JPWO2003032966A1 - グルタチオン増強用組成物 - Google Patents
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Abstract
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも１種を含有するグルタチオン増強用組成物、及び、さらにシステインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質又は酵母、ビタミン類から選ばれる少なくとも１種を含有するグルタチオン増強用組成物。
Description
技術分野
本発明は、グルタチオンの細胞内合成を促進する成分を含有する組成物に関する。また、本発明は、グルタチオン増強用；ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用；抗紫外線用及び／又は美白用；グルタチオンの細胞内合成促進による細胞傷害防御用、細胞傷害修復用；肝臓、腎臓、肺機能の改善あるいは治療用；過酸化脂質等の蓄積による疾患用；白内障用；老化の予防及び／又は治療用の各組成物、さらに、グルタチオンの細胞内合成を促進する成分を含有する医薬、皮膚外用剤、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、美容食品などの食品に関する。
背景技術
グルタチオンは生体内に幅広く分布する抗酸化物質であり、システイン、グルタミン酸及びグリシンから成るトリペプチドである。生体内の主な還元剤としてその作用部位であるＳＨ基によって種々の酸化還元的代謝による細胞防御、異物代謝、及び修復過程等に重要な役割を担っている。グルタチオンは、グルタチオンペルオキシダーゼの基質として生体内に発生した過酸化水素や過酸化脂質などの過酸化物を無毒化し、自身が酸化される事により生体内に及ぼす酸化障害（例えば上記過酸化物やフリーラジカルなど）から保護する働きがある。
酸化促進物と抗酸化能の機構間の均衡が前者優位となったときに、その酸化的ストレスが生じる。そして過剰な酸化ストレスや異物等が付加されると生体内のグルタチオンは消費枯渇し、正常な細胞の働きを維持できなくなる。グルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状としては、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、急性あるいは慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、及び生理学的な加齢に伴う老化現象、癌化などがある。
上記列挙したグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療にはグルタチオン製剤が用いられてきた。しかし、グルタチオンの経口摂取は臓器によって思うような成果が期待できない。注射剤による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等いくつかの問題を抱えていた。細胞内グルタチオン量は細胞内に存在するシステイン量に依存しているため、近年、こうした細胞内システイン量を増加させるためのＳ含有化合物が開示されてきた（特開平０１−２６５１６号公報、特開平０２−４５４２０号公報、特開平０５−３０１８１１号公報、特開平０８−３１９２４２号公報）。例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−２−オキソチアゾリジン−２−カルボン酸、グルタチオンエステル等である。しかし、こうした化合物も臓器によっては効果に十分満足できるものではなかった。
細胞内グルタチオン量を決定するもう一つの要因として、グルタミン酸とシステインを縮合させる酵素、ガンマグルタミルシステイン合成酵素の発現量及び活性が知られている。この酵素の活性及び発現量は、熱ショック、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１のようなサイトカイン、インシュリンやグルココルチコイドのようなホルモン、重金属、細胞増殖や細胞周期に関わる因子など様々な要因によって調節される。また、この酵素の遺伝子５’末端領域には、抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が存在し、抗酸化物質に対して応答する配列を持っている。詳細なメカニズムは未だ完全には明らかとされていないが、食品の抗酸化剤として用いられるブチルヒドロキシアニソールをマウスに投与しグルタチオン濃度を上昇させることでホスゲンより誘導した肺浮腫に対して予防できることが報告されている（Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃａｌ．１９９９，１１（９），８５５−８７１頁）。しかし、従来から知られるビタミンＣ、マンニトール、アミノ酸（ヒスチジン等）などの抗酸化剤やオリーブ抽出物（特開２０００−１２８７６５、特開２００１−１８１６３２、特開２００１−２６５１８）、オリーブ抽出物の加水分解物（特開平０９−７８０６１号公報）などの抗酸化剤がグルタチオン増強作用を有していることは報告されておらず、またこのような作用メカニズムにより上記列挙した疾病の予防や治療に用いられているものは具体的にはまだない。
発明の開示
グルタチオン濃度の低下を回復させることを目的として、細胞内にシステインを供給するためのＳ含有化合物を使用するという従来の技術は、グルタチオン濃度の低下をきたしていない細胞にはほとんど取り込まれないため、有為なグルタチオン生成を促すことができなかった。そのため、紫外線の曝露、喫煙、アルコール類の飲食といったグルタチオン消費が予想される場合での障害の予防、正常レベルよりグルタチオン濃度を高めることで治療が見込まれる疾病等にも十分満足な効果は得られなかった。
本発明はグルタチオンの生体内濃度を高めるものであり、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の障害、疾患に対する予防と治療、正常レベルよりグルタチオン濃度を高めることによって治療可能となる疾病等に有効であり、効果的で安全性の高いグルタチオン増強用組成物を提供することをその課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（以下ＤＰＥともいう。）にグルタチオンの細胞内合成を促進する作用があることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記組成物に関する。
１． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有するグルタチオン増強用組成物。
２． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、成いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、ガンマグルタミルシステイン合成酵素産生促進用、グルタチオン還元酵素産生促進用、及びシスチン膜輸送担体産生促進用から選ばれる少なくとも一つの用途に用いられる組成物。
３． グルタチオン増強成分として、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール又はその配糖体の少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
４． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
５． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの欠乏によって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
６． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、酸化的ストレスによって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物
７． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの細胞内合成促進による細胞傷害防御用及び／又は細胞傷害修復用組成物。
８． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肝機能改善用あるいは肝臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
９． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、腎機能改善用あるいは腎臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
１０． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
１１． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肺機能改善用あるいは肺疾患の予防用／又は治療用組成物。
１２． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、白内障の予防用及び／又は治療用組成物。
１３． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、老化の予防用及び／又は治療用組成物。
１４． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物が、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、オドリコソウ（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライト（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、ジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、プランタゴ・プシリウム（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタ、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニン（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコ（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニン（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウ（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコ（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラ（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニク（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイ（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニク（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケ（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロ（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイ（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲ（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウ（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンラン（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ）、ホオノキ（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイ（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルス（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマ（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨル（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコ（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギ（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイ（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミン（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子（Ｌｉｇｕｓｔｒｉｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラ（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）から選ばれる少なくとも１種類である、上記１、２、４〜１３のいずれかに記載の組成物。
１５． さらに、システインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質、システイン及び／又はシスチンを含む酵母、及びビタミン類から選ばれる少なくとも１種類を含有する上記１〜１４のいずれかに記載の組成物。
１６． 組成物が経口用又は非経口用である、上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１７． 組成物が、皮膚外用である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１８． 組成物が、医薬である上記１〜１７のいずれかに記載の組成物。
１９． 組成物が、食品である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
２０． 食品が、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、又は美容食品である上記１９記載の組成物。
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明により見出された有効成分である２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールは、下記化学式（１）で示される。
配糖体としては、単糖類、２糖類、３糖類などとの配糖体が挙げられ、そのような糖類を構成する糖としては、アロース、ガラクトース、グルコースなどを挙げることができる。
具体的には、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−アロピラノシド、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（２）参照）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（３）参照）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（４）参照）などを挙げることができる。
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールを天然物から得る方法としては、例えばオリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）からの抽出がある。ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物として、例えば、オドリコソウ（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライト（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、ジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、プランタゴ・プシリウム（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタ、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニン（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコ（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニン（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウ（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコ（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラ（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニク（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイ（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニク（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケ（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコ（Ｆｒａｘｉｎ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロ（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイ（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲ（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウ（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンラン（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ）、ホオノキ（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイ（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルス（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマ（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨル（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコ（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギ（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイ（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミン（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラ（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）等が挙げられる。
さらに、ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物として、次の科に属するものが挙げられる。
キンチャクソウ属ゴマノハグサ科Ｃａｌｃｅｏｌａｒｉａ ｈｙｐｅｒｉｃｉｎａ、Ｃａｌｃｅｏｌａｒｉａ ｓｐ、同クロタキカズラ科Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｓｐ、ホンオニク属ハマウツボ科Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ、クサギ属クマツヅラ科Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｊｏｈｎｓｔｏｎｉｉ、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｍｙｒｉｃｏｉｄｅｓ、ジキタリス属ゴマノハグサ科Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ ｓｓｐ、Ｄｉｇｔａｌｉｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｄｉｇｔａｌｉｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ ｓｓｐ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ、トリネコ属モクセイ科Ｆｒａｘｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ、Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｘｙｃａｒｂａ、ソケイ属モクセイ科Ｊａｓｍｉｎｕｍ ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｅ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｐｏｌｙａｎｔｈｕｍ、ラルップソウ属ラルップソウ科Ｌａｇｏｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ、メハジキ属シソ科Ｌｅｏｎｕｒｕｓ ｇｌａｕｃｅｎｓ、イボタノキ属モクセイ科Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｐｅｄｕｎｃｕｌａｒｅ、Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ、Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｓｐｐ、シシンラン属イワタバコ科Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｄｌｏｒｕｓ、ニガハッカ属シソ科Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ａｌｌｙｓｓｏｎ、ツルレイシ属ウリ科Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｂａｌｓａｍｉｎａ、ハマウツボ属ハマウツボ科Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ ａｒｅｎａｒｉａ、シオガマギク属ゴマノハグサ科Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｐｌｉｃａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｅｍｉｔｏｒｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｐｉｃａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｔｒｉａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｔｒｉａｔａ ｐａｌｌ ｓｓｐ．Ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ。
