KR20170020878A - 지방산 및 생체분자에 대한 접합에서의 이의 용도 - Google Patents

지방산 및 생체분자에 대한 접합에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 링커를 통해 하기 화학식 A1, A2 또는 A3
Figure pct00350

[식 중, R1, R2, R3, R4, Ak, n, m 및 p는 본원에서 정의된다]을 갖는 지방산에 연결된 생체분자를 포함하는 접합체를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 접합체 예컨대 GDF15 접합체의 제작 방법, 및 이의 치료 용도 예컨대 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료 또는 예방에 또한 관련된다. 본 발명은 약리학적으로 활성인 작용제 및 제약 조성물의 조합물을 추가로 제공한다.

Description

지방산 및 생체분자에 대한 접합에서의 이의 용도{FATTY ACIDS AND THEIR USE IN CONJUGATION TO BIOMOLECULES}
발명의 분야
본 발명은 반감기 및 작용 지속기간이 개선된 GDF15의 신규 접합체, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 신규 지방산 및 접합을 통해 생체분자의 반감기를 연장하는 것에서의 이의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
펩티드 및 단백질은 의료업에서 널리 사용되고, 재조합 DNA 기술을 사용하여 이들을 생산할 수 있기 때문에, 앞으로 이의 중요성이 또한 증가할 것으로 예상될 수 있다. 또한 진행 중인 인간 게놈 연구의 결과로서, 흥미로운 생물학적 활성이 있는 공지된 내인성 펩티드 및 단백질의 수가 급속하게 증가되고 있다. 이의 생물학적 활성으로 인해, 다수의 이러한 폴리펩티드 및 단백질이 원칙적으로 치료제로서 사용될 수 있다. 그러나, 내인성 펩티드 또는 단백질은 펩티다제에 의한 신속한 분해 및/또는 신장 여과 및 소변에서의 배설로 인해 이의 반감기가 종종 수 분이기 때문에 약물 후보물로서 항상 적절하지는 않다. 인간 혈장에서의 폴리펩티드 또는 단백질의 반감기는 매우 다양하다 (수 분에서 1주일 초과까지).
치료제의 높은 소거율은 장기간에 걸쳐 이의 높은 혈액 수준을 유지하기를 원하는 경우에 불편하다. 이러한 단점을 극복하기 위해 현재 사용되는 한 가지 방식은 일부 치료 펩티드 또는 단백질이 분해되더라도, 충분한 양이 잔류하여 치료적으로 효과적이도록, 많은 투여량의 관심 치료 펩티드 또는 단백질을 환자에게 투여하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 환자에게 불편하다. 대부분의 치료 펩티드 또는 단백질이 경구로 투여될 수 없기 때문에, 치료 펩티드 또는 단백질이 지속적으로 주입되거나, 정맥내 주사에 의해 빈번하게 주입되거나, 또는 불편한 피하 주사 경로에 의해 빈번하게 투여되어야 할 것이다. 빈번한 투여를 필요로 하는 것은 허용될 수 없는 높은 예상 치료 비용의 더 많은 잠재적인 펩티드 또는 단백질 치료제를 또한 초래한다. 또한 다량의 분해된 펩티드 또는 단백질의 존재가 바람직하지 않은 부작용을 생성시킬 수 있다.
불편한 투여 및 높은 비용은 매력적인 생체활성 프로파일이 있는 대부분의 치료 펩티드 또는 단백질이 약물 후보물로서 개발될 수 없는 두 가지 이유이다.
따라서, 펩티드 또는 단백질의 반감기를 연장하는 한 가지 접근법은 치료 펩티드 또는 단백질을 생물학적 활성을 여전히 유지하면서 이의 분해를 느리게 하는 방식으로 변형시키는 것이다. 혈청 알부민은 반감기가 1주일을 초과하고, 펩티드 또는 단백질의 혈장 반감기를 증가시키는 한 가지 접근법은 이를 혈청 알부민 또는 기타 혈장 단백질에 결합하는 화학 물질로 유도체화하는 것이었다.
그러나, 낮은 독성 및 치료적 장점을 유지하면서 생체 내에서 더 긴 작용 지속기간을 제공하기 위해 치료 생체분자 예컨대 펩티드 및 단백질을 변형시키는 새로운 반감기 연장 모이어티를 확인하는 것이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 링커를 통해 하기 화학식 A1, A2 또는 A3
Figure pct00001
[R1은 CO2H 또는 H이고;
R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 H, OH, CO2H, -CH=CH2 또는 -C≡CH이고;
Ak는 분지형 C6-C30알킬렌이고;
n, m 및 p는 서로 독립적으로 6 내지 30의 정수이다]을 갖는 지방산에 접합된 생체분자를 포함하는 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
화학식 A1, A2 및 A3의 지방산은, 링커를 통해 관심 생체분자에 연결되었을 때, 더욱 통상적으로 사용되는 지방산 잔기보다 훨씬 더 큰 정도로 상기 생체분자의 반감기를 증가시키는 것으로 발견되었다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 R2 및 R3 중 적어도 하나가 CO2H인 화학식 A1의 지방산에 연결된 생체분자를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 관심 생체분자는 치료 펩티드, 치료 단백질 또는 RNA이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 관심 생체분자는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 APJ 효능제 펩티드, 옥시토신 수용체 효능제 펩티드, 세릴랙신(Serelaxin), NPFF, PIP 펩티드, FGF23 펩티드, AgRP 펩티드, 또는 성장 분화 인자 15 (GDF15) 단백질, 이의 상동체, 변이체, 단편 및 기타 변형 형태이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 접합체 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 접합체, 및 하나 이상의 치료적으로 활성인 작용제의 제약 조합물을 포함하는 조합물에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 다양한 질환, 장애 및 병태, 및/또는 이의 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 본원에 기술된 접합체 및 이의 조성물의 용도를 고려한다.
예를 들어, 본 발명은 생체분자가 APJ 효능제인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, APJ 수용체의 활성화를 필요로 하는 대상체에서 APJ 수용체를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는, APJ 수용체의 활성화를 통해, 급성 대상부전 심부전 (ADHF), 만성 심부전, 폐 고혈압, 심방 세동, 브루가다 증후군, 심실성 빈맥, 아테롬성동맥경화증, 고혈압, 재협착, 허혈성 심혈관 질환, 심근병증, 심장 섬유증, 부정맥, 수분 정체, 당뇨병 (임신성 당뇨병 포함), 비만, 말초 동맥 질환, 뇌혈관 사고, 일과성 허혈 발작, 외상성 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 화상 손상 (일광화상 포함) 및 자간전증의 치료에서 유용하다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 본 발명의 접합체는 급성 대상부전 심부전 (ADHF) 또는 만성 심부전의 치료에서 유용하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 옥시토신 수용체 효능제 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 옥시토신 수용체의 활성화를 필요로 하는 대상체에서 옥시토신 수용체를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는, 옥시토신 수용체의 활성화를 통해, 자폐증 (치료적 또는 예방적), 편두통, 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD), 반항 장애 (ODD), 스트레스 (외상후 스트레스 장애 포함), 불안증 (불안 장애 및 우울증 포함), 정신분열증, 정신과 장애 및 기억 상실, 알콜 금단, 약물 중독, 프래더-윌리 증후군, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 글루코스 수준 상승, 인슐린 수준 상승 및 당뇨성 신장병증, 섬유근육통, 수면 장애, 수면 무호흡증, 이완기 심부전, 요실금, 아테롬성동맥경화증, 고혈압, 발기 부전, 전립선 비대증 증상, 비-알콜성 지방간 질환, 수유 손상 병태, 분만 유도 손상, 자궁 이완증 병태, 과다 출혈, 염증, 통증, 복통, 요통, 남성 및 여성 성기능 장애, 과민성 장 증후군 (IBS), 변비, 위장 폐색, 외과적 실혈, 산후 출혈, 상처 치유, 감염, 유선염, 태반 배출 손상, 골다공증의 치료에서; 그리고, 암 및 태반 기능부전의 진단을 위해 유용하다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 본 발명의 접합체는 자폐증, 불안증 (불안 장애 및 우울증 포함), 편두통, ADHD, 반항 장애, 정신분열증, 정신과 장애, 비만, 수유 손상 병태, 분만 유도 손상, 자궁 이완증 병태, 과다 출혈, 산후 출혈의 치료에서 유용하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 프래더-윌리 증후군의 치료에 유용하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 AgRP 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 쿠싱 증후군, 고코르티솔증, 이소성 ACTH 증후군, 부신피질 질량의 변화, 원발성 색소침착 결절성 부신피질 질환 (PPNAD), 카니 복합증 (CNC), 코르티솔-유도 미네랄로코르티코이드 과잉, 외상후 스트레스 장애와 연관된 병태, 다모증, 얇은 피부, 근육병증, 골다공증, 조직 취약성 증가, 상처 치유 불량, 고혈압, 당뇨병, 낮은 혈청 칼륨, 낮은 호산구 및 림프구감소증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 본 발명의 접합체는 쿠싱 증후군, 고코르티솔증, 이소성 ACTH 증후군, 골다공증의 치료에서 유용하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 FGF23 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, FGF23-관련 질환 예컨대 연령-관련 병태 (근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 뇌 위축, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 폐 기종, 골다공증, 골관절염, 면역 부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 여명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 연령-관련 청력 상실로 이루어진 군으로부터 선택됨), 대사 장애 (제II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택됨), 고인산혈증 (종양성 석회증, 고인산혈증성 골과다증 증후군), 만성 신장 질환, 만성 신부전, 암, 유방암, 및/또는 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 세릴랙신 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 급성 심부전, 만성 박출률 저하 심부전 (HFrEF), 만성 박출률 보존 심부전 (HFpEF), 이완기 기능장애, 심근경색-후 리모델링, 협심증, 고혈압, 폐 고혈압, 폐 동맥 고혈압, 섬유증 (미만성, 심장, 신장, 폐, 간), 피부경화증, 상처 치유, 중증 사지 허혈, 말초 혈관 질환, 간헐적 파행, 신장 기능장애 및 만성 신장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 본 발명의 세릴랙신 접합체는 급성 심부전, 만성 박출률 저하 심부전 (HFrEF), 만성 박출률 보존 심부전 (HFpEF), 이완기 기능장애, 심근경색-후 리모델링, 협심증, 고혈압, 폐 고혈압 또는 폐 동맥 고혈압의 치료에서 유용하다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 PIP 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 예컨대 제2형 당뇨병 (T2DM), 췌장 베타 세포 손상, 글루코스 불내성, 고혈당증, 인슐린 저항성, 비만, 이상지질혈증, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 대사 증후군, 및 기타 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체분자가 NPFF 펩티드인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 비-알콜성 지방간염, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비, 긴박 실금, 진정, 신경병성 및 염증성 통증, 기억 상실, 및 기타 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 당뇨병, 제2형 당뇨병, 비만, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 췌장염, 이상지질혈증, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면이 하기의 본 발명의 상세한 설명에서 설명될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 24가 참조예 3보다 더욱 효과적으로 혈장 APOC3 수준을 감소시켰다는 것을 나타낸다.
상세한 설명
정의:
본 발명을 해석하기 위한 목적으로, 달리 상술되지 않는 한 하기의 정의가 적용될 것이고, 언제든지 적합한 경우에는 단수형으로 사용된 용어가 복수형을 또한 포함할 것이고, 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥적으로 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")가 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "접합체"에 대한 언급은 하나 이상의 접합체에 대한 언급을 포함하고, "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드에 대한 언급을 포함하는 식이다.
알킬이라는 용어는 1 내지 30개의 탄소 원자를 포함하는, 완전히 포화된 분지형 또는 비-분지형 (또는 직쇄 또는 선형) 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 바람직하게는, 알킬은 5 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 10 내지 15개의 탄소 원자를 포함한다. C10 - 15알킬은 10 내지 15개의 탄소를 포함하는 알킬 사슬을 지칭한다. "알킬렌"이라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 2가 알킬을 지칭한다.
"알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합이 있는 분지형 또는 비-분지형 탄화수소를 지칭한다. "C2 -30-알키닐"이라는 용어는 2 내지 7개의 탄소 원자가 있고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 탄화수소를 지칭한다.
"알키닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합이 있는 분지형 또는 비-분지형 탄화수소를 지칭한다. "C2 -30-알키닐"이라는 용어는 2 내지 7개의 탄소 원자가 있고 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 탄화수소를 지칭한다.
아릴이라는 용어는 고리 부분에 6-10개의 탄소 원자가 있는 단환식 또는 이환식 방향족 탄화수소 기를 지칭한다. 아릴의 대표적인 예는 페닐 또는 나프틸이다.
헤테로아릴이라는 용어는 탄소 원자 및 1 내지 5개의 헤테로원자로부터 선택된 5-10개의 고리 구성원을 함유하는 단환식 또는 이환식 헤테로아릴을 포함하고, 각각의 헤테로원자는 O, N 또는 S로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 S 및 N은 다양한 산화 상태로 산화될 수 있다. 이환식 헤테로아릴 시스템의 경우, 시스템은 완전히 방향족이다 (즉, 모든 고리가 방향족이다).
시클로알킬이라는 용어는 포화 또는 불포화이지만 비-방향족인, 3-12개의 탄소 원자, 바람직하게는 3-8개, 또는 3-7개의 탄소 원자의 단환식, 이환식 또는 삼환식 탄화수소 기를 지칭한다. 이환식 및 삼환식 시클로알킬 시스템의 경우, 모든 고리가 비-방향족이다. 예를 들어, 시클로알킬은 시클로알케닐 및 시클로알키닐을 포함한다. "시클로알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합이 있는, 3-12개의 탄소 원자의 이환식 또는 삼환식 탄화수소 기를 지칭한다. "시클로알키닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합이 있는, 3-12개의 탄소 원자의 이환식 또는 삼환식 탄화수소 기를 지칭한다.
헤테로시클릴이라는 용어는 O, S 및 N으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고, 여기서 N 및 S는 다양한 산화 상태로 임의적으로 산화될 수 있는, 포화 또는 불포화이고 비-방향족인 (부분적으로 불포화이지만 비-방향족인) 단환식, 이환식 또는 삼환식 고리 시스템을 지칭한다. 한 실시양태에서, 헤테로시클릴 모이어티는 5-7개의 고리 원자를 함유하고 O, S 또는 N으로부터 선택된 추가적인 헤테로원자를 임의적으로 함유하는 포화 단환식 고리를 나타낸다. 헤테로고리형 고리는 알킬, 할로, 옥소, 알콕시, 할로알킬, 할로알콕시로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 헤테로시클릴은 이환식 또는 삼환식이다. 다환식 시스템의 경우, 일부 고리가 방향족일 수 있고, 포화된 또는 부분적으로 포화된 고리 또는 고리들에 융합될 수 있다. 전체적인 융합 시스템은 완전히 방향족이지 않다. 예를 들어, 헤테로고리형 고리 시스템은 포화된 또는 부분적으로 포화된 시클로알킬 고리 시스템과 융합된 방향족 헤테로아릴일 수 있다.
"접합체"라는 용어는 링커를 통해 생체분자와 지방산 모이어티가 공유결합으로 부착된 결과로서 형성된 실체를 지칭하도록 의도된다. "접합"이라는 용어는 생체분자와 지방산 모이어티가 공유결합으로 부착되는 것을 초래하는 화학 반응을 지칭한다.
생체분자:
본원에서 사용된 바와 같은 생체분자라는 용어는 항체 (예를 들어, 모노클로날, 키메라, 인간화, 나노바디, 및 이의 단편 등), 콜레스테롤, 호르몬, 펩티드, 단백질, 화학요법제 및 기타 유형의 항신생물 작용제, 저분자량 약물, 비타민, 보조인자, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소성 핵산, 안티센스 핵산, 트리플렉스(triplex) 형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA 또는 RNA 조성물, 키메라 DNA:RNA 조성물, 알로자임, 앱타머, 리보자임, 디코이(decoy) 및 이의 유사체, 플라스미드 및 기타 유형의 발현 벡터, 및 소형 핵산 분자, RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산 (siNA), 메신저 리보핵산 (메신저 RNA, mRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 리보뉴클레오티드 (LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), sisiRNA (소형 내부 분절화 간섭 RNA), aiRNA (비대칭 간섭 RNA), 및 관련 세포 및/또는 조직, 예컨대 세포 배양물, 대상체 또는 생물 내의 것에 대한 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 1개, 2개 또는 이를 초과하는 개수의 미스매치가 있는 siRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이같은 화합물은 정제되거나 또는 부분적으로 정제될 수 있고, 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있으며, 화학적으로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 생체분자는 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산 (siNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자이다.
다른 실시양태에서, 생체분자는 폴리펩티드 (또는 단백질), 또는 펩티드이다. 폴리펩티드 또는 펩티드의 예는 APJ 효능제 펩티드, 옥시토신 펩티드, 세릴랙신, NPFF, PIP 펩티드, FGF23 펩티드, AgRP 펩티드 및 GDF15 펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 생체분자는 GDF15 폴리펩티드, 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태이다.
"리보핵산" (RNA)은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드들의 중합체이고, 여기서 각각의 뉴클레오티드는 당 성분으로서 리보스 또는 이의 변형물을 함유한다. 각각의 뉴클레오티드는 염기로서 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 우라실 (U) 또는 이의 변형물을 함유한다. mRNA 분자 내의 유전 정보는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 염기의 서열에서 코딩되고, 이는 각각 3개의 뉴클레오티드 염기로 이루어진 코돈으로 배열된다. 번역 (단백질 합성)을 종결시키는 정지 코돈을 제외하고는, 각각의 코돈은 폴리펩티드의 특정 아미노산을 코딩한다. 살아 있는 세포 내에서, mRNA가 단백질 합성 부위인 리보솜으로 수송되고, 여기에서 단백질 합성 (번역)을 위한 유전 정보를 제공한다. 더 충분한 설명을 위해, 문헌 [Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Science]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "RNAi 작용제", "짧은 간섭 RNA", "siRNA", "짧은 간섭 핵산", "siNA" 등의 용어는 서열-특이적 방식으로 RNA 간섭 (RNAi) 또는 유전자 침묵화를 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스성 복제를 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산 분자, sisiRNA (소형 내부 분절화 간섭 RNA), aiRNA (비대칭 간섭 RNA), 관련 세포 및/또는 조직에 대한 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 1개, 2개 또는 이를 초과하는 개수의 미스매치가 있는 siRNA, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 하나 이상의 미스매치가 있는 RNAi 작용제, 센스 가닥이 안티센스 가닥에 비해 매우 짧고/짧거나 하나 이상의 단일-가닥 틈(nick)이 있는 RNAi 작용제, 또는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 임의의 기타 분자를 포함한다. RNAi 작용제는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 당, 염기 및/또는 포스페이트에서 변형 또는 치환될 수 있다. 비제한적인 예로서, RNAi 작용제가 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 및 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA)로 이루어진 군으로부터 선택된 2'-변형물로 2' 위치에서 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 모든 피리미딘 (우리딘 및 시티딘)이 2'-O-메틸-변형 뉴클레오시드이다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 포스페이트가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포노에이트 및 아미드 링커로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드간 링커로 치환될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 DNA, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산 (TNA), 글리콜 핵산 (GNA), 아라비노스 핵산 (ANA), 2'-플루오로아라비노스 핵산 (FANA), 시클로헥센 핵산 (CeNA), 안히드로헥시톨 핵산 (HNA), 비-잠금(unlocked) 핵산 (UNA)으로 변형 또는 치환될 수 있다. RNAi 작용제의 다양한 변형 및 치환이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. siRNA는 동물 및 식물에서의 서열-특이적 전사-후 유전자 침묵화 프로세스인 RNA 간섭을 담당한다. 침묵화되는 유전자 표적에 대해 상동성이거나 특이적인 더 긴 이중-가닥 RNA (dsRNA)로부터 리보뉴클레아제 III 절단에 의해 siRNA가 천연적으로 생성된다; 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 인공 RNAi 작용제가 생산될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"라는 용어는 천연적으로 생산되었든 합성에 의해 생산되었든, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다. 약 10개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 통상적으로 "펩티드"로 지칭된다. "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산의 서열을 지시하도록 의도되고, 여기서 상기 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 이러한 용어는 공유결합 상호작용, 예를 들어 시스테인 다리, 또는 비-공유결합 상호작용에 의해 함께 보유되는 2개 이상의 펩티드로 이루어질 수 있는 폴리펩티드 및 단백질이라는 용어를 포함한다. 관련 기술 분야에서 인정되는 3-문자 또는 1-문자 약어가 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 잔기를 나타내도록 사용된다. "D"가 선행하는 경우를 제외하고는, 아미노산은 L-아미노산이다. 1-문자 약어가 대문자인 경우, 이는 D-아미노산을 지칭한다. 1-문자 약어가 소문자인 경우, 이는 L-아미노산을 지칭한다. 아미노산 약어의 군 또는 문자열을 사용하여 펩티드를 나타낸다. 펩티드는 N-말단이 왼쪽에 있도록 표시되고, N-말단에서 C-말단으로 서열이 기재된다.
본 발명의 펩티드는 비-천연 아미노산 (즉, 천연에서 발생하지 않는 화합물)을 함유하고, 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 기타 아미노산 유사체가 대안적으로 사용될 수 있다.
특정한 비-천연 아미노산이 문헌 [Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003]; [Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003]; [Wang et al., Science 292:498-500, 2001]; [Zhang et al., Science 303:371-373, 2004] 또는 미국 특허 번호 7,083,970에 기술된 기술에 의해 도입될 수 있다. 간략하게, 이러한 발현 시스템 중 일부는 넌센스 코돈, 예컨대 앰버(amber) TAG를 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 내로 도입하기 위해 부위-지정 돌연변이유발을 수반한다. 그 후, 도입된 넌센스 코돈에 대해 특이적이고 선택된 비-천연 아미노산이 채워진 tRNA를 이용할 수 있는 숙주 내로 이같은 발현 벡터를 도입한다. 본 발명의 폴리펩티드에 모이어티를 접합시키는 목적에 이로운 특정 비-천연 아미노산은 아세틸렌 및 아지도 측쇄가 있는 것을 포함한다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 각각의 이러한 폴리펩티드 사슬이 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산 분자와 접합될 수 있다. 단백질은 비-펩티드성 성분, 예컨대 탄수화물 기를 또한 포함할 수 있다. 단백질이 생산되는 세포에 의해 탄수화물 및 기타 비-펩티드성 치환기가 단백질에 부가될 수 있고, 이는 세포 유형에 따라 다를 것이다. 본원에서 단백질은 이의 아미노산 백본 구조의 관점에서 정의된다: 치환기 예컨대 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드는 "이종성" 단백질 또는 폴리펩티드이다.
"단리된 폴리펩티드 또는 단리된 단백질"은 천연에서 이러한 폴리펩티드와 회합된 세포 성분, 예컨대 탄수화물, 지질, 또는 기타 단백질성 불순물이 본질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들어 GDF15)이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드 또는 단백질의 제제는 폴리펩티드 또는 단백질을 고도로 순수한 형태, 즉, 적어도 약 80％ 순수하거나, 적어도 약 90％ 순수하거나, 적어도 약 95％ 순수하거나, 95％ 초과로 순수한, 예컨대 96％, 97％, 또는 98％ 또는 이를 초과하는 값으로 순수하거나, 또는 99％ 초과로 순수한 형태로 함유한다. 특정 단백질 제제가 단리된 폴리펩티드 또는 단백질을 함유한다는 것을 나타내는 한 가지 방식은 단백질 제제의 소듐 도데실 술페이트 (SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마시 브릴런트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후에 단일 밴드가 나타나는 것에 의한 것이다. 그러나, "단리된"이라는 용어는 동일한 폴리펩티드 또는 단백질이 대안적인 물리적 형태, 예컨대 이량체 또는 대안적으로 글리코실화 또는 유도체화된 형태로 존재하는 것을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 이의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도를 방해할, 이의 천연 환경에서 발견되는 임의의 다른 오염 폴리펩티드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다.
통상의 기술자는 다양한 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드 또는 단백질에서 이의 활성을 반드시 감소시키지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은, "이의 치환기로서 통상적으로 사용되는 아미노산"은 보존적 치환 (즉, 화학적 특성이 유사한 아미노산으로의 치환)을 포함한다. 보존적 치환의 목적을 위해, 비-극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 (친수성), 중성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 글루탐산을 포함한다. 아미노산 치환의 예는 L-아미노산이 이의 상응하는 D-아미노산을 치환하는 것, 시스테인이 호모시스테인 또는 티올-함유 측쇄가 있는 기타 비-천연 아미노산을 치환하는 것, 리신이 호모리신, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 오르니틴 또는 아미노-함유 측쇄가 있는 기타 비-천연 아미노산을 치환하는 것, 또는 알라닌이 노르발린을 치환하는 것 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산"이라는 용어는 천연 발생 아미노산, 천연 발생 아미노산과 비슷한 방식으로 기능하는 비천연 아미노산, 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭하며, 이들 모두는 이의 구조가 D 및 L 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 이같은 입체이성질체로 존재한다. 본원에서 아미노산은 이의 명칭, 통상적으로 공지된 이의 3-문자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회가 권장하는 1-문자 기호에 의해 지칭된다.
"천연 발생"이라는 용어는 천연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않은 물질을 지칭한다. 유사하게, 본원에서 사용된 바와 같은 "비-천연 발생", "비천연" 등은 천연에서 발견되지 않거나 또는 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 지칭한다. 아미노산과 관련되어 사용되는 경우에, "천연 발생"이라는 용어는 20개의 통상적인 아미노산 (즉, 알라닌 (A 또는 Ala), 시스테인 (C 또는 Cys), 아스파르트산 (D 또는 Asp), 글루탐산 (E 또는 Glu), 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 글리신 (G 또는 Gly), 히스티딘 (H 또는 His), 이소류신 (I 또는 Ile), 리신 (K 또는 Lys), 류신 (L 또는 Leu), 메티오닌 (M 또는 Met), 아스파라긴 (N 또는 Asn), 프롤린 (P 또는 Pro), 글루타민 (Q 또는 Gln), 아르기닌 (R 또는 Arg), 세린 (S 또는 Ser), 트레오닌 (T 또는 Thr), 발린 (V 또는 Val), 트립토판 (W 또는 Trp), 및 티로신 (Y 또는 Tyr))을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"이라는 용어는 임의의 생물에서 이와 동일한 또는 동일하지 않은 임의의 생물로부터의 미변형 또는 변형 유전자를 사용하여 생합성에 의해 생성될 수 없는 아미노산 구조를 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어는 천연 발생 (야생형) 단백질 서열 또는 본 발명의 서열에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 지칭한다. 이는 20개의 천연 발생 아미노산 중 하나가 아닌 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체, 셀레노시스테인, 피롤리신 (Pyl), 또는 피롤린-카르복시-리신 (Pcl, 예를 들어, PCT 특허 공보 WO2010/48582에 기술된 바와 같음)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이같은 비-천연 아미노산 잔기는 천연 발생 아미노산의 치환, 및/또는 비-천연 아미노산의 천연 발생 (야생형) 단백질 서열 또는 본 발명의 서열 내로의 삽입에 의해 도입될 수 있다. 원하는 기능성, 예를 들어, 기능성 모이어티 (예를 들어, PEG)를 연결하는 능력을 분자에 부여하도록 비-천연 아미노산 잔기가 도입될 수도 있다. 아미노산과 관련하여 사용되는 경우에, "U" 기호는 본원에서 사용된 바와 같은 "비-천연 아미노산" 및 "비천연 아미노산"을 의미할 것이다.
폴리펩티드 또는 단백질을 지칭하는 본원에서 사용된 바와 같은 "유사체"라는 용어는 펩티드/단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고/되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드/단백질로부터 결실되고/되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드/단백질에 부가된 변형된 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 펩티드의 N-말단 및/또는 펩티드의 C-말단에서 아미노산 잔기의 이같은 부가 또는 결실이 일어날 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "접합체의 에스테르"라는 용어는 카르복실산 기의 에스테르 유도체 형태가 존재하는 (예를 들어, C-말단의 -CO2H가 -COOR로 전환된) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 지칭하고, 식 중 에스테르의 R은 C1-6 알킬 기 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등, C3-8 시클로알킬 기 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등, C6-10 아릴 기 예컨대 페닐, α-나프틸 등, C6-10 아릴-C1-6 알킬 기, 예를 들어 페닐-C1-2 알킬 기 예컨대 벤질, 페네틸, 벤즈히드릴 등, 및 α-나프틸-C1-2 알킬 기 예컨대 α-나프틸메틸 등을 지칭한다. 접합체의 펩티드 또는 폴리펩티드 모이어티가 C 말단 이외의 위치에서 추가적인 카르복실 또는 카르복실레이트 기를 보유하는 경우, 이같은 기가 아미드화 또는 에스테르화된 폴리펩티드 또한 본 발명의 폴리펩티드의 카테고리에 속한다. 이같은 경우에, 예를 들어 에스테르는 상기 언급된 C-말단 에스테르와 동일한 종류의 에스테르일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "접합체의 아미드"라는 용어는 카르복실산 기의 아미드 유도체가 존재하는 (예를 들어, -CO2H가 -CO(NR'R')로 전환된) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 지칭하고, 식 중 R'는 H 또는 R이고, R은 상기에서 정의된다. "접합체의 아미드"라는 용어는 아미노 기 (즉, 지방산에 접합된 아미노 기 이외의 것)의 아미드 유도체가 존재하는 (예를 들어, -NH2가 -NH-C(O)R로 전환된) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 또한 지칭하고, 식 중 R은 상기에서 정의된다. 바람직한 실시양태에서, "접합체의 아미드"는 C-말단의 카르복실산 기가 아미드화된 (예를 들어, -CO2H가 -C(O)NH2, -C(O)NH-C1-6 알킬, -C(O)NH-C1-2알킬페닐, 또는 -C(O)N(C1-6 알킬)2로 전환된) 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 접합체이다.
"APJ" ("아펠린 수용체", "안지오텐신-유사-1 수용체", "안지오텐신 II-유사-1 수용체" 등으로 또한 지칭됨)라는 용어는 7개의 막횡단 도메인이 있는 잔기 380개의 Gi-커플링 수용체를 가리키고, 이의 유전자는 인간에서 11번 염색체의 긴 아암(arm) 상에 국소화된다 (NCBI 참조 서열: NP_005152.1이고, NCBI 참조 서열: NM_005161에 의해 코딩됨). APJ는 1993년에 인간 게놈 DNA로부터 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 최초로 클로닝되었고 (O'Dowd et al. Gene, 136:355-60, 1993), 제1형 안지오텐신 II 수용체와 유의한 상동성을 공유한다. 그러나, 이러한 상동성에도 불구하고, 안지오텐신 II는 APJ에 결합하지 않는다. 수 년 동안 고아였지만, 내인성 리간드가 단리되었고, 아펠린으로 명명되었다 (Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)).
"APJ 효능제"라는 용어는 아펠린 폴리펩티드를 포함한다; 아펠린은 잔기 77개의 전구단백질을 가리키고 (NCBI 참조 서열: NP_0059109.3이고, NCBI 참조 서열: NM_017413.3에 의해 코딩됨), 이는 생물학적으로 활성인 형태의 아펠린 펩티드, 예컨대 아펠린-36, 아펠린-17, 아펠린-16, 아펠린-13, 아펠린-12로 프로세싱된다. "아펠린-36"으로 지칭되는 전장 성숙 펩티드는 36개의 아미노산을 포함하지만, 가장 강력한 아이소형은 "Pyr-1-아펠린-13 또는 Pyr1-아펠린-13"으로 지칭되는, 13량체의 아펠린 (아펠린-13)의 피로글루타메이트화 형태이다. 여러 아펠린 형태가, 예를 들어, 미국 특허 6,492,324B1에 기술되어 있다. 아펠린 펩티드 효능제가 특허 출원 번호 WO 2013/111110, 미국 출원 번호 14/082771, 및 미국 가출원 번호 61/858263, 61/858280 및 61/858290에 또한 기술되어 있고, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
"옥시토신 수용체 효능제 펩티드" 또는 "옥시토신 펩티드"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되고, 옥시토신 및 이의 유사체를 포함한다. 옥시토신은 위치 1과 위치 6 사이에서 디술피드 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기가 있는 아미노산 9개의 고리형 펩티드 호르몬이다. 인간 옥시토신은 Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly 서열을 포함한다. "옥시토신 수용체 효능제 펩티드"라는 용어는 생체활성을 유지하는 옥시토신의 유사체를 또한 포함한다. 이같은 유사체 분자는 옥시토신 수용체에 결합하는 것을 포함하여 내인성 옥시토신과 유사한 방식으로 작용할 수 있다. 특히 흥미로운 옥시토신의 유사체는 PCT 출원 번호 WO 2014/095773 (특히 실시예 13)에 개시된 것; 미국 특허 출원 번호 US2011/044905 (특히 실시예 49)에 개시된 것; 및 문헌 [Kazimierz Wisniewski et al., Journal of Medicinal Chemistry 2014, 57, 5306-5317] 및 [Zbigniew Grzonka et al., Journal of Medicinal Chemistry 1983, 26, 1786-1787]에 개시된 것을 포함하고, 이들은 모두 본원에 참고로 포함된다.
"PIP" 또는 "프로락틴-유도성 펩티드"는 다양한 생물학적 프로세스에서 역할을 나타내는 진뱅크 (GenBank) 등록 번호 NP_002643의 단백질을 의미한다. PIP는 관련 기술 분야에 총체적 낭성 질환 유체 단백질-15 (GCDFP-15); 분비형 액틴-결합 단백질 (SABP); 보조이하선(extraparotid) 당단백질 (EP-GP); 및 17-kDa CD4-결합 단백질 (GP17)로 또한 공지되어 있다. PIP는 외분비 장기, 및 양성 및 악성 인간 유방 종양에서 발현된다. 분비된 성숙 PIP 단백질은 분자 질량이 13 kDa이고, SDS-PAGE에서 17-20 kDa 폴리펩티드로 러닝되어, 글리코실화 이벤트를 시사한다. PIP는 인간 체액에 기여하는 대부분의 장기에 발현된다; PIP 발현은 타액선에서 최고이고, 누선, 전립선, 근육, 기관 및 유선이 뒤를 잇는다. PIP 유전자가 PIP 폴리펩티드를 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "PIP 펩티드"는 인간 PIP, 또는 인간 PIP의 적어도 하나의 활성을 유지하는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태를 의미한다.
인간 PIP의 비제한적인 예의 서열이 서열식별번호(SEQ ID NO): 11에서 제시된다:
Figure pct00002
서열식별번호: 11은 기능에 요구되지 않는 신호 펩티드 (아미노산 1-28)를 포함하는, 전장 인간 야생형 PIP를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 "PIP"이라는 용어의 또 다른 비제한적인 예는 서열식별번호: 11의 아미노산 (aa) 29-146 이고, 이는 따라서 신호 펩티드 (아미노산 1-28)가 없고, 서열식별번호: 12로서 하기에서 제시된다.
Figure pct00003
PIP의 "상동체", "변이체", "단편" 또는 "변형 형태" 등은 인간 PIP와 유사하지만 동일하지 않은, 그러나 인간 PIP의 적어도 하나의 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 이같은 폴리펩티드는 인간 PIP의 것 (예를 들어, 서열식별번호: 12)과 동일하지 않은 서열을 가질 수 있거나, 또는 인간 PIP의 것 (예를 들어, 서열식별번호: 12)과 동일한 서열을 갖지만, 일부 다른 방식 (예를 들어, 번역-후 변형)으로 다를 수 있다. 이같은 폴리펩티드는 서열식별번호: 12에 대해, 예를 들어, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％ 또는 적어도 95％의 서열 동일성을 포함할 수 있거나, 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열로부터, 예를 들어, 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 차이 (예를 들어, 치환, 결실 및/또는 부가)가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, PIP 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태는 서열식별번호: 12로부터 적어도 90％의 서열 동일성을 유지하거나 또는 최대 25개의 아미노산 차이가 있다. PIP 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태는 인간 PIP의 적어도 하나의 활성을 유지한다.
"FGF23" 또는 "섬유모세포 성장 인자 23"은 FGF-23, ADHR; FGFN; HPDR2; HYPF; PHPTC로 또한 공지된 폴리펩티드를 의미한다; 외부 ID: OMIM: 605380 MGI: 1891427 호몰로진(HomoloGene): 10771 진카드(GeneCards): FGF23 유전자; 종: 인간; 엔트레즈(Entrez) 8074; 앙상블(Ensembl) ENSG00000118972; 유니프롯(UniProt): Q9GZV9; RefSeq (mRNA): NM_020638; RefSeq (단백질): NP_065689; 위치 (UCSC): 12번 염색체: 4.48 - 4.49 Mb; 종: 마우스; 엔트레즈: 64654; 앙상블: ENSMUSG00000000182; 유니프롯: Q9EPC2; RefSeq (mRNA): NM_022657; RefSeq (단백질): NP_073148; 위치 (UCSC): 6번 염색체: 127.07 - 127.08 Mb. FGF23 유전자가 FGF23 폴리펩티드를 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "FGF23 펩티드"는 인간 FGF23, 또는 인간 FGF23의 적어도 하나의 활성을 유지하는 이의 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태를 의미한다.
신호 펩티드를 포함하는 인간 FGF23의 비제한적인 예의 서열이 서열식별번호: 9에서 제시된다:
Figure pct00004
서열식별번호: 9는 기능에 요구되지 않는 신호 펩티드 (아미노산 1-24)를 포함하는, 전장 인간 야생형 FGF23를 나타낸다. 문헌 [Yamashita et al. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498]; [Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500-6505]; 및 [Zhang et al. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824].
본원에서 사용된 바와 같은 "FGF23"이라는 용어의 비제한적인 예는 서열식별번호: 9의 아미노산 (aa) 25-251이고, 이는 따라서 신호 펩티드 (아미노산 1-24)가 없고, 서열식별번호: 8로서 하기에서 제시된다.
Figure pct00005
FGF23의 "상동체", "변이체", "단편" 또는 "변형 형태" 등은 인간 FGF23 (예를 들어, 서열식별번호: 8)과 유사하지만 동일하지 않은, 그러나 인간 FGF23의 적어도 하나의 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 이같은 폴리펩티드는 서열식별번호: 8에 대해, 예를 들어, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％ 또는 적어도 95％의 서열 동일성을 포함할 수 있거나, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열로부터, 예를 들어, 최대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 차이 (예를 들어, 치환, 결실 및/또는 부가)가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, FGF23 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태는 서열식별번호: 8로부터 적어도 90％의 서열 동일성을 유지하거나 또는 최대 25개의 아미노산 차이가 있다. FGF23 상동체, 변이체, 단편 또는 변형 형태는 인간 FGF23의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 이같은 활성 (또는 기능)은, 비제한적인 예로서, FGF23 수용체에 결합하는 것, 클로토(Klotho) 단백질과 상호작용하는 것, 세포 증식, 및 세포 신호전달에서의 역할; 및 Egr-1-루시페라제 검정법을 포함하는 FGF23 활성의 다양한 시험관내 검정법에서의 활성; 및 FGF23-관련 질환 예컨대 연령-관련 병태 (근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 뇌 위축, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 폐 기종, 골다공증, 골관절염, 면역 부전, 고혈압, 치매, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 전립선암, 뇌졸중, 여명 감소, 기억 상실, 주름, 신장 기능 손상, 및 연령-관련 청력 상실로 이루어진 군으로부터 선택됨), 대사 장애 (제II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증, 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택됨), 고인산혈증 (종양성 석회증, 고인산혈증성 골과다증 증후군), 만성 신장 질환, 만성 신부전, 암, 유방암, 및/또는 근육 위축과 관련된 활성을 포함하여, 인간 FGF23에 대해 공지된 것들을 포함한다. 문헌 [Yamashita et al. 2000 Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498]; [Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500-6505]; [Urakawa et al. 2006 Nature 444: 770-774]; [Zhang et al. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824]; WO 2013/027191, WO 2011/092234 및 WO 2009/095372. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 지방산 및 FGF23 펩티드를 포함하고, 여기서 FGF23 펩티드가 FGF23의 적어도 하나의 활성을 유지하는 접합체를 제공하고; 일부 실시양태에서, 유지된 FGF23 활성은 시험관내 Egr-1-루시페라제 검정법에서의 활성이다.
FGF23의 "상동체"는 인간 FGF23에 상응하지만, 상이한 공급원, 예컨대 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 사이노몰구스 원숭이, 소, 돼지, 양, 말, 개 등으로부터의 것인, 그러나 인간 FGF23의 적어도 하나의 기능을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다.
FGF23의 "변이체"는, 예를 들어 서열식별번호: 8에 비해, 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 결실, 치환 또는 부가)를 포함하지만, 인간 FGF23의 적어도 하나의 기능을 유지하는 FGF23을 의미한다. FGF23에서의 돌연변이는 위치 Y154, Q156, R176, R179, C206 및 C244에서의 것을 포함한다. 이같은 돌연변이는 기존에 기술되었다. R179에서의 돌연변이는 FGF23에 단백질분해 저항성을 부여한다; ADHR에서, 176RXXR179 부위의 돌연변이는 FGF23의 절단 및 불활성화를 방지한다. 문헌 [White et al. 2000 Nat. Genet. 26: 345-348]; [Liu et al. 2003 J. Biol. Chem. 278: 37419-37426]. Y154에서의 돌연변이는 분해를 감소시키고; Q156에서의 돌연변이는 절단 부위를 제거하며; C206 및 C244에서의 돌연변이는 이량체화 및 응집을 감소시킨다. WO 2013/027191 및 WO 2011/092234. FGF23 상동체, 변이체, 또는 변형 형태는 하나 이상의 추가적인 아미노산 (일반적으로는 야생형 인간 FGF23에서 발견되지 않음)을 추가로 포함할 수 있다.
FGF23 변이체의 비제한적인 예가 여기서 제시된다:
Figure pct00006
서열식별번호: 10은 신호 펩티드 (aa 1-24)가 결실되었지만, 위치 1의 최초의 M이 재도입되었고, R179에 상응하는 아미노산이 Q로 돌연변이된 FGF23 변이체를 나타낸다. 서열식별번호: 10은 "hFGF23 R 179Q", "FGF23 R179", "hFGF23(R179Q)" 등으로 또한 지정되고, 실시예 28C에서 사용된 FGF23 변이체를 나타낸다.
추가적인 FGF23 변이체는, 비제한적인 예로서, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖지만, 또한 Y154, Q156, R176, R179, C206 및 C244 중 하나 이상에서 돌연변이가 있는 것을 포함한다. 추가적인 FGF23 변이체는, 비제한적인 예로서, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖지만, 또한 Y154, Q156, R176, R179, C206 및 C244 중 하나 이상에서 돌연변이가 있고, 하나 이상의 추가적인 아미노산 (일반적으로는 야생형 인간 FGF23에서 발견되지 않음)을 추가로 포함하는 것을 포함한다.
FGF23의 "단편"은, 예를 들어 서열식별번호: 8에 비해, 하나 이상의 결실된 아미노산을 포함하지만, 인간 FGF23의 적어도 하나의 기능을 유지하는 FGF23을 의미한다. FGF23의 기능성 단편은 서열식별번호: 8의 아미노산 180-251을 포함한다 (Goetz et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 407-412). FGF23 단편은 또한, 예를 들어 위치 Y154, Q156, R176, R179, C206 및 C244 중 임의의 하나 이상에서, 하나 이상의 돌연변이가 있을 수 있지만, 인간 FGF23의 적어도 하나의 기능을 유지할 수 있다.
FGF23의 "변형 형태"는 FGF23, 예를 들어, 서열식별번호: 8의 것과 유사하거나 동일한 서열을 포함하지만, 하나 이상의 변형이 있고, 인간 FGF23의 적어도 하나의 기능을 유지하는 FGF23을 의미한다. 이같은 변형은, 비제한적인 예로서, 번역-후 변형 (인산화, 메틸화, 또는 탄수화물 부가), 또는 FGF23이 아닌 제2 모이어티에 접합되는 것을 포함할 수 있다. 이같은 제2 모이어티는, 비제한적인 예로서, 신호 펩티드, 알파 또는 베타 클로토 또는 이의 단편 (예를 들어, 가용성 클로토 또는 s클로토), Fc (예를 들어, FcLALA), 또는 기타 변형일 수 있다. WO 2011/092234 및 WO 2009/095372.
본원에서 사용된 바와 같은, "AgRP 펩티드 또는 폴리펩티드"라는 용어 및 유사 용어는 아구티(Agouti)-관련 펩티드, 즉, 아미노산 132개로 구성된 신호전달 분자를 지칭하고, 이는 번역 후에 이의 활성 또는 성숙 형태인 AgRP (83-132) (10개의 시스테인 잔기를 함유하고 5개의 디술피드 결합의 네트워크를 형성함)로 프로세싱된다. AgRP는 멜라노코르틴 수용체 MC3R 및 MC4R의 역전 효능제 역할을 한다. 모든 경우의 "AgRP 펩티드"라는 용어는 이의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, AgRP는 아미드 형태일 수 있고, 예를 들어, C-말단 -CO2H가 아미드화되어 C(O)-NH2를 형성한다. 다른 실시양태에서, AgRP는 산 형태일 수 있다.
"AgRP 펩티드"라는 용어는 AgRP의 더욱 짧은 생물학적으로 활성인 단편을 또한 포함한다. 단편은 서열 면에서 동일하지만, 모 서열보다 길이가 더 짧고, 생물학적 활성 (즉, 역전 효능작용)을 유지하는 모 서열의 일부분이다. AgRP 폴리펩티드의 단편, 뿐만 아니라 이의 변이체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Jackson, P. J. et al., Biochemistry 41, 7565-7572]에 또한 기술되어 있다. 예를 들어 AgRP (87-120) 및 AgRP(87-132)는 AgRP(83-132)와 대략적으로 동일한 MC3R 및 MC4R 친화력을 보유하고, 등가의 역전 효능작용을 나타낸다. AgRP 폴리펩티드의 추가적인 단편이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Christine G. Joseph et al., Peptides 24 (2003), 263-270]에 기술되어 있다. 단편의 예는 AgRP(86-132) 및 단환식 AgRP (109-118), 뿐만 아니라 N- 및/또는 C-말단에서의 이의 신장물이다.
"AgRP 폴리펩티드"라는 용어는 천연 발생 AgRP 폴리펩티드 서열이 변형된 AgRP 폴리펩티드인 "AgRP 돌연변이체 폴리펩티드"를 또한 포함한다. 이같은 변형이 본원에 참고로 포함된 PCT 출원 번호 WO2013/006656에 기술되어 있다.
"GDF15 펩티드", "GDF15 폴리펩티드" 및 "GDF15 단백질"이라는 용어는 상호교환가능하게 사용되고, 포유동물, 예컨대 인간 또는 마우스에서 발현되는 천연-발생 야생형 폴리펩티드를 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "GDF15 단백질"이라는 용어는 아미노산 29개의 신호 펩티드 (아미노산 1-29), 아미노산 167개의 프로-도메인 (아미노산 30-196), 및 아미노산 112개의 성숙 도메인 (아미노산 197-308) (퓨린(furin)-유사 프로테아제에 의해 프로-도메인으로부터 절단됨)을 함유하는 아미노산 잔기 308개로 이루어진 임의의 전장 GDF15 폴리펩티드 (NCI Ref. Seq. NP_004855.2)를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 아미노산 308개의 GDF15 폴리펩티드는 "전장" GDF15 폴리펩티드로 지칭된다; 아미노산 112개의 GDF15 폴리펩티드 (예를 들어 아미노산 197-308)는 "성숙" GDF15 폴리펩티드이다. 성숙 GDF15 펩티드는 TGF~ 수퍼패밀리 구성원에 전형적인 시스테인 노트(knot) 모티프 (3개의 사슬내 디술피드 결합이 있음) 및 1개의 사슬간 디술피드 결합의 형성에 요구되는 7개의 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. 성숙 GDF15 펩티드는 제4의 사슬내 디술피드 결합을 형성하는 2개의 추가적인 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, 생물학적으로 활성인 GDF15는 1개의 사슬간 디술피드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 성숙 펩티드의 동종이량체이다. 따라서 GDF15 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질의 다량체, 더욱 특히 이량체를 또한 포함한다. 동종이량체 GDF15를 구성하는 각각의 단량체 단위가 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "GDF15" 또는 "GDF15 단백질"은 인간 GDF15, 또는 인간 GDF15의 적어도 하나의 활성을 유지하는 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 변형 형태를 또한 의미한다.
"GDF15 돌연변이체 폴리펩티드" 또는 "GDF15 변이체 폴리펩티드"라는 용어는 천연 발생 GDF15 폴리펩티드 서열이 변형된 GDF15 폴리펩티드를 포함한다. 이같은 변형은 비-천연 발생 아미노산, 비-천연 발생 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체로의 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 측면에서, "GDF15 돌연변이체 단백질" 또는 "GDF15 변이체 폴리펩티드"라는 용어는 천연 GDF15 폴리펩티드의 소정의 위치에서 일반적으로 발견되는 적어도 하나의 잔기가 결실되거나 또는 천연 GDF15 서열에서 이러한 위치에서 일반적으로는 발견되지 않는 잔기로 교체된 GDF15 단백질 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 천연 GDF15 폴리펩티드의 소정의 위치에서 일반적으로 발견되는 단일 잔기를 이러한 위치에서 일반적으로는 발견되지 않는 1개를 초과하는 잔기로 교체하는 것이 바람직할 수 있다; 또 다른 경우에, 천연 GDF15 폴리펩티드 서열을 유지하고, 단백질 내의 소정의 위치에서 하나 이상의 잔기를 삽입하는 것이 바람직할 수 있다; 또 다른 경우에, 소정의 잔기를 완전히 제거하는 것이 바람직할 수 있다; 이러한 구축물 모두가 "GDF 15 돌연변이체 단백질" 또는 "GDF15 변이체 단백질"이라는 용어에 포함된다. 본 발명의 한 측면에서, GDF15 돌연변이체 단백질 또는 "GDF15 변이체 단백질"은 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 7 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 갖는다. 본 발명은 이같은 GDF15 돌연변이체 폴리펩티드 서열 또는 GDF15 변이체 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 분자를 또한 포함한다.
GDF15의 "상동체", "변이체", "단편" 또는 "변형 형태" 등은 인간 GDF15와 유사하지만 동일하지 않은, 그러나 인간 GDF15의 적어도 하나의 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다.
GDF15의 "변형 형태"는 GDF15의 서열과 유사하거나 동일한 서열을 포함하지만, 하나 이상의 변형이 있고, 인간 GDF15의 적어도 하나의 활성을 유지하는 GDF15를 의미한다. 이같은 변형은, 비제한적인 예로서, 번역-후 변형 (인산화, 메틸화, 또는 탄수화물 부가)을 포함할 수 있다.
GDF15의 "상동체"는 인간 GDF15에 상응하지만, 상이한 공급원, 예컨대 포유동물, 예컨대 사이노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트 등으로부터의 것인, 그러나 인간 GDF15의 적어도 하나의 기능을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 경우에, GDF15 상동체는 대상체와 동일한 종으로부터 유래된 GDF15 돌연변이체 폴리펩티드의 성숙 형태로 대상체에서 대사 장애를 치료하거나 호전시키는데 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, GDF15 폴리펩티드, 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 변형 형태는 천연-발생 GDF15 단백질과 적어도 약 85 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, GDF15 폴리펩티드는 천연-발생 GDF15 폴리펩티드 아미노산 서열과 적어도 약 90 퍼센트, 또는 약 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이같은 GDF15 폴리펩티드, 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 변형 형태는 야생형 GDF15 돌연변이체 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성, 예컨대 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추는 능력; 체중을 감소시키는 능력; 또는 글루코스 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선하는 능력을 보유한다.
