CN100516200C - 用于角膜和眶内缺损修复的脂肪组织来源的基质细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用脂肪组织来源的基质细胞治疗和修复任何与眼有关的组织缺损的组合物及方法，所述组织缺损包括但不限于继发于外伤、代谢病、先天缺陷或外科手术的那些。脂肪组织来源的基质细胞以未分化、分化或脂肪细胞的状态单独或者在生物相容性材料的存在下培养。所得的材料外科使用以矫正许多恰当的眼内缺损。

Description

用于角膜和眶内缺损修复的脂肪组织来源的基质细胞及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2001年11月9日递交的美国序列号No.60/347,605的优先权。
发明领域
本发明提供了分离的脂肪组织来源的基质细胞，其被诱导表达至少一种眼内基质细胞的特征。还提供了用分化的或未分化的脂肪来源的基质细胞修复眼的角膜和眶内缺损的方法。
发明背景
眼是由多组织类型构成的复杂器官。眼由三个不同的层构成，从外到内依次为：巩膜和角膜、脉络膜和视网膜。这三层内部为折射介质：房水、晶状体和玻璃体。基质细胞为眼每一层构成整体所必要的组分，并与相邻上皮、内皮、神经元及炎性细胞共享重要的调节关系。许多情况影响眼和它的功能。例如，角膜疾病包括所谓的原发病和继发病(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)：46-54)。眼的原发病包括但不限于：无虹膜或虹膜缺失；红斑角皮病或皮肤变红及角化过度；以及具有多重内分泌缺陷的角膜炎。眼的继发病包括但不限于：化学损伤；热损伤；接触镜角膜病；反复角膜缘外科手术以及带状角膜病(自角膜缘向角膜形成灰色条带的变性病症)。
许多这些疾病涉及角膜自我更新的干细胞，其定居于角膜缘的基底层中，位于角膜和结膜之间(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)：46-54)。角膜缘功能不全(insufficiency)或干细胞机能障碍产生包括视力降低、畏光、炎症、水肿以及眼睑控制肌肉痉挛在内的症状。在有些情况下，这可以通过向角膜患病区域移植健康角膜缘组织得以矫正，象离散分布的化学烧伤的情况。许多证据显示角膜干细胞与它们下面的基质之间的相互作用对于正常功能是关键性的。
这两种相邻的细胞类型表现出特异性的自分泌和旁分泌途径。这些途径由基质细胞所释放的细胞因子介导，包括但不限于，转化生长因子β1和β2(TGFβ)、胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝生长因子(HGF)以及角质形成细胞生长因子(KGF)。这些细胞因子中每一个的受体由角膜上皮细胞合成。同样地，角膜上皮细胞合成TGFβ1和β2、IGF、bFGF和血管内皮生长因子(VEGF)。除了VEGF受体，基质细胞表达所有这些细胞因子以及血小板衍生生长因子(PDGF)和上皮生长因子(EGF)的受体(Kruse和Volcker，1997，Curr.Opin.Opthalmol.8(4)：46-54)。
角膜通过将光折射到晶状体和视网膜上在正常视力的维持中起着关键性的作用。这需要角膜上皮细胞连续不断地自我更新以保护深层组织免受感染(Lu等2001，Exp Biol Med 226(7)：653-64)。外科手术操作，例如屈光性角膜切削术或激光原位角膜磨镶术，涉及部分角膜的去除。实施这些操作用来治疗各种形式的近视(myopia或nearsightedness)(Wilson等2001，Arch Ophthalmol：119(6)：889-96)。
这些操作之后的修复需要伴随着上皮分层的基质收缩(Taliana等2001，Invest Ophthalmol Vis Sci；42(1)：81-9)。在愈合过程中，很多患者经历术后前“基质混浊”，在动物模型中特征在于出现表达α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的肌成纤维细胞(Nakamura等2001，Br JOphthalmol；85(2)：209-13)。这些肌成纤维细胞在培养物中由TGFβ诱导，并在体内被抗-TGFβ抗体阻断(Jester等1997，Cornea；16(2)：177-87；Jester等1999，Prog Retin Eye Res；18-(3)：311-56)。同样地，存在着上皮细胞和相邻基质间直接的相互作用能够诱导肌成纤维细胞基质分化的证据。这进一步受到羊膜存在的影响(Choi和Tseng 2001，Cornea；20(2)：197-204)。动物模型中“基质混浊”的程度与屈光性角膜切削术期间对角膜基质的损害深度相对应(Moller-Pedersen等1998，Cornea；17(6)：627-39)。而在患者中，角膜混浊的程度相同，不取决于去除上皮细胞的技术(基于机械或激光的技术)(Lee等2001，Ophthalmology；108(1)：112-20)。
多种生物材料已用于治疗和修复角膜和眼缺损及损伤。角膜胞外基质富含胶原质和糖胺聚糖(Robert等2001，Pathol Biol(Paris)；49(4)：353-63)。已发现一种糖胺聚糖-透明质酸糖胺多糖在大鼠和家兔模型中可改善角膜上皮伤口愈合，如通过评估基质和内皮层评价的(Nakamura等1997，Exp Eye Res；64(6)：1043-50；Chung等1999，Ophthalmic Res；31(6)：432-9)。Tseng及他人开拓了羊膜在治疗多种眼疾中的应用(美国专利No.6,152,142)。羊膜是有极性的，具有“基质”侧和“基底膜”侧。基质侧含有胶原I和III及纤连蛋白，其基底层分布有IV型胶原质、层粘连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖。羊膜的基底膜侧支持上皮细胞生长，而基质侧以与胶原相似的方式支持成纤维细胞的生长。羊膜分离自人类胎盘，冷藏，并用于眼内疾病的外科手术修复。
羊膜的作用机制尚未完全了解。不过，存在关于培养物中羊膜的存在抑制成纤维细胞表达TGFβ(Lee等2000，Curr Eye Res；20(4)：325-334)以及上皮细胞表达白介素1α和白介素1β(Solomon等2001，Br J Ophthalmol；85(4)：444-449)的体外证据。
羊膜已被成功地用于治疗广泛的角膜和眼缺损。例如，已经利用多层羊膜填充基质层、基底膜以及作为伤口覆盖物治疗深度角膜和巩膜溃疡(Hanada等2001，Am J Opthalmol；131(3)：324-31)。已发现羊膜可减轻HIV-1角膜炎(一种免疫介导的疾病)中的基质炎症和溃疡(Heiligenhaus等2001，Invest Ophthalmol Vis Sci；42(9)：1969-1974)。也已用羊膜治疗了几种神经营养性角膜溃疡(Chen等2000，Br JOphthalmol；84(8)：826-833)。羊膜恢复角膜和结膜表面，并减轻由急性化学或热烧伤引起的角膜缘基质炎症(Meller等2000，Ophthalmology；107(5)：980-989)。在患有部分角膜缘干细胞缺陷的患者中羊膜被用作为角膜缘自体移植或同种异体移植的备选(Anderson等2001，Br J Ophthalmol；85(5)：567-575)。羊膜也用于外科手术治疗翼状胬肉(从结膜延伸到角膜的膜翼状折叠，附着于巩膜上)(Solomon等2001，Ophthalmology：108(3)：449-460)。羊膜作为结膜备选物被成功地用于治疗晚发作的青光眼滤床渗漏(Budenz等2000，Am JOphthalmol；130(5)：580-588；Barton等2001，Invest Ophthalmol VisSci；42(8)：1762-1768)，以及当用于外科手术治疗带状角膜病(结节病、慢性眼色素层炎及其它病因继发的角膜基底膜中的钙沉积)时，可改善稳定角膜上皮的恢复并减轻眼疼痛(Anderson等2001，Cornea；20(4)：354-361)。
由于与获取羊膜材料有关的困难，研究人员一直在寻找修复眼或角膜缺损的基质材料的替代来源。
