PT1541674E - Adipócitos cultivados em primário para terapia génica - Google Patents

Description

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Descrição "Adipócitos cultivados em primário para terapia génica"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a adipócitos cultivados em primário para terapia génica para os quais foram transferidos um ou vários gene estranhos.

Antecedentes da Invenção

As terapias génicas actuais (Toyooka et al., Folia Pharmacol. Jpn. 116:158-162, 2000) podem ser classificadas em dois grupos: (1) processos para transferir genes terapêuticos para doentes administrando directamente vectores virais, plasmideos nus ou análogos que codificam para o gene (in vivo), e (2) processos de remover temporariamente células de doentes, transferindo um gene para estas células, e depois devolvendo estas células ao doente (ex vivo).

Grandes problemas permanecem por resolver nos processos in vivo, tais como a eficiência da transferência, expressão continua, e transferência selectiva de genes para células alvo. Processos ex vivo, por outro lado, podem ultrapassar potencialmente estes problemas. A grande maioria dos exemplos de processos ex vivo foi efectuada utilizando células do sistema sanguíneo (linfócitos periféricos) e células da medula óssea), uma vez que a sua recolha e transplante é relativamente fácil e o fardo sobre os doentes é reduzido (Tani et al., Saishin Igaku, 56:258-267, 2001) . No que diz respeito a células diferentes das células do sistema sanguíneo, foram efectuados processos que transferem genes para hepatócitos e depois devolvem estas células ao doente (Raper, S. E. et al., Cell Transplant 2(5):381-400, 1993), mas a maior parte destes 2 processos focalizam-se na recuperação, manutenção e aumento da função das próprias células transfectadas.

Descrição Detalhada da Invenção

Enquanto que se procura células adequadas para terapia génica ex vivo, os presentes inventores desenvolveram a ideia de utilizar adipócitos cultivados em primário. A utilização de adipócitos possui as vantagens seguintes: (1) Existem muitos relatórios sobre factores humorais secretados a partir de adipócitos, e os adipócitos compreendem as funções de produção de hormonas e podem actuar como órgãos secretores (Bradley R. D., et al., Recent Prog. Horm. Res., 2001, 56, 329-358); (2) os adipócitos podem ser facilmente recolhidos, uma vez que também existem subcutaneamente, e técnicas dizendo respeito à sua extirpação estão a ser desenvolvidas nos campos da cirurgia plástica e cosmética; além disso, mesmo, quando os adipócitos são enxertados em tecido subcutâneo, que permite uma implantação fácil, estas células não são heterotrópicas uma vez que pertenciam originalmente a esta região; (3) dado que adipócitos cultivados em primário isolados proliferam activamente mesmo in vitro, são adequados a procedimentos, tais como transferência de gene; (4) dado que é provável que os adipócitos permaneçam numa área limitada após implantação, as células enxertadas podem ser extirpadas, após implantação se desejado (especificamente, quando se pretende eliminar a expressão do gene); (5) dado que os próprios adipócitos produzem factores angiogénicos (Mick, G. J., et al., Endocrinology 2002, 143(3): 948-43) pode ser esperado um elevado nivel de enxerto após implantação. 3 (6) a extirpação de adipócitos ou implantação possui um pequeno impacto no corpo humano, porque o peso deste órgão altera-se grandemente em adultos; e (7) os adipócitos são largamente reconhecidos como supérfluos e obstrutivos e autorização para a sua recolha pode ser facilmente obtida.

Apesar de investigações com objectivos semelhantes utilizando queratinócitos estarem actualmente em curso (J. Gene. Med. 2001 Jan-Feb. 3(1):21—31; Histochem. Cell. Biol. 2001 Jan, 115(1):73-82), a remoção da barreira biológica da pele no processo de isolar a cultura primária é problemática atendendo ao risco de infecção. A dor dos doentes durante a extirpação e implantação é prevista ser grande, e a re-extirpação (4, mencionada acima) para eliminar a expressão não é fácil. Além disso, quando se utilizam queratinócitos, ou pele que pode apenas ser enxertada a duas dimensões, a quantidade do enxerto pode apenas ser aumentada aumentando a área da superfície do enxerto. Por isso, adipócitos que permitem um transplante tridimensional são considerados mais úteis.

Os presentes inventores conceberam processos para transferir de forma eficiente, genes para adipócitos cultivados em primário. Confirmaram também que os genes transferidos ficam funcionais após implantação e verificaram que os adipócitos podem ser eficazmente utilizados na terapia génica. Além disso, os adipócitos que expressam de forma estável o gene estranho transferido in vivo durante um longo período de tempo podem ser obtidos, através dos processos desta invenção. Os adipócitos maduros implantados podem continuar a expressar genes estranhos durante um ano ou mais. Além disso, se a expressão do gene estranho se tornar desnecessária após implantação do 4 adipócito, a expressão pode ser interrompida removendo o enxerto. A presente invenção diz respeito aos items seguintes: 1. Composição farmacêutica compreendendo pré-adipócitos cultivados em primário, em que o adipócito mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula, através do vector retroviral, em que a proteína é a insulina, ou um péptido do tipo glucanona l(GLP-l). 2. Pré-adipócito cultivado em primário, em que o pré-adipócito mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula, e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula pelo vector retroviral para ser utilizado em terapia génica em que a proteína é insulina ou GLP-1. 3. A composição farmacêutica do item 1, ou o pré-adipócito para ser utilizado de acordo com o item 2, em que o pré-adipócito possui a capacidade de expressar significativamente a proteína in vivo durante pelo menos 20 dias. 4. Composição farmacêutica do item 1 a 3, ou o pré-adipócito para ser utilizado de acordo com o item 2 ou 3, em que o pré-adipócito é utilizado para libertar a proteína na circulação sanguínea. 5. Um processo in vitro para produzir um pré-adipócito para utilizar em terapia génica, em que o processo compreende os passos de: (1) cultivar em primário um pré-adipócito; e (2) transferência, e depois manter de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada 5 para o exterior da célula, em que a proteína é insulina ou GLP-1. 6. 0 processo do item 5, em que o gene estranho é transferido por um vector retroviral. 7. Pré-adipócito para utilização de acordo com o item 2 que foi produzido pelo processo do item 5 ou 6. 8. Uma composição para implante, em que a composição compreende um pré-adipócito cultivados em primário que mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula, e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula pelo vector retroviral, e um veículo farmaceuticamente aceitável para ser utilizado em terapia génica, em que a proteína é insulina, ou GLP-1. 9. Composição de implante para uso de acordo com o item 8, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4, que compreende ainda um componente de matriz extracelular. 10. Composição de implante para utilizar e acordo com o item 8 ou 9, ou a composição farmacêutica de qualquer um dos items 1, 3, 4 e 9, que compreende ainda um factor de angiogénese. 11. Um pré-adipócito cultivado em primário que mantém de forma estável um gene que codifica para a insulina ou um péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1) para ser utilizado para baixar a glucose do sangue, em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula, através do vector retroviral. 12. Um animal não humano no corpo do qual foi implantado um pré-adipócito do item 2 cultivados em primário. A seguir será descrito o modo de efectuar esta invenção.

Em primeiro lugar, a presente invenção disponibiliza adipócitos cultivados em primário para terapia génica, em 6 que os adipócitos mantêm de forma estável gene(s) estranho(s) que codificam para uma(s) proteína(s) que é (são) secretada(s) para o exterior da célula.

Aqui um gene estranho diz respeito a um gene de insulina ou GLP-1 transferido do exterior para adipócitos cultivados em primário. Além disso, células em cultura primária dizem respeito a células não estabelecidas que são cultivadas a partir de tecidos removidos de um corpo vivo. Adipócitos dizem respeito a adipócitos maduros e células compreendendo a capacidade de se diferenciarem em tecido adiposo, tais como pré-adipócitos. Mais especificamente, a não ser que se diga em particular que os adipócitos são adipócitos "maduros", eles também incluem pré-adipócitos. Adipócitos maduros são células esféricas que armazenam gordura, e contêm gotas líquidas. A gordura armazenada em adipócitos maduros pode ser identificada utilizando coloração com óleo vermelho 0. Adipócitos maduros secretam geralmente leptina em resposta à insulina. Os Pré-adipócidos existem normalmente como células estromais que ainda não se diferenciaram em adipócitos maduros. Os pré-adipócitos podem ser isolados tratando tecido adiposo com colagenase, ou podem ser isolados como resultado da divisão de adipócitos maduros utilizando o método de cultura de tecto descrito abaixo (Sugihara, et al. Nippon Rinsho 1995, 53, 115-120; Sugihara, H., et al. J. Lipid Res. 1987, 28, 1038-1045; Zhang Η. H., et al. J. Endocrinol. 2000, 164, 119-128) . Apesar da existência de antigénios de superfície específicos dos adipócitos não ter sido confirmada, níveis elevados da expressão de CD36 e semelhantes foram encontrados em adipócitos maduros (Abumrad N. A., et al. J. Biol. Chem. 1993 Aug 25, 268(24):17665-8). Além disso, adipócitos extremamente puros podem ser recolhidos utilizando tais moléculas como marcadores. Induzindo diferenciação como descrito abaixo, os pré-adipócitos 7 podem-se diferenciar em adipócitos maduros de alguns dias a várias semanas (Hauner H., et ai., J. Clin. invest. 84, 1663-1670, 1989; Marko, et al., Endocrinology 136, 4582-4588, 1994). Adipócitos cultivados em primário podem ser isolados a partir do tecido desejado, por exemplo, tecido adiposo subcutâneo ou tecido adiposo visceral tal como o tecido que circunda o tecido do epididimo ou mesentérico. A frase "para terapia génica" diz respeito à utilização da expressão in vivo de uma proteína(s) codificada por um gene(s) estranho(s) anticipando um efeito terapêutico. Além disso, células para terapia génica dizem respeito a células que transportam um gene(s) estranho(s), em que as células são utilizadas para administrar o gene estranho a um corpo, através de administração ex vivo, e as células compreendem a capacidade de expressarem a proteína naquele corpo. A administração ex vivo diz respeito à remoção dos tecidos adiposos ou adipócitos de um indivíduo, efectuar a transferência génica in vitro, e depois implantar as células no mesmo ou diferente indivíduo. Células para terapia génica referem-se preferencialmente a células utilizadas para tratar desordens que são células que estão implantadas de modo a que uma proteína específica seja produzida. Preferencialmente, o tratamento, através de uma proteína específica inclui terapia de substituição, que utiliza uma proteína, cuja deficiência física, ou funcional, ou ausência provoca uma desordem. A proteína específica é insulina ou GLP-1 que apresenta actividade na corrente sanguínea, ou é alimentada a um tecido alvo através da corrente sanguínea, e funciona na superfície celular daquele tecido. Um fornecimento contínuo da proteína específica é também preferencialmente necessário durante um determinado período de tempo (por exemplo, durante alguns dias, a algumas semanas ou mais). Factores e desordens para 8 os quais a terapia de substituição de proteína já foi efectuada, ou se prevê ser eficaz podem todos tornar-se alvos.