다양한 각각의 실시양태에서, GDF15 폴리펩티드, 또는 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 변형 형태는 생물학적 활성이 천연 발생 형태의 성숙 GDF15 단백질의 것과 등가이거나, 이보다 크거나 또는 이보다 적다. 생물학적 활성의 예는 혈액 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추는 능력; 체중을 감소시키는 능력; 또는 글루코스 내성, 지질 내성, 또는 인슐린 감수성을 개선하는 능력; 소변 글루코스 및 단백질 배설을 낮추는 능력을 포함한다.
폴리펩티드 또는 단백질의 구조의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같은 "N-말단" (또는 "아미노 말단") 및 "C-말단" (또는 "카르복실 말단")이라는 용어는 각각 폴리펩티드의 맨 끝의 아미노 및 카르복실 끝부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료 폴리펩티드" 또는 "치료 단백질"이라는 용어는 치료 용도를 위해 개발 중이거나 또는 치료 용도를 위해 개발된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다.
링커는 생체분자와 지방산 모이어티를 분리한다. 이는 주로 스페이서로서의 역할을 하기 때문에, 이의 화학 구조는 중요하지 않다.
링커는 2개의 반응기/관능기를 함유하는 화학적 모이어티이고, 그 중 하나는 생체분자와 반응할 수 있고, 다른 하나는 지방산 모이어티와 반응할 수 있다. 링커의 2개의 반응기/관능기는 연결 모이어티 또는 스페이서를 통해 연결되고, 연결 모이어티 또는 스페이서의 구조는 링커가 생체분자 및 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산 모이어티에 커플링되는 것을 방해하지 않는 한 중요하지 않다.
링커는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산들로 구성될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되고, 여기서 아미노산은 20개의 천연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 1 내지 20개의 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인 및 리신 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 입체적으로 방해되지 않은 다수의 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리글리신, 폴리알라닌, 글리신 및 알라닌의 조합물 (예컨대 폴리(Gly-Ala)), 또는 글리신 및 세린의 조합물 (예컨대 폴리(Gly-Ser))이다. 일부 실시양태에서, 링커는 히스티딘, 알라닌, 메티오닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 선택된 다수의 아미노산으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리-히스티딘 모이어티를 함유한다.
일부 실시양태에서, 링커는 비천연 아미노산으로부터 선택된 1 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 아미노산 잔기 1-10개의 링커가 지방산 모이어티와의 접합에 바람직하지만, 본 발명은 임의의 길이 또는 조성의 링커를 고려한다. 비-천연 아미노산 링커의 예는 하기 화학식
Figure pct00007
의 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 또는 이의 반복 단위이다.
본원에 기술된 링커는 예시적이고, 훨씬 더 길고 다른 잔기를 포함하는 링커가 본 발명에 의해 고려된다. 비-펩티드 링커 또한 본 발명에 의해 고려된다.
다른 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 알킬 기, 알케닐 기, 시클로알킬 기, 아릴 기, 헤테로아릴 기, 헤테로고리형 기, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이의 조합을 포함하고, 각각의 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 천연 또는 비천연 아미노산은 임의적으로 조합되고, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- 또는 =NH-N(알킬)-로부터 선택된 화학 기를 통해, 함께 연결되거나 또는 생체분자 및/또는 지방산 모이어티에 연결된다.
알킬 스페이서를 함유하는 링커, 예를 들어, -NH-(CH2)z-C(O)- 또는 -S-(CH2)z-C(O)- 또는 -O-(CH2)z-C(O)-, -NH-(CH2)z-NH-, -O-C(O)-(CH2)z-C(O)-O-, -C(O)-(CH2)z-O-, -NHC(O)-(CH2)z-C(O)-NH- 등 [식 중, z는 2-20이다]이 사용될 수 있다. 이러한 알킬 링커는 저급 알킬 (예를 들어, C1-C6), 저급 아실, 할로겐 (예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 또는 페닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 입체적으로 방해하지 않는 임의의 기로 추가로 치환될 수 있다.
링커는 중합체성 속성의 것일 수도 있다. 링커는 생체안정적이거나 생체분해성인 중합체 사슬 또는 단위를 포함할 수 있다. 반복 연결이 있는 중합체는 결합 불안정성에 따라 생리학적 조건 하에 안정성 정도가 다양할 수 있다. 중합체는 폴리카르보네이트 (-O-C(O)-O-), 폴리에스테르 (-C(O)-O-), 폴리우레탄 (-NH-C(O)-O-), 폴리아미드 (-C(O)-NH-)와 같은 결합을 함유할 수 있다. 이러한 결합은 예로서 제공되고, 본 발명의 중합체 사슬 또는 링커에서 사용될 수 있는 결합의 유형을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 적절한 중합체는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴산 아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌글리콜 및 이의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르 등 및 이의 혼합물을 포함한다. 중합체 링커는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG 링커는 선형 또는 분지형일 수 있다. 본 발명에서의 PEG 링커의 분자량은 임의의 특정 크기로 제한되지 않지만, 특정 실시양태에서 분자량은 100 내지 5000 돌턴 예를 들어 500 내지 1500 돌턴이다.
링커는 펩티드 또는 폴리펩티드/단백질의 아미노 기와 지방산 모이어티 상의 관능기/반응기 (예를 들어, 화학식 A1, A2 및 A3의 지방산 모이어티의 카르복실산 관능기) 사이의 다리를 형성하는 적합한 관능성-반응성 기를 양쪽 말단에 함유한다.
링커는 상이한 성질의 여러 연결 모이어티 (또는 스페이서) (예를 들어, 아미노산, 헤테로시클릴 모이어티, PEG 및/또는 알킬 모이어티의 조합)를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 연결 모이어티는 펩티드 또는 폴리펩티드/단백질의 아미노 기와 상이한 성질의 다음 연결 모이어티 사이의 다리를 형성하는 적합한 관능성-반응성 기를 양쪽 말단에 함유하고/하거나, 상이한 성질의 이전 연결 모이어티와 지방산 모이어티 사이의 다리를 형성하는 적합한 관능성-반응성 기를 함유한다.
변형된 펩티드 또는 폴리펩티드 및/또는 펩티드-폴리펩티드의 부분적 구축물 (즉, 부분적 링커에 부착된 펩티드/폴리펩티드)은 지방산 모이어티 (또는 변형된 지방산 모이어티: 즉, 이미 부분적 링커에 부착됨) 상의 이용가능한 반응성 관능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 반응기를 포함한다. 반응기는 공유결합을 형성할 수 있는 화학 기이다. 하나의 접합 부위에 반응기가 위치하고, 이는 일반적으로 카르복시, 포스포릴, 아실 기, 에스테르 또는 혼합 무수물, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드, 테트라진, 알킨, 이미데이트, 피리딘-2-일디술파닐일 수 있으며, 이에 의해 또 다른 접합 부위의 관능기 예컨대 아미노 기, 히드록실 기, 알켄 기, 히드라진 기, 히드록실아민 기, 아지드 기 또는 티올 기와 공유결합을 형성할 수 있다.
생체분자 또는 변형된 생체분자를 링커에 접합시키고/시키거나 링커를 지방산 모이어티에 접합시키고/시키거나 상이한 성질의 다양한 연결 모이어티들을 함께 접합시키기 위한 특히 흥미로운 반응성 기는 N-히드록시숙신이미드, 알킨 (더욱 특히 시클로옥틴)이다.
관능기는 하기를 포함한다: 1. 말레이미드, 토실 술폰 또는 피리딘-2-일디술파닐과 반응하기 위한 티올 기; 2. 카르복실산 또는 활성화된 카르복실산 (예를 들어, N-히드록시숙신아미드 화학을 통한 아미드 결합 형성), 포스포릴 기, 아실 기 또는 혼합 무수물에 결합하기 위한 아미노 기 (예를 들어, 아미노산의 아미노 관능기); 3. 말단 알킨, 더욱 특히 시클로옥틴과의 후이스겐(Huisgen) 고리화부가 (더욱 통상적으로 클릭(click) 화학으로 공지됨)를 진행하기 위한 아지드; 4. 히드록실아민 또는 히드라진과 반응하여 각각 옥심 또는 히드라진을 형성하기 위한 카르보닐 기; 5. 아자 [4+2] 부가에서 테트라진과 반응하기 위한 알켄, 더욱 특히 스트레인(strained) 알켄. 링커 및 관능기/반응기의 여러 예가 본원에서 기술되지만, 본 발명은 임의의 길이 및 조성의 링커를 고려한다.
실시양태
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에서 기술된다. 각각의 실시양태에서 상술된 특색이 다른 상술된 특색과 조합되어 추가 실시양태를 제공할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
실시양태 1에서, 본 발명은 링커를 통해 하기 화학식 A1, A2 또는 A3
Figure pct00008
[R1은 CO2H, H이고;
R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 H, OH, CO2H, -CH=CH2 또는 -C≡CH이고;
Ak는 분지형 C6-C30알킬렌이고;
n, m 및 p는 서로 독립적으로 6 내지 30의 정수이다]을 갖는 지방산 모이어티에 연결된 생체분자를 포함하는 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
실시양태 1의 추가 측면에서, 실시양태 1에 따른 접합체는 상기 기술된 바와 같은 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산을 추가로 포함할 수 있다. 생체분자에 대한 지방산의 선택적 접합을 달성하는 것 및/또는 단일 접합을 달성하는 것의 어려움을 고려하여, 본 발명의 접합체는 하나 이상의 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산 모이어티에 연결된 생체분자를 포함할 수 있다. 추가적으로, 일부 단백질의 다량체성 성질을 고려하여, 다량체성 단백질을 구성하는 각각의 단량체 단위가 지방산 모이어티에 연결될 수 있지만, 단량체 단위 중 적어도 하나가 지방산 모이어티에 연결되는 한, 모든 단량체 단위가 반드시 지방산 모이어티에 연결되어야 하는 것은 아니다. 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 접합체의 혼합물에 관한 것이다. 예를 들어, 혼합물은 화학식 A1, A2 또는 A3의 하나의 지방산 모이어티에 연결된 생체분자, 예를 들어 다량체성 생체분자, 예를 들어 이량체성 생체분자, 및 화학식 A1, A2 또는 A3의 하나를 초과하는 지방산 모이어티에 연결된 생체분자, 예를 들어 다량체성 생체분자, 예를 들어 이량체성 생체분자를 포함할 수 있다. 하기의 본 발명의 예는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 지방산의 선택적 또는 비-선택적 다중접합의 이러한 측면을 추가로 강조한다.
실시양태 1A에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 화학식 A1인 실시양태 1에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, 접합체는 n 및 m이 독립적으로 8 내지 20, 바람직하게는 10 내지 16인 화학식 A1의 지방산 모이어티를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 화학식 A1이고 R2 및 R3 중 적어도 하나가 CO2H인 실시양태 1 또는 1A에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 2에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 하기 화학식
Figure pct00009
[식 중, Ak3, Ak4, Ak5, Ak6 및 Ak7은 독립적으로 (C8- 20)알킬렌이고, R5 및 R6은 독립적으로 (C8- 20)알킬이다]으로부터 선택되는 실시양태 1 또는 1A에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 3에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 하기 화학식
Figure pct00010
으로부터 선택되는 실시양태 1, 1A 또는 2에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 3A에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 하기 화학식
Figure pct00011
으로부터 선택되는 실시양태 1, 1A 또는 2에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 3B에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 화학식 A2 또는 A3인 실시양태 1에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, 접합체는 p가 8 내지 20인 화학식 A2의 지방산 모이어티 또는 Ak가 C8- 20알킬렌인 화학식 A3의 지방산 모이어티를 포함한다.
실시양태 3C에서, 본 발명은 지방산 모이어티가 하기 화학식
Figure pct00012
[식 중, Ak2는 C8- 20알킬렌이다]으로부터 선택되는 실시양태 1 또는 3B에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 4에서, 본 발명은 링커가 하나 이상의 알킬 기, 알케닐 기, 시클로알킬 기, 아릴 기, 헤테로아릴 기, 헤테로고리형 기, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이의 조합물을 포함하고, 각각의 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 천연 또는 비천연 아미노산이 임의적으로 조합되고, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- 또는 =NH-N(알킬)-로부터 선택된 화학 기를 통해 함께 연결되거나 또는 생체분자 및/또는 지방산 모이어티에 연결되는, 이전 실시양태 중 임의의 것에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 5에서, 본 발명은 링커가 화학식
Figure pct00013
[식 중, y는 0 내지 34이다]의 비-분지형 올리고 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는, 이전 실시양태 중 임의의 것에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 6에서, 본 발명은 링커가 하기 화학식
Figure pct00014
Figure pct00015
으로부터 선택된 헤테로고리형 모이어티를 포함하는 (또는 추가로 포함하는), 이전 실시양태 중 임의의 것에 따른 접합체에 관한 것이다.
이같은 헤테로시클릴 함유 링커는 예를 들어 아지드-알킨 후이스겐 고리화부가 (더욱 통상적으로 클릭 화학으로 공지됨)에 의해 수득된다. 더욱 특히, 상기 도시된 헤테로시클릴 중 일부는 시클로알킨과 아지드-함유 모이어티의 반응으로부터 초래된다.
시클로알킨은 시판원으로부터 쉽게 입수가능하고, 따라서 아지드 관능기를 함유하는 모이어티 (예를 들어, 말단 아지드 관능기를 함유하는 링커)와의 고리화부가를 통해 관능화될 수 있다. 단백질 표지화에서 고리형 알킨 클릭 화학을 사용하는 예가 본원에 참고로 포함된 미국 2009/0068738에 기술되어 있다.
후이스겐 고리화부가에서 사용될 수 있는 시클로알킨 작용제의 비제한적인 예는 하기와 같다:
Figure pct00016
Figure pct00017
실시양태 6A에서, 본 발명은 링커가 하기 화학식
Figure pct00018
[식 중, r은 0 내지 2의 정수이고, s는 0 내지 3의 정수이다]으로부터 선택된 헤테로시클릴을 포함하는 (또는 추가로 포함하는), 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
이같은 헤테로고리형 링커는 알켄, 바람직하게는 스트레인 알켄 예컨대 시클로알칸과 하기 모이어티
Figure pct00019
[식 중, Rf는 예를 들어 -CH2NH2, -OH, -CH2-CO2H, -S-CH2-CO2H, -(O-CH2)4-6-C(O)-OH 또는
Figure pct00020
이다]의 아자 [4+2] 고리화부가를 통해 수득될 수 있다.
이같은 테트라진 모이어티는 시판원으로부터 쉽게 입수가능하고, 알켄-함유 모이어티, 예를 들어, 말단 알켄 관능기를 함유하는 링커와 반응될 수 있다.
실시양태 6B에서, 본 발명은 링커가 화학식
Figure pct00021
의 헤테로시클릴을 포함하는 (또는 추가로 포함하는), 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
이같은 헤테로고리형 모이어티는 말레이미드를 티올 함유 모이어티, 예컨대 말단 티올 관능기를 함유하는 링커와 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
쉽게 입수가능하고/하거나 시판되는 이러한 시약들이 직접적으로 또는 상기 기술된 바와 같은 링커를 통해 관심 펩티드 또는 폴리펩티드에 부착된다. 알킨, 말레이미드 또는 테트라진 반응기가 지방산 모이어티 상에 또는 링커-지방산 구축물 (예를 들어, PEG-지방산 구축물) 상에 존재하는 관능기 (각각 아지드, 티올 및 알켄)과 반응된다.
실시양태 7에서, 본 발명은 링커가 히스티딘, 메티오닌, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 또는 추가로 포함하는, 이전 실시양태 중 임의의 것에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 한 특정 측면에서, 링커는 히스티딘, 알라닌 및 메티오닌으로부터 선택된 1 내지 6개의 아미노산을 포함한다.
실시양태 8에서, 본 발명은 생체분자가 펩티드 또는 폴리펩티드인 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 실시양태 8의 한 특정 측면에서, 본 발명은 펩티드 또는 폴리펩티드가 1) 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태; 2) APJ 효능제 펩티드, 3) 옥시토신 수용체 효능제 펩티드, 4) 세릴랙신, 5) NPFF, 6) PIP 펩티드, 7) FGF23 펩티드, 8) AgRP 펩티드 또는 9) siRNA인 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 8A에서, 본 발명은 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태; 또는 이의 이량체인 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 생체분자는 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15) 돌연변이체 또는 변이체이다. 바람직한 실시양태에서, 생체분자는 GDF15 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체의 이량체이다. GDF15 폴리펩티드 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 동종이량체 성질을 고려하여, 동종이량체를 구성하는 2개의 폴리펩티드 사슬 각각 (즉, 각각의 단량체 단위)이 링커를 통해 화학식 A1, A2 또는 A3의 지방산 분자에 연결될 수 있다. 따라서, GDF15 동종이량체가 링커를 통해 1개 또는 2개의 지방산에 연결될 수 있다. 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된 GDF15의 구조는
Figure pct00022
[식 중, FA는 지방산 모이어티를 나타내고, L은 링커를 나타내며, GDF15 단량체 단위 1 및 단량체 단위 2 양쪽 모두가 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]; 또는
Figure pct00023
[식 중, FA는 지방산 모이어티이고, L은 링커이며, 단량체 단위 중 하나만 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]로 표시될 수 있고, 상기 식들 중 2개의 단량체 단위 사이의 선은 디술피드 결합을 나타낸다. 추가로, 본 발명은 구조 A의 접합체 및 구조 B의 접합체를 포함하는 혼합물에 또한 관련된다.
실시양태 8B에서, 본 발명은 인간 GDF15 돌연변이체가 성숙 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기를 또 다른 잔기로 교체하여 수득되는 실시양태 8A에 따른 접합체를 구상한다. 이러한 실시양태의 한 특정 측면에서, 인간 GDF15의 N-말단의 마지막 2개의 아미노산 잔기 (즉, 아르기닌 198 및 알라닌 197)가 아미노산 서열 XH- [식 중, H는 히스티딘이고, X는 메티오닌, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 선택되는 아미노산이다]로 교체되었다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, hGDF15 돌연변이체는 MH(199-308)hGDF15 또는 AH(199-308)hGDF15이다.
실시양태 8C에서, 인간 GDF15의 N-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기 (즉 아스파라긴 199, 아르기닌 198 및 알라닌 197)가 아미노산 서열 XHX'- [식 중, H는 히스티딘이고, X' 및 X는 메티오닌, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산이다]로 교체되었다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 인간 GDF15의 N-말단의 마지막 3개의 아미노산 잔기 (즉 아스파라긴 199, 아르기닌 198 및 알라닌 197)가 아미노산 서열 AHX'- [식 중, H는 히스티딘이고, X'는 메티오닌, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산이다]로 교체되었다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 변형된 GDF15 단백질은 MHA(200-308)hGDF15 또는 AHA(200-308)hGDF15이다.
천연 GDF15 단백질과 비교하여, GDF15 돌연변이체는 N-말단에서의 단백질의 선택적 표지화 (즉, GDF15의 바람직한 N-말단에서의 지방산 접합)를 가능하게 한다. 공동-출원된 미국 출원 번호 62/015,858 (대리인 사건 PAT056275-US-PSP) 및 62/082,337 (대리인 사건 번호 PAT056275-US-PSP02)에 펩티드 및 단백질의 선택적 표지화가 추가로 상세하게 기술되어 있다.
실시양태 8D에서, 본 발명은 생체분자가 APJ 효능제 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, APJ 효능제 펩티드는 본원에 참고로 포함된 PCT 특허 출원 번호 WO 2013/111110, WO 2014/081702, WO 2015/013168, WO 2015/013165, WO 2015/013167 및 WO 2015/013169에 기술된 펩티드이다.
실시양태 8E에서, 본 발명은 생체분자가 옥시토신 수용체 효능제 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, 옥시토신 수용체 효능제 펩티드는 본원에 참고로 포함된 PCT 특허 출원 번호 WO 2009/122285 (훼링 비.브이.(Ferring B.V.)) 및 WO 2014/095773 (호프만-라 로슈(Hoffman-La Roche))에 기술된 펩티드이다.
실시양태 8F에서, 본 발명은 생체분자가 AgRP 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, AgRP 펩티드는 C-말단이 -유리 CO2H 또는 이의 아미드 (예를 들어 -C(O)NH2) 형태인 AgRP(83-132)이다.
실시양태 8G에서, 본 발명은 생체분자가 FGF23 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, FGF23 펩티드는 R179에서의 돌연변이를 포함하고 Y154, Q156, R176, R179, C206 및 C244에서의 하나 이상의 추가적인 돌연변이를 임의적으로 포함하는 서열식별번호: 8의 FGF23 변이체이다. 이러한 실시양태의 또 다른 특정 측면에서, FGF23 펩티드는 R179, Q156, C206 및 C244에서의 돌연변이가 있는 서열식별번호: 8의 FGF23 변이체이다.
실시양태 8H에서, 본 발명은 생체분자가 세릴랙신인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 8I에서, 본 발명은 생체분자가 NPFF 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 8J에서, 본 발명은 생체분자가 PIP 펩티드인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, PIP 펩티드는 his 태그가 부착된 단백질 MHHHHHHH-PIP [식 중, PIP는 서열식별번호: 12의 것이다]이다.
실시양태 8K에서, 본 발명은 생체분자가 siRNA인 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 8L에서, 본 발명은 링커를 통해 생체분자에 연결된 제2 지방산 모이어티를 추가로 포함하는, 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 바람직하게는, 2개의 지방산-링커 모이어티는 동일한 구조의 것이다.
실시양태 9에서, 본 발명은 하기 구조
Figure pct00024
Figure pct00025
[식 중, hGDF15*는 N-말단의 2 또는 3개의 아미노산이 각각 아미노산 서열 XH- 또는 XHX'- (식 중, H는 히스티딘이고, X 및 X'는 독립적으로 M 및 A로부터 선택된다)로 교체된 hGDF15, 또는 이의 이량체이고;
his-hGDF15는 1 내지 6개의 히스티딘 아미노산 및 임의적인 1 또는 2개의 메티오닌 아미노산을 포함하는 태그가 hGDF15의 N-말단에 부가된 hGDF15, 또는 이의 이량체이며;
s는 20-30의 정수이다]를 갖는 실시양태 1, 2, 8, 8A, 8B 또는 8C에 따른 접합체에 관한 것이다.
이러한 실시양태의 한 측면에서, 태그는 히스티딘 아미노산 및 1 또는 2개의 비-인접 메티오닌 아미노산을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 히스티딘 및 메티오닌 아미노산은 N-말단 아미노산에 인접한 위치의 아미노산이 히스티딘이도록 배열된다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 태그는 MHHHHHHM- 및 MHHHHHH-로부터 선택된다.
실시양태 9의 특정 측면에서, hGDF15* 및 his-hGDF15의 동종이량체 성질을 고려하여, 동종이량체를 구성하는 1개 또는 2개의 폴리펩티드 사슬 (단량체 단위)이 링커를 통해 지방산 분자에 연결될 수 있다. 그 결과, 동종이량체가 N-말단에서 링커를 통해 1개의 지방산 분자에 연결될 수 있거나 또는 2개의 지방산 분자에 연결될 수 있다. 이같은 실시양태는 하기 화학식을 갖는, 링커를 통해 지방산에 연결된 GDF15 생체분자로 표시될 수 있다:
[화학식 C]
Figure pct00026
; 또는
[화학식 D]
Figure pct00027
[식 중, his-hGDF15 또는 hGDF15* (상기 정의된 바와 같음)의 양쪽 단량체 단위가 양쪽 N-말단에서 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]; 또는
[화학식 E]
Figure pct00028
; 또는
[화학식 F]
Figure pct00029
[식 중, his-hGDF15 또는 hGDF15* (상기 정의된 바와 같음)의 단량체 단위 중 하나만 N-말단에서 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]. 또한, 본 발명은 본 발명의 접합체의 혼합물; 예를 들어, 화학식 C의 접합체 및 화학식 E의 접합체를 포함하는 혼합물, 또는 화학식 D의 접합체 및 화학식 F의 접합체를 포함하는 혼합물을 또한 구상한다.
실시양태 10에서, 본 발명은 화학식 C의 접합체 및 화학식 E의 접합체의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 실시양태 10A에서, 본 발명은 화학식 D의 접합체 및 화학식 F의 접합체의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
따라서, 실시양태 10B에서, 본 발명은
1. N-말단의 2 또는 3개의 아미노산이 각각 아미노산 서열 XH- 또는 XHX'- (식 중, H는 히스티딘이고, X 및 X'는 독립적으로 M 및 A로부터 선택된다)로 교체된 동종이량체 hGDF15의 변이체; 또는
1 내지 6개의 히스티딘 아미노산 및 임의적인 1 또는 2개의 메티오닌 아미노산을 포함하는 태그가 hGDF15의 N-말단에 부가된 동종이량체 hGDF15; 및
2. 1 또는 2개의 화학식
Figure pct00030
의 지방산을 포함하고, 지방산이 링커를 통해 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 연결된, 청구항 1, 2, 9 또는 10에 따른 접합체; 또는 접합체 혼합물에 관한 것이다.
실시양태 10C에서, 본 발명은 hGDF15*는 N-말단의 2 또는 3개의 아미노산이 각각 아미노산 서열 XH- 또는 XHX'- (식 중, H는 히스티딘이고, X 및 X'는 독립적으로 M 및 A로부터 선택된다)로 교체된 hGDF15, 또는 이의 이량체이고;
his-hGDF15는 4 내지 6개의 히스티딘 아미노산 및 1 또는 2개의 메티오닌 아미노산을 포함하는 태그가 hGDF15의 N-말단에 부가된 hGDF15, 또는 이의 이량체이며;
s는 22 내지 28의 정수인 실시양태 9, 10, 10A 또는 10B의 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 태그는 히스티딘 아미노산 및 1 또는 2개의 비-인접 메티오닌 아미노산을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 히스티딘 및 메티오닌 아미노산은 N-말단 아미노산에 인접한 위치의 아미노산이 히스티딘이도록 배열된다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 태그는 MHHHHHHM- 및 MHHHHHH-로부터 선택된다.
실시양태 11에서, 본 발명은 생체분자가 M-(His)6-hGDF15 (서열식별번호: 1), M-(his)6-M-hGDF15 (서열식별번호: 2), MH(199-308)hGDF15 (서열식별번호: 4), MHA(200-308)hGDF15 (서열식별번호: 6), AHA(200-308)hGDF15 (서열식별번호: 7) 및 AH(199-308)GDF15 (서열식별번호: 5); 또는 이의 이량체로부터 선택되는, 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 11A에서, 본 발명은 생체분자가 MH(199-308)hGDF15 (서열식별번호: 4), MHA(200-308)hGDF15 (서열식별번호: 6), AHA(200-308)hGDF15 (서열식별번호: 7) 및 AH(199-308)GDF15 (서열식별번호: 5); 또는 이의 이량체로부터 선택되는, 실시양태 11에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 11B에서, 본 발명은 생체분자가 AHA(200-308)hGDF15 (서열식별번호: 7); 또는 이의 이량체로부터 선택되는, 실시양태 11에 따른 접합체에 관한 것이다.
실시양태 12에서, 본 발명은 링커를 통해 지방산에 연결된 생체분자가 화학식 G 또는 화학식 H:
[화학식 G]
Figure pct00031
[화학식 H]
Figure pct00032
의 것이고, 상기 식 중 AHA-hGDF15는 서열식별번호: 7이고, 지방산이 1개 또는 2개의 단량체 단위의 N-말단에서 연결된, 실시양태 11B에 따른 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학식 G의 접합체 및 화학식 H의 접합체를 포함하는 혼합물을 구상한다.
실시양태 13에서, 본 발명은 화학식 G를 갖는 실시양태 12에 따른 접합체 및 화학식 H를 갖는 실시양태 12에 따른 접합체의 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, 혼합물은 화학식 G의 접합체 및 화학식 H의 접합체의 몰비가 1:1이다.
AHA-(200-308)-hGDF15 (서열식별번호: 7)는 천연 단백질에서 관찰되는 클립핑(clipping) 부위를 제거하도록, 뿐만 아니라 잠재적인 메티오닌 (M1) 포르밀화 부위 및 N-199 탈아미드 부위를 제거하도록 디자인되었다. 천연 hGDF15 서열에서 관찰된 클리핑, 탈아미드화 또는 메티오닌 산화를 나타내지 않은 물질 품질 검사에 의해 AHA의 우수한 품질 및 균질성이 입증되었다.
Figure pct00033
실시양태 14에서, 본 발명은 지방산 잔기가 링커를 통해 펩티드 또는 단백질의 N-말단에 부착되는, 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 실시양태 15에서, 본 발명은 접합체의 혈장 안정성 반감기가 5시간을 초과하는 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 접합체의 혈장 안정성 반감기는 10시간을 초과한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 접합체의 혈장 안정성 반감기는 20시간을 초과하거나 또는 30시간을 초과한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 접합체의 혈장 안정성 반감기는 40시간을 초과하거나 또는 50시간을 초과한다.
실시양태 16에서, 본 발명은 비-접합 생체분자와 비교하여 혈장 안정성 반감기의 개선이 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 75배인 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 생체분자, 링커 및 지방산 모이어티 (R1 내지 R4, n, m, p 및 Ak)는 하기 실시예 섹션에 의해 정의되는 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화학식
Figure pct00034
[R1은 CO2H 또는 H이고;
R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, OH, CO2H, -CH=CH2 또는 -C≡CH이고; 단, R2 및 R3은 동일하지 않고;
R4는 CO2H이고;
n 및 m은 서로 독립적으로 6 내지 30의 정수이다]의 화합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은 R2 및 R3 중 적어도 하나가 CO2H인 화학식 A1의 화합물에 관한 것이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본 발명은
Figure pct00035
로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다.
펩티드/폴리펩티드 및/또는 이의 변형 형태의 합성
본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성 화학 공정 또는 재조합 방법, 또는 양쪽 방법의 조합에 의해 생산될 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드/단백질 구축물은 전장으로 제조될 수 있거나 또는 비-전장 단편으로 합성되어 연결될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 펩티드 합성에 대해 그 자체로 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다. 펩티드 합성 방법은 고체-상 합성 및 액체-상 합성 중 임의의 것일 수 있다. 따라서, 단백질을 구성할 수 있는 부분적인 펩티드 또는 아미노산을 이의 나머지 부분과 축합함으로써 관심 펩티드 및 폴리펩티드가 생산될 수 있고, 생성물에 보호기가 있는 경우, 보호기가 탈착되어 목적 펩티드가 제작될 수 있다. 공지된 축합 및 탈보호 방법은 하기 문헌 (1) - (5)에 기술된 절차를 포함한다.
(1) M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966,
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965,
(3) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975,
(4) Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977, 및
(5) Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten.
반응 후, 통상적인 정제 기술 예컨대 용매 추출, 칼럼 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 및 재결정화의 조합에 의해 펩티드 또는 폴리펩티드가 정제 및 단리될 수 있다. 상기와 같이 단리된 펩티드가 유리 화합물인 경우, 이는 공지된 방법에 의해 적절한 염으로 전환될 수 있다. 반대로, 단리된 생성물이 염인 경우, 이는 공지된 방법에 의해 유리 펩티드로 전환될 수 있다.
아미드화에 적절한 펩티드 합성을 위한 수지를 사용함으로써 폴리펩티드의 아미드가 수득될 수 있다. 이러한 수지는 클로로메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 벤즈히드릴아민 수지, 아미노메틸 수지, 4-벤질옥시벤질 알콜 수지, 4-메틸벤즈-히드릴아민 수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미도메틸 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시 수지, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 등을 포함한다. 이같은 수지를 사용하여, α-아미노 기 및 측쇄의 관능기가 적절하게 보호된 아미노산이 그 자체로 공지된 다양한 축합 기술에 의해 목적 펩티드의 서열에 따라 수지 상에서 축합된다. 일련의 반응이 끝날 때, 펩티드 또는 보호된 펩티드가 수지로부터 제거되고, 보호기가 제거되며, 필요하다면 디술피드 결합이 형성되어, 목적 폴리펩티드가 수득된다.
상기 언급된 보호된 아미노산의 축합을 위해, 펩티드 합성을 위한 다양한 활성화 시약 예컨대 HATU, HCTU 또는 예를 들어 카르보디이미드가 사용될 수 있다. 카르보디이미드는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 포함한다. 이같은 시약으로의 활성화를 위해, 라세미화 억제제 첨가물, 예를 들어 HOBt 또는 옥시마 퓨어(Oxyma Pure)가 사용될 수 있다. 보호된 아미노산이 직접적으로 활성화 시약 또는 라세미화 억제제와 함께 수지에 첨가될 수 있거나, 또는 대칭성 산 무수물, HOBt 에스테르, 또는 HOOBt 에스테르로서 예비-활성화된 후 수지에 첨가될 수 있다. 보호된 아미노산의 활성화 또는 수지 축합을 위한 용매는 펩티드 축합 반응에 유용한 것으로 공지된 용매 중에서 적합하게 선택될 수 있다. 예를 들어, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 클로로포름, 트리플루오로에탄올, 디메틸 술폭시드, DMF, 피리딘, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 또는 이들의 적절한 혼합물이 언급될 수 있다. 반응 온도는 펩티드 결합 형성에 유용한 것으로 지금까지 공지된 범위로부터 선택될 수 있고, 일반적으로 약 -20℃ - 50℃의 범위로부터 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 일반적으로 1.5-4배 과량의 비율로 사용된다. 닌히드린 반응을 이용한 테스트에 의해 축합이 불충분한 것으로 발견되면, 보호기를 제거하지 않으면서 충분한 축합이 달성되도록 축합 반응을 반복할 수 있다. 반복된 축합이 여전히 충분한 정도의 축합을 제공하지 못하면, 미반응 아미노 기를 아세트산 무수물 또는 아세틸이미다졸로 아세틸화시킬 수 있다.
출발 물질 아미노산에 대한 아미노기의 보호기는 Z, Boc, 3급-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, CI-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피오티오일, 또는 Fmoc를 포함한다. 사용될 수 있는 카르복시-보호기는 상기 언급된 C1-6 알킬, C3-8 시클로알킬 및 C6- 10아릴-C1- 2알킬, 뿐만 아니라 2-아다만틸, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 4-클로로벤질, 펜아실, 벤질옥시카르보닐히드라지도, 3급-부톡시카르보닐히드라지도, 및 트리틸히드라지도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세린 및 트레오닌의 히드록시 기는 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호될 수 있다. 상기 에스테르화에 적절한 기는 탄소-유래 기 예컨대 저급 알카노일 기, 예를 들어 아세틸 등, 아로일 기, 예를 들어 벤조일 등, 벤질옥시카르보닐, 및 에톡시카르보닐을 포함한다. 상기 에테르화에 적절한 기는 벤질, 테트라히드로피라닐, 및 3급-부틸을 포함한다. 티로신의 페놀계 히드록실 기에 대한 보호기는 Bzl, Cl2-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, 및 3급-부틸을 포함한다.
히스티딘에 대한 이미다졸의 보호기는 Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리에틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, 및 Fmoc를 포함한다.
출발 아미노산의 활성화된 카르복실 기는 상응하는 산 무수물, 아지드 및 활성 에스테르, 예를 들어 알콜 예컨대 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸 알콜, p-니트로페놀, HONB, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt 등과의 에스테르를 포함한다. 출발 아미노산의 활성화된 아미노 기는 상응하는 포스포르아미드를 포함한다.
보호기의 제거 방법은 촉매 예컨대 팔라듐 블랙 또는 팔라듐-탄소 (palladium-on-carbon)의 존재 하에서 수소 기체를 사용하는 촉매성 환원, 무수성 플루오르화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰신, 트리플루오로아세트산, 또는 이같은 산의 혼합물로의 산 처리, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진으로의 염기 처리, 액체 암모니아에서의 나트륨 금속으로의 환원을 포함한다. 상기 언급된 산 처리에 의한 제거 반응은 일반적으로 -20℃ - 40℃의 온도에서 수행되고, 유리하게는 양이온 수용체 예컨대 아니솔, 페놀, 티오아니솔, m-크레솔, p-크레솔, 디메틸 술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올의 첨가와 함께 수행될 수 있다. 히스티민의 이미다졸 기를 보호하는데 사용된 2,4-디니트로페닐 기는 티오페놀 처리에 의해 제거될 수 있는 한편, 트립토판의 인돌 기를 보호하는데 사용된 포르밀 기는 묽은 수산화나트륨 용액 또는 묽은 수성 암모니아로의 알칼리 처리, 뿐만 아니라 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올의 존재 하에서의 상기 언급된 산 처리에 의해 제거될 수 있다.
출발 물질의 반응에 참여하면 안 되는 관능기를 보호하는 방법, 사용될 수 있는 보호기, 보호기를 제거하는 방법, 및 반응에 참여할 관능기를 활성화시키는 방법 모두가 공지된 기 및 방법 중에서 신중하게 선택될 수 있다.
폴리펩티드의 아미드 형태를 수득하는 또 다른 방법은 먼저 C-말단 아미노산의 -카르복실 기를 아미드화시킨 후, 원하는 사슬 길이까지 N-측으로 펩티드 사슬을 연장하고, 이어서 C-말단 펩티드의 α-아미노 기 및 목적 폴리펩티드의 나머지를 형성할 아미노산 또는 펩티드의 α-카르복시 기를 선택적으로 탈보호시키고, 혼합 용매 예컨대 상기 언급된 것에서 단편의 α-아미노 기 및 측쇄 관능기가 상기 언급된 적절한 보호기로 보호된 2개의 단편을 축합시키는 것을 포함한다. 이러한 축합 반응의 파라미터는 앞서 기술된 것과 동일할 수 있다. 축합에 의해 수득된 보호된 펩티드로부터, 모든 보호기를 상기 기술된 방법에 의해 제거함으로써 목적한 미처리 펩티드가 제공된다. 이러한 미처리 펩티드를 공지된 정제 절차에 의해 정제할 수 있고, 주요 분획을 동결건조시켜, 목적한 아미드화 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 폴리펩티드의 에스테르를 수득하기 위해, C-말단 아미노산의 a-카르복실 기가 원하는 알콜과 축합되어 아미노산 에스테르가 제공되고, 그 후 아미드 생산에 대해 상기 기술된 절차가 이어진다.
대안적으로, 재조합 발현 방법이 특히 유용하다. 숙주 세포 (펩티드 서열을 코딩하는 핵산을 포함하도록 인공적으로 조작되고, 전사 및 번역을 수행할 것이며, 임의적으로는 펩티드를 세포 성장 배지 내로 분비할 세포)를 사용하는 재조합 단백질 발현이 관련 기술 분야에서 일상적으로 사용된다. 재조합 생산 공정을 위해, 펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이 전형적으로 통상적인 방법에 의해 합성되고, 발현 벡터 내로 통합될 것이다. 이같은 방법은 추가적인 펩티드 서열 또는 다른 단백질 또는 단백질 단편 또는 도메인에 융합된 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 조성물의 제작에 특히 바람직하다. 임의적으로 숙주 세포는 이. 콜라이(E.Coli), COS-1, COS-7, HEK293, BHT21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, heLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 RNA 형태 또는 DNA 형태 (DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함함)일 수 있는 상기 기술된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 본 발명의 조성물을 코딩하는 코딩 서열은 유전자 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 변할 수 있다.
본 발명의 조성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 변이체에 대한 코딩 서열만 포함할 수 있거나, 변이체에 대한 코딩 서열 및 추가적인 코딩 서열 예컨대 기능성 폴리펩티드, 또는 리더 또는 분비 서열 또는 전구-단백질 서열을 포함할 수 있거나, 변이체에 대한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 인트론 또는 변이체에 대한 코딩 서열의 5' 및/또는 3'의 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 따라서, "변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 변이체에 대한 코딩 서열뿐만 아니라 추가적인 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 지시된 치환을 함유하는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 또한 관련된다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 상기 기술된 바와 같은 인간 GDF15 서열의 천연 발생 대립유전자 변이체, 비-천연 발생 변이체, 또는 말단절단 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 기술된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 개시된 변이체의 단편, 유도체 또는 유사체를 코딩하는, 이같은 폴리뉴클레오티드의 변이체를 또한 포함한다. 이같은 뉴클레오티드 변이체는 제1 또는 제2 실시양태의 지시된 아미노산 치환 중 적어도 하나가 존재하는 한 결실 변이체, 치환 변이체, 말단절단 변이체, 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.
서열이 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 (즉, 발현 제어 서열의 기능화를 보장하도록 위치한) 후에 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 숙주에서 발현될 수 있다. 전형적으로 이러한 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합부로서 숙주 생물에서 복제가 가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선별 마커, 예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유하여, 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용할 것이다. 적합한 프로모터의 제어 하에 포유동물 세포, 곤충, 효모, 박테리아 또는 기타 세포에서 GDF15 변이체가 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 구축물로부터 유래된 RNA를 사용하여 이같은 단백질을 생산하도록 무세포 번역 시스템을 사용할 수도 있다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 특히 유용한 원핵생물 숙주이다. 사용하기에 적절한 기타 미생물 숙주는 바실루스 서브틸루스(Bacillus subtilus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 및 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)의 다양한 종을 포함하지만, 기타 미생물이 또한 선택물로서 사용될 수 있다. 이러한 원핵생물 숙주에서, 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기원)을 전형적으로 함유할 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 추가적으로, 다수의 널리 공지된 프로모터 중 임의의 것, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (Trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다 또는 T7로부터의 프로모터 시스템이 존재할 수 있다. 전형적으로 프로모터는, 임의적으로는 오퍼레이터 서열과 함께, 발현을 제어할 것이고, 전사 및 번역의 시작 및 완료를 위한 리보솜 결합 부위 서열 등이 있을 것이다.
단백질 발현 분야의 통상의 기술자는 이. 콜라이에서 발현되는 경우 성숙 서열의 N-말단에 메티오닌 또는 메티오닌-아르기닌 서열이 도입될 수 있고, 본 발명의 맥락에서 고려된다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 달리 언급되지 않는 한, 이. 콜라이에서 발현된 본 발명의 조성물은 N-말단에 메티오닌 서열이 도입되어 있다.
기타 미생물, 예컨대 효모 또는 진균이 발현에 또한 사용될 수 있다. 필요하다면 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터 (3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해성 효소 포함), 및 복제 기원, 종결 서열 등이 있는 적절한 벡터와 함께, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피키아 안구스타(Pichia angusta)가 바람직한 효모 숙주의 예이다. 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 및 스키조필룸 콤뮨(Schizophyllum commune)이 진균 숙주의 예이지만, 기타 진균이 선택물로서 또한 사용될 수 있다.
포유동물 조직 세포 배양이 본 발명의 폴리펩티드를 발현 및 생산하는데 또한 사용될 수 있다. 무손상 변이체를 분비할 수 있는 다수의 적절한 숙주 세포주가 관련 기술 분야에 공지되어 있고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, NSO 세포, 시리아 햄스터 난소 세포주, HeLa 세포, 또는 인간 배아 신장 세포주 (즉 HEK293, HEK293EBNA)를 포함한다.
포유동물 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터, 인핸서, 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 라우스 육종 바이러스 등으로부터의 프로모터이다. 바람직한 폴리아데닐화 부위는 SV40 및 소 성장 호르몬으로부터 유래된 서열을 포함한다.
세포성 숙주의 유형에 따라 다른 널리 공지된 방법에 의해 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 (예를 들어, 본 발명의 조성물 및 발현 제어 서열을 코딩하는 것)가 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염이 원핵생물 세포에 대해 통상적으로 사용되는 한편, 인산칼슘 처리 또는 전기천공이 기타 세포성 숙주에 사용될 수 있다.
다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 이같은 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는, 예를 들어, 본 발명의 조성물에 사용된 생산 공정의 성질에 좌우될 것이다.
폴리펩티드는 실질적으로 순수하거나 단리된 형태 (예를 들어, 다른 폴리펩티드가 없음)로 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 존재할 수 있는 다른 성분 (예를 들어, 다른 폴리펩티드 또는 다른 숙주 세포 성분)에 비해 이러한 폴리펩티드가 강화된 조성물 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 다른 발현된 단백질이 실질적으로 없는 조성물 내에 폴리펩티드가 존재하도록, 정제된 폴리펩티드가 제공될 수 있고, 예를 들어, 조성물의 90％ 미만, 60％ 미만, 50％ 미만, 40％ 미만, 30％ 미만, 20％ 미만, 10％ 미만, 5％ 미만, 또는 1％ 미만이 다른 발현된 단백질로 구성된다.
지방산 모이어티의 합성
반응식 1은 화학식 A2의 지방산 모이어티의 합성을 기술한다.
<반응식 1>
Figure pct00036
[식 중, P1 및 P2는 카르복실산 보호기 예컨대 예를 들어 메틸, 에틸, tert-부틸, 메톡시벤질, 벤질, 벤질옥시, 메톡시메틸, 메틸티오메틸, 테트라히드로피라닐, 펜아실, N-프탈이미드, 신나밀, 트리페닐메틸, 9-안트릴메틸, 피페로닐, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴 또는 2-알킬 1,3 옥사졸린이고; LG는 이탈기 예컨대 할로 (예를 들어 Br, Cl, I) 또는 트리플루오로메탄술포닐옥시이고, R4 및 p는 실시양태 1에서 정의된 바와 같다].
보호된 말론산 (1A)을 염기 (예를 들어 수소화나트륨, 포타슘 또는 세슘 카르보네이트, 수산화나트륨, 리튬 디이소프로필 아미드, 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드, 포타슘 비스(트리메틸실릴)아미드, 리튬 테트라메틸피페리디드, 1,8-디아자시클로운데크-7-엔, N,N-디이소프로필 에틸 아민 또는 2,6-디t-부틸푸트리딘)의 존재 하에 용매 예컨대 DMF, THF 또는 디메틸 아세트아미드에서 알킬화제 (1B)로 알킬화시키면 보호된 지방산 모이어티 (1C)가 생성된다. R4가 OH 또는 CO2H인 경우, 알킬화 단계 이전에 이러한 관능기의 보호가 요구될 수 있다. 히드록실에 대한 보호기는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 1. 에테르 예컨대 메틸 에테르, 메톡시메틸 에테르 (MOM), 테트라히드로피라닐 에테르 (THP), t-부틸 에테르, 알릴 에테르, 벤질 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르, t-부틸디페닐 실릴 에테르, 트리벤질 실릴 에테르, 이소프로필디메틸실릴 에테르, 트리페닐메틸 에테르, 니트로벤질 에테르, 2. 에스테르 및 카르보네이트 예컨대 아세트산 에스테르, 포르메이트 에스테르, 트리클로로아세테이트 에스테르, 페녹시아세테이트 에스테르, 피발로에이트 에스테르, 벤조에이트 에스테르, 메틸 카르보네이트, 벤질 카르보네이트, 알릴 카르보네이트, 니트레이트 에스테르, 아다마노에이트 에스테르, 니트로페닐 카르보네이트이다.
적합한 탈보호 방법을 사용한 탈보호에 의해 화학식 A2의 지방산 모이어티가 수득된다. NaOH, KOH, 또는 LiOH로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 염, 또는 TFA, HCl, 또는 BCl3으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 산을 사용하여 중간체 (1C)의 가수분해를 위해 표준 방법이 적용될 수 있다. P1 또는 P2가 벤질 또는 메톡시벤질인 경우, 바람직한 탈보호 방법은 팔라듐-탄소와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 촉매의 존재 하에서의 수소화이다.
반응식 2는 R1이 C(O)2H인 화학식 A1의 지방산 모이어티의 합성을 도시한다.
<반응식 2>
Figure pct00037
[식 중, P1 및 P2, LG는 상기에서 정의된 바와 같고, R2, R3, n 및 m은 실시양태 1에서 정의된 바와 같다].
보호된 말론산 (1A)에 알킬화제 (2A) 및 (2C) (이의 순서는 뒤바뀔 수 있음)로의 2회의 연속적인 알킬화가 진행된 후, 상기에서 반응식 1에서 기술된 바와 같은 적합한 방법을 사용하여 탈보호가 진행된다. R2 및 R3이 OH 또는 CO2H인 경우, 알킬화 단계 이전에 이러한 관능기의 보호가 요구될 수 있다.
R1이 CO2H인 화학식 A1의 상응하는 지방산 모이어티의 탈카르복실화에 의해 R1이 H인 화학식 A1의 지방산 모이어티를 제조할 수 있다. 탈카르복실화 조건, 예컨대 염기성 조건 (예를 들어, 수산화암모늄) 하에서의 탈카르복실화가 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
생체분자-링커 구축물의 합성
<반응식 3>
Figure pct00038
[식 중, B는 생체분자 또는 이의 변형 형태이고, Z1은 알킬렌 사슬이 옥소 (=O)로 임의 치환되고, 하나 이상의 탄소가 O 또는 NH로 교체된 C1-C20 알킬렌 링커이며; C1은 플루오르로 임의 치환된 단환식, 이환식 또는 삼환식 탄소고리형 또는 헤테로고리형 고리 시스템이다].
표준 아미드 커플링 방법을 사용하여 시클로알킨 (3B)이 이의 카르복실산 반응기를 통해 생체분자 (3A)의 아미노 잔기에 (예를 들어, N-말단의 아미노 관능기 또는 리신의 측쇄에) 부착된다. 중간체 (3B)를 이의 활성화 형태로 전환시킨 후 [예를 들어, 상응하는 피롤리딘-2,5-디온으로 전환시키거나 (표준 N-히드록시숙신이미드 화학을 사용함), 또는 산 (3B)을 트리포스겐, 카르보닐디이미다졸, 4-니트로페닐 클로로포르메이트 또는 디숙신이미딜 카르보네이트와 같은 시약을 사용하여 전환시키거나, 산 (3B)을 티오닐 클로라이드 또는 옥살릴 클로라이드와 같은 시약을 사용하여 상응하는 산 할로겐화물로 전환시키거나, 또는 산 (3B)을 ClC(O)O-이소부틸, 2,4,6-트리클로로벤조일 클로라이드 또는 프로필 포스폰산 무수물 고리형 삼량체 (T3P)와 같은 시약을 사용하여 상응하는 혼합 무수물로 전환시킴], 옥사졸리딘-2,5-디온, 산 할로겐화물, 또는 혼합 무수물을 염기 예컨대 3급 아민 (예를 들어 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필 에틸아민) 또는 K2CO3의 존재 또는 부재 하에 생체분자 (3A)와 반응시키는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 커플링 방법이 적용될 수 있다. 대안적으로, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, 또는 디메틸아미노피리딘과 같은 시약의 존재 또는 부재 하에 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC HCl), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP), 또는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 펩티드 축합 시약을 사용하여 생체분자 3A 가 산 3B와 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 시클로알킨/산 중간체 (3B)가 NHS 화학을 사용하여 이의 활성화 형태로 전환된 후 생체분자 상의 아미노 관능기와 반응된다.
생체분자의 N-말단의 아미노 관능기의 선택적 아실화가 개발되었고, 공동-출원된 미국 출원 번호 62/015,858 (대리인 사건 PAT056275-US-PSP) 및 62/082,337 (대리인 사건 번호 PAT056275-US-PSP02)에서 보고되었다.
선택적 아실화는 NHS-활성화 시클로옥틴 유사체 ((3B)의 NHS 유도체)와 N-말단 아미노산에 인접한 히스티딘 아미노산을 포함하도록 N-말단이 변형된 생체분자의 반응을 수반한다. 히스티딘 아미노산의 이웃 효과의 존재로 인해, 이러한 반응은 pH 4에서 수행될 때 N-말단의 아미노 관능기에 대해 고도로 선택적이다.
지방산 잔기 링커 구축물의 합성
클릭 화학을 위한 지방산-링커 구축물
반응식 4는 말단 아지도 관능기가 있는 지방산-PEG 링커 구축물의 합성을 기술한다.
<반응식 4>
Figure pct00039
[식 중, y는 0 내지 34이고, FA는 이의 카르복실산 관능기 중 하나를 통해 PEG 링커에 부착된 화학식 A1, A2 또는 A3에 기술된 바와 같은 지방산 모이어티이고, FA는 하기 화학식
Figure pct00040
을 갖는다].
아미드 커플링 반응을 통해 지방산 모이어티 (4B)가 PEG 함유 링커 (4A)에 부착된다. 공지된 커플링 방법이 상기에서 반응식 3에서 상세하게 기술되었다. 바람직하게는, 지방산 모이어티 상의 산 관능기가 NHS 화학을 사용하여 활성화된다.
R1이 CO2H이고, R2, R3 및 R4가 CO2H 또는 OH인 경우, 반응성 부위를 제어하기 위해 커플링 반응 전에 보호기가 도입될 필요가 있을 수 있다. 카르복실산 및 히드록시 기에 대한 보호기가 상기에서 반응식 1에서 기술되었다. 대안적으로, NHS화학을 사용하여 카르복실산의 선택적 활성화가 달성될 수 있다.
관심 생체분자에 직접적으로 부착하기 위한 지방산-링커
반응식 5는 말단 CO2H 관능기가 있는 지방산-PEG 링커 구축물의 합성을 기술한다.
<반응식 5>
Figure pct00041
[식 중, FA는 상기에서 반응식 4에서 정의된 바와 같고, y는 0 내지 34이다].
상기 기술된 아미드 커플링을 사용하여 지방산 (4B)이 PEG 함유 링커 (5A)에 부착될 수 있다.
트랜스글루타미나제 효소를 사용하여 관심 생체분자에 부착하기 위한 지방산-링커 구축물
반응식 5A는 트랜스글루타미나제 효소를 사용할 때 리신의 부위-선택적 변형을 허용하는 글루탐산 아미노산을 함유하는 지방산-링커 구축물의 제조를 기술한다.
<반응식 5B>
Figure pct00042
[식 중 y 및 FA는 앞서 정의된 바와 같다]. 이같은 구축물은 리신의 측쇄 상의 아미노 기의 부위-선택적 변형을 허용한다. 단백질의 이러한 부위-선택적 트랜스글루타미나제 변형이 2013년 7월 11일에 출원된 미국 출원 번호 61/845,273(대리인 사건 번호 PAT055641-US-PSP)에 기술되어 있다.
본 발명의 접합체의 합성
클릭 화학을 사용하는 접합
<반응식 6>
Figure pct00043
[식 중, B는 관심 생체분자 또는 이의 변형 형태 (예를 들어 돌연변이체 또는 히스티딘 태그를 함유하는 생체분자)이고, y, C1, Z1, FA 및 y는 상기에서 정의된다].
시클로알킨 구축물 (3C)에 지방산-링커 구축물 (4C)의 말단 아지드와의 후이스겐 고리화부가 (통상적으로 클릭 화학으로 공지됨)가 진행된다. 클릭 화학의 예가 미국 2009/0068738에 기술되어 있다.
커플링 조건을 사용하는 직접적인 부착을 통한 접합
