JPH08510896A - 標的遺伝子の調節的転写および他の生物学的結果 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質のダイマー化およびオリゴマー化は、細胞膜受容体、転写因子、小胞融合タンパク質並びに他のクラスの細胞内および細胞外タンパク質の活性化に寄与する一般的な生物学的制御機序である。本発明者は、細胞内タンパク質の調節的（誘導）ダイマー化またはオリゴマー化のための一般的な方法を開発してきた。原則として、任意の２種類の標的タンパク質は、それらを有する細胞または生物を細胞透過性の合成リガンドで処理することによって結合することができる。本発明の実施を例証するために、本発明者は、（１）リポーター遺伝子のシグナリングおよび転写をもたらすＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体のζ鎖の細胞質尾部の細胞内凝集、（２）細胞特異的アポプトシス（プログラム化された細胞死）をもたらすＦａｓ受容体の細胞質尾部のホモダイマー化および（３）リポーター遺伝子の直接的転写をもたらすＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａ１４）および転写活性化ドメイン（ＶＰ１６）のヘテロダイマー化を誘導した。本発明者の細胞透過性合成リガンドとの調節的細胞内タンパク質結合は、生物学的研究および医学、特に遺伝子療法における新しい可能性を与える。遺伝子転移技術を用いて本発明者の人工受容体を導入すると、活性「ダイマライザー」または「脱ダイマライザー」をそれぞれ経口投与することによって治療用タンパク質の過剰発現をもたらすシグナリング経路を開始させることができるしまたは停止させることができる。異なる受容者からの細胞は、種々の疾患において用いるための異なる治療用タンパク質を過剰発現する経路を有するような構造でありうるので、ダイマライザーは「万能薬」として役立つ可能性がある。それらは、更に、他の状況では静脈内注射または細胞内発現を必要とすると考えられる治療用アンチセンス薬またはタンパク質（例えば、ＬＤＬ受容体またはＣＦＴＲタンパク質）の細胞透過性有機代替物と考えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 標的遺伝子の調節的転写および他の生物学的結果技術分野 本発明は、キメラタンパク質とダイマーまたはマルチマー、好ましくは非ペプ チド有機分子とのオリゴマー化に関する材料、方法および用途に関する。本発明 の態様は、宿主細胞の組換え修飾および遺伝子療法におけるそれらの使用または 誘導遺伝子発現の他の用途によって例証される。序論 生物学的特異性は、通常、タンパク質間の極めて特異的な相互作用に起因する 。この原理は、細胞外分子が細胞内現象に影響を及ぼす過程であるシグナル形質 導入によって例証される。多数の経路は、細胞表面受容体に対する細胞外リガン ドの結合によって始まる。多くの場合、受容体ダイマー化は、リン酸基転移およ び、シグナリングカスケードを継続するタンパク質の補充をもたらす。膜受容体 はホモダイマー化によって活性化されうるという認識は、二つの受容体に架橋し た抗体によって受容体が活性化されうるという知見に起因した。次に、多数の受 容体は、それらの性質を共有することが分かった。多数の受容体の細胞外および 貫膜部分は、リガンド依存性ダイマー化またはオリゴマー化によって受容体の細 胞質ドメインをごく接近させることによって機能すると考えられるが、受容体の 細胞質ドメインは、細胞の内部区分に対して特定のシグナルを伝達する。 他にも、種々の系においてリガンド−受容体相互作用が研究されてきた。例え ば、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５８，１２３は 、Ｂ細胞抗原受容体複合体の細胞質エフェクターを記載している。デュラン（Ｄ ｕｒａｎｄ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，１７１５、バ ーウェイ（Ｖｅｒｗｅｉｊ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５ ，１５７８８およびショウ（Ｓｈａｗ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１ ，２０２は、ＮＦ−ＡＴに支配された転写が、厳密に抗原受容体の制御下にある ことを報告している。シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６によるＮＦ−ＡＴに支 配された転写の阻害は、エメル（Ｅｍｍｅｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８ ９）２４６，１６１７およびフラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ （１９９１）３５２，８０３によって報告されている。デュランら、Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． （１９８８）８，１７１５およびマティラ（Ｍａｔｔｉｌａ ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９０）９，４４２５は、ＮＦ−ＡＴ結合部位を記載 している。ζ鎖を記載している参考文献としては、オルロフ（Ｏｒｌｏｆｆ）ら 、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４７，１８９〜１９１；キニト（Ｋｉｎｅｔ）ら 、Ｃｅｌｌ（１９８９）５７，３５１〜３５４；ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，９７ ０９〜９７１３およびラニア（Ｌａｎｉｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４ ２，８０３〜８０５がある。ＣＤ４免疫粘着は、バーン（Ｂｙｒｎ）ら、Ｎａｔ ｕｒｅ （１９９０）３４４，６６７〜６７０によって記載されている。ＣＤ８− ζ融合タンパク質は、アービング（Ｉｒｖｉｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９２）６ ４，８９１によって記載されている。レトゥルナー（Ｌｅｔｏｕｒｎｅｒ）およ びクラウスナー（Ｋｌａｕｓｎｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５，７ ９も参照されたい。 プロモーター部分との転写因子結合並びに転写因子の個別の活性化およびＤＮ Ａ結合を記載している代表的な論文としては、キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ （１９８６）２３１，６９９；フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）およびソ ング（Ｓｏｎｇ）、同書（１９８９）３４０，２４５；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ ）、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１，９；レヴィン（Ｌｅｗｉｎ）、Ｃｅｌｌ（１９ ９０）６１，１１６１；プタシュン（Ｐｔａｓｈｎｅ）およびガン（Ｇａｎｎ） 、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６，３２９；アダムス（Ａｄａｍｓ）およびワ ークマン（Ｗｏｒｋｍａｎ）、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２，３０６がある。 小胞集中および融合を記載している代表的な論文としては、ソルナー（Ｓｏｌ ｌｎｅｒ）ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２，３１８〜３２４；並びにベネ ット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）およびシェラー（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ）（１９９３）Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，２５５９〜２５６３がある 。 調節的タンパク質分解を記載している代表的な論文としては、ホフストラッサ ー（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ）ら（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１，６９７；シェ フナー（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ），Ｍ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５，４９５； ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４，３６４〜 ３６８がある。 ＦＫ５０６および関連化合物に適切な合成技術および修飾に関する追加情報を 提供する代表的な刊行物としては、ＧＢ２２４４９９１Ａ号；ＥＰ０４５５４２ ７Ａ１号；ＷＯ９１／１７７５４号；ＥＰ０４６５４２６Ａ１号、ＵＳ５，０２ ３，２６３号およびＷＯ９２／００２７８号明細書がある。 しかしながら、この開示から明らかであるように、前述の著者はだれも、本発 明を記載していないし示唆してもいない。本発明は、以下に詳細に開示されるが 、生細胞中においてタンパク質ホモダイマー化、ヘテロダイマー化およびオリゴ マー化を用いるための一般的に利用可能な方法および材料に関する。キメラ応答 個体タンパク質は、特異的受容体ドメインとの融合タンパク質として細胞内で発 現される。受容体ドメインに対して結合する細胞透過性多価リガンド試薬による 細胞の処理は、キメラのダイマー化またはオリゴマー化をもたらす。他のキメラ 受容体を類推して（例えば、ワイス（Ｗｅｉｓｓ）、Ｃｅｌｌ（１９９３）７３ ，２０９を参照されたい）、キメラタンパク質は、所望の連続的結果、例えば、 連続的タンパク質−タンパク質相互作用による細胞内シグナルの伝達およびそれ による転写因子の特異的サブセットの活性化をオリゴマー化が引き起こすように 設計される。合成リガンドによるキメラタンパク質の細胞内架橋は、様々な細胞 性過程の基本的研究においておよび治療用または農業用に重要なタンパク質の合 成の調節において可能性がある。更に、リガンドに媒介されたオリゴマー化は、 現在、調節的遺伝子療法を可能にしている。そのような場合、それは、安全性、 発現レベルおよび遺伝子療法によって得られる全体の有効性の増加に対する新た なアプローチを提供する。発明の概要 本発明は、新規のキメラ（すなわち「融合」）タンパク質および該キメラタン パク質をオリゴマー化することができる小形有機分子を提供する。キメラタンパ ク質は、以下に詳細に記載のように、追加（「作用」）ドメインに融合した少な くとも１個のリガンド結合性（すなわち「受容体」）ドメインを含む。更に記載 のように、キメラタンパク質は、追加ドメインも同様に含むことができる。これ らのキメラタンパク質は、種々のドメインが異なる源に由来しているセンスでの 組換え体であり、天然においてそのままで一緒に見出されることはない（すなわ ち、異種である）。 遺伝子、すなわち、本明細書中において「遺伝子」または「ＤＮＡ」構築物と 称するＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡ分子は、新規のキメラタンパク質、および 場合により標的遺伝子をコードし、宿主細胞の遺伝子工学のために提供される。 更に、このような修飾された細胞を生産するおよび用いるための方法および組成 物が提供される。本発明の工学処理された細胞は、少なくとも一つのこのような キメラタンパク質または１個または複数のキメラタンパク質をコードしている第 一列の遺伝子構築物を含む。これら構築物は、例えば、特定のドメインまたは発 現制御配列をコードしている成分部分が天然において互いに直接結合して見出さ れることがない（すなわち、異種である）センスでの組換え体である。 本発明の一つのＤＮＡ構築物は、（ａ）少なくとも一つの受容体ドメイン（あ る選択されたリガンドに対して結合することができる）を、（ｂ）異種の追加（ 「作用」）タンパク質ドメインに対して融合して含むキメラタンパク質をコード している。重要なことに、リガンドは、２種類（またはそれ以上）の受容体ドメ インに対して、すなわち、このような受容体ドメインを含むキメラタンパク質に 対して、順にまたは同時に、好ましくは約１０^-6Ｍ未満、更に好ましくは約１０^-7 Ｍ未満、なお一層好ましくは約１０^-8Ｍ未満、そして若干の実施態様において 約１０^-9Ｍ未満のＫｄ値で結合することができる。リガンドは非タンパク質であ るのが好ましく、分子量は約５ｋＤａ未満である。そのようにオリゴマー化され たキメラタンパク質の受容体ドメインは、同じであってよいしまたは異なってよ い。キメラタンパク質は、リガンドに対する暴露によって、すなわち、互いのオ リゴマー化によって生物学的過程を開始することができる。コード化されたキメ ラタンパク質は、更に、キメラタンパク質を望ましい細胞区分に対して向けるこ とができる細胞内標的ドメインを含むことができる。該標的ドメインは、分泌リ ーダ配列、膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメイン、膜結合ドメインまたは 、例えば、小胞若しくは核と結合するようにタンパク質を支配する配列でありう る。 キメラタンパク質の作用ドメインは、１種類または複数のキメラタンパク質の オリゴマー化によって望ましい生物学的結果をもたらすことができる広範囲のタ ンパク質ドメインから選択することができる。例えば、作用ドメインは、リガン ドに対する暴露および引続きのオリゴマー化によって、検出可能な細胞内シグナ ル；Ｇａｌ４などのＤＮＡ結合タンパク質；またはＶＰ１６などの転写活性化ド メインを開始することができるＣＤ３ゼータサブユニットなどのタンパク質ドメ インを含むことができる。多数の他の例を本明細書中において提供する。検出可 能な細胞内シグナルの一つの例は、オリゴマー化に応答する転写制御要素（例え ば、エンハンサー／プロモーター要素等）の転写制御下の遺伝子の転写を活性化 するシグナルである。 以下に更に詳細に論及されるように、本発明の種々の実施態様において、キメ ラタンパク質は、ＦＫ５０６型リガンド、シクロスポリンＡ型リガンド、テトラ サイクリンまたはステロイドリガンドに対して結合することができる。このよう なリガンドは、キメラタンパク質と、同じであってよいしまたは異なってよい他 のキメラタンパク質分子とのオリゴマー化をもたらす。 場合により、細胞は、リガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化 によって引き起こされたシグナルに対して、すなわち、リガンドに対する暴露に 対して応答性の転写制御要素（例えば、プロモーター／エンハンサー）の転写制 御下の標的遺伝子を含む第二組換え遺伝子構築物または１種類若しくは複数のこ のような構築物の第二列を更に含む。これらの構築物は、標的遺伝子が本来は応 答性転写制御要素の転写制御下にないセンスでの組換え体である。 本発明の一つの態様において、ＤＮＡ構築物は、（ａ）上記のようなキメラタ ンパク質のオリゴマー化に応答性の転写制御要素および（ｂ）標的遺伝子との結 合において宿主細胞中への転写制御要素の相同的組換えを可能にする標的遺伝子 からのフランキングＤＮＡ配列を含む。もう一つの実施態様において、構築物は 、望ましい遺伝子座中への標的遺伝子の相同的組換えを可能にする標的遺伝子座 からの望ましい遺伝子およびフランキングＤＮＡ配列を含む。構築物は、更に、 応答性転写制御要素を含むことができるし、または応答性要素は遺伝子座によっ て提供されることができる。標的遺伝子は、表面膜タンパク質、分泌タンパク質 、細胞質タンパク質またはリボザイム若しくはアンチセンス配列をコードするこ とができる。 本発明の構築物は、更に、宿主細胞中への構築物のトランスフェクションおよ び構築物を有するトランスフェクタントの選択を可能にする選択可能なマーカー を含むことができる。本発明は、更に、宿主染色体中へのエピソームトランスフ ェクションのためであろうとまたは組込みのためであろうと、このような構築物 を含むＤＮＡベクターを包含する。ベクターは、例えば、アデノウイルス、アデ ノ関連性ウイルスまたはレトロウイルスのベクターを含むウイルスベクターであ ってよい。 本発明は、更に、本発明者のＤＮＡ構築物のいずれかによってコードされたキ メラタンパク質、並びに該ＤＮＡ構築物を含むおよび／または発現する細胞を包 含し、凍結されていようと活発に増殖中であろうと、培養中であろうとそれらを 含む完全な生物であろうと、様々な種および系統の原核細胞および真核細胞、特 に、酵母、蠕虫、昆虫、マウス若しくは他の齧歯類動物およびヒト細胞を含む他 の哺乳動物細胞を包含する。 例えば、一つの態様において、本発明は、好ましいが必ずしも哺乳動物ではな い細胞であって、（１）本発明のある選択されたオリゴマー化リガンドに対して 結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインおよび（ｉｉ）受容体ド メインに関しては異種であるが、１種類またはそれ以上の他の類似のドメインと のオリゴマー化によって、前記オリゴマー化に応答性の転写制御要素の転写制御 下の標的遺伝子の転写活性化を引き起こすことができるもう一つのタンパク質ド メインを含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物を含む上記細 胞を提供する。細胞は、更に、前記オリゴマー化リガンドに応答性の転写制御要 素の発現制御下の標的遺伝子を含む。選択されたリガンドに対する引続きの暴露 は標的遺伝子を発現する。 もう一つの態様において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインおよび第一の選択さ れたリガンド残基に対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメイ ンを含む第一キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物の第一セットを含 む細胞を提供する。細胞は、更に、転写活性化ドメインおよび第二の選択された リガンド（第一の選択されたリガンド残基と同じであってよいしまたは異なって よい）に対して結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第 二キメラタンパク質を含む。細胞は、更に、細胞が１個または複数の選択された リガンド残基を含む物質に対する暴露後に標的遺伝子を発現するように、ＤＮＡ 結合ドメインと結合し且つ転写活性化ドメインに対して応答性である異種転写制 御配列の転写制御下の標的遺伝子をコードしているＤＮＡ構築物を含む。 更に提供されるのは、オリゴマー化リガンドに対する暴露によって、すなわち 、キメラタンパク質のオリゴマー化によって生物学的過程を開始することができ る異種追加タンパク質ドメインに融合された、ある選択されたリガンドに対して 結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含むキメラタンパク質 をコードしている第一ＤＮＡ構築物；およびオリゴマー化リガンドに応答性の転 写制御要素の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二ＤＮＡ構築物を含む ＤＮＡ組成物である。 本発明のもう一つの典型的なＤＮＡ組成物は、第一および第二キメラタンパク 質をコードしているＤＮＡ構築物の第一列並びにキメラタンパク質分子のオリゴ マー化に応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二 ＤＮＡ構築物を含む。第一キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物は、 （ａ）ある選択された第一リガンド残基に対して結合することができる少なくと も一つの第一受容体ドメインを、（ｂ）オリゴマー化リガンドに対する暴露によ って、すなわち、第二キメラタンパク質分子に対する第一キメラタンパク質のオ リゴマー化によって生物学的過程を開始することができる異種追加タンパク質ド メインに対して融合して含む。第二キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構 築物は、（ｉ）ある選択された第二リガンド残基に対して結合することができる 少なくとも一つの第一受容体ドメインを、（ｉｉ）オリゴマー化リガンドに対す る暴露によって、すなわち、第一キメラタンパク質に対するオリゴマー化によっ て生物学的過程を開始することができる異種追加タンパク質ドメインに対して融 合して含む。このような場合の第一および第二受容体残基は同じであってよいし または異なっていてよいし、選択された第一および第二リガンド残基も同様に同 じであってよいしまたは異なっていてよい。 本発明者のリガンドは、それらのオリゴマーを生成するための本発明の２種類 またはそれ以上のキメラタンパク質分子に対して結合することができる分子であ り、式 リンカー−｛ｒｂｍ₁，ｒｂｍ₂，・・・ｒｂｍ_n｝ （式中、ｎは、２〜約５の整数であり、ｒｂｍ₍₁₎〜ｒｂｍ_(n)は、同じであって よいしまたは異なっていてよいし且つ１種類または複数のキメラタンパク質に対 して結合することができる受容体結合残基である） を有する。ｒｂｍ残基は、２個またはそれ以上のｒｂｍ残基に対して共有結合（ 「−」）することができる二官能性または多官能性分子であるリンカー残基に対 して共有結合している。好ましくは、リガンドは分子量が約５ｋＤａ未満であり 、タンパク質ではない。このようなリガンドの例としては、ｒｂｍ残基が同じで あるかまたは異なり且つＦＫ５０６型残基、シクロスポリン型残基、ステロイド またはテトラサイクリンを含むものがある。シクロスポリン型残基としては、シ クロスポリンおよび天然に存在するかまたは修飾された、好ましくはＫｄ値が約 １０^-6Ｍ未満の、シクロスポリンに対して結合することができるその誘導体があ る。若干の実施態様において、リガンドは、天然に存在する受容体に対して約１ ０^-6より大、更に好ましくは約１０^-5より大のＫｄ値で結合することか好ましい 。本発明の典型的なリガンドは、少なくとも一つのｒｂｍがＦＫ５０６、ＦＫ５ ２０、ラパマイシンまたはＣ９、Ｃ１０若しくは両方に修飾されたそれらのら誘 導体の分子を含むものであり、そのリガンドは、天然に存在する受容体タンパク 質に関するＫｄ値より少なくとも一桁、好ましくは２桁、更に好ましくは３桁、 なお一層好ましくは４桁若しくは５桁またはそれ以上少ないＫｄ値の修飾受容体 または修飾受容体ドメインを含むキメラ分子に対して結合する。リンカー残基は 以下に更に詳細に記載されるが、例示のために、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン残基、 Ｃ４〜Ｃ１８アザアルキレン残基、Ｃ６〜Ｃ２４Ｎ−アルキレンアザアルキレン 残基、Ｃ６〜Ｃ１８アリーレン残基、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレン残基または Ｃ８〜Ｃ３６ビスカルボキサミドアルキレン残基のような残基がある。 本発明のモノマーｒｂｍ、更には本発明者のキメラタンパク質に対して結合す ることができるが（個々のｒｂｍのモノマー性のために）それらのダイマー化ま たは高次オリゴマー化に影響を与えないｒｂｍの単コピーを含む化合物は、オリ ゴマー化アンタゴニストである。 一つの実施態様において、本発明の遺伝子工学処理された細胞は、所望のタン パク質の調節的生産に用いることができる。その実施態様において、リガンドに 誘導された調節下で望ましい遺伝子を発現するように本発明にしたがって工学処 理された細抱を、慣用的手段による培養で増殖させる。培地に対するリガンドの 添加は、所望の遺伝子の発現および所望の遺伝子タンパク質の生産をもたらす。 次に、遺伝子の発現およびタンパク質の生産を、以下に詳細に記載のように、培 地に対してオリゴマー化アンタゴニスト試薬を加えることによって止めることが できる。或いは、本発明を用いて、リガンド誘導可能細胞死特性を細胞中に工学 処理するのに用いることができる。次に、このような工学処理された細胞は、リ ガンドを培地に対して加えることによってそれらの目的（例えば、所望のタンパ ク質または池の生産物の生産）をかなえた後に、細胞培養から除去することがで きる。本発明の工学処理された細胞は、更に、インビボで用いて完全な生物、好 ましくはヒトを含む動物を、例えば、このような細胞を含む動物中で望ましいタ ンパク質または他の結果を細胞が生じるように修飾することができる。このよう な用途としては遺伝子療法がある。或いは、キメラタンパク質およびオリゴマー 化分子を細胞外で用いて、生理学的作用を開始するように協力して作用するタン パク質を集めることができる。 本発明は、したがって、オリゴマー化リガンドの添加に反応して細胞中の生物 学的作用を達成するための材料および方法を提供する。該方法は、本発明によっ て工学処理された細胞を提供することおよび該細胞をリガンドに対して暴露する ことを必要とする。 例えば、本発明の一つの実施態様は、細胞中の標的遺伝子の転写を活性化する ための方法である。該方法は、（ａ）本発明のキメラタンパク質をコードしてい る少なくとも一つのＤＮＡ構築物および（ｂ）標的遺伝子を含む且つ発現するこ とができる細胞を提供することを必要とする。キメラタンパク質は、ある選択さ れたオリゴマー化リガンドに対して結合することができる少なくとも一つの受容 体ドメインを含む。受容体ドメインは、オリゴマー化リガンドに対する暴露によ って、すなわち、作用ドメインの別のコピーを含む１種類またはそれ以上の他の キメラタンパク質とのオリゴマー化によって、細胞内シグナルを開始することが できる作用ドメインに対して融合される。そのシグナルは、遺伝子、例えばこの 場合、そのシグナルに応答性の転写制御要素の転写制御下にある標的遺伝子の転 写を活性化することができる。該方法は、したがって、標的遺伝子の発現を引き 起こすのに有効な量のキメラタンパク質に対して結合することができるオリゴマ ー化リガンドに対する細胞の暴露を必要とする。細胞が培養中で増殖している場 合、リガンドに対するそれらの暴露は、培地に対してリガンドを加えることによ って行なわれる。細胞が宿主生物中に存在している場合、リガンドに対するそれ らの暴露は、宿主生物に対してリガンドを投与することによって行なわれる。例 えば、宿主生物が動物、特に（ヒトを含む）哺乳動物である場合、リガンドは、 宿主動物に対して経口、頬、舌下、経皮、皮下、筋内、静脈内、関節内または吸 入投与によって、投与に適当なビヒクル中で投与される。 本発明は、更に、本発明の工学処理された細胞を包含する論題において、標的 遺伝子の転写を活性化するための、例えば、本発明のもう一つの生物学的結果を 達成するための、本発明のオリゴマー化リガンドを薬学的に許容しうる担体と一 緒に、場合により１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と一緒に含 む薬剤組成物を包含する。オリゴマー化リガンドは、他のところに詳細に記載の ホモオリゴマー化試薬またはヘテロオリゴマー化試薬でありうる。同様に、本発 明は、更に、問題の本発明の工学処理された細胞におけるキメラタンパク質のオ リゴマー化レベルを全体としてまたは一部分減少させるための、そしてそれによ って標的遺伝子の転写を脱活性化するための、例えば、本発明の別の生物学的結 果を停止させるための、本発明のオリゴマー化アンタゴニストを薬学的に許容し うる担体、場合により１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤と一緒 に含む薬剤組成物を包含する。したがって、薬剤組成物を製造するためのオリゴ マー化試薬およびオリゴマー化アンタゴニスト試薬の使用は、本発明によって包 含される。 本発明は、更に、本発明のオリゴマー化リガンドに応答性の宿主生物、好まし くは動物、多くの場合哺乳動物を提供する方法を提供する。該方法は、本発明に したがって工学処理された、すなわち、これについてのキメラタンパク質をコー ドしているＤＮＡ構築物等を含む細胞を生物中に導入することを必要とする。或 いは、本発明のＤＮＡ構築物を宿主生物、例えば、哺乳動物中に、１種類または それ以上の宿主哺乳動物細胞のトランスフェクションを可能にする条件下で導入 することができる。 本発明者は、更に、本発明のリガンドに応答性の細胞を生産するためのキット を提供する。一つのキットは、少なくとも一つの受容体ドメインおよび作用ドメ イン（他のところに記載されている）を含む本発明者のキメラタンパク質の一つ をコードしている少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含む。キットは、キットのＤ ＮＡ構築物によってコードされたキメラタンパク質分子をオリゴマー化すること ができる一定量の本発明のリガンドを含んでいてよいし、更に、モノマーリガン ド試薬などの一定量のオリゴマー化アンタゴニストを含んでいてよい。唯一のキ メラタンパク質が１種類または複数の構築物によってコードされている場合、オ リゴマー化リガンドはホモオリゴマー化リガンドである。２種類以上のこのよう なキメラタンパク質がコードされている場合、ヘテロオリゴマー化リガンドが含 まれていてよい。キットは、更に、遺伝子標的および／またはキメラタンパク質 分子のオリゴマー化に応答性の転写制御要素をコードしている「第二列」ＤＮＡ 構築物を含んでいてよい。ＤＮＡ構築物は、好ましくは、トランスフェクタント の好都合な選択のための１種類またはそれ以上の選択マーカー、更には原核生物 の複製、真核生物の発現等に有用な他の慣用的なベクター要素と結合している。 選択マーカーは、それそれ異なるＤＮＡ構築物に対して同じであってよいしまた は異なっていてよく、１種類または複数のこのようなＤＮＡ構築物それぞれを含 む細胞の選択を可能にする。 例えば、本発明の一つのキットは、転写活性化因子ドメインに対して融合した （ある選択されたリガンドに対して結合することができる）少なくとも一つの受 容体ドメインを含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；ＤＮ Ａ結合ドメインに対して融合した（ある選択されたリガンドに対して結合するこ とができる）少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二キメラタンパク質をコ ードしている第二ＤＮＡ構築物；並びにＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡ配 列であって、第一および第二キメラタンパク質の存在下でのリガンドに対する暴 露によって転写活性化される該ＤＮＡ配列を含む転写制御要素の制御下の標的遺 伝子をコードしている第三ＤＮＡ構築物を含む。 