JP2002047178A

JP2002047178A - Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤

Info

Publication number: JP2002047178A
Application number: JP2000235144A
Authority: JP
Inventors: Megumi Obayashi; 恵大林
Original assignee: Noevir Co Ltd
Current assignee: Noevir Co Ltd
Priority date: 2000-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2002-02-12

Abstract

(57)【要約】【課題】紫外線、特に長波長紫外線（ＵＶ
Ａ）照射により真皮線維芽細胞において促進されるＩ型
マトリックスメタロプロテアーゼの産生に対し、特異的
且つ高い阻害活性を示し、皮膚の光老化の防止に有効な
Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤を得
る。【解決手段】スルフヒドリル基を有する化合物
及びジスルフィド結合を有する化合物（ただしリポ酸及
びその塩並びに誘導体を除く）より選択した１種又は２
種以上を担体に含有させる。前記化合物としては、L-シ
ステイン，D-システイン，DL-システイン，L-シスチ
ン，D-シスチン，DL-シスチン，酸化型グルタチオン，
還元型グルタチオン，及びこれらの塩並びに誘導体が好
ましく使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、長波長紫外線（Ｕ
ＶＡ）照射により真皮線維芽細胞において促進されるＩ
型マトリックスメタロプロテアーゼの産生を特異的に阻
害し得るＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、マトリックス線維の分解を促進す
るマトリックスメタロプロテアーゼと病態との関係につ
いて、多くの知見が得られている。真皮においては、紫
外線照射により線維芽細胞におけるＩ型マトリックスメ
タロプロテアーゼの産生が誘導され、その結果、真皮細
胞外マトリックスの主成分であるコラーゲンの分解が促
進され、しわの形成や弾性の低下といった皮膚の老化が
進行することが知られている。

【０００３】かかる紫外線により促進される皮膚の老化
を改善し、或いは防止するべく、紫外線吸収剤や散乱剤
の皮膚外用剤への配合や、紫外線照射により生じる活性
酸素種の消去作用を有する物質のスクリーニングが盛ん
に行われてきた。それと同時に、上記したようなコラー
ゲンの分解に関与するＩ型マトリックスメタロプロテア
ーゼの活性を阻害する物質のスクリーニングも行われて
いる。

【０００４】たとえば、アシルフェニルグリシン誘導体
（特開平７−１０１９２５）、ザクロ実，レモンバーム
実及び葉，グアバ，ハマメリスといった植物の抽出物
（特開平７−１９６５２６，同７−２９１８７３，同８
−２８３１３３）、ポリポレン酸及びこれを含有するホ
ウロクタケ抽出物（特開平９−４０５５２）、ジカルボ
ン酸（特開平９−１２４４７２）、アスペルギルス属微
生物の産生物質（特開平９−２４１２８７）などが開示
されている。

【０００５】しかしながら、これまでに得られたＩ型マ
トリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の中には、細菌性
のコラゲナーゼ等に対し強い活性を示し、間質系のＩ型
マトリックスメタロプロテアーゼに対する特異性の低い
ものや、阻害活性の十分でないもの、安定性に欠けるも
のも存在していた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明において
は、紫外線、特にＵＶＡ照射により真皮線維芽細胞にお
いて促進されるＩ型マトリックスメタロプロテアーゼの
産生に対し、特異的且つ高い阻害活性を示すＩ型マトリ
ックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤を得ることを目的
とした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するべく
種々検討した結果、スルフヒドリル基を有する化合物、
又はリポ酸以外のジスルフィド結合を有する化合物が、
ＵＶＡ照射により促進される真皮線維芽細胞におけるＩ
型マトリックスメタロプロテアーゼ産生に対し、特異的
な阻害作用を示すことを見いだし、本発明を完成するに
至った。

