KR20030007089A - 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 입상 구조체 및그 제조방법 - Google Patents

폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 입상 구조체 및그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 약물을 함유하여 실질적으로 허용불가능한 초기 버스트 방출과 관련된 서방성 프레파라트로서 기능하나, 실질적으로 허용가능한 제로오더 방출을 소정 기간 보이는 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 해당 입상 구조체의 제조방법과, 그리고, 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체중에 약물을 안정적으로 편입시킬 수 있는 약물을 고함량 지니는 서방성 프레파라트 및 이러한 프레파라트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은, 또, 고기능성 폴리머화합물을 이용하는 동시에 오일상 및/또는 수상을 고상중에 편입시켜 이루어진 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 그 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 외부셸로서 단일의 폴리머멤브레인의 중공구조를 지니고 미립자중에 많은 기포를 함유가능한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 이러한 구조체를 고재현성으로 제조가능한 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체는, 특이한 구조의 폴리하이드록시알카노에이트와 소망의 목적용의 약물로 이루어지고, 이러한 구조체에는 오일상 및/또는 수상, 혹은 기상이 포함되어 있다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 입상 구조체 및 그 제조방법{PARTICULATE CONSTRUCT COMPRISING POLYHYDROXYALKANOATE AND METHOD FOR PRODUCING IT}
본 발명은, 모노머유닛으로서 적어도 3-하이드록시알칸산을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트(이하, "PHA"라 칭할 경우도 있음)를 함유하는 고상이 고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상을 편입(즉, 배합)시키고 있는 것을 특징으로 하는 마이크로캡술과 같은 입상 구조체 및 상기 PHA가 고상, 액상 및 기상의 적어도 적어도 1개의 상을 피복하고 있는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체에 관한 것이다. 본 발명은, 또, 수상 및 적어도 PHA를 함유하는 오일상으로 이루어진 w/o형 에멀젼 혹은 수상에 이러한 w/o형 에멀젼을 유화시켜 얻어진 w/o/w형 에멀젼으로부터, PHA에 고상, 액상 및 기상의 적어도 적어도 1개의 상을 편입 혹은 피복시키는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐과 같은 입상구조체의 제조방법, 예를 들면, 액중(in-liquid)건조, 상분리, 분무건조 혹은 유사한 방법에 의해 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 또한, 적어도 PHA를 함유하는 오일상 및 수상으로 이루어진 o/w형 에멀젼으로부터 PHA를 캡슐화하는(즉, 캡슐로 싸는) 제조방법에 있어서, 이러한 캡슐화는, 예를 들면, 코팅인 것을 특징으로 하는 방법, 예를 들면, 액중 건조, 상분리, 분무건조 혹은 유사한 방법에 의해 마이크로캡슐 등의 입상 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 수상 및 적어도 PHA를 함유하는 오일상으로 이루어진 w/o형 에멀젼 혹은 수상에 이러한 w/o형 에멀젼을 유화시켜 얻어진 w/o/w형 에멀젼에 있어서, 수상에 함유된 3-하이드록시아실 코엔자임 A와 PHA합성효소를 이용해서 PHA를 합성해서, 해당 PHA를 고상, 액상 및 기상의 적어도 적어도 1개의 상에 편입 혹은 피복시키고, 캡슐화가 코팅인 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 오일상 및 적어도 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 함유하는 수상으로 이루어진 w/o형 에멀젼에 있어서, 수상중의 PHA합성효소에 의해 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 중합함으로써 PHA를 캡슐화하는 데 있어, 상기 캡슐화가 코팅인 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 의약품 혹은 농약 등의 화학물질을 함유하는 서방형 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 상기 마이크로캡슐과 같은 입상구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 약품, 혹은 농약 등의 약물을 함유하는 서방성 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 상기 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 안료, 염료, 헤모글로빈, 화장품성분 혹은 비료성분을 함유하는 입상 구조체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 이러한 입상 구조체를 함유하는 잉크조성물, 혈액세포조성물, 화장품용 조성물 혹은 비료조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은, 또, 기상을 편입시킨 중공의 마이크로캡슐과 같은 중공의 입상 구조체, 그 제조방법 및 초음파반사부재로서 이러한 중공의 입상 구조체를 이용하는 초음파구조매체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 생체내로 경구 혹은 비경구적으로 투약되는 초음파 콘트라스트매체에 대해 상기 중공의 마이크로캡슐와 같은 중공의 입상 구조체를 적용해서 초음파진단에 이용하는 용도에 관한 것이다.
마이크로캡슐은, 의약품, 농약, 식품, 접착제 및 액정 등의 각종 분야에 있어서 연구되어 왔다. 예를 들면, 의약품분야에 있어서는, 서방성 프레파라트로서의 용도를 연구하여 짧았던 약물의 작용기간을 연장시켜, 연장된 약물효과 뿐만 아니라, 투약량, 부작용의 저감 등의 기타 효과와 비순응성의 개량 등이 기대되고 있다. 최근, 일정한 속도, 실질적으로 제로오더(zero-order)로 약물을 방출할 수있는 각종 방출량이 제어된 약물의 프레파라트가 제안되어 있다. 이러한 방출량이 제어된 프레파라트는, 경구투약, 주사, 피부패치용도를 위한 프레파라트로서 개발중에 있다.
마이크로캡슐도, 각종 다른 분야, 예를 들면, 화장품분야에서는, 불안정한 유효성분을 소망의 부위로 전달하여 서서히 방출시키는 수단으로서; 농약분야에서는, 서방성을 지닌 약물이나 비료로서; 기록재료분야에서는, 캡슐화 잉크로서 연구되고 있다.
의약품분야에 있어서는, 미국 특허 제 6,146,665호 공보에, 친수성 약물을 포획하는 폴리하이드록시알카노에이트의 미다공질 입자를 제조하는 방법 및 친지성(lipophilic) 약물이 용해되어 있는 오일방울인 코어재료를 폴리하이드록시알카노에이트외피로 둘러싸서 이루어진 의약품조성물이 개시되어 있다.
경구프레파라트가 광범위하게 연구·개발되어 많은 프레파라트가 시판되고 있으나, 주사프레파라트는, 인슐린의 저장프레파라트로 한정되어 있다. 이것에 의해, 서방능을 제공하는 폴리머화합물의 개발의 부족에 기인된다. 경구 프레파라트의 경우, 폴리머화합물이 인체에서 분해되지 않을 필요가 있고, 주사프레파라트에서는, 절대적으로 인체내에서 분해·대사되어 독성을 발현하는 일없이 인체로부터 배설될 필요가 있고, 또한, 주사부위에서의 국소분배가 없도록 하는 등의 다른 엄격한 조건을 필요로 한다.
이러한 상황하에서, 근년, 각종 폴리머성분, 구체적으로는, 수술작업에서의 꿰매는 실로 이용되는 폴리락트산, 락트산-글리콜산 공중합체 및 하이드록시부티르산 공중합체가 안전하고 유용한 폴리머화합물로서 기대되고 있다(일본국 공고특허 평 1-57087호 공보, WO 94/10982 및 일본국 공개특허 평 8-15133호, 평 8-217691호 공보 참조)
사실상, 이들 폴리머화합물에 있어서 친수성 약물을 함유하는 서방성 프레파라트를 제조하는 각종 마이크로캡슐화수법이 보고되어 있다. 3-하이드록시부티르산(이하, "PHB"라 칭함)에 대해서도, 활성 펩티드성분의 방출이 제어된 마이크로캡슐 및 락티드를 포획하고 있는 마이크로캡슐이 보고되어 있다(일본국 공개특허 소 61-431119호 공보, Drug Delivery System 7(5), 367-371, 1992 및 Drug Delivery System 8(2), 131-136, 1993). 3-하이드록시부티르산/4-하이드록시부티르산 공중합체에 대해서도, 생리활성물질의 방출속도를 모노머비로 제어가능한 서방성 프레파라트가 개시되어 있다(일본국 공개특허 평 11-199514호 공보).
이들 기술의 대부분은 수용성 약물을 포함한다. 예를 들면, 일본국 공개특허 소 60-100516호 공보 및 일본국 공개특허 소 62-201816호 공보에는, 수중 건조법을 높은 포획비로 사용함으로써 수용성 약물의 고도의 분산가능한 서방성 마이크로캡슐을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또, 일본국 공개특허 평 1-158529호 공보 및 일본국 공개특허 평 2-124814호 공보에는, 폴리락트산-글리콜산 공중합체중에 수용성 약물을 함유시키는 방법이 개시되어 있고, 일본국 공개특허 평 3-32302호 공보 및 일본국 공개특허 평 2-330741호 공보에는, 생리활성 폴리펩티드 및 EGF를 함유하는 서방성 프레파라트가 개시되어 있다. 또한, 일본국 공개특허 평 4-321622호 공보에는, 락트산/글리콜산비가 80/20 내지 100/0이고 중량평균분자량이 7,000 내지 30,000인 공중합체 혹은 단독중합체를 함유하는, 2개월이상 제로오더(zero-order)로 폴리펩티드를 방출가능한 장기서방성 마이크로캡슐이 개시되어 있다.
종래의 마이크로캡슐의 제조방법은, 계면중합, 인시튜(in-situ)중합 등의 화학적 방법, 상분리(코아세르베이션), 계면석출, 액중(in-liquid)건조, 오리피스법 등의 물리화학적 방법, 분무건조, 건조혼합 등의 기계적 방법으로 크게 분류할 수 있다. 이들 방법중, 계면중합, 인시튜중합, 액중건조, 오리피스법 및 상분리(코아세르베이션)가 수용성 제제를 마이크로캡슐화하는 데 적용되고 있다.
각종 생리활성 폴리펩티드 혹은 수용성 저분자량 약물을 함유하는 서방성 마이크로캡슐이 다수 보고되어 있으나(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 12, pp 1-9(1995); 일본국 공고특허 평 2-503315호 공보; EPA 0586238; J. Pharm, Sci., 75, pp 750-755(1986); 및 일본국 공개특허 소-57-118512호 공보), 이러한 마이크로캡슐의 대부분은, (1) 제조프로세스중에 외부 수상으로의 약물의 누설량이 높아 저포획률로 되고, (2) 얻어진 마이크로캡슐이 일반적으로 다공질이고 많은 초기방출을 보이거나, (3) 생리활성물질이 제조프로세스중에 변질되어 생리적 이용성이 불충분하므로, 용도에 따른 장기 서방성의 점에서 만족스럽지 못하다.
마이크로캡슐의 서방성의 개량에 관해서, 일본국 공개특허 소 61-63613호 공보에는, 기재로서 폴리락트산을 이용하는 마이크로캡슐에 있어서, 유기용매중에 가용이고 생체중에서 소화가능한 유용성 첨가제(중간사슬 지방산 트리글리세라이드,저급 지방산 트리글리세라이드 등)를, 폴리락트산의 이러한 유기용매용액중에 균일하게 용해시켜, 투약으로부터 소정 시간후에 폴리락트산계 마이크로캡슐에서의 활성 성분의 방출속도의 감소를 방지하는 것이 개시되어 있다. 그러나, 기타 기재나 활성 성분의 수용액을 이용하는 마이크로캡슐의 제조에 대해서는 교시되어 있지 않다. 일본국 공개특허 평 8-151321호 공보에는, S/O/W형 에멀젼으로부터 제조되는 비정질의 수용성 생리활성 물질과 폴리머를 함유하는 마이크로캡슐이 개시되어 있으나, 내부수상으로서 약물의 수용액을 함유하는 마이크로캡슐의 제조방법 혹은 수용성 생리활성 펩티드의 금속착체를 이용하는 방법에 대해서는 전혀 교시되어 있지 않다. 또, EP 0765660호에는, 프레파라트에 s/o/w에멀젼을 이용해서 비정질 2-피페라지논-1-아세트산유도체를 함유하는 마이크로캡슐이 개시되어 있으나, 내부수상으로서 약물의 수용액을 이용하는 마이크로캡슐의 제조방법이나 수용성 생리활성 펩티드의 금속착체를 이용하는 방법은 전혀 교시되어 있지 않다. 일반적으로, 수용성 생리활성 물질을 함유하는 마이크로캡슐의 제조시, w/o형이, 균일한 약물함량과 조작성을 고려해서, 약물을 고체상태로 이용하는 s/o형보다 우수하다. 따라서, w/o형이 공업적 규모의 양산에 바람직하다.
서방성 프레파라트를 이용하는 약물방출제어에서 종종 지적되고 있는 문제점은, 피검체에 대한 상기 프레파라트의 투약후 초기 방출단계시 다량의 약물이 방출되는 소위 초기 버스트(burst)현상이라 불리는 현상이다. 이러한 초기 버스트가 발생하면, 혈액중의 약물농도가 허용상한치를 초과하여 피검체를 위험하게 한다. 초기 버스트는, 약물화합물의 종류나 생분해성 폴리머의 구조를 선택함으로써 어느정도 방지할 수 있지만, 아직까지 초기 버스트를 방지하기 위한 기본적인 용액은 발견하지 못했다. 한편, 약물화합물을 장기간에 걸친 점차적인 방출을 실현하기 위하여, 혹은 프레파라트의 소정량중의 고가의 약물을 경제적인 이점에서 가능한 한 적게 배합시키기 위해, 마이크로캡슐중에 가능한 한 약물화합물의 농도를 높게 함유시키는 것이 요구되고 있다.
그러나, 종래 알려진 마이크로캡슐의 제조방법에 의하면, 마이크로캡슐중에 포획되는 약물화합물의 비율(포획비)이 낮아지고 있는 경향에 있다. 수용성 약물의 경우, 특히, 약물이 멤브레인밖으로 새나가는 경향이 있어 포획비가 낮아지는 것은 심각한 문제이다. 반면, 포획비를 높게 할 수 있는 방법으로 제조된 마이크로캡슐은, 초기 버스트가 약물방출중에 일어나는 경향이 있다고 하는 결점을 지니고 있다.
한편, 초음파진단이나 검사에 있어서, 초음파 반사제로서 생체에 폴리머의 미소구인 마이크로벌룬(microballoon)을 투여하는 것이 제안되어 있다. 액체중에 분산된 미소 기포, 즉, 마이크로버블은, 종래, 초음파진단이나 검사용의 매우 유효한 초음파반사기로 되는 것이 공지되어 있다. 그러나, 이러한 마이크로버블은, 안정제가 첨가된 경우에도 아무리 길더라도 수분내의 단시간에 소실되어 버릴 것이다. 이 때문에, 마이크로버블은, 제조직후 환자에게 투여하지 않으면 안되므로, 실제적인 수술장소에서 사용하기 곤란하다. 또, 인체에의 투여후 혈관을 통한 투과가 용이하도록, 해당 기포의 크기는 1 내지 10㎛정도의 범위내일 필요가 있다. 일반화된 마이크로버블의 대부분은, 40 내지 50㎛의 범위내이므로, 이러한 마이크로버블이, 초음파진단을 목적으로 해서 인체에 투여하는 데 반드시 적합한 것은 아니다.
이들 마이크로버블의 결점을 해소하기 위해, 인체에의 미소구 폴리머인 마이크로벌룬의 투여가 제안되어 있다(예를 들면, 일본국 공개특허 평 3-503684호 공보). 그러나, 종래의 방법으로 제조된 마이크로벌룬은, 높은 콘트라스트효과를 얻기 위해 다량 투입할 필요가 있다. 특히, 심근(심장근육)에 대해서, 상기 요구되는 높은 콘트라스트효과를 제공할 수 있는 유효한 콘트라스트매체는 없다. 이것은, 주로, 이러한 마이크로벌룬이 내부에 중공의 구조를 지니지 않아 내부에 기포를 함유하는 균일한 미소입자를 얻기 곤란하기 때문이다. 그 밖에, 이러한 마이크로벌룬은, 다량 투입시, 인체에 과도한 부담을 주게 되므로 안전상의 문제를 해결할 필요가 있다.
한편, 생물공학을 이용해서 폴리머화합물을 제조하는 연구가 활발히 진행되어 왔고, 그중 일부는 실용화되어 있다. 예를 들면, 공지의 미생물폴리머로서는, 폴리-3-하이드록시-n-부티르산(PHB), 폴리-3-하이드록시-n-부티르산과 폴리-3-하이드록시-n-발레르산과의 공중합체(PHB/V) 등의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)류; 박테리아 셀룰로스, 풀루란 등의 다당류; 폴리-γ-글루탐산, 폴리리신 등의 폴리아미노산류 등을 들 수 있다. 특히, PHA는 기타 현존하는 플라스틱과 같은 융합제법 등에 의해 각종 제품으로 처리될 수 있다. 또한, 의료용 연질부재로서의 PHA의 적용도 기대되고 있다.
많은 미생물이 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 것이 보고되어 있다. 예를 들면, 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus) H16(ATCC No.17699), 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.), 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) 또는 슈도모나스속(Pseudomonassp.)에 의한 PHB/V의 미생물생산이 보고되어 있다(일본국 공개특허 평 5-74492호 공보, 일본국 공개특허 평 6-15604호 공보, 일본국 공개특허 평 7-14352호 공보, 일본국 공개특허 평 8-19227호 공보 등). 또, 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans) IFO 13852는, 3-하이드록시-n-부티르산과 4-하이드록시-n-부티르산의 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 생산하고(일본국 공개특허 평 9-191893호 공보), 아에로모나스 카비에(Aeromonas caviae)가, 3-하이드록시-n-부티르산과 3-하이드록시-n-헥산산과의 공중합체를 생산한다(일본국 공개특허 평 5-93049호 공보 및 일본국 공개특허 평 7-265065호 공보).
이들 PHB 및 PHB/V의 생합성은, 생체내에서 각종 대사경로를 통해 각종 탄소원으로부터 합성되는 (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 혹은 (R)-3-하이드록시발레릴 CoA를 기질로서 이용한 효소중합반응이다. 이 중합반응을 촉매하는 효소는, PHB신타제(이것을 "PHB폴리메라제" 혹은 "PHB신타제"라 칭함)이다. CoA는 코엔자임A의 약어이고, 그 화학적 구조는 하기 화학식:
으로 표시된다.
최근, 중간사슬길이(탄소수가 약 3 내지 12개임)의 3-하이드록시알칸산으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트(mcl-PHA)에 대한 활발한 연구가 행해지고 있다.
예를 들면, 일본국 특허 제 2642937호 공보에서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347에, 비고리식 지방족 탄화수소로부터, 탄소수 6 내지 12의 3-하이드록시알칸산 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 생산할 수 있는 것이 개시되어 있다. 또, Appl. Environ. Microbiol, 58, 746(1992)에는, 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans)가 옥탄산을 단일 탄소원으로 이용해서, 3-하이드록시-n-부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산을 모노머유닛으로서 지닌 PHA를 생산하고, 또, 헥산산을 단일 탄소원으로 이용해서, 3-하이드록시-n-부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산을 모노머유닛으로서 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 여기서, 출발물질로서의 지방산보다도 사슬길이가 긴 3-하이드록시알칸산 모노머유닛은 하기 기재된 지방산 합성경로로부터 유도되는 것으로 추정된다.
Int. J. Biol. Macromol., 16(3), 119(1994)에는, 슈도모나스속 61-3균주가 글루콘산나트륨을 단일 탄소원으로 이용해서, 3-하이드록시-n-부티르산, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산 및 3-하이드록시데칸산 등의 3-하이드록시알칸산과, 3-하이드록시-5-cis-데센산, 3-하이드록시-5-cis-도데센산 등의 3-하이드록시알켄산의 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
상기 PHA는, 곁사슬로서 알킬기를 지닌 모노머유닛으로 이루어져 있다(통상의(usual)-PHA). 그러나, PHA의 보다 광범위한 응용, 예를 들면, 기능성 폴리머로서의 응용을 고려하면, 알킬기이외의 다른 치환기를 지닌 곁사슬(예를 들면, 페닐기, 불포화 탄화수소류, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소류, 에폭사이드류 등의 치환기를 지닌 곁사슬)을 지닌 PHA는 극히 유용한 것으로 기대된다(특이한(unusual)-PHA).
페닐기를 지닌 특이한-PHA의 생합성에 대해서는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-페닐발레르산으로부터 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다(Polymers 24, p5256-5260(1991), Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990)); Chirality, 3 492-494(1991)). Polymers, 29, 1762-1766(1996)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(4-톨릴)발레르산(5-(4-메틸페닐)발레르산)으로부터 3-하이드록시-5-(4-톨릴)발레르산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 또한, Polymers, 32, 2889-2895(1999)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 5-(2,4-디니트로페닐)발레르산으로부터 3-하이드록시-5-(2,4-디니트로페닐)발레르산유닛 및 3-하이드록시-5-(4-니트로페닐)발레르산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
페녹시기를 지닌 특이한-PHA에 대해서는, Macromol. Chem. Phys., 195, 1665-1672(1994)에, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛과 3-하이드록시-9-페녹시노난산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 또, Polymers, 29, 3432-3435(1996)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 6-페녹시헥산산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산유닛과 3-하이드록시-6-페녹시헥산산유닛을 지닌 PHA, 8-페녹시옥탄산으로부터 3-하이드록시-4-페녹시부티르산유닛, 3-하이드록시-6-페녹시헥산산유닛 및 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산유닛을 지닌 PHA 및 11-페녹시운데칸산으로부터 3-하이드록시-5-페녹시발레르산유닛 및 3-하이드록시-7-페녹시헵탄산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 또한, Can. J. Microbiol., 41, 32-43(1995)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) ATCC 29347균주 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442균주가, 각각 p-시아노페녹시헥산산 및 p-니트로페녹시헥산산으로부터 3-하이드록시-p-시아노페녹시헥산산유닛을 지닌 PHA 및 3-하이드록시-p-니트로페녹시헥산산유닛을 지닌 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 또, 일본국 특허 제 2989175호에는, 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)발레르산유닛 혹은 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)발레르산유닛으로 이루어진 단독중합체 혹은 적어도 3-하이드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트유닛 혹은 3-하이드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트유닛을 함유하는 공중합체와, 이들 단독중합체 또는 공중합체를 제조하는 방법이 기재되어 있고, 이러한 단독중합체 및 공중합체는 고융점 및 양호한 작업성을 지니는 동시에 발수성과 입체규칙성을 제공할 수 있는 것으로 개시되어 있다.
시클로헥실기를 지닌 특이한-PHA의 일례로서, Polymers, 30, 1611-1615(1997)에는, 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)가 시클로헥실부티르산 혹은 시클로헥실발레르산으로부터 이러한 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
곁사슬에 치환기를 지닌 PHA중에서, 곁사슬에 설파이드(-S-) 황원자를 지닌 PHA의 개발에 대한 것으로, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 27N01균주를 이용하고 또 옥탄산과 11-(페닐설파닐)운데칸산을 기질로서 이용해서, 3-하이드록시-5-(페닐설파닐)발레르산 및 3-하이드록시-7-(페닐설파닐)헵탄산을 모노머유닛으로 함유하는 PHA를 생산하는 것이 Macromolecules, 32, 8215-8318(1999)에 보고되어 있다. 이 제법에 있어서는, 슈도모나스 푸티다 27N01균주를 성장기질로서 옥탄산만을 함유하는 배지에서 예비배양하고, 얻어진 종자배양액을, 11-(페닐설파닐)운데칸산만을 기질로서 함유하는 배지에 주입하는 방법을 이용하고 있다.
또, Polymer Preprints, Japan, Vol. 49, No. 5, 1034(2000)에는, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 27N01균주를 이용하고 또 11-[(페닐메틸)-설파닐]헵탄산을 기질로서 이용해서, 2개의 모노머유닛, 즉, 3-하이드록시-5-벤질티오-발레르산 및 3-하이드록시-7-[(페닐메틸)설파닐]헵탄산으로 이루어진 PHA를 생산하는 방법이 보고되어 있다. 이 제법에 있어서는, 슈도모나스 푸티다 27N01균주를 증식기질로서 옥탄산만을 함유하는 배지에서 예비배양하고, 얻어진 배양액을, 11-[(페닐메틸)설파닐]운데칸산만을 기질로서 함유하는 배지에 주입하는 방법을 이용하고 있다.
이들 mcl-PHA 및 특이한-PHA는 기질로서 (R)-3-하이드록시아실 CoA를 이용하는 효소중합반응을 통해 합성된다. 이러한 3-하이드록시아실 CoA는, 상이한 알칸산으로부터 생체내에서 각종 대사경로(예를 들면, β-산화경화 혹은 지방산합성경로)를 통해 생산된다. 이 중합반응을 촉매하는 효소가 PHA신타제(이것을 "PHB폴리메라제" 혹은 "PHB신타제"라 칭함)이다. 다음은, 알칸산으로부터 PHA신타제에의해 β-산화경로 및 중합반응을 통해 PHA로 이르는 반응루트이다.
한편, 지방산합성경로를 통해 제조를 행할 경우, 이 경로에서 생성된 (R)-3-하이드록시아실-ACP("ACP"란 아실캐리어프로테인을 의미함)는 PHA를 PHA신타제에 의해 합성하는 (R)-3-하이드록시아실 CoA로 변환되는 것으로 여겨진다.
최근, 균체로부터 단리된 PHB신타제 혹은 PHA신타제를 이용해서in vitro에서 PHA를 합성하는 시도가 행해지고 있다.
예를 들면, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 92, 6279-6283(1995)에는, 기질로서 3-하이드록시부티릴 CoA와 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutropus)로부터 유도된 PHB신타제를 이용해서 3-하이드록시-n-부티르산유닛으로 이루어진 PHB를 성공적으로 합성한 것이 기재되어 있다. 또, Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60(1999)에는, 3-하이드록시부티릴 CoA 또는 3-하이드록시발레릴 CoA와 알칼리게네스 유트로퍼스로부터 유래된 PHB신타제를 반응시켜 3-하이드록시-n-부티르산유닛 및 3-하이드록시-n-발레르산유닛으로 이루어진 PHA를 성공적으로 합성한 것이 기재되어 있다. 또한, 이 보고서에는, 라세미 3-하이드록시부티릴 CoA가 PHB신타제와 반응하면, 해당 효소의 입체선택성에 의거해서 단지 (R)3-하이드록시-n-부티르산유닛으로 이루어진 PHB가 성공적으로 합성되었다는 것이 언급되어 있다. Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84(2000)에는, 알칼리게네스 유트로퍼스로부터 유래된 PHB신타제를 이용한in vitroPHB신타제가 보고되어 있다.
FERMS Microbiol. Lett., 168, 319-324(1998)에는, 크로마티움 비노섬(Chromatium vinosum)으로부터 유래된 PHB신타제와 3-하이드록시부티릴 CoA를 반응시킴으로써 3-하이드록시-n-부티르산유닛으로 이루어진 PHB를 성공적으로 합성한 것이 기재되어 있다.
Appl. Mirobiol. Biotechnol., 54, 37-43(2000)에는, 3-하이드록시데칸산으로 이루어진 PHA가, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래된 PHA신타제와 3-하이드록시데카노일 CoA와의 반응에 의해 합성되는 것이 개시되어 있다.
이상 설명한 바와 같이, 생물공학법을 폴리머합성에 적용하면, 종래의 유기합성에 의해서는 얻을 수 없는 신규의 폴리머화합물을 합성하는 것이 가능하고, 또, 새로운 기능을 부여할 수 있는 동시에 폴리머화합물을 구축하는 것이 가능하다. 또, 종래의 다단계 반응을 단지 1단계 반응으로 변경할 수 있는 경우가 많으므로, 제조프로세스의 간편화, 비용절감 및 시간절약이 기대된다. 또한, 이것에 의해, 유기용매류, 산류, 알칼리류, 계면활성제류 등의 소비절감, 온화한 반응조건 및 비석유계 원료나 미가공 원료로부터의 합성이 가능해지므로, 환경에의 부담이 적고 자원재활용형의 합성프로세스가 가능해진다. 보다 상세하게는, 미가공 원료로부터의 합성에 대해서는, 생물공학적 합성에서 촉매로서 사용되는 효소의 기질특이성이 일반적으로 매우 높으므로, 저순도의 원료를 사용한 경우에도 소망의 반응을 선택적으로 촉진시키는 것이 가능해진다. 따라서, 폐기물이나 재활용원료의 사용을 기대할 수 있다.
한편, 본 발명자들은, 폴리머화합물에 많은 부가가치를 부여하기 위해 원소공학으로서 폴리머화합물로 피복된 약물의 마이크로캡슐에 주의를 기울였다. 폴리머화합물로 약물을 피복함으로써, 얻어진 마이크로캡슐은, 매우 유용한 작용성, 특히 서방성을 획득한다. 종래, 이러한 마이크로캡슐은 대부분 유기합성에 의해 제조되었다.
이러한 마이크로캡슐을 상기 설명한 바와 같은 생물공학방법에 의해 제조할 수 있다면, 신규의 폴리머화합물의 이용과 신규의 작용과 구조의 실현이 가능해지고, 또한, 환경에의 부담이 낮은 동시에 자원재활용에 의해 저렴한 비용의 제조프로세스를 실현하는 것도 가능해진다. 예를 들면, 생물체의 촉매활성에 대한 입체선택특이성과 매우 엄격한 분자인식능을 활용해서, 환경에의 부담이 적은 매우 간단한 프로세스에 의해 신규의 기능성 폴리머화합물 혹은 매우 높은 카이럴성의 폴리머화합물로 피복된 마이크로캡슐을 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 상기 고도의 기능성 폴리머화합물을 이용한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 그 제조방법, 그리고, 생물공학적 프로세스에 의해 마이크로캡슐 등의 입상 구조체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
이상 설명한 바와 같이, 생분해성 폴리머인 폴리락트산 혹은 락트산-글리콜산 공중합체로 이루어진 마이크로캡슐에의 수용성 약물의 내포는, 약물의 서방특성에 있어서 여전히 많은 쟁점이 있다. 또, 수용성 약물은, 입상 구조체에 효과적으로 함유되지 않거나 마이크로캡슐화 되지 않고 용이하게 분산되는 경향이 있다고 하는 결점이 있다.
본 발명은, 상기 종래의 기술의 결점을 해소하는 것으로 여겨지며, 본 발명의 목적은, 약물, 특히 수용성 약물을 함유하는 마이크로캡슐 또는 수불용성 약물(일반적으로 물에 거의 녹기 어려운 약물을 포함함)을 함유하는 마이크로캡슐 등의 입상 구조체의 경우에도 실질적으로 결함있는 초기방출을 보이지 않고 또한 실질적으로 소정 기간 허용가능한 제로오더방출을 보이는 서방성 프레파라트 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다. 또, 본 발명은, 마이크로캡슐 등의 입상 구조체에 약물, 특히 수용성 약물을 안정적으로 함유하는 높은 약물 함량의 서방성 프레파라트 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
예를 들면, 미국 특허 제 6,146,665호에 개시된 미립자는, 독성이 없고, 생분해성인 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 다공질 과립에 친수성 약물을 포획하고 있는 것으로, 약물을 그대로 원위치에 포획가능하지만, 다공질 구조이므로, 친수성 약물을 확산에 의해 신속히 방출하여, 서방성을 제어하기 곤란하다.
본 발명이 해소하고자 하는 과제는, 폴리하이드록시알카노에이트의 구조를 최적화함으로써 서방성과 약물보유능력을 최적화하여, 친수성 약물, 기타 수용성 물질, 친유성(oleophilic) 약물 혹은 기타 소수성 물질에 대해서도 서방성을 제어가능하고, 보유능력이 우수한 약물보유입자를 제공하는 데 있다.
또, 본 발명은, 내부에 안료, 염료, 농약성분, 헤모글로빈, 화장품성분 혹은 비료성분을 함유하는 입상 구조체 및 그 제조방법을 제한된다. 또한, 이러한 입상 구조체를 함유하는 잉크조성물, 농약조성물, 혈액세포성분, 화장품조성물 혹은 비료조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
또, 상기 설명한 바와 같이, 입자내부에 중공의 구조를 지니지 않고, 다수의 기포를 함유하는 균일한 미립자를 얻기 곤란하였던 종래의 방법에서 얻어지는 마이크로벌룬은, 초음파진단이나 검사시에 높은 콘트라스트효과를 얻기 위해 다량 투입할 필요가 있고, 특히 심근의 콘트라스트조성에 있어서는, 소망의 높은 콘트라스트효과에 충분히 대응할 수 있는 효과적인 콘트라스트매체가 아니었다. 이러한 마이크로벌룬을 다량 투약하면, 어떤 경우에는 생체에 과중한 부담을 주게 되어 안전성의 점에서 해결해야 할 문제점이 생긴다.
상기 문제를 고려해서, 본 발명은, 미립자중에 많은 기포를 함유시키기 위해, 1개의 PHA멤브레인을 지닌 마이크로캡슐형상의 중공 구조를 지닌 미립자를 선택적으로 얻을 수 있는 중공의 마이크로캡슐과 같은 중공의 입상 구조체의 제조방법과, 아울러, 중공의 마이크로캡슐과 같은 중공의 입상 구조체를 이용해서 높은 콘트라스트효과를 발휘하는 초음파 콘트라스트매체를 제공하기 위한 것이다. 보다 구체적으로는, 심근, 심장공동(심장강) 및 간의 초음파진단이나 검사에 이용가능한 높은 콘트라스트효과의 초음파콘트라스트매체를 제공하기 위한 것이다.
도 1은 실험예 16에 있어서의 시험방법의 원리를 표시한 개략도.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
1: 폴리프로필렌용기2: 수조
3: 교반봉
본 발명의 입상 구조체는, 3-하이드록시알칸산유닛을 함유하고, 고상, 액상 및 기상중 적어도 하나를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 고상으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 또한, 3-하이드록시아실 CoA를 물/오일계면에서 소망의 PHA를 합성하는 PHA합성효소를 함유하는 반응계에 첨가해서, 고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상이 PHA로 캡슐화되거나 피복되어 있는 입상 구조체를 제조하는 생물공학적 방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라페라트는, 상기 입상 구조체를 함유하는 프레파라트이다. 또, 본 발명의 프레파라트의 제조방법은, 상기 입상 구조체의 제조프로세스를 포함하는 프레파라트를 제조하는 방법이다. 이러한 프레파라트는, 약물, 특히 실질적으로 수불용성의 약물의 초기방출이 낮아, 장기간에 걸쳐 충분한 서방성을 나타내는 높은 약물함량의 서방성 프레파라트로서 적합하다. 또, 이러한 프레파라트는, 약물, 특히 수용성 약물의 초기방출성이 낮아, 장기간에 걸쳐 충분한 서방성을 나타내는 높은 약물함량의 서방성 프레파라트로서 적합하다.
또한, 본 발명자들은, 높은 콘트라스트효과의 초음파콘트라스트매체를 개발하고자 예의 검토를 행한 결과, 본 발명의 중공의 입상 구조체가 미립자중에 다량의 기포를 함유가능한 중공의 입상 구조체로서 적합하다는 점과, 상기 중공의 입상 구조체를 물에 분산시킨 후, 감압하에 건조시키고, 퍼플루오로카본기체를 건조장치에 충전시켜, 상기 가스로 중공의 입상 구조체의 중공의 구조의 내부, 즉 기포를 충전시킴으로써, 본 발명의 초음파 콘트라스트매체, 즉, 생체내에서 높은 초음파 콘트라스트효과를 지닌 콘트라스트매체를 얻을 수 있는 점을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 초음파 콘트라스트매체는, 상기 중공의 입상 구조체를 함유하는 초음파 콘트라스트매체이다. 본 발명의 초음파 콘트라스트매체는 심근, 심장강(심장을 구성하는 심실과 심방) 및 간의 콘트라스트형성에 유용하다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태예에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 입상 구조체(이하, 마이크로캡슐이라고도 칭하며, 2층구조체에 한정되지 않고 고상에 고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상이 편입되어 있는 구조라면 어느 것이라도 포함함)는, 고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상이, 곁사슬에 치환기를 지닌 각종 구조의 모노머유닛을 함유하는 PHA로 캡슐화 혹은 피복되어 있는 형상의 마이크로캡슐이어도 되며, 고기능성 마이크로캡슐로서 극히 유용하다. 이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
<마이크로캡슐>
본 명세서에서 이용된 "마이크로캡슐"이란 용어는, 전적으로 약물전달계(DDS) 혹은 고분자화학에서의 일반적인 개념을 포함하나, 이것과 반드시등가일 필요는 없다. 주사형 전자현미경관찰하, 첨부된 특허청구범위 및 본 명세서에 있어서의 "마이크로캡슐"은, 각종 형상, 예를 들면, 돌출부가 많은 가시를 지닌 나무딸기나 캔디(포루투칼어로 콘페이토로 알려져 있음), 적혈구와 같은 원반형상, 럭비공같은 회전타원체나 대장균과 같은 나선체 등을 지닌다. 또, 본 발명의 명세서에 있어서의 "마이크로캡슐"은, 폴리머에멀젼이나 라텍스 혹은 폴리머현탁액을 구성하는 미소구의 특성을 지닌다. 이와 같이 해서, 첨부된 특허청구범위 및 본 명세서에서 사용되는 "마이크로캡슐"이란 용어는, 반드시 약물전달계(DDS)나 구분자화학에서 통상적으로 사용되는 개념과 등가일 필요는 없고, 본 발명의 헤테로폴리머계의 주요 "형태"를 참조해서 간편하게 사용되는 것이다.
예를 들면, 본 발명의 마이크로캡슐에 있어서의 고상, 액상 혹은 기상에 포함되는 것과 고체기질 PHA와의 관계에는, 다음과 같은 것이 포함된다:
(1) 기상, 액상 혹은 기상에 내포된 적어도 1종의 물질이 미소구의 고체물질을 구성하는 PHA에 분산·혼합되어 있는 단일혼합상으로 이루어진 모노리식(monolithic)형 및
(2) 2상, 즉, 외부의 PHA박막(피복층)과 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종의 물질을 함유하는 내부로 이루어진 레저보어(reservoir)형.
본 발명에 있어서는, 상기 (2)의 형태가, 마이크로캡슐내의 함유량을 다량으로 할 수 있다는 견지에서 바람직하다. 예를 들면, 액체가 함유되어 있을 경우, 그 액체는 오일 및/또는 물일 수 있고, 하나의 캡슐이 그 안에 물과 오일의 혼합물을 함유하는 것이 가능하다. "오일(오일상)" 및 "물(수상)"은, 각각, 에멀젼중의"오일상의 성질을 지닌 물질"과 "수상의 성질을 지닌 물질"을 지칭한다. 물과 에멀젼을 형성할 수 있고 약물 등을 보유하기 위해 본 발명에 적합하게 사용될 수 있는 오일상 성분의 비제한적인 예로서는, 두유, 참기름, 면실유, 올리브유, 잇꽃유(safflower oil), 옥수수유, 땅콩유 등의 식물성 유지, 중간사슬지방산 트리글리세라이드(예를 들면, 카프릴산, 카프르산 혹은 라우르산(예를 들면, 닛뽄유시 사 제품인 Panasate 800, 810, 1000 또는 1200), 액체 파라핀, 스쿠알렌 또는 스쿠알란 등의 액체 탄화수소류 등을 들 수 있다. 마이크로캡슐내의 오일상을 포함하는 오일상에 PHA를 용해시킴으로써 마이크로캡슐화를 행할 경우, 후술하는 바와 같이 PHA를 용해시킬 수 있는 오일상을 사용한다. 수상을 형성하기 위해서는, 기본적으로 물을 기준으로 한 수계 용매를 이용할 수 있다. 이들 상에 소망의 물질을 용해시킴으로써 소망의 기능의 마이크로캡슐을 얻을 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐은, 직경 1 내지 10㎛범위내의 작은 구형의 마이크로캡슐일 수 있다.
또, 고체물질과 같이 약물 등을 보유할 경우, 모노리식 입상 구조체(마이크로스피어(microsphere)즉, 미소구)를 이용하는 것이 유리하다. 예를 들면, 본 발명의 입상 구조체의 서방형 프레파라트에 포함되는 약물(A)과 PHA(B)간의 상호관계로서는, 예를 들면, 다음과 같은 1) 내지 4)의 형태를 들 수 있다:
1) 약물(A)을 하나의 코어부에 함유하고, PHA(B)를 외피에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
2) 약물(A)을 복수의 코어부에 함유하고, PHA(B)를 외피에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
3) 약물(A)을 복수의 섬부분에 함유하고, PHA(B)를 대양같은 부분에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
4) 약물(A)과 PHA(B)가 상호 용해되어 있는 마이크로상분리구조를 지닌 형태.
