KR20100029272A - 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

처리된 리포애스퍼레이트 조직에 존재하는 세포가 환자의 치료에 사용된다; 환자의 치료 방법은 지방 조직으로부터 수득된 농축된 양의 줄기 세포를 환자에게 전달하도록 지방 조직을 처리하는 단계를 포함한다. 이 방법은 줄기 세포가 환자에게 투여되기 전에 외부 환경에 노출되지 않도록 밀폐 시스템 중에서 실시될 수 있다. 환자에게 투여되는 조성물은 조성물이, 지방 조직이 환자로부터 수거될 때보다 높은 농도의 줄기 세포를 갖도록 지방 조직 및 줄기 세포의 혼합물을 포함한다.

Description

처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법{Systems and Methods for treating Patients with Processed Lipoaspirate Cells}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 "Bedside Device, System 및 Use of Processed Lipoaspirate Cells 및 Adipoderived Stem Cells" 명칭 하에 2001년 12월 7일 출원된 미국 가출원 제60/338,856호의 이익을 청구하는 것이고, 그 전체 내용을 본원에서 참고로 인용한다.

1. 기술 분야

본 발명은 일반적으로 지방 조직으로부터 유래된 세포에 관한 것이고, 더욱 구체적으로는 아디포-유래의 줄기 세포, 아디포-유래의 줄기 세포를 사용하는 방법, 아디포-유래의 줄기 세포를 포함하는 조성물 및 아디포-유래의 줄기 세포를 제조하고 사용하는 시스템에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

재생 의학은 신체의 재생 메카니즘을 임상적으로 표적화된 방식으로, 즉 통상의 치료 메카니즘의 일부가 아닌 방식 또는 통상의 메카니즘을 인위적으로 증폭시킴으로써 재생 메카니즘을 이용하는 것으로 정의할 수 있다. 이 방법의 한가지 전통적인 예로는, 제공자로부터 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하여 정상적인 조혈 재생 메카니즘이 수거되거나 실질적으로 없어지거나 손상된 수여자에게 이식함으로써, 수여자의 혈액 생성 능력을 회복시키거나 재생시키는 골수 이식법에 있다(Thomas 1994). 최근의 임상 및 전임상 연구에서, 이러한 방식이 골(Connolly 1998; Horwitz, Prockop et. 1999; Horwitz, Prockop et al. 2001), 심장(Fukuda 2001; Orlic, Kajstura et al.2001; Orlic, Kajstura etal. 2001; Strauer, Brehm et al. 2002) 및 간장(Avital, Inderbitzin et al. 2001)을 비롯한 조직을 재생(또는 재생을 시도)하는 연구와 함께 골수의 비조혈 줄기 세포 성분으로 확대되어 왔다. 이들 연구는 골수에서 비조혈 줄기 세포 및 내피 전구체 세포의 존재 검출에 바탕을 두어 왔다(Prockop, Azizi et al. 2000) (Pittenger, Mackay et al. 1999) (Shi, Rafii et al. 1998; Carmeliet 및 Luttun 2001).

이들 연구는 제공자 및 숙주 세포가 유전자 마커에 의해 구별될 수 있는 골수 이식의 수여 동물을 사용하여 수여자에서 새로운 혈관 생성의 일부 분획물이 제공자의 골수 세포로부터 유래되었음을 보여주었다(Carmeliet 및 Luttun 2001)(Takahashi, Kalka et al. 1999; Murayama, Tepper et al. 2002). 이 연구는 골수가 상기 세포를 함유하고 있음을 명확하게 증명하고 있는 한편, 그에 따라 연구자가 순환 중인 내피 전구체 세포(EPCs) 또는 골수 줄기 세포(MSCs)를 검출하는 경우 이들 세포가 반드시 골수로부터 유래된 것이라고 자동적으로 가정할 정도로 골수가 해당 수의 그러한 세포를 포함하는 유일한 조직을 의미하는 것으로까지 일반적으로 확대된다. 따라서, 다른 조직으로부터의 세포 집단이 대안적인 또는 아마도 더 우수한 치료 관련 세포 집단의 공급원이 될 수 있다는 개념은 다루어지고 있지 않다.

지방 조직이 다기능 줄기 세포 집단을 함유하고 있다는 것이 증명되었다.(Huang, Beanes et al. 2002; Mizuno, Zuk et al. 2002)(Zuk, Zhu et al. 2001). 주크 등(Zuk et al., (출판중) Human Adipose Tissue Is A source Of Multipotent Stem Cells, Molecular Biology of the Cell) 및 다른 사람들은 이 조직이 내피 세포의 원천이라는 것을 이미 밝혔다(Kem, Knedler et al. 1983; Hutley, Herington et al. 2001)(미국특허 제5,372,945호 Alchas et al, 1994] (단, 후자의 문헌은 내피 전구체 세포를 연구하지 않고 그에 대해 어떤 식으로든지 언급하고 있지 않음).

줄기 세포는 신체내 마스터 세포이다. 배아로부터의 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포(ESC)는 전부는 아니지만 상당수의 인체의 모든 타입의 세포 및 조직이 되는 것으로 알려졌다. 이들 초기 배아 세포는 개체의 모든 유전자 정보를 포함하고 있을 뿐만 아니라, 신체의 200+ 세포 및 조직 중 어느 것이라도 될 수 있는 발생 능력을 갖는다. 현재의 연구는 이들 세포가 중대한 과학적 및 임상적 잠재력을 갖는다는 것을 시사하고 있다.

그러나, ESC는 그 사용에 있어 이론적 한계가 있다. 임상적으로 사용되는 경우, ESC는 반드시 다른 개체의 배아로부터 얻어야 한다. 배아로부터 유래된 줄기 세포 또는 조직을 다른 사람에게 이식할 경우, 거부 반응을 피하기 위해 세포 수여자에게 독성의 면역 억제 약물이 필요할 수 있다. 또한, 다른 개체의 세포는 수여자에게 감염될 수 있는 바이러스 또는 다른 휘귀하지만 중요한 질환을 나를 수 있다. 또한, ESC-유사 세포(예, 기형종)은 종양을 형성하는 것으로 알려져 있다.

최근에, 비배아 또는 성체 줄기 세포가 확인되었고 ESC의 임상적 용도에 대한 중요한 잠재 대체물로 기술되고 있다. 이들 세포는 전부는 아니지만 많은 조직에서 아마도 종양 또는 다른 파괴적 질환 과정에 반응하여 손상된 조직을 치료할 수 있는 것을 기다리면서 비활성적으로 존재한다. 현재 과학적 증거는, 각 개체가 전부는 아니지만 많은 종류의 세포 및 조직이 되려는 능력을 ESC와 공유할 수 있는 줄기 세포의 풀(pool)을 갖는다는 것을 보여준다.

성체 줄기 세포 집단은 1 이상의 피부, 근육, 골수, 간장, 뇌 및 지방 조직에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 현재까지, 조직의 조작에서 그러한 세포의 제안된 적용에는 세포 순도 및 세포 배양의 과정에 의해 세포수, 순도 및 성숙도를 증가시키는 것을 포함한다. 이들 단계는 대부분의 조직에서 희소적인 줄기 세포를 보충해 주는 것이 필수적이다. 예를 들어, 골수에서 중간엽 줄기 세포의 빈도수는 100,000분의 1과 1 백만 유핵 세포 중의 1 사이에서 측정된다. 유사하게, 피부로부터 줄기 세포의 추출은 수 주간에 걸친 일련의 복잡한 세포 배양을 포함한다. 심장 질환의 임상 시험에서 골격 근육 유래된 줄기 세포를 사용할 때, 2 및 3주간의 배양 단계를 사용함으로써, 세포 수가 임상적으로 상응하는 수로 증가하고 근육으로의 세포 분화가 촉진된다.

이들 증식 및 분화 단계는 증가된 세포 수, 순도 및 성숙도를 제공할 수 있지만, 비용도 또한 증가시킨다. 이 비용에는 세포 숙성에 따른 세포 기능 손실, 잠재적으로 유용한 비줄기 세포 개체의 손실, 환자에게 세포의 잠재적 적용의 지연, 증가된 금전적 비용 및 배양 중 주위 미생물에 의한 세포 오염의 증가된 위험이 포함된다. 조작되는 대신에 본질적으로 모든 골수로 사용된 골수 유래의 세포에 대한 인간 데이타가 현재 입수가능하지만(Horwitz, Prockop et al. 1999; Horwitz, Prockop et al. 2001)(Strauer, Brehm et al. 2002), 유도된 임상적 이점은 차선적이고, 성과는 거의 확실히 골수로부터 입수가능한 제한적인 세포 용량 및 순도와 관련된다.

상당수의 장치가 지방 조직으로부터 세포를 수집하기 위해 개발되어 왔지만, 이들 장치는 지방 조직의 수거를 위한 흡출 장치를 최적으로 수용하지 못한다는 점, 지방 조직 상의 수집에서 조직 상의 처리까지 부분 또는 완전 자동화의 부족, 100ml의 지방 조직 보다 큰 부피 용적의 결핍, 지방 조직의 수집으로부터 조직 상의 처리까지 부분 또는 완전 밀폐 시스템의 결핍 및 한 시료로부터의 물질이 다른 시료를 상호 오염시키는 부수적인 위험을 감소시키는 성분의 취급성의 결핍 중 1 이상의 단점을 가질 수 있다.

증가된 수율, 농도 및(또는) 순도를 갖는 활성 세포의 개체를 신속하고 신뢰성있게 제조할 수 있고, 그에 따라 세포의 추출후 조작의 필요성을 감소시키거나 수거할 수 있는 대안적인 방식에 대한 필요성이 있다. 이상적으로, 이 세포 개체는 수여자에게 직접 제공하기에 적합한 방식으로 수득된다.

발명의 요약

본 발명은 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 촉진하거나 발생시키거나 유지하기에 필수적인 첨가제와 함께 수여자에게 직접 제공되는, 지방 조직으로부터 유도된 세포를 사용하기 위한 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 지방 조직 처리는 밀폐된 무균성 유체/조직 경로를 유지하는 시스템에서 일어난다. 이는 예비조립되고 연결된 세트의 밀폐된 무균성 용기 및 밀폐된 경로 내에서 조직 및 유체 성분의 전달을 가능케하는 튜브의 사용에 의해 달성된다. 이 공정 세트는 시약의 첨가, 온도 및 처리 시간을 조절함으로써 조작자가 공정을 수동으로 다룰 필요성을 경감시킬 수 있는 장치에 도입된 일련의 처리 시약(예, 염수, 효소 등)과 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조직 추출에서 처리 및 수여자에게의 투여는 동일한 설비, 실제 그 과정을 받는 환자의 동일한 방에서 모두 수행될 것이다.

본 발명의 일면에 따르면, 원료 지방 조직은 성숙한 지방세포 및 연결 조직을 실질적으로 수거하고, 그에 따라 수요자의 신체 내에 배치하기 적합한 균일한 다수의 지방 조직 유도된 세포를 얻도록 처리된다. 세포는 다른 세포, 조직, 조직 단편 또는 다른 세포 성장 및(또는) 분화의 촉진자와 함께 수요자에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기한 임의의 첨가제와 함께 세포는 수여자에 대한 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 얻을 목적으로 단일의 작동 절차의 측면에서 그들이 얻어진 사람에게 투여된다.

한 실시양태에서, 환자를 치료하는 방법은 a) 조직 수거 시스템을 제공하는 단계, b) 조직 수거 시스템을 사용하여 환자에게서 어떤 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수거하는 단계, c) 적어도 파엣(paet)의 지방 조직을 처리해 처리 전의 지방 조직의 줄기 세포의 농도와 다른 줄기 세포의 농도를 수득하는 단계 및 d) 환자에게 투여되기 전에 조직 수거 시스템으로부터 줄기 세포를 수거하지 않고 줄기 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 실시양태에서, 환자를 치료하는 방법은 a) 조직 수거 시스템을 제공하는 단계, b) 조직 수거 시스템을 사용하여 환자에게서 어떤 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수거하는 단계, c) 지방 조직을 처리하여 지방 조직에서 줄기 세포의 농도를 증가시키는 단계 및 d) 농축된 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 다른 단일량(uniportion)의 지방 조직과 혼합하는 단계 및 e) 증가된 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 본 발명에 따른 시스템은 i) 환자에게서 수거된 지방 조직을 수용하도록 구성된 조직 수집 입구부 및 ii) 용기 내에 배치되어 환자에게서 수거된 지방 조직을 보유하고 환자에게서 수거된 비지방 조직을 통과시키도록 구성된 필터를 포함하는 조직 수집 용기(a), 조직 수거 시스템으로부터 줄기 세포를 수거함이 없이 지방 조직으로부터 얻어진 줄기 세포를 수용하는 조직 수집 용기와 결합되어, 1종 이상의 첨가제를 투여하여 함유된 줄기 세포와 혼합하는 첨가제 투입부를 포함하는 혼합 용기(b) 및 혼합 용기 중의 세포가 환자에게 투여 중 조직 수집 시스템으로부터 수거되도록 구성된 출구(c)를 포함한다.

본 발명의 조성물은 소정 농도의 줄기 세포를 갖는 환자에게서 수거된 지방 조직의 제1 부분 및 지방 조직의 제 1 부분보다 큰 줄기 세포의 농도를 갖는 환자에게서 수거된 지방 조직의 제2 부분을 포함한다.

본원에 기술된 특징들의 임의의 특징 또는 조합은, 임의의 조합에 포함된 특징들이 문맥, 본 명세서 및 당업자의 지식에서 자명한 바와 같이 상호 모순되지 않는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 추가의 이점 및 측면은 아래 상세한 설명으로부터 명확하다.

본 발명의 바람직한 실시양태의 상세 설명

이제, 본 발명의 현재 바람직한 실시양태를 상세히 참조할 것이다. 본 발명의 예가 첨부된 도면에 예시되어 있다. 가능하다면, 동일하거나 유사한 부분을 나타내기 위해 동일하거나 유사한 부호를 도면 및 설명 부분에서 사용된다. 도면은 단순화된 형태이고 정밀한 축척이 아니다. 본원의 개시 내용을 참조하여, 오직 편의 및 명료함을 위해서, 상부, 바닥, 좌측, 우측, 상향, 하향, 위쪽, 보다 위에, 밑에, 보다 아래에, 배면 및 정면과 같은 방향에 관한 용어를 첨부된 도면과 관련하여 사용된다. 그러한 방향에 관한 용어는 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

본원의 개시 내용은 어떤 예시된 실시양태에 관한 것이지만, 이들 실시양태은 예시적으로 제시된 것이지 제한적으로 사용된 것이 아님을 이해하여야 한다. 아래 상세한 설명은 대표적 실시양태를 논한 것이지만, 첨부된 특허청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범위에 들어올 수 있는 실시양태의 모든 변형 형태, 대체물 및 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용된 다양한 세포 또는 조직 분리 기술과 함께 실시될 수 있고, 통상적으로 실시되는 처리 단계가 본 발명을 이해하는데 필요한 만큼만 본원에 포함된다.

