CZ2004694A3

CZ2004694A3 - Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně pro opravu korneálních a intraorbitálních defektů a použití těchto buněk

Info

Publication number: CZ2004694A3
Application number: CZ2004694A
Authority: CZ
Inventors: Bentley Cheatham; Jeffrey M. Gimble
Original assignee: Artecel Sciences, Inc.
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2005-03-16
Also published as: MXPA04004309A; KR20100018089A; KR20100131011A; EP1892289A3; CN1592782A; RU2331668C2; WO2003039481A3; AU2002360362A1; US20030125293A1; JP2005508174A; HUP0401945A3; BR0214021A; CA2465908A1; CN100516200C; WO2003039481A2; HUP0401945A2; PL370261A1; EP1456354A4; EP1892289A2; KR20050044392A

Description

Buňky stromatu korneálních a buněk odvozené z adipózní tkáně pro opravu intraorbitálních defektů a použití těchto

Oblast techniky

Vynález poskytuje buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně indukované k expresi alespoň jedné vlastnosti intraokulární buňky stromatu. Vynález se rovněž týká způsobů opravy korneálních intraorbitálních defektů oka za použití diferencovaných nebo nediferencovaných buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně.

Dosavadní stav techniky

Oko je komplexní orgán tvořený více typy tkání. Oko obsahuje tři různé typy obalů; směrem od vnějšího k vnitřnímu: bělmo a rohovku, cévnatky a sítnici. V těchto třech povlacích jsou refrakční media: komorová voda, krystalické čočky, a sklivec. Kmenové buňky jsou nedílnou složkou každé vrstvy oka a sdílejí důležitý regulační vztah se sousedními epiteliálními, endoteliálnímí, neuronálními a zánětlivými buňkami. Oko a jeho funkci ovlivňuje celá řada podmínek. Poruchy rohovky zahrnují například tak zvané primární a sekundární choroby (Kruše & Volcker, 19 97, Curr. Opin. Opthalmol. 8 (4): 46-54). Primární choroby oka zahrnují neomezujícím způsobem: aniridii neboli absenci duhovky; eythrokeratodermie neboli zčervenání a hyperkeratózu pokožky; a keratitidu s násobnou endokrinní deficiencí. Sekundární choroby oka zahrnují neomezujícím způsobem: poškození chemikáliemi; tepelná poškození;

• · · · · · · 4 keratopatii související s nošením kontaktních čoček; opakované limbální chirurgické zákroky a pásovou keratopatii, což je degenerativní stav, při kterém se šedý pás rozšíří z limbu do rohovky.

Na mnoha těchto poruchách se podílejí autoobnovující kmenové buňky rohovky, které se nacházejí v bazálni vrstvě limbu ležící mezi rohovkou a spojivkou (Kruše & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol. 8 (4): 46-54). Limbální nedostatečnost nebo dysfunkce kmenových buněk vede k takovým příznakům, které zahrnuji zhoršené vidění, fotofobii, zánět, edém a spasmus svalů ovládajících oční víčko. V některých případech lze tyto symptomy napravit transplantací zdravé limbální tkáně do nemocných oblastí rohovky, jako je tomu v případech diskrétně lokalizovaného chemického poleptání. Celá řada důkazů naznačuje, že interakce mezi kmenovými buňkami rohovky a pod nimi ležícího stromatu je pro normální funkci zásadní.

Tyto dva sousední buněčné typy vykazují specifické autokrinní a parakrinní dráhy. Tyto dráhy jsou mediovány cytokiny uvolňovanými buňkami stromatu, které zahrnují neomezujícím způsobem transformační růstový faktor (βΐ a £32 (TGF£3) , insulinu podobný růstový faktor (IGF) , růstový faktor bazického fibroblastu (bFGF), hepatický růstový faktor (HGF) a růstový faktor keratinocytů (KGF). Receptory pro každý z těchto faktorů jsou syntetizovány epiteliálními buňkami rohovky. Stejně tak syntetizují epiteliální buňky rohovky TGF£3l a £32, IGF, bFGF a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF). S výjimkou VEGF receptoru exprimují buňky stromatu receptory pro všechny tyto cytokiny a stejně tak růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF) a epidermální růstový faktor (EGF) (Kruše & Volcker, 1997, Curr. Opin. Opthalmol. 8 (4): 46-54).

Rohovka hraje zásadní úlohu při zachovávání normálního vidění tím, že odráží světlo na čočky a sítnici. To vyžaduje kontinuální autoobnovu epiteliálních buněk rohovky, která chrání hlubší vrstvy tkáně před infekcí (Lu et al. 2001, Exp Biol Med 226 (7) : 653-64) . Chirurgické postupy, jakými jsou například fotorefrakční keratektomie nebo laser in sítu keratomileusis, zahrnují odstranění části rohovky. Tyto postupy se používají při léčbě určitých forem myopie neboli krátkozrakosti (Wilson et al. 2001, Arch Ophthalmol: 119 (6): 889-96).

Opravy, které je třeba provést po těchto procedurách vyžadují kontrakci stromatu doprovázenou epiteliální stratifikací (rozvrstvením) (Taliana et al. 2001, Invest

Ophthalmol Vis Sci; 42(1): 81-9). Během léčebného procesu zažívá mnoho pacientů postoperační přední zákal stromatu, který je charakterizován na zvířecích modelech vzhledem myofibroblastických buněk exprimujících alfa aktin hladkého svalstva (α-SMA) (Nakamura et al. 2001, Br J Ophthalmol; 85 (2) : 209-13) . Tyto myofibroblastické buňky jsou v kultuře indukovány TGF£3 a blokovány in vivo anti-TGFp protilátkami (Jester et al. 1997, Cornea; 16 (2) : 177-87; Jester et al.

1999, Prog Retin Eye Res; 18-(3): 311-56). Stejně tak existuje důkaz, že přímé interakce mezi epiteliálními buňkami a sousedním stromatem mohou indukovat stromální diferenciaci myofibroblastů. Toto je dále ovlivněno amniotických membrán (Choi & Tseng 2001, (2) : 197-204) . Rozsah zákalu stromatu u hloubce poškození stromatu přítomnosti Cornea; 2 0 zvířecích modelů odpovídá rohovky během fotorefrakční keratektomie (Moller-Pedersen et al. 1998, Cornea; 17 (6): 627-39). U pacientů je stupeň zákalu rohovky stejný bez ohledu na to, která technika se • · • · · · • · · · • · · · · použila pro odstranění epiteliální buňky laserová) (Lee et al. 2001, Ophthalmology;

(mechanická nebo 108 (1) : 112-20) .

Pro léčbu a opravu rohovky a očních defektů a poranění se používá celá řada různých biomaterialů. Extracelulární matrix rohovky je bohatý na kolagen a glykosaminoglykany (Robert et al. 2001, Pathol Biol (Paris); 49 (4): 353-63). Z hodnocení stromální a endoteliální vrstvy (Nakamura et al. 1997, Exp Eye Res; 64 (6) : 1043-50; Chung et al. 1999,

Ophthalmic Res; glykosaminoglykan (6) označovaný

432-9) vyplynulo, že jako hyaluronan, zlepšuje membrány při US 6 152 142) .

léčbu epiteliálniho poranění rohovky u krysích a králičích modelů. Tseng a ostatní zahájili používání amniotické léčbě různých očních poruch (Patent Amniotická membrána je polarizovaná a má „stromální stranu a stranu „základní membrány. Stromální strana obsahuje kolageny I a III a fibronektin s bazální laminální distribucí kolagenového typu IV, laminin a heparin sulfátproteoglykan. Strana amniotické membrány označená jako strana „základní membrány podporuje růst epiteliální buňky, zatímco stromální strana podporuje růst fibroblastů podobným způsobem jako kolagen. Amniotická membrána se izoluje z lidské placenty, konzervuje zamražením a následně se použije pro chirurgickou opravu intraokulárních porucha.

Mechanizmus účinku amniotické membrány zůstává zcela neodhalen. Nicméně existuje in vitro důkaz, že přítomnost amniotické membrány v kultuře potlačuje exprimaci TGF{3 fibroblasty (Lee et al. 2000, Curr Eye Res; 20 (4) : 325334) a interleukinem la a interleukinem 1β epiteliálními buňkami (Solomon et al. 2001, Br J Ophthalmol; 85 (4): 444449) .

Amniotická membrána se úspěšně používá pro léčbu širokého spektra defektů oka a rohovky. Například hluboké vředy rohovky a bělma se léčí použitím více vrstev amniotické membrány, které vyplní vrstvu stromatu, základní membrány, a současně slouží k překrytí rány (Hanada et al. 2001, Am J Opthalmol; 131 (3) : 324-31) . Zjistilo se, že amniotická membrána redukuje zánět stromatu a ulceraci v případě HIV-1 keratitidy, imunitně mediované choroby (Heiligenhaus et al. 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42 (9) : 1969-1974) . Závažné neurotrofické vředy rohovky se rovněž léčí pomocí amniotických membrán (Chen et al. 2000, Br J Ophthalmol; 84 (8) : 826-833) . Amniotická membrána obnovila povrch rohovky a spojivky a omezila limbální stromální zánět způsobený akutním chemickým nebo tepelným popálením (Meller et al. 2000, Ophthalmology; 107 (5): 980989). Amniotická membrána se používala jako alternativa k limbálnímu autotransplantátu nebo alotransplantátu u pacientů s parciální deficiencí limbálních kmenových buněk (Anderson et al. 2001, Br J Ophthalmol; 85 (5) : 567-575) . Amniotické membrány se rovněž používají při chirurgické léčbě pterygie, křídlovitého přehybu membrány vybíhající od spojivky k rohovce, s přichycením k bělmu (Solomon et al. 2001, Ophthalmology: 108 (3): 449-460). Amniotické membrány se úspěšně používají pro léčbu glaukomu s pozdním nástupem a s prosakujícím filtračním polštářkem jako alternativa spojivky (Budenz et al. 2000, Am J Ophthalmol; 130 (5) : 580-588; Bartoň et al. 2001, Invest Ophthalmol Vis Sci; 42 (8): 1762-1768) a stejně tak ke zlepšení regenerace stabilního epitelu rohovky a redukce okulární bolesti, pokud se použije při chirurgickém ošetření pásové keratopatie, při ukládání vápníku v základní membráně rohovky sekundárně k sarkoidóze, při chronické uveitidě a z jiných důvodů (Anderson et al. 2001, Cornea; 20 (4) : 354361) .

Vzhledem k obtížím souvisejícím s obstaráváním amniotických materiálů, hledají výzkumníci alternativní zdroje materiálu stromatu pro opravu defektů oka nebo rohovky.

EP 93830229.6 (Cancedda et al.) popisuje způsoby kultivace již diferencovaných okulárních epiteliálních buněk in vitro, které mají být použity při následné transplantaci v rámci léčby defektů rohovky. Zdrojem epiteliálních buněk je autologní bioptický materiál ze zdravého oka. Takoví pacienti slouží současně jako dárci i příjemci.

