 별도의 언급이 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술용어와 과학용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 보통으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는, 조성물, 방법, 및 그 조성물 또는 방법에 필수적인 각각의 구성요소에 관해 사용되나, 필수적이든 그렇지 않든 불특정 요소의 포함을 허용한다.
본원에 사용된 용어 "필수적으로 이루어지는"은 주어진 실시형태에 필요한 요소들을 나타낸다. 이 용어는 그 실시형태의 기본적인 그리고 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소들의 존재를 허용한다.
용어 "구성되는"은 본원에 기술된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각각의 구성성분을 나타내며, 이는 그 실시형태의 설명에 언급되지 않은 어느 요소를 제외한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형 용어는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서 예를 들면, "방법"은 본원에 기술되거나 및/또는 본 명세서를 읽는 당 기술분야의 숙련자 또는 기타에게 자명한 유형의, 1 또는 그 이상의 방법들, 및/또는 단계들을 포함한다. 마찬가지로, 단어 "또는"은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, "및"을 포함하는 것을 의도한 것이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 대등한 방법들과 재료들을 이용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 후술한다. 약어 "예"(e.g.)는 "예를 들면"(exempli gratia)에서 유래한 것으로, 본원에서는 비제한적인 예를 지시하는 데 이용된다. 따라서, 약어 "예"는 용어 "예를 들면"과 동의어이다.
세포생물학과 분자생물학의 일반적 용어의 정의는 “The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, 제19판, Merck Research Laboratories 간행, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 간행, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149), Crowther J. R. (2000)에서 찾아볼 수 있다. 분자생물학의 일반적 용어의 정의는 Benjamin Lewin, Genes X, Jones & Bartlett Publishing 간행, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 간행, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서도 찾아볼 수 있다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명은 예를 들면 그 내용이 전체로서 본원에 참조로 통합된 문헌들인 U. S. Pat. Nos: 4,965,343, 및 5,849,954; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley 및 Sons, Inc.); Culture of Animal Cell: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005); 및 Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998) 에 기재된 바와 같은 표준적 절차를 사용하여 행할 수 있다.
용어 "감소하다", "감소시키다", "감소된" 및 "감소"는 모두 본원에서 참조기준에 대하여 통계적으로 유의한 양의 감소를 일반적으로 의미하는 데 이용된다. 그러나 의심을 피하기 위해, "감소시키다", "감소", 또는 "감소하다"는 전형적으로 주어진 처리의 부재시와 비교할 때 적어도 10%의 감소, 예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%의 감소, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 감소(예컨대, 주어진 처리의 부재시와 비교하여 주어진 실체(entity) 또는 파라미터의 완전한 부재), 또는 주어진 처리의 부재시와 비교하여 10∼99%의 어느 값의 감소를 의미한다.
용어 "증가된", "증가하다", 또는 "증진시키다"는 모두 본원에서 통계적으로 유의한 양의 증가를 일반적으로 의미하는 데 이용된다. 의심을 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가하다", 또는 "증진시키다"는 참조 수준과 비교할 때, 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가, 또는 100%의 증가, 또는 참조 수준과 비교할 때 10∼100% 사이의 증가, 또는 참조 수준과 비교할 때 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 이상 사이의 어느 증가를 의미한다.
본원에 사용된 용어, "유지하는" 또는 "배양하는"은 조직 또는 세포 집단의 생존 능력을 연속시키는 것을 나타낸다. 유지된 조직은 대사적으로 활성의 세포 집단을 가질 것이다. 이들 세포의 수는 적어도 3일 넘도록 대략 안정되거나 또는 늘어날 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어, "마이크로유체 장치"와 "마이크로유체 칩"은 서로 호환적으로 사용되며, 그 내부 또는 그 위에 구비되는 마이크로유체 구조를 갖는 구조 또는 기체(substrate)를 나타낸다. 일부 실시형태에서는, 상기 칩은 마이크로유체 시스템에 탈착 가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "줄기 세포"는 분화되지 않은 것으로서, 원하는 세포 유형, 즉, 내피 세포 또는 장 상피 세포 등으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "배아 줄기 세포"(embryonic stem cell)은, 분화전능성(totipotent)이며, 배아 전 조직(예를 들면, 포배), 배아 조직(embryonic tissue), 또는 임신 중의 어느 시기, 전형적이지만 필수적인 것은 아닌 것으로서 임신 약 10∼12주 전에 채취한 태아 조직을 포함하는, 수정 후 임신 말기 전에 형성되는 조직으로부터 유래한 세포를 나타낸다. 배아 줄기 세포는 인간 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 조직, 또는 수립된 배아 세포주 등으로부터, 직접 얻을 수 있다. 일 실시형태에서는, 배아 줄기 세포는 Thomson et al.(그 완전한 내용이 본원에 전체로서 통합된 문헌 U.S. Pat. Nos. 5,843,780 및 6,200,806; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995)에 기술된 바와 같이 얻어진다.
본원에 사용된 용어 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 본원에서 호환적으로 사용되며, 분화된 세포에서 유래한 다능성 세포를 나타낸다. 예를 들면, iPSC는 Takahashi et al. (Cell, 126: 663-676, 2006)에 기재된 바와 같은 방법에 따라 Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4 등의 전사 인자들의 과발현에 의해 얻을 수 있다. iPSC를 생산하는 다른 방법으로는 예를 들면 그 완전한 내용이 본원에 전체로서 통합된 문헌들인 Takahashi et al. Cell, 131: 861-872, 2007 및 Nakagawa et al. Nat. Biotechnol. 26: 101-106, 2008에 기재된 방법들이 있다.
용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적인 유의성을 나타내고, 일반적으로 마커 농도의 표준보다 2 표준편차(2SD) 아래 또는 그보다 밑을 의미한다. 이 용어는 차이가 있다는 통계적 증거를 나타낸다. 그것은 귀무가설이 실제로 참일 때, 그 귀무가설을 거부하는 결정을 내릴 확률로 정의된다. 그 결정은 종종 p값을 이용하여 이루어진다.
작동예 또는 달리 지시한 바 외에는, 본원에 사용된 성분들의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"(about)에 의해 수정된 바와 같이 이해하여야 한다. 용어 "약"은 백분율과 연결하여 사용될 때, ±1%를 의미할 수 있다.
단수형 용어는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 마찬가지로, 단어 "또는"은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, "및"을 포함하는 것을 의도한 것이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 대등한 방법들과 재료들을 이용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 후술한다. 약어 "예"는 "예를 들면"에서 유래한 것으로, 본원에서는 비제한적인 예를 지시하는 데 이용된다. 따라서, 약어 "예"는 "예를 들면"과 동의어이다.
다른 용어들은 본 발명의 다양한 양태의 기술 내에서 본원에 정의된다.
명세서 및 도면에 걸쳐, 본원에 기술된 세포 배양 시스템은 "거트 온 어 칩"(gut on a chip)과 호환적으로 나타낼 수 있다. 도 5는 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 일 실시형태를 나타낸다. 본원에 기술된 발명의 일부 실시형태에 따르면, 세포 배양 시스템은 유체 공급원에 연결된 유체 채널(10)을 구비하며, 상기 유체 공급원이 상기 유체 채널(10)에 유체를 공급하는, 유체 장치를 포함할 수 있다. 상기 유체 채널(10)의 크기와 형상은 오르가노이드의 원하는 크기 및 형상 및/또는 제공되는 유체의 체적 및 유속에 따라 변할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유체 장치"는 1 이상의 유체 채널을 구비하는 어느 크기 또는 오리엔테이션의 장치를 나타낸다. 유체 장치는 후술하는 유속 범위 내에서 어느 양의 유체를 움직일 수 있으며, 예를 들면, 유체 장치는 마이크로유체 장치 또는 더 큰 체적의 유체를 움직일 수 있는 장치일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "채널"은 기체(substrate) 내 또는 기체 상에 배치된 어느 모세관, 채널, 관(tube), 또는 홈(groove)을 나타낸다. 채널은 마이크로채널, 즉 마이크로 체적의 액체를 통과시키는 사이즈의 채널일 수 있다.
유체 공급원은, 다량의 유체를 포함하여, 그 유체가 당해 유체 공급원으로부터 그 유체 장치의 1 이상의 채널을 통과하여 움직이게 할 수 있는 저장소 또는 다른 용기일 수 있다. 상기 유체 공급원은 유체를 이끄는 어느 수단, 예를 들면 배관, 파이프, 채널, 기타에 의해 상기 유체 장치의 1 이상의 채널에 결합될 수 있다. 유체 장치 및/또는 유체 공급원은 포트를 구비할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "포트"(port)는 유체 및/또는 세포가 시스템에 들어가게 및/또는 나오게 및/또는 시스템의 일부에 들어가게 및/또는 나오게 하는 수단을 제공하는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 일부를 나타낸다. 포트는 유체 시스템 또는 마이크로유체 시스템의 배관, 커넥션, 또는 어댑터와의 연결(connection)을 수락 및/또는 확보하고 유체 시스템 또는 마이크로유체 시스템에 부착되었을 때 유체 및/또는 세포를 통과하게 하는 크기 및 형상일 수 있다.
본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 유체는 유체 공급원으로부터 장치의 유체 채널(10)을 통해 유체 수집 저장소(도시하지 않음)를 향해 흐른다. 양의 또는 음의 또는 이들 둘다의 유체 압력을 사용하여 유체를 유체 채널(10)을 통하여 흐르게 할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 유체 공급원 내의 유체는 가압될 수 있으며 유체 공급원과 유체 채널(10) 사이에 밸브를 마련하여 유체의 채널로의 흐름을 제어할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 유체 채널(10)의 출구 포트에 진공원(vacuum source)을 연결하여 유체를 유체 채널(10)을 통해 뽑아낼 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 중력을 사용하여 유체를 유체 채널(10)을 통해 흐르게 할 수 있다. 예를 들면, 유체 공급원은 장치 위로 올리고 유체 수집 저장소는 장치 아래에 위치시켜 유체를 유체 채널(10)을 통해 흐르게 하는 정적, 유동, 및 동적 압력을 제공할 수 있다. 유체 공급원 또는 유체 경로 중의 밸브를 사용하여 유체 흐름의 속도를 제어할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 1 이상의 펌프를 사용하여 유체를 유체 공급원으로부터 유체 채널(10)을 통해 흐르게 할 수 있다.
도 21은 설명의 목적으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 시스템(100)의 다이어그램을 보여준다. 시스템(100)은 마이크로유체 장치(5)에 연결된 1 이상의 유체 공급원(예, 32, 34)을 포함할 수 있으며(예, 도 3, 5, 6 및 12에 도시된 바와 같이), 상기 마이크로유체 장치(5)는 1 이상의 유체 수집 저장소(예, 36, 38)에 연결될 수 있는 1 이상의 유체 채널(10)을 포함한다. 일부 실시형태에서는, 유체 공급원(32, 34)은 유체를 유지 및 공급하는 단순한 플라스틱 용기 또는 서로 다른 유체들을 유지 및 공급하는 2 이상의 분리된 구획을 가진 용기일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 공급원(34)은, 그 공급원 용기를 가압 가스(52)(예, 공기 또는 다른 불활성 가스) 또는 다른 유체(예, 물, 매체)의 공급에 연결함으로써, 가압될 수 있으며, 그 압력은 유체를 공급원(34)을 나와 장치(5) 내부로 그리고 유체 채널(10)을 통하여 흐르게 한다. 이 실시형태에서는, 공급원 용기는 상기 압력을 유지하기에 충분한 밀봉된 금속 또는 플라스틱 용기일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 수집 저장소(38)는 진공원(54)에 연결될 수 있으며, 그 진공은 유체를 장치(5) 내부로 그리고 유체 채널(10)을 통하여 유체 수집 저장소(38)로 흐르게 한다. 가압 또는 진공에 추가적으로 또는 대안적으로, 유체 공급원(32, 34) 용기를 올려서 마이크로유체 장치(5)에 양의 압력을 부여할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서는 밸브(44, 48)를 마련하여 장치(5)를 통한 유체의 흐름을 제어할 수 있다. 밸브(44, 48)는, 컴퓨터 시스템(700) 등의 제어 시스템에 연결되어, 밸브 및 유체 흐름의 자동 제어를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서는, 시스템은 1 이상의 펌프(42, 46)를 포함하여, 유체 공급원(32)으로부터 마이크로유체 장치(5)로 그리고 유체 채널(10)을 통해 유체 수집 저장소(36)까지 유체를 펌핑할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서는, 하나의 펌프(예, 42 또는 46)를 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서는, 2개의 펌프(42, 46) 또는 그 이상의 펌프를 사용할 수 있다. 펌프(42, 46)를, 컴퓨터 시스템(700) 등의 제어 시스템에 연결하여, 밸브 및 유체 흐름의 자동 제어를 가능하게 할 수 있다. 펌프(42, 46)는 예를 들면, 시린지 펌프(syringe pump), 연동 펌프(peristaltic pump), 또는 용적형 펌프(positive displacement pump) 등의 어느 동적(dynamic) 또는 용량형(displacement) 펌프일 수 있다.
본원에 기재되고 도 5에 나타내어진 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 세포 배양 시스템은 채널 내에 위치하며 1 이상의 막 지지 부재(22, 24)에 부착된 막(20)을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 막(20)은 유체 채널(10)을 제1 세포 배양 채널(12) 및 제2 세포 배양 채널(14)로 분할할 수 있다. 제1 및 제2 세포 배양 채널은 임의의 오리엔테이션으로 있을 수 있다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 세포 배양 채널을 분할하는 막(20)은, 하나의 세포 배양 채널이 다른 세포 배양 채널의 바로 위에 위치하도록, 단일의 평면을 따라 수평으로 펼쳐질 수 있다(도 5에 나타낸 바와 같이). 대안적으로, 세포 배양 채널을 분할하는 막(20)은, 두개의 세포 배양 채널이 어느 채널도 다른 채널의 위에 있지 않도록 사이드-바이-사이드로 위치하도록, 단일의 평면을 따라 수직으로 펼쳐질 수 있다. 대안적으로, 세포 배양 채널을 분할하는 막(20)은, 제1 세포 배양 채널이 그 막에 의해 형성된 관(tube) 내에 위치하고 제2 세포 배양 채널이 상기 막과 상기 유체 채널(10)의 벽의 사이에 공간을 포함하는, 관형 및/또는 원통형 막일 수 있다. 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 일부 실시형태에 따르면, 막 지지 부재들을, 상기 막 지지 부재들을 움직여서 상기 막을 그 막의 적어도 1차원을 따라 신장시킬 수 있는 막 변형 기구(26)에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 상기 막은 적어도 부분적으로 유연하다. 일부 실시형태에서 상기 막은 적어도 1차원으로 유연하며, 예로서 상기 막은 1차원으로, 또는 2차원으로, 또는 3차원으로 신장할 수 있다. 상기 막은 어느 부분적으로 유연한 생체적합성 재료로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막은 PDMS로 만들어질 수 있다. 생체적합성 재료의 추가적 예를 이하에 기술한다.
일부 실시형태에서 상기 막은 적어도 부분적으로 다공성이다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 공극은 직경이 0.5 ㎛∼10 ㎛일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 막의 공극은 직경이 약 10 ㎛일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 막의 공극은 직경이 약 5 ㎛일 수 있다. 막을 가로지르는 세포의 이행(transmigration)이 소망되는 실시형태에서(예, 면역 세포), 직경이 약 5 ㎛의 공극이 특히 유용하다. 일부 실시형태에서는, 상기 공극은 불규칙적인 간격을 두고 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 공극은 규칙적인 간격을 두고 있다. 일부 실시형태에서는, 공극이 5 ㎛ 이상, 예를 들면, 10 ㎛ 이상, 25 ㎛ 이상, 50 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 1000 ㎛ 이상, 5 mm 이상, 또는 그 이상 떨어져 있을 수 있다.
일부 실시형태에서는, 상기 막은 평면일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막은 원통형일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 두께는 15 ㎛ 이상, 예를 들어, 두께가, 15 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 25 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 35 ㎛ 이상, 40 ㎛ 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 두께는 15 ㎛∼40 ㎛일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 두께는 25 ㎛∼30 ㎛ 일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막의 두께는 약 30 ㎛일 수 있다.
일부 실시형태에서는, 막(20)은 유체 채널 내의 적어도 2개의 막 지지 부재들(22, 24)에 부착된다. 본원에 사용된 용어, "막 지지 부재"는 상기 막이 부착되는, 세포 배양 시스템의 부분이다. 막 지지 부재는 유체 채널의 벽이거나, 또는, 기둥(post), 일련의 기둥들, 클램프(clamp), 또는 유체 채널에 구비된 포트와 같은 분리된 구조물이다. 일부 실시형태에서는, 막 지지 부재(22, 24)는 위치, 오리엔테이션 및/또는 굴곡(flex)을 변경할 수 있으며; 그에 의해 막(20)에 변형 또는 움직임을 부여할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 적어도 하나의 막 지지 부재가 막 변형 기구에 결합된다. 일부 실시형태에서는, 제1 막 지지 부재는 막 변형 기구에 결합되며 제2 막 지지 부재는 막 변형 기구에 결합되지 않는다. 일부 실시형태에서는, 2 이상의 막 지지 부재들이 막 변형 기구에 결합된다. 본원에 사용된 용어, "막 변형 기구"는 막 지지 부재(22, 24)를 위치, 오리엔테이션 및/또는 굴곡을 변경시켜; 그에 의해 막을 적어도 1 방향으로 신장시키는 수단이다. 막 변형 기구는 막 지지 부재를, 움직이거나 굴곡시켜서 신장시킬 수 있다. 막 변형 기구의 비제한적 예는 진공실, 펌프에 연결된 유체실, 플런저(plunger), 기타 이에 유사한 것을 들 수 있다.
도 3, 5, 6 및 12에 나타난 바와 같이, 상기 막 변형 기구로는, 유체 채널(10)의 벽들(22, 24)을 밖으로 굴곡시켜서 상기 벽들에 부착된 상기 막(20)을 유체 채널(10)의 벽들(22, 24) 사이에서 신장시키는, 1 이상의 진공실(26)을 들 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 막(20)은 안정 위치에서 유체 채널(10)의 벽들(22, 24) 사이에서 신장되고, 양의 압력이 상기 실(26)에 가해져서 상기 벽들(22, 24)을 안으로 굴곡시켜 상기 막(20) 상의 변형을 감소 및/또는 제거할 수 있다. 다른 기구를 사용하여 상기 막(20)에 변형을 가할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 막(20)에 국지화된 변형을 부여하거나 또는 상기 막(20)을 다른 차원을 따라 변형시키기 위해 추가의 공기실(pneumatic chamber)을 유체 채널(10) 주위에 마련할 수 있다.
