KR101004086B1

KR101004086B1 - 유전자 치료용 초대 배양 지방세포

Info

Publication number: KR101004086B1
Application number: KR1020077016046A
Authority: KR
Inventors: 마사시 이토; 야스시 사이토
Original assignee: 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2010-12-27
Also published as: KR20070087062A; PT2213730E; NZ537072A; US8071085B2; US20090010901A1; ATE492630T1; PT1541674E; JPWO2003106663A1; AU2003242459B2; CN1671836B; BR0312441A; ES2559430T3; CA2488414A1; EP2213730B1; BRPI0312441B8; EP1541674B9; US7820438B2; WO2003106663A1; DK1541674T3; DK2213730T3

Abstract

본 발명은 세포외로 분비하는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포에 관한 것이다. 본 발명은 종래 생체외(ex vivo) 유전자 치료에 이용되어온 골수세포와 간세포를 대신하는, 유전자 치료에 적합한 세포를 제공한다. 본 발명에 의하여 채취 및 이식이 용이하고 이식 후에 제거도 가능한 생체외에서 유전자 치료에 적합한 초대 배양 지방세포에 외래 유전자를 도입하는 방법 특히, 레트로 바이러스 벡터를 이용하는 방법이 확립되었고 세포외로 분비하는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양 유전자 치료용 지방세포가 확립되었다.

유전자치료, 지방세포

Description

유전자 치료용 초대 배양 지방세포{PRIMARY CULTURED ADIPOCYTES FOR GENE THERAPY}

본 발명은 외래 유전자를 도입한 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포에 관한 것이다.

현재 행해지고 있는 유전자 치료(토요오카 등, Folia Pharmacol. Jpn. 116:158-162, 2000)는 (1) 치료용 유전자를 코드하는 바이러스 벡터 또는 naked plasmid 등을 직접 환자에게 투여하여 유전자 도입하는 방법(생체내, in vivo), (2) 환자로부터 세포를 일단 채취하여 그 세포에 유전자를 도입하고 환자에게 되돌려주는 방법(생체외, ex vivo)의 2 종류로 크게 나눌 수 있다.

이 중 생체내 방법은, 도입 효율이나 발현 지속, 표적 세포로의 선택적인 유전자 도입이라고 하는 점에서 큰 과제를 남기고 있다. 한편, 생체외 방법은 이러한 과제를 해소할 수 있는 가능성이 있다. 생체외 방법에 있어서는, 채취와 이식이 비교적 용이하고 환자의 부담이 적기 때문에 혈액계의 세포(말초혈 임파구, 골 수세포)를 사용한 예가 대다수를 차지하고(타니 등, 최신의학, 56:258-267, 2001), 또, 혈액계 이외의 세포에서는 간장 세포에 유전자 도입하여 되돌려주는 방법(Raper SE et al., Cell Transplant 2(5):381-400, 1993)이 행해지고 있지만, 그 대부분이 도입 세포 자체의 기능 회복, 유지, 증강에 주목적이 있다.

생체외 유전자 치료에 적절한 세포를 찾아내는 과정에서, 본 발명자 등은 초대 배양의 지방세포를 이용하는 것을 고려하였다. 지방세포를 이용하는 이점으로서 이하의 점을 들 수 있다.

(1) 지방세포로부터 분비되는 액성 인자가 여럿 보고되고 지방세포가 호르몬 생산, 분비 장기로서의 기능을 가지고 있다 (Bradley RD, et al., Recent Prog Horm Res, 2001; 56,329-358).

(2) 피하에도 존재하기 때문에 채취가 용이하고, 더욱이 성형외과, 미용정형 분야 등에서 적출에 관한 기술이 발달하고 있다. 또, 용이하게 이식가능한 피하에 이식한 경우에도, 본래 그곳에 존재하는 세포이기 때문에 다른 부위로의 이식(heterotrophic)이 되지 않는다.

(3) 단리한 초대 배양 지방세포는 인비트로에서도 활발하게 증식하기 때문에 유전자 도입 등의 조작에 적절하다.

(4) 이식 후에 국소에 생착한다고 예상되기 때문에, 이식 후에 이식세포를 제거하고 싶은 경우(즉, 유전자 발현을 소거하고 싶은 경우)에도 대응 가능하다.

(5) 지방세포 자신이 혈관 신생 인자를 생산하기 때문에(Mick GJ, et al., Endocrinology 2002;143(3):948-53) 이식 후의 높은 생착(engraftment)을 기대할 수 있다.

(6) 성인에 있어서 크게 중량이 변동하는 장기이고, 적출/이식에 따르는 인 체에 대한 영향이 적다.

(7) 지방세포는 여분의 것이라고 하는 인식이 강하고, 채취 동의를 얻기 쉽다고 예상된다.

현재, 같은 시도로서 케라티노사이트(keratinocyte)를 이용하여 검토되고 있지만(J Gene Med 2001 Jan-Feb;3(1):21-31, Histochem Cell Biol 2001 Jan;115(1):73-82) 초대 배양을 단리하는 과정에서 생체 보호막인 피부를 제거하는 것은 감염 위험 등에서 문제가 있다. 제거, 이식에 수반하는 환자의 고통도 강하다고 예상되며 발현을 소거하기 위한 재적출(상기 4)등도 용이하지 않다. 또, 2 차원으로 밖에 이식할 수 없는 케라티노사이트/피부는 이식량의 증가를, 이식 평면의 면적 증가에 의해서만 달성할 수 있기 때문에 입체적으로 이식가능한 지방세포가 보다 유용하다고 사료된다.

본 발명자 등은, 초대 배양한 지방세포에 효율적으로 유전자를 도입하는 방법을 고안하고 나아가 도입한 유전자가 이식 후에도 기능하고 있다는 것을 확인하여 지방세포가 유전자 치료에 유효하게 활용될 수 있음을 찾아내었다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 도입한 외래 유전자를 체내에서 장기간 안정되게 발현하는 지방세포를 얻는 것이 가능하다. 이식한 성숙 지방세포는 1년 이상 외래 유전자의 발현을 지속할 수 있다. 또, 지방세포를 이식 후에 외래 유전자의 발현이 불필요해지면, 이식편을 꺼내는 것으로 외래 유전자의 발현을 정지시키는 것도 가능하다.

즉, 본 발명은 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적 으로 유지하는, 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포, 당해 세포의 제조방법, 당해 세포를 포함한 이식 조성물 및 당해 세포의 이용 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,

〔1〕세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는, 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포,

〔2〕당해 유전자가 레트로 바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터에 의해 당해 세포에 도입된,〔1〕기재의 지방세포,

〔3〕체내에서 적어도 20일 이상 당해 단백질을 유의하게 발현하는 능력을 가지는,〔1〕기재의 지방세포,

〔4〕당해 단백질을 혈중으로 방출시키기 위해서 이용하는,〔1〕기재의 지방세포,

〔5〕당해 단백질이 인슐린 또는 GLP－1 (Glucagon-Like Peptide 1)인,〔1〕기재의 지방세포,

〔6〕이하의 단계,

　(i) 지방세포를 초대 배양하는 단계,

　(ii) 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입하고 안정적으로 유지시키는 단계,

를 포함하는 유전자 치료용 지방세포를 제조하는 방법,

〔7〕당해 외래 유전자를 레트로 바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터에 의해 도입하는,〔6〕기재의 방법,

〔8〕〔6〕또는〔7〕기재의 방법에 의해 제조된 유전자 치료용 지방세포,

〔9〕세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유전자 치료용 이식 조성물,

〔10〕추가로 세포외 기질 성분(extracellular matrix componet)을 포함하는,〔9〕기재의 이식 조성물,

〔11〕추가로 혈관신생 인자(angiogenesis factor)를 포함하는,〔9〕기재의 이식 조성물,

〔12〕세포외로 분비되는 소망하는 치료 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포를 체내에 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 치료방법,

〔13〕단백질을 혈중으로 방출시키는 방법으로서, 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포를 체내에 투여하는 단계를 포함하는 방법,

〔14〕당해 단백질을 20일 이상 혈중으로 방출시키는 방법인,〔13〕기재의 방법,

〔15〕혈당을 저하시키는 방법으로서, 인슐린 또는 GLP－1(Glucagon-Like Peptide 1)을 코드하는 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포를 체내에 투여하는 단계를 포함하는 방법,

〔16〕세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포가 체내에 이식된 동물에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 설명한다.

본 발명은 우선, 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정 으로 유지하는, 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포를 제공한다.

여기서 외래 유전자란, 초대 배양 지방세포에 외부에서 도입된 유전자를 말하며, 초대 배양 지방세포가 생산하고 있지 않는 단백질을 코드하는 유전자 등이 포함된다. 또 초대 배양의 세포란, 생체로부터 채취한 조직으로부터 배양된 세포로, 세포주화하지 않은(non-established) 세포를 말한다. 또한, 지방세포 (adipocytes)라 함은 성숙 지방세포(mature adipocytes) 및 전지방세포 (preadipocytes)등의 지방으로 분화하는 능력을 가지는 세포를 말한다. 즉, 특히 "성숙" 지방세포라고 특별히 언급되지 않는 이상, 지방세포에는 전지방세포도 포함된다. 성숙 지방세포는 구형으로 지방을 축적한 세포이며 기름 방울을 포함하고 있다. 성숙 지방세포에 축적된 지방은 oil red O 염색에 의하여 확인할 수 있다. 성숙 지방세포는, 일반적으로 인슐린에 반응하여 렙틴(leptin)을 분비한다. 전지방세포는 본래, 성숙 지방세포로 분화하기 전의 간질(stromal) 세포로서 존재한다. 전지방세포는, 지방조직(adipose tissue)을 콜라게나아제 처리하여 단리할 수 있지만, 후술하는 천정배양법(ceiling culture method)에 따라 성숙 지방세포가 분열한 결과 생기는 전지방세포를 단리할 수도 있다(스기하라 등, 일본임상 1995, 53；115-120, Sugihara H, et al. J Lipid Res. 1987, 28;1038-1045, Zhang HH, et al. J Endcriniol. 2000,164;119-128). 또, 지방세포 특이적인 표면 항원의 존 재는 확인되지는 않았지만, CD36 등은 성숙 지방세포에 강하게 발현이 인식된다(Abumrad NA, et al. J Biol Chem. 1993 Aug 25;268(24):17665-8). 따라서 이러한 분자를 마커로 하여 보다 높은 순도로 지방세포를 회수하는 것도 생각할 수 있다. 전지방세포는, 후술하는 분화 유도에 의하여 몇일로부터 수주간 사이에 성숙 지방세포로 분화할 수 있다(Hauner H, et al., J. Clin. Invest. 84, 1663-1670, 1989; Marko, et al. Endocrinology 136, 4582-4588, 1994). 초대 지방세포는 소망하는 조직으로부터 단리하여도 좋고, 예를 들면 피하지방 조직, 부고환 주위 또는 장간막 등의 내장 지방조직으로부터 얻을 수 있다.

유전자 치료용이란, 외래 유전자가 코드하는 단백질을, 그 효과를 기대하여 체내에서 발현시키는 용도로 이용하는 것을 말한다. 또한, 유전자 치료용 세포란, 생체외 투여에 의하여 외래 유전자를 체내에 투여하는 용도에 이용하는, 나아가 생체외로 투여된 체내에서 당해 단백질을 발현하는 능력을 가지는, 당해 외래 유전자를 보유하는 세포를 말한다. 생체외 투여란, 지방조직 또는 지방세포를 개체로부터 채취하고 인비트로에서 유전자 도입을 수행한 후, 동일 또는 다른 개체에 이식하는 것을 말한다.

유전자 치료용 세포는, 보다 바람직하게는, 어느 특정 단백질을 생산하는 세포를 이입하여 질환을 치료하기 위해서 이용하는 세포를 말한다. 바람직하게는, 어느 특정 단백질에 의한 치료는, 그 물리적 혹은 기능적인 부족 혹은 결여에 의해 질환이 일어나는 단백질에 의한 보충요법 또는 어떤 병의 용태의 발증, 악성화를 초래하는 인자를 중화할 수 있는 작용을 가지는 단백질에 의한 중화요법을 들 수 있다. 어느 특정 단백질이란, 혈류 중에서 활성을 나타내는 혹은, 혈류 중으로부터 대상 조직에 공급되어 당해 조직의 세포 표면에서 작용하는 단백질로서, 일정 기간(예를 들면 몇일로부터 수주간, 또는 그 이상) 지속적인 공급을 필요로 하는 것이 바람직하다. 이미 단백질 보충요법이 시행되고 있거나 혹은 유효성이 예측되고 있는 인자 및 질환은 모두 대상이 될 수 있다.