Patent US 6 117 675 (van der Kooy et al.) popisuje kmenové buňky izolované ze sítnice savců, které jsou diferencovány in vitro na retinální pigmentové epiteliální buňky, které se transplantují subjektu trpícímu chorobou sítnice. Zdrojem retinálních kmenových buněk je embryonální nebo raně post-natální tkáň.

Patent US 5 912 178 (Wille, Jr.) popisuje media a způsoby in vitro produkce různých typů histologicky kompletního lidského epitelu zahrnujícího epiderm, rohovku, tkáň dásně a močovodu. Výsledný epitel se pěstuje in vitro z izolovaných živočišných epiteliálních buněk nebo bazálních kmenových buněk izolovaných z epiteliální tkáně.

Patent US 5 942 487 (Ogawa et al.) popisuje kompozici obsahující faktor kmenové buňky, který lze aplikovat na postiženou tkáň rohovky za účelem stimulace růstu rohovky. Vynálezci se domnívají, že kmenové buňky rohovky jsou stimulovány k migraci a k růstu.

• ·· · ·· · · · ··· · ·· · · · ·· • · ··· ···· • · · · · ··· ····· • · ······ ··· ···· ··· ·· ·· ·

Patent US 5 8δ3 531 (Advanced Tissue Sciences, lne.) popisuje tubulární živou tkáň stromatu připravenou in vitro, obsahující buňky stromatu a proteiny pojivové tkáně přirozeně sekretované buňkami stromatu, které jsou přichyceny k v podstatě obalujícímu trojrozměrnému tubulárnímu rámu, který je vyroben z biokompatibilního, neživého materiálu majícího intersticiální prostory přemostěné buňkami stromatu.

Cílem vynálezu je poskytnout buňku, materiál a způsob napomáhající při opravě okulárních defektů, zahrnujících defekty rohovky.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje stromální nebo kmenovou buňku odvozenou z adipózní tkáně, která je diferencována k tomu, aby vykazovaly alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost intraokulární nebo okulární buňky stromatu. Tuto buňku lze použít při terapeutické léčbě degenerativní nebo jiné choroby oka.

Předložený vynález rovněž poskytuje způsoby a kompozice pro použití a kultivaci buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně pro léčbu intra-okulárních nebo okulárních defektů libovolné etiologie.

Podle dalšího aspektu vynálezu jsou poskytnuty způsoby a kompozice pro konzistentní kvalitativní a kvantitativní indukci buněk stromatu odvozených ze subkutánní, prsní, gonadální, omentální nebo kterékoliv další adipózní tkáně k tomu, aby exprimovaly alespoň jednu genotypickou nebo • · · · · · · • · · · · · · • · · · · ····· fenotypickou vlastnost intra-okulárních nebo buněk stromatu.

okulárních

Podle dalšího aspektu vynálezu se buňky odvozené z izolované adipózní tkáně indukují k diferenciaci na buňku, která exprimuje alespoň jednu vlastnost intraokulární buňky stromatu, přičemž tento způsob indukce zahrnuje krok uvedení buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáň do kontaktu s okulár indukující látkou. Tato látka se nachází v chemicky definovaném médiu buněčné kultury a zahrnuje růstové faktory, cytokiny, chemická činidla a/nebo hormony v koncentracích dostatečných pro indukci buněk stromatu odvozených z izolované adipózní tkáně k exprimaci alespoň jednoho okulárního buněčného markéru.

Podle dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně geneticky zpracují tak, aby exprimovaly proteiny, které mohou modifikovat buněčný fenotyp a indukovat dráhy, které usnadní regeneraci a opravu libovolného intra-okulárního defektu. Toto se realizuje tak, že se buňka za vhodných podmínek vystaví působení vektoru genového přenosu, který obsahuje nukleovou kyselinu zahrnující transgen, takže dojde k zavedení požadované nukleové kyseliny do buňky. Alternativně se buňka ošetří prostou nukleovou kyselinou, která se tímto může zabudovat do buňky.

Vynález dále poskytuje způsob léčby degenerativního stavu oka hostitele, který zahrnuje podání buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně, které byly indukovány k expresi vlastnosti požadované okulární buňky. Výraznou výhodou vynálezu je to, že buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně lze izolovat přímo z těla hostitele • « (autologní transplantace), nebo je lze darovat jiným hostitelem (alogenní transplantace).

Podle dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně kultivují v jejich nediferencovaném nebo diferencovaném stavu v nebo na trojrozměrné matrici tvořené přírodním nebo syntetickým biokompatibilním materiálem tak, aby mohly být použity pro chirurgickou opravu míst intra-okulární stromální ulcerace.

Podle dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně použijí přímo bez diferenciace pro autologní a alogenní transplantaci buněk, která má podpořit úspěšné operace glaukomu tím, že koriguje vytékání puchýřku. U tohoto provedení se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně aplikuji do oka, výhodně v požadované oblasti, a diferenciace se jim umožní bud' (i) souběžným podáním příslušných cytokiny a dalších biologických faktoru nebo (ii) in vivo díky faktorům již přítomným nebo indukovaným v těle hostitele.

U ještě dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně použijí pro autologní a alogenní transplantaci buněk při léčbě lidských stavů, které zahrnují neomezujícím způsobem zákal rohovky indukovaný fotorefrakční/terapeutickou keratektomií, opravu během odstraňování „obnaženého bělma pterygie, chirurgickou léčbu pásové keratopatie, chirurgické odstranění tumorů, lézí nebo zjizvené tkáně z povrchu spojivky nebo rohovky.

U ještě dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně transplantují v kombinaci s tkání amniotické membrány do postiženého oka.

• · · · · · • · · · · · ·

V dalším aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně diferencují před transplantací do postiženého oka na buňky adipoblastické linie.

U ještě dalšího aspektu vynálezu se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně diferencují na buňky adipoblastické linie a transplantují společně s tkání amniotické membrány do postiženého oka.

Buňky podle vynálezu se použijí bud' jako homogenní populace buněk nebo jako součást buněčné populace, ve které ostatní buňky sekretuj i látky pro podporu růstu nebo diferenciace okulární buňce podobné buňky.

Vynález se rovněž týká kitu pro izolaci kmenových buněk nebo buněk stromatu z adipózní tkáně, který zahrnuje prostředek pro izolaci adipózní tkáně z těla pacientů a prostředek pro separaci kmenových buněk ze zbytku adipózní tkáně. Tento kit rovněž zahrnuje médium pro diferenciaci kmenových buněk, přičemž toto médium způsobuje, že buňka exprimuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost okulární buňky nebo je obecně okulárogenní.

Vynález dále zahrnuje kompozice a způsoby genetické modifikace tkáně buňky podle vynálezu odvozené z adipózní tkáně. Takové kompozice zahrnují buňku odvozenou z adipózní tkáně v kombinaci s biologicky slučitelnou mřížkovou strukturou, která tkání umožní diferenciaci a expanzi. Tímto způsobem lze tedy vyrábět oku podobnou tkáň nebo celé orgány. Biologicky slučitelná mřížka může být odvozena z adipózní tkáně jako takové a zahrnuje libovolný lidský protein, proteoglykan, glykoprotein, hyaluronin, molekulu fibronektinu, hormon, cytokiny a růstové faktory. Mřížka může rovněž zahrnovat nebo může být připraven z polymerů • · · · · · • Λ · · · · · • · · · · · · • · · · · ····· • · · · · · ··· ·· ·· · monomerů zvolených z množiny sestávající z kyseliny glykolové, kyseliny mléčné, propylfumarátu, kaprolaktonu, hyaluronanu, kyseliny hyaluronové nebo jejich kombinací.

Alternativně může být polymerním materiálem protein, polysacharid, polyhydroxykyselina, polyorthoester, polyanhydrid, polyfosfazen, syntetický polymer nebo jejich kombinace. Polymerním materiálem může být rovněž hydrogel tvořený suspenzí síťujícího polymeru majícího v sobě dispergované buňky.

Další cíle a znaky vynálezu budou zjevnější po prostudování následujícího popisu a přiložených patentových nároků.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje průtokovou cytometrickou analýzu lidských buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně.

Obrázek znázorňuje reprezentativní průtokovou cytometrickou analýzu pro CD9, CD29 (beta 1-integrin), CD44 (receptor hyaluronátu), CD49d (alfa 4 integrin), CD55 (rozpad urychlující faktor) a HLA-ABC (antigen histokompatibility 1. třídy). Nediferencované buňky stromatu izolované z těla jediného dárce se zabarví monoklonálními protilátkami proti indikovaným antigenům (plná čára, pravá strana každého panelu); a isotypickou monoklonální kontrolní protilátkou (tečkovaná čára, levá strana každého panelu). Reprezentativní n = 5 dárců. Čára naznačuje fluorescenční intenzitu > 99 % kontroly.

Obr. 2 schematicky znázorňuje progenitory lymfoidu 12. den kokultivace. Signifikantní procento jak CD34⁺, tak • · · · ··· · · ·· • · ··· · * · « • · · ·· · · · ····· • · ······ ··· ···· ··· ·· ·· ·

CD34’ buněk exprimovalo buď CD7 nebo CD10 antigen (n = 4 dárců stromatu, n = 2 UCB dárců). Jednotlivé fenotypy representovaly následující procenta celkové hematopoietické populace: rané progenitory lymfoidu 20,2 % (CD34⁺ CD7⁺) , resp. 9,5 %(CD34⁺ CD10 ⁺ ) ; progenitory NK/T-buňky (CD34“CD7 ⁺ ) 31,4 %; a progenitory B-buňky (CD34'CD10⁺) 7,7 %.

Předmětem vynálezu jsou tedy stromální nebo kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně indukované k expresi alespoň jedné genotypické nebo fenotypické vlastnosti buňky okulárního původu. Výhodněji buňka vykazuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost korneální epiteliální buňky. Alternativně buňka vykazuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost okulární stromální buňky. Buňky produkované způsoby podle vynálezu poskytují zdroj částečně nebo zcela diferencovaných nebo nediferencovaných funkčních buněk majících genotypické nebo fenotypické vlastnosti zralých okulárních buněk pro výzkum, transplantaci a vývoj celulárních terapeutických produktů při léčbě chorob živočichů, výhodně lidských choroby, opravě nebo zlepšení tkáně a korekci degenerativních chorob oka, výhodně korneální epitelie. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají způsoby výroby a použití takových buněk.

I. Definice „Spojivka označuje membránu, která lemuje oční víčko a překrývá odkrytý povrch bělma.

„Rohovka označuje transparentní strukturu tvořící přední část fibrózní vrstvy oka. Je tvořena pěti vrstvami, ··· · ··· · · ·· • · ··· · · · · • · · · · ··· ··.··· konkrétně: 1) předním korneálním epitelem, který je nedílnou součástí spojivky; 2) přední limitující vrstvou (Bowmanova membrána); 3) substantía propría neboli stromální vrstvou; 4) zadní limitující vrstvou (Descemetní membrána); a 5) endoteliem přední komory nebo keratodermu.