도 22의 A∼D는 상기 막(20)에 변형을 가할 수 있는 대안적 기구의 몇 가지 예들을 보여준다. 도 22의 A는 본 발명의 일 실시형태를 보여주며, 여기서 막(20)은 장치(5)의 벽들(22, 24)에 부착되고, 벽들(22, 24) 중 하나 또는 둘다는 유연하며 모터(M)에 부착되어 있어 그에 의해 그 벽들을 굴곡시켜 상기 막(20)에 변형을 가한다. 본 발명에 따르면, 상기 모터(M)는 벽들(22, 24)에 힘을 가할 수 있는 어느 장치로서, 예를 들면, 공기 또는 유압(pneumatic 또는 hydraulic) 실린더, 전기 모터 및 납 스크류 또는 케이블 및 풀리(pulley), 또는 솔레노이드를 들 수 있다. 추가의 힘이 요망되는 경우, 지레 및/또는 기계적 이득(mechanical advantage)을 활용하는 기구, 예를 들면 오버-센터 기구 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 대안적 실시형태에 따르면, 모터(M)는, 자유롭게 신장될 수 있는 막(20)에, 예를 들면, 도 22의 B에 도시된 바와 같이 유체 채널(10) 내의 슬롯(slot) 또는 다른 개구(opening)을 통해, 직접 결합될 수 있다. 씰(seal)을 마련하여 유체가 유체 채널(10) 밖으로 새어나오는 것을 막을 수 있다. 일부 실시형태에서는, 막을, 팽팽하게 당겨질 수 있는 케이블 또는 코드에 결합하여, 그 막에 변형을 가할 수 있으며, 1 이상의 풀리를 마련하여 상기 케이블 또는 코드를 용이하게 팽팽하게 할 수 있다. 상기 케이블 또는 코드는, 예를 들면, 전기 모터를 사용하여 풀리 주위로 그 케이블 또는 코드를 감음으로써 팽팽하게 할 수 있다. 대안적 실시형태에서, 상기 막(20)은 상기 막(20)의 1 가장자리에 평행하게 뻗어 있는 축(shaft) 주위로 그것을 감음으로써 변형될 수 있다.
본 발명의 대안적 실시형태에 따르면, 유체 채널(10)은 2개의 강체 요소(22, 24)로 형성될 수 있으며, 도 22의 C에 나타낸 바와 같이, 상기 중 하나의 요소(22)는 다른 요소(24) 내에서 슬라이딩한다. 전술한 바와 같이, 모터(M)를 사용하여 요소(22)를 요소(24)에 대하여 움직여 요소(22) 및 요소(24)의 반대쪽 가장자리에 결합 또는 부착된 막(20)에 변형을 가할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 겹치는 표면을 따른 씰(seal) 또는 벨로즈(bellows)를 사용하여 유체 채널(10)을 씰할 수 있다.
본 발명의 대안적 실시형태에 따르면, 유체 채널(10)은, 2개의 측벽들(22, 24) 간에 막(20)이 뻗어 있는 유연 하우징(flexible housing)으로 형성될 수 있다. 이 실시형태에서는, 유체 채널(10)의 상부 및/또는 저부에 힘을 가하여 상기 측벽(22) 및 측벽(24)을 바깥으로 굴곡시켜 상기 막(20)을 변형시킬 수 있다. 변형을 유발하는 힘은, 상부와 저부 벽이 만나면 횡 방향으로 팽창하는 유체 채널(10) 중을 흐르는 유체에 의해 보조될 수 있다. 이 실시형태에서는, 도 22의 D에 나타낸 바와 같이, 측벽(22) 및 측벽(24)은 그 측벽의 소정 부분을 따라 구부러지도록, 예를 들면 측벽(22, 24)이 유체 채널(10)의 상부 및 저부 벽을 만나고 막(20)이 측벽(22, 24)에 결합 또는 부착되도록 구성될 수 있다. 이 실시형태에서는, 유체 채널의 상부 및/또는 저부에 대한 압력을, 입구 포트부터 출구 포트까지 뻗어 있는 유체 채널(10)의 길이방향 축을 따라 순차로(sequentially) 가하여, 예를 들면, 연동 운동(peristaltic motion)을 시뮬레이션할 수 있다.
도 5에 나타낸 실시형태에서는, 막 지지 부재들(22, 24)은 유체 채널(10)의 제1 및 제2 벽을 포함하며 막 변형 기구(26)는 진공실이다. 상기 막은 제1실 벽 (제1 막 지지 부재) (22)과 제2실 벽 (제2 막 지지 부재)(24)에 장착된다. 각각의 조작 채널(26)은, 각각의 막 지지 부재(22, 24)에, 조작 채널(26)이 유체 채널(10) 및 다른 조작 채널(26)을 기준으로 하여 막 지지 부재(22, 24)의 반대측에 위치하도록, 인접하여 위치한다. 압력차 (유체 채널(10)에 비교한)를 진공을 통해 각 조작 채널(26)에 가하여, 상기 막 지지 부재를 원하는 방향으로 굴곡시켜 막(20)을 그 방향으로 팽창 또는 수축시킨다. 각각의 조작 채널(26)은 압력차를 부여할 수 있는 진공 시스템에 연결된다. 조작 채널(26)을 동일한 진공 시스템에 연결시키거나 또는 진공 시스템을 분리할 수 있다. 조작 채널(26)은 조작 채널 내의 포트와 배관을 통해 진공 시스템에 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서는, 상기 막을 0%∼50% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 5%∼15% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 약 10% 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포의 이상 조건 및/또는 상태를 생성하기 위해, 상기 막을 15%를 초과하여 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 상기 막은 20% 넘게 신장될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막은 불규칙적 또는 간헐적으로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 주기적으로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.01 Hz∼2 Hz의 주기적 속도로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.05 Hz∼0.25 Hz의 주기적 속도로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.2 Hz 미만의 주기적 속도로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.01 Hz∼0.18 Hz의 주기적 속도로 주기적으로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 약 0.15 Hz의 주기적 속도로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.15 Hz의 주기적 속도로 신장시킬 수 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 막을 0.2 Hz를 초과하는 주기적 속도로 신장시켜서, 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성할 수 있다(예, 장의 과잉수축의 모델링)
일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템은 마이크로유체 시스템일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "마이크로유체 시스템"은 유체의 마이크로리터 및/또는 나노리터의 조작이 가능한 기계를 나타낸다. 도 12b에 제시한 세포 배양 시스템의 실시형태에 의해 나타낸 바와 같이, 마이크로유체 시스템은, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 적어도 채널(들) 및 막 부재를 포함할 수 있는 마이크로유체 칩(50)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서는, 그 칩이 특정 마이크로유체 시스템에 사용될 수 있도록 칩(50)의 크기와 형상을 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 그 칩이 특정 마이크로유체 시스템의 제조자 또는 공급자에 의해 제공되는 다른 칩의 대체품으로서 사용될 수 있도록, 칩(50)의 크기, 형상 및 구조를 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 칩(50)은, 1 이상의 마이크로유체 채널(10)에 의해 1 이상의 출구 포트(62)에 연결된 1 이상의 입구 포트(60)를 포함할 수 있다. 포트(60, 62)는 특정 마이크로유체 시스템의 관 및/또는 커넥터를 받아들이는데 필요한 적절한 크기 및 형상으로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 입구 포트(들)(60)과 출구 포트(들)(62)을 연결하여, 유체가 입구 포트(들)(60)에 들어가서, 출구 포트(들)(62)에 이르기 전까지, 유체 채널(들)(10)의 일부 또는 전부를 통과할 수 있도록 할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 복수의 포트들이 유체 채널에 연결될 수 있다. 도 12b에 나타낸 실시형태에서는, 2개의 세포 배양 채널의 각각이 폭 1,000 ㎛, 길이 10,000 ㎛, 및 높이 150 ㎛이다. 조작 채널들(44, 46)은 높이 330 ㎛, 폭 1,684 ㎛, 및 길이 9,089 ㎛이다. 막(20)은 중심에서 중심까지 측정한 간격이 25 ㎛인 직경 10 ㎛의 공극을 갖는, 두께 30 ㎛의 PDMS 막이다. 일부 실시형태에서는, 칩(50)은 폭 15,000 ㎛; 길이 25,000 ㎛; 및 높이 5,000 ㎛일 수 있다.
도 23은 본원에 기술된 시스템의 일 실시형태를 나타낸다. 이 실시형태에서는, 유체 채널(10)은 폭 1,000 ㎛, 길이 10,000 ㎛, 및 높이 330 ㎛이며; 2개의 세포 배양 채널은 각각 폭1,000 ㎛, 길이 10,000 ㎛, 및 높이 150 ㎛이다. 진공실(26)은 폭 1,684 ㎛, 길이 9,089 ㎛, 및 높이 330 ㎛이다. 상기 막 (20)은 중심에서 중심까지 측정한 간격이 25 ㎛인 직경 10 ㎛의 공극을 갖는, 두께 30 ㎛의 PDMS 막이다.
유체 채널(10)과 세포 배양 채널(12 및 14)의 치수는 비율로 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 채널(10)의 높이:폭 비율은 1: 2 이상, 예를 들어, 1: 2 이상, 1:2.5 이상, 1:3 이상, 또는 1:35 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 채널(10)의 높이:폭 비율은 약 1:3이다. 일부 실시형태에서는, 유체 채널(10)의 높이:폭 비율은 1:5 이상, 예를 들어, 1:5 이상, 1:10 이상, 1:20 이상, 1:30 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 채널(10)의 높이:폭 비율은 약 1:30일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 진공실(26)의 폭에 대한 유체 채널(10)의 폭의 비율은 1:0.75 이상, 예, 1:0.75 이상, 1:1 이상, 1:1.25 이상, 1:1.5 이상, 또는 1:1.75 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 진공실(26)의 폭에 대한 유체 채널(10)의 폭의 비율은 1:1 내지 1:2일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 진공실(26)의 폭에 대한 유체 채널(10)의 폭의 비율은 약 1:1.68일 수 있다.
일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 폭: 길이 비율은 1:5 이상, 예를 들어 1:6 이상, 1:7 이상, 1:10 이상, 1:15 이상, 1:20 이상, 또는 1:30 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 폭: 길이 비율은 1:6 내지 1:20일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 폭: 길이 비율은 약 1:10일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이:폭 비율은 1:5 이상, 예를 들어 1:5 이상, 1:6 이상, 1:7 이상, 1:8 이상, 1:10 이상, 또는 1:15 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이: 폭 비율은 1:5 내지 1:10일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이: 폭 비율은 약 1:6.67일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이: 길이 비율은 1:20 이상, 예를 들어 1:20 이상, 1:25 이상, 1:30 이상, 1:40 이상, 1:50 이상, 1:60 이상, 1:70 이상, 1:80 이상, 또는 1:100 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이: 길이 비율은 1:20 내지 1:100일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널(12, 14)의 높이: 길이 비율은 약 1:66.67일 수 있다.
본원에 기술된 세포 배양 시스템의 구조 (예, 상기 막, 포트 및/또는 상기 막 지지 구조) 는, 에칭, 3-D 프린팅, 머시닝(machining), 또는 마이크로-머시닝(micro-machining) 등에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템은 에칭 프리(etching-free)이다. 일 실시형태에서는, 도 12b에 나타낸 세포 배양 시스템의 실시형태는 다음과 같이 형성될 수 있다. 세포 배양 시스템은 유연 투명 폴리디메틸실록산(PDMS; Sylgard, Dow Corning) 폴리머로부터 제조될 수 있다. 정렬된 상부 및 하부 마이크로채널들은 동일 사이즈(높이 150 ㎛ × 폭 1,000 ㎛) 로서 직경 10 ㎛ 원형 공극을 간격 25 ㎛로(중심에서 중심까지) 함유하는 두께 30 ㎛의 PDMS 막에 의해 분리될 수 있다(도 12a∼12c). 도 13에 나타낸 바와 같이, PDMS 프리폴리머(PDMS:경화제 15:1 w/w 비율)를, 포토레지스트(SU-8 100, Microchem, Newton, MA)로 만들어진 역(inverse) 채널 디자인으로 마이크로제작된 몰드 위에 캐스팅하여, 상부 및 하부 마이크로채널 층들을 따로따로 제조할 수 있다. 다공막(도 12c, 우측 삽입도)은, 원형 지주들(circular pillars)을 갖는, 지주 배열(post arrays)을 구비하는 마이크로제작된 실리콘 웨이퍼(직경 10 ㎛ × 높이 30 ㎛, 25 ㎛ 간격; MEMS and Nanotechnology Exchange, Reson, VA) 상에 PDMS 프리폴리머를 캐스팅하고, 상기 프리폴리머를 경화된, 평평한 실란화 PDMS 지지층 상에 놓고(overlaying), 상기 셋업(setup) 상에 3kg 추를 두고, 60℃에서 12시간 동안 상기 폴리머를 경화시킴으로써 제조될 수 있다. 웨이퍼로부터 다공성 PDMS 막과 지지층을 박리한 후, 다공성막의 표면을, 라보라토리 코로나 트리터(laboratory corona treater)(BD-20AC, Electro-Technic Products, Inc., Chicago, IL)에 의해 생성되는 플라즈마에 노출시킬 수 있으며, 상부 마이크로채널 층도 그렇게 할 수 있다. 다공성 PDMS 막 및 상부 마이크로채널 층의 플라스마 처리된 표면들은 그 후 즉시 공형 접촉(conformal contact)으로 둘 수 있다. 전체 셋업(setup)을 80℃에서 밤새 인큐베이션한 결과, 2개의 PDMS 층들이 비가역적으로 결합된다. 그리고 나서, PDMS 지지층을 PDMS 다공성막의 저부로부터 박리하고, 옆의 진공실에 걸쳐 위치한 이 막의 일부를 겸자를 사용하여 찢어내어, 풀 하이트(full-height)의 속이 빈 진공실을 제조할 수 있다. 찢어내어진 PDMS 막의 노출된 표면과, 상부층과 동일 형상의 하부 PDMS 마이크로채널 층의 상부 표면을, 플라스마에 노출하고, 정렬하고, 스테레오스코프(Zeiss Discovery V20 Stereo Microscope, Carl Zeiss MicroImaging Gmb, Germany) 하에서 함께 프레스하고, 80℃에서 밤새 경화하여, 주(main) 마이크로채널의 어느 쪽에도 속이 빈 진공실을 구비하는, 전체가 결합된 장치를 제조할 수 있다(도 12a 및 도 13). 유체 매체(medium) 및 진공원으로부터, 상부 및 하부 마이크로유체 채널까지, 허브-프리(hub-free) 스테인레스 스틸제 뭉툭한 바늘(18G; Kimble Chase, Vineland, NJ)을 사용하여, 각각, 배관(Tygon 3350 silicone tubing, ID 1/32", OD 3/32", Beaverton, MI)을 연결할 수 있다. 이에 의해, 중앙 마이크로채널 내의 배양 배지의 흐름을 제어하는 것과, 연동 운동을 모사하는 주기적인 기계적 변형을 가하기 위해 컴퓨터 제어 하에서 측실(side chamber)에 진공을 가하는 것을 조정하는 것이 가능하게 된다(도 12d).
본원에 기술된 세포 배양 시스템은 설계 및 적용 요건에 따라 생체적합성 유연 재료 또는 생체적합성 비유연성 재료로 제작될 수 있다. 도면에 나타낸 설계는 예시적인 것으로서 본원에 기술된 세포 배양 시스템은 도면에 나타난 구성에 한정되지 않는다. 세포 배양 시스템 및/또는 그 부분은 폴리디메틸 실록산(PDMS), 폴리우레탄 또는 폴리이미드 등의 생체적합성 재료로 만들어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 배양 시스템 및/또는 그 일부는 유리, 실리콘, 폴리설폰, 경성 플라스틱, 기타, 이들 재료의 조합과 같은 비유연성 재료에 의해 제조될 수도 있다.
생체적합성 폴리머란 생물 기능에 독성의 또는 유해한 효과를 갖지 않는 재료를 말한다. 생체적합성 폴리머는 천연 또는 합성 폴리머를 포함한다. 생체적합성 폴리머로는 콜라겐, 폴리(락테이트산), 폴리(글리콜산)과 같은 폴리(알파에스테르), 폴리오르쏘에스테르 및 폴리언하이드라이드 및 그들의 코폴리머, 폴리글리콜산 및 폴리글락틴, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 불화 폴리에틸렌, 페놀릭, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤즈옥사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오로올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 재생 셀룰로오스, 실리콘, 우레아-포름알데히드, 폴리글락틴, 또는 이들 재료의 코폴리머 또는 물리적 배합물을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
생체적합성 재료는, 예를 들면, 금속 기체 상의 세라믹 코팅일 수도 있다. 그러나 어떤 유형의 코팅 재료와 코팅도 금속, 세라믹스, 폴리머, 하이드로겔 또는 이들 재료의 조합 등의 상이한 유형의 재료들로 만들어질 수 있다. 생체적합성 재료로는 옥사이드, 포스페이트, 카보네이트, 나이트라이드 또는 카보나이트라이드를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 옥사이드 중에서는 탄탈륨 옥사이드, 알루미늄 옥사이드, 이리듐 옥사이드, 지르코늄 옥사이드 또는 티타늄 옥사이드가 바람직하다. 기체(substrate)는 금속, 세라믹스, 폴리머 또는 이들 중 어느 것의 조합과 같은 재료로 만들어진다. 스테인레스 스틸, 니티놀, 티타늄, 티타늄 알로이, 또는 알루미늄과 같은 금속과, 지르코니아, 알루미나, 또는 칼슘 포스페이트와 같은 세라믹스가 특히 관심의 대상이다.
생체적합성 폴리머는 예를 들면, 용매 캐스팅(solvent casting), 압축 성형, 필라멘트 드로잉(filament drawing), 메싱(meshing), 세탈(leaching), 위빙(weaving) 및 코팅 등의 방법을 사용하여 성형될 수 있다. 용매 캐스팅에서는, 1 이상의 폴리머의 메틸렌 클로라이드과 같은 적절한 용매에의 용액이 분지 패턴 부조 구조로 캐스팅된다. 용매를 증발시킨 후, 박막이 얻어진다. 압축 성형에서는, 폴리머가 최고 30,000파운드/inch2의 압력으로 프레스되어 적절한 패턴으로 된다. 필라멘트 드로잉은 용융 폴리머로부터의 드로잉을 포함하고 메싱은 섬유를 압축하여 펠트 유사 재료로 함으로써 메시(meshi)를 형성하는 것을 포함한다. 세탈(leaching)에서는, 두 재료를 함유하는 용액을 RUG의 최종 형상에 가까운 형상으로 스프레드한다. 다음에 용매를 사용하여 성분들 중 하나를 녹여 제거함으로써, 공극이 형성된다(참조. Mikos, U.S. Pat. No. 5,514,378, 그 내용이 전체로서 여기에 참조로 통합된다). 핵 형성(nucleation)에서는, RUG 형상의 박막이 방사선 손상 재료의 트랙(track)을 생성하는 방사성 핵분열 생성물에 노출된다. 다음에 폴리카보네이트 시트를 산 또는 염기로 에칭하여, 방사선 손상 재료의 트랙을 공극으로 전환한다. 최종적으로, 레이저를 사용하여, 많은 재료를 통하여 개개의 홀(hole)을 성형하고 버닝(burning)함으로써 균일한 공극 크기의 RUG 구조를 형성할 수 있다. 코팅은 예를 들면 액화 코폴리머(폴리-DL-락티드 co-글리콜라이드 50:50 80 mg/ml 메틸렌 클로라이드) 같은 재료로 폴리머 구조를 코팅 또는 침투시켜 그 기계적 특성을 바꾸는 것을 나타낸다. 코팅은 원하는 기계적 특성이 얻어질 때까지 1층 또는 복수층으로 행해져도 된다. 이들 성형 테크닉은 조합하여 채용될 수 있는데, 예를 들어, 폴리머 매트릭스는 위빙, 압축 성형 및 접합(glue)될 수 있다. 나아가 상이한 프로세스에 의해 성형된 상이한 폴리머 재료를 결합하여 복합체 형상을 형성해도 된다. 복합체 형상은 층상 구조일 수 있다. 예를 들면, 폴리머 매트릭스는 1 이상의 폴리머 매트릭스에 부착되어 다층 폴리머 매트릭스 구조를 형성해도 된다. 그 부착은 액체 폴리머에 의한 접합(gluing) 또는 봉합(suturing)에 의해 행하여져도 된다. 추가로, 폴리머 매트릭스는 솔리드 블록으로 형성되고 레이저 또는 다른 표준 머시닝 테크닉에 의해 원하는 최종 형태로 성형되어도 된다. 레이저 성형이란 레이저를 사용하여 재료를 제거하는 프로세스를 말한다.
