CN1930305A - 过氧化物酶体增殖物激活受体α靶基因的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的特征是鉴定出新的人过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的靶基因及该新靶基因在治疗或监测代谢异常的治疗以及在鉴定用于治疗代谢异常的化合物中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及用于治疗或监控代谢异常的治疗方法和组合物。本发明也涉及用于鉴定代谢异常治疗用化合物的方法和组合物。具体地讲,本发明的方法包括Pa9、Pa13和Pa21三种PPARα靶基因的用途。
发明背景
肥胖症、糖尿病、高血压和高脂血症等代谢异常,在大多数工业化社会中是一个重要的公共卫生问题。这类代谢异常使个体易患冠状动脉病、中风和其它心血管疾病。越来越多的数据表明,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)在脂质代谢和葡萄糖代谢中起到关键作用并参与代谢障碍。
PPAR是配体激活转录因子,隶属于核受体亚家族。激活PPAR与其它核受体即类视黄醇X受体形成异质二聚体,并改变靶基因的转录。激活PPAR与称为过氧化物酶体增殖物应答元件(PPRE,其位于靶基因启动子上)的特异性DNA序列结合,增加了转录起始率。迄今为止所鉴定的大多数PPRE都是由间隔一个核苷酸的典型AGGTCA序列的直接重复序列组成(Schoonjans等,1996,BiochimBiophys Acta,1302:93-109)。三种PPAR亚型已经表征为PPARα、PPARδ和PPARγ。在褐色脂肪组织、肝、心、肾和肌肉细胞中观察到较高水平的PPARα表达,在此它调节脂肪酸的分解代谢。PPARδ广泛表达,其功能现已阐明。PPARγ主要存在于脂肪组织、结肠和巨噬细胞中,并且参与脂肪细胞分化、脂质贮藏和葡萄糖平衡(Lee等,2003,出处同上)。
PPAR的配体包括膳食脂肪酸以及用于治疗高脂血症或II型糖尿病的大量药物。例如,贝特类药物(fibrate)是一类降低血清甘油三酯的药物,是PPARα的合成激动剂。贝特类药物的实例包括但不限于吉非贝齐、苯扎贝特、非诺贝特、氯贝丁酯和新开发的微粉化非诺贝特。PPARα的其它合成激动剂包括但不限于GW2331、WY14643和L165041(Mukherjee等,2002,J Steroid Biochem Mol Biol.81(3):217-25)。噻唑烷二酮类(TZD)是一类胰岛素敏感药物,是高亲和性PPARγ激动剂。TZD的实例包括但不限于文迪雅(罗格列酮)和Resulin(曲格列酮)。
某些PPARα激动剂(例如贝特类)的作用看来具有种属特异性(Vosper等,2002,Pharmacology & Therapeutics,95:47-62)。在啮齿动物中给予贝特会诱导脂质平衡的关键性基因,例如HD(3-酰烯基CoA脱氢酶)基因、ACOX(脂酰CoA氧化酶)基因和ME(苹果酸酶(MalicEnzyme))基因(Castelein等,1994 J.Biolo.Chem.269:26754-758)。这与PPARα-裸鼠的研究结果是一致的,表明PPARα在维持啮齿动物的肝、脂肪细胞和骨骼肌等葡萄糖代谢和脂质代谢的主要靶组织的β-氧化途径的组成型活性上起到关键性作用(Leone等,1999,Proc.Natl.Acsd.Sci.U.S.A.96:7473-7478)。在人和若干其它“非敏感”物种(例如豚鼠和狨猴(marmoset))中给予贝特类,所诱导的基因看来不如贝特类在啮齿动物中诱导的那么多(Stael等,1997,Current PharmaceuticalDesign 3:1-14)。在人肝细胞或几种其它“非敏感”物种的肝中,没有观察贝特类对过氧化物酶体脂肪酸氧化的调节。但是,这些“非敏感”动物确实对贝特类表现出有效的降脂反应。
对PPARα所调节的新的人体基因进行鉴定,是理解贝特类在病人中的治疗机制的关键。新的PPARα靶基因对于贝特类和其它PPARα激动剂活性的临床监测来说具有价值。另外,新的PPARα靶基因将有助于快速鉴定和开发用于治疗代谢异常的新化合物。此外,新的PPARα靶基因还将有助于开发治疗代谢异常的新方法。
发明概述
目前已经发现,本文所说的基因Pa9、Pa13和Pa21是人过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的靶基因。
因此,就一般方面而言,本发明提供测定患者PPARα的生物活性的方法。该方法包括测定患者基因表达水平的步骤,所述基因选自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
就另一个一般方面而言,本发明提供评价患者代谢异常的治疗有效性的方法。该方法包括下述步骤:a)测定治疗期间或治疗之后患者体内选自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表达水平;和b)将步骤a)中测定的表达水平与治疗之前患者体内所述基因表达水平进行比较;其中,治疗期间或治疗之后患者体内所述基因表达水平增加,表明对患者代谢异常的治疗是有效的。
本发明的特征也在于试剂盒,该试剂盒用于评价患者代谢异常的治疗有效性。试剂盒可包括核酸探针,该探针在严格性杂交条件下与选自以下的核酸分子杂交:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQID NO:5或其互补序列。试剂盒也可包括抗体,该抗体与选自以下的多肽分子特异性结合:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。试剂盒还可包括使用说明书,该说明书用于确定对患者代谢异常的治疗是否有效。
就另一个一般方面而言,本发明提供用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法。该方法的一个实例包括下述步骤:a)使PPARα-反应系统与包含缓冲剂和试验化合物的溶液接触;b)测定PPARα-反应系统受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因表达水平;和c)将步骤(b)的结果与其中PPARα-反应系统仅与缓冲液接触的对照的结果进行比较。该方法的其它实例包括下述步骤:a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽与包含缓冲剂和候选化合物或试验化合物的溶液接触;b)测定试验化合物对多肽活性的影响;和c)将步骤(b)的结果与其中多肽仅与缓冲液接触的对照进行比较。
本发明的另一个一般方面涉及患者代谢异常的治疗方法。该方法包括给予患者治疗有效量的组合物的步骤,该组合物能改变患者细胞内人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表达模式或生物活性。
就又一个基本方面而言,本发明提供PPARα-反应系统,该系统包含功能性PPARα蛋白和核酸分子,该核酸分子包含与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接的报道基因编码序列。本发明也包括分离的核酸分子,该核酸分子包含与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接的报道基因编码序列。
就其它方面而言,根据以下公开内容(包括发明详述及其优选实施方案和所附权利要求书),本发明的特征和优势将会是显而易见的。
附图简述
图1显示Pa9微阵列注释(annotation)序列(GenBank检索号W30988)与人FDRG基因序列(GenBank检索号AX278133)之间的DNA序列比对。
图2显示Pa13微阵列注释序列(GenBank检索号N26311)与人TGF-β超家族蛋白质基因序列(GenBank检索号AB000584)之间的DNA序列比对。
图3显示Pa21微阵列注释序列(GenBank检索号H49601)与人C20orf139基因序列(GenBank检索号NM_080725)之间的DNA序列比对。
图4说明在SKMU细胞中,PPARα特异性siRNA降低PPARα基因表达水平。
图5说明在PPARα表达降低的SKMU细胞中,WY14643减少了对Pa9基因表达的诱导。
图6说明在PPARα表达降低的SKMU细胞中,没有检测到WY14643对Pa13基因表达的诱导。
图7说明在PPARα表达降低的SKMU细胞中,没有检测到WY14643对Pa21基因表达的诱导。
发明详述
本文所用的术语“包括”、“含有”、“具有”和“包含”均使用其开放式、非限制性含义。
下面是本说明书中有时使用的缩写词:
bp=碱基对
cDNA=互补DNA
C20orf139=染色体20可读框139
ELISA=酶联免疫吸附测定
FDRG=血纤蛋白原结构域相关蛋白
kb=千碱基;1000碱基对
nt=核苷酸
PAGE=聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBMC=外周血单核细胞
PCR=聚合酶链式反应
PPARα=过氧化物酶体增殖物激活受体α
PPRE=过氧化物酶体增殖物应答元件
RT PCR=逆转录聚合酶链式反应
SDS=十二烷基硫酸钠
SiRNA=小干扰RNA
SKMU=骨骼肌
SSC=氯化钠/柠檬酸钠
TZDs=噻唑烷二酮
UTR=非翻译区
WAT=白色脂肪组织。
多肽或核酸的“活性”、“生物活性”或“功能活性”,是指按照标准技术在体内或体外进行测定时多肽或核酸分子所具有的活性。这类活性可以是直接活性或间接活性,前者例如与第二种蛋白质的酶活性相关或对第二种蛋白质的酶活性,后者例如由该蛋白质与第二种蛋白质相互作用所介导的细胞信号传导活性。
本文所用的“生物样品”是指含有细胞或组织物的样品或者由细胞或组织物组成的样品,例如分离自患者的细胞或生物流体。“患者”可以是哺乳动物,例如大鼠、小鼠、猴子或人,它们作为治疗、观察或试验的对象。生物样品的实例包括例如痰液、血液、血细胞(例如白细胞)、羊水、血浆、精液、骨髓、组织或穿刺活检样品、尿液、腹膜液、胸腔积液和细胞培养物。生物样品也可包括组织切片,例如用于组织学目的的冷冻切片。
在优选的实施方案中,生物样品是来自病人的“临床样品”。生物样品也可以称为“患者样品”。试验生物样品是作为分析、监测或观察对象的生物样品。对照生物样品是试验生物样品的阳性对照或阴性对照。通常,对照生物样品含有与试验生物样品类型相同的靶组织、细胞和生物流体。
“细胞”是指适于检测方法灵敏度的至少一个细胞或多个细胞。适于本发明的细胞可以是细菌细胞,但优选真核细胞,最优选哺乳动物细胞。
“克隆”是由单细胞或共同祖先经有丝分裂而来的细胞群体。
“细胞系”是原代细胞的克隆,其在体外能稳定生长多代。
“基因”是参与产生肽、多肽或蛋白质的DNA区段,包括编码区以及编码区前(“5′UTR”)后(“3′UTR”)的非编码区。“基因”也可包括各编码区段(“外显子”)之间的间插非编码序列(“内含子”)。“启动子”是指参与RNA聚合酶的结合从而启动基因转录的DNA调节序列。启动子通常是基因上游(“5′-”)的转录起始位点。“调节序列”是指能控制基因表达的基因部分。“调节序列”可包括启动子、增强子和其它表达控制元件,例如聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点(用于细菌表达)和/或操纵子。“编码区”是指通过三联密码编码氨基酸和翻译起始信号及终止信号的基因部分。
