JP2022046809A - キメラ抗原受容体及びその使用方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞の提供。【解決手段】特異的結合対の第１のメンバー、第１の調節ドメイン、二量体化対の第１のメンバー、特異的結合対の第１のメンバーと第１の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインとを含む第１のポリペプチド、及び膜貫通ドメイン、第２の調節ドメイン、二量体化対の第２のメンバー、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第２のポリペプチドを含むか、又は特異的結合対の第１のメンバー、調節ドメイン、二量体化対の第１のメンバー、特異的結合対の第１のメンバーと調節ドメインとの間に介在する膜通ドメインとを含む第１のポリペプチド、及び二量体化対の第２のメンバー、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む第２のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７６５，５８５号の利益を主張するものである。
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＥＹ０１６５４６及びＧＭ１０１７８２の下で、政府支援を得て行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１４年２月１３日に作成され、１５３ＫＢのサイズを有する、テキストファイル「ＵＣＳＦ－４６４ＷＯ ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
序論
細胞ベースの養子免疫療法では、患者から単離された免疫細胞は、後に細胞が患者に移し戻された後に新しい治療機能を行うことを可能にする合成タンパク質を発現するように改変され得る。かかる合成タンパク質の例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。現在使用されるＣＡＲの例は、細胞外認識ドメイン（例えば抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合である。抗原係合の際に、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞において、腫瘍細胞の死を誘導するための細胞溶解分子の放出等の、活性化関連応答を開始させ得る。しかしながら、かかるＣＡＲは、薬理学的に制御される能力を有しない。当技術において、薬理学的に制御することのできる条件付で活性化可能なＣＡＲの必要性が存在する。
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び該ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、該ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞を提供する。本開示のＣＡＲは、様々な方法において使用され得、これらも開示される。
[本発明1001]
ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）特異的結合対の第1のメンバーと、
ｉｉ）第1の調節ドメインと、
ｉｉｉ）二量体化対の第1のメンバーと、
ｉｖ）特異的結合対の前記第1のメンバーと前記第1の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと
を含む、第1のポリペプチド；及び
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉ）第2の調節ドメインと、
ｉｉｉ）前記二量体化対の第2のメンバーと、
ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、前記第2のポリペプチド
を含むか、または
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）特異的結合対の第1のメンバーと、
ｉｉ）調節ドメインと、
ｉｉｉ）二量体化対の第1のメンバーと、
ｉｖ）特異的結合対の前記第1のメンバーと前記調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと
を含む、第1のポリペプチド；及び
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉ）前記二量体化対の第2のメンバーと、
ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、第2のポリペプチド
を含む、前記ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
[本発明1002]
前記第1のポリペプチドが、前記特異的結合対の前記第1のメンバーと前記膜貫通ドメインとの間に介在するヒンジ領域を含む、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1003]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、抗体もしくは抗体断片、リガンド、または受容体である、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1004]
前記ヒンジ領域が免疫グロブリンＩｇＧヒンジ領域またはＣＤ8由来のヒンジである、本発明1002のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1005]
前記第1及び第2の調節ドメインが、4－1ＢＢ（ＣＤ137）、ＣＤ28、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－40、ＣＤ27、ＣＤ30、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＤＡＰ10、ＤＡＰ12、及びＣＤ28から選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1006]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＺＡＰ70及びＣＤ3－ゼータから選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1007]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1008]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、小分子二量体化剤の存在下でホモ二量体を形成する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1009]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、小分子二量体化剤の存在下でヘテロ二量体を形成する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1010]
前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーが、
ａ）ＦＫ506結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ、
ｂ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、
ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、
ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）、
ｅ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びＧｒｙＢ、
ｆ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びＤＨＦＲ、
ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ、
ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ、
ｉ）Ｃｒｙ2及びＣＩＰ、
ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ1
から選択される、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1011]
ｉ）前記第1及び第2の調節ドメインが4－1ＢＢに由来し、
ｉｉ）前記二量体化対の前記第1及び第2のメンバーがＦＫＢＰ及びＦＲＢであり、かつ
ｉｉ）前記シグナル伝達ドメインがＩＴＡＭを含む、
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1012]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、一本鎖Ｆｖである、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1013]
前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、細胞上、固体表面上、または脂質二重層に存在するエピトープに結合する、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1014]
前記細胞が癌細胞である、本発明1013のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
[本発明1015]
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された、哺乳類細胞。
[本発明1016]
幹細胞、前駆細胞、または幹細胞もしくは前駆細胞から誘導された細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1017]
Ｔリンパ球またはＮＫ細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1018]
本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1019]
前記ヌクレオチド配列が、Ｔリンパ球特異的プロモーターまたはＮＫ細胞特異的プロモーターに機能的に連結される、本発明1018の核酸。
[本発明1020]
インビトロ転写ＲＮＡである、本発明1018の核酸。
[本発明1021]
本発明1018の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
[本発明1022]
Ｔリンパ球を二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバーと接触させる工程を含む、Ｔリンパ球を活性化する方法であって、前記Ｔリンパ球が、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲを生成するように遺伝子改変され、前記二量体化剤及び特異的結合対の前記第2のメンバーの存在下で、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲが二量体化して、前記Ｔリンパ球を活性化し、それにより活性化されたＴリンパ球を生成する、前記方法。
[本発明1023]
特異的結合対の前記第2のメンバーが抗原である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記接触がインビボで生じる、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記活性化されたＴリンパ球が標的細胞の死滅を媒介する、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記活性化されたＴリンパ球が、ＩＬ－2及び／またはＩＦＮ－γを生成する、本発明1022の方法。
[本発明1027]
前記標的細胞が癌細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの前記特異的結合対の前記第1のメンバーが、癌細胞上のエピトープに対して特異的な抗体である、本発明1022の方法。
[本発明1029]
本発明1015の細胞を作製する方法であって、哺乳類細胞を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程、または哺乳類細胞を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡで遺伝子改変する工程を含む、前記方法。
[本発明1030]
前記遺伝子改変がエクスビボで実行される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記細胞が、Ｔリンパ球、幹細胞、ＮＫ細胞、前駆細胞、幹細胞由来の細胞、または前駆細胞由来の細胞である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
個体における癌を治療する方法であって、
ｉ）前記個体から得られたＴリンパ球を、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程であって、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの抗原結合ドメインが、前記個体における癌細胞上のエピトープに対して特異的であり、かつ前記遺伝子改変がエクスビボで実行される、工程；
ｉｉ）前記遺伝子改変されたＴリンパ球を前記個体に導入する工程；ならびに
ｉｉｉ）前記個体に、有効量の二量体化剤を投与する工程であって、前記二量体化剤が前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの二量体化を誘導し、前記二量体化が前記遺伝子改変されたＴリンパ球の活性化及び前記癌細胞の死滅を提供し、それにより前記癌を治療する工程
を含む、前記方法。
[本発明1033]
前記二量体化剤がラパログである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
宿主細胞を二量体化剤及び特異的結合対の第2のメンバーと接触させる工程を含む、宿主細胞の活性を調節する方法であって、Ｔリンパ球が、本発明1001のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲを生成するように遺伝子改変され、かつ前記二量体化剤及び特異的結合対の前記第2のメンバーの存在下で、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲが二量体化して、宿主細胞の少なくとも1つの活性を調節する、前記方法。
[本発明1035]
前記活性が、増殖、細胞生存、アポトーシス、遺伝子発現、または免疫活性化である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
特異的結合対の前記第2のメンバーが抗原である、本発明1034の方法。
構築物番号１２２のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２２のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２３のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２３のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２５のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２５のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１２６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１６８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１６８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１６９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１６９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１６９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１７０のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１７０のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１９７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１９７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２０６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２０６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２０６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２０７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２０７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１９９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１９９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号１９９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 ５つのオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 対照ジャーカット株によるＩＬ－２生成を描写する。 ＣＡＲ構築物「１２２＋２０６」と「１９７＋２０６」との間の比較を描写する。 オンスイッチＣＡＲ「１９７＋２０６」を用いて細胞毒性データを描写する。 ＣＡＲ構築物「１２２＋１９９」、「１９７＋１９９」、及び「１２２＋１６８」を使用するＴ細胞活性化データを描写する。 例示的なオンスイッチＣＡＲの略図である。 様々な例示的なオンスイッチＣＡＲを描写する。 様々な例示的なオンスイッチＣＡＲを描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ヒトメソテリンを認識する、３つの異なるオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 ジベレリン酸応答性二量体化対を有するオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成を描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチＣＡＲ及び従来のＣＡＲを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチＣＡＲ及び従来のＣＡＲを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチＣＡＲ及び従来のＣＡＲを描写する。 様々な共刺激ドメインを有する、例示的なオンスイッチＣＡＲ及び従来のＣＡＲを描写する。 構築物番号２７０のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号２７０のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３００のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３００のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３３６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３３６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３３７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３３７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３５７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３５７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６５のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６５のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６６のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３６７のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３９８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３９８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３９９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３９９のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号４００のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号４００のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３５８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。 構築物番号３５８のドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
定義