본 발명은 지방 조직에 존재하는 세포 집단 및 세포 집단을 인간 또는 동물 환자에게 투여하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 지방 조직의 세포 집단은 치료적 및 미용적 목적으로 세포의 공급원으로 사용될 수 있다. 특히, 세포는 재생 세포로 치료될 수 있는 질환과 같이 재생 의약으로 사용될 수 있다. 일단의 세포는 다른 지방세포 또는 결합 조직 없이 환자에게 투여될 수 있거나, 본원에서 농의한 바와 같이 농축된 양으로 지방 조직과 함께 혼합되어 투여될 수 있다.

지방 조직은 본질적으로 줄기 세포가 풍부한 공급원이다. 이 발견은 적어도 부분적으로는 지방조직의 주요 비줄기 세포 성분(지방세포; adipocyte)의 수거의 용이성때문일 수 있다. 따라서, 인간 및 동물 연구에서, 처리된 리포애스퍼레이트(PLA)는 0.1% 이상, 더욱 전형적으로는 0.5%보다 큰 빈도수로 조직 세포를 함유한다. 본 발명의 어떤 실시양태에서, 약 2 내지 12%의 줄기 세포를 함유하는 PLA가 얻어졌다. 추가의 실시양태에서, PLA를 처리하여 줄기 세포가 집단에서 100% 까지의 세포를 구성하는 세포의 집단을 얻는다. 본원에서 본 발명에 따라 얻어진 줄기 세포의 양은 골수 중에서 100,000분의 1(0.001%)의 공개된 빈도수보다 실질적으로 크다(Castro-Malaspina, Ebell et al. 1984)(Muschler, Nitto et al. 2001). 나아가, 지방 조직의 수집은 유사한 부피의 골수의 수집보다 더 낮은 치사율과 관련된다(Nishimori, Yamada et al. 2002). 또한, 지방 조직은 환자에게 치료법을 제공할 수 있는 내피 전구체 세포를 함유한다(예, Masuda, H., C. Kalka, 및 T. Asahara, Endothelial progenitor cells for regeneration. Hum Cell, 2000. 13(4): p. 153-60; Kaushal, S., et al., Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenetor cells expanded ex vivo. Nat Med, 2001. 7(9); p. 1035-40; 및 kawamotom A., et al., Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation, 2001. 103(5): p. 634-7).

본원에서, "지방 조직"은 지방세포 및 미세혈관 세포를 비롯해 다중 세포형을 포함하는 조직을 말한다. 지방 조직에는 줄기 세포 및 내피 전구체 세포가 포함된다. 따라서, 지방 조직은 지방을 저장하는 연결 조직을 포함하는 지방을 가리킨다.

본원에서 "지방 조직 단위"는 지방 조직의 분리되거나 또는 측정가능한 양을 말한다. 지방 조직의 단위는 단위의 중량 및(또는) 부피를 결정하여 측정할 수 있다. 상기에서 확인된 데이타에 기초해, 환자에게서 수거된 것과 같은 처리된 리포애스퍼레이트의 단위는 0.1% 이상의 세포 성분이 줄기 세포인 세포 성분을 갖는다. 본원의 개시 내용에서, 지방 조직의 단위는 환자에게서 수거된 지방 조직의 전체 양을 의미하거나, 환자에게서 수거된 지방 조직의 전체 양보다 적은 양을 의미할 수 있다. 따라서, 지방 조직의 단위는 다른 단위의 지방 조직과 병합되어 개개 단위의 합인 중량 또는 부피를 갖는 지방 조직의 단위를 형성할 수 있다.

본원에서, "부분"은 전체보다 적은 물질 양을 말한다. 작은 부분은 50% 미만의 양을 말하고, 큰 부분은 50%보다 큰 양을 말한다. 따라서, 환자에게서 수거된 지방 조직의 전체 양보다 적은 지방 조직 단위는 수거된 지방 조직의 부분이다.

본원에서 "줄기 세포"는 2 이상의 특정 기능을 갖고 자체 재생성을 갖는 각종 다른 세포형으로 분화하는 잠재력를 갖는 다기능(multipotent) 세포를 말한다. 본원에서 개시된 줄기 세포의 일부는 다기능(pluripotent)일 수 있다.

본원에서 "처리된 애스퍼레이트(PLA)"란 성체 지방세포 및 연결 조직으로부터 활성 세포 성분(예, 줄기 세포를 포함하는 성분)을 분리하도록 처리된 지방 조직을 말한다. 전형적으로, PLA는 지방 조직으로부터 세포를 씻고 분리시켜 수득한 펠렛의 세포를 말한다. 상기 펠렛은 세포가 원심분리 용기의 바닥에서 응집되도록 세포 현탁액을 원심분리하여 수득하는 것이 전형적이다.

본발명의 방법을 실시함에 있어, 환자에게 투여된 세포는 지방 조직으로부터 얻어진다. 지방 조직은 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 지방 조직은 흡입 보조 지방흡입술, 초음파 보조 지방흡입술 및 절개 지방조직제거술에 의해 환자로부터 수거될 수 있다. 또한, 상기 절체에는 절개 지방조직제거술과 흡입 보조 지방흡입술의 조화과 같이 위 절차들의 조합이 포함된다. 조직 또는 그의 일부 단편은 환자에게 재이식될 것으로 의도될 때, 지방 조직은 세포 성분의 생존률을 보전하고 잠재적인 감염성 미생물(예, 박테리아 및(또는) 바이러스)에 의한 조직의 오염의 가능성을 최소화하는 방식으로 수집되어야 한다. 따라서, 조직 추출은 오염을 최소화하기 위해 무균성 또는 살균성 방식으로 수행되어야 한다. 흡입 보조 지방흡입술이 지방 조직을 수거하는데 바람직할 수 있는데, 다른 기술(예, 초음파 보조 지방흡입술)과 관련될 수 있는 줄기 세포 손상에 대한 최소한의 가능성으로 조직을 수집하는 최소한의 해로운 방법을 제공하기 때문이다.

흡입 보조 지방흡입술의 경우, 지방 조직은 환자에게서 존재하는 지방 조직 저장소에 또는 그 근처에 캐뉼러의 삽입 후에 흡인 장치에 지방의 흡출에 의해 수집된다. 한 실시양태에서, 작은 캐뉼러가 시린지에 결합될 수 있고 지방 조직이 수동 힘을 사용해 흡출될 수 있다. 시린지 또는 다른 유사한 장치는 사용이 비교적 적당한 양의 지방 조직(예, 0.1 ml 내지 수백 밀리리터의 지방 조직)을 수집하는 데 바람직할 수 있다. 이들 비교적 작은 장치를 사용하는 절차는, 절차가 일반적인 마취와 반대로 오직 국부 마취로 수행될 수 있다는 장점이 있다. 이 범위를 넘는(예, 수백 밀리리터보다 큰) 더 큰 부피의 지방 조직은 제공자 및 수집 절차를 수행하는 사람의 판단에 의해 일반적인 마취를 필요로 할 수 있다. 더 큰 부피의 지방 조직의 수거가 바람직한 경우, 비교적 더 큰 캐뉼러 및 자동화 흡인 장치를 이 절차에서 사용할 수 있다.

절개 지방조직 수거술 절차에는, 조직(예, 피부)를 함유하는 지방 조직을 절차의 부수적인 부분으로 수거되는 절차, 즉 수술의 1차 목적이 조직(예, 비만 또는 미용 수술에서의 피부)의 수거가고 지방 조직이 1차 목표의 조직과 함께 수거되는 경우가 포함된다(단, 위 절차에 한정되는 것은 아님).

환자에게서 수거되는 지방 조직은 추가의 처리를 위해 장치로 수집된다. 본원에서 논의하는 바와 같이, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 장치는 줄기 세포 및(또는) 내피 전구체 세포를 포함하는 처리된 지방 조직 세포 집단의 제조를 위한 조직을 수집할 목적으로 고안되고 사용된다. 다른 실시양태에서, 상기 장치는 추출 절차를 수행하는 의사에 의해 조직 수집을 위해 전형적으로 사용된 임의의 통상의 장치일 수 있다.

수집된 조직의 양은 공여자의 체중, 접근 가능한 지방 조직 수집 부위의 입수가능성, 수반되는 및 기존의 투약 및 상태 (예를 들면 항응고제 치료), 및 수집된 조직의 임상적 목적을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 다수의 변수에 좌우될 것이다. 조혈성 줄기 세포 (수용자의 혈액 세포-생성 능력을 재생시키는데 사용되는 골수 또는 제대혈-유래의 줄기 세포)의 이식 경험은 생착 (engraftment)이 역치 효과를 갖는 세포 용량-의존적이라는 것을 나타낸다. 그러므로, 다른 변수에 의하여 정해진 한계 내에서 "많을수록 좋다"가 적용될 것이며, 채취가 가능한 경우 가능한 많은 조직을 수집할 것이 일반 원칙일 것이다.

마른 개체에서 추출한 지방 조직의 100 ml의 줄기 세포 백분율이 비만 공여자에서 추출한 것보다 많다는 것이 발견되었다 (표 1). 이는 비만 개체의 증가한 지방 함량의 희석 효과를 반영한다. 그러므로, 본 발명의 한 면에 따라서, 보다 마른 환자에서 꺼내질 양에 비하여 과체중 공여자로부터 많은 양의 조직을 수득하는 것이 바람직할 것이다. 이 관찰은 또한 본 발명의 유용성이 보다 많은 양의 지방 조직을 갖는 개체에 제한되지 않는다는 것을 나타낸다.

체중 지수의 조직 및 세포 수율 상의 영향

체중 지수 상태	얻어진 조직의 양 (g)	총 세포 수율
보통	641±142	2.1±0.4
비만	1,225±173	2.4±0.5
p 값	0.03	0.6

본원의 개시에 따라서 치료를 받는 환자는 지방 조직 또는 지방 조직에서 유래한 줄기 세포를 사용하는 다른 치료와 상이한 농도의 줄기 세포를 받게 된다. 그러므로, 환자에서 수거된 지방 조직은 환자에게 투여되는 줄기 세포의 농도를 변화시키도록 처리된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 환자는 지방 조직 이식및 다른 유사한 줄기 세포 기초 치료에 통상적으로 존재하는 줄기 세포의 농도보다 고농도의 줄기 세포를 받는다. 농축된 줄기 세포는 지방-유래의 줄기 세포 및(또는) 실질적으로 성숙한 지방 세포 및 결합 조직이 없는 내피 전구체 세포를 포함하는 조성물로 투여될 수 있거나, 다른 예로서, 농축된 줄기 세포는 증가한 양의 줄기 세포를 갖는 한 단위의 지방 조직을 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 처리되지 않은 지방 조직의 균등한 단위에서 발견되는 줄기 세포의 농도보다 높은 농도의 줄기 세포를 포함한다. 어떤 실시양태에서, 조성물은 0.1 % 이상의 세포가 줄기 세포인 세포 성분을 갖는다. 다른 실시양태에서, 조성물은 줄기 세포가 세포 성분의 약 2 % 및 12 % 사이로 이루어진 세포 성분을 갖는다. 100 % 이하와 같은 보다 높은 농도의 줄기 세포는 상이한 조성물에 또한 포함된다. 본 조성물은 본원에서 논의한 바와 같이 추가의 성분, 예를 들어 세포 분화 인자, 성장 촉진제, 면역 억제제 또는 의료 장치를 포함할 수 있다. 조성물이 주로 한 유형의 세포 (예를 들어, 지방-유래의 줄기 세포 또는 지방-유래의 내피 전구체 세포)를 함유하는 임의의 조성물을 얻기 위하여, 줄기 세포 또는 내피 전구체 세포에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포-특이적 항체를 사용하는 것과 같이 다른 세포 유형을 분리하는 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.

대부분의 적용을 위하여, 활성 세포 집단의 제조는 지방 조직의 성숙 지방을 많이 갖는 지방 세포 성분을 수거하는 것이 요구될 것이다. 이는 통상적으로, 조직을 우선 유리 지방 (파열된 지방 세포에서 유리됨) 및 말초 혈액 요소 (조직 채취 중에 절단된 혈관에서 유리됨)의 존재를 감소시키기 위하여 헹구고, 그후 결합 조직 매트릭스로부터 유리 무손상 지방 세포 및 다른 세포 집단으로 탈응집(disaggregation)시키는 일련의 세척 및 탈응집 단계에 의하여 달성된다. 임의의 실시양태에서, 전체 지방 세포 성분 또는 비-줄기 세포 성분은 지방 조직의 줄기 세포 성분으로부터 분리된다. 다른 실시양태에서, 지방 세포 성분의 한부분 또는 부분들 만이 줄기 세포로부터 분리된다. 그러므로, 임의의 실시양태에서, 줄기 세포는 내피 전구체 세포와 투여될 수 있다.

헹굼은 조직을 유리 지방 및 혈액의 성분인 단일 세포 성분을 씻어내기 위하여 용액과 혼합하고, 무손상 지방 조직 단편을 남기는 임의적이나 바람직한 단계이다. 한 실시양태에서, 환자로부터 수거된 지방 조직은 등장성 식염수 또는 다른 생리학적 용액 (예를 들어, 애보트 랩스 (Abbott Labs)의 박스터 인코포레이티드 (Baxter Inc) 또는 노르모소 (Normoso) (등록상표)의 플라스마라이트 (Plasmalyte)(등록상표))과 혼합한다. 무손상 지방 조직 단편은 유리 지방 및 세포로부터 여과, 경사법, 침전 및 원심분리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의하여 분리될 수 있다. 본 발명의 예시된 실시양태에서, 본원에서 논의된 바와 같이, 지방 조직은 조직 수집 용기 내에 위치한 필터를 사용하여 비-지방 조직으로부터 분리된다. 다른 실시양태에서, 지방 조직은 경사법, 침전 및(또는) 원심분리 기술을 이용하여 물질을 분리하는 조직 수집 용기를 사용하여 비-지방 조직으로부터 분리된다.

그후 무손상 조직 단편은 기계적 힘 (다지기 또는 전단력), 단일 또는 조합의 단백질 분해 효소 (예를 들어 콜라게나제, 트립신, 리파제, 미국 특허 제5,952, 215호에 개시된 리버라제 H1 및 펩신)로 효소적 분해, 또는 기계적 및 효소적 방법의 조합을 포함하는 임의의 통상적인 기술 또는 방법을 사용하여 탈응집된다. 예를 들어, 무손상 조직 단편의 세포 성분은, 미국 특허 제5,372,945호에 개시된 바와 같이 지방 조직의 모세혈관 내피 세포를 수집하는 방법과 유사하게 지방 조직의 콜라게나제-매개된 해리를 이용한 방법에 의하여 탈응집될 수 있다. 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 콜라게나제를 사용하는 추가적인 방법이 미국 특허 제5,830,714호 및 5,952,215호 및 윌리엄 등의 문헌 [Williams, S.K., S. McKenney et al (1995) "Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion." Cell Transplant 4(3): 281-9]에서 개시되었다. 유사하게, 트웬티맨 등의 문헌 [Twentyman, P.R. and J.M. Yuhas (1980) "Use of bacterial neutral protease for disaggregation of mouse tumours and multicellular tumor spheroids." Cancer Lett 9(3): 225-8]에 개시된 바와 같이 중성 프로테아제가 콜라게나제를 대신하여 사용될 수 있다. 더욱이, 러셀 등의 문헌 [Russell, S.W., W.F. Doe, et al. (1976). "Inflammatory cell in solid murine neoplasms. I. Tumor disaggregation and identification of constituent inflammatory cells." Int J Cancer 18(3): 322-30]에서 개시된 바와 같이 콜라게나제 및 트립신의 조합과 같은 효소의 조합을 사용하거나, 엔젤홈 등의 문헌 [Engelholm, S.A., M. Spang-Thomsen, et al. (1985). "Disaggregation of human solid tumours by combined mechanical and enzymatic methods." Br J Cancer 51(1): 93-8]에서 개시된 바와 같이 트립신과 같은 효소 및 기계적 해리의 조합을 사용할 수 있다.