【０００８】すなわち本発明は、スルフヒドリル基を有
する化合物及び、リポ酸及びその塩並びに誘導体以外の
ジスルフィド結合を有する化合物より選択した１種又は
２種以上を、担体に含有させてＩ型マトリックスメタロ
プロテアーゼ産生阻害剤とする。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明において用いるスルフヒド
リル基を有する化合物としては、L-システイン，D-シス
テイン，DL-システイン，L-ホモシステイン，D-ホモシ
ステイン，DL-ホモシステイン，システアミン，ジヒド
ロリポ酸，システイニルグリシン，補酵素Ａ，還元型グ
ルタチオン，還元型メタロチオネイン，還元型チオレド
キシン等が挙げられ、ジスルフィド結合を有する化合物
としては、L-シスチン，D-シスチン，DL-シスチン，L-
ホモシスチン，D-ホモシスチン，DL-ホモシスチン，酸
化型グルタチオン，酸化型メタロチオネイン，酸化型チ
オレドキシン等が挙げられる。さらにこれらのアルカリ
金属塩，塩酸塩，硫酸塩，酢酸塩，乳酸塩，アンモニウ
ム塩といった塩や、アルキル又はアルケニルエステル，
コレステリルエステル，ホスファチジルエステル，アミ
ド，配糖体などの誘導体をも用いることができる。本発
明においては、前記スルフヒドリル基を有する化合物及
び、リポ酸及びその塩並びに誘導体以外のジスルフィド
結合を有する化合物より、１種又は２種以上を選択して
用いる。

【００１０】上記のスルフヒドリル基を有する化合物及
び、リポ酸及びその塩並びに誘導体以外のジスルフィド
結合を有する化合物の中でも、L-システイン，D-システ
イン，DL-システイン，L-シスチン，D-シスチン，DL-シ
スチン，酸化型グルタチオン，還元型グルタチオン及び
これらの塩並びに誘導体が、Ｉ型マトリックスメタロプ
ロテアーゼ産生阻害作用の点から、好ましく使用でき
る。

【００１１】本発明においては、上記スルフヒドリル基
を有する化合物及び、リポ酸及びその塩並びに誘導体以
外のジスルフィド結合を有する化合物より選択した１種
又は２種以上を担体に含有させて、Ｉ型マトリックスメ
タロプロテアーゼ産生阻害剤とする。担体としては、
水、エタノール，プロパノール，ブタノール等低級アル
コールなどの極性有機溶媒、これらの混合液といった液
状担体、各種乳濁液、各種クリーム基剤、軟膏基剤、ゲ
ル、粉体などが用いられる。従って、本発明に係るＩ型
マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤は、ローシ
ョン剤，懸濁剤，乳剤，クリーム剤，軟膏剤，ゲル剤，
粉末剤，散剤，顆粒剤等の形態で提供することができ
る。また、リポソームやマイクロカプセルに内包させた
状態とすることもできる。なお、本発明に係るＩ型マト
リックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤には、本発明の
特徴を損なわない範囲で、抗酸化剤，防菌防黴剤，紫外
線吸収剤等の安定化剤や、吸収促進剤等を添加すること
もできる。

【００１２】本発明に係るＩ型マトリックスメタロプロ
テアーゼ産生阻害剤における、スルフヒドリル基を有す
る化合物及び、リポ酸及びその塩並びに誘導体以外のジ
スルフィド結合を有する化合物より選択した１種又は２
種以上の含有量は、用いる担体の種類及び剤型により異
なるが、０．０００１重量％〜１．０重量％程度とする
のが適切である。

【００１３】

【実施例】さらに実施例により、本発明について詳細に
説明する。

【００１４】［実施例１〜実施例５］Ｉ型マトリック
スメタロプロテアーゼ産生阻害剤L-システイン，還元型
グルタチオン，酸化型グルタチオンをそれぞれ１０ｍＭ
となるように精製水に溶解して、実施例１，実施例３，
実施例４とし、L-シスチンを１０ｍＭとなるように９
９．５容量％エタノールに溶解して、実施例２とし、グ
ルタチオンエチルエステルを１０ｍＭとなるように５０
容量％エタノール水溶液に溶解して、実施例５とした。

【００１５】上記の実施例１〜実施例５について、ＵＶ
Ａを照射した際のＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ
産生に対する阻害効果を次のようにして評価した。ま
ず、ヒト線維芽細胞を２×１０⁴個／ウェルとなるよう
に９６穴プレートに播種し、牛胎仔血清５(w/v)％を添
加したダルベッコ基礎培地（ＤＭＥＭ）にて、３７℃で
２４時間培養した。Ｈａｎｋｓ(+)液で洗浄した後、培
地を、各最終濃度の試料を含むＨａｎｋｓ(+)液０．１
ｍｌに交換し、４０Ｊ／ｃｍ²のＵＶＡを照射した。次
いでＨａｎｋｓ(+)液で洗浄し、培地を０．１(w/v)％牛
血清アルブミンを含有するＤＭＥＭに交換して３７℃で
２４時間培養した後、生細胞数を計測し、培地上清中の
Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ活性を測定した。
また比較のため、代表的な抗酸化剤であるビタミンＥに
ついても、同様に評価を行った。