이하에 대표적인 대상을 분류별로 기재하지만, 용도는 이것으로 한정되는 것은 아니고, 유사한 목적에 따라 유사한 인자를 사용하는 것은 본 발명의 범주에 포함된다.

보충요법에는, 호르몬 또는 사이토카인의 부족, 기능 저하에 의해 발증, 악화되는 질환에 대한 보충, 선천성 유전자 결손에 의한 질환에 대한 보충, 병의 용태 개선 인자의 보충 등이 포함된다:

인슐린/당뇨병; 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1, glucagon-like peptide-1)/당뇨병, 비만, 섭식장애(eating disorders); GLP-2/염증성 장질환(inflammatory enteropathy), 암화학요법등에 수반하는 소화관 장애(gastrointestinal disorders accompanying cancer chemotherapy); 렙틴/비만증, 지방위축성 당뇨병(lipodystrophic diabetes); 아디포넥틴(adiponectin)/당뇨병, 혈관장애(angiopathy); 혈액응고 제VIII, 제IX인자/혈우병(hemophilia); 리포프로테인 리파아제(LPL)/LPL 결손증, 고트리글리세라이드혈증(hypertriglyceridemia); 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스페라제(LCAT)/LCAT 결손증; 에리트로포이에틴/적혈구감소 증(erythropenia); 아포 A-I/저HDL혈증(hypo-HDL cholesterolemia), 알부민/저단백혈증(hypoproteinemia); 심방성 나트륨 펩티드(ANP, atrial natriuretic peptide)/고혈압, 심부전(cardiac failure); 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)/유방암, 전립선암; 안지오스타틴, 엔도스타틴/혈관신생(angiogenesis), 전이저해(metastasis inhibition); 모르핀 수용체 작동 펩티드(morphine receptor agonist peptide)(내인성 오피오이드 펩티드(enkephalin 등)나 다이노르핀(dynolphin) 등)/동통 완화(pain relief); 칼시토닌 골형성인자(BMP)/골다공증(osteoporosis); 인터페론-α·-β/악성 종양; 인터페론-γ/악성 종양, 간염, 알레르기, 인터페론-β1/다발성 경화증(multiple sclerosis); 인터루킨-1α·-1β/악성 종양; 인터루킨-4/마른 버짐(psoriasis); 인터루킨-10/자가면역질환; 인터루킨-12/악성 종양; 췌장분비성 트립신 억제자(pancreatic secretory trypsin inhibitor)/췌장염(pancreatitis), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase)/허혈성 심장질환(ischemic heart disease), 혈관장애(angiopathy) 등.

병의 용태 형성 인자(pathologic formation factors) 혹은 악성화 인자(malignant transformation factors)의 중화요법(neutralization therapy)에는, 가용화 수용체나 중화 항체의 부분 펩티드, 도미넌트 네가티브형 단백질의 생산이 이에 포함된다.

종양괴사 인자-α가용화 수용체(TNF-αsolubilized receptor) /만성 관절 류마티스; 가용화 IgE 수용체/알레르기; 가용화 IgA 수용체/음식 알레르기; 가용화 세포 상해성 T 임파구 항원-4(CTLA4)/자가면역질환; 가용화 CD40 리간드/면역질환; 도미넌트 네가티브형 혈액 응고 제VIIa 인자/혈전증(thrombosis); 섬유아세포 증식인자 가용화 수용체(fibroblast growth factor (FGF) solubilized receptor)/혈관내막비후(vascular intimal thickening) 등.

또한, 본 발명의 지방세포는 이른바 「치료」에 이용하는 것으로 한정되지 않고, 소망하는 분비 단백질을 체내에서 발현시키기 위해서 이용되는 세포가 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의하여 어느 특정의 단백질을 후천적으로 발현시켜 모델 동물로 하는 것이 가능하다. 당해 방법을 이용하면, 병의 용태 발증 인자 혹은 악성화 인자를 후천성으로 발현하는 질환 모델 동물의 제작이 가능하고, 당해 동물을 이용하여 약물을 스크리닝 하는 일도 가능해진다. 또, 병의 용태 개선 인자(pathologic improvement factors)를 발현시키면, 해당 인자가 병의 용태를 개선한다고 하는 신약 탐색의 작업 가설의 증명에도 이용할 수 있다. 동물로서는, 소망하는 비사람 동물, 바람직하게는 비사람 포유동물(설치류, 영장류 등을 포함한다)이 이용된다.

본 발명의 초대 배양의 유전자 치료용 지방세포는, 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정적으로 유지하고 있다. 「안정적으로 유지한다」란, 세포분열에 수반하여 외래 유전자가 딸세포에 전달되는 것을 말하며, 보다 구체적으로는 외래 유전자가 세포의 염색체에 삽입되고 있는 것을 말한다. 본 발명의 유전자 치료용 지방세포는, 바람직하게는 외래 유전자가 염색체 삽입 형(chromosome-incorporating)의 바이러스 벡터에 의해 안정적으로 도입되고 있다. 보다 바람직하게는, 외래 유전자가 레트로 바이러스 벡터에 의해 도입되고 있다.

레트로 바이러스 벡터는, 세포의 염색체에 안정적으로 삽입되고 도입 유전자를 장기간에 걸쳐서 발현하는 능력을 가지고 있지만, 도입 효율 및 도입 유전자의 발현의 지속성은 세포종에 의존하고 있다. 예를 들면, 레트로 바이러스 벡터에 의해 도입된 유전자는 세포가 증식하고 있는 동안은 발현이 지속되지만, 세포의 증식이 멈추면 발현이 정지하는 경우가 있다 (Lund AH, et al., J Biomed Sci 1996; 3:365-378; Niwa, O. et al., 1983, Cell, 32:1105-1113). 외래 유전자의 발현 억제는 특히 생체내 또는 생체외 방법에 의해 체내에 유전자를 도입한 후에 자주 관찰된다. 이러한 발현 억제에는, 도입 유전자의 프로모터 또는 코딩 서열의 de novo의 메틸화가 관여하고 있다고 언급되고 있다 (Jahner D and Jaenisch R, Nature 315: 594-597, 1985; Challita P-M and Kohn DB, Proc Natl Acad Sci USA 91: 2567-2571, 1994; Hoeben RC et al., J Virol 65: 904-912, 1991). 또 도입 유전자의 사이런싱에는 히스톤의 탈아세틸화도 관여하고 있다(Chen, W.Y. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97: 377-382,2000; Chen, W.Y. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94: 5798-5803, 1997). 그렇지만, 본 발명자 등이 레트로 바이러스 벡터를 매개하여 초대 배양의 지방세포에 외래 유전자를 도입하였는 바, 놀랄 만하게 도입 유전자의 발현이 인비트로 및 인비보의 양쪽 모두에 있어서, 지극히 안정적으로 지속하는 것이 판명되었다. 도입 유전자의 발현은, 분화 전의 지방세포에서도, 성숙 지방세포에서도 안정되어 있으며, 인비트로 배양에서 실험의 전기 간인 80 일 이상에 걸쳐서, 또 체내에 이식되었을 경우는 실험의 전기간인 360 일 이상에 걸쳐서 발현이 지속하는 것이 확인되었다. 따라서, 외래 유전자가 안정적으로 도입된 초대 배양의 지방세포는, 장기간 안정하게 당해 유전자를 발현하는 임플란트로서 이용할 수 있는 것이 판명되었다.

본 발명의 유전자 치료용 지방세포는, 인비트로에서 한층 더 바람직하게는 인비보에 있어서, 적어도 20 일 이상에 걸쳐서 외래 유전자가 코드하는 단백질을 유의하게 발현하는 능력을 가진다. 유의하게 발현한다는 것은, 예를 들면 외래 유전자를 도입하지 않는 경우에 비하여 통계학상 유의하게(예를 들면 유의수준 5% 또는 그것보다 높은 유의성을 가지고) 발현이 검출되는 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 지방세포는, 체내에 이식되었을 경우, 체내에 있어 적어도 30 일 이상, 보다 바람직하게는 40 일 이상, 보다 바람직하게는 50 일 이상, 보다 바람직하게는 60 일 이상, 보다 바람직하게는 80 일 이상, 보다 바람직하게는 100 일 이상, 보다 바람직하게는 150 일 이상, 보다 바람직하게는 200 일 이상, 보다 바람직하게는 250일 이상, 보다 바람직하게는 300 일 이상, 보다 바람직하게는 350 일 이상에 걸쳐서, 외래 유전자가 코드하는 단백질을 유의하게 발현하는 능력을 가진다.

또한, 본 발명의 유전자 치료용 지방세포는 당해 세포가 보유하는 외래 유전자가 코드하는 단백질을 혈중에 방출시키기 위한 세포로서 특히 유용하다. 혈중에 방출시키는 단백질로서는, 혈류 중 또는 대상 조직의 세포 표면에서 활성을 나타내는 소망하는 분비 단백질이 포함되며, 예를 들면 호르몬 및 사이토카인 등의 소망 하는 액성 인자 및 항체 등을 예시할 수 있다. 구체적으로는, 상기와 같이 당뇨병등의 치료에 있어서 인슐린 및/또는 글루카곤 유사 펩티드-1 (Glucagon-Like Peptide 1; GLP-1) 등의 혈당 강하 호르몬, 혈우병 등의 치료에 있어서 혈액 응고 인자, TNF-α가 항진하는 만성 관절 류마티스 등의 치료에 있어서는 TNF-α수용체의 가용화 단편 또는 항 TNF-α항체(Fab 및 scFv 등의 항체 가변 영역을 포함한 항체 단편을 포함한다) 등을 들 수 있다. 예를 들면 인슐린이면, 효율적으로 성숙형 인슐린을 생산할 수 있도록 개열부위(site1 및 site2)를 지방세포 내에서 발현하는 프로테아제의 개열서열로 치환할 수 있다(예를 들면 Groskreutz DJ, et al. JBC, 1994, 269(8), 6241). 또한, 단일 사슬형으로 변형된 인슐린 아날로그를 사용할 수도 있다(Lee HC , et al., Nature. 2000 Nov 23; 408(6811): 483-8). GLP-1로서는, GLP-1 수용체(NP_002053, Thorens, B. et al., Diabetes 42, 1678-1682 (1993); Dillon, J.S. et al., Endocrinology 133, 1907-1910 (1993); Graziano, M.P. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 141-146 (1993); Stoffel, M. et al., Diabetes 42, 1215-1218 (1993))의 리간드로서 작용하는 소망 펩티드를 이용할 수 있지만, 예를 들면 GLP-1(7-37) 등을 들 수 있다(Diabetes, 1998, 47:159-69; Endocrinology, 2001, 142: 521-7, Curr Pharm Des., 2001, 7:1399-412, Gastroenterology, 2002, 122:531-44).

또한, 본 발명은 이하의 단계,

(1) 지방세포를 초대 배양하는 단계;

(2) 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입, 바람직하게는 레트로 바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터에 의해 도입하여 안정적으로 유지시키는 단계;

를 포함하는 유전자 치료용 지방세포를 제작하는 방법 및, 이 방법에 의해 제작된 유전자 치료용 지방세포에 관한 것이다.

안정적으로 유지시킨다는 것은, 외래 유전자가 세포 분열에 수반하여 딸세포에 전달되도록 유전자를 도입하는 것을 말하며, 보다 구체적으로는 외래 유전자를 세포의 염색체에 삽입하는 것이다. 외래 유전자가 염색체에 삽입되어 안정적 발현을 획득한 것을 분자생물학적으로 증명하기 위해서는, 서던블롯법이나 게놈 DNA를 이용한 PCR법 등을 실시할 수 있다. 또, 안정적 도입 세포를 보다 농축하기 위해서는, 예를 들면 세포에 목적 유전자와 함께 발현시킨 GFP 등을 인식시켜 농축하는 Fluorescence Activated Cell Sorter(FACS) 등의 방법을 이용할 수 있다.

1. 초대 배양의 지방세포를 채취하는 방법

초대 배양의 지방세포는 스기하라 등의 보고(Sugihara H. et al., Differentiation, 31:42-49, 1986)에 기재된 방법에 의하여 채취할 수 있다. 구체적으로는 지방조직, 바람직하게는 이식 수취인(리시피언트) 자신의 피하지방 조직, 혹은 부고환 주위 또는 장간막 등의 내장 지방조직으로부터 지방조직을 무균적으로 적출하고 예를 들면 PBS로 세정한 후, 가위 혹은 수술용 나이프를 이용하여 잘게 자른다. 이 잘게 자른 조직을 적당량의, 바람직하게는 1~3 mg/ml의 콜라게나아제 를 포함한 배지에서 37℃, 적당한 시간, 바람직하게는 20~60 분간 진탕소화(digested by shaking)한 후, 원심분리에 의해 침전물과 부유층으로 분리한다.

