JP2023145542A - キメラ抗原受容体及びその使用方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体(CAR)、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びCARを生成するように遺伝子改変された細胞の提供。【解決手段】特異的結合対の第1のメンバー、第1の調節ドメイン、二量体化対の第1のメンバー、特異的結合対の第1のメンバーと第1の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインとを含む第1のポリペプチド、及び膜貫通ドメイン、第2の調節ドメイン、二量体化対の第2のメンバー、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第2のポリペプチドを含むか、又は特異的結合対の第1のメンバー、調節ドメイン、二量体化対の第1のメンバー、特異的結合対の第1のメンバーと調節ドメインとの間に介在する膜通ドメインとを含む第1のポリペプチド、及び二量体化対の第2のメンバー、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第2のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体の条件付活性CAR。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2013年2月15日に出願された米国特許仮出願第61/765,585号の利益を主張するものである。
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号EY016546及びGM101782の下で、政府支援を得て行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
配列表は、2014年2月13日に作成され、153KBのサイズを有する、テキストファイル「UCSF-464WO SeqList_ST25.txt」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
序論
細胞ベースの養子免疫療法では、患者から単離された免疫細胞は、後に細胞が患者に移し戻された後に新しい治療機能を行うことを可能にする合成タンパク質を発現するように改変され得る。かかる合成タンパク質の例は、キメラ抗原受容体(CAR)である。現在使用されるCARの例は、細胞外認識ドメイン(例えば抗原結合ドメイン)、膜貫通ドメイン、及び1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合である。抗原係合の際に、CARの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞において、腫瘍細胞の死を誘導するための細胞溶解分子の放出等の、活性化関連応答を開始させ得る。しかしながら、かかるCARは、薬理学的に制御される能力を有しない。当技術において、薬理学的に制御することのできる条件付で活性化可能なCARの必要性が存在する。
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体(CAR)、及び該CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、該CARを生成するように遺伝子改変された細胞を提供する。本開示のCARは、様々な方法において使用され得、これらも開示される。
[本発明1001]
ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体(CAR)であって、
a)第1のポリペプチドであって、
i)特異的結合対の第1のメンバーと、
ii)第1の調節ドメインと、
iii)二量体化対の第1のメンバーと、
iv)特異的結合対の前記第1のメンバーと前記第1の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと
を含む、第1のポリペプチド;及び
b)第2のポリペプチドであって、
i)膜貫通ドメインと、
ii)第2の調節ドメインと、
iii)前記二量体化対の第2のメンバーと、
iv)細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、前記第2のポリペプチド
を含むか、または
a)第1のポリペプチドであって、
i)特異的結合対の第1のメンバーと、
ii)調節ドメインと、
iii)二量体化対の第1のメンバーと、
iv)特異的結合対の前記第1のメンバーと前記調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと
を含む、第1のポリペプチド;及び
b)第2のポリペプチドであって、
i)前記二量体化対の第2のメンバーと、
ii)細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、第2のポリペプチド
を含む、前記ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体(CAR)。
[本発明1002]
前記第1のポリペプチドが、前記特異的結合対の前記第1のメンバーと前記膜貫通ドメインとの間に介在するヒンジ領域を含む、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1003]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、抗体もしくは抗体断片、リガンド、または受容体である、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1004]
前記ヒンジ領域が免疫グロブリンIgGヒンジ領域またはCD8由来のヒンジである、本発明1002のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1005]
前記第1及び第2の調節ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、BTLA、OX-40、CD27、CD30、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、及びCD28から選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1006]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ZAP70及びCD3-ゼータから選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1007]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含む、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1008]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、小分子二量体化剤の存在下でホモ二量体を形成する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1009]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、小分子二量体化剤の存在下でヘテロ二量体を形成する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1010]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、
a)FK506結合タンパク質(FKBP)及びFKBP、
b)FKBP及びカルシニューリン触媒サブユニットA(CnA)、
c)FKBP及びシクロフィリン、
d)FKBP及びFKBP-ラパマイシン関連タンパク質(FRB)、
e)ジャイレースB(GyrB)及びGryB、
f)ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)及びDHFR、
g)DmrB及びDmrB、
h)PYL及びABI、
i)Cry2及びCIP、
j)GAI及びGID1
から選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1011]
i)前記第1及び第2の調節ドメインが4-1BBに由来し、
ii)前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーがFKBP及びFRBであり、かつ
ii)前記シグナル伝達ドメインがITAMを含む、
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1012]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、一本鎖Fvである、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1013]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、細胞上、固体表面上、または脂質二重層に存在するエピトープに結合する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1014]
前記細胞が癌細胞である、本発明1013のヘテロ二量体の条件付活性CAR。
[本発明1015]
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARを生成するように遺伝子改変された、哺乳類細胞。
[本発明1016]
幹細胞、前駆細胞、または幹細胞もしくは前駆細胞から誘導された細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1017]
Tリンパ球またはNK細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1018]
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1019]
前記ヌクレオチド配列が、Tリンパ球特異的プロモーターまたはNK細胞特異的プロモーターに機能的に連結される、本発明1018の核酸。
[本発明1020]
インビトロ転写RNAである、本発明1018の核酸。
[本発明1021]
本発明1018の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
[本発明1022]
Tリンパ球を二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバーと接触させる工程を含む、Tリンパ球を活性化する方法であって、前記Tリンパ球が、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARを生成するように遺伝子改変され、前記二量体化剤及び特異的結合対の前記第2のメンバーの存在下で、前記ヘテロ二量体の条件付活性CARが二量体化して、前記Tリンパ球を活性化し、それにより活性化されたTリンパ球を生成する、前記方法。
[本発明1023]
特異的結合対の前記第2のメンバーが抗原である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記接触がインビボで生じる、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記活性化されたTリンパ球が標的細胞の死滅を媒介する、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記活性化されたTリンパ球が、IL-2及び/またはIFN-γを生成する、本発明1022の方法。
[本発明1027]
前記標的細胞が癌細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
前記ヘテロ二量体の条件付活性CARの前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、癌細胞上のエピトープに対して特異的な抗体である、本発明1022の方法。
[本発明1029]
本発明1015の細胞を作製する方法であって、哺乳類細胞を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程、または哺乳類細胞を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含むRNAで遺伝子改変する工程を含む、前記方法。
[本発明1030]
前記遺伝子改変がエクスビボで実行される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記細胞が、Tリンパ球、幹細胞、NK細胞、前駆細胞、幹細胞由来の細胞、または前駆細胞由来の細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
個体における癌を治療する方法であって、
i)前記個体から得られたTリンパ球を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程であって、前記ヘテロ二量体の条件付活性CARの抗原結合ドメインが、前記個体における癌細胞上のエピトープに対して特異的であり、かつ前記遺伝子改変がエクスビボで実行される、工程;
ii)前記遺伝子改変されたTリンパ球を前記個体に導入する工程;ならびに
iii)前記個体に、有効量の二量体化剤を投与する工程であって、前記二量体化剤が前記ヘテロ二量体の条件付活性CARの二量体化を誘導し、前記二量体化が前記遺伝子改変されたTリンパ球の活性化及び前記癌細胞の死滅を提供し、それにより前記癌を治療する工程
を含む、前記方法。
[本発明1033]
前記二量体化剤がラパログである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
宿主細胞を二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバーと接触させる工程を含む、宿主細胞の活性を調節する方法であって、Tリンパ球が、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性CARを生成するように遺伝子改変され、かつ前記二量体化剤及び特異的結合対の前記第2のメンバーの存在下で、前記ヘテロ二量体の条件付活性CARが二量体化して、宿主細胞の少なくとも1つの活性を調節する、前記方法。
[本発明1035]
前記活性が、増殖、細胞生存、アポトーシス、遺伝子発現、または免疫活性化である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
特異的結合対の前記第2のメンバーが抗原である、本発明1034の方法。
構築物番号122のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号122のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号123のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号123のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号125のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号125のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号126のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号168のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号168のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号169のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号169のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号169のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号170のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号170のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号197のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号197のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号206のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号206のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号206のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号207のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号207のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号199のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号199のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号199のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 5つのオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 対照ジャーカット株によるIL-2生成を描写する。 CAR構築物「122+206」と「197+206」との間の比較を描写する。 オンスイッチCAR「197+206」を用いて細胞毒性データを描写する。 CAR構築物「122+199」、「197+199」、及び「122+168」を使用するT細胞活性化データを描写する。 例示的なオンスイッチCARの略図である。 様々な例示的なオンスイッチCARを描写する。 様々な例示的なオンスイッチCARを描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、3つの異なるオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成を描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチCAR及び従来のCARを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチCAR及び従来のCARを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチCAR及び従来のCARを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチCAR及び従来のCARを描写する。 構築物番号270のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号270のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号300のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号300のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号336のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号336のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号337のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号337のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号357のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号357のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号365のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号365のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号366のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号366のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号367のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号367のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号398のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号398のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号399のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号399のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号400のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号400のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号358のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号358のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
定義
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの、ポリマー形態のヌクレオチドを指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、あるいは、プリン及びピリミジン塩基、または他の天然、化学もしくは生化学改変された、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片を含み、Fab、Fv、scFv、及びFd断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、例えば無傷抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')、及びFv断片;二重特異性抗体;直鎖状抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995));一本鎖抗体分子;ならびに抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる、それぞれが単一抗原結合部位を有する、2つの同一な抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Fc」断片と、を生成する。ペプシン治療は、2つの抗原結合部位を有し、かつ抗原を依然として架橋連結することのできるF(ab')を産出する。
「一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のV及びVドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、Fvポリペプチドは、VドメインとVドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、sFvが、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。sFvの確認には、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、2つの物質の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数(Kd)で表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも1倍高く、少なくとも2倍高く、少なくとも3倍高く、少なくとも4倍高く、少なくとも5倍高く、少なくとも6倍高く、少なくとも7倍高く、少なくとも8倍高く、少なくとも9倍高く、少なくとも10倍高く、少なくとも20倍高く、少なくとも30倍高く、少なくとも40倍高く、少なくとも50倍高く、少なくとも60倍高く、少なくとも70倍高く、少なくとも80倍高く、少なくとも90倍高く、少なくとも100倍高く、もしくは少なくとも1000倍高く、またはそれ以上であり得る。抗体の標的タンパク質への親和性は、例えば約100ナノモル(nM)~約0.1nM、約100nM~約1ピコモル(pM)、または約100nM~約1フェムトモル(fM)またはそれ以上であり得る。本明細書で使用される場合、「結合力」という用語は、2つ以上の物質の複合体の、希釈後の解離への抵抗性を指す。「免疫反応性」及び「優先的結合」という用語は、抗体及び/または抗原結合断片に関して、本明細書で交換可能に使用される。
「結合」という用語は、例えば、塩橋及び水橋等の相互作用を含む、共有結合性、静電気的、疎水性、ならびにイオン性、及び/または水素結合相互作用による、2つの分子間の直接会合を指す。非特異的結合は、約10-7M未満の親和性での結合、例えば、10-6M、10-5M、10-4M等の親和性での結合を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、隣接するポリペプチド領域に構造的可撓性及び間隔を与える、可撓性ポリペプチドコネクタ領域(本明細書では「ヒンジ」または「スペーサ」とも称される)を指し、自然または合成ポリペプチドから構成され得る。免疫グロブリン(例えばIgG1)由来の「ヒンジ領域」は、一般的に、ヒトIgG1のGlu216からPro230に伸展していると定義される(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド(S-S)結合を形成する第1のシステイン残基及び最終システイン残基を、同じ位置に配置することによって、IgG1配列と整列し得る。ヒンジ領域は、自然発生または非自然発生であり得、米国特許第5,677,425号に記載される変性ヒンジ領域を含むがこれに限定されない。ヒンジ領域は、CH1ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスに由来する、完全ヒンジ領域を含み得る。「ヒンジ領域」という用語は、CD8、及び、隣接する領域に可撓性及び間隔を提供することにおいて同様の機能を提供する他の受容体に由来する領域も含み得る。
「単離」ポリペプチドは、その自然環境の成分から、識別されて分離ならびに/または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、ポリペプチドに対する診断もしくは治療用途に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、(1)ローリー法で判定される抗体の重量で、90重量%を超える、95重量%を超える、もしくは98重量%を超える、例えば99重量%を超えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターの使用によりN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または(3)クーマシーブルーまたは銀染色を使用して、還元または非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により均一になるまで、精製され得る。ポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分は存在し得ないため、単離ポリペプチドは、組み換え細胞内の原位置ポリペプチドを含む。いくつかの例では、単離ポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程によって調製され得る。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、一般的に、骨髄内で生成される造血幹細胞(HSC)に由来する、白血球(white blood cell)(白血球(leukocyte))を含む。「免疫細胞」は、例えば、リンパ球(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞)、及び骨髄由来細胞(好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞)を含む。
「T細胞」は、Tヘルパー細胞(CD4細胞)、細胞毒性T細胞(CD8細胞)、T制御性細胞(Treg)及びガンマデルタT細胞を含む、CD3を発現する免疫細胞のすべての種類を含む。
「細胞毒性細胞」は、CD8T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、及び好中球、を含み、これらの細胞は細胞毒性応答を媒介することができる。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般的に、分化多能性または多能性幹細胞を含む。「幹細胞」は、例えば、胚幹細胞(ES)、間葉幹細胞(MSC)、誘導分化多能性幹細胞(iPS)、及び方向付けされた前駆細胞(造血幹細胞(HSC)、骨髄由来細胞等)を含む。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理及び/または生理効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で、予防的であり得、かつ/または疾患及び/もしくは疾患に帰属する逆効果に対する部分的もしくは完全治療の点で、治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳類の、例えばヒトの疾患のあらゆる治療を網羅し、かつ、(a)疾患が、その疾患にかかりやすくあり得るがまだそれを有すると診断されていない患者内で、発症することを防止すること、(b)疾患を抑制すること、すなわちその進行を阻止すること、(c)疾患を軽減すること、すなわち疾患を後退させること、を含む。
本明細書で交換可能に使用される、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、哺乳類を指し、ネズミ類(例えばラット、マウス)、ウサギ類(例えばウサギ)、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、有蹄類(例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)等を含むがこれらに限定されない。
「治療的有効量」または「効果的な量」は、疾患の治療のために、哺乳類または他の対象に投与されたときに、疾患に対するかかる治療をもたらすのに十分である、物質の量または2つの物質の組み合わせた量を指す。「治療的有効量」は、物質(複数可)、疾患、及びその重症度、ならびに、治療される対象の年齢、体重等に応じて変動し得る。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の10分の1までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、かつ、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って、これらも本発明に包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの1つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、これから説明される。本明細書で言及されるすべての出版物は、それとの関連で出版物が引用される方法及び/または物質を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で及び添付の請求項において使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「キメラ抗原受容体」への言及は、複数のかかるキメラ抗原受容体を含み、「二量体化剤結合対」への言及は、1つ以上の二量体化剤結合対及び当業者に既知のその等価物等を含む。請求項は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の列挙に関連する、「単に」、「のみ」等のような排他的用語の使用、または「否定的」限定の使用に対する、先行詞の役割を果たすことが意図される。
明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせで提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の好適な副組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
詳細な説明
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体(CAR)、及び該CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、該CARを生成するように遺伝子改変された細胞を提供する。本開示のCARは、様々な方法において使用され得、これらも開示される。
ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は簡素にするために本明細書で「CAR」と称される。