【００１６】培地上清中のＩ型マトリックスメタロプロ
テアーゼ活性は、最終濃度０．０４ｍｇ／ｍｌのトリプ
シンを添加して３７℃で１５分間インキュベートした
後、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤
を添加し、これについて、フルオレセインイソチオシア
ネート（ＦＩＴＣ）で標識したＩ型コラーゲンを基質と
して用いて測定した。すなわち、０．２５ｍｇ／ｍｌの
ＦＩＴＣ標識Ｉ型コラーゲンを含有する５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．２Ｍ塩化ナトリウム，５
ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２(w/v)％アジ化ナトリ
ウムを含む）５０μｌを、前記トリプシン処理した培地
上清５０μｌに加え、遮光下にて３７℃で２時間反応さ
せた。次いで４０ｍＭのο-フェナントロリン（phenant
hroline）５μｌを加えて反応を停止した後、３７℃に
て３０分間コラーゲンの変性処理を行い、エタノールと
０．１７Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５、０．６７Ｍ
塩化ナトリウムを含む）との容量比７：３の混合液５０
μｌを添加し、変性されたコラーゲンのみを抽出した。
２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清の蛍光強
度を励起波長４９５ｎｍ，蛍光波長５２０ｎｍで測定し
た。

【００１７】実施例１〜実施例５について、試料の最終
濃度（各実施例に含まれるスルフヒドリル基を有する化
合物もしくはジスルフィド結合を有する化合物の最終濃
度で示す）と、Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ活
性との関係を、それぞれ表１〜表５に示した。また、試
料を添加しない場合の前記酵素活性を１００として示し
たＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生インデック
スについても、各表中に併せて示した。ビタミンＥにつ
いては、表６に示した。

【００１８】

【表１】

【００１９】

【表２】

【００２０】

【表３】

【００２１】

【表４】

【００２２】

【表５】

【００２３】

【表６】

【００２４】表１〜表５において、実施例を添加しない
系では、４０Ｊ／ｃｍ²のＵＶＡを照射することによ
り、培地中に産生，分泌されたＩ型マトリックスメタロ
プロテアーゼは４０倍〜６０倍近くに増加することが認
められる。しかしながら、実施例１添加系ではL-システ
イン濃度にして０．０６２５ｍＭで約３０％まで、０．
２５ｍＭ〜１ｍＭで１６〜１８％までＩ型マトリックス
メタロプロテアーゼの産生が抑制されていた。実施例２
添加系では、L-シスチン濃度にして０．２５ｍＭで２７
％まで、実施例３添加系では、還元型グルタチオン濃度
にして０．２５ｍＭで６４％まで、実施例４添加系で
は、酸化型グルタチオン濃度にして０．２５ｍＭで６０
％まで、１ｍＭで５０％まで、実施例５添加系では、グ
ルタチオンエチルエステル濃度にして０．０６２５ｍＭ
〜０．２５ｍＭでほぼ６０％まで、１ｍＭでほぼ５０％
までＩ型マトリックスメタロプロテアーゼの産生が抑制
されていた。これに対し表６より明らかなように、抗酸
化剤であるビタミンＥについては、同じ濃度範囲で有意
なＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制効果は
認められていなかった。

【００２５】また、各実施例に含有されるスルフヒドリ
ル基を有する化合物もしくはジスルフィド結合を有する
化合物について、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀値）を算出し
た結果を表７に示した。

【００２６】

【表７】

【００２７】表６より、実施例１〜実施例５に含有され
るスルフヒドリル基を有する化合物もしくはジスルフィ
ド結合を有する化合物のうちでは、L-システインが最も
低濃度で有効であることが示される。還元型グルタチオ
ン，酸化型グルタチオン及びグルタチオンのエチルエス
テルについては、いずれもほぼ同程度のＩ型マトリック
スメタロプロテアーゼ産生阻害作用が認められていた。

