JP6823696B2 - 脂肪酸、および生体分子へのコンジュゲーションにおけるその使用 - Google Patents

脂肪酸、および生体分子へのコンジュゲーションにおけるその使用 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、半減期および作用持続時間が改善されている、GDF15の新規なコンジュ
ゲート、その作製方法、およびその使用方法に関する。本発明はさらに、新規な脂肪酸、
および生体分子の半減期をコンジュゲーションによって延長する際のその使用に関する。
発明の背景
ペプチドおよびタンパク質は、医療業務において広く使用されており、組換えDNA技
術によって産生することができるので、その重要性は、今後も増していくと予想できる。
興味深い生物学的活性を有する既知の内因性ペプチドおよびタンパク質の数は、ヒトゲノ
ムの調査が進展していることもあって、急速に増えている。こうしたポリペプチドおよび
タンパク質の多くは、その生物学的活性のために、基本的には、治療薬として使用できる
ことになる。しかし、内因性ペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、ペプチダーゼに
よる急速な分解、および/または腎臓での濾過、尿中への排出により、半減期が数分しか
ないため、薬物候補として必ずしも安定しているとは限らない。ヒト血漿中でのポリペプ
チドまたはタンパク質の半減期は、ばらつきが激しい(数分から1週間超まで)。
治療薬のクリアランスが高いことは、長期間にわたってその血中濃度を高く保つことが
望ましい場合には、不都合である。この欠点を克服するために現在使用されている一手段
は、対象となる治療用ペプチドまたはタンパク質を大量の投薬量で患者に投与して、一部
の治療用ペプチドまたはタンパク質が分解されたとしても、十分に治療上有効なままとな
るようにすることである。しかし、この方法は、患者にとって快適ではない。大半の治療
用ペプチドまたはタンパク質は経口投与するできないので、治療用ペプチドまたはタンパ
ク質は、絶えず注入する、静脈内注射によって頻回注入する、または皮下注射という不便
な経路によって頻回投与することのいずれかの必要があることになる。頻回投与が必要に
なると、大いに可能性のあるペプチドまたはタンパク質治療薬に、許容されない非常に突
出した治療コストが伴う結果にもなる。分解された多量のペプチドまたはタンパク質の存
在によって、望ましくない副作用も生じかねない。
投与の苦痛および高いコストは、魅力的な生物活性プロファイルを有する大半の治療用
ペプチドまたはタンパク質を薬物候補として開発することができない、2つの理由である
したがって、ペプチドまたはタンパク質の半減期を延長する一つの手法は、生物学的活
性を依然として維持しながら、その分解の速度を緩めるように、治療用ペプチドまたはタ
ンパク質を修飾することである。血清アルブミンは、半減期が1週間より長く、ペプチド
またはタンパク質の血漿半減期を延長する一つの手法は、血清アルブミンまたは他の血漿
タンパク質に結合する化学的エンティティを用いてこれを誘導体化することとされている
しかし、低い毒性および治療上の利点を維持しながらin vivoでの作用持続時間
をより長くするためには、ペプチドやタンパク質などの治療用生体分子を修飾する新たな
半減期延長性部分を特定することが依然として求められている。
発明の概要
本発明は、リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、前記脂肪酸は、次
式A1、A2、またはA3:
[Rは、COHまたはHであり、
、R、およびRは、互いに独立して、H、OH、COH、−CH=CH、ま
たは−C≡CHであり、
Akは、分枝状C〜C30アルキレンであり、
n、m、およびpは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]を有する、コンジュ
ゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩に関する。
式A1、A2、およびA3の脂肪酸は、対象となる生体分子にリンカーを介してコンジ
ュゲートさせたとき、前記生体分子の半減期を、より一般的に使用される脂肪酸残基より
はるかに大きく延長させることが判明した。
別の実施形態では、本発明は、R2およびR3の少なくとも一方がCO2Hである式A
1の脂肪酸に連結している生体分子を含むコンジュゲートに関する。
本発明の別の実施形態では、対象となる生体分子は、治療用ペプチド、治療用タンパク
質、またはRNAである。この実施形態のさらに別の態様では、対象となる生体分子は、
ペプチドまたはポリペプチドである。この実施形態のさらに別の態様では、ペプチドまた
はポリペプチドは、APJアゴニストペプチド、オキシトシン受容体アゴニストペプチド
、セレラキシン(serelaxin)、NPFF、PIPペプチド、FGF23ペプチド、Ag
RPペプチド、または増殖分化因子15(GDF15)タンパク質、これらの相同体、変
異体、断片、および他の修飾形態である。
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される
1種または複数の担体とを含む医薬組成物に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲート、および治療活性のある
1種または複数の薬剤の医薬組合せを含むを含む組合せに関する。
別の実施形態では、本発明は、式A1、A2、およびA3の脂肪酸に関する。
別の実施形態では、本発明は、種々の疾患、障害、状態、および/またはその症状を治
療および/または予防するための、本明細書に記載のコンジュゲートおよびその組成物の
使用を企図する。
たとえば、本発明は、それを必要とする対象においてAPJ受容体を活性化させる方法
であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子
がAPJアゴニストである、方法に関する。本発明のコンジュゲートは、APJ受容体の
活性化を介して、急性非代償性心不全(ADHF)、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、
Brugada症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性
心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病(妊娠糖尿病を含める)、
肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化
症、熱傷(日焼けを含める)、および子癇前症の治療において有用である。この実施形態
の好ましい態様では、本発明のコンジュゲートは、急性非代償性心不全(ADHF)また
は慢性心不全の治療において有用である。
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてオキシトシン受容体を活
性化させる方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを
含み、生体分子がオキシトシン受容体アゴニストペプチドである、方法に関する。本発明
のコンジュゲートは、オキシトシン受容体の活性化を介して、自閉症(治療または予防)
、偏頭痛、注意欠陥多動性障害(ADHD)、反抗挑戦性障害(ODD)、外傷後ストレ
ス障害を含めたストレス、不安障害を含めた不安、うつ病、統合失調症、精神障害、およ
び記憶喪失、アルコール離脱、薬物嗜癖、プラダー・ウィリー症候群、代謝性障害または
疾患、2型真性糖尿病、肥満、異脂肪血症、グルコースレベルの上昇、インスリンレベル
の上昇、および糖尿病性腎症、線維筋痛症、睡眠障害、睡眠時無呼吸、拡張期心不全、尿
失禁、アテローム性動脈硬化症、高血圧、勃起機能不全、前立腺肥大症状、非アルコール
性脂肪性肝疾患、易感染性授乳条件(compromised lactation condition)、分娩誘発障
害(labor induction impairment)、子宮弛緩状態、過度の出血、炎症、疼痛、腹痛、背
痛、男性および女性の性機能不全、過敏性大腸症候群(IBS)、便秘、胃腸管閉塞、外
科的失血、分娩後出血、創傷治癒、感染症、乳腺炎、胎盤娩出障害、骨粗鬆症の治療にお
いて、またがんおよび胎盤機能不全の診断に有用である。この実施形態の好ましい態様で
は、本発明のコンジュゲートは、自閉症、不安障害を含めた不安、うつ病、偏頭痛、AD
HD、反抗挑戦性障害、統合失調症、精神障害、肥満、易感染性授乳条件、分娩誘発障害
、子宮弛緩状態、過度の出血、分娩後出血の治療において有用である。さらに、より好ま
しい実施形態において、本発明のコンジュゲートは、プラダー・ウィリー症候群の治療に
有用である。
さらに別の実施形態では、本発明は、クッシング症候群、コルチゾン過剰症、異所性A
CTH症候群、副腎皮質質量の変化、原発性色素性結節状副腎皮質病変(PPNAD)カ
ーニー複合(CNC)、コルチゾール誘発性ミネラルコルチコイド過剰、外傷後ストレス
障害と関連する状態、多毛症、薄い皮膚、筋症、骨粗鬆症、組織脆弱性の増大、不十分な
創傷治癒、高血圧、真性糖尿病、少ない血清カリウム、少ない好酸球、およびリンパ球減
少症を治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与するこ
とを含み、生体分子がAgRPペプチドである、方法に関する。この実施形態の好ましい
態様では、本発明のコンジュゲートは、クッシング症候群、コルチゾン過剰症、異所性A
CTH症候群、骨粗鬆症の治療において有用である。
さらに別の実施形態では、本発明は、FGF23関連疾患、たとえば、(サルコペニア
、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化、肺気腫、骨粗鬆症、
骨関節炎、免疫不適格、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、
加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余命の短縮、記憶喪失、しわ、腎臓機能の障害、
および加齢性失聴からなる群から選択される)加齢性状態、(II型糖尿病、メタボリッ
ク症候群、高血糖、および肥満からなる群から選択される)代謝性障害、高リン血症(腫
瘤様石灰沈着症、高リン血性骨化過剰症候群(hyperphosphatemic hyperostosis syndrom
e))、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および/または筋萎縮を治療または予
防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み
、生体分子がFGF23ペプチドである、方法に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、急性心不全、駆出率が低下した慢性心不全(HF
rEF)、駆出率が保たれた慢性心不全(HFpEF)、拡張機能障害、心筋梗塞後リモ
デリング、アンギナ、高血圧、肺高血圧、肺動脈高血圧、線維症(びまん性、心、腎、肺
、肝)、強皮症、創傷治癒、重症下肢虚血、末梢血管疾患、間欠性跛行、腎機能障害、お
よび慢性腎臓病を治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に
投与することを含み、生体分子がセレラキシンペプチドである、方法に関する。この実施
形態の好ましい態様では、本発明のセレラキシコンジュゲートは、急性心不全、駆出率が
低下した慢性心不全(HFrEF)、駆出率が保たれた慢性心不全(HFpEF)、拡張
機能障害、心筋梗塞後リモデリング、アンギナ、高血圧、肺高血圧、または肺動脈高血圧
の治療において有用である。
さらに別の実施形態では、本発明は、代謝性障害、たとえば、2型真性糖尿病(T2D
M)、膵臓β細胞障害、耐糖能障害、高血糖、インスリン抵抗性、肥満、異脂肪血症、非
アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、メタボリック症候群、および他の代謝性障害を治
療または予防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与する
ことを含み、生体分子がPIPペプチドである、方法に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、代謝性障害または疾患、2型真性糖尿病、肥満、
膵炎、異脂肪血症、非アルコール性脂肪性肝炎、インスリン抵抗性、高インスリン血症、
耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化
症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎
臓病を含める)、ニューロパシー、胃不全麻痺、切迫尿失禁、沈静、神経障害性および炎
症性疼痛、記憶喪失、および他の代謝性障害を治療または予防する方法であって、治療有
効量の本発明のコンジュゲートを対象に投与することを含み、生体分子がNPFFペプチ
ドである、方法に関する。
本発明のさらに別の態様では、本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、糖尿病、
2型真性糖尿病、肥満、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、
および他の進行性肝疾患、膵炎、異脂肪血症、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐
糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症
、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓
病を含める)、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を、それを必要と
する対象において治療する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲートを対象に
投与することを含み、生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、
変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、方法に関する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明において解明される。
実施例24が、参考例3より効果的に血漿APOC3レベルを低下させたことを示す図である。
詳細な記述
定義:
本明細書を解釈する目的では、別段指定しない限り、以下の定義が適用され、適切な場
合は必ず、単数で使用された用語は複数も包含し、逆もまたそうなる。
本明細書で使用するとき、また添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an
」、および「the」が、文脈によって明らかにそうでなく規定されない限り、複数の指
示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「the c
onjugate」への言及は、1つまたは複数のコンジュゲートへの言及を包含し、「
the polypeptide」への言及は、1つまたは複数のポリペプチドへの言及
を包含する、などである。
用語アルキルとは、1〜30個の炭素原子を含む、完全飽和の分枝状もしくは非分枝状
(または直鎖もしくは線状)炭化水素部分を指す。アルキルは、5〜20個の炭素原子、
より好ましくは10〜15個の炭素原子を含むことが好ましい。C10〜15アルキルと
は、10〜15個の炭素を含むアルキル鎖を指す。用語「アルキレン」とは、二価の、上
で定義したとおりのアルキルを指す。
用語「アルケニル」とは、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する分枝状または
非分枝状炭化水素を指す。用語「C2〜30−アルキニル」とは、2個〜7個の炭素原子
を有し、少なくとも1つの炭素−炭素三重を含む炭化水素を指す。
用語「アルキニル」とは、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する分枝状または
非分枝状炭化水素を指す。用語「C2〜30−アルキニル」とは、2個〜7個の炭素原子
を有し、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を含む炭化水素を指す。
用語アリールとは、環部分に6〜10個の炭素原子を有する、単環式または二環式の芳
香族炭化水素基を指す。アリールの代表例は、フェニルまたはナフチルである。
用語ヘテロアリールは、炭素原子と1〜5個のヘテロ原子とから選択される5〜10個
の環員を含んでおり、各ヘテロ原子は、O、N、またはSから独立して選択され、Sおよ
びNは、種々の酸化状態に酸化されていてもよい、単環式または二環式ヘテロアリールを
包含する。二環式ヘテロアリール系については、系は完全に芳香族である(すなわち、す
べての環が芳香族である)。
用語シクロアルキルとは、3〜12個の炭素原子、好ましくは3〜8個、または3〜7
個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが非芳香族の単環式、二環式、または三環式炭
化水素基を指す。二環式および三環式のシクロアルキル系については、すべての環が非芳
香族である。たとえば、シクロアルキルは、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルを
包含する。用語「シクロアルケニル」とは、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有す
る、3〜12個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。用語「シクロアルキ
ニル」とは、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する、3〜12個の炭素原子の二
環式または三環式炭化水素基を指す。
用語ヘテロシクリルとは、O、S、およびNから選択される少なくとも1個のヘテロ原
子を含んでおり、NおよびSは、場合により種々の酸化状態に酸化されていてもよい、飽
和または不飽和の非芳香族(部分的不飽和であるが非芳香族の)単環式、二環式、または
三環式環系を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、5〜7個の環原子と、O、
S、またはNから選択されるさらなるヘテロ原子とを場合により含んでいる、飽和した単
環に相当する。このヘテロ環は、アルキル、ハロ、オキソ、アルコキシ、ハロアルキル、
ハロアルコキシで置換されていてもよい。他の実施形態では、ヘテロシクリルは、二環式
または三環式である。多環式の系については、一部の環が芳香族で、飽和または部分的に
飽和した1つまたは複数の環に縮合していてもよい。全体的に縮合した系は、完全には芳
香族でない。たとえば、ヘテロ環系は、芳香族ヘテロアリール環が飽和または部分的に飽
和したシクロアルキル環系と縮合したものである場合もある。
用語「コンジュゲート」とは、生体分子と脂肪酸部分とをリンカーを介して共有結合さ
せた結果として生成されたエンティティを指すものである。用語「コンジュゲーション」
とは、生体分子と脂肪酸部分との共有結合をもたらす化学反応を指す。
生体分子:
本明細書で使用するとき、生体分子という用語は、限定はしないが、抗体(たとえば、
モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、およびその断片など)、コレステロール
、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法薬および他のタイプの抗悪性腫瘍薬、低分
子量薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素
性核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、アンチセンスDNAまた
はRNA組成物、キメラDNA:RNA組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、
デコイおよびその類似体、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、小核酸分子、R
NAi剤、短鎖干渉性核酸(siNA)、伝令リボ核酸(伝令RNA、mRNA)、短鎖
干渉性RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRN
A)、短鎖ヘアピン型RNA(shRNA)分子、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核
酸ボヌクレオチド(LNA)、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸(TNA)、グ
リコール核酸(GNA)、sisiRNA(低分子内部グメント化干渉性RNA)、ai
RNA(非対称干渉性RNA)、ならびに細胞培養物、対象、または生物中などの該当す
る細胞および/または組織に対して、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチを1、2
、またはそれ以上有するsiRNAを包含する。このような化合物は、精製または部分的
に精製されたものでよく、自然に存在するものでも合成品でもよく、化学修飾されていて
もよい。
一実施形態では、生体分子は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、またはRNAi
剤、短鎖干渉性核酸(siNA)、短鎖干渉性RNA(siRNA)、二本鎖RNA(d
sRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または短鎖ヘアピン型RNA(shRNA
)分子である。
他の実施形態では、生体分子は、ポリペプチド(もしくはタンパク質)、またはペプチ
ドである。ポリペプチドまたはペプチドの例は、APJアゴニストペプチド、オキシトシ
ンペプチド、セレラキシン、NPFF、PIPペプチド、FGF23ペプチド、AgRP
ペプチド、およびGDF15ペプチドである。好ましい実施形態では、生体分子は、GD
F15ポリペプチド、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態であ
る。
「リボ核酸」(RNA)とは、各ヌクレオチドがリボースまたはその修飾物を糖成分と
して含んでいる、ホスホジエステル結合で連結されたヌクレオチドのポリマーである。各
ヌクレオチドは、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)、
またはこれらの修飾物を塩基として含んでいる。mRNA分子の中の遺伝情報は、mRN
A分子のヌクレオチド塩基の配列にコードされており、塩基は、取り合わされて、それぞ
れ3つのヌクレオチド塩基からなるコドンをなしている。翻訳(タンパク質合成)を終結
させる終止コドンを除き、各コドンは、ポリペプチドの特定のアミノ酸をコードする。生
細胞内では、mRNAは、タンパク質合成の場であるリボソームに輸送され、そこで、タ
ンパク質合成(翻訳)のための遺伝情報を提供する。これ以上の記述については、Albert
s B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Science
を参照されたい。
本明細書で使用する用語「RNAi剤」、「短鎖干渉性RNA」、「siRNA」、「
短鎖干渉性核酸」、「siNA」などは、配列特異的なRNA干渉(RNAi)または遺
伝子サイレンシングを介して遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下向き調節する
ことのできる、いずれかの核酸分子を指す。この用語は、短鎖干渉性RNA(siRNA
)、短鎖ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖干渉性
オリゴヌクレオチド、化学修飾された短鎖干渉性核酸分子、sisiRNA(低分子内部
セグメント化干渉性RNA)、aiRNA(非対称干渉性RNA)、該当する細胞および
/または組織に対して、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチを1、2、またはそれ
以上有するsiRNA、センス鎖とアンチセンス鎖間のミスマッチが1つまたは複数存在
するRNAi剤、センス鎖がアンチセンス鎖に比べて非常に短い、かつ/または1つもし
くは複数の一本鎖ニックを有する、RNAi剤、またはRNA干渉を仲介しうる他のいず
れかの分子を包含する。RNAi剤は、リボヌクレオチドを含むものでもよいし、または
1つもしくは複数の糖、塩基、および/もしくはリン酸において修飾または置換されてい
てもよい。非限定的な例として、RNAi剤は、2’位において修飾される場合があり、
2’−修飾は、2’−デオキシ、2’−デオキシ−2’−フルオロ、2’−O−メチル、
2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)、2’−O−アミノプロピル(2’−O
−AP)、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)、2’−O−ジメ
チルアミノプロピル(2’−O−DMAP)、2’−O−ジメチルアミノエチルオキシエ
チル(2’−O−DMAEOE)、および2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O
−NMA)からなる群から選択される。一実施形態では、すべてのピリミジン(ウリジン
およびシチジン)が、2’−O−メチル修飾されたヌクレオシドである。種々の実施形態
において、1つまたは複数のリン酸は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホ
スホルアミデート、ボラノホスホノエート、およびアミドリンカーから選択される、修飾
されたヌクレオシド間リンカーで置換されていてよい。種々の実施形態において、1つま
たは複数のヌクレオチドは、DNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)
、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ア
ラビノース核酸(ANA)、2’−フルオロアラビノース核酸(FANA)、シクロヘキ
セン核酸(CeNA)、アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、アンロックド核酸(U
NA)で修飾または置換されていてよい。RNAi剤の種々の修飾および置換は、当業界
で知られており、本開示の状況で使用することができる。siRNAは、動物および植物
において、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であるRNA干渉を担う。s
iRNAは、発現停止された遺伝子ターゲットと相同である、またはそれに特異的である
、より長い二本鎖RNA(dsRNA)から、リボヌクレアーゼIII切断によって自然
に生じ、人工RNAi剤は、当業界で知られているいずれかの方法によって製造すること
ができる。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」とは、自然に産生されようが合成によ
って生成されようが、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。
約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ぶのが普通である。用語「
ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された2つ以上のアミノ酸の配列を示すもの
であり、前記アミノ酸は、天然でも天然でなくてもよい。この用語は、たとえばシステイ
ン架橋などの共有結合性相互作用、または非共有結合相互作用によってまとまった2つ以
上のペプチドからなるものでよい、用語ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。当業
界で受け入れられている3文字または1文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポ
リペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「D」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、
L−アミノ酸である。1文字略語が大文字であるとき、略語は、D−アミノ酸を指す。1
文字略語が小文字であるとき、略語は、L−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたは
アミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、N末端を左側にして示し、配列
は、N末端からC末端に向かって記す。
本発明のペプチドは、非天然アミノ酸(すなわち、自然界では発生しない化合物)を含
んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いても
よい。
ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 200
3、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500
, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第7,083,9
70号明細書に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発
現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードす
るオープンリーディングフレームに、アンバーTAGなどのナンセンスコドンが導入され
る。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なtRN
Aを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる
。本発明のポリペプチドに諸部分をコンジュゲートさせる目的で有益な特定の非天然アミ
ノ酸として、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を有するものが挙げられる。
「タンパク質」とは、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。こうし
たポリペプチド鎖はそれぞれ、式A1、A2、またはA3の脂肪酸分子とコンジュゲート
させることができる。タンパク質は、炭水化物基などの非ペプチド成分も含んでよい。炭
水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生されるところの細胞によってタ
ンパク質に付加される場合があり、細胞の種類によって様々となる。タンパク質は、本明
細書では、そのアミノ酸主鎖構造に関して定義しており、炭水化物基などの置換基は一般
に指定してないが、それにもかかわらず存在してよい。非宿主DNA分子によってコード
されたタンパク質またはポリペプチドは、「異種」タンパク質またはポリペプチドである
「単離ポリペプチドまたは単離タンパク質」とは、本来はポリペプチドに随伴する炭水
化物、脂質、または他のタンパク質性不純物などの細胞成分を本質的に含まないポリペプ
チドまたはタンパク質(たとえば、GDF15)である。通常、単離ポリペプチドまたは
タンパク質の調製物は、高度に精製された形、すなわち、純度少なくとも約80%、純度
少なくとも約90%、純度少なくとも約95%、純度95%超、たとえば、96%、97
%、98%、もしくはこれより高い純度、または純度99%超のポリペプチドまたはタン
パク質を含有する。特定のタンパク質調製物が単離ポリペプチドまたはタンパク質を含有
することを示す1つの手段は、タンパク質調製物をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ゲルをCoomassie Brilliant
Blue染色した後の単一バンドの出現によるものである。しかし、用語「単離」は、
二量体などの別の物理的形態、または別法としてグリコシル化もしくは誘導体化された形
態の同じポリペプチドまたはタンパク質の存在を除外しない。単離ポリペプチドは、その
治療、診断、予防、または研究用途の妨げとなる、その自然環境において見出される他の
いかなる混入ポリペプチドまたは他の混入物も、実質的に含まないことが好ましい。
当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの配列におい
て、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的ア
ミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換
基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換(すなわち、化学的特徴が同等であ
るアミノ酸での置換)を包含する。保存的置換の目的で、非極性(疎水性)アミノ酸とし
ては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性(親水性)天然アミノ酸と
しては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン
が挙げられる。正電荷を有する(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およ
びヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸
およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するD−アミノ
酸の代わりにL−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有す
る他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、
ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸
の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなど
が挙げられる。
本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能で
ある場合、すべて、そのDおよびL立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でない
アミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミ
ノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその3文
字記号、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclatur
e Commissionが推奨する1文字記号のいずれかで呼ぶ。
用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指
す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、
自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指
す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、20種の通常のア
ミノ酸(すなわち、アラニン(AまたはAla)、システイン(CまたはCys)、アス
パラギン酸(DまたはAsp)、グルタミン酸(EまたはGlu)、フェニルアラニン(
FまたはPhe)、グリシン(GまたはGly)、ヒスチジン(HまたはHis)、イソ
ロイシン(IまたはIle)、リシン(KまたはLys)、ロイシン(LまたはLeu)
、メチオニン(MまたはMet)、アスパラギン(NまたはAsn)、プロリン(Pまた
はPro)、グルタミン(QまたはGln)、アルギニン(RまたはArg)、セリン(
SまたはSer)、トレオニン(TまたはThr)、バリン(VまたはVal)、トリプ
トファン(WまたはTrp)、およびチロシン(YまたはTyr)を指す。
本明細書で使用する用語「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」は、同じで
あろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子
を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すもの
である。これら用語は、自然に存在する(野生型)タンパク質配列または本発明の配列中
に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、20種の自然に存
在するアミノ酸の1つ、セレノシステイン、ピロリシン(Pyl)、またはピロリン−カ
ルボキシ−リシン(Pcl、たとえば、PCT特許公開第2010/48582号に記載
のとおり)でない、改変アミノ酸および/またはアミノ酸類似体を包含する。このような
非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および/または自然に
存在する(野生型)タンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によ
って導入することができる。非天然アミノ酸残基は、分子に所望の機能性、たとえば、機
能性部分(たとえば、PEG)を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる
。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「U」は、本明細書で使用される「非天然アミ
ノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。
ポリペプチドまたはタンパク質について本明細書で使用する用語「類似体」とは、ペプ
チド/タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置き換えられて
いる、かつ/または1つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド/タンパク質から欠失して
いる、かつ/または1つまたは複数のアミノ酸残基がペプチド/タンパク質に付加されて
いる、修飾されたペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸残基のこのような付加
または欠失は、ペプチドのN末端および/またはペプチドのC末端で起こりうる。
本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲートのエステル」とは、カルボン酸基のエ
ステル誘導体が存在する(たとえば、C末端の−COHが−COORに変換されている
)ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートを指し、エステルのRは、メチル、
エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1〜6アルキル基、シクロペ
ンチル、シクロヘキシルなどのC3〜8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなど
のC6〜10アリール基、C6〜10アリールC1〜6アルキル基、たとえば、ベンジル
、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニルC1〜2アルキル基、およびα−ナフチル
メチルなどのα−ナフチル−C1〜2アルキル基などを指す。コンジュゲートのペプチド
またはポリペプチド部分が、C末端以外の位置に追加のカルボキシル基またはカルボキシ
レート基を有するとき、こうした基がアミド化またはエステル化されているポリペプチド
も、本発明のポリペプチドの範疇に入る。そうした場合において、エステルは、たとえば
、上述のC末端エステルと同じ種類のエステルでよい。
本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲートのアミド」とは、カルボン酸基のアミ
ド誘導体が存在する(たとえば、−COHが−CO(NR’R’に変換されている)ペ
プチドまたはポリペプチドを含むコンジュゲートを指し、R’は、HまたはRであり、R
は、上で規定している。用語「コンジュゲートのアミド」は、アミノ基のアミド誘導体が
存在する(すなわち、脂肪酸にコンジュゲートしているアミノ基以外)(たとえば、−N
が−NH−C(O)Rに変換されている)ペプチドまたはポリペプチドを含むコンジ
ュゲートも指し、Rは、上で規定している。好ましい実施形態では、「コンジュゲートの
アミド」は、C末端のカルボキシル基がアミド化されている(たとえば、−COHが−
C(O)NH、−C(O)NH−C1〜6アルキル、−C(O)NH−C1〜2アルキ
ルフェニル、または−C(O)N(C1〜6アルキル)に変換されている)ペプチドま
たはポリペプチドを含むコンジュゲートである。
用語「APJ」(「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様1受容体」、「アンジオ
テンシンII様1受容体」などとも呼ばれる)とは、380残基、7回膜貫通ドメインの
Gi共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの11番染色体の長腕上に位置する(NC
BI参照配列:NP_005152.1、NCBI参照配列:NM_005161によっ
てコードされる)。APJは、1993年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用
して、ヒトゲノムDNAから初めてクローン化され(O’Dowd et al. Gene, 136:355-60
、1993)、1型アンジオテンシンII受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性
にもかかわらず、アンジオテンシンIIは、APJを結合しない。この内因性リガンドは
、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された(Tatemoto et al.,
Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998))。
用語「APJアゴニスト」はアペリンポリペプチドを含む:アペリンは、77残基のプ
レタンパク質(NCBI参照配列:NP_0059109.3、NCBI参照配列:NM
_017413.3によってコードされる)を指し、これがプロセシングを受けて、生物
学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−36、アペリン−17、アペリン
−16、アペリン−13、アペリン−12になる。「アペリン−36」と呼ばれる全長成
熟ペプチドは、36アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Pyr−1−ア
ペリン−13またはPyr−アペリン−13」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のア
ペリン13量体(アペリン−13)である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許第
6,492,324B1号明細書に記載されている。アペリンペプチドアゴニストは、参
照により本明細書に援用される、特許出願国際公開第2013/111110号パンフレ
ット、米国特許出願公開第14/082771号明細書、ならびに米国仮特許出願公開第
61/858263号明細書、米国仮特許出願公開第61/858280号明細書、およ
び米国仮特許出願公開第61/858290号明細書にも記載されている。
用語「オキシトシン受容体アゴニストペプチド」または「オキシトシンペプチド」は、
互換的に使用され、オキシトシンおよびその類似体を包含する。オキシトシンは、1位と
6位の間にジスルフィド架橋を形成する2つのシステイン残基を有する、9アミノ酸の環
状ペプチドホルモンである。ヒトオキシトシンは、配列Cys−Tyr−Ile−Gln
−Asn−Cys−Pro−Leu−Glyを含む。用語「オキシトシン受容体アゴニス
トペプチド」は、生物活性を保持するオキシトシンの類似体も包含する。そのような類似
体分子は、オキシトシン受容体を結合することを含めて、内因性オキシトシンと似たよう
にして作用しうる。特に重要なオキシトシンの類似体は、PCT出願番号、国際公開第2
014/095773号パンフレット(詳細には実施例13)で開示されているもの、米
国特許出願公開第US2011/044905号明細書(詳細には実施例49)で開示さ
れているもの、ならびにKazimierz Wisniewski et al., Journal of Medicinal Chemistr
y 2014, 57, 5306-5317およびZbigniew Grzonka et al., Journal of Medicinal Chemist
ry 1983, 26, 1786-1787で開示されているものであり、これら文献は、すべて参照により
本明細書に援用される。
「PIP」または「プロラクチン誘導ペプチド」とは、多様な生物学的過程において役
割を示す、GenBank受託番号がNP_002643であるタンパク質を意味する。
PIPは、当業界において、巨大な嚢胞性疾患流体タンパク質(gross cystic disease f
luid protein)15(GCDFP−15)、分泌性アクチン結合性タンパク質(SABP
)、耳下腺外糖タンパク質(EP−GP)、および17kDa CD4結合性タンパク質
(GP17)としても知られている。PIPは、外分泌臓器ならびに良性および悪性のヒ
ト乳腺腫瘍において発現される。成熟分泌PIPタンパク質は、分子質量が13kDaで
あり、SDS−PAGEでは17〜20kDaのポリペプチドとして移動し、グリコシル
化事象が示唆される。PIPは、ヒトの体液に寄与するほとんどの臓器において発現され
、PIPの発現は、唾液腺に続いて、涙腺、前立腺、筋肉、気管線、および乳腺で最も高
い。PIP遺伝子は、PIPポリペプチドをコードする。
本明細書で使用する「PIPペプチド」とは、ヒトPIP、またはヒトPIPの少なく
とも1つの活性を保持するその相同体、変異体、断片、もしくは修飾形態を意味する。
ヒトPIPの非限定的な例の配列は、配列番号11で示される。
1 MRLLQLLFRA SPATLLLVLC LQLGANKAQD NTRKIIIKNF DIPKSVRPND EVTAVLAVQT
61 ELKECMVVKT YLISSIPLQG AFNYKYTACL CDDNPKTFYW DFYTNRTVQI AAVVDVIREL
121 GICPDDAAVI PIKNNRFYTI EILKVE(配列番号11)
配列番号11は、機能にとって必要とならないシグナルペプチド(アミノ酸1〜28)
を含む全長ヒト野生型PIPに相当する。
本明細書で使用する用語「PIP」の別の非限定的な例は、それゆえシグナルペプチド
(アミノ酸1〜28)を欠いている配列番号11のアミノ酸(aa)29〜146であり
、以下に配列番号12として示す。
1 QDNTRKIIIK NFDIPKSVRP NDEVTAVLAV QTELKECMVV KTYLISSIPL QGAFNYKYTA
61 CLCDDNPKTF YWDFYTNRTV QIAAVVDVIR ELGICPDDAA VIPIKNNRFY TIEILKVE
(配列番号12)
PIPなどの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒトPI
Pに類似しているが同一でないものの、ヒトPIPの少なくとも1つの活性を保持する、
ポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチドは、ヒトPIPの配列(たとえば、配
列番号12)と同一でない配列を有する場合もあれば、またはヒトPIPの配列(たとえ
ば、配列番号12)と同一の配列を有するが、他のいくつかの様態(たとえば、翻訳後修
飾)が異なっている場合もある。そうしたポリペプチドは、たとえば、配列番号12に対
する配列同一性が、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは
少なくとも95%でよく、または、たとえば、配列番号12のアミノ酸配列とに、最大で
5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸の相違(
たとえば、置換、欠失、および/もしくは付加)を有していてよい。一部の実施形態では
、そのPIP相同体、変異体、断片、または修飾形態は、少なくとも90%の配列同一性
を保持し、または配列番号12とに最大で25アミノ酸の相違を有する。PIP相同体、
変異体、断片、または修飾形態は、ヒトPIPの少なくとも1つの活性を保持する。
「FGF23」または「線維芽細胞増殖因子23」とは、FGF−23、ADHR;F
GFN;HPDR2;HYPF;PHPTC;外部ID:OMIM:605380 MG
I:1891427 HomoloGene:10771 GeneCards:FGF
23Gene;種:ヒト;Entrez8074;Ensembl ENSG00000
118972;UniProt:Q9GZV9;RefSeq(mRNA):NM_02
0638;RefSeq(タンパク質):NP_065689;所在(UCSC):Ch
r12:4.48〜4.49Mb;種:マウス;Entrez:64654;Ensem
bl:ENSMUSG00000000182;UniProt:Q9EPC2;Ref
Seq(mRNA):NM_022657;RefSeq(タンパク質):NP_073
148;所在(UCSC):Chr6:127.07〜127.08Mbとしても知られ
ているポリペプチドを意味する。FGF23遺伝子は、FGF23ポリペプチドをコード
する。
本明細書で使用する「FGF23ペプチド」とは、ヒトFGF23、またはヒトFGF
23の少なくとも1つの活性を保持するその相同体、変異体、断片、もしくは修飾形態を
意味する。
シグナルペプチドを含むヒトFGF23の非限定的な例の配列は、配列番号9で示され
る。
10 20 30 40 50
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
210 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I(配列番号9)
配列番号9は、機能にとって必要とならないシグナルペプチド(アミノ酸1〜24)を
含む全長ヒト野生型FGF23に相当する。Yamashita et al. 2000 Biochem. Biophys.
