KR20100131011A - 각막 결함 및 안와내 결함 복원용의 지방조직 유래 스트로마 세포 및 이의 용도 - Google Patents
각막 결함 및 안와내 결함 복원용의 지방조직 유래 스트로마 세포 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 외상, 대사성 질병, 선천적 이상 또는 수술에 수반되는 결함을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 안구 관련 조직 결함을 치료하고 복원하기 위해 지방조직 유래 스트로마 세포를 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 지방조직 유래 스트로마 세포는, 단독으로 또는 생체적합성 물질의 존재하에서, 미분화 상태, 분화 상태 또는 지방세포 상태로 배양된다. 생성된 물질은 다양한 안와내 결함을 교정하기 위해 외과적으로 사용된다.
Description
본 발명은 안와내 스트로마 세포(stromal cell)의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도시킨 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 제공한다. 또한, 분화되거나 미분화된 지방 유래 스트로마 세포를 사용하여 눈의 각막 결함 및 안와내 결함을 복원하기 위한 방법이 제공된다.
눈은 다수의 조직 유형으로 구성된 복합 기관이다. 세 가지 상이한 막은 눈을 구성하며, 외측에서 내측으로 공막과 각막, 맥락막, 및 망막이 있다. 세 가지 막 안에는 굴절 매질, 즉, 방수, 수정체액 및 초자체액이 존재한다. 스트로마 세포는 눈의 각각의 층의 필수불가결한 성분으로, 이웃하는 상피세포, 내피세포, 신경세포 및 염증세포와 중요한 조절 관계를 공유한다. 다수의 질환이 눈 및 이의 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, 각막 질환으로는 소위 1차 질병 및 2차 질병이 있다 (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol. 8(4):46-54). 눈의 1차 질병으로는 무홍채증 또는 홍채 부재; 홍색각질피부증 또는 피부의 발적 및 각화과다증; 및 다발성 내분비 결핍을 수반한 각막염이 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 눈의 2차 질병으로는 화학적 상해; 열적 상해; 콘택트렌즈 각막병증; 반복성 윤부 수술, 및 회색 대(band)가 윤부로부터 각막으로 전개되는 퇴행성 질환인 대상 각막증이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
이러한 질환 중 대부분은 각막의 자체 신생성(self-renewing) 줄기세포를 포함하며, 이러한 줄기세포는 각막과 결막 사이에 있는 윤부의 기저층에 존재한다 (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol. 8(4):46-54). 윤부 부전 또는 줄기세포 기능장애는 시력 감퇴, 눈부심, 염증, 부종, 및 눈꺼풀 제어 근육의 연축을 포함하는 증상을 일으킨다. 일부 경우에 있어서, 이는 건강한 윤부 조직을 각막의 환부에 이식함으로써 교정될 수 있으며, 불연속적으로 국재화된 화학적 화상의 경우가 그러하다. 다양한 증거는 각막 줄기세포 및 이들의 근원이 되는 스트로마 사이의 상호작용이 정상적인 기능을 위해 중요함을 보여준다.
두 개의 인접 세포 유형이 특정 오토크린(autocrine) 및 파라크린(paracrine) 경로를 디스플레이한다. 이들 경로는 형질전환 성장 인자 β1 및 β2 (TGFβ), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 간염 성장 인자 (HGF), 및 각질세포 성장 인자 (KGF)를 포함하지만 이들에 제한되지 않는, 스트로마 세포에 의해 방출된 사이토카인에 의해 매개된다. 이들 각각의 수용체는 각막 상피 세포에 의해 합성된다. 이와 같이, 각막 상피 세포는 TGFβ1 및 β2, IGF, bFGF, 및 혈관 상피 성장 인자 (VEGF)를 합성한다. VEGF 수용체를 제외하고는, 스트로마 세포는 이러한 모든 사이토카인 뿐만 아니라 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)와 표피 성장 인자 (EGF)에 대한 수용체를 발현한다 (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol. 8(4):46-54).
각막은 광을 수정체 및 망막상으로 굴절시킴으로써 정상 시력을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 이는 조직의 보다 심층을 감염으로부터 보호하기 위해 각막 상피 세포의 연속적인 자체 신생을 필요로 한다 (Lu et al 2001, Exp Biol Med 226(7):653-64). 굴절교정 레이저각막절제술 (photorefractive keratectomy) 또는 레이저각막절삭술 (laser in situ keratomileusis)과 같은 수술은 각막 일부의 분리를 포함한다. 이러한 수술은 근시를 치료하기 위해 수행된다 (Wilson et al 2001, Arch Ophthalmol: 119(6):889-96).
상기 수술 후의 복원은 상피 층화를 수반하는 스트로마 수축을 필요로 한다 (Taliana et al 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci: 42(1):81-9). 치유 과정 동안, 많은 환자는 동물 모델에서 알파 평활근 액틴 (α- SMA)를 발현하는 근섬유아세포의 출현을 특징으로 하는 수술후 전방 "스트로마 연무(stromal haze)"를 경험한다 (Nakamura et al 2001, Br J Ophthalmol; 85(2):209-13). 이러한 근섬유아세포는 TGFβ에 의해 배양물에서 유도되며, 항-TGFβ항체에 의해 생체내에서 차단된다 (Jester et al 1997, Cornea; 16(2):177-87; Jester et al 1999, Prog Retin Eye Res; 18-(3):311-56). 게다가, 상피세포와 인접 스트로마 간의 직접적 상호작용이 근섬유아세포의 스트로마 분화를 유도할 수 있다는 증거가 있다. 이는 양막의 존재에 의해 추가로 영향을 받는다 (Choi & Tseng 2001, Cornea; 20(2):197-204). 동물 모델에서 "스트로마 연무"의 정도는 굴절교정 레이저각막절제술 동안의 각막 스트로마에 대한 손상의 깊이에 상응한다 (Moller-Pedersen et al 1998, Cornea; 17(6):627-39). 환자 간에, 각막 연무의 정도는 상피 세포 분리 기술 (기계 기반 또는 레이저 기반)과 무관하게 동일하다 (Lee et al 2001, Ophthalmology; 108(1):112-20).
다양한 생체물질이 각막 및 안구 결함 및 상해를 치료하고 복원시키기 위해 사용되어 왔다. 각막 세포외 매트릭스는 콜라겐과 글리코사미노글리칸이 풍부하다 (Robert et al 2001, Pathol Biol (Paris); 49(4):353-63). 글리코사미노글리칸, 히알루로난은 스트로마 및 내피층의 평가에 의해 판단되는 바와 같이 랫트 및 토끼 모델에서 각막 상피 창상 치유를 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (Nakamura et al 1997, Exp Eye Res; 64(6):1043-50; Chung et al 1999, Ophthalmic Res;31(6):432-9). 챙(Tseng) 등은 다양한 안구 질환의 치료에 양막을 사용하는 것을 개척하였다 (미국 특허 제 6,152,142호). 양막은 "스트로마" 측 및 "기저막" 측으로 분극되어 있다. 스트로마측은 콜라겐 I 및 III 및 피브로넥틴을 함유하며, 콜라겐 타입 IV, 라미닌 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸의 기저판 분포를 지닌다. 양막의 기저막측은 상피세포 성장을 뒷받침해주는 반면, 스트로마측은 콜라겐과 유사한 방식으로 섬유아세포의 성장을 뒷받침해준다. 양막은 인간 태반으로부터 단리되고, 저온보존된 후, 안구내 질환의 외과적 복원을 위해 사용된다.
양막의 작용 메카니즘은 아직 불완전하게 이해된 상태이다. 그러나, 배양물에서 양막의 존재가 섬유아세포에 의한 TGFβ의 발현을 억제하고 (Lee et al 2000, Curr Eye Res; 20(4):325-334) 상피 세포에 의한 인터루킨 1α및 인터루킨 1β의 발현을 억제한다는 (Solomon et al 2001, Br J Ophthalmol; 85(4):444-449) 시험관내 증거가 있다.
양막은 광범위한 각막 및 안구 결함을 치료하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 심부 각막 및 공막 궤양이 스트로마층, 기저막, 및 창상 덮개로서 다층의 양막을 사용함으로써 치료되었다 (Hanada et al 2001, Am J Opthalmol; 131(3):324-31). 양막은 면역 매개성 질병인 HIV-1 각막염에서 스트로마 염증 및 궤양형성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Heiligenhaus et al 2001, . Invest Ophthalmol Vis Sci; 42(9):1969-1974). 또한, 중증 신경영양성 각막 궤양이 양막을 사용하여 치료되었다 (Chen et al 2000, Br J Ophthalmol; 84(8):826-833). 양막은 각막 및 결막 표면을 회복시켰고, 급성 화학적 또는 열적 화상에 기인하는 윤부 스트로마 염증을 감소시켰다 (Meller et al 2000, Ophthalmology;107(5):980-989). 양막은 부분적 윤부 줄기세포 결핍을 지닌 환자에서 윤부 자가이식편 또는 동종이식편에 대한 대체물로서 사용되었다 (Anderson et al 2001, Br J Ophthalmol; 85(5):567-575). 또한, 양막은 공막에 대한 부착물을 사용하는 결막에서 각막으로 연장되는 막의 날개 유사 주름인 군날개(pterygia)의 외과적 치료에서 사용되어 왔다 (Solomon et al 2001, Ophthalmology: 108(3):449-460). 양막은 결막에 대한 대체물로서 후기 발병 녹내장 여과층 누출을 치료하는 데에 성공적으로 사용되었을 뿐만 아니라 (Budenz et al 2000, Am J Ophthalmol; 130(5):580-588; Barton et al 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42(8):1762-1768), 사르코이드증, 만성 포도막염 및 그 밖의 원인에 2차적인 각막 기저막에서의 칼슘 침착증인 대상 각막염의 외과적 치료에 사용되는 경우에 안정한 각막 상피의 회복을 개선시키고 안구 동통을 감소시키기 위해 사용되었다 (Anderson et al 2001, Cornea; 20(4):354-361).
양막 물질의 획득과 관련된 어려움으로 인해, 연구자들은 안구 또는 각막 결함의 복원을 위한 대안적인 스트로마 물질 공급원을 탐색해왔다.
칸세다(Cancedda) 등의 EP 93830229.6 에는 각막 결함을 치료하기 위한 후속 이식에 사용하기 위해 시험관내에서 이미 분화된 안구 상피 세포를 배양하는 방법에 기재되어 있다. 상피 세포의 공급원은 건강한 눈으로부터의 자가유래 생검 물질이다. 따라서, 환자는 공여자 및 수용자 둘 모두의 기능을 한다.
