WO2017018413A1 - 細胞培養装置 - Google Patents

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WO2017018413A1
WO2017018413A1 PCT/JP2016/071879 JP2016071879W WO2017018413A1 WO 2017018413 A1 WO2017018413 A1 WO 2017018413A1 JP 2016071879 W JP2016071879 W JP 2016071879W WO 2017018413 A1 WO2017018413 A1 WO 2017018413A1
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WO
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culture
culture substrate
substrate
cells
tubular
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/071879
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English (en)
French (fr)
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小西　聡
卓也 藤田
服部　浩二
裕允 河野
Original Assignee
学校法人立命館
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Publication date
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Priority to JP2017530878A priority patent/JP6712082B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/06—Tubular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for artificially culturing biological cells.
  • Patent Document 1 imitates the peristaltic movement of the intestine and the like by applying a mechanical force along the planar direction to cells cultured in a planar manner on a flexible porous membrane.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture apparatus capable of constructing cultured cells in an environment closer to that of a living body.
  • a cell culture device comprises: A culture substrate having a culture surface on which cells are cultured; A drive unit for opening and closing the culture substrate between a closed form and an open form;
  • the closed form is a form in which the culture substrate forms a flow path having an internal volume with the culture surface as an inner surface
  • the open form is a form in which the culture surface of the culture substrate is more open than the culture surface of the culture substrate in the closed configuration.
  • the culture substrate has a closed form in which a flow path having an internal volume with the culture surface as an inner surface is formed, and the culture surface is more than the culture surface of the culture substrate in the closed form. It is opened and closed between the open form opened to the outside. Therefore, the force by the flow of the fluid can be reproduced in an environment closer to the living body by flowing the chemical solution or the like in the internal flow path of the closed culture substrate. Therefore, it is possible to evaluate the reaction that occurs in the cultured cells in a manner close to the reaction that occurs in the cells of an actual living body. Moreover, since the culture surface of the culture substrate in the open configuration is opened more than the culture surface of the culture substrate in the closed configuration, cell culture and cell observation on the culture surface can be easily performed.
  • the culture substrate in the open form is formed flat. Thereby, culture
  • the closed culture substrate is preferably formed in a tubular shape.
  • a living organ such as an intestinal tract can be patterned, and a reaction when a chemical solution or the like is flowed can be faithfully reproduced.
  • the whole outer periphery is a closed form but the form where a part of outer periphery was open
  • the said drive part has a balloon actuator provided in the surface on the opposite side to the said culture surface in the said culture
  • the balloon actuator may have a region through which the liquid that has permeated the culture substrate passes.
  • the surfaces on the culture substrate side at both ends of the balloon actuators facing each other constitute a seal surface in surface contact with each other. Is preferred. With such a configuration, it is possible to prevent leakage when a chemical solution or the like is flowed into the tubular culture substrate.
  • the sealing surface is subjected to a water repellent treatment. With such a configuration, it is possible to more reliably prevent leakage when a chemical solution or the like is flowed into the tubular culture substrate.
  • a water repellent treatment is applied to an inner peripheral surface of an end portion of the culture substrate to which an introduction pipe for allowing a fluid to flow into the culture substrate in the closed form is connected.
  • the cell culture device of the present invention it is possible to construct cultured cells in an environment closer to a living body.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a cell culture device according to a first embodiment. It is sectional drawing which expands and shows a part of culture base material. It is explanatory drawing of a balloon actuator. It is explanatory drawing which shows the operating principle of a balloon actuator. It is a top view which shows the state which set the cell culture apparatus to the fluid supply apparatus. It is sectional drawing of a fluid supply apparatus. It is sectional explanatory drawing which shows the connection part of an introductory tube and a culture base material. It is a plane explanatory view of a balloon actuator concerning a 2nd embodiment. It is explanatory drawing which shows the operating principle of a balloon actuator. It is a plane explanatory view of a balloon actuator concerning a 3rd embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic view of a cell culture apparatus according to the first embodiment.
  • the cell culture device 10 of the present embodiment imitates an organ formed in a tubular shape using artificially cultured cells, and fluids such as a drug solution flow in the mimicked organ, so that the cultured cells in the organ It tries to reproduce the reaction.
  • an intestinal tract, a blood vessel, etc. are mentioned as a tubular organ.
  • the cell culture device 10 of this embodiment exemplifies a device that imitates the intestine as a tubular organ.
  • a cell culture device 10 capable of performing evaluation of absorbability of drugs and the like for cultured cells and evaluation of permeability will be described.
  • the cell culture device 10 of this embodiment can also be used to individually perform only one of the absorbability evaluation and the permeability evaluation.
  • the cell culture device 10 of this embodiment includes a culture substrate 11 and a drive unit 12 that applies a driving force to the culture substrate 11 to deform the culture substrate 11.
  • the culture substrate 11 is formed in a rectangular shape in plan view.
  • the upper surface of the culture substrate 11 is a culture surface 11a on which cells are seeded and cultured.
  • the culture substrate 11 can be elastically deformed.
  • the culture substrate 11 is opened and closed by the drive unit 12.
  • the culture substrate 11 includes a planar (flat) form (also referred to as a planar form or an open form) as shown in FIG. 1A and a tubular (cylindrical) form as shown in FIG. Shape) (also referred to as a tubular form or a closed form).
  • the culture substrate 11 is formed in a tubular shape with the culture surface 11a on the inside, and can flow a fluid as indicated by an arrow inside.
  • the tubular culture substrate 11 forms a flow path having an internal volume with the culture surface 11a as an inner surface.
  • the culture surface 11a of the planar culture substrate 11 is largely opened to the outside as compared with the tubular culture substrate 11. That is, since the culture substrate 11 in the tubular form is formed in a tubular shape whose outer periphery is completely closed, the culture surface 11a is only opened to the outside at both ends in the tube axis direction. The material 11 is in a state where the entire culture surface 11a is opened.
  • the culture base material 11 becomes a tubular form when a driving force is applied from the driving unit 12, and becomes a flat form when the driving force is released.
  • the tube axis direction (cylinder axis direction) of the tubular culture substrate 11 is defined as the X direction
  • the horizontal direction orthogonal to the X direction is defined as the Y direction. Therefore, the culture substrate 11 in the planar form is arranged such that each side is parallel to the X direction or the Y direction.
  • FIG. 2 is an explanatory cross-sectional view showing a part of the culture substrate 11 in an enlarged manner.
  • the culture substrate 11 includes a filter 21 provided on the driving unit 12 (on a balloon actuator 30 described later) and a collagen sheet 22 as an extracellular matrix (ECM) provided on the filter 21.
  • the cells S are cultured on the collagen sheet 22 in a state where the culture substrate 11 is immersed in a liquid serving as a medium.
  • caco-2 cells are statically cultured on the culture substrate 11 as the cells S to mimic the intestinal epithelium.
  • the filter 21 is a porous membrane that can transmit a liquid containing a drug or the like.
  • the filter 21 can be joined to a balloon actuator 30 (manufactured by PDMS) of the drive unit 12 to be described later, for example, formed using polycarbonate (PC), polymethyl methacrylate (PMMA), polypropylene (PP), or the like as a material. Can be used.
  • the culture substrate 11 may be configured by providing an ECM directly on the drive unit 12 (balloon actuator 30).
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the drive unit 12.
  • the drive unit 12 connects the balloon actuator 30, the air supply device 36 that supplies air to the balloon actuator 30, and the balloon actuator 30 and the air supply device 36, and supplies air from the air supply device 36 to the balloon actuator 30.
  • a supply pipe 37 serving as a path is provided.
  • the balloon actuator 30 is elastically deformed by a change in internal air pressure, and causes the culture substrate 11 to perform a predetermined motion.
  • the balloon actuator 30 of the present embodiment includes a plurality of partial actuators 31 that are elongated in the Y direction and arranged in the X direction. The plurality of partial actuators 31 are connected and integrated by a connecting portion 32 at a central portion in the Y direction.