부유층을, 바람직하게는 추가로 1~2회의 원심분리에 의해 세정한 후, 배지가 충분히 있는 배양 플라스크에 가한다. 거품을 제하고 통상의 배양면이 천상이 되도록 CO₂ 인큐베이터내에 정치하여 배양한다(천정배양). 적당한 기간, 바람직하게는 10~14 일간 배양 후, 트립신 처리에 의해 천정면에 접착한 세포를 회수하고, 이후, 통상의 배양계로 계대배양 한다.

초대 배양 지방세포는 유전자 도입전 또는 후에 동결보존 해도 된다. 이에 의하여 지방세포를 1회 채취하는 것 만으로 여러 차례 사용이 가능하다.

2. 지방세포로의 유전자 도입

유전자 도입은, 유전자 도입 시약(Fugene 6：Roche 사제, Lipofectamin：Invitrogen 사제, Cellphect transfection kit (인산-칼슘법)：Amersham 사제 등), 전기천공법(일렉트로포레이션법, Chen H. et al., J Biol. Chem. 1997: 272 (12), 8026-31), 바이러스 벡터(Kay MA., et al., Nat Med 2001, 7, 33-40)에 의해 실시할 수 있다. 바람직하게는 바이러스 벡터에 의한 도입을, 더욱 바람직하게는 레트로 바이러스 벡터(Arai T. et al., J. Virol., 1998: 72, pp1115-21 등)에 의한 도입을 이용한다.

플라스미드에 의해 도입하는 경우는, 플라스미드를 지방세포에 트랜스펙션 한 후, 도입한 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 지방세포를 선별할 수 있다. 이러한 선별은, 예를 들면 외래 유전자를 코드하는 플라스미드에 약제 내성 유전자를 보유하게 하든가, 혹은 약제 내성 유전자를 가지는 플라스미드와 함께 트랜스펙션을 실시하여 트랜스펙트한 세포를 약제로 선별하는 것으로써 실시할 수 있다. 혹은, 트랜스펙트한 세포를 한계희석에 의해 클론화하는 것에 의해 얻을 수 있다. 또 플라스미드에 의해 도입하는 경우는, 염색체로의 삽입 효율을 높이기 위해서 파지 유래의 인테그라제를 한시적으로 발현시키는 방법을 이용할 수도 있다(Mol Cell Biol. 2001 Jun;21(12):3926-34).

바이러스 벡터를 이용한 지방세포로의 유전자 도입으로서는, 아데노 수반 바이러스 (adeno-associated virus; AAV)를 이용하는 방법을 들 수 있다. AAV란, 파보바이러스과(Parvoviridae)의 Dependovirus 속에 속하는 바이러스이며, 도입 유전자가 염색체에 삽입되는 성질을 가진다. 2개의 inverted terminal repeats (ITRs)의 사이에 외래 유전자를 삽입하고, 아데노바이러스 E1, E2A, E4 단백질의 존재 하에서 AAV의 패키징 단백질(rep 및 cap 유전자 산물)을 발현시키는 것으로 외래 유전자가 도입된 재조합 AVV 벡터를 제작할 수 있다 (Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-29; Kaplitt, M. G. et al. (1994) Nat. Genet. 8, 148-54; Xiao, X. et al. (1996) J. Virol. 70, 8098-108; Kessler, P. D. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14082-4087; Xiao, W. et al. (1998) J. Virol. 72, 10222-0226).

본 발명에 있어서는, 보다 바람직하게는 레트로 바이러스 벡터에 의해 외래 유전자를 지방세포에 도입한다. 레트로 바이러스는 레트로 바이러스과 (Retroviridae)에 속하는 바이러스를 말하며, 온코바이러스, Foamy 바이러스 (Russell DW, and Miller AD, J Virol 1996; 70:217-222; Wu M et al., J Virol 1999; 73:4498-4501), 렌티 바이러스(예를 들면 HIV-1 (Naldini L et al., Science 1996; 272:263-267; Poeschla E et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:11395-11399; Srinivasakumar N et al., J Virol 1997;71:5841-5848; Zufferey R, et al. Nat Biotechnol 1997;15:871-875; Kim VN, e al., J Virol 1998;72:811-816) 및 고양이 면역 부전 바이러스(feline immunodeficiency virus) (Johnston JC et al., J Virol 1999; 73:4991-5000; Johnston J and Power C., J Virol 1999; 73:2491-2498; Poeschla EM et al., Nat Med 1998;4:354-357) 등)등이 포함된다. 본 발명에 있어서 이용하는 레트로 바이러스 벡터는, 바람직하게는 Moloney 마우스 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus; MoMLV) 벡터이다 (T. M. Shinnick, R. A. Lerner and J. G. Sutcliffe, Nature 293, 543-548, 1981).

레트로 바이러스는, 자기 불활성화형 (self inactivating; SIN) 벡터여도 된다. SIN 벡터는 바이러스의 패키징 시에, 3' LTR의 일부를 결실하게 하여 제작할 수 있다 (Yu SF et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:3194; Yee, J. K. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5197-5201; Zufferey, R. et al., 1998, J. Virology, 72, 9873-9880). 레트로 바이러스 내의 외래 유전자는 LTR에 의해 전사시킬 수도 있고, 벡터 내부의 다른 프로모터로부터 발현시킬 수도 있다. 예를 들면 CMV 프로모터, EF-1α프로모터, CAG 프로모터 등의 구성적 발현 프로모 터, 또는 소망하는 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 또, LTR의 일부를 다른 프로모터로 치환한 키메라 프로모터를 이용할 할 수도 있다.

레트로 바이러스에 의해 유전자를 도입하려면 , 구체적으로는, 패키지 세포, 예를 들면 293-EBNA 세포(Invitrogen 사제)에, 도입하고 싶은 유전자를 삽입한 플라스미드, 예를 들면 pBabe CL-SEAP-IRES-GFP를, 유전자 도입 시약 등을 사용하여 유전자 도입하고 적당한 기간, 바람직하게는 1~3 일간 배양 후, 상청 내에 생산된 재조합 바이러스를 모아 도입하고 싶은 지방세포에 감염시킨다.

사람을 포함한 포유동물의 지방세포에 넓게 감염하도록, 레트로 바이러스 벡터는 넓은 트로피즘(tropism)을 가지는 엔벨로프 단백질을 가지는 것이 바람직하다. 예를 들면, amphotropic envelope 단백질(예를 들면 4070 A 등) (Accession K02729; Sorge, J. et al., Mol. Cell. Biol. 4 (9), 1730-1737 (1984))을 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 레트로 바이러스는, 바람직하게는 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus)의 G 단백질 (VSV-G) (Rose, J.K. and Gallione, C.J., J. Virol. 39 (2), 519-528 (1981))에 의해 슈도타이프화 되고 있다 (Emi, T. Friedmann and J. K. Yee, J. Virol., 65 (3), 1202-1207 (1991); Yee, J. -K. et al. (1994) Methods Cell Biol. 43 43:99-112; Burns, J. C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 90:8033-8037). VSV- G에 의해 슈도타이핑 함으로써, 지방세포에 고효율로 유전자를 도입할 수 있다. VSV-G 슈도타이프화 벡터는 패키징 세포에 VSV-G를 발현시켜 제작할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 VSV-G를 유도 발현할 수 있는 패키징 세포(Arai T. et al., J. Virol., 1998: 72, pp1115-21 등)를 매우 적합하게 이용할 수 있다.

제작한 바이러스의 타이터 측정에 대해서는, 단계 희석한 바이러스 용액을 감염시켜, 감염세포의 콜로니수를 계수하여 결정할 수 있으며 상세하게는 Ausubel 등 (Ausubel, F.M. et al. Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. (John Wiley & Sons, NY))을 참조할 수 있다. 혹은, Byun 등 (Byun, J. et al. (1996) Gene Ther. 33333:1018-1020), Tafuro 등 (Tafuro, S. et al. (1996) Gene Ther. 33333:679-684), Miyao 등 (Miyao, Y. et al. (1995) Cell Struct. Funct. 20 20:177-183), Claudio 등 (Claudio, P. P. et al. (2001) Anal. Biochem. 291: 96-101), 또는 Cashion 등 (Cashion, L. M. et al. (1999) Biotechniques 26 26: 924-930) 의 방법에 따라 결정할 수도 있다.

바이러스 벡터를 초대 배양 지방세포에 도입하려면, 당해 벡터를 당해 세포에 접촉시키면 좋다. 예를 들면, 바이러스 벡터를 포함한 배양액 내에서 초대 배양 지방세포를 인큐베이트 한다. 지방세포는, 바람직하게는 전지방세포 상태로 감염시킨다. 0.5~8 ㎍/ml정도의 polybrene를 첨가하는 것으로 감염 효율을 높일 수 있다. 다중 감염도(MOI)는 특히 제한은 없지만, 0.1~100의 사이에서 적당히 조절할 수 있다. 유전자 도입 세포는, 예를 들면 마커 유전자를 이용하여 선별하여도 되지만, MOI를 약 2 이상, 바람직하게는 약 3, 4, 또는 5 이상으로 감염시키면, 선별하지 않아도 대부분의 세포에 유전자를 도입하는 것이 가능하다. 유전자 도입한 지방세포는, 그대로 이식에 이용할 수도 있고, 경우에 따라서는 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), Dexamethasone 및 인슐린을 포함한 배지에서 배양하여 성숙 지방세포로 만들 수도 있다. 이 경우, IBMX나 Dexamethasone는, 주로 지방세포의 퍼옥시좀 증식제 응답성 수용체-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)를 활성화 하기 위해서 이용되므로, 동 수용체를 직접 활성화 하는 약제(예를 들면 티아졸리딘 유도체인 피오글리타존(pioglitazone)/Takeda Pharmaceutical Company Limited, 로지글리타존(rosiglitazone)/GlaxoSmithKline 등)를 동시에 첨가할 수 있다.

소망한 치료 유전자를 가지는 본 발명의 초대 배양의 지방세포를, 면역학적으로 적합한 수취인(recipient)의 체내에 이식하여 당해 치료 유전자가 코드하는 분비 단백질을 체내에서 발현시키는 것에 의한 유전자 치료가 가능해진다. 이식하는 초대 배양의 지방세포는, 바람직하게는 수취인과 동일 숙주 세포이다. 본 발명의 초대 배양 지방세포의 이식에 의한 유전자 치료 방법은, 소망한 분비 단백질을, 그 효과를 기대하여 체내에서 발현시킴으로써 적용할 수 있다. 예를 들면 질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 가지는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 보유하는 본 발명의 지방세포를 이식하는 것으로써, 당해 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있다. 또한, 본 발명은 단백질을 혈중에 방출시키는 방법으로서, 본 발명의 초대 배양 지방세포를 체내에 투여하는 공정을 포함한 방법에 관한 것이다. 본 방법에 따라, 적어도 20일 이상에 걸쳐서, 바람직하게는 30일 이상, 보다 바람직하게는 40일 이상, 보다 바람직하게는 50일 이상, 보다 바람직하게는 60일 이상, 보다 바람직하게는 80일 이상, 보다 바람직하게는 100일 이상, 보다 바람직하게는 150일 이상, 보다 바람직하게는 200일 이상, 보다 바람직하게는 250일 이상, 보다 바람직하게는 300일 이상, 보다 바람직하게는 350일 이상, 외래 유전자가 코드하는 단백질을 혈중에 유의하게 분비시킬 수 있다. 체내에서 발현한 외래 단백질은, EIA 등의 면역분석 등에 의해 검출 및/또는 정량할 수 있다.　덧붙여 이식한 세포를 꺼내는 것에 의해, 투여한 외래 유전자의 발현을 바라는 시기에 정지시키는 것이 가능하다. 또 경우에 따라서는, 유도형 자살 유전자(HSV-tk등)를 이식 세포에 도입하여 두는 것으로, 예를 들면 ganciclovir를 투여하여 이식 세포를 제거하는 일도 가능하다.

또한, 본 발명은 세포외로 분비되는 단백질을 코드하는 외래 유전자를 안정 적으로 유지하는 초대 배양의 지방세포, 및 약학적으로 허용 되는 담체를 포함하는 유전자 치료용의 이식 조성물을 제공한다. 이용되는 담체로서는, 예를 들면 생리 식염수, 인산 완충액, 배양액, 혈청, 및 체액 등을 들 수 있다. 또, 세포의 골격( saffold)이 되는 고체 또는 겔상의 지지체 등과 조합하여도 좋다.