„Sítnice označuje nejvnitřnější ze tří vrstev oční bulvy obklopující tělo sklivce a pokračující směrem dozadu společně s optickým nervem. Dělí se na dva pars optica, které spočívají na cévnatkách, pars ciliaris, které spočívají na řasinkovém těle, a pars iridica, které spočívají na zadním povrchu duhovky. Obecně je sítnice tvořena vnější, pigmentovanou vrstva (pars pigmentosa) a vnitřní, transparentní vrstvou (pars nervosa), které společně tvoří pars optica. Optická část oka sestává z 9 vrstev označo-vaných směrem ven: 1) vnitřní limitující membrány; 2) vrstvy nervových vláken; 3) vrstvy ganglionových buněk; 4) vnitřní plexiformní vrstvy; 5) vnitřní jaderné vrstvy; 6) vnější plexiformní vrstvy; 7) vnější jaderné vrstvy; 8) vnější limitující membrány; a 9) vrstvy tyčinek a čípků.

„Transformační růstový faktor (TGF) označuje 55kDa, 391aminokyselinový (aa) preproprotein, který sestává z 23 aa signální sekvence, 256aa pro-regionu a 112aa zralého segmentu. Před sekrecí se pro-region štěpí na RxxR místě pomocí furinu podobné proteasy. Ta generuje neglykosylovaný 25kDa, pomocí disulfídu propojený zralý dímer, který se nekovalentně spojuje se svými již navázanými disulfidem propojenými pro-regiony za vzniku „latentního komplexu. Tento komplex je sekretován. K aktivaci dochází extracelulárně za celé řady podmínek nejpravděpodobněji přes serin/threonin kinasu transmembrány, kdy se iniciuje

intracelulární signální kaskáda mediovaná rodinou Smad transkripčních faktorů.

„Bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF), rovněž známý jak FGF-2, označuje 18kDa neglykosylovaný polypeptid, který vykazuje jak intracelulární, tak extracelulární aktivitu. BFGF je sekretován jako monomer. Po sekreci se bFGF odděluje na heparin sulfátu (HS) buněčného povrchu nebo matrixových glykosaminoglykanu. Ačkoliv je bFGF sekretován jako monomer, zdá se, že HS buněčného povrchu dimeruje monomerni bFGF na konfiguraci, která je následně schopna dimerovat a aktivovat FGF receptory.

„Růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF) označuje 30kDa homodimerovou nebo heterodimerovou kombinaci dvou geneticky odlišných ale strukturně příbuzných, polypeptidových řetězců označovaných jako A a B. Původně byl identifikován jako mitogen fibroblastu odvozený z krevních destiček v séru. Následné studie prokázaly, že mnoho typů buněk sekretuje PDGF a že cytokin je mitogenem pro buňky mesodermální linie (svalová, kosterní, pojivová tkáň).

„Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) byl původně identifikován jako růstový faktor a faktor přežití pro endoteliální buňky. Indukuje proliferaci endoteliálních buněk a reguluje angiogenezi a vaskulogenezi. VEGF je heparin-vážící glykoprotein, který se sekretuje jako 45kDa homodimer. Buňky mnoha typu, ale zpravidla ne samotné endoteliální buňky, sekretují VEGF.

„Hepatocytový růstový faktor (HGF), rovněž znám jako rozptylový faktor, označuje multifunkční cytokin, který podporuje mitogenezi, migraci, invazi a morfogenezi. HGF15 • · · · · · · • · 9 9 * · « • · · ··· 9 · · · « •·· ·9 ·· 9 dependentní signalizace moduluje integrinovou funkci tím, že podporuje agregaci a buněčnou adhezi. K HGF/SFindukovaným účinkům dochází přes signalizaci receptoru MET tyrosin kinasy a přes následné navázání ligandu.

„Keratinocytový růstový faktor (KGF), nebo FGF-7, označuje 28kDa jednořetězcový sekretovaný glykoprotein, jehož cíl se omezuje v podstatě na epitel. Tato molekula je syntetizována jako 194aa prekursor, který obsahuje 31aa signální sekvenci a 163aa zralý segment. Zralý růstový faktor se váže na heparin a jeho receptor (KGFR) přes diskrétní oblasti molekuly. Dospělé buňky, které exprimují FGF-7 zahrnují fíbroblasty, T-buňky, buňky hladkého svalstva a buňky ovariální théky. U embrya se KGF nachází v mnoha vývojových stádiích celého mesenchymu.

„Insulinu podobné růstové faktory (IGF),IGF-I a IGF11, sdílejí 50 % strukturní homologii s insulinem. IGFs působí jako mitogenní stimulátory buněčné proliferace a stejně tak jako supresory celulárních apoptických drah. Za kontroly růstového hormonu (GH) jsou játra primárním místem produkce IGF. Hladiny IGF-I jsou rovněž ovlivněny výživou a vývojovými stádii. IGFs Produkce autokrinní a parakrinní tkáně přispívá k vytvoření hladin IGF dostupných pro regulaci růstu.

„Vývojový fenotyp je potenciál buňky získat konkrétní fyzikální fenotyp procesem diferenciace.

„Hormon je libovolná látka, která je sekretována buňkami a která po kontaktování způsobuje fenotypickou změnu v téže nebo jiné buňce.

„Genotyp je exprese alespoň jednoho transkriptu mediátorové RNA genu souvisejícího s diferenciační drahou.

Výraz transgenický se použije pro popis libovolného živočicha nebo jeho libovolné části zahrnující neomezujícím způsobem buňky, kultury nebo tkáně, které uvnitř buněk obsahují exogenní genetický materiál. Buňky podle vynálezu mohou mít v sobě přidanou DNA a tyto buňky lze následně použít pro transplantaci nebo pro in vitro produkci hormonů, buněk nebo tkání.

„Transgen znamená libovolný kousek DNA uměle zavedené do buněk, který se stane součástí genomu buňky, buněčné linie, tkáně nebo organizmu (tj . bud' stabilně integrované nebo ve formě stabilního extrachromozomálního prvku), který se vyvine z této buňky. Takový transgen může zahrnovat gen, který je částečně nebo zcela heterologní neboli cizí pro buňku nebo organizmus, do kterých je tento heterologní gen zaveden, nebo může reprezentovat gen homologní k endogennímu genu organizmu. Do definice spadá i transgen vytvořený poskytnutím RNA sekvence, která se přepíše do DNA a následně zabuduje do genomu. Výraz „transgenní dále zahrnuje libovolný organizmus nebo jeho součást, zahrnující, neomezujícím způsobem, buňky, buněčné linie, buněčné kultury nebo tkáně, jejichž genorn byl změněn in vitro manipulací nebo libovolnou transgenní technologií.

II. Kmenové buňky nebo buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně

Kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně nebo „buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně označují buňky, které pocházejí z adipózní tkáně. Výraz „Adipózní označuje libovolnou tukovou tkáň. Adipózní tkání může být hnědá nebo bílá adipózní tkáň odvozená ze subkutánního, **ι «9 <

9 · · 9 · 9 » * 9 « * · · ««999 • · · 9 9 ·« 9 ··· ···· · omentálního/viscerálního, prsního, gonadálního nebo dalšího místa adipózní tkáně. Výhodně je adipózní tkání subkutánní bílá adipózní tkáň. Tyto buňky mohou obsahovat primární buněčnou kulturu nebo imortalizovanou buněčnou linii. Adipózní tkáň lze získat z libovolného organizmu majícího tukovou tkáň. Výhodně je adipózní tkání savčí tkáň, nejvýhodněji adipózní tkáň člověka. Konvenčním zdrojem adipózní tkáně je liposukční zákrok, nicméně, zdroj adipózní tkáně nebo způsob izolace adipózní tkáně není pro vynález rozhodující.

Dospělé lidské extramedulární buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně reprezentují zdroj stromálních kmenových buněk, které lze běžně získávat při minimálním riziku nebo nepohodlí pacientů. Z patologických důkazů vyplývá, že buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně jsou schopné diferenciace po víceliniových dráhách. Adipózní tkáň je snadno přístupná a u mnoha osob v nadbytku. Obezita je stav, který lze ve Spojených státech amerických, kde více jak 50 % dospělých přesahuje doporučený faktor BMI, vypočítaný na základě jejich váhy, považovat za epidemický.

Je dobře zdokumentováno, že adipocyty jsou obnovitelnou buněčnou populací. I po chirurgickém odstranění liposukcí nebo jinými postupy lze u dané osoby na stejném místě po určité době pozorovat obnovu adipocytů. Z tohoto vyplývá, že adipózní tkáň obsahuje kmenové buňky stromatu, které jsou schopné autoobnovy.

Adipózní tkáň nabízí mnoho praktických výhod pro tkáňový inženýring. Za prvé je hojná. Za druhé lze získat způsoby, které představují minimální riziko pro pacienty. Za třetí je obnovitelná. Zatímco buňky stromatu reprezentují méně než 0,01 % nukleované buněčné populace

kostní dřeně, existuje až 8,6 x 10⁴ buněk stromatu na gram adipózní tkáně (Sen et al. 2001, Journal of Cellular Biochemístry 81: 312-319) . Ex vivo expanze během 2 až 4 týdnů poskytne až 500 milionů buněk stromatu z 0,5 kg adipózní tkáně. Tyto buňky lze použít okamžitě nebo je lze konzervovat zamražením pro budoucí autologní nebo alogenní aplikace.

Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně rovněž exprimují určitý počet adhezních a povrchových proteinů. Tyto zahrnují markéry buněčného povrchu, jako například CD9; CD2 9 (integrin beta 1) ; CD44 (receptor hyaluronátu) ; CD49d,e (integrin alfa 4,5); CD54 (ICAM1); CD55 (faktor urychlující rozpad); CD105 (endoglin); CD106 (VCAM-1); CD166 (ALCAM) a HLA-ABC (antigen histokompatibility 1. třídy); a cytokiny, jakými jsou například interleukiny 6, 7, 8, 11; makrofágové-kolonie stimulující faktor; GMkolonie stimulující faktor; granulocytové-kolonie stimulující faktor; leukémii inhibující faktor; faktor kmenových buněk a kostní morfogenetický protein. Mnoho těchto proteinů má potenciál vykazovat krvetvorbu podporující funkci a všechny jsou společně sdíleny buňkami stromatu kostní dřeně.