  • Each partial actuator 31 includes hollow portions 34 inside both sides in the length direction (Y direction).
  • the hollow portions 34 are in communication with each other via an internal tube 35.
  • the internal pipe 35 is connected to an air supply device 36 such as a compressor via a supply pipe 37.
  • an air supply device 36 such as a compressor
  • both end portions in the longitudinal direction of the partial actuators 31 approach each other and deform from a planar shape to a ring shape (see the right side in FIG. 3). ).
  • each partial actuator 31 is held in a ring shape.
  • each partial actuator 31 returns to a planar form by elastic return (see the left side of FIG. 3).
  • FIG. 4 is a cross-sectional explanatory view showing the operating principle of the balloon actuator.
  • the balloon actuator 30 (each partial actuator 31) is composed of a two-layer silicone rubber layer having a first film body 41 and a second film body 42, and is hollow between the first film body 41 and the second film body 42. A portion 34 is formed.
  • the hollow portion 34 is configured by forming a concave portion 41 a on one or both of the opposing surfaces of the first and second film bodies 41 and 42.
  • both the first film body 41 and the second film body 42 are formed of a stretchable silicone rubber, the surface area of the first film body 41 and the second film body 42 is expanded while expanding the surface area like a balloon by the pressure of air supplied into the hollow portion 34. Expands. In the balloon actuator 30, since the second film body 42 is thinner and softer than the first film body 41, the second film body 42 expands larger than the first film body 41 even under the same pressure.
  • the balloon actuator 30 is bent in the same direction as the expansion direction of the first film body 41, that is, in the example of FIG. Two or more recesses 41 a may be formed in the length direction of the partial actuator 31.
  • FIG. 5 and 6 show an apparatus for flowing a fluid through the culture substrate 11 of the cell culture apparatus 10 shown in FIG.
  • the cell culture device 10 is placed on the storage container 50.
  • 5A shows a state in which the culture substrate 11 is in a planar form
  • FIG. 5B shows a state in which the culture substrate 11 is in a tubular form.
  • the storage container 50 is formed with a first pool (first storage unit) 51 and a second pool (second storage unit) 52. Liquid is stored in the first pool 51 in advance.
  • a medium used for culturing cells for example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) can be used.
  • the tubular culture substrate 11 is immersed in the liquid stored in the first pool 51.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the culture substrate 11 and the balloon actuator 30 are largely bent before and after the first pool 51, but actually, the culture substrate 11 and the balloon actuator 30 are immersed in the first pool 51 in a smoothly curved state.
  • physiological saline such as BS (Buffered Saline) and HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) can also be used.
  • An introduction tube 53 is connected to one end of the tubular culture substrate 11.
  • a drug solution containing a drug to be subjected to drug discovery screening flows through the introduction tube 53, and the drug solution is perfused into the culture substrate 11 having a tubular shape.
  • the other end of the culture substrate 11 faces the second pool 52, and the chemical solution flowing out of the culture substrate 11 is stored in the second pool 52.
  • the culture base material 11 is deformed into a flat form as shown in FIG.
  • the state of the cultured cells after this can be easily observed.
  • the inner surface of one end in the axial direction of the tubular culture substrate 11 to which the introduction tube 53 is connected is subjected to water repellent treatment.
  • the inner surface of the end portion of the culture substrate 11 is coated with a water repellent film 54 such as a parylene film. Therefore, it is possible to prevent the chemical solution flowing into the culture substrate 11 from the introduction tube 53 from flowing back into the introduction tube 53 or leaking.
  • the culture substrate 11 is deformed from a planar form to a tubular form when a driving force is applied from the balloon actuator 30 and is elastically restored by releasing the driving force from the balloon actuator 30. It deformed from a tubular form to a planar form.
  • the driving force from the balloon actuator 30 is applied even when the tubular form is deformed to the flat form.
  • the balloon actuator 30 includes two types of partial actuators 31a and 31b.
  • One partial actuator 31a is the same as that of the first embodiment, and as shown in FIG. 4B, the air is supplied to the hollow portion 34 and bends upward.
  • the other partial actuator 31 b is bent downward when air is supplied to the hollow portion 34.
  • the other partial actuator 31b is arranged one by one at both ends in the X direction, and a plurality of one partial actuator 31a are arranged between the partial actuators 31b at both ends.
  • the partial actuator 31b is composed of a third film body 61 and a fourth film body 62, and both film bodies 61, 62 are composed of PDMS.
  • the thickness t 3 of the third film body 61 where the recess 61 a is formed is larger than the thickness t 4 of the fourth film body 62, and the hardness of the third film body 61 is greater than that of the fourth film body 62. Is also high. This is the same as the relationship between the first film body 41 and the second film body 42 in the partial actuator 31a.
  • the thickness t 3 of the third film body 61 of the partial actuator 31b is larger than the thickness t 1 (see FIG. 4) of the first film body 41 of the partial actuator 31a, and the hardness is also higher.
  • air is supplied to the partial actuator 31b from an air supply device 38 (see FIG. 8) different from the partial actuator 31a.
  • Part actuator 31b when the hollow portion 34 of air is supplied, most elongation not occur in the third film body 61, the stress F 3 tensile occurs in the third film body 61 is small. On the other hand, since the fourth film body 62 expands and expands greatly, a tensile stress F 4 larger than the tensile stress F 3 generated in the third film body 61 is generated. For this reason, the partial actuator 31b bends downward.
  • the air supply device 36 when the culture substrate 11 is deformed from the flat form to the tubular form, only the air supply device 36 operates to cause the partial actuator 31a to bend and move the culture substrate 11.
  • the air supply device 38 When the actuator is deformed from the tubular form to the planar form, only the air supply device 38 operates to cause the partial actuator 31b to bend. Therefore, not only when deforming from a flat form to a tubular form, but also when deforming from a tubular form to a flat form, the driving force from the balloon actuator 30 acts on the culture substrate 11, and rapid deformation is possible. It has become.
  • the partial actuators 31b are provided only at both ends in the X direction of the culture substrate 11, and the partial actuators 31a are provided in most other parts. Therefore, it is possible to apply a larger driving force when deforming from a planar form to a tubular form, and it is possible to deform the tubular form more quickly and to maintain the tubular form with certainty. Further, the partial actuator 31b does not adversely affect the cells cultured on the culture substrate 11 because the third film body 61 on the culture substrate 11 side hardly expands.
  • FIG. 10 is an explanatory plan view of a balloon actuator according to the third embodiment.
  • the balloon actuator 30 according to this embodiment includes two types of partial actuators 31a and 31b as in the second embodiment, but one partial actuator 31a and the other partial actuator 31b are alternately arranged in the X direction. Is arranged.
  • the driving force can be imparted to the culture substrate 11 in a balanced manner. it can.
  • a partial actuator 31a that is upside down may be used as the partial actuator 31b. In this case, the partial actuator 31b bends in the reverse direction (downward) on the same operating principle as shown in FIG. 4, and applies a driving force to the culture substrate 11 when it is deformed from the tubular form to the flat form. can do.
  • the second film body 42 that expands more greatly is disposed on the culture surface 11a side, a portion having little influence on the culture of cells, for example, as shown in FIG. It is preferable to arrange the partial actuators 31b at both ends.
  • the contact surface (seal surface) of both end portions 30a of the balloon actuator 30 is subjected to water repellent treatment.
  • a film 66 having water repellency can be provided on the sealing surface.
  • the water repellent treatment is required not to inhibit the adsorption between the seal surfaces.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view of the cell culture device according to the fifth embodiment.
  • the culture substrate 11 in the open configuration is curved in an arc shape
  • the culture substrate 11 in the closed configuration has a form curved with a smaller arc radius than the culture substrate 11 in the open form.