Cancedda等的EP 93830229.6公开了体外培养已分化的眼上皮细胞用于随后的移植以治疗角膜缺损的方法。上皮细胞的来源是来自健康眼的自体活检材料。这样患者既作为供体又作为受体。
van der Kooy等的美国专利No.6,117,675公开了分离自哺乳动物视网膜的干细胞，其在体外分化为视网膜色素上皮细胞，并被移植到患有视网膜疾病的个体中。视网膜干细胞的来源是胚胎或早期出生后组织。
Wille，Jr.的美国专利No.5,912,178公开了用于在体外形成各种类型的组织学完整的人类上皮的培养基和方法，所述上皮包括表皮、角膜、齿龈和输尿管组织。所得的上皮由分离的动物上皮细胞或分离自上皮组织的基底干细胞在体外生长。
Ogawa等的美国专利No.5,942,487公开了包含干细胞因子的能够施用于患病角膜组织以刺激角膜生长的组合物。该发明人猜测角膜干细胞被刺激迁移并生长。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美国专利No.5,863,531公开了体外制备的管状活基质组织，包含基质细胞和该基质细胞天然分泌的结缔组织蛋白，其附着于且实质上包被由生物相容性无生命材料构成的三维管状构架，其中具有通过基质细胞桥接的间质间隙。
本发明的目的是提供协助修复眼包括角膜缺损的细胞、材料和方法。
发明概述
本发明提供了脂肪来源的基质细胞或干细胞，它已分化为具有眼内或眼基质细胞的至少一种基因型或表型特征。该细胞可用于眼的变性疾病或其它疾病的治疗性治疗。
本发明还提供了利用和培养脂肪组织来源的基质细胞治疗任何病因学的眼内或眼缺损的方法和组合物。
在本发明的另一个方面，提供了稳定地定性和定量诱导来源于皮下、乳腺、生殖腺、网膜或任何其它脂肪组织部位的基质细胞表达至少一种眼内或眼基质细胞的基因型或表型的方法和组合物。
在本发明的另一个方面，分离的脂肪组织来源的细胞被诱导分化成为表达至少一种眼内基质细胞的特征的细胞，包括步骤：使分离的脂肪组织来源的基质细胞与眼诱导物质接触。该物质在化学成分确定的细胞培养基中，包括生长因子、细胞因子、化学制剂和/或激素，浓度足以诱导分离的脂肪组织来源的基质细胞表达至少一种眼细胞标志。
在本发明的另一个方面，脂肪组织来源的基质细胞被基因改造以表达能够修饰细胞表型并诱导促进任何眼内缺损恢复和修复的途径的蛋白。这通过在合适的条件下将细胞暴露于含核酸(包括转基因)的基因转移载体完成，这样预期的核酸被引入到细胞中。备选地，细胞用裸露核酸处理且允许掺入裸露核酸。
本发明进一步提供了治疗宿主中变性眼病的方法，包括施用已被诱导表达期望的眼细胞的一种特征的脂肪来源的基质细胞。本发明独特的优势在于脂肪组织来源的基质细胞可直接从宿主分离(自体移植)，或者可以由另一宿主捐赠(同种异体移植)。
在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞以其未分化或分化状态在由用于外科手术修复眼内基质溃疡位点的天然或合成的生物相容性材料组成的三维基质之中或之上培养。
在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞无需分化直接用于细胞的自体和同种异体移植，以通过矫正气泡渗漏而促进成功的青光眼外科手术，在这个实施方案中，向眼施用脂肪来源的基质细胞，优选是在所期望的位置上，并通过(i)共同施用合适的细胞因子和其它生物因子，或者(ii)已经存在的或在宿主中诱导的体内因子而使之分化。
又在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞用于细胞的自体和同种异体移植，以治疗人类疾病，包括但不限于，由屈光性/治疗性角膜切削术诱导的角膜混浊，“露巩膜”去除翼状胬肉期间的修复，外科手术治疗带状角膜病，外科手术去除结膜和角膜表面的肿瘤或病变或疤痕组织等。
又在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞与羊膜组织联合植入到病眼中。
在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞在植入病眼中之前分化为成脂细胞系细胞。
又在本发明的另一方面，脂肪组织来源的基质细胞分化为成脂细胞系细胞并与羊膜组织一起植入到病眼中。
本发明的细胞或者作为均一细胞群或者作为其中其它细胞分泌物质支持该眼样细胞生长或分化的细胞群的一部分应用。
本发明也构思了用于从脂肪组织中分离干细胞或基质细胞的试剂盒，其包括用于从患者中分离脂肪组织的工具以及用于将干细胞与脂肪组织的剩余物分离的工具。试剂盒还包括用于分化干细胞的培养基，其中培养基导致细胞表达眼细胞的至少一种基因型或表型特征，或者通常是眼原性的。
本发明进一步包括从本发明的脂肪来源的细胞设计改造组织的组合物和方法。此类组合物包括与使组织分化和扩展的生物相容性网格(lattice)结构组合的脂肪来源的细胞。这样以这种方式，眼样组织或完整器官得以制造。生物相容性网格可以本身是脂肪来源的，并包括任何人类蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纤连蛋白分子、激素、细胞因子和生长因子。网格也可以包括或由选自羟基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己内酯、透明质酸糖胺多糖、透明质酸或其组合的单体的聚合物制备。可选地，聚合材料可以是蛋白、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈、合成聚合物或其组合。聚合材料也可以是通过交联其中分散有细胞的聚合物悬液形成的水凝胶。
本发明的其它目的和特点由于下述公开内容及所依附的权利要求将会更加充分明显。
附图的简要说明
图1为人类脂肪来源的基质细胞的流式细胞仪分析。描绘的是代表性的CD9、CD29(β1-整联蛋白)、CD44(透明质酸受体)、CD49d(α4整联蛋白)、CD55(衰变加速因子)以及HLA-ABC(1类组织相容性抗原)的流式细胞仪分析。分离自单个供体的未分化的基质细胞用针对所示抗原的单克隆抗体(实线，每个图表的右侧)；同种型单克隆对照抗体(虚线，每个图表的左侧)染色。代表n＝5个供体。柱条表示荧光强度＞99％对照。
图2为12天共培养物中淋巴先祖细胞的示意图。显著百分比的CD34+和CD34-细胞表达CD7或CD10抗原(n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体)。个体表型代表下列总造血细胞群的百分比：早期淋巴先祖细胞分别为20.2％(CD34+CD7+)和9.5％(CD34+CD10+)；NK/T-细胞先祖(CD34-CD7+)，31.4％；而B-细胞先祖(CD34-CD10+)，7.7％。
发明详述
本发明是脂肪来源的基质细胞或干细胞，其被诱导表达至少一种起源于眼的细胞的基因型或表型特征。更优选地，细胞具有至少一种角膜上皮细胞的基因型或表型特征。可选地，细胞具有至少一种眼基质细胞的基因型或表型特征。由本发明的方法产生的细胞提供了部分或完全分化的、或者未分化的功能细胞来源，所述细胞具有成熟眼细胞的基因型或表型特征，用来研究、移植和研发细胞治疗产品，以治疗动物疾病，优选人类疾病，组织修复或改善，以及矫正眼，优选角膜上皮的变性疾病。也包括制备和利用此类细胞的方法。
I.定义
“结膜”是指衬着眼睑并覆盖巩膜的暴露表面的膜。
“角膜”是指形成眼的纤维膜的前部的透明构造。它由5层构成，具体地：1)前角膜上皮，与结膜是连续的；2)前限制层(前弹性层)；3)固有质(substantia propria)或基质层；4)后限制层(后弹性层)；和5)前房的内皮或keratoderma。
“视网膜”是指眼球3层被膜的最里层，包绕玻璃体并在后与视神经相连续。它被分为视部(位于脉络膜上)、睫状体部(位于睫状体上)以及虹膜部(位于虹膜后表面上)。粗略地讲，视网膜由外色素层(色素部)以及内透明层(神经部)组成，它们一起构成了视部。眼的视部由9层组成，从内向外命名为：1)内限制膜；2)神经纤维层；3)神经节细胞层；4)内网织层；5)内核层；6)外网织层；7)外核层；8)外限制膜；和9)杆细胞和锥细胞层。