Res. Comm. 277: 494-498、Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6500
-6505、およびZhang et al. 2004 Protein Sci. 13: 2819-2824。
本明細書で使用する用語「FGF23」の非限定的な例は、それゆえシグナルペプチド
(アミノ酸1〜24)を欠いている配列番号9のアミノ酸(aa)25〜251であり、
以下に配列番号8として示す。
10 20 30 40 50
YPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
210 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I(配列番号8)
FGF23などの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒト
FGF23(たとえば、配列番号8)に類似しているが同一でないものの、ヒトFGF2
3の少なくとも1つの活性を保持する、ポリペプチドを意味する。そうしたポリペプチド
は、たとえば、配列番号8に対する配列同一性が、少なくとも70%、少なくとも80%
、少なくとも90%、もしくは少なくとも95%でよく、または、たとえば、配列番号8
のアミノ酸配列とに、最大で5、10、15、20、25、30、35、40、45、も
しくは50アミノ酸の相違(たとえば、置換、欠失、および/もしくは付加)を有してい
てよい。一部の実施形態では、そのFGF23相同体、変異体、断片、または修飾形態は
、少なくとも90%の配列同一性を保持し、または配列番号8とに最大で25アミノ酸の
相違を有する。そのFGF23相同体、変異体、断片、または修飾形態は、ヒトFGF2
3の少なくとも1つの活性を保持する。そのような活性(または機能)には、非限定的な
例として、FGF23受容体への結合、Klothoタンパク質との相互作用、細胞の増
殖、および細胞シグナル伝達における役割;Egr−1−ルシフェラーゼアッセイを始め
とする、FGF23活性の種々のin vitroアッセイにおける活性、ならびに、F
GF23関連疾患、たとえば、(サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳萎縮、アテローム
性動脈硬化症、動脈硬化、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節炎、免疫不適格、高血圧、認知症、
ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性、前立腺がん、卒中、平均余
命の短縮、記憶喪失、しわ、腎臓機能の障害、および加齢性失聴からなる群から選択され
る)加齢性状態、(II型糖尿病、メタボリック症候群、高血糖、および肥満からなる群
から選択される)代謝性障害、高リン血症(腫瘤様石灰沈着症、高リン血性骨化過剰症候
群)、慢性腎疾患、慢性腎不全、がん、乳がん、および/または筋萎縮に関連した活性を
含めて、ヒトFGF23について知られているものが含まれる。Yamashita et al. 2000
Biochem. Biophys. Res. Comm. 277: 494-498、Shimada et al. 2001 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 98: 6500-6505、Urakawa et al. 2006 Nature 444: 770-774、Zhang et al. 2
004 Protein Sci. 13: 2819-2824、国際公開第2013/027191号パンフレット、
国際公開第2011/092234号パンフレット、および国際公開第2009/095
372号パンフレット。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の脂肪酸と、F
GF23ペプチドとを含み、FGF23ペプチドは、FGF23の少なくとも1つの活性
を保持する、コンジュゲートを提供し、一部の実施形態では、保持されるFGF23の活
性は、in vitro Egr−1−ルシフェラーゼアッセイにおける機能である。
FGF23の「相同体」とは、ヒトFGF23に相当するが、哺乳動物、たとえば、マ
ウス、ラット、カニクイザル、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌなどの異なる供給源由
来であり、それでもなおヒトFGF23の少なくとも1つの機能を保持する、ポリペプチ
ドを意味する。
FGF23の「変異体」とは、たとえば配列番号8に対して1つまたは複数の突然変異
(たとえば、欠失、置換、または付加)を含むが、それでもなおヒトFGF23の少なく
とも1つの機能を保持するFGF23を意味する。FGF23の突然変異としては、Y1
54、Q156、R176、R179、C206、およびC244位における突然変異が
挙げられる。このような突然変異は、以前に記載されている。R179における突然変異
によって、FGF23に耐タンパク質分解性が付与され、ADHRでは、176RXXR
179部位の突然変異によって、FGF23の切断および不活性化が妨げられる。White
et al. 2000 Nat. Genet. 26: 345-348、Liu et al. 2003 J. Biol. Chem. 278: 37419-3
7426。Y154における突然変異によって、分解が減少し、Q156における突然変異に
よって、切断部位が消去され、C206およびC244における突然変異によって、二量
体化および凝集が減少する。国際公開第2013/027191号パンフレットおよび国
際公開第2011/092234号パンフレット。FGF23相同体、変異体、または修
飾形態は、(野生型ヒトFGF23には通常見られない)1つまたは複数の追加のアミノ
酸をさらに含んでもよい。
FGF23変異体の非限定的な例をここに示す。
10 20 30 40 50
MYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
60 70 80 90 100
YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
110 120 130 140 150
NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
160 170 180 190 200
PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
110 220 230 240 250
PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
260
I(配列番号10)
配列番号10は、シグナルペプチド(aa1〜24)が欠失しているが、1位における
最初のMが再導入されており、R179に対応するアミノ酸がQに突然変異している、F
GF23の変異体を示す。配列番号10は、「hFGF23 R179Q」、「FGF2
3 R179」、「hFGF23(R179Q)」などとも呼ばれ、実施例28Cで使用
されるFGF23変異体に相当する。
追加のFGF23変異体には、非限定的な例として、配列番号8または配列番号10の
配列を有するが、Y154、Q156、R176、R179、C206、およびC244
のうちの1箇所以上にも突然変異を有するものが含まれる。追加のFGF23変異体には
、非限定的な例として、配列番号8または配列番号10の配列を有するが、Y154、Q
156、R176、R179、C206、およびC244のうちの1箇所以上にも突然変
異を有し、(野生型ヒトFGF23には通常見られない)1つまたは複数の追加のアミノ
酸をさらに含むものが含まれる。
FGF23の「断片」とは、たとえば配列番号8に対して1つまたは複数の欠失したア
ミノ酸を含むが、それでもなおヒトFGF23の少なくとも1つの機能を保持するFGF
23を意味する。FGF23の機能しうる断片は、配列番号8のアミノ酸180〜251
を含む。Goetz et al. 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 407-412。FGF23断
片は、たとえば、Y154、Q156、R176、R179、C206、およびC244
位のいずれか1つまたは複数において、1つまたは複数の突然変異を有する場合もあるが
、ヒトFGF23の少なくとも1つの活性を保持しうる。
FGF23の「修飾形態」とは、FGF23の配列、たとえば配列番号8と同様または
同一の配列を含むが、1つまたは複数の修飾を含み、ヒトFGF23の少なくとも1つの
活性を保持するFGF23を意味する。このような修飾には、非限定的な例として、翻訳
後修飾(リン酸化、メチル化、もしくは炭水化物の付加)、またはFGF23でない第2
の部分へのコンジュゲーションを含めることができる。そのような第2の部分は、非限定
的な例として、シグナルペプチド、αもしくはβKlothoもしくはその断片(たとえ
ば、可溶性KlothoもしくはsKlotho)、Fc(たとえば、FcLALA)、
または他の修飾でよい。国際公開第2011/092234号パンフレットおよび国際公
開第2009/095372号パンフレット。
本明細書で使用するとき、用語「AgRPペプチドまたはポリペプチド」などとは、ア
グーチ関連ペプチド、すなわち、翻訳後プロセシングを受けてその活性または成熟形態で
あるAgRP(83〜132)になる、32アミノ酸で構成されたシグナル伝達分子を指
し、10のシステイン残基を含んでおり、5つのジスルフィド結合の網状組織を形成する
。AgRPは、メラノコルチン受容体MC3RおよびMC4Rの逆アゴニストとしての役
割を果たす。用語「AgRPペプチド」は、すべての例において、その塩を包含する。一
部の実施形態では、AgRPは、たとえば、C末端−CO2Hがアミド化されてC(O)
−NH2を形成することによる、アミドの形でよい。他の実施形態では、AgRPは、酸
の形でよい。
用語「AgRPペプチド」は、AgRPの、生物学的に活性のあるより短い断片も包含
する。断片とは、配列が同一であるが、親配列より長さがより短く、生物学的活性(すな
わち、逆アゴニズム)を保持する、親配列の一部分である。AgRPポリペプチドの断片
ならびにその変異体は、参照により本明細書に援用される、Jackson, P. J. et al., Bio
chemistry 41, 7565-757にも記載されている。たとえば、AgRP(87〜120)およ
びAgRP(87〜132)は、AgRP(83〜132)とほぼ同じMC3RおよびM
C4R親和性を有し、同等の逆アゴニズムを示す。AgRPポリペプチドのその他の断片
は、参照により本明細書に援用される、Christine G. Joseph et al., Peptides 24 (200
3), 263-270に記載されている。断片の例は、AgRP(86〜132)および単環Ag
RP(109〜118)、ならびにNおよび/またはC末端におけるこれらの伸長である
用語「AgRPポリペプチド」は、自然に存在するAgRPポリペプチド配列が修飾を
受けたAgRPポリペプチドである、「AgRP突然変異体ポリペプチド」も包含する。
そのような修飾は、参照により本明細書に援用される、PCT出願番号、国際公開第20
13/006656号パンフレットに記載されている。
用語「GDF15ペプチド」、「GDF15ポリペプチド」および「GDF15タンパ
ク質」は、互換的に使用され、ヒトやマウスなどの哺乳動物において発現される、自然に
存在する野生型ポリペプチドを意味する。この開示の目的では、用語「GDF15タンパ
ク質」は、29アミノ酸のシグナルペプチド(アミノ酸1〜29)、167アミノ酸のプ
ロドメイン(アミノ酸30〜196)、およびプロドメインからフューリン様プロテアー
ゼによって切除される112アミノ酸(アミノ酸197〜308)の成熟ドメインを含ん
でいる、308アミノ酸残基からなるいずれかの全長GDF15ポリペプチド(NCI参
考配列NP_004855.2)を指すのに互換的に使用してよい。308アミノ酸のG
DF15ポリペプチドを「全長」GDF15ポリペプチドと呼び、112アミノ酸のGD
F15ポリペプチド(たとえば、アミノ酸197〜308)を「成熟」GDF15ポリペ
プチドと呼ぶ。成熟GDF15ペプチドは、TGF〜スーパーファミリーの仲間に典型的
である、(3つの鎖内ジスルフィド結合を有する)システインノットモチーフおよび単一
の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要となる7つの保存されたシステイン残基を含んでい
る。成熟GDF15ペプチドは、4番目の鎖内ジスルフィド結合を形成する2つの追加の
システイン残基も含んでいる。したがって、生物学的に活性のあるGDF15は、1つの
鎖間ジスルフィド結合によって共有結合連結されている、成熟ペプチドのホモ二量体であ
る。したがって、GDF15タンパク質またはポリペプチドには、このタンパク質の多量
体、より詳細には二量体も含まれる。ホモ二量体GDF15を構成する各モノマー単位を
、式A1、A2、またはA3の脂肪酸に連結することができる。
本明細書で使用する「GDF15」または「GDF15タンパク質」はまた、ヒトGD
F15、またはヒトGDF15の少なくとも1つの活性を保持するその相同体、変異体、
突然変異体、断片、もしくは修飾形態も意味する。
用語「GDF15突然変異体ポリペプチド」または「GDF15変異体ポリペプチド」
は、自然に存在するGDF15ポリペプチド配列が修飾されたものである、GDF15ポ
リペプチドを包含する。そのような修飾には、限定はしないが、自然に存在しないアミノ
酸、自然に存在しないアミノ酸類似体、およびアミノ酸模倣物での置換を含めた、1つま
たは複数のアミノ酸置換が含まれる。
一態様では、用語「GDF15突然変異体タンパク質」または「GDF15変異体ポリ
ペプチド」は、未変性GDF15ポリペプチドの所与の位置に通常見られる少なくとも1
つの残基が欠失し、または未変性GDF15配列中のその位置に通常は見られない残基で
置き換えられたものである、GDF15タンパク質配列を指す。一部の場合では、未変性
GDF15ポリペプチドの所与の位置に通常見られる単一の残基を、その位置に通常は見
られない2つ以上の残基で置き換えることが望ましくなり、さらに他の場合では、未変性
GDF15ポリペプチド配列を保持し、タンパク質中の所与の位置に1つまたは複数の残
基を挿入することが望ましい場合もあり、さらに他の場合では、所与の残基を完全に欠失
させることが望ましい場合もあり、これらの構築物はすべて、用語「GDF15突然変異
体タンパク質」または「GDF15変異体タンパク質」に包含される。本発明の一態様で
は、GDF15突然変異体タンパク質または「GDF15変異体タンパク質」は、配列番
号1〜配列番号7のいずれか1つから選択される配列を有する。本発明はまた、このよう
なGDF15突然変異体ポリペプチド配列またはGDF15変異体ポリペプチド配列をコ
ードする核酸分子も包含する。
GDF15などの「相同体」、「変異体」、「断片」、または「修飾形態」とは、ヒト
GDF15に類似しているが同一でないものの、ヒトGDF15の少なくとも1つの活性
を保持する、ポリペプチドを意味する。
GDF15の「修飾形態」とは、GDF15の配列と同様または同一の配列を含むが、
1つまたは複数の修飾を含み、ヒトGDF15の少なくとも1つの活性を保持するGDF
15を意味する。このような修飾には、非限定的な例として、翻訳後修飾(リン酸化、メ
チル化、もしくは炭水化物の付加)を含めることができる。
GDF15の「相同体」とは、ヒトGDF15に相当するが、哺乳動物、たとえば、カ
ニクイザル、マウス、ラットなどの異なる供給源由来であり、それでもなおヒトGDF1
5の少なくとも1つの機能を保持する、ポリペプチドを意味する。一部の例では、GDF
15相同体は、対象において代謝障害を治療し、または改善させるのに、対象と同じ種由
来である、成熟型のGDF15突然変異体ポリペプチドとして使用することができる。
種々の実施形態において、GDF15ポリペプチド、その相同体、変異体、突然変異体
、断片、または修飾形態は、自然に存在するGDF15タンパク質に対する同一性が少な
くとも約85パーセントであるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、GDF15ポリ
ペプチドは、自然に存在するGDF15ポリペプチドアミノ酸配列に対する同一性が少な
くとも約90パーセント、または約95、96、97、98、もしくは99パーセントで
あるアミノ酸配列を含む。このようなGDF15ポリペプチド、その相同体、変異体、突
然変異体、断片、または修飾形態は、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド、も
しくはコレステロールレベルを低下させる能力;体重を減少させる能力;または耐糖能、
エネルギー消費、もしくはインスリン感受性を改善する能力などの、野生型GDF15突
然変異体ポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。
種々のそれぞれの実施形態において、GDF15ポリペプチド、またはその相同体、変
異体、突然変異体、断片、もしくは修飾形態は、自然に存在する形態の成熟GDF15タ
ンパク質の生物学的活性と同等である、それを超える、またはそれ未満である生物学的活
性を有する。生物学的活性の例としては、血中グルコース、インスリン、トリグリセリド
、もしくはコレステロールレベルを低下させる能力;体重を減少させる能力;または耐糖
能、脂質耐性、もしくはインスリン感受性を改善する能力;尿中グルコースおよびタンパ
ク質排出を減少させる能力が挙げられる。
ポリペプチドまたはタンパク質の構造に関連して本明細書で使用するとき、用語「N末
端」(または「アミノ末端」)および「C末端」(または「カルボキシル末端」)とは、
それぞれ、ポリペプチドの最も端のアミノ末端およびカルボキシル末端を指す。
本明細書で使用する用語「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」とは、治
療に使用するために開発されている、または治療に使用するために開発されたポリペプチ
ドまたはタンパク質を意味する。
リンカーは、生体分子と、脂肪酸部分とを隔てる。リンカーは、主としてスペーサーと
して働くので、その化学構造は肝要でない。
リンカーは、一方が生体分子、他方が脂肪酸部分と反応しうる、2つの反応性基/官能
基を含んでいる化学的部分である。リンカーの2つの反応性基/官能基は、連結部分また
はスペーサーを介して連結され、連結部分またはスペーサーの構造は、リンカーの、生体
分子、および式A1、A2、またはA3の脂肪酸部分とのリンカーの結合の妨げとならな
い限り、肝要でない。
リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結しているアミノ酸で構成されたものでよ
い。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された1〜2
0個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、20種の自然に存在するアミノ酸から選択され
る。種々の実施形態において、1〜20個のアミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、
アラニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびリシンから選択
される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンやアラニンなどの、立体障害のない
大多数のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリ
アラニン、グリシンとアラニンの組合せ(ポリ(Gly−Ala)など)、またはグリシ
ンとセリンの組合せ(ポリ(Gly−Ser)など)である。一部の実施形態では、リン
カーは、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシ
ンから選択されるアミノ酸で大多数が構成されている。一部の実施形態では、リンカーは
、ポリヒスチジン部分を含んでいる。
一部の実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される1〜20のアミノ酸
を含む。脂肪酸部分とのコンジュゲーションには、1〜10アミノ酸残基のリンカーが好
ましいが、本発明は、いずれの長さまたは組成のリンカーも企図する。非天然アミノ酸リ
ンカーの一例は、次式:
を有する8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸またはその反復単位である。
本明細書に記載のリンカーは、例示的なものであり、はるかに長い、また他の残基を含
むリンカーが、本発明によって企図される。非ペプチドリンカーも、本発明によって企図
される。
他の実施形態では、リンカーは、1つまたは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロ
アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレングリコール、お
よび/または1つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せ
を含み、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシ
クリル、ポリエチレングリコール、および/または天然もしくは天然でないアミノ酸はそ
れぞれ、場合により合体および連結し合っており、または生体分子および/もしくは脂肪
酸部分に、−C(O)O−、−OC(O)−、−NHC(O)−、−C(O)NH−、−
O−、−NH−、−S−、−C(O)−、−OC(O)NH−、−NHC(O)−O−、
=NH−O−、=NH−NH−、もしくは=NH−N(アルキル)−から選択される化学
基を介して連結している。
アルキルスペーサーを含んでいるリンカーは、たとえば、−NH−(CH−C(
O)−または−S−(CH−C(O)−または−O−(CH−C(O)−、
−NH−(CH−NH、−O−C(O)−(CH2)−C(O)−O−、−C(
O)−(CH−O−、−NHC(O)−(CH−C(O)−NH−などであ
り、zは、2〜20である。こうしたアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキ
ル(たとえば、C〜C)、低級アシル、ハロゲン(たとえば、Cl、Br)、CN、
NH2、またはフェニルを含めた、いずれかの非立体障害性基でさらに置換されていても
よい。
リンカーは、ポリマーの性質のものでもよい。リンカーは、生物学的に安定または生分
解性であるポリマー鎖または単位を含んでよい。連結が繰り返されているポリマーは、結
合不安定性に応じて、生理的条件下で様々な程度の安定性を備えうる。ポリマーは、ポリ
カルボネート(−O−C(O)−O−)、ポリエステル(−C(O)−O−)、ポリウレ
タン(−NH−C(O)−O−)、ポリアミド(−C(O)−NH−)などの結合を含ん
でいてよい。こうした結合は、例として示しており、本発明のポリマー鎖またはリンカー
において用いることのできる結合のタイプを限定するものではない。適切なポリマーとし
ては、たとえば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、N−(2−ヒドロキ
シプロピル)−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレン
グリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロー
スおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコール
およびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニ
ルエチルエーテルなど、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、たと
えば、ポリエチレングリコール(PEG)である。PEGリンカーは、線状または分枝状
である場合がある。本発明におけるPEGリンカーの分子量は、特定のいずれかの大きさ
に限定されないが、ある特定の実施形態は、100〜5000ダルトン、たとえば、50
0〜1500ダルトンの間の分子量を有する。
リンカーは、ペプチドまたはポリペプチド/タンパク質のアミノ基と脂肪酸部分上の官
能基/反応性基(たとえば、式A1、A2、およびA3の脂肪酸部分のカルボン酸官能基
)との間に架橋を形成する適切な官能基−反応性基を、両方の末端に含んでいる。
リンカーは、性質の異なるいくつかの連結部分(またはスペーサー)(たとえば、アミ
ノ酸、ヘテロシクリル部分、PEG、および/またはアルキル部分の組合せ)を含んでも
よい。この例において、各連結部分は、ペプチドまたはポリペプチド/タンパク質のアミ
ノ基と、性質の異なる次の連結部分との間に架橋を形成する適切な官能基反応性基を両方
の末端に含んでおり、かつ/または性質の異なる前の連結部分と脂肪酸部分との間に架橋
を形成する適切な官能基−反応性基を含んでいる。
修飾されたペプチドもしくはポリペプチドおよび/またはペプチド−ポリペプチド部分
構築物(すなわち、部分的なリンカーに付着しているペプチド/ポリペプチド)は、脂肪
酸部分(または修飾された脂肪酸部分、すなわち、部分的なリンカーにすでに付着してい
るもの)上の利用可能な反応性官能基と反応して共有結合を形成しうる反応性基を含む。
反応性基は、共有結合を形成しうる化学基である。反応性基は、コンジュゲーションの一
方の部位に配置され、一般に、それによってコンジュゲーションの他方の部位にあるアミ
ノ基、ヒドロキシル基、アルケン基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミン基、アジド基、
またはチオール基のような官能基と共有結合を形成することのできる、カルボキシ、ホス
ホリル、アシル基、エステルまたは混合無水物、マレイミド、N−ヒドロキシスクシンイ
ミド、テトラジン、アルキン、イミデート、ピリジン−2−イル−ジスルファニルでよい
生体分子または修飾された生体分子をリンカーにコンジュゲートさせる、および/また
はリンカーを脂肪酸部分にコンジュゲートさせる、および/または性質の異なる種々の連
結部分を互いにコンジュゲートさせるための、特に重要な反応性基は、N−ヒドロキシス
クシンイミド、アルキン(より詳細にはシクロオクチン)である。
官能基としては、1.マレイミド、トシルスルホン、またはピリジン−2−イルジスル
ファニルと反応させるためのチオール基;2.カルボン酸もしくは活性化型カルボン酸(
たとえば、N−ヒドロキシスクシンアミド化学によるアミド結合形成)、ホスホリル基、
アシル基、または混合無水物に結合させるためのアミノ基(たとえば、アミノ酸のアミノ
官能基);3.末端アルキン、より詳細にはシクロオクチンとのHuisgen付加環化
(より一般的にはクリックケミストリーとして知られる)にかけるためのアジド;4.ヒ
ドロキシルアミンまたはヒドラジンと反応させて、それぞれオキシムまたはヒドラジンを
生成するためのカルボニル基;5.アザ[4+2]付加においてテトラジンと反応させる
ためのアルケン、より詳細には歪みアルケンが挙げられる。リンカーおよび官能基/反応
性基のいくつかの例を本明細書で述べてはいるが、本発明は、リンカーまたはいずれの長
さおよび組成を企図する。
実施形態
本発明の種々の実施形態をここに記載する。各実施形態で明細に述べられた特色は、明
細に述べられた他の特色と組み合わせて、さらなる実施形態を実現してもよいと認識され
る。
実施形態1において、本発明は、リンカーを介して脂肪酸部分に連結している生体分子
を含み、前記脂肪酸部分は、次式A1、A2、またはA3:
[Rは、COH、Hであり、
、R、およびRは、互いに独立して、H、OH、COH、−CH=CH、ま
たは−C≡CHであり、
Akは、分枝状C〜C30アルキレンであり、
n、m、およびpは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]
である、コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩
に関する。
実施形態1のさらなる態様では、実施形態1に従うコンジュゲートは、上述のとおりの
式A1、A2、またはA3の脂肪酸をさらに含んでもよい。選択的なコンジュゲーション
および/または脂肪酸の生体分子への一価コンジュゲーションを実現することの難しさを
考慮して、本発明のコンジュゲートは、式A1、A2、またはA3の1つまたは複数の脂
肪酸部分に連結している生体分子を含んでもよい。加えて、一部のタンパク質の多重結合
性の性質を考慮すると、多量体タンパク質を構成する各モノマー単位が脂肪酸部分に連結
しうるが、モノマー単位の少なくとも1つが脂肪酸部分に連結している限り、必ずしもす
べてのモノマー単位が脂肪酸部分に連結する必要はない。さらなる態様では、本発明は、
本発明のコンジュゲートの混合物に関する。たとえば、混合物は、式A1、A2、または
A3の1つの脂肪酸部分に連結している生体分子、たとえば、多量体生体分子、たとえば
二量体生体分子と、式A1、A2、またはA3の2つ以上の脂肪酸部分に連結している生
体分子、たとえば、多量体生体分子、たとえば二量体生体分子とを含む場合がある。以下
の本発明の実施例では、脂肪酸のタンパク質またはポリペプチドへの選択的または非選択
的な多重コンジュゲーションに関するこの態様をさらに強調する。
実施形態1Aにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が式A1である、実施形態1に従う
コンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記コンジュゲートは、nお
よびmが、独立して、8〜20、好ましくは10〜16である、式A1の脂肪酸部分を含
む。この実施形態の別の態様では、本発明は、前記脂肪酸部分が式A1であり、Rおよ
びRの少なくとも一方がCOHである、実施形態1または1Aに従うコンジュゲート
に関する。
実施形態2において、本発明は、前記脂肪酸部分が次式:
[式中、Ak、Ak、Ak、Ak、およびAkは、独立して、(C8〜20
アルキレンであり、RおよびRは、独立して、(C8〜20)アルキルである]から
選択される、実施形態1または1Aに従うコンジュゲートに関する。
実施形態3において、本発明は、前記脂肪酸部分が次式:
から選択される、実施形態1、1A、または2に従うコンジュゲートに関する。
実施形態3Aにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が次式:
から選択される、実施形態1、1A、または2に従うコンジュゲートに関する。
実施形態3Bにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が式A2またはA3である、実施形
態1に従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前記コンジュゲー
トは、pが8〜20である式A2の脂肪酸部分、またはAkがC8〜20アルキレンであ
る式A3の脂肪酸部分を含む。
実施形態3Cにおいて、本発明は、前記脂肪酸部分が次式:
[式中、Akは、C8〜20アルキレンである]から選択される、実施形態1または3
Bに従うコンジュゲートに関する。
実施形態4において、本発明は、前記リンカーが、1つまたは複数のアルキル基、アル
ケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、ヘテロ環基、ポリエチレ
ングリコール、1つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合
せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘ
テロシクリル、ポリエチレングリコール、および/または天然もしくは天然でないアミノ
酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および/
もしくは前記脂肪酸部分に、−C(O)O−、−OC(O)−、−NHC(O)−、−C
(O)NH−、−O−、−NH−、−S−、−C(O)−、−OC(O)NH−、−NH
C(O)−O−、=NH−O−、=NH−NH−、もしくは=NH−N(アルキル)−か
ら選択される化学基を介して連結している、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジ
ュゲートに関する。
実施形態5において、本発明は、前記リンカーが、式:
[式中、yは、0〜34である]の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、前述
の実施形態のいずれかに従うコンジュゲートに関する。
実施形態6において、本発明は、前記リンカーが、次式:
から選択されるヘテロ環部分を含む(またはさらに含む)、前述の実施形態のいずれかに
従うコンジュゲートに関する。
このようなヘテロシクリルを含んだリンカーは、たとえば、より一般的にはクリックケ
ミストリーとして知られる、アジド−アルキンHuisgen付加環化によって得られる
。より詳細には、上で示したヘテロシクリルのいくつかは、シクロアルキンを含アジド部
分と反応させた結果として得られる。
シクロアルキンは、市販品供給元から容易に入手可能であり、したがって、アジド官能
基を含んでいる部分(たとえば、末端アジド官能基を含んでいるリンカー)との付加環化
によって機能付与することができる。タンパク質標識における環状アルキンクリックケミ
ストリーの使用の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第2009/0068
738号明細書に記載されている。
Huisgen付加環化において使用することのできるシクロアルキン剤の非限定的な
例は、
である。
実施形態6Aにおいて、本発明は、前記リンカーが、次式:
[式中、rは、0〜2の整数であり、sは、0〜3の整数である]から選択されるヘテロ
シクリルを含む(またはさらに含む)、実施形態1〜5のいずれか1つに従うコンジュゲ
ートに関する。
このようなヘテロ環式リンカーは、アルケン、または好ましくは歪みアルケン、たとえ
ばシクロアルカンの、次の部分:
[式中、Rfは、たとえば、−CHNH、−OH、−CH−COH、−S−CH
−COH、−(O−CH4−6−C(O)−OH、または
である]とのアザ[4+2]付加環化によって得ることができる。
このようなテトラジン部分は、市販品供給元から容易に入手可能であり、アルケンを含
んでいる部分、たとえば、末端アルケン官能基を含んでいるリンカーと反応させることが
できる。
実施形態6Bにおいて、本発明は、前記リンカーが、次式:
のヘテロシクリルを含む(またはさらに含む)、実施形態1〜5のいずれか1つに従うコ
ンジュゲートに関する。
このようなヘテロ環部分は、マレイミドを、チオールを含んでいる部分、たとえば、末
端チオール官能基を含んでいるリンカーと反応させることにより取得できる。
容易に入手可能である、および/または市販品として入手可能である、こうした試薬は
、直接、または上述のとおりのリンカーを介して、対象となるペプチドまたはポリペプチ
ドに付着させる。アルキン、マレイミド、またはテトラジン反応性基は、脂肪酸部分また
はリンカー−脂肪酸構築物(たとえば、PEG−脂肪酸構築)上に存在する官能基(それ
ぞれ、アジド、チオール、およびアルケン)と反応する。
実施形態7において、本発明は、前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン
、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される1つまたは複数の
アミノ酸を含むまたはさらに含む、前述の実施形態のいずれかに従うコンジュゲートに関
する。この実施形態の特定の一態様では、前記リンカーは、ヒスチジン、アラニン、およ
びメチオニンから選択される1〜6つのアミノ酸を含む。
実施形態8において、本発明は、前記生体分子がペプチドまたはポリペプチドである、
前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。実施形態8の特定の一態
様では、本発明は、前記ペプチドまたはポリペプチドが、1)ヒト増殖分化因子15(G
DF15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態、2)APJ
アゴニストペプチド、3)オキシトシン受容体アゴニストペプチド、4)セレラキシン、
5)NPFF、6)PIPペプチド、7)FGF23ペプチド 8)AgRPペプチド、
または9)siRNAである、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関
する。
実施形態8Aにおいて、本発明は、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF1
5)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態、またはこれらの二
量体である、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形
態の一態様では、前記生体分子は、ヒト増殖分化因子15(GDF15)突然変異体また
は変異体である。好ましい実施形態では、前記生体分子は、GDF15またはその変異体
もしくは突然変異体の二量体である。GDF15ポリペプチドまたはその突然変異体もし
くは変異体のホモ二量体の性質を考慮すると、ホモ二量体を構成する2本のポリペプチド
鎖(すなわち、各モノマー単位)のそれぞれが、式A1、A2、またはA3の脂肪酸分子
にリンカーを介して連結しうる。したがって、GDF15ホモ二量体は、1つまたは2つ
の脂肪酸にリンカーを介して連結される場合もある。リンカーを介して脂肪酸部分に連結
しているGDF15の構造は、以下のように表すことができる。
[式中、FAは、脂肪酸部分、Lは、リンカーを表し、GDF15モノマー単位1および
モノマー単位2は、両方とも、リンカーを介して脂肪酸部分に連結している]または
[式中、FAは、脂肪酸部分、Lは、リンカーであり、モノマー単位の一方だけが、リン
カーを介して脂肪酸部分に連結しており、2つのモノマー単位間の線は、ジスルフィド結
合を表す]。さらに、本発明はまた、構造Aのコンジュゲートと構造Bのコンジュゲート
とを含む混合物に関する。
実施形態8Bにおいて、本発明は、前記ヒトGDF15突然変異体が、成熟ポリペプチ
ドの1つまたは複数のアミノ酸残基を別の残基で置き換えることにより得たものである、
実施形態8Aに従うコンジュゲートを企図する。この実施形態の特定の一態様では、ヒト
GDF15のN末端における最後の2つのアミノ酸残基(すなわち、アルギニン198お
よびアラニン197)が、アミノ酸配列XH−[Hは、ヒスチジンであり、Xは、メチオ
ニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから選択されるアミノ酸で
ある]で置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、前記hGDF15突然
変異体は、MH(199−308)hGDF15またはAH(199−308)hGDF
15である。
実施形態8Cでは、ヒトGDF15のN末端における最後の3つのアミノ酸残基(すな
わち、アスパラギン199、アルギニン198、およびアラニン197)が、アミノ酸配
列XHX’−[Hは、ヒスチジンであり、X’およびXは、メチオニン、アラニン、グル
タミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択されるアミノ酸である]で置き
換えられている。この実施形態の別の態様では、ヒトGDF15のN末端における最後の
3つのアミノ酸残基(すなわち、アスパラギン199、アルギニン198、およびアラニ
ン197)が、アミノ酸配列AHX’−[Hは、ヒスチジンであり、X’は、メチオニン
、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択されるアミノ
酸である]で置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、修飾GDF15タ
ンパク質は、MHA(200−308)hGDF15またはAHA(200−308)h
GDF15である。
未変性GDF15タンパク質に比べて、GDF15突然変異体では、タンパク質のN末
端における選択的な標識(すなわち、GDF15の好ましいN末端における脂肪酸のコン
ジュゲーション)が可能になる。ペプチドおよびタンパク質の選択的な標識については、
同時出願された米国特許出願公開第62/015,858号明細書(代理人案件整理PA
T056275−US−PSP)および米国特許出願公開第62/082,337号明細
書(代理人案件整理番号PAT056275−US−PSP02)にさらに詳細に記載さ
れている。
実施形態8Dにおいて、本発明は、前記生体分子がAPJアゴニストペプチドである、
実施形態1〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態
様では、前記APJアゴニストペプチドは、参照により本明細書に援用される、PCT特
許出願番号、国際公開第2013/111110号パンフレット、国際公開第2014/
081702号パンフレット、国際公開第2015/013168号パンフレット、国際
公開第2015/013165号パンフレット、国際公開第2015/013167号パ
ンフレット、および国際公開第2015/013169号パンフレットに記載されている
ペプチドある。
実施形態8Eにおいて、本発明は、前記生体分子がオキシトシン受容体アゴニストペプ
チドである、実施形態1〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形
態の特定の態様では、前記オキシトシン受容体アゴニストペプチドは、参照により本明細
書に援用される、PCT特許出願番号、国際公開第2009/122285号パンフレッ
ト(Ferring B.V.)および国際公開第2014/095773号パンフレッ
ト(Hoffman−La Roche)に記載されているペプチドである。
実施形態8Fにおいて、本発明は、前記生体分子がAgRPペプチドである、実施形態
1〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、
前記AgRPペプチドは、C末端が遊離−COHまたはそのアミド(たとえば、−C(
O)NH)の形である、AgRP(83−132)である。
実施形態8Gにおいて、本発明は、前記生体分子がFGF23ペプチドである、実施形
態1〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では
、前記FGF23ペプチドは、R179における突然変異と、場合によりY154、Q1
56、R176、R179、C206、およびC244における1つまたは複数の追加の
突然変異とを有する配列番号8であるFGF23変異体である。この実施形態の別の特定
の態様では、FGF23ペプチドは、R179、Q156、C206、およびC244に
おける突然変異を有する配列番号8であるFGF23変異体である。
実施形態8Hにおいて、本発明は、前記生体分子がセレラキシンである、実施形態1〜
8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。
実施形態8Iにおいて、本発明は、前記生体分子がNPFFペプチドである、実施形態
1〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。
実施形態8Jにおいて、本発明は、前記生体分子がPIPペプチドである、実施形態1
〜8のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、前
記PIPペプチドは、hisでタグ付けされたタンパク質MHHHHHHH−PIPであ
り、PIPは、配列番号12のものである。
実施形態8Kにおいて、本発明は、前記生体分子がsiRNAである、実施形態1〜8
のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。
実施形態8Lにおいて、本発明は、前記生体分子にリンカーを介して連結された第2の
脂肪酸部分をさらに含む、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する
。2つの脂肪酸−リンカー部分は、同じ構造のものであることが好ましい。
実施形態9において、本発明は、次の構造:
を有する、実施形態1、2、8、8A、8B、または8Cに従うコンジュゲートに関する
。式中、hGDF15*は、N末端にある2または3つのアミノ酸がアミノ酸配列XH−
またはXHX’−[Hは、ヒスチジンであり、XおよびX’は、MおよびAから独立して
選択される]でそれぞれ置き換えられているhGDF15またはその二量体であり、
his−hGDF15は、1〜6つのヒスチジンアミノ酸と、場合により1または2つの
メチオニンアミノ酸とを含むタグがそのN末端に付加されているhGDF15またはその
二量体であり、
sは、20〜30の間の整数である。
この実施形態の一態様では、前記タグは、ヒスチジンアミノ酸と、1つまたは2つの近
接しないメチオニンアミノ酸とを含む。この実施形態の別の態様では、ヒスチジンおよび
メチオニンアミノ酸の取り合わせは、N末端アミノ酸に近接する位置にあるアミノ酸がヒ
スチジンになるようになっている。この実施形態のさらなる態様では、前記タグは、MH
HHHHHM−およびMHHHHHH−から選択されたものである。
実施形態9の特定の態様では、hGDF15*およびhis−hGDF15のホモ二量
体の性質を考慮すると、ホモ二量体を構成する1または2本のポリペプチド鎖(モノマー
単位)が、脂肪酸分子にリンカーを介して連結しうる。結果として、ホモ二量体は、N末
端において、1つまたは2つの脂肪酸分子にリンカーを介して連結する場合がある。この
ような実施形態は、以下の式を有する、脂肪酸にリンカーを介して連結しているGDF1
5生体分子によって表すことができる。
[式中、his−hGDF15またはhGDF15*(上で規定したとおり)の両方のモ
ノマー単位は、両方のN末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている]
、または
[式中、his−hGDF15またはhGDF15*(上で規定したとおり)のモノマー
単位の一方だけが、N末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている]。
さらに、本発明はまた、本発明のコンジュゲートの混合物、たとえば、式Cのコンジュゲ
ートと式Eのコンジュゲートとを含む混合物、または式Dのコンジュゲートと式Fのコン
ジュゲートとを含む混合物も企図する。
実施形態10において、本発明は、式Cのコンジュゲートと式Eのコンジュゲートの混
合物を含む組成物に関する。実施形態10Aにおいて、本発明は、式Dのコンジュゲート
と式Fのコンジュゲートの混合物を含む組成物に関する。
したがって、実施形態10Bにおいて、本発明は、
1.N末端にある2または3つのアミノ酸がアミノ酸配列XH−またはXHX’−[Hは
、ヒスチジンであり、XおよびX’は、MおよびAから独立して選択される]でそれぞれ
置き換えられている、ホモ二量体hGDF15の変異体、または
1〜6つのヒスチジンアミノ酸と、場合により1または2つのメチオニンアミノ酸とを含
むタグがそのN末端に付加されているホモ二量体hGDF15と、
2.式:
の1または2つの脂肪酸と
を含み、前記脂肪酸は、前記ポリペプチド鎖のN末端にリンカーを介して連結している、
請求項1、2、9、または10に従うコンジュゲート、またはコンジュゲートの混合物に
関する。
実施形態10Cにおいて、本発明は、
hGDF15*が、N末端にある2または3つのアミノ酸がアミノ酸配列XH−またはX
HX’−[Hは、ヒスチジンであり、XおよびX’は、MおよびAから独立して選択され
る]でそれぞれ置き換えられているhGDF15またはその二量体であり、
his−hGDF15が、4〜6つのヒスチジンアミノ酸と、1または2つのメチオニン
アミノ酸とを含むタグがそのN末端に付加されているhGDF15またはその二量体であ
り、
sが、22〜28の間の整数である、実施形態9、10、10A、または10Bのコンジ
ュゲートに関する。この実施形態の一態様では、前記タグは、ヒスチジンアミノ酸と、1
つまたは2つの近接しないメチオニンアミノ酸とを含む。この実施形態の別の態様では、
ヒスチジンおよびメチオニンアミノ酸の取り合わせは、N末端アミノ酸に近接する位置に
あるアミノ酸がヒスチジンになるようになっている。この実施形態のさらなる態様では、
前記タグは、MHHHHHHM−およびMHHHHHH−から選択されたものである。
実施形態11において、本発明は、前記生体分子が、M−(His)6−hGDF15
(配列番号1)、M−(his)6−M−hGDF15(配列番号2)、MH(199−
308)hGDF15(配列番号4)、MHA(200−308)hGDF15(配列番
号6)、AHA(200−308)hGDF15(配列番号7)、およびAH(199−
308)GDF15(配列番号5)、またはこれらの二量体から選択されたものである、
前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。
実施形態11Aにおいて、本発明は、前記生体分子が、MH(199−308)hGD
F15(配列番号4)、MHA(200−308)hGDF15(配列番号6)、AHA
(200−308)hGDF15(配列番号7)、およびAH(199−308)GDF
15(配列番号5)、またはこれらの二量体から選択されたものである、実施形態11に
従うコンジュゲートに関する。
実施形態11Bにおいて、本発明は、前記生体分子がAHA(200−308)hGD
F15(配列番号7)またはその二量体から選択されたものである、実施形態11に従う
コンジュゲートに関する。
実施形態12において、本発明は、前記脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生
体分子が、式Gまたは式Hのものである、実施形態11Bに従うコンジュゲートに関する
式中、AHA−hGDF15は、配列番号7であり、脂肪酸は、2つのモノマー単位の一
方または両方のN末端において連結している。さらに、本発明は、式Gのコンジュゲート
と式Hのコンジュゲートとを含む混合物を企図する。
実施形態13において、本発明は、式Gを有する実施形態12に従うコンジュゲートと
、式Hを有する実施形態12に従うコンジュゲートの混合物を含む組成物に関する。この
実施形態の特定の態様では、前記混合物は、1:1のモル比の式Gのコンジュゲートと式
Hのコンジュゲートである。
AHA−(200−308)−hGDF15(配列番号7)は、未変性タンパク質内に
認められるクリッピング部位、ならびに潜在的なメチオニン(M1)ホルミル化部位およ
びN−199アミド分解部位が除去されるように設計した。AHAの優れた質および均一
性は、hGDF15未変性配列内に認められたクリッピング、アミド分解、またはメチオ
ニン酸化が、材料品質検査によって示されなかったことにより確認された。
実施形態14において、本発明は、前記脂肪酸残基が、前記ペプチドまたはタンパク質
のN末端にリンカーを介して付着している、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジ
ュゲートに関する。実施形態15において、本発明は、血漿安定性半減期が5時間を超え
る、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。この実施形態の一態
様では、前記コンジュゲートは、10時間を超える血漿安定性半減期を有する。この実施
形態の別の態様では、前記コンジュゲートは、20時間を超えるまたは30時間を超える
血漿安定性半減期を有する。この実施形態のさらに別の態様では、前記コンジュゲートは
、40時間を超えるまたは50時間を超える血漿安定性半減期を有する。
実施形態16において、本発明は、コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安
定性半減期の向上が、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または7
5倍である、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートに関する。
別の実施形態では、前記生体分子、前記リンカー、および前記脂肪酸部分(R〜R
、n、m p、およびAk)は、以下の実施例の部において定めるものである。
一実施形態では、本発明は、式:
[Rは、COHまたはHであり、
およびRは、互いに独立して、H、OH、COH、−CH=CH、または−C
≡CHであり、但し、RおよびRは、同一でなく、
は、COHであり、
nおよびmは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]の化合物、またはそのアミ
ド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩に関する。この実施形態の別の態様では、
本発明は、RおよびRの少なくとも一方がCOHである、式A1の化合物に関する
。この実施形態のさらに別の態様では、本発明は、
からなる群から選択される化合物に関する。
ペプチド/ポリペプチドおよび/またはその修飾形態の合成
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれか
によって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。ペプチドまたはポリ
ペプチド/タンパク質構築物は、全長として生成してもよいし、または全長でない断片と
して合成し、つないでもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド合成の
ための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方
法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよ
びポリペプチドは、タンパク質を構成しうる部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部
と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製
造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献(1)〜(5
)に記載の手順が挙げられる。
(1)M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers
, New York, 1966、
(2)Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
(3)Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Ma
ruzen, 1975、
(4)Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Pr
otein Chemistry IV, 205, 1977、および
(5)Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesi
s, Hirokawa Shoten
反応後、ペプチドまたはポリペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体
クロマトグラフィー、サイズ排斥クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述の
ように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な
塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によっ
てペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。
ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得るこ
とができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリル
アミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−
ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc
−アミノメチル)フェノキシ樹脂、塩化2−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。この
ような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ
酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹
脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から
外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチ
ドを得る。
上述の保護されたアミノ酸の縮合には、HATU、HCTU、またはたとえばカルボジ
イミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイ
ミドとしては、DCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびN−エチル−
N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を
用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、HOBtまたはOxyma Pur
eを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と
共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、HOBtエステル、または
HOOBtエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ
酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわ
かっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、N,N−ジメチルホル
ムアミド、N−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルス
ルホキシド、DMF、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセ
トニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。反応温度
は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択すること
ができ、普通は、約−20℃〜50℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、
一般に、1.5〜4倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって
、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せず
に、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の
縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでア
セチル化することができる。
出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Z、Boc、第三級アミルオキシカル
ボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、CI
−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホ
ルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはFm
ocが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、
上述のC1〜6アルキル、C3〜8シクロアルキル、およびC6〜10アリール−C1〜
アルキル、ならびに2−アダマンチル、4−ニトロベンジル、4−メトキシベンジル、
4−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキ
シカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。
セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護
することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば
、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、
ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に
適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる
。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Bzl、Cl−Bzl、
2−ニトロベンジル、Br−Z、および第三級ブチルが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、4−メトキシ−2,3,6−ト
リエチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt
、およびFmocが挙げられる。
出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活
性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、
2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、p−ニトロフェノール、HON
B、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBtなどのアル
コールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホ
スホルアミドが挙げられる。
保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下
で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタ
ンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピ
ルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモ
ニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一
般に、−20℃〜40℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、
m−クレゾール、p−クレゾール、硫化ジメチル、1,4−ブタンジチオール、1,2−
エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒス
チジンのイミダゾール基の保護に使用した2,4−ジニトロフェニル基は、チオフェノー
ルでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用
したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理
、ならびに1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオール存在下での上述の酸処
理によって脱離させることができる。
出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、
保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の
基および方法の中から公正に選択することができる。
アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、C末端アミノ酸の−カルボキシル基を最初
にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までN側に伸長し、次いで、
C末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるア
ミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ
基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている2つの断片を、上で挙げたも
のなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述
したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によって
すべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチ
ドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプ
チドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、C末端アミノ酸のa−カ
ルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド
生成について上述した手順に従う。
別法として、組換え発現法が特に有用である。宿主細胞(ペプチドの配列をコードする
核酸を含むように人工的に操作されており、転写および翻訳を行い、場合によりペプチド
を細胞成長培地に分泌する細胞)を使用する組換えタンパク質発現は、当業界で日常的に
使用される。組換え生成法については、通常、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸
が、従来の方法によって合成され、発現ベクターに組み込まれることになる。このような