Seguidamente, alvos representativos são listados de acordo com a sua classificação, mas a sua utilização não pode ser compreendida como estando limitada a estes exemplos, e a utilização de factores semelhantes para objectivos semelhantes está incluída no âmbito desta invenção. A terapia de substituição inclui suplementação contra desordens que se desenvolvem ou são exacerbadas pela falta, ou função reduzida de uma hormona, suplementação contra desordens devido a um defeito genético congénito e suplementação de um factor para melhoria da patologia: insulina/diabetes; péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1)/diabetes, obesidade, desordens alimentares.

Além disso os adipócitos da presente invenção não se encontram limitados aqueles utilizados para a chamada "terapia", mas incluem células utilizadas para a expressão in vivo de uma proteína secretora desejada. Por exemplo, os processos desta invenção permitem a produção de animais modelo, através de uma expressão a posteriori de uma proteína em particular. Utilizando estes processos podem ser produzidos animais modelo da doença com uma expressão a posteriori de patogénese ou factores agravantes e estes animais podem ser utilizados para rastrear fármacos. Além disso, através da expressão de factores de melhoria da patologia, estes processos podem ser utilizados como demonstração de hipóteses de trabalho para novas descobertas de fármacos em que um determinado factor melhora a condição patológica. Os animais que são utilizados incluem animais não humanos desejados, e preferencialmente mamíferos não-humanos (incluindo roedores e primatas). 9

Os adipócitos cultivados em primário para as terapias génicas desta invenção mantêm de forma estável um gene(s) de insulina ou GLP-1 que codifica que é secretado no exterior da célula. A frase "mantém de forma estável" significa que o gene estranho é transmitido a células filhas durante a divisão celular, e mais especificamente, esta frase diz respeito à incorporação do gene estranho num cromossoma da célula. Os adipócitos para a terapia génica desta invenção compreendem um gene(s) da insulina ou de GLP-1, transferido de forma estável, através de um cromossoma que incorpora um vector virai. 0 gene GLP-1 da insulina é transferido por um vector retroviral. 0 vector retroviral é integrado de forma estável num cromossoma de uma célula e compreende a capacidade de expressar um gene transferido durante um periodo longo. A eficiência de transferência do vector e continuação da expressão do gene transferido depende do tipo celular. Por exemplo, um gene transferido por um vector retroviral pode apresentar uma expressão continuada, enquanto que as células crescem, mas a expressão pode parar, quando a crescimento celular pára (Lund, A. H., et al. J. Biomed. Sei. 1996, 3:365-378; Niwa, 0. et al., 1983, Cell, 32:1105-1113). A expressão do gene estranho é frequentemente observada como sendo suprimida, particularmente após introdução do gene num corpo, através de processos in vivo ou ex vivo. Tal supressão da expressão é dita envolver a metilação de novo do promotor ou da sequência de codificação do gene transferido (Jahner, D. e Jaenisch, R., Nature 315: 594-597, 1985; Challita, P.- -M. e Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sei . USA 91:2567-2571, 1994; Hoeben, R.C. et al., J. Virol. 65:904-912, 1991) • Além disso , a desacetilação da histona encontra-se envolvida no silenciamento do gene transferido (Chen, W. Y. et al., 10

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:377-382, 2000; Chen, w. Y. e tal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:5798-5803, 1997). Contudo, quando os presentes inventores transferiram um gene estranho para adipócitos cultivados em primário utilizando um vector retroviral, surpreendentemente verificou-se que a expressão do gene transferido persistia de foram extremamente estável, tanto in vitro como in vivo. A expressão dos genes transferidos é estável em adipócitos antes da diferenciação e também em adipócitos maduros. Confirmou-se que a expressão do gene transferido persistia ao longo da duração da experiência em culturas in vitro (80 dias ou mais), e ao longo da duração da experiência, quando implantada no corpo (360 dias ou mais) . Além disso, podem ser utilizados como implantes adipócitos cultivados em primário para os quais um gene(s) de insulina ou GLP-1 foi transferido de forma estável que expressam um gene(s) durante um longo período de tempo.

Os adipócitos para a terapia génica desta invenção compreendem a capacidade de expressar de forma significativa insulina ou GLP-1 codificada por um gene(s) estranho(s) de insulina ou GLP-1 durante pelo menos 20 dias ou mais in vitro, ou mais preferencialmente in vivo. A frase "expressa de forma significativa" significa, por exemplo, que a expressão é detectada a um nível estatisticamente significativo, quando comparada com o caso em que o gene estranho não é transfectado (por exemplo com um nível de significância de 5% ou uma significância mais elevada). Mais preferencialmente, os adipócitos da presente invenção, quando transplantados para o corpo compreendem a capacidade de expressar significativamente insulina ou GLP-1 codificado por um gene(s) da insulina ou GLP-1 durante pelo menos 30 dias ou mais, preferencialmente 40 dias, ou mais, mais preferencialmente 50 dias, ou mais, ainda mais preferencialmente 60 dias, ou mais, ainda mais 11 preferencialmente 80 dias, ou mais, no entanto ainda mais preferencialmente 100 dias ou mais, no entanto, ainda mais preferencialmente 250 dias ou mais, no entanto ainda mais preferencialmente 150 dias ou mais, no entanto ainda mais preferencialmente 200 dias ou mais, no entanto ainda mais preferencialmente 300 dias ou mais e mesmo ainda mais preferencialmente 350 dias ou mais.

Os adipócitos para a terapia génica desta invenção são particularmente úteis para libertar insulina ou GLP-1 na corrente sanguínea que são codificados por genes estranhos transportados pelas células. Proteínas libertadas para o fluxo sanguíneo são a insulina e/ou o péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1) para tratar a diabetes e doenças semelhantes. Por exemplo, no caso da insulina, os locais de cisão (local 1 e local 2) podem ser substituídos pela sequência de clivagem da protease expressa em adipócitos, de modo que a insulina madura possa ser produzida de forma eficiente (por exemplo, Groskreutz, D. J., et al. JBC, 1994, 269(8), 6241). Pode também ser utilizado um análogo de insulina modificado para cadeia simples (Lee, H. C., et al., Nature. 2000 Nov 23, 408 (6811):483-8). No caso da GLP-1 pode ser utilizado um péptido desejado que actua como ligando para o receptor GLP-1 (NP_002053; Thorens, B. et al., Diabetes 42, 1678-1682 (1993); Dillon, J. S. et al., Endocrinology 133, 1907-1910 (1993); Graziano, Μ. P. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 141-146(1993); Stoffel, M. et al., Diabetes 42, 1215-1218 (1993)). Um exemplo é GLP-1 (7-37) (Diabetes, 1998, 47:159-69; Endocrinology, 2001, 142:521-7; Curr. Pharm. Des., 2001, 7:1399-412; Gastroenterology, 2002, 122:531-44). A presente invenção diz também respeito a processos de produzir adipócitos para serem utilizados em terapia génica, em que os processos compreendem os passos de: (1) Cultivar em primário pré-adipócitos, e 12 (2) transferir células com um gene(s) estranho (s) que codificam para uma proteína(s) que é secretada para o exterior da célula, preferencialmente utilizando um vector retroviral de modo a que o gene se mantenha de forma estável, em que a dita proteína é insulina ou GLP-1. A presente invenção também diz respeito a adipócitos para terapia génica produzida, através deste processo. "Mantido de forma estável" significa transferência de um gene(s) estranho(s) que é transferido para células filhas, quando a célula se divide, e mais especificamente diz respeito à integração do gene estranho no cromossoma das células. Transferência de Southern ou PCR utilizando ADN genómico pode demonstrar sob o ponto de vista biológico que o gene estranho atingiu uma expressão estável integrando-o num cromossoma. Além disso, para concentrar as células transfectadas de forma estável, pode ser utilizado, por exemplo, um processo que utiliza fluorescência na classificação de células activadas (FACS), que concentra células reconhecendo GFP co-expresso pelas células conjuntamente com o gene alvo. 1. Processos de recolher adipócitos cultivados em primário

Os adipócitos cultivados em primário podem ser recolhidos, através de processos descritos no relatório de Sugihara et al. (Sugihara, H. et al., Differentiation, 31:42-4, 1986). Mais especificamente, o tecido adiposo, e preferencialmente os receptores de implantes possuem tecido adiposo subcutâneo, ou tecido visceral adiposo, tal como o tecido que rodeia o epidídimo ou tecido mesentérico é extirpado sob condições estéreis, e por exemplo, após lavagem com PBS, é morcelado utilizando um par de tesouras, ou uma faca cirúrgica. Este tecido morcelado é digerido agitando a 37°C num meio compreendendo uma quantidade adequada de 13 colagenase, preferencialmente 1 a 3 mg/ml, durante uma duração adequada de tempo, preferencialmente durante 20 a 60 minutos e depois separados num resíduo precipitado e camada sobrenadante por centrifugação. A camada sobrenadante é preferencialmente lavada uma ou duas vezes por centrifugação, e é depois adicionada a um frasco de cultura cheio com meio. As bolhas são removidas, e o frasco é deixado em repouso num incubador de C02 para cultura de modo que a superfície da cultura convencional seja um tecto (cultura tecto) . Após cultura durante um período adequado, preferencialmente 10 a 14 dias, as células aderentes à superfície do tecto são recolhidas, através de tratamento com tripsina. Estas células são posteriormente subcultivadas num sistema de cultura convencional.

Adipócitos cultivados em primário podem ser armazenados por congelamento antes, ou após transferência dos genes. Este procedimento permite uma utilização múltipla de adipócitos após uma recolha única. 2. Transferência de genes para adipócitos A transferência de genes pode ser efectuada utilizando reagentes de transferência de genes (Fugene 6, Roche; Lipofectamin, invitrogen; kit de transfecção Cellphect (processo do fosfato de cálcio), Amersham; etc.), processos de electroporação (Chen, H. et al., J. Biol. Chem. 1997, 272(12), 8026-31), ou vectores virais (Kay, Μ. A., et al., Nat. Med. 2001, 7, 33-40). A transferência é preferencialmente efectuada utilizando vectores virais, e mais preferencialmente utilizando vectores retrovirais (por ex., Arai, T. et al., J. Virol., 1998, 72, p.1115-21).

Quando a transferência de genes é efectuada utilizando um plasmídeo, o plasmídeo é transfectado em adipócitos e 14 são seleccionados aqueles adipócitos que mantêm estável o gene estranho transferido. Tais adipócitos podem ser seleccionados, por exemplo, equipando o plasmideo que codifica para o gene estranho com um gene de resistência a fármacos, ou efectuando a transfecção conjuntamente com um plasmideo que transporta um gene de resistência ao fármaco, e depois seleccionando as células transfectadas utilizando este fármaco. Por outro lado, as células podem se obtidas por clonagem das células transfectadas, através de técnicas de diluição limitantes. Além disso, quando a transferência de genes é efectuada utilizando um plasmideo, pode ser utilizado um processo que expressa de forma transiente um fago derivado da integrase para aumentar a eficiência da inserção cromossómica (Mol. Cell Biol. 2001 Jun, 21(12):3926-34) .