반 데르 쿠이(van der Kooy) 등의 미국 특허 제 6,117,675호에는 망막 질병에 걸린 개체내로 이식되는 시험관내에서 망막 색소 상피 세포로 분화된 포유류의 망막으로부터 단리된 줄기세포가 기재되어 있다. 망막 줄기세포의 공급원은 배아 조직 또는 생후 초기 조직이다.
윌리, 쥬니어(Wille, Jr.)의 미국 특허 제 5,912,178호에는 표피, 각막, 잇몸 및 뇨관 조직을 포함하는 다양한 타입의 조직학적으로 완전한 인간 상피의 시험관 형성을 위한 배지 및 방법이 기재되어 있다. 생성된 상피는 단리된 동물 상피 세포 또는 상피 조직으로부터 단리된 기저 스트로마 세포로부터 시험관내에서 성장된다.
오가와(Ogawa) 등의 미국 특허 제 5,942,487호에는 각막 성장을 자극하기 위해 병에 걸린 각막 조직에 적용될 수 있는 줄기세포 인자를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 상기 특허의 발명자들은 각막 줄기 세포가 이동하고 성장하도록 자극된다고 가정하고 있다.
어드밴스드 티슈 사이언시스, 인크.(Advanced Tissue Sciences, Inc.)의 미국 특허 제 5,863,531호에는 스트로마 세포에 의해 다리결합된 간질 공간을 지닌 생체적합성 비-생물질로 구성된 3차원 관형 프레임워크에 부착되어 이를 실질적으로 에워싸는 스트로마 세포에 의해 천연적으로 분비된 결합조직 단백질 및 스트로마 세포를 포함하는, 시험관내에서 제조된 관형 생 스트로마 조직이 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 각막을 포함하는 안구 결함을 복원하는 것을 보조하기 위한 세포, 물질 및 방법을 제공하는 데에 있다.
발명의 개요
본 발명은 안내 또는 안구 스트로마 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 지니도록 분화된 지방 유래 스트로마 세포 또는 줄기세포를 제공한다. 이러한 세포는 눈의 퇴행성 질병 또는 그 밖의 질병의 치료적 처리를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 임의의 병인을 지닌 안내 또는 안구 결함을 치료하기 위해 지방조직 유래 스트로마 세포를 사용하고 배양하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 피하, 유선, 성선, 그물막 또는 임의의 다른 지방조직 부위로부터 유래된 스트로마 세포를 일관되게 정성적 및 정량적으로 유도시켜서, 안내 또는 안구 스트로마 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현시키는 방법 및 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 단리된 지방조직 유래 세포는, 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 안구 유도 물질과 접촉시키는 단계를 포함하여 안구내 스트로마 세포의 하나 이상의 특징을 발현시키는 세포로 분화되도록 유도된다. 이러한 물질은 화학적으로 규정된 세포 배양 배지내에 존재하며, 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 유도시켜서 하나 이상의 안구 세포 마커를 발현시키기에 충분한 농도로 성장 인자, 사이토카인, 화학제, 및/또는 호르몬을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 세포 표현형을 변형시킬 수 있고 임의의 안내 결함의 회복 및 복원을 촉진시키는 경로를 유도시킬 수 있는 단백질을 발현시키도록 유전공학처리된다. 이는 원하는 핵산이 세포내로 도입되게 하는 적합한 조건하에서 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 유전자 전달 벡터에 세포를 노출시킴으로써 달성된다. 또한, 세포는 네이키드 핵산으로 처리되어, 이를 포함하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 원하는 안구 세포의 특징을 발현하도록 유도시키는 대신에 지방 유래 스트로마 세포를 투여하는 것을 포함하여, 숙주의 퇴행성 눈 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 독특한 이점은 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주로부터 직접 단리될 수 있거나 (자가유래 이식), 또 다른 숙주에 의해 공여될 수 있다 (동종 이식)는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 안구내 스트로마 궤양형성 부위를 외과적으로 복원시키기 위해 사용되는 천연 또는 합성 생체적합성 물질로 구성된 3차원 매트릭스내에서 또는 이러한 매트릭스상에서 미분화 상태 또는 분화 상태로 배양된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 수포 누출을 교정함으로써 성공적인 녹내장 수술을 촉진하기 위한 세포의 자가유래 및 동종 이식을 위해 분화없이 직접 사용된다. 이러한 구체예에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는, 바람직하게는 원하는 위치에서 눈에 투여되어, (i) 적합한 사이토카인 및 그 밖의 생물학적 인자의 공동 투여를 통해, 또는 (ii) 숙주에 이미 존재하거나 여기서 유도되는 생체내 인자를 통해 분화되어 진다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 특히 굴절교정/치료용 레이저각막절제술, 군날개의 "공막 노출(bare sclera)" 제거 동안의 복원, 대상 각막증의 외과적 처리, 결막 또는 각막 표면으로부터의 종양, 병변 또는 흉터 조직의 외과적 제거에 의해 유도되는 각막 연무를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인간 질환의 치료를 위한 세포의 자가유래 및 동종 이식을 위해 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 양막 조직과 함께 병에 걸린 눈에 이식된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 병에 걸린 눈에 이식되기 전에 아디포블라스트(adipoblast) 계통의 세포로 분화된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포는 아디포블라스트 계통의 세포로 분화되고, 양막 조직과 함께 병에 걸린 눈에 이식된다.
본 발명의 세포는 세포의 균일한 집단으로서 또는 다른 세포가 안구 유사 세포의 성장 또는 분화를 위한 물질을 분비하는 세포 집단의 일부로서 사용된다.
또한, 본 발명은 환자로부터 지방조직을 단리하기 위한 수단 및 지방조직의 나머지로부터 줄기세포를 분리하기 위한 수단을 포함하는, 지방조직으로부터 줄기세포 또는 스트로마 세포를 단리하기 위한 키트를 고려한다. 또한, 키트는 줄기세포를 분화시키기 위한 배지를 포함하며, 이러한 배지는 세포가 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현하게 하거나 일반적으로 안구발생성이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 지방 유래 세포로부터 조직을 공학처리하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 이러한 조성물은 조직이 분화되고 팽창하게 되도록 생물학적으로 적합한 격자구조와 함께 지방 유래 세포를 포함한다. 따라서, 이러한 방식으로, 눈 유사 조직 또는 전체 장기가 제조된다. 생물학적으로 적합한 격자는 지방 유래된 것 그 자체일 수 있으며, 임의의 인간 단백질, 프로테오글리칸, 당단백질, 히알루로닌, 피브로넥틴 분자, 호르몬, 사이토카인 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 또한, 격자는 글리콜산, 락트산, 프로필 푸마레이트, 카프로락톤, 히알루로난, 히알루론산 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 단량체의 중합체를 포함하거나 이로부터 제조될 수 있다. 또한, 중합체 물질은 단백질, 다당류, 폴리히드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리안하드라이드, 폴리포스파젠, 합성 중합체 또는 이들의 조합물일 수 있다. 또한, 중합체 물질은 세포가 분산되어 있는 중합체 현탁액을 가교시킴으로써 형성된 하이드로겔일 수 있다.
본 발명의 그 밖의 목적 및 특징은 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1은 인간 지방 유래 스트로마 세포의 유동혈구계산 분석을 도시한 것이다. CD9, CD29 (베타 1-인테그린), CD44 (히알루로네이트 수용체), CD49d (알파 4 인테그린), CD55 (붕괴 가속 인자) 및 HLA-ABC (클래스 I 조직적합성 항원)에 대한 대표적인 유동혈구계산 분석이 도시되어 있다. 단일 공여자로부터 단리된 미분화 스트로마 세포를 표시된 항원에 대한 모노클로날 항체 (실선, 각각의 패널의 우측); 이소타입 모노클로날 대조 항체 (점선, 각각의 패널의 좌측)로 염색하였다. 대표적인 공여자수 n은 5이다. 바아는 대조군의 99% 보다 큰 형광 세기를 나타낸다.
도 2는 12일 공동배양에서의 림프계 프로제니터(lymphoid progenitor)를 개략적으로 도시한다. 상당한 비율의 CD34+ 및 CD34- 세포 둘 모두가 CD7 또는 CD10 항원을 발현시켰다 (n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자). 개개의 표현형은 전체 조혈 집단의 하기 비율을 나타내었다: 초기 림프계 프로제니터, 각각 20.2% (CD34+ CD7+) 및 9.5% (CD34+ CD10+); NK/T-세포 프로제니터 (CD34- CD7+), 31.4%; 및 B-세포 프로제니터 (CD34- CD10+), 7.7%.
도 2는 12일 공동배양에서의 림프계 프로제니터(lymphoid progenitor)를 개략적으로 도시한다. 상당한 비율의 CD34+ 및 CD34- 세포 둘 모두가 CD7 또는 CD10 항원을 발현시켰다 (n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자). 개개의 표현형은 전체 조혈 집단의 하기 비율을 나타내었다: 초기 림프계 프로제니터, 각각 20.2% (CD34+ CD7+) 및 9.5% (CD34+ CD10+); NK/T-세포 프로제니터 (CD34- CD7+), 31.4%; 및 B-세포 프로제니터 (CD34- CD10+), 7.7%.
본 발명은 안구 기원의 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 발현시키도록 유도된 지방 유래 스트로마 세포 또는 줄기세포에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 세포는 각막 상피 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 지닌다. 또한, 세포는 안구 스트로마 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 지닌다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 동물 질병, 바람직하게는 인간 질병의 치료, 조직 복원 또는 개선, 및 눈의 퇴행성 질병, 바람직하게는 각막 상피의 교정을 위한 세포 요법용 생성물의 연구, 이식, 및 개발을 위해 성숙한 안구 세포의 유전자형 또는 표현형 특징을 지닌 부분 분화되거나 완전 분화된 기능성 세포 공급원 또는 미분화된 기능성 세포 공급원을 제공한다. 이러한 세포를 생성시키고 사용하는 방법이 또한 포함된다.
I.
정의
"결막"은 눈꺼풀의 안쪽을 대고 공막의 노출 표면을 덮고있는 막을 의미한다.
"각막"은 눈의 섬유층의 전방부를 형성하는 투명한 구조를 의미한다. 이는 5개의 층, 즉, 1) 결막과 연속되는 전방 각막 상피, 2) 전방 경계층 (Bowman 막), 3) 고유질(substantia propria) 또는 스트로마층, 4) 후방 경계층 (Descemet 막), 및 5) 전안방(anterior chamber)의 내피 또는 각피로 구성된다.