본원에 기술된 세포 배양 시스템의 발명의 1 이상의 유체 채널을 통해 흐르게 하는 유체는 장 세포를 유지 또는 배양함에 적절한 어느 유체일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체 채널을 제1 세포 배양 채널 및 제2 세포 배양 채널로 분할하고 동일 유체 또는 상이한 유체를 각각의 채널을 통해 흐르게 할 수 있다. 제1 세포 배양 채널이 장 상피 세포를 포함하는 경우, 제1 세포 배양 채널을 통해 흐르는 유체는 장 세포를 유지 또는 배양함에 적절한 유체일 수 있다. 제2 세포 배양 채널이 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포를 포함하는 경우, 제2 세포 배양 채널을 통해 흐르는 유체는 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포를 유지 또는 배양함에 적절한 유체일 수 있다. 미생물 세포가 세포 배양 시스템 내에 존재하는 경우, 그 유체는 미생물 세포를 유지 또는 배양함에 적절해야 하며, 예를 들면, 그것은 미생물 세포가 감수성을 갖는 항생제를 함유해선 안 된다. 유체들은 세포 배양 배지, 용액, 버퍼, 영양분, 추적자 화합물(tracer compound), 염료, 항미생물제, 또는 본원에 기술된 세포 배양 시스템에서 배양되는 세포에 독성이지 않은 다른 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 장 세포, 장 상피 세포, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포, 및 미생물 세포를 유지 또는 배양함에 적합한 유체들을 잘 알고 있을 것이다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 장 상피 세포를 유지 또는 배양함에 적합한 유체로는, 20% 태아 소 혈청(FBS; Gibco), 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 100 μg/mL 노르모신 (Invivogen, San Diego, CA), 및 25 mM HEPES로 보충된, 4.5 g/L 글루코오스를 함유하는 덜베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM; Gibco, Grand Island, NY); 또는 20% 태아 소 혈청(FBS; Gibco), 및 25 mM HEPES로 보충된, 4.5 g/L 글루코오스를 함유하는 덜베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium); 를 들 수 있다.
일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템의 1 이상의 실(chamber)을 통해 흐르는 유체는 전단 응력을 받는다. 일부 실시형태에서는, 유체 흐름 및/또는 시스템의 디자인을 조절하여 원하는 전단 응력을 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템의 1 이상의 실 내의 유체에 의해 경험되는 전단 응력은 포유동물의 장 내에서 만나는 것과 동등한 전단 응력일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템의 1 이상의 실 내의 유체에 의해 경험되는 전단 응력은 장 장애를 겪는 포유동물의 장 내에서 만나는 것과 동등한 전단 응력일 수 있다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 장 장애는 질병 또는 폐색일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 0.3 dyne/cm2 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 0.1 dyne/cm2 이하일 수 있다. 일부실시형태에서는, 전단 응력은 0.0008∼0.08 dyne/cm2일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 0.010∼0.026 dyne/cm2일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 약 0.018 dyne/cm2일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력 및/또는 유체의 유속을 조절하여 장 상피 세포의 이상 상태 및/또는 조건을 생성(예, 장의 내강 성분의 "플러시 아웃"(flush-out)을 모델링)할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 전단 응력은 세포 배양 시스템 내에서 장 상피 세포가 배양되는 동안의 시간 동안 대략 동일하다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 세포 배양 시스템 내에서 장 상피 세포가 배양되는 동안의 시간 동안 증가 및/또는 감소할 수 있으며, 예를 들면, 전단 응력은 새로 첨가된 세포가 막 및/또는 기 존재하는 세포에 부착하도록 두는 시간 동안 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 규칙적, 주기적 패턴으로 변화될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 불규칙적 패턴으로 변화될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 경시적으로 0∼1000 dyne/cm2 변화할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 경시적으로 0.0008∼0.08 dyne/cm2 변화될 수 있다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 1 이상의 채널을 통해 흐르는 유체의 유속은 포유 동물의 장 내에서 만나는 그것과 동등하다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템의 1 이상의 실(chamber) 내의 유체의 유속은 장 장애를 겪는 포유 동물의 장 내에서 만나는 그것과 동등한 유체 유속일 수 있다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 장 장애는 질병 또는 폐색일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 500 ㎕/hr 이하일 수 있으며, 예를 들면, 500 ㎕/hr, 400 ㎕/hr, 300 ㎕/hr, 200 ㎕/hr, 100 ㎕/hr, 50 ㎕/hr, 10 ㎕/hr 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 100 ㎕/hr 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 50 ㎕/hr 이하일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 0∼50 ㎕/hr일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 40 ㎕/hr 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 35 ㎕/hr 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 0∼39 ㎕/hr일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 0∼35 ㎕/hr일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 0∼30 ㎕/hr일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 약 30 ㎕/hr일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 세포 배양 시스템 내에서 장 상피 세포가 배양되는 동안의 시간 동안 대략 동일하다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 세포 배양 시스템 내에서 장 상피 세포가 배양되는 동안의 시간 동안 증가 및/또는 감소할 수 있으며, 예를 들면, 유체의 유속은 새로 첨가된 세포가 막 및/또는 기 존재하는 세포에 부착하도록 두는 시간 동안 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 규칙적, 주기적 패턴으로 변화될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 유체의 유속은 불규칙적 패턴으로 변화될 수 있다.
일부 실시형태에서는, 유체 공급원으로부터의 유체 채널(10) 또는 막 변형 기구(26)를 통하는 유체 흐름의 제어는 자동화될 수 있다. 유체 공급원 또는 막 변형 기구로부터의 용액의 흐름의 제어가 자동화되는 실시형태에서는, 시린지 펌프 또는 솔레노이드를 사용할 수 있다. 다른 실시형태에서는, 1 이상의 컴퓨팅 장치 또는 시스템을 사용하여 유체 흐름 또는 막 변형 기구(26)을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 컴퓨팅 장치를 유체 공급원으로부터의 유체의 흐름을 제어하기 위해 유체 공급원 또는 포트(60)에 결합해도 된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 컴퓨팅 장치를 막 지지 부재(22, 24)의 움직임 및 막(20)의 신장을 자동화하는 막 변형 기구에 결합해도 된다. 예를 들면, 컴퓨팅 장치를 사용하여 진공 조작 채널 내의 압력을 제어할 수 있다.
도 20은, 그 안에서 기계가 본원에서 토의된 바와 같은 유체 흐름 또는 막 신장의 제어를 행하도록 하는 지시 세트가 이행되는, 컴퓨터 시스템(700)의 예시적 형태로서의 기계의 다이어그램도를 보여준다. 대안적 실시형태에서는, 기계는 단독의 장치로서 작동하거나 또는 다른 기계에 연결(예, 네트워크화) 되어도 된다. 상기 기계는 그 기계가 담당할 작용을 특정하는 퍼스널 컴퓨터, 태블릿, 개인 휴대 정보 단말기(PDA), 휴대폰, 웹 어플라이언스(web appliance), 네트워크 교환기(network router), 스위치 또는 브리지, 또는 지시 세트를 실행(순차 또는 그 반대) 가능한 어느 기계를 포함할 수 있다. 나아가, 단일의 기계만을 묘사하였으나, 용어 "기계"(machine)는, 본원에 기술된 방법의 1 이상을 수행하기 위해 개별적으로 또는 조인트하여 지시 세트(또는 복수의 지시 세트)를 수행하는 기계들의 임의의 집합을 포함하는 것으로 받아들여질 것이다.
일부 실시형태에 따르면, 컴퓨터 시스템(700)은, 프로세서(750) (예, 중앙 처리 장치(CPU), 그래픽 처리 유닛(GPU) 또는 이들 둘다), 주 메모리(760) (예, 독취 전용메모리(ROM), 플래쉬 메모리, 싱크로너스(synchronous) DRAM (SDRAM) 또는 램버스(Rambus) DRAM(RDRAM) 등의 다이나믹 RAM(DRAM), 기타) 및/또는 스태틱 메모리(770)(예, 플래쉬 메모리, 스태틱 RAM(static random access memory(SRAM), 기타)를 포함할 수 있으며, 이들은 버스(bus)(795)를 통해 서로 커뮤니케이션할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 컴퓨터 시스템(700)은 비디오 디스플레이 유닛(710) (예, 액정 디스플레이(LCD), 발광 다이오드 디스플레이(LED), 전계발광 디스플레이(ELD), 플라스마 디스플레이 패널(PDP), 유기 발광 다이오드 디스플레이(OLED), 표면 전도 전자 방출 디스플레이(surface conduction electron-emitted display (SED), 나노크리스탈 디스플레이, 3D 디스플레이, 또는 음극선관 (CRT))을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서는 컴퓨터 시스템(700)은 영숫자 입력 장치(715)(예, 키보드), 커서 컨트롤 장치(720)(예, 마우스 또는 콘트롤러), 디스크 드라이브 유닛(730), 신호 생성 장치(740)(예, 스피커), 및/또는 네트워크 인터페이스 장치(780)를 포함할 수 있다.
디스크 드라이브 유닛(730)은, 본원에 기술된 어느 1 이상의 방법 또는 기능을 구현하는 1 이상의 지시 세트(예, 소프트웨어(736))가 저장된 컴퓨터-판독 가능 매체(734)를 포함한다. 소프트웨어(736)는, 또한, 컴퓨터 시스템(700), 주 메모리(760) 및 프로세서(750)에 의한 그 실행 중에, 주 메모리(760) 내에 및/또는 프로세서(750) 내에, 완전히 또는 적어도 부분적으로, 존재할 수 있다. 프로세서(750) 및 주 메모리(760)는, 또한, 각각 지시(754) 및 지시(764)를 갖는 컴퓨터-판독 가능 매체를 구성할 수도 있다. 소프트웨어(736)는 네트워크 인터페이스 장치(780)를 통해 네트워크(790)에서 더 송신되거나 또는 수신되어도 된다.
컴퓨터-판독 가능 매체(734)를 단일 매체인 예시적 실시형태로 나타내었지만, 용어 "컴퓨터-판독 가능 매체"는 1 이상의 지시 세트를 저장하는 단일 매체 또는 복수의 매체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다 (예, 중앙집중형 또는 산포형 데이터베이스, 및/또는 연합 캐시 및 서버). 용어 "컴퓨터-판독 가능 매체"는 기계에 의한 실행을 위한 지시 세트를 저장, 인코딩 또는 운반할 수 있어서, 그 기계에게, 개시된 실시형태들의 어느 1 이상의 방법을 실행하게 하는, 어느 매체를 포함하는 것으로 해석될 것이다. 용어 "컴퓨터-판독 가능 매체"는, 따라서, 솔리드 스테이트 메모리, 및 광학 및 자기 매체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 해석될 것이다.
본원에 개시된 유체 흐름 및 막 변형 기구의 자동 제어에 관한 프로세스와 테크닉은 본질적으로 어떤 특정의 장치에 관련되지 않으며 부품들의 어느 적합한 조합에 의해 실현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 다양한 유형의 일반 목적 장치들을 본원에 기술된 교시에 따라 사용할 수 있다. 본원에 기술된 기능을 수행하기 위해 특화된 장치를 구성하는 것은 유익함을 알 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 많은 다른 조합의 하드웨어, 소프트웨어, 및 펌웨어가, 개시된 실시형태들을 실시함에 적합함을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서는, 막의 적어도 일면이 복수의 생 세포의 부착을 지원하는 적어도 1 유형의 부착 분자로 코팅된다. 일부 실시형태에서는 막의 일면이 복수의 생 세포의 부착을 지원하는 적어도 1 유형의 부착 분자로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 막의 두면이 복수의 생 세포의 부착을 지원하는 적어도 1 유형의 부착 분자로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 1 이상의 유형의 부착 분자, 예를 들어, 1 유형의 부착 분자, 2 유형의 부착 분자, 3 유형의 부착 분자, 4 유형의 부착 분자, 또는 그 이상의 유형의 부착 분자가 상기 막을 코팅한다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 상기 막에 화학적으로 결합하지 않고 상기 막에 부착하는 젤, 용액, 하이드로겔, 또는 다른 조성물로서 상기 막에 적용된다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 막에 화학적으로 결합, 예를 들어, 공유 결합 또는 가교 결합된다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자가 막에 매립된 채로 막이 생성된다 (예, 중합된다). 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 세포외기질의 성분일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 장 상피 세포의 표면상에 하나의 분자에 의해 결합된 하나의 분자일 수 있다. 부착 분자의 유형의 비한정적 예로서는 콜라겐; I형 콜라겐(collagen type I), II형 콜라겐; III형 콜라겐; IV형 콜라겐; V형 콜라겐; VI형 콜라겐; VII형 콜라겐; VIII 형 콜라겐; IX형 콜라겐, X형 콜라겐; XI형 콜라겐; XII형 콜라겐; XIII형 콜라겐; XIV형 콜라겐; 세포외기질, MATRIGEL™; 라미닌; 프로테오글리칸; 비트로넥틴; 피브로넥틴; 폴리-D-리신; 엘라스틴; 히알루론산; 글리코스아미노글리칸; 인테그린; 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, 및/또는 폴리사커라이드를 들 수 있다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 포유동물로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 합성되거나 또는 트란스제닉 생물로부터 얻어진다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 인간이 기원이다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자는 포유동물이 기원 또는 마우스가 기원 또는 영장류가 기원이다. 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 부착 분자의 탄수화물 및 펩티드 서열을 합성 또는 제조하는 방법을 잘 알고 있다. 부착 분자는 상업적으로도 입수 가능하며, 예를 들면 MATRIGEL™ (Cat No 356234; BD Biosciences Franklin Lakes, NJ) 또는 라미닌 (Cat No. 354232; BD Biosciences Franklin Lakes, NJ)이다. 일부 실시형태에서는, 부착 분자의 농도는 10 μg/mL∼1,000 μg/mL일 수 있으며, 예를 들면, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 500 μg/mL, 1,000 μg/mL 또는 이들 사이의 어느 값이다. 일부 실시형태에서는, 막은 I형 콜라겐 및 MATRIGEL™을 포함하는 혼합물로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 막은 50 μg/mL I형 콜라겐 및 300 μg/mL MATRIGEL™을 포함하는 혼합물로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 막은 50 μg/mL I형 콜라겐 및 300 μg/mL MATRIGEL™을 포함하는 1:1 (v:v) 혼합물로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 막은 무혈청 DMEM에 용해된 50 μg/mL I형 콜라겐 및 300 μg/mL MATRIGEL™을 포함하는 1:1 (v:v) 혼합물로 코팅된다. 일부 실시형태에서는, 막은 무혈청 DMEM에 용해된 래트로부터의 I형 콜라겐 50 μg/mL 및 300 μg/mL MATRIGEL™을 포함하는 1:1 (v:v) 혼합물로 코팅된다.
본원에 개시된 세포 배양 시스템의 일부 실시형태에서는, 적어도 1층의 장 상피 세포는 상기 막의 적어도 1 표면에 부착된다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포의 1 이상의 층, 예를 들어, 1층, 2층, 3층, 또는 더 많은 층이 상기 막에 부착된다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 상기 막의 한 면에 부착된다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 상기 막의 두 면에 부착된다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 1차 세포, 1차 소장 세포, 1차 대장 세포, 소장 세포, 대장 세포, 배양 세포, 계대 세포(passaged cell), 무한 증식 세포(immortalized cell), 트랜스제닉 세포, 유전자 변형 세포, 암 세포 또는 장암에 걸린 동물로부터의 세포, 장 질병 또는 장애에 걸린 동물로부터의 세포, 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 파네트 세포, 크립트 세포, 점액 분비 세포, Caco2 세포, 또는 HT-29 세포이다. 일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템 내의 장 상피 세포는 융모 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템은 제1 세포 배양 채널과 제2 세포 배양 채널을 포함하며, 상기 제1 세포 배양 채널은 장 상피 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템은 제1 세포 배양 채널과 제2 세포 배양 채널을 포함하며, 상기 제1 세포 배양 채널은 장 상피 세포를 포함하고 상기 제2 세포 배양 채널은 내피 세포, 면역 세포, 근육 세포 및/또는 결합 조직 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널 내의 세포는 그 세포 배양 채널에 노출된 막의 표면에 부착된다.
일부 실시형태에서는, 1 이상의 층의 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포, 예를 들어, 1층, 2층, 3층 또는 더 많은 층의 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포가 상기 막에 부착된다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포는 장 내피 세포이다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포는 모세관 내피 세포이다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포는 림프 내피 세포이다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포는 1차 세포, 1차 소장 세포, 1차 대장 세포, 피브로블라스트, 소장 세포, 대장 세포, 배양 세포, 계대 세포, 무한 증식 세포, 트랜스제닉 세포, 유전자 변형 세포, 암 세포 또는 장 및/또는 내피 암에 걸린 동물로부터의 세포, 장 질병 또는 장애에 걸린 동물로부터의 세포, 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)이다.
본원에 사용된 용어, "면역 세포"는 적응 또는 액성 면역에 관련된 면역 시스템의 어느 세포이다. 면역 세포의 비제한적 예에는 말초혈액 단핵세포 (PBMC), 형질세포양 수상세포(PDC), 골수 수상세포(MDC), B 세포, 마크로파지, 단구, 내츄럴 킬러 세포, NKT 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 과립구 또는 그 전구체가 포함된다.
본원에 사용된 용어, "결합 조직"은 기관을 지지하고, 그들 사이의 공간을 채우거나, 또는 근육을 뼈에 연결시키거나(힘줄과 인대) 관절 연골에 저마찰 중량 표면을 제공하는 것과 같은 기계적 기능을 수행하는 동물 조직을 나타낸다. 결합 조직은 그들의 상대적으로 혈관이 없는 매트리스 및 낮은 세포 밀도로 특징지워진다. 가장 풍부한 결합 조직은 망상 기질, 근육, 지방 조직, 연골 및 뼈이다. 결합 조직의 추가 예로는, 간충 조직, 점액 결합 조직, 성근 조직(areolar (loose)), 탄성(elastic), 또는 혈액을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 영구 분화 세포뿐만 아니라 결합 조직 세포 및 조직으로 분화할 잠재력이 있는 전구체 세포도 "결합 조직"의 정의 내에 포함된다.
일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템은 미생물 세포 및/또는 병원체를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포 및/또는 병원체는 장 상피 세포와 동일한 세포 배양 채널 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포 및/또는 병원체는 제1 세포 배양 채널 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포는 건강한 동물의 장 또는 창자에서 발견되는 미생물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포 및/또는 병원체는 건강하지 않은, 예를 들면 장 질병 또는 장애를 가진 동물의 장 또는 창자에서 발견되는 유기체일 수 있다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포 및/또는 병원체는 장의 질병 또는 장애를 일으키거나 기여하는 유기체일 수 있다.
일부 실시형태에서는, 미생물 세포가 호기성이다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포가 혐기성이다. 일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템은 호기성 및 혐기성 미생물 세포 둘다를 포함한다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포는 본원에 개시된 세포 배양 시스템에서 적어도 1일간 배양된다. 본원에 개시된 세포 배양 시스템 내에서의 미생물 세포의 배양을 이용하여 장의 미생물총 환경(microflora environment)을 모델링 및/또는 재현할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 본원에 개시된 세포 배양 시스템 내에서의 미생물 세포의 배양은 장 상피 세포의 생존 능력(viability)을 감소시키지 않으며, 예를 들면, 장 상피 세포의 생존 능력은 세포 배양 시스템에 미생물 세포를 도입한 후 10% 미만으로 감소된다.