그후 활성 세포 집단 (처리된 리포애스퍼레이트)이 성숙한 지방 세포의 존재를 감소시킴으로써 탈응집된 조직 단편으로부터 얻어질 수 있다. 처리된 리포애스퍼레이트 현탁액 및 지방 조직이 탈응집된 액체는 그후 또다른 용기 (예를 들어, 세포 수집 용기)를 통과한다. 현탁액은 조직 수집 용기로부터 현탁액을 거두어서 세포 수집 용기로 넣는 연동 펌프와 같은 펌프를 사용하여 1 개 이상의 도관을 통하여 세포 수집 용기로 흐를 수 있다. 다른 실시양태는 밀폐 시스템을 유지하면서 중력 또는 진공을 사용할 수 있다. 현탁액 중의 세포의 분리는 부력 밀도 침전, 원심 분리, 세광, 고체 상 부분에의 차별 부착 및 고체 상 부분으로부터의 용출, 항체-매개 선별, 전하의 차이; 면역자기 비즈, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 또는 다른 수단에 의하여 달성될 수 있다. 이러한 각종 기술 및 본 기술을 수행하기 위한 장치의 예는 헴스트리트 등의 문헌 [Hemstreet, G.P., 3rd, P.G. Enoch, et al. (1980) "Tissue disaggregation of human renal cell carcinoma with further isopyknic and isokinetic gradient purification." Cancer Res 40 (4): 1043-9]; 슈바이쳐 등의 문헌 [Schweitzer, C.M., van, et al. (1995). "Isolation and culture of human bone marrow endothelial cells." Exp Hematol 23(1): 41-8]; 그린 등의 문헌 [Gryn, J., R.K. Shadduck, et al. (2002). "Factors affecting purification of CD34(+) peripheral blood stem cells using the Baxter Isolex 300i." J Hematother stem cells Res 11(4): 719-30]; 프린스 등의 문헌 [Prince, H.M., J. Bashford, et al. (2002). "Isolex 300i CD34-selected cells to support multiple cycles of high-dose therapy." Cytotherapy 4(2): 137-45]; 와트 등의 문헌 [Watts, M.J., T.C. Somervaille, et al. (2002). "Variable product purity and functional capacity after CD34 selection: a direct comparison of the CliniMACS (v2.1) and Isolex 300i (v2.5) clinical scale devices." Br J Haematol 118(1): 117-23]; 메인워링 등의 문헌 [Mainwaring, G. and A. F. Rowley (1985). "Separation of leucocytes in the dogfish (Scyliorhinus canicula) using density gradient centrifugation and differential adhesion to glass coverslips." Cell Tissue Res 241 (2): 283-90]; 그린버그 등의 문헌 [Greenberg, A. W. and D. A. Hammer (2001). "Cell separation mediated by differential rolling 부착." Biotechnol Bioeng 73 (2) : 111-24]; 및 미국 특허 제6,277,060호; 6,221,315호; 6,043,066호; 6,451,207호; 5,641,622호; 및 6,251,295호에서 발견될 수 있다. 예시된 실시양태에서, 현탁액 중의 세포는 현탁액 중의 비세포 성분으로부터 스핀 막 필터를 사용하여 분리된다. 다른 실시양태에서, 현탁액 중의 세포는 비세포성 성분으로부터 원심분리기를 사용하여 분리된다. 상기 예시적인 실시양태에서, 세포 수집 용기는 원심분리기에 놓여지도록 구성된 (예를 들어, 수동으로 또는 로봇에 의함) 가요성 백일 수 있다. 다른 실시양태에서, 가요성 백은 사용되지 않는다. 본원에서 논의된 바와 같이 원심 분리 후에, 세포 성분은 펠렛을 형성하고, 그후 이는 세포가 하나 이상의 도관을 통과하여 혼합 용기로 갈 수 있도록 완충 용액에 재현탁될 수 있다. 재현탁액 유체는 임의의 적절한 수단에 의하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 완충액은 세포 수집 용기 상의 포트로 주사될 수 있거나, 세포 수집 용기는 여분을 파열함으로써 세포의 펠렛과 혼합될 수 있는 완충액의 여분을 포함할 수 있다. 스핀 막 필터가 사용되는 경우, 세포는 분리 절차 후에 액체의 부피로 남기 때문에 재현탁액은 임의적이다.

본 발명의 임의의 실시양태가 지방 조직을 완전히 탈응집시켜 성숙한 지방 세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포를 분리하는 방법에 관한 것이지만, 본 발명의 추가의 실시양태는 지방 조직을 단지 부분적으로만 탈응집시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 부분적 탈응집은 하나 이상의 효소로 수행될 수 있고, 다른 경우 효소가 완전히 조직을 탈응집시키는데 남겨질 시간의 양에 비교하여 일찍 지방 조직의 적어도 일부로부터 수거된다. 상기 공정은 더 적은 처리 시간을 필요로 한다.

한 특정 실시양태에서, 조직은 무균 완충 등장성 식염수로 세척하고, 적당한 탈응집에 충분한 콜라게나제 농도, 온도 및 시간에서 콜라게나제와 배양하였다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 콜라게나제 효소는 관련 당국 (예를 들어, 미국 식품 의약품 안전청 (U. S. Food and Drug Administration))에 의하여 인간의 사용이 승인될 것이다. 적절한 콜라게나제 제제는 재조합 및 비-재조합 콜라게나제를 포함한다. 비-재조합 콜라게나제는 F. 호프만-라 로슈 Ltd (F. Hoffmann-La Roche Ltd) 인디애나폴리스, 인디애나주 (Indianapolis, IN) 및(또는) 어드밴스 바이오팩쳐 코포레이션 (Advance Biofactures Corp.), 린브룩, 뉴욕주 (Lynbrook, NY.)에서 얻었다. 재조합 콜라게나제는 또한 미국 특허 제6,475,764호에 개시된 바와 같이 얻을 수 있다.

한 실시양태에서, 용액은 약 10 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml 농도의 콜라게나제를 함유하고, 약 30 ℃ 내지 약 38 ℃에서 약 20 분 내지 약 60 분 동안 인큐베이션한다. 이러한 파라미터는, 시스템이 적당한 시간 프레임에서 목적하는 세포 집단을 추출하는데 효율적인 것을 입증하기 위한 경험적 연구에 의하여 최적화된 콜라게나제 효소의 출처에 따라 다양할 것이다. 특히 바람직한 농도, 시간 및 온도는 45 분 동안, 약 37 ℃에서 인큐베이션된 20 ㎍/ml 콜라게나제 (블렌드자임 1, 로슈 (Blendzyme 1, Roche))이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 사용된 콜라게나제 효소는 관련 당국 (예를 들어, 미국 식품 의약품 안전청)에 의하여 인간의 사용이 승인된 물질이다. 사용된 콜라게나제는 미생물 및 오염 물질, 예를 들어 내독소가 없어야 한다.

이하의 활성 세포 집단의 탈응집은 첨가제 및(또는) 탈응집 공정의 부산물 (예를 들어, 콜라게나제 및 새로 유리된 유리 지방)을 수거하기 위하여 세척/헹구어질 수 있다. 그후 활성 세포 집단은 앞서 논의한 바와 같이 원심 분리 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의하여 농축될 수 있다. 이러한 후-처리 세척/농축 단계는 별개로 또는 동시에 적용될 수 있다.

한 실시양태에서, 세포를 농축시키고, 세포 집단을 연속 흐름 스핀 막 시스템 등, 예를 들어 미국 특허 제5,034,135호 및 5,234,608호에 개시된 시스템을 통과시킴으로써 콜라게나제를 수거한다.

전술한 것에 추가로, 활성 세포 집단을 더욱 정제하는데 적용될 수 있는 많은 후-세척 방법이 있다. 이들은 양성 선별 (목적 세포를 선별), 음성 선별 (원하지 않는 세포의 선택적 수거), 또는 그것의 조합을 포함한다.

한 실시양태에서, 처리된 리포애스퍼레이트 내의 세포의 아집단의 차별 부착 및(또는) 용출하게 하기 위하여 선택된 부착 성질을 갖는 고체 상 물질이 세포 세척 단계 후에 시스템으로 끼워진다. 이 일반적 접근은, 차별적으로 백혈구를 포획하는 필터가 오염된 백혈구의 수혈된 적혈구를 수거하기 위하여 사용되는 임상적 혈액 수혈에서 수행된다 (솔리 등의 문헌 [Soli, M., et al., A multicentre evaluation of a new filtration protocol for leucocyte depletion of high-haematocrit red blood cells collected by an automated blood collection system. Vox Sang, 2001. 81 (2): p. 108-12]; 스미스 등의 문헌 [Smith, J.W., Apheresis techniques and cellular immunomodulation. Ther Apher, 1997.1 (3): p. 203-6] 참조). 이 유형의 필터는 팔 베디칼 (Pall Bedical (Leukogard RS and Purecell RCQ)) 및 아사히 (Asahi (RS2000))에 의하여 분배되었다. 차별 부착은 또한 단핵 세포 (버델 등의 문헌 [Berdel, W. E. , et al., Purification of human monocytes by adherence to polymeric fluorocarbon. Characterization of the monocyte-enriched cell fraction. Immunobiology, 1982. 163(5): p. 511- 20] 참조) 및 표피 줄기 세포 (비켄바흐 등의 문헌 [Bickenbach, J. R. and E. Chism, Selection and extended growth of murine epidermal stem cells in culture. Exp Cell Res, 1998. 244(1) : p. 184-95] 참조)의 양성 선별에 적용되었다. 이 실시양태에서, 처리된 리포애스퍼레이트은 흐르면서 목적 세포 및 원하지 않는 세포 집단의 차별적 부착을 촉진하도록 미리-정해진 완충액 조건에서 필터 물질을 통과할 것이다. 양성 선별을 위하여, 필터 물질 및 조건은 원하지 않는 물질이 필터를 자유롭게 통과하고 과량의 완충액으로 씻어내면서, 목적 세포의 선택적 부착을 허용할 것이다. 목적 세포는 유속, pH, 이온 강도 및(또는) 부착에 필요한 양이온의 존재와 같은 조건을 변화시켜서 필터로부터 용출시킬 것이다. 필터 물질은 3-차원 메쉬, 소입자의 충진된 카세트, 중공-섬유 또는 높은 표면적을 갖는 다른 기전의 형태일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이 필터 장치는 도 1에 나타난 일회용 세트의 완전한 부분이고 도 4에 나타난 장치로 끼워질 것이다. 세트 및 장치는 둘다 특정 도면에 나타난 예에서; 도 1에서 필터 및 하우징을 포함하기 위하여 및 도 4에서 밀폐, 무균 액체 경로의 유지에 필요한 필터 하우징 및 튜브 (밸브 포함)를 끼워 넣기 위하여 약간 변형될 것이다. 다르게는 혼합 챔버 (도 4의 성분 108; 도 1의 성분 30)는 장치 설비 및 필터/하우징 각각에 의하여 대체될 수 있다.

이 차별 부착 접근의 대안의 실시양태는 목적 및 원하지 않는 세포에 차별적으로 발현된 표면 분자를 인식하는 항체 및(또는) 항체의 조합을 사용하는 것을 포함한다. 특정 세포 표면 표지 (또는 그것의 조합)의 발현에 기초한 선별은, 고체 상 지지 구조에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착하는 항체의 또다른 일반적으로 적용되는 기술이다 (게이셀하트 등의 문헌 [Geiselhart, A., et al., Positive selection of CD56+ lymphocytes by magnetic cell sorting. Nat Immun, 1996. 15 (5): p.227-33]; 포마네크 등의 문헌 [Formanek, M., et al., Magnetic cell separation for purification of human oral keratinocytes: an effective method for functional studies without prior cell subcultivation. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1998. 255 (4): p. 211-5]; 그래플러 등의 문헌 [Graepler, F., U. Lauer, and M. Gregor, Magnetic cell sorting for parietal cell purification using a new monoclonal antibody without influence on cell function. J Biochem Biophys Methods, 1998. 36 (2-3): p.143-55]; 코바리 등의 문헌 [Kobari, L., et al., CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J Hematother Stem Cell Res, 2001. 10(2): p.273-81]; 모르 등의 문헌 [Mohr, M., et al., Simultaneous immunomagnetic CD34+ cell selection and B-cell depletion in peripheral blood progenitor cell samples of patients suffering from B-cell non-Hodgkin's lymphoma. Clin Cancer Res, 2001. 7(1): p. 51-7]; 및 푸흐 등의 문헌 [Pugh, R. E., et al., CD19 selection improves the sensitivity of B cell lymphom detection. J Hematother, 1998. 7(2): p.159-68] 참조). 이 접근은 양성 선별 및 음성 선별 둘다에서 명백한 적용인데, 예를 들어 잔여 백혈구는 CD45 항체를 사용하여 수거될 수 있다. 유사하게, 레이 (Reyes)등은 인간 골수로부터 다기능 성체 조상 세포 (multipotential adult progenitor cell)를 선별하는 항체의 복합 블렌드를 적용하였다 (레이 등의 문헌 [Reyes, M., et al., Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cell. Blood, 2001. 98(9): p. 2615-25] 참조). 예를 들면, 지방 세포에 특이적으로 결합하는 AP2와 같은 항체 (조이너 등의 문헌 [Joyner, C. J. , et al., Development of a monoclonal antibody to the aP2 protein to identify adipocyte precursors in tumours of adipose differentiation. Pathol Res Pract, 1999. 195 (7): p.461-6] 참조)는 잔여 지방 세포 (미성숙 지방세포 및 지방모세포 포함)를 선택적으로 수거하는데 사용될 수 있다. 양성 선별은 목적 세포 집단에 특이적인 항체를 사용하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 퀴리시 (Quirici) 등은 신경 성장 인자 수용체 (Nerve Growth Factor Receptor)에 항체를 사용하여 골수-유래의 중간엽 줄기 세포를 풍부하게 하였다 (퀴리시 등의 문헌 [Quirici, N., et al., Isolation of bone marrow mesenchymal stem cell by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Exp Hematol, 2002. 30 (7): p.783-91] 참조).