いくつかの実施形態では、本開示のCARは、a)第1のポリペプチドであって、i)特異的結合対のメンバー(例えば抗原結合ドメイン)と、ii)第1の調節ドメインと、iii)二量体化対の第1のメンバーと、iv)特異的結合対のメンバー(例えば抗原結合ドメイン)と第1の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第1のポリペプチド、及びb)第2のポリペプチドであって、i)膜貫通ドメインと、ii)第2の調節ドメインと、iii)二量体化対の第2のメンバーと、iv)細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第2のポリペプチド、を含む。調節ドメインは、共刺激ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のCARは、a)第1のポリペプチドであって、i)特異的結合対のメンバー(例えば抗原結合ドメイン)と、ii)第1の共刺激ドメインと、iii)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第1のメンバーと、iv)特異的結合対のメンバー(例えば抗原結合ドメイン)と第1の共刺激ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第1のポリペプチド、及びb)第2のポリペプチドであって、i)膜貫通ドメインと、ii)第2の共刺激ドメインと、iii)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第2のメンバーと、iv)細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第2のポリペプチド、を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCARは、a)第1のポリペプチドであって、i)特異的結合対(例えば抗原結合ドメイン)のメンバーと、ii)調節ドメインと、iii)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第1のメンバーと、iv)特異的結合対(例えば抗原結合ドメイン)のメンバーと調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第1のポリペプチド、及びb)第2のポリペプチドであって、i)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第2のメンバーと、ii)細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第2のポリペプチド、を含む。調節ドメインは、共刺激ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のCARは、a)第1のポリペプチドであって、i)特異的結合対(例えば抗原結合ドメイン)のメンバーと、ii)共刺激ドメインと、iii)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第1のメンバーと、iv)特異的結合対(例えば抗原結合ドメイン)のメンバーと共刺激ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第1のポリペプチド、及びb)第2のポリペプチドであって、i)二量体化対(例えば二量体化剤結合対)の第2のメンバーと、ii)細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第2のポリペプチド、を含む。
本願のCARの一実施例は図17に模式的に表される。本開示のCARは、真核細胞、例えば哺乳類細胞の、形質膜内に存在し得、好適な哺乳類細胞には、細胞毒性細胞、Tリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫、前駆細胞、前駆細胞の子孫、及びNK細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞の形質膜内に存在する場合、本開示のCARは、1)二量体化剤が、CAR内の二量体化剤結合対の第1及び第2のメンバーに結合する、または別様で二量体の第1及び第2のメンバーの二量体化を誘導する、ならびに2)特異的結合対のメンバー(例えば抗原結合ドメイン)を結合する因子、例えばCARの抗原結合ドメインに結合する抗原、の存在下で活性である。特異的結合対のメンバーに結合する因子は、特異的結合対の第2のメンバーである。特異的結合対の第2のメンバーは、可溶性(例えば細胞に結合していない)因子、標的細胞等の細胞の表面に存在する因子、固体表面に提供される因子、脂質二重層内に存在する因子等であり得る。特異的結合対のメンバーが抗体であり、特異的結合対の第2のメンバーが抗原である場合、抗原は、可溶性(例えば細胞に結合していない)抗原、標的細胞等の細胞の表面に存在する抗原、固体表面に提供される抗原、脂質二重層内に存在する抗原等であり得る。
いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの特異的結合対のメンバーに結合する特異的結合対の第2のメンバー(例えばCARの抗原結合ドメインに結合する抗原)、及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内の少なくとも1つの核酸の発現を増加させる。例えば、いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびに、CARの抗原結合ドメインに結合する抗原、及び二量体化剤によって活性化される場合、抗原及び/または二量体化剤の不在下での核酸の転写レベルに比較して、細胞内の少なくとも1つの核酸の発現を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させる。
例えば、本開示のCARの第2のポリペプチドは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含み得、かかる場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、活性化されたT細胞の核因子(NFAT)依存性転写を増加させる。NFAT依存性転写は、例えば、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5;AP-1;Sp1;NKκB;等を含む、NFATファミリーの任意のメンバーによって誘導される転写を含む。
本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、いくつかの場合では、細胞による1つ以上のサイトカインの増加した生成をもたらし得る。例えば、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、抗原及び/または二量体化剤の不在下で細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させ得る。生成を増加させることができるサイトカインは、インターフェロン、例えばIL-2、インターフェロンガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、IL-15、IL-12、IL-4、IL-5、IL-10;ケモカイン;成長因子等を含むが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内の核酸の転写の増加及び細胞によるサイトカインの生成の増加の両方をもたらし得る。
いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、及び二量体化剤によって活性化される場合、CARの第1のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を細胞表面で発現する標的細胞に対する、細胞による細胞毒性活性をもたらす。例えば、真核細胞が細胞毒性細胞(例えばNK細胞または細胞毒性Tリンパ球)である場合、本開示のCARは、細胞の形質膜内に存在する場合、及び二量体化剤によって活性化される場合、その細胞表面でCARの第1のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する標的細胞に対する、細胞の細胞毒性活性を増加させる。例えば、真核細胞がNK細胞またはTリンパ球である場合、本開示のCARは、細胞の形質膜内に存在する場合及び二量体化剤によって活性化される場合、二量体化剤の不在下の細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞の細胞毒性を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させる。
いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、増殖及び拡大(増加した細胞分裂または抗アポトーシス応答のいずれかによる)等の、他のCAR活性化関連事象をもたらし得る。
いくつかの場合では、本開示のCARは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにCARの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内シグナル伝達調節、細胞分化、または細胞死等の、他のCAR活性化関連事象をもたらし得る。
本開示のCARは、真核細胞膜内に存在し得、CARの第1及び第2のポリペプチドは互いに共有連結されない。本開示のCARは、真核細胞膜内に、膜内のあらゆる他のポリペプチドに共有連結されない単一のヘテロ二量体として存在し得る。あるいは、本開示の第1のCARは、真核細胞膜内に、本開示の第2のCARに共有または非共有連結されるヘテロ二量体として存在し得る。いくつかの場合では、第1及び第2のCARは、第1のCARの第1のポリペプチド及び第2のCARの第1のポリペプチドの両方において存在するヒンジ領域内に存在するシステイン間に形成される、ジスルフィド結合を介して、共有連結される。
いくつかの場合では、本開示のCARは真核細胞膜内に存在し得、二量体化の際に、CARがヘテロ二量体シグナロボディ(signalobody)CAR、例えば、少なくとも2つの依存性ポリペプチドで構成されるシグナロボディ、を表し得るように、CARの第1のポリペプチドは抗体断片を含み、CARの第2のポリペプチドはサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインを含む。「シグナロボディ」は、当業者に既知であるように、抗体断片及びサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインで構成される、単一キメラ高分子である。特定の例では、本開示のヘテロ二量体シグナロボディCARは、二量体化剤によって二量体化し、かつ、抗原例えば多量体化抗原によって活性化されて、真核細胞の細胞膜内に存在する場合、ヘテロ二量体シグナロボディCARの多量体化を誘導し得る。ヘテロ二量体シグナロボディCARのかかるリガンド誘導多量体化は、シグナル伝達を、活性化、例えば増加させ得る、または永続化、例えば維持し得、例えば、ヘテロ二量体シグナロボディCARのリガンド誘導多量体化は、細胞応答を引き出すシグナルを伝送し得る。いくつかの場合では、複数のヘテロ二量体シグナロボディCARは、所望の細胞応答を引き出すために、組み合わせて利用され得る。
特異的結合対のメンバー
本開示のCARは、特異的結合対のメンバーを含む。特異的結合対は、抗原抗体結合対、リガンド受容体結合対等を含むがこれらに限定されない。よって、本開示のCARにおける使用に好適な特異的結合対のメンバーは、抗原、抗体、リガンド、及びリガンド結合受容体を含む。
抗原結合ドメイン
本開示のCARにおける使用に好適な抗原結合ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、これの様々な種類が当業者に既知である。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、一本鎖Fv(scFv)である。他の抗体ベースの認識ドメイン(cAb VHH(ラクダ科抗体可変ドメイン)及びヒト化版、IgNAR VH(サメ抗体可変ドメイン)及びヒト化版、sdAb VH(単一ドメイン抗体可変ドメイン)及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが、使用に好適である。いくつかの例では、一本鎖TCR(scTv、VαVβ含有単鎖2ドメインTCR)等のT細胞受容体(TCR)ベースの認識ドメインも使用に好適である。
本開示のCARにおける使用に好適な抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。いくつかの場合では、抗原結合ドメインは、癌細胞によって発現される(合成される)抗原、すなわち癌細胞関連抗原において存在するエピトープに対して特異的である。癌細胞関連抗原は、例えば、乳癌細胞、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞(例えば小細胞肺癌細胞)、非ホジキンB細胞リンパ腫(B-NHL)細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞(例えば小細肺癌細胞)、メラノーマ細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽腫細胞、神経膠腫、膠芽腫、髄芽腫、大腸癌細胞等に、関連する抗原であり得る。癌細胞関連抗原は、非癌細胞によっても発現され得る。
本願のCARの抗原結合ドメインが結合することができる抗原の非限定的な例には、例えば、CD19、CD20、CD38、CD30、Her2/neu、ERBB2、CA125、MUC-1、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、CD44表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原(CEA)、上皮成長因子受容体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮成長因子受容体-2(VEGFR2)、高分子量メラノーマ関連抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2等が挙げられる。
リガンド
いくつかの場合では、本願のCARにおける使用に好適な特異的結合対のメンバーは、受容体のためのリガンドである。リガンドは、サイトカイン(例えばIL-13等)、成長因子(例えばヘレグリン、血管内皮成長因子(VEGF)等)、インテグリン結合ペプチド(例えば配列Arg-Gly-Aspを含むペプチド)等を含むが、これらに限定されない。
本願のCARにおける特異的結合対のメンバーがリガンドである場合、CARは、二量体化剤物質及び特異的結合対の第2のメンバーの両方の存在下で活性化され得、特異的結合対の第2のメンバーはリガンドのための受容体である。例えば、リガンドがVEGFである場合、特異的結合対の第2のメンバーは、可溶性VEGF受容体を含むVEGF受容体であり得る。別の例では、リガンドがヘレグリンである場合、特異的結合対の第2のメンバーはHer2であり得る。
受容体
上記のように、いくつかの場合では、本願のCARに含まれる特異的結合対のメンバーは、受容体、例えばリガンドのための受容体、共受容体である。受容体は、受容体のリガンド結合断片であり得る。好適な受容体には、成長因子受容体(例えばVEGF受容体);キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーK、メンバー1(NKG2D)ポリペプチド(MICA、MICB、及びULB6のための受容体);サイトカイン 受容体(例えばIL-13受容体、IL-2受容体等);Her2;CD27;天然細胞毒性受容体(NCR)(例えばNKP30(NCR3/CD337)ポリペプチド( HLA-B関連転写物3(BAT3)及びB7-H6のための受容体);等);等が挙げられるがこれらに限定されない。
ヒンジ領域
いくつかの場合では、本願のCARの第1のポリペプチドは、ヒンジ領域(本明細書で「スペーサ」とも称される)を含み、ヒンジ領域は抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に介在する。いくつかの場合では、ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。いくつかの場合では、ヒンジ領域は、受容体に由来するヒンジ領域ポリペプチド(例えばCD8誘導ヒンジ領域)である。
ヒンジ領域は、約4アミノ酸~約50アミノ酸、例えば、約4アミノ酸~約10アミノ酸、約10アミノ酸~約15アミノ酸、約15アミノ酸~約20アミノ酸、約20アミノ酸~約25アミノ酸、約25アミノ酸~約30アミノ酸、約30アミノ酸~約40アミノ酸、または約40アミノ酸~約50アミノ酸の、長さを有し得る。
好適なスペーサは、容易に選択され得、かつ、4アミノ酸~10アミノ酸、5アミノ酸~9アミノ酸、6アミノ酸~8アミノ酸、または7アミノ酸~8アミノ酸を含む、1アミノ酸(例えばGly)~20アミノ酸、2アミノ酸~15アミノ酸、3アミノ酸~12アミノ酸等の、複数の好適な長さのいずれかであり得、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であり得る。
例示的なスペーサは、グリシンポリマー(G)、グリシンセリンポリマー (例えば、(GS)、(GSGGS)(SEQ ID NO:37)、及び(GGGS)(SEQ ID NO:38)、式中nは少なくとも1の整数、を含む)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び当業者に既知の他の可撓性リンカーを含む。グリシン及びグリシン-セリンポリマーが使用され得、Gly及びSerの両方は比較的構造不定であり、したがって成分間の中間テザーの役割を果たし得る。グリシン-ポリマーが使用され得、グリシンはアラニンさえよりも有意に多くファイ-プシ間隔にアクセスし、かつ、より長い側鎖を有する残基よりもずっと制限されない(Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992)を参照されたい)。例示的なスペーサは、
Figure 2023145542000001
等を含むがこれらに限定されない、アミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、本願のCARの第1のポリペプチド内のヒンジ領域は、少なくとも1つのシステインを含む。例えば、いくつかの場合では、ヒンジ領域は配列Cys-Pro-Pro-Cysを含み得る。存在する場合、第1のCARのヒンジ領域内のシステインは、第2のCARにおけるヒンジ領域とジスルフィド結合を形成するために使用可能であり得る。
免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列は当業者に既知であり、例えば、Tan et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:162;及びHuck et al.(1986)Nucl.Acids Res.14:1779を参照されたい。非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000002
(例えば、Glaser et al.(2005)J.Biol.Chem. 280:41494を参照);
Figure 2023145542000003
等のうちの1つを含み得る。
ヒンジ領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4、ヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ヒンジ領域は、野生型(自然発生)ヒンジ領域に比較して、1つ以上のアミノ酸置換及び/または挿入及び/または欠失を含み得る。例えば、ヒトIgG1ヒンジのHis229 は、Tyrで置換され得、よってヒンジ領域は、配列
Figure 2023145542000004
を含む;例えばYan et al.(2012)J.Biol.Chem.287:5891を参照されたい。
ヒンジ領域は、ヒトCD8に由来するアミノ酸配列を含み得、例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列
Figure 2023145542000005
またはその変異体を含み得る。
膜貫通ドメイン
本開示のCARの第1及び第2のポリペプチドは、真核細胞膜への挿入のための膜貫通ドメインを含む。第1のポリペプチドの膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインと共刺激ドメインとの間に介在する。第1のポリペプチドがヒンジ領域を含む場合、第1のポリペプチドが、アミノ末端(N末端)からカルボキシル末端(C末端)への順で、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、第1の共刺激ドメイン、及び二量体化剤結合対の第1のメンバーを含むように、膜貫通ドメインはヒンジ領域と共刺激ドメインとの間に介在する。
第2のポリペプチドの膜貫通ドメインは、第2のポリペプチドが、N末端からC末端への順で、膜貫通ドメイン、第2の共刺激ドメイン、二量体化剤結合対の第2のメンバー、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むように、ポリペプチドのN末端またはその付近にある。
真核(例えば哺乳類)細胞の細胞膜へのポリペプチドの挿入を提供する、任意の膜貫通(TM)ドメインが、使用に好適である。1つの非限定的な例として、TM配列
Figure 2023145542000006
が使用され得る。好適なTM配列の追加の非限定的な例には、a)CD8ベータ由来:
Figure 2023145542000007
;b)CD4由来:
Figure 2023145542000008
;c)CD3ゼータ由来:
Figure 2023145542000009
;d)CD28由来:
Figure 2023145542000010
;e)CD134(OX40)由来:
Figure 2023145542000011
;及びf)CD7由来:
Figure 2023145542000012
が挙げられる。
リンカー
いくつかの場合では、本願のCARの第1のポリペプチドは、任意の2つの隣接するドメインの間にリンカーを含む。例えば、リンカーは、第1のポリペプチドの、膜貫通ドメインと第1の共刺激ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第1のポリペプチドの、第1の共刺激ドメインと二量体化剤結合対の第1のメンバーとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第2のポリペプチドの、膜貫通ドメインと第2の共刺激ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第2のポリペプチドの、第2の共刺激ドメインと二量体化剤結合対の第2のメンバーとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第2のポリペプチドの、二量体化剤結合対の第2のメンバーと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に配置され得る。
リンカーペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、概して可撓性性質のスペーサペプチドによって連結され得るが、他の化学連結は除外されない。リンカーは、約6~約40アミノ酸の間の長さ、または約6~約25アミノ酸の間の長さのペプチドであり得る。これらのリンカーは、タンパク質を連結するために、合成、リンカーコードオリゴヌクレオチドを使用することによって生成され得る。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーが使用され得る。好適なリンカーは概して可撓性のペプチドをもたらす配列を有し得ることに留意し、連結ペプチドは、仮想的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グラニン及びアラニン等の小アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作成することにおいて有用である。かかる配列の作成は、当業者にはルーチンである。
好適なリンカーは、容易に選択され得、かつ、4アミノ酸~10アミノ酸、5アミノ酸~9アミノ酸、6アミノ酸~8アミノ酸、または7アミノ酸~8アミノ酸を含む、1アミノ酸(例えばGly)~20アミノ酸、2アミノ酸~15アミノ酸、3アミノ酸~12アミノ酸等の、異なる長さの任意の好適なものであり得、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であり得る。
例示的な可撓性リンカーは、グリシン ポリマー(G)、グリシン-セリン ポリマー(例えば(GS)、GSGGS(SEQ ID NO:37)、及びGGGS(SEQ ID NO:38)、式中nは少なくとも1の整数、を含む)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び当業者に既知の他の可撓性リンカーを含む。 グリシン及びグリシン-セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方は比較的構造不定であり、したがって成分間の中間テザーの役割を果たし得るため、興味深い。グリシンは、アラニンさえよりも有意に多くファイ-プシ間隔にアクセスし、かつ、より長い側鎖を有する残基よりもずっと制限されないため、グリシンポリマーが特に興味深い(Scheraga,Rev.Computational Chem. 11173-142(1992)を参照されたい)。例示的な可撓性リンカーは、
Figure 2023145542000013
等を含むが、これらに限定されない。当業者は、リンカーが、可撓性リンカーならびにより可撓性の低い構造をもたらす1つ以上の部分を含み得るように、上記の任意の要素に結合されるペプチドの設計は、すべてまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得ることを認識するであろう。
調節ドメイン
本開示のCARにおける使用に好適な調節ドメインは、共刺激ドメインを含む。
いくつかの場合では、本願のCARの第1のポリペプチドの調節ドメインは、CARの第2のポリペプチドの調節ドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの場合では、CARの第1のポリペプチドの調節ドメインは、CARの第2のポリペプチドの調節ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一なアミノ酸配列を含む。本願のCARの第1のポリペプチドの調節ドメインは、本願のCARの第2のポリペプチドの調節ドメインと実質的に同じ長さを有し得、例えば、第1及び第2の調節ドメインは、10アミノ酸未満または5アミノ酸未満で、長さが互いと異なり得る。いくつかの場合では、第1及び第2の調節ドメインは同じ長さを有する。
本願のCARの第1及び第2のポリペプチドに含まれるのに好適な調節ドメインは、約30アミノ酸~約70アミノ酸(aa)の長さを有し得、例えば調節ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有し得る。他の場合では、調節ドメインは約70アミノ酸~約100アミノ酸、約100アミノ酸~約200アミノ酸、または200アミノ酸を超える長さを有し得る。
本開示のCARにおける使用に好適な共刺激ドメインは、概して、受容体に由来するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはホモ二量体化する。本願の共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であり得る(すなわち、共刺激ドメインは膜貫通タンパク質に由来し得る)。好適な共刺激ポリペプチドの非制限的な例には、4-1BB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR、及びHVEMが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、本願のCARの第1のポリペプチドの共刺激ドメインは、CARの第2のポリペプチドの共刺激ドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの場合では、CARの第1のポリペプチドの共刺激ドメインは、CARの第2のポリペプチドの共刺激ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一なアミノ酸配列を含む。本願のCARの第1のポリペプチドの共刺激ドメインは、本願のCARの第2のポリペプチドの共刺激ドメインと実質的に同じ長さを有し得、例えば、第1及び第2の共刺激ドメインは、10アミノ酸未満または5アミノ酸未満で、長さが互いと異なり得る。いくつかの場合では、第1及び第2の共刺激ドメインは同じ長さを有する。
本願のCARの第1及び第2のポリペプチドに含まれるのに好適な共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約70アミノ酸(aa)の長さを有し得、例えば共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有し得る。他の場合では、共刺激ドメインは約70アミノ酸~約100アミノ酸、約100アミノ酸~約200アミノ酸、または200アミノ酸を超える長さを有し得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質4-1BB(TNFRSF9;CD137;4-1BB;CDw137;ILA等としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000014
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質CD28(Tp44としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000015
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ICOS(AILIM、CD278、及びCVID1としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000016
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質OX-40(TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1Lとしても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000017
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質BTLA(BTLA1及びCD272としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000018
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質CD27(S152、T14、TNFRSF7、Tp55としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000019
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質CD30(TNFRSF8、D1S166E、及びKi-1としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000020
の連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、または約160アミノ酸~約185アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質GITR(TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357、及びGITR-Dとしても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000021
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質HVEM(TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR、及びTR2としても知られる)の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000022
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第1及び第2のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約30アミノ酸~約35アミノ酸、約35アミノ酸~約40アミノ酸、約40アミノ酸~約45アミノ酸、約45アミノ酸~約50アミノ酸、約50アミノ酸~約55アミノ酸、約55アミノ酸~約60アミノ酸、約60アミノ酸~約65アミノ酸、または約65アミノ酸~約70アミノ酸長を有する。
二量体対
本願のCARにおける使用に好適な二量体対は、二量体化剤結合対を含む。本開示のCARにおける使用に好適な二量体化剤結合対は、いくつかの実施形態では、同じ分子の異なる部位に結合するポリペプチド(本明細書で「二量体化剤」と称される)である。二量体化剤の存在下で、二量体化剤結合対の両方のメンバーは、二量体化剤の異なる部位に結合し、よって互いと近接する。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、可逆的である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、不可逆的である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、非共有結合性である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、共有結合性である。
使用に好適な他の二量体対は、二量体対の第1のメンバーの二量体化剤への結合の際に二量体化する二量体化剤結合対を含み、二量体化剤は二量体対の第1のメンバーにおける立体構造変化を誘導し、立体構造変化は、二量体対の第1のメンバーが二量体対の第2のメンバーに結合(共有結合または非共有結合)することを可能にする。
使用に好適な他の二量体対は、光(例えばブルーライト)への曝露が二量体対の二量体化を誘導する二量体対を含む。
機構に関わらず、二量体対は、二量体化を誘導する物質への曝露の際に二量体化し、物質はいくつかの場合では小分子であり、他の場合では光である。よって、簡素にするために、「二量体化剤結合対」を参照する以下の議論は、機構に関わらず二量体化する二量体対を含む。
好適な二量体(例えば二量体化剤結合対)の非制限的な例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
a)FK506結合タンパク質(FKBP)及びFKBP、
b)FKBP及びカルシニューリン触媒サブユニットA(CnA)、
c)FKBP及びシクロフィリン、
d)FKBP及びFKBP-ラパマイシン関連タンパク質(FRB)、
e)ジャイレースB(GyrB)及びGryB、
f)ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)及びDHFR、
g)DmrB及びDmrB、
h)PYL及びABI、
i)Cry2及びCIB1、ならびに
j)GAI及びGID1。
本願のCARの二量体(例えば二量体化剤結合対)の第1または第2のメンバーは、約50アミノ酸~約300アミノ酸以上の長さを有し得、例えば本願のCARの二量体(例えば二量体化剤結合対)の第1または第2のメンバーは、約50アミノ酸~約100アミノ酸、約100アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約200アミノ酸、約200アミノ酸~約250アミノ酸、約250アミノ酸~約300アミノ酸、または300アミノ酸を超える長さを有し得る。
いくつかの場合では、本願のCARの二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、FKBPに由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000023