方法は、追加のペプチド配列または他のタンパク質もしくはタンパク質断片もしくはドメ
インに融合したペプチドを含むポリペプチド組成物の製造に特に好ましい。宿主細胞は、
場合により、大腸菌(E.Coli)、COS−1、COS−7、HEK293、BHT21、
CHO、BSC−1、Hep G2、653、SP2/0、293、heLa、骨髄腫、
リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは植物細胞、またはこれらのいずれかの派生、不死化、も
しくは形質転換細胞から選択される少なくとも1種でよい。
本発明はまた、RNAの形でも、またはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを
含めたDNAの形でもよい、上述の変異体をコードするポリヌクレオチドも包含する。D
NAは、二本鎖でも一本鎖でもよい。本発明の組成物をコードするコード配列は、遺伝暗
号の冗長性または縮重の結果として様々となりうる。
本発明の組成物をコードするポリヌクレオチドには、次のもの、すなわち、変異体のコ
ード配列のみ;変異体のコード配列と、機能ポリペプチドやリーダーもしくは分泌配列ま
たはプロタンパク質配列などの追加のコード配列;変異体のコード配列と、変異体のコー
ド配列の5’および/または3’側のイントロンや非コード配列などの非コード配列を含
めることができる。したがって、用語「変異体をコードするポリヌクレオチド」は、変異
体のコード配列だけでなく、追加のコード配列および/または非コード配列を含むポリヌ
クレオチドも含みうる、ポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに、示された置換を含んでいる、ポリペプチドの断片、類似体、および誘
導体をコードする、記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異
体は、上述のとおり、ヒトGDF15配列の自然に存在するアレル変異体、自然に存在し
ない変異体、または切断型変異体でよい。したがって、本発明は、上述の変異体をコード
するポリヌクレオチド、ならびに開示された変異体の断片、誘導体、または類似体をコー
ドする、そのようなポリヌクレオチドの変異体も包含する。このようなヌクレオチド変異
体には、第1または第2の実施形態の、示されたアミノ酸置換の少なくとも1つが存在し
さえすれば、欠失変異体、置換変異体、切断型変異体、および付加または挿入変異体が含
まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、配列を発現制御配列に作動可能に連結(すなわち、それ
が確実に機能するように配置)した後、宿主中で発現させることができる。こうした発現
ベクターは、通常、宿主生物中で、エピソームとして、または宿主染色体DNAの一体部
分として複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換され
た細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、たとえば、テトラサイクリン、ネオマ
イシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含む。GDF15変異体は、哺乳動物細胞、昆虫
、酵母、細菌細胞、または他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現させる
ことができる。本発明のDNA構築物から得られたRNAを使用する、無細胞翻訳系を用
いて、このようなタンパク質を生成することもできる。
大腸菌(Escherichia Coli)(E. coli)は、特に本発明のポリヌクレオチドのクロー
ン化に有用な、原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主として、枯草菌(Baci
llus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにセラチア属(S
erratia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、連鎖球菌属(Streptococcus)、および
ブドウ球菌属(Staphylococcus)の種々の種が挙げられるが、選択できるものとして、他
の微生物宿主を用いてもよい。こうした原核生物宿主では、宿主細胞と適合しうる発現制
御配列(たとえば、複製開始点)を通常含んでいる発現ベクターも作製することができる
。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、β−
ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλもしくはT7からのプロモーター系など
の、よく知られたいくつかのプロモーターのいずれかが存在してもよい。プロモーターは
通常、転写および翻訳を開始し、完了するために、場合によりオペレーター配列と共に発
現を制御し、リボソーム結合部位配列などを備えている。
タンパク質発現の分野の技術者なら、大腸菌(E. coli)中での発現については、成熟
配列のN末端に、メチオニンまたはメチオニン−アルギニン配列が導入される場合があり
、本発明の文脈の範囲内で予期されることを認識されよう。したがって、別段注釈を加え
ない限り、大腸菌(E. coli)中で発現させた本発明の組成物は、N末端に導入されたメ
チオニン配列を有する。
酵母や真菌などの他の微生物も、発現に使用してよい。ピキア・パストリス(Pichia p
astoris)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces p
ombe)、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)が、好ましい酵母宿主の例であり、適切
なベクターは、望み通りに、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を始め
とするプロモーターや複製開始点などの発現制御配列、停止配列などを有する。クロコウ
ジカビ(Aspergillus niger)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、およ
びスエヒロタケ(Schizophyllum commune)が真菌宿主の例ではあるが、選択できるもの
として、他の真菌宿主も用いてよい。
哺乳動物組織細胞培養も、本発明のポリペプチドの発現および生成に使用することがで
きる。無傷の変異体を分泌しうるいくつかの適切な宿主細胞系が当業界で開発されており
、CHO細胞系、種々のCOS細胞系、NSO細胞、シリアンハムスター卵巣細胞系、H
eLa細胞、またはヒト胎児由来腎臓細胞系(すなわち、HEK293、HEK293E
BNA)が挙げられる。
哺乳動物細胞用の発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーなどの発
現制御配列、およびリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位な
どの必要なプロセシング情報部位、および転写停止配列を含む場合がある。好ましい発現
制御配列は、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイル
ス、ラウス肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部
位としては、SV40およびウシ成長ホルモン由来の配列が挙げられる。
対象となる(たとえば、本発明の組成物および発現制御配列をコードする)ポリヌクレ
オチドを含んでいるベクターは、細胞宿主の種類に応じて様々となる、よく知られた方法
によって、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。たとえば、原核細胞には、塩
化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるのに対し、他の細胞宿主には、リン
酸カルシウム処理または電気穿孔法を使用することができる。
種々のタンパク質精製法を用いることができ、そのような方法は、当業界で知られてお
り、たとえば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990)およびScopes, Pro
tein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982)に記載され
ている。選択される精製ステップは、たとえば、本発明の組成物に使用された生成方法の
性質に応じて決まる。
ポリペプチドは、(たとえば、他のポリペプチドを含まない)実質的に純粋または単離
された形で調製することができる。ポリペプチドは、存在しうる他の成分(たとえば、他
のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分)に比べてポリペプチドが富化されている組成物
として存在する場合もある。たとえば、他の発現タンパク質を実質的に含まない、たとえ
ば、他の発現タンパク質が組成物の90%未満、60%未満、50%未満、40%未満、
30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満しか占めていない組成
物としてポリペプチドが存在するような、精製ポリペプチドを提供することができる。
脂肪酸部分の合成
スキーム1に、式A2の脂肪酸部分の合成について記載する。
式中、PおよびPは、カルボン酸保護基、たとえば、メチル、エチル、tert−ブ
チル、メトキシベンジル、ベンジル、ベンジルオキシ、メトキシメチル、メチルチオメチ
ル、テトラヒドロピラニル、フェナシル、N−フタルイミド、シンナミル、トリフェニル
メチル、9−アントリルメチル、ピペロニル、トリメチルシリル、t−ブチルジメチルシ
リル、または2−アルキル1,3オキサゾリンであり、LGは、脱離基、たとえば、ハロ
(たとえば、Br、Cl、I)またはトリフルオロメタンスルホニルオキシであり、R
およびpは、実施形態1に記載のとおりである。
DMF、THF、ジメチルアセトアミドなどの溶媒中にて、塩基(たとえば、水素化ナ
トリウム、炭酸カリウムもしくは炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、リチウムジイソプロ
ピルアミド、ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド、カリウムビス(トリメチルシ
リル)アミド、リチウムテトラメチルピペリジド、1,8−ジアアザシクロウンデカ−7
−エン、N,N−ジイソプロピルエチルアミン、または2,6−ジt−ブチルプトリジン
)の存在下、保護されたマロン酸(1A)をアルキル化剤(1B)でアルキル化すると、
保護された脂肪酸部分(1C)が生成される。RがOHまたはCOHであるとき、ア
ルキル化ステップの前に、これらの官能基の保護が必要となる場合もある。ヒドロキシル
のための保護基は、当業界で知られており、たとえば、1.メチルエーテル、メトキシメ
チルエーテル(MOM)、テトラヒドロピラニルエーテル(THP)、t−ブチルエーテ
ル、アリルエーテル、ベンジルエーテル、t−ブチルジメチルシリルエーテル、t−ブチ
ルジフェニルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、イソプロピルジメチルシリ
ルエーテル、トリフェニルメチルエーテル、ニトロベンジルエーテルなどの、エーテル、
2.酢酸エステル、ギ酸エステル、トリクロロ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、
ピバル酸エステル、安息香酸エステル、メチルカーボネート、ベンジルカーボネート、ア
リルカーボネート、硝酸エステル、アダマン酸エステル(adamanoate ester)、ニトロフ
ェニルカーボネートなどの、エステルおよびカーボネートである。
式A2の脂肪酸部分は、適切な脱保護法を使用して脱保護することにより得られる。限
定はしないが、NaOH、KOH、もしくはLiOHから選択される塩基、または限定は
しないが、TFA、HCl、もしくはBClから選択される酸を使用する、中間体(1
C)の加水分解には、標準の方法を適用することができる。PまたはPが、ベンジル
またはメトキシベンジルであるとき、好ましい脱保護方法は、限定はしないがパラジウム
炭素などの、触媒存在下での水素化である。
スキーム2に、RがC(O)Hである式Aの脂肪酸部分の合成を図示する。
式中、PおよびP、LGは、上で規定したとおりであり、R、R、n、およびm
は、実施形態1で規定したとおりである。
保護されたマロン酸(1A)は、スキーム1において上述した適切な方法を使用する脱
保護の前に、アルキル化剤(2A)および(2C)による2つのアルキル化に続けてかけ
られるが、この順序は逆にすることもできる。RおよびRがOHまたはCOHであ
るとき、アルキル化ステップの前に、これらの官能基の保護が必要となる場合もある。
がHである式Aの脂肪酸部分は、R1がCO2Hである、対応する式Aの脂肪
酸部分の脱炭酸によって調製することができる。塩基性条件(たとえば、水酸化アンモニ
ウム)下での脱炭酸などの脱炭酸条件が、当業界でよく知られている。
生体分子−リンカー構築物の合成
式中、Bは、生体分子またはその修飾形態であり、Zは、C〜C20アルキレンリン
カーであり、アルキレン鎖は、オキソ(=O)で場合により置換されており、1つまたは
複数の炭素は、OまたはNHで置き換えられており、C1は、フッ素で場合により置換さ
れている、単環式、二環式、もしくは三環式の炭素環またはヘテロ環系である。
標準のアミドカップリング法を使用して、シクロアルキン(3B)を、生体分子(3A
)のアミノ残基(たとえば、N末端またはリシン側鎖のアミノ官能基)に、そのカルボン
酸反応性基を介して付着させる。限定はしないが、中間体(3B)をその活性化型に変換
[たとえば、(標準のN−ヒドロスクシンイミド化学を使用して)対応するピロリジン−
2,5−ジオンに変換、トリホスゲン、カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸4−ニト
ロフェニル、またはジスクシンイミジルカーボネートなどの試薬を使用して酸(3B)を
変換、塩化チオニルや塩化オキサリルなどの試薬を使用して酸(3B)を対応する酸ハロ
ゲン化物に変換、またはClC(O)O−イソブチル、2,4,6−トリクロロベンゾイ
ルクロリド、プロピルホスホン酸無水物環状三量体(T3P)などの試薬を使用して酸(
3B)を対応する混合無水物に変換した後、オキサゾリジン2,5−ジオン、酸ハロゲン
化物、または混合無水物を]、第三級アミン(たとえば、トリエチルアミンまたはN,N
−ジイソプロピルエチルアミン)やKCOなどの塩基の存在下または非存在下で生体
分子(3A)と反応させることを含めて、既知のカップリング方法を適用することができ
る。別法として、限定はしないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソ
プロピルカルボジイミド(DIC)、1−エチル3−(3−ジメチルアミノプロピル)カ
ルボジイミド塩酸塩(EDC HCl)、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリ
ス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、またはベン
ゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサ
フルオロホスフェート(BOP)を始めとするペプチド縮合試薬を、1−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール、ジメチルアミノピリジ
ンなどの試薬の存在下または非存在下で使用して、生体分子3Aを酸3Bと結合させるこ
ともできる。シクロアルキン/酸中間体(3B)は、NHS化学を使用してその活性化型
に変換してから、生体分子上のアミノ官能基と反応させることが好ましい。
生体分子のN末端にあるアミノ官能基の選択的なアシル化は、同時出願された米国特許
出願公開第62/015,858号明細書(代理人案件整理PAT056275−US−
PSP)および国特許出願公開第62/082,337号明細書(代理人案件整理番号P
AT056275−US−PSP02)において、開発および報告がなされている。
選択的なアシル化は、NHSによって活性化されたシクロオクチン類似体((3B)の
NHS誘導体)を、N末端アミノ酸に近接するヒスチジンアミノ酸を含むようにN末端が
修飾されている生体分子と反応させるものである。反応は、pH4で実施すると、ヒスチ
ジンアミノ酸の隣接効果の存在によって、N末端にあるアミノ官能基に高度に選択的にな
る。
脂肪酸残基リンカー構築物の合成
クリックケミストリーのための脂肪酸−リンカー構築物
スキーム4に、末端アジド官能基を用いた脂肪酸PEGリンカー構築物の合成を記載す
る。
式中、yは、0〜34であり、FAは、そのカルボン酸官能基の1つを介してPEGリン
カーに付着している、式A1、A2、またはA3に記載のとおりの脂肪酸部分であり、F
Aは、次式を有する。
アミドカップリング反応によって、脂肪酸部分(4B)を、PEGを含んでいるリンカ
ー(4A)に付着させる。既知のカップリング法については、上でスキーム3において詳
述している。脂肪酸部分上の酸官能基は、NHS化学を使用して活性化させることが好ま
しい。
がCOHであり、R、R、およびRが、COHまたはOHである場合、
反応性部位を制御するために、カップリング反応の前に、保護基を導入する必要があるこ
ともある。カルボン酸およびヒドロキシ基のための保護基は、上でスキーム1に記載して
いる。別法として、カルボン酸の選択的な活性化は、NHS化学を使用して実現すること
もできる。
対象となる生体分子に直接付着させるための脂肪酸−リンカー
スキーム5に、末端CO2H官能基を用いた脂肪酸PEGリンカー構築物の合成を記載
する。
式中、FAは、上でスキーム4において規定したとおりであり、yは、0〜34である。
上述のアミドカップリングを使用して、脂肪酸(4B)を、PEGを含んでいるリンカ
ー(5A)に付着させることができる。
対象となる生体分子に、トランスグルタミナーゼ酵素を使用して付着させるための脂肪酸
−リンカー構築物
スキーム5Aに、トランスグルタミナーゼ酵素を使用するとリシンの部位選択的修飾が
可能になる、グルタミン酸アミノ酸を含んでいる脂肪酸−リンカー構築物の調製を記載す
る。
式中、yおよびFAは、予め規定したとおりである。このような構築物では、リシン側鎖
上のアミノ基の選択的な部位修飾が可能になる。タンパク質のこのトランスグルタミナー
ゼ選択的部位修飾は、2013年7月11日出願の米国特許出願公開第61/845,2
73号明細書(代理人案件整理番号PAT055641−US−PSP)に記載されてい
る。
本発明のコンジュゲートの合成
クリックケミストリーを使用するコンジュゲーション
式中、Bは、対象となる生体分子またはその修飾形態(たとえば、突然変異体、またはヒ
スチジンタグを含んでいる生体分子)であり、y、C1、Z、FA、およびyは、上で
規定している。
シクロアルキン構築物(3C)は、一般的にはクリックケミストリーとして知られてい
る、脂肪酸−リンカー構築物(4C)の末端アジドとのHuisgen付加環化を経る。
クリックケミストリーの例は、US2009/0068738に記載されている。
カップリング条件を使用して直接付着させることによるコンジュゲーション
式中、Bは、対象となる生体分子またはその修飾形態(たとえば、突然変異体、および/
またはヒスチジンタグを含んでいる生体分子)であり、脂肪酸−リンカー構築物は、生体
分子のN末端に付着している。
標準のアミドカップリング法を使用して、脂肪酸−リンカー構築物(5B)を、生体分
子(3A)のアミノ残基(たとえば、N末端またはリシン側鎖のアミノ官能基)に、その
カルボン酸反応性基を介して付着させる。既知のカップリング法については、上でスキー
ム3において詳述している。脂肪酸−リンカー構築物上の酸官能基は、NHS化学を使用
して活性化させることが好ましい。
生体分子のN末端にあるアミノ官能基の選択的なアシル化は、同時出願された米国特許
出願公開第62/015,858号明細書(代理人案件整理PAT056275−US−
PSP)および米国特許出願公開第62/082,337号明細書(代理人案件整理番号
PAT056275−US−PSP02)において、開発および報告がなされている。選
択的なアシル化は、NHSによって活性化された化合物((5B)のNHS誘導体)を、
N末端アミノ酸に近接するヒスチジンアミノ酸を含むようにN末端が修飾されている生体
分子と反応させるものである。反応は、pH4で実施すると、ヒスチジンアミノ酸の隣接
効果の存在によって、N末端にあるアミノ官能基に高度に選択的になる。
トランスグルタミナーゼ酵素を使用するコンジュゲーション
生体分子のそのリシン側鎖における選択的な修飾は、トランスグルタミナーゼ酵素を使
用して実現することができる。このような修飾は、2013年7月11日出願の米国特許
出願公開第61/845,273号明細書(代理人案件整理番号PAT055641−U
S−PSP)または国際公開第2015/006728号パンフレット(この出願の実施
例25)で報告されている。
医薬組成物
本発明のコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入、鼻腔内、経口など
を始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好まし
い実施形態では、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩の
連続的な静脈内投与を用いる。本発明におけるコンジュゲートは、ボーラスとして、また
は一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用して
もよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲート投与を
、1日〜数日間(たとえば、2〜3日間以上)またはより長期間、たとえば、数週間、数
か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なコンジュゲ
ート投与を少なくとも約3日間、好ましくは少なくとも約6日間施す。別の実施形態では
、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約1週間施す。他の実施形態で
は、断続的または連続的なコンジュゲート投与を少なくとも約2週間施す。投与中または
複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿コンジュゲート濃度を維持すること
が望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度など
に基づき決定することができる。そのような望ましい値(複数可)は、標準の臨床試験を
実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、Fc
Rn機序によって、経口的に送達することができるはずである(Nat Rev Immunol. 7(9),
715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physio
l 304: G262-G270, 2013)。
別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、も
しくは塩と、1種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、経口投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製
剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態(限定はせず、カプセ
ル剤、錠剤、丸剤、顆粒、凍結乾燥剤、粉末、または坐剤を含める)、または液体形態(
限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含める)に仕立てることができる。医薬組成
物は、無菌製造、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ/または、従来の
不活性希釈剤、膜形成剤、等張化剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、
湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。
注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するた
めの、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液と滅菌粉末を含む。
静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Cremopho
r ELTM(BASF、ニュージャージー州Parsippany)、またはリン酸緩
衝食塩水(PBS)が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであ
り、容易な注射適用性(syringability)が存在する程度に流動的にすべきである。好ま
しい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物によ
る汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、
エタノール、ポリオール(たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエ
チレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよ
い。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合で
は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物に
よる作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノー
ル、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多
くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、アミノ酸、ソ
ルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延
長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成
物に含めることにより実現できる。一部の実施形態では、コンジュゲート生成物の分解ま
たは凝集に対する安定化を促進し、可溶性を改善し、投与および活性化合物の放出を支援
するために、組換えアルブミンなどの多機能賦形剤を製剤工程に織り込んでもよい(BioP
harm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44)。
ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の
乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ/ま
たは保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤(solution promoter)、浸透圧調節
用の塩、および/または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は
、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、または
コーティング法に従って調製され、それぞれ、約0.1〜75%、または約1〜50%の
活性成分を含有する。
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の1つまたは組合せを含有する適切
な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散
液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する
滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するた
めの滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法
では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得
られる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療的経口投与の目的で
は、活性化合物は、賦形剤と混ぜ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラ
チンカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、含嗽液として使用するため
に流動性担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および/また
は佐剤材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トロ
ーチ剤などは、次の成分、すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチン
などの結合剤、デンプンやラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、コ
ーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムやSterotesなどの滑沢剤
、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースやサッカリンなどの甘味剤、ま
たはハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの着香剤のいずれか、または同様の性
質の化合物を含有してよい。経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を向上させ、かつ
/または吸収を強化するための薬剤が組み込まれていると有利な場合もある。
吸入による投与について、発明治療薬は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの
気体を含有する加圧容器もしくは計量分配装置、またはネブライザーから、エアロゾルス
プレーの形で送達することが好ましい。治療薬の全身送達のために、肺が広い表面積を備
えていることは注目される。
薬剤は、たとえば、米国特許出願公開第2004/0096403号明細書に記載のも
のなどのポリマー系微小粒子に、または当業界で知られている他の広範な薬物送達ビヒク
ルのいずれかと共同して、カプセル封入することができる。本発明の他の実施形態では、
たとえば、米国特許出願公開第2004/0062718号明細書に記載されているよう
に、薬剤を荷電脂質と共同して送達する。後者の系は、治療用ポリペプチドであるインス
リンの投与に使用されており、ペプチド剤の投与についてこの系の実益を示していること
が注目される。
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。
経皮的適用に適する組成物は、有効量の本発明のコンジュゲートを適切な担体と共に含
む。経皮送達に適する担体として、ホストの皮膚を介した透過を手助けする薬理学的に許
容される被吸収性溶媒が挙げられる。経皮的デバイスは、たとえば、裏部材と、化合物を
場合により担体と共に含有するレザバーと、場合により、ホストの皮膚の化合物を、長期
間にわたって、制御され、予め決められた速度で送達するための速度制御バリアと、デバ
イスを皮膚に固定するための手段とを備えた絆創膏の形態である。
たとえば皮膚および眼への局所適用に適する組成物には、水溶液、懸濁液、軟膏、クリ
ーム、ゲル、または、たとえばエアロゾルなどによる送達のためのスプレー製剤が含まれ
る。このような局所送達系は、特に、皮膚への適用に相応しくなる。すなわち、こうした
局所送達系は、当業界でよく知られている美容製剤を含めた局所的使用に特に適する。こ
のような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤(tonicity enhancing agent)、緩衝
剤、および保存剤を含有してもよい。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用である。ポリペプチド治療薬(た
とえば、抗体、融合タンパク質など)の皮下投与に適する製剤成分および方法は、当業界
で知られている。たとえば、米国特許出願公開第2011/0044977号明細書、米
国特許第8,465,739号明細書、および米国特許第8,476,239号明細書を
参照されたい。通常、皮下投与用の医薬組成物は、適切な安定剤(たとえば、メチオニン
などのアミノ酸、およびまたはスクロースなどの糖)、緩衝剤、および等張化剤(tonici
fying agent)を含有する。
本明細書で使用するとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連することがある
。こうした適用は、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末(単独、混合物、たとえばラクトースと
の乾燥ブレンドとして、またはたとえばリン脂質との混合型要素粒子としてのいずれか)
の形で、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーから
エアロゾルスプレー体裁の形で、適切な噴射剤を使用しまたは使用せずに、好都合に送達
することができる。
本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する1種また
は複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、
そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、pH緩衝液
、または塩緩衝液、組換えアルブミンが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のコンジュゲー
トの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を
指す。多くの場合、本発明のコンジュゲートは、アミノ基および/もしくはカルボキシル
基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および/または塩基の塩を形成すること
ができる。
薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベ
シル酸塩、臭化物/臭化水素酸塩、炭酸水素塩/炭酸塩、硫酸水素塩/硫酸塩、カンファ
ースルホン酸塩、塩化物/塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩(chlortheophyllonate)、
クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グル
クロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩/ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビ
オン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メ
シル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタ
デカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩/リン酸
水素塩/リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コ
ハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、
無機酸および有機酸に対して生成することができる。
塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リ
ン酸などが挙げられる。
塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸
、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸
、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリ
チル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に
対して生成することができる。
塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表の
I〜XII列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウ
ム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特
に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシ
ウム塩が挙げられる。
塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級ア
ミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交
換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチ
ン、コリネート(cholinate)、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグル
ミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。
本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性また
は酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした
化合物を化学量論量の相応しい塩基(Na、Ca、Mg、またはKの水酸化物、炭酸塩、
炭酸水素塩など)と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相
応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒
中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル
、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望
ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences
”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWer
muthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (
Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られている
であろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、
保存剤(たとえば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬
物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素、組換えアルブミン
などの多機能賦形剤など、およびこれらの組合せを包含する(たとえば、Remington’s P
harmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参
照されたい)。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治
療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。
本発明の方法
GDF15循環レベルは、いくつもの病的および生理的状態において、最も顕著な例と
しては、妊娠(Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788)、β−サラセ
ミア(Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101)(Zimmermann MB, 2008 Am J Clin Nutr 88
:1026-31)、および先天性赤血球異形成貧血(Tamary H 2008, Blood. 112:5241-4)にお
いて、上昇することが報告されている。GDF15は、文献の報告において、いくつもの
生物学的活性と関連付けられている。GDF15ノックアウトおよびトランスジェニック
マウスの研究では、GDF15が、虚血/再潅流または過負荷によって誘発された心臓損
傷に対しては保護的に(Kempf T, 2006, Circ Res.98:351-60)(Xu J, 2006, Circ Res.
98:342-50)、加齢と関連する運動ニューロンおよび感覚ニューロン減少に対しては保護
的に(Strelau J, 2009, J Neurosci. 29 : 13640-8)、腎臓における代謝性アシドーシ
スに対しては穏やかに保護的になる場合があり、がん患者においては悪液質を引き起こす
場合がある(Johnen H 2007 Nat Med. 11: 1333-40)ことが示唆された。多くのグループ
によって、細胞アポトーシスおよび増殖におけるGDF15の役割も研究されており、異
なる細胞培養および異種移植片モデルが使用されて、議論を呼ぶ結果が報告された。トラ
ンスジェニックマウスでの研究では、GDF15が、発癌物質またはApe突然変異によ
って誘発された、腸および肺における新形成に対して保護的であることが示された(Baek
SJ 2006, Gastroenterology. 131: 1553-60、Cekanova M 2009, Cancer Prev Res 2:450
-8)。
GDF15は、炎症、がん、および代謝においても役割を果たすことが報告されている
(Samule Breit et al. Growth Factors, October 2011; 29(5): 187-195)。GDF15
はさらに、生理的食欲および体重の調節との関連も示唆されている(Vicky Wang-Wei Tsa
i et al. Public Library of Science: PLOS ONE 2013, Vol. 8, Issue 2, e55174)。
本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、糖尿病、2型真性糖尿病、肥満、膵炎、
異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、および他の
進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリッ
ク症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全
、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓病を含める)、ニューロパシー
、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を、それを必要とする対象において治療または予
防する方法であって、治療有効量の本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステ
ル、もしくは塩、またはコンジュゲートの混合物を前記対象に投与することを含み、前記
生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変異体、
断片、および他の修飾形態である、方法を提供する。
このような方法は、たとえば、投与頻度を減らすなどの有利な効果をもたらす場合もあ
る。
したがって、さらなる実施形態として、本発明は、代謝性障害または疾患、すなわち、
2型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝
疾患/脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐
糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症
、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓
病を含める)、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害を治療するための
、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変
異体、断片、および他の修飾形態である、本明細書に記載のとおりのコンジュゲート、ま
たはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、または本明細書に記載のコ
ンジュゲートの混合物の使用を提供する。
したがって、さらなる実施形態として、本発明は、コンジュゲート、またはそのアミド
、エステル、もしくは薬学的に許容される塩、またはコンジュゲートの混合物の、治療に
おける使用を提供する。
治療に用いる本発明の医薬組成物または併用品の有効量は、たとえば、治療の状況およ
び目的に応じて決まる。当業者なら、治療に適した投与量レベルは、したがって、ある程
度、得られた分子、コンジュゲートを使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ
(体重、体表面、または臓器サイズ)および状態(年齢および総体的な健康)に応じて様
々となることは理解されよう。それに応じて、臨床家は、最適な治療効果が得られるよう
に、投与量を漸増し、投与経路を修正することができる。典型的な投与量は、上で言及し
た要素に応じて、約0.1μg/kgから約100mg/kgまで、またはそれ以上の範
囲となりうる。他の実施形態では、投与量は、0.1μg/kgから約100mg/kg
まで、または1μg/kgから約100mg/kgまでの範囲となりうる。この実施形態
のさらなる態様では、投与量は、5μg/kg〜25μg/kgの範囲となりうる。この
実施形態のさらに別の態様では、投与量は、10μg/kg〜20μg/kgの範囲とな
りうる。
投与の頻度は、使用される製剤中の二重機能タンパク質の薬動学パラメーターに応じて
決まる。通常、臨床家は、組成物を、所望の効果が実現される投与量に達するまで投与す
る。したがって、組成物は、一用量として、(所望の分子を同じ量含有する場合もあれば
、そうでない場合もある)2回分以上の用量として徐々に、または埋め込み装置もしくは
カテーテルによる継続的な注入として、投与される場合がある。適切な投与量のさらなる
改善は、当業者によって型通りになされ、当業者が日常行う職務の範囲内である。適切な
投与量は、適切な用量−反応データを使用して突き止めることができる。
本明細書で使用する用語「治療有効用量」および「治療有効量」とは、研究者、医師、
または他の臨床家の探究の対象である組織系、動物、またはヒトにおいて、治療される疾
患または障害の症状の緩和または改善を含む生物学的または薬用反応を誘発するコンジュ
ゲートの量、すなわち、1つまたは複数の所望の生物学的または薬用反応、たとえば、血
糖、インスリン、トリグリセリド、またはコレステロールレベルを低下させる、体重を減
少させる、食物摂取を減らす、または耐糖能、エネルギー消費、もしくはインスリン感受
性を改善することを観察可能なレベルで支持する、GDF15(またはGDF15突然変
異体)ポリペプチドコンジュゲートの量を意味する。
用語「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物(たとえば哺乳動物)を指すの
に、互換的に使用される。
本明細書で使用するとき、いずれかの疾患または障害の「治療(treat、trea
ting、またはtreatment)」という用語は、一実施形態では、疾患または障
害を改善する(すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも1つの進展を緩慢にし、
阻止し、または軽減する)ことを指す。別の実施形態では、「治療(treat、tre
ating、またはtreatment)」とは、患者によって認識可能でなくてよいも
のを含めて、少なくとも1つの身体的パラメーターを緩和または改善することを指す。さ
らに別の実施形態では、「治療(treat、treating、またはtreatme
nt)」は、疾患または障害を、身体的に(たとえば、認識可能な症状の安定化)、生理
学的に(たとえば、身体的パラメーターの安定化)、または両方において、調節すること
を指す。したがって、治療は、活動性の疾患を(たとえば、GDF15コンジュゲートの
場合では、体重が減少するように、食物摂取を減らすために、血流中のインスリンおよび
/もしくはグルコースのレベルを低下させるために、耐糖能を向上させるためにグルコー
スレベルの変動が最小限に抑えられるように、かつ/またはグルコース恒常性の混乱によ
って引き起こされる疾患から保護されるように)抑制する(すなわち、疾患、障害、もし
くは状態、またはそれに伴う臨床症状の発症またはそれ以上の進展を阻止する)ことを包
含する。
さらに別の実施形態では、「治療(treat、treating、またはtreat
ment)」は、疾患または障害の発症、進展、または進行を予防するまたは遅らせるこ
とを指す。
本明細書で使用する用語「治療を必要とする」とは、医師または他の医療従事者(care
giver)によってなされる、対象にとって治療が必要であるまたは恩恵となるかどうかの
判断を指す。この判断は、医師または医療従事者の専門知識の範囲内にある様々な要素に
基づいてなされる。
用語「予防(prevent、preventing、prevention)」など
は、(たとえば、臨床症状の存在によって明らかにされるような)対象が疾患、障害、状
態などになるリスクを一時的もしくは永続的に予防、抑制、抑止、もしくは低減し、また
は、一般に、特定の疾患、障害、もしくは状態になる素因のある対象に関して、その発症
を遅らせるような形で(たとえば、疾患、障害、状態、またはその症状の発症の前に)開
始される、(本発明のコンジュゲートまたはコンジュゲートを含む医薬組成物を投与する
などの)行動の過程を指す。ある特定の例では、この用語は、疾患、障害、もしくは状態
の進行を緩慢にする、またはそれが有害もしくは別な形で望ましくない状態へと進行する
のを阻止することも指す。
用語「代謝性疾患または障害」とは、限定はしないが、高インスリン血症、異常な耐糖
能、肥満、腹部または上部身体区画への脂肪の再分布、高血圧;高トリグリセリド、低い
高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール、および高い低密度リポタンパク質(L
DL)粒子を特徴とする異脂肪血症を含む、関連性のある体質群を指す。代謝性疾患また
は障害を有する対象は、2型糖尿病、および、たとえばアテローム性動脈硬化症になるリ
スクがある。
語句「グルコース代謝障害」は、対象において、グルコースレベルおよび/またはイン
スリンレベルが健康な個体に比べて上昇していることと関連する臨床症状または臨床症状
の組合せを特徴とする、いずれかの障害を包含する。グルコースおよび/またはインスリ
ンレベルの上昇は、特に、次の疾患、障害、および状態、すなわち、高血糖、II型糖尿
病、妊娠糖尿病、I型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能の障害、高インスリン血症、グ
ルコース代謝障害、糖尿病前症、代謝性障害(シンドロームXとも呼ばれる代謝性疾患ま
たは障害など)、および肥満において現れる場合がある。本開示のGDF15コンジュゲ
ート、およびその組成物を使用すると、たとえば、グルコース恒常性を実現および/また
は維持して、たとえば、血流中のグルコースレベルを低下させ、かつ/または健康な対象
において見られる範囲までインスリンレベルを低下させることができる。
本明細書で使用する用語「インスリン抵抗性」とは、正常な量のインスリンによって、
正常な生理学的反応または分子反応を引き起こすことができない状態を指す。一部の場合
では、内因的に産生または外因的に投与される生理学的超過量のインスリンによって、全
体または一部においてインスリン抵抗性を克服し、生体反応を引き起こすことができる。
本明細書で使用する語句「耐糖能」とは、グルコース摂取が変動するときに血漿グルコ
ースおよび/または血漿インスリンのレベルを制御しうる対象の能力を指す。たとえば、
耐糖能は、約120分以内に、血漿グルコースのレベルを低下させてグルコース摂取前に
求められたレベルに戻す、対象の能力を包含する。
用語「耐糖能障害」または耐糖能の障害(IGT)は、心血管病態のリスクの増大と関
連付けられる、前糖尿病性の血糖異常(dysglycemia)の状態である。前糖尿病性の状態
によって、対象が、グルコースを細胞に効率よく移動させ、それを効率的な燃料源として
利用することができなくなる結果、血糖レベルが上昇し、ある程度のインスリン抵抗性が
生じる。
用語「2型真性糖尿病」とは、過剰なグルコース産生と、グルコースクリアランスが不
十分であり、膵臓が十分なインスリンを産生できない結果として過度に高いままとなる循
環グルコースレベルとを特徴とする状態である。
本明細書で使用する用語「高血糖」とは、対象の血漿中を循環するグルコースの量が健
康な個体に比べて増加している状態を指す。高血糖は、本明細書に記載するとおりの空腹
時血糖レベルの測定を始めとする、当業界で知られている方法を使用して診断することが
できる。
用語「低血糖(Hypoglycemia)」は、低血糖(low blood sugar)とも呼ばれ、血糖レ
ベルが下がりすぎるあまり、身体活動に十分なエネルギーが提供されないときに起こる。
本明細書で使用する用語「高インスリン血症」とは、循環インスリンのレベルが上昇し
ており、同時に、血糖レベルが上昇しているまたは正常である状態を指す。高インスリン
血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高い低密度リポタンパク質(LDL)、
低い高密度リポタンパク質(HDL)などの異脂肪血症、高い尿酸レベル、多嚢胞性卵巣
症候群、II型糖尿病、および肥満と関連するインスリン抵抗性によって引き起こされる
場合がある。高インスリン血症は、血漿インスリンレベルが約2pU/mLより高いとき
に診断することができる。
用語「膵炎」とは、膵臓の炎症である。
用語「異脂肪血症」とは、リポタンパク質過剰産生または欠乏を含めた、リポタンパク
質代謝の障害である。異脂肪血症は、血液中の、総コレステロール、低密度リポタンパク
質(LDL)コレステロール、およびトリグリセリド濃度の上昇と、高密度リポタンパク
質(HDL)コレステロール濃度の低下とによって顕在化しうる。
用語「脂肪性肝疾患(FLD)」は、脂肪肝としても知られ、トリグリセリド脂肪の大
きな液胞が、脂肪症(すなわち、細胞内における脂質の異常滞留)の過程を経て、肝臓細
胞に蓄積する状態である。原因が多岐にわたるにもかかわらず、脂肪肝は、世界中で過度
のアルコール摂取および(インスリン抵抗性の影響を伴うまたは伴わない)肥満のある者
に起こる、単一疾患とみなすことができる。この脂肪代謝過程が混乱すると、脂肪が過剰
な量で肝臓に蓄積し、その結果、脂肪肝になる場合がある。脂肪の蓄積には、脂肪性肝炎
と呼ばれる、肝臓の進行性の炎症(肝炎)が伴うこともある。アルコールの寄与を考慮に
入れることにより、脂肪肝は、アルコール性脂肪症または非アルコール性脂肪性肝疾患(
NAFLD)、より重症の形態を、アルコール性脂肪性肝炎および非アルコール性脂肪性
肝炎(NASH)と称することもできる。
用語「脂肪性肝炎」とは、小葉内の炎症および線維症を伴った肝細胞の脂肪化を特徴と
するタイプの肝疾患である。過度のアルコール摂取との関連がないとき、脂肪性肝炎は、
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)と呼ばれる。
用語「進行性肝疾患」とは、肝脂肪症のような比較的良性の状態から、肝炎、線維症、
硬変、および肝細胞癌を始めとするより重症の状態へと進行する、広範囲の肝臓病理によ
って引き起こされる肝疾患である。PNPLA3は、NAFLD/NASH、AFLD/
ASH、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス、原発性硬化性胆管
炎などの進行性肝疾患と明確に関連付けられている(Paola Dongiovanni et al. World J
ournal of Gastroenterology, 2013, 19(41), 6969-6978)。
用語「肥満」とは、ヒト対象に関して、体型指数(BMI)が30以上の成人であると
定義することができる(疾病管理センター)。
「メタボリック症候群」は、心疾患、および糖尿病や卒中のような他の疾患のリスクを
高める危険因子群であると定義することができる。こうした危険因子には、高血糖(絶食
後に1デシリットルあたり少なくとも110ミリグラム(mg/dl))、高トリグリセ
リド(血流中に少なくとも150mg/dL)、低HDL(40mg/dl未満)、およ
び130/85mmHg以上の血圧が含まれる(世界保健機関)。
用語「心血管疾患」とは、心臓および血管に関係した疾患である。
用語「アテローム性動脈硬化症」とは、太い動脈および中型サイズの動脈の内膜に不規
則に分布した脂質沈着を特徴とする血管疾患であり、時として動脈の管腔を狭小化させ、
最終的には線維化および石灰化へと進行する。病変は、普通は限局的であり、ゆっくりか
つ断続的に進行する。血流の制限が、大部分の臨床症状発現の原因であるが、病変の分布
および重症度によっていろいろである。
冠動脈疾患とも呼ばれる用語「冠動脈心疾患」とは、心臓に血液および酸素を供給する
細い血管の狭小化である。
「糖尿病合併症」とは、高い血糖レベルによって引き起こされる、腎臓、神経(ニュー
ロパシー)、足(足部潰瘍および循環不良)、眼(たとえば、網膜症)などの、他の身体
機能の問題である。糖尿病は、心疾患ならびに骨および関節障害のリスクも高める。他の
長期的な糖尿病合併症としては、皮膚の問題、消化の問題、性機能不全、ならびに歯と歯
肉の問題が挙げられる。
本明細書で使用するとき、語句「体重障害」とは、体重過多および/または食欲亢進と
関連する状態を指す。対象の年齢、身長、性別、および健康状態を含めた、種々のパラメ
ーターを使用して、対象が、基準の健康な個体に比べて過体重であるかどうかが判定され
る。たとえば、対象の体重(キログラム)を対象の身長(平方メートル)で割ることによ
り算出される、対象の体型指数(BMI)を評価することで、対象を過体重または肥満で
あるとみなすことができる。BMIが−18.5〜−24.9kg/mの範囲にある成人
は、正常な体重であるとみなされ、BMIが−25kg/m〜−29.9kg/mの間で
ある成人は、過体重(肥満予備軍)とみなすことができ、BMIが−30kg/m以上で
ある成人は、肥満であるとみなすことができる。食欲亢進は、往々にして体重過多の一因
となる。たとえば、多くの場合不眠を伴う朝の食欲不振と晩の多食を特徴とするが、視床
下部の傷害と関係がない場合もある、夜間食行動異常症候群を始めとして、食欲亢進と関
連するいくつかの状態が存在する。
本明細書に記載するすべての方法は、本明細書において別段指摘しない限り、または文
脈からそうでないと否定されない限り、適切などの順序で実施してもよい。本明細書で示
される、ありとあらゆる例の使用、または例示的な言い回し(たとえば、「など(suc
h as)」)は、単に本発明をよりよく理解させるためのものであり、別途請求項に記
載する本発明の範囲に限定を設けてはいない。
本発明によるコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次の方法によ
って評価することができる。
アッセイおよびデータ
本発明に従う実施例1および19BのGDF15コンジュゲートの活性および血漿安定
性は、以下に記載する次のin vitroおよびin vivo法によって評価するこ
とができる。
動物研究の方法
本文書に記載するすべての動物研究は、地域および連邦政府の規制および指針に従うN
ovartis Institutes for Biomedical Resear
ch Animal Care and Use Committeeによって承認され
ている。食餌性肥満の雄のマウス(C57BL/6NTac)をTaconicから購入
し、6週齢以後は60%脂肪食(Research Diets D12492i)を与
えた。到着後、マウスは、12時間:12時間の逆の明−暗サイクル下で、1ケージあた
り1匹の動物として収容した。動物はすべて、いかなる使用の前にも、最低1週間は順化
させた。通常、月齢3〜4か月の間のマウスを研究対象とした。研究の1日前に、各群が
同様の平均体重を有するように、マウスを体重に基づきランダム化した。研究当日、マウ
スを新たなケージに入れ、古い食物を取り除いた。およそ1時間後、暗サイクルの直前に
、マウスに、媒体(30mMの酢酸ナトリウム、pH4)または脂質にコンジュゲートさ
せたGDF15類似体(0.5mg/kg)いずれかの一用量を皮下投与した。すべての
注射が完了した後、マウスの体重を計り直し、定められた量の食物を戻した(マウス1匹
あたり約50g)。約2週間にわたり、図に示した時点の食物摂取および体重を測定した
。上述のとおりに処置した代理動物において、示した時点で血漿を採取し、ELISAに
よって、製造者の指示通りにGDF15レベルを測定した(R&D Systems Q
uantikine Human GDF15 Immunoassay、DGD150
)。
DIOマウス0.5mg/kg皮下一用量
本発明のコンジュゲートの活性および半減期を上述のアッセイにおいて試験した。
表1のデータは、本発明のコンジュゲートが、コンジュゲートしていないhGDF15
および/またはpeg化hGDF15に比べて有意に長い作用持続時間を有することを示
している。
固形飼料を与えたイヌにおけるGDF15−コンジュゲートの有効性:GDF15−脂肪
酸コンジュゲート
研究目的:0.05mg/kgの本発明によるGDF15−脂肪酸部分コンジュゲート
または媒体対照の皮下投与が食物摂取に与える効果を、ビーグル犬において、急性の設定
(6時間)および96時間の期間で評価すること。この化合物のPKプロファイルを評価
するために、投与後14日間にかけての異なる時点で、血漿サンプルを採取した。研究の
間終始体重を測定した。
動物:ベースライン体重および処置
投与手順:ベースライン体重および血液サンプルを収集した後に、媒体またはGDF1
5の投与を行った。GDF15−脂肪酸部分コンジュゲートを0.97mg/mlの溶液
として供給し、希釈せずに皮下注射によって0.05mg/kgで投与した。媒体動物に
は、等体積の30mmol/lの酢酸ナトリウムpH4媒体(52μl/kg)を皮下注
射によって与えた。
採血:橈側皮静脈または頚静脈から血液サンプルを採取し(EDTAおよびプロテアー
ゼ阻害剤のDiprotin Aおよびアプロチニンを含有する管に3ml)、4℃で2
0分間3,000rpmで遠心分離するまで氷上に置いた。血漿を等分に分配し、分析ま
で−70℃で保管した。0、6.75、24.75、48.75、72.75、および9
6.75時間の時点で採取した。7、10、および14日目に追加のサンプルを採取した
食物摂取測定:制約なしの食物摂取の測定を、投与から45分後に始めた。この食物摂
取測定は、急性測定(0〜6時間)と亜慢性測定(0〜96時間)の2つの相からなる。
0〜2時間に、イヌに500gの通常固形飼料(Hill’s J/D食)を与えた。
2時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、2〜4時間にかけて別の50
0gの固形飼料を与えておいた。4時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計
り、4〜6時間にかけて別の300gの固形飼料を与えておいた。6時間の時点で、残っ
ている食物を取り除き、重量を計った。この時点(6.75時間)で血液サンプルを採取
した。次いで、イヌに、500gの固形飼料を一晩与えておいた。1〜4日目の朝に、残
っている食物を取り除き、重量を計り、各動物から血液サンプルを採取した。1〜3日目
には、次いでイヌに500gの固形飼料を24時間にかけて与えておいた。4日目に、イ
ヌをその通常の固形飼料割当て(260g)に戻した。
追加の食物摂取測定:7、14、および28日目に、研究動物に6時間を与えてその日
用固形飼料(260g)を消費させた。この期間の終わりに、残っている食物を集め、重
量を計った。
体重測定:ベースライン時ならびに2、4、7、10、14、18、および28日目に
、体重を測定した。ベースライン体重は、絶食状態で収集した。2および4日目に収集し
た体重は、絶食後のものでなかった。媒体処置動物については、他のすべての体重を絶食
状態で収集した。GDF15処置動物について、7〜28日目に求められた体重は、食欲
を刺激し、重量を回復するために動物に食物が継続的に与えられていたので、絶食後のも
のでなかった。
固形飼料を与えたイヌにおける本発明のGDF15−脂肪酸アッセイコンジュゲートの有
効性
研究目的:媒体対照および0.015mg/kgまたは0.005mg/kgの本発明
のGDF15−脂肪酸部分コンジュゲートの皮下投与が食物摂取に与える効果を、ビーグ
ル犬において、急性の設定(6時間)および96時間の期間で評価すること(この研究で
は、すべてのイヌにおいて、媒体群が処置群より前に実施される)。この化合物のPKプ
ロファイルを評価するために、投与後14日間にかけての異なる時点で、血漿サンプルを
採取する。研究の間終始体重を測定した。
動物:ベースライン体重および処置
投与手順:ベースライン体重および血液サンプルを収集した後に、媒体の投与を行った
。媒体動物に、52μl/kgの30mmol/l酢酸ナトリウムpH4媒体(52μl
/kg)を皮下注射によって与えた。ベースライン体重および血液サンプルを収集した後
に、GDF15の投与を行った。GDF15−脂肪酸部分コンジュゲートを1.20mg
/mlの溶液として供給し、希釈後に皮下注射によって0.015mg/kgおよび0.