イワブクロ属ゴマノハグサ科Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｃｒａｎｄａｌｌｉｉ、オオキセワタ属シソ科Ｐｈｌｏｍｉｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ、オオバコ属オオバコ科Ｐｌａｎｔａｇｏ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｈｏｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍｙｏｓｕｒｏｓ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｓｐ、ハマクサギ属クマツヅラ科Ｐｒｅｍｎａ ｃｏｒｙｍｂｏｓａ ｖａｒ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｐｒｅｍｎａ ｓｕｂｓｅａｎｄｅｎｓ、プロスタンテラ属シソ科Ｐｒｏｓｔａｎｔｈｅｒａ ｍｅｌｉｓｓｉｆｏｌｉａ、ゴマノハグサ属ゴマノハグサ科Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａ ｎｏｄｏｓａ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａ ｓｃｏｐｏｌｉｉ、イヌゴマ属シソ科Ｓｔａｃｈｙｓ ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉａ、Ｓｔａｃｈｙｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、ハシドイ属モクセイ科Ｓｙｒｉｎｇａ ｓｐ、ニガグサ属シソ科Ｔｅｕｃｒｉｕｍ ｃｈａｍａｅｄｒｙｓ、Ｔｅｕｃｒｉｕｍ ｐｏｌｉｕｍ、モウズイカ属ゴマノハグサ科Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ、クワガタソウ属ゴマクハグサ科Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｂｅｌｌｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｆｕｈｓｉｉ、その他、シスタンチェ タブロザ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｔｕｂｕｌｏｓａ）、マルカハミア ルテア（Ｍａｒｋｈａｍｉａ ｌｕｔｅａ）、ニュウボルディア レイビス（Ｎｅｗｂｏｕｌｄｉａ ｌａｅｖｉｓ）、ニュメラス プラント（ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｓｐｐ．）、オルトカーパス デンシフローラス（Ｏｒｔｈｏｃａｒｐｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｓ（Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ））、レッジア カペンシス（Ｒｅｔｚｉａ ｃａｐｅｎｓｉｓ）、サルバドラ カルトロピス（Ｓａｌｖａｄｏｒａ ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ）、サナンゴ ラセモサム（Ｓａｎａｎｇｏ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、ストロビランタス エスピー（Ｓｔｒｏｂｉｌａｎｔｈｕｓ ｓｐ）、トリコマンス レニホーム（Ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ）。
上記した植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、及び、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などでＤＰＥ又はその配糖体を含有している部位はすべて利用可能である。
上記した植物は、そのまま、抽出物、抽出物の加水分解物、又は植物の加水分解物として使用可能である。
本発明組成物で用いるＤＰＥを天然物から得るための抽出方法としては、例えば、オリーブ葉を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、オリーブ葉を圧搾して得られる搾汁等を適当な溶媒で抽出し、場合によっては加水分解処理を施し、不溶部分を濾過等で取り除きこの液から溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いて目的物を得る方法が挙げられる。その際、バイオアッセイを並行して行い、細胞内グルタチオン活性を指標として精製を進めることが望ましい。抽出に用いる溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、１，３ブチレングリコール等のアルコール類、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒、水等が挙げられる。これら溶媒は単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。抽出条件は、特に限定されないが、例えば、温度は５〜９５℃、好ましくは１５〜８５℃で常温でも好適に抽出することが出来る。
圧力は常圧、加圧、減圧の何れでも良い。
抽出時間は選定した溶媒によっても異なるが数分〜数時間であり、反復抽出、振とう抽出、抽出時間の延長等により抽出効率を高めることができる。
また、加水分解を行う場合、エステラーゼのような酵素による分解や、乳酸菌や酵母などの微生物による分解、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸等の酸による分解、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによる分解等が挙げられる。加水分解の条件は、特に限定されないが酵素や微生物を用いる場合は使用する酵素や微生物の至適温度、ｐＨに合わせ、通常、１０〜５５℃、ｐＨ３〜８、５〜２４時間程度、加水分解を行う。酸やアルカリを用いて加水分解を行う場合、通常、２〜１５重量％の濃度で常温〜６０℃にて０．５〜２４時間程度、加水分解を行う。
これら抽出物や抽出加水分解物は、必要に応じてｐＨ調整を行った後、凍結乾燥、減圧蒸留、減圧・真空乾燥、スプレードライなどの公知の方法で濃縮乾燥物を得ことが出来る。精製処理の方法については特に限定されないが、例えば、順相及び逆相クロマトグラフィーによる精製、再結晶、再沈殿、脱色処理、脱臭処理等を組み合わせて精製することができる。
化学合成法によっても上記化合物は得る事ができる。例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びリチウムアルミニウムハイドライド（ＬｉＡｌＨ４）を０℃に冷却し、攪拌下に３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を２０〜３０分かけて加えた後、徐々に昇温し６時間還流する。反応液を放冷後、濾液に精製水及び１０％塩酸を加えて反応を停止させる。次に酢酸エチルを用いて抽出を行い、減圧下で溶媒を留去して乾燥物を得る。この乾燥物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製しＤＰＥを得ることができる。
得られたＤＰＥは、例えば、ＤＰＥとテトラアセチル−α−ブロモグルコースを反応させ、ギ酸を加えて酸性にして得られる沈殿を遠心分離により回収し濃縮後、酸化リン（Ｖ）を脱水剤とする真空デシケーターで乾燥後、無水メタノールに溶解し、２８％ナトリウムメチラートメタノール液を加えて脱アセチル化する。次に、この溶液を６Ｎ塩酸で中和し、不溶物をろ紙にてろ過し、メタノール及び水でそれぞれ洗浄し、洗浄液とろ液を合わせて濃縮乾固し粗ＤＰＥ配糖体（ＤＰＥグルコシド）を得ることができる。その後、粗ＤＰＥグルコシドはＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて構造決定し、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−１−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；７６８７３−９９−９）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−３’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；１４２５４２−８９−０）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；５４６９５−８０−６）をそれぞれ得る事が出来る。
ＤＰＥ又はその配糖体は、植物中のもの、植物抽出物中のもの、植物又は植物よりの抽出物を加水分解した加水分解物中のもの、更にそれら抽出物、加水分解物より精製されたもの、又は、化学合成されたものの何れであっても本発明において使用可能である。
ＤＰＥ又はその配糖体は、卓越した細胞内のグルタチオン合成を促進する作用を有しており、グルタチオン増強剤として使用できる。またこのグルタチオン増強剤は、システインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質、システイン及び／又はシスチンを含む酵母、またビタミンＣ、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム等のビタミン類等と併用することにより、更に優れた効果を発揮する。
グルタチオンは、植物、微生物、そして全ての哺乳類動物の各組織に存在する生体内抗酸化物質であり、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの２種類が知られている。グルタチオンペルオキシダーゼとグルタチオン還元酵素によって、グルタチオンは、酸化と還元の状態、いわゆるレドックスサイクルによって調整され、抗酸化物質としての機能を維持している。グルタチオンの各機能を働かせるために必要な部位は、その構成員であるシステインのＳＨ基である。また、一般に知られているグルタチオンの役割としては、１）タンパク内のＳＨ基の保護、２）フリーラジカルのスカベンジング、３）システインの貯蔵形態としての役割、４）ＤＮＡ合成や免疫機能のような基本的な細胞プロセスにおける調整が挙げられる（Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１．５２，２８７−３０５頁、Ｒａｖｅｎ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ ｙｏｒｋ．１９８８．４０１−４１７頁、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９０．８７，３３４３−３３４７頁、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１９９７．２３２，４３５−４３８頁）。
グルタチオンが消費され枯渇する、あるいは欠乏に陥る要因としては、常時発生している活性酸素等による酸化的ストレスの要因と、放射線、紫外線、アルコール、化学物質、薬、あるいは重金属等の要因が考えられ、日常こうしたリスクに曝されると上記列挙したグルタチオンの機能は失われ疾病へと進展する。また、一般的にグルタチオンの生産レベルは、加齢とともに低下する。
例えば、肺疾患の一つである、急性呼吸窮迫症候群においては、多くの場合、その患者のグルタチオンレベルが低くなっており、そのため、肺細胞の酸化的損傷を生じる酸化的ストレスがもたらされている。
グルタチオンが関連する疾患としては、紫外線曝露による細胞傷害、肌荒れ、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、アルコール多飲による急性あるいは慢性アルコール肝障害、生体異物又は放射線による肝障害、薬、重金属及び化学物質による肝障害、肝不全、肝炎、紫外線による免疫力の低下や自己免疫疾患、アレルギー性疾患、後天性免疫不全症候群等の免疫疾患、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、慢性腎不全、癌化及び生理学的な加齢に伴う老化現象、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、細血管障害性溶血性貧血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳動脈硬化症、虚血などの各種動脈硬化症性疾患、白内障、脳及び神経変性疾患（脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、成人呼吸器障害症候群、骨髄形成不全、糖尿病、ネフローゼ、高血圧症、肥満、潜在性ウィルス感染症、胃潰瘍などが挙げられる。
グルタチオンの合成を促進することにより、肝臓、肺、腎臓、皮膚、脳などの各臓器細胞における細胞内グルタチオンレベルを増加させることができる。
ＤＰＥ又はその配糖体は、細胞内のグルタチオン合成を促進する作用を有しており、グルタチオンの減少、欠乏、枯渇に起因する疾患の予防と治療に対して有用である。
グルタチオン増強用組成物は、グルタチオンの欠乏や枯渇によって起こる疾患、活性酸素等による酸化的ストレスによって起こる疾患、急性あるいは慢性アルコール肝障害、肝不全、肝炎等の肝臓疾患、腎臓疾患、過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、白内障、老化などの予防、治療、さらに、肝機能の改善、腎機能の改善、肺機能の改善など臓器機能の改善に有効である。
「グルタチオンの欠乏や枯渇によって起こる疾患」は、アルコール多飲による急性あるいは慢性アルコール肝障害、生体異物又は放射線による肝障害、薬、重金属及び化学物質による肝障害、肝不全、肝炎、紫外線による免疫力の低下や自己免疫疾患、アレルギー性疾患、後天性免疫不全症候群等の免疫疾患、虚血性心疾患、白内障、脳及び神経変性疾患（脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、成人呼吸器障害症候群、骨髄形成不全、糖尿病、ネフローゼ、高血圧症、肥満、アテローム性動脈硬化症、潜在性ウイルス感染症、胃潰瘍などである。
「酸化的ストレスによって起こる疾患」は、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、慢性腎不全、白内障、虚血性心疾患、胃潰瘍、癌化及び生理学的な加齢に伴う老化現象などである。
「過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患」は、虚血性心疾患、細血管障害性溶血性貧血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳動脈硬化症、脳虚血などの各種動脈硬化症性疾患、いわゆる血管系の疾患である。また、皮膚の肌荒れ等も含まれる。
「システインの供給源となるＳ含有化合物」としては、その分子内にＳＨ基を有する化合物であって、メチオニンからの硫黄転移反応によって誘導される非システイン基質でもある物質を使用することができる。例えば、ＳＨ基を有する化合物としては、グルタチオン、アセチル化グルタチオン、グルタチオンエステル類、グルタチオン塩酸塩、グルタチオンリン酸塩、グルタチオン硫酸塩等のグルタチオン又はその誘導体、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、塩酸システイン、硫酸システイン、リン酸システイン等のシステイン又はその誘導体、メルカプトエタノール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、アンモニウムチオラクテート、モノエタノールアミンチオラクテート等が挙げられ、非システイン基質としては、Ｌ−２−オキソチアゾリジン−２−カルボン酸塩、その他シスチン等を挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
「システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母」としては、乳清、卵白、血清アルブミン、ラクトアルブミン、ケラチン、羽毛の抽出物、人毛の抽出物や１％以上グルタチオンを含む酵母、例えばパン酵母やトラル酵母等が挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
「ビタミン類」には、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ類、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ類、ビタミンＥ類、ビタミンＫ類、パントテン酸、パントテン酸Ｃａ、ビオチン、葉酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸等が含まれ、またこれらビタミン類の誘導体も含まれる。
「抗紫外線用及び／又は美白用組成物」は既成のシミ・ソバカスに対する淡色化作用を示す組成物を示すものである。シミ・ソバカスはメラニン生成が過剰となりその沈着によっておこる結果である。そのため、従来技術は、メラニン生成に深く関与するチロシナーゼの阻害物質を探索することにより、メラニン生成抑制を目指していた。しかし、本発明の作用機序はそれとは異なり細胞内のグルタチオン合成を促進することによる作用である。メラニンには黒色メラニンのユウメラニンと淡赤褐色メラニンのフェオメラニンの２種類あり、細胞内グルタチオンはメラニン生成の過程でフェオメラニン生成経路に作用する。色素産生細胞にグルタチオンを添加すると、フェオメラニンの比率が高まり、細胞を淡色化する作用が実験的に報告されている（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９．９３，１００−１０７頁）。また、グルタチオンはビタミンＣの酸化型濃色メラニンから還元型淡色メラニンにする作用を亢進させることが知られている。臨床的に既成のシミ・ソバカス等の色素沈着を改善することが報告されている（臨皮，１９６７．２１（７），７２５−７２９頁）。グルタチオン増強作用によって、既成に形成されているシミ、ソバカス等の色素沈着を改善し、これらを淡色化することができる。
またここで特筆すべきは、ＤＰＥは抗酸化物質としては既に公知である（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９４，３２（１），３１−３６頁）が、本発明における「細胞傷害防御用及び／又は細胞傷害修復用組成物」におけるＤＰＥ又はその配糖体は、紫外線や発癌性物質等の外因的要因より細胞外から発生した活性酸素やフリーラジカル等の攻撃に対し、細胞内のグルタチオン合成を促進することによって、その攻撃を受けた細胞膜等の傷害を間接的に軽減したり、あるいは修復する作用を発揮するものであって、従来の抗酸化物質のように発生した活性酸素を直接消去する作用とは異なる作用を発揮するものである。
ＤＰＥ又はその配糖体は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生を促進する作用を有しているので、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用組成物の有効成分として利用することができる。また、ＤＰＥ又はその配糖体は、更にシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質及び酵母、並びにビタミン類からなる群より選ばれる少なくとも１種類と併用して、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用組成物とすることができる。
ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体は、おのおのがコードされる遺伝子の制御領域に共通のコンセンサス配列を有している。それは抗酸化剤応答配列といわれる配列（ＲＴＧＡＣｎｎｎＧＣ）でＮｒｆ２やｃ−Ｊｕｎ等の転写因子がこの配列を介して協調的にこれら遺伝子発現を制御し、生体防御システムを構築していると考えられている（蛋白 核酸 酵素．１９９９，４４（１５），２３７０−２３７６頁）。その他この配列によって制御されている酵素群としてはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、フェリチン、グルタチオンポンプ（ＧＳ−Ｘポンプ）、ウリジンニリン酸−グルクロン酸転移酵素等が挙げられる。