본 발명의 이식 조성물은, 바람직하게는 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 성분을 포함하고 있다. 세포외 기질 성분이란, 세포 간에 축적되는 불용성의 망상 또는 섬유상 구조물에 포함되는 단백질 또는 뮤코 다당 등의 성분을 말하며, 생물로부터 분리된 것 및 인공적으로 재구성한 것이어도 좋다. 바람직하게는 본 발명에서 이용되는 ECM 성분으로서는 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 헤파란 황산(heparan sulfate), 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 콘드로이친 황산(chondroitin sulfate), 히알론(hyaluronate), 데르마탄 황산(dermatan sulfate), 각질 황산(keratin sulfate), 엘라스틴(elastin) 또는 그 2종 이상의 조합을 들 수 있다. 이러한 ECM 성분은 겔화시켜 지방세포와 혼합시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 이용되는 ECM 겔은, 상기 성분의 적어도 1종 이상이 포함되어 있으면 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 적어도 IV형 콜라겐, 라미닌 및 헤파란 황산을 포함하고 있다. 이러한 ECM로서는, Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 종양으로부터 추출한 기질 (Matrigel (등록상표)) (Becton Dickinson Labware사)를 들 수 있다(미국특허 제 4,829,000호). 본 발명에 이용되는 ECM 성분 및 지방세포를 포함한 조성물의 구조는 특히 한정되지 않고, 예를 들면 겔상 또는 페이스트상의 그물 구조, 섬유상 구조, 평판(디스크)상 구조, 벌집상, 스펀지 유사 구조일 수 있다. ECM 성분의 겔화는, 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면 0.3~0.5% 정도의 콜라겐 수용액을 37℃에서 10~30 분간 인큐베이션하여 겔화시킬 수 있다. 혹은, 겔화제를 이용하여 ECM 성분을 겔화시킬 수도 있다.

또한, 본 발명의 이식 조성물은, 바람직하게는 혈관 신생 인자를 포함하고 있다. 혈관 신생 인자를 포함한 본 발명의 이식 조성물은, 이식 후 주위에 혈관이 형성되어 보다 높은 효율로 외래 단백질을 혈중에 분비할 수 있다. 혈관 신생 인자로서는, 생체 내에서 혈관 신생을 유도할 수 있는 인자이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 혈관 내피세포 증식 인자(VEGF), 알칼리성 섬유아세포 증식 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 증식 인자(aFGF), 혈소판 유래 증식 인자, 트랜스포밍 증식 인자-β(TGF-β), 오스테오넥틴(Osteonectin), 안지오포이에 틴(angiopoietin), 간세포 증식 인자(HGF)등을 예시할 수 있다. 가장 바람직하게는, bFGF를 들 수 있다. bFGF는 FGF2라고도 불리며 섬유아세포의 증식 뿐만 아니라, 혈관내피 세포, 연골, 골아세포, 표피 세포 등 여러가지 세포의 증식을 촉진하는 활성을 가진다(Abraham et al., EMBO J., 5, 2523-2528, 1986; Prats et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1836-1840, 1989). 본 발명에 있어 이용되는 bFGF로서는, 천연의 단백질 뿐만 아니라, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 제조된 것, 및 그 수식체(modified form)여도 된다. bFGF로서는, 예를 들면 WO87/01728, WO89/04832, WO86/07595, WO87/03885, 유럽 특허 출원공개 제 237966호, 유럽 특허 출원공개 제 281822호, 유럽 특허 출원공개 제 326907호, 유럽 특허 출원공개 제 394951호, 유럽 특허 출원공개 제 493737호 등에 기재된 것을 예시할 수 있다. 혹은, 혈관 신생 인자를 한시적으로 발현하는 다른 발현 벡터를 지방세포에 도입할 수도 있다(WO97/49827 참조). 이와 같이 이용되는 혈관 신생 인자는, 본 발명의 지방세포로부터 외래 단백질을 효율적으로 혈중에 분비시키기 위해서 이식 세포 주변에 혈관이 형성되는 것이 주요한 목적이므로, 혈관 유도 인자를 코드하는 벡터를 이용하여 지방세포로부터 혈관 유도 인자를 발현시키는 경우에는 한시적으로 발현하는 벡터(즉 염색체에 삽입되지 않은 벡터)를 이용하는 것이 바람직하다. 지방세포로부터 혈관 유도 인자를 장기간 발현시키면, 이식한 지방세포 주위에 혈관이 과잉 형성되거나 전신에 부작용을 미칠 염려가 있기 때문에, 본 발명의 초대 배양의 지방세포에는 혈관 신생 인자를 코드하는 외래 유전자가 안정적으로 도입되어 있지 않은 것이 바람직하다.

3. 지방세포의 이식

유전자 도입한 지방세포는, 적당한 세포 농도, 바람직하게는 0.2 x 10⁷~2 x 10⁷/ml, 레트로 바이러스 벡터로 도입하였을 경우는 0.2 x 10⁶~5 x 10⁶/ml으로 조정하고 단체인 그대로 혹은 효과적인 매체, 바람직하게는 콜라겐 등의 세포외 기질을 포함한 용액 등과 혼합하여 피하조직이나 지방조직, 바람직하게는 피하조직 내에 주입한다. 지방조직으로의 주입은 절개하여 지방조직을 노출시켜 할 수도 있다. 성숙 지방세포로 최종 분화시킨 세포는, 이식 후에 증식하지 않고 외래 유전자를 장기간 일정한 레벨로 발현한다. 이식한 체내에 있어서 외래 유전자의 발현 레벨은, 이식한 세포수에 비례하기 때문에 이식에 당해서는, 미리 인비트로에서 측정한 외래 유전자의 발현 레벨에 따라 이식하는 지방세포량을 조절하면, 이식한 체내에서 소망하는 발현량을 장기간 유지하는 것이 가능하다.

본 발명에 의해 생체외에서의 유전자 치료에 적절한 초대 배양 지방세포에 외래 유전자를 도입하는 방법이 확립되어 외래 유전자를 안정적으로 유지하는 초대 배양 지방세포가 확립되었다.

이하에, 구체적인 예를 가지고 본 발명을 나타내지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 덧붙여 본 명세서 내에 인용된 문헌은 본 명세서의 일부로서 삽입된다.

< 실시예 1> 마우스 지방세포의 초대 배양

[방법]

3주령의 ICR계 웅성 마우스 혹은 4-5 주령의 C57BL/6 웅성 마우스(모두 Charles River)를 디에틸 에테르로 마취하고 심장으로부터 모든 피를 채혈하여 희생시켰다. 그 다음, 서혜부 피하지방(inguinal subcutaneous fat), 혹은 부고환 주위 지방(fat surrounding the epididymis), 장관막 지방조직(mesenteric adipose tissue)을 각각 무균적으로 적출하였다. 적출한 조직을 PBS로 세정한 후, 가위 혹은 수술용 나이프를 이용하여 잘게 자르고 이 세절 조직을 1 mg/ml의 콜라게나아제(S1 fruction/Nitta gelatin)를 포함하는 통상 배지(DMEM-high glucose/SIGMA, 10% FCS)에서 37℃, 20-60 분간 진탕 소화한 후, 원심분리(300g, 5 min)하여 침전물과 부유층으로 분리하였다.

부유층은 추가로 1~2회의 원심분리하여 콜라게나아제를 희석 제거한 후, 배지가 충분히 있는 T-25 플라스크 (IWAKI)에 가하였다. 거품을 제외하고 통상의 배양면이 천상이 되도록 CO₂ 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂로 배양하였다(천정배양). 10~14 일간 배양 후, 트립신 처리에 의해 천정면에 접착한 세포를 회수하고 통상 의 배양계로 옮겼다. 이후, 1:3~1:10의 비율로 계대배양을 행하였다.

분화 유도는 6 well 플레이트에서 컨플루언트로 배양한 세포를 유도 배지(0.5 mM IBMX, 0.25 uM dexamethasone, 10 ㎍/ml Insulin를 첨가한 통상 배지)로 교환하여 48 시간 자극하였다. 그 후 성숙 배지(10 ㎍/ml Insulin를 첨가한 통상 배지)에서 배양하여 분화를 유도하였다. 성숙 배지는 3 일 마다 교환하였다.

Oil red O 염색액은, 0.3 g의 Oil red O를 100 ml의 이소프로판올(99%)에 섞은 보존 용액과 증류수를 3：2의 비율로 사용시에 혼합하여 섞었다. 세포는 PBS로 세정한 후에 10% 중성 포르말린액(WAKO)으로 고정하였다. PBS로 재차 세정 후, Oil red O 염색액으로 실온에서 10 분간 염색하였다. PBS에서 재차 세정하고 세균 검사를 수행하였다.

［결과］

3 주령의 ICR 마우스 피하지방에서 단리한 초대 배양 지방세포의 현미경 사진을 도 1에 나타낸다. 천정배양 14 일 후 천정측 배양면에 지방적을 가지는 지방세포의 부착(adhesion)을 관찰하였다(A). 이것을 통상 배양계로 옮기면 (B)와 같이 섬유아세포처럼 증식하지만, IBMX, 덱사메타존(dexamethasone), 인슐린에 의해 분화를 유도하자 다시 지방적을 가지는 성숙 지방세포로 분화하였다(C). 저장된 지방은 Oil red O 염색에 의해 적색으로 염색되었다(D). 본 수단에 의해 단리된 세포가 분화능을 가지는 초대 배양 지방세포인 것으로 나타났다.

< 실시예 2> 초대 배양 지방세포로의 내열성 분비형 알칼라인포스파타제 ( AP ) 유전자 의 한시적 도입과 도입 지방세포의 마우스로의 이입

유전자 발현의 모델계로서 AP 유전자, 즉 SEAP 유전자(Clontech) 또는 PLAP 유전자(Goto M. et al. Mol.Pharmacol. vol. 49 860-873 (1996))를 초대 배양 지방세포에 도입하여 AP 활성의 추이를 검토하였다 (양 AP 유전자 산물은 내열형으로서 열처리에 의해 내재성 알칼라인포스파타제와 용이하게 구별할 수 있다 ).

[방법]

(1) SEAP 유전자를 한시적으로 도입한 초대 배양 지방세포의 제조

AP를 발현하는 plasmid(pcDNA3.1-SEAPmh)는 pSEAP2-basic vector(Clontech)를 제한효소 HindIII-XbaI으로 이중 소화(double digestion)하여 얻어진 SEAP 서열을, 포유류 세포 발현용 벡터인 pcDNA3.1 Myc-HisA(Invitrogen)의 HindIII-XbaI 부위에 삽입하여 구축하였다.

10cm dish로의 유전자 도입에 당하여, 500 ㎕의 FCS-free DMEM 배지와 15 ㎕의 Fugene 6 시약(Roche 사제)을 혼합하고 5 ㎍의 pcDNA3.1-SEAPmh를 가하여 실온에서 15분간 정치하였다. 이 혼합액을, 10cm dish에서 70~80% confluent로 배양한 초대 배양 세포(ICR 피하지방 유래)에 가하여 CO₂ 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다.

(2) 알칼라인 포스파타제 유전자를 도입한 초대 배양 지방세포의 마우스로의 이입

유전자 도입한 세포를 트립신 처리에 의해 회수하고 PBS로 2회 원심분리하여 세정 후 1 x 10⁷ cells/ml가 되도록 PBS에 현탁하였다. 동물(ICR계 누드 마우스, 시술시 5주령)은 sodium pentobarbital (Nembutal; Dainippon Pharmaceutical) 50 mg/kg을 복강내 투여하여 마취하였다. 시술부 부근을 희석 히비텐액(dilute Hibitane solution)(스미토모 제약)으로 소독하고 오른쪽 뒷다리 밑 부근의 피부를 3~5 mm 정도 절개하여 서혜부 피하지방(inguinal subcutaneous fat)을 노출시켰다. 제조한 세포 현탁액 0.55 ml(5.5 x 10⁶cells/head)를 1 ml 시린지에 준비하여 22 G 주사바늘을 이용하여 피하지방 내에 주입하였다. 대조를 위하여 컨트롤에는 PBS를 같은 부위에 주입하였다. 또, 단백 보충법과 비교하기 위해서, 정제 AP(Roche) 1㎍을 PBS에 무균적으로 용해하고 똑같이 주입하였다. 절개한 피부를 봉합하고 시술부를 수술용 이소딘(isodine, Meiji Seika)으로 소독하였다.

이식 전(0일) 및 이식 후 경일적으로 헤파린-코팅된 커필러리(Dramond)를 이용하여 안저정맥총(postorbital venous plexus)으로부터 채혈하였다. 전혈로부터 2000 g, 15분간의 원심분리에 의해 plasma를 얻었다. 이 plasma 중의 AP 활성을, 측정 키트(SEAP reporter gene assay kit, Roche 사제)을 이용하여 첨부한 메뉴얼에 따라 측정하였다.