“转化生长因子β”(TGFβ)是55kDa、391个氨基酸(aa)的前蛋白原，其由23个aa的信号序列，256个aa的蛋白原(pro)-区域以及112个aa的成熟区段组成。分泌前，蛋白原-区域由弗林蛋白酶样蛋白酶在RxxR位点处切割。这产生非糖基化的25kDa二硫键连接的成熟二聚体，其与它先前所连的二硫键连接的蛋白原-区域非共价结合，形成“隐性复合物”。该复合物被分泌。活化在胞外在多种条件下发生，极有可能是通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶引发由转录因子Smad家族介导的胞内信号级联反应。
“碱性成纤维细胞生长因子”(bFGF)，也被称为FGF-2，为18kDa非糖基化的多肽，其既表现出胞内活性又表现出胞外活性。BFGF作为单体分泌。分泌后，bFGF被隔绝到细胞表面硫酸肝素(HS)或基质糖胺聚糖上。虽然bFGF作为单体分泌，细胞表面HS似乎使单体bFGF以非共价侧对侧的构型二聚化，其随后能够二聚化并活化FGF受体。
“血小板衍生生长因子”(PDGF)为30kDa的命名为A和B的两个基因上不同而结构上相关的多肽链的同二聚体或异二聚体组合。它最初在血清中被鉴定为血小板衍生的成纤维细胞有丝分裂原。后来的研究证明许多细胞类型分泌PDGF，并且该细胞因子是中胚层细胞系(肌肉、骨骼、结缔组织)细胞的有丝分裂原。
“血管内皮生长因子”(VEGF)首先被鉴定为内皮细胞的生长和存活因子。它诱导内皮细胞增殖并调节血管生成和脉管生成。VEGF是肝素结合糖蛋白，其作为45kDa的同二聚体分泌。很多细胞类型但通常非内皮细胞本身分泌VEGF。
“肝细胞生长因子”(HGF)，也被称为分散因子，是促进有丝分裂发生、迁移、侵入和形态发生的多功能细胞因子。HGF-依赖性信号传导通过促进聚集和细胞粘附而调节整联蛋白功能。HGF/SF-诱导的效果通过MET酪氨酸激酶受体配体结合之后的信号传导而发生。
“角质形成细胞生长因子”(KGF)或FGF-7，是28kDa的单链分泌糖蛋白，其具有相对局限于上皮细胞的靶标。该分子作为194个aa的前体合成，含有31个aa的信号序列和163个aa的成熟区段。成熟的生长因子通过该分子分离的区域与肝素及其受体(KGFR)结合。表达FGF-7的成人细胞包括成纤维细胞、T-细胞、平滑肌细胞和卵巢卵泡膜细胞。在胚胎中，KGF可在发育的许多阶段见于整个间充质。
“胰岛素样生长因子”(IGF)，IGF-I和IGF-II，与胰岛素享有50％的结构同源性。IGF起着细胞增殖的促有丝分裂刺激物以及细胞凋亡途径的抑制剂的作用。在生长激素(GH)的调控下，肝是IGF产生的主要部位。IGF-I水平也受到营养和发育阶段的影响。自分泌和旁分泌组织产生的IGF有助于可用于生长调控的IGF的水平。
“发育表型”是细胞通过分化过程获得特定表型的潜能。
“激素”是由细胞分泌的且在接触时导致同一个细胞或另一个细胞表型改变的任何物质。
“基因型”是指分化途径相关基因的至少一个信使RNA转录物的表达。
术语“转基因的”用于描述任何动物或其部分，包括但不限于在其细胞内包括外源遗传材料的细胞、培养物或组织。本发明的细胞可以向其添加DNA，并且然后这些细胞能够用于移植或者用于体外产生激素、细胞或组织。
“转基因”是指通过技术手段插入到细胞中的任何DNA片段，其成为由该细胞发育而来的细胞、细胞系、组织或生物体基因组的一部分(即稳定地整合或作为稳定的染色体外元件)。这种转基因可包括对于被引入异源基因的细胞或生物体来说部分或完全异源或者外来的基因，或者可代表与该生物体内源基因同源的基因。包括在该定义中的是通过提供RNA序列，转录成为DNA，然后掺入基因组中所创建的转基因。术语“转基因的”还另外包括通过体外操作或通过任何转基因技术改变了其基因组的任何生物体或其部分，包括但不限于细胞、细胞系、细胞培养物或组织。
II.脂肪来源的干细胞或基质细胞
脂肪来源的干细胞或“脂肪来源的基质细胞”是指起源于脂肪组织的细胞。“脂肪”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是来自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织部位的褐色或白色脂肪组织。优选地，脂肪为皮下白色脂肪组织。此类细胞可以包括原代细胞培养物或者永生化的细胞系。脂肪组织可以来自于具有脂肪组织的任何生物体。优选地，脂肪组织是哺乳动物的，更优选地该脂肪组织是人类的。脂肪组织便利的来源是来自吸脂外科手术，不过，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对于本发明不是关键性的。
成人髓外脂肪组织来源的基质细胞代表了能够以对患者最小风险或者不适而常规收获的基质干细胞来源。病理证据提示脂肪来源的基质细胞能够沿着多种细胞系途径分化。脂肪组织容易得到并且在许多个体中丰富。在美国肥胖为流行病比例的状况，其中大于50％的成人超过了推荐的基于他们的身高的BMI。
已经充分证明脂肪细胞是可补充的细胞群。即使是通过吸脂术或其它操作在外科手术除去后，常见个体中脂肪细胞随着时间的重现。这提示脂肪组织含有能够自我更新的基质干细胞。
脂肪组织为组织工程应用提供了许多实用的优势。首先，它很丰富。其次，它能以患者最小风险的方法获得。第三，它是可补充的。虽然基质细胞代表小于0.01％的骨髓有核细胞群，但每克脂肪组织存在高达8.6×104个基质细胞(Sen等2001，Journal of CellularBiochemistry 81：312-319)。从0.5千克脂肪组织离体扩增2到4周可产生高达500,000,000个基质细胞。这些细胞可即刻使用，或者冷藏以备将来的自体或同种异体应用。
脂肪来源的基质细胞也表多种粘附蛋白和表面蛋白。这些蛋白包括细胞表面标志例如CD9；CD29(整联蛋白β1)；CD44(透明质酸受体)；CD49d、e(整联蛋白α4、5)；CD54(ICAM1)；CD55(衰变加速因子)；CD105(endoglin)；CD106(VCAM-1)；CD166(ALCAM)和HLA-ABC(I类组织相容性抗原)；以及细胞因子例如白介素6、7、8、11；巨噬细胞集落刺激因子；GM集落刺激因子；粒细胞集落刺激因子；白血病抑制因子；干细胞因子以及骨形态发生蛋白。许多这些蛋白具有行使造血支持功能的潜能，并且它们都为骨髓基质细胞所共有。
分离、扩增和分化人类脂肪组织来源的细胞的方法已有报道。例如参见Burris等1999，Mol Endocrinol 13：410-7；Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.2002Jan 18；290(2)：763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，189：54-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50：407-413；Halvorsen等2001，TissueEng.7(6)：729-41；Harp等2001，Biochem Biophys Res Commun 281：907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 10：43-48；Sen等2001，Journal of Cellular Biochemistry 81：312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13：513-517。脂肪组织来源的基质细胞通过胶原酶消化和差速离心从切碎的人脂肪组织中获得[Halvorsen等2001，Metabolism 50：407-413；Hauner等1989，J Clin Invest 84：1663-1670；Rodbell等1966，.J Biol Chem 241：130-139]。其他人已经证明人类脂肪组织来源的基质细胞能够沿着脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞系途径分化[Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.2002 Jan 18；290(2)：763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，189：54-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50：407-413；Halvorsen等，2001，Tissue Eng.2001 Dec；7(6)：729-41；Harp等2001，Biochem BiophysRes Commun 281：907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 10：43-48；Sen等2001，Journal of Cellular Biochemistry 81：312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13：513-517；Zuk等2001，TissueEng.7：211-228。