Byly popsány způsoby izolace, expanze a diferenciace buněk odvozených z lidské adipózní tkáně. Viz například Burris et al. 1999, Mol Endocrínol 13: 410-7; Erickson et al. 2002, Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jan 18; 290 (2) : 763- 9; Gronthos et al. 2001, Journal of Cellular Physiology, 189: 54-63; Halvorsen et al. 2001, Metabolism 50: 407-413; Halvorsen et al. 2001, Cell Eng. 7 (6) : 72941; Harp et al. 2001, Biochem Biophys Res Commun 281: 907912; Saladin et al. 1999, Cell Growth & Diff 10: 43-48; Sen et al. 2001, Journal of Cellular Biochemístry 81: 312-319;

I

Zhou et al. 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517. Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně se získají z rozemletí lidské adipózní tkáně digescí kolagenasy a diferenciálním odstředóváním [Halvorsen et al. 2001, Metabolism 50: 407413; Hauner et al. 1989, J Clin Invest 84: 1663- 1670; Rodbell et al. 1966,. J Biol Chem 241: 130-139]. Ostatní prokázaly, že buňky stromatu odvozené z lidské adipózní tkáně lze diferencovat po drahách adipocytové, chondrocytové a osteoblastové linie [Erickson et al. 2002, Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jan 18; 290 (2) : 763-9; Gronthos et al. 2001, Journal of Cellular Physiology, 189: 54-63; Halvorsen et al. 2001, Metabolism 50: 407-413; Halvorsen etal, 2001, Tissue Eng. 2001 Dec; 7 (6): 729-41; Harp et al. 2001, Biochem Biophys Res Commun 281: 907- 912; Saladin et al. 1999, Cell Growth & Diff 10: 43-48; Sen et al. 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81: 312-319; Zhou et al. 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al. 2001, Tissue Eng. 7: 211-228.

Dospělé buňky stromatu odvozené z lidské adipózní tkáně lze expandovat ex vivo, diferencovat po unikátních liniových drahách, geneticky zpracovat, a opět zavést do těla jednotlivců buď ve formě autologní nebo alogenní transplantace.

WO 00/53795 (University of Pittsburgh a The Regents of University of, California) a patentová přihláška US 2002/0076400 (University of Pittsburgh) popisují kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně a mřížky v podstatě prosté adipocytú a červených krvinek a klonální populace kmenových buněk pojivové tkáně. Tyto buňky lze použít, samotné nebo v rámci biologicky kompatibilních kompozic, ke generování diferencovaných tkání a struktur, jak in vivo, tak in vitro. Kromě toho lze buňky expandovat a kultivovat, aby

produkovaly hormony a poskytovaly kondiciovaná kultivační média pro podporu růstu a expanzi jiné buněčné populace. V další kategorií tyto publikace popisují z tuku odvozenou mřížku v podstatě prostou buněk, která zahrnuje extracelulární matricový materiál z adipózní tkáně. Tuto mřížku lze použít jako substrát pro usnadnění růstu a diferenciace buněk, in vivo nebo in vitro, v kitu nebo zralé tkáni nebo strukturách. Žádná z publikací nepopisuje buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně, které by byly indukované pro expresi alespoň jedné fenotypické nebo genotypické vlastnosti intraokulární buňky stromatu.

Patent US 6 391 297 (Artecel Sciences) popisuje kompozici obsahující izolovanou buňku stromatu odvozenou z lidské adipózní tkáně, která byla diferencována, aby vykazovala alespoň jednu vlastnost osteoblastu, kterou lze použít in vivo pro opravu kosti a pro léčbu onemocnění kosti. Tuto osteoblastu podobnou buňku odvozenou z adipózní tkáně lze případně geneticky modifikovat nebo kombinovat s matricí.

Patent US 6 426 222 (BioHoldings International) popisuje způsoby indukce diferenciace osteoblastu z lidské extramodulární adipózní tkáně inkubací buněk adipózní tkáně v kapalném nutričním médiu, které musí obsahovat glukokortikoid.

WO 00/44882 a Patent US 6 153 432 (kde jsou jako vynálezci zapsání Halvorsen et al.) popisují metody a kompozice pro diferenciaci lidských preadipocytů izolovaných z adipózní tkáně na adipocyty nesoucí biochemické, genetické a fyziologické vlastnosti podobné těm, které lze pozorovat u izolovaných primárních adipocytů.

• · · · · ···· • * · · · · · · ····· • · ······ ······· ··· ·· «· ·

WO 01/62901 a publikovaná patentová přihláška US 2001/0033834 (Artecel Sciences) popisuje buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně, které byly indukovány k expresi alespoň jedné fenotypické vlastnosti neuronálního, astrogliového, hematopoietického progenitoru nebo hepatické buňky. Kromě toho jsou zde rovněž popsány buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně, které byly dediferencovány tak, že postrádají adipocytové fenotypické markéry.

Patent US 6 429 013 (Artecel Sciences) popisuje kompozice obsahující buňku stromatu odvozenou z izolované adipózní tkáně, která byla indukována k expresi alespoň jedné vlastnosti chondrocytu. Jsou zde rovněž popsány způsoby diferenciace těchto buněk.

Patent US 6 200 606 (Peterson et al.) uvádí, že prekurzorové buňky, které mají potenciál tvořit kost nebo chrupavku, lze izolovat z celé řady hematopoetických a nehematopoetických tkání, včetně periferní krve, kostní dřeně a adipózní tkáně.

Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně použitelné v rámci metody podle vynálezu se izolují celou řadou různých pro odborníky v daném oboru známých metod, například za použití metod popsaných ve WO 00/53795 (University of Pittsburgh et al.) a WO 00/44882 a patentu US 6 153 432 (Zen-Bio, lne.) U výhodného způsobu se adipózní tkáň izoluje z těla savce, výhodně z těla člověka. Výhodným zdrojem adipózní tkáně je subkutánní adipózní zdroj. U lidí se adipózní tkáň zpravidla izoluje liposukcí. Pokud mají být buňky podle vynálezu transplantovány do těla člověka, potom je výhodné, pokud se adipózní tkáň izoluje z těla

stejného jedince, a poskytne se tak autologni transplantát. Alternativně může být transplantovaná tkáň alogenní.

Jako neomezující příklad lze uvést případ, kdy se u způsobu izolace buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně na adipózní tkáň aplikuje kolagenasa v koncentracích 0,01 % až 0,5 %, výhodně 0,04 % až 0,2 %, nej výhodně ji 0,1 %, trypsinem v koncentracích 0,01 % až 0,5 %, výhodně 0,04 % až 0,04 %, nejvýhodněji 0,2 %, při teplotách 25 °C až 50 °C, výhodně 33 °C až 40 °C, nejvýhodněji při 37 °C, po dobu 10 min až 3 h, výhodně 3 0 min až 1 h, nej výhodně ji 45 min. Buňky se protáhnou přes nylonový nebo mušelínový filtr s velikostí ok 20 pm až 800 pm, výhodněji 40 pm až 400 pm, nejvýhodněji 70 pm. Buňky se následně podrobí diferenciální centrifugací přímo v mediích nebo gradientově centrifugací na roztoku Ficoll nebo Percoll nebo jiné částicové gradientově centrifugací. Buňky se odstřeďují při rychlostech lOOx až 3000xG, výhodněji 200x až 1500xG, nejvýhodněji při 500xG po dobu 1 min až 1 h, výhodněji 2 min až 15 min, nejvýhodněji 5 min, při teplotách 4 °C až 50 °C, výhodně 20 °C až 40 °C, nejvýhodněji při 25 °C.

U ještě dalšího způsobu izolace buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně se používá mechanický systém, jaký je například popsán v patentu US 5 786 207 (Katz et al.). Tento systém se používá pro zavedení vzorku adipózní tkáně do automatizovaného přístroje, kde vzorek podstoupí proplachovací fázi a disociační fázi, přičemž tkáň je zde míchána a odstřeďována a výsledná buněčná suspenze se j ímá do nádobky vhodné pro přímé zavedení do odstředivky. Tímto způsobem se ze vzorku tkáně izolují buňky odvozené z adipózní tkáně a současně se zachová celulární integrita požadovaných buněk.

ι

III. Indukce buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně k tomu, aby vykazovaly alespoň jednu vlastnost okulární buňky

Součástí vynálezu je ošetření buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně, které indukuje tvorbu buňky, jež exprimuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost okulární buňky. Neomezující příklady jak indukovat diferenciaci buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně zahrnují: 1) použití buněčných medií; 2) použití nosných buněk; 3) přímou implantaci nediferencovaných buněk do tkáně pacienta; a 4) techniky buněčného inženýrství.

A) Indukce za použití buněčných médií

Aniž by se vynález vázal na některou konkrétní teorii, předpokládá se, že ošetření buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně médiem obsahujícím kombinaci séra, embryonálních extraktů, purifikovaných nebo rekombinantních růstových faktorů, cytokinů, hormonů, a/nebo chemických činidel, ve dvourozměrném nebo trojrozměrném mikroprostředí, bude indukovat diferenciaci.

Konkrétněji vynález poskytuje způsob diferenciace buněk odvozených z adipózní tkáně na buňku mající genotypickou nebo fenotypickou vlastnost pankreatické buňky, přičemž tento způsob zahrnuje: rozprostření izolovaných dospělých kmenových buněk odvozených z adipózní tkáně v požadované hustotě na plotny, například v hustotě přibližně 1000 buněk/cm² až přibližně 500 000 buněk/cm²; inkubaci buněk v chemicky definovaném kultivačním médiu obsahujícím alespoň jednu sloučeninu zvolenou z množiny sestávající z růstového faktoru, hormonu, cytokinů, sérového faktoru, kapaliny receptorů jaderných hormonů nebo libovolného dalšího definovaného chemického činidla.

U ještě dalšího aspektu vynálezu se diferencované buňky podle vynálezu pěstují v kulturách, dokud se neobjeví důkaz tvorby korneálního epitelu. Media obsahující epitel se potom analyzuj í odborníkům v daném oboru známými standardními biochemickými analytickými technikami určenými pro stanovení přítomnosti markérů, které by indikovaly korneální epiteliální funkci. Vrstvy korneálního epitelu se následně naroubují do tkáně hostitele za účelem vytvoření nebo regenerace tkáně.

Základní média použitelná v rámci způsobů podle vynálezu zahrnují neomezujícím způsobem Neurobasal (případně doplněný fetálním bovinním sérem nebo bazickým fibroblastickým růstovým faktorem (bFGF)), N2, B27, Minimální Essential Médium Eagle, ADC-1, LPM (prostý albuminu bovinního séra), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ Médium (s a bez modifikace FittonJackson), Basal Medium Eagle (BME-s přídavkem báze Earleho soli), Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM-bez séra), Yamane, IMEM-20, Glasgow Modification Eagle Médium (GMEM), Leibovitz L-15 Médium, McCoy's 5A Médium, Médium M199 (M199E-S bází Earleho soli), Médium M199 (M199H-S bází Hankeho soli), Minimum Essential Médium Eagle (MEM-E- s bází Earleho soli), Minimum Essential Médium Eagle (MEM-Hs bází Hankeho soli) a Minimum Essential Médium Eagle (MEMNAA- s neesenciálními aminokyselinami), a celá řada dalších, včetně média 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411,MDBC 153. Výhodným médiem pro použití v rámci vynálezu je DMEM. Tato a další použitelná média jsou mimo jiné k dispozici u společnosti GIBCO, Grand Island, N. Y., USA a Biological Industries, Beth Aemek, Israel. Seznam celé řady těchto médií je sumarizován v Methods in Enzymology, Volume LVIII, „Cell Culture, pp. 62-72 (ed. Jakoby a Pastan, Academie Press, lne).