［결과］

알칼라인포스파타제 (AP) 발현 플라스미드 pcDNA3.1-SEAPmh를 한시적으로 도입한 초대 배양 세포를 마우스에 이식하여 얻어진 혈장내 AP 활성을 도 2에 나타낸 다. 비교 대조로서 투여한 1 ㎍의 정제 AP 단백질(Roche)의 주입에서는 혈중 AP 활성은 투여 후 7 일의 시점에서 대조 레벨까지 저하되었다. 한편, 한시적 유전자 도입한 세포를 이식한 마우스에서는, 이식 후 4 일째를 피크로 하는 혈중 AP 활성이 확인되었고 발현 기간은 14 일간이었다. 한시적으로 유전자 도입된 세포 이식에 의한 인비보에서의 발현은, 단백질의 주입에 의한 것보다 좀더 지속되지만 지속기간이 짧고, 혈중 농도의 변동도 큰 것이 명백하였다.

< 실시예 3> 바이러스 벡터를 이용한, AP 를 안정적으로 발현하는 지방세포의 제작

[방법]

(1) AP 및 대조구로 GFP 발현 벡터의 구축

PLAP 유전자는 문헌 (Goto M. et al. Mol.Pharmacol. vol. 49 860-873 (1996))에 기재된 pTK-PLAP로부터 HindIII, BglII를 이용하여 잘라내었다. SEAP 유전자는 pcDNA3.1-SEAPmh를 HindIII/PmeI로 이중 소화하여 수득하였다. GFP 유전자는 pEGFP-N2로부터 NotI-NcoI에 의해 잘라내었다.

바이러스 벡터 제작에 이용하는 플라스미드 pBabeCLXI2G는, pBabePuro (Morgenstern, J.P. et al. Nucleic Acids Res. vol. 18 3587-3596 (1990))을 기본으로 하여 그것으로부터 SV40 프로모터와 네오마이신 내성 유전자를 SalI-ClaI에 의해 자른 후 Klenow fragment 에 의해 평활화하고, 거기에 pIRES2-EGFP로부터 HincII-HincII에 의해 자른 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus (EMCV))의 IRES(internal ribosome re-rentry site)와 GFP(green fluorescent protein)로 치환함과 함께, 추가로 그 LTR(long terminal repeat)로부터 외래 유전자 삽입 부분(멀티 클로닝 사이트)까지의 부분(SspI-BamHI)을 pCLXSN(IMGENEX)의 상당하는 서열(SspI-BamHI)과 치환하여 제조한 것이다. 또 pBabeCLXI2G의 IRES-GFP의 부분을 IRES-퓨로마이신 내성 유전자로 치환한 pBabeCLXIP도 이용하였다.

상술한 PLAP, SEAP, GFP 각각의 DNA 단편을 Klenow fragment에 의한 평활 처리 후 HpaI에 의해 절단한 pBabeCLXIP 벡터 내지는 pBabeCLXI2G에 삽입하여 각각 pBabeCL(PLAP)IP, pBabeCL(SEAPmh)I2G, pBabeCL(GFP)IP를 얻었다.

(2) 바이러스 벡터의 제작

10cm dish로의 유전자 도입은 이하와 같이 행하였다. 500 ㎕의 FCS-free의 DMEM 배지에 plasmid 도입 시약 TransIT(Mirus) 30 ㎕를 혼합하여 실온에서 5분간 방치하였다(DMEM/TransIT 혼합액). 또다른 tube에 VSV-G를 코드하는 벡터(pCALG, Arai T. et al., J. Virol., 1998: 72, pp1115-21로부터 변형) 3.3 ㎍, Gag·Pol를 코드하는 벡터(pCLAmpho/ RetroMax system(IMGENEX)) 3.3 ㎍ 및 패키지 시그널과 도입 유전자를 포함하는 벡터(pBabeCL(PLAP)IP, 혹은 pBabeCL(SEAPmh)I2G, 혹은 pBabeCL(GFP)IP) 3.3 ㎍의 합계 9.9 ㎍을 혼합하였다(plasmid액). DMEM/TransIT 혼합액에 plasmid액을 가하여 혼합한 후에 추가로 실온에서 15분 방치한 후 전날 2x10⁶cells /10cm dish로 준비하여 하룻밤 배양한 293-EBNA 세포(Invitrogen)에 첨가하였다.

첨가 8 시간 후에 배지를 교환하여 2 일간 배양 후에 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청은, 협잡물(오염물)을 제거하기 위해 원심분리(300 g, 5 min) 또는 0.45 ㎛ 시린지 필터(밀리포어 사제)로 여과하고 이 상청을 바이러스액으로서 사용하였다(각각, MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP, MLV(VSV)/ pBabeCL(SEAPmh)I2G, MLV(VSV) /pBabeCL(GFP)IP). 일부의 바이러스액은 초원심분리(19,500 rpm, 100분)에 의해 농축하여 사용하였다.

(3) 초대 배양 지방세포에의 유전자 도입과 배양

유전자 도입에 이용하는 지방세포(ICR 마우스 피하지방 유래, 동 마우스 부고환 주위 지방 유래, 동 마우스 장간막 지방 유래, C57BL/6 마우스 피하지방 유래)는 도입 전날 50-80% 컨플루언트가 되도록 6 well 또는 96 well의 플레이트에 준비하였다. 배지를 버리고 4 ㎍/ml Polybrene(SIGMA) 액과 바이러스액을 등량씩 세포에 첨가하여 바이러스 벡터를 도입하였다. 도입 8 시간 후에 통상 배지로 교환하여 추가 배양 및 계대배양을 실시하였다. 일부의 세포에 대해서는, 도입 4 일째의 시점에서 24 시간의 배양 상청을 회수하여 AP 활성을 측정하였다(도 3).

계대배양은 10 cm dish 스케일로 <실시예 1>에 기재한 방법에 준하여 실시하고 4~7 일간 배양하여 컨플루언트에 이르면 배지를 바꾸어 17시간 후의 배양 상청 내의 AP 활성을 측정하였다. 이 세포를 계속 계대하여 같은 조작을 행하고 발현의 지속 여부를 검토하였다(도 5, 6). 모든 계대일에 AP 활성을 측정한 것은 아니다.

분화 유도는 6 well 플레이트로 <실시예 1>에 기재한 방법에 준하여 행하였다. 다만, 유도 배지에서 3 일간 처리하고 이후 성숙 배지를 3 일 마다 교환하였다. 배양 상청 중의 AP 활성은 3 일간 마다 배양 상청을 이용하여 측정하고 그림의 횡축은 상청을 회수한 날로 표시하였다. GFP 도입 세포에 대해서는 적당한 GFP광 하에서 현미경 사진을 촬영하였다(도 4, 6). 덧붙여 '비분화 유도 조건'이란, 유도 배지·성숙 배지 대신에 통상 배지에서 계속 배양한 조건을 의미한다.

［결과］

도 3은, 레트로 바이러스 벡터를 이용한 경우의, 조직 유래 세포마다 유전자 도입 효율의 비교를 나타내는 그림이다. ICR 마우스의 서혜부 피하, 부고환 주위, 장간막에 존재하는 각 지방조직으로부터 각각 단리한 초대 배양 지방세포에 유전자 도입을 실시하였는데, 어느 세포에 있어서도 배양 상청중에 AP 활성이 인식되었다. 당해 레트로 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입은 유래하는 부위에 의존하지 않고 가능함을 명백히 하였다.

도 4는, GFP 발현 레트로 바이러스 벡터를 도입한 세포의 분화 유도상을 나타내는 현미경상이다. 유전자 도입 13일 후에 분화 유도가 시작되어, 3주간 경과 후에 사진을 촬영하였다. 지방적을 포함한 세포에 GFP의 형광이 관찰되어 당해 바이러스 벡터가 분화능을 가지는 전지방세포(preadipocytes)에 유전자 도입 가능하다는 사실, 한편 당해 벡터에 의한 유전자 도입이 분화능에 영향을 미치지 않는다는 사실을 명백히 하였다.

도 5는, AP 발현 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포의 계대 배양에 있어서의 발현의 지속성을 나타내는 그림이다. 10 cm dish에서 컨플루언트에 이른 세포의 17시간 후의 배양 상청 중의 AP 활성을 측정하였다. C57BL/6 마우스 피하지방 유래의 초대 배양 지방세포(a)에서는 검토한 87 일간에 걸쳐서, ICR 마우스 피하지방 유래의 초대 배양 지방세포(b)에서는 검토한 63 일간에 걸쳐서, 지속적인 AP 생산이 관찰되었다. 이들 결과로부터, 당해 바이러스 벡터의 초대 배양 지방세포로의 도입에 의해 분열 후의 딸세포에도 외래 유전자가 유지되는, 안정적인 발현 세포의 제작이 가능한 것을 명백히 하였다.

도 6은, 분화 유도한 유전자 도입 지방세포에 있어서의 발현의 변화를 나타내는 사진 및 그림이다. ICR 피하지방 유래의 GFP 발현 지방세포는, 통상 배양하(a) 및 분화 유도하(b)의 어느 쪽에서도 강한 GFP 발현이 관찰되었다. 또, ICR 피하지방 유래의 AP 발현 지방세포는, 비분화 유도하(비분화) 및 분화 유도하(분화)의 어디에서도, 지속적인 AP의 발현이 검출되었다(c).　당해 바이러스 벡터에 의해 유전자 도입된 초대 배양 지방세포는, 도 5에 명시한 증식하 뿐만 아니라, 비분화 유도하 즉, 비증식 상태나 성숙하라고 하는 어느 단계에 있어서도 안정적으로 유전자 발현을 나타내는 것을 명확히 하였다.

< 실시예 4> 플라스미드 벡터를 이용한 인슐린을 안정적으로 발현하는 지방세포의 제작

유전자의 도입법은 플라스미드 벡터를 이용한 방법도 허용된다.

[방법]

(1) 사람 인슐린 유전자의 단리와 수식

사람 췌장 유래 cDNA 라이브러리(Stratagene)에 대하여 표 1에 나타낸 프라이머(Insulin Fw 및 Rv)를 이용하여 PCR 반응을 수행하고 사람 인슐린 유전자 단편을 얻었다. 얻어진 354 bp의 단편에 대하여 염기 서열을 동정하고, native 인슐린으로서 pCR2.1 TOPO 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝 하였다.

(굵은 글씨는 Fw에서는 개시코돈을, Rv에서는 종결코돈의 안티센스를 각각 가리킨다. 밑줄은, 도입한 변이 부분을 나타낸다. )

다음으로, 지방세포에서 성숙 인슐린을 발현시키기 위해서, 문헌(JBC, 1994, 269(8), 6241-)에 근거하여 유전자 변형(genetic modification)을 실시하였다. 구체적으로는, 사람 인슐린 B 사슬과 C 펩티드의 결합부(site1) 및 동 C 펩티드와 A 사슬의 결합부(site2), 및 B 사슬 10 번째의 히스티딘 잔기(B10) 각각의 변이를 포함하는 양방향의 프라이머를 각각 합성하여(표 1), Quikchange mutagenesis kit(Stratagene)에 의해 변이체를 얻었다. 이 반응을 site1 및 site2에 대해서 행한 것을 s1s2 변이체, site1, site2 및 B10에 대해서 행한 것을 s1s2B10 변이형 인슐린으로 하였다. 얻어진 변형 사람 인슐린 유전자에 대하여 염기서열을 확인하고 pcDNA3.1 벡터에 삽입하여 유전자 도입에 이용하였다.

(2) 초대 배양 지방세포로의 유전자 도입

500 ㎕의 FCS-free DMEM 배지와 15㎕의 Fugene 6 시약(Roche)을 혼합하고 도입 플라스미드 5㎍을 가하여 실온에서 15분간 정치하였다. 이 혼합액을, 10 cm dish 에서 70~80% 컨플루언트로 배양한 초대 배양 세포(C57BL/6 마우스 부고환 주위 지방조직 유래)에 가하여 CO₂ 인큐베이터 내에서 24 시간 배양하였다. 유전자 도입 4 일 후에 세포를 T225 플라스크에 계대하고, 하룻밤 배양한 후에 0.2 mgU/ml의 G418(SIGMA)를 포함하는 배지로 교환하여 3 주간 배양하고 유전자 도입 세포를 선택하였다. 얻어진 G418 내성 세포를 10 cm dish에 플래이팅하고, 배양 상청 중의 인슐린을 초고감도 인슐린 EIA 키트(모리나가)에 의해 측정하였다. 본 EIA 키트는 프로세싱 되기 전의 프로 인슐린과 성숙 인슐린을 함께 검출한다.