"망막"은 안구의 3층중 가장 내부에 위치하며, 초자체를 둘러싸고 후방에서 시신경과 연결되는 막을 의미한다. 이것은 맥락막에 놓여있는 망막시부와 모양체에 놓여있는 망막모양체부, 및 홍채의 후면에 놓여있는 망막홍채부로 나뉜다. 대체적으로, 망막은 외측의 색소상피층 (pars pigmentosa)과 투명한 내층 (pars nervosa)으로 구성되며, 이들은 함께 시부를 구성한다. 눈의 시부는 내부에서 외부의 순서로 다음과 같이 9층으로 구성된다: 1) 내부 경계층; 2) 신경섬유층; 3) 신경절세포층; 4) 내부 망상층; 5) 내부 핵층; 6) 외부 망상층; 7) 외부 핵층; 8) 외부 경계막; 및 9) 막대 원뿔층.
"형질전환 성장 인자 β" (TGFβ)는 23개 aa의 시그널 서열, 256개 aa의 프로(pro)-영역 및 112개 aa의 성숙한 세그먼트로 구성된 55kDa의 391개 아미노산 (aa) 프레프로단백질(preproprotein)이다. 분비 전에, 프로-영역은 퓨린 유사 프로테아제에 의해 RxxR 부위에서 절단된다. 이는 선부착(previously attached) 이황화물 결합된 프로-영역과 비공유결합하여 "잠재 복합체"를 형성하는 글리코실화되지 않은 25kDa의 이황화물 결합된 성숙한 이량체를 생성시킨다. 이러한 복합체가 분비된다. 활성화는 거의 확실하게는 트랜스멤브레인 세린/트레오닌 키나아제를 통해 다양한 조건하에서 세포외부에서 일어나서, 전사 인자의 Smad 패밀리에 의해 매개되는 세포내 시그널 캐스케이드를 개시시킨다.
"염기성 섬유아세포 성장 인자" (bFGF)는 또한 FGF-2로서 알려져 있으며, 세포내 및 세포외 활성 둘 모두를 나타내는 18kDa의 글리코실화되지 않은 폴리펩티드이다. bFGF는 단량체로서 분비된다. 분비된 후, bFGF는 세포 표면 헤파린 설페이트 (HS) 또는 매트릭스 글리코사미노글리칸상에 격리된다. bFGF가 단량체로서 분비된다고 하더라도, 세포 표면 HS는, 후속하여 FGF 수용체를 이량체화시키고 활성화시킬 수 있는, 비공유 측부 대 측부 형태로 단량체 bFGF를 이량체화시키는 것으로 여겨진다.
"혈소판 유래 성장 인자" (PDGF)는 A 및 B로 표시되는 두 개의 유전학적으로 구별되지만 구조적으로 관련된 폴리펩티드 사슬의 30kDa의 동종이량체 또는 이종이량체 조합물이다. 이는 혈청에서 혈소판 유래 섬유아세포 유사분열물질로서 최초로 확인되었다. 후속 실험은 다수의 세포 유형이 PDGF를 분비하고, 사이토카인이 중배엽 계통의 세포 (근육, 뼈, 결합 조직)에 대한 유사분열물질임을 입증하였다.
"혈관 내피 성장 인자" (VEGF)는 내피 세포에 대한 성장 및 생존 인자로서 최초로 확인되었다. 이는 내피 세포 증식을 유도하고, 혈관형성 및 맥관형성을 조절한다. VEGF는 45kDa 동종이량체로서 분비되는 헤파린 결합 당단백질이다. 통상적으로 내피 세포 자체는 아닌 다수의 세포 유형이 VEGF를 분비한다.
"간세포 성장 인자" (HGF)는 또한 산란 인자로서 알려져 있으며, 유사분열, 이동, 침습 및 형태발생을 촉진하는 다기능성 사이토카인이다. HGF-의존성 시그널링은 응집 및 세포 유착을 촉진시킴으로써 인테그린 기능을 조절한다. HGF/SF 유도 효과는 리간드 결합 후에 MET 티로신 키나아제 수용체의 시그널링을 통해 발생한다.
"각질세포 성장 인자" (KGF), 또는 FGF-7은 비교적 상피로 국한되는 표적을 지닌 28kDa의 단일 사슬 분비 당단백질이다. 이 분자는 31개 aa 시그널 서열 및 163개 aa 성숙한 세그먼트를 함유하는 194개 aa 전구체로서 합성된다. 성숙한 성장 인자는 이러한 분자의 분리된 영역을 통해 헤파린 및 이의 수용체 (KGFR)와 결합한다. FGF-7을 발현하는 성체 세포는 섬유아세포, T-세포, 평활근 세포, 및 난소 난포막세포(theca cell)을 포함한다. 배아에 있어서, KGF는 중간엽에 걸친 다수의 발생 단계에서 발견된다.
"인슐린 유사 성장 인자" (IGF), IGF-I 및 IGF-II는 인슐린과 50%의 구조적 상동성을 공유한다. IGF는 세포 증식의 유사분열 자극물질 뿐만 아니라 세포 아폽토시스 경로의 억제물질로서 작용한다. 성장 호르몬 (GH)의 조절하에서, 간은 IGF 생성의 주요 부위이다. IGF-I 수준은 또한 영향 및 발생 단계에 의해 영향을 받는다. IGF의 오토크린 및 파라크린 생성은 성장 조절을 위해 이용가능한 IFG의 수준에 기여한다.
"발생 표현형"은 분화 작용을 통해 특정 물리적 표현형을 획득하는 세포의 잠재성이다.
"호르몬"은 세포에 의해 분비되고 접촉시에 동일한 세포 또는 또 다른 세포의 표현형 변화를 유도하는 임의의 물질이다.
"유전자형"은 분화 경로와 관련된 유전자의 하나 이상의 메신저 RNA 전사체의 발현이다.
"유전자이식"이란 용어는 세포내에 외인성 유전 물질을 포함하는 임의의 동물 또는 세포, 배양물 또는 조직을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 이의 부분을 나타내기 위해 사용된다. 본 발명의 세포에는 DNA가 첨가될 수 있고, 이러한 세포는 그 후 이식, 또는 호르몬, 세포 또는 조직의 시험관내 생성을 위해 사용될 수 있다.
"이식유전자"는 기술에 의해 세포내로 삽입되어, 이러한 세포로부터 발생되는 세포주, 조직 또는 생물체의 게놈의 일부가 되는 (즉, 안정하게 통합되거나 안정한 염색체외 엘리먼트로서 통합됨) DNA의 임의의 조각을 의미한다. 이러한 이식유전자는 세포 또는 이종성 유전자가 도입되는 생물체에 부분 또는 완전 이종성이거나 외래인 유전자를 포함할 수 있거나, 생물체의 내인성 유전자에 동종인 유전자를 나타낼 수 있다. 상기 정의에는 DNA로 전사된 후 게놈내로 포함되는 RNA 서열을 제공함으로써 생성된 이식유전자가 포함된다. "유전자이식"이란 용어는 추가로 게놈이 시험관내 조작 또는 임의의 유전자이식 기술에 의해 변경된 세포, 세포주, 세포 배양물 또는 조직을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 생물체 또는 이의 부분을 포함한다.
II
.
지방-유래 줄기세포 또는
스트로마
세포
지방 유래 줄기세포 또는 "지방-유래 스트로마 세포"는 지방 조직으로부터 유래되는 세포를 나타낸다. "지방"이란 임의의 지방 조직을 의미한다. 지방 조직은 피하, 그물막/내장, 유선, 성선, 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래되는 갈색 또는 백색의 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방은 피하 백색 지방 조직이다. 이러한 세포는 1차 세포 배양물 또는 불멸화된 세포주를 포함할 수 있다. 지방 조직은 지방 조직을 지닌 임의의 생물체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 포유류, 가장 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. 지방 조직의 편리한 공급원은 지방흡입술로부터 수득되지만, 지방 조직 공급원 또는 지방 조직을 단리하는 방법은 본 발명에 중요한 것이 아니다.
성인 수질외 지방 조직 유래 스트로마 세포는 환자에게 최소의 위험 또는 불쾌감을 주면서 일상적으로 수거될 수 있는 스트로마 줄기 세포 공급원을 나타낸다. 병리학적 증거는 지방 유래 스트로마 세포가 다수의 계통 경로로 따라서 분화할 수 있음을 시사한다. 지방 조직은 용이하게 입수할 수 있으며, 다수의 개체에 풍부하게 존재한다. 비만은 미국에서 유행 비율을 지닌 질환이며, 성인의 50% 이상이 신장을 기준으로 한 권장 BMI를 초과하고 있다.
지방세포가 보충가능한 세포 집단이라는 것은 널리 입증되어 있다. 지방흡입 또는 다른 시술에 의한 외과적 제거 후에도, 개체에서 시간이 지남에 따라 지방세포가 재발하는 것이 흔히 관찰된다. 이는 지방 조직이 자체 신생성일 수 있는 스트로마 줄기세포를 함유함을 시사한다.
지방 조직은 조직 공학처리 적용을 위한 다수의 실용적인 이점을 제공한다. 첫째, 지방 조직은 풍부하다. 둘째, 환자에게 최소의 위험을 나타내는 수거 방법을 이용할 수 있다. 셋째, 지방 조직은 보충가능하다. 백색의 스트로마 세포가 골수 핵형성 세포 집단의 0.01% 미만이지만, 지방 조직 그램 당 8.6 x 104개 이하의 스트로마 세포가 존재한다 (Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319). 2 내지 4주에 걸친 생체외 증식은 지방 조직 0.5 킬로그램으로부터 500만개 이하의 스트로마 세포를 생성시킨다. 이러한 세포는 바로 사용될 수 있거나 장래의 자가 또는 동종 적용을 위해 저온보존될 수 있다.
또한, 지방 유래 스트로마 세포는 다수의 유착 및 표면 단백질을 발현한다. 이들 단백질로는 세포 표면 마커, 예를 들어 CD9, CD29 (인테그린 베타 1), CD44 (히알루로네이트 수용체), CD49d,e (인테그린 알파 4, 5), CD54 (ICAM1), CD55 (붕괴 가속 인자), CD105 (엔도글린), CD106 (VCAM-1), CD166 (ALCAM) 및 HLA-ABC (클래스 I 조직적합성 항원); 및 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 6, 7, 8, 11; 대식구-콜로니 자극 인자; GM-콜로니 자극 인자; 과립구-콜로니 자극 인자; 백혈병 억제 인자; 줄기세포 인자 및 뼈 형태발생 단백질이 있다. 이들 단백질의 대부분은 조혈 지원 기능을 하는 잠재력을 지니며, 이들 모두는 골수 스트로마 세포에 의해 공유된다.