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの、ポリマー形態のヌクレオチドを指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン及びピリミジン塩基、または他の天然、化学もしくは生化学改変された、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片を含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びＦｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、例えば無傷抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一抗原結合部位を有する、２つの同一な抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」断片と、を生成する。ペプシン治療は、２つの抗原結合部位を有し、かつ抗原を依然として架橋連結することのできるＦ（ａｂ'）２を産出する。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの確認には、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの物質の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）で表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１倍高く、少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高く、少なくとも４倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも６倍高く、少なくとも７倍高く、少なくとも８倍高く、少なくとも９倍高く、少なくとも１０倍高く、少なくとも２０倍高く、少なくとも３０倍高く、少なくとも４０倍高く、少なくとも５０倍高く、少なくとも６０倍高く、少なくとも７０倍高く、少なくとも８０倍高く、少なくとも９０倍高く、少なくとも１００倍高く、もしくは少なくとも１０００倍高く、またはそれ以上であり得る。抗体の標的タンパク質への親和性は、例えば約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）またはそれ以上であり得る。本明細書で使用される場合、「結合力」という用語は、２つ以上の物質の複合体の、希釈後の解離への抵抗性を指す。「免疫反応性」及び「優先的結合」という用語は、抗体及び／または抗原結合断片に関して、本明細書で交換可能に使用される。
「結合」という用語は、例えば、塩橋及び水橋等の相互作用を含む、共有結合性、静電気的、疎水性、ならびにイオン性、及び／または水素結合相互作用による、２つの分子間の直接会合を指す。非特異的結合は、約１０－７Ｍ未満の親和性での結合、例えば、１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ等の親和性での結合を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、隣接するポリペプチド領域に構造的可撓性及び間隔を与える、可撓性ポリペプチドコネクタ領域（本明細書では「ヒンジ」または「スペーサ」とも称される）を指し、自然または合成ポリペプチドから構成され得る。免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）由来の「ヒンジ領域」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に伸展していると定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１６１－２０６）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する第１のシステイン残基及び最終システイン残基を、同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列と整列し得る。ヒンジ領域は、自然発生または非自然発生であり得、米国特許第５，６７７，４２５号に記載される変性ヒンジ領域を含むがこれに限定されない。ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスに由来する、完全ヒンジ領域を含み得る。「ヒンジ領域」という用語は、ＣＤ８、及び、隣接する領域に可撓性及び間隔を提供することにおいて同様の機能を提供する他の受容体に由来する領域も含み得る。
「単離」ポリペプチドは、その自然環境の成分から、識別されて分離ならびに／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、ポリペプチドに対する診断もしくは治療用途に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法で判定される抗体の重量で、９０重量％を超える、９５重量％を超える、もしくは９８重量％を超える、例えば９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは銀染色を使用して、還元または非還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により均一になるまで、精製され得る。ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分は存在し得ないため、単離ポリペプチドは、組み換え細胞内の原位置ポリペプチドを含む。いくつかの例では、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製され得る。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、一般的に、骨髄内で生成される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））を含む。「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。
「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）及びガンマデルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する免疫細胞のすべての種類を含む。
「細胞毒性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球、を含み、これらの細胞は細胞毒性応答を媒介することができる。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般的に、分化多能性または多能性幹細胞を含む。「幹細胞」は、例えば、胚幹細胞（ＥＳ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、誘導分化多能性幹細胞（ｉＰＳ）、及び方向付けされた前駆細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）、骨髄由来細胞等）を含む。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理及び／または生理効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点で、予防的であり得、かつ／または疾患及び／もしくは疾患に帰属する逆効果に対する部分的もしくは完全治療の点で、治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳類の、例えばヒトの疾患のあらゆる治療を網羅し、かつ、（ａ）疾患が、その疾患にかかりやすくあり得るがまだそれを有すると診断されていない患者内で、発症することを防止すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわちその進行を阻止すること、（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患を後退させること、を含む。
本明細書で交換可能に使用される、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、哺乳類を指し、ネズミ類（例えばラット、マウス）、ウサギ類（例えばウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ類、ネコ類、有蹄類（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等を含むがこれらに限定されない。
「治療的有効量」または「効果的な量」は、疾患の治療のために、哺乳類または他の対象に投与されたときに、疾患に対するかかる治療をもたらすのに十分である、物質の量または２つの物質の組み合わせた量を指す。「治療的有効量」は、物質（複数可）、疾患、及びその重症度、ならびに、治療される対象の年齢、体重等に応じて変動し得る。
本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変動し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、より小さい範囲に含まれ得、かつ、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って、これらも本発明に包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、これから説明される。本明細書で言及されるすべての出版物は、それとの関連で出版物が引用される方法及び／または物質を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で及び添付の請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「キメラ抗原受容体」への言及は、複数のかかるキメラ抗原受容体を含み、「二量体化剤結合対」への言及は、１つ以上の二量体化剤結合対及び当業者に既知のその等価物等を含む。請求項は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の列挙に関連する、「単に」、「のみ」等のような排他的用語の使用、または「否定的」限定の使用に対する、先行詞の役割を果たすことが意図される。
明確にするために、別個の実施形態の文脈において説明される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせで提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴は、別個にまたは任意の好適な副組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
詳細な説明
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び該ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、該ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞を提供する。本開示のＣＡＲは、様々な方法において使用され得、これらも開示される。
ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体
本開示は、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体を提供し、キメラ抗原受容体は簡素にするために本明細書で「ＣＡＲ」と称される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ａ）第１のポリペプチドであって、ｉ）特異的結合対のメンバー（例えば抗原結合ドメイン）と、ｉｉ）第１の調節ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対の第１のメンバーと、ｉｖ）特異的結合対のメンバー（例えば抗原結合ドメイン）と第１の調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第１のポリペプチド、及びｂ）第２のポリペプチドであって、ｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉ）第２の調節ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対の第２のメンバーと、ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第２のポリペプチド、を含む。調節ドメインは、共刺激ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ａ）第１のポリペプチドであって、ｉ）特異的結合対のメンバー（例えば抗原結合ドメイン）と、ｉｉ）第１の共刺激ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第１のメンバーと、ｉｖ）特異的結合対のメンバー（例えば抗原結合ドメイン）と第１の共刺激ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第１のポリペプチド、及びｂ）第２のポリペプチドであって、ｉ）膜貫通ドメインと、ｉｉ）第２の共刺激ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第２のメンバーと、ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第２のポリペプチド、を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ａ）第１のポリペプチドであって、ｉ）特異的結合対（例えば抗原結合ドメイン）のメンバーと、ｉｉ）調節ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第１のメンバーと、ｉｖ）特異的結合対（例えば抗原結合ドメイン）のメンバーと調節ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第１のポリペプチド、及びｂ）第２のポリペプチドであって、ｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第２のメンバーと、ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第２のポリペプチド、を含む。調節ドメインは、共刺激ドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、ａ）第１のポリペプチドであって、ｉ）特異的結合対（例えば抗原結合ドメイン）のメンバーと、ｉｉ）共刺激ドメインと、ｉｉｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第１のメンバーと、ｉｖ）特異的結合対（例えば抗原結合ドメイン）のメンバーと共刺激ドメインとの間に介在する膜貫通ドメインと、を含む第１のポリペプチド、及びｂ）第２のポリペプチドであって、ｉ）二量体化対（例えば二量体化剤結合対）の第２のメンバーと、ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む第２のポリペプチド、を含む。
本願のＣＡＲの一実施例は図１７に模式的に表される。本開示のＣＡＲは、真核細胞、例えば哺乳類細胞の、形質膜内に存在し得、好適な哺乳類細胞には、細胞毒性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫、前駆細胞、前駆細胞の子孫、及びＮＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞の形質膜内に存在する場合、本開示のＣＡＲは、１）二量体化剤が、ＣＡＲ内の二量体化剤結合対の第１及び第２のメンバーに結合する、または別様で二量体の第１及び第２のメンバーの二量体化を誘導する、ならびに２）特異的結合対のメンバー（例えば抗原結合ドメイン）を結合する因子、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原、の存在下で活性である。特異的結合対のメンバーに結合する因子は、特異的結合対の第２のメンバーである。特異的結合対の第２のメンバーは、可溶性（例えば細胞に結合していない）因子、標的細胞等の細胞の表面に存在する因子、固体表面に提供される因子、脂質二重層内に存在する因子等であり得る。特異的結合対のメンバーが抗体であり、特異的結合対の第２のメンバーが抗原である場合、抗原は、可溶性（例えば細胞に結合していない）抗原、標的細胞等の細胞の表面に存在する抗原、固体表面に提供される抗原、脂質二重層内に存在する抗原等であり得る。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの特異的結合対のメンバーに結合する特異的結合対の第２のメンバー（例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原）、及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内の少なくとも１つの核酸の発現を増加させる。例えば、いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびに、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原、及び二量体化剤によって活性化される場合、抗原及び／または二量体化剤の不在下での核酸の転写レベルに比較して、細胞内の少なくとも１つの核酸の発現を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させる。
例えば、本開示のＣＡＲの第２のポリペプチドは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含み得、かかる場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）依存性転写を増加させる。ＮＦＡＴ依存性転写は、例えば、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、ＮＦＡＴ５；ＡＰ－１；Ｓｐ１；ＮＫκＢ；等を含む、ＮＦＡＴファミリーの任意のメンバーによって誘導される転写を含む。
本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、いくつかの場合では、細胞による１つ以上のサイトカインの増加した生成をもたらし得る。例えば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、抗原及び／または二量体化剤の不在下で細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させ得る。生成を増加させることができるサイトカインは、インターフェロン、例えばＩＬ－２、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０；ケモカイン；成長因子等を含むが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内の核酸の転写の増加及び細胞によるサイトカインの生成の増加の両方をもたらし得る。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、及び二量体化剤によって活性化される場合、ＣＡＲの第１のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を細胞表面で発現する標的細胞に対する、細胞による細胞毒性活性をもたらす。例えば、真核細胞が細胞毒性細胞（例えばＮＫ細胞または細胞毒性Ｔリンパ球）である場合、本開示のＣＡＲは、細胞の形質膜内に存在する場合、及び二量体化剤によって活性化される場合、その細胞表面でＣＡＲの第１のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する標的細胞に対する、細胞の細胞毒性活性を増加させる。例えば、真核細胞がＮＫ細胞またはＴリンパ球である場合、本開示のＣＡＲは、細胞の形質膜内に存在する場合及び二量体化剤によって活性化される場合、二量体化剤の不在下の細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞の細胞毒性を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させる。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、増殖及び拡大（増加した細胞分裂または抗アポトーシス応答のいずれかによる）等の、他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の形質膜内に存在する場合、ならびにＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する抗原及び二量体化剤によって活性化される場合、細胞内シグナル伝達調節、細胞分化、または細胞死等の、他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る。
本開示のＣＡＲは、真核細胞膜内に存在し得、ＣＡＲの第１及び第２のポリペプチドは互いに共有連結されない。本開示のＣＡＲは、真核細胞膜内に、膜内のあらゆる他のポリペプチドに共有連結されない単一のヘテロ二量体として存在し得る。あるいは、本開示の第１のＣＡＲは、真核細胞膜内に、本開示の第２のＣＡＲに共有または非共有連結されるヘテロ二量体として存在し得る。いくつかの場合では、第１及び第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの第１のポリペプチド及び第２のＣＡＲの第１のポリペプチドの両方において存在するヒンジ領域内に存在するシステイン間に形成される、ジスルフィド結合を介して、共有連結される。
いくつかの場合では、本開示のＣＡＲは真核細胞膜内に存在し得、二量体化の際に、ＣＡＲがヘテロ二量体シグナロボディ（ｓｉｇｎａｌｏｂｏｄｙ）ＣＡＲ、例えば、少なくとも２つの依存性ポリペプチドで構成されるシグナロボディ、を表し得るように、ＣＡＲの第１のポリペプチドは抗体断片を含み、ＣＡＲの第２のポリペプチドはサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインを含む。「シグナロボディ」は、当業者に既知であるように、抗体断片及びサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインで構成される、単一キメラ高分子である。特定の例では、本開示のヘテロ二量体シグナロボディＣＡＲは、二量体化剤によって二量体化し、かつ、抗原例えば多量体化抗原によって活性化されて、真核細胞の細胞膜内に存在する場合、ヘテロ二量体シグナロボディＣＡＲの多量体化を誘導し得る。ヘテロ二量体シグナロボディＣＡＲのかかるリガンド誘導多量体化は、シグナル伝達を、活性化、例えば増加させ得る、または永続化、例えば維持し得、例えば、ヘテロ二量体シグナロボディＣＡＲのリガンド誘導多量体化は、細胞応答を引き出すシグナルを伝送し得る。いくつかの場合では、複数のヘテロ二量体シグナロボディＣＡＲは、所望の細胞応答を引き出すために、組み合わせて利用され得る。
特異的結合対のメンバー
本開示のＣＡＲは、特異的結合対のメンバーを含む。特異的結合対は、抗原抗体結合対、リガンド受容体結合対等を含むがこれらに限定されない。よって、本開示のＣＡＲにおける使用に好適な特異的結合対のメンバーは、抗原、抗体、リガンド、及びリガンド結合受容体を含む。
抗原結合ドメイン
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な抗原結合ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、これの様々な種類が当業者に既知である。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びヒト化版、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びヒト化版、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが、使用に好適である。いくつかの例では、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβ含有単鎖２ドメインＴＣＲ）等のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に好適である。