미생물 세포는 박테리아 세포일 수 있으며, 그램 양성과 그램 음성 박테리아 둘다 포함된다. 본원에 개시된 세포 배양 시스템에 유용한 박테리아 세포의 비제한적 예에는 락토바칠루스(Lactobacillus); 박테로이데스(Bacteroides); 루미노콕쿠스(Ruminococcus); 펩토콕쿠스(Peptococcus); 펩토스트렙토콕쿠스(Peptostreptococcus); 비피도박테리움(Bifidobacterium); 에스케리키아(Escherichia); 아크로모박터(Achromobacter); 아시드아미노콕쿠스 페르멘탄스(Acidaminococcusfermentans); 아키네토박터 카코아세티쿠스(Acinetobactercacoaceticus); 아에로모나스(Aeromonas); 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenesfaecalis); 바칠루스(Bacillus); 부티리비베리오피브로솔벤스(Butyriviberiofibrosolvens); 캄플리오박터(Camplyobacter); 캄필로박터콜리(Campylobactercoli); 클로스트리듐 디피칠레(Clostridiumdifficile); 클로스트리듐소르델리(Clostridiumsordelli); 엔테로박터 클로아캐(Enterobactercloacae);엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcusfaecalis); 엔테로콕쿠스패키움(Enterococcusfaecium); 대장균(Escherichiacoli); 플라보박테리움(Flavobacterium); 미코박테리움(Mycobacterium); 미코플라스마(Mycoplasma); 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonasshigelloides); 프로피오니박테리움아크네스(Propionibacteriumacnes); 슈도모나스애루기노사(Pseudomonasaeruginosa); 루미노콕쿠스브로미이(Ruminococcusbromii); 팔련구균(Sarcina); 스타필로콕쿠스아우레우스(Staphylococcusaureus); 스트렙토콕쿠스안기노수스(Streptococcusanginosus);베요넬라(Veillonella); 비브리오(Vibrio); 예르시니아엔테로코리티카(Yersiniaenterocolitica); 락토바칠루스 람노수스(Lactobacillusrhamnosus); 락토바칠루스람노수스GG(Lactobacillusrhamnosus GG); 비피도박테리움 브레베(Bifidobacteriumbreve); 비피도박테리움 론검(Bifidobacteriumlongum); 비피도박테리움인판티스(Bifidobacteriuminfantis); 락토바칠루스아치도필루스(Lactobacillusacidophilus); 락토바칠루스플란타룸(Lactobacillusplantarum); 락토바칠루스파라카세이(Lactobacillusparacasei); 락토바칠루스불가리쿠스(Lactobacillusbulgaricus); 및 스트렙토콕쿠스 테르모필루스(Streptococcusthermophilus)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서는, 미생물 세포가 병원성이다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포가 장 병원체이다. 병원성 미생물 세포의 비제한적 예에는 장관독소원성 대장균(enterotoxigenic Escherichiacoli); 빌로필라 와드스워르티아(Bilophila wadsworthia); 시겔라(Shigella); 예르시니아(Yersinia); 플레이시오모나스(Pleisiomonas); 비브리오(Vibrio); 애로모나스(Aeromonas); 캄필로박터(Campylobacter); 크리토스포리디아(Crytosporidia); 콕키도시스(Coccidosis); 살모넬라(Salmonella); 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori); 클로스트리듐 디피킬레(Clostridium difficile); 살모넬라 케도우고우(Salmonella kedougou; 박테오리데스(Bacteroides); 클로스트리듐(Clostridium); 피르미큐테스(Firmicutes); 시겔리아 디센테리애(Shigellia dysenteriae); 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica); 살모넬라 티피(Salmonella typhi); 리스테리아(Listeria); 리스테리아 모노치토게네스(Listeria monocytogenes); 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus); 프로테우스(Proteus); 비브리오 콜레래(Vibrio cholera);엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica); 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 장 병원체들은 잘 연구되었고 기술되었으며(참조: 예를 들면, Microbial Pathogenesis and the Intestinal Epithelial Cell-Gail A. Hecht-2003-ASM press), 이 책에 기재된 장 병원체는 참조로서 본원에 통합된다.
일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템은 병원체를 포함한다. 본원에 사용된 용어, "병원체"는 어느 장 장애 또는 장 질병을 일으키거나 관련되는 것으로 알려진 바이러스, 박테리아, 균류(fungi), 및 기생충을 포함할 수 있다. 미생물 병원체는 상술되어 있다. 생(viral) 장 병원체의 비제한적인 예에는 로타바이러스(rotavirus); 노르워크양 바이러스(norwalk-like viruses); 아데노바이러스(adenoviruses); 아스트로바이러스(astroviruses); 삿포로양 바이러스(sapporo-like viruses); 토로바이러스(toroviruses); 코로나바이러스(coronaviruses); 피코르나바이러스(picornaviruses); 헤르페스 바이러스(herpes viruses); 및 노로바이러스(noroviruses)가 포함된다. 균류 장 병원체의 비제하적 예에는 칸디다(Candida), 아스페르킬루스(Aspergillus), 및 칸디다알비칸스(Candida albicans)가 포함된다. 장 기생충의 비제한적 예에는 단세포 기생충, 다세포 기생충, 아메바, 충(worms), 조충(tape worms), 원생동물, 흡충(flukes), 환형동물, 요충, 구충(hookworms), 기라디아 람블리아(Giradia lamblia), 크립토스포르디움(cryptosporidium), 및 엔타모이바 히스토리티카(Entamoeba histolytica)가 포함된다.
본원에 기술된 세포 배양 시스템의 일부 실시형태에서는, 시스템은 제1 세포 배양 채널의 적어도 일부와 접촉하는 혐기성 가스실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 혐기성 가스실은 유체에 의해 점유되어 있지 않은 제1 세포 배양의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 혐기성 가스실은 제1 세포 배양 채널 위의 세포 배양 시스템 내의 공동(void) 또는 공간(space)이며, 제1 세포 배양 채널 내의 유체의 상부 표면에 접하는 적어도 하나의 포트(port), 갭(gap) 또는 다른 수단을 갖는다. 일부 실시형태에서는, 제1 세포 배양 채널을 통해 흐르는 유체에 산소 구배가 수립된다. 일부 실시형태에서는, 제1 세포 배양 채널에의 유일한 입구점 또는 출구점이 막 내의 공극이 되도록, 장 상피 및 선택적으로, 미생물 세포가 도입된 후에 제1 세포 배양 채널을 씰링함으로써, 제1 세포 배양 채널 내에 혐기성 및/또는 빈산소(hypoxic) 조건을 생성할 수 있다. 그리고 나서 제2 세포 배양 채널에 유체를 제공할 수 있다. 제2 세포 배양 채널에 제공된 유체는 산소가 공급될 수도 있고(oxygenated) 산소가 제거될 수도 있다(deoxygenated).
일부 실시형태에서는, 적어도 제1 세포 배양 채널에 제공되는 유체는 제1 세포 배양 채널에 들어가기 전에 산소가 제거된다. 산소의 제거(deoxygenation)는, 진공 탈기, 막 탈기, 불활성 가스에 의한 치환, 또는 용액을 환원제와 접촉시키는 것에 의하는 등의 비한정적인 예를 수단으로 하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 제1 세포 배양 채널을 통해 흐르는 유체 내의 산소 수준이 8×10-2mol/L 이하; 예를 들어 4×10-2mol/L 이하; 8×10-3mol/L 이하; 또는 4×10-3mol/L 이하이다. 일부 실시형태에서는, 산소의 수준은 각각의 세포 배양 채널에서 같다. 일부 실시형태에서는, 혐기성, 불활성 가스를 1 이상의 세포 배양 채널을 통해 흐르게 한다. 일부 실시형태에서는, 호기성 및 혐기성 미생물의 공배양에 의해 세포 배양 채널 내의 산소의 국지적 농도를 감소시킬 수 있다.
본원에 기술된 세포 배양 시스템을 사용하여 본원에 기술된 세포 배양 시스템에 의해 구성된 세포에 대한 비-장 세포, 조직, 및/또는 인자들의 효과를 연구할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템을 포함하는 제1 세포 배양 시스템이, 장 상피 세포가 아닌 세포 또는 조직을 포함하는, 어느 디자인의 제2 세포 배양 시스템에 연결 또는 결합된다. 일부 실시형태에서는, 상기 제2 세포 배양 시스템에 의해 포함되는 세포 또는 조직은 간 세포 및/또는 조직이다. 일부 실시형태에서는, 제2 세포 배양 시스템의 유출물의 일부 분획 및/또는 장 상피 세포가 아닌 세포에 유래하는 인자들(예, 신호 전달 분자, 성장 인자, 또는 호르몬)이, 장 상피 세포를 포함하는 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 유체 채널을 통해 흐르는 유체에 도입된다. 그리고나서 본원에 기술된 제1 세포 배양 시스템 내의 장 상피 세포, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포, 및/또는 미생물 세포의 응답(응답)을 결정할 수 있다. 장 상피 세포, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포, 및/또는 미생물 세포의 응답, 및 그들을 결정 및/또는 측정하는 방법은 후술한다.
일부 실시형태에서는, 유체에 세포를 첨가하고 그 유체를 세포가 도입되는 유체 채널 및/또는 세포 배양 채널을 통하여 흐르게 함으로써 본원에 개시된 세포 배양 시스템에 세포를 도입한다. 일부 실시형태에서는, 세포의 부착을 증진하기 위해, 세포를 채널 내로 흐르게 하고, 그리고나서 유체의 흐름을 일시 정지시켜 그 세포가 막, 부착 분자, 및/또는 이미 채널 내에 존재하는 다른 세포에 부착하도록 둔다. 일부 실시형태에서는, 세포의 부착을 증진하기 위해, 세포 배양 시스템을 일시 회전시키거나 또는 리오리엔테이션(re-orientation)하여, 세포의 부착을 원하는 표면이 채널의 바닥 표면이 되도록 한다. 일부 실시형태에서는, 유체 흐름 또는 세포 배양 시스템의 오리엔테이션의 변경이 2분 이상, 예를 들면 2분, 5분, 15분, 30분, 60분, 120분 또는 그 이상 지속된다. 일부 실시형태에서는, 유체 흐름 또는 세포 배양 시스템의 오리엔테이션의 변경이 약 1시간 지속된다. 일부 실시형태에서는, 유체 흐름 또는 세포 배양 시스템의 오리엔테이션의 변경이 약 90분 지속된다.
본원에 개시되는 일부 실시형태는 장 오르가노이드의 제조 방법으로서, 이 방법은 장 상피 세포를 배양 및/또는 유지하는데 적합한 유체를, 본원에 개시된 세포 배양 시스템에 대하여, 상기 유체가 상기 장 상피 세포에 접촉하도록 제공하는 단계, 및 상기 장 세포를 체외에서 배양하는 단계를 포함한다. 장 상피 세포를 배양 및/또는 유지하는데 적합한 유체의 예는 본원에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서는, 상기 장 오르가노이드의 제조 방법은 제1 세포 배양 채널 내에서 장 상피 세포를 배양하고 제2 세포 배양 채널 내에서 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포를 배양하는 것을 더 포함한다. 일부 실시형태에서는, 2개의 세포 배양 채널을 분리하는 막을 신장시킨다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 채널을 통해 흐르는 유체의 흐름은 약 30 ㎕/hr이다. 일부 실시형태에서는, 전단 응력은 약 0.02 dyne/cm2이다. 일부 실시형태에서는, 상기 막은 약 0.15 Hz로 평면을 따라 약 10% 신장된다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포는 Caco-2 세포이다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포는 락토바칠루스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG)이다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포를 적어도 융모 구조가 분명할 때까지 배양한다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템을 사용하여, 줄기 세포, 예를 들어, iPSC, 성체 줄기 세포, 또는 ESC를 본원에 기술된 세포 배양 시스템에 도입함으로써, 줄기 세포의 성숙 장 세포로의 분화를 연구할 수 있다. 분화 인자들 및/또는 분화 인자 후보들을 선택적으로 상기 세포 배양 시스템에 첨가하여 그들의 줄기 세포 분화에 대한 효과를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템은 장 처리, 기능, 및/또는 병리를 평가하기 위한 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템 내의 세포를 장 장애, 예를 들면, 셀리악병, 크론씨 병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome)을 겪는 환자로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서는, 세포 배양 시스템 내의 조건을 변경하여 장 장애를 시뮬레이션할 수 있다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 병원성 미생물 세포를 세포 배양 시스템에 도입함, 고수준의 미생물 세포를 세포 배양 시스템에 도입함; 또는 유체의 유속을 증가시켜 설사를 시뮬레이션함에 의해, 장 장애를 시뮬레이션 및/또는 모델링할 수 있다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템은 장 효과인자 작용물질(intestinal effector agent)을 평가하기 위한 시스템을 포함한다. 본원에 기술된 일부 실시형태는, 장 효과인자 작용물질의 평가 방법이며, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 장 상피 세포를 적어도 하나의 장 치료 효과인자 작용물질 후보와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포 배양 시스템에서 상기 세포의 응답을 측정하여 상기 적어도 하나의 장 치료 효과인자 작용물질 후보의 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서는, 장 효과인자 작용물질은 화합물, 혼합물, 또는 유기체(organism)일 수 있다. 효과인자 작용물질 후보는, 장 상피 세포 및/또는 장에서 발견 가능한 미생물의 거동을 조절(modulate)하는 것으로 알려진 작용물질이거나 또는 장 상피 세포 및/또는 장에서 발견 가능한 미생물의 거동을 조절 가능한지를 알아보기 위해 테스트할 작용물질일 수도 있다. 일부 실시형태에서는, 장 효과인자 작용물질은 처리(treatment) 또는 약물(drug)이다. 일부 실시형태에서는, 장 효과인자 작용물질은 병원체 및/또는 독소이다. 장 효과인자 작용물질의 비제한적 예는, 치료제, 소분자, 영양 보조 식품, 지사제, 프로바이오틱스(probiotics), 천연 장 미생물총 및/또는 미생물, 식품, 비타민, 병원체, 및 독소이다. 일부 실시형태에서는, 장 효과인자 작용물질은 대상자 또는 환자에게 경구투여될 수 있는 물질이다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 세포는 1 이상의 장 효과인자 작용물질, 예를 들어, 하나의 효과인자 작용물질, 두 효과인자 작용물질, 세 효과인자 작용물질, 또는 그 이상의 효과인자 작용물질과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 장 상피 세포는 1 이상의 효과인자 작용물질과 접촉된다. 일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 미생물 또는 병원체 세포는 세포는 1 이상의 장 효과인자 작용물질과 접촉된다. 일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 내피, 면역, 또는 결합 세포는 1 이상의 장 효과인자 작용물질과 접촉된다. 비한정적인 예를 수단으로 하여, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 장 상피 세포는, 하나의 약물이 천연 장 미생물총을 조절하는지 또는 2개의 약물이 상호작용하는지 여부를 결정하기 위해, 2 이상의 효과인자 작용물질과 접촉될 수 있다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 세포 배양 시스템의 세포의 응답을 측정하여 적어도 하나의 장 치료 효과인자 작용물질 후보의 효과를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 장 상피 세포의 응답이 측정된다. 일부 실시형태에서는, 미생물 세포의 응답이 측정된다. 일부 실시형태에서는, 내피 세포, 면역 세포, 및/또는 결합 조직 세포의 응답이 측정된다. 세포의 응답의 측정은, 몰폴로지, 생존 능력, 세포수, 대사율, 전사, 번역, 마커 유전자 발현, 리포터 유전자의 수준, 수송, 장벽 기능, 또는 밀착 연접(tight junction)의 몰폴로지, 및/또는 세포 층의 투과성의 변화를 결정하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포의 응답의 측정은, 장 효과인자 작용물질의 세포에 도입되는, 세포에 의해 대사되는, 세포에 의해 분비되는, 또는 1 이상의 층의 세포를 가로지르는, 속도를 결정하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포의 응답을 측정하는 것은, 세포가 어떻게 장 효과인자 작용물질을 대사하는가를 결정하는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세포의 약물 대사 기능은 활성 CYP3A4 효소에 의해 발광형으로 전환되는 화학적 또는 발광원성의 기질을 사용하여 CYP3A4 효소 활성을 측정하여 융모 형성의 전 또는 후에 분석할 수도 있다. CYP3A4 활성의 분석는 당 업계에 주지이며 CYP3A4 활성을 검출하는 기질은 상업적으로 입수 가능하며, 예를 들면, Luciferin-IPA (Cat No V9001; Promega Madison, WI)이다. 세포의 응답을 측정하는 비제한적 예에는, 공초점 현미경(confocal microscopy)을 사용한 세포 몰폴로지의 결정; 면역형광 현미경을 사용한 단백질 수준의 결정; 및/또는 Ag/AgCl 전극 와이어(직경 0.008" A-M systems, Inc., Sequim, WA)에 결합된 전압-오옴 미터(87V Industrial Multimeter, Fluke Corporation, Everett, WA)를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정함에 의한, 정단의(apical) 밀착 연접(tight junction)의 수립에 기인하는 장 상피 세포 단층의 완전성(integrity)의 결정이 포함된다.
본원에 기술된 방법과 세포 배양 시스템은 약학, 독성학, 약물 개발, 약물 전달, 단백질 또는 펩티드 전달, 약물 대사, 항생 효과, 약물 코팅의 적합성 및 분해성, IgA 수송, 유전자 변형 유기체의 알러지 유발성 및 독성에 대한 스크리닝, 약물-약물 상호작용, 약물 생체이용효율, 약물 클리어런스(drug clearance), 다기관 상호작용(multi-organ interactions), 나노독성, 진단, 치료, 영양학적 응용, 장 장벽의 생리, 위장(GI) 질병 모델 및 그 메커니즘, 위장관 내의 질병의 병인학, 상처 치유, 조직 재생, 조직 공학, 장 항상성, 장 줄기 세포 연구, 숙주-미생물 상호 작용, 위장관내 미생물 공동체, 점액층내의 미생물 바이오필름, 및 프로바이오틱스 치료의 목적을 위한 장 효과인자 작용물질의 시험 또는 실험에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서는, 본원에 기술된 방법 및 세포 배양 시스템을 약물 트랜스포터 폴리모피즘을 포함하는 세포와 함께 약물 개발, 약물 전달, 약물 대사 및 약물 클리어런스 연구에 사용할 수 있다.
개시된 실시형태의 기재는, 망라적이거나 또는 그 개시된 정확한 형태로 개시를 한정하는 것을 의도하는 것이 아니다. 본 발명의 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 개시된 특정 실시형태들, 실시예들은 본원에 설명의 목적으로 기재되어 있으며, 다양한 등가의 변형물이 본 개시의 범위 내에서 가능할 것이다. 예를 들면, 방법의 단계나 기능이 소정의 순서로 나타나 있지만, 대안적 실시형태는 다른 순서로 기능들을 행할 수 있으며, 또는 기능들은 실질적으로 동시에 행하여질 수도 있다. 본원에 제공된 개시가 교시하는 바는, 다른 적절한 과정이나 방법에도 적용가능한 것이다. 본원에 기술된 다양한 실시형태들은 조합되어 추가의 실시형태들을 제공할 수 있다. 본원에 개시된 양상들은 수정될 수 있으며, 필요하다면, 개시된 바와 또다른 실시형태를 제공하기 위해, 상술한 참고문헌들의 구성, 기능 및 개념과 적용을 채용할 수 있다. 이러한 변화와 다른 변화들이 상세한 설명을 고려하여 개시된 내용에 가해질 수 있다.