Výhodná media pro kultivaci korneálních epiteliálních buněk jsou v daném oboru známá a zahrnují media popsaná v patentu US 5 912 175 (Wille, Jr.) . Obecně platí, že media použitelná v rámci způsobů podle vynálezu budou zahrnovat fetální sérum bovinního nebo jiného druhu v koncentraci alespoň 1 % až přibližně 30 %, výhodně alespoň přibližně 5 % až 15 %, nejvýhodněji přibližně 10 %. Embryonální extrakty kuřecího nebo jiného druhu jsou přítomny v koncentraci přibližně 1 % až 30 %, výhodně alespoň přibližně 5 % až 15 %, nejvýhodněji přibližně 10 %.

Růstové faktory, cytokiny a hormony použité v rámci vynálezu zahrnují neomezujícím způsobem růstový hormon, erytropoetín, trombopoetín, ínterleukin 3, interleukin 6, interleukin 7, makrofáqové kolonie stimulující faktor, c-kit ligand/faktor kmenové buňky, ligand osteoprotegerinu, inzulín, inzulínu podobné růstové faktory, epidermální růstový faktor, fibroblastový růstový faktor, nervový růstový faktor, ciliární neurotrofní faktor, z krevních destiček odvozený růstový faktor a kostní morfogenetický protein v koncentracích pg/ml až mg/ml. Při takových koncentracích jsou například růstové faktory, cytokiny a hormony použitelné v rámci způsobů podle vynálezu schopny z buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně při testech jednotek tvořících kolonie (CFU) indukovat až 100 % tvorbu krevních buněk (linie lymfoidu, erytroidu, myeloidu nebo krevní destičky) . (Moore et al. (1973) J. Nati. Cancer

Inst. 50: 603-623; Lee et al. (1989) J. Immunol. 142: 38753883; Medina et al. (2993) J. Exp. Med. 178: 1507-1515.

Rovněž se zjistilo, že do kultivačního média lze přidat i další složky. Těmito složkami mohou být antibiotika, albumin, aminokyseliny a další složky, které jsou v oblasti zabývající se kultivací buněk známy. Kromě toho lze přidat složky, které zlepší proces diferenciace. V médiu mohou být obsažena i další chemická činidla, která zahrnují neomezujícím způsobem steroidy, retinoidy a další chemické sloučeniny nebo činidla, která indukují alespoň o 25 % až 50 % vyšší diferenciaci buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně, než je tomu v případě pozitivní kontroly.

Zjistilo se, že výše popsané podmínky buněčných medií poskytnou buňku, která exprimuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost jednoho typu pankreatické buňky, tj . pankreatické alfa, beta, delta nebo PP buňky. Konkrétní buněčné typy se separují libovolným odborníkům v daném oboru známým způsobem. Zvláště výhodné jsou prostředky, které využívají genotypické nebo fenotypické vlastnosti exprimované diferencovanými buňkami. Fenotypické markéry požadovaných buněk, jejichž seznam je uveden níže, jsou odborníkům v daném oboru známé, a hojně publikované v literatuře. Nicméně do rozsahu vynálezu patří i další fenotypické markéry, které lze identifikovat bez provádění dalších experimentů. Veškeré tyto markéry se používají pro potvrzení toho, že se dospělé kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně indukovaly k diferencovanému stavu.

Liniově specifické fenotypické vlastnosti mohou zahrnovat neomezujícím způsobem proteiny buněčného povrchu, cytoskeletové proteiny, buněčnou morfologii a/nebo sekreční produkty. Diferencované korneální epiteliální buňky

například syntetizují receptory pro transformaci růstového faktoru βΐ a β2 (TGFJ3) , insulinu podobného růstového faktoru (IGF), bazického fibroblastového růstového faktoru (bFGF), hepatického růstového faktoru (HGF), a keratinocytového růstového faktoru (KGF) (Kruše & Volcker, 1997, Curr Opin Opthalmol; 8 (4): 46-54). Odborníkovi v daném oboru my mělo být jasné, že kalorimetrické, fluorescenční, imunochemické, polymerázová řetězová reakce, chemické nebo radiochemické metody jsou schopny snadno odhalit přítomnost nebo absenci pro linii specifického markéru.

U dalšího provedení vynález poskytuje dediferencovanou dospělou kmenovou buňku odvozenou z izolované adipózní tkáně, která může být indukována k expresi alespoň jedné genotypické nebo fenotypické vlastnosti okulární buňky v kultivačním médiu schopném takové diferenciace. Dediferencovaná dospělá kmenová buňka odvozená z izolované adipózní tkáně je identifikována na základě absence zralých adipocytových markérů.

B) Použití podpůrných buněk pro podporu diferenciace buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně

U dalšího provedení podle vynálezu, se používají podpůrné buňky pro podporu diferenciace buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně. Buňky odvozené z adipózní tkáně podle vynálezu se izolují a kultivují v populaci buněk, přičemž nejvýhodnějš£ populací je definovaná populace. Populace buněk je heterogenní a zahrnuje podpůrné buňky pro dodání faktorů buňkám podle vynálezu. Podpůrné buňky zahrnují další typy buněk, které budou podporovat diferenciaci, růst a zachování požadovaných buněk. Pokud je žádoucí buňka stromatu odvozená z adipózní tkáně, která exprimuje alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost korneální epiteliální buňky, potom se libovolným výše popsaným způsobem nejprve izolují buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně, a nechají růst v kultuře v přítomnosti dalších okulárních nebo neokulárních podpůrných buněk. U dalšího provedení se podpůrné buňky odvodí z primárních kultur těchto typů buněk odebraných z kultivované korneální tkáně. U ještě dalšího provedení se podpůrné buňky odvodí z imortalizovaných buněčných linií. U některých provedení se podpůrné buňky získají autologně. U dalších provedení se podpůrné buňky získají allogenně.

Předložený vynález rovněž počítá s tím, že lze buňky použité pro podporu diferenciace požadované buňky geneticky zpracovat tak, aby se chovaly jako podpůrné buňky. Tyto buňky jsou geneticky modifikované k tomu, aby exprimovaly exogenní geny nebo potlačovaly expresi endogenních genů libovolným níže popsaným způsobem, který je odborníkům v daném oboru znám. Způsob genetické modifikace buněk podle vynálezu zahrnuje vystavení buněk působení holých nukleokyselinových fragmentů (tj . DNA nebo RNA), kdy se nukleové kyseliny zabudují do genomu buňky způsobem, při kterém se nukleové kyseliny exprimují v buňce. Alternativně lze buňky podle vynálezu vystavit vektoru genového přenosu, který obsahuje nukleovou kyselinu zahrnující transgen, takže se nukleová kyselina zavede do buňky za podmínek vhodných pro expresi transgenu v buňce.

I • · · · ··· · · · · • * ··· ···· • · · · · ··· ····· • · ······ ··· ···· ··· ·· ·· ·

C) Implantace

V dalším aspektu vynález poskytuje buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně a diferencované buňky exprimující alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost okulární buňky, která je použitelná při autologních a alogenních transplantacích. Výhodně je subjektem savec, výhodněji je subjektem člověk.

Podle dalšího aspektu tedy vynález popisuje způsob poskytnutí diferencovaných buněk exprimujících alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost pankreatické buňky subjektu, přičemž tento způsob zahrnuje:

a) izolaci buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně;

b) umístění na plotny a inkubování buněk v médiu vhodném pro diferenciaci buněk; a

c) zavedení diferencovaných buněk do těla subjektu.

U dalšího provedení vynález představuje způsob poskytnutí nediferencovaných buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně subjektu, přičemž tento způsob zahrnuje:

a) izolaci buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně;

a

b) zavedení nediferencovaných buněk do těla subjektu.

V rámci vynález se rovněž počítá s tím, že pokud se nediferencované buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně zavedou do těla subjektu, potom se u jednoho konkrétního provedení zavedou přímo do poškozeného oka. U ještě dalšího aspektu vynálezu se nediferencované buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně zavedou společně s libovolnou podpůrnou buňkou nebo médiem nebo diferenciačním faktorem, které jsou zde popsány a které vytvoří prostředí vhodné pro in vivo diferenciací buněk stromatu. Těmito podpůrnými buňkami jsou • · ··· · · · · • · · · · · · · ····· • · ······ ··· 9··· 999 ·· «· · podle jednoho provedení například amniotické buňky. U dalšího provedení jsou podpůrné buňky odvozeny z primárních kultur těchto typů buněk odebraných z kultivované korneální tkáně. U ještě dalšího provedení se podpůrné buňky odvodí z imortalizovaných buněčných linií. U některých provedení se podpůrné buňky získají autologně. U dalších provedení se podpůrné buňky získají allogenně.

U dalšího provedení je poskytnuta dediferencovaná buňka odvozená z adipózní tkáně v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem pro terapeutické aplikace, které zahrnují neomezujícím způsobem opravu, regeneraci, rekonstrukci nebo zlepšení stavu tkáně. Buňky odvozené z adipózní tkáně lze kultivovat způsoby popsanými v patentu US 6 153 432 (zde zabudovaném pouze formou odkazu) k dediferenciaci buněk, takže dediferencované dospělé kmenové buňky lze následně indukovat k expresi genotypických nebo feno-typických vlastností buněk jiných než jakými jsou buňky odvozené z adipózní tkáně. Dediferencované buňky odvozené z adipózní tkáně jsou modifikované tak, aby zahrnovaly ne-endogenní genovou sekvenci pro produkci požadovaného proteinu nebo peptidu. Dediferencovaná buňka odvozená z adipózní tkáně může být u alternativního provedení podána hostiteli ve dvojrozměrné nebo trojrozměrné matricí ve snaze dosáhnout požadovaného terapeutického účinku. U jednoho provedení se dediferencovaná buňka získá autologně z pacientových vlastních buněk. Alternativně se dediferencovaná buňka získá alogenně.

D) Genetická manipulace buněk odvozených z adipózní tkáně podle vynálezu

Kmenové buňky a jejich progeny jsou důležitými cíly pro genovou terapii, při které se zavádějí geny podporující zdraví jednotlivců, kterým se kmenové buňky transplantovaly.

U ještě dalšího provedení se buňka odvozená z adipózní tkáně exprimující alespoň jednu genotypickou nebo fenotypickou vlastnost okulární buňky geneticky modifikuje, aby exprimovala exogenní geny nebo potlačovala expresi endogenních genů. Vynález poskytuje způsob genetické modifikace takových buněk a populací. Jeden způsob geneticky modifikace buněk podle vynálezu zahrnuje vystavení buněk působení holých fragmentů nukleové kyseliny (tj . DNA nebo RNA), kdy se nukleové kyseliny zabudují do genomu buňky tak, že se budou nukleové kyseliny exprimovat uvnitř buňky.