005mg/kgで投与した。GDF15保存液は、先行する研究で送達された52μl
/kgを維持するために希釈した。
採血:研究の媒体群および処置群について血液サンプルを採取した。橈側皮静脈または
頚静脈からサンプルを採取し(EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤のDiprotin
Aおよびアプロチニンを含有する管に3ml)、4℃で20分間3,000rpmで遠心
分離するまで氷上に置いた。血漿を等分に分配し、分析まで−70℃で保管した。0、6
.75、24.75、48.75、72.75、および96.75時間の時点で採取した
。7、10、および14日目に追加のサンプルを採取した。
食物摂取測定:研究の媒体群および処置群両方について、食物摂取を測定した。制約な
しの食物摂取の測定を、投与から45分後に始めた。この食物摂取測定は、急性測定(0
〜6時間)と亜慢性測定(0〜96時間)の2つの相からなる。
0〜2時間に、イヌに500gの通常固形飼料(Hill’s J/D食)を与えた。
2時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計り、2〜4時間にかけて別の50
0gの固形飼料を与えておいた。4時間の時点で、残っている食物を取り除き、重量を計
り、4〜6時間にかけて別の300gの固形飼料を与えておいた。6時間の時点で、残っ
ている食物を取り除き、重量を計った。この時点(6.75時間)で血液サンプルを採取
した。次いで、イヌに、500gの固形飼料を一晩与えておいた。1〜4日目の朝に、残
っている食物を取り除き、重量を計り、各動物から血液サンプルを採取した。1〜3日目
には、次いでイヌに500gの固形飼料を24時間にかけて与えておいた。4日目に、イ
ヌをその通常の固形飼料割当て(260g)に戻した。
追加の食物摂取測定:媒体群では7日目〜14日目の間、処置群では7日目〜28日目
の間の異なる日々に、研究動物に6時間を与えてその日用固形飼料(260g)を消費さ
せた。この期間の終わりに、残っている食物を集め、重量を計った。1週間に1回、定期
的に食物消費を測定した。給餌から1、2、4、および6時間後に225gの固形飼料の
消費を測定して、各イヌの摂食パターンが正常に戻っているかどうかを判定した。
体重測定:研究の媒体群および処置群両方について、体重を測定した。媒体群について
は、ベースライン時ならびに2、4、7、10、および14日目に体重を測定した。処置
群については、ベースライン時ならびに2、4、7、10、14、17、21、24、お
よび28日目に体重を測定した。2および4日目に収集した体重は、絶食後のものでなか
った。他のすべての体重は、絶食状態で求めた。
実施例2のコンジュゲートを上記アッセイにおいて試験した。
GDF15−コンジュゲートは、肥満マウスにおける糖尿病および脂肪性肝疾患を含めた
代謝性疾患の測定値を改善する
食餌性肥満マウスに、媒体または実施例19Bm(0.5mg/kg/皮下)を1週間
に1回4週間投与した。最初の投与から2週間後に非絶食後グルコースおよびインスリン
を測定し、最初の投与から4週間後に、終夜絶食後の血中グルコースおよびインスリンを
測定した。実施例19Bmは、非絶食後グルコースを23%低下させた(媒体処置の20
7.1mg/dlに対して実施例19Bmは160.4mg/dl、p<0.05)。実
施例19Bmは、非絶食後インスリンレベルを媒体処置マウスに比べて75%低下させた
(2.1対8.7ng/ml、p<0.05)。初回投与から4週間後に、実施例19B
mは、空腹時血中グルコースを28%(142.7対199.5mg/dl、p<0.0
5)、空腹時インスリンを78%(0.77対3.5ng/ml、p<0.05)低下さ
せた。脂肪性肝疾患のマーカーも、実施例19Bmを1週間に1回、4回投与することに
より改善された。実施例19Bmは、肝脂肪症を57.5%(肝臓脂肪11.36対26
.73%、p<0.05)減少させ、肝細胞損傷のマーカーであるアラニンアミノ基転移
酵素(ALT)の血漿レベルを58%(46.2対110.5U/L、p<0.05)低
下させた。加えて、実施例19Bmは、進行性肝疾患の原因遺伝子であるPNPLA3の
肝臓での発現を77%(p<0.05)低減させた。
本発明に従う実施例20および21のAPJアゴニストコンジュゲートの活性および血
漿安定性は、以下に記載する次のin vitroおよびin vivo法によって評価
することができる。
hAPJカルシウムフラックスアッセイ:
Chem−5 APJ安定細胞(Millipore#HTS068C)を、25ul
の増殖培地中に10,000細胞/ウェルで384ウェルフォーマットに播き、次いで、
37℃の組織培養インキュベーターにおいて24時間増殖させた。アッセイの1時間前に
、2.5mMのプロベネシドを含有する25ul/ウェルのFLIPR Calcium
4色素(Molecular Devices R8142)を加え、37℃の組織培
養インキュベーターにおいて細胞を1時間インキュベートした。ペプチドを、HBSS、
0.1%BSA添加HEPES緩衝液に可溶化し、50uMから5pMへと、三通りに1
0倍連続希釈した。FLIPR Tetraを使用して、色素を含んだ細胞にペプチドを
加えた(1:5、10uM〜1pMの範囲の最終ペプチド濃度とする)。細胞内部にある
FLIPR色素は、カルシウムに結合後に蛍光を発したが、細胞の外側からの蛍光は遮蔽
された。FLIPR Tetraにおいて470〜495の励起波長および515〜57
5の発光波長を使用して、蛍光を測定した。読み取りは、ペプチドを加える10秒前に開
始して合計3分間行った。最大−最小値を算出し、各ペプチド濃度に対してプロットし、
GraphPad prismソフトウェアを使用して、ペプチドによるカルシウムフラ
ックス刺激について、曲線変曲点におけるEC50値を算出した。
in vivoアッセイ:
コンジュゲートをPBS(リン酸緩衝食塩水)に溶解させて濃度を1mg/mlとして
、投与溶液を生成した。投与溶液は、雄のSprague−Dawleyラットに、1m
g/kgの用量に相当する1ml/体重kgの体積で、側方尾静脈から静脈内投与した。
投与後の定められた時間に頚静脈カテーテルから静脈血サンプルを取得し、直ちに氷上に
置いた。こうしたサンプルを4Cで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した
生体分析:
検量線の作製:ペプチドコンジュゲートを水に溶解させて1mg/mlとすることによ
り、保存溶液を調製した。10uLの保存液を990uLのラット血漿と混合して、血漿
中に10,000ng/mlの作業保存液を生成した。これを血漿中に連続希釈して、5
000、1000、500、100、50、10、5、および1ng/mlの標準とした
サンプルおよび標準物質の調製:25uLの血漿サンプルまたは標準物質を清浄なプレ
ートに移した。内部標準としての100ng/mlのグリブリドを含有する150uLの
アセトニトリル:MeOH(1:1)を各バイアルに加え、プレートをボルテックス撹拌
して中身を混合した。プレートを4Cにて4000rpmで遠心分離した。125uLの
上清を清浄なプレートに移し、50uLの水と混合し、LC/MSによって分析した。
LC/MS分析:
HPLC:オートサンプラーを備えたAgilent 1290 HPLC
カラム:MAC−MOD ACE C18、3μm、30mm×内径2.1mm
移動相A:0.1%のアセトニトリル中ギ酸
移動相B:0.1%の水中ギ酸
勾配プログラム:
質量分析計:AB Sciex 6500
MS条件:Q1(m/z+)809.3;Q3(m/z+)923.7;DP:60;C
E:25
データ解析:MSデータを取り込み、WatsonLIMS v7.4ソフトウェアを使
用して解析した。
上述のアッセイを使用しての本発明のAPJアゴニスト−コンジュゲートの活性および安
定性
本発明に従う実施例26Aおよび26Bのオキシトシンコンジュゲートの活性および血
漿安定性は、以下に記載する次のin vitroおよびin vivo法によって評価
することができる。
in vitroアッセイの説明:
材料および方法
化合物プレートの調製
調達した化合物をDMSO中に調製し、最終的にはEurofins Discove
ry Services GPCRProfiler(登録商標)Assay Buff
er中に調製して、最終アッセイ濃度の3倍の濃度とした。同様に、媒体対照および陽性
対照を調製して、すべてのアッセイが確実に適正に対照されるようにした。
ウェルはすべて、Eurofins Discovery Services GPC
RProfiler(登録商標)Assay Bufferを使用して調製した。GPC
RProfiler(登録商標)Assay Bufferは、20mMのHEPESお
よび2.5mMのプロベネシドを含有するようにHBSSが補足されている、pH7.4
の改良されたハンクス平衡塩類溶液(HBSS)であった。
カルシウムフラックスアッセイ
アゴニストアッセイ
調達した化合物を、分析する各濃度について二通りにプレーティングした。参考アゴニ
ストであるオキシトシンも同様にして調製して、アッセイ対照として利用した。参考アゴ
ニストであるオキシトシンは、(参考アゴニストが最大の反応を誘発した濃度)で含めた
アゴニストアッセイは、FLIPRTETRA機器において行い、そこで、蛍光/発光
ベースラインが確立された後、試験化合物、媒体対照、および参考アゴニストをアッセイ
プレートに加えた。アゴニストアッセイは、合計180秒とし、これを使用して、分析す
る各GPCRを活性化させる各化合物の能力を評価した。3分のアゴニストアッセイが終
了した後、アッセイプレートを25℃でさらに7分間インキュベートした。
データ処理
すべてのプレートについて、適正なベースライン補正を行った。ベースライン補正の処
理がなされたなら、最大蛍光/発光値をエクスポートし、データを処理して、活性化百分
率および阻害百分率を計算した。0〜−30%のマイナスの値は、生物学的な変動性の結
果である場合もある。データ処理計算は、次のとおりである:((最大RLU)−(ベー
スライン平均))/((陽性平均)−(ベースライン平均))
In vivoアッセイの説明:
コンジュゲートをPBS(リン酸緩衝食塩水)に溶解させて濃度を3mg/mlとして
、投与溶液を生成した。投与溶液は、雄のSprague−Dawleyラットに、3m
g/kgの用量に相当する1ml/体重kgの体積で、側方尾静脈から静脈内投与した。
投与後の定められた時間に頚静脈カテーテルから静脈血サンプルを取得し、直ちに氷上に
置いた。こうしたサンプルを4Cで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した
生体分析:
検量線の作製:ペプチドコンジュゲートおよびペプチドを、別個の2本のバイアルにお
いて、ジメチルスルホキシドに溶解させて1mg/mlとすることにより、保存溶液を調
製した。10uLの各保存液を980uLのラット血漿と混合して、血漿中に10,00
0ng/mlの作業保存液を生成した。これを血漿中に連続希釈して、5000、100
0、500、100、50、10、5、1、0.5、および0.1ng/mlの標準とし
た。
サンプルおよび標準物質調製:25uLの血漿サンプルまたは標準物質を清浄なプレー
トに移した。内部標準としての100ng/mlのグリブリドを含有する150uLのア
セトニトリルを各バイアルに加え、プレートをボルテックス撹拌して中身を混合した。プ
レートを4Cにて4000rpmで遠心分離した。125uLの上清を清浄なプレートに
移し、150uLの水と混合し、LC/MSによって分析した。
LC/MS分析:
HPLC:オートサンプラーを備えたAgilent 1290 HPLC
カラム:MAC−MOD ACE C18、3μm、30mm×内径2.1mm
移動相A:0.1%のアセトニトリル中ギ酸
移動相B:0.1%の水中ギ酸
勾配プログラム:
質量分析計:AB Sciex 6500
ペプチドMS条件:Q1(m/z+)945.20;Q3(m/z+)687.27;D
P:140;CE:39
ペプチドコンジュゲートMS条件:Q1(m/z+)1270.85;Q3(m/z+)
468.30;DP:140;CE:77
データ解析:MSデータを取り込み、WatsonLIMS v7.4ソフトウェアを使
用して解析した。
上述のアッセイに従う、本発明のオキシトシン脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性
国際公開第2014/095773号パンフレットの実施例13を以下に示す。
本発明のオキシトシン−脂肪酸コンジュゲートは、コンジュゲートしていないオキシト
シン類似体に比べて、半減期の75倍の延長を示した。
本発明に従う実施例27Aおよび27BのAgRPコンジュゲートの活性および血漿安
定性は、以下に記載する次のin vitroおよびin vivo法によって評価する
ことができる。
A)HTRF cAMPアッセイプロトコール:
HEK293/MC4R細胞の継代
細胞:HEK293/MC4R安定細胞系
完全培地:DMEM/F12 1:1(Gibco、カタログ番号11039、アッセイ
用、無フェノールレッド培地 カタログ番号21041)
10%FBS(熱不活化されたもの、Gibco、カタログ番号10082)
200μg/mLのGeneticin(Gibco、カタログ番号10131)
15mMのHepes(GIBCO、カタログ番号15630)
2mMのL−グルタミン(GIBCO、カタログ番号25030)
フラスコ:150cmの組織培養処理されたフラスコ(Corning、カタログ番号
430825)
− 条件培地を吸引する。
− 25mLのDPBS(Gibco、カタログ番号14190)で洗浄し、次いでそれ
を吸引する。
*FBSによって、トリプシン−EDTA処理が抑制される
− 2.5mLの0.05%トリプシン−EDTA(Gibco、カタログ番号2530
0)を加える。
− 数分放置し、次いでフラスコを数回軽く叩いて、細胞を引き離す。
− 25mLの完全培地を加えて、トリプシン−EDTA処理を停止させる。
*アッセイ用の細胞調製物、無フェノールレッド完全培地を使用する必要がある。
− 数回の穏やかなピペット操作によって、凝集した細胞を再懸濁する。
− 懸濁液を50mLの遠心管に移す。
− 1200rpmで3分間遠心沈殿する。
− 上清を吸引する。
− 底をやさしく叩くことにより細胞を分散させる。
− 5〜10mLの完全培地を加え、次いで穏やかなピペット操作によって再懸濁する。
*アッセイ用の細胞調製物、無フェノールレッド完全培地を使用する必要がある。
− 0.5mLの懸濁液をVi−cell用のサンプルバイアルに移す。
− Vi−cellを使用して細胞数をカウントする。*細胞密度および生存度を毎回記
録する。
− 1〜3×10個の細胞を新しい150cmフラスコに移す。
3日間:3×10細胞/フラスコ
4日間:1×10細胞/フラスコ
− 37C、5%COでインキュベートする。
HTRF cAMPアッセイに向けた細胞播種(アッセイの1日前)
・ 継代の部にあるとおりに細胞懸濁液を調製する。
・ 懸濁液を2.34×105細胞/mLに希釈する。
*1枚の384ウェルプレートに対して13mLで十分である。
・ 30μLの細胞懸濁液を、Poly−D−Lysine BIOCOAT 384ウ
ェル透明プレート(Becton Dickinson、カタログ番号354660)の
各ウェルに分注する:7000細胞/ウェル
*ポリ−D−リシンでコーティングされたプレートは、このアッセイにおいて不可欠であ
る。
*cAMP標準物質のウェルについては細胞なし
・ 37C、5%COで終夜インキュベートする。
HTRF cAMPアッセイ
1.試薬の調製
・ 1M IBMX
IBMX(MW222.25g/mol、ACROS カタログ番号228420010
) 111mg
DMSO(Sigma Aldrich、カタログ番号D2650) 500uL
4℃で保管する。
・ 40mg/mLのBSA溶液
ウシ血清アルブミン(Sigma A7030−50G) 200mg
dHO 5mL
4℃で保管する。
・ 1mg/mL(176uM)のAgRPマスター溶液(HBSS/2mg/mLのB
SA中)
R&DヒトAgRP C末端(カタログ番号3726−AG−100) 100ug/
バイアル
1×ハンクス液(HBSS)(Gibco、カタログ番号14065、CaおよびMg含
有) 95uL
40mg/mLのBSA溶液 5uL
4℃で保管する。
・ 2mMのNDP−aMSHマスター溶液
NDP−aMSH(MW1646.9、Bachem、カタログ番号H1100) 1
mg/バイアル
dHO 304uL
*溶解させたなら、10uLずつのアリコートを200uLの管に分注し、次いで−20
Cで保管した。
・ アッセイ緩衝液1
HBSS 10mL
1M Hepes(Gibco、カタログ番号15630) 0.2mL
1M IBMX 20uL
*IBMXの沈殿を回避するために、完全に溶解するまで緩衝液をボルテックス撹拌して
ください。
・ アッセイ緩衝液2
HBSS 20mL
1M Hepes(Gibco、カタログ番号15630) 0.4mL
1M IBMX 40uL
40mg/mLのBSA溶液 0.25mL
*IBMXの沈殿を回避するために、完全に溶解するまで緩衝液をボルテックス撹拌して
ください。
・ IgG滴定およびAgRP滴定のための6nMのNDP−aMSH
2uMのNDP−aMSH(マスター溶液の1000倍希釈液) 10.8uL
アッセイ緩衝液1 3600uL
*1回の384ウェルアッセイについての例
・ IgG滴定のための120nMのAgRP
10倍希釈したマスター溶液(17.6uM) 26uL
アッセイ緩衝液2 3800uL
*1枚の384ウェルプレートについての例
・ 滴定用のNDP−aMSH作業溶液(試薬を参照のこと)
・ 滴定用のAgRP作業溶液(試薬を参照のこと)
・ 滴定用のIgG作業溶液(試薬を参照のこと)
・ cAMP標準溶液(試薬を参照のこと)
2.アッセイ(2ステッププロトコール)
アッセイキット:Cisbio cAMP HiRange HTRFキット(カタログ
番号62AM6PEB)
− IgG/AgRP混合物(1:1)の調製
・ 15uLのIgG作業溶液と15uLの120nM AgRPを混合し、次いで周囲
温度で1時間インキュベートする。
− アッセイプレートの調製
・ 細胞を含有する384ウェルアッセイプレートをWipeallの上で逆さにして培
地を捨て、次いで軽く叩いて培地を取り除いた。
・ 各ウェルに100μLのDPBSを加え、同じようにして捨てた。
*PBSを捨てたなら、できる限りすぐに次に進んで、乾き切らないようにする。
・ 次の試薬10μLを、使用者のサンプルの並べ方に従って各ウェルに移す。
cAMP標準:cAMP標準物質
cAMP滴定についての陰性対照:HTRFキットの中の希釈剤
陽性対照:HTRFキットの中のcAMP陽性対照
MSH滴定:アッセイ緩衝液2
AgRP滴定:AgRP作業溶液
IgG滴定:IgG/AgRP混合物
細胞アッセイ用の陰性対照:アッセイ緩衝液2
− 384ウェルプレートを1200RPMでフラッシュ遠心沈殿する。
− 細胞を周囲温度で15分間インキュベートする。
− 次の試薬10μLを、使用者のサンプルの並べ方に従って各ウェルに加える。
cAMP標準:アッセイ緩衝液1
cAMP滴定についての陰性対照:アッセイ緩衝液1
陽性対照:アッセイ緩衝液1
MSH滴定:MSH作業溶液
AgRP滴定:6nM MSH溶液
IgG滴定:6nM MSH溶液
細胞アッセイ用の陰性対照:アッセイ緩衝液1
− 384ウェルプレートを1200RPMでフラッシュ遠心沈殿する。
− 細胞を周囲温度でさらに30分間インキュベートする。
*このインキュベート時間はそれほど厳格でない。アッセイ開発データによれば、+/−
5分は可となるはずである。
− 10μLのcAMP−d2(キットの中に支給されている溶解緩衝液に1:4希釈し
たもの)を加える。
*重要!! 陰性対照については、cAMP−d2でなく、溶解緩衝液だけとする。
− 10μLの抗cAMPクリプテート(キットの中に支給されている溶解緩衝液に1:
4希釈したもの)を加える。
− 1200RPMでフラッシュ遠心沈殿する。
− アッセイプレートを周囲温度で45〜60分間インキュベートする。
− 各サンプル30μLを、組織培養処理された384ウェル白色ポリスチレンアッセイ
プレート(Corning、カタログ番号3572)に移す。
− 1200RPMでフラッシュ遠心沈殿する。
− 次の設定のMolecular device M5またはM5eを用いて蛍光を測
定する。
Molecular device M5/M5eの設定
B)MC3 cAMPアッセイ
材料:
細胞:HEK293/MC3R安定細胞系
完全培地:DMEM/F12 1:1(Gibco、カタログ番号11039)
10%FBS(熱不活化されたもの、Gibco、カタログ番号10082)×
200μg/mLのGeneticin(Gibco、カタログ番号10131)
2mMのL−グルタミン(GIBCO、カタログ番号25030)
フラスコ:150cmの組織培養処理されたフラスコ(Corning、カタログ番号
430825)
アッセイ緩衝液
HBSS(Gibco−14175−095) 10mL
1M Hepes(Fisher、カタログ番号BP299−1) 0.2mL
500mM IBMX(MW222.25g/mol、ACROS カタログ番号228
420010) 40ul
BSA 0.25%
プレート
384ウェルべた底、Greiner bio−one(カタログ番号−781080)
アッセイプロトコール(アンタゴニストプロトコール):
I.条件培地を吸引する。
II. 2.5mLのDPBS(Gibco、カタログ番号14190)で洗浄する
III. 2mLの0.25%トリプシン−EDTA(Gibco、カタログ番号252
00−056)を加える。
IV.フラスコをインキュベーターに入れて数分間放置し、フラスコを数回軽く叩いて、
細胞を引き離す。
V. 10mLの完全培地を加えて、トリプシン−EDTA処理を停止させ、数回の穏や
かなピペット操作によってこれをよく混合して、凝集した細胞を再懸濁する。
VI. 1.5mlの細胞を、20mlの完全培地を含有する新しい150cmのフラス
コに移す。
VII.残りの懸濁液を50mLの遠心管に移す。
VIII. 1200rpmで4分間遠心沈殿する。上清を吸引する。
IX. 6mLのアッセイ緩衝液を管に加え、穏やかなピペット操作によって細胞を再懸
濁する。
X. 0.5mLの懸濁液をVi−cell用のサンプルバイアルに移し、別の0.5m
lのPBSを加える。
XI. Vi−cellを使用して細胞数をカウントする。*細胞密度および生存度を毎
回記録する。
i. IBMXを含有する10ul/ウェルのアッセイ緩衝液に、4K/ウェルで細胞を
播く。
ii.プレートをインキュベーターに入れて約30分間放置した後、浮遊細胞に対してア
ッセイを開始する。
cAMP定量については、2ステップcAMPプロトコールに従う。
手順
I.アンタゴニストウェルに対してのみ、10ul/ウェルの細胞に、アッセイ緩衝液中
に3倍に調製された5ulのAgRPを加える。
II.陽性対照ウェル(NDP−α−MSHを含有することになるウェル)には、5ul
の緩衝剤を加える。
III.プレートを37℃で約20分間インキュベートする。
IV. AgRP DRCを含有するウェルに、5ul/ウェルの、4倍に調製されたア
ゴニストEC80(NDP−α−MSH)を加える。
V. NDP−α−MSH EC50を算出するために、5ul/ウェルの、4倍に調製
されたアゴニスト(NDP−α−MSH)DRC(プレートにおける最終最高濃度は10
0nMである)を加える。
VI.陰性対照だけに緩衝液を加える。
VII. 384ウェルプレートをパルス回転させ、細胞をインキュベーターにおいて3
0分間インキュベートする。
VIII.次の試薬10μLを各ウェルに加える。
a. 10μLのcAMP−d2
b. *重要!! 陰性対照については、cAMP−d2を加えず、溶解緩衝液および1
0ul/ウェルのTb−クリプテートだけを加える。
c. 10μLの抗cAMPクリプテート
d.プレートをパルス回転させ、室温で60分間インキュベートする。
C.in vivoアッセイの説明:
10ナノモルのコンジュゲートを300μLのPBS(リン酸緩衝食塩水)に溶解させ
て、投与溶液を生成した。投与溶液(300μM)を、雄のSprague−Dawle
yラットに側方尾静脈から静脈内投与した(ラット1匹あたり10ナノモルの用量に相当
する)。投与後の定められた時間に、尾の断片から血液を採取し、直ちに氷上に置いた。
こうしたサンプルを4Cで遠心分離し、上清の血漿を分析用の新たな管に移した。
生体分析:
検量線の作製:実施例27Aおよび27Bの2種の脂肪酸コンジュゲートならびに1種
の成熟ヒトAgRPペプチドを使用して標準物質を作製した。保存標識ペプチドを、カゼ
インを含有するELISAサンプル希釈剤に希釈して100ug/mlとすることにより
、各AgRPの中間保存溶液を調製した。アッセイに向けて、中間液を、ウシ血清アルブ
ミン(BSA)を含有するELISAサンプル希釈剤に希釈して2500pg/mLの先
頭標準濃度とし、次いで2倍連続希釈して、ゼロ用量標準を含めた16段階とした。
サンプル希釈:血漿サンプルを、BSAを含有するELISAサンプル希釈剤に10倍
希釈し、次いで、31,250倍まで5倍連続希釈した。
5B1ヒトAgRP ELISA法:384ウェルのマイクロプレートを、室温(RT
)において、1×PBS中に30uL/ウェルの抗ヒトAgRPクローン5B1で終夜コ
ーティングした。プレートを吸引し、室温において90uL/ウェルの乳系遮断剤で2時
間ブロックした。これ以降のインキュベートはすべて、30uL/ウェルで実施した。プ
レートを再び吸引し、サンプルおよび標準物質を室温で2時間ウェルに加えておいた。次
いで、プレートを、tween−20を含有するリン酸系洗浄緩衝液で3回洗浄し、ビオ
チン標識ヤギ抗ヒトAgRPポリクローナル抗体をウェルに加えて、結合したAgRPを
室温で2時間かけて検出した。プレートを再び洗浄し、HRP標識ストレプトアビジン試
薬を室温で30分間ウェルに加えておいた。プレートを最後にもう1回洗浄し、化学発光
基質をすべてのウェルに加え、プレートの光出力をSpectramx M5で直ちに読
み取った。
データ解析:生データを整理し、基礎PKパラメーターについて分析した。
上述のアッセイに従う、本発明のAgRP脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性:
実施例28A、28B、および28CのFGF23コンジュゲートの活性および血漿安
定性は、以下に記載する次のin vitro法によって評価することができる。
in vitro活性アッセイ
Egr−1−ルシフェラーゼ:精製hFGF23−FAコンジュゲートの生物学的活性
を、Egr−1−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験した。hFGF23−
FAコンジュゲートがFGF23受容体に結合した結果、Egr−1の下流が活性化され
、Egr−1プロモーターによって調節されるルシフェラーゼレポーターが発現された。
Egr−1−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、Urakawa et al. (Nature, 2006, Vol
444, 770-774)が報告したことに基づき構築した。48ウェルポリ−D−リシンプレート
に播いたHEK293T細胞に、Egr−1−ルシフェラーゼレポーター遺伝子、全長膜
貫通型のKlotho、およびトランスフェクション正常化レポーター遺伝子(ウミシイ
タケルシフェラーゼ)をトランスフェクトした。トランスフェクションから5時間後、ト
ランスフェクション混合物を、段階的な濃度の試験タンパク質を含有する3mlの1%F
BS添加DMEMと差し替えた。20時間後に細胞をpassive lysis bu
ffer(Promega、カタログ番号E194A)に溶解させ、Dual−Glo
Luciferase Assay System(Promega、カタログ番号E2
940)を使用して、ルシフェラーゼ活性を求めた。
本発明に従う実施例29Aおよび29Bのセレラキシン脂肪酸コンジュゲートの活性お
よび血漿安定性は、以下に記載する次のin vitroおよびin vivo法によっ
て評価することができる。
in vitro活性アッセイ#1:
材料:
DMEM: F12培地(Gibco、カタログ番号11320)
IBMX(Sigma、カタログ番号I5879)
384べた底白色プレート(Greiner bio−one、カタログ番号78194
5)
20,000 dynamic−2 cAMPキット(Cisbio、カタログ番号62
AM4PEC)
アデノシン3’,5’−環状一リン酸(Sigma、カタログ番号A9501)
Matrix−plate mate plus(5μlのアッセイ試薬を加えるのに使
用した)
PBS−Gibco(カタログ番号10010−023)
プロトコール:
1日目:べた底PDLコーティッド白色プレートにおいて、10μlのDMEM:F12
培地に、RXFP1−HEK293/親HEK293細胞を8000個播いた。
2日目:化合物を用いてアッセイを実施した。
アゴニストモード(概要):
・ 37℃で終夜10μlのDMEM:F12培地中に細胞
・ 細胞に2000μM(4x)のIBMX 5μlを37℃で30分間
・ 上記に5μlの4x化合物/セレラキシンを37℃で30分間
(ステップ3の化合物希釈400nMから−最終は先頭100nM)
・ 10μlのcAMP−d2コンジュゲート
・ 10μlの抗cAMPクリプテートコンジュゲート
・ 室温で1時間インキュベートする。
・ FRETシグナルを読む−Envision 665nm/620nm
化合物の調製
セレラキシン:
1)保存液を、15μlの化合物を30μl(最終は40μM)に変えることによりPB
Sに3倍希釈した、683.3μM、すなわち、188.3のPBS pH7.4中11
.7μlに、手作業で希釈した。
2)1:10、すなわち、6μlの上記を54μlのDMEM:F12(最終は4μM)
に、手作業で希釈した。
3)1:10、すなわち、10μlの上記を90μlのDMEM:F12(最終は400
nM)に、手作業で希釈した。
セレラキシン−FAコンジュゲート
1)保存液を、15μlの化合物を30μに変えることによりPBSに3倍希釈した、P
BS pH7.4中40μMに希釈した。
2)1:10、すなわち、6μlの上記を54μlのDMEM:F12に、手作業で希釈
した。
3)1:10、すなわち、10μlの上記を90μlのDMEM:F12(1:100希
釈)に、手作業で希釈した。
脂肪酸
1)保存液を、15μlの化合物を30μに変えることによりPBSに3倍希釈した、P
BS pH7.4中40μMに希釈した。
2)1:10、すなわち、6μlの上記を54μlのDMEM:F12に、手作業で希釈
した。
3)1:10、すなわち、10μlの上記を90μlのDMEM:F12(1:100希
釈)に、手作業で希釈した。
cAMP検量線希釈:
1. DMEM:F12培地に希釈した150μlのcAMP標準を最初の列に(280
0nM)。
2. 100μlのDMEM:F12培地をその後の10までの列に(1〜11)
3. 50μlを100μlに変えることによる3倍希釈
4.ステップ3からの20μlを検量線プレートの適切なウェルに
5. 10μlの抗d2および抗cAMPクリプテートコンジュゲート
6.室温で1時間インキュベートする。
7. FRETシグナルを読む−Envision 665nm/620nm
分析:
Graph pad prismを使用して、cAMPのnM濃度をLog(x)変換し
た。
4パラメーター非線形回帰を使用して、検量線からcAMP量を内挿した。
内挿された値を、10^Y変換を使用してnMに変換した。
計算されたcAMP量を、4パラメーター非線形回帰を使用して、化合物濃度に対してプ
ロットした。
ウシ血清アルブミンおよびヒト血清存在下でのin vitro活性#2:
材料:
DMEM:F12培地(Gibco、カタログ番号11320)
IBMX(Sigma、カタログ番号I5879)
384べた底白色プレート(Greiner bio−one、カタログ番号78194
5)
20,000 dynamic−2 cAMPキット(Cisbio、カタログ番号62
AM4PEC)
アデノシン3’,5’−環状一リン酸(Sigma、カタログ番号A9501)
Matrix−plate mate plus(5μlのアッセイ試薬を加えるのに使
用した)
PBS−Gibco(カタログ番号10010−023)
1M HEPES Gibco(カタログ−15630−080)
1×HBSS Gibco(カタログ−14175−095)
アッセイ緩衝液−1×HBSS+10mM HEPES
ウシ血清アルブミン カタログ番号A2153(Sigma−Aldrich)
Sigma Aldrich−H4522(ヒト血清)
条件:
・ 600μMのBSA
・ 4%のヒト血清
・ 10%のヒト血清(Sigma aldrich−H4522)
・ アッセイ緩衝液
試験する化合物:
・ セレラキシン
・ セレラキシン−FA(実施例29A)
化合物の取扱い:
セレラキシン−:保存液は(796.57uM)、すなわち4.75mg/ml MW
は5963ダルトンである。
セレラキシン10ul保存液を190ulのPBSに溶解させ、最終濃度を40μMとし
、これを30ulを60ulのアッセイ緩衝液に変えることにより3倍希釈し、11点曲
線(A2〜A12)12番目を0とする。
セレラキシン−FAコンジュゲート:保存液は(287.79uM)、すなわち2.6
1mg/ml MWは9069ダルトンである。
セレラキシン27.798ul保存液を172.2ulのPBSに溶解させ、最終濃度を
40μMとし、これを30ulを60ulのアッセイ緩衝液に変えることにより3倍希釈
し、11点曲線(A2〜A12)12番目を0とする。
BSA保存溶液の調製:
666.66uMのBSAについて:アッセイ緩衝液30mlを、1.32グラムのBS
Aを溶解させることにより作製した。
600uMのBSAについて:アッセイ緩衝液30mlを、1.18グラムのBSAを溶
解させることにより作製した。
BSAなしは、アッセイ緩衝液だけを含有する。
ヒト血清
4.44%のHSについて:28.66mlのアッセイ緩衝液中1.34ml
4%のHSについて:28.8mlのアッセイ緩衝液中1.2ml
11.11%のHSについて:26.67mlのアッセイ緩衝液中3.33ml
10%のHSについて:27mlのアッセイ緩衝液中3ml
手順:
1日目:8,000細胞/ウェルのRXFP1−HEK293およびHEK293(親)
細胞を、ベタ底プレート上の基本DMEM:F12培地に、10μl/ウェルの体積で播
く。細胞を37℃/5%COで終夜インキュベートする。
2日目:
1.細胞を50ulのアッセイ緩衝液で2回洗浄し、1回目および2回目の洗浄後に、ペ
ーパータオルの上でやさしく叩いて、アッセイ緩衝液を取り除いた。
2.IBMX(666.66uM)を含有するそれぞれの培地(600uMのBSA、4
%のBSA、10%のヒト血清、およびアッセイ緩衝液単独)である15ulの培地で、
細胞を37℃で30分間前処理した。
3.化合物を3倍連続希釈する、11点曲線−先のウェルから15ulの化合物を30u
lのPBSを含有する後続のウェルに移す、ウェル11はPBSのみ
4.ステップ3からのアッセイ緩衝液に(1:10)希釈する(すなわち、10ulから
90ulのアッセイ緩衝液)。
5.ステップ4からそれぞれの培地(666.66μMのBSA、4.44%および11
.11%のヒト血清、アッセイ緩衝液)に再び希釈(1:10)し、BSAの最終濃度を
600μM、ヒト血清を4%および10%とする。
6.(*化合物をそのそれぞれの培地において室温で1時間インキュベートした後、細胞
に加える)
7.ステップ6からの5ul、すなわち、4×セレラキシン/セレラキシン−FAを15
ulの細胞に、37℃で30分以上(セレラキシンの先頭濃度は100nMである)
8. 10ulのcAMP d2コンジュゲートを加える。
9. 10ulの抗cAMP−クリプテートを加える。
10.室温で1時間インキュベートする。
11. EnvisionでFRETを読む。
12.そのそれぞれの培地においてcAMP検量線を作成した。
cAMP検量線希釈:
cAMP標準物質の最初の保存液は、1120000nMとする。
1. 20ulのcAMP保存液を60ulのアッセイ緩衝液に溶解させることにより、
最初の保存液を希釈する(1:4)。
2.ステップ1のアッセイ緩衝液への(1:10)希釈(すなわち、180ulのアッセ
イ緩衝液中20ulである)
3.ステップ2の、それぞれの濃度の4.44%および11.11%のHS、666.6
6uMのBSA、またはBSAなしへの(1:10)希釈。最終濃度は、最終的に4%、
10%のHS、および600μMのBSAとなる。
cAMP検量線
1.それぞれのcAMP標準150μlを最初の列に加える(2800nM)。
2.それぞれの濃度のアッセイ緩衝液600uMのBSA、4%および10%のHS、0
%)100μlを後続の11列、すなわち(2〜12)に加える。
3. 50μlを後続のウェルの100μlに変えることによる3倍希釈、12番目のウ
ェルはcAMPなしの0である。
4.ステップ3からの20μlを検量線プレートの適切なウェルに
5. 10μlのd2コンジュゲートを加える。
6.室温で1時間インキュベートする。
7. HTRF− Envisionで読む。
分析:
Graph pad prismを使用して、cAMPのnM濃度をLog(x)変換す
る。
4パラメーター非線形回帰を使用して、検量線からcAMP量を内挿した。
内挿された値を、10^Y変換を使用してnMに変換した。
計算されたcAMP量を、4パラメーター非線形回帰を使用して、化合物濃度に対してプ
ロットした。
結果:
in vivoアッセイ:
化合物(セレラキシンおよびセレラキシンコンジュゲート)を種々のげっ歯動物モデル
において試験して、短期および長期の心血管反応を評価することができる。
短期モデル−マウス(いずれの系統でもよいがDBA/2が好ましい)またはラット(
いずれの系統でもよいがSprague−Dawleyが好ましい)を、イソフルランを
吸入させて麻酔し、100%の酸素中約2%のイソフルランによって、安定した外科的水
準の麻酔を維持し、直腸温度を正常レベルに保つ。頚動脈および頚静脈(マウス)または
大腿動脈および静脈(ラット)を、覆っている皮膚を切開することで露出させ、血管にカ
テーテルを入れる。動脈圧を継続的に測定し、心拍を呼び起こすために、動脈カテーテル
を圧変換器に接続し、シグナルをデジタルデータ取得システム(たとえば、Ponema
h)に向ける。別法としては、皮下に挿入した針電極を通して記録された心電図シグナル
によって心拍を呼び起こす。動脈圧および心拍を安定させた後、自律神経遮断剤カクテル
(たとえば、2mg/kgずつのアトロピンおよびプロプラノロール)を約3〜4分かけ
て静脈内投与する。新血管パラメーターが再び安定したとき、セレラキシンまたはセレラ
キシンコンジュゲートを静脈内ボーラスとして約3秒かけて注射する。リラキシンは、特
徴的な遅い開始(約6分でピーク反応)を伴う心拍の上昇および作用時間の持続(時間)
を誘発する。動物を同じく準備して、連続した心エコー画像を集め、それをオフラインで
分析することにより、心室の心機能(たとえば、駆出率、左室径短縮率、心拍出量)を測
定する。
長期モデル−マウス(いずれの系統でもよいがDBA/2が好ましい)またはラット(
いずれの系統でもよいがSprague−Dawleyが好ましい)を、イソフルランを
吸入させて麻酔し、100%の酸素中約2%のイソフルランによって、安定した外科的水
準の麻酔を維持する。手術前後および手術後に鎮痛剤を投与する。動脈および静脈に上述
のとおりにカニューレを挿入するが、但し、カテーテルを背側皮膚領域で外面化し、ヘパ
リン化食塩水でフラッシュし、ステンレス鋼製のピンで栓をする。マウスでは、皮下カテ
ーテルを皮下に埋め、同様にして外面化してもよい可能性がある。ラットでは、ばねテザ
ー/スイベルシステムによってカテーテルを振り向ける。研究当日、動脈カテーテルを圧
変換器に接続し、上述のとおりに自律神経遮断を実現するが、但し、マウスでは皮下カテ
ーテルから遮断剤を投与してもよく、どちらの種の遮断も、その後は、自律神経剤の継続
的な静脈内または皮下注入によって維持する。動脈圧および心拍を、デジタルデータ取得
システムで継続的にモニターする。動脈圧および心拍を安定させた後、自律神経遮断剤を
約3〜4分かけて静脈内または皮下投与する。新血管パラメーターが再び安定したとき、
セレラキシンまたはセレラキシンコンジュゲートを静脈内ボーラスとして約3秒かけて注
射する。マウスまたはラットにおいて数週間かけて心室の心機能および心拍を評価するた
めに、セレラキシンコンジュゲートを1週間に1〜3回皮下注射し、ベースライン時に、
その後は毎週、連続した心エコー画像を収集する。
セレラキシン供給源:
セレラキシン(組換え1本鎖ヒトリラキシン)
Connetics corporation、ロット番号00L605
20nMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中1.0mg/mL(5mLバイアル)
各用量に所望される濃度のセレラキシンとするための、保存溶液の媒体への希釈
実施例30のPIPコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次のi
n vitroおよびin vivo法によって評価することができる。
グルコース刺激によるインスリン分泌(GSIS)アッセイ:
GSIS試験は、高脂肪食誘発肥満(DIO)マウスにおける組換えヒトプロラクチン
誘導タンパク質(hPIP)後の、in vivoでの膵臓β細胞機能の測定として実施
した。簡潔に述べると、マウス(m=5−7/群)を終夜(5:00PM〜8:00AM
)絶食させ、試験日に、ベースライン時点として示した、体重および血糖(BG、Emb
raceグルコース計量器で測定したもの)。次に、マウスに、hPIP(未変性PIP
およびFAにコンジュゲートさせたPIP、PBS溶液、4ml/体重kgで投与)また
は媒体対照(PBS)を1回静脈内(IV)投与した。hPIP投与から45分後、すべ
てのマウスに、経口グルコース(3g/kgのデキストロース、PBS溶液、4ml/体
重kgで投与)を投与した。グルコース負荷の直前(0分時点として示す)、ならびにグ
ルコースから15分および30分後に、血糖を測定した。グルコースから0分、15分、
および30分後に、血液サンプルを採取して血漿を単離し、血漿インスリンの測定を行っ
た。
薬動学(PK)アッセイ:
hPIPの血漿暴露を、単回静脈内投与後にDIOマウスにおいて測定した。簡潔に述
べると、制約なく給餌されたDIOマウス(n=2)に、hPIP(未変性PIPおよび
FAにコンジュゲートさせたPIP、PBS溶液、4ml/体重kgで投与)を1回静脈
内(IV)投与した。投与から0.25、0.5、1、3、7、24、および48時間後
に、血液サンプルを採取し、血漿を単離し、社内ELISAアッセイによる(以下に示す
プロトコール)。
アッセイでは、次のステップによって測定を行った。
・ 30ulのhPIP抗体(PIP−8−ABとして示す、社内で産生したたもの、N
BCクローン番号87.19G9A11、PBS中8ug/ml)で、プレートを終夜室
温でコーティングした。
・ 吸引した後、100ulのブロッキング用試薬で2時間ブロックした。
・ 吸引し、30ulのサンプルを加えて、2時間インキュベートし、サンプルおよび標
準物質を、カゼイン緩衝液(1%のカゼイン、1.7mMのリン酸二水素ナトリウム、8
.1mMのリン酸水素ナトリウム七水和物、0.15Mの塩化ナトリウム、0.7%のT
riton X−100、および0.1%のアジ化ナトリウム)に希釈する。
・ プレートを100ulのTeknova洗浄緩衝液(0.05%のPBS中Twee
n)で3回洗浄した。
・ 30ulのビオチン標識PIP抗体(PIP−6Abとして示す、社内で産生したも
の、MBCクローン番号87.8C6B3、カゼイン緩衝液中10ug/ml)、1時間
インキュベートする。
・ 上記のとおりに洗浄した。
・ 30ulのストレプトアビジン−HRP(Pierceカタログ番号21140、H
RP緩衝液中0.4ug/ml)をHRP緩衝液(0.4%のカゼイン、1.7mMのリ
ン酸二水素ナトリウム、8.1mMのリン酸水素ナトリウム七水和物、0.15Mの塩化
ナトリウム、および0.1%のクロロアセトアミド)に加え、30分インキュベートした

・ 上記のとおりに洗浄した。
・ 30フェムトの化学発光基質(Thermoカタログ番号34096)を加え、直ち
に読み取る。
上述のアッセイに従う、本発明のPIP脂肪酸コンジュゲートの活性および安定性
本発明のPIP脂肪酸コンジュゲートは、暴露期間が延長されており、その結果、有効
性が向上している。
実施例31のNPFFコンジュゲートの活性および血漿安定性は、以下に記載する次の
in vitro法によって評価することができる。
Cisbio cAMPキットを用いたcAMPアッセイプロトコール
本発明のNPFF−FAコンジュゲートを、以下に記載するアッセイにおいて、ホルス
コリンの存在下で試験した。
1日目:「継代培養プロトコール」に従って細胞を384ウェルプレートに播く。
1.抗生物質なしで増殖培地を作製する(必要に応じて)。
2. 70%のエタノールを吹き付けた後、37℃の水浴中で、抗生物質なしの増殖培地
ボトルを平衡化する。
3. Versene(T.75フラスコあたり3ml)で細胞を引き離す。
4. 17mlの増殖培地を含有する50mlのFalcon管に移す。
5. 150gで4分遠心分離する。
6.細胞ペレットを10mlの刺激緩衝液に再懸濁する。細胞を数える。
7.抗生物質を含有する増殖培地に5’000細胞/50ulで細胞懸濁液を調製する。
8. Viaflow 384−125ulピペットを使用して、50ulの細胞懸濁液
を播く。
9.プレートを15分間TCフード下に置く。
10. 37℃、5%CO、および湿度90%でインキュベートする。
2日目:
試薬溶液の調製
1.アッセイ緩衝液:
500mlのHBSS+10mlのHEPES。室温で保管する。
アッセイ緩衝液:250mlのHBSS/HEPES+250ulのIBMX 1000
倍溶液+0.1%BSA(825ul)。毎日新たに作製する。
2.ホルスコリン2倍溶液:アッセイにおける最終1uM:
化合物希釈用:40ulのFSK/100mlのアッセイ緩衝液
NPFF希釈用:10ulのDMSO/10mlの2倍FSK
3. NPFF希釈:保存溶液 dHO中1mM−アッセイにおける最終1uM
a. 5ulの保存液/625ulのFSK 2倍/DMSO
b. 100ulの溶液a+300ulのFSK 2倍/DMSO。アッセイにおける最
終1uM
c. 10の1/4希釈ステップを行う:FSK 2倍/DMSO中100ul+300
ul
4.化合物希釈:保存溶液 DMSO中10mM−アッセイにおける最終40uM
a. 5ulの保存液/625ulのFSK 2倍
b. 11の1/4希釈ステップを行う: 100ul+300ul FSK 2倍
5. cAMP標準:
a. 10ulのcAMP標準保存液(1.12mM)+90ulのアッセイ緩衝液
b. 10ulの希釈物a+90ulの刺激緩衝液
c. 20ulの希釈物b+428ulの刺激緩衝液:500nM
d. 希釈物cから出発して11の1/2希釈を行う:100ulの希釈物c+100u
lの刺激緩衝液
6. cAMP検出試薬:
a. d2−cAMP:1000Ul/20mlの溶解緩衝液(1枚の384ウェルプレ
ートについて250ul/5ml)
b. クリプテートコンジュゲート:1000Ul/20mlの溶解緩衝液(1枚の38
4ウェルプレートについて250ul/5ml)
アッセイ手順
ステップ1:
1.刺激緩衝液を調製する。
2.Cisbio溶解緩衝液を室温に置く。
3.WellMateを準備する(70%のアルコールに続いてdH0およびHBSS
/HEPESで洗浄する)。
4.ホルスコリンおよび化合物希釈物を調製する。
ステップ2:ホルスコリンでの刺激
1.細胞を50ulの刺激緩衝液で洗浄する:
a.プレートをやさしく叩いてO/N培地を除去する。
b.プレートの上部に白色のペーパータオルをあてがい、プレートを逆さにして、VWR
Symphony4417遠心機を使用して、300RPMで20秒間遠心する。
c. WellMateを使用して50ulの刺激緩衝液を加える。
d.プレートをやさしく叩いてO/N培地を除去する。
e.プレートの上部に白色のペーパータオルをあてがい、プレートを逆さにして、VWR
Symphony4417遠心機を使用して、300RPMで20秒間遠心する。
f.顕微鏡で細胞を調べる。
2. Viaflow384を使用して、IBMXを含有する10ulの刺激緩衝液を加
える。
3. Viaflow384を使用して、化合物を含有する10ulの2倍ホルスコリン
溶液を加える(7番目の床に対して)。溶液を混合した後で細胞に加える。
4.室温で30分間インキュベートする(温度変化を避けるためにプレートを引き出しに
入れる)。
5. cAMP検量線を準備し、cAMP検出試薬を調製する。
6. 20ul/ウェルのcAMP検量線を検量線プレート(アッセイプレートと同じプ
レート)に加える。
ステップ3:LANCE cAMPアッセイ
1. Combi384を使用して、10ulのd2 cAMP/ウェルをアッセイプレ
ートに加える。
2. 10ul/ウェルのクリプテートコンジュゲートをアッセイプレートに手作業で加
える。
3.プレートにシールをする。
4.室温で最低1時間インキュベートする(プレートは、24時間以内に読み取ってよい
)。
5.プレートの底にテープを貼る。
6. Envisionの「Cisbio384 full plate」プログラムで
読み取る。
7.生データがアクセサリファイルに入っているのを確かめる。
8. GraphPadでデータを解析する(アクセサリファイルの中のファイルを参照
する)。
生体分子がsiRNAである本発明によるコンジュゲートの活性および血漿安定性は、
以下に記載する次のin vivo法によって評価することができる。
方法
実施例24のコンジュゲートは、APOC3 siRNAがGalNAc(参考例3)
および脂肪酸とコンジュゲートした化合物である。ヒトAPOC3トランスジェニックマ
ウス(B6;CBA−Tg(APOC3)3707Bres/J)をJackson L
aboratory(メイン州バーハーバー)から購入した。マウスには、12時間の明
/暗サイクル下で、標準のげっ歯動物固形飼料および水を制約なく与えた。この条件下で
、APOC3トランスジェニックマウスは、高トリグリセリド血症を自然に発症し、血漿
TG含有量が著しく増加する(Aalto-Setala K, J Clin Invest 1992)。各群の4匹のマ
ウスに、参考例3(APOC3 siRNA−GalNAc)または実施例24のコンジ
ュゲートのいずれかを、25mg/体重Kgの用量で皮下注射した。注射直前のベースラ
イン時、ならびに注射してから2、4、7、および14日後に、血液を採取した。血漿を
使用して、CisbioのHTRFアッセイでヒトAPOC3タンパク質レベルを測定し
た。一方向ANOVAを使用して、群間の統計学的差異を比較した。
結果
ベースライン血漿APOC3レベルは、参考例3およびコンジュゲート24群において
、それぞれ、176±21mg/dLおよび178±9mg/dLであった。参考例3は
、時間依存的に、投与から5日後に、血漿APOC3レベルをベースラインに対して56
%低下させた。比較すると、実施例24のコンジュゲートは、血漿APOC3をより効果
的に低下させ、投与から5日後で80%の低下であった(図1)。作用持続時間は、図1
に示されるとおり、参考例3と実施例24とで似通っている。
本発明のコンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも5時間、少なくとも10時間、少
なくとも20時間、少なくとも30時間、少なくとも40時間、または少なくとも50時
間である。一実施形態では、コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向
上は、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または75倍
である。
併用療法
本発明のコンジュゲートは、1種または複数の他の治療薬と同時またはその前もしく後
に投与することができる。本発明のコンジュゲートは、他の薬剤と同じもしくは異なる投
与経路で別々に投与してもよいし、または同じ医薬組成物にして一緒に投与してもよい。
一実施形態では、本発明は、療法において同時に、別々に、または順次使用される併用
型調製物として、前述の実施形態のいずれか1つのコンジュゲートまたは実施形態10お
よび13に記載のとおりのコンジュゲートの混合物と、少なくとも1種の他の治療薬とを
含む製品を提供する。一実施形態では、前記療法は、それを必要とする対象における、代
謝性障害または疾患、2型真性糖尿病、肥満、異脂肪血症、グルコースレベルの上昇、イ
ンスリンレベルの上昇、および糖尿病性腎症の治療であって、治療有効量の本発明のコン
ジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を前記対象に投与することを含み
、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変
異体、断片、および他の修飾形態である、治療である。
併用型調製物として提供される製品には、前述の実施形態のいずれか1つのコンジュゲ
ートと他の治療薬とを同じ医薬組成物中に一緒に含む組成物、または別個の形態の前述の
実施形態のいずれか1つのコンジュゲートと他の治療薬とを、たとえばキットの形にした
ものがある。
一実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれか1つのコンジュゲートまたは実
施形態10もしくは13に従うコンジュゲートの混合物と、別の治療薬とを含む医薬組成
物を提供する。場合により、医薬組成物は、上述のとおりの、薬学的に許容される医薬添
加剤を含んでもよい。
一実施形態では、本発明は、2種以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも1種
が、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートを含有する、キットを提供する
。一実施形態では、キットは、容器、分割ボトル、分割ホイル包などの、前記組成物を別
々に保持する手段を含む。そのようなキットの一例は、錠剤、カプセル剤などの包装に一
般に使用されているような、ブリスターパックである。
本発明のキットを使用すると、たとえば経口と皮下と非経口という異なる剤形を投与す
る、別個の組成物を異なる投与間隔で投与する、または別個の組成物の用量を互いに合わ
せて漸増することができる。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは通常、投与の
説明書を含む。本発明の併用療法では、本発明のコンジュゲートと他の治療薬は、同じま
たは異なる製造業者によって製造および/または製剤されたものでよい。さらに本発明の
コンジュゲートと他の治療薬は、(i)(たとえば、本発明のコンジュゲートと他の治療
薬を含むキットの場合において)併用製品が医師に発売される前に、(ii)投与のすぐ
前に医師自らによって(または医師の指導のもとで)、(iii)たとえば本発明のコン
ジュゲートと他の治療薬を順次投与する際に患者自らで、一緒にされて併用療法になる場
合もある。
本発明はまた、本明細書に記載する疾患または状態を治療するための、前述の実施形態
のいずれか1つに従うコンジュゲートの使用であって、患者が別の治療薬による治療を前
もって(たとえば24時間以内に)受けている、使用を提供する。本発明はまた、本明細
書に記載する疾患または状態を治療するための、別の治療薬の使用であって、患者が前述
の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートによる治療を前もって(たとえば24時
間以内に)受けている、使用を提供する。
第2の薬剤または治療と「組み合わせて」という用語は、本発明のコンジュゲート(た
とえば、前述の実施形態のいずれか1つに従うコンジュゲートまたは本明細書に別な形で
記載するコンジュゲート)の第2の薬剤または治療との共投与、最初の本発明の化合物に
続いての第2の薬剤または治療の投与、および最初の第2の薬剤または治療に続いての本
発明のコンジュゲートの投与を包含する。
用語「第2の薬剤」および「共薬剤」は、互換的に使用され、本明細書に記載する疾患
または障害、たとえば、代謝性障害または疾患、すなわち、2型真性糖尿病、肥満、膵炎
、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、および他
の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリ
ック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不
全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが、慢性腎臓病を含める)、ニューロパ
シー、胃不全麻痺、および他の代謝障害から選択される障害または疾患の症状を治療、予
防、または軽減することが当分野で知られているいずれかの薬剤を包含する。
一実施形態では、前記療法は、代謝性障害または疾患、すなわち、2型真性糖尿病、肥
満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、
および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、
メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒
中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓病を含める)、ニュ
ーロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害の、それを必要とする対象における治
療であって、治療有効量の本発明のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もし
くは塩を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GD
F15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、治療で
ある。
前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変
異体、断片、および他の修飾形態である本発明のコンジュゲートと組み合わせる第2の薬
剤の例としては、次のものが挙げられる。
1.抗糖尿病薬、たとえば、インスリン、インスリン誘導体および模倣物;スルホニル尿
素(たとえば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリ
ブリド、グリメピリド、グリピジド)などのインスリン分泌促進物質;グリブリドおよび
Amaryl;メグリチニド、たとえばナテグリニドやレパグリニドなどの、インスリン
分泌性スルホニル尿素受容体リガンド;(たとえばインスリン感作によって)インスリン
作用を強化し、したがって末梢組織におけるグルコース利用を促進する、チアゾリジンジ
オン(たとえば、ロシグリタゾン(AVANDIA)、トログリタゾン(REZULIN
)、ピオグリタゾン(ACTOS)、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン
(netoglitazone)、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン
(adaglitazone)、ダルグリタゾン;PTP−112などの、タンパク質チロシンホスフ
ァターゼ1B(PTP−1B)阻害薬;トルセトラピブなどの、コレステリルエステル転
送タンパク質(CETP)阻害薬;SB−517955、SB−4195052、SB−
216763、NN−57−05441、NN−57−05445などの、GSK3(グ
リコーゲンシンターゼキナーゼ3)阻害薬;GW−0791やAGN−194204など
のRXRリガンド;T−1095などの、ナトリウム依存的グルコース共輸送体阻害薬;
BAY R3401などのグリコーゲンホスホリラーゼA阻害薬;ビグアナイド、たとえ
ば、メトホルミン、およびグルコース利用を促進し、肝臓のグルコース産生を低下させ、
および/または腸管からのグルコース出力を低減する他の薬剤;α−グルコシダーゼ阻害
薬、たとえば、アカルボース、ミギイトイ(migiitoi)、および炭水化物消化、したがっ
て、腸からの吸収を緩慢にし、食後高血糖を減らす他の薬剤;GLP−1(グルカゴン様
ペプチド1)、エキセンディン4などのGLP−1類似体およびGLP−1模倣物;なら
びにビルダグリプチンなどのDPPIV(ジペプチジルペプチダーゼIV)阻害薬、
2.脂質低下薬、たとえば、3−ヒドロキシ−3−メチル−グルタリル補酵素A(HMG
−CoA)還元酵素阻害薬、たとえば、ロバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン
、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン(velostatin)、フル
バスタチン、ダルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、およびリバスタチン
(rivastatin);スクアレンシンターゼ阻害薬;FXR(ファルネソイドX受容体)およ
びLXR(肝臓X受容体)リガンド;コレスチラミンやコレセベラムなどの胆汁酸捕捉剤
;フィブラート;ニコチン酸およびアスピリン、
3.抗肥満薬、たとえば、オーリスタットまたはリモナバント、フェンテルミン、トピラ
メート、クネキサ(qunexa)、ロカセリン(locaserin)、
4.降圧薬、たとえば、エタクリン酸、フロセミド、トルセミドなどのループ利尿薬;ベ
ナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリ
ル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルなどのアンジオテンシ
ン変換酵素(ACE)阻害薬;ジゴキシンなどの、Na−K−ATPアーゼ膜ポンプの阻
害薬;中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害薬;オマパトリラート、サンパトリラート
(sampatrilat)、ファシドトリルなどのACE/NEP阻害薬;カンデサルタン、エプ
ロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンなどのアンジ
オテンシンIIアンタゴニスト、特にバルサルタン;ジテキレン(ditekiren)、ザンキ
レン(zankiren)、テルラキレン(terlakiren)、アリスキレン、RO66−1132、
Ro−66−1168などのレニン阻害薬;アセブトロール、アテノロール、ベタキソロ
ール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、
チモロールなどのβ−アドレナリン受容体遮断薬;ジゴキシン、ドブタミン、ミルリノン
などの強心薬(inotropic agent);アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロ
ジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニフェジピン、ニソルジピン、ベラパミルなどのカ
ルシウムチャネル遮断薬;アルドステロン受容体アンタゴニスト;ならびにアルドステロ
ンシンターゼ阻害薬、
5.ペルオキシソーム増殖因子−活性化因子受容体のアゴニスト、たとえば、フェノフィ
ブレート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、BMS−298585、
L−796449、特許出願国際公開第2004/103995号パンフレットに詳細に
記載されている化合物、すなわち、実施例1〜35の化合物もしくは請求項21に詳細に
挙げられている化合物、または特許出願国際公開第03/043985号パンフレットに
詳細に記載されている化合物、すなわち、実施例1〜7の化合物もしくは請求項19に詳
細に挙げられている化合物、特に、(R)−1−{4−[5−メチル−2−(4−トリフ
ルオロメチル−フェニル)−オキサゾール−4−イルメトキシ]−ベンゼンスルホニル}
−2,3−ジヒドロ−1H−インドール−2−カルボン酸もしくはその塩、ならびに
6.Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633、図1〜7に記載されている詳
細な抗糖尿病性化合物。
さらに、本開示は、代謝を刺激するまたは食欲を低下させる薬剤、減量を促進するため
の改良された食事および/または運動レジメンなどの、減量を促進する薬剤および方法と
の併用療法を企図する。
本発明の実施例
略語
ACN アセトニトリル
BEH エチレン架橋型ハイブリッド
BOC tert−ブチルオキシカルボニル
BSA ウシ血清アルブミン
DCM ジクロロメタン
DCC N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DIC N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA N,N’−ジイソプロピルエチルアミン
DMAP ジメチルアミノピリジン
DMF N,N’−ジメチルホルムアミド
DTT ジチオトレイトール
DOT 3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオール
EDC 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ESI エレクトロスプレーイオン化
FFA 蛍光フォーカスアッセイ
Fmoc フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド
HCTU: O−(6−クロロベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N
’−テトラメチルウロニウムヘキサフルホロホスフェート
HEP ヘプタン
HFIP ヘキサフルオロイソプロパノール
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HRMS 高分解能質量分析
HOBT ヒドロキシベンゾトリアゾール
HS ヒト血清
LC/MS 液体クロマトグラフィー/質量分析
MS 質量分析
MW 分子量
MRT 平均滞留時間
NHS N−ヒドロキシスクシンイミド
NMM N−メチルモルホリン
NMR 核磁気共鳴
PEG ポリエチレングリコール
pE ピログルタミン酸
pbf 2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル
PG: 保護基
PK 薬物動態
Pol ポリマー担体
QTOF: 四重極飛行時間質量分析計
Rt: 保持時間
RtまたはRT: 室温
Rpm: 1分当たりの回転数
Sc 皮下の
SFC 超臨界流体
SPPS 固相ペプチド合成
TBME メチルtert−ブチルエーテル
Trt トリチル
THF テトラヒドロフラン
TEA トリメチルアミン
TIS トリエチルシラン
t、s、quin、br、m、d(三重項、一重項、五重項、ブロード、多重項)
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
合成:
HPLC−分析方法F
− カラム:XBridge BEH300 C18(100×4.6分)、3μm;
Part n°:186003612
− 溶離液A:水中0.1%TFA/溶離液B:ACN中0.1%TFA
− 流れ:1.0ml/分
− 温度:40℃
− 勾配:
UPLC−HRMS−分析方法G
− Waters Acquity UPLC(登録商標) BEH C18、1.7
μm、2.1×50mm;Part n°:186002350
− 溶離液A:水中0.05%FA+3.75mMの酢酸アンモニウム;溶離液B:A
CN中0.04%FA
− 流れ:1.0ml/分
− 温度:50℃
− 勾配:4.4分で2〜98%
方法H:LC−MS法
− HPLC:移動相A:2%HFIP+0.1%TEA;移動相B:メタノール;
− 勾配:0分間95%のA、4分間:75%のA、8分間10%のA、8.1分間9
5%のA、10分間95%のA;
− 流量:250μl/分;
− カラム:Acquity UPLC BEH C18、1.7um、2.1×50
mm(waters);
− カラム温度:75℃
− MS:QTOF(waters)ネガティブモード;
− ESI:2.9kv;昇温キャピラリー350℃;スプレーガス:600ml/分
;電源温度:150℃
方法I:LC−MS法:
− 移動相A:水+0.1%ギ酸
− 移動相B:アセトニトリル+0.1%ギ酸
− 勾配:0分間98%のA、0.06分間98%のA、1.76分間2%のA、2.