어느 전술한 실시형태들의 특정 요소들은 다른 실시형태들의 요소들과 조합 또는 다른 실시형태들의 요소들로 치환될 수 있다. 나아가, 개시된 어떤 실시형태와 관련된 이점은 이들 실시형태의 맥락에서 기재된 것이고, 다른 실시형태도 그러한 이점을 발휘할 수 있지만, 본 개시의 범주에 속하는 모든 실시형태가 반드시 그러한 이점을 발휘해야 하는 것은 아니다.
명시된 모든 특허문헌 및 다른 간행물은 설명 및 개시의 목적으로 참조에 의해 본원에 명시적으로 통합되며, 예를 들면, 그러한 간행물에 기재된 방법들은 본 발명과 연결하여 사용될 수 있다. 이들 간행물은 오로지 그들의 개시가 본원의 출원일 전이기 때문에 제공된다. 이와 관련하여 그 무엇도, 선행 발명이라는 이유 또는 다른 어떠한 이유로도, 본 발명이 그러한 개시에 선행하는 자격을 갖지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문헌의 일자에 대한 모든 진술 또는 내용의 표현은 출원인이 이용가능한 정보에 기초한 것으로서 이들 문헌의 일자나 내용의 정확성에 관한 자백을 구성하지 않는다.
본 발명은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 다음의 실시예에 의해 더 설명된다.
본 발명의 일부 실시형태는 다음의 번호 매겨진 단락에 의해 정의될 수 있다.
1. 유체 공급원에 연결된 유체 채널을 구비하며, 상기 유체 공급원이 상기 유체 채널에 유체를 공급하는, 유체 장치;
막 지지 부재들 사이의 상기 채널 내에 위치하며, 그 적어도 일부가 유연한, 막;
상기 막 지지 부재들에 결합되며, 상기 막 지지 부재들을 움직여서 상기 막을 그 막의 적어도 1차원을 따라 신장시킬 수 있는, 막 변형 기구; 및
상기 막의 적어도 1 표면에 부착된 적어도 1층의 장 상피 세포
을 포함하는 세포 배양 시스템으로서,
상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 1.0 dyne/㎠ 미만인 세포 배양 시스템.
2. 단락 1에 있어서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 0.008∼0.08 dyne/㎠인, 세포 배양 시스템.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 약 0.018 dyne/㎠인, 세포 배양 시스템.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 변화할 수 있는, 세포 배양 시스템.
5. 단락 4에 있어서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 0∼1000 dyne/㎠ 변화할 수 있는, 세포 배양 시스템.
6. 단락 4 또는 단락 5에 있어서, 상기 유체 채널을 통해 흐르는 상기 유체에의 전단 응력이 경시적으로 0.008∼0.08 dyne/㎠ 변화할 수 있는, 세포 배양 시스템.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 0%∼50% 신장시키는, 세포 배양 시스템.
8. 단락 1 내지 6 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 5%∼15% 신장시키는, 세포 배양 시스템.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 약 10% 신장시키는, 세포 배양 시스템.
10. 단락 1 내지 9 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 15%를 초과하여 신장시켜서 상기 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성하는, 세포 배양 시스템.
11. 단락 1 내지 10 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 0.01 Hz∼2 Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장시키는, 세포 배양 시스템.
12. 단락 1 내지 11 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 0.05 Hz∼0.25 Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장시키는, 세포 배양 시스템.
13. 단락 1 내지 12 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 0.15 Hz의 속도로 주기적으로 신장시키는, 세포 배양 시스템.
14. 단락 1 내지 12 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 0.2 Hz를 초과한 속도로 주기적으로 신장시켜서 상기 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성하는, 세포 배양 시스템.
15. 단락 1 내지 14 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 불규칙적으로 또는 간헐적으로 신장시키는, 세포 배양 시스템.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 500 ㎕/hr 미만의 유속으로 흐르는, 세포 배양 시스템.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 100 ㎕/hr 미만의 유속으로 흐르는, 세포 배양 시스템.
18. 단락 1 내지 17 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 0∼50 ㎕/hr의 유속으로 흐르는, 세포 배양 시스템.
19. 단락 1 내지 18 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체가 상기 유체 채널을 통하여 약 30 ㎕/hr의 유속으로 흐르는, 세포 배양 시스템.
20. 단락 1 내지 19 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막의 적어도 일면을 코팅하는 복수의 생 세포의 부착을 지원하는 적어도 1종의 부착 분자를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
21. 단락 20에 있어서, 상기 적어도 1종의 부착 분자가 콜라겐; I형 콜라겐; MATRIGEL™; 세포외기질; 라미닌; 프로테오글리칸; 비트로넥틴; 피브로넥틴; 폴리-D-리신; 폴리펩티드; 올리고뉴클레오티드; DNA; 및 폴리사커라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 세포 배양 시스템.
22. 단락 1 내지 21 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 장 상피 세포가 포유동물 또는 인간 세포인, 세포 배양 시스템.
23. 단락 1 내지 22 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 장 상피 세포가 Caco2 세포; HT-29 세포; 1차 소장 상피 세포; 1차 대장 상피 세포; iPS 세포; ESC 세포; 줄기 세포; 파네트 세포; 크립트 세포; 및 점액 분비 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 세포 배양 시스템.
24. 단락 1 내지 23 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템의 상기 장 상피 세포가 융모 구조를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
25. 단락 1 내지 24 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템이 상기 막의 적어도 제2 표면 상에 적어도 1층의 내피 세포를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
26. 단락 1 내지 25 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막이, 상기 유체 채널을 제1 세포 배양 채널과 제2 세포 배양 채널로 분할하도록 위치한, 세포 배양 시스템.
27. 단락 26에 있어서, 상기 제1 세포 배양 채널이 장 상피 세포를 포함하는, 세포 배양 시스템,
28. 단락 26 또는 단락 27에 있어서, 상기 제2 세포 배양 채널이 내피 세포, 면역 세포, 및 결합 조직 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포를 포함하는, 세포 배양 시스템.
29. 단락 1 내지 단락 27 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템이 미생물 세포 또는 병원체를 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
30. 단락 29에 있어서, 상기 미생물 세포가 상기 시스템 내에 적어도 1일간 유지되는, 세포 배양 시스템.
31. 단락 29 또는 단락 30에 있어서,
상기 미생물 세포가 락토바칠루스(Lactobacillus); 박테로이데스(Bacteroides); 루미노콕쿠스(Ruminococcus); 펩토콕쿠스(Peptococcus); 펩토스트렙토콕쿠스(Peptostreptococcus); 비피도박테리움(Bifidobacterium); 에스케리키아(Escherichia); 아크로모박터(Achromobacter); 아시드아미노콕쿠스 페르멘탄스(Acidaminococcusfermentans); 아키네토박터 카코아세티쿠스(Acinetobactercacoaceticus); 아에로모나스(Aeromonas); 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenesfaecalis); 바칠루스(Bacillus); 부티리비베리오피브로솔벤스(Butyriviberiofibrosolvens); 캄플리오박터(Camplyobacter); 캄필로박터콜리(Campylobactercoli); 클로스트리듐 디피칠레(Clostridiumdifficile); 클로스트리듐소르델리(Clostridiumsordelli); 엔테로박터 클로아캐(Enterobactercloacae);엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcusfaecalis); 엔테로콕쿠스패키움(Enterococcusfaecium); 대장균(Escherichiacoli); 플라보박테리움(Flavobacterium); 미코박테리움(Mycobacterium); 미코플라스마(Mycoplasma); 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonasshigelloides); 프로피오니박테리움아크네스(Propionibacteriumacnes); 슈도모나스애루기노사(Pseudomonasaeruginosa); 루미노콕쿠스브로미이(Ruminococcusbromii); 팔련구균(Sarcina); 스타필로콕쿠스아우레우스(Staphylococcusaureus); 스트렙토콕쿠스안기노수스(Streptococcusanginosus); 베요넬라(Veillonella); 비브리오(Vibrio); 예르시니아엔테로코리티카(Yersiniaenterocolitica); 락토바칠루스 람노수스(Lactobacillusrhamnosus); 락토바칠루스람노수스 GG(Lactobacillusrhamnosus GG); 비피도박테리움 브레베(Bifidobacteriumbreve); 비피도박테리움 론검(Bifidobacteriumlongum); 비피도박테리움인판티스(Bifidobacteriuminfantis); 락토바칠루스아치도필루스(Lactobacillusacidophilus); 락토바칠루스플란타룸(Lactobacillusplantarum); 락토바칠루스파라카세이(Lactobacillusparacasei); 락토바칠루스불가리쿠스(Lactobacillusbulgaricus); 및 스트렙토콕쿠스 테르모필루스(Streptococcusthermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 세포 배양 시스템.
32. 단락 29 또는 단락 30에 있어서, 상기 미생물 세포가 병원성인, 세포 배양 시스템.
33. 단락 29 또는 단락 32에 있어서, 상기 병원체가 장관독소원성 대장균(enterotoxigenic Escherichiacoli); 빌로필라 와드스워르티아(Bilophila wadsworthia); 시겔라(Shigella); 예르시니아(Yersinia); 플레이시오모나스(Pleisiomonas); 비브리오(Vibrio); 애로모나스(Aeromonas); 캄필로박터(Campylobacter); 크리토스포리디아(Crytosporidia); 콕키도시스(Coccidosis); 살모넬라(Salmonella); 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori); 클로스트리듐 디피킬레(Clostridiumdifficile); 살모넬라 케도우고우(Salmonellakedougou; 박테오리데스(Bacteroides); 클로스트리듐(Clostridium); 피르미큐테스(Firmicutes); 시겔리아 디센테리애(Shigellia dysenteriae); 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica); 살모넬라 티피(Salmonella typhi); 리스테리아(Listeria); 리스테리아 모노치토게네스(Listeria monocytogenes);비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus); 프로테우스(Proteus); 비브리오 콜레래(Vibriocholera); 엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica); 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 로타바이러스(rotavirus); 노르워크양 바이러스(norwalk-like viruses); 아데노바이러스(adenoviruses); 아스트로바이러스(astroviruses); 삿포로양 바이러스(sapporo-like viruses); 토로바이러스(toroviruses); 코로나바이러스(coronaviruses); 피코르나바이러스(picornaviruses); 헤르페스 바이러스(herpes viruses); 노로바이러스(noroviruses); 칸디다(Candida), 아스페르킬루스(Aspergillus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 단세포 기생충, 다세포 기생충, 아메바, 충(worms), 조충(tape worms), 원생동물, 흡충(flukes), 환형동물, 요충, 구충(hookworms), 기라디아 람블리아(Giradia lamblia), 크립토스포르디움(cryptosporidium), 및 엔타모이바 히스토리티카(Entamoeba histolytica)로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 세포 배양 시스템.
34. 단락 29 내지 단락 33 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 미생물 세포가 호기성인, 세포 배양 시스템.
35. 단락 29 내지 단락 33 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 미생물 세포가 혐기성인, 세포 배양 시스템.
36. 단락 29 내지 단락 35 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템이 호기성 및 혐기성 미생물 세포를 모두 포함하는, 세포 배양 시스템.
37. 단락 29 내지 단락 36 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 미생물 세포가 상기 제1 세포 배양 채널 내에 존재하는, 세포 배양 시스템.
38. 단락 29 내지 단락 37 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템이 상기 제1 세포 배양 채널의 적어도 일부와 접촉하는 혐기성 가스실을 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
39. 단락 38에 있어서, 상기 제1 세포 배양 채널을 통해 흐르는 상기 유체에 산소 구배가 수립되는, 세포 배양 시스템.
40. 단락 1 내지 39 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막이 적어도 부분적으로 다공성인, 세포 배양 시스템.
41. 단락 40에 있어서, 상기 막의 적어도 하나의 공극 어퍼쳐(pore aperture)가 폭 치수를 따라 0.5∼10 ㎛인, 세포 배양 시스템.
42. 단락 1 내지 41 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막이 폴리디메틸실록산(PDMS)을 포함하는, 세포 배양 시스템.
43. 단락 1 내지 42 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 막을 진공압에 기인하여 신장시키는, 세포 배양 시스템.
44. 단락 43에 있어서, 상기 시스템이, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치한 상기 장치의 제1실 벽으로서, 상기 막이 상기 제1실 벽에 장착되어 있는, 제1실 벽;
상기 제1실 벽의 반대쪽 상의, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접한 제1 조작 채널로서, 상기 제1 조작 채널과 상기 적어도 하나의 유체 채널 간에 가해지는 압력차가, 상기 제1실 벽을, 제1의 원하는 방향으로 굴곡시켜 상기 막으로 정의되는 평면을 따라 팽창 또는 수축시키는, 제1 조작 채널; 및
상기 적어도 하나의 유체 채널과 상기 적어도 하나의 조작 채널 사이에 압력차를 부여하는 진공 시스템으로서, 상기 막이 상기 압력차에 응하여 상기 평면을 따라 신장하는, 진공 시스템
을 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
45. 단락 44에 있어서, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치한 상기 장치의 제2실 벽으로서, 상기 막의 반대쪽 단부가 상기 제2실 벽에 장착되어 있는, 제2실 벽; 및
상기 제2실 벽의 반대쪽 상의, 상기 적어도 하나의 유체 채널에 인접하여 위치하는 제2 조작 채널로서, 상기 제2 조작 채널과 상기 적어도 하나의 유체 채널 간의 압력차가, 상기 제2실 벽을, 제2의 원하는 방향으로 굴곡시켜 상기 막으로 정의되는 평면을 따라 팽창 또는 수축시키는, 제2 조작 채널
을 더 포함하는, 세포 배양 시스템.
46. 단락 1 내지 단락 45 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 유체 장치가 마이크로유체 칩을 포함하는, 세포 배양 시스템.
47. 단락 1 내지 단락 46 중 어느 1 단락에 있어서, 상기 시스템이, 기원이 장이 아닌 세포 또는 조직을 포함하는 제2 세포 배양 시스템에 연결 또는 결합된, 세포 배양 시스템.
48. 단락 47에 있어서, 상기 제2 세포 배양 시스템이 간의 세포 또는 조직을 포함하는, 세포 배양 시스템.
49. 장 상피 세포를 유지하는데 적합한 유체를, 단락 1 내지 단락 48 중 어느 한 단락에 기재된 세포 배양 시스템에 대하여, 상기 유체가 상기 장 상피 세포에 접촉하도록 제공하는 단계; 및
상기 장 상피 세포를 체외에서 배양하는 단계
를 포함하는 장 오르가노이드 제조 방법.
50. 단락 49에 있어서, 상기 세포를 적어도 융모 구조가 분명할 때까지 배양하는 단계를 더 포함하는, 장 오르가노이드 제조 방법.
51. 단락 1 내지 단락 48 중 어느 1 단락에 기재된 세포 배양 시스템을 포함하는 장 효과인자 작용물질 평가 시스템.
실시예
실시예 1
'거트 온 어 칩'(gut-on-a-chip)은, 장 운동성(예를 들어, 연동운동 및 분절운동)에 유사한 율동적인 기계적 왜곡을 경험할 수 있는, 다공성 유연 세포외기질(ECM) 코팅된 막에 의해 분리된, 모세혈관 및/또는 림프 유미관(lymphatic lacteal)으로부터 배양된 인간 장 상피 세포 및 인간 내피 세포의 단층을 함유하는 마이크로유체 시스템일 수 있으며, 이 시스템은 인간 장의 조직-조직 계면 및 마이크로구조를 재현하도록 디자인되어 있다(도 1). '거트 온 어 칩' 프로젝트의 목적은, 경구로 전달되는 화합물, 치료제, 영양 보조 식품, 기능성 식품, 병원체, 및 독소에 대한 인간의 응답에 대한 강력하고, 재현가능하며, 예측적인 체외 플랫폼(in vitro platform)을 제공하는 것이다. 거트 온 어 칩은 약학, 독성학, 약물 개발, 약물 전달, 약물 대사, 약물-약물 상호작용, 약물 생체이용효율, 약물 클리어런스, 다기관 상호작용(예를 들어 장과 간), 진단, 치료, 영양학적 응용, 장 장벽의 생리, 위장(GI) 질병 모델 및 그 메커니즘, 위장관 내의 질병의 병인학, 상처 치유, 조직 재생, 조직 공학, 장 항상성, 장 줄기 세포 연구, 숙주-미생물 상호 작용, 위장관내 미생물 공동체, 점액층내의 미생물 바이오필름, 프로바이오틱스 치료, 및 잠재적으로 모든 다른 위장관 관련 연구의 분야의 광범위한 응용에 유용해야 한다.
근접 위치한 병렬의 마이크로채널들(1,000×10,000×150 ㎛ = W×L×H)의 2중층을 함유하는 3D 구조를 갖는, 실리콘 엘라스토머 폴리머(폴리디메틸실록산, PDMS)를 사용한, 거트 온 어 칩 시작품(prototype) 마이크로유체 장치의 제작을 여기에 기술한다. 하나의 마이크로채널은 장 내강(lumen)을 나타내며 다른 하나의 마이크로채널은 모세 마이크로 혈관구조를 모사한다. 이들 마이크로채널은 직경 10 ㎛의 홀(hole)을 갖는 두께 30 ㎛의 유연, 다공성 PDMS 막에 의해 분리되어 있다(도 2). 마이크로채널 옆에는, 2개의 진공실이 배치되어 마이크로채널에 진공-유도 기계적 변형을 가한다(도 3의 A∼D). 거트 온 어 칩 을 기하학적으로 최적화하여, 장 상피 세포에의 전단 응력과, 세포-기체 부착의 강도의 차이에 기인하는 상피 단층의 박리에 의해 발견되는 문제를, 최소화하였다. 그 구성 과정 역시, 이전에 사용되던 과정에 비교하면, 속이 빈 진공실을 제조하는 에칭-프리(etching-free) 과정을 개발함으로써 성공적으로 개선되었는데, 왜냐하면 PDMS 에칭 과정은 장치마다 고르지 못한 에칭 효율, 독성 화학물질의 사용, 및 시간/노동 문제의 관점에서 문제가 있었기 때문이다.
여기에 기재한 실험은 인간 결장 샘 암종 Caco-2 세포에 의해 행하여졌으며, 이는 존재하는 상업적 약물-시험 제품에서 인간의 흡수성 장 상피를 모델링하는데 통상 사용되는 것이다. Caco-2 세포는 일부 분자 트랜스포터와 약물 대사 효소를 결여하고[2] 점액층을 분비하지 않는 것으로 보고되었지만[3], 인간 소장 기능과 연관성이 높은 장벽 기능, 밀착 연접 단백질 발현, 선택적 투과성, 및 쇄자연 효소(brush border enzymes)의 활성을 재수립할 수 있는 잘 특성화된 세포주이다[4]. 인간 마이크로 혈관 내피 세포(HMVEC)를 사용하여, 도 1에 나타낸 바와 같이, 공배양된 Caco-2 세포로부터의 다공성 ECM-코팅 막의 반대측 쪽에, 모세관 내피를 형성하였다.
인간 장 기능의 체외 분석을 위한 이 모델을 개발하기 위해, 마이크로유체 장치 내에 다공성 PDMS 막을 제작하고 나서, DMEM(4.5 g/L 글루코오스, 항생제 함유, 그러나 무혈청)에 용해된 콜라겐 I과 Matrigel의 혼합물을 마이크로채널에 주입하고, 그 장치를, 5% CO2 37℃의 가습 인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이트함으로써 ECM으로 코팅했다. 다음날 DMEM(4.5 g/L 글루코오스, 20% 혈청 FBS, 항생제 함유)을 채널을 통해 관류시키고(perfuse)(30 ㎕/h), 그리고나서 Caco-2 세포(∼5×106 세포/mL)를 배지 중에서 하나의 채널 내로 6시간 동안 흐르게 하였다(도 4의 A). Caco-2 세포를 상부 마이크로채널 내에 도입한 후, 장치에 연결된 모든 배관을 클램핑하고, 세포를 5% CO2 37℃의 가습 인큐베이터에서 1.5시간 동안 인큐베이트하여 세포 부착을 촉진하였다(도 4의 B).