“基因表达微阵列分析”是指这样的检测方法:其中使探针寡核苷酸“微阵列”与目标核酸样品(例如靶样品、例如来自特定组织类型的多聚腺苷酸mRNA或其逆转录物)接触。参见例如Nees等(2001),Curr Cancer Drug Targets,1(2):155-75。接触是在杂交条件下进行,然后除去未结合核酸。所得到的杂交核酸模式提供所检测样品的基因特征相关信息。基因表达分析可同时检测上千个基因的表达,提供大量的基因相互作用和功能的信息。基因表达分析具有各种不同用途,例如鉴定基因表达,找出基因表达与特定表型之间的关系,筛选疾病易感型体质并鉴定特定药物对细胞基因表达的效果(例如在毒性试验中)。本文所用的“微阵列”是指一种基质,例如基本上是平面的基质,例如生物芯片或基因芯片,其空间上分布有多种聚合物分子并稳定缔合或固定在基质表面上。示例性的微阵列模式包括寡核苷酸阵列和点阵列。基因表达微阵列分析方法是本领域技术人员已知的。有关综述参见例如Yang等(2002),Nat Rev genet 3(8):579-88),或美国专利第6,004,755号,所述文献公开了使用DNA微阵列进行定量基因表达分析的方法。
“人Pa9基因”是指这样的基因:(1)在严格性杂交条件下与具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的核酸分子特异性杂交;(2)编码具有SEQID NO:2氨基酸序列的蛋白质;或(3)编码能与抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)结合的蛋白质,该抗体针对具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白质。“严格性杂交条件”具有本领域已知含义,描述于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,(1989)。示例性的严格性杂交条件包括在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、在约45℃杂交,接着在0.2xSSC和0.1%SDS中、在50-65℃洗涤一次或多次。“人Pa9基因”包括人NL2TIE配体同源多肽基因(描述于US6348350)和人FDRG基因(描述于WO0177151)。示例性的人Pa9基因包括人Pa9结构和功能多态性的基因。“多态性”是指群体内个体中在特定基因座上的一系列基因变异体。
“分离的”核酸分子是基本上与其它核酸分子分离的核酸分子。“分离的”核酸分子可以是例如这样的核酸分子:不含在该核酸来源生物基因组DNA的5′和3′端天然侧接该核酸分子的至少一个核苷酸序列。分离的核酸分子包括但不限于独立于其它序列的分离的核酸分子(例如由PCR或限制性内切核酸酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片段),以及掺入到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)内的核酸分子,或者掺入到原核生物或真核生物基因组DNA内的先前分离的核酸。另外,分离的核酸分子可包含作为杂合或融合核酸分子组成部分的核酸分子。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自其细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白,或者当化学合成时则基本上不含化学前体或其它化学品。术语“基本上不含细胞材料”包括蛋白质制剂,其中所述蛋白从细胞中分离或重组产生后与该细胞组分分离。因此,基本上不含细胞材料的蛋白质包括这样的蛋白质制剂:其含有小于约30%、20%、10%或5%(干重)异源蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)。在一个实施方案中,当蛋白质或其生物活性部分是重组产生时,也优选基本上不含培养基,即培养基含量小于约20%、10%或5%的蛋白质制剂体积。当蛋白质是通过化学合成而来的,则优选基本上不含化学前体或其它化学品,即与参与该蛋白质合成的化学前体或其它化学品彼此分离。因此,该蛋白制剂含有小于约30%、20%、10%、5%(干重)的并非目标多肽的化学前体或化合物。分离的生物活性多肽可具有几种不同的物理形式。分离的多肽可以呈全长新生或为加工的多肽形式,或者是部分加工的多肽或加工多肽的组合。可以经特异性蛋白水解切割事件,对全长新生的多肽进行翻译后修饰,导致形成全长新生多肽的片段。片段或片段的物理结合可具有全长多肽相关生物活性,然而,各片段相关生物活性的程度可以是不同的。
术语“标记”用于标记试剂(例如核酸探针或抗体)时,包括通过将检测物质与试剂偶联从而用试剂直接标记(即物理连接),以及用其它能直接标记的试剂进行间接标记。可直接检测的标记包括荧光标记和放射性同位素。说明性的放射性同位素标记包括例如35S、32p和3H。优选的荧光剂是吸收光波长约为300-900nm的荧光剂,更优选约400-800nm的荧光剂,其中最大吸收光波长范围优选在约500-800nm。可用于单标记引物的荧光剂实例包括荧光素、罗丹明、BODIPY、花青染料等。荧光剂进一步描述于Smith等,Nature(1986),321:647-679。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体以及带有生物素的末端标记的DNA探针来检测第一抗体,使得可以用荧光标记的链霉抗生物素等来检测它们。对于标记核酸分子来说的“末端标记”是指标记部分存在于至少邻近末端区域。优选的末端标记具有在核酸分子5′端的部分。标记也可在3′端,使用例如末端脱氧核苷酸转移酶。
“Pa13基因”是指这样的基因:(1)在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子与人Pa13cDNA(SEQ ID NO:3)具有大于约60%的核苷酸序列同一性;(2)编码蛋白质,该蛋白质与人Pa13蛋白(SEQ ID NO:4)具有大于约60%的氨基酸序列同一性;或(3)编码能与抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)结合的蛋白质,该抗体针对本文所述的人Pa13蛋白。“人Pa13基因”包括人TGF-β超家族蛋白(Yokoyama-Kobayashi等,1997,J Biochem(Tokyo).122(3):622-6,GenBank蛋白质标识号:BAA19151)。
“Pa13基因”可以在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子与SEQ ID NO:3具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的核苷酸序列同一性。在其它实施方案中,Pa13基因编码蛋白质,该蛋白质与SEQ ID NO:4具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa13基因”包括人Pa13结构和功能多态性的基因及其在包括大鼠、小鼠、猪、狗和猴子在内的其它动物中的直向同源物。
“Pa21基因”是指这样的基因:(1)在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子与人Pa21cDNA(SEQ ID NO:5)具有大于约60%核苷酸序列同一性;(2)编码蛋白质,该蛋白质与人Pa21蛋白(SEQ ID NO:6)具有大于约60%的氨基酸序列同一性;或(3)编码能与抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)结合的蛋白质,该抗体针对本文所述的人Pa21蛋白。人“Pa21基因”包括人C20orf139基因(Strausberg等,2002 Dec 24,Proc Natl Acad Sci USA.;99(26):16899-903.Epub 2002Dec 11.,GenBank蛋白质标识号:NP_542763)。
“Pa21基因”可以在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子与SEQ ID NO:5具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的核苷酸序列同一性。在其它实施方案中,“Pa21基因”编码蛋白质,该蛋白质与SEQ ID NO:6具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。示例性的“Pa21基因”包括人Pa21结构和功能多态性的基因及其在包括大鼠、小鼠、猪、狗和猴子在内的其它动物中的直向同源物。
本文所用的“过氧化物酶体增殖物激活受体α”或“PPARα”是指这样的多肽:(1)与人PPARα蛋白具有大于约60%氨基酸序列同一性(Sher等,1993.Biochemistry.32(21):5598-604,GenBank蛋白质标识号:NP_005027);(2)能与抗体(例如多克隆抗体或单克隆抗体)结合,该抗体针对本文所述的人PPARα蛋白;或(3)由多核苷酸所编码,该多核苷酸在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子序列与人PPARαcDNA(GenBank核苷酸检索号:NM_005036)具有大于约60%核苷酸序列同一性。
“PPARα”可以是这样的多肽:与人PPARα蛋白具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中,“PPARα”是由多核苷酸所编码的多肽,该多核苷酸在严格性杂交条件下与核酸分子特异性杂交,该核酸分子序列与人PPARαcDNA具有大于约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的核苷酸序列同一性。示例性的“PPARα”蛋白包括人PPARα蛋白结构和功能多态性以及在包括大鼠、小鼠、猪、狗和猴子在内的其它动物中的PPARα直向同源物。“功能性PPARα”是指全长PPARα蛋白或任何保留PPARα生物活性的片段PPARα蛋白,例如当它一旦与膳食脂肪酸、贝特类或其它PPARα激动剂结合,即可激活包括本文所公开的Pa9、Pa13和Pa21在内的宿主靶基因的转录。
术语“PPARα靶基因”或“PPARα的靶基因”包括其表达受PPARα调节的任何类型和来源的基因。这类基因的实例是啮齿动物的脂肪酸酰基-CoA氧化酶、3-烯酰基Co-A脱氢酶和苹果酸酶,以及本文所述的Pa9、Pa13和Pa21基因。具体地讲,术语“PPARα靶基因”包括其启动子序列、尤其是其PPARα结合序列,例如过氧化物酶体增殖物应答元件(PPRE)。靶基因可以以任何DNA构象的形式存在。它们可存在于细胞内,或者可以以分离的形式存在。靶基因也可与其它序列结合在一起,尤其是与编码报告蛋白的序列结合在一起。
“重组宿主细胞”是已被外源DNA序列转化或转染的细胞。当采用各种将DNA转移到原核细胞或真核细胞中的已知技术,将外源DNA导入本文所用的细胞时,该细胞就被外源DNA“转化”。外源DNA可以整合(共价连接)到染色体DNA上成为细胞基因组,或不整合。例如,外源DNA可以附加体(例如质粒)形式保留。或者,对于稳定转化或转染细胞而言,外源DNA整合到染色体内,使其通过染色体复制而遗传给子细胞。该稳定性由以下事实证明:稳定转化或转染细胞能够建立由含有外源DNA的子细胞群体组成的细胞系或克隆。重组宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,包括细菌(例如大肠杆菌E.coli)、真菌细胞(例如酵母)、哺乳动物细胞(包括人、牛、猪、猴和啮齿类来源的细胞系)和昆虫细胞(例如源自果蝇属(Drosophila)和蚕的细胞系)。可以进一步理解术语“重组宿主细胞”不仅是指特定患者细胞,而且也指该细胞的子代或潜在子代。因为在连续传代中因突变或环境影响会发生某些修饰,所以这样的子代实际上可能与母细胞不同,但仍然包括在本文所用的术语的范围之内。