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、本願のCARの二量体化剤結合対のメンバーは、カルシニューリン触媒サブユニットA(PPP3CA;CALN;CALNA;CALNA1;CCN1;CNA1;PPP2B;CAM-PRP触媒サブユニット;カルシニューリンAアルファ;カルモジュリン依存性カルシニューリンAサブユニットアルファイソ型;タンパク質ホスファターゼ2B、触媒サブユニット、アルファイソ型;等としても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列(PP2Acドメイン):
Figure 2023145542000024
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、シクロフィリン(シクロフィリンA、PPIA、CYPA、CYPH、PPIaseA等としても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000025
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、MTOR(FKBP-ラパマイシン関連タンパク質;FK506結合タンパク質12-ラパマイシン関連タンパク質1;FK506結合タンパク質12-ラパマイシン関連タンパク質2;FK506-結合タンパク質12-ラパマイシン複合体関連タンパク質1;FRAP;FRAP1;FRAP2;RAFT1;及びRAPT1としても知られる)に由来する。例えば好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列(「Frb」:Fkbp-ラパマイシン結合ドメイン、としても知られる):
Figure 2023145542000026
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、GyrB(DNAジャイレースサブユニットBとしても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次の大腸菌からのGyrBアミノ酸配列:
Figure 2023145542000027
(または任意の有機体からのDNAジャイレースサブユニットB配列)の連続した一続きの約100アミノ酸~約200アミノ酸(aa)、約200アミノ酸~約300アミノ酸、約300アミノ酸~約400アミノ酸、約400アミノ酸~約500アミノ酸、約500アミノ酸~約600アミノ酸、約600アミノ酸~約700アミノ酸、または約700アミノ酸~約800アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合では、二量体化剤結合対のメンバーは、上記の大腸菌からのGyrBアミノ酸配列のアミノ酸1~220と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素、DHFRP1、及びDYRとしても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000028
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、DmrB結合ドメイン(すなわちDmrBホモ二量体化ドメイン)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対のメンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000029
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、PYLタンパク質(アブシジン酸受容体として、及びRCARとしても知られる)に由来する。例えば、本願の二量体化剤結合対のメンバーは、シロイヌナズナのもの等のタンパク質:PYR1、RCAR1(PYL9)、PYL1、PYL2、PYL3、PYL4、PYL5、PYL6、PYL7、PYL8(RCAR3)、PYL10、PYL11、PYL12、PYL13に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかと、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2023145542000030
Figure 2023145542000031
Figure 2023145542000032
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、ABIタンパク質(アブシジン酸非感受性としても知られる)に由来する。例えば、本願の二量体化剤結合対のメンバーは、シロイヌナズナのもの等のタンパク質:ABI1(アブシジン酸非感受性1、タンパク質ホスファターゼ2C 56、AtPP2C56、P2C56、及びPP2C ABI1としても知られる)ならびに/またはABI2(P2C77、タンパク質ホスファターゼ2C 77、AtPP2C77、アブシジン酸非感受性2、タンパク質ホスファターゼ2C ABI2、及びPP2C ABI2としても知られる)に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、または約190アミノ酸~約200アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2023145542000033
Figure 2023145542000034
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、Cry2タンパク質(クリプトクロム2としても知られる)に由来する。例えば、本願の二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、シロイヌナズナのもの等の、しかしこれに限定されない、任意の有機体(例えば植物)からのCry2タンパク質に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、または約190アミノ酸~約200アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Cry2(シロイヌナズナ)
Figure 2023145542000035
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、CIB1シロイヌナズナタンパク質(転写因子bHLH63としても知られる)に由来する。例えば好適な二量体(例えば二量体化剤結合対)メンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000036
の連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、または約190アミノ酸~約200アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、GAIシロイヌナズナタンパク質(ジベレリン酸非感受性、及びDELLAタンパク質GAIとしても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000037
の連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、または約190アミノ酸~約200アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体(例えば二量体化剤結合対)のメンバーは、GID1シロイヌナズナタンパク質(ジベレリン受容体GID1としても知られる)に由来する。例えば、好適な二量体メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、または約190アミノ酸~約200アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2023145542000038
二量体化剤
二量体化剤結合対の第1のメンバー及び二量体化剤結合対の第2のメンバーの二量体化を提供することができる、二量体化剤(dimerizer)(「二量体化剤」(dimerizing agent))は、例えば、以下を含む(二量体化剤は、二量体化剤結合対に続いて括弧内にある)。
a)FKBP及びFKBP(ラパマイシン);
b)FKBP及びCnA(ラパマイシン);
c)FKBP及びシクロフィリン(ラパマイシン);
d)FKBP及びFRG(ラパマイシン);
e)GyrB及びGyrB(クーママイシン);
f)DHFR及びDHFR(メトトレキサート);
g)DmrB及びDmrB(AP20187);
h)PYL及びABI(アブシジン酸);
i)Cry2及びCIB1(青色光);ならびに
j)GAI及びGID1(ジベレリン)。
上記のように、ラパマイシンは二量体化剤の役割を果たし得る。あるいは、ラパマイシン誘導体または類似体が使用され得る。例えば、WO96/41865、WO99/36553、WO01/14387、及びYe et al(1999)Science 283:88-91を参照されたい。例えば、類似体、相同体、誘導体、及びラパマイシンに構造的に関連する他の化合物(「ラパログ」)は、とりわけ、ラパマイシンに関連する次の改変:C7、C42、及び/またはC29でのメトキシの脱メチル化、脱離、または交換;C13、C43、及び/またはC28でのヒドロキシの脱離、誘導体化、または交換;C14、C24、及び/またはC30でのケトンの還元、脱離、または誘導体化;6員ピペコラート環と5員プロリル環の交換;シクロへキシル環上の代替の置換またはシクロへキシル環と置換されたシクロペンチル環の交換:のうちの1つ以上を有する、ラパマイシンの変異体を含む。追加の情報は、例えば、米国特許第5,525,610号、同第5,310,903号、同第5,362,718号、及び同第5,527,907号において提供される。C-28ヒドロキシル基の選択的エピマー化は説明されており、例えばWO 01/14387を参照されたい。ラパマイシンの代わりとしての使用に好適な追加の合成二量体化剤は、米国特許出願公開第2012/0130076号に記載されるものを含む。
ラパマイシンは次の構造を有する。
Figure 2023145542000039
好適なラパログは、例えば次を含む。
Figure 2023145542000040
さらにラパログとして好適なのは、次の式の化合物である:
Figure 2023145542000041
式中、nは1または2であり;R28及びR43は、独立して、H、または置換されたもしくは非置換の脂肪族もしくはアシル部分であり;R7a及びR7bのうちの一方がHであり、他方がハロ、R、OR、SR、-OC(O)R、-OC(O)NR、-NR、-NRC(OR)R、NRC(O)OR、-NRSO、もしくはNRSONRB'であるか、またはR7a及びR7bは、一緒になって、以下のテトラエン部分内のHであり:
Figure 2023145542000042
式中、Rは、Hまたは置換されたもしくは非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、もしくはヘテロアリール部分であり、かつ、式中R及びRB'は、独立して、H、OH、または置換されたもしくは非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、もしくはヘテロアリール部分である。
上記のように、クーママイシンは二量体化剤の役割を果たし得る。あるいは、クーママイシン類似体が使用され得る。例えば、Farrar et al.(1996)Nature 383:178-181、及び米国特許第6,916,846号を参照されたい。
上記のように、いくつかの場合では、二量体化剤は、メトトレキサート、例えば非細胞毒性のホモ二官能性メトトレキサート二量体である。例えば米国特許第8,236,925号を参照されたい。
細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のCARにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、CARの活性化(すなわち、抗原及び二量体化剤によって活性化される)に応答して、明確で検出可能なシグナル(例えば、細胞による1つ以上のサイトカインの生成の増加;標的遺伝子の転写における変化;タンパク質の活性における変化;細胞挙動における変化、例えば細胞死;細胞増殖;細胞分化;細胞生存;細胞シグナル伝達応答の調節等)を提供する任意の所望のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、下記のように、少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ等)の、ITAMモチーフを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、DAP10/CD28型のシグナル伝達鎖を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合CARに共有結合されないが、代わりに細胞質内で拡散される。
ITAM
本開示のCARにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ITAMモチーフは、YXL/Iであり、式中X 及びXは独立して任意のアミノ酸(SEQ ID NO:130)である。いくつかの場合では、本願のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのITAMモチーフを含む。いくつかの場合では、ITAMモチーフは細胞内シグナル伝達ドメイン内で2度反復され、ITAMモチーフの第1及び第2のインスタンスは、6~8アミノ酸で互いから分離され、例えば(YXL/I)(X(YXL/I) であり、式中nは6~8の整数であり、6~8Xのそれぞれは、任意のアミノ酸(SEQ ID NO:131)であり得る。いくつかの場合では、本願のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、3つのITAMモチーフを含む。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAMモチーフを含むポリペプチドに由来するITAMモチーフ含有部分であり得る。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のITAMモチーフ含有タンパク質からのITAMモチーフ含有ドメインであり得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含む必要はない。好適なITAMモチーフ含有ポリペプチドの例には、DAP12;FCER1G(Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖);CD3D(CD3デルタ);CD3E(CD3イプシロン);CD3G(CD3ガンマ);CD3Z(CD3ゼータ);及びCD79A(抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、DAP12(TYROBP;TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質;KARAP;PLOSL;DNAX-活性化タンパク質12;KAR関連タンパク質;TYROタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質;キラー活性化受容体関連タンパク質;キラー活性化受容体関連タンパク質;等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列(4つのイソ型):
Figure 2023145542000043
のうちのいずれかと、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長DAP12アミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000044
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、FCER1G(FCRG;Fcイプシロン受容体Iガンマ鎖;Fc受容体ガンマ鎖;fc-イプシロンRIガンマ;fcRガンマ;fceRIガンマ;高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ;免疫グロブリンE受容体の高親和性ガンマ鎖;等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000045
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長FCER1Gアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000046
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖(CD3D;CD3-デルタ;T3D;CD3抗原、デルタサブユニット;CD3デルタ;CD3d抗原、デルタポリペプチド(TiT3複合体);OKT3、デルタ鎖;T細胞受容体T3デルタ鎖;T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖;等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列(2つのイソ型):
Figure 2023145542000047
のうちのいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、または約150アミノ酸~約170アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字の下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長CD3デルタアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000048
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、式中、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖(CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖、AI504783、CD3、CD3イプシロン、T3e等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000049
の連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約205アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長CD3イプシロンアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000050
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ガンマ鎖(CD3G、T細胞受容体T3ガンマ鎖、CD3-ガンマ、T3G、ガンマポリペプチド(TiT3複合体)、等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000051
の連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、または約150アミノ酸~約180アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長CD3ガンマアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000052
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖(CD3Z、T細胞受容体T3ゼータ鎖、CD247、CD3-ゼータ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ、等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列(2つのイソ型):
Figure 2023145542000053
のうちのいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、または約150アミノ酸~約160アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長CD3ゼータアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000054
のうちのいずれかと、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD79A(B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖;CD79a抗原(免疫グロブリン関連アルファ);MB-1膜糖タンパク質;ig-アルファ;膜結合免疫グロブリン関連タンパク質;表面IgM-関連タンパク質;等としても知られる)に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列(2つのイソ型):
Figure 2023145542000055
のうちのいずれかの連続した一続きの約100アミノ酸~約110アミノ酸(aa)、約110アミノ酸~約115アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約200アミノ酸、または約200アミノ酸~約220アミノ酸と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長CD79Aアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000056
と、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ITAMモチーフには、太字で下線が引かれている。
DAP10/CD28
本開示のCARにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。
DAP10シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列:
Figure 2023145542000057
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列:
Figure 2023145542000058
の全長と、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
CD28シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列:
Figure 2023145542000059
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列:
Figure 2023145542000060
の全長と、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ZAP70
本開示のCARにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ZAP70ポリペプチド、例えば、次のアミノ酸配列:
Figure 2023145542000061
の連続した一続きの約300アミノ酸~約400アミノ酸、約400アミノ酸~約500アミノ酸、または約500アミノ酸~619アミノ酸と、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
追加の配列
本願のCARの第1及び/または第2のポリペプチドは、1つ以上の追加のポリペプチドドメインをさらに含み得、かかるドメインは、シグナル配列、エピトープタグ、親和性ドメイン、及び検出可能なシグナルを生成するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。
シグナル配列
本願のCARにおける、例えば本願のCARの第1のポリペプチドにおける、使用に好適なシグナル配列は、自然発生シグナル配列、合成(例えば人工)シグナル配列等を含む、任意の真核生物シグナル配列を含む。
エピトープタグ
好適なエピトープタグは、赤血球凝集素(HA;例えばYPYDVPDYA(SEQ ID NO:122);FLAG(例えばDYKDDDDK(SEQ ID NO:123);c-myc(例えばEQKLISEEDL;SEQ ID NO:4)等を含むがこれらに限定されない。
親和性ドメイン
親和性ドメインは、結合相手と相互作用し得るペプチド配列、例えば、識別または精製に有用な固体支持体上で固定化されるもの等、を含む。ヒスチジン等の、複数の連続的単一アミノ酸をコードするDNA配列は、発現タンパク質に融合されると、ニッケルセファロース等の樹脂カラムへの高親和性結合による、組み換えタンパク質の一工程精製に使用され得る。例示的な親和性ドメインは、His5(HHHHH)(SEQ ID NO:124)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO:125)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:4)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:123)、Strepタグ(WSHPQFEK)(SEQ ID NO:126)、赤血球凝集素、例えばHAタグ(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:122)、GST、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、RYIRS(SEQ ID NO:127)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:128)、キチン結合ドメイン、S-ペプチド、T7ペプチド、SH2ドメイン、C-end RNAタグ、
Figure 2023145542000062
;カルシウム結合タンパク質、例えばカルモジュリン、トロポニンC、カルシニューリンB、ミオシン軽鎖、レコベリン、S-モジュリン、ビジニン、VILIP、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、S100タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンD9K、カルビンジンD28K、及びカルレチニンからのもの等の、例えば亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合ドメインのような、金属結合ドメイン;インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、MyoD、Id、ロイシンジッパー配列、及びマルトース結合タンパク質を含む。
検出可能シグナル生成ポリペプチド
好適な検出可能シグナル生成タンパク質は、例えば、蛍光タンパク質、検出可能シグナルを生成物として生成する反応を触媒する酵素等を含む。
好適な蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはその変異体、GFPの青色蛍光変異体(BFP)、GFPのシアン蛍光変異体(CFP)、GFPの黄色蛍光変異体(YFP)、高感度GFP(EGFP)、高感度CFP(ECFP)、高感度YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、不安定化EGFP(dEGFP)、不安定化ECFP(dECFP)、不安定化EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRedモノマー、J-Red、二量体2、t-二量体2(12)、mRFP1、ポシロポリン、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaedeタンパク質及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質、ならびに、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質結合体を含むが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例には、mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrape1、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner et al.(2005)Nat.Methods 2:905-909)等が挙げられる。例えば、Matz et al.(1999)Nature Biotechnol.17:969-973に記載される、花虫類種からの様々な蛍光及び有色タンパク質の任意のものが、使用に好適である。
好適な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、ベータ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ(GO)等を含むがこれらに限定されない。
配列の組み換え
特定の例では、CARのポリペプチド、例えばCARドメインの配列は、部位特異的組み換え技術の使用を通して、細胞内で再配置または欠失させ得る。特定の実施形態では、特定のCARへの細胞活性化関連応答は、部位特異的組み換えによって変更され得、例えば、第1の活性化関連応答を誘発するCARの第1の細胞内シグナル伝達ドメインは、第2の活性化関連応答を誘発する第2の細胞内シグナル伝達ドメインと交換され得る。特定の例では、CARの特定の二量体化剤への応答は、部位特異的組み換えによって変更され得、例えば、第1の二量体化剤の存在下でCARの二量体化を引き起こす第1の二量体化剤結合対は、第2の二量体化剤の存在下でCARの二量体化を引き起こす第2の二量体化剤結合対と交換され得る。当業者には明確であるように、部位特異的組み換えは、CARの任意のドメインまたは配列を、本明細書に開示される任意の他のドメインまたは配列と交換するために、細胞内で使用され得る。さらに、当業者に明確であるように、部位特異的組み換えは、CARの任意のドメインまたは配列を欠失させるために細胞内で使用され得る。配列及びドメインのかかる交換及び切除は、当業者に既知であり、例えば、Tone et al.(2013)Biotechnology and Bioengineering,3219-3226に記載されるシグナロボディ内のドメイン切り替えを参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書で開示される。インビボで部位特異的組み換えを行うための機構及び要件は、当業者に既知であり、例えば、Grindley et al.(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605及びTropp(2012)Molecular Biology(Jones&Bartlett Publishers,Sudbury,MA)を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
核酸
本開示は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、例えば組み換え発現ベクターを含む、DNAであり得る。本開示のヘテロ二量体の条件付活性CAR の第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、RNA、例えばインビトロ合成RNAであり得る。
いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1のポリペプチドのみをコードする(第2のポリペプチドをコードしない)ヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第2のポリペプチドのみをコードする(第1のポリペプチドをコードしない)ヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合では、本願の核酸は、例えば哺乳類細胞内で、本開示のCARの生成を提供する。他の場合では、本願の核酸は、CARコード核酸の増幅を提供する。
本開示のCARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えばプロモーター、エンハンサー等に機能的に連結され得る。
好適なプロモーター及びエンハンサー要素は、当業者に既知である。細菌細胞における発現については、好適なプロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP、及びtrcを含むがこれらに限定されない。真核細胞における発現については、好適なプロモーターは、軽及び/または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素;サイトメガロウイルス前初期プロモーター;単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター;初期及び後期SV40プロモーター;レトロウイルスからの長い末端反復に存在するプロモーター;マウスメタロチオネイン-Iプロモーター;及び様々な当業者に既知の組織特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない。
可逆的誘導性プロモーターを含む、好適な可逆的プロモーターは当業者に既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの有機体、例えば真核生物及び原核生物から単離されてこれらに由来し得る。第2の有機体内での使用のための、第1の有機体由来の可逆的プロモーターの改変、例えば第1の原核生物及び第2の真核生物、第2の真核生物及び第2の原核生物等は、当業者に公知である。かかる可逆的プロモーター、及びかかる可逆的プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質も含むシステムは、アルコール調節プロモーター(例えば、アルコール脱水素酵素I(alcA)遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質(AlcR)に応答性のプロモーター等)、テトラシクリン調節プロモーター(例えば、Tet活性化因子、TetON、TetOFF等を含むプロモーターシステム)、ステロイド調節プロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステム等)、金属調節プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーターシステム等)、病因関連調節プロモーター(例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアゾール調節プロモーター等)、温度調節プロモーター(例えば、熱ショック誘導性プロモーター(例えば、HSP-70、HSP-90、大豆熱ショックプロモーター等)、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーター等を含むがこれらに限定されない。