항체-기초의 접근의 한 실시양태에서, 항체 (예를 들어, AP2) 또는 항체의 칵테일 (예를 들어, AP2, CD3, CD19, CD11b)는 처리된 리포애스퍼레이트에 첨가될 것이다. 많은 다른 항체 및 항체 조합은 당업자에 의하여 인식될 것이고 실시예의 방법으로만 제공된다. 인큐베이션 후, 이러한 항체가 그들의 동족 항원에 적절한 결합을 하도록 미리-정해진 상태 하에서, 세포는 스핀 막 필터 또는 세포 세척 챔버의 다른 실시양태를 통과시킴으로써 세척하여 결합되지 않은 과량의 항체를 수거할 것이다. 그후 세포는 앞서 기재한 실시양태와 유사한 고체 상 구조를 통과시키고, 고체 상은 세포 표면에 이제 결합한 1차 항체에 높은 친화도로 부착할 수 있는 2차 항체에 부착한다. 목적 세포, 예를 들어 지방 조직-유래의 줄기 세포는 선택된 항체 (항체 칵테일)에 의하여 인식된 세포 표면 항원의 발현이 없기 때문에 이 필터를 자유롭게 통과할 것이고, 이로써 음성 선별 시스템이 만들어진다. 이 실시양태에서, 일회용 세트 (도 3) 및 장치 (도 4)는 상기 실시양태에 기재된 바와 유사하게 약간의 변형을 하기 쉽다.

항체-매개 양성 선별 실시양태는 세포를 고체 상 지지체으로부터의 박리를 촉진시키는 제3 첨가제를 포함하여 유사한 방식으로 달성될 수 있다. 이 실시양태에서, 효소 파파인 또는 키모파파인은 항체 분자를 절단하고 고체 상 지지체로부터 세포를 유리시키기 위하여 첨가될 수 있다 (시빈 등의 문헌 [Civin, C.I., et al.,Positive stem cell selection--basic science. Prog Clin Biol Res, 1990. 333(387): p.387-401; discussion 402] 참조). 또다른 대안은 미국 특허 제6,017,719호에 승-라우 (Tseng-Law) 등에 의하여 기재된 바와 같이, 항체에 결합하는 세포 표면 항원과 경쟁하는 특정 펩티드를 사용하는 것일 것이다.

또다른 실시양태에서 세포 펠렛을 재현탁하고, 연속 또는 불연속 밀도로 형성되는 액체 물질 위에 (또는 아래에) 깔고, 세포 밀도에 기초하여 세포 집단을 분리하기 위하여 원심분리기에 위치시킬 수 있다. 상기 경사를 형성하는데 적절한 매질의 예는 퍼콜 및 피콜-파크 (퀴안 등의 문헌 [Qian, X., L.Jin, and R. V. Lloyd, Percoll Density Gradient-Enriched Populations of Rat Pituitary Cells: Interleukin 6 Secretion, Proliferative Activity, and Nitric Oxide Synthase Expression. Endocr Pathol, 1998. 9(1): p.339-346]; 스미츠 등의 문헌 [Smits, G., W. Holzgreve, and S. Hahn, An examination of different Percoll density gradients and magnetic activated cell sorting (MACS) for the enrichment of fetal erythroblasts from maternal blood. Arch Gynecol Obstet, 2000. 263 (4): p.160-3] 참조) 또는 피콜-파크 (레너 등의 문헌 [Lehner, M. and W. Holter, Endotoxin-free purification of monocytes for dendritic cell generation via discontinuous density gradient centrifugation based on diluted Ficoll-Paque Plus. Int Arch Allergy Immunol, 2002. 128(1): p.73-6] 참조)를 포함한다. 반 메리스 (Van Merris) 등은 (반 메리스 등의 문헌 [Van Merris, V., et al., Separation of bovine bone marrow into maturation-related myeloid cell fractions. Vet Immunol Immunopathol, 2001.83 (1-2): p.11-7] 참조), 불연속 3-단계 퍼콜 경사를 사용하여 이 기초에서 그들의 성숙 상태에 따라서 소 골수 세포 (bovine bone marrow)를 분리하였다. 이 실시양태는 임의의 잔여 세포 집단 및 미성숙 지방 세포 (전-지방세포)를 세포 집단으로부터 분리해 낼 수 있을 것이다.

유사한 실시양태에서, 성분채집술과 같은 연속 흐름 접근 (스미스 등의 문헌 [Smith, J.W., Apheresis techniques and cellular immunomodulation. Ther Apher, 1997. 1(3): p.203-6] 참조) 및 (반류가 있거나 없는) 세광 (라쉬 등의 문헌 [Lasch, J., G. Kullertz, and J.R. Opalka, Separation of erythrocytes into age-related fractions by density or size? Counterflow centrifugation. Clin Chem Lab Med, 2000.38 (7): p.629-32]; 이토 등의 문헌 [Ito, Y. and K. Shinomiya, A new continuous-flow cell separation method based on cell density: principle, apparatus, and preliminary application to separation of human buffy coat. J Clin Apheresis, 2001. 16(4): p.186-91]; 드루베크 등의 문헌 [Dlubek, D., et al., Enrichment of normal progenitors in counter-flow centrifugal elutriation (CCE) fractions of fresh chronic myeloid leukemia leukapheresis products. Eur J Haematol, 2002.68 (5): p.281-8] 참조)이 사용될 수 있다. 상기 기전은 연령 기초로 적혈구를 분리하는 것을 포함한, 혈액 세포를 분류하기 위하여 사용되었고 (라쉬 등의 문헌 [Lasch, J., G. Kullertz, and J.R. Opalka, Separation of erythrocytes into age-related fractions by density or size? Counterflow centrifugation. Clin Chem Lab Med, 2000. 38(7): p.629-32] 참조), 처리된 리포애스퍼레이트으로부터 목적 세포를 더욱 정제하는데 이 일반 접근의 적용은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 이 실시양태는 본 장치가 성분채집술 또는 세광 가능성을 제공하는 제2 장치와 통합되도록 도 4 및 일회용 세트 (도 3)의 장치에 변형을 요구할 수 있다.

단기간의 세포 팽창의 따른 플라스틱에의 부착은 또한 골수-유래의 성체 줄기 세포 집단에 적용되었다 (자이스월 등의 문헌 [Jaiswal, N., et al., Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem, 1997. 64(2): p.295-312]; 호우 등의 문헌 [Hou, L., et al., Study of in vitro expansion and differentiation into neuron-like cells of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 2002. 23(8): p.415-9] 참조). 이 접근은 다른 집단이 유지되거나 (그로써 성장하는 선택된 세포에 의하여 희석되어 감소되고) 요구되는 성장 조건이 없기 때문에 손실되는 동안 한 집단을 선택적으로 팽창시키기 위한 배양 조건을 사용한다. 세키야 (Sekiya) 등은 골수-유래의 줄기 세포에 대하여 사용될 수 있는 조건을 기재하였다 (세키야 등의 문헌 [Sekiya, I., et al., Expansion of Human Adult Stem Cells from Bone Marrow Stroma: Conditions that Maximize the Yields of Early Progenitors and Evaluate Their Quality. Stem Cells, 2002. 20(6): p.530-41] 참조). 조직 배양 플라스틱에 차별 부착이 있거나 없는) 이 접근은 본 발명의 추가의 실시양태에 적용될 수 있다. 상기 실시태양에서, 세포는 도 4에 나타낸 장치로부터 수거되어 세포 배양 구성요소를 제공하는 제2 장치로 주입된다. 상기 장치는 통상적인 실험실용 조직 배양 인큐베이터 또는 타사오 등의 미국 특허 제6,001,642호 또는 암스트롱 등의 미국 특허 제6,238,908호에 개시된 바와 같은 바이오리액터-스타일 장치의 형태도 가능하다. 또다른 실시양태에서, 혼합 성분(도 4에 나타낸 장치의 구성요소 108; 도 3에 나타낸 구성요소 30)은 처리된 리포애스퍼레이트의 단기간 부착 및(또는) 세포 배양을 가능하게 하는 바이오리액터 구성요소로 교환될 수 있다. 상기 또다른 실시양태는 바이오리액터 구성요소를 장치내로 포함시키는 것을 허용하여 상기 장치로부터 세포를 수거하여 또다른 장치로 주입할 필요를 없앤다.

일부 실시양태에서, 활성 세포 집단을 환자에게 직접 투여한다. 달리 말하면, 활성 세포 집단(예를 들어, 줄기 세포 및(또는) 내피세포 전구체)를 환자에게 투여하기 전에 시스템으로부터 수거하거나 시스템의 외부 환경에 노출시키지 않고 환자에게 투여한다. 밀폐 시스템의 제공은 환자에게 투여될 물질의 오염의 가능성을 감소시킨다. 따라서, 활성 세포 집단이 더욱 무균질이 될 것이기 때문에, 밀폐 시스템에서 지방 조직의 처리는 기존의 방법에 비해 장점을 제공한다. 상기 실시양태에서, 줄기 세포 및(또는) 내피세포 전구체가 외부 환경에 노출되거나 시스템으로부터 수거되는 경우는 오로지 세포가 적용 장치로 회수되어 환자에게 투여되는 때이다. 일 실시양에서, 적용 장치는 밀폐 시스템의 일부일 수도 있다. 따라서, 상기 실시양태에서 사용되는 세포는 배양을 위해 처리되거나 또는 동결보존되지 않는다.

상기 기술된 바에 따른 농축된 활성 세포는 추가 처리없이 환자에게 투여될 수 있거나, 다른 조직 또는 세포와 혼합된 후 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농축된 활성 세포(예를 들어, 줄기 세포 또는 내피 세포 전구체)는 유사하게 처리되지 않은 지방 조직의 하나 이상의 유닛과 혼합된다. 따라서, 본 발명의 방법을 실시함에 의해 활성 세포의 높은 농도를 갖는 지방 조직을 포함하는 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 지방 조직의 다양한 유닛의 부피들은 상이할 수 있다. 예를 들어, 어떤 유닛의 부피는 지방 조직의 다른 유닛의 부피를 25% 이상 초과할 수 있다. 나아가, 어떤 유닛의 부피는 지방 조직의 다른 유닛의 부피를 50% 이상, 예를 들어, 100% 이상, 심지어 150% 이상을 초과할 수 있다. 또한, 목적하는 조성물은 지방 조직의 하나 이상의 다른 유닛을 이용하여 활성 세포를 함유하는 세포 펠렛일 수 있는 농축된 활성 세포 집단과 지방 조직의 제1 유닛을 혼합하여 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 다른 유닛은 줄기 세포의 증가된 농도를 가지지 않을 것이거나, 달리 말하면, 지방 조직의 제1 유닛에 포함되는 것보다 적은 활성 세포 농도를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 유닛들 중의 하나는 예를 들어 증가된 농도의 활성 세포를 포함하는 동결보존 물질이다.

다른 실시양태에서, 활성 세포 집단의 적어도 일부는 후속-이식/접합을 위해 저장된다. 집단을 하나 이상의 분량 또는 단위로 나누어 줄기 세포 및(또는) 내피세포 전구체의 집단의 일부는 후속-적용을 위해 보존하고, 일부는 환자에게 즉시 적용된다. 2002년 9월 12일자로 출원되고, 2001년 9월 14일 출원된 미국 가출원 60/322,070의 이익을 주장하고 공동 양도된 미국 특허 출원 제10/242,094호(PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES)(상기 문헌의 내용은 본원에 인용문헌으로 포함되었음)에 개시된 바와 같은 세포 은행에서 세포의 전부 또는 일부의 장기간 보관에 대한 방법도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 실시양태에서, 세포는 처리전 지방 조직의 유닛보다 높은 농도의 줄기 세포를 포함하는 조성물을 제공하는 새로운 또는 보존된 지방 조직의 하나 이상의 유닛과 혼합될 수 있다.

처리의 마지막 단계에, 농축된 세포는 피하로, 정맥내, 근육내 또는 복강내 기술에 의해 수용체에게 주입을 위한 전달 장치, 예를 들어, 시린지로 로딩될 수 있다. 달리 말하면, 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 환자에게 주입할 수 있고, 예를 들어, 전신 또는 국부 전달을 위해 혈관으로, 조직(예를 들어, 심근 또는 골격근)으로, 진피(피하)로, 조직 공간(예를 들어, 요도주위) 또는 다른 위치로 주입될 수 있다. 바람직한 실시양태는 주사 또는 카테터에 의한 주입 또는 예비성형된 매트릭스와 같은 첨가제와 결합하여 직접 외과적 이식에 의한 주입을 포함한다.

활성 세포 집단은 단독으로 또는 다른 세포, 조직, 조직 절편, 탈회된 뼈, 성장 인자, 예를 들어, 인슐린 또는 약물, 예를 들어, 티아글리타존 류의 일원, 생물학적으로 활성 또는 불활성의 화합물, 재흡수가능 플라스틱 스캐폴드 또는 집단의 전달, 효력, 내성 또는 기능을 강화시키는 목적의 다른 첨가제와 함께 적용될 수 있다. 세포 집단은 미용, 구조적 또는 치료 목적의 구현을 위한 세포의 기능을 변화, 강화 또는 보충시키는 방식으로 세포 배양에서의 주입에 의해 또는 DNA의 삽입에 의해 변경될 수도 있다. 예를 들어, 줄기 세포의 유전자 전달 기술은 모스카(Mosca), J.D., J.K.헨드릭(Hendricks) 등의 2000년 문헌["Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery." Clin Orthop(379 Suppl):S71-90]에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지된 것이고, 바이러스 트랜스펙션 기술 및 더 구체적으로는 월터(Walther)W. 및 U.Stein의 2000년 문헌["Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases." Drugs 60(2): 249-71] 및 아타나소포울로스(Athanasopoulos), T., S.Fabb 등(2000)의 문헌["Gene therapy vectors based on adeno-associated virus: characteristics and applications to acquired and inherited diseases(review)." Int J Mol Med 6 (4): 363-75]에 개시된 바와 같은 아데노-결합 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 무라마츠(Muramatsu),T., A.나카무라(Nakamura) 등의 문헌["In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to 조직s of living animals (Review)" Int J Mol Med 1 (1):55-62]에 개시된 바와 같은 비-바이러스 기재 기술도 또한 수행될 수 있다.

일부 실시태양에서, 세포는 지방 조직의 미처리 단편과 혼합하여 매우 큰 게이지 주사 또는 지방흡입 캐뉼러를 이용하여 수용체에게 다시 주입할 수 있다. 처리된 세포로 보충시키지 않는 자가이식 지방의 전달은 성형외과 또는 재건외과에서 통상적인 방법이다. 그러나, 전달된 물질이 빠르게 재흡수되는 경향이 있어 불안정한 이식을 초래할 수 있기 때문에 그 결과 예측할 수 없다. 예를 들어, 성숙한 지방세포가 실질적인 고갈된 본 발명의 지방 조직-유래 세포는 이식편의 연장된 생존 및 작용을 지지하는 환경을 제공할 수 있다.