06分間2%のA、2.16分間98%;流量:1ml/分;
− カラム:ACQUITY UPLC BEH C18、130Å、1.7μm、2
.1mm×50mm;
− カラム温度:50℃
− 検出器:UV/Vis/CAD(荷電したエアロゾル検出器)
UPLC HRMS方法J:
− カラム:Acquity BEH300 C4 1.7μm、2.1×50mm
− 溶離液A:水(0.1%TFA)
− 溶離液B:ACN(0.1%TFA)
− 流れ:0.5mL/分
− 温度:40℃
− 勾配:20%で0.5分保持、10分で80%ACNまでの勾配
方法K:
− カラム:Waters Protein BEH C4カラム、300オングスト
ローム、3.5um、4.6×100mm
− 移動相:A:水(0.05%TFA)B:ACN(0.05%TFA)
− 流れ:2mL/分
− 温度:40℃
− 勾配:1分間25%のBを保持、10分に25〜60%のACNの勾配、10.5
0分に95%のBまでの勾配および2分間の保持、次いで25%で2分間の平衡化。通算
稼働時間は15分である。
− 質量分析計:Waters ZQ mass spec
− UPLC:カラム:BEH C4、300オングストローム、1.7um、2.1
×50mm
方法L:
− カラム:Proswift Monolith 4.6×50mm
− 移動相:A:水(0.1%ギ酸)B:ACN(0.1%ギ酸)
− 流れ:1mL/分
− 温度:50℃
− 勾配:0分間3%のB;2分で3〜80%のB;2.1分間10%のB;2.8分
間95%のB;2.9分間3%のB
− 質量分析計:Qtof ESI 走査範囲100〜1900;Mass Lynx
ソフトウェアパッケージのMax Ent 1によりデコンボリューションした
− UPLC:Waters Acquity
分析方法S:
− Xbridge C18カラム、3.5μM、3.0×3.0mm
− 溶離液:A:水+5mMの水酸化アンモニウム B:ACN
− 流量:2mL/分
− 勾配:0.0分間2%のB;1.70分で2%〜95%のB;2.00分間95%
のB;2.10分間5%のB;
− 質量分析計:Single Quadrupole ESI
− HPLC:Agilent 1100シリーズ
− 温度:40C
分析方法T:
中間体1:ベンジル11−ブロモウンデカノエート
11−ブロモウンデカン酸(4g、15.08mmol)、ベンジルアルコール(1.
875mL、18.10mmol)、およびDMAP(92mg、0.754mmol)
を、N中にて、室温でDCMに溶解させた。EDC−HCl(4.34g、22.63
mmol)を加え、反応液を17時間撹拌した。反応液を濃縮し、続いてEtO(15
0mL)で希釈した。混合物を水(30mL)で抽出し、水性相をEtO(150mL
)で抽出した。合わせた有機物をブライン(20mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥さ
せた。溶媒を除去し、残渣をフラッシュカラム(シリカ120g、0〜10%のEt
/石油エーテル)で精製して、中間体1を無色の液体(6.75g、定量的)として得た
:LCMS法 方法A Rt=1.79分、M+H 355.2;1H NMR (400 MHz, ク
ロロホルム-d) δ ppm 1.18 - 1.36 (m, 10 H) 1.37 - 1.47 (m, 2 H) 1.64 (五重線, J=
7.33 Hz, 2 H) 1.85 (dt, J=14.56, 7.06 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 3.40 (t,
J=6.88 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 5 H).
中間体2:トリベンジルウンデカン−1,1,11−トリカルボキシレート
NaH(113mg、2.83mmol)を、N2中にて、0℃で、DMF(6mL)
に懸濁させた。マロン酸ジベンジル(0.704mL、2.82mmol)を、撹拌中の
懸濁液に30分かけてゆっくり加えた。DMF(3mL)に溶解させた中間体1(903
mg、2.54mmol)を加え、反応液を0℃で2.75時間撹拌させた後、室温に温
め、終夜撹拌した。反応物をEtO(75mL)で希釈し、水(20mL)で抽出した
。水性相をEtO(75mL)で抽出し、合わせた有機物をブライン(30mL)で洗
浄した。有機物を、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム(シ
リカ80g、0〜10%のEtOAc/HEP)で精製して、70%の純度の無色の油状
物(770mg、1.38mmol、34%)を得た:LCMS 方法B Rt=1.4
1分、M+H 559.6。
中間体3:トリベンジルドコサン−1,11,11−トリカルボキシレート
DMF(2mL)中NaH(66.1mg、1.65mmol)の懸濁液に、0℃で、
N2中にて、DMF(4mL)中中間体2(770mg、1.38mmol)を加えた。
35分後に、DMF(2mL)中1−ブロモウンデカン(0.338mL、1.52mm
ol)の溶液を反応液に加え、これを25分間撹拌した後に室温に温めた。反応液を2日
間撹拌した。反応液をEtO(75mL)で希釈し、10%LiCl(25mL)で抽
出した。水性相をEtO(75mL)で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し
、Na2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残渣のフラッシュカラム(シリカ80g
、0〜10%のEtOAc/HEP)による精製によって、中間体3を無色の油状物(5
90mg、0.827mmol、33%)として得た:LCMS法 方法B Rt=1.
89分、M+Na 735.5;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.87 - 0.9
5 (m, 3 H) 1.07 (br. s., 4 H) 1.14 - 1.36 (m, 28 H) 1.66 (五重線, J=7.43 Hz, 2 H
) 1.85 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H) 7.27
(d, J=2.32 Hz, 1 H) 7.28 - 7.43 (m, 14 H).
中間体4:ドコサン−1,11,11−トリカルボン酸
THF(12mL)に溶解させた中間体3(590mg、0.827mmol)を、T
HF(8mL)中10%の炭素担持Pdの懸濁液と合わせた。懸濁液を撹拌し、バルーン
により水素雰囲気下に置いた。1時間後、反応液をメンブレンフィルターに通し、固体を
EtOAcですすいだ。濾液を蒸発させ、表題化合物を無色の油状物(353mg、0.
798mmol、96%)として得た:LCMS法 方法B Rt=1.16分、M+H
443.5;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.77 - 0.84 (m, 3 H) 1.06
- 1.33 (m, 32 H) 1.59 (五重線, J=7.18 Hz, 2 H) 1.83 - 1.92 (m, 4 H) 2.32 (t, J=7
.03 Hz, 2 H).
中間体5:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)−
2−ウンデシルトリデカン二酸
DCM(1.57mL)中DCC(126mg、0.610mmol)の溶液を、N
中にて、DCM(5mL)およびTHF(5mL)中中間体4およびN−ヒドロキシスク
シンイミドの溶液に加えた。3.5時間後、溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマト
グラフィー(SFC;Princeton 2−エチル−ピリジン、20×150mm、
20〜30%のMeOH/CO)によって精製して、表題化合物を無色の油状物(13
8mg、0.256mmol、50%)として得た:LCMS法 B Rt=1.21分
、M+H 540.5;1H NMR (600 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 0.91 (t, J=7.20
Hz, 3 H) 1.22 - 1.42 (m, 34 H) 1.57 (五重線, J=7.34 Hz, 2 H) 1.93 - 1.96 (m, 2
H) 2.28 (t, J=7.47 Hz, 2 H) 2.79 (br. d, J=6.30 Hz, 4 H).
中間体6および6A:2−(アジド−PEG23−カルバモイル)−2−ウンデシルトリ
デカン二酸構築物(6)および12−(アジド−PEG23−カルバモイル)トリコサノ
ン酸構築物(6A)
中間体5(36mg、0.066mmol)およびアジド−dPEG23−NH(Q
uanta Biodesign:73mg、0.066mmol)をTHF(1.5m
L)中で合わせ、シェーカープレート上で15分間混合した後、DIPEA(17μL、
0.10mmol)を加えた。反応液をシェーカープレート上に終夜放置した。溶媒を蒸
発させ、残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50mm、55〜80%のA
CN/水+0.1%TFA)によって精製して、中間体6(39mg、0.025mmo
l、38%)および中間体6a(20mg、0.013mmol、20%)を得た:LC
MS 方法B Rt=1.11分、[M+2H]+2 763.4;1H NMR (400 MHz,
クロロホルム-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.10 - 1.19 (m, 2 H) 1.20 - 1.29 (m,
23 H) 1.32 (br. s., 7 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.69 - 1.79 (m, 2 H) 1.96 - 2.10
(m, 2 H) 2.35 (t, J=7.15 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.57 (m, 2 H)
3.58 - 3.62 (m, 2 H) 3.62 - 3.73 (m, 90 H) 7.46 (br. s., 1 H);
LCMS 方法B Rt=1.23分、[M+2]+2 740.9;1H NMR (400 MHz,
クロロホルム-d) δ ppm 0.83 - 0.96 (m, 3 H) 1.27 (br. s., 25 H) 1.29 - 1.37 (m,
7 H) 1.37 - 1.46 (m, 2 H) 1.53 - 1.73 (m, 4 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 3.41 (t
, J=5.07 Hz, 2 H) 3.44 - 3.52 (m, 2 H) 3.55 - 3.60 (m, 2 H) 3.60 - 3.74 (m, 90 H
) 6.19 - 6.30 (m, 1 H).
あるいは、構築物6Aは、以下の手順に従って得られる:THF(1mL)中中間体5
(48mg、0.042mmol)の溶液を、アジド−PEG23−アミン(Quant
a Biodesign カタログ番号10525)(46mg、0.042mmol)
を入れたバイアルに加えた。反応液を20分間撹拌した後、DIPEA(11μL、0.
063mmol)を加え、次いで終夜維持した。アジド−PEG23−アミン(23mg
、0.021mmol)およびDIPEA(5μL、0.029mmol)を加え、反応
液をもう1日撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Xbridge C18 3
0×50mm、10〜30%のACN/5mMのNH4OH)によって精製した。画分の
凍結乾燥により、生成物の混合物が得られた。材料を、HPLC(Sunfire C1
8 30×50mm、45〜70%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、
中間体6A(30mg、0.020mmol、48%)を得た:LCMS法 B Rt=
0.81分、[M+H+HO]+2 764.5;1H NMR (400 MHz, アセトニトリル-
d3)δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62 (m, 6 H) 2.14 (t,
J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H) 3.37 - 3.43 (m, 2
H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1 H).
中間体7:(((11−ブロモウンデシル)オキシ)メタントリイル)トリベンゼン
トリチルクロリド(2.49g、8.92mmol)、11−ブロモウンデカン−1−
オール(2.00g、7.96mmol)、およびDMAP(10mg、0.080mm
ol)を、N中にて、DCM(16mL)に溶解させた。撹拌しながら、DIPEA(
1.39mL、7.96mmol)を加え、反応液を7日間維持した。反応液を、DCM
(20mL)と水(10mL)の間に分配した。有機相を水(20mL)で抽出し、Mg
SOで乾燥させ、濃縮した。濃縮物を、フラッシュカラム(シリカ 120g、0〜6
%のEtOAc/HEP)によって精製して、中間体7(2.50g、5.07mmol
、64%)を無色の油状物として得た:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.19
- 1.49 (m, 14 H) 1.58 - 1.69 (m, 2 H) 1.79 (dt, J=14.50, 7.00 Hz, 1 H) 1.87 (dt
, J=14.55, 7.03 Hz, 1 H) 3.07 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.43 (t, J=6.85 Hz, 1 H) 3.55
(t, J=6.79 Hz, 1 H) 7.18 - 7.36 (m, 10 H) 7.42 - 7.52 (m, 5 H).
中間体8:ジベンジル2−(11−(トリチルオキシ)ウンデシル)マロネート
NaH(113mg、2.83mmol)を、0℃で、N2中にて、DMF(6mL)
に懸濁させた。マロン酸ジベンジルを、撹拌した懸濁液にゆっくり加えた。30分後、D
MF(3mL)中中間体7(1.26g、2.54mmol)の溶液を加えた。撹拌の1
5分後、得られた混合物を室温に温めた。3日後、反応液をEtO(75mL)で希釈
し、水(40mL)で抽出した。水性相をEtO(75mL)で抽出した。合わせた有
機物をNaSOで乾燥させ、濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム(シリカ80g、
0〜10%のEtOAc/HEP)によって精製して、表題化合物を無色の油状物(81
5mg、1.17mmol、41%)として得た:HPLC 方法B Rt=1.68分
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.16 - 1.40 (m, 16 H) 1.58 - 1.69 (m,
2 H) 1.94 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 3.45 (t, J=7.52 Hz, 1 H)
5.16 (s, 4 H) 7.21 - 7.28 (m, 3 H) 7.28 - 7.39 (m, 16 H) 7.42 - 7.51 (m, 6 H).
中間体9:トリベンジル22−(トリチルオキシ)ドコサン−1,11,11−トリカル
ボキシレート
DMF(2mL)中中間体8(815mg、1.17mmol)の溶液に、N中にて
、0℃で、DMF(2mL)中NaH(56mg、1.40mmol)の懸濁液を加えた
。混合物を1時間撹拌した。DMF(2mL)中ベンジル11−ブロモウンデカン酸(4
57mg、1.29mmol)を反応液に加えた。添加の20分後に、反応液を室温に温
め、終夜撹拌した。反応液をEtO(75mL)で希釈し、水(25mL)で抽出した
。水性相をEtO(75mL)で抽出し、有機物を合わせた。合わせた有機物をNa
SOで乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム(シリカ 40g、0〜10%
のEtOAc/HEP)によって精製して、表題化合物を無色の油状物(780mg、0
.803mmol、69%)として得た:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.
99 - 1.14 (m, 4 H) 1.15 - 1.41 (m, 26 H) 1.58 - 1.71 (m, 4 H) 1.82 - 1.96 (m, 4
H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 3.06 (t, J=6.66 Hz, 2 H) 5.12 (s, 4 H) 5.14 (s, 2 H)
7.28 (s, 24 H) 7.42 - 7.52 (m, 6 H).
中間体10:22−(トリチルオキシ)ドコサン−1,11,11−トリカルボン酸
THF(2.5mL)中10%の炭素担持Pd(11mg、0.010mmol)の懸
濁液を、THF(2.5mL)中中間体9(200mg、0.206mmol)の溶液に
加えた。撹拌した懸濁液を、バルーンにより水素中に置いた。2.25時間後、反応液を
メンブレンフィルターに通し、固体をEtOAcですすいだ。濾液を蒸発させ、中間体1
0(150mg、定量的)を得た:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.04 - 1
.33 (m, 30 H) 1.45 - 1.62 (m, 4 H) 1.76 - 1.91 (m, 4 H) 2.21 - 2.36 (m, 2 H) 2.9
7 (t, J=6.60 Hz, 2 H) 7.06 - 7.18 (m, 4 H) 7.19 - 7.24 (m, 5 H) 7.33 - 7.50 (m,
6 H).
中間体11:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)
−2−(11−トリチルオキシ)ウンデシル)トリデカン二酸(11)。
中間体10(150mg、0.214mmol)およびN−ヒドロキシスクシンイミド
(25mg、0.214mmol)をDCM(4mL)中で合わせた。DCM(0.61
mL)に溶解させたDCC(49mg、0.235mmol)を加え、反応液を室温で7
時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50
mm;65〜95%のACN/水+0.1%TFA)により、続いてSFC(Princ
eton 2−エチルピリジンカラム 20×100mm、25〜35%のMeOH/C
O2)によって精製して、中間体11(34mg、0.043mmol、20%)を無色
の油状物として得た:LCMS 方法B Rt=1.47分、M−COH 752.7
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.13 - 1.42 (m, 30 H) 1.56 - 1.73 (m,
4 H) 1.94 - 2.14 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.83 (br. s., 4 H) 3.06 (t, J
=6.66 Hz, 2 H) 7.15 - 7.28 (m, 3 H) 7.29 - 7.36 (m, 6 H) 7.41 - 7.50 (m, 6 H).
中間体12:2−((アジド−PEG23)カルバモイル)−2−(11−ヒドロキシウ
ンデシル)トリデカン二酸構築物
THF(1.5mL)中アジド−dPEG23−アミン(Quanta Biodes
ign)42mg、0.038mmol)を、N中にて、中間体11(34mg、0.
043mmol)と合わせた。反応液をシェーカープレート上に置き、20分間撹拌した
。DIPEA(7.44μL、0.043mmol)を加え、反応液を2時間撹拌した。
DIPEA(4μL、0.023mmol)を加え、反応液を終夜維持した。溶媒を蒸発
させ、残渣をDCM(3mL)およびTFA(0.5mL)中に溶かした。溶液を1時間
撹拌し、この時点で、溶媒を取り除いた。残渣をHPLC(Sunfire C18 3
0×50mm、45〜70%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、中間体
12(4mg、1.8μmol、4.2%)を得た:LCMS 方法B Rt=0.75
分、[M+2H]+2 771.4;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.05 -
1.39 (m, 30 H) 1.52 - 1.82 (m, 6 H) 1.97 - 2.09 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 2
H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.51 - 3.63 (m, 6 H) 3.63 - 3.75 (m, 90 H) 4.36 (t,
J=6.72 Hz, 1 H) 7.49 - 7.65 (m, 1 H).
中間体13:13−(ベンジルオキシ)−12−((ベンジルオキシ)カルボニル)−1
3−オキソトリデカン酸
DMF(3mL)中マロン酸ジベンジル(0.88mL、3.52mmol)を、N
中にて、0℃で、NaH(274mg、6.86mmol)の懸濁液にゆっくり加えた。
混合物を1.5時間撹拌した後、室温に温めた。DMF(3mL)中11−ブロモウンデ
カン酸(933mg、3.52mmol)を加え、反応を終夜行わせた。反応液を3時間
で80℃まで加熱した後、冷却した。反応液をEtOAc(50mL)およびEtO(
50mL)で希釈し、1MのHCl(25mL)で抽出した。水性相をEtOAc/Et
O(100mL)で抽出した。合わせた有機物をNaSOで乾燥させ、溶媒を蒸発
させた。残渣をフラッシュカラム(C18 50g 30〜100%のACN/水+0.
1TFA)によって精製して、中間体13(315mg、0.672mmol、19%)
を白色の粉末として得た:LCMS 方法B Rt=1.05分、M+H 469.5。
中間体14:23−(ベンジルオキシ)−12,12−ビス((ベンジルオキシ)カルボ
ニル)−23−オキソトリコサン酸
NaH(54mg、1.34mmol)を、0℃で、N中にて、DMF(1mL)に
懸濁した。混合物に、DMF(3mL)中中間体13(315mg、0.672mmol
)を液滴方式で加えた。反応液を1時間撹拌した後、DMF(1mL)中中間体1(23
9mg、0.672mmol)を加えた。反応液を、0℃で、さらに45分間維持した後
、室温に温めた。反応液を終夜撹拌した。反応液を1:1のEtOとEtOAc(75
mL)で希釈し、1MのHCl(20mL)で抽出した。水性相を1:1のEtOとE
tOAc(75mL)で抽出した。合わせた有機物をNaSOで乾燥させ、蒸発させ
た。得られた残渣のHPLC(Xbridge C18 30×50mm、45〜70%
のACN/水+5mMのNH4OH)による精製により、表題化合物(132mg、0.
178mmol、26%)を得た:LCMS法 B;Rt=1.53分、M−H 741
.8。
中間体15:1,11,11−トリベンジル21−(2,5−ジオキソピロリジン−1−
イル)ヘニコサン−1,11,11,21−テトラカルボキシレート
DCM(1mL)中DCC(44mg、0.213mmol)を、DCM(2.5mL
)中中間体14(132mg、0.178mmol)およびN−ヒドロキシスクシンイミ
ド(20mg、0.178mmol)の溶液に加えた。反応液を、シェーカープレート上
で、17時間撹拌した。反応液を濾過し、固体をDCMですすいだ。濾液を濃縮し、フラ
ッシュカラム(シリカ 12g、0〜40%のEtOAc/HEP)によって精製して、
中間体15(107mg、0.127mmol、72%)を得た:LCMS 方法B R
t=1.53分、M+Na 862.8。
中間体16:22−((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)−22−オキ
ソドコサン−1,11,11−トリカルボン酸
THF(2.5mL)中中間体15(107mg、0.127mmol)の溶液に、T
HF(2.5mL)中10%の炭素担持Pdの懸濁液を加えた。混合物を、水素雰囲気下
に1.5時間置いた。反応液をメンブレンフィルターに通し、固体をDCMおよびTHF
で洗浄した。濾液を蒸発させて、表題化合物を含有する無色の油状物(95mg、定量的
)を得た:LCMS 方法B Rt=0.65分、M+H 570.5。
中間体17:2−(11−(アジド−PEG23−アミノ)−11−オキソウンデシル)
トリデカン二酸構築物
THF(1mL)中中間体16(48mg、0.042mmol)の溶液を、アジド−
dPEG23−アミン(Quanta Biodesign:46mg、0.042mm
ol)を入れたバイアルに加えた。反応液を20分間撹拌した後、DIPEA(11μL
、0.063mmol)を加え、次いで、終夜維持した。アジド−PEG23−アミン(
23mg、0.021mmol)およびDIPEA(5μL、0.029mmol)を加
え、反応液をもう1日撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Xbridge C
18 30×50mm、10〜30%のACN/5mMのNH4OH)によって精製した
。画分の凍結乾燥により、生成物の混合物が得られた。材料を、HPLC(Sunfir
e C18 30×50mm、45〜70%のACN/水+0.1%TFA)によって精
製して、表題の中間体17(30mg、0.020mmol、48%)を得た:LCMS
SQ4 Rt=0.81分、[M+H+HO]+2 764.5;1H NMR (400 MHz,
アセトニトリル-d3) δ ppm 1.30 (br. s., 28 H) 1.40 - 1.50 (m, 2 H) 1.50 - 1.62
(m, 6 H) 2.14 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 2.23 - 2.35 (m, 3 H) 3.32 (q, J=5.58 Hz, 2 H)
3.37 - 3.43 (m, 2 H) 3.47 - 3.52 (m, 2 H) 3.53 - 3.68 (m, 90 H) 6.54 (br. s., 1
H).
中間体18:テトラベンジルヘニコサン−1,11,11,21−テトラカルボキシレー
DMF(2mL)中NaH(48mg、1.21mmol)の懸濁液に、0℃で、N
中にて、DMF(2mL)中中間体2(337mg、0.603mmol)をゆっくり加
えた。混合物を15分間撹拌した後、DMF(2mL)中中間体1(429mg、1.2
1mmol)を加えた。反応液を0℃で20分間撹拌した後、室温に温めた。反応液を、
室温で、撹拌しながら、3日間維持した。反応液をEtO(75mL)で希釈し、水(
20mL)で抽出した。水性相をEtO(75mL)で抽出した。合わせた有機物をN
SOで乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム(シリカ 24g、0〜1
5%のEtOAc/HEP)によって精製して、表題化合物(315mg、0.378m
mol、63%)を得た:LCMS 方法B Rt=1.70分、M+Na 855.8
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.95 - 1.13 (m, 4 H) 1.13 - 1.40 (m, 2
4 H) 1.59 - 1.72 (m, 4 H) 1.82 - 1.95 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 4 H) 5.12 (s,
4 H) 5.14 (s, 4 H) 7.14 - 7.44 (m, 20 H).
中間体19:ヘニコサン−1,11,11,21−テトラカルボン酸
THF(4mL)中10%の炭素担持Pd(20mg、0.019mmol)の懸濁液
を、THF(6mL)中中間体18(315mg、0.378mmol)の溶液に加え、
反応液を水素雰囲気下に2時間置いた。メンブレンフィルターを使用して固体を取り出し
、EtOAcで洗浄した。濾液を蒸発させて、中間体19(179mg、定量的)を白色
の固体として得た:LCMS 方法A Rt=1.24分、M+H 473.4;1H NMR
(400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.99 - 1.15 (m, 4 H) 1.24 (br. s., 24 H) 1.48 (五重線
, J=6.94 Hz, 4 H) 1.62 - 1.76 (m, 4 H) 2.18 (t, J=7.34 Hz, 4 H) 12.23 (br. s, 4
H).
中間体20:11−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル
)ヘニコサン−1,11,21−トリカルボン酸
N−ヒドロキシスクシンイミド(20mg、0.170mmol)および中間体19(
90mg、0.190mmol)を、DCM(3mL)およびTHF(0.3mL)に溶
解させた。DCM(0.5mL)中DCC(39mg、0.190mmol)の溶液を加
え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Sunfire C18
30×50mm;35〜60%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、表
題化合物を白色の粉末(21mg、0.037mmol、19%)として得た:LCMS
(方法C Rt=1.01分、M+H 570.3。
中間体21および21a:11−((アジド−PEG23)カルバモイル)ヘニコサン−
1,11,21−トリカルボン酸(21)および12−((アジド−PEG23)カルバ
モイル)トリコサン二酸(21a)
アジド−PEG23−アミン(41mg、0.037mmol)および中間体20(2
1mg、0.037mmol)をTHF(1mL)中で合わせ、10分間撹拌した。DI
PEA(9.66μL、0.055mmol)を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸
発させ、残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50mm、35〜60%のA
CN/水+0.1%TFA)によって精製して、中間体21(22mg、0.014mm
ol、38%)および21a(4mg、2.6μmol、7%)を得た:LCMS 方法
B Rt=0.69分、M+H 1555.3;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ
ppm 1.27 (br. s., 19 H) 1.29 - 1.41 (m, 9 H) 1.65 (五重線, J=7.12 Hz, 4 H) 1.78
(td, J=12.13, 4.22 Hz, 2 H) 1.95 - 2.08 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.21 Hz, 4 H) 3.41 (
t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.54 (q, J=5.05 Hz, 2 H) 3.58 - 3.77 (m, 92 H) 7.60 (t, J=4.9
5 Hz, 1 H);
LCMS 方法B Rt=0.78分、M−H 1509.3;1H NMR (400 MHz, クロ
ロホルム-d) δ ppm 1.18 (br. s., 19 H) 1.21 - 1.38 (m, 11 H) 1.43 - 1.63 (m, 6 H
) 1.91 - 2.04 (m, 1 H) 2.26 (t, J=7.15 Hz, 4 H) 3.31 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.40 (q
, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.50 (m, 2 H) 3.51 - 3.69 (m, 90 H) 6.23 (t, J=5.01 Hz,
1 H).
中間体22:ジベンジル2−ウンデシルマロネート
DMF(1.5mL)中マロン酸ジベンジル(0.88mL、3.52mmol)を、
N2中にて、0℃で、DMF(6mL)中NaH(155mg、3.87mmol)の懸
濁液に滴下添加した。混合物を30分間撹拌した後、DMF(1.5mL)中1−ブロモ
ウンデカン(0.785mL、3.52mmol)を反応液に加えた。反応液を室温に温
め、5日間撹拌した。反応液をEtO(75mL)で希釈し、水(20mL)で抽出し
た。水性相をEtO(75mL)で抽出した。合わせた有機物をNaSOで乾燥さ
せ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム(シリカ 80g、0〜10%のEtOAc/
HEP)によって精製して、表題化合物(974mg、2.22mmol、63%)を無
色の油状物として得た:LCMS 方法B Rt=1.55分、M+H 439.5。
中間体23:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)
−2−ウンデシルトリデカン酸
DMF(1mL)中ジベンジル2−ウンデシルマロネート(中間体22:400mg、
0.912mmol)を、N2中にて、0℃で、DMF(2mL)中NaH(44mg、
1.09mmol)の懸濁液に滴下添加した。混合物を45分間撹拌した後、DMF(1
mL)中1−ブロモウンデカン(0.285mL、1.28mmol)を反応液に加えた
。反応液を室温に温め、1日撹拌した。反応液をEtO(75mL)で希釈し、水(2
0mL)で抽出した。水性相をEtO(75mL)で抽出した。合わせた有機物をNa
SOで乾燥させ、蒸発させた。残渣をフラッシュカラム(シリカ 40g、0〜5%
のEtOAc/HEP)によって精製して、無色の油状物(412mg)を得た。油状物
をTHF/MeOHに溶解させ、10%Pd/Cカートリッジを備えたThales N
ano H−Cube(1mL/分、2バール H2、22C)を通した。流出物を集め
、蒸発させて、ワックス状の固体(272mg)を得た。ワックス状の固体を3:1のD
CM/THFに溶解させ、油状物に濃縮した。油状物を、N中にて、DCM(6mL)
に再度溶解させ、N−ヒドロキシスクシンイミド(68mg)、続いてDCM(3mL)
中DCC(136mg)を加えた。反応物を終日撹拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮
した。濃縮物をフラッシュカラム(C18 12g、25〜100%のACN/水+0.
1%ギ酸)によって精製した。得られた材料を、超臨界流体クロマトグラフィー(Pri
nceton 2−エチルピリジン 20×150mm;5〜15%のMeOH/CO2
)によってさらに精製して、中間体23(37mg、0.073mmol、8%)を得た
:LCMS 方法B Rt=1.67分、M+NH 527.6;1H NMR (400 MHz,
クロロホルム-d) δ ppm 0.80 - 0.94 (m, 6 H) 1.18 - 1.42 (m, 36 H) 1.97 - 2.14 (m
, 4 H) 2.87 (br. s., 4 H).
中間体24:2−((アジド−PEG23)カルバモイル)−2−ウンデシルトリデカン
THF(1mL)中中間体23(37mg、0.073mmol)の溶液を、アジド−
dPEG23−アミン(Quanta Biodesign:80mg、0.073mm
ol)を入れたバイアルに加えた。溶液をシェーカープレート上で撹拌し、DIPEA(
11μL、0.065mmol)を加えた。反応液を終夜撹拌した後、DIPEAの追加
分(12μL、0.071mmol)を加え、反応を終夜行わせた。溶媒を蒸発させ、残
渣を超臨界流体クロマトグラフィー(Princeton Amino 21×150m
m;20〜30%のMeOH/CO2)によって精製して、表題化合物(45mg、0.
030mmol、41%)を得た:LCMS 方法B Rt=1.50分、[M+2H]
+2 748.1;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.85 Hz, 6
H) 1.09 - 1.38 (m, 30 H) 1.58 (br. s., 12 H) 1.64 - 1.76 (m, 2 H) 1.98 - 2.16 (m
, 2 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 2 H) 3.46 - 3.64 (m, 5 H) 3.64 - 3.91 (m, 83 H).
中間体25:ジ−tert−ブチル2−ウンデシルマロネート
DMF(2mL)中ジ−tert−ブチルマロネート(1.0g、4.62mmol)
を、N中にて、0℃で、DMF(5mL)中NaH(213mg、5.32mmol)
の懸濁液に加えた。反応液を30分間撹拌した後、DMF(2mL)中1−ブロモウンデ
カンを加えた。加えた後、反応液を室温に温め、2日間撹拌した。反応液をEtO(7
5mL)で希釈し、水(25mL)で抽出した。水性相をEtO(75mL)で抽出し
た。合わせた有機物をNaSOで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。濃縮物を、フラッシ
ュカラム(シリカ 120g、0〜40%のEtO/石油エーテル)によって精製して
、中間体25(0.998g、2.69mmol、58%)を得た:LCMS 方法B
Rt=1.64分、M+Na 393.5;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm
0.85 - 0.94 (m, 3 H) 1.24 - 1.36 (m, 18 H) 1.41 - 1.52 (m, 18 H) 1.74 - 1.86 (m,
2 H) 3.13 (t, J=7.58 Hz, 1 H).
中間体26:1−ベンジル11,11−ジ−tert−ブチルドコサン−1,11,11
−トリカルボキシレート
表題化合物を、出発材料として中間体25を使用して、中間体9と同様の方法で合成し
、無色の油状物(980mg、1.52mmol、66%)を得た:1H NMR (400 MHz,
クロロホルム-d) δ ppm 0.89 (t, J=6.91 Hz, 3 H) 1.06 - 1.20 (m, 4 H) 1.20 - 1.35
(m, 28 H) 1.45 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1.83 (m, 4 H) 2.36 (t, J=7
.52 Hz, 2 H) 5.12 (s, 2 H) 7.30 - 7.45 (m, 5 H).
中間体27:12,12−ビス(tert−ブトキシカルボニル)トリコサン酸
中間体26を使用して、表題化合物(472mg、0.851mmol、100%)を
、中間体19と同様の方法で合成した:LCMS 方法B Rt=1.76分、M−H
553.6;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.95 (m, 3 H) 1.07 -
1.21 (m, 4 H) 1.21 - 1.40 (m, 28 H) 1.46 (s, 18 H) 1.58 - 1.70 (m, 2 H) 1.72 - 1
.84 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.46 Hz, 2 H).