いくつかの例では、好適なプロモーターを含有する座位または構築物または導入遺伝子は、誘導性システムの誘導を通して不可逆的に切り替えられる。不可逆的切り替えの導入に好適なシステムは、当業者に公知であり、例えば不可逆的切り替えの誘導は、Cre-lox媒介組み換えを利用し得る(例えばFuhrmann-Benzakein et al.,PNAS(2000)28:e99を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる)。当業者に既知の、リコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組み換え部位等の任意の好適な組み合わせが、不可逆的に切り替え可能なプロモーターを生成する際に使用され得る。本明細書の他の箇所に記載される、部位特異的組み換えを行うための方法、機構、及び要件は、不可逆的に切り替えられたプロモーターを生成することにおける用途を見出し、当業者に公知であり、例えば、Grindley et al.(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605及びTropp(2012)Molecular Biology(Jones&Bartlett Publishers,Sudbury,MA)を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの場合では、プロモーターは、CD8細胞特異的プロモーター、CD4細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはNK特異的プロモーターである。例えば、CD4遺伝子プロモーターが使用され得、例えば、Salmon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739、及びMarodon et al.(2003)Blood 101:3416を参照されたい。別の例として、CD8遺伝子プロモーターが使用され得る。NK細胞特異的発現は、Ncr1(p46)プロモーターの使用により達成され得、例えば、Eckelhart et al.(2011)Blood 117:1565を参照されたい。
いくつかの実施形態では、例えば、酵母細胞における発現について、好適なプロモーターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーター等の構成型プロモーター;またはGAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PHO5プロモーター、CUP1プロモーター、GAL7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、及びAOX1(例えばピキア属における使用のため)等の調節可能プロモーターである。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
原核宿主細胞内での使用に好適なプロモーターは、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;ラクトースオペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えばlac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーター等;araBADプロモーター; ssaG プロモーターまたは関連プロモーター(例えば米国特許公開第20040131637号を参照されたい)、pagCプロモーター (Pulkkinen and Miller,J.Bacteriol,1991:173(1):86-93;Alpuche-Aranda et al.,PNAS,1992;89(21):10079-83)、nirBプロモーター(Harborneら(1992)Mol.Micro.6:2805-2813)等(例えばDunstan et al.(1999)Infect.Immun.67:5133-5141;McKelvie et al.(2004)Vaccine 22:3243-3255;及びChatfield et al.(1992) Biotechnol.10:888-892を参照されたい)等のインビボ調節プロモーター;シグマ70プロモーター、例えばコンセンサスシグマ70プロモーター(例えば、ジェンバンク登録番号AX798980、AX798961、及びAX798183を参照されたい);固定相プロモーター、例えばdps プロモーター、spv プロモーター等;病原性アイランドSPI-2(例えばWO96/17951を参照されたい)由来のプロモーター;actAプロモーター(例えばShetron-Rama et al.(2002)Infect.Immun.70:1087-1096);rpsMプロモーター(例えばValdivia and Falkow(1996).Mol.Microbiol.22:367を参照されたい);tetプロモーター (例えばHillen,W.and Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.and Heinemann,U.(編)Topics in Molecular and Structural Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162を参照されたい);SP6プロモーター(例えば、Melton et al.(1984)Nucl.Acids Res.12:7035)等を含むがこれらに限定されない。大腸菌等の原核生物内での使用に好適な強力なプロモーターは、Trc、Tac、T5、T7、及びPラムダを含むがこれらに限定されない。細菌性宿主細胞内での使用のためのオペレータの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレータ(LacIリプレッサータンパク質は、ラクトースに接触すると立体構造を変更し、それによりLacIリプレッサータンパク質がオペレータに結合することを防止する)、トリプトファンプロモーターオペレータ(トリプトファンと複合すると、TrpRリプレッサータンパク質はオペレータに結合する立体構造を有し、トリプトファンの不在下では、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレータに結合しない立体構造を有する)及び tacプロモーターオペレータ(例えばdeBoer et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25を参照されたい)が挙げられる。
本願のCARをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター及び/またはクローニングベクター内に存在し得る。本願のCARが2つの別個のポリペプチドを含む場合、2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別個のベクター内でクローン化され得る。発現ベクターは、選択マーカー、複製の起点、ならびにベクターの複製及び/または維持を提供する他の特徴を含み得る。好適な発現ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクター等を含む。
複数の好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くは本願の組み換え構築物を生成するために市販されている。次のベクターが例として提供される。細菌性:pBs、ファージスクリプト、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及びpRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden).真核性:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVL(Pharmacia)。
発現ベクターは、概して、非相同タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の付近に位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において作動可能な選択マーカーが存在し得る。好適な発現ベクターは、ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス;ポリオウイルス;アデノウイルス(例えば、Liら,Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras et al.,Gene Ther 6:515 524,1999;Li and Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto et al.,H Gene Ther 5:1088 1097,1999;WO94/12649、WO93/03769;WO93/19191;WO94/28938;WO95/11984、及びWO95/00655を参照されたい); アデノ関連ウイルス (例えば、Ali et al.,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery et al.,PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett et al.,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997;Jomary et al.,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling et al.,Hum Gene Ther 10:641 648,1999;Ali et al.,Hum Mol Genet 5:591 594,1996;WO93/09239におけるSrivastava、Samulski et al.,J.Vir.(1989)63:3822-3828;Mendelson et al.,Virol.(1988)166:154-165;及びFlotte et al.,PNAS(1993)90:10613-10617を参照されたい);SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshi et al.,PNAS 94:10319 23,1997;Takahashi et al.,J Virol73:7812 7816,1999を参照されたい);レトロウイルスベクター(例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルス等のレトロウイルス由来のベクター);等に基づくウイルスベクター)を含むがこれらに限定されない。
上記のように、いくつかの実施形態では、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、RNA、例えばインビトロ合成RNAであり得る。RNAのインビトロ合成の方法は、当業者に既知であり、任意の既知の方法が、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むRNAを合成するために使用され得る。RNAを宿主細胞に導入するための方法は当業者に既知である。例えば、Zhao et al.(2010)Cancer Res.15:9053を参照されたい。本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むRNAを宿主細胞に導入することは、インビトロまたはエクスビボまたはインビボで実行され得る。例えば、宿主細胞(例えばNK細胞、細胞毒性Tリンパ球等)は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARの第1及び/または第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するRNAで電気穿孔され得る。
細胞
本開示は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARを生成するように遺伝子改変された哺乳類細胞を提供する。
好適な哺乳類細胞は、初代細胞及び不死化細胞株を含む。好適な哺乳類細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類(例えばマウス、ラット)細胞株等を含む。好適な哺乳類細胞株は、HeLa細胞(例えばアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)第CCL-2号)、CHO細胞(例えば、ATCC第CRL9618号、同第CCL61号、同第CRL9096号)、293細胞(例えば、ATCC第CRL-1573号)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えばATCC第CRL-1658号)、Huh-7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC第CCL10号)、PC12細胞(ATCC第CRL1721号)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC第CRL1651号)、RAT1細胞、マウスL細胞(ATCC第CCLI.3号)、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(ATCC第CRL1573号)、HLHepG2細胞、Hut-78、ジャーカット、HL-60、NK細胞株(例えば、NKL、NK92、及びYTS)等を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例では、細胞は不死化細胞株ではないが、代わりに個体から得られた細胞(例えば初代細胞)である。例えば、いくつかの場合では、細胞は個体から得られた免疫細胞である。例えば、細胞は個体から得られたTリンパ球である。別の例として、細胞は個体から得られた細胞毒性細胞である。別の例として、細胞は個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
免疫細胞を活性化する方法
本開示は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで、免疫細胞を活性化する方法を提供する。本方法は、概して、免疫細胞(インビトロ、インビボ、またはエクスビボ)を二量体化剤及び抗原と接触させることを含み、免疫細胞は本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARを生成するように遺伝子改変される。二量体化剤及び抗原の存在下で、ヘテロ二量体の条件付活性CARは二量体化して、免疫細胞を活性化し、それにより活性化された免疫細胞を生成する。免疫細胞は、例えば、細胞毒性Tリンパ球、NK細胞、CD4T細胞、T制御性(Treg)細胞等を含む。
遺伝子改変された免疫細胞(例えばTリンパ球、NK細胞)を、二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバー(例えば、抗原、リガンド、受容体)と接触させることは、特異的結合対の第2のメンバー及び/または二量体化剤の不在下で免疫細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、免疫細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させ得る。その生成を増加させることができるサイトカインは、IL-2及びIFN-γを含むがこれらに限定されない。
遺伝子改変された免疫細胞(例えばTリンパ球、NK細胞)を、二量体化剤及び抗原と接触させることは、抗原及び/または二量体化剤の不在下で免疫細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、免疫細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させ得る。その生成を増加させることができるサイトカインは、IL-2及びIFN-γを含むがこれらに限定されない。
遺伝子改変された細胞毒性細胞(例えば、細胞毒性Tリンパ球)を二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバー(例えば、抗原、リガンド、受容体)と接触させることは、二量体化剤の不在下での細胞毒性細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させ得る。
遺伝子改変された細胞毒性細胞(例えば細胞毒性Tリンパ球)を、二量体化剤及び抗原と接触させることは、二量体化剤の不在下での細胞毒性細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させ得る。
他の実施形態では、例えば、宿主免疫細胞に応じて、遺伝子改変された宿主細胞を二量体化剤及び抗原と接触させることは、細胞増殖、細胞生存、細胞死等を増加または減少させ得る。
条件付で活性化可能な細胞を生成する方法
本開示は、条件付で活性化可能な細胞を生成する方法を提供する。本方法は、概して、哺乳類細胞を、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターまたはRNA(例えばインビトロ転写RNA)で遺伝子改変することを含む。遺伝子改変され多細胞は、a)CARの第1のポリペプチドが結合する抗原、及びb)二量体化剤(dimerizer)(二量体化剤(dimerizing agent))の存在下で、条件付で活性化可能である。遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実行され得る。細胞は、免疫細胞(例えば、Tリンパ球またはNK細胞)、幹細胞、前駆細胞等であり得る。
いくつかの場合では、遺伝子改変はエクスビボで実行される。例えば、Tリンパ球、幹細胞、またはNK細胞が個体から得られ、個体から得られた該細胞は本開示のCARを発現するように遺伝子改変される。遺伝子改変され多細胞は、a)CARの第1のポリペプチドが結合する抗原、及びb)二量体化剤の存在下で、条件付で活性化可能である。いくつかの場合では、遺伝子改変され多細胞はエクスビボで活性化される。他の場合では、遺伝子改変され多細胞は、個体(例えば、そこから細胞が得られた個体)に導入され、遺伝子改変され多細胞は、例えば個体に二量体化剤を投与することによって、インビボで活性化される。例えば、抗原が個体における細胞の表面に存在する場合、抗原を投与する必要はない。遺伝子改変され多細胞は、個体における細胞の表面に存在する抗原と接触し、個体への二量体化剤の投与の際に、遺伝子改変された細胞が活性化される。例えば、遺伝子改変された細胞がTリンパ球である場合、遺伝子改変された細胞は、CARが結合するその表面に抗原を提供する細胞に対して細胞毒性を示し得る。
治療方法
本開示は、本願のCARを使用する様々な治療方法を提供する。
細胞毒性方法
本開示のCARは、Tリンパ球またはNK細胞内に存在する場合、標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。本開示のCARは、標的細胞上に存在する抗原に結合し、それにより、CARを生成するように遺伝子改変されたTリンパ球またはNK細胞による標的細胞の死滅を媒介する。CARの抗原結合ドメインは、標的細胞の表面に存在する抗原に結合する。
標的細胞は癌細胞を含むがこれに限定されない。よって、本開示は、標的癌細胞を死滅させる、またはその増殖を抑制する方法を提供し、該方法は、Tリンパ球またはNK細胞が標的癌細胞の表面に存在する抗原を認識して、標的細胞の死滅を媒介するように、本願のCARを生成するように遺伝子改変された細胞毒性免疫エフェクター細胞(例えば細胞毒性T細胞、またはNK細胞)を接触させることを含む。
本開示は、癌を有する個体における癌を治療する方法を提供し、該方法は、i)個体から得られたTリンパ球を、本開示のヘテロ二量体の条件付活性CARをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程であって、ヘテロ二量体の条件付活性CARの抗原結合ドメインが個体における癌細胞上のエピトープに対して特異的であり、かつ遺伝子改変がエクスビボで実行される、遺伝子改変する工程、ii)遺伝子改変されたTリンパ球を個体に導入する工程、iii)個体に二量体化剤の有効量を投与する工程、を含み、二量体化剤がヘテロ二量体の条件付活性CARの二量体化を誘導し、該二量体化が遺伝子改変されたTリンパ球の活性化及び癌細胞の死滅を提供し、それにより癌を治療する。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る癌腫は、食道癌腫、幹細胞癌腫、基底細胞癌腫(皮膚癌の一形態)、扁平細胞癌腫(様々な組織)、移行細胞癌腫(膀胱の悪性新生物)を含む膀胱癌腫、気管支原性癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、胃癌腫、肺の小細胞癌腫及び非小細胞癌腫を含む肺癌腫、副腎皮質癌腫、甲状腺癌腫、膵臓癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、前立腺癌腫、アデノ癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭アデノ癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、腎細胞癌腫、腺管上皮内癌または胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、子宮癌腫、精巣癌腫、骨原性癌腫、上皮癌腫、ならびに上咽頭癌腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る肉腫は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る他の固形腫瘍は、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る白血病は、a)慢性骨髄増殖症候群(多能性造血幹細胞の腫瘍性障害);b)急性骨髄性白血病(制限された系統可能性の多能性造血幹細胞または造血細胞の腫瘍性形質転換;c)B細胞CLL、T細胞CLL前リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ性白血病(CLL;免疫未熟かつ機能不全小リンパ球のクローン増殖);ならびにd)急性リンパ芽球性白血病(リンパ芽球の蓄積を特徴とする)を含むがこれらに限定されない。本願の方法を使用して治療することができるリンパ腫は、B細胞リンパ腫(例えばバーキットリンパ腫)、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法に従う治療の影響を受けやすくあり得る他の癌は、非定型髄膜腫(脳)、島細胞癌腫(膵臓)、髄様癌腫(甲状腺)、間葉腫(腸)、肝細胞癌腫 (肝臓)、肝芽腫(肝臓)、明細胞癌腫(腎臓)、及び神経線維腫縦隔を含む。
免疫調節方法
本願の方法は、炎症状態及び自己免疫疾患を治療するためにも使用することができる。本願のCARは、免疫調節方法における使用のために、Tヘルパー細胞またはTregにおいて発現される。免疫調節方法は、例えば、哺乳類対象における病原体に対する免疫応答を強化すること、免疫無防備状態の対象における免疫応答を強化すること、炎症応答を低減させること、例えば自己免疫疾患を治療するために、哺乳類対象における自己抗原への免疫応答を低減すること、臓器または組織拒絶反応を低減するために、哺乳類対象における移植された臓器または組織への免疫応答を低減させること、を含む。
本方法が自己抗原への免疫応答を低減することを含む場合、CARを活性化するために使用される抗原は自己抗原である。本方法が移植された臓器または組織への免疫応答を低減することを含む場合、CARを活性化するために使用される抗原は、移植された臓器に特異的な抗原である。
製剤、用量、及び投与経路
上記のように、本開示の治療方法は、それを必要とする個体への二量体化剤の有効量の投与を含み、かつ、抗原の投与も含み得る。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に1回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下でのTリンパ球の細胞毒性活性に比較して、本願のCARを発現するTリンパ球の細胞毒性活性のレベルを、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させる量である。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に1回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下でのNK細胞の細胞毒性活性に比較して、本願のCARを発現するNK細胞の細胞毒性活性のレベルを、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、または10倍を超えて増加させる量である。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に1回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下での癌細胞の数及び/または腫瘍量に比較して、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または75%を超えて、個体における癌細胞の数を減少させる及び/または個体における腫瘍量を低減する量である。
いくつかの実施形態では、二量体化剤の有効量は、単独で(例えば単独療法で)または1つ以上の追加の治療薬との組み合わせで(例えば併用療法で)1回以上の用量で投与されると、二量体化剤を用いる治療の不在下での、腫瘍増殖速度、癌細胞数、または腫瘍量に比較して、腫瘍増殖速度、癌細胞数、腫瘍量のうちの1つ以上を、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれを超えて低減させるのに有効である量である。
製剤
本願の方法において、二量体化剤は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して、宿主に投与することができる。よって、二量体化剤は治療的投与のための様々な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、二量体化剤は、適切で医薬的に容認可能なキャリアまたは希釈剤との組み合わせにより医薬組成物に製剤され得、かつ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル等の、固体、半固体、液体、または気体形態の調製物に製剤され得る。
医薬的剤形において、二量体化剤はそれらの医薬的に容認可能な塩の形態で投与され得、またはそれらは単独で、もしくは適切な会合においては他の医薬活性化合物との組み合わせでも使用され得る。次の方法及び賦形剤は、単に例示的であり全く限定的でない。
好適な賦形剤媒体は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、媒体は、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤等の補助剤を少量含み得る。かかる剤形を調整する実際の方法は、当業者に既知であるかまたは明白であるだろう。例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985を参照されたい。投与される組成物または製剤は、任意の事象において、治療されている対象において所望の状態に到達するのに十分な量の二量体化剤を含む。
医薬的に容認可能な、媒体、アジュバント、キャリア、または希釈剤等の、賦形剤は、一般の人々に容易に入手可能である。さらに、医薬的に容認可能な、pH調節及び緩衝剤、等長化剤、安定化剤、湿潤剤等の、補助剤は、一般の人々に容易に入手可能である。
経口調製物については、二量体化剤は単独で、または適切な添加剤との組み合わせで、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプン等の従来の添加剤との;結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤との;トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤との;タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤との;ならびに所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び着香料との、組み合わせで使用されて、錠剤、粉末、顆粒、またはカプセルを作製し得る。
二量体化剤は、植物油または他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の、水性または非水性溶剤内でそれらを溶解、懸濁、または乳化させることによって、及び所望であれば、可溶化剤、等長剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、及び保存剤等の、従来の添加剤を用いて、注射用の調製物に製剤され得る。
二量体化剤を含む医薬組成物は、所望の度合いの純度を有する二量体化剤を、任意の生理的に容認可能な、キャリア、賦形剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤、及び/または等長化剤と混合することによって調製される。容認可能なキャリア、賦形剤、及び/または安定化剤は、用いられる用量及び濃度において受容者に無毒であり、かつ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸を含む抗酸化剤;保存剤(エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロル-m-クレゾール、メチルもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ等);アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びそれらの組み合わせ等の、アミノ酸; 単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;低分子量(約10残基未満) ポリペプチド;ゼラチンまたは血清アルブミン等のタンパク質;EDTA等のキレート剤;トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、N-メチルグルコサミン, ガラクトサミン、及びノイラミン酸等の、糖;ならびに/またはTween、Brij Pluronics、Triton-X、もしくはポリエチレングリコール(PEG)等の、非イオン性界面活性剤等の、緩衝剤を含む。
本医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から復元された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は投与の前に無菌駅で復元されるべきである。凍結乾燥組成物を復元するための標準的な手順は、ある量(典型的に凍結乾燥の間に除去された量と同等である)の純粋を加え戻すことであるが、しかしながら、抗菌剤を含む溶液が非経口投与のための医薬組成物の生成に使用され得、Chen(1992)Drug Dev Ind Pharm18,1311-54も参照されたい。
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として好適な物理的に離散的な単位を指し、それぞれの単位は、医薬的に容認可能な希釈剤、キャリア、または媒体との関連で、所望の効果を生成するために十分な量で計算された所定の量の二量体化剤を含む。所与の二量体化剤の仕様は、用いられる具体的な二量体化剤及び到達されるべき効果、ならびに宿主内のそれぞれの二量体化剤に関連する薬力学に依存し得る。
いくつかの実施形態では、二量体化剤は放出制御製剤に製剤される。徐放性調製物は、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、そこにおいてマトリクスが造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである、二量体化剤に接触する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。生物活性の起こり得る損失は、適切な添加剤を使用することによって、含水量を制御することによって、及び特定のポリマーマトリクス組成物を発達させることによって、防止され得る。
用量
好適な用量は、様々な臨床学的因子に基づき、主治医または他の有資格医療従事者によって判断され得る。医療当業者に公知であるように、任意の1人の患者に対する用量は、患者の大きさ、体の表面積、年齢、投与される具体的な二量体化剤、患者の性別、投与の時間及び経路、健康状態、ならびに同時に投与されている他の薬品を含む、多くの因子に依存する。二量体化剤は、投与1回当たり1 ng/kg体重~20mg/kg体重、例えば0.1mg/kg体重~10mg/kg体重、例えば0.5mg/kg体重~5mg/kg体重の量で投与され得るが、しかしながら、特に前述の因子を考慮すると、この例示的な範囲未満またはこれを超える用量が想定される。投与計画が持続注入である場合、これは、1分につき体重1キログラム当たり1μg~10mgの範囲でもあり得る。
当業者は、投与レベルが、特異的二量体化剤、症状の重症度、及び被験者の副作用への感受性の関数として変動し得ることを容易に理解するだろう。所与の化合物についての好ましい用量は、様々な手段により当業者によって容易に判断可能である。
投与経路
二量体化剤は、インビボ及びエクスビボ方法、ならびに全身及び局所の投与経路を含む、任意の使用可能な方法及び薬品送達に好適な経路を使用して個体に投与される。
従来の医薬に容認可能な投与経路は、腫瘍内、腫瘍周囲、筋肉内、気管内、頭蓋内、皮下、皮内、局所投与、静脈内、動脈内、直腸、経鼻、経口、ならびに他の経腸及び非経口の投与経路を含む。投与経路は、組み合わされ得、または所望であれば、二量体化剤及び/または所望の効果に応じて調節され得る。二量体化剤は、単一の用量または複数の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、二量体化剤は経口投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は局所投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は腫瘍内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は腫瘍周囲に投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は頭蓋内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は静脈内投与される。
二量体化剤は、全身または局所経路を含む、従来の薬品の送達に好適な任意の使用可能な従来の方法及び経路を使用して宿主に投与され得る。概して、本発明によって企図される投与経路は、経腸、非経口、または吸入経路を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
吸入投与以外の非経口投与経路は、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内、腫瘍内、腫瘍周囲、及び静脈内経路、すなわち、消化管を通る以外の任意の投与経路を含むが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、二量体化剤の全身または局所送達をもたらすために進められ得る。全身送達が所望である場合、投与は典型的に、医薬調製物の侵襲性または全身に吸収された局所または粘膜投与を含む。
二量体化剤は、経腸投与によっても対象に送達され得る。経腸の投与経路は、経口及び直腸(例えば坐薬を使用する)送達を含むが必ずしもこれらに限定されない。