  • the culture substrate 11 in the closed form is in a form in which both ends in the Y direction are not in contact with each other and a gap is formed between the both ends. Even in such a closed form, it can be said that the culture substrate 11 is tubular, and a flow path having an internal volume with the culture surface 11a as an inner surface is formed. Therefore, the fluid can be perfused as in the first embodiment.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the cell culture device according to the sixth embodiment.
  • two support members 71 formed in a semicircular arc shape are provided, and the culture substrate 11 having the culture surface 11 a is provided on the inner surface of each support member 71.
  • One end portions of the two support members 71 are rotatably connected to each other by a hinge portion 72.
  • Each support member 71 has rigidity enough to maintain a semicircular arc shape.
  • cultivation base material 11 can be deform
  • the culture substrate 11 can be transformed into an open form by separating the other end portions of the two support members 71 from each other.
  • a channel is formed by the culture substrate 11 in the closed form, and fluid can be perfused through the channel.
  • the culture substrate 11 in the open form can suitably perform cell culture and observation.
  • the culture substrate 11 is moved between the closed configuration and the open configuration by rotating the two support members 71 using a drive unit (not shown) including a motor, a fluid pressure cylinder, and the like. Can be deformed.
  • the support member 71 can be formed of, for example, a synthetic resin material, and may have a permeation region that allows the liquid that has permeated the culture substrate 11 to pass through, as in the first embodiment.
  • the culture substrate 11 can be opened and closed between the closed configuration shown in FIG. 14 (b) and the open configuration shown in FIG. 14 (a), and the culture surface 11a of the culture substrate 11 in the open configuration is
  • the culture surface 11a of the culture substrate 11 in the closed configuration is more open than the culture surface 11a. Therefore, it is possible to suitably perform culture and observation on the culture surface 11a of the culture substrate 11 in the open form.
  • the culture substrate 11 can be closed and opened by rotating a part 73b of the support member 73 using a drive unit (not shown) including a motor, a fluid pressure cylinder, and the like. Can be deformed between.
  • the support member 73 may have a permeable region that allows the liquid that has passed through the culture substrate 11 to pass through, as in the first embodiment.
  • the drive unit 12 that deforms the culture substrate 11 is not limited to the one using the balloon actuator 30, and the culture substrate 11 is deformed between a tubular form (closed form) and a planar form (open form).
  • Other configurations may be used as long as possible.
  • the drive unit 12 performs another motion, for example, a motion simulating a peristaltic motion performed by a tubular organ. Also good.
  • the plurality of partial actuators 31 of the first embodiment can be individually driven, and can be realized by sequentially contracting in the X direction.
  • the culture substrate 11 in the tubular form may not be a perfect circle in cross section, but may be an elliptical shape or a flat circular shape.
  • the transmission region 33 formed in the balloon actuator 30 is not limited to being formed in a notch shape, and may be formed in a hole shape penetrating the balloon actuator 30 in the thickness direction. Moreover, when not evaluating the permeability
  • the inventor of the present application examined the influence of the opening / closing operation of the culture substrate by the balloon actuator on the cells on the culture substrate. Specifically, caco-2 cells that mimic the intestinal epithelium were cultured on a culture substrate. DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was used for caco-2 cells. Supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin G (100 UmL ⁇ 1 ), streptomycin (100 ⁇ g mL ⁇ 1 ), and 1% non-essential amino acids in an environment of 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air Caco-2 cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Caco-2 cells were passaged by dissociation in 0.05% trypsin and EDTA, and the cells were seeded on the collagen constituting the culture substrate on the upper surface of the balloon actuator. Caco-2 cells reached confluence in 7 days. The medium was changed every 24 hours.
  • the balloon actuator was used in a form of sealing when the culture substrate was formed in a tubular shape and both end portions were overlapped with each other.
  • a balloon actuator having a shape that does not have a permeable region for allowing liquid to permeate and covers the entire outside of the culture substrate was used.
  • FIG. 15 shows an image of the surface of the culture substrate.
  • FIG. 15 (a) shows a state after the upper surface of the balloon actuator is coated with collagen
  • FIG. 15 (b) shows a state where cells are seeded
  • FIG. 15 (c) shows that caco-2 cells are statically cultured.
  • FIG. 15 (d) shows a state after staining with calcein AM after static culturing of caco-2 cells
  • FIG. 15 (e) shows a state after repeatedly operating the balloon actuator ten times
  • FIG. 15 (f) shows a state stained with calcein AM after the balloon actuator has been repeatedly operated 10 times.
  • the U-shaped line projected on the image indicates the peripheral edge of the hollow portion of the balloon actuator.
  • FIG. 15 (b) As a result of the above operation, as shown in FIG. 15 (b), the caco-2 cells adhered to the surface of the culture substrate, and the monolayer caco-2 cells were normally formed on the culture substrate. It could be confirmed. It was also confirmed that there was no detachment of caco-2 cells even after the balloon actuator was operated 10 times (see FIGS. 15 (c) and (e)). These results indicate that cell viability is maintained and that the caco-2 cells are firmly attached to the culture substrate during repeated actuation of the balloon actuator. Moreover, it was confirmed that the caco-2 cells on the culture substrate were uniformly stained with calcein AM (see FIGS. 15 (d) and 15 (f)). This indicates that monolayer caco-2 cells are firmly formed by cell-cell junctions. In addition, when fluid was flowing through the tubular culture substrate, fluid leakage did not occur.
  • FIG. 16 is a microscopic image of caco-2 cells.
  • FIGS. 16A and 16B are bright field images of the bottom and top of a tubular culture substrate. From this image, it was confirmed that the caco-2 cells were not detached due to the shear stress accompanying the perfusion of the drug solution.
  • FIGS. 16C and 16D are images obtained by imaging the fluorescence signal of calcein at the bottom and top of the tubular culture substrate
  • FIGS. 16E and 16F are images of the fluorescence signal of Texas Red. It is an image. From these images, it was confirmed that calcein and Texas red were uniformly absorbed by caco-2 cells regardless of the degree of hydrophilicity.
  • FIG. 17 is an image showing a plurality of types of culture substrates and balloon actuators having different inner diameters.
  • FIG. 17A shows a culture substrate having an inner diameter of about 0.5 mm
  • FIG. 17B shows an inner diameter of about 1.0 mm
  • FIG. 17C shows an inner diameter of about 2.0 mm.
  • FIG. 22 is a table showing the relationship between the inner diameter of a tubular culture substrate (hereinafter also simply referred to as “tube”) and the mechanical properties of the fluid flowing through the tube.
  • the flow velocity u, the shear stress ⁇ , the pressure drop ⁇ P, and the Reynolds number Re are calculated by the following equations (1) to (4), respectively.
  • FIG. 18 shows the relationship between the inner diameter of the tube and the shear stress.
  • FIG. 19 shows images obtained by flowing a fluid containing Texas Red as a lipophilic drug model through three types of tubular culture substrates having different inner diameters, and imaging a fluorescence signal of Texas Red.
  • 19A shows a case where the inner diameter is 0.5 mm
  • FIG. 19B shows a case where the inner diameter is 1.0 mm
  • FIG. 19C shows a case where the inner diameter is 2.0 mm.
  • the inner diameter of the tubular culture substrate is 0.5 mm and 1.0 mm
  • the former is imaged more red than the latter, and the inner diameter is 1.0 mm and 2.0 mm.
  • the former was imaged more red than the latter. Therefore, it can be said that the smaller the inner diameter of the tube, the faster the lipophilic drug is absorbed.
  • FIG. 20 shows images obtained by flowing a fluid containing calcein as a hydrophilic drug model through three types of tubular culture substrates having different inner diameters, and capturing fluorescence signals of calcein.
  • 20A shows the case where the inner diameter is 0.5 mm
  • FIG. 20B shows the case where the inner diameter is 1.0 mm
  • FIG. 20C shows the case where the inner diameter is 2.0 mm.
  • the inner diameter of the tubular culture substrate was any, the state of caco-2 cell staining did not change, and there was almost no difference in the rate of absorption of the hydrophilic drug.