<반응식 7>
Figure pct00044
[식 중, B는 관심 생체분자 또는 이의 변형 형태 (예를 들어 돌연변이체 및/또는 히스티딘 태그를 함유하는 생체분자)이고, 지방산-링커 구축물이 생체분자의 N-말단에 부착된다].
표준 아미드 커플링 방법을 사용하여 지방산-링커 구축물 (5B)이 이의 카르복실산 반응성 기를 통해 생체분자 (3A)의 아미노 잔기에 (예를 들어, N-말단의 아미노 관능기 또는 리신의 측쇄에) 부착된다. 공지된 커플링 방법이 상기에서 반응식 3에서 상세하게 기술되었다. 바람직하게는, 지방산-링커 구축물 상의 산 관능기가 NHS 화학을 사용하여 활성화된다.
생체분자의 N-말단의 아미노 관능기의 선택적 아실화가 개발되었고, 공동-출원된 미국 출원 번호 62/015,858 (대리인 사건 PAT056275-US-PSP) 및 62/082,337 (대리인 사건 번호 PAT056275-US-PSP02)에서 보고되었다. 선택적 아실화는 NHS-활성화 화합물 ((5B)의 NHS 유도체)와 N-말단 아미노산에 인접한 히스티딘 아미노산을 포함하도록 N-말단이 변형된 생체분자의 반응을 수반한다. 히스티딘 아미노산의 이웃 효과의 존재로 인해, 이러한 반응은 pH 4에서 수행될 때 N-말단의 아미노 관능기에 대해 고도로 선택적이다.
트랜스글루타미나제 효소를 사용하는 접합
<반응식 7B>
Figure pct00045
생체분자의 이의 리신 측쇄에서의 선택적 변형이 트랜스글루타미나제 효소를 사용하여 달성될 수 있다. 이같은 변형이 2013년 7월 11일에 출원된 미국 출원 번호 61/845,273(대리인 사건 번호 PAT055641-US-PSP) 또는 WO 2015/006728 (이러한 출원의 실시예 25)에서 보고되었다.
제약 조성물
본 발명의 접합체는 피하, 근육내, 정맥내, 복막내, 흡입, 비강내, 경구 등을 포함하는 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 본 발명의 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 염의 연속적인 정맥내 투여를 사용한다. 본 발명의 접합체는 볼루스로서 또는 연속 주입으로서 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 이식가능한 펌프가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 간헐적 또는 연속적 접합체 투여가 1일 내지 수 일 (예를 들어, 2-3일 또는 이를 초과하는 일수) 동안, 또는 더 긴 기간, 예를 들어, 수 주, 수 개월 또는 수 년 동안 계속된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 또는 연속적 접합체 투여가 적어도 약 3일, 바람직하게는 적어도 약 6일 동안 제공된다. 다른 실시양태에서, 간헐적 또는 연속적 접합체 투여가 적어도 약 1주일 동안 제공된다. 다른 실시양태에서, 간헐적 또는 연속적 접합체 투여가 적어도 약 2주일 동안 제공된다. 투여 동안 또는 다중 용량의 투여 사이에 평균 혈장 접합체 농도를 특정 역치 초과로 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 농도는, 예를 들어, 대상체의 생리학적 상태, 질환 중증도 등을 기초로 결정될 수 있다. 표준 임상 시험을 수행함으로써 이같은 바람직한 값(들)을 확인할 수 있다. 대안적으로, 펩티드 또는 이의 접합체가 FcRn 메커니즘을 통해 경구로 전달될 수 있다. (Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007; Nat Commun. 3;3:610, 2012, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013).
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 접합체 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 투여 경로 예컨대 경구 투여, 피하 투여, 비경구 투여 및 직장 투여 등을 위해 제약 조성물이 제형될 수 있다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 고체 형태 (비제한적으로 캡슐, 정제, 환제, 과립, 동결건조물, 분말 또는 좌약을 포함함), 또는 액체 형태 (비제한적으로 용액, 현탁액 또는 에멀션을 포함함)로 제조될 수 있다. 제약 조성물은 통상적인 제약 공정 예컨대 방부처리 제작, 멸균에 적용될 수 있고/있거나 통상적인 불활성 희석제, 케이트 형성제, 장성 작용제, 윤활제, 또는 완충 작용제, 뿐만 아니라 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤화제, 유화제 및 완충제 등을 함유할 수 있다.
주사용 용도에 적절한 제약 조성물은 무균성 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 무균성 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말을 전형적으로 포함한다.
정맥내 투여의 경우, 적절한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL™ (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균성이어야 하고, 용이한 주사능(syringability)이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 바람직한 제약 제형은 제작 및 보관 조건 하에 안정적이고, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 일반적으로, 관련된 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용의 방지가 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 아미노산, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함하는 것에 의해 주사성 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분해 또는 응집으로부터의 접합체 생성물의 안정화를 용이하게 하기 위해, 용해도를 개선하기 위해, 그리고 활성 성분의 투여 및 방출을 보조하기 위해 다기능성 부형제 예컨대 재조합 알부민이 제형 공정 내로 혼입될 수 있다. (BioPharm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44).
특정한 주사성 조성물은 수성 등장성 용액 또는 현탁액이고, 지방 에멀션 또는 현탁액으로부터 좌약이 유리하게 제조된다. 상기 조성물은 멸균될 수 있고/있거나 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤화제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 이는 치료적으로 유용한 기타 물질을 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 각각 제조되고, 약 0.1-75％ 또는 약 1-50％의 활성 성분을 함유한다.
필요한 양의 활성 화합물을, 필요하다면 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합물과 함께, 적합한 용매에 혼입한 후, 멸균 여과함으로써 무균성 주사성 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 분산액이 제조된다. 무균성 주사성 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 산출되는 진공 건조 및 냉동-건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물이 부형제와 혼입되어, 정제, 트로키 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 구강세정제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 경구 조성물을 제조할 수도 있다. 제약상 상용성인 결합제, 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 중 임의의 것, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제. 유리하게는 경구 투여용 제형에 위장관에서의 안정성을 개선하고/하거나 흡수를 강화하기 위한 작용제가 혼입될 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 바람직하게는 본 발명의 치료제는 적절한 추진제, 예를 들어, 기체 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 폐가 치료제의 전신 전달을 위한 넓은 표면적을 제공한다는 것을 주지한다.
예를 들어, 중합체성 마이크로입자 예컨대 미국 공개 20040096403에 기술된 것 내에, 또는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 다른 약물 전달 비히클 중 임의의 것과 회합되어 작용제가 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 예를 들어, 미국 공개 20040062718에 기술된 바와 같은 하전된 지질과 회합되어 작용제가 전달된다. 후자의 시스템이 치료 폴리펩티드인 인슐린의 투여에 사용되어, 펩티드 작용제의 투여를 위한 이러한 시스템의 유용성이 실연되었음을 주지한다.
전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수도 있다.
경피 적용을 위한 적절한 조성물은 유효량의 본 발명의 접합체를 적절한 담체와 함께 포함한다. 경피 전달에 적절한 담체는 숙주의 피부를 통과하는 것을 보조하는 흡수가능한 약리학상 허용되는 용매를 포함한다. 예를 들어, 경피 장치는 백킹(backing) 부재, 화합물을 (임의적으로는 담체와 함께) 함유하는 저장소, 임의적인, 화합물을 장기간에 걸쳐 미리 정해진 제어된 속도로 숙주 피부에 전달하기 위한 속도 제어 장벽, 및 장치를 피부에 고정하는 수단을 포함하는 붕대의 형태이다.
국소 적용, 예를 들어, 피부 및 눈에 대한 적용에 적절한 조성물은 수용액, 현탁액, 연고, 크림, 겔 또는 스프레이성 제형 (예를 들어, 에어로졸 등에 의한 전달용)을 포함한다. 이같은 국소 전달 시스템은 피부 적용에 특히 적합할 것이다. 따라서 이는 관련 기술 분야에 널리 공지된 국소 제형 (미용 제형 포함)에서 사용하기에 특히 적절하다. 이는 가용화제, 안정화제, 장성 강화제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 피하 투여를 위한 것이다. 폴리펩티드 치료제 (예를 들어, 항체, 융합 단백질 등)의 피하 투여를 위한 적절한 제형 성분 및 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0044977 및 미국 특허 번호 8,465,739 및 미국 특허 번호 8,476,239를 참조한다. 전형적으로, 피하 투여용 제약 조성물은 적절한 안정화제 (예를 들어 아미노산, 예컨대 메티오닌, 및 또는 당류 예컨대 수크로스), 완충 작용제 및 장성부여제를 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같은 국소 적용은 흡입 또는 비강내 적용에 또한 관련된다. 이는 건조 분말 흡입기로부터의 건조 분말의 형태로 (단독으로, 혼합물, 예를 들어 락토스와의 건식 블렌드로서, 또는 혼합 성분 입자, 예를 들어 인지질과의 혼합 성분 입자로서), 또는 적절한 추진제를 사용하면서 또는 이를 사용하지 않으면서 가압 용기, 펌프, 스프레이, 아토마이저 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이 제시물의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.
본 발명은 활성 성분으로서의 본 발명의 화합물이 분해될 속도를 감소시키는 하나 이상의 작용제를 포함하는 제약 조성물 및 투여 형태를 추가로 제공한다. 본원에서 "안정화제"로 지칭되는 이같은 작용제는 항산화제 예컨대 아스코르브산, pH 완충제, 또는 염 완충제, 재조합 알부민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 본 발명의 접합체의 생물학적 유효성 및 성질을 유지하고, 전형적으로는 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 염을 지칭한다. 다수의 경우에, 본 발명의 접합체는 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 이와 유사한 기의 존재에 의해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.
무기 산 및 유기 산으로 제약상 허용되는 산 부가염이 형성될 수 있고, 예를 들어, 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 브로마이드/히드로브로마이드, 비카르보네이트/카르보노네이트, 비술페이트/술페이트, 캄포르술포네이트, 클로라이드/히드로클로라이드, 클로르테오필로네이트, 시트레이트, 에탄디술포네이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 히푸레이트, 히드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우릴술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸술페이트, 나프토에이트, 나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥타데카노에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/히드로겐 포스페이트/디히드로겐 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술포살리실레이트, 타르트레이트, 토실레이트 및 트리플루오로아세테이트 염이다.
염이 유도될 수 있는 무기 산은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 염이 유도될 수 유기 산은, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 술포살리실산 등을 포함한다. 무기 및 유기 염기로 제약상 허용되는 염기 부가염이 형성될 수 있다.
염이 유도될 수 있는 무기 염기는, 예를 들어 암모늄 염 및 주기율표의 I 내지 XII족으로부터의 금속을 포함한다. 특정 실시양태에서, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연 및 구리로부터 염이 유도되고, 특히 적절한 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다.
염이 유도될 수 있는 유기 염기는, 예를 들어 1급, 2급, 및 3급 아민, 천연연 발생의 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함한다. 특정 유기 아민은 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 메글루민, 피페라진 및 트로메타민을 포함한다.
통상적인 화학적 방법에 의해 모 화합물인 염기성 또는 산성 모이어티로부터 본 발명의 제약상 허용되는 염이 합성될 수 있다. 일반적으로, 이같은 염은 유리 산 형태의 이러한 화합물을 화학량론적 양의 적합한 염기 (예컨대 Na, Ca, Mg 또는 K 히드록시드, 카르보네이트, 비카르보네이트 등)와 반응시킴으로써, 또는 유리 염기 형태의 이러한 화합물을 화학량론적 양의 적합한 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 전형적으로 이같은 반응은 물에서 또는 유기 용매에서, 또는 이러한 2가지의 혼합물에서 수행된다. 일반적으로, 실행가능한 경우, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비-수성 매질의 사용이 바람직하다. 추가적인 적절한 염의 목록을, 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)]; 및 ["Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use", Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)]에서 확인할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장성 작용제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 다기능성 부형제 예컨대 재조합 알부민 등 및 이의 조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상의 담체가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 또는 제약 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
본 발명의 방법
여러 병리학적 및 생리학적 병태, 가장 현저하게는 임신 (Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788), β-지중해빈혈 (Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101) (Zimmermann MB, 2008 Am J Clin Nutr 88:1026-31), 및 선천성 적혈구형성이상 빈혈 (Tamary H 2008, Blood. 112:5241-4)에서 GDF15 혈행 수준이 상승되는 것으로 보고되었다. GDF15는 문헌 보고에서 여러 생물학적 활성에 또한 연관되었다. GDF15 녹아웃(knockout) 및 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 연구는 GDF15가 허혈성/재관류- 또는 과부하-유도 심상 손상에 대해 보호적일 수 있고 (Kempf T, 2006, Circ Res.98:351-60) (Xu J, 2006, Circ Res. 98:342-50), 노화-연관 운동 뉴런 및 감각 뉴런 손실에 대해 보호적일 수 있으며 (Strelau J, 2009, J Neurosci . 29 : 13640-8), 신장에서 대사성 산증에 대해 경도로 보호적일 수 있고, 암 환자에서 악액질을 야기할 수 있음 (Johnen H 2007 Nat Med . 11: 1333-40)을 시사하였다. 다수의 그룹이 세포 아포토시스(apoptosis) 및 증식에서의 GDF15의 역할을 또한 연구하였고, 상이한 세포 배양 및 이종이식 모델들을 사용하여 논쟁적인 결과를 보고하였다. 트랜스제닉 마우스에서의 연구는 GDF15가 장 및 폐에서 발암원 또는 Ape 돌연변이-유도 신생물에 대해 보호적임을 나타냈다 (Baek SJ 2006, Gastroenterology. 131: 1553-60; Cekanova M 2009, Cancer Prev Res 2:450-8).
GDF15는 염증, 암 및 대사에서 역할을 하는 것으로도 보고되었다 (Samule Breit et al. Growth Factors, October 2011; 29(5): 187-195). GDF15는 추가로 생리학적 식욕 및 체중 조절에 연루되었다 (Vicky Wang-Wei Tsai et al. Public Library of Science: PLOS ONE 2013, Vol. 8, Issue 2, e55174).
본 발명은 생체 분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 염, 또는 접합체 혼합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 당뇨병, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
이같은 방법은 유리한 효과 예컨대 투여 빈도를 감소시키는 효과가 있을 수 있다.
따라서, 추가 실시양태로서, 본 발명은 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 본원에 기술된 바와 같은 접합체 또는 본원에 기술된 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염 또는 접합체 혼합물의 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료를 위한 용도를 제공한다.
따라서, 추가 실시양태로서, 본 발명은 요법에서의 접합체 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염, 또는 접합체 혼합물의 용도를 제공한다.
치료적으로 사용될 본 발명의 제약 조성물 또는 조합물의 유효량은, 예를 들어, 치료 맥락 및 목적에 좌우될 것이다. 통상의 기술자는 따라서 치료를 위한 적합한 투여량 수준이, 부분적으로, 전달되는 분자, 접합체가 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 크기 (체중, 체표면적, 또는 기관 크기) 및 상태 (연령 및 일반적인 건강)에 따라 다를 것임을 이해할 것이다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 수득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다. 전형적인 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상까지의 범위일 수 있다. 다른 실시양태에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 투여량은 투여량은 5 ㎍/kg 내지 25 ㎍/kg 범위일 수 있다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 투여량은 10 ㎍/kg 내지 20 ㎍/kg 범위일 수 있다.
투약 빈도는 사용되는 제형 내의 이중 기능 단백질의 약동학적 파라미터에 좌우될 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서 조성물은 단일 용량으로서, 2회 이상의 용량 (동일한 양의 원하는 분자를 함유할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있음)으로서 경시적으로, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통해 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적합한 투여량의 추가 정련이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 이루어지고, 이들이 일상적으로 수행하는 업무 영역에 속한다. 적합한 투여량을 적합한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료적 유효 용량" 및 "치료적 유효량"이라는 용어는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화 또는 호전을 포함하는, 연구원, 의사 또는 기타 임상의가 추구하는 조직계, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 약효성 반응을 도출하는 접합체의 양, 즉 관찰가능한 수준의 하나 이상의 목적한 생물학적 또는 약효성 반응, 예를 들어 혈액 글루코스, 트리글리세리드, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추는 것; 체중을 감소시키는 것; 음식물 섭취를 감소시키는 것 또는 글루코스 내성, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선하는 것을 지지하는 GDF15 (또는 GDF15 돌연변이체) 폴리펩티드의 양을 의미한다.
"환자" 또는 "대상체"라는 용어는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용된 바와 같은, 임의의 질환 또는 장애를 "치료하다", 이를 "치료하는", 또는 이의 "치료"라는 용어는 질환 또는 장애를 호전시키는 것 (즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달을 느리게 하거나, 정지시키거나 또는 감소시키는 것)을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 환자가 인식할 수 없는 것을 포함하는 적어도 하나의 신체적 파라미터를 완화 또는 호전시키는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 신체적으로 (예를 들어, 인식할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로 (예를 들어, 신체적 파라미터의 안정화), 또는 양쪽 모두로 조정하는 것을 지칭한다. 따라서, 치료는 활성 질환을 억제하는 것 (즉, 질환, 장애 또는 병태 또는 이와 연관된 임상 증상의 발달 또는 추가 발달을 정지시키는 것)을 포함한다 (예를 들어, GDF15 접합체의 경우, 체중을 감소시키도록, 음식물 섭취를 감소시키도록, 혈류 내의 인슐린 및/또는 글루코스 수준을 감소시키도록, 글루코스 내성을 증가시켜 글루코스 수준의 변동을 최소화하도록, 및/또는 글루코스 항상성의 파괴에 의해 야기되는 질환에 대해 보호하도록).
또 다른 실시양태에서, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 또는 발달 또는 진행을 예방하거나 지연시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료를 필요로 하는"이라는 용어는 대상체가 치료를 필요로 하거나 또는 치료가 대상체에게 이로울 것이라고 의사 또는 기타 관리자가 내리는 판단을 지칭한다. 이러한 판단은 의사 또는 관리자의 전문 지식의 영역에 속하는 다양한 요소를 기초로 이루어진다.
"예방하다", "예방하는", "예방" 등의 용어는, 일반적으로 특정 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬운 대상체의 정황에서, (예를 들어, 질환, 장애, 병태 또는 이의 증상의 발병 이전에) 질환, 장애, 병태 등이 발달될 대상체의 위험 (예를 들어, 임상 증상의 부재에 의해 결정된 바와 같음)을 일시적으로 또는 영구적으로 방지하거나, 저해하거나, 억제하거나 또는 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 방식으로 시작되는 행동 과정 (예컨대 본 발명의 접합체 또는 접합체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것)을 지칭한다. 특정 경우에, 이러한 용어는 질환, 장애 또는 병태의 진행을 느리게 하는 것 또는 해롭거나 또는 달리 바람직하지 않는 상태로의 이의 진행을 억제하는 것을 또한 지칭한다.
"대사 질환 또는 장애"라는 용어는 고인슐린혈증, 비정상적인 글루코스 내성, 비만, 복부 또는 상체 구획으로의 지방 재분포, 고혈압, 높은 트리글리세리드, 낮은 고밀도 지질단백질 (HDL)-콜레스테롤 및 높은 작고 조밀한 저밀도 지질단백질 (LDL) 입자를 특징으로 하는 이상지질혈증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 연관된 특색 군을 지칭한다. 대사 질환 또는 장애에 걸린 대상체는 제2형 당뇨병 및 예를 들어 아테롬성동맥경화증이 발달될 위험이 있다.
"글루코스 대사 장애"라는 구절은 건강한 개체에 비하여 대상체에서의 상승된 글루코스 수준 및/또는 상승된 인슐린 수준과 연관된 임상 증상 또는 임상 증상의 조합을 특징으로 하는 임의의 장애를 포함한다. 상승된 글루코스 및/또는 인슐린 수준이 하기의 질환, 장애 및 병태에서 명시될 수 있다: 특히, 고혈당증, 제II형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 제I형 당뇨병, 인슐린 저항성, 손상된 글루코스 내성, 고인슐린혈증, 손상된 글루코스 대사, 당뇨병 전기, 대사 장애 (예컨대 X 증후군으로 또한 지칭되는 대사 질환 또는 장애), 및 비만. 본 개시내용의 GDF15 접합체, 및 이의 조성물이, 예를 들어, 글루코스 항상성을 달성 및/또는 유지하기 위해, 예를 들어, 혈류 내의 글루코스 수준을 감소시키기 위해, 및/또는 인슐린 수준을 건강한 대상체에서 발견되는 범위로 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "인슐린 저항성"이라는 용어는 정상적인 양의 인슐린이 정상적인 생리학적 또는 분자적 반응을 일으킬 수 없는 병태를 지칭한다. 일부 경우에, 내인성으로 생산된 또는 외인성으로 투여된 생리학적으로 과다한 (hyper-physiological) 양의 인슐린이 인슐린 저항성을 전체적으로 또는 부분적으로 극복할 수 있고, 생물학적 반응을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "글루코스 내성"이라는 구절은 글루코스 섭취가 변동될 때 혈장 글루코스 및/또는 혈장 인슐린의 수준을 제어하는 대상체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 글루코스 내성은 약 120분 이내에 혈장 글루코스 수준을 글루코스 섭취 전에 결정된 수준으로 되돌려 감소시키는 대상체의 능력을 포함한다.
"글루코스 불내성", 또는 "손상된 글루코스 내성 (IGT)"이라는 용어는 심혈관 병리학의 위험 증가와 연관된 당뇨병 전기 상태의 이상혈당증이다. 당뇨병 전기 병태는 대상체가 글루코스를 세포 내로 효율적으로 이동시켜 이를 효율적인 연료원으로서 이용하는 것을 방지하여, 혈액에서의 글루코스 수준 상승 및 어느 정도의 인슐린 저항성에 이른다.
"제2형 당뇨병"이라는 용어는 과도한 글루코스 생산을 특징으로 하는 병태이고, 불충분한 글루코스 소거 및 췌장이 충분한 인슐린을 생산할 수 없는 것의 결과로서 순환 글루코스 수준이 과도하게 높게 잔존한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "고혈당증"이라는 용어는 건강한 개체에 비해 대상체의 혈액 혈장에서 상승된 양의 글루코스가 순환되는 병태를 지칭한다. 본원에 기술된 바와 같은 공복 혈액 글루코스 수준의 측정을 포함하여, 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 고혈당증이 진단될 수 있다.
낮은 혈당으로 또한 칭해지는 "저혈당증"이라는 용어는 혈액 글루코스 수준이 신체 활동을 위한 충분한 에너지를 제공하기에는 너무 낮게 저하될 때 발생한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "고인슐린혈증"이라는 용어는, 동반적으로 혈액 글루코스 수준이 상승되었거나 정상일 때, 순환 인슐린 수준이 상승된 병태를 지칭한다. 이상지질혈증 예컨대 높은 트리글리세리드, 높은 콜레스테롤, 높은 저밀도 지질단백질 (LDL) 및 낮은 고밀도 지질단백질 (HDL); 높은 요산 수준; 다낭성 난소 증후군; 제II형 당뇨병 및 비만과 연관된 인슐린 저항성에 의해 고인슐린혈증이 야기될 수 있다. 고인슐린혈증은 혈장 인슐린 수준이 약 2 pU/mL보다 높은 것으로 진단될 수 있다.
"췌장염"이라는 용어는 췌장의 염증이다.
"이상지질혈증"이라는 용어는 지질단백질 과다생산 또는 결핍을 포함하는, 지질단백질 대사의 장애이다. 혈액에서의 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질 (LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도의 상승 및 고밀도 지질단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소에 의해 이상지질혈증이 명시될 수 있다.
지방간으로 또한 공지된 "지방간 질환 (FLD)"이라는 용어는 지방증 프로세스 (즉, 세포 내에서의 지질의 비정상적 정체)를 통해 트리글리세리드 지방의 대형 액포가 간 세포에 축적되는 병태이다. 여러 원인이 있음에도 불구하고, 지방간은 알콜을 과도하게 섭취하는 사람 및 비만인 사람 (인슐린 저항성의 효과가 있거나 또는 이러한 효과가 없음)에서 전세계적으로 발생하는 단일 질환으로 간주될 수 있다. 지방 대사의 이러한 프로세스가 파괴되면, 지방이 과도한 양으로 간에 축적되어 지방간을 초래할 수 있다. 지방 축적은 지방간염으로 칭해지는, 간의 진행성 염증 (간염)을 동반할 수도 있다. 알콜 기여를 고려하여, 지방간은 알콜성 지방증 또는 또는 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD), 및 더욱 중증인 형태인 알콜성 지방간염 및 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로 명명될 수 있다.
"지방간염"이라는 용어는 소엽내 염증 및 섬유증을 동반한 간세포의 지방 변화를 특징으로 하는 간 질환의 유형이다. 과도한 알콜 섭취와 연관되지 않은 경우, 이는 비-알콜성 지방간염 (NASH)으로 지칭된다.
"진행성 간 질환"이라는 용어는 간 지방증과 같은 비교적 양성인 상태에서 간염, 섬유증, 간경변 및 간세포 암종을 포함하는 더욱 중증인 상태로 진행되는 광범위한 간 병리학에 의해 야기되는 간 질환이다. PNPLA3이 진행성 간 질환 예컨대 NAFLD/NASH, AFLD/ASH, 바이러스성 간염, 윌슨병, 유전성 혈색소증 및 원발성 경화성 담관염과 특히 연관되었다 (Paola Dongiovanni et al. World Journal of Gastroenterology, 2013, 19(41), 6969-6978).
인간 대상체의 관점에서의 "비만"이라는 용어는 체질량 지수 (BMI)가 30 이상인 성인으로서 정의될 수 있다 (미국 질병 관리 센터(Centers for Disease Control and Prevention)). "대사 증후군"은 심장 질환 및 기타 질환 예컨대 당뇨병 및 뇌졸중에 대한 위험을 상승시키는 위험 인자들의 군으로서 정의될 수 있다. 이러한 위험 인자들은 하기를 포함한다: 높은 혈당 - 공복 후 적어도 110 밀리그램/데시리터 (mg/dl); 높은 트리글리세리드 - 혈류 내의 적어도 150 mg/dL; 낮은 HDL - 40 mg/dl 미만; 및 130/85 mmHg 이상의 혈압 (세계 보건 기구(World Health Organization)).
"심혈관 질환"이라는 용어는 심장 또는 혈관과 관련된 질환이다.
"아테롬성동맥경화증"이라는 용어는 대형 및 중형 크기의 동맥의 내막 내의 불규칙하게 분포된 지질 침착물을 특징으로 하는 혈관 질환이고, 이는 때때로 동맥 내강의 협소화를 야기하고, 결국 섬유증 및 석회화로 진행된다. 병변은 일반적으로 국소적이고, 천천히, 그리고 간헐적으로 진행된다. 혈액 유동을 제한하는 것이 병변의 분포 및 중증도가 다양한 대부분의 임상 징후의 원인이다.
관상 동맥 질환으로 또한 칭해지는 "관상 심장 질환"이라는 용어는 혈액 및 산소를 심장에 공급하는 소형 혈관의 협소화이다.
"당뇨병 합병증"은 다른 신체 기능 예컨대 신장, 신경 (신경병증), 발 (발 궤양 및 불량한 혈행) 및 눈 (예를 들어, 망막병증)과 함께 높은 혈액 글루코스 수준에 의해 야기되는 문제이다. 당뇨병은 심장 질환 및 뼈 및 관절 장애에 대한 위험을 또한 증가시킨다. 당뇨병의 기타 장기 합병증은 피부 문제, 소화 문제, 성기능장애, 및 치아 및 잇몸 문제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "체중 장애"라는 구절은 과도한 체중 및/또는 식욕 강화와 연관된 병태를 지칭한다. 대상체의 연령, 신장, 성별 및 건강 상태를 포함하여, 다양한 파라미터가 건강한 기준 개체와 비교하여 대상체가 과체중인지 여부를 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 대상체의 체중 (킬로그램 단위)을 대상체의 신장 (미터 단위)의 제곱으로 나눔으로써 계산되는 대상체의 체질량 지수 (BMI)의 평가에 의해 대상체가 과체중 또는 비만인 것으로 간주될 수 있다. BMI가 -18.5 내지 -24.9 kg/m 범위인 성인은 정상 체중인 것으로 간주되고, BMI가 -25 내지 -29.9 kg/m인 성인은 과체중 (비만-전)으로 간주될 수 있으며, BMI가 -30 kg/m 이상인 성인은 비만으로 간주될 수 있다. 식욕 강화가 과도한 체중에 빈번하게 기여한다. 아침의 식욕 감퇴 및 저녁의 대식증 (종종 불면증과 연관됨)을 특징으로 하지만, 시상하부에 대한 손상과 관련될 수 있는 야식 증후군을 예를 들어 포함하여, 식욕 강화와 연관된 여러 병태가 있다.
본원에서 달리 지시되거나 또는 달리 맥락적으로 명확하게 모순되지 않는 한, 본원에 기술된 모든 방법이 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 본 발명을 더 잘 예시하도록 의도될 뿐이고, 달리 청구된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 방법에 의해 평가할 수 있다.
검정법 및 데이터
본 발명에 따른 실시예 1 및 19B의 GDF15 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
동물 연구용 방법
본 문서에 기술된 모든 동물 연구는 지방 및 연방 규정 및 지침에 따라 노바티스 생의학 연구 동물 관리 및 사용 위원회(Novartis Institutes for Biomedical Research Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 식이-유도 비만 수컷 마우스 (C57BL/6NTac)를 타코닉(Taconic)에서 구입하고, 6주령 이후로 계속 60％ 지방 사료 (리서치 다이어트(Research Diets) D12492i)를 급식하였다. 도착 시, 마우스를 우리 당 1마리의 동물로 12h:12h 반전 밝음-어두움 주기 하에서 거주시켰다. 모든 동물이 임의의 사용 전에 최소 1주일 동안 적응되었다. 전형적으로 3-4개월령의 마우스를 연구하였다. 연구 1일 전에, 각각의 군의 평균 체중이 유사하도록 마우스를 체중을 기초로 무작위화하였다. 연구일에, 마우스를 새로운 우리에 놓고, 오래된 음식물을 제거하였다. 약 1시간 후 및 어두움 주기 직전에, 마우스에게 단일 피하 용량의 비히클 (30 mM 아세트산나트륨, pH 4) 또는 지질-접합 GDF15 유사체 (0.5 mg/kg)를 제공하였다. 모든 주입을 완료한 후, 마우스의 체중을 다시 재고, 규정된 양의 음식물로 되돌렸다 (마우스 당 ~ 50 g). 음식물 섭취 및 체중을 ~2주의 과정에 걸쳐 도면에서 지시된 시점에 측정하였다. 상기 기술된 바와 같이 처리된 대리 동물에서, 지시된 시점에 혈장을 수집하고, 제조사 (R&D 시스템즈(R&D Systems)의 퀀티카인(Quantikine) 인간 GDF15 면역검정법; DGD150)의 설명서에 따라 ELISA에 의해 GDF15 수준을 측정하였다.
DIO 마우스 단일 0.5 mg/kg 피하 용량
본 발명의 접합체의 활성 및 반감기를 상기 기술된 검정법에서 테스트하였다.
<표 1>
Figure pct00046
표 1의 데이터는 본 발명의 접합체가 비-접합 hGDF15와 비교하여 및/또는 PEG화 hGDF15와 비교하여 유의하게 더 긴 작용 지속기간을 지닌다는 것을 실연한다.
사료를 급식한 개에서의 GDF15 -접합체 효능: GDF15 -지방산 접합체
연구 목적: 비글견에서의 급성 환경 (6시간)에서의 음식물 섭취 및 96시간 기간에 걸친 음식물 섭취에 대한 0.05 mg/kg의 본 발명에 따른 GDF15-지방산 모이어티 접합체 또는 비히클 대조군의 피하 투여의 효과의 평가. 이러한 화합물의 PK 프로파일을 평가하기 위해 14일의 투약-후 기간에 걸쳐 다양한 시점에 혈장 샘플을 수집하였다. 연구 동안 체중을 측정하였다.
<표 2>
동물: 기준선 체중 및 처리
Figure pct00047
투약 절차: 기준선 체중 및 혈액 샘플 수집 후에 비히클 또는 GDF15를 투약하였다. 0.97 mg/ml 용액으로서 GDF15-지방산 모이어티 접합체가 공급되었고, 희석하지 않고 0.05 mg/kg으로 피하 주사에 의해 투약하였다. 등가량의 30 mmol/l 아세트산나트륨 pH 4 비히클 (52 ㎕/kg)을 피하 주사에 의해 비히클 동물에게 제공하였다.
혈액 수집: 혈액 샘플을 요측피정맥 또는 경정맥으로부터 수집하고 (3 ml를 EDTA 및 프로테아제 억제제인 디프로틴(Diprotin) A 및 아프로티닌(Aprotinin)을 함유하는 튜브에 수집함), 4℃에서 20분 동안 3,000 rpm으로 원심분리할 때까지 얼음 상에 놓았다. 혈장을 분취량으로 분배하고, 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 하기의 시점에 수집하였다: 0, 6.75, 24.75, 48.75, 72.75 및 96.75시간. 제7일, 제10일 및 제14일에 추가적인 샘플을 수집하였다.
음식물 섭취 측정: 자유로운 음식물 섭취의 측정을 투약 45분 후에 시작하였다. 이러한 음식물 섭취 측정은 2가지 단계로 이루어진다: 급성 측정 (0-6시간) 및 아만성 측정 (0-96시간).
0-2시간 동안, 개에게 500 g의 일반식 (힐스(Hill's)의 J/D 사료)를 제공하였다. 2시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 또 다른 500 g의 사료를 2-4시간 기간 동안 제공하였다. 4시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 또 다른 300 g의 사료를 4-6시간 기간 동안 제공하였다. 6시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하였다. 혈액 샘플을 이러한 시점 (6.75시간)에 수집하였다. 그 후, 개에게 500 g의 사료를 철야로 제공하였다. 제1일-제4일 아침에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 각각의 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 제1일-제3일에, 그 후 개에게 500 g의 사료를 24시간 기간 동안 제공하였다. 제4일에, 개를 이의 일반적인 할당량의 사료 (260 g)로 돌려보냈다.
추가적인 음식물 섭취 측정: 제7일, 제14일 및 제28일에, 연구 동물에게 이의 일일 사료 (260 g)를 소비하도록 6시간을 제공하였다. 이러한 기간 말기에, 임의의 나머지 음식물을 수집하고, 칭량하였다.
체중 측정: 기준선 및 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제18일 및 제28일에 체중을 측정하였다. 기준선 체중은 공복 상태에서 수집하였다. 제2일 및 제4일에 수집된 체중은 공복 상태가 아니였다. 비히클 처리 동물의 경우, 모든 다른 체중을 공복 상태에서 수집하였다. GDF15 처리 동물의 경우, 식욕을 자극하고 체중을 되찾기 위해 동물에게 음식물을 계속 제공하였기 때문에, 제7일-제28일에 측정된 체중은 공복 상태가 아니였다.
사료를 급식한 개에서의 본 발명의 GDF15 -지방산 접합체의 효능 검정법
연구 목적: 비글견에서의 급성 환경 (6시간)에서의 음식물 섭취 및 96시간 기간에 걸친 음식물 섭취에 대한 비히클 대조군 및 0.015 mg/kg 또는 0.005 mg/kg의 본 발명의 GDF15-지방산 모이어티 접합체의 피하 투여의 효과의 평가 (이러한 연구에서, 모든 개에서 비히클 아암이 처리 아암 전에 수행될 것이다). 이러한 화합물의 PK 프로파일을 평가하기 위해 14일의 투약-후 기간에 걸쳐 다양한 시점에 혈장 샘플을 수집하였다. 연구 동안 체중을 측정하였다.
<표 3>
동물: 기준선 체중 및 처리
Figure pct00048
투약 절차: 기준선 체중 및 혈액 샘플 수집 후에 비히클을 투약하였다. 52 ㎕/kg의 30 mmol/l 아세트산나트륨 pH 4 비히클 (52 ㎕/kg)을 피하 주사에 의해 비히클 동물에게 제공하였다. 기준선 체중 및 혈액 샘플 수집 후에 GDF15를 투약하였다. 1.20 mg/ml 용액으로서 GDF15-지방산 모이어티 접합체가 공급되었고, 0.015 mg/kg 및 0.005 mg/kg으로 희석 후에 피하 주사에 의해 투약하였다. 이전 연구에서 전달된 52 ㎕/kg을 유지하기 위해 GDF15 원액이 희석되었다.
혈액 수집: 연구의 비히클 및 처리 아암에 대해 혈액 샘플을 수집하였다. 샘플을 요측피정맥 또는 경정맥으로부터 수집하고 (3 ml를 EDTA 및 프로테아제 억제제인 디프로틴 A 및 아프로티닌을 함유하는 튜브에 수집함), 4℃에서 20분 동안 3,000 rpm으로 원심분리할 때까지 얼음 상에 놓았다. 혈장을 분취량으로 분배하고, 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 하기의 시점에 수집하였다: 0, 6.75, 24.75, 48.75, 72.75 및 96.75시간. 제7일, 제10일 및 제14일에 추가적인 샘플을 수집하였다.
음식물 섭취 측정: 연구의 비히클 및 처리 아암 양쪽 모두 동안에 음식물 섭취를 측정하였다. 자유로운 음식물 섭취의 측정을 투약 45분 후에 시작하였다. 이러한 음식물 섭취 측정은 2가지 단계로 이루어진다: 급성 측정 (0-6시간) 및 아만성 측정 (0-96시간).
0-2시간 동안, 개에게 500 g의 일반식 (힐스의 J/D 사료)를 제공하였다. 2시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 또 다른 500 g의 사료를 2-4시간 기간 동안 제공하였다. 4시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 또 다른 300 g의 사료를 4-6시간 기간 동안 제공하였다. 6시간에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하였다. 혈액 샘플을 이러한 시점 (6.75시간)에 수집하였다. 그 후, 개에게 500 g의 사료를 철야로 제공하였다. 제1일-제4일 아침에, 나머지 음식물을 제거하고, 칭량하고, 각각의 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 제1일-제3일에, 그 후 개에게 500 g의 사료를 24시간 기간 동안 제공하였다. 제4일에, 개를 이의 일반적인 할당량의 사료 (260 g)로 돌려보냈다.
추가적인 음식물 섭취 측정: 비히클 아암에서의 제7일과 제14일 사이 및 처리 아암에서의 제7일과 제28일 사이의 다양한 날에, 연구 동물에게 이의 일일 사료 (225 g)를 소비하도록 6시간을 제공하였다. 이러한 기간 말기에, 임의의 나머지 음식물을 수집하고, 칭량하였다. 1주일에 1번, 음식물 소비를 시간별로 측정하였다. 225 g 사료의 소비를 급식 1, 2, 4 및 6시간 후에 측정하여, 각각의 개의 급식 패턴이 정상으로 돌아왔는지를 결정하였다.
체중 측정: 연구의 비히클 및 처리 아암 양쪽 모두 동안에 체중을 측정하였다. 비히클 아암 동안, 기준선 및 제2일, 제4일, 제7일, 제10일 및 제14일에 체중을 측정하였다. 처리 아암 동안, 기준선 및 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제17일, 제21일, 제24일 및 제28일에 체중을 측정하였다. 제2일 및 제4일에 수집된 체중은 공복 상태가 아니였다. 모든 다른 체중은 공복 상태에서 결정되었다.
실시예 2의 접합체를 상기 검정법에서 테스트하였다.
<표 4>
개 단일 피하 용량
Figure pct00049
GDF15 -접합체가 비만 마우스에서 당뇨병 및 지방간 질환을 포함한 대사 질환의 척도를 개선한다
식이-유도 비만 마우스에게 비히클 또는 실시예 19Bm (0.5 mg/kg/ 피하)을 4주 동안 1주일에 1회 투약하였다. 비-공복 글루코스 및 인슐린을 1차 투약 2주 후에 측정하였고, 철야 공복 혈액 글루코스 및 인슐린을 1차 투약 4주 후에 측정하였다. 실시예 19Bm이 비-공복 글루코스를 23％만큼 감소시켰다 (207.1 mg/dl 비히클 처리 대 160.4 mg/dl 실시예 19Bm; p<0.05). 실시예 19Bm이 비-공복 인슐린 수준을 비히클 처리 마우스에 비교하여 75％만큼 감소시켰다 (2.1 대 8.7 ng/ml; p<0.05). 최초 투약 4주 후에, 실시예 19Bm이 공복 혈액 글루코스를 28％만큼 감소시켰고 (142.7 대 199.5 mg/dl; p<0.05), 공복 인슐린을 78％만큼 감소시켰다 (0.77 대 3.5 ng/ml; p<0.05). 4회의 1회/주 용량의 실시예 19Bm에 의해 지방간 질환의 마커가 또한 개선되었다. 실시예 19Bm이 간 지방증을 57.5％만큼 감소시켰고 (11.36 대 26.73％ 간 지방; p<0.05), 간세포 손상 마커인 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈청 수준을 58％만큼 감소시켰다 (46.2 대 110.5 U/L; p<0.05). 또한, 실시예 19Bm이 진행성 간 질환에서의 원인성 유전자인 PNPLA3의 간 발현을 77％ (p<0.05)만큼 감소시켰다.
본 발명에 따른 실시예 20 및 21의 APJ-효능제 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
hAPJ 칼슘 유동 검정법:
안정적인 Chem-5 APJ 세포 (밀리포어(Millipore) # HTS068C)를 384-웰 포맷으로 25 ul 성장 배지 내에 10,000개의 세포/웰로 플레이팅한 후, 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 24시간 성장시켰다. 검정법 1시간 전에, 25 ul/웰 FLIPR 칼슘 4 염료 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) R8142) + 2.5 mM 프로베네시드를 첨가하고, 세포를 37℃ 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 인큐베이션하였다. 펩티드를 HBSS, HEPES & 0.1％ BSA 완충제에 가용화시키고, 삼중으로 50 uM에서 5 pM로 10배로 연속 희석하였다. FLIPR 테트라(Tetra)를 사용하여, 펩티드를 염료와 함께 세포에 첨가하였다 (1:5, 10 uM 내지 1 pM 범위의 최종 펩티드 농도). 세포 내부의 FLIPR 염료는 칼슘에 결합한 후 형광을 방출한 반면, 세포 외부로부터의 형광은 차폐되었다. FLIPR 테트라 상에서 470-495 여기 및 515-575 방출 파장을 사용하여 형광을 측정하였다. 펩티드 첨가 10초 전에 시작하여, 총 3분 동안 판독하였다. 각각의 펩티드 농도에 대해 최대-최소 값을 계산하여 플롯팅하였고, 그래프패드 프리즘(GraphPad prism) 소프트웨어를 사용하여, 펩티드에 의한 칼슘 유동 자극에 대해 곡선 변곡점에서 EC50 값을 계산하였다.
생체내 검정법:
접합체를 PBS (포스페이트 완충 염수)에 1 mg/ml의 농도로 용해시켜 투약 용액을 형성시켰다. 투약 용액을 1 mg/kg의 용량에 상응하는 1 ml/kg 체중의 부피로 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여하였다. 투약 후의 미리 정해진 시간에 정맥혈 샘플을 경정맥 카테터로부터 획득하고, 즉각적으로 젖은 얼음 상에 놓았다. 이러한 샘플을 4℃에서 원심분리하고, 상청액 혈장을 분석을 위해 신선한 튜브로 옮겼다.
생분석:
표준 곡선 제조: 펩티드 접합체를 물에 1 mg/ml로 용해시킴으로써 원액을 제조하였다. 10 uL의 원액을 990 uL 래트 혈장과 혼합하여, 혈장 내의 10,000 ng/ml의 작업 원액을 형성시켰다. 이를 혈장에서 연속 희석하여, 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5 및 1 ng/ml의 표준물을 형성시켰다.
샘플 및 표준물 제조: 25 uL 혈장 샘플 또는 표준물을 깨끗한 플레이트로 옮겼다. 내부 표준물로서의 100 ng/ml 글리부리드를 함유하는 150 uL 아세토니트릴:MeOH (1:1)를 각각의 바이알에 첨가하고, 내용물이 혼합되도록 플레이트를 와동시켰다. 플레이트를 4℃에서 4000 rpm으로 원심분리하였다. 125 uL 상청액을 깨끗한 플레이트로 옮기고, 50 uL 물과 혼합하고, LC/MS로 분석하였다.
LC/MS 분석:
HPLC: 오토샘플러가 있는 애질런트(Agilent) 1290 HPLC
칼럼: MAC-MOD ACE C18, 3 ㎛, 30 mm × 2.1 mm 내부 직경
이동상 A: 아세토니트릴 내의 0.1％ 포름산
이동상 B: 물 내의 0.1％ 포름산
구배 프로그램:
Figure pct00050
질량 분광계: AB 사이엑스(AB Sciex) 6500
MS 조건: Q1 (m/z+) 809.3; Q3 (m/z+) 923.7; DP: 60; CE: 25
데이터 분석: 왓슨 LIMS(Watson LIMS) v7.4 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터를 포착하고 분석하였다.
상기 기술된 검정법을 사용한 본 발명의 APJ 효능제 -접합체의 활성 및 안정성
<표 5>
Figure pct00051
본 발명에 따른 실시예 26A 및 26B의 옥시토신 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
시험관내 검정법 설명:
물질 & 방법
화합물 플레이트 제조
공급된 화합물이 DMSO에서 제조되었고, 궁극적으로는 최종 검정법 농도보다 3배 더 높은 농도로 유로핀스 디스커버리 서비시즈(Eurofins Discovery Services)의 GPCR프로파일러(GPCRProfiler)® 검정법 완충제에서 제조되었다. 유사하게, 비히클 대조군 및 양성 대조군이 모든 검정법이 적합하게 제어되는 것을 확실히 하도록 제조되었다.
Figure pct00052
모든 웰을 유로핀스 디스커버리 서비시즈의 GPCR프로파일러® 검정법 완충제를 사용하여 제조하였다. GPCR프로파일러® 검정법 완충제는 pH 7.4에서 20 mM HEPES 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하도록 보충된 변형된 행크 밸런스 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution) (HBSS)이었다.
칼슘 유동 검정법
효능제 검정법
공급된 화합물(들)을 검정된 각각의 농도에 대해 이중으로 플레이팅하였다.
검정법 대조군으로서의 역할을 하도록 참조 효능제인 옥시토신을 유사한 방식으로 제조하였다. 참조 효능제인 옥시토신은 Emax (참조 효능제가 최대 반응을 도출한 농도)로 포함되었다.
형광/발광 기준선이 확립된 후 테스트 화합물(들), 비히클 대조군 및 참조 효능제가 검정법 플레이트에 첨가된 FLIPRTETRA 기기에서 효능제 검정법을 수행하였다. 효능제 검정법은 총 180초였고, 검정된 각각의 GPCR을 활성화시키는 각각의 화합물의 능력을 평가하도록 사용되었다.
3분 효능제 검정법의 완료 시, 검정법 플레이트를 추가로 7분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다.
데이터 프로세싱
모든 플레이트를 적합한 기준선 보정에 적용하였다. 기준선 보정이 프로세싱되었으면, 최대 형광/발광 값을 내보내고, 데이터를 조작하여 활성화 백분율 및 억제 백분율을 계산하였다. 0 내지 -30％의 음의 값은 생물학적 가변성의 결과일 수 있다. 데이터 조작 계산은 하기와 같다: ((최대 RLU)-(기준선 평균)) / ((양의 값 평균)-(기준선 평균))
생체내 검정법 설명:
접합체를 PBS (포스페이트 완충 염수)에 3 mg/ml의 농도로 용해시켜 투약 용액을 형성시켰다. 투약 용액을 3 mg/kg의 용량에 상응하는 1 ml/kg 체중의 부피로 수컷 스프라그-돌리 래트의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여하였다. 투약 후의 미리 정해진 시간에 정맥혈 샘플을 경정맥 카테터로부터 획득하고, 즉각적으로 젖은 얼음 상에 놓았다. 이러한 샘플을 4℃에서 원심분리하고, 상청액 혈장을 분석을 위해 신선한 튜브로 옮겼다.
생분석:
표준 곡선 제조: 펩티드 접합체 및 펩티드를 2개의 별개의 바이알에서 디메틸술폭시드에 1 mg/ml로 용해시킴으로써 원액을 제조하였다. 10 uL의 각각의 원액을 980 uL 래트 혈장과 혼합하여, 혈장 내의 10,000 ng/ml의 작업 원액을 형성시켰다. 이를 혈장에서 연속 희석하여, 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 및 0.1 ng/ml의 표준물을 형성시켰다.
샘플 및 표준물 제조: 25 uL 혈장 샘플 또는 표준물을 깨끗한 플레이트로 옮겼다. 내부 표준물로서의 100 ng/ml 글리부리드를 함유하는 150 uL 아세토니트릴을 각각의 바이알에 첨가하고, 내용물이 혼합되도록 플레이트를 와동시켰다. 플레이트를 4℃에서 4000 rpm으로 원심분리하였다. 125 uL 상청액을 깨끗한 플레이트로 옮기고, 150 uL 물과 혼합하고, LC/MS로 분석하였다.
LC/MS 분석:
HPLC: 오토샘플러가 있는 애질런트 1290 HPLC
칼럼: MAC-MOD ACE C18, 3 ㎛, 30 mm × 2.1 mm 내부 직경
이동상 A: 아세토니트릴 내의 0.1％ 포름산
이동상 B: 물 내의 0.1％ 포름산
구배 프로그램:
Figure pct00053
질량 분광계: AB 사이엑스 6500
펩티드 MS 조건: Q1 (m/z+) 945.20; Q3 (m/z+) 687.27; DP: 140; CE: 39
펩티드 접합체 MS 조건: Q1 (m/z+) 1270.85; Q3 (m/z+) 468.30; DP: 140; CE: 77
데이터 분석: 왓슨 LIMS v7.4 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터를 포착하고 분석하였다.
상기 기술된 검정법에 따른 본 발명의 옥시토신 지방산 접합체의 활성 및 안정성
<표 6>
Figure pct00054
WO2014/095773의 실시예 13이 하기에서 표시된다:
Figure pct00055
본 발명의 옥시토신-지방산 접합체가 비-접합 옥시토신 유사체와 비교하여 반감기에서 75배의 증가를 실연한다.
본 발명에 따른 실시예 27A 및 27B 의 AgRP 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
A) HTRF cAMP 검정법 프로토콜:
HEK293 / MC4R 세포의 계대
세포: 안정적인 HEK293/MC4R 세포주
완전 배지: DMEM/F12 1:1 (깁코(Gibco), 카탈로그 번호 11039, 검정법의 경우는, 비-페놀 레드 배지 카탈로그 번호 21041)
10％ FBS (열 불활성화, 깁코, 카탈로그 번호 10082)
200 ㎍/mL 제네티신(Geneticin) (깁코, 카탈로그 번호 10131)
15 mM 헤페스(Hepes) (깁코, 카탈로그 번호 15630)
2 mM L-글루타민 (깁코, 카탈로그 번호 25030)
플라스크: 150 ㎠ 조직 배양 처리 플라스크 (코닝(Corning), 카탈로그 번호 430825).
- 컨디셔닝 배지를 흡인한다.
- 25 mL의 DPBS (깁코, 카탈로그 번호 14190)로 세정한 후, 이를 흡인한다.
* FBS가 트립신- EDTA 처리를 억제한다
- 2.5 mL의 0.05％ 트립신-EDTA (깁코, 카탈로그 번호 25300)를 첨가한다.
- 수 분 동안 방치한 후, 플라스크를 수회 탭핑(tapping)하여 세포를 탈착시킨다.
- 25 mL의 완전 배지를 첨가하여 트립신-EDTA 처리를 정지시킨다.
* 검정법용 세포 제제의 경우 , 비-페놀 레드 완전 배지를 사용하여야 한다.
- 부드럽게 수회 피펫팅하여 덩어리진 세포를 재현탁시킨다.
- 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다
- 1200 rpm으로 3분 동안 스피닝한다
- 상청액을 흡인한다
- 바닥을 부드럽게 탭핑함으로써 세포를 분산시킨다
- 5-10 mL의 완전 배지를 첨가한 후, 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킨다.
* 검정법용 세포 제제의 경우 , 비-페놀 레드 완전 배지를 사용하여야 한다.
- 0.5 mL의 현탁액을 바이-셀(Vi-cell)을 위한 샘플 바이알로 옮긴다
- 바이-셀에 의해 세포수를 계수한다. * 매번 세포 밀도 및 생육력을 기록한다.
- 1-3×106개의 세포를 새로운 150 cm 플라스크로 옮긴다.
3일 동안: 3×106개의 세포/플라스크
4일 동안: 1×106개의 세포/플라스크
- 37℃에서 5％ CO2로 인큐베이션한다.
HTRF cAMP 검정법을 위한 세포 시딩 (seeding) (검정법 1일 전)
Figure pct00056
계대 섹션에서와 같이 세포 현탁액을 제조한다.
Figure pct00057
현탁액을 2.34 ×105 개의 세포/mL로 희석한다
* 13 mL가 하나의 384-웰 플레이트에 충분하다
Figure pct00058
30 ㎕의 세포 현탁액을 폴리-D-리신 바이오코트(BIOCOAT) 384-웰 투명 플레이트 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 카탈로그 번호 354660)의 각각의 웰 내로 분배한다: 7000 개의 세포/웰
* 폴리 -D-리신 코팅 플레이트가 이러한 검정법에서 필수적이다.
* cAMP 표준물의 웰에는 세포가 없다.
Figure pct00059
37℃에서 5％ CO2로 철야로 인큐베이션한다.
HTRF cAMP 검정법
1. 시약 제조
Figure pct00060
1 M IBMX
IBMX (MW 222.25 g/mol, 아크로스(ACROS) 카탈로그 번호 228420010) 111 mg
DMSO (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 카탈로그 번호 D2650) 500 uL
4℃에서 보관한다
Figure pct00061
40 mg /mL BSA 용액
소 혈청 알부민 (시그마(Sigma) A7030-50G) 200 mg
dH2O 5 mL
4℃에서 보관한다
Figure pct00062
1 mg /mL (176 uM ) AgRP 마스터 용액 ( HBSS / 2 mg /mL BSA 내)
R&D 인간 AgRP C-말단 (카탈로그 번호 3726-AG-100) 100 ug/바이알
1× 행크 완충 염 용액 (HBSS) (깁코, 카탈로그 번호 14065, Ca 및 Mg 있음) 95 uL
40 mg/mL BSA 용액 5 uL
4℃에서 보관한다
Figure pct00063
2 mM NDP - aMSH 마스터 용액
NDP-aMSH (MW 1646.9, 바켐(Bachem), 카탈로그 번호 H1100) 1 mg/바이알
dH2O 304 uL
* 용해되면, 10 uL 분취량을 200 uL 튜브로 분배한 후, -20℃에서 보관한다.
Figure pct00064
검정법 완충제 1
HBSS 10 mL
1 M 헤페스 (깁코, 카탈로그 번호15630) 0.2 mL
1 M IBMX 20 uL
* IBMX 침전을 방지하기 위해, 완전히 용해될 때까지 완충제를 와동시키기 바란다.
Figure pct00065
검정법 완충제 2
HBSS 20 mL
1 M Hepes (깁코, 카탈로그 번호15630) 0.4 mL
1 M IBMX 40 uL
40 mg/mL BSA 용액 0.25 mL
* IBMX 침전을 방지하기 위해, 완전히 용해될 때까지 완충제를 와동시키기 바란다.
Figure pct00066
IgG 적정 및 AgRP 적정을 위한 6 nM NDP - aMSH
2 uM NDP-aMSH (마스터 용액의 1000배 희석물) 10.8 uL
검정법 완충제 1 3600 uL
* 하나의 384-웰 검정법에 대한 예
Figure pct00067
IgG 적정을 위한 120 nM AgRP
10배 희석된 마스터 용액 (17.6 uM) 26 uL
검정법 완충제 2 3800 uL
* 하나의 384-웰 검정법에 대한 예
Figure pct00068
적정을 위한 NDP-aMSH 작업 용액 (시약 참조)
Figure pct00069
적정을 위한 AgRP 작업 용액 (시약 참조)
Figure pct00070
적정을 위한 IgG 작업 용액 (시약 참조)
Figure pct00071
cAMP 표준 용액 (시약 참조)
2. 검정법 (2단계 프로토콜)
검정법 키트 : 시스바이오(Cisbio)의 cAMP 하이레인지 ( HiRange ) HTRF 키트 (카탈로그 번호 62AM6PEB )
- IgG/AgRP 믹스 (1:1)의 제조
Figure pct00072
15 uL의 IgG 작업 용액 및 15 uL의 120 nM AgRP를 혼합한 후, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션한다
- 검정법 플레이트의 제조
Figure pct00073
세포를 함유하는 384-웰 검정법 플레이트를 와이프올(Wipeall) 상에 뒤집고, 배양 배지를 제거하기 위해 탭핑함으로써, 배양 배지를 폐기한다.
Figure pct00074
100 ㎕의 DPBS를 각각의 웰에 첨가하고, 동일한 방식으로 폐기한다.
* PBS를 폐기했으면, 가능한 한 빨리 다음 단계로 이동하여 건조를 방지한다.
Figure pct00075
10 ㎕의 하기 시약을 샘플 정렬을 기초로 각각의 웰 내로 옮긴다.
cAMP 표준물: : cAMP 표준물
cAMP 적정을 위한 음성 대조군 : HTRF 키트 내의 희석제
양성 대조군 : HTRF 키트 내의 cAMP 양성 대조군
MSH 적정 : 검정법 완충제 2
AgRP 적정 : AgRP 작업 용액
IgG 적정 : IgG/AgRP 혼합물
세포 검정법에 대한 음성 대조군 : 검정법 완충제 2
- 384-웰 플레이트를 1200 RPM으로 순간적으로 스피닝한다.
- 세포를 15분 동안 주위 온도에서 인큐베이션한다.
- 10 ㎕의 하기 시약을 샘플 정렬을 기초로 각각의 웰 내로 옮긴다.
cAMP 표준물: : 검정법 완충제 1
cAMP 적정을 위한 음성 대조군 : 검정법 완충제 1
양성 대조군 : 검정법 완충제 1
MSH 적정 : MSH 작업 용액
AgRP 적정 : 6 nM MSH 용액
IgG 적정 : 6 nM MSH 혼합물
세포 검정법에 대한 음성 대조군 : 검정법 완충제 1
- 384-웰 플레이트를 1200 RPM으로 순간적으로 스피닝한다.
- 세포를 추가로 30분 동안 주위 온도에서 인큐베이션한다
* 이러한 인큐베이션 시간은 엄격하지 않다. 검정법 개발 데이터에 따라 +/- 5분이 허용되어야 한다.
- 10 ㎕의 cAMP-d2 (키트에서 제공된 용해 완충제에 1:4 희석됨)를 첨가한다.
* 중요!! 음성 대조군의 경우 , cAMP -d2가 아니라 용해 완충제만 첨가한다.
- 10 ㎕의 항-cAMP 크립테이트 (키트에서 제공된 용해 완충제에 1:4 희석됨)를 첨가한다.
- 1200 RPM으로 순간적으로 스피닝한다
- 검정법 플레이트를 45-60분 동안 주위 온도에서 인큐베이션한다.
- 30 ㎕의 각각의 샘플을 백색의 조직 배양 처리 폴리스티렌 384-웰 검정법 플레이트 (코닝, 카탈로그 번호 3572)로 옮긴다.