治療によって意図されるのは、宿主を冒す病的状態に関連する症状を少なくとも改善することであり、改善は広い意味で使用され、癌等の治療されている病的状態に関連する、パラメータ、例えば症状の強さを少なくとも低減させることを指す。したがって、治療は、宿主がもはや病的状態または少なくとも病的状態を特徴づける症状を患わないように、病的状態または少なくともそれに関連する症状が、完全に抑制される、例えば発症することが防止される、または止められる、例えば終結させられる状況も含む。
いくつかの実施形態では、二量体化剤は、脳動脈における部位へまたは直接脳組織への、注射及び/または送達によって投与される。二量体化剤は、標的部位に、例えば、直接注射によって、浸透圧ポンプまたは緩効性粒子等の薬品送達デバイスの埋め込みによって、標的部位への微粒子銃送達等によって、直接投与されることができる。
併用療法
いくつかの実施形態では、二量体化剤は、標準的な癌療法にアジュバント療法として投与される。標準的な癌療法は、手術(例えば癌組織の手術による除去)、放射線療法、骨髄移植、化学療法による治療、抗体治療、生物学的応答改変物質治療、及び前述のものの特定の組み合わせを含む。
放射線療法は、ビーム等の外部から適用される源から、または小型放射線源の埋め込みによって送達される、X線またはガンマ線を含むが、これらに限定されない。
癌治療における使用に好適な抗体は、裸抗体、例えば、トラスツズマブ(Herceptin)、ベバシズマブ(Avastin(商標))、セツキシマブ(Erbitux(商標))、パニツムマブ(Vectibix(商標))、イピリムマブ(Yervoy(商標))、リツキシマブ(Rituxan)、アレムツズマブ(Lemtrada(商標))、オファツムマブ(Arzerra(商標))、オレゴボマブ(OvaRex(商標))、ランブロリズマブ(MK-3475)、ペルツズマブ(Perjeta(商標))、ラニビズマブ(Lucentis(商標))等、及び結合抗体、例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン(Mylortarg(商標))、ブレンツキシマブベドチン(Adcetris(商標))、90Y標識イブリツモマブチウキセタン(Zevalin(商標))、131I標識トシツモマ(Bexxar(商標))等を含むがこれらに限定されない。癌治療における使用に好適な抗体は、腫瘍関連抗原に対して産生された抗体を含むがこれに限定されない。かかる抗原は、CD20、CD30、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド(例えば、GD2、GD3、GM2等)、Le、VEGF、VEGFR、インテグリンアルファ-V-ベータ-3、インテグリンアルファ-5-ベータ-1、EGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、テネイシン等を含むがこれらに限定されない。
本開示の方法に関連する使用に好適な生物学的応答改変物質は、(1)チロシンキナーゼ(RTK)活性の抑制剤、(2)セリン/トレオニンキナーゼ活性の抑制剤、(3)腫瘍抗原に特異的に結合する抗体等の腫瘍関連抗原拮抗薬、(4)アポトーシス受容体作動薬、(5)インターロイキン-2、(6)インターフェロン-α、(7)インターフェロン-γ、(8)コロニー刺激因子、(9)血管新生の抑制剤;及び(10)腫瘍壊死因子の拮抗薬、を含むがこれらに限定されない。
化学療法物質は、癌細胞の増殖を低減させる非ペプチド性(すなわち非タンパク質性)化合物であり、細胞毒性物質及び細胞分裂阻害剤を包括する。化学療法物質の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物(ビンカ)アルカロイド、及びステロイドホルモンが挙げられる。
細胞増殖を低減させるために作用する物質は、当業者に既知であり幅広く使用されている。かかる物質は、メクロレタミン、シクロホスファミド(Cytoxan(商標))、メルファラン(L-サルコリシン)、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、及びテモゾロミドを含むがこれらに限定されない、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、及びトリアゼン、等のアルキル化剤を含む。
代謝拮抗剤は、シタラビン(CYTOSAR-U)、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル(5-FU)、フロクスウリジン(FudR)、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン(6-MP)、ペントスタチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、メトトレキサート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸(PDDF、CB3717)、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF)、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、及びゲムシタビンを含むがこれらに限定されない、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ抑制剤を含む。
好適な天然物及びそれらの誘導体(例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン)は、Ara-C、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン;ブレキナル;アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等;ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシド等;抗生物質、例えば、アンソラサイクリン、塩酸ダウノルビシン(ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン)、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びモルホリノ誘導体等;フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン;塩基性糖ペプチド、例えば、ブレオマイシン;アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン(ミトラマイシン);アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン;アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン;大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、FK-506(タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシン等;等を含むがこれらに限定されない。
他の抗増殖性細胞毒性物質は、ナベルベン、CPT-11、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォスアミド、及びドロロキサフィンである。
抗増殖性活性を有する、微小管に影響を与える物質も使用に好適であり、アロコルヒチン(NSC406042)、ハリコンドリンB(NSC609395)、コルヒチン(NSC757)、コルヒチン誘導体(例えばNSC33410)、ドルスタチン10(NSC376128)、メイタンシン(NSC153858)、リゾキシン(NSC332598)、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、Taxol(登録商標)誘導体、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、チオコルヒチン(NSC361792)、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン;エポチロンA、エポチロンB、ディスコデルモリドを含むがこれらに限定されない、天然及び合成エポチロン;エストラムスチン、ノコダゾール等、を含むがこれらに限定されない。
使用に好適なホルモン調節剤及びステロイド(合成類似体を含む)は、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン等; エストロゲン及びプレゲスチン、例えば、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン;等;及び副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド;17α-エチニルエストラジオール;ジエチルスチルベストロール、テストステロン,フルオキシメステロン, プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド(ドロゲニル)、トレミフェン(フェアストン)、及びZoladex(登録商標)を含むがこれらに限定されない。エストロゲンは増殖及び分化を模擬し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物がこの活性を阻害するために使用される。コルチコステロイドはT細胞増殖を抑制し得る。
他の化学療法物質は、金属複合体、例えば、シスプラチン(シス-DDP)、カルボプラチン等 ;尿素、例えばヒドロキシ尿素;ヒドラジン、例えばN-メチルヒドラジン;エポドフィロトキシン;トポイソメラーゼ抑制剤;プロカルバジン;ミトキサントロン;ロイコボリン;テガフール;等を含む。対象となる他の抗増殖性物質は、例えば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デソキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン(SKF105685);Iressa(登録商標)(ZD 1839、4-(3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(3-(4-モルホリニル)プロポキシ)キナゾリン);等を含む。
「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」(本明細書では、例えば、ドセタキセル、TAXOL(商標)、TAXOTERE(商標)(ドセタキセルの製剤)、パクリタキセルの10-デスアセチル類似体、及びパクリタキセルの3'N-デスベンゾイル-3'N-t-ブトキシカルボニル類似体等の、類似体、製剤、及び誘導体を含むと理解されるべきである)は、当業者に既知の技術を利用して容易に調製され得(WO94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO94/07876、WO93/23555、WO93/10076;米国特許第5,294,637号、同第5,283,253号、同第5,279,949号、同第5,274,137号、同第5,202,448号、同第5,200,534号、同第5,229,529号、及びEP590,267も参照されたい)、または例えばミズーリ州セントルイスのSigma Chemical Co.(セイヨウイチイからのT7402、タキサスヤンナネンシスからのT-1912)を含む、様々な市販の供給源から得られ得る。
パクリタキセルは、パクリタキセルの一般的で化学的に入手可能な形態のみではなく、類似体及び誘導体(例えば、上記のようにTaxotere(商標)ドセタキセル)ならびにパクリタキセル結合体(例えば、パクリタキセル-PEG、パクリタキセル-デキストラン、またはパクリタキセル-キシロース)も指すということが理解されるべきである。
さらに、親水性誘導体及び疎水性誘導体の両方を含む様々な既知の誘導体も「タキサン」という用語に含まれる。タキサン誘導体は、国際特許出願WO99/18113に記載されるガラクトース及びマンノース誘導体;WO99/14209に記載されるピペラジノ及び他の誘導体;WO99/09021、WO98/22451、及び米国特許第5,869,680号に記載されるタキサン誘導体;WO98/28288に記載される6-チオ誘導体;米国特許第5,821,263号に記載されるスルフェンアミド誘導体;及び米国特許第5,415,869号に記載されるタキソール誘導体、を含むがこれらに限定されない。これは、WO98/58927、WO98/13059、及び米国特許第5,824,701号に記載されるものを含むがこれらに限定されない、パクリタキセルのプロドラッグをさらに含む。
治療に好適な対象
様々な対象が、癌を治療する本願の方法を用いた治療に好適である。好適な対象は、癌を有する、癌と診断された、癌を発症する危険性のある、癌を有したことがあり癌の再発の危険性がある、癌について二量体化剤以外の物質で治療されたことがありかかる治療に応答することができなかった、または癌について二量体化剤以外の物質で治療されたことがあるがかかる治療への初期応答の後に再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物を含む。
本願の免疫調節方法を用いた治療に好適な対象は、自己免疫障害を有する個体、臓器または組織移植受容者である個体等、免疫無防備状態の個体、及び病原体に感染した個体を含む。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数(例えば量、温度等)に関する正確性を保証するように努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。略語、例えば、bp、塩基対(複数可);kb、キロベース(複数可);pl、ピコリットル(複数可);sまたはsec、秒(複数可);min、分(複数可);hまたはhr、時間(複数可);aa、アミノ酸(複数可);kb、キロベース(複数可);bp、塩基対(複数可);nt、ヌクレオチド(複数可);i.m.筋肉内の(に);i.p.腹腔内の(に);s.c.皮下の(に);i.v.静脈内の(に);等が使用され得る。
実施例1:CARの生成
材料及び方法
設計最適化プロセスを通して、抗ヒトCD19scFVが、CAR内の抗原認識ドメインとして選択された。図18A及び18Bは、数的に識別される2つのポリペプチドから成るそれぞれのCARの分子構造をまとめる。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。膜アンカーポリペプチドは、図面を単純にするためにモノマーとして描写される。
CAR構築物の生成
非ヒトCD19scFVをコードする配列は、一構築物からクローン化された。ヒト4-1BB共刺激及びCD3ゼータITAMシグナル伝達鎖は、Open Biosystemsによって提供されたcDNAからクローン化した。FKBP及びFRBコード配列は、Addgeneによって提供されたプラスミドからクローン化された。
標準的な分子クローン化技術(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限消化、結紮等)が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
ヒト初代CD8+T細胞を、University Institutional Review Boardによって承認された通り、RosetteSep Human CD8+T Cell Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies、番号15063)を使用する負の選択によって、アフェレーシス(カリフォルニア州サンフランシスコのBlood Centers of the PacificからのTrima残差)の後に、匿名のドナーの血液から単離した。細胞は、X-VIVO15(Lonza、番号04-418Q)、5%のヒトAB血清(Valley Biomedical Inc.、番号HP1022)、10mMのN-アセチルL-システイン(Sigma-Aldrich、番号A9165)、及び100IU/mLの組み換えヒトIL-2(NCI/BRB Preclinical Repository)、から成るヒトT細胞培地において培養された。NFAT活性化の際に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するジャーカット細胞株を、10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で維持した。U.PennからのK562標的細胞を、10%のFBSを添加したIMDM中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性VSV-G偽型レンチウイルスを、pHR'SIN:CSW導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、pCMVdR8.91、及びpMD2.Gと、同時形質移入された、Lenti-X293T細胞(Clontech Laboratories、番号632180)から、Lipofectamine LTX(Life Technologies、番号15338)を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の48時間後に採取し、導入に直接使用した。
ウイルス導入の24時間前、初代ヒトT細胞を、ヒトT-Activator CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies、番号111-31D)を1:3の細胞:ビーズ比で使用して、活性化した。培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びK562細胞を前もって1~2日間分裂させた。導入されたジャーカット及びK562細胞を実験を行う前に少なくとも7日間培養した。初代T細胞を、ヒトT細胞培地中で、細胞が静止期に戻るまで約2週間、約10^6/mLに維持した。レンチウイルス構築物においてコードされるCARの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
IL-2生成及びNFAT活性の定量
CARを発現するジャーカットCD4+T細胞を、U.Pennからのコグネイトまたは非コグネイトK562標的細胞と、1:2のエフェクター:標的比で混合した。ラパログA/C Heterodimerizer(Clontech Laboratories、番号635055)を連続的に培地中で希釈し、反応混合物に加えた。20~24時間インキュベートした後、培地上清を採取し、BD OptEIA Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences、番号555190)で分析した。フローサイトメトリーを行い、CAR活性の別個のインジケータとして、ジャーカット細胞におけるNFAT依存性GFPレポーター発現を定量化した。
フローサイトメトリーベースの方向付け直された(re-directed)細胞毒性アッセイ
コグネイト及び非コグネイトK562標的細胞を、混合物中の両方の種類の細胞がフローサイトメトリーによって同時に定量化され得るように、明確な蛍光タンパク質を発現するように操作した。標的細胞種類を、1:1比で混合し、ヒト初代CD8+エフェクターT細胞と、5:2のエフェクター:標的比で同時インキュベートした。100IU/mLのヒトIL-2及び様々な量のラパログ(Clontech Laboratories、番号635055)を、反応混合物に加えた。24時間インキュベートした後、試料を400gで5分間遠心分離した。ペレット状の細胞を、洗浄緩衝剤(PBS+0.5%のBSA+0.1%のアジ化ナトリウム)中で再懸濁し、フローサイトメトリーの前に、同等の量のBD Cytofix(BD cat、番号554655)で固定した。エフェクター細胞の方向付け直された細胞毒性活性を列挙するために、生存するコグネイト標的細胞と非コグネイト標的細胞との比をそれぞれの試料について計算した。
結果
様々なCAR構築物によって引き出されたIL-2生成を評価した。データは図12に提供される。
図12:5つのオンスイッチCAR変異体によって引き起こされたIL-2生成。エフェクター=CARで操作されたヒトCD4+ジャーカットT細胞。標的=コグネイトCD19抗原を有するまたは有さないK562細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたIL-2の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量化した。
図13:図12に記載されるものと同じ実験における、対照ジャーカット株によるIL-2生成。構築物「125」は、臨床試験において現在使用される従来の対照物を示す。
図14:図12に記載されるものと同一の条件下での、別個の実験における「122+206」と「197+206」との間の比較。
図15は、オンスイッチCAR「197+206」によって与えられた薬理学的に滴定可能な細胞毒性を示す。小分子ラパログの存在下で、CARはコグネイト標的細胞に対する方向付け直された細胞毒性を効果的に媒介する。高用量のラパログでは、このオンスイッチCARは「125」従来CARと同程度に強力にシグナル伝達をすることができる。エフェクター=CARまたは対照ベクターで操作されたヒト初代CD8+T細胞。標的=コグネイトヒトCD19抗原または非コグネイトヒトメソテリン抗原のいずれかを発現するK562細胞株の蛍光誘導体。
図16は、細胞内シグナル伝達ドメインとしてのT細胞受容体経路からの細胞質チロシンキナーゼZap70で構築されたCARについてのデータを示す。
図16は、オンスイッチCARのいくつかの変異体で操作されたジャーカット細胞からのデータを示す。操作されたジャーカット細胞は、コグネイト抗原(CD19)及び示された濃度のラパログを伴ってまたは伴わずに、K562標的細胞と同時インキュベートした。CAR成分として、Zap70キナーゼ(「199」と記される左から1つ目及び2つ目の構造)は、NFAT機能を活性化することにおいて、ITAM(「168」と記される左から3つ目の構造)と同程度に有効であった。4-1BBシグナル伝達ドメインの追加は、受容体の抗原認識部分の表面発現を増加させ、「197+199」によるより強力なシグナル伝達をもたらした。非シグナル伝達CAR(最も右)は負の対照として含まれた。
実施例2:メソテリン標的CAR
材料及び方法
複数のキメラ抗原受容体構築物が作製され試験された。ここに示される構築物は、3つの異なる抗ヒトメソテリンscFvを抗原認識ドメインとしてコードする。図19A、19B、及び19Cは、それぞれのCARが2つのポリペプチドを含む、それぞれの抗ヒトメソテリンCARの分子構造をまとめる。それぞれの抗ヒトメソテリンCARの細胞内部分は、2つの4-1BB共刺激ドメイン、FKBP及びFRB二量体化剤結合対、ならびにITAM細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ここに示される3つの異なる抗原認識ドメインは、抗メソテリンHN1scFv、SS1scFv、及びm912scFvである。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。
CAR構築物の生成
抗メソテリンをコードする配列は、構築物からクローン化したか、またはPCRによって遺伝子アセンブリを介して合成した。ヒト4-1BB共刺激及びCD3ゼータITAMシグナル伝達鎖は、Open Biosystemsによって提供されたcDNAからクローン化した。HN1scFvコード配列、SS1scFvコード配列、及びm912scFvコード配列は、PCRによって合成され、いくつかの場合では、コドン最適化された。FKBP及びFRBコード配列は、Addgeneプラスミドからクローン化した。
標準的な分子クローン化技術(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限消化、結紮等)が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
NFAT活性化の際にGFPを発現するジャーカット細胞株を、10%のFBS、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で維持した。K562標的細胞を、10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したIMDM中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性VSV-G偽型レンチウイルスを、pHR'SIN:CSW導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、pCMVdR8.91、及びpMD2.Gと、同時形質移入された、Lenti-X293T細胞(Clontech Laboratories、番号632180)から、Lipofectamine LTX(Life Technologies、番号15338)を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の48時間後に採取し、導入に直接使用した。
培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びK562細胞を前もって1~2日間分裂させた。導入されたジャーカット及びK562細胞を実験を行う前に少なくとも7日間培養した。レンチウイルス構築物においてコードされるCARの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
IL-2生成の定量
CARを発現するジャーカットCD4+T細胞を、コグネイトまたは非コグネイトK562標的細胞と、1:2のエフェクター:標的比で混合した。ラパログA/C Heterodimerizer(Clontech Laboratories、番号635055)を連続的に培地中で希釈し、反応混合物に加えた。20~24時間インキュベートした後、培地上清を採取し、BD OptEIA Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences、番号555190)で分析した。
結果
抗メソテリンCAR構築物によって引き出されたIL-2生成を評価した。データは図19D~Fに提供される。
図19:HN1scFv(図19D)、SS1scFv(図19E)、及びm912scFv(図19F)オンスイッチCAR変異体によって引き起こされるIL-2生成。従来CAR(図19G、構築物番号358)によるIL-2生成を測定し、オンスイッチCAR(図19D)との比較のために含めた。エフェクター=CARで操作されたヒトCD4+ジャーカットT細胞。標的=コグネイトメソテリン抗原を有するまたは有さないK562細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたIL-2の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量化した。
実施例3:オンスイッチCARの二量体化剤としてのジベレリン酸
材料及び方法
図20Aは、本願のジベレリン酸二量体化剤CARの分子構造をまとめる。抗原結合部分は、抗ヒトCD19scFvを含む。細胞内部分は、2つの4-1BB共刺激ドメイン、GID1及びGAI二量体化剤結合対、ならびにITAM細胞内シグナル伝達ドメインを含む。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。
CAR構築物の生成
ジベレリン酸二量体化剤CARをコードする配列を構築物からクローン化した。抗CD19scFvをプラスミドからクローン化した。ヒト4-1BB共刺激及びCD3ゼータITAMシグナル伝達鎖は、Open Biosystemsによって提供されたcDNAからクローン化した。GID1及びGAIコード配列を、Addgeneプラスミドからクローン化した。標準的な分子クローン化技術(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限消化、結紮等)が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
NFAT活性化の際にGFPを発現するジャーカット細胞株を、10%のFBS、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で維持した。K562標的細胞を、10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したIMDM中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性VSV-G偽型レンチウイルスを、pHR'SIN:CSW導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、pCMVdR8.91、及びpMD2.Gと、同時形質移入された、Lenti-X293T細胞(Clontech Laboratories、番号632180)から、Lipofectamine LTX(Life Technologies、番号15338)を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の48時間後に採取し、導入に直接使用した。
培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びK562細胞を前もって1~2日間分裂させた。導入されたジャーカット及びK562細胞を実験を行う前に少なくとも7日間培養した。レンチウイルス構築物においてコードされるCARの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
IL-2生成の定量
CARを発現するジャーカットCD4+T細胞を、コグネイトまたは非コグネイトK562標的細胞と、1:2のエフェクター:標的比で混合した。エタノール(Toronto Research Chemicals、番号G377500)中で予め溶解させたジベレリン酸-3アセトキシメチルエステル(ジベレリン酸-3AM) を成長培地中で希釈し反応混合物に加えた。ジベレリン酸(ジベレリン酸-3AM)を10mMで使用した。20~24時間インキュベートした後、培地上清を採取し、BD OptEIA Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences、番号555190)で分析した。
結果
ジベレリン酸二量体化剤CAR構築物によって引き出されたIL-2生成を評価した。データは図20に提供される。
図20:ジベレリン酸二量体化剤CAR変異体によって引き起こされたIL-2生成(図20B)。従来CAR(図20C、構築物「125」)によるIL-2生成を測定し、オンスイッチCARとの比較のために含めた。 エフェクター=CARで操作されたヒトCD4+ジャーカットT細胞。標的=コグネイトCD19抗原を有するまたは有さないK562細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたIL-2の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量化した。
実施例4:様々な共刺激ドメインを有するオンスイッチCAR
材料及び方法
複数のキメラ抗原受容体構築物を、4-1BB共刺激ドメインを様々な他の共刺激ドメインで交換したことを除き、本質的に実施例1について記載した通りに作製した。図21A及び21Bは、ここに記載されるCARの分子構造をまとめる。
CAR構築物の生成
抗ヒトCD19scFvをコードする配列を、プラスミドからクローン化した。ヒトCD3ゼータITAMシグナル伝達鎖、ならびにヒト共刺激ドメインCD28及びOX-40コード配列を、Open Biosystemsによって提供されたcDNAからクローン化した。FKBP及びFRBコード配列は、Addgeneからのプラスミドからクローン化された。
標準的な分子クローン化技術(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限消化、結紮等)が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
CAR構築物の試験
エフェクター及び標的細胞を、CD28及びOX-40共刺激ドメインを含む記載されるオンスイッチCAR構築物(図21A~B、それぞれ構築物「365+367」及び「399+400」)、ならびに対応する従来のCAR対照物(図21C~D、それぞれ構築物「366」及び「398」)を使用して、実施例1に従って培養及び形質移入した。IL-2生成、NFAT活性アッセイ、及びフローサイトメトリーベースのアッセイも、実施例1について記載されるように、構築物を含むCD28共刺激ドメイン及び構築物を含むOX-40共刺激ドメインを用いて、行うことができる。あるいは、CD28及びOX-40共刺激ドメインを含むオンスイッチCAR構築物のサブユニットは、実施例1からの構築物のサブユニットと対になり得る(例えば「197+367」、「365+206」、「197+400」、「399+206」等)。
実施例5:オンスイッチCARのインビボ評価
オンスイッチCARは、標的腫瘍細胞の死滅をインビボで媒介する能力について評価され得る。オンスイッチCARを発現するT細胞の注射によって引き出されるインビボでの腫瘍細胞の死滅を評価する。インビトロでコグネイト抗原を発現することが確認されており、かつ、対応するCARを発現するCD8T細胞によって死滅し得る腫瘍細胞株を使用する。生物発光撮像によりインビボで腫瘍量を定量化することを可能にするために、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼのいずれかを発現するように操作された腫瘍細胞を使用することができる。腫瘍細胞を、免疫無防備状態のマウス(例えば6~10週齢の雌のNOD 重症複合免疫不全ガンマ(NSG)マウス)に、皮下腫瘍モデルについては皮下に、または全身腫瘍モデルについては静脈内に、のいずれかで注入する。腫瘍移植の方法及び移植する腫瘍細胞の最適数は、使用される腫瘍細胞株に最適な条件に基づき得る。腫瘍量は、生物発光撮像によって、及び適用可能であればキャリパー測定によって、一週間に2回モニタすることができる。腫瘍量が検出可能になったらただちに、オンスイッチCARを発現する合計0.5~2.5×10^7のT細胞(1:1のCD4:CD8)を、マウスに静脈内注入し、治療を開始する。二量体化小分子薬(例えばラパログ)をビヒクル配合物中で腹腔内投与する。オンスイッチCARを発現するT細胞を、抗腫瘍効果を増強するために、実験の間繰返し注入することができる。インターロイキン-2(IL-2)を、抗腫瘍効果を増強するために投与することができる。
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されてきたが、当業者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得、かつ等価物が置換され得るということが理解されるべきである。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正が行われてもよい。すべてのかかる修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であるよう意図されている。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
<120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND METHODS OF USE THEREOF
<150> US 61/765,585
<151> 2013-02-15
<160> 145
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20