인간 지방조직 유래 세포를 단리하고, 증식시키고, 분화시키는 방법은 보고되어 있다 (참조: Burris et al 1999, Mol Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jan 18;290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al 2001, Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517). 지방조직 유래 스트로마 세포는 콜라게나제 분해 및 차별적 원심분리에 의해 분쇄된 인간 지방조직으로부터 수득된다 [Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989, J Clin Invest 84:1663-1670; Rodbell et al 1966, . J Biol Chem 241:130-139]. 그 밖의 문헌은 인간 지방조직 유래 스트로마 세포가 지방세포, 연골세포 및 골모세포 계통 경로를 따라서 분화될 수 있음을 입증하였다 [Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jan 18;290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal of Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al, 2001, Tissue Eng. 2001 Dec;7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & Diff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al 2001, Tissue Eng. 7:211-228].
인간 지방조직 유래 성체 스트로마 세포는 환자에게 최소의 위험 및 불쾌감을 주면서 일상적으로 수거될 수 있는 성체 스트로마 세포 공급원을 나타낼 수 있다. 이러한 세포는 생체외에서 증식될 수 있고, 독특한 계통 경로를 따라서 분화될 수 있고, 유전공학처리될 수 있으며, 자가 또는 동종 이식물로서 개체내로 재도입될 수 있다.
유니버시티 오브 피츠버그(University of Pittsburgh) 및 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아(The Regents of the University of California)의 WO 00/53795 및 유니버시티 오브 피츠버그의 미국 특허 출원 제 2002/0076400호에는 지방세포 및 적혈구가 실질적으로 없는 지방 유래 줄기세포 및 격자 및 결합조직 줄기세포의 클론 집단이 기재되어 있다. 이러한 세포는 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 분화된 조직 및 구조를 생성시키기 위해 단독으로 또는 생물학적으로 적합한 조성물내에서 사용될 수 있다. 또한, 이러한 세포는 호르몬을 생성시키고 그 밖의 세포 집단의 성장 및 증식을 지원하기 위한 조절된 배양배지를 제공하기 위해 증식되고 배양될 수 있다. 또 다른 양태에 있어서, 상기 간행물에는 지방조직으로부터의 세포외 매트릭스 물질을 포함하는, 세포가 실질적으로 없는 지질 유래 격자가 기재되어 있다. 이러한 격자는 세포가 생체내 또는 시험관내에서 성장하여 원기(anlagen) 또는 성숙한 조직 또는 구조로 분화되는 것을 촉진하는 기질로서 사용될 수 있다. 상기 문헌 중 어느 것에도 안와내 스트로마 세포의 하나 이상의 표현형 또는 유전자형 특징을 발현하도록 유도된 지방조직 유래 스트로마 세포가 기재되어 있지 않다.
아르테셀 사이언시스(Artecel Sciences)의 미국 특허 제 6,391,297호에는 생체내에서 뼈를 복원하고 뼈 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 골모세포의 하나 이상의 특징을 나타내도록 분화된 단리된 인간 지방조직 유래 스트로마 세포의 조성물이 기재되어 있다. 이러한 지방 유래 골모세포 유사 세포는 임의로 유전학적으로 변형되거나 매트릭스와 조합될 수 있다.
바이오홀딩즈 인터내셔널(BioHoldings International)의 미국 특허 제 6,426,222호에는 글루코코르티코이드를 함유함에 틀림없는 액상 영양배지에서 지방조직 세포를 인큐베이션시킴으로써 인간 골수외 지방조직으로부터 골모세포의 분화를 유도시키는 방법이 기재되어 있다.
할보르센(Halvorsen) 등이 발명자로서 게재된 WO 00/44882 및 미국 특허 제 6,153,432호에는 지방조직으로부터 단리된 인간 지방전구세포(preadipocyte)를 단리된 초기 지방세포에서 관찰되는 특징과 유사한 생화학적, 유전학적 및 생리학적 특징을 함유하는 지방세포로 분화시키기 위한 방법 및 조성물이 기재되어 있다.
아르테셀 사이언시스의 WO 01/62901 및 공개 미국 특허 출원 제 2001/0033834호에는 신경 대교세포 조혈 프로제니터 또는 간세포의 하나 이상의 표현형 특징을 발현하도록 유도시킨 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포가 기재되어 있다. 또한, 지방세포 표현형 마커가 존재하지 않도록 분화된 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포가 기재되어 있다.
아르테셀 사이언시스의 미국 특허 제 6,429,013호에는 연골세포의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도시킨 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포에 대한 조성물이 기재되어 있다. 또한, 이러한 세포를 분화시키는 방법이 기재되어 있다.
피터슨(Peterson) 등의 미국 특허 제 6,200,606호에는 뼈 또는 연골을 발생시킬 수 있는 잠재력을 지닌 전구 세포가 말초혈, 골수 및 지방조직을 포함하는 다양한 조혈 및 비-조혈 조직으로부터 단리될 수 있는 것으로 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 유용한 지방조직 유래 스트로마 세포는 유니버시티 오브 피츠버그 등의 WO 00/53795에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 단리된다. 한 가지 바람직한 방법에 있어서, 지방조직은 포유류 피검체, 바람직하게는 인간 피검체로부터 단리된다. 지방조직의 바람직한 공급원은 그물막 지방이다. 인간의 경우, 지방은 전형적으로 지방흡입에 의해 단리된다. 본 발명의 세포가 인간 피검체내로 이식되는 경우, 지방조직은 자가 이식편을 제공하기 위해 동일한 피검체로부터 단리되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 이식된 세포는 동종이다.
제한적이지 않은 예로서, 지방조직 유래 스트로마 세포를 단리하는 한 가지 방법에 있어서, 지방조직을 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.2%, 가장 바람직하게는 0.1% 농도의 콜라게나제, 0.01 내지 0.5%, 바람직하게는 0.04 내지 0.04%, 가장 바람직하게는 0.2% 농도의 트립신으로 25 내지 50℃, 바람직하게는 33 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 10분 내지 3시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간, 가장 바람직하게는 45분간 처리한다. 세포는 20 내지 800 마이크론, 더욱 바람직하게는 40 내지 400 마이크론, 가장 바람직하게는 70 마이크론의 나일론 또는 치즈클로쓰(cheesecloth) 메시 필터를 통과시킨다. 그 후, 세포를 배지에서 직접 또는 피콜(Ficoll) 또는 퍼콜(Percoll) 또는 그 밖의 미립자 구배상에서 차별적 원심분리에 적용시킨다. 세포는 4 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃, 가장 바람직하게는 25℃의 온도에서 1분 내지 1시간, 더욱 바람직하게는 2분 내지 15분, 가장 바람직하게는 5분간 100 내지 3000× g, 더욱 바람직하게는 200 내지 1500× g, 가장 바람직하게는 500× g의 속도로 원심분리할 수 있다.
지방 유래 스트로마 세포를 단리하는 또 다른 방법에 있어서, 카츠(Katz) 등의 미국 특허 제 5,786,207호에 기재된 바와 같이 기계적 시스템이 사용된다. 지방 조직 샘플을 자동화 기기내로 도입시키고, 이를 세척 페이즈(phase)와 해리 페이즈에 적용시키기 위한 시스템이 사용되며, 해리 페이즈에서 조직은 생성된 세포 현탁액이 센트리퓨지-레디(centrifuge-ready) 리셉터클내로 수집되도록 교반되고 회전된다. 이러한 방식으로, 지방 유래 세포를 조직 샘플로부터 단리하여, 원하는 세포의 세포 무결성을 보존한다.
III . 안구 세포의 하나 이상의 특징을 나타내도록 하기 위한 지방 유래 스 트로마 세포의 유도
본 발명은 안구 세포의 하나 이상의 표현형 또는 유전자형 특징을 발현하는 세포를 형성하도록 유도하기 위해 지방 유래 스트로마 세포를 처리하는 것을 포함한다. 지방 유래 스트로마 세포의 분화를 유도시키는 방법의 제한적이지 않은 예로는 1) 세포 배지의 사용; 2) 지원 세포의 사용; 3) 미분화 세포의 환자의 조직내로의 직접 이식; 및 4) 세포 공학처리 기술이 있다.
A) 세포 배지 유도
본 발명이 어떠한 조작 이론에 의해 결부되는 것은 아니나, 지방 유래 스트로마 세포에 대한, 2차원 또는 3차원 미소환경에서의 혈청, 배아 추출물, 양막 조직/양수, 정제되거나 재조합된 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및/또는 화학 작용제의 조합을 함유하는 배지로의 처리가 목적하는 분화를 유도할 것으로 여겨진다.
보다 구체적으로, 본 발명은 지방 유래 세포를 안구 세포의 유전자형 또는 표현형 특성을 갖는 세포로 분화시키는 방법으로서, 단리된 지방 유래 성체의 줄기 세포를 약 1,000 내지 약 500,000세포/cm2의 밀도를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 목적하는 밀도로 플레이팅 시키는 단계; 및 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 혈청 인자, 핵 호르몬 수용체 리간드 또는 임의의 다른 정의된 화학 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 화학적으로 규정된 배지에서 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일면에서, 본 발명의 분화된 세포는 각막 상피 형성의 증거가 관찰될 때까지 배양물 중에서 성장한다. 이후, 상기 각막 상피를 함유하는 배지는, 각막 상피 기능을 표시해 줄 수 있는 마커의 존재 여부에 대해 당해 기술자들에게 공지된 표준 생화학 분석 기술에 의해 분석된다. 이후, 각막 상피의 층은 조직 생성 또는 재생의 목적으로 숙주 조직에 생착된다.
본 발명의 방법에 유용한 기초 배지는 배지 199, CMRL1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, 윌리암 G, 뉴만 & 티텔(Neuman & Tytell), 히구치(Higuchi), MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함하는 것 중에서도 Neurobasal™(우태아 혈청 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF))로 보충되거나 보충되지 않음), N2, B27, 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM(우혈청 알부민 비함유, F10(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(피튼-잭슨(Fitton-Jackson) 변형이 있거나 없는), 기초 배지 이글(Basal Medium Eagle)(얼 염 염기가 첨가된 BME), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(혈정 부재의 DMEM), 야만(Yamane), IMEM-20, 글라스고우 변형 이글 배지(Glasgow Modification Eagle Medium)(GMEM), 라비보비츠 L-15 배지(Leibovitz L-15 Medium), 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A Medium), 배지 M199(얼 염기(Earle's salt base)를 갖는 M199E), 배지 M199(행크 염 염기(Hank's salt base)를 갖는 M199H), 최소 필수 배지 이글(얼 염기를 갖는 MEM-E), 최소 필수 배지 이글(행크 염기를 갖는 MEM-H) 및 최소 필수 배지 이글(비필수 아미노산을 갖는 MEM-NAA)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 배지 및 그 밖의 유용한 배지는 특히 GIBCO(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재) 및 바이올로지컬 인더스트리스(Biological Industries)(이스라엘 베트 하에멕 소재)로부터 구입할 수 있다. 이러한 다수의 배지는 문헌(Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, edited by William B. Jakoby and Ira H. Pastan, published by Academic Press, Inc.)에 요약되어 있다.