- 1200 RPM으로 순간적으로 스피닝한다.
- 하기 설정의 몰레큘러 디바이스 M5 또는 M5e로 형광을 측정한다.
몰레큘러 디바이스 M5/M5e 설정
Figure pct00076
B) MC3 cAMP 검정법
물질:
세포: 안정적인 HEK293/MC3R 세포주
완전 배지: DMEM/F12 1:1 (깁코, 카탈로그 번호 11039)
10％ FBS (열 불활성화, 깁코, 카탈로그 번호 10082) x
200 ㎍/mL 제네티신 (깁코, 카탈로그 번호 10131)
2 mM L-글루타민 (깁코, 카탈로그 번호 25030)
플라스크: 150 ㎠ 조직 배양 처리 플라스크 (코닝, 카탈로그 번호 430825).
검정법 완충제
HBSS (깁코 - 14175-095) 10 mL
1 M 헤페스 (피셔(Fisher), 카탈로그 번호 BP299-1) 0.2 mL
500 mM IBMX (MW 222.25 g/mol, 아크로스 카탈로그 번호 228420010) 40 ul
BSA 0.25％
플레이트
고형 바닥의 384-웰, 그라이너 바이오-원(Greiner bio-one) (카탈로그 번호 - 781080)
검정법 프로토콜 (길항제 프로토콜):
I. 컨디셔닝 배지를 흡인한다.
II. 2.5 mL의 DPBS (깁코, 카탈로그 번호 14190)로 세정한다.
III. 2 mL의 0.25％ 트립신-EDTA (깁코, 카탈로그 번호 25200-056)를 첨가한다.
IV. 플라스크를 수 분 동안 인큐베이터에서 방치하고, 플라스크를 수회 탭핑하여 세포를 탈착시킨다.
V. 10 mL의 완전 배지를 첨가하여 트립신-EDTA 처리를 정지시키고, 부드럽게 수회 피펫팅함으로써 이를 잘 혼합하여, 덩어리진 세포를 재현탁시킨다.
VI. 1.5 ml의 세포를 20 mL의 완전 배지를 함유하는 새로운 150 cm 플라스크로 옮긴다.
VII. 나머지 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
VIII. 1200 rpm으로 4분 동안 스피닝한다. 상청액을 흡인한다.
IX. 6 mL의 검정법 완충제를 튜브에 첨가하고, 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킨다.
X. 0.5 mL의 현탁액을 바이-셀을 위한 샘플 바이알로 옮기고, 또 다른 0.5 ml의 PBS를 첨가한다.
XI. 바이-셀에 의해 세포수를 계수한다. * 매번 세포 밀도 및 생육력을 기록한다.
i. 세포를 IBMX를 함유하는 10 ul/웰의 검정법 완충제에 4000개/웰로 플레이팅한다.
ii. 현탁액 세포에서 검정법을 시작하기 전에 ~30분 동안 플레이트를 인큐베이터에서 방치한다.
cAMP 결정을 위해 2-단계 cAMP 프로토콜을 따른다.
절차
I. 10 ul/웰의 세포에, 검정법 완충제에서 3×로 제조된 5 ul의 AgRP를 길항제 웰에만 첨가한다.
II. 5 ul의 완충제를 양성 대조군 웰 (NDP-α-MSH가 있을 웰)에 첨가한다.
III. 플레이트를 37℃에서 ~20분 동안 인큐베이션한다.
IV. 4×로 제조된 5 ul/웰의 효능제 EC80 (NDP-α-MSH)을 AgRP DRC를 함유하는 웰에 첨가한다.
V. NDP-α-MSH EC50 계산을 위해 4× (플레이트에서의 최종 최고 농도는 100 nM임)로 제조된 5 ul/웰의 효능제 (NDP-α-MSH) DRC를 첨가한다.
VI. 음성 대조군에만 완충제를 첨가한다.
VII. 384-웰 플레이트를 펄스식으로 스피닝하고, 세포를 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
VIII. 10 ㎕의 하기 시약을 각각의 웰에 첨가한다:
a. 10 ㎕의 cAMP-d2
b. *중요!! 음성 대조군의 경우 , cAMP -d2를 첨가하지 않고 용해 완충제 및 10 ul/ 웰의 Tb - 크립테이트만 첨가한다.
c. 10 ㎕의 항-cAMP 크립테이트
d. 플레이트를 펄스식으로 스피닝하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다.
C. 생체내 검정법 설명 :
10 나노몰의 접합체를 300 ㎕의 PBS (포스페이트 완충 염수)에 용해시켜 투약 용액을 형성시켰다. 투약 용액 (300 μM)을 수컷 스프라그-돌리 래트의 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 투여하였다 (래트 당 10 나노몰 용량에 상응함). 투약 후의 미리 정해진 시간에 혈액을 꼬리 절단을 통해 수집하고, 즉각적으로 젖은 얼음 상에 놓았다. 이러한 샘플을 4℃에서 원심분리하고, 상청액 혈장을 분석을 위해 신선한 튜브로 옮겼다.
생분석:
표준 곡선 제조: 실시예 27A 및 27B의 2개의 지방산 접합체 및 1개의 성숙 인간 AgRP 펩티드를 사용하여 표준물을 제조하였다. 원액으로 표지된 펩티드를 ELISA 샘플 희석제 + 카제인에 100 ug/ml로 희석함으로써 각각의 AgRP의 중간체 원액을 제조하였다. 검정법을 위해, ELISA 샘플 희석제 + 소 혈청 알부민 (BSA)에서 중간체를 2500 pg/mL의 최고 표준 농도로 희석한 후, 0 용량 표준물을 포함하는 16가지의 지점으로 2배로 연속 희석하였다
샘플 희석: ELISA 샘플 희석제 + BSA에서 혈장 샘플을 10배로 희석한 후, 31,250배까지 5배 연속 희석하였다.
5B1 인간 AgRP ELISA 방법: 384-웰 마이크로플레이트를 항-인간 AgRP 클론 5B1로 1× PBS 내의 30 uL/웰로 실온 (RT)에서 철야로 코팅하였다. 플레이트를 흡인하고, 90 uL/웰의 밀크-기반 차단제로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 모든 추가 인큐베이션을 30 uL/웰로 수행하였다. 플레이트를 다시 흡인하고, 샘플 및 표준물을 2시간 동안 실온에서 웰에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 포스페이트 기반 세정 완충제 + 트윈-20으로 3회 세정하고, 비오틴화 염소 항-인간 AgRP 폴리클로날 항체를 웰에 첨가하여, 2시간 동안 실온에서 결합된 AgRP를 검출하였다. 플레이트를 다시 세정하고, HRP-표지 스트렙타비딘 시약을 30분 동안 실온에서 웰에 첨가하였다. 웰을 마지막으로 세정하고, 화학발광 기질을 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 즉각적으로 스펙트라맥스(Spectramax) M5에서 빛 출력에 대해 판독하였다.
데이터 분석: 미처리 데이터를 구조화하고, 기본적인 PK 파라미터에 대해 분석하였다.
상기 기술된 검벙법에 따른 본 발명의 AgRP 지방산 접합체의 활성 및 안정성 :
<표 7>
Figure pct00077
실시예 28A, 28B 및 28C의 FGF23 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 방법으로 평가할 수 있다.
시험관내 활성 검정법
Egr -1- 루시페라제 : 정제된 hFGF23-FA 접합체의 생물학적 활성을 Egr-1-루시페라제 리포터 검정법에서 테스트하였다. hFGF23-FA 접합체가 FGF23 수용체에 결합하면, Egr-1의 하류 활성화 및 Egr-1 프로모터에 의해 조절되는 루시페라제 리포터의 발현이 초래된다. 문헌 [Urakawa et al., Nature, 2006, Vol 444, 770-774]에서 보고된 것을 기초로 Egr-1-루시페라제 리포터 유전자를 구축하였다. 48-웰 폴리-D-리신 플레이트에 시딩된 HEK293T 세포를 Egr-1-루시페라제 리포터 유전자, 전장 막횡단 형태의 클로토 및 형질감염 표준화 리포터 유전자 (레닐라(Renilla) 루시페라제)로 형질감염시켰다. 형질감염 5시간 후, 형질감염 믹스를 등급화된 농도의 테스트 단백질을 함유하는 3 ml DMEM + 1％ FBS로 교체하였다. 20시간 후에 세포를 수동 용해 완충제 (프로메가(Promega), 카탈로그 #E194A)에서 용해시키고, 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시페라제 검정법 시스템 (프로메가, 카탈로그 #E2940)을 사용하여 루시페라제 활성을 결정하였다.
결과
<표 8>
Figure pct00078
본 발명에 따른 실시예 29A 및 29B의 세릴랙신 지방산 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
시험관내 활성 검정법 # 1:
물질:
DMEM: F12 배지 (깁코, 카탈로그 #11320)
IBMX (시그마, 카탈로그 #I5879)
384 고형 바닥 백색 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 #781945)
20,000 다이나믹-2 cAMP 키트 (시스바이오, 카탈로그 #62AM4PEC)
아데노신 3', 5'-고리형 모노포스페이트 (시그마, 카탈로그 #A9501)
매트릭스-플레이트 메이트 플러스(Matrix-plate mate plus) (5 ㎕의 검정법 시약을 첨가하는데 사용됨)
PBS-깁코 (카탈로그 #10010-023)
Figure pct00079
프로토콜:
제1일: 8k의 RXFP1-HEK293 /모 HEK293 세포를 고체 바닥의 PDL 코팅 백색 플레이트 내의 10 ㎕의 DMEM: F12 배지에 시딩하였다.
제2일: 화합물로 검정법을 실행하였다.
효능제 모드 (개관):
Figure pct00080
10 ㎕의 DMEM:F12 배지 내의 세포, 37℃, 철야.
Figure pct00081
5 ㎕의 2000 μM (4×)의 IBMX를 30분 동안 37℃에서 세포에 첨가함
Figure pct00082
상기에 5 ㎕의 4× 화합물/세릴랙신을 30분 동안 37℃에서 첨가함
(화합물 희석의 단계 3, 400 nM로부터의 것 - 최종은 최고 100 nM이다)
Figure pct00083
10 ㎕의 cAMP-d2 접합체
Figure pct00084
10 ㎕의 항-cAMP 크립테이트 접합체
Figure pct00085
1시간 동안 실온에서 인큐베이션
Figure pct00086
FRET 신호 판독 -인비젼(Envision) 665 nm/620 nm
화합물 제조
세릴랙신 :
1) 683.3 μM의 원액을 희석하였고, 즉, 11.7 ㎕를 188.3 PBS pH 7.4에 희석하였고, 15 ㎕의 화합물을 30 ㎕로 옮김으로써 PBS에서 3×배 희석하였다 (최종은 40 μM이다) - 수동
2) 1:10 희석하였고, 즉 6 ㎕의 상기 물질을 54 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 (최종은 4 μM이다) - 수동
3) 1:10 희석하였고, 즉 10 ㎕의 상기 물질을 90 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 (최종은 400 nM이다) - 수동
세릴랙신 - FA 접합체
1) 원액을 PBS pH 7.4에서 40 μM로 희석하였고, 15 ㎕의 화합물을 30 ㎕로 옮김으로써 PBS에서 3×배 희석하였다.
2) 1:10 희석하였고, 즉 6 ㎕의 상기 물질을 54 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 - 수동.
3) 1:10 희석하였고, 즉 10 ㎕의 상기 물질을 90 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 (1:100 희석) - 수동.
지방산
1) 원액을 PBS pH 7.4에서 40 μM로 희석하였고, 15 ㎕의 화합물을 30 ㎕로 옮김으로써 PBS에서 3×배 희석하였다.
2) 1:10 희석하였고, 즉 6 ㎕의 상기 물질을 54 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 - 수동.
3) 1:10 희석하였고, 즉 10 ㎕의 상기 물질을 90 ㎕의 DMEM:F12에 희석하였다 (1:100 희석) - 수동.
cAMP 표준 곡선 희석물 :
1. DMEM:F12 배지에 희석된 150 ㎕의 cAMP 표준물을 제1 칼럼에 첨가함 (2800 nM).
2. 100 ㎕의 DMEM:F12 배지를 10개까지의 후속 칼럼에 첨가함 (1-11).
3. 50 ㎕를 100 ㎕로 옮김으로써 3× 희석함
4. 단계 3으로부터의 20 ㎕를 표준 곡선 플레이트의 적합한 웰에 놓음
5. 10 ㎕의 항-d2 & 항-cAMP 크립테이트 접합체
6. 실온에서 1h 인큐베이션함
7. FRET 신호 판독 -인비젼 665 nm/620 nm
분석:
그래프 패드 프리즘을 사용하여 cAMP nM 농도를 로그 (x)로 변환하였다.
4-파라미터 비-선형 회귀를 사용하여 표준 곡선으로부터 cAMP 양을 내삽하였다.
내삽된 값을 10^Y 변환을 사용하여 nM로 전환하였다.
산정된 cAMP 양을 4-파라미터 비-선형 회귀를 사용하여 화합물 농도에 대해 플롯팅하였다
결과:
<표 9>
Figure pct00087
소 혈청 알부민 및 인간 혈청 # 2의 존재 하에서의 시험관내 활성:
물질:
DMEM: F12 배지 (깁코, 카탈로그 #11320)
IBMX (시그마, 카탈로그 #I5879)
384 고형 바닥 백색 플레이트 (그라이너 바이오-원, 카탈로그 #781945)
20,000 다이나믹-2 cAMP 키트 (시스바이오, 카탈로그 #62AM4PEC)
아데노신 3', 5'-고리형 모노포스페이트 (시그마, 카탈로그 #A9501)
매트릭스-플레이트 메이트 플러스 (5 ㎕의 검정법 시약을 첨가하는데 사용됨)
PBS-깁코 (카탈로그 #10010-023)
1 M HEPES 깁코 (카탈로그-15630-080)
1× HBSS 깁코 (카탈로그-14175-095)
검정법 완충제 - 1×HBSS + 10 mM HEPES
소 혈청 알부민 카탈로그 # A2153 (시그마-알드리치)
시그마 알드리치 -H4522 (인간 혈청)
조건:
Figure pct00088
600 μM의 BSA
Figure pct00089
4％ 인간 혈청
Figure pct00090
10％ 인간 혈청 (시그마 알드리치 -H4522)
Figure pct00091
검정법 완충제
테스트된 화합물:
Figure pct00092
세릴랙신
Figure pct00093
세릴랙신-FA (실시예 29A)
화합물 취급:
세릴랙신: 원액은 796.57 uM, 즉 4.75 mg/ml이고, MW는 5963 돌턴이다.
190 ul의 PBS에 용해된 세릴랙신 10 ul 원액 (최종 농도 40 μM)을 30 ul를 60 ul의 검정법 완충제 11지점 곡선 (A2-A12이고, 제12 지점은 0이다)으로 옮김으로써 3×배 희석한다.
세릴랙신-FA 접합체: 원액은 287.79 uM, 즉 2.61 mg/ml이고, MW는 9069 돌턴이다.
172.2 ul의 PBS에 용해된 세릴랙신 27.798 ul 원액 (최종 농도 40 μM)을 30 ul를 60 ul의 검정법 완충제 11지점 곡선 (A2-A12이고, 제12 지점은 0이다)으로 옮김으로써 3×배 희석한다.
BSA 원액 제조:
666.66 uM BSA: 1.32 g의 BSA를 용해시킴으로써 검정법 완충제 30 mL를 만들었다.
600 uM BSA: 1.18 g의 BSA를 용해시킴으로써 검정법 완충제 30 mL를 만들었다.
BSA 없음에는 검정법 완충제만 있다.
인간 혈청
4.44％ HS: 28.66 ml의 검정법 완충제 내의 1.34 ml
4％ HS: 28.8 ml의 검정법 완충제 내의 1.2 ml
11.11％ HS: 26.67 ml의 검정법 완충제 내의 3.33 ml
10％ HS : 27 ml의 검정법 완충제 내의 3 ml
절차:
제1일: 8,000개의 세포/웰의 RXFP1-HEK293 및 HEK293 (모) 세포를 고체 바닥 플레이트 상의 기본 DMEM:F12 배지에 10 ㎕/웰 부피로 시딩하였다. 세포를 37℃/5％ CO2에서 철야로 인큐베이션하였다.
제2일:
1. 세포를 50 ul의 검정법 완충제로 2×회 세정하고, 1차 및 2차 세정 후에 페이퍼타월 상에서 부드럽게 탭핑하여 검정법 완충제를 제거한다.
2. 각각의 배지 (600 uM의 BSA, 4％ BSA, 10％ 인간 혈청 및 검정법 완충제 단독)를 함유하는 15 ul의 배지 + IBMX (666.66 uM)로 세포를 30분 동안 37℃에서 예비-처리하였다.
3. 화합물을 11지점 곡선으로 3× 연속 희석한다 - 이전 웰로부터의 15 ul의 화합물을 30 ㎕의 PBS가 있는 후속 웰로 옮기고, 웰 11은 PBS만 있다.
4. 단계 3으로부터 검정법 완충제에 (1:10) 희석한다 (즉, 10 ul를 90 ul의 검정법 완충제에 희석함)
5. 다시 단계 4로부터 각각의 배지 (666.66 μM의 BSA & 4.44％ & 11.11％ 인간 혈청 및 검정법 완충제)에 (1:10) 희석하고, BSA의 최종 농도는 600 μM이고, 인간 혈청의 최종 농도는 4 & 10％이다.
6. (* 세포에 첨가하기 전에, 화합물을 이의 각각의 배지에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다)
7. 단계 6으로부터의 5 ul, 즉 4× 세릴랙신/세릴랙신-FA를 추가로 30분 동안 37℃에서 15 ul의 세포에 첨가한다 (세릴랙신의 최고 농도는 100 nM이다).
8. 10 ul cAMP d2 접합체를 첨가한다.
9. 10 ul 항-cAMP-크립테이트를 첨가한다.
10. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다.
11. 인비젼에서 FRET를 판독한다.
12. 각각의 배지에서 cAMP 표준 곡선을 만들었다.
cAMP 표준 곡선 희석물 :
cAMP 표준물의 최초의 원액은 1120000 nM이다.
1. 20 ul의 cAMP 원액을 60 ul의 검정법 완충제에 용해시킴으로써 최초의 원액을 (1:4) 희석한다.
2. 검정법 완충제에서의 단계 1의 (1:10) 희석 (즉, 20 ul를 180 ul의 검정법 완충제에 희석한다)
3. 4.44％ & 11.11％ HS, 666.66 uM BSA 또는 BSA 없음의 각각의 농도에서의 단계 2의 (1:10) 희석 ― 최종 농도는 4％, 10％의 HS 및 600 μM의 BSA가 될 것이다.
cAMP 표준 곡선
1. 150 ㎕의 각각의 cAMP 표준물을 제1 칼럼에 첨가한다 (2800 nM)
2. 100 ㎕의 검정법 완충제 + 각각의 농도 600 uM BSA, 4％ & 10％ HS 및 0％)를 11개의 후속 칼럼, 즉 2-12에 첨가한다.
3. 50 ㎕를 100 ㎕의 후속 웰로 옮김으로써 3× 희석하고, 제12 웰은 cAMP가 없는 0이다.
4. 단계 3으로부터의 20 ㎕를 표준 곡선 플레이트의 적합한 웰에 놓는다.
5. 10 ㎕의 d2 접합체를 첨가한다.
6. 실온에서 1h 인큐베이션한다.
7. HTRF를 판독한다 - 엔비젼
분석:
그래프 패드 프리즘을 사용하여 cAMP nM 농도를 로그 (x)로 변환한다.
4-파라미터 비-선형 회귀를 사용하여 표준 곡선으로부터 cAMP 양을 내삽하였다.
내삽된 값을 10^Y 변환을 사용하여 nM로 전환하였다.
산정된 cAMP 양을 4-파라미터 비-선형 회귀를 사용하여 화합물 농도에 대해 플롯팅하였다
결과:
<표 10>
Figure pct00094
생체내 검정법:
화합물 (세릴랙신 및 세릴랙신 접합체)을 다양한 설치류 모델에서 테스트하여 단기 및 장기 심혈관 반응을 평가할 수 있다.
단기 모델 ― 마우스 (임의 계통, 그러나 DBA/2가 바람직함) 또는 래트 (임의 계통, 그러나 스프라그-돌리가 바람직함)를 이소플루란 흡입으로 마취하고, 100％ 산소 내의 ~2％ 이소플루란으로 안정적인 외과 수준의 마취에서 유지시켰고, 이의 직장 온도가 정상 수준에서 유지되었다. 경동맥 및 경정맥 (마우스) 또는 대퇴 동맥 및 정맥 (래트)을 상부 피부 절개를 통해 노출시키고, 혈관에 카테터를 삽입하였다. 동맥 카테터가 압력 변환기에 연결되고, 동맥압의 지속적인 측정 및 심박수 유발을 위해 신호가 디지털 데이터 획득 시스템 (예를 들어, 포네마(Ponemah))으로 송신된다. 대안적으로, 피하에 삽입된 바늘 전극을 통해 기록된 심전도 신호에 의해 심박수가 유발된다. 동맥압 및 심박수를 안정화되게 한 후, 자율신경 차단제 (예를 들어, 각각 2 mg/kg의 아트로핀 및 프로프라놀롤)의 칵테일을 ~3-4분에 걸쳐 정맥내 투여한다. 심혈관 파라미터가 다시 안정화되면, 세릴랙신 또는 세릴랙신 접합체를 정맥내 볼루스로서 ~3초에 걸쳐 주사한다. 릴랙신은 특징적인 느린 개시 (~6분 내의 최고 반응) 및 지속적인 작용 지속기간 (수 시간)으로 심박수 증가를 일으킨다. 일부 동물 표본에서, 심실 심장 기능 (예를 들어, 박출률, 분획 단축, 심박출량)을 일련의 심장 초음파 영상을 수집함으로써 측정하고, 이는 오프라인에서 분석된다.
장기 모델 ― 마우스 (임의 계통, 그러나 DBA/2가 바람직함) 또는 래트 (임의 계통, 그러나 스프라그-돌리가 바람직함)를 이소플루란 흡입으로 마취하고, 100％ 산소 내의 ~2％ 이소플루란으로 안정적인 외과 수준의 마취에서 유지시킨다. 수술 주위 기간 및 수술 후에 진통제를 투여한다. 동맥 및 정맥에 상기 기술된 바와 같이 캐뉼러를 삽입하지만, 등쪽 피부 영역을 통해 카테터를 외부로 노출시키고, 헤파린처리 염수를 플러싱하고, 스테인리스-스틸 핀으로 막는다. 또한 마우스에서 피하 카테터를 피하 이식하여 유사한 방식으로 외부로 노출시킬 수 있다. 래트에서는, 카테터가 스프링-테더(tether)/스위블(swivel) 시스템을 통해 관리된다. 연구일에, 동맥 카테터를 압력 변환기에 연결하고, 마우스에서는 차단제가 피하 카테터를 통해 투여될 수도 있다는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 자율신경 차단을 달성하고, 그 후 양쪽 종 모두에서 자율신경 작용제의 연속적인 정맥내 또는 피하 주입에 의해 차단을 유지한다. 동맥압 및 심박수를 디지털 데이터 획득 시스템으로 지속적으로 모니터링한다. 동맥압 및 심박수를 안정화되게 한 후, 자율신경 차단제를 ~3-4분에 걸쳐 정맥내 또는 피하 투여한다. 심혈관 파라미터가 다시 안정화되면, 세릴랙신 또는 세릴랙신 접합체를 정맥내 볼루스로서 ~3초에 걸쳐 주사한다. 마우스 또는 래트에서 수 주의 기간에 걸쳐 심실 심장 기능 및 심박수를 평가하기 위해, 세릴랙신 접합체를 주 당 1-3회 피하 주사하고, 그 후 일련의 심장 초음파 영상을 기준선에서, 그리고 매주 수집한다.
세릴랙신 출처:
세릴랙신 (재조합 1-사슬 인간 릴랙신)
코네틱스 코포레이션(Connetics corporation), 롯트(lot) # 00L605
20 nM Na 아세테이트 완충제 (pH 5.0) 내의 1.0 mg/mL (5 mL 바이알)
각각의 용량에 대한 세릴랙신의 목적 농도로 원액을 비히클에서 희석함.
실시예 30의 PIP 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 및 생체내 방법으로 평가할 수 있다.
글루코스 -자극 인슐린 분비 ( GSIS ) 검정법:
고지방 식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서 재조합 인간 프로락틴-유도성 단백질 (hPIP) 후의 생체내 췌장 베타 세포 기능의 측정으로서 GSIS 테스트를 수행하였다. 간략하게, 마우스 (m=5-7마리/군)를 철야로 단식시키고 (5:00PM-8:00AM), 테스트일에 체중 및 혈액 글루코스 (BG; 임브레이스(Embrace) 글루코스 측정기로 결정됨)을 측정하였고, 이를 기준선 시점으로 지정하였다. 그 후, 마우스에게 hPIP (천연 및 FA-접합 PIP; PBS 내의 용액; 4 ml/kg 체중으로 투여됨) 또는 비히클-대조군 (PBS)을 1회 정맥내 (IV) 투여하였다. hPIP 투여 45분 후, 모든 마우스에게 경구 글루코스 (3 g/kg 덱스트로스; PBS 내의 용액; 4 ml/kg 체중으로 투여됨)를 투약하였다. 글루코스 로드 직전 (0분 시점으로 지정됨), 및 글루코스 15분 후 및 30분 후에 혈액 글루코스를 측정하였다. 0분, 글루코스 15분 후 및 글루코스 30분 후에, 혈장 단리를 위해 혈액 샘플을 수집하고, 혈장 인슐린을 측정하였다.
약동학 (PK) 검정법:
DIO 마우스에서 단일 IV 투여 후에 hPIP의 혈장 노출을 측정하였다. 간략하게, 자유롭게 급식시킨 DIO 마우스 (n=2)에게 hPIP (천연 및 FA-접합 PIP; PBS 내의 용액; 4 ml/kg 체중으로 투여됨)를 1회 정맥내 (IV) 투여하였다. 투약 0.25, 0.5, 1, 3, 7, 24 및 48시간 후에 혈액 샘플을 수집하여 혈장을 단리하고, 사내ELISA 검정법 (하기에 제시된 프로토콜)에 의해 검정하였다.
하기 단계에 의해 검정법을 측정하였다:
Figure pct00095
플레이트를 철야로 실온에서 30 ul hPIP 항체 (PIP-8-AB로 지정됨; 사내 생산; NBC 클론# 87.19G9A11, PBS 내의 8 ug/ml)로 코팅하였다.
Figure pct00096
흡인한 후, 100 ul 차단 시약으로 2시간 동안 차단하였다.
Figure pct00097
흡인하고, 30 ul 샘플을 첨가하여 2시간 동안 인큐베이션하고, 카세인 완충제 (1％ 카세인, 1.7 mM 1염기성 인산나트륨, 8.1 mM 2염기성 인산나트륨 7수화물, 0.15 M 염화나트륨, 0.7％ 트리톤 X-100, 및 0.1％ 아지드화나트륨)에서 샘플 및 표준물을 희석하였다.
Figure pct00098
플레이트를 3× 100 ul의 테크노바(Teknova) 세정 완충제 (PBS 내의 0.05％ 트윈)로 세정하였다.
Figure pct00099
30 ul 비오틴화 PIP 항체 (PIP-6 Ab로 지정됨; 사내 생산, MBC 클론# 87.8C6B3, 카세인 완충제 내의 10 ug/ml)를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다.
Figure pct00100
상기와 같이 세정하였다.
Figure pct00101
30 ul 스트렙타비딘-HRP (피어스(Pierce) 카탈로그 # 21140, HRP 완충제 내의 0.4 ug/ml)를 첨가하고 (HRP 완충제: 0.4％ 카세인, 1.7 mM 1염기성 인산나트륨, 8.1 mM 2염기성 인산나트륨 7수화물, 0.15 M 염화나트륨, 및 0.1％ 클로로아세트아미드), 30분 동안 인큐베이션하였다.
Figure pct00102
상기와 같이 세정하였다.
Figure pct00103
30 펨토(Femto) 화학발광 기질 (써모(Thermo) 카탈로그 #34096)을 첨가하고, 즉각적으로 판독하였다.
상기 기술된 검벙법에 따른 본 발명에 따른 PIP 지방산 접합체의 활성 및 안정성
<표 11>
Figure pct00104
본 발명의 PIP 지방산 접합체는 노출이 연장되어, 효능 개선을 초래한다.
실시예 31의 NPFF 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 방법으로 평가할 수 있다.
시스바이오 cAMP 키트를 이용한 cAMP 검정법 프로토콜
본 발명의 NPFF-FA 접합체를 아래에 기술된 검정법에서 포르스콜린의 존재 하에 테스트하였다.
시약/물질
Figure pct00105
제1일: 세포를 384-웰 플레이트 내로 플레이팅한다 .
"하위배양 프로토콜"을 따른다.
1. 항생제 (필요한 경우) 없이 성장 배지를 제조한다.
2. 70％ 에탄올을 분무한 후 항생제가 없는 성장 배지 병을 37℃ 수조에서 평형화시킨다.
3. 베르센(Versene) (T.75 플라스크 당 3 ml)으로 세포를 탈착시킨다.
4. 17 ml의 성장 배지를 함유하는 50 ml 팔콘 튜브 내로 옮긴다.
5. 4분 동안 150 g로 원심분리한다.
6. 세포 펠릿을 10 ml 자극 완충제에 재현탁시킨다. 세포를 계수한다.
7. 항생제가 있는 성장 배지에서 5,000개의 세포/50 ul로 세포 현탁액을 제조한다.
8. 비아플로(Viaflow) 384-125 ul 피펫을 사용하여 50 ul의 세포 현탁액을 플레이팅한다.
9. 플레이트를 15분 동안 TC 후드에 놓는다.
10. 37℃, 5％ CO2 및 90％ 습도에서 인큐베이션한다.
제2일 :
시약 용액 제조:
1. 검정법 완충제 :
500 ml HBSS + 10 ml HEPES. 실온에서 보관한다.
검정법 완충제: 250 ml HBSS/HEPES + 250 ul IBMX 1000× 용액 + 0.1 ％ BSA (825 ul). 매일 새로 제조한다.
2. 포르스콜린 2× 용액: 검정법에서 최종 1 uM :
화합물 희석: 40 ul FSK / 100 ml 검정법 완충제.
NPFF 희석: 10 ul DMSO / 10 ml 2× FSK.
3. NPFF 희석물 : dH2O 내의 1 mM 원액 -검정법에서 최종 1 uM
a. 5 ul 원액 / 625 ul FSK 2×/DMSO.
b. 100 ul 용액 a + 300 ul FSK 2×/DMSO. 검정법에서 최종 1 uM.
c. 10회의 1/4 희석 단계: 100 ul + 300 ul FSK 2×/DMSO.
4. 화합물 희석물 : DMSO 내의 10 mM 모액 - 검정법에서 최종 40 uM
a. 5 ul 원액 / 625 ul FSK 2×.
b. 11회의 1/4 희석 단계: 100 ul + 300 ul FSK 2×.
5. cAMP 표준물 :
a. 10 ul cAMP 표준물 원액 (1.12 mM) + 90 ul 검정법 완충제.
b. 10 ul 희석물 a + 90 ul 자극 완충제.
c. 20 ul 희석물 b + 428 ul 자극 완충제: 500 nM.
d. 희석물 c에서 시작하여 11회의 1/2 희석 단계: 100 ul 희석물 c + 100 ul 자극 완충제.
6. cAMP 검출 시약:
a. d2- cAMP: 1000 ul/ 20 ml 용해 완충제. (하나의 384-웰 플레이트에 대해250 ul/ 5 ml).
b. 크립테이트 접합체: 1000 ul/ 20 ml 용해 완충제. (하나의 384-웰 플레이트에 대해 250 ul/ 5 ml).
검정법 절차
단계 1 :
1. 자극 완충제를 제조한다.
2. 실온에서 시스바이오 용해 완충제를 넣는다.
3. 웰메이트(WellMate)를 준비한다 (70％ 알콜에 이어서 dH20 및 HBSS/HEPES로 세정한다).
4. 포르스콜린 및 화합물 희석물을 제조한다.
단계 2 : 포르스콜린 자극
1. 세포를 50 ul의 자극 완충제로 세정한다:
a. 플레이트를 부드럽게 탭핑하여 O/N 배지를 제거한다.
b. 백색 페이퍼 타월을 플레이트의 상부에 놓고, VWR 심포니(Symphony) 4417 원심분리기를 사용하여, 플레이트를 뒤집어서 20초 동안 300 RPM으로 원심분리한다.
c. 웰메이트를 사용하여 50 ul의 자극 완충제를 첨가한다.
d. 플레이트를 부드럽게 탭핑하여 O/N 배지를 제거한다.
e. 백색 페이퍼 타월을 플레이트의 상부에 놓고, VWR 심포니 4417 원심분리기를 사용하여, 플레이트를 뒤집어서 20초 동안 300 RPM으로 원심분리한다.
f. 현미경에서 세포를 점검한다.
2. 비아플로 384를 사용하여 IBMX를 함유하는 10 ul의 자극 완충제를 첨가한다.
3. 비아플로 384를 사용하여 화합물을 함유하는 10 ul의 2× 포르스콜린 용액을 첨가한다 (7층). 세포에 첨가하기 전에 용액을 혼합한다.
4. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. (온도 변화를 방지하도록 플레이트를 서랍 내에 놓는다).
5. cAMP 표준 곡선 및 cAMP 검출 시약을 제조한다.
6. 20 ul/웰의 cAMP 표준 곡선을 표준 곡선 플레이트 (검정법 플레이트와 동일한 플레이트)에 첨가한다.
단계 3 : LANCE cAMP 검정법
1. 콤비(Combi) 384를 사용하여 10 ul d2 cAMP/웰을 검정법 플레이트에 첨가한다.
2. 수동으로 10 ul/웰 크립테이트 접합체를 검정법 플레이트에 첨가한다.
3. 플레이트를 밀봉한다.
4. 최소 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다 (24시간 이내에 플레이트를 판독할 수 있다).
5. 플레이트 바닥에 테이프를 놓는다.
6. 인비젼 프로그램 "시스바이오 384 전체 플레이트"에서 판독한다
7. 미처리 데이터를 보조 파일로 확인한다.
8. 그래프패드로 데이터를 분석한다 (보조 파일 내의 파일을 확인한다).
결과:
<표 12>
Figure pct00106
생체분자가 siRNA인 본 발명의 접합체의 활성 및 혈장 안정성을 아래에 기술된 하기의 시험관내 방법으로 평가할 수 있다.
방법
실시예 24의 접합체는 GalNAc (참조예 3) 및 지방산과 접합된 APOC3 siRNA의 화합물이다. 인간 APOC3 트랜스제닉 마우스 (B6;CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J)를 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory) (메인주 바 하버)에서 구입하였다. 12 h 밝음/어두움 주기로 마우스에게 표준 설치류 사료 및 물을 자유롭게 급식하였다. 이러한 조건 하에, APOC3 트랜스제닉 마우스에서 혈장 TG 함량이 현저하게 증가하면서 고트리글리세리드혈증이 자발적으로 발생된다 (Aalto-Setala K, J Clin Invest 1992). 각각의 군의 4마리의 마우스에게 참조예 3 (APOC3 siRNA-GalNAc) 또는 실시예 24의 접합체를 25 mg/Kg 체중의 용량으로 피하 주사하였다. 주사 직전의 기준선, 및 주사 2, 4, 7 및 14일 후에 혈액을 수집하였다. 혈장을 사용하여, 시스바이오로부터의 HTRF 검정법으로 인간 APOC3 단백질 수준을 측정하였다. 1원 ANOVA를 사용하여 군들 간의 통계적 차이를 비교하였다.
결과
기준선 혈장 APOC3 수준은 참조예 3 및 접합체 24 군에서 각각 176±21 mg/dL 및 178±9 mg/dL였다. 참조예 3은 기준선 수준에 비해 투약 5일 후 56％ 만큼 혈장 APOC3 수준을 시간-의존적으로 감소시켰다. 대조적으로, 실시예 24의 접합체는 투약 5일 후의 80％ 감소로 혈장 APOC3을 더욱 효과적으로 감소시켰다 (도 1). 도 1에 나타난 바와 같이 참조예 3 및 실시예 24 양쪽 모두에 대해 작용 지속기간이 유사하다.
본 발명의 접합체는 혈장 안정성이 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 20시간, 적어도 30시간, 적어도 40시간 또는 적어도 50시간이다. 한 실시양태에서, 비-접합 생체분자에 비교된 혈장 안정성 개선이 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배 또는 50배 또는 75배이다.
조합 요법
본 발명의 접합체는 하나 이상의 다른 치료제와 동시에, 또는 그전에 또는 그후에 투여될 수 있다. 본 발명의 접합체는 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 개별적으로, 또는 다른 작용제와 동일한 제약 조성물에서 함께 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 요법에서의 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 이전 실시양태 중 어느 하나의 접합체 또는 실시양태 10 및 13에 기술된 바와 같은 접합체 혼합물, 및 적어도 하나의 다른 치료제를 포함하는 제품을 제공한다. 한 실시양태에서, 요법은 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 염을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 글루코스 수준 상승, 인슐린 수준 상승 및 당뇨성 신장병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 이의 치료이다.
조합 제제로서 제공되는 제품은 이전 실시양태 중 어느 하나의 접합체 및 다른 치료제(들)를 동일한 제약 조성물 내에 함께 포함하거나 또는 이전 실시양태 중 어느 하나의 접합체 및 다른 치료제(들)를 개별적인 형태, 예를 들어 키트 형태로 포함하는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 이전 실시양태 중 어느 하나의 접합체 또는 실시양태 10 및 13에 따른 접합체 혼합물, 및 또 다른 치료제(들)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의적으로, 제약 조성물은 상기에서 기술된 바와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제약 조성물 중 적어도 하나가 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체를 포함하는 2개 이상의 개별적인 제약 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 상기 조성물들을 개별적으로 보유하기 위한 수단, 예를 들어, 용기, 분할된 병, 또는 분할된 호일 포켓을 포함한다. 이같은 키트의 예는 정제, 캡슐 등의 포장에 전형적으로 사용되는 바와 같은 블리스터 팩(blister pack)이다.
본 발명의 키트는 상이한 투여 형태, 예를 들어, 경구, 피하 및 비경구로 투여하기 위해, 개별적인 조성물들을 상이한 투여 간격으로 투여하기 위해, 또는 개별적인 조성물들을 서로에 대해 적정하기 위해 사용될 수 있다. 순응도를 보조하기 위해, 본 발명의 키트는 전형적으로 투여 설명서를 포함한다. 본 발명의 조합 요법에서, 본 발명의 접합체 및 다른 치료제는 동일한 또는 상이한 제조업체에 의해 제작 및/또는 제형될 수 있다. 또한, (i) 조합 제품이 의사에게 배포되기 전에 (예를 들어, 본 발명의 접합체 및 다른 치료제를 포함하는 키트의 경우); (ii) 투여 직전에 의사 자신에 의해 (또는 의사의 지도 하에); (iii) 환자 자신에서, 예를 들어 본 발명의 접합체 및 다른 치료제의 순차적 치료 동안에, 본 발명의 접합체 및 다른 치료제가 조합 요법으로 합쳐질 수 있다.
본 발명은 환자가 사전에 (예를 들어, 24시간 이내에) 또 다른 치료제로 치료된, 본원에 기재된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 환자가 사전에 (예를 들어, 24시간 이내에) 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체로 치료된, 본원에 기재된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 또 다른 치료제의 용도를 또한 제공한다.
제2 작용제 또는 치료와 "조합된"이라는 용어는 본 발명의 접합체 (예를 들어, 이전 실시양태 중 어느 하나에 따른 접합체 또는 본원에서 다른 식으로 기술된 접합체)와 제2 작용제 또는 치료를 공동-투여하는 것, 본 발명의 화합물을 먼저 투여한 후, 제2 작용제 또는 치료를 투여하는 것, 및 제2 작용제 또는 치료를 먼저 투여한 후, 본 발명의 접합체를 투여하는 것을 포함한다.
"제2 작용제" 및 "공동-작용제"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기술된 질환 또는 장애, 예를 들어, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애로부터 선택된 장애 또는 질환의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 감소시키는 것으로 관련 기술 분야에 공지된 임의의 작용제를 포함한다.
한 실시양태에서, 요법은 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 본 발명의 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 염을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 이의 치료이다.
생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 본 발명의 접합체와 조합되는 제2 작용제의 예는 하기를 포함한다:
1. 항당뇨병 작용제, 예컨대 인슐린, 인슐린 유도체 및 모방체; 인슐린 분비촉진제 예컨대 술포닐우레아 (예를 들어, 클로로파미드, 톨라자미드, 아세토헥사미드, 톨부타미드, 글리부리드, 글리메피리드, 글리피지드); 글리부리드 및 아마릴(Amaryl); 인슐린 분비 자극성 술포닐우레아 수용체 리간드 예컨대 메글리티니드, 예를 들어, 나테글리니드 및 레파글리니드; 인슐린 작용을 강화하여 (예를 들어, 인슐린 감작화에 의해), 말초 조직에서의 글루코스 이용을 촉진하는 티아졸리딘디온 (예를 들어, 로시글리타존 (아반디아(AVANDIA)), 트로글리타존 (레줄린(REZULIN)), 피오글리타존 (악토스(ACTOS)), 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존, 시글리타존, 아다글리타존, 다르글리타존; 단백질 티로신 포스파타제-1B (PTP-1B) 억제제 예컨대 PTP-112; 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP) 억제제 예컨대 토르세트라핍, GSK3 (글리코겐 신타제 키나제-3) 억제제 예컨대 SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 및 NN-57-05445; RXR 리간드 예컨대 GW-0791 및 AGN-194204; 나트륨-의존적 글루코스 공동-수송체 억제제 예컨대 T-1095; 글리코겐 포스포릴라제 A 억제제 예컨대 BAY R3401; 글루코스 이용을 촉진하고/하거나, 간 글루코스 생산을 감소시키고/시키거나 장 글루코스 산출을 감소시킴으로써 작용하는 비구아니드 예컨대 메트포르민 및 기타 작용제; 탄수화물 소화를 느리게 하고, 결과적으로 장으로부터의 흡수를 느리게 하여, 식후 고혈당을 감소시키는 알파-글루코시다제 억제제 예컨대 아카르보스 및 미글리톨 및 기타 작용제; GLP-1 (글루카곤 펩티드-1), GLP-1 유사체 예컨대 엑센딘(Exendin)-4 및 GLP-1 모방체; 및 DPPIV (디펩티딜 펩티다제 IV) 억제제 예컨대 빌다글립틴;
2. 혈중지질저하제 예컨대 3-히드록시-3-메틸-글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제 억제제, 예를 들어 로바스타틴, 피타바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 세리바스타틴, 메바스타틴, 벨로스타틴, 플루바스타틴, 달바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴 및 리바스타틴; 스쿠알렌 신타제 억제제; FXR (파르네소이드 X 수용체) 및 LXR (간 X 수용체) 리간드; 담즙산 격리제, 예컨대 콜레스티라민 및 콜레세벨람; 피브레이트; 니코틴산 및 아스피린;
3. 항비만제 예컨대 오를리스타트 또는 리모나반트, 펜테르민, 토피라메이트, 큐넥사, 및 로카세린;
4. 항고혈압제, 예를 들어 루프성 이뇨제 예컨대 에타크린산, 푸로세미드 및 토르세미드; 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 예컨대 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 페리노도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴 및 트란돌라프릴; Na-K-ATPase 막 펌프 억제제 예컨대 디곡신; 뉴트랄엔도펩티다제 (NEP) 억제제; ACE/NEP 억제제 예컨대 오마파트릴랫, 삼파트릴랫 및 파시도트릴; 안지오텐신 II 길항제 예컨대 칸데사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 텔미사르탄 및 발사르탄, 특히 발사르탄; 레닌 억제제 예컨대 디테키렌, 잔키렌, 테를라키렌, 알리스키렌, RO 66-1132 및 RO-66-1168; β-아드레날린성 수용체 차단제 예컨대 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤 및 티몰롤; 수축촉진제 예컨대 디곡신, 도부타민 및 밀리논; 칼슘 채널 차단제 예컨대 암로디핀, 베프리딜, 딜티아젬, 펠로디핀, 니카르디핀, 니모디핀, 니페디핀, 니솔디핀 및 베라파밀; 알도스테론 수용체 길항제; 및 알도스테론 신타제 억제제;
5. 퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체의 효능제, 예컨대 페노피브레이트, 피오글리타존, 로시글리타존, 테사글리타자르, BMS-298585, L-796449, 특허 출원 WO 2004/103995에 구체적으로 기술된 화합물, 즉, 실시예 1 내지 35의 화합물 또는 특허청구범위 제21항에 구체적으로 열거된 화합물, 또는 특허 출원 WO 03/043985에 구체적으로 기술된 화합물, 즉, 실시예 1 내지 7의 화합물 또는 특허청구범위 제19항에 열거된 화합물, 특히 (R)-1-{4-[5-메틸-2-(4-트리플루오로메틸-페닐)-옥사졸-4-일메톡시]-벤젠술포닐}-2,3-디히드로-1H-인돌-2-카르복실산 또는 이의 염; 및
6. 문헌 [Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633]의 도면 1 내지 7에 기술된 특정 항당뇨병 화합물.
또한, 본 개시내용은 체중 감소를 촉진하는 작용제 또는 방법, 예컨대 대사를 자극하거나 식욕을 감소시키는 작용제, 및 체중 감소를 촉진하기 위한 식단 변형 및/또는 운동 요법과의 조합 요법을 구상한다.
본 발명의 실시예
약어
ACN 아세토니트릴
BEH 에틸렌 가교 하이브리드
BOC tert-부틸옥시카르보닐
BSA 소 혈청 알부민
DCM 디클로로메탄
DCC N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
DIC N,N'-디이소프로필카르보디이미드
DIPEA N,N'-디이소프로필에틸아민
DMAP 디메틸아미노피리딘
DMF N,N '-디메틸포름아미드
DTT 디티오트레이톨
DOT 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올
EDC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
ESI 전기분무 이온화
FFA 형광 초점 검정법
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드
HCTU: O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEP 헵탄
HFIP 헥사플루오로이소프로판올
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HRMS 고해상도 질량 분광법
HOBT 히드록시벤조트리아졸
HS 인간 혈청
LC/MS 액체 크로마토그래피/질량 분광법
MS 질량 분광법
MW 분자량
MRT 평균 체류 시간
NHS N-히드록시숙신이미드
NMM N-메틸모르폴린
NMR 핵 자기 공명
PEG 폴리에틸렌 글리콜
pE 피로글루타메이트
pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PG: 보호기
PK 약동학
Pol 중합체 지지제
QTOF: 사중극자 비행 시간 질량 분광계
Rt: 체류 시간
Rt 또는 RT: 실온
Rpm: 분당 회전수
Sc 피하
SFC 초임계 유체
SPPS 고체상 펩티드 합성
TBME 메틸 tert-부틸 에테르
Trt 트리틸
THF 테트라히드로푸란
TEA 트리메틸아민
TIS 트리에틸실란
t, s, quin, br, m, d (삼중선, 단일선, 오중선, 넓음, 다중선)
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
합성:
기술된 LCMS 방법
Figure pct00107
Figure pct00108
HPLC - 분석 방법 F
Figure pct00109
칼럼: 엑스브리지 BEH300 C18 (100×4.6 mm), 3 ㎛; 파트 n°: 186003612
Figure pct00110
용리제 A: 물 내의 0.1％ TFA / 용리제 B: ACN 내의 0.1％ TFA
Figure pct00111
유동: 1.0 ml/분
Figure pct00112
온도: 40℃
Figure pct00113
구배:
Figure pct00114
UPLC - HRMS - 분석 방법 G
Figure pct00115
워터스 액퀴티 UPLC® BEH C18, 1.7 ㎛, 2.1×50 mm; 파트 n°: 186002350
Figure pct00116
용리제 A: 물 내의 0.05％ FA + 3.75 mM 아세트산암모늄; 용리제 B: ACN 내의 0.04％ FA
Figure pct00117
유동: 1.0 ml/분
Figure pct00118
온도: 50℃
Figure pct00119
구배: 4.4분 내에 2 → 98％
방법 H: LC-MS 방법
Figure pct00120
HPLC: 이동상 A: 2％ HFIP + 0.1％ TEA; 이동상 B: 메탄올;
Figure pct00121
구배: 0분 95％ A, 4분: 75％ A, 8분 10％ A, 8.1분 95％ A, 10분 95％ A;
Figure pct00122
유속: 250 ㎕/분;
Figure pct00123
칼럼: 액퀴티 UPLC BEH C18, 1.7um, 2.1×50 mm (워터스);
Figure pct00124
칼럼 온도: 75℃
Figure pct00125
MS: QTOF (워터스) 음성 모드;
Figure pct00126
ESI: 2.9kv; 모세관 온도 350℃; 분무 기체: 600 mL/분; 소스 온도: 150℃
방법 I: LC -MS 방법:
Figure pct00127
이동상 A: 물 + 0.1％ 포름산;
Figure pct00128
이동상 B: 아세토니트릴 + 0.1％ 포름산;
Figure pct00129
구배: 0분 98％ A, 0.06분 98％ A, 1.76분 2％ A, 2.06분 2％ A, 2.16분 98％; 유속: 1 ml/분.;
Figure pct00130
칼럼: 액퀴티 UPLC BEH C18, 130Å, 1.7 ㎛, 2.1 mm × 50 mm;
Figure pct00131
칼럼 온도: 50℃;
Figure pct00132
검출기: UV/Vis/CAD (하전된 에어로졸 검출기)
UPLC HRMS 방법 J:
Figure pct00133
칼럼: 액퀴티 BEH300 C4 1.7 ㎛, 2.1×50 mm
Figure pct00134
용리제 A: 물 (0.1％ TFA)
Figure pct00135
용리제 B: ACN (0.1％ TFA)
Figure pct00136
유동: 0.5 mL/분
Figure pct00137
온도: 40℃
Figure pct00138
구배: 20％에서 0.5분 유지, 10분 내에 80％ ACN로 상승
방법 K:
Figure pct00139
칼럼: 워터스 프로틴(Protein) BEH C4 칼럼, 300 옹스트롬, 3.5 um, 4.6×100 mm
Figure pct00140
이동상: A: 물 (0.05％ TFA) B: ACN (0.05％ TFA)
Figure pct00141
유동: 2 mL/분
Figure pct00142
온도: 40℃
Figure pct00143
구배: 25％ B에서 1분 동안 유지, 10분에 25-60％ ACN로 상승, 10.50분에 95％ B로 상승시킨 후 2분 동안 유지, 그 후 25％에서 2분 동안 평형화. 총 실행시간은 15분이다.
Figure pct00144
질량 분광계: 워터스 ZQ 질량 분광계
Figure pct00145
UPLC: 칼럼: BEH C4, 300 옹스트롬, 1.7 um, 2.1×50 mm
방법 L:
Figure pct00146
칼럼: 프로스위프트 모노리스 4.6 × 50 mm
Figure pct00147
이동상: A: 물 (0.1％ 포름산) B: ACN (0.1％ 포름산)
Figure pct00148
유동: 1 mL/분
Figure pct00149
온도: 50℃
Figure pct00150
구배: 0분 3％ B; 2분 내에 3％ → 80％ B; 2.1분 10％ B; 2.8분 95％ B; 2.9분 3％ B
Figure pct00151
질량 분광계: Qtof ESI 스캔 범위 100-1900; 매스 링크스 소프트웨어 패키지 내의 Max Ent 1로 디컨볼루션됨
Figure pct00152
UPLC: 워터스 액퀴티
Figure pct00153
Figure pct00154
분석 방법 S:
Figure pct00155
엑스브리지 C18 칼럼, 3.5 μM, 3.0 × 3.0 mm
Figure pct00156
용리제: A: 물 + 5 mM 수산화암모늄 B: ACN
Figure pct00157
유속: 2 mL/분
Figure pct00158
구배: 0.0분 2％ B; 1.70분 내에 2％ → 95％ B; 2.00분 95％ B; 2.10분 5％ B;
Figure pct00159
질량 분광계: 단일 사중극자 ESI
Figure pct00160
HPLC: 애질런트 1100 시리즈
Figure pct00161
온도: 40C
분석 방법 T:
Figure pct00162
중간체 1: 벤질 11- 브로모운데카노에이트
Figure pct00163
11-브로모운데칸산 (4 g, 15.08 mmol), 벤질 알콜 (1.875 mL, 18.10 mmol), 및 DMAP (92 mg, 0.754 mmol)를 실온에서 N2 하에 DCM에 용해시켰다. EDC-HCl (4.34 g, 22.63 mmol)을 첨가하고, 반응물을 17시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축한 후, Et2O (150 mL)로 희석하였다. 혼합물을 물 (30 mL)로 추출하고, 수성 상을 Et2O (150 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 염수 (20 mL)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 제거하고, 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 120 g, 0-10％ Et2O / 석유 에테르)으로 정제하여, 중간체 1이 무색 액체 (6.75 g, 정량적)로서 산출되었다: LCMS 방법 - 방법 A, Rt = 1.79분, M+H 355.2; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.18 - 1.36 (m, 10 H) 1.37 - 1.47 (m, 2 H) 1.64 (quin, J=7.33 Hz, 2 H) 1.85 (dt, J=14.56, 7.06 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 3.40 (t, J=6.88 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 5 H).
중간체 2 : 트리벤질 운데칸 -1,1,11- 트리카르복실레이트 .
Figure pct00164
NaH (113 mg, 2.83 mmol)를 0℃에서 N2 하에 DMF (6 mL)에 현탁시켰다. 디벤질 말로네이트 (0.704 mL, 2.82 mmol)를 교반 중인 현탁액에 30분에 걸쳐 첨가하였다. DMF (3 mL)에 용해된 중간체 1 (903 mg, 2.54 mmol)을 첨가하고, 반응물을 0℃에서 2.75시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온되게 하고, 철야로 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (20 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하고, 합친 유기물을 염수 (30 mL)로 세정하였다. 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하였다. 농축물을 플래시 칼럼 (실리카 80 g, 0-10％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 70％ 순도의 무색 오일 (770 mg, 1.38 mmol, 34％)이 산출되었다: LCMS 방법 - 방법 B, Rt = 1.41분, M+H 559.6.
중간체 3: 트리벤질 도코산-1,11,11- 트리카르복실레이트
Figure pct00165
N2 하의 0℃의 DMF (2 mL) 내의 NaH (66.1 mg, 1.65 mmol)의 현탁액에 DMF (4 mL) 내의 중간체 2 (770 mg, 1.38 mmol)를 첨가하였다. 35분 후, DMF (2 mL) 내의 1-브로모운데칸 (0.338 mL, 1.52 mmol)의 용액을 반응물에 첨가하고, 25분 동안 교반한 후, 실온으로 가온되게 하였다. 반응물을 2일 동안 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 10％ LiCl (25 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 염수로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 80 g, 0-10％ EtOAc/HEP)으로 정제하여, 중간체 3이 무색 오일 (590 mg, 0.827 mmol, 33％)로서 산출되었다: LCMS 방법 - 방법 B, Rt= 1.89분, M+Na 735.5; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.87 - 0.95 (m, 3 H) 1.07 (br. s., 4 H) 1.14 - 1.36 (m, 28 H) 1.66 (quin, J=7.43 Hz, 2 H) 1.85 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H) 7.27 (d, J=2.32 Hz, 1 H) 7.28 - 7.43 (m, 14 H).
중간체 4 : 도코산 -1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00166
THF (12 mL)에 용해된 중간체 3 (590 mg, 0.827 mmol)을 THF (8 mL) 내의 10％ Pd-탄소의 현탁액과 합쳤다. 현탁액을 교반하고, 풍선을 통해 수소 대기 하에 놓았다. 1시간 후에, 반응물을 막 필터에 통과시키고, 고체를 EtOAc로 씻었다. 여과액을 증발시켜, 표제 화합물이 무색 오일 (353 mg, 0.798 mmol, 96％)로서 산출되었다: LCMS 방법 - 방법 B, Rt = 1.16분, M+H 443.5; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.77 - 0.84 (m, 3 H) 1.06 - 1.33 (m, 32 H) 1.59 (quin, J=7.18 Hz, 2 H) 1.83 - 1.92 (m, 4 H) 2.32 (t, J=7.03 Hz, 2 H).
중간체 5: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)-2- 운데실트리데칸디오산
Figure pct00167
DCM (1.57 mL) 내의 DCC (126 mg, 0.610 mmol)의 용액을 N2 하에 DCM (5 mL) 및 THF (5 mL) 내의 중간체 4 및 N-히드록시숙신이미드의 용액에 첨가하였다. 3.5시간 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC; 프린스톤(Princeton) 2-에틸-피리딘, 20×150 mm, 20-30％ MeOH / CO2)로 정제하여, 표제 화합물이 무색 오일 (138 mg, 0.256 mmol, 50％)로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.21분, M+H 540.5; 1H NMR (600 MHz, 아세토니트릴-d3) δ ppm 0.91 (t, J=7.20 Hz, 3 H) 1.22 - 1.42 (m, 34 H) 1.57 (quin, J=7.34 Hz, 2 H) 1.93 - 1.96 (m, 2 H) 2.28 (t, J=7.47 Hz, 2 H) 2.79 (br. d, J=6.30 Hz, 4 H).
중간체 6 및 6A: 2-( 아지도 - PEG23 - 카르바모일 )-2- 운데실트리데칸디오산 구축물 (6) 및 12-(아지도-PEG23-카바모일)트리코산산 구축물 (6A)
Figure pct00168
중간체 5 (36 mg, 0.066 mmol) 및 아지도-dPEG23-NH2 (퀀타 바이오디자인(Quanta Biodesign): 73 mg, 0.066 mmol)를 THF (1.5 mL)에서 합치고, 진탕기 플레이트 상에서 15분 동안 혼합한 후, DIPEA (17 ㎕, 0.10 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 철야로 진탕기 플레이트 상에 놓았다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 55-80％ ACN/물 + 0.1％ TFA)로 정제하여, 중간체 6 (39 mg, 0.025 mmol, 38％) 및 중간체 6a (20 mg, 0.013 mmol, 20％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.11분, [M+2H]+2 763.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.10 - 1.19 (m, 2 H) 1.20 - 1.29 (m, 23 H) 1.32 (br. s., 7 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.69 - 1.79 (m, 2 H) 1.96 - 2.10 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.15 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.57 (m, 2 H) 3.58 - 3.62 (m, 2 H) 3.62 - 3.73 (m, 90 H) 7.46 (br. s., 1 H); LCMS - 방법 B, Rt = 1.23분, [M+2]+2 740.9; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.83 - 0.96 (m, 3 H) 1.27 (br. s., 25 H) 1.29 - 1.37 (m, 7 H) 1.37 - 1.46 (m, 2 H) 1.53 - 1.73 (m, 4 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.44 - 3.52 (m, 2 H) 3.55 - 3.60 (m, 2 H) 3.60 - 3.74 (m, 90 H) 6.19 - 6.30 (m, 1 H).
대안적으로, 하기 절차에 따라 구축물 6A를 수득한다: THF (1 mL) 내의 중간체 5 (48 mg, 0.042 mmol)의 용액을 아지도-PEG23-아민 (퀀타 바이오디자인 카탈로그 # 10525) (46 mg, 0.042 mmol)이 충전된 바이알에 첨가하였다. 반응물을 20분 동안 와동시킨 후, DIPEA (11 ㎕, 0.063 mmol)를 첨가하고, 철야로 유지시켰다. 아지도-PEG23-아민 (23 mg, 0.021 mmol) 및 DIPEA (5 ㎕, 0.029 mmol)를 첨가하고, 반응물을 하루 더 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (엑스브리지 C18 30×50 mm, 10-30％ ACN / 5 mM NH4OH)로 정제하였다. 분획들의 동결건조로 생성물들의 혼합물이 초래되었다. 물질을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 + 0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 중간체 6A (30 mg, 0.020 mmol, 48％)가 산출되었다: LCMS 방법 - B, Rt = 0.81분, [M+H+H3O]+2 764.5; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62 (m, 6 H) 2.14 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H) 3.37 - 3.43 (m, 2 H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1 H).
중간체 7: (((11- 브로모운데실 ) 옥시 ) 메탄트리일 ) 트리벤젠
Figure pct00169
트리틸 클로라이드 (2.49 g, 8.92 mmol), 11-브로모운데칸-1-올 (2.00 g, 7.96 mmol), 및 DMAP (10 mg, 0.080 mmol)를 N2 하에 DCM (16 mL)에 용해시켰다. 교반하면서, DIPEA (1.39 mL, 7.96 mmol)를 첨가하고, 반응물을 7일 동안 유지시켰다. 반응물을 DCM (20 mL)과 물 (10 mL) 사이에서 분획화시켰다. 유기 상을 물 (20 mL)로 추출하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 농축하였다. 농축물을 플래시 칼럼 (실리카 120 g, 0-6％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 중간체 7 (2.50 g, 5.07 mmol, 64％)이 무색 오일로서 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.19 - 1.49 (m, 14 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.79 (dt, J=14.50, 7.00 Hz, 1 H) 1.87 (dt, J=14.55, 7.03 Hz, 1 H) 3.07 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.43 (t, J=6.85 Hz, 1 H) 3.55 (t, J=6.79 Hz, 1 H) 7.18 - 7.36 (m, 10 H) 7.42 - 7.52 (m, 5 H).
중간체 8: 디벤질 2-(11-( 트리틸옥시)운데실 )말로네이트
Figure pct00170
NaH (113 mg, 2.83 mmol)를 N2 하에 0℃에서 DMF (6 mL)에 현탁시켰다. 교반된 현탁액에 디벤질 말로네이트를 천천히 첨가하였다. 30분 후, DMF (3 mL) 내의 중간체 7 (1.26 g, 2.54 mmol)의 용액을 첨가하였다. 15분 동안 교반한 후, 생성된 혼합물을 실온으로 가온되게 하였다. 3일 후, 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (40 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축하였다. 농축물을 플래시 칼럼 (실리카 80 g, 0-10％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 표제 화합물이 무색 오일 (815 mg, 1.17 mmol, 41％)로서 산출되었다: HPLC - 방법 B, Rt = 1.68분; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.16 - 1.40 (m, 16 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.94 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.45 (t, J=7.52 Hz, 1 H) 5.16 (s, 4 H) 7.21 - 7.28 (m, 3 H) 7.28 - 7.39 (m, 16 H) 7.42 - 7.51 (m, 6 H).