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。いくつかの場合では、抗原結合ドメインは、癌細胞によって発現される（合成される）抗原、すなわち癌細胞関連抗原において存在するエピトープに対して特異的である。癌細胞関連抗原は、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば小細肺癌細胞）、メラノーマ細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽腫細胞、神経膠腫、膠芽腫、髄芽腫、大腸癌細胞等に、関連する抗原であり得る。癌細胞関連抗原は、非癌細胞によっても発現され得る。
本願のＣＡＲの抗原結合ドメインが結合することができる抗原の非限定的な例には、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２等が挙げられる。
リガンド
いくつかの場合では、本願のＣＡＲにおける使用に好適な特異的結合対のメンバーは、受容体のためのリガンドである。リガンドは、サイトカイン（例えばＩＬ－１３等）、成長因子（例えばヘレグリン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）等）、インテグリン結合ペプチド（例えば配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐを含むペプチド）等を含むが、これらに限定されない。
本願のＣＡＲにおける特異的結合対のメンバーがリガンドである場合、ＣＡＲは、二量体化剤物質及び特異的結合対の第２のメンバーの両方の存在下で活性化され得、特異的結合対の第２のメンバーはリガンドのための受容体である。例えば、リガンドがＶＥＧＦである場合、特異的結合対の第２のメンバーは、可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むＶＥＧＦ受容体であり得る。別の例では、リガンドがヘレグリンである場合、特異的結合対の第２のメンバーはＨｅｒ２であり得る。
受容体
上記のように、いくつかの場合では、本願のＣＡＲに含まれる特異的結合対のメンバーは、受容体、例えばリガンドのための受容体、共受容体である。受容体は、受容体のリガンド結合断片であり得る。好適な受容体には、成長因子受容体（例えばＶＥＧＦ受容体）；キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＮＫＧ２Ｄ）ポリペプチド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢ６のための受容体）；サイトカイン 受容体（例えばＩＬ－１３受容体、ＩＬ－２受容体等）；Ｈｅｒ２；ＣＤ２７；天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）（例えばＮＫＰ３０（ＮＣＲ３／ＣＤ３３７）ポリペプチド（ ＨＬＡ－Ｂ関連転写物３（ＢＡＴ３）及びＢ７－Ｈ６のための受容体）；等）；等が挙げられるがこれらに限定されない。
ヒンジ領域
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの第１のポリペプチドは、ヒンジ領域（本明細書で「スペーサ」とも称される）を含み、ヒンジ領域は抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に介在する。いくつかの場合では、ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。いくつかの場合では、ヒンジ領域は、受容体に由来するヒンジ領域ポリペプチド（例えばＣＤ８誘導ヒンジ領域）である。
ヒンジ領域は、約４アミノ酸～約５０アミノ酸、例えば、約４アミノ酸～約１０アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１５アミノ酸～約２０アミノ酸、約２０アミノ酸～約２５アミノ酸、約２５アミノ酸～約３０アミノ酸、約３０アミノ酸～約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸～約５０アミノ酸の、長さを有し得る。
好適なスペーサは、容易に選択され得、かつ、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸等の、複数の好適な長さのいずれかであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。
例示的なスペーサは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシンセリンポリマー （例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、式中ｎは少なくとも１の整数、を含む）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当業者に既知の他の可撓性リンカーを含む。グリシン及びグリシン－セリンポリマーが使用され得、Ｇｌｙ及びＳｅｒの両方は比較的構造不定であり、したがって成分間の中間テザーの役割を果たし得る。グリシン－ポリマーが使用され得、グリシンはアラニンさえよりも有意に多くファイ－プシ間隔にアクセスし、かつ、より長い側鎖を有する残基よりもずっと制限されない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的なスペーサは、
Figure 2022046809000001
等を含むがこれらに限定されない、アミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの第１のポリペプチド内のヒンジ領域は、少なくとも１つのシステインを含む。例えば、いくつかの場合では、ヒンジ領域は配列Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓを含み得る。存在する場合、第１のＣＡＲのヒンジ領域内のシステインは、第２のＣＡＲにおけるヒンジ領域とジスルフィド結合を形成するために使用可能であり得る。
免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列は当業者に既知であり、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１６２；及びＨｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：１７７９を参照されたい。非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000002
（例えば、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２８０：４１４９４を参照）；
Figure 2022046809000003
等のうちの１つを含み得る。
ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、ヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ヒンジ領域は、野生型（自然発生）ヒンジ領域に比較して、１つ以上のアミノ酸置換及び／または挿入及び／または欠失を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９ は、Ｔｙｒで置換され得、よってヒンジ領域は、配列
Figure 2022046809000004
を含む；例えばＹａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：５８９１を参照されたい。
ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８に由来するアミノ酸配列を含み得、例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列
Figure 2022046809000005
またはその変異体を含み得る。
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲの第１及び第２のポリペプチドは、真核細胞膜への挿入のための膜貫通ドメインを含む。第１のポリペプチドの膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインと共刺激ドメインとの間に介在する。第１のポリペプチドがヒンジ領域を含む場合、第１のポリペプチドが、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）への順で、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、第１の共刺激ドメイン、及び二量体化剤結合対の第１のメンバーを含むように、膜貫通ドメインはヒンジ領域と共刺激ドメインとの間に介在する。
第２のポリペプチドの膜貫通ドメインは、第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端への順で、膜貫通ドメイン、第２の共刺激ドメイン、二量体化剤結合対の第２のメンバー、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むように、ポリペプチドのＮ末端またはその付近にある。
真核（例えば哺乳類）細胞の細胞膜へのポリペプチドの挿入を提供する、任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインが、使用に好適である。１つの非限定的な例として、ＴＭ配列
Figure 2022046809000006
が使用され得る。好適なＴＭ配列の追加の非限定的な例には、ａ）ＣＤ８ベータ由来：
Figure 2022046809000007
；ｂ）ＣＤ４由来：
Figure 2022046809000008
；ｃ）ＣＤ３ゼータ由来：
Figure 2022046809000009
；ｄ）ＣＤ２８由来：
Figure 2022046809000010
；ｅ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来：
Figure 2022046809000011
；及びｆ）ＣＤ７由来：
Figure 2022046809000012
が挙げられる。
リンカー
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの第１のポリペプチドは、任意の２つの隣接するドメインの間にリンカーを含む。例えば、リンカーは、第１のポリペプチドの、膜貫通ドメインと第１の共刺激ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第１のポリペプチドの、第１の共刺激ドメインと二量体化剤結合対の第１のメンバーとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第２のポリペプチドの、膜貫通ドメインと第２の共刺激ドメインとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第２のポリペプチドの、第２の共刺激ドメインと二量体化剤結合対の第２のメンバーとの間に配置され得る。別の例として、リンカーは、第２のポリペプチドの、二量体化剤結合対の第２のメンバーと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に配置され得る。
リンカーペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、概して可撓性性質のスペーサペプチドによって連結され得るが、他の化学連結は除外されない。リンカーは、約６～約４０アミノ酸の間の長さ、または約６～約２５アミノ酸の間の長さのペプチドであり得る。これらのリンカーは、タンパク質を連結するために、合成、リンカーコードオリゴヌクレオチドを使用することによって生成され得る。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーが使用され得る。好適なリンカーは概して可撓性のペプチドをもたらす配列を有し得ることに留意し、連結ペプチドは、仮想的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グラニン及びアラニン等の小アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作成することにおいて有用である。かかる配列の作成は、当業者にはルーチンである。
好適なリンカーは、容易に選択され得、かつ、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸等の、異なる長さの任意の好適なものであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。
例示的な可撓性リンカーは、グリシン ポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリン ポリマー（例えば（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、及びＧＧＧＳｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、式中ｎは少なくとも１の整数、を含む）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当業者に既知の他の可撓性リンカーを含む。 グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方は比較的構造不定であり、したがって成分間の中間テザーの役割を果たし得るため、興味深い。グリシンは、アラニンさえよりも有意に多くファイ－プシ間隔にアクセスし、かつ、より長い側鎖を有する残基よりもずっと制限されないため、グリシンポリマーが特に興味深い（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ． １１１７３－１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的な可撓性リンカーは、
Figure 2022046809000013
等を含むが、これらに限定されない。当業者は、リンカーが、可撓性リンカーならびにより可撓性の低い構造をもたらす１つ以上の部分を含み得るように、上記の任意の要素に結合されるペプチドの設計は、すべてまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得ることを認識するであろう。
調節ドメイン
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な調節ドメインは、共刺激ドメインを含む。
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの第１のポリペプチドの調節ドメインは、ＣＡＲの第２のポリペプチドの調節ドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの場合では、ＣＡＲの第１のポリペプチドの調節ドメインは、ＣＡＲの第２のポリペプチドの調節ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含む。本願のＣＡＲの第１のポリペプチドの調節ドメインは、本願のＣＡＲの第２のポリペプチドの調節ドメインと実質的に同じ長さを有し得、例えば、第１及び第２の調節ドメインは、１０アミノ酸未満または５アミノ酸未満で、長さが互いと異なり得る。いくつかの場合では、第１及び第２の調節ドメインは同じ長さを有する。
本願のＣＡＲの第１及び第２のポリペプチドに含まれるのに好適な調節ドメインは、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有し得、例えば調節ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有し得る。他の場合では、調節ドメインは約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、または２００アミノ酸を超える長さを有し得る。
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な共刺激ドメインは、概して、受容体に由来するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはホモ二量体化する。本願の共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であり得る（すなわち、共刺激ドメインは膜貫通タンパク質に由来し得る）。好適な共刺激ポリペプチドの非制限的な例には、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの第１のポリペプチドの共刺激ドメインは、ＣＡＲの第２のポリペプチドの共刺激ドメインと実質的に同じアミノ酸配列を有する。例えば、いくつかの場合では、ＣＡＲの第１のポリペプチドの共刺激ドメインは、ＣＡＲの第２のポリペプチドの共刺激ドメインのアミノ酸配列に、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を含む。本願のＣＡＲの第１のポリペプチドの共刺激ドメインは、本願のＣＡＲの第２のポリペプチドの共刺激ドメインと実質的に同じ長さを有し得、例えば、第１及び第２の共刺激ドメインは、１０アミノ酸未満または５アミノ酸未満で、長さが互いと異なり得る。いくつかの場合では、第１及び第２の共刺激ドメインは同じ長さを有する。
本願のＣＡＲの第１及び第２のポリペプチドに含まれるのに好適な共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有し得、例えば共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有し得る。他の場合では、共刺激ドメインは約７０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約２００アミノ酸、または２００アミノ酸を超える長さを有し得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質４－１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９；ＣＤ１３７；４－１ＢＢ；ＣＤｗ１３７；ＩＬＡ等としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000014
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（Ｔｐ４４としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000015
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８、及びＣＶＩＤ１としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000016
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ－４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５－９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000017
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（ＢＴＬＡ１及びＣＤ２７２としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000018
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000019
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、及びＫｉ－１としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000020
の連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、または約１６０アミノ酸～約１８５アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５－９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、及びＧＩＴＲ－Ｄとしても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000021
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
いくつかの場合では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３－３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ、及びＴＲ２としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、好適な共刺激ドメインは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000022
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１及び第２のポリペプチド両方の共刺激ドメインは、約３０アミノ酸～約３５アミノ酸、約３５アミノ酸～約４０アミノ酸、約４０アミノ酸～約４５アミノ酸、約４５アミノ酸～約５０アミノ酸、約５０アミノ酸～約５５アミノ酸、約５５アミノ酸～約６０アミノ酸、約６０アミノ酸～約６５アミノ酸、または約６５アミノ酸～約７０アミノ酸長を有する。
二量体対
本願のＣＡＲにおける使用に好適な二量体対は、二量体化剤結合対を含む。本開示のＣＡＲにおける使用に好適な二量体化剤結合対は、いくつかの実施形態では、同じ分子の異なる部位に結合するポリペプチド（本明細書で「二量体化剤」と称される）である。二量体化剤の存在下で、二量体化剤結合対の両方のメンバーは、二量体化剤の異なる部位に結合し、よって互いと近接する。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、可逆的である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、不可逆的である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、非共有結合性である。いくつかの実施形態では、二量体化剤への結合は、共有結合性である。
使用に好適な他の二量体対は、二量体対の第１のメンバーの二量体化剤への結合の際に二量体化する二量体化剤結合対を含み、二量体化剤は二量体対の第１のメンバーにおける立体構造変化を誘導し、立体構造変化は、二量体対の第１のメンバーが二量体対の第２のメンバーに結合（共有結合または非共有結合）することを可能にする。