또다른 면에서, 세포 집단은 수용체로 주입되어, 매크로포어 바이오서저리(MacroPore Biosurgery) 인크.(미국 특허 제6,269,716호 및 미국 특허 제5,919,234호)에 의해 제조된 바와 같은 재흡수가능한 플라스틱 외포에 의해 둘러쌓일 수 있다. 상기 세팅에서, 외포는 근육 및 다른 연한 조직이 골절의 영역으로 탈수되는 것을 방지하고, 설치된 처리된 지방 조직-유래 세포가 골절의 복구를 촉진할 수 있게 한다. 상기 면에서, 뼈발생후 단백질 성장인자 또는 생물학적 또는 인공적 골격과 같은 추가 구성성분으로 보충시킴에 의해 이로운 효과가 강화될 수 있다.

다른 면에서, 세포는 뼈 치료시 또는 접합시 세포가 성장 인자의 그 자신의 근원으로서 작용할 수 있게 하는 뼈발생후 성장 인자를 코딩하는 유전자와 결합될 수 있다. 유전자의 첨가는 아데노바이러스 형질도입, "유전자 총", 리포좀-매개 형질도입 및 레트로바이러스 또는 렌테바이러스-매개 형질도입을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다.

특히, 세포 및(또는) 세포를 포함하는 조직이 세포 및(또는) 조직을 채취한 환자 이외의 환자에게 투여되는 경우, 세포 및(또는) 조직을 받은 환자에게 이식 거부를 감소시키고, 바람직하게는 방지하는 하나 이상의 면역억제제를 투여할 수 있다. 본원에 개시된 방법에 적절한 면역억제제의 예는 T-세포/B-세포 공동자극 경로를 억제하는 약물, 예를 들어, 미국 특허 공개번호 제20020182211호에 개시된 바와 같이 CTLA4 및 B7 경로를 통한 T-세포 및 B-세포의 커플링을 방해하는 약물을 포함한다. 다른 예에는 사이클로스포린, 미오페닐레이트 모페틸, 라파미신 및 항-티모사이트 글로불린을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서는, 세포가 하나 이상의 세포 분화제, 예를 들어, 사이토카인 및 성장 인자와 함께 환자에게 투여된다. 다양한 세포 분화제의 예는 문헌[Gimble,J.M., C.Morgan, et al.(1995)."Bone morphogenetic proteins inhibit adipocyte differentiation by bone marrow stromal cells." J cell Biochem 58(3): 393-402; Lennon, D.P., S.E.Haynesworth, et al.(1995). "A chemically defined medium supports in vitro proliferation and maintains the osteochondral potential of rat marrow-derived mesenchymal stem cell." Exp cell Res 219 (1):211-22; Majumdar,M.K., M.A.Thiede, et al.(1998). "Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cell (MSCs) and stromal cell." J cell Physiol 176 (1):57-66;Caplan,A.I. and V.M.Goldberg(1999). "Principles of tissue engineered regeneration of skeletal tissues." Clin Orthop (367 Suppl):S12-6; Ohgushi,H. and A.I.Caplan(1999). "Stem cells technology and bioceramics: from cell to gene engineering." J Biomed Mater Res 48 (6): 913-27; Pittenger, M.F., A.M. Mackay, et al. (1999). "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell." Science 284 (5411) :143-7; Caplan,A.l. and S.P.Bruder(2001). "Mesenchymal stem cells:building blocks for molecular medicine in the 21st century." Trends Mol Med 7(6):259-64; Fukuda, K.(2001). "Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cell for cardiovascular tissue engineering." Artif Organs 25 (3): 187-93; Worster, A.A., B.D. Brower-Toland, et al. (2001). "Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cell sequentially exposed to transforming growth factor-betal in monolayer and insulin-like growth factor-I in a three-dimensional matrix." J Orthop Res 19 (4): 738-49; Zuk, P.A., M.Zhu, et al.(2001). "Multilineage cell from human adipose tissue: implications for cell-based therapies." Tissue Eng 7 (2): 211-28; and Mizuno, H. , P. A. Zuk, et al. (2002). "Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cell." Plast Reconstr Surg 109 (1):199-209; discussion 210-1]에 개시된다.

줄기 세포 및(또는) 내피 세포 전구체를 환자에게 투여함에 의해, 저속/비-결합 골절, 골다공증(연령-관련 또는 화학요법-유도), 뼈의 유전 질병(불완전골형성증)을 포함하는 뼈 관련 질환, 질병 또는 상해; 지방 관련 질환 또는 질병; 간기능상실, 간염 B 및 간염 C를 포함하는 간 관련 질병; 심장 발작 또는 만성 심장 기능상실을 포함하는 심근 경색; 직장 질환 또는 신장 손상; 망막 질환 또는 손상 또는 괴사; 상처 치료(예를 들면, 외과 또는 당뇨 궤양으로 인한); 외상 및 유전 모두로 인한 골격 근육 질환; 외상 및 자가면역의 연골 및 관절 복구; 폐 상해; 당뇨병; 창자 질환; 신경계 질환, 질병 또는 상해, 예를 들어, 척추 상해, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 및 졸중을 포함하는 중추신경계 질환, 질병 또는 상해를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 다양한 질병이 치료될 수 있다.

줄기 세포는 또한 예를 들어, 주름의 감소, 기관 질량의 증가 등을 포함하는 물리적 외관을 증가 또는 개선시킴에 의한 미용 목적을 위해 환자에게 투여될 수 있다.

환자로부터 지방 조직을 수거하는 조직 수거 시스템이 도 1에 예시되어 있다. 넓은 실시양태에서는, 조직 수거 시스템(10)은 조직 수집 용기(12) 및 조직 수집 용기(12)에 결합된 혼합 용기(30)을 포함한다. 혼합 용기(30) 및 조직 수집 용기(12) 간의 결합은 바람직하게는 조직 수집 용기(12)로부터 혼합 용기(30)으로 향하는 조직이 외부 환경에 노출되지 않는 밀폐 시스템을 정의한다. 시스템(10)은 또한 조직 수집 시스템(10)으로부터 수거된 농축된 줄기 세포가 환자에게 투여되는 것을 구조화시킨 아웃렛 32를 포함한다. 조직 수집 용기(12)는 조직 수집 입구부 14 및 필터(16)을 포함한다. 필터(16)은 용기내에 배치되고, 예를 들어 조직이 환자로부터 수거될 때 지방 조직을 보유하고 비-지방 조직은 통과시키도록 구성된다. 보다 구체적으로, 필터(16)은 유리 지질, 혈액 및 염수를 통과시키면서 지방 조직의 초기 수집 중에, 또는 다른 실시 태양에서는 지방 조직의 초기 수집 후에 지방 조직의 단편을 보유한다. 이에 관해, 필터(16)은 약 20μm 내지 5mm 크기 범위의 동일하거나 상이한 크기의 다수의 세공을 포함한다. 바람직한 실시양태에서는, 필터는 약 265㎛ 및 약 47% 개방 면적의 세공 크기를 갖는 약 200㎛ 두께의 임상 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 상기 물질은 헹구는 동안 조직을 보유하지만 세포는 메쉬를 통해 빠져나가 조직 탈응집시킨다. 따라서, 조직을 환자로부터 흡입할 때, 비-지방 조직을 지방 조직으로부터 분리시킬 수 있다. 혼합 용기(30)은 혼합 용기(30)에 포함된 줄기 세포와 혼합된 혼합 용기(30)으로 첨가제를 사용자가 투여시키는 것을 가능하게 하는 구조의 추가 포트(31)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조직 수집 용기(12)의 치수는 필터 내로 약 1 리터의 조직 단편의 보유가 가능한 정도여야 한다. 다른 실시양태에서, 조직 수집 용기(12)는 더 크거나 작은 부피의 조직 단편을 보유하는 크기일 수 있으며; 예를 들어, 조직 수집 용기는 지방 조직 단편 100ml 이상이며, 지방 조직 단편 약 2L 이하를 저장하는 크기일 수 있다.

도 1의 시스템(10)에 존재하는 추가 특징을 보면, 조직 입구문(14)는 튜빙(22)를 경유하여 캐뉼러(24)와 결합되어 조직 수거 라인을 정의한다. 예시적인 실시양태에서, 캐뉼러(24)는 통합된 일회용 지방 흡입 캐뉼러가고, 튜빙은 구부러질수 있는 튜빙이다. 캐뉼러는 환자내로 주입되어 환자로부터 지방 조직을 수거하도록 치수화된다. 시스템에서 사용되는 튜빙(22)는 붕괴 가능성이 감소되도록 흡입형 지방흡입과 관련된 음압을 견딜 수 있어야 한다. 조직 수집 용기(12)는 또한 조직 입구부 14로부터 필터(16)의 반대 방향에 배치된 흡출 포트(18)을 포함한다. 흡출 입구(18)은 손으로 또는 자동으로 작동될 수 있는 흡인 장치(20)과 결합되도록 구성된다. 흡인 장치(20)은 시린지일 수 있거나, 다른 것들 중에서 전기 진공 흡인 장치일 수 있다. 흡인 장치(20)은 환자로부터 조직을 수거하는 용기(12) 및 캐뉼러(24)에 충분한 음압을 제공할 수 있어야 한다. 예시된 바와 같이, 흡인 장치(20)은 튜빙(22)을 경유에 하여 흡출 포트(18)에 결합된다.

조직 수거 시스템(10)은 조직 수집 용기(12) 및 혼합 용기(30) 사이에 배치된 세포 수집 용기(26)을 포함하는 것으로도 예시된다. 세포 수집 용기(26)은 시스템(10) 내에 배치되어 세포, 예를 들어, 줄기 세포를 혼합 용기로 통과하기 전에 조직 수집 용기(12)에서 세포 수집 용기(26)로 통과시킨다. 예시적인 실시양태에서, 세포 수집 용기(26)은 세포 수집 포트(48)을 경유하여 조직 수집 용기(12)와 결합된다. 시스템(10)의 일 실시태양에서, 세포 수집 용기(26)은 현탁액 중의 세포 분리를 용이하게 하는 세포 농축기(나타내지 않음)을 포함한다. 세포 농축기의 예는 예를 들어, 세포의 크기 또는 밀도에 기초하여 다른 물질로부터 세포를 분리시킬 수 있는 원심분리 장치이다. 또다른 예는 상기 논의된 바와 같은 스피닝 막 필터이다. 시스템(10)은 또한 세포 수집 용기(26)으로부터 혼합 용기(30)으로 세포를 통과시키고, 예를 들어, 세포보다 큰 물질의 통과를 막도록 구성된 필터(28)을 포함하는 것으로 예시된다. 세포 수집 용기(26)은 또한 폐기물 용기(36)으로의 출구를 포함한다. 세포 수집 용기(26)에 포함된 물질의 유동 방향은 물질이 폐기물 용기(36)으로 흘러가는지 또는 혼합 용기(30)으로 흘러가는지를 조절할 수 있는 하나 이상의 밸브의 배치에 의해 정해진다.

예시적인 실시양태에서, 세포 필터(28)은 200㎛미만의 직경 또는 길이를 갖는 다수의 세공을 포함한다. 일정 실시양태에서, 세공은 200㎛보다 작은 직경을 가질 수 있다. 또다른 실시양태에서는 세공은 20 내지 200㎛사이의 직경을 갖는다. 세포 필터(28)은 세포 수집 용기(26)으로부터 이격되어 있을 수 있거나 세포 수집 용기(26) 내에 포함될 수 있다. 세포 필터(28)은 또한 세포 수집 용기(26)에 완정하게 형성될 수 있다. 시스템(10)의 추가 실시양태는 필터(28)을 포함하지 않는다. 세포 수집 용기는 임의의 적절한 물질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 수집 용기(26)은 플라스틱 백, 예를 들어, 혈액 은행에서 혈액 처리에 통상적으로 사용되는 것들 일 수 있거나; 다른 실시태양에서, 구조적으로 딱딱할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 수집 용기(26)은 구성성분 제조 챔버 및 세포 세척/분리 챔버를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서는 구성요소 제조 챔버는 상기 세포를 재현탁시기 위한 완충제 또는 성장 인자와 같은 환자에게 투여하기 위한 줄기 세포 분리 공정을 강화시키는 약물의 첨가를 위한 하나 이상의 포트를 포함한다. 상기 실시양태에서, 바람직하게는 구성요소 제조 챔버는 용기 중에서 세포 및 첨가제를 혼합 또는 교반시키는 혼합 장치를 포함한다. 구성요소 제조 챔버는 또한 그 내부에 수집되는 세포를 수거하기 위한 하나 이상의 포트를 포함한다. 어떤 입구는 혼합 용기(30)으로 세포를 통과시키기도록 제공될 수 있다. 다른 입구는 세포 또는 세포의 일부를 뼈 단편을 포함하는 다른 표적, 예를 들어, 이식 물질로 또는 세포 배양 또는 정화 장치로 향하도록 제공될 수 있다. 일 실시태양에서, 세포 세척/분리 챔버는 원심분리기 이외에 세포 농축기로 사용될 수 있거나 또는 바람직하게는 원심분리기의 대용품으로서 사용될 수 있는 스피닝 막 필터 성분을 포함한다.

시스템(10)은 조직 수집 용기(12)로부터 혼합 용기(30)으로의 도관을 제공하도록 배치된 조직 복구 라인(34)를 포함하는 것으로 예시된다. 따라서, 조직 복구 라인(34)는 조직 수집 용기(12)에 포하된 조직을 조직 수집 용기(26)으로부터 수득한 세포와 조직을 혼합시킬 수 있는 혼합 용기(30)으로 통과시키거나 이동시키게 한다. 예시적인 실시양태에서, 조직 복구 라인(34)은 필터(16)에 포함된 것인 지방 조직을 수거하는 조직 용기(12)내로 연장된다. 조직은 하나 이상의 펌프 또는 흡인 장치를 사용하여 조직 복구 라인(34)를 통해 통과되거나 이동하게 되어 헹구어졌지만 반드시 탈응집된 것은 아닌 지방 조직을 통과시킨다.

일 실시양태에서, 시스템(10)은 조직 수집 용기(12)에 포함된 물질의 온도를 조절하도록 시스템(10)에 대해 위치한 온도 조절 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 온도 조절 장치는 가열기이고, 다른 실시양태에서, 온도 조절 장치는 냉각기이다. 또다른 실시태양에서는, 온도 조절 장치는 가열기과 냉각기 사이를 변경시킬 수 있다. 온도 조절 장치는 조직 수집 용기(12)에 포함된 지방 조직의 온도를 조절하는 장치일 수 있거나, 조직 수집 용기(12)에 전달되는 액체의 온도를 변화시키도록 배치된 장치일 수 있다. 지방 조직을 가열하는 것이 활성 세포 구성요소의 분리를 증가시키도록 조직의 탈응집을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 일부 실시태양에서는 세포를 보호하도록 조직의 일부, 바람직하게는 활성 세포 구성요소를 냉각시키는 것이 바람직하다. 세포의 온화한 냉각조차도 처리 중에 세포 생존을 증가시키는데 적절한 보호를 제공할 수 있다.