각막 상피 세포를 배양하기 위한 바람직한 배지는 당해 공지되어 있으며, 윌리, 쥬니어(Wille, Jr.)의 미국 특허 제 5,912,175호에 기재된 배지가 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 유용한 배지는 소 또는 다른 종 기원의 태아혈청을 1 내지 약 30%, 바람직하게는 약 5% 내지 15%, 매우 바람직하게는 약 10%의 농도로 함유할 것이다. 닭 또는 그 밖의 종 기원의 배아 추출물은 약 1 내지 30%, 바람직하게는 약 5% 내지 15%, 매우 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재한다.
본 발명에 유용한 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및 그 밖의 특정 인자로는 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준의 농도의 생장 호르몬, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 인터류킨 3, 인터류킨 6, 인터류킨 7, 대식구 콜로니 자극 인지, c-키트 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테제린(osteoprotegerin) 리간드, 인슐린, 인슐린형 성장 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, CNTF(cilary neurotrophic factor), 혈소판 유래 성장 인자, 및 골 형태발생 단백질을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 농도에서, 본 발명의 방법에 유용한 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬은 콜로니 형성 유닛(CFU) 검정으로 혈구(림프성, 적혈구성, 골수성 또는 혈소판 계통)의 형성율을 100% 까지 유도할 수 있다[참조: Moore et al.(1973) J. Natl. Cancer Inst. 50:603-623; Lee et al. (1989) J. Immuno. 142:3875-3883; Medina et al.(2993) J. Exp. Med. 178:1507-1515].
또한, 배지를 배양하기 위해 추가 성분이 첨가될 수 있는 것으로 인지된다. 이러한 추가 성분으로는 항생제, 알부민, 아미노산 및 세포 배양에 당해 공지된 그 밖의 성분을 포함한다. 추가로, 분화 과정을 증진시키기 위해 성분들이 첨가될 수 있다. "화학 작용제"라 함은 포지티브 대조표준에 대해 25 내지 50% 만큼 지방 유래 스트로마 세포의 분화를 유도하는, 스테로이드계, 레티노이드계, 및 그 밖의 화합물 또는 작용제를 의미한다.
상기 기술된 세포 배지 조건은 단일 타입 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시키는 세포를 생성시키는 것으로 인지된다. 이러한 특정 세포 타입은 당업자들에게 공지된 임의의 수단에 의해 단리된다. 분화된 세포에 의해 발현된 유전자형 또는 표현형 특성을 이용하는 수단이 특히 유용하다. 하기 기재된 바와 같은 목적하는 세포의 표현형 마커는 당해 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌에 다수 개시되어 있다. 추가의 표현형 마커가 계속해서 개시되고 있으며, 또는 과도한 실험 없이도 확인될 수 있다. 이러한 임의의 마커는, 지방 유래 성체 줄기 세포가 분화된 상태로 유도되었는 지를 확인하는데 사용된다. 계통 특이적 표현형 특성에는 세포 표면 단백질, 세포골격 단백질, 세포 형태, 및/또는 분비 생성물이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 분화된 각막 상피 세포는 형질전환 성장 인자 β1 및 β2(TGFβ), 인슐린형 성장 인자(IGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 간 성장 인자(HGF), 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 대한 수용체를 합성한다[참조: Kruse & Volcker, 1997, Curr Opin Opthalmol; 8(4): 46-54]. 당해 통상의 기술자는 공지된 열량측정법, 형광법, 면역화학법, 중합효소 연쇄반응 방법, 화학적 또는 방사화학적 방법이 계통 특이적 마커의 존재 또는 부재를 용이하게 확인하는 것을 인지할 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분화를 유도할 수 있는 배지내에서 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시키도록 유도될 수 있는 탈분화 단리된 지방 유래 성체 줄기 세포를 제공한다. 탈분화된 지방 유래 성체 줄기 세포는 성숙된 지방세포 마커의 부재에 의해 확인된다.
B) 지방 유래
스트로마
세포의 분화를
촉진시키기
위한 지지 세포의 사용
본 발명의 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 지방 유래 스트로마 세포의 분화를 촉진시키는 데 사용된다. 따라서, 본 발명의 지방 유래 세포는 단리되어 세포 집단 내에서 배양되며, 매우 바람직하게는, 이러한 세포 집단은 정의된 집단이다. 세포 집단은 이종성이며, 본 발명의 세포에 대한 인자를 공급하기 위한 지지 세포를 포함한다. 지지 세포는 목적하는 세포의 분화, 성장 및 유지를 촉진시키는 그 밖의 세포 타입을 포함한다. 비제한 실시예로서, 각막 상피 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시키는 지방 유래 스트로마 세포가 요망되는 경우, 지방 유래 스트로마 세포는 먼저 상기 기술된 임의의 수단에 의해 먼저 단리되고, 그 밖의 안구 또는 비안구 지지 세포의 존재 하에서 배양물 중에서 성장한다. 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 배양된 각막 조직으로부터 채취된 이러한 세포 타입의 1차 배양물로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 부동화된 세포주로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서, 지지 세포는 자가 이식에 의해 얻어진다. 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 동종이계적으로 얻어진다.
또한, 본 발명에 의해 목적하는 세포의 분화를 지지하는데 사용되는 세포는 유전공학처리되어 지지 세포가 될 수 있음이 고려된다. 상기 세포는 하기 기재되거나 당업자들에게 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 외인성 유전자를 발현시키거나 내인성 유전자의 발현을 억제하도록 유전적으로 변형된다. 본 발명의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법 중 하나는 핵산이 세포 내에서 발현되는 방식으로 핵산이 세포의 게놈에 혼입되도록 세포를 네이키드 핵산 단편(즉, DNA 또는 RNA)에 노출시키는 것을 포함한다. 다르게는, 본 발명의 세포는, 이식유전자가 세포내에서 발현되기에 적합한 조건 하에서 핵산이 세포에 도입되도록, 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 유전자 전달 벡터에 노출된다.
C) 이식
또 다른 일면에서, 본 발명은 자가이식 및 이종 이식에 유용한 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시키는 지방 유래 스트로마 세포 및 분화된 세포를 제공한다. 바람직하게는, 피검체는 포유동물, 매우 바람직하게는, 피검체는 인간이다.
따라서, 또 다른 일면에서, 본 발명은 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 피검체에 대해 발현시킬 수 있는 분화된 세포를 제공하기 위한 방법으로서,
a) 지방 조직 유래 스트로마 세포를 단리하는 단계,
b) 상기 세포를 세포의 분화에 적합한 배지에서 플레이팅시키고 인큐베이션시키는 단계 및
c) 분화된 세포를 피검체에 도입시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 비분화된 지방 유래 스트로마 세포를 피검체에 제공하기 위한 방법으로서,
a) 지방 조직 유래 스트로마 세포를 단리하는 단계; 및
b) 비분화된 세포를 피검체에 도입시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서는, 비분화된 지방 유래 스트로마 세포가 피검체에 도입되는 경우, 일 특정 구체예에서는 질병이 있는 눈에 직접 도입되는 것이 고려된다. 본 발명의 또 다른 일면에서, 비분화된 지방 유래 스트로마 세포는 스트로마 세포의 생체내 분화에 적합한 환경을 제공하는, 상기 기술된 바와 같은 임의의 세포 또는 배지 또는 분화된 인자와 함께 도입된다. 예를 들어, 일 특정 구체예에서 이러한 지지 세포는 양막 세포이다. 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 배양된 각막 조직으로부터 취한 상기 세포 타입의 1차 배양물로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 지지 세포는 부동화된 세포주로부터 유도된다. 일부 구체예에서, 지지 세포는 자가이식에 의해 얻어진다. 다른 구체예에서, 지지 세포는 동종이계적으로 얻어진다.
또 다른 구체예에서, 탈분화된 지방 유래 세포가 조직 회복, 재생, 재구성 또는 증진을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 치료적 용도에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제공된다. 지방 유래 세포는 본원에서 참고문헌으로 인용되는 미국 특허 제 6,153,432호에 기재된 방법에 의해 배양되어 세포를 탈분화시켜, 탈분화된 성체 줄기 세포가 유도되어 이후 지방 조직 유래 세포 이외의 세포의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시킨다. 탈분화된 지방 유래 세포는 목적하는 단백질 또는 펩티드를 생성하기 위해 비내인성 유전자 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 탈분화된 지방 유래 세포는 또 다른 구체예에서 목적하는 치료 목적을 위해 2차원 또는 3차원 매트릭스의 숙주에 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 탈분화된 세포는 환자 자신의 세포로부터 자가이식에 의해 얻어진다. 다르게는, 탈분화된 세포는 동종이계적으로 얻어진다.
D) 본 발명의 지방 유래 세포의 유전자 조작
줄기 세포 및 이의 후손은 유전자 치료에 중요한 목표이며, 이 경우, 삽입된 유전자는 줄기 세포가 이식된 개체의 건강을 증진시킨다.
또 다른 구체예에서, 안구 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특성을 발현시키는 지방 조직 유래 세포는 외인성 유전자를 발현시키거나 내인성 유전자의 발현을 억제하기 위해 유전적으로 변형된다. 본 발명은 이러한 세포 및 집단을 유전적으로 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법 중 하나는 핵산이 세포의 게놈에 혼입되어 핵산이 세포내에서 발현되도록 세포를 네이키드 핵산 단편(즉, DNA 또는 RNA)에 노출시키는 것을 포함한다.
다르게는, 본 발명의 세포는 이식유전자를 포함하는 핵산을 포함하는 유전자 전달 벡터에 노출되므로써 이식유전자가 세포내에서 발현되기에 적합한 조건 하에서 핵산이 세포로 도입된다. 이식유전자는 적합한 프로모터에 조작가능하게 결합된 코딩 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 카세트일 수 있다. 이러한 코딩 폴리누클레오티드는 단백질을 엔코딩할 수 있거나, 생물학적으로 활성체 RNA(예컨대, 안티센스 RNA 또는 리보자임)을 엔코딩할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 코딩 폴리누클레오티드는 독소에 내성을 부여하는 유전자, 호르몬, 사이토카인, 세포 표면 결합된 세포내 신호 부분(예컨대, 세포 부착 분자, 수용체 등), 내인성 호르몬의 성장 또는 분비 촉진 인자, 펩티드 또는 그 밖의 인자, 또는 기타 세포 생성물을 엔코딩할 수 있다. 정해진 이식유전자를 전달하기 위해 유전자 전달 기술을 사용하는 것이 요망되는 경우, 이식유전자의 서열은 알려져 있을 것이다.
