KR101700590B1 - 식중독 바이러스 감염 모델 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

식중독 바이러스 감염 모델 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물의 장 조직을 준비하는 단계; 상기 장 조직에 식중독 바이러스를 접종하여 감염시키는 단계; 상기 식중독 바이러스로 감염된 장 조직을 세척하는 단계; 및 상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독 바이러스 배양방법 및 이를 이용한 바이러스 감염모델에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사람의 위장관 구조와 해부학적/생리학적으로 가장 유사한 동물의 소장 조직을 이용하여 사람 노로바이러스와 같은 난배양성 식중독 바이러스를 체외배양하고, 이를 통한 바이러스 감염 모델을 제공함으로써 식품 또는 식수 시료 내 식중독 바이러스의 생존력 및 감염력을 평가하는데 사용할 수 있다.

Description

식중독 바이러스 감염 모델 및 이를 이용한 검출방법{Food-borne virus infection model and dectection method thereof}
본 발명은 동물의 장 추출물을 이용한 노로바이러스 감염 모델 및 이를 이용한 노로바이러스 생존성 판별기술에 관한 것이다.
노로바이러스는 현재까지 다섯 가지 유전자형(genogroup)이 알려져 있으며, 그 중 Ⅰ형과 Ⅱ형 노로바이러스가 사람에게 대량 식중독을 일으키는 병원체로 분변에 오염된 식수나 식품을 섭취하는 분변-구강경로 또는 직접적인 사람과 사람간 접촉을 통하여 대량 식중독을 일으키는 대표적인 바이러스성 병원체이다.
전 세계적으로 가장 빈번하게 발생하고 있는 노로바이러스 식중독은 국내에서 1999년에 처음 보고되었으며, 2003년 집단 식중독 사고가 발생함에 따라, 바이러스성 식중독 위해가 크게 주목받게 되었으며, 공중보건의 위협 및 경제적 손실을 해결하기 위하여 식중독 예방에 대한 중요성이 대두되고 있다.
현재 노로바이러스의 경우, 세포배양 기술이 확립되어 있지 않아 이를 검출하기 위한 방법으로 PCR(Polymerase Chain reaction) 방법과 이를 응용한 Nested RT-PCR, Realtime RT-PCR 방법과 같은 분자생물학적 검출 방법이 개발되어 왔다.
그러나, 바이러스의 핵산을 검출하는 상기 방법들은 병원체의 존재여부를 확인할 수 있으나, 죽어있는 바이러스도 함께 검출됨에 따라 바이러스의 감염력 또는 생존성을 정확하게 판별할 수 없다는 한계점이 있다.
이에 따라, 노로바이러스와 물리/화학적 특성이 유사하며 배양이 가능한 feline calicivirus (FCV), murine norovirus (MNV), poliovirus, bacteriophage MS2 등을 사람 노로바이러스의 대체모델 (human norovirus surrogate)로 이용하여 노로바이러스 복제와 병원성, 면역학적 측면을 이해하는 연구가 상당부분 진행되었다. 그러나 상기 대체 모델과 사람 노로바이러스 간에 임상적 징후, 숙주 수용체, 감염 세포 유형, 유전적 특징과 물리·화학적 처리에 따른 생존성에서 차이를 나타냄에 따라, 사람 노로바이러스 대체모델로는 사람 노로바이러스의 생존성 및 감염력을 확인하는데 한계가 있다.
최근에는 20여 개의 세포주를 이용한 노로바이러스 배양 및 소장상피 세포주를 이용한 3차원 입체배양 기술을 적용한 노로바이러스 배양방법이 보고되었으나, 노로바이러스 배양 및 연구 재현성이 떨어져 적합하지 않은 것으로 보고되어 졌다. 이 후, 무균돼지와 같은 특수 동물을 활용한 노로바이러스 감염 연구가 발표되었으나, 전 세계적으로 무균돼지를 유지하고 있는 시설이 제한적이며, 무균돼지 생산성이 매우 낮아 실험동물로 사용되는 무균돼지에 막대한 비용이 소요된다는 문제점이 있다. 따라서 현재 노로바이러스 감염성 및 생존성 연구에 활용될 수 있는 모델의 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제2005-0120114호(2005.12.22)
본 발명은 체외 배양이 불가능한 식중독 바이러스인 사람 노로바이러스의 배양방법 및 이에 따른 바이러스 감염 모델을 제공하여 생존력과 감염력을 확인할 수 있는 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 동물의 장 조직을 준비하는 단계; 상기 장 조직에 식중독 바이러스를 접종하여 감염시키는 단계; 상기 식중독 바이러스로 감염된 장 조직을 세척하는 단계; 및 상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독 바이러스 배양방법을 제공한다.