Alternativně se buňky podle vynálezu vystaví vlivu vektoru genového přenosu, který obsahuje nukleovou kyselinu zahrnující transgen, kdy se nukleová kyselina zavede do buňky za podmínek vhodných pro exprimaci transgenu uvnitř buňky. Transgenem může být exprimační kazeta zahrnující kódující polynukleotid operativně spojený s vhodným promotorem. Kódujícím polynukleotidem může kódovat protein nebo může kódovat biologicky aktivní RNA (např. protismyslnou RNA nebo ribozym). Kódující polynukleotid může tedy například kódovat gen vyvolávající rezistenci proti toxinu, hormonu, cytokinu, intracelulárnímu signálnímu zbytku navázanému na buněčném povrchu (např. molekuly buněčné adheze, receptory atd.), faktoru

podporujícímu růst nebo sekrece endogenního hormonu, peptidu nebo jiného faktoru nebo kteréhokoliv jiného buněčného produktu. Tam, kde je žádoucí použití technologie genového přenosu pro dodávku daného transgenu, je jeho sekvence známá.

V exprimační kazetě je kódující polypeptid operativně napojen na vhodný promotor. Příklady vhodných promotorů zahrnují prokaryotické promotory a virové promotory (např. retrovirové promotory, herpes virus promotory, cytomegalovirus promotory). Dalšími vhodnými promotory jsou eukaryotické promotory, jakými jsou například zesilovače, konstitutivné aktivní promotory, signálně specifické promotory a tkáňově specifické promotory. Odborníci v daném oboru budou schopni na základě svých znalostí zvolit příslušný promotor vhodný pro řízení genové exprimace v předem definovaném buněčném kontextu. Exprimační kazeta může zahrnovat více než jeden kódující polynukleotid, a může, pokud je to žádoucí, rovněž zahrnovat další prvky (např. poly-A sekvence, transkripční regulační prvky apod.).

Exprimační kazeta obsahující transgen by měla být zabudována do genového vektoru vhodného pro dodávku transgenu do buněk. V závislosti na finální aplikaci, lze takto použít pro genetickou modifikaci buněk libovolný vektor, například plasmidy, holé DNA, nebo viry. Rovněž lze použít libovolný způsob konstrukce požadované exprimační kazety uvnitř vektorů. Tyto způsoby jsou v daném oboru známy a zahrnují takové způsoby, jakými jsou například přímé klonování, homologní rekombinace apod. Odborníkům v daném oboru je známo, že volba vektoru bude vysokou měrou určena způsobem použitým pro zavedení vektoru do buněk.

·· · · · · ··« • · · · ··«· • · · « · · · ·«··»

Geneticky upravené buňky lze následně různými způsoby zavést do organizmu za podmínek vhodných pro exprimaci transgenu in vivo. U výhodného provedení podle vynálezu může tedy transgen kódovat růstové faktory, jakými jsou například TGF£3. Buňky obsahující transgen pro TGFJ3 lze následně zavést do oka nemocného člověka nebo jiného savce.

Alternativně se exogenní cizí nebo homologní nukleové kyseliny přenesou do buněk podle vynálezu celou řadou dalších technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Nukleové kyseliny se přenášejí například způsoby, které zahrnují, neomezujícím způsobem, elektroporaci, fosforečnan vápenatý, mikroinjektáž, lipofekce, retro- nebo další virový nebo mikrobiální vektor nebo libovolný další odborníkům v daném oboru známý prostředek.

E) Charakteristika buněk diferencovaný neomezuj ícím „Charakterizace výsledných diferencovaných buněk má za cíl identifikovat povrchové a. intracelulární proteiny, geny a/nebo další markéry, které jsou indikátorem liniové determinaci buněk stromatu na konkrétní koncový stav. Tyto metody mohou zahrnovat způsobem (a) detekci proteinů buněčného povrchu imunofluorescenčními metodami za použití proteinově specifických monoklonálních protilátek navázaných za použití sekundárního fluorescenčního tágu, včetně použití metody proudové cytometrie; (b) detekci intracelulárních proteinů imunofluorescenčními metodami za použití proteinově specifických monoklonálních protilátek navázaných za použití sekundárního fluorescenčního tágu, včetně použití metody proudové cytometrie; (c) detekci • · • · buněčných genů polymerasovou řetězovou reakcí, in sítu hybridizací a/nebo analýzy northernova přenosu. Konečně lze diferencované buňky charakterizovat identifikací povrchových a intracelulárních proteinů, genů a/nebo dalších markérů, které jsou indikátorem liniové determinace buněk stromatu do příslušného konkrétního koncového diferencovaného stavu. Tyto metody, které jsou popsány výše, zahrnují neomezujícím způsobem (a) detekci proteinů buněčného povrchu imunofluorescenčními testy, jakými jsou proudová cytometrie nebo in šitu imunozabarvení buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně, přičemž proteiny buněčného povrchu jsou například alkalická fosfatasa, CD44, CD146, integrin beta 1 nebo osteopontin (Gronthos et al. 1994 Blood 84: 4164-4173); (b) detekci intracelulárních proteinů imunofluorescenčními metodami, jakými jsou například průtoková cytometrie nebo in šitu imunozabarvení buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně za použití specifických monoklonálních protilátek; (c) detekci exprese liniově selektivních mRNAs, jakými jsou například TGF£1 a β2, IGF, bFGF a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), způsoby, jakými jsou například polymerasová řetězová reakce, in šitu hybridizace a/nebo další blotové (přenesení na plotnu) analýzy (Viz Gimble et al. 1989 Blood 74 :303-311) .

F) Použití Buněk podle vynálezu jako terapeutických činidel

Nejvýhodněji, buňky a populace podle vynálezu se použijí jako terapeutická činidla. U jednoho provedení se buňka stromatu odvozená z adipózní tkáně aplikuje do oka, výhodně do požadované oblasti, a nechá diferencovat buď skrze (i) souběžné podání příslušných cytokinů a dalších

999 9999 biologických faktorů, nebo (ii) in vivo faktory, které jsou již přítomné nebo které se indukují v těle hostitele. Obecně tyto způsoby zahrnuj í přenos buněk do požadované tkáně nebo depotu, buď in vitro ve formě transplantátu před implantací nebo in vivo do živočicha přímo. Buňky se přenesou do požadované tkáně libovolným vhodným způsobem, který se bude obecně měnit v závislosti na typu tkáně. Buňky se například Buňky lze například přenést do roubu koupelí roubu v kultivačním médiu obsahujícím buňky nebo infuzí kultivačního média obsahujícího buňky do tohoto roubu. Alternativně lze buňky naočkovat na požadovaném místě ve tkáni a založit tak populaci. Buňky lze přenést na místa in vivo za použití zařízení, která jsou odborníkům v daném oboru známá, například za použití katétrů, trocarů, kanyl nebo stentů naočkovaných buňkami atd.

Diferencované nebo nediferencované buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně podle vynálezu nacházejí uplatnění při léčbě různých poruch. Buňky se používají při léčbě poruch rohovky, které zahrnují neomezujícím způsobem: anirídíi neboli absenci duhovky; eythrokeratodermii neboli zčervenání a hyperkeratózu pokožky; keratitidu s násobnou endokrinní deficiencí; chemické poranění; tepelné poranění; keratopatii související s nošením kontaktních čoček; a opakované limbální chirurgické zákroky nebo limbální nedostatečnost. Kromě toho lze buňky podle vynálezu použít pro regeneraci rohovky po takových chirurgických zákrocích, jakými jsou například fotorefrakční keratektomie nebo laser in šitu keratomileusis, oba zahrnující odstranění částí rohovky. Regenerace po těchto zákrocích často vede k pooperačnímu přednímu „stromálnímu zákalu, který je charakterizován na zvířecích modelech objevením se myofibroblastických buněk exprimujících alfa aktin hladkého • · svalstva (α-SMA), čemuž může použiti buněk a způsobů podle vynálezu vynález úspěšně zabránit. Chorobný stav, který má být léčen, může být výsledkem autoimunitní dysfunkce nebo infekce virem nebo některým jiným infekčním činidlem.

IV. Tkáňové inženýrství

Zde popsané buňky lze použít ve tkáňovém inženýrství. Vynález poskytuje způsoby produkce živočišné látky, který zahrnuje zachování buněk podle vynálezu za podmínek dostatečných pro jejich expanzi a diferenciaci na požadovanou látku. Tato látka může například zahrnovat část oka. Zde popsané buňky se použijí v kombinaci s libovolnou známou technikou tkáňového inženýrství, mezi které lze zahrnout veškeré odborníkům v daném oboru známé techniky popsané v následujících patentech US: patent US 5 902 741 a US 5 863 531 (Advanced Tissue Sciences, lne.); patent US 6 139 574 (Vacanti et al.); patent US 5 759 830, (Vacanti et al.); patent US 5 741 685 (Vacanti); patent US 5 736 372 (Vacanti et al.); patent US 5 804 178 (Vacanti et al.); patent US 5 770 417 (Vacanti et al.); patent US 5 770 193 (Vacanti et al.); patent US 5 709 854 (Griffith-Cima et al.); patent US 5 516 532 (Atala et al.); patent US 5 855 610 (Vacanti et al.) ; patent US 5 041 138 (Vacanti et al.); patent US 6 027 744 (Vacanti et al.); patent US 6 123 727 (Vacanti et al.) ; patent US 5 536 656 (Kemp et al.); patent US 5 144 016 (Skjak-Braek et al.); patent US 5 944 754 (Vacanti); patent US 5 723 331 (Tubo et al.); a patent US 6 143 501 (Sittinger et al) .

Pro výrobu takové struktury je nutné udržovat buňky a populace podle vynálezu za podmínek vhodných pro jejich

expanzi a dělení za vzniku orgánu. To lze realizovat jejich přenosem do těla živočicha, zpravidla s ohledem na to, která nová hmota se požaduje. Vynález tedy muže usnadnit regeneraci části oka živočicha, do jehož příslušných tkání jsou tyto buňky implantovány.

U ještě dalších provedení se buňky indukují diferenciaci a expanzi do tkáně in vitro. V tomto případě jsou buňky kultivovány na substrátech, které usnadňují tvorbu do trojrozměrných struktur vhodných pro vývoj tkáně. Buňky jsou tedy například kultivovány nebo naočkovány na bio-kompatibilní mřížku, například na mřížku, která zahrnuje extracelularní matrixový materiál, syntetické polymery, cytokiny, růstové faktory, atd. Tuto mřížku lze tvarovat do požadovaných tvarů, které usnadní vývoj jednotlivých typů tkáně.

Vynález tedy poskytuje kompozici obsahující buňky a populace a biologicky kompatibilní mřížku. Mřížku lze vyrobit z polymerního materiálu majícího vlákna jako pletivo nebo houba, zpravidla s otvory řádově 100 pm a přibližně 300 pm. Tyto struktury poskytuje dostatečnou plochu, na které mohou buňky růst a proliferovat. Je žádoucí, aby mřížka byla během určité doby biologicky rozložitelná, takže se po vytvoření živočišné látky do této látky absorbuje. Vhodné polymery lze vyrobit z monomerů, jakými jsou kyselina glykolová, kyselina mléčná, propylfumarát, kaprolakton apod. Další mřížky mohou zahrnovat proteiny, polysacharidy, polyhydroxykyseliny, polyorthoestery, polyanhydridy, polyfosfozeny nebo syntetické polymery, zejména biologicky rozložitelné polymery nebo kteroukoliv jejich kombinaci. Mřížka může rovněž zahrnovat hormony, jakými jsou například růstové faktory, cytokiny, morfogeny (např. kyselinu retinovou atd.), požadované • · · · · • · · · · • · · · ♦ extracelulární matrixové materiály (např. fibronektin, laminin, kolagen atd.) nebo další materiály (např. DNA, viry, ostatní buněčné typy atd.), které jsou žádány.