<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 3
gagcagaagc tgatcagcga ggaggacctg 30

<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 4
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10

<210> 5
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 5
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726

<210> 6
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser

<210> 7
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207

<210> 8
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 8
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65

<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 9
tccctaggaa gcgggtccgg tagcggatct 30

<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 10
Ser Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10

<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 11
atgggagtcc aggtggaaac catctcccca ggagacgggc gcaccttccc caagcgcggc 60
cagacctgcg tggtgcacta caccgggatg cttgaagatg gaaagaaatt tgattcctcc 120
cgggacagaa acaagccctt taagtttatg ctaggcaagc aggaggtgat ccgaggctgg 180
gaagaagggg ttgcccagat gagtgtgggt cagagagcca aactgactat atctccagat 240
tatgcctatg gtgccactgg gcacccaggc atcatcccac cacatgccac tctcgtcttc 300
gatgtggagc ttctaaaact ggaa 324

<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 12
Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys
35 40 45
Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
50 55 60
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala
85 90 95
Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105

<210> 13
<211> 282
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 13
atgatcctct ggcatgagat gtggcatgaa ggcctggaag aggcatctcg tttgtacttt 60
ggggaaagga acgtgaaagg catgtttgag gtgctggagc ccttgcatgc tatgatggaa 120
cggggccccc agactctgaa ggaaacatcc tttaatcagg cctatggtcg agatttaatg 180
gaggcccaag agtggtgcag gaagtacatg aaatcaggga atgtcaagga cctcctccaa 240
gcctgggacc tctattatca tgtgttccga cgaatctcaa ag 282

<210> 14
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 14
Met Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu
20 25 30
Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu
35 40 45
Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu
50 55 60
Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln
65 70 75 80
Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90

<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 15
ggaagcgggt ccggtagcgg atcttcccta 30

<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 16
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Leu
1 5 10

<210> 17
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 17
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

<210> 19
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tcgcgaggaa gcgggtccgg tagcggatct 30

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Ser Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10

<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 21
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

<210> 22
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 22
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235

<210> 23
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 23
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126

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<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 24
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40

<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 25
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgcct cctcgc 336

<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 26
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

<210> 27
<211> 144
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 27
atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcagacg 60
actccaggag agagatcatc actccctgcc ttttaccctg gcacttcagg ctcttgttcc 120
ggatgtgggt ccctctctct gccg 144

<210> 28
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 28
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
35 40 45

<210> 29
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 29
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72

<210> 30
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 30
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20

<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 31
ggttccggca gcggatctgg tagcggaagc gggtccggta gcggatct 48

<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 32
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15

<210> 33
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 33
atcctctggc atgagatgtg gcatgaaggc ctggaagagg catctcgttt gtactttggg 60
gaaaggaacg tgaaaggcat gtttgaggtg ctggagccct tgcatgctat gatggaacgg 120
ggcccccaga ctctgaagga aacatccttt aatcaggcct atggtcgaga tttaatggag 180
gcccaagagt ggtgcaggaa gtacatgaaa tcagggaatg tcaaggacct cctccaagcc 240
tgggacctct attatcatgt gttccgacga atctcaaag 279

<210> 34
<211> 93
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 34
Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu
20 25 30
Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr
35 40 45
Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp
50 55 60
Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala
65 70 75 80
Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90

<210> 35
<211> 1857
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 35
atgccagacc ccgcggcgca tctgcccttc ttctacggca gcatctcgcg tgccgaggcc 60
gaggagcacc tgaagctggc gggcatggcg gacgggctct tcctgctgcg ccagtgcctg 120
cgctcgctgg gcggctatgt gctgtcgctc gtgcacgatg tgcgcttcca ccactttccc 180
atcgagcgcc agctcaacgg cacctacgcc attgccggcg gcaaagcgca ctgtggaccg 240
gcagagctct gcgagttcta ctcgcgcgac cccgacgggc tgccctgcaa cctgcgcaag 300
ccgtgcaacc ggccgtcggg cctcgagccg cagccggggg tcttcgactg cctgcgagac 360
gccatggtgc gtgactacgt gcgccagacg tggaagctgg agggcgaggc cctggagcag 420
gccatcatca gccaggcccc gcaagtggag aagctcattg ctacgacggc ccacgagcgg 480
atgccctggt accacagcag cctgacgcgt gaggaggccg agcgcaaact ttactctggg 540
gcgcagaccg acggcaagtt cctgctgagg ccgcggaagg agcagggcac atacgccctg 600
tccctcatct atgggaagac ggtgtaccac tacctcatca gccaagacaa ggcgggcaag 660
tactgcattc ccgagggcac caagtttgac acgctctggc agctggtgga gtatctgaag 720
ctgaaggcgg acgggctcat ctactgcctg aaggaggcct gccccaacag cagtgccagc 780
aacgcctcag gggctgctgc tcccacactc ccagcccacc catccacgtt gactcatcct 840
cagagacgaa tcgacaccct caactcagat ggatacaccc ctgagccagc acgcataacg 900
tccccagaca aaccgcggcc gatgcccatg gacacgagcg tgtatgagag cccctacagc 960
gacccagagg agctcaagga caagaagctc ttcctgaagc gcgataacct cctcatagct 1020
gacattgaac ttggctgcgg caactttggc tcagtgcgcc agggcgtgta ccgcatgcgc 1080
aagaagcaga tcgacgtggc catcaaggtg ctgaagcagg gcacggagaa ggcagacacg 1140
gaagagatga tgcgcgaggc gcagatcatg caccagctgg acaaccccta catcgtgcgg 1200
ctcattggcg tctgccaggc cgaggccctc atgctggtca tggagatggc tgggggcggg 1260
ccgctgcaca agttcctggt cggcaagagg gaggagatcc ctgtgagcaa tgtggccgag 1320
ctgctgcacc aggtgtccat ggggatgaag tacctggagg agaagaactt tgtgcaccgt 1380
gacctggcgg cccgcaacgt cctgctggtt aaccggcact acgccaagat cagcgacttt 1440
ggcctctcca aagcactggg tgccgacgac agctactaca ctgcccgctc agcagggaag 1500
tggccgctca agtggtacgc acccgaatgc atcaacttcc gcaagttctc cagccgcagc 1560
gatgtctgga gctatggggt caccatgtgg gaggccttgt cctacggcca gaagccctac 1620
aagaagatga aagggccgga ggtcatggcc ttcatcgagc agggcaagcg gatggagtgc 1680
ccaccagagt gtccacccga actgtacgca ctcatgagtg actgctggat ctacaagtgg 1740
gaggatcgcc ccgacttcct gaccgtggag cagcgcatgc gagcctgtta ctacagcctg 1800
gccagcaagg tggaagggcc cccaggcagc acacagaagg ctgaggctgc ctgtgcc 1857

<210> 36
<211> 619
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 36
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn
275 280 285
Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys
290 295 300
Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser
305 310 315 320
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
325 330 335
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
340 345 350
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
355 360 365
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
370 375 380
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
385 390 395 400
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
405 410 415
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
420 425 430
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
435 440 445
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
450 455 460
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
465 470 475 480
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
485 490 495
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
500 505 510
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
515 520 525
Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys
530 535 540
Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
545 550 555 560
Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp
565 570 575
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
580 585 590
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
610 615

<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> the amino acids in this region can be repeated n times, where n
is an integer of at least one
<400> 37
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5

<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(4)
<223> the amino acids in this region can be repeated n times, where n
is an integer of at least one
<400> 38
Gly Gly Gly Ser
1

<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 39
Gly Gly Ser Gly
1

<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 40
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5

<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 41
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5

<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 42
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5

<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 43
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5

<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 44
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5

<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr
1 5

<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 46
Cys Pro Pro Cys
1

<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 47
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15

<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 48
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10

<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 49
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10

<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 50
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5

<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 51
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5

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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 52
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 53
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10

<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 54
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro

<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 55
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10

<210> 56
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 56
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45

<210> 57
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 57
Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Ile His Leu Cys Cys
20

<210> 58
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 58
Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly
1 5 10 15
Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys
20 25

<210> 59
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 59
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
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20

<210> 60
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 60
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
1 5 10 15
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20 25

<210> 61
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 61
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
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Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
20 25

<210> 62
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 62
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20

<210> 63
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 63
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<210> 64
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 64
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35

<210> 65
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 65
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35

<210> 66
<211> 114
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 66
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<210> 67
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 67
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Pro

<210> 68
<211> 187
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 68
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<210> 69
<211> 54
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 69
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<400> 70
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60