人类脂肪组织来源的成人基质细胞代表了能够以对患者最小风险或者不适而常规收获的成人干细胞来源。它们能够离体扩增，沿着独特的细胞系途径分化，被基因工程改造，以及作为自体或者同种异体移植重新引入到个体中。
匹兹堡大学(University of Pittsburgh)和加州大学董事会(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795以及转让给匹兹堡大学的美国专利申请No.2002/0076400公开了基本上没有脂肪细胞和红细胞的脂肪来源的干细胞和网格，以及结缔组织干细胞克隆群。所述细胞可以在体内和体外单独或者处于生物相容性组合物中使用，以产生分化的组织和结构。另外，细胞可以扩增并培养以产生激素并提供支持其它细胞群生长和扩增的条件培养基。在另一个方面，这些出版物公开了基本上无细胞的脂肪来源的网格，它包括来自脂肪组织的胞外基质材料。网格可用作为基质(substrate)在体内或体外促进细胞生长和分化为原基或成熟组织或结构。没有一种出版物公开被诱导表达眼内基质细胞的至少一种表型或基因型特征的脂肪组织来源的基质细胞。
转让给Artecel Sciences的美国专利No.6,391,297公开了分离的人类脂肪组织来源的基质细胞的组合物，其已经分化表现出成骨细胞的至少一种特征，能够用于体内修复骨骼和治疗骨病。该脂肪来源的成骨细胞样细胞可任选地进行遗传修饰或与基质组合。
转让给BioHoldings International的美国专利No.6,426,222公开了通过在必须含有糖皮质激素的液体营养培养基中温育脂肪组织细胞而从人类髓外脂肪组织诱导成骨细胞分化的方法。
列举Halvorsen等为发明人的WO00/44882和美国专利No.6,153,432公开了将分离自脂肪组织的人类前脂肪细胞分化为带有与在分离的原始脂肪细胞中所观察到的相似的生物化学、遗传以及生理学特征的脂肪细胞的方法和组合物。
Artecel Sciences的WO01/62901以及公开的美国专利申请No.2001/0033834公开了已经被诱导表达神经元、星形胶质细胞、造血先祖细胞或肝细胞的至少一种表型特征的分离的脂肪组织来源的基质细胞。另外，也公开了已经分化从而缺乏脂肪细胞表型标志的分离的脂肪组织来源的基质细胞。
转让给Artecel Sciences的美国专利No.6,429,013公开了涉及已经被诱导表达至少一种软骨细胞特征的分离的脂肪组织来源的基质细胞的组合物。也公开了分化这些细胞的方法。
Peterson等的美国专利No.6,200,606公开了具有产生骨骼或软骨潜能的前体细胞可以从包括外周血、骨髓和脂肪组织的多种造血及非造血组织中分离。
可用于本发明的方法的脂肪组织来源的基质细胞是通过本领域技术人员公知的各种方法分离的，例如象匹兹堡大学等的WO 00/53795中所描述的。在优选的方法中，脂肪组织分离自哺乳动物受试者，优选为人类受试者。优选的脂肪组织来源是网膜脂肪。在人类中，脂肪典型地通过吸脂术分离。如果本发明的细胞要移植到人类受试者中，优选脂肪组织分离自同一个受试者，以便提供自体移植。可选地，移植的细胞是同种异体的。
作为非限制性实例，在分离脂肪组织来源的基质细胞的一个方法中，脂肪组织用0.01到0.5％之间，优选0.04到0.2％，最优选0.1％浓度的胶原酶、0.01到0.5％之间，优选0.04到0.04％，最优选0.2％浓度的胰蛋白酶在25到50℃之间，优选在33到40℃之间，最优选在37℃的温度下处理10分钟到3小时，优选30分钟到1小时，最优选45分钟。细胞通过20微米到800微米之间，更优选40微米到400微米之间，最优选70微米的尼龙或粗棉布网孔过滤器。然后将细胞直接在培养基中或经Ficoll或Percoll或其它粒子梯度进行差速离心。细胞可以在4到50℃之间，优选在20到40℃之间，最优选在25℃的温度下以100到3000X g之间，更优选200到1500X g之间，最优选以500Xg的速度离心1分钟到1小时，更优选2到15分钟，最优选5分钟。
又在另一种分离脂肪来源的基质细胞的方法中，利用了诸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的机械系统。使用系统将脂肪组织样品引入到自动化装置中，使其经历洗涤阶段和分离阶段，其中组织被搅拌并旋转，从而将所得的细胞悬液收集到离心预备状态的容器中。以这种方式，从组织样品中分离脂肪来源的细胞，保持目的细胞的细胞完整性。
III.诱导脂肪来源的基质细胞表现出眼细胞的至少一种特征
本发明包括处理脂肪来源的基质细胞以诱导它形成表达眼细胞的至少一种基因型或表型特征的细胞。如何诱导脂肪来源的基质细胞分化的非限制性实例包括：1)细胞培养基的利用；2)支持细胞的利用；3)将未分化的细胞直接植入患者组织中；和4)细胞工程技术。
A)细胞培养基诱导
虽然本发明不束缚于任何操作理论，人们相信用含有血清、胚胎提取物、羊膜组织/液体、纯化或重组的生长因子、细胞因子、激素和/或化学制剂的组合的培养基，在二维或三维微环境中处理脂肪来源的基质细胞，将会诱导预期的分化。
更具体地，本发明提供了将脂肪来源的细胞分化为具有眼细胞的基因型或表型特性的细胞的方法，包括：以期望的密度平板接种分离的脂肪来源的成人干细胞，包括但不限于约1,000到约500,000细胞/cm2的密度；在化学成分确定的培养基中温育细胞，所述培养基包含从由生长因子、激素、细胞因子、血清因子、核激素受体配体或任何其它明确的化学制剂组成的组中选择的至少一种化合物。
又在本发明的另一个方面，本发明的分化细胞在培养物中生长，直至观察到角膜上皮形成的迹象。然后通过本领域熟练技术人员公知的标准生物化学分析技术对含有上皮的培养基分析可指示角膜上皮功能的标志的存在。然后将角膜上皮层移入到宿主组织中用以组织增殖或再生目的。
可用于本发明的方法的基本培养基包括但不限于NeurobasalTM(补充有或未补充胎牛血清或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))、N2、B27、Eagle极限必需培养基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有或无Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培养基(BME-添加Earle′s盐基)、Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5A培养基、培养基M199(M199E-带Earle′s盐基)、培养基M199(M199H-带Hank′s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-E-带Earle′s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-H-带Hank′s盐基)以及Eagle极限必需培养基(MEM-NAA-带非必需氨基酸)，在无数其它培养基中，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman& Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC153。优选的用于本发明的培养基为DMEM。这些及其它有用的培养基可获自GIBCO，Grand Island，纽约，美国以及Biological Industries，Bet HaEmek，以色列等。许多这些培养基概述于Academic Press，Inc.出版的由William B.Jakoby和Ira H.Pastan编辑的Methods in Enzymology，卷LVIII，″Cell Culture″，62-72页中。