Při tvorbě kompozice se buňky zavádějí do mřížky tak, že pronikají do intersticiálních prostor v mřížce. Mřížku lze například ponořit do roztoku nebo suspenze obsahující buňky, nebo je lze do mřížky zavádět infuzí nebo injekcí. Výhodně se použije hydrogel připravený zesilováním suspenze zahrnující polymer a mající v sobě dispergované buňky podle vynálezu. Tento způsob přípravy umožní dispergaci buněk v celém rozsahu mřížky a usnadní rovnoměrnější prostupnost mřížky buňkami. Samozřejmě, že kompozice může rovněž zahrnovat zralé buňky požadovaného fenotypu nebo jejich prekurzory, zejména pro umocnění indukce stimulovaných buněk v mřížce nebo pro podporu produkce hormonů, jakým je například inzulín nebo glukagon, v mřížce.

Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že mřížky vhodné pro začlenění do kompozice lze odvodit z libovolného vhodného zdroje, např. matrigelu, a mohou samozřejmě zahrnovat komerční zdroje pro vhodné mřížky. Další vhodnou mřížku lze odvodit z acelulární části adipózní tkáně, například extracelulární matrice adipózní tkáně v podstatě prosté buněk. Tyto matrice odvozené z adipózní tkáně zpravidla zahrnují proteiny, jakými jsou například proteoglykany, glykoproteiny, hyaluronin, fibronektiny, kolageny apod., přičemž všechny tyto látky slouží jako vynikající substráty pro růst buněk. Kromě toho tyto mřížky odvozené z adipózní tkáně mohou obsahovat hormony, cytokin, růstové faktory apod. Odborníci v daném oboru jsou seznámeni se způsoby izolaci takové mřížky odvozené z adipózní tkáně, které jsou například popsány ve WO 00/53795 (University of Pittsburgh) jejíž obsah je zde uveden formou odkazu.

Buňky, populace, mřížky a kompozice podle vynálezu se používají při inženýrství a regeneraci tkáně. Vynález se tedy týká implantovatelné struktury zabudovávající libovolný ze zde popsaných inventivních znaků. Přesná povaha implantátu se bude měnit v závislosti na požadovaném použití. Implantát může obsahovat zralou tkáň nebo může obsahovat nezralou tkáň nebo mřížku. Implantát může tedy například obsahovat populaci buněk podle vynálezu, u které probíhá pankreatická diferenciace, případně naočkovanou uvnitř mřížky o vhodné velikosti a rozměrech. Takový implantát se vstříkne nebo naroubuje do těla hostitele, čímž se podnítí tvorba nebo regenerace okulární tkáně pacienta.

Mřížky odvozené z adipózní tkáně se běžně používají jako součást kitu buněčné kultury. Vynález tedy dále poskytuje kit zahrnující mřížky podle vynálezu odvozené z adipózní tkáně a jednu nebo více dalších složek, jakými jsou například hydratační činidla (např. voda, fyziologicky kompatibilní solné roztoky, připravená media buněčných kultur, sérum nebo jejich substráty buněčných kultur kombinace nebo deriváty), (např. mističky, plotny, lahvičky atd.), media buněčných kultur (je jedno jestli v kapalné nebo práškové formě), antibiotika, hormony apod. Kit může sice zahrnovat libovolnou takovou složku, nicméně výhodně zahrnuje všechny složky nezbytné pro podporu kultivace a růstu požadovaných buněk po správném skombinování. Pokud je to žádoucí, potom může požadovaný kit rovněž obsahovat buňky, naočkované do mřížky.

Předložený vynález bude nyní objasněn podrobněji za použití následujících příkladů. Nicméně je třeba zdůraznit, že tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Induktivní metody in vitro

Kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně se izolují již popsaným způsobem z odpadního materiálu po liposukci (Sen et al. , 2001, J. Cell Biochem. 81, 312-319). Kultivace buněk pokračuje v přítomnosti (neomezující výčet) následujících médií: Neurobasal (InVi trogen) obohacený nebo neobohacený fetálním bovinním sérem (FBS) , N2, B27 (InVitrogen) nebo bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF). Modulace hladiny glukózy se provádí v médiích. Buňky očkují v různých hustotách a zavádějí v intervalech každé 3 dny až 6 dnů. Nej výhodně ji se očkují v hustotě přibližně 1000 buněk/cm² až přibližně 500 000 buněk/cm².

Během kultivační periody se kondiciovaná media analyzují za použití komerčně dostupných rádio-imunotestů nebo imunosorpčních testů enzymového navázání zaměřených na biochemické markéry a exprimaci fenotypických markérů souvisejících s okulárními buňkami stromatu nebo korneálními epiteliálními buňkami. Imunohistochemické(IHC) analýzy se prováděly za použití protilátek proti (ne výlučně) libovolnému výše popsanému fenotypickému markéru.

• · · · • · · · · · I

Příklad 2

Celulární Biochemistry standardizovaná laserová

Použití buněk odvozených z adipózní tkáně společně s biokompatibilní membránou

Tento příklad poskytuje některé způsoby použití buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně v nediferencovaném nebo adipocyty diferencovaném stavu v kompozici společně s biokompatibilním materiálem pro transplantaci při opravě intra-okulární léze. Pacienti, kteří podstupují chirurgický zákrok, jakým je fototerapeutická keratektomie prováděná za použití 193nm excimerového paprsku generovaného v VISX Star S2 Excimer Laser (VISX, lne., Santa Clara, CA) a dopravovaného při 10 Hz při hustotě prošlé energie

160 mJ/cm², jak popisuje Lee et al. (2001, Journal of

81: 312-319). Provedla se fotoablace pomocí centrálního laseru o průměru 6 mm při nastavení hloubky pro epiteliální debridement 45 pm a při příslušném nastavení pro stromální ablaci. Po PRK se buď nediferencované nebo adipocyticky diferencované dospělé kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně zavedou do oblasti, kde byla provedena ablace, a to v kompozici obsahující rovněž biokompatibilní materiál. Před zavedením se buňky odvozené z adipózní tkáně kultivují řízeným způsobem na povrchu biokompatibilní membrány, která zahrnují neomezujícím způsobem, amniotickou membránu, prasečí intestinální submukózu, kožní štěpy Ampligraft a Dermagraft nebo podobný produkt. Buňky odvozené z adipózní tkáně se kultivují jako nediferencované fibroblastu-podobné buňky nebo jako buňky indukované k tomu, aby prošly adipocytovou diferenciací způsoby popsanými v Halvorsen et al. (2001, Metabolism 50: 407-413). Tento kompozit buněk a biomateriálu se nařeže na velikost, která bude odpovídat velikosti defektu. Povrch buněk odvozených z adipózní tkáně se umístí vedle obnažené plochy rohovky. Kompozit buněk a biomateriálu se k tomuto místu přišije pomocí 10-0 nylonu a přerušovaných nebo kontinuálních stehů v rohovce a limbu; veškerý přebytečný kompozit se odřízne (Anderson et al. 2001,. Br J Ophthalmol; 85 (5) : 567-575) . Po provedení chirurgického zákroku se zavedou jednorázové bandážové kontaktní čočky a nakapou se topická antibiotika. Pacienti se hodnotí postoperativně 1 až 4 dny po chirurgickém zákroku a po příslušnou časovou periodu (až jeden měsíc) se udržují na léčbě antibiotiky. Potom následují vyšetření, která se provádějí po 1, 3 a 6 měsících a zahrnují testování vizuální ostrosti, manifestace vyšetření štěrbinovou lampou a in vivo mikroskopii.

refrakce, konfokální

Příklad 3

Metody genové terapie

Dále budou popsány způsoby převedení buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně na buňky exprimující alespoň jeden růstový faktor nebo protein urychlující intraokulární opravu (TGF blokující protein), které používají libovolný vektorový přístup (virový, transfekční, atd.). Pacienti, kteří postupují chirurgický zákrok se podrobí fototerapeutické keratektomii za použití 193nm excimerového paprsku generovaného v VISX Star S2 Excimer Laser (VISX, lne., Santa Clara, CA) a dopravovaného při 10 Hz a při hustotě prošlé energie 160 mj/cm², jak popisuje Lee et al. (2001, Ophthalmology; 108(1): 112-20). Provedla se standardizovaná laserová fotoablace pomocí centrálního laseru o průměru 6 mm při nastavení hloubky pro epiteliální debridement 45 pm a při příslušném nastavení pro stromální ablaci. Po PRK se bud' nediferencované nebo adipocyticky diferencované dospělé kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně zavedou do oblasti, kde byla provedena ablace, a to v kompozici obsahující rovněž biokompatibilní materiál. Před zavedením se buňky are transfektují nebo transdukují pomocí příslušného nukleokyselinového vektoru exprimujícího rozpustný protein receptoru transformačního růstového faktoru beta typu II. Tento protein se naváže na cytokin transformačního růstového faktoru beta a inhibuje svou schopnost iniciovat signální transdukční kaskádu na buněčné úrovni (Rowland-Goldsmith et al. 2001, Clin Cancer Res. 2001,7 (9): 2931-40). O transformačním růstovém faktoru beta je známo, že interferuje s regenerací po korneálním zákroku a podporuje korneální fibrózu (Jester et al. 1997, Rohovka; 16 (2): 177-87).

Geneticky upravené buňky se následně kultivují řízeným způsobem v kompozici obsahující rovněž biokompatibilní materiál. Před zavedením se buňky odvozené z adipózní tkáně kultivují řízeným způsobem na povrchu biokompatibilní membrány, která zahrnují neomezujícím způsobem, amniotickou membránu, prasečí intestinální submukózu, kožní štěpy Ampligraft a Dermagraft nebo podobný produkt. Buňky odvozené z adipózní tkáně se kultivují jako nediferencované fibroblastu-podobné buňky nebo jako buňky indukované k tomu, aby prošly adipocytovou diferenciací způsoby popsanými v Halvorsen et al. (2001, Metabolism 50: 407413) . Tento kompozit buněk a biomateriálu se nařeže na velikost, která bude odpovídat velikosti defektu. Povrch buněk odvozených z adipózní tkáně se umístí vedle obnažené plochy rohovky. Kompozit buněk a biomateriálu se k tomuto

místu přišije pomocí 10-0 nylonu a přerušovaných nebo kontinuálních stehu v rohovce a limbu; veškerý přebytečný kompozit se odřízne (Anderson et al. 2001, . Br J

Ophthalmol; 85 (5): 567-575). Po provedení chirurgického zákroku se zavedou jednorázové bandážové kontaktní čočky a nakapou se topická antibiotika.