或いは、応答性転写制御要素の制御下の標的遺伝子を導入するためのＤＮＡ構 築物は、工学処理された細胞が、専門家によって与えられるべき遺伝子を誘発的 に発現するキットを提供するように標的遺伝子の代わりにクローニング部位を含 むことができる。 本発明の他のキットは、１種類またはそれ以上が作用ドメイン（転写開始シグ ナル発生因子、転写活性化因子、ＤＮＡ結合タンパク質等）の代わりにクローニ ング部位を含んでいるキメラタンパク質のための１種類または２種類（またはそ れ以上）のＤＮＡ構築物を含むことができ、どの作用ドメインでも／使用者が望 むものを挿入することを可能にする。このようなキットは、場合により、前記の ような他の要素、例えば、応答性発現制御下の標的遺伝子のためのＤＮＡ構築物 、オリゴマー化リガンド、アンタゴニスト等を含むことができる。 キットはいずれも、本発明の構築物によって安定して形質転換された陽性対照 細胞を含むことができ、それらは、リガンドに対する細胞の暴露に応答してリポ ーター遺伝子（ＣＡＴのためのβ−ガラクトシダーゼまたは任意の好都合に検出 可能な遺伝子産物）を発現する。リポーター遺伝子の発現を検出するおよび／ま たは定量するための試薬を更に提供することができる。図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＳＸＮｅｏ／ＩＬ２（ＩＬ２−ＳＸ）の略図である。Ｎ Ｆ−ＡＴ−ＳＸにおいて、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーターを有するＩＬ− ２−ＳＸからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡフラグメントは、基礎転写を 与える最小のＩＬ−２プロモーターおよび３個のタンデムＮＦＡＴ結合部位（以 下に記載される）を含む誘導要素によって置き換えられる。 図２は、細胞内シグナリングキメラプラスミドｐ＃ＭＸＦｎおよびｐ＃ＭＦｎ Ｚの製造のフローダイヤグラムであり、ｎは結合ドメインの数を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、細胞外シグナリングキメラプラスミドｐ＃１ＦＫ３／ｐ ＢＪ５の製造のフローダイヤグラムである。 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、本発明において用いられるプラスミドの構築にお いて用いられるプライマーの配列である。 図５は、受容体ＴＡＣ／ＣＤ３ζとリガンドとの反応に対する、異なるエンハ ンサー基を有するリポーター構築物の反応のチャートである。 図６は、実施例１に記載のＴＡｇジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞による各 種リガンドの活性のチャートである。 図７は、細胞外受容体１ＦＫ３（ＦＫＢＰｘ３／ＣＤ３ζ）によるリガンドＦ Ｋ１０１２Ａ（８、図９Ｂ）の活性のチャートである。 図８は、ミリストイル化ＣＤ３ζ／ＦＫＢＰ１２キメラによるシグナリングに よるＮＦＡＴリポーターの活性化のチャートである。 図９Ａおよび９Ｂは、アリル結合ＦＫ５０６変異型およびシクロヘキシル結合 ＦＫ５０６変異型それぞれの化学構造である。 図１０は、ＦＫ５２０の誘導体の合成のフローダイヤグラムである。 図１１ＡおよびＢは、ＦＫ５２０の誘導体の合成のフローダイヤグラムおよび ＦＫ５２０の化学構造であり、それらの下部構造は突然変異体ＦＫＢＰ１２に対 して結合するように設計される。 図１２は、推定上の切片における修飾ＦＫ５２０を有する突然変異体ＦＫＢＰ の図示である。 図１３は、ＦＫ５２０およびシクロスポリンのヘテロダイマーの合成のフロー ダイヤグラムである。 図１４は、受容体ドメインとしてイムノフィリン残基を有するキメラタンパク 質によって図示されるキメラタンパク質のオリゴマー化の略図である。 図１５は、キメラタンパク質のリガンドに媒介されたオリゴマー化を表わし、 転写開始シグナルの引き金を図式的に示す。 図１６は、ＦＫ−５０６型残基を基剤とするＨＥＤおよびＨＯＤ試薬について の合成スキームを表わす。 図１７は、ＣｓＡで開始する（ＣｓＡ）２の合成を表わす。 図１８は、融合ｃＤＮＡ構築物およびタンパク質ＭＺＦ３Ｅの概観である。 図１９は、ＦＫ１０１２存在下のＭＺＦ１ＥｈとＭＺＦ１Ｅｆとの共免疫沈降 を表わす（Ｅｈ：Ｆｌｕ−エピトープ−ｔａｇ、Ｅｆ：−フラグ−エピトープ− ｔａｇ）。 図２０は、細胞の低下した転写活性によって示されるような、ミリストイル化 Ｆａｓ−ＦＫＢＰ１２融合タンパク質（ＭＦＦ３Ｅ）によってトランスフェクト されたジュルカットＴ細胞系のＦＫ１０１２に誘導された細胞死を示す。 図２１Ａは、一時的トランスフェクション検定におけるシクロスポリン−Ｆａ ｓ（およびＦａｓ−シクロスポリン）融合構築物の分析である。ＭＣ３ＦＥはこ の系列において最も有効であることが分かった。 図２１Ｂは、イムノフィリン−Ｆａｓ抗原キメラ、および大型Ｔ抗原によって 安定して形質転換されたジュルカットＴ細胞における一時的発現実験結果を表わ す。Ｍｙｒ：残基１〜１４をコードしているｐｐ６０^c-srcから得られたミリス チル化配列（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９ ４（１９８９）：１５３６〜４４）；ＦＫＢＰ：ヒトＦＫＢＰ１２；Ｃｙ ｐＣ：残基３６〜２１２をコードしているネズミシクロフィリンＣ配列（フライ トマン（Ｆｒｅｉｄｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ ６６ ４（１９９１）：７９９〜８ ０６）：Ｆａｓ：残基１７９〜３１９をコードしているヒトＦａｓ抗原の細抱内 トメイン（オイム（Ｏｅｈｍ９ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７ １５（１ ９９２）：１０７０９〜１５）。細胞は、３個のタンデムＡＰ１プロモーターの 制御下の分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター遺伝子をコードしているプラ スミドを、６倍モル過剰のイムノフィリン融合構築物と一緒に用いてエレクトロ ポレーションが行なわれた。２４時間後、リポーター遺伝子の合成および（Ｃｓ Ａ）２を刺激するＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で細胞を刺激した。４８時間目に細 抱のリポーター遺伝子活性を評価した。抗ＨＡエピトープ抗体を用いて、ウェス タンブロットを２４時間目に行なった。 図２２は、実施例８からのＣＡＴ検定結果を表わす。 図２３は、修飾ＦＫ−５０６型化合物の合成を表わす。説明 Ｉ．総論 本発明は、キメラタンパク質、該キメラタンパク質をオリゴマー化するための 有機分子およびそれらを用いるシステムを提供する。融合タンパク質は、（好ま しくは小形の）有機オリゴマー化分子に対して結合するための結合ドメインおよ びキメラタンパク質のオリゴマー化の結果としての生理学的作用または細胞性過 程を果たすことができる作用ドメインを有する。 誘導タンパク質結合の基本的概念を図１４に図示する。ヘテロダイマー化（ま たはヘテロオリゴマー化、「ＨＥＤ」）およびホモダイマー化（またはホモオリ ゴマー化、「ＨＯＤ」）として機能しうるリガンドは、ダンベル形構造として表 わされている。 （ホモダイマー化およびホモオリゴマー化とは、本発明のリガンドのそばにあ るように結合された、ダイマーまたはオリゴマーを形成する類似成分の結合を意 味する。ヘテロダイマー化およびヘテロオリゴマーとは、ダイマーまたはオリゴ マーを形成する類似していない成分の結合を意味する。したがって、ホモオリゴ マーは、特定の成分の多重コピーの結合を含むが、ヘテロオリゴマーは、異なる 成分のコピーの結合を含む。接頭辞を伴ってまたは伴うことなく本明細書中で用 いられる「オリゴマー化」、「オリゴマー化する」および「オリゴマー」という 用語は、反対の明白な表示を欠いた「ダイマー化」、「ダイマー化する」および 「ダイマー」を包含する意味である） 図１４で更に表わされているのは、目的の標的タンパク質ドメイン（「作用ド メイン」）およびリガンドに対して結合しうる１個またはそれ以上の受容体ドメ インを含む融合タンパク質分子である。細胞内キメラタンパク質、すなわち、そ れらを生産する細胞中にあるタンパク質については、細胞標的配列（細胞小器官 標的アミノ酸配列を含む）も存在するのが好ましい。受容体ドメインに対するリ ガンドの結合は、融合タンパク質をヘテロ−またはホモダイマー化する。オリゴ マー化は、作用ドメインを互いに極めて接近させることによって、それぞれの作 用ドメインが通常関与している細胞性過程、例えば、ＴＣＲに媒介されたシグナ ル導入などを引き起こす。 オリゴマー化によって引き起こされうる細胞性過程としては、物理的状態など の状態変化、例えば、立体配座変化、結合パートナーの変化、細胞死、転写の開 始、チャンネル開口、Ｃａ⁺²などのイオン放出等または化学反応、例えば、アシ ル化、メチル化、加水分解、リン酸化若しくは脱リン酸化などの化学的状態の変 化、酸化還元状態の変化、転位等がある。したがって、リガンドに媒介されたオ リゴマー化によって引き起こされうるこのような過程はいずれも、本発明の範囲 内に包含される。 本発明の最初の応用として、オリゴマー化分子に応答性であるように細胞を修 飾する。修飾された細胞は、遺伝子療法において並びに誘導転写または翻訳（両 方とも用語表現に包含される）が望まれる他の用途において用いることができる 。細胞は、遺伝子構築物の少なくとも第一または第一列（該列は１種類の構築物 のみを含むことができる）、および望ましくは構築物の第二または第二列（該列 は１種類の構築物のみを含むことができる）を含むゲノムを特徴とする。 このような遺伝子構築物の性質および数は、キメラタンパク質の性質およびそ れが細胞中で果たす役割に依存する。例えば、キメラタンパク質が遺伝子の発現 に関係しているべきである（および細胞表面膜または細胞小器官、例えば、核若 しくは小胞に関係するようにキメラタンパク質を支配する細胞内標的配列または ドメインを含むことができる）実施態様においては、通常、少なくとも２列の構 築物、すなわち、リガンドに媒介されたオリゴマー化によって標的遺伝子発現を 支配するシグナルを開始する１種類または複数のキメラタンパク質をコードして いる第一列、および望ましくは、標的遺伝子および／またはそれについてのシグ ナルに応答性である発現制御要素を含む第二列が存在する。 ホモオリゴマー、通常ホモダイマーが関与している場合、第一列の単一構築物 のみが必要とされるが、ヘテロオリゴマーが関与している場合、２個またはそれ 以上、通常は３煙以下の構築物が関与しうる。第一列の構築物によってコードさ れているキメラタンパク質は、遺伝子転写の発動作用に関係し、そして通常、オ リゴマー化されたキメラタンパク質が直接的にまたは間接的に１種類またはそれ 以上の標的遺伝子の転写を開始することができる場合、表面膜または核に対して 向けられる。１種類または複数の外因性遺伝子が導入される場合、または外因性 若しくは組換え体発現制御配列が（例えば、相同的組換えによって）導入される 場合、どちらの場合にも、キメラタンパク質のオリゴマー化によって転写が活性 化される内因性遺伝子の発現のために追加の構築物の第二列が必要とされる。 キメラタンパク質が細胞内であり且つ別の遺伝子の転写の開始を伴うことなく 直接的に作用しうる場合、構築物の異なる第一列を用いる。例えば、オキソサイ トーシスに関係したタンパク質は、該タンパク質がオリゴマー化分子の存在下以 外は複合体でないのが普通である場合、誘導的または構成的に発現させることが できる。宿主細胞中で複合体を作らない；他のタンパク質との複合体形成によっ て阻害され、その阻害はリガンドとのオリゴマー化によって克服することができ ；宿主細胞中で利用できない過程による活性化を必要とするこれらの性質のいず れかまたは全てを有するタンパク質を用いることにより；または複合体形成およ び膜融合の程度がオリゴマー化分子存在で増大される場合に、小胞と原形質膜と の融合を支配してキメラタンパク質を生成するタンパク質を修飾することにより 、エキソサイトーシスは、オリゴマー化分子によって誘導されるべき能力である またはを有する。 他の細胞内タンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼおよび細胞周期調 節タンパク質は、同様に修飾することができるし且つ用いることができる。 本発明の遺伝子構築物の種々のクラスを以下のように記載する。 （１）リガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で （ホモオリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タン パク質と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）、１種類またはそれ以上の遺伝 子の転写活性化を引き起こす一連の結果を引き起こすシグナルを誘導するように 、結合ドメインが細胞外または細胞内であり且つ作用ドメインが細胞内である場 合、結合ドメインおよび作用ドメインを含むキメラタンパク質をコードする構築 物； （２）リガンドに媒介されたタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で（ホモ オリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タンパク質 と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）、１種類または複数のオリゴマーとＤ ＮＡ転写開始部分との複合体形成によって直接的に転写の開始を誘導するように 、結合ドメインおよび作用ドメインが核内にある場合、結合ドメインおよび作用 ドメインを有するキメラタンパク質をコードする構築物； （３）リガンドに媒介されたタンパク質のオリゴマー化が、それ自体で（ホモ オリゴマーを生成する）または異なる作用ドメインを含む異なる融合タンパク質 と一緒に（ヘテロオリゴマーを生成する）オキソサイトーシスを引き起こすよう に、結合ドメインおよび作用ドメインが細胞質である場合、結合ドメインおよび 作用ドメインを有するキメラタンパク質をコードする構築物；および （４）結合ドメインおよび作用ドメインが細胞外であり且つ作用ドメインが、 （非制限例として、作用ドメイン自体が物質、受容体または他の膜タンパク質に 対して結合して、リガンドに媒介されたキメラのオリゴマー化によって、１種類 またはそれ以上の類似のまたは類似していない分子または細胞の架橋を生じる） 生物学的活性の開始と関係している場合、結合ドメインおよび作用ドメインを有 するキメラタンパク質をコードする構築物；および （５）タンパク質と、異なる作用ドメインを含む標的タンパク質とのリガンド に媒介されたオリゴマー化が、前記オリゴマー化された標的タンパク質の脱安定 化および／または分解若しくは失活をもたらすように、結合ドメインおよび作用 ドメインを有する脱安定性、不活性または短命のキメラタンパク質をコードする 構築物。ＩＩ．転写調節 前記グループ（１）および（２）の１種類または複数の構築物を最初に考える 。グループ（１）構築物は、グループ（２）構築物と作用が異なる。グループ（ １）構築物は、幾分多面的であり、すなわち、多数の野生型遺伝子並びに１種類 または複数の標的遺伝子を活性化することができる。更に、リガンドに対するグ ループ（１）遺伝子の発現産物の応答は比較的遅い。グループ（２）構築物は、 特異的標的遺伝子を支配することができ且つ転写される遺伝子数を制限すること ができる。リガンドに対するグループ（２）構築物の発現産物の応答は極めて速 い。 グループ（１）および（２）のための問題のシステムとしては、キメラタンパ ク質をコードしているＤＮＡ配列を含む構築物の第一列があり、１〜３種類、通 常は１〜２種類の異なる構築物が関与しているのが一般的である。通常、該シス テムは、１種類またはそれ以上の遺伝子、通常は外因性遺伝子を発現させる構築 物の第二列を更に含む。「外因性遺伝子」とは、例えば、細胞の性質のために、 細胞の遺伝的欠陥のために、遺伝子が異種に由来するかまたは突然変異若しくは 合成遺伝子であるため或いはその同等の理由のために、他の状況では通常は細胞 によって発現されない遺伝子を意味する。このような遺伝子は、タンパク質、ア ンチセンス分子、リボザイム等をコードすることができるし、または発現制御配 列が通常通り結合していない内因性遺伝子に対して結合した若しくは結合される べき発現制御配列を含むＤＮＡ配列でありうる。例えば、前述のように、構築物 は、リガンドに誘導された内因性遺伝子の発現のための外因性または組換え体発 現制御配列を含むことができる。 グループ（１）、（２）および（３）の構築物によってコードされたキメラタ ンパク質は、しばしば好ましいように、キメラタンパク質を所望の区分、例えば 、所望の生理学的活性がリガンドに媒介されたキメラタンパク質のオリゴマー化 、少なくともダイマー化によって開始されることができる表面膜、核、小胞膜ま たは他の部位に対して向ける配列を含む細胞内標的ドメインを有することができ る。 キメラタンパク質は、少なくとも一つのリガンド分子を結合することができる 第二（「結合」または「受容体」）ドメインを含む。リガンドは２個以上の結合 部位またはエピトープを含むことができるので、それは本発明のキメラタンパク 質とダイマーまたは高次ホモ若しくはヘテロオリゴマーを生成することができる 。キメラタンパク質の結合ドメインは、１個または複数の結合部位を有すること ができるので、ホモオリゴマーは二価リガンドと生成されることができる。この 方法において、リガンドは、第二ドメインが結合しうる２個またはそれ以上のエ ピトープを有することによってキメラタンパク質をオリゴマー化し、それによっ てキメラタンパク質を高次オリゴマー化させることができる。 キメラタンパク質は、更に、リガンドに媒介されたキメラタンパク質分子のオ リゴマー化の際に結合ドメインによって生物学的活性を開始することができる第 三（「作用」）ドメインを含む。例えば、作用ドメインは、リガンドに媒介され たオリゴマー化の結果としてのシグナルの導入に関係していることがある。この ようなシグナルは、例えば、シグナル導入に関与した特定の中間体成分に応じて 、１種類またはそれ以上の遺伝子の転写開始を引き起こすことがある。細胞内標 的ドメインがミリスチン酸残基を含み；受容体ドメインが３個のＦＫＢＰ１２残 基を含み；そして作用ドメインがゼータサブユニットを含む典型的なキメラタン パク質を表わしている図１５を参照されたい。他のキメラタンパク質において、 作用ドメインは、オリゴマー化によって１種類またはそれ以上の標的遺伝子の転 写開始を引き起こす内因性および／または外因性の転写因子を含むことができる 。作用ドメインは、小胞膜と表面または他の膜との融合に関係しているタンパク 質またはそれらの部分、例えば、ＳＮＡＰおよびＳＮＡＲＥ群のタンパク質を含 むことができる（ソルナー（Ｓｏｌｌｎｅｒ）ら（１９９３）３６２，３１８お よび３５３；Ｃｅｌｌ（１９９３）７２，４３）。Ａ．表面膜受容体 本発明の一つの態様のキメラタンパク質は、表面膜に関与し且つ１種類または それ以上の遺伝子の転写をもたらすシグナルを導入することができる。その過程 は、１種類または複数の標的遺伝子と結合したプロモーター部分に対する転写因 子の結合が最高点に達する一連の相互作用において多数の補助タンパク質を必要 とする。転写因子が、他の遺伝子と結合したプロモーター部分に対して結合する 場合、転写はそこで同様に開始される。この実施態様のキメラタンパク質をコー ドしている構築物は、プロセッシングにされることがあり、したがって成熟キメ ラタンパク質中に存在していないかもしれないシグナル配列をコードすることが できる。キメラタンパク質は、いずれにせよ、（ａ）予め決定されたリガンドを 結合することができる結合ドメイン、（ｂ）細胞表面／膜に対して融合タンパク 質を輸送し且つ細胞表面膜に対して結合したタンパク質を保持するための貫膜ド メインまたは付着脂質を含む（多くの実施態様において好ましいが）任意の膜結 合ドメイン、および（ｃ）作用ドメインとしての細胞質シグナル開始ドメインを 含む。細抱質シグナル開始ドメインは、転写開始領域において開始されたシグナ ルのための認識配列を有する遺伝子の転写を引き起こすシグナルを開始すること ができる。 キメラタンパク質からのシグナルによって発現が調節される遺伝子を、それが 内因性または外因性（またはハイブリッド）発現制御配列の発現制御下の外因性 遺伝子であろうと内因性遺伝子であろうと、本明細書中において「標的」遺伝子 と称する。更に、膜に対して結合するキメラタンパク質の分子部分を「保持ドメ イン」と称する。適当な保持ドメインとしては、膜の脂質層に対して直接的に、 例えば、膜中の脂質関与または膜を介する延長等によって結合する残基がある。 このような場合、図１５に示されたように、タンパク質は膜、特に細胞膜に対し て輸送され且つ結合されるようになる。Ｂ．核転写因子 別の第一構築物は、タンパク質を核に対して輸送させる細胞標的配列を含むキ メラタンハク質をコードする。この（「シグナル共通」）配列は、二部分から成 る塩基性反復と称される多数の塩基性アミノ酸を有する（ガルシア・バストス（ Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｃａ Ａｃｔａ （１９９１）１０７１，８３〜１０１において論及された） 。この配列は、Ｎ−またはＣ末端の内部またはそれに近い分子のいずれかの部分 に現れることがあるし、そかも核の中にあるキメラタンパク質を生じる。本発明 の一つの実施態様の実施は、少なくとも２種類の（「第一列」）キメラタンパク 質、すなわち、（１）標的遺伝子と結合した転写開始領域のＤＮＡに対して結合 する作用ドメインを有するものおよび（２）第一キメラタンパク質 のＤＮＡ結合ドメインと一緒に、標的遺伝子の転写を開始することができる転写 活性化ドメインを作用ドメインとして含む異なるキメラタンパク質を必要とする 。２種類の作用ドメインまたは転写因子は、同じかまたは異なるタンパク質分子 に由来しうる。 転写因子は、細胞宿主に対して内因性または外因性でありうる。転写因子が外 因性であるが宿主中で機能性であり、しかも内因性ＲＮＡポリメラーゼと協同す ることができる（外因性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするよりもむしろ、そのた めに遺伝子を導入しうる）場合、融合された転写因子によって機能性の外因性プ ロモーター要素は、標的遺伝子の転写を調節するための第二構築物と一緒に与え られることができる。これによって、転写の開始は、外因性プロモーター領域と 結合した１種類または複数の遺伝子、すなわち、１種類または複数の標的遺伝子 に限定されることができる。 活性に対して２種類のサブユニットを必要とする多数の転写因子が知られてい る。或いは、単一転写因子が二つの別個の機能性ドメイン（例えば、転写活性化 ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン）に分割されることができる場合、それぞれ のドメインは、極めて接近して集められた場合以外はそれ自体不活性であるので 、転写活性が回復される。用いることができる転写因子としては、フィールズお よびソング、上記によって記載の二つのドメインに分割されることができる酵母 ＧＡＬ４がある。著者らは、ＧＡＬ４（１〜１４７）−ＳＮＦＩおよびＳＮＦ４ −ＧＡＬ４（７６８〜８８１）の融合を使用しており、そこにおいてＳＮＦ１お よび−４は、結合ドメインとしての問題の結合タンパク質によって置き換えるこ とができる。ＧＡＬ４およびＶＰ１６またはＨＮＦ−１の組合せを用いることが できる。他の転写因子は、Ｊｕｎ、ＦｏｓおよびＡＴＦ／ＤＲＥＢ系列、Ｏｃｔ １、Ｓｐ１、ＨＮＦ−３、ステロイド受容体超系列等のメンバーである。 ＤＮＡ結合ドメインおよび天然に存在する活性化ドメインまたはその修飾され た形の組合せを用いる代わりとして、活性化ドメインを、転写活性化ドメインと 、制限されないがＲＮＡポリメラーゼＩＩが挙げられるＲＮＡポリメラーゼとの 間の架橋によって結合した結合タンパク質の一つで置き換えることができる。こ れらのタンパク質としては、ＴＡＦと称するタンパク質、ＴＦＩＩタンパク質、 特にＢおよびＤまたは類似のものがある。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質と ＲＮＡポリメラーゼとの間の架橋に役立ち且つ転写を開始させる融合タンパク質 またはそれらの結合モチーフなどのタンパク質のいずれか１種類または組合せを 用いることができる。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼに最も近いタンパク質を ＤＮＡ結合ドメインと一緒に用いて転写を開始させる。所望ならば、問題の構築 物は、３種類またはそれ以上、通常約４種類以下のタンパク質を集めて、転写開 始複合体を提供することができる。 転写活性化ドメインを作用ドメインとして有するよりもむしろ、不活性化ドメ イン、例えば、ｓｓｎ−６／ＴＵＰ−１またはクリュッペル（Ｋｒｕｐｐｅｌ） 系列サプレッサードメインを用いることができる。この方法において、調節は、 構成的に発現される遺伝子の転写を停止させる。例えば、遺伝子療法の場合、成 長ホルモンなどのホルモン、血液タンパク質、免疫グロブリン等を構成的に発現 させることができる。リガンド結合ドメインに対して結合したＤＮＡ結合ドメイ ンを含む一つのキメラタンパク質およびリガンド結合ドメインに対して結合した 不活性化ドメインを含む別のキメラタンパク質をコードしている構築物を用いる ことにより、遺伝子の発現はリガンドに媒介されたオリゴマー化によって阻害さ れることがある。 特に、転写活性化ドメイン若しくはサブユニットに対して融合したリガンド結 合ドメイン、転写不活性化ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタン パク質をコードしている構築物は、他の構築物について記載されたのと同様に設 計され且つ組み立てられる。しばしば、転写因子のＮ末端は、リガンド結合ドメ インのＣ末端に対して結合されるが、いくつかの場合、例えば、単一転写因子の 二つの個々のドメインが二つの異なるキメラ間に分かれている場合、逆も真であ る。ＩＩＩ．エキソサイトーシス リガンドに媒介されたオリゴマー化機序のもう一つの用途は、転写よりもむし ろタンパク質の輸出がリガンドによって制御されているエキソサイトーシスであ る。これは、分泌シグナル配列によって目的の１種類または複数のタンパク質を 分泌させる代わりとして、目的の１種類またはそれ以上のタンパク質の発現と一 緒に用いることができる。この実施態様は、二つの異なる第一構築物を必要とす る。一方の構築物は、ソルナーら、上記によって記載の小胞膜中に組込まれるよ うにタンパク質を小胞に対して向けるキメラタンパク質をコードする。小胞結合 タンパク質として用いることができるタンパク質としては、別個にまたは組合せ でのＶＡＭＰ（シナプトブレビン（ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ））、ＳＮＣ２ 、ｒａｂ３、ＳＥＣ４、シナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）等が ある。細胞膜タンパク質としては、別個にまたは組合せでのシンタキシン（ｓｙ ｎｔａｘｉｎ）、ＳＳＯ１、ＳＳＯ２、ノイレキシン（ｎｅｕｒｅｘｉｎ）等が ある。他の構築物は、前記のように、表面膜に対する輸送を提供し且つミリスト イルシグナル配列、他の原形質膜標的配列（例えば、プレニル化のための）また は貫膜保持ドメインを用いる。コードされたタンパク質は上記参考文献に記載さ れており、全部または機能的部分が作用ドメインとして役立ちうる。これらの構 築物は、小胞に対する輸送についてまたは内因性タンパク質の輸出を促進するよ うにエンドサイトーシス内因性タンパク質について適切にコードされた外因性タ ンパク質の発現と一緒に用いることができると考えられる。 様々な機序をエキソサイトーシスに用いることができる。細胞種類および細胞 中のエンドサイトーシスに対して制限されているそのタンパク質に応じて、１種 類またはそれ以上の小胞に結合したタンパク質または細胞性タンパク質は、リガ ンドによって活性化される応答要素を有する１種類またはそれ以上の構築物によ ってコードされることができる。特に興味深いのは、ＶＡＭＰおよびシンタキシ ンの組合せである。或いは、エキソサイトーシスを制御する非制限タンパク質を 構成的に発現させることができるし且つエキソサイトーシス制限タンパク質のリ ガンドに調節された発現を与えることができる。最終的に、エキソサイトーシス に関係したキメラタンパク質を構成的に発現させることができるので、エキソサ イトーシスはキメラタンパク質とリガンドとをオリゴマー化することによって制 御される。適当な結合ドメインを用いることにより、小胞表面上でオリゴマー化 される種々のキメラタンパク質が、活性複合体および／またはリガンドを介する １種類または複数の小胞タンパク質と細胞膜表面タンパク質との結合を生成する ようにすることができる。キメラタンパク質は、欠失、突然変異等のようなエキ ソサイトーシスを制御するタンパク質間の結合親和性を実質的に減少させるリガ ンドの修飾のために、リガンド不存在下ではエキソサイトーシスを与えることが できない。これらの修飾は、個々のタンパク質の重複フラグメントを用い且つフ ラグメントが活性を保持していることを決定することによって容易に決定するこ とができる。フラグメントは、結合に実質的に影響を与える個々のアミノ酸を決 定するのにアラニン置換を用いることによって更に修飾することができる（ベー ンケ（Ｂｅｏｈｎｃｋｅ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０，３３ １〜３４１；エバボルド（Ｅｖａｖｏｌｄ）ら、同書（１９９２）１４８，３４ ７〜３５３）。 小胞のルーメン中に組み立てられたタンパク質並びにエキソサイトーシスに関 係した融合タンパク質は、前記のように、構成的にまたは誘導的に発現させるこ とができる。エキソサイトーシスの目的に応じて、内因性または外因性タンパク 質が関与しているかどうか、輸出されるタンパク質が構成的または誘導的に発現 されるかどうか、エキソサイトーシスに関係した融合タンパク質および輸出され るタンパク質の転写を開始するのに同一リガンドを用いることができるかどうか 、または異なるタンパク質が異なる誘導シグナルにしたがうべきであるかどうか が、発現が制御される方式を決定しうる。その他の態様において、少なくとも一 つのタンパク質およびエキソサイトーシス両方の発現がリガンド制御にしたがう ことがある。 種々のタンパク質は、タンパク質の生理学的活性を損なうことなくタンパク質 を小胞に対して輸送するための細胞標的配列の導入によって修飾されることがで きる。デリバリー機序としてエキソサイトーシスを用いることにより、比較的高 い用量を短時間で供給し、宿主の性質に応じて、小胞系においてタンパク質の高 局在化レベルまたは高濃度を生じることができる。