“序列”是指聚合物中单体的线性顺序,例如多肽中氨基酸的顺序或者多核苷酸中核苷酸的顺序。
正如本领域已知的,“序列同一性或相似性”是指经序列比较而测定的两个以上多肽序列或两个以上多核苷酸序列之间的关系。在本领域中,“同一性”也指多肽序列或多核苷酸序列之间的序列相关程度,视情况而定,可经所述序列链间比对而确定。
为了测定两个氨基酸序列或两个核酸的%同一性或相似性,为了最佳比较的目的,将序列进行比对(例如将空位引入第一氨基酸序列或核酸序列中,以便与第二氨基酸序列或核酸序列进行最佳比对)。然后,对相应氨基酸位或核苷酸位的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置在第二序列的相应位置上被相同或相似氨基酸残基或核苷酸占据时,则这些分子在该位置是相同的或相似的。两个序列间的%同一性或相似性是序列共享相同或相似位置数的函数(即%同一性=相同位置数/位置总数(例如重叠位置)×100)。在一个实施方案中,两个序列具有相同长度。
同一性和相似性都可容易地求出。在计算%同一性时,只计算准确的匹配。测定序列间同一性或相似性的常用方法包括例如公开于以下文献的方法:Carillo等(1988),SIAM J.AppliedMath.48,1073。设计测定同一性的优选方法,得到所测序列间的最大匹配。测定同一性和相似性的方法已经编成了计算机程序。
用于比较两个序列的数学算法的一个实例是以下文献的算法:Karlin等(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,该算法在以下文献中被修改:Karlin等(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877。所述算法已经结合到Altschul等(1990),J Mol.Biol 215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。为了比较目的而得到带空位的比对,可使用以下文献所述的Gapped BLAST:Altschul等(1997),NucleicAcids Res.25:3389-3402。或者,可以使用PSI-Blast,进行迭代搜索,检测分子间的距离关系。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时,可以使用相关程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。另外,也可使用FASTA方法(Atschul等(1990),J.Molec.Biol.215,403)。
用于序列比较的数学算法的另一个实例是Myers等(1988),CABIOS 4:11-17的算法。该算法结合到ALIGN程序(2.0版)中,作为GCG序列比对软件包的组成部分(Devereux等(1984),Nucleic AcidsResearch 12(1),387)。
本文所用的术语“基本上相似”是指包括相同序列以及其上经缺失、取代或添加而得到的修饰序列的多核苷酸或多肽序列,所述序列保持任何生物活性部分并具有其任何保守基序。
本文所用的术语“治疗有效量”是指由研究人员、兽医、医学博士或其它临床医师所确定的活性化合物或药物在组织系统、动物或人中引发生物反应或药物反应(包括减轻所治疗疾病的症状)的量。确定本发明药物组合物治疗有效量的方法是本领域已知的。
术语“载体”是指能够将其上连接的其它核酸转移的核酸分子。一类载体是“质粒”,是指其中可以插入额外DNA区段的环状双链DNA环。其它类型的载体是其中可以插入额外DNA区段的病毒载体。某些载体在所导入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)一旦导入宿主细胞后,整合在宿主细胞基因组上并且随宿主基因组复制而复制。此外,某些载体,例如表达载体,能够指导与其操作性连接的基因的表达。一般而言,用于重组DNA技术的载体通常呈质粒形式。然而,本发明包括其它形式的载体,例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒),它们起到等同的作用。
评价代谢异常的治疗有效性的方法
就一般方面而言,本发明提供测定患者PPARα的生物活性的方法。该方法包括测定患者体内所述基因表达水平的步骤,所述基因选自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因。
本发明提供评价患者代谢异常的治疗有效性的方法。代谢异常可以是血脂异常(dyslipidaernia)或与血脂异常相关疾病,例如动脉粥样硬化、肥胖症、血栓形成或冠状动脉病、高血压、绞痛、慢性肾衰竭、外周血管病、中风、II型糖尿病、葡萄糖耐量减低(IGT)和代谢综合征(X综合征)。
在一个优选的实施方案中,本发明的方法可用于评价涉及PPARα激动剂或调节剂的治疗有效性。PPARα激动剂的实例包括但不限于吉非贝齐、苯扎贝特、非诺贝特、氯贝丁酯、微粉化非诺贝特、GW2331、WY14643、L165041及其衍生物。
采自患者的生物样品可用于测定患者体内选自Pa9、Pa13或Pa21的PPARα靶基因的表达水平。可以使用技术人员已知的任何合适方法(例如通过穿刺活检),获取生物样品。例如,生物样品可以得自PPARα表达集中的褐色脂肪组织、肝、心、肾或肌肉。生物样品也可得自脂肪组织或外周血单核细胞(PBMC)。
在某些实施方案中,可以通过测定PPARα靶基因的mRNA量,来测定该靶基因的表达水平。可以使用各种技术,测定生物样品中特定基因的mRNA的量。例如,可以通过使生物样品与能够特异性检测mRNA的化合物或试剂接触,从而测定mRNA。通常使用能够与mRNA特异性杂交的标记核酸探针。例如,对人Pa9mRNA具有特异性的核酸探针可以是全长人Pa9cDNA,其具有SEQ ID NO:1或其部分的核苷酸序列,例如长度至少为15、30、50、100、250或500个核苷酸的寡核苷酸,其可以在严格性杂交条件下与人Pa9mRNA杂交。在严格性条件下,对人Pa9mRNA具有特异性的核酸探针不仅将会与该mRNA杂交,而且还会与生物样品中存在的其它mRNA杂交。用于本发明的核酸探针包括在严格性杂交条件下能够与SEQ IDNO:1、3或5杂交的探针。
测定生物样品中特定基因的mRNA含量的其它技术是定量实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。可以通过逆转录,从样品制备来自基因(例如人Pa9基因)的互补DNA(cDNA)。通过PCR,使用在严格性杂交条件下能够与Pa9cDNA杂交的寡核苷酸引物,可以扩增cDNA。用于RT-PCR的试剂盒是市售的,例如来自Applied Biosystems(Foster City,CA)的“One-Step RT-PCR Master Mix Reagent”试剂盒。
最近十几年来,原位杂交一直广泛用于研究细胞或组织特定区室的mRNA的分布和表达。用于原位杂交的核酸探针种类包括不同长度的单链寡核苷酸、单链RNA探针(核糖核酸探针(riboprobe))或双链cDNA序列。可以专门针对任何已知表达的核酸序列来设计探针。各种不同放射性同位素和非同位素标记是市售的,可用于原位杂交。有关原位杂交方法的综述,参见McNicol等(1997),J.Pathol 182(3):250-61。测定生物样品中特定基因的mRNA含量的其它有用的技术包括DNA微阵列分析、斑点印迹和RNA杂交。
在某些实施方案中,可以通过测定PPARα靶基因所编码的多肽含量,来确定生物样品中PPARα靶基因的表达水平。可通过使生物样品与能够特异性检测蛋白质的化合物或试剂接触,来测定生物样品中该蛋白质含量。例如,用于检测人Pa9蛋白的优选试剂是能够与该多肽部分特异性结合的抗体。在一个优选方法中,可以使用对偶联可检测标记的人Pa9蛋白具有特异性的抗体,用于检测人Pa9蛋白质。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用完整的抗体分子或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。抗体可以通过专家实验室而得到。例如,可以在相当短的时间内,开发出针对对Pa9、Pa13或Pa21蛋白具有特异性的合成肽序列的抗体,使得能够更大程度地便于研究这些目的靶标。
检测多肽(例如Pa9、Pa13或Pa21蛋白)的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光以及免疫组织化学。实施这些方法的细节可参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,New York,(1989))。
另外,可以通过无创性定量方法,例如正电子发射断层扫描(PET)造影,测定活的人体器官中PPARα靶基因的表达水平(Sedvall等,(1988)Psychopharmacol.Ser.,5:27-33)。例如,可以将痕量Pa9蛋白结合放射性示踪物经静脉注射到患者体内,然后对患者体内褐色脂肪组织、肝、心、肾、肌肉或其它器官中放射性标记的分布进行造影。PET造影以及其它无创性定量造影的方法是本领域技术人员已知的(有关综述参见Passchier等,(2002)Methods 27:278)。
可以得到完整的检测试剂盒,其中包含检测PPARα靶基因表达水平所需的所有试剂,通常还有优化方案。
确定患者代谢异常的治疗有效性的试剂盒
因此,本发明的特征也在于用于确定患者代谢异常的治疗有效性的试剂盒。所述试剂盒优选包括适于密封在至少一个容器中的区室化载体。载体还包括能够测定生物样品中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的多肽或mRNA的试剂,以及测定生物样品中多肽或mRNA含量的方法(例如酶或底物)。试剂盒也可包括对照样品或系列对照样品,这些对照样品可以被检测并与所含有的试验样品对比。试剂盒的各组分可封装在单独容器中,所有不同容器可放在单一包装中,并附有使用说明书,该说明书用于确定对患者代谢异常的治疗是否有效。
对于基于抗体的试剂盒,试剂盒可包括例如:(1)第一抗体(例如与固体支持物连接的抗体),该抗体与Pa9、Pa13或Pa21基因所编码的多肽结合;并且任选地,(2)不同的第二抗体,该抗体与多肽或第一抗体结合并且与可检测试剂缀合;和(3)基本上纯化的由Pa9、Pa13或Pa21基因所编码的多肽,作为阳性对照。例如,基于抗体的试剂盒可包括抗体,该抗体与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽特异性结合。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。技术人员已知的任何合适方法都可用于开发抗体。