이들 형태에 있어서, 코어부는 약물 단독으로 혹은 다른 성분과 조합해서 이루어져 있어도 되고, 셀부는 PHA 단독으로 혹은 다른 성분과 조합해서 이루어져 있어도 된다.
본 발명의 입상 구조체로서는, 예를 들면, 유효약물과 PHA를 적어도 함유하는 조성물로 이루어진 직경 10 내지 100nm범위의 미소구형상의 프레파라트를 들 수 있다. 자체에멀젼화능력의 점에서, 서브마이크론크기(평균입자크기가 1㎛를 초과하지 않음)를 이용하는 것이 바람직하다.
또, 본 발명의 중공의 입상 구조체는, PHA를 함유하는 외부입자형성부와 내부중공부로 이루어지고, PHA와 중공부로 이루어진 격막부는 내부에 혼합되어 있어도 된다. 이러한 형태로서는, 예를 들면, 1) 중공부과 PHA에 분산 혹은 산란되어 있는 기본적으로 단일상의 PHA의 미립자로 이루어진 모노리식 중공입자(미소구라고도 칭함)와, 2) 명백하게 내부와 외부의 2상, 즉, PHA를 함유하는 외부박막(피막 혹은 셸)과 셸로 둘러싸여 보호된 내부중공부(코어)로 분리되어 있는 레저보어형의 중공의 마이크로캡슐을 들 수 있다.
본 발명의 "중공의 입상 구조체"는, 예를 들면, 외피가 적어도 PHA를 함유하는 조성물로 이루어져 있는, 직경 1 내지 10㎛범위의 미소구형상의 미립자로 이루어진 것을 들 수 있다.
또, 본 발명의 중공의 입상 구조체에 있어서의 PHA함유셸과 중공부의 구성, 구체적으로는, 기포(A)와 PHA(B)와의 관계로서는, 하기 1) 내지 4)의 형태를 들 수 있다:
1) 기포(A)를 하나의 코어부에 함유하고, PHA(B)를 외피에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
2) 기포(A)를 복수의 코어부에 함유하고, PHA(B)를 외피에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
3) 기포(A)를 복수의 섬부분에 함유하고, PHA(B)를 바다 부분에 함유하고 있는 코어/셸구조를 지닌 마이크로캡슐의 형태;
4) 기포(A)와 PHA(B)가 상호 혼합되어 있는 마이크로상분리구조를 지닌 형태.
이들 형태에 있어서, 코어부는 기포 단독으로 혹은 다른 성분과 조합해서 이루어져 있어도 되고, 셸부는 PHA 단독으로 혹은 다른 성분과 조합해서 이루어져 있어도 된다.
본 발명의 입상 구조체는, 폴리하이드록시알카노에이트의 모노머유닛조성이, 해당 입상 구조체의 내부로부터 해당 입상 구조체를 덮고 있는 외부 방향으로 변화하는 점도 특징으로 한다.
또, 입상 구조체는, 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부가 화학적 변성되어 있는 점도 특징으로 한다.
예를 들면, 상기 화학적 변성되어 있는 폴리하이드록시알카노에이트로서는, 그라프트사슬을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트를 들 수 있다. 이러한 그라프트사슬을 에폭시기에 도입해서 적어도 에폭시기를 포함하는 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트로 할 수 있다. 또, 그라프트사슬은, 아미노기를 지닌 화합물로 이루어진 그라프트사슬이어도 된다. 예를 들면, 상기 아미노기를 지닌 화합물은, 말단 아미노기로 변성된 화합물이 바람직하다. 말단에 아미노기를 지닌 화합물로서는, 예를 들면, 적어도 폴리비닐아민, 폴리에틸렌이민 및 아미노말단변성 폴리실록산으로부터 선택된 폴리머를 들 수 있다.
상기 화학적으로 변성된 폴리하이드록시알카노에이트는, 적어도 일부가 가교되어 있는 폴리하이드록시알카노에이트일 수 있다. 예를 들면, 상기 가교된 폴리하이드록시알카노에이트로서는, 에폭시기상에서 가교반응을 행하여, 적어도 에폭시기를 지닌 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 들 수 있다. 가교반응은, 예를 들면, 적어도 디아민 화합물, 무수숙신산, 2-에틸-4-메틸이미다졸 또는 전자선조사를 이용하는 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 상기 디아민화합물로서는 헥사에틸렌디아민이 바람직하다.
상기 마이크로캡슐은, 일반적으로 w/o/w(water in oil in water)형 에멀젼법 또는 o/w(oil in water)형 에멀젼법으로 제조할 수 있다.
구체적으로는, 본 출원의 다른 발명은, 1) 클로로포름 등의 유기용매중에 PHA를 용해시키고, 수용액을 첨가해서 에멀젼화해서 w/o에멀젼을 얻고, 2) 필요에따라 다량의 물에 상기 에멀젼을 주입하여 에멀젼화시켜 w/o/w에멀젼을 얻고, 3) 예를 들면, 감압하 증발에 의해 유기용매를 제거해서 소형의 구형상 입자를 침전시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종의 물질과 PHA로 이루어진 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 발명은, 1) 클로로포름 등의 유기용매중에 PHA를 용해시키고, 2) 이러한 유기상을 다량의 물에 주입하여 에멀젼화시켜 o/w에멀젼을 얻고, 3) 예를 들면, 감압하 증발에 의해 유기용매를 PHA의 용해도를 초과하는 정도로 제거해서 소형의 구형상 석출물을 생성시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 방법은, 1) 유기용매에 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 수용액을 첨가하여 에멀젼화시켜 w/o에멀젼을 얻고, 2) PHA합성반응을 행하여 소형의 구형상 석출물을 생성시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 방법은, 1) 유기용매에 상기 수용액을 첨가해서 유화시켜 w/o에멀젼을 얻고, 2) 이러한 에멀젼에 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 물을 다량 첨가하여 w/o/w에멀젼을 얻고, 3) PHA합성반응을 행하여 소형의 구형상 석출물을 생성시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 방법은, 1) 유기용매에 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 수용액을 첨가하여 에멀젼화시켜 w/o에멀젼을 얻고, 2) 이러한 에멀젼에 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 물을 다량 첨가하여 w/o/w에멀젼을 얻고, 3) PHA합성반응을 행하여 소형의 구형상 석출물을 생성시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 방법은, 1) 유기용매에 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 수용액을 첨가하여 에멀젼화시켜 w/o에멀젼을 얻고, 2) 이러한 에멀젼을 다량의 물에 주입해서 w/o/w에멀젼을 얻고, 3) PHA합성반응을 행하여 소형의 구형상 입자를 침전시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 방법은, 1) 유기용매를 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 다량의 물에 주입하여 에멀젼화시켜 w/o에멀젼을 얻고, 2) PHA합성반응을 행하여 소형의 구형상 석출물을 생성시키고, 필요에 따라 회수하여 건조함으로써, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1종과 PHA를 함유하는 마이크로캡슐을 제조하는 방법이다.
<PHA의 각종 예와 그의 제조방법>
본 발명에 있어서 사용가능한 PHA는, 적어도 하기 화학식[1] 내지 [10]으로표시되는 모노머유닛을 포함한다:
(식중, R1 및 a는 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 조합의 군으로부터 선택된 것임:
(1) R1은, 수소원자(H)이고, a는 3 내지 10의 어느 하나의 정수임;
(2) R1은, 할로겐원자이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
(3) R1은, 크로모포어(chromophore)이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
(4) R1은,
이고, a는 1 내지 7의 어느 하나의 정수임).
(식중, b는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임).
(식중, c는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임).
(식중, d는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임).
(식중, e는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임).
(식중, f는 0 내지 7의 어느 하나의 정수임).
(식중, g는 1 내지 8의 어느 하나의 정수임).
[식중, h는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R6은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)].
[식중, i는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)].
(식중, j는 1 내지 9의 어느 하나의 정수임).
본 발명에 있어서, PHA는, 3-하이드록시알카노에이트를 모노머유닛으로서 지닌 폴리에스테르수지이다. 상기 PHA가 미생물에 의해 생산된다면, 이러한 폴리에스테르수지는, 일반적으로 R체단독으로 이루어진 입체규칙성(아이소택틱) 중합체이나, 이러한 입체규칙성 중합체는, 본 발명의 목적을 물성 및 기능의 양면에 있어서 얻을 수 있는 한 중요한 것은 아니고, 어택틱(atactic) 중합체를 이용하는 것도 가능하다. 또, PHA는, 유기금속촉매(예를 들면, 알루미늄, 아연 혹은 주석을 포함하는 유기촉매)에 의해 락톤화합물의 개환중합을 행하는 화학적 합성에 의해 얻을 수도 있다.
또한, PHA를, w/o, w/o/w 혹은 o/w에멀젼의 제조와 조합해서 3-하이드록시아실 CoA과 PHA합성효소를 이용해서 합성할 경우, PHA합성효소에 의해 합성가능한 어느 PHA이어도 된다. 이상 설명한 바와 같이, PHA합성효소는, 생체내의 PHA합성반응계의 최종단계를 촉매하므로, 생체내에서 합성가능한 것으로 공지된 PHA는, 이러한 효소의 촉매작용에 의해 합성된다. 결과적으로, 고상, 액상 혹은 기상의 적어도 1개의 상이, PHA합성효소를 이용해서 소망의 PHA에 대응하는 3-하이드록시아실 CoA로부터 생체내에서 합성되는 것으로 알려진 종류의 PHA에 의해 함유 혹은 피복되어 있는 마이크로캡슐을 제조하는 것이 가능해진다.
또, 본 발명에서, 곁사슬구조 R1 내지 R7에 있어서, 각종 원자와 작용기로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 원자 혹은 작용기를 선택할 수 있다. 또, R2 내지 R7의 치환위치에 대해서도, 오르토, 메타 혹은 파라위치에 있어서 대응하는 모노머유닛으로 이루어진 PHA를 얻을 수 있으나, 이들 이성질체에 있어서의 작용성 혹은 물성에 큰 차이가 없다면, 폴리머에의 주입의 용이성이나 수율을 고려해서 메타 혹은 파라치환된 이성질체를 이용하는 것이 유리하다.
상기 식[1] 내지 [10]에 있어서, 할로겐원자는 불소, 염소 혹은 브롬일 수 있다. 크로모포어는, 크로모포어를 지닌 3-하이드록시아실 CoA가 PHA신타제에 의해 촉매되는 한 특히 한정되지 않고, 폴리머합성시의 입체장애의 점에서, 탄소수 1 내지 5의 메틸렌사슬이 크로모포어와 CoA가 결합된 카르복실기사이에 존재하는 것이 바람직하다. 크로모포어의 흡광파장이 자외선영역내일 경우, 착색된 구조체가 얻어지며, 흡광파장이 가시영역밖일 경우, 해당 구조체는 각종 전자재료로서 이용해도 된다. 이러한 크로모포어로서는, 니트로조, 니트로, 아조, 디아릴메탄, 트리아릴메탄, 크산텐, 아크리딘, 퀴놀린, 메틴, 티아졸, 인다민, 인도페놀, 락톤, 아미노케톤, 하이드록시케톤, 스틸벤, 아진, 옥사진, 티아진, 안트라퀴논, 프탈로시아닌, 인디고이드 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 PHA로서는, 상기 모노머유닛을 복수개 함유하는 랜덤공중합체 혹은 블록공중합체를 사용할 수 있다. 따라서, 내부에 함유된 작용기 혹은 각 모노머유닛의 특성을 활용함으로써 PHA의 물성을 제어하여 PHA에 대해 일부 기능을 부가하는 것이 가능해지고, 또한, 작용기간의 상호작용을 활용함으로써 얻어진 새로운 기능을 나타내는 것도 가능해진다.
또, 모노머화합물의 첨가량 및 그 첨가순서를 적절하게 제어함으로써, 임의의 순서와 임의의 배합비를 지닌 블록공중합체를 합성하는 것도 가능하다. 또, 필요에 따라, PHA의 합성과정후 혹은 합성과정중에 화학적 변성 등을 실시해도 된다.
또한, 기본 재료인 3-하이드록시아실 CoA의 종류와 농도의 변경을 통해 해당 조성물을 경시변화(즉, 시간경과에 따른 변화)시킴으로써, 상기 구조체의 형상이 입자형상과 같을 경우 반경방향으로, 또한, 해당 구조체가 판형상일 경우에는 수직방향으로 PHA의 모노머유닛조성을 변화시키는 것이 가능하다.
마이크로캡슐의 표면층상의 PHA 및 그 내부층상의 PHA를 적절하게 선택함으로써, 본 발명의 효과, 예를 들면, 액체 혹은 기체의 보유기능, 서방성제어 및 수용액중의 자체분산성을 보다 향상시키는 것이 가능하다. 구체적으로는, PHA의 모노머유닛을 적절하게 선택함으로써, 마이크로캡슐의 안쪽에서 바깥쪽 방향을 따라 PHA를 변화시켜, 다층구조체 혹은 경사(그라디언트)구조체를 형성하는 것이 가능하다.
또, 마이크로캡슐의 표면층상의 PHA에 그라프트사슬을 도입함으로써, 이러한 그라프트사슬상에 의거한 작용성, 예를 들면, 액체 혹은 기체의 보유기능, 서방성 제어, 수용액중의 자체분산성을 발휘하는 것이 가능하다. 또한, 마이크로캡슐의 표면층상의 PHA를 가교시킴으로써, 액체 혹은 기체의 보유기능, 마이크로캡슐의 기계적 강도 및 서방성 제어기능을 향상시키는 것 또한 가능하다.
본 발명의 PHA의in vivo합성 혹은in vitro합성에 의한 제조시, 상기 각종 모노머유닛을 함유시켜도 되나, 단, 소망의 폴리머의 기능과 물성을 고려해서 그 갯수를 적절하게 선택할 필요가 있다. 일반적으로, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는, 6종류 이하의 모노머의 편입이 충분할 것으로 기대되나, 기능성 및 물성의 미묘한 제어를 원할 경우에는 그 이상 이용해도 된다.
본 발명의 마이크로캡슐에 이용되는, PHA생산미생물에 의해 혹은 PHA합성효소에 의해in vitro에서 합성된 PHA는, R체 단독으로 이루어진 입체규칙성 폴리머이다.
본 발명에 있어서, 이러한 소망의 물성의 PHA는, PHA를 합성가능한 미생물의 배양조건을 선택함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들면, 배양시간 등을 제어함으로써, 수평균분자량을 제어하는 것이 가능하다. 또, 용매추출이나 재석출에 의해 저분자량성분을 제거함으로써, 수평균분자량을 제어하는 것도 가능하다. 또,in vitro합성에서도, 반응용액의 조성과 반응시간을 적절하게 선택함으로써 다양한 물성을 제어할 수 있다.
PHA의 수평균분자량은, 약 1,000 내지 10,000,000, 바람직하게는, 약 5,000 내지 1,000,000의 범위이다. 또, PHA의 분산도(중량평균분자량/수평균분자량)는 바람직하게는, 1 내지 10, 보다 바람직하게는, 1 내지 5의 범위내이다.
마이크로캡슐에 대해서는, 예를 들면, 액체, 액체보유능력, 서방성 및 수용액중의 자체 분산성을 포함한 것이 중요한 특징이다. 본 발명의 마이크로캡슐은 이들 요구조건을 만족시키는 것을 가장 특징으로 한다. 구체적으로는, 액체보유능력, 서방성 및 수용액중의 자체분산성은, 상기 설명한 바와 같이 PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있다.
또, 약물, 특히 수용성 약물을 포함하는 서방성 프레파라트의 경우, 초기방출속도 및 후속의 방출속도의 양자를 제어하는 것이 방출특성의 제어시 중요하다. 본 발명의 마이크로캡슐은, 이들 요건을 충족시키는 것을 가장 특징으로 한다.구체적으로는, 약물의 초기방출량은, 전술한 바와 같은 PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있고, 약물방출기간도 PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있다. 또, 본 발명의 서방성 프레파라트는 제로오더 방출속도를 지닌 서방성 프레파라트로 한정되지 않고, 임의 높은 초기방출량을 지니거나 약물방출시 시간지연을 지닌 서방성 프레파라트로서 설계해도 되므로, 극히 넓은 적용범위를 지닌다.
또, 약물, 특히 실질적으로 수불용성 약물을 포함하는 서방성 프레파라트의 경우, 초기방출속도와 후속의 방출속도의 양자의 제어는, 방출특성의 제어시 중요하다. 본 발명의 마이크로캡슐은, 이들 요구조건을 만족하는 것을 가장 특징으로 한다. 구체적으로는, 약물의 초기방출량은, 전술한 바와 같은 PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있고, 약물방출기간도, PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있다. 또, 본 발명의 서방성 프레파라트는 제로오더 방출속도를 지닌 서방성 프레파라트로 한정되지 않고, 임의 높은 초기방출량을 지니거나 약물방출시 시간지연을 지닌 서방성 프레파라트로서 설계해도 되므로, 극히 넓은 적용범위를 지닌다.
또, 초음파 콘트라스트매체로서 이용할 경우, 중공의 입상 구조체에 함유된 기포량과 이러한 기포의 보유능력이 모두 중요하다. 본 발명의 초음파 콘트라스트매체는, 초음파 콘트라스트로서 본 발명의 중공의 입상 구조체를 이용하는 것을 가장 특징으로 한다. 구체적으로는, 기포보유능력은, 전술한 바와 같은 PHA의 모노머유닛의 종류/조성비/분자량/결정성을 제어함으로써 제어할 수 있다.
미생물에 의한 PHA생산의 구체적인 방법은, 알칸산을 함유하는 배지에서, 화학식[1] 내지 [10]의 모노머유닛에 대응하는 이들 알칸산으로부터 상기 모노머유닛중 적어도 1종의 모노머유닛을 함유하는 PHA를 제조할 수 있는 미생물을 배양하는 것이다. 본 발명의 PHA를 제조가능한 미생물은, PHA를 생산가능한 미생물 혹은 이러한 미생물의 PHA합성효소의 유전자가 도입된 형질전환체로부터 적절하게 선택된 것일 수 있다. 이하, 배양방법에 대해 설명한다.
예를 들면, 하기 화학식[22]로 표시되는 5-(4-플루오로페닐)발레르산(FPVA)으로부터 하기 화학식[21]로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산(3-HFPV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HFPV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[24]로 표시되는 4-페녹시부티르산(PxBA)으로부터 하기 화학식[23]으로 표시되는 3-하이드록시-4-페녹시발레르산(3-HPxB)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HPxB모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또한, 하기 화학식[26]으로 표시되는 4-시클로헥실부티르산(CHBA)으로부터 하기 화학식[25]로 표시되는 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산(3-HCHB)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HCHB모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[28]로 표시되는 5-벤조일발레르산(BzVA)으로부터 하기 화학식[27]로 표시되는 3-하이드록시-5-벤조일발레르산(3-HBzV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HBzV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[30]으로 표시되는 5-(4-플루오로벤조일)발레르산(FBzVA)으로부터 하기 화학식[29]로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산(3-HFBzV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HFBzV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또한, 하기 화학식[32]로 표시되는 5-티에닐 발레르산(TVA)으로부터, 하기 화학식[31]로 표시되는 3-하이드록시-5-티에닐발레르산(3HTV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HTV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[34]로 표시되는 5-티에노일발레르산(ToVA)으로부터 하기 화학식[33]으로 표시되는 3-하이드록시-5-티에노일발레르산(3HToV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HToV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[36]으로 표시되는 5-(4-플루오로티오페녹시)발레르산(FTPxVA)으로부터 하기 화학식[35]로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-플루오로티오페녹시)발레르산(3HFTPxV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HFTPxV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[38]로 표시되는 5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산으로부터 하기 화학식[37]로 표시되는 3-하이드록시-5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3-하이드록시-5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[40]으로 표시되는 5-티오티에녹시발레르산(FTxVA)으로부터 하기 화학식[39]로 표시되는 3-하이드록시-5-티오티에녹시발레르산(3HTTxV)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HTTxV모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또, 하기 화학식[42]로 표시되는 옥탄산(OA)으로부터 하기 화학식[41]로 표시되는 3-하이드록시-옥탄산(3HO)모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3HO모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
또한, 하기 화학식[44]로 표시되는 옥텐산으로부터 하기 화학식[43]으로 표시되는 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산모노머유닛으로 이루어진 폴리하이드록시알카노에이트를 생산가능한 미생물을 배양함으로써, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 제조하는 것이 가능하다:
<미생물>
본 발명의 방법에서 이용되는 미생물은, 대응하는 알칸산을 함유하는 배지에서의 배양에 의해 화학식[1] 내지 [10]으로 표시되는 적어도 1종의 유닛을 포함하는 PHA를 생산가능한 미생물이면 어느 것이라도 된다.
PHA합성용 미생물은, PHB 또는 PHB/V생산균일 수 있고, 이러한 미생물은, 아에로모나스속(Aeromonassp), 코마모나스속(Comamonassp.), 메틸로박테리움속(Methylobacteriumsp.), 파라코커스속(Paracoccussp.) 및 슈도모나스속(Pseudomonassp.)뿐만 아니라, 본 발명자들이 분리한 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01균주, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64균주 및 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) TL2균주의 것을 들 수 있다. 이들 균주 KK01, TB64 및 TL2는, 각각의 수탁번호: FERM BP-4235, FERM BP-6933 및 FERM BP-6913하에, 공업과학기술원의 공업과학기술연구소의 국제특허 유기물기탁소에 기탁되어 있다.
예를 들면, PHA신타제생산미생물로서는, mcl-PHA 또는 특이한-PHA생산미생물을 사용할 수 있다. 이러한 미생물로서는, 상기 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans), 슈도모나스속(Pseudomonassp.) 61-3균주, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT 2442, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)외에, 모두 본 발명자들이 단리한 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45, 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2, 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161 등의 슈도모나스속의 균주, 일본국 공개특허 제 2001-78753호 공보에 개시된 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK3(FERM P-17370), 일본국 공개특허 제 2001-69968호 공보에 개시된 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK4(FERM P-17371) 등의 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.)에 속하는 균주를 들 수 있다. 상기 미생물외에, mcl-PHA 및 특이한-PHA를 생산가능한 아에로모나스속 및 코마모나스속의 미생물을 사용하는 것도 가능하다.
P91, H45, YN2 및 P161균주는, 특허수속상의 미생물기탁의 국제승인에 관한 부다페스트조약하에, 일본국 305-0046 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1-3에 위치한 공업과학기술연구소(전신은 공업기술원 생명공학기술연구소)의 국제특허미생물기탁소에 기탁되어 있다.
상기 P91, H45, YN2 및 P161균주의 균학적 성질은 하기와 같다. 또, P161균주에 대해서는, 16S rRNA의 염기서열이 서열번호 1로 표시되어 있다.
슈도모나스 푸티다 P91
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.6㎛×1.5㎛
세포의 다형성: -
운동성: +
포자형성: -
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 양성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
슈도모나스 치코리이 H45
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.0 내지 1.2)㎛
세포의 다형성: -
운동성: +
포자형성: -
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 음성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 음성
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 음성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
슈도모나스 치코리이 YN2
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 간상균, 0.8㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: -
운동성: +
포자형성: -
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면층이 원활, 광택있음, 크림색의 투명함
(2) 생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 음성
인돌생산: 양성
글루코스 산성화: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
4%NaCl에서의 생육: 양성(약)
폴리-β-하이드록시부티르산의 축적: 음성
Tween 80의 가수분해: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 음성
D-만니톨: 음성
N-아세틸-D-글루코사민: 음성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
슈도모나스 젯세니이 P161
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기: 구형상, 직경 Φ0.6㎛ 또는 간상 0.6㎛×(1.5 내지 2.0)㎛
세포의 다형성: +(신장형)
운동성: +
포자형성: 없-
그램염색: 음성
콜로니형상: 원형, 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표면이 원활, 광택있음, 담황색
(2)생리학적 성질
카탈라제: 양성
옥시다제: 양성
O/F시험: 산화형
질산환원: 양성
인돌생산: 음성
아르기닌디하이드롤라제: 양성
우레아제: 음성
에스쿨린가수분해: 음성
젤라틴가수분해: 음성
β-갈락토시다제: 음성
King's B 한천에서의 형광색생산: 양성
(3) 기질동화능
글루코스: 양성
L-아라비노스: 양성
D-만노스: 양성
D-만니톨: 양성
N-아세틸-D-글루코사민: 양성
말토스: 음성
글루콘산 칼륨: 양성
n-카프르산: 양성
아디프산: 음성
dl-말산: 양성
시트르산 나트륨: 양성
아세트산 페닐: 양성
PHA신타제생산 미생물의 루틴배양에 대해서는, 예를 들면, 세포원료를 준비하거나, 효소생산을 위한 충분한 세포를 얻거나 혹은 세포의 활성상태를 유지하기 위해, 미생물증식에 필요한 성분을 함유하는 적절한 배지를 선택할 수 있다. 배지로서는, 육즙, 효모엑스 등의 일반적인 천연배지나 영양원을 첨가한 합성배지등, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치지 않는 것인 한 어느 것이라도 이용할 수 있다.
온도, 통기, 교반 등의 배양조건은, 사용되는 미생물에 따라 적절하게 선택한다.
한편, 상기 PHA생산미생물에 의해 소망의 3-하이드록시알칸산유닛을 함유하는 PHA를 생산시킬 경우, 예를 들면, PHA생산원료로서 모노머유닛에 대응하는 알칸산이외에도 미생물의 증식용의 탄소원을 적어도 함유하는 무기배지를 이용할 수 있다. 원료 알칸산의 초기함량은, 바람직하게는, 0.01%에서 1.0%(w/v), 보다 바람직하게는, 0.02 내지 0.2%(w/v)의 범위내에서 선택한다. 원료 알칸산은, 반드시 물에 대한 충분한 용해성을 지닐 필요는 없고, 본 발명의 상기 미생물을 이용할 때는 현탁상태로 잔존해도 된다.
배지에 있어서 알칸산의 용해성을 향상시키기 위해, 1-헥사데센 혹은 n-헥사데칸 등의 용매중에 용해 혹은 미세하게 분산된 상태에서 배지에 알칸산을 첨가하는 것이 가능하다. 이 경우, 1-헥사데센 혹은 n-헥사데칸 등의 용매의 농도는, 3%(v/v)를 초과하지 않을 필요가 있다.
미생물의 증식에 이용되는 증식기질은, 배지에 개별적으로 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 증식기질에 대해서는, 효모엑스, 폴리펩톤 혹은 육류엑스 등의 영양원을 사용할 수 있다. 또, 사용되는 균주에 의한 증식기질로서의 유효성을 고려해서, 당류, TCA경로에서 중간물로서 생성되거나 TCA경로부터 1단계 혹은 2단계의 생화학반응에 의해 생성된 유기산 혹은 그 염, 아미노산 혹은 그의 염을 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 소망의 모노머의 비율을 낮출 수 있다면, 탄소수 4 내지 12의 직사슬형 알칸산 혹은 그 염을 이용할 수 있다. 그러나, 이 경우, 치환체없는 단순한 직사슬 모노머의 비율이 높아지므로 고려해야 한다.
이들 기질중, 당류로서는, 글리세르알데하이드, 에리트로스, 아라비노스, 크실로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스라고 하는 알도스류; 글리세롤, 에리트리톨, 크실리톨 등의 알디톨류; 글루콘산 등의 알돈산류; 글루쿠론산, 갈락투론산 등의 우론산류; 말토스, 슈크로스, 락토스 등의 이당류 등으로부터 선택되는 1종이상의 화합물을 적합하게 이용할 수 있다.
또, 유기산 또는 그 염으로서는, 피루브산, 옥살로아세트산, 시트르산, 이소시트르산, 케토글루타르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 락트산 또는 그 염으로부터 선택되는 1종이상의 화합물을 적합하게 이용할 수 있다.
또한, 아미노산 또는 그 염으로서는, 글루탐산, 아스파라긴산 및 그 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 화합물을 적합하게 이용할 수 있다.
이들 각종 증식기질중, 폴리펩톤과 당류가 바람직하다. 이러한 증식기질의 배지중의 함량은, 바람직하게는, 0.1 내지 5%(w/v), 보다 바람직하게는, 0.2 내지 2%(w/v)이다.
미생물이 PHA를 생산하여 축적시키게 하는 배양방법에 있어서, 충분한 증식후, 염화암모늄 등의 질소원이 제한된 배지에 균체를 옮겨, 소망의 유닛의 기질을 구성하는 화합물을 함유한 상태에서 더욱 배양을 행함으로써 생산성을 더욱 높여도 된다. 예를 들면, 배양조건이 다른 복수의 단계를 접속함으로써 다단법을 이용해도 된다.
배양온도는 상기 균주를 충분히 증식시킬 수 있는 온도라면 어느 것이라도 되며, 15 내지 40℃, 바람직하게는, 20 내지 35℃, 보다 바람직하게는, 20 내지 30℃의 범위이다.
배양에는, 배지에 함유된 출발물질인 알칸산으로부터, 이용된 미생물이 증식되어 PHA를 생산하는 배양방법인 한 액체배양이나 고체배양 등의 어떠한 배양법을 이용해도 된다. 또, 배양의 종류로서는, 원료로서 증식기질과 산소를 적절하게 공급할 수 있는 한, 회분(batch)식 배양, 유동회분식 배양, 반연속배양, 연속배양 등의 어느 배양법을 이용해도 된다. 액체회분식 배양의 예로서는, 진탕플라스크에 의한 진탕을 통해 산소를 공급하는 방법, 자(jar)발효기를 이용하는 산소공급방법 등을 들 수 있다.
상기의 배양방법에 사용가능한 무기배지로서는, 미생물의 성장을 지지하기 위해, 인원(예를 들면, 인산염 등), 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등의 성분을 함유하고 있는 한 어떠한 것이라도 된다. 따라서, 무기염배지로서는, 예를 들면, MSB배지, E배지(J. Biol. Chem., 218, 97-106(1956)), M9배지 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 실시예에서 사용하는 M9배지의 조성은 이하와 같다.
Na2HPO4: 6.2g
KH2HPO4: 3.0g
NaCl: 0.5g
NH4Cl: 1.0g
(1리터중, pH 7.0)
또, 양호한 증식 및 PHA신타제의 생산을 위해서는, 이하의 조성의 미량성분용액을 0.3%(v/v)정도 첨가하는 것이 바람직하다.
미량성분용액
니트릴로트리아세트산: 1.5g
MgSO4: 3.0g
MnSO4: 0.5g
NaCl : 1.0g
FeSO4: 0.1g
CaCl2: 0.1g
CoCl2: 0.1g
ZnSO4: 0.1g
CuSO4: 0.1g
AlK(SO4)2: 0.1g
H3BO3: 0.1g
Na2MoO4: 0.1g
NiCl2: 0.1g
(1리터중)
<PHA의 회수>
배양액으로부터의 PHA의 취득에는, 통상 행하여지고 있는 방법을 적용할 수 있다. PHA가 배양액 속에 분비되는 경우에는, 배양액으로부터의 추출정제방법이, 또, PHA가 균체에 축적되는 경우에는, 균체로부터의 추출정제방법이 사용된다. 예를 들면, 미생물의 배양균체로부터의 PHA의 회수에는, 통상 행하여지고 있는 클로로포름 등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하기는 하나, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 아세톤이 사용되는 경우도 있다. 또, 유기용매를 사용하기 어려운 환경속에 있어서는, SDS(sodium dodecyl sulfate) 등의 계면활성제에 의한 처리, 리소자임 등의 효소에 의한 처리, EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 등의 약제에 의한 처리에 의해서 PHA 이외의 균체성분을 제거해서, PHA를 회수하는 방법을 사용할 수도 있다.
또한, 미생물의 배양, 미생물에 의한 PHA의 생산과 균체에의 축적 및 균체로부터의 PHA의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명의 PHA생산법에 이용되는 미생물은 상기 4종의 균주로 제한되는 것은 아니고, 이들 4종의 균주와 마찬가지로 PHA생산능력을 지니는 미생물이라면 어떠한 미생물도 사용할 수 있다.
<형질전환체에 의한 생합성>
상기 PHA생산균주의 PHA신타제유전자가 도입되어 있는 형전전환체를 이용해서 PHA신타제를 생산하는 것도 가능하다. PHA신타제유전자의 클로닝, 발현벡더의 구축 및 형질전환은, 종래의 방법에 따라 행할 수 있다. 대장균(Escherichia coli) 등의 균체숙주를 이용해서 얻어진 형질전환체를 배양하기 위해서는, LB배지 등의 천연배지나, M9배지 등의 합성배지를 이용할 수 있다. 세포(균체)는 25 내지 37℃에서 8 내지 27시간 통기하에 배양한다. 배양후, 상기 세포를 모아서 해당 세포내에 축적된 PHA신타제를 회수한다. 배지에는, 필요에 따라, 카나마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 클로르암페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다. 또, 유도촉진물질을 발현벡터에 사용할 경우, 형질전환체를 배양할 때 배지에 대응하는 유도물질을 첨가함으로써 발현을 촉진해도 된다. 이러한 유도물질로서는, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 테트라사이클린 또는 인돌아크릴산(IAA)을 들 수 있다.
<3-하이드록시아실 CoA>
구체적으로는, 본 발명에서 PHA신타제의 기질로서 이용가능한 3-하이드록시아실 CoA는, 하기 화학식[11] 내지 [20]으로 표시되는 것을 들 수 있다:
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R1 및 a는 상기화학식[1]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R2 및 b는 상기 화학식[2]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R3 및 c는 상기 화학식[3]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R4 및 d는 상기 화학식[4]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R5 및 e는 상기 화학식[5]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, f는 상기 화학식[6]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, g는 상기 화학식[7]에서와 마찬가지로 1 내지 8의 어느 하나의 정수임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R6 및 h는 상기 화학식[8]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R7 및 i는 상기 화학식[9]에서와 마찬가지임);
(식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, j는 상기 화학식[10]에서와 마찬가지로 1 내지 9로부터의 어느 하나의 정수임).
이들 3-하이드록시아실 CoA는, 예를 들면, 효소를 이용한in vitro합성, 미생물, 식물 등의 생물체를 이용한in vivo합성 및 화학합성으로부터 선택된 적절한 방법에 의해 합성할 수 있다. 효소합성은, 특히, 이들 기질을 합성하는 데 통상 이용된다. 예를 들면, 시판의 아실 CoA신타제(아실 CoA 리가제, E.C. 6.2.1.3)를 이용해서 하기 반응:
3-하이드록시알칸산 + CoA → 3-하이드록시아실 CoA
을 촉매하는 방법이 공지되어 있다(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997), Aool, Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43(2000) 등). 효소나 유기체를 이용한 합성법은, 고정화 효소나 세포(즉, 균체)를 이용한 회분식 혹은 연속식이어도 된다.
<PHA신타제 및 미생물생산>
본 발명에 사용되는 PHA신타제는, 각종 미생물로부터 선택된 1종의 미생물을 이용하거나, 이러한 미생물의 PHA신타제유전자가 도입된 형질전환체를 이용해서 PHA신타제를 생산할 수 있다.
<PHA합성효소의 획득>
본 발명의 PHA합성효소의 생산에 이용되는 미생물의 루틴배양에 대해서는, 예를 들면, 세포를 준비하거나, 효소생산을 위해 충분한 세포를 얻거나, 혹은 세포의 활성상태를 유지하기 위해, 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유하는 배지를 적절하게 선택할 수 있다.
목적 미생물을 증식시킬 수 있는 한 액체배양, 고체배양 등의 어떠한 배양법이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 회분식 배양, 유동회분식 배양, 반연속배양, 연속배양 등의 어느 배양법을 이용해도 된다. 액체회분식 배양의 예로서는, 배양플라스크를 진탕시켜 산소를 공급하는 방법, 통기에 의해 산소를 공급하는 자발효기를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 이들 방법은 복수를 조합해서 다단방법으로 해도 된다.
상기 PHA생산미생물을 이용해서 PHA신타제를 생산하기 위해서는, 먼저, 미생물을 옥탄산, 노난산 등의 알칸산을 함유하는 배지에서 증식한 후, 대수후기에서 초기의 정상성장상의 세포를, 원심분리 등에 의해 수확하여 해당 세포로부터 효소를 추출한다. 상기와 같이 세포를 배양하면, 첨가된 알칸산으로부터 세포내에 mc-PHA가 합성된다. 이 경우, PHA신타제는 세포내에 합성된 PHA의 미립자와 결합을 형성하고 있다. 그러나, 본 발명자들은, 실질적인 효소활성이 배양세포를 파쇠하거나 원심분리할 경우 상청액에 존재하는 것을 발견하였다. 이 효소가 후기대수의 비교적 초기성장상에서 초기정상상동안 활성적으로 합성되기 때문에 PHA신타제 없이 소량이 존재하는 것으로 여겨진다.
상기 배양방법에 사용가능한 무기배지로서는, 미생물의 성장을 지지하기 위해, 인원(예를 들면, 인산염 등), 질소원(예를 들면, 암모늄염, 질산염 등) 등의 성분을 함유하고 있는 한 어떠한 것이라도 된다. 따라서, 무기염배지로서는, 예를 들면, MSB배지, E배지(J. Biol. Chem., 218, 97-106(1956)), M9배지 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 실시예에서 사용하는 M9배지의 조성은 전술한 바와 같다.
또, 양호한 증식 및 PHA신타제의 생산을 위해서는, 전술한 조성의 미량성분용액을 0.3%(v/v)정도 첨가하는 것이 바람직하다.
배양온도는 상기 균주를 충분히 증식시킬 수 있는 온도라면 어느 것이라도 되며, 14 내지 40℃, 바람직하게는, 약 20 내지 35℃의 범위이다.
또, 상기 PHA생산균주의 PHA신타제유전자가 도입되어 있는 형전전환체를 이용해서 PHA신타제를 생산하는 것도 가능하다. PHA신타제유전자의 클로닝, 발현벡더의 구축 및 형질전환은, 종래의 방법에 따라 행할 수 있다. 대장균(Escherichia coli) 등의 균체숙주를 이용해서 얻어진 형질전환체를 배양하기 위해서는, LB배지 등의 천연배지나, M9배지 등의 합성배지를 이용할 수 있다. 세포(균체)는 25 내지 37℃에서 8 내지 27시간 통기하에 배양한다. 배양후, 상기 세포를 모아서 해당 세포내에 축적된 PHA신타제를 회수한다. 배지에는, 필요에 따라, 카나마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 클로르암페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다. 또, 유도촉진물질을 발현벡터에 사용할 경우, 형질전환체를 배양할 때 배지에 대응하는 유도물질을 첨가함으로써 발현을 촉진해도 된다. 이러한 유도물질로서는, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 테트라사이클린 또는 인돌아크릴산(IAA)을 들 수 있다.
PHA신타제는, 세포라이세이트(cell lysate) 혹은 황산암모늄에 의해 침전된 단백질 성분 등의 미가공(즉, 조제의(crude)) 효소나, 각종 방법에 의해 정제된 정제효소이어도 된다. 효소프라파라트에는, 금속염, 글리세린, 디티올트레이톨, EDTA, 소혈청알부민(BSA) 등의 안정제 혹은 활성화제를 첨가해도 된다.
PHA신타제는, 효소활성이 유지되는 한 어떠한 방법으로 단리·정제해도 된다. 예를 들면, 효소는, 프렌치처리 혹은 초음파균질화기를 이용해서 세균세포,리소자임 또는 각종 계면활성제를 파쇄하고, 세포라이세이트를 원심분리해서 제조된 조제의 효소 또는 그의 황산암모늄석출물을, 어피니티(affinity)크로마토그래피, 양이온 혹은 음이온 이온교환크로마토그래피, 겔여과 혹은 이들의 소정의 조합에 의해 정제하는 방법에 의해 정제할 수 있다. N말단 또는 C말단에 히스티딘잔기와 같은 태그를 지닌 융합단백질로서 표현되는 재조합단백질은, 이 태그를 통해 어피니티수지에 결합함으로써 용이하게 정제할 수 있다. 대상 단백질을 트롬빈 등의 프로테아제 및 , 혈액응고인자 Xa로 처리함으로써, pH를 낮춤으로써 혹은 결합길항제로서의 고농도 이미다졸을 첨가함으로써 융합단백질로부터 단리해도 된다. 또는, 발현벡터로서 pTYB1(뉴잉글랜드바이오랩사 제품)를 이용하고, 태그가 인테인을 함유한 경우, 디티오트레이톨을 이용해서 감압하에 결합을 파괴해도 된다. 히스티딘태그에 부가해서, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 키틴결합영역(CBD), 말토즈결합단백질(MBP) 및 티오레독신이 융합단백질의 어피니티정제를 가능하게 하는 것으로 공지되어 있다. GST융합단백질은, GST어피니티수지에 의해 정제할 수 있다.