  • the shear stress ⁇ decreases as the inner diameter r of the tubular culture substrate increases, and the shear stress ⁇ increases as the inner diameter r decreases. Therefore, the greater the inner diameter r, the greater the mucin layer thickness.
  • the thickness T is large and the absorption of the lipophilic drug is delayed (see FIG. 21 (a)).
  • the smaller the inner diameter r the smaller the thickness T of the mucin layer and the faster the absorption of the lipophilic drug (FIG. 21 (b)). Reference). Therefore, it can be said that the rate of lipophilic drug absorption can be controlled by controlling the shear stress by adjusting the inner diameter of the tubular culture substrate.
  • various flow states of the tube in the living body can be reproduced, and the speed of absorption of the lipophilic drug can also be reproduced.

Abstract

生体により近い環境の培養細胞を構築することができる細胞培養装置を提供する。細胞培養装置は、細胞Ｓが培養される培養面（１１ａ）を有する培養基材（１１）と、培養基材（１１）を閉形態と開形態との間で開閉させる駆動部（１２）とを備え、閉形態は、培養基材（１１）が、培養面（１１ａ）を内面とした内部容積をもつ流路を形成する形態であり、開形態は、培養基材（１１）の培養面（１１ａ）が、閉形態における培養基材（１１）の培養面（１１ａ）よりも外部に開放された形態である。

Description

細胞培養装置
　本発明は、生物の細胞を人工的に培養するための装置に関する。
　例えば、薬剤を設計するプロセスにおいて、候補となる化合物を選定するために行われる創薬スクリーニングには、生体の細胞を人工的に培養したものが用いられている。
　従来、このような培養細胞は、ディッシュ上やマイクロウェル内で培養されるのが一般的である。また、最近ではより生体に近い状態で細胞を培養することにより臓器を模したオンチップ臓器も開発されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２０１４－５０６８０１号公報
　上記のように創薬スクリーニングを行う場合、体内において滞留時間が最も長い、腸における物質吸収プロセスを模倣した培養細胞を用いることが有効である。
　しかしながら、ディッシュ上やマイクロウェル内で細胞を二次元的に培養した場合、必ずしも生体内で起こる反応を再現できない。例えば、腸管内を薬剤を含む液体（薬液）が流動することを想定して二次元的に培養された細胞上に薬液を流したとしても、その細胞全体に均一に流体が作用せず、流体の流れに起因する剪断力等の機械的な力を細胞に適切に付与することができない。そのため、細胞に薬剤が吸収され、透過する過程を正確に再現することは困難である。
　また、特許文献１記載の技術は、可撓性多孔膜上に平面的に培養された細胞に対して平面方向に沿った機械的な力を付与することで、腸の蠕動運動等を模倣し、生体の環境を再現しようとしているが、二次元的に細胞が培養される点では上記と同様であり、流体の流れに起因する機械的な力を再現することは困難である。
　本発明は、生体により近い環境の培養細胞を構築することができる細胞培養装置を提供することを目的とする。
（１）　本発明に係る細胞培養装置は、
　細胞が培養される培養面を有する培養基材と、
　前記培養基材を閉形態と開形態との間で開閉運動させる駆動部とを備え、
　前記閉形態は、前記培養基材が、前記培養面を内面とした内部容積をもつ流路を形成する形態であり、
　前記開形態は、前記培養基材の前記培養面が、前記閉形態における前記培養基材の前記培養面よりも開放された形態である。
　上記構成の細胞培養装置では、培養基材が、培養面を内面とする内部容積をもつ流路を形成する閉形態と、閉形態における前記培養基材の前記培養面よりも、前記培養面が外部に開放された開形態との間で開閉される。そのため、閉形態の培養基材の内部流路に、薬液等を流動させることで生体により近い環境で流体の流れによる力を再現することができる。したがって、培養細胞に生じる反応等も、実際の生体の細胞に生じる反応等に近いかたちで評価することが可能となる。また、開形態における培養基材の培養面は、閉形態における培養基材の培養面よりも開放されるので、培養面上における細胞の培養や細胞の観察を容易に行うことができる。
（２）前記開形態の前記培養基材は、平坦に形成されることが好ましい。
　これにより、従来と同様の態様により細胞の培養や観察等を行うことができる。
（３）前記閉形態の培養基材は、管状に形成されることが好ましい。
　このような構成によって、腸管等の生体の器官を模様することができ、薬液等を流したときの反応を忠実に再現することができる。なお、ここでいう管状とは、外周全体が閉じた形態である場合だけでなく、外周の一部が開放された形態であってもよい。
（４）前記駆動部は、前記培養基材における前記培養面とは反対側の面に設けられたバルーンアクチュエータを有していることが好ましい。
　このような構成によって、駆動部を簡素に構成することができる。
（５）前記バルーンアクチュエータは、前記培養基材を透過した液体が通り抜ける領域を有していてもよい。
　このような構成によって、培養基材を透過した液体は、駆動部のバルーンアクチュエータを通り抜けて培養基材外へ排出される。そのため、例えば、閉形態の培養基材内を流れる薬液等が細胞に吸収され、透過した後の状態を評価することができる。
（６）前記閉形態の前記培養基材が管状に形成される場合、互いに対向する前記バルーンアクチュエータの両端部における前記培養基材側の面は、互いに面接触するシール面を構成していることが好ましい。
　このような構成によって、管状の培養基材内に薬液等を流動させたときの漏れを防止することができる。
（７）前記シール面には、撥水処理が施されていることが好ましい。
　このような構成によって、管状の培養基材内に薬液等を流動させたときの漏れをより確実に防止することができる。
（８）前記閉形態の前記培養基材に流体を流入させるための導入管が接続される、当該培養基材の端部の内周面には、撥水処理が施されていることが好ましい。
　このような構成によって、培養基材から管への液体の逆流を抑制することができる。
　本発明の細胞培養装置によれば、生体により近い環境の培養細胞を構築することができる。
第１の実施形態に係る細胞培養装置を示す概略的な斜視図である。 培養基材の一部を拡大して示す断面図である。 バルーンアクチュエータの説明図である。 バルーンアクチュエータの作動原理を示す説明図である。 細胞培養装置を流体供給装置にセットした状態を示す平面図である。 流体供給装置の断面図である。 導入管と培養基材との接続部を示す断面説明図である。 第２の実施形態に係るバルーンアクチュエータの平面説明図である。 バルーンアクチュエータの作動原理を示す説明図である。 第３の実施形態に係るバルーンアクチュエータの平面説明図である。 第４の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。 第５の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。 第６の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。 第７の実施形態に係る細胞培養装置の斜視図である。 評価実験１における培養基材の表面の画像である。 評価実験２における培養基材の表面の画像である。 評価実験３に用いた培養基材およびバルーンアクチュエータの画像である。 評価実験３における培養基材の内径と培養基材の表面に作用するせん断応力との関係を示すグラフである。 評価実験３における培養基材の表面の画像である。 評価実験３における培養基材の表面の画像である。 薬剤が培養細胞に吸収される状態を説明する模式図である。 流体の力学的特性を示す表である。