ガンマグルタミルシステイン合成酵素は、グルタチオンの構成アミノ酸であるグルタミン酸とシステインが結合する際、マグネシウム存在下で触媒する酵素である。グルタチオンがこの酵素をフィードバック阻害することから、この酵素の活性が、グルタチオン合成の律速段階となると考えられている。
グルタチオン還元酵素はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ関与で酸化型グルタチオンを非可逆的に還元する酵素である。グルタチオンを介した細胞内の酸化還元状態の形成に重要な役割をしていると考えられている。
シスチン膜輸送担体は、細胞膜に存在する膜タンパクで、塩基性アミノ酸、特にＳ供与体の一つであるシスチン、そしてグルタミン酸に高い特異性を持っている。その働きはシスチンとグルタミン酸の交換輸送を担うことで通常細胞内のグルタミン酸を放出し、細胞外のシスチンを取り込む形で機能する。細胞内に輸送されたシスチンはシステインを経由してグルタチオンの生成に関与する。近年、エックスシーティー（ｘＣＴ）という５０キロダルトンのシスチン膜輸送担体がクローニングされ、リンパ球の活性化抗原として知られていた４Ｆ２抗原重鎖（４Ｆ２ｈｃ）とヘテロ２量体を形成してシスチンの輸送に関与していることが明らかとなった。
本発明のグルタチオン増強用組成物は、食品、経口用あるいは非経口用の医薬等として使用できる。
上記食品としては、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、美容食品等がある。
医薬としての投与方法は、経口投与又は非経口投与の何れでも良く、非経口投与の場合、直腸内投与、注射などである。投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。医薬品用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの添加剤を適宜添加することも可能である。また、食品としては、ジュースのような飲料に配合することもできる。
ＤＰＥ又はその配糖体の有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、成人１日あたり０．０１〜１０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは１〜１００ｍｇである。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母を含有する場合には、成人１日あたり５〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは、５０〜５００ｍｇである。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣとしては成人１日あたり１０〜２０００ｍｇ、特に好ましくは３００〜１０００ｍｇである。これらは１日数回に分けて投与しても良い。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物体、その抽出物、植物体又はその抽出物の加水分解物の有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の活性の強さなどにより、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、植物抽出物の加水分解物の投与量は、オリーブ葉抽出加水分解物の場合、１日あたり０．０１〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは１〜３００ｍｇである。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質や酵母を配合する場合には、システイン量として、１日あたり５〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは、５０〜５００ｍｇである。１日に数回に分けて投与しても良い。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣとしては成人１日あたり１０〜２０００ｍｇ、特に好ましくは３００〜１０００ｍｇである。ニコチン酸アミドは成人あたり０．１〜１００ｍｇ、特に好ましく５〜３０ｍｇである。これらは１日数回に分けて投与しても良い。
また、本発明のグルタチオン増強用組成物は皮膚外用として、薬事法のいう化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品であることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
ＤＰＥ又はその配糖体の皮膚外用組成物における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、全重量の０．００１〜２０重量％程度、好ましくは０．０１〜５重量％である。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質や酵母を含有する場合には、システイン量としては、その含有量は０．００１〜３０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣの場合には０．００１〜４０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物、その抽出物、その抽出物や植物の加水分解物の皮膚外用組成物における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、ライラック抽出物の場合、全重量の０．００１〜２０重量％程度、好ましくは０．０１〜５重量％である。また、システインの供給源となる化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母を含有する場合には、システイン量としては、その含有量は０．００１〜３０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣの場合には０．００１〜４０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
ＤＰＥ又はその配糖体を化粧料素材として使用する場合、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油に添加することにより化粧料素材として利用することができる。含有量は、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油の質量に対して、０．０００１〜２０重量％、好ましくは、０．０１〜５重量％である。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物、その抽出物、それらの加水分解物を化粧料素材として使用する場合、例えば、キンモクセイの抽出物あるいは抽出加水分解物をコムギ胚芽油又はオリーブ油に添加することにより、化粧料素材として利用することができる。植物の抽出物又は抽出加水分解物の含有量は、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油の重量に対して、０．１〜６０重量％、好ましくは、０．５〜５０重量％である。
ＤＰＥ又はその配糖体は毒性が低く、毎日１０００ｍｇ／ｋｇ、１００日間という長期間ラットに経口投与しても、死亡例はなかった。
発明を実施するための最良の形態
実施例
以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
植物からの抽出及びその加水分解
オドリコソウの地上部（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライトの地上部（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、車前草（全草）（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、桃の葉（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカの実（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、車前子（種子）（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、ジオウ（根）（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、オオバコの全草（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセアの花（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜の葉（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタの種子、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニンの種子（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコの全草（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメの実（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニンの種子（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイの花（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラの全藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウの種子（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコの茎（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラの実（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニクの全草（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギの葉（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイの葉（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニクの全草（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケの全藻（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、オリーブの葉（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、レンギョウの実（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウの茎（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコの樹皮（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキの樹皮（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロの地上部（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草の全草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイの全草（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲの葉（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウの全草（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチの実（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキの実（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンランの全草（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ）、ホオノキの樹皮（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイの全草（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイの花（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルスの葉（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマの茎（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨルの全草（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラの全草（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシの葉（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコの葉（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギの塊茎（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイの花（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラックの葉（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミンの全草（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子の種子（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラの全草（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリの実（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリの全草（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）を各５００ｇに９９．５％エタノール液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬して抽出した後、抽出液をエバポレーターにて減圧濃縮し、エタノール溶媒を取り除いた。
各抽出物のそれぞれ乾燥重量は、５０．５、１０．４、４０．１、２０．３、４０．３、６８．８、７２．１、５２．６、４３．３、４６．１、３６．８、２９．７、３６．８、３４．６、２０．２、２５．４、３４．２、７８．７、４０．６、２６．８、１５．７、３９．３、５０．８、６０．９、１１０．０、４０．７、３０．６、３０．４、２２．３、７７．８、４０．８、８０．７、５３．６、４４．６、２９．６、４４．７、５０．１、７２．３、３５．６、４３．６、６０．４、２５．６、８０．６、５９．４、６６．９、３７．５、４８．８、６０．１、５７．６、１０．２、２１．９、１９．６、８．０３、４５．６、３２．３、３６．９、２８．４、３７．０、４３．４ｇであった。
次に、加水分解物を得るために、上記した操作と同じ操作により得られた植物抽出液に、１Ｎ硫酸を用いてｐＨ２になるよう調整し、１００℃で１時間攪拌して加水分解処理し、次いで水酸化ナトリウムを用いて中和し、エバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥より乾固して加水分解物を得た。
それぞれの加水分解物の乾燥重量は順に、５５．５、１３．４、４６．１、２４．３、４７．３、７２．８、９０．１、５９．６、４８．３、５１．１、４５．８、３４．７、４２．１、３９．１、２５．９、３０．７、３９．１、７４．４、４７．３、２７．９、２３．４、４６．５、４８．８、４８．９、７２．０、４７．７、３７．４、３６．４、２７．３、７２．４、４４．８、８３．７、５７．６、４９．６、３５．６、４７．７、５３．１、７３．３、３６．６、４７．６、５８．４、３０．６、７８．６、６１．４、６４．９、４５．５、４６．８、５４．１、５６．６、１４．２、２２．３、２６．６、１２．０３、４３．６、５３．３、４６．９、３５．４、４８．７、４６．４ｇであった。得られた抽出物及びその加水分解物は使用直前にエタノール溶媒を用いて１０ｍｇ／ｍｌに再調製し、実験に用いた。
［実施例２］
植物からの２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＤＰＥ）の抽出
オリーブ葉（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、ライラック葉（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キンモクセイ葉（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）を各１５００ｇに９９．５％エタノール液７．５Ｌを加え、室温で一晩浸漬、抽出した後、抽出液をエバポレーターにて減圧濃縮してエタノール溶媒を取り除き、各抽出物の乾燥重量３００、２８５、２６４ｇを得た。次にメタノールを用いてＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより分画し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、メタノール溶媒を取り除き、乾燥重量２５、１８、１４ｇを得た。次に酢酸エチル：ヘキサン混合液（３：２）を用いてシリカゲルカラフィーより分画し、同様の操作より粗画分の乾燥重量６、７、４ｇを得た。メタノールで再溶解後、これを更に１３％メタノールを用いてＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、それぞれＤＰＥ０．４、０．３、０．２ｇを得た。
［実施例３］
植物抽出物の加水分解物からのＤＰＥの抽出
オリーブ葉、ライラック葉、キンモクセイ葉を各１５００ｇに９９．５％エタノール液７．５Ｌを加え、室温で一晩浸漬、抽出した後、抽出液を１Ｎ硫酸を用いてｐＨ２に調整し１００℃で１時間攪拌し加水分解処理をした。その後、水酸化ナトリウムを用いて中和し、エバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥によりオリーブ、ライラック、キンモクセイの葉溶媒抽出物の加水分解物を乾燥重量で３４５、３８４、３２２ｇ得た。次にこの加水分解物をメタノールに溶解し、ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより分画し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し粗画分の乾燥重量８７、７１、５５ｇを得た。次に酢酸エチル：ヘキサン混合液（３：２）を用いてシリカゲルカラフィーより分画し、同様の操作より粗画分の乾燥重量２８、２１、１５ｇを得た。これを更に１３％メタノールを用いてＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、ＤＰＥ２、２、１ｇを得た。
［実施例４］
ＤＰＥの化学合成
トラヒドロフランＴＨＦ（２００ｍｌ）及びリチウムアルミニウムハイドライドＬｉＡｌＨ４（５．１２ｇ：０．１３ｍｏｌ）を０℃に冷却し、攪拌下に３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（７．６ｇ：０．０４５ｍｏｌ）を２０〜３０分かけて加えた後、徐々に昇温し６時間還流する。反応液を放冷後、氷水（１００ｍｌ）及び１０％塩酸（１００ｍｌ）を加えて反応を停止させた。次に酢酸エチル（１００ｍｌ）にて３〜４回抽出操作を繰り返し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下で溶媒を留去して乾燥物を得た。この乾燥物をシリガゲルカラムクロマトグラフィーにより精製しＤＰＥ（４．５ｇ）を得た。
［実施例５］
ＤＰＥ配糖体の化学合成
実施例４で得られたＤＰＥを６００ｍｇとり、テトラアセチル−α−ブロモグルコース４ｇを５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、２．７ｇの炭酸カリウムを添加し、スターラーで攪拌しながら室温で一晩反応させた。この反応液を３００ｇの氷の上に注ぎ、ギ酸を加えて酸性にして得られる沈殿を、１０００×ｇ、１５分間、遠心分離により回収した。これを蒸留水で１回洗浄した後、メタノールに溶解しエバポレーターで乾固した。ついで酸化リン（Ｖ）を脱水剤とする真空デシケーターで乾燥後、１０ｍｌ無水メタノールに溶解し、２８％ナトリウムメチラートメタノール液１．６ｍｌを加え、室温で２０分間反応させ、脱アセチル化した。次に、この溶液を６Ｎ塩酸で中和し、不溶物をろ紙にてろ過し、メタノール及び水でそれぞれ洗浄し、洗浄液とろ液を合わせて濃縮乾固し粗ＤＰＥグルコシド５７３ｍｇを得た。その後、粗ＤＰＥグルコシドはＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより分画し、減圧濃縮後、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−１−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−３’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）をそれぞれ１７７、２１４、１６６ｍｇを得た。
［実施例６］