PHA신타제의 효소활성은, 각종 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)과 컬러현상을 이용하는 PHA신타제에 의해 촉매되는 PHA중합반응동안 3-하이드록시아실 CoA로부터 방출된 CoA를 측정하는 하기 방법이 있다:
시약 1: 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0)중에 용해된 소혈청알부민(시그마)의 3.0㎎/㎖용액; 시약 2: 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0)중에 3-하이드록시옥타노일CoA의 3.0mM용액; 시약 3: 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0)중의 트리클로로아세트산 10㎎/㎖용액; 시약 4: 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0)중의 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)의 2.0mM용액.
-제 1반응(PHA합성반응): 100㎕의 시약 1을 시료(효소)용액 100㎕에 첨가해서 혼합한 후, 해당 혼합물을 30℃에서 1분간 예비배양하고, 100㎕의 시약 2를 첨가하여 혼합한다. 얻어진 혼합물을 30℃에서 1시간 예비배양하고, 시약 3을 첨가해서 반응을 정지시킨다.
-제 2반응(자유 CoA의 발색): 얻어진 제 1반응용액을 원심분리(15,000×g, 10분간)한다. 상청액 500㎕에, 시약 4를 500㎕ 첨가하여 30℃에서 10분간 배양한다. 다음에, 412nm에서의 흡수를 측정한다.
-효소활성의 산출: 1분내에 CoA 1μmol을 방출하는 효소의 양을 1유닛(U)으로 정의한다.
일반적으로, 상기 효소에 의해 합성된 PHA는, R체 단독으로 이루어진 입체규칙성 폴리머이다.
<친수성 약물을 함유하는 입상 구조체 및 그 제조방법>
본 발명의 일실시형태예에 의하면, 입상 구조체는, 적어도 약물과 PHA를 함유하고, 미소구 혹은 마이크로캡슐 등의 각종 형태인 것으로 가정할 수 있다. 구체예로서는, 약물을 PHA에 용해 혹은 분산되어 있는 미소구를 고용체로서 분자상태로 함유하는 코어이다.
서방성 프레파라트 단독으로 이용가능하거나 필요에 따라 첨가제를 지닌 본발명의 입상 구조체는, 약물성분을 함유하는 용액이 내부 수상을 구성하고 PHA를 함유하는 용액이 오일상을 구성하는 w/o에멀젼 또는 상기 w/o에멀젼을 각종 방법을 이용해서 외부 수상에 또 유화시킴으로써 형성된 w/o/w에멀젼으로부터 제조할 수 있다.
이러한 방법으로서는, 액중 건조, 상분리, 분무건조 등을 들 수 있다.
또는, 입상 구조체는, 내부 수상이 약물, PHA합성효소 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 w/o에멀젼에서, 혹은, PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 또 함유해도 되는 외부수상에서 상기 w/o에멀젼의 유화를 행함으로써 형성된 w/o/w에멀젼에서 PHA합성을 행하는in vitro합성에 의해 제조할 수 있다.
또는, 입상 구조체는, 내부수상이 약물용액인 w/o에멀젼을, PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 외부 수상에서 유화시킴으로써 제조된 w/o/w에멀젼을 이용해서 PHA합성반응에 의해 적절하게 제조할 수 있다.
<w/o에멀젼의 제조-친수성 약물의 편입, 즉, 배합->
내부상이 약물을 함유하는 용액이고 오일상이 본 발명의 PHA를 함유하는 용액인 w/o에멀젼은 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다.
먼저, 수용성 약물을, 필요에 따라 내부 수상에 대해, 젤라틴, 한천, 폴리비닐알콜 또는 염기성 아미노산(아르기닌, 히스티딘 또는 리신) 등의 약물보유물질을 지닌 물에 용해 혹은 분산시키고, 여기서의 약물의 농도는 약 0.001 내지 90중량%, 바람직하게는, 0.01 내지 80중량%의 범위이다. 상기 약물보유물질의 첨가량은, 해당 약물에 대해 약 0.01 내지 100중량배, 바람직하게는, 0.05 내지 50중량배의범위이다. 또, 이러한 약물보유물질을 먼저 약물과 함께 물에 임의의 농도로 용해시키고, 필터를 통해 여과시켜 미생물과 먼지를 제거하고, 동결건조한 후, 사용전에 용해시키는 것도 가능하다. 본 발명의 서방성 프레파라트의 약물포획효율은, 내부상에 약물보유물질이 없이도 충분히 높다. 내부 수상에는, 카르복시산, 아세트산, 옥살산, 시트르산, 인산, 염화수소산, 수산화나트륨, 아르기닌, 리신 또는 그의 염 등의 약물의 안정성과 용해성을 유지시키도록 pH조정제를 함유시켜도 된다. 약물용 안정제로서는, 알부민, 젤라틴, 트레할로스, 시트르산, EDTA, 덱스트린, 시클로덱스트린(α, β, γ) 또는 그 유도체(말토실 β-시클로덱스트린 또는 β-시클로덱스트린 설포부틸에테르), 아황산수소나트륨, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리올, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(예를 들면, 트윈(Tween) 80 또는 트윈 60(일본국 카오사 제품)) 등의 계면활성제 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-60 또는 HCO-70, 일본국 닛코화학사 제품) 등을 함유시켜도 된다. 또, 파라옥시벤조산 에스테르(메틸파라벤 또는 프로필파라벤), 벤질알콜, 클로로부탄올 및 티멜로잘 등의 통상의 방부제를 함유시켜도 된다.
이와 같이 해서 얻어진 내부 수상은, PHA함유용액(오일상)과 혼합해서 유화시켜 w/o에멀젼을 제조한다. 유화는, 공지의 방법, 예를 들면, 간헐진동법, 프로펠러교반기 또는 터빈교반기 등의 믹서를 이용한 교반, 콜로이드밀법, 균질화법 또는 초음파법, 또는 이들의 조합법에 의해 행할 수 있다. w/o에멀젼의 유화수준은, 약물방출성에 영향을 미치고, 불충분한 유화는 초기 버스트를 증가시키는 경향이 있다. 내부 수상의 크기가 미세할 수록, 약물과 PHA간의 상호작용이 보다 향상되어, PHA의 종류/조성비/분자량/결정화도에 따라 PHA에 의한 정확한 방출제어를 보다 가능하게 한다.
PHA를 함유하는 오일상은, 물과 실질적으로 혼화될 수 없는 유기용매에 용해된 PHA의 용액이다. 유기용매의 수중 용해도는, 상온(20℃)에서 3중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 또, 유기용매의 비점은, 120℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 유기용매의 예로서는, 디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 4염화탄소 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤류; 테트라하이드로푸란, 에틸에테르, 이소프로필에테르 등의 에테르류; 아세트산에틸, 아세트산부틸 등의 에스테르류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류 등을 들 수 있고; 이들은 2종이상의 혼합물로 이용해도 된다. 보다 바람직하게는, 유기용매는, 할로겐화 탄화수소(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 4염화탄소 등)이다. 오일상중의 PHA농도는, PHA의 종류와 분자량, 용매의 종류에 따라 다르지만, 바람직하게는, 0.01 내지 80중량%, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 70중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 60중량%이다. 내부 수상과의 상용성, 외부 수상에의 분포 및 유기용매의 증발을 변화시키기 위해, 오일상에 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로푸란 등의 부분 친수성 유기용매를 첨가해도 된다. 그리고, 내부의 약물을 용해 혹은 안정화시키기 위해, 글루코스-지방산에스테르 등의 계면활성제를 첨가할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 오일상을 사용전에 세균 및 먼지를 제거하기 위해 여과를 행해도 된다. PHA함유용액은, PHA의 안정성에 따라실온의 기밀밀폐용기에서 혹은 서늘한 장소에서 보관해도 된다.
PHA를 함유하는 유기용매에 대한 약물을 함유하는 수용액의 혼합비는, 1: 약 0.1 내지 1000, 바람직하게는, 1: 약 1 내지 100(중량부)이다. 또, 서방성 프레파라트중의 약물이 양은, 약물의 종류, 소망의 약물효과 및 효능기간에 따라, PHA의 약 0.01 내지 50중량%, 바람직하게는, 0.1 내지 40중량%, 보다 바람직하게는, 1 내지 30중량%이다.
<w/o/w에멀젼의 제조 및 액중 건조-친수성 약물의 배합->
다음에, 이와 같이 해서 얻어진 w/o에멀젼에 대해 입상체 형성공정을 실시한다. 예를 들면, 액중건조에 의해 입상체형성을 행할 경우, w/o에멀젼을 또, 수상(이하, "외부수상"이라 칭함)에 첨가해서 w/o/w에멀젼을 제조한 후, 오일상중의 유기용매를 제거해서 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 얻는다.
외부 수상의 체적은, 일반적으로 오일상의 체적에 대해 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배이다.
외부 수상에는 유화제를 함유시켜도 되며, 이 때의 유화제로서는, 안정한 w/o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어느 것이라도 가능하며, 예를 들면, 음이온성 계면활성제(올레산나트륨, 스테아르산나트륨 또는 황산 라우릴나트륨), 비이온성 계면활성제[폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들면, 트윈(Tween) 80 또는 트윈 60, 미국 아틀라스 파워사 제품) 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-70, HCO-60 또는 HCO-50, 일본국 닛코화학사 제품)], 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸셀룰로스, 레시틴, 젤라틴, 히알우론산 또는그 유도체 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 복수종을 조합해서 이용해도 된다. 외부 수상중의 유화제의 농도는, 약 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는, 0.05 내지 10중량%의 범위내이다.
상기 외부 수상에는, 또한, 수용액이 삼투압을 나타내는 물질이라면 어떠한 것이라도 가능한 삼투압조정제, 예를 들면, 수용성 다가 알콜, 수용성 1가알콜, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체, 수용성 아미노산류, 수용성 펩티드류, 단백질 및 그 유도체 등을 첨가해도 된다.
상기 수용성 다가 알콜류로서는, 글리세린 등의 2가 알콜류, 아라비톨, 크실리톨(자일리톨), 아도니톨 등의 5가 알콜류, 만니톨, 소르비톨, 주르시톨 등의 6가 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중, 6가알콜, 특히 만니톨이 바람직하다. 상기 수용성 1가 알콜로서는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중, 에탄올이 바람직하다. 상기 수용성 단당류로서는, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 2-데옥시리보스 등의 5탄당류, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 소르보스, 람노스, 푸코스 등의 6탄당류 등을 들 수 있고, 이들 중 6탄당이 바람직하다. 상기 수용성 이당류로서는, 말토스, 셀로비오스, α,α-트레할로스, 락토스, 글루코스 등을 들 수 있고, 이들 중, 락토스, 글루코스 등이 바람직하다. 상기 수용성 올리고당류로서는, 말토트리오스, 라피노스 등의 3당류, 스타키오스 등의 4당류 등을 들 수 있고, 이들 중, 3당류가 바람직하다. 상기 수용성 단당류, 이당류 및 올리고당류의 유도체로서는, 글루코사민, 갈락토사민, 글루쿠론산, 갈락투론산 등을 들 수 있다.
상기 수용성 아미노산으로서는, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌, 프롤린, 하이드록시프롤린, 시스테인, 메티오닌 등의 중성 아미노산류; 아스파라긴산, 글루탐산 등의 산성 아미노산류; 리신, 아르기닌, 히스티딘 등의 염기성 아미노산류 등을 들 수 있다. 또, 이러한 수용성 아미노산과 산(염화수소산, 황산 또는 인산) 혹은 알칼리(나트륨 혹은 칼륨 등의 알칼리금속)와의 염류를 이용해도 된다. 수용성 펩티드류, 단백질류 및 그 유도체로서는, 카세인, 글로부린, 프롤라민, 알부민, 젤라틴 등을 들 수 있다. 상기 삼투압조정제중에서, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 가장 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류를 들 수 있다. 이러한 삼투압 조정제는 단독으로 혹은 2종이상 조합해서 이용해도 된다. 이러한 삼투압 조정제는, 외부 수상의 삼투압이 생리식염수의 삼투압의 약 1/50 내지 5배, 바람직하게는, 1/25 내지 3배이다. 구체적으로는, 외부 수상중의 삼투압조정제의 농도는, 비이온성 물질의 경우, 약 0.001 내지 60중량%, 바람직하게는, 0.01 내지 40중량%, 보다 바람직하게는, 0.05 내지 30중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 10중량%이다.
이온성 물질의 경우, 삼투압 조정제는, 상기 농도를 총이온가로 나누어서 얻어진 농도에서 사용한다. 삼투압 조정제의 첨가량은, 용해도미만일 필요는 없고 일부 현탁상태에서 사용할 수 있다.
본 발명에서 w/o/w에멀젼을 제조할 경우, w/o에멀젼의 점도는, 50 내지10,000cp의 범위내에서 조정하는 것이 바람직하다. 상기 점도는, 예를 들면, (1) 오일상중의 PHA농도의 조정, (2) 수상과 오일상의 비의 조정, (3) w/o에멀젼의 온도의 조정, (4) 외부 수상의 온도의 조정 또는 (5) 외부 수상안으로 주입시 냉매 혹은 라인히터에 의한 w/o에멀젼의 온도의 조정에 의해 조정할 수 있다. 이들 방법은, 단독으로 혹은 조합해서 이용해도 된다. 이들 방법에 있어서, 단지 필요한 것은, w/o에멀젼의 점도를 w/o/w에멀젼으로 환산해서 50 내지 10,000cp의 범위내로 하는 것이다. 상기 방법(1)에 있어서, 오일상중의 PHA의 조정해야 할 농도는, PHA 및 유기용매의 종류에 따라 그대로 유일하게 구할 수는 없고, 바람직하게는, 약 10 내지 80중량%이다. 상기 방법(2)에 있어서, 수상과 오일상의 조정해야 할 비는, 약물의 종류와 양, 오일상의 성질에 따라 그대로 구할 수 없고, 바람직하게는, w/o=약 1 내지 50체적%이다. 상기 방법(3)에 있어서, w/o에멀젼의 온도는, 예를 들면, 약 -20℃ 내지 유기용매의 비점까지의 범위, 바람직하게는, 0℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. w/o에멀젼의 점도는, 상기 (1) 또는 (2)의 방법에 있어서 제조시에 조정할 수 있다. 상기 방법(4)에 있어서, 외부 수상의 온도는, 상기 방법(3)과 유사한 결과를 얻도록 w/o에멀젼의 첨가전에 조정해도 된다. 외부 수상의 온도는, 예를 들면, 약 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 12 내지 25℃이다.
유기용매의 제거는, 공지의 방법, 예를 들면, 상압 혹은 점차적인 감압하에 프로펠러교반기 혹은 자기교반기에 의한 교반하에 유기용매를 증발시키는 방법 또는 예를 들면, 회전증발기에서 제어된 진공도 및 온도하에 유기용매를 증발시키는방법에 의해 행할 수 있다.
그 후, 입상 구조체에 대해서는, 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 입상 구조체의 표면상에 달라 붙은 자유약물, 약물보유물질, 유화제 등을 제거하고, 나머지 용매 및 물은 감압하 건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 제거한다.
<상분리-친수성 약물의 배합->
상분리에 의한 입상체 형성의 경우, 입상 구조체는, 코아세르베이션제를 w/o에멀젼에 교반하 점차로 첨가함으로써, PHA를 석출시켜 고형화시켜 제조한다. 코아세르베이션제는, 상기 입상체형성용의 PHA를 용해시키지 않고 PHA의 용매와 혼화가능한 폴리머, 광유 혹은 식물성 유지에 의거한 물질이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 실리콘오일, 참기름, 두유, 옥수수유, 면실유, 야자유, 아마인유, 광유, n-헥산, n-헵탄, 메탄올 혹은 에탄올 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상 조합해서 이용해도 된다.
w/o에멀젼에 대한 코아세르베이션제의 양은, 예를 들면, 약 0.01 내지 1,000체적배, 바람직하게는, 0.1 내지 200체적배이다. 얻어진 입상 구조체는, 원심분리 혹은 여과후, 헥산 혹은 헵탄 등의 세정액으로 반복해서 세정하여 코아세르베이션제를 제거하고, 해당 세정액은 가열에 의해 혹은 감압하에 증류시킨다. 그 후, 필요에 따라, 자유약물 및 유기용매를 전술한 액중건조의 경우와 마찬가지 방법으로 제거한다.
<분무건조-친수성 약물의 배합->
분무건조에 의한 입상체 형성의 경우, 액중 건조법과 마찬가지 방법으로 제조한 w/o에멀젼 혹은 w/o/w에멀젼을, 노즐로부터 분무건조기의 건조실내로 분무하여, 매우 단시간내에 분쇄된 액적내의 유기용매와 물을 증류시킴으로써, 미분말상태의 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조한다. 노즐은, 2액형 노즐, 가압노즐 혹은 회전원반형이어도 된다. 얻어진 입상 구조체는, 필요에 따라, 증류수로 수회 세정하여, 해당 입상 구조체의 표면에 달라 붙어 있는 자유약물, 약물보유물질, 유화제 등을 제거한다. 다음에, 세정된 마이크로캡슐에 대해 감압건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 유기용매의 제거를 행한다.
<입상 구조체 및 그 제조방법-친유성 약물의 배합>
본 발명의 입상 구조체는, 적어도 약물과 PHA를 함유하는 입상 구조체로, 미소구 혹은 마이크로캡슐 등의 각종 형태를 취할 수 있다. 구체예로서는, PHA를 함유하는 코어에 약물을 지닌 마이크로캡슐, 분자상태에서 고용체로서 PHA에 약물이 용해 혹은 분산되어 있는 입상 구조체(미소구)를 들 수 있다.
본 발명의 입상 구조체는, 약물, PHA 및 유기용매를 함유하는 오일상으로부터 유기용매를 제거함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, (a) 약물과 (b) PHA를 함유하는 유기용매액을 제조하기 위해서는, 상기 (a) 및 (b)를 용매계에 최종적으로 균일하게 용해 혹은 분산시키는 방법을 채용하면 된다. 이러한 방법의 예로서는, (1) 용매중의 (a)의 용액 혹은 분산액과, 용매중의 (b)의 용액 혹은 분산액을 혼합하는 방법, (2) 용매중의 (a)의 용액 혹은 분산액과 (b)를 혼합하는 방법, (3) 용매중의 (b)의 용액 혹은 분산액과 (a)를 혼합하는 방법, (4)상기 (a), (b) 및 용매를 혼합하여 용매중의 (a), (b)의 용액을 형성하는 방법을 들 수 있다. 상기 용매는, 해당 용매의 혼합후 상기 (a) 및 (b)가 용해상태로 유지되도록 선택하는 것이 적합하다. 구체적으로는, 상기 용매는, 상기 유기용매중의 하나에 의해, 혹은 2종이상을 적절한 비율로 혼합함으로써, 그리고, 필요에 따라, 상기 유기용매를 상기 (a) 및 (b)의 용해를 저해하지 않는 정도로 첨가함으로써 얻을 수 있다.
마이크로캡슐과 같은 본 발명의 입상 구조체는, 약물과 PHA의 용액 혹은 분산액으로 이루어진 오일상으로부터 유기용매를 제거함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 이미 공지된 방법, 예를 들면, 용매를 증발시켜 입상 구조체를 고형화시키는 방법(액중 건조), 상기 용액 혹은 현탁액에 교반하 PHA를 용해시키지 않고 혼화가능한 용매(소위 빈용매)를 첨가하여 PHA의 상분리를 행함으로써 고형화된 입상 구조체를 형성하는 방법, 분무건조에 의해 입상 구조체를 얻는 방법, 상기 오일상으로부터 유기용매를 제거함으로써 얻어진 고체를 제트밀 등에 의해 분쇄하는 가스분쇄방법, 혹은 유사한 방법을 이용할 수 있다.
유기용매중 약물을 용해 및/또는 현탁시키고, 이러한 유기상을 PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 다량의 물에 주입하여 유화시켜, o/w에멀젼을 얻고, PHA합성반응을 행하여 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체를 제조하는 방법을 이용하는 것도 유리하다.
<유기용매의 예-친유성 약물의 배합->
상기 유기용매의 예로서는, 수중 용해도가 상온(20℃)에서 3중량%를 초과하지 않는 유기용매가 바람직하다. 또, 유기용매의 비점은, 120℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 유기용매의 예로서는, 할로겐화 탄화수소류(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 또는 4염화탄소 등), 케톤류(아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등), 에테르류(테트라하이드로푸란, 에틸에테르, 이소프로필에테르 등), 에스테르류(아세트산에틸, 아세트산부틸 등), 방향족 탄화수소류(벤젠, 톨루엔, 크실렌 등) 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상의 혼합물로 이용해도 된다. 보다 바람직하게는, 유기용매는, 할로겐화 탄화수소(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 4염화탄소 등)이다.
<약물/PHA농도-친유성 약물의 배합->
약물의 양은, 약물의 종류, 효과의 소정 기간에 의존하나, 용액중의 농도는, 약 0.001 내지 200w/w%, 바람직하게는, 0.001 내지 100w/w%, 보다 바람직하게는, 0.01 내지 50w/w%의 범위내이다. 또, 프레파라트중의 약물의 양도, 약물의 종류, 소망의 약제효과 및 효능기간에 의존하나, PHA에 대해 약 0.01 내지 60w/w%, 바람직하게는, 0.1 내지 55w/w%, 보다 바람직하게는, 1 내지 50w/w%의 범위내이다. PHA농도는, PHA의 분자량 및 용매의 종류에 따라 다르지만, 바람직하게는, 약 0.01 내지 80w/w%, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 70w/w%, 가장 바람직하게는, 1 내지 60w/w%이다.
<액중 건조-친수성 약물의 배합>
액중건조에 의한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체의 제조는, 통상, 수상에 약물, PHA 및 유기용매를 함유하는 오일상을 분산시켜 o/w에멀젼을 형성하고 나서, 오일상중의 유기용매를 제거함으로써 행한다. 수상의 체적은, 일반적으로 오일상의 체적에 대해 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배이다. 수상의 온도는, 미리, 예를 들면, 약 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. 수상에는 유화제를 함유시켜도 되며, 이 때의 유화제로서는, 안정한 o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어느 것이라도 가능하며, 예를 들면, 음이온성 계면활성제(올레산나트륨, 스테아르산나트륨 또는 황산 라우릴나트륨), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(트윈 80 또는 트윈 60, 미국 아틀라스 파워사 제품) 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-70, HCO-60 또는 HCO-50, 일본국 닛코화학사 제품) 등의 비이온성 계면활성제, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸셀룰로스, 레시틴, 젤라틴, 히알우론산 또는 그 유도체 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 복수종을 조합해서 이용해도 된다. 외부수상중의 유화제의 농도는, 약 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는, 0.05 내지 10중량%의 범위내이다. 수상의 체적은, 일반적으로 오일상의 체적에 대해서 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배, 가장 바람직하게는, 5 내지 1,000배이다. 수상에는 유화제를 함유시켜도 되며, 이 때의 유화제로서는, 안정한 o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어느 것이라도 가능하다.
유화제는, 비독성 혹은 비항원 유화제가 바람직하며, 예를 들면, 음이온성계면활성제(올레산나트륨, 스테아르산나트륨 또는 황산 라우릴나트륨 등), 양이온성 계면활성제(라우릴트리메틸암모늄 클로라이드 등), 양성 계면활성제(N-라우릴글리신 등), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(트윈 80 또는 트윈 60, 트윈 40 또는 트윈 20, 미국 아틀라스 파워사 제품) 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-70, HCO-60 또는 HCO-50, 일본국 닛코화학사 제품) 등의 비이온성 계면활성제, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 레시틴, 전분, 카제인, 펙틴, 젤라틴, 알긴산, 알기네이트, 로쿠스트빈(locust bean)고무, 구아고무, 아라비아고무, 크산텐고무, 한천, 카라기난, 히알우론산, 바일산염, 코알산 나트륨 또는 폴리옥시에틸렌에테르 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 복수종을 조합해서 이용해도 된다.
유화제의 사용농도는, 약 0.001 내지 20w/v%, 바람직하게는, 0.01 내지 10w/v%, 0.05 내지 5w/v%의 범위내에서 적절하게 선택할 수 있다. 유화는, 공지의 방법, 예를 들면, 간헐진동법, 프로펠러교반기 또는 터빈교반기 등의 믹서를 이용한 교반, 회전자 및 정지자간의 좁은 틈새에 의한 고속회전, 초음파진동, 좁은 틈새를 통한 초음파통과 또는 실라스벌룬을 소결시켜 얻어진 미세 구멍을 지닌 무기멤브레인을 통한 통과에 의해 행할 수 있다.
이러한 w/o에멀젼은 유화수준에 의해 약물방출성이 영향을 받고, 불충분다면, 초기 버스트를 증가시키는 경향이 있고, 내부 수상의 크기가 소정의 수준보다도 미세할 수록, 약물과 PHA간의 상호작용이 보다 향상되어, PHA의 생분해성에 따라 PHA에 의한 정확한 방출제어를 보다 가능하게 한다.
본 발명의 o/w에멀젼의 제조시의 구성성분의 공급은, 공지의 기술에 따른 각종 모드, 예를 들면, 용기에 PHA용액을 주입하고 유화제를 함유하는 수상을 첨가하는 방법, 첨가의 순서를 역으로 하는 방법 혹은 양자를 일정한 비율로 연속적으로 공급하는 방법을 취할 수 있다. 회전혼합의 경우, 첫번째 언급한 순서가 바람직하다. 이 경우, PHA가 연속상을 구성하고, 수상이 분산상을 구성하는 w/o에멀젼을 최초로 형성하고, 상기 에멀젼이 수상 성분의 첨가량의 증가에 따라 w/o형에서 o/w형으로 변환됨으로써, 오일상의 입상체 형성을 촉진시킨다.
유기용매의 제거는, 공지의 방법, 예를 들면, 상압 혹은 점차적인 감압하에 프로펠러교반기 혹은 자기교반기에 의한 교반하에 유기용매를 증발시키는 방법 또는 예를 들면, 회전증발기에서 제어된 진공도하에 유기용매를 증발시키는 방법에 의해 행할 수 있다. o/w에멀젼의 액중건조시, 입상 구조체는 고형화시켜 그 구조를 결정한다. 이와 같이 해서 얻어진 입상 구조체에 대해서는, 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 입상 구조체의 표면상에 달라 붙은 자유약물, 약물보유물질, 유화제 등을 제거하고, 증류수 등에의 재분산후, 동결건조한다.
<상분리-친유성 약물의 배합->
상분리에 의한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 제조의 경우, 코아세르베이션제를, 약물과 PHA를 함유하는 유기용매에, 교반하에 일정 속도로 점차로 첨가함으로써, PHA를 석출시켜 고형화시킨다. 이러한 코아세르베이션제는, 약물 및 PHA의 유기용매용액의 0.01 내지 1,000배, 바람직하게는, 0.05 내지 500배, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 200배의 양을 첨가한다. 또, 해당 코아세르베이션제는, 상기입상 구조체용의 PHA를 용해시키지 않고 PHA의 용매와 혼화가능한 폴리머, 광유 혹은 식물성 유지에 의거한 물질이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 실리콘오일, 참기름, 두유, 옥수수유, 면실유, 야자유, 아마인유, 광유, n-헥산, n-헵탄, 메탄올 혹은 에탄올 등을 들 수 있다.
이들은 2종이상 조합해서 사용해도 된다. 마이크로캡슐과 같은 얻어진 입상 구조체는, 여과후, 헵탄 등으로 반복해서 세정하여 코아세르베이션제를 제거하고, 자유약물 및 유기용매의 제거를 행한다.
<입상 구조체 및 그 제조방법-액상의 배합->
본 발명의 마이크로캡슐은, 적어도 약물과 PHA를 함유하는 입상 구조체로, 앞에서 설명한 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐은, 내부 수상과 약물을 함유하여 내부수상을 구성하는 용액으로 이루어진 w/o에멀젼, 또는 w/o에멀젼을 또 외부 수상에 유화시킴으로써 형성된 w/o/w에멀젼, 또는 PHA를 함유하는 오일상과 외부수상으로 이루어진 o/w에멀젼을 마이크로캡슐화함으로써 제조할 수 있다. 이러한 마이크로캡슐화는, 예를 들면, 액중건조, 상분리, 분무건조 혹은 마찬가지 방법에 의해 행할 수 있다.
또, PHA합성효소 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 용액이 내부 수상을 구성하는 w/o에멀젼, PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 함유해도 되는 외부 수상에 상기 w/o에멀젼의 유화를 또 행함으로써 형성된 w/o/w에멀젼, 또는 PHA합성효소 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 용액이 외부 수상을 구성하는 o/w에멀젼을 형성하고, PHA합성반응을 행함으로써 마이크로캡슐을 제조하는 방법(in vitro합성)을 유리하게 이용하는 것도 가능하다.
<w/o에멀젼의 제조-액상의 배합->
본 발명의 내부 수상과 PHA를 함유하는 오일상으로 이루어진 w/o에멀젼은, 하기 방법으로 제조할 수 있다.
먼저, 내부 수상의 물은, 외부 오일상의 유기용매용액과 비중을 일치시키기 위해, 무기 혹은 유기염의 수용액일 수 있다. 무기염으로서는, 예를 들면, 염화칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화칼슘, 브롬화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소칼륨 등을 들 수 있다. 유기염으로서는, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 인산, 아스코르빈산 등의 유기산의 나트륨염 혹은 칼륨염을 들 수 있다. 이들 중, 본 발명에 있어서는, 경제성, 비중일치의 용이성 및 세정의 용이성을 고려해서, 염화칼슘의 수용액이 바람직하다. 이러한 무기 혹은 유기염의 물에의 첨가량은, PHA의 유기용매용액과 비중을 일치시키기 위해, 약 1 내지 60w/v%, 바람직하게는, 20 내지 50w/v%이다. 이와 같이 해서, 오일상에 물방울이 균일하게 분산된 w/o에멀젼을 얻을 수 있다.
이와 같이 해서 얻어진 내부 수상과 PHA함유용액(오일상)을 혼합하여 유화시켜 w/o에멀젼을 제조한다. 유화는, 공지의 방법, 예를 들면, 간헐진동법, 프로펠러교반기 또는 터빈교반기 등의 믹서를 이용한 교반, 콜로이드밀법, 균질화법 또는 초음파법, 또는 이들의 조합법에 의해 행할 수 있다. w/o에멀젼을 제조하는 주된 유화는, 최종 마이크로캡슐구조의 균일성을 확보하는 데 중요하며, 이 단계에서, PHA의 유기용매용액중에 가능한 한 균일하게 내부 수상을 분산시키는 것이 필요하다. 이 목적을 위해, 내부 수상의 물방울의 직경은 가능한 한 축소시키는 것이 바람직하며, 다른 분산법과 조합한 초음파조사를 이용하는 것이 유리하다.
PHA를 함유하는 상기 용액(오일상)은, 물과 실질적으로 혼화될 수 없는 유기용매에 용해된 PHA의 용액이다. 이러한 유기용매의 수중 용해도는, 상온(20℃)에서 3중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 또, 유기용매의 비점은, 120℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 유기용매의 예로서는, 할로겐화 탄화수소류(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 또는 4염화탄소 등), 케톤류(아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등), 에테르류(테트라하이드로푸란, 에틸에테르, 이소프로필에테르 등), 에스테르류(아세트산에틸, 아세트산부틸 등), 방향족 탄화수소류(벤젠, 톨루엔, 크실렌 등) 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상의 혼합물로 이용해도 된다. 보다 바람직하게는, 유기용매는, 할로겐화 탄화수소(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 4염화탄소 등)이다. 오일상중의 PHA농도는, PHA의 종류와 분자량, 용매의 종류에 따라 다르지만, 바람직하게는, 약 0.01 내지 80중량%, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 70중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 60중량%이다. 내부 수상과의 상호용해성, 외부 수상에 대한 유기용매의 분포 및 유기용매의 증발을 변화시키기 위해, 오일상에는, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 테트라하이드로푸란 등의 친수성 유기용매를 부분적으로 첨가해도 된다. 이와 같이 해서 얻어진 오일상은, 사용전에 여과해서 세균이나 먼지 등을 제거해도 된다. 또, PHA를 함유하는 용액은, PHA의 안정성에 따르지만, 서늘한 장소에서 혹은 실온에서 기밀밀폐용기에 보관해도 된다.
수용성 용액과 PHA를 함유하는 유기용매용액과의 혼합비는, 전자 1중량%에 대해, 후자 약 0.1 내지 1000중량부, 바람직하게는, 약 1 내지 100중량부이다.
<w/o/w에멀젼의 제조 및 액중 건조-액상배합->
다음에, 이와 같이 해서 얻어진 w/o에멀젼에 대해 마이크로캡슐화처리를 행한다. 예를 들면, 마이크로캡슐화를 액중 건조에 의해 행할 경우, w/o에멀젼을 또 수상(이하, "외부수상"이라 칭함)에 첨가해서 w/o/w에멀젼을 제조한 후, 오일상중의 유기용매를 제거해서 마이크로캡슐을 얻는다.
외부 수상의 체적은, 일반적으로 오일상의 체적에 대해 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배이다.
외부 수상에는 유화제를 함유시켜도 되며, 이 때의 유화제로서는, 안정한 w/o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어느 것이라도 가능하며, 예를 들면, 음이온성 계면활성제(올레산나트륨, 스테아르산나트륨 또는 황산 라우릴나트륨), 비이온성 계면활성제[폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들면, 트윈 80 또는 트윈 60, 미국 아틀라스 파워사 제품) 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-70, HCO-60 또는 HCO-50, 일본국 닛코화학사 제품)], 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸셀룰로스, 레시틴, 젤라틴, 히알우론산 또는 그 유도체 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 복수종을 조합해서 이용해도 된다. 외부 수상중의 유화제의 농도는, 약 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는, 0.05 내지 10중량%의 범위내이다.
상기 외부 수상에는, 또한, 수용액이 삼투압을 나타내는 물질이라면 어떠한 것이라도 가능한 삼투압조정제, 예를 들면, 수용성 다가 알콜, 수용성 1가알콜, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체, 수용성 아미노산류, 수용성 펩티드류, 단백질 및 그 유도체 등을 첨가해도 된다.
상기 수용성 다가 알콜류로서는, 글리세린 등의 2가 알콜류, 아라비톨, 크실리톨(자일리톨), 아도니톨 등의 5가 알콜류, 만니톨, 소르비톨, 주르시톨 등의 6가 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중, 6가알콜, 특히 만니톨이 바람직하다. 상기 수용성 1가 알콜로서는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중, 에탄올이 바람직하다. 상기 수용성 단당류로서는, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 2-데옥시리보스 등의 5탄당류, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 소르보스, 람노스, 푸코스 등의 6탄당류 등을 들 수 있고, 이들 중 6탄당이 바람직하다. 상기 수용성 이당류로서는, 말토스, 셀로비오스, α,α-트레할로스, 락토스, 글루코스 등을 들 수 있고, 이들 중, 락토스, 글루코스 등이 바람직하다. 상기 수용성 올리고당류로서는, 말토트리오스, 라피노스 등의 3당류, 스타키오스 등의 4당류 등을 들 수 있고, 이들 중, 3당류가 바람직하다. 상기 수용성 단당류, 이당류 및 올리고당류의 유도체로서는, 글루코사민, 갈락토사민, 글루쿠론산, 갈락투론산 등을 들 수 있다.
상기 수용성 아미노산으로서는, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌, 프롤린, 하이드록시프롤린, 시스테인, 메티오닌 등의 중성 아미노산류; 아스파라긴산, 글루탐산 등의 산성 아미노산류; 리신, 아르기닌, 히스티딘 등의 염기성 아미노산류 등을 들 수 있다. 또, 이러한 수용성 아미노산과 산(염화수소산, 황산 또는 인산) 혹은 알칼리(나트륨 혹은 칼륨 등의 알칼리금속)와의 염류를 이용해도 된다. 수용성 펩티드류, 단백질류 및 그 유도체로서는, 카세인, 글로부린, 프롤라민, 알부민, 젤라틴 등을 들 수 있다. 상기 삼투압조정제중에서, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 가장 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류를 들 수 있다. 이러한 삼투압 조정제는 단독으로 혹은 2종이상 조합해서 이용해도 된다. 이러한 삼투압 조정제는, 외부 수상의 삼투압이 생리식염수의 삼투압의 약 1/50 내지 5배, 바람직하게는, 1/25 내지 3배이다. 구체적으로는, 외부 수상중의 삼투압조정제의 농도는, 비이온성 물질의 경우, 약 0.001 내지 60중량%, 바람직하게는, 0.01 내지 40중량%, 보다 바람직하게는, 0.05 내지 30중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 10중량%이다. 이온성 물질의 경우, 삼투압 조정제는, 상기 농도를 총이온가로 나누어서 얻어진 농도에서 사용한다. 삼투압 조정제의 첨가량은, 용해도미만일 필요는 없고 일부 현탁상태에서 사용할 수 있다.
w/o에멀젼의 물속에의 유화시, w/o에멀젼을 물에 분산시킨 후 교반을 행한다. 교반은, 상기 유화법중의 어느 방법에 의해 행할 수 있으나, 유기용매액상의 단일층이 물을 배합하고 있는 구조를 지닌 유기용매용액의 마이크로캡슐을 얻을 때는 균질화기를 이용하는 것이 바람직하다. 균질화기를 이용할 경우, 교반은, 0.1 내지 30분, 바람직하게는, 0.5 내지 20분간, 100 내지 100,000rpm, 바람직하게는,1,000 내지 50,000rpm에서 행한다.
이러한 조작에 의해, 외부 수상중의 w/o에멀젼액적의 직경은 축소된다. 따라서, 균질화기에 의한 교반은, w/o에멀젼액적중 수상의 분산상태를 변화시키는 일없이 w/o에멀젼액적의 직경을 감소시키는 데 유효하다. 최종의 미립자에 있어서 단일의 폴리머멤브레인구조를 얻기 위해 w/o에멀젼액적의 직경을 1 내지 20㎛로 축소시키는 것이 중요하다. 다음에, 에멀젼을 예를 들면, 프로펠러교반기에 의한 교반하 이 상태에서 방치한다. 이러한 상태에서는, w/o에멀젼액적중의 내부 수상이 불안정하므로, PHA의 고형화전에 통합되어 커다란 단일의 물방울을 형성한다. 한편, w/o에멀젼 자체는, 외부 수상에 있어서 유화제에 의해 안정화되어 있으므로, 그 결과, 내부 수상이 PHA의 유기용매용액의 단층으로 둘러싸여 있는 캡슐구조가 형성된다.
이러한 캡슐구조를 지닌 w/o에멀젼의 형성을 촉진하기 위해, 내부 수상중의 염의 종류와 양, 오일상중의 폴리머의 농도, 오일상(w/o에멀젼액적) 및 유화상태의 외부 수상의 온도, 그리고, 오일상과 수상의 비를 적절하게 조정하는 것이 바람직하다. 특히, 내부 수상중의 무기염의 사용은, 내부 수상의 표면장력을 증대시키므로, 수상을 불안정하게 하여, 입자형성과정에서 w/o에멀젼액적중의 수상을 통합시킴으로써, 단일의 멤브레인구조의 에멀젼의 비율이 증대되어 버린다.