　以下、細胞培養装置のより詳細な実施形態を説明する。
［第１の実施形態］
　図１は、第１の実施形態に係る細胞培養装置の概略図である。
　本実施形態の細胞培養装置１０は、人工的に培養した細胞を用いて管状に形成された器官を模倣し、模倣した器官内に薬液等の流体を流動させることで、当該器官における培養細胞の反応を再現しようとするものである。例えば、管状の器官として腸管や血管などが挙げられる。本実施形態の細胞培養装置１０は、特に、管状の器官として腸管を模倣したものを例示する。また、本実施形態では、培養細胞に対する薬剤等の吸収性の評価と、透過性の評価とを行うことが可能な細胞培養装置１０について説明する。ただし、本実施形態の細胞培養装置１０は、吸収性評価及び透過性評価のいずれか一方のみを個別に行うために用いることもできる。
　本実施形態の細胞培養装置１０は、培養基材１１と、この培養基材１１に駆動力を与えて培養基材１１を変形させる駆動部１２とを備えている。
　培養基材１１は、平面視で矩形状に形成されている。培養基材１１の上面は、細胞が播種され、かつ培養される培養面１１ａとされている。また、培養基材１１は、弾性変形可能である。
　培養基材１１は、駆動部１２によって開閉運動される。具体的に、培養基材１１は、図１（ａ）に示すような平面状（平坦状）の形態（平面形態又は開形態ともいう）と、図１（ｂ）に示すような管状（円筒状）の形態（管状形態又は閉形態ともいう）との間で変形される。管状形態では、培養基材１１は、培養面１１ａを内側にして管状に形成され、内部に矢印で示すように流体を流すことができる。言い換えると、管状形態の培養基材１１は、培養面１１ａを内面とする内部容積をもつ流路を形成する。また、平面形態の培養基材１１は、管状形態の培養基材１１よりも培養面１１ａが外部に大きく開放される。すなわち、管状形態の培養基材１１は、外周が完全に閉じた管状に形成されるため、培養面１１ａは、管軸方向の両端において外部に開放されるだけであるが、平面形態の培養基材１１は、培養面１１ａの全体が開放された状態となる。
　なお、培養基材１１は、駆動部１２から駆動力が付与されることによって管状形態となり、駆動力が解除されることによって平面形態となる。
　以下の説明においては、管状形態の培養基材１１の管軸方向（筒軸方向）をＸ方向とし、このＸ方向に直交する水平方向をＹ方向とする。したがって、平面形態の培養基材１１は、各辺がＸ方向又はＹ方向と平行に配置される。
　図２は、培養基材１１の一部を拡大して示す断面説明図である。培養基材１１は、駆動部１２上（後述するバルーンアクチュエータ３０上）に設けられたフィルター２１と、フィルター２１上に設けられた細胞外マトリクス（ＥＣＭ）としてのコラーゲンシート２２とを備えている。細胞Ｓは、培養基材１１を培地となる液体に浸けた状態でコラーゲンシート２２上で培養される。本実施形態では、細胞Ｓとして、ｃａｃｏ－２細胞を培養基材１１上に静置培養し、腸管上皮を模倣する。フィルター２１は、薬剤を含む液体等を透過可能な多孔質膜とされている。フィルター２１としては、後述する駆動部１２のバルーンアクチュエータ３０（ＰＤＭＳ製）に接合可能なもの、例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等を素材として形成されたものを使用することができる。また、培養基材１１は、駆動部１２（バルーンアクチュエータ３０）上に直接ＥＣＭを設けることによって構成してもよい。
　図３は、駆動部１２を示す説明図である。
　駆動部１２は、バルーンアクチュエータ３０と、バルーンアクチュエータ３０に空気を供給する空気供給装置３６と、バルーンアクチュエータ３０と空気供給装置３６とを接続し、空気供給装置３６からバルーンアクチュエータ３０への空気の供給路となる供給管３７とを備えている。バルーンアクチュエータ３０は、内部の空気圧の変化によって弾性変形し、培養基材１１に所定の運動を行わせる。本実施形態のバルーンアクチュエータ３０は、Ｙ方向に細長く形成された複数の部分アクチュエータ３１をＸ方向に並べて備えている。複数の部分アクチュエータ３１は、Ｙ方向の中央部において連結部３２によって連結され、一体化されている。隣接する部分アクチュエータ３１の間には、Ｙ方向の外端縁から内側へ向けて切り欠け状に形成された透過領域３３が形成される。したがって、培養基材１１を透過した液体は、透過領域３３を介してバルーンアクチュエータ３０を通り抜けることができる。
　各部分アクチュエータ３１は、長さ方向（Ｙ方向）の両側の内部に中空部３４を備えている。そして、各中空部３４は、互いに内部管３５を介して連通されている。内部管３５は、コンプレッサ等の空気供給装置３６に供給管３７を介して接続されている。空気供給装置３６が、各部分アクチュエータ３１の中空部３４に空気を供給することによって、各部分アクチュエータ３１の長手方向両端部が互いに接近し、平面状からリング状に変形する（図３の右側参照）。また、中空部３４に空気を供給した状態を維持することによって、各部分アクチュエータ３１はリング状の形態に保持される。空気供給装置３６が中空部３４に対する空気の供給を停止すると、各部分アクチュエータ３１は、弾性復帰によって平面形態に戻る（図３の左側参照）。
　図４は、バルーンアクチュエータの作動原理を示す断面説明図である。
　バルーンアクチュエータ３０（各部分アクチュエータ３１）は、第１膜体４１と第２膜体４２とを有する２層のシリコーンラバー層からなり、第１膜体４１と第２膜体４２との間に中空部３４が形成されている。中空部３４は、第１及び第２膜体４１，４２の対向面の一方又は両方に、凹部４１ａを形成することによって構成される。
　第１膜体４１及び第２膜体４２は、シリコーンラバーの一種であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）薄膜によって構成されている。第１膜体４１と第２膜体４２は、それぞれ厚さが異なっている。具体的には、第１膜体４１において、凹部４１ａが形成された部分の厚さｔ１が、第２膜体４２の厚さｔ２よりも大きくなっている。また、第１膜体４１と第２膜体４２とは、それぞれ硬度が異なっている。具体的には、第１膜体４１は、第２膜体４２よりも硬度が高く形成されている。
　第１膜体４１と第２膜体４２は、ともに伸縮自在なシリコーンラバーによって形成されているため、中空部３４内に供給された空気の圧力によって、風船のように、その表面積を拡げつつ伸びて膨張する。そして、バルーンアクチュエータ３０は、第２膜体４２が、第１膜体４１よりも薄く柔らかいため、同じ圧力下でも、第２膜体４２は第１膜体４１よりも大きく膨張する。
　第１膜体４１及び第２膜体４２が膨張すると、それぞれの膜体４１，４２において、図示のような引っ張り応力Ｆ１、Ｆ２が発生するが、第１膜体４１は、第２膜体４２よりも厚く硬度が高いため、第１膜体４１における引っ張り応力Ｆ１は、第２膜体４２における引っ張り応力Ｆ２よりも大きくなる。そのため、バルーンアクチュエータ３０には、第１膜体４１の膨張方向と同じ方向、すなわち図４の例では上方への曲がり運動が生じる。なお、凹部４１ａは、部分アクチュエータ３１の長さ方向に２以上形成されていてもよい。