对于基于寡核苷酸的试剂盒,该试剂盒可包括例如:寡核苷酸,例如标记寡核苷酸,其可在严格性杂交条件下与Pa9、Pa13或Pa21基因的mRNA杂交。例如,该试剂盒可包括标记的寡核苷酸,其可在严格性杂交条件下与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3或其互补序列杂交。或者,该试剂盒可包括一对引物,用于从基因Pa9、Pa13或Pa21mRNA逆转录和扩增核酸分子。例如,该试剂盒可包括一对引物,用于从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3扩增核酸分子。
对于基因Pa9、Pa13和Pa21作为新的PPARα靶基因的鉴定,也允许新筛选方法或测定的开发,用于鉴定化合物在治疗代谢疾病中的潜在功效。
用于治疗代谢异常的化合物的鉴定方法
本发明的一般方面涉及用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法。该方法包括化合物的鉴定,该类化合物能改变人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表达水平,或者能改变人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码多肽的生物活性。
可以采用常规实验室模式或适于高通量的测定,实施化合物的鉴定方法。术语“高通量”是指允许同时对多个样品进行简便易行的筛选的测定设计,并且可以包括机器人操作能力。高通量测定的其它所需特征是经过优化以降低试剂用量或使操作次数最小化、以便获得所需分析的测定设计。测定模式的实例包括96孔板或384孔板、漂浮液滴(levitating droplet)和“芯片实验室(lab on a chip)”微通道芯片,用于液体处理实验。正如本领域技术人员已知的,当塑料模板和液体处理装置的微型化是先进的,或者当设计出改进的测定装置时,使用本发明的测定可以更有效地筛选更多样品。
用于筛选的候选化合物可选自各种化学类别,优选选自有机化合物类。尽管候选化合物可以是大分子,但是优选候选化合物是小分子有机化合物,即分子量大于50但小于2500的化合物。候选化合物具有一个或多个与多肽结构相互作用所需的化学官能团。优选候选化合物具有至少一个氨基、羰基、羟基或羧基,优选至少两个这样的官能团,更优选至少三个这样的官能团。候选化合物可包括环碳或杂环结构部分和/或芳族或多芳族结构部分,所述部分被一个或多个以上示例的官能团所取代。候选化合物也可以是生物分子,例如肽、糖、脂肪酸、固醇类、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶、以上物质的衍生物或结构类似物,或其组合等。当化合物是核酸时,该化合物优选是DNA或RNA分子,尽管具有非天然键或亚单位的修饰核酸也包括在内。
候选化合物可得自各种来源,包括合成或天然化合物文库。例如许多方法可用于随机和定向合成各种不同的有机化合物和生物分子,包括表达的随机寡核苷酸、合成有机组合文库、随机肽的噬菌体展示文库等。也可采用任何本领域已知的组合文库的各种方法,获取候选化合物,包括生物文库;空间可寻址的平行固相或液相文库;需要重叠合法的合成文库方法;“一珠一化合物”文库方法;以及使用亲合色谱选择的合成文库方法(参见例如Lam(1997),Anticancer Drug Des.12:145)。或者,可以使用呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库,或者可以常规制备天然化合物文库。此外,天然和合成产生的文库和化合物可以经常规化学、物理和生物化学方法进行常规修饰。
此外,可以对已知药理学试剂进行定向或随机化学修饰,例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等,以产生所述试剂的结构类似物。可以随机选择候选化合物,或者可以根据与PPARα结合和/或调节PPARα活性功能的现有化合物,来选择候选化合物。例如,候选试剂的一个来源是基于已知PPARα活化剂或抑制剂的分子文库,其中在分子的一个或多个位置上改变化合物结构,使其含有更多或更少的化学部分或不同的化学部分。在产生类似活化剂/抑制剂文库中,可以对分子结构变化进行定向、随机取代和/或添加,或定向与随机组合的取代和/或添加。
各种其它试剂也可包含在混合物中。这些试剂包括例如盐、缓冲剂、中性蛋白(例如白蛋白)和去垢剂,这些试剂可用于促进优化蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸结合。所述试剂也可降低反应组分的非特异性或背景相互作用。也可使用改进测定效果的其它试剂,例如核酸酶抑制剂、抗微生物试剂等。
本领域中可找到合成分子文库的方法实例,例如Zuckermann等(1994),J Med.Chem.37:2678。化合物文库可以存在于溶液中(例如Houghten(1992),Biotechniques 13:412-421),或者在珠子(Lam(1991),Nature 354:82-84)、芯片(Fodor(1993),Nature 364:555-556)、细菌(美国专利第5,223,409号)、孢子(美国专利第5,571,698号)、质粒(Cull等(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或噬菌体(参见例如Scott和Smith(1990),Science 249:386-390)中。
在一个实施方案中,本发明提供用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法,该方法包括下述步骤:a)使PPARα-反应系统与包含缓冲剂和试验化合物的溶液接触;b)测量PPARα-反应系统受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因表达水平;和任选将步骤(b)的结果与试验化合物不存在时所测定的PPARα-反应系统的对照进行比较。
用于治疗代谢异常的鉴定化合物包括可增加或降低PPARα-反应系统中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表达的任何化合物。例如,该化合物可以在PPARα-反应系统中与PPARα结合并直接调节PPARα的生物活性,导致PPARα-反应系统中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达增加或降低。化合物也可与细胞组分结合,从而在PPARα-反应系统中与PPARα相互作用并间接调节PPARα相关生物活性,导致PPARα-反应系统中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达增加或降低。化合物还可通过与PPARα生物活性无关的机制,增加或降低PPARα-反应系统中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达。
“PPARα-反应系统”在其最广泛含义上是指响应PPARα基因刺激(例如当使用PPARα激动剂时)的单细胞、组织和复杂多细胞生物体(例如哺乳动物)。在一个优选的实施方案中,PPARα-反应系统是包含功能性PPARα蛋白和至少一种选自Pa9、Pa13和Pa21基因的PPARα靶基因的动物、组织或细胞。PPARα-反应系统可以是内源PPARα和内源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21的天然宿主。例如,人肝细胞HuH7细胞、人原代脂肪细胞和人原代骨骼肌细胞(SKMC)都是可用于本发明的天然PPARα-反应系统。PPARα-反应系统也可以是用于PPARα的重组宿主细胞。技术人员已知的任何合适方法都可用于获取这样的具有重组PPARα的PPARα反应系统。例如,对于至少一种内源PPARα靶基因Pa9、Pa13或Pa21,可以通过将编码功能性PPARα蛋白的外源DNA导入天然宿主细胞中,构建PPARα-反应系统。可以采用上述方法,通过测量PPARα-反应系统中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA或蛋白含量,来确定该PPARα-反应系统中Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达水平。
在另一个实施方案中,PPARα-反应系统包括功能性PPARα蛋白和核酸分子,该核酸分子包含与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接的报道基因编码序列。该系统在响应PPARα调节剂时允许报道基因的转录调节。因此,可以根据报道基因活性,间接测定PPARα靶基因的表达水平。例如,当萤光素酶(luc)基因用作报道基因时,可以根据PPARα-反应系统的生物发光量来测定PPARα靶基因的表达水平。其它报道基因包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸转移酶基因和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。可以容易地测得报道基因的生物活性。试剂盒是市售的,便于测定报道基因活性。
技术人员已知的任何合适方法都可用于构建包含报道基因编码序列的核酸,该报道基因编码序列与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接。人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列包括分别与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因天然相关的或控制这些基因的基因表达的任何核苷酸序列。优选的调节序列包括一个或多个潜在PPRE。例如,SEQ ID NO:19或其部分的核苷酸序列代表人Pa13基因的调节序列;而SEQ ID NO:20或其部分的核苷酸序列代表人Pa21基因的调节序列。
在另一个实施方案中,本发明提供用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法,该方法包括下述步骤:a)使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽与包含缓冲剂和试验化合物的溶液接触;b)测定试验化合物对多肽活性的影响;和c)将步骤(b)的结果与缺乏试验化合物的对照进行比较。
结合测定可用于鉴定与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽结合、并能潜在增加或降低多肽生物活性的化合物。一个示例性结合测定包括下述步骤:(a)将试验化合物与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽和多肽的标记配体一起孵育;(b)将所述多肽与未结合的标记配体分离开来;和(c)通过降低标记配体与多肽结合的量,鉴定抑制配体与多肽结合的化合物。标记的多肽配体的实例是对多肽具有特异性的标记抗体。可以使用表达人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的宿主细胞(重组或天然)用于结合测定。优选将由宿主细胞制备的细胞膜用于结合测定。更优选基本上纯化的人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽用于结合测定。
有多种方式可将所述多肽与未结合的标记配体分离开来。通常,将至少一种组分固定在固体基质上,未结合组分可从该基质上容易地分离出来。固体基质可由许多材料制成,并且可制成各种形状,例如微量滴定板、微珠、浸棒(dipstick)、树脂颗粒等。优选选择使信噪比最大化、背景结合最小化以及便于分离和成本低廉的基质。