Na presente invenção, o gene estranho da insulina ou GLP-1 e transferido para os adipócitos utilizando um vector retroviral. Retrovirus dizem respeito a vírus que pertence à família Retroviridae, e incluem oncovírus, vírus espumantes (Russell, D. w. e Miller, A.D., J. Virol. 1996, 70:217-222; Wu, M. et al., J. Virol. 1999, 73:4498-4501) e lentivírus (por exemplo, HIV-1 (Naldini, L. et al., Science 1996, 272:263-267; Poeschla, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93: 11395-11399; Srinivasakumar, N et al., J. Virol. 1997, 71:5841-5848; Zufferey, R., et al. Nat. Biotechnol. 1997, 15: 871-875: Kim, V. N., et al., J. Virol. 1998, 72:811-816) e vírus da imunodeficiência felina (Johnston, J. C. et al., J. Virol. 1999, 73:4991-5000; Johnston, J. e Power, C. J. Virol. 1999, 73:2491-2498; Poeschla, E. M. et al., Nat. Med. 1998, 4:354-357). Um vector retroviral mais preferido para ser utilizado nesta invenção é um vector de vírus da leucemia de Moloney de murino (MoMLV) (T. M. Shinnick, R A. Lerner e J. G.

Sutcliffe, Nature 293, 543-548, 1981) . 15

Os retrovírus podem ser vectores de auto-inactivação (SIN). Um vector SIN pode ser preparado suprimindo uma porção de 3' LTR durante a encapsidação virai (Yu S. F. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:3194; Yee, J. K. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:5197-5201; Zufferey, R. et al, 1988, J. Virology, 72, 9873-9880) . O gene estranho no retrovirus pode ser transcrito por LTR, ou pode ser expresso a partir de outro promotor dentro do vector. Por exemplo, um promotor de expressão constitutivo, tal como o promotor CMV, promotor EF-Ια, ou promotor CAG, ou pode ser utilizado um promotor indutivel desejado. Além disso, pode ser utilizado um promotor quimérico em que uma porção de LTR é substituída por outro promotor.

Para transferir genes que utilizam retrovirus, especificamente, um plasmideo que transporta um gene a ser transferido, tal como pBabe CL-SEAP-IRES-GFP, é um gene transferido para células de encapsidação, tais como células 293-EBNA (Invitrogen), utilizando um reagente de transferência de gene e semelhantes. Isto é então cultivado durante um período adequado de tempo, preferencialmente de um a três dias, e os vírus recombinantes produzidos no sobrenadante são recolhidos. Os adipócitos a serem transfectados são então infectados com os vírus.

Os vectores retrovirais compreendem preferencialmente uma proteína de envelope com um largo tropismo, de modo a poderem infectar uma larga gama de adipócitos de mamíferos, incluindo os dos seres humanos. Por exemplo, pode ser utilizada a proteína anfotrópica de envelope (por exemplo 4070A) (Número de acesso K02729; Sorge, J. et al., Mol. Cell. Biol. 4(9), 1730-1737 (1984)). Na presente invenção o retrovírus é preferencialmente pseudotipado (Emi, T. Friedmann e J. K. Yee, J. Virol., 65(3), 1202-1207 (1991); Yee, J-K. et al. (1994) Methods Cell Biol. 43 43:99-112; Burns, J. C. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 16 90:8033-8037) pela proteína do vírus G da estomatite vesicular (VSG-G) (Rose, J. K. e Gallione, C. J., J. Virol. 39(2), 519-528 (1981)). A pseudotipagem por VSV-G torna possível uma elevada eficiência de transferência dos genes para os adipócitos. O vector VSV-G pseudotipado pode ser produzido expressando VSV-G em células de encapsidação. Mais especificamente, por exemplo, podem ser favoravelmente utilizadas células de encapsidação que podem expressar por indução VSV-G (por exemplo, Arai T. et al., J. Virol., 1998:72, p.1115-21). O título dos vírus produzidos pode ser determinado infectando células com soluções de vírus que foram diluídas em vários passos e contando o número de colónias de células infectadas (para detalhes, ver Ausubel et al). (Ausubel, F. M. et al. Eds (1995) Current Protocols in Molecular Biology. (John Wiley & Sons, NY)). Alternativamente o título pode ser determinado, através do processo de Byun et al. (Byun, J. et al. (1996) Gene Ther. 33333:1018-1020), Tafuro et al. (Tafuro, S. et al. (1996) Gene Ther. 33333:679-684), Miyao, Y. et al. (1995) Cell Struct. Funct. 2020:177-183), Cláudio et al. (Cláudio, P. P. et al. (2001) Anal. Biochem. 291:96-101), ou Cashion et al. (Cashion, L. M. et al. (1999) Biotechniques 26 26:924-930).

Adipócitos cultivados em primário podem ser introduzidos com vectores virais contactando os vectores com as células. Por exemplo, adipócitos cultivados em primário são incubados numa solução de cultura compreendendo vectores virais. Os adipócitos são preferencialmente infectados na forma de pré-adipócitos. A eficiência da infecção pode ser aumentada adicionando 0,5 a 8 pg/ml de polibrene. A multiplicidade da infecção (MOI) não se encontra particularmente limitada, mas pode ser ajustada adequadamente na gama de 0,1 a 100. Células com genes transferidos podem ser seleccionadas utilizando um 17 gene marcador, por exemplo. Contudo se a infecção for efectuada a uma MOI de aproximadamente 2 ou mais, ou preferencialmente aproximadamente 3, 4, 5, ou mais, o gene pode ser transferidos para a maior parte das células, mesmo sem selecção. Os adipócitos com genes transferidos podem ser utilizados para implante sem mais tratamentos, ou em determinados casos, podem ser convertidos em adipócitos maduros, através de cultura num meio compreendendo 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX), dexametasona, e insulina. Em tais casos, uma vez que IBMX e dexametasona são utilizadas principalmente para activar o receptor-γ (PPAR-γ) activado proliferador da peroxisoma, fármacos que activam directamente este receptor (por exemplo os derivados de tiazolidina, pioglitazona/Takeda Pharmaceutical Company Limitada e rosiglitazona/Glaxo SmithKline) podem ser adicionados ao mesmo tempo.

Os adipócitos cultivados em primário desta invenção, que transportam o gene terapêutico desejado da insulina ou da GLP-1 podem ser implantados no corpo de um receptor imunologicamente compatível, possibilitando assim a terapia genica, através da expressão in vivo da proteína secretora codificada pelo gene terapêutico. Os adipócitos cultivados em primário a serem implantados são preferencialmente células do mesmo hospedeiro receptor. Os processos de terapia génica em que os adipócitos cultivados em primário desta invenção se encontram implantados podem ser aplicados expressando uma proteína secretora de insulina ou de GLP-1 desejada em antecipação aos efeitos daquela proteína. Por exemplo, uma desordem pode ser tratada ou evitada implantando os adipócitos desta invenção, que mantêm um gene(s) estranho da insulina ou GLP-1 que codifica para uma insulina ou GLP-1 compreendendo um efeito terapêutico ou preventivo contra a desordem. Além disso, a presente invenção diz respeito a processos de libertar proteínas na 18 corrente sanguínea, em que os processos compreendem os passos de administração dos adipócitos cultivados em primário desta invenção a um corpo. Utilizando estes processos, a insulina ou a GLP-1 codificada por um gene estranho de insulina ou GLP-1 pode ser significativamente secretado para a corrente sanguínea durante pelo menos 20 dias ou mais, preferencialmente durante 30 dias ou mais, mais preferencialmente 40 dias ou mais, mesmo mais preferencialmente 50 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 60 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 80 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 100 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 150 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 200 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 250 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 300 dias ou mais, ainda mais preferencialmente 350 dias ou mais. 0 gene estranho da insulina ou da GLP-1 expresso num corpo pode ser detectado e/ou quantificado, por exemplo, através de imunoensaios tais como EIA. Remoção das células transplantadas podem parar a expressão do gene estranho da insulina ou de GLP-1 administrado em qualquer altura. Em determinados casos a transferência de um gene suicida indutível (por ex. HSV-tk) às células enxertadas, as células enxertadas podem ser eliminadas administrando ganciclovir, por exemplo. A presente invenção também disponibiliza composições de implante para utilização em terapia génica, em que as composições compreendem adipócitos cultivados em primário que mantêm de forma estável um gene(s) da insulina ou da GLP-1 que codifica para uma insulina ou GLP-1 secretada para o exterior da célula e veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos são soro fisiológico, tampão fosfato, soluções de cultura, soros, e fluidos corporais. Estes podem também ser combinados com um sólido 19 ou de gel que se torna um andaime para as células. As composições de implante da presente invenção compreendem preferencialmente um componente de matriz extracelular (ECM). Um componente de matriz extracelular diz respeito a um componente, tal como uma proteína ou mucopolissacárido compreendido numa rede insolúvel ou estrutura fibrosa acumulada entre as células. Estas podem ser isoladas a partir de organismos ou reconstruídos artificialmente. Componentes ECM utilizados preferencialmente nesta invenção são colagénio, fibronectina, vibronectina, laminina, sulfato de heparano, proteoglicano, glicosaminoglicano, sulfato de condroitina, hialuranato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina, elastina, ou combinações dos dois ou mais acima. Preferencialmente estes componentes ECM são construídos na forma de gel e depois misturados com adipócitos. Os geles de ECM utilizados nesta invenção não se encontram particularmente imitados, desde que pelo menos um ou vários dos componentes acima mencionados se encontrem compreendidos, mas compreendem preferencialmente pelo menos um colagénio do tipo IV, laminina, e sulfato de heparano. Tais ECMs incluem um substrato extraído a partir do tumor do rato Engelbreth-Holm-Swarm (Matrigel®) (Becton Dickinson Labware) (Patente US de invenção n° 4,829,000). A estrutura das composições compreendendo o componente ECM e os adipócitos utilizados na presente invenção não se encontra particularmente limitada, e pode ser, por exemplo, uma estrutura em gel ou em rede, uma estrutura fibrosa, uma estrutura (disco) plano, uma estrutura em favos de mel, uma estrutura tipo esponja. Componentes ECM podem ser gelifiçados de acordo com processos convencionais. Por exemplo, a gelificação pode ser efectuada incubando uma solução aquosa compreendendo aproximadamente 0,3 a 0,5% de colagénio a 37°C durante dez a 30 minutos. Alternativamente 20 os componentes ECM podem ser gelificados utilizando um agente de gelificação.