使用に好適な他の二量体対は、光（例えばブルーライト）への曝露が二量体対の二量体化を誘導する二量体対を含む。
機構に関わらず、二量体対は、二量体化を誘導する物質への曝露の際に二量体化し、物質はいくつかの場合では小分子であり、他の場合では光である。よって、簡素にするために、「二量体化剤結合対」を参照する以下の議論は、機構に関わらず二量体化する二量体対を含む。
好適な二量体（例えば二量体化剤結合対）の非制限的な例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
ａ）ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ、
ｂ）ＦＫＢＰ及びカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、
ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、
ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＢ）、
ｅ）ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びＧｒｙＢ、
ｆ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びＤＨＦＲ、
ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ、
ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ、
ｉ）Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１、ならびに
ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１。
本願のＣＡＲの二量体（例えば二量体化剤結合対）の第１または第２のメンバーは、約５０アミノ酸～約３００アミノ酸以上の長さを有し得、例えば本願のＣＡＲの二量体（例えば二量体化剤結合対）の第１または第２のメンバーは、約５０アミノ酸～約１００アミノ酸、約１００アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、約２００アミノ酸～約２５０アミノ酸、約２５０アミノ酸～約３００アミノ酸、または３００アミノ酸を超える長さを有し得る。
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＦＫＢＰに由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000023
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、本願のＣＡＲの二量体化剤結合対のメンバーは、カルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＰＰＰ３ＣＡ；ＣＡＬＮ；ＣＡＬＮＡ；ＣＡＬＮＡ１；ＣＣＮ１；ＣＮＡ１；ＰＰＰ２Ｂ；ＣＡＭ－ＰＲＰ触媒サブユニット；カルシニューリンＡアルファ；カルモジュリン依存性カルシニューリンＡサブユニットアルファイソ型；タンパク質ホスファターゼ２Ｂ、触媒サブユニット、アルファイソ型；等としても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列（ＰＰ２Ａｃドメイン）：
Figure 2022046809000024
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、シクロフィリン（シクロフィリンＡ、ＰＰＩＡ、ＣＹＰＡ、ＣＹＰＨ、ＰＰＩａｓｅＡ等としても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000025
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＭＴＯＲ（ＦＫＢＰ－ラパマイシン関連タンパク質；ＦＫ５０６結合タンパク質１２－ラパマイシン関連タンパク質１；ＦＫ５０６結合タンパク質１２－ラパマイシン関連タンパク質２；ＦＫ５０６－結合タンパク質１２－ラパマイシン複合体関連タンパク質１；ＦＲＡＰ；ＦＲＡＰ１；ＦＲＡＰ２；ＲＡＦＴ１；及びＲＡＰＴ１としても知られる）に由来する。例えば好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列（「Ｆｒｂ」：Ｆｋｂｐ－ラパマイシン結合ドメイン、としても知られる）：
Figure 2022046809000026
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＧｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースサブユニットＢとしても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次の大腸菌からのＧｙｒＢアミノ酸配列：
Figure 2022046809000027
（または任意の有機体からのＤＮＡジャイレースサブユニットＢ配列）の連続した一続きの約１００アミノ酸～約２００アミノ酸（ａａ）、約２００アミノ酸～約３００アミノ酸、約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、約５００アミノ酸～約６００アミノ酸、約６００アミノ酸～約７００アミノ酸、または約７００アミノ酸～約８００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合では、二量体化剤結合対のメンバーは、上記の大腸菌からのＧｙｒＢアミノ酸配列のアミノ酸１～２２０と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素、ＤＨＦＲＰ１、及びＤＹＲとしても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000028
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＤｍｒＢ結合ドメイン（すなわちＤｍｒＢホモ二量体化ドメイン）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対のメンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000029
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＰＹＬタンパク質（アブシジン酸受容体として、及びＲＣＡＲとしても知られる）に由来する。例えば、本願の二量体化剤結合対のメンバーは、シロイヌナズナのもの等のタンパク質：ＰＹＲ１、ＲＣＡＲ１（ＰＹＬ９）、ＰＹＬ１、ＰＹＬ２、ＰＹＬ３、ＰＹＬ４、ＰＹＬ５、ＰＹＬ６、ＰＹＬ７、ＰＹＬ８（ＲＣＡＲ３）、ＰＹＬ１０、ＰＹＬ１１、ＰＹＬ１２、ＰＹＬ１３に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2022046809000030
Figure 2022046809000031
Figure 2022046809000032
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＡＢＩタンパク質（アブシジン酸非感受性としても知られる）に由来する。例えば、本願の二量体化剤結合対のメンバーは、シロイヌナズナのもの等のタンパク質：ＡＢＩ１（アブシジン酸非感受性１、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ ５６、ＡｔＰＰ２Ｃ５６、Ｐ２Ｃ５６、及びＰＰ２Ｃ ＡＢＩ１としても知られる）ならびに／またはＡＢＩ２（Ｐ２Ｃ７７、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ ７７、ＡｔＰＰ２Ｃ７７、アブシジン酸非感受性２、タンパク質ホスファターゼ２Ｃ ＡＢＩ２、及びＰＰ２Ｃ ＡＢＩ２としても知られる）に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、または約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2022046809000033
Figure 2022046809000034
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、Ｃｒｙ２タンパク質（クリプトクロム２としても知られる）に由来する。例えば、本願の二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、シロイヌナズナのもの等の、しかしこれに限定されない、任意の有機体（例えば植物）からのＣｒｙ２タンパク質に由来し得る。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、または約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Ｃｒｙ２（シロイヌナズナ）
Figure 2022046809000035
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＣＩＢ１シロイヌナズナタンパク質（転写因子ｂＨＬＨ６３としても知られる）に由来する。例えば好適な二量体（例えば二量体化剤結合対）メンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000036
の連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、または約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＧＡＩシロイヌナズナタンパク質（ジベレリン酸非感受性、及びＤＥＬＬＡタンパク質ＧＡＩとしても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体化剤結合対メンバーは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000037
の連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、または約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの場合では、二量体（例えば二量体化剤結合対）のメンバーは、ＧＩＤ１シロイヌナズナタンパク質（ジベレリン受容体ＧＩＤ１としても知られる）に由来する。例えば、好適な二量体メンバーは、次のアミノ酸配列のうちのいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸、約１６０アミノ酸～約１７０アミノ酸、約１７０アミノ酸～約１８０アミノ酸、約１８０アミノ酸～約１９０アミノ酸、または約１９０アミノ酸～約２００アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Figure 2022046809000038
二量体化剤
二量体化剤結合対の第１のメンバー及び二量体化剤結合対の第２のメンバーの二量体化を提供することができる、二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（「二量体化剤」（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ））は、例えば、以下を含む（二量体化剤は、二量体化剤結合対に続いて括弧内にある）。
ａ）ＦＫＢＰ及びＦＫＢＰ（ラパマイシン）；
ｂ）ＦＫＢＰ及びＣｎＡ（ラパマイシン）；
ｃ）ＦＫＢＰ及びシクロフィリン（ラパマイシン）；
ｄ）ＦＫＢＰ及びＦＲＧ（ラパマイシン）；
ｅ）ＧｙｒＢ及びＧｙｒＢ（クーママイシン）；
ｆ）ＤＨＦＲ及びＤＨＦＲ（メトトレキサート）；
ｇ）ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ（ＡＰ２０１８７）；
ｈ）ＰＹＬ及びＡＢＩ（アブシジン酸）；
ｉ）Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１（青色光）；ならびに
ｊ）ＧＡＩ及びＧＩＤ１（ジベレリン）。
上記のように、ラパマイシンは二量体化剤の役割を果たし得る。あるいは、ラパマイシン誘導体または類似体が使用され得る。例えば、ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９９／３６５５３、ＷＯ０１／１４３８７、及びＹｅ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８８－９１を参照されたい。例えば、類似体、相同体、誘導体、及びラパマイシンに構造的に関連する他の化合物（「ラパログ」）は、とりわけ、ラパマイシンに関連する次の改変：Ｃ７、Ｃ４２、及び／またはＣ２９でのメトキシの脱メチル化、脱離、または交換；Ｃ１３、Ｃ４３、及び／またはＣ２８でのヒドロキシの脱離、誘導体化、または交換；Ｃ１４、Ｃ２４、及び／またはＣ３０でのケトンの還元、脱離、または誘導体化；６員ピペコラート環と５員プロリル環の交換；シクロへキシル環上の代替の置換またはシクロへキシル環と置換されたシクロペンチル環の交換：のうちの１つ以上を有する、ラパマイシンの変異体を含む。追加の情報は、例えば、米国特許第５，５２５，６１０号、同第５，３１０，９０３号、同第５，３６２，７１８号、及び同第５，５２７，９０７号において提供される。Ｃ－２８ヒドロキシル基の選択的エピマー化は説明されており、例えばＷＯ ０１／１４３８７を参照されたい。ラパマイシンの代わりとしての使用に好適な追加の合成二量体化剤は、米国特許出願公開第２０１２／０１３００７６号に記載されるものを含む。
ラパマイシンは次の構造を有する。
Figure 2022046809000039
好適なラパログは、例えば次を含む。
Figure 2022046809000040
さらにラパログとして好適なのは、次の式の化合物である：
Figure 2022046809000041
式中、ｎは１または２であり；Ｒ２８及びＲ４３は、独立して、Ｈ、または置換されたもしくは非置換の脂肪族もしくはアシル部分であり；Ｒ７ａ及びＲ７ｂのうちの一方がＨであり、他方がハロ、ＲＡ、ＯＲＡ、ＳＲＡ、－ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＡＲＢ、－ＮＲＡＲＢ、－ＮＲＢＣ（ＯＲ）ＲＡ、ＮＲＢＣ（Ｏ）ＯＲＡ、－ＮＲＢＳＯ２ＲＡ、もしくはＮＲＢＳＯ２ＮＲＡＲＢ'であるか、またはＲ７ａ及びＲ７ｂは、一緒になって、以下のテトラエン部分内のＨであり：
Figure 2022046809000042
式中、ＲＡは、Ｈまたは置換されたもしくは非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、もしくはヘテロアリール部分であり、かつ、式中ＲＢ及びＲＢ'は、独立して、Ｈ、ＯＨ、または置換されたもしくは非置換の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、もしくはヘテロアリール部分である。
上記のように、クーママイシンは二量体化剤の役割を果たし得る。あるいは、クーママイシン類似体が使用され得る。例えば、Ｆａｒｒａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１７８－１８１、及び米国特許第６，９１６，８４６号を参照されたい。
上記のように、いくつかの場合では、二量体化剤は、メトトレキサート、例えば非細胞毒性のホモ二官能性メトトレキサート二量体である。例えば米国特許第８，２３６，９２５号を参照されたい。
細胞内シグナル伝達ドメイン
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの活性化（すなわち、抗原及び二量体化剤によって活性化される）に応答して、明確で検出可能なシグナル（例えば、細胞による１つ以上のサイトカインの生成の増加；標的遺伝子の転写における変化；タンパク質の活性における変化；細胞挙動における変化、例えば細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達応答の調節等）を提供する任意の所望のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、下記のように、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ等）の、ＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型のシグナル伝達鎖を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合ＣＡＲに共有結合されないが、代わりに細胞質内で拡散される。
ＩＴＡＭ
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉであり、式中Ｘ１ 及びＸ２は独立して任意のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）である。いくつかの場合では、本願のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの場合では、ＩＴＡＭモチーフは細胞内シグナル伝達ドメイン内で２度反復され、ＩＴＡＭモチーフの第１及び第２のインスタンスは、６～８アミノ酸で互いから分離され、例えば（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ）（Ｘ３）ｎ（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ） であり、式中ｎは６～８の整数であり、６～８Ｘ３のそれぞれは、任意のアミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）であり得る。いくつかの場合では、本願のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部分であり得る。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質からのＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであり得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含む必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例には、ＤＡＰ１２；ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）；ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）；及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ－活性化タンパク質１２；ＫＡＲ関連タンパク質；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列（４つのイソ型）：
Figure 2022046809000043
のうちのいずれかと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000044
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ；Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖；Ｆｃ受容体ガンマ鎖；ｆｃ－イプシロンＲＩガンマ；ｆｃＲガンマ；ｆｃｅＲＩガンマ；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ；免疫グロブリンＥ受容体の高親和性ガンマ鎖；等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000045
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000046
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３－デルタ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、デルタサブユニット；ＣＤ３デルタ；ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）；ＯＫＴ３、デルタ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖；等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列（２つのイソ型）：
Figure 2022046809000047
のうちのいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸～約１７０アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字の下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３デルタアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000048
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、式中、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅ等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000049
の連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２０５アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３イプシロンアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000050
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３－ガンマ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）、等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000051
の連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸～約１８０アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ガンマアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000052
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ、等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列（２つのイソ型）：
Figure 2022046809000053
のうちのいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸～約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸～約１６０アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ゼータアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000054
のうちのいずれかと、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
いくつかの場合では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）；ＭＢ－１膜糖タンパク質；ｉｇ－アルファ；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面ＩｇＭ－関連タンパク質；等としても知られる）に由来する。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列（２つのイソ型）：
Figure 2022046809000055
のうちのいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸～約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０アミノ酸～約１１５アミノ酸、約１１５アミノ酸～約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸～約１３０アミノ酸、約１３０アミノ酸～約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸、または約２００アミノ酸～約２２０アミノ酸と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
同様に、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。よって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000056
と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、ＩＴＡＭモチーフには、太字で下線が引かれている。
ＤＡＰ１０／ＣＤ２８
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。
ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列：
Figure 2022046809000057
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列：
Figure 2022046809000058
の全長と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＣＤ２８シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列：
Figure 2022046809000059
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列：
Figure 2022046809000060
の全長と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＺＡＰ７０
本開示のＣＡＲにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチド、例えば、次のアミノ酸配列：
Figure 2022046809000061
の連続した一続きの約３００アミノ酸～約４００アミノ酸、約４００アミノ酸～約５００アミノ酸、または約５００アミノ酸～６１９アミノ酸と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
追加の配列
本願のＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドは、１つ以上の追加のポリペプチドドメインをさらに含み得、かかるドメインは、シグナル配列、エピトープタグ、親和性ドメイン、及び検出可能なシグナルを生成するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。
シグナル配列
本願のＣＡＲにおける、例えば本願のＣＡＲの第１のポリペプチドにおける、使用に好適なシグナル配列は、自然発生シグナル配列、合成（例えば人工）シグナル配列等を含む、任意の真核生物シグナル配列を含む。
エピトープタグ
好適なエピトープタグは、赤血球凝集素（ＨＡ；例えばＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）；ＦＬＡＧ（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）；ｃ－ｍｙｃ（例えばＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）等を含むがこれらに限定されない。
親和性ドメイン
親和性ドメインは、結合相手と相互作用し得るペプチド配列、例えば、識別または精製に有用な固体支持体上で固定化されるもの等、を含む。ヒスチジン等の、複数の連続的単一アミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、発現タンパク質に融合されると、ニッケルセファロース等の樹脂カラムへの高親和性結合による、組み換えタンパク質の一工程精製に使用され得る。例示的な親和性ドメインは、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）、Ｃ－ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）、赤血球凝集素、例えばＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７）、Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）、キチン結合ドメイン、Ｓ－ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ－ｅｎｄ ＲＮＡタグ、
Figure 2022046809000062
；カルシウム結合タンパク質、例えばカルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ－モジュリン、ビジニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、及びカルレチニンからのもの等の、例えば亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合ドメインのような、金属結合ドメイン；インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列、及びマルトース結合タンパク質を含む。
検出可能シグナル生成ポリペプチド
好適な検出可能シグナル生成タンパク質は、例えば、蛍光タンパク質、検出可能シグナルを生成物として生成する反応を触媒する酵素等を含む。
好適な蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその変異体、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、Ｊ－Ｒｅｄ、二量体２、ｔ－二量体２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質、ならびに、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質結合体を含むが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例には、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５－９０９）等が挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９－９７３に記載される、花虫類種からの様々な蛍光及び有色タンパク質の任意のものが、使用に好適である。
好適な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、β－グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等を含むがこれらに限定されない。
配列の組み換え
特定の例では、ＣＡＲのポリペプチド、例えばＣＡＲドメインの配列は、部位特異的組み換え技術の使用を通して、細胞内で再配置または欠失させ得る。特定の実施形態では、特定のＣＡＲへの細胞活性化関連応答は、部位特異的組み換えによって変更され得、例えば、第１の活性化関連応答を誘発するＣＡＲの第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、第２の活性化関連応答を誘発する第２の細胞内シグナル伝達ドメインと交換され得る。特定の例では、ＣＡＲの特定の二量体化剤への応答は、部位特異的組み換えによって変更され得、例えば、第１の二量体化剤の存在下でＣＡＲの二量体化を引き起こす第１の二量体化剤結合対は、第２の二量体化剤の存在下でＣＡＲの二量体化を引き起こす第２の二量体化剤結合対と交換され得る。当業者には明確であるように、部位特異的組み換えは、ＣＡＲの任意のドメインまたは配列を、本明細書に開示される任意の他のドメインまたは配列と交換するために、細胞内で使用され得る。さらに、当業者に明確であるように、部位特異的組み換えは、ＣＡＲの任意のドメインまたは配列を欠失させるために細胞内で使用され得る。配列及びドメインのかかる交換及び切除は、当業者に既知であり、例えば、Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３２１９－３２２６に記載されるシグナロボディ内のドメイン切り替えを参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書で開示される。インビボで部位特異的組み換えを行うための機構及び要件は、当業者に既知であり、例えば、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７－６０５及びＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
核酸
本開示は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、例えば組み換え発現ベクターを含む、ＤＮＡであり得る。本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ の第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ、例えばインビトロ合成ＲＮＡであり得る。
いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１のポリペプチドのみをコードする（第２のポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第２のポリペプチドのみをコードする（第１のポリペプチドをコードしない）ヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合では、本開示の核酸は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合では、本願の核酸は、例えば哺乳類細胞内で、本開示のＣＡＲの生成を提供する。他の場合では、本願の核酸は、ＣＡＲコード核酸の増幅を提供する。
本開示のＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えばプロモーター、エンハンサー等に機能的に連結され得る。
好適なプロモーター及びエンハンサー要素は、当業者に既知である。細菌細胞における発現については、好適なプロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、及びｔｒｃを含むがこれらに限定されない。真核細胞における発現については、好適なプロモーターは、軽及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期及び後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスからの長い末端反復に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター；及び様々な当業者に既知の組織特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない。
可逆的誘導性プロモーターを含む、好適な可逆的プロモーターは当業者に既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの有機体、例えば真核生物及び原核生物から単離されてこれらに由来し得る。第２の有機体内での使用のための、第１の有機体由来の可逆的プロモーターの改変、例えば第１の原核生物及び第２の真核生物、第２の真核生物及び第２の原核生物等は、当業者に公知である。かかる可逆的プロモーター、及びかかる可逆的プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質も含むシステムは、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコール脱水素酵素Ｉ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーター等）、テトラシクリン調節プロモーター（例えば、Ｔｅｔ活性化因子、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーターシステム）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステム等）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステム等）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアゾール調節プロモーター等）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、大豆熱ショックプロモーター等）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーター等を含むがこれらに限定されない。
いくつかの例では、好適なプロモーターを含有する座位または構築物または導入遺伝子は、誘導性システムの誘導を通して不可逆的に切り替えられる。不可逆的切り替えの導入に好適なシステムは、当業者に公知であり、例えば不可逆的切り替えの誘導は、Ｃｒｅ－ｌｏｘ媒介組み換えを利用し得る（例えばＦｕｈｒｍａｎｎ－Ｂｅｎｚａｋｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）２８：ｅ９９を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる）。当業者に既知の、リコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組み換え部位等の任意の好適な組み合わせが、不可逆的に切り替え可能なプロモーターを生成する際に使用され得る。本明細書の他の箇所に記載される、部位特異的組み換えを行うための方法、機構、及び要件は、不可逆的に切り替えられたプロモーターを生成することにおける用途を見出し、当業者に公知であり、例えば、Ｇｒｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７－６０５及びＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたく、該文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの場合では、プロモーターは、ＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターが使用され得、例えば、Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７７３９、及びＭａｒｏｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１：３４１６を参照されたい。別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターが使用され得る。ＮＫ細胞特異的発現は、Ｎｃｒ１（ｐ４６）プロモーターの使用により達成され得、例えば、Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１７：１５６５を参照されたい。
いくつかの実施形態では、例えば、酵母細胞における発現について、好適なプロモーターは、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーター等の構成型プロモーター；またはＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、及びＡＯＸ１（例えばピキア属における使用のため）等の調節可能プロモーターである。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
原核宿主細胞内での使用に好適なプロモーターは、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ラクトースオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えばｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーター等；ａｒａＢＡＤプロモーター； ｓｓａＧ プロモーターまたは関連プロモーター（例えば米国特許公開第２００４０１３１６３７号を参照されたい）、ｐａｇＣプロモーター （Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１：１７３（１）：８６－９３；Ａｌｐｕｃｈｅ－Ａｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９２；８９（２１）：１００７９－８３）、ｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．６：２８０５－２８１３）等（例えばＤｕｎｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１３３－５１４１；ＭｃＫｅｌｖｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３２４３－３２５５；及びＣｈａｔｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８８８－８９２を参照されたい）等のインビボ調節プロモーター；シグマ７０プロモーター、例えばコンセンサスシグマ７０プロモーター（例えば、ジェンバンク登録番号ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、及びＡＸ７９８１８３を参照されたい）；固定相プロモーター、例えばｄｐｓ プロモーター、ｓｐｖ プロモーター等；病原性アイランドＳＰＩ－２（例えばＷＯ９６／１７９５１を参照されたい）由来のプロモーター；ａｃｔＡプロモーター（例えばＳｈｅｔｒｏｎ－Ｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１０８７－１０９６）；ｒｐｓＭプロモーター（例えばＶａｌｄｉｖｉａ ａｎｄ Ｆａｌｋｏｗ（１９９６）．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３６７を参照されたい）；ｔｅｔプロモーター （例えばＨｉｌｌｅｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９）Ｉｎ Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．（編）Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４３－１６２を参照されたい）；ＳＰ６プロモーター（例えば、Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）等を含むがこれらに限定されない。大腸菌等の原核生物内での使用に好適な強力なプロモーターは、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、及びＰラムダを含むがこれらに限定されない。細菌性宿主細胞内での使用のためのオペレータの非限定的な例には、ラクトースプロモーターオペレータ（ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、ラクトースに接触すると立体構造を変更し、それによりＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレータに結合することを防止する）、トリプトファンプロモーターオペレータ（トリプトファンと複合すると、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレータに結合する立体構造を有し、トリプトファンの不在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレータに結合しない立体構造を有する）及び ｔａｃプロモーターオペレータ（例えばｄｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５を参照されたい）が挙げられる。
本願のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター及び／またはクローニングベクター内に存在し得る。本願のＣＡＲが２つの別個のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別個のベクター内でクローン化され得る。発現ベクターは、選択マーカー、複製の起点、ならびにベクターの複製及び／または維持を提供する他の特徴を含み得る。好適な発現ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクター等を含む。
複数の好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くは本願の組み換え構築物を生成するために市販されている。次のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）．真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