［결과］

도 7은, 초대 배양 지방세포로의 플라스미드 도입에 의한 (프로)인슐린 생산을 나타내는 그림이다. C57BL/6 마우스 부고환 주위 지방조직 유래의 지방세포에, native 사람 인슐린 유전자 (native), 혹은 site1/site2/B10 변형(s1s2B10)을 각각 삽입한 pcDNA3.1 Myc-His 벡터 또는 공 벡터(mock)를 트랜스펙션 하였다. G418 선택하여 얻어진 내성 세포의 배양 상청 중에 사람(프로) 인슐린이 검출되었다. 초대 배양 지방세포에 대한 안정적인 유전자 도입은, 플라스미드 벡터에 의해서도 가능함을 나타내었다.

< 실시예 5> 아데노 수반 바이러스를 이용한 AP 를 안정적으로 발현하는 지방세포의 제작

유전자 도입법은, 아데노 수반 바이러스(AAV)를 이용한 방법도 허용된다.

[방법]

AAV Helper-Free System (Stratagene)를 이용하여 검토하였다. <실시예 2>에 기재한 PLAP 단편(HindIII, BglII를 이용해 자른 단편)을 pAAV-MCS 벡터의 동 제한효소 사이트에 삽입하여 pAAV-PLAP를 얻었다.

AAV 벡터의 제작은 이하와 같이 행하였다. OPTI-MEM (Invitrogen) 1.75 ml 과 plasmid 도입 시약 Fugene 220 ㎕를 혼합하고 그 후 pAAV-PLAP, pAAV-RC, pHelper를 각각 25 ㎍ 씩 혼합하여 실온에서 15 분 방치하였다(Fugene/plasmid액). 한편 293-EBNA 세포를, 15cm dish에서 60-70% 컨플루언트 상태가 되도록 준비하였다. 배양액을 FCS-free의 DMEM으로 치환하고 그것에 Fugene/plasmid액을 균등하게 적하하여(instilled) 2-3시간 배양하였다. 다음으로 최종 농도가 10%가 되도록 FCS를 첨가하고 추가로 2 일간 배양하였다. 세포를 트립신 처리로 회수하고 원심분리시킨 후, 최종 용량이 3 ml가 되도록 50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl 용액에 현탁하였다. 이 현탁액에 대하여 드라이아이스-에탄올/37℃의 동결/융해를 3 사이클 실시하여 세포를 파쇄하였다. 추가로 Benzonase (SIGMA)에 의해 숙주 게놈 DNA를 분해한 후 9,000 rpm, 30 분의 원심분리를 행하여 상청을 필터 여과하여 바이러스액을 제조하였다.

초대 배양 지방세포(C57BL/6 마우스 피하지방 유래)는, 유전자 도입 전날 1x10⁴cells/well로 12 well plate에 플래이팅하고 하룻밤 배양 후, 40 mM의 Hydroxyurea 및 1 mM의 Butylic acid(모두 SIGMA)를 포함한 배지에서 6 시간 처리하였다. 이 배지를 제거하고, FCS-free의 DMEM로 1/100 희석한 바이러스액을 0.5 ml/well로 첨가하였다. 1 시간 배양 후, 최종농도 10%가 되도록 FCS 함유 배지를 첨가하여 하룻밤 배양하였다. 이후, 통상의 배지 교환을 행하고 24 일째에 계대하였다.

도입 1, 7, 25 일째에 배지를 교환하고 각각 2 일 후의 배양상청을 AP 측정에 이용하였다. 65℃에서 20 분간 가온하여 필요에 따라서 희석한 배양상청 10 ㎕에, 50 ㎕의 에세이 버퍼(16 mM NaHCO₃, 12 mM Na₂CO₃, 0.8 mM MgSO₄)와 50 ㎕의 발광시약(CDP-Star Ready to Use with SapphierII, TROPIX)을 혼합하고 차광하에서 30분간 반응시켜, 루미노미터(luminometer)로 측정하였다.

[결과]

도 8은 AP 발현 AAV를 도입한 초대 배양 지방세포(C57BL/6 마우스 피하지방 유래)에 있어서 AP의 안정적 발현을 나타내는 그림이다. 배양 상청 중의 AP 활성은 전시험 기간을 통하여 지속적으로 검출되었다. 초대 배양 지방세포에 대한 안정적 유전자 도입은 AAV 벡터에 의해서도 얻어짐을 나타내었다.

< 실시예 6> 사람 인슐린을 발현하는 레트로 바이러스 벡터의 구축과 지방세포로의 도입

[방법]

<실시예 4>에서 구축한 사람 변형 인슐린 유전자(s1s2B10Ins)를 <실시예 3>의 방법에 준하여 pBabeCLXI2G 벡터에 삽입하였다(pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G). 이 플라스미드를 VSV-G를 코드하는 벡터(pVPack-VSV-G/Stratagene), Gag·Pol를 코드하는 벡터(pVPack-gp/Stratagene로부터 변형)와 함께 293-EBNA 세포에 <실시예 3>의 방법에 준하여 도입하고 변형 인슐린 발현 레트로 바이러스 벡터를 제작하였다(MLV(VSV) /pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G). 10 cm dish 22 매의 293-EBNA 세포의 배양상청(약 200 ml)을 회수하고 원심분리/필터 처리에 의해 불용물을 제거한 후에 초원심분리(19,500 rpm, 100분)에 의하여 농축 바이러스액을 얻었다. 이것을, 전날 6 well 플레이트에 플래이팅한 초대 배양 지방세포(C57BL/6 피하지방 유래)에 도입하였다.

유전자 도입한 세포를 6 well 플레이트에 다시 플래이팅하고, <실시예 1>의 방법에 준하여 분화를 유도하였다. 유도 전 3 일부터 유도 개시일까지의 3일간(유도전) 및 유도 14 일째에서 17 일째의 3일간(유도 후)의 배양 상청을 각각 회수하여 <실시예 4>와 같은 방법으로 인슐린 양을 측정하였다. 또, 목적 부위에서 프로세싱이 일어나 성숙 인슐린이 생성되는 것을 확인하기 위해서, 성숙 인슐린 만을 인식하는 인슐린 EIA 키트의(IBL)의 측정도 행하였다. 대조구로는, 동시에 분화 유도한 비유전자 도입 세포의 배양 상청을 이용하였다.

[결과]

도 9는, s1s2B10 인슐린 발현 레트로 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포에 있어서 분화 유도시의 인슐린 발현을 나타내는 그림이다. (A) 모리나가제 EIA에 의한 결과, (B) IBL제 EIA에 의한 결과를 각각 가리킨다. 인슐린은 분화 유도 전 또는 분화 유도 후의 어느쪽에서도 안정적으로 분비되며, 변이형 인슐린 유전자 도입에 의해 지방세포로부터 성숙 인슐린을 생산할 수 있음이 명백하였다.

< 실시예 7> 사람 glucagon - like peptide - 1(GLP-1)를 발현하는 레트로 바이러스 벡터의 구축과 지방세포로의 도입

GLP-1은 섭식시에 소장 L세포로부터 생산되어 췌장 β세포에 작용하여 인슐린 분비를 자극하는 작용을 가지는 펩티드이다. 그 외에도, 췌장 β세포의 재생 작용이나 식욕 억제 작용, 위의 배설 억제 작용 등, 항당뇨병·항비만의 다양한 작용을 가지는 것이 밝혀지고 있다(Meier JJ et al. Eur J Pharmacol. 2002, 12;440(2-3):269-79, Drucker DJ.Gastroenterology. 2002;122(2):531-544). 이 펩티드는 프리프로글루카곤 유전자로부터 생산되는 폴리펩티드로부터 조직 특이적 프로세싱에 의해 생기는, GLP-1의 아미노산 서열로서 7번에서 37번(혹은 36번의 아미드체)의 펩티드가 주된 약리활성을 가지는 것이 알려져 있다(Drucker DJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May;84(10):3434-3438, Kreymann B et al. Lancet. 1987, 5;2(8571):1300-1304, Mojsov S et al. J Clin Invest. 1987 Feb;79(2):616-619). 이 인자를 지방세포로부터 생산시킬 수 있도록 이하와 같이 검토하였다.

[방법]

<실시예 3>에서 이용한 PLAP 유전자의 시그널 펩티드(17 아미노산)에 사람 GLP-1(7-37)와 종결코돈을 연결한 서열(코드서열을 서열번호：10에 나타낸다)을 포함하는 합계 156 base pair의 염기의 배열을 설계하고 중앙에 22 mer의 오버랩을 가지도록 뉴클레오티드를 합성하였다(표 1 중 sPL-GLP-1 Fw 및 sPL-GLP-1 Rv). 이것을 어닐링시키고 Pfu polymerase(Stratagene)에 의해 이중 사슬로 만든 후 5'말단, 3'말단의 프라이머(표 1의 GLP-5' 및 GLP-3')를 이용한 PCR에 의해 목적 단편을 증폭하였다. 이 단편을 pCR2.1 벡터에 서브클로닝 한 후에 제한효소로 잘라 <실시예 3>과 같이 pBabeCLXI2G 벡터에 삽입하였다(pBabeCL(sPL-GLP1) I2G). 이것을 <실시예 6>과 같은 방법으로 293-EBNA 세포에 도입하고, GLP-1 발현 레트로 바이러스 벡터를 제작하였다(MLV(VSV) /pBabeCL(sPL-GLP-1) I2G). 10 cm dish 9 매의 293-EBNA 세포의 배양 상청(약 90 ml)을 회수하고 원심분리/필터 처리에 의해 불용물을 제거한 후 초원심분리(19,500 rpm, 100분)에 의해 농축 바이러스액을 수득하였다. 이것을 전날 6 well 플레이트에 플래이팅한 초대 배양 지방세포(C57BL/6 피하지방 유래)에 도입하였다. 도입한 지방세포를 12 well 플레이트에 다시 플래이팅하고 <실시예 1>의 방법에 준하여 분화 유도하였다. 비유도란, 유도 배지·성숙배지 대신에 통상 배지에서 계속 배양한 조건을 의미한다. 7 일 후에, 1 mM의 Valine-pyrrolidine(GLP-1 분해 효소 저해제, (주)에자이에서 합성)를 포함하는 FCS-free DMEM 배지로 교환하였다. 18 시간 후에 배양 상청을 회수하고, 활성형 GLP-1(7-37) 양을 ELISA법(LINCO)에 의해 측정하였다.

［결과］

도 10은, GLP-1(7-37) 발현 레트로 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포에 있어서의 발현을 나타내는 그림이다. 비분화 유도 및 분화 유도 후의 지방세포의 배양 상청에, 활성형인 GLP-1(7-37)의 발현이 관찰되었다. 프리프로 타입으로 생산되고 프로세싱에 의해 잘라지는 인자여도, 본 방법에 따라 그 인자만을 지방세포로부터 생산시켜 얻을 수 있음이 명백하였다.

< 실시예 8>　 AP 안정적 발현 세포의 마우스로의 이식(시험 1)

[방법]

<실시예 3>의 방법으로 제작한 AP 발현 지방세포(MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP) IP도입, C57BL/6 피하지방 유래)를 컨플루언트로 배양한 후, 트립신 처리에 의해 회수하고 PBS로 세정한 후, 5x10⁶ cells/ml가 되도록 빙온하의 마트리겔 (Becton Dickinson)에 현탁하였다. 이것을 C57BL/6 마우스(시술시 8 주령, Charles River)의 뒤쪽 피하 (dorsal subcutaneous area, Sc)에 마우스 한마리 당 0.2 ml의 용량(1x10⁶cells/head)을 주입하여 이식하였다(분화 유도 없음). 한편, 동 세포를 컨플루언트로 배양한 후, <실시예 1>에 나타낸 유도 배지에서 3 일간 배양하고 같은 처리를 하여 이식하였다(분화 유도 있음). <실시예 2>에 나타내는 방법으로 경일적으로 채혈을 실시하여 혈장 내의 AP 활성을 측정하였다.

［결과］

도 11은, AP 발현 초대 배양 지방세포를 이식한 마우스에 있어서의, 혈장 내 AP 활성의 추이를 나타내는 그림이다. 어느 이식법에 의해서도 약 50 일간의 전시험 기간에 걸쳐서 발현의 지속이 관찰됐지만, 이식전 3 일간의 분화 유도 자극을 주고 나서 이식한 개체(분화 유도 있음)가, 유도없이 이식한 개체에 비하여 적은 변동폭으로 발현이 지속되었다. 분화 유도 자극을 줌으로써 이식 후의 생존률을 개선할 수 있을 가능성을 나타내었다.