グルタチオン活性の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）含有ダルベコ変法イーグル培養液（ＤＭＥＭ）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略すこともある。）含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、被験物質をエタノールに溶解し、実施例１の植物抽出物及びその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られた配糖体について最終濃度２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌ、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、２４時間培養後、細胞を回収した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。回収した細胞は、超音波により破砕し、メタリン酸を用いて除タンパク後、再度中和してグルタチオン測定用サンプルとした。グルタチオン測定はＢａｋｅｒらの方法に従った（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９０，３６０−３６５頁）。簡潔には、２−（Ｎ−ホルモリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ）中に還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、グルタチオン還元酵素、及び発色剤の５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を加え、測定用サンプルあるいは検量線用の標品と反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、グルタチオン濃度とした。結果を表１及び表２に示す。表１及び表２よりコントロールと比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体は細胞内グルタチオン濃度を高めることがわかる。
［実施例７］
Ｓ含有化合物（システイン）との併用効果
基本的には実施例６の方法に従い実験を行ったが、Ｓ含有化合物を任意の濃度で添加したいため、添加時の培養液はＳ含有化合物が入っていないＤＭＥＭ培養液（メチオニン、システイン、シスチンフリー）を用いた。実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２．５μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、３時間後にＳ含有化合物として中性域にｐＨ調整したシステインを最終濃度２００、４００μＭとなるよう添加した。比較はシステインのみを同量添加したそれぞれのコントロール群との比率より算出した（システインのみ添加した群をそれぞれシステイン最終濃度２００μＭ、４００μＭのコントロール群とし、それぞれのコントロール群の活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した）。結果を表３に示す。表３からこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体に対してＳ含有化合物であるシステインを添加することにより、システインの濃度に依存して細胞内グルタチオン濃度が高まった。これより、これらの植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はＳ含有化合物と協調してグルタチオン合成に関与していることがわかる。
［実施例８］
Ｓ含有化合物（シスチン）との併用効果
基本的には実施例６の方法に従い実験を行ったが、Ｓ含有化合物を任意の濃度で添加したいため、添加時の培養液はＳ含有化合物が入っていないＤＭＥＭ培養液（メチオニン、システイン、シスチンフリー）を用いた。実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、同時にＳ含有化合物としてシスチンを最終濃度２００μＭとなるよう添加した。比較はシスチンのみを添加したコントロール群との比率より算出した（シスチンのみ添加した群をコントロール群とし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した）。結果を表４に示す。表４からこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体に対してＳ含有化合物であるシスチンを添加することにより、細胞内グルタチオン濃度が高まった。これより、これらの植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はＳ含有化合物と協調してグルタチオン合成に関与していることがわかる。
［実施例９］
肝細胞に対する作用
ｃｌｏｎｅ９ヒト肝細胞（大日本製薬株式会社製）を８×１０６ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、被験物質をエタノールに溶解し、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度１０μｇ／ｍｌそれぞれ添加し、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。添加２４時間後、細胞を回収し実施例５の方法に従ってグルタチオン測定を行った。結果を表５に示す。表５から本発明より見出された植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体を添加することによって、コントロールとの比較から肝細胞においても細胞内グルタチオン濃度を高めることがわかる。
［実施例１０］
細胞内グルタチオン増強による活性酸素の細胞傷害に対する抵抗性
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を８×１０４ｃｅｌｌｓ各直径３．５ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で１日間培養した。０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、２４時間、３７℃でプレインキュベーションし細胞内グルタチオン濃度を高めた。２４時間後、培養液を吸引除去し、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）液にて２回洗浄した。本試験では細胞内グルタチオン濃度を高めることにより発生させた活性酸素による影響を軽減できるか評価するものであるため、本発明により見出された植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はプレインキュベーション後、完全に取り除いた。
細胞を洗浄後、一重項酸素発生剤であるローズベンガルを最終濃度５０μＭとなるようＨａｎｋｓ液に溶かして細胞に添加し可視光１０分照射を行い、細胞に一重項酸素を曝露した。Ｈａｎｋｓ液に細胞を浸す時間、可視光を浴びさせる時間は全ての群で統一した。曝露後、再度細胞をＨａｎｋｓ液で洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、３日後、コルターカウンターにより細胞を計測し、生細胞数を比較した。比較には一重項酸素に曝露していない非曝露群の細胞数を１００％として評価した。結果を表６に示す。表６より、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体を添加することによって一重項酸素に曝露された各群の生存率は被験物質無処置群（コントロール）と比較して改善されていることがわかる。曝露時にはこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体は取り除かれているため、細胞内グルタチオン濃度を高めることにより発生させた活性酸素による影響を軽減できることを示している。
［実施例１１］
美白試験
実施例１で得られたオドリコソウ、アイブライト、車前草、車前子、オリーブ、レンギョウ、イワタバコ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラック、クマツヅラ、ニガウリの抽出物とその加水分解物、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を用いて以下の試験によって、メラニン抑制活性を測定した。
メラニンを生成する細胞として、マウス由来の培養Ｂ１６メラノーマ細胞を用いてＦＢＳを終濃度１０％になるように添加した最少基礎培養液（ＭＥＭ）で培養し、該細胞を３×１０３ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で６ウェルプレートの各ウェルに６ｍｌ播種し、５日間ＣＯ２インキュベーター内で培養して培養液を交換した。実施例１の植物抽出物及びその加水分解物を１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、続けて３日間同条件で培養後、細胞を洗浄しスクレーパー処理により細胞を剥がし、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により可溶化して４７５ｎｍ、２６０ｎｍの吸光度を測定し、Ｓ４７５、Ｓ２６０とする。メラニン抑制率は被験物質を添加しない培養液で培養した細胞の４７５ｎｍ、２６０ｎｍにおける吸光度をＣ４７５、Ｃ２６０として次式１により計算した。ポジティブコントロールとしてビタミンＣ３ｍＭおよびコウジ酸３ｍＭを用いた。この結果を表７及び表８に示す。表７及び表８に示したように、被験物質添加によりメラニン生成が抑制され、被験物質が美白作用を示すことがわかる。
［実施例１２］
ウエスタンブロッティングによるシスチン膜輸送担体（ｘＣＴ）産生能の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、それぞれ、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように、そして、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、更に２４時間後、細胞を回収した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。細胞回収は、可溶化剤（０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）を加え、４℃、３０分振とう後、可溶化液を回収し１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。上清は蒸留水で透析し凍結乾燥にて乾固した。
次に蒸留水４００μｌで溶解し、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク定量後サンプル間のタンパク量補正を行った。これに任意の量のサンプルバッファーを加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとした。サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液〔０．１％の牛血清アルブミンおよび０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ〕で洗浄後、一次抗体（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したｘＣＴに対するポリクローナル抗体）に浸し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗ラビットイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液〔ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ベクターラボラトリー社製）〕に浸し、室温で１５分間反応させた。反応終了後、発色強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ １Ｄ（アマシャム ファルマシア バイオテック社製）により測定した。
ウエスタンブロッティングによる細胞抽出物のｘＣＴ産生能の測定結果を表９に示す。表９よりコントロールと比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はｘＣＴの発現を亢進することがわかる。
［実施例１３］
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるガンマグルタミルシステイン合成酵素の産生促進活性の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、それぞれ、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように、そして、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、８時間後、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ライフテックオリエンタル）を用いて、プロトコールに従い全ＲＮＡを回収した。
回収した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ（東洋紡）により、ガンマグルタミルシステイン合成酵素ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨｍＲＮＡの発現促進活性を測定した。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子はハウスキーピング遺伝子として知られ、全ての細胞で恒常的に発現していることから、コントロール遺伝子として広く用いられている。ＰＣＲ用プライマーとして、ガンマグルタミルシステイン合成酵素は５’−ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＧ Ｇ−３’及び５’−ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ Ｇ−３’を用い、Ｇ３ＰＤＨは５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’及び５’−ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡ−３’を用いた。ＰＣＲの反応条件は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素が、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５６℃、１分、７４℃、１分を３５回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。一方、Ｇ３ＰＤＨは、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５８℃、１分、７４℃、１分を２０回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を電気泳動後、エチジウムブロマイドにより染色し、デジタルカメラにより写真撮影後、その染色強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ １Ｄ（アマシャム ファルマシア バイオテック社製）により測定した。被験物質無添加（エタノール１％）をコントロール群とし、発現量の評価は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素ｍＲＮＡの染色強度をＧ３ＰＰＨ染色強度で割った値を１とし、被験物質添加時の発現量と比較検討を行った。表１０よりコントロール群と比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はガンマグルタミルシステイン合成酵素の発現を亢進することがわかる。
以下に処方例を示す。
［錠剤の製造］
実施例１で得られたオリーブ加水分解物とシスチンを用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合；重量％）
オリーブ加水分解物（乾燥重量） １６
シスチン １６
ビタミンＣ ２０
ニコチン酸アミド １
セルロース ２０
難消化性デキストリン ２４
ショ糖脂肪酸エステル ３
［錠剤の製造］
実施例３〜４で得た２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールとグルタチオン含有酵母を用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合；重量％）
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール １０
乳糖 ６２
コーンスターチ １７
グァーガム １
グルタチオン含有酵母 １０
［ジュースの製造］
常法に従って、下記組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合；重量％）
果糖ブトウ糖液糖 ５．００
クエン酸 １０．４
ビタミンＣ ０．５０
香料 ０．０２
色素 ０．１０
ライラック抽出物（乾燥重量） １０．０
精製水 ７３．９８
［スキンケア製品（ハンドクリーム）の製造］
常法に従って、下記組成のハンドクリームを製造した。
（組 成） （配合；重量％）
イソステアリン酸イソプロピル ８．０
ホホバ油 ６．０
セタノール ８．０
ステアリルアルコール ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．５
プロピレングリコール ６．０
ソルビトール １．０
パラベン ０．４
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール ０．８
ビタミンＥ ０．５
ビタミンＣ １．０
香料 ０．１
精製水 ６４．７
産業上の利用の可能性
以上から明らかなように本発明の組成物は、グルタチオン増強活性を有することから、生体内におけるグルタチオンの供給量を増加させることができるので、グルタチオンの欠乏によって起こる疾患の予防、又は治療、特に、急性あるいは慢性アルコール肝障害や肝不全、肝炎等の肝臓疾患、又は肝機能の改善に有用である。更に、活性酸素等による酸化的ストレスによって起こる疾患、特に、紫外線暴露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカス、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、肺機能の改善、白内障、生理学的な加齢に伴う老化の予防、又は治療にも用いることができる。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母と併用することで、グルタチオン増強活性は飛躍的に上がるので、本発明の組成物は上記疾患の予防、又は治療に対してより優れた効果を持つ組成物として有用である。
【配列表】
本発明は、グルタチオンの細胞内合成を促進する成分を含有する組成物に関する。また、本発明は、グルタチオン増強用；ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用；抗紫外線用及び／又は美白用；グルタチオンの細胞内合成促進による細胞傷害防御用、細胞傷害修復用；肝臓、腎臓、肺機能の改善あるいは治療用；過酸化脂質等の蓄積による疾患用；白内障用；老化の予防及び／又は治療用の各組成物、さらに、グルタチオンの細胞内合成を促進する成分を含有する医薬、皮膚外用剤、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、美容食品などの食品に関する。
背景技術
グルタチオンは生体内に幅広く分布する抗酸化物質であり、システイン、グルタミン酸及びグリシンから成るトリペプチドである。生体内の主な還元剤としてその作用部位であるＳＨ基によって種々の酸化還元的代謝による細胞防御、異物代謝、及び修復過程等に重要な役割を担っている。グルタチオンは、グルタチオンペルオキシダーゼの基質として生体内に発生した過酸化水素や過酸化脂質などの過酸化物を無毒化し、自身が酸化される事により生体内に及ぼす酸化障害（例えば上記過酸化物やフリーラジカルなど）から保護する働きがある。
酸化促進物と抗酸化能の機構間の均衡が前者優位となったときに、その酸化的ストレスが生じる。そして過剰な酸化ストレスや異物等が付加されると生体内のグルタチオンは消費枯渇し、正常な細胞の働きを維持できなくなる。グルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状としては、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、急性あるいは慢性アルコール肝障害、肝臓病、慢性腎不全、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、特発性肺線維症、白内障、虚血性心疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、胃潰瘍、成人呼吸器障害症候群、免疫不全、骨髄形成不全、後天性免疫不全症候群、潜伏性ウイルス感染症、及び生理学的な加齢に伴う老化現象、癌化などがある。
上記列挙したグルタチオンの細胞内濃度の低下によって引き起こされる病状の治療にはグルタチオン製剤が用いられてきた。しかし、グルタチオンの経口摂取は臓器によって思うような成果が期待できない。注射剤による治療は、経口摂取による治療より効果は期待できるものの、痛みを伴うこと、通院が必要なこと等いくつかの問題を抱えていた。細胞内グルタチオン量は細胞内に存在するシステイン量に依存しているため、近年、こうした細胞内システイン量を増加させるためのＳ含有化合物が開示されてきた（特開平０１−２６５１６号公報、特開平０２−４５４２０号公報、特開平０５−３０１８１１号公報、特開平０８−３１９２４２号公報）。例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−２−オキソチアゾリジン−２−カルボン酸、グルタチオンエステル等である。しかし、こうした化合物も臓器によっては効果に十分満足できるものではなかった。