优选的培养角膜上皮细胞的培养基是本领域公知的，并包括Wille，Jr.的美国专利No.5,912,175中所描述的培养基。一般而言，可用于本发明的方法的培养基含有牛或其它物种来源的胎血清，浓度至少1％到约30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％。鸡或其它物种来源的胚胎提取物以约1％到30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％的浓度存在。
可用于本发明的生长因子、细胞因子、激素及其它特异性因子包括但不限于在pg/ml到mg/ml水平之间浓度的生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨嗜细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、osteoprotegerin配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子以及骨形态发生蛋白。例如在此浓度下，可用于本发明的方法的生长因子、细胞因子和激素在集落形成单位(CFU)测定中能够诱导高达100％的血细胞形成(淋巴系、红系、髓系或血小板系)(Moore等(1973)J.Natl.Cancer Inst.50：603-623；Lee等(1989)J.Immunol.142：3875-3883；Medina等(2993)J.Exp.Med.178：1507-1515。
已进一步确认可以向培养基中添加额外的组分。此类组分包括抗生素、白蛋白、氨基酸及本领公知的用于培养细胞的其它组分。另外，可以添加组分以增强分化过程。“化学制剂”是指类固醇、类视黄醇及相对于阳性对照诱导脂肪来源的基质细胞分化至少25-50％的其它化学化合物或药剂。
已确认上文所述的细胞培养基条件产生表达单一类型的眼细胞的至少一种基因型或表型特征的细胞。该特定的细胞类型通过本领域技术人员公知的任何手段分离。尤其有用的是利用该分化细胞表达的基因型或表型特征的手段。如下文所列的目的细胞的表型标志是本领域普通技术人员所熟知的，并已在文献中充分地公开。额外的表型标志继续有待公开或无需过度实验即可鉴定。这些标志中的任何一种都可用来确认脂肪来源的成人干细胞已经被诱导至分化状态。细胞系特异性表型特征包括但不限于细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞形态学和/或分泌产物。例如，分化的角膜上皮细胞合成转化生长因子β1和β2(TGFβ)、胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝生长因子(HGF)以及角质形成细胞生长因子(KGF)的受体(Kruse和Volcker，1997，Curr Opin Opthalmol；8(4)：46-54)。本领域普通技术人员将会意识到已知的量热、荧光、免疫化学、聚合酶链式反应、化学或放射化学方法可容易地确定细胞系特异性标志的存在或不存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了去分化的、分离的脂肪来源的成人干细胞，其能够在能够进行此类分化的培养基中被诱导表达眼细胞的至少一种基因型或表型特征。去分化的脂肪来源的成人干细胞通过缺乏成熟脂肪细胞标志进行鉴定。
B)利用支持细胞促进脂肪来源的基质细胞分化
在本发明的另一个实施方案中，支持细胞被用来促进脂肪来源的基质细胞分化。因此，本发明的脂肪来源的细胞被分离并在细胞群中培养，最优选该群是确定的群。该细胞群是异质的，包括为本发明的细胞提供因子的支持细胞。支持细胞包括促进目的细胞分化、生长和维持的其它细胞类型。作为非限制性实例，如果需要表达至少一种角膜上皮细胞的基因型或表型特征的脂肪来源的基质细胞，首先通过上文所述的任何手段分离脂肪来源的基质细胞，并在存在其它眼或非眼支持细胞下在培养物中生长。在另一个实施方案中，支持细胞来自于从培养的角膜组织中取得的这些细胞类型的原代培养物。又在另一个实施方案中，支持细胞来自于永生化的细胞系。在一些实施方案中，支持细胞是自体获得的。在其它实施方案中，支持细胞是同种异体获得的。
本发明也构思用于支持目的细胞分化的细胞可被基因工程改造为支持细胞。细胞通过下文所述的或者本领域技术人员公知的任何方法被基因改造以表达外源基因或阻遏内源基因的表达。一种基因改造本发明的细胞的方法包括将细胞暴露于裸露核酸片段(即DNA或RNA)，由此核酸以核酸在细胞内表达的方式被掺入该细胞的基因组中。可选地，本发明的细胞被暴露于包含包括转基因的核酸的基因转移载体，由此该核酸在适于转基因在细胞内表达的条件下被引入到细胞中。
C)植入
在另一方面，本发明提供了可用于自体及同种异体移植的表达至少一种眼细胞基因型或表型特征的脂肪来源的基质细胞和分化细胞。优选地，受试者为哺乳动物，更优选地，受试者为人类。
因此，又在另一个方面，本发明公开了向受试者提供能够表达至少一种眼细胞的基因型或表型特征的分化细胞的方法，包括：
a)分离脂肪组织来源的基质细胞；
b)在适于分化该细胞的培养基中平板接种并温育细胞；
c)将分化细胞引入到受试者中。
在本发明的另一个实施方案中，涉及向受试者提供未分化的脂肪来源的基质细胞的方法，包括
a)分离脂肪组织来源的基质细胞；
b)将该未分化的细胞引入到受试者中。
本发明构思当向受试者引入未分化的脂肪来源的基质细胞时，在一个特别的实施方案中，将它们直接引入到病眼中。又在本发明的另一方面，未分化的脂肪来源的基质细胞与如本文所述的将会提供适于该基质细胞在体内分化的环境的任何支持细胞或培养基或分化因子一起引入。例如，这些支持细胞在一个特别的实施方案中是羊膜细胞。在另一个实施方案中，支持细胞来自于从培养的角膜组织中取出的这些细胞类型的原代培养物。又在另一个实施方案中，支持细胞来自于永生化的细胞系。在一些实施方案中，支持细胞是自体获得的。在其它实施方案中，支持细胞是同种异体获得的。
在另一个实施方案中，去分化的脂肪来源的细胞与药学上可接受的载体组合提供用于治疗应用，包括但不限于组织修复、再生、重建或增强。脂肪来源的细胞可以通过美国专利No.6,153,432(特此引用作为参考)中公开的方法培养以使细胞去分化，由此该去分化的成人干细胞然后被诱导表达不同于脂肪组织来源细胞的细胞的基因型或表型特征。去分化的脂肪来源的细胞可以被修饰以包括非内源性基因序列用以产生目的蛋白或肽。去分化的脂肪来源的细胞可以，在备选的实施方案中，在二维或三维基质中施用于宿主以用于预期的治疗目的。在一个实施方案中，去分化的细胞是从患者自身细胞中自体获得的。备选地，去分化的细胞同种异体获得。
D)对本发明的脂肪来源的细胞的遗传操作
干细胞及其后代是基因治疗的重要靶标，其中插入的基因促进移植了这些干细胞的个体的健康。
又在另一个实施方案中，表达眼细胞的至少一种基因型或表型特征的脂肪组织来源的细胞被基因改造以表达外源基因或阻遏内源基因的表达。本发明提供了基因改造此类细胞和细胞群的方法。一种基因改造本发明的细胞的方法包括将细胞暴露于裸露核酸片段(即DNA或RNA)，由此该核酸被掺入该细胞的基因组中从而核酸在细胞内表达。
备选地，本发明的细胞被暴露于包含包括转基因的核酸的基因转移载体，由此该核酸在适于转基因在细胞内表达的条件下被引入到细胞中。转基因可以是表达盒，包括可操作地连接于合适的启动子的编码多核苷酸。编码多核苷酸可以编码蛋白，或者它可以编码生物学活性的RNA(如反义RNA或核酶)。这样，例如，编码多核苷酸可以编码赋予毒素抗性的基因、激素、细胞因子、细胞表面结合的胞内信号传导部分(如细胞粘附分子、受体等)、促进生长或内源激素分泌的因子、肽或其它因子、或者任何其它细胞产物。当期望使用基因转移技术递送给定的转基因时，它的序列将会是已知的。