例如通过从贮池中取出珠子或浸棒,倒空或稀释贮池(例如微量滴定板孔),或者用洗涤液或溶剂漂洗珠子、颗粒、色谱柱或滤器,来进行分离。分离步骤优选包括多步漂洗和洗涤。例如,当固体基质是微量滴定板时,各孔可用洗涤液洗涤数次,该洗涤液通常包含不参与特异性结合的孵育混合物的组分,例如盐、缓冲剂、去垢剂、非特异性蛋白质等。当固体基质是磁珠时,该磁珠可以用洗涤液洗涤一次或多次并用磁力进行分离。
各种标记可用于标记配体,例如可直接检测(例如放射性、发光、光密度或电密度等)或间接检测(例如表位标记(例如FLAG表位)、酶标记(例如辣根过氧化物酶)等)的标记。
在本发明的不止一个以上测定方法的实施方案中,最好将多肽或其配体固定化,便于将多肽的结合形式与未结合形式分离开来,并且适于测定的自动化。在候选化合物存在或不存在时,可以在适于所含有的反应物的任何容器中完成试验化合物与多肽的结合,或多肽与靶分子的相互作用。所述容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中,可以提供多肽的融合蛋白,该蛋白中添加了允许一个或两个多肽及其配体与基质结合的结构域。例如,具有谷胱甘肽-S-转移酶的多肽的融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical;St.Louis,MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上,然后将其与试验化合物或试验化合物和多肽的标记配体结合,再将混合物在有助于复合物形成的条件(例如在盐和pH的生理条件下)下孵育。孵育后,珠子或微量滴定板各孔经洗涤除去任何未结合组分,如上所述直接或间接测定复合物形成。或者,可以将复合物从基质上解离下来,用标准技术测定本发明多肽的结合或活性水平。
将蛋白质固定在基质上的其它技术也可用于本发明的筛选测定。例如,可使用生物素和链霉抗生物素缀合,将多肽或其配体固定化。
采用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒,PierceChemicals;Rockford,IL),可以由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化多肽或靶分子,并固定在链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的各孔上。或者,与多肽具有反应性、但不干扰多肽与其靶分子结合的抗体,可以衍生到板的各孔上,并且多肽可以通过抗体缀合而捕获在板的各孔上。除上述GST固定化复合物的方法之外,测定所述复合物的方法还包括使用对本发明多肽或靶分子具有反应性的抗体的复合物免疫测定,以及依赖于多肽相关酶活性检测的酶联测定。
基因Pa9、Pa13和Pa21作为新的PPARα靶基因的鉴定,也允许开发代谢异常的新治疗方法。
代谢异常的治疗方法
因此,本发明的另一个一般方面涉及患者代谢异常的治疗方法。该方法包括给予患者治疗有效量的组合物的步骤,所述组合物能改变患者细胞内人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表达模式或生物活性。
在一个实施方案中,该治疗方法包括给予患者化合物的步骤,该化合物能够增加或降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达或生物活性。可使用上述化合物鉴定方法,来鉴定这些化合物。
在另一个实施方案中,可以在细胞中使用靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因治疗,治疗患者代谢异常。例如,反义疗法可用于降低细胞中人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达,当需要降低人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达或活性时。
基于反义策略的原理是根据这一假说:通过mRNA和互补反义种类之间的胞内杂交,可以达到基因表达的序列-特异性抑制。杂合RNA双链体的形成可干扰靶mRNA(例如基因Pa9、Pa13或Pa21的mRNA)的加工/转运/翻译和/或稳定性。杂交是发生反义效应所需的。反义策略可使用各种方法,包括使用反义寡核苷酸,注射反义RNA和反义RNA表达载体的转染。反义链与有义链杂交所诱导的表型效应是基于例如蛋白质水平、蛋白质活性测定和靶mRNA水平的标准的变化。
反义核酸可以与靶基因的完整编码链或其部分互补。反义核酸分子也可以与靶基因编码链的全部或部分非编码区互补。非编码区(“5′UTR和3′UTR”)是侧接编码区的5′和3′序列,它们不能翻译成氨基酸。优选非编码区是靶基因转录或翻译调节区。
反义寡核苷酸的长度可以是例如取自SEQ ID NO:1、3或5互补序列的约15、25、35、45或65个核苷酸或更长。优选该序列长度为至少18个核苷酸,以便与靶mRNA序列实现足够强的退火,以防止序列翻译(Izant等,1984,Cell,36:1007-1015;Rosenberg等,1985,Nature,313:703-706)。可以采用化学合成和酶促连接反应,使用本领域已知方法,构建反义核酸。例如,可以使用天然存在的核苷酸或不同修饰的核苷酸(其设计用来增加分子的生物稳定性或增加反义核酸和有义核酸间形成的双链体的物理稳定性),化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸),例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。反义核酸分子可以是CC-端基异构核酸分子。CC-端基异构核酸分子与互补RNA构成特异性双链杂合体,其中与常规P-单位不同,这些链彼此平行排列(Gaultier等(1987)Nucleic Acids Res.15:6625-6641)。反义核酸分子也可包括2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215:327-330)。
或者,也可采用生物方法,用表达载体来产生反义核酸,该载体中已经如上所述以反义方向亚克隆了核酸。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式,其中反义核酸在高效调节区控制下产生,其活性可通过导入载体的细胞类型来决定。为了得到足够胞内浓度的反义分子,优选载体构建体,其中反义核酸分子处于强pol II或pol III启动子控制之下。有关使用反义基因的基因表达调节的讨论,参见Weintraub等(1985,Trends in Genetics,第1(1)卷,第22-25页)。
通常,通过微量注射、脂质体包被,将反义核酸给予患者,或者通过含反义序列的载体的表达原位产生反义核酸。反义核酸分子的给药途径的实例包括在组织部位直接注射。当病毒载体导入宿主细胞时,可将反义核酸连接到介导反义核酸转移的病毒载体上。合适的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒等。或者,可以修饰反义核酸分子,以靶向所选细胞,然后系统给药。例如,对于系统给药来说,可以修饰反义分子,使其与所选细胞表面表达的受体或抗原特异性结合,例如通过将反义核酸分子与结合在细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接在一起。
一旦进入细胞内,反义核酸分子与编码Pa9、Pa13或Pa21蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合,因而抑制表达,例如通过抑制转录和/或翻译。杂交可通过常规核苷酸互补,形成稳定的双链体,或者例如在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下,通过双螺旋的大沟内的特异性相互作用。
在一个优选的实施方案中,该方法包括使用小干扰RNA(siRNA)。当对应于沉默基因的双链RNA(dsRNA)存在于细胞内时,许多生物体具有通过称为RNA干扰的过程而使基因表达沉默的机制。使用dsRNA来降低特定基因活性的技术首先是用秀丽隐杆线虫(C.elegans)而开发的,该技术被称为RNA干扰,即RNAi(Fire等,(1998),Nature 391:806-811)。已经发现RNAi用于许多生物体中,最近又在哺乳动物细胞中发现(有关综述参见Moss,(2001),Curr Biol 11:R772-5)。当RNAi显示出参与产生21-25个核苷酸的小RNA,人们有了重大进展(Hammond等,(2000)Nature 404:293-6;Zamore等,(2000)Cell101:25-33)。这些小的干扰RNA或siRNA可能起初来源于较大dsRNA,这些较大dsRNA开始加工并与靶RNA互补,最终使靶RNA降解。siRNA本身是在两端具有短突出端的双链。它们的作用是指导RNA,在互补区指导靶的单一切割(Elbashir等,(2001)Genes Dev 15:188-200;Zamore等,(2000)Cell 101:25-33)。
包含约21-25个与SEQ ID NO:1、3或5的核苷酸序列互补的核苷酸的SiRNA可用于本发明的治疗方法。产生siRNA的方法是本领域技术人员已知的。例如WO0175164 A2介绍了从体外系统产生长度为21-23个核苷酸(nt)的siRNA并用所述siRNA来干扰细胞或生物体内基因的mRNA的方法。也可以使用稳定的表达系统,从哺乳动物细胞体内制备siRNA。例如目前报道了一个称为pSUPER的载体系统,该系统指导哺乳动物细胞内siRNAs的合成(Brummelkamp等,(2002)Science 296:550-3)。使用siRNA来降低细胞内基因表达的实例见实施例3。
本发明提供治疗患者的代谢异常的方法,该方法包括下述步骤:(a)将靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的siRNA导入患者细胞内,用于在患者细胞内降解;和(b)将(a)所产生的细胞维持在siRNA干扰患者细胞内人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA的条件下。可使用本文所述的反义核酸的类似方法,将siRNA导入患者细胞内。
在另一个实施方案中,可使用基因治疗,通过将能够表达人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子导入患者细胞内,增加人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达。在提高人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的表达或生物活性是有益的情况下,所述基因治疗对疾病治疗尤其有用。
一种进行离体基因治疗的方法概述于美国专利第5,399,346号,也见于该专利文件史所提交的文献,所有这些文献都是公众可得的文件。一般而言,基因治疗包括在体外将基因的功能性拷贝导入患者细胞内,然后将基因工程细胞返还到患者体内。基因的功能性拷贝是处于调节元件的可操作性控制之下,这允许在基因工程细胞内表达该基因。大量转染和转导技术以及合适表达载体都是本领域普通技术人员众所周知的,其中的一些描述于PCT申请WO95/00654。体内基因治疗使用载体,例如腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒和疱疹病毒,例如EB病毒。也可以使用需要体外感染的非病毒方法,实现基因转移。这类方法可包括磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。对于将DNA传递给细胞来说,靶向脂质体也是潜在有益的。