본 발명의 방법에 있어서의 w/o/w에멀젼의 제조시, w/o에멀젼의 점도는, 50 내지 10,000cp의 범위내에서 조정하는 것이 바람직하다. 상기 점도는, 예를 들면, (1) 오일상중의 PHA농도의 조정, (2) 수상과 오일상의 비의 조정, (3) w/o에멀젼의 온도의 조정, (4) 외부 수상의 온도의 조정 또는 (5) 외부 수상안으로 주입시 냉매 혹은 라인히터에 의한 w/o에멀젼의 온도의 조정에 의해 조정할 수 있다. 이들 방법은, 단독으로 혹은 조합해서 이용해도 된다. 이들 방법에 있어서, 단지 필요한 것은, w/o에멀젼의 점도를 w/o/w에멀젼으로 환산해서 50 내지 10,000cp의 범위내로 하는 것이다. 상기 방법(1)에 있어서, 오일상중의 PHA의 조정해야 할 농도는, PHA 및 유기용매의 종류에 따라 그대로 유일하게 구할 수는 없고, 바람직하게는, 약 10 내지 80중량%이다. 상기 방법(2)에 있어서, 수상과 오일상의 조정해야 할 비는, 오일상의 성질에 따라 그대로 구할 수 없고, 바람직하게는, w/o=약 1 내지 50체적%이다. 상기 방법(3)에 있어서, w/o에멀젼의 조정해야 할 온도는, 예를 들면, 약 -20℃ 내지 유기용매의 비점까지의 범위, 바람직하게는, 0℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. w/o에멀젼의 점도는, 상기 (1) 또는 (2)의 방법에 있어서 제조시에 조정할 수 있다. 상기 방법(4)에 있어서, 외부 수상의 온도는, 상기 방법(3)과 유사한 결과를 얻도록 w/o에멀젼의 첨가전에 조정해도 된다. 외부 수상의 온도는, 예를 들면, 약 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 12 내지 25℃이다.
유기용매의 제거는, 공지의 방법, 예를 들면, 상압 혹은 점차적인 감압하에 프로펠러교반기 혹은 자기교반기에 의한 교반하에 유기용매를 증발시키는 방법 또는 예를 들면, 회전증발기에서 제어된 진공도 및 온도하에 유기용매를 증발시키는 방법에 의해 행할 수 있다.
그 후, 입상 구조체에 대해서는, 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 입상 구조체의 표면상에 달라 붙은 자유약물, 약물보유물질, 유화제 등을 제거하고, 나머지 용매 및 물은 감압하 건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 제거한다. 그렇지 않으면, 상기 공정에서 제조된 마이크로캡슐슬러리를 직접 적절한 분산매체에 분산시켜도 된다.
증류수중에의 재분산의 경우, 분산제를 첨가해도 된다. 분산제는, 미립자의 응집을 방지하는 기능을 한다. 분산제로서는, 예를 들면, 트윈 80과 같은 계면활성제, 슈크로스지방산 에스테르, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 갈락토즈 혹은 슈크로스 등을 들 수 있다. 이러한 분산제는, 수중에 약 0.001 내지 30중량%의 농도로 용해시킴으로써 사용한다.
단일의 PHA멤브레인구조를 지닌 생성된 미립자는, 직접 재분산시켜도 되지만, 이들은 다공질 구조를 지닌 입자를 함유하고 있으므로, 세정후 저속에서 원심분리해서 침전물과 비침전물로 분리를 행한다. 이러한 원심분리는 1 내지 60분간 약 30 내지 3,000rpm의 회전수에서 행하고, 바람직하게는 수회 행한다.
원심분리에 의해, PHA로 이루어진 단일의 멤브레인구조를 지닌 마이크로캡슐은, 비침전물상에 회수된다. 건식미립자를 얻기 위해서는, 필요에 따라 감압하 가열건조 혹은 동결건조를 사용할 수 있으나, 후자가 바람직하다.
이와 같이 해서 얻어진 마이크로캡슐의 입자직경은 1 내지 10㎛이다. 하기 실시예에서 설명하는 바와 같이, 마이크로캡슐은 캡슐표면에 구멍없이 구형상을 지닌다.
<상분리-액상배합->
상분리에 의해 마이크로캡슐을 제조할 경우, 코아세르베이션제를 약물과 PHA의 유기용매용액에 교반하 점차로 첨가함으로써, PHA를 석출시켜 고형화시킨다. 코아세르베이션제는, 상기 입상 구조체용의 PHA를 용해시키지 않고 PHA의 용매와 혼화가능한 폴리머, 광유 혹은 식물성 유지에 의거한 물질이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 실리콘오일, 참기름, 두유, 옥수수유, 면실유, 야자유, 아마인유, 광유, n-헥산, n-헵탄, 메탄올 혹은 에탄올 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상 조합해서 이용해도 된다. 이러한 코아세르베이션제의 양은, 예를 들면, 약물과 PHA의 유기용매용액의 체적의 0.01 내지 1,000체적배, 바람직하게는, 0.1 내지 200체적배이다. 얻어진 입상 구조체는, 원심분리 혹은 여과후, 헵탄 등으로 반복해서 세정하여 코아세르베이션제를 제거하고, 해당 세정액은 가열에 의해 혹은 감압하에 증류시킨다. 필요에 따라, 유기용매를 전술한 액중건조의 경우와 마찬가지 방법으로 제거한다.
<분무건조-액상의 배합->
분무건조에 의한 마이크로캡슐화의 경우, 액중 건조법과 마찬가지 방법으로 제조한 w/o에멀젼 혹은 w/o/w에멀젼을, 노즐로부터 분무건조기의 건조실내로 분무하여, 매우 단시간내에 분쇄된 액적내의 유기용매와 물을 증류시킴으로써, 미분말상태의 마이크로캡슐을 제조한다. 노즐은, 2액형 노즐, 가압노즐 혹은 회전원반형이어도 된다. 얻어진 입상 구조체는, 필요에 따라, 증류수로 수회 세정하여, 해당 입상 구조체의 표면에 달라 붙어 있는 유화제를 제거한다. 다음에, 세정된 마이크로캡슐에 대해 감압건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 유기용매의 제거를 행한다.
<o/w에멀젼의 제조-액상의 배합->
w/o에멀젼으로부터 액중 건조에 의한 마이크로캡슐화는, 수상에 유기용매와 PHA를 함유하는 오일상을 분산시켜 w/o에멀젼을 형성한 후, 오일상중의 용매를 제거한다. 수상의 체적은, 통상, 오일상의 체적의 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배이다. 수상의 온도는, 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. 수상에는, 유화제를 첨가해도 되며, 유화제로서는, 안정한 o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어떠한 것이라도 되며, 전술한 유화제를 이용하는 것이 유리하다. 외부 수상중의 유화제의 농도는, 약 0.001 내지 20중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 10중량%, 보다 바람직하게는, 0.05 내지 5중량%의 범위내이다. 또한, 상기 공지의 혼합장치를 유화공정에 이용할 수 있다.
w/o에멀젼제조용의 유화는, 최종 마이크로캡슐구조의 균일성을 확보하는 데 중요하고, 이 단계에서, 외부 수상에 가능한 한 균일하게 PHA를 함유하는 내부 수상을 분산시키는 것이 필요하다. 이 목적을 위해, 내부 오일상의 액적의 직경을 가능한 한 작게 하는 것이 바람직하며, 다른 분산법과 조합한 초음파조사를 이용하는 것이 유리하다.
본 발명의 o/w에멀젼의 제조시 구성성분의 공급은, 공지의 기술에 따른 각종 모드, 예를 들면, 용기에 PHA용액을 주입하고 유화제를 함유하는 수상을 첨가하는 방법, 첨가의 순서를 역으로 하는 방법 혹은 양자를 일정한 비율로 연속적으로 공급하는 방법을 취할 수 있다. 회전혼합의 경우, 첫번째 언급한 순서가 바람직하다. 이 경우, PHA가 연속상을 구성하고, 수상이 분산상을 구성하는 w/o에멀젼을 최초로 형성하고, 상기 에멀젼이 수상 성분의 첨가량의 증가에 따라 w/o형에서 o/w형으로 변환됨으로써, 오일상의 입상체 형성을 촉진시킨다.
유기용매의 제거는, 전술한 방법에 의해 행할 수 있다.
그 후, 마이크로캡슐을 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 해당 마이크로캡슐의 표면상에 달라 붙은 유화제 등을 제거하고, 증류수 등에의 재분산후, 동결건조한다. 또는 상기 공정에서 제조한 마이크로캡슐슬러리를 직접 적절한 분산매체에 분산시켜도 된다.
<중공의 입상 구조체 및 그 제조방법>
본 발명의 중공의 입상 구조체는, 적어도 내부에 기포(중공)를 함유하고, 또, 외부피막(셸)에 PHA를 함유하며, 전술한 바와 같은 형태를 취할 수 있다.
초음파 콘트라스트매체에 적용가능한 본 발명의 중공의 입상 구조체는, 오일상이 유기용매와 PHA를 함유하는 w/o에멀젼, 상기 w/o에멀젼을 또 외부 수상에 유화시킴으로써 형성된 w/o/w에멀젼, 또는 오일상이 PHA와 유기용매를 함유하는 o/w에멀젼에 있어서 PHA를 고형화함으로써 제조할 수 있다. 이러한 마이크로캡슐화는, 예를 들면, 액중건조, 상분리, 분무건조 혹은 마찬가지 방법에 의해 행할 수 있다.
또, PHA합성효소 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 수상에서, w/o에멀젼, PHA합성효소와 3-하이드록시아실 CoA를 또 함유해도 되는 외부 수상에서 상기 w/o에멀젼의 유화를 행함으로써 형성된 w/o/w에멀젼, 또는 외부 수상이 PHA신타제 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 o/w에멀젼을 이용해서, PHA합성을 행하는in vitro합성방법을 이용하는 것도 유리하다.
또한, PHA신타제 및 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 외부 수상에서 w/o에멀젼을 유화시킴으로써 형성된, w/o/w에멀젼의 외부 수상에서 PHA합성을 행함으로써 중공의 입상 구조체를 제조하는 방법을 이용하는 것도 가능하다.
<w/o에멀젼의 제조-중공의 입상 구조체->
본 발명의 중공의 입상 구조체의 제조에 이용되는, 내부 수상과 PHA를 함유하는 오일상으로 이루어진 w/o에멀젼은, 하기 방법으로 제조할 수 있다.
먼저, 내부 수상은, 외부 오일상의 유기용매용액과 비중을 일치시키기 위해, 무기 혹은 유기염의 수용액일 수 있다. 무기염으로서는, 예를 들면, 염화칼슘, 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화칼슘, 브롬화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소칼륨 등을 들 수 있다. 유기염으로서는, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 인산, 아스코르빈산 등의 유기산의 나트륨염 혹은 칼륨염을 들 수 있다. 이들 중, 본 발명에 있어서는, 경제성, 비중일치의 용이성 및 세정의 용이성을 고려해서, 염화칼슘의 수용액이 바람직하다. 이러한 무기 혹은 유기염의 물에의 첨가량은, PHA의 유기용매용액과 비중을 일치시키기 위해, 약 1 내지 60w/v%, 바람직하게는, 20 내지 50w/v%이다. 이와 같이 해서, 수용액의 비중을 PHA를 함유하는 오일상의 비중과 일치시킴으로써, 오일상에 물방울이 균일하게 분산된 w/o에멀젼을 얻을 수 있다.
이와 같이 해서 얻어진 내부 수상으로 될 상기 비중조정이 행해진 수용액과 PHA함유용액(오일상)을 혼합하여 유화시켜 w/o에멀젼을 제조한다. 유화는, 공지의 방법, 예를 들면, 간헐진동법, 프로펠러교반기 또는 터빈교반기 등의 믹서를 이용한 교반, 콜로이드밀법, 균질화법 또는 초음파법, 또는 이들의 조합법에 의해 행할 수 있다. w/o에멀젼을 제조하는 주된 유화는, w/o에멀젼의 내부 수상의 물방울 직경이 형성될 중공의 입상 구조체의 중공부와 그의 외부 크기를 규정하므로, 최종 마이크로캡슐구조의 균일성을 확보하는 데 중요하며, 이 단계에서, 마찬가지 레벨의 단일의 멤브레인중공구조를 지닌 각 중공의 입상 구조체를 제공하기 위해, PHA의 유기용매용액중에 가능한 한 균일하게 내부 수상을 분산시키는 것이 필요하다. 또한, 제조된 중공의 입상 구조체를 초음파 콘트라스트매체로서 사용하기 위해, 중공의 입상 구조체의 외부직경을 10㎛를 초과하지 않도록 제한하는 것이 바람직하다. 이들 인자를 고려해서, 내부 수상의 물방울의 직경은 가능한 한 축소시키는 것이 바람직하며, 다른 분산법과 조합한 초음파조사를 이용하는 것이 유리하다.
상기 용액(오일상)은, 물과 실질적으로 혼화될 수 없는 유기용매에 용해된 PHA의 용액이다. 이러한 유기용매의 수중 용해도는, 상온(20℃)에서 3중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 또, 유기용매의 비점은, 120℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 유기용매의 예로서는, 할로겐화 탄화수소류(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 또는 4염화탄소 등), 케톤류(아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등), 에테르류(테트라하이드로푸란, 에틸에테르, 이소프로필에테르 등), 에스테르류(아세트산에틸, 아세트산부틸 등), 방향족 탄화수소류(벤젠, 톨루엔, 크실렌 등) 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상의 혼합물로 이용해도 된다. 보다 바람직하게는, 유기용매는, 할로겐화 탄화수소(디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄, 4염화탄소 등)이다. 오일상중의 PHA농도는, PHA의 종류와 분자량, 용매의 종류에 따라 다르지만, 바람직하게는, 약 0.01 내지 80중량%, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 70중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 60중량%이다.
내부 수상과의 상호용해성, 외부 수상에 대한 유기용매의 분포 및 유기용매의 증발을 변화시키기 위해, 오일상에는, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 테트라하이드로푸란 등의 친수성 유기용매를 부분적으로 첨가해도 된다. 이와 같이 해서 얻어진 오일상은, 사용전에 여과해서 세균이나 먼지 등을 제거해도 된다. 또, PHA를 함유하는 용액은, PHA의 안정성에 따르지만, 서늘한 장소에서 혹은 실온에서 기밀밀폐용기에 보관해도 된다.
수용성 용액과 PHA를 함유하는 유기용매용액과의 혼합비는, 전자 1중량%에 대해, 후자 약 0.1 내지 1000중량부, 바람직하게는, 약 1 내지 100중량부이다.
<w/o/w에멀젼의 제조 및 액중 건조-중공의 입상 구조체->
다음에, 이와 같이 해서 얻어진 w/o에멀젼에 대해 중공의 마이크로캡슐화처리를 행한다. 예를 들면, 중공의 마이크로캡슐화를 액중 건조에 의해 행할 경우, w/o에멀젼을 또 수상(이하, "외부수상"이라 칭함)에 첨가해서 w/o/w에멀젼을 제조한 후, 오일상중의 유기용매를 제거해서 중공의 입상 구조체를 얻는다.
외부 수상의 체적은, 일반적으로 오일상의 체적에 대해 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배이다.
외부 수상에는 유화제를 함유시켜도 되며, 이 때의 유화제로서는, 안정한 w/o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어느 것이라도 가능하며, 예를 들면, 음이온성 계면활성제(올레산나트륨, 스테아르산나트륨 또는 황산 라우릴나트륨), 비이온성 계면활성제[폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들면, 트윈 80 또는 트윈 60, 미국 아틀라스 파워사 제품) 또는 폴리옥시에틸렌아마인유 유도체(HCO-70, HCO-60 또는 HCO-50, 일본국 닛코화학사 제품)], 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 카르복시메틸셀룰로스, 레시틴, 젤라틴, 히알우론산 또는 그 유도체 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 혹은 복수종을 조합해서 이용해도 된다. 외부 수상중의 유화제의 농도는, 약 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는, 0.05 내지 10중량%의 범위내이다.
상기 외부 수상에는, 또한, 수용액중에 침투압을 나타내는 물질이라면 어떠한 것이라도 가능한 침투압조정제, 예를 들면, 수용성 다가 알콜, 수용성 1가알콜, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체, 수용성 아미노산류, 수용성 펩티드류, 단백질 및 그 유도체 등을 첨가해도 된다.
상기 수용성 다가 알콜류로서는, 글리세린 등의 2가 알콜류, 아라비톨, 크실리톨(자일리톨), 아도니톨 등의 5가 알콜류, 만니톨, 소르비톨, 주르시톨 등의 6가 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중, 6가알콜, 특히 만니톨이 바람직하다. 상기 수용성 1가 알콜로서는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 들 수 있고, 이들 중,에탄올이 바람직하다. 상기 수용성 단당류로서는, 아라비노스, 크실로스, 리보스, 2-데옥시리보스 등의 5탄당류, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 소르보스, 람노스, 푸코스 등의 6탄당류 등을 들 수 있고, 이들 중 6탄당이 바람직하다. 상기 수용성 이당류로서는, 말토스, 셀로비오스, α,α-트레할로스, 락토스, 글루코스 등을 들 수 있고, 이들 중, 락토스, 글루코스 등이 바람직하다. 상기 수용성 올리고당류로서는, 말토트리오스, 라피노스 등의 3당류, 스타키오스 등의 4당류 등을 들 수 있고, 이들 중, 3당류가 바람직하다. 상기 수용성 단당류, 이당류 및 올리고당류의 유도체로서는, 글루코사민, 갈락토사민, 글루쿠론산, 갈락투론산 등을 들 수 있다.
상기 수용성 아미노산으로서는, 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌, 프롤린, 하이드록시프롤린, 시스테인, 메티오닌 등의 중성 아미노산류; 아스파라긴산, 글루탐산 등의 산성 아미노산류; 리신, 아르기닌, 히스티딘 등의 염기성 아미노산류 등을 들 수 있다. 또, 이러한 수용성 아미노산과 산(염화수소산, 황산 또는 인산) 혹은 알칼리(나트륨 혹은 칼륨 등의 알칼리금속)와의 염류를 이용해도 된다. 수용성 펩티드류, 단백질류 및 그 유도체로서는, 카세인, 글로부린, 프롤라민, 알부민, 젤라틴 등을 들 수 있다.
상기 침투압조정제중에서, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 이당류, 올리고당류 및 그 유도체가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류, 수용성 단당류, 가장 바람직하게는, 수용성 다가 알콜류를 들 수 있다. 이러한 침투압 조정제는 단독으로 혹은 2종이상 조합해서 이용해도 된다. 이러한 침투압 조정제는, 외부 수상의 침투압이 생리식염수의 침투압의 약 1/50 내지 5배, 바람직하게는, 1/25 내지 3배이다. 구체적으로는, 외부 수상중의 침투압조정제의 농도는, 비이온성 물질의 경우, 약 0.001 내지 60중량%, 바람직하게는, 0.01 내지 40중량%, 보다 바람직하게는, 0.05 내지 30중량%, 가장 바람직하게는, 1 내지 10중량%이다. 이온성 물질의 경우, 침투압 조정제는, 상기 농도를 총이온가로 나누어서 얻어진 농도에서 사용한다. 침투압 조정제의 첨가량은, 용해도미만일 필요는 없고 일부 현탁상태에서 사용할 수 있다.
w/o에멀젼의 물속에의 유화시, w/o에멀젼을 물에 분산시킨 후 교반을 행한다. 교반은, 상기 유화법중의 어느 방법에 의해 행할 수 있으나, 유기용매액상의 단일층이 물을 배합하고 있는 구조를 지닌 유기용매용액의 에밀젼입자(마이크로캡슐)을 얻을 때는 균질화기를 이용하는 것이 바람직하다. 균질화기를 이용할 경우, 교반은, 0.1 내지 30분, 바람직하게는, 0.5 내지 20분간, 100 내지 100,000rpm, 바람직하게는, 1,000 내지 50,000rpm에서 행한다.
이러한 조작에 의해, 외부 수상중의 w/o에멀젼액적의 직경은 축소된다. 따라서, 균질화기에 의한 교반은, w/o에멀젼액적중 수상의 분산상태를 변화시키는 일없이 w/o에멀젼액적의 직경을 감소시키는 데 유효하다. 최종의 미립자에 있어서 단일의 폴리머멤브레인구조를 얻기 위해 w/o에멀젼액적의 직경을 1 내지 20㎛로 축소시키는 것이 중요하다. 다음에, 에멀젼을 예를 들면, 프로펠러교반기에 의한 교반하 이 상태에서 방치한다. 이러한 상태에서는, w/o에멀젼액적중의 내부 수상이 불안정하므로, PHA의 고형화전에 통합되어 커다란 단일의 물방울을 형성한다. 한편, w/o에멀젼 자체는, 외부 수상에 있어서 유화제에 의해 안정화되어 있으므로, 그 결과, 내부 수상이 PHA의 유기용매용액의 단층으로 둘러싸여 있는 캡슐구조가 형성된다.
이러한 캡슐구조를 지닌 w/o에멀젼의 형성을 촉진하기 위해, 내부 수상중의 염의 종류와 양, 오일상중의 폴리머의 농도, 오일상(w/o에멀젼액적) 및 유화상태의 외부 수상의 온도, 그리고, 오일상과 수상의 비를 적절하게 조정하는 것이 바람직하다. 특히, 내부 수상중의 무기염의 사용은, 내부 수상의 표면장력을 증대시키므로, 수상을 불안정하게 하여, 입자형성과정에서 w/o에멀젼액적중의 수상을 통합시킴으로써, 단일의 멤브레인구조의 에멀젼의 비율이 증대되어 버린다.
본 발명의 방법에 있어서의 w/o/w에멀젼의 제조시, w/o에멀젼의 점도는, 50 내지 10,000cp의 범위내에서 조정하는 것이 바람직하다. 상기 점도는, 예를 들면, (1) 오일상중의 PHA농도의 조정, (2) 수상과 오일상의 비의 조정, (3) w/o에멀젼의 온도의 조정, (4) 외부 수상의 온도의 조정 또는 (5) 외부 수상안으로 주입시 냉매 혹은 라인히터에 의한 w/o에멀젼의 온도의 조정에 의해 조정할 수 있다. 이들 방법은, 단독으로 혹은 조합해서 이용해도 된다. 이들 방법에 있어서, 단지 필요한 것은, w/o에멀젼의 점도를 w/o/w에멀젼으로 환산해서 50 내지 10,000cp의 범위내로 하는 것이다. 상기 방법(1)에 있어서, 오일상중의 PHA의 조정해야 할 농도는, PHA 및 유기용매의 종류에 따라 그대로 유일하게 구할 수는 없고, 바람직하게는, 약 10 내지 80중량%이다. 상기 방법(2)에 있어서, 수상과 오일상의 조정해야 할 비는, 오일상의 성질에 따라 그대로 구할 수 없고, 바람직하게는, w/o=약 1 내지 50v/v%이다. 상기 방법(3)에 있어서, w/o에멀젼의 조정해야 할 온도는, 예를 들면, 약 -20℃ 내지 유기용매의 비점까지의 범위, 바람직하게는, 0℃ 내지 30℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. w/o에멀젼의 점도는, 상기 (1) 또는 (2)의 방법에 있어서 제조시에 조정할 수 있다. 상기 방법(4)에 있어서, 외부 수상의 온도는, 상기 방법(3)과 유사한 결과를 얻도록 w/o에멀젼의 첨가전에 조정해도 된다. 외부 수상의 온도는, 예를 들면, 약 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 12 내지 25℃이다.
유기용매의 제거는, 공지의 방법, 예를 들면, 상압 혹은 점차적인 감압하에 프로펠러교반기 혹은 자기교반기에 의한 교반하에 유기용매를 증발시키는 방법 또는 예를 들면, 회전증발기에서 제어된 진공도 및 온도하에 유기용매를 증발시키는 방법에 의해 행할 수 있다.
그 후, 입상 구조체에 대해서는, 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 입상 구조체의 표면상에 달라 붙은 유화제 등을 제거하고, 나머지 용매 및 물은 감압하 건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 제거한다.
증류수중에의 재분산의 경우, 분산제를 첨가해도 된다. 분산제는, 미립자의 응집을 방지하는 기능을 한다. 분산제로서는, 예를 들면, 트윈 80과 같은 계면활성제, 슈크로스지방산 에스테르, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 갈락토즈 혹은 슈크로스 등을 들 수 있다. 이러한 분산제는, 수중에 약 0.001 내지 30중량%의 농도로 용해시킴으로써 사용한다.
단일의 PHA멤브레인구조를 지닌 생성된 미립자는, 직접 재분산시켜도 되지만, 이들은 다공질 구조를 지닌 입자를 함유하고 있으므로, 세정후 저속에서 원심분리해서 침전물과 비침전물로 분리를 행한다. 이러한 원심분리는 1 내지 60분간 약 50 내지 3,000rpm의 회전수에서 행하고, 바람직하게는 수회 행한다.
원심분리에 의해, PHA로 이루어진 단일의 멤브레인구조를 지닌 중공의 입상 구조체는, 비침전물상에 회수된다. 이러한 단일의 멤브레인구조의 중공의 입상 구조체를 이용하는 초음파 콘트라스트는 높은 초음파 콘트라스트효과를 발휘한다. 또, 건식미립자를 얻기 위해서는, 필요에 따라 감압하 가열건조 혹은 동결건조를 사용할 수 있으나, 후자가 바람직하다.
이와 같이 해서 얻어진 중공의 입상 구조체의 입자직경은 1 내지 10㎛이다. 하기 실시예에서 설명하는 바와 같이, 중공의 입상 구조체는, 중공부의 비율이 많고 캡슐표면에 구멍없이 구형상을 지닌다.
<상분리-중공의 입상 구조체->
상분리에 의해 중공의 마이크로캡슐을 제조할 경우, 코아세르베이션제를 약물과 PHA의 유기용매용액에 교반하 점차로 첨가함으로써, PHA를 석출시켜 고형화시켜, 중공의 입상 구조체를 제조한다. 코아세르베이션제는, 상기 입상체 형성용의 PHA를 용해시키지 않고 PHA의 용매와 혼화가능한 폴리머, 광유 혹은 식물성 유지에 의거한 물질이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면, 실리콘오일, 참기름, 두유, 옥수수유, 면실유, 야자유, 아마인유, 광유, n-헥산, n-헵탄, 메탄올 혹은 에탄올 등을 들 수 있고, 이들은 2종이상 조합해서 이용해도 된다. 이러한 코아세르베이션제의 양은, 예를 들면, 약물과 PHA의 유기용매용액의 체적의 0.01 내지 1,000체적배, 바람직하게는, 0.1 내지 200체적배이다. 얻어진 마이크로캡슐은, 원심분리 혹은 여과후, 헵탄 등으로 반복해서 세정하여 코아세르베이션제를 제거하고, 해당 세정액은 가열에 의해 혹은 감압하에 증류시킨다. 필요에 따라, 유기용매를 전술한 액중건조의 경우와 마찬가지 방법으로 제거한다.
<분무건조-중공의 입상 구조체->
분무건조에 의한 중공의 마이크로캡슐화의 경우, 액중 건조법과 마찬가지 방법으로 제조한 w/o에멀젼 혹은 w/o/w에멀젼을, 노즐로부터 분무건조기의 건조실내로 분무하여, 매우 단시간내에 분쇄된 액적내의 유기용매와 물을 증류시킴으로써, 미분말상태의 마이크로캡슐을 제조한다. 노즐은, 2액형 노즐, 가압노즐 혹은 회전원반형이어도 된다. 얻어진 입상 구조체는, 필요에 따라, 증류수로 수회 세정하여, 해당 입상 구조체의 표면에 달라 붙어 있는 유화제를 제거한다. 다음에, 세정된 마이크로캡슐에 대해 감압건조 혹은 증류수중의 재분산후의 동결건조에 의해 유기용매의 제거를 행한다.
<o/w에멀젼의 제조-중공의 입상 구조체->
w/o에멀젼으로부터 액중 건조에 의한 중공의 입상 구조체의 제조는, 수상에 유기용매와 PHA를 함유하는 오일상을 분산시켜 w/o에멀젼을 형성한 후, 오일상중의 용매를 제거함으로써 행한다. 수상의 체적은, 통상, 오일상의 체적의 약 1 내지 10,000배, 바람직하게는, 2 내지 5,000배, 보다 바람직하게는, 5 내지 2,000배, 특히 바람직하게는, 약 50 내지 1000배이다. 수상의 온도는, 약 5 내지 30℃, 바람직하게는, 10 내지 25℃, 보다 바람직하게는, 10 내지 20℃이다. 수상에는, 유화제를 첨가해도 되며, 유화제로서는, 안정한 o/w에멀젼을 형성할 수 있는 유화제라면 어떠한 것이라도 되며, 전술한 유화제를 이용하는 것이 유리하다. 외부 수상중의 유화제의 농도는, 약 0.001 내지 20w/v%, 바람직하게는 약 0.01 내지 10w/v%%, 보다 바람직하게는, 0.05 내지 5w/v%의 범위내이다. 또한, 상기 공지의 혼합장치를 유화공정에 이용할 수 있다.
w/o에멀젼제조용의 유화는, 오일상의 액적직경이 그의 외부크기와 그의 중공부의 구조를 규정하므로, 최종 중공의 입상 구조체의 균일성을 확보하는 데 중요하다. 각 중공의 입상 구조체를 마찬가지 레벨의 중공구조를 지니도록 하기 위해, 이 단계에서, 외부 수상에 가능한 한 균일하게 PHA를 함유하는 내부 오일상을 분산시키는 것이 필요하다. 이 목적을 위해, 내부 오일상의 액적의 직경을 가능한 한 작게 하는 것이 바람직하며, 다른 분산법과 조합한 초음파조사를 이용하는 것이 유리하다.
본 발명의 o/w에멀젼의 제조시 구성성분의 공급은, 공지의 기술에 따른 각종 모드, 예를 들면, 용기에 PHA용액을 주입하고 유화제를 함유하는 수상을 첨가하는 방법, 첨가의 순서를 역으로 하는 방법 혹은 양자를 일정한 비율로 연속적으로 공급하는 방법을 취할 수 있다. 회전혼합의 경우, 첫번째 언급한 순서가 바람직하다. 이 경우, PHA가 연속상을 구성하고, 수상이 분산상을 구성하는 w/o에멀젼을 최초로 형성하고, 상기 에멀젼이 수상 성분의 첨가량의 증가에 따라 w/o형에서 o/w형으로 변환됨으로써, 오일상의 입상체 형성을 촉진시킨다.
유기용매의 제거는, w/o에멀젼에 적용가능한 전술한 방법에 의해 행할 수 있다. 그 후, 중공의 입상 구조체를 원심분리 혹은 여과에 의해 회수한 후에, 증류수로 수회 세정하여 해당 마이크로캡슐의 표면상에 달라 붙은 유화제 등을 제거하고, 증류수 등에의 재분산후, 동결건조한다.
< in vitro 합성>
in vitro합성에 의해 입상 구조체를 제조하는 방법은, 적어도 w/o에멀젼, 또는, 이러한 w/o에멀젼으로부터 w/o/w에멀젼 또는 o/w에멀젼을 준비하는 공정과, 3-하이드록시아실 CoA와 PHA신타제를 반응시켜 PHA를 합성하는 공정을 포함한다.
PHA신타제와 같은 효소단백질은, 복수의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이고, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴산 혹은 글루탐산 등의 자유 이온기를 지닌 아미노산에 의한 친수성을 나타내나, 또한, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌 또는 프롤린 등의 자유 소수성 기를 지닌 아미노산에 의한 또한 유기폴리머에 의한 수소성도 나타낸다. 따라서, 친수성과 소수성은, 레벨은 다르지만, 물/오일계면에서 발휘될 수 있다.
표면전하의 극성과 양 및 PHA신타제의 수소성은 pH, 염농도, 반응액(수상)의 온도에 따라 다르므로, 반응액을 효소활성에 의해 허용되는 범위내로 조정하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 염농도의 저감에 의해 PHA신타제의 전하량이 증가되는 것이 가능하다. 또, pH의 변화에 의해서도 반대하전이 증가되는 것이 가능하다. 또한, 염농도의 증가에 의해 수소성의 증가도 가능해진다. 또, 반응에 적합한 용액조건은, PHA신타제의 하전상태나 소수성을 검사함으로써, 전기영동 혹은젖음각 측정을 실시함으로써 선택할 수 있다. 또한, w/o에멀젼, w/o/w에멀젼 혹은 o/w에멀젼에 있어서 물/오일계면에 존재하는 PHA신타제의 양을 직접 측정함으로써 상기 조건을 결정하는 것도 가능하다. 상기 계면에 존재하는 양은, 예를 들면, 공지의 농도를 지닌 PHA신타제용액을 지닌 w/o에멀젼, w/o/w에멀젼 혹은 o/w에멀젼을 제조하고 나서, 수상중의 자유PHA신타제의 농도를 측정함으로써 측정할 수 있다.
3-하이드록시아실 CoA의 중합에 의한 PHA합성반응에 있어서 CoA를 1μmol/분 방출시키는 PHA의 양을 1유닛(U)으로 규정함으로써, 반응에 사용될 효소의 양은, 오일상 1g당 10 내지 1,000U, 바람직하게는, 50 내지 500U의 범위내에서 선택한다.
수상이 내부 수상으로서의 PHA에 의해 덮여 있는 입상 구조체는, 상기 PHA신타제와 소망의 PHA의 원료로서 작용하는 3-하이드록시아실 CoA를 함유하는 반응액에 있어서 물/오일계면에서의 PHA합성에 의해 제조한다. 상기 w/o 또는 o/w에멀젼에 있어서의 수상은, PHA신타제의 활성을 나타낼 수 있는 조건으로 조정된 반응계로서 구축할 필요가 있고, 통상 pH 5.5 내지 9.0, 바람직하게는, 7.0 내지 8.5의 범위내의 완충액으로 제조한다. 그러나, 이 조건은, 이용될 PHA신타제의 최적pH 또는 pH안정성에 따라, 상기 범위밖으로 설정해도 된다. 이러한 완충액은, 이용되는 PHA신타제의 활성이 발현될 수 있는 한 소망의 pH범위에 따라 적절하게 선택할 수 있으나, 아세트산 완충액, 인산완충액, 인산칼륨완충액, 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS)완충액, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS)완충액, 트리스염화수소산 완충액, 글리신완충액, 2-(시클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES)완충액 등의 생화학반응에 이용되는 통상의 완충액을 이용하는 것이 유리하다. 완충액의 농도는, 이용되는 PHA신타제의 활성이 발현될 수 있는 한 특히 한정되지 않고, 5.0mM 내지 1.0M, 바람직하게는, 0.1 내지 0.2M의 범위내에서 선택하는 것이 유리하다. 반응온도는, 이용될 PHA신타제의 특성에 따라 적절하게 선택하나, 통상 4 내지 50℃, 바람직하게는, 20 내지 40℃의 범위내에서 선택한다. 그러나, 상기 조건은 이용되는 PHA신타제의 최적 온도 또는 열저항에 따라 상기 범위밖으로 설정해도 된다.
반응시간은, 통상 이용되는 PHA신타제의 안정성에 의존하나, 통상 1분 내지 24시간, 보다 바람직하게는, 30분 내지 3시간의 범위내이다. 반응액중의 3-하이드록시아실 CoA의 농도는, 이용될 PHA신타제의 활성을 발현할 수 있는 범위내에서 적절하게 선택하나, 통상 0.1mM 내지 1.0M, 바람직하게는, 0.2mM 내지 0.2M의 범위내에서 선택한다. 반응액의 pH는, 반응액중의 3-하이드록시아실 CoA의 농도가 높으면 낮게 되는 경향이 있으므로, 3-하이드록시아실 CoA에 대해 고농도를 선택할 경우 상기 완충액에 있어서 고농도를 지니는 것이 바람직하다.
또, 상기 방법에 있어서, 수용성 반응액중의 3-하이드록시아실 CoA의 종류와 농도 등의 조성을 시간에 따라 변화시킴으로써, 입상 구조체를 구성하는 PHA의 모노머유닛조성은, 안쪽에서부터 바깥쪽으로 변화시킬 수 있다. 마이크로캡슐구조를 형성할 경우, 셸을 구성하는 PHA의 모노머유닛조성은, 안쪽에서부터 바깥쪽으로 변화시킬 수 있다.
모노머유닛조성의 변화를 보이는 이러한 입상 구조체에 있어서, 단층형상PHA는 해당 조성이 변화하여, 안쪽에서부터 바깥쪽으로 반경 방향으로 기울기를 지닌 조성을 포함하는 마이크로캡슐형태를 취할 수 있다. 이러한 형태는, 예를 들면, PHA의 합성과정에서, 다른 조성의 3-하이드록시아실 CoA를 첨가함으로써, 실현할 수 있다.
PHA피막의 조성이 단계적으로 변화하고, 약물이 상이한 조성의 PHA의 복수층으로 덮여 있는 덮여 있는 다른 형태도 가능하다. 이러한 형태는, 3-하이드록시아실 CoA의 임의의 조성을 지닌 PHA을 합성한 후, 예를 들면, 원심분리에 의해 반응액으로부터 제조중인 마이크로캡슐을 회수하고, 재차 3-하이드록시아실 CoA의 상이한 조성을 지닌 반응액을 첨가함으로써 실현할 수 있다.
이하, o/w에멀젼 및 w/o에멀젼으로부터 입상 구조체의 제조를 설명하나, 입상 구조체는, w/o/w에멀젼으로부터도 마찬가지로 제조할 수 있다. 내부 수상과 외부 수상의 양쪽에 있어서 PHA신타제와 3-하이드록시아실 CoA를 함유시키는 것이 가능하나, 약물포획률을 상승시키기 위해 외부수상에만 PHA를 합성하는 것도 가능하다. PHA신타제 및 3-하이드록시아실 CoA는, 내부 수상과 외부 수상에 있어서 4개의 조합으로 존재할 수 있으나, 이러한 조합은, 약물포획률, 약물방출특성 및 방법의 용이함 및 비용을 고려해서 적절하게 선택해도 된다.
상기 반응에서 얻어진 입상 구조체는, 필요에 따라 세정공정을 행해도 된다. 입상 구조체용의 세정방법은, 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체의 제조목적에 적합하지 않은 변화를 지닌 입상 구조체를 제공하지 않는 한 특히 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 여과에 의한 회수후, 헵탄 등으로 반복적으로 세정하여 자유약물및 용매를 제거한다. 또, 반응액중에 함유된 불필요한 성분은, 원심분리에 의해 입상 구조체를 침전시키고, 상청액을 제거함으로써 제거할 수 있다. 또, PHA가 불용인 헵탄 등의 세정수를 첨가해서 세정하고 원심분리르 행하는 것도 가능하다. 또한, 입상 구조체는, 필요에 따라 건조공정을 행하거나, 각종 2차 프로세스 또는 화학적 변성을 행해도 된다.
예를 들면, 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체의 표면상의 PHA에 대해 화학적 변성을 행함으로써, 보다 유용한 기능과 특성을 지닌 입상 구조체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 그라프트사슬을 도입함으로써, 그라프트사슬로부터 유래된 서방성 혹은 액상 혹은 기상의 유지능력의 제어 등의 각종 특성이 향상된 입상 구조체를 얻을 수 있다. 또, 마이크로캡슐 등의 이의 표면상의 PHA를 가교함으로써, 액상 혹은 기상의 보유능이나 서방성 능력을 향상시킬 수 있다.
화학적 변성의 방법은, 소망의 기능과 구조를 얻을 수 있는 한 특히 제한되는 것은 아니지만, 곁사슬에 반응성 작용기를 지닌 PHA를 합성하고, 이러한 작용기의 화학적 반응을 이용해서 화학적 변성을 행하는 방법을 유리하게 이용할 수 있다.
상기 반응성 작용기의 종류는, 소망의 기능과 구조를 얻을 수 있는 한 특히 제한되지 않고, 상기 에폭시기를 일례로서 인용할 수 있다. 곁사슬에 에폭시기를 지닌 폴리하이드록시알카노에이트는, 에폭시기를 지닌 통상의 폴리머에 있어서도 같이 화학적 변환을 행할 수 있다. 구체적으로는, 수산기로의 변환이나 설폰기의 도입을 행할 수 있다. 또, 티올이나 아민을 지닌 화합물을 첨가하는 것도 가능하고, 특히, 에폭시기와의 반응성이 높은 말단 아미노기를 지닌 화합물의 첨가하의 반응에 의해 폴리머의 그라프트사슬을 형성할 수 있다.
말단에 아미노기를 지닌 화합물의 예로서는, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌아민 또는 아미노변성 폴리실록산(아미노변성 실리콘오일) 등의 아미노변성 폴리머를 들 수 있다. 이들 중, 아미노변성 폴리실록산은, 시판의 변성 실리콘오일이어도 되고, 혹은, 예를 들면, J. Amer. Chem. Soc., 78, 2278(1956)에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있으며, 서방기능, 액상 혹은 기상의 보유능력 또는 수용액중의 자체분산성의 제어의 향상 등, 폴리머내의 그라프트사슬의 첨가에 의해 효과를 제공할 것으로 기대된다.