在表达盒内，编码多肽可操作地与合适的启动子连接。合适的启动子的实例包括原核启动子和病毒启动子(如反转录病毒启动子、疱疹病毒启动子、巨细胞病毒启动子)。其它合适的启动子是真核启动子，例如增强子、组成型活性启动子、信号特异性启动子及组织特异性启动子。本领域技术人员熟知选择适于驱动基因在预定的细胞环境中表达的合适的启动子。表达盒可以包括不止一个编码多核苷酸，而且根据需要它可以包括其它元件(如多聚-A序列、转录调控元件等)。
包含转基因的表达盒应当掺入适于将转基因递送到细胞的遗传载体中。根据期望的最终应用，可以使用诸如质粒、裸露DNA或病毒的任何这类载体来基因改造细胞。可以使用在所用载体中构建期望的表达盒的任何方法。这些方法是本领域熟知的，并且包括诸如直接克隆、同源重组等的方法。本领域技术人员将会理解载体的选择在很大程度上将决定用于将该载体引入细胞的方法。
然后可以通过多种不同的方法在使转基因在体内表达的条件下将基因改变的细胞引入到生物体中。因此，在本发明优选的实施方案中，转基因可以编码生长因子例如TGFβ。然后可以将含有TGFβ转基因的细胞引入到患病的人或其它哺乳动物的眼中。
备选地，外源外来的或同源的核酸通过许多本领域技术人员熟悉的其它技术转移到本发明的细胞中。因此，核酸通过包括但不限于电穿孔、磷酸钙、微注射、脂质转染、反转录病毒或其它病毒或微生物载体的方法或者本领域技术人员公知的任何其它手段转移。
E)细胞表征
对所得的分化细胞的“表征”旨在鉴定可指示基质细胞细胞系定型到特定终末分化状态的表面及胞内蛋白、基因和/或其它标志。这些方法包括但不限于(a)利用用第二荧光标记连接的蛋白特异性单克隆抗体通过免疫荧光法检测细胞表面蛋白，包括利用流式细胞计数法；(b)利用用第二荧光标记连接的蛋白特异性单克隆抗体通过免疫荧光法检测胞内蛋白，包括利用流式细胞计数法；(c)通过聚合酶链式反应、原位杂交和/或RNA印迹分析检测细胞基因。终末分化细胞可以通过鉴定指示基质细胞细胞系定型到特定终末分化状态的表面及胞内蛋白、基因和/或其它标志来表征。这些方法包括但不限于(a)通过对脂肪来源的基质细胞表面蛋白例如碱性磷酸酶、CD44、CD146、整联蛋白β1或骨桥蛋白进行免疫荧光测定例如流式细胞计数或者原位免疫染色而检测细胞表面蛋白(Gronthos等1994 Blood 84：4164-4173)，(b)通过利用特异性单克隆抗体对脂肪组织来源的基质细胞进行免疫荧光测定法例如流式细胞计数或者原位免疫染色而检测胞内蛋白；(c)通过诸如聚合酶链式反应、原位杂交和/或其它印迹分析的方法检测细胞系选择性mRNA的表达，例如由角膜上皮细胞所产生的那些，包括TGFβ1和β2、IGF、bFGF和血管内皮生长因子(VEGF)(参见Gimble等1989Blood 74：303-311)。
F)利用本发明的细胞作为治疗剂
最优选地，本发明的细胞和细胞群作为治疗剂使用。在一个实施方案中，向眼施用脂肪来源的基质细胞，优选在期望的部位，并通过(i)共同施用合适的细胞因子和其它生物因子或者(ii)已经存在的或在宿主中诱导的体内因子而使之分化。一般而言，此类方法包括将细胞转移到期望的组织或库(depot)，或者在体外作为移植或植入前的移植物，或者在体内直接施与动物。细胞通过任何合适的方法被转移到期望的组织中，这通常根据组织类型而变化。例如，通过用含有细胞的培养基浸泡移植物或者灌注移植物而将细胞转移到移植物上。备选地，细胞被种植在组织内期望的部位上以建立细胞群。可利用本领域技术人员熟知的装置，例如种植有细胞的导管、套针、套管或支架等而将细胞转移到体内部位。
本发明的分化或未分化的脂肪来源的基质细胞可用于治疗多种疾病。该细胞被用于治疗角膜的疾病，包括但不限于：无虹膜或虹膜缺失；红斑角皮病或皮肤变红及角化过度；以及具有多重内分泌缺陷的角膜炎；化学损伤；热损伤；接触镜角膜病；以及反复角膜缘外科手术或角膜缘功能不全。另外，本发明的细胞在诸如屈光性角膜切削术或激光原位角膜磨镶术的外科手术操作之后可用于再生角膜，这两者都涉及部分角膜的去除。这些操作的恢复通常引起术后的前“基质混浊”，特征在于动物模型中出现表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞，这可以通过利用本发明的细胞和操作来预防。待治疗的疾病状态可以是自身免疫机能障碍或病毒或某些其它传染因子的感染造成的。
IV.组织工程
本文所述的细胞可以在组织工程中使用。本发明提供了产生动物物质的方法，包括在足以使其扩增并分化为期望物质的条件下维持本发明的细胞。所述物质可以包括，例如眼的一部分。就此而论，本文所述的细胞可与任何已知的组织工程技术联合应用，所述组织工程技术包括但不限于下面描述的那些技术：Advanced Tissue Sciences，Inc.的美国专利No.5,902,741和5,863,531；Vacanti等的美国专利No，6,139,574；Vacanti等的美国专利No.5,759,830；Vacanti的美国专利No.5,741,685；Vacanti等的美国专利No.5,736,372；Vacanti等的美国专利No.5,804,178；Vacanti等的美国专利No.5,770,417；Vacanti等的美国专利No.5,770,193；Griffith-Cima等的美国专利No.5,709,854；Atala等的美国专利No.5,516,532；Vacanti等的美国专利No.5,855,610；Vacanti等的美国专利No.5,041,138；Vacanti等的美国专利No.6,027,744；Vacanti等的美国专利No.6,123,727；Kemp等的美国专利No.5,536,656；Skjak-Braek等的美国专利No.5,144,016；Vacanti的美国专利No.5,944,754；Tubo等的美国专利No.5,723,331以及Sittinger等的美国专利No.6,143,501。
为产生这样的结构，细胞和细胞群在适于其扩增并分裂形成器官的条件下维持。这可以通过将它们转移到动物中典型地期望新物质的部位而实现。因此，本发明能够在其中所述细胞植入了这样的组织中的动物中促进部分眼的再生。
又在其它实施方案中，细胞在体外被诱导分化并扩增为组织。就此而论，细胞可以单独或在细胞混合物中给药，或者备选地可以在促进形成有益于组织发育的三维结构的基质上培养。因此，例如，细胞可以培养于或者种植在生物相容性网格上，例如包括胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子等的网格上。这样的网格可以塑造成期望的形状以促进组织类型的发育形成。
因此，本发明提供了包括本发明的细胞和细胞群以及生物相容性网格的组合物。网格可以从聚合材料形成，具有作为网孔或海绵的纤维，典型地具有在100μm和约300μm之间数量级的空隙。这种结构提供细胞能够在上面生长和增殖的充足面积。期望地，网格随着时间可生物降解，这样它将随着动物物质的发育形成而被其吸收。合适的聚合物或共聚物网格利用单体例如羟基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己内酯等制备。其它网格可包括蛋白、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈或合成聚合物，尤其是生物可降解聚合物，或其任何组合。而且，根据需要，网格可以包括激素，例如生长因子、细胞因子、形态发生素(如视黄酸等)、期望的胞外基质材料(如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或其它材料(如DNA、病毒、其它细胞类型等)。
为形成该组合物，细胞被引入到网格中，从而它们渗透进其中的间质间隙。例如，基质可以用含有细胞的溶液或悬液浸泡，或者该细胞溶液或悬液可以注入或注射到基质中。优选地，利用通过交联包括聚合物并且其中还分散有本发明的细胞的悬液而形成的水凝胶。这种形成方法允许细胞分散在整个网格中，促进网格更加均匀地被细胞渗透。当然，组合物还可以包括期望表型的成熟细胞或其前体，特别地用于加强对网格内本发明细胞的诱导，或者促进网格内激素的产生。