発現ベクターは、概して、非相同タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の付近に位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において作動可能な選択マーカーが存在し得る。好適な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９；Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照されたい）； アデノ関連ウイルス （例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７；Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９；Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６；ＷＯ９３／０９２３９におけるＳｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５；及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照されたい）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルス等のレトロウイルス由来のベクター）；等に基づくウイルスベクター）を含むがこれらに限定されない。
上記のように、いくつかの実施形態では、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ、例えばインビトロ合成ＲＮＡであり得る。ＲＮＡのインビトロ合成の方法は、当業者に既知であり、任意の既知の方法が、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含むＲＮＡを合成するために使用され得る。ＲＮＡを宿主細胞に導入するための方法は当業者に既知である。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：９０５３を参照されたい。本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを宿主細胞に導入することは、インビトロまたはエクスビボまたはインビボで実行され得る。例えば、宿主細胞（例えばＮＫ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球等）は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するＲＮＡで電気穿孔され得る。
細胞
本開示は、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲを生成するように遺伝子改変された哺乳類細胞を提供する。
好適な哺乳類細胞は、初代細胞及び不死化細胞株を含む。好適な哺乳類細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えばマウス、ラット）細胞株等を含む。好適な哺乳類細胞株は、ＨｅＬａ細胞（例えばアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）第ＣＣＬ－２号）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ９６１８号、同第ＣＣＬ６１号、同第ＣＲＬ９０９６号）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＲＬ－１５７３号）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えばＡＴＣＣ第ＣＲＬ－１６５８号）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ第ＣＣＬ１０号）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１７２１号）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１６５１号）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ第ＣＣＬＩ．３号）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５７３号）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ－７８、ジャーカット、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）等を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例では、細胞は不死化細胞株ではないが、代わりに個体から得られた細胞（例えば初代細胞）である。例えば、いくつかの場合では、細胞は個体から得られた免疫細胞である。例えば、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。別の例として、細胞は個体から得られた細胞毒性細胞である。別の例として、細胞は個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
免疫細胞を活性化する方法
本開示は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで、免疫細胞を活性化する方法を提供する。本方法は、概して、免疫細胞（インビトロ、インビボ、またはエクスビボ）を二量体化剤及び抗原と接触させることを含み、免疫細胞は本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲを生成するように遺伝子改変される。二量体化剤及び抗原の存在下で、ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲは二量体化して、免疫細胞を活性化し、それにより活性化された免疫細胞を生成する。免疫細胞は、例えば、細胞毒性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞等を含む。
遺伝子改変された免疫細胞（例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞）を、二量体化剤及び特異的結合対の第２のメンバー（例えば、抗原、リガンド、受容体）と接触させることは、特異的結合対の第２のメンバー及び／または二量体化剤の不在下で免疫細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、免疫細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させ得る。その生成を増加させることができるサイトカインは、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γを含むがこれらに限定されない。
遺伝子改変された免疫細胞（例えばＴリンパ球、ＮＫ細胞）を、二量体化剤及び抗原と接触させることは、抗原及び／または二量体化剤の不在下で免疫細胞によって生成されるサイトカインの量に比較して、免疫細胞によるサイトカインの生成を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させ得る。その生成を増加させることができるサイトカインは、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γを含むがこれらに限定されない。
遺伝子改変された細胞毒性細胞（例えば、細胞毒性Ｔリンパ球）を二量体化剤及び特異的結合対の第２のメンバー（例えば、抗原、リガンド、受容体）と接触させることは、二量体化剤の不在下での細胞毒性細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させ得る。
遺伝子改変された細胞毒性細胞（例えば細胞毒性Ｔリンパ球）を、二量体化剤及び抗原と接触させることは、二量体化剤の不在下での細胞毒性細胞の細胞毒性活性に比較して、細胞毒性細胞の細胞毒性活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させ得る。
他の実施形態では、例えば、宿主免疫細胞に応じて、遺伝子改変された宿主細胞を二量体化剤及び抗原と接触させることは、細胞増殖、細胞生存、細胞死等を増加または減少させ得る。
条件付で活性化可能な細胞を生成する方法
本開示は、条件付で活性化可能な細胞を生成する方法を提供する。本方法は、概して、哺乳類細胞を、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターまたはＲＮＡ（例えばインビトロ転写ＲＮＡ）で遺伝子改変することを含む。遺伝子改変され多細胞は、ａ）ＣＡＲの第１のポリペプチドが結合する抗原、及びｂ）二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ））の存在下で、条件付で活性化可能である。遺伝子改変は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実行され得る。細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）、幹細胞、前駆細胞等であり得る。
いくつかの場合では、遺伝子改変はエクスビボで実行される。例えば、Ｔリンパ球、幹細胞、またはＮＫ細胞が個体から得られ、個体から得られた該細胞は本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。遺伝子改変され多細胞は、ａ）ＣＡＲの第１のポリペプチドが結合する抗原、及びｂ）二量体化剤の存在下で、条件付で活性化可能である。いくつかの場合では、遺伝子改変され多細胞はエクスビボで活性化される。他の場合では、遺伝子改変され多細胞は、個体（例えば、そこから細胞が得られた個体）に導入され、遺伝子改変され多細胞は、例えば個体に二量体化剤を投与することによって、インビボで活性化される。例えば、抗原が個体における細胞の表面に存在する場合、抗原を投与する必要はない。遺伝子改変され多細胞は、個体における細胞の表面に存在する抗原と接触し、個体への二量体化剤の投与の際に、遺伝子改変された細胞が活性化される。例えば、遺伝子改変された細胞がＴリンパ球である場合、遺伝子改変された細胞は、ＣＡＲが結合するその表面に抗原を提供する細胞に対して細胞毒性を示し得る。
治療方法
本開示は、本願のＣＡＲを使用する様々な治療方法を提供する。
細胞毒性方法
本開示のＣＡＲは、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞内に存在する場合、標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。本開示のＣＡＲは、標的細胞上に存在する抗原に結合し、それにより、ＣＡＲを生成するように遺伝子改変されたＴリンパ球またはＮＫ細胞による標的細胞の死滅を媒介する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的細胞の表面に存在する抗原に結合する。
標的細胞は癌細胞を含むがこれに限定されない。よって、本開示は、標的癌細胞を死滅させる、またはその増殖を抑制する方法を提供し、該方法は、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が標的癌細胞の表面に存在する抗原を認識して、標的細胞の死滅を媒介するように、本願のＣＡＲを生成するように遺伝子改変された細胞毒性免疫エフェクター細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞、またはＮＫ細胞）を接触させることを含む。
本開示は、癌を有する個体における癌を治療する方法を提供し、該方法は、ｉ）個体から得られたＴリンパ球を、本開示のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程であって、ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの抗原結合ドメインが個体における癌細胞上のエピトープに対して特異的であり、かつ遺伝子改変がエクスビボで実行される、遺伝子改変する工程、ｉｉ）遺伝子改変されたＴリンパ球を個体に導入する工程、ｉｉｉ）個体に二量体化剤の有効量を投与する工程、を含み、二量体化剤がヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの二量体化を誘導し、該二量体化が遺伝子改変されたＴリンパ球の活性化及び癌細胞の死滅を提供し、それにより癌を治療する。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る癌腫は、食道癌腫、幹細胞癌腫、基底細胞癌腫（皮膚癌の一形態）、扁平細胞癌腫（様々な組織）、移行細胞癌腫（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌腫、気管支原性癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、胃癌腫、肺の小細胞癌腫及び非小細胞癌腫を含む肺癌腫、副腎皮質癌腫、甲状腺癌腫、膵臓癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、前立腺癌腫、アデノ癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭アデノ癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、腎細胞癌腫、腺管上皮内癌または胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、子宮癌腫、精巣癌腫、骨原性癌腫、上皮癌腫、ならびに上咽頭癌腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る肉腫は、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る他の固形腫瘍は、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法による療法の影響を受けやすくあり得る白血病は、ａ）慢性骨髄増殖症候群（多能性造血幹細胞の腫瘍性障害）；ｂ）急性骨髄性白血病（制限された系統可能性の多能性造血幹細胞または造血細胞の腫瘍性形質転換；ｃ）Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ；免疫未熟かつ機能不全小リンパ球のクローン増殖）；ならびにｄ）急性リンパ芽球性白血病（リンパ芽球の蓄積を特徴とする）を含むがこれらに限定されない。本願の方法を使用して治療することができるリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫（例えばバーキットリンパ腫）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等を含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示される方法に従う治療の影響を受けやすくあり得る他の癌は、非定型髄膜腫（脳）、島細胞癌腫（膵臓）、髄様癌腫（甲状腺）、間葉腫（腸）、肝細胞癌腫 （肝臓）、肝芽腫（肝臓）、明細胞癌腫（腎臓）、及び神経線維腫縦隔を含む。
免疫調節方法
本願の方法は、炎症状態及び自己免疫疾患を治療するためにも使用することができる。本願のＣＡＲは、免疫調節方法における使用のために、Ｔヘルパー細胞またはＴｒｅｇにおいて発現される。免疫調節方法は、例えば、哺乳類対象における病原体に対する免疫応答を強化すること、免疫無防備状態の対象における免疫応答を強化すること、炎症応答を低減させること、例えば自己免疫疾患を治療するために、哺乳類対象における自己抗原への免疫応答を低減すること、臓器または組織拒絶反応を低減するために、哺乳類対象における移植された臓器または組織への免疫応答を低減させること、を含む。
本方法が自己抗原への免疫応答を低減することを含む場合、ＣＡＲを活性化するために使用される抗原は自己抗原である。本方法が移植された臓器または組織への免疫応答を低減することを含む場合、ＣＡＲを活性化するために使用される抗原は、移植された臓器に特異的な抗原である。
製剤、用量、及び投与経路
上記のように、本開示の治療方法は、それを必要とする個体への二量体化剤の有効量の投与を含み、かつ、抗原の投与も含み得る。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に１回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下でのＴリンパ球の細胞毒性活性に比較して、本願のＣＡＲを発現するＴリンパ球の細胞毒性活性のレベルを、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させる量である。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に１回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下でのＮＫ細胞の細胞毒性活性に比較して、本願のＣＡＲを発現するＮＫ細胞の細胞毒性活性のレベルを、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍を超えて増加させる量である。
二量体化剤の「有効量」は、いくつかの場合では、それを必要とする個体に１回以上の用量で投与されると、二量体化剤の不在下での癌細胞の数及び／または腫瘍量に比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または７５％を超えて、個体における癌細胞の数を減少させる及び／または個体における腫瘍量を低減する量である。
いくつかの実施形態では、二量体化剤の有効量は、単独で（例えば単独療法で）または１つ以上の追加の治療薬との組み合わせで（例えば併用療法で）１回以上の用量で投与されると、二量体化剤を用いる治療の不在下での、腫瘍増殖速度、癌細胞数、または腫瘍量に比較して、腫瘍増殖速度、癌細胞数、腫瘍量のうちの１つ以上を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれを超えて低減させるのに有効である量である。
製剤
本願の方法において、二量体化剤は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便利な手段を使用して、宿主に投与することができる。よって、二量体化剤は治療的投与のための様々な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、二量体化剤は、適切で医薬的に容認可能なキャリアまたは希釈剤との組み合わせにより医薬組成物に製剤され得、かつ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐薬、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル等の、固体、半固体、液体、または気体形態の調製物に製剤され得る。
医薬的剤形において、二量体化剤はそれらの医薬的に容認可能な塩の形態で投与され得、またはそれらは単独で、もしくは適切な会合においては他の医薬活性化合物との組み合わせでも使用され得る。次の方法及び賦形剤は、単に例示的であり全く限定的でない。
好適な賦形剤媒体は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、媒体は、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤等の補助剤を少量含み得る。かかる剤形を調整する実際の方法は、当業者に既知であるかまたは明白であるだろう。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を参照されたい。投与される組成物または製剤は、任意の事象において、治療されている対象において所望の状態に到達するのに十分な量の二量体化剤を含む。
医薬的に容認可能な、媒体、アジュバント、キャリア、または希釈剤等の、賦形剤は、一般の人々に容易に入手可能である。さらに、医薬的に容認可能な、ｐＨ調節及び緩衝剤、等長化剤、安定化剤、湿潤剤等の、補助剤は、一般の人々に容易に入手可能である。
経口調製物については、二量体化剤は単独で、または適切な添加剤との組み合わせで、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、またはジャガイモデンプン等の従来の添加剤との；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤との；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤との；タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤との；ならびに所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び着香料との、組み合わせで使用されて、錠剤、粉末、顆粒、またはカプセルを作製し得る。
二量体化剤は、植物油または他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の、水性または非水性溶剤内でそれらを溶解、懸濁、または乳化させることによって、及び所望であれば、可溶化剤、等長剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、及び保存剤等の、従来の添加剤を用いて、注射用の調製物に製剤され得る。
二量体化剤を含む医薬組成物は、所望の度合いの純度を有する二量体化剤を、任意の生理的に容認可能な、キャリア、賦形剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤、及び／または等長化剤と混合することによって調製される。容認可能なキャリア、賦形剤、及び／または安定化剤は、用いられる用量及び濃度において受容者に無毒であり、かつ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸を含む抗酸化剤；保存剤（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチルもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ等）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びそれらの組み合わせ等の、アミノ酸； 単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満） ポリペプチド；ゼラチンまたは血清アルブミン等のタンパク質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン， ガラクトサミン、及びノイラミン酸等の、糖；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の、非イオン性界面活性剤等の、緩衝剤を含む。
本医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から復元された液体形態であり得、凍結乾燥調製物は投与の前に無菌駅で復元されるべきである。凍結乾燥組成物を復元するための標準的な手順は、ある量（典型的に凍結乾燥の間に除去された量と同等である）の純粋を加え戻すことであるが、しかしながら、抗菌剤を含む溶液が非経口投与のための医薬組成物の生成に使用され得、Ｃｈｅｎ（１９９２）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ１８，１３１１－５４も参照されたい。
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として好適な物理的に離散的な単位を指し、それぞれの単位は、医薬的に容認可能な希釈剤、キャリア、または媒体との関連で、所望の効果を生成するために十分な量で計算された所定の量の二量体化剤を含む。所与の二量体化剤の仕様は、用いられる具体的な二量体化剤及び到達されるべき効果、ならびに宿主内のそれぞれの二量体化剤に関連する薬力学に依存し得る。