作为一个实例,可将编码靶基因的DNA分子首先克隆到逆转录病毒载体中。由载体表达靶基因的过程,可以被其内源启动子或逆转录病毒长末端重复序列或对某些靶细胞具有特异性的启动子驱动。然后可将载体导入患者细胞内,在靶细胞内成功表达靶基因。基因可优选以这样的形式传递给细胞:该细胞可采用该基因形式来编码足够的蛋白质,以提供有效功能。逆转录病毒载体通常是优选基因传递载体,尤其是用于基因治疗,因为其感染的高效率和稳定整合和表达。或者,可通过非病毒技术,包括使用配体-DNA缀合物或腺病毒-配体-DNA缀合物的受体介导靶向DNA转移、脂质转染膜融合或直接微量注射,将编码靶基因的DNA分子转移给细胞,用于基因治疗。这些方法及其变化方法对于离体以及体内基因治疗来说是合适的。适用于本发明方法的基因治疗分子方法学方案描述于GeneTherapy Protocols,Paul D主编,Robbins,Human press,Totowa NJ,1996。
治疗期间,给予个体的本发明核酸分子的有效量可因以下各因素而异,包括患者类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况;待治疗病症的严重程度;给药途径;患者的肝肾功能;和所用的具体核酸分子。具有基因治疗专业技能的内科医师或兽医可确定并指定预防、抵抗或阻止疾病进程所需有效量。达到既产生功效又无毒性的浓度范围的最佳准确性,需要根据核酸分子对靶位点利用度的动力学的方案。这涉及到对参与基因治疗的核酸分子的分布、平衡和消除方面的考虑。
本文公开的基因治疗可以常规试验所确定的合适剂量单独使用,以便得到PPARα靶基因活性的最佳增加或降低,同时使任何潜在毒性最小化。另外,最好也可以与其它药物联合用药或序贯用药。当联合给予几种药物以达到所需效果时,可以调整给药剂量。这些不同药物的剂量可以独立优化,并联合给予以达到协同结果,其中与任一种药物单独使用相比,病理减少得更多。
以下实施例说明本发明,但是却并不限制本发明。
实施例1
对人体细胞中由PPARα激动剂所调节的靶基因的鉴定
DNA微阵列技术用于鉴定人体细胞中由贝特类或其它PPARα激动剂所调节的靶细胞。
人肝细胞HuH7细胞是肝上皮细胞,得自Japan Health ScienceResearch Resources Bank(Osaka,Japan)。人原代脂肪细胞是专门用于脂肪合成和贮存的结缔组织细胞,得自Zen-Bio,Inc(Research TrianglePark,NC)。人原代骨骼肌细胞(SKMC)得自Cambrex Bio Science(Walkersville,MD)。PPARα激动剂Wy14643(Agatha等,2000,Archivesof Biochemistry and Biophysics 380:353-359)和非诺贝特分别得自Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)和Sigma(St Louis,MO)。
将人HuH7细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco,NY)中培养。细胞用经活性炭吸附脱脂的小牛血清(5%)(Sigma,St Louis,MO)处理约4-18小时。然后,将细胞用不同浓度的PPARα激动剂(Wy14643或非诺贝特)处理约20-24小时。将人SKM细胞在骨骼肌生长培养基(Cambrex Bio Science,Walkersville,MD)中培养,再用不同浓度的PPARα激动剂(Wy14643或非诺贝特)处理约18-20小时。将人原代脂肪细胞在前脂肪细胞培养基(Cat #PM_1,Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC)中培养,再用不同浓度的PPARα激动剂(Wy14643或非诺贝特)处理约18-20小时。
从细胞中分离出总RNA,进行DNA微阵列处理。使用JJPRD版MEGA和MEGAB DNA微阵列(约6,000个基因/芯片)。总共分析了约12,000个基因。超过40片靶芯片和MEG-GA芯片用于实验分析。从用PPARα配体处理的细胞中,测定了超过12,000个基因的表达水平,并与用溶媒对照处理的细胞的表达水平进行比较。使用软件OMNI-Viz(OmniViz,Inc.Richland,WA),对其基因表达水平被PPARα激动剂增加或降低的基因进行系统搜索。在所分析的1种、2种或所有3种细胞(人脂肪细胞、SKM细胞和HuH7细胞)中,鉴定出约24个基因由于PPARα激动剂处理而在基因表达中具有超过约1.8倍的变化。根据这些基因的cDNA序列,设计TaqMan探针,并使用实时定量PCR(RTQPCR),以证实基因表达的变化。证实了在所有的三种人体细胞中,Pa9、Pa13和Pa21三种基因受到PPARα激动剂的调节。
按照生产商提供的方案,从培养细胞纯化总RNA(Trizon methods,Invitrogen Inc.Ca)。分别根据GenBank序列检索号W30988、AB000584和NM_080725,设计用于Pa9、Pa13和Pa21的聚合酶链式反应(PCR)引物和荧光探针(TagMan探针)。使用软件PrimerDesign(AppliedBiosystems,Foster City,Ca),设计引物和探针。用于Pa9的PCR引物是SEQ ID NO:7(5′-CCTGCAGCCA TTCCAACCT)和SEQ ID NO:8(5′-TCCCTTCTTA AGCTTCTGCCG)。用于Pa9的荧光探针是SEQ IDNO:9(6FAM-CAGTACTTCC GCTCCATCCC ACAGCA)。用于Pa13的PCR引物是SEQ ID NO:10(5′-AGCAGTCCTG GTCCTTCCAC T)和SEQ ID NO:11(5′-AATCGGGTGT CTCAGGAACC T)。用于Pa13的荧光探针是SEQ ID NO:12(6FAM-ACCTCAGTTG TCCTGCCCTGTGGAATG)。用于Pa21的PCR引物是SEQ ID NO:13(5′-TGCTCGTTAC TTCATGGTCC C)和SEQ ID NO:14(5′-TCCACCCCTC CTTCCTTGA)。用于Pa21的荧光探针是SEQ ID NO:15(6FAM-TGGCTGCTGT ATCCCCAAGA ATCATGTC)。所有引物和探针都由Keystone实验室(Camarillo,Ca)合成。
逆转录(RT)和PCR在一个步骤中进行,使用ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)中的“One-Step RT-PCR Master MixReagent”试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)。每次反应在25μl总体积中进行,该总体积内含有40ng总RNA。反应条件是:48℃30分钟,60℃30分钟,94℃5分钟,接着是94℃20秒和60℃1分钟的40次循环。18S核糖体RNA的引物是由Applied Biosystems开发和提供的。人18S核糖体RNA的测定用作测定和装入错误标准化的内部控制。根据生产商的使用说明,用Ct值(算法PCR曲线与计算域值线交叉的循环次数)采集PCR数据,用该数值求出ΔCt(靶基因的Ct减去18S核糖体RNA对照的Ct)。使用如文献所述的等式2-ΔΔCt,计算相对mRNA水平(Heid等,1996,Genome Res.6:986-994)。
PPARα激动剂Wy14643或非诺贝特增加人HuH7细胞(表1)、原代SKMU细胞(表2)或原代脂肪细胞(表3)内Pa9、Pa13或Pa21基因表达。毫不奇怪,基因表达模式在不同细胞类型中是不同的,因为基因调节极大地受细胞环境的影响。这些靶基因Pa9、Pa13和Pa21是PPARα激动剂特异性的,因为强效PPARγ激动剂罗格列酮在其有效浓度时在人HuH7肝细胞内不能显著增加这些基因的表达(表4)。
表1
人HuH7肝细胞中的基因表达
处理 | %±SE(%) | ||
Pa9(W38098) | Pa13(N26311) | Pa21(H4960) | |
溶媒对照 | 100±1 | 100±14 | 100±37.3 |
Wy14643,3μMWy14643,10μMWy14643,30μMWy14643,100μMWy14643,300μM | 90±17190±62.1200±48540±57.8690±42.8 | 70±28100±4140±26.4130±17.7720±36.4 | 145.5±21.9163.6±35372.7±17.8227.3±14.8481.8±12.1 |
非诺贝特,3μM非诺贝特,10μM非诺贝特,30μM非诺贝特,100μM非诺贝特,300μM | 110±12.790±2380±2140±37.1200±11.5 | 180±43.9160±55250±4.8750±10.8710±7.3 | 63.6±17.3227.3±54209.1±20.4300±20.6336.4±24.3 |
表2
人原代骨骼肌细胞中的基因表达
处理 | %±SE(%) | ||
Pa9(W38098) | Pa13(N26311) | Pa21(H4960) | |
溶媒对照 | 100±29 | 100±37.2 | 100±11 |
Wy14643,3μMWy14643,10μMWy14643,30μMWy14643,100μMWy14643,300μM | 110±24.5230±35.7870±30860±0.9610±10.2 | 36.4±6.445.5±10136.4±38.7290.9±54.11672.7±32 | 130±23.8200±48.5310±1.9560±16.62250±11.7 |
非诺贝特,3μM非诺贝特,10μM非诺贝特,30μM非诺贝特,100μM非诺贝特,300μM | 120±34.2230±15.7340±7.4350±19.7550±14 | 72.7±30.963.6±11.8181.8±3218.2±2.9309.1±7.4 | 110±14.5290±1.4280±52.5670±46710±23.1 |
表3
人原代脂肪细胞中的基因表达
处理 | %±SE(%) | ||
Pa9(W38098) | Pa13(N26311) | Pa21(H4960) | |
溶媒对照 | 100±17.6 | 100±12 | 100±30 |
Wy14643,10μMWy14643,50μMWy14643,250μM | 124±7.2358±6.9437±17.3 | 56±1055±2214±7.9 | 92±10108±2314±2.5 |
非诺贝特,10μM非诺贝特,50μM非诺贝特,250μM | 114±11.4127±1.5526±25.8 | 70±27.145±13.3206±34.4 | 63±5.6109±4.5121±17.3 |
表4
人HuH7肝细胞中的基因表达
处理 | %±SE(%) | ||
Pa9(W38098) | Pa13(N26311) | Pa21(H4960) | |
溶媒对照 | 100±22.3 | 100±25.2 | 100±8 |
罗格列酮,1μM | 147±31.2 | 217±20.2 | 97±17.5 |
实施例2
基因PA9、13和21的生物信息特征