【００２８】続いて、本発明に係る他のＩ型マトリック
スメタロプロテアーゼ産生阻害剤について以下に示す。

【００２９】［実施例６］ローション状Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）エタノール１０．００（重量％）（２）ヒドロキシエチルセルロース１．００（３）L-システイン塩酸塩０．０２（４）パラオキシ安息香酸メチル０．１０（５）精製水８８．８８製法：(1)〜(4)を順次(5)に添加し、均一に溶解する。

【００３０】［実施例７］乳剤型Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）ステアリン酸０．２０（重量％）（２）セタノール１．５０（３）ワセリン３．００（４）流動パラフィン７．００（５）ポリオキシエチレン(10E.O.)モノオレイン酸１．５０エステル（６）酢酸トコフェロール０．２５（７）グリセリン５．００（８）パラオキシ安息香酸メチル０．１０（９）トリエタノールアミン１．００（10）L-シスチン０．０５（11）精製水８０．４０製法：(1)〜(6)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解
し、７０℃に保つ。一方、(7)〜(11)の水相成分を混
合，加熱して均一とし、７０℃とする。この水相成分に
前記油相成分を撹拌しながら徐々に添加して乳化し、冷
却する。

【００３１】［実施例８］ゲル状Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）ジプロピレングリコール１０．００（重量％）（２）カルボキシビニルポリマー０．５０（３）水酸化カリウム０．１０（４）パラオキシ安息香酸メチル０．１０（５）精製水８９．２５（６）L-システアミン０．０５製法：(5)に(2)を均一に溶解した後、(1)に(4)を溶解し
て添加し、次いで(3)を加えて増粘させ、(6)を添加，混
合する。

【００３２】［実施例９］水中油型クリーム状Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）ミツロウ６．０（重量％）（２）セタノール５．０（３）還元ラノリン８．０（４）スクワラン２７．５（５）グリセリル脂肪酸エステル４．０（６）親油型グリセリルモノステアリン酸エステル２．０（７）ポリオキシエチレン(20E.O.)ソルビタン５．０モノラウリン酸エステル（８）プロピレングリコール５．０（９）パラオキシ安息香酸メチル０．１（10）精製水３７．３（11）L-ホモシステイン０．１製法：(1)〜(7)の油相成分を混合，加熱して均一に溶解
し、７５℃に保つ。一方、(8)〜(10)の水相成分を混
合，加熱して均一とし、７５℃とする。この水相成分に
前記油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサー
にて均一に乳化し、冷却後４０℃にて(11)を添加，混合
する。

【００３３】［実施例１０］油中水型クリーム状Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）スクワラン３８．００（重量％）（２）グリセリルジイソステアリン酸エステル３．００（３）ホスファチジルグルタチオン０．１５（４）有機変性ベントナイト１．５０（５）シリコーン処理酸化チタン３．００（６）1,3-ブチレングリコール５．００（７）パラオキシ安息香酸メチル０．１０（８）精製水４９．２５製法：(1)〜(4)を混合，加熱して溶解し、(5)を分散し
て７０℃とし、油相とする。一方、(7)を(6)に溶解して
(8)に加えて混合し、７０℃に加熱する。前記油相に水
相を添加し、ホモジナイザー処理して乳化後冷却する。

【００３４】［実施例１１］水中油型乳剤性軟膏型Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（１）白色ワセリン２５．００（重量％）（２）ステアリルアルコール２５．００（３）シスチンジエチルエステル０．１０（４）グリセリン１２．００（５）ラウリル硫酸ナトリウム１．００（６）パラオキシ安息香酸メチル０．１０（７）精製水３６．７０（８）システイニルグリシン０．１０製法：(1)〜(5)の油相成分を混合，溶解して均一とし、
７５℃に加熱する。一方、(6)を(7)に溶解して７５℃に
加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後
４０℃にて(8)を添加，混合する。

【００３５】［実施例１２］Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤含有リポソーム（１）L-システイン１．０(w/v)％水溶液５０．０ｍｌ（２）補酵素Ａ１．０(w/v)％水溶液５０．０ｍｌ（３）大豆レシチン８０．０ｇ（４）d-δ-トコフェロール０．５ｇ製法：(1)，(2)を混合し、これに(4)を添加，混合した
(3)を添加して５５℃で懸濁し、次いで超音波処理して
リポソームを調製し、遠心分離により回収する。