いくつかの実施形態では、二量体化剤は放出制御製剤に製剤される。徐放性調製物は、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、そこにおいてマトリクスが造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである、二量体化剤に接触する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、ヒドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。生物活性の起こり得る損失は、適切な添加剤を使用することによって、含水量を制御することによって、及び特定のポリマーマトリクス組成物を発達させることによって、防止され得る。
用量
好適な用量は、様々な臨床学的因子に基づき、主治医または他の有資格医療従事者によって判断され得る。医療当業者に公知であるように、任意の１人の患者に対する用量は、患者の大きさ、体の表面積、年齢、投与される具体的な二量体化剤、患者の性別、投与の時間及び経路、健康状態、ならびに同時に投与されている他の薬品を含む、多くの因子に依存する。二量体化剤は、投与１回当たり１ ｎｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ体重～５ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与され得るが、しかしながら、特に前述の因子を考慮すると、この例示的な範囲未満またはこれを超える用量が想定される。投与計画が持続注入である場合、これは、１分につき体重１キログラム当たり１μｇ～１０ｍｇの範囲でもあり得る。
当業者は、投与レベルが、特異的二量体化剤、症状の重症度、及び被験者の副作用への感受性の関数として変動し得ることを容易に理解するだろう。所与の化合物についての好ましい用量は、様々な手段により当業者によって容易に判断可能である。
投与経路
二量体化剤は、インビボ及びエクスビボ方法、ならびに全身及び局所の投与経路を含む、任意の使用可能な方法及び薬品送達に好適な経路を使用して個体に投与される。
従来の医薬に容認可能な投与経路は、腫瘍内、腫瘍周囲、筋肉内、気管内、頭蓋内、皮下、皮内、局所投与、静脈内、動脈内、直腸、経鼻、経口、ならびに他の経腸及び非経口の投与経路を含む。投与経路は、組み合わされ得、または所望であれば、二量体化剤及び／または所望の効果に応じて調節され得る。二量体化剤は、単一の用量または複数の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、二量体化剤は経口投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は局所投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は腫瘍内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は腫瘍周囲に投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は頭蓋内投与される。いくつかの実施形態では、二量体化剤は静脈内投与される。
二量体化剤は、全身または局所経路を含む、従来の薬品の送達に好適な任意の使用可能な従来の方法及び経路を使用して宿主に投与され得る。概して、本発明によって企図される投与経路は、経腸、非経口、または吸入経路を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
吸入投与以外の非経口投与経路は、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、髄腔内、胸骨内、腫瘍内、腫瘍周囲、及び静脈内経路、すなわち、消化管を通る以外の任意の投与経路を含むが、必ずしもこれらに限定されない。非経口投与は、二量体化剤の全身または局所送達をもたらすために進められ得る。全身送達が所望である場合、投与は典型的に、医薬調製物の侵襲性または全身に吸収された局所または粘膜投与を含む。
二量体化剤は、経腸投与によっても対象に送達され得る。経腸の投与経路は、経口及び直腸（例えば坐薬を使用する）送達を含むが必ずしもこれらに限定されない。
治療によって意図されるのは、宿主を冒す病的状態に関連する症状を少なくとも改善することであり、改善は広い意味で使用され、癌等の治療されている病的状態に関連する、パラメータ、例えば症状の強さを少なくとも低減させることを指す。したがって、治療は、宿主がもはや病的状態または少なくとも病的状態を特徴づける症状を患わないように、病的状態または少なくともそれに関連する症状が、完全に抑制される、例えば発症することが防止される、または止められる、例えば終結させられる状況も含む。
いくつかの実施形態では、二量体化剤は、脳動脈における部位へまたは直接脳組織への、注射及び／または送達によって投与される。二量体化剤は、標的部位に、例えば、直接注射によって、浸透圧ポンプまたは緩効性粒子等の薬品送達デバイスの埋め込みによって、標的部位への微粒子銃送達等によって、直接投与されることができる。
併用療法
いくつかの実施形態では、二量体化剤は、標準的な癌療法にアジュバント療法として投与される。標準的な癌療法は、手術（例えば癌組織の手術による除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法による治療、抗体治療、生物学的応答改変物質治療、及び前述のものの特定の組み合わせを含む。
放射線療法は、ビーム等の外部から適用される源から、または小型放射線源の埋め込みによって送達される、Ｘ線またはガンマ線を含むが、これらに限定されない。
癌治療における使用に好適な抗体は、裸抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ（商標））、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（商標））、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（商標））、ランブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））等、及び結合抗体、例えば、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｒｔａｒｇ（商標））、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））、１３１Ｉ標識トシツモマ（Ｂｅｘｘａｒ（商標））等を含むがこれらに限定されない。癌治療における使用に好適な抗体は、腫瘍関連抗原に対して産生された抗体を含むがこれに限定されない。かかる抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２等）、Ｌｅｙ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリンアルファ－Ｖ－ベータ－３、インテグリンアルファ－５－ベータ－１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン等を含むがこれらに限定されない。
本開示の方法に関連する使用に好適な生物学的応答改変物質は、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の抑制剤、（２）セリン／トレオニンキナーゼ活性の抑制剤、（３）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体等の腫瘍関連抗原拮抗薬、（４）アポトーシス受容体作動薬、（５）インターロイキン－２、（６）インターフェロン－α、（７）インターフェロン－γ、（８）コロニー刺激因子、（９）血管新生の抑制剤；及び（１０）腫瘍壊死因子の拮抗薬、を含むがこれらに限定されない。
化学療法物質は、癌細胞の増殖を低減させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であり、細胞毒性物質及び細胞分裂阻害剤を包括する。化学療法物質の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、及びステロイドホルモンが挙げられる。
細胞増殖を低減させるために作用する物質は、当業者に既知であり幅広く使用されている。かかる物質は、メクロレタミン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、及びテモゾロミドを含むがこれらに限定されない、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、及びトリアゼン、等のアルキル化剤を含む。
代謝拮抗剤は、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、ペントスタチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、メトトレキサート、１０－プロパルギル－５，８－ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８－ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、及びゲムシタビンを含むがこれらに限定されない、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ抑制剤を含む。
好適な天然物及びそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン）は、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等；ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポシド等；抗生物質、例えば、アンソラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えば、ブレオマイシン；アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ－５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等；等を含むがこれらに限定されない。
他の抗増殖性細胞毒性物質は、ナベルベン、ＣＰＴ－１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イフォスアミド、及びドロロキサフィンである。
抗増殖性活性を有する、微小管に影響を与える物質も使用に好適であり、アロコルヒチン（ＮＳＣ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ７５７）、コルヒチン誘導体（例えばＮＳＣ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、Ｔａｘｏｌ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ３６１７９２）、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン；エポチロンＡ、エポチロンＢ、ディスコデルモリドを含むがこれらに限定されない、天然及び合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾール等、を含むがこれらに限定されない。
使用に好適なホルモン調節剤及びステロイド（合成類似体を含む）は、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン等； エストロゲン及びプレゲスチン、例えば、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン；等；及び副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド；１７α－エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン，フルオキシメステロン， プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（フェアストン）、及びＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）を含むがこれらに限定されない。エストロゲンは増殖及び分化を模擬し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物がこの活性を阻害するために使用される。コルチコステロイドはＴ細胞増殖を抑制し得る。
他の化学療法物質は、金属複合体、例えば、シスプラチン（シス－ＤＤＰ）、カルボプラチン等 ；尿素、例えばヒドロキシ尿素；ヒドラジン、例えばＮ－メチルヒドラジン；エポドフィロトキシン；トポイソメラーゼ抑制剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフール；等を含む。対象となる他の抗増殖性物質は、例えば、ミコフェノール酸、サリドマイド、デソキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ １８３９、４－（３－クロロ－４－フルオロフェニルアミノ）－７－メトキシ－６－（３－（４－モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン）；等を含む。
「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」（本明細書では、例えば、ドセタキセル、ＴＡＸＯＬ（商標）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０－デスアセチル類似体、及びパクリタキセルの３'Ｎ－デスベンゾイル－３'Ｎ－ｔ－ブトキシカルボニル類似体等の、類似体、製剤、及び誘導体を含むと理解されるべきである）は、当業者に既知の技術を利用して容易に調製され得（ＷＯ９４／０７８８２、ＷＯ９４／０７８８１、ＷＯ９４／０７８８０、ＷＯ９４／０７８７６、ＷＯ９３／２３５５５、ＷＯ９３／１００７６；米国特許第５，２９４，６３７号、同第５，２８３，２５３号、同第５，２７９，９４９号、同第５，２７４，１３７号、同第５，２０２，４４８号、同第５，２００，５３４号、同第５，２２９，５２９号、及びＥＰ５９０，２６７も参照されたい）、または例えばミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セイヨウイチイからのＴ７４０２、タキサスヤンナネンシスからのＴ－１９１２）を含む、様々な市販の供給源から得られ得る。
パクリタキセルは、パクリタキセルの一般的で化学的に入手可能な形態のみではなく、類似体及び誘導体（例えば、上記のようにＴａｘｏｔｅｒｅ（商標）ドセタキセル）ならびにパクリタキセル結合体（例えば、パクリタキセル－ＰＥＧ、パクリタキセル－デキストラン、またはパクリタキセル－キシロース）も指すということが理解されるべきである。
さらに、親水性誘導体及び疎水性誘導体の両方を含む様々な既知の誘導体も「タキサン」という用語に含まれる。タキサン誘導体は、国際特許出願ＷＯ９９／１８１１３に記載されるガラクトース及びマンノース誘導体；ＷＯ９９／１４２０９に記載されるピペラジノ及び他の誘導体；ＷＯ９９／０９０２１、ＷＯ９８／２２４５１、及び米国特許第５，８６９，６８０号に記載されるタキサン誘導体；ＷＯ９８／２８２８８に記載される６－チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載されるスルフェンアミド誘導体；及び米国特許第５，４１５，８６９号に記載されるタキソール誘導体、を含むがこれらに限定されない。これは、ＷＯ９８／５８９２７、ＷＯ９８／１３０５９、及び米国特許第５，８２４，７０１号に記載されるものを含むがこれらに限定されない、パクリタキセルのプロドラッグをさらに含む。
治療に好適な対象
様々な対象が、癌を治療する本願の方法を用いた治療に好適である。好適な対象は、癌を有する、癌と診断された、癌を発症する危険性のある、癌を有したことがあり癌の再発の危険性がある、癌について二量体化剤以外の物質で治療されたことがありかかる治療に応答することができなかった、または癌について二量体化剤以外の物質で治療されたことがあるがかかる治療への初期応答の後に再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物を含む。
本願の免疫調節方法を用いた治療に好適な対象は、自己免疫障害を有する個体、臓器または組織移植受容者である個体等、免疫無防備状態の個体、及び病原体に感染した個体を含む。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数（例えば量、温度等）に関する正確性を保証するように努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｐｌ、ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロベース（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．筋肉内の（に）；ｉ．ｐ．腹腔内の（に）；ｓ．ｃ．皮下の（に）；ｉ．ｖ．静脈内の（に）；等が使用され得る。
実施例１：ＣＡＲの生成
材料及び方法
設計最適化プロセスを通して、抗ヒトＣＤ１９ｓｃＦＶが、ＣＡＲ内の抗原認識ドメインとして選択された。図１８Ａ及び１８Ｂは、数的に識別される２つのポリペプチドから成るそれぞれのＣＡＲの分子構造をまとめる。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。膜アンカーポリペプチドは、図面を単純にするためにモノマーとして描写される。
ＣＡＲ構築物の生成
非ヒトＣＤ１９ｓｃＦＶをコードする配列は、一構築物からクローン化された。ヒト４－１ＢＢ共刺激及びＣＤ３ゼータＩＴＡＭシグナル伝達鎖は、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されたｃＤＮＡからクローン化した。ＦＫＢＰ及びＦＲＢコード配列は、Ａｄｄｇｅｎｅによって提供されたプラスミドからクローン化された。
標準的な分子クローン化技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限消化、結紮等）が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認された通り、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１５０６３）を使用する負の選択によって、アフェレーシス（カリフォルニア州サンフランシスコのＢｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰａｃｉｆｉｃからのＴｒｉｍａ残差）の後に、匿名のドナーの血液から単離した。細胞は、Ｘ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ、番号０４－４１８Ｑ）、５％のヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．、番号ＨＰ１０２２）、１０ｍＭのＮ－アセチルＬ－システイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ａ９１６５）、及び１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（ＮＣＩ／ＢＲＢ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、から成るヒトＴ細胞培地において培養された。ＮＦＡＴ活性化の際に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するジャーカット細胞株を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。Ｕ．ＰｅｎｎからのＫ５６２標的細胞を、１０％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭ中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスを、ｐＨＲ'ＳＩＮ：ＣＳＷ導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、ｐＣＭＶｄＲ８．９１、及びｐＭＤ２．Ｇと、同時形質移入された、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３２１８０）から、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１５３３８）を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の４８時間後に採取し、導入に直接使用した。
ウイルス導入の２４時間前、初代ヒトＴ細胞を、ヒトＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１１１－３１Ｄ）を１：３の細胞：ビーズ比で使用して、活性化した。培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びＫ５６２細胞を前もって１～２日間分裂させた。導入されたジャーカット及びＫ５６２細胞を実験を行う前に少なくとも７日間培養した。初代Ｔ細胞を、ヒトＴ細胞培地中で、細胞が静止期に戻るまで約２週間、約１０＾６／ｍＬに維持した。レンチウイルス構築物においてコードされるＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
ＩＬ－２生成及びＮＦＡＴ活性の定量
ＣＡＲを発現するジャーカットＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕ．Ｐｅｎｎからのコグネイトまたは非コグネイトＫ５６２標的細胞と、１：２のエフェクター：標的比で混合した。ラパログＡ／Ｃ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３５０５５）を連続的に培地中で希釈し、反応混合物に加えた。２０～２４時間インキュベートした後、培地上清を採取し、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５５１９０）で分析した。フローサイトメトリーを行い、ＣＡＲ活性の別個のインジケータとして、ジャーカット細胞におけるＮＦＡＴ依存性ＧＦＰレポーター発現を定量化した。
フローサイトメトリーベースの方向付け直された（re-directed）細胞毒性アッセイ