細胞内グルタチオン量を決定するもう一つの要因として、グルタミン酸とシステインを縮合させる酵素、ガンマグルタミルシステイン合成酵素の発現量及び活性が知られている。この酵素の活性及び発現量は、熱ショック、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１のようなサイトカイン、インシュリンやグルココルチコイドのようなホルモン、重金属、細胞増殖や細胞周期に関わる因子など様々な要因によって調節される。また、この酵素の遺伝子５’末端領域には、抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が存在し、抗酸化物質に対して応答する配列を持っている。詳細なメカニズムは未だ完全には明らかとされていないが、食品の抗酸化剤として用いられるブチルヒドロキシアニソールをマウスに投与しグルタチオン濃度を上昇させることでホスゲンより誘導した肺浮腫に対して予防できることが報告されている（Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃａｌ．１９９９，１１（９），８５５−８７１頁）。しかし、従来から知られるビタミンＣ、マンニトール、アミノ酸（ヒスチジン等）などの抗酸化剤やオリーブ抽出物（特開２０００−１２８７６５、特開２００１−１８１６３２、特開２００１−２６５１８）、オリーブ抽出物の加水分解物（特開平０９−７８０６１号公報）などの抗酸化剤がグルタチオン増強作用を有していることは報告されておらず、またこのような作用メカニズムにより上記列挙した疾病の予防や治療に用いられているものは具体的にはまだない。
発明の開示
グルタチオン濃度の低下を回復させることを目的として、細胞内にシステインを供給するためのＳ含有化合物を使用するという従来の技術は、グルタチオン濃度の低下をきたしていない細胞にはほとんど取り込まれないため、有為なグルタチオン生成を促すことができなかった。そのため、紫外線の曝露、喫煙、アルコール類の飲食といったグルタチオン消費が予想される場合での障害の予防、正常レベルよりグルタチオン濃度を高めることで治療が見込まれる疾病等にも十分満足な効果は得られなかった。
本発明はグルタチオンの生体内濃度を高めるものであり、グルタチオンの欠乏によって起こる各種臓器の機能低下や種々の障害、疾患に対する予防と治療、正常レベルよりグルタチオン濃度を高めることによって治療可能となる疾病等に有効であり、効果的で安全性の高いグルタチオン増強用組成物を提供することをその課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（以下ＤＰＥともいう。）にグルタチオンの細胞内合成を促進する作用があることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記組成物に関する。
１． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有するグルタチオン増強用組成物。
２． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、成いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、ガンマグルタミルシステイン合成酵素産生促進用、グルタチオン還元酵素産生促進用、及びシスチン膜輸送担体産生促進用から選ばれる少なくとも一つの用途に用いられる組成物。
３． グルタチオン増強成分として、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール又はその配糖体の少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
４． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
５． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの欠乏によって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
６． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、酸化的ストレスによって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物
７． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの細胞内合成促進による細胞傷害防御用及び／又は細胞傷害修復用組成物。
８． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肝機能改善用あるいは肝臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
９． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、腎機能改善用あるいは腎臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
１０． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
１１． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肺機能改善用あるいは肺疾患の予防用／又は治療用組成物。
１２． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、白内障の予防用及び／又は治療用組成物。
１３． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、老化の予防用及び／又は治療用組成物。
１４． ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物が、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、オドリコソウ（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライト（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、ジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、プランタゴ・プシリウム（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタ、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニン（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコ（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニン（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウ（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコ（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラ（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニク（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイ（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニク（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケ（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロ（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイ（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲ（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウ（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンラン（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ）、ホオノキ（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイ（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルス（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマ（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨル（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコ（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギ（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイ（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミン（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子（Ｌｉｇｕｓｔｒｉｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラ（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）から選ばれる少なくとも１種類である、上記１、２、４〜１３のいずれかに記載の組成物。
１５． さらに、システインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質、システイン及び／又はシスチンを含む酵母、及びビタミン類から選ばれる少なくとも１種類を含有する上記１〜１４のいずれかに記載の組成物。
１６． 組成物が経口用又は非経口用である、上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１７． 組成物が、皮膚外用である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１８． 組成物が、医薬である上記１〜１７のいずれかに記載の組成物。
１９． 組成物が、食品である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
２０． 食品が、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、又は美容食品である上記１９記載の組成物。
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明により見出された有効成分である２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールは、下記化学式（１）で示される。
具体的には、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−アロピラノシド、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（２）参照）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（３）参照）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（下記化学式（４）参照）などを挙げることができる。
さらに、ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物として、次の科に属するものが挙げられる。
キンチャクソウ属ゴマノハグサ科Ｃａｌｃｅｏｌａｒｉａ ｈｙｐｅｒｉｃｉｎａ、Ｃａｌｃｅｏｌａｒｉａ ｓｐ、同クロタキカズラ科Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｓｓｉｎｏｐｓｉｓ ｓｐ、ホンオニク属ハマウツボ科Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ、クサギ属クマツヅラ科Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｊｏｈｎｓｔｏｎｉｉ、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｍｙｒｉｃｏｉｄｅｓ、ジキタリス属ゴマノハグサ科Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ ｓｓｐ、Ｄｉｇｔａｌｉｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ、Ｄｉｇｔａｌｉｓ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ ｓｓｐ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ、トリネコ属モクセイ科Ｆｒａｘｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ、Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｘｙｃａｒｂａ、ソケイ属モクセイ科Ｊａｓｍｉｎｕｍ ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｅ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｐｏｌｙａｎｔｈｕｍ、ラルップソウ属ラルップソウ科Ｌａｇｏｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ、メハジキ属シソ科Ｌｅｏｎｕｒｕｓ ｇｌａｕｃｅｎｓ、イボタノキ属モクセイ科Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｐｅｄｕｎｃｕｌａｒｅ、Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ、Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｓｐｐ、シシンラン属イワタバコ科Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｄｌｏｒｕｓ、ニガハッカ属シソ科Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ａｌｌｙｓｓｏｎ、ツルレイシ属ウリ科Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｂａｌｓａｍｉｎａ、ハマウツボ属ハマウツボ科Ｏｒｏｂａｎｃｈｅ ａｒｅｎａｒｉａ、シオガマギク属ゴマノハグサ科Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｐｌｉｃａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｅｍｉｔｏｒｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｐｉｃａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｔｒｉａｔａ、Ｐｅｄｉｃｕｌａｒｉｓ ｓｔｒｉａｔａ ｐａｌｌ ｓｓｐ．Ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ。
イワブクロ属ゴマノハグサ科Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｃｒａｎｄａｌｌｉｉ、オオキセワタ属シソ科Ｐｈｌｏｍｉｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ、オオバコ属オオバコ科Ｐｌａｎｔａｇｏ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉａ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｈｏｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍｙｏｓｕｒｏｓ、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｓｐ、ハマクサギ属クマツヅラ科Ｐｒｅｍｎａ ｃｏｒｙｍｂｏｓａ ｖａｒ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｐｒｅｍｎａ ｓｕｂｓｅａｎｄｅｎｓ、プロスタンテラ属シソ科Ｐｒｏｓｔａｎｔｈｅｒａ ｍｅｌｉｓｓｉｆｏｌｉａ、ゴマノハグサ属ゴマノハグサ科Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａ ｎｏｄｏｓａ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａ ｓｃｏｐｏｌｉｉ、イヌゴマ属シソ科Ｓｔａｃｈｙｓ ｌａｖａｎｄｕｌｉｆｏｌｉａ、Ｓｔａｃｈｙｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、ハシドイ属モクセイ科Ｓｙｒｉｎｇａ ｓｐ、ニガグサ属シソ科Ｔｅｕｃｒｉｕｍ ｃｈａｍａｅｄｒｙｓ、Ｔｅｕｃｒｉｕｍ ｐｏｌｉｕｍ、モウズイカ属ゴマノハグサ科Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ、クワガタソウ属ゴマクハグサ科Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｂｅｌｌｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｆｕｈｓｉｉ、その他、シスタンチェ タブロザ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｔｕｂｕｌｏｓａ）、マルカハミア ルテア（Ｍａｒｋｈａｍｉａ ｌｕｔｅａ）、ニュウボルディア レイビス（Ｎｅｗｂｏｕｌｄｉａ ｌａｅｖｉｓ）、ニュメラス プラント（ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｓｐｐ．）、オルトカーパス デンシフローラス（Ｏｒｔｈｏｃａｒｐｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｓ（Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ））、レッジア カペンシス（Ｒｅｔｚｉａ ｃａｐｅｎｓｉｓ）、サルバドラ カルトロピス（Ｓａｌｖａｄｏｒａ ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ）、サナンゴ ラセモサム（Ｓａｎａｎｇｏ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、ストロビランタス エスピー（Ｓｔｒｏｂｉｌａｎｔｈｕｓ ｓｐ）、トリコマンス レニホーム（Ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ）。
上記した植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、及び、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などでＤＰＥ又はその配糖体を含有している部位はすべて利用可能である。
上記した植物は、そのまま、抽出物、抽出物の加水分解物、又は植物の加水分解物として使用可能である。
本発明組成物で用いるＤＰＥを天然物から得るための抽出方法としては、例えば、オリーブ葉を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、オリーブ葉を圧搾して得られる搾汁等を適当な溶媒で抽出し、場合によっては加水分解処理を施し、不溶部分を濾過等で取り除きこの液から溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いて目的物を得る方法が挙げられる。その際、バイオアッセイを並行して行い、細胞内グルタチオン活性を指標として精製を進めることが望ましい。抽出に用いる溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、１，３ブチレングリコール等のアルコール類、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒、水等が挙げられる。これら溶媒は単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。抽出条件は、特に限定されないが、例えば、温度は５〜９５℃、好ましくは１５〜８５℃で常温でも好適に抽出することが出来る。
圧力は常圧、加圧、減圧の何れでも良い。
抽出時間は選定した溶媒によっても異なるが数分〜数時間であり、反復抽出、振とう抽出、抽出時間の延長等により抽出効率を高めることができる。
また、加水分解を行う場合、エステラーゼのような酵素による分解や、乳酸菌や酵母などの微生物による分解、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸等の酸による分解、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによる分解等が挙げられる。加水分解の条件は、特に限定されないが酵素や微生物を用いる場合は使用する酵素や微生物の至適温度、ｐＨに合わせ、通常、１０〜５５℃、ｐＨ３〜８、５〜２４時間程度、加水分解を行う。酸やアルカリを用いて加水分解を行う場合、通常、２〜１５重量％の濃度で常温〜６０℃にて０．５〜２４時間程度、加水分解を行う。
これら抽出物や抽出加水分解物は、必要に応じてｐＨ調整を行った後、凍結乾燥、減圧蒸留、減圧・真空乾燥、スプレードライなどの公知の方法で濃縮乾燥物を得ことが出来る。精製処理の方法については特に限定されないが、例えば、順相及び逆相クロマトグラフィーによる精製、再結晶、再沈殿、脱色処理、脱臭処理等を組み合わせて精製することができる。