본 발명은 식중독 바이러스 감염 모델을 제공한다,
또한, 본 발명은 동물의 장 조직을 준비하는 단계; 상기 장 조직에 시료를 처리하는 단계; 상기 시료가 처리된 장 조직을 세척하고 배지를 첨가하는 단계; 상기 첨가된 배지를 회수하고 배지를 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양하는 단계; 및 상기 회수된 배지 또는 돼지 장 조직에서 식중독 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 식중독 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 난배양성 식중독 바이러스 배양방법은 사람의 위장관 구조와 해부학적/생리학적으로 가장 유사한 돼지의 소장 조직을 이용하여 사람 노로바이러스와 같은 난배양성 식중독 바이러스를 체외배양함으로써, 기존의 동물실험보다 실험동물의 개체 수를 최소화시키면서 실험군 자료 확보 및 비용의 효율성을 극대화할 수 있는 식중독 바이러스 감염 모델을 제공하여 식품 또는 식수 시료 내 식중독 바이러스를 검출하고, 검출된 식중독 바이러스의 생존력 및 감염력을 평가하는데 사용할 수 있다.
도 1은 돼지 장 조직을 이용하여 노로바이러스를 체외 배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 노로바이러스 감염된 돼지 장 조직에 배지를 첨가하고 3, 6, 9, 12 및 24 시간 째 배양액을 회수하여 바이러스 역가를 확인한 그래프이다.
도 3은 노로바이러스 감염된 돼지 장 조직을 면역염색화학 방법으로 염색하여 바이러스 항원을 확인한 결과이다.
본 발명은 동물의 장 조직을 준비하는 단계; 상기 장 조직에 식중독 바이러스를 접종하여 감염시키는 단계; 상기 식중독 바이러스로 감염된 장 조직을 세척하는 단계; 및 상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독 바이러스 배양방법을 제공할 수 있다.
상기 동물의 장 조직은 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 10×10 mm 크기로 절단된 십이지장 또는 공장일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 동물은 돼지, 소, 말, 개, 원숭이, 토끼 및 쥐로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 돼지일 수 있다.
상기 식중독 바이러스는 장 조직에 105 복제수(Copy number) 내지 106 복제수(Copy number)로 접종되며 40 내지 80분 동안 감염시킬 수 있다.
상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계는 배지를 첨가하고 3시간 간격으로 배지를 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 돼지 장 조직에 사람 노로바이러스와 열처리된 노로바이러스를 감염시키고 각각 3, 6, 9, 12 및 24 시간째 배양액을 회수하여 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 2와 같이 사람 노로바이러스가 처리된 돼지 장 조직 배양액에서는 24시간까지 노로바이러스의 농도가 4 log 수준으로 유지된 반면, 열처리된 노로바이러스가 처리된 돼지 장 조직의 배양액에서는 바이러스 역가가 측정되지 않았다.
상기 결과로부터 본 발명의 바이러스 배양방법은 난배양성 식중독 바이러스인 사람 노로바이러스의 체외 배양에 적합한 방법임이 확인되었다.
상기 식중독 바이러스는 장관계 바이러스인 노로바이러스, A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스 및 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 노로바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 배양방법에 따른 식중독 바이러스 감염 모델을 제공할 수 있다. 보다 바람직하게는 사람 노로바이러스가 감염된 돼지 장 조직 모델일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 장 조직을 준비하는 단계; 상기 장 조직에 시료를 처리하는 단계; 상기 시료가 처리된 장 조직을 세척하고 배지를 첨가하는 단계; 상기 첨가된 배지를 회수하고 배지를 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양하는 단계; 및 상기 회수된 배지 또는 동물의 장 조직에서 식중독 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 식중독 바이러스 검출방법을 제공할 수 있다.
상기 검출방법은 식중독 바이러스의 존재 여부뿐만 아니라 식중독 바이러스의 감염력 및 생존성을 판별할 수 있다.
상기 동물의 장 조직은 십이지장 및 공장으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 동물은 돼지, 소, 말, 개, 원숭이, 토끼 및 쥐로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 돼지일 수 있다.
상기 시료는 장 조직에 105 복제수(Copy number) 내지 106 복제수(Copy number)로 접종되며 40 내지 80분 동안 처리될 수 있다.