　図５及び図６は、図１に示す細胞培養装置１０の培養基材１１に流体を流すための装置を示す。細胞培養装置１０は、貯留容器５０上に載置されている。図５（ａ）は、培養基材１１を平面形態にした状態、図５（ｂ）は、培養基材１１を管状形態にした状態で示す。貯留容器５０には、第１のプール（第１の貯留部）５１と第２のプール（第２の貯留部）５２とが形成されている。第１のプール５１内には予め液体が貯留されている。この液体には、細胞を培養する際に用いられる培地、例えばＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）が用いることができる。管状形態の培養基材１１は、第１のプール５１に貯留された液体に浸漬されている。なお、図６においては、培養基材１１及びバルーンアクチュエータ３０が第１のプール５１の前後において大きく屈曲されているが、実際には、滑らかに湾曲した状態で第１のプール５１に浸漬される。第１のプール５１に貯留する液体としては、ＢＳ（Buffered Saline）やＨＢＳＳ（Hank's Balanced Salt Solution）等の生理食塩水を用いることもできる。
　管状形態の培養基材１１の一端部には、導入管５３が接続されている。この導入管５３には、例えば創薬スクリーニングの対象となる薬剤を含む薬液が流動し、その薬液が管状形態の培養基材１１内に潅流される。培養基材１１の他端部は、第２のプール５２に臨んでおり、培養基材１１の内部から流出する薬液は、第２のプール５２に貯留される。
　培養基材１１を管状形態とすることによって、培養基材１１の内面の培養細胞には、薬液の流れによる剪断力等の機械的な力が、実際の生体の腸管に近い状態で作用することになる。そして、培養基材１１の内部を潅流する薬液が、培養細胞に吸収され、フィルター２１を透過して培養基材１１外に滲み出すと、その薬液は、バルーンアクチュエータ３０の透過領域３３を通り抜けて第１のプール５１内の液体に混合される。したがって、第１のプール５１に混合された液体の状態によって薬剤の透過性の評価を適切に行うことができる。また、第２のプール５２に貯留された薬液には、薬剤の吸収によって培養細胞から分泌される成分等が含まれる場合があるため、当該薬液も評価の対象とすることができる。
　また、管状形態の培養基材１１の内部に薬液を灌流させたあと、図５（ａ）に示すように、培養基材１１を平面形態に変形させることで、薬剤を吸収し、薬剤に反応した後の培養細胞の状態を容易に観察することができる。
　さらに、培養基材を管状形態にして薬液を環流させ、その後、培養基材を平面形態にして細胞の観察を行うという操作を繰り返し行うことも可能である。
　図７に示すように、導入管５３が接続される管状形態の培養基材１１の軸方向一端部の内面には、撥水処理が施されている。例えば、培養基材１１の端部の内面には、パリレン膜等の撥水膜５４がコーティングされている。そのため、導入管５３から培養基材１１内に流入する薬液が、導入管５３に逆流したり漏洩したりするのを防止することができる。
［第２の実施形態］
　上述した第１の実施形態では、培養基材１１は、バルーンアクチュエータ３０から駆動力が作用することによって平面形態から管状形態に変形し、バルーンアクチュエータ３０からの駆動力を解除することによって弾性復帰により管状形態から平面形態に変形するものであった。第２の実施形態では、管状形態から平面形態に変形する際にもバルーンアクチュエータ３０からの駆動力を付与するものとなっている。
　具体的には、図８に示すように、バルーンアクチュエータ３０は、２種類の部分アクチュエータ３１ａ，３１ｂを備えている。一方の部分アクチュエータ３１ａは、第１の実施形態と同様のものであり、図４（ｂ）に示すように、中空部３４に空気が供給されることによって上方に曲がり運動する。他方の部分アクチュエータ３１ｂは、図９に示すように、中空部３４に空気が供給されることによって下方に曲がり運動を行うものとなっている。他方の部分アクチュエータ３１ｂは、Ｘ方向の両端に１つずつ配置され、一方の部分アクチュエータ３１ａは、両端の部分アクチュエータ３１ｂの間に複数配置されている。
　図９に示すように、部分アクチュエータ３１ｂは、第３膜体６１と第４膜体６２とからなり、両膜体６１，６２は、ＰＤＭＳからなっている。第３膜体６１の凹部６１ａが形成された部分の厚さｔ３は、第４膜体６２の厚さｔ４よりも大きく、さらに第３膜体６１の硬度が、第４膜体６２よりも高くなっている。この点は、部分アクチュエータ３１ａにおける第１膜体４１と第２膜体４２との関係と同様である。しかし、部分アクチュエータ３１ｂの第３膜体６１の厚さｔ３は、部分アクチュエータ３１ａの第１膜体４１の厚さｔ１（図４参照）よりも大きく、硬度も高くなっている。また、部分アクチュエータ３１ｂには、部分アクチュエータ３１ａとは異なる空気供給装置３８（図８参照）から空気が供給される。
　部分アクチュエータ３１ｂは、中空部３４に空気が供給されると、第３膜体６１にほとんど伸びが生じず、第３膜体６１に生じる引っ張り応力Ｆ３は小さい。これに対して、第４膜体６２は大きく伸びて膨張するため、第３膜体６１に生じる引っ張り応力Ｆ３よりも大きな引っ張り応力Ｆ４が生じる。そのため、部分アクチュエータ３１ｂは、下方に曲がり運動を生じる。
　そして、本実施形態のバルーンアクチュエータ３０は、培養基材１１を平面形態から管状形態に変形させるときは、空気供給装置３６のみが作動することによって部分アクチュエータ３１ａが曲がり運動を行い、培養基材１１を管状形態から平面形態に変形させるときは、空気供給装置３８のみが作動することによって、部分アクチュエータ３１ｂが曲がり運動を行う。そのため、平面形態から管状形態に変形する場合だけでなく、管状形態から平面形態に変形する場合にも、培養基材１１にはバルーンアクチュエータ３０からの駆動力が作用し、迅速な変形が可能となっている。
　部分アクチュエータ３１ｂは、培養基材１１のＸ方向の両端のみに設けられており、その他の大部分に部分アクチュエータ３１ａが設けられている。そのため、平面形態から管状形態に変形させるときにより大きな駆動力を付与することができ、より迅速に管状形態に変形させることができるとともに、管状形態を確実に維持することができる。
　また、部分アクチュエータ３１ｂは、培養基材１１側の第３膜体６１はほとんど膨張しないので、培養基材１１に培養された細胞に悪影響を及ぼすこともない。
［第３の実施形態］
　図１０は、第３の実施形態に係るバルーンアクチュエータの平面説明図である。この実施形態に係るバルーンアクチュエータ３０は、第２の実施形態と同様に、２種類の部分アクチュエータ３１ａ，３１ｂを備えているが、一方の部分アクチュエータ３１ａと他方の部分アクチュエータ３１ｂとがＸ方向に関して交互に配置されている。
　したがって、本実施形態においては、培養基材１１を平面形態から管状形態に変形させるときと、管状形態から平面形態に変形させるときの双方において培養基材１１にバランスよく駆動力を付与することができる。
　なお、第２及び第３の実施形態においては、部分アクチュエータ３１ｂとして、部分アクチュエータ３１ａを表裏反転したものを使用してもよい。この場合、部分アクチュエータ３１ｂは、図４に示すものと同様の作動原理で逆方向（下方向）に曲がり運動を行い、管状形態から平面形態に変形するときに培養基材１１に駆動力を付与することができる。ただし、この場合、より大きく膨張する第２膜体４２が培養面１１ａ側に配置されることになるので、細胞の培養への影響が少ない箇所、例えば、図８に示すように、Ｘ方向の両端部に部分アクチュエータ３１ｂを配置することが好ましい。
［第４の実施形態］
　図１１は、第４の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。
　本実施形態では、図１１（ａ）に示すように、バルーンアクチュエータ３０のＹ方向の幅は、培養基材１１の幅よりも大きく形成されている。そして、図１１（ｂ）に示すように、培養基材１１を管状形態に変形させると、バルーンアクチュエータ３０のＹ方向の両端部３０ａが管状形態の培養基材１１から径方向外方へ突出して互いに重ね合わされ、面接触した状態となる。これによって、管状形態の培養基材１１の内部に流体を流したときの漏れが防止される。