【００３６】上記の実施例６〜実施例１２について、実
使用試験によりＵＶＡに起因する光老化に対する防止効
果を評価した。実使用試験は、日常戸外で作業する２０
才〜５０才代の男女パネラー２０名を１群とし、各群に
４月〜７月の４カ月間、１日２回実施例及び比較例のそ
れぞれをブラインドにて使用させて行った。なお比較例
１〜比較例７は、実施例６〜実施例１２において、スル
フヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有
する化合物のすべてを没食子酸ナトリウムに代替して調
製した。実施例１２及び比較例７については、リポソー
ム１５ｇを精製水８５ｇに分散して使用させた。

【００３７】光老化防止効果は、各パネラーについて、
使用試験開始前及び使用試験終了後の皮膚のしわ及び皮
膚弾性を比較して評価した。皮膚のしわは写真撮影及び
皮膚表面のレプリカの画像解析により評価し、皮膚弾性
はキュートメーターを用いた測定結果により評価した。
皮膚のしわ及び皮膚弾性について、使用試験終了後に改
善が見られたかどうかを判断し、皮膚のしわについては
「改善」，「やや改善」，「変化なし」，「やや悪
化」，「悪化」の５段階で、皮膚弾性については「向
上」，「やや向上」，「変化なし」，「やや低下」，
「低下」の５段階で評価し、各評価を得たパネラー数に
て表８に示した。

【００３８】

【表８】

【００３９】表８より明らかなように、本発明に係る実
施例使用群では、いずれにおいても皮膚のしわの悪化傾
向及び皮膚弾性の低下傾向を認めたパネラーは存在せ
ず、皮膚のしわについては４５％以上のパネラーで改善
傾向が認められ、皮膚弾性については６５％以上のパネ
ラーで向上傾向が認められていた。これに対し、本発明
の実施例において含まれるスルフヒドリル基を有する化
合物及びジスルフィド結合を有する化合物のすべてを、
抗酸化剤である没食子酸ナトリウムに代替した比較例使
用群では、皮膚のしわ及び皮膚弾性について明確な改善
もしくは向上を認めたパネラーは存在せず、皮膚のしわ
については３５％以上のパネラーで悪化傾向を認めてお
り、皮膚弾性については４５％以上のパネラーで低下傾
向を認めていた。

【００４０】すなわち、本発明の実施例使用群では、Ｕ
ＶＡ照射により誘導されるＩ型マトリックスメタロプロ
テアーゼの産生が阻害された結果、真皮細胞外マトリッ
クスの構成成分であるコラーゲンの分解が有効に抑制さ
れて、皮膚のしわの増加や皮膚弾性の低下といった光老
化現象が良好に抑制されたと考えられる。一方、抗酸化
剤を配合した比較例使用群では、かかる効果は十分には
認められなかった。

【００４１】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明により、紫
外線、特にＵＶＡ照射により真皮線維芽細胞において促
進されるＩ型マトリックスメタロプロテアーゼの産生に
対し、特異的且つ高い阻害活性を示すＩ型マトリックス
メタロプロテアーゼ産生阻害剤を得ることができ、これ
により、皮膚の光老化を有効に防止することが可能とな
った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4C083 AA082 AB032 AB242 AB442 AC012 AC022 AC072 AC102 AC122 AC242 AC402 AC422 AC442 AC482 AC542 AC581 AC582 AC782 AD042 AD092 AD282 AD411 AD412 AD472 AD512 AD572 AD662 CC04 CC05 DD23 DD27 DD31 DD32 DD33 DD41 DD45 EE06 EE07 EE13 EE16 FF05 4C084 AA02 BA01 BA08 BA15 BA23 CA59 DC31 MA63 NA14 ZA891 ZC201 ZC512 4C206 AA01 AA02 JA58 JA62 MA01 MA04 MA83 NA14 ZA89 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スルフヒドリル基を有する化合物及びジ
スルフィド結合を有する化合物（ただしリポ酸及びその
塩並びに誘導体を除く）より選択した１種又は２種以上
を含有して成る、Ｉ型マトリックスメタロプロテアーゼ
産生阻害剤。
【請求項２】スルフヒドリル基を有する化合物及びジ
スルフィド結合を有する化合物が、L-システイン，D-シ
ステイン，DL-システイン，L-シスチン，D-シスチン，D
L-シスチン，酸化型グルタチオン，還元型グルタチオ
ン，及びこれらの塩並びに誘導体であることを特徴とす
る、請求項１に記載のＩ型マトリックスメタロプロテア
ーゼ産生阻害剤。