中間体28:11,11−ジ−tert−ブチル1−(2,5−ジオキソピロリジン−1
−イル)ドコサン−1,11,11−トリカルボキシレート
中間体27(200mg、0.360mmol)およびN−ヒドロキシスクシンイミド
(42mg、0.360mmol)をDCM(3mL)に溶解させた。DCM(1.6m
L)中DCC(89mg、0.433mmol)の溶液を加え、反応液を4.5時間撹拌
した。反応液を濾過し、濾液を濃縮した。濃縮物をフラッシュカラム(シリカ 24g、
0〜40%のEtOAc/HEP)によって精製して、表題化合物を無色の油状物(70
mg、0.107mmol、30%)として得た:LCMS 方法B Rt=1.74分
、M+Na 674.7。
中間体29および29A:2−(11−((アジド−PEG23)−アミノ)−11−オ
キソウンデシル)−2−ウンデシルマロン酸(29)および13−((アジド−PEG2
3)−アミノ)−13−オキソ−2−ウンデシルトリデカン酸(29A)
THF(1mL)中中間体28(35mg、0.054mmol)の溶液を、アジド−
PEG23−アミン(59mg、0.054mmol)を入れたバイアルに加えた。DI
PEA(14μL、0.081mmol)を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発さ
せ、残渣をDCM(1mL)およびTFA(0.2mL)に再度溶解させた。反応液を1
.25時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣を、HPLC(Sunfire 30×
50mm C18、55〜80%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、得
られた材料をDCM(4mL)およびTFA(2mL)中に再度溶解させ、1.5時間撹
拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を、HPLC(Sunfire 30×50mm C18
、55〜80%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、中間体29(28m
g、0.016mmol、29%)および中間体29A(1mg、0.6μmol、1%
)を得た:LCMS 方法B Rt=1.08分、[M+H+HO]+2 771.5
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) σ ppm 0.90 (t, J=6.72 Hz, 3 H) 1.26 (br. s.,
24 H) 1.32 - 1.41 (m, 8 H) 1.62 (五重線, J=7.64 Hz, 2 H) 1.88 - 2.01 (m, 4 H) 2
.31 (t, J=7.70 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.46 - 3.56 (m, 3 H) 3.57 - 3.9
0 (m, 91 H);
LCMS 方法B Rt=1.29分、[M+2H]+2 741.1。
中間体30:22−((アジド−PEG23)アミノ)−22−オキソドコサン−1,1
1,11−トリカルボン酸
THF(1mL)中中間体16(58mg、0.063mmol)の溶液を、アジド−
PEG23−アミン(70mg、0.063mmol)を入れたバイアルに加えた。DI
PEA(17μL、0.095mmol)を加え、反応液をシェーカープレート上で終夜
撹拌した。反応液を濃縮し、HPLC(Sunfire C18 30×50mm、35
〜60%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、中間体30(57mg、0
.036mmol、57%)をワックス状の白色の固体として得た:LCMS 方法B
Rt=0.62分、M+H 1555.4;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm
1.28 (br. s., 18 H) 1.30 - 1.40 (m, 10 H) 1.63 (m, J=7.10, 7.10, 7.10, 7.10, 7.1
0 Hz, 4 H) 1.88 - 2.02 (m, 4 H) 2.28 (t, J=8.10 Hz, 2 H) 2.35 (t, J=7.40 Hz, 2 H
) 3.41 (t, J=5.07 Hz, 2 H) 3.50 (dt, J=9.20, 4.39 Hz, 2 H) 3.57 - 3.63 (m, 2 H)
3.63 - 3.73 (m, 90 H)
中間体31:1−ベンジル3−tert−ブチル2ウンデシルマロネート
0℃で、N中にて、DMF(8mL)中NaH(160mg、4.0mmol)の懸
濁液に、DMF(2mL)中ベンジルtert−ブチルマロネート(1.0g、4.0m
mol)を加えた。混合物を50分間撹拌し、その後、DMF(2mL)中1−ブロモウ
ンデカンを加えた。さらに1時間撹拌した後、反応液を室温に温めた。反応液を終夜維持
した。EtO(100mL)および水(20mL)を反応液に分配して加えた。水性相
をEtO(100mL)で抽出し、合わせた有機物をNaSOで乾燥させた。溶媒
を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム(C18 12g、40〜100%のACN/水+
0.1%TFA)によって精製して、表題化合物を無色の油状物(1.14g、2.82
mmol、71%)として得た:LCMS方法A Rt=1.58分、M+Na 427
.4;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.96 (m, 3 H) 1.28 (br. s,
12 H) 1.31 (m, J=3.90 Hz, 6 H) 1.41 (s, 9 H) 1.88 (q, J=7.38 Hz, 2 H) 3.29 (t, J
=7.58 Hz, 1 H) 5.19 (q, J=12.27 Hz, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 5 H).
あるいは、DMF中炭酸カリウム(2当量)の存在下で、1−ヨードウンデカン(1.
2当量)を使用して、マロン酸tert−ブチルのアルキル化を実行させることができる
中間体32:1,11−ジベンジル11−tert−ブチルドコサン−1,11,11−
トリカルボキシレート
出発材料として中間体31(650mg、1.61mmol)を使用して、表題化合物
を、中間体9と同様の方法で合成し、無色の油状物(823mg、1.21mmol、7
5%)を得た:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12
(m, J=6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz,
2 H) 1.85 (t, J=8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2
H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H).
中間体33:13−(ベンジルオキシ)−2−((ベンジルオキシ)カルボニル)−13
−オキソ−2−ウンデシルトリデカン酸
DCM(3mL)中中間体32(200mg、0.295mmol)の溶液に、TFA
(0.6mL)を加え、反応液を室温で3時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッ
シュカラム(シリカ 12g、0〜15%のEtOAc/HEP)によって精製して、表
題化合物(177mg、0.284mmol、96%)を得た:1H NMR (400 MHz, クロ
ロホルム-d) δ ppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H)
1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 -
2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J=7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44
(m, 10 H).
中間体34:1,11−ジベンジル11−(2,5−ジオキソシクロペンチル)ドコサン
−1,11,11−トリカルボキシレート
出発材料として中間体33(177mg、0.284mmol)を使用して、表題化合
物を、中間体15と同様の方法で合成し、無色の油状物(153mg、0.213mmo
l、75%)を得た:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H)
1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (五重線, J=7.40 Hz, 2 H) 1.89 -
2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s
, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H).
中間体35:
THF(1.5mL)およびDCM(1.5mL)中中間体34(145mg、0.2
01mmol)の溶液を、アミノ−PEG24−酸を入れたバイアルに加えた。DIPE
A(88μL、0.504mmol)を加え、反応液をシェーカープレート上で15時間
撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー(Waters HI
LIC 20×150mm、15〜25%のMeOH/CO2)によって精製して、中間
体35(151mg、0.086mmol、43%)を得た:LCMS方法D Rt=1
.30分、[M+2H]+2 876.4;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm
0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15
H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J=12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2
.37 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J=6.72, 2.32 Hz, 2 H)
3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J=6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2
H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J=5.26 Hz, 1 H).
中間体36:
DCM(0.265mL)中DCC(22mg、0.103mmol)を、DCM(1
.5mL)中中間体35(150mg、0.086mmol)およびN−ヒドロキシスク
シンイミドの溶液に加えた。反応液を1.5時間撹拌した。さらなるTHF(0.5mL
)中N−ヒドロキシスクシンイミド(10mg)およびDCM(0.265mL)中DC
C(22mg)を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラ
ム(シリカ 12、0〜5%のMeOH/DCM)によって精製して、中間体36(15
9mg、定量)を白色の固体として得た:LCMS方法B Rt=1.55分、[M+H
O+H]+2 933.9。
中間体37:
THF(5mL)中中間体36(159mg、0.086mmol)の溶液に、THF
(1mL)中10%の炭素担持Pd(4.6mg、4.3μmol)の懸濁液を加えた。
反応液を水素中に置き、40分間撹拌した。さらに炭素担持Pd(7mg、6.5μmo
l)を加え、水素中にてもう1時間撹拌した。反応液をメンブレンフィルターに通し、濾
液を蒸発させた。残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50mm、45〜7
0% ACN/水+0.1%TFA)によって精製して、表題化合物(83mg、0.0
47mmol、54%)を得た:LCMS方法B Rt=1.03分、[M+2H]+2
835.2;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17
(br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.
97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J=6.48 Hz, 2
H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J=6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J=4.46 Hz, 1 H)
中間体38:11−ブロモウンデカ−1−イン
DCM(10mL)中10−ウンデシン−1−オール(2.29mL、11.9mmo
l)および四臭化炭素(4.34g、13.1mmol)の溶液に、N2中にて、0℃で
、トリフェニルホスフィン(3.43g、13.1mmol)を30分かけて滴下添加し
た。添加が完了したら、反応液を室温に温めた。1.5時間後、反応液を、撹拌中のシク
ロヘキサン(75mL)に注ぎ、沈殿を集めた。固体をシクロヘキサンで洗浄し、合わせ
た濾液を蒸発させた。残渣をフラッシュカラム(シリカ 80g、0〜10%のEtOA
c/HEP)で精製して、表題化合物(1.75g、7.57mmol、64%)を得た
:1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.21 - 1.35 (m, 6 H) 1.35 - 1.48 (m, 4
H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.80 - 1.91 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.63 Hz, 1 H) 2.19 (td,
J=7.09, 2.69 Hz, 2 H) 3.41 (t, J=6.85 Hz, 2 H).
中間体39:ジ−tert−ブチル2−(ウンデカ−10−イン−1−イル)マロネート
マロン酸ジ−tert−ブチル(800mg、3.70mmol)を、0℃で、N
にて、DMF(9mL)に溶解させ、NaH(148mg、3.70mmol)を加えた
。反応液を0℃で30分撹拌し、中間体38(770mg、3.33mmol)をゆっく
り滴下添加し、黄色の溶液を得た。反応液を0℃で2時間撹拌し、次いで室温に温め、1
6時間撹拌した。混合物をEtOAc(75mL)に溶かし、HO(25mL)で洗浄
した。水性層をEtOAc(75mL)で抽出し、合わせた有機層をNaSOで乾燥
させ、濾過して、濃縮した。混合物を、フラッシュカラム(12gのシリカカートリッジ
、0〜20%のEtOAc/ヘプタン)により2回精製して、画分を濃縮し、162.1
mgの所望の生成物を無色の油状物(12%)として得た。LCMS(Waters A
cquity UPLC BEH C18、130Å、1.7μm、2.1mm×50m
m、50℃、溶媒名A:水+0.1%ギ酸、溶媒名B:アセトニトリル+0.1%ギ酸、
2.20分かけて98%のB):R:1.37分、MS[M+H]実測値:366.0
、計算値:366.535。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.29 (s, 10 H)
1.47 (s, 18 H) 1.52 (dd, J=14.78, 7.20 Hz, 3 H) 1.48 (d, J=1.26 Hz, 1 H) 1.75 -
1.83 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td, J=7.14, 2.65 Hz, 2 H) 3.11 (t,
J=7.58 Hz, 1 H).
中間体40:11,11−ジ−tert−ブチル1−エチルドコサ−21−イン−1,1
1,11−トリカルボキシレート
中間体39(162.1mg、0.442mmol)を、0℃で、DMF(2mL)に
溶解させ、NaH(21.23mg、0.531mmol)を加えた。反応液を0℃で1
5分間撹拌し、11−ブロモウンデカン酸エチル(143mg、0.486mmol)を
ゆっくり滴下添加した。反応液を室温に温め、16時間撹拌した。混合物をEtOAc(
40mL)で希釈し、HO(20mL)で1回洗浄した。水性層をEtOAc(40m
L)で1回抽出し、有機層を合わせ、NaSOで乾燥させ、濾過し、濃縮して、透明
の黄色の油状物を得た。サンプルを1mLのDCMに溶解させ、フラッシュカラム(12
g シリカカラム、0〜20%のEtOAc/ヘプタン、15分)によって精製した。画
分を合わせ、濃縮して、90.1mgの所望の生成物(35%)を得た。1H NMR (400 MH
z, クロロホルム-d) δ ppm 1.28 (br. s., 24 H) 1.45 (s, 18 H) 1.48 (s, 3 H) 1.53
(d, J=7.58 Hz, 3 H) 1.51 (s, 1 H) 1.64 (br. s., 1 H) 1.61 (d, J=7.33 Hz, 1 H) 1.
77 (d, J=16.93 Hz, 2 H) 1.74 - 1.80 (m, 2 H) 1.94 (t, J=2.65 Hz, 1 H) 2.18 (td,
J=7.07, 2.53 Hz, 2 H) 2.29 (t, J=7.58 Hz, 2 H) 4.13 (q, J=7.24 Hz, 2 H).
中間体41:12,12−ビス(tert−ブトキシカルボニル)トリコス−22−イン
BuOH(1mL)中中間体40(21.7mg、0.037mmol)の溶液に、
30℃で、N中にて、BuOH(2mL)中KOtBu(114mg、1.012m
mol)の溶液を加えた。混合物を室温で撹拌し、TLC(1:1のEtOAc/ヘキサ
ン、KMnO、還流)によってモニターした。3時間後に、出発材料を消費し、反応混
合物を1MのHCl(20mL)で失活させ、EtOAc(25mL)で2回抽出した。
有機層を合わせ、NaSOで乾燥させ、濾過し、濃縮して、透明無色の油状物(18
mg、87%)とした。材料を、さらに精製することなく次のステップに持ち越した。1H
NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.27 (br. s., 22 H) 1.44 (br. s., 18 H) 1.
48 (s, 3 H) 1.52 (s, 3 H) 1.62 (br. s., 2 H) 1.77 (br. s., 4 H) 1.94 (br. s., 1
H) 2.18 (s, 2 H) 2.35 (s, 2 H).
中間体42:ドコサ−21−イン−1,11,11−トリカルボン酸
TFA(2mL)を中間体41(12mg、0.022mmol)に加え、反応液を室
温で1時間撹拌した。混合物をDCM(10mL)で希釈し、2倍に濃縮し、褐色の油状
物を得た。材料をEtOAc(10mL)に溶かし、HO(20mL)で洗浄した。有
機層をNaSOで乾燥させ、濾過し、濃縮して、褐色の油状物とした。未精製材料を
1mLのMeOHに溶解させ、MS起動式HPLC(Sunfire 30×50mm
5umカラム 0.1%TFA含有ACN/H2O 75ml/分、1.5ml注入、3
.5分かけて45〜70%のACN)によって精製した:R=3.42分;MS[M+
H+Na]実測値:461.00、計算値:461.597。画分をプールし、凍結乾燥
して、5.3mgの表題化合物を56%の収率で得た。
中間体43:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)
−2−(ウンデカ−10−イン−1−イル)トリデカン二酸
THF(0.5mL)中中間体42(5.3mg、0.012mmol)の溶液に、N
−ヒドロキシスクシンイミド(1.53mg、0.013mmol)を加えた。THF(
0.5mL)中DCC(2.493mg、0.012mmol)の溶液を加え、混合物を
、室温で、N中にて、4時間撹拌した。出発材料の変換が完了したことが、LCMSに
よって観察された。混合物を濃縮し、さらに精製することなく次のステップに移行した。
LCMS(Sunfire C18 3.5μm 3.0mm×30mm、40℃、酸性
溶離液A:水+0.05%のトリフルオロ酢酸、塩基性溶離液A:水+5mMの水酸化ア
ンモニウム、溶離液B:ACN、2分かけて5〜95%):R=1.72分、MS[M
+H+Na]実測値:558.0、計算値:558.67。
中間体44:
DCM(0.5mL)中中間体43(3.2mg、5.97μmol)の溶液に、DC
M(0.5mL)およびDIPEA(2.09μL、0.012mmol)中アジド−d
PEG23−アミン(Quanta Biodesign、7.88mg、7.17μm
ol)の溶液を加え、混合物を室温で16時間撹拌し、この時点で出発材料の変換がLC
MSによって観察された。反応混合物を濃縮し、1mLのMeOHに溶解させ、MS起動
式HPLC(Sunfire 30×50mm 5umカラム 0.1%TFA含有AC
N/H2O 75ml/分、1.5ml注入、5分で55〜80%のACNの勾配、R
=1.92分)によって精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、1.7mgの表題化合
物を19%の収率で得た。LCMS(Acquity BEH 1.7μm 2.1×5
0mm −50℃、溶媒名A:水+0.1%ギ酸、溶媒名B:アセトニトリル+0.1%
ギ酸、2.20分かけて98%のB):R=1.89分、MS[M+H/2]実測値:
760.0、計算値:759.5。
中間体45:ドコサ−21−エン−1,11,11−トリカルボン酸
11−ブロモ−デカ−1−インの代わりに11−ブロモ−デカ−1−エンを用いて、中
間体39〜42の手順に従って、中間体45を調製する。
中間体46:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)
−2−(ウンデカ−10−エン−1−イル)トリデカン二酸
DCM(2mL)中DCC(187mg、0.908mmol)を、DCM(7mL)
およびTHF(0.7mL)中N−ヒドロキシスクシンイミド(99mg、0.862m
mol)およびドコサ−21−エン−1,11,11−トリカルボン酸(中間体45:4
00mg、0.908mmol)の溶液に加えた。反応液を終夜撹拌した後、溶媒を蒸発
させた。残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50mm;55〜80%のA
CN/水+0.1%TFA)によって精製して、表題化合物(155mg、0.288m
mol、32%)を得た:LCMSによる 方法C Rt=1.51分、M+H 538
.3;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 1.16 - 1.46 (m, 28 H) 1.60 - 1.87
(m, 3 H) 1.91 - 2.17 (m, 5 H) 2.38 (t, J=7.03 Hz, 2 H) 2.86 (br. s., 4 H) 3.68 (
dd, J=11.25, 7.34 Hz, 1 H) 3.78 (dd, J=11.31, 5.20 Hz, 1 H) 3.99 - 4.10 (m, 1 H)
.
中間体47および47A:
アジド−dPEG23−アミン(Quanta Biodesign:164mg、0
.149mmol)および中間体46(80mg、0.149mmol)をTHF(2.
5mL)に溶解させた。DIPEA(39μL、0.233mmol)を加え、反応液を
終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Sunfire C18 30×50
mm;45〜70%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して、化合物47(9
7mg、0.061mmol、41%)および47A(32mg、0.021mmol、
14%)を得た:LCMS 方法C Rt=1.35分、[M+2H]+2 761.9
1H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 1.05 - 1.18 (m, 3 H) 1.19 - 1.32 (m
, 20 H) 1.36 (t, J=7.15 Hz, 1 H) 1.48 - 1.59 (m, 2 H) 1.65 - 1.75 (m, 2 H) 2.01
- 2.06 (m, 2 H) 2.25 (t, J=7.46 Hz, 2 H) 3.33 - 3.39 (m, 2 H) 3.39 - 3.44 (m, 2
H) 3.50 - 3.67 (m, 98 H) 4.84 - 4.95 (m, 1 H) 4.95 - 5.06 (m, 1 H) 5.83 (ddt, J=
17.07, 10.29, 6.68, 6.68 Hz, 1 H) 7.31 (t, J=5.44 Hz, 1 H);
LCMS 方法C Rt=1.50分、[M+2H]+2 739.9;1H NMR (400 MH
z, アセトニトリル-d3) δ ppm 1.16 - 1.42 (m, 30 H) 1.42 - 1.63 (m, 5 H) 2.00 - 2
.07 (m, 2 H) 2.22 - 2.28 (m, 2 H) 2.40 - 2.52 (m, 2 H) 3.25 - 3.33 (m, 2 H) 3.33
- 3.42 (m, 2 H) 3.42 - 3.50 (m, 2 H) 3.50 - 3.68 (m, 88 H) 4.86 - 5.06 (m, 2 H)
5.83 (ddt, J=17.04, 10.26, 6.71, 6.71 Hz, 1 H) 6.40 - 6.74 (m, 1 H).
中間体48:2−ウンデシルマロン酸
中間体22(290mg、0.661mmol)を使用して、表題化合物(185mg
、定量的)を、中間体19と同様の方法で合成した:LCMS 方法B LCMS Rt
=0.82分、M−H 257.3。
中間体49:2−(((2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)オキシ)カルボニル)
トリデカン酸
DCC(122mg、0.592mmol)を、DCM(6mL)およびTHF(0.
5mL)中中間体48(170mg、0.658mmol)およびN−ヒドロキシスクシ
ンイミド(68mg、0.592mmol)の溶液に加えた。反応液を16時間撹拌した
後、DCM(0.5mL)中DCC(30mg、0.145mmol)をさらに加えた。
反応液をさらに2日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をHPLC(Sunfire C
18 30×50mm、45〜70%のACN/水+0.1%TFA)によって精製して
、表題化合物を白色の粉末(46mg、0.129mg、20%)を得た:LCMS 方
法B Rt=0.94分、M+H 356.3;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ
ppm 0.89 (t, J=7.00 Hz, 3 H) 1.20 - 1.40 (m, 16 H) 1.43 - 1.55 (m, 2 H) 1.99 - 2
.14 (m, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 3.71 (t, J=7.46 Hz, 1 H).
中間体50および50A:
表題化合物を、中間体49(30mg、0.084mmol)から、50および50A
と同様の方法で合成し、中間体50(18mg、0.013mmol、16%)および中
間体50A(5mg、4μmol、5%)を得た:LCMS 方法B Rt=0.85分
、M+H 1340.3;1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ ppm 0.82 - 0.98 (m,
3 H) 1.20 - 1.36 (m, 16 H) 1.36 - 1.51 (m, 2 H) 1.83 - 2.02 (m, 1 H) 2.11 - 2.27
(m, 1 H) 2.33 (dd, J=11.80, 4.22 Hz, 1 H) 3.41 (t, J=5.14 Hz, 3 H) 3.49 (d, J=5
.01 Hz, 1 H) 3.56 - 3.79 (m, 92 H);
LCMS 方法B Rt=0.96分、M+H 1296.3。
中間体51〜57:GDF15タンパク質の変異体。
大腸菌(E.coli)細胞中でのヒトGDF−15タンパク質の発現
大腸菌(E.coli)株BL21(DE3)Gold(Stratagene)およびRo
setta(DE3)pLysS細胞(Novagen)を、それぞれ51〜56の構築
物および構築物MAHA−(200−308)−hGDF15で形質転換し、pET26
bベクターにクローニングした。形質転換した細胞を、OD600が1.5に到達するま
で、最初は3ml、次いで50mlのLuria Broth(Bacto−Trypt
one 10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 5/L、グルコース6g/L)中
で抗生物質選択下で増殖させた。予備培養物を使用して、Terrific Broth
培地(NH4SO4 1.2g/L、H2PO4 0.041g/L、K2HPO4 0
.052g/L、Bacto−Tryptone 12g/L、酵母エキス 24g/L
)で満たした2つの1L発酵槽に接種した。pHが7.1を超えて上昇したときに、1m
Mのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の自動添加によって、
培養物を誘導した。他の発酵パラメータは以下であった:温度=37℃;2NのNaOH
/H2SO4の添加によってpH7.0+/−0.2に調整された;撹拌機の速度のカス
ケードでpO2>30%、空気流および酸素添加。誘導の5時間後、培養物を10℃に冷
却し、細胞を遠心分離によって回収した。
GDF15変異体の精製およびリフォールディング
a)封入体
目的のタンパク質を発現する組換え大腸菌(coli)のペレットを、50mMのNaH
PO/150mMのNaCl/5mMのベンズアミジンHCl/5mMのDTT、pH
8.0、4℃に再懸濁させ(5%w/v)、ホモジナイズし、Frenchプレス(80
0および80バール)を2回通して溶解させた。封入体(IB)を、4℃にて12,00
0rpmで60分間遠心分離することによって単離した。
b)フォールディングされていない粗製タンパク質の精製
IBを、6Mのグアニジン/100mMのNaHPO/10mMのTris/20
mMのβ−メルカプトエタノール pH8.0中に可溶化し(5%w/v)、室温で2時
間撹拌した。デブリを12,000rpmでの遠心分離によって除去した。可溶化したI
BをNi−NTA−Superflowでさらに精製した(Hisタグを有さない構築物
は、高いヒスチジン含有量によりこの樹脂に同様に結合する)。6Mのグアニジン/10
0mMのNaHPO/10mMのTris/5mMのβ−メルカプトエタノール p
H8.0でのベースライン洗浄後、結合した材料を、pH4.5に調整した同じ緩衝液で
溶出させた。溶出液をpH8.0に調整し、100mMのDTTを加え、溶液を4℃で終
夜撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸(TFA、水中10%の保存溶液)の添加によっ
て、pHを2に調整し、水中0.1%のTFAで、溶液を1:1にさらに希釈した。粗製
のタンパク質溶液を、50分で0〜50%のアセトニトリルの勾配を使用して、RP−H
PLC(Poros)によりさらに精製した。画分を含有するGDF−15を、プールし
、凍結乾燥させた。
c)タンパク質のフォールディング
方法1:凍結乾燥した材料を100mMの酢酸中に2mg/mlで溶解させ、フォール
ディング緩衝液(100mMのCHES/1MのNaCl/30mMのCHAPS/5m
MのGSH/0.5mMのGSSG/20%のDMSO、pH9.5、4℃)中で15〜
20倍に希釈し、溶液を4℃で3日間穏やかに撹拌した。3日後に、3体積の100mM
酢酸を加え、溶液を限外濾過(5kDaカットオフ)によって約100〜200mlま
で濃縮し、100mMの酢酸で10倍に希釈し、再濃縮した。リフォールディングされた
材料を、50℃で作動する、Vydac C4カラムでの分取RP−HPLC(緩衝液A
:水中0.1%のTFA、緩衝液B:アセトニトリル中0.05%のTFA)によってさ
らに精製した。ローディング後、カラムを15%の緩衝液Bで洗浄し、50分で15%の
B〜65%のBの勾配で溶出した。目的のタンパク質を含有する集めた画分を、等体積の
緩衝液Aで希釈し、凍結乾燥した。リフォールディング収率は、両方のタンパク質に対し
て約25%であった。
方法2:フォールディング緩衝液:100mMのCHES、pH9.4、0.9Mのアル
ギニン、0.5MのNaCl、1mMのEDTA、2.5mMのGSH、1mMのGSS
G(最終濃度)を用いた方法1に従うプロトコール。
以下のGDF−15変異体を、上記手順に従って調製した。
中間体51:M−(His)−hGDF15
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL
GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQ
IK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT D
TGVS LQTYD DLLAK DCHCI (配列番号1)。
LCMS:計算質量値:26462 実測質量値:26464
中間体52:M−(His)−M−hGDF15
MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADW
VLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDT
VPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
(配列番号2)。
LCMS:計算質量値:26724 実測質量値:26725
中間体53:His−dGDF15:
MHHHHHHAHARDGCPLGEGRCCRLQSLRASLQDLGWANWV
VAPRELDVRMCVGACPSQFRSANTHAQMQARLHGLNPDAA
PAPCCVPASYEPVVLMHQDSDGRVSLTPFDDLVAKDCHCV
(配列番号3)。
LCMS:計算質量値(二量体):26368 実測質量値:26363
中間体54:MH−(199−308)−hGDF15
MHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ
VTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP
ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (配列番号4)
LCMS:計算質量値:24636 実測質量値:24638
中間体55:AH−(199−308)−hGDF15
AHNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ
VTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP
ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (配列番号5)
ステップ1:構築物M−His−TEV(ENLYFQ/A)−H−hsGDF15
aa199−308の調製
構築物M−His6−TEV(ENLYFQ/A)−H−hsGDF15 aa199
−308は、上記手順(ステップa、bおよびc)に従って調製した。
ステップ2:ステップ1からのタンパク質のTEV切断
凍結乾燥したタンパク質を水中に可溶化させて、最終濃度1.75mg/mlとした。
タンパク質を、6MのGuan/50mM Tris、pH8.0+50mMのDTT中
で1:1に希釈することによって再度アンフォールディングさせ、室温で1時間撹拌した
。材料を、Vydac C4カラムでの分取RP−HPLCによって再精製し、凍結乾燥
した。26mgの凍結乾燥物を、26mlの50mM Tris/3M UREA、pH
7,5+3000ユニットのAcTEVプロテアーゼ(Invitrogen、1257
5−023)中に可溶化させ、4日間インキュベートした。次いで、トリフルオロ酢酸(
TFA、水中10%の保存溶液)の添加によって、pHをpH2.0に調整し、溶液を、
水中0.1%のTFAで150mlまでさらに希釈した。0.22umの膜を介した濾過
の後、材料を、Vydac C4カラムでの分取RP−HPLCによって再度精製して、
上手く切断されたタンパク質を単離した。画分を手動で集め、標的タンパク質を含有する
画分を単離し、凍結乾燥した。次いで、切断されたGDF15タンパク質をリフォールデ
ィングさせ、リフォールディングしたタンパク質を上述のように精製した。
LCMS:計算質量値(二量体):24516 実測質量値:24518
以下のGDF15変異体を、上記手順に従って調製することができる。
中間体56:MHA−(200−308)−hGDF15
MHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ
VTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP
ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (配列番号6)
LCMS:計算質量値(二量体):24752
以下のGDF15変異体を、上記手順に従って調製した。
中間体57:AHA−(200−308)−hGDF15
AHAGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQ
VTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP
ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (配列番号7)
LCMS:計算質量値(二量体):24430;実測質量値(二量体):24432
中間体58:His−hGDF15BCNコンジュゲート
His−hGDF15
配列:MHHHHHHMARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW
ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLK
PDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDC
HCI
His−hGDF15(中間体52:0.6mL、4.8mg/mL)の保存溶液を、
30mMのNaOAc pH4.5緩衝液(5.2mL)で0.5mg/mLまで希釈し
た。DMSO(251μL)中(1R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4
−イン−9−イルメチル(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)カーボネート(NH
S−BCN)の10mg/mL保存溶液をゆっくり加え、反応液を24℃で21時間シェ
ーカープレートに置いた。反応液を、30mMのNaOAc pH4.5緩衝液で30m
Lまで希釈し、10kDa MWCOアミコン遠心濾過器を使用して(4回繰り返す)、
2mLまで濃縮して、2.5mLの濃縮物を得た。A280(ε=29090M−1cm
−1、26730g/mol)に基づくと、濃度は0.93mg/mL(2.33mg、
80%)であった:LCMS QT2_15−60kDa_15分_極性(方法E)。得
られた溶液をMALDIによって分析し、主要なコンジュゲーションが+1および+2で
あることを示した(単量体および二量体のN−末端標識化)。
His−hGDF15+1BCN(ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イニル)は、G
DF15ホモ二量体の1分子におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2BCNは、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単位におけ
るN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3BCNは、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位における
非選択反応に相当する。
中間体59:His−hGDF15BCNコンジュゲート
His−hGDF15配列:
MHHHH HHAR NGDHC PLGPG RCCRL HTVRA SLEDL
GWADW VLSPR EVQVT MCIGA CPSQF RAANM HAQ
IK TSLHR LKPDT VPAPC CVPAS YNPMV LIQKT D
TGVS LQTYD DLLAK DCHCI
His−hGDF15(中間体51:7.04mL、1.42mg/mL)の保存溶液
を、30mMのNaOAc pH4.5緩衝液(12.95mL)で0.5mg/mLま
で希釈した。DMSO(0.88mL)中(1R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0
]ノナ−4−イン−9−イルメチル(2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)カーボネ
ート(NHS−BCN)の10mg/mL保存溶液をゆっくり加え、反応液を24℃で2
1時間シェーカープレートに置いた。さらに一部のNHS−BCN保存溶液(176μL
)を加え、反応液を24℃で24時間維持した。反応液を、30mMのNaOAc pH
4.5緩衝液で60mLまで希釈し、10kDa MWCO限外濾過カートリッジを使用
して4mLまで濃縮して(4回繰り返す)、4.1mLの濃縮物を得た。A280(ε=
29090M−1cm−1、26700g/mol)に基づくと、濃度は2.19mg/
mL(8.98mg、89%)であった:LCMS QT2_15−60kDa_15分
_極性(方法E)
His−hGDF15+1BCN(ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イニル)は、G
DF15ホモ二量体の1分子におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2BCNは、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単位におけ
るN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3BCNは、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位における
非選択反応に相当する。
中間体60:His−dog−GDF15−BCN
100uLのHis−dGDF15(0.68mg/mL)、100uLのpH4.5
の緩衝液、4uLの10mg/mLのBCN−NHS溶液を合わせて、室温で2日間イン
キュベートした。得られた混合物を、Amicon 10kで4回洗浄し、200uLの
溶液を得て、これを次のステップで使用した。生成物を、コンジュゲートにさらに変換さ
せるために、粗生成物として持ち越した。
本発明の実施例
His−hGDF15+脂肪酸−PEG−Nクリックのための一般手順。BCN標識
されたGDF15を、30mMのNaOAc緩衝液(pH4.5)中で0.5mg/mL
に希釈し、一方、水中FA−PEG−N(脂肪酸−PEG23−アジド)の10mg/
mL溶液を調製した。GDF15溶液に、10当量のFA−PEG−Nを加え、反応液
を、シェーカープレート上に、24℃で、終夜置いた。反応をLCMS(QTOF法 1
5〜60kDa_15分_極性)によりモニターし、未反応のBCN標識されたGDF1
5が観察されなくなるまで、追加のFA−PEG−Nを必要に応じて50当量まで加え
た。次いで、反応液を、30mMのNaOAc緩衝液(pH4)を用いて5〜10倍希釈
し、10kDaのMWCO限外濾過カートリッジを使用して、緩衝液を新しい緩衝液と交
換した(濃縮とそれに続く希釈を4サイクル)。サンプルをA280で測定して、約1m
g/mLまで濃縮し、定量された回収率は34%まで定量的であった。最終のコンジュゲ
ートは、LCMS(QTOF法 15〜60kDa_15分_極性)またはMaldiに
より分析した。
実施例1:中間体21にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−59)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例2:中間体44にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−59)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例3:中間体29AにコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−59
):
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例4:中間体24にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(中間体58
):
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例5:中間体29にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子における
N末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例6:中間体55にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子における
N末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例7:中間体6AにコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の単量体単
位におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例9:中間体30にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(単量体
単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の分子(単
量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例10:中間体12にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58
):
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の分子(単
量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例13:中間体6にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−59)
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の分子(両
方の単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例14:中間体17にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58
):
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の分子(両
方の単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
実施例15:
ステップ1:
THF(5mL)中2,2,13,13−テトラメチルテトラデカン二酸(Aldri
ch CPR、注文番号PH002322)(100mg、0.318mmol)および
N−ヒドロキシスクシンイミド(40.3mg、0.35mmol)の溶液に、THF(
5mL)中DCC(65.6mg、0.318mmol)の溶液を加え、混合物を室温で
終夜撹拌した。LC−MS分析によって、所望の生成物への部分的な変換が観察された。
混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をDCM(40mL)に再度溶解させ、水で洗浄
し、Na2SO4で乾燥させ、ヘプタン/EtOAc/DCC(10:1:1)で溶出す
るシリカクロマトグラフィーによって精製して、混合物を得た。混合物を、MS起動式酸
HPLC[(55〜80%のACN 3.5分の勾配):室温=2.48分、計算質量値
:314.46 実測質量値:314.00]によってさらに精製して、クリーンな生成
物(50mg、38.2%の収率)を得、出発材料を回収した。
ステップ2:
DCM(3mL)中NHS−2,2,13,13−テトラメチルテトラデカン二酸(1
0mg、0.024mmol)の溶液に、アジド−dPEG23−アミン(10mg、0
.049mmol)およびDIPEA(9uL、0.049mmol)を加え、混合物を
室温で1時間撹拌した。混合物を濃縮し、MeOH(3mL)に再度溶解させ、MS起動
式HPLC(55〜80%のACN 3.5分の勾配 室温=2.35分、予測質量値:
514.70 実測質量値:514.40)によって精製して、7mgのクリーンな生成
物を58%の収率で得た。
ステップ3:
100μLのBCN−dGDF15(I−60:pH4.5の緩衝液中0.68mg/
mL)の溶液に、pH4.5の緩衝液(100μL)およびアジド(DMSO中6μL、
10mg/mL)を加え、混合物を室温で終夜インキュベートした。混合物をAmico
n 10kで4回洗浄した。得られた溶液をMALDIによって分析し、主要なコンジュ
ゲーションが+1および+2であることを示した。Maldi:計算質量値:26546
実測質量値:26483;計算質量値:27060 実測質量値:27128;計算質
量値:27574 実測質量値:27789。
実施例16:中間体44にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN(I−58
):
His−hGDF15+1FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の1分子(1つの
単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
His−hGDF15+2FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の両方の分子(両
方の単量体単位)におけるN末端アミノ官能基での反応に相当する。
実施例17:中間体52にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN
7mLのpH4の酢酸ナトリウム緩衝液中3mLのシクロオクチンGDF15(I−5
8:0.46mg/mL、0.051umol)の溶液に、脂肪酸pegアジド(35m
g/mLのDMSO中15uL、0.36umol)を加え、混合物を室温で終夜インキ
ュベートした。MALDI分析によって、変換が完了したことを観察した。アミコン濾過
10kDにより精製した生成物を3回洗浄して、4.3mlの0.29mg/mlの所望
の生成物を90%の収率で得た。Maldi:シクロオクチン sm 約5% 予測質量
値:26902 実測質量値:26997;+1脂肪酸 約40% 予測質量値:284
21 実測質量値:28525;+2脂肪酸 約50% 予測質量値:29940 実測
質量値:30191 +3脂肪酸 5% 予測質量値:31459 実測質量値:318
74。
実施例18:中間体37にコンジュゲートされたMH−(199−308)GDF15(
I−54)
MH−(199−308)−GDF15(中間体54:0.393mL、0.028μ
mol、1.78mg/mL)を1.5mlの30mM酢酸ナトリウム緩衝液に加え、N
HS脂肪酸(474ug、0.284umol、10mg/ml)を溶液に加えた。5時
間後、反応をMALDIにより完了した。生成物を、アミコン限外濾過10kDを使用し
て5回洗浄することによって精製して、575ugのコンジュゲートを73%の収率で得
た。MALDI:sm(18%)、予想質量値:24638 実測質量値:24735;
+1脂肪酸(38%) 予想質量値:26192 実測質量値:26268;+2脂肪酸
(40%) 予想質量値:27746 実測質量値:27798;+3脂肪酸(4%)
予想質量値:29300 実測質量値:29333。
実施例19A:中間体37にコンジュゲートされたHis−hGDF15(I−59)
His−GDF15(0.493mL、0.026μmol、1.42mg/mL)を
1.5mlの30mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4)に加え、nhs脂肪酸(0.2
21mg、0.132umol、10mg/mL)を溶液に加えた。終夜反応が完了しな
かったため、さらに2.5当量の脂肪酸NHS(0.110mg、0.066umol、
10mg/mL)を加え、5時間後、Maldiは主要な生成物として+2コンジュゲー
トを示した。生成物を、アミコン限外濾過10kDを使用して5回洗浄することによって
精製して、565ugのコンジュゲートを76%の収率で得た。MALDI:sm(18
%)、予想質量値:26468 実測質量値:26553;+1脂肪酸(38%) 予想
質量値:28022 実測質量値:28099;+2脂肪酸(40%) 予想質量値:2
9576 実測質量値:29649;+3脂肪酸(4%) 予想質量値:31130 実
測質量値:31201。
実施例19B:中間体37とコンジュゲートされたAHA−hGDF15
分子生物学グレードの水中の中間体37の10mg/mL溶液を調製した。AHA−h
GDF15(中間体57、30mMのNaOAc(pH4.0)中6.67mg/mL、
5.247mL、1.433μmol)に、30mMのNaOAc(pH4.6)(許容
される範囲4.5〜5.0)を加えて、最終タンパク質濃度0.88mg/mLを得た。
中間体37(10当量、2.39mL、0.014mmol)を加え、反応液を室温で1
8時間混合した。反応バイアル中に沈殿が形成された。反応混合物を、4×15mLの1
0kDaアミコン遠心濾過器の中で分割して、それぞれを、30mMのNaOAc(pH
4.0)で15mLに希釈した。材料を、30mMのNaOAc(pH4.0)に4回緩
衝液交換し、サンプルを合わせて、25.6mLの体積とし、洗浄の間に、フィルターの
沈殿をピペットチップで撹拌した。沈殿が溶液中に残ったので、混合物を4℃で終夜静置
した。濃度は、A280(30040cm−1−1;27538g/mol)によって
、1.62mg/mL(100%)であることが測定された。UPLC分析により、+1
FA(保持時間:4.88分)および+2FA生成物(保持時間:5.80分)の60%
の回収率が示された(方法J)。LCMS法Tは、所望の質量を示す。
実施例19Bの粗製の混合物(以下の表に表された比率)をin vivoで試験し、
表1に報告した:
(実施形態11B、式Hで表されるように)AHA−hGDF15+1FA(脂肪酸)
は、GDF15ホモ二量体の(単量体単位における)ポリペプチド鎖の1つにおけるN末
端アミノ官能基での反応に相当する。
(実施形態11B、式Gで表されるように)AHA−hGDF15+2FA(脂肪酸)
は、GDF15ホモ二量体の両方のポリペプチド鎖におけるN末端アミノ官能基での反応
に相当する。
AHA−hGDF15+3FA(脂肪酸)は、GDF15ホモ二量体の一部の他の部位
における非選択反応に相当する。
精製:
粗生成物を、逆相クロマトグラフィー(緩衝液A 水中0.1%TFA、緩衝液B A
CN中0.1MTFA 勾配;99%〜80%緩衝液A)、Waters BEH300
130Å、3.5μm、4.6mm×100mm 流量2.5ml/分によって精製し
た。
画分1:未反応AHA−hGDF15:Rt=17.33分
画分2:(19B1)AHA−hGDF15+1FA:Rt=20.20分(およそ1
5%の収率)(式H)
画分3:(19B2)AHA−hGDF15+2FA:Rt=21.60分(およそ1
5%の収率)(式G)
画分4:(19B3)AHA−hGDF15+3FA:Rt=23.0分(およそ5%
の収率)
19B1と19B2の1:1の比の混合物を調製し、試験した(19Bm)。
あるいは、反応は、pH4.73で、10mMのNaHPO−7HOおよび30
mMのNaOAc中で行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体37の10mg/
mL溶液を調製した。AHA−hGDF15(中間体57、30mMのNaOAc(pH
4.0)中12.04mg/mL、4.15μL、0.002μmol)に、30mMの
NaOAc 10mMのNaHSO−7HO(pH4.73)を加えて、最終タン
パク質濃度0.88mg/mLを得た。中間体37(20当量、6.83μL、0.04
1μmol)を加え、反応液を室温で18時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁
った。UPLC分析により、58%の+1および+2生成物が示された(方法J)。
反応はまた、pH4.6で、30mMのNaOAcおよび10mMのKHPO中で
行ってもよく、分子生物学グレードの水中中間体37の10mg/mL溶液を調製した。
AHA−hGDF15(中間体57、30mMのNaOAc(pH4.0)中6.21m
g/mL、5.261mL、1.337μmol)に、30mMのNaOAc 10mM
のKHSO(pH4.6)(許容される範囲4.5〜5.0)を加えて、最終タンパ
ク質濃度0.88mg/mLを得た。中間体37(10当量、68.3μL、0.409
μmol)を加え、反応液を室温で7時間混合した。反応混合物は、沈殿によって濁った
。反応混合物を、15mLの10kDaアミコン遠心濾過器の中4つの9mL部分に分割
して、30mMのNaOAc(pH4.0)で15mLに希釈した。材料を、30mMの
NaOAc(pH4.0)に4回緩衝液交換し、各洗浄の間に、沈殿をピペットチップで
撹拌した。反応混合物を75mLの体積まで濃縮した。沈殿が残ったので、材料を4℃で
2日間保存した。濃度は、A280(30040cm−1−1、27538g/mol
)によって、0.4mg/mL(97%)であることが測定された。UPLC分析により
、+1および+2生成物の61%の回収率が示された(方法J)。
参照例1
中間体PEG−ミリスチン酸構築物にコンジュゲートされたHis−hGDF15BCN
(I−58)
ステップ1:
アジド−PEG23−アミン(30mg、0.027mmol)およびミリスチン酸N
HSエステル(Tronto Research Chemicals、カタログ番号S
69080)(12mg、0.037mmol)の混合物に、DCM(1mL)およびD
IPEA(13uL)を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。混合物を、EtOAc/ヘ
プタン(0〜100%)、次いでMeOH/DCM(0〜10%)で溶出するシリカクロ
マトグラフィーによって精製して、およそ5%のMeOH/DCMで、クリーンな生成物
を得た。LCMS:(勾配:1.4分で40〜98%のB−流れ 1mL/分 溶離液A
:水+0.05%のギ酸+3.75mMの酢酸アンモニウム、溶離液B:アセトニトリル
+0.04%ギ酸)LCMS:室温=2.20(方法C)質量+H 計算値:1354.
71 実測質量値:1354.4。
ステップ2:
BCN−hGDF15(I−52:800uL、0.25mg/mL)の溶液に、a(
DMSO中2mg/mL、6.3uL、10当量)を加え、混合物を室温で終夜撹拌した
。定量的収量で1.1mL 0.20mg/mL。(Maldi:+1計算質量値:28
223 実測質量値:28640;+2計算質量値:29543;実測質量値:2996
2、+3計算質量値:30863 実測質量値:31426、+4計算質量値:3218
3 実測質量値:32911)。
参照例2
his−hGDF15−PEG23
30mMのNaOAc(pH4.0)(427μL)中His−hGDF15BCN(
I59:427μL、1.17mg/mL、0.019μmol)の溶液に、アジド−d
PEG23−アミン(Quanta Biodesign、104μg、0.094μm
ol)を加えた。反応液を室温で16時間混合し、この時点で、10kDaのMWCO
Amicon遠心濾過器を使用して、サンプルを5回、希釈および濃縮して、140μL
の体積にすることによって、混合物を30mMのNaOAc(pH4.0)中に交換した
。MALDI分析によって、+1から+4生成物への完全な変換が示された。濃度は、A
280によって、2.099mg/mL(57%)であることが測定された(29090
M−1cm−1、27600g/mol)。
実施例20:中間体47にコンジュゲートされたアペリン環状ペプチドBCN:
ステップ1:pE−R−P−C−L−S−C−K−G−P−(D−Nle)−NH(
フェネチル)(ジスルフィドC〜C)アセテートの合成
− 中間体20aの調製
(Fmoc−D−Nle−OHを用いた2−クロロトリチルクロリド樹脂の導入、Fmo
c除去および樹脂の導入の算定)
2−クロロトリチルクロリド樹脂(50.0g、85.0mmol)をDCM(400
mL)に懸濁させ、懸濁液を10分間撹拌し、次いで、溶媒を排出し、樹脂をDCM(3
×200mL)で洗浄した。次いで、DCM(120.0mL)中Fmoc−D−Nle
−OH(24.0g、68.0mmol)およびDIPEA(96.5ml、552.5
mmol)の溶液を樹脂に加え、懸濁液に窒素を流し、室温で5分間撹拌した。もう一度
DIPEA(22.7ml、127.5mmol)を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌
した。
反応混合物を排出し、樹脂を、DCM(3×250mL)で、各回2分間洗浄した。樹
脂を、混合物DCM/MeOH/DIPEA(70:15:15)(2×250mL)で
、各回10分間失活させた。
ピペリジン/DMF(1:3)(1×300mL)で5分間樹脂を処理することによっ
て、Fmoc基を切断し、次いで、樹脂を15分間排出し(1×300mL)、続いて、
以下のステップで洗浄した:DMF(6×250mL、各回2分)、イソプロパノール(
2×250mL、各回2分)およびTBME(6×250mL、各回2分)。樹脂を、真
空中で、35℃にて、24時間乾燥させ、中間体20a(57.8g、導入=1.08m
mol/g)を得た。
− 中間体20bの調製
(線状ペプチドの組み立て)
中間体20a(18.5g、20.0mmol)を、自動ペプチド合成装置(CSBI
O536(商標))での固相ペプチド合成にかけた。カップリングサイクルを以下のとお
り規定した。
− アミノ酸カップリング:AA(3.0当量)、DIC(3.0当量)、HOBt
(3.0当量)、DMF(以下の表を参照のこと)
− 洗浄:DMF(4×150mL、各回2分)。
− Fmoc脱保護:ピペリジン/DMF(1:3)(5分間で150mL、次いで
15分間で150mL)。
− 洗浄:DMF(6×150mL、各回2分)。
ペプチドを組み立てた後、樹脂をDMF(6×150mL、各回2分)、イソプロパノ
ール(6×150mL、各回2分)およびTBME(6×150mL、各回2分)で洗浄
した。ペプチド樹脂を、高真空中で、35℃にて、終夜乾燥させて、中間体20b(57
.6g、20.0mmol)を得た。
− 中間体20cの調製
(樹脂からのHFIPの切断)
中間体20bの一部(27g、9.37mmol)をDCM(300mL)に懸濁させ
、15分間撹拌した。樹脂を排出して、次いで、HFIP/DCM(3:7)(3×27
0mL、各回15分)で処理した。切断溶液を濾去して集めた。樹脂をDCM(3×30
0mL)で洗浄した。合わせた切断溶液および洗浄液を、真空中で濃縮乾固した。白色の
粉末を、真空中で、35℃にて、終夜乾燥させて、中間体20c−バッチ1(23.5g
、9.37mmol)を得た。
中間体20b(28.0g、9.72mmol)をもう一度用いて、上述の手順を繰り
返し、中間体20c−バッチ2(26.1g、9.72mmol)を得た。
− 中間体20dの調製
(フェネチルアミンの液相カップリング)
中間体20c−バッチ2(20.0g、7.44mmol、1.0当量)およびHAT
U(5.23g、13.8mmol、1.85当量)をDMF(400mL)に溶解させ
た。DMF(60mL)中フェネチルアミン(1.67g、13.8mmol、1.85
当量)およびDIPEA(3.56g、27.6mmol、3.71当量)の溶液を加え
た。
反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、0℃に冷却し、次いで、ブライン(46
0mL)を加えた。懸濁液を10分間撹拌し、次いで、生成物を濾過によって単離した。
濾過ケークをHO(300mL)で洗浄し、次いで、これを注意深く取り出し、次いで
DCM(300mL)に溶解させた。溶液をMgSO4で乾燥させ、次いで、真空中で濃
縮乾固した。粗生成物を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー(溶離液:D
CMおよびDCM/iPrOH(8:2))にかけて、中間体20d−バッチ1(14.