중간체 9: 트리벤질 22-( 트리틸옥시 ) 도코산 -1,11,11- 트리카르복실레이트
Figure pct00171
DMF (2 mL) 내의 중간체 8 (815 mg, 1.17 mmol)의 용액을 N2 하에 0℃에서 DMF (2 mL) 내의 NaH (56 mg, 1.40 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. DMF (2 mL) 내의 벤질 11-브로모운데카노에이트 (457 mg, 1.29 mmol)를 반응물에 첨가하였다. 첨가 후 20분 동안 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 철야로 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (25 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하고, 유기물을 합쳤다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 40 g, 0-10％ EtOAc/HEP)로 정제하여, 표제 화합물이 무색 오일 (780 mg, 0.803 mmol, 69％)로서 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.99 - 1.14 (m, 4 H) 1.15 - 1.41 (m, 26 H) 1.58 - 1.71 (m, 4 H) 1.82 - 1.96 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H) 7.28 (s, 24 H) 7.42 - 7.52 (m, 6 H).
중간체 10: 22 -( 트리틸옥시 ) 도코산 -1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00172
THF (2.5 mL) 내의 10％ Pd-탄소 (11 mg, 0.010 mmol)의 현탁액을 THF (2.5 mL) 내의 중간체 9 (200 mg, 0.206 mmol)의 용액에 첨가하였다. 교반된 현탁액을 풍선을 통해 수소 하에 놓았다. 2.25시간 시간 후, 반응물을 막 필터에 통과시키고, 고체를 EtOAc로 씻었다. 여과액을 증발시켜, 중간체 10 (150 mg, 정량적)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.04 - 1.33 (m, 30 H) 1.45 - 1.62 (m, 4 H) 1.76 - 1.91 (m, 4 H) 2.21 - 2.36 (m, 2 H) 2.97 (t, J=6.60 Hz, 2 H) 7.06 - 7.18 (m, 4 H) 7.19 - 7.24 (m, 5 H) 7.33 - 7.50 (m, 6 H).
중간체 11: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)-2-(11-( 트리틸옥시 ) 운데 실)트리데칸디오산 (11).
Figure pct00173
중간체 10 (150 mg, 0.214 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (25 mg, 0.214 mmol)을 DCM (4 mL)에서 합쳤다. DCM (0.61 mL)에 용해된 DCC (49 mg, 0.235 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 7시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm; 65-95％ ACN/물 + 0.1％ TFA)에 이어서 SFC (프린스톤 2-에틸피리딘 칼럼 20×100 mm, 25-35％ MeOH / CO2)로 정제하여, 중간체 11 (34 mg, 0.043 mmol, 20％)이 무색 오일로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.47분, M-CO2H 752.7; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.13 - 1.42 (m, 30 H) 1.56 - 1.73 (m, 4 H) 1.94 - 2.14 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.83 (br. s., 4 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 7.15 - 7.28 (m, 3 H) 7.29 - 7.36 (m, 6 H) 7.41 - 7.50 (m, 6 H).
중간체 12: 2 -((아지도- PEG23 ) 카르바모일 )-2-(11- 히드록시운데실 ) 트리데칸디오산 구축물
Figure pct00174
THF (1.5 mL) 내의 아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인, 42 mg, 0.038 mmol)을 N2 하에 중간체 11 (34 mg, 0.043 mmol)과 합쳤다. 반응물을 진탕기 플레이트 상에 놓고, 20분 동안 와동시켰다. DIPEA (7.44 ㎕, 0.043 mmol)를 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 와동시켰다. DIPEA (4 ㎕, 0.023 mmol)를 첨가하고, 반응물을 철야로 유지시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 DCM (3 mL) 및 TFA (0.5 mL)에 녹였다. 용액을 1시간 동안 와동시키고, 이러한 시점에 용매를 제거하였다. 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 중간체 12 (4 mg, 1.8 μmol, 4.2％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.75분, [M+2H]+2 771.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.05 - 1.39 (m, 30 H) 1.52 - 1.82 (m, 6 H) 1.97 - 2.09 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.63 (m, 6 H) 3.63 - 3.75 (m, 90 H) 4.36 (t, J=6.72 Hz, 1 H) 7.49 - 7.65 (m, 1 H).
중간체 13: 13 -( 벤질옥시 )-12-(( 벤질옥시 )카르보닐)-13- 옥소트리데칸산
Figure pct00175
DMF (3 mL) 내의 디벤질 말로네이트 (0.88 mL, 3.52 mmol)를 N2 하에 0℃에서 NaH (274 mg, 6.86 mmol)의 현탁액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 1.5시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온되게 하였다. DMF (3 mL) 내의 11-브로모운데칸산 (933 mg, 3.52 mmol)을 첨가하고, 반응을 철야로 진행되게 하였다. 반응물을 3시간 동안 80℃로 가열한 후, 냉각되게 하였다. 반응물을 EtOAc (50 mL) 및 Et2O (50 mL)로 희석하고 1 M HCl (25 mL)로 추출하였다. 수성 상을 EtOAc / Et2O (100 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (C18 50 g 30-100％ ACN/물 + 0.1 TFA)으로 정제하여, 중간체 13 (315 mg, 0.672 mmol, 19％)이 백색 분말로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.05분, M+H 469.5.
중간체 14: 23 -( 벤질옥시 )-12,12- 비스 (( 벤질옥시 )카르보닐)-23- 옥소트리코산산
Figure pct00176
NaH (54 mg, 1.34 mmol)를 N2 하에 0℃에서 DMF (1 mL)에 현탁시켰다. 혼합물에 DMF (3 mL) 내의 중간체 13 (315 mg, 0.672 mmol)을 적가 방식으로 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 후, DMF (1 mL) 내의 중간체 1 (239 mg, 0.672 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 추가로 45분 동안 0℃에서 유지시킨 후, 실온으로 가온되게 하였다. 반응물을 철야로 교반하였다. 반응물을 1:1 Et2O 및 EtOAc (75 mL)로 희석하고, 1 M HCl (20 mL)로 추출하였다. 수성 상을 1:1 Et2O 및 EtOAc (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 생성된 잔류물을 HPLC (엑스브리지 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 + 5 mM NH4OH)로 정제하여, 표제 화합물 (132 mg, 0.178 mmol, 26％)이 산출되었다: LCMS 방법 - B; Rt= 1.53분, M-H 741.8.
중간체 15 : 1 ,11,11- 트리벤질 21-(2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 헤니코산 -1,11,11,21-테트라카르복실레이트
Figure pct00177
DCM (1 mL) 내의 DCC (44 mg, 0.213 mmol)를 DCM (2.5 mL) 내의 중간체 14 (132 mg, 0.178 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (20 mg, 0.178 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 진탕기 플레이트 상에서 17시간 동안 와동시켰다. 반응물을 여과하고, 고체를 DCM으로 씻었다. 여과액을 농축하고, 플래시 칼럼 (실리카 12 g, 0-40％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 중간체 15 (107 mg, 0.127 mmol, 72％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.53분, M+Na 862.8.
중간체 16: 22 -((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )-22-옥소 도코산 -1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00178
THF (2.5 mL) 내의 중간체 15 (107 mg, 0.127 mmol)의 용액에 THF (2.5 mL) 내의 10％ Pd-탄소의 현탁액을 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기 하에 1.5시간 시간 동안 놓았다. 반응물을 막 필터에 통과시키고, 고체를 DCM 및 THF로 세정하였다. 여과액을 증발시켜, 표제 화합물을 함유한 무색 오일 (95 mg, 정량적)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.65분, M+H 570.5.
중간체 17: 2 -(11-( 아지도 - PEG23 -아미노)-11- 옥소운데실 ) 트리데칸디오산 구축물
Figure pct00179
THF (1 mL) 내의 중간체 16 (48 mg, 0.042 mmol)의 용액을 아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인: 46 mg, 0.042 mmol)이 충전된 바이알에 첨가하였다. 반응물을 20분 동안 와동시킨 후, DIPEA (11 ㎕, 0.063 mmol)를 첨가하고, 철야로 유지시켰다. 아지도-PEG23-아민 (23 mg, 0.021 mmol) 및 DIPEA (5 ㎕, 0.029 mmol)을 첨가하고, 반응물을 하루 더 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (엑스브리지 C18 30×50 mm, 10-30％ ACN / 5 mM NH4OH)로 정제하였다. 분획들의 동결건조로 생성물들의 혼합물이 초래되었다. 물질을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 중간체 17 (30 mg, 0.020 mmol, 48％)이 산출되었다: LCMS SQ4, Rt = 0.81분, [M+H+H3O]+2 764.5; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62 (m, 6 H) 2.14 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H) 3.37 - 3.43 (m, 2 H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1 H).
중간체 18: 테트라벤질 헤니코산 -1,11,11,21- 테트라카르복실레이트
Figure pct00180
N2 하의 0℃의 DMF (2 mL) 내의 NaH (48 mg, 1.21 mmol)의 현탁액에 DMF (2 mL) 내의 중간체 2 (337 mg, 0.603 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후, DMF (2 mL) 내의 중간체 1 (429 mg, 1.21 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 20분 동안 교반한 후, 실온으로 가온되게 하였다. 반응물을 3일 동안 교반하면서 실온에서 유지시켰다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (20 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 24 g, 0-15％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 표제 화합물 (315 mg, 0.378 mmol, 63％)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.70분, M+Na 855.8; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.95 - 1.13 (m, 4 H) 1.13 - 1.40 (m, 24 H) 1.59 - 1.72 (m, 4 H) 1.82 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 4 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 4 H) 7.14 - 7.44 (m, 20 H).
중간체 19 : 헤니코산 -1,11,11,21- 테트라카르복실산
Figure pct00181
THF (4 mL) 내의 10％ Pd-탄소 (20 mg, 0.019 mmol)의 현탁액을 THF (6 mL) 내의 중간체 18 (315 mg, 0.378 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 수소 대기 하에 놓았다. 막 필터를 사용하여 고체를 제거하고, 이를 EtOAc로 세정하였다. 여과액을 증발시켜, 중간체 19 (179 mg, 정량적)가 백색 고체로서 산출되었다: LCMS - 방법 A, Rt = 1.24분, M+H 473.4; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.99 - 1.15 (m, 4 H) 1.24 (br. s., 24 H) 1.48 (quin, J=6.94 Hz, 4 H) 1.62 - 1.76 (m, 4 H) 2.18 (t, J=7.34 Hz, 4 H) 12.23 (br. s, 4 H).
중간체 20 : 11 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)헤니코산-1,11,21-트리카 르복실산
Figure pct00182
N-히드록시숙신이미드 (20 mg, 0.170 mmol) 및 중간체 19 (90 mg, 0.190 mmol)를 DCM (3 mL) 및 THF (0.3 mL)에 용해시켰다. DCM (0.5 mL) 내의 DCC (39 mg, 0.190 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 철야로 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm; 35-60％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 화합물이 백색 분말 (21 mg, 0.037 mmol, 19％)로서 산출되었다: LCMS - 방법 C, Rt = 1.01분, M+H 570.3.
중간체 21 및 21a : 11-((아지도- PEG23 ) 카르바모일 ) 헤니코산-1,11,21-트리카 르복실 산 (21) 및 12-((아지도-PEG23)카르바모일) 트리코산디오산 (21a)
Figure pct00183
아지도-PEG23-아민 (41 mg, 0.037 mmol) 및 중간체 20 (21 mg, 0.037 mmol)을 THF (1 mL)에서 합치고, 10분 동안 와동시켰다. DIPEA (9.66 ㎕, 0.055 mmol)를 첨가하고, 반응물을 철야로 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 35-60％ ACN/물 + 0.1％ TFA)로 정제하여, 중간체 21 (22 mg, 0.014 mmol, 38％) 및 21a (4 mg, 2.6 μmol, 7％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.69분, M+H 1555.3; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.27 (br. s., 19 H) 1.29 - 1.41 (m, 9 H) 1.65 (quin, J=7.12 Hz, 4 H) 1.78 (td, J=12.13, 4.22 Hz, 2 H) 1.95 - 2.08 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 4 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.54 (q, J=5.05 Hz, 2 H) 3.58 - 3.77 (m, 92 H) 7.60 (t, J=4.95 Hz, 1 H); LCMS - 방법 B, Rt = 0.78분, M-H 1509.3; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.18 (br. s., 19 H) 1.21 - 1.38 (m, 11 H) 1.43 - 1.63 (m, 6 H) 1.91 - 2.04 (m, 1 H) 2.26 (t, J=7.15 Hz, 4 H) 3.31 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.40 (q, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.50 (m, 2 H) 3.51 - 3.69 (m, 90 H) 6.23 (t, J=5.01 Hz, 1 H).
중간체 22: 디벤질 2- 운데실말로네이트
Figure pct00184
DMF (1.5 mL) 내의 디벤질 말로네이트 (0.88 mL, 3.52 mmol)를 N2 하에 0℃에서 DMF (6 mL) 내의 NaH (155 mg, 3.87 mmol)의 현탁액에 적가식으로 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, DMF (1.5 mL) 내의 1-브로모운데칸 (0.785 mL, 3.52 mmol)을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 한 후, 5일 동안 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (20 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 80 g, 0-10％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 표제 화합물 (974 mg, 2.22 mmol, 63％)이 무색 오일로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.55분, M+H 439.5.
중간체 23: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)-2- 운데실트리데칸산
Figure pct00185
DMF (1 mL) 내의 디벤질 2-운데실말로네이트 (중간체 22: 400 mg, 0.912 mmol)를 N2 하에 0℃에서 DMF (2 mL) 내의 NaH (44 mg, 1.09 mmol)의 현탁액에 적가식으로 첨가하였다. 혼합물을 45분 동안 교반한 후, DMF (1 mL) 내의 1-브로모운데칸 (0.285 mL, 1.28 mmol)을 반응물에 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 1일 동안 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (20 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 40 g, 0-5％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 무색 오일 (412 mg)이 산출되었다. 오일을 THF/MeOH에 용해시키고, 10％ Pd/C 카트리지가 있는 탈레스 나노 H-큐브(Thales Nano H-Cube) (1 mL/분, 2 바 H2, 22C)에 통과시켰다. 유출물을 수집하고, 증발시켜, 납질 고체 (272 mg)가 산출되었다. 납질 고체를 3:1 DCM / THF에 용해시키고, 오일로 농축하였다. 오일을 N2 하에 DCM (6 mL)에 재용해시키고, N-히드록시숙신이미드 (68 mg)를 첨가한 후, DCM (3 mL) 내의 DCC (136 mg)를 첨가하였다. 반응물을 일 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여과액을 농축하였다. 농축물을 플래시 칼럼 (C18 12 g, 25-100％ ACN/물 + 0.1％ 포름산)으로 정제하였다. 생성된 물질을 초임계 유체 크로마토그래피 (프린스톤 2-에틸피리딘 20×150 mm; 5-15％ MeOH / CO2)로 추가로 정제하여, 중간체 23 (37 mg, 0.073 mmol, 8％)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.67분, M+NH4 527.6; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.80 - 0.94 (m, 6 H) 1.18 - 1.42 (m, 36 H) 1.97 - 2.14 (m, 4 H) 2.87 (br. s., 4 H).
중간체 24: 2 -(( 아지도 - PEG23 ) 카르바모일 )-2- 운데실트리데칸산
Figure pct00186
THF (1 mL) 내의 중간체 23 (37 mg, 0.073 mmol)의 용액을 아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인: 80 mg, 0.073 mmol)이 충전된 바이알에 첨가하였다. 용액을 진탕기 플레이트 상에서 와동시키고, DIPEA (11 ㎕, 0.065 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 철야로 와동시킨 후, 추가 분량의 DIPEA (12 ㎕, 0.071 mmol)를 첨가하고, 철야로 반응이 진행되게 하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 초임계 유체 크로마토그래피 (프린스톤 아미노(Amino) 21×150 mm; 20-30％ MeOH / CO2)로 정제하여, 표제 화합물 (45 mg, 0.030 mmol, 41％)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.50분, [M+2H]+2 748.1; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.85 Hz, 6 H) 1.09 - 1.38 (m, 30 H) 1.58 (br. s., 12 H) 1.64 - 1.76 (m, 2 H) 1.98 - 2.16 (m, 2 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.64 (m, 5 H) 3.64 - 3.91 (m, 83 H).
중간체 25: 디-tert-부틸 2- 운데실말로네이트
Figure pct00187
DMF (2 mL) 내의 디-tert-부틸 말로네이트 (1.0 g, 4.62 mmol)를 N2 하에 0℃에서 DMF (5 mL) 내의 NaH (213 mg, 5.32 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 교반한 후, DMF (2 mL) 내의 1-브로모운데칸을 첨가하였다. 첨가 시, 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 2일 동인 교반하였다. 반응물을 Et2O (75 mL)로 희석하고, 물 (25 mL)로 추출하였다. 수성 상을 Et2O (75 mL)로 추출하였다. 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켰다. 농축물을 플래시 칼럼 (실리카 120 g, 0-40％ Et2O/ 석유 에테르)로 정제하여, 중간체 25 (0.998g, 2.69 mmol, 58％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.64분, M+Na 393.5; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.85 - 0.94 (m, 3 H) 1.24 - 1.36 (m, 18 H) 1.41 - 1.52 (m, 18 H) 1.74 - 1.86 (m, 2 H) 3.13 (t, J=7.58 Hz, 1 H).
중간체 26 : 1 - 벤질 11,11-디-tert-부틸 도코산-1,11,11-트리카르복실레이트
Figure pct00188
중간체 25를 출발 물질로 사용하여 중간체 9와 유사한 방식으로 표제 화합물을 합성하여, 무색 오일 (980 mg, 1.52 mmol, 66％)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.89 (t, J=6.91 Hz, 3 H) 1.06 - 1.20 (m, 4 H) 1.20 - 1.35 (m, 28 H) 1.45 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1.83 (m, 4 H) 2.36 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.12 (s, 2 H) 7.30 - 7.45 (m, 5 H).
중간체 27 : 12 ,12- 비스(tert-부톡시카르보닐)트리코산산
Figure pct00189
중간체 26을 사용하여, 표제 화합물 (472 mg, 0.851 mmol, 100％)을 중간체 19와 유사한 방식으로 합성하였다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.76분, M-H 553.6; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.95 (m, 3 H) 1.07 - 1.21 (m, 4 H) 1.21 - 1.40 (m, 28 H) 1.46 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1.84 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.46 Hz, 2 H).
중간체 28: 11 ,11-디-tert-부틸 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 도코산-1,11,11-트리카르복실레이트
Figure pct00190
중간체 27 (200 mg, 0.360 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (42 mg, 0.360 mmol)를 DCM (3 mL)에 용해시켰다. DCM (1.6 mL) 내의 DCC (89 mg, 0.433 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응물을 4.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 여과액을 농축하였다. 농축물을 플래시 칼럼 (실리카 24 g, 0-40％ EtOAc/HEP)으로 정제하여 표제 화합물이 무색 오일 (70 mg, 0.107 mmol, 30％)로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.74분, M+Na 674.7.
중간체 29 및 29A: 2-(11-((아지도- PEG23 )-아미노)-11-옥소 운데실 )-2- 운데실말론산 (29) 및 13-((아지도- PEG23 )-아미노)-13-옥소-2- 운데실트리데칸산 (29A)
Figure pct00191
THF (1 mL) 내의 중간체 28 (35 mg, 0.054 mmol)의 용액을 아지도-PEG23-아민 (59 mg, 0.054 mmol)이 충전된 바이알에 첨가하였다. DIPEA (14 ㎕, 0.081 mmol)를 첨가하고, 반응물을 철야로 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 DCM (1 mL) 및 TFA (0.2 mL)에 재용해시켰다. 반응물을 1.25시간 동안 와동시킨 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 HPLC (선파이어 30×50 mm C18, 55-80％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하고, 생성된 물질을 DCM (4 mL) 및 TFA (2 mL)에 재용해시키고, 1.5시간 동안 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 30×50 mm C18, 55-80％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 중간체 29 (28 mg, 0.016 mmol, 29％) 및 중간체 29A (1 mg, 0.6 μmol, 1％)가 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.08분, [M+H+H3O]+2 771.5; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.72 Hz, 3 H) 1.26 (br. s., 24 H) 1.32 - 1.41 (m, 8 H) 1.62 (quin, J=7.64 Hz, 2 H) 1.88 - 2.01 (m, 4 H) 2.31 (t, J=7.70 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.46 - 3.56 (m, 3 H) 3.57 - 3.90 (m, 91 H); LCMS - 방법 B, Rt = 1.29분, [M+2H]+2 741.1.
중간체 30: 22 -(( 아지도 - PEG23 )아미노)-22- 옥소도코산 -1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00192
THF (1 mL) 내의 중간체 16 (58 mg, 0.063 mmol)의 용액을 아지도-PEG23-아민 (70 mg, 0.063 mmol)이 충전된 바이알에 첨가하였다. DIPEA (17 ㎕, 0.095 mmol)를 첨가하고, 반응물을 진탕기 플레이트 상에서 철야로 와동시켰다. 반응물을 농축하고, HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 35-60％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 중간체 30 (57 mg, 0.036 mmol, 57％)이 백색의 납질 고체로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.62분, M+H 1555.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.28 (br. s., 18 H) 1.30 - 1.40 (m, 10 H) 1.63 (m, J=7.10, 7.10, 7.10, 7.10, 7.10 Hz, 4 H) 1.88 - 2.02 (m, 4 H) 2.28 (t, J=8.10 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.40 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.50 (dt, J=9.20, 4.39 Hz, 2 H) 3.57 - 3.63 (m, 2 H) 3.63 - 3.73 (m, 90 H)
중간체 31: 1 - 벤질 3- tert -부틸 2- 운데실말로네이트
Figure pct00193
N2 하의 0℃의 DMF (8 mL) 내의 NaH (160 mg, 4.0 mmol)의 현탁액에 DMF (2 mL) 내의 벤질 tert-부틸 말로네이트 (1.0 g, 4.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50분 동안 교반한 후, DMF (2 mL) 내의 1-브로모운데칸을 첨가하였다. 추가로 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 실온으로 가온되게 하였다. 반응물을 철야로 유지시켰다. Et2O (100 mL) 및 물 (20 mL)을 첨가하여, 반응물을 분획화시켰다. 수성 상을 Et2O (100 mL)로 추출하고, 합친 유기물을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 칼럼 (C18 12 g, 40-100％ ACN/물 + 0.1％ TFA)으로 정제하여, 표제 화합물이 무색 오일 (1.14 g, 2.82 mmol, 71％)로서 산출되었다: LCMS - 방법 A, Rt = 1.58분, M+Na 427.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.96 (m, 3 H) 1.28 (br. s, 12 H) 1.31 (m, J=3.90 Hz, 6 H) 1.41 (s, 9 H) 1.88 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.29 (t, J=7.58 Hz, 1 H) 5.19 (q, J=12.27 Hz, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 5 H).
대안적으로, DMF 내의 탄산칼륨 (2 당량)의 존재 하에 1-요오도운데칸 (1.2 당량)을 사용하여 tert-부틸 말로네이트의 알킬화를 수행할 수 있다.
중간체 32 : 1 ,11- 디벤질 11- tert -부틸 도코산 -1,11,11- 트리카르복실레이트
Figure pct00194
중간체 31 (650 mg, 1.61 mmol)을 출발 물질로 사용하여 중간체 9와 유사한 방식으로 표제 화합물을 합성하여, 무색 오일 (823 mg, 1.21 mmol, 75％)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12 (m, J=6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (quin, J=7.40 Hz, 2 H) 1.85 (t, J=8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H).
중간체 33: 13 -( 벤질옥시 )-2-(( 벤질옥시 )카르보닐)-13-옥소-2- 운데실트리데칸산
Figure pct00195
DCM (3 mL) 내의 중간체 32 (200 mg, 0.295 mmol)의 용액에 TFA (0.6 mL)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 12 g, 0-15％ EtOAc / HEP)으로 정제하여, 표제 화합물 (177 mg, 0.284 mmol, 96％)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H) 1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (quin, J=7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44 (m, 10 H).
중간체 34: 1 ,11- 디벤질 11-(2,5- 디옥소시클로펜틸 ) 도코산 -1,11,11- 트리카르복실레이트
Figure pct00196
중간체 33 (177 mg, 0.284 mmol)을 출발 물질로 사용하여 중간체 15와 유사한 방식으로 표제 화합물을 합성하여, 무색 오일 (153 mg, 0.213 mmol, 75％)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (quin, J=7.40 Hz, 2 H) 1.89 - 2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H).
중간체 35:
Figure pct00197
THF (1.5 mL) 및 DCM (1.5 mL) 내의 중간체 34 (145 mg, 0.201 mmol)의 용액을 아미노-PEG24-산이 충전된 바이알에 첨가하였다. DIPEA (88 ㎕, 0.504 mmol)를 첨가하고, 반응물을 진탕기 플레이트 상에서 15시간 동안 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 초임계 유체 크로마토그래피 (워터스 HILIC 20×150 mm; 15-25％ MeOH / CO2)로 정제하여, 중간체 35 (151 mg, 0.086 mmol, 43％)가 산출되었다: LCMS - 방법 D, Rt = 1.30분, [M+2H]+2 876.4; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15 H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J=12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J=6.72, 2.32 Hz, 2 H) 3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J=5.26 Hz, 1 H).
중간체 36:
Figure pct00198
DCM (0.265 mL) 내의 DCC (22 mg, 0.103 mmol)를 DCM (1.5 mL) 내의 중간체 35 (150 mg, 0.086 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드의 용액에 첨가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 교반하였다. 추가적인 THF (0.5 mL) 내의 N-히드록시숙신이미드 (10 mg) 및 DCM (0.265 mL) 내의 DCC (22 mg)를 첨가하고, 반응물을 철야로 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 12, 0-5％ MeOH / DCM)으로 정제하여, 중간체 36 (159 mg, 정량적)이 백색 고체로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.55분, [M+H3O+H]+2 933.9.
중간체 37:
Figure pct00199
THF (5 mL) 내의 중간체 36 (159 mg, 0.086 mmol)의 용액에 THF (1 mL) 내의 10％ Pd-탄소 (4.6 mg, 4.3 μmol)의 현탁액을 첨가하였다. 반응물을 수소 하에 놓고, 40분 동안 교반하였다. Pd-탄소 (7 mg, 6.5 μmol)를 더 첨가하고, 추가로 1시간 동안 수소 하에 교반하였다. 반응물을 막 필터에 통과시키고, 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 + 0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 화합물 (83 mg, 0.047 mmol, 54％)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 1.03분, [M+2H]+2 835.2; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17 (br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J=4.46 Hz, 1 H)
중간체 38: 11 -브로모운데크-1-인
Figure pct00200
N2 하의 0℃의 DCM (10 mL) 내의 10-운데킨-1-올 (2.29 mL, 11.9 mmol) 및 사브롬화탄소 (4.34 g, 13.1 mmol)의 용액에 트리페닐포스핀 (3.43g, 13.1 mmol)을 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 첨가 완료 시, 반응물을 실온으로 가온되게 하였다. 1.5시간 후, 반응물을 교반 중인 시클로헥산 (75 mL) 내로 붓고, 침전물을 수집하였다. 고체를 시클로헥산으로 세정하고, 합친 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 플래시 칼럼 (실리카 80 g, 0-10％ EtOAc/HEP)으로 정제하여, 표제 화합물 (1.75 g, 7.57 mmol, 64％)이 산출되었다: 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.21 - 1.35 (m, 6 H) 1.35 - 1.48 (m, 4 H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.80 - 1.91 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.63 Hz, 1 H) 2.19 (td, J=7.09, 2.69 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=6.85 Hz, 2 H).
중간체 39 : 디 - tert -부틸 2-(운데크-10- 인 -1- 일 )말로네이트
Figure pct00201
디-tert-부틸 말로네이트 (800 mg, 3.70 mmol)를 0℃에서 N2 하에 DMF (9 mL)에 용해시키고, NaH (148 mg, 3.70 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 30분 동안 0℃에서 교반하고, 중간체 38 (770 mg, 3.33 mmol)를 적가식으로 천천히 첨가하여, 황색 용액이 생성되었다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온되게 하고, 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (75 mL)에 녹이고, H2O (25 mL)로 세정하였다. 수성 층을 EtOAc (75 mL)로 추출하고, 합친 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 혼합물을 플래시 칼럼 (12 g 실리카 카트리지, 0-20％ EtOAc/헵탄)으로 2회 정제하고, 분획을 농축하여, 162.1 mg의 목적 생성물이 무색 오일 (12％)로서 산출되었다. LCMS (워터스 액퀴티 UPLC BEH C18, 130 Å, 1.7 ㎛, 2.1 mm × 50 mm, 50℃, 용매 명칭 A: 물 + 0.1％ 포름산, 용매 명칭 B: 아세토니트릴 + 0.1％ 포름산, 2.20분에 걸쳐 98％ B): Rt = 1.37분, MS [M+H] 관측치: 366.0, 계산치: 366.535. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.29 (s, 10 H) 1.47 (s, 18 H) 1.52 (dd, J=14.78, 7.20 Hz, 3 H) 1.48 (d, J=1.26 Hz, 1 H) 1.75 - 1.83 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td, J=7.14, 2.65 Hz, 2 H) 3.11 (t, J=7.58 Hz, 1 H).
중간체 40: 11 ,11-디-tert-부틸 1-에틸 도코스-21-인-1,11,11-트리카르복실레이트
Figure pct00202
중간체 39 (162.1 mg, 0.442 mmol)를 0℃에서 DMF (2 mL)에 용해시키고, NaH (21.23 mg, 0.531 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 에틸 11-브로모운데카노에이트 (143 mg, 0.486 mmol)를 천천히 적가식으로 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc (40 mL)로 희석하고, H2O (20 mL)로 1회 세정하였다. 수성 층을 EtOAc (40 mL)로 1회 추출하고, 유기 층을 합치고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 맑은 황색 오일이 제공되었다. 샘플을 1 mL DCM에 용해시키고, 플래시 칼럼 (12 g 실리카 칼럼, 0-20％ EtOAc/헵탄, 15분)으로 정제하였다. 분획들을 합치고, 농축하여, 90.1 mg의 목적 생성물 (35％)이 제공되었다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.28 (br. s., 24 H) 1.45 (s, 18 H) 1.48 (s, 3 H) 1.53 (d, J=7.58 Hz, 3 H) 1.51 (s, 1 H) 1.64 (br. s., 1 H) 1.61 (d, J=7.33 Hz, 1 H) 1.77 (d, J=16.93 Hz, 2 H) 1.74 - 1.80 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td, J=7.07, 2.53 Hz, 2 H) 2.29 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 4.13 (q, J=7.24 Hz, 2 H).
중간체 41: 12 ,12- 비스(tert-부톡시카르보닐)트리코스 -22-인산
Figure pct00203
tBuOH (1 mL) 내의 중간체 40 (21.7 mg, 0.037 mmol)의 용액에 N2 하에 30℃에서 tBuOH (2 mL) 내의 KOtBu (114 mg, 1.012 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, TLC (1:1 EtOAc/헥산, KMnO4 , 환류)로 모니터링하였다. 3시간 후에 출발 물질이 소비되었고, 반응 혼합물을 1 M HCl (20 mL)로 켄칭(quenching)하고, EtOAc (25 mL)로 2회 추출하였다. 유기 층을 합치고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 맑은 무색 오일 (18 mg, 87％)이 제공되었다. 추가로 정제하지 않고 물질을 다음 단계로 보냈다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.27 (br. s., 22 H) 1.44 (br. s., 18 H) 1.48 (s, 3 H) 1.52 (s, 3 H) 1.62 (br. s., 2 H) 1.77 (br. s., 4 H) 1.94 (br. s., 1 H) 2.18 (s, 2 H) 2.35 (s, 2 H).
중간체 42: 도코스 -21-인-1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00204
TFA (2 mL)를 중간체 41 (12 mg, 0.022 mmol)에 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석하고, 2회 농축하여, 갈색 오일이 제공되었다. 물질을 EtOAc (10 mL)에 녹이고, H2O (20 mL)로 세정하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 갈색 오일이 제공되었다. 미처리 물질을 1 mL MeOH에 용해시키고, MS-유발 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입, 3.5분에 걸쳐 45-70％ ACN)로 정제하였다: Rt = 3.42분; MS [M+H+Na] 관측치: 461.00, 계산치: 461.597. 분획들을 풀링(pooling)하고, 동결건조시켜, 5.3 mg의 표제 화합물이 56％ 수율로 제공되었다.
중간체 43: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)-2-( 운데크 -10-인-1-일)트리데칸디오산
Figure pct00205
THF (0.5 mL) 내의 중간체 42 (5.3 mg, 0.012 mmol)의 용액에 N-히드록시 숙신이미드 (1.53 mg, 0.013 mmol)를 첨가하였다. THF (0.5 mL) 내의 DCC (2.493 mg, 0.012 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 N2 하에 4시간 동안 교반하였다. 출발 물질의 완전한 전환이 LCMS로 관찰되었다. 혼합물을 농축하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계로 보냈다. LCMS (선파이어 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm, 40℃, 산성 용리제 A: 물 + 0.05％ 트리플루오로아세트산, 염기성 용리제 A: 물 + 5 mM 수산화암모늄, 용리제 B: ACN, 2분에 걸쳐 5-95％): Rt = 1.72분; MS [M+H+Na] 관찰: 558.0, 계산치: 558.67.
중간체 44:
Figure pct00206
DCM (0.5 mL) 내의 중간체 43 (3.2 mg, 5.97 μmol)의 용액에 DCM (0.5 mL) 및 DIPEA (2.09 ㎕, 0.012 mmol) 내의 아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인, 7.88 mg, 7.17 μmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 시간 동안 교반하고, 이러한 시점에 출발 물질의 전환이 LCMS로 관찰되었다. 반응 혼합물을 농축하고, 1 mL MeOH에 용해시키고, MS-유발 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼 ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입, 55-80％ ACN 5분 구배, Rt = 1.92분)로 정제하고, 분획들을 풀링하고, 동결건조시켜, 1.7 mg의 표제 화합물이 19％ 수율로 제공되었다. LCMS (액퀴티 BEH 1.7 μm 2.1×50 mm - 50℃, 용매 명칭 A: 물 + 0.1％ 포름산, 용매 명칭 B: 아세토니트릴 + 0.1％ 포름산, 2.20분에 걸쳐 98％ B): Rt = 1.89분; MS [M+H/2] 관측치: 760.0, 계산치: 759.5.
중간체 45: 도코스 -21-엔-1,11,11- 트리카르복실산
Figure pct00207
11-브로모-데크-1-엔으로 11-브로모-데크-1-인을 치환하여 중간체 39-42에 대한 절차를 따라 중간체 45를 제조하였다.
중간체 46: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1-일) 옥시 )카르보닐)-2-( 운데크 -10-엔-1-일)트리데칸디오산
Figure pct00208
DCM (2 mL) 내의 DCC (187 mg, 0.908 mmol)를 DCM (7 mL) 및 THF (0.7 mL) 내의 N-히드록시숙신이미드 (99 mg, 0.862 mmol) 및 도코스-21-엔-1,11,11-트리카르복실산 (중간체 45: 400 mg, 0.908 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 철야로 교반한 후, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm; 55-80％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 화합물 (155 mg, 0.288 mmol, 32％)이 산출되었다: LCMS - 방법 C, Rt = 1.51분, M+H 538.3; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.16 - 1.46 (m, 28 H) 1.60 - 1.87 (m, 3 H) 1.91 - 2.17 (m, 5 H) 2.38 (t, J=7.03 Hz, 2 H) 2.86 (br. s., 4 H) 3.68 (dd, J=11.25, 7.34 Hz, 1 H) 3.78 (dd, J=11.31, 5.20 Hz, 1 H) 3.99 - 4.10 (m, 1 H).
중간체 47 및 47A :
Figure pct00209
아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인: 164 mg, 0.149 mmol) 및 중간체 46 (80 mg, 0.149 mmol)을 THF (2.5 mL)에 용해시켰다. DIPEA (39 ㎕, 0.233 mmol)를 첨가하고, 반응물을 철야로 와동시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm; 45-70％ ACN/물 +0.1％ TFA)로 정제하여, 화합물 47 (97 mg, 0.061 mmol, 41％) 및 47A (32 mg, 0.021 mmol, 14％)가 산출되었다: LCMS - 방법 C, Rt = 1.35분, [M+2H]+2 761.9; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ ppm 1.05 - 1.18 (m, 3 H) 1.19 - 1.32 (m, 20 H) 1.36 (t, J=7.15 Hz, 1 H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.65 - 1.75 (m, 2 H) 2.01 - 2.06 (m, 2 H) 2.25 (t, J=7.46 Hz, 2 H) 3.33 - 3.39 (m, 2 H) 3.39 - 3.44 (m, 2 H) 3.50 - 3.67 (m, 98 H) 4.84 - 4.95 (m, 1 H) 4.95 - 5.06 (m, 1 H) 5.83 (ddt, J=17.07, 10.29, 6.68, 6.68 Hz, 1 H) 7.31 (t, J=5.44 Hz, 1 H); LCMS - 방법 C, Rt = 1.50분, [M+2H]+2 739.9; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ ppm 1.16 - 1.42 (m, 30 H) 1.42 - 1.63 (m, 5 H) 2.00 - 2.07 (m, 2 H) 2.22 - 2.28 (m, 2 H) 2.40 - 2.52 (m, 2 H) 3.25 - 3.33 (m, 2 H) 3.33 - 3.42 (m, 2 H) 3.42 - 3.50 (m, 2 H) 3.50 - 3.68 (m, 88 H) 4.86 - 5.06 (m, 2 H) 5.83 (ddt, J=17.04, 10.26, 6.71, 6.71 Hz, 1 H) 6.40 - 6.74 (m, 1 H).
중간체 48 : 2 - 운데실말론산
Figure pct00210
중간체 22 (290 mg,0.661 mmol)를 사용하여, 표제 화합물 (185 mg, 정량적)을 중간체 19와 유사한 방식으로 합성하였다: LCMS - 방법 B, LCMS Rt = 0.82분, M-H 257.3
중간체 49: 2 -(((2,5- 디옥소피롤리딘 -1- 일 ) 옥시 )카르보닐)트리데칸산
Figure pct00211
DCC (122 mg, 0.592 mmol)를 DCM (6 mL) 및 THF (0.5 mL) 내의 중간체 48 (170 mg, 0.658 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (68 mg, 0.592 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반한 후, DCM (0.5 mL) 내의 DCC (30 mg, 0.145 mmol)를 더 첨가하였다. 반응물을 추가로 2일 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 HPLC (선파이어 C18 30×50 mm, 45-70％ ACN/물 + 0.1％ TFA)로 정제하여, 표제 화합물이 백색 분말 (46 mg, 0.129 mg, 20％)로서 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.94분, M+H 356.3; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.89 (t, J=7.00 Hz, 3 H) 1.20 - 1.40 (m, 16 H) 1.43 - 1.55 (m, 2 H) 1.99 - 2.14 (m, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 3.71 (t, J=7.46 Hz, 1 H).
중간체 50 및 50A:
Figure pct00212
표제 화합물을 중간체 49 (30 mg, 0.084 mmol)로부터 50 및 50A와 유사한 방식으로 합성하여, 중간체 50 (18 mg, 0.013 mmol, 16％) 및 중간체 50A (5 mg, 4 μmol, 5％)이 산출되었다: LCMS - 방법 B, Rt = 0.85분, M+H 1340.3; 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.82 - 0.98 (m, 3 H) 1.20 - 1.36 (m, 16 H) 1.36 - 1.51 (m, 2 H) 1.83 - 2.02 (m, 1 H) 2.11 - 2.27 (m, 1 H) 2.33 (dd, J=11.80, 4.22 Hz, 1 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 3 H) 3.49 (d, J=5.01 Hz, 1 H) 3.56 - 3.79 (m, 92 H); LCMS - 방법 B, Rt = 0.96분, M+H 1296.3.
중간체 51-57: GDF15 단백질의 돌연변이체
이. 콜라이 세포에서의 인간 GDF -15 단백질의 발현
이. 콜라이 균주 BL21 (DE3) 골드(Gold) (스트라타진(Stratagene)) 및 로제타(Rosetta) (DE3) pLysS 세포 (노바젠(Novagen))를 pET26b 벡터 내로 클로닝된 구축물 51 내지 56 및 구축물 MAHA-(200-308)-hGDF15로 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 항생제 선별 하에 먼저 3 ml, 그 후 50 ml의 루리아 브로스(Luria Broth) (박토-트립톤(Bacto-Tryptone) 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 5/L, 글루코스 6 g/L)에서 1.5의 OD600에 도달할 때까지 성장시켰다. 예비-배양물을 사용하여, 테리픽 브로스(Terrific Broth) 배지 (NH4SO4 1.2 g/L, H2PO4 0.041 g/L, K2HPO4 0.052 g/L, 박토-트립톤 12 g/L, 효모 추출물 24 g/L)가 채워진 2개의 1-L 발효기에 접종하였다. pH가 7.1 초과로 증가되었 때 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 자동 첨가에 의해 배양물이 유도되었다. 기타 발효 파라미터는 하기와 같았다: 온도 = 37℃; pH 7.0 +/- 0.2 (2N NaOH/H2SO4 첨가로 조정됨); pO2>30％ + 케스케이드식 교반기 속도, 공기 유동 및 산소 첨가. 유도 5시간 후, 배양물을 10℃로 냉각하고, 원심분리로 세포를 수확하였다.
GDF15 변이체의 정제 및 리폴딩
a) 봉입체
관심 단백질을 발현하는 재조합 이. 콜라이 펠릿을 4℃에서 50 mM NaH2PO4 / 150 mM NaCl / 5 mM 벤즈아미딘 HCl / 5 mM DTT, pH 8.0에 재현탁시키고 (5％ w/v), 균질화시키고, 프렌치 프레스에 2회 통과시켜 용해시켰다 (800 및 80 바). 4℃에서 60분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하여 봉입체 (IB)를 단리하였다.
b) 폴딩되지 않은 미처리 단백질의 정제
IB를 6 M 구아니딘 / 100 mM NaH2PO4 / 10 mM 트리스 / 20 mM 베타-메르캅토에탄올, pH 8.0에 가용화시키고 (5％ w/v), 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 12,000 rpm으로 원심분리하여 잔해물을 제거하였다. 가용화된 IB를 Ni-NTA-수퍼플로(Superflow) 상에서 추가로 정제하였다 (His 태그가 없는 구축물도 높은 히스티딘 함량으로 인해 이러한 수지에 잘 결합한다). 6 M 구아니딘 / 100 mM NaH2PO4 / 10 mM 트리스 / 5 mM 베타-메르캅토에탄올, pH 8.0으로의 기준선 세정 후, 결합된 물질을 pH 4.5으로 조정된 동일한 완충제로 용리시켰다. 용리물을 pH 8.0으로 조정하고, 100 mM DTT를 첨가하고, 용액을 철야로 4℃에서 교반하였다. 그 후, 트리플루오로아세트산 (TFA, 물 내의 10％ 원액)을 첨가하여 pH를 2로 조정하고, 용액을 물 내의 0.1％ TFA로 추가로 1:1 희석하였다. 미처리 단백질 용액을 50분 내의 0-50％ 아세토니트릴의 구배를 사용하여 RP-HPLC (포로스(Poros))로 추가로 정제하였다. GDF-15를 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조시켰다.
c) 단백질 폴딩
방법 1: 동결건조된 물질을 2 mg/ml로 100 mM 아세트산에 용해시키고, 폴딩 완충제 (100 mM CHES / 1 M NaCl / 30 mM CHAPS / 5 mM GSH / 0.5 mM GSSG / 20％ DMSO, pH 9.5, 4℃)에서 15-20배 희석하고, 용액을 3일 동안 4℃에서 부드럽게 교반하였다. 3일 후, 3 부피의 100 mM 아세트산을 첨가하고, 용액을 초여과 (5 kDa 차단값)로 약 100-200 ml로 농축하고, 100 mM 아세트산으로 10배 희석하고, 다시 농축하였다. 리폴딩된 물질을 50℃에서 실행된 비닥(Vydac) C4 칼럼 상에서의 분취용 RP-HPLC로 추가로 정제하였다 (완충제 A: 물 내의 0.1％ TFA; 완충제 B: 아세토니트릴 내의 0.05％ TFA). 로딩 후, 칼럼을 15％ 완충제 B로 세정하고, 50분 내의 15％ B → 65％ B의 구배로 용리시켰다. 관심 단백질을 함유하는 수집된 분획을 등부피의 완충제 A로 희석하고, 동결건조시켰다. 리폴딩 수율은 양쪽 단백질에 대해 약 25％였다.
방법 2: 100 mM CHES, pH 9.4, 0.9 M 아르기닌, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM GSH, 1 mM GSSG (최종 농도)의 폴딩 완충제로 방법 1에서와 같은 프로토콜을 따랐다.
상기 절차에 따라 하기의 GDF15 돌연변이체가 제조되었다:
중간체 51: M -(His) 6 - hGDF15
Figure pct00213
LCMS: 계산 질량: 26462 관측 질량: 26464
중간체 52: M-(His) 6 -M- hGDF15
Figure pct00214
LCMS: 계산 질량: 26724 관측 질량: 26725
중간체 53: His- dGDF15 :
Figure pct00215
LCMS: 계산 질량 (이량체): 26368 관측 질량: 26363
중간체 54: MH -(199-308)- hGDF15
Figure pct00216
LCMS: 계산 질량: 24636 관측 질량: 24638
중간체 55: AH-(199-308)- hGDF15
Figure pct00217
단계 1: M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15 aa199-308 구축물의 제조
M-His6-TEV(ENLYFQ/A)-H-hsGDF15 aa199-308 구축물을 상기 절차 (단계 a, b 및 c)에 따라 제조하였다.
단계 2: 단계 1로부터의 단백질의 TEV 절단
동결건조된 단백질을 1.75 mg/ml의 최종 농도로 물에 가용화시켰다. 6 M Guan/50 mM 트리스, pH 8.0 + 50 mM DTT에 1:1 희석함으로써 단백질이 다시 언폴딩되었고, 이를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물질을 비닥 C4 칼럼 상에서의 분취용 RP-HPLC로 다시 정제하고, 동결건조시켰다. 26 mg의 동결건조물을 26 ml 50 mM 트리스/3M UREA, pH 7.5 + 3000 유닛의 AcTEV 프로테아제 (인비트로젠, 12575-023)에 가용화시키고, 4일 동안 인큐베이션하였다. 트리플루오로아세트산 (TFA, 물 내의 10％ 원액)을 첨가하여 pH를 2.0으로 조정하고, 용액을 물 내의 0.1％ TFA로 추가로 150 ml로 희석하였다. 0.22 um 막으로 여과한 후, 물질을 비닥 C4 칼럼 상에서의 분취용 RP-HPLC로 다시 정제하여, 성공적으로 절단된 단백질을 단리하였다. 수동으로 분획을 수집하였다: 표적 단백질을 함유하는 분획을 단리하고, 동결건조시켰다. 그 후, 상기 기술된 바와 같이, 절단된 GDF15 단백질을 리폴딩시키고 리폴딩된 단백질을 정제하였다.
LCMS: 계산 질량 (이량체): 24516 관측 질량:24518
상기 절차에 따라 하기의 GDF15 돌연변이체가 제조될 수 있다:
중간체 56: MHA -(200-308)- hGDF15
Figure pct00218
LCMS: 계산 질량 (이량체): 24752
상기 절차에 따라 하기의 GDF15 돌연변이체가 제조되었다:
중간체 57: AHA-(200-308)- hGDF15
Figure pct00219
LCMS: 계산 질량(이량체): 24430: 관측 질량 (이량체): 24432
중간체 58 : His- hGDF15 BCN 접합체
Figure pct00220
His- hGDF15
Figure pct00221
His-hGDF15 (중간체 52: 0.6 mL, 4.8 mg/mL)의 원액을 30 mM NaOAc pH 4.5 완충제 (5.2 mL)로 0.5 mg/mL로 희석하였다. DMSO (251 ㎕) 내의 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (NHS-BCN)의 10 mg/mL 원액을 천천히 첨가하고, 반응물을 24℃에서 21시간 동안 진탕기 플레이트 상에 놓았다. 반응물을 30 mM NaOAc pH 4.5 완충제로 30 mL로 희석하고, 10 kDa MWCO 초여과 카트리지를 사용하여 2 mL로 농축하여 (4× 반복), 2.5 mL의 농축물이 산출되었다. A280 (ε = 29090M-1 cm-1, 26730 g/mol)을 기초로, 농축물은 0.93 mg/mL (2.33 mg, 80％)였다: LCMS QT2_15-60kDa_15분_극성 (방법 E). 생성된 용액을 MALDI로 분석하였고, 이는 주요 접합이 +1 및 +2 (단량체 및 이량체의 N-말단 표지화)임을 가리켰다.
Figure pct00222