　また、バルーンアクチュエータ３０の両端部３０ａの接触面（シール面）には、撥水処理が施されている。例えば、シール面に撥水性を有するフィルム６６を設けることができる。これにより、管状形態の培養基材１１を流れる流体の漏れをより確実に防止することができる。ただし、撥水処理は、シール面同士の吸着を阻害しないことが必要とされる。なお、バルーンアクチュエータ３０が、図３、図９、及び図１０に示すように複数の部分アクチュエータ３１，３１ａ，３１ｂからなる場合、バルーンアクチュエータ３０のＹ方向の両端部に、互いに重ね合わされる部分をＹ方向に延長して設け、この延長した部分によってＸ方向に隣接する複数の部分アクチュエータ３１，３１ａ，３１ｂを互いに連結してもよい。
［第５の実施形態］
　図１２は、第５の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。
　本実施形態では、図１２（ａ）に示すように、開形態における培養基材１１が、円弧状に湾曲した形態であり、図１２（ｂ）に示すように、閉形態における培養基材１１が、開形態における培養基材１１よりも小さい円弧半径で湾曲した形態となっている。
　閉形態における培養基材１１は、Ｙ方向の両端部が接しておらず、両端部の間に隙間が形成された形態となっている。このような閉形態においても、培養基材１１は管状であるといえ、培養面１１ａを内面とする内部容積を有する流路が形成される。したがって、上記第１の実施形態と同様に、流体を灌流させることができる。
　また、開形態では、培養基材１１は湾曲しているが、その培養面１１ａが開形態の培養面１１ａよりも大きく開放されているため、培養面１１ａに対する細胞の培養や観察を好適に行うことができる。
　なお、本実施形態においても、開形態の培養基材１１は、第１の実施形態と同様に平面状に形成されてもよい。逆に、第１の実施形態における開形態の培養基材１１が、本実施形態のようにわずかに湾曲していてもよい。また、閉形態の培養基材１１は、液体を灌流させることが可能な程度に湾曲していればよいが、管状形態の中心軸回りに１８０°を超える範囲で湾曲した形態とすることが好適である。
［第６の実施形態］
　図１３は、第６の実施形態に係る細胞培養装置の断面図である。
　本実施形態では、半円弧状に形成された２つの支持部材７１が設けられ、各支持部材７１の内面に培養面１１ａを有する培養基材１１が設けられている。２つの支持部材７１の一端部同士は、ヒンジ部７２によって互いに回動自在に連結されている。各支持部材７１は、半円弧状の形態を維持できる程度の剛性を有したものとされる。そして、図１３（ｂ）に示すように、２つの支持部材７１の他端部同士を突き合わせることによって培養基材１１を閉形態（管状形態）に変形することができ、図１３（ａ）に示すように、２つの支持部材７１の他端部同士を離反させることによって培養基材１１を開形態に変形することができる。
　本実施形態においても、閉形態の培養基材１１により流路が形成され、この流路に流体を灌流させることができる。また、開形態の培養基材１１は、培養面１１ａが大きく開放されるので、細胞の培養や観察を好適に行うことができる。
　なお、本実施形態においては、モータや流体圧シリンダ等からなる駆動部（図示省略）を用いて２つの支持部材７１を回転させることにより、培養基材１１を閉形態と開形態との間で変形させることができる。支持部材７１は、例えば合成樹脂材により形成することができ、第１の実施形態等と同様に、培養基材１１を透過した液体を通り抜けさせることができる透過領域を有していてもよい。
［第７の実施形態］
　図１４は、第７の実施形態に係る細胞培養装置の斜視図である。
　本実施形態では、図１４（ｂ）に示すように、管状（筒状）に形成された支持部材７３の内側に培養基材１１が設けられており、培養基材１１の内部に流路が形成されている。また、本実施形態では、支持部材７３の一部７３ｂと、その内側の培養基材１１の一部１１ｂとは、ヒンジ部７４を介して他の部分に対して回動可能に構成されている。
　したがって、図１４（ｂ）に示す閉形態と、図１４（ａ）に示す開形態との間で培養基材１１を開閉運動させることができ、開形態における培養基材１１の培養面１１ａが、閉形態における培養基材１１の培養面１１ａよりも開放されている。そのため、開形態における培養基材１１の培養面１１ａに対する培養や観察を好適に行うことができる。
　なお、本実施形態においても、モータや流体圧シリンダ等からなる駆動部（図示省略）を用いて支持部材７３の一部７３ｂを回転させることにより、培養基材１１を閉形態と開形態との間で変形させることができる。支持部材７３は、第１の実施形態等と同様に、培養基材１１を透過した液体を通り抜けさせることができる透過領域を有していてもよい。
　本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内において適宜変更可能である。
　例えば、培養基材１１を変形させる駆動部１２は、バルーンアクチュエータ３０を用いたものに限定されず、培養基材１１を管状形態（閉形態）と平面形態（開形態）との間で変形させることができる限り、他の構成を用いてもよい。
　駆動部１２は、培養基材１１を閉形態と開形態との間で変形させることに加えて、他の運動、例えば、管状の器官が行う蠕動運動を模した運動を行わせるものであってもよい。この場合、第１の実施形態の複数の部分アクチュエータ３１を個別に駆動可能とし、かつＸ方向に順番に収縮運動させることによって実現させることができる。
　管状形態の培養基材１１は、断面形状が真円でなくてもよく、楕円形や扁平な円形状であってもよい。
　バルーンアクチュエータ３０に形成される透過領域３３は、切り欠け状に形成するに限らず、バルーンアクチュエータ３０を厚さ方向に貫通する孔形状に形成してもよい。
　また、培養細胞に対する液体の透過性を評価しない場合には、培養基材１１の培養面１１ａとは反対側の全体を覆うようにバルーンアクチュエータ３０を設けてもよい。この場合、培養細胞の液体の吸収性評価を行うことができる。
［評価実験１］
　本出願の発明者は、バルーンアクチュエータによる培養基材の開閉動作が培養基材上の細胞に与える影響について調べた。
　具体的には、培養基材上に、腸管上皮を模倣するｃａｃｏ－２細胞を培養した。ｃａｃｏ－２細胞には、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製を用いた。３７℃、ＣＯ２５％、空気９５％の環境下で、１０％熱不活性ウシ胎児血清、ペニシリンＧ（１００ＵｍＬ－１）、ストレプトマイシン（１００μｇ ｍＬ－１）、および、１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）内でｃａｃｏ－２細胞を培養した。ｃａｃｏ－２細胞は、０．０５％トリプシンおよびＥＤＴＡ中で解離することによって継代し、バルーンアクチュエータの上面において培養基材を構成するコラーゲン上に細胞を播種した。ｃａｃｏ－２細胞は、７日間でコンフルーエンスに達した。培地は２４時間毎に交換した。
　バルーンアクチュエータには、図１１に示すように、培養基材を管状形態に形成したときに、両端部が互いに重ね合わされることによってシールする形態のものを用いた。また、バルーンアクチュエータには、液体を透過させるための透過領域が形成されず、培養基材の外側全体を覆う形状のものを用いた。
　培養基材上に単層のｃａｃｏ－２細胞を培養した後、１時間、カルセインＡＭ（１μｇ　ｍＬ－１）にｃａｃｏ－２細胞を曝露した。そして、バルーンアクチュエータを作動することによって、１０秒間、培養基材を平面形態から管状形態に変形し、作動の前後のｃａｃｏ－２細胞の明視野像および蛍光像を観察し、この手順を１０回繰り返した。図１５に、培養基材の表面の画像を示す。
　図１５（ａ）は、バルーンアクチュエータの上面をコラーゲンでコートした後の状態、図１５（ｂ）は、細胞を播種した後、図１５（ｃ）は、ｃａｃｏ－２細胞を静的に培養した後の状態、図１５（ｄ）は、ｃａｃｏ－２細胞を静的に培養した後のカルセインＡＭで染色された状態、図１５（ｅ）は、バルーンアクチュエータを１０回繰り返し作動した後の状態、図１５（ｆ）は、バルーンアクチュエータを１０回繰り返し作動した後のカルセインＡＭで染色された状態を示す。なお、図１５および後で説明する図１６において、画像に映し出されたＵ字状の線はバルーンアクチュエータの中空部の周縁を示している。