4g、6.6mmol)を得た。
フラッシュクロマトグラフィーを除いて、中間体20c−バッチ1(23.4g、9.
37mmol)を用いて同じ手順を繰り返し、中間体20d−バッチ2(28.0g、9
.37mmol)を得た。
− 中間体20eの調製
(保護基の除去)
中間体20d−バッチ2(28.0g、9.37mmol)をTFA/DCM/EDT
/TIS(90:5:2.5:2.5)(290mL)に溶解させ、反応液を室温で2時
間撹拌した。
切断溶液を濾去し、冷TBME(3L)(0〜4℃)に注いだ。濁った懸濁液を氷水浴
で30分間撹拌し、次いで、細孔4のガラスフィルターを通して濾過した。このようにし
て得られた白色の固体をTBME(2×100mL)で洗浄し、次いで、真空中で、35
℃にて、終夜乾燥させて、中間体20e−バッチ1(8.9g、5.9mmol)を得た
中間体20d−バッチ1(14.4g、6.6mmol)を用いて、同じ手順を繰り返
し、中間体20e−バッチ2(9.6g、6.3mmol)を得た。
− pE−R−P−C−L−S−C−K−G−P−(D−Nle)−NH(フェネ
チル)(ジスルフィドC〜C)アセテートの調製
1)環化
中間体20e(5.0g、3.3mmol)を水(500mL)に溶解させた。酢酸(
93mL)中ヨウ素(1.18g、4.66mmol、1.41当量)の溶液を一度に加
えた。反応混合物を室温で10分間撹拌した。水(5.8mL)中アスコルビン酸(1.
03g、5.83mmol、1.77当量)の溶液を加え、反応混合物を10分間撹拌し
、濾過し、4℃で精製まで保存した。
18.3g(12.1mmol)の中間体20eがプロセッシングされるまで、同じ環
化手順を繰り返した。
2)精製
環状ペプチドの溶液を、注入毎に0.5〜5.0gのペプチドずつ、分取HPLCにか
けた。95%超の純度を有する画分をプールし、凍結乾燥させて、総量4.89g(3.
2mmol)の精製ペプチド(TFA塩)を得た。
3)イオン交換による酢酸塩の形成
そのOH形態で75g(100mL)の強陰イオン交換樹脂(Ion exchan
ger III、Merck)を、焼結したガラスフィルター(多孔度3)に置き、次い
で、酢酸/水(1:3)(300mL)の溶液を加え、懸濁液を手動で2分間撹拌し、次
いで、樹脂を排出した。もう一度酢酸/水(1:3)(300mL)を用いて、プロセス
を繰り返した。中性のドレインが観察されるまで、樹脂を脱イオン水で洗浄した。次いで
、樹脂を、焼結したガラスフィルター(多孔度3)を備える4×20cmのカラムに移し
た。
4.8gの精製ペプチドを脱イオン水(50mL)に溶解させ、カラムに加えた。生成
物を脱イオン水(200mL)で溶出した。生成物の溶出の制御は、TLCスポッティン
グによって行われ、豊富な画分をプールし、凍結乾燥させて、pE−R−P−C−L−
S−C−K−G−P−(D−Nle)−NH(フェネチル)(ジスルフィドC〜C
)アセテート(4.1g、2.9mmol)を得た。
純粋な生成物を分析HPLC(分析方法F;t=8.01分)およびUPLC−HR
MS(分析方法G;測定値:[M+2H]2+=643.328;計算値:[M+2H]
2+=643.324)によって分析された。酢酸含有率は7.99〜8.27%であり
、含水率は1.94〜1.96%であった。
ステップ2:pE−R−P−C−L−S−CP−N−[[(1α,8α,9α)−ビ
シクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメトキシ]カルボニル]−K−G−P−
(D−Nle)−NH(フェネチル)[ジスルフィドC4〜C7]の調製
DMF(1mL)中pE−R−P−C−L−S−C−K−G−P−(D−Nle)
−NH(フェネチル)トリアセテート[ジスルフィドC4〜C7](100mg、0.0
68mmol)、炭酸水素ナトリウム(38mg、0.452mmol)および水(87
uL)の混合物を、室温で10分間撹拌し、次いで、(1R,8S)−ビシクロ[6.1
.0]ノナ−4−イン−9−イルメチルスクシンイミジルカーボネート(Berry&a
ssociates、20mg、0.068mmol)を加えた。反応混合物を室温で9
0分間撹拌した。1mLの水を混合物に加え、得られた溶液を凍結乾燥して、さらに精製
することなく次のステップに使用される粉末を得た。
ステップ3:実施例20の調製:
pE−R−P−C−L−S−C−N−[[(1α,8α,9α)−ビシクロ[6
.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメトキシ]カルボニル]−K−G−P−(D−Nl
e)−NH(フェネチル)[ジスルフィドC4〜C7](1mLの水中50mgのステッ
プ2からの生成物、0.034mmol)および中間体47(52mg、268uLの水
中)を室温で約3時間撹拌した。次いで、反応混合物を、分取HPLC(Sunfire
30×50mm 5umカラム 0.1%TFA含有ACN/H2O 75ml/分、
15〜40%のACN 5分の勾配)によって精製した。生成物画分を凍結乾燥させて、
表題生成物をTFA塩(24mg、21%)として得た。LCMS(Waters Ac
quity UPLC BEH C18 1.7um 2.1×50mm、50℃、溶離
液A:水+0.1%ギ酸、溶離液B:アセトニトリル+0.1%ギ酸、勾配は5.15分
かけて2%〜98%のB/A):保持時間:2.77分、MS[M+2]2+:実測値:
1491.8808、計算値:1491.8560。
実施例21A:中間体47にコンジュゲートされたアペリン環状ペプチドBCN
ステップ1:
米国特許第8,673848号明細書で調製されたとおりのpE−R−P−R−L−C
−H−K−G−P−Nle−C−F−OH(ジスルフィドC〜C12)50mg、
0.033mmol、炭酸水素ナトリウム(18mg、0.215mmol)および水(
40uL)をDMF(0.5mL)に混ぜた混合物を、室温で10分間撹拌し、次いで(
1R,8S)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメチルスクシンイミジ
ルカーボネート(Berry&associates、18mg、0.065mmol)
を加えた。反応混合物を室温で90分間撹拌した。+1および+2追加の混合物をLCM
Sによって観察したので、混合物を質量起動式HPLCによって精製した(ペプチド 方
法5 25〜50%のACN 5分の勾配:条件:Sunfire 30×50mm 5
umカラム 0.1%TFA含有ACN/H2O 75ml/分 1.5ml注入):保
持時間 3.2分(+1)、保持時間 4.65分、4.9分(+1および+2の混合物
)。LCMSによって、所望の+1生成物が61%の収率で、+1、+2混合物が18%
の収率で確認される。LCMS:(塩基性溶離液A:水+5mM水酸化アンモニウム 溶
離液B:ACN 酸性カラム:Sunfire C18 3.5μm 3.0×30mm
−40℃ 塩基性カラム:XBridge C18 3.5μm 3.0×30mm
−40℃)保持時間:0.98分;MS[M+2]2+:実測値:856.0、計算値:
865.0245。
ステップ2:
pE−R−P−R−L−C−H−N−[[(1α,8α,9α)−ビシクロ[6.
1.0]ノナ−4−イン−9−イルメトキシ]カルボニル]−K−G−P−Nle−C
−F−OH(ジスルフィドC〜C12)(21.33mg、0.014mmol)およ
び中間体47(24mg、0.014mmol)の混合物を、室温で約3時間撹拌した。
反応物はLCMSによって完了し、凍結乾燥させて、表題生成物(23mg、48%)を
得た。LCMS(Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7u
m 2.1mm×50mm、50℃、溶離液A:水+0.1%ギ酸、溶離系B:アセトニ
トリル+0.1%ギ酸、勾配は5.15分かけて2%〜98%のB/A):保持時間:2
.22分、MS[M+2]2+:実測値:1616.9464、計算値:1616.97
6。
実施例21B:脂肪酸−リンカー構築物I−37にコンジュゲートされたアペリン環状ペ
プチド
ステップ1:A−H−Q−R−P−C−L−S−C−K−G−P−Dnle−フェネチル
アミン中間体21B1の合成
フェネチルアミン−AMEBA樹脂(Sigma Aldrich、0.1mmol、
1.0mmol/g)を自動ペプチド合成装置(CEM Liberty Blue M
icrowave)で、Arg残基に対して2倍の標準ArgとDnleを用い、2倍の
時間でカップリングさせることにより固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、0.2M
のDMF中溶液として調製した。標準のカップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング:AA(5当量)、HATU(5当量)、DIEA(25当
量)
− 洗浄:DMF(3×7mL)
− Fmoc脱保護:20%ピペリジン/0.1M HOBt(2×7mL)
− 洗浄:DMF(4×7mL、次いで1×5mL)
ペプチドを組み立てた後、樹脂をDMF(2×50mL)およびDCM(2×50mL
)で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体21B1(276mg、0.1mmol
)を得た。
ステップ2:中間体21B2の調製(樹脂からのペプチドの切断)
中間体21B1(276mg、0.1mmol)を4mLのTFA溶液(37mLのT
FA、1mLの水、1mLのTIPS、3.06gのDTT)と合わせて、室温で3時間
振盪した。溶液を樹脂から除去し、40mLの冷EtO中に沈殿させた。溶液をボルテ
ックスし、氷上に10分間静置した後、4000rpmで5分間遠心分離した。溶媒を除
去し、白色固体を冷EtO(各回40mL)でさらに2回洗浄し、遠心分離し(各回5
分)、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させ、中間体21B2(17.4mg、0
.012mmol)を得た。LCMS(SQ2 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、A
cquity UPLC BEH C18カラム、130Å、1.7μm、2.1mm×
50mm、50℃):R=1.83分、MS[M+H]1513.5。
ステップ3:中間体21B3の調製(システイン残基の環化)
中間体21B1(29.6mg、0.020mmol)を水(3mL)および10滴の
DMSOに溶解させて、わずかに濁った溶液を得た。ヨウ素(HOAc中50mM、0.
783mL、0.039mmol)をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で終夜混合し
た。粗製反応液のLCMS分析により、出発材料の完全な変換が示された。色が消失する
まで、0.5Mのアスコルビン酸を滴下添加した。材料を、MS起動式HPLCによって
精製した。プールした画分の凍結乾燥により、7mgの所望の生成物を白色粉末(4.6
3μmol、24%)として得た。LCMS(SQ2 生成物分析−酸性−ペプチド、A
cquity UPLC BEH C18カラム、130Å、1.7μm、2.1mm×
50mm、50℃):R=0.90分、MS[M+H]1511.8。
ステップ4:アペリンA−H−Q−R−P−C−L−S−C−K−G−P−Dnle−フ
ェネチルアミンおよび中間体 I−37を含むコンジュゲート(N末端コンジュゲーショ
ン)の調製−実施例21B
NHS−脂肪酸の10mg/mL溶液を、HO中で調製した。中間体21B3(1.
5mg、0.993μmol)を、30mMのpH4のNaOAc緩衝液(672μL)
に溶解させ、NHS−脂肪酸(I−37:0.850mL、5.10μmol)を加えた
。反応液を室温で16時間混合し、この時点で、追加の1.5mgのNHS−脂肪酸(H
O中10mg/mL)を加え、反応液を室温で16時間混合した。8mgのNHS−脂
肪酸(HO中10mg/mL)を加え、反応液を室温で3日間混合し、1.7mgのN
HS−脂肪酸(HO中10mg/mL)を加えた。混合物を室温で16時間振盪し、M
−起動式HPLCにより精製して、1.7mgの表題化合物を白色の粉末(0.510μ
mol、51%)として得た。LCMS(SQ2 生成物分析−酸性−ペプチド−極性、
Acquity UPLC BEH C18カラム、130Å、1.7μm、2.1mm
×50mm、50℃):R=3.87分、MS[M+H+2/2]1533.1;[M
+H+3/3]1022.9。
実施例22〜24は、脂肪酸のsiRNAとのコンジュゲートに言及する。
siRNA合成のためのキットは、例えば、New England Biolabs
およびAmbionから市販されている。siRNA剤は、当業界で知られている手順を
使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応(enzymatic ligation reaction)を
使用して構築され得る。例えば、siRNA剤は、天然に存在するヌクレオチド、または
オフターゲット効果を減少させ、および/もしくは分子の生物学的安定性を増大させ、も
しくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成された二本鎖の物理的安定性を増大させ
るよう設計された様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学的に合成され得、例えばホスホ
ロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。「G」、「C」
、「A」、「T」および「U」の各々は、一般に、それぞれ塩基としてのグアニン、シト
シン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。しかしながら
、用語「リボヌクレオチド」、「デオキシヌクレオチド」、または「ヌクレオチド」は、
修飾ヌクレオチドまたは代理置換部分(surrogate replacement moiety)を指す場合もあ
る。
当業者は、当業界で知られている任意の従来の方法を使用して、所望のようにsiRN
Aを合成および修飾することが可能であると認識している(Henschel et al. 2004 DEQOR
: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids R
esearch 32 (Web Server Issue):W113-W120を参照のこと)。
実施例22:式A3の脂肪酸部分のsiRNAへのコンジュゲーション
中間体22aの調製:
TTR siRNA[当業界で知られている従来の方法を使用して合成された、トラン
スサイレチン(TTR)に対するsiRNA]を、標準のオリゴヌクレオチドの手順(例
えば、6−(4−モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル−(2−シアノエチル)−(N
,N−ジイソプロピル)−ホスホラミダイト(Glen Researchカタログ番号
:10−1906)との反応)を使用して、22aに変換した。
TTR siRNA:
アンチセンス鎖:Puau*u*rX058 ここで、
Pはリン酸であり、小文字は2’−OMe修飾ヌクレオチドを示し、下線を付した文字は
2’−F修飾ヌクレオチドを示し、イタリック体の文字は2’−MOE修飾ヌクレオチド
を示し、rは非塩基リビトールであり、はホスホロチオエート結合を指し、X058は
式:
の非ヌクレオチド3’末端キャップである。
センス鎖:aacuar−C6OH
−は、リン酸エステルを指し、C6OH(C6としても知られている)は式:
の非ヌクレオチド3’末端キャップである。
中間体22bの調製:
0℃の0.556mlのsiRNA22aの溶液(TTR siRNA H2O中14
.02mM、7.79μmol)に0.556mlのDMFを加え、室温に温めた。次い
で、208μlのTEA(DMF中0.3M、62μmol)を加え、260μlのBC
N−NHS((1R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イル
メチルN−スクシンイミジルカーボネート)(DMF中0.15M、39μmol)。得
られた反応液を室温で1時間撹拌した。分析HPLCにより、出発材料22aの消失が示
された。反応液を、脱イオン化HOで10mlに希釈すると、濁った。上記混合物を酢
酸エチルで5回抽出し、有機低分子を除去した。水性層を分離し、凍結乾燥させた。乾燥
した生成物固体(22b)をそのまま使用した。
実施例22の調製:
80μlの化合物22b(HO中12.3mM、0.968μmol)と65μlの
ビス脂肪酸−N(22c:実施例15のステップ2:DMSO中44.7mM、2.9
0μmol)を混合した。得られた混合物は濁っていたので、80μlの1:1DMF/
THFを加えたが、反応液はまだ少し濁っていた。さらに80μlのDMSOを加え、透
明の溶液を得た。反応液を室温で終夜撹拌した。反応液を脱イオン化H2Oで希釈し、H
PLCにかけて精製して、5.6mgの化合物22(収率65.9%)を得た。精製のた
めのHPLC条件:カラム:Xselect Prepフェニルヘキシル 5um OB
D 19×50mm;有機溶媒:100mMのTEAで改変されたACN;水性溶媒:1
00mMのTEA.HOAcで改変されたHO;勾配:5〜60%のAcCN/H
;時間:10分。LC−MS方法Hにより、生成物は、デコンボリューション後に、保持
時間5.44分で、所望の分子量8778で、単一のピークを示した。
実施例23:式A1の脂肪酸部分のsiRNAへのコンジュゲーション 化合物4の調製
実施例23は、実施例22と同様の手順を使用して調製された。
23aの調製:
DCM(16mL)中NHS−脂肪酸(20mg)の溶液に、アジド−peg7−アミ
ン(QuantaBiodesign、カタログ番号10523)(31mg)およびD
IPEA(52uL)を加え、混合物を室温で2時間撹拌した。変換が完了したことを、
LC−MS分析により観察した。混合物を濃縮し、MeOH(3mL)に再度溶解させ、
0.1%TFAを用いるMS起動式HPLCによって精製して(保持時間=1.59分、
予測質量値(M+1):818.062 実測質量値:817.9)、クリーンな生成物
を得た。HPLC MSシステムで設定された800Daのカットオフにより、材料の半
分が失われた。5〜10mg(17〜33%)のクリーンな生成物が得られた。
80μlの22b(HO中12.3mM、0.968μmol)と65μlのトリス
脂肪酸−N3(23a:DMSO中44.7mM、2.90μmol)を混合した。反応
により、5.2mgの化合物23(収率58.0%)が得られた。LC−MS方法Hによ
り、生成物は、デコンボリューション後に、保持時間5.87分で、所望の分子量925
7で、単一のピークを示した。
実施例24:式A3の脂肪酸のAPOCIII siRNAへのコンジュゲーション
24bの調製
25mlのDCM中24a(1.244g、4.19mmol)の溶液に、TEA(0
.58ml、4.19mmol)を加え、続いて、N3−ペンタン酸(500mg、3.
49mmol)を加えた。最後に、EDC(804mg、4.19mmol)を加えた。
反応液を室温で4時間撹拌した。反応液をブラインとDCMの間で抽出した。合わせた全
ての有機物を、乾燥させ、濃縮して、60%の酢酸エチル/ヘプタンを用いるSiO2ゲ
ルにより精製して、1.20gの化合物24b(収率89%)を得た。1H NMR (クロロホ
ルム-d, 400NHz) d: 5.88-6.37 (m, 1H), 4.60 (d, J=4.8 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.33
(t, J=6.7 Hz, 2H), 3.13 (d, J=6.5 Hz, 2H), 2.30 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.81-1.95 (m
, 1H), 1.63-1.81 (m, 5H), 1.48-1.57 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.36 (d, J=6.8 Hz, 2H
)
24cの調製
12mlのTHF中24b(860mg、2.23mmol)の溶液に、1NのNaO
H(5.58ml、5.58mmol)を加えた。反応液を室温で0.5時間撹拌した。
反応液をブラインで希釈し、20mlのDCMを加えた。1NのHClで、水性層のpH
をpH約5に調整し、次いで、DCMで抽出した。合わせた全ての有機物を、乾燥させ、
濃縮して、粗製の固体を6mlのDCMに再度溶解させた。0.6mlのTFAを加え、
反応液を室温で2時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物24c(400mg、54%
)を得、これをさらに精製することなく直接使用した。LC−MS方法Iにより、生成物
は、272.5の質量(M+H)で、0.43分に主要なピークを示した。
24eの調製
10mlのDCM中24c(400mg、1.04mmol)の溶液に、TEA(0.
434ml、3.11mmol)を加え、続いて24d(538mg、1.35mmol
)を加えた。反応液を室温で3時間撹拌した。反応液をH2OおよびDCMの間で抽出し
た。合わせた全ての有機物を、乾燥させ、濃縮して、8%のMeOH/DCMを用いるS
iO2ゲルにより精製して、475mgの24e(収率82%)を得た。1H NMR (クロロ
ホルム-d, 400MHz) d: 6.74-6.98 (m, 1H), 5.95-6.13 (m, 1H), 4.55 (dd, J=7.2, 2.4
Hz, 2H), 3.32 (t, J=6.7 Hz, 4H), 3.11 (d, J=5.8 Hz, 2H), 2.30-2.37 (m, 2H), 2.20
-2.26 (m, 2H), 1.90 (br. s., 2H), 1.71-1.80 (m, 2H), 1.59-1.71 (m, 4H), 1.51-1.5
9 (m, 2H), 1.35-1.51 (m, 13H), 1.20-1.35 (m, 13H)
24fの調製
中間体24f2の調製
MeOH(40ml)中24f1(1.0g、4.97mmol)の溶液に、TEA(
1.04ml、7.45mmol)を加え、続いてジt−ブチルカーボネート(2.17
g、9.94mmol)を加えた。反応液を60℃で1.5時間加熱した。反応液を濃縮
して、5%のMeOH/DCMを用いるSiO2カラムにより精製して、1.2gの化合
物24f2(収率80%)を得た。1H NMR (クロロホルム-d, 400MHz) d: 4.51 (br. s,
1H), 3.00-3.22 (m, 2H), 2.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.59-1.71 (m, 2H), 1.46 (s, 11H)
, 1.29 (br. s., 12H).
中間体24f3の調製
DCM(30ml)中24f2(1.2g、3.98mmol)の溶液に、N−ヒドロ
キシスクシンイミド(0.60g、5.18mmol)を加え、続いてEDC(1.0g
、5.18mmol)を加えた。溶液を室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮して、SiO
2カラムに直接導入して、40%の酢酸エチル/ヘプタンで精製して、1.46gの化合
物24f3(収率92%)を得た。1H NMR (クロロホルム-d, 400MHz) d: 4.49 (br. s,
1H), 3.04-3.19 (m, 2H), 2.86 (d, J=4.5 Hz, 4H), 2.62 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.70-1.8
2 (m, 2H), 1.37-1.53 (m, 13H), 1.30 (br. s., 10H)
中間体24fの調製
DCM(1.5ml)中GalNAc3−NH2(300mg、0.16mmol)の
溶液に、TEA(0.11ml、0.79mmol)を加え、続いて24f3(188m
g、0.47mmol)を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した。次いで、トリフルオロ
酢酸(1.0ml)を加えた。2時間後、LC−MSにより、中間体の消失が示された。
反応液を濃縮して、酸性条件下で、検出としてELSDを用いて、オープンアクセスHP
LCで精製した。生成物を含有するHPLC画分を集め、溶媒を蒸発させて、220mg
の化合物24f(収率67%)を得た。LC−MSにより、一部の生成物が1つのアセチ
ル基を失ったことが示された。精製のためのHPLC条件:カラム:Sunfire 3
0×100mm 5umカラム;有機溶媒:7.5%TFA含有ACN;水性溶媒:7.
5%TFA含有HO;流量:75ml/分。勾配:15〜40%のH2O/AcCN;
時間:9.5分。検出:検出としてELSD(蒸発光散乱検出)。LC−MS方法Iによ
り、生成物は、989.9の質量(M/2+H)で、0.83分にピークを示した。
24gの調製
3mlのDCM中24e(172mg、0.31mmol)の溶液に、24f(250
mg、0.12mmol)を加え、続いてTEA(0.069ml、0.50mmol)
を加えた。最後に、EDC(95mg、0.5mmol)を加えた。反応液を室温で終夜
撹拌した。反応液を濃縮して、5%のMeOH/DCMを用いるSiOカラムにより精
製して、230mgの24g(収率74%)を得た。LC−MS方法Iにより、生成物は
、1258.2の質量(M/2+H)で、1.30分にピークを示した。
24hの調製
1mlのTHF中24g(230mg、0.091mmol)の溶液に、0.457m
lの4NのHCl(ジオキサン中、1.83mmol)を加えた。反応液を室温で1時間
撹拌した。反応液を濃縮して、HPLCにより精製して、糖の1つのアセチル基を失った
、50mgの24h(収率23%)を得た。精製のためのHPLC条件:カラム:Sun
fire 30×100mm 5umカラム;有機溶媒:7.5%TFA含有ACN;水
性溶媒:7.5%TFA含有HO;流量:75ml/分。勾配:15〜40%のH2O
/AcCN;時間:9.5分。検出:検出としてELSD(蒸発光散乱検出)。LC−M
S方法Iにより、生成物は、1187.1の質量(M/2+H)で、0.95分にピー
クを示した。
24iの調製
2mlのDCM中2,2,13,13−テトラメチルテトラデカン二酸(40mg、0
.127mmol)の溶液に、N−OHスクシンイミド(9.81mg、0.085mm
ol)を加え、続いて、追加のEDC(16.34mg、0.085mmol)を加えた
。反応液を室温で終夜撹拌した。反応液を濃縮して、HPLCにより精製して、20mg
の24i(収率38%)を得た。精製のためのHPLC条件:カラム:Sunfire
30×100mm 5umカラム;有機溶媒:7.5%TFA含有ACN;水性溶媒:7
.5%TFA含有HO;流量:75ml/分。勾配:45〜70%のH2O/AcCN
;時間:9.5分。検出:検出としてELSD(蒸発光散乱検出)。LC−MS方法Iに
より、生成物は、434.3の質量(M+Na)で、1.55分にピークを示した。
24jの調製
0.5mlのDCM中24h(20mg、8.05μmol)の溶液に、TEA(4.
5μl、32μmol)を加え、続いて、追加の24i(6.62mg、16μmol)
およびDMAP(3.93mg、32μmol)を加えた。反応液を室温で終夜撹拌した
。脱保護のために、0.5mlの2NのMeNH/MeOHを加えた。反応液を室温で
もう一晩撹拌した。反応液を濃縮して、アセトンを加えて生成物を沈殿させ、過剰な試薬
および脂質を除去して、12mgの24j(収率64%)を得た。LC−MS方法Iによ
り、生成物は、1166.9の質量(M/2+H)で、0.69分にピークを示した。
24Kの調製
ステップ1:
APOCIII siRNA[当業界で知られている従来の方法を使用して合成された、
遺伝子APOCIII(APOC3またはApoc 3としても知られている)に対する
siRNA]:
オリゴヌクレオチドのアニーリング
一般手順:
各オリゴヌクレオチドのペレットを、遠心分離において簡単に遠心沈殿させ、Dupl
ex緩衝液(100mMの酢酸カリウム;30mMのHEPES、pH7.5)に、高濃
度(緩衝液100mL当たり1〜10のOD260)で溶解させた。加熱(94℃まで)
およびボルテックスを使用して、再懸濁を促進してもよい。次いで、センス鎖およびアン
チセンス鎖を、当量で一緒に加えた。次いで、混合オリゴヌクレオチドを94℃まで加熱
し、徐々に冷却した。重要な二次構造を有する配列には、より段階的な冷却/アニーリン
グステップが用いられてもよい。これは、オリゴ溶液を、水浴またはヒートブロックに置
き、機器のプラグを抜く/スイッチをオフにすることによって容易に行われる。得られた
生成物は、安定な、二本鎖形態であり、4℃または冷凍で保存できる。
APOCIII siRNAのアンチセンス鎖は、APOCIIIの配列を含み、鎖の
3’末端はリン酸で終了し、5’から3’の順に、リビトール、もう1つのリン酸、およ
び3’末端キャップX058、式:
の非ヌクレオチド3’末端キャップをさらに含む。
センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的なAPOCIIIの配列を含み、鎖の3’末端は
リン酸で終了し、5’から3’の順に、リビトール、もう1つのリン酸、および3’末端
キャップC6OH、式:
の非ヌクレオチド3’末端キャップをさらに含む。
APOCIII siRNAを、2−ジメトキシトリチルオキシメチル−6−フルオレ
ニルメトキシカルボニルアミノ−ヘキサン−1−サクシノイル−長鎖アルキルアミノ−C
PG(Glen Researchカタログ番号20−2957)と反応させると、生成
物24k1を生じた。
ステップ2
APOCIII siRNA(24k1:401μL、HO中11.2mM、4.4
9μmol)を、401μlのDMFと混合し、透明の溶液を得た。次いで、TEA(1
80μl、DMF中0.25M、45μmol)を加え、続いて、BCN−NHS((1
R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメチルN−スクシ
ンイミジルカーボネート)(9.16mg、31μmol)を加えた。反応液を室温で1
時間撹拌した。反応液を、H2Oで10mlまで希釈し、酢酸エチルで3回抽出した。水
性層を分離し、約5mlまで濃縮し、PD−10脱塩カラム(GE healthcar
e)によって精製した。
24の調製
24j(5.8mg、2.5μmol)を、105μlの化合物24k(HO中Ap
oc3 siRNA 9.5mM、0.993μmol)に加えた。1時間後、反応液は
粘性になった。よって、別に60μlのHOを加え、反応液を室温で終夜撹拌した。反
応液をHOで希釈し、HPLCにより精製して、5mgのコンジュゲート24(収率5
7%)を得た。精製のためのHPLC条件:カラム:Xselect Prep フェニ
ルヘキシル 5um OBD 19×50mm;有機溶媒:100mMのTEA.HOA
cで改変されたAcCN;水性溶媒:100mMのTEA.HOAcで改変されたH
;勾配:5〜50%のAcCN/H2O;時間:10分。LC−MS方法Hにより、生成
物は、デコンボリューション後に、所望の分子量8896で、5.96分にピークを示し
た。
参照例3
GalNAcとコンジュゲートしたsiRNA
参照例3は、24jをGalNac3−N3(以下)で置き換え、実施例24の手段に
従って調製した。
GalNac3−N3の調製
中間体2の調製
化合物1(2.06g、1.07mmol)を、20mlのエタノールに溶解させた。
TFA(82ul、1.07mmol)を加え、続いて10%のPd/C(0.114g
、0.11mmol)を加えた。反応液を、Hバルーン中で6時間処理した。反応液を
濾過し、エタノールで洗浄し、濃縮して、白色の固体を得て、これを次のステップに直接
使用した。LC−MS方法Iにより、生成物は、898.5の質量(M/2+H)で、
0.81分にピークを示した。
中間体3の調製
化合物2(4.848g、0.479mmol)を、10mlの無水DMFに溶解させ
、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4アジドブタノエート(0.325g、1.4
36mmol)を加え、続いて、追加のDIPEA(0.418ml、2.394mmo
l)を加えた。反応液を室温で終夜反応させた。反応液を、加熱せずに濃縮し、予備平衡
したSiO2カラムに導入し、0〜20%のメタノール/DCMステップ勾配で精製して
、2.383gの化合物3(収率49.25%)を得た。LC−MS方法Iにより、生成
物は、953.7の質量(M/2+H)で、1.27分にピークを示した。
中間体4の調製
化合物3(1.33g、0.70mmol)をMeNH2(17.45ml、メタノー
ル中2.0M、34.9mmol)と混合した。反応液を室温で2時間撹拌した。LC−
MSにより、生成物のピークのみが示された。反応液を濃縮した。次いで、固体をエタノ
ールに再度溶解させ、アセトンを用いて沈殿させて、1.0gの化合物4(収率94%)
を得た。LC−MS方法Iにより、生成物は、764.5の質量(M/2+H)で、0
.53分にピークを示した。
実施例25:キャリアタンパク質(CRM197)と脂肪酸のコンジュゲーション
ステップ1:2−((2,2−ジメチル−4−オキソ−3,8,11,14,17,20
,23,26,29,32,35,38−ドデカオキサ−5−アザテトラコンタン−40
−イル)カルバモイル)−2−ウンデシルトリデカン二酸(25a)。
t−boc−N−アミドーdPEG(登録商標)11−アミン(100mg、0.15
5mmol、Quanta Biodesign)および中間体5(80mg、0.14
8mmol)をTHF(3mL)に溶解させ、室温で、窒素中にて撹拌した。30分後、
DIPEA(0.05mL、0.286mmol)を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌
した。変換が完了したことをLCMSによって観察した(酸性溶離液A:水+0.05%
のトリフルオロ酢酸、溶離液B:ACN、カラム Sunfire C18 3.5μm
3.0×30mm −40℃、2分で5〜95%の勾配、保持時間1.92分)。反応
混合物を減圧下で濃縮し、次いで、約1.5mLのアセトニトリルに溶解させた。MS起
動式HPLC(Sunfire 30×50mm 5umカラム 0.1%TFA含有A
CN/H2O 75ml/分、1.5ml注入、3.5分かけて65〜95%のACNの
勾配、保持時間3.23分)により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、85mgの
クリーンな生成物を54%の収率で得た。透明の油状物。LCMS:方法D Rt=1.
18分、M+H 1070.1;1H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 0.82 -
1.03 (m, 1 H) 1.11 - 1.37 (m, 10 H) 1.37 - 1.51 (m, 2 H) 1.51 - 1.64 (m, 1 H) 1.
69 - 1.82 (m, 1 H) 1.90 - 2.04 (m, 66 H) 2.05 - 2.21 (m, 8 H) 2.21 - 2.42 (m, 1
H) 3.17 - 3.28 (m, 1 H) 3.40 - 3.68 (m, 13 H).
ステップ2:2−((35−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27
,30,33−ウンデカオキサぺンタトリアコンチル)カルバモイル)−2−ウンデシル
トリデカン二酸(25b)。
25a(5mg、4.68μmol)をDCM(体積:2mL)に溶解させ、次いで、
トリフルオロ酢酸(25μl、0.324mmol)を加えた。反応混合物を、室温で、
窒素雰囲気下で、約2時間撹拌した。変換が完了したことをLCMSによって観察した(
酸性溶離液A:水+0.05%のトリフルオロ酢酸、溶離液B:ACN、カラム Sun
fire C18 3.5μm 3.0×30mm −40℃、2分で5〜95%の勾配
、保持時間1.45分)。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、DCMですすぎ、3回
再度濃縮した。アセトニトリルとDMSOの混合物に溶解させた。MS起動式HPLC(
Sunfire 30×50mm 5umカラム 0.1%TFA含有ACN/H2O
75ml/分、1.5ml注入、3.5分かけて45〜70%のACNの勾配、保持時間
2.50分)により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、2.5mgのクリーンな生
成物を55%の収率で得た。透明の油状物。
方法A Rt=1.45分、M+H 969.9;1H NMR (400 MHz, アセトニトリル-
d3) δ ppm 0.62 - 0.91 (m, 2 H) 0.91 - 1.10 (m, 3 H) 1.10 - 1.31 (m, 18 H) 1.46
(五重線, J=7.21 Hz, 2 H) 1.59 - 1.89 (m, 35 H) 1.94 - 2.09 (m, 1 H) 2.16 (t, J=7
.40 Hz, 2 H) 2.97 - 3.11 (m, 1 H) 3.24 - 3.37 (m, 1 H) 3.37 - 3.61 (m, 28 H) 3.6
1 - 3.89 (m, 2 H) 7.85 (br. s., 1 H).
ステップ3:2−(((S)−5−(3−アミノ−3−オキソプロピル)−3,6−ジオ
キソ−1−フェニル−2,10,13,16,19,22,25,28,31,34,3
7,40−ドデカオキサ−4,7−ジアザドテトラコンタン−42−イル)カルバモイル
)−2−ウンデシルトリデカン二酸(25d)。
THF(体積:2mL)中25b(20mg、0.018mmol)の溶液をZ−L−
Gln−Osu 25c(Santa Cruz Biotechnology、CAS
34078−85−8、11mg、0.029mmol)に加え、次いでDIPEA(7
5μl、0.429mmol)を加えた。室温で、窒素雰囲気下にて、週末にかけて撹拌
した。変換が完了したことをLCMSによって観察した(酸性溶離液A:水+0.05%
のトリフルオロ酢酸、溶離液B:ACN、カラム Sunfire C18 3.5μm
3.0×30mm −40℃、2分で5〜95%の勾配、保持時間1.77分)。反応
混合物を減圧下で濃縮し、次いで、アセトニトリルに溶解した。MS起動式HPLC(S
unfire 30×50mm 5umカラム 0.1%TFA含有ACN/H2O 7
5ml/分 1.5ml注入、3.5分かけて55〜80%のACNの勾配、保持時間2
.70分)により精製し、画分をプールし、凍結乾燥して、10.5mgのクリーンな生
成物を46%の収率で、透明無色の油状物として得た。方法C Rt=1.60分、M+
H 1232.4;1H NMR (400 MHz, アセトニトリル-d3) δ ppm 0.67 - 0.93 (m, 2 H
) 0.93 - 1.10 (m, 2 H) 1.10 - 1.32 (m, 15 H) 1.45 (五重線, J=7.24 Hz, 1 H) 1.59
- 1.69 (m, 1 H) 1.75 - 1.93 (m, 30 H) 1.94 - 2.21 (m, 20 H) 3.23 (五重線, J=5.26
Hz, 1 H) 3.28 - 3.51 (m, 23 H) 3.95 (td, J=7.73, 5.44 Hz, 1 H) 4.92 - 5.22 (m,
1 H) 5.78 (br. s., 1 H) 6.13 - 6.42 (m, 1 H) 6.88 (br. s., 1 H) 7.20 - 7.36 (m,
2 H) 7.42 (t, J=5.07 Hz, 1 H).
ステップ4:脂肪酸を用いるCRM197のmTGase媒介標識化(実施例25):
100mMのトリス緩衝液(pH8)中25dの溶液(8mg/mL、203μL、1
.316μmol)に、CRM197(33mg/mL、1.515μL、0.0008
6μmol)を加え、続いて、PBS中のトランスグルタミナーゼ酵素(味の素)(50
mg/mL、0.455μL、0.00060μmol)の溶液を加えた。反応液を室温
で16時間撹拌した。10kDaのMWCO Amicon遠心分離器を使用して、反応
液を5回希釈および濃縮して、体積を100μLにすることによって、反応混合物を、1
00mMのトリス緩衝液(pH8)に交換した。LCMS分析により、+1、+2、+3
および+4生成物への変換が示された。LCMS QT2;タンパク質_35〜70kD
a_3分:R=1.45分;MS[M+25d]:実測値:59625、計算値:59
624;MS[M+(2×25d)]:実測値:60839、計算値:60838;MS
[M+(3×25d)]:実測値:62054、計算値:62052;MS[M+(4×
25d)]:実測値:63270、計算値:63266。
CRM197配列:
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW
KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE
TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI
NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS
CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF
HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT
TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL
VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT
VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI
SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH
ペプチドマッピングの実験概要:
ペプチドマッピング消化:5μgの改変CRM197および陽性対照CRM197サン
プルを20mMのDTTで還元し、1/30(w/w)の酵素/タンパク質で、26℃で
、終夜、トリプシンを用いて消化した。トリプシンで消化されたタンパク質のアリコート
を、GluC酵素を用いて、1/20の酵素/タンパク質比で、4時間、26℃でさらに
消化した;全ての酵素はRoche Diagnostics(有限会社、ドイツ)から
購入されたことに留意されたい。
逆相LC−MS/MS分析:得られた消化されたペプチドを、Agilent Cap
LC(サンタクララ、カリフォルニア州)にライゲーションしたThermo LTQ
Orbitrap Discovery(Thermo Fisher Scienti
fic Inc.、Waltham、マサチューセッツ州)での液体クロマトグラフエレ
クトロスプレータンデム質量分析(LC−ESI MS/MS)によって分析した。約1
0〜15pmolのCRM対照と改変CRM197消化物を、カラムに40℃で導入した
(Waters Acuity BEH C18、1.7μm、1×100mm カラム
)。10μL/分の状態で0〜1分、4%のB、1.1分で7%のBまで増加させる、5
5分で45%のB、次いで63分で95%のBの勾配で合計80分稼働させ、続いて、洗
浄およびカラム平衡化を行った。質量分析計のパラメータは、m/z300〜2000か
らの30000分解能で、30ミリ秒間、FTMS分析計を使用する、フルスキャン事象
を含んだ。衝突誘起解離MS/MSを、イオントラップ型質量分離法における上位7つの
強度のイオン(1+イオンを除外する)で行い、500(全ての事象について)シグナル
強度閾値で30ミリ秒間活性化した。
データ分析およびデータベース検索:全ての質量スペクトルを、Qual Brows
er V2.0.7(Thermo Scientific)で処理した。mascot
generic file(mgf)をMS Decon Tools(R.D.Sm
ith Lab、PPNL)を用いて作成し、混在タンパク質に対する社内カスタムデー
タベースおよびSwissProtデータベース(513,877配列を有するV57)
に加えて提供されたタンパク質配列に対するMascot V2.3.01(Matri
x Science Inc.、ボストン、マサチューセッツ州)データベース検索を使
用して検索した。検索パラメータは以下を含む:酵素:セミトリプシンまたはトリプシン
/Glu−C、3つまでのミスクリベージ(missed cleavage)を許容する;非確定的修
飾(variable modification):「CRM Tgase+アルキン 362Da mod
(CKR)、CRM Tgase+アルキン 362Da mod(N末端)、CRM
Tgase+アジド 463Da mod(CKR)、CRM Tgase+アジド 4
63Da mod(N末端)」と呼ばれるデータべースに対する小分子の予測付加質量(
362.147787Daおよび463.206698Da);ペプチドの許容誤差(pe
ptide tolerance):±20ppm;MS/MS許容誤差(MS/MS tolerance):±0.6
Da。配列包括度および小分子修飾の評価は、>95%信頼区間でのイオンスコアで行わ
れた。次いで、高スコアのペプチドイオンを、Qual Browserを使用する手動
のMS/MS分析のために選択した。
リシン修飾が生じる位置を、上掲のマッピング実験に従って判定することができる。2
014年7月11日に出願された米国特許出願第2015/0017192号明細書(代
理人明細書番号PAT055641−US−NP)においてCRM197について記載さ
れた、同様のコンジュゲーションにより、本発明者らは、修飾が、Lys37またはLy
s39、Lys33およびLys440で生じたと推定する。
実施例26A:オキシトシン誘導体と脂肪酸のコンジュゲーション:
ステップ1:樹脂で保護されたオキシトシンの調製
オキシトシンの樹脂で保護された形態(26a1)は、実施例21Bのステップ1と似
たようにして合成された。
ステップ2:アリル脱保護、環化、樹脂からの切断
保護された中間体(26a1)(0.2mmol)を、フェニルシラン(1mmol)
およびPd(PPh(0.02mmol)を含有する6mlのDCM中に溶かした
。樹脂をこの溶液中で15分間撹拌し、次いで濾過した。DCM溶液中のフェニルシラン
/Pd(PPhを用いて、この手順を2回繰り返した。最後の撹拌後、樹脂を濾過
し、NMP(3回)、DCM(3回)、0.5%DIEA/DCM(3回)および最終は
NMP(3回)で洗浄した。得られた洗浄された樹脂を真空中で乾燥させた。乾燥させた
樹脂の一部(約0.1mmol)を、6mLのNMP中PyBOP(0.2mmol)、
HOBt(0.4mmol)、およびDIEA(0.5mmol)の溶液に溶かした。こ
の反応液を室温で20時間撹拌した。樹脂を濾過し、EtOAc(3回)およびDCM(
3回)で洗浄した。樹脂を、4mLの95/2.5/2.5のTFA/TIPS/H
に溶かし、2時間撹拌した。次いで、TFA/TIPS/HO溶液を、冷(−20℃未
満)EtO中に濾過し、切断されたペプチドを沈殿させた。遠心分離後、EtOをデ
カントし、オフホワイトの残渣をEtOで洗浄し、再度遠心分離した。得られたオフホ
ワイトの固体を、N中にて、終夜乾燥させた。この固体を、質量起動式分取HPLC(
Waters Autopure HPLC System;Sunfire C18
30×50mm 5umカラム;移動相:水中7.5〜20%のACN、5分の勾配、7
5mL/分、0.1%TFAで改変)で精製した。中間体(26a2)に相当する画分を
合わせ、冷凍し、凍結乾燥させて、白色の固体(13.5mg、14%)とした。HRM
S−分析法G:Rt=0.90分、MS m/z 988.5225[M+H]
ステップ3:脂肪酸へのコンジュゲーション
0.5mLのpH=6.40のリン酸緩衝液中中間体(26a2)の溶液に、0.5m
LのpH=6.40のリン酸緩衝液中I−37(8.39μmol)の溶液を加えた。反
応液を室温で18時間撹拌した。次いで、反応混合物を、4.5μmのフリットを通して
濾過し、質量起動式分取HPLC(Waters Autopure HPLC Sys
tem;Sunfire C18 30×50mm 5umカラム;移動相:水中45〜
70%のACN、5分の勾配、75ml/分、0.1%TFAで改変)で精製した。オキ
シトシン−FAコンジュゲート(26A)に相当する画分を合わせ、冷凍し、凍結乾燥さ
せて、白色の固体(1.71mg、24%)とした。LCMS−分析法G:Rt=3.0
7分、MS m/z 2540.5[M+H]
実施例26B:オキシトシン誘導体と脂肪酸のコンジュゲーション
ブチレート−Tyr−Ile−Gln−Asn−Cys−Gly(N−CH2CH
2CH2NH2)−Leu−Gly−NH2=スルフィド結合(26b1):
を中間体I−37と反応させることによって、上記実施例26Aのステップ3に従って、
上記実施例(26B)を調製することができる。
環状ペプチド(26b1)を、参照により本明細書に援用されるWisniewski et al, J.