다공성 PDMS 막의 표면에 Caco-2 세포가 부착된 후, 저부 마이크로채널을 클램핑하면서(즉, 관류 없음), 배양 배지(4.5 g/L 글루코오스, 항생제, 및 20% FBS를 함유하는 DMEM)를 상부 마이크로채널에 30 ㎕/h로 48시간 동안 관류시켜 융합(confluent) 및 구별된(differentiated) Caco-2 단층을 수립하였다(도 4의 C 및 D). 일단 Caco-2 단층이 양호하게 수립되자(도 4의 C 및 D), 상부 및 저부 쌍방의 마이크로채널을 배양 배지(4.5 g/L 글루코오스, 항생제, 및 20% FBS를 함유하는 DMEM)로 30 ㎕/h로 동시 관류하였다. 다공성 PDMS 막의 다른 쪽 위에 HMVE 세포를 접종하기 전에, DMEM(4.5 g/L 글루코오스, 항생제, 및 5% 혈청를 함유): EGM2-MV, 1:4, v/v)을 제2 채널을 통해 24시간 관류시켰다. HMVE 세포 (∼5x106 세포/mL)를 저부 마이크로채널 내로 시딩하고(seeding), 장치의 위아래를 역전시켜, Caco-2 단층의 반대쪽 위에 HMVE 세포의 부착을 1.5시간 동안 촉진하였다. HMVEC가 잘 부착된 후, 상부 및 저부 쌍방의 마이크로채널을 통해 배지를 30 ㎕/h로 관류시켜 Caco-2 및 HM VE 세포의 공배양을 유지하였다(도 5). 20∼40 ㎕/h의 일정한 유속 범위(이는 0.012∼0.024 dyne/cm2의 전단 응력 범위에 상당함)를 갖는 시린지 펌프(syringe pump)에 의해 제어되는 배관을 통해, 배양 배지를 관류시켰다. 소장 내에서 생체 내 관찰된 전단 응력은 0.008∼0.08 dyne/cm2의 범위에 있는 것으로 보고되었으며, 이는 본 실시형태의 거트 온 어 칩 장치의 전단 응력의 범위와 잘 일치한다 [5-6].
세포 단층이 완전히 융합(confluent)되고 정의된 유동 조건 하에서 안정되었을 때, 수송 실험을 행하였다. ∼26%(∼85 kPa)까지의 다양한 연장%로 0.15 Hz의 일정한 빈도로 음압을 진공실에 가함으로써 유도되는 주기적 신장에 의해 기계적 변형을 가하였다(도 3의 A∼D). Caco-2 및 HMVE 세포의 공배양된 단층을, 수송 또는 장벽 기능 분석 실험을 개시하기 전에, 12시간 이상 주기적 변형을 겪게 하였다. 본 거트 온 어 칩 장치에 가해진 주기적인 기계적 변형은, 경상피 전기 저항(transepithelial electrical resistance, TEER)(데이터를 나타내지 않음)의 큰 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 장 상피의 장벽 기능이 증진된 장의 생리적 연동운동을 유의하게 모사함이 발견되었다. 상부 및 저부 마이크로채널 간의 전기 저항을, 오옴 미터를 구비한 Ag/AgCl 전극으로 모니터링하고, 그 저항을 그 값에 세포 단층의 표면적을 곱함으로써 TEER 값으로 전환하였다. 상기 세포 단층에, 5%의 변형 증분으로 0%부터 25% 연장(elongation)까지 24시간 이상 기계적 변형을 가하였을 때, TEER 값이 급증하고, 그리고나서 더 높은 평탄한 값에 이르며, 경시적으로 조직-조직 계면의 % 연장이 증가함에 따라 점진적으로 증가함이 관찰되었다.
세포 단층을 통한 분자 침투성을 측정하기 위해, 프레시한 배양 배지를 동시에 하부 채널(즉, 모세관 측)에 흐르게 하면서, 배양 배지에 용해한 표적 분자를 상부 마이크로채널(즉, 내강측) 에 도입하였다. 저부 채널로부터 간헐적으로 샘플을 채취하여 분석하여 세포 단층을 통한 누적 분자 수송을 어림하였다(도 6a∼6c). 이들 연구에 의해, Caco-2 세포 단층을 단독 시험하든 HMVE 세포 단층과 조합하여 시험하든, 기계적 변형이 FITC-덱스트란 (도 7 및 9) 및 루시퍼 옐로우(도 8) 를 포함하는 형광 분자의 방세포 수송(paracellular transport)를 증가시키는 것으로 나타났다. 본 조직-조직 장벽 기능모델에서 얻어진 겉보기 투과계수(Papp)를 Papp = (dQ/dt)/(A-Co)(식에서, Q는 수용자 측에의 화합물의 수송된 누적량(vg), t는 시간(sec), A는 그것을 가로질러 수송이 일어나는 세포 단층의 노출 표면적(cm2)이고 Co는 공여자 측의 화합물의 초기 농도(14/mL)이다)의 식에 기초하여 계산하였다 [7]. TEER 값이 증가하는 것은 더 높은 접합부(junctional) 장벽이 존재함을 나타낸다는 것을 고려할 때, 현재로서는, 왜 기계적 신장이 대분자(FD20) 및 소분자 (LY) 쌍방의 방세포 수송을 증진하는지 명확히 이해되고 있지 않다. 그러나, 이는 이전에 렁 온 어 칩(lung-on-a-chip)에서 관찰된 양자 도트(quantum dot) 수송 연구에서 관찰된[1], 생리적으로 적절한 트랜스사이토시스 응답(transcytosis response)으로부터 초래하는 것일지도 모른다.
트랜스포터-매개 투과성을 측정하기 위해, Caco-2 세포가 발현하는 것으로 알려진 주지의 투과성 글리코프로틴(P-gp) 유출 수송 경로에 대하여, 로더민(Rhodamine) 123(Rho123)을 기질로 사용하였다. 상업적 Transwell 필터 셋업을 사용한 정적 조건하에서, P-gp을 통한 Rho123의 유출에 의해 나타나는 바와 같이, Rho123 수송이 관찰되었으며, 이는 'AP>BL' 수송보다 'BL>AP' 수송에서의 더 큰 P app값에 상당한다(도 10). 또한, P-gp 저해제인 베라파밀(Verapamil)이 양 채널에 가해질 때, BL측으로부터 AP측으로의 유출이 극적으로 감소하였다(도 10). Rho123이 Caco-2 단층에서 P-gp를 표적으로 하여 잘 기능함이 확인된 후, Rho123을 거트 온 어 칩 장치에 가하였다. 이 예비 실험에서는, 배양 배지에 용해된 Rho123을 기계적 변형의 존재 또는 부재하에 AP측 또는 BL측에 가하였다. 기계적 변형의 존재에서는, P app값은 증진된 투과율로 귀결되었으며, 이는 Rho123 유출의 Papp 값보다 높았다.
이 결과에 기초하여, 본 거트 온 어 칩 마이크로유체 장치는 그 생리적 적절성을 평가하기 위해 기계적 변형의 존재 또는 부재하에 영양물질 흡수, 이온 수송 및 나노 입자/나노 입자 복합체(conjugate) 수송을 시험하기 위한 신규한 체외 장 모델로서의 잠재적 용도를 갖는다. 거트 온 어 칩은, 체내 적절성을 최대화하기 위한 기계적 변형의 존재 또는 부재 하에, 약물 수송(섭취(uptake) 및 유출(efflux)), 약물 동력학, 약역학, 대사, 약물-약물 상호작용, 제형의 흡수의 효과뿐만 아니라, 유효성, 독성, 및 클리어런스를 포함하는 약물 개발을 연구하는데 사용될 수도 있다. 그것은 장 융모의 구조와의 토폴로지 유사성에 의해 장 상피와 다른 세포 유형(예를 들어 모세관 또는 림프 내피, 면역 세포, 결합 조직, 기타) 간의 상호 작용을 탐구하는데 적용될 수 있다 (도 1).
'거트 온 어 칩'은 또한 기계적 변형의 존재 또는 부재 하에 종래의 약물 및 나노사이즈 재료의 독성(즉 나노 독성)을 평가하는데 적용될 수 있다. 이에 더하여, 관련 미생물들을 포함하는 임계적인 성분들과 병인학적 인자들을 재현함으로써, 염증성 장 질병(예를 들어 크론씨 병 및 궤양성 대장염), 장폐색(ileus), 및 자극성 장 증후군과 같은 위장관 질병을 모델링하는데 사용될 수도 있다. 본원에 기술된 시스템은 또한 장 질병에 대한 개시, 전파, 종결, 중심 기구의 탐구, 예방 접종, 및 잠재적 약물의 개발을 가능하게 하며, 숙주-미생물 상호작용, 숙주 세포와 미생물의 공배양, 병원체와 프로바이오틱 균주 간의 상호 작용(interplay), 위장관 내에서의 바이오필름 형성, 및 장 상피 및 다른 세포 유형에 대한 프로바이오틱 균주의 포지티브/네거티브 효과를 실연한다(demonstrate). 나아가, '거트 온 어 칩' 플랫폼 상에 제작된(engineered) 인간 미생물 군집(microbiomes)을 활용하여, 유전자조작된 미생물 군집이 미생물 공동체와 숙주 조직 내에서 장 건강을 잠재적으로 증진시키기 위해 어떻게 역할하는지를 나타낼 수 있다. 거트 온 어 칩은 또한 장 줄기 세포의 연구에 사용될 수 있다. 마이크로 제작된 장치 내의 다양한 공간 구조에 의해, 장 줄기 세포의 적소(niche)와 그들의 운명을 조절할 수 있다.
나아가, 본원에 기술된 시스템은, 장 기능의 보다 실제적인 모델을 제공하는 잠재력을 가진 인간 장의 융모 마이크로 구조(architecture)를 보다 가깝게 모사하는 비평면적 다공막과 함께 사용될 수 있다. 이는 미생물총-상피 상호작용 및 음식 흡수를 분석하는 연구에 특히 적절할 수 있다.
거트 온 어 칩에 가해지는 기계적 변형은 살아있는 인간의 장에서 일어나는 연동운동 및 분절운동이 일어나는 생체내 물리적 마이크로 환경의 생리적 적절성을 실연한다. 예를 들면, 본원에 기술된 결과는, 장 상피 단층의 주기적 변형(예를 들면 0∼25% 연장으로 빈도 0.15 Hz)이, 정적 Transwell 배양 또는 기계적 신장이 없는 종래의 마이크로유체 시스템의 사용 둘다에 비해 특정 분자의 겉보기 투과율을 증가시키면서, 접합부의 장벽 기능의 유의한 증가를 유발함을 밝혀낸다(도 7, 8 및 9). 생리적인 기계적 변형에 의한 이 수송 결과는, 체외에서 약물 후보를 평가하는 궁극의 판단기준이 될 수 있다.
기계적 변형이 낳는 효과는 몇가지의 결정적인 이점을 제공한다. 첫째, 거트 온 어 칩은, 인간을 기원으로 하는 세포들(예를 들어, 인간 장 세포주, 인간 1차 장 세포, 또는 인간 장 줄기 세포)을 통합함으로써 인체 내의 전체 장 기관 생리를 보다 가깝게 모사하는 생리적 응답을 나타낸다. 이 생리적 적절성은, 약물 개발의 중간 단계에서의 신뢰성 있는 약물 스크리닝 프로세스를 개발하는 것뿐만 아니라 재현가능한 약물 동력학의 개발에 있어서 가치를 가질 것이다. 둘째, 거트 온 어 칩은, 상이한 세포 유형의 근접(proximity)이 영양 물질과 약물 화합물의 흡수와 수송에 상승효과를 만들어내는데에 어떻게 기여하는지를 나타내기 위한, 기관 수준의 기능성을 제공할 수 있다. 세째, 거트 온 어 칩은, 아직 완전히 이해되어 있지 않은 체외 모델, 인시츄(in situ) 동물 모델, 및 생체내 인체 간의 정보의 갭을 극적으로 줄일 수 있다. 인간 장 미생물 또는 잠재적 병원성 미생물을 적용함으로써, 거트 온 어 칩은, 중요한(critical) 숙주 세포를 갖는 인간 장 내의 상황을 재구성하는데 사용될 수 있다. 동물 모델에서의 결과는, 뚜렷한 종간의 차이 탓에, 인간에서 관찰되는 약물 수송 및 대사 반응을 종종 예측하지 못하기 때문에, 거트 온 어 칩은 생리적 또는 병적 장 연동운동을 모사하는 기계적 변형 하에서, 3차원 구조의 복수의 인간 기관-특이적 세포 유형들을 통합함으로써, 강한 생체내 적절성을 갖는 대안적 체외 모델을 제공할 수 있다.
참고문헌
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실시예 2
극히 중요한 미생물 공생자와 함께 인간 장의 기계적, 구조적, 흡수, 수송 및 병태생리학적 특성을 모사하는, 장의 체외 생 세포 기반 모델의 개발은, 의약 개발을 가속시킬 수 있으며, 동물 실험을 잠재적으로 대체할 수 있다. 살아있는 장의 복잡한 구조 및 생리를 모사하는, 세포외기질(ECM)으로 코팅되고 인간 장 상피(Caco-2) 세포로 라이닝된 다공성 유연 막에 의해 분리된 2개의 마이크로유체 채널을 구비하는 생체 모방의 '인간 거트 온 어 칩' 마이크로장치의 일 실시형태를 기술한다.
장 마이크로 환경은, 마이크로채널에 대하여 낮은 전단 응력(0.02 dyne/cm2)을 생산하는 저속으로(30 ㎕/hr) 유체를 흐르게 하고, 생리적 연동운동을 모사하는 주기적 변형(10%; 0.15 Hz)을 부여함으로써, 재생성된다. 이러한 조건 하에서, 빠르게 극성화(polarize)하는 원주형 상피가 발달하고, 자발적으로 장 융모 구조를 재현하는 주름(folds)으로 되어, 정적 Transwell 모델에서의 배양에서의 세포보다 전체 장을 더 잘 모사하는, 소분자에 대한 고완전성의 장벽을 형성한다. 이에 더하여, 정상 장 미생물(Lactobacillus rhamnosus GG)을, 상피 세포 생존 능력을 양보하지 않고, 배양된 상피의 내강 내 표면 상에서, 연장된 기간 동안(>1주) 성공적으로 공배양할 수 있으며, 이는 인간에게서 이전에 관찰된 바와 같이 장벽 기능을 실제로 중진시킨다. 따라서, 본 거트 온 어 칩은, 수송, 흡수, 및 독성 연구에 적합한, 제어된 마이크로유체 환경 내에서의 그 기능에 임계적인, 인간 장의 복합적인(multiple) 동적 물리적 및 기능적 특징을 재현하며, 따라서 약물 시험뿐만 아니라 새로운 장 질병 모델의 개발에 대해서도 뛰어난 가치를 갖는다.
약물 개발은, 많은 비용이 들고, 노동 집약적이며, 시간 소모가 크고 윤리적으로 의문의 여지가 있는 동물 모델의 사용에 의존하기 때문에, 제약이 있었다.1 더 염려되는 것은 동물 모델은 종종 인간에게서 얻어지는 결과를 예측하지 못하며,2-3 이는 약물 또는 영양소의 대사, 수송 및 경구 흡수에 관한 시험을 다룰 때 특히 문제로 된다.4-5 이러한 이유로, 경상피 장벽 및 수송 연구를 가능하게 하는8-9 Transwell 필터 인서트6-7를 활용하는 세포 배양 시스템, 및 장기간의 배양도 지원하는 미니어쳐화 마이크로유체 모델10-14 등의, 인간 장 기능의 체외 모델의 개발에 대한 관심이 늘어났다. 다른 이들은, 인간 장 융모의 형상, 크기 및 밀도를 모사하는 마이크로가공된 하이드로젤 기체 상에서 인간 장 상피(예, Caco-2) 세포를 배양함으로써 체외에서 장 내벽의 정상 3차원(3D) 구조를 재생성하는 것을 시도하였다.11 그러나, 존재하는 체외 장 모델 중 어느 것도, 정상적인 기관 생리15, 뿐만 아니라 크론씨 병이나 다른 장 장애의 발병16-17에 결정적인, 살아있는 장의 기계적으로 활성인 마이크로 환경(연동 운동과 내강 내부의 유체 흐름)을 재현할 수 없다. 존재하는 체외 장 모델의 다른 한계는, 살아있는 장에서는 통상적으로 일어나는, 배양된 장 상피의 내강 표면 상에서 살아있는 미생물을 연장된 기간 동안 기르는 것이 가능하지 않았던 것이다. 이는 핵심적인 문제인데, 왜냐하면 미생물 공생자는, 통상, 장 장벽 기능, 약물과 화학물질의 대사 및 흡수, 및 많은 질병에 상당한 기여를 하기 때문이다.18-22 따라서, 연동운동을 행하고, 유체 흐름을 경험하며, 인간 세포 생존 능력을 양보함 없이 미생물 총의 성장을 지원하는, 인간 '거트 온 어 칩'의 형태의 인간 장의 보다 생리적으로 적절한 체외 모델을 여기에 기술한다.
마이크로장치 디자인 및 제작: 이전에 호흡을 하는 렁-온-어-칩(lung-on-a-chip) 장치를 생성하는데 사용했던 소프트 리소그래피(soft lithography) 기술을 적응시킴으로써, 유연 투명 폴리디메틸실록산 (PDMS; Sylgard, Dow Corning) 폴리머로부터, 거트 온 어 칩 장치를 제작하였다.23 정렬된 상부 및 하부 마이크로채널은 동일 크기(높이 150 ㎛ × 폭 1,000 ㎛) 였으며, 간격(중심에서 중심)이 25 ㎛인 직경 10 ㎛의 공극을 갖는, 두께 30 ㎛의 PDMS 막에 의해 분리되었다(도 12a∼12c). 도 13에 나타낸 바와 같이, PDMS 프리폴리머(PDMS: 경화제 15:1 w/w 비율)를, 포토레지스트(SU-8 100, Microchem, Newton, MA)로 만들어진 역(inverse) 채널 디자인으로 마이크로제작된 몰드 위에 캐스팅하여, 상부 및 하부 마이크로채널 층들을 따로따로 제조하였다. 다공막(도 12c, 우측 삽입도)은, 원형 지주들(circular pillars)을 갖는, 지주 배열(post arrays)을 구비하는 마이크로제작된 실리콘 웨이퍼(직경 10 ㎛ × 높이 30 ㎛, 25 ㎛ 간격; MEMS 및 Nanotechnology Exchange, Reson, VA) 상에 PDMS 프리폴리머를 캐스팅하고, 상기 프리폴리머를 경화된, 평평한 실란화 PDMS 지지층 상에 놓고, 상기 셋업(setup) 상에 3kg 추를 두고, 60℃에서 12시간 동안 상기 폴리머를 경화시킴으로써 제조하였다. 웨이퍼로부터 다공성 PDMS 막과 지지층을 박리한 후, 다공성막의 표면을, 라보라토리 코로나 트리터(laboratory corona treater)(BD-20AC, Electro-Technic Products, Inc., Chicago, IL)에 의해 생성되는 플라즈마에 노출시키고, 상부 마이크로채널 층도 그렇게 하였다. 다공성 PDMS 막 및 상부 마이크로채널 층의 플라스마 처리된 표면들을 그 후 즉시 공형 접촉(conformal contact)으로 두었다. 전체 셋업(setup)을 80℃에서 밤새 인큐베이션한 결과, 2개의 PDMS 층들이 비가역적으로 결합되었다. 그리고 나서, PDMS 지지층을 PDMS 다공성막의 저부로부터 박리하고, 옆의 진공실에 걸쳐 위치한 이 막의 일부를 겸자를 사용하여 찢어내어, 풀 하이트(full-height)의 속이 빈 진공실을 제조하였다. 찢어내어진 PDMS 막의 노출된 표면과, 상부층과 동일 형상의 하부 PDMS 마이크로채널 층의 상부 표면을, 플라스마에 노출하고, 정렬하고, 스테레오스코프(Zeiss Discovery V20 Stereo Microscope, Carl Zeiss MicroImaging Gmb, Germany) 하에서 함께 프레스하고, 80℃에서 밤새 경화하여, 주(main) 마이크로채널의 양쪽에 속이 빈 진공실을 구비하는, 전체가 결합된 장치를 제조하였다 (도 12a 및 도 13). 유체 매체(medium) 및 진공원으로부터, 상부 및 하부 마이크로유체 채널까지, 허브-프리(hub-free) 스테인레스 스틸제 뭉툭한 바늘(18G; Kimble Chase, Vineland, NJ)을 사용하여, 각각, 배관(Tygon 3350 silicone tubing, ID 1/32" OD 3/32" Beaverton, MI)을 연결하였다. 이에 의해, 중앙 마이크로채널 내의 배양 배지의 흐름을 제어하는 것과, 연동 운동을 모사하는 주기적인 기계적 변형을 가하기 위해 컴퓨터 제어 하에서 측실(side chamber)에 진공을 가하는 것을 조정하는 것이 가능하게 되었다(도 12d).