에폭시기를 지닌 폴리머의 화학적 변환의 다른 예로서는, 헥사메틸렌디아민, 무수숙신산 또는 2-에틸-4-메틸이미다졸 등의 디아민화합물을 들 수 있고, 물리화학적 변환의 예로서는, 전자선조사에 의한 가교반응을 들 수 있다. 이들 중, 결사슬에 에폭시기를 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응은, 하기 방법:
영문 p145의 식 삽입
으로 진행되어 가교폴리머를 생성한다.
이와 같이 해서 얻어진 입상 구조체에 있어서, 전체 입자중의 내부적으로 배합된 부분의 체적비는, 약 10 내지 90%이지만, 입상 구조체의 기능, 기계적 강도등을 고려해서 약 35 내지 85%의 범위가 바람직하다.
마이크로캡슐과 같은 입상 구조체에 있어서는, PHA에 의한 약물의 피복은, 가스크로마토그래피에 의한 조성분석과 전자현미경하의 형태 관찰을 조합한 방법 또는 TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer)와 이온스퍼터링을 이용함으로써 각 구성층의 질량 스펙트럼으로부터 구조를 판정해서 구조를 판정하는 방법에 의해 확인할 수 있다. 그러나, 보다 직접적이고 간단한 확인을 위해서, 본 발명자들이 새롭게 개발한, 니일 블루 A에 의한 염색과 형광현미경 관찰을 조합하는 방법을 조합한 방법을 이용할 수 있다. 무세포(in vitro)계에서의 PHA합성의 간단한 판정을 위해 예의 연구한 결과, 본 발명자들은,in vivoPHA 생산의 간단한 판정에 유용한 것으로서, Appl. Environ. Microbiol., 44, 238-241(1982)에 보고된, PHA와 특이적 결합에 의해 형광을 발생하는 니일 블루 A가, 적절한 방법과 사용조건을 선택함으로써 무세포계에서의 PHA합성을 판정하는 데 이용가능한 것을 발견하고, 상기 방법에 이르게 되었다. 이 방법에 있어서, 무세포계에서의 PHA합성은, 여과후 소정농도의 니일 블루 A와, PHA를 함유하는 반응액을 혼합해서 소정 파장의 여기광을 조사해서, 합성된 PHA단독으로부터 생성된 형광의 형광현미경 관찰을 행함으로써 용이하게 판정할 수 있다. 본 발명의 입상 구조체의 제조에 적용되는 이 방법은, 소수성 용액의 표면을 덮는 PHA를 직접 관찰해서 평가하는 것이 가능하다.
<정형화제-소수성 약물의 배합>
본 발명의 서방성 프레파라트는, 생체내 투여시 독성이 거의 없는 것이 바람직하며, 동결건조 혹은 분무건조에 의해 용이하게 건조되고, 또, 생체내에의 투입시 신속하게 혹은 필요에 따라 용해되는 정형화제를 포함한다. 이러한 정형화제의 예로서는, 당류, 셀룰로스유도체, 아미노기, 단백질, 폴리아크릴산유도체, 유기염 및 무기염 등을 들 수 있다. 이러한 정형화제는, 2종이상을 적절한 비율로 혼합해서 이용해도 된다. 당류의 예로서는, D-만니톨, 아르긴산 나트륨, 프럭토스, 덱스트란, 덱스트린, 슈크로스, D-소르피톨, 락토스, 글루코스, 말토스, 전분류 및 트레할로스 등을 들 수 있다. 셀룰로스유도체의 예로서는, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 아세트산 프탈산 셀룰로스, 아세트산 프탈산 하이드록시메틸셀룰로스, 아세트산 숙신산 하이드록시메틸셀룰로스 등을 들 수 있다. 아미노산의 예로서는, 글리신, 알라닌, 티로신, 아르기닌, 리신 등을 들 수 있다. 단백질의 예로서는, 젤라틴, 피브린, 콜라겐, 알부민 등을 들 수 있다. 폴리아크릴산 유도체의 예로서는, 폴리아크릴산 나트륨, 메타크릴산/아크릴산 공중합체(유드라기드: 롬사 제품, 독일) 등을 들 수 있다. 유기염의 예로서는, 시트르산 나트륨, 타르타르산 나트륨, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨 등을 들 수 있다. 무기염의 예로서는, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산 나트륨, 인산칼륨 등을 들 수 있다. 상기 외에, 정형화제는, 폴리비닐피롤리돈이나 폴리비닐알콜 등의 서방성 프레파라트의 기재를 구성하는 폴리머를 용해시키지 않는 수용성 폴리머이어도 된다. 정형화제로서는, 바람직하게는, 당류, 특히 용이한 동결건조가 가능하고 독성이 낮은 D-만니톨이 바람직하다.
정형화제의 양은, 그의 용해도, 장력, 점도, 분산성 및 정형화제를 용해시켜 얻어진 용액의 안정성에 의해 구하나, 서방성 프레파라트의 건조후, 그 안의 정형화제의 함량이 예를 들면, 약 0.5 내지 99중량%, 바람직하게는, 1 내지 90중량%, 보다 바람직하게는, 2 내지 60중량%이다. 정형화제로서 D-만니톨을 사용할 경우, 건조된 서방성 프레파라트중의 그 함량은, 약 2 내지 40중량%인 것이 특히 바람직하다. 이러한 정형화제의 첨가는, 1) 서방성 프레프라트(특히 마이크로캡슐)의 건조시 및 건조후 접촉빈도와 입자의 충돌을 감소시켜, 동결 건조 혹은 분무건조시 입자의 균일성을 확보하고, 2) 유리전이온도보다도 높은 온도에서 서방성 프레파라트의 건조를 가능하게 하여, 물 혹은 유기용매의 보다 완전한 제거를 가능하게 하고, 3) 양호한 분산성을 지니고, 예를 들면, 서늘한 장소에 보관하는 것으로 제한되지 않고 실온에서 장기간 사용하는 서방성 프레파라트를 제공하는 등의 우수한 효과를 제공한다.
본 발명에 있어서, 정형화제를 함유하는 서방성 프레파라트는, 상기 액중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 입상 구조체와 정형화제를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 입상 구조체는, 세정후 감압하 건조하거나, 세정후 증류수중에서 재분산시켜 동결건조해도 된다. 혼합방법은, 특히 제한되지 않고, 균일한 혼합물을 제공하는 방법이 바람직하다. 또, 정형화제를 함유하는 서방성 프레파라트는, 분무건조에 의한 입상 구조체의 제조에 있어서, w/o에멀젼의 분무시 별개의 노즐로부터 정형화제의 수용액을 분무함으로써 제조할 수 있다. 정형화제를 함유하는 서방성 프레파라트는, 또한, 수중건조나 분무건조에 사용되는 w/o/w에멀젼의 제조시, 외부 수상으로서 정형화제의 수용액을 이용함으로써 제조할 수도 있다. 정형화제를 함유하는 서방성 프레파라트는, 또한, 수중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 입상 구조체를 세정하고, 세정된 입상 구조체를 정형화제가 용해 혹은 분산되어 있는 증류수중에 분산시키고, 해당 입상 구조체를 동결건조 혹은 감압건조함으로써 제조할 수도 있다. 또, 세정된 입상 구조체를 증류수에 분산시킨 후, 이와 같이 해서 얻어진 정형화제를 용해 혹은 분산시키고, 동결건조 혹은 감압건조하는 것도 가능하다. 세정된 입상 구조체를 형상제어제가 분산되어 있는 증류수에 분산시키거나, 혹은, 세정된 입상 구조체를 증류수에 분산시켜 얻어진 분산액에 정형화제를 용해시킨 후, 동결건조함으로써 특히 균일한 혼합물을 얻을 수 있다.
<가열처리-친수성 약물->
상기 수중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 입상 구조체는, 또, 필요에 따라, PHA의 유리전이온도(Tg)와 동일 혹은 해당 유리전이온도를 초과하지 않고, 입상 구조체를 구성하는 입자의 상호 달라붙음이 일어나지 않는 온도로 가열함으로써, 입상 구조체중의 물 또는 유기용매를 보다 완전하게 제거하여 서방능을 향상시켜도 된다. 이러한 조작에 있어서, 유기용매는, 약 1000ppm미만, 바람직하게는, 500ppm이하, 보다 바람직하게는, 100ppm의 수준까지 제거하는 것이 바람직하다. 가열은, 바람직하게는, 필요에 따라 정형화제의 첨가후 그리고 입상 구조체의 동결건조 혹은 감압건조후에 행하는 것이 바람직하나, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 입상 구조체를 적은 부분으로 분할한 후 행할 수 있다.
PHA의 유리전이온도미만의 온도로의 가열은, 물 혹은 유기용매의 충분한 제거를 얻을 수는 없는 반면, 지나치게 높은 온도로의 가열은, 입상 구조체의 융합 혹은 변형의 위험이나, 약물의 분해 혹은 열화의 위험이 증가된다. 따라서, 가열온도는, 일정하게 정할 수는 없지만, PHA나 약물의 물성(분자량, 안정성 등), 입상 구조체의 평균입자크기, 가열시간, 입상 구조체의 건조수준, 가열방법 등을 고려해서 적절하게 결정할 수 있다. 가열은, PHA의 유리전이온도와 적어도 동일하지만 입상 구조체의 상호 달라붙음을 일으키지 않는 온도에서 행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 30℃ 높은 온도까지의 범위, 가장 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 20℃ 높은 온도까지의 범위에서 행한다. 가열시간은, 가열온도 및 처리대상 입상 구조체의 양에 따라 다르지만, 일반적으로는, 입상 구조체가 소정의 온도에 도달한 후 약 6 내지 120시간, 바람직하게는, 12 내지 96시간이다. 가열시간의 상한은, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한 값미만으로 되는 한, 특히 제한되지 않고, 입상 구조체가 유리전이온도이상에서 연화되므로, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한계미만으로 되어, 입자의 물리적 접촉에 의한 혹은 입자의 혼화하의 하중에 의한 변형을 일으키면 가열을 신속하게 정지시키는 것이 바람직하다. 가열방법은, 특히 한정되지 않고, 가열은, 입상 구조체가 균일하게 가열될 수 있는 방법이면 어느 방법이라도 행할 수 있다. 이러한 가열건조는, 예를 들면, 항온조, 유출탱크, 가동층 혹은 키른(kirn)에서 가열함으로써, 혹은 전자파에 의해 가열함으로써 행할 수 있다. 이들 중, 항온조에서의 가열건조가 바람직하다. 동결건조후 감압하의 입상 구조체의 가열에 의하면, 입상 구조체중의 유기용매를 효율적으로 제거할 수 있어, 생물체에 대해 안전한 입상 구조체를 제공할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 입상 구조체중의 유기용매의 잔존량은, 약 100ppm이하이다.
<항응고제-친유성 약물의 배합->
액중건조, 코아세르베이션 혹은in vitro합성에 의한 제조시, 수세과정에서 입자의 상호응고를 방지하기 위해, 세정액으로서 사용된 증류수에 항응고제를 첨가해도 된다. 이러한 항응고제로서는, 만니톨, 락토스, 글루코스 혹은 전분(옥수수전분 등) 등의 수용성 다당류, 또는 글리신, 피브린 또는 콜라겐 등의 단백질, 염화나트륨 혹은 인산수소나트륨 등의 무기염을 들 수 있다.
<분무건조-친유성 약물의 배합->
분무건조에 의한 마이크로캡슐과 같은 입상체 형성의 경우, 약물과 PHA의 유기용매중의 용액 혹은 분산액을, 노즐로부터 분무건조기의 건조실내로 분무하여, 매우 단시간내에 분쇄된 액적내의 유기용매를 증류시킴으로써, 입상 구조체를 제조한다. 노즐은, 2액형 노즐, 가압노즐 혹은 회전원반형이어도 된다. 필요하다면, 상기 항응고제의 수용액을 별도의 노즐로부터 분무하여, 약물 및 PHA의 수용액 혹은 분산액의 유기용매중의 분무와 동시에, 입상 구조체의 응결을 방지하기 위해 별개의 노즐로부터 상기 항응고제의 수용액을 분무하는 데 유효하다. 얻어진 입상 구조체는, 필요에 따라, 감압하 가열에 의해 물 및 유기용매의 제거를 행한다.
<유기용매의 제거-친유성 약물->
유기용매의 제거는, 공지의 방법, 예를 들면, 상압 혹은 점차적인 감압하에프로펠러교반기 혹은 자기교반기에 의한 교반하에 유기용매를 증발시키는 방법 또는 예를 들면, 회전증발기에서 제어된 진공도하에 유기용매를 증발시키는 방법에 의해 행할 수 있다. o/w에멀젼의 액중건조시, 입상 구조체는 고형화시켜 그 구조를 결정한다. 이와 같이 해서 얻어진 입상 구조체에 대해서는, 원심분리 혹은 여과후에, 증류수로 수회 세정하여 입상 구조체의 표면상에 달라 붙은 자유약물, 약물보유물질, 유화제 등을 제거하고, 증류수 등에의 재분산후, 동결건조한다.
<항응고제-친유성 약물의 배합->
동결건조후, 항응고제를 첨가해도 된다. 이러한 항으고제로서는, 만니톨, 락토스, 글루코스 혹은 전분(옥수수전분 등) 등의 수용성 다당류, 무기염, 아미노산 또는 단백질을 들 수 있고, 이들중, 만니톨이 바람직하다. 입상 구조체와 항응고제의 혼합비(중량비)는, 약 50:1 내지 1:1, 바람직하게는, 20:1 내지 1:1, 보다 바람직하게는, 10:1 내지 5:1이다. 또, 수세과정에서 입자의 상호응고를 방지하기 위해, 세정액으로서 사용된 증류수에 항응고제를 첨가해도 된다. 이러한 항응고제로서는, 만니톨, 락토스, 글루코스 혹은 전분(옥수수전분 등) 등의 수용성 다당류, 또는 글리신, 피브린 또는 콜라겐 등의 단백질, 염화나트륨 혹은 인산수소나트륨 등의 무기염을 들 수 있고, 바람직한 항응고제는, 만니톨이다.
<가열처리-친유성 약물의 배합->
동결건조후, 감압하 가열을 행하여 입상 구조체중의 물과 유기용매를 더욱 제거함으로써, 서방성을 향상시켜도 된다. PHA의 유리전이온도보다도 낮은 온도에서의 가열은, 약물의 과잉의 초기방출을 향상시킬 수 없는 반면, 과도하게 높은온도에서의 가열은 입상 구조체의 융합이나 변형 혹은 약물의 분해나 열화를 증대시킨다. 따라서, 가열온도는 일정하게 결정할 없으나, PHA, 약물의 물성(분자량, 안정성 등), 입상 구조체의 평균입자크기, 가열시간, 입상 구조체의 건조수준,가열방법 등을 고려해서 적절하게 결정할 수 있다. 이러한 동작에 따라, 유기용매는, 약 1000ppm미만, 바람직하게는, 500ppm이하, 보다 바람직하게는, 100ppm의 수준까지 제거하는 것이 바람직하다.
가열은, 바람직하게는, 입상 구조체의 상호 달라붙음을 일으키지 않고 PHA의 유리전이온도와 실질적으로 적어도 동일한 온도에서 행하는 것이 바람직하다.
서방성은, PHA의 유리전이온도로부터 약 30℃ 높은 온도까지의 범위, 보다 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 10℃ 높은 온도까지, 가장 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 4℃ 높은 온도(특히 유리전이온도보다도 3 내지 4℃ 높은 온도)까지의 범위에서 행한다. 가열시간은, 가열온도 및 처리대상 입상 구조체의 양에 따라 다르지만, 일반적으로는, 입상 구조체가 소정의 온도에 도달한 후 약 24 내지 120시간, 바람직하게는, 48 내지 120시간이다. 가열시간의 상한은, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한 값미만으로 되는 한, 특히 제한되지 않고, 입상 구조체가 유리전이온도이상에서 연화되므로, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한계미만으로 되어, 입자의 물리적 접촉에 의한 혹은 입자의 혼화하의 하중에 의한 변형을 일으키면 가열을 신속하게 정지시키는 것이 바람직하다.
가열방법은, 특히 한정되지 않고, 가열은, 입상 구조체가 균일하게 가열될 수 있는 방법이면 어느 방법이라도 행할 수 있다. 이러한 가열건조는, 예를 들면, 항온조, 유출탱크, 가동층 혹은 키른(kirn)에서 가열함으로써, 혹은 전자파에 의해 가열함으로써 행할 수 있다. 이들 중, 항온조에서의 가열건조가 바람직하다. 동결건조후 감압하의 입상 구조체의 가열에 의하면, 입상 구조체중의 유기용매를 효율적으로 제거할 수 있어, 생물체에 대해 안전한 입상 구조체를 제공할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 입상 구조체중의 유기용매의 잔존량은, 약 100ppm이하이다.
<오일상 혹은 수상에 함유된 물질-액상배합->
마이크로캡슐속의 물질은 본 발명의 마이크로캡슐의 용도에 따라 적절하게 선택한다.
본 발명의 마이크로캡슐을 농약조성물에 사용할 경우, 카바메이트농약, 유기인계 농약, 피레트로이드계 농약, 요소계 농약, 아닐리드계 살균제, 아졸계 살균계 또는 디카르복시이미드살균제 등의 농약핸드북(Japanese Botanical Antiepidemic Association)에 기재된 물질이면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 비료조성물로 사용할 경우, 그 내부의 물질은, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 요소, 아세토알데하이드축합 요소 또는 이소부틸알데하이드축합 요소 등의 질소계 비료의 수용액, 인산계 비료의 수용액, 과인산칼슘, 2과인산칼슘 혹은 용합 인비료 등의 인산계 비료의 수용액, 황산칼륨, 염화칼륨 등의 칼륨계 비료의 수용액, 어류찌끼, 뼈찌끼, 두유찌끼 등의 유기비료의 수용성 현탁액, 인산암모늄 또는 인산칼륨 등의 3원복합비료의 수용액, 또는 미량원소복합비료의 수용액 등을 들 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 화장품에 사용할 경우, 그 내부의 물질로서는, 습윤성분, 허브추출, 티로시나제, 스파록시데디무스타제 또는 리파제 등의 효소, 레티놀, 아스코르빈산, 토코페롤, 피리독살 또는 리보플라빈 등의 비타민, 베타카로틴 또는 클로로필 등의 유기염료, 글리세린, 소르비톨, 요소, 락트산, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 습윤성분, 글루코스유도체 등의 공중합체, 파라핀, 스테아릴알콜, 세틸알콜, 스쿠알란, 실리콘오일 또는 스테아리스 등의 완화제, 트리트먼트성분, 비듬방지성분, 모발영양성분, 자외선흡수제, 항산화제 또는 방향제 등을 들 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 인공혈구로서 사용할 경우, 내부에 함유되는 물질로서는, 헤모글로빈 또는 헤모시아닌을 들 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 잉크 혹은 도료에 사용할 경우, 그 내부에 함유되는 물질로서는, 염료의 수용액 혹은 안료의 수용액, 보다 구체적으로는,
C.I.애시드레드 52, C.I.애시드블루 1, C.I.애시드블랙 2 또는 123 등의 산성 염료; C.I.베이직블루 7 또는 C.I.베이직레드 1 등의 염기성 염료;
C.I.다이렉트블랙 19 또는 C.I.다이렉트블루 86 등의 직접염료;
C.I.솔벤트블랙 7 또는 123, C.I.솔벤트레드 8, 49 또는 100,
C.I.솔벤트블루 2, 25, 55 또는 70, C.I.솔벤트그린 3, C.I.솔벤트옐로 21 또는 61, C.I.솔벤트오렌지 37, C.I.솔벤트바이올렛 8 또는 21 등의 유용성 염료;
C.I.반응성 옐로 15 또는 42, C.I.반응성 레드 24 혹은 218, C.I.반응성 블루 38 또는 220 등의 반응성 염료;
카본블랙, 산화구리, 2산화망간, 아닐린블랙, 활성탄, 비자성 페라이트, 마그네타이트 등의 흑색안료; 크롬옐로, 아연옐로, 옐로산화철, 카드뮴옐로, 미네랄패스트옐로, 니켈티탄옐로, 네이벌옐로, 나프톨옐로 S, 한자옐로 G, 한자옐로 10G, 벤지딘옐로 G, 벤지딘옐로 GR, 퀴놀린옐로레이크, 퍼머넌트옐로 NCG, 타르트라진 등의 황색안료; 레드크롬옐로, 몰리브덴오렌지, 퍼머넌트오렌지 GTR, 피라졸론오렌지, 벌칸오렌지, 벤지딘오렌지 G, 인단트렌브릴리언트오렌지 RK, 인단트렌브릴리언트오렌지 GK 등의 오렌지안료; 적색산화철, 카드륨레드납, 황화수은, 카드뮴, 퍼머넌트레드 4R, 리톨레드, 피라졸론레드, 워칭레드, 칼슘염, 레이크레드 C, 레이크레드 D, 브릴리언트 카민 6B, 브릴리언트카민 3B, 에오신레이크, 로다민레이크 B, 알리자린레이크 등의 적색안료; 아이론블루, 코발트블루, 알칼리블루레이크, 빅토리아블루레이크, 구리프탈로시아닌블루, 메탈프리 프탈로시아닌블루, 부분염소화 프탈로시아닌블루 화합물, 패스트스카이블루, 인다트렌블루 BC 등의 블루안료; 망간퍼플, 패스트바이올렛 B, 메틸바이올렛 드의 자색안료; 산화크롬, 크롬그린, 피그먼트그린 B, 말라카이트그린레이크, 파이널옐로그린 G 등의 녹색안료; 산화아연, 산화티탄, 황화아연 등의 백색안료; 바리테스, 탄산바륨, 점토, 화이트카본, 탤크, 알루미나화이트 등의 체질안료 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것이 아님은 물론이다.
본 발명의 마이크로캡슐을 서방약물에 사용할 경우, 함유되는 약물로서는, 용이한 수용성 약물 혹은 난수용성 (유용성) 약물 등을 들 수 있다. 이러한 약물로서는, 스테롤(예를 들면, 콜레스테로, 사이토스테롤 등), 에스트로겐(예를 들면,에스트론, 에스트라디올, 그의 에스테르 혹은 에티닐에스트라디올 등), 콜티코이드류 및 에스테르류, 칼시토닌 등의 펩티드호르몬, 항생제(겐타마이신, 반코마이신, 아미카신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 미노사클린, 테트라마이신 등), 클로르암페니콜, 매크로라이드항생제(예를 들면, 에티트로마이신, 그의 유도체, 특히 그의 팔미트산 에스테르 혹은 스테아르산 에스테르 등), 구충용 세균약물 및 피부약(예를 들면, 클로트리마졸, 미코나졸 또는 디트라놀 등), 항염증억제제(예를 들면, 인도메타신, 디크로페낙, 플루루비프로펜, 케토프로펜, 4-비페닐아세트산 또는 그의 에틸에스테르 등), 시아노발라민 등의 비타미뉴, 유로키나제 등의 효소약물, 플루오로우라실 또는 알라시티딘 등의 항암제 등을 들 수 있다.
<정형화제-기상배합->
본 발명의 중공의 입상 구조체를 이용해서 제조한 초음파 콘트라스트매체에는, 바람직하게는 생체내 투여시 독성이 거의 없으며, 동결건조 혹은 분무건조에 의해 용이하게 건조되고, 또, 생체내에의 투입시 신속하게 혹은 필요에 따라 용해되는 정형화제를 포함한다. 이러한 정형화제의 예로서는, 당류, 셀룰로스유도체, 아미노기, 단백질, 폴리아크릴산유도체, 유기염 및 무기염 등을 들 수 있다. 이러한 정형화제는, 2종이상을 적절한 비율로 혼합해서 이용해도 된다. 당류의 예로서는, D-만니톨, 아르긴산 나트륨, 프럭토스, 덱스트란, 덱스트린, 슈크로스, D-소르피톨, 락토스, 글루코스, 말토스, 전분류 및 트레할로스 등을 들 수 있다. 셀룰로스유도체의 예로서는, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 아세트산 프탈산셀룰로스, 아세트산 프탈산 하이드록시메틸셀룰로스, 아세트산 숙신산 하이드록시메틸셀룰로스 등을 들 수 있다.
아미노산의 예로서는, 글리신, 알라닌, 티로신, 아르기닌, 리신 등을 들 수 있다. 단백질의 예로서는, 젤라틴, 피브린, 콜라겐, 알부민 등을 들 수 있다. 폴리아크릴산 유도체의 예로서는, 폴리아크릴산 나트륨, 메타크릴산/아크릴산 공중합체(유드라기드: 롬사 제품, 독일) 등을 들 수 있다. 유기염의 예로서는, 시트르산 나트륨, 타르타르산 나트륨, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨 등을 들 수 있다. 무기염의 예로서는, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산 나트륨, 인산칼륨 등을 들 수 있다. 상기 외에, 정형화제는, 폴리비닐피롤리돈이나 폴리비닐알콜 등의 PHA를 용해시키지 않는 수용성 폴리머이어도 된다. 정형화제로서는, 바람직하게는, 당류, 특히 용이한 동결건조가 가능하고 독성이 낮은 D-만니톨이 바람직하다.
정형화제의 양은, 그의 용해도, 장력, 점도, 분산성 및 정형화제를 용해시켜 얻어진 용액의 안정성에 의해 구하나, 서방성 프레파라트의 건조후, 그 안의 정형화제의 함량이 예를 들면, 약 0.5 내지 99중량%, 바람직하게는, 1 내지 90중량%, 보다 바람직하게는, 2 내지 60중량%이다. 정형화제로서 D-만니톨을 사용할 경우, 건조된 서방성 프레파라트중의 그 함량은, 약 2 내지 40중량%인 것이 특히 바람직하다. 이러한 정형화제의 첨가는, 1) 초음파 콘트라스트매체(특히 미소구)의 건조시 및 건조후 접촉빈도와 입자의 충돌을 감소시켜, 동결 건조 혹은 분무건조시 입자의 균일성을 확보하고, 2) 유리전이온도보다도 높은 온도에서 서방성 프레파라트의 건조를 가능하게 하여, 물 혹은 유기용매의 보다 완전한 제거를 가능하게 하고, 3) 양호한 분산성을 지니고, 예를 들면, 서늘한 장소에 보관하는 것으로 제한되지 않고 실온에서 장기간 사용하는 초음파 콘트라스트매체를 제공하는 등의 우수한 효과를 제공한다.
본 발명에 있어서, 정형화제를 함유하는 초음파 콘트라스트매체는, 상기 액중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 입상 구조체와 정형화제를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 중공의 입상 구조체는, 세정후 감압하 건조하거나, 세정후 증류수중에서 재분산시켜 동결건조해도 된다. 혼합방법은, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 믹서를 이용하는 방법을 들 수 있으나, 균일한 혼합물을 제공하는 방법이 바람직하다. 또, 정형화제를 함유하는 초음파 콘트라스트매체는, 분무건조에 의한 중공의 입상 구조체의 제조에 있어서, w/o에멀젼의 분무시 별개의 노즐로부터 정형화제의 수용액을 분무함으로써 제조할 수 있다. 정형화제를 함유하는 초음파 콘트라스트매체는, 또한, 수중건조나 분무건조에 사용되는 w/o/w에멀젼의 제조시, 외부 수상으로서 정형화제의 수용액을 이용함으로써 제조할 수도 있다. 정형화제를 함유하는 초음파 콘트라스트매체는, 또한, 수중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 중공의 입상 구조체를 세정하고, 세정된 중공의 입상 구조체를 정형화제가 용해 혹은 분산되어 있는 증류수중에 분산시키고, 해당 중공의 입상 구조체를 동결건조 혹은 감압건조함으로써 제조할 수도 있다. 또, 세정된 중공의 입상 구조체를 증류수에 분산시킨 후, 이와 같이 해서 얻어진 정형화제를 용해 혹은 분산시키고, 동결건조 혹은 감압건조하는 것도 가능하다. 세정된 중공의 입상 구조체를 형상제어제가 분산되어 있는 증류수에 분산시키거나, 혹은, 세정된 입상구조체를 증류수에 분산시켜 얻어진 분산액에 정형화제를 용해시킨 후, 동결건조함으로써 특히 균일한 혼합물을 얻을 수 있다.
<가열처리-기상의 배합->
상기 수중건조, 상분리 혹은 분무건조에 의해 얻어진 중공의 입상 구조체는, 또, 필요에 따라, PHA의 유리전이온도(Tg)와 동일 혹은 해당 유리전이온도를 초과하지 않고, 중공의 입상 구조체를 구성하는 입자의 상호 달라붙음이 일어나지 않는 온도로 가열함으로써, 중공의 입상 구조체중의 물 또는 유기용매를 보다 완전하게 제거하여 서방능을 향상시켜도 된다. 이러한 조작에 있어서, 유기용매는, 약 1000ppm미만, 바람직하게는, 500ppm이하, 보다 바람직하게는, 100ppm의 수준까지 제거하는 것이 바람직하다. 가열은, 바람직하게는, 필요에 따라 정형화제의 첨가후 그리고 중공의 입상 구조체의 동결건조 혹은 감압건조후에 행하는 것이 바람직하나, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 입상 구조체를 적은 부분으로 분할한 후 행할 수 있다.
PHA의 유리전이온도미만의 온도로의 가열은, 물 혹은 유기용매의 충분한 제거를 얻을 수는 없는 반면, 지나치게 높은 온도로의 가열은, 중공의 입상 구조체의 융합 혹은 변형의 위험이 증가된다. 따라서, 가열온도는, 일정하게 정할 수는 없지만, PHA의 물성(분자량, 안정성 등), 중공의 입상 구조체의 평균입자크기, 가열시간, 중공의 입상 구조체의 건조수준, 가열방법 등을 고려해서 적절하게 결정할 수 있다. 가열은, PHA의 유리전이온도와 적어도 동일하지만 입상 구조체의 상호 달라붙음을 일으키지 않는 온도에서 행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 30℃ 높은 온도까지의 범위, 가장 바람직하게는, PHA의 유리전이온도로부터 약 20℃ 높은 온도까지의 범위에서 행한다.
가열시간은, 가열온도 및 처리대상 중공의 입상 구조체의 양에 따라 다르지만, 일반적으로는, 중공의 입상 구조체가 소정의 온도에 도달한 후 약 6 내지 120시간, 바람직하게는, 12 내지 96시간이다. 가열시간의 상한은, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한 값미만으로 되는 한, 특히 제한되지 않고, 중공의 입상 구조체가 유리전이온도이상에서 연화되므로, 잔존하는 유기용매나 물이 허용가능한계미만으로 되어, 입자의 물리적 접촉에 의한 혹은 입자의 혼화하의 하중에 의한 변형을 일으키면 가열을 신속하게 정지시키는 것이 바람직하다.
가열방법은, 특히 한정되지 않고, 가열은, 중공의 입상 구조체가 균일하게 가열될 수 있는 방법이면 어느 방법이라도 행할 수 있다. 이러한 가열건조는, 예를 들면, 항온조, 유출탱크, 가동층 혹은 키른(kirn)에서 가열함으로써, 혹은 전자파에 의해 가열함으로써 행할 수 있다. 이들 중, 항온조에서의 가열건조가 바람직하다. 동결건조후 감압하의 중공의 입상 구조체의 가열에 의하면, 해당 입상 구조체중의 유기용매를 효율적으로 제거할 수 있어, 생물체에 대해 안전한 중공의 입상 구조체를 제공할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 중공의 입상 구조체중의 유기용매의 잔존량은, 약 100ppm이하이다.
<용도-친수성 약물의 배합->
본 발명에 이용되는 약물은, 특히 제한되지 않고, 생리활성 폴리펩티류, 항생제, 안티유마이세테스제(antieumycetes agents),안티하이퍼케미아제(antihyperkemia agents), 순환계 약물, 항혈소판제(혈소판응결억제제), 항혈 크롯제(anti-blood-clot agents), 지혈제, 항종양제, 해열제, 안탈직스(antalgics), 항염증제, 진해거담제, 진정제, 아미오토닉제(amyotonic agents), 항간질제, 항궤양제, 항우울제, 항알레르기성 제제, 강심제, 항부정맥제, 혈관확장제, 이뇨제, 항당뇨병약, 호르몬제, 항결핵제, 항마취제, 골흡수억제제, 골발육촉진제, 혈관생성억제제 등을 들 수 있으나, 특히 수용성 약물이 바람직하다.
<프레파라트-친수성 약물의 배합>
본 발명의 서방성 프레파라트는, 마이크로캡슐과 같은 본 발명의 입상 구조체로 이루어져 있어도 되고, 혹은 각종 프레파라트형태, 예를 들면, 주사프레파라트, 매립프레파라트, 경구프레파라트(분체, 과립, 캡슐, 정제, 시럽, 에멀젼 혹은 현탁액 등), 코용 프레파라트 또는 좌약(직장용 좌약 혹은 질좌약 등) 등의 각종 형태로 형성할 수 있다. 이러한 프레파라트는, 약제프레파라트분야에서 통상이용되는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사프레파트는, 수성 혹은 유성 분산매체에 상기 입상 구조체를 분산시켜 제조할 수 있다. 수성 분산매체는, 장력동등화제(염화나트륨, 글루코스, D-만니톨, 소르비톨 또는 글리세린 등), 분산제(트윈 80, HCO-50, HCO-60, 카르복시메틸셀룰로스 또는 아르긴산 나트륨 등), 보존제(벤질알콜, 염화벤잘코늄 또는 페놀 등) 또는 통증감소제(예를 들면, 글루코스, 칼슘굴로코네이트 또는 프로카인 하이클로리네이트 등) 등을 들 수 있다. 또, 유성 분산매체로서는, 올리브유, 참기름, 땅콩유, 두유, 옥수수유 또는중간사슬 지방산 글리세라이드 등을 들 수 있다. 이러한 주사프레파라트는, 예비충전주사기의 챔버에 충전시켜도 되고, 혹은, 분산매체 및 입상 구조체를 소위 2중 챔버 예비충전주사기(DPS)의 상이한 챔버에 개별적으로 충전시켜도 된다. 또, 주사프레파라트의 제조시, 정형화제(예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 락토스 혹은 글루코스 등)를 상기 언급한 조성의 입상 구조체에 첨가하고, 재분산시킨 후, 해당 혼합물을 동결건조 혹은 분무건조하여 고형화하고, 증류수를 가해서 주사 혹은 사용에 적합한 분산매체로 함으로써 보다 안정한 서방성 프레파라트를 얻을 수 있다. 현탁주사프레파라트로서의 사용시의 입자크기는, 단지 분산의 필요한 레벨에 대응하고 주사바늘이 통과하는 데 필요하면 되며, 평균입자크기는, 예를 들면, 약 0.1 내지 500㎛, 바람직하게는, 1 내지 300㎛, 보다 바람직하게는, 2 내지 200㎛의 범위내이다. 또, 입상 구조체는, 전술한 바와 같이 수상에 침투압조정제를 첨가함으로써, 주사바늘이 통과하는 데 적합한 구형상으로 해도 된다. 방부제프레파라트는, 예를 들면, 모든 방부제생성공정을 행하고, 감마선으로 멸균처리하거나 방부제를 첨가함으로써 입상 구조체로부터 얻을 수 있으나, 이러한 방법으로 제한되는 것은 아니다.
경구프레파라트는, 상기 입상 구조체에, 정형화제(락토즈, 백설탕 혹은 전분 등), 브레이크제(전분 혹은 탄산칼슘 등), 바인더(전분, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 혹은 하이드록시프로필셀룰로스 등), 윤활제(탤크, 스테아르산 마그네슘 혹은 폴리에틸렌글리콜 6000 등) 등을 첨가한 후, 압축성형하고, 필요에 따라, 시식마스킹, 장내용해성 혹은 효능기간을 목적으로 해서 각종 방법으로 피복(코팅)을 행함으로써 제조할 수 있다. 피복에 대해서는, 예를 들면, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리옥시에틸렌글리콜, 트윈 80, 플루로닉 F68, 셀룰로스 아세테이트프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 유드로기드 메타크릴산-아크릴산 공중합체(롬사 제품, 독일) 혹은 안료(산화티탄 혹은 인디안레드 등)을 이용할 수 있다.
코용 프레파라트는, 고체, 반고체 혹은 액체이어도 된다. 고체의 코용 프레파라트는, 전술한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 자체로 이루어져 있을 수 있으나, 일반적으로는, 이러한 입상 구조체에 정형화제(글루코스, 만니톨, 전분 또는 미세결정성 셀룰로스 등), 점성제(숙성 고무, 셀룰로스유도체 혹은 아크릴산폴리머 등)를 첨가·혼합함으로써 제조할 수 있다. 또, 액체의 코용 프레파라트는, 전술한 주사프레파라트와 마찬가지 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 이러한 코용 프레파라트에는, pH조정제(예를 들면, 카르본산, 인산, 시트르산, 염화수소산 혹은 수산화나트륨 등), 방부제(예를 들면, 파라옥시벤조산 에스테르류, 클로로부탄올 혹은 염화벤잘코늄 등) 등을 함유시켜도 된다. 좌약은 유성 혹은 수성이어도 되고, 고체, 반고체 혹은 액체이어도 된다. 좌약은, 통상, 오일계 재료, 수계 재료 혹은 수성 겔계 재료 등으로 제조된다. 오일계 재료는, 예를 들면, 고급 지방산 글리세라이드[카카오지방 혹은 Witepsols(다이나마이트 노벨사 제품, 독일)], 중간 지방산(미그리올(다이나마이트 노벨사 제품, 독일)) 혹은 식물성 유지(참기름, 두유, 혹은 면실유 등) 등을 들 수 있다. 수계 재료로서는, 폴리에틸렌글리콜류,프로필렌글리콜류 등을 들 수 있다. 수계 겔계 재료로서는, 천연고무, 셀룰로스유도체, 비닐계 중합체 혹은 아크릴산계 중합체 등을 들 수 있다.
본 발명의 서방성 프레파라트는, 저독성이고, 포유류(인간, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐, 시궁쥐 혹은 산토끼 등)에 안전하게 사용할 수 있다. 서방성 프레파라트의 투여량은, 약물의 종류와 함량, 프레파라트의 종류, 약물방출기간, 대상질병[예를 들면, 전립선암, 전립선비대증, 자궁내막염, 자궁근종, 조숙발정, 방광암, 유방암, 자궁경관암, 만성 임파성 백혈병, 만성 골수백혈병, 콜론암, 위염, 호지킨병(악성 육아종증), 악성 흑색종, 염기전위, 다중골수종, 비호지킨병의 임파종, 비미소세포 폐암, 난소암, 소화성 위궤양, 토탈 유마이세테스(total eumycetes) 전염병, 미소세포폐암, 심장판막증, 유두병, 난소다낭종, 불임증, 여성의 만성 비오벌레이션(non-ovalation)에 있어서의 오벌레이션유도증, 여드름, 월경불순(예를 들면, 계속적인 생리불순), 난소 및 유방의 적혈구증가증(난소적혈구증가증을 포함함), 부인과 암, 난소 하이퍼안드로게네미아 및 하이퍼트리코시스, 유아흉선을 통한 T세포발생에 의한 에이즈, 남성낙태치료용 남성산아제한 및 산아제한 등의 호르몬의존질병치료제, PMS(premensual symptoms)억제, 수태(IVF) 등]과, 대상 동물에 따라 다르지만, 이러한 약물의 유효량이내이다. 약물의 시간당 투여량은, 예를 들면, 1개월간의 서방성 프레파라트의 경우, 성인 체중당 약 0.01 내지 100㎎/㎏, 바람직하게는, 0.05 내지 50㎎/㎏, 가장 바람직하게는, 0.1 내지 10㎎/㎏의 범위내에서 적절하게 선택할 수 있다. 서방성 프레파라트의 시간당 투여량은, 성인 체중당 약 0.1 내지 500㎎/㎏, 보다 바람직하게는, 0.2 내지 300㎎/㎏이다. 투여빈도는, 약물의 종류와 함량, 프레파라트의 종류, 약물방출기간, 대상질병 및 대상동물에 따라, 수주에 1회, 매달 1회 혹은 수개월당 1회 등으로부터 적절하게 선택할 수 있다.