발현 카세트내에서, 상기 코딩 폴리펩티드는 적합한 프로모터에 조작가능하게 연결된다. 적합한 프로모터의 예로는 원핵 프로모터 및 바이러스 프로모터(예컨대, 레트로바이러스 프로모터, 단순포진 프로모터, 시토메갈로바이러스 프로모터)가 포함된다. 그 밖의 적합한 프로모터는 증강제, 구성적으로 활성체 프로모터, 신호 특이적 프로모터 및 조직 특이적 프로모터와 같은 진핵 프로모터이다. 미리 정해진 세포 내용물에서 유전자 발현을 일으키기에 적합한 적당한 프로모터를 선택하는 것은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 발현 카세트는 하나 이상의 코딩 폴리누클레오티드를 포함할 수 있으며, 요망에 따라 다른 요소(예컨대, 폴리-A 서열, 전사 조절 요소 등)를 포함할 수 있다.
이식유전자를 함유하는 발현 카세트는 이식유전자를 세포에 전달하기에 적합한 유전자 벡터에 도입되어야 한다. 요망되는 용도 적용에 따라, 임의의 이러한 벡터는 플라스미드, 네이키드 DNA 또는 바이러스와 같은 세포를 유전적으로 변형시키는데 사용될 수 있다. 사용되는 벡터내에서 요망되는 발현 카세트를 구성하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 당해 널리 공지되어 있으며, 직접 클로닝, 상동성 재조합 등과 같은 방법이 포함된다. 당해 기술자들은 벡터의 선택이 대체적으로 벡터를 세포에 도입시키는 데 사용되는 방법을 결정할 것임을 이해할 것이다.
이후, 유전적으로 변형된 세포는 이식유전자가 세포내 발현되기 위한 조건 하에서 여러 방법에 의해 유기체내 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이식유전자는 TGFβ와 같은 성장 인자에 대해 엔코딩할 수 있다. 이후, TGFβ에 대한 이식유전자를 함유하는 세포는 질병이 있는 인간 또는 그 밖의 포유 동물의 눈에 도입될 수 있다.
다르게는, 외인성 외래물질 또는 상동성 핵산은 당해 기술자들에게 익숙한 여러 다른 기술에 의해 본 발명의 세포에 전달된다. 따라서, 핵산은 전기영동, 칼슘 포스페이트, 미소주입, 리포펙션(lipofection), 레트로- 또는 그 밖의 바이러스 또는 미생물 벡터, 또는 당해 기술자들에게 공지된 그 밖의 수단을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 방법에 의해 전달된다.
E) 세포 특성화
형성된 분화된 세포의 "특성화"에 의해 스트로마 세포의 특정 최종 분화된 상태로의 계통 이행을 표시하는 표면 및 세포내 단백질, 유전자 및/또는 그 밖의 마커의 확인이 의도된다. 이러한 방법은 (a) 유동혈구계산 방법을 사용하는 것을 포함하는, 제 2 형광 태그(tag)를 사용하여 연결된 단백질 특이적 단일클론성 항체를 사용하는 면역형광 방법에 의한 세포 표면 단백질의 검출; (b) 유동혈구계산 방법을 사용하는 것을 포함하는, 제 2 형광 태그를 사용하여 연결된 단백질 특이적 단일클론성 항체를 사용하는 면역형광 방법에 의한 세포내 단백질의 검출; 및 (c) 중합효소 사슬 반응, 제자리 혼성화 반응 및/또는 노던 블롯 분석에 의한 세포 유전자의 검출을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 최종 분화된 세포는 특정 최종 분화된 상태로의 스트로마 세포의 계통 이행을 나타내는 표면 및 세포내 단백질, 유전자 및/또는 그 밖의 마커를 확인하므로써 특성화될 수 있다. 이들 방법은 (a) 알칼리 포스파타아제, CD44, CD146, 인테그린 베타 1 또는 오스테오폰틴과 같은 지방 유래 스트로마 세포 표면 단백질의 유동혈구계산 방법 또는 제자리 면역염색과 같은 면역형광 검정에 의한 세포 표면 단백질의 검출(Gronthos et al. 1994 Blood 84:4164-4173), (b) 특이적 단일클론성 항체를 사용하여 지방 조직 유래 스트로마 세포의 유동혈구계산 방법 또는 제자리 면역염색화와 같은 면역형광법에 의한 세포내 단백질의 검출; 및 (c) 중합효소 사슬 반응, 제자리 혼성화반응 및/또는 그 밖의 블롯 검정에 의한, TGFβ1 및 β2와 같은 각막 상피 세포, IGF, bFGF 및 혈관계 상피 성장 인자(VEGF)에 의해 생성된 것들과 같은 계통 선택적 mRNA의 발현의 검출이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다[참조: (Gimble et al. 1989 Blood 74: 303-311].)
F) 치료제로서 본 발명의 세포의 용도
매우 바람직하게는, 본 발명의 세포 및 집단은 치료제로서 사용된다. 일 구체예에서, 지방 유래 스트로마 세포가 눈, 바람직하게는 요망되는 위치에 투여되어 (i) 적합한 사이토카인 및 그 밖의 생물학적 인자의 동시 투여를 통해, 또는 (ii) 숙주내 이미 존재하거나 유도되는 생체내 인자를 통해 분화된다. 일반적으로, 이러한 방법은 이식 또는 생착 전에 그라프트로서 시험관내로, 또는 동물에 직접 생체내로 목적하는 조직 또는 데폿(depot)에 세포를 전달하는 것을 포함한다. 세포는 임의의 적합한 방법에 의해 요망되는 조직에 전달되며, 이러한 방법은 일반적으로 조직 타입에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 세포는, 세포를 함유하는 배지로 그라프트를 배씽(bathing)하거나, 이러한 배지에 주입하므로써 그라프트로 전달된다. 다르게는, 이러한 세포는 조직내 요망되는 부위 상에서 시딩(seeding)되어 집단을 형성한다. 세포는 예를 들어, 카테테르, 투관침, 캐뉼라 또는 세포로시딩된 스텐트(stent) 등과 같은 당업자들에게 공지된 기구를 사용하여 생체내 부위에 전달될 수 있다.
본 발명의 분화되거나 분화되지 않은 지방 유래 스트로마 세포는 여러 질병의 치료에 사용된다. 이들 세포는 무홍채증 또는 홍채의 부재; 에리트로케라토더미아(erythrokeratodermia) 또는 피부의 발적 및 다발성 내분비계 결핍증; 화학적 손상; 열손상; 콘택즈 렌즈 각막병증 및 반복성 사지 수술 또는 사지 기능부전을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌, 각막 질환을 치료하는데 사용된다. 추가로, 본 발명의 세포는 각막의 일부 제거를 포함하는 엑시머(PRK) 또는 라식(LASIK)과 같은 수술 과정 후 각막을 재생하는데 사용된다. 상기 과정의 회복은, 종종 동물 모델에서 본 발명의 세포 및 절차를 사용하므로써 방지되는 알파 평활근 액틴(α-SMA)를 발현시키는 근섬유아세포성 세포의 출현에 의해 특징되는 수술후 전"스크로마 연무"를 초래한다. 치료되어야 하는 질병 상태는 바이러스 또는 몇몇 다른 감염성 작용제에 의한 감염 또는 자가면역 기능장애의 결과일 수 있다.
IV
. 조직 공학처리
본원에서 기재된 세포는 조직 조작에 사용될 수 있다. 본 발명은 목적하는 물질로 증식 및 분화에 충분한 조건 하에서 본 발명의 세포를 유지시키는 것을 포함하여 동물 물질을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 물질은 예를 들어, 눈의 일부를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본원에서 기술된 세포는 하기 문헌에 개시된 기술을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 임의의 공지된 조직 조작 기술과 조합하여 사용된다[참조: U.S. Patent Nos. 5,902,741 and 5,863,531 to Advanced Tissue Sciences, Inc.; U.S. Patent No, 6,139,574, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,759,830, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,741,685, Vacanti,; U.S. Patent No. 5,736,372, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,804,178, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,770, 417, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,770,193, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,709,854, Griffith-Cima et al.; U.S. Patent No. 5,516,532, Atala et al.; U.S. Patent No. 5,855,610, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,041,138, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 6,027,744, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 6,123,727, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,536,656, Kemp et al.; U.S. Patent No. 5,144,016, Skjak-Braek et al.; U.S. Patent No. 5,944,754, Vacanti; U.S. Patent No. 5,723,331, Tubo et al.; and U.S. Patent No. 6,143,501, Sittinger et al.].
이러한 구조를 생성하기 위해, 세포 및 집단은 증식시키고 분화시키기에 적합한 조건하에서 유지되어 기관을 형성한다. 이는 세포 및 집단을 동물의 일반적으로 새로운 물질이 요망되는 부위에 전달하므로써 달성된다. 따라서, 본 발명은 세포가 눈의 일부와 같은 조직에 이식되는 동물내 이러한 조직의 재생을 용이하게 할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 세포는 시험관내에서 조직으로 분화되고 증식되도록 유도된다. 이와 같이, 세포는 단독으로 투여되거나 세포의 혼합물로 투여되거나, 다르게는 조직 전개를 유도하는 3차원 구조물로의 형성을 용이하게 하는 기질 상에서 배양될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세포는 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것과 같은 생적합성 격자 상에서 배양되거나 시딩될 수 있다. 이러한 격자는 조직 타입의 형성을 용이하게 하기 위한 목적하는 형태로 성형될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 세포 및 집단 및 생물학적으로 적합한 격자를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 격자는 일반적으로 100㎛ 내지 약 300㎛ 정도의 공간이 있는 메쉬 또는 스펀지로서 섬유를 갖는 중합체 물질로부터 형성될 수 있다. 이러한 구조는 세포가 성장하고 증식할 수 있는 충분한 면적을 제공한다. 바람직하게는, 격자는 시간이 경과에 따라 생분해되기 때문에, 진행됨에 따라 동물 물질로 흡수될 수 있다. 적합한 중합체 또는 공중합체 격자는 글리콜산, 락트산, 프로필 푸마레이트, 카프롤락탐 등과 같은 단량체를 사용하여 제조된다. 그 밖의 격자는 단백질, 폴리사카라이드, 폴리히드록시 산, 폴리오르쏘에스테르, 다가무수물, 폴리포스포젠, 또는 합성 중합체, 특히 생분해성 중합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 격자는 경우에 따라 성장 인자, 사이토카인, 모르포겐(예컨대, 레티노산 등), 목적하는 세포외 매트릭스 물질(예컨대, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 등) 또는 그 밖의 물질(예컨대, DNA, 바이러스, 그 밖의 세포 타입 등)을 포함할 수 있다.