Além disso, as composições de implante da presente invenção compreendem preferencialmente um factor de angiogénese. As composições de implante desta invenção que compreendem um factor de angiogénese fazem com que vasos sanguíneos se formem à volta deles após implantação, e podem secretar uma proteína estranha na corrente sanguínea com uma eficiência mais elevada. Os factores de angiogénese não se encontram particularmente limitados, desde que sejam factores que podem induzir a angiogénese in vivo, e exemplos são factor de crescimento celular endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crescimento de fibroblasto acidico (aFGF), factor de crescimento derivado das plaquetas, factor de transformação β (TGF-β), osteonectina, angiopoietina, e factor de crescimento de hepatócitos (HGF). Exemplos mais preferidos são bFGF.bFGFs que também são designados FGF2, não são apenas factores de crescimento de fibroblastos, mas também compreendem a actividade de promover o crescimento de várias células, tais como células endoteliais vasculares, de cartilagem, osteoblastos, e células epidérmicas (Abraham et al., EMBO J., 5, 2523-2528, 1986; Prats et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86 1836-180, 1989). Os bFGFs utlizados na presente invenção não são apenas proteínas naturais, mas podem também ser produzidas por engenharia genética por tecnologia de ADN recombinante, e suas formas modificadas. Exemplos de bFGFs são aqueles descritos em WO87/01728, WO89/04832, WO86/07595, WO87/03885, Patente Europeia de invenção Nos 237966, 281822, 326907, 394951, e 493737. Alternativamente, outro vector de expressão que expressa de forma transiente um factor de angiogénese pode ser introduzido nos adipócitos (ver W097/49827). O objectivo principal de factores de 21 angiogénese utilizados desta forma é formar vasos sanguíneos à volta das células transplantadas para que a proteína estranha possa ser secretada de forma eficiente na corrente sanguínea dos adipócitos desta invenção. Por isso, utiliza-se um vector que codifica para um factor de indução vascular para expressar aquele factor de indução vascular a partir de adipócitos, a utilização de um vector de expressão transiente (mais especificamente um vector que não é incorporado no cromossoma) é preferido. Quando os adipócitos expressam um factor indutor vascular durante um longo período formam-se quantidades em excesso de vasos sanguíneos à volta dos adipócitos implantados que podem provocar efeitos secundários sistémicos. Por isso, é preferível que o gene estranho que codifica para um factor de angiogénese não seja transferido de forma estável para os adipócitos cultivados em primário desta invenção. 3. Implantação dos adipócitos

Os adipócitos com genes transferidos são preparados com uma concentração celular adequada, preferencialmente de 0,2xl07 a 2xl07 células/ml, ou 0,2xl06 a 5xl06 células/ml, quando transfectadas com um retrovírus. São infundidas como tal no tecido subcutâneo ou tecido adiposos, preferencialmente tecido subcutâneo, ou misturando com um meio eficaz, preferencialmente uma solução compreendendo uma matriz extracelular, tal como colagénio. A injecção no tecido adiposo pode ser efectuada fazendo uma incisão e expondo o tecido adiposo. Células que se diferenciaram terminalmente em adipócitos maduros não vão proliferar após transplantação, e vão expressar o gene estranho durante um longo período a um nível constante. 0 nível de expressão de um gene estranho num corpo que recebe um implante é proporcional ao número de células implantadas. Por isso, 22 quando se efectua um implante, pode ser mantido um nivel desejado de expressão durante um longo período num corpo que recebe um implante ajustando a quantidade de adipócitos que são implantados para alinhar com um nível de expressão pré-medido in vitro do gene estranho.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 é um conjunto de microfotografias de adipócitos cultivados em primário isolados a partir da gordura subcutânea de ratinhos ICR com idade de três semanas. (A) apresenta adipócitos que aderiram à superfície da cultura do lado do tecto após 14 dias de cultura de tecto, (B) apresenta adipócitos cultivados em primário crescidos numa cultura normal, (C) apresenta adipócitos maduros que armazenaram gotas de lípidos devido a indução de diferenciação, e (D) apresenta uma imagem corada por óleo vermelho 0 de células induzidas por diferenciação. A Fig. 2 apresenta a actividade da fosfatase alcalina do plasma (AP) obtida implantando ratinhos ICR nus com adipócitos cultivados em primário (derivados de gordura subcutânea de ratinhos ICR) que são tansfectados de forma transiente com plasmídeo que expressa AP pcADN3.1-SEAPmh. A Fig. 3 apresenta uma comparação da eficiência da transferência génica, quando o vector retroviral MLV (VSV)/pBabeCL (PLAP) IP é transductado para adipócitos cultivados em primário derivados de vários tipos de tecido adiposo. A Fig. 4 é um conjunto de microfotografias que apresenta imagens da indução por diferenciação de adipócitos cultivados em primário transdutados com MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP) (A) e (B) representam respectivamente uma micrografia de luz visível, e uma fotografia por fluorescência GFP do mesmo campo visual. 23 A Fig. 5 apresenta a duração da expressão AP em subculturas de adipócitos cultivados em primário transductados com um vector virai que expressa AP. (A) apresenta o resultado da transferência do gene SEAP (MLV(VSV)/pBabeCL(SEAPmh)I2G) ou o gene PLAP (MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP para células derivadas da gordura subcutânea de ratinhos C57BL/6. (B) mostra o resultado da transferência do gene PLAP (MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP) ou gene GFP (MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP) em adipócitos derivados de ratinhos ICR. A Fig. 6 é um conjunto de fotografias e um gráfico que mostram a alteração na expressão de adipócitos com genes transferidos com diferenciação induzida. (A) apresenta uma imagem de microscopia GFP de visivel de adipócitos cultivados em primário em condições indutoras da não diferenciação, em que os adipócitos transfectados com MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP são derivados de gordura subcutânea de ICR. (B) apresenta uma imagem de microscópio GFP semelhante realizada sob condições indutoras da diferenciação (C) apresenta a produção de AP por adipócitos cultivados em primário transfectados MLV(VSV)/pBabeCL(FLAP)IP (derivados de gordura subcutânea ICR) em condições indutoras de não diferenciação (não diferenciação) e condições indutoras de diferenciação (diferenciação). A Fig. 7 apresenta a produção de (pró)insulina, através de transfecção de plasmideo em adipócitos cultivados em primário. A Fig. 8 apresenta a expressão estável de AP em adipócitos cultivados em primário (derivados da gordura subcutânea de ratinhos de C57BL/6) transfectadas com AAV que expressam AP. A Fig. 9 apresenta a expressão de insulina na altura da indução de diferenciação em adipócitos cultivados em 24 primário transfectados com o vector retroviral slsB210 que expressa insulina. (A) apresenta os resultados que utilizam EIA produzidos por Morinaga e (B) apresenta os resultados que utilizam um EIA produzido por IBL. A Fig. 10 apresenta a expressão de GLP-l(7-37) em adipócitos cultivados em primário transfectados com vector retroviral que expressa GLP-l(7-37). As medições foram efectuadas em triplicado, e os seus valores médios e desvios padrão são indicados. A Fig. 11 mostra o efeito da presença, ou ausência da estimulação de pré-implantação da indução de diferenciação na expressão AP in vivo na implantação de adipócitos cultivados em primário que expressam AP.

Fig. 12 é um conjunto de gráficos e uma fotografia. (A) apresenta a alteração na actividade AP do plasma, quando adipócitos que expressam AP cultivados em primário são implantados na presença de estimulação de diferenciação utilizando Matrigel suplementado com FGF básico. (B) mostra a perda de actividade AP do plasma na extirpação da Matrigel implantada (indivíduo A). (C) apresenta uma imagem de GFP por microscopia de luz visível de Matrigel extirpado do grupo de controlo que recebeu células transfectadas com GFP. Para o grupo implantado com PLAP apresentado em (A), os valores indicados são a média do grupo e desvio padrão dos valores medidos para cada indivíduo até ao 32° dia. Os valores restantes são valores médios. A Fig. 13 apresenta os resultados do exame a longo termo da actividade AP na corrente sanguínea dos ratinhos que receberam um implante, através do processo da Fig. 12(A), e através de uma variedade de outros processos. A Fig. 14 apresenta os resultados do teste de extirpação semelhante ao da Fig. 12(B) na última fase da transplantação. 25 A Fig. 15 apresenta a dependência da actividade AP do sangue no número de células implantadas, quando se implantam adipócitos que expressam AP. Os valores indicados são a média do grupo e desvio padrão das medidas de cada indivíduo. A Fig. 16 apresenta o efeito de implantar adipócitos sls2BlO que expressam insulina em ratinhos diabéticos induzidos com STZ. (A) apresenta o efeito do nivel de glucose do plasma em jejum, e (B) apresenta o efeito no peso corporal. Os valores indicados são a média do grupo e o desvio padrão das medidas de cada indivíduo.

Melhor processo de Efectuar a Invenção A presente invenção será descrita abaixo em detalhe utilizando exemplos, mas não é para ser considerada como estando limitada a eles. Todas as referências aqui citadas são incorporadas nesta descrição.

Exemplo 1 Cultura primária de adipócitos de murino Métodos

Ratinhos ICR machos de três semanas de idade ou ratinhos C57BL/6 machos de quatro a cinco semanas (ambos da Charles River) foram anestesiados com éter dietilico, e sacrificados recolhendo o sangue total do coração. A seguir gordura subcutânea inguinal, ou gordura que circunda o epididimo, e tecido adiposo mesentérico foram extirpados individualmente em condições estéreis. Os tecidos extirpados foram lavados com PBS, e depois foram morcelados utilizando um par de tesouras, ou um bisturi cirúrgico. Este tecido morcelado foi digerido com agitação a 37°C durante 20 a 60 minutos em meio normal (DMEM-glucose 26 elevada/ SIGMA, 10% FCS) compreendendo 1 mg/ml de colagenase (Fracção Sl/gelatina Nitta), e depois separado em precipitado e camada em suspensão por centrifugação (300 g, cinco minutos). A camada em flotação foi ainda centrifugada uma ou duas vezes para remover a colagenase por diluição, e depois adicionada a um frasco T-25 (IWAKI) cheio com meio. As bolhas foram removidas, e cultivou-se sob uma atmosfera de 5% de C02 num incubador de C02 a 37°C de modo que a superfície da cultura convencional estava invertida (cultura de tecto) . Dez a 14 dias após a cultura, as células aderentes à superfície do tecto foram recolhidas, através de tratamento com tripsina e transferidas para um sistema de cultura normal. A subcultura foi então efectuada numa proporção de 1:3 a 1:10.

Para induzir a diferenciação, o meio das células cultivadas até à confluência numa placa de 6 poços foi transferido para um meio de indução (meio normal suplementado com 0,5 mM IBMX, 0,25 μΜ de dexametasona, e 10 pg/ml de insulina) . Esta estimulação foi continuada durante 48 horas. A seguir as células foram diferenciadas num meio de maturação (meio normal suplementado com 10 μρ/ιηΐ de insulina) . O meio de maturação foi trocado em cada três dias.