조직 수거 시스템(10)의 출구(32)는 혼합 용기(30)의 구성요소로 예시되어 있다. 추가 실시태양에서, 출구(32)는 혼합 용기(30)으로부터 이격되어 있다. 출구(32)는 조직 수거 시스템(10)의 밀봉된 배열을 유지하는 칸막이를 포함하고, 일부 실시양태는 출구(32)는 액체 불투과성 막(예를 들어, 액체 및 공기를 불투과시키는 막)을 포함한다. 출구(32)는 적절한 조건하에서 혼합 용기(30)의 조성물을 환자에게 전달하도록 구성되어야 한다. 예를 들어, 시린지가 조성물을 빨아들이도록 사용된다면, 출구(32)는 시스템 또는 조성물의 무균성을 손상시키지 않고 시린지의 바늘을 수용할 수 있어야 한다. 또다른 실시양태에서, 출구가 조성물을 투여하지만 조성물을 빨아들이지는 않도록 형성된 장치, 예를 들어, 양압을 적용하여 조성물이 캐뉼러를 통해 치환되는 조성물을 투여하는 캐뉼러와 결합된다면, 출구(32)는 혼합 용기(30)에 포함된 조성물이 캐뉼러로 통과되는 것을 가능하게 하도록 배치되어야 한다. 다른 실시양태에서, 출구(32)는 양압을 적용함으로서 조성물을 투여하는 캐뉼러 또는 시린지의 바늘과 같은 조성물을 투여하는 장치를 포함할 수 있거나 밀폐 시스템 방식으로 결합될 수 있다.

조직 수거 시스템(10)은 또한 조직 수집 용기(12)로부터 폐기물을 수집하도록 배치된 폐기물 용기(36)을 포함하는 것으로 예시된다. 예시적인 실시양태에서, 폐기물 용기(36)은 또한 세포 수집 용기(26)으로부터 폐기물을 수집하도록 결합되고 배치된다. 세척 용기(38)은 세척액, 예를 들어, 염수 또는 임의의 다른 적절한 완충액을 세척 포트(46)을 경유하여 조직 수집 용기(12)로 전달하는 세척 라인(29)와 용액 소통하도록 제공된다. 조직 수집 용기(12)는 또한 조직 수집 용기(12) 내에 압력의 양을 조절하기 위한 공기 입구(40)을 포함한다. 첨가 라인(42)는 조직 수집 용기(12)상에 제공되고, 첨가제가 조직 수집 용기(12)로 첨가되는 것을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법을 참고하여, 첨가 라인(42)은 하나 이상의 효소를 조직 수집 용기(12)로 전달하도록 하여 필터(16)에 포함되는 지방 조직의 잔여물로부터 활성 세포 성분의 분리를 용이하게 하도록 제공된다. 예시된 바와 같이, 첨가 라인(42)은 효소를 적절한 용기로부터 수집하도록 사용될 수 있는 바늘 (44)을 포함한다.

조직 수거 시스템(10)의 구성요소의 특정 실시양태가 도 2 및 도 3에 예시되어 있고, 유사 번호가 유사 부분을 나타낸다. 도 2 및 도 3의 특정 실시양태에서, 조직 수집 용기(12)는 흡입이 용기에 적용되는 경우 그 형태를 보유하는 보디를 포함한다. 더 구체적으로는, 조직 수집 용기(12)는 강체(rigid body), 예를 들어, 275㎛의 메쉬 크기를 갖는 임상 등급 폴리에스테르의 개략적으로 원뿔형 필터를 포함하는 임상 등급 폴리카르보네이트로 구성되는 본체를 포함한다. 딱딱한 조직 수집 용기는 대략 8 인치 높이 및 대략 5 인치 직경의 크기를 가질 수 있고; 벽 두께는 약 0.125인치일 수 있다. 실린더의 내부는 흡입 튜빙을 위한 2개의 포트, 무균 도킹 기술을 통해 연결을 위한 튜빙을 갖는 2개의 포트, 고무 격벽을 통해 바늘 구멍 접근을 위한 2개의 포트를 통해 접근된다. 상이한 물질, 메쉬 크기 및 포트의 수 및 종류를 이용하여 동일한 성능이 얻어질 수 있다. 예를 들어, 100 ㎛보다 작거나 수천 마이크론 크기의 메쉬 세공 크기는 염수 및 혈액 세포의 통과를 가능하게 하면서도 지방 조직 집합 및 단편을 보유하는 동일한 목적을 달성한다. 유사하게, 장치 목적은 별법의 딱딱한 플라스틱 물질의 사용에 의해, 일회용 캐뉼러를 비-일회용, 다중-사용 무균 캐뉼러로 교환함에 의해 또는 당업자에게 공지된 다수의 다른 변형에 의해서도 달성될 수 있다. 그러나, 조직 수거 시스템(10)의 다른 실시양태에서는, 조직 수집 용기(12)는 접을 수 있는 바디, 예를 들어, 조직 수집 백을 포함할 수 있다. 이러한 시스템에서 백은 백에 흡입 적용시 백으로 접혀질 가능성을 수거하는 것을 돕는 지지체, 예를 들어, 내부 또는 외부 프레임을 제공하는 것이 바람직하다.

조직 수거 시스템(10) 안의 오염을 감소시키기 위해서 하나 이상의 클램프(23)이, 상기 시스템의 다수의 구성요소에 상기 라인을 통해 재료의 흐름을 조절하는 다수의 라인 또는 도관 상에 제공된다. 클램프(23)은 사용자가 조직 수거 시스템(10)의 다양한 영역을 효과적으로 밀봉하도록 한다. 바람직한 실시양태에서, 시스템(10)의 하나 이상의 구성요소는 일회용이다. 본 실시양태에서 상기 구성요소들을 재사용하는 것을 방지하는 것은 다양한 구성요소의 반복사용과 관련될 수 있는 오염을 감소시키는데 도움이 된다. 또한, 일회용 세트로 구성요소들을 제공하는 것은, 단번에 모든 구성요소들을 살균할 수 있어 여기에 개시된 방법의 실시에 요구되는 시간을 실질적으로 감소시키는 장점을 제공한다, 완전 또는 부분 자동화 실시양태에서, 컴퓨터-조절 밸브는 클램프(23)의 대체물로서 또는 부가하여 장착될 수 있다.

또한, 조직 수거 시스템(10)은 부가적인 장치 또는 구성요소를 포함할 수 있는데, 이는 다른 것 중에서 필터(16)에 보유된 재료 부피의 측정을 가능하게 하거나, 추출 또는 처리 단계에 관한 문자화된 정보의 기록을 가능하게 하거나, 작동 중에 스탠드 또는 베딩(bedding)에 장치를 부착하는 것과 같은 기타 보조 기능을 수행한다.

상기 조직 수거 시스템(10)의 구성요소들은 생체 유체 또는 조직과 비반응성이어야 하고, 생체 유체 또는 조직을 처리하는데 사용되는 약제와 비반응성이어야 한다. 또한, 다양한 구성요소들이 제조되는 재료는 오토클레이빙이나 조사 (이에 한정되지는 않으나 베타- 또는 감마-조사를 포함함)와 같은 살균과정에 잘 견딜 수 있어야 한다. 튜빙과 캐뉼러 핸들은 폴리에틸렌과 같은 임의의 적당한 재료로 제조될 수 있다. 상기 캐뉼러는 스테인레스 스틸로 제조될 수 있다.

여기에 개시된 본 발명에 따라서, 상기 조직 수거 시스템(10)은 지방 조직 안에 발견된 줄기 세포의 수거, 처리 및 관리에 편리한 밀폐 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 지방 조직의 수거를 위해 환자 근처에 둘 수도 있고, 상기 조직은 상기 시스템으로부터 수거될 조직을 요구하지 않고 처리 될 수 있다. 따라서, 제공된 시스템은 신선한 줄기 세포가 개선된 조성물을 환자에게 제공할 수 있으며 줄기 세포의 배양 및(또는) 보존에 관련된 가능한 위험을 감소시킬 수 있다.

여기의 개시를 참조하여, 환자에서 조직을 추출하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (i) 환자를 종래의 지방분해흡입술에 대해 준비시키는 단계; (ii) 캐뉼러와 조직 수거 시스템을 패키징 재료로부터 살균 필드로 수거하는 단계; (iii) 지방흡인 펌프 (통상적인 트랩과 인-라인 미생물 필터를 가짐)를 조직 수집 용기로부터 통해진 호스 어댑터에 연결시키는 단계; (iv) 상기 조직 수집 용기의 흡인구 상에 튜빙 스크류 클램프가 결합되지 않음을 확인하는 단계; (v) 원하지 않는 지방 조직을 수거하기 위해 일정한 지방흡인 캐뉼러로 캐뉼러를 사용하는 단계; (vi) 원하는 양의 지방 조직이 조직 수집 용기에 수집된 후에 조직 수집 용기를 밀봉하기 위해 두개의 튜빙 스크류 클램프를 수동으로 적용하는 단계; 및 (vii) 조직 수집 용기가 바르게 환자 식별 레이블로 표지되었는지 확인하고 기관 업무에 따라 레이블 (단계의 날짜 및 시간 등)상에 다른 정보를 기록하는 단계.

상기 도시된 조직 수거 시스템(10)를 참조하여, 튜빙(22)를 인-라인 유체 트랩을 가진 흡인 소스(20)에 부착하고 캐뉼러(24)를 채취 장소(harvest site) 안으로 삽입함에 의해 조직은 처리 구성요소 안으로 직접 수집된다. 그리고 나서 지방 조직은 조직 수집 용기(12)안으로 흡출(aspirate)되며, 조직 수집 용기(12)안에 수용된 필터(16)에 의해 유지된다. 조직 수집에 이어서, 수집된 지방 조직은 세척 라인(39)를 통해 조직 수집 용기(12)에 부가된 세척 용기(38)에 포함된 살균 식염수로 씻겨 진다. 조직 수집 용기(12)가 도시된 실시양태에서 흡인 하에서 수집을 견디는 강성 재료로 제조될 때, 염수가 추가되는 동안 하우징으로부터 치환된 공기는 공기-입구(40)을 통해 배출될 수 있다. 다르게는, 상기 공기는 폐용기(36) 또는 유사한 유지 장소 안으로 치환되어질 수 있다. 일단 상기 조직이 씻겨지면, 폐물질은 폐용기(36) 안으로 흐르게 할 수 있다.

어떤 실시양태에서는, 미손상 지방 조직의 일단은 수집 용기(12)에서 지방 조직의 탈응집에 앞서 조직 수집 용기(12)에서 수거될 수 있다. 미손상 지방 조직의 일단은, 상기 일단이 혼합 용기(30)에 넘겨질 수 있도록 조직 회수 라인(34)을 따라 통과된다. 이들 실시양태에서는, 상기 미손상 조직은 환자에 대한 투여에 앞서 줄기 세포와 혼합될 수 있다.

조직이 수집된 후, 니들(44)가 콜라게나아제가 포함된 효소용액의 살균 바이알 안으로 삽입될 수 있으며, 그리고 나서 상기 용액은 조직 수집 용기(12) 안으로 통과되고 여기서 37 ℃에서 또는 근방에서 30 내지 60분 동안 상기 지방 조직과 혼합된다. 세척 단계는 필요한 만큼 반복될 수 있으며, 탈응집된 조직은 세척 후 수율을 최대화하기 위해 활성 세포 집단이 용출된다. 조직 탈응집의 끝에서 상기 조직 수집 용기(12)는 피하 지방 세포를 부상(flotation)하게 하기 위해 수직으로 놓여진다. 그 때 상기 활성 세포 집단은 세포 수집 용기(26) 안으로 흘러들어가게 하고, 여기서 상기 세포는 콜라게나아제와 잔여 유리지방과 분리된다. 세포는 당업자에게 알려진 임의의 방법 (예를 들면 순차 원심분리/재-현탁 세척 또는 연속 흐름 기구등을 포함하나, 이에 한정되지는 않음)에 의해 세척 및(또는) 농축될 수 있다. 그리고 나서 상기 농축되고 세척된 세포는 혼합 용기(30) 안으로 흘러들어가게 하는데, 거기서 환자에의 투여를 위한 출구(32)를 통해 수거되기 전에 조직 회수 라인(34)로부터의 미손상 조직 및(또는) 임의의 의도된 첨가제와 혼합될 수 있다. 세포 수집 용기(26) 안에 포함된 물질은 세포 필터(28)을 사용하여 여과되고, 이어서 사용시 색전증(embolism)에 이르게 할 수 있는 원하지 않는 잔여 세포와 조직을 세척할 수 있다.

처리 동안에, 다양한 용기에 결과를 향상시키기 위해 하나 이상의 첨가제가 필요한 만큼 첨가될 수 있다. 첨가제의 몇가지 예로서는 세척과 탈응집을 최적화하는 약제, 처리 동안에 활성 세포 집단의 생존능력을 향상시키는 첨가제, 항생제와 같은 항균제, 피하지방세포 및(또는) 적혈 세포를 용해시키는 첨가제, 흥미 있는 세포 집단을 풍부하게 하는 첨가제 (고체상에 차별적 부착 또는 세포집단의 풍부함 또는 실질적인 감소를 촉진함)를 들 수 있다.

상기 실시양태에서, 상기 조직 수집 용기(12)는 조직 수거 시스템(10)의 처리 구성요소에 내재한 것이다. 다르게는, 그 내용이 명백히 여기에 참조로 포함된 공유 미국특허출원 10/242,094호 [제목: PRESERVATION OF NON EMBRYONIC 세포 FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES, 2002. 9. 12 출원, 우선권주장: 미국임시특허출원 60/322,070 2001. 9. 14]에 개시된 바와 같은 분리된 조직 수집 용기가, 처리 구성요소에 상기 탈응집된 물질을 계속해서 운반하면서 전체적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있다. 부가적인 가능한 조직 수집 용기는 미국특허 6,316,247호와 미국특허 5,372,945호에 개시되어 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태에서는 상기 방법은 상기 방법의 단계들을 자동적으로 수행할 수 있는 하나 이상의 부가장치를 제공함으로써 자동화될 수 있다. 그러한 실시양태에서, 처리 장치 (예를 들어 마이크로프로세서 또는 퍼스널 컴퓨터)는 상기 기술한 바와 같이 단계를 부분적으로 또는 완전히 자동화하는 장치이다. 그러한 자동화할 수 있는 단계의 예로서는, 이에 한정되지는 않지만, 상기 시스템 또는 처리 장치의 펌프 또는 밸브를 제어함으로써, 특정한 튜빙 경로에 따른 유체와 조직의 유입과 유출의 제어; 압력 센서로 방해물의 탐지; 혼합 기구, 부피 측정 메커니즘을 사용하여 특정 경로를 따라 이동하는 조직 및(또는) 유체의 양의 측정; 열제어 장치를 사용하여 다수의 구성요소의 온도 유지; 세포의 세척과 농축, 및 타이밍과 소프트웨어 메커니즘으로 공정통합을 포함한다. 한 실시양태에서 소프트웨어는 공정의 파라메터를 제어하여 특정한 오퍼레이터-정의된 파라메터로 합성된 세포 집단을 생산하게 한다. 따라서, 상기 자동화 장치(들)은 단계의 성능을 향상시키고, 지방 조직의 자동화된 수집과 환자에의 투여를 위한 지방 조직의 자동화된 처리를 제공한다.