세포 배양: 인간 Caco-2 장 상피 세포 (Caco-2BBE 인간 결장직장 암종주24)를 하버드 소화기 질병 센터(Harvard Digestive Disease Center)로부터 얻어, 20% 태아 소 혈청(FBS; Gibco), 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 100 μg/mL 노르모신 (Invivogen, San Diego, CA), 및 25 mM HEPES로 보충된, 4.5 g/L 글루코오스를 함유하는 덜베코 변법 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM; Gibco, Grand Island, NY)에서 길렀다. Caco-2 세포의 살아있는 장 미생물과의 공배양을 위한 배양 배지로부터 항생제를 제거하였다.
마이크로장치의 제작 및 조립 후에, 배관과 마이크로유체 채널을, 그 장치에 70% (v/v) 에탄올을 흐르게 하고 전체 시스템을 60℃ 오븐에서 건조시킴으로써, 멸균했다. 건조된 장치는 그 후 자외광과 오존에 30분간 동시 노출시켰다(UVO Cleaner 342, Jelight Company Inc., Irvine, CA) . 무혈청 DMEM 내에 래트의 I형 콜라겐(50 μg/mL; Gibco)과 Matrigel (300 μg/mL; BD Biosciences, Bedford, MA)을 함유하는 ECM 용액25-27 을 마이크로채널에 주입하고, 마이크로채널을 배양 배지로 관류한 후에, 37℃ 2시간 인큐베이션하였다. 트립신/EDTA 용액(0.05%; Gibco)에 의해 수확한 Caco-2 세포를, ECM-코팅된 다공막의 상부 표면 위에, 멸균 주사기(1 mL 투베르쿨린 슬립 팁(Tuberculin slip tip); BD, Franklin Lakes, NJ)와 니들(25G 5/8; BD)을 사용하여 그 세포 용액을 상부 마이크로채널 내로 온화하게 끌어당겨 플레이팅하였다(1.5×105 세포/cm2). 이 세포 밀도에서는, 거트 온 어 칩 장치에 씨딩한 후에 마이크로채널 내에 세포의 응집 또는 겹침은 관찰되지 않았다. Caco-2 세포를 ECM-코팅된 PDMS 표면에 ∼30분 이내로 부착시키고 1시간 이내로 세포-세포 부착을 생성하였다(나타내지 않음). 1시간 후, 시린지 펌프 (BS-8000; Braintree Scientific Inc., Braintree, MA)를 사용하여 배양 배지를 상부 채널을 통해 일정한 유속(30 ㎕/hr, 0.02 dyne/cm2 전단 응력을 발생시킴)으로 배양 제1일 동안 연속적으로 관류시켜 Caco-2 세포가 완전한 단층을 수립한 것을 확인하고, 그 후 상부 및 하부 채널 양자를 통해 배지를 동일 유속으로 흐르게 하였다.
장의 연동운동을 모사하는 주기적 방식으로 Caco-2 단층을 기계적으로 변형하기 위해, 컴퓨터-제어 FX5K 장력 장치(computer-controlled FX5K Tension instrument) (Flex Cell International Corporation, Hillsborough, NC)를 사용하여, 주기적 흡인을 진공실에 연결된 배관에 가하였다(도 12a, 12b). 이 장치는 거트 온 어 칩 내의 다공막의 1방향성 연장을 ∼50%까지 할 수 있다; 그러나, 본 연구에서는 살아있는 인간 장 내에서 상피 세포가 경험하는 기계적 마이크로 환경을 보다 가깝게 모사하는 주기적 신장 요법(10% 평균 세포 변형, 0.15 Hz 빈도)16, 28을 적용하였다. 가해진 압력과, 다공막 기체의 뒤틀림과 세포 변형 간의 관계를 먼저 넓은 범위(0∼30% 변형)에 걸쳐 정량하여 장치의 제어 인자들의 특성을 규명하였다(도 12e).
거트 온 어 칩 장치에서 사용된 것과 같은 I형 콜라겐과 Matrigel의 ECM 혼합물로 프리 코팅된 다공성 폴리에스테르 막 삽입물(insert)(0.33 cm2, 0.4 ㎛ 공극)을 함유하는 Transwell 플레이트(Corning Inc., Lowell, MA) 내에서의 Caco-2 세포의 정적 배양을 이용하여 대조구 연구를 행하였다. Transwell 실의 정단측 및 기저외측 양쪽에 대하여 격일로 배지를 리프레시하면서 Caco-2 세포도 동일 밀도(1.5×105 세포/cm2)로 플레이팅하였다.
상피 장벽 측정: 정단의 밀착 연접의 수립에 기인하는 인간 장 상피 세포 단층의 완전성을, 공초점 면역 형광 현미경의 사용과 경상피 전기 저항(TEER)의 측정에 의해, 밀착 접합부의 단백질인 오클루딘29 에 대한 염색에 의해 평가하였다. Transwell 배양에서, 젓가락 모양 전극에 결합된 Millicell ERS 미터(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 TEER를 측정하고, 세포의 부재 하에 측정된 베이스라인 저항값을 빼고, 그리고나서 남은 '고유'(specific) 저항값(Ω)에 세포 배양 표면적(cm2)을 곱하여 TEER 값(Ωcm2)을 결정하였다. 거트 온 어 칩에서 배양된 Caco-2 단층의 TEER는 Ag/AgCl 전극 와이어(직경 0.008" A-M systems, Inc., Sequim, WA)에 결합된 전압-오옴 미터(87V Industrial Multimeter, Fluke Corporation, Everett, WA)를 사용하여 측정하였으며; 대조구 연구에 의해 양 방법에서 유사한 TEER값이 얻어진 것을 확인하였다. 다시, Caco-2 단층에 의해 얻어진 결과로부터 세포의 부재 하에 측정된 베이스라인 저항값을 빼고, 고유 저항에 PDMS 막 상의 총 세포 배양 표면적을 곱함으로써 특이적 TEER 값을 결정하였다 (표 1).
아미노펩티다제 활성의 측정: 인간 장 상피 세포 기능성을, 분화된 인간 장 Caco-2 세포 단층30 에 의해 발현되는, 정단(apical)의 쇄자연 아미노펩티다제 효소의 비활성도(specific activity)를 L-알라닌-4-니트로아닐리드 하이드로클로라이드(A4N; Sigma, St. Louis, MO)를 기질로 하여 정량함으로써 측정하였다. Transwell 연구에서는, 4N 기질 용액(배지에 1.5 mM)을 5일 또는 21일간 배양된 세포의 상부 실에 가하고, 37℃ 2시간의 인큐베이션 후에, 상부 실 내의 용액(70 ㎕)을 96 웰 플레이트(Black/clear flat bottom, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ)에 옮겨, 그곳에서 절단 산물 (즉, 4-니트로아닐린)을 배양 배지를 기준으로 사용하여 405 nm에서 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 정량하였다. 아미노펩티다제의 비활성도는 총 활성을 총 세포수로 나누어 구하였다. 절단 산물의 실제 양은 4-니트로아닐린의 보정 곡선에 기초하여 어림하였다.
거트 온 어 칩에서 아미노펩티다제의 비활성도를 측정하기 위해, 5일간 주기적인 기계적 변형(10% 변형, 0.15 Hz 빈도)의 존재 또는 부재 하에 배양된 Caco-2 단층을 함유하는 장치의 상부 마이크로채널을 통해 4N 용액을 30 ㎕/hr로 흐르게 하였다. 상부 마이크로채널의 출구로부터 매 1시간마다 수집된 샘플(30 ㎕)을 Transwell 샘플의 분석에 사용된 것과 동일한 체적(70 ㎕)으로 희석하고 96웰 플레이트(Black/clear flat bottom, BD Falcon)로 옮겨 그곳에서 광학적 밀도를 상술한 바와 같이 측정하였다.
방세포 투과율 측정: 밀착 연접 완전성이 수립된(TEER ≥ 600Ωcm2) 후에, 장 세포 단층의 겉보기 투과계수(P app, cm/sec)를, 경시적으로 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 덱스트란 (FD20; 20 KDa; Sigma, St. Louis, MO)의 수송을 측정함으로써 결정했다. Transwell 연구에서는, 상부 실 내의 상피의 정단면에 FD20을 가하고(200 ㎕; 1 mg/mL), 프레시한 배양 배지의 동일 체적에 의해 동시에 보충하면서, 하부 실로부터 분획량 (70 ㎕)을 매 15분마다 제거하였다(700 ㎕ 총 체적). 하부 실로부터 수집된 샘플의 형광 강도(490 nm 여기/ 520 nm 방출)를 즉시 측정하여 세포의 정단면으로부터 기저외측 표면으로 수송된 FD20의 양을 정량하였다. 배양 배지 단독에서 측정된 베이스라인 형광 값을 뺀 후에, 겉보기 투과계수(P app)를, P app(cm/sec) = (dQ/dt)(1/AC o )(식에서, dQ/dt는 정상 상태 유동(g/sec), A는 배양 표면적(cm2)이고 Co는 세포 정단면에 적용된 FD20 용액의 초기 농도(g/L)이다)에 따라 계산하였다.31
거트 온 어 칩을 사용하여 수행된 연구에서는, 상부 채널을 통하여 상기 FD20 용액을 관류하고, 하부 채널의 출구로부터 매 1시간마다 수집된 샘플 분획량(30 ㎕)을 분석하여 Caco-2 방세포 장벽을 가로질러 수송된 FD20의 양을 정량하였다. 마이크로채널 내의 Caco-2 단층을, 5일간, 주기적인 기계적 변형(10% 변형, 빈도 0.15 Hz)에의 노출의 존재 또는 부재 하에, 중간 흐름(30 ㎕/hr)의 존재 하에, 배양하였다.
미생물의 연구: 생리적으로 적절한 인간 장 상피 세포-미생물상호작용을 연구하기 위해, American Type Culture Collection(ATCC 53103; Manassas, VA)으로부터, 기원적으로 인간 장에서 단리된32 Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)의 균주를 얻었다. 4∼5일간 사전 배양된 Caco-2 세포 단층의 정단면에 옮기기 전에, 교반 없이 밤새 가습 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내의 오토클레이브된 락토바칠리 MRS 브로쓰(Lactobacilli MRS broth)(BD Diagnostic, Sparks, MD) 중에서 길러, 적절한 장 장벽 완전성을 형성하였다(TEER ≥ 600 Ωcm2). LGG 세포의 씨딩(∼1.0×107 CFU/mL, 최종 세포 밀도) 전에, 세포 배양 배지를, 12시간 동안 무항생제 배지로 전환하였다. Transwell 배양 내의 Caco-2 세포의 정단면 위에 위치한 LGG 세포를 1.5시간 동안 인큐베이션하고, 무항생제 배양 배지를 2번 교환함으로써 부착하지 않은 세포를 조심스럽게 씻어내고, 지시된 연장 배양동안 동일 배지에서 인큐베이션하였다. 부착 기간 후라는 점을 제외하면 거트 온 어 칩 내에서의 연구에서 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여, 무항생제 배지를, 주기적 신장(10% 변형, 빈도 0.15 Hz)과 함께 40 ㎕/hr으로, 상부 및 하부 마이크로채널 양쪽을 통해 관류시켰다.
미생물 β-갈락토시다아제 활성 측정: 공배양 연구에서 LGG 세포의 생존 능력 및 기능성을 분석하기 위해, LGG β-갈락토시다아제의 촉매 활성을, 그 효소 기질인 O-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드(ONPG; Sigma, St. Louis, MO)를 절단하는 배양 미생물의 능력을 측정함에 의해, 결정하였다. 이들 연구를 위해, LGG 및 Caco-2 세포를 거트 온 칩 내에서 공배양하고, 배지에 O-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드를 첨가하기(30 μg/mL) 전에, 48시간 동안 무항생제 배지로 관류시켰다(40 ㎕/hr). 상부 마이크로채널의 출구로부터 매 1시간마다 수집된 샘플(30 ㎕)을, SpectraMax M5 instrument(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 사용하여 광학 밀도(420 nm)를 측정함으로써 분석하여, LGG 세포 내의 β-갈락토시다아제에 의해 방출된 산물(즉, O-니트로페놀)의 양을 정량하였다. 절단 산물의 양을 O-니트로페놀의 보정 곡선에 기초하여 어림하였다.
몰폴로지 연구: 배양 동안의 세포의 이미지를, Zeiss Axiovert 40CFL 위상차 현미경에 이미징 소프트웨어(imaging software)(Motic images plus 2.0; Motic China Group Co., Ltd.)를 구비한 Moticam 2500 카메라(Motic China Group Co., Ltd.)를 사용하여 기록했다. 세포의 형상 및 극성을 시각화하기 위해, 4% 파라포름알데히드에 고정되고 0.3% Triton-X-100(Sigma, St. Louis, MO)에 투과화시킨 Caco-2 세포 단층 내에서 F-액틴, 핵, 및 뮤신을 각각, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-팔로이딘(phalloidin)(Sigma, St. Louis, MO), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드(DAPI; Molecular Probe, Eugene, OR), 및 뮤신 2 항체33 (마우스 단일클론 항체; abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 염색하였다.
형광 염색 후, 세포를, 광전자 증배관이 장착되어 있고 405 nm 레이저와 백색광 레이저 (489-670 nm)에 결합된 역 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Leica SP5 X MP, Germany)을 사용하여 스캐닝하였다. 상피 밀착 연접을 시각화하기 위해, 항 오클루딘 항체(anti-occludin antibodies)(마우스 단일클론 항체-Alexa Fluor 594; Molecular Probe, Eugene, OR)을 사용하여 면역 형광 염색을 행하고, CCD 카메라(CoolSNAP HQ2, 1392×040 해상도; Photometrics, Tucson, AZ)에 결합된 Zeiss Axio Observer Z1 에피(epi)-형광 현미경에 샘플을 시각화하고; 기록된 상의 컴퓨터화 이미지 분석을 MetaMorph 이미지 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 행하였다.
통계적 분석: 모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었다(SEM). 정량화된 데이터의 통계적 평가를 위해, GraphPad InStat 버전 3.10 (GraphPad Software Inc., San Diego CA)을 사용하여 Tukey-Kramer 다중 비교 시험에 의한 일원 배치 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 행하였다. 차이는 p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
전단 응력의 계산: 다음 식,63 τ = 6μ Q /h 2 w (식에서 μ는 배양 배지의 점도(g/cm·s), Q 체적 유속(cm3/s), 그리고 w(cm) 와 h(cm)는 각각 마이크로채널의 폭과 높이이다)에 따라 전단 응력 (τ, dyne/cm2)을 계산하였다.
β-갈락토시다아제 활성의 측정: β-갈락토시다아제의 촉매 활성을 측정하기 위해, 상술한 바와 같이 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (ONPG; Sigma, St. Louis, MO)를 사용하였다. LGG 세포 배양을 MRS 배지에서 행하고 나서, 지수증식기(exponential phase)에서 LGG 세포를 수확하였다. LGG 세포를 무항생제 세포 배양 배지로 2번 세정한 후, 세포 밀도를, ONPG-함유 무항생제 세포 배양 배지에서 ∼1.0×108 CFU/mL로 조정하고(30 μg/mL, 최종 ONPG 농도), 샘플을 가습 분위기에서 5% CO2 하에 37℃에서 즉시 인큐베이션하였다. 12시간 동안 간헐적으로 취한 샘플을 원심분리하고, 상징액의 광학 밀도를 420 nm에서 측정하였다(SpectraMax M5, Molecular Devices); 프레시한 배양 배지를 기준으로서 사용하였다. Caco-2 세포를 ECM-코팅된 24-웰 플레이트(Falcon, BD)에서 2주간 배양하고, ONPG 분석을 행하기 전에 배양 배지를 12시간 동안 무항생제 배지로 전환하였다. ONPG 용액 (30 μg/mL)을 Caco-2 배양 플레이트에 가한 후에, 배양 배지로부터 샘플 분획량을 간헐적으로 채취하고 광학 밀도를 420 nm에서 측정하였다.
결과 및 토의
거트 온 어 칩 마이크로시스템 디자인: 거트 온 어 칩 마이크로장치의 실시형태는, 장의 동적 기계적 마이크로 환경을 모사하고, 관류에 기초한, 미생물 공생자와의 장기에 걸친 세포 배양을 지원하고, 체외에서의 장 상피 장벽 기능의 분석이 가능하도록 디자인되었다. 이 목표를 달성하기 위해, 마이크로시스템 디자인에는, ECM으로 코팅되고 인간 Caco-2 장 상피 세포로 라이닝된 얇은 다공막에 의해 분리된, 2층의 근접 위치한 마이크로유체 채널이 도입되었다(도 12a). 양쪽의 마이크로채널을 통해 배양 배지를 관류시켜(10∼100 ㎕/min) 인간 장 내에서 통상 경험되는 유체 흐름과 전단 응력을 모사하였다.34-36 인간 장의 연동운동에 의해 유발되는 그것에 유사한 상피 세포 단층의 율동적인 기계적 변형을 생성하기 위해, 컴퓨터 제어 진공 매니폴드에 의해 조절되는 주기적 흡인을, 마이크로채널의 양측에 위치한 풀 하이트(full-height)의 속이 빈 진공실에 가하여, 탄성의 ECM-코팅된 다공막을 반복적으로 신장 및 이완하였다(도 12d). 이들 조건에서 길러진 인간 장 상피 단층 내의 세포 형상의 위상차 현미경 분석에 의해 흡인 압력의 수준이 0kPa로부터 45kPa로 상승됨에 따라 기체 뒤틀림과 세포 변형도 0%로부터 30%로 선형 증가함을 확인하였다(도 12a∼12e).