<용도-친유성 약물의 배합->
본 발명에 이용되는 약물은, 특히 제한되지 않고, 생리활성 폴리펩티류, 항생제, 안티유마이세테스제, 안티하이퍼케미아제, 순환계 약물, 항혈소판제(혈소판응결억제제), 항종양제, 해열제, 안탈직스, 항염증제, 진해거담제, 진정제, 아미오토닉제(amyotonic agents), 항간질제, 항궤양제, 항우울제, 항알레르기성 제제, 강심제, 항부정맥제, 혈관확장제, 이뇨제, 항당뇨병약, 호르몬제, 골흡수억제제 등을 들 수 있으나, 특히 난용성 약물이 바람직하다. 예를 들면, 스테로이드계 악물, 단백질계 약물, 펩티드계 약물, 5-플루오로우라실, Me-CCUN, 오메프라졸 혹은 백금계 프레파라트(구체적으로는, 시스플라틴, 카르보플라틴, 이소플라틴 또는 그의 변성물질 등) 등의 항암약물을 유리하게 이용할 수 있다.
<프레파라트-친유성 약물의 배합>
본 발명의 서방성 프레파라트는, 마이크로캡슐과 같은 본 발명의 입상 구조체로 이루어져 있어도 되고, 혹은 각종 프레파라트형태, 예를 들면, 주사프레파라트, 매립프레파라트, 경구프레파라트(분체, 과립, 캡슐, 정제, 시럽, 에멀젼 혹은 현탁액 등), 코용 프레파라트 또는 좌약(직장용 좌약 혹은 질좌약 등) 등의 각종 형태로 형성할 수 있다. 이러한 프레파라트는, 약제프레파라트분야에서 통상이용되는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사프레파트는, 수성 혹은유성 분산매체에 상기 입상 구조체를 분산시켜 제조할 수 있다. 수성 분산매체는, 장력동등화제(염화나트륨, 글루코스, D-만니톨, 소르비톨 또는 글리세린 등), 분산제(트윈 80, HCO-50, HCO-60, 카르복시메틸셀룰로스 또는 아르긴산 나트륨 등), 보존제(벤질알콜, 염화벤잘코늄 또는 페놀 등) 또는 통증감소제(예를 들면, 글루코스, 칼슘굴로코네이트 또는 프로카인 하이클로리네이트 등) 등을 들 수 있다. 또, 유성 분산매체로서는, 올리브유, 참기름, 땅콩유, 두유, 옥수수유 또는 중간사슬 지방산 글리세라이드 등을 들 수 있다. 이러한 주사프레파라트는, 예비충전주사기의 챔버에 충전시켜도 되고, 혹은, 분산매체 및 입상 구조체를 소위 2중 챔버 예비충전주사기(DPS)의 상이한 챔버에 개별적으로 충전시켜도 된다. 또, 주사프레파라트의 제조시, 정형화제(예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 락토스 혹은 글루코스 등)를 상기 언급한 조성의 입상 구조체에 첨가하고, 재분산시킨 후, 해당 혼합물을 동결건조 혹은 분무건조하여 고형화하고, 증류수를 가해서 주사 혹은 사용에 적합한 분산매체로 함으로써 보다 안정한 서방성 프레파라트를 얻을 수 있다. 현탁주사프레파라트로서의 사용시의 입자크기는, 단지 분산의 필요한 레벨에 대응하고 주사바늘이 통과하는 데 필요하면 되며, 평균입자크기는, 예를 들면, 약 0.1 내지 500㎛, 바람직하게는, 1 내지 300㎛, 보다 바람직하게는, 2 내지 200㎛의 범위내이다. 또, 입상 구조체는, 전술한 바와 같이 수상에 침투압조정제를 첨가함으로써, 주사바늘이 통과하는 데 적합한 구형상으로 해도 된다. 방부제프레파라트는, 예를 들면, 모든 방부제생성공정을 행하고, 감마선으로 멸균처리하거나 방부제를 첨가함으로써 입상 구조체로부터 얻을 수 있으나, 이러한 방법으로 제한되는것은 아니다.
경구프레파라트는, 상기 입상 구조체에, 정형화제(락토즈, 백설탕 혹은 전분 등), 브레이크제(전분 혹은 탄산칼슘 등), 바인더(전분, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 혹은 하이드록시프로필셀룰로스 등), 윤활제(탤크, 스테아르산 마그네슘 혹은 폴리에틸렌글리콜 6000 등) 등을 첨가한 후, 압축성형하고, 필요에 따라, 시식마스킹, 장내용해성 혹은 효능기간을 목적으로 해서 각종 방법으로 피복(코팅)을 행함으로써 제조할 수 있다. 피복에 대해서는, 예를 들면, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리옥시에틸렌글리콜, 트윈 80, 플루로닉 F68, 셀룰로스 아세테이트프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 유드로기드 메타크릴산-아크릴산 공중합체(롬사 제품, 독일) 혹은 안료(산화티탄 혹은 인디안레드 등)을 이용할 수 있다.
코용 프레파라트는, 고체, 반고체 혹은 액체이어도 된다. 고체의 코용 프레파라트는, 전술한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 자체로 이루어져 있을 수 있으나, 일반적으로는, 이러한 입상 구조체에 정형화제(글루코스, 만니톨, 전분 또는 미세결정성 셀룰로스 등), 점성제(숙성 고무, 셀룰로스유도체 혹은 아크릴산폴리머 등)를 첨가·혼합함으로써 제조할 수 있다. 또, 액체의 코용 프레파라트는, 전술한 주사프레파라트와 마찬가지 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 이러한 코용 프레파라트에는, pH조정제(예를 들면, 카르본산, 인산, 시트르산, 염화수소산 혹은 수산화나트륨 등), 방부제(예를 들면, 파라옥시벤조산 에스테르류, 클로로부탄올혹은 염화벤잘코늄 등) 등을 함유시켜도 된다. 좌약은 유성 혹은 수성이어도 되고, 고체, 반고체 혹은 액체이어도 된다. 좌약은, 통상, 오일계 재료, 수계 재료 혹은 수성 겔계 재료 등으로 제조된다. 오일계 재료는, 예를 들면, 고급 지방산 글리세라이드[카카오지방 혹은 Witepsols(다이나마이트 노벨사 제품, 독일)], 중간 지방산(미그리올(다이나마이트 노벨사 제품, 독일)) 혹은 식물성 유지(참기름, 두유, 혹은 면실유 등) 등을 들 수 있다. 수계 재료로서는, 폴리에틸렌글리콜류, 프로필렌글리콜류 등을 들 수 있다. 수계 겔계 재료로서는, 천연고무, 셀룰로스유도체, 비닐계 중합체 혹은 아크릴산계 중합체 등을 들 수 있다.
본 발명의 서방성 프레파라트는, 저독성이고, 포유류(인간, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐, 시궁쥐 혹은 산토끼 등)에 안전하게 사용할 수 있다. 서방성 프레파라트의 투여량은, 약물의 종류와 함량, 프레파라트의 종류, 약물방출기간, 대상질병[예를 들면, 전립선암, 전립선비대증, 자궁내막염, 자궁근종, 조숙발정, 방광암, 유방암, 자궁경관암, 만성 임파성 백혈병, 만성 골수백혈병, 콜론암, 위염, 호지킨병(악성 육아종증), 악성 흑색종, 염기전위, 다중골수종, 비호지킨병의 임파종, 비미소세포 폐암, 난소암, 소화성 위궤양, 토탈 유마이세테스 전염병, 미소세포폐암, 심장판막증, 유두병, 난소다낭종, 불임증, 여성의 만성 비오벌레이션(non-ovalation)에 있어서의 오벌레이션유도증, 여드름, 월경불순(예를 들면, 계속적인 생리불순), 난소 및 유방의 적혈구증가증(난소적혈구증가증을 포함함), 부인과 암, 난소 하이퍼안드로게네미아 및 하이퍼트리코시스, 유아흉선을 통한 T세포발생에 의한 에이즈, 남성낙태치료용 남성산아제한 및 산아제한 등의 호르몬의존질병치료제,PMS(premensual symptoms)억제, 수태(IVF) 등]과, 대상 동물에 따라 다르지만, 이러한 약물의 유효량이내이다. 약물의 시간당 투여량은, 예를 들면, 1개월간의 서방성 프레파라트의 경우, 성인 체중당 약 0.01 내지 100㎎/㎏, 바람직하게는, 0.05 내지 50㎎/㎏, 가장 바람직하게는, 0.1 내지 10㎎/㎏의 범위내에서 적절하게 선택할 수 있다. 서방성 프레파라트의 시간당 투여량은, 성인 체중당 약 0.1 내지 500㎎/㎏, 보다 바람직하게는, 0.2 내지 300㎎/㎏이다. 투여빈도는, 약물의 종류와 함량, 프레파라트의 종류, 약물방출기간, 대상질병 및 대상동물에 따라, 수주에 1회, 매달 1회 혹은 수개월당 1회 등으로부터 적절하게 선택할 수 있다.
<용도-액상의 배합->
비료조성물로서 본 발명의 마이크로캡슐을 이용할 경우, 마이크로캡슐화의 과정에서 얻어진 슬러리를 직접 농약조성물로서 이용하는 것이 가능하나, 수성 현탁액, 수성 프레파라트, 분체 혹은 과립 등의 용이하게 이용가능한 프레파라트를 형성하는 것도 가능하고, 수성 현탁액이 특히 바람직하다. 이러한 수성 현탁액은, 점성화제, 동결방지제, 비중조정제, 방부제 등의 안정제를 전술한 바와 같이 해서 얻어진 마이크로캡슐슬러리에 첨가함으로써 제조할 수 있다. 사용되는 점성화제로서는, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로스, 크산텐고무, 람잔고무, 로커스트빈고무, 카라기난 혹은 월란고무, 규산마그네슘알루미늄, 스멕타이트, 벤토나이트, 헥토라이트, 건식 실리카 등의 합성폴리머, 혹은 알루미나졸 등을 들 수 있다. 동결방지제로서는, 프로필렌글리콜 등의 알콜류를 들 수 있다. 비중조정제로서는, 황산나트륨 혹은 요소 등의 수용성 염을 들 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 마이크로캡슐을 농약조성물로서 이용할 경우, 마이크로캡슐화과정에서 얻어진 슬리러를 농약조성물로서 직접 사용하는 것이 가능하나, 수성 현탁액, 수성, 프레파라트, 분체 혹은 과립 등의 용이하게 이용가능한 프레파라트를 형성하는 것도 가능하고, 수성 현탁액이 특히 바람직하다. 이러한 수성 현탁액은, 점성화제, 동결방지제, 비중조정제, 방부제 등의 안정제를 전술한 바와 같이 해서 얻어진 마이크로캡슐슬러리에 첨가함으로써 제조할 수 있다. 사용되는 점성화제로서는, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로스, 크산텐고무, 람잔고무, 로커스트빈고무, 카라기난 혹은 월란고무, 규산마그네슘알루미늄, 스멕타이트, 벤토나이트, 헥토라이트, 건식 실리카 등의 합성폴리머, 혹은 알루미나졸 등을 들 수 있다. 동결방지제로서는, 프로필렌글리콜 등의 알콜류를 들 수 있다. 비중조정제로서는, 황산나트륨 혹은 요소 등의 수용성 염을 들 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 화장품조성물로서 이용할 경우, 예를 들면, 고체 혹은 액체 파라핀, 크리스탈오일, 세레신, 오조켈라이트 혹은 몬탄왁스 등의 탄화수소류; 올리브유, 그라운드왁스, 카르나우바왁스, 라노린 혹은 고래왁스 등의 식물성 혹은 동물성 유지나 왁스류; 스테아르산, 팔미트산, 올레산, 글리세린모노스테아레이트 에스테르, 글리세린 디스테아레이트 에스테르, 글리세린 모노올레에이트 에스테르, 이소프로필미리스트산 에스테르, 이소프로필스테아르산 에스테르 혹은 부틸스테아르산 에스테르 등의 지방산류 및 그의 에스테르류; 메틸폴리실록산, 메틸폴리시클로실록산, 메틸페닐올실록산 혹은 실리콘 폴리에스테르공중합체 등의 실리콘류; 에탄올, 이소프로필알콜, 세틸알콜, 스테아릴알콜, 팔미틸알콜 혹은 헥실도데실알콜 등의 알콜류; 글리콜, 글리세린 혹은 소르비톨 등의 습윤효과를 지닌 다가 알콜류 등을 들 수 있다.
본 발명의 마이크로캡슐을 인공혈구로서 사용할 경우, 마이크로캡슐화 과정에서 얻어진 슬러리를 생리식염수에 현탁시키고, 겔여과 또는 원심분리 등의 공지의 방법에 의해 커다란 입자를 제거한다.
본 발명의 마이크로캡슐을 잉크조성물로서 이용할 경우, 이들을 수성 매체에 분산시킨다. 수성 매체에의 분산을 용이하게 하기 위해, 계면활성제, 보호콜로이드, 수용성 유기용매 등을 피복의 내부성을 충분히 열화시키지 않는 범위내에서 첨가해도 된다. 또한, 방부제, 점성조정제, pH조정제, 킬레이트제 등을 첨가해도 된다. 본 발명의 수성 안료잉크에 첨가할 수 있는 보호콜로이드의 예로서는, 아교, 젤라틴, 카제인, 알부민, 아라비아고무 혹은 어류아교, 등의 천연보호제, 아르긴산, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌옥사이드, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 방향족 아미드류, 폴리아크릴산, 폴리비닐에테르, 폴리비닐피롤리돈, 아크릴계 수지 혹은 폴리에스테르 드으이 합성 폴리머류 등을 들 수 있다. 보호콜로이드는, 가요성, 점성 및 신속건조성을 향상시키기 위해 필요에 따라 사용하고, 잉크중의 보호콜로이드의 비율은, 바람직하게는, 30질량%를 초과하지 않도록, 보다 바람직하게는, 20질량%를 초과하지 않도록 한다.
본 발명의 수성 안료잉크에 첨가할 수 있는 계면활성제로서는, 음이온성, 양이온성, 양성 혹은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다. 음이온성 계면활성제의 예로서는, 스테아르산나트륨, 올레산칼륨 혹은 반경화된 소의 지방산나트륨염 등의지방산염류;
도데실황산 나트륨, 트리(2-하이드록시에틸)암모늄 도데실설페이트 혹은
옥타데실황산 나트륨 등의 알킬설폰산에스테르염류;
노닐벤젠설폰산나트륨, 도데실벤젠설폰산나트륨, 옥타데실벤젠설폰산 나트륨 혹은 도데실디페닐에테르디설폰산 나트륨 등의 벤젠설폰산염류;
도데실나프탈렌설폰산 나트륨 혹은 나프탈렌설폰산-포르말린축합물 등의
나프탈렌설폰산염류;
디도데실 설포숙신산 나트륨 혹은 디옥타데실 설포숙신산 나트륨 등의
설포숙신산에스테르염류;
폴리옥시에틸렌 도데실에테르 황산 나트륨,
폴리옥시에틸렌 도데실에테르황산 트리(2-하이드록시에틸)암모늄,
폴리옥시에틸렌 옥타데실에테르황산 나트륨 혹은
폴리옥시에틸렌 도데실페닐에테르황산 나트륨 등의
폴리옥시에틸렌황산에스테르염류;
도데실인산 칼륨 혹은 옥타데실인산 나트륨 등의 인산에스테르염류 등을 들 수 있다. 양이온성 계면활성제의 예로서는, 아세트산 옥타데실암모늄 혹은
팜유아민 아세트산염 등의 알킬아민염류;
클로로도데실트리메틸암모늄, 클로로옥타데실트리메틸암모늄,
클로로디옥타데실디메틸암모늄 혹은 클로로도데실벤질디메틸암모늄 등의 4급 암모늄염류 등을 들 수 있다. 양성 계면활성제의 예로서는, 도데실베타인 혹은
옥타데실베타인 등의 알킬베타인류;
도데실디메틸아민옥사이드 등의 아민옥사이드류 등을 들 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌 도데실에테르,
폴리옥시에틸렌 헥사데실에테르, 폴리옥시에틸렌 옥타데실에테르 혹은
폴리옥시에틸렌 (9-옥타데실)에테르 등의 폴리옥시에틸렌 도데실에테르류;
폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르 혹은 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌 페닐에테르류;
폴리옥시화 에틸렌, 코폴리옥시에틸렌옥시프로필렌 등의 옥실란폴리머류;
소르비탄도데칸산에스테르, 소르비탄옥타데칸산에스테르,
소르비탄(9-옥타데칸산)에스테르, 소르비탄(9-옥타데칸산)트리에스테르,
폴리옥시에틸렌-소르비탄도데칸산에스테르,
폴리옥시에틸렌-소르비탄옥타데칸산에스테르,
폴리옥시에틸렌-소르비탄(9-옥타데칸산)에스테르,
폴리옥시에틸렌-소르비탄(9-옥타데칸산)트리에스테르 등의 소르비탄지방산 에스테르류;
폴리옥시에틸렌-소르비탄(9-옥타데칸산)테트라에스테르 등의 소르비톨지방산 에스테르류;
글리세린 옥타데칸산 에스테르 혹은 글리세린 (9-옥타데센산)에스테르 등을 들 수 있다. 이러한 비이온성 계면활성제중에서, HLB가 적어도 14와 동등한 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 상기 계면활성제의 첨가량은, 단일의 계면활성제를 단독으로 사용하는 지 혹은 2종이상의 계면활성제를 조합해서 사용하는 지의 여부에 따라 다르나, 잉크조성물의 전체량에 관해서 0 내지 10질량%, 바람직하게는, 0 내지 5질량%의 범위내이다. 본 발명의 수성 안료잉크조성물은, 물을 20 내지 95질량%, 안료를 1 내지 60체적% 함유한다.
<퍼플루오로카본-기상의 배합->
초음파 콘트라스트매체로서 이용할 본 발명의 중공의 입상 구조체의 중공부에는, 해당 중공의 입상 구조체를 물에 분산시킨 후, 건조장치내에서 감압하에 건조시키고 나서, 감압상태에 있는 해당 건조장치내에 퍼플루오로카본가스를 도입시키고, 압력을 바람직하게는 상압으로 회복시킴으로써, 퍼플루오로가스를 충전시킬 수 있다.
중공의 입상 구조체가 분산되어 있는 물은 상기 분산제를 함유하고 있어도 된다. 감압건조는, 필요에 따라 감압하 가열건조하거나 동결건조함으로써 행할 수 있으나, 후자가 바람직하다. 퍼플루오로카본은, 콘트라스트매체의 인체에의 투여후에도 기체상태를 유지하기 위해 체온을 초과하지 않는 끓는 온도를 지니고, 10℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 퍼플루오로카본으로서는, 예를 들면, 옥타플루오로시클로부탄, 옥타플루오로프로판, 헥사플루오로에탄 등을 들 수 있다. 사용될 퍼플루오로카본가스는, 물에 난용인 것이 바람직하므로, 혈액 등의 인체 유체내에 용해되지 않아, 콘트라스트증대 효과기간이 연장될 수 있다.
<수용성 캐리어-기상의 배합->
본 발명의 방법에 의해 얻어진, 건조한 미립자상태의 중공의 입상 구조체는,적절한 수용성 캐리어(생리식염수 혹은 수용성 만니톨용액)에 분산시켜, 초음파 콘트라스트매체로서 사용시, 인체에 경구 혹은 비경구로 투여한다. 이러한 수용성 캐리어는, 필요에 따라 공지의 분산제를 함유해도 된다. 초음파 콘트라스트매체로서 사용시, 중공의 입상 구조체는, 수용성 캐리어를 함유하는 콘트라스트매체의 전체량에 대해서 0.01 내지 80%, 바람직하게는, 0.01 내지 50%의 농도로 첨가한다.
실시예
이하, 본 발명에 대해 실시예를 참조해서 보다 상세히 설명한다. 이하에 기재한 각 예는 본 발명의 최량의 형태이나, 본 발명의 기술적 범주는 이들 실시예로 한정되지 않는다. 여기서 "%" 및 "부"는 특별한 언급이 없는 한 중량에 의거한 것이다. 여기서의 "마이크로캡슐"은, 상기 2가지 형태, 즉, 1층(모노리식)형과 2층(코어/셸)형을 포함하며, 이들을 일괄적으로 마이크로캡슐이라 칭한다.
참고예 1 PHA신타제생산능을 지닌 형질전환체의 구축
TB 64균주로부터 유래된 PHB신타제생산능을 지닌 형질전환체의 구축은, 본 발명자들이 특허로 개별적으로 이미 출원하였으나, 그 구체예를 이하에 설명한다. TB 64균주를 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑스, 0.5% 염화나트륨, pH 7.4) 1000㎖에 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 마르마르(Marmar) 등에 의한 방법에 의해 염색체 DNA를 단리하였다. 얻어진 DNA를 제한효소 Sau3Al에 의해 부분 소화시켰다. 또, 제한효소 BamHI에 의해 벡터 pUC18을 절단하였다. 말단 탈인산화후(Molecular Cloning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press), DNA라이게이션키트 Ver. II(타카하라슈조사 제품)를 이용해서 벡터의 분열위치에 염색체 DNA의 Sau3AI 부분소화단편을 결찰하였다. 이들 결찰된 염색체 DNA단편에 의해 대장균(Escherichia coli) HB 101을 형질전환하여 TB64균주의 DNA라이브러리를 구축하였다.
다음에, TB64균주의 PHA신타제유전자를 커버하고 있는 DNA를 얻기 위해, 대표적인 스크리닝을 행하였다. 2% 글루코스를 함유하는 LB배지를 스크리닝에 사용하고, 평탄한 한전배지상의 콜로니가 적절한 크기로 성장한 때 수단블랙용액을 분사하고, 자외선조사하 형광을 보이는 콜로니를 회수하였다. 얻어진 콜로니로부터 알칼리법에 의해 플라스미드를 회수함으로써 PHA신타제유전자를 덮고 있는 DNA단편을 얻을 수 있었다.
획득한 유전자단편을, IncP, IncQ 또는 IncW 비양립성 기에 속하지 않는 와이드 숙주복제영역(Mo Bi Tec)을 지닌 벡터 pBBR122로 형질전환시켰다. 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64ml균주(PHA신타제음성균주 결여)를 전기영동에 의해 이 재결합플라스미드에 의해 형질전환한 경우, TB64ml균주의 PHA합성능을 회복하여 상보성을 나타내었다.
다음에, PHB신타제유전자의 개시코돈근방에 염기서열을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 지정하여 합성하고(Amarsham Pharmacia Biotech), 프라이머로서 해당 뉴클레오타이드를 이용해서 PCR을 행하여 PHB신타제유전자(LA-PCR 키트; 타카라 슈조사 제품)를 포함하는 단편을 증폭하였다.
얻어진 PCR단편을 제한효소 BamHI에 의해 완전히 소화시켰다. 또, BamHI에 의해 벡터 pTrc99A도 절단하였다. 말단 탈인산화후(Molecular Cloning, 1, 572,(1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press), DNA라이게이션키트 Ver. II(타카하라슈조사 제품)를 이용해서 완전한 BamHI 소화단편을 결찰하였다. 얻어진 형질전환 플라스미드벡터에 의해, 대장균(Escherichia coli) HB 101(타카하라 슈조사)을 염화칼슘법에 의해 형질전환하여 얻어진 형질전환체로부터 형질전환 플라스미드 pTB 64-PHB를 회수하였다. 이어서, 이 pTB 64-PHB에 의해, 대장균(Escherichia coli) HB 101을 염화칼슘법으로 형질전환하여 pTB 64-PHB형질전환균주를 얻었다.
참고예 2 GST융합된 PHB신타제생산능을 형질전환체의 구축
pTB 64-PHB형질전환균주를 LB배지 200㎖에 접종하고, 125스트로크/분에서 진탕하에 37℃에서 배양하였다. 이 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 통상의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 회수하였다.
다음에, pTB 64-PHB에 대해 상류측 프라이머(서열번호 1) 및 하류측 프라이머(서열번호 2)를 각각 합성하였다(Amarsham Pharmacia Biotech). 이들 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용해서, 주형으로서 pTB 64-PHB를 이용하여 PCR을 행하여, 상류측에 BamHI제한부위, 하류측에 XhoI제한부위를 지닌 PHB신타제유전자(LA-PCR 키트: 타카하라슈조사 제품)의 전체길이를 증폭하였다.
각각의 정제된 PCR증폭품을 BamHI 및 XhoI로 소화시킨 후, 플라스미드 pGEX-6P-1(Amarsham Pharmacia Biotech)의 대응하는 제한부위에 삽입하였다. 이들 벡터에 의해 대장균 JM109를 형질전환하고, 그 결과, PHA신타제를 발현하는 균주를 얻었다. 확인을 위해, 해당 플라스미드 DNA를, 미니프레프(Miniprep)(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA)에 의해 다량 제작하고, BamHI 및XhoI에 의해 소화시키고, 얻어진 DNA단편을 동정하였다.
참고예 3 PHB신타제의 제조
얻어진 발현균주를 앰피실린(100㎍/ℓ)이 첨가된 2xYT배지(폴리펩톤 16g/ℓ, 효모엑스 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.0) 100㎖에서 30℃에서 하룻밤 예비배양하였다.
다음에, 이것을 앰피실린(100㎍/ℓ)이 첨가된 2xYT배지(폴리펩톤 16g/ℓ, 효모엑스 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.0) 10ℓ에 첨가하고, 30℃에서 3시간 배양을 해아였다. 다음에, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 최종농도가 1mM이 되도록 하고 30℃에서 3시간 배양을 행하였다.
회수된 배양액을 78000m/s2(=8000G), 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상청액의 제거후, 균체펠릿을 4℃에서 PBS용액 500㎖에 재현탁시켰다. 이 균체액을 각회 40㎖씩 미리 4℃로 냉각된 용기에 붓고, 프렌치프레스에 의해 216MPA(=2200kg/㎠)의 가압하, 균체액을 노즐로부터 조금씩 방출하여, 균체분쇄처리를 행하였다. 분쇄된 균체액을 4℃, 78000m/s2(=8000G)에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 이 액체를 0.45㎛의 필터로 여과하고 고체를 제거하였다. 상청액중, 글루타티온 트랜스퍼라제(GST)로 용합된 소망의 PHB합성효소의 존재를, SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
다음에, GST융합 PHB합성효소를 글루타티온 세파로즈 4B(Amarsham Pharmacia Biotech)로 정제하였다. 글루타티온 세파로즈 4B의 75%슬러리 6.65㎖를 4℃,4900m/s2(=500G)에서 5분간 원심분리하고, 상청액의 제거후, 4℃에서 PBS용액 200㎖에 재현탁을 회수하였다. 4℃, 4900m/s2(=500G)에서 5분간 재차 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 후, PBS용액 5㎖에 4℃에서 재현탁시켜 글루타티온 세파로즈 4B의 50%슬러리를 얻었다.
상청액의 전체량을 이와 같이 해서 얻어진 글루타티온 세파로즈 4B의 50%슬러리 10㎖에 첨가하고, 해당 혼합물을 온화하게 진탕하여, 해당 상청액중의 소망의 융합 단백질을 글루타티온 세파로즈 4B에 의해 어피니티흡수되도록 한다.
상기 액체를 4℃, 4900m/s2(=500G)에서 5분간 원심분리하고, PBS용액 5㎖중에 4℃에서 재현탁시키고, 마찬가지의 원심분리를 재차 행하고, 상청액을 제거하였다. GST-융합 PHB합성효소가 고착되어 있는 글루타티온 세파로스 4B를 PBS용액중 재현탁과 원심분리 2회를 반복함으로써 세정하고, 분열완충액(TTris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM, 디티올트레이톨 1mM, pH 7) 5㎖에 최종적으로 현탁시켰다. 다음에, 분열완충액중의 프레시션 프로테아제(Amarsham Pharmacia Biotech)의 4%용액 0.5㎖와, 해당 혼합물을 5℃에서 4시간 온화하게 진탕하였다. 얻어진 혼합물을 4℃, 4900m/s2(=500G)에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 다음에, 상기에 설명한 바와 같이 제조한 글루타티온 세파로스 4B의 50%슬러리 1㎖를 4℃, 4900m/s2(=500G)에서 5분간 원심분리하고, 상청액제거후의 글루타티온 세파로스 4B에 상기에서 회수한 상청액을 첨가하여, 얻어진 혼합물을 온화하게 진탕하여 글루타티온 세파로스 4B에 해당 상청액에 남아있는 프레시션 프로테아제를 흡수시켰다. 다음에, 4℃, 4900m/s2(=500G)에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 이 상청액은, SDS-PAGE에서 단일결합을 보여, 정제된 것임을 나타내었다.
함유된 PHB합성효소의 활성을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 소혈청알부민(시그마사 제품)을 0.1M 트리스염산완충액(pH 8.0)에 3.0㎎/㎖로 용해시키고, 이와 같이 해서 얻어진 용액 100㎕를 효소용액 100㎕에 첨가하고, 해당 혼합물을 30℃에서 1분간 예비배양하였다. 다음에, 0.1M 트리스염산완충액(pH 8.0)에 3.0mM로 용해된 3-하이드록시부티릴 CoA의 용액 100㎕를 첨가한 후, 해당 혼합물을 30℃에서 1 내지 30분간 배양하고 나서, 0.1M 트리스염산완충액(pH 8.0)에 10㎎/㎖로 용해된 트리클로로아세트산용액을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 반응종결후의 용액을 원심분리(147,000m/s2(15,000G), 10분)하고, 0.1M 트리스염산완충액(pH 8.0)에 용해된 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)의 2mM용액 500㎕를 첨가하고, 2차반응(자유 CoA의 발색반응)후, 원심분리(147,000m/s2(15,000G), 10분)하고, 500㎕의 상청액을 500㎕의 시약 4에 첨가하고, 30℃에서 10분간 배양후, 412nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성은, 1분내에 1μmol의 CoA의 방출을 일으키는 효소량을 1유닛(U)으로 취해서 산출하였다. 그 결과, 상대활성 7.5U/㎖가 얻어졌다. 얻어진 액체를 레이호겔의 첨가하에 한외여과해서 10U/㎖까지 농축시킴으로써, 정제된 효소액(1)을 얻었다.
참고예 4 PHB합성효소를 함유하는 조제의 효소액의 제조
효모엑스 0.5% 및 무기물용액 0.3%(하기 참조)를 함유하는 M9배지(하기 조성) 100ℓ중에서, KK01 및 TL2균주를 30℃에서 24시간 배양하고, 회수된 배양액을 4℃, 7800m/s2(=8000G)에서 10분간 원심분리하고, 상청액의 제거후, 균체펠릿을 PBS용액 500㎖에 4℃에서 재현탁시켰다. 균체액을 미리 4℃로 냉각된 용기에, 각회 40㎖씩 붓고, 프렌치프레스에 의한 2200㎏/㎠의 가압하에, 해당 균체액을 노즐로부터 조금씩 방출하여 균체분쇄처리를 행하였다. 분쇄된 균체액을 4℃, 7800m/s2(=8000G)에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 회수하였다. 해당 액을 0.45㎛의 여과기로 여과하고, 함유된 PHB합성효소의 활성을 전술한 방법에 의해 측정하였다. 그 결과, 얻어진 상대활성은, KK01균주에 대해서는 1.6U/㎖, TL2균주에 대해서는 1.2U/㎖였다. 이 액체를, 유기물용액견본응축기(상품명: 미즈부토리쿤: 아토사 제품)의 첨가하에, 한외여과에 의해 10U/㎖까지 농축함으로써, KKO1균주로부터 유래된 정제된 효소액(1) 및 TL2균주로부터 유래된 정제된 효소액(2)를 얻었다.
[M9배지]
Na2HPO4: 6.2g
KH2HPO4: 3.0g
NaCl: 0.5g
NH4Cl: 1.0g
(1리터중, pH 7.0)
[무기물용액]
니트릴로트리아세트산: 1.5g
MgSO4: 3.0g
MnSO4: 0.5g
NaCl : 1.0g
FeSO4: 0.1g
CaCl2: 0.1g
CoCl2: 0.1g
ZnSO4: 0.1g
CuSO4: 0.1g
AlK(SO4)2: 0.1g
H3BO3: 0.1g
Na2MoO4: 0.1g
NiCl2: 0.1g
(1리터중)
참고예 5 PHA신타제생산능을 지닌 형질전환체의 구축
YN2균주를 LB배지(1% 폴리펩톤(닛뽄 세이야쿠사 제품), 0.5% 효모엑스(Difco), 0.5% 염화나트륨, pH 7.4) 100㎖에 30℃에서 하룻밤 배양한 후, 마르마르(Marmar) 등에 의한 방법에 의해 염색체 DNA를 단리하였다. 얻어진 DNA를 제한효소 HindIII에 의해 완전 소화시켰다. 또, HindIII에 의해 벡터 pUC18을 절단하였다. 말단 탈인산화후(Molecular Cloning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press), DNA라이게이션키트 Ver. II(타카하라슈조사 제품)를 이용해서 벡터의 분열위치(클로닝부위)에 염색체 DNA의 HindIII 완전소화단편을 결찰하였다. 이들 염색체 DNA단편을 함유하는 플라스미드벡터에 의해 대장균(Escherichia coli) HB 101을 형질전환하여 YN2균주의 DNA라이브러리를 구축하였다. 다음에, YN2균주의 PHA신타제유전자를 덮고 있는 DNA단편을 선택하기 위해, 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드(Amarsham Pharmacia Biotech)를 합성함으로써, 콜로니혼성화용 프로브를 제작하였다. 다음에, 주형으로서 염색체 DNA를 이용해서 PCR을 행하였다. PCR증폭된 DNA단편을 프로브로서 사용하였다. 시판의 라벨링효소 Alk Phos Direct(Amarsham Pharmacia Biotech)를 이용해서 프로브의 라벨링을 행하였다. 얻어진 콜로니혼성화용의 라벨링된 프로브를 이용해서, YN2의 염색체 DNA라이브러리로부터, PHA신타제유전자를 함유하는 재결합플라스미드를 지닌 콜론을 선택하였다. 선택된 콜론으로부터 알칼리프로세스에 의해 플라스미드를 회수하여 PHA신타제유전자를 함유하는 DNA단편을 얻었다. 이 유전자단편을, IncP, IncQ 또는 IncW 비양립성 기에 속하지 않는 와이드 숙주복제영역(Mo Bi Tec)을 지닌 벡터pBBR122로 형질전환시켰다. 슈도모나스 치코리이 YN2ml균주(PHA합성음성균주)를 전기영동에 의해 이 재결합플라스미드에 의해 형질전환한 바, YN2ml균주의 PHA합성능을 회복하여 상보성을 나타내었다. 따라서, 선택된 유전자단편은, 슈도모나스 치코리이 YN2ml내의 PHA신타제로 번역될 수 있는 PHA신타제유전자영역을 함유하는 것으로 확인되었다.
이 DNA단편의 염기서열은 상거법(Sanger method)에 의해 결정하였다. 그 결과, 결정된 염기서열에 있어서 폴리펩티드를 인코딩하는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 각각 표시되는 염기서열을 나타내었다. 이들 PHA신타제유전자에 대해서, 주형으로서 염색체 DNA를 이용해서 PCR을 행하여, 완전한 PHA신타제유전자를 생성하였다. 구체적으로는, 서열번호 5의 PHA신타제에 대응하는 상류측 프라이머(서열번호 7) 및 하류측 프라이머(서열번호 8)와, 서열번호 6의 PHA신타제유전자에 대응하는 상류측 프라이머(서열번호 9) 및 하류측 프라이머(서열번호 10)가 각각 합성되었다(Amarsham Pharmacia Biotech).
이들 프라미어를 이용해서, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시된 6염기서열의 각각에 대해 PCR을 행한 후, PHA신타제유전자의 전체길이를 증폭하였다(LA-PCR 키트; 타카라 슈조사 제품). 다음에, 얻어진 PCR증폭단편과 발현벡터 pTrc99A를 제한효소 HindIII에 의해 소화하고, 탈인산화후(Molecular Cloning, 1, 572, (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press), DNA라이게이션키트 Ver. II(타카하라슈조사 제품)를 이용해서 발현벡터 pTrc99A의 제한부위에 양말단에서의 불필요한 염기서열을 배제한 전체길이의 PHA신타제유전자를 함유하는 DNA단편을 연결하였다.
얻어진 재결합 플라스미드의 각각에 의해, 대장균(Escherichia coliHB 101: 타카라슈조사 제품)을 염화칼슘법으로 형질전환하고, 얻어진 재결합체를 배양하고 해당 재결합플라스미드를 증폭한 후, 재결합플라스미드를 각각 회수하였다. 염기서열번호 5의 DNA를 지닌 재결합플라스미드를 pYN2-C1이라 지칭하고, 염기서열번호 6의 DNA를 지닌 재결합플라스미드를 pYN2-C2라 지칭하였다. 대장균(Escherichia coliHB101fB 결여균주)을 염화칼슘법으로 각각 pYN2-C1 및 pYN2-C2에 의해 형질전환하여 각각 재결합 플라스미드를 지닌 재결합 대장균, 즉, pYN2-C1재결합균주 및 pYN2-C2재결합균주를 얻었다.
참고예 6 PHA신타제(1)의 제조
pYN2-C1에 대해, 상류측 프라이머(서열번호 11) 및 하류측 프라이머(서열번호 12)를 각각 지정하여 합성하였다(Amarsham Pharmacia Biotech). 이들 프라이머 및 주형 pYN2-C1를 이용해서 LA-PCR 키트(타카하라슈조사 제품)에 의해 PCR을 행하여, 상류측에 BamHI제한부위, 하류측에 XhoI제한부위를 지닌 PHB신타제유전자의 전체길이를 합성하였다.
마찬가지로, YN2-C2에 대해서, 상류측 프라이머(서열번호 13) 및 하류측 프라이머(서열번호 14)를 각각 지정하여 합성하였다(Amarsham Pharmacia Biotech). 이들 프라이머 및 주형 pYN2-C2를 이용해서 LA-PCR 키트(타카하라슈조사 제품)에 의해 PCR을 행하여, 상류측에 BamHI제한부위, 하류측에 XhoI제한부위를 지닌 PHB신타제유전자의 전체길이를 증폭하였다.
각각의 정제된 PCR증폭품을 BamHI 및 XhoI이라 지칭하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(Amarsham Pharmacia Biotech)의 대응하는 제한부위에 삽입하였다. 이들 벡터에 의해 대장균 JM109를 형질전환하고, 그 결과, PHA신타제를 발현하는 균주를 얻었다. 확인을 위해, 해당 플라스미드 DNA를, 미니프레프(Miniprep)(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA)에 의해 다량 제작하고, BamHI 및 XhoI에 의해 소화시키고, 얻어진 DNA단편을 동정하였다. 이 PHA신타제를 다음과 같이 표시하고 정제하였다. 즉, 얻어진 균주를 LB-Amp배지 10㎖에서 하룻밤 예비배양하고 나서, 0.1㎖배양액을 LB-Amp배지 10㎖에 옮기고, 37℃, 170rpm에서 3시간 진탕배양하였다. 다음에, IPTG를 배지에 1mM의 농도까지 첨가하고, 37℃에서 4 내지 12시간 배양을 계속하였다.
IPTG에 의해 유기된 대장균체를 회수(8,000×g, 2분, 4℃)하고, 4℃에서 인산완충 생리식염수(PBS: 8g NaCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4, 0.2g KCl, 1000㎖ 정제수)의 1/10체적에 재현탁하였다. 균체를 동결·해동·음파에 의해 파쇄하여 원심분리(8,000×g, 10분, 4℃)하여 고체불순물을 제거하였다. SDS-PAGE에 의해 상청액중에 목적으로 하는 재결합단백질이 존재하는 것을 확인하고, 유기발현된 GST융합단백질을, 글루타티온 세파로스 4B(Amarsham Pharmacia Biotech)를 이용해서 정제하였다. 글루타티온 세파로스는, 비특정흡수를 피하기 위해 미리 처리하였다. 즉, 글루타티온 세파로스를 동등량의 PBS로 3회 세정하고(8,000×g, 1분, 4℃), 동등량의 4% 소혈청알부민 PBS를 4℃에서 1시간 첨가하였다. 그 후, 세파로스를 동등량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2양의 PBS에 재현탁시켰다. 글루타티온 세파로스의 전처리된 40㎕를 상기 균체없는 추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃에서 서서히 교반하여 각각 글루타티온 세파로스상에 융합단백질 GST-YN2-C1 및 GST-YN2-C2를 흡착시켰다. 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)에 의해 글루타티온 세파로스를 회수한 후, PBS 400㎕로 3회 세정하였다. 세정후, 글루타티온 10mM을 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반하여 흡착된 융합단백질을 용출시켰다. 원심분리(8,000×g, 2분, 4℃)후, 상청액을 회수하여 PBS에 대해 투석하여 GST융합단백질을 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 단일결합이 인식되었다.