구체적인 자동화 장치가 도 4에 도시되어 있다. 조직 수거 용기(도시하지 않음)가 장치(100)안으로 제대로 정렬되도록 색표지된 가이드 마크(112-118)을 사용하여 놓여지고, 적절한 경로로 튜빙을 삽입하였다. 장치(100)은 다수의 밸브(105, 110)와 다수의 펌프(104, 109)을 포함한다. 사용자가 정의한 프로그램에 따라 유체와 조직의 흐름을 조절하는 집적 마이크로프로세서 시스템에 의해 제어되는 일련의 밸브(105, 110)과 펌프(104, 109) 안에 튜빙이 놓여진다. 프로그램 선택은 사용자 인터페이스 패널(106)을 통해 전달된다. 염수 용기는 홀딩 구조체(101) 상으로 놓여지고 조직 수집 용기에 부착된다. 콜라게나아제 또는 다른 조직 분해 매질 또는 혼합물(도시하지 않음)의 바이알 또는 튜브가 조직 수집 용기 안으로 점(103)에서 삽입된다. 폐백(waste bag)이 홀딩 구조체(111) 안으로 삽입되고, 세포 분리 챔버/세포 수집 용기는 홀딩 구조체(107) 안으로 놓여지며 조직/세포 혼합 용기는 홀딩 구조체(108) 안으로 놓여진다. 상기 조직 수집 용기는 교반/인큐베이션 챔버(102) 안으로 놓여진다.

상기 용기가 상기 장치 안에 배치되기 전에 또는 상기 장치 안에 자리를 잡은 동안에, 지방 조직은 조직 수집 용기 안으로 수집될 수 있다. 상기 장치는 임의의 투명한 삽입물(119) 또는 조직 수집 용기 안에 조직의 부피를 측정하게 하는 기타 장치를 포함할 수 있다. 다르게는, 부피는 교반/인큐베이션 챔버(102) (조직 수집 용기(12)에 대응됨)에 포함된 물질의 중량을 측정하여 결정될 수 있다. 이 부피는 사용자 인터페이스 스크린(106) 상에 표시될 수 있다.

그리고 나서, 마이크로프로세서는 라인(114, 115) 상의 밸브(105)를 열고, 수집 챔버(102) 안으로 염수를 도입하고 폐백(111)에 폐물질(115)를 수거하기 위해기 위해 라인(114) 상의 펌프(104)를 작동시킨다. 본 공정에서, 수집 챔버는 진동에 의해서 흔들리며 상기 챔버(102)안에 통합된 가열 장치에 의해 프로그램된 온도로 유지된다. 어떤 실시양태에서는 조직 처리가 미리 덥혀진 염수를 사용할 수 있는데, 이 경우, 교반/인큐베이션 챔버의 가열장치의 역할은 온도를 증가시키는 것보다 정해진 미리 프로그램된 온도로 보유하는 것이다.

일단 상기 조직이 0 % 내지 100 % 중 임의의 미손상된 비율로 세척되면, 세척된 지방 조직은 라인(116) 상의 밸브(110)과 펌프(109)의 작동에 의해 인큐베이션 챔버(102)로부터 수거될 수 있다. 이 시점에서 회수된 물질은 혼합 챔버(108)에 보관된다. 분해 매질(103)은 라인(113) 상의 밸브(105)를 열고 다른 밸브를 닫고 라인(113) 상의 펌프(104)를 작동시킴으로써 챔버(102)에 남아 있는 물질에 첨가된다. 분해 매질의 첨가 후에 상기 챔버(102)를 교반하고 상기한 바와 같은 온도에서 유지된다. 프로그램된 인큐베이션 기간의 끝에서, 교반은 정지되어 피하지방세포가 부상하게 한다. 부가적인 염수가 이 공정을 촉진하기 위해 첨가될 수 있다. 피하지방세포의 부상 후에, 라인(112, 115) 상의 밸브들이, 챔버(102)에서 세포 세척 챔버(107) 안으로 목적 세포 집단을 수거하게 하기 위해 열린다. 세척된 세포는 혼합 챔버(108) 안으로 라인(117)을 통해 수거된다. 표면에 부상하는 세척 용액은 라인(118)을 통해 폐챔버(111)로 수거된다. 부가적인 염수는 라인(114)를 통해 세척 공정을 완료하기 위해 시스템 안으로 통과되어진다. 세포는 챔버(108)에서 처리시 미리 라인(116)을 통해 수거된 임의의 미손상 조직과 혼합된다. 혼합은 당 업계에서 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있는데, 그 수단으로는, 이에 한정되지는 않지만, 챔버의 교반/역립(inversion) 또는 간헐적인 압축 또는 움직이는 롤러 등을 포함한다. 그리고 나서 혼합된 물질은 일회용 세트의 혼합 챔버의 출구를 통해 수거된다.

상기 장치는 미리 프로그램된 파라메터(106)에 따른 공정을 자동화하기 위한 마이크로프로세서-제어 메커니즘을 포함한다. 본 시스템은 또한 방해물의 탐지를 위한 압력센서의 사용과 유사한 안전 및 품질 제어 메커니즘을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 시스템의 소프트웨어 구성요소는, 예를 들어 다수의 일회용 구성요소, 온도, 부피 측정, 조직 부피, 세포 수 파라메터, 가해진 효소 투여량, 인큐베이션 시간, 오퍼레이터 동일성, 날짜와 시간 등을 포함하는 "데이터 처리"의 자동화된 수집을 포함한다. 상기 장치의 바람직한 실시양태에서, 바코드 판독 시스템이 처리의 문서화의 일부로서 이들 변수 (예를 들어 일회용 세트 제조번호, 유효기간, 콜라게나아제의 제조번호 및 유효기간, 환자/샘플 식별표 등)의 데이터를 장치 제어기 안에 기록하도록 통합된다. 이는 데이터 기재 오류의 확률을 감소시킨다. 이 장치는 USB 또는 당 업계에서 알려진 다른 인터페이스 포트와 시스템을 사용하여 제어기 시스템으로 쉽게 일체화될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 장치는 데이터 기재와 공정의 문서화의 통합 제어를 제공한다. 이들 파라메터의 출력된 보고서는 상기 장치의 프로그램된 작동의 사용자-정의된 파라메터의 부분이다. 자연스럽게 이는 프린터 요소 (하드웨어와 드라이버) 또는 소프트웨어용 프린터 드라이버와 프린터용 인터페이스 출력 커넥터 (USB 포트 등)을 상기 장치의 하드웨어에 통합시키도록 요구한다.

추가의 실시양태에서는 제어기에 통합된 소프트웨어가 장치 안에 튜빙과 다른 구성요소를 적절히 삽입하는데 필요한 단계동안 사용자를 촉진한다. 소프트웨어는 또한 튜빙의 정확한 삽입, 방해물의 부존재 등을 확인하기 위한 자동화 시험을 개시한다.

본 장치에서 처리에의 일반적인 접근방법은 본 개시에서 수동 세포 처리에서 기술된 것과 동일한 파라메터를 사용한다. 세포 처리를 위해 사용된 다단계 메커니즘의 다른 많은 형태는 당 업자에게 자명하고 본 기재는 단지 하나의 예로서 포함되는 것이다. 예를 들어, 세척 및 탈응집 과정 동안의 조직과 염수의 혼합은 현재 실시예에서와 같이 교반에 의해, 또는 유체 재순환에 의해 일어날 수 있다. 세포 세척은 회전 멤브래인 접근법, 순차 부착, 순차 원심분리 (순차 침강, 속도 또는 변화도 분리 등에 한정되지는 않지만, 이들을 포함) 같은 연속 유체 메커니즘에 의해 또는 이들 수단의 조합에 의해 중개된다. 유사하게, 세포의 추가적인 조작을 하게 하는 부가 구성요소는 성장 인자 또는 다른 생물 반응 변성제의 첨가 (린드의 문헌[Lind, M., Growth factor stimulation of bone healing. Effects on osteoblasts, osteomies, and implants fixation. Acta Orthop Scand Suppl, 1998. 283: p.2-37], 하나다 등의 문헌 [Hanada, K., J. E. Dennis, and A. I. Caplan, Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein-2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Bone Miner Res, 1997.12(10): p.1606-14], 리버만의 문헌[Lieberman, J. R., et al., Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cells line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents. J Orthop Res, 1998.16(3): p.330-9)] 참조), 다른 구조 구성요소와 세포의 혼합 (예를 들어 골편 (진 등의 문헌[Jean, J. L. , S. J. Wang, and M. K. Au, Treatment of a large segmental bone defect with allograft and autogenous bone marrow graft. J Formos Med Assoc, 1997. 96(7): p.553-7] 참조), 콜라겐 (사데의 문헌 [Saadeh, P. B., et al., Repair of a Critical Size Defect in the Rat Mandible Using Allogenic Type I Collagen. J Craniofac Surg, 2001. 12(6): p.573-579] 참조) 및(또는) 수여자 안에 세포 이식을 위한 합성 구성요소 (페티트 등의 문헌[Petite, H., et al., Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol, 2000. 18(9): p.959-63.]; 가오 등의 문헌 [Gao, J., et al., Tissue- Engineered Fabrication of an Osteochondral Composite Graft Using Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng, 2001. 7(4): p.363-71]; 오구시 등의 문헌 [Ohgushi, H. and A. I. Caplan, Stem Cells technology and bioceramics: from cells to gene engineering. J Biomed Mater Res, 1999. 48(6): p. 913-27]; 카플란 등의 문헌 [Caplan, A. I. and V. M. Goldberg, Principles of tissue engineered regeneration of skeletal tissues. Clin Orthop, 1999 (367 Suppl): p.S12-6] 참조) 를 포함한다. 후-처리 조작도 또한 세포 배양 (카플란의 문헌 [Caplan, A. I. and S. P. Bruder, Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med, 2001. 7(6): p. 259-64]; 페티트의 문헌 [Petite, supra; Zuk, P. A., et al., Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Eng, 2001. 7(2): p. 211-28] 참조), 유전자 전이 (러스키의 문헌 [Luskey, B. D., et al., Gene transfer into murine hematopoietic stem cells and bone marrow stromal cells. Ann N Y Acad Sci, 1990. 612(398): p. 398-406]; 그롬페 등의 문헌 [Grompe, M., et al., Therapeutic trials in the murine model of hereditary tyrosinaemia type I : a progress report. J Inherit Metab Dis, 1998. 21(5) : p.518-31]; 가지트 등의 문헌 [Gazit, D., et al., Engineered pluripotent mesenchymal cells integrate and differentiate in regenerating bone: a novel cell-mediated gene therapy. J Gene Med, 1999. 1(2): p. 121-33]; 모스카 등의 문헌 [Mosca, J. D. , et al., Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery. Clin Orthop, 2000(379 Suppl): p.S71-90] 참조), 또는 추가적인 세포 정제 (그린버그 등의 문헌 [Greenberg, A. W. and D. A. Hammer, Cells separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol Bioeng, 2001. 73(2): p.111-24]; 마인와링 등의 문헌 [Mainwaring, G. and A. F. Rowley, Separation of leucocytes in the dogfish (Scyliorhinus canicula) using density gradient centrifugation and differential adhesion to glass coverslips. Cells Tissues Res, 1985. 241(2): p.283-90]; 슈바이저 등의 문헌 [Schweitzer, C. M. , et al. , Isolation and culture of human bone marrow endothelial 세포. Exp Hematol, 1995. 23(1) :p.41-8] 참조)를 또한 포함할 수 있다. 그러한 기능의 수행에 대한 메커니즘은 도 4에 도시된 장치 내에 통합될 수 있고, 별도의 장치로 결합될 수도 있다.

본 발명의 추가적인 실시양태에서, 종래의 지방 조직 트랩 안에 수집된 조직은 다른 조직들을 처리하기 위해 고안된 처리 세트로 이동될 수 있었다. 예를 들어, 박스터 사 (Baxter Inc.)는 골수기질 이식 채취 (bone marrow transplant harvest)의 세팅에 사용되기 위해 의도된 일련의 플라스틱 백과 필터를 제조 및 판매한다 (문헌 ["Bone Marrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and Inline Filters", Product Code, 4R2107, U. S. Pat. Nos. 4,346,703 and 5,724,988] 참조). 이 백 세트는 수집된 지방 조직을 세척하기 위해 사용될 수 있는 통합된 800 ㎛ 필터를 가진 큰 원추형의 백을 포함한다. 본 실시예에서, 800 ㎛보다 큰 지방 조직 조각들은 백 속에 남게 된다. 그리고 나서 이 조각들은 염수 (또는 다른 세척 용액)을 반복적으로 가해 세척할 수 있으며, 이어서 필터 아래의 포트를 통해 폐물질은 수거된다. 혼합은 수동으로 또는 벤치탑 록킹 (benchtop rocking) 장치를 사용하여 행해질 수 있으며, 가열 패드를 사용하여 가열되었다. 탈응집은 이 백의 관강 (lumen) 안에서 일어날 수 있다. 탈응집 후에 세포는 통합된 800 ㎛ 필터를 통해 (그리고 임의적으로 키트에 의해 제공된 하나 이상의 더 작은 메쉬 크기를 갖는 필터를 통해) 통과되었고, 수집 백 (또한 제공됨) 안에 수집되었다. 그리고 나서 이 백은 원심분리기 (예를 들어 Sorval RC-3C) 안에 놓여질 수 있었고, 거기서 세포는 순차적으로 세척되고 농축될 수 있었다. 세포는 또한 박스터 사 (Cytomate 또는 Baxter CS3000)나 코브 사 (Cobe Inc.) (Cobe Spectra)에 의해 판매되는 존재하는 세포 세척 장치 (대부분 인간 혈액 제품을 세척하기 위해 개발된)를 사용하여 세척할 수도 있다. 상기 일회용 구성 요소는 제조사에 의해 제공되는 부속품을 사용하여 통합될 수 있거나 또는 테루모 사 (Terumo Inc.)에 의해 제작된 것과 같은 살균 연결 장치 (sterile connecting device)를 사용하여 연결될 수 있다. 유사하게 덜 통합적인 이 접근방법에서 기술된 메커니즘은 중앙 제어기에 연결될 수 있으며 더 통합적인 장치의 구성요소로서 조립될 수 있다. 튜브 연동식 펌프 (peristaltic pump) 또는 펌프의 배터리는 유체 경로를 열고 닫기 위해서 수동의 또는 자동화된 클램핑을 사용하여 유체 흐름을 자동화하는데에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 조직 수거 시스템과 처리 세트는 수술실 또는 외래 환자 수속실 (효과적으로는 환자의 침대 쪽에서)과 같은 치료를 받는 환자의 주변에 존재한다. 이는 신속하고 효과적인 조직 채취와 처리를 가능하게 하며, 샘플 핸들링/레이블링 상의 오류를 방지하며, 이에 따라 전체 단계의 수행을 단일 수술 절차 진행으로 가능하게 한다.