コグネイト及び非コグネイトＫ５６２標的細胞を、混合物中の両方の種類の細胞がフローサイトメトリーによって同時に定量化され得るように、明確な蛍光タンパク質を発現するように操作した。標的細胞種類を、１：１比で混合し、ヒト初代ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と、５：２のエフェクター：標的比で同時インキュベートした。１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２及び様々な量のラパログ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３５０５５）を、反応混合物に加えた。２４時間インキュベートした後、試料を４００ｇで５分間遠心分離した。ペレット状の細胞を、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋０．１％のアジ化ナトリウム）中で再懸濁し、フローサイトメトリーの前に、同等の量のＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ ｃａｔ、番号５５４６５５）で固定した。エフェクター細胞の方向付け直された細胞毒性活性を列挙するために、生存するコグネイト標的細胞と非コグネイト標的細胞との比をそれぞれの試料について計算した。
結果
様々なＣＡＲ構築物によって引き出されたＩＬ－２生成を評価した。データは図１２に提供される。
図１２：５つのオンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされたＩＬ－２生成。エフェクター＝ＣＡＲで操作されたヒトＣＤ４＋ジャーカットＴ細胞。標的＝コグネイトＣＤ１９抗原を有するまたは有さないＫ５６２細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたＩＬ－２の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化した。
図１３：図１２に記載されるものと同じ実験における、対照ジャーカット株によるＩＬ－２生成。構築物「１２５」は、臨床試験において現在使用される従来の対照物を示す。
図１４：図１２に記載されるものと同一の条件下での、別個の実験における「１２２＋２０６」と「１９７＋２０６」との間の比較。
図１５は、オンスイッチＣＡＲ「１９７＋２０６」によって与えられた薬理学的に滴定可能な細胞毒性を示す。小分子ラパログの存在下で、ＣＡＲはコグネイト標的細胞に対する方向付け直された細胞毒性を効果的に媒介する。高用量のラパログでは、このオンスイッチＣＡＲは「１２５」従来ＣＡＲと同程度に強力にシグナル伝達をすることができる。エフェクター＝ＣＡＲまたは対照ベクターで操作されたヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞。標的＝コグネイトヒトＣＤ１９抗原または非コグネイトヒトメソテリン抗原のいずれかを発現するＫ５６２細胞株の蛍光誘導体。
図１６は、細胞内シグナル伝達ドメインとしてのＴ細胞受容体経路からの細胞質チロシンキナーゼＺａｐ７０で構築されたＣＡＲについてのデータを示す。
図１６は、オンスイッチＣＡＲのいくつかの変異体で操作されたジャーカット細胞からのデータを示す。操作されたジャーカット細胞は、コグネイト抗原（ＣＤ１９）及び示された濃度のラパログを伴ってまたは伴わずに、Ｋ５６２標的細胞と同時インキュベートした。ＣＡＲ成分として、Ｚａｐ７０キナーゼ（「１９９」と記される左から１つ目及び２つ目の構造）は、ＮＦＡＴ機能を活性化することにおいて、ＩＴＡＭ（「１６８」と記される左から３つ目の構造）と同程度に有効であった。４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの追加は、受容体の抗原認識部分の表面発現を増加させ、「１９７＋１９９」によるより強力なシグナル伝達をもたらした。非シグナル伝達ＣＡＲ（最も右）は負の対照として含まれた。
実施例２：メソテリン標的ＣＡＲ
材料及び方法
複数のキメラ抗原受容体構築物が作製され試験された。ここに示される構築物は、３つの異なる抗ヒトメソテリンｓｃＦｖを抗原認識ドメインとしてコードする。図１９Ａ、１９Ｂ、及び１９Ｃは、それぞれのＣＡＲが２つのポリペプチドを含む、それぞれの抗ヒトメソテリンＣＡＲの分子構造をまとめる。それぞれの抗ヒトメソテリンＣＡＲの細胞内部分は、２つの４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ二量体化剤結合対、ならびにＩＴＡＭ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ここに示される３つの異なる抗原認識ドメインは、抗メソテリンＨＮ１ｓｃＦｖ、ＳＳ１ｓｃＦｖ、及びｍ９１２ｓｃＦｖである。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。
ＣＡＲ構築物の生成
抗メソテリンをコードする配列は、構築物からクローン化したか、またはＰＣＲによって遺伝子アセンブリを介して合成した。ヒト４－１ＢＢ共刺激及びＣＤ３ゼータＩＴＡＭシグナル伝達鎖は、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されたｃＤＮＡからクローン化した。ＨＮ１ｓｃＦｖコード配列、ＳＳ１ｓｃＦｖコード配列、及びｍ９１２ｓｃＦｖコード配列は、ＰＣＲによって合成され、いくつかの場合では、コドン最適化された。ＦＫＢＰ及びＦＲＢコード配列は、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミドからクローン化した。
標準的な分子クローン化技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限消化、結紮等）が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
ＮＦＡＴ活性化の際にＧＦＰを発現するジャーカット細胞株を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。Ｋ５６２標的細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＩＭＤＭ中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスを、ｐＨＲ'ＳＩＮ：ＣＳＷ導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、ｐＣＭＶｄＲ８．９１、及びｐＭＤ２．Ｇと、同時形質移入された、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３２１８０）から、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１５３３８）を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の４８時間後に採取し、導入に直接使用した。
培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びＫ５６２細胞を前もって１～２日間分裂させた。導入されたジャーカット及びＫ５６２細胞を実験を行う前に少なくとも７日間培養した。レンチウイルス構築物においてコードされるＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
ＩＬ－２生成の定量
ＣＡＲを発現するジャーカットＣＤ４＋Ｔ細胞を、コグネイトまたは非コグネイトＫ５６２標的細胞と、１：２のエフェクター：標的比で混合した。ラパログＡ／Ｃ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３５０５５）を連続的に培地中で希釈し、反応混合物に加えた。２０～２４時間インキュベートした後、培地上清を採取し、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５５１９０）で分析した。
結果
抗メソテリンＣＡＲ構築物によって引き出されたＩＬ－２生成を評価した。データは図１９Ｄ～Ｆに提供される。
図１９：ＨＮ１ｓｃＦｖ（図１９Ｄ）、ＳＳ１ｓｃＦｖ（図１９Ｅ）、及びｍ９１２ｓｃＦｖ（図１９Ｆ）オンスイッチＣＡＲ変異体によって引き起こされるＩＬ－２生成。従来ＣＡＲ（図１９Ｇ、構築物番号３５８）によるＩＬ－２生成を測定し、オンスイッチＣＡＲ（図１９Ｄ）との比較のために含めた。エフェクター＝ＣＡＲで操作されたヒトＣＤ４＋ジャーカットＴ細胞。標的＝コグネイトメソテリン抗原を有するまたは有さないＫ５６２細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたＩＬ－２の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化した。
実施例３：オンスイッチＣＡＲの二量体化剤としてのジベレリン酸
材料及び方法
図２０Ａは、本願のジベレリン酸二量体化剤ＣＡＲの分子構造をまとめる。抗原結合部分は、抗ヒトＣＤ１９ｓｃＦｖを含む。細胞内部分は、２つの４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＧＩＤ１及びＧＡＩ二量体化剤結合対、ならびにＩＴＡＭ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。すべての膜アンカーポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体である。
ＣＡＲ構築物の生成
ジベレリン酸二量体化剤ＣＡＲをコードする配列を構築物からクローン化した。抗ＣＤ１９ｓｃＦｖをプラスミドからクローン化した。ヒト４－１ＢＢ共刺激及びＣＤ３ゼータＩＴＡＭシグナル伝達鎖は、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されたｃＤＮＡからクローン化した。ＧＩＤ１及びＧＡＩコード配列を、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミドからクローン化した。標準的な分子クローン化技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限消化、結紮等）が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
エフェクター及び標的細胞の培養条件
ＮＦＡＴ活性化の際にＧＦＰを発現するジャーカット細胞株を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。Ｋ５６２標的細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＩＭＤＭ中で培養した。
レンチウイルスを用いたエフェクター及び標的細胞の操作
汎親和性ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルスを、ｐＨＲ'ＳＩＮ：ＣＳＷ導入遺伝子発現ベクター、ウイルスパッケージングプラスミド、ｐＣＭＶｄＲ８．９１、及びｐＭＤ２．Ｇと、同時形質移入された、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、番号６３２１８０）から、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１５３３８）を使用して、生成した。感染培地上清を形質移入の４８時間後に採取し、導入に直接使用した。
培養物が導入の時に対数期にあるであろうことを保証するために、ジャーカット及びＫ５６２細胞を前もって１～２日間分裂させた。導入されたジャーカット及びＫ５６２細胞を実験を行う前に少なくとも７日間培養した。レンチウイルス構築物においてコードされるＣＡＲの発現レベルを、フローサイトメーターを使用して、フルオロフォア結合抗体または蛍光レポータータンパク質のいずれかを検出することによって定量化した。
ＩＬ－２生成の定量
ＣＡＲを発現するジャーカットＣＤ４＋Ｔ細胞を、コグネイトまたは非コグネイトＫ５６２標的細胞と、１：２のエフェクター：標的比で混合した。エタノール（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、番号Ｇ３７７５００）中で予め溶解させたジベレリン酸－３アセトキシメチルエステル（ジベレリン酸－３ＡＭ） を成長培地中で希釈し反応混合物に加えた。ジベレリン酸（ジベレリン酸－３ＡＭ）を１０ｍＭで使用した。２０～２４時間インキュベートした後、培地上清を採取し、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５５１９０）で分析した。
結果
ジベレリン酸二量体化剤ＣＡＲ構築物によって引き出されたＩＬ－２生成を評価した。データは図２０に提供される。
図２０：ジベレリン酸二量体化剤ＣＡＲ変異体によって引き起こされたＩＬ－２生成（図２０Ｂ）。従来ＣＡＲ（図２０Ｃ、構築物「１２５」）によるＩＬ－２生成を測定し、オンスイッチＣＡＲとの比較のために含めた。 エフェクター＝ＣＡＲで操作されたヒトＣＤ４＋ジャーカットＴ細胞。標的＝コグネイトＣＤ１９抗原を有するまたは有さないＫ５６２細胞株。エフェクター細胞によって分泌されたＩＬ－２の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化した。
実施例４：様々な共刺激ドメインを有するオンスイッチＣＡＲ
材料及び方法
複数のキメラ抗原受容体構築物を、４－１ＢＢ共刺激ドメインを様々な他の共刺激ドメインで交換したことを除き、本質的に実施例１について記載した通りに作製した。図２１Ａ及び２１Ｂは、ここに記載されるＣＡＲの分子構造をまとめる。
ＣＡＲ構築物の生成
抗ヒトＣＤ１９ｓｃＦｖをコードする配列を、プラスミドからクローン化した。ヒトＣＤ３ゼータＩＴＡＭシグナル伝達鎖、ならびにヒト共刺激ドメインＣＤ２８及びＯＸ－４０コード配列を、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって提供されたｃＤＮＡからクローン化した。ＦＫＢＰ及びＦＲＢコード配列は、Ａｄｄｇｅｎｅからのプラスミドからクローン化された。
標準的な分子クローン化技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限消化、結紮等）が、レンチウイルス発現プラスミドを生成するために適用された。
ＣＡＲ構築物の試験
エフェクター及び標的細胞を、ＣＤ２８及びＯＸ－４０共刺激ドメインを含む記載されるオンスイッチＣＡＲ構築物（図２１Ａ～Ｂ、それぞれ構築物「３６５＋３６７」及び「３９９＋４００」）、ならびに対応する従来のＣＡＲ対照物（図２１Ｃ～Ｄ、それぞれ構築物「３６６」及び「３９８」）を使用して、実施例１に従って培養及び形質移入した。ＩＬ－２生成、ＮＦＡＴ活性アッセイ、及びフローサイトメトリーベースのアッセイも、実施例１について記載されるように、構築物を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び構築物を含むＯＸ－４０共刺激ドメインを用いて、行うことができる。あるいは、ＣＤ２８及びＯＸ－４０共刺激ドメインを含むオンスイッチＣＡＲ構築物のサブユニットは、実施例１からの構築物のサブユニットと対になり得る（例えば「１９７＋３６７」、「３６５＋２０６」、「１９７＋４００」、「３９９＋２０６」等）。
実施例５：オンスイッチＣＡＲのインビボ評価
オンスイッチＣＡＲは、標的腫瘍細胞の死滅をインビボで媒介する能力について評価され得る。オンスイッチＣＡＲを発現するＴ細胞の注射によって引き出されるインビボでの腫瘍細胞の死滅を評価する。インビトロでコグネイト抗原を発現することが確認されており、かつ、対応するＣＡＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞によって死滅し得る腫瘍細胞株を使用する。生物発光撮像によりインビボで腫瘍量を定量化することを可能にするために、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼのいずれかを発現するように操作された腫瘍細胞を使用することができる。腫瘍細胞を、免疫無防備状態のマウス（例えば６～１０週齢の雌のＮＯＤ 重症複合免疫不全ガンマ（ＮＳＧ）マウス）に、皮下腫瘍モデルについては皮下に、または全身腫瘍モデルについては静脈内に、のいずれかで注入する。腫瘍移植の方法及び移植する腫瘍細胞の最適数は、使用される腫瘍細胞株に最適な条件に基づき得る。腫瘍量は、生物発光撮像によって、及び適用可能であればキャリパー測定によって、一週間に２回モニタすることができる。腫瘍量が検出可能になったらただちに、オンスイッチＣＡＲを発現する合計０．５～２．５×１０＾７のＴ細胞（１：１のＣＤ４＋：ＣＤ８＋）を、マウスに静脈内注入し、治療を開始する。二量体化小分子薬（例えばラパログ）をビヒクル配合物中で腹腔内投与する。オンスイッチＣＡＲを発現するＴ細胞を、抗腫瘍効果を増強するために、実験の間繰返し注入することができる。インターロイキン－２（ＩＬ－２）を、抗腫瘍効果を増強するために投与することができる。
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されてきたが、当業者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得、かつ等価物が置換され得るということが理解されるべきである。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの修正が行われてもよい。すべてのかかる修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であるよう意図されている。

Claims (16)

  1. メソテリンに特異的に結合する一本鎖抗体可変領域を含む抗原結合ドメインと、二量体化対の第１のメンバーと、第１の膜貫通ドメインとを含む、第１のポリペプチド；及び
    二量体化対の第２のメンバーと、第２の膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、第２のポリペプチド；
    を含む、ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    第１のポリペプチドの二量体化対のメンバーと第２のポリペプチドの二量体化対のメンバーとを結合する二量体化剤と共に、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを細胞で発現させると、前記二量体化剤によって二量体化される、前記ヘテロ二量体の条件付活性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３－ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインまたはＺＡＰ７０細胞内シグナル伝達ドメインである、請求項１に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
  3. 前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドの両方が、共刺激ポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
  4. 前記共刺激ポリペプチドが、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭからなる群より選択される、請求項３に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
  5. 前記二量体化対の前記第１及び第２のメンバーが、
    a) ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ－ラパマイシン関連蛋白質（ＦＲＢ）、
    b) ジベレリン酸非感受性（ＧＡＩ）タンパク質及びジベレリン受容体（ＧＩＤ１）タンパク質、
    c) ＦＫＢＰ及びカルシニューリン触媒サブユニットＡ（ＣｎＡ）、
    d) アブシジン酸受容体（ＰＹＬ）タンパク質及びアブシジン酸非感受性（ＡＢＩ）タンパク質、
    e) ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、
    f) ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ、
    g) ジャイレースＢ（ＧｙｒＢ）及びＧｙｒＢ、
    h) ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びＤＨＦＲ、ならびに
    i) ＤｍｒＢ及びＤｍｒＢ
    から選択される、請求項１－４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲ。
  6. 請求項１－５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  7. 前記ヌクレオチド配列が、Ｔリンパ球特異的プロモーターまたはＮＫ細胞特異的プロモーターに機能的に連結される、請求項６に記載の核酸分子。
  8. インビトロ転写ＲＮＡであるか、または組み換え発現ベクター上に存在する、請求項６または７に記載の核酸分子。
  9. 請求項１－５のいずれかに記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変された、インビトロまたはエクスビボ哺乳類細胞。
  10. 幹細胞、前駆細胞、幹細胞もしくは前駆細胞から誘導された細胞、Ｔリンパ球、またはＮＫ細胞である、請求項９に記載の細胞。
  11. 前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１０に記載の細胞。
  12. Ｔリンパ球を二量体化剤及びメソテリンと接触させる工程を含む、Ｔリンパ球をインビトロまたはエクスビボで活性化する方法であって、前記Ｔリンパ球が、請求項１－５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変され、前記二量体化剤及び前記メソテリンの存在下で、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲが二量体化して、前記Ｔリンパ球を活性化し、それにより活性化されたＴリンパ球を生成する、前記方法。
  13. 請求項９－１１のいずれか１項に記載の細胞を作製する方法であって、哺乳類細胞を、請求項１－５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで、インビトロまたはエクスビボで遺伝子改変する工程、または哺乳類細胞を、請求項１－５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡで遺伝子改変する工程を含む、前記方法。
  14. 個体における癌を治療する方法における使用のための請求項１－５のいずれか１項に記載の条件付活性ＣＡＲであって、前記方法が、
    i) 前記個体から得られたＴリンパ球を、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変する工程であって、前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの抗原結合ドメインが、前記個体における癌細胞上のメソテリンエピトープに対して特異的であり、かつ前記遺伝子改変がエクスビボで実行される工程；
    ii) 前記遺伝子改変されたＴリンパ球を前記個体に導入する工程；ならびに
    iii) 前記個体に、有効量の二量体化剤を投与する工程であって、前記二量体化剤が前記ヘテロ二量体の条件付活性ＣＡＲの二量体化を誘導し、前記二量体化が前記遺伝子改変されたＴリンパ球の活性化及び前記癌細胞の死滅を提供し、それにより前記癌を治療する工程
    を含む、前記条件付活性ＣＡＲ。
  15. 前記二量体化剤がラパログである、請求項１４に記載の使用のための条件付活性ＣＡＲ。
  16. 前記癌が、中皮腫、乳癌、または肺癌である、請求項１４または１５に記載の使用のための条件付活性ＣＡＲ。
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