His-hGDF15 +1BCN (비시클로[6.1.0]논-4-이닐)은 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2BCN은 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3BCN은 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
중간체 59 : His- hGDF15 BCN 접합체
Figure pct00223
His-hGDF15 서열:
Figure pct00224
His-hGDF15 (중간체 51: 7.04 mL, 1.42 mg/mL)의 원액을 30 mM NaOAc pH 4.5 완충제 (12.95 mL)로 0.5 mg/mL로 희석하였다. DMSO (0.88 mL) 내의 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (NHS-BCN)의 10 mg/mL 원액을 천천히 첨가하고, 반응물을 24℃에서 24시간 동안 진탕기 플레이트 상에 놓았다. 추가 분량의 NHS-BCN 원액 (176 ㎕)을 첨가하고, 반응물을 24℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 반응물을 30 mM NaOAc pH 4.5 완충제로 60 mL로 희석하고, 10 kDa MWCO 초여과 카트리지를 사용하여 4 mL로 농축하여 (4× 반복), 4.1 mL의 농축물이 산출되었다. A280 (ε = 29090M-1 cm-1, 26700 g/mol)을 기초로, 농축물은 2.19 mg/mL (8.98 mg, 89％)였다: LCMS QT2_15-60kDa_15분_극성 (방법 E).
Figure pct00225
His-hGDF15 +1BCN (비시클로[6.1.0]논-4-이닐)은 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2BCN은 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3BCN은 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
중간체 60: His-개- GDF15 - BCN
Figure pct00226
100 uL His-dGDF15 (0.68 mg/mL), 100 uL pH 4.5 완충제, 4 uL의 10 mg/mL BCN-NHS 용액을 합치고, 실온에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 생성된 혼합물을 아미콘(Amicon) 10k로 4회 세정하여, 200 uL 용액이 제조되었고, 이를 다음 단계에서 사용하였다. 접합체로의 추가적인 전환을 위해 생성물을 미처리물로서 보냈다.
본 발명의 실시예:
His- hGDF15 + 지방산-PEG-N 3 클릭을 위한 일반적인 절차. BCN-표지 GDF15를 30 mM NaOAc pH 4.5 완충제에서 0.5 mg/mL로 희석한 한편, 물 내의 FA-PEG-N3 (지방산-PEG23-아지드)의 10 mg/mL 용액을 제조하였다. GDF15 용액에 10 당량의 FA-PEG-N3을 첨가하고, 반응물을 24℃에서 철야로 진탕기 플레이트 상에 놓았다. 반응 진행을 LCMS (QTOF 방법 15-60kDa_15분_극성)으로 모니터링하고, 미반응 BCN-표지 GDF15가 관찰되지 않을 때까지, 필요하다면 50 당량까지, 추가적인 FA-PEG-N3을 첨가하였다. 그 후, 반응물을 30 mM NaOAc pH 4 완충제로 5-10× 희석하고, 10 kDa MWCO 초여과 카트리지를 사용하여 완충제를 새로운 완충제로 교환하였다 (4회 사이클의 농축 후 희석). 샘플을 A280로 측정된 바와 같은 ~1 mg/mL로 농축하였고, 회수율은 정량적으로 34％였다. 최종 접합체를 LCMS (QTOF 방법 15-60kDa_15분_극성) 또는 MALDI로 분석하였다.
실시예 1 : 중간체 21에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-59):
Figure pct00227
Figure pct00228
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 2 : 중간체 44에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-59):
Figure pct00229
Figure pct00230
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 3: 중간체 29A에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-59):
Figure pct00231
Figure pct00232
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 4 : 중간체 24에 접합된 His- hGDF15 BCN (중간체 58):
Figure pct00233
Figure pct00234
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 5: 중간체 29에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00235
Figure pct00236
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 6: 중간체 55에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00237
Figure pct00238
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 7: 중간체 6A에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00239
Figure pct00240
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 단량체 단위 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 9: 중간체 30에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00241
Figure pct00242
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 분자 (단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 10: 중간체 12에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00243
Figure pct00244
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 분자 (단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 13 : 중간체 6에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-59):
Figure pct00245
Figure pct00246
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 분자 (양쪽 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 14: 중간체 17에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00247
Figure pct00248
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 분자 (양쪽 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
실시예 15:
단계 1:
Figure pct00249
THF (5 mL) 내의 2,2,13,13-테트라메틸테트라데칸디오산 (알드리치 CPR(Aldrich CPR), 주문 번호 PH002322) (100 mg, 0.318 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (40.3 mg, 0.35 mmol)의 용액에 THF (5 mL) 내의 DCC (65.6 mg, 0.318 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다. 목적 생성물로의 부분적인 전환이 LC-MS 분석으로 관찰되었다. 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축하였다. 잔류물을 DCM (40 mL)에 다시 용해시키고, 물로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 실리카 크로마토그래피로 정제하고, 헵탄/EtOAc/DCC (10:1:1)로 용리시켜, 혼합물이 제공되었다. 혼합물을 MS-유발 산 HPLC [(55-80％ ACN 3.5분 구배): rt= 2.48분, 계산 질량: 314.46, 관측 질량: 314.00]로 추가로 정제하여, 깨끗한 생성물 (50 mg, 38.2％ 수율)이 제공되었고, 출발 물질이 회수되었다.
단계 2:
Figure pct00250
DCM (3 mL) 내의 NHS-2,2,13,13-테트라메틸테트라데칸디오산 (10 mg, 0.024 mmol)의 용액에 아지도-dPEG3-아민 (10 mg, 0.049 mmol) 및 DIPEA (9 uL, 0.049 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하고, MeOH (3 mL)에 다시 용해시키고, MS-유발 HPLC (55-80％ ACN 3.5분 구배 rt=2.35, 질량 예상치: 514.70 관측 질량: 514.40)로 정제하여, 7 mg의 깨끗한 생성물이 58％ 수율로 제공되었다.
단계 3:
Figure pct00251
100 ㎕ BCN-dGDF15 (I-60: pH 4.5 완충제 내의 0.68 mg/mL)의 용액에 pH 4.5 완충제 (100 ㎕) 및 아지드 (DMSO 내의 6 ㎕, 10 mg/mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 철야로 인큐베이션하였다. 혼합물을 아미콘 10k로 4회 세정하였다. 생성된 용액을 MALDI로 분석하였고, 이는 주요 접합을 +1 및 +2로 가리켰다. MALDI: 계산 질량: 26546, 관측 질량: 26483; 계산 질량: 27060, 관측 질량: 27128; 계산 질량: 27574 관측 질량: 27789.
실시예 16 : 중간체 44에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
Figure pct00252
Figure pct00253
His-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 1개의 분자 (1개의 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
His-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 분자 (양쪽 단량체 단위) 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다.
실시예 17: 중간체 52에 접합된 His- hGDF15 - BCN
Figure pct00254
7 mL의 pH 4 아세트산나트륨 완충제 내의 3 mL 시클로옥틴 GDF15 (I- 58: 0.46 mg/mL, 0.051umol)의 용액에 지방산 PEG 아지드 (35 mg/mL DMSO 내의 15 uL, 0.36 umol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 철야로 인큐베이션하였다. MALDI 분석에 의해 완전한 전환이 관찰되었다. 생성물을 3회의 아미콘 여과 10 kD 세정으로 정제하여, 0.29 mg/ml의 목적 생성물 4.3 ml가 90％ 수율로 제공되었다. MALDI: 시클로옥틴 sm ~5％ 예상 질량: 26902, 관측 질량: 26997; +1 지방산 ~40％ 예상 질량: 28421, 관측 질량: 28525; +2 지방산 ~50％ 예상 질량: 29940, 관측 질량: 30191; +3 지방산 5％ 예상 질량: 31459, 관측 질량:31874.
실시예 18: 중간체 37에 접합된 MH -(199- 308)GDF15 (I-54)
Figure pct00255
MH-(199-308)-GDF15 (중간체 54: 0.393 mL, 0.028 μmol, 1.78 mg/mL)를 1.5 ml의 30 mM 아세트산나트륨 완충제에 첨가하였다. NHS 지방산 (474 ug, 0.284 umol, 10 mg/ml)을 용액에 첨가하였다. 5시간 후, MALDI에 따르면 반응이 완료되었다. 아미콘 초여과 10 kD를 사용하여 5회 세정함으로써 생성물을 정제하여, 575 ug의 접합체가 73％ 수율로 제공되었다. MALDI: sm (18％), 예상 질량: 24638, 관측 질량: 24735; +1 지방산 (38％) 예상 질량: 26192, 관측 질량: 26268; +2 지방산 (40％) 예상 질량: 27746, 관측 질량: 27798; +3 지방산 (4％) 예상 질량: 29300, 관측 질량: 29333.
실시예 19A: 중간체 37에 접합된 His- hGDF15 (I-59)
Figure pct00256
His-GDF15 (0.493 ml, 0.026 μmol, 1.42 mg/ml)를 1.5 ml의 30 mM 아세트산나트륨 pH=4 완충제에 첨가하였다. NHS 지방산 (0.221 mg, 0.132 umol, 10 mg/mL)을 용액에 첨가하였다. 철야로 반응이 완료되지 않아서, 2.5 당량의 지방산 NHS (0.110 mg, 0.066 umol, 10 mg/mL)을 더 첨가하였고, 5시간 후에 MALDI가 +2 접합체를 주요 생성물로서 나타냈다. 아미콘 초여과 10 kD를 사용하여 5회 세정함으로써 생성물을 정제하여, 565 ug의 접합체가 76％ 수율로 제공되었다. MALDI: sm (18％), 예상 질량: 26468, 관측 질량: 26553; +1 지방산 (38％) 예상 질량: 28022, 관측 질량: 28099; +2 지방산 (40％) 예상 질량: 29576, 관측 질량: 29649; +3 지방산 (4％) 예상 질량: 31130, 관측 질량: 31201.
실시예 19B: 중간체 37과 접합된 AHA- hGDF15
Figure pct00257
분자 생물학 등급의 물 내의 중간체 37의 10 mg/mL 용액을 제조하였다. AHA-hGDF15 (중간체 57, 30 mM NaOAc pH 4.0 내의 6.67 mg/mL, 5.247 mL, 1.433 μmol)에 30 mM NaOAc pH 4.6 (허용가능 범위 4.5-5.0)을 첨가하여, 0.88 mg/mL의 최종 단백질 농도를 제공하였다. 중간체 37 (10 당량, 2.39 mL, 0.014 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하였다. 반응 바이알에서 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 4×15 mL 10 kDa 아미콘 원심분리 필터에서 분할하고, 각각을 30 mM NaOAc pH 4.0으로 15 mL로 희석하였다. 세정 사이에 필터 내의 침전물을 피펫 팁으로 와동시키면서, 물질을 30 mM NaOAc pH 4.0으로 4× 완충제-교환하고, 샘플들을 25.6 mL의 부피로 합쳤다. 침전물이 용액에 잔존하여, 혼합물을 4℃에서 철야로 두었다. A280 (30040 cm-1M-1, 27538 g/mol)에 의해 농도가 1.62 mg/mL (100％)인 것으로 측정되었다. UPLC 분석은 +1FA (체류 시간: 4.88분) 및 +2FA 생성물 (체류 시간: 5.80분)의 60％ 회수를 나타냈다 (방법 J). LCMS 방법 T는 목적 질량을 나타냈다.
실시예 19B의 미처리 혼합물 (하기 표에 나타난 비)을 생체 내에서 테스트하였고, 표 1에서 보고된다:
Figure pct00258
AHA-hGDF15 +1FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 폴리펩티드 사슬 중 하나 상의 (단량체 단위 상의) N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다 (실시양태 11B, 화학식 H에서 나타난 바와 같음).
AHA-hGDF15 +2FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 양쪽 폴리펩티드 사슬 상의 N-말단 아미노 관능기에서의 반응에 상응한다 (실시양태 11B, 화학식 G에서 나타난 바와 같음).
AHA-hGDF15 +3FA (지방산)는 GDF15 동종이량체의 일부 다른 부위에서의 비-선택적 반응에 상응한다.
정제:
미처리 생성물을 워터스 BEH300 (130 Å, 3.5 ㎛, 4.6 mm×100 mm, 유속 2.5 ml/분) 상에서 역상 크로마토그래피 (완충제 A: 물 내의 0.1％ TFA; 완충제 B: ACN 내의 0.1 M TFA; 구배; 99％-80％ 완충제 A)로 정제하였다.
분획 1: 미반응 AHA-hGDF15: Rt=17.33분
분획 2: (19B1): AHA-GDF15 +1FA: Rt=20.2분 (약 15％ 수율) (화학식 H)
분획 3: (19B2): AHA-GDF15 + 2FA: Rt=21.6분 (약 15％ 수율) (화학식 G)
분획 4: (19B3): AHA-GDF15 + 3 FA: Rt=23.0분 (약 5％ 수율)
19B1 및 19B2의 1:1 비 혼합물을 제조하고, 테스트하였다 (19Bm).
대안적으로, pH 4.73의 10 mM Na2HPO4-7H2O 및 30 mM NaOAc에서 반응을 수행할 수 있다: 분자 생물학 등급의 물 내의 중간체 37의 10 mg/mL 용액을 제조하였다. AHA-hGDF15 (중간체 57, 30 mM NaOAc pH 4.0 내의 12.04 mg/mL, 4.15 ㎕, 0.002 μmol)에 30 mM NaOAc 10 mM Na2HPO4 - 7H2O pH 4.73을 첨가하여, 0.88 mg/mL의 최종 단백질 농도를 제공하였다. 중간체 37 (20 당량, 6.83 ㎕, 0.041 μmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하였다. 침전물이 있으면서 반응 혼합물이 탁해졌다. UPLC 분석이 58％ +1 및 +2 생성물을 나타냈다 (방법 J).
Figure pct00259
pH 4.6의 30 mM NaOAc 및 10 mM K2HPO4에서 반응을 수행할 수도 있다: 분자 생물학 등급의 물 내의 중간체 37의 10 mg/mL 용액을 제조하였다. AHA-hGDF15 (중간체 57, 30 mM NaOAc pH 4.0 내의 6.21 mg/mL, 5.261 mL, 1.337 μmol)에 30 mM NaOAc 10 mM K2HPO4 pH 4.6 (허용가능 범위 4.5-5.0)을 첨가하여, 0.88 mg/mL의 최종 단백질 농도를 제공하였다. 중간체 37 (10 당량, 68.3 ㎕, 0.409 μmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 7시간 동안 혼합하였다. 침전물이 있으면서 반응 혼합물이 탁해졌다. 반응 혼합물을 15 mL 10 kDa 아미콘 원심분리 필터에서 4개의 9 mL 분량으로 분할하고, 30 mM NaOAc pH 4.0으로 15 mL로 희석하였다. 각각의 세정 사이에 침전물을 피펫 팁으로 와동시키면서, 물질을 30 mM NaOAc pH 4.0으로 4× 완충제-교환하하였다. 반응 혼합물을 75 mL의 부피로 농축하였다. 침전물이 잔존하여, 물질을 4℃에서 2일 동안 보관하였다. A280 (30040 cm-1M-1, 27538 g/mol)에 의해 농도가 0.4 mg/mL (97％)인 것으로 측정되었다. UPLC 분석이 +1 및 +2 생성물의 61％ 회수를 나타냈다 (방법 J).
Figure pct00260
참조예 1: 중간체 PEG-미리스트산 구축물에 접합된 His- hGDF15 BCN (I-58):
단계 1:
Figure pct00261
아지도-PEG23-아민 (30 mg, 0.027 mmol) 및 미리스트산 NHS 에스테르 (토론토 리서치 케미컬스(Toronto Research Chemicals), 카탈로그 # S69080) (12 mg, 0.037 mmol)의 혼합물에 DCM (1 mL) 및 DIPEA (13 uL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다. 혼합물을 실리카 크로마토그래피로 정제하고, EtOAc/헵탄 (0-100％)에 이어서 MeOH/DCM (0-10％)으로 용리시켜, 깨끗한 생성물이 약 5％ MeOH/DCM에서 제공되었다. LCMS: (구배: 1.4분 내에 40 → 98％ B - 유동 1 mL/분, 용리제 A: 물 + 0.05％ 포름산 + 3.75 mM 아세트산암모늄, 용리제 B: 아세토니트릴 + 0.04％ 포름산). LCMS: rt=2.20 (방법 C) 질량 +H 계산치: 1354.71, 관측 질량: 1354.4.
단계 2:
Figure pct00262
BCN-hGDF15 (I- 52: 800 uL, 0.25 mg/mL)의 용액에 a (DMSO 내의 2 mg/mL, 6.3 uL, 10 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다. 1.1 mL 0.20 mg/mL (정량적 수율). (MALDI: +1 계산 질량: 28223, 관측 질량: 28640; +2 계산 질량: 29543, 관측 질량: 29962, +3 계산 질량: 30863, 관측 질량: 31426, +4 계산 질량: 32183, 관측 질량: 32911).
참조예 2 : his- hGDF15 - PEG23
Figure pct00263
Figure pct00264
30 mM NaOAc pH 4.0 (427 ㎕) 내의 His-hGDF15 BCN (I59: 427 ㎕, 1.17 mg/mL, 0.019 μmol)의 용액에 아지도-dPEG23-아민 (퀀타 바이오디자인, 104 ㎍, 0.094 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 혼합하였고, 이러한 시점에 샘플을 140 ㎕의 부피로 5회 희석 및 농축함으로써 10 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 혼합물을 30 mM NaOAc pH 4.0 내로 교환하였다. MALDI 분석이 +1 내지 +4 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. A280 (29090 M-1cm-1, 27600 g/mol)에 의해 농도가 2.099 mg/mL (57％)인 것으로 측정되었다.
실시예 20: 중간체 47에 접합된 아펠린 고리형 펩티드 BCN :
단계 1: pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH( 페네틸 ) (디술피드 C4-C7) 아세테이트의 합성
Figure pct00265
Figure pct00266
중간체 20a의 제조
(2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 Fmoc -D- Nle -OH를 로딩함, Fmoc 제거, 및 수지 로딩의 결정)
2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (50.0 g, 85.0 mmol)를 DCM (400 mL)에 현탁시키고, 현탁액을 10분 동안 교반한 후, 용매를 배수시키고, 수지를 DCM (3 × 200 mL)으로 세정하였다. 그 후, DCM (120.0 mL) 내의 Fmoc-D-Nle-OH (24.0 g, 68.0 mmol) 및 DIPEA (96.5 ml, 552.5 mmol)의 용액을 수지에 첨가하고, 현탁액에 질소를 플러싱하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 또 다른 분량의 DIPEA (22.7 ml, 127.5 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다.
반응 혼합물을 배수시키고, 수지를 DCM (3 × 250 mL)으로 매회 2분 동안 세정하였다. 수지를 DCM/MeOH/DIPEA (70:15:15) 혼합물 (2 × 250 mL)로 매회 10분 동안 켄칭시켰다.
수지를 피페리딘/DMF (1:3) (1 × 300 mL)로 5분 동안 처리하여 Fmoc 기를 절단한 후, 15분 동안 수지를 배수시켰고 (1 × 300 mL), 세정 단계가 이어졌다: DMF (6 × 250 mL, 매회 2분), 이소프로판올 (2 × 250 mL, 매회 2분) 및 TBME (6 × 250 mL, 매회 2분). 수지를 진공 하에 35℃에서 24시간 동안 건조시켜, 중간체 20a (57.8 g, 로딩 = 1.08 mmol/g)가 산출되었다.
Figure pct00267
중간체 20b의 제조
(선형 펩티드의 조립)
중간체 20a (18.5 g, 20.0 mmol)를 자동 펩티드 합성기 (CSBIO536™) 상에서의 고체 상 펩티드 합성에 적용하였다. 하기와 같이 커플링 사이클이 규정되었다:
Figure pct00268
아미노산 커플링: AA (3.0 당량), DIC (3.0 당량), HOBt (3.0 당량), DMF (하기 표 참조)
Figure pct00269
세정: DMF (4 × 150 mL, 매회 2분).
Figure pct00270
Fmoc 탈보호: 피페리딘/DMF (1:3) (5분 동안 150 mL, 그 후 15분 동안 150 mL).
Figure pct00271
세정: DMF (6 × 150 mL, 매회 2분).
Figure pct00272
펩티드 조립 후, 수지를 DMF (6 × 150 mL, 매회 2분), 이소프로판올 (6 × 150 mL, 매회 2분) 및 TBME (6 × 150 mL, 매회 2분)로 세정하였다. 펩티드 수지를 고진공 하에 35℃에서 철야로 건조시켜, 중간체 20b (57.6 g, 20.0 mmol)가 제공되었다.
Figure pct00273
중간체 20c의 제조
(수지로부터의 HFIP 절단)
분량의 중간체 20b (27 g, 9.37 mmol)를 DCM (300 mL)에 용해시키고, 15분 동안 교반하였다. 수지를 배수시킨 후, HFIP/DCM (3:7) (3 × 270 mL, 매회 15분)으로 처리하였다. 절단 용액을 여과하고, 수집하였다. 수지를 DCM (3 × 300 mL)으로 세정하였다. 합친 절단 및 세정 용액을 진공에서 농축 건조시켰다. 백색 분말을 진공 하에 35℃에서 철야로 건조시켜, 중간체 20c- 뱃치(Batch)1 (23.5 g, 9.37 mmol)이 산출되었다.
상기 언급된 절차를 또 다른 분량의 중간체 20b (28.0 g, 9.72 mmol)로 반복하여, 중간체 20c-뱃치2 (26.1 g, 9.72 mmol)가 산출되었다.
Figure pct00274
중간체 20d의 제조
(페네틸아민의 용액 상 커플링)
중간체 20c- 뱃치2 (20.0 g, 7.44 mmol, 1.0 당량) 및 HATU (5.23 g, 13.8 mmol, 1.85 당량)를 DMF (400 mL)에 용해시켰다. DMF (60 mL) 내의 페네틸아민 (1.67 g, 13.8 mmol, 1.85 당량) 및 DIPEA (3.56 g, 27.6 mmol, 3.71 당량)의 용액을 첨가하였다.
반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 0℃로 냉각시키고, 염수 (460 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 10분 동안 교반한 후, 생성물을 여과로 단리하였다. 필터 케이크를 H2O (300 mL)로 세정한 후, 이를 조심스럽게 제거하고, DCM (300 mL)에 용해시켰다. 용액을 MgSO4 상에서 건조시킨 후, 진공에서 농축 건조시켰다. 미처리 생성물을 실리카 겔 상에서의 플래시 크로마토그래피 (용리제: DCM 및 DCM/iPrOH (8:2))에 적용하여, 중간체 20d- 뱃치1 (14.4 g, 6.6 mmol)가 산출되었다.
플래시 크로마토그래피를 제외하고는 동일한 절차를 중간체 20c- 뱃치1 (23.4 g, 9.37 mmol)로 반복하여, 중간체 20d-뱃치2 (28.0 g, 9.37 mmol)가 산출되었다.
Figure pct00275
중간체 20e의 제조
(보호기 제거)
중간체 20d- 뱃치2 (28.0 g, 9.37 mmol)를 TFA/DCM/EDT/TIS (90:5:2.5:2.5) (290 mL)에 용해시키고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
절단 용액을 여과하고, 저온 TBME (3 L) (0-4℃)에 부었다. 혼탁한 현탁액을 얼음-물 수조에서 30분 동안 교반한 후, 세공 4 유리 필터를 통해 여과하였다. 이렇게 수득된 백색 고체를 TBME (2 × 100 mL)로 세정한 후, 35℃에서 철야로 진공에서 건조시켜, 중간체 20e- 뱃치1 (8.9 g, 5.9 mmol)가 산출되었다.
동일한 절차를 중간체 20d- 뱃치1 (14.4 g, 6.6 mmol)로 반복하여, 중간체 20e-뱃치2 (9.6 g, 6.3 mmol)가 산출되었다.
Figure pct00276
pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH( 페네틸 ) (디술피드 C4-C7) 아세테이트의 제조
1) 고리화
중간체 20e (5.0 g, 3.3 mmol)를 물 (500 mL)에 용해시켰다. 아세트산 (93 mL) 내의 요오드 (1.18 g, 4.66 mmol, 1.41 당량)의 용액을 1 분량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 물 (5.8 mL) 내의 아스코르브산 (1.03 g, 5.83 mmol, 1.77 당량)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 10분 동안 교반하고, 여과하고, 정제할 때까지 4℃에서 보관하였다.
18.3 g (12.1 mmol)의 중간체 20e가 가공될 때까지 동일한 고리화 절차를 반복하였다.
2) 정제
고리형 펩티드의 용액을 주입 당 0.5-5.0 g 펩티드의 분량으로 분취용 HPLC에 적용하였다. 순도가 95％를 초과하는 분획을 풀링하고, 냉동 건조시켜, 총량 4.89 g (3.2 mmol)의 정제된 펩티드 (TFA 염)이 생산되었다.
3) 이온 교환에 의한 아세테이트 형성
OH- 형태의 75 g (100 mL)의 강력한 음이온 교환체 수지 (이온 익스체인저(Ion exchanger) III, 머크(Merck))를 소결 유리 필터 (기공률 3)에 놓은 후, 아세트산/물 (1:3) 용액 (300 mL)을 첨가하고, 현탁액을 수동으로 2분 동안 교반하고, 수지를 배수시켰다. 또 다른 분량의 아세트산/물 (1:3) (300 mL)로 공정을 반복하였다. 중성 배수가 관찰될 때까지 수지를 탈이온수로 세정하였다. 그 후, 수지를 소결 유리 필터 (기공률 3)가 구비된 4 × 20 cm 칼럼으로 옮겼다.
4.8 g의 정제된 펩티드를 탈이온수 (50 mL)에 용해시키고, 칼럼에 첨가하였다. 생성물을 탈이온수 (200 mL)로 용리시켰다. TLC 스폿팅(spotting)으로 생성물 용리를 제어하고, 풍부 분획을 풀링하고, 냉동 건조시켜, pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(페네틸) (디술피드 C4-C7) 아세테이트 (4.1 g, 2.9 mmol)가 제공되었다.
순수한 생성물을 분석용 HPLC (분석 방법 F; tR=8.01분) 및 UPLC-HRMS (분석 방법 G; 측정치: [M+2H]2+=643.328; 계산치: [M+2H]2+=643.324)로 분석하였다. 아세테이트 함량은 7.99-8.27％였고, 물 함량은 1.94-1.96％였다.
단계 2: pE-R-P-C*-L-S-CP-N 6 -[[(1α,8α,9α)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시]카르보닐]-K-G-P-(D-Nle)-NH(페네틸) [디술피드 C4-C7]의 제조
Figure pct00277
DMF (1 mL) 내의 pE-R-P-C*-L-S-C*-K-G-P-(D-Nle)-NH(페네틸) 트리아세테이트 [디술피드 C4-C7] (100 mg, 0.068 mmol), 중탄산나트륨 (38 mg, 0.452 mmol) 및 물 (83 uL)의 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, (1R,8S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 숙신이미딜 카르보네이트 (베리 & 어소시에이츠(Berry & associates), 20 mg, 0.068 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 1 mL의 물을 혼합물에 첨가하고, 생성된 용액을 동결건조시켜, 분말이 제공되었고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 3: 실시예 20의 제조:
Figure pct00278
pE-R-P-C*-L-S-C*-N 6 -[[(1α,8α,9α)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시]카르보닐]-K-G-P-(D-Nle)-NH(페네틸) [디술피드 C4-C7] (1 mL의 물 내의 50 mg의 단계 2로부터의 생성물, 0.034 mmol) 및 중간체 47 (268 uL의 물 내의 52 mg)의 혼합물을 실온에서 약 3 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 분취용 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 15-40％ ACN 5분 구배)로 정제하였다. 생성물 분획을 동결건조시켜, 표제 생성물이 TFA 염 (24 mg, 21％)으로서 제공되었다. LCMS (워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 um 2.1×50 mm, 50℃, 용리제 A: 물 + 0.1％ 포름산, 용리제 B: 아세토니트릴 + 0.1％ 포름산, 구배: 5.15분에 걸쳐 2％ → 98％ B/A): 체류 시간: 2.77분; MS [M+2]2 +: 관측치: 1491.8808, 계산치: 1491.8560.
실시예 21A: 중간체 47에 접합된 아펠린 고리형 펩티드 BCN
단계 1:
Figure pct00279
DMF (0.5 mL) 내의 pE-R-P-R-L-C*-H-K-G-P-Nle-C*-F-OH(디술피드 C6-C12) (50 mg, 0.033 mmol, 미국 특허 번호 8,673848에서 제조된 바와 같음), 중탄산나트륨 (18 mg, 0.215 mmol) 및 물 (40 uL)의 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, (1R,8S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 숙신이미딜 카르보네이트 (베리 & 어소시에이츠, 18 mg, 0.065 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. + 1 및 +2 부가물의 혼합물이 LCMS로 관찰되었고, 따라서 혼합물을 질량-유발 HPLC로 정제하였다 (펩티드 방법 5, 25-50％ ACN 5분 구배: 조건: 선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입): rt 3.2분 (+1), rt 4.65분, 4.9분 (+1 및 +2 혼합물). LCMS에서, 목적한 +1 생성물이 61％ 수율로, +1, +2 혼합물이 18％ 수율로 확인되었다. LCMS: (염기성 용리제 A: 물 + 5 mM 수산화암모늄, 용리제 B: ACN, 산성 칼럼: 선파이어 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm - 40℃, 염기성 칼럼: 엑스브리지 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm - 40℃), 체류 시간: 0.98분; MS [M+2]2+: 관측치: 856.0, 계산치: 865.0245.
단계 2:
Figure pct00280
pE-R-P-R-L-C*-H-N 6 -[[(1α,8α,9α)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시]카르보닐]-K-G-P-Nle-C*-F-OH (디술피드 C6-C12) (21.33 mg, 0.014 mmol) 및 중간체 47 (24 mg, 0.014 mmol)의 혼합물을 실온에서 약 3 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완료되었고, 이를 동결건조시켜, 표제 생성물 (23 mg, 48％)이 제공되었다. LCMS (워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 um 2.1×50 mm, 50℃, 용리제 A: 물 + 0.1％ 포름산, 용리제 B: 아세토니트릴 + 0.1％ 포름산, 구배: 5.15분에 걸쳐 2％ → 98％ B/A): 체류 시간: 2.22분; MS [M+2]2 +: 관측치: 1616.9464, 계산치: 1616.976.
실시예 21B: 지방산-링커 구축물 I-37에 접합된 아펠린 고리형 펩티드
단계 1: A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P-Dnle-페네틸 아민 중간체 21B1의 합성
Figure pct00281
Arg 잔기에 대한 표준 이중 Arg 및 Dnle 이중 커플링으로 자동 펩티드 합성기 (CEM 리버티 블루 마이크로웨이브(CEM Liberty Blue Microwave)) 상에서의 고체 상 펩티드 합성에 페네틸아민-AMEBA 수지 (시그마 알드리치, 0.1 mmol, 1.0 mmol/g)를 적용하였다. DMF 내의 0.2 M 용액으로 아미노산을 제조하였다. 하기와 같이 표준 커플링 사이클이 규정되었다:
Figure pct00282
아미노산 커플링: AA (5 당량), HATU (5 당량), DIEA (25 당량)
Figure pct00283
세정: DMF (3 × 7 mL)
Figure pct00284
Fmoc 탈보호: 20％ 피페리딘/0.1 M HOBt (2 × 7 mL)
Figure pct00285
세정: DMF (4 × 7 mL then 1 × 5 mL)
Figure pct00286
펩티드 조립 후, 수지를 DMF (2 × 50 mL) 및 DCM (2 × 50 mL)으로 세정하고, 진공 하에 건조시켜, 중간체 21B1 (276 mg, 0.1 mmol)이 제공되었다.
단계 2: 중간체 21B2의 제조 (수지로부터의 펩티드 절단)
Figure pct00287
중간체 21B1 (276 mg, 0.1 mmol)를 4 mL TFA 용액 (37 mL TFA, 1 mL H2O, 1 mL TIPS, 3.06 g DTT)과 합치고, 실온에서 3시간 동안 진탕시켰다. 용액을 수지로부터 제거하고, 40 mL의 저온 Et2O 내로 침전시켰다. 용액을 와동시키고, 얼음 상에서 10분 동안 정치시킨 후, 4000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 용매를 제거하고, 백색 고체를 저온 Et2O (매회 40 mL)로 2회 더 세정하고, 원심분리하고 (매회 5분), 따라냈다. 고체를 진공 하에 철야로 건조시켜, 중간체 21B2 (17.4 mg, 0.012 mmol)가 산출되었다. LCMS (SQ2 생성물분석-산성-펩티드-극성, 액퀴티 UPLC BEH C18 칼럼, 130 Å, 1.7 ㎛, 2.1 mm × 50 mm, 50℃): Rt = 1.83분, MS [M+H] 1513.5.
Figure pct00288
단계 3: 중간체 21B3의 제조 (시스테인 잔기의 고리화)
중간체 21B1 (29.6 mg, 0.020 mmol)을 물 (3 mL) 및 10 방울의 DMSO에 용해시켜, 약간 탁한 용액이 제공되었다. 요오드 (HOAc 내의 50 mM, 0.783 mL, 0.039 mmol)를 천천히 적가식으로 첨가하고, 반응물을 실온에서 철야로 혼합하였다. 미처리 반응물의 LCMS 분석이 출발 물질의 완전한 전환을 나타냈다. 색이 사라질 때까지 0.5 M 아스코르브산을 적가식으로 첨가하였다. 물질을 MS-유발 HPLC로 정제하였다. 풀링된 분획들의 동결건조로 7 mg의 목적 생성물이 백색 분말 (4.63 μmol, 24％)로서 제공되었다. LCMS (SQ2 생성물분석-산성-펩티드, 액퀴티 UPLC BEH C18 칼럼, 130 Å, 1.7 ㎛, 2.1 mm × 50 mm, 50℃): Rt = 0.90분, MS [M+H] 1511.8.
단계 4: 아펠린 A-H-Q-R-P-C-L-S-C-K-G-P- Dnle - 페네틸 아민 및 중간체 I-37을 포함하는 접합체의 제조 (N-말단 접합)- 실시예 21B
Figure pct00289
NHS-지방산의 10 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. 중간체 21B3 (1.5 mg, 0.993 μmol)을 30 mM pH4 NaOAc 완충제 (672 μL)에 용해시키고, NHS-지방산 (I-37: 0.850 mL, 5.10 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 혼합하고, 이러한 시점에 추가적인 1.5 mg의 NHS-지방산 (H2O 내의 10 mg/mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 16시간 동안 혼합하였다. 8 mg의 NHS-지방산 (H2O 내의 10 mg/mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 3일 동안 혼합하고, 1.7 mg의 NHS-지방산 (H2O 내의 10 mg/mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 진탕시키고, M-유발 HPLC로 정제하여, 1.7 mg의 표제 화합물이 백색 분말 (0.510 μmol, 51％)로서 제공되었다. LCMS (SQ2 생성물분석-산성-펩티드-극성, 액퀴티 UPLC BEH C18 칼럼, 130 Å, 1.7 ㎛, 2.1 mm × 50 mm, 50℃): Rt = 3.87분, MS [M+H+2/2] 1533.1; [M+H+3/3] 1022.9.
실시예 22 내지 24는 지방산과 siRNA의 접합체에 적용된다.
예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 및 앰비온(Ambion)으로부터, siRNA 합성용 키트가 시판된다. 관련 기술 분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및 효소에 의한 라이게이션 반응을 사용하여 siRNA 작용제를 구축할 수 있다. 예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드, 또는 표적을 벗어나는 효과를 감소시키고/감소시키거나 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 안티센스 핵산과 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양한 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 siRNA 작용제를 화학적으로 합성할 수 있고, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 일반적으로 "G", "C", "A", "T" 및 "U" 각각은 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 각각 염기로서 함유하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, "리보뉴클레오티드", "데옥시뉴클레오티드", 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 변형된 뉴클레오티드 또는 대용물인 대체 모이어티를 지칭할 수도 있다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 siRNA를 원하는 대로 합성 및 변형시키는 것이 가능하다는 것을 이해할 것이다 (문헌 [Henschel et al. 2004 DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32 (Web Server Issue): W113-W120]을 참조한다).
실시예 22: 화학식 A3의 지방산 모이어티와 siRNA의 접합
Figure pct00290
중간체 22a의 제조:
TTR siRNA [관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 합성된, 트랜스티레틴 (TTR)에 대한 siRNA]로부터 표준 올리고뉴클레오티드 절차 (예를 들어 6-(4-모노메톡시트리틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트 (글렌 리서치(Glen Research) 카탈로그 번호: 10-1906)와의 반응)을 사용하여 22a로 전환되었다.
Figure pct00291
TTR siRNA:
안티센스 가닥:Puagagcaagaacacug u *u*rX058
[식 중, P는 포스페이트이고, 소문자는 2'-OMe 변형 뉴클레오티드를 가리키고, 밑줄친 문자는 2'-F 변형 뉴클레오티드를 가리키고, 이탤릭체 문자는 2'-MOE 변형 뉴클레오티드를 지칭하고, r은 염기가 없는 리비톨이고, *는 포스포로티오에이트 결합을 지칭하며, X058은 화학식
Figure pct00292
의 비-뉴클레오티드성 3' 말단 캡(cap)이다].
센스 가닥: aacaguguucuugcuc uar-C6OH
[식 중, -는 포스페이트를 지칭하고; C6OH (C6으로도 공지됨)는 화학식
Figure pct00293
의 비-뉴클레오티드성 3' 말단 캡이다].
중간체 22b의 제조:
0℃의 0.556 ml의 siRNA 22a 용액 (H2O 내의 TTR siRNA 14.02 mM, 7.79 μmol)에 0.556 ml DMF를 첨가하고, 실온으로 가온시켰다. 그 후, 208 ㎕ TEA (DMF 내의 0.3 M, 62 μmol)를 첨가하고, 260 ㎕ BCN-NHS ((1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 N-숙신이미딜 카르보네이트) (DMF 내의 0.15 M, 39 μmol)를 첨가하였다. 생성된 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 분석용 HPLC이 출발 물질 22a의 소멸을 나타냈다. 반응물을 탈이온 H2O로 10 mL로 희석하였고, 반응물이 탁해졌다. 상기 혼합물을 에틸아세테이트로 5회 추출하여, 소형 유기 분자를 제거하였다. 수성 층을 분리하고, 동결건조시켰다. 건조 생성물 고체 (22b)를 그대로 사용하였다.
실시예 22의 제조:
80 ㎕ 화합물 22b (H2O 내의 12.3 mM, 0.968μmol) 및 65 ㎕ 비스 지방산-N3 (22c: 실시예 15의 단계 2: DMSO 내의 44.7 mM, 2.90 μmol)을 혼합하였다. 생성된 혼합물이 탁했고, 따라서 80 ㎕ 1:1 DMF/THF를 첨가하였고, 반응물이 여전히 약간 탁했다. 또 다른 80 ㎕ DMSO를 첨가하여 맑은 용액을 얻었다. 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 반응물을 탈이온 H2O로 희석하고, HPLC에서 정제하여, 5.6 mg 화합물 22 (65.9％ 수율)이 산출되었다. 정제용 HPLC 조건: 칼럼: 엑스셀렉트 프렙(Xselect Prep) 페닐헥실 5 um OBD 19×50 mm; 유기 용매: 100 mM TEA.HOAc로 변형된 ACN; 수성 용매: 100 mM TEA.HOAc로 변형된 H2O; 구배: 5-60％ AcCN/H2O; 시간: 10분. LC-MS 방법 H 하에서, 생성물이 디컨볼루션 후 8778의 목적 MW으로 5.44분의 체류 시간으로 단일 피크를 나타냈다.
실시예 23: 화학식 A1의 지방산 모이어티와 화합물 4의 siRNA 제제의 접합
Figure pct00294
실시예 22와 동일한 절차를 사용하여 실시예 23을 제조하였다.
23a의 제조:
DCM (16 mL) 내의 NHS-지방산 (20 mg)의 용액에 아지도-peg7-아민 (퀀타 바이오디자인, 카탈로그 #10523) (31 mg) 및 DIPEA (52 uL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완전한 전환이 LC-MS 분석으로 관찰되었다. 혼합물을 농축하고, MeOH (3 mL)에 다시 용해시키고, 0.1％ TFA를 사용한 MS-유발 HPLC로 정제하여 (rt=1.59분, 예상 질량 (M+1): 818.062, 관측 질량: 817.9), 깨끗한 생성물이 제공되었다. HPLC MS 시스템에서 설정된 800 Da 차단값으로 인해 물질의 절반이 손실되었다. 5-10 mg (17-33％)의 깨끗한 생성물이 수득되었다.
80 ㎕ 22b (H2O 내 12.3 mM, 0.968 μmol) 및 65 ㎕ 트리스 지방산-N3 (23a: DMSO 내 44.7 mM, 2.90 μmol)을 혼합하였다. 반응으로 5.2 mg 화합물 23 (58.0％ 수율)이 산출되었다. LC-MS 방법 H 하에서, 생성물이 디컨볼루션 후 9257의 목적 MW로 5.87분의 체류 시간으로 단일 피크를 나타냈다.
실시예 24: 화학식 A3의 지방산과 APOCIII siRNA의 접합
Figure pct00295
Figure pct00296
Figure pct00297
24b의 제조
25 ml DCM 내의 24a (1.244 g, 4.19 mmol)의 용액에 TEA (0.58 ml, 4.19 mmol)를 첨가한 후, N3-펜탄산 (500 mg, 3.49 mmol)을 첨가하였다. 마지막으로 EDC (804 mg, 4.19 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응물을 염수와 DCM 사이에서 추출하였다. 모든 유기물을 합치고, 건조시키고, 농축하고, SiO2 겔 + 60％ 에틸아세테이트/헵탄 상에서 정제하여, 1.20 g 화합물 24b (89％ 수율)가 산출되었다. 1H NMR (클로로포름-d, 400NHz) d: 5.88-6.37 (m, 1H), 4.60 (d, J=4.8 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.33 (t, J=6.7 Hz, 2H), 3.13 (d, J=6.5 Hz, 2H), 2.30 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.81-1.95 (m, 1H), 1.63-1.81 (m, 5H), 1.48-1.57 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.36 (d, J=6.8 Hz, 2H)
24c의 제조
12 ml THF 내의 24b (860 mg, 2.23 mmol)의 용액에, 1 N NaOH (5.58 ml, 5.58 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 염수로 희석하고, 20 mL DCM을 첨가하였다. 수성 층의 pH를 1 N HCl로 pH ~5로 조정한 후, DCM으로 추출하였다. 모든 유기물을 합치고, 건조시키고, 농축하고, 미처리 고체를 6 ml DCM에 다시 용해시켰다. 0.6 ml TFA를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축하여, 미처리 24c (400 mg, 54％)가 산출되었고, 이를 추가 정제 없이 직접적으로 사용하였다. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 272.5 (M+H+)의 질량으로 0.43분에서 주요 피크를 나타냈다.
24e의 제조
10 mL DCM 내의 24c (400 mg, 1.04 mmol)의 용액에, TEA (0.434 ml, 3.11 mmol)를 첨가한 후, 24d (538 mg, 1.35 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 H2O와 DCM 사이에서 추출하였다. 모든 유기물을 합치고, 건조시키고, 농축하고, SiO2 겔 + 8％ MeOH/DCM 상에서 정제하여, 475 mg의 24e (82％ 수율)가 산출되었다. 1H NMR (클로로포름-d, 400MHz) d: 6.74-6.98 (m, 1H), 5.95-6.13 (m, 1H), 4.55 (dd, J=7.2, 2.4 Hz, 2H), 3.32 (t, J=6.7 Hz, 4H), 3.11 (d, J=5.8 Hz, 2H), 2.30-2.37 (m, 2H), 2.20-2.26 (m, 2H), 1.90 (br. s., 2H), 1.71-1.80 (m, 2H), 1.59-1.71 (m, 4H), 1.51-1.59 (m, 2H), 1.35-1.51 (m, 13H), 1.20-1.35 (m, 13H)
24f의 제조
Figure pct00298
중간체 24f2의 제조
MeOH (40 mL) 내의 24f1 (1.0 g, 4.97 mmol)의 용액에, TEA (1.04 ml, 7.45 mmol)를 첨가한 후, 디 t-부틸 디카르보네이트 (2.17g, 9.94 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응물을 농축하고, SiO2 칼럼 + 5％ MeOH/DCM 상에서 정제하여, 1.2 g 화합물 24f2 (80％ 수율)가 산출되었다. 1H NMR (클로로포름-d, 400MHz) d: 4.51 (br. s, 1H), 3.00-3.22 (m, 2H), 2.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.59-1.71 (m, 2H), 1.46 (s, 11H), 1.29 (br. s., 12H).
중간체 24f3의 제조
DCM (30 mL) 내의 24f2 (1.2 g, 3.98 mmol)의 용액에, N-히드록실 숙신이미드 (0.60 g, 5.18 mmol)를 첨가한 후, EDC (1.0 g, 5.18 mmol)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 철야로 교반하였다. 반응물을 농축하고, 직접적으로 SiO2 칼럼 상에 로딩하고, 40％ 에틸아세테이트/헵탄으로 정제하여, 1.46 g 화합물 24f3 (92％ 수율)이 산출되었다. 1H NMR (클로로포름-d, 400MHz) d: 4.49 (br. s, 1H), 3.04-3.19 (m, 2H), 2.86 (d, J=4.5 Hz, 4H), 2.62 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.70-1.82 (m, 2H), 1.37-1.53 (m, 13H), 1.30 (br. s., 10H)
중간체 24f의 제조
DCM (1.5 ml) 내의 GalNAc3-NH2 (300 mg, 0.16 mmol)의 용액에, TEA (0.11 ml, 0.79 mmol)를 첨가한 후, 24f3 (188 mg, 0.47 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 그 후, 트리플루오로아세트산 (1.0 mL)을 첨가하였다. 2시간 후, LC-MS가 중간체 소멸을 나타냈다. 반응물을 농축하고, ELSD로 검출하면서 산성 조건 하에서의 오픈-액세스(open access) HPLC 상에서 정제하였다. 생성물을 함유하는 HPLC 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜, 220 mg 화합물 24f (67％ 수율)가 산출되었다. 일부 생성물이 1개의 아세틸 기를 손실한 것으로 LC-MS에서 나타났다. 정제용 HPLC 조건: 칼럼: 선파이어 30×100 mm 5 um 칼럼; 유기 용매: ACN + 7.5％ TFA; 수성 용매: H2O + 7.5％ TFA; 유속: 75 ml/분. 구배: 15-40％ H2O/AcCN; 시간: 9.5분. 검출: ELSD (증기화 광 산란 검출기) 검출. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 989.9 (M/2+H+)의 질량으로 0.83분에서 피크를 나타냈다.
24g의 제조
3 mL DCM 내의 24e (172 mg, 0.31 mmol)의 용액에, 24f (250 mg, 0.12 mmol)를 첨가한 후 TEA (0.069ml, 0.50 mmol)를 첨가하였다. 마지막으로 EDC (95 mg, 0.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 반응물을 농축하고, SiO2 칼럼 + 5％ MeOH/DCM 상에서 정제하여, 230 mg 24g (74％ 수율)가 산출되었다. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 1258.2 (M/2+H+)의 질량으로 1.30분에서 피크를 나타냈다.
24h의 제조
1 ml THF 내의 24g (230 mg, 0.091 mmol)의 용액에, 0.457 ml 4N HCl (디옥산 내, 1.83 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축하고, HPLC 상에서 정제하여, 50 mg 24h (23％ 수율)가 산출되었고, 이는 당 상의 1개의 아세틸 기가 손실되었다. 정제용 HPLC 조건: 칼럼: 선파이어 30×100 mm 5 um 칼럼; 유기 용매: ACN + 7.5％ TFA; 수성 용매: H2O + 7.5％ TFA; 유속: 75 ml/분. 구배: 15-40％ H2O/AcCN; 시간: 9.5분. 검출: ELSD (증기화 광 산란 검출기) 검출. LC-MS 방법 I 하에, 생성물이 1187.1 (M/2+ H+)의 질량으로 0.95분에서 피크를 나타냈다.
24i의 제조
2 ml DCM 내의 2,2,13,13-테트라메틸테트라데칸디오산 (40 mg, 0.127 mmol)의 용액에, N-OH 숙신이미드 (9.81 mg, 0.085 mmol)를 첨가한 후, EDC (16.34 mg, 0.085 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 반응물을 농축하고, HPLC 상에서 정제하여, 20 mg 24i (38％ 수율)가 산출되었다. 정제용 HPLC 조건: 칼럼: 선파이어 30×100 mm 5 um 칼럼; 유기 용매: ACN + 7.5％ TFA; 수성 용매: H2O + 7.5％ TFA; 유속: 75 ml/분. 구배: 45-70％ H2O/AcCN; 시간: 9.5분. 검출: ELSD (증기화 광 산란 검출기) 검출. LC-MS 방법 I 하에, 생성물이 434.3 (M+Na+)의 질량으로 1.55분에서 피크를 나타냈다.
24j의 제조
0.5 ml DCM 내의 24h (20 mg, 8.05 μmol)의 용액에, TEA (4.5 ㎕, 32 μmol)를 첨가한 후, 24i (6.62 mg, 16 μmol) 및 DMAP (3.93 mg, 32 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 그 후, 0.5 ml 2N MeNH2/MeOH를 탈보호를 윙해 첨가하였다. 반응물을 실온에서 또 한번 철야로 교반하였다. 반응물을 농축하고, 아세톤을 첨가하여 생성물을 침전시키고 과량의 시약 및 지질을 제거하여, 12 mg 24j (64％ 수율)가 산출되었다. LC-MS 방법 I 하에, 생성물이 1166.9 (M/2+ H+)의 질량으로 0.69분에서 피크를 나타냈다.
24K의 제조
Figure pct00299
단계 1:
APOCIII siRNA [관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 합성된, APOCIII (APOC3 또는 Apoc 3으로도 공지됨)에 대한 siRNA]:
올리고뉴클레오티드 어닐링 (annealing)
일반 절차:
각각의 올리고뉴클레오티드 펠릿을 원심분리기에서 간략하게 스피닝하고, 듀플렉스(Duplex) 완충제 (100 mM 아세트산칼륨; 30 mM HEPES, pH 7.5)에 고농도 (100 mL 완충제 당 1-10 OD260)로 용해시킨다. 가열 (94℃까지) 및 와동을 사용하여 재현탁을 용이하게 한다. 그 후 센스 및 안티센스 가닥을 함께 등몰량으로 첨가한다. 그 후, 혼합된 올리고뉴클레오티드를 94℃로 가열하고, 점진적으로 냉각시킨다. 유의한 2차 구조가 있는 서열의 경우, 더욱 점진적인 냉각/어닐링 단계를 사용할 수 있다. 이는 올리고 용액을 수조 또는 가열 블럭에 놓고 기기의 플러그를 뽑는/기기를 끄는 것에 의해 쉽게 행해진다. 생성물은 안정적인 이중-가닥 형태일 것이고, 이를 4℃에서 또는 냉동하여 보관할 수 있다.
APOCIII siRNA의 안티센스 가닥은 APOCIII의 서열을 포함하고, 여기서 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'→3' 방향으로 리비톨, 또 다른 포스페이트, 및 3' 말단 캡 X058 (화학식
Figure pct00300
의 비-뉴클레오티드성 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다.
센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 상보적인 APOCIII의 서열을 포함하고, 여기서 가닥의 3' 말단은 포스페이트로 종결되고, 5'→3' 방향으로 리비톨, 또 다른 포스페이트, 및 3' 말단 캡 C6OH (화학식
Figure pct00301
의 비-뉴클레오티드성 3' 말단 캡)을 추가로 포함한다.
APOCIII siRNA를 2-디메톡시트리틸옥시메틸-6-플루오레닐메톡시카르보닐아미노-헥산-1-숙시노일-장쇄 알킬아미노-CPG (글렌 리서치 카탈로그 번호 20-2957)와 반응시켜, 생성물 24k1이 생성되었다.
단계 2
APOCIII siRNA (24k1: 401 ㎕, H2O 내의 11.2 mM, 4.49 μmol)를 401 ㎕ DMF와 혼합하여, 맑은 용액을 얻었다. 그 후, TEA (180 ㎕, DMF 내의 0.25 M, 45 μmol)를 첨가하고, BCN-NHS ((1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 N-숙신이미딜 카르보네이트) (9.16 mg, 31 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 H2O로 10 mL로 희석하고, 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 수성 층을 분리하고, ~5 ml로 농축하고, PD-10 탈염 칼럼 (GE 헬스케어(GE healthcare)) 상에서 정제하였다.
24의 제조
24j (5.8 mg, 2.5 μmol)를 105 ㎕ 화합물 24k (H2O 내의 Apoc 3 siRNA 9.5 mM, 0.993 μmol)에 첨가하였다. 1시간 후, 반응물이 점성이 되었다. 따라서, 또 다른 60 ㎕ H2O를 첨가하고, 반응물을 실온에서 철야로 교반하였다. 반응물을 H2O로 희석하고, HPLC 상에서 정제하여, 5 mg 접합체 24 (57％ 수율)가 산출되었다. 정제용 HPLC 조건: 칼럼: 엑스셀렉트 프렙 페닐헥실 5 um OBD 19×50 mm; 유기 용매: 100 mM TEA.HOAc로 변형된 AcCN; 수성 용매: 100 mM TEA.HOAc로 변형된 H2O; 구배: 5-50％ AcCN/H2O; 시간: 10분. LC-MS 방법 H 하에서, 생성물이 디컨볼루션 후 8896의 목적 질량으로 5.96분에서 피크를 나타냈다.
참조예 3: GalNAc와 접합된 siRNA
Figure pct00302
참조예 3을 (24j를 GalNac3-N3 (하기)로 교체하여) 실시예 24의 절차에 따라 제조하였다.
GalNac3 -N3의 제조
Figure pct00303
중간체 2의 제조
화합물 1 (2.06 g, 1.07 mmol)을 20 ml 에탄올에 용해시키고, TFA (82 ul, 1.07 mmol)를 첨가한 후, 10％ Pd/C (0.114 g, 0.11 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 6시간 동안 H2 풍선 하에서 처리하였다. 반응물을 여과하고, 에탄올로 세정하고, 농축하여 백색 고체를 얻고, 이를 다음 단계에서 직접적으로 사용하였다. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 898.5 (M/2+H+)의 질량으로 0.81분에서 피크를 나타냈다.
중간체 3 의 제조
화합물 2 (4.848 g, 0.479 mmol)를 10 ml 무수 DMF에 용해시키고, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-4 아지도부타노에이트 (0.325 g, 1.436 mmol)를 첨가한 후, DIPEA (0.418 ml, 2.394 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 철야로 실온에서 반응시켰다. 가열하지 않으면서 반응물을 농축하고, 예비-평형화된 SiO2 칼럼 상에 직접적으로 로딩하고, 0-20％ 메탄올/DCM 단계 구배로 정제하여, 2.383g 화합물 3 (49.25％ 수율)이 산출되었다. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 953.7 (M/2+H+)의 질량으로 1.27분에서 피크를 나타냈다.
중간체 4 의 제조
화합물 3 (1.33g, 0.70 mmol)을 MeNH2 (17.45 ml, 메탄올 내의 2.0 M, 34.9 mmol)와 혼합하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. LC-MS에서, 생성물 피크만 나타났다. 반응물을 농축하였다. 그 후, 고체를 에탄올 내로 다시 용해시키고, 아세톤으로 침전시켜, 1.0 g 화합물 4 (94％ 수율)가 산출되었다. LC-MS 방법 I 하에서, 생성물이 764.5 (M/2+H+)의 질량으로 0.53분에서 피크를 나타냈다.
실시예 25: 담체 단백질 ( CRM197 ) 및 지방산의 접합
단계 1: 2 -((2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38- 도데카옥사 -5-아자테트라콘탄-40-일)카르바모일)-2-운데실트리데칸디오산 (25a).
Figure pct00304
t-boc-N-아미도-dPEG®11-아민 (100 mg, 0.155 mmol, 퀀타 바이오디자인) 및 중간체 5 (80 mg, 0.148 mmol)를 THF (3 mL)에 용해시키고, 실온에서 질소 하에 교반하였다. 30분 후, DIPEA (0.05 mL, 0.286 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다. LCMS (산성 용리제 A: 물 + 0.05％ 트리플루오로아세트산, 용리제 B: ACN, 칼럼: 선파이어 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm - 40℃, 5-95％ 구배 2분, 체류 시간 1.92분)에서, 완전한 전환이 관찰되었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축한 후, 약 1.5 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. MS-유발 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입, 65-95％ ACN 3.5분 구배, 체류 시간 3.23분) 상에서 정제하고, 분획들을 풀링하고, 동결건조시켜, 85 mg의 깨끗한 생성물이 54％ 수율로 제공되었다. 맑은 오일. LCMS: 방법 D, Rt= 1.18분, M+H 1070.1; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ ppm 0.82 - 1.03 (m, 1 H) 1.11 - 1.37 (m, 10 H) 1.37 - 1.51 (m, 2 H) 1.51 - 1.64 (m, 1 H) 1.69 - 1.82 (m, 1 H) 1.90 - 2.04 (m, 66 H) 2.05 - 2.21 (m, 8 H) 2.21 - 2.42 (m, 1 H) 3.17 - 3.28 (m, 1 H) 3.40 - 3.68 (m, 13 H).