Solução corante de óleo vermelho O foi preparada misturando uma solução stock preparada misturando 0,3 g de óleo vermelho O em 100 ml de isopropanol (99%), com água destilada numa proporção de 3:2 na altura da utilização. As células foram lavadas com PBS e depois fixadas com uma solução neutra de formalina a 100% (WAKO). Após nova lavagem com PBS, as células foram coradas com solução corante de óleo vermelho O à temperatura ambiente durante 10 minutos. As células foram novamente lavadas com PBS, e depois examinadas por microscópio. 27

Resultados A Fig. 1 é um conjunto de microfotografias de adipócitos cultivados em primário isolados a partir da cultura subcutânea de ratinhos ICR de três semanas de idade. Após 14 dias de cultura de tecto, a adesão de adipócitos que transportam gotas de líquido foi observada na superfície de cultura do lado do tecto (A). Quando estas células foram transferidas para um sistema de cultura normal, apresentavam crescimento de fibroblastos como mostrado em (B). Contudo, quando a diferenciação foi induzida por IBMX, a dexametasona, e a insulina, as células diferenciaram-se novamente em adipócitos maduros que transportam gotas de líquido (C) . A gordura armazenada foi corada de vermelho, através de coloração com óleo vermelho 0 (D) . Mostrou-se que as células isoladas através deste método eram adipócitos cultivados em primário compreendendo a capacidade de se diferenciarem.

Exemplo 2 Transferência transiente do gene secretor termoestável da fosfatase alcalina (AP) em adipócitos cultivados em primário, e implantação de adipócitos transfectados em ratinhos.

Como sistema modelo para a expressão génica, o gene AP, mais especificamente o gene SEAP (Clontech) ou gene PLAP (Goto, M. et al. Mol. Pharmacol. Vol. 49 860-873 (1996)) foi transferido para adipócitos cultivados em primário e foram examinadas as alterações na actividade da AP. (Ambos os produtos génicos AP são termostáveis e podem ser facilmente distinguidos de fosfatases alcalinas endógenas por tratamento térmico). 28 Métodos

(1) Produção de adipócitos cultivados em primário transfectados de forma transiente com o gene SEAP 0 plasmídeo que expressa AP (pcADN3.1-SEAPmh) foi construído inserindo a sequência SEAP, obtida por digestão dupla do vector básico pSEAP-2 (Clontech) com enzimas de restrição HindIII-Xbal no local HindiIl-Xbal de pcADN3.lMyc-HisA (Invitrogen), que é um vector para a expressão em células de mamíferos.

Para cada transferência de gene para uma placo de 10 cm, misturou-se 500pL de meio DMEM isento de FCS e 15 pL de reagente Fugene 6 (Roche), depois foi adicionado 5 pg de pcADN3.1-SEAPmh. Esta mistura foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. Esta mistura foi adicionada a células cultivadas em primário (derivadas da gordura subcutânea ICR) cultivadas até 70 a 80% de confluência numa placa de 10 cm. Isto foi então cultivado durante 24 horas num incubador de CO2. (2) Implantação em ratinhos de adipócitos cultivados em primário com genes transferidos de fosfatase alcalina. Células com genes transferidos foram recolhidas, através de tratamento com tripsina, e lavadas duas vezes com PBS por centrifugação. As células foram então suspensas em PBS a lxlO7 células/ml. Os animais (ratinhos ICR nus, com cinco semanas de idade na altura da operação) foram anestesiados por administração intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital de sódio (Nembutal; Dainippon Pharmaceutical). Após desinfecção da área a ser operada com uma solução diluída de Hibitano (Sumitomo Pharmaceuticals), foi efectuada uma incisão de 3 mm a 5 mm na pele próxima da 29 base da pena direita posterior, e a gordura inguinal subcutânea foi exposta. Carregou-se 0,55 ml da suspensão celular preparada (5,5xl06 células/cabeça) numa seringa de 1 ml, e isto foi injectado na gordura subcutânea utilizando uma agulha de injecção 22 G. Como controlo foi injectado no mesmo local PBS. Para comparar isto com o processo de suplementação de proteína, dissolve-se 1 μρ de AP purificada (Roche) em PBS em condições estéreis, e isto foi injectado de forma semelhante. A pele com a incisão foi suturada e o local operado foi desinfectado com isodine cirúrgica (Meiji Seika). O sangue foi colhido utilizando um capilar revestido com heparina (Dramond) do plexo venoso pós-orbital antes da implantação (dia 0) e após implantação ao longo do tempo. O plasma foi obtido a partir do sangue completo por centrifugação a 2000 g durante 15 minutos. A actividade AP neste plasma foi medida utilizando o kit de ensaio (kit de ensaio do gene repórter SEAP, Roche), seguindo as instruções em anexo.

Resultados A Fig. 2 apresenta a actividade do plasma conseguida implantando nos ratinhos células cultivadas em primário que foram transfectadas de forma transiente com plasmídeo pcADN3.1-SEAPmh que expressa a fosfatase alcalina AP. Para fins de comparação foram administrados por injecção aos ratinhos 1 μρ de proteína AP purificada (Roche). Sete dias após a administração a actividade AP no sangue nestes ratinhos diminuiu para o nivel de controlo. Por outro lado, a actividade AP no sangue nos ratinhos que receberam um implante destas células que suportavam genes transfectados de forma transiente foi confirmada ter um máximo no quarto dia após implantação, e a duração da expressão foi de 14 30 dias. A duração da expressão in vivo implantando células que transportam um gene transfectado de forma transiente foi curta, e verificou-se que a concentração no sangue variava grandemente, apesar de ser mantida mais tempo do que injectando a proteína.

Exemplo 3 Produção utilizando um vector virai de adipócitos que expressam de forma estável AP Métodos (1) Construção de vectores de expressão AP e GFP de controlo O gene PLAP foi excisado a partir de pTK-PLAP utilizando HindIII e Bg/II, como descrito na literatura (Goto, M. et al. Mol. Pharmacol. Vol. 49, 860-873 (1996)). O gene SEAP foi obtido por digestão dupla de pcADN3.1-SEAPmh com HindIIl/Pmel. O gene GFP foi excisado de pEGFP-N2 utilizando NotI-Ncol. O plasmídeo, pBabeCLXl2G utilizado para produção do vector virai foi produzido com base em pBabePuro (Morgenstern, J. P. et al. Nucleic Acids Res, vol. 18, 3587-3596 (1990)), excisando o seu promotor SV40 e genes da resistência à neomicina utilizando Sall-Clal, e tornando aquelas extremidades rombas com fragmentos de Klenow, depois substituindo estes fragmentos com o local de reentrada interno do ribossoma (IRES) do vírus da encefalomiocardite (EMCV), que foi excisado de pIRES2-EGFP por HincII-HincII, e a proteína fluorescente verde (GFP); substituindo seguidamente a porção da repetição do terminal longo (LTR) pelo local de inserção do gene estranho (local de multi-clonagem) (Sspl-BamHI) com uma sequência

correspondente (Sspl-BamHI) de pCLXSN (IMGENEX). Além disso foi também utilizado pBabeCLXIP, em que a porção IRES-GFP 31 de pBabeCLXl2G tinha sido substituída com o gene da resistência à puromicina IRES.

Cada um dos fragmentos de ADN dos acima mencionados PLAP, SEAP, e GFP foram tornados rombos com fragmentos de Klenow, depois inseridos nos vectores pBabeCLXIP ou pBabeCLXI2G cindido com Hpa I, dando origem a pBabeCL(PLAP)IP, pBabeCL (SEAPmh)l2G, e pBabeCL(GFP)IP, respectivamente. (2) Produção de vectores virais

Cada transferência de gene para uma placa de 10 cm foi efectuada como se segue: 30 μΡ de reagente de transfecção de plasmídeo TranslT (MIRUS) foi misturado com 500 μΡ de meio DMEM isento de FCS, e depois deixado em repouso à temperatura ambiente durante cinco minutos (solução misturada de misturada DMEM/ TransiT). Num tubo separado 3,3 μ9 de um vector que codifica para VSV-G (pCALG, modificado de acordo com Arai, T. et al., J. Virol., 1998, 72, p.1115-21), 3,3 μρ de um vector que codifica para Gag-Pol (sistema pCLAmpho/RetroMax (imgenex) ), e 3,3 μρ de um vector compreendendo um sinal de encapsidação e o gene transferido (pBabeCL(PLAP)IP, pBabeCL(SEAPmh)I2G, ou pBabeCL(GFP)IP, foram misturados, totalizando 9,9 μρ (da solução de plasmídeo). A solução de plasmídeo foi adicionada à solução misturada DMEM/TransIT, vigorosamente agitada e depois deixada em repouso à temperatura ambiente durante 15 minutos. Isto foi então adicionado a células 293-EBNA (Invitrogen), cultivadas de um dia para o outro de 2xl06 células/10 cm de placa no dia anterior. O meio foi trocado oito horas após adição, e o sobrenadante da cultura foi recolhido após cultura durante outros dois dias. O sobrenadante da cultura recolhido foi 32 centrifugado (300 g, cinco minutos), ou filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 μιη (Millipore) para remover contaminantes, e este sobrenadante foi utilizado como solução de vírus (MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP, MLV(VSV)/pBabeCL(SEAPmh)I2G, e MLV(VSV)/pBabeCL (GFP)IP, respectivamente). Parte da solução do vírus foi concentrada por ultracentrifugação (19,500 rpm, 100 minutos) e depois utilizada. (3) Transferência de genes e cultura de adipócitos cultivados em primário

Os adipócitos a serem utilizados na transferência génica (derivados de gordura subcutânea, gordura que circunda o epidídimo, e gordura mesentérica de ratinhos ICR, e a gordura subcutânea dos ratinhos C57BL/6) foram preparados em placas de 6 poços ou de 96 poços de modo a apresentarem 50 a 80% de confluência no dia antes da transfecção. O meio foi rejeitado e adicionou-se quantidades iguais de 4 pg/rnL de solução de polibrene (SIGMA) e solução de vírus às células para realizar a transdução do vector virai. Oito horas após a transdução, o meio foi alterado para um meio normal, e foi efectuada outra cultura e subcultura. A actividade AP de uma porção das células foi medida recolhendo o sobrenadante de uma cultura de 24 horas no dia quatro após transfecção (Fig. 3) . A subcultura foi efectuada de acordo com o processo do Exemplo 1 a uma escala de placa de 10 cm. As células foram cultivadas durante quatro a sete dias, e o meio foi trocado, quando se atingiu a confluência. A actividade AP foi medida no sobrenadante da cultura 17 horas mais tarde. Estas células foram subcultivadas de forma contínua e realizando de forma adequada manipulações semelhantes, a 33 manutenção da expressão foi examinada (Figs 5 e 6). A actividade AP não foi medida de cada vez que a subcultura foi efectuada. A diferenciação foi efectuada em placas de 6 poços de acordo com o método do Exemplo 1. Contudo, o tratamento foi efectuado durante três dias com meio de indução, que foi substituído por meio de maturação cada três dias seguintes. A actividade AP do sobrenadante de cultura foi medida utilizando o sobrenadante de cultura obtido cada três dias e o eixo dos xx nas figuras mostram o dia em que o sobrenadante foi recolhido. Para as células GFP-transfectadas foram tiradas microfotografias sob luz GFP adequada (Figs. 4 e 6). Condições indutoras de não diferenciação referem-se a condições em que a cultura é continuada num meio normal em vez de num meio de indução ou meio maduro.