상피 유기체에 대한 장 마이크로 환경의 모사의 영향: 장의 물리적 마이크로 환경의 모사의 생리적 적절성을 탐구하기 위해, 유체 흐름 및 기계적 변형 없이 정적 Transwell 실에서(도 14의 A), 또는 거트 온 어 칩 마이크로유체 장치에서흐름만(도 14의 B)에 의해 또는 흐름에 더하여 주기적인 기계적 변형(도 14의 C)에 의해, Caco-2 세포를 길렀다. Caco-2 세포는 통상 분화된 장 장벽 기능을 나타내기 위해서는 적어도 3주간 Transwell 시스템에서 길러야 하므로, 본 발명자들은 이러한 정적 배양에서의 제21일에서 세포를 분석하였다. 예비적 연구에서, 잘 구획된 상피 단층이 마이크로유체 장치 내에서 더 신속하게 형성됨이 주목되었으며, 따라서, 상피 단층 기능을 Transwell 배양과 비교하는 이러한 연구는 마이크로유체 시스템 내에서의 배양의 겨우 3일 후에 행하여질 수 있었다.
밀착 연접 단백질인 오클루딘을 겨냥한 항체를 사용한, 위상차 및 면역 형광 현미경 연구에 의해, 마이크로장치 내의 세포는 더 짧은 시간 동안 배양되었음에도 불구하고, Caco-2 세포가 세 배양 조건 모두에서 잘 발달된 밀착 연접을 갖는 융합 폴리고날 상피 단층을 형성하는 것이 확인되었다 (도 14의 A∼C). 그러나 F-액틴 분포와 핵 위치의 공초점 형광 현미경 분석은, Transwell 내에서 정적 조건 하에 길러진 상피 세포가 매우 평평해지고 그 형태가 거의 비늘 모양임을 나타내었다 (도 14의 A). 대조적으로, 인간 장에서 경험되는 것34,36과 유사한 속도(30 ㎕/hr; 0.02 dyne/cm2 전단 응력)의 유체 흐름의 존재 하에, 동시적인 주기적 변형의 존재 또는 부재 하에 생육된 세포는, 크기가 거의 6배 커서(도 14의 D), 기저의 핵을 갖는 분극화된 상피 세포 형태를 나타내었다(도 14의 B∼C). 사실상, 유체 흐름 하의 세포는 생체 내의 건강한 완전체 인간 장 상피 세포에서 보고된31 것과 같은 원주형 형상 및 크기(30∼40 μm 키(height)) 부근이었다.
하나의 가능성은, 세포 몰폴로지에 대한 이 효과는 Transwell 실과 비교한 마이크로채널 장치 내 배치의 인위적인 결과(artifact)일 수 있다는 것이다. 그러나, 마이크로유체 채널 내의 유체의 유속이 최소 수준으로 낮추어졌을 때(10 ㎕/hr), 세포는 키가 증가하지 않았으며, 정적 Transwell 시스템 내에서와 무척 닮아있었고 38 (도 14의 A), 한편 그 속도를 100 ㎕/hr로 증가시키면 30 ㎕/hr에서 관찰한 것을 넘는 추가적인 효과가 없었다(도 18의 A∼C). 따라서, 장 상피의 정단면에 걸친 생리적 유체 흐름 및 전단 응력의 인가는, Transwell 시스템 내의 세포가 3주 후에조차 평평한(flat) 채로 남는 조건 하에서 배양했을 때 3일 내에 이들 세포의 키와 분극화의 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 세포 분화를 촉진한다. 게다가, 주기적 변형은 어떤 유의한 추가적 효과도 일으키지 않았기 때문에 흐름 또는 전단 응력은 이 응답의 임계 결정 인자였다(도 14의 D).
흥미롭게도, 거트 온 어 칩 마이크로장치 내에서 Caco-2 세포를 흐름 및 주기적 변형과 함께 더 장시간 배양하였을 때, 원래는 평면의 원주형 상피가 자발적으로 자라서 요철과 주름을 형성함이 발견되었다(도 15의 A). 그 수직 단면을 면역 형광 공초점 현미경에 의해 분석하였을 때, 이들 주름은 기저 핵을 갖는 극성화된 원주형 상피 세포에 의해 라이닝되고 크립트에 의해 분리된 정상 장 융모의 몰폴로지를 나타냄이 발견되었다(도 15의 B). 이들 융모 구조 내의 상피 세포의 정단면은 뮤신 2에 대하여 양성으로 염색되었으며, 그것은 이 점성 단백질이 생체 내에서 퇴적되는 곳이다.39 이 체외 모델에서 관찰된 융모 형성의 타이밍(약 수주(weeks))은 생체 내에서 관찰되는 융모 갱신 속도와도 일치한다.40-41 Caco-2 세포에 의한 장 융모의 자발적 형성은 이전에는 보고된 바 없으며, 평면 ECM 기체 위에 플레이팅한 후에 일어나는 이 응답은, 낮은 수준의 유체 흐름(및 전단 응력), 뿐만 아니라 주기적 연동 운동을 경험하는 정상 장의 기계적 마이크로 환경의 재현에 직접적으로 의존하는 것으로 보인다.
체외에서의 장 장벽 기능의 재구성: 약물 스크리닝 용도뿐만 아니라 세포 생물학적 연구를 위한 도구로 종종 사용되는 장 상피 장벽 기능의 Transwell 모델은8, 42, 다공성 Transwell 막 상에서의 Caco-2 세포의 배양을 포함하며, 밀착 연접 완전성은 TEER를 정량화함으로써 측정된다. 따라서, 정적 Transwell 조건에서 길러진 Caco-2 단층의 TEER 대(vs.) 생리적인 주기적 변형(10%; 0.15 Hz)의 존재 또는 부재 하에서 흐름(30 ㎕/hr)과 함께 거트 온 어 칩 장치에서 형성되는 것의 그것을 비교하였다. 이들 연구는 모든 세 배양 조건에서 길러진 세포는 그들의 TEER 값을 플레이팅 후 첫 6일에 걸쳐 증가시켰으며, 그리고나서 비슷한 높은 수준을, 배양의 적어도 4 내지 5일 동안 유지하였다. 그러나, 변형이 있거나 또는 없는 마이크로유체 장치 내의 세포는 정적 Transwell 배양 내의 세포의 그것보다 3∼4배 높은 피크 TEER 수준을 나타내었다 (도 16의 A).
장 상피의 겉보기 투과계수(P app)를 형광 덱스트란 (FD20)을 사용하여 측정하였으며, 이는 밀착 연접과 관련된 공극에 기인한 장 상피의 방세포 장벽 기능을 특징짓는다.31 세포의 P app 는 Caco-2 세포가 Transwell 실에서 5일간 배양되든 21일간 배양되든 동일함이 밝혀졌다(∼4×10-8 cm/sec)(도 16의 B). 유체 흐름(30 ㎕/hr)만 있는 마이크로유체 장치 내에서의 5일간의 세포 배양도 유사한 P app를 나타내었다; 그러나 주기적인 기계적 변형의 추가적인 부여(10% 변형, 0.15 Hz + 30 ㎕/hr 흐름)는 방세포 투과율의 4배를 넘는 증가를 유발하였다(도 16의 B).
이들 결과는 Transwell 배양에서의 Caco-2 세포 단층이 생체 내 인간 또는 동물 장에서 관찰되는 것보다 낮은 방세포 투과율을 나타냄을 보여주는 간행된 연구 결과와 일치한다.43-45 이러한 낮은 수준의 투과율은 정적 Transwell 배양에서의 확산을 제한할 수 있는, 얇고 교반되지 않은 유체 층의 존재로부터 기인할 수 있음이 제안된 바 있다.46 그렇다면 혹자는, 유체 흐름이, 교반되지 않은 확산층의 두께를 감소시키는 유체 전단 응력을 일으킴으로써, 방세포 투과율을 증가시킬 것으로 기대할 지 모르나43-44, 47, 유체 흐름만으로는 본원에 기술된 시스템의 방세포 투과율을 변화시키지 못했다. 그 대신, 본원에 기술된 바와 같이, 주기적 변형은 방세포 투과율을 증가시켰으며, 이는 이들 세포 단층 내에서 TEER를 변화시키지 않는 조건 하에서 일어났으며(도 16의 B 대 도 16의 A), 이는 기계적 뒤틀림이 수송의 방세포기구를 직접적으로 변화시킬 수 있음을 암시한다. 주기적인 기계적 변형은 증가된 트란스사이토시스의 결과로 폐의 상피 및 내피 세포 단층을 가로지르는 나노입자의 수송을 증가시킬 수 있는데,23 여기에도 그와 유사한 기구가 관여할 수도 있다.
다음으로, 상피 세포 아미노펩티다제의 촉매 활성을 분석하여 유체 흐름과 기계적 변형이 인간 장 상피 세포의 세포 분화를 변화시키는지 여부를 결정하였다. 아미노펩티다제 활성의 발현에 의해 측정된 Caco-2 세포 분화는 정적 Transwell 시스템 내에서 5일간에 비해 21일간 배양된 세포에 대하여 7배를 초과하여 증가하였으며(도 16의 C), 이는 이전에 반포된 발견들과 일치한다.48 중요하게도, 마이크로유체 장치 내에서의 유체 흐름(30 ㎕/hr) 하에서의 세포의 배양은 이 응답을 크게 가속하였으며, 배양에서 겨우 5일 후에 아미노펩티다제 활성이 거의 9배 증가되었고, 세포가 동일한 유체 흐름 및 주기적인 기계적 변형(10% 변형, 0.15 Hz) 을 동시에 가하는 거트 온 어 칩 내에서 기른 때는 더욱 큰 증가를 일으켰다. 이들 결과는 주기적 변형이 Caco-2 세포에서 장 분화 특이적 효소 활성의 발현을 유사하게 증가시킬 수 있음을 보여준 과거 연구와 일치한다.25
숙주-미생물총(Host-microflora) 공배양: 체외에서 효과적으로 모델링된 바 없었던 인간 장 생리의 가장 중요한 요소 중 하나는 장 내강의 미생물 공동체의 정상적인 존재이다.49 거트 온 어 칩에서 생산된 고도로 분화된 장 상피가 미생물총의 공배양을 지원할 수 있는지를 탐구하기 위해, 정상 장 미생물인, 락토바실러스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus)(LGG)를 Caco-2 단층의 정단면 상에서 배양하고, 정적 조건 하에서 Transwell 실에서 배양된 세포를 대조구로서 사용하였다. 96시간 동안의 연속적 흐름(40 ㎕/hr) 과 주기적 변형(10%, 0.15 Hz)이 있는 마이크로유체 공배양 후에, LGG 세포의 마이크로 콜로니는 여전히 Caco-2 단층의 표면에 밀착 부착한 채로 남아 있었다(도 17의 A). 칼세인-AM과 에티듐 호모다이머-1에 의한, 배양물의 생/사 염색에 의해, 각각, 이들 조건 하에서 LGG와 함께 공배양된 후에 Caco-2 상피 세포가 완전히(> 95%) 생존하여 있음이 확인되었다(도 17의 B). LGG는 배양에서 단독으로 길러졌을 때 박테리아-특이적 β-갈락토시다아제 활성을 발현함에 대하여, 이는 장 상피 세포에 의해서는 발현되지 않는다(도 19). 본 발명자들이 공배양의 상부 실 내에서 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였을 때, 그것 역시 높은 채로 있었으며, 이는 LGG 세포 역시 이들 배양 조건 하에서 생존하여 있었음을 확인시켜준다(도 17의 D).
중요한 것은, 장 세포 단층이 그 정단면 상에서 자라는 살아 있는 미생물과의 이러한 공배양 조건 하에서 정상 장벽 기능을 유지할 수 있었을 뿐만 아니라, TEER의 정량에 의해 측정된 장벽 완전성은 실제로 경시적으로 향상되었다 (도 17의 C). 이 결과는, LGG를 포함하는, 박테리아의 프로바이오틱 균주가, 체외에서 장 상피의 완전성을 증가시키고50 인간의 장 장벽 기능을 증진시킨다고 보고된51 발견과 일치한다. 대조적으로, 정적 Transwell 시스템에서는 공배양의 제1일에 걸쳐 TEER가 산일하였으며(dissipated) 48시간 후에는 상피 단층의 사멸과 완전한 박리 탓에 전혀 측정될 수 없었다(도 17의 C).
인간의 미생물 군집은 장 건강과 질병에 있어서 중심적인 역할을 하며18, 52-53 따라서 숙주-미생물 상호작용을 연구하기 위한 체외 플랫폼의 개발은 세포 생물학자 및 생리학자뿐만 아니라 의약 과학자들에게 지대한 관심의 대상이다.54-55 과거의 연구들은 미생물 부착,56 침투,57 전위,58 및 바이오필름 형성59을 연구하기 위해 살아 있는 박테리아와 함께 장 상피 세포의 단기간의 공배양을 행하였다. 그러나 미생물의 숙주 세포와의 장기 공배양은 미생물의 과증식과 상피 생존 능력의 소실 탓에 불가능했다. 이는 숙주 세포와 미생물 간의 생육 조건을 짝짓는 것,59 무항생제 배양 조건에서 미생물의 개체 밀도의 제어,60 또는 미생물 세포에 의한 대사물(예를 들어 유기산)의 생산 제한61-62에 어려움이 있기 때문일 것이다. 본원에 기술된 실험에서, LGG 세포는 Transwell 시스템의 정체된 꼭대기 실(apical chamber) 내에서 구속 없이 길러졌으며, 장 상피 세포 생존과 일치하지 않는 배지 pH (pH 2.5-3.0)의 급격한 감소를 일으켰다(나타내지 않음). 그러나, 중요하게도, 거트 온 어 칩의 마이크로유체성은 이러한 도전을 감수하게 하는 수단을 제공하는 바, 왜냐하면 그것은 연속 흐름 바이오리액터(continuous flow bioreactor)로서 효과적으로 기능하기 때문이다. 특이적으로, 거트 온 어 칩에서의 배양 배지의 희석율 (∼8.0 h-1)은 배양 배지에서의 LGG의 특이적 성장 속도(∼0.2 h-1)보다 훨씬 높으며, 이는 유기산 및 결합되지 않은 LGG 세포의 제거를 가능하게 한다. Caco-2 단층의 표면 상에 밀착 부착한 LGG 세포는 거트 온 어 칩 장치에 남은 반면 모든 부착되지 않은 LGG 세포는 씻겨 나갔으며, 이는 배양의 억제되지 않은 과성장을 방지하였다. 장 상피 완전성이 LGG 공배양의 존재에서 유의하게 증가한 것을 고려하면, 미생물의 존재는, 이러한 동적 계면을 유지하는데 필수적인 상피 세포 기능(예를 들면, 뮤신 분비)을 증진시키는 정상 마이크로 환경적인 단서(cue)를 분명하게 제공하며, 이는 인간 임상 연구와 일치한다.51
이 실시예에 기재된 인간 거트 온 어 칩 마이크로장치의 실시형태는, 주기적인 기계적 변형, 유체 흐름 및 미생물총의 공존 등의 적절한 생리적 단서의 존재하에서, 결정적인 장 기능을 연구 및 교란시키는 제어된 마이크로 플랫폼을 제공한다. 이 장치의 특성화는, 살아 있는 장에서 경험되는 낮은 수준의 유체 흐름 및 전단 응력을 재현하는 것이, 가속된 장 상피 세포 분화, 3D 융모 유사 구조의 형성, 및 증가된 장 장벽 기능을 촉진함에 충분하며, 정상 연동운동을 모사하는 주기적인 기계적 변형의 추가는 이들 응답을 더욱 증진함을 드러낸다. 게다가, 일단 거트 온 어 칩 장치 내에서 분화되면, 장 상피는 인간 장 내에서 정상적으로 서식하는 미생물총의 성장을 지원할 수 있다. 인간 연동운동 거트 온 어 칩은 따라서 장 기능의 기계적 조절 연구, 뿐만 아니라 숙주-미생물 공생 및 진화 연구를 촉진시킬 수 있을 것이다. 상기한 발명이 정상 인간 장의 많은 복잡한 기능을 효과적으로 재현하는 것을 고려할 때, 그것은 약물 스크리닝과 독성 시험의 필수적인 플랫폼도 될 수 있을 것이다.
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실시예 1과 2에 기재된 거트 온 어 칩 실시형태의 디자인 파라미터들
기술자(DESCRIPTOR) 값(VALUE)
세포 마이크로채널

폭 × 길이 × 높이
상부 마이크로채널의 체적
생육 표면적
유효 공극 면적
PDMS 막의 공극률
액체의 체류 시간(30 ㎕/hr에서)

1,000 × 10,000 ×150 ㎛
∼1.2 ㎕
0.11 cm2
0.021 cm2
19.5%
∼4.51분
진공실 치수
폭 × 길이 × 높이a

1,684 × 9,089 ×330 ㎛
생리적 파라미터
체적 유속(volumetric flow rate)의 범위
전단 응력의 범위b, c
주기적인 기계적 변형의 범위
주기적인 기계적 변형의 빈도

10∼100 ㎕/hr
0.006∼0.06 dyne/cm2
0∼30% (세포 변형으로)
0.15 Hz
a: 진공실의 높이는 빈 영역의 총 높이를 고려하여 어림되었으며, 상부 및 하부 층의 높이(150 ㎛)와 다공막의 두께(30 ㎛)를 모두 고려하였다.b: 전단 응력의 범위는 이 표에 지정된 유체의 유속(fluid flow rate)의 범위에 상응한다.c: 전단 응력은 ESI 실험(Experimental)에서의 식에 의해 계산되었다.

Claims (22)

  1. 장 상피 세포를 배양하기 위한 방법으로서,
    a) 배양 배지를 포함하는 유체 공급원에 연결된 마이크로채널, 및 마이크로채널 내에 위치한 막을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 막의 적어도 1 표면에 장 상피 세포를 도입하는 단계;
    c) 유체 공급원으로부터 마이크로채널로 배양 배지를 유속으로 공급하는 단계; 및
    d) 적어도 융모 구조가 분명해질 때까지 장 상피 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 장 상피 세포가 상기 막의 적어도 1 표면에 부착되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유속이 1.0 dyne/㎠ 미만의 전단 응력을 생성하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 500 ㎕/hr 미만의 유속으로 공급되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 100 ㎕/hr 미만의 유속으로 공급되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 약 30 ㎕/hr의 유속으로 공급되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 막은 적어도 일부가 유연하고, 막 지지 부재를 포함하며; 상기 막 지지 부재를 움직일 수 있는 막 변형 기구(membrane strain mechanism)가 상기 막 지지 부재에 결합되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 방법은 배양 단계 동안 막의 적어도 1차원을 따라 상기 막을 신장시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 막이 5%∼15% 신장되는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 막이 0.01Hz∼2Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장되는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 막이 0.05Hz∼0.25Hz의 범위 내의 속도로 주기적으로 신장되는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 막이 0.2Hz를 초과한 속도로 주기적으로 신장되어서 장 상피 세포의 이상 조건/상태를 생성하는 방법.
  13. 제7항에 있어서, 막이 불규칙적으로 또는 간헐적으로 신장되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 막이 적어도 부분적으로 다공성인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 막이 적어도 1 유형의 부착 분자로 코팅되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 부착 분자가 콜라겐; I형 콜라겐; MATRIGEL™; 세포외기질; 라미닌; 프로테오글리칸; 비트로넥틴; 피브로넥틴; 폴리-D-리신; 폴리펩티드; 올리고뉴클레오티드; DNA; 및 폴리사커라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 장 상피 세포가 Caco2 세포; HT-29 세포; 1차 소장 상피 세포; 1차 대장 상피 세포; iPS 세포; ESC 세포; 줄기 세포; 파네트 세포; 크립트 세포; 및 점액 분비 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 막의 적어도 제2 표면 상에 적어도 1층의 내피 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 장 상피 세포가 132시간 내에 상기 융모 구조를 발달시키는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 장 상피 세포가 170시간 내에 상기 융모 구조를 발달시키는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 막이 상기 마이크로채널을 제1실(chamber) 및 제2실로 분할하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 유체가 1 이상의 실(chamber)을 통해 흐르는 방법.
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