本领域技术人员将会理解适于包括在组合物中的网格可来自任何合适的来源，如基质凝胶(matrigel)，并且当然可以包括合适网格的商业来源。另一种合适的网格来自于脂肪组织的无细胞部分，例如基本上没有细胞的脂肪组织胞外基质。典型地此类脂肪来源的网格包括蛋白例如蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纤连蛋白、胶原等，它们全部可作为细胞生长的出色基质。另外，此类脂肪来源的网格可以包括激素、细胞因子、生长因子等。本领域技术人员将会知晓分离这种脂肪来源的网格的方法，例如匹兹堡大学的WO 00/53795中所公开的方法，特此引用作为参考。
本发明的细胞、细胞群、网格和组合物可用于组织工程和再生。因此，本发明涉及合并任何公开的发明特征的可植入结构。植入物的确切性质将根据期望的用途而变化。植入物可以包括成熟组织或可以包括未成熟组织或网格。因此，例如，植入物可以包括正在经历分化的本发明的细胞群，任选地种植在适当大小和维度的网格内。这样的植入物被注射或植入到宿主内，以促进患者体内眼组织的产生或再生。
脂肪来源的网格可便利地作为细胞培养试剂盒的一部分使用。因此，本发明提供了试剂盒，其包括本发明的脂肪来源的网格和一种或多种其它组分，例如水合剂(如水、生理相容性盐溶液、制备的细胞培养基、血清或其组合或衍生物)、细胞培养基质(如皿、板、瓶等)、细胞培养基(无论液体还是粉末形式)、抗生素、激素等。虽然试剂盒可以包括任何此类成分，优选地它包括所有在适当组合后支持目的细胞培养和生长的必要成分。期望的试剂盒也可以包括所述的种植到网格中的细胞。
备选地，本发明的细胞被分化为细胞，具有角膜上皮细胞的至少一种特征，它在体外扩增以长成角膜上皮组织用于随后植入到患者中。细胞单独或者与其它组织例如羊膜组织联合植入。
现在将通过下列实施例更加充分地描述本发明。不过，本发明可具体体现为许多不同的形式，而不应当理解为限于本文所列的实施方案。确切地讲，提供这些实施方案，从而使公开更加彻底和完整，并将充分地向本领域技术人员传达本发明的范围。
实施例
实施例1
体外诱导方法
脂肪来源的肝细胞按照描述分离自吸脂术废物材料(Sen等，2001，Journal of Cellular Biochemistry 81：312-319)。这些细胞可以在但不限于下列培养基：补充有或未补充胎牛血清(FBS)的NeurobasalTM(InVitrogen)、N2、B27(InVitrogen)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的存在下延续培养。也可以对培养基中的葡萄糖水平进行调节。细胞以各种密度种植，并以每3-6天的时间间隔饲喂。最优选地，它们以约1000到约500,000细胞/cm2的密度种植。
在培养期间，利用商业上可获得的放射免疫测定或酶联免疫吸附测定对条件培养基进行生物化学标志以及与眼基质细胞或角膜上皮细胞相关的表型标志表达的分析。利用针对(但不限于)任何上文所述的表型标志的抗体进行免疫组织化学(IHC)分析。
实施例2
利用带有生物相容性膜的脂肪来源的细胞
提供了利用在组合物中带有生物相容性材料的未分化状态或者脂肪细胞分化状态的脂肪组织来源的基质细胞用以移植修复眼内病损的途径。如Lee等(2001，Journal of Cellular Biochemistry 81：312-319)所述，外科手术患者利用VISX Star S2受激准分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)内产生并在10Hz以160mJ/cm2的注量(fluence)输出的193nm的受激准分子束经历光性治疗性角膜切削术。对上皮清创术采用45μm的深度设置，对基质部分切除术采取合适的设置，进行标准化的中心6-mm直径的激光光部分切除术(photoablation)。PRK之后，将未分化的或脂肪细胞分化的脂肪组织来源的成人干细胞处于带有生物相容性材料的组合物中引入到部分切除的区域。在引入前，脂肪来源的细胞以定向方式培养于生物相容性膜表面，包括但不限于羊膜、猪肠粘膜下层、AmpligraftTM、DermagraftTM或相似产品。脂肪来源的细胞或者作为未分化的成纤维细胞样细胞培养，或者根据Halvorsen等(2001，Metabolism 50：407-413)描述的方法诱导其经历脂肪细胞分化。切割细胞/生物材料复合物以适合缺损大小。脂肪来源的细胞表面被置于邻近角膜裸露区。在角膜和角膜缘中用10-0尼龙利用间断或连续的咬合将细胞/生物材料复合物缝合到位，修剪掉任何多余的复合物(Anderson等2001，.Br J Ophthalmol；85(5)：567-575)。在该外科手术之后，插入可弃型绷带接触镜并局部滴注抗生素。患者在外科手术后进行1到4天的术后评估，并维持抗生素治疗持续适当的时间(长达1个月)。在1、3和6个月时进行随访检查，包括视觉敏度测试、manifest折射、裂隙灯评估以及体内同焦点显微镜检查。
实施例3
基因治疗方法
下面记载的是利用任何载体途径(病毒、转染、其它)将脂肪组织来源的基质细胞转变为表达至少一种生长因子或加速眼内修复的蛋白(TGFβ阻断蛋白)的细胞的方法。如Lee等(2001，Ophthalmology；108(1)：112-20)所述，外科手术患者利用VISX Star S2受激准分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)内产生并在10Hz以160mJ/cm2的注量输出的193nm的受激准分子束经历光性治疗性角膜切削术。对上皮清创术采用45μm的深度设置，对基质部分切除术采取合适的设置，进行标准化的中心6-mm直径的激光光部分切除术。PRK之后，将未分化的或脂肪细胞分化的脂肪组织来源的成人干细胞处于带有生物相容性材料的组合物中引入到部分切除的区域。在引入前，细胞用表达可溶性II型转化生长因子β受体蛋白的合适核酸载体转染或转导。该蛋白与转化生长因子β细胞因子结合并抑制它在细胞水平引发信号传导级联反应的能力(Rowland-Goldsmith等2001，Clin CancerRes.2001，7(9)：2931-40)。转化生长因子β已知可干扰角膜外科手术后的恢复并促进角膜纤维化(Jester等1997，Cornea；16(2)：177-87)。
然后以定向的方式在生物相容性膜表面上培养基因工程改造的细胞，所述膜包括但不限于羊膜、猪肠粘膜下层、AmpligraftTM、DermagraftTM或相似产品。细胞或者作为未分化的成纤维细胞样细胞培养，或者根据Halvorsen等(2001，Metabolism 50：407-413)描述的方法诱导其经历脂肪细胞分化。切割细胞/生物材料复合物以适合缺损大小。细胞表面被置于邻近角膜裸露区。在角膜和角膜缘用10-0尼龙利用间断或连续咬合将细胞/生物材料复合物缝合到位，修剪掉任何多余的复合物(Anderson等2001，.Br J Ophthalmol；85(5)：567-575)。在外科手术之后，插入可弃型绷带接触镜并局部滴注抗生素。
患者在外科手术后进行1到4天的术后评估，并维持抗生素治疗持续适当的时间(长达1个月)。在1、3和6个月时进行随访检查，包括视觉敏度测试、manifest折射、裂隙灯评估以及体内同焦点显微镜检查。
实施例4
简单移植
将脂肪组织来源的基质细胞在眼内单独移植。如Lee等(2001，Ophthalmology；108(1)：112-20)所述，外科手术患者利用VISX Star S2受激准分子激光器(VISX，Inc.，Santa Clara，CA)内产生并在10Hz以160mJ/cm2的注量输出的193nm受激准分子束经历光性治疗性角膜切削术。对上皮清创术采用45μm的深度设置，对基质部分切除术采取合适的设置，进行标准化的中心6-mm直径的激光光部分切除术。PRK之后，将未分化的或脂肪细胞分化的脂肪组织来源的成人干细胞通过直接注射引入到部分切除区域。细胞或者作为单一的细胞悬液或者作为细胞片层引入。在外科手术之后，插入可弃型绷带接触镜并局部滴注抗生素。患者在外科手术后进行1到4天的术后评估，并维持抗生素治疗持续适当的时间(长达1个月)。在1、3和6个月时进行随访检查，包括视觉敏度测试、manifest折射、裂隙灯评估以及体内同焦点显微镜检查。