Pacienti se hodnotí postoperativně 1 až 4 dny po chirurgickém zákroku a po příslušnou časovou periodu (až jeden měsíc) se udržují na léčbě antibiotiky. Potom následují vyšetření, která se provádějí po 1, 3 a 6 měsících a zahrnují testování vizuální ostrosti, manifestace refrakce, vyšetření štěrbinovou lampou a in vivo konfokální mikroskopii.

Příklad 4

Jednoduchá transplantace

Buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně se transplantují jako takové intraokulárně. Pacienti, kteří podstupují chirurgický zákrok, jakým je fototerapeutická keratektomie prováděná za použití 193nm excimerového paprsku generovaného v VISX Star S2 Excimer Laser (VISX, lne., Santa Clara, CA) a dopravovaného při 10 Hz při hustotě prošlé energie 160 mJ/cm², jak popisuje Lee et al. (2001, Journal of Celulární Biochemistry 81: 312-319) .

Provedla se standardizovaná laserová fotoablace pomocí centrálního laseru o průměru 6 mm pří nastavení hloubky pro epiteliální debridement 45 pm a při příslušném nastavení pro stromální ablaci. Po PRK se buď nediferencované nebo adipocyticky diferencované dospělé kmenové buňky odvozené z adipózní tkáně zavedou do oblasti, kde byla provedena • · · · · • · · · · · • ··· ····· ablace přímou injektáží. Buňky se zavedou buď ve formě jednobuněčné suspenze nebo ve formě vrstev buněk. Po provedení chirurgického zákroku se zavedou jednorázové bandážové kontaktní čočky a nakapou se topická antibiotika.

Pacienti se hodnotí postoperat ivně 1 až 4 dny po chirurgickém zákroku a po příslušnou časovou periodu (až jeden měsíc) se udržují na léčbě antibiotiky. Potom následují vyšetření, která se provádějí po 1, 3 a 6 měsících a zahrnují testování vizuální ostrosti, manifestace refrakce, vyšetření štěrbinovou lampou a in vivo konfokální mikroskopii.

Příklad 5

Profil exprese cytokinů u kmenových buněk odvozených z lidské adipózní tkáně

Hodnotí se profil exprimace cytokinů u buněk stromatu odvozených z lidské adipózní tkáně získané od více dárců. U těchto experimentů se souvislé inaktivní kultury stromálních buněk odvozených z adipózní tkáně indukovaly lipopolysaccharidem (LPS, 100 ng/ml) a kondiciované médium a celá RNA se sklízeli po 1 hodině až 24 hodinách. V případě buněk stromatu odvozených jak z myší, tak z lidské kostní dřeně se prokázalo, že buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně exprimují následující cytokinové mRNAs: interleukiny 6, 7, 8, a 11 (IL-6, -7, -8, -11), leukémii inhibující faktor (LIF), makrofágové-kolonie stimulující faktor (M-CSF), granulocyt-makrofágové-kolonie stimulující faktor (GM-CSF), granulocytové-kolonie stimulující faktor (G-CSF), flt-3 ligand, faktor kmenových buněk, tumor nekrotizující faktor (TNFa)a kostní morfogenetické proteiny 2 a 4 t (BMP-2, -4).

Příklady 6

Schopnost kmenových buněk odvozených z lidské adipózní tkáně podporovat proliferaci a diferenciaci progenitorových buněk lidské pupečníkové krve

Určovala se schopnost buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně podporovat proliferaci a diferenciaci CD34⁺hematopoietických progenitorových buněk lidské pupečníkové krve v ko-kulturách. Spojité kultury buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně se založily ve 24jamkových plotnách (6 X 10⁴ buněk na jamku). Vzorky pupečníkové krve (UCB) se zbavily kontaminujících erythrocytů ošetřením Hetastarch a kontaminujících granulocytů hustotním odstřeďováním Ficoll. Zbývající UCB jednojaderné buňky se liniově vyprázdnily podle protokolu StemSep (StemCells, Vancouver, BC) ; který vychází ze selekce imunomagneticky negativních buněk za použití koktejlu protilátek působících proti CD2,CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b a glykoforinu A. Během posledního purifikačního kroku se líh' UCB buňky zabarvily pomocí CD34 protilátek a roztřídily průtokovou cytometrií. Až 10 000 finálních CD34⁺ UCB buněk se ko-kultivovalo jednotlivých jamkách se spojitou vrstvou buněk stromatu odvozených z adipózní tkáně. Kultury se po dobu of 12 dnů, 3 týdnů nebo 6 týdnů udržovaly v nepřítomnosti exogenních cytokinů. Na konci těchto period se jednotlivé jamky sklidily trypsinovou/EDTA digescí a analyzovaly průtokovou cytometrií za použití kombinace následujících kombinací protilátek (fluorescenční tágy jsou • · · · • · · · · • · · ····· označeny v závorkách) : CD45 (FITC) , CD34 (APC) a buď CD7, CD10 nebo CD38 (PE) . Výsledky těchto testů jsou shrnuty níže.

Tyto studie sledovaly expanzi populací UCB hematopoietických buněk ve 12denních adipózní stromální kulturou podporovaných kokulturách. Za absence exogenních cytokinů podporovaly buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně 5,lnásobně vyšší expanzi celkových počtů hematopoietických buněk (průměr, n = 4 stromální dárci, n = 2 UCB dárci; rozsah 2 - 9,4). To odpovídá 2,4násobně vyšší expanzi CD34⁺ UCB buněčné populace (průměr, n = 4 stromální dárci, n = 2 UCB dárci; rozsah 1,4 - 3,3) . Signifikantní procento CD34⁺ i CD34'buněk exprimovaných buď antigenem CD7 nebo CD10 (Obr. 4, průměr, n = 4 stromální dárci, n = 2 UCB dárci). Jednotlivé fenotypy reprezentovaly následující procenta celkové hematopoietické populace: rané lymfoidní progenitory, 20,2 % (CD34⁺CD7 ⁺ ) , resp. 9,5 % (CD34⁺CD10 ⁺ ) ;

NK/T-buněčné progenitory (CD34'CD7 ⁺ ) , 31,4 %; a B-buňka progenitory (CD34CD10 ⁺ ) , 7,7 %.

Další analýza naznačila, že dochází k signifikantní expanzi raných lymfoidních progenitorů. Populace CD34⁺CD7⁺se expandovala 4,8+2,2x během 12denní periody progenitorů (střední hodnota ± standardní odchylka, n = 4 stromální dárci, n = 2 UCB dárci). Podobně byla expanze populace

CD34⁺CD10⁺ 3,5±l,6vyšší než progenitorů (střední hodnota ± standardní odchylka, n = 4 stromální dárci, n = 2 UCB dárci). Tyto hodnoty překročily násobnou expanzi celkové CD34⁺ populace, z čehož vyplývá, že tento postup zvyšuje počet lidských lymfoidních progenitorů. Tyto výsledky naznačují, že buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně mohou podporovat diferenciaci hematopoietických progenitorových buněk in vitro.

Claims

1. Buňka stromatu odvozená z izolované adipózní tkáň indukované k expresi alespoň jedné vlastnosti okulární buňky.

2. Okulární buňka podle nároku 1 diferencovaná in vitro.

3. Okulární buňka podle nároku 1 diferencovaná in vivo.

4. Okulární buňka podle nároku 1, kdy je exogenní genetický materiál před diferenciací zaveden do buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně.

5. Okulární buňka podle nároku 1, kdy je buňkou lidská buňka.

6. Okulární buňka podle nároku 1 implantovaná do těla hostitele.

7. Okulární buňka podle nároku 1, kdy je do buňky zaveden exogenní genetický materiál.

• · až 8,

v.

»· · · • · • φ • · •·· «·φ·

8. Okulární buňka podle kteréhokoliv kdy je buňkou korneální epiteliální buňka.

• r· ·* » • · « t · · · • · · · · · 4 • · ··· ·····

1 · · · · « • •Φ ·· ·· · z nároků 1

9. Okulární buňka podle kteréhokoliv z kdy je buňkou okulární stromální buňka.

nároků 1

10. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje buňku stromatu odvozenou z izolované adipózní tkáně indukované k expresi alespoň jedné vlastnosti okulární buňky a biokompatibilní materiál.

11. Kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že se biokompatibilní materiál zvolí z množiny sestávající z amniotické membrány, kolagenu, hydrogelu, polykyseliny glykolové, polykyseliny mléčné, kyseliny polyglykolové/ polymléčné, hyaluronátu nebo fibrinu.

12. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že biokompatibilním materiálem je amniotická membrána.

13. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že je okulární buňkou korneální epiteliální buňka.

·· · ·· ··· • · · · · ··· • · · · ·«·· • · · · ··· ····· • ······ •·· ····· ·· ·

14. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že okulární buňkou je okulární stromálni buňka.

15. Způsob diferenciace buněk stromatu odvozených z izolované adipózní tkáně k tomu, aby vykazovaly alespoň jeden markér buňky související s okem, vyznačující se tím, že zahrnuje krok uvedení buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáň do kontaktu s místem intra-okulární tkáně v těle hostitele.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně získají od hostitele.

17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně izolují z těla dárce, který není hostitelem.

18. Způsob diferenciace buněk stromatu odvozených z izolované adipózní tkáně, aby vykazovaly alespoň jeden markér okulární buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáně do kontaktu s okulár indukující látkou.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že okulár indukující látka se nachází v chemicky definovaném médiu buněčné kultury.

20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že markérem okulární buňky je markér pro korneální epiteliální buňku.

21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že markérem okulární buňky je markér pro okulární buňku stromatu.

22. Způsob léčby oční nemoci, degenerativního stavu nebo pooperačního stavu hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje: i) indukci buňky stromatu odvozené z izolované adipózní tkáň k exprimaci alespoň jednoho markéru okulární buňky; a ii) transplantaci indukované buňky do těla hostitele.

23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně izolují z těla hostitele.

24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že oční nemocí, degeneratívním stavem nebo pooperačním stavem je aniridie, eythrokeratodermie, keratitida, chemické poranění; tepelné poranění; keratopatie spojená s nošením * * ··· ···· * · · ·· ··· ····· • · ······ ······· ··· · · ,, _β kontaktních čoček; opakované limbální chirurgické zákroky, limbální nedostatečnost, fotorefrakční keratektomie, laser in sítu keratomileusis, autoimunitní dysfunkce nebo virová nebo bakteriální infekce.

25. Způsob léčby oční nemoci, degenerativního stavu nebo pooperačního stavu hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje: i) izolaci buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně; a ii) transplantaci buňky do intra-okulárního místa v těle hostitele.

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že se buňky stromatu odvozené z adipózní tkáně izolují z těla hostitele.

27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, ze oční nemocí, degenerativním stavem nebo pooperačním stavem je aniridie, eythrokeratodermie, keratitida, chemické poranění; tepelné poranění; keratopatie spojená s nošením kontaktních čoček; opakované limbální chirurgické zákroky, limbální nedostatečnost, fotorefrakční keratektomie, laser in šitu keratomileusis, autoimunitní dysfunkce nebo virová nebo bakteriální infekce.

28. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že se buňka stromatu odvozená z adipózní tkáně před transplantací do těla hostitele dediferencuj e.