< 실시예 9>　 AP 안정적 발현 세포의 마우스로의 이식(시험 2)

[방법]

(1) 이식

<실시예 3>에서 제작한 AP 발현 지방세포(MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP) IP도입, ICR 피하지방 유래)를 컨플루언트로 배양한 후, 트립신 처리에 의해 회수하여 PBS로 세정한 후에, 5x10⁶ cells/ml가 되도록 1 ㎍/ml의 bFGF(Genzyme Techne)를 첨가한 빙온하의 마트리겔 (Becton Dickinson)에 현탁하였다. 이것을 ICR계 누드 마우스(시술시 6 주령, 찰즈 리버)의 뒤쪽 피하(Sc), 서혜부 피하지방내(fat), 복강내 (ip) 각 부위에 마우스 한마리 당 0.2 ml의 용량(1x10⁶ cells/head)을 주입하여 이식하였다. 대조구로서 GFP 발현 지방세포를 마찬가지로 처리하여 피하에 이식하였다.

또한, AP 발현 세포의 일부는, <실시예 1>에 나타내는 유도 배지에서 3일간 배양한 후에, 마찬가지로 회수하여 이식하였다(Dif). 또 일부는 유도 배지 후 추가로 성숙 배지에서 4 일간 배양하여 마찬가지로 회수하여 이식하였다(Mat).

또 AP 발현 세포의 일부는, 이식과 같은 조건(1x10⁶/0.2 ml 마트리겔- bFGF 첨가)으로 8 well-Labteck chamber(Nunc)에 플래이팅하고 37℃에서 가온하여 고형화하였다. 이 고형화 겔을 마우스의 피하에 삽입하여 이식하였다. 이 때, 고형화 후에 통상 배지에서 배양한 것을 pre-fixed (pf)/gr, 분화 유도 배지에서 배양한 것을 pf/dif로 하여 7 일간 배양 후에 이식하였다.

이식 전(0일) 및 이식 후 경일적으로 <실시예 2>의 방법에 준하여 plasma 중의 AP 활성을 측정하였다.

(2) 적출

분화 유도 후에 이식한 군(Dif/Sc) 가운데, 개체 A에 대해서는 이식 5주 후에, 개체 B에 대해서는 이식 43 주 째에, 각각 이식 세포덩어리를 마트리겔과 함께 적출하였다. 대조군의 일례에 대해서도, 이식 5 주째에 적출하였다. 각각, 50 mg/kg의 넴부탈을 복강내 투여하고 마취한 후에 피부를 절개하여 육안적으로 확인할 수 있있었던 이식 마트리겔 편을 절제하였다. 수술 부위는 봉합하고 이소딘(메이지)으로 소독하여 이후 마찬가지로 사육하고 경일적으로 채혈하였다.

［결과］

도 12(a)는, AP 발현 초대 배양 지방세포를 분화 자극하고 동시에 basic FGF 첨가 마트리겔을 이용하여 이식하였을 때(Dif/Sc군)의 혈장내 AP 활성의 추이를 50 일간 검토한 결과이다. 혈중 AP 활성은 약 5배의 범위에서 49 일간에 걸쳐서 안정적으로 변화하였다. 이식시의 bFGF 첨가에 의하여 이식 후의 생착율을 보다 개선할 수 있음을 나타내었다. 또는 (b)는 동 기간 내에서 이식 마트리겔의 적출에 의한 혈장 AP 활성의 소실(개체 A)을 나타내는 그림이다. PLAP 도입군의 평균치에 비해 적출 개체에서는 매우 분명한 AP 활성의 저하가 인정되어 혈중 AP는 이식 세포에서 유래한 것이며 또 이식편의 적출에 의해 유전자 발현은 신속하게 소거가능한 것임을 분명히 하였다. 이 때, 대조구인 GFP 도입 세포 이식군으로부터도 일부 적출을 하였는데, 적출 마트리겔 중에 GFP 양성 세포가 관찰되며 한편 많게는 도 6(B)과 같이 공포상(vacuole image)을 나타내었다(c). 당해 방법에 의해 이식한 초대 배양 지방세포가 성숙 지방으로서 인비보에서 생착할 가능성을 나타내었다.

도 13은, 도 12(a)에 있어서의 이식 마우스 및 그 외 다양한 방법으로 이식한 마우스의 혈중 AP 활성을 보다 장기에 걸쳐 검토한 결과이다. PLAP 도입 세포의 이식군에서는, 어느 이식 부위·이식법에 의해서도 명확한 혈중 AP 활성의 상승이 관찰되었다. 혈중 AP 활성은 장기에 걸쳐 지속하며, 특히 Dif/Sc 군(도 12(a)에 예시한 군)은 시험기간의 1년에 걸쳐서 안정적인 AP 발현이 관찰되었다. 그 외의 이식법에 있어서도, 모두 시험 기간내(ip 군에서는 316 일, fat 군에서는 54 일, Sc 군에서는 225 일, Mat/Sc 군에서는 317 일, pre-fix의 2 군에서는 314 일)에서 지속적으로 AP 생산이 관찰되었다. 이식 후 1 주 이내에 인정되는 활성의 피크는 ip 군이 가장 높고, 이하, Sc>fat> Dif/Sc≒pf-dif >pf-gr≒Mat/Sc의 순서였다. 또, 이식 후의 변동폭에 대해서는 전군 비교가능한 13 주 경과시와 피크와의 비로 보면 pre-fix의 2 군에서 약 3 배로 가장 변동이 적고, ip 군이나 Dif/Sc, Mat/Sc 군에서는 약 5 배, Sc 군이나 fat 군에서는 약 10 배였다. 각 이식법에서는 이식 직후의 피크치나 이식 후의 변동폭이 달라, 이들은 이용하는 유전자 산물이나 병의 용태의 특징, 기술의 간편성 등에 따라 구분하여 사용하는 것이 가능하다. 체외에서 유전자를 안정 도입한 초대 배양 지방세포의 이식은, 다양한 방법으로 이식 가능하며 또 이식 후에는 장기적으로 안정하게 인비보 유전자의 발현이 가능함을 분명히 하였다.

도 14는, 도 12(b)에 예시한 것과 같은 적출 시험을, 이식 후기에 행한 결과를 나타내는 그림이다. 이식 초기에 적출한 개체(개체 A) 뿐만 아니라, 이식 후기에 적출한 개체(개체 B)에 있어서도, 적출 후 빠른 혈중 AP 활성의 소실을 관찰하였다. 본 방법에 의해 이식된 지방세포는 이식 후 장기간에 걸쳐서 이식 부위에 국부적으로 존재하며 시기에 의존하지 않고 필요에 따라서 적출하여 유전자 발현을 소거할 수 있음을 밝혔다.

< 실시예 10>　 AP 안정적 발현 세포의 마우스로의 이식(시험 3)

이식 세포수의 용량 의존성을 확인하기 위해서, 다음의 검토를 하였다.

[방법]

<실시예 3>에서 제작한 AP 발현 지방세포(MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP 도입, ICR 피하지방 유래)를 컨플루언트로 배양하고 <실시예 1>에 나타내는 유도 배지에서 3일간 배양한 후 트립신 처리에 의해 회수하였다. PBS로 세정한 후에, 5x10⁶ cells/ml가 되도록 마트리겔에 현탁하였다. AP 세포 현탁액에 대해서는 마트리겔에 의해 5 배씩의 단계 희석을 실시하고 각각 1x10⁶ cells/ml, 2x10⁵ cells/ml 용액을 제조하였다. 이들에 최종농도 1 ㎍/ml가 되도록 bFGF를 첨가하고 ICR계 누드 마우스의 뒤쪽 피하에 마우스 한마리 당 0.2 ml의 용량으로 이식하였다(각각 고용량 :1x10⁶ cells/head, 중용량: 2 x 10⁵ cells/head, 저용량: 4x10⁴ cells/head). 컨트롤로서 GFP 발현 지방세포를 마찬가지로 처리하고 고용량과 같은 조건(1x10⁶ cells/head)에서 피하에 이식하였다.

［결과］

도 15는, AP 발현 지방세포의 이식에 있어서 이식 세포수 의존적인 혈중 AP 활성을 나타내는 그림이다. 이식 세포수를 변화시키는 것으로, 지속기간에 영향없이 용량 의존적인 혈중 AP 활성이 관찰되었다. 특히, 중·저용량군에서는 고용량군에서 보여지고 있던 이식 후 조기 단계에서의 피크를 나타내지 않고, 보다 적은 변동폭으로 변화하였다. 인비보의 발현량을 이식된 세포수에 의해 용이하게 조정할 수 있고 최적세포수를 조절하여 이식 후의 혈중 농도(발현량)를 보다 안정화시킬 수 있음이 밝혀졌다.

< 실시예 11>　인슐린 발현 지방세포의 이식에 의한, 당뇨병 모델 마우스의 혈당 저하 작용

[방법]

당뇨병 마우스는, 8 주령의 웅성 C57BL/6 마우스에 대해 170 mg/kg의 스트렙토조토신(STZ, SIGMA)을 10 ml/kg로 정맥내 투여하여 제작하였다. STZ 투여 1, 2주 후에 각각 공복시 혈당치(FBG)를 측정하고 300 mg/dl이상의 FBG를 나타낸 개체를 당뇨병으로 판정하였다. 또한 혈당치는 전혈을 채취한 직후에 과염소산을 처리하고 글루코오스 테스트-II(WAKO)를 이용하여 측정하였다.

<실시예 6>에서 제작한 MLV(VSV) /pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G 도입 지방세포를 <실시예 10>과 같은 방법으로 분화 유도 자극 후, 5x10⁶/ml가 되도록 1 ㎍/ml의 bFGF를 첨가한 마트리겔에 현탁하였다. 이 현탁액을 한 부위 당 0.2 ml씩, 당뇨병 마우스의 뒤쪽 피하에 합계 4 부위(4x10⁶/head)에 이식하였다. 대조군에는, 비유전자 도입의 지방세포를 같은 방법에 의해 이식하였다. 이식은 STZ 처치 19 일 후에 실시하고 이후 경시적으로 FBG를 측정하였다. 통계 해석은 대조군과의 비교(unpaired t test)에 의하여 행하였다.

［결과］

도 16은 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한, s1s2B10 인슐린 발현 지방세포의 이식에 의한 효과를 나타낸 그림이다. 대조구에는 비유전자 도입 세포를 이식하였다. 인슐린 발현 세포 이식군의 혈당치는 이식 7 일째로부터 저하 경향을 나타내었고, 이식 13, 21 일째에는 유의한 혈당 저하 작용을 나타내었다(a). 또, 이식 20 일 후의 체중은 인슐린 발현 세포 이식군이 대조군에 비해 유의하게 높으며, 당뇨병에 의한 체중 감소를 회복시켰다(b). AP를 이용한 검토 결과로부터 이 혈당 저하 작용은 장기적으로 지속됨이 추측된다. 이와 같이, 이식한 초대 배양 지방세포로부터 생산된 외래 유전자 산물이 수취인의 병의 용태 변화에 기여할 수 있음을 분명히 함과 동시에 본 방법에 의한 당뇨병 치료의 가능성이 제시되었다.

도 1은 3 주령의 ICR 마우스 피하지방으로부터 단리한 초대 배양 지방세포의 현미경 사진이다. (a) 천정배양 14 일 후의 천정측 배양면에 접착한 지방세포, (b) 통상배양계에서 증식시킨 초대 배양 지방세포, (c) 분화 유도에 의해 지방적(lipid droplet)을 축적한 성숙 지방세포, (d) 분화 유도 세포의 Oil red O 염색상을 각각 가리킨다.

도 2는 알칼라인 포스파타제 (AP) 발현 플라스미드 pcDNA3.1-SEAPmh를 한시적으로 도입한 초대 배양 지방세포(ICR 피하지방 유래)를 ICR계 누드 마우스에 이식하여 얻어진 혈장내 AP 활성을 나타내는 그림이다.

도 3은 레트로 바이러스 벡터 MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP를, 각 지방조직 유래의 초대 배양 지방세포에 도입하였을 때의 유전자 도입 효율의 비교를 나타내는 그림이다.

도 4는 MLV(VSV) /pBabeCL(GFP)IP를 도입한 초대 배양 지방세포의 분화 유도상을 나타내는 현미경 사진이다. (a) 광학 현미경 사진, (b) A와 동일한 시야의 GFP 형광 사진을 각각 가리킨다.

도 5는 AP 발현 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포의 계대배양에 있어서의 AP 발현의 지속성을 나타내는 그림이다. (a) C57BL/6 마우스 피하지방 유래의 세포에 SEAP 유전자(MLV(VSV)/ pBabeCL(SEAPmh) I2G) 또는 PLAP 유전자(MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP)를 도입한 결과, (b) ICR 마우스 유래 지방세포의 세포에 PLAP 유전자(MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP) 또는 GFP 유전자(MLV(VSV) /pBabeCL(GFP)IP)를 도입한 결과를 각각 가리킨다.