实施例5
人类脂肪来源的基质细胞的细胞因子表达特征
已确定了来自多个供体的人类脂肪来源的基质细胞的细胞因子表达特征。在这些实验中，用脂多糖(LPS，100ng/ml)和条件培养基诱导铺满的静止的脂肪来源的基质细胞培养物，并在1到24小时的周期之后收获总RNA。与鼠和人骨髓来源的基质细胞共同的是，脂肪来源的基质细胞表达下列细胞因子mRNA：白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、flt-3配体、干细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNFα)以及骨形态发生蛋白2和4t(BMP-2，-4)。
实施例6
人类脂肪来源的基质细胞支持人类脐带血先祖细胞增殖和分化的能力
确定了人类脂肪来源的基质细胞支持共培养中的人类脐带血CD34+造血先祖细胞增殖和分化的能力。在24孔板上建立铺满的脂肪来源的基质细胞的培养物(6×104细胞/孔)。脐带血(UCB)标本通过用羟乙基淀粉(hetastarch)处理排除污染的红细胞，并通过Ficoll密度离心排除污染的粒细胞。余下的UCB单核的细胞根据StemSepTM(StemCells，Vancouver，BC)方案进行细胞系耗竭(lineage depleted)；这有赖于利用针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b以及血型糖蛋白A的抗体的混合物的免疫磁性阴性细胞的选择。在最后的纯化步骤中，lin-UCB细胞用CD34抗体染色，并通过流式细胞仪分拣。多达10,000个最终的CD34+UCB细胞在单个孔中与铺满的脂肪来源的基质细胞层共培养。培养物在缺乏外源细胞因子下维持12天、3周或6周。在这些周期的末尾，通过胰蛋白酶/EDTA消化收集单个孔，并利用下列抗体组合的组合(荧光标记显示在括号中)通过流式细胞仪进行分析：CD45(FITC)、CD34(APC)以及CD7、CD10或者CD38(PE)。这些测定的结果描述如下。
这些研究检查了UCB造血细胞群在12天脂肪基质支持的共培养物中的扩增。在缺乏外源细胞因子的情况下，脂肪来源的基质细胞支持总造血细胞数目的5.1-倍扩增(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围2-9.4)。这与CD34+UCB细胞群的2.4-倍扩增相应(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围1.4-3.3)。显著百分比的CD34+和CD34-细胞都表达CD7或CD10抗原(图4，平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体)。个体表型代表下列总造血细胞群的百分比：早期淋巴先祖细胞分别为20.2％(CD34+CD7+)和9.5％(CD34+CD10+)；NK/T-细胞先祖(CD34-CD7+)，31.4％；而B-细胞先祖(CD34-CD10+)，7.7％。
进一步分析显示早期淋巴先祖细胞的显著扩增。CD34+CD7+细胞群扩增了4.8±2.2-倍超过12天周期的先祖细胞(均值±s.d.，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体)。同样地，CD34+CD10+细胞群扩增了3.5±1.6倍先祖细胞(均值±s.d.，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体)。这些数值超过了CD34+细胞群总体的扩增倍数，提示该途径将富集人类淋巴先祖细胞。这些结果显示脂肪来源的基质细胞在体外能够支持造血先祖细胞的分化。
对于得益于前述说明书和相关附图中提出的教导的本发明所属技术领域的技术人员来说，本发明的修饰和其它实施方案将是显而易见的。因而，应当理解本发明不局限于所公开的具体实施方案，并且修饰和其它实施方案旨在包括在所附的权利要求书的范围之内。虽然本文使用了具体术语，它们仅仅是以通称和描述性的意义使用的，而并非用于限制目的。

Claims (19)

1.分离的脂肪组织来源的基质细胞，其经分化表达角膜上皮细胞的至少一种蛋白质特征，其中所述角膜上皮细胞的蛋白质特征选自下列中的至少一种：转化生长因子β(TGFβ)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体、肝生长因子(HGF)受体和角质形成细胞生长因子(KGF)受体。
2.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，它是在体外分化的。
3.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，它是在体内分化的。
4.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，其中在分化前向分离的脂肪组织来源的基质细胞中引入了外源性遗传材料。
5.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，其中细胞是人类的。
6.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，它被植入宿主中。
7.权利要求1的脂肪组织来源的基质细胞，其中向细胞中引入了外源性遗传材料。
8.组合物，包括经分化表达角膜上皮细胞的至少一种蛋白质特征的分离的脂肪组织来源的基质细胞和生物相容性材料，其中所述角膜上皮细胞的蛋白质特征选自下列中的至少一种：转化生长因子β(TGFβ)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体、肝生长因子(HGF)受体和角质形成细胞生长因子(KGF)受体。
9.权利要求8的组合物，其中生物相容性材料从由羊膜、胶原、水凝胶、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/聚乳酸、透明质酸盐或纤维蛋白组成的组中选择。
10.权利要求9的组合物，其中生物相容性材料为羊膜。
11.使分离的脂肪组织来源的基质细胞分化以表现出至少一种角膜上皮细胞标志的体外方法，包括使分离的脂肪组织来源的基质细胞与眼诱导物质接触的步骤，其中所述角膜上皮细胞标志选自下列中的至少一种：转化生长因子β(TGFβ)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体、肝生长因子(HGF)受体和角质形成细胞生长因子(KGF)受体。
12.权利要求11的方法，其中眼诱导物质存在于化学成分确定的细胞培养基中。
13.经诱导表达至少一种角膜上皮细胞标志的分离的脂肪组织来源的基质细胞在制备通过将诱导的细胞植入宿主而治疗宿主的眼疾、变性病症或术后病症的药物中的用途，其中所述角膜上皮细胞标志选自下列中的至少一种：转化生长因子β(TGFβ)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体、肝生长因子(HGF)受体和角质形成细胞生长因子(KGF)受体。
14.权利要求13的用途，其中脂肪组织来源的基质细胞分离自该宿主。
15.权利要求13的用途，其中眼疾、变性病症或手术病症为无虹膜、红斑角皮病、角膜炎、化学损伤；热损伤；接触镜角膜病；反复角膜缘外科手术、角膜缘功能不全、屈光性角膜切削术、激光原位角膜磨镶术、自身免疫机能障碍或者病毒或细菌感染。
16.分离的脂肪组织来源的基质细胞在制备通过将该细胞植入宿主的眼内部位而治疗宿主的眼疾、变性病症或术后病症的药物中的用途。
17.权利要求16的用途，其中脂肪组织来源的基质细胞分离自该宿主。
18.权利要求16的用途，其中眼疾、变性病症或手术病症为无虹膜、红斑角皮病、角膜炎、化学损伤；热损伤；接触镜角膜病；反复角膜缘外科手术、角膜缘功能不全、屈光性角膜切削术、激光原位角膜磨镶术、自身免疫机能障碍或者病毒或细菌感染。
19.权利要求16-18之任一项的用途，其中脂肪组织来源的基质细胞在植入宿主前被去分化。
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