조성물을 형성하기 위해, 세포는 격자에 도입되어 격자내 간극에 침투한다. 예를 들어, 매트릭스가 세포를 함유하는 용액 또는 서스펜션으로 젖셔질 수 있거나, 세포 용액 또는 현탁액이 매트릭스에 주입되거나 주사될 수 있다. 바람직하게는, 중합체를 포함하고, 분산된 본 발명의 세포를 갖는 현탁액의 가교에 의해 형성된 하이드로겔이 사용된다. 이러한 형성 방법은 세포가 격자를 통해 분산되도록 하여 세포에 의한 격자의 침투를 훨씬 더 용이하게 한다. 상기 조성물이 또한 특히 격자내 본 발명의 세포의 유도를 증강시키거나 격자내 호르몬의 생성을 촉진시키기 위해 바람직한 표현형 또는 이의 전구체의 성숙 세포를 포함할 수 있음은 물론이다.
당업자들은, 조성물로의 내포에 적합한 격자가 적합한 공급원, 예를 들어 매트리겔로부터 유도될 수 있으며, 유도될 수 있으며, 적합한 격자에 대한 상업용 공급원을 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 또 다른 적합한 격자는 지방 조직의 무세포 부분, 예를 들어 사실상 세포가 결핍된 지방 조직 세포외 매트릭스로부터 유도된다. 일반적으로 이러한 지방 유래 격자는 프로테오글리칸, 글리코단백질, 히알루로닌, 피브로넥틴, 콜라겐 등과 같은 단백질을 포함하며, 이들 모두는 세포 성장을 위한 탁월한 기질로서 작용한다. 추가로, 이러한 지방 유래 격자는 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함할 수 있다. 당업자들은 본원의 참고 문헌으로 인용되는 WO 00/53795호(출원인이 유니버시티 오브 피츠버그임)에 기술되어 있는 바와 같은 지방 유래 격자를 단리시키는 방법을 인지하고 있을 것이다.
본 발명의 세포, 집단, 격자 및 조성물은 조직 조작 및 재생에 사용된다. 따라서, 본 발명은 기술된 본 발명의 특징중 어느 하나를 포함하는 이식가능한 구조물에 관한 것이다. 임플란트(implant)의 정확한 특성은 요망되는 용도에 따라 달라질 것이다. 임플란트는 성숙한 조직을 포함하거나 미성숙 조직 또는 격자를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 임플란트는 임의로 적합한 크기 및 치수의 격자내에 시딩된, 분화가 진행되는 본 발명의 세포의 집단을 포함할 수 있다. 이러한 임플란트는 숙주내 주입되거나 생착되어 환자의 안구 조직의 생성 또는 재생을 촉진한다.
지방 유래 격자는 편리하게는 세포 배양 키트의 일부로 사용된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 지방 유래 격자 및 하나 이상의 다른 성분, 예컨대 수화제(예컨대, 물, 생리적으로 적합한 염수 용액, 제조된 세포 배지, 혈청 또는 이의 조합체 또는 유도체), 세포 배양 기질(예컨대, 디시, 플레이트 바이알 등), 세포 배지(액체형이든지 분말형이든지), 항생제 및 호르몬 등을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 임의의 이러한 성분을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 적절한 조합 시에 요망되는 세포의 배양 및 성장을 지지하는데 필요한 모든 성분을 포함하는다. 바람직한 키트는 또한 기술된 바와 같이 격자로 시딩되는 세포를 포함할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 세포는 시험관내 증식되는 각막 상피 세포의 하나 이상의 특성을 지닌 세포로 분화되어 차후 환자에게로의 이식을 위한 각막 상피 조직을 성장시킨다. 이러한 세포는 단독으로 이식되거나 양막 조직과 같은 다른 조직과 함께 이식된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 자세히 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에서 기술된 이러한 구체예로 제한되어서는 안된다. 오히려, 이들 구체예가 제시되므로써 본 명세서가 보다 완벽하고 완전하게 될 것이며, 본 발명의 범위를 당업자들에게 완전히 이해시킬 수 있을 것이다.
실시예
실시예
1
시험관내
유도 방법
지방 유래 줄기 세포를 문헌에 기술된 바와 같이 지방흡입 폐물질로부터 단리시켰다[참조: Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319]. 상기 세포는 우태아혈청(FBS), N2, B27(InVitrogen), 또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충되거나 보충되지 않은 Neurobasal™(Invitrogen) 배지(그러나, 이러한 배지로 제한되는 것은 아니다)의 존재 하에서 배양을 지속할 수 있다. 배지내 글루코스 수준이 또한 조절될 수 있다. 세포를 다양한 밀도로 시딩하고, 3 내지 6일의 간격 마다 공급하였다. 매우 바람직하게는, 상기 세포를 약 1000 내지 약 500,000세포/㎤의 밀도로 시딩하였다.
배양 기간 동안, 조건화된 배지를, 각막 스트로마 세포 또는 각막 상피 세포와 결합된 표현형 마커의 발현 및 생화학적 마커를 검정하기 위한 통상의 방사선 면역 검정 또는 효소결합 면역흡수 검정을 사용하여 분석하였다. 상기 기술된 임의의 표현형 마커에 대한 항체(그러나, 이로 제한되는 것은 아님)를 사용하여 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다.
실시예
2
생적합성
막을 갖는 지방 유래 세포의 용도
본 실시예에서는 안구내 병변을 치료하기 위한 이식용 생적합성 물질을 갖는 조성물 중의 미분화되거나 지방세포 분화된 상태의 지방 조직 유래 스트로마 세포의 용도에 대한 방법이 제공된다. 수술 환자를, VISX 스타 S2 엑시머 레이저(VISX Star S2 Excimer Laser)(VISK, Inc., Santa Clara, CA)내 생성되며, Lee 등(2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)에 기술된 바와 같은 160mJ/㎠의 형광을 갖고 10Hz로 전달되는 193nm 엑시머 빔을 사용하여 굴절교정 레이저각막절제수술을 하였다. 상피 이물질 제거용 45㎛ 깊이 셋팅과 스트로마 제거용 적합한 셋팅으로 표준화된 중심 6mm 직경의 레이저 광융해(photoablation)을 수행하였다. PRK 이후, 분화되지 않거나 지방세포 분화된 지방 조직 유래 성체 줄기 세포를 생적합성 물질을 갖는 조성물로 제거된 영역에 도입하였다. 도입하기 전에, 지방 유래 세포를, 양막, 돼지 장 점막, Ampligraft™, Dermagraft™, 또는 유사한 생성물을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 생적합성 막의 표면 상에서 직접적으로 배양하였다. 지방 유래 세포를 미분화된 섬유아세포형 세포로서 배양하거나, 버센(Halvorsen) 등의 문헌(2001, Metabolism 50: 407-413)에 기술된 방법에 따라 지방세포 분화가 일어나도록 유도하였다. 세포/생물질 복합체를 잘라내어 결함 크기로 맞추었다. 지방 유래 세포 표면을 각막의 노출된 영역에 놓았다. 세포/생물질의 복합체를 중단되거나 연결되는 땀을 사용하여 10 내지 0 나일론을 사용하여 각막내 두어 가장 자리를 봉합하고, 과잉의 복합체를 잘라내었다[참조: Anderson et al 2001, Br J Ophthalmol; 85:5): 567-575]. 수술 후, 1회용 안대 컨택트 렌즈를 삽입하고, 국소 항생제를 주입하였다. 환자를 수술 후 1 내지 4일 동안 수술 후 경과를 평가하고, 적합한 기간(1개월까지) 동안 항생제 치료를 계속하였다. 이어서, 1, 3 및 6개월째에 수행되는 조사에는 시력 테스트, 굴절 및 조절 검사, 슬릿 램프(slit lamp) 평가 및 생체내 공초점 현미경에서의 조사가 포함되었다.
실시예
3
유전자 치료 방법
하기에서는, 지방 조직 유래 스트로마 세포를 임의의 벡터 방법(바이러스, 트랜스펙션, 기타)을 사용하여 안구 회복을 촉진시키는 하나 이상의 성장 인자 또는 단백질(TGFβ차단 단백질)을 발현시키는 세포로 전환시키는 방법이 기술된다. 수술 환자를, VISX 스타 S2 엑시머 레이저(VISK, Inc., Santa Clara, CA)내 생성되며, Lee 등(2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)에 기술된 바와 같은 160mJ/㎠의 형광을 갖고 10Hz로 전달되는 193nm 엑시머 빔을 사용하여 굴절교정 레이저각막절제수술을 하였다. 상피 이물질 제거용 45㎛ 깊이 셋팅과 스트로마 제거용 적합한 셋팅으로 표준화된 중심 6mm 직경의 레이저 광융해를 수행하였다. PRK 이후, 분화되지 않거나 지방세포 분화된 지방 조직 유래 성체 줄기 세포를 생적합성 물질을 갖는 조성물로 제거된 영역에 도입하였다. 도입하기 전에, 세포를, 가용성 타입 II 형질전환 성장 인자 베타 수용체 단백질을 발현시키는 적합한 핵산 벡터로 트랜스펙션시키거나 형질도입하였다. 상기 단백질은 형질전환 성장 인자 베타 사이토카인과 결합하여 세포 수준에서 신호 형질도입 케스케이드를 개시시키는 상기 사이토카인의 능력을 억제한다[참조: Rowland-Goldsmith et al 2001, Clin Cancer Res. 2001, 7(9): 2931-40]. 형질전환 성장 인자 베타는 각막 수술후 회복을 방해하여 각막 섬유증을 촉진시키는 것으로 공지되어 있다[참조: Jester et al, 1997, Cornea; 16(2):177-87].
이후, 유전공학처리된 세포를 양막, 돼지 장 점막, Ampligraft™, Dermagraft™, 또는 유사한 생성물을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 생적합성 막의 표면 상에서 직접적으로 배양하였다. 지방 유래 세포를 미분화된 섬유아세포형 세포로서 배양하거나, 버센 등의 문헌(2001, Metabolism 50: 407-413)에 기술된 방법에 따라 지방세포 분화가 일어나도록 유도하였다. 세포/생물질 복합체를 잘라내어 결함 크기로 맞추었다. 지방 유래 세포 표면을 각막의 노출된 영역에 놓았다. 세포/생물질의 복합체를 중단되거나 연결되는 땀을 사용하여 10 내지 0 나일론을 사용하여 각막내 두어 가장 자리를 봉합하고, 과잉의 복합체를 잘라내었다[참조: Anderson et al 2001, Br J Ophthalmol; 85:5): 567-575]. 수술 후, 1회용 안대 컨택트 렌즈를 삽입하고, 국소 항생제를 주입하였다.