다음에, 각 GST융합단백질 500㎍을 프레시션 프로테아제(Amarsham Pharmacia Biotech, 5U)에 의해 소화시키고, 글루타티온 세파로스를 통과시켜 GST를 제거하였다. 유출분획을 또, PBS와 균형을 이룬 세파덱스 G200컬럼에 적재시킨 후, 최종 정제품으로서 발현 단백질 YN2-C1 및 YN2-C2를 얻었다. SDS-PAGE에 의해 단일밴드(각각 60.8kDa 및 61.5kDa)가 확인되었다.
상기 효소를 바이오리퀴드농축제(미즈부토리쿤 AB-1100, 아토사 제품)로 농축하여 정제된 효소용액 10U/㎖를 얻었다.
상기 방법에 의해 효소활성을 측정하였다. 해당 시료의 단백질농도는 마이크로 BCA단백질정제시약키트(Pierce Chemical Co.)를 이용해서 구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 표시한다.
활성 특이활성
pYN2-C1 2.1U/㎖ 4.1U/㎎단백질
pYN2-C2 1.5U/㎖ 3.6U/㎎단백질
참고예 7 PHA신타제(2)의 합성
효모엑스(Difco) 0.5% 및 옥탄산 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 대장균 P91, H45, YN2 및 P161을 각각 접종하고, 30℃, 125스트로크/분에서 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)하여 회수한 후, 해당 균체를 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0) 200㎖에 재현탁시키고, 또, 원심분리하여 세정하였다. 해당 균체를 0.1M트리스-HCl완충액(pH 8.0) 200㎖에 재현탁시키고 초음파균질화기에 의해 파쇄하고, 원심분리(12,000×g, 4℃, 10분)하여, 상청액을 회수하여 조제의(crude) 효소를 얻었다.
각 조제의 효소활성을 전술한 방법에 의해 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 표시한다.
기원 활성
P91 P91균주 0.1U/㎖
H45 H45균주 0.2U/㎖
YN2 YN2균주 0.4U/㎖
P161 P161균주 0.2U/㎖
이러한 효소를 유기물용액견본응축기(상품명: 미즈부토리쿤; 아토사 제품)에 의해 농축하여 조제의 효소용액 10U/㎖을 얻었다.
참고예 8 3-하이드록시아실 CoA의 합성
Rehm BHA, Kruger N, Steinbuchel A(1998) Journal of Biological Chemistry 273 pp24044-24051에 따라 소정의 변화를 가미해서 (R)-3-하이드록시옥타노일-CoA를 합성하였다. 아실-CoA신타제(시그마사 제품)를 2mM ATP, 5mM MgCl2, 2mM 코엔자임 A 및 2mM (R)-3-하이드록시옥타노에이트를 함유하는 (R)-트리스염산완충액(50mM, pH 7.5)에 0.1mU/㎕의 농도로 용해시켰다. 37℃의 욕조에 유지하고, 적절하게 샘플링해서 반응의 진행을 HPLC에 의해 분석하였다. 샘플링한 반응액에 0.02N의 황산을 첨가하여 효소반응을 종결시키고, 미반응기질 (R)-3-하이드록시옥타노에이트를 n-헵탄에 의한 추출에 의해 제거하였다. HPLC분석은 RP18컬럼(뉴클레오실 C18, 7㎛, 나우서(Knauser))을 이용하였고, 이동상으로서 25mM인산완충액(pH 5.3)을 이용해서, 아세토니트릴의 선형 농도경사하에 용출을 행하고, 다이오드어레이검출기에 의해 200 내지 500nm의 흡수스펙트럼을 모니터하면서 효소반응에 의해 생성된 티오에스테르화합물을 검출하였다. (R)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 및 (R)-3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레릴 CoA도 마찬가지 방법에 의해 합성하였다.
(실시예 1)
D-글루코스 0.5% 및 5-(4-플루오로페닐)발레르산(FPVA) 0.1%를 함유하는 M9배지 20ℓ에 슈도모나스 치코리이 YN2균주(FERM BP-7375)를 접종하고, 30℃, 80회전/분에서 2.5ℓ/분의 통기하에 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, D-글루코스 0.5% 및 FPVA 0.1%를 함유하지만, 질소원(NH4Cl)은 함유하지 않는 M9배지 20ℓ에 재현탁하고, 또 30℃, 80회전/분에서 2.5ℓ/분의 통기하에 진탕배양하였다. 48시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 젖은 균체로부터 1g을 평가용으로 분리한 후, 냉메탄올로 한번 세정해서 동결건조펠릿을 얻었다.
남은 젖은 균체를 약 1.7%의 차아염소산나트륨수용액 500㎖에 현탁시키고, 약 4℃에서 2시간 진탕해서 PHA를 추출하였다. PHA를 원심분리해서 회수하고 건조하여 배양액 1ℓ당 PHA 0.87g을 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 1이라 칭한다.
상기 동결건조펠릿을 20㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 후, 회전식 증발기에서 농축하고, 농축액을 냉메탄올중에서 재침전시키고, 또 침전물만을 회수하여 진공건조해서 PHA를 얻었다.
얻어진 PHA의 조성은 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 25㎖가지형 플라스크에 PHA 약 10㎎을 넣고, 클로로포름 2㎖에 용해시킨 후, 3%황산을 함유하는 메탄올용액 2㎖를 첨가하여 100℃에서 환류하에 3.5시간 반응시켰다. 반응후, 탈이온수 10㎖를 첨가하고, 10분간 격렬하게 진탕한 후, 하부의 클로로포름층을 꺼내고 나서, 황산마그네슘으로 탈수하고, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, 컬럼: DB-WAX(J&W, 0.32㎜×30m), EI법)로 분석해서, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정(同定)을 행하였다. 그 결과, PHA모노머유닛의 96%가 3HFPV였고, 4%는 3-하이드록시발레르산이었다. 따라서, FPVA로부터 유래된 소망의 3HFPV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 얻을 수 있었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=71,500, Mw=158,000이었다.
(실시예 2)
FPVA대신에 3-하이드록시-4-페녹시부티르산(PxBA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.15g의 양으로 3-하이드록시-4-페녹시부티르산모노머유닛(3HPxB)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 2라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은, PxBA 95%, 3-하이드록시부티르산유닛 5%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, FxBA로부터 유래된 소망의 3HPxB모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=71,500, Mw=158,000이었다.
(실시예 3)
FPVA대신에 4-시클로헥실부티르산(CHBA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.79g의 양으로 3-하이드록시-4-시클로헥실부티르산모노머유닛(3HCHB)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 3이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은, 3HCHB 98%, 3-하이드록시부티르산유닛 2%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, CHBA로부터 유래된 소망의 3HCHB모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=92,000, Mw=218,000이었다.
(실시예 4)
FPVA대신에 5-벤조일발레르산(BzVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.55g의 양으로 3-하이드록시-5-벤조일발레르산모노머유닛(3HBzV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 4라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛의 88%가 3HBzV였고, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종이 12%였다. 이와 같이 해서, BzVA로부터 유래된 소망의 3HBzV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=325,000, Mw=1,240,000이었다.
(실시예 5)
FPVA대신에 5-(4-플루오로벤조일)발레르산(FBzVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.35g의 양으로 3-하이드록시-5-(4-플루오로벤조일)발레르산모노머유닛(3HFBzV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 5라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HFBzV 79%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 21%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, FBzVA로부터 유래된 소망의 3HFBzV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=285,000, Mw=833,000이었다.
(실시예 6)
FPVA대신에 5-티에닐발레르산(TVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.85g의 양으로 3-하이드록시-5-티에닐발레르산모노머유닛(3HTV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 6이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HTV 97%와, 3-하이드록시부티르산유닛 3%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, TVA로부터 유래된 소망의 3HTV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=75,000, Mw=185,000이었다.
(실시예 7)
FPVA대신에 5-티에노일발레르산(ToVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.15g의 양으로 3-하이드록시-5-티에노일발레르산모노머유닛(3HToV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 7이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HToV 62%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 38%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, ToVA로부터 유래된 소망의 3HToV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=105,000, Mw=252,000이었다.
(실시예 8)
FPVA대신에 5-(4-플루오로티오페녹시)발레르산(FTPxVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.92g의 양으로 3-하이드록시-5-(4-플루오로티오페녹시)발레르산모노머유닛(3HFTPxV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 8이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HFTPxV 82%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 18%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, FTPxVA로부터 유래된 소망의 3HFTPxV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=95,000, Mw=282,000이었다.
(실시예 9)
FPVA대신에 5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.35g의 양으로 3-하이드록시-5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산모노머유닛을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 9라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3-하이드록시[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산 89%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 11%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, 5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산으로부터 유래된 소망의 3-하이드록시-5-[(4-플루오로페닐메틸)설파닐]발레르산모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=35,000, Mw=92,000이었다.
(실시예 10)
FPVA대신에 5-티오티에녹시발레르산(TTxVA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 1.1g의 양으로 3-하이드록시-5-티오티에녹시발레르산모노머유닛(3HTTxV)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 10이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HTTxV 90%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 10%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, TTxVA로부터 유래된 소망의 3HTTxV모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=205,000, Mw=550,000이었다.
(실시예 11)
FPVA대신에 옥탄산(OA)을 사용한 이외에는 실시예 1과 동일한 조건하에 실시예 1과 마찬가지 처리를 행하여 배양액 1ℓ당 0.75g의 양으로 3-하이드록시-옥탄산모노머유닛(HO)을 함유하는 PHA를 얻었다. 이 PHA를 실시예화합물 11이라 칭한다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행한 바, PHA모노머유닛은 3HO 65%와, 3-하이드록시부티르산유닛, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종 35%로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, OA로부터 유래된 소망의 3HO모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=132,000, Mw=312,000이었다.
(실시예 12)
효모엑스 0.1%를 함유하는 M9한천배지상에서 성장시킨 YN2균주의 콜로니를, 멸균생리식염액에 OD(600nm) 1.0까지 현탁시켰다. 얻어진 현탁액을 미리 제조한 탄소원은 어느 것도 함유하지 않는 1/10N M9한천배지 100개의 판상에 뿌리고, 1-옥텐의 분위기중에서 30℃에서 배양하였다.
4일후 균체를 회수하고, 메탄올로 세정하고, 원심분리에 의해 회수하여 감압하 건조하였다. 건조된 균체를 클로로포름 50㎖에 가하고, 30℃에서 48시간 교반하여 PHA를 추출하였다. 클로로포름층을 여과한 후, 증발기에서 농축시키고 냉메탄올에 주입하였다. 침전물을 회수하여 감압하 건조하여 PHA 0.26g을 얻었다.
얻어진 PHA에 대해서 실시예 1과 마찬가지로 평가를 행하고, 또,1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)을 행하였다. 프로톤은 곁사슬의 말단의 메틴에 포함되었고, 곁사슬의 말단의 이중결합과 에폭시기는 Macromolecules, 31, 1480-1486(1998)에 따라 귀속되었다. 그 결과, PHA모노머유닛은 에폭시유닛 17%, 포화유닛 30% 및 불포화유닛 53%로 이루어져 있었다. 포화 및 불포화유닛은, 3-하이드록시헥산산, 3-하이드록시헵탄산, 3-하이드록시옥탄산, 3-하이드록시데칸산, 3-하이드록시도데칸산, 3-하이드록시헥센산, 3-하이드록시헵텐산, 3-하이드록시옥텐산 및 3-하이드록시도데센산의 적어도 1종으로 이루어져 있었다. 이와 같이 해서, 1-옥텐으로부터 유래된 소망의 에폭시모노머유닛의 비율이 높은 PHA를 고수율로 얻을 수 있었다. 분자량은 Mn=251,000, Mw=550,000이었다.
(실시예 13)
N-(S)-2-테트라하이드로푸로일-Gly-D2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NmeTyr-Dlsy(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DalaNH2(이하, "펩티드 A"라 칭함)의 아세트산염(TAP사 제품) 500㎎을 증류수 0.6㎖에 용해시켰다. 얻어진 용액을, 4.5g의 실시예화합물 1을 디클로로메탄 5.8㎖에 용해시켜 형성한 용액에 첨가하고, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의해 60초간 혼합하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 w/o에멀젼을 16℃까지 냉각시키고, 미리 16℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)의 0.1%수용액 1000㎖에 첨가하고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 w/o/w에멀젼을 형성하였다. w/o/w에멀젼을 실온에서 3시간 교반하여 디클로로메탄을 증발시킴으로써, w/o에멀젼을 고형화시키고, 원심분리기(05PR, 히타치사 제품)에 의해 2000rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 증류수에 재분산시키고, 얻어진 분산액을 또 원심분리하여 자유약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고, D-만니톨 0.3g을 첨가하여 동결건조하여 분체형상의 마이크로캡슐 1을 얻었다. 이 마이크로캡슐 1중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 3에 표시한다.
(실시예 14 내지 24)
실시예화합물 1 대신에 실시예화합물 2 내지 12를 이용한 이외에는 실시예 13과 동일한 조건하에 실시예 13의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 2 내지 12를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 3에 표시한다.
(실시예 25)
50부의 상기 마이크로캡슐 12를, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 물을 동결건조에 의해 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 13을 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 3에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 13에 대해 적외흡수를 측정하였다(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X). 그 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 13에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 13이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 26)
50부의 상기 마이크로캡슐 12를, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 14를 얻었다. 이 마이크로캡슐 14중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 3에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 14에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 14에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 14가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(비교예 1)
실시예화합물대신에 락트산-글리콜산공중합체(PLGA)(와코쥰야쿠사 제품, 로트번호 940810, 락트산/글리콜산(몰비):74/26, GPC중량평균분자량: 10,000, GPC수평균분자량: 3,900, 말단기 정량분석에 의한 수평균분자량: 3,700)를 이용한 이외에는 실시예 13과 동일한 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 15를 얻었다. 그중의 약물함량은 하기 표 3에 표시한다.
실시예 캡슐번호 실시예화합물 약물함량(%)
13 1 1 16.5
14 2 2 17.1
15 3 3 17.8
16 4 4 18.0
17 5 5 18.7
18 6 6 16.4
19 7 7 17.6
20 8 8 18.1
21 9 9 17.3
22 10 10 18.7
23 11 11 17.0
24 12 12 17.6
25 13 12+가교 17.1
26 14 12+그라프트 16.7
비교예 1 15 PLGA 14.0
(실시예 27)
펩티드 A(TAP)의 아세트산염 500㎎을, 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 0.6㎖에 용해시키고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 60㎎과 소혈청알부민 5㎎을 첨가하여 용해시켰다. 얻어진 용액을 디클로로메탄 5.8㎖에 첨가하고, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의해 60초간 혼합하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 w/o에멀젼을 16℃까지 냉각시키고, 미리 16℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)의 0.1%수용액 1000㎖에 첨가하고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 w/o/w에멀젼을 형성하였다. w/o/w에멀젼을 실온에서 3시간 교반하여 디클로로메탄을 증발시키면서 PHA의 합성을 행하고, 고형화된 w/o에멀젼을 원심분리기(05PR, 히타치세이사쿠쇼사 제품)에 의해 2000rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 증류수에 재분산시키고, 얻어진 분산액을 또 원심분리하여 자유약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고, D-만니톨 0.3g을 첨가하여 동결건조하여 분체형상의 마이크로캡슐 16을 얻었다. 이 마이크로캡슐 16중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
상기 캡슐 16을 클로로포름 20㎖에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피(셸)를 구성하는 PHB를 추출하였다. 이 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHB모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 얻어진 캡슐 16의 외피의 주성분은, 얻어진 크로마토그램에서의 주성분의 피크가 표준 하이드록시부티르산의 메틸화 화합물의 것과 동일한 체류시간을 지녔으므로, PHB로서 확인되었다.
또, PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=73,000었다.
(실시예 28)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(1)을 사용한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 17을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
실시예 27에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 17의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 17에 함유된 PHA의 수평균분자량은 71,000이었다.
(실시예 29)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 27과동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 18을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
실시예 27에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 18의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 18에 함유된 PHA의 수평균분자량은 73,000이었다.
(실시예 30)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조한 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 사용한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 19를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
실시예 27에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 19의 외피의 주성분은 3-하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 19에 함유된 PHA의 수평균분자량은 24,000이었다.
(실시예 31)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 수화된 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 지닌 Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조한 (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 사용한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 20을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
실시예 27에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 20의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 20에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 32)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, 3-하이드록시-5-페닐발레르산을 이용해서 Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조한 (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 사용한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 21을 얻었다. 상기 3-하이드록시-5-페닐발레르산은, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 브로모아세트산 에틸과 3-페녹시프로판올(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성됨)로부터 합성된 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화함으로써 제조하였다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
실시예 27에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 21의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 21에 함유된 PHA의 수평균분자량은 24,000이었다.
(실시예 33)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페녹시발레릴 CoA 60㎎의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 27과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 22를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 시간에 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 약물 1이 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)으로 덮여있고, 또, 그 위에 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 22에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 34)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 60㎎대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 48㎎과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 12㎎(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 27과 동일한 조건하에 실시예 27의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 23을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 4에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 캡슐 23의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 77%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 23%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 23에 함유된 PHA의 수평균분자량은 22,000이었다.
(실시예 35)
50부의 상기 마이크로캡슐 23을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 24를 얻었다. 이 마이크로캡슐 24중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 24에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 24에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 24가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 36)
50부의 상기 마이크로캡슐 24를, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 25를 얻었다. 이 마이크로캡슐 25중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 4에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 25에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 25에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 25가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 캡슐번호 약물함량(%)
27 16 16.2
28 17 16.5
29 18 17.0
30 19 17.5
31 20 18.1
32 21 17.8
33 22 18.0
34 23 18.1
35 24 17.5
36 25 17.0
(실시예 37)
펩티드 A(TAP)의 아세트산염 500㎎을, 증류수 0.6㎖에 용해시키고, 얻어진 용액을 디클로로메탄 5.8㎖에 첨가하고, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의해 60초간 혼합하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 w/o에멀젼을 16℃까지 냉각시키고, 미리 16℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)의 0.1%수용액 100㎖에 첨가하고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 w/o/w에멀젼을 형성하였다. 이 w/o/w에멀젼에, 정제효소액(1) 5㎖, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 1g 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 100㎎을 첨가하여 용해시켰다.
상기 w/o/w에멀젼을 실온에서 3시간 교반하여 디클로로메탄을 증발시키면서 PHA의 합성을 행하고, 고형화된 w/o에멀젼을 원심분리기(05PR-22, 히타치세이사쿠쇼사 제품)에 의해 2000rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 증류수에 재분산시키고, 얻어진 분산액을 또 원심분리하여 자유약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고, D-만니톨 0.3g을 첨가하여 동결건조하여 분체형상의 마이크로캡슐 26을 얻었다. 이 마이크로캡슐 26중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
상기 캡슐 26을 클로로포름 20㎖에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHB를 추출하였다. 이 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHB모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 얻어진 캡슐 26의 외피의 주성분은, 얻어진 크로마토그램에서의 주성분의 피크가 표준 하이드록시부티르산의 메틸화 화합물의 것과 동일한 체류시간을 지녔으므로, PHB로서 확인되었다.
또, PHB의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=78,000었다.
(실시예 38)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(1)을 사용한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 27을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
실시예 37에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 27의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 27에 함유된 PHA의 수평균분자량은 75,000이었다.
(실시예 39)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 37과동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 28을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
실시예 37에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 28의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 28에 함유된 PHA의 수평균분자량은 77,000이었다.
(실시예 40)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 29를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
실시예 37에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 29의 외피의 주성분은 하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 29에 함유된 PHA의 수평균분자량은 27,000이었다.
(실시예 41)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시킨 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 30을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
실시예 37에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 30의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 30에 함유된 PHA의 수평균분자량은 22,000이었다.
(실시예 42)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성된 3-페녹시프로판올과 브로모아세트산 에틸을 출발물질로 해서, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 31을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
실시예 37에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 31의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 31에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 43)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 1g의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 37과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 32를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 시간에 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 약물 1이 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)으로 덮여 있고, 또, 그 위에 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 32에 함유된 PHA의 수평균분자량은 24,000이었다.
(실시예 44)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 1g대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 800㎎과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 200㎎(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 37과 동일한 조건하에 실시예 37의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 33을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 5에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 캡슐 33의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 76%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 24%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 33에 함유된 PHA의 수평균분자량은 25,000이었다.
(실시예 45)
50부의 상기 마이크로캡슐 33을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 34를 얻었다. 이 마이크로캡슐 34중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 34에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 34에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 34가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 46)
50부의 상기 마이크로캡슐 34를, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 35를 얻었다. 이 마이크로캡슐 35중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 5에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 35에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 35에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 35가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 캡슐번호 약물함량(%)
37 26 17.1
38 37 16.9
39 28 17.2
40 29 17.9
41 30 18.5
42 31 18.1
43 32 18.5
44 33 18.9
45 34 18.0
46 35 17.3
(실험예 1)
약 20㎎의 마이크로캡슐 12를 분산매체(증류수중의 2.5㎎의 카르복시메틸셀룰로스, 0.5㎎의 폴리소르베이트 80 및 25㎎의 만니톨의 용액) 0.5㎖에 분산시키고, 10주된 수컷 SD쥐의 등에 주사바늘 22G로 피하주사를 놓았다.
일부 쥐는 투여후 소정 시간간격으로 죽었고, 투여부위에 남아 있는 마이크로캡슐을 채취하여 그 안의 펩티드 A의 양을 구하였다. 그 결과를 하기 표 6에 표시한다.
(실험예 2 내지 9 및 비교실험예 1)
실험예 1에 있어서 마이크로캡슐 13, 14, 15, 23, 24, 25, 33, 34 및 35를 각각 이용한 이외에는 실험예 1과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 프레파라트를 얻고, 시간경과에 따른 펩티드 A함량을 분석하였다. 그 잔류율을 하기 표 6에 표시한다.
실험예 마이크로캡슐 투여후 시간경과(주)에 따른 잔류율
1 2 3 4
1 12 85.0 66.1 45.4 30.1
2 13 90.5 72.3 53.1 37.9
3 14 86.1 67.3 48.3 34.0
4 23 83.4 63.9 42.7 32.0
5 24 92.1 73.4 49.9 39.2
6 25 87.3 64.2 45.3 33.3
7 33 83.9 64.1 44.1 32.5
8 34 91.0 72.1 51.2 40.0
9 35 86.1 65.0 45.9 34.8
비교실험예 1 15 83.2 55.1 36.2 20.0
(실시예 47)
500㎎의 실시예화합물 1을 클로로포름 70㎖에 용해시켰다. 다음에, 수용성 염료인 다이렉트 스페셜 블랙 AXN(닛뽄 카야쿠사 제품)용액 10㎖를 첨가하고, 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 회전증발기에서 처리하여 60℃에서 감압하 유기용매를 증류제거함으로써 염료를 지닌 마이크로캡슐을 얻었다. 갑작스런 비등을 피하기 위해, 초기에 증발기내의 진공도를 높게 유지하고, 유기용매의 증발이 진행함에 따라 점차로 낮춘다. 그 후, 마이크로캡슐중에 소량 남아 있는 유기용매를 질소가스의 플러쉬(flushing)에 의해 제거하였다. 이와 같이 해서 얻어진 염료보유 마이크로캡슐에, 10mM 인산완충액(pH 7.0)을 30㎖까지 첨가한 후, 1,2μ필터(아크로디스크, 젤만사 제품)를 통해 여과하고 10mM인산완충액에 투석멤브레인(스펙트래퍼, 스펙트럼메디칼사 제품)을 이용해서 투석하여 자유 염료를 제거하였다. 이와 같이 해서 얻어진 염료보유 마이크로캡슐 36을 잉크 1용으로 사용하였다. 평균입자크기를 다이나믹광산란에 의해 측정하고, 광학 현미경 및 전자현미경하의 관찰결과를 하기표 7에 표시한다.
(실시예 48 내지 58)
실시예 47에 있어서, 폴리머로서 실시예화합물 2 내지 12를 사용한 이외에는 실시예 47과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 잉크 2 내지 12용의 마이크로캡슐 37 내지 47을 얻었다.
평균입자크기를 다이나믹광산란에 의해 측정하고, 광학 현미경 및 전자현미경하의 관찰결과를 하기 표 7에 표시한다.
(실시예 59)
50부의 상기 마이크로캡슐 47을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 48을 얻었다. 평균입자크기를 다이나믹광산란에 의해 측정하고, 광학 현미경 및 전자현미경하의 관찰결과를 하기 표 7에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 48에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 48에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 48이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 60)
50부의 상기 마이크로캡슐 47을, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 동시에 잉크 14를 구성하는 마이크로캡슐 49를 얻었다. 평균입자크기를 다이나믹광산란에 의해 측정하고, 광학 현미경 및 전자현미경하의 관찰결과를 하기 표 7에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 49에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 49에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 49가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(비교예 2)
실시예 47에 있어서, 폴리머로서 폴리DL락트산(수평균분자량 7000)을 이용한 이외에는 마찬가지 조건하에 실시예 47의 처리를 행하여, 잉크 15로서 마이크로캡슐 50을 얻었다.
평균입자크기를 다이나믹광산란에 의해 측정하고, 광학 현미경 및 전자현미경하의 관찰결과를 하기 표 7에 표시한다.
실시예 캡슐번호 실시예화합물 평균입자크기 구멍
47 36 1 750 없음
48 37 2 720 없음
49 38 3 840 없음
50 39 4 770 없음
51 40 5 850 없음
52 41 6 830 없음
53 42 7 850 없음
54 43 8 840 없음
55 44 9 820 없음
56 45 10 790 없음
57 46 11 830 없음
58 47 12 820 없음
59 48 12+가교 840 없음
60 49 12+그라프트 870 없음
비교예 2 50 PLGA 980 있음
(실시예 61)
클로로포름 70㎖에, 슈도모나스치코리이 YN2균주로부터 참고예 6에서 제조한 10U/㎖의 PHA신타제 YN2-Cl과 참고예 8에서 제조한 1mM (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 함유하는 수용성 염료인 다이렉트 스페셜 블랙 AXN(닛뽄 카야쿠사 제품)용액 10㎖를 첨가하고, 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 37℃에서 3시간 배양하여 PHA신타제를 얻었다.
겔여과(세파덱스 G-50 컬럼)에 의해 반응액을 크기별로 분리하여 마이크로캡슐을 얻었다. 다이나믹광산란법에 의거한 바, 마이크로캡슐의 평균입자크기는 820nm였고, 단분산상태였다.
제조된 마이크로캡슐의 일부를 진공에서 건조한 후, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, PHA는, 3-하이드록시옥탄산 모노머유닛으로 이루어진 것으로 확인되었다. 또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=13,000, Mw=32,000이었다.
(실시예 62)
항생물질인 반코마이신을 보유하는 마이크로캡슐을 하기 방법에 의해 제조하였다. 클로로포름 70㎖에, 5%글루코스용액 10㎖를 첨가하고, 여기에, 반코마이신 0.2g과, 슈도모나스치코리이 YN2균주로부터 참고예 6에서 제조한 10U/㎖의 PHA신타제 YN2-Cl과 참고예 8에서 제조한 1mM의 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하고, 이 혼합물을 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 37℃에서 3시간 배양하여 PHA신타제를 얻었다.
겔여과(세파덱스 G-50 컬럼)에 의해 반응액을 크기별로 분리하여 마이크로캡슐을 얻었다. 다이나믹광산란법에 의거한 바, 마이크로캡슐의 평균입자크기는 840nm였고, 단분산상태였다.
제조된 마이크로캡슐의 일부를 진공에서 건조한 후, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, PHA는, 3-하이드록시-5-발레르산 모노머유닛으로 이루어진 것으로 확인되었다. 또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=15,000, Mw=37,000이었다.
(실시예 63)
농약효능화합물로서 디메틸(3-메틸-4-니트로페닐)포르포로티오에이트를 보유하는 마이크로캡슐을 하기 방법으로 제조하였다.
클로로포름 70㎖에, P161균주로부터 참고예 7에서 제조한 PHA신타제 10U/㎖와 참고예 8에서 제조한 1mM의 (R)-3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레릴 CoA를 함유하는 디메틸(3-메틸-4-니트로페닐)포스포로티오에이트의 5%용액 10㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 37℃에서 3시간 배양하여 PHA신타제를 얻었다.
겔여과(세파덱스 G-50 컬럼)에 의해 반응액을 크기별로 분리하여 마이크로캡슐을 얻었다. 다이나믹광산란법에 의거한 바, 마이크로캡슐의 평균입자크기는770nm였고, 단분산상태였다.
제조된 마이크로캡슐의 일부를 진공에서 건조한 후, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, PHA는, (R)-3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산 모노머유닛으로 이루어진 것으로 확인되었다. 또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=13,000, Mw=30,000이었다.
(실시예 64)
초음파흡수제인 2,4-디하이드록시벤조페논을 보유한 화장품용의 마이크로캡슐을 하기 방법으로 제조하였다.
클로로포름 70㎖에, H45균주로부터 참고예 7에서 제조한 10U/㎖의 PHA신타제와 참고예 8에서 제조한 1mM의 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 함유하는 2,4-디하이드록시벤조페논의 5%용액 10㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 37℃에서 3시간 배양하여 PHA신타제를 얻었다.
겔여과(세파덱스 G-50 컬럼)에 의해 반응액을 크기별로 분리하여 마이크로캡슐을 얻었다. 다이나믹광산란법에 의거한 바, 마이크로캡슐의 평균입자크기는 750nm였고, 단분산상태였다.
제조된 마이크로캡슐의 일부를 진공에서 건조한 후, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, PHA는, 3-하이드록시옥탄산 모노머유닛으로 이루어진 것으로 확인되었다. 또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=16,000, Mw=34,000이었다.
(실시예 65)
클로로포름 70㎖에, 수가용성 형광염료칼세인의 수용액 10㎖를 첨가하고, P91균주로부터 참고예 8에서 제조한 10U/㎖의 PHA신타제와 참고예 8에서 제조한 1mM의 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA를 첨가하고, 이 혼합물을 프로브초음파진동기(오오타케사 제품)에 의해 유화를 행하여 w/o에멀젼을 얻었다. 이 초음파조사는 50W의 파워를 30초간 행하고 10회 반복하였다. 이와 같이 해서 제조한 에멀젼을 37℃에서 3시간 배양하여 PHA신타제를 얻었다.
겔여과(세파덱스 G-50 컬럼)에 의해 반응액을 크기별로 분리하여 마이크로캡슐을 얻었다. 다이나믹광산란법에 의거한 바, 마이크로캡슐의 평균입자크기는 840nm였고, 단분산상태였다.
제조된 마이크로캡슐의 일부를 진공에서 건조한 후, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, PHA는, 3-하이드록시옥탄산 모노머유닛으로 이루어진 것으로 확인되었다. 또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=18,000, Mw=40,000이었다.
(실시예 66)
칼세인을 보유한 PHA피복된 마이크로캡슐을 실시예 65와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 이 마이크로캡슐 2부에, 슈도모나스 치코리이 YN2부터 참고예 6에서 제조한 PHA신타제 YN2-C1 100U/㎖, (R)-3-하이드록시피메릴 CoA(J. Bacteriol., 182, 2753-2760(2000)에 따라 제조함) 30mM 및 소혈청알부민(시그마세 제품) 0.1%를 함유하는 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 100부를 첨가하였다.
3시간 진탕후, 반응생성물을 0.1M 인산완충액(pH 7.0)으로 세정하여 미반응물질을 제거하고, 바람건조하여 마이크로캡슐을 얻었다.
이 마이크로캡슐을 동결건조한 후, 캡슐구조체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-피메르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 리보좀의 PHA 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 시간에 3-하이드록시-옥탄산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 표면이 친수성 작용기를 지닌 폴리하이드록시피메레이트로 덮여 있고, 그 아래쪽의 층이 폴리하이드록시옥탄산으로 이루어져 있는 2층구조인 것으로 확인되었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=19,000, Mw=42,000이었다.
(실시예 67)
칼세인을 보유하는 PHA피복 마이크로캡슐을 실시예 65와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 마이크로캡슐 1부에, 슈도모나스 치코리이 YN2균주로부터 참고예 6에서 제조한 PHA신타제 YN2-C1 10U/㎖, (R,S)-3-하이드록시-5-페녹시발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 브로모아세트산 에틸과 3-페녹시프로판알로부터 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시켜 3-하이드록시-5-페녹시발레르산을 얻은 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함) 24mM, (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA(Int. J. Biol. Marcromol., 12, 85-91(1990)에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화 부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화하고 나서, Eur. J. Biochem, 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함) 6mM 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1%를 함유하는 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 49부를 첨가하였다.
3시간 진탕후, 반응액을 0.1M 인산완충액(pH 7.0)으로 세정하여 미반응물질을 제거하고, 바람건조하여 마이크로캡슐 51을 얻었다.
비교참조용으로, (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA대신에 3-하이드록시옥타노일 CoA를 사용한 이외에는 마찬가지 방법으로 해서 마이크로캡슐 52를 얻었다.
상기 반응액중 10㎕부분을 슬라이드글라스위에 놓고, 니일블루 A의 수중 1%용액 10㎕를 첨가하고, 이들 용액을 슬라이드글라스상에서 혼합하고, 커버글라스를 덮고, 형광현미경(330 내지 380nm여기필터, 420nm장파장통과흡수필터, 니콘사 제푸)하에 관찰하였다. 그 결과, 마이크로캡슐의 표면으로부터 형광이 관찰되어, 해당 마이크로캡슐이 표면상에 PHA로 피복되어 있는 것이 확인되었다.
또, 시료의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 회수하고, 진공건조하고, 클로로포름중에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHA를 추출하였다. 이 추출물을1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)하고 모노모유닛의 산출률을 하기 표 8에 표시한다.
캡슐구조체중의 외피PHA의 조성(1H-NMR, 단위%)
모노머유닛 캡슐 51 캡슐 52
3-하이드록시-5-페녹시발레르산 82% 71%
3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산 18% -
3-하이드록시옥탄산 - 29%
또, 50부의 상기 마이크로캡슐 51에 대해서, 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의한 마이크로캡슐의 회수 및 순수 50부중에의 현탁처리를 3회 반복하였다. 다음에, 헥사메틸렌디아민 0.5부를 현탁액중에 가교제로서 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 건조동결에 의해 물을 제거하였다(마이크로캡슐 53을 얻음). 또한, 이 마이크로캡슐 53을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 54를 얻었다.
상기 마이크로캡슐 53 및 54를 각각 클로로포름에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 PHA피복을 추출한 후, 클로로포름을 진공건조하여 제거하였다. 해당 추출물을 시차주사열량계(DSC: 퍼킨엘머사 제품, 피리스 1, 승온속도: 10℃/분)를 이용해서 분석한 결과, 마이크로캡슐 53은, 폴리머중의 에폭시기가 헥사메틸렌디아민과 반응하고, 폴리머간의 가교가 가열중에 진행되고 있는 것을 나타내는 약 90℃에서 현저한 발열피크를 보였다. 한편, 마이크로캡슐 54는, 현저한 열흐름을 보이지 않아 가교반응이 완결된 것을 나타내었다.
또한, 이들 시료를 적외흡수를 측정한 결과(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품,1720X), 마이크로캡슐 53에서는 아민(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시(약 822㎝-1에서)를 나타내는 피크가 관찰되었으나, 마이크로캡슐 54에서는 관찰되지 않았다.
이들 결과는, 곁사슬에 에폭시기를 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 가교폴리머를 얻을 수 있는 것을 나타낸다.
한편, 비교참조용으로서의 마이크로캡슐 52에 대해서도 마찬가지 평가를 행하였으나, 폴리머의 상호가교를 명백하게 나타내는 결과를 얻을 수 없었다.
(실시예 68)
200㎎의 8-[1-옥소-3-[1-(페닐메틸)피페리딘-4-일]프로필]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-1-벤즈아제핀(이하, "약물 1"이라 칭함) 및 2.0g의 실시예화합물 1의 디클로로메탄 2㎖중의 용액을 16 내지 18℃까지 냉각하고, 미리 16 내지 18℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)의 0.1%수용액 500㎖에 붓고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 o/w에멀젼을 형성하였다. 이 o/w에멀젼을 실온에서 3시간 교반하여 디클로로메탄을 증발시킴으로써 오일상을 고형화시키고, 1500rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 석출물을 증류수에 재분산시키고, 이 분산액을 또, 원심분리하여 자유 약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시켜 마이크로캡슐 55를 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 9에 표시한다. 해당 약물함량은, 마이크로캡슐 25㎎에, 60% 아세토니트릴을 함유하는 10mM 인산완충액(pH 7.0)에 용해시킨 마이크로캡슐 25㎎에 대해 HPLC법에 의해 구하였다.
(실시예 69 내지 79)
실시예 68에 있어서, 실시예화합물 2 내지 12를 사용한 이외에는 실시예 68과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 56 내지 66을 얻었다. 각 마이크로캡슐중의 약물함량을 하기 표 9에 표시한다.
(실시예 80)
50부의 상기 마이크로캡슐 66을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 67을 얻었다.
또, 상기 마이크로캡슐 67에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 67에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 67이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 81)
50부의 상기 마이크로캡슐 66을, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 68을얻었다.
또, 마이크로캡슐 68에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 68에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 68이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(비교예 3)
실시예 68에 있어서, 실시예화합물 1대신에 락트산-글리콜산공중합체(PLGA)(와코쥰야쿠사 제품, 로트번호 K1030, 락트산/글리콜산(몰비): 75/25, GPC중량평균분자량:13,000)를 이용한 이외에는 마찬가지 조건하에 실시예 68의 처리를 행하여, 마이크로캡슐 69를 얻었다. 여기서의 약물함량을 하기 표 9에 표시한다.
실시예 캡슐번호 실시예화합물 약물함량
68 55 1 12.3
69 56 2 11.2
70 57 3 11.9
71 58 4 12
72 59 5 12.5
73 60 6 10.7
74 61 7 11.2
75 62 8 11.8
76 63 9 11.3
77 64 10 12.0
78 65 11 10.8
79 66 12 11.2
80 67 12+가교 10.9
81 68 12+그라프트 10.7
비교예 3 69 PLGA 9.5
(실시예 82)
1.5g의 약물 1과 4.5g의 실시예화합물 1의 디클로로메탄 9㎖중의 용액을 16 내지 18℃까지 냉각하고, 미리 16 내지 18℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)의 0.1%수용액 500㎖에 붓고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 8000rpm에서 o/w에멀젼을 형성하였다. 이 o/w에멀젼을 실온에서 3시간 교반하여 디클로로메탄을 증발시킴으로써 오일상을 고형화시키고, 1500rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 석출물을 증류수에 재분산시키고, 이 분산액을 또, 원심분리하여 자유 약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고 동결건조하여 분체형상의 마이크로캡슐 70을 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 10에 표시한다.
(실시예 83 내지 93)
실시예 82에 있어서, 실시예화합물 2 내지 12를 사용한 이외에는 실시예 82과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 71 내지 81을 얻었다. 각 마이크로캡슐중의 약물함량을 하기 표 10에 표시한다.
(실시예 94)
실시예 80에 있어서 마이크로캡슐 81을 사용한 이외에는 마찬가지 방법으로 마이크로캡슐 82를 제조하였다. 해당 마이크로캡슐중의 약물함량을 하기 표 10에 표시한다.
(실시예 95)
실시예 81에 있어서 마이크로캡슐 81을 사용한 이외에는 마찬가지 방법으로 마이크로캡슐 83을 제조하였다. 해당 마이크로캡슐중의 약물함량을 하기 표 10에표시한다.
(비교예 4)
실시예 82에 있어서, 실시예화합물 대신에 락트산-글리콜산공중합체(PLGA)(와코쥰야쿠사 제품, 로트번호 K1030, 락트산/글리콜산(몰비): 75/25, GPC중량평균분자량:13,000)를 이용한 이외에는 마찬가지 조건하에 실시예 82의 처리를 행하여, 마이크로캡슐 84를 얻었다. 여기서의 약물함량을 하기 표 10에 표시한다.