Resultados A Fig. 3 é uma comparação da eficiência da transferência génica para cada tipo de célula derivada de tecido, quando se utilizam vectores retrovirais. A actividade AP foi confirmada no sobrenadante de cultura de todas as células, quando a transferência génica foi efectuada nos adipócitos cultivados em primário isolados de cada um dos tecidos adiposos que existem no tecido subcutâneo inguinal, área à volta do epididimo e mesentérica de ratinhos ICR. Este facto mostrou que os vectores retrovirais podem transferir genes independentemente do local de origem da célula. A Fig. 4 é um conjunto de microfotografias que apresenta imagens da indução de diferenciação de células transductadas com um vector retroviral que expressa GFP. A indução da diferenciação foi iniciada 13 dias após transferência génica, e as fotografias foram tiradas três 34 semanas mais tarde. Foi observada fluorescência GFP em células contendo gotas lipidicas que mostraram que o vector virai pode transferir genes para pré-adipócitos que possuem a capacidade de se diferenciarem, e que a transferência génica através do vector não afecta a sua capacidade de se diferenciar. A Fig. 5 apresenta a continuidade da expressão nas subculturas de adipócitos cultivados em primário transfectados com um vector virai que expressa AP. A actividade AP foi medida no sobrenadante de cultura retirado 17 horas após as células terem atingido a confluência numa placa de 10 cm. A produção AP continua foi confirmada durante 87 dias em que adipócitos cultivados em primário derivados de gordura subcutânea de ratinhos C57BL/6 foram examinados (A), e ao longo de 63 dias em que adipócitos cultivados em primário derivados de gordura subcutânea de ratinhos ICR foram examinados (B) . Estes resultados mostraram que a transdução do vector virai em adipócitos cultivados em primário podem produzir células de expressão estável que mantêm os genes estranhos nas células filhas produzidas após divisão. A Fig. 6 é um conjunto de fotografias e um gráfico que mostra as alterações de expressão em adipócitos induzidos a diferenciação com genes transferidos. Os adipócitos que expressam GFP derivados de gordura de ICR subcutânea apresentavam uma forte expressão GFP em condições de cultura normais (A), e condições indutoras de diferenciação (B) . Além disso, adipócitos que expressam AP derivados de gordura subcutânea de ICR apresentavam expressão AP continua tanto em condições indutoras de não diferenciação (não diferenciação) e condições indutoras de diferenciação (diferenciação) (C) . Verificou-se que os adipócitos cultivados em primário com genes transferidos por vectores virais exprimiam de forma estável genes em qualquer fase, 35 não apenas nas condições de proliferação descritas na Fig. 5, mas também em condições de não diferenciação, ou mais especificamente em condições de não proliferação ou condições de maturidade.

Exemplo 4 Produção de adipócitos que segregam de forma estável insulina utilizando um vector plasmidico

Processos de transferência génica incluem métodos que utilizam vectores plasmidicos

Processos (1) Isolamento e modificação do gene da insulina humana A PCR foi efectuada numa biblioteca de ADNc derivada do pâncreas humano (Stratagene), utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1 (Insulina Fw e Rv). Foi obtido um fragmento do gene da insulina humana. Foi determinada a sequência nucleótidica deste fragmento de 354-pb, e o fragmento foi subclonado no vector pCR2.lT0P0 (Invitrogen) como insulina nativa. 36

Tabela 1

Sequências de iniciadores utilizados para PCR

Iniciador Sequência nucleótidica (5'-) Insulina Fw CATAAGCTTACCATGGCCCTGTGGATGC GC (SEQ ID N°:1) Insulina Rv CATTCTAGACTAGTTGCAGTAGTTCTCC AG (SEQ ID N° 2) Local 1 CTTCTACACACCCAGGACCAAGCGGGAG GCAGAGGAC (SEQ ID N°:3) Local 2 CCCTGGAGGGATCCCGGCAGAAGCGTGG (SEQ ID N°:4) B10 CACCTGTGCGGATCCGACCTGGTGGAAG C (SEQ ID N°:5) sPL-GLP-lFw TTCCACCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTG CTGGGCCTGAGGCTACAGCTCTCCCTGG GCCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG (SEQ ID N°:6) sPL-GLP-lRv AATTATCCTCGGCCTTTCACCAGCCAAG CAATGAACTCCTTGGCAGCTTGGCCTTC CAAATAAGAACTTACATCACTGGTAAAG GTCCCTTCAGC(SEQ ID N°:7) GLP-5' TTCCACCATGCTGCTGCTGC(SEQ ID N° : 8) GLP-3' AATTATCCTCGGCCTTTCACCAG (SEQ ID N°:9) (As letras a negrito designam o codão de iniciação em Fw, e o anti-sentido do codão de paragem em Rv. 0 sublinhado indica porções mutadas.) A seguir, para expressar a insulina madura nos adipócitos foi efectuada a modificação genética com base na literatura (JBC, 1994, 269(8), 6241-). Mais especificamente, os iniciadores em ambas as direcções foram sintetizados individualmente para conter mutações em cada um dos locais de junção entre a cadeia da insulina humana B e o péptido C (local 1), entre o mesmo péptido C e cadeia A (local 2), e o 10° residuo de histidina da cadeia B (B10) (tabela 1). As mutações foram obtidas utilizando um kit de mutagénese Quikchange (Stratagene). Efectuando esta reacção no local 1 e no local 2 deu origem ao mutante sls2. Efectuando a reacção no local 1, local 2, e B10 deu origem à insulina mutante sls2Bl0. Após confirmação da sequência 37 nucleótidica do gene obtido da insulina humana modificado, o gene foi incorporado no vector pcADN3.1, e depois utilizado para transferência génica. (2) Transferência génica para adipócitos cultivados em primário

Após mistura de 500 pL de meio DMEM isento de FCS e 15 pL de reagente 6 Fugene (Roche), adicionou-se 5 μg de plasmideo transfectado e deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução misturada foi adicionada aos adipócitos cultivados em primário (derivados de tecido adiposo à volta do epidídimo de ratinhos C57BL/6), que tinham sido cultivados até a uma confluência de 70 a 80% numa placo de 10 cm. Isto foi cultivado durante 24 horas num incubador de C02. Quatro dias após a transferência génica, as células foram subcultivadas num frasco T225, e cultivadas de um dia para o outro. O meio foi então trocado por um meio compreendendo 0,2 mgU/ml de G418 (SIGMA), e a cultura foi continuada durante três semanas, em que células com genes transferidos foram seleccionadas. As células obtidas G418-resistentes foram aplicadas numa placa de 10 cm, e a quantidade de insulina no sobrenadante de cultura foi medida utilizando um kit EIA de insulina ultra-sensível (Morinaga). Este kit de EIA detecta pro-insulina, que não tinha ainda sido processada, e insulina madura.

Resultados A Fig. 7 mostra a produção de (pro)insulina, através de transfecção de plasmideo em adipócitos cultivados em primário. Cada um dos vectores pcADN3.lMyc-His que incorporam individualmente o gene nativo da insulina humana 38 (nativa) e a forma modificada do Iocall/Iocal2/Bl0-(s1s2B10), um vector vazio ("mock"-controlo), foi transfectado para adipócitos derivados do tecido adiposo que circunda o epididimo dos ratinhos C57BL6. Foi detectada a (pro)insulina humana no sobrenadante da cultura de células resistentes obtidas por selecção com G418. Isto mostrou que uma transferência de genes estável para adipócitos cultivados em primário é também possível utilizando um vector plasmídico.

Exemplo 5 Produção utilizando um vírus adeno-associado de adipócitos que expressam de forma estável AP Métodos de transferência de genes incluindo processos que utilizam vírus adeno-associados (AAV).

Processos 0 estudo foi efectuado utilizando o sistema AAV Helper-Free (Stratagene). 0 fragmento PLAP do Exemplo 2 (um fragmento excisado utilizando Hindlll e Bg/Il) foi inserido no mesmo local da enzima de restrição do vector pAAV-MCS, dando origem a pAAV-PLAP. A produção do vector AAV foi efectuada como se segue: 1,75 mL de OPTI-MEM (Invitrogen) foi misturado com 220 pL do reagente de transfecção de plamídeo Fugene, depois 25 pg de cada pAAV-PLAP, pAAV-RC, e pHelper foram misturados, e deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos (Fugene/soluções de plasmídeo). Entretanto, foram preparadas células 293-EBNA crescidas até a uma confluência de 60 a 70% em placas de 15 cm. A solução de cultura foi alterada para dmem isento de FCS, depois a solução de Fugene foi instilada homogeneamente, e isto foi cultivado durante duas a três horas. FCS foi então adicionado até a 39 uma concentração final de 10%, e isto foi cultivado durante mais dois dias. As células foram recolhidas por tratamento com tripsina e centrifugação, e depois novamente suspensa em solução de tris-HCl 50 mM e 150 mM de NaCl de modo que o volume final fosse 3 ml. As células foram quebradas efectuando três ciclos de congelamento-descongelamento gelo seco-etanol/37°C nesta solução em suspensão. Além disso, após degradação do ADN genómico hospedeiro utilizando Benzonase (SIGMA), a solução virai foi produzida por centrifugação a 9000 rpm durante 30 minutos seguida de filtração do sobrenadante.

Adipócitos cultivados em primário (derivados de gordura subcutânea de ratinhos C57BL/6) foram aplicados numa placa de 12 poços a lxlO4 células/poço no dia antes da transferência génica, e foram cultivados. Foram depois tratados durante seis horas num meio contendo 40 mM de hidróxiureia e 1 mM de ácido butirico (ambos da SIGMA). Após remoção deste meio, adicionou-se 0,5 mL/poço da solução virai diluída 1/100 com DMEM isento de FCS. Após cultura durante uma hora, meio contendo FCS foi adicionado até a uma concentração final de 10%, e isto foi cultivado de um dia para o outro. Depois, foram efectuadas trocas de meio normal e a subcultura foi efectuada no dia 24. O meio foi trocado no primeiro, sétimo, e 25° dia de transferência, e o sobrenadante de cultura recolhido dois dias após cada troca foi utilizado para os ensaios de AP. 10 μΒ do sobrenadante que foi diluído de acordo com o necessário foi aquecido a 65°C durante 20 minutos, depois 50 μΒ de tampão de ensaios (16 mM de NaHC03, 12 mM Na2C03, 0,8 mM de MgSCh), e 50 μΒ de reagente corante luminescente (CDP-Star pronto a usar com Sapphire II, TROPIX), foram misturadas, feitos reagir no escuro durante 30 minutos, e depois medidos com um luminómetro. 40

Resultados A Fig. 8 apresenta uma expressão estável de AP em adipócitos cultivados em primário (derivados de gordura subcutânea de ratinhos C57BL/6) transfectados com AAV que expressa AP. A actividade AP foi detectada no sobrenadante de cultura ao longo de todo o periodo de observação. Isto mostrou que uma transferência de genes estável para adipócitos cultivados em primário pode ser conseguida utilizando um vector AAV.