상기 시료는 식중독 바이러스 감염이 의심되는 식품, 식수, 지하수 및 분변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 장 조직에 첨가된 배지는 3시간 간격으로 회수되고 신선한 배지로 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양될 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 내지 6시간 동안 배양될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 도 3과 같이 바이러스 감염시 바이러스가 숙주세포 내로 이동하는데 수 초에서 수 분이 소요되며, 본 발명에 따른 장 조직 모델에서는 감염력을 유지한 사람 노로바이러스가 감염 후 최대 12시간까지 검출되었으며, 조직 손상에 따른 형태학적 변이를 고려하였을 때, 바이러스 감염 후 3~6 시간 배양하여 조직을 고정하고 바이러스 항원을 검출하는 것이 최적의 조건임을 확인할 수 있었다.
상기 식중독 바이러스는 노로바이러스, A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스 및 아데노바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 노로바이러스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식중독 바이러스는 중합효연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; Realtime RT-PCR), 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC) 및 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상의 방법으로 검출될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 바이러스 접종 모델 제작
돼지의 소장 중에서 십이지장(duodenum)과 공장(jejunum)을 약 10×10 mm 크기로 절단하고, 6-well 배양 플레이트에 부착시킨 생검 폼 패드(약 25×25 mm)에 올려놓은 후, 사람 노로바이러스(GII.4)를 106 카피(copy) 수준으로 장 조직에 100 ㎕ 접종하였다. 또한, 대조군으로 열처리하여 불활성화된 바이러스를 동일한 방법으로 장 조직에 접종하였다.
1 시간 동안 감염시킨 뒤, PBS로 3회 세척하고 RPMI 1640 배지를 3 ㎖ 씩 첨가하여 3 시간 동안 배양하였다.
그 후, 배지를 모두 회수하고, 다시 배지 3 ㎖을 첨가하여 3 시간 동안 배양하는 방식으로 총 3, 6, 9, 12 및 24 시간마다 배지를 회수하였다. 세포 실험과 다르게 배지상에 조직을 장시간 배양시킬 경우, 조직이 부패될 수 있기 때문에 도 1과 같이 3시간 간격으로 배지를 교체해 주었다.
< 실시예 2> 노로바이러스 핵산 검출
1. 바이러스 회수 및 RNA 분리
실시예 1에서 시간대별로 회수된 배양액에서 바이러스 역가를 측정하기 전에 QIAamp viral RNA minikit(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
500 ㎕의 배양액에 Buffer RLT 600 ㎕를 넣어주고 full speed로 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 1.5 ml 튜브에 옮겨 70 % 에탄올 1 volume을 첨가하였다. RNeasy spin column에 상기 혼합액을 700 ㎕씩 넣어주고, 8000~10000 rpm에서 15초 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. RNeasy spin column에 buffer RW1 700 ㎕을 넣고 8000~10000 rpm에서 15초 동안 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. RNeasy spin column에 buffer RPE 500 ㎕을 넣고 8000~10000 rpm에서 15초 동안 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 상기 동일한 방법으로 RPE 500 ㎕을 넣고 8000~10000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. RNeasy spin column을 1.5 ml 튜브에 놓고 spin column membrane에 RNase free water 30~50 ㎕ 첨가한 후, 8000~10000 rpm에서 1분 동안 원심분리하고 사용 전 까지는 -74℃에 저장하였다.
2. 실시간 중합효소연쇄반응( Real - time reverse transcription PCR )
실시간 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR)을 수행하여 상기 방법으로 추출된 RNA의 copy를 확인하였다.
표 1과 같이 개시된 프라이머를 사용하여, 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 먼저, DEPC 처리된 증류수, cDNA, Premix Ex Taq(2X), 각 프라이머 10 pmol 및 프로브 5 pmol이 포함된 총 25 ㎕의 반응혼합물을 제조한 후, Thermal Cycler Dice Real-Time System (TaKaRa, Japan)을 이용하여 95 ℃에서 10분, 45 PCR 싸이클(95 ℃에서 15초, 56℃에서 1분)을 진행하였다.
그 결과, 도 2와 같이 장 조직에 감염된 노로바이러스는 24시간까지 약 4 log 수준으로 유지되는 것이 확인된 반면, 열 처리된 바이러스를 접종한 대조군에서는 24시간까지 바이러스 역가가 측정되지 않았다.