도 6은 분화 유도한 유전자 도입 지방세포에 있어서의 발현 변화를 나타내는 사진 및 그림이다. (a) MLV(VSV) /pBabeCL(GFP)IP를 도입한 ICR 피하지방 유래 초대 배양 지방세포의 비분화 유도하에 있어서의 GFP 광현미경상, (b) 같은 분화 유도하에서 GFP 현미경상, (c) 비분화 유도하(비분화) 및 분화 유도하(분화)에 있어서의 MLV(VSV) /pBabeCL(PLAP)IP 도입 초대 배양 지방세포(ICR 피하지방 유래)의 AP 생산을 각각 가리킨다.

도 7은 초대 배양 지방세포로의 플라스미드 도입에 의한 (프로)인슐린 생산을 나타내는 그림이다.

도 8은 AP 발현 AAV를 도입한 초대 배양 지방세포(C57BL/6 마우스 피하지방 유래)에 있어서의 AP의 안정적 발현을 나타내는 그림이다.

도 9는 s1s2B10 인슐린 발현 레트로 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포에 있어서의 분화 유도시의 인슐린 발현을 나타내는 그림이다. (a) 모리나가제 EIA에 의한 결과, (b) IBL제 EIA에 의한 결과를 각각 가리킨다.

도 10은 GLP-1(7-37) 발현 레트로 바이러스 벡터를 도입한 초대 배양 지방세포에 있어서의 GLP-1(7-37)의 발현을 나타내는 그림이다. 각각 3점의 측정을 실시하고 평균치와 표준편차로 나타내었다.

도 11은 AP 발현 초대 배양 지방세포의 이식에서 인비보 AP 발현에 미치는 이식전 분화 유도 자극의 유무에 의한 효과를 나타낸 그림이다.

도 12는 (a) AP 발현 초대 배양 지방세포의 분화 자극 basic FGF 첨가 마트 리겔을 이용해 이식하였을 때의 혈장내 AP 활성의 추이, (b) 이식 마트리겔(Matrigel)의 적출에 의한 혈장내 AP 활성의 소실(개체 A), (c) 대조구인 GFP 도입 세포 이식군으로부터 적출한 마트리겔의 GFP 광현미경상을 각각 나타내는 그림 및 사진이다. (a)의 PLAP 이식군 32 일째까지는, 개체별 측정치의 군평균과 표준편차로, 기타는 평균치로 나타내었다.

도 13은 도 12(a) 및 그 외 다양한 방법으로 이식한 마우스의 혈중 AP 활성을 보다 장기에 걸쳐 검토한 결과를 나타내는 그림이다.

도 14는 도 12(b)에 예시한 것과 같은 적출 시험을 이식 후기에 행한 결과를 나타내는 그림이다.

도 15는 AP 발현 지방세포의 이식에 있어서 이식 세포수 의존적인 혈중 AP 활성을 나타내는 그림이다. 개체별 측정치의 군평균과 표준편차로 나타내었다.

도 16은 STZ 유발 당뇨병 마우스에 대한 s1s2B10 인슐린 발현 지방세포의 이식에 의한 효과를 나타낸 그림이다. (a) 공복시 혈당치에 미치는 효과, (b) 체중에 미치는 효과를 각각 가리킨다. 개체별 측정치의 군평균과 표준편차로 나타내었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> AN AGENT FOR DIFFRENTIATING HEMATOPOIETIC STEM CELL INTO NATURAL KILLER CELL COMPRISING VDUP1 PROTEIN OR GENE EDCODING THE SAME, AND A METHOD OF DIFFERENTIATING HEMATOPOIETIC STEM CELL INTO NATURAL KILLER CELL USING THEREOF <130> 5p-05-01 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Val Met Phe Lys Lys Ile Lys Ser Phe Glu Val Val Phe Asn Asp 1 5 10 15 Pro Glu Lys Val Tyr Gly Ser Gly Glu Lys Val Ala Gly Arg Val Ile 20 25 30 Val Glu Val Cys Glu Val Thr Arg Val Lys Ala Val Arg Ile Leu Ala 35 40 45 Cys Gly Val Ala Lys Val Leu Trp Met Gln Gly Ser Gln Gln Cys Lys 50 55 60 Gln Thr Leu Asp Tyr Leu Arg Tyr Glu Asp Thr Leu Leu Leu Glu Glu 65 70 75 80 Gln Pro Thr Gly Glu Asn Glu Met Val Ile Met Arg Pro Gly Asn Lys 85 90 95 Tyr Glu Tyr Lys Phe Gly Phe Glu Leu Pro Gln Gly Pro Leu Gly Thr 100 105 110 Ser Phe Lys Gly Lys Tyr Gly Cys Val Asp Tyr Trp Val Lys Ala Phe 115 120 125 Leu Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Gln Glu Ala Lys Lys Asn Phe Glu 130 135 140 Val Met Asp Leu Val Asp Val Asn Thr Pro Asp Leu Met Ala Pro Val 145 150 155 160 Ser Ala Lys Lys Glu Lys Lys Val Ser Cys Met Phe Ile Pro Asp Gly 165 170 175 Arg Val Ser Val Ser Ala Arg Ile Asp Arg Lys Gly Phe Cys Glu Gly 180 185 190 Asp Asp Ile Ser Ile His Ala Asp Phe Glu Asn Thr Cys Ser Arg Ile 195 200 205 Val Val Pro Lys Ala Ala Ile Val Ala Arg His Thr Tyr Leu Ala Asn 210 215 220 Gly Gln Thr Lys Val Phe Thr Gln Lys Leu Ser Ser Val Arg Gly Asn 225 230 235 240 His Ile Ile Ser Gly Thr Cys Ala Ser Trp Arg Gly Lys Ser Leu Arg 245 250 255 Val Gln Lys Ile Arg Pro Ser Ile Leu Gly Cys Asn Ile Leu Lys Val 260 265 270 Glu Tyr Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ser Val Pro Gly Ser Lys Lys Val 275 280 285 Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile Gly Ser Arg Ser Gly Leu Ser Ser 290 295 300 Arg Thr Phe Ser Met Ala Ser Arg Thr Ser Ser Glu Met Ser Trp Ile 305 310 315 320 Asp Leu Asn Ile Pro Asp Thr Pro Glu Ala Pro Pro Cys Tyr Met Asp 325 330 335 Ile Ile Pro Glu Asp His Arg Leu Glu Ser Pro Thr Thr Pro Leu Leu 340 345 350 Asp Asp Val Asp Asp Ser Gln Asp Ser Pro Ile Phe Met Tyr Ala Pro 355 360 365 Glu Phe Gln Phe Met Pro Pro Pro Thr Tyr Thr Glu Val Asp Pro Cys 370 375 380 Val Leu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Gln 385 390 395 <210> 2 <211> 1191 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atggtgatgt tcaagaagat caagtctttt gaggtggtct tcaacgaccc cgagaaggtg 60 tacggcagcg gggagaaggt ggccggacgg gtaatagtgg aagtgtgtga agttacccga 120 gtcaaagccg tcaggatcct ggcttgcggc gtggccaagg tcctgtggat gcaagggtct 180 cagcagtgca aacagacttt ggactacttg cgctatgaag acacacttct cctagaagag 240 cagcctacag gtgagaacga gatggtgatc atgaggcctg gaaacaaata tgagtacaag 300 ttcggcttcg agcttcctca agggcccctg ggaacatcct ttaaaggaaa atatggttgc 360 gtagactact gggtgaaggc ttttctcgat cgtcccagcc agccaactca agaggcaaag 420 aaaaacttcg aagtgatgga tctagtggat gtcaataccc ctgacctaat ggcaccagtg 480 tctgccaaaa aggagaagaa agtttcctgc atgttcattc ctgatggacg tgtgtcagtc 540 tctgctcgaa ttgacagaaa aggattctgt gaaggtgatg acatctccat ccatgctgac 600 tttgagaaca cgtgttcccg aatcgtggtc cccaaagcgg ctattgtggc ccgacacact 660 taccttgcca atggccagac caaagtgttc actcagaagc tgtcctcagt cagaggcaat 720 cacattatct cagggacttg cgcatcgtgg cgtggcaaga gcctcagagt gcagaagatc 780 agaccatcca tcctgggctg caacatcctc aaagtcgaat actccttgct gatctacgtc 840 agtgtccctg gctccaagaa agtcatcctt gatctgcccc tagtgattgg cagcaggtct 900 ggtctgagca gccggacatt cagcatggcc agccggacga gctctgagat gagctggata 960 gacctaaaca tcccagatac cccagaagct cctccttgct atatggacat cattcctgaa 1020 gatcacagac tagagagccc caccacccct ctgctggacg atgtggacga ctctcaagac 1080 agtcctatct ttatgtacgc ccctgagttc cagttcatgc ccccacccac ttacactgag 1140 gtggatccgt gcgtccttaa caacaacaac aacaacaaca acgtgcagtg a 1191

Claims

레트로 바이러스 벡터를 이용하여 세포외로 분비되는, 인슐린 또는 GLP-1(Glucagon-Like Peptide 1) 단백질을 코드하는 외래 유전자를 도입한, 지방조직으로부터 분리 배양된, 생체외(ex vivo) 유전자 치료용 전지방세포.
제 1항의 전지방세포를 성숙지방세포로 분화시킨 생체외(ex vivo) 유전자 치료용 성숙지방세포.
제 1항에 있어서, 상기 전지방세포는 추가로 혈관 신생 인자(angiogenesis factor)를 한시적으로 발현하는 발현 벡터가 투입된 것을 특징으로 하는 전지방세포.
제 1항에 있어서, 상기 전지방세포는 체내에서 적어도 50일 이상 당해 단백질을 유의하게 발현하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 전지방세포.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 전지방세포는 이식하는 세포 수에 의해 당해 단백질의 혈중 농도를 조절하는 것을 특징으로 하는 전지방세포.
제 1항에 있어서, 상기 전지방세포는 이식 후에 이식한 세포를 적출함으로써 당해 단백질의 혈중 농도를 저하시키는 것을 특징으로 하는 전지방세포.
제 1항의 생체외(ex vivo) 유전자 치료용 전지방세포를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(ⅰ) 지방조직으로부터 전지방세포를 분리배양하는 단계; 및

(ⅱ) 전지방세포에 세포외로 분비되는, 인슐린 또는 GLP-1(Glucagon-Like Peptide 1) 단백질을 코드하는 외래 유전자를 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 도입하고 염색체 중에 안정적으로 유지시키는 단계.
제 2항의 생체외(ex vivo) 유전자 치료용 성숙지방세포를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(ⅰ) 지방조직으로부터 전지방세포를 분리 배양하는 단계;

(ⅱ) 전지방세포에, 세포외에 분비되는, 인슐린 또는 GLP-1(Glucagon-Like Peptide 1) 단백질을 코드하는 외래 유전자를 레트로 바이러스 벡터를 사용해 도입하고 염색체 중에 안정적으로 유지시키는 단계; 및

(ⅲ) 전지방세포를 성숙지방세포로 최후 분화시키는 단계.
제 8항에 있어서, 단계(ⅱ) 후에 추가로 (ⅲ)혈관신생 인자(angiogenesis factor)를 한시적으로 발현하는 발현 벡터를 상기 전지방세포에 투입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항의 생체외(ex vivo) 유전자 치료용 성숙지방세포를 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

(ⅰ) 지방조직으로부터 전지방세포를 분리배양하는 단계;

(ⅱ) 그 전지방세포에, 세포외에 분비되는, 인슐린 또는 GLP-1(Glucagon-Like Peptide 1) 단백질을 코드하는 외래 유전자를 레트로 바이러스 벡터를 사용하여 도입하고 염색체 중에 안정적으로 유지시키는 단계;

(ⅲ) 혈관신생인자를 한시적으로 발현하는 발현벡터를 전지방세포에 도입하는 단계;및

(ⅳ) 전지방세포를 성숙지방세포로 최후 분화시키는 단계.
제 1항의 전지방세포 및 약학적으로 허용된 담체를 포함하는, 당뇨병 치료를 위한 생체외(ex vivo) 유전자 치료용의 이식조성물.
제 2항의 성숙지방세포 및 약학적으로 허용된 담체를 포함하는, 당뇨병 치료를 위한 생체외(ex vivo) 유전자 치료용의 이식조성물.
삭제
제 12항에 있어서, 추가로 혈관 신생 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식조성물.
제 12항에 있어서, 추가로 세포외 기질성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 이식조성물.
제 1항의 전지방세포를 유효성분으로 하는, 당뇨병 치료를 위한 보충 요법용 이식 치료제.
삭제
제 13항에 있어서, 추가로 혈관신생인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식조성물.
제 13항에 있어서, 추가로 세포외기질성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 이식조성물.
제 2항의 성숙지방세포를 포함하는, 당뇨병 치료를 위한 보충 요법용 이식 치료제.
삭제