化学合成法によっても上記化合物は得る事ができる。例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びリチウムアルミニウムハイドライド（ＬｉＡｌＨ４）を０℃に冷却し、攪拌下に３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を２０〜３０分かけて加えた後、徐々に昇温し６時間還流する。反応液を放冷後、濾液に精製水及び１０％塩酸を加えて反応を停止させる。次に酢酸エチルを用いて抽出を行い、減圧下で溶媒を留去して乾燥物を得る。この乾燥物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製しＤＰＥを得ることができる。
得られたＤＰＥは、例えば、ＤＰＥとテトラアセチル−α−ブロモグルコースを反応させ、ギ酸を加えて酸性にして得られる沈殿を遠心分離により回収し濃縮後、酸化リン（Ｖ）を脱水剤とする真空デシケーターで乾燥後、無水メタノールに溶解し、２８％ナトリウムメチラートメタノール液を加えて脱アセチル化する。次に、この溶液を６Ｎ塩酸で中和し、不溶物をろ紙にてろ過し、メタノール及び水でそれぞれ洗浄し、洗浄液とろ液を合わせて濃縮乾固し粗ＤＰＥ配糖体（ＤＰＥグルコシド）を得ることができる。その後、粗ＤＰＥグルコシドはＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて構造決定し、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−１−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；７６８７３−９９−９）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−３’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；１４２５４２−８９−０）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）（ＣＡＳ；５４６９５−８０−６）をそれぞれ得る事が出来る。
ＤＰＥ又はその配糖体は、植物中のもの、植物抽出物中のもの、植物又は植物よりの抽出物を加水分解した加水分解物中のもの、更にそれら抽出物、加水分解物より精製されたもの、又は、化学合成されたものの何れであっても本発明において使用可能である。
ＤＰＥ又はその配糖体は、卓越した細胞内のグルタチオン合成を促進する作用を有しており、グルタチオン増強剤として使用できる。またこのグルタチオン増強剤は、システインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質、システイン及び／又はシスチンを含む酵母、またビタミンＣ、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム等のビタミン類等と併用することにより、更に優れた効果を発揮する。
グルタチオンは、植物、微生物、そして全ての哺乳類動物の各組織に存在する生体内抗酸化物質であり、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの２種類が知られている。グルタチオンペルオキシダーゼとグルタチオン還元酵素によって、グルタチオンは、酸化と還元の状態、いわゆるレドックスサイクルによって調整され、抗酸化物質としての機能を維持している。グルタチオンの各機能を働かせるために必要な部位は、その構成員であるシステインのＳＨ基である。また、一般に知られているグルタチオンの役割としては、１）タンパク内のＳＨ基の保護、２）フリーラジカルのスカベンジング、３）システインの貯蔵形態としての役割、４）ＤＮＡ合成や免疫機能のような基本的な細胞プロセスにおける調整が挙げられる（Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１．５２，２８７−３０５頁、Ｒａｖｅｎ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ ｙｏｒｋ．１９８８．４０１−４１７頁、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９０．８７，３３４３−３３４７頁、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１９９７．２３２，４３５−４３８頁）。
グルタチオンが消費され枯渇する、あるいは欠乏に陥る要因としては、常時発生している活性酸素等による酸化的ストレスの要因と、放射線、紫外線、アルコール、化学物質、薬、あるいは重金属等の要因が考えられ、日常こうしたリスクに曝されると上記列挙したグルタチオンの機能は失われ疾病へと進展する。また、一般的にグルタチオンの生産レベルは、加齢とともに低下する。
例えば、肺疾患の一つである、急性呼吸窮迫症候群においては、多くの場合、その患者のグルタチオンレベルが低くなっており、そのため、肺細胞の酸化的損傷を生じる酸化的ストレスがもたらされている。
グルタチオンが関連する疾患としては、紫外線曝露による細胞傷害、肌荒れ、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、アルコール多飲による急性あるいは慢性アルコール肝障害、生体異物又は放射線による肝障害、薬、重金属及び化学物質による肝障害、肝不全、肝炎、紫外線による免疫力の低下や自己免疫疾患、アレルギー性疾患、後天性免疫不全症候群等の免疫疾患、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、慢性腎不全、癌化及び生理学的な加齢に伴う老化現象、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、細血管障害性溶血性貧血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳動脈硬化症、虚血などの各種動脈硬化症性疾患、白内障、脳及び神経変性疾患（脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、成人呼吸器障害症候群、骨髄形成不全、糖尿病、ネフローゼ、高血圧症、肥満、潜在性ウィルス感染症、胃潰瘍などが挙げられる。
グルタチオンの合成を促進することにより、肝臓、肺、腎臓、皮膚、脳などの各臓器細胞における細胞内グルタチオンレベルを増加させることができる。
ＤＰＥ又はその配糖体は、細胞内のグルタチオン合成を促進する作用を有しており、グルタチオンの減少、欠乏、枯渇に起因する疾患の予防と治療に対して有用である。
グルタチオン増強用組成物は、グルタチオンの欠乏や枯渇によって起こる疾患、活性酸素等による酸化的ストレスによって起こる疾患、急性あるいは慢性アルコール肝障害、肝不全、肝炎等の肝臓疾患、腎臓疾患、過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、白内障、老化などの予防、治療、さらに、肝機能の改善、腎機能の改善、肺機能の改善など臓器機能の改善に有効である。
「グルタチオンの欠乏や枯渇によって起こる疾患」は、アルコール多飲による急性あるいは慢性アルコール肝障害、生体異物又は放射線による肝障害、薬、重金属及び化学物質による肝障害、肝不全、肝炎、紫外線による免疫力の低下や自己免疫疾患、アレルギー性疾患、後天性免疫不全症候群等の免疫疾患、虚血性心疾患、白内障、脳及び神経変性疾患（脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、成人呼吸器障害症候群、骨髄形成不全、糖尿病、ネフローゼ、高血圧症、肥満、アテローム性動脈硬化症、潜在性ウイルス感染症、胃潰瘍などである。
「酸化的ストレスによって起こる疾患」は、紫外線曝露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカスの生成、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、慢性腎不全、白内障、虚血性心疾患、胃潰瘍、癌化及び生理学的な加齢に伴う老化現象などである。
「過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患」は、虚血性心疾患、細血管障害性溶血性貧血、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳動脈硬化症、脳虚血などの各種動脈硬化症性疾患、いわゆる血管系の疾患である。また、皮膚の肌荒れ等も含まれる。
「システインの供給源となるＳ含有化合物」としては、その分子内にＳＨ基を有する化合物であって、メチオニンからの硫黄転移反応によって誘導される非システイン基質でもある物質を使用することができる。例えば、ＳＨ基を有する化合物としては、グルタチオン、アセチル化グルタチオン、グルタチオンエステル類、グルタチオン塩酸塩、グルタチオンリン酸塩、グルタチオン硫酸塩等のグルタチオン又はその誘導体、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、塩酸システイン、硫酸システイン、リン酸システイン等のシステイン又はその誘導体、メルカプトエタノール、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、アンモニウムチオラクテート、モノエタノールアミンチオラクテート等が挙げられ、非システイン基質としては、Ｌ−２−オキソチアゾリジン−２−カルボン酸塩、その他シスチン等を挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
「システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母」としては、乳清、卵白、血清アルブミン、ラクトアルブミン、ケラチン、羽毛の抽出物、人毛の抽出物や１％以上グルタチオンを含む酵母、例えばパン酵母やトラル酵母等が挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
「ビタミン類」には、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ類、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ類、ビタミンＥ類、ビタミンＫ類、パントテン酸、パントテン酸Ｃａ、ビオチン、葉酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸等が含まれ、またこれらビタミン類の誘導体も含まれる。
「抗紫外線用及び／又は美白用組成物」は既成のシミ・ソバカスに対する淡色化作用を示す組成物を示すものである。シミ・ソバカスはメラニン生成が過剰となりその沈着によっておこる結果である。そのため、従来技術は、メラニン生成に深く関与するチロシナーゼの阻害物質を探索することにより、メラニン生成抑制を目指していた。しかし、本発明の作用機序はそれとは異なり細胞内のグルタチオン合成を促進することによる作用である。メラニンには黒色メラニンのユウメラニンと淡赤褐色メラニンのフェオメラニンの２種類あり、細胞内グルタチオンはメラニン生成の過程でフェオメラニン生成経路に作用する。色素産生細胞にグルタチオンを添加すると、フェオメラニンの比率が高まり、細胞を淡色化する作用が実験的に報告されている（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９．９３，１００−１０７頁）。また、グルタチオンはビタミンＣの酸化型濃色メラニンから還元型淡色メラニンにする作用を亢進させることが知られている。臨床的に既成のシミ・ソバカス等の色素沈着を改善することが報告されている（臨皮，１９６７．２１（７），７２５−７２９頁）。グルタチオン増強作用によって、既成に形成されているシミ、ソバカス等の色素沈着を改善し、これらを淡色化することができる。
またここで特筆すべきは、ＤＰＥは抗酸化物質としては既に公知である（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９４，３２（１），３１−３６頁）が、本発明における「細胞傷害防御用及び／又は細胞傷害修復用組成物」におけるＤＰＥ又はその配糖体は、紫外線や発癌性物質等の外因的要因より細胞外から発生した活性酸素やフリーラジカル等の攻撃に対し、細胞内のグルタチオン合成を促進することによって、その攻撃を受けた細胞膜等の傷害を間接的に軽減したり、あるいは修復する作用を発揮するものであって、従来の抗酸化物質のように発生した活性酸素を直接消去する作用とは異なる作用を発揮するものである。
ＤＰＥ又はその配糖体は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生を促進する作用を有しているので、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用組成物の有効成分として利用することができる。また、ＤＰＥ又はその配糖体は、更にシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質及び酵母、並びにビタミン類からなる群より選ばれる少なくとも１種類と併用して、ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体の産生促進用組成物とすることができる。
ガンマグルタミルシステイン合成酵素、グルタチオン還元酵素、シスチン膜輸送担体は、おのおのがコードされる遺伝子の制御領域に共通のコンセンサス配列を有している。それは抗酸化剤応答配列といわれる配列（ＲＴＧＡＣｎｎｎＧＣ）でＮｒｆ２やｃ−Ｊｕｎ等の転写因子がこの配列を介して協調的にこれら遺伝子発現を制御し、生体防御システムを構築していると考えられている（蛋白 核酸 酵素．１９９９，４４（１５），２３７０−２３７６頁）。その他この配列によって制御されている酵素群としてはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、フェリチン、グルタチオンポンプ（ＧＳ−Ｘポンプ）、ウリジンニリン酸−グルクロン酸転移酵素等が挙げられる。
ガンマグルタミルシステイン合成酵素は、グルタチオンの構成アミノ酸であるグルタミン酸とシステインが結合する際、マグネシウム存在下で触媒する酵素である。グルタチオンがこの酵素をフィードバック阻害することから、この酵素の活性が、グルタチオン合成の律速段階となると考えられている。
グルタチオン還元酵素はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ関与で酸化型グルタチオンを非可逆的に還元する酵素である。グルタチオンを介した細胞内の酸化還元状態の形成に重要な役割をしていると考えられている。
シスチン膜輸送担体は、細胞膜に存在する膜タンパクで、塩基性アミノ酸、特にＳ供与体の一つであるシスチン、そしてグルタミン酸に高い特異性を持っている。その働きはシスチンとグルタミン酸の交換輸送を担うことで通常細胞内のグルタミン酸を放出し、細胞外のシスチンを取り込む形で機能する。細胞内に輸送されたシスチンはシステインを経由してグルタチオンの生成に関与する。近年、エックスシーティー（ｘＣＴ）という５０キロダルトンのシスチン膜輸送担体がクローニングされ、リンパ球の活性化抗原として知られていた４Ｆ２抗原重鎖（４Ｆ２ｈｃ）とヘテロ２量体を形成してシスチンの輸送に関与していることが明らかとなった。
本発明のグルタチオン増強用組成物は、食品、経口用あるいは非経口用の医薬等として使用できる。
上記食品としては、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、美容食品等がある。
医薬としての投与方法は、経口投与又は非経口投与の何れでも良く、非経口投与の場合、直腸内投与、注射などである。投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。医薬品用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの添加剤を適宜添加することも可能である。また、食品としては、ジュースのような飲料に配合することもできる。
ＤＰＥ又はその配糖体の有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、成人１日あたり０．０１〜１０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは１〜１００ｍｇである。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母を含有する場合には、成人１日あたり５〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは、５０〜５００ｍｇである。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣとしては成人１日あたり１０〜２０００ｍｇ、特に好ましくは３００〜１０００ｍｇである。これらは１日数回に分けて投与しても良い。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物体、その抽出物、植物体又はその抽出物の加水分解物の有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の活性の強さなどにより、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、植物抽出物の加水分解物の投与量は、オリーブ葉抽出加水分解物の場合、１日あたり０．０１〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは１〜３００ｍｇである。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質や酵母を配合する場合には、システイン量として、１日あたり５〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは、５０〜５００ｍｇである。１日に数回に分けて投与しても良い。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣとしては成人１日あたり１０〜２０００ｍｇ、特に好ましくは３００〜１０００ｍｇである。ニコチン酸アミドは成人あたり０．１〜１００ｍｇ、特に好ましく５〜３０ｍｇである。これらは１日数回に分けて投与しても良い。
また、本発明のグルタチオン増強用組成物は皮膚外用として、薬事法のいう化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品であることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
ＤＰＥ又はその配糖体の皮膚外用組成物における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、全重量の０．００１〜２０重量％程度、好ましくは０．０１〜５重量％である。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含んだタンパク質や酵母を含有する場合には、システイン量としては、その含有量は０．００１〜３０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣの場合には０．００１〜４０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物、その抽出物、その抽出物や植物の加水分解物の皮膚外用組成物における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、ライラック抽出物の場合、全重量の０．００１〜２０重量％程度、好ましくは０．０１〜５重量％である。また、システインの供給源となる化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母を含有する場合には、システイン量としては、その含有量は０．００１〜３０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。ビタミン類は、それぞれの１日必要量に応じて適宜配合することができる。例えば、ビタミンＣの場合には０．００１〜４０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１０重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
ＤＰＥ又はその配糖体を化粧料素材として使用する場合、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油に添加することにより化粧料素材として利用することができる。含有量は、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油の質量に対して、０．０００１〜２０重量％、好ましくは、０．０１〜５重量％である。
ＤＰＥ又はその配糖体を含む植物、その抽出物、それらの加水分解物を化粧料素材として使用する場合、例えば、キンモクセイの抽出物あるいは抽出加水分解物をコムギ胚芽油又はオリーブ油に添加することにより、化粧料素材として利用することができる。植物の抽出物又は抽出加水分解物の含有量は、例えば、コムギ胚芽油又はオリーブ油の重量に対して、０．１〜６０重量％、好ましくは、０．５〜５０重量％である。
ＤＰＥ又はその配糖体は毒性が低く、毎日１０００ｍｇ／ｋｇ、１００日間という長期間ラットに経口投与しても、死亡例はなかった。
発明を実施するための最良の形態
実施例
以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
［実施例１］
植物からの抽出及びその加水分解