상기 결과로부터 장 조직에 노로바이러스의 감염 및 배양이 상당한 수준으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
프라이머 서열(5'→3') 서열목록
COG2F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 1
COG2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 2
RING2-TP(Probe) TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT 3
< 실시예 3> 면역조직화학( Immunohistochemistry ; IHC )을 이용한 노로바이러스 확인
특이적인 항원-항체 반응을 기반으로 한 검출방법인 면역조직화학(IHC)으로 조직 내 노로바이러스의 감염 위치를 확인하였다.
바이러스 접종 후 시간경과에 따라 바이러스 배양액이 회수된 장 조직을 10% 포름알데하이드에 24시간 고정시키고 일반적인 조직처리 절차를 거쳐 파라핀에 포매하여 블록으로 제작하였다. 각각의 파라핀 블록 조직을 4~5 μm 두께의 슬라이드로 제작하고 1차 항체인 항-노로바이러스 GII.4+GII.15 마우스 단일 클론 항체와 고트 항-마우스 IgG 2차 항체를 이용하여 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 3과 같이 노로바이러스를 접종한 장 조직에서 바이러스 항원이 확연하게 관찰된 반면, 85℃ 조건으로 90초간 가열한 바이러스를 접종한 장 조직에서는 바이러스 생존성이 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 돼지 장 조직 모델은 배지 상에서 체외 배양되는 모델로 플레이트에 부착되어 증식되는 세포보다 산소 접촉 기회가 많아 짐에 따라, 사후 세포사멸과 부패가 빠르게 진행된다. 이러한 장 조직의 특성상 세포사멸에 따른 장 융모의 손상이 배양시간과 비례하게 관찰되었다. 따라서, 장 조직을 이용한 형태학적 관찰을 위해서는 부검 후 최대 6~8시간 이내 관찰하는 것이 적합한 것으로 확인되었다.
일반적으로 바이러스 감염시 바이러스가 숙주세포 내로 이동하는데 수 초에서 수 분이 소요되며, 본 발명에 따른 장 조직 모델에서는 감염력을 유지한 사람 노로바이러스가 감염 후 최대 12시간까지 검출되었으며, 조직 손상에 따른 형태학적 변이를 고려하였을 때, 바이러스 감염 후 3~6 시간에 조직을 고정하고 바이러스 항원을 검출하는 것이 최적의 조건임을 상기 결과로부터 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Food borne virus infection model and dectection method thereof <130> ADP-2015-0240 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COG2F <400> 1 Cys Ala Arg Gly Ala Arg Asx Cys Asn Ala Thr Gly Thr Thr Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Arg Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Gly 20 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COG2R <400> 2 tcgacgccat cttcattcac a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RING2-TP <400> 3 tgggagggcg atcgcaatct 20

Claims (9)

  1. 사람을 제외한 포유동물의 장 조직을 준비하는 단계;
    상기 장 조직에 노로바이러스를 접종하여 감염시키는 단계;
    상기 노로바이러스로 감염된 장 조직을 세척하는 단계; 및
    상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 배양방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 장 조직은 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 장 조직인 것을 특징으로 하는 노로바이러스 배양방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 노로바이러스는 장 조직에 105 복제수(Copy number) 내지 106 복제수(Copy number)로 접종되며 40 내지 80분 동안 감염시키는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 배양방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세척된 장 조직을 배양하는 단계는 배지를 첨가하고 3시간 간격으로 배지를 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 배양방법.
  5. 삭제
  6. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 배양방법에 따라 노로바이러스가 감염된 체외 장 모델.
  7. 사람을 제외한 포유동물의 장 조직을 준비하는 단계;
    상기 장 조직에 시료를 처리하는 단계;
    상기 시료가 처리된 장 조직을 세척하고 배지를 첨가하는 단계;
    상기 첨가된 배지를 회수하고 배지를 교체하여 3 내지 24시간 동안 배양하는 단계; 및
    상기 회수된 배지 또는 동물의 장 조직에서 노로바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 노로바이러스 검출방법.
  8. 삭제
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 노로바이러스는 상기 회수된 배지 또는 배지가 회수된 장 조직에서 중합효연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; Realtime RT-PCR), 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC) 및 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 이루어진 군에서 하나 또는 둘 이상의 방법으로 검출되는 것을 특징으로 하는 노로바이러스 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050120114A (ko) 2004-06-18 2005-12-22 주식회사 코젠바이오텍 병원성 알엔에이 바이러스 검출방법, 및 검출키트
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