단계 2: 2 -((35-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33- 운데카옥사펜타트리아콘틸 )카르바모일)-2-운데실트리데칸디오산 ( 25b ).
Figure pct00305
25a (5 mg, 4.68 μmol)를 DCM (부피: 2 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오로아세트산 (25 ㎕, 0.324 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 대기 하에 약 2시간 동안 교반하였다. LCMS (산성 용리제 A: 물 + 0.05％ 트리플루오로아세트산, 용리제 B: ACN, 칼럼: 선파이어 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm - 40℃, 5-95％ 구배 2분, 체류 시간 1.45분)에서, 완전한 전환이 관찰되었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축한 후, DCM으로 씻고, 다시 3회 농축하였다. 아세토니트릴 및 DMSO의 혼합물에 용해시켰다. MS-유발 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입, 45-70％ ACN 3.5분 구배, 체류 시간 2.50분) 상에서 정제하고, 분획들을 풀링하고 동결건조시켜, 2.5 mg의 깨끗한 생성물이 55％ 수율로 제공되었다. 맑은 오일.
방법 A, Rt = 1.45분, M+H 969.9; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ ppm 0.62 - 0.91 (m, 2 H) 0.91 - 1.10 (m, 3 H) 1.10 - 1.31 (m, 18 H) 1.46 (quin, J=7.21 Hz, 2 H) 1.59 - 1.89 (m, 35 H) 1.94 - 2.09 (m, 1 H) 2.16 (t, J=7.40 Hz, 2 H) 2.97 - 3.11 (m, 1 H) 3.24 - 3.37 (m, 1 H) 3.37 - 3.61 (m, 28 H) 3.61 - 3.89 (m, 2 H) 7.85 (br. s., 1 H).
단계 3: 2-(((S)-5-(3-아미노-3-옥소프로필)-3,6-디옥소-1-페닐-2,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-도데카옥사-4,7-디아자도테트라콘탄-42-일)카르바모일)-2-운데실트리데칸디오산 (25d).
Figure pct00306
THF (부피: 2 mL) 내의 25b (20 mg, 0.018 mmol)의 용액을 Z-L-Gln-Osu 25c (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology), CAS 34078-85-8, 11 mg, 0.029 mmol)에 첨가한 후, DIPEA (75 ㎕, 0.429 mmol)를 첨가하였다. 주말에 걸쳐 실온에서 질소 대기 하에 교반하였다. LCMS (산성 용리제 A: 물 + 0.05％ 트리플루오로아세트산, 용리제 B: ACN, 칼럼: 선파이어 C18 3.5 ㎛ 3.0×30 mm - 40℃, 5-95％ 구배 2분, 체류 시간 1.77분)에서, 완전한 전환이 관찰되었다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축한 후, 아세토니트릴에 용해시켰다. MS-유발 HPLC (선파이어 30×50 mm 5 um 칼럼, ACN/H2O + 0.1％ TFA 75 ml/분, 1.5 ml 주입, 55-80％ ACN 3.5분 구배, 체류 시간 2.70분) 상에서 정제하고, 분획들을 풀링하고, 동결건조시켜, 10.5 mg의 깨끗한 생성물이 46％ 수율로 맑은 무색 오일로서 제공되었다. 방법 C, Rt = 1.60분, M+H 1232.4; 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ ppm 0.67 - 0.93 (m, 2 H) 0.93 - 1.10 (m, 2 H) 1.10 - 1.32 (m, 15 H) 1.45 (quin, J=7.24 Hz, 1 H) 1.59 - 1.69 (m, 1 H) 1.75 - 1.93 (m, 30 H) 1.94 - 2.21 (m, 20 H) 3.23 (quin, J=5.26 Hz, 1 H) 3.28 - 3.51 (m, 23 H) 3.95 (td, J=7.73, 5.44 Hz, 1 H) 4.92 - 5.22 (m, 1 H) 5.78 (br. s., 1 H) 6.13 - 6.42 (m, 1 H) 6.88 (br. s., 1 H) 7.20 - 7.36 (m, 2 H) 7.42 (t, J=5.07 Hz, 1 H).
단계 4: 지방산으로의 CRM197의 mTGase -매개 표지화 ( 실시예 25):
Figure pct00307
100 mM 트리스 완충제 pH 8 내의 25d의 용액 (8 mg/mL, 203 ㎕, 1.316 μmol)에 CRM197 (33 mg/mL, 1.515 ㎕, 0.00086 μmol)을 첨가한 후, PBS 내의 트랜스글루타미나제 효소 (아지노모토(Ajinomoto))의 용액 (50 mg/mL, 0.455 ㎕, 0.00060 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 100 ㎕의 부피로 5회 희석 및 농축함으로써 10 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 반응 혼합물을 100 mM 트리스 완충제 pH 8 내로 교환하였다. LCMS 분석이 +1, +2, +3 및 +4 생성물로의 전환을 나타냈다. LCMS QT2; 단백질_35-70 kDa_3분: Rt = 1.45분; MS [M+25d]: 관측치: 59625, 계산치: 59624; MS [M+(2 × 25d)]: 관측치: 60839, 계산치: 60838; MS [M+(3 × 25d)]: 관측치: 62054, 계산치: 62052; MS [M+(4 × 25d)]: 관측치: 63270, 계산치: 63266.
CRM197 서열:
Figure pct00308
Figure pct00309
펩티드 맵핑 (mapping) 실험 개관:
펩티드 맵핑 소화: 5 ㎍의 변형 CRM197 및 양성 대조군 CRM197 샘플을 20 mM DTT로 환원시키고, 1/30 (w/w) 효소/단백질로 26℃에서 철야로 트립신으로 소화시켰다. 분취량의 트립신-소화 단백질을 1/20 효소/단백질 비로 4시간 동안 26℃에서 GluC 효소로 추가로 소화시켰다; 주: 모든 효소를 로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics Gmbh) (독일)에서 구입하였다.
역상 LC-MS/MS 분석: 생성된 소화된 펩티드를 애질런트 CapLC (캘리포니아주 산타 클라라)에 커플링된 써모 LTQ 오비트랩 디스커버리(Thermo LTQ Orbitrap Discovery) (써모 피셔 사이언티픽 인크(Thermo Fisher Scientific Inc.), 매사추세츠주 월섬) 상에서 액체 크로마토그래피 전기분무 탠덤 질량 분광법 (LC-ESI MS/MS)으로 분석하였다. ~10-15 pmole의 CRM 대조군 및 변형된 CRM197 소화물을 40℃의 칼럼 (워터스 액퀴티 BEH C18, 1.7 ㎛, 1×100 mm 칼럼)에 로딩하였다. 0-1분에 4％ B로 시작하여, 1.1분에 7％ B로, 55분에 45％ B로, 63분에 95％ B로 상승시켜, 총 80분의 구배를 10 ㎕/분으로 실행한 후, 세정하고, 칼럼을 평형화시켰다. 질량 분광계 파라미터는 30 ms 동안의 m/z 300-2000으로부터의 30000 해상도의 FTMS 분석기를 사용한 전체 스캔 이벤트를 포함하였다. 상위 7개의 강한 이온 (1+ 이온 제외)에 대해, 30 ms 동안 500 (모든 이벤트에 대해)의 신호 강도 역치 카운트로 활성화된 이온 트랩 분석기에서 충돌 유도 해리(Collision Induced Dissociation) MS/MS를 수행하였다.
데이터 분석 및 데이터베이스 검색: 모든 질량 스펙트럼을 퀄 브라우저(Qual Browser) V 2.0.7 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에서 프로세싱하였다. MS 데콘툴스(DeconTools) (PPNL의 알.디. 스미스 랩(R.D. Smith Lab))로 마스코트(Mascot) 일반 파일 (mgf)을 생성시키고, 사내 커스텀 데이터베이스에 첨가된 제공된 단백질 서열, 및 오염 단백질에 대한 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 (513,877개의 서열이 있는 V57)에 대해, 마스코트 V2.3.01 (매트릭스 사이언스 인크(Matrix Science Inc.), 매사추세츠주 보스턴) 데이터베이스 검색을 사용하여 검색하였다. 검색 파라미터는 하기를 포함하였다: 효소: 3회까지의 누락 절단이 허용된, 세미트립신 또는 트립신/Glu-C; 가변성 변형: 소형 분자의 예상 질량 (362.147787 Da 및 463.206698 Da)을 "CRM Tgase +알킨 362Da mod (CKR),CRM Tgase +알킨 362Da mod (N-말단),CRM Tgase+아지드 463Da mod (CKR),CRM Tgase+아지드 463Da mod (N-말단)"으로 칭해지는 데이터베이스에 부가함; 펩티드 허용성: ±20 ppm; MS/MS 허용성: ±0.6 Da. >95％ 신뢰도의 이온 점수로 서열 커버리지(coverage) 및 소형 분자 변형 평가가 행해졌다. 그 후, 고득점 펩티드 이온을 퀄 브라우저를 사용하는 수동 MS/MS 분석용으로 선택하였다.
리신 변형이 발생한 위치를 상기 맵핑 실험에 따라 결정할 수 있다. 2014년 7월 11일에 출원된 미국 출원 번호 US 2015/0017192 (대리인 사건 번호 PAT055641-US-NP)에서 CRM197에 대해 기술된 유사한 접합에 따라, Lys37 또는 Lys39, Lys 33 및 Lys440에서 변형이 발생한 것으로 추정하였다.
실시예 26A: 옥시토신 유도체 및 지방산의 접합:
Figure pct00310
단계 1: 수지 상의 보호된 옥시토신의 제조
Figure pct00311
수지 상의 보호된 형태의 옥시토신 (26a1)을 실시예 21B 단계 1과 유사하게 합성하였다.
단계 2: 알릴 탈보호 , 고리화, 수지로부터의 절단
Figure pct00312
보호된 중간체 (26a1) (0.2 mmol)를 페닐실란 (1 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (0.02 mmol)를 함유하는 6 ml의 DCM에 녹였다. 수지를 이러한 용액에서 15분 동안 와동시킨 후, 여과하였다. 이러한 절차를 DCM 내의 페닐실란/Pd(PPh3)4의 용액으로 2회 반복하였다. 마지막 와동 후, 수지를 여과하고, NMP (3회), DCM (3회), 0.5％ DIEA/DCM (3회)로 세정하고, 마지막으로 NMP (3회)로 세정하였다. 생성된 세정된 수지를 진공 하에 건조시켰다. 분량의 건조된 수지 (~0.1 mmol)를 6 mL의 NMP 내의 PyBOP (0.2 mmol), HOBt (0.4 mmol), 및 DIEA (0.5 mmol)의 용액에 녹였다. 이러한 반응물을 실온에서 20시간 동안 와동시켰다. 수지를 여과하고, EtOAc (3회) 및 DCM (3회)로 세정하였다. 그 후, 수지를 4 mL의 95/2.5/2.5 TFA/TIPS/H2O에 녹이고, 2시간 동안 와동시켰다. 그 후 TFA/TIPS/H2O 용액을 저온 (<-20℃) Et2O 내로 여과하여, 절단된 펩티드를 침전시켰다. 원심분리 후, Et2O를 따라내고, 회백색 잔류물을 Et2O로 세정하고, 다시 원심분리하였다. 생성된 회백색 고체를 N2 하에 철야로 건조시켰다. 이러한 고체를 질량-유발 분취용 HPLC (워터스 오토퓨어(Autopure) HPLC 시스템; 선파이어 C18 30×50 mm 5 um 칼럼; 이동상: 물 내의 7.5-20％ ACN, 5분 구배, 75 mL/분, 0.1％ TFA로 변형됨) 상에서 정제하였다. 중간체 ( 26a2 )에 상응하는 분획들을 합치고, 냉동시키고, 동결건조시켜, 백색 고체 (13.5 mg, 14％)가 제공되었다. HRMS- 분석 방법 G: Rt = 0.90분, MS m/z 988.5225 [M+H]+.
단계 3: 지방산으로의 접합
0.5 mL의 pH = 6.40 포스페이트 완충제 내의 중간체 ( 26a2 ) (2.82 μmol)의 용액에 0.5 mL의 pH = 6.40 포스페이트 완충제 내의 I-37 (8.39 μmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 4.5 ㎛ 프릿을 통해 여과하고, 질량-유발 분취용 HPLC (워터스 오토퓨어 HPLC 시스템; 선파이어 C18 30×50 mm 5 um 칼럼; 이동상: 물 내의 45-70％ ACN, 5분 구배, 75 ml/분, 0.1％ TFA로 변형됨) 상에서 정제하였다. 옥시토신-FA 접합체 (26A)에 상응하는 분획들을 합치고, 냉동시키고, 동결건조시켜, 백색 고체 (1.71 mg, 24％)가 제공되었다. LCMS-분석 방법 G: Rt = 3.07분, MS m/z 2540.5 [M+H]+.
Figure pct00313
실시예 26B: 옥시토신 유도체 및 지방산의 접합:
Figure pct00314
*부티레이트-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys*-Gly(N-CH2CH2CH2NH2)-Leu-Gly-NH2 (* = 술피드 결합) (26b1):
Figure pct00315
을 중간체 I- 37과 반응시킴으로써 상기 기술된 실시예 26A의 단계 3에 따라 상기 예 (26B)를 제조할 수 있다.
본원에 참고로 포함된 문헌 [Wisniewski et al, J. Med. Chem. (2014), 57 5306-5317]의 실시예 41의 절차를 개조하여 고리형 펩티드 (26b1)를 제조하였다.
이러한 펩티드를 1 mmol Fmoc-연결 아미드 AMS 수지 상에서 Fmoc 화학을 통해 수동으로 합성하였다. 아미노산에 대해 사용된 보호기는 하기와 같다: Tyr에 대한 t-부틸 기, Gln 및 Asn에 대한 Trt 기. 2개의 일반적이지 않은 아미노산인 Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO2알릴)-OH 및 Fmoc-[Nα-CH2CH2CH2NH(Boc)]Gly-OH를 사용하였다. DMF에서 Fmoc 보호기를 제거하고 보호된 아미노산 (3 당량)을 커플링시키는 것을 반복함으로써 펩티드 사슬이 조립되었다. HBTU 및 HOBt (3 당량: 3 당량)을 커플링 시약으로서 사용하였고, N-메틸모르폴린 (NMM, 6 당량)을 염기로서 사용하였다. DMF 내의 20％ 피페리딘 (수지 부피의 3배)을 탈-Fmoc 시약으로서 사용하였다. 각각의 커플링 및 탈-Fmoc 후 수지를 DMF (수지 부피의 3배)로 세정하였고, 각각의 커플링 후 닌히드린 테스트를 수행하여 커플링 효율을 점검하였다.
마지막 Fmoc 보호기를 제거한 후, 수지를 에틸 에테르로 세정하고, 진공 하에 건조시켰다. 수지 상에서의 알릴 에스테르 보호기의 선택적 제거를 DCM/THF (1/1, 수지 부피의 10배) 내의 Pd(PPh3)4/5,5-디메틸-1,3-시클로헥산디온 (1 당량/10 당량)으로 3시간 동안 수행하였다. 수지를 DMF (3×)로 세정한 후, DMF 내의 0.5％ 소듐 디에틸 디티오카르바메이트 (5×)로 세정하였다. 마지막으로, 수지 상에서의 고리화를 DMF 내의 HCTU/NMM (3 당량/6 당량)로 수행하였다. 수지를 세정하고, 진공 하에 건조시켜, 3.2 그램의 펩티드 수지가 산출되었고, 이를 3시간 동안 실온에서 32 ml TFA/TIS/DOT/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v)로 처리하여, 측쇄 보호기를 제거하고 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 미처리 펩티드를 저온 에테르로부터 침전시킨 후, 여과로 수집하고, 고진공 하에 건조시켰다. 수율: 1.15 g (116％).
모든 미처리 펩티드를 2-인치 C18 칼럼 + TFA 완충제 (완충제 A, 물 내의 0.1％ TFA; 완충제 B, 아세토니트릴) 상에서 정제하였다. 순도 >95％의 풀링된 분획을 건조 상태로 동결건조시켰다. 84 mg의 최종 펩티드가 수득되었다 (TFA 염). MS: 991.6 [M+H]+, HPLC 체류 시간 9.49분 (방법: 유속 1.2 mL/분; 완충제 A: 물 내의 0.1％ TFA; 완충제 B: 아세토니트릴 내의 0.1％ TFA; 실온; 칼럼: 디스커버리(Discovery), C18, 4.6mm × 250 mm, 5 마이크로; 구배 (선형: 20분 내의 15％-35％ 완충제 B; 주입 부피 0.02 mL).
실시예 27: 아구티 -관련 단백질 ( AgRP )-지방산 접합체
AgRP (83-132)-FA 접합체 :
실시예 27A: 지방산이 링커 (PEG)를 통해 AgRP의 N-말단에 부착된 AgRP의 1-지방산 접합체 (AgRP+1FA)
Figure pct00316
[식 중, AgRP(83-132)는 하기의 서열:
Ser-Ser-Arg-Arg-Cys-Val-Arg-Leu-His-Glu-Ser-Cys-Leu-Gly-Gln-Gln-Val-Pro-Cys-Cys-Asp-Pro-Cys-Ala-Thr-Cys-Tyr-Cys-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Cys-Tyr-Cys-Arg-Lys-Leu-Gly-Thr-Ala-Met-Asn-Pro-Cys-Ser-Arg-Thr을 갖고; 위치 C87&C102, C94&C108, C101&C119, C105&C129,C110&C117 다리에서의 5개의 디술피드 다리를 함유한다].
실시예 27B: 하나의 지방산이 링커 (PEG)를 통해 AgRP의 N-말단 (즉, 세린 83)에 부착되고 다른 지방산이 PEG 링커를 통해 위치 121의 리신의 측쇄에 부착된 AgRP(83-132)의 2-지방산 접합체 (AgRP+2 FA).
pH 4.5 시트레이트 완충제 내의 AgRP(83-132) (R&D 시스템즈™로부터 입수가능함)의 10 mg/ml 용액 0.90 mL (9 mg, 1.585 μmol)에 0.80 mL의 pH=4.43 아세테이트 완충제를 첨가한 후, H2O 내의 I-37의 10 mg/ml 용액 1.30 mL (13 mg, 7.79 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. HRMS (QT2)에서, 1.89분의 AgRP +1FA, m/z 7226.3 [M+H]+ , 및 2.41분의 AgRP + 2FA, m/z 8778.4 [M+H]+ 양쪽 모두가 존재하는 것으로 나타났다. 반응물을 4.5 ㎛ 프릿을 통해 여과하고, 상기와 같이 실행된 제2 반응물 (0.881 μmol AgRP, 2.64 μmol I- 37)과 합치고, 분취용 HPLC (워터스 오토퓨어 HPLC 시스템; 워터스 프로틴 BEH C4 칼럼, 300 옹스트롬, 5 um, 10×250 mm; 이동상: 물 내의 20-80％ ACN, 11분 구배, 10 mL/분, 0.1％ TFA로 변형됨; 실행 시간: 15분; 분획 수집: UV 210 nm) 상에서 정제하였다. AgRP + 1FA 및 AgRP + 2FA에 상응하는 분획들을 단리하고, 냉동시키고, 동결건조시켜, AgRP + 1FA (27A) 및 AgRP + 2FA (27B)의 TFA 염이 백색 고체 (3.24 mg, 16％ AgRP + 1FA; 2.26 mg, 9％ AgRP + 2FA)로서 제공되었다. LCMS-분석 방법 G: (AgRP + 1FA) Rt = 1.91분, MS m/z 7226.4 [M+H]+; (AgRP + 2FA) Rt = 2.43분, MS m/z 8778.4 [M+H]+.
지방산의 부착 위치를 결정하기 위한 표지화 실험
반응 혼합물을 제조사의 프로토콜에 따라 Asp-N (프로메가)로 소화시킴으로써 N-말단 Ser 잔기에서의 표지화가 확인되었다. 모든 펩티드 맵핑 검정법을 브루커 맥시스 임팩트(Bruker Maxis Impact) Q-TOF 질량 분광계와 커플링된 써모 디오넥스 얼티메이트(Thermo Dionex Ultimate) 3000 LC를 사용하여 달성하였다. 40℃에서 유지된 액퀴티 UPLC BEH130 C18 칼럼 (2.1×150 mm, 1.7 ㎛, 워터스) 상에서 분리를 수행하였다. 물 내의 0.1％ FA 이동상 A로 하고, 아세토니트릴 내의 0.1％ FA를 이동상 B로 하여, 유속은 0.1 mL/분이었다.
Asp-N (프로메가 파트# V162A)의 용액을 20 uL의 HPLC/MS 물 (0.1 ㎍/㎕)에서 재구성시켰다. 약 10 ㎍의 샘플을 6 M 요소, 10 mM 디티오트레이톨, 5 mM EDTA, 및 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)에 25 ㎕의 최종 부피로 희석하였다. 환원 및 알킬화 후, 용액을 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)로 6회 희석한 다음, 추가적인 1 마이크로그램의 Asp-N으로 단백질분해를 수행하였다. 소화물을 섭씨 37도에서 철야로 두었다. LCMS 분석은 하기 표에 나타난 바와 같이 각각의 단편 상에 1개의 지방산이 부가된 야생형 AgRP 및 변형 AgRP의 N-말단 D 위치에서 절단이 발생하였음을 가리켰다.
Figure pct00317
실시예 28 (28A, 28B 및 28C)는 hFGF23 변이체의 접합체에 관한 것이다.
사용된 FGF23 변이체
본 실시예에서 사용되고 "hFGF23(R179Q)", "hFGF23 R179" 또는 간단히 "hFGF23"으로 지정된 인간 FGF23 변이체의 서열이 서열식별번호: 10에서 제공된다. 이러한 FGF23 변이체는 신호 펩티드가 없지만, 위치 1의 M이 복원되어 있고, R179에 돌연변이 (R179Q)가 있다. 본원에 기술된 지방산을 포함하는 접합체가 이러한 FGF23 펩티드로 제조되었고 (실시예 28C), 표 8에서 적어도 하나의 FGF23 활성을 유지하는 것으로 나타났다.
인간 FGF23의 2개의 다른 변이체를 본 실시예 (실시예 28A 및 28B)에서 또한 사용하여, 본원에 개시된 지방산과의 접합체를 구축하였다. 서열식별번호: 10의 펩티드와 유사하게, 이들은 FGF23 신호 펩티드가 없고 R179에 돌연변이가 있지만, 하나 이상의 추가적인 돌연변이가 있고, 그러나 적어도 하나의 FGF23 활성을 유지한다. 이러한 2개의 FGF23 변이체가 본 실시예에서 사용되고, 양쪽 모두 "hFGF23-변이체" 또는 "FGF23 변이체" 등으로서 지정된다.
본원에 기술된 접합체를 생산하는 방법을 FGF23, 또는 이의 상동체, 변이체, 단편, 또는 변형 형태를 포함하는 다른 FGF23 펩티드에 사용할 수 있다.
FGF23 변이체 생산을 위한 프로토콜
형질전환 :
pET28c-hFGF23 R179Q 발현 플라스미드를 BL21(DE3) 수용성 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 42℃에서 45초 동안 열 충격을 가하고, SOC 배지를 첨가하고, 박테리아를 37℃ 진탕기에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 hFGF23(R179) 폴리펩티드를 제조하였다. 그 후, 박테리아 배양물을 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 스프레딩하고, 철야로 37℃에서 인큐베이션하였다. 단리된 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 내로 옮기고, 37℃에서 철야로 진탕하면서 인큐베이션하고, 25 mL 분취량을 카나마이신을 함유하는 새로운 LB 배지 내로 옮기고, 37℃에서 약 2.5시간 동안 진탕시켰다. 세포의 밀도가 충분할 때 (~0.6의 OD), 37℃에서 계속 진탕하면서 1 M IPTG를 각각의 배양물에 첨가하여 폴리펩티드 발현을 유도하였다. 4시간 후, 6000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화시키고, 펠릿을 -20℃에서 냉동하였다. 이어서, 펠릿을 용해 완충제 (50 mM 트리스, pH 8, 100 mM NaCl, 0.1％ 트리톤 X-100)에 다시 현탁시키고, 마이크로플루다이저를 사용하여 세포를 용해시켰다. 100 mL의 용해 혼합물 당 10 mg 리소자임 및 10 ㎕ DNase (1 유닛/mL, 인비트로젠)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 20분 동안 8000 rpm으로 스피닝하고, 3회의 100 mL의 용해 완충제 교환 및 스피닝으로 세정하고, 4번째에는 트리톤 X-100이 없는 용해 완충제로 세정하였다. 최종 스피닝으로부터의 펠릿 (봉입체의 펠릿)을 즉각적으로 50 mM 트리스, pH 7.4, 6 M 구아니딘, 10 mM DTT에 용해시키고, 단백질 농도를 결정하고, 리폴딩 전에 1 mg/ml으로 조정하였다.
단백질 리폴딩 :
단백질을 리폴딩시키기 위해, 368 mg의 환원된 글루타티온 (GSSH) 및 74 mg의 산화된 글루타티온 (GSSG)을 각각 400 ml의 가용화된 봉입체에 첨가하였다. 단백질을 철야로 4℃에서 4 L의 50 mM 트리스, pH 8.0 및 250 mM의 아르기닌에 대해 투석하였다. 그 후, 2 L의 투석 완충제를 제거하고, 2 L의 물로 교체하고, 추가로 8시간 동안 투석을 계속하였다. 그 후, 투석 완충제를 20 mM 트리스, pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM 아르기닌으로 바꾸고, 철야로 투석을 계속하였다.
단백질 정제:
단백질을 정제하기 위해, 투석된 혼합물을 12000 rpm으로 30분 동안 스피닝하고, 상청액을 최종 투석 완충제로 평형화된 헤파린-세파로스 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 20× 층 부피의 1×PBS로 세정하였다. 리폴딩된 단백질을 0.5 M NaCl이 보충된 1×PBS로 용리시키고, 단백질 순도를 SDS-PAGE 겔에 의해 평가하고, 단백질 농도를 280 nm 파장에서의 이의 OD에 의해 측정하였다.
실시예 28A: hFGF23 변이체와 지방산의 접합
Figure pct00318
Figure pct00319
[식 중, hFGF23변이체-NH2- 내의 -NH2는 리신 잔기의 아미노 관능기를 의미한다].
단계 1: 중간체 28a
Figure pct00320
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 5-아미노-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-옥소펜타노에이트 (0.5 g, 1.325 mmol)를 DMF (부피: 9.96 ml)에 용해시키고, tert-부틸 (2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)카르바메이트 (0.503 ml, 2.120 mmol)를 첨가하였다. DIPEA (0.274 g, 2.120 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 목적 생성물의 형성 및 ZQ-NHS 출발 물질의 소비를 나타냈다 (방법 A, Rt = 0.98분, M+H 511.4). 반응 혼합물을 DCM (100 mL) 내로 붓고, 얼음물 (3 × 50 mL)로 세정하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여, 1.14 g의 황색 오일이 제공되었다. LCMS 분석이 목적 생성물의 존재를 가리켰다 (방법 M, Rt = 1.82분, M+H 511.4, 1.14 g). 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 보냈다.
단계 2: 중간체 28b, 벤질 (5-아미노-1-((2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸)아미노)-1,5-디옥소펜탄-2-일)카르바메이트
Figure pct00321
트리플루오로아세트산 (10 mL, 2.233 mmol)을 중간체 28a (1.14 g, 2.233 mmol)에 첨가하고, 실온에서 약 1시간 동안 교반하였다. LCMS 분석이 출발 물질의 목적 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다 (방법 A, Rt = 0.56분, M+H 411.3). 반응 혼합물을 DCM (30 mL)에 녹이고, 2회 오일로 농축하였다. 오일을 1 mL ACN 및 1 mL MeOH로 희석하고, MS-유발 HPLC (방법 N)로 정제하였다. 목적 질량의 분획들을 풀링하고, 냉동시키고, 동결건조시켜, 중간체 28b가 백색 분말로서 산출되었다 (방법 O, Rt = 0.22분, M+H 411.3, 160 mg, 18％)
단계 3: 중간체 28c,
중간체 28b (19.69 mg, 0.048 mmol)를 DMF (0.5 mL)에 용해시키고, DMF (1.0 mL) 내의 중간체 37 (50 mg, 0.030 mmol)의 용액에 첨가하였다. 3 방울의 DIPEA를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다 (방법 B, Rt = 1.22분, M+H+2/2 982.9). 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피를 위해 20 g C-18 칼럼 상에 로딩하였다. 20분 기간에 걸친 100％ 물 (0.1％ TFA) → 100％ MeCN의 용매 구배를 사용하여, 분획들을 수집하고, LCMS로 분석하였다. 목적 질량의 분획들을 합치고, 냉동시키고, 철야로 동결건조시켜, 중간체 28c가 맑은 무색 오일로서 산출되었다 (방법 C, Rt = 1.21분, M+H+2/2 982.9, M+H+3/3 655.5, 15.3 mg, 26％). 임시로 해석된 1H-NMR이 6.29 ppm (1H, br m)에서 형성된 아미드 결합의 존재를 가리켰다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.52 (s, 1H), 7.35 (d, J = 3.3 Hz, 5H), 5.10 (s, 2H), 4.30 (s, 1H), 3.77 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.69 - 3.49 (m, 94H), 3.46 (s, 4H), 2.59 (s, 3H), 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 25H), 2.08 - 1.94 (m, 4H), 1.79 - 1.65 (m, 2H), 1.65 - 1.52 (m, 2H), 1.40 - 1.06 (m, 31H), 0.94 - 0.82 (m, 3H).
Figure pct00322
단계 4: hFGF23 - 변이체 + 중간체 28c
이러한 단계용으로, 신호 펩티드가 없고, 서열식별번호: 8에 비해 하나 이상의 돌연변이가 있지만, 적어도 하나의 FGF23 활성을 유지하는 인간 FGF23 (hFGF23) 변이체 ("hFGF23-변이체")가 사용되었고, 여기서 "FGF23-변이체-NH2" 내의 "-NH2"는 리신 잔기의 아미노 관능기를 가리킨다.
30 mM MES pH 6 내의 TGase의 50 mg/mL 용액 및 30 mM MES pH 6 완충제 내의 중간체 28c의 8 mg/mL 용액을 제조하였다. 지방산 용액이 MES pH 6에서 탁해졌다. hFGF23-변이체 (30 mM MES pH 6 내의 0.3 mg/mL, 7.5 ml, 0.088 μmol)에, 중간체 28c (217 ㎕, 0.883 μmol)를 첨가한 후, TGase (33.5 ㎕, 0.044 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하고, 추가적인 217 ㎕의 중간체 28c를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하고, 추가적인 217 ㎕의 중간체 28c를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하고, 추가적인 108.5 ㎕의 중간체 28c를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 혼합하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 출발 물질의 완전한 전환을 나타냈다 (방법 P, Rt = 1.55분, M+H 27432). 반응 혼합물을 2개의 4 mL 10 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터 사이에서 분할하고, 30 mM MES pH 6 완충제로 완충제를 3× 교환한 후, 1.5 mL로 농축하였다. 물질을 냉장고에서 철야로 보관하였다. 일부 고체가 튜브 바닥에 침강되었다. A280 (18730 cm-1M-1, 25485 g/mol)에 의해 상청액 농도가 0.43 mg/mL (27％)인 것으로 측정되었다.
실시예 28B: hFGF23 - 변이체와 ZQG - PEG11 -지방산의 접합
이러한 실시예용으로, 지방산, 및 신호 펩티드가 없고 서열식별번호: 8에 비해 하나 이상의 돌연변이가 있지만, 적어도 하나의 FGF23 활성을 유지하는 FGF23 변이체를 포함하는 접합체가 제조되었다.
Figure pct00323
[식 중, hFGF23-변이체-NH2 내의 -NH2는 리신 잔기의 아미노 관능기를 의미한다].
중간체 25d의 8 mg/mL 용액을 100 mM pH 8 트리스 완충제에서 제조하였다. TGase의 50 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. hFGF23-변이체의 용액 (6.5 mL, 0.090 μmol)에, 중간체 25d (0.207 mL, 1.343 μmol)를 첨가한 후, TGase (0.136 mL, 0.179 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3일 동안 혼합하였고, +1 종으로의 90％ 전환이 관찰되었다 (LCMS 방법 Q, Rt = 7.24분, M+H 26616). 반응물을 2 mL 부피로 6회 희석 및 농축함으로써 10 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 반응 혼합물을 PBS 1× 완충제 내로 교환하였다. A280 (18730 cm-1M-1, 26617 g/mol)에 의해 농도가 0.125 mg/mL인 것으로 측정되었다 (LCMS 방법 Q, Rt = 7.24분, M+H 26616).
실시예 28C: h- FGF23 R179 + ZQG - PEG11 -지방산의 접합:
이러한 실시예용으로, FGF23 변이체 "hFGF23 R179"를 사용하여 접합체가 제조되었다. 이는 신호 펩티드가 없고, R179에 돌연변이가 있다. 서열식별번호: 10에서 서열이 제공된다.
계산 질량: 25463
중간체 25d의 8 mg/mL 용액을 100 mM pH 8 트리스 완충제에서 제조하였다. TGase의 50 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. hFGF23 R179의 용액 (2.50E+04 ㎕, 0.393 μmol)에 중간체 25d (750 ㎕, 4.87 μmol)를 첨가한 후, TGase (597 ㎕, 0.785 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2일 동안 혼합하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 출발 물질의 완전한 전환을 나타냈다 (방법 P, Rt = 1.58분, M+H 26674). 반응 혼합물을 이온 굔환 크로마토그래피로 정제하여, +1 접합체가 제공되었다 (방법 R, Rt = 3.87분, M+H 26674):
Figure pct00324
[식 중, hFGF23 R179-NH2 내의 -NH2는 리신 잔기의 아미노 관능기를 의미한다].
실시예 29A 및 29B는 세릴랙신의 접합체에 관한 것이다.
실시예 29A: 세릴랙신 -지방산 접합체 (+1 지방산 접합체)
Figure pct00325
세릴랙신 + ZQG - PEG 11 -지방산 ( 실시예 25d):
세릴랙신 서열:
Figure pct00326
; 및
"세릴랙신-NH2" 내의 -NH2는 하기의 맵핑 실험에서 증명된 바와 같이 리신 K17의 측쇄의 반응성 아미노 관능기를 의미한다; MW 5963 g/mol.
ZQG-PEG11-지방산 (실시예 25d)의 8 mg/mL 용액을 100 mM 트리스 pH 8 완충제에서 제조하였다. mTGase의 50 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. 100 mM 트리스 pH 8 (1.018 mL, 0.5 mg/mL 반응물) 내의 세릴랙신 (211 ㎕, 0.168 μmol)의 용액에 실시예 25d (516 ㎕, 3.35 μmol)를 첨가한 후, mTGase (아지노모토, 255 ㎕, 0.335 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 3일 동안 혼합한 후, 추가적인 100 ㎕의 ZQG-PEG11-지방산을 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 18시간 동안 혼합한 후, 반응물을 0.7 mL의 부피로 5회 희석 및 농축함으로써 10 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 PBS 1× 완충제 내로 교환하였다. 물질을 방법 K를 통해 정제하였고, 목적 물질이 있는 분획들을 풀링하고, 냉동시키고, 동결건조시켜, 백색 분말이 제공되었다. 물질을 1 mL 30 mM NaOAc 완충제 pH 5에 용해시켰고, A280 (5969cm-1M-1, 7178 g/mol)에 의해 농도가 0.25 mg/mL (25％)인 것으로 측정되었다. LCMS 방법 L: Rt = 1.65분; MS [M+1 +1FA]: 관측치: 7180, 계산치: 7178.
세릴랙신 맵핑에 대한 실험 절차
샘플 단백질분해
약 10 ㎍의 단백질을 25 ㎕의 최종 부피로 6 M 요소, 10 mM 디티오트레이톨, 5 mM EDTA, 및 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)에 용해시키고, 1시간 동안 37℃에서 유지시켜, 디술피드 결합을 환원시켰다. 요오도아세트아미드 (500 mM, 1 uL)를 첨가하여 유리 티올을 알킬화시키고, 용액을 실온에서 1시간 동안 암실에서 정치시켰다. 그 후, 용액을 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)로 6× 희석하고, LysC (1 ug, 프로메가 V107A)를 첨가하고, 용액을 37℃에서 철야로 유지시켜, 단백질을 소화시켰다. 포름산 (98％, 2 uL)을 첨가하여 단백질분해를 켄칭시키고, 생성된 펩티드 혼합물을 LC-MS/MS로 분석하였다.
LC-MS/MS 분석
브루커 맥시스 임팩트 Q-TOF 질량 분광계와 커플링된 써모 디오넥스 얼티메이트 3000 HPLC를 사용하여 펩티드 맵핑을 수행하였다. MS를 브루커 컴퍼스(Bruker Compass) v. 1.7 및 브루커 otof컨트롤(Bruker otofControl) v. 3.4 소프트웨어를 사용하여 제어하였고, 기기 파라미터 설정은 하기와 같았다: 질량 범위 300-2,000 Da; 분무 전압 4.0 kV; 모세관 온도 200℃; 건조 기체 유동 5.0 L/분. 40℃에서 유지된 워터스 액퀴티 UPLC BEH130 C18 칼럼 (2.1×100 mm, 1.7 ㎛)으로 분획화하였다. 이동상은 각각 물 및 아세토니트릴 내의 0.1％ 포름산이었고, 유속은 100 uL/분이었다. 사용된 구배는 0-2분, 2％ B; 2-3분, 2％-8％ B; 3-10분, 8％-29％ B; 10-14분, 29％-33％ B; 14-16분, 33％-37％ B; 16-20분, 37％-73％ B; 20-22분, 73％-95％ B; 22-25분, 95％ B; 25-26분, 95％-2％ B; 26-30분, 2％ B였다. 브루커 데이터애널리시스(Bruker DataAnalysis) v. 4.2를 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
맵핑 실험은 [CCHVGCTK17(fa)RSLARFC - 2H2O], 질량: 3088.56 Da, 전하: 5, Rt = 13.4분, 관측 m/z 618.71, 예상 m/z 618.72로서 할당된 펩티드를 기초로 세릴랙신으로의 지방산 부가가 리신 K17에서 주로 발생한다는 것을 가리켰다.
실시예 29B: 세릴랙신 -지방산 접합체 (하기 기술된 바와 같은 + 1FA , + 2FA 및 + 3FA 접합체의 혼합물)
Figure pct00327
[식 중, "세릴랙신-NH2" 내의 -NH2는 리신의 측쇄의 반응성 아미노 관능기를 의미한다].
세릴랙신 + 중간체 37: 실시예 29B가 하기의 혼합물로서 테스트되었다 .
Figure pct00328
서열:
Figure pct00329
지방산 중간체 37의 10 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. 30 mM NaOAc 완충제 pH 4 (755 ㎕) 내의 세릴랙신 (105 ㎕, 0.084 μmol, 4.75 mg/mL)의 용액에, 지방산 중간체 37 (140 ㎕, 0.839 μmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 16시간 동안 혼합하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 출발 물질의 90％ 전환을 나타냈다. 추가적인 70 ㎕의 중간체 37을 첨가하고, 반응물을 16시간 동안 실온에서 혼합하였고, 이러한 시점에 MALDI 분석이 >95％ 전환을 나타냈다. 반응물을 0.2 mL의 부피로 4회 희석 및 농축함으로써 3 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 용액을 PBS 1× 완충제 내로 교환하였다. A280 (5969 M-1cm-1; 9068 g/mol)에 의해 농도가 2.61 mg/mL인 것으로 측정되었다. LCMS 방법 L: Rt = 1.56분; MS [M+1 +1 FA]: 관측치: 7516, 계산치: 7517; Rt = 1.65분; MS [M+1 +2 FA]: 관측치: 9069, 계산치: 9071; Rt = 1.74분; MS [M+1 +3 FA]: 관측치: 10622, 계산치: 10625.
실시예 30: M-His- hPIP와 지방산 구축물 (I- 37)의 접합 - (하기 기술된 바와 같은 +1 FA 접합체 및 +2 FA 접합체의 혼합물)
M-His- hPIP (29-146) 서열:
Figure pct00330
하기로부터 발현됨
발현된 단백질 서열:
Figure pct00331
뉴클레오티드 서열:
Figure pct00332
PIP 발현 벡터:
인간 PIP를 코딩하는 포유동물 발현 벡터가 표준 클로닝 방법으로 생성되었다. 5'-NheI (코작(Kozak) 서열이 이어짐) 및 3'-EcoRI 부위가 있는, 마우스 Ig 카파 사슬 신호 서열에 이어지는 MHHHHH 서열 및 그 뒤의 성숙형 PIP을 함유하는 단편을 코돈-최적화 및 합성하였다 (DNA2.0). 그 후, 이러한 서열을 CMV 프로모터 하류의 pcDNA3.1 (인비트로젠) 기반 벡터의 독특한 5'-NheI 및 3'-EcoRI 부위 내로 클로닝하였다.
PIP 발현 및 정제:
PIP 발현 플라스미드 DNA를 표준 폴리에틸렌이민 방법을 사용하여 HEK293T 세포 내로 1 × 106 개의 세포/ml의 밀도로 형질감염시켰다. 그 후 500 ml 배양물을 4일 동안 37℃에서 8％ CO2의 습식 대기 하에 3 L 플라스크 내의 프리스타일(FreeStyle) 293 배지 (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))에서 배양하였다. 정화된 컨디셔닝 배지로부터 PIP 단백질을 정제하였다.
Figure pct00333
[식 중, M-His-PIP는 서열식별번호: 12를 갖고, "M-his"는 MHHHHHH이다].
접합:
지방산-링커 구축물 #1의 10 mg/mL 용액을 H2O에서 제조하였다. M-His-hPIP (0.700 mL, 0.048 μmol)를 30 mM NaOAc 완충제 pH 4 (619 ㎕, 0.5 mg/mL 반응물)로 희석하고, 중간체 37 (0.081 mL, 0.484 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 혼합하였고, 이러한 시점에 LCMS 분석이 +1 (50％) 및 +2 (20％) 생성물로의 70％ 전환을 나타냈다. 그 후, 반응물을 350 ㎕의 부피로 5회 희석 및 농축함으로써 3 kDa MWCO 아미콘 원심분리 필터를 사용하여 물질을 PBS 1× 완충제 내로 교환하였다. A280 (13850 cm-1M-1, 14472 g/mol)에 의해 농도가 1.7 mg/mL (70％)인 것으로 측정되었다. LCMS 방법 L, Rt = 1.46분; MS [M+1]: 관측치: 14472, 계산치: 14476. Rt = 1.57분; MS [M+1 +1FA 탈글리코실화]: 관측치: 16025, 계산치: 16030. Rt = 1.69분; MS [M+1 +2FA 탈글리코실화]: 관측치: 17578, 계산치: 17584.
M-His- hPIP + 지방산-링커 구축물 I-37: 실시예 30이 하기의 혼합물로서 테스트되 었다.
Figure pct00334
PIP 맵핑을 위한 실험 절차
샘플 단백질분해
약 10 ㎍의 단백질을 25 ㎕의 최종 부피로 6 M 요소, 10 mM 디티오트레이톨, 5 mM EDTA, 및 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)에 용해시키고, 1시간 동안 37℃에서 유지시켜, 디술피드 결합을 환원시켰다. 요오도아세트아미드 (500 mM, 1 uL)를 첨가하여 유리 티올을 알킬화시키고, 용액을 실온에서 1시간 동안 암실에서 정치시켰다. 그 후, 용액을 50 mM 트리스_HCl (pH = 8.0)로 6× 희석하고, LysC (1 ug, 프로메가) 또는 트립신/Lys C 믹스 (1 ug, 프로메가)를 첨가하고, 용액을 37℃에서 철야로 유지시켜, 단백질을 소화시켰다. 포름산 (98％, 2 uL)을 첨가하여 단백질분해를 켄칭시키고, 생성된 펩티드 혼합물을 LC-MS/MS로 분석하였다.
LC-MS/MS 분석
브루커 맥시스 임팩트 Q-TOF 질량 분광계와 커플링된 써모 디오넥스 얼티메이트 3000 HPLC를 사용하여 펩티드 맵핑을 수행하였다. MS를 브루커 컴퍼스 v. 1.7 및 브루커 otof컨트롤 v. 3.4 소프트웨어를 사용하여 제어하였고, 기기 파라미터 설정은 하기와 같았다: 질량 범위 300-2,000 Da; 분무 전압 4.0 kV; 모세관 온도 200℃; 건조 기체 유동 5.0 L/분. 40℃에서 유지된 워터스 액퀴티 UPLC BEH130 C18 칼럼 (2.1×100 mm, 1.7 ㎛)으로 분획화하였다. 이동상은 각각 물 및 아세토니트릴 내의 0.1％ 포름산이었고, 유속은 100 uL/분이었다. 사용된 구배는 0-2분, 2％ B; 2-3분, 2％-8％ B; 3-10분, 8％-29％ B; 10-14분, 29％-33％ B; 14-16분, 33％-37％ B; 16-20분, 37％-73％ B; 20-22분, 73％-95％ B; 22-25분, 95％ B; 25-26분, 95％-2％ B; 26-30분, 2％ B였다. 브루커 데이터애널리시스 v. 4.2를 사용하여 데이터를 프로세싱하였다.
맵핑 실험은 [fa-MHHHHHHQDNTRK], 질량: 3265.76 Da, 전하: 4, Rt = 23.4분, 관측 m/z: 817.44, 예상 m/z: 817.45에 의해 증명되는 바와 같이 MH6-PIP로의 지방산 부가가 N-말단에서 우선적으로 발생한다는 것을 가리켰다.
펩티드 단편 [SVRPNDEVTAVLAVQTELK(fa)ECMVVK], 질량: 4366.45 Da, 전하 3, Rt= 23.5분, 관측 m/z:1456.49, 예상 m/z: 1456.49에 의해 증명되는 바와 같이 리신 K42에서의 약간의 지방산 부가가 발생한다. K42에서의 지방산 부가는 이러한 리신에 인접한 트립신 절단을 차단하여, 부가 위치를 입증하는 하는 역할을 한다.
실시예 31: 클릭 화학을 이용한 NPFF와 지방산의 접합
Figure pct00335
단계 1: NPFF 클릭 화학 손잡이의 제조
Figure pct00336
계산치 MH+ 1258.8
DMSO (1 mL) 내의 NPFF (알파 에이사(Alfa Aesar), J66509, 5 mg, 3.82 μmol)의 용액에, 트리에틸아민 (5.32 ㎕, 0.038 mmol)를 첨가한 후, (1R,8S,9r)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 (2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 카르보네이트 (1.335 mg, 4.58 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 미처리물로서 다음 반응 단계로 보냈다.
단계 2: 접합
단계 1로부터의 미처리 반응 혼합물에 중간체 6 (I-6)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 진탕시켰다. 완료 시, 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (시스템: 애질런트 바이오이너트 시스템데이트(Agilent Bioinert SystemDate); 칼럼: 워터스 프로틴 BEH C4 칼럼, 300 옹스트롬, 5 um, 10×250 mm; UPLC 방법 전개용 칼럼: BEH C4m, 300A, 1.7 um, 2.1×50 mm; 이동상: 6분 내의 46-56％ ACN 구배, 0.1％ TFA로 변형됨, A: 물, B: 아세토니트릴; 유속: 2.0 mL/분; 실행 시간: 15분; 분획 수집: UV 210nm)를 사용하여 정제하여, 백색 고체인 표제 화합물이 TFA 염으로서 산출되었다; LCMS: 방법 S: ELSD: Rt 1.46분; MS m/z 928.3 [(M/3)+H]+
본 발명의 접합체가 비-접합 생체분자와 비교하여 효능이 유사하거나 또는 개선되었지만, 추가적으로 본 발명의 접합체는 비-접합 생체분자와 비교하여 혈장 안정성이 개선되었음을 알 수 있다. 상기 실시예에서의 접합체는 혈장 안정성이 5시간 초과, 10시간 초과, 20시간 초과, 30시간 초과, 40시간 초과, 일부 경우에는 50시간 초과인 것으로 확인되었다.
본 발명의 예시적인 실시양태들이 이렇게 기술되었지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 내부의 개시내용은 단지 예시적이라는 것과 다양한 기타 변경, 개조 및 변형이 본 발명의 범주 내에서 이루어질 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 다라서, 본 발명은 그 안에서 예시된 바와 같은 구체적인 실시양태에 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> NOVEL FATTY ACIDS AND THEIR USE IN CONJUGATION TO BIOMOLECULES <130> PAT056274 <140> <141> <150> PCT/US2015/036328 <151> 2015-06-18 <150> 62/107,016 <151> 2015-01-23 <150> 62/082,327 <151> 2014-11-20 <150> 62/015,862 <151> 2014-06-23 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met His His His His His His Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu 1 5 10 15 Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val 35 40 45 Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met 50 55 60 His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val 65 70 75 80 Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile 85 90 95 Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu 100 105 110 Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 115 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met His His His His His His Met Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro 1 5 10 15 Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu 20 25 30 Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln 35 40 45 Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn 50 55 60 Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr 65 70 75 80 Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu 85 90 95 Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu 100 105 110 Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 115 120 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Met His His His His His His Ala His Ala Arg Asp Gly Cys Pro Leu 1 5 10 15 Gly Glu Gly Arg Cys Cys Arg Leu Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Gln 20 25 30 Asp Leu Gly Trp Ala Asn Trp Val Val Ala 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polypeptide <400> 13 Met His His His His His His Gln Asp Asn Thr Arg Lys Ile Ile Ile 1 5 10 15 Lys Asn Phe Asp Ile Pro Lys Ser Val Arg Pro Asn Asp Glu Val Thr 20 25 30 Ala Val Leu Ala Val Gln Thr Glu Leu Lys Glu Cys Met Val Val Lys 35 40 45 Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile Pro Leu Gln Gly Ala Phe Asn Tyr Lys 50 55 60 Tyr Thr Ala Cys Leu Cys Asp Asp Asn Pro Lys Thr Phe Tyr Trp Asp 65 70 75 80 Phe Tyr Thr Asn Arg Thr Val Gln Ile Ala Ala Val Val Asp Val Ile 85 90 95 Arg Glu Leu Gly Ile Cys Pro Asp Asp Ala Ala Val Ile Pro Ile Lys 100 105 110 Asn Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ile Leu Lys Val Glu 115 120 125 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly 1 5 <210> 15 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met His His His His His His His Gln Asp Asn Thr Arg Lys Ile Ile 1 5 10 15 Ile Lys Asn Phe Asp Ile Pro Lys Ser Val Arg Pro Asn Asp Glu Val 20 25 30 Thr Ala Val Leu Ala 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between residues <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Norleucine <220> <223> C-term OH <400> 18 Xaa Arg Pro Arg Leu Cys His Lys Gly Pro Xaa Cys Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamate <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(12) <223> Disulfide bond between residues <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Lys-N6-[[(1-alpha,8-alpha,9-alpha)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9- ylmethoxy]carbonyl] <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Norleucine <220> <223> C-term OH <400> 19 Xaa Arg Pro Arg Leu Cys His Lys Gly Pro Xaa Cys Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 5'-phosphate <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> 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modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> 2'-MOE modified nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> Abasic ribitol nucleotide <220> <223> 3'-X058 end cap <400> 20 uagagcaaga acacuguun 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O-methyl modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(18) <223> 2'-MOE modified nucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> Abasic ribitol nucleotide <220> <223> 3'-C6OH end cap <400> 21 aacaguguuc uugcucuan 19 <210> 22 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys 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<213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Agouti-Related Peptide sequence <400> 25 Ser Ser Arg Arg Cys Val Arg Leu His Glu Ser Cys Leu Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Pro Cys Cys 20 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val 1 5 10 15 Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Cys Phe Arg 20 25 30 Ala Leu Ser Arg Lys Thr Cys Gly Val His Cys Cys Lys Asn Ala Leu 35 40 45 Ala Ser Tyr Leu Glu 50 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Lys-fatty acid <400> 27 Cys Cys His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Pyroglutamate <400> 28 Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val 1 5 10 15 Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Cys Phe Arg 20 25 30 Ala Leu Ser Arg Lys Thr Cys Gly Val His Cys Cys Lys Asn Ala Leu 35 40 45 Ala Ser Tyr Leu Xaa 50 <210> 29 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Met His His His His His His Gln Asp Asn Thr Arg 20 25 30 Lys Ile Ile Ile Lys Asn Phe Asp Ile Pro Lys Ser Val Arg Pro Asn 35 40 45 Asp Glu Val Thr Ala Val Leu Ala Val Gln Thr Glu Leu Lys Glu Cys 50 55 60 Met Val Val Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile Pro Leu Gln Gly Ala 65 70 75 80 Phe Asn Tyr Lys Tyr Thr Ala Cys Leu Cys Asp Asp Asn Pro Lys Thr 85 90 95 Phe Tyr Trp Asp Phe Tyr Thr Asn Arg Thr Val Gln Ile Ala Ala Val 100 105 110 Val Asp Val Ile Arg Glu Leu Gly Ile Cys Pro Asp Asp Ala Ala Val 115 120 125 Ile Pro Ile Lys Asn Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ile Leu Lys Val 130 135 140 Glu 145 <210> 30 <211> 454 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 gctagccacc atggagactg atactttgtt gttgtgggta ctgttgcttt gggtgcccgg 60 tagtaccggt atgcatcacc accaccatca ccaggacaac acccggaaga tcatcatcaa 120 gaacttcgac atccctaaga gcgtgcgccc aaacgatgaa gtcaccgcgg tgctggcagt 180 gcagactgag ctgaaggagt gcatggtggt caagacgtac ctgatttcgt ccatcccgct 240 gcaaggcgcc ttcaactaca agtacactgc ctgcctctgt gacgacaacc ccaagacctt 300 ttactgggac ttctacacca atagaactgt ccagattgct gccgtggtgg atgtgatcag 360 ggaattggga atttgccccg acgatgcggc cgtgattccg atcaagaaca accgcttcta 420 taccatcgag atccttaaag tggaatgaga attc 454 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polyhistidine tag <400> 31 Met His His His His His 1 5 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met-fatty acid <400> 32 Met His His His His His His Gln Asp Asn Thr Arg Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Lys-fatty acid <400> 33 Ser Val Arg Pro Asn Asp Glu Val Thr Ala Val Leu Ala Val Gln Thr 1 5 10 15 Glu Leu Lys Glu Cys Met Val Val Lys 20 25 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Agouti-Related Peptide sequence <400> 34 Asp Pro Cys Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Phe Cys Tyr 1 5 10 15 Cys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Met Asn Pro Cys Ser Arg Thr 20 25 30 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Agouti-Related Peptide sequence <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 35 Ser Ser Arg Arg Cys Val Arg Leu His Glu Ser Cys Leu Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Pro Cys Cys 20 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Agouti-Related Peptide sequence <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 36 Asp Pro Cys Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Phe Cys Tyr 1 5 10 15 Cys Arg Lys Leu Gly Thr Ala Met Asn Pro Cys Ser Arg Thr 20 25 30