실시예 캡슐번호 실시예화합물 약물함량
82 70 1 21.5
83 71 2 22.5
84 72 3 24.2
85 73 4 24.2
86 74 5 25.1
87 75 6 21.8
88 76 7 23.0
89 77 8 24.0
90 78 9 22.8
91 79 10 23.9
92 80 11 22.0
93 81 12 21.5
94 82 12+가교 21.4
95 83 12+그라프트 21.2
비교예 4 84 PLGA 19.5
(실시예 96)
200㎎의 약물 1의 디클로로메탄 2㎖중의 용액을 16 내지 18℃까지 냉각하고, 미리 16 내지 18℃로 냉각한 0.1%의 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품)을 함유하는 0.1M인산완충액(pH 7.0) 100㎖에 붓고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 o/w에멀젼을 형성하였다. 이 o/w에멀젼에, 정제된 효소액(1) 5㎖, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 1g 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1g을 첨가하고, 실온에서 3시간 온화하게 교반하여, PHA합성과 디클로로메탄의 증발을 행함으로써 오일상을 고형화시키고, 1500rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 석출물을 증류수에 재분산시키고, 이 분산액을 또, 원심분리하여 자유 약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고 동결건조하여 분체형상의 마이크로캡슐 85를 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 11에 표시한다. 약물함량은, 아세토니트릴 60%를 함유하는 인산완충액(pH 7.0) 10㎖에 용해시킨 마이크로캡슐 25㎎에 대해 HPLC법에 의해 구하엿다.
제조한 마이크로캡슐 85를, 클로로포름 20㎖에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHB를 추출하였다. 해당 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHA모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, 캡슐 85의 외피는, 얻어진 크로마토그램에서의 주피크가, 하이드록시부티르산의 표준메틸화화합물과 동일한 체류시간을 지녔으므로 PHB인 것으로 확인되었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=78,0000이었다.
(실시예 97)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(1)을 사용한 이외에는 실시예 96과동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 86을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
실시예 96에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 86의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 86에 함유된 PHA의 수평균분자량은 75,000이었다.
(실시예 98)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 87을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
실시예 96에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 87의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 87에 함유된 PHA의 수평균분자량은 74,000이었다.
(실시예 99)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 88을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
실시예 96에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 88의 외피의 주성분은 하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 88에 함유된 PHA의 수평균분자량은 25,000이었다.
(실시예 100)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시킨 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 89를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
실시예 96에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 89의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 89에 함유된 PHA의 수평균분자량은 22,000이었다.
(실시예 101)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성된 3-페녹시프로판올과 브로모아세트산 에틸을 출발물질로 해서, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 90을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
실시예 96에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 마이크로캡슐 90의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 90에 함유된 PHA의 수평균분자량은 24,000이었다.
(실시예 102)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 1g의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 96과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 마이크로캡슐 91을 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바,캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 시간에 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 약물 1이 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)으로 덮여 있고, 또, 그 위에 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐 91에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 103)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 1g대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 0.8g과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 0.2g(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 96과 동일한 조건하에 실시예 96의 처리를 행한 결과, 마이크로캡슐 92를 얻었다. 이러한 마이크로캡슐중의 약물 함량을 하기 표 11에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 캡슐 92의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 75%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 25%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 마이크로캡슐92에 함유된 PHA의 수평균분자량은 20,000이었다.
(실시예 104)
50부의 상기 마이크로캡슐 92를, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 마이크로캡슐 93을 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 93에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 93에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 마이크로캡슐 93이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 105)
50부의 상기 마이크로캡슐 92를, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 94를 얻었다. 이 마이크로캡슐중의 펩티드 A의 함량을 하기 표 11에 표시한다.
또, 마이크로캡슐 94에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 마이크로캡슐 94에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 마이크로캡슐 94가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 캡슐번호 약물함량(%)
96 85 12.2
97 86 12.8
98 87 11.9
99 88 13.3
100 89 13.1
101 90 13.8
102 91 14.0
103 92 13.2
104 93 12.8
105 94 12.5
(실험예 10)
실시예 93에서 얻어진 68㎎의 마이크로캡슐 81(30㎎/㎏체중에 상당함)을 분산매체(2.5㎎의 카르복시메틸셀룰로스 , 1.0㎎의 폴리소르베이트 및 25.0㎎의 만니톨을 용해시킨 증류수) 0.5㎖에 분산시키고, 10주된 수컷 SD쥐의 등에 주사바늘 22G로 피하주사를 놓았다. 투여후 매 소정 시간간격으로 쥐가 죽었고, 투여부위에 남아있는 마이크로캡슐을 채취하여 그 안의 약물의 양을 구하였다. 그 결과를 하기 표 12에 표시한다.
(실험예 11 내지 15 및 비교실험예 2)
실험예 10에 있어서 마이크로캡슐 82, 83, 84, 92, 93 및 94를 각각 30㎎/㎏체중에 상당하는 양으로 이용한 이외에는 실험예 10과 마찬가지 조건하에 처리를 행하고, 시간경과에 따른 잔류약물을 분석하였다. 그 잔류율을 하기 표 12에 표시한다.
실험예 마이크로캡슐 투여후 시간경과(주)에 따른 잔류율
1 2 3 4
10 81 87.3 59.2 10.7 2.4
11 82 91.1 68.3 23.2 8.7
12 83 88.4 62.1 13.2 4.1
13 92 88.8 62.2 12.3 3.4
14 93 90.1 66.0 25.1 9.9
15 94 86.7 61.4 15.2 4.9
비교실험예 2 84 85.2 58.2 6.2 0.5
(실시예 106)
2.0g의 실시예화합물 1을 염화메틸렌 20㎖에 용해시키고, 진탕교반하여 w/o에멀젼을 얻었다. 다음에, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의해 교반하, w/o에멀젼 32㎖를 폴리비닐알콜의 1w/v%수용액 200㎖에 부어 w/o/w에멀젼을 얻었다. 이 w/o/w에멀젼을 6시간 교반하여 염화메틸렌을 증발시킴으로써 w/o에멀젼중의 실시예화합물 1을 고형화시켰다. 미립자를 원심분리에 의해 회수하고 냉순수로 세정한 후, 트윈 80의 0.1%수용액에 재분산시키고, 동결건조하여 분체형상의 중공의 마이크로캡슐 1을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 1로 초음파 콘트라스트매체 1을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 13에 표시한다.
(실시예 107 내지 117)
w/o에멀젼의 제조시 폴리머로서 실시예화합물 2 내지 12를 이용하여 오일상중에 용해시킨 이외에는, 실시예 106과 마찬가지 처리를 행하여, 미립자 분체형상의 중공의 마이크로캡슐 2 내지 12를 얻었다. 또, 이들 마이크로캡슐로부터 각각초음파 콘트라스트매체를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 13에 표시한다.
(실시예 118)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 12를, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 물을 동결건조에 의해 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 중공의 마이크로캡슐 13을 얻었다. 또, 가교된 중공의 마이크로캡슐 13을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 13을 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 13에 표시한다.
또, 중공의 마이크로캡슐 13에 대해 적외흡수를 측정하였다(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X). 그 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 중공의 마이크로캡슐 13에서는 소실되었다. 이것은, 디아민과 에폭시기의 개환부가에 의해 가교된 폴리머로 덮인 중공의 마이크로캡슐 13이, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 119)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 12를, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 중공의 마이크로캡슐 14를 얻고, 또, 표면상에 폴리실록산그라프트사슬에 의해 변성된 중공의 마이크로캡슐 14를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 14를 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 13에 표시한다.
또, 중공의 마이크로캡슐 14에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 중공의 마이크로캡슐 14에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 중공의 마이크로캡슐 14가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산을 반응시킴으로써 에폭시기와 아미노기의 개환부가에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(비교예 5)
w/o에멀젼제조시 폴리머로서 폴리DL락트산(수평균분자량 7000)을 이용해서 오일상에 용해시킨 이외에는 실시예 106과 동일한 조건하에 처리를 행하여 중공의 마이크로캡슐 15를 얻었고, 또, 폴리DL락트산으로 이루어진 중공의 마이크로캡슐 15를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 15를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 13에 표시한다.
실시예 중공의 캡슐번호 실시예화합물 평균입자크기(㎛) 구멍
106 1 1 6.7 없음
107 2 2 7.1 없음
108 3 3 7.3 없음
109 4 4 6.8 없음
110 5 5 7.2 없음
111 6 6 7.2 없음
112 7 7 6.9 없음
113 8 8 7.5 없음
114 9 9 7.4 없음
115 10 10 7.3 없음
116 11 11 7.1 없음
117 12 12 7.4 없음
118 13 12+가교 7.5 없음
119 14 12+그라프트 7.7 없음
비교예5 15 PLGA 6.2 있음
구멍: 이것은, 구멍이 건조조작중에 내부상에서의 물 혹은 유기용매의 증발에 의해 외피에 형성되었는 지의 여부를 나타냄.
(실시예 120)
정제효소액(1) 0.6㎖, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 300㎎ 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 12㎎을 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 12㎖에 용해시킨 수용액을, 염화메틸렌 20㎖에 첨가하고, 얻어진 용액을 진탕교반하여 w/o에멀젼을 얻었다. 내부 수상의 직경을, 초음파 조사에 의해 축소시켰다. 다음에, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의한 교반하에, 폴리비닐알콜 1w/v%의 수요액 200㎖에 상기 w/o에멀젼 32㎖를 부어 w/o/w에멀젼을 얻었다. 이 w/o/w에멀젼을 6시간 교반하여 PHA를 합성하고, 또, 염화메틸렌을 증발시킴으로써 w/o에멀젼중의 실시예화합물 1을 고형화시켰다. 미립자를 원심분리에 의해 회수하고 냉순수로 세정한 후, 트윈 80의 0.1%수용액에 재분산시키고, 동결건조하여 분체형상의 중공의 마이크로캡슐 16을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 16으로 초음파 콘트라스트매체 16을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
상기 중공의 마이크로캡슐 16을 클로로포름 20㎖에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHB를 추출하였다. 이 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHB모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, 중공의 마이크로캡슐 16의 외피의 주성분은, 얻어진 크로마토그램에서의 주성분의 피크가 표준 하이드록시부티르산의 메틸화 화합물의 것과 동일한 체류시간을 지녔으므로, PHB인 것으로 확인되었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 컬럼온도: 40℃, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=72,000었다.
(실시예 121)
정제된 효소액(1)대신에 KK01균주로부터 유래된 조제의 효소액(1)을 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 17을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 17을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 17을 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
실시예 120에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 17의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 17에 함유된 PHA의 수평균분자량은 73,000이었다.
(실시예 122)
정제된 효소액(1)대신에 TL2균주로부터 유래된 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 18을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 18을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 18을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
실시예 120에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 18의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 18에 함유된 PHA의 수평균분자량은 72,000이었다.
(실시예 123)
정제된 효소액(1)대신에 재조합 PHA신타제의 정제효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 19를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 19를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 19를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
실시예 120에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 19의 외피의 주성분은 3-하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 19에 함유된 PHA의 수평균분자량은 25,000이었다.
(실시예 124)
정제된 효소액(1)대신에 재조합 PHA신타제의 정제 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시킨 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 20을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 20을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 20을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
실시예 120에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 20의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 20에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 125)
정제된 효소액(1)대신에 재조합 PHA신타제의 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성된 3-페녹시프로판올과 브로모아세트산 에틸을 출발물질로 해서, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 21을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 21을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 21을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
실시예 120에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 21의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 21에 함유된 PHA의 수평균분자량은 22,000이었다.
(실시예 126)
정제된 효소액(1)대신에 P91균주로부터 유래된 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 1g의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 120과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 중공의 마이크로캡슐 22를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 22를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 22를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 깊이로 스퍼터링이 진행한 경우 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 초기 효소반응에 의해 생성된 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)이, 후기단계에서의 효소반응에 의해 생성된 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 22에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 127)
정제된 효소액(1)대신에 YN2균주로부터 유래된 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 300㎎대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 240㎎과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 60㎎(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 120과 동일한 조건하에 실시예 120의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 23을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 23을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 23을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 23의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 77%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 23%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 23에 함유된 PHA의 수평균분자량은 25,000이었다.
(실시예 128)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 23을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 중공의 마이크로캡슐 24를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 24를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 24를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 24에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 24에서는 소실되었다. 이것은, 다아민과 에폭시기의 개환부가에 의해 가교된 폴리머로 덮인 중공의 마이크로캡슐 24가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 129)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 23을, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 중공의 마이크로캡슐 25를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 25를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 25를 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 14에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 25에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 25에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬에 의해 화학변성된 중공의 마이크로캡슐 25가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 중공의 캡슐번호 평균입자크기 구멍
120 16 6.7 없음
121 17 6.9 없음
122 18 7.1 없음
123 19 7.8 없음
124 20 7.4 없음
125 21 6.9 없음
126 22 7.5 없음
127 23 7.2 없음
128 24 7.4 없음
129 25 7.3 없음
(실시예 130)
염화메틸렌 20㎖를 순수 12㎖에 첨가하고, 진탕교반하여 w/o에멀젼을 얻었다. 다음에, 소형 균질화기(키네마티카사 제품)에 의해 교반하, w/o에멀젼 32㎖를 폴리비닐알콜 1w/v%, 정제효소액(1) 5㎖, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 1g 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 100㎎을 함유하는 0.1M 인산완충액(pH 7.0) 100㎖에 부어 w/o/w에멀젼을 얻었다. 이 w/o/w에멀젼을 6시간교반하여 PHA를 합성하고, 또, 염화메틸렌을 증발시킴으로써 생성된 PHA를 고형화시키고 마이크로캡슐미립자를 제조하였다. 이 미립자를 원심분리에 의해 회수하고 냉순수로 세정한 후, 트윈 80의 0.1%수용액에 재분산시키고, 동결건조하여 분체형상의 중공의 마이크로캡슐 26을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 26으로 초음파 콘트라스트매체 26을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
상기 중공의 마이크로캡슐 26을 클로로포름 20㎖에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHB를 추출하였다. 이 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHB모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, 중공의 마이크로캡슐 26의 외피는, 얻어진 크로마토그램에서의 주피크가 표준 하이드록시부티르산의 메틸화 화합물의 것과 동일한 체류시간을 지녔으므로, PHB인 것으로 확인되었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=71,000었다.
(실시예 131)
정제된 효소액(1)대신에 KK01균주로부터 유래된 조제의 효소액(1)을 사용한이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 27을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 27을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 27을 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
실시예 130에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 27의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 27에 함유된 PHA의 수평균분자량은 76,000이었다.
(실시예 132)
정제된 효소액(1)대신에 TL2균주로부터 유래된 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 28을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 28을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 28을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
실시예 130에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 28의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 28에 함유된 PHA의 수평균분자량은 75,000이었다.
(실시예 133)
정제된 효소액(1)대신에 TL2균주로부터 유래된 조제의 효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 29를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 29를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 29를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
실시예 130에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 29의 외피의 주성분은 3-하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 29에 함유된 PHA의 수평균분자량은 25,000이었다.
(실시예 134)
정제된 효소액(1)대신에 P91균주로부터 유래된 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시킨 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 30을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 30을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 30을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
실시예 130에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 30의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 30에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 135)
정제된 효소액(1)대신에 P91균주로부터 유래된 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성된 3-페녹시프로판올과 브로모아세트산 에틸을 출발물질로 해서, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 31을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 31을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 31을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
실시예 130에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 31의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 31에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 136)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 1g의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 130과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 중공의 마이크로캡슐 32를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 32를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 32를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 지점에서 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 초기에 생성된 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)이, 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 32에 함유된 PHA의 수평균분자량은 22,000이었다.
(실시예 137)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 1g대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 800㎎과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 200㎎(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 130과 동일한 조건하에 실시예 130의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 33을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 33을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 33을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 33의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 76%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 24%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 33에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 138)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 33을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 중공의 마이크로캡슐 34를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 34를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 34를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 34에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 34에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 중공의 마이크로캡슐 34가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 139)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 33을, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 중공의 마이크로캡슐 35를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 35를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 35를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 15에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 35에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 35에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬에 의해 화학변성된 중공의 마이크로캡슐 35가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 중공의 캡슐번호 평균입자크기(㎛) 구멍
130 26 6.8 없음
131 27 6.9 없음
132 28 7.3 없음
133 29 8.1 없음
134 30 7.7 없음
135 31 7.5 없음
136 32 7.7 없음
137 33 7.5 없음
138 34 7.7 없음
139 35 7.7 없음
(실시예 140)
디클로로메탄 2㎖를 16 내지 18℃까지 냉각하고, 미리 16 내지 18℃로 냉각한 폴리비닐알콜(EG-40, 닛뽄 합성화학사 제품) 0.1%를 함유하는 0.1M인산완충액(pH 7.0)에 붓고, 터빈형 호모믹서(토쿠슈키카사 제품)로 7000rpm에서 o/w에멀젼을 형성하였다. 이 o/w에멀젼에, 정제효소액(1) 5㎖, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA(시그마알드리치재팬사 제품) 1g 및 소혈청알부민(시그마사 제품) 0.1g을 첨가하고, 실온에서 3시간 온화하게 교반하여 PHA합성과 디클로로메탄의 증발을 행함으로써 오일상을 고형화시키고, 1500rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 석출물을 증류수에 재분산시키고, 이 분산액을 또, 원심분리하여 자유 약물을 제거하였다. 얻어진 마이크로캡슐을 소량의 증류수에 재분산시키고 동결건조하여 분체형상의 중공의 마이크로캡슐 36을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 36으로 초음파 콘트라스트매체 36을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
상기 중공의 마이크로캡슐 36을 클로로포름 20㎖에 현탁시키고, 60℃에서 20시간 교반하여 외피를 구성하는 PHB를 추출하였다. 이 추출물을 구멍직경이 0.45㎛인 멤브레인필터로 여과한 후, 감압하 회전증발기에서 농축시키고 나서, 종래의 방법에 의해 메탄올리시스를 행하고, 가스크로마토그래피-질량분광분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)에 의해 분석하여 PHB모노머유닛의 메틸에스테르화합물을 동정하였다. 그 결과, 중공의 마이크로캡슐 36의 외피는, 얻어진 크로마토그램에서의 주피크가 표준 하이드록시부티르산의 메틸화 화합물의 것과 동일한 체류시간을 지녔으므로, PHB인 것으로 확인되었다.
또, PHA의 분자량을 겔투과크로마토그래피(GPC; 토소, HLC-8020, 컬럼: 폴리머래보래토리, PL겔-MIXED-C(5㎛), 용매: 클로로포름, 폴리스티렌환산)에 의해 평가한 바, Mn=75,000었다.
(실시예 141)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(1)을 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 37을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 37을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 37을 제작하였다. 광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
실시예 140에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 37의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 37에 함유된 PHA의 수평균분자량은 73,000이었다.
(실시예 142)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 38을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 38을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 38을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
실시예 140에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 38의 외피의 주성분은 PHB인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 38에 함유된 PHA의 수평균분자량은71,000이었다.
(실시예 143)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(2)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에 (R)-3-하이드록시옥타노일 CoA(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 39를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 39를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 39를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
실시예 140에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 39의 외피의 주성분은 3-하이드록시옥탄산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 39에 함유된 PHA의 수평균분자량은 23,000이었다.
(실시예 144)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화시킨 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 40을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 40을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 40을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
실시예 140에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 40의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 40에 함유된 PHA의 수평균분자량은 20,000이었다.
(실시예 145)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(3)을 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA(J. Org. Chem., 55, 1490-1492(1990)에 따라 합성된 3-페녹시프로판올과 브로모아세트산 에틸을 출발물질로 해서, 아연계 레호르마트스키(Reformatsky)반응에 의해 얻어진 3-하이드록시-5-페닐발레르산에스테르를 수화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)를 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 41을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 41을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 41을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
실시예 140에서와 마찬가지로 평가한 결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 41의 외피의 주성분은 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA인 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 41에 함유된 PHA의 수평균분자량은 24,000이었다.
(실시예 146)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(4)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA를 이용해서 PHA합성반응을 개시한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행하였다. 반응은, 실온에서 1시간 행하였고, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 1g의 첨가후, 실온에서 2시간 반응을 더욱 행하였다. 그후, 실시예 140과 마찬가지 조건하에 처리를 행하여 중공의 마이크로캡슐 42를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 42를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 42를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
캡슐구성체의 표면상에 형성된 폴리머의 질량을, TOF-SIMS(time fo flight secondary ion mass spectrometer) IV(카메카사 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 질량스펙트럼을 확인한 바, 캡슐구성체의 표면상의 PHA는, 주로 3-하이드록시-5-페녹시발레르산 유닛으로 이루어져 있었다. 또, 마찬가지의 TOF-SIMS질량스펙트럼측정시, 이온스퍼터링에 의해 캡슐구조체의 표면을 점차로 스크레이핑한 바, 캡슐구조체를 구성하는 PHA의 주성분이 소정 지점에서 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛으로 변화된 것이 확인되었다. 이들 결과, 본 실시예의 캡슐구조체는, 초기에 생성된 폴리(3-하이드록시-5-페닐발레르산)이, 후기에 생성된 폴리(3-하이드록시-5-페녹시발레르산)으로 덮여 있는 것으로 확인되었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 42에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 147)
정제된 효소액(1)대신에 조제의 효소액(5)를 사용하고, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 1g대신에, (R,S)-3-하이드록시-5-페닐발레릴 CoA 800㎎과 (R,S)-3-하이드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA 200㎎(Int. J. Biol. Macromol., 12, 85-91(1990)에 기재된 방법에 따라 3-하이드록시-7-옥텐산을 합성한 후, 그 불포화부분을 3-클로로벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재된 방법에 따라 제조함)을 사용한 이외에는 실시예 140과 동일한 조건하에 실시예 140의 처리를 행한 결과, 중공의 마이크로캡슐 43을 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 43을 이용해서 초음파 콘트라스트매체 43을 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
1H-NMR분석(장치: FT-NMR(브루커(Bruker) DPX 400); 측정핵종:1H; 용매: TMS봉입된 CDCl3)결과, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 43의 외피는, 3-하이드록시-5-페닐발레르산유닛 75%와, 3-하이드록시-7,8-에폭시옥탄산유닛 25%로 이루어진 PHA인 것을 나타내었다. 또, 겔투과크로마토그래피에 의한 분석에 의거한 바, 얻어진 중공의 마이크로캡슐 43에 함유된 PHA의 수평균분자량은 21,000이었다.
(실시예 148)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 43을, 순수 50부에 현탁시키고, 해당 현탁액중에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5부를 용해시켰다. 용해를 확인한 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 혼합물을 70℃에서 12시간 반응시켜 중공의 마이크로캡슐 44를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 44를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 44를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 44에 대해 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X)를 측정한 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 44에서는 소실되었다. 이것은, 가교폴리머로 덮인 중공의 마이크로캡슐 44가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
(실시예 149)
50부의 상기 중공의 마이크로캡슐 43을, 말단아미노기변성 폴리실록산(변성실리콘오일 TSF4700, GE-토시바실리콘사 제품) 10부에 첨가하고, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 이 반응생성물을, 메탄올중에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분)를 반복하고 세정건조하여 폴리실록산그라프트사슬을 지닌 중공의 마이크로캡슐 45를 얻었다. 또, 이 중공의 마이크로캡슐 45를 이용해서 초음파 콘트라스트매체 45를 제작하였다.
광학현미경 및 전자현미경하의 중공의 마이크로캡슐의 관찰결과를 하기 표 16에 표시한다.
또, 상기 중공의 마이크로캡슐 45에 대해 측정한 적외흡수(FT-IR: 퍼킨엘머사 제품, 1720X) 결과, 가열전에 관찰된 아민피크(약 3340㎝-1에서) 및 에폭시피크(약 822㎝-1에서)가 해당 중공의 마이크로캡슐 45에서는 소실되었다. 이 결과는, 폴리실록산그라프트사슬에 의해 화학변성된 중공의 마이크로캡슐 45가, 곁사슬에 에폭시유닛을 지닌 PHA와 말단아미노기변성 폴리실록산과의 반응에 의해 얻어진 것을 나타낸다.
실시예 중공의 캡슐번호 평균입자크기(㎛) 구멍
140 36 6.9 없음
141 37 6.9 없음
142 38 7.1 없음
143 39 7.4 없음
144 40 7.5 없음
145 41 7.5 없음
146 42 7.3 없음
147 43 7.7 없음
148 44 7.8 없음
149 45 7.7 없음
(실험예 16) 초음파 콘트라스트효과의 in vitro 시험
도 1에 표시한 시험장치에 의해, 중공의 마이크로캡슐을 이용한 초음파 콘트라스트매체의 초음파 콘트라스트효과를 검사하였다. 생리식염수 100㎖를 함유하는 폴리프로필렌용기(1)를 수조(2)에 고정시키고, 해당 용기(1)내에 교반봉(3)을설치하여 자기교반기를 이용해서 내용물의 교반을 행하였다. 상기 각 실시예 및 비교예에서 얻어진 중공의 마이크로캡슐입자를, 수개의 농도로 1w/v% 트윈 80수용액 1㎖에 현탁시키고, 상기 용기(1)속의 생리식염수에 부었다. 다음에, 중심주파수 5㎒의 섹터프로브가 장비된 초음파화상진단장치(소노레이어 αSSH-140, 토시바사 제푸)를 이용해서, 해당 용기(1)를 화상의 중앙에 위치시키는 방식으로 주사조작을 행하였다. 다음에, 콘트라스트가 향상된 화상의 정지상태에서, 상기 용기(1)의 정면 혹은 해당 용기(1)의 전체에서 밝은 점의 휘도를 초음파 콘트라스트효과의 인덱스로 하였다.
농도가 다른 실시예 117 내지 119, 127 내지 129, 137 내지 139, 147 내지 149 및 비교예 5에서 얻어진 마이크로캡슐미립자를 이용한 초음파 콘트라스트매체 12 내지 14, 23 내지 25, 33 내지 35, 43 내지 45 및 15의 각각의 용액 1㎖를, 상기 생리식염수 100㎖에 가하여 상이한 현탁농도를 부여하고, 용기(1)의 정면상의 밝은 점의 시간에 따른 변화를 검사하였다.
그 결과, 초음파 콘트라스트매체 12 내지 14, 23 내지 25, 33 내지 35 및 43 내지 45의 어느 것에 대해서도, 밝은 점의 평균초기휘도는, 첨가량이 20㎎을 초과하지 않은 경우 25 내지 30의 범위내에서 일정하였다. 한편, 시간에 따른 감쇠율은, 첨가량(현탁농도)에 따라 달라, 현탁농도가 낮을 수록 감쇠율이 높다. 예를 들면, 첨가량이 5 또는 2.5㎎인 경우, 밝은 점의 평균휘도는 주입후 약 5분에 20미만으로 되었으나, 첨가량이 10 또는 20㎎인 경우에는, 밝은 점의 평균휘도가 주입으로부터 30분후에도 20이상이었다.
한편, 중공의 마이크로캡슐입자의 첨가량이 40㎎이상이면, 초기음파차폐를 보였고, 밝은 점의 초기휘도가 10 또는 20㎎ 첨가한 경우보다도 낮은 약 23이었으나, 주입후 분산이 진행됨에 따라 밝은 점의 휘도가 시간경과에 따라 증대되어, 약 10분에 28정도에 도달했다. 그 후, 밝은 점의 고휘도는, 입자의 고현탁농도(80㎎) 동안에는 유지되거나, 점차로 낮은 현탁농도(40㎎)에서는 점차로 감쇠되지만, 밝은 점의 평균휘도는, 어느 농도에서도, 밝은 점의 휘도가 피크에 도달한 이우 30분이 지나도 25이상이었다.
따라서, 본 발명의 중공의 PHA마이크로캡슐을 물 1㎖당 현탁농도 10㎎이상에서 사용되는 초음파 콘트라스트매체로 제조함으로써, 높은 콘트라스트효과를 장기간 유지할 수 있다.
한편, 폴리-DL-락트산(평균분자량 70000)으로 제조한 중공의 마이크로캡슐 15를 이용한 초음파 콘트라스트매체 15에 있어서는, 어떠한 현탁농도에서도, 밝은 점의 평균휘도가 초기에 20이상이었으나, 그 후, 5분후 및 약 10분후 10이하로 급속히 감쇠되었으므로, 본 발명의 초음파 콘트라스트매체에 비해서 주입후의 콘트라스트효과의 연속성이 열등하였다.
이상, 본 발명에 의하면, 고도의 기능성 폴리머화합물을 이용한 마이크로캡슐과 같은 입상 구조체 및 그 제조방법, 그리고, 생물공학적 프로세스에 의해 마이크로캡슐 등의 입상 구조체를 제조하는 방법을 제공하는 것이 가능하다.
또, 본 발명에 의하면, 폴리하이드록시알카노에이트의 구조를 최적화함으로써 서방성과 약물보유능력을 최적화하여, 친수성 약물, 기타 수용성 물질, 친유성(oleophilic) 약물 혹은 기타 소수성 물질에 대해서도 서방성을 제어가능하고, 보유능력이 우수한 약물보유입자를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 의하면, 내부에 안료, 염료, 농약성분, 헤모글로빈, 화장품성분 혹은 비료성분을 함유하는 입상 구조체 및 그 제조방법을 제한된다. 또한, 이러한 입상 구조체를 함유하는 잉크조성물, 농약조성물, 혈액세포성분, 화장품조성물 혹은 비료조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이 가능하다..
나아가서는, 본 발명에 의하면, 미립자중에 많은 기포를 함유시키기 위해, 1개의 PHA멤브레인을 지닌 마이크로캡슐형상의 중공 구조를 지닌 미립자를 선택적으로 얻을 수 있는 중공의 마이크로캡슐과 같은 중공의 입상 구조체의 제조방법과, 아울러, 중공의 마이크로캡슐과 같은 중공의 입상 구조체를 이용해서 높은 콘트라스트효과를 발휘하는 초음파 콘트라스트매체를 제공하는 것이 가능하다. 보다 구체적으로는, 심근, 심장공동(심장강) 및 간의 초음파진단이나 검사에 이용가능한 높은 콘트라스트효과의 초음파콘트라스트매체를 제공하는 것이 가능하다.

Claims (60)

  1. 폴리하이드록시알카노에이트를 함유해서 제 1고상을 구성하는 외부상과;
    상기 외부상에 편입된 내부상을 구비한 입상 구조체에 있어서,
    상기 내부상이 제 2고상, 액상 혹은 기상의 적어도 하나의 상인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  2. 제 1항에 있어서, 셸내에 코어부를 편입시킨 형태의 마이크로캡슐을 지니고, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 상기 셸내에 함유되어 있고, 상기 코어부에는 상기 내부상의 적어도 하나의 상이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 하기 화학식[1] 내지 [10]으로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 모노모유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 입상 구조체:
    [화학식[1]]
    (식중, R1 및 a는 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 조합의 군으로부터 선택된 것임:
    (1) R1은, 수소원자(H)이고, a는 0 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (2) R1은, 할로겐원자이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (3) R1은, 크로모포(chromophore)이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (4) R1은,
    이고, a는 1 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[2]]
    (식중, b는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[3]]
    (식중, c는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[4]]
    (식중, d는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[5]]
    (식중, e는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[6]]
    (식중, f는 0 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[7]]
    (식중, g는 1 내지 8의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[8]]
    [식중, h는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R6은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[9]]
    [식중, i는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[10]]
    (식중, j는 1 내지 9의 어느 하나의 정수임).
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 수평균분자량이 5,000 내지 1,000,000인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 모노모유닛조성이 상기 입상 구조체의 안쪽으로부터 바깥쪽 방향으로 변화하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부가 화학적으로 변성되어 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 화학적으로 변성된 폴리하이드록시알카노에이트가 적어도 그라프트사슬을 지닌 폴리하이드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 그라프트사슬은, 적어도 에폭시기를 지닌 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트의 화학적 변성에 의해 도입되는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 그라프트사슬이 아미노기를 지닌 화합물로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 아미노기를 지닌 화합물이 말단 아미노변성 화합물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 말단 아미노변성 화합물이 폴리비닐아민, 폴리에틸렌이민 및 말단 아미노변성 폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  12. 제 6항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부가 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 가교된 폴리하이드록시알카노에이트는, 적어도 에폭시기를 지닌 모노머유닛을 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트를 가교시킴으로써 형성된 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 가교된 폴리하이드록시알카노에이트는, 디아민화합물, 무수숙신산, 2-에틸-4-이미다졸 및 전자선조사로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나에 의해 가교된 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 디아민화합물이 헥사메틸렌디아민인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  16. 폴리하이드록시알카노에이트를 함유하는 오일상과 유기용매를 준비하는 공정과;
    상기 오일상으로부터 상기 유기상 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비함으로써;
    상기 오일상으로부터 유래된 고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상을 함유하는 입상 구조체를 제조하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 오일상과 수상으로부터 에멀젼을 제조하는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 오일상에 상기 수상을 분산시켜 w/o에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 오일상에 상기 수상을 분산시켜 w/o에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o에멀젼을 제 2의 수상에 분산시켜 w/o/w에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o/w에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  20. 제 17에 있어서, 상기 수상에 상기 오일상을 분산시켜 o/w에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 o/w에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  21. 제 16항에 있어서, 상기 물의 제거는, 액중건조, 상분리 및 분무건조의 적어도 한가지 방법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  22. 제 16항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 하기 화학식[1] 내지 [10]으로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 모노모유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법:
    [화학식[1]]
    (식중, R1 및 a는 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 조합의 군으로부터 선택된 것임:
    (1) R1은, 수소원자(H)이고, a는 0 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (2) R1은, 할로겐원자이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (3) R1은, 크로모포어(chromophore)이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (4) R1은,
    이고, a는 1 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[2]]
    (식중, b는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[3]]
    (식중, c는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[4]]
    (식중, d는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[5]]
    (식중, e는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[6]]
    (식중, f는 0 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[7]]
    (식중, g는 1 내지 8의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[8]]
    [식중, h는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R6은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[9]]
    [식중, i는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[10]]
    (식중, j는 1 내지 9의 어느 하나의 정수임).
  23. 제 16항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는, 해당 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능력을 지닌 미생물을 이용해서 생산된 것을 특징으로 하는입상 구조체의 제조방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는, 해당 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능력에 관여하는 유전자가 도입되어 있는 형질전환체에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 유전자는 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능력을 지닌 미생물로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능력을 지닌 미생물은, 적어도 슈도모나스속(Pseudomonassp.), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.), 랄스토니아속(Ralstoniasp.) 및 알칼리게네스속(Alcaligenessp.)의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 슈도모나스속(Pseudomonassp.), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.), 랄스토니아속(Ralstoniasp.) 또는 알칼리게네스속(Alcaligenessp.)에 속하는 미생물이, 적어도 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii)YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01(FERM BP-4235), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK3(FERM P-17370), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK4(FERM P-17371), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64(FERM BP-6933) 및 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) TL2(FERM P-14642)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 생산능력을 지닌 형질전환체의 숙주미생물이 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  29. 폴리하이드록시알카노에이트 신타제와 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 함유하는 수상을 준비하는 공정과;
    상기 수상과 오일상에 의한 에멀젼을 제조하는 공정과;
    3-하이드록시아실 코엔자임 A을 폴리하이드록시알카노에이트 신타제에 의해 중합하여 폴리하이드록시알카노에이트를 합성하는 공정과;
    유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비함으로써;
    고상, 액상 및 기상의 적어도 1개의 상을 함유하는 입상 구조체를 제조하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 오일상에 상기 수상을 분산시켜 w/o에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 오일상에 제 1수상을 분산시켜 w/o에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o에멀젼을 제 2의 수상에 분산시켜 w/o/w에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 w/o/w에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한
    것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 제 1수상이 폴리하이드록시알카노에이트 신타제와 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 제 2수상이 폴리하이드록시알카노에이트 신타제와 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2수상이 폴리하이드록시알카노에이트 신타제와 3-하이드록시아실 코엔자임 A를 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  35. 제 29항에 있어서, 상기 수상에 상기 오일상을 분산시켜 o/w에멀젼을 제조하는 공정과;
    상기 o/w에멀젼으로부터 유기용매 및/또는 물을 제거하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  36. 제 29항에 있어서, 상기 물의 제거는, 액중건조, 상분리 및 분무건조의 적어도 한가지 수법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  37. 제 29항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 하기 화학식[1] 내지 [10]으로 표시되는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 모노모유닛을 함유하고, 상기 3-하이드록시아실 코엔자임 A는 각각 하기 화학식[11] 내지 [20]으로 표시되는 대응하는 구조를 지니는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법:
    [화학식[1]]
    (식중, R1 및 a는 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 조합의 군으로부터 선택된 것임:
    (1) R1은, 수소원자(H)이고, a는 0 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (2) R1은, 할로겐원자이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (3) R1은, 크로모포어(chromophore)이고, a는 1 내지 10의 어느 하나의 정수임;
    (4) R1은,
    이고, a는 1 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[2]]
    (식중, b는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[3]]
    (식중, c는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R3은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[4]]
    (식중, d는 0 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5및 -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[5]]
    (식중, e는 1 내지 8의 어느 하나의 정수이고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5및 -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임);
    [화학식[6]]
    (식중, f는 0 내지 7의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[7]]
    (식중, g는 1 내지 8의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[8]]
    [식중, h는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R6은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2및 -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[9]]
    [식중, i는 1 내지 7의 어느 하나의 정수이고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR' 및 -SO2R"로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임(단, R'는수소원자(H), Na, K, -CH3및 -C2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기이고, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3및 -OC2H5로 이루어진 군으로부터 선택된 기임)];
    [화학식[10]]
    (식중, j는 1 내지 9의 어느 하나의 정수임);
    [화학식[11]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R1 및 a는 상기 화학식[1]에서와 마찬가지임);
    [화학식[12]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R2 및 b는 상기 화학식[2]에서와 마찬가지임);
    [화학식[13]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R3 및 c는 상기 화학식[3]에서와 마찬가지임);
    [화학식[14]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R4 및 d는 상기 화학식[4]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[15]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R5 및 e는 상기 화학식[5]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[16]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, f는 상기 화학식[6]으로표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[17]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, g는 상기 화학식[7]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[18]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R6 및 h는 상기 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[19]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, R7 및 i는 상기 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임);
    [화학식[20]]
    (식중, -SCoA는 알칸산에 결합된 코엔자임 A를 나타내고, j는 상기 화학식[10]로 표시되는 모노머유닛의 것과 마찬가지임).
  38. 제 29항에 있어서, 상기 3-하이드록시아실 코엔자임 A의 조성물은, 상기 입상 구조체의 안쪽으로부터 바깥쪽 방향으로 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 모노머유닛조성이 변하도록 경시변화시키는 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  39. 제 29항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트의 적어도 일부에 화학적 변성을 시키는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  40. 제 29항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제는, 해당 신타제의 생산능력을 지닌 미생물을 이용해서 생산된 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제는, 해당 신타제의 생산능력에 관여하는 유전자가 도입된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 유전자는 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제의 생산능력을 지닌 미생물로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  43. 제 40항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제의 생산능력을 지닌 미생물은, 적어도 슈도모나스속(Pseudomonassp.), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.), 랄스토니아속(Ralstoniasp.) 및 알칼리게네스속(Alcaligenessp.)의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 슈도모나스속(Pseudomonassp.), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.), 랄스토니아속(Ralstoniasp.) 또는 알칼리게네스속(Alcaligenessp.)에 속하는 미생물이, 적어도 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) P91(FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) H45(FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) YN2(FERM BP-7375), 슈도모나스 젯세니이(Pseudomonas jessenii) P161(FERM BP-7376), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) KK01(FERM BP-4235), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK3(FERM P-17370), 부르크홀데리아속(Burkholderiasp.) OK4(FERM P-17371), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) TB64(FERM BP-6933) 및 알칼리게네스속(Alcaligenessp.) TL2(FERM P-14642)로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  45. 제 41항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제의 생산능력을 지닌 형질전환체의 숙주미생물이 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 입상 구조체의 제조방법.
  46. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 약품성분인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  47. 제 46항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 약품프레파라트.
  48. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 농약성분인 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  49. 제 48항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 농약조성물.
  50. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 기상을 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 기상이 퍼플루오로카본가스로 충전되어 있는 것을특징으로 하는 입상 구조체.
  52. 제 50항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 초음파콘트라스트매체.
  53. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 적어도 염료 혹은 안료를 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  54. 제 53항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 잉크조성물.
  55. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 헤모글로빈을 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  56. 제 55항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 혈구조성물.
  57. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 화장품성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 입상 구조체.
  58. 제 57항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 화장품조성물.
  59. 제 1항에 있어서, 상기 내부상이 비료성분을 함유하는 것을 특징으로 하는입상 구조체.
  60. 제 59항에 의한 입상 구조체를 함유해서 이루어진 비료조성물.
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