国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)资助的生物信息程序(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于DNA序列分析。GenBank数据库(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)用于检索DNA序列。SwissPro数据库(
http://www.ebi.ac.uk/swissprot)用于检索蛋白质序列。BLAST程序(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)用于基因搜索。Motif程序(
http://motif.genome.ad ip)用于搜索功能性DNA结构(基序、调节序列、结构域等)。LocusLink程序(
http://www.nobi.nlm.nih.gov/LocusLink)用于搜索序列和基因座的描述性信息。另外,Wisconsin软件包(GCG,Genetics Computer Group)用于序列编辑和序列装配(SEQED)、序列比较(GAP、BESTFIT、PILEUP)和DNA序列翻译(TRANSLATION)。
1)Pa9
用于微阵列的Pa9基因序列的原始注释是GenBank检索号W30988:类似于人血纤蛋白原相关蛋白HFREP-1前体的智人(Homosapiens)cDNA克隆。BLAST搜索表明W30988序列(序列中的多个“n”是因为测序误差)与几个GenBank序列条目共享约97%(339/349;比较得分是e-162)的序列同一性,所述GenBank序列条目例如GenBank检索号BC023647、AF202636、AF169312、AF153606、AB056477、E39784 BD075801、AX578037、AX464136、AX278133、AX201322、AX079971、AX079874、AX068560、AR243163和AR194215。这些GenBank序列条目看来是相同的并编码约406个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:2)。所编码的蛋白质在US6348350中称为人NL2TIE配体同源多肽,而在WO0177151中称为人血纤蛋白原结构域相关(FDRG)蛋白。蛋白质的其它注释包括血管生成素样蛋白PP1158和TIE受体酪氨酸激酶配体同源物等。
WO0177151(实施例12)公开了当用10μg/ml吡格列酮(一种PPARγ激动剂)处理稳定表达PPARγ的NIH3T3成纤维细胞达2小时后,鼠FDRG表达水平在该细胞内增加了10倍。另外,WO0177151(实施例13)公开了在Zucker糖尿病肥胖大鼠中,当用慢性曲格列酮(一种PPARγ激动剂)治疗该动物时,鼠FDRG表达在白色脂肪组织(WAT)中被下调3-5倍。这些观察结果与啮齿动物中FDRG成为PPARγ的靶基因是一致的。
另外,Kersten等(2000,J.Biolo.Chem.275:28488-493)表明,与鼠FDRG相同的鼠FIAF(禁食诱导脂肪因子)的表达在PPARα裸小鼠肝内下降。他们也发现,经WY14643处理后,在PPARα野生型小鼠肝细胞内鼠FIAF的表达增加,而在PPARα裸小鼠肝细胞内却不增加。另外,他们表明,鼠FIAF的表达在杂合PPARγ突变小鼠WAT中减少。这些结果与FDRG在啮齿动物中成为PPARα(肝内)和PPARγ(WAT内)的靶基因是一致的。
然而,人们不能因为FDRG是啮齿动物体内PPARα或PPARγ的靶基因,就简单地下结论说它在人体内就是PPARα或PPARγ的靶基因。贝特类或其它PPARα激动剂的作用是种属特异性的,而在啮齿动物体内许多被贝特类或其它PPARα激动剂诱导的基因在人体内却不被诱导。另外,因为小鼠FDRG与人FDRG共享相对低的序列同一性:在cDNA水平上约73%序列同一性,在蛋白质水平上约76%序列同一性,所以小鼠和人体内FDRG的基因调节机制可能不同。
SEQ ID NO:1提供了人FDRG基因(AX278133)的核苷酸序列,W30988与FDRG基因间的序列比对见图1。序列比对的检测表明,W30988与人FDRG基因间的序列差异主要是因为W30988的测序误差所致。进行定量实时RT-PCR,以测定人FDRG基因的基因表达是否受PPARα的调节。采用类似于实施例1所述的RT-PCR实验,测定用30μM或100μM Wy14643刺激的人骨骼肌细胞中基因Pa9和基因FDRG的表达水平。用于测定Pa9基因表达的PCR引物和探针是如实施例1所述的SEQ ID NO:7、8和9。这些引物和探针可在严格性杂交条件下与W30988杂交。设计用于测定FDRG基因表达的PCR引物和荧光探针,使得它们可与FDRG基因杂交,该基因在与W30988核苷酸序列共享序列同一性的区域之外。FDRG基因的引物和探针是:SEQ ID NO:16即5′-AGCCCCCTTT CTGAGTGCA、SEQ ID NO:17即5′-CCCTTGGTCC ACGCCTCTA和SEQ ID NO:18即6FAM-TGAGATCGAG GCTGCAGGAT ATGCTCA。如表5所示,Wy14643诱导Pa9基因表达,在30μM的浓度时达3.64倍,而在100μM的浓度时达6.45倍。对同一RNA样品的测定表明,Wy14643诱导FDRG基因表达,在30μM的浓度时达4.37倍,而在100μM的浓度时达7.8倍。从不同系列的人SKM RNA样品可以获得类似结果(数据未显示)。根据Pa9基因(W30988)和FDRG基因(NM_139314)之间的序列同源性,以及本文所述的mRNA定量测定数据,可以合理地得出以下结论:1)W30988实际上是NM_139314全长cDNA序列的部分序列;2)包含W30988序列的人Pa9基因与人FDRG基因相同;和3)人FDRG基因确实被PPARα上调。
表5
人原代骨骼肌细胞中的基因表达
处理 | Pa9基因表达 | FDRG基因表达 | ||
诱导倍数 | SE | 诱导倍数 | SE | |
溶媒 | 1.00 | 0.20 | 1.00 | 0.14 |
WY14643,30μM | 3.64 | 0.01 | 4.37 | 0.06 |
WY14643,100μM | 6.45 | 0.18 | 7.80 | 0.79 |
2)Pa13
用于微阵列的Pa13基因序列的原始注释是GenBank检索号N26311,即一种没有其它功能性注释的cDNA克隆。BLAST搜索表明N26311的核苷酸序列与公开于WO0194629的多个怀疑的癌细胞基因克隆共享约98%(416/424)的序列同一性,所述基因克隆例如GenBank检索号AX329948。另外,N26311与几个其它GenBank序列条目共享约95%(387/404)同一性,所述GenBank序列条目包括GenBank检索号U88323、AF019770、AB000584、E09952、AX468429、AX408886、AR236374、AR127403、BC000529、AX052609、AR091376、E10038和AR107279。这些GenBank序列条目看来是相同的并编码约308个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:4)。该编码蛋白质的GenBank注释包括TGF-β超家族蛋白质、胎盘骨形态发生蛋白PLAB、巨噬细胞抑制细胞因子-1(MIC-1)、TGF-β超家族蛋白质、被具有抗肿瘤特性的基因激活的非甾体抗炎药、肝癌中表达的基因和前列腺生长因子等。先前已经建立或描述了蛋白质与糖尿病(或肥胖症,或高脂血症)之间无相关性。
这些GenBank条目AB000584的代表性核苷酸序列示于SEQ IDNO:3,N26311与AB000584间的序列比对见图2。对序列比对的检测表明,N26311与AB000584间的序列差异主要是因为N26311的测序误差所致。因此,包含N26311核苷酸序列的人Pa13基因可能与AB000584所述的TGF-β超家族蛋白质基因相同(Yokoyama-Kobayashi等,1997,J Biochem(Tokyo).122(3):622-6)。采用与TGF-β超家族蛋白质基因杂交的PCR引物和探针(SEQ ID NO:10、11和12),确实已经发现,人TGF-β超家族蛋白质基因被PPARα上调,该TGF-β超家族蛋白质基因在与N26311的核苷酸序列共享序列同源性的区域之外(参见实施例1的数据)。
另外,在人Pa13基因5′非翻译区(5′-UTR)鉴定出潜在PPRE。SEQID NO:19显示5′-UTR,从紧接TGF-β超家族蛋白质基因ATG翻译起始位点上游的-2538bp至-1bp,该TGF-β超家族蛋白质基因与Pa13基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是从人类基因组序列数据库的GenBank检索号AC008397的152956bp至155493bp下载的。在SEQID NO:19的碱基970和2508上鉴定出两个潜在的转录起始位点。在SEQ ID NO:19的碱基160、564和1033上鉴定出各自包含AGGTCA序列的3个潜在PPRE。在SEQ ID NO:19内也发现了具有TGACCT、AGGTCG或GGGTCA序列的几个其它潜在PPRE位点。该结果与Pa13基因在人体细胞中受到PPAR的转录调节是一致的。
3)Pa21
用于微阵列的Pa21基因序列的原始注释是GenBank检索号H49601:类似于过敏毒素趋化性受体的cDNA克隆。BLAST搜索表明H49601的核苷酸序列与几个GenBank序列条目共享约93%(384/410)的序列同一性,所述GenBank序列条目包括GenBank检索号AF075053、AL833944、AL121758、BC017001、AK098418和AX368959。这些GenBank序列条目看来是相同的。大多数GenBank条目的注释是具有未知功能的cDNA克隆。一些注释怀疑是癌细胞基因克隆。H49601也与GenBank检索号NM_080725(SEQ ID NO:5)的互补序列共享93%(384/410)的序列同一性,该GenBank检索号NM080725编码137个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:6)。该蛋白先前被称为染色体20可读框139(C20orf139)。先前已经建立或描述了C20orf139与糖尿病(或肥胖症,或高脂血症)之间无相关性。
H49601与NM_080725间的序列比对见图3。序列比对的检测表明,H49601与NM_080725间的序列差异主要是因为H49601的测序误差所致。因此,包含H49601的核苷酸序列的Pa21基因可能与NM080725中描述的C20orf139基因相同。采用与C20orf139基因杂交的PCR引物和探针(SEQ ID NO:13、14和15),确实已经发现,人C20orf139基因被PPARα上调,该C20orf139基因在与H49601核苷酸序列共享序列同源性的区域之外(参见实施例1的数据)。
另外,在C20orf139基因5′非翻译区(5′-UTR)鉴定出潜在PPRE。SEQ ID NO:20显示5′-UTR,从紧接C20orf139基因ATG翻译起始位点上游的-1bp至-3000bp,该C20orf139基因与Pa21基因相同。5′-UTR的核苷酸序列是从人类基因组序列数据库的GenBank检索号Hs20_11544的568887bp至571886bp下载的。发现2个“AGGTCA”PPRE位点分别在-2201bp和-2866bp。发现3个“TGACCT”位点分别在-872bp、-893bp、-2344bp。该结果与C20orf139在人体细胞中受到PPAR的转录调节是一致的。