<210> 71
<211> 292
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 71
Leu Glu Glu Ser Val Ala Leu Arg Ile Ile Thr Glu Gly Ala Ser Ile
1 5 10 15
Leu Arg Gln Glu Lys Asn Leu Leu Asp Ile Asp Ala Pro Val Thr Val
20 25 30
Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp Leu Met Lys Leu Phe Glu
35 40 45
Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr Leu Phe Leu Gly Asp Tyr
50 55 60
Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys Val Leu Tyr Leu Trp Ala
65 70 75 80
Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Leu Phe Leu Leu Arg Gly Asn His
85 90 95
Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr Phe Lys Gln Glu Cys Lys
100 105 110
Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Asp Ala Cys Met Asp Ala Phe Asp
115 120 125
Cys Leu Pro Leu Ala Ala Leu Met Asn Gln Gln Phe Leu Cys Val His
130 135 140
Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile Asn Thr Leu Asp Asp Ile Arg Lys Leu
145 150 155 160
Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Tyr Gly Pro Met Cys Asp Ile Leu
165 170 175
Trp Ser Asp Pro Leu Glu Asp Phe Gly Asn Glu Lys Thr Gln Glu His
180 185 190
Phe Thr His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser Tyr Phe Tyr Ser Tyr Pro
195 200 205
Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln His Asn Asn Leu Leu Ser Ile Leu Arg
210 215 220
Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg Met Tyr Arg Lys Ser Gln
225 230 235 240
Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile Phe Ser Ala Pro Asn Tyr
245 250 255
Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val Leu Lys Tyr Glu Asn Asn
260 265 270
Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser Pro His Pro Tyr Trp Leu
275 280 285
Pro Asn Phe Met
290

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 72
Met Val Asn Pro Thr Val Phe Phe Asp Ile Ala Val Asp Gly Glu Pro
1 5 10 15
Leu Gly Arg Val Ser Phe Glu Leu Phe Ala Asp Lys Val Pro Lys Thr
20 25 30
Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr
35 40 45
Lys Gly Ser Cys Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe Met Cys Gln Gly
50 55 60
Gly Asp Phe Thr Arg His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly
65 70 75 80
Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe Ile Leu Lys His Thr Gly Pro Gly
85 90 95
Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe
100 105 110
Phe Ile Cys Thr Ala Lys Thr Glu Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val
115 120 125
Phe Gly Lys Val Lys Glu Gly Met Asn Ile Val Glu Ala Met Glu Arg
130 135 140
Phe Gly Ser Arg Asn Gly Lys Thr Ser Lys Lys Ile Thr Ile Ala Asp
145 150 155 160
Cys Gly Gln Leu Glu
165

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 73
Met Ser Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Ile Lys Val Leu Lys Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ala Val Arg Lys Arg Pro Gly Met Tyr Ile Gly Asp Thr Asp Asp
20 25 30
Gly Thr Gly Leu His His Met Val Phe Glu Val Val Asp Asn Ala Ile
35 40 45
Asp Glu Ala Leu Ala Gly His Cys Lys Glu Ile Ile Val Thr Ile His
50 55 60
Ala Asp Asn Ser Val Ser Val Gln Asp Asp Gly Arg Gly Ile Pro Thr
65 70 75 80
Gly Ile His Pro Glu Glu Gly Val Ser Ala Ala Glu Val Ile Met Thr
85 90 95
Val Leu His Ala Gly Gly Lys Phe Asp Asp Asn Ser Tyr Lys Val Ser
100 105 110
Gly Gly Leu His Gly Val Gly Val Ser Val Val Asn Ala Leu Ser Gln
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Val Ile Gln Arg Glu Gly Lys Ile His Arg Gln Ile
130 135 140
Tyr Glu His Gly Val Pro Gln Ala Pro Leu Ala Val Thr Gly Glu Thr
145 150 155 160
Glu Lys Thr Gly Thr Met Val Arg Phe Trp Pro Ser Leu Glu Thr Phe
165 170 175
Thr Asn Val Thr Glu Phe Glu Tyr Glu Ile Leu Ala Lys Arg Leu Arg
180 185 190
Glu Leu Ser Phe Leu Asn Ser Gly Val Ser Ile Arg Leu Arg Asp Lys
195 200 205
Arg Asp Gly Lys Glu Asp His Phe His Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Ala
210 215 220
Phe Val Glu Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Thr Pro Ile His Pro Asn Ile
225 230 235 240
Phe Tyr Phe Ser Thr Glu Lys Asp Gly Ile Gly Val Glu Val Ala Leu
245 250 255
Gln Trp Asn Asp Gly Phe Gln Glu Asn Ile Tyr Cys Phe Thr Asn Asn
260 265 270
Ile Pro Gln Arg Asp Gly Gly Thr His Leu Ala Gly Phe Arg Ala Ala
275 280 285
Met Thr Arg Thr Leu Asn Ala Tyr Met Asp Lys Glu Gly Tyr Ser Lys
290 295 300
Lys Ala Lys Val Ser Ala Thr Gly Asp Asp Ala Arg Glu Gly Leu Ile
305 310 315 320
Ala Val Val Ser Val Lys Val Pro Asp Pro Lys Phe Ser Ser Gln Thr
325 330 335
Lys Asp Lys Leu Val Ser Ser Glu Val Lys Ser Ala Val Glu Gln Gln
340 345 350
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355 360 365
Lys Ile Val Val Gly Lys Ile Ile Asp Ala Ala Arg Ala Arg Glu Ala
370 375 380
Ala Arg Arg Ala Arg Glu Met Thr Arg Arg Lys Gly Ala Leu Asp Leu
385 390 395 400
Ala Gly Leu Pro Gly Lys Leu Ala Asp Cys Gln Glu Arg Asp Pro Ala
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Tyr Leu Val Glu Gly Asp Ser Ala Gly Gly Ser Ala
420 425 430
Lys Gln Gly Arg Asn Arg Lys Asn Gln Ala Ile Leu Pro Leu Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Leu Asn Val Glu Lys Ala Arg Phe Asp Lys Met Leu Ser Ser
450 455 460
Gln Glu Val Ala Thr Leu Ile Thr Ala Leu Gly Cys Gly Ile Gly Arg
465 470 475 480
Asp Glu Tyr Asn Pro Asp Lys Leu Arg Tyr His Ser Ile Ile Ile Met
485 490 495
Thr Asp Ala Asp Val Asp Gly Ser His Ile Arg Thr Leu Leu Leu Thr
500 505 510
Phe Phe Tyr Arg Gln Met Pro Glu Ile Val Glu Arg Gly His Val Tyr
515 520 525
Ile Ala Gln Pro Pro Leu Tyr Lys Val Lys Lys Gly Lys Gln Glu Gln
530 535 540
Tyr Ile Lys Asp Asp Glu Ala Met Asp Gln Tyr Gln Ile Ser Ile Ala
545 550 555 560
Leu Asp Gly Ala Thr Leu His Thr Asn Ala Ser Ala Pro Ala Leu Ala
565 570 575
Gly Glu Ala Leu Glu Lys Leu Val Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Lys
580 585 590
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Thr Val Thr Arg Trp Val Asn Ala Leu Val Ser Glu Leu Asn Asp Lys
625 630 635 640
Glu Gln His Gly Ser Gln Trp Lys Phe Asp Val His Thr Asn Ala Glu
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Gln Asn Leu Phe Glu Pro Ile Val Arg Val Arg Thr His Gly Val Asp
660 665 670
Thr Asp Tyr Pro Leu Asp His Glu Phe Ile Thr Gly Gly Glu Tyr Arg
675 680 685
Arg Ile Cys Thr Leu Gly Glu Lys Leu Arg Gly Leu Leu Glu Glu Asp
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Gln Ala Leu Asp Trp Leu Val Lys Glu Ser Arg Arg Gly Leu Ser Ile
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Thr Thr Met Asp Pro Glu Ser Arg Arg Met Leu Arg Val Thr Val Lys
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770 775 780
Val Glu Pro Arg Arg Ala Phe Ile Glu Glu Asn Ala Leu Lys Ala Ala
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Asn Ile Asp Ile

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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 74
Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
1 5 10 15
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
35 40 45
Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
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Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His
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Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu
130 135 140
Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
180 185

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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 75
Met Ala Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
1 5 10 15
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
20 25 30
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
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Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
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Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105 110

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 76
Met Asn Gly Asp Glu Thr Lys Lys Val Glu Ser Glu Tyr Ile Lys Lys
1 5 10 15
His His Arg His Glu Leu Val Glu Ser Gln Cys Ser Ser Thr Leu Val
20 25 30
Lys His Ile Lys Ala Pro Leu His Leu Val Trp Ser Ile Val Arg Arg
35 40 45
Phe Asp Glu Pro Gln Lys Tyr Lys Pro Phe Ile Ser Arg Cys Val Val
50 55 60
Gln Gly Lys Lys Leu Glu Val Gly Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Lys
65 70 75 80
Ser Gly Leu Pro Ala Thr Lys Ser Thr Glu Val Leu Glu Ile Leu Asp
85 90 95
Asp Asn Glu His Ile Leu Gly Ile Arg Ile Val Gly Gly Asp His Arg
100 105 110
Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Thr Ile Ser Leu His Ser Glu Thr Ile Asp
115 120 125
Gly Lys Thr Gly Thr Leu Ala Ile Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro
130 135 140
Glu Gly Asn Thr Lys Glu Glu Thr Cys Phe Phe Val Glu Ala Leu Ile
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Gln Cys Asn Leu Asn Ser Leu Ala Asp Val Thr Glu Arg Leu Gln Ala
165 170 175
Glu Ser Met Glu Lys Lys Ile
180

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<211> 161
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 77
Met Glu Thr Ser Gln Lys Tyr His Thr Cys Gly Ser Thr Leu Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Asp Ala Pro Leu Ser Leu Val Trp Ser Ile Leu Arg Arg Phe
20 25 30
Asp Asn Pro Gln Ala Tyr Lys Gln Phe Val Lys Thr Cys Asn Leu Ser
35 40 45
Ser Gly Asp Gly Gly Glu Gly Ser Val Arg Glu Val Thr Val Val Ser
50 55 60
Gly Leu Pro Ala Glu Phe Ser Arg Glu Arg Leu Asp Glu Leu Asp Asp
65 70 75 80
Glu Ser His Val Met Met Ile Ser Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu
85 90 95
Val Asn Tyr Arg Ser Lys Thr Met Ala Phe Val Ala Ala Asp Thr Glu
100 105 110
Glu Lys Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Glu Gly
115 120 125
Asn Ser Glu Glu Glu Thr Thr Ser Phe Ala Asp Thr Ile Val Gly Phe
130 135 140
Asn Leu Lys Ser Leu Ala Lys Leu Ser Glu Arg Val Ala His Leu Lys
145 150 155 160
Leu

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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 78
Met Lys Thr Ser Gln Glu Gln His Val Cys Gly Ser Thr Val Val Gln
1 5 10 15
Thr Ile Asn Ala Pro Leu Pro Leu Val Trp Ser Ile Leu Arg Arg Phe
20 25 30
Asp Asn Pro Lys Thr Phe Lys His Phe Val Lys Thr Cys Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Asp Gly Gly Glu Gly Ser Val Arg Glu Val Thr Val Val Ser
50 55 60
Asp Leu Pro Ala Ser Phe Ser Leu Glu Arg Leu Asp Glu Leu Asp Asp
65 70 75 80
Glu Ser His Val Met Val Ile Ser Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu
85 90 95
Val Asn Tyr Gln Ser Lys Thr Thr Val Phe Val Ala Ala Glu Glu Glu
100 105 110
Lys Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val Val Asp Val Pro Glu Gly Asn
115 120 125
Thr Glu Glu Glu Thr Thr Leu Phe Ala Asp Thr Ile Val Gly Cys Asn
130 135 140
Leu Arg Ser Leu Ala Lys Leu Ser Glu Lys Met Met Glu Leu Thr
145 150 155

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<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 79
Met Glu Ser Ser Lys Gln Lys Arg Cys Arg Ser Ser Val Val Glu Thr
1 5 10 15
Ile Glu Ala Pro Leu Pro Leu Val Trp Ser Ile Leu Arg Ser Phe Asp
20 25 30
Lys Pro Gln Ala Tyr Gln Arg Phe Val Lys Ser Cys Thr Met Arg Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Lys Gly Gly Glu Gly Lys Gly Ser Val Arg Asp
50 55 60
Val Thr Leu Val Ser Gly Phe Pro Ala Asp Phe Ser Thr Glu Arg Leu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Asp Asp Glu Ser His Val Met Val Val Ser Ile Ile Gly
85 90 95
Gly Asn His Arg Leu Val Asn Tyr Lys Ser Lys Thr Lys Val Val Ala
100 105 110
Ser Pro Glu Asp Met Ala Lys Lys Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Val
115 120 125
Val Asp Val Pro Glu Gly Thr Ser Glu Glu Asp Thr Ile Phe Phe Val
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Arg Tyr Asn Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Thr Lys
145 150 155 160
Lys Met Met Lys

<210> 80
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 80
Met Ala Asn Ser Glu Ser Ser Ser Ser Pro Val Asn Glu Glu Glu Asn
1 5 10 15
Ser Gln Arg Ile Ser Thr Leu His His Gln Thr Met Pro Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Gln Asp Glu Phe Thr Gln Leu Ser Gln Ser Ile Ala Glu Phe His
35 40 45
Thr Tyr Gln Leu Gly Asn Gly Arg Cys Ser Ser Leu Leu Ala Gln Arg
50 55 60
Ile His Ala Pro Pro Glu Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp
65 70 75 80
Arg Pro Gln Ile Tyr Lys His Phe Ile Lys Ser Cys Asn Val Ser Glu
85 90 95
Asp Phe Glu Met Arg Val Gly Cys Thr Arg Asp Val Asn Val Ile Ser
100 105 110
Gly Leu Pro Ala Asn Thr Ser Arg Glu Arg Leu Asp Leu Leu Asp Asp
115 120 125
Asp Arg Arg Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Gly Gly Glu His Arg Leu
130 135 140
Arg Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Arg Phe Glu Lys Glu Glu
145 150 155 160
Glu Glu Glu Arg Ile Trp Thr Val Val Leu Glu Ser Tyr Val Val Asp
165 170 175
Val Pro Glu Gly Asn Ser Glu Glu Asp Thr Arg Leu Phe Ala Asp Thr
180 185 190
Val Ile Arg Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ala Ser Ile Thr Glu Ala Met
195 200 205
Asn Arg Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Ser Gln Val Arg
210 215 220

<210> 81
<211> 190
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 81
Met Ser Ser Ser Pro Ala Val Lys Gly Leu Thr Asp Glu Glu Gln Lys
1 5 10 15
Thr Leu Glu Pro Val Ile Lys Thr Tyr His Gln Phe Glu Pro Asp Pro
20 25 30
Thr Thr Cys Thr Ser Leu Ile Thr Gln Arg Ile His Ala Pro Ala Ser
35 40 45
Val Val Trp Pro Leu Ile Arg Arg Phe Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Lys
50 55 60
His Phe Val Lys Arg Cys Arg Leu Ile Ser Gly Asp Gly Asp Val Gly
65 70 75 80
Ser Val Arg Glu Val Thr Val Ile Ser Gly Leu Pro Ala Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Glu Arg Leu Glu Phe Val Asp Asp Asp His Arg Val Leu Ser Phe
100 105 110
Arg Val Val Gly Gly Glu His Arg Leu Lys Asn Tyr Lys Ser Val Thr
115 120 125
Ser Val Asn Glu Phe Leu Asn Gln Asp Ser Gly Lys Val Tyr Thr Val
130 135 140
Val Leu Glu Ser Tyr Thr Val Asp Ile Pro Glu Gly Asn Thr Glu Glu
145 150 155 160
Asp Thr Lys Met Phe Val Asp Thr Val Val Lys Leu Asn Leu Gln Lys
165 170 175
Leu Gly Val Ala Ala Thr Ser Ala Pro Met His Asp Asp Glu
180 185 190

<210> 82
<211> 209
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 82
Met Asn Leu Ala Pro Ile His Asp Pro Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr
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Thr Ser Ser Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Thr Lys Asp Glu Phe Ser Thr
20 25 30
Leu Asp Ser Ile Ile Arg Thr His His Thr Phe Pro Arg Ser Pro Asn
35 40 45
Thr Cys Thr Ser Leu Ile Ala His Arg Val Asp Ala Pro Ala His Ala
50 55 60
Ile Trp Arg Phe Val Arg Asp Phe Ala Asn Pro Asn Lys Tyr Lys His
65 70 75 80
Phe Ile Lys Ser Cys Thr Ile Arg Val Asn Gly Asn Gly Ile Lys Glu
85 90 95
Ile Lys Val Gly Thr Ile Arg Glu Val Ser Val Val Ser Gly Leu Pro
100 105 110
Ala Ser Thr Ser Val Glu Ile Leu Glu Val Leu Asp Glu Glu Lys Arg
115 120 125
Ile Leu Ser Phe Arg Val Leu Gly Gly Glu His Arg Leu Asn Asn Tyr
130 135 140
Arg Ser Val Thr Ser Val Asn Glu Phe Val Val Leu Glu Lys Asp Lys
145 150 155 160
Lys Lys Arg Val Tyr Ser Val Val Leu Glu Ser Tyr Ile Val Asp Ile
165 170 175
Pro Gln Gly Asn Thr Glu Glu Asp Thr Arg Met Phe Val Asp Thr Val
180 185 190
Val Lys Ser Asn Leu Gln Asn Leu Ala Val Ile Ser Thr Ala Ser Pro
195 200 205
Thr

<210> 83
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 83
Met Leu Ala Val His Arg Pro Ser Ser Ala Val Ser Asp Gly Asp Ser
1 5 10 15
Val Gln Ile Pro Met Met Ile Ala Ser Phe Gln Lys Arg Phe Pro Ser
20 25 30
Leu Ser Arg Asp Ser Thr Ala Ala Arg Phe His Thr His Glu Val Gly
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Pro Asn Gln Cys Cys Ser Ala Val Ile Gln Glu Ile Ser Ala Pro Ile
50 55 60
Ser Thr Val Trp Ser Val Val Arg Arg Phe Asp Asn Pro Gln Ala Tyr
65 70 75 80
Lys His Phe Leu Lys Ser Cys Ser Val Ile Gly Gly Asp Gly Asp Asn
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Val Gly Ser Leu Arg Gln Val His Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala
100 105 110
Ser Ser Thr Glu Arg Leu Asp Ile Leu Asp Asp Glu Arg His Val Ile
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Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg Leu Ser Asn Tyr Arg Ser
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195 200 205