환자를 수술 후 1 내지 4일 동안 수술 후 경과를 평가하고, 적합한 기간(1개월까지) 동안 항생제 치료를 계속하였다. 이어서, 1, 3 및 6개월째에 수행되는 조사에는 시력 테스트, 굴절 및 조절 검사, 슬릿 램프 평가 및 생체내 공초점 현미경에서의 조사가 포함되었다.
실시예
4
단순 이식
지방 조직 유래 스트로마 세포를 단독으로 안구내에 이식하였다. 수술 환자를, VISX 스타 S2 엑시머 레이저(VISK, Inc., Santa Clara, CA)내 생성되며, Lee 등(2001, Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)에 기술된 바와 같은 160mJ/㎠의 형광을 갖고 10Hz로 전달되는 193nm 엑시머 빔을 사용하여 굴절교정 레이저각막절제수술을 하였다. 상피 이물질 제거용 45㎛ 깊이 셋팅과 스트로마 제거용 적합한 셋팅으로 표준화된 중심 6mm 직경의 레이저 성형술을 수행하였다. PRK 이후, 분화되지 않거나 지방세포 분화된 지방 조직 유래 성체 줄기 세포를 직접 주입에 의해 제거된 영역에 도입하였다. 세포를 단일 세포 현탁액 또는 세포의 시트(sheets)로서 도입하였다. 수술 후, 1회용 안대 컨택트 렌즈를 삽입하고, 국소 항생제를 주입하였다. 환자를 수술 후 1 내지 4일 동안 수술 후 경과를 평가하고, 적합한 기간(1개월까지) 동안 항생제 치료를 계속하였다. 이어서, 1, 3 및 6개월째에 수행되는 조사에는 시력 테스트, 굴절 및 조절 검사, 슬릿 램프(slit lamp) 평가 및 생체내 공초점 현미경에서의 조사가 포함되었다.
실시예
5
인간 지방 유래
스트로마
세포의 사이토카인 발현 프로파일
다수 공여자로부터 인간 지방 유래 스트로마 세포의 사이토카인 발현 프로파일을 측정하였다. 본 실험에서는, 컨플루언트(confluent)한 정지상태의 지방 유래 스트로마 세포 배양물을 리포폴리사카라이드(LPS, 100ng/ml)로 유도하고, 조건화된 배지 및 총 RNA를 1 내지 24시간 후에 수거하였다. 뮤린 및 인간의 골수 유래 스트로마 세포 둘 모두와 공통적으로 지방 유래 스트로마 세포는 하기 사이토카인 mRNA를 발현시켰다: 인터류킨 6, 7, 8 및 11(IL-6, -7, -8, -11), 백혈병 억제 인자(LIF), 대식구-콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-대식구-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), flt-3 리간드, 줄기 세포 인자, 종양 괴사 인자α(TNFα) 및 골 형태발생 단백질 2 및 4t(BMP-2, 4).
실시예
6
인간 제대혈
프로제니터
세포의 증식 및 분화를 지지하는 인간 지방 유래
스트로마
세포의 능력
배양물 중에서 인간 제대혈 CD34+ 조혈 프로제니터 세포의 증식 및 분화를 지지하는 인간 지방 유래 스트로마 세포의 능력을 측정하였다. 지방 유래 스트로마 세포의 컨플루언트 배양물을 24 웰 플레이트에서 만들었다(웰당 6 X 104개의 세포). 제대혈(UCB) 시편을 헤타스타치(hetastarch)로 처리하여 오염성 적혈구를 제거하고, 피콜(Ficoll) 밀도 원심분리에 의해 오염성 과립구를 제거하였다. 남아있는 UCB 단핵 세포를 StemSep™(StempCells, Vancouver, BC) 프로토콜에 따라 계통 고갈시켰다. 이는 CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b 및 글리코포린(glycophorin) A에 대한 항체 혼합물을 사용하는 면역자기 네가티브 세포 분리에 의존한다. 마지막 정제 단계에서, lin - UCB 세포를 CD34 항체로 염색하고 유동혈구계산에 의해 분류하였다. 최종 CD34+ UCB 세포의 10,000개 이하를 개개의 웰에서 컨플루언트 지방 유래 스트로마 세포층과 공동 배양시켰다. 배양물을 12일, 3주 또는 6주 동안 외인성 사이토카인의 부재 하에서 유지시켰다. 이 기간의 종료시에, 개개의 웰을 트립신/EDTA 분해에 의해 수집하여 하기 항체 조합물(괄호안은 형광 태그임)의 조합을 사용하여 유동혈구계산에 의해 분석하였다: CD45(FITC), CD34(APC), 및 CD7, CD10 또는 CD38(PE) 중 어느 하나. 이들 검정 결과는 하기에 기재된다.
상기 연구는, 12일된 지방 스트로마 지지된 공동 배양물 중에서 UCB 조혈 세포 집단의 증식을 조사한 것이다. 외인성 사이토카인의 부재 하에서, 지방 유래 스트로마 세포는 총 조혈 세포수(평균, n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자; 범위 2 - 9.4)의 5.1배 증식을 지지하였다. 이는 CD34+ UCB 세포 집단(평균, n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자; 범위 1.4 - 3.3)의 2.4배 증식에 상응한다. CD34+ 및 CD34- 양자의 상당 비율(%)이 CD7 또는 CD10 항원을 발현시켰다(도 4, 평균, n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자). 개개의 표현형은 하기 %의 총 조혈 집단을 나타낸다: 초기 림프계 프로제니터, 각각 20.2%(CD34+ CD7+) 및 9.5%(CD34+ CD10+); NK/T-세포 프로제니터(CD34+ CD7-), 31.4%; 및 B-세포 프로제니터(CD34- CD10+), 7.7%.
또한, 초기 림프계 프로제니터의 상당한 증식이 있었음이 분석되었다. CD34+ CD7- 집단은 12일 된 프로제니터(평균 ±s.d., n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자)에 비해 4.8±2.2배 증식되었다. 유사하게, CD34+ CD10+ 집단은 프로제니터(평균 ±s.d., n = 4 스트로마 공여자, n = 2 UCB 공여자)에 비해 3.5±1.6배 증식되었다. 이러한 값은 CD34+ 집단의 상기 증식 배율을 초과하는 것이며, 이러한 방법은 인간 림프계 프로제니터가 풍부할 것임을 시사하는 것이다. 이러한 결과는 지방 유래 스트로마 세포가 시험관내 조혈 프로제니터의 분화를 지지할 수 있음을 나타낸다.
본원 발명의 변경 및 그 밖의 구체예에 상기 상세한 설명 및 관련 도면에 제시된 교시의 이점을 가짐을 본 발명이 속한 당업자들에게는 자명할 것이다. 그러므로, 본 발명은 상기 기재된 특정 구체예로 제한되지 않으며, 다른 구체예도 첨부되는 청구범위의 범주내에 포함되도록 의도되는 것으로 이해해야 한다. 본원에서 특정 용어가 사용되어 있지만, 이들 용어는 단지 유전적 및 기술적 의미로 사용된 것이지 제한의 목적은 아니다.
Claims (29)
- 안구 세포의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도시킨 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포.
- 제 1항에 있어서, 시험관내에서 분화됨을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항에 있어서, 생체내에서 분화됨을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항에 있어서, 분화 전에, 외인성 유전 물질이 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항에 있어서, 세포가 인간 세포임을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항에 있어서, 숙주내로 이식됨을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항에 있어서, 외인성 유전 물질이 세포내로 도입됨을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 각막 상피 세포임을 특징으로 하는 안구 세포.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 안구 스트로마 세포임을 특징으로 하는 안구 세포.
- 안구 세포의 하나 이상의 특징을 발현하도록 유도시킨 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포 및 생체적합성 물질을 포함하는 조성물.
- 제 10항에 있어서, 생체적합성 물질이 양막, 콜라겐, 하이드로겔, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리글리콜산/폴리락트산, 히알루로네이트, 또는 피브린으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
- 제 11항에 있어서, 생체적합성 물질이 양막임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 세포가 각막 상피 세포임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 세포가 안구 스트로마 세포임을 특징으로 하는 조성물.
- 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 숙주의 안와내 조직 부위와 접촉시키는 단계를 포함하여, 하나 이상의 안구 관련된 세포 마커를 나타내도록 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 분화시키는 방법.
- 제 15항에 있어서, 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주로부터 수득됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주가 아닌 공여체로부터 단리됨을 특징으로 하는 방법.
- 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 안구 유도 물질과 접촉시키는 것을 포함하여, 하나 이상의 안구 세포 마커를 나타내도록 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 분화시키는 방법.
- 제 18항에 있어서, 안구 유도 물질이 화학적으로 규정된 세포 배양 배지내에 존재함을 특징으로 하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 안구 세포 마커가 각막 상피 세포에 대한 마커임을 특징으로 하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 안구 세포 마커가 안구 스트로마 세포에 대한 마커임을 특징으로 하는 방법.
- i) 하나 이상의 안구 세포 마커를 발현시키도록 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포를 유도시키고;
ii) 유도된 세포를 숙주내로 이식하는 것을 포함하여, 숙주의 안구 질병, 퇴행성 질환 또는 수술후 질환을 치료하는 방법. - 제 22항에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주로부터 단리됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 안구 질환, 퇴행성 질환 또는 수술 질환이 무홍채증, 홍색각질피부증(eythrokeratodermia), 각막염, 화학적 상해; 열적 상해; 콘택트렌즈 각막병증; 반복성 각막윤부(limbal) 수술, 각막윤부 부전, 굴절교정 레이저각막절제술 (photorefractive keratectomy), 레이저각막절삭술 (laser in situ keratomileusis), 자기면역 기능장애, 또는 바이러스 또는 세균 감염임을 특징으로 하는 방법.
- i) 지방조직 유래 스트로마 세포를 단리하고;
ii) 세포를 숙주의 안와내 부위내로 이식하는 것을 포함하여, 숙주의 안구 질병, 퇴행성 질환 또는 수술후 질환을 치료하는 방법. - 제 25항에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주로부터 단리됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항에 있어서, 안구 질환, 퇴행성 질환 또는 수술 질환이 무홍채증, 홍색각질피부증, 각막염, 화학적 상해; 열적 상해; 콘택트렌즈 각막병증; 반복성 윤부 수술, 윤부 부전, 굴절교정 레이저각막절제술, 레이저각막절삭술, 자기면역 기능장애, 또는 바이러스 또는 세균 감염임을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 지방조직 유래 스트로마 세포가 숙주내로 이식되기 전에 탈분화됨을 특징으로 하는 방법.
- 제대혈 프로제니터(progenitor) 세포를 단리된 지방조직 유래 스트로마 세포와 공동-배양하는 것을 포함하여, 단리된 제대혈 프로제니터 세포를 증식시키는 방법.
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