实施例3
降低的PPARα导致降低对Pa9、Pa13或Pa21基因表达的诱导
采用siRNA技术,首次建立具有降低的PPARα表达的人SKM细胞。然后测定Pa9、Pa13和Pa21在这些细胞中的基因表达,证实这些基因确实受到PPARα的调节。
按照本领域技术人员已知的方法,设计出对PPARα具有特异性的SiRNA寡聚物并用于在人SKMU细胞中敲减(knock-down)或降低PPARα表达水平(Brummelkamp等,2002,Science,296:550-553)。使用GenBank检索号S74349(人过氧化物酶体增殖物激活受体α,cDNA;PPARα)作为模板并使用软件Target Finder(Ambion,Austin,TX),最初设计出4套siRNA寡聚物。在这4套寡聚物中,发现有2套更有效,因而选择这2套进行PPARα-敲减(knockdown)研究。这2套siRNA序列对应于相对起始密码子的第一核苷酸的cDNA的907bp至927bp(SEQ ID NO:21,5′-AACGATCAAG TGACATTGCT A)和1106bp至1126bp(SEQ ID NO:22,5′-AACTGGATGA CAGTGATATC T)。寡聚物由Ambion Inc.(Austin,TX)化学合成。通用阴性对照siRNA寡聚物购自Ambion。
提前一天制备人原代骨骼肌细胞(hSKM,由Cambrex(MD)提供),次日以4.67×104细胞/60mm碟的密度进行转染(约20%汇合度)。将细胞在无抗生素的SKGM培养基(Cambrex,MD)中、在37℃、5%CO2中培养24小时。
按照生产商的使用说明,将siRNA转染到培养细胞中。简而言之,转染前,先将siPORT胺(Ambion,TX)用无抗生素和血清的SKGM培养基(10μl siPORT/ml)稀释,再将siRNA(50nM)加入到混合物中。将SKM细胞(提前在多个碟中制备)用2ml所得混合物转染4小时。向各碟加入8ml新鲜SKGM培养基(无抗生素),使细胞生长最大化并降低由转染剂导致的潜在细胞毒性。作为对照,将细胞也用单独siPORT胺或siPORT胺加上通用阴性对照siRNA来转染。
用改良Qiagen RNeasy方法(Qiagen,Ca)转染48小时后,从某些转染碟中,分离出总RNA。用实时PCR证实PPARα表达水平确实被siRNA敲减。在所用的优化条件下,发现SKM细胞内PPARα表达水平被siRNA降低了70-80%(图4)。
证实实验后,将PPARα-敲减细胞用不同化合物再处理16小时。再从细胞中分理出总RNA,然后进行实时PCR,用实施例1所述的RT-PCR技术定量测定目标靶基因(例如Pa9、Pa13和Pa21)的表达水平。结果表明:A)经Wy14643处理后,在PPARα表达水平降低的SKM细胞中,Pa9表达水平仅增加了2.35倍,相比之下,在PPARα表达水平没有降低的细胞中进行诱导,则增加了33.48倍(图5);B)对于Pa13基因(图6)和Pa21基因(图7),也观察到类似结果;和C)在PPARα表达水平降低的SKM细胞中,已知的非PPARα靶基因即PPARd的表达水平没有变化。
由上文可知,本发明第一时间发现了本文所定义的人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因,是过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的靶基因。尽管提供了以上详述和优选实施方案来说明本发明及其各种特征和优势,但是,可以理解,本发明并不是由上文限定,而是按照专利法原则之下的合理诠释,由所附权利要求书予以限定。
Claims (38)
1.一种测定来自患者的生物样品中过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)活性的方法,该方法包括测定样品中选自人Pa9基因、Pa13基因和Pa21基因的基因表达水平的步骤。
2.一种评价患者代谢异常的治疗有效性的方法,该方法包括下述步骤:
a.测定治疗期间或治疗之后患者体内选自人Pa9基因、Pa13和Pa21的基因表达水平;和
b.将步骤a)中测定的表达水平与治疗之前患者体内所述基因表达水平进行比较;
其中治疗期间或治疗之后患者体内所述基因表达水平增加,表明对患者代谢异常的治疗是有效的。
3.权利要求2的方法,其中所述代谢异常是血脂异常或血脂异常相关疾病。
4.权利要求2的方法,其中所述代谢异常是动脉粥样硬化、肥胖症、血栓形成或冠状动脉病、高血压、绞痛、慢性肾衰竭、周围血管病、中风、II型糖尿病或代谢综合征即X综合征。
5.权利要求2的方法,其中所述代谢异常的治疗包括能够调节过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的生物活性的药物。
6.权利要求5的方法,其中所述药物是PPARα激动剂。
7.权利要求2的方法,该方法还包括从患者获取生物样品的步骤,其中测定所述生物样品中所述基因在患者体内的表达水平。
8.权利要求7的方法,其中所述来自患者的生物样品是外周血单核细胞。
9.权利要求7的方法,其中所述来自患者的生物样品来自脂肪组织、肝、心、肾或肌肉。
10.权利要求2的方法,其中通过测量患者体内所述基因的mRNA含量来确定所述基因的表达水平。
11.权利要求10的方法,其中在严格性杂交条件下能够与SEQ IDNO:1杂交的核酸探针,用于测量患者的人Pa9mRNA含量。
12.权利要求10的方法,其中在严格性杂交条件下能够与SEQ IDNO:3杂交的核酸探针,用于测量患者的人Pa13mRNA含量。
13.权利要求10的方法,其中在严格性杂交条件下能够与SEQ IDNO:5杂交的核酸探针,用于测量患者的人Pa21mRNA含量。
14.权利要求2的方法,其中通过测量所述患者体内所述基因编码的多肽含量,来确定所述基因的表达水平。
15.权利要求14的方法,其中能够与SEQ ID NO:2特异性结合的抗体,用于测量患者的人Pa9蛋白含量。
16.权利要求14的方法,其中能够与SEQ ID NO:4特异性结合的抗体,用于测量患者的人Pa13蛋白含量。
17.权利要求14的方法,其中能够与SEQ ID NO:6特异性结合的抗体,用于测量患者的人Pa21蛋白含量。
18.一种用于评价患者代谢异常的治疗有效性的试剂盒,该试剂盒包括在严格性杂交条件下与选自以下的核酸分子杂交的核酸探针:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5或其互补序列。
19.一种用于评价患者代谢异常的治疗有效性的试剂盒,该试剂盒包括与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的多肽分子特异性结合的抗体。
20.权利要求18或19的试剂盒,该试剂盒还包括使用说明书,该说明书用于确定对患者代谢异常的治疗是否有效。
21.一种用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法,该方法包括下述步骤:
a.使人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因所编码的多肽与包含缓冲剂和候选化合物或试验化合物的溶液接触;
b.测定所述试验化合物对所述多肽活性的影响;和
c.将步骤(b)的结果与其中所述多肽仅与缓冲液接触的对照的结果进行比较。
22.权利要求21的方法,其中所述多肽是由宿主细胞表达的。
23.权利要求21的方法,其中所述多肽与分离的膜制备物缔合。
24.权利要求21的方法,其中所述多肽是纯化的。
25.一种用于治疗患者代谢异常的化合物的鉴定方法,该方法包括下述步骤:
a.使PPARα-反应系统与包含缓冲剂和候选化合物或试验化合物的溶液接触;
b.测量PPARα-反应系统受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因表达水平;和
c.将步骤(b)的结果与缺乏试验化合物的对照的结果进行比较。
26.权利要求25的方法,其中所述PPARα-反应系统是动物、组织或细胞。
27.权利要求25的方法,其中所述PPARα-反应系统包括功能性PPARα蛋白和受人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因。
28.权利要求27的方法,其中所述功能性PPARα蛋白是由PPARα-反应系统内源表达的。
29.权利要求27的方法,其中所述功能性PPARα蛋白是由导入所述PPARα-反应系统中的外源DNA分子重组表达的。
30.权利要求27的方法,其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因分别是人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因。
31.权利要求27的方法,其中受到人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列控制的基因是报道基因。
32.权利要求31的方法,其中所述报道基因选自绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、萤光素酶(luc)基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸转移酶基因和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。
33.一种PPARα-反应系统,所述系统包含功能性PPARα蛋白和核酸分子,所述核酸分子包含与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接的报道基因编码序列。
34.一种分离的核酸分子,所述分子包含与人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因调节序列操作性连接的报道基因编码序列。
35.权利要求34的分离的核酸分子,其中所述报道基因选自绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、萤光素酶(luc)基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶基因、新霉素磷酸转移酶基因和鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。
36.一种治疗患者代谢异常的方法,该方法包括将治疗有效量的组合物给予患者的步骤,所述组合物能改变患者细胞内人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的基因表达或生物活性,其中所述组合物不是已知的PPARα激动剂或拮抗剂。
37.权利要求36的方法,其中所述组合物是siRNA,所述siRNA靶向人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的mRNA,用于在患者细胞内降解。
38.权利要求36的方法,其中所述组合物是能够在患者细胞内表达人Pa9基因、Pa13基因或Pa21基因的核酸分子。
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