オドリコソウの地上部（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライトの地上部（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、車前草（全草）（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、桃の葉（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカの実（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、車前子（種子）（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、ジオウ（根）（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、オオバコの全草（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセアの花（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜の葉（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタの種子、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニンの種子（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコの全草（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメの実（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニンの種子（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイの花（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラの全藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウの種子（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコの茎（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラの実（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニクの全草（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギの葉（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイの葉（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニクの全草（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケの全藻（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリスの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブの葉（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、オリーブの葉（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、レンギョウの実（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウの茎（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコの樹皮（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキの樹皮（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロの地上部（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草の全草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイの全草（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲの葉（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウの全草（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチの実（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキの実（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンランの全草（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒｕｓ）、ホオノキの樹皮（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイの全草（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイの花（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルスの葉（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマの茎（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨルの全草（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラの全草（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシの葉（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコの葉（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギの塊茎（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイの花（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラックの葉（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミンの全草（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子の種子（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラの全草（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリの実（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリの全草（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）を各５００ｇに９９．５％エタノール液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬して抽出した後、抽出液をエバポレーターにて減圧濃縮し、エタノール溶媒を取り除いた。
各抽出物のそれぞれ乾燥重量は、５０．５、１０．４、４０．１、２０．３、４０．３、６８．８、７２．１、５２．６、４３．３、４６．１、３６．８、２９．７、３６．８、３４．６、２０．２、２５．４、３４．２、７８．７、４０．６、２６．８、１５．７、３９．３、５０．８、６０．９、１１０．０、４０．７、３０．６、３０．４、２２．３、７７．８、４０．８、８０．７、５３．６、４４．６、２９．６、４４．７、５０．１、７２．３、３５．６、４３．６、６０．４、２５．６、８０．６、５９．４、６６．９、３７．５、４８．８、６０．１、５７．６、１０．２、２１．９、１９．６、８．０３、４５．６、３２．３、３６．９、２８．４、３７．０、４３．４ｇであった。
次に、加水分解物を得るために、上記した操作と同じ操作により得られた植物抽出液に、１Ｎ硫酸を用いてｐＨ２になるよう調整し、１００℃で１時間攪拌して加水分解処理し、次いで水酸化ナトリウムを用いて中和し、エバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥より乾固して加水分解物を得た。
それぞれの加水分解物の乾燥重量は順に、５５．５、１３．４、４６．１、２４．３、４７．３、７２．８、９０．１、５９．６、４８．３、５１．１、４５．８、３４．７、４２．１、３９．１、２５．９、３０．７、３９．１、７４．４、４７．３、２７．９、２３．４、４６．５、４８．８、４８．９、７２．０、４７．７、３７．４、３６．４、２７．３、７２．４、４４．８、８３．７、５７．６、４９．６、３５．６、４７．７、５３．１、７３．３、３６．６、４７．６、５８．４、３０．６、７８．６、６１．４、６４．９、４５．５、４６．８、５４．１、５６．６、１４．２、２２．３、２６．６、１２．０３、４３．６、５３．３、４６．９、３５．４、４８．７、４６．４ｇであった。得られた抽出物及びその加水分解物は使用直前にエタノール溶媒を用いて１０ｍｇ／ｍｌに再調製し、実験に用いた。
［実施例２］
植物からの２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール（ＤＰＥ）の抽出
オリーブ葉（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、ライラック葉（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キンモクセイ葉（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）を各１５００ｇに９９．５％エタノール液７．５Ｌを加え、室温で一晩浸漬、抽出した後、抽出液をエバポレーターにて減圧濃縮してエタノール溶媒を取り除き、各抽出物の乾燥重量３００、２８５、２６４ｇを得た。次にメタノールを用いてＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより分画し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、メタノール溶媒を取り除き、乾燥重量２５、１８、１４ｇを得た。次に酢酸エチル：ヘキサン混合液（３：２）を用いてシリカゲルカラフィーより分画し、同様の操作より粗画分の乾燥重量６、７、４ｇを得た。メタノールで再溶解後、これを更に１３％メタノールを用いてＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、それぞれＤＰＥ０．４、０．３、０．２ｇを得た。
［実施例３］
植物抽出物の加水分解物からのＤＰＥの抽出
オリーブ葉、ライラック葉、キンモクセイ葉を各１５００ｇに９９．５％エタノール液７．５Ｌを加え、室温で一晩浸漬、抽出した後、抽出液を１Ｎ硫酸を用いてｐＨ２に調整し１００℃で１時間攪拌し加水分解処理をした。その後、水酸化ナトリウムを用いて中和し、エバポレーターで減圧濃縮後、凍結乾燥によりオリーブ、ライラック、キンモクセイの葉溶媒抽出物の加水分解物を乾燥重量で３４５、３８４、３２２ｇ得た。次にこの加水分解物をメタノールに溶解し、ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより分画し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し粗画分の乾燥重量８７、７１、５５ｇを得た。次に酢酸エチル：ヘキサン混合液（３：２）を用いてシリカゲルカラフィーより分画し、同様の操作より粗画分の乾燥重量２８、２１、１５ｇを得た。これを更に１３％メタノールを用いてＯＤＳカラムクロマトグラフィーより分画し、減圧濃縮後、ＤＰＥ２、２、１ｇを得た。
［実施例４］
ＤＰＥの化学合成
トラヒドロフランＴＨＦ（２００ｍｌ）及びリチウムアルミニウムハイドライドＬｉＡｌＨ４（５．１２ｇ：０．１３ｍｏｌ）を０℃に冷却し、攪拌下に３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（７．６ｇ：０．０４５ｍｏｌ）を２０〜３０分かけて加えた後、徐々に昇温し６時間還流する。反応液を放冷後、氷水（１００ｍｌ）及び１０％塩酸（１００ｍｌ）を加えて反応を停止させた。次に酢酸エチル（１００ｍｌ）にて３〜４回抽出操作を繰り返し、得られた酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、減圧下で溶媒を留去して乾燥物を得た。この乾燥物をシリガゲルカラムクロマトグラフィーにより精製しＤＰＥ（４．５ｇ）を得た。
［実施例５］
ＤＰＥ配糖体の化学合成
実施例４で得られたＤＰＥを６００ｍｇとり、テトラアセチル−α−ブロモグルコース４ｇを５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、２．７ｇの炭酸カリウムを添加し、スターラーで攪拌しながら室温で一晩反応させた。この反応液を３００ｇの氷の上に注ぎ、ギ酸を加えて酸性にして得られる沈殿を、１０００×ｇ、１５分間、遠心分離により回収した。これを蒸留水で１回洗浄した後、メタノールに溶解しエバポレーターで乾固した。ついで酸化リン（Ｖ）を脱水剤とする真空デシケーターで乾燥後、１０ｍｌ無水メタノールに溶解し、２８％ナトリウムメチラートメタノール液１．６ｍｌを加え、室温で２０分間反応させ、脱アセチル化した。次に、この溶液を６Ｎ塩酸で中和し、不溶物をろ紙にてろ過し、メタノール及び水でそれぞれ洗浄し、洗浄液とろ液を合わせて濃縮乾固し粗ＤＰＥグルコシド５７３ｍｇを得た。その後、粗ＤＰＥグルコシドはＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより分画し、減圧濃縮後、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−１−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−１−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−３’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＤＰＥ−４’−Ｏ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｃｉｄｅ）をそれぞれ１７７、２１４、１６６ｍｇを得た。
［実施例６］
グルタチオン活性の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）含有ダルベコ変法イーグル培養液（ＤＭＥＭ）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略すこともある。）含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、被験物質をエタノールに溶解し、実施例１の植物抽出物及びその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られた配糖体について最終濃度２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌ、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、２４時間培養後、細胞を回収した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。回収した細胞は、超音波により破砕し、メタリン酸を用いて除タンパク後、再度中和してグルタチオン測定用サンプルとした。グルタチオン測定はＢａｋｅｒらの方法に従った（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９０，３６０−３６５頁）。簡潔には、２−（Ｎ−ホルモリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ）中に還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、グルタチオン還元酵素、及び発色剤の５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を加え、測定用サンプルあるいは検量線用の標品と反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、グルタチオン濃度とした。結果を表１及び表２に示す。表１及び表２よりコントロールと比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体は細胞内グルタチオン濃度を高めることがわかる。
Ｓ含有化合物（システイン）との併用効果
基本的には実施例６の方法に従い実験を行ったが、Ｓ含有化合物を任意の濃度で添加したいため、添加時の培養液はＳ含有化合物が入っていないＤＭＥＭ培養液（メチオニン、システイン、シスチンフリー）を用いた。実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２．５μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、３時間後にＳ含有化合物として中性域にｐＨ調整したシステインを最終濃度２００、４００μＭとなるよう添加した。比較はシステインのみを同量添加したそれぞれのコントロール群との比率より算出した（システインのみ添加した群をそれぞれシステイン最終濃度２００μＭ、４００μＭのコントロール群とし、それぞれのコントロール群の活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した）。結果を表３に示す。表３からこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体に対してＳ含有化合物であるシステインを添加することにより、システインの濃度に依存して細胞内グルタチオン濃度が高まった。これより、これらの植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はＳ含有化合物と協調してグルタチオン合成に関与していることがわかる。
Ｓ含有化合物（シスチン）との併用効果
基本的には実施例６の方法に従い実験を行ったが、Ｓ含有化合物を任意の濃度で添加したいため、添加時の培養液はＳ含有化合物が入っていないＤＭＥＭ培養液（メチオニン、システイン、シスチンフリー）を用いた。実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、同時にＳ含有化合物としてシスチンを最終濃度２００μＭとなるよう添加した。比較はシスチンのみを添加したコントロール群との比率より算出した（シスチンのみ添加した群をコントロール群とし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した）。結果を表４に示す。表４からこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体に対してＳ含有化合物であるシスチンを添加することにより、細胞内グルタチオン濃度が高まった。これより、これらの植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はＳ含有化合物と協調してグルタチオン合成に関与していることがわかる。
肝細胞に対する作用
ｃｌｏｎｅ９ヒト肝細胞（大日本製薬株式会社製）を８×１０６ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、被験物質をエタノールに溶解し、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度１０μｇ／ｍｌそれぞれ添加し、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。添加２４時間後、細胞を回収し実施例５の方法に従ってグルタチオン測定を行った。結果を表５に示す。表５から本発明より見出された植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体を添加することによって、コントロールとの比較から肝細胞においても細胞内グルタチオン濃度を高めることがわかる。
細胞内グルタチオン増強による活性酸素の細胞傷害に対する抵抗性
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を８×１０４ｃｅｌｌｓ各直径３．５ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で１日間培養した。０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、２４時間、３７℃でプレインキュベーションし細胞内グルタチオン濃度を高めた。２４時間後、培養液を吸引除去し、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）液にて２回洗浄した。本試験では細胞内グルタチオン濃度を高めることにより発生させた活性酸素による影響を軽減できるか評価するものであるため、本発明により見出された植物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はプレインキュベーション後、完全に取り除いた。
細胞を洗浄後、一重項酸素発生剤であるローズベンガルを最終濃度５０μＭとなるようＨａｎｋｓ液に溶かして細胞に添加し可視光１０分照射を行い、細胞に一重項酸素を曝露した。Ｈａｎｋｓ液に細胞を浸す時間、可視光を浴びさせる時間は全ての群で統一した。曝露後、再度細胞をＨａｎｋｓ液で洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、３日後、コルターカウンターにより細胞を計測し、生細胞数を比較した。比較には一重項酸素に曝露していない非曝露群の細胞数を１００％として評価した。結果を表６に示す。表６より、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体を添加することによって一重項酸素に曝露された各群の生存率は被験物質無処置群（コントロール）と比較して改善されていることがわかる。曝露時にはこれらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体は取り除かれているため、細胞内グルタチオン濃度を高めることにより発生させた活性酸素による影響を軽減できることを示している。
美白試験