　以上の操作の結果、図１５（ｂ）に示すように、ｃａｃｏ－２細胞は培養基材の表面に付着し、単層のｃａｃｏ－２細胞が培養基材上に正常に形成されたことが確認できた。また、バルーンアクチュエータを１０回繰り返して作動した後もｃａｃｏ－２細胞の剥離がないことを確認できた（図１５（ｃ）および（ｅ）参照）。これらの結果は、細胞の生存能力が維持され、バルーンアクチュエータの繰り返しの作動中にもｃａｃｏ－２細胞がしっかりと培養基材に付着していることを表す。また、培養基材上のｃａｃｏ－２細胞はカルセインＡＭによって均一に染色されたことを確認できた（図１５（ｄ）（ｆ）参照）。これは、単層のｃａｃｏ－２細胞が細胞間の接合によってしっかりと形成されていることを表している。また、管状形態の培養基材に流体を流しているときに、流体の漏れも生じなかった。
［評価実験２］
　次に、本出願の発明者は、管状形態の培養基材に薬剤が均一に流れ、ｃａｃｏ－２細胞に均一に吸収されるかを調べた。
　管状形態の培養基材には、薬液に相当する液体として蛍光色素を含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ'　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を０．０５ｍＬｍｉｎ－１の流量で１時間灌流した。蛍光色素には、親水性薬剤のモデルとしてのカルセインと、親油性薬剤のモデルとしてのテキサスレッドとを用い、それぞれの濃度を１００μｍｏｌＬ－１，１０μｍｏｌＬ－１とした。その後、管状形態の培養基材の底部および上部におけるｃａｃｏ－２細胞の明視野画像と蛍光画像とを観察した。
　図１６は、ｃａｃｏ－２細胞の顕微鏡画像である。特に、図１６（ａ）（ｂ）は、管状形態の培養基材の底部および上部の明視野画像である。この画像から、薬液の灌流に伴うせん断応力によってｃａｃｏ－２細胞が剥離されていないことが確認できた。図１６（ｃ）（ｄ）は、管状形態の培養基材の底部および上部におけるカルセインの蛍光信号を撮像した画像であり、図１６（ｅ）（ｆ）は、テキサスレッドの蛍光信号を撮像した画像である。これらの画像から、カルセインおよびテキサスレッドは、親水性の程度に関わらず、ｃａｃｏ－２細胞に均一に吸収されていることが確認された。
［評価実験３］
　本出願の発明者は、管状形態の培養基材に薬液等の液体を流したときの、流体の力学的特性および培養基材への薬剤の吸収について調べた。具体的には、内径が異なる複数種類の管状形態の培養基材に対して薬剤を含む流体を流し、流体を流す前後の培養基材の状態を観察した。また、管状形態の各培養基材における流体の力学的特性を演算により求めた。
　図１７は、内径が異なる複数種類の培養基材およびバルーンアクチュエータを示す画像である。図１７（ａ）は、内径が約０．５ｍｍ、図１７（ｂ）は、内径が約１．０ｍｍ、図１７（ｃ）は、内径が約２．０ｍｍの培養基材を示す。
　図２２は、管状形態の培養基材（以下、単に「管」ともいう）の内径と、管を流れる流体の力学的特性との関係を示す表である。この表において、流速ｕ、せん断応力τ、圧力降下ΔＰ、レイノルズ数Ｒｅは、それぞれ次の式（１）～（４）によって演算される。
　　ｕ＝Ｑ／（πｒ２）　・・・　（１）
　　τ＝４μＱ／（πｒ３）　・・・　（２）
　　ΔＰ＝８μＱＬ／（πｒ４）　・・・　（３）
　　Ｒｅ＝２ρＱ／（μπｒ）　・・・　（４）
　ただし、Ｑは液体の流量、μは液体の粘度、ρは液体の密度、Ｌは管の長さ、ｒは管の半径である。液体の流量Ｑは、０．０５ｍＬ／ｍｉｎとし、３分間液体を灌流させた。
　式（２）に示すように、管の半径ｒ（内径２ｒ）を変化させると、せん断応力τも変化することが判る。図１８に、管の内径とせん断応力との関係を示す。
　また、図１９は、内径が異なる３種類の管状形態の培養基材に、親油性薬剤のモデルとしてテキサスレッドを含む流体を流し、テキサスレッドの蛍光信号を撮像した画像を示す。図１９（ａ）は、内径が０．５ｍｍの場合、（ｂ）は内径が１．０ｍｍの場合、（ｃ）は、内径が２．０ｍｍの場合である。管状形態の培養基材の内径が０．５ｍｍの場合と１．０ｍｍの場合とを比較すると、前者の方が後者よりもより赤く撮像され、内径が１．０ｍｍの場合と２．０ｍｍの場合とを比較すると、前者の方が後者よりもより赤く撮像された。したがって、管の内径が小さい程、より速く親油性薬剤が吸収されているといえる。
　また、図２０は、内径が異なる３種類の管状形態の培養基材に、親水性薬剤のモデルとしてカルセインを含む流体を流し、カルセインの蛍光信号を撮像した画像を示す。図２０（ａ）は、内径が０．５ｍｍの場合、図２０（ｂ）は内径が１．０ｍｍの場合、図２０（ｃ）は、内径が２．０ｍｍの場合である。管状形態の培養基材の内径がいずれの場合においても、ｃａｃｏ－２細胞の染色の状態は変わらず、親水性薬剤の吸収の速さにほとんど差はなかった。
　以上の結果から、次のように考察することができる。
　図２１に示すように、培養基材に培養されたｃａｃｏ－２細胞からは、粘性の高いムチンが分泌され、ｃａｃｏ－２細胞の表面が親水性のムチン層（粘液層）で覆われる。このムチン層は非撹拌水層とも呼ばれ、ｃａｃｏ－２細胞への親油性薬剤の吸収を妨げる障壁となる一方、親水性薬剤の吸収は妨げない。また、ムチン層は、流体の流れによって培養基材の内面に作用するせん断応力によって厚さＴが変化すると考えられる。図２２に示すように、管状形態の培養基材の内径ｒが大きい程せん断応力τは小さくなり、内径ｒが小さい程せん断応力τが大きくなるので、当該内径ｒが大きい程、ムチン層の厚さＴが大きく親油性薬剤の吸収が遅くなり（図２１（ａ）参照）、当該内径ｒが小さい程、ムチン層の厚さＴが小さく親油性薬剤の吸収が速くなる（図２１（ｂ）参照）と考えることができる。したがって、管状形態の培養基材の内径を調整することによってせん断応力をコントロールすれば、親油性薬剤の吸収の速さをコントロールすることが可能であるといえる。また、管状形態の培養基材の内径を調整することによって、生体における管の様々な流れの状態を再現することができ、親油性薬剤の吸収の速さも再現することができると考えられる。
１０　　　：細胞培養装置
１１　　　：培養基材
１１ａ　　：培養面
１２　　　：駆動部
３０　　　：バルーンアクチュエータ
３０ａ　　：両端部
５３　　　：導入管
Ｓ　　　　：細胞

Claims (8)

  1. 　細胞が培養される培養面を有する培養基材と、
    　前記培養基材を閉形態と開形態との間で開閉させる駆動部とを備え、
    　前記閉形態は、前記培養基材が、前記培養面を内面とした内部容積をもつ流路を形成する形態であり、
    　前記開形態は、前記培養基材の前記培養面が、前記閉形態における前記培養基材の前記培養面よりも外部に開放された形態である、細胞培養装置。
  2. 　前記開形態の前記培養基材が平坦に形成される、請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記閉形態の前記培養基材が管状に形成される、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
  4. 　前記駆動部が、前記培養基材における前記培養面とは反対側の面に設けられたバルーンアクチュエータを有している、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記バルーンアクチュエータは、前記培養基材を透過した液体が通り抜ける領域を有している、請求項４に記載の細胞培養装置。
  6. 　前記閉形態の前記培養基材が管状に形成され、
    　前記閉形態の前記培養基材において、互いに対向する前記バルーンアクチュエータの両端部における前記培養基材側の面が、互いに面接触するシール面を構成している、請求項４又は５に記載の細胞培養装置。
  7. 　前記シール面に撥水処理が施されている、請求項６に記載の細胞培養装置。
  8. 　前記閉形態の前記培養基材に流体を流入させるための導入管が接続される、当該培養基材の端部の内周面に、撥水処理が施されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
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