<210> 84
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 84
Met Arg Ser Pro Val Gln Leu Gln His Gly Ser Asp Ala Thr Asn Gly
1 5 10 15
Phe His Thr Leu Gln Pro His Asp Gln Thr Asp Gly Pro Ile Lys Arg
20 25 30
Val Cys Leu Thr Arg Gly Met His Val Pro Glu His Val Ala Met His
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His Thr His Asp Val Gly Pro Asp Gln Cys Cys Ser Ser Val Val Gln
50 55 60
Met Ile His Ala Pro Pro Glu Ser Val Trp Ala Leu Val Arg Arg Phe
65 70 75 80
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Gln Gly Asp Gly Leu His Val Gly Asp Leu Arg Glu Val Met Val Val
100 105 110
Ser Gly Leu Pro Ala Val Ser Ser Thr Glu Arg Leu Glu Ile Leu Asp
115 120 125
Glu Glu Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly Asp His Arg
130 135 140
Leu Lys Asn Tyr Arg Ser Val Thr Thr Leu His Ala Ser Asp Asp Glu
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Gly Thr Val Val Val Glu Ser Tyr Ile Val Asp Val Pro Pro Gly Asn
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<210> 85
<211> 215
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 85
Met Pro Thr Ser Ile Gln Phe Gln Arg Ser Ser Thr Ala Ala Glu Ala
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His Val Val Ile Gly Asp Gly Arg Glu Val Gly Ser Val Arg Glu Val
100 105 110
Arg Val Val Ser Gly Leu Pro Ala Ala Phe Ser Leu Glu Arg Leu Glu
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Ile Met Asp Asp Asp Arg His Val Ile Ser Phe Ser Val Val Gly Gly
130 135 140
Asp His Arg Leu Met Asn Tyr Lys Ser Val Thr Thr Val His Glu Ser
145 150 155 160
Glu Glu Asp Ser Asp Gly Lys Lys Arg Thr Arg Val Val Glu Ser Tyr
165 170 175
Val Val Asp Val Pro Ala Gly Asn Asp Lys Glu Glu Thr Cys Ser Phe
180 185 190
Ala Asp Thr Ile Val Arg Cys Asn Leu Gln Ser Leu Ala Lys Leu Ala
195 200 205
Glu Asn Thr Ser Lys Phe Ser
210 215

<210> 86
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 86
Met Glu Met Ile Gly Gly Asp Asp Thr Asp Thr Glu Met Tyr Gly Ala
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Leu Val Thr Ala Gln Ser Leu Arg Leu Arg His Leu His His Cys Arg
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Asn Ile Ile Gly Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Leu
115 120 125
Thr Val His Pro Glu Met Ile Asp Gly Arg Ser Gly Thr Met Val Met
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Glu Ser Phe Val Val Asp Val Pro Gln Gly Asn Thr Lys Asp Asp Thr
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Cys Tyr Phe Val Glu Ser Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala
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Cys Val Ser Glu Arg Leu Ala Ala Gln Asp Ile Thr Asn Ser Ile Ala
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Thr Phe Cys Asn Ala Ser Asn Gly Tyr Arg Glu Lys Asn His Thr Glu
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Thr Asn Leu
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Val Asp Val Lys Ser Gly Leu Pro Ala Thr Arg Ser Thr Glu Arg Leu
85 90 95
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Gly Asp His Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Ser Ile Ile Ser Leu His Pro
115 120 125
Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ile Gly Thr Leu Val Ile Glu Ser Phe Val
130 135 140
Val Asp Val Pro Glu Gly Asn Thr Lys Asp Glu Thr Cys Tyr Phe Val
145 150 155 160
Glu Ala Leu Ile Lys Cys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Asp Ile Ser Glu
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Asp Glu Ile Asn Gly Ser Asp Ile Thr Ser Glu Lys Lys Met Ile
100 105 110
Ser Arg Thr Glu Ser Arg Ser Leu Phe Glu Phe Lys Ser Val Pro Leu
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130 135 140
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Leu Pro Leu Ser Val Asp His Lys Pro Asp Arg Glu Asp Glu Ala Ala
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Gly Asn Ser Thr Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Leu His Phe Gly Glu Ile
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Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ala Gly Met Arg Glu Leu Trp Ala Thr Gly
340 345 350
Trp Met His Asn Arg Ile Arg Val Ile Val Ser Ser Phe Ala Val Lys
355 360 365
Phe Leu Leu Leu Pro Trp Lys Trp Gly Met Lys Tyr Phe Trp Asp Thr
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Leu Leu Asp Ala Asp Leu Glu Cys Asp Ile Leu Gly Trp Gln Tyr Ile
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Ser Gly Ser Ile Pro Asp Gly His Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Pro
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Trp Leu Pro Glu Leu Ala Arg Leu Pro Thr Glu Trp Ile His His Pro
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Trp Asp Ala Pro Leu Thr Val Leu Lys Ala Ser Gly Val Glu Leu Gly
450 455 460
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Leu Ala Lys Ala Ile Ser Arg Thr Arg Glu Ala Gln Ile Met Ile Gly
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Ala Ala Pro Asp Glu Ile Val Ala Asp Ser Phe Glu Ala Leu Gly Ala
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Met Trp Asp Ser His Val Gln Asn Leu Tyr Gly Asn Leu Gly Val
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<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 94
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Met Met Asn Glu Glu Asp Asp Gly Asn Gly Met Asp Glu Leu Leu Ala
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Val Leu Gly Tyr Lys Val Arg Ser Ser Glu Met Ala Asp Val Ala Gln
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Gly Ile Gly Pro Pro Ala Pro Asp Asn Phe Asp Tyr Leu His Glu Val
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Gly Cys Lys Leu Ala His Leu Ala Glu Ala Ile His Val Glu Phe Glu
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Ser Leu His Tyr Tyr Ser Thr Leu Phe Asp Ser Leu Glu Gly Val Pro
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Ser Gly Gln Asp Lys Val Met Ser Glu Val Tyr Leu Gly Lys Gln Ile
435 440 445
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260 265 270
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
275 280 285
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
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<400> 97
Met Ala Gly Ser Glu Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Lys Thr Val Val
1 5 10 15
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Leu Ala Tyr Asn
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Phe
35 40 45
Leu Asp Arg Lys Val Pro Ala Asn Ala Asn Pro Val Asn Gly Val Phe
50 55 60
Ser Phe Asp Val Ile Ile Asp Arg Gln Thr Asn Leu Leu Ser Arg Val
65 70 75 80
Tyr Arg Pro Ala Asp Ala Gly Thr Ser Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gln
85 90 95
Asn Pro Val Asp Gly Glu Ile Val Pro Val Ile Val Phe Phe His Gly
100 105 110
Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp Thr Leu
115 120 125
Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Gly Ala Val Val Val Ser Val Asn
130 135 140
Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Arg Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp Asp Gly
145 150 155 160
Trp Ala Val Leu Lys Trp Val Asn Ser Ser Ser Trp Leu Arg Ser Lys
165 170 175
Lys Asp Ser Lys Val Arg Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ser Gly Gly
180 185 190
Asn Ile Val His Asn Val Ala Val Arg Ala Val Glu Ser Arg Ile Asp
195 200 205
Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Pro Met Phe Gly Gly Thr Glu Arg
210 215 220
Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr Val Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Arg Ala Phe Leu Pro Glu Gly Glu Asp Arg
245 250 255
Glu His Pro Ala Cys Ser Pro Phe Gly Pro Arg Ser Lys Ser Leu Glu
260 265 270
Gly Leu Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu Asp Leu
275 280 285
Ile Gln Asp Trp Gln Leu Lys Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys Ala Gly
290 295 300
Gln Glu Val Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Gln Ala Thr Ile Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Thr Val Met Asp Glu Ile Ala
325 330 335
Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys Gln
340

<210> 98
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 98
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys

<210> 99
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 99
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Thr Arg Lys
65 70 75 80
Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln
85 90 95
Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
100 105 110

<210> 100
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 100
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr
85 90 95
Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
100

<210> 101
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 101
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln
65 70 75 80
Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
85 90 95
Arg Pro Tyr Tyr Lys
100

<210> 102
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 102
Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser
1 5 10 15
Asp Leu Asn Thr Gln
20

<210> 103
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 103
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85

<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 104
Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Lys His Glu
20

<210> 105
<211> 171
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 105
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170

<210> 106
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 106
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln
85 90 95
Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
115 120 125

<210> 107
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 107
Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gly Gly Asn
20

<210> 108
<211> 207
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 108
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205

<210> 109
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 109
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Leu Asn Gln Arg
20

<210> 110
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 110
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180

<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 111
Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gln Gly Asn
20

<210> 112
<211> 163
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 112
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
115 120 125
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
145 150 155 160
Pro Pro Arg

<210> 113
<211> 164
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 113
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg

<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 114
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Val Leu Asp Lys Arg
20

<210> 115
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 115
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Glu Ile Gly Met Lys
20

<210> 116
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 116
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Leu His Met Gln
20

<210> 117
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 117
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225

<210> 118
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 118
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Glu Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu
85 90 95
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr
130 135 140
Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
145 150 155 160
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
165 170 175
Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
180 185

<210> 119
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 119
Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu
1 5 10 15
Asp Ile Ser Arg Gly
20

<210> 120
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 120
Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met
1 5 10 15
Pro Gly Arg Gly
20

<210> 121
<211> 68
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 121
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65

<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 122
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5

<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 123
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5

<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 124
His His His His His
1 5

<210> 125
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 125
His His His His His His
1 5

<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 126
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5

<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 127
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5

<210> 128
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 128
Phe His His Thr
1

<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 129
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala

<210> 130
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> the amino acids in these positions can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> the amino acids in this position can be either Leu or Ile
<400> 130
Tyr Xaa Xaa Xaa
1

<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> the amino acids in these positions can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> the amino acids in this positions can be either Leu or Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(10)
<223> the amino acids in these positions can be any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(12)
<223> the amino acids in these positions may be present or absent such
that either one or two amino acids are present. the amino acids
in these positions can be any amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> the amino acids in this positions can be either Leu or Ile
<400> 131
Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15

<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 132
gattacaagg atgacgatga caag 24

<210> 133
<211> 732
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 133
Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys
1 5 10 15
Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys
20 25 30
Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr
35 40 45
Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala
50 55 60
Thr Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys
65 70 75 80
Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr
85 90 95
Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr Ala
145 150 155 160
Cys Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys
165 170 175
Thr Thr Cys Thr Ala Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly
180 185 190
Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Cys Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Gly Ala
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala
225 230 235 240
Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys
245 250 255
Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala
260 265 270
Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr
275 280 285
Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys
325 330 335
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Cys Ala
340 345 350
Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly
355 360 365
Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys
370 375 380
Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly
385 390 395 400
Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala
405 410 415
Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala
420 425 430
Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr
435 440 445
Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr
450 455 460
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr
465 470 475 480
Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala
485 490 495
Gly Thr Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala
500 505 510
Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys
515 520 525
Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr
530 535 540
Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys
545 550 555 560
Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala
565 570 575
Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala
580 585 590
Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly
595 600 605
Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys
610 615 620
Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly
625 630 635 640
Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys
645 650 655
Ala Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly
660 665 670
Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys
675 680 685
Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys
690 695 700
Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Ala
705 710 715 720
Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Gly Cys
725 730

<210> 134
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 134
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser
145 150 155 160
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
165 170 175
Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Ala Ser

<210> 135
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 135
ggatcccagg tgcagctgca ggaatctggc cctggcctcg tgaagcccag cgagacactg 60
agcctgacct gtaccgtgtc tggcggctct gtgtccagcg gcagctacta ctggtcctgg 120
atcagacagc cccctggcaa gggcctggaa tggatcggct acatctacta cagcggctcc 180
accaactaca accccagcct gaagtccaga gtgaccatca gcgtggacac cagcaagaac 240
cagttctccc tgaagctgag cagcgtgaca gccgccgata ccgccgtgta ctactgtgcc 300
agagagggca agaacggcgc cttcgacatc tggggccagg gcacaatggt caccgtgtca 360
tctggtggag gaggatctgg gggaggcgga agcggaggcg gcggatctga tattcagatg 420
acccagagcc ccagcagcct gagcgcctct gtgggcgaca gagtgacaat tacctgccgg 480
gccagccaga gcatcagcag ctacctgaac tggtatcagc agaagcccgg caaggccccc 540
aaactgctga tctacgccgc cagctctctg cagtctggcg tgcccagcag attttccggc 600
tctggcagcg gcaccgactt caccctgacc atctctagcc tgcagcccga ggacttcgcc 660
acctactact gccagcagag ctacagcacc cccctgacct ttggcggagg caccaaggtg 720
gaaatcaag 729

<210> 136
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 136
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser
20 25 30
Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Lys Asn Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys

<210> 137
<211> 1044
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 137
atggctgcga gcgatgaagt taatcttatt gagagcagaa cagtggttcc tctcaataca 60
tgggttttaa tatccaactt caaagtagcc tacaatatcc ttcgtcgccc tgatggaacc 120
tttaaccgac acttagctga gtatctagac cgtaaagtca ctgcaaacgc caatccggtt 180
gatggggttt tctcgttcga tgtcttgatt gatcgcagga tcaatcttct aagcagagtc 240
tatagaccag cttatgcaga tcaagagcaa cctcctagta ttttagatct cgagaagcct 300
gttgatggcg acattgtccc tgttatattg ttcttccatg gaggtagctt tgctcattct 360
tctgcaaaca gtgccatcta cgatactctt tgtcgcaggc ttgttggttt gtgcaagtgt 420
gttgttgtct ctgtgaatta tcggcgtgca ccagagaatc catacccttg tgcttatgat 480
gatggttgga ttgctcttaa ttgggttaac tcgagatctt ggcttaaatc caagaaagac 540
tcaaaggtcc atattttctt ggctggtgat agctctggag gtaacatcgc gcataatgtg 600
gctttaagag cgggtgaatc gggaatcgat gttttgggga acattctgct gaatcctatg 660
tttggtggga atgagagaac ggagtctgag aaaagtttgg atgggaaata ctttgtgacg 720
gttagagacc gcgattggta ctggaaagcg tttttacccg agggagaaga tagagagcat 780
ccagcgtgta atccgtttag cccgagaggg aaaagcttag aaggagtgag tttccccaag 840
agtcttgtgg ttgtcgcggg tttggatttg attagagatt ggcagttggc atacgcggaa 900
gggctcaaga aagcgggtca agaggttaag cttatgcatt tagagaaagc aactgttggg 960
ttttacctct tgcctaataa caatcatttc cataatgtta tggatgagat ttcggcgttt 1020
gtaaacgcgg aatgtatgcg tgac 1044

<210> 138
<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 138
Met Ala Ala Ser Asp Glu Val Asn Leu Ile Glu Ser Arg Thr Val Val
1 5 10 15
Pro Leu Asn Thr Trp Val Leu Ile Ser Asn Phe Lys Val Ala Tyr Asn
20 25 30
Ile Leu Arg Arg Pro Asp Gly Thr Phe Asn Arg His Leu Ala Glu Tyr
35 40 45
Leu Asp Arg Lys Val Thr Ala Asn Ala Asn Pro Val Asp Gly Val Phe
50 55 60
Ser Phe Asp Val Leu Ile Asp Arg Arg Ile Asn Leu Leu Ser Arg Val
65 70 75 80
Tyr Arg Pro Ala Tyr Ala Asp Gln Glu Gln Pro Pro Ser Ile Leu Asp
85 90 95
Leu Glu Lys Pro Val Asp Gly Asp Ile Val Pro Val Ile Leu Phe Phe
100 105 110
His Gly Gly Ser Phe Ala His Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ile Tyr Asp
115 120 125
Thr Leu Cys Arg Arg Leu Val Gly Leu Cys Lys Cys Val Val Val Ser
130 135 140
Val Asn Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Asn Pro Tyr Pro Cys Ala Tyr Asp
145 150 155 160
Asp Gly Trp Ile Ala Leu Asn Trp Val Asn Ser Arg Ser Trp Leu Lys
165 170 175
Ser Lys Lys Asp Ser Lys Val His Ile Phe Leu Ala Gly Asp Ser Ser
180 185 190
Gly Gly Asn Ile Ala His Asn Val Ala Leu Arg Ala Gly Glu Ser Gly
195 200 205
Ile Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Leu Asn Pro Met Phe Gly Gly Asn
210 215 220
Glu Arg Thr Glu Ser Glu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Tyr Phe Val Thr
225 230 235 240
Val Arg Asp Arg Asp Trp Tyr Trp Lys Ala Phe Leu Pro Glu Gly Glu
245 250 255
Asp Arg Glu His Pro Ala Cys Asn Pro Phe Ser Pro Arg Gly Lys Ser
260 265 270
Leu Glu Gly Val Ser Phe Pro Lys Ser Leu Val Val Val Ala Gly Leu
275 280 285
Asp Leu Ile Arg Asp Trp Gln Leu Ala Tyr Ala Glu Gly Leu Lys Lys
290 295 300
Ala Gly Gln Glu Val Lys Leu Met His Leu Glu Lys Ala Thr Val Gly
305 310 315 320
Phe Tyr Leu Leu Pro Asn Asn Asn His Phe His Asn Val Met Asp Glu
325 330 335
Ile Ser Ala Phe Val Asn Ala Glu Cys Met Arg Asp
340 345

<210> 139
<211> 276
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 139
atgaagagag atcatcatca tcatcatcat caagataaga agactatgat gatgaatgaa 60
gaagacgacg gtaacggcat ggatgagctt ctagctgttc ttggttacaa ggttaggtca 120
tccgaaatgg ctgatgttgc tcagaaactc gagcagcttg aagttatgat gtctaatgtt 180
caagaagacg atctttctca actcgctact gagactgttc actataatcc ggcggagctt 240
tacacgtggc ttgattctat gctcaccgac cttaat 276

<210> 140
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 140
Met Lys Arg Asp His His His His His His Gln Asp Lys Lys Thr Met
1 5 10 15
Met Met Asn Glu Glu Asp Asp Gly Asn Gly Met Asp Glu Leu Leu Ala
20 25 30
Val Leu Gly Tyr Lys Val Arg Ser Ser Glu Met Ala Asp Val Ala Gln
35 40 45
Lys Leu Glu Gln Leu Glu Val Met Met Ser Asn Val Gln Glu Asp Asp
50 55 60
Leu Ser Gln Leu Ala Thr Glu Thr Val His Tyr Asn Pro Ala Glu Leu
65 70 75 80
Tyr Thr Trp Leu Asp Ser Met Leu Thr Asp Leu Asn
85 90

<210> 141
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 141
ggatcccagg tgcagctggt gcagtctggc gccgaagtga aaagaccagg cgccagcgtg 60
caggtctcct gtagagccag cggctacagc atcaacacct actacatgca gtgggtgcgc 120
caggccccag gcgctggact ggaatggatg ggcgtgatca accccagcgg cgtgacaagc 180
tacgcccaga aattccaggg cagagtgacc ctgaccaacg acaccagcac caacacagtg 240
tacatgcagc tgaacagcct gaccagcgcc gacaccgccg tgtactactg tgccagatgg 300
gccctgtggg gcgacttcgg catggatgtg tggggcaagg gcaccctcgt gaccgtgtct 360
agcggaggcg gaggatctgg cggaggggga tctggaggcg gcggaagcga catccagatg 420
acccagagcc ctagcaccct gagcgccagc atcggcgata gagtgaccat cacctgtcgg 480
gccagcgagg gcatctatca ctggctggcc tggtatcagc agaagcccgg caaggccccc 540
aagctgctga tctacaaggc cagctctctg gcctctggcg cccctagcag attttctggc 600
agcggctccg gcaccgactt caccctgaca atcagcagcc tgcagcccga cgacttcgcc 660
acctactatt gccagcagta cagcaactac cccctgacct tcggcggagg caccaagctg 720
gaaatcaag 729

<210> 142
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<400> 142
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Gln Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Val Thr Ser Tyr Ala Gln Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Asn Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Trp Ala Leu Trp Gly Asp Phe Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys

<210> 143
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 143
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135

<210> 144
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 144
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 145
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 145
cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 60
acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 111

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
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