実施例１で得られたオドリコソウ、アイブライト、車前草、車前子、オリーブ、レンギョウ、イワタバコ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラック、クマツヅラ、ニガウリの抽出物とその加水分解物、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を用いて以下の試験によって、メラニン抑制活性を測定した。
メラニンを生成する細胞として、マウス由来の培養Ｂ１６メラノーマ細胞を用いてＦＢＳを終濃度１０％になるように添加した最少基礎培養液（ＭＥＭ）で培養し、該細胞を３×１０３ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で６ウェルプレートの各ウェルに６ｍｌ播種し、５日間ＣＯ２インキュベーター内で培養して培養液を交換した。実施例１の植物抽出物及びその加水分解物を１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、続けて３日間同条件で培養後、細胞を洗浄しスクレーパー処理により細胞を剥がし、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により可溶化して４７５ｎｍ、２６０ｎｍの吸光度を測定し、Ｓ４７５、Ｓ２６０とする。メラニン抑制率は被験物質を添加しない培養液で培養した細胞の４７５ｎｍ、２６０ｎｍにおける吸光度をＣ４７５、Ｃ２６０として次式１により計算した。ポジティブコントロールとしてビタミンＣ３ｍＭおよびコウジ酸３ｍＭを用いた。この結果を表７及び表８に示す。表７及び表８に示したように、被験物質添加によりメラニン生成が抑制され、被験物質が美白作用を示すことがわかる。
ウエスタンブロッティングによるシスチン膜輸送担体（ｘＣＴ）産生能の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、それぞれ、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように、そして、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、更に２４時間後、細胞を回収した。被験物質の代わりに細胞にエタノールのみを最終濃度１％となるように添加した群をコントロールとし、その活性を１とした場合の各被験物質群の活性を対コントロール比として評価した。細胞回収は、可溶化剤（０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）を加え、４℃、３０分振とう後、可溶化液を回収し１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心して細胞片を除去した。上清は蒸留水で透析し凍結乾燥にて乾固した。
次に蒸留水４００μｌで溶解し、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク定量後サンプル間のタンパク量補正を行った。これに任意の量のサンプルバッファーを加え、ウエスタンブロッティング用サンプルとした。サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）に浸し、室温で１時間ブロッキングした。洗浄液〔０．１％の牛血清アルブミンおよび０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ〕で洗浄後、一次抗体（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したｘＣＴに対するポリクローナル抗体）に浸し、室温で一晩反応させた。洗浄後、二次抗体（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したビオチン化抗ラビットイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酵素溶液（洗浄液で１ｍｇ／ｍｌに調製したアルカリフォスファターゼアビジンＤ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、基質液〔ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ベクターラボラトリー社製）〕に浸し、室温で１５分間反応させた。反応終了後、発色強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ １Ｄ（アマシャム ファルマシア バイオテック社製）により測定した。
ウエスタンブロッティングによる細胞抽出物のｘＣＴ産生能の測定結果を表９に示す。表９よりコントロールと比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はｘＣＴの発現を亢進することがわかる。
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるガンマグルタミルシステイン合成酵素の産生促進活性の測定
ＣＣＤ１０５９正常ヒト皮膚繊維芽細胞（大日本製薬株式会社製）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ各直径６ｃｍシャーレ（ヌンク社製）に播種し、１０％の非働化したＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３日間培養した。８０％コンフルエントになった細胞は０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換し、２４時間の馴化後、培養液を吸引除去し、新しい０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液に置換後、それぞれ、実施例１で得られたオリーブ、レンギョウ、キンモクセイ、ギンモクセイ、ライラックの抽出物とその加水分解物を最終濃度１００μｇ／ｍｌ、実施例３〜４で得られたＤＰＥ及び実施例５で得られたＤＰＥ配糖体を最終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように、そして、培養液中のエタノール含有率が１％以下となるよう添加し、８時間後、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ライフテックオリエンタル）を用いて、プロトコールに従い全ＲＮＡを回収した。
回収した全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ（東洋紡）により、ガンマグルタミルシステイン合成酵素ｍＲＮＡ及びＧ３ＰＤＨｍＲＮＡの発現促進活性を測定した。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子はハウスキーピング遺伝子として知られ、全ての細胞で恒常的に発現していることから、コントロール遺伝子として広く用いられている。ＰＣＲ用プライマーとして、ガンマグルタミルシステイン合成酵素は５’−ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＧ Ｇ−３’及び５’−ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ Ｇ−３’を用い、Ｇ３ＰＤＨは５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＣＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＣ−３’及び５’−ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＡ−３’を用いた。ＰＣＲの反応条件は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素が、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５６℃、１分、７４℃、１分を３５回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。一方、Ｇ３ＰＤＨは、９４℃、７分処理後、９４℃、１分、５８℃、１分、７４℃、１分を２０回繰り返した後、７４℃、１０分処理し、４℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を電気泳動後、エチジウムブロマイドにより染色し、デジタルカメラにより写真撮影後、その染色強度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ １Ｄ（アマシャム ファルマシア バイオテック社製）により測定した。被験物質無添加（エタノール１％）をコントロール群とし、発現量の評価は、ガンマグルタミルシステイン合成酵素ｍＲＮＡの染色強度をＧ３ＰＰＨ染色強度で割った値を１とし、被験物質添加時の発現量と比較検討を行った。表１０よりコントロール群と比べ、これらの植物抽出物及びその加水分解物、ＤＰＥとＤＰＥ配糖体はガンマグルタミルシステイン合成酵素の発現を亢進することがわかる。
［錠剤の製造］
実施例１で得られたオリーブ加水分解物とシスチンを用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合；重量％）
オリーブ加水分解物（乾燥重量） １６
シスチン １６
ビタミンＣ ２０
ニコチン酸アミド １
セルロース ２０
難消化性デキストリン ２４
ショ糖脂肪酸エステル ３
［錠剤の製造］
実施例３〜４で得た２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノールとグルタチオン含有酵母を用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組 成） （配合；重量％）
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール １０
乳糖 ６２
コーンスターチ １７
グァーガム １
グルタチオン含有酵母 １０
［ジュースの製造］
常法に従って、下記組成のジュースを製造した。
（組 成） （配合；重量％）
果糖ブトウ糖液糖 ５．００
クエン酸 １０．４
ビタミンＣ ０．５０
香料 ０．０２
色素 ０．１０
ライラック抽出物（乾燥重量） １０．０
精製水 ７３．９８
［スキンケア製品（ハンドクリーム）の製造］
常法に従って、下記組成のハンドクリームを製造した。
（組 成） （配合；重量％）
イソステアリン酸イソプロピル ８．０
ホホバ油 ６．０
セタノール ８．０
ステアリルアルコール ２．０
ポリオキシエチレンラウリルエーテル １．５
プロピレングリコール ６．０
ソルビトール １．０
パラベン ０．４
２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール ０．８
ビタミンＥ ０．５
ビタミンＣ １．０
香料 ０．１
精製水 ６４．７
産業上の利用の可能性
以上から明らかなように本発明の組成物は、グルタチオン増強活性を有することから、生体内におけるグルタチオンの供給量を増加させることができるので、グルタチオンの欠乏によって起こる疾患の予防、又は治療、特に、急性あるいは慢性アルコール肝障害や肝不全、肝炎等の肝臓疾患、又は肝機能の改善に有用である。更に、活性酸素等による酸化的ストレスによって起こる疾患、特に、紫外線暴露による細胞傷害、炎症、黒色化、シミ、ソバカス、タバコの喫煙等が要因の肺疾患、肺機能の改善、白内障、生理学的な加齢に伴う老化の予防、又は治療にも用いることができる。また、システインの供給源となるＳ含有化合物あるいはシステイン及び／又はシスチンを含むタンパク質や酵母と併用することで、グルタチオン増強活性は飛躍的に上がるので、本発明の組成物は上記疾患の予防、又は治療に対してより優れた効果を持つ組成物として有用である。
【配列表】
Claims (20)
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有するグルタチオン増強用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、ガンマグルタミルシステイン合成酵素産生促進用、グルタチオン還元酵素産生促進用、及びシスチン膜輸送担体産生促進用から選ばれる少なくとも一つの用途に用いられる組成物。
- グルタチオン増強成分として、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール又はその配糖体の少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含む、抗紫外線用及び／又は美白用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの欠乏によって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、酸化的ストレスによって起こる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、グルタチオンの細胞内合成促進による細胞傷害防御用及び／又は細胞傷害修復用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肝機能改善あるいは肝臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、腎機能改善あるいは腎臓疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、過酸化脂質等の過酸化物やフリーラジカルにより引き起こされる疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、肺機能改善あるいは肺疾患の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、白内障の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体、又は２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物、該植物の抽出物、該植物の加水分解物、或いは該植物の抽出物の加水分解物（但し、オリーブ及びその抽出物は除く）から選ばれる少なくとも一種を含有する、老化の予防用及び／又は治療用組成物。
- ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エタノール若しくはその配糖体を含む植物が、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、オドリコソウ（Ｌａｍｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、アイブライト（Ｅｕｐｈｒａｓｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ラカンカ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）、ジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、プランタゴ・プシリウム（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｐｓｙｌｌｉｕｍ）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ）、エキナセア（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、桜（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、プランタゴ・オバタ、（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ）、イクリニン（Ｐｒｕｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ）、イワタバコ（Ｃｏｎａｎｄｒｏｎ ｒａｍｏｎｄｉｏｉｄｅｓ．Ｓｉｅｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃ）、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、カンキョウニン（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、キンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ノゲイトウ（Ｃｅｌｏｓｉａ ａｒｇｅｎｔｅａ Ｌ．）、ヤブタバコ（Ｃａｒｐｅｓｉｕｍ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ）、バルロタ・ニグラ（Ｂａｌｌｏｔａ ｎｉｇｒａ）、オニク（Ｂｏｓｃｈｎｉａｋｉａ ｒｏｓｓｉｃａ）、フサフジウツギ（Ｂｕｄｄｌｅｊａ ｄａｖｉｄｉｉ）、スダジイ（Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ホンオニク（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｓａｌｓａ）、ジャゴケ（Ｃｏｎｏｃｅｐｈａｌｕｍ ｃｏｎｉｃｕｍ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｉｌｓ ｌａｎａｔａ）、キバナジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌｕｔｅａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、フォックスグローブ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｓｐ）、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、シナレンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｖｉｒｉｄｉｓｓｉｍａ）、トネリコ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マンナノキ（Ｆｒａｘｉｎｕｓ ｏｒｎｕｓ）、ウラジロ（Ｇｌｅｉｃｈｅｎｉａ ｇｌａｕｃａ）、羊膜草（Ｈｅｍｉｐｈｒａｇｍａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ボルネオソケイ（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍ）、シチヘンゲ（Ｌａｎｔａｎａ ｃａｍａｒａ）、テンニンソウ（Ｌｅｕｃｏｓｃｅｐｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ネズミモチ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、イボタノキ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉｕｍ）、シシンラン（Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｉｏｒｕｓ）、ホオノキ（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｂｏｖａｔａ）、ヨルソケイ（Ｎｙｃｔａｎｔｈｅｓ ａｒｂｏｒ−ｔｒｉｓｔｉｓ）、ギンモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペンステモン・プロケルス（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ ｐｒｏｃｅｒｕｓ）、コシオガマ（Ｐｈｔｈｅｉｒｏｓｐｅｒｍｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、プランタゴ・マヨル（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ）、ウワミズザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ｇｒａｙａｎａ）、ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、ピレナイイワタバコ（Ｒａｍｏｎｄａ ｍｙｃｏｎｉ）、チョロギ（Ｓｔａｃｈｙｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、ハシドイ（Ｓｙｒｉｎｇａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ジャスミン（Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｓａｍｂａｃ、Ｊａｓｍｉｎｕｍ ｏｆｆｉｎａｌｅ）、女貞子（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、クマツヅラ（Ｖｅｒｂｅｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）、オオイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｐｅｒｓｉｃａ）から選ばれる少なくとも１種類である、上記１、２、４〜１３のいずれかに記載の組成物。
- さらに、システインの供給源となるＳ含有化合物、システイン及び／又はシスチンを含むタンパク質、システイン及び／又はシスチンを含む酵母、及びビタミン類から選ばれる少なくとも１種類を含有する上記１〜１４のいずれかに記載の組成物。
- 組成物が経口用又は非経口用である、上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
- 組成物が、皮膚外用である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
- 組成物が、医薬である上記１〜１６のいずれかに記載の組成物。
- 組成物が、食品である上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
- 食品が、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、又は美容食品である上記１９記載の組成物。
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