Exemplo 6 Construção de um vector retroviral que expressa insulina humana, e sua transdução em adipócitos Métodos 0 gene da insulina humana modificada construído no Exemplo 4 (sls2Bl01ns) foi inserido no vector pBabeCLXl2G seguindo o processo do Exemplo 3 (pBabeCL(sls2Bl01ns)I2G). Este plasmídeo conjuntamente com um vector que codifica para VSV-G (pVPack-VSV-G/Stratagene), e vector que codifica Gag-Pol (modificado a partir de pVPack-gp/Stratagene) foram introduzidos em células 293-EBNA de acordo com o processo do exemplo 3, produzindo deste modo o vector retroviral modificado que expressa insulina (MLV(VSV)/pBabeCL(sls2B101ns)I2G). Foi recolhido o sobrenadante de cultura (aproximadamente 200 mL) de células 293-EBNA de vinte e duas placas de 10 cm, o material insolúvel foi removido por centrifugação/ tratamento de filtração, e depois a solução de vírus concentrada foi obtida por ultra-centrifugação (19, 500 rpm, 100 minutos) . Isto foi transferido para adipócitos cultivados em primário (derivados de gordura subcutânea de C57BL/6), que foi aplicada numa placa de 6 poços no dia anterior. 41

As células com genes transferidos foram novamente aplicadas em placas numa placa de 6 poços, e a diferenciação foi induzida de acordo com o processo do Exemplo 1. Cada um dos sobrenadantes de cultura foi recolhido durante três dias, de três dias antes da indução até ao dia de iniciação da indução (pré-indução), e durante três dias desde o dia 14° ao dia 17° de indução (pós-indução). A quantidade de insulina foi testada pelo mesmo processo que no exemplo 4. Além disso, para confirmar que o processamento ocorria nos locais desejados, e que a insulina madura era produzida foram efectuados medidas utilizando o kit EIA (IBL), que reconhece apenas a insulina madura. 0 sobrenadante de cultura de células não transferidas com genes, que foram simultaneamente sujeitas a indução por diferenciação foi utilizado como controlo.

Resultados A Fig. 9 apresenta a expressão da insulina na altura da indução da diferenciação em adipócitos cultivados em primário transductados com o vector retroviral que expressa insulina sls2BlO. (A) apresenta os resultados da utilização de EIA produzido por Morinaga, e (B) apresenta os resultados utilizando EIA produzido por IBL. Estes resultados mostram que a insulina é secretada de forma estável, antes e depois da indução de diferenciação, e que a transferência do gene da insulina mutante pode provocar a produção de insulina madura a partir de adipócitos.

Exemplo 7 Construção de um vector retroviral que expressa o péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1), e sua transdução em adipócitos . 42 GLP-1 é um péptido que é produzido a partir de pequenas células intestinais L durante a tomada de alimentos, e compreende o efeito de estimular a secreção de insulina actuando em células pancreáticas β. GLP-1 é também conhecido por possuir uma variedade de outros efeitos anti-diabéticos e anti-obsesidade tais como um efeito de regeneração em células pancreáticas β, um efeito supressor do apetite, e um efeito inibidor no esvaziamento gástrico (Meier, j. j. et al. Eur. j. Pharmacoil. 2002, 12; 440(2-3):269-79; Drucker, D. J. Gastroenterology 2002; 122(2):531-544). Um péptido compreendendo as posições 7 a 3 7 da sequência de aminoácidos de GLP-1 (ou até à posição 36 na forma de amida), é formada por processamento específico do tecido do polipéptido produzido a partir do gene de preproglucagona, e é conhecido por compreender a actividade farmacológica principal (Drucker, D. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987 May; 84(10):3434-3438,-Kreymann, B. et al. Lancet. 1987, 5; 2(8571):1300-1304; Mojsov, S. et al. J. Clin. Invest. 1987 Feb, 79(2):616-619) . O exame seguinte foi efectuado de modo a produzir este factor a partir de adipócitos.

Processos

Foi desenhada uma sequência nucleótidica com um total de 156 pares de bases, compreendendo uma sequência (SEQ ID N° 10 apresenta a sequência de codificação) em que o GLP-1(7-37) humano e um codão de paragem estão ligados ao péptido de sinalização (17 aminoácidos) do gene PLAP utilizado no Exemplo 3. Os nucleótidos foram sintetizados de modo a que um 22 mero estava compreendido no centro (sPL-GLP-lFw e sPL-GLP-lRv na Tabela 1). Estes foram emparelhados e foi formada uma cadeia dupla utilizando a Pfu polimerase (Stratagene). O fragmento alvo foi então 43 amplificado por PCR utilizando os iniciadores de extremidade 5' e extremidade 3' (GLP-5' e GLP-3' na Tabela 1) . Este fragmento foi subclonado no vector pCR2.1, depois excisado utilizando as enzimas de restrição e posteriormente inserido no vector pBabeCLXl2G, como no exemplo 3 (pBabeC-L(sPL-GLPl)I2G) . Isto foi transferido para células 293 EBNA, através de um processo semelhante ao do Exemplo 6, produzindo um vector retroviral que expressa GLP-1 (MLV(VSV)/pBabeCL(SPL-GLP-1)I2G). Recolheu-se aproximadamente 90 ml do sobrenadante de cultura de células 293-EBNA de nove placas de 10 cm. O material insolúvel foi recolhido por tratamento centrifugação/filtração, e o sobrenadante foi então ultracentrifugado (19500 rpm, 100 minutos) para dar uma solução de vírus concentrada. Esta foi então transductada para adipócitos cultivados em primário (derivados de gordura subcutânea de C57BL/6) que tinham sido aplicados numa placa de 6 poços no dia anterior. Os adipócitos transfectados foram novamente aplicados numa placa de 12 poços, e a indução de diferenciação foi efectuada de acordo com o método do exemplo 1. "Não induzido" diz respeito a uma condição em que a cultura foi continuada num meio normal em vez de num meio de indução ou meio maduro. Sete dias mais tarde, o meio foi trocado por DMEM isento de FCS compreendendo 1 mM de valina-pirrolidina (inibidor da enzima de degradação GLP-1; sintetizada na Eisai). O sobrenadante de cultura foi recolhido 18 horas mais tarde, e a quantidade de GLP-1(7-37) activa foi medida utilizando ELISA (LINCO).

Resultados A Fig. 10 apresenta o nível da expressão em adipócitos cultivados em primário transfectados com GLP-1(7-37) que expressa o vector retroviral. A expressão da forma activa 44 de GLP-l(7-37) foi observada no sobrenadante da cultura de adipócitos induzidos não diferenciados e adipócitos induzidos diferenciados. Isto mostrou que mesmo, quando um factor é produzido como o preprotipo e depois cortado por processamento, este processo permite a produção de apenas aquele factor a partir dos adipócitos.

Exemplo 8 Implantação de ratinhos com células que expressam de forma estável AP (Teste 1)

Processos

Após cultura dos adipócitos que expressam AP (transductados com MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP; derivado de gordura subcutânea de C57BL/6) produzida, através do processo do Exemplo 3 até à confluência, as células foram recolhidas por tratamento com tripsina, lavadas com PBS, e suspensas a 5xl07 células/ml em Matrigel à temperatura do gelo (Becton Dickinson) . A implantação foi efectuada injectando isto na área subcutânea dorsal (Sc) de ratinhos C57BL/6 (com oito semanas de idade na altura da operação; Charles River) a uma dose de 0,2 mL por ratinho (lxlO6 células/cabeça)(sem indução de diferenciação). Por outro lado, as mesmas células foram cultivadas até à confluência, depois cultivadas durante três dias em meio indutor do Exemplo 1, e depois implantados, através de processos semelhantes (com indução da diferenciação). O sangue foi recolhido ao longo do tempo, através do processo indicado no Exemplo 2, e a actividade AP no plasma foi medida.

Resultados A Fig 11 mostra a alteração da actividade AP no plasma em ratinhos implantados com adipócitos cultivados em primário 45 que expressam AP. Os indivíduos que receberam um implante de células sujeitos a estimulação indutora de diferenciação durante três dias antes da implantação ("com indução da diferenciação") mostraram uma menor flutuação na expressão continuada do que os indivíduos que receberam um implante de células que não foram induzidas. Contudo, ambos os processos de implantação mostraram uma expressão contínua ao longo de todos os cerca de 50 dias de observação. Isto mostra que a taxa de sobrevivência da pós-transplantação de células pode ser melhorada disponibilizando estimulação indutora de diferenciação.

Exemplo 9 Implantação em ratinhos com células que expressam de forma estável AP (Teste 2)

Processos (1) Implantação

Os adipócitos que expressam AP (transductados com MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP; derivados de gordura subcutânea de ICR) produzidos no Exemplo 3 foram cultivados até à confluência. As células foram recolhidas, através do tratamento com tripsina, lavadas com PBS, e suspensas a 5xl07 células/ml em Matrigel à temperatura do gelo (Becton Dickinson) à qual se adicionou 1 μς/πιΐ de bFGF (Genzyme Techne). A implantação foi efectuada injectando isto a uma dose de 0,2 mL por ratinho (lxlO6 células/cabeça) a cada local (área subcutânea dorsal (Sc), gordura subcutânea inguinal (gordura), e região intraperitoneal (ip)), dos ratinhos ICR nus (com seis semanas de idade na altura da operação, Charles River). Como controlo, a expressão de adipócitos GFP foram tratados de forma semelhante e implantados no tecido subcutâneo. 46

Algumas das células que expressam AP foram cultivadas durante três dias pelo meio de indução do Exemplo 1, e depois recolhidos e implantados da mesma maneira (Dif). Após a utilização do meio de indução, algumas destas células foram cultivadas durante quatro dias num meio de maturação, e depois recolhidas e implantadas da mesma maneira (Mat).

Além disso, algumas das células que expressam AP foram aplicadas numa câmara de 8 poços Labteck (Nunc) nas mesmas condições utilizadas para implantação (Matrigel adicionado 1x106/0,2 mL bFGF), e depois as células foram solidificadas por aquecimento a 37°C. A implantação foi conseguida inserindo este gel solidificado na área subcutânea do ratinho. Aqui as células cultivadas num meio normal após solidificação foram designados como pré-fixados (pf)/g, e as células foram cultivadas num meio indutor de diferenciação foram designadas como pf/dif. A implantação foi efectuada após sete dias de cultura. A actividade AP no plasma foi medida ao longo do tempo, antes da implantação (dia 0) e após implantação, de acordo com o processo do Exemplo 2. (2) Extirpação

No grupo implantado após indução da diferenciação (Dif/Sc), as massas de células implantadas foram extirpadas conjuntamente com o Matrigel de indivíduos A e B, cinco e 43 semanas após implantação, respectivamente. A extirpação foi efectuada na amostra de controlo na quinta semana desde a implantação. A cada indivíduo foi administrado intraperitonialmente 50 mg/kg de Nembutal, como anestesia. Foi feita então uma incisão na sua pele foi então incisada e a secção de Matrigel implantada confirmada visualmente foi extirpada. O local de cirurgia foi suturado e 47 desinfectado com Isodine (Meiji). Os animais foram então criados da mesma maneira, e o sangue foi colhido ao longo do tempo.