Med. Chem. (2014), 57 5306-5317に開示される実施例41の手順を採用することによっ
て調製した。
ペプチドは、Fmoc化学により、1mmolのFmoc−RinkアミドAMS樹脂
で手動で合成した。アミノ酸に対して使用された保護基は:Tyrに対するt−ブチル基
、GlnおよびAsnに対するTrt基である。2種の珍しいアミノ酸、Fmoc−Cy
s(CHCHCHCOアリル)−OHおよびFmoc−[Nα−CHCH
NH(Boc)]Gly−OHを使用した。Fmoc保護基を繰り返し除去し、DM
F中で保護されたアミノ酸(3当量)をカップリングすることによって、ペプチド鎖を樹
脂上で組み立てた。HBTUおよびHOBt(3当量:3当量)をカップリング試薬とし
て使用し;N−メチルモルホリン(NMM、6当量)を塩基として使用した。DMF中2
0%のピペリジン(樹脂体積の3倍)を、de−Fmoc試薬として使用した。各カップ
リングおよびde−Fmoc後に、DMF(樹脂体積の3倍)によって樹脂を洗浄し;各
カップリング後に、ニンヒドリン試験を行い、カップリング効率を確認した。最後のFm
oc保護基の除去に続いて、樹脂をエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。アリ
ルエステル保護基の選択的な樹脂上除去を、DCM/THF(1/1、樹脂体積の10倍
)中Pd(PPh3)4/5,5−ジメチル−1,3−シクロヘキサンジオン(1当量/
10当量)によって3時間行った。樹脂をDMFで洗浄し(3×)、続いて、DMF中0
.5%のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで洗浄した。最後に、樹脂上での環化を
、DMF中HCTU/NMM(3当量/6当量)によって行った。樹脂を洗浄して、真空
中で乾燥させて、3.2グラムのペプチド樹脂を得て、これを32mlのTFA/TIS
/DOT/HO(92.5/2.5/2.5/2.5、v/v)で、3時間、室温で処
理し、側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを切断した。次いで、濾過によって集めた
冷エーテルから、粗製のペプチドを沈殿させ、高圧中で乾燥させた。収量:1.15g(
116%)。
ペプチドの全ての粗生成物を、2インチのC18カラムで、TFA緩衝液(緩衝液A、
水中0.1%TFA;緩衝液B、アセトニトリル)を用いて精製した。純度95%超のプ
ールされた画分を乾燥させるために凍結乾燥した。84mgの最終ペプチドを得た(TF
A塩)。MS:991.6[M+H]、HPLC 保持時間9.49分(方法:流量1
.2mL/分;緩衝液A:水中0.1%TFA;緩衝液B:アセトニトリル中0.1%T
FA;室温;カラム:Discovery、C18、4.6mm×250mm、5マイク
ロ;勾配(直線状)20分で15%〜35%の緩衝液B;注入体積0.02mL)
実施例27:アグーチに関するタンパク質(AgRP)−脂肪酸コンジュゲート
AgRP(83−132)−FAコンジュゲート
実施例27A:AgRPのモノ脂肪酸コンジュゲート(AgRP+1FA)、ここで、脂
肪酸は、リンカー(PEG)を介してAgRPのN末端に結合している。
ここで、AgRP(83−132)は以下の配列を有する:
Ser−Ser−Arg−Arg−Cys−Val−Arg−Leu−His−Glu−
Ser−Cys−Leu−Gly−Gln−Gln−Val−Pro−Cys−Cys−
Asp−Pro−Cys−Ala−Thr−Cys−Tyr−Cys−Arg−Phe−
Phe−Asn−Ala−Phe−Cys−Tyr−Cys−Arg−Lys−Leu−
Gly−Thr−Ala−Met−Asn−Pro−Cys−Ser−Arg−Thr;
これは、C87とC102、C94とC108、C101とC119、C105とC12
9、C110とC117の架橋の位置に、5ジスルフィド架橋を含有する。
実施例27B:AgRP(83−132)のジ脂肪酸コンジュゲート(AgRP+2FA
)、ここで、1つの脂肪酸は、リンカー(PEG)を介してAgRPのN末端(すなわち
、セリン83)に結合しており、他方の脂肪酸は、PEGリンカーを介して位置121の
リシンの側鎖に結合している。
pH4.5のクエン酸緩衝液(9mg、1.585μmol)中0.90mlのAgR
P(83−132)の10mg/ml溶液(R&D Systems(商標)から入手可
能)に、0.80mlのpH=4.43酢酸緩衝液を加え、続いて、HO中1.3ml
のI−37の10mg/ml溶液(13mg、7.79μmol)を加えた。反応液を室
温で16時間撹拌した。HRMS(QT2)により、1.89分で、AgRP+1FA、
m/z 7226.3[M+H]、および2.41分で、AgRP+2FA、m/z
8778.4[M+H]の両方の存在が示された。反応液を、4.5μmのフリットを
通して濾過し、上記のように稼働された第2の反応液(0.881μmolのAgRP、
2.64μmol I−37)と合わせ、分取HPLC(Waters Autopur
e HPLC System;Waters Protein BEH C4カラム、3
00オングストローム、5um、10×250mm;移動相:水中20〜80%のACN
、11分の勾配、10mL/分、0.1%TFAで改変;稼働時間:15分;画分収集:
UV 210nm)で精製した。AgRP+1FAおよびAgRP+2FAに相当する画
分を単離し、冷凍し、凍結乾燥して、AgRP+1FA(27A)およびAgRP+2F
A(27B)のTFA塩を白色の固体(3.24mg、16%のAgRP+1FA;2.
26mg、9%のAgRP+2FA)を得た。LCMS−分析方法G:(AgRP+1F
A)Rt=1.91分、MS m/z 7226.4[M+H];(AgRP+2FA
)Rt=2.43分、MS m/z 8778.4[M+H]
脂肪酸の結合位置を判定するための標識化実験
N末端Ser残基の標識化を、製造業者のプロトコルに従って、反応混合物を、Asp
−N(Promega)で消化することによって確認した。全てのペプチドマッピングア
ッセイを、Bruker Maxis Impact Q−TOF質量分析計とライゲー
ションしたThermo Dionex Ultimate 3000LCを使用して達
成した。40℃に保ったAQUITY UPLC BEH130 C18カラム(2.1
×150mm、1.7μm、Waters)で、分離を行った。流量は、移動相Aとして
、水中0.1%FA、移動相Bとして、アセトニトリル中0.1%FAで0.1mL/分
であった。
Asp−N(Promega パート番号V162A)の溶液を、20uLのHPLC
/MS水(0.1μg/μL)中で再構成した。およそ10μgのサンプルを、6Mの尿
素、10mMのジチオトレイトール、5mMのEDTA、および50mMのTris_H
Cl(pH=8.0)中最終体積25μLまで希釈した。還元およびアルキル化後、50
mMのTris_HCl(pH=8.0)を用いて、溶液を6倍に希釈し、次いで、追加
の1マイクログラムのAsp−Nを用いて、タンパク質分解を行った。セ氏37度で、消
化は終夜起こった。LCMS分析により、以下の表に示されたように、各断片に1つの追
加の脂肪酸を付加することで、野生型AgRPおよび修飾AgRPのN末端D位で切断が
起こったことが示された。
実施例28(28A、28Bおよび28C)は、hFGF23変異体のコンジュゲートに
関する。
使用されたFGF23変異体
この実施例で、「hFGF23(R179Q)」、「「hFGF23 R179」」ま
たは単に「hFGF23」として使用され、示されるヒトFGF23変異体の配列は、配
列番号10で提供される。このFGF23変異体は、シグナルペプチドを欠いているが、
1位に修復されたMを有し、R179(R179Q)に突然変異を有する。本明細書に記
載された脂肪酸を含むコンジュゲートは、このFGF23ペプチド(実施例28C)で調
製され、表8において、少なくとも1つのFGF23活性を保持することが示された。ヒ
トFGF23の2種の他の変異体も、この実施例(実施例28Aおよび28B)で使用さ
れ、本明細書で開示された脂肪酸とコンジュゲートを構築した。配列番号10のペプチド
のように、これらはFGF23シグナルペプチドを欠き、R179に突然変異を有するが
、1つまたは複数のさらなる突然変異を有し、少なくとも1つのFGF23活性を保持す
る。これら2種のFGF23変異体は、「hFGF23−変異体」または「FGF23変
異体」などとしてこの実施例で使用され、両方が示される。
本明細書で記載されたコンジュゲートを生成するための方法は、FGF23、またはそ
のホモログ、変異体、断片、もしくは修飾形態を含む他のFGF23ペプチドを用いて使
用され得る。
FGF23変異体生成のためのプロトコル
形質転換
hFGF23(R179)ポリペプチドを、pET28c−hFGF23 R179Q
発現プラスミドをBL21(DE3)コンピテント細胞に一過性導入し、氷上で30分間
インキュベートし、42℃で45秒間ヒートショックを与え、SOC培地を加え、37℃
のシェーカーで1時間細菌をインキュベートすることによって作製した。その後、細菌培
養物を、カナマイシンを含有するLBプレートに広げ、37℃で終夜インキュベートした
。単離したコロニーを、カナマイシンを含有するLB培地に移し、37℃で振盪しながら
終夜インキュベートし、25mLのアリコートを、カナマイシンを含有する新しいLB培
地に移し、37℃で約2.5時間振盪した。細胞が充分な密度(OD約0.6)となった
ら、1MのIPTGを、37℃で振盪を続けながら、各培地に加え、ポリペプチドの発現
を誘導した。4時間後、6000rpmで10分間遠心分離することによって、細胞をペ
レット化し、ペレットを−20℃で冷凍した。次に、ペレットを溶解緩衝液(50mMの
Tris、pH8、100mMのNaCl、0.1% Triton X−100)に再
懸濁させ、細胞をマイクロフルイダー(microfluider)を使用して溶解させた。100m
Lの溶解ミックス当たり10mgのリゾチームおよび10μLのDNase(1mL当た
り1単位、Invitrogen)を加え、室温で30分間インキュベートし、次いで、
8000rpmで、4℃で、20分間遠心沈殿させ、100mLの溶解緩衝液と回転を3
回変え、4回目にTriton X−100なしの溶解緩衝液で洗浄した。最終回転から
のペレット(封入体の)を、50mMのTris、pH7.4、6Mのグアニジン、10
mMのDTTに直ちに可溶化させ、タンパク質濃度を判定し、リフォールディング前に1
mg/mlに調整した。
タンパク質のリフォールディング:
タンパク質をリフォールディングするために、368mgの還元グルタチオン(GSS
H)と74mgの酸化グルタチオン(GSSG)をそれぞれ400mlの可溶化封入体に
加えた。タンパク質を、4Lの50mMのTris(pH8.0)および250mMのア
ルギニンに対して、4℃で終夜透析した。次いで、2Lの透析緩衝液を除去し、2Lの水
で置き換え、もう8時間透析を継続した。次いで、透析緩衝液を、20mMのTris(
pH8.0)、50mMのNaCl、25mMのアルギニンに代えて、透析を終夜継続し
た。
タンパク質の精製:
タンパク質を精製するために、透析された混合物を、12000rpmで30分間回転
させ、最終の透析緩衝液で平衡化されたヘパリン−セファロースカラムに導入し、カラム
をベッドボリュームの20倍の1×PBSで洗浄した。リフォールディングされたタンパ
ク質を、0.5MのNaClを補充した1×PBSで溶出し、タンパク質の精製をSDS
−PAGEゲルによって評価し、タンパク質濃度を280nm波長におけるODによって
測定した。
実施例28A:hFGF23変異体と脂肪酸のコンジュゲーション
ここで、hFGF23変異体−NH−における−NHは、リシン残基のアミノ官能基
を意味する。
ステップ1:中間体28a
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル5−アミノ−2−(((ベンジルオキシ)カル
ボニル)アミノ)−5−オキソペンタノエート(0.5g、1.325mmol)をDM
F(体積:9.96ml)に溶解させ、tert−ブチル(2−(2−(2−アミノエト
キシ)エトキシ)エチル)カルバメート(0.503ml、2.120mmol)を加え
た。DIPEA(0.274g、2.120mmol)を混合物に加え、反応液を室温で
2時間撹拌し、この時点で、LCMS分析により、所望の生成物の形成とZQ−NHS出
発材料の消費が示された(方法A、R=0.98分、M+H 511.4)。反応混合
物をDCM(100mL)に注ぎ、冷水で洗浄した(3×50mL)。有機層をNa
で乾燥させ、濾過し、濃縮して、1.14gの黄色の油状物を得た。LCMS分析に
より、所望の生成物の存在が示された(方法M、Rt=1.82分、M+H 511.4
、1.14g)。材料を、さらに精製することなく次のステップに持ち越した。
ステップ2:中間体28b、ベンジル(5−アミノ−1−((2−(2−(2−アミノエ
トキシ)エトキシ)エチル)アミノ)−1,5−ジオキソペンタン−2−イル)カルバメ
ート
トリフルオロ酢酸(10mL、2.233mmol)を中間体28a(1.14g、2
.233mmol)に加え、室温で約1時間撹拌した。LCMS分析により、出発材料の
、所望の生成物への完全な変換が示された(方法A、R=0.56分、M+H 411
.3)。反応混合物をDCM(30mL)に溶かし、油状物になるまで2回濃縮した。油
状物を、1mLのACNおよび1mLのMeOHで希釈し、MS起動式HPLCによって
精製した(方法N)。所望の質量を有する画分をプールし、冷凍し、凍結乾燥して、中間
体28bを白色の粉末として得た(方法O、R=0.22分、M+H 411.3、1
60mg、18%)。
ステップ3:中間体28c
中間体28b(16.69mg、0.048mmol)をDMF(0.5mL)に溶解
させ、DMF(1.0mL)中中間体37(50mg、0.030mmol)の溶液に加
えた。3滴のDIPEAを加え、反応液を室温で2時間撹拌し、この時点で、LCMS分
析により、生成物への完全な変換が示された(方法B、R=1.22分、M+H+2/
2 982.9)。反応混合物を、逆相クロマトグラフィー用の20gのC−18カラム
に導入した。20分間をかけて、100%の水(0.1%TFA)〜100%のMeCN
への溶媒の勾配を使用して、画分を集め、LCMSによって分析した。所望の質量を有す
る画分を合わせ、冷凍し、終夜凍結乾燥させて、中間体28cを、透明無色の油状物とし
て得た(方法C、R=1.21分、M+H+2/2 982.9、M+H+3/3 6
55.5、15.3mg、26%)。H−NMRにより、6.29ppmで形成された
アミド結合の存在(1H、br m)が示されると、暫定的に解釈される。1H NMR (400
MHz, クロロホルム-d) δ 7.52 (s, 1H), 7.35 (d, J = 3.3 Hz, 5H), 5.10 (s, 2H), 4.
30 (s, 1H), 3.77 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.69 - 3.49 (m, 94H), 3.46 (s, 4H), 2.59 (
s, 3H), 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 25H), 2.08 - 1.94 (m, 4H), 1.79 - 1.65 (m, 2H), 1.6
5 - 1.52 (m, 2H), 1.40 - 1.06 (m, 31H), 0.94 - 0.82 (m, 3H).
ステップ4:hFGF23変異体+中間体28c
このステップのために、シグナルペプチドを欠くが、配列番号8に対して1つまたは複
数の突然変異を有し、少なくとも1つのFGF23活性を保持する、ヒトFGF23(h
FGF23)変異体(「hFGF23変異体」を使用し、ここで「FGF23変異体−N
」における「−NH」は、リシン残基のアミノ官能基を示す。
30mMのMES(pH6)中TGaseの50mg/mL溶液と、30mMのMES
緩衝液(pH6)中中間体28cの8mg/mL溶液を調製した。MES(pH6)中で
、脂肪酸溶液は濁った。hFGF23変異体(30mMのMES(pH6)中0.3mg
/mL、7.5ml、0.088μl)に、中間体28c(217μl、0.883μm
ol)、続いてTGase(33.5μl、0.044μmol)を加えた。反応液を室
温で18時間混合し、追加の217μLの中間体28cを加えた。反応液を室温で18時
間混合し、追加の217μLの中間体28cを加えた。反応液を室温で18時間混合し、
追加の108.5μLの中間体28cを加えた。反応液を室温で4時間混合し、この時点
で、LCMS分析により、出発材料の完全な変換が示された(方法P、R=1.55分
、M+H 27432)。反応混合物を、2つの4mLの10kDaのMWCO Ami
con遠心分離器に分割し、緩衝液を、3回、30mMのMES緩衝液(pH6)と交換
し、次いで、1.5mLまで濃縮した。材料を冷蔵庫に終夜保存した。一部の固体が、チ
ューブの底に沈降した。上清の濃縮物は、0.43mg/mL(27%)であることが、
A280(18730cm−1M−1、25485g/mol)によって測定された。
実施例28B:hFGF23変異体のZQG−PEG11−脂肪酸とのコンジュゲーショ

この実施例では、脂肪酸と、シグナルペプチドを欠き、配列番号8に対して1つまたは
複数の突然変異を有するが、変異体が、少なくとも1つのFGF23活性を保持するFG
F23変異体とを含むコンジュゲートが調製された。
ここで、hFGF23変異体−NHにおける−NHは、リシン残基のアミノ官能基を
意味する。
中間体25dの8mg/mL溶液を、100mMのpH8のトリス緩衝液中で調製した
。TGaseの50mg/mL溶液を、HO中で調製した。hFGF23変異体の溶液
(6.5mL、0.090μmol)の溶液に、中間体25d(0.207mL、1.3
43μmol)、続いてTGase(0.136mL、0.179μmol)を加えた。
反応液を室温で3日間混合し、+1種への90%の変換が観察された(LCMS 方法Q
、R=7.24分、M+H 26616)。反応混合物を、10kDaのMWCO A
micon遠心分離器を使用して、反応液を、6回、希釈および2mLの体積まで濃縮す
ることによって、PBS 1×緩衝液に交換した。濃縮物は、0.125mg/mLであ
ることがA280(18730cm−1M−1、26617g/mol)によって測定さ
れた(LCMS 方法Q、R=7.24分、M+H 26616)。
実施例28C:h−FGF23 R179+ZQG−PEG11−脂肪酸のコンジュゲー
ション
この実施例では、FGF23変異体「hFGF23 R179」を使用して、コンジュ
ゲートが調製された。これは、シグナルペプチドを欠き、R179に突然変異を有する。
配列は、配列番号10として提供されている。
計算質量値:25463
中間体25dの8mg/mL溶液を、100mMのpH8のトリス緩衝液中で調製した
。TGaseの50mg/mL溶液を、HO中で調製した。hFGF23 R179の
溶液(2.50E+04μl、0.393μmol)の溶液に、中間体25d(750μ
l、4.87μmol)、続いてTGase(597μl、0.785μmol)を加え
た。反応液を室温で2日間混合し、この時点で、LCMS分析により、出発材料の完全な
変換が示された(方法P、R=1.58分、M+H 26674)。反応混合物を、イ
オン交換クロマトグラフィーにより精製して、+1コンジュゲートを得た(方法R、R
=3.87分、M+H 26674):
ここで、hFGF23 R179−NHにおける−NHは、リシン残基のアミノ官能
基を意味する。
実施例29Aおよび29Bは、セレラキシンのコンジュゲートに関する。
実施例29A:セレラキシン−脂肪酸コンジュゲート(+1脂肪酸コンジュゲート)
セレラキシン+ZQG−PEG11−脂肪酸(実施例25d):
セレラキシン配列:
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALSRKTCG
VHCCKNALASYLE;
「セレラキシン−NH2」における−NH2は、以下のマッピング実験によって明らかに
されたリシンK17の側鎖における反応性アミノ官能基を意味する;分子量 5963g
/mol。
ZQG−PEG11−脂肪酸(実施例25d)の8mg/mL溶液を、100mMのト
リス緩衝液(pH8)中で調製した。TGaseの50mg/mL溶液を、HO中で調
製した。100mMのトリス(pH8)中セレラキシン(211μL、0.168μmo
l)の溶液(1.018mL、0.5mg/mL反応液)に、実施例25d(516μl
、3.35μmol)、続いてmTGase(味の素、255μl、0.335μmol
)を加えた。反応液を37℃で3日間混合し、次いで、追加の100μLのZQG−PE
11−脂肪酸を加えた。反応液を37℃で18時間混合し、次いで、10kDaのMW
CO Amicon遠心分離器を使用して、反応液を、5回、希釈および0.7mLの体
積まで濃縮することによって、PBS 1×緩衝液に交換した。材料を、方法Kにより精
製して、所望の材料を有する画分をプールし、冷凍し、凍結乾燥させて、白色の粉末を得
た。材料を1mLの30mM NaOAc緩衝液(pH5)に溶解させ、濃縮物は、0.
25mg/mL(25%)であることが、A280(5969cm−1M−1、7178
g/mol)によって測定された。LCMS方法L:R=1.65分;MS[M+1+
1FA]:実測値:7180、計算値:7178。
セレラキシンマッピングのための実験手順
サンプルのタンパク質分解
およそ10μgのタンパク質を、最終体積25μLの6Mの尿素、10mMのジチオト
レイトール、5mMのEDTA、および50mMのTris_HCl(pH=8.0)に
溶解させ、37℃で1時間維持して、ジスルフィド結合を還元した。ヨードアセトアミド
(500mM、1uL)を加え、遊離チオールをアルキル化し、溶液を、暗所で1時間、
室温で静置させた。次いで、50mMのTris_HCl(pH=8.0)で溶液を6倍
に希釈し、LysC(1ug、Promega V107A)を加え、溶液を37℃で終
夜維持して、タンパク質を消化した。ギ酸(98%、2uL)を加え、タンパク質分解を
失活させ、得られたペプチド混合物を、LC−MS/MSによって分析した。
LC−MS/MS分析
ペプチドマッピングを、Bruker Maxis Impact Q−TOF質量分
析計とライゲーションしたThermo Dionex Ultimate 3000H
PLCを使用して行った。MSは、Bruker Compass v.1.7およびB
ruker otofControl v.3.4ソフトウェアを使用して制御し、機器
パラメータは以下のように設定した:質量範囲 300〜2,000Da;スプレー電圧
値 4.0kV;昇温キャピラリー 200℃;乾燥ガス流 5.0L/分。画分化は、
40℃に維持したWaters ACQUITY UPLC BEH130 C18 カ
ラム(2.1×100mm、1.7μm)を用いて行った。移動相は、それぞれ、水中0
.1%ギ酸とアセトニトリルであり、流量は100uL/分であった。使用された勾配は
、0〜2分、2%のB;2〜3分、2%〜8%のB;3〜10分、8%〜29%のB;1
0〜14分、29%〜33%のB;14〜16分、33%〜37%のB;16〜20分、
37%〜73%のB;20〜22分、73%〜95%のB;22〜25分、95%のB;
25〜26分、95%〜2%のB;26〜30分、2%のB。データ処理は、Bruke
r DataAnalysis v.4.2を使用して行った。
マッピング実験により、セレラキシンへの脂肪酸の付加は、[CCHVGCTK17
fa)RSLARFC−2HO]として割り当てられたペプチドに対してリシンK17
で最初に起こり、質量:3088.56Da、電荷:5、Rt=13.4分、実測値 m
/z 618.71、予測値 m/z 618.72であることが示された。
実施例29B:セレラキシン−脂肪酸コンジュゲート(以下に記載された+1FA、+2
FAおよび+3FAコンジュゲートの混合物)
ここで、「セレラキシン−NH」における−NHは、リシンの側鎖における反応性ア
ミノ官能基を意味する。
配列:
DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSCFRALSRKTCG
VHCCKNALASYLpE
脂肪酸中間体37の10mg/mL溶液を、HO中で調製した。30mMのNaOA
c緩衝液(pH4)(755μL)中セレラキシンの溶液(105μL、0.084μm
ol、4.75mg/mL)に、脂肪酸中間体37(140μL、0.839μmol)
を加えた。反応液を室温で16時間混合し、この時点で、LCMS分析により、出発材料
の90%の変換が示された。追加の70μLの中間体37を加え、反応液を室温で16時
間混合し、この時点で、MALDI分析により、95%超の変換が示された。溶液を、3
kDaのMWCO Amicon遠心分離器を使用して、反応液を、4回、希釈および0
.2mLの体積まで濃縮することによって、PBS 1×緩衝液に交換した。濃縮物は、
2.61mg/mLであることが、A280(5969M−1cm−1、9068g/m
ol)によって測定された。LCMS 方法L:R=1.56分;MS[M+1+1F
A]:実測値:7516、計算値:7517;R=1.65分;MS[M+1+2FA
]:実測値:9069、計算値:9071;R=1.74分;MS[M+1+3FA]
:実測値:10622、計算値:10625。
実施例30:M−His−fPIPの脂肪酸構築物(I−37)とのコンジュゲーション
−(以下に記載する+1FAコンジュゲート、および+2FAコンジュゲートの混合物)
M−His−hPIP(29−146)配列:
MHHHHHHQDNTRKIIIKNFDIPKSVRPNDEVTAVLAVQTE
LKECMVVKTYLISSIPLQGAFNYKYTACLCDDNPKTFYWD
FYTNRTVQIAAVVDVIRELGICPDDAAVIPIKNNRFYTIE
ILKVE (配列番号13)
発現形態
発現されたタンパク質の配列:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGMHHHHHHQDNTRKIIIKNFD
IPKSVRPNDEVTAVLAVQTELKECMVVKTYLISSIPLQGA
FNYKYTACLCDDNPKTFYWDFYTNRTVQIAAVVDVIRELG
ICPDDAAVIPIKNNRFYTIEILKVE
ヌクレオチド配列:
GCTAGCCACCATGGAGACTGATACTTTGTTGTTGTGGGTA
CTGTTGCTTTGGGTGCCCGGTAGTACCGGTATGCATCACC
ACCACCATCACCAGGACAACACCCGGAAGATCATCATCAA
GAACTTCGACATCCCTAAGAGCGTGCGCCCAAACGATGAA
GTCACCGCGGTGCTGGCAGTGCAGACTGAGCTGAAGGAGT
GCATGGTGGTCAAGACGTACCTGATTTCGTCCATCCCGCT
GCAAGGCGCCTTCAACTACAAGTACACTGCCTGCCTCTGT
GACGACAACCCCAAGACCTTTTACTGGGACTTCTACACCA
ATAGAACTGTCCAGATTGCTGCCGTGGTGGATGTGATCAG
GGAATTGGGAATTTGCCCCGACGATGCGGCCGTGATTCCG
ATCAAGAACAACCGCTTCTATACCATCGAGATCCTTAAAG
TGGAATGAGAATTC
PIP発現ベクター:
ヒトPIPをコードする哺乳動物発現ベクターを、標準のクローニング方法によって生
成した。マウスIgκ鎖シグナル配列、続いて、MHHHHH配列、次いで、5’−Nh
elを有する成熟PIP(続いて、Kozak配列)および3’−EcoRI部位を含有
する断片をコドン最適化され、合成された(DNA2.0)。次いで、この配列は、CM
Vプロモーターの下流のpcDNA3.1(Invitrogen)をベースとするベク
ターのユニークな5’−Nhelおよび3’−EcoRI部位にクローニングされた。
PIP発現および精製:
PIP発現プラスミドDNAは、標準のポリエチレンイミン方法を使用して、1ml当
たり1×10個の細胞の密度でHEK293T細胞に遺伝子導入した。次いで、500
mlの培養物を、3Lフラスコ中FreeStyle 293培地(Life Tech
nologies)において、8%のCOの湿気のある環境で、37℃で4日間増殖さ
せた。PIPタンパク質を、清澄な馴化培地から精製した。
ここで、M−His−PIPは、配列番号12を有し、「M−his」はMHHHHHH
である。
コンジュゲーション:
脂肪酸−リンカー構築物番号1の10mg/mL溶液をHO中で調製した。M−Hi
s−hPIP(0.700mL、0.048μmol)を、30mMのNaOAc緩衝液
(pH4)(619μL、0.5mg/mL反応液)で希釈し、中間体37(0.081
mL、0.484μmol)を加えた。反応液を室温で18時間混合し、この時点で、L
CMS分析により、+1(50%)および+2(20%)生成物への70%の変換が示さ
れた。次いで、材料を、3kDaのMWCO Amicon遠心分離器を使用して、反応
液を、5回、希釈および350μLの体積まで濃縮することによって、PBS 1×緩衝
液に交換した。濃縮物は、1.7mg/mL(70%)であることが、A280(138
50cm−1M−1、14472g/mol)によって測定された。LCMS 方法L:
=1.46分;MS[M+1]:実測値:14472、計算値:14476。R
1.57分;MS[M+1+脱グリコシル化した1FA]:実測値:16025、計算値
:16030。R=1.69分;MS[M+1+脱グリコシル化した2FA]:実測値
:17578、計算値:17584。
PIPマッピングのための実験手順
サンプルのタンパク質分解
およそ10μgのタンパク質を、最終体積25μLの6Mの尿素、10mMのジチオト
レイトール、5mMのEDTA、および50mMのTris_HCl(pH=8.0)に
溶解させ、37℃で1時間維持して、ジスルフィド結合を還元した。ヨードアセトアミド
(500mM、1uL)を加え、遊離チオールをアルキル化し、溶液を、暗所で1時間、
室温で静置させた。次いで、50mMのTris_HCl(pH=8.0)で溶液を6倍
に希釈し、LysC(1ug、Promega)またはトリプシン/Lys Cミックス
(1ug、Promega)を加え、溶液を37℃で終夜維持して、タンパク質を消化し
た。ギ酸(98%、2uL)を加え、タンパク質分解を失活させ、得られたペプチド混合
物を、LC−MS/MSによって分析した。
LC−MS/MS分析
ペプチドマッピングを、Bruker Maxis Impact Q−TOF質量分
析計とライゲーションしたThermo Dionex Ultimate 3000H
PLCを使用して行った。MSは、Bruker Compass v.1.7およびB
ruker otofControl v.3.4ソフトウェアを使用して制御し、機器
パラメータは以下のように設定した:質量範囲 300〜2,000Da;スプレー電圧
値 4.0kV;昇温キャピラリー 200℃;乾燥ガス流 5.0L/分。画分化は、
40℃に維持したWaters ACQUITY UPLC BEH130 C18 カ
ラム(2.1×100mm、1.7μm)を用いて行った。移動相は、それぞれ、水中0
.1%ギ酸とアセトニトリルであり、流量は100uL/分であった。使用された勾配は
、0〜2分、2%のB;2〜3分、2%〜8%のB;3〜10分、8%〜29%のB;1
0〜14分、29%〜33%のB;14〜16分、33%〜37%のB;16〜20分、
37%〜73%のB;20〜22分、73%〜95%のB;22〜25分、95%のB;
25〜26分、95%〜2%のB;26〜30分、2%のBであった。データ処理は、B
ruker DataAnalysis v.4.2を使用して行った。
マッピング実験により、MH−PIPへの脂肪酸の付加は、[fa−MHHHHHH
QDNTRK]によって明らかにされたように、N末端で優先的に起こり、質量:326
5.76Da、電荷:4、Rt=23.4分、実測値 m/z 817.44、予測値
m/z 817.45であることが示された。
わずかな程度の脂肪酸の付加が、ペプチド断片[SVRPNDEVTAVLAVQTE
LK(fa)ECMVVK]によって明らかにされたように、リシンK42において起こ
る、質量:4366.45Da、電荷:3、Rt=23.5分、実測値 m/z 145
6.49、予測値 m/z 1456.49.K42における脂肪酸の付加により、この
リシンに近接したトリプシン切断をブロックし、付加の位置を確認させる。
実施例31:クリック化学を使用するNPFFの脂肪酸とのコンジュゲーション
ステップ1:NPFFクリック化学ハンドルの調製
計算値 MH+ 1258.8
DMSO(1mL)中NPFF(Alfa Aesar、J66509、5mg、3.
82μmol)の溶液に、トリエチルアミン(5.32μl、0.038mmol)、次
いで(1R,8S,9r)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−0−イルメチル(
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル)カーボネート(1.335mg、4.58μm
ol)を加えた。反応混合物を室温で撹拌した。完了後、反応混合物を、次の反応ステッ
プへの粗製物として得た。
ステップ2:コンジュゲーション
ステップ1からの粗製反応混合物に、中間体6(I−6)を加えた。反応混合物を室温
で振盪した。完了後、反応混合物を、逆相クロマトグラフィー(システム:Agilen
t Bionert SystemDate;カラム:Waters Protein
BEH C4 カラム、300オングストローム、5um、10×250mm;UPLC
方法開発のためのカラムは、BEH C4m、300A、1.7um、2.1×50mm
;移動相:6分で46〜56%のACNの勾配、0.1%TFAAでの改変:水、B:ア
セトニトリル;流量:2.0mL/分;稼働時間:15分;画分収集:UV 210nm
)を使用して精製して、表題化合物、すなわちTFA塩としての白色の固体を得た;LC
MS:方法S:ELSD:Rt 1.46分;MS m/z 928.3[(M/3)
H]
本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートされていない生体分子と同様の、または改
良された効果を有するが、さらに、本発明のコンジュゲートは、コンジュゲートされてい
ない生体分子と比較して改良されたプラズマ安定性を有することを示すことができる。上
記実施例におけるコンジュゲートは、5時間超、10時間超、20時間超、30時間超、
40時間超、一部の場合には50時間超のプラズマ安定性を有することが見出された。
本発明の例示的実施形態でこのように記載されたことについて、当業者は、開示の範囲は例示的であるにすぎず、様々な他の代替、改変、および修飾が、本発明の範囲内でなされてもよいことに留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書に例示される特定の実施形態に限定されない。

本発明は以下の態様を包含し得る。
[1] リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、
前記脂肪酸は、次式A1、A2、またはA3:
[R 1 は、CO 2 HまたはHであり、
2 、R 3 、およびR 4 は、互いに独立して、H、OH、CO 2 H、−CH=CH 2 、または−C≡CHであり、
Akは、分枝状C 6 〜C 30 アルキレンであり、
n、m、およびpは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]を有する、
コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[2] 前記脂肪酸が
[式中、Ak 3 、Ak 4 、Ak 5 、Ak 6 、およびAk 7 は、独立して、(C 8 20 )アルキレンであり、R 5 およびR 6 は、独立して、(C 8 20 )アルキルである]から選択される、上記[1]に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[3] 前記脂肪酸が
[式中、Ak 2 は、線状C 8 〜C 20 アルキレンである]から選択される、上記[1]または[2]に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[4] 前記リンカーが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、1つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および/または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および/もしくは前記脂肪酸部分に、−C(O)O−、−OC(O)−、−NHC(O)−、−C(O)NH−、−O−、−NH−、−S−、−C(O)−、−OC(O)NH−、−NHC(O)−O−、=NH−O−、=NH−NH−、もしくは=NH−N(アルキル)−から選択される化学基を介して連結している、上記[1]、[2]、または[3]に記載のコンジュゲート。
[5] 前記リンカーが、式:
[式中、yは、0〜34である]の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、上記[1]から[4]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[6] 前記リンカーが、次式のヘテロ環部分:
[式中、rは、0〜2の整数であり、sは、0〜3の整数である]を含む、上記[1]から[5]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[7] 前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[8] 前記生体分子が、1)ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態またはその二量体、2)APJアゴニストペプチド、3)オキシトシン受容体アゴニストペプチド、4)セレラキシン、5)NPFF、6)PIPペプチド、7)FGF23ペプチド 8)AgRPペプチド、および9)siRNAから選択される、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[9] 前記脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生体分子が、次式:
[式CおよびDにおいて、his−hGDF15またはhGDF15*の両方のモノマー単位は、両方のN末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている]、または
[式EおよびFにおいて、his−hGDF15またはhGDF15*のモノマー単位の一方だけが、N末端において、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されている]の1つを有し、
hGDF15*は、N末端にある2または3つのアミノ酸がアミノ酸配列XH−またはXHX’−[Hは、ヒスチジンであり、XおよびX’は、MおよびAから独立して選択される]でそれぞれ置き換えられているhGDF15であり、
his−hGDF15は、1〜6つのヒスチジンアミノ酸と、場合により1または2つのメチオニンアミノ酸とを含むタグがそのN末端に付加されているhGDF15であり、
sは、20〜30の間の整数であり、
his−hDGF15の2つのモノマー単位間、またはhGDF15*の2つのモノマー単位間の線は、ジスルフィド結合を表す、上記[1]または[2]に記載のコンジュゲート。
[10] 式Cを有する上記[9]に記載のコンジュゲートと式Eを有する上記[9]に記載のコンジュゲートとを含む混合物、または式Dを有する上記[9]に記載のコンジュゲートと式Fを有する上記[9]に記載のコンジュゲートとを含む混合物。
[11] 前記生体分子が、MH(199−308)hGDF15、MHA(200−308)hGDF15、AHA(200−308)hGDF15、もしくはAH(199−308)GDF15、またはその二量体である、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
[12] 脂肪酸にリンカーを介して連結している前記生体分子が、式Gまたは式Hのものである、上記[9]または[11]に記載のコンジュゲート
[式中、AHA−hGDF15は、配列番号7であり、前記脂肪酸は、2つのモノマー単位の一方または両方のN末端において、リンカーを介して連結しており、2つのAHA−hGDF15単位間の線は、ジスルフィド結合を表す]。
[13] 式Gを有する上記[12]に記載のコンジュゲートと式Hを有する上記[12]に記載のコンジュゲートとを含む混合物。
[14] 前記脂肪酸部分が、前記ペプチドまたはタンパク質のN末端にリンカーを介して付着している、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[15] 10時間を超える、20時間を超える、または30時間を超える血漿安定性半減期を有する、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
[16] コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向上が、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または75倍である、前記のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
[17] 代謝性障害または疾患、すなわち、2型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓病を含める)、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害から選択される疾患または障害を、それを必要とする対象において治療または予防する方法であって、上記[1]から[9]、[11]、[12]、および[14]から[16]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記[10]または[13]に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩の治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、方法。
[18] GDF15突然変異体が、MH(199−308)hGDF15、MHA(200−308)hGDF15、AHA(200−308)hGDF15、AH(199−308)GDF15、MHHHHHHM−hGDF15、およびMHHHHHH−hGDF15、またはこれらの二量体から選択される、上記[17]に記載の方法。
[19] 医薬として使用するための、上記[1]から[9]、[11]、[12]、および[14]から[16]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記[10]または[13]に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[20] 代謝性障害または疾患、糖尿病、2型真性糖尿病、肥満、膵炎、異脂肪血症、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患/脂肪性肝炎、および他の進行性肝疾患、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック症候群、高血圧、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心疾患、糖尿病合併症(限定はしないが慢性腎臓病を含む)、ニューロパシー、胃不全麻痺、ならびに他の代謝性障害の治療または予防において使用するための、前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、上記[1]から[9]、[11]、[12]、および[14]から[16]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記[10]または[13]に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[21] 前記生体分子が、ヒト増殖分化因子15(GDF15)、その相同体、変異体、突然変異体、断片、および他の修飾形態である、治療有効量の、上記[1]から[9]、[11]、[12]、および[14]から[16]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記[10]または[13]に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と、治療活性のある1種または複数の共薬剤とを含む、組合せ。
[22] 前記共薬剤が、抗糖尿病薬、脂質低下薬、抗肥満薬、降圧薬、およびペルオキシソーム増殖因子−活性化因子受容体のアゴニストから選択されたものである、上記[21]に記載の組合せ。
[23] 前記共薬剤が、インスリン、インスリン誘導体および模倣物;インスリン分泌促進物;グリブリド、Amaryl;インスリン分泌性スルホニル尿素受容体リガンド;チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン(netoglitazone)、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン(adaglitazone)、ダルグリタゾン、コレステリルエステル転送タンパク質(CETP)阻害薬、GSK3(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3)阻害薬;RXRリガンド;ナトリウム依存的グルコース共輸送体阻害薬;グリコーゲンホスホリラーゼA阻害薬;ビグアナイド;α−グルコシダーゼ阻害薬、GLP−1(グルカゴン様ペプチド−1)、GLP−1類似体、GLP−1模倣物;DPPIV(ジペプチジルペプチダーゼIV)阻害薬、3−ヒドロキシ−3−メチル−グルタリル補酵素A(HMG−CoA)還元酵素阻害薬;スクアレンシンターゼ阻害薬;FXR(ファルネソイドX受容体)、LXR(肝臓X受容体)リガンド;コレスチラミン;フィブラート;ニコチン酸、アスピリン;オーリスタットまたはリモナバント;ループ利尿薬、フロセミド、トルセミド;アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬;Na−K−ATPアーゼ膜ポンプの阻害薬;中性エンドペプチダーゼ(NEP)阻害薬;ACE/NEP阻害薬;アンジオテンシンIIアンタゴニスト;レニン阻害薬;β−アドレナリン受容体遮断薬;強心薬、ドブタミン、ミルリノン;カルシウムチャネル遮断薬;アルドステロン受容体アンタゴニスト;アルドステロンシンターゼ阻害薬;フェノフィブレート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、BMS−298585、およびL−796449から選択される、上記[22]に記載の組合せ。
[24] 治療有効量の、上記[1]から[9]、[11]、[12]、および[14]から16]のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または上記[10]または[13]に記載のコンジュゲートの混合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される1種または複数の担体とを含む医薬組成物。
[25] 式:
[R 1 は、CO 2 HまたはHであり、
2 およびR 3 は、互いに独立して、H、OH、CO 2 H、−CH=CH 2 、または−C≡CHであり、但し、R 2 およびR 3 は、同一でなく、
4 は、CO 2 Hであり、
nおよびmは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]の化合物、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
[26] R 2 およびR 3 の少なくとも一方がCO 2 Hである式A1の化合物である、上記[25]に記載の化合物。
[27]
からなる群から選択される、上記[25]または[26]に記載の化合物。

Claims (13)

  1. リンカーを介して脂肪酸に連結している生体分子を含み、
    前記生体分子はペプチドまたはポリペプチドであり、
    前記脂肪酸は、次式A1:
    [Rは、COHであり、
    、およびRは、互いに独立して、H、OH、COH、−CH=CH、または−C≡CHであり、
    n、およびmは、互いに独立して、6〜30の間の整数である]を有する、
    コンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  2. 前記脂肪酸が
    [式中、Ak、Ak、Ak、Ak、およびAkは、独立して、線状(C8〜20)アルキレンであり、RおよびRは、独立して、線状(C8〜20)アルキルである]から選択される、請求項1に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  3. 前記脂肪酸が
    から選択される、請求項1または2に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  4. 前記リンカーが、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、1つまたは複数の天然もしくは天然でないアミノ酸、またはこれらの組合せを含み、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコール、および/または天然もしくは天然でないアミノ酸はそれぞれ、場合により互いに合体および連結しており、または前記生体分子および/もしくは前記脂肪酸部分に、−C(O)O−、−OC(O)−、−NHC(O)−、−C(O)NH−、−O−、−NH−、−S−、−C(O)−、−OC(O)NH−、−NHC(O)−O−、=NH−O−、=NH−NH−、もしくは=NH−N(アルキル)−から選択される化学基を介して連結している、請求項1、2、または3に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  5. 前記リンカーが、式:
    [式中、yは、0〜34である]の非分枝状オリゴエチレングリコール部分を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  6. 前記リンカーが、次式の1つのヘテロ環部分:
    [式中、rは、0〜2の整数であり、sは、0〜3の整数である]を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  7. 前記リンカーが、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから独立して選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  8. 前記脂肪酸部分が、前記ペプチドまたはポリペプチドのN末端にリンカーを介して付着している、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  9. 前記生体分子が、)APJアゴニストペプチド、)オキシトシン受容体アゴニストペプチド、)セレラキシン、)NPFF、)PIPペプチド、)FGF23ペプチド、および)AgRPペプチドから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  10. 10時間を超える、20時間を超える、または30時間を超える血漿安定性半減期を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  11. コンジュゲートしていない生体分子と比べた血漿安定性の向上が、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または75倍である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩。
  12. 治療有効量の、請求項1〜11のいずれか一項に記載のコンジュゲート、またはそのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される1種または複数の担体とを含む医薬組成物。
  13. 以下:

    から選択される化合物。
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