본 발명은 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 촉진하거나 발생시키거나 유지하기에 필수적인 첨가제와 함께 수여자에게 직접 제공되는, 지방 조직으로부터 유도된 세포를 사용하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다.

도 1은 처리된 지방 조직의 조직 수거 시스템이다.
도 2는 도 1의 조직 수거 시스템의 조직 수집 용기이다.
도 3은 도 2의 조직 수집 용기의 부분 횡단면도이다.
도 4는 조직 수거 시스템의 작업을 자동화하는 처리 장치이다.
도 5는 그래프트 중량 대 세포 용량을 기술한 그래프이다.
도 6은 알콜 처리된 마우스에 대한 처리된 리포애스퍼레이트의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 처리된 리포애스터레이트를 수여받은 알콜 처리된 마우스의 간장 조직의 현미경사진이다.

다음 실시예들은 본 기술이 적용될 수 있는 구체적인 상태와 세팅들을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위와 본 발명에 포함된 청구범위를 제한하기 위해 의도된 것들은 아니다.

실시예 1: 자기 조직의 지방 전이

자기 조직의 지방 전이는 미용과 생체구조의 상대적으로 일반적인 단계로서 이는 동일한 개체 안에서 하나의 위치에서 지방 조직 (지방)을 채취한 다음 이를 다른 위치에 재이식하는 것이다 (콜만의 문헌 [Coleman, S. R. (1995)."Long-term survival of fat transplants: controlled demonstrations. "Aesthetic Plast Surg 19(5): 421-5]; 콜만의 문헌 [Coleman, S. R. (2001)."Structural fat grafts: the ideal filler" Clin Plast Surg 28(1): 111-9]; 콜만의 문헌 [Coleman, W. P., 3rd (1991). "Autologous fat transplantation. "Plast Reconstr Surg 88(4): 736.] 참조). 그러나, 상기에 나타낸 바와 같이, 이 단계는 자주 일치하지 않는 이식으로 인해 문제가 발생되어 이식된 물질이 완전히 또는 부분적으로 다시 흡수되거나 또는 흉터 조직 (에르미아 등의 문헌 [Eremia, S. and N. Newman (2000). "Long-term follow-up after autologous fat grafting: analysis of results from 116 patients followed at least 12 months after receiving the last of a minimum of two treatments." Dermatol Surg 26(12): 1150-8] 참조)에 의해 대체된다. 새로운 혈관이 형성되고 상기 이식체에 영양을 공급하는 시간 동안, 이식된 지방 조직이 괴사되는 것이 기능 손실의 적어도 일부분의 원인일 수 있다. 따라서 근육층과 같이 고도로 관이 발달한 부위 안으로 이식된 조직은, 조금 덜 관류 (perfused)하는 조직 안으로 이식되었을 때보다, 더 좋은 이식성을 보인다. (구레로산토스 등의 문헌 [Guerrerosantos, J., A. Gonzalez-Mendoza, et al. (1996). "Long-term survival of free fat grafts in muscle: an experimental study in rats. "Aesthetic Plast Surg 2 (5): 403-8] 참조).

본 개시에 기술된 바와 같이 제조된, 처리된 리포애스퍼레이트 (lipoaspirate)는 상기 이식체를 추가적인 내피 전구체와 줄기 세포와 함께 추가함으로써 이 문제점을 처리한다. 인브레드 위스타르 래트 (Inbred Wistar rat)에서 추출된 지방 조직 조각들은 여기에 개시된 방법에 따라 처리된 리포애스퍼레이트와 혼합되었다. 그리고 나서 이 조성물은 수여자 쥐 (recipient rat)의 머리가죽 아래와 넓적다리 안에 피하 이식되었다. 대조 실험으로서, 동일한 수의 동물이 지방 조직 하나만을 (처리된 리포애스퍼레이트 없이) 머리가죽 아래에 수용한 한편, 넓적다리에 이식체를 수용한 동물은 지방 조직 하나만을 이식한 반대측성 (contralateral)의 넓적다리를 가진다. 그래프트는 이식 후 한달 시점에 채취되었다.

그 결과 (도 5)는 처리된 리포애스퍼레이트의 투여량이 증가함에 따라 넓적다리의 그래프트 중량도 증가하는 경향을 보인다. 상기 이식체의 조직 검사는 처리된 리포애스퍼레이트가 추가된 그래프트의 혈관질도 개선되었음을 보여준다. 이들 쥐에 도살 스컬(dorsal skull)의 낮은 혈관질에 기인한 낮은 전체적인 보유력에도 불구하고 유사한 상관관계가 머리가죽 이식체에서도 관찰되었다.

본 기술의 임상적 응용에서, 상기한 바와 같이 본 개시에 따라 얻어진 처리된 리포애스퍼레이트를 제조하고 손상되지 않은(비-탈응집된) 지방 조직 단편과 혼합하였다. 지방 조직 및 줄기 세포의 혼합물을 포함하는 조성물을 수용자에게 이식하여 윤곽 결함(주름, "디보트(divots)," 얽은 자국 및 더 큰 결점)을 교정하기 위한(Coleman, S. R. (2001). "Structural fat grafts: the ideal filler?" Clin Plast Surg 28(1): 111-9), 또는 요도와 같은 손상된 구조에 대한 지지체를 제공하기 위한[Palma, P. C., C. L. Riccetto, et al. (1997). "Repeated lipoinjections for stress urinary incontinence." J Endourol 11(1): 67-70; Lee, P. E., R. C. Kung, et al. (2001). "Periurethral autologous fat injection as treatment for female stress urinary incontinence: a randomized double-blind controlled trial." J Urol 165(1): 153-8)] 자가 연조직 필러를 제공할 수 있다.

실시예 2: 급성 간 손상

복강내 알릴 알콜 주사에 의해 유도된 간 손상은 문맥주위 급성 간 손상의 일반적 모델이다(Lee, J. H. , Z. Ilic, et al. (1996). "Cell kinetics of repair after allyl alcohol-induced liver necrosis in mice." Int J Exp Pathol 77(2): 63-72; Werlich, T., K. J. Stiller, et al. (1999)." Experimental studies on stem cell concept of liver regeneration. II." Exp Toxicol Pathol 51(1): 93-8.; Yin, L., D. Lynch, et al. (1999). "Participation of different cell types in the restitutive response of the rat liver to periportal injury induced by allyl alcohol." J Hepatol 31(3): 497-507). 이 모델을 간 재생에 중요한 줄기 세포의 집단의 존재를 증명하기 위하여 사용하였다(Yavorkovsky, L., E. Lai, et al. (1995). "Participation of small intraportal stem cell in the restitutive response of the liver to periportal necrosis induced by allyl alcohol." Hepatology 21(6): 1702-12; Werlich, T., K. J. Stiller, et al. (1999). "Experimental studies on stem cell concept of liver regeneration. II." Exp Toxicol Pathol 51(1): 93-8). 본 발명자들은 이 모델을 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스에서 알콜-유도 손상 후에 처리된 리포애스퍼레이트를 주사하여 변형시켰다. 동물을 제1주에 희생시키고 간을 수거하여 칭량하고 조직학적 검사를 위해 준비하였다. 그 결과(도 6 및 7) 처리된 리포애스퍼레이트를 받은 동물에 있어서 실질적으로 개선된 간 중량이 나타났다. 조직학적 분석 결과 처리된 동물에게서 백혈구 침윤 또는 간 중량을 비정상적으로 증가시킬 수 있는 다른 기전에 대한 증거 없이 정상 조직구도가 나타났다.

임상 세팅에서, 간 손상 환자에게서 본 개시에 따라 지방 조직을 추출하고 처리할 것이다. 그 후 처리된 리포애스퍼레이트를 전신적 운반을 위하여 정맥내로 주사하거나 간 순환계를 통하여 간으로 표적화할 수 있다.

실시예 3: 급성 심장 손상

급성 심근 경색(심장 마비)은 심근에 허혈 손상을 일으킨다. 조직 손상은 손상된 조직의 재관류 및 심근 조직의 재생에 의해 최소화될 수 있다(Murry, C. E., R. W. Wiseman, et al. (1996). "Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis." J Clin Invest 98(11): 2512-23; Orlic, D., J. Kajstura, et al. (2001). "Bone marrow cell regenerate infarcted myocardium." Nature 410(6829): 701-5; Rajnoch, C., J. C. Chachques, et al. (2001). "Cellular therapy reverses myocardial dysfunction." J Thorac Cardiovasc Surg 121(5): 871-8; Strauer, B. E., M. Brehm, et al. (2002). "Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans." Circulation 106(15): 1913-8). 본 개시에 기재된 임상적 접근은 골수 수확과 연관된 병적 상태 없이 세포를 다수로 순수하게 제공할 수 있다는 점에서 재생 세포의 가능성 있는 우수한 공급원을 제공할 것이다.

실시예 4: 유전 질병에 대한 동종이형 응용

호르위츠(Horwitz) 등은 골수로부터의 줄기 세포가 비-조혈 장애, 특히 불완전 골형성증 환자에게 임상적 이익을 제공할 수 있다는 것을 입증하였다(Horwitz, E. M. , D. J. Prockop, et al. (1999). "Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cell in children with osteogenesis imperfecta." Nat Med 5(3): 309-13; Horwitz, E. M., D. J. Prockop, et al. (2001). "Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta." Blood 97(5): 1227-31). 이 연구에서, 저자는 세포를 세포배양으로 증식시켜서 MSC 성분을 팽창시키고 정제함으로써 골수에서 비-조혈 줄기 세포의 낮은 숫자 및 빈도를 보완하려고 시도하였다. 그러나, 상기한 바와 같이, 세포배양에서 세포를 증식시키는 것은 상당한 기술적 및 임상적 문제와 관련되고, 본 개시에 따라 처리된 지방 조직이 세포 배양을 필요로 하지 않으면서 다수의 줄기 세포의 공급원을 제공할 수 있는 가능성은 환자 보호에 있어서 가능성 있는 상당한 개선을 나타낸다. 이 모델에서 유전적 질병의 영향을 받지 않는 적절하게 매칭된 공여자(정상 유전자형 또는 무증상 보균자), 바람직하게는 형제자매 또는 다른 1등 친족(first degree relative)이 공여자 세포의 공급원이 될 것이지만 관계 없는 공여자의 사용도 본 발명의 범위 내이다. 세포를 지방 조직에서 추출하여 유전 질병이 있는 환자에게로 주입하면 절충된 조직 기능 또는 재생을 일으킨다. 예는 불완전 골형성증, 더스체네스(Duschenes) 근육 위축증(및 다른 근육 위축증), 유전적 망막 퇴행 질병, 유전성 티로신혈증, 및 수많은 다른 유전 질병을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

이의 결론은 자가(자기) 처리된 리포애스퍼레이트가 줄기 세포 구획으로 유전자의 삽입에 의해 변형되는 유전자 치료 접근의 적용이 동종이형(비-자기) 공여자에 대한 요구를 없앨 것이라는 것이다. 이러한 접근은 신규 유전자가 줄기 세포 내로 삽입된 감염성 질병의 치료에도 사용될 수 있다. 예를 들면 안티센스 또는 리보자임 제작물을 항-HIV 효과를 제공할 수 있는 세포를 생산하는데 사용할 수 있다. 이러한 접근은 약물 운반 비히클로서 작용할 수 있는 줄기 세포를 생산하는데에도 사용할 수 있다.

참고 문헌

본원에 기재된 특징 또는 특징의 조합은 이러한 모든 조합에 포함되는 특징이 상호 모순되지 않는다면 본 발명의 범위 내에 포함되고, 이는 정황, 본 명세서, 및 당업자의 지식으로부터 명백하다. 본 발명을 요약하기 위한 목적으로, 본 발명의 특정 측면, 이점 및 신규 특징을 본원에 기재하였다. 물론, 이러한 모든 측면, 이점 또는 특징이 본 발명의 특정 실시양태에서 반드시 구체화되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 추가적 이점 및 측면은 하기 상세한 설명 및 청구항에서 명백하다.

상기 실시양태는 예시적으로 제공된 것이고, 본 발명은 이 실시예에 의해 제한되지 않는다. 당업자가 상기 기재를 고려하여 상호 배타적이지 않은 범위까지 개시된 실시태양에 다수의 변경 및 변형을 가할 것이다. 또한, 다른 조합, 삭제, 치환 및 변형이 본 개시를 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 실시양태에 의해 한정되는 것으로 의도되지 않고, 첨부하는 청구항에 의해 한정될 것이다.

다수의 간행물 및 특허가 상기에 인용되었다. 인용된 간행물 및 특허는 그 전체가 인용됨으로써 본원에 포함된다.

Claims (11)

1. 비처리 지방조직을 포함하는 제1 성분을 제공하는 단계;
   탈응집되고 농축된 지방조직 세포를 포함하는 제2 성분을 제공하는 단계;
   상기 제1 성분과 제2 성분을 혼합하여 혼합물을 제공하는 단계를 포함하고,
   상기 비처리 지방조직과 지방조직 세포는 동일한 개체로부터 입수한 것이고,
   상기 지방조직 세포는 탈응집된 지방유래 줄기세포를 포함하며,
   상기 제2 성분 중 상기 탈응집된 지방유래 줄기세포는 상기 제1 성분의 비처리 지방조직에 혈관 생성을 촉진하기에 충분한 빈도를 가지는 것인, 연조직 손상의 치료나 미용적 재건을 위한 약학 조성물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 비처리 지방조직이, 개체로부터 얻은 탈응집되지 않고 손상되지 않은 지방조직을 포함하는 것인 제조 방법.
3. 제1항에 있어서, 제2 성분을 제공하는 단계가, 탈응집되지 않은 지방조직을 탈응집시켜 탈응집된 지방조직을 제공하는 단계를 포함하는 제조 방법.
4. 제3항에 있어서, 제2 성분을 제공하는 단계가 탈응집된 지방조직을 농축하는 단계를 더 포함하는 제조 방법.
5. 제1항에 있어서, 제2 성분을 제공하는 단계가, 지방조직을 처리하여 지방조직 세포를 수집하는 장치를 이용하는 것인 제조 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 탈응집된 지방유래 줄기세포가 제2 성분 중 유핵 세포 전체의 0.1% 이상인 제조 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 탈응집된 지방유래 줄기세포가 제2 성분 중 유핵 세포의 전체의 2% 내지 12%인 제조 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 탈응집된 지방유래 줄기세포가 제2 성분 중 유핵 세포의 전체의 2% 내지 12%인 제조 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 줄기세포 농도가 제1 성분 중의 줄기세포 농도보다 50% 이상 더 높아지도록 제1 성분과 제2 성분의 양을 조절하는 제조 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 줄기세포 농도가 제1 성분 중의 줄기세포 농도보다 200% 이상 더 높아지도록 제1 성분과 제2 성분의 양을 조절하는 제조 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 줄기세포 농도가 제1 성분 중의 줄기세포 농도보다 300% 이상 더 높아지도록 제1 성분과 제2 성분의 양을 조절하는 제조 방법.

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