Resultados A Fig. 12 (A) mostra o resultado de se examinar a alteração na actividade AP do plasma ao longo de 50 dias, quando adipócitos cultivados em primário que expressam AP foram implantados utilizando Matrigel a que se adicionou FGF básico, na presença de estimulação de diferenciação (grupo Dif/Sc). Alteração na actividade AP no sangue era estável durante 49 dias ao longo de uma gama de cerca de 5 vezes. Isto mostrou que a adição de bFGF na altura da implantação pode ainda melhorar a taxa de pós-implantação dos enxertos. (B) apresenta o desaparecimento da actividade do plasma AP devido à extirpação de Matrigel implantado (indivíduo A) ao longo do mesmo período. A actividade AP nos indivíduos extirpados foi significativamente diminuída comparada com o valor médio de PLAP transdutado. Isto mostrou que a AP do sangue deriva de células implantadas, e que a extirpação de enxertos pode eliminar rapidamente a expressão dos genes. Desta vez, a extirpação foi também realizada numa porção do grupo de controlo que foi implantado com células transfectadas GFP. Células GFP positivas foram encontradas no Matrigel extirpado, e muitas delas exibiram uma imagem do vacúolo (C) semelhante à apresentada na Fig. 6(B) . Isto mostrou que os adipócitos cultivados em primário implantados, através deste processo podem ser enxertados como tecido adiposo maduro in vivo. A Fig. 13 apresenta o resultado do exame a longo termo de actividade AP no sangue nos ratinhos implantados da Fig. 12(A), e os ratinhos que recebem um implante, através de uma variedade de outros métodos. No grupo implantado com 48 células PLAP transfectadas, um aumento claro da actividade AP do sangue foi confirmada para todos os locais de implantação e métodos de implantação. A actividade AP no sangue foi mantida durante um longo período de tempo, e em particular, foi observada uma expressão AP estável durante um ano durante o período de teste do grupo Dif/Sc (o grupo foi descrito na Fig. 12 (A)). A produção contínua de AP foi também confirmada para outros processos de implantação, todos durante o período de exame (316 dias para o grupo ip, 54 dias para o grupo de gordura, 225 dias para o grupo Sc, 317 dias para o grupo Mat/Sc, e 314 dias para os dois grupos pré-fix.). 0 pico de actividade foi observado num período de uma semana após implantação e foi mais elevado no grupo ip. Os valores mais elevados foram então na ordem de Sc>gordura>Dif/Sc«pf-dif>pf-gr«Mat/Sc. A gama de variação após implantação foi observada como uma proporção entre a actividade após 13 semanas e o pico de actividade, que pode ser comparado em todos os grupos. A variância foi menor, aproximadamente três vezes, nos dois grupos pré-fix., aproximadamente cinco vezes nos grupos ip, Dif/Sc, e Dif/Sc, e Mat/Sc, e aproximadamente 10 vezes nos grupos Sc e de gordura. O valor do pico imediatamente após implantação, e a gama de variação após implantação diferia para cada método de implantação. Qualquer um destes métodos pode então ser utilizado de acordo com as características do produto génico utilizado, as características patológicas, e a simplicidade da técnica. Isto mostrou que a implantação de adipócitos cultivados em primário, nos quais foram introduzidos de forma estável ex vivo genes pode ser efectuada, através de uma variedade de processos, e que a expressão de genes in vivo estável a longo termo é possível após implantação. A Fig. 14 apresenta o resultado de se efectuar uma experiencia de extirpação semelhante à descrita na Fig. 49 12(B), na fase tardia de implantação. A actividade AP no sangue após extirpação foi confirmada desaparecer rapidamente, não apenas em indivíduos, em que a extirpação foi efectuada nas fases iniciais da implantação (indivíduo A), mas também em indivíduos em que a extirpação foi efectuada nas fases tardias da implantação (indivíduo B) . Isto mostrou que adipócitos implantados, através deste processo se encontram localizados no local de implantação durante um longo período de tempo após implantação, e a sua extirpação, quando adequada, pode eliminar a expressão génica independentemente do tempo.

Exemplo 10 Transplantação de ratinhos com células que expressam de forma estável AP (Teste 3)

As observações seguintes foram efectuadas para confirmar a dependência da "dose" do número de células implantadas. Métodos

Os adipócitos que expressam AP produzidos no Exemplo 3 (transfectados com MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP; derivados da gordura subcutânea de ICR) foram cultivados até à confluência. As células foram cultivadas durante três dias no meio de indução indicado no Exemplo 1, e depois recolhidas, através do tratamento com tripsina. Após lavagem com PBS, as células foram suspensas em 5xl07 células/ml em Matrigel. Uma diluição de cinco vezes em passos foi efectuada na solução de suspensão celular AP utilizando Matrigel, e foram preparadas respectivamente soluções de lxlO7 células/ml e 2xl06 células/ml. Foi 50 adicionado bFGF a estas soluções até a uma concentração final de 1 μg/ml, e depois foram implantadas na área subcutânea dorsal de ratinhos nus ICR a uma dose de 0,2 ml por ratinho (dose elevada: lxlO6 células/cabeça; dose média:2xl05 células/cabeça; baixa dosagem:4xl04 células/cabeça). Como controlo, adipócitos com expressão GFP foram tratados de forma semelhante, e foram implantados no tecido subcutâneo nas mesmas condições, tal como nas condições de doses elevadas (lxlO6 células/cabeça).

Resultados A Fig. 15 apresenta a dependência da actividade AP do sangue no número de células implantadas, quando se implanta adipócitos que expressam AP. A actividade AP no sangue dependente da dose foi observada, quando se altera o número de células implantadas, e isto não foi influenciado pela duração. Mais especificamente, o grupo médio ou de baixa dosagem não apresentavam um pico na fase inicial de implantação que foi observado no grupo de elevada dosagem, e a gama de flutuação era mais estreita. Isto mostrou que o nível de expressão in vivo pode facilmente ser ajustado utilizando o número de células implantadas, e que ajustando o número óptimo de células, a concentração sanguínea pós-implantação (nível de expressão) pode ser estabilizada.

Exemplo 11 Efeito hipoglicémico no modelo da diabetes em ratinhos devido à implantação de adipócitos que expressam insulina Métodos

Foram produzidos ratinhos diabéticos administrando por via intravenosa ratinhos C57BL/6 com 10 mL/kg de 170 mg/kg 51 de estreptozotocina (STZ, SIGMA). Foram medidos individualmente os niveis de glucose no sangue em jejum (FBG) na semana um e na semana 2 após administração de STZ, e indivíduos com um FBG de 300 mg/dl ou mais determinou-se terem diabetes. O nivel de açúcar no sangue foi medido efectuando um tratamento por perclorato imediatamente após recolha do sangue total e depois utilizando o Teste-II da glucose (WAKO).

Os adipócitos transfectados com MLV (VSV)/pBabeCL(sls2Bl01ns)I2G produzidos no Exemplo 6 foram sujeitos a estimulação de indução de diferenciação utilizando o mesmo método que no Exemplo 10, e depois suspensos a 5xl07 células/ml em Matrigel a que 1 μρ/ιτιΐ de bFGF tinha sido adicionado. Esta solução da suspensão foi implantada na área subcutânea dorsal de cada ratinho diabético, a 0,2 mL por local num total de quatro locais (quatro x 106/cabeça). Por cada grupo de controlo adipócitos com genes não transferidos foram implantados, através do mesmo método. A implantação foi efectuada 19 dias após tratamento com STZ, e depois, o nível FBF foi medido ao longo do tempo. Análise estatística foi efectuada comparando com o grupo de controlo (teste t não emparelhado).

Resultados A Fig. 16 mostra o efeito de implantar adipócitos sls2BlO que expressam insulina em ratinhos diabéticos induzidos por STZ. Células com genes não transferidos foram implantadas como controlo. O nível de glucose no sangue do grupo implantado com células que expressam insulina tende a decrescer desde o sétimo dia de implantação, e um efeito hipoglicémico significativo foi indicado no 13° dia e 21° 52 dia de implantação (A) . 0 peso corporal 20 dias após a implantação era significativamente mais elevado em células que expressam insulina do que no grupo de controlo, e a perda de peso devido a diabetes foi por isso melhorada (B). Os resultados do exame utilizando AP sugere que este efeito hipoglicémico será mantido durante um longo período. Por isso, o produto génico estranho produzido a partir dos adipócitos cultivados em primário implantados mostrou ser capaz de contribuir para a modificação da patologia do hospedeiro, indicando que este método pode ser capaz de tratar a diabetes.

Aplicabilidade Industrial A presente invenção estabeleceu métodos para transferência ex vivo de um gene estranho em adipócitos cultivados em primário adequados para a terapia génica, e estabeleceu adipócitos cultivados em primário que mantêm de forma estável um gene estranho.

Listagem de Sequências

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Lisboa, 14 de Março de 2011.

Claims (12)

1 Reivindicações 1. Composição farmacêutica compreendendo um pré-adipócito cultivado em primário, em que o pré-adipócito mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula pelo vector retroviral, em que a proteína é insulina, ou o péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1).

2. Pré-adipócito cultivado em primário, em que o pré-adipócito mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteina que é secretada para o exterior da célula, e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula pelo vector retroviral para ser utilizado em terapia génica, em que a proteina é insulina ou GLP-1.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, ou o pré-adipócito para ser utilizado de acordo com a reivindicação 2, em que o pré-adipócito possui a capacidade de expressar significativamente a proteína in vivo durante pelo menos 20 dias.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação ao 1 ou 3, ou o pré-adipócito para ser utilizado de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que o pré-adipócito é utilizado para libertar a proteína para a corrente sanguínea.

5. Processo in vitro para produzir um pré-adipócito para ser utilizado em terapia génica, em que o processo compreende os passos de: (1) cultivar em primário um pré-adipócito; e 2 (2) transferir e manter de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula, em que a proteína é insulina ou GLP-1.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o gene estranho é transferido por um vector retroviral.

7. Pré-adipócito para ser utilizado de acordo com a reivindicação 2 que foi produzido, através do processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6.

8. Composição de implante, em que a composição compreende um pré-adipócito cultivado em primário que mantém de forma estável um gene estranho que codifica para uma proteína que é secretada para o exterior da célula e em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula pelo vector retroviral, e um veículo farmaceuticamente aceitável, para utilização na terapia génica, em que a proteína é insulina ou GLP-1.

9. Composição de implante para ser utilizada de acordo com a reivindicação 8, ou a composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4 que compreende ainda um componente de matriz extracelular.

10. Composição do implante para ser utilizada de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3, 4 e 9 que compreende ainda um factor de angiogénese.

11. Préadipócito cultivado em primário que mantém de forma estável um gene que codifica para insulina ou para um péptido do tipo glucagona 1 (GLP-1) para ser utilizado para 3 baixar a glucose no sangue, em que o gene foi inserido num vector retroviral e foi transferido para a célula, através do vector retroviral.

12. Animal não humano, em cujo corpo foi implantado o pré adipócito cultivado em primário de acordo com reivindicação 2. Lisboa, 14 de Março de 2011.