Claims (27)

  1. 링커를 통해 하기 화학식 A1, A2 또는 A3을 갖는 지방산에 연결된 생체분자를 포함하는 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00337

    R1은 CO2H 또는 H이고;
    R2, R3 및 R4는 서로 독립적으로 H, OH, CO2H, -CH=CH2 또는 -C≡CH이고;
    Ak는 분지형 C6-C30알킬렌이고;
    n, m 및 p는 서로 독립적으로 6 내지 30의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 지방산이
    Figure pct00338

    [식 중, Ak3, Ak4, Ak5, Ak6 및 Ak7은 독립적으로 (C8- 20)알킬렌이고, R5 및 R6은 독립적으로 (C8- 20)알킬이다]로부터 선택되는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지방산이
    Figure pct00339

    [식 중, Ak2는 선형 C8-C20알킬렌이다]로부터 선택되는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합물을 포함하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 천연 또는 비천연 아미노산은 임의로 조합되고, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, =NH-O-, =NH-NH- 또는 =NH-N(알킬)-로부터 선택되는 화학 기를 통해 함께 연결되거나 또는 생체분자 및/또는 지방산 모이어티에 연결되는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 화학식
    Figure pct00340

    [식 중, y는 0 내지 34이다]의 비-분지형 올리고 에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 화학식
    Figure pct00341

    [식 중, r은 0 내지 2의 정수이고, s는 0 내지 3의 정수이다]의 헤테로고리형 모이어티를 포함하는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 히스티딘, 메티오닌, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴 및 글리신으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자가 1) 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태, 또는 이의 이량체, 2) APJ 효능제 펩티드, 3) 옥시토신 수용체 효능제 펩티드, 4) 세릴랙신(Serelaxin), 5) NPFF, 6) PIP 펩티드, 7) FGF23 펩티드, 8) AgRP 펩티드 및 9) siRNA로부터 선택되는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 링커를 통해 지방산에 연결된 생체분자가 하기 화학식
    [화학식 C]
    Figure pct00342
    [화학식 D]
    Figure pct00343

    [화학식 C 및 D에서, his-hGDF15 또는 hGDF15*의 양쪽 단량체 단위가 양쪽 N-말단에서 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]; 또는
    [화학식 E]
    Figure pct00344

    [화학식 F]
    Figure pct00345

    [화학식 E 및 F에서, his-hGDF15 또는 hGDF15*의 단량체 단위 중 하나만 N-말단에서 링커를 통해 지방산 모이어티에 연결된다]을 갖고;
    상기 식들 중, hGDF15*는 N-말단의 2 또는 3개의 아미노산이 각각 아미노산 서열 XH- 또는 XHX'- (식 중, H는 히스티딘이고, X 및 X'는 독립적으로 M 및 A로부터 선택된다)로 교체된 hGDF15이고;
    his-hGDF15는 1 내지 6개의 히스티딘 아미노산 및 임의적인 1 또는 2개의 메티오닌 아미노산을 포함하는 태그가 hGDF15의 N-말단에 부가된 hGDF15이며;
    s는 20-30의 정수이고;
    his-hDGF15의 2개의 단량체 단위 또는 hGDF15*의 2개의 단량체 단위 사이의 선은 디술피드 결합을 나타내는 것인 접합체.
  10. 화학식 C를 갖는 제9항에 따른 접합체 및 화학식 E를 갖는 제9항에 따른 접합체를 포함하는 혼합물, 또는 화학식 D를 갖는 제9항에 따른 접합체 및 화학식 F를 갖는 제9항에 따른 접합체를 포함하는 혼합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자가 MH(199-308)hGDF15, MHA(200-308)hGDF15, AHA(200-308)hGDF15 또는 AH(199-308)GDF15; 또는 이의 이량체인 접합체.
  12. 제9항 또는 제11항에 있어서, 링커를 통해 지방산에 연결된 생체분자가 화학식 G 또는 화학식 H
    [화학식 G]
    Figure pct00346

    [화학식 H]
    Figure pct00347

    의 것이고,
    상기 식 중 AHA-hGDF15는 서열식별번호(SEQ ID NO): 7이고, 지방산이 1개 또는 2개의 단량체 단위의 N-말단에서 링커를 통해 연결되고, 2개의 AHA-hGDF15 단위 사이의 선은 디술피드 결합을 나타내는 것인 접합체.
  13. 화학식 G를 갖는 제12항에 따른 접합체 및 화학식 H를 갖는 제12항에 따른 접합체를 포함하는 혼합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 모이어티가 링커를 통해 펩티드 또는 단백질의 N-말단에 부착되는 것인 접합체, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체의 혈장 안정성 반감기가 10시간 초과, 20시간 초과, 또는 30시간 초과인 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 비-접합 생체분자와 비교하여 혈장 안정성 개선이 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 75배인 접합체.
  17. 생체 분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 제1항 내지 제9항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제10항 또는 제13항에 따른 접합체 혼합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애 또는 질환, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이러한 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, GDF15 돌연변이체가 MH(199-308)hGDF15, MHA(200-308)hGDF15, AHA(200-308)hGDF15, AH(199-308)GDF15, MHHHHHHM-hGDF15 및 MHHHHHH-hGDF15, 또는 이의 이량체로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제10항 또는 제13항에 따른 접합체 혼합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  20. 대사 장애 또는 질환, 당뇨병, 제2형 당뇨병, 비만, 췌장염, 이상지질혈증, 알콜성 및 비-알콜성 지방간 질환/지방간염 및 기타 진행성 간 질환, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 고혈압, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심부전, 관상 심장 질환, 당뇨병 합병증 (만성 신장 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 신경병증, 위 마비 및 기타 대사 장애의 치료, 또는 예방에서 사용하기 위한, 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 제1항 내지 제9항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제10항 또는 제13항에 따른 접합체 혼합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
  21. 생체분자가 인간 성장 분화 인자 15 (GDF15), 이의 상동체, 변이체, 돌연변이체, 단편 및 기타 변형 형태인 치료적 유효량의 제1항 내지 제9항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제10항 또는 제13항에 따른 접합체 혼합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 치료상 활성인 공동-작용제를 포함하는 조합물.
  22. 제21항에 있어서, 공동-작용제가 항당뇨병제, 혈중지질저하제, 항비만제, 항고혈압제, 및 퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체의 효능제로부터 선택되는 조합물.
  23. 제22항에 있어서, 공동-작용제가 인슐린, 인슐린 유도체 및 모방체; 인슐린 분비촉진제; 글리부리드, 아마릴(Amaryl); 인슐린 분비 자극성 술포닐우레아 수용체 리간드; 티아졸리딘디온, 피오글리타존, 발라글리타존, 리보글리타존, 네토글리타존, 트로글리타존, 엔글리타존. 시글리타존, 아다글리타존, 다르글리타존, 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (CETP) 억제제, GSK3 (글리코겐 신타제 키나제-3) 억제제; RXR 리간드; 나트륨-의존적 글루코스 공동수송체 억제제; 글리코겐 포스포릴라제 A 억제제; 비구아니드; 알파-글루코시다제 억제제, GLP-1 (글루카곤-유사 펩티드-1), GLP-1 유사체, GLP-1 모방체; DPPIV (디펩티딜 펩티다제 IV) 억제제, 3-히드록시-3-메틸-글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제 억제제; 스쿠알렌 신타제 억제제; FXR (파르네소이드 X 수용체), LXR (간 X 수용체) 리간드; 콜레스티라민; 피브레이트; 니코틴산, 아스피린; 오를리스타트 또는 리모나반트; 루프성 이뇨제, 푸로세미드, 토르세미드; 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제; Na-K-ATPase 막 펌프 억제제; 뉴트랄엔도펩티다제 (NEP) 억제제; ACE/NEP 억제제; 안지오텐신 II 길항제; 레닌 억제제; β-아드레날린성 수용체 차단제; 수축촉진제, 도부타민, 밀리논; 칼슘 채널 차단제; 알도스테론 수용체 길항제; 알도스테론 신타제 억제제; 페노피브레이트, 피오글리타존, 로시글리타존, 테사글리타자르, BMS-298585 및 L-796449로부터 선택되는 것인 조합물.
  24. 치료적 유효량의 제1항 내지 제9항, 제11항, 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 제10항 또는 제13항에 따른 접합체 혼합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  25. 하기 화학식의 화합물, 또는 이의 아미드, 에스테르 또는 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00348

    R1은 CO2H 또는 H이고;
    R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, OH, CO2H, -CH=CH2 또는 -C≡CH이고; 단, R2 및 R3은 동일하지 않고;
    R4는 CO2H이고;
    n 및 m은 서로 독립적으로 6 내지 30의 정수이다.
  26. 제25항에 있어서, R2 및 R3 중 적어도 하나가 CO2H인 화학식 A1의 화합물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    Figure pct00349

    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
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