興味深いタンパク質としては 、例えば、インスリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、エリ トロポエチン、コロニー刺激因子、成長因子、炎症性ペプチド、細胞遊走因子が ある。 タンパク質を小胞に向けるためのコーディング配列は、エキソサイトーシスに 関係した小胞結合タンパク質から入手可能である。例えば、ソルナーら、上記を 参照されたい。 オリゴマー化機序の別の用途は、タンパク質分解または不活性化の制御である 。例えば、本発明の比較的安定なすなわち長命のキメラタンパク質は、半減期が 比較的短いまたは他の状況では分解に対してオリゴマーを脱安定化させるかまた は集中させる本発明の異なるキメラタンパク質とのリガンドに媒介されたオリゴ マー化によって、分解に対して脱安定化するかまたは集中することができる。こ の実施態様において、リガンドに媒介されたオリゴマー化は、タンパク質に対し て短くされた半減期を輸送中に与えることによってその生物学的機能を調節する 。後者のキメラタンパク質は、リソソームに対してタンパク質を集中させるドメ インまたはタンパク質をサイトゾル若しくは核または非リソソーム細胞小器官に おけるタンパク質分解開裂に対して感受性にするドメインを含むことができる。 細胞中のタンパク質の半減期は、アミノ酸残基プロリン、グルタミン酸、セリ ンおよびトレオニンに富む前記タンパク質中の短アミノ酸配列の存在、従って「 ＰＥＳＴ」、同様の機能を有する他の配列、プロテアーゼ感受性開裂部位並びに ユビキチン化状態を含む多数の因子によって決定される。ユビキチン化は、タン パク質を分解に対して集中させる短ポリペプチド鎖の１個またはそれ以上の単位 ユビキチンによるタンパク質の修飾である。タンパク質のユビキチン化率は、処 理されるタンパク質のＮ末端アミノ酸およびアミノ末端付近の１個またはそれ以 上の独特のリシン残基の識別によって主に決定されると考えられる。ＩＶ．他の調節システム 個々のタンパク質に関係した特定の活性についてオリゴマー化によって制御す ることができる他の生物学的機能は、プロテインキナーゼ若しくはホスファター ゼ活性、レダクターゼ活性、シクロオキシゲナーゼ活性、プロテアーゼ活性また はサブユニット結合による任意の他の酵素反応である。更に、Ｇタンパク質と、 細胞周期に関係した受容体タンパク質、例えば、サイクリンおよびｃｄｃキナー ゼ、多単位解毒酵素との結合に備えることができる。Ｖ．構築物の成分 グループ（１）および（２）キメラタンパク質に結合した第二のすなわち追加 の構築物（標的遺伝子）は、転写および適当に翻訳によってタンパク質の発現お よび／または他の遺伝子の調節、例えば、アンチセンス、転写因子の発現、膜融 合タンパク質の発現等を引き起こすことができる目的の１種類または複数の配列 、通常はＲＮＡに対して転写される目的の少なくとも１種類の遺伝子を生じる活 性受容体または活性転写因子からのシグナル開始に対して応答性であるように、 指定された標的認識配列または応答性要素を有する転写開始領域を含む。 異なる目的および異なる部位に対して、異なる結合ドメインおよび異なる細胞 質ドメインを用いる。表面膜に結合したキメラタンパク質受容体に対して、リガ ンド結合ドメインが細胞外である場合、キメラタンパク質は、種々の表面膜タン パク質から選択された細胞外ドメインを含むように設計されることができる。同 様に、シグナルを導入することができる表面膜タンパク質の異なる細胞質または 細胞内ドメインを、内因性遺伝子が細胞質部分によって調節されることに応じて 用いることができる。キメラタンパク質が内在している、表面膜タンパク質に対 して内在している、または細胞小器官、例えば、核、小胞等に結合している場合 、リガンド結合ドメインタンパク質は、適当に、表面膜または他の膜を越えるこ とができる分子を結合することができるドメインに限定される。したがって、こ れらの結合ドメインは、概して、タンパク質または核酸を含まない小形の天然に 存在するかまたは合成のリガンド分子に対して結合する。Ａ．細胞質ドメイン グループ（１）のキメラタンパク質受容体は、細胞変異タンパク質を含む種々 の細胞表面膜受容体の一つからの細胞質ドメインを含むことができ、そこにおい て、細胞質ドメインに関係した転写の開始に関与した認識配列は知られているし またはこのような配列に対して応答性の遺伝子は知られている。目的の突然変異 受容体は、有害な副作用、例えば、脱調節細胞増殖またはサイトカインの不適当 な放出に関係することがある遺伝子の活性化から標的遺伝子の転写活性化を分離 する。特に興味深い受容体結合細胞質ドメインは、以下の特性を有する。すなわ ち、受容体活性化は、細胞宿主中の比較的少ない（望ましくは１００未満の）、 概して無害の遺伝子の転写の開始をもたらし；受容体活性化によって開始される 転写に必要な他の因子は細胞宿主中に存在し；標的遺伝子以外を活性化させる遺 伝子は、これらの細胞が用いられている目的に影響を与えないし；細胞質ドメイ ンのオリゴマー化または他の利用可能な機序はシグナル開始を引き起こし；そし て望ましいリガンド結合ドメインに対する細胞質ドメインの結合はシグナリング を妨げない。多数の異なる細胞質ドメインが知られている。これらドメインの多 くはチロシンキナーゼであるかまたはチロシンキナーゼと複合体を形成し、例え ば、ＣＤ３ζ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ等である。論及についてはカントリー（ Ｃａｎｔｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９１）６４，２８１を参照されたい。架橋 、例えば、ダイマー化によって活性化されるチロシンキナーゼ受容体（ヤーデン （Ｙａｒｄｅｎ）およびウーリッヒ（Ｕｌｒｉｃｈ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ． （１９８８）５７，４４３によって最初に提唱された命名法に基づ き、サブクラスＩ：ＥＧＦ−Ｒ、ＡＴＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ ３／ｃ−ｅｒｂＢ−３、Ｘｍｒｋ；サブクラスＩＩ：インスリン−Ｒ、ＩＧＦ− １Ｒ［インスリン様成長因子受容体］、ＩＲＲ；サブクラスＩＩＩ：ＰＤＧＦ− Ｒ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ−Ｂ、ＣＳＦ−１−Ｒ（Ｍ−ＣＳＦ／ｃ−Ｆｍｓ）、ｃ− ｋｉｔ、ＳＴＫ−１／Ｆｌｋ−２；およびサブクラスＩＶ：ＦＧＦ−Ｒ、ｆｌｇ ［酸性ＦＧＦ］、ｂｅｋ［塩基性ＦＧＦ］がある）；神経栄養チロシンキナーゼ ：Ｔｒｋ系列としては、ＮＧＦ−Ｒ、Ｒｏｒ１、２がある。架橋によってチロシ ンキナーゼと結合する受容体としては、ＣＤ３ζ系列：ＣＤ３ζおよびＣＤ３η （主としてＴ細胞中で見出され、Ｆｙｎと結合する）；Ｆｃ_εＲＩのβおよびγ 鎖（主としてマスト細胞および好塩基性細胞中で見出される）；Ｆｃ_γＲＩＩＩ ／ＣＤ１６のγ鎖（主としてマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細 胞中で見出される）；ＣＤ３γ、−δおよび−ε（主としてＴ細胞中で見出され る）；Ｉｇ−α／ＭＢ−１およびＩｇ−β／Ｂ２９（主としてＢ細胞中で見出さ れる）がある。多数のサイトカインおよび成長因子キナーゼは、チロシンキナー ゼおよび／または他のシグナリング分子と相互作用し且つ本発明のキメラタンパ ク質中で細胞質ドメインとして用いることができる共通のβサブユニットと結合 する。これらには、（１）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５受容体によっ て共有された共通のβサブユニット；（２）ＩＬ−６、白血病阻害因子（ＬＩＦ ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭおよびＩＬ−１１受容 体に結合したβ鎖ｇｐ１３０；（３）ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１３（お よびおそらくはＩＬ−９）の受容体にも結合したＩＬ−２受容体γサブユニット ；（４）Ｇ−ＣＳＦ受容体の細胞質ドメインに対して相同であるＩＬ−２受容体 のβ鎖がある。 インターフェロンα／βおよびγ（チロシンキナーゼのＪＡＫ、Ｙｙｒ系列の １種類またはそれ以上のメンバーを活性化しうる）を含む受容体のインターフェ ロン系列並びに成長ホルモン、エリトロポエチンおよびプロラクチン（ＪＡＫ２ を更に活性化しうる）の受容体は、更に、細胞質ドメイン源として用いることが できる。 他の細胞質ドメイン源としては、細胞表面受容体のＴＧＦ−β系列がある（キ ングスリー（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ），Ｄ．、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ １９９４ ８ １３３によって論及された）。受容体のこの系列は、 架橋によって活性化されると考えられるそれらの細胞質ドメイン中にセリン／ト レオニンキナーゼ活性を含む。 転写因子の活性化および不活性化に関係したチロシンキナーゼは、外因性遺伝 子の発現を開始するまたは阻害するように制御されうるし且つ用いられうる特定 の経路を提供する場合に特に興味深い。 下記の表は、多数の受容体および受容体に関係した特性並びに遺伝子を活性化 するそれらの核応答要素を提供する。表は完全ではないが、本発明において用い るための典型的なシステムを提供する。 多くの場合、突然変異細胞質ドメインは、導入されるシグナルが野生型とは異 なることがある場合に得られ、１種類または複数の野生型経路と比較して限定さ れたまたは異なる経路を生じる。例えば、ＥＧＦおよびＦＧＦなどの成長因子の 場合、突然変異は、シグナルが細胞増殖から切り離されているがなおｃ−ｆｏｓ によって維持されている場合に報告された（ピーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ （１９９２）３５８，６７８）。 チロシンキナーゼ受容体は、広範囲の全身にわたる細胞で見出しうる。対照的 に、ＣＤ３ζ−系列、Ｉｇ系列およびリンホカインβ鎖受容体系列は、主として 造血系細胞、特に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基性細胞、マクロファー ジ、好中球およびナチュラルキラー細胞で見られる。ＮＦ−ＡＴ転写に必要なシ グナルは、主として抗原受容体のゼータ（ζ）鎖に、そしてそれより少ないが、 ＣＤ３γ、δ、εに由来する。 細胞質ドメインは、それが天然に存在するようにまたはそれが切断され、修飾 され若しくは突然変異しうるように、少なくとも約１０アミノ酸、通常少なくと も約３０アミノ酸、更に通常は少なくとも約５０アミノ酸、そして一般的には約 ４００アミノ酸以下、通常約２００アミノ酸以下である。（ロメオ（Ｒｏｍｅｏ ）ら、Ｃｅｌｌ（１９９２）６８，８８９〜８９３を参照されたい。）いずれの 種も用いることができるが、通常、宿主細胞に対して内因性の種が好ましい。し かしながら、多くの場合、異なる種からの細胞質ドメインを有効に用いることが できる。上記に示した細胞質ドメインはいずれも、更には現在知られているまた は引続き発見されるかもしれない他のものも用いることができる。 大部分は、転写因子に結合した他のキメラタンパク質は、主として、キメラタ ンパク質を核膜の内側に向ける細胞標的配列を有することおよび転写因子または それらの作用ドメインとしての部分を有することが異なる。通常、転写因子作用 ドメインは、「ＤＮＡ結合ドメイン」および「活性化ドメイン」に分けることが できる。ＤＮＡ結合ドメインには１種類またはそれ以上のリガンド結合ドメイン および活性化ドメインには１種類またはそれ以上のリガンド結合ドメインを与え ることができる。この方法で、ＤＮＡ結合ドメインを、多数の結合ドメインおよ び／または活性化ドメインに対して結合させることができる。それ以外の場合、 シグナル導入のために表面膜と結合したキメラタンパク質についての議論は、ゲ ノムＤＮＡに対する直接結合のためのキメラタンパク質にあてはまる。同様に、 エキソサイトーシスに関係したキメラタンパク質は、主として、形質導入性細胞 質タンパク質の代わりに、小胞膜と表面膜との融合に関係したタンパク質に関し て異なる。Ｂ．細胞標的ドメイン シグナルペプチドまたは配列は、細胞表面膜に対してキメラタンパク質を輸送 し、そこにおいて同一のまたは他の配列は、細胞表面膜に対するキメラタンパク 質の結合をコードして入る。シグナル配列、２個または３個のＮ末端極性アミノ 酸、続いて約１５〜２０個の主として疎水性のアミノ酸についての一般的なモチ ーフは存在するが、個々のアミノ酸は広範囲に変化しうる。したがって、宿主中 で機能性であり且つキメラタンパク質の他のドメインの一つと結合していてよい しまたはしていなくてよいほとんど全てのシグナルペプチドを用いることができ る。通常、シグナルペプチドはプロセッシングされ、成熟キメラタンパク質中に 保持されない。シグナルペプチドをコードしている配列は、コーディング配列の ５′末端にあり、開始メチオニンコドンを含んでいる。 膜保持ドメインの選択は、このような膜保持ドメインが実質的に代替可能であ り、しかも活性化のための別の膜部分に対して結合するまたは接着するのに必要 な臨界的アミノ酸は存在しないことが分かったので、本発明に対して臨界的では ない。したがって、膜保持ドメインは、宿主細胞に対して内因性であろうとなか ろうと、任意の好都合な表面膜または細胞質タンパク質から単離することができ る。 少なくとも２種類の異なる膜保持ドメイン、すなわち、膜を越えて伸長するア ミノ酸配列である貫膜保持ドメイン；および脂質が細胞表面膜の脂質と結合して いる脂質膜保持ドメインが存在する。 大部分は、構築の容易さのために、融合タンパク質の構築を単純化する性質が ある細胞質ドメインまたは受容体ドメインの貫膜ドメインを用いることができる 。しかしながら、脂質膜保持ドメインのために、通常、プロセッシングシグナル は、膜に対するＮ末端結合のコーディング配列の５′末端におよびＣ末端結合の ３′末端近くに加えられる。脂質膜保持ドメインは、グリシンに結合した約１２ 〜２４個の炭素原子、具体的には１４個の炭素原子を有する脂質、更に具体的に はミリストイルを有する。脂質結合ドメインのシグナル配列はＮ末端配列であり 、しかも広範囲に変化することができ、通常、残基２にグリシンおよび残基７に リシンまたはアルギニンを有する（カプラン（Ｋａｐｌａｎ）ら、Ｍｏｌｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． （１９８８）８，２４３５）。脂質膜結合を与えるように翻 訳後プロセッシングを必要とするペプチド配列は、カル（Ｃａｒｒ）ら、ＰＮＡ Ｓ ＵＳＡ （１９８８）７９，６１２８；エイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）ら、ＦＥ ＢＳ Ｌｅｔｔ．（１９８２）１５０，３１４；ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓ ｏｎ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８３）８０，３１９；シュルツ（Ｓｃｈｕｌ ｚ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８４），１２３，２１３１；デルマン（Ｄｅｌ ｌｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４，３７４によって記載され；そ してＡｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７，６９において 論及されている。興味深いアミノ酸配列としては、配列Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ −Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒがある。種々のＤＮＡ配列を用いて、融合受 容体タンパク質中のこのような配列をコードすることができる。 概して、貫膜ドメインは、約１８〜３０アミノ酸、更に通常は約２０〜３０ア ミノ酸を有し、その中心部分は主として中性の無極性アミノ酸であり、ドメイン の末端は極性アミノ酸、しばしば荷電アミノ酸であり、概して、貫膜ドメインの 末端に約１〜２個の荷電した、主として塩基性アミノ酸、続いてらせん切断残基 、例えば、ｐｒｏ−またはｇｌｙ−を有する。Ｃ．リガンド結合ドメイン 本発明のキメラタンパク質のリガンド結合（「ダイマー化」）ドメインは、天 然または非天然リガンド、好ましくは非天然合成リガンドを用いて誘導を可能に する任意の好都合なドメインでありうる。結合ドメインは、構築物の性状および リガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内部または外部でありうる。受容体を 含む広範囲の結合タンパクが知られており、上記に示した細胞質部分と結合した 結合タンパク質がある。特に興味深いのは、そのためのリガンド（好ましくは小 形有機リガンド）が知られているまたは容易に製造されうる結合タンパク質であ る。これらの受容体またはリガンド結合ドメインとしては、ＦＫＢＰおよびシク ロフィリン受容体；ステロイド受容体；テトラサイクリン受容体；上記に示され た池の受容体；並びに類似のもの；更には抗体、特に、重鎖または軽鎖サブユニ ット、その突然変異配列、確率法、組合せ合成等によって得られたランダムアミ ノ酸配列から得ることができる「非天然」受容体がある。大部分は、受容体ドメ インは、天然ドメインとしてかまたはその切断された活性部分として少なくとも 約５０アミノ酸〜約３５０アミノ酸未満、通常２００アミノ酸未満である。好ま しくは、結合ドメインは、小形の（＜２５ｋＤａ、ウイルスベクター中での有効 なトランスフェクションを可能にする）、モノマー性（これはアビジン−ビオチ ン系を除外する）非免疫原であり、しかもダイマー化のための配置をとることが できる合成的に利用可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有するべきである。 受容体ドメインは、キメラタンパク質をコードしている構築物の設計および適 当なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外でありうる。疎水性リ ガンドについては、結合ドメインは膜の両側にありうるが、親水性リガンド、特 に、タンパク質リガンドについては、結合に利用可能である形のリガンドを内部 化するための輸送系が存在しなければ、通常、結合ドメインは細胞膜の外側にあ る。細胞内受容体については、構築物は、シグナルペプチドおよび受容体ドメイ ン配列の貫膜ドメイン５′若しくは３′または受容体ドメイン配列の脂質結合シ グナル配列５′を有するところまでコードすることができる。受容体ドメインが シグナルペプチドと貫膜ドメインとの間にある場合、受容体ドメインは細胞外で ある。 受容体をコードしている構築物の一部分は、様々な理由で突然変異を誘発させ ることができる。突然変異が誘発された部分は、より高い結合親和性を与えるこ とができるし、天然に存在する受容体および突然変異が誘発された受容体のリガ ンドによる識別を可能にすることができるし、受容体−リガンド対を設計する機 会を与えること等ができる。受容体の変化は、結合部位において組合せ技術を用 いるランダム突然変異誘発であることが知られているアミノ酸変化を伴うことが あり、その場合、結合部位と結合したアミノ酸または立体配座変化に関係した他 のアミノ酸のコドンは、既知の変化によってかまたはランダムに、特定のアミノ 酸の１種類または複数のコドンを変化させ、適当な原核細胞宿主において得られ たタンパク質を発現させた後、得られたタンパク質の結合をスクリーニングする ことによって突然変異を誘発することができる。この状態を代表するものは、Ｆ ＫＢＰ１２のＰｈｅ３６をＡｌａにおよび／またはＡｓｐ３７をＧｌｙまたはＡ ｌａに変更して、ＦＫ５０６またはＦＫ５２０の９位または１０位の置換基を調 節することである。特に、Ｔｙｒ２６、Ｐｈｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２お よびＰｈｅ９９の内の一つまたはそれ以上の代わりにＶａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、 Ｍｅｔまたは他の小形アミノ酸を含む突然変異体ＦＫＢＰ１２部分は、Ｃ９およ び／またはＣ１０に修飾を含むＦＫ５０６型およびＦＫ−５２０型の受容体ドメ インとして特に興味深い。 抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、具体的にはフラグメント、更に 具体的には可変部全部若しくは一部分または高親和性結合を生じる重鎖および軽 鎖の融合体は、結合ドメインとして用いることができる。抗体は、生理学的に許 容しうるハプテン分子および結合親和性についてスクリーニングされた個々の抗 体サブユニットに対して製造することができる。サブユニットをコードしている ｃＤＮＡを単離し、そして不変部の欠失、可変部の一部分、可変部の突然変異誘 発等によって修飾して、リガンドに対して適当な親和性を有する結合タンパク質 ドメインを得ることができる。この方法において、ほとんど全ての生理学的に許 容しうるハプテン化合物を、リガンドとしてまたはリガンドにエピトープを与え るように用いることができる。結合ドメインが知られており、しかも結合に有用 なリガンドが存在する場合、抗体単位の代わりに天然受容体を用いることができ る。 タンパク質をコードしている配列のインビトロ突然変異誘発または組合せ修飾 を用いる能力は、異なるリガンドの結合親和性についてスクリーニングされうる タンパク質のライブラリーの製造を可能にする。例えば、結合タンパク質をコー ドしているＤＮＡ配列中の１か所またはそれ以上の部位において１〜５種類、１ ０種類またはそれ以上のコドンの配列を全くランダムにし、発現構築物を製造し 且つ該発現構築物を単細胞微生物中に導入し、そしてライブラリーを生じさせる ことができる。次に、１種類または望ましくは多数のリガンドに対する結合親和 性についてライブラリーをスクリーニングすることができる。次に、それらが導 入される細胞と適合しうる最良の親和性配列を結合ドメインとして用いることが できる。リガンドは、内因性タンパク質に対するリガンドの結合レベルを決定す るのに用いられる宿主細胞によってスクリーニングされる。結合プロフィールは 、内因性タンパク質に対する結合親和性による突然変異が誘発された結合ドメイ ンに対する結合親和性比率の増加を明確にすると考えられる。次に、最良の結合 プロフィールを有するこれらのリガンドをリガンドとして用いうる。ファージ表 示技術は、非制限実施例と同様、前述の実施において用いることができる。Ｄ．マルチマー化 導入されたシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンドに媒介された オリゴマー化に起因する、すなわち、リガンド結合後のオリゴマー化の結果とし て得られるが、他の結合結果、例えば、アロステリック活性化は、シグナルを開 始するのに用いることができる。キメラタンパク質の構築物は、各種ドメインの 順序および個々のドメインの反復数に関して変化する。５′〜３′方向の転写に おける細胞外受容体ドメインについて、構築物は、シグナルペプチド、受容体ド メイン、貫膜ドメインおよび細胞内（細胞質）であるシグナル開始ドメインを含 むタンパク質をコードする。しかしながら、受容体ドメインが細胞内である場合 、違った順序を用いることができ、その場合、シグナルペブチドの後に受容体か またはシグナル開始ドメイン、続いて残りのドメインが続くことができ、或いは 、多数の受容体ドメインを含み、シグナル開始ドメインは受容体ドメインの間に 挟まれることができる。通常、シグナル開始ドメインの活性部位は、配列に対し て内部にあり、遊離カルボキシル末端を必要としない。ドメインはそれぞれマル チマー化されることができ、特に、受容体ドメインは、通常約５回反復以下、更 に通常は約３回反復以下である。 受容体をマルチマー化するために、キメラ表面膜タンパク質の受容体ドメイン のリガンドは、通常、それが少なくとも二つの結合部位を有し、その結合部位そ れぞれが受容体ドメインに対して結合することができるセンスでマルチマー化さ れる。望ましくは、問題のリガンドは、ダイマーまたは高次オリゴマー、通常は ほぼテトラマー以下の小形合成有機分子であり、典型的に、個々の分子は少なく とも約１５０Ｄ〜約５ｋＤ未満、通常は約３ｋＤ未満である。合成リガンドおよ び受容体の各種対を用いることができる。例えば、天然受容体を必要とする実施 態様において、ダイマーＦＫ５０６をＦＫＢＰ受容体と一緒に用いることができ 、ダイマー化されたシクロスポリンＡをシクロスポリン受容体と一緒に用いるこ とができ、ダイマー化されたエストロゲンをエストロゲン受容体と一緒に用いる ことができ、ダイマー化されたグルココルチコイドをグルココルチコイド受容体 と一緒に用いることができ、ダイマー化されたテトラサイクリンをテトラサイク リン受容体と一緒に用いることができ、ダイマー化されたビタミンＤをビタミン Ｄ受容体と一緒に用いること等ができる。或いは、トリマーなどの高次リガンド を用いることができる。非天然受容体、例えば、抗体サブユニット、修飾抗体サ ブユニットまたは修飾受容体等を必要とする実施態様において、種々様々な化合 物のいずれも用いることができる。これらのリガンドの重要な特徴は、それらが にダイマー化されうることである。 リガンドは、同一のまたは異なる結合ドメインを有するキメラタンパク質のヘ テロダイマー化またはヘテロオリゴマー化を媒介することができるので、それら は、異なるエピトープ（「ＨＥＤ」試薬とも称される）と一緒に異なる受容体結 合分子を有することができる。例えば、リガンドは、ＦＫ５０６またはＦＫ５０ ６型残基およびＣｓＡまたはシクロスポリン型残基を含んでいてよい。両方の残 基は、共通のリンカー残基に対して共有結合している。このようなリガンドは、 第一キメラタンパク質が、ＦＫ５０６型残基に対して結合することができるＦＫ ＢＰ１２などの受容体ドメインを含み且つ第二キメラタンパク質が、シクロスポ リンＡ型残基に対して結合することができるシクロフィリンなどの受容体ドメイ ンを含んでいる場合、第一および第二キメラタンパク質のオリゴマー化を媒介す るのに有用であると考えられる。ＶＩ．細胞 細胞は原核細胞であってよいが、好ましくは、植物、酵母、蠕虫、昆虫および 哺乳動物を含む真核細胞である。現在のところ、細胞は、哺乳動物細胞、具体的 には霊長類、更に具体的にはヒトであるが、目的の動物、具体的には家畜動物、 例えば、ウマ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、イヌ、ネコ等のいずれとも組合せること ができることが特に好ましい。これらの種の中からの各種細胞、例えば、造血系 、神経系、間葉、皮膚、粘膜、支質、筋、脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、 腎臓、胃腸、肺等が関与しうる。特に興味深いのは、リンパ系または骨髄単球系 統に関与しうる有核細胞を全て含む造血系細胞である。特に興味深いのは、Ｔ− およびＢ細胞系統、マクロファージおよび単球、筋芽細胞並びに繊維芽細胞のメ ンバーである。更に、特に興味深いのは、造血系、神経系、支質、筋、肝臓、肺 、胃腸等の幹細胞および前駆細胞である。 細胞は、オートロガス細胞、同系細胞、同種異系細胞および若干の場合として も異種細胞でありうる。細胞は、主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）プ ロフィールを変化させることによって、機能性クラスＩ ＭＨＣ分子の生成を妨 げるβ₂−ミクログロブリンを失活させ、クラスＩＩ分子の失活、１種類または それ以上のＭＨＣ分子を発現させ、細胞障害活性に関係した遺伝子の発現を促進 するまたは阻害することによって細胞障害能力を促進するまたは失活させること 等によって修飾することができる。 若干の場合、特異的クローンまたはオリゴクローン細胞が興味深いことがあり 、その場合、細胞は特定の特異性を有し、例えば、特定の抗原特異性またはホー ミング標的部位特異性を有するＴ細胞およびＢ細胞である。ＶＩＩ．リガンド 天然に存在する物質および合成物質両方を含む広範囲のリガンドを本発明にお いて用いて、キメラタンパク質分子のオリゴマー化を行なうことができる。リガ ンドを選択するための利用可能なおよび容易に観察可能なまたは測定可能な判定 基準は、（Ａ）リガンドが生理学的に許容しうる（すなわち、それが用いられる 細胞または動物に対して過度の毒性がない）、（Ｂ）それが適当な薬用量範囲を 有する、（Ｃ）望ましくは（遺伝子療法用途を含む全ての動物における用途に対 して）それを経口で与えることができる（胃腸系において安定であり且つ血管系 に吸収される）、（Ｄ）それが細胞膜および他の膜を必要に応じて通過しうる、 そして（Ｅ）所望の用途に適当な親和性によって受容体ドメインに対して結合す ることである。第一の望ましい判定基準は、化合物が、受容体によるその活性化 能力に対する以外は比較的生理学的に不活性であることである。天然受容体に対 して結合するリガンドが少なく且つ天然受容体に対して結合する全リガンドの比 率が低いほど、応答は優れているのが一般的である。特に、リガンドは、天然の タンパク質に対して強力な生物学的作用を持つべきではない。大部分は、リガン ドは非ペプチドであり且つ非核酸である。 問題の化合物は、大部分は、２個またはそれ以上の単位を有し、該単位は、同 じでありうるしまたは異なりうるし、中心の結合基によって互いに結合している ことができる。「単位」とは、受容体ドメインを結合することができる個々の残 基（例えば、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、シクロスポリンＡ、ステロイド等）であ る。通常、単位はそれぞれ、少なくともホモダイマーまたは高次オリゴマーにお ける同一反応性基によって結合基に結合している。 前記のように、小形の非タンパク質性有機分子であって、上気判定基準を満た し、しかも本発明によるリガンドを提供するように様々な部位でダイマー化する ことができる該小形有機分子に対して、種々の天然に存在する受容体が存在する 。これらの化合物の実質的な修飾は、結合能力が保持され且つ望ましい特異性を 有する限りにおいて許される。化合物の多くは大環式化合物、例えば、マクロラ イドである。適当な結合親和性は、適当に１０^-4未満、好ましくは１０^-6未満、 更に好ましくは約１０^-7未満のＫｄ値に反映されるが、１０^-9または１０^-10未 満の結合親和性は可能であり且つ若干の場合最も望ましい。 現在のところ好ましいリガンドは、ＦＫＢＰタンパク質および／またはシクロ フィリンタンパク質に対して結合することができる化合物のオリゴマー、通常は ダイマーを含む。このようなリガンドとしては、天然のまたは突然変異が誘発さ れた結合ドメインに対する結合能力を保持しているシクロスポリンＡ、ＦＫ５０ ６、ＦＫ５２０およびラパマイシン並びにそれらの誘導体のホモ−およびヘテロ マルチマー（通常、２〜４単位、更に通常は２〜３単位）を含む。このような化 合物の多数の誘導体はすでに知られており、本発明の実施において用いることが できる合成高親和性ＦＫＢＰリガンドがある。例えば、ホルト（Ｈｏｌｔ）ら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９９３ ，１１５，９９２５〜９９３５を参照さ れたい。ＦＫ５０６およびその類似体の結合にとって興味深い部位としては、約 １７〜２４個の環状炭素原子を包含する位置およびこのような環状原子に結合し た置換基位置、例えば、２１位（アリル）、２２位、３７位、３８位、３９位お よび４０位または３２位（シクロヘキシル）があるが、２１を除く同様の位置は ＦＫ５２０にとって興味深い。シクロスポリンにとって興味深い部位としては、 ＭｅＢｍｔ、３位および８位がある。 特に興味深いのは、特に、リガンドの天然に存在する受容体に関してその結合 特性を変化させるリガンドに対する修飾である。同時に、結合タンパク質を変化 させてリガンドの変化を調節することが考えられる。例えば、ＦＫ５０６の９位 または１０位の基を（ヴァン・デュイン（Ｖａｎ Ｄｕｙｎｅ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２，８３９）、それらの立体的必要条件を増加させるよう に、ヒドロキシルをより大きい立体的必要条件を有する基で置き換えることによ って、或いは１０位のカルボニルを修飾し、そのカルボニルをより大きい立体的 必要条件を有するかまたはカルボニルを機能化する、例えば、Ｎ置換シッフ塩基 若しくはイミンを生成する基で置き換えて、その位置の嵩を増加させることによ って修飾することができる。このような部位に好都合に導入されうる各種官能基 は、エーテルを生成するアルキル基、アシルアミド基、Ｎ−アルキル化アミン（ 但し、２−ヒドロキシエチルイミンも１，３−オキサゾリンを生成することがで きる）または類似のものである。概して、置換基は、通常、酸素、硫黄、窒素等 である１〜３個、通常は１〜２個のヘテロ原子を含む約１〜６個、通常１〜４個 、そして更に通常は１〜３個の炭素原子である。基本的構造を有する異なる誘導 体を用いることにより、結合のための異なるコンホメーションの必要条件を有す る異なるリガンドを生成することができる。受容体に突然変異を誘発させること によって、構造がほとんど違わない修飾されたリガンドに対して異なる親和性を 有する実質的に同様の配列を有する異なる受容体を得ることができる。 用いることができる他のリガンドはステロイドである。ステロイドはオリゴマ ー化することができるので、それらの自然の生物学的活性は、１種類またはそれ 以上のステロイド受容体ドメインを含むキメラタンパク質に関するそれらの結合 能力を損なうことなく実質的に減少する。非制限実施例により、グルココルチコ イドおよびエストロゲンをそのように用いることができる。各種薬剤も、該薬剤 が特定の受容体に対して高親和性で結合することが知られている場合に用いるこ とができる。これは、特に、受容体の結合ドメインが知られていて、それによっ て完全な天然受容体タンパク質よりもむしろ結合ドメインのみの本発明のキメラ タンパク質の使用が許されるような場合である。この目的には酵素および酵素阻 害剤を用いることができる。Ａ．リンカー カルボン酸誘導体を含むアミド基、エーテル、有機および無機エステルを含む エステル、アミノ等のような各種官能基は、結合に関与することができる。結合 させるためには、特定のモノマーを、酸化、ヒドロキシル化、置換、還元等によ って修飾して、カップリングのための部位を提供することができる。モノマーに 応じて、様々な部位をカップリングの部位として選択することができる。 マルチマーリガンドは、任意の好都合な手段によって合成することができ、そ の場合の結合基は、受容体に対するリガンドの結合部位の結合を妨げない部位で ある。生理学的活性のための活性部位および受容体ドメインに対するリガンドの 結合部位が異なる場合、通常、リガンドを失活させるように活性部位で結合する ことが望ましい。二つの分子（水素以外）間の鎖中に、通常、１〜３０原子、更 に通常は約１〜２０原子の各種結合基を用いることができ、その場合、該結合基 は主として炭素、水素、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る。結合基は、広範 囲の官能基、例えば、アミドおよびエステル、有機および無機両方のアミン、エ ーテル、チオエーテル、ジスルフィド、第四アンモニウム塩、ヒドラジン等を包 含しうる。鎖としては、脂肪族基、脂環式基、芳香族基または複素環式基がある 。鎖は、合成の容易さおよびマルチマーリガンドの安定性に基づいて選択される 。したがって、長期活性を維持することが望ましい場合、比較的不活性な鎖を用 いて、マルチマーリガンド結合が開裂されないようにする。或いは、血流中での 短い半減期のみが望ましい場合、容易に開裂される様々な基、例えば、エステル およびアミド、特にペプチドを用いることができ、その場合、循環性および／ま たは細胞内プロテアーゼが結合基を開裂することができる リガンド間の結合基として、様々な基、例えば、通常２〜２０個の炭素原子を 有するアルキレン、通常４〜１８個の炭素原子を有するアザアルキレン（但し、 窒素は通常二つの炭素原子間である）、通常６〜２４個の炭素原子を有するＮ− アルキレンアザアルキレン（上記を参照されたい）、通常６〜１８個の炭素原子 を有するアリーレン、通常８〜２４個の炭素原子を有するアルジアルキレン、約 ８〜３６個の炭素原子を有するビス−カルボキサミドアルキレン等を用いること ができる。典型的な基としては、デシレン、オクタデシレン、３−アザペンチレ ン、５−アザデシレン、Ｎ−ブチレン−５−アザノニレン、フェニレン、キシレ ン、ｐ−ジプロピレンベンゼン、ビス−ベンゾイル−１，８−ジアミノオクタン 等がある。前記のリンカー分子を含む多価または他の（以下を参照されたい）リ ガンド分子は、対応する受容体ドメインを有する本発明のキメラタンパク質によ って、下記の実施例に記載の材料および方法を用いて評価することができる。Ｂ．リガンド特性 細胞内結合ドメインに対して、リガンドは、生物活性の形で膜を越えて移動す るように選択される、すなわち、それは膜透過性である。各種リガンドは疎水性 であり、またはリポフィリン基による適当な修飾によってそのようにされること ができる。特に、結合橋は、約１２〜２４個の炭素原子を有する脂肪族側鎖を提 供することによってリガンドの親油性を増大させるのに役立つことができる。或 いは、望ましくは、エンドソーム形成を伴うことなく、膜を越える輸送を促進す る１個またはそれ以上の基を提供することができる。 例えば、２種類の異なる結合部位が受容体のダイマー化に用意されている若干 の場合、マルチマーリガンドを用いる必要はない。他の場合において、リガンド の結合は、受容体ドメインのコンホメーション変化を引き起こし、受容体の活性 化、例えば、オリゴマー化を引き起こすことができる。他の機序は、更に、細胞 質ドメインの活性化を引き起こすコンホメーションの変化と共に、単一受容体の 結合などのシグナルの誘導に対して機能することができる。Ｃ．リガンドアンタゴニスト モノマーリガンドは、マルチマーリガンドの作用を逆行させる、すなわち、オ リゴマーの形成または維持を阻害するまたは破壊するのに用いることができる。 したがって、細胞活性化作用を急速に終結させることが望ましい場合、モノマー リガンドを用いることができる。便宜上、親リガンド残基は、マルチマーと同様 の部位で、多官能性化合物の代わりに一官能性化合物を置換する以外は同様の方 法を用いて修飾することができる。ポリアミンの代わりに、特に、２〜２０個の 炭素原子（それらはそれより長いことがあるが）、通常２〜１２個の炭素原子を 有するモノアミン、例えば、エチルアミン、ヘキシルアミン、ベンジルアミン等 を用いることができる。或いは、一価の親化合物が過度の望ましくない生理学的 活性（例えば、免疫抑制、有糸分裂誘発、毒性等）を有していない場合、該親化 合物を用いることができる。Ｄ．代償性突然変異を含む突然変異受容体に対して結合することができる、「隆 起部分」を有する典型的なヘテロオリゴマー化（ＨＥＤ）およびホモオリゴマー 化（ＨＯＤ）試薬 前記で論及されたように、受容体の結合ポケット中の側鎖残基と立体的に衝突 する試薬上の置換基（「隆起部分（ｂｕｍｐｓ）」）の存在ゆえに、野生型受容 体（例えば、ＦＫＢＰ１２）に対してあまり結合できない修飾ＨＥＤ／ＨＯＤ試 薬を製造することができる。更に、干渉性残基に突然変異を含む（代償性突然変 異）対応する受容体を製造し、それによってリガンドを隆起部分と一緒に結合す る能力を得ることができる。「隆起付き（ｂｕｍｐｅｄ）」リガンド残基および 代償性突然変異を有する受容体ドメインの使用は、本試薬の特異性、例えば力価 を増大させるべきである。隆起付き試薬は、他の場合は天然リガンド残基を基剤 とするダイマーライザーに対して「緩衝剤」として作用しうる内因性野生型受容 体に対して結合すべきではない。更に、新規の受容体−リガンド対の生成は、ヘ テロダイマー化が必要とされる場合に用いられるＨＥＤ試薬を同時に生じるべき である。例えば、調節された小胞融合は、ＨＥＤ試薬を用いてシンタキシン（原 形質膜融合タンパク質）およびシナプトブレビン（小胞膜融合タンパク質）のヘ テロダイマー化を誘導することによって活性化することができる。これは、研究 手段を提供するのみならず、適当に修飾された分泌細胞を用いる糖尿病の遺伝子 療法の根拠として役立ちうると考えられる。 典型的な「隆起付きＦＫ１０１２」として、本発明者は、ＦＫ５０６のＣ１０ アセトアミドおよびホルムアミド誘導体を製造した。ＦＫ１０１２Ａ−Ｃおよび ＦＫ５０６Ｍの合成に関する更に詳細については、図１６Ａおよび本報告、スペ ンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、「合成リガンドによるシグナル導入の制御（Ｃｏ ｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓ ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｉｇａｎｄｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２ ５１３６（ １９９３）：１０１９〜１０２４を参照されたい。本発明者は、隆起付きＦＫ１ ０１２の２種類のクラス、すなわち、Ｃ１０に隆起部分を有する一つおよびＣ９ に有する一つを生成するように選択する。ＦＫ５０６のＣ１０アセトアミドおよ びホルムアミドのＲ−およびＳ−異性体は、図０５Ｂの配列反応にしたがって合 成された。これらの隆起付き誘導体は、ＦＫＢＰ１２に対するそれらの結合親和 性が少なくとも３桁減少した（図１６Ｂ）。親和性は、ＦＫＢＰ１２のロータマ ーゼ活性を阻害する誘導体の能力を測定することによって決定された。 Ｃ９隆起付き誘導体の第二クラスの典型的なメンバーは、既知の方法の適応に よって製造されたスピロ−エポキシド（図１６Ｃに表された）である。例えば、 フィシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５６ ８（１９９１）：２ ９００〜７およびエドムンズ（Ｅｄｍｕｎｄｓ）ら、Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ ３２ ４８（１９９１）：８１９〜８２０を参照されたい。Ｃ９誘導体の特に興味深い 系列は、それらのｓｐ３ハイブリッド形成を特徴とし、Ｃ９位の酸化状態を減少 させる。いくつかのこのような化合物は、図１６Ｃに示された反応にしたがって 合成された。 ヘテロダイマー〔および他のヘテロオリゴマー）は、少なくとも、ホモダイマ ー混入がそれらの成功した使用に悪影響を及ぼすことがある用途に対して、ホモ ダイマーとは異なるように構築される必要があるということは理解されるべきで ある。この問題を克服するように開発された一つの典型的な合成計画は、図１６ Ｄに概説されている。過剰のトリエチルアミン含有塩化メチレン中におけるモノ アロク保護１．６−ヘキサンジアミン（シュタール（Ｓｔａｈｌ）ら、Ｊ Ｏｒ ｇ Ｃｈｅｍ ４３ １１（１９７８）：２２８５〜６）とＦＫ５０６の誘導体 とのカッブリングは、アロク−アミン置換ＦＫ５０６を４４％収率で生成した。 この中間体は、現在、任意の活性ＦＫ５０６（または隆起付きＦＫ５０６）分子 とのカップリングにおいて用いることができる。ＴＨＦ中の適当な所のジメドン の存在下における触媒テトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウムによ る脱保護は、アミン保護基を除去する。活性ＦＫ５０６誘導体による迅速な処理 に続くデシル化は、ダイマー生成物をもたらす。この技法を用いて、例示された ＨＯＤおよびＨＥＤ試薬を合成した。Ｅ．典型的なシクロスポリン基剤試薬 シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、高親和性（６ｎＭ）によってその細胞内受容 体シクロスポリンである１８ｋＤａモノマータンパク質に対して結合する環状ウ ンデカペプチドである。得られた複合体は、ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６複合体と 同様、薬剤の免疫抑制性を引き起こすタンパク質ホスファターゼカルシニューリ ンに対して結合し且つそれを失活させる。本発明のもう一つの例証として、本発 明者は、ＣｓＡをそのＭｅＢｍｔ１側鎖によって６段階でおよび総収率３５％で ダイマー化して、（ＣｓＡ）２を生成した（図１７、工程１〜４はエバール（Ｅ ｂｅｒｌｅ）ら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５７ ９（１９９２）：２６８９〜９ １に報告されたように行なわれた）。ＦＫ１０１２と同様、ダイマー化のための 部位は、得られたダイマーがシクロフィリン２分子に対して結合しうるが、シク ロフィリン結合後のカルシニューリンに対して結合することができないように選 択された。本発明者は、（ＣｓＡ）２がシクロフィリンＡに対して１：２化学量 論によって結合することを実証した。したがって、（ＣｓＡ）２は、ＦＫ１０１ ２と同様、シグナリング経路を阻害しないし、したがって免疫抑制性でも毒性で もない。ＩＩＩ．標的遺伝子 Ａ．転写開始領域 第二構築物または第二系列の構築物は、キメラ受容体タンパク質のリガンドに 媒介されたオリゴマー化に対して、おそらくは、以下に論及されるように転写開 始シグナルの発生および導入によって応答する応答性要素を５′領域に有する。 したがって、少なくとも一つの転写開始システム、例えば、細胞質ドメインによ って直接的にか若しくは間接的に活性化されるまたは二つのドメインの結合によ って活性化されうる因子を知る必要がある。更に、得られた転写開始システムに 対して応答性である少なくとも一つのプロモーター領域を知る必要がある。その 転写制御下のプロモーター領域かまたは遺伝子を知る必要がある。言い換えると 、作用ドメインは、ある与えられたプロモーターまたは応答性要素によって転写 を開始する場合のその作用ドメインの役割に基づいて（「第一」系列構築物によ ってコードされた）キメラタンパク質のために選択されうる。例えば、上記項目 Ｖ（Ａ）「細胞質ドメイン」を参照されたい。 応答性要素が知られている場合、それを標的遺伝子構築物中に包含させて、（ エピソームによろうと染色体取込みによろうと）ゲノム中への組込み用の発現カ セットを提供することができる。細胞質ドメインを含むタンパク質に対する天然 リガンド結合の際に細胞質ドメインによって転写的に活性化される遺伝子が知ら れている限りにおいて、応答性要素の特定の配列が単離されている必要はない。 次に、相同的組換えは、内因性プロモーター領域の転写調節下にあるプロモータ ー領域から下流に目的の遺伝子を挿入するために用いることができる。特異的応 答性要素配列が知られている場合、それは、他の態様、例えば、転写、特定の転 写因子の結合等の速度に関して高いまたは低い活性を有することができる異なる 転写開始領域と一緒に用いることができる。 したがって、発現構築物は、転写方向のその５′末端に、応答性要素および通 常は治療用遺伝子である目的の標的遺伝子の誘導転写開始を可能にするプロモー ター配列を有する。転写終結領域はさほど重要ではないが、ｍＲＮＡの安定性を 低下させ、したがってタンパク質の作用期間を制限するのに役立つＡＵ配列を挿 入することによってｍＲＮＡの寿命を増加させるかまたは半減期を短くするのに 用いることができる。不可欠な転写終結および適当に翻訳終結を与えるいずれの 領域も用いることができる。 応答性要素は単一配列でありうるしまたは通常はオリゴマー化されて約５回反 復以下、通常約３回反復を有することができる。 更に、相同的組換えを用いて、プロモーターおよび／またはオリゴマー化結果 に応答性である応答性要素を含む内因性転写制御配列を除去するか若しくは失活 させる、および／またはこのような応答性転写制御配列を望ましい内因性遺伝子 上流に挿入することができる。Ｂ．生成物 目的のタンパク質または目的のアンチセンス配列または目的のリボザイムをコ ードする遺伝子を含む広範囲の遺伝子を必要的遺伝子として用いることができる 。標的遺伝子は、望ましい表現型を与える目的の配列のいずれでもありうる。標 的遺伝子は、表面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質を発現する ことができるし、または異なる種類の生成物を発現することができる多数の標的 遺伝子が存在しうる。標的遺伝子は、転写調節タンパク質を阻害することによっ て特定の経路を変調するかまたは特定の経路の阻害剤の翻訳を阻害することによ って該経路を作動させることができるアンチセンス配列であってよい。標的遺伝 子は、適切な転写調節剤の発現または特定の経路の阻害剤の発現をＲＮＡレベル で妨げることによって特定の経路を変調しうるリボザイムをコードすることがで きる。単独でまたは組合せで発現されるタンパク質は、ホーミング、細胞毒性、 増殖、免疫応答、炎症性応答、血餅の形成若しくは溶解、ホルモン調節等を伴う ことがある。発現されたタンパク質は、天然に存在する、天然に存在するタンパ ク質の突然変異体、独特の配列またはそれらの組合せであると考えられる。 遺伝子は、細胞によって分泌される全ての遺伝子でありうるので、コードされ た生成物は、宿主によって望まれるかまたは必要とされる場合はいつでも、意の ままに利用できるようになりうる。各種分泌生成物としては、ホルモン、例えば 、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、下垂体放出因子、ＡＣＴＨ、メ ラノトロピン、リラキシン等；成長因子、例えば、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ −α、−β、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、エリ トロポエチン、巨核球刺激および成長因子等；インターロイキン、例えば、ＩＬ −１〜−１３；ＴＮＦ−αおよび−β等：並びに酵素、例えば、組織プラスミノ ーゲン活性化因子、補体カスケードのメンバー、ペルフォリン、スーパーオキシ ドジスムターゼ、凝固因子、抗トロンビンＩＩＩ、因子ＶＩＩＩｃ、因子ＶＩＩ ＩｖＷ、α−抗トリプシン、プロテインＣ、プロテインＳ、エンドルフィン、ダ イノルフィン、骨形態形成タンパク質、ＣＦＴＲ等がある。 遺伝子は、天然の表面膜タンパク質であるかまたは適当なシグナルペプチドお よび貫膜配列を導入することによってそのように製造される任意の遺伝子であり うる。各種タンパク質としては、ホーミング受容体、例えば、Ｌ−セレクチン（ Ｍｅｌ−１４）、血液関連タンパク質、特に、クリングル構造を有する、例えば 、因子ＶＩＩＩｃ、因子ＶＩＩＩｖＷ、造血系細胞マーカー、例えば、ＣＤ３、 ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ細胞受容体、ＴＣＲサブユニットα、β、γ、δ、ＣＤ１０ 、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１等、受容体、例えば、イ ンターロイキン受容体ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ等、イオン、例えば、Ｈ⁺、Ｃａ^{+ 2} 、Ｋ⁺、Ｎａ⁺、Ｃｌ^-の流入または流出のためのチャンネルタンパク質等；Ｃ ＦＴＲ、チロシン活性化モチーフ、ζ活性化タンパク質等がある。 タンパク質は、エキソサイトーシスのための小胞に対する輸送のために修飾さ れうる。小胞に対して向けられるタンパク質からの配列を加えることにより、配 列が、一方の若しくはもう一方の末端近くが修飾されているかまたはタンパク質 源と同様の位置にある場合、修飾タンパク質は小胞中にパッケージングするため にゴルジ装置に対して向けられる。エキソサイトーシスのためのキメラタンパク 質の存在と関連したこの過程は、細胞外媒質および比較的高局在化濃度に対する タンパク質の迅速な輸送を可能にする。 更に、細胞内タンパク質、例えば、代謝経路中のタンパク質、調節タンパク質 ステロイド受容体、転写因子等は、特に、宿主細胞の性状に応じて興味深いこと がある。上記のタンパク質のいくつかは、細胞内タンパク質としても役立ちうる 。 以下に、種々の遺伝子をいくつか例示する。Ｔ細胞中に、Ｔ細胞受容体の一方 または両方の鎖をコードしている遺伝子を導入することを望むことができる。Ｂ 細胞については、分泌のための免疫グロブリンの重鎖およ軽鎖を提供することが できた。皮膚細胞、例えば、ケラチノサイト、特に幹細胞ケラチノサイトについ ては、α−、β−、γ−インターフェロン、抗走化性因子、細菌細胞壁タンパク 質に特異的なプロテアーゼ等を分泌させることによって感染防御を与えることが できた。 治療的価値がある遺伝子の発現を提供する他に、細胞を特定の部位に向けるこ とを望みうる多数の状況が存在する。部位としては、解剖学的部位、例えは、リ ンパ節、粘膜組織、皮膚、滑膜、肺若しくは他の内部器官または機能性部位、例 えば、血餅、損傷部位、外科手術部位、炎症、感染等を挙げることができる。宿 主標的部位において天然に存在するエピトープに対して結合させることによって 宿主細胞を特定の部位に向ける表面膜タンパク質を発現させることにより、分泌 生成物の局在化濃度を達成することができる。目的のタンパク質としては、ホー ミング受容体、例えば、Ｌ−セレクチン、ＧＭＰ１４０、ＣＬＡＭ−１等若しく はアドルッシン、例えば、ＥＬＡＭ−１、ＰＮＡｄ、ＬＮＡｄ等、血餅結合タン パク質、または走化性因子の局在化勾配に対して応答する細胞表面タンパク質が ある。治療用生成物の放出の価値が大である場合、細胞を特定の部位に向けるこ とを望む多数の状況が存在する。 多くの場合、修飾された細胞を死滅させることができることを望むことがあり 、その場合、処理を終結させることが望ましく、細胞が存在した後の細胞の不存 在が興味深い研究または他の結果において細胞は腫瘍性が適当である。この目的 に対して、結合ドメインに対して融合されたＦａｓ抗原またはＴＮＦ受容体を発 現させることができる。（ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｌｅ）−フクナガ（Ｆｕｋ ｕｎａｇａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６，３１４〜３１７）最初の修 飾において、このような構築物を構成的に発現させることができるので、修飾さ れた細胞はそれらの表面上かまたはそれらの細胞質中に存在するこのようなタン パク質を有する。或いは、同じかまたは異なるリガンドが発現を開始し且つアポ プトシスを開始することができる場合、発現を制御することができる。目的の標 的遺伝子の発現に関係した結合領域とは異なる結合領域に対して結合した細胞質 中のＦａｓ抗原またはＴＮＦ受容体の細胞質部分が与えられることにより、修飾 された細胞を制御された条件下で死滅させることができる。Ｃ．典型的な実証 例示として、癌患者または発作を起こしやすい患者を以下のように治療するこ とができる。本明細書中に記載のように修飾された細胞を患者に対して投与し且 つ長時間保持させた。典型的な細胞としては、プラズマ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞ま たは他の造血系細胞がある。細胞は、血餅に対して結合する、例えば、クリング ルドメイン構造を有するタンパク質または接着性相互作用性タンパク質、例えば 、ＣＤ４１を発現するように、および血餅溶解性タンパク質、例えば、組織プラ スミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ等を発現するように修飾された。 この方法において、リガンドに媒介されたオリゴマー化によって、細胞は血餅の 部分に蓄積し、高局在化濃度の血栓崩壊性タンパク質が得られた。 もう一つの実施例は再灌流損傷である。寿命が限られた細胞、例えば、マクロ ファージまたは多形核白血球（「好中球」）を用いることができた。細胞は、再 灌流損傷部位に対して細胞を向ける好中球ホーミング受容体を有していた。細胞 は、更に、一重項酸素を破壊し且つ組織に対するラジカル攻撃を阻害するスーパ ーオキシドジスムターゼを発現した。 第三の実施例は自己免疫疾患である。寿命が延長された細胞、例えば、Ｔ細胞 を用いることができた。構築物は、自己免疫損傷部位に対するホーミングのため のまたは損傷を引き起こした細胞に対する細胞障害性攻撃のための受容体を与え られた。次に、損傷を引き起こした細胞に対して治療を方向付けた。或いは、可 溶性受容体または他のペプチド若しくはタンパク質を分泌させ、そこで分泌生成 物は、損傷が生じた細胞の活性化を阻害しまたはアネルギーを誘導した。もう一 つ別の場合は、変性作用を減少させるのに役立ちうる抗炎症性生成物を分泌させ ることであった。 第四の実施例は、被包によってエンドルフィンを用いる慢性痛の治療を包含す る。ヒト繊維芽細胞系統を、キメラ転写調節タンパク質がヒトエンドルフィンの 転写を制御している構築物によってトランスフェクトする。ＤＮＡ構築物は、Ｔ ＡＴＡＡＡ部位および転写開始部位の上流のＨＮＦ−１転写因子ＧＴＴＡＡＧ ＴＴＡＡＣの結合部位の３コピーから成る。エンドルフィンｃＤＮＡを、開始部 位の下流並びにポリアデニル化および終結配列の上流に挿入した。場合により、 エンドルフィンｃＤＮＡに、タンパク質を不安定にさせる「ＰＥＳＴ」配列およ びそれを速やかに分解させるｍＲＮＡの３′非翻訳部分のＡＵＵＡ配列を供給す る。 繊維芽細胞は、更に、一方が、繊維芽細胞において機能性の調節開始および終 結領域の転写および翻訳制御下のトリマーＦＫＢＰ結合ドメインに対して結合し たアミノ酸１〜２５０からのＤＮＡ結合配列をちょうどコードするように切断さ れたＨＮＦ−１ ｃＤＮＡをコードすると考えられる二つの転写単位を有する構 築物によってトランスフェクトされる。構築物は、トリマーＦＫＢＰ′に対して 結合したＨＮＦ−４に由来する転写活性化ドメインの生産を支配する同様の調節 領域によって駆動される追加の転写単位を含むと考えられる。（プライムは、修 飾されたＦＫ５０６に対してｎＭ濃度で結合する変更されたＦＫＢＰを意味する 。修飾は、内因性ＦＫＢＰに対する結合を阻害する。） これらの遺伝学的に修飾された細胞は、免疫認識を阻害するように被包され且 つ患者の皮膚または他の好都合な内部部位下におかれた。患者が痛みに投薬を必 要とする場合、患者は、ダイマーリガンドＦＫ５０６−ＦＫ５０６′を与えられ 、約１μｇ〜１ｍｇが十分であった。この方法において、注射または嗜癖の危険 性を伴うことなく痛みを軽減することができた。 第五の実施例は骨粗しょう症の治療である。リンパ球はクローン発生させるこ とができるしまたは皮膚繊維芽細胞は治療される患者から培養で増殖させること ができる。細胞は前記のようにトランスフェクトされ、そこで、骨形態形成因子 ｃＤＮＡ遺伝子がエンドルフィン遺伝子に取って代わった。リンパ球に対しては 抗原特異的クローンが用いられ、それらはｓＩｇのイディオタイプに対する抗体 によるそれらの破壊を可能にした。更に、ｓＩｇの抗原の投与は、細胞集団を増 加させて、供給されうるタンパク質の量を増加させた。リンパ球クローンを注入 し、リガンドを、骨形態形成因子の生産に必要とされる程度に投与した。リガン ドに対する応答を監視することによって、投薬量を必要なレベルに調整するよう に、生産される骨形態形成因子の量を調整することができた。 第六の場合は、破壊される必要があるかもしれない細胞に関与する遺伝子療法 に関連した一般的な用途を有する。例えば、修飾された細胞は癌になることがあ るしまたは別の病的状態を引き起こすことがある。構築物は、必要な転写および 翻訳調節領域を有し且つオリゴマー化によって細胞死、例えば、アポプトシスを 引き起こすタンパク質をコードしている修飾された細胞中にトランスフェクトさ れた。例えば、ｆａｓ抗原またはＡｐｏ−１抗原は、大部分の細胞種においてア ポプトシスを誘導する（トラウス（Ｔｒａｕｔｈ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２４５，３０１〜３０５；ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂａ）−フクナガら（１ ９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，３１４）。この方法において、遺伝子療法また は他の目的に用いられる細胞中に保護構築物を同時トランスフェクトすることに より、細胞の一部分または全部の死を確実にする必要性がありうる場合、リガン ドによって細胞障害性が制御されるように、細胞を修飾することができる。 もう一つの状態は、抗原特異的Ｔ細胞を修飾することであり、そこでは、細胞 を活性化するようにタンパク質産物の発現を活性化することができる。Ｔ細胞受 容体は、腫瘍細胞、病原体、細胞性自己免疫等に対して向けられた。細胞を活性 化させることにより、例えば、ＩＬ−２などのインターロイキンにより、リガン ドに応答して修飾Ｔ細胞を増加させることができた。修飾Ｔ細胞の他の用途とし ては、細胞障害性、内皮細胞などの標的細胞の表面膜タンパク質のアップレギュ レーションまたは他の生物学的結果が望まれる特異的部位に対してＴ細胞を向け るためのホーミング受容体の発現があると考えられる。 或いは、標的部位に対して高用量の細胞障害因子を供給することが望ましいこ とがある。例えば、ホーミング受容体による腫瘍抗原の認識によって、腫瘍浸潤 性リンパ球（ＴＩＬ）は、障害濃度のＴＮＦまたは他の同様の生成物の供給を引 き起こすことができる。 別の場合は、エキソサイトーシスで輸送されるホルモンまたは因子を輸出する ことである。エキソサイトーシスを促進することによって、多量のホルモンまた は因子が輸出され；更に、細胞質中のホルモンまたは因子の量に基づくフィード バック機序が存在する場合、ホルモンまたは因子の増加した生産が起こる。或い は、ホルモンまたは因子の発現を誘導することができるので、発現および輸出は 付随的に誘導することができる。 更に、維持された体液、例えば、血管系、リンパ系、脳脊髄液等中のタンパク 質を提供することができる。宿主中において長い寿命を有することができる細胞 、例えば、造血系細胞、ケラチノサイト、筋細胞等、特に、幹細胞を修飾するこ とにより、それらのタンパク質を体液中において長時間維持することができる。 細胞は、分泌またはエンドサイトーシスを与える構築物によって修飾することが できる。分泌のための構築物は、輸送ドメイントとしてシグナルペプチド、続い て他のキメラタンパク質の場合と同様、結合ドメインおよび作用ドメインを有し ていた。作用ドメインは、同じかまたは異なるタンパク質に由来しうる。例えば 、組織プラスミノーゲン活性化因子については、一つの作用ドメインとして血餅 結合領域および別の作用ドメインとしてプラスミノーゲン活性部位を有していた 。或いは、一つの作用ドメインとしてＬＦＡ−１および第二作用ドメインとして セレクションなどの結合タンパク質を有することにより、ホーミングの阻止を促 進することができた。タンパク質のサブユニット、例えば、インテグリン、Ｔ細 胞受容体、ｓｌｇ等を修飾することにより、分子に対して互いに結合させること ができる可溶型の表面膜タンパク質が得られた。他の機会は、補体タンパク質、 血餅形成に関与する血小板膜タンパク質、細胞表面上の自己抗原および感染因子 表面上の病原性分子である。ＩＸ．細胞中への構築物の導入 通常、１個または複数の構築物を含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも 一つのマーカーが存在し且つ２個またはそれ以上のマーカーが存在しうる場合、 構築物は、１個またはそれ以上のＤＮＡ分子または構築物として導入することが できる。構築物は、慣用的な方法で製造することができ、その場合、遺伝子およ び調節領域を単離し、適当な場合連結し、適当なクローニング宿主中にクローン 化し、制限若しくは配列決定または他の好都合な手段によって分析することがで きる。特に、「プライマー修復」、連結反応、インビトロ突然変異誘発等を適切 に用いて１種類またはそれ以上の突然変異を導入することができる場合、ＰＣＲ を用いて、機能性単位の全部または一部分を含む個々のフラグメントを単離する ことができる。次に、いったん完成され且つ適当な配列を有することが実証され た１個または複数の構築物を、宿主細胞中に任意の好都合な手段によって導入す ることができる。構築物は、非複製欠陥ウイルスゲノム様アデノウイルス、アデ ノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）若しくは単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、またはレト ロウイルスベクターを含む、細胞中への感染若しくは形質導入のための他のもの に組込まれ且つ包括されることができる。構築物は、所望ならば、トランスフェ クションのためのウイルス配列を含むことができる。或いは、構築物は、融合、 エレクトロポレーション、バイオリスティクス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、トラ ンスフェクション、リポフェクションまたは類似のものによって導入することが できる。通常、宿主細胞を、１個または複数の構築物を導入する前に培養中で増 殖させ且つ増加させた後、１個または複数の構築物の導入および１個または複数 の構築物の組込みに適当な処理を行なう。次に、細胞を増加させ、そして構築物 中に存在するマーカーによってスクリーニングする。うまく用いることができる 各種マーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイ グロマイシン耐性等がある。 若干の場合において、構築物が特定の遺伝子座に組込まれることが望ましい場 合、相同的組換えのための標的部位があってよい。例えば、相同的組換えについ て当該技術分野において知られているような材料および方法を用いて、内因性遺 伝子をノックアウトし且つそれを、構築物によってコードされた遺伝子で（同じ 遺伝子座またはどこか他のところに）置き換えることができる。或いは、遺伝子 を提供する代わりに、内因性遺伝子の転写開始領域を修飾して、シグナル開始ド メインに対して応答性であるようにすることができる。このような実施態様にお いて、内因性遺伝子、例えば、ＥＰＯ、ｔＰＡ、ＳＯＤまたは類似のものの転写 は、リガンドの投与によって制御された。相同的組換えのためには、Ωかまたは Ｏ−ベクターを用いることができる。例えば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）および カペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１，５０３〜５１２； マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６，３４８〜 ３５２；およびジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３ ８，１５３〜１５６を参照されたい。 構築物は、遺伝子全部をコードしている単一ＤＮＡ分子としてまたは１種類若 しくはそれ以上の遺伝子を有する種々のＤＮＡ分子として導入することができる 。構築物は、同時にまたは連続して、それぞれ同じであるかまたは異なるマーカ ーと一緒に導入することができる。典型的な実施例において、一つの構築物は、 特異的応答性要素（例えば、ＮＦＡＴ）の制御下の治療用遺伝子を含み、受容体 融合タンパク質をコードしているもう一つは、リガンド受容体ドメイン（例えば 、ＭＺＦ３Ｅの場合と同様）に対して融合したシグナリング領域を含んでいた。 治療用生成物の供給効率を増加させるホーミング受容体または他の生成物をコー ドしている第三のＤＮＡ構築物も更に導入することができる。 ＤＮＡ構築物源を製造するのにおよびトランスフェクションを行なうために用 いることができる有用な要素、例えば、細菌または酵母の複製起点、選択可能な および／または増幅可能なマーカー、原核生物または真核生物における発現のた めのプロモーター／エンハンサー要素等を有するベクターは当該技術分野におい て周知であり、多くは商業的に入手可能である。Ｘ．細胞およびリガンドの投与 次に、ＤＮＡ構築物によって修飾された細胞を、選択的条件下の培養で増殖さ せた後、構築物を有するように選択される細胞を増加させ、そして更に、例えば 、宿主細胞中の構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて分 析することができる。修飾された宿主細胞がいったん識別されたら、引続き、そ れらを計画されたように、例えば、培養中で増殖させるかまたは宿主生物中に導 入するように用いることができる。 細胞の性状に応じて、広範囲の方法で細胞を宿主生物、例えば、哺乳動物中に 導入することができる。造血系細胞は、血管系中に注射によって投与することが でき、通常、少なくとも約１０⁴個〜概して約１０¹⁰個以下、更に通常は約１０⁸ 個以下の細胞が存在する。用いることができる細胞数は、多数の環境、導入の目 的、細胞の寿命、用いられるプロトコル、例えば、投与回数、細胞の増殖能力、 治療薬の安定性、治療薬に対する生理学的要求等に依る。或いは、移植片として 用いることができる皮膚細胞についての細胞数は、熱傷または他の損傷に対して 適用される層の寸法によると考えられる。概して、筋芽細胞または繊維芽細胞に ついての細胞数は、少なくとも約１０⁴個〜約１０⁸個以下であり、そして分散剤 として適用することができ、一般的には目的の部位またはその付近に注射される 。細胞は、通常、生理学的に許容しうる媒質中にある。 細胞のエクスビボ修飾の代わりに、多くの場合、細胞をインビボで修飾したい ことがある。この目的で、標的組織および細胞のインビボでの修飾のための種々 の技法が開発されてきた。宿主中へのウイルスのトランスフェクションおよびラ ンダム組込みを可能にするアデノウイルスおよびレトロウイルスなどの多数のウ イルスベクターが開発されてきた。例えば、ダベンスキー（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ） ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，７５２ ９〜７５３３；カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３ ，３７５〜３７８；ハイバート（Ｈｉｅｂｅｒｔ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，３５９４〜３５９８；ハツォグル（ Ｈａｔｚｏｇｌｕ）ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１７２８ ５〜１７２９３およびフェリー（Ｆｅｒｒｙ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８３７７〜８３８１を参照されたい。ベ クターは、脈管内若しくは筋肉内などの注射、吸入または他の非経口方式によっ て投与することができる。 インビボ遺伝子修飾にしたがって、修飾の方法は、組織の性状、必要な細胞修 飾の効率、特定の細胞を修飾する機会の回数、導入されるＤＮＡ組成物に対する 組織の接近容易性等に依る。標的転写開始領域を有する弱毒化または修飾された レトロウイルスを用いることにより、所望ならば、問題の転写因子構築物の一つ を用いて、ウイルスが生産され且つ隣接する細胞をトランスフェクトするように ウイルスを活性化させることができる。 ＤＮＡ導入は、いずれの場合にも組込みを生じる必要がない。若干の場合、導 入されたＤＮＡの一時的維持は十分でありうる。この方法において、細胞を宿主 中に導入した後、予め決定された時間後、例えば、細胞が特定部位にホーミング することができた後に作動させることができた場合、短期効果が得られた。 次に、細胞質ドメインを活性化させるリガンドを所望のように投与することが できる。リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与方法、半減期、存 在する細胞数、各種プロトコルを用いることができる。リガンドは非経口かまた は経口によって投与することができる。投与回数は前記の因子に依る。リガンド は、経口によって丸剤、散剤若しくは分散剤として；口腔によって；舌下によっ て；脈管内、腹腔内、皮下注射によって；吸入または類似のものによって摂取す ることができる。リガンド（およびモノマー化合物）は、各種投与経路のために 、当該技術分野において周知の慣用的な方法および材料を用いて配合することが できる。正確な投与量および具体的な投与方法は、上記因子に依るし且つ担当医 師またはヒト若しくは動物の医療提供者によって決定される。大部分は、投与方 法は経験的に決定される。 リガンドによる活性化が逆行する場合、モノマー化合物を投与してよいしまた はリガンドと競合しうる他の単一結合部位化合物であってよい。したがって、逆 反応の場合すなわち治療効果を終結させる要求において、速やかな逆転が望まれ るならば、モノマー結合化合物を何等かの好都合な方法で、特に脈管内に投与す ることができる。或いは、ＤＮＡ結合ドメインと一緒に不活性化ドメインを存在 させることができるし、または構成的に発現された構築物として存在するＦａｓ またはＴＮＦ受容体を有することによってアポプトシスを与えることができる。 任意の用途に対する具体的なリガンド用量は、治療薬物モニタリングに用いら れる手順にしたがって決定することができ、そこでは、特定の発現レベルの維持 が長期間にわたって、例えば、約２週間を越えて望まれるかまたは個々の若しく は反復用量のリガンドを用いる反復治療が、例えば、２週間若しくはそれ以上の 長期間隔を伴って短期間にわたって存在する。予め決定された範囲内のリガンド 用量を与え、そして時間−発現レベル関係を得るようにその応答を監視し、更に は治療応答も観察した。時間中に観察されたレベルおよび治療応答に応じて、応 答後の次回により多いまたはより少ない用量を与えることができた。この方法を 、治療的範囲内の用量が得られるまで何度も繰り返した。リガンドを長期にわた って投与して、リガンドの維持量がいったん決定されたら、次に、細胞系が適当 な応答およびレベルの発現生物を与えていることを確実にするために長期間隔で 検定を行なうことができた。 該系が、多数の変数、例えば、リガンドに対する細胞応答、発現効率および適 当なところでは、分泌レベル、発現生成物の活性、患者の特別な要求（これらは 時間および環境によって変化しうる）、細胞の損失または個々の細胞の発現活性 の損失の結果としての細胞活性の減損速度によって左右されることは理解される べきである。したがって、集団全体に投与されうる万能細胞がたとえ存在したと しても、個々の患者それぞれについて、それぞれの患者の個々に適当な用量を監 視することが考えられる。 問題の方法論および組成物は、広範囲の症状および適応症の治療に用いること ができる。例えば、Ｂ−およびＴ細胞は、癌、感染症、代謝欠損症、心臓血管病 、遺伝性凝固欠損症、自己免疫疾患、関節変形症、例えば、関節炎、肺病、腎臓 病、内分泌異常等の治療において用いることができる。繊維芽細胞および筋芽細 胞などの構造に関係した各種細胞は、遺伝的欠損症、例えば、結合組織欠損症、 関節炎、肝臓病等の治療において用いることができる。肝細胞は、多量のタンパ ク質が、欠損を補足するようにまたは肝若しくは門脈循環に対して治療生成物を 供給するように製造される必要がある場合に用いることができる。 以下の実施例を例示として与えるが、制限としてではない。実施例 細胞の形質転換および評価 実施例１：Ｔ細胞受容体のＣＤ３鎖を架橋することによる単離されたＩＬ−２エ ンハンサー結合転写因子の誘導 。 ヒトＩＬ−２プロモーター（−３２５〜＋４７；ＭＣＢ（８６）６，３０４２ ）の制御下の胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＸ Ｎｅｏ／ＩＬ−２（ＩＬ２−ＳＸ）（図１）、およびリポーター遺伝子が、種々 のプロモーター要素（すなわち、ＮＦＡＴ、ＮＫ Ｂ、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１およ びＡＰ１それぞれ）を含む合成オリゴマーと組み合わされた最小限のＩＬ−２プ ロモーター（−３２５〜−２９４および−７２〜＋４７）の転写制御下である関 連プラスミド変異型（すなわち、ＮＦＡＴ−ＳＸ、ＮＦ Ｂ−ＳＸ、ＯＡＰ／Ｏ ｃｔ１−ＳＸおよびＡＰ−１−ＳＸ）は、（１）ＳｓｐＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ によって切断されたｐＰＬ／ＳＥＡＰ（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ （１９８８）６６，１）；（２）ＮｄｅＩによって切断され、クレノウでブラン トにされた後、ＰｖｕＩによって切断されたｐＳＶ２／Ｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． （１９８２）１，３３２）；および（３）ＰｖｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによっ て切断された各種プロモーター含有プラスミド（すなわち、ＮＦＡＴ−ＣＤ８、 Ｂ−ＣＤ８、ｃｘ１２ｌａｃＺ−Ｏｃｔ−１、ＡＰＩ−ＬＵＣＩＦ３Ｈまたはｃ ｘ１５ＩＬ２）（以下に記載された）の３部分連結反応によって製造された。Ｎ ＦＡＴ−ＣＤ８は、ヒトＩＬ−２エンハンサーからのＮＦＡＴ−結合部位（−２ ８６〜２５７；Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．（１９９０）４，１８２３）の３ コピーを含み且つｃｘ１２ｌａｃＺ−Ｏｃｔは、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１／（ＡＲＲ Ｅ−１）結合部位（ＭＣＢ，（１９８８）８，１７１５）の４コピーを含み；Ｂ −ＣＤ８は、ネズミ軽鎖（ＥＭＢＯ（１９９０）９，４４２５）からのＮＦ Ｂ 結合部位結合部位の３コピーを含み、そしてＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈは、メタロ チオネンプロモーターからのＡＰ−１部位（５′−ＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣ−３ ′）の５コピーを含む。 それぞれのトランスフェクションにおいて、キメラ受容体ＴＡＣ／ＴＡＣ／Ｚ （ＴＴＺ）（ＰＮＡＳ ８８，８９０５〜８９０９）をコードしている発現ベク ターｐＣＤＬ−ＳＲ（ＭＣＢ ８，４６６〜７２）（Ｔａｃ−ＩＬ２受容体鎖） ５μｇを、ＴＡｇジュルカット細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原によって安定してト ランスフェクトされたヒトＴ細胞白血病系ジュルカットの誘導体（ノースラプ（ Ｎｏｒｔｈｒｕｐ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［１９９３］）中において種 々の分泌アルカリ性ホスファターゼ基剤リポータープラスミド（図１のｐＳＸＮ ｅｏ／ＩＬ２の地図を参照されたい）と一緒に同時トランスフェクさせた。各リ ポータープラスミドは、リポーター遺伝子上流の最小限のＩＬ−２プロモーター か、或いは完全なＩＬ−２エンハンサー／プロモーターの文脈中に、独特のＩＬ −２エンハンサー結合転写因子の結合部位のマルチマー化オリゴヌクレオチドを 含む。２４時間後、細胞のアリコート（約１０⁵個）を、結合抗ＴＡＣ（ＣＤ２ ５）ｍＡｂ（３３Ｂ．１；ＡＭＡＣ，ウェストブルック（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ） ，ＭＥ）の対数希釈が入っている微量滴定ウェルに入れた。陽性対照としておよ びトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン（１μｍ）およ びＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクションからのアリコートに対し て加えた。更に１４時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファタ ーゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わし た。ＦＫ５０６ １ｎｇ／ｍｌの添加は、ＮＦＡＴによる全部の活性をバックグ ラウンドレベルまで降下させ、脱活性化はＦＫ５０６によって遮断されたのと同 様の経路であることが実証された。得られた各データポイントは二つの試料の平 均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図５を参照されたい。デ ータは、既知の細胞外受容体を用いて、リポーター遺伝子および異なるエンハン サーとの適当な反応が得られることを示している。ＴｃＲ複合体（すなわち、Ｏ ＫＴ３）に対するＭＡｂを用いた場合、同様の結果が得られた。実施例２：免疫抑制薬ＦＫ５０６並びにシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはダイ マー誘導体化合物ＦＫ１０１２Ａ（８）、ＦＫ１０１２Ｂ（５）およびＣｓＡダ イマー（ＰＢ−１−２１８）の阻害活性。 イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を１０⁵個のＴＡ ｇ−ジュルカット細胞に対して加えた。更に、各種薬剤の滴定を加えた。５時間 後、細胞を緩洗剤（すなわち、トリトンＸ−１００）中で溶解させ、そして抽出 物をβ−ガラクトシダーゼ基質ＭＵＧ（メチルガラクトシジルウンベリフェロン ）と一緒に１時間インキュベートした。グリシン／ＥＤＴＡ停止緩衝液を加え、 そして抽出物の蛍光を検定した。得られた各データポイントは二つの試料の平均 であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。意外にも、ＦＫ１０１２Ｂ は、最高濃度（すなわち、５μｇ／ｍｌ）で僅かにマイトジェン活性を増加させ るように見えるが；しかしながら、対照実験は、ＦＫ１０１２Ｂそれだけでは促 進性でないことを示す。図６を参照されたい。実施例３．キメラＦＫＢＰ１２／ＣＤ３（１ＦＫ３）受容体に対するダイマーＦ Ｋ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ａの活性。 キメラ受容体（１ＦＫ３）を有する真核生物発現ベクターｐＢＪ５（１６Ｓス プライス部位およびポリＡ部位間に挿入されたポリリンカーを含むｐＣＤＬ−Ｓ Ｒに基づく）５μｇを、ＮＦＡＴ誘導分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター プラスミドＮＦＡＴ−ＳＸの４μｇと同時トランスフェクトさせた。対照として 、平行トランスフェクションにおいて１ＦＫ３／ｐＢＪ５の代わりにｐＢＪ５を ５μｇ用いた。２４時間後、約１０⁵個の細胞を含む各トランスフェクションの アリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ａの対数希釈と一緒にインキュベー トした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イ オノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクシ ョンからのアリコートに対して加えた。更に１４時間インキュベーション後、上 澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照 試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６ ２ｎｇ／ｍｌの添加は、全部の刺 激をバックグラウンドレベルまで降下させ、活性化はＦＫ５０６によって遮断さ れたのと同様の経路であることが実証された。したがって、ＦＫ５０６またはシ クロスポリンは、これらの化合物の使用に対して有効な解毒薬として役立つ。得 られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って 数回行なわれた。図７を参照されたい。実施例４Ａ．ミリストイル化キメラＣＤ３／ＦＫＢＰ１２（ＭＺＦ３Ｅ）受容体 に対するダイマーＦＫ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ｂの活性 。 本発明者は、「ＦＫ１０１２」と称するＦＫ５０６基剤ＨＯＤ試薬による陽性 結果を含むリガンド設計および合成に対する多数のアプローチをうまく実証した 。本発明者は、ＦＫ１０１２が、２：１結合化学量論（Ｋｄ（１）＝０．１ｎＭ ；Ｋｄ（２）＝０．８ｎＭ）の高親和性を達成し且つカルシニューリン媒介ＴＣ Ｒシグナリングを阻害しないことを発見した。リガンドは、「免疫抑制性」でも 毒性でもない（細胞培養中最大０．１ｍＭまで）。同様に、本発明者は、ＣｓＡ 受容体シクロフィリンに対して１：２化学量論で結合するが、カルシニューリン に対して結合しないシクロスポリンＡ基剤ホモダイマー化試薬を製造した。した がって、ＦＫ１０１２と同様、（ＣｓＡ）２はシグナリング経路を阻害しないし 、したがって免疫抑制性でも毒性でもない。 リガンドに媒介されたタンパク質結合についてのこれらのおよび他の本発明者 の実施例は、シグナル導入経路の制御を引き起こした。典型的な場合、これは、 翻訳後ミリストイル化に十分なＳｒｃの小フラグメント（Ｍ）、ゼータの細胞質 尾部（Ｚ；Ｂ細胞受容体の成分も用いた）、３個の逐次的ＦＫＢＰ１２（Ｆ３） およびｆｌｕエピトープ標識（Ｅ）から成る細胞内受容体を生成することによっ て達成された。ヒト（ジュルカット）Ｔ細胞における構築物ＭＺＦ３Ｅ（図１８ ）の発現によって、本発明者は、コード化されたキメラタンパク質が、ＦＫ１０ １２に媒介されたオリゴマー化を行なうことを確証した。付随したゼータ鎖の凝 集は、ＦＫ１０１２に応答したアルカリ性ホスファターゼの分泌（ＳＥＡＰ）に よって実証されるように（ＥＣ₅₀＝５０ｎＭ）、内因性ＴＣＲシグナリング経路 （図１５）によるシグナリングをもたらした。ＳＥＡＰリポーター遺伝子のプロ モーターは、ＴＣＲシグナリング後に核において組み立てられる活性Ｔ細胞の核 因子（ＮＦＡＴ）によって転写活性化されるように構築された。ＦＫ１０１２に 誘導されたシグナリングは、ＦＫ５０６−Ｍと称するリガンドの無毒性モノマー 変型によって誘導された脱凝集過程によって終結させることができる。 具体的には、ミリストイル化キメラ受容体を有する真核生物発現ベクターｐＢ Ｊ５の５μｇを、ＮＦＡＴ−ＳＸ ４μｇと同時トランスフェクトさせた。ＭＺ Ｅ、ＭＺＦ１Ｅ、ＭＺＦ２ＥおよびＭＺＦ３Ｅは、ミリストイル化ＣＤ３細胞質 ドメインの下流にそれぞれＦＫＢＰ１２の０、１、２または３コピーを含む（図 ２を参照されたい）。対照として、ｐＢＪ５の５μｇを平行トランスフェクショ ンにおいて用いた。２４時間後、約１０⁵個の細胞を含む各トランスフェクショ ンのアリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ｂの対数希釈と一緒にインキュ ベートした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために 、イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェ クションからのアリコートに対して加えた。更に１２時間インキュベーション後 、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性 対照試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６ １ｎｇ／ｍｌの添加は、全部 の刺激をバックグラウンドレベル付近まで降下させ、活性化はＦＫ５０６によっ て遮断されたのと同様の経路であることが実証された。この結果は、問題の細胞 活性の可逆性のもう一つの根拠である。得られた各データポイントは二つの試料 の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図８を参照されたい 。ミリストイル化誘導体は、約一桁までの低濃度のリガンドに応答し且つＮＦＡ Ｔ依存性転写を同様のレベルまで活性化するが、リガンドが異なることに注目す べきである。図７および図８を比較されたい。 インビボＦＫ１０１２誘導タンパク質ダイマー化 本発明者は、次に、ＭＺＦ３Ｅ受容体の細胞内凝集がＦＫ１０１２によって実 際に誘導されるのを確実にすることを望んだ。したがって、ＭＺＦ３Ｅ構築物の インフルエンザ血球凝集素エピトープ標識（ｆｌｕ）を、別のエピトープ標識（ ｆｌａｇ−Ｍ２）と交換した。近縁関係のキメラＭＺＦ３Ｅ_fluおよびＭＺＦ３ Ｅ_flagを、ジュルカットＴ細胞において共発現させた。細胞をＦＫ１０１２Ａで 処理した後、アガロースビーズに結合した抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降実験 を行なった。ＦＫ１０１２Ａ（１μＭ）存在下において、タンパク質キメラＭＺ Ｆ３Ｅ_flagは、ＭＺＦ３Ｅ_fluと相互作用し且つＭＺＦ３Ｅ_flagと一緒に共免疫 沈降する。ＦＫ１０１２Ａ不存在下において、ＭＺＦ３Ｅ_fluとの共免疫沈降は 観察されない。シグナルを与えないＦＫＢＰモノマー構築物ＭＺＦ１Ｅ_fluおよ びＭＺＦ１Ｅ_flagを用いる関連実験は、それらがＦＫ１０１２Ａによって更にダ イマー化されることを示した（図１９Ａ）。これは、内因性Ｔ細胞受容体および 本発明者の人工受容体ＭＺＦ３Ｅ両方で観察された凝集の必要条件を反映してい る。 ＦＫ１０１２誘導タンパク質チロシンリン酸化 ＴＣＲ、ＣＤ３およびゼータ鎖の細胞内ドメインは、抗原刺激後に細胞質タン パク質チロシンキナーゼと相互作用する。Ｓｒｃ系列の具体的なメンバー（ｌｃ ｋおよび／またはｆｙｎ）は、これらの細胞内ドメイン中の活性化モチーフ（チ ロシン活性化モチーフ、ＴＡＭ）の１個またはそれ以上のチロシン残基をリン酸 化する。チロシンキナーゼＺＡＰ−７０は、（その２種類のＳＨ２ドメインによ って）チロシンリン酸化Ｔ細胞受容体に対して補充され、活性化され、そしてお そらくホスホリパーゼＣの更に下流の活性化に関与する。ＭＺＦ３Ｅによって安 定してトランスフェクトされたジュルカット細胞に対する抗ＣＤ３ ＭＡｂかま たはＦＫ１０１２Ａの添加は、内因性Ｔ細胞受容体ゼータ鎖およびＭＺＦ３Ｅ構 築物それぞれの免疫沈降後のインビトロキナーゼ検定によって測定されたように 、ゼータ鎖に対するキナーゼ活性の強化をもたらした。抗ＣＤ３ ＭＡｂかまた はＦＫ１０１２による細胞の処理後のチロシンリン酸化は、単クローン性α−ホ スホチロシン抗体を用いて検出された。全細胞溶解産物を、刺激後の種々の時間 に分析した。チロシンリン酸化タンパク質の同様のパターンは、抗ＣＤ３ ＭＡ ｂかまたはＦＫ１０１２による刺激後に観察された。パターンは、おそらくはＺ ＡＰ−７０である７０ｋＤａの主バンドおよび１２０ｋＤａ、６２ｋＤａ、５５ ｋＤａおよび４２ｋＤａの副バンドから成った。実施例４（Ｂ）：イムノフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節 Ｆａｓ抗原は、細胞表面受容体の神経成長因子（ＮＧＦ）／腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）受容体超系列のメンバーである。Ｆａｓ抗原と抗体との、その細胞外ドメ インに対する架橋は、プログラム化された細胞死すなわちアポプトシスを引き起 こすまだ十分に理解されていないシグナリング経路を活性化する。Ｆａｓ抗原お よびそれに関係したアポプトシス性シグナリング経路は、おそらくは全部の腫瘍 細胞を含む大部分の細胞に存在している。該経路は、壊死性細胞死においては見 られない凝縮された細胞質、炎症反応の不存在およびヌクレオソームＤＮＡのフ ラグメント化を特徴とする急速且つ独特の細胞死（２時間）をもたらす。 本発明者は、更に、アポプトーシス性細胞死をもたらす第二の誘導シグナリン グシステムを開発した。ＭＺＦ３Ｅ経路と同様、この一つは、構成的に発現され た「応答個体」遺伝子の生産物である人工受容体を活性化することによって開始 される。しかしながら、新しい経路は、本発明者のＨＯＤ試薬が、トランスフェ クトされた誘導（例えば、リポーター）遺伝子産物よりもむししろ内因性経路の 生産物を誘導する点で第一とは異なる。 Ｆａｓ経路に対する増加性制御は、将来の生物学的研究および医学にとって重 要な意味がありうる。細胞特異的プロモーターの制御下の「死滅」応答個体遺伝 子によって形質転換された動物が生じるかもしれない。次に、標的細胞は、動物 成体をＨＯＤ試薬で処置することによってそこで化学的に除去されうる。この方 法で、自己免疫疾患の誘導および維持における記憶若しくは認識または免疫細胞 中の特定の脳細胞の役割を評価しうる。死滅応答個体遺伝子は、Ｍ．ブレーズ（ Ｂｌａｅｓｅ）および共同研究者（カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５６ ５０６３（１９９２）；１５５０〜２）によって開発されたヒト遺 伝子療法を用いて腫瘍中に導入された後、（脳腫瘍の治療に関して 最近報告された「ガンシクロビア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）」遺伝子療法臨床 試験を類推して）ＨＯＤ試薬で患者を治療することによって引続き活性化される かもしれない。最後に、本発明者は、死滅応答個体遺伝子と治療用遺伝子との共 投与を包含する将来の遺伝子治療の成分を考えている。これは、遺伝子療法に対 して「フェールセーフ」成分を提供すると考えられる。何かがうまくいかない場 合（一般的に論及された問題は、癌をもたらす腫瘍サプレッサー遺伝子の組込み に誘導された減損である）、遺伝子療法患者は、トランスフェクトされた細胞全 部を死滅させる「フェールセーフ」丸剤を服用しうる。この概念は、本発明者を ＨＯＤ試薬の直交システムの開発に集中させた。したがって、本発明者は、第一 と交差反応する可能性がなく、しかも治療用遺伝子の転写を開始させるまたは停 止させるのに用いられると考えられる試薬の第二セットを望んだ。 Ｆａｓ抗原の細胞質シグナリングドメインに対して融合した３個のＦＫＢＰ１ ２ドメインから成るキメラｃＤＮＡを構築した（図２０）。この構築物は、ヒト ジュルカット細胞およびネズミＤ１０Ｔ細胞において発現された場合、ＦＫ１０ １２試薬によってダイマー化し且つシグナリングカスケードを開始するように誘 導されて、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスを引き起こすことがある。ＭＦＦ３ Ｅによって一時的にトランスフェクトされた細胞の、ＦＫ１０１２Ａに媒介され た死滅についてのＬＤ₅₀は、リポーター遺伝子活性の減損によって決定したとこ ろ１５ｎＭである（図２０；検定の論及については。図２１の標題を参照された い）。これらのデータは、安定してトランスフェクトされた細胞系における細胞 死の測定値と一致する。安定なトランスフェクタントは均一な細胞集団を表わす ので、それらは、死が壊死（膜ブレブ形成、ヌクレオソームＤＮＡフラグメント 化）によるよりもむしろアポプトシスによることを確かめるのに用いられてきた 。しかしながら、一時的トランスフェクションプロトコルは、はるかに少ない作 業しか必要としないので、以下に記載のように、初期検定システムとして用いら れてきた。実施例４（Ｃ）：シクロフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節 本発明者は、更に、一連のシクロフィリンＣ−Ｆａｓ抗原構築物を製造し且つ 一時的発現検定において（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスを誘導するそれらの能 力を検定した（図２１Ａ）。更に、（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスは、系列Ｍ Ｃ３ＦＥ（Ｍ＝Ｓｒｃのミリストイル化ドメイン、Ｃ＝シクロフィリンドメイン 、Ｆ＝Ｆａｓの細胞質尾部、Ｅ＝ｆｌｕエピトープ標識）中の最も活性な構築物 によって安定してトランスフェクトされたヒトジュルカットＴ細胞を用いて実証 された。Ｆａｓの細胞質尾部は、１、２、３または４個の逐次的シクロフィリン ドメインの前か後に融合された。更に、Ｆａｓドメインを欠いている二つの対照 構築物を製造した。この場合、本発明者は、シグナリングドメインが、ダイマー 化ドメインの後におかれた場合にのみ機能することを観察した。（ゼータ鎖構築 物は、ダイマー化ドメインの前か後におかれた場合にシグナルを与える。）ウェ スタンブロッティングによって確かめたところ、８種類のシグナリング構築物の 発現レベルおよびそれらの活性は両方とも定量的に異なった（図２１Ｂ）。これ までのところで、最適システムは、ＭＣ３ＦＥであることが分かった。ＭＣ３Ｆ Ｅによる（ＣｓＡ）２に媒介された細胞死のＬＤ₅₀は約２００ｎＭである。これ らのデータは、細胞内タンパク質結合を調節するためのシクロフィリン−シクロ スポリン相互作用の有用性を実証し且つＦＫＢＰ１２−ＦＫ１０１２システムと 交差反応しない直交試薬システムを例証する。更に、この場合、データは、Ｆａ ｓ細胞質尾部によるシグナル導入の開始にはダイマー化のみが必要とされ、凝集 は必要とされないことを示している。 ミリストイル化シグナルのＮ末端グリシンのアラニンへの突然変異は、ミリス トイル化を、したがって膜局在化を妨げる。本発明者は、更に、突然変異した構 築物（ΔＭＦＦ３Ｅ）が、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスの誘導物質として同 様に強力であったことを観察しており、Ｆａｓに媒介された細胞死に膜局在化が 不可欠ではないことが示された。実施例５．ネズミシグナリングキメラタンパク質の構築 図４に記載のプライマーを用いることによって種々のフラグメントが得られた 。プライマー番号の論及する場合、図４を参考にすべきである。 ネズミクラスＩＩ ＭＨＣ受容体（Ｃｅｌｌ，３２，７４５）のＩ−Ｅ鎖を含 む約１．２ｋｂ ｋｃＤＮＡフラグメントをシグナルペプチド源として用い、Ｐ ＃６０４８およびＰ＃６０４９を用い、供給者（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）） によって記載のようにＰＣＲを用いて７０ｂｐ ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩフラグメ ントを生成した。第二フラグメントは、ＣＤ３（ＰＮＡＳ，８８，８９０５）の 貫膜および細胞質ドメインに対して結合したＴａｃ（ＩＬ２受容体鎖）を含むプ ラスミドを用いて得られた。Ｐ＃６０５０およびＰ＃６０５１を用い、ＣＤ３の 貫膜および細胞質ドメインを含むＰＣＲによって３２０ｂｐ ＸｈｏＩ−Ｅｃｏ ＲＩフラグメントが得られた。これら二つのフラグメントを連結し且つＳａｃＩ Ｉ−ＥｃｏＲＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に挿入してプラスミドＳＰＺ／ＫＳを提供した。 ＦＫ５０６のための結合ドメインを得るために、プラスミドｒｈＦＫＢＰ（Ｓ ．シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６，６ ７４によって提供された）をＰ＃６０５２およびＰ＃６０５３と一緒に用いて、 ヒトＦＫＢＰ１２を含む３４０ｂｐ ＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを得た。 このフラグメントを、ＸｈｏＩ−ＳａｌＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ中に挿入して、プラスミドＦＫ１２／ＫＳを提供し、これがＦＫＢＰ１２ 結合ドメイン源であった。ＳＰＺ／ＫＳをＸｈｏＩによって消化し、ホスファタ ーゼ処理して（細胞腸アルカリ性ホスファターゼ；ＣＩＰ）自己アニーリングを 防止し、そしてＦＫ１２／ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ Ｆ ＫＢＰ１２含有フラグメントと組合せた。ＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマーお よびトリマーを正しい配置で含むクローンを単離した。クローン１ＦＫ１／ＫＳ 、１ＦＫ２／ＫＳおよび１ＦＫ３／ＫＳは、転写方向に、ネズミＭＨＣクラスＩ Ｉ遺伝子Ｉ−Ｅからのシグナルペプチド、ヒトＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマ ーまたはトリマーそれぞれ、およびＣＤ３の貫膜および細胞質部分から成る。最 後に、ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、制限酵素を用いてｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔから切断し、そしてＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化された ｐＢＪ５のポリリンカー中に連結して、プラスミド１ＦＫ１／ｐＢＪ５、１ＦＫ ２／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５をそれそれ生成した。図３および図４を 参照されたい。実施例６ Ａ．細胞内シグナリングキメラの構築 。 ｃ−ｓｒｃからのミリストイル化配列は、ペルマン（Ｐｅｌｌｍａｎ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ ３１４，３７４から得られ、それをＣＤ３の相補的配列に対して 結合して、Ｐ＃８９０８と称する貫膜ドメインの３′配列に対して相補的である プライマーを提供した。このプライマーは、ミリストイル化配列の５′末端に隣 接したＳａｃＩＩ部位および３′末端に隣接したＸｈｏＩ配列を有する。他のプ ライマーＰ＃８４６２は、ＣＤ３の３′末端に対して相補的な配列のＳａｌＩ認 識部位３′、停止コドンおよびＥｃｏＲＩ認識部位を有する。ＰＣＲを用いて、 ４５０ｂｐ ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得たが、これは５′〜３′ 方向に融合したミリストイル化配列およびＣＤ３配列から成った。このフラグメ ントをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＢＪ５（ＸｈｏＩ）（ＳａｌＩ）中に連結 し且つクローン化して、プラスミドＭＺ／ｐＢＪ５を生成した。最後に、ＭＺ／ ｐＢＪ５をＳａｌＩによって消化し、ホスファターゼ処理し、そしてＦＫ１２／ ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ ＦＫＢＰ１２含有フラグメン トと組み合わせ且つ連結させた。クローニング後、５′〜３′方向にミリストイ ル化配列、ＣＤ３およびＦＫＢＰ１２マルチマーを有する所望の構築物を含むプ ラスミドを単離し、そして正しい構造を有すると立証した。図２および図４を参 照されたい。Ｂ．細胞内シグナリングキメラの発現カセットの構築 。 構築物ＭＺ／ｐＢＪ５（ＭＺＥ／ｐＢＪ５）を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａ ｌＩによって消化し、ＴＣＲζフラグメントを除去し、そして得られたベクター を１０倍モル過剰のＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマー、トリマーまたは高次マ ルチマーと連結して、ＭＦ１Ｅ、ＭＦ２Ｅ、ＭＦ３Ｅまたは、ＭＦ_nＥ／ＰＢＪ ５を製造する。次に、和合性フランキング制限部位（すなわち、ＸｈｏＩおよび ＳａｌＩ）を含むように設計された活性ドメインを、ＭＦ_nＥ／ｐＢＪ５の独特 のＸｈｏＩまたはＳａｌＩ制限部位中にクローン化することができる。実施例７．核キメラの構築 Ａ．ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン−１個または複数のＦＫＢＰドメイン−エ ピトープ標識 。 ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）を、Ｋｏｚａｃ配列の 上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を有する５′プライマー（＃３７）並 びにＳａｌＩ部位を有する３′プライマー（＃３８）を用いてＰＣＲによって増 幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩによって消化し、 ロモーター（−３２５〜−２９４および−７２〜＋４７）の転写制御下である関 連プラスミド変異型（すなわち、ＮＦＡＴ−ＳＸ、ＮＦ Ｂ−ＳＸ、ＯＡＰ／Ｏ ｃｔ１−ＳＸおよびＡＰ−１−ＳＸ）は、（１）ＳｓｐＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ によって切断されたｐＰＬ／ＳＥＡＰ（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ （１９８８）６６，１）；（２）ＮｄｅＩによって切断され、クレノウでブラン トにされた後、ＰｖｕＩによって切断されたｐＳＶ２／Ｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ． （１９８２）１，３３２）；および（３）ＰｖｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによっ て切断された各種プロモーター含有プラスミド（すなわち、ＮＦＡＴ−ＣＤ８、 Ｂ−ＣＤ８、ｃｘ１２１ａｃＺ−Ｏｃｔ−１、ＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈまたはｃ ｘ１５ＩＬ２）（以下に記載された）の３部分連結反応によって製造された。Ｎ ＦＡＴ−ＣＤ８は、ヒトＩＬ−２エンハンサーからのＮＦＡＴ−結合部位（−２ ８６〜２５７；Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．（１９９０）４，１８２３）の３ コピーを含み且つｃｘ１２ｌａｃＺ−Ｏｃｔは、ＯＡＰ／Ｏｃｔ−１／（ＡＲＲ Ｅ−１）結合部位（ＭＣＢ，（１９８８）８，１７１５）の４コピーを含み；Ｂ −ＣＤ８は、ネズミ軽鎖（ＥＭＢＯ（１９９０）９，４４２５）からのＮＦ Ｂ 結合部位結合部位の３コピーを含み、そしてＡＰ１−ＬＵＣＩＦ３Ｈは、メタロ チオネンプロモーターからのＡＰ−１部位（５′−ＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣ−３ ′）の５コピーを含む。 それぞれのトランスフェクションにおいて、キメラ受容体ＴＡＣ／ＴＡＣ／Ｚ （ＴＴＺ）（ＰＮＡＳ ８８，８９０５〜８９０９）をコードしている発現ベク ターｐＣＤＬ−ＳＲ（ＭＣＢ ８，４６６〜７２）（Ｔａｃ−ＩＬ２受容体鎖） ５μｇを、ＴＡｇジュルカット細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原によって安定してト ランスフェクトされたヒトＴ細胞白血病系ジュルカットの誘導体（ノースラプ（ Ｎｏｒｔｈｒｕｐ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．［１９９３］）中において種 々の分泌アルカリ性ホスファターゼ基剤リポータープラスミド（図１のｐＳＸＮ ｅｏ／ＩＬ２の地図を参照されたい）と一緒に同時トランスフェクさせた。各リ ポータープラスミドは、リポーター遺伝子上流の最小限のＩＬ−２プロモーター か、或いは完全なＩＬ−２エンハンサー／プロモーターの文脈中に、独特のＩＬ −２エンハンサー結合転写因子の結合部位のマルチマー化オリゴヌクレオチドを 含む。２４時間後、細胞のアリコート（約１０⁵個）を、結合抗ＴＡＣ（ＣＤ２ ５）ｍＡｂ（３３Ｂ．１；ＡＭＡＣ，ウェストブルック（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ） ，ＭＥ）の対数希釈が入っている微量滴定ウェルに入れた。陽性対照としておよ びトランスフェクション効率を調節するために、イオノマイシン（１μｍ）およ びＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクションからのアリコートに対し て加えた。更に１４時間インキュベーション後、上澄みのアルカリ性ホスファタ ーゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照試料の活性と相対して表わし た。ＦＫ５０６ １ｎｇ／ｍｌの添加は、ＮＦＡＴによる全部の活性をバックグ ラウンドレベルまで降下させ、脱活性化はＦＫ５０６によって遮断されたのと同 様の経路であることが実証された。得られた各データポイントは二つの試料の平 均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図５を参照されたい。デ ータは、既知の細胞外受容体を用いて、リポーター遺伝子および異なるエンハン サーとの適当な反応が得られることを示している。ＴｃＲ複合体（すなわち、Ｏ ＫＴ３）に対するＭＡｂを用いた場合、同様の結果が得られた。実施例２：免疫抑制薬ＦＫ５０６並びにシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはダイ マー誘導体化合物ＦＫ１０１２Ａ（８）、ＦＫ１０１２Ｂ（５）およびＣｓＡダ イマー（ＰＢ−１−２１８）の阻害活性 。 イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を１０⁵個のＴＡ ｇ−ジュルカット細胞に対して加えた。更に、各種薬剤の滴定を加えた。５時間 後、細胞を緩洗剤（すなわち、トリトンＸ−１００）中で溶解させ、そして抽出 物をβ−ガラクトシダーゼ基質ＭＵＧ（メチルガラクトシジルウンベリフェロン ）と一緒に１時間インキュベートした。グリシン／ＥＤＴＡ停止緩衝液を加え、 そして抽出物の蛍光を検定した。得られた各データポイントは二つの試料の平均 であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。意外にも、ＦＫ１０１２Ｂ は、最高濃度（すなわち、５μｇ／ｍｌ）で僅かにマイトジェン活性を増加させ るように見えるが；しかしながら、対照実験は、ＦＫ１０１２Ｂそれだけでは促 進性でないことを示す。図６を参照されたい。実施例３．キメラＦＫＢＰ１２／ＣＤ３（１ＦＫ３）受容体に対するダイマーＦ Ｋ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ａの活性 。 キメラ受容体（１ＦＫ３）を有する真核生物発現ベクターｐＢＪ５（１６Ｓス プライス部位およびポリＡ部位間に挿入されたポリリンカーを含むｐＣＤＬ−Ｓ Ｒに基づく）５μｇを、ＮＦＡＴ誘導分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター プラスミドＮＦＡＴ−ＳＸの４μｇと同時トランスフェクトさせた。対照として 、平行トランスフェクションにおいて１ＦＫ３／ｐＢＪ５の代わりにｐＢＪ５を ５μｇ用いた。２４時間後、約１０⁵個の細胞を含む各トランスフェクションの アリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ａの対数希釈と一緒にインキュベー トした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために、イ オノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェクシ ョンからのアリコートに対して加えた。更に１４時間インキュベーション後、上 澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性対照 試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６ ２ｎｇ／ｍｌの添加は、全部の刺 激をバックグラウンドレベルまで降下させ、活性化はＦＫ５０６によって遮断さ れたのと同様の経路であることが実証された。したがって、ＦＫ５０６またはシ クロスポリンは、これらの化合物の使用に対して有効な解毒薬として役立つ。得 られた各データポイントは二つの試料の平均であり、実験は同様の結果を伴って 数回行なわれた。図７を参照されたい。実施例４Ａ．ミリストイル化キメラＣＤ３／ＦＫＢＰ１２（ＭＺＦ３Ｅ）受容体 に対するダイマーＦＫ５０６誘導体ＦＫ１０１２Ｂの活性 。 本発明者は、「ＦＫ１０１２」と称するＦＫ５０６基剤ＨＯＤ試薬による陽性 結果を含むリガンド設計および合成に対する多数のアプローチをうまく実証した 。本発明者は、ＦＫ１０１２が、２：１結合化学量論（Ｋｄ（１）＝０．１ｎＭ ；Ｋｄ（２）＝０．８ｎＭ）の高親和性を達成し且つカルシニューリン媒介ＴＣ Ｒシグナリングを阻害しないことを発見した。リガンドは、「免疫抑制性」でも 毒性でもない（細胞培養中最大０．１ｍＭまで）。同様に、本発明者は、ＣｓＡ 受容体シクロフィリンに対して１：２化学量論で結合するが、カルシニューリン に対して結合しないシクロスポリンＡ基剤ホモダイマー化試薬を製造した。した がって、ＦＫ１０１２と同様、（ＣｓＡ）２はシグナリング経路を阻害しないし 、したがって免疫抑制性でも毒性でもない。 リガンドに媒介されたタンパク質結合についてのこれらのおよび他の本発明者 の実施例は、シグナル導入経路の制御を引き起こした。典型的な場合、これは、 翻訳後ミリストイル化に十分なＳｒｃの小フラグメント（Ｍ）、ゼータの細胞質 尾部（Ｚ；Ｂ細胞受容体の成分も用いた）、３個の逐次的ＦＫＢＰ１２（Ｆ３） およびｆｌｕエピトープ標識（Ｅ）から成る細胞内受容体を生成することによっ て達成された。ヒト（ジュルカット）Ｔ細胞における構築物ＭＺＦ３Ｅ（図１８ ）の発現によって、本発明者は、コード化されたキメラタンパク質が、ＦＫ１０ １２に媒介されたオリゴマー化を行なうことを確証した。付随したゼータ鎖の凝 集は、ＦＫ１０１２に応答したアルカリ性ホスファターゼの分泌（ＳＥＡＰ）に よって実証されるように（ＥＣ₅₀＝５０ｎＭ）、内因性ＴＣＲシグナリング経路 （図１５）によるシグナリングをもたらした。ＳＥＡＰリポーター遺伝子のプロ モーターは、ＴＣＲシグナリング後に核において組み立てられる活性Ｔ細胞の核 因子（ＮＦＡＴ）によって転写活性化されるように構築された。ＦＫ１０１２に 誘導されたシグナリングは、ＦＫ５０６−Ｍと称するリガンドの無毒性モノマー 変型によって誘導された脱凝集過程によって終結させることができる。 具体的には、ミリストイル化キメラ受容体を有する真核生物発現ベクターｐＢ Ｊ５の５μｇを、ＮＦＡＴ−ＳＸ ４μｇと同時トランスフェクトさせた。ＭＺ Ｅ、ＭＺＦ１Ｅ、ＭＺＦ２ＥおよびＭＺＦ３Ｅは、ミリストイル化ＣＤ３細胞質 ドメインの下流にそれぞれＦＫＢＰ１２の０、１、２または３コピーを含む（図 ２を参照されたい）。対照として、ｐＢＪ５の５μｇを平行トランスフェクショ ンにおいて用いた。２４時間後、約１０⁵個の細胞を含む各トランスフェクショ ンのアリコートを、指示通りに薬剤ＦＫ１０１２Ｂの対数希釈と一緒にインキュ ベートした。陽性対照としておよびトランスフェクション効率を調節するために 、イオノマイシン（１μｍ）およびＰＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）を各トランスフェ クションからのアリコートに対して加えた。更に１２時間インキュベーション後 、上澄みのアルカリ性ホスファターゼ活性を検定し、そしてこれらの活性を陽性 対照試料の活性と相対して表わした。ＦＫ５０６ １ｎｇ／ｍｌの添加は、全部 の刺激をバックグラウンドレベル付近まで降下させ、活性化はＦＫ５０６によっ て遮断されたのと同様の経路であることが実証された。この結果は、問題の細胞 活性の可逆性のもう一つの根拠である。得られた各データポイントは二つの試料 の平均であり、実験は同様の結果を伴って数回行なわれた。図８を参照されたい 。ミリストイル化誘導体は、約一桁までの低濃度のリガンドに応答し且つＮＦＡ Ｔ依存性転写を同様のレベルまで活性化するが、リガンドが異なることに注目す べきである。図７および図８を比較されたい。 インビボＦＫ１０１２誘導タンパク質ダイマー化 本発明者は、次に、ＭＺＦ３Ｅ受容体の細胞内凝集がＦＫ１０１２によって実 際に誘導されるのを確実にすることを望んだ。したがって、ＭＺＦ３Ｅ構築物の インフルエンザ血球凝集素エピトープ標識（ｆｌｕ）を、別のエピトープ標識（ ｆｌａｇ−Ｍ２）と交換した。近縁関係のキメラＭＺＦ３Ｅ_fluおよびＭＺＦ３ Ｅ_flagを、ジュルカットＴ細胞において共発現させた。細胞をＦＫ１０１２Ａで 処理した後、アガロースビーズに結合した抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降実験 を行なった。ＦＫ１０１２Ａ（１μＭ）存在下において、タンパク質キメラＭＺ Ｆ３Ｅ_flagは、ＭＺＦ３Ｅ_fluと相互作用し且つＭＺＦ３Ｅ_flagと一緒に共免疫 沈降する。ＦＫ１０１２Ａ不存在下において、ＭＺＦ３Ｅ_fluとの共免疫沈降は 観察されない。シグナルを与えないＦＫＢＰモノマー構築物ＭＺＦ１Ｅ_fluおよ びＭＺＦ１Ｅ_flagを用いる関連実験は、それらがＦＫ１０１２Ａによって更にダ イマー化されることを示した（図１９Ａ）。これは、内因性Ｔ細胞受容体および 本発明者の人工受容体ＭＺＦ３Ｅ両方で観察された凝集の必要条件を反映してい る。 ＦＫ１０１２誘導タンパク質チロシンリン酸化 ＴＣＲ、ＣＤ３およびゼータ鎖の細胞内ドメインは、抗原刺激後に細胞質タン パク質チロシンキナーゼと相互作用する。Ｓｒｃ系列の具体的なメンバー（１ｃ ｋおよび／またはｆｙｎ）は、これらの細胞内ドメイン中の活性化モチーフ（チ ロシン活性化モチーフ、ＴＡＭ）の１個またはそれ以上のチロシン残基をリン酸 化する。チロシンキナーゼＺＡＰ−７０は、（その２種類のＳＨ２ドメインによ って）チロシンリン酸化Ｔ細胞受容体に対して補充され、活性化され、そしてお そらくホスホリパーゼＣの更に下流の活性化に関与する。ＭＺＦ３Ｅによって安 定してトランスフェクトされたジュルカット細胞に対する抗ＣＤ３ ＭＡｂかま たはＦＫ１０１２Ａの添加は、内因性Ｔ細胞受容体ゼータ鎖およびＭＺＦ３Ｅ構 築物それぞれの免疫沈降後のインピトロキナーゼ検定によって測定されたように 、ゼータ鎖に対するキナーゼ活性の強化をもたらした。抗ＣＤ３ ＭＡｂかまた はＦＫ１０１２による細胞の処理後のチロシンリン酸化は、単クローン性α−ホ スホチロシン抗体を用いて検出された。全細胞溶解産物を、刺激後の種々の時間 に分析した。チロシンリン酸化タンパク質の同様のパターンは、抗ＣＤ３ ＭＡ ｂかまたはＦＫ１０１２による刺激後に観察された。パターンは、おそらくはＺ ＡＰ−７０である７０ｋＤａの主バンドおよび１２０ｋＤａ、６２ｋＤａ、５５ ｋＤａおよび４２ｋＤａの副バンドから成った。実施例４（Ｂ）：イムノフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節 Ｆａｓ抗原は、細胞表面受容体の神経成長因子（ＮＧＦ）／腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）受容体超系列のメンバーである。Ｆａｓ抗原と抗体との、その細胞外ドメ インに対する架橋は、プログラム化された細胞死すなわちアポプトシスを引き起 こすまだ十分に理解されていないシグナリング経路を活性化する。Ｆａｓ抗原お よびそれに関係したアポプトシス性シグナリング経路は、おそらくは全部の腫瘍 細胞を含む大部分の細胞に存在している。該経路は、壊死性細胞死においては見 られない凝縮された細胞質、炎症反応の不存在およびヌクレオソームＤＮＡのフ ラグメント化を特徴とする急速且つ独特の細胞死（２時間）をもたらす。 本発明者は、更に、アポプトーシス性細胞死をもたらす第二の誘導シグナリン グシステムを開発した。ＭＺＦ３Ｅ経路と同様、この一つは、構成的に発現され た「応答個体」遺伝子の生産物である人工受容体を活性化することによって開始 される。しかしながら、新しい経路は、本発明者のＨＯＤ試薬が、トランスフェ クトされた誘導（例えば、リポーター）遺伝子産物よりもむししろ内因性経路の 生産物を誘導する点で第一とは異なる。 Ｆａｓ経路に対する増加性制御は、将来の生物学的研究および医学にとって重 要な意味がありうる。細胞特異的プロモーターの制御下の「死滅」応答個体遺伝 子によって形質転換された動物が生じるかもしれない。次に、標的細胞は、動物 成体をＨＯＤ試薬で処置することによってそこで化学的に除去されうる。この方 法で、自己免疫疾患の誘導および維持における記憶若しくは認識または免疫細胞 中の特定の脳細胞の役割を評価しうる。死滅応答個体遺伝子は、Ｍ．ブレーズ（ Ｂｌａｅｓｅ）および共同研究者（カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５６ ５０６３（１９９２）；１５５０〜２）によって開発されたヒト遺 伝子療法を用いて腫瘍中に導入された後、（脳腫瘍の治療に関して 最近報告された「ガンシクロビア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）」遺伝子療法臨床 試験を類推して）ＨＯＤ試薬で患者を治療することによって引続き活性化される かもしれない。最後に、本発明者は、死滅応答個体遺伝子と治療用遺伝子との共 投与を包含する将来の遺伝子治療の成分を考えている。これは、遺伝子療法に対 して「フェールセーフ」成分を提供すると考えられる。何かがうまくいかない場 合（一般的に論及された問題は、癌をもたらす腫瘍サプレッサー遺伝子の組込み に誘導された減損である）、遺伝子療法患者は、トランスフェクトされた細胞全 部を死滅させる「フェールセーフ」丸剤を服用しうる。この概念は、本発明者を ＨＯＤ試薬の直交システムの開発に集中させた。したがって、本発明者は、第一 と交差反応する可能性がなく、しかも治療用遺伝子の転写を開始させるまたは停 止させるのに用いられると考えられる試薬の第二セットを望んだ。 Ｆａｓ抗原の細胞質シグナリングドメインに対して融合した３個のＦＫＢＰ１ ２ドメインから成るキメラｃＤＮＡを構築した（図２０）。この構築物は、ヒト ジュルカット細胞およびネズミＤ１０Ｔ細胞において発現された場合、ＦＫ１０ １２試薬によってダイマー化し且つシグナリングカスケードを開始するように誘 導されて、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスを引き起こすことがある。ＭＦＦ３ Ｅによって一時的にトランスフェクトされた細胞の、ＦＫ１０１２Ａに媒介され た死滅についてのＬＤ₅₀は、リポーター遺伝子活性の減損によって決定したとこ ろ１５ｎＭである（図２０；検定の論及については。図２１の標題を参照された い）。これらのデータは、安定してトランスフェクトされた細胞系における細胞 死の測定値と一致する。安定なトランスフェクタントは均一な細胞集団を表わす ので、それらは、死が壊死（膜ブレブ形成、ヌクレオソームＤＮＡフラグメント 化）によるよりもむしろアポプトシスによることを確かめるのに用いられてきた 。しかしながら、一時的トランスフェクションプロトコルは、はるかに少ない作 業しか必要としないので、以下に記載のように、初期検定システムとして用いら れてきた。実施例４（Ｃ）：シクロフィリンＦａｓ抗原キメラによるプログラム化された細 胞死の調節 本発明者は、更に、一連のシクロフィリンＣ−Ｆａｓ抗原構築物を製造し且つ 一時的発現検定において（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスを誘導するそれらの能 力を検定した（図２１Ａ）。更に、（ＣｓＡ）２依存性アポプトシスは、系列Ｍ Ｃ３ＦＥ（Ｍ＝Ｓｒｃのミリストイル化ドメイン、Ｃ＝シクロフィリンドメイン 、Ｆ＝Ｆａｓの細胞質尾部、Ｅ＝ｆｌｕエピトープ標識）中の最も活性な構築物 によって安定してトランスフェクトされたヒトジュルカットＴ細胞を用いて実証 された。Ｆａｓの細胞質尾部は、１、２、３または４個の逐次的シクロフィリン ドメインの前か後に融合された。更に、Ｆａｓドメインを欠いている二つの対照 構築物を製造した。この場合、本発明者は、シグナリングドメインが、ダイマー 化ドメインの後におかれた場合にのみ機能することを観察した。（ゼータ鎖構築 物は、ダイマー化ドメインの前か後におかれた場合にシグナルを与える。）ウェ スタンブロッティングによって確かめたところ、８種類のシグナリング構築物の 発現レベルおよびそれらの活性は両方とも定量的に異なった（図２１Ｂ）。これ までのところで、最適システムは、ＭＣ３ＦＥであることが分かった。ＭＣ３Ｆ Ｅによる（ＣｓＡ）２に媒介された細胞死のＬＤ₅₀は約２００ｎＭである。これ らのデータは、細胞内タンパク質結合を調節するためのシクロフィリン−シクロ スポリン相互作用の有用性を実証し且つＦＫＢＰ１２−ＦＫ１０１２システムと 交差反応しない直交試薬システムを例証する。更に、この場合、データは、Ｆａ ｓ細胞質尾部によるシグナル導入の開始にはダイマー化のみが必要とされ、凝集 は必要とされないことを示している。 ミリストイル化シグナルのＮ末端グリシンのアラニンへの突然変異は、ミリス トイル化を、したがって膜局在化を妨げる。本発明者は、更に、突然変異した構 築物（ΔＭＦＦ３Ｅ）が、ＦＫ１０１２依存性アポプトシスの誘導物質として同 様に強力であったことを観察しており、Ｆａｓに媒介された細胞死に膜局在化が 不可欠ではないことが示された。実施例５．ネズミシグナリングキメラタンパク質の構築 図４に記載のプライマーを用いることによって種々のフラグメントが得られた 。プライマー番号の論及する場合、図４を参考にすべきである。 ネズミクラスＩＩ ＭＨＣ受容体（Ｃｅｌｌ，３２，７４５）のＩ−Ｅ鎖を含 む約１．２ｋｂ ｋｃＤＮＡフラグメントをシグナルペプチド源として用い、Ｐ ＃６０４８およびＰ＃６０４９を用い、供給者（プロメカ（Ｐｒｏｍｅｇａ）） によって記載のようにＰＣＲを用いて７０ｂｐ ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩフラグメ ントを生成した。第二フラグメントは、ＣＤ３（ＰＮＡＳ，８８，８９０５）の 貫膜および細胞質ドメインに対して結合したＴａｃ（ＩＬ２受容体鎖）を含むプ ラスミドを用いて得られた。Ｐ＃６０５０およびＰ＃６０５１を用い、ＣＤ３の 貫膜および細胞質ドメインを含むＰＣＲによって３２０ｂｐ ＸｈｏＩ−Ｅｃｏ ＲＩフラグメントが得られた。これら二つのフラグメントを連結し且つＳａｃＩ Ｉ−ＥｃｏＲＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中に挿入してプラスミドＳＰＺ／ＫＳを提供した。 ＦＫ５０６のための結合ドメインを得るために、プラスミドｒｈＦＫＢＰ（Ｓ ．シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６，６ ７４によって提供された）をＰ＃６０５２およびＰ＃６０５３と一緒に用いて、 ヒトＦＫＢＰ１２を含む３４０ｂｐ ＸｈｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを得た。 このフラグメントを、ＸｈｏＩ−ＳａｌＩによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ中に挿入して、プラスミドＦＫ１２／ＫＳを提供し、これがＦＫＢＰ１２ 結合ドメイン源であった。ＳＰＺ／ＫＳをＸｈｏＩによって消化し、ホスファタ ーゼ処理して（細胞腸アルカリ性ホスファターゼ；ＣＩＰ）自己アニーリングを 防止し、そしてＦＫ１２／ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ Ｆ ＫＢＰ１２含有フラグメントと組合せた。ＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマーお よびトリマーを正しい配置で含むクローンを単離した。クローン１ＦＫ１／ＫＳ 、１ＦＫ２／ＫＳおよび１ＦＫ３／ＫＳは、転写方向に、ネズミＭＨＣクラスＩ Ｉ遺伝子Ｉ−Ｅからのシグナルペプチド、ヒトＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマ ーまたはトリマーそれぞれ、およびＣＤ３の貫膜および細胞質部分から成る。最 後に、ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、制限酵素を用いてｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔから切断し、そしてＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩによって消化された ｐＢＪ５のポリリンカー中に連結して、プラスミド１ＦＫ１／ｐＢＪ５、１ＦＫ ２／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５をそれそれ生成した。図３および図４を 参照されたい。実施例６ Ａ．細胞内シグナリングキメラの構築 。 ｃ−ｓｒｃからのミリストイル化配列は、ペルマン（Ｐｅｌｌｍａｎ）ら、Ｎ ａｔｕｒｅ ３１４，３７４から得られ、それをＣＤ３の相補的配列に対して 結合して、Ｐ＃８９０８と称する貫膜ドメインの３′配列に対して相補的である プライマーを提供した。このプライマーは、ミリストイル化配列の５′末端に陽 接したＳａｃＩＩ部位および３′末端に隣接したＸｈｏＩ配列を有する。他のフ ライマーＰ＃８４６２は、ＣＤ３の３′末端に対して相補的な配列のＳａｌＩ記 識部位３′、停止コドンおよびＥｃｏＲＩ認識部位を有する。ＰＣＲを用いて、 ４５０ｂｐ ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを得たが、これは５′〜３′ 方向に融合したミリストイル化配列およびＣＤ３配列から成った。このフラグメ ントをＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＢＪ５（ＸｈｏＩ）（ＳａｌＩ）中に連結 し且つクローン化して、プラスミドＭＺ／ｐＢＪ５を生成した。最後に、ＭＺ／ ｐＢＪ５をＳａｌＩによって消化し、ホスファターゼ処理し、そしてＦＫ１２／ ＫＳからの１０倍モル過剰のＸｈｏＩ−ＳａｌＩ ＦＫＢＰ１２含有フラグメン トと組み合わせ且つ連結させた。クローニング後、５′〜３′方向にミリストイ ル化配列、ＣＤ３およびＦＫＢＰ１２マルチマーを有する所望の構築物を含むブ ラスミドを単離し、そして正しい構造を有すると立証した。図２および図４を参 照されたい。Ｂ．細胞内シグナリングキメラの発現カセットの構築 。 構築物ＭＺ／ｐＢＪ５（ＭＺＥ／ｐＢＪ５）を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａ ＩＩによって消化し、ＴＣＲζフラグメントを除去し、そして得られたベクター を１０倍モル過剰のＦＫＢＰ１２のモノマー、ダイマー、トリマーまたは高次マ ルチマーと連結して、ＭＦ１Ｅ、ＭＦ２Ｅ、ＭＦ３Ｅまたは、ＭＦ_nＥ／ｐＢＪ ５を製造する。次に、和合性フランキング制限部位（すなわち、ＸｈｏＩおよび ＳａｌＩ）を含むように設計された活性ドメインを、ＭＦ_nＥ／ｐＢＪ５の独特 のＸｈｏＩまたはＳａｌＩ制限部位中にクローン化することができる。実施例７．核キメラの構築 Ａ．ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン−１個または複数のＦＫＢＰドメイン−エ ピトープ標識 。 ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）を、Ｋｏｚａｃ配列の 上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を有する５′プライマー（＃３７）並 びにＳａｌＩ部位を有する３′プライマー（＃３８）を用いてＰＣＲによって増 幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩによって消化し、 そしてＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ Ｋ Ｓ（＋）中に連結して、構築物ｐＢＳ−ＧＡＬ４を生成した。構築物を配列決定 によって確認した。ｐＢＳ−ＧＡＬ４からのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩフラグメント を単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位において構築物１ＦＫ１／ｐＢ Ｊ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５（ミリストイル化配列を含む、実施例６を参照さ れたい）中に連結して、構築物ＧＦ１Ｅ、ＧＦ２ＥおよびＧＦ３Ｅを生成した。 ＰＣＲ増幅生成物の５′末端： ＰＣＲ増幅生成物の３′末端： Ｂ．ＨＮＦ１ダイマー化／ＤＮＡ結合ドメイン−１個または複数のＦＫＢＰド メイン−標識 。 ＨＮＦ１ａダイマー化／ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜２８２）を、Ｋｏ ｚａｃ配列の上流のＳａｃＩＩ部位および翻訳開始部位を有する５′プライマー （＃３９）並びにＳａｌＩ部位を有する３′プライマー（＃４０）を用いてＰＣ Ｒによって増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し、ＳａｃＩＩおよびＳａｌＩによ って消化し、そしてＳａｃＩＩおよびＳａｌＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔＩＩ ＫＳ（＋）中に連結して、構築物ｐＢＳ−ＨＮＦを生成した。構築物 を配列決定によって確認した。ｐＢＳ−ＨＮＦからのＳａｃＩＩ／ＳａｌＩフラ グメントを単離し、そしてＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位において構築物１ＦＫ １／ｐＢＪ５および１ＦＫ３／ｐＢＪ５中に連結して、構築物ＨＦ１Ｅ、ＨＦ２ ＥおよびＨＦ３Ｅを生成した。 ＰＣＲ増幅生成物の５′端： ＣＲ増幅生成物の３′端： Ｃ．１個または複数のＦＫＢＰドメイン−１個または複数のＶＰ１６転写活性 化ドメイン−エピトープ標識 。 これらの構築物は三段階で、すなわち、（ｉ）ミリストイル化配列がＸｈｏＩ 部位のすぐ上流の開始部位で置き換えられたＩＦＫ３／ｐＢＪ５から構築物を生 成して、構築物ＳＦ３Ｅを生成し；（ｉｉ）核局在化配列を該ＸｈｏＩ部位中に 挿入して構築物ＮＦ３Ｅを生成し；（ｉｉｉ）ＶＰ１６活性化ドメインを、ＮＦ ３ＥのＳａｌＩ部位中にクローン化して構築物ＮＦ３Ｖ１Ｅを生成することで製 造された。 （ｉ）ＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位に隣接されたＫｏｚａｃ配列および開始 部位をコードしている相補的オリゴヌクレオチド（＃４５および＃４６）をアニ ーリングし、リン酸化し、そしてＭＦ３ＥのＳａｃＩＩおよびＸｈｏＩ部位中に 連結して構築物ＳＦ３Ｅを生成した。 一般的な開始部位の挿入 （ｉｉ）５′ＳａｌＩ部位および３′ＸｈｏＩ部位に隣接されたＳＶ４０ Ｔ 抗原核局在化配列をコートしている相補的オリゴヌクレオチト（＃４７および＃ ４８）をアニーリングし、リン酸化し、そしてＳＦ１ＥのＸｈｏＩ部位中に連結 して、構築物ＮＦ１Ｅを生成した。構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。 １２８位のリシンの代わりにトレオニンが置換されている核局在化配列の突然変 異体または欠陥型を含む構築物を更に単離した。これをＮＦ１Ｅ−Ｍと称する。 ＦＫＢＰ１２ドメインのマルチマーは、ＦＫＢＰ１２配列をｐＢＳ−ＦＫＢＰ１ ２からのＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離し且つこのフラグメントを 、ＸｈｏＩによって直鎖状にされたＮＦ１Ｅ中に連結することによって得られた 。これによって構築物ＮＦ２ＥおよびＮＦ３Ｅが生成された。 一般的な開始部位へのＮＬＳの挿入 １２８位のトレオニンは欠陥ＮＬＳを生じる。 （ｉｉｉ）ＶＰ１６転写活性化ドメイン（アミノ酸４１３〜４９０）を、Ｓａ ｌＩ部位を有する５′プライマー（＃４３）およびＸｈｏＩ部位を有する３′プ ライマー（＃４４）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ生成物を単離し 、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩによって消化し、そしてＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位 においてＭＦ３Ｅ中に連結して、構築物ＭＶ１Ｅを生成した。構築物を配列決定 によって確認した。マルチマー化されたＶＰ１６ドメインは、単一ＶＰ１６配列 をＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＭＶ１Ｅから単離し、そしてこのフラ グメントを、ＸｈｏＩによって直鎖状にされたＭＶ１Ｅ中に連結することによっ て生成された。構築物ＭＶ２Ｅ、ＭＶ３ＥおよびＭＶ４Ｅをこの方法で生成した 。１種類またはそれ以上の多重ＶＰ１６ドメインをコードしているＤＮＡフラグ メントは、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＭＶ１ＥまたはＭＶ２Ｅから 単離され、そしてＳａｌＩによって直鎖状にされたＮＦ１Ｅ中に連結されて、構 築物ＮＦ１Ｖ１ＥおよびＮＦ１Ｖ３Ｅを生成した。ＦＫＢＰ１２ドメインのマル チマーは、ＦＫＢＰ１２配列をＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてｐＢＳ− ＦＫＢＰ１２から単離し、そしてこのフラグメントを、ＸｈｏＩによって直鎖状 にされたＮＦ１Ｖ１Ｅ中に連結することによって得られた。これによって構築物 ＮＦ２Ｖ１ＥおよびＮＦ３Ｖ１Ｅが生成された。 ＰＣＲ増幅生成物の５′末端： ＰＣＲ増幅生成物の３′末端： オリゴヌクレオチド： 実施例８．転写誘導の実証。 ジュルカットＴＡｇ細胞を、エレクトロポレーション（９６０μＦ）２５０ｖ ）によって指定された構築物（各構築物５μｇ）を用いてトランスフェクトした 。２４時間後、細胞を新しい培地中に再懸濁させ且つ分別した。各トランスフェ クションの半分を、最終濃度１μＭでのダイマーＦＫ５０６誘導体（実施例１４ ）と一緒にインキュベートした。１２時間後、細胞を洗浄し、そして細胞抽出物 を反復凍結融解によって調製した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼ（ＣＡＴ）活性を、標準的なプロトコルによって測定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら監修（１９８９）ＣＳＨラボラトリー 、１６〜５９頁および次の数頁。データ（図２２）は、３７℃で１８時間インキ ュベーション後の抽出物（全抽出物量は１２０μＬ）７０μＬ中に存在するＣＡ Ｔ活性を実証する。検定に用いられた試料は以下の通りである。 合成化学例 他の箇所で指摘したように、オリゴマー化剤として存在する特に重要な化合物 は、以下の構造： リンカー−｛rbm₁，rbm₂，…rbm_n｝ ［式中、“リンカー”は、同一または異なっていてもよい“n”（２〜約５の 整数、通常、２もしくは３）レセプター結合部分（“rbm類”）に共有結合した 、例えば、本明細書に記載するリンカー部分である。］ を有する。本明細書の他の箇所で検討したように、レセプター結合部分は、例え ば、セクションＶ（Ｃ）に列挙したような公知のレセプターに対するリガンド（ またはその類縁体）であり、ＦＫＢＰに結合することのできるＦＫ５０６、ＦＫ ５２０、ラパマイシンおよびその類縁体、ならびに、それぞれのレセプターに結 合することのできるシクロスポリン類、テトラサイクリン類、その他の抗微生物 剤およびマクロライド類ならびにステロイド類を包含する。 リンカーは、二以上のレセプター結合部分に共有結合（“−”）することので きる二官能性または多官能性分子である。リンカー部分の例は、セクションＶＩ （Ａ）および種々の実施例で開示してあり、とりわけ、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン 、Ｃ４〜Ｃ１８アザアルキレン、Ｃ６〜Ｃ２４Ｎ−アルキレンアザアルキレン、 Ｃ６〜Ｃ１８アリーレン、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレンおよびＣ８〜Ｃ３６ビ スカルボキサアミドアルキレンが挙げられる。 これらの化合物は、市販されている物質および／または当分野公知の方法を用 いて製造することができる。これら化合物に対する人工のレセプターは、以降に 記載するようにして得ることができる。特に重要な化合物は、ＫＤ１０^-6未満、 好ましくは、約１０^-7未満、さらにより好ましくは、１０^-8未満でレセプターに 結合する化合物である。 重要なオリゴマー化剤の一つの亜類は、一以上のレセプター結合部分がＦＫ５ ０６、ＦＫ−５０６タイプの化合物またはその誘導体であるものであり、レセプ ター結合部分は、図２３Ａにおける化合物５または１３当たり（ＦＫ５０６ナン バリングを用いて）、Ｃ２１でアリル基を介するか、または、シクロヘキシル環 （Ｃ２９〜Ｃ３４）、例えば、図２３Ｂにおける化合物８、１６、１７当たりＣ ３２ヒドロキシルを介して、リンカー部分に共有結合される。この類の化合物は 、以下の実施例も含め、本明細書に開示された方法を採用することによって製造 することができる。 重要なオリゴマー化剤のもう一つの亜類は、レセプター結合部分の少なくとも 一つがＦＫ５２０またはその誘導体であり、ＦＫ５２０またはその誘導体の分子 が、図１０におけるＦＫ１０４０ＡまたはＦＫ１０４０Ｂのように、リンカー部 分に共有結合しているものである。この類の化合物は、図１０のスキーム１もし くは図１１Ａおよび図１１Ｂのスキーム２または図１２および図１３のスキーム ３を採用することによって製造することができる。 重要なオリゴマー化剤のさらなる亜類は、レセプター結合部分の少なくとも一 つがシクロスポリンＡまたはその誘導体であるものである。 本発明のこれらおよびその他のオリゴマー化剤が、ホモオリゴマー化試薬（rb mが同一である）またはヘテロオリゴマー化剤（rbmが異なる）であってもよいこ とを理解する必要がある。ヘテロオリゴマー化剤は、本明細書中の処理方法、例 えば、図１３のスキーム３および本明細書のその他の箇所で検討した処理方法に 類似した方法によって製造することができる。 以下の合成例は、例として示すものである。Ａ． 一般的な処理方法 反応は、全て、窒素またはアルゴン加圧下、オーブン で乾燥させたガラス器具中で行った。空気および水分に鋭敏な化合物は、ゴム栓 を介して、シリンジまたはカニューレで導入した。Ｂ． 物理的なデータ プロトン核磁気共鳴スペクトル（¹ＨＮＭＲ）は、Bruke r AM-500（500MHz）およびAM-400（400MHz）分光器で記録した。ケミカルシフト は、内部標準としての溶剤共鳴（クロロホルム，７．２７ppm）を用いて、テト ラメチルシランからのppmで報告する。データは、以下の通り、ケミカルシフト 、多重度（s＝シングレット、d＝ダブレット、t＝トリプレット、q＝カルテット 、br＝広がった、m＝マルチプレット）、カップリングコンスタント（Hz）、積 分で報告する。低分解能および高分解能質量スペクトルが得られた。Ｃ． クロマトグラフィ 反応は、E．Merkのシリカゲル60Fガラスプレート（０ ．２５mm）を用いて、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によりモニターした。成 分は、長波長の紫外光による照射、ヨード蒸気への暴露、および／または、セリ ックアンモニウムモリブデート水溶液への浸漬、続く、加熱によって目視した。 クロマトグラフィ用の溶剤は、ＨＰＬＣ等級であった。E．Merkシリカゲル60（ ２３０〜４００メッシュ）について指示された溶剤システムの強制流（フラッシ ュクロマトグラフィ）を用いて、液体クロマトグラフィを行った。Ｄ． 溶剤および試薬 試薬および溶剤は、全て、分析用等級であり、以下、例 外的と受け取られるように使用した。 テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ベンゼン、トルエンおよびジエチルエーテル は、ナトリウム金属ベンゾフェノンケチルから蒸留した。トリエチルアミンおよ びアセトニトリルは、カルシウムハイドライドから蒸留した。ジクロロメタンは 、五酸化リンから蒸留した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、減圧でカルシ ウムハイドライドから蒸留し、４Ａモレキュラーシーブ上で貯蔵した。ＦＫ５０６誘導体の製造 実施例 ９ ＦＫ５０６−ＴＢＳ₂のハイドロボレーション／酸化（１〜２） ハイドロボレーションは、Evansの方法［Evans，et al.，JACS（1992）114，6 679；ibid．（1992）6679-6685］に従い行った［ナンバリングについては、Hard ing，et al.，Nature（1989）341，758参照］。１０mlのフラスコに、２４，３ ２−ビス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］ＦＫ５０６（３３．８mg，０ ．０３３mmol）と［Rh(nbd)(diphos-4)］BF₄（３．１mg，０．００４mmol，１３ mol％）とを充填した。オレンジ色の混合物をトルエン（２．０ml）に溶解し、 溶剤を減圧下４時間かけて除去した。フラスコを窒素で注意深くパージし、オレ ンジ色の油状物をＴＨＦ（３．０ml，最終濃度１０mM）に溶解し、氷冷バスで０ ℃に冷却した。カテコールボラン（９８μl，０．０９８mmol，ＴＨＦ１．０M溶 液，３．０当量）をシリンジで加え、得られた溶液を０℃で４５分間撹拌した。 ０．２mlＴＨＦ／ＥｔＯＨ（１：１）で反応を０℃でクエンチし、続いて、ｐＨ ７．０緩衝液（Fisher：0.05Mリン酸塩）０．２mlを加え、ついで、３０％Ｈ₂Ｏ₂ ０．２mlを 加えた。溶液を室温で少なくとも１２時間撹拌した。減圧下、溶剤を除去し、残 る油状物をベンゼン（１０ml）に溶解し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ ml）で洗浄した。相を分離し、水相をベンゼン（２×１０ml）で逆抽出した。有 機相を合わせ、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で一回洗浄した。ベン ゼン相をＭｇＳＯ₄で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン ：酢酸エチル２：１）に付すと、透明無色の油状物（１２．８mg，０．０１２mm ol，３７％）として、所望の第１級アルコールを与えた。 混合カーボネートの製造（２〜３） 混合カーボネートの製造は、Ghoshの方法［Ghosh，et l.，Tetrahedron Lett ．（1992）33，2781-2784］によって達成された。１０mlのフラスコに、第１級 アルコール（２９．２mg，０．０２７８mmol）とベンゼン（４ml）とを充填した 。減圧下、６０分間かけて、溶剤を除去した。油状物をアセトニトリル（２．０ ml，最終濃度１４mM）に溶解し、トリエチルアミン（７７μl，０．５６mmol） を加えつつ、２０℃で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ ３６mg，０．１４mmol）を一度に加え、溶液を２０℃で４６時間撹拌した。反応 混合物をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で 洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン（２×１０ml）で逆抽出した（ba ck-extracted）。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッシ ュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付した 。所望の混合カーボネートは、透明な無色の油状物（１６．８mg，０．０１４mm ol，５１％）として、単離された。 ＦＫ５０６の二量化（３〜４） 乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に 、混合カーボネート（７．３mg，０．００６１mmol）とアセトニトリル（２５０ μl，最終濃度２５mM）とを充填した。トリエチルアミン（１０μl，０．０７５ mmol）を加え、続いて、ｐ−キシリーレンジアミン（８．３μl，０．００２７m mol，０．３２MＤＭＦ溶液）を加えた。反応物を２０℃で２２時間撹拌し、ジク ロロメタン（１０ml）で希釈することによってクエンチした。溶液を炭酸水素ナ トリ ウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を分離し、水層をジクロロメタン（２ ×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、 フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１） に付すと、透明な無色の油状物（４．３mg，１．９μmol，７０％）として、所 望の保護されたダイマーを与えた。 ＦＫ５０６タイマーの脱保護（４〜５） 回転翼を取り付けた１．５mlのポリプロピレンチューブに、保護されたダイマ ー（３．３mg，１．４μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５ml，最終濃度 ３mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher）を加えつつ、溶液を２ ０℃で撹拌した。溶液を室温で１８時間撹拌した。ついで、脱保護されたＦＫ５ ０６誘導体を、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶 液との間で分配させた。両相を混合するために、試験管に激しい渦流を生じさせ 、分離後、有機相をピペットで除去した。水相をジクロロメタン（４×２ml）で 逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロ マトグラフィ（ヘキサン：ＴＨＦ：エーテル１：１：１〜ＴＨＦ：エーテル１： １）に付すと、透明な無色の油状物（１．７ｍｇ，０．９３μmol，６５％）と して、所望のダイマーを与えた。 上記処理法に従い、他のモノアミン類およびジアミン類、例えば、ベンジルア ミン（１４）、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン等を使用するこ とができる。実施例 １０ ＦＫ５０６のＬ−セレクトライドによる還元（ＦＫ５０６〜６） Danishefskyと共同研究者達は、ＦＫ５０６をＬ−セレクトライドで処理する と、Ｃ２４およびＣ２２ヒドロキシル基で形成するボロネートエステルを有する ２２−ジヒドロ−ＦＫ５０６を与えることを示した［Coleman and Danishefsky ，Heterocycles（1989）28，157-161；Fisher，et al.，J．Org．Chem．（1991 ）56，2900-2907］。 混合カーボネートの製造（６〜７） １０mlのフラスコに、２２−ジヒドロ−ＦＫ５０６−sec-ブチルボロネート （１２５．３mg，０．１４４mmol）とアセトニトリル（３．０ml，最終濃度５０ mM）とを充填し、トリエチルアミン（２００μl，１．４４mmol，１０当量）を 透明な溶液に加えつつ、室温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボ ネート（１８４．０ｍｇ，０．７１９mmol）を一度に加え、透明な溶液を室温で ４４時間撹拌した。溶液を酢酸エチル（２０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム 飽和水溶液（１０ml）で洗浄し、相を分離した。ついて、水相を酢酸エチル（２ ×１０ml）で逆抽出し、有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、得られた油 状物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜１：２）に 付すと、透明な無色の油状物（８９．０mg，０．０８８mmol，６１％）として所 望の混合カーボネートを与えた。 ＦＫ５０６混合カーボネートの二量化（７〜８） 乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に 、混合カーボネート（１５．０mg，０．０１４８mmol）とジクロロメタン（５０ ０μl，最終濃度３０mM）とを充填した。トリエチルアミン（９μl，０．０６７ mmol，１０当量）を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、ｐ−キシリーレン ジアミン（０．８mg，０．００５９mmol）を加えた。反応物を２０℃で１６時間 撹拌し、ジクロロメタン（５ml）で希釈することによってクエンチした。炭酸水 素ナトリウム飽和水溶液（５ml）で溶液を洗浄した。相を分離し、水層をジクロ ロメタン（２×５ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し 、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜１：２ ）に付すと、透明な無色の油状物（７．４mg，３．８μmol，６５％）として、 所望のダイマーを与えた。 上記処理法に従い、キシリーレンジアミンの代わりに、その他のモノアミン類 、ジアミン類またはトリアミン類、例えば、ベンジルアミン（１５）、オクチレ ンジアミン、デカメチレンジアミン（１６）、ビス−ｐ−ジベンジルアミン、Ｎ −メチルジエチレンアミン、トリス−アミノエチルアミン（１７）、トリス−ア ミノプロピルアミン、１，３，５−トリアミノメチルシクロヘキサン等を使用す ることができる。実施例 １１ ＦＫ５０６（１〜９）の酸化開裂および還元 Kellyの処理方法［VanRheenen et al.，Tetrahedron Lett．（1976）17，1973 -1976］に従い、オスミレーション（osmylation）を行った。Danishefskyの処理 方法［Zell，et al.，J．Org．Chem．（1986）51，5032-5036］に従い、開裂を 行った。Krishnamurthyの処理方法［J．Org．Chem.，（1981）46，4628-4691］ に従い、アルデヒド還元を行った。１０mlのフラスコに、２４，３２−ビス［（ ｔ−ブチルジメチルシリル）］オキシ］−ＦＫ５０６（８４．４mg，０．０８２ mmol）、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（４８mg，０．４１mmol，５当量） およびＴＨＦ（２．０ml，最終濃度４１mM）を充填した。オスミウムテトラオキ シド（４５μl，０．００８mmol，０．１当量）をシリンジを介して加えた。透 明な無色の溶液を室温で５時間撹拌した。ついで、反応物を５０％水性メタノー ル（１．０ml）で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウムを一度に加えた。曇った混合物 を室温で４０分間撹拌し、エーテル（１０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽 和水溶液（５ml）で洗浄した。相を分離し、水層をエーテル（２×５ml）で逆抽 出した。合わせた有機層は、（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、固体のナトリウムサルフ ァイト（５０mg）で処理した。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、油状物をフラ ッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１）に付すと、透 明な無色の油状物として、中間体の不安定なアルデヒド（５３．６mg）を与えた 。このアルデヒドを直ちにＴＨＦ（４．０ml）に溶解し、窒素雰囲気下、−７８ ℃に冷却し、リチウムトリス［（３−エチル−３−ペンチル）オキシ］アルミニ ウムハイドライド（０．６０ml，０．０８２mmol，０．１４MＴＨＦ溶液，１． ０当量）で処理した。透明な溶液は、−７８℃で１０分間撹拌し、ついで、エー テル（４ml）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液を加えることによってクエ ンチした。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固体の硫酸ナトリウ ムを加えた。ついで、混合物を濾過し、濃縮し、得られた油状物をフラッシュク ロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル２：１）に付すと、透明な無色の油状物 （３９．５mg，０．０３８mmol，４７％）として、所望のアルコールを与えた。 混合カーボネート類の製造（９〜１０） 混合カーボネートの製造は、Ghosh,TetrahedronLett．（1992）33，2781-2784 の方法によって達成された。１０mlのフラスコに、第１級アルコール（３８．２ mg，０．０３６９mmol）とアセトニトリル（２．０ml，最終濃度１０mM）とを充 填し、２，６−ルチジン（４３μl，０．３７mmol，１０当量）を加えつつ、室 温で撹拌した。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（４８mg，０．１８ mmol）を一度に加え、溶液を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をエーテル（ １０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄した。相を 分離し、水層をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（Ｍｇ ＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチ ル２：１〜１：１）に付した。所望の混合カーボネートが、透明な無色の油状物 （３２．６mg，０．０２８mmol，７５％）として単離された。 ベンジルカルバメートの製造（１０〜１１） 乾燥した１mlのコニカルガラスビーカー（Kontes Scientific Glassware）に 、混合カーボネート１０（８．７mg，０．００７４mmol）とアセトニトリル（５ ００μl，最終濃度１５mM）とを充填した。トリエチルアミン（１０μl，０．０ ７４mmol，１０当量）を加えつつ、溶液を室温で撹拌し、続いて、ベンジルアミ ン（１．６μl，０．０１５mmol，２当量）を加えた。反応物を室温で４時間撹 拌した。乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグラフィ （ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１）に付すと、透明な無色の油状物（６． ２mg，５．３μmol，７２％）として、所望の保護されたモノマーを与えた。 回転翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたモノマー （０．２mg，５．３μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５ml，最終濃度１ １mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．０N）を加 えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で１８時間撹拌した。ついで、１５ ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、脱保護 されたＦＫ５０６誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて両相を 混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で 、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッ シュ クロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル１：１〜０：１）に付すと、透明な無 色の油状物（３．９mg，４．１μmol，７８％）として、所望の脱保護されたベ ンジルカルバメートを与えた。 ベンジルカルバメート（１３）をジアミン、例えば、キシリーレンジアミン（ １２）、ヘキサメチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジア ミン（１３）またはその他のジアミン類で置き換えることによって、本発明のダ イマー化合物類が製造される。実施例 １２ ＦＫ５０６の混合カーボネート（１２）の製造 １０mlのフラスコに、２４，３２−ビス［（ｔ−ブチルジメチルシリル）］オ キシ］−ＦＫ５０６（３３９．５mg，０．３２９mmol）、４−メチルモルホリン Ｎ−オキシド（１９３mg，１．６４mmol，５当量）、水（０．２０ml）およびＴ ＨＦ（８．０ml，最終濃度４１mN）を充填した。オスミウムテトラオキシド（０ ．１８３ml，０．０３３mmol，０．１当量，０．１８M水溶液）をシリンジを介 して加えた。透明な無色の溶液を室温で４．５時間撹拌した。反応物を５０％水 性メタノール（４．０ml）で希釈し、過ヨウ素酸ナトリウム（７００mg，３．２ ９mmol，１０当量）を一度に加えた。曇った混合物を室温で２５分間撹拌し、エ ーテル（２０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１０ml）で洗浄し た。相を分離し、水層をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。合わせた有機相 は、ＭｇＳＯ₄および固体のナトリウムサルファイト（５０mg）上で乾燥させた 。ついで、有機相を濾過し、濃縮し、得られたアルデヒドを直ちにＴＨＦ（８． ０ml）に溶解し、窒素雰囲気下で、−７８℃に冷却し、リチウムトリス［（３− エチル−３−ペンチル）オキシ］アルミニウムハイドライド（２．３５ml，０． ３２９mmol，ＴＨＦの０．１４M溶液，１．０当量）で処理した。透明な溶液は 、−７８℃で６０分間撹拌し（ＴＬＣによって綿密にモニターした）、ついで、 エーテル（５ml）で希釈し、塩化アンモニウム飽和水溶液（０．３ml）を加える ことによってクエンチした。混合物を室温まで暖め、溶液を乾燥するために、固 体の硫酸ナトリウムを加えた。混合物を２０分間撹拌し、濾過し、濃縮し、得ら れた油状物を直ちにアセトニトリル（１０ml）に溶解した。得られた第１級アル コール のＣＨ₃ＣＮ溶液に、２，６−ルチジン（０．３８０ml，３．３mmol，１０当量 ）とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（４２０mg，１．６５mmol，５ 当量）とを加えた。不均一な混合物を室温で１９時間撹拌し、その時点で、溶液 をエーテル（３０ml）で希釈し、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２０ml）で洗 浄した。水相をエーテル（２×１０ml）で逆抽出した。有機相を合わせ、（Ｍｇ ＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチ ル３：１〜２：１〜１：１）に付した。所望される混合カーボネート１２は、透 明な無色の油状物（２１７mg，０．１８４mmol，４工程を通して５６％）として 単離された。実施例 １３ ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチ ルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリーレンジアミン架橋）の製 造 乾燥した１mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート（２３．９mg， ０．０２３mmol）とアセトニトリル（５００μl，最終濃度４１mM）とを充填し た。トリエチルアミン（２８μl，０．２０mmol，１０当量）を加え、続いて、 ｐ−キシリーレンジアミン（４６μl，０．０１０１mmol，０．２２MＤＭＦ溶液 ）を加えた。反応物を室温で１８時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状 物を直接フラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜 １：１）に付すと、透明な無色の油状物（１１．９mg，５．３μmol，５２％） として、所望の保護されたダイマーを与えた。実施例 １４ ＦＫ１０１２−Ａ（ｐ−キシリーレンジアミン架橋）（１３）の 製造 回転翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー （１１．０mg，４．９μmol）を入れた。アセトニトリル（０．５Oml，最終濃度 １０mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．０N）を 加えつつ、溶液を２０℃で撹拌した。溶液を室温で１６時間撹拌した。ついで、 １５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で、脱 保護されたＦＫ５０６誘導体を分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相 を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml） で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラ ッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／ＴＨＦ／エーテル：１：１：１〜ＴＨＦ／ エーテル１：１）に付すと、透明な無色の油状物（５．５mg，３．０μmol，６ ３％）として、ＦＫ１０１２−Ａを与えた。実施例 １５ ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチ ルシリル）オキシ］−ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカン架橋）の製造 乾燥した１mlのコニカルガラスビーカーに、混合カーボネート（５３．３mg， ０．０４５３mmol）とアセトニトリル（２．０ml，最終濃度１１mM）とを充填し た。トリエチルアミン（１６μl，０．１１mmol，５当量）を加え、続いて、ジ アミノデカン（６１μl，０．０２２６mmol，０．３７MＤＭＦ溶液）を加えた。 反応物を室温で１２時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラ ッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル３：１〜２：１〜１：１）に付 すと、透明な無色の油状物（１８．０mg，７．８μmol，３５％）として、所望 の保護されたダイマーを与えた。実施例 １６ ＦＫ１０１２−Ｂ（ジアミノデカン−１，１０架橋）（１４）の 製造 撹拌翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー （１８．０mg，７．８μmol）を入れた。アセトニトリル（０．４５ml，最終濃 度１６mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液；Fisher，最終濃度３．６N） を加えつつ、溶液を２０℃で撹拌した。溶液を２３℃で１７時間撹拌した。つい で、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液との間で 、生成物ＦＫ１０１２−Ｂを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさせて相を 混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４×２ml）で 、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し、フラッ シュクロマトグラフィ（１００％酢酸エチル〜酢酸エチル／メタノール２０：１ ）に付すと、透明な無色の油状物（５．３mg，２．９μmol，３７％）として、 ＦＫ１０１２−Ｂを与えた。実施例 １７ ２４，２４’，３２，３２’−テトラキス［（ｔ−ブチルジメチ ルシリル）オキシ］ＦＫ１０１２−Ｃ（ヒス−ｐ−アミノメチルベンゾイルジア ミノデカン架橋）の製造 乾燥した２５mlテイア形（tear-shaped）フラスコに、ジアミンリンカー（１ ５．１mg，０．０３４４mmol）とＤＭＦ１．０mlとを充填した。別のフラスコで 、混合カーボネートとトリエチルアミン（０．１００ml，０．７００mmol，２０ 当量）とをジクロロメタン２．０mlに溶解し、ついで、緩やかに（４×０．５０ ml）、ヒス−ｐ−アミノメチルベンゾイルジアミノデカン−１，１０の撹拌溶液 に加えた。混合カーボネート１２を入れたフラスコをジクロロメタン（２×０． ５０ml）で洗浄し、混合カーボネート１２を完全に移した。反応物を２３℃で１ ６時間撹拌し、乾燥窒素流で溶剤を除去し、油状物を直接フラッシュクロマトグ ラフィ（ヘキサン／酢酸エチル１：１〜１：２）に付すと、透明な無色の油状物 （２９．６mg，１１．５μmol，３４％）として、所望の保護されたダイマーを 与えた。実施例 １８ ＦＫ１０１２−Ｃ（１５）の製造 撹拌翼を取り付けた１．５mlポリプロピレンチューブに、保護されたダイマー （２９．６mg，１１．５μmol）（１７）を入れた。アセトニトリル（０．４５m l，最終濃度２３mM）を加え、ＨＦ（５５μl，４８％水溶液：Fisher，最終濃度 ３．６N）を加えつつ、溶液を室温で撹拌した。溶液を室温で１７時間撹拌した 。ついで、１５ml試験管中、ジクロロメタンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液と の間で、所望される対称なダイマーを分配させた。試験管に激しい渦流を生じさ せて相を混合し、分離後、有機相をピペットで除去した。ジクロロメタン（４× ２ml）で、水相を逆抽出し、合わせた有機相を（ＭｇＳＯ₄で）乾燥し、濃縮し 、フラッシュクロマトグラフィ（１００％酢酸エチル〜酢酸エチル／メタノール １５：１）に付すと、透明な無色の油状物（１１．５mg，５．５μmol，４７％ ）として、ＦＫ１０１２−Ｃを与えた。ＣｓＡ誘導体の製造 実施例 １９ ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＨ¹ＣｓＡ（２） ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＡｃ¹・ＣｓＡ（１）（１６１mg，１２４mmol） ［Eberle and Nuninger，J．Org．Chem．（1992）57，2689参照。］をメタノー ル（１０ml）に溶解した。ＫＯＨ（１９６mg）を水（８ml）に溶解した。ＫＯＨ 溶液２９７ml（０．１３０mmol，１．０５当量）を（１）のＭｅＯＨ溶液に加え た。この新たな溶液を不活性雰囲気下室温で４時間撹拌し、その時点で、反応を 酢酸（２ml）でクエンチした。５cm×２５cm，１２μ，１００Ａ．Ｃ１８カラム を用い、０．１％（v/v）トリフルオロ酢酸を含有する７０％アセトニトリル／ Ｈ₂Ｏで溶離する逆相ＨＰＬＣによって反応混合物を精製すると、所望のモノア セテート（２）１１２mg（７２％）を与えた。 ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＣＯＩｍ¹ＣｓＡ（３） ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＨ¹ＣｓＡ（２）（５７mg，４５．５μmol）とカ ルボニルジイミダゾール（１５mg，２当量，９１μmol）とを５０ml丸底フラス コに移し、乾燥ＴＨＦ（６ml）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（３２ μl，４当量，１８２μmol）を加え、ついで、ロータリーエバポレータで、溶剤 を室温で除去した。酢酸エチルを溶離液として用いるシリカゲル上、フラッシュ クロマトグラフィによって残渣を精製すると、所望のカルバメート（３）４５mg （７３％）を与えた。 トリス（２−アミノエチル）アミンＣｓＡトリマートリアセテート（６） ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）・・ＯＣＯｌｍ¹ＣｓＡ（３）（７．５mg，５．５４μm ol，３．１当量）をＴＨＦ（１００μl）に溶解した。ジイソプロピルエチルア ミン（６２μl，５当量，アミン１００μlをＴＨＦ４mlに含有する溶液８．９３ μmol）を加え、続いて、トリス（２−アミノエチル）アミン（２６μl，１．７ ９μmol，トリスアミン１０１mgを１０mlＴＨＦに含有する溶液１当量）を加え た。この溶液をＮ₂雰囲気下５日間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ついで、 ０〜５％メタノールクロロホルムを用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグ ラフィにより精製すると、所望の生成物（６）４．１mgを与えた。実施例 ２０ ジアミノデカンＣｓＡダイマー（８） 固体のＮａ金属（２００mg，過剰）を乾燥メタノール（１０ml）と０℃で反応 させた。ジアミノデカンＣｓＡダイマージアセテート（５）（４．０mg）をＭｅ ＯＨ（５ml）に溶解させた。ＮａＯＭｅ溶液２．５mlを（５）の溶液に加えた。 不活性雰囲気下室温で撹拌２．５時間後、酢酸（２ml）で溶液をクエンチし、５ mm×２５mm，１２μ，１００Ａ．Ｃ１８カラムを用い、０．１％（v/v）トリフ ルオロ酢酸を含有する７０〜９５％アセトニトリル／Ｈ₂Ｏで２０分間かけて溶 離する逆相ＨＰＬＣによって反応生成物を精製すると、所望のジオール２．５mg （６０％）を与えた。 トリス（２−アミノエチル）アミンを０．４５当量の１，１０−ジアミノデカ ンで置き換えることによって、ジアミノデカンＣｓＡジアセテート（５）を製造 した。実施例 ２１ ｐ−キシリーレンジアミンＣｓＡダイマー（４） トリス（２−アミノエチル）アミンを０．４５当量のｐ−キシリーレンジアミ ンで置き換えることによって、ｐ−キシリーレンジアミンＣｓＡダイマー（４） を製造した。 文献に記載された処理方法に従い、１（ＭｅＢｍｔ１）部位以外の部位をリン カーすることによって、シクロフィリンのその他の誘導体を製造した。 位置８Ｄ異性体類縁体は、生成有機体にＤ−アミノ類縁体を供給して特にその 部位に組み込むことによって製造される。Patchett，et al.，J．Antibiotics（ 1992）45，943(β-MeSO)D-Ala⁸-CsA）：Traber，et al.，ibid，（1989）42，59 1参照。位置３の類縁体は、特にＳａｃ３の炭素部位でのＣｓＡのポリリチエー ション／アルキレーションによって製造される。（シクロフィリン結合および活 性プロフイル、特に、D-MePhe3-CsAに対しては）Wenger，Transp1ant Proceeedi ng（1986）18，213，supp.５；および、（誘導体の製造に対しては）1987年10月 27日に発行されたSeebachの米国特許No．4,703,033参照。 シクロスポリンＡの代わりに、上記処理方法に従うと、ＣｓＡのその他天然産 の変種を本発明での使用のために多量化（multimerized）することができる。実施例 ２２ （Ａ）ＦＫ１０１２“バンプ(Bump)”化合物およびＦＫＢＰ１２ 類の代償性突然変異（Compensatory Mutations）による構造基体のデザインおよ び合成 ＦＫ５０６のＣ９およびＣ１０における置換基は、合成によってもアクセスす ることができ、合成によってアクセスされているが、異なる一連のＦＫＢＰ１２ 側鎖残基と相反する。かくして、このようなリガンドに対する突然変異によって 生じるレセプターの一つの類は、異なる修飾基を含有し、あるものは、Ｃ１０置 換基に対する代償穴を形成し、また、あるものは、Ｃ９置換基に対する代償穴を 形成する。炭素１０は、選択的に修飾され、（ＦＫ５０６でのヒドロキシル基に 対して）炭素から突出するＮ−アセチルまたはＮ−ホルミル基を有する。これら 誘導体の結合性は、これらＣ１０バンプが固有のＦＫＢＰ１２に対する結合を有 効に失うことを明瞭に現す。図２３は、追加のＣ９バンプを含有するＦＫ５０６ −タイプ部分の合成のためのスキームを示す。このようなリガンドを本発明のリ ンカー部分と結合させることによって、代償性突然変異を有する対応結合領域を 含有するキメラ蛋白質に対するＨＥＤおよびＨＯＤ（ならびに拮抗剤）を構成す ることができる。Ｃ９およびＣ１０に修飾基を含有するＨＥＤ試薬の例を図２３ に示す。 かくして、本発明は、Ｃ９およびＣ１０のいずれか、もしくは、両方に、−Ｏ Ｒ、−Ｒ、−（ＣＯ）ＯＲ、−ＮＨ（ＣＯ）Ｈまたは−ＮＨ（ＣＯ）Ｒ［式中、 Ｒは、直鎖、分岐または環式であってもよい、置換もしくは非置換パーオキシド 類およびカーボネート類を含む、置換または非置換アルキルまたはアリールアル キルである。］を含む官能基を含有するＦＫ−５０６−タイプ部分を含む一つの 類のＦＫ−５０６−タイプの化合物を包含する。“ＦＫ５０６−タイプ部分”と しては、ＦＫ−５０６の環構造の少なくとも（置換もしくは非置換）Ｃ２〜Ｃ１ ５部分を保持し、天然または修飾ＦＫＢＰと結合することができ、好ましくは、 約１０^-6以下のＫｄ値を有する、（ラパマイシンをも含む）ＦＫ５０６、ＦＫ５ ２０、および、合成もしくは天然産の変種、類縁体およびその誘導体が挙げられ る。 本発明は、さらに、本発明のリンカー部分に共有結合した、このような一以上 のＦＫ−５０６−タイプの化合物を含有するホモダイマーおよびヘテロダイマー ならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。これらＦＫ−５０６−タイプ の化合物のモノマー類も、また、リンカー部分に共有結合されていてもいなくと も重要であり、あるいは、対応するＦＫＢＰに対するそれらの結合親和性が失わ れないように修飾されていてもいなくとも重要である。このようなモノマー化合 物は、オリゴマー化拮抗試薬、すなわち、類似のＦＫ−５０６−タイプ化合物に 基づくオリゴマー化試薬に対する拮抗剤として使用することができる。好ましく は、本発明に従うこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、ＦＫＢＰ１２に対 するＦＫ５０６の親和性よりも少なくとも０．１％、好ましくは、少なくとも約 １％、さらに好ましくは、少なくとも約１０％大きい親和性を有する、天然、ま たは、好ましくは、突然変異によって生ずる、ＦＫＢＰ類と結合する。例えば、 以下のHolt et al.参照。 本発明のこれらおよびその他リガンドに対するレセプター領域は、構造基体、 部位指向またはランダム突然変異法によって得ることができる。我々は、Ｃ９お よび／またはＣ１０に修飾基を含有するＦＫ５０６−タイプおよびＦＫ−５２０ −タイプのリガンドに対するレセプター領域として、一以上のＴｙｒ２６、Ｐｈ ｅ３６、Ａｓｐ３７、Ｔｙｒ８２およびＰｈｅ９９の代わりに、Ｖａｌ、Ａｌａ 、Ｇｌｙ、Ｍｅｔまたはその他の小さなアミノ酸を含有するＦＫＢＰ１２部分の 系統を考えている。 部位指向突然変異は、メガプライマー突然変異プロトコールを用いて行うこと ができる［例えば、Sakar and Sommer，Bio Techniques 84（1990）：404-407参 照］。cＤＮＡシーケンスは、シーケナーゼキットで行われる。突然変異を生ず るＦＫＢＰ１２類の発現は、多くのＦＫＢＰ突然変異体がE．Coli菌株ＸＡ９０ で発現されているので、E.Coli菌株ＸＡ９０中のプラスミド（plasmid）ｐＨＮ １⁺で行うことができる。突然変異を生ずる蛋白質は、便宜上、ＤＥ５２アニオ ン交換樹脂上で分画によって精製され、続いて、他の箇所で記載したように、セ ファロース上のサイズ排除によって精製される。例えば、Aldape et al，J．Bio l．Chem 267 23（1992）：16029-32およびPark et al.，J．Biol Chem 267 5（1 992）：3316-3324参照。結合定数は、二つの方法のうちの一つによって、容易に 決定することができる。突然変異を生ずるＦＫＢＰ類が十分なロータマーゼ（ro tamas e）活性を維持する場合には、標準ロータマーゼ分析法を利用することができる 。例えば、Galat et al，Biochemistry 31（1992）：2427-2434参照。これとは 別に、突然変異を生ずるＦＫＢＰ１２類は、我々が先にＦＫＢＰ類およびシクロ フィリン類で使用した、ＬＨ２０樹脂と放射性標識したＴ２−ジヒドロＦＫ５０ ６およびＴ２−ジヒドロＣｓＡとを用いる結合分析法に付すことができる。Bier er et al．Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87 4（1993）：555-69。（Ｂ） 酵母の２−ハイブリッドシステムを用いるバンプ−ＦＫ５０６類に対す るＦＫＢＰ１２中での代償性突然変異の選択 ＦＫＢＰ１２を含めて、レセプター蛋白質またはレセプター領域を得るための 一つのアプローチは、強力な酵母の“２−ハイブリッド”または“相互作用トラ ップ”システムである。２−ハイブリッドシステムは、相互に相互作用する蛋白 質を検出するために使用されている。転写活性領域に融合されたターゲット蛋白 質からなる“ベイト（bait）”融合蛋白質は、ＤＮＡ結合領域に融合された強力 な“フック（hooks）”のcＤＮＡライブラリーで共同発現される（co-expressed ）。蛋白質−蛋白質（ベイト−フック）相互作用は、その合成がＤＮＡ結合の合 体と活性領域とを必要とする、レポータージーン生成物の発現によって検出され る。ここでいう酵母の２−ハイブリッドシステムは、本来、Elledgeと共同研究 者によって開発された。Durfee et al，Genes & Development 74（1993）：555- 69およびHarper et al，Cell 75 4（1993）：805-816。 ２−ハイブリッドシステムそれ自体は、小さな分子、有機リガンドを含むレセ プター−リガンド相互作用に洞察を与えることができないので、我々は、（以下 に記載する）新しいＦＫ１０１２誘発可能な転写活性システムを開発した。この システムを用いると、小さな分子（例えば、本発明のＦＫ５０６類もしくはＦＫ １０１２類またはＦＫ５０６−タイプの分子）を調べることができるように、２ −ハイブリッドシステムを拡張することができる。最初に、ＦＫ５０６のＣ９お よびＣ１０を取り囲む部位に局所的に局在させた突然変異体で突然変異を生ずる ＦＫＢＰ類（フック）のcＤＮＡライブラリーを発生させる。ベイトに対しては 、二つの異なる方法を追及することができる。第１の方法は、ＦＫ５０６がＦＫ Ｂ Ｐ１２と結合し、カルシニューリンと結合する複合表面を形成する能力を使用す る。かくして、シーケンス特異転写活性化剤は、ＤＮＡ結合領域−突然変異体Ｆ ＫＢＰ１２…バンプ−ＦＫ５０６…カルシニューリンＡ−活性化領域（ここで、 …は、非共有結合相互作用を表す。）を構成する。第２の方法は、ＦＫ１０１２ 類が二つのＦＫＢＰに同時に結合することのできる能力を使用する。ＦＫ１０１ ２のＨＥＤバージョンは、以下のアンサンブルに対してスクリーニングするため に使用される。ＤＮＡ−結合領域−突然変異体ＦＫＢＰ１２…バンプ−ＦＫ５０ ６−正常なＦＫ５０６…ワイルドタイプのＦＫＢＰ−活性化領域。 １． ベイトとしてのカルシニューリンＧａ１４活性化領域融合 Ｇａ１４活性化領域とカルシニューリンＡサブユニット融合構造とを含有する ｐＳＥ１１０７の誘導体を構成した。提案された様式でベイトとして機能するそ の能力は、カルシニューリンのＦＫＢＰ−ＦＫ５０６結合部位をマップ（map ou t）するための２−ハイブリッドシステムを用いる研究によって立証された。 ２． ベイトとしてのhFＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域融合： hＦＫＢＰ１２ｃＤＮＡは、開放読み取りフレーム（open reading frame）全 体をカバーするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして削除され、平滑 末端化され、平滑末端化されたｐＳＥ１１０７のＸｈｏＩ部位に連結されて、全 長にわたるhＦＫＢＰ−Ｇａ１４活性化領域蛋白質融合を生ずる。 ３． 突然変異体hＦＫＢＰ１２cＤＮＡライブラリー hＦＫＢＰ１２は、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化され、平滑化され、 ＮＣｏｌで切断され、平滑化されたpＡＳ１（Durfee et al．supra）にクローン 化することができる。このプラスミドは、さらに、ＮｄｅＩで消化されて、ｐＡ Ｓ１のポリリンカーシーケンスのＮｄｅＩ部位とhＦＫＢＰ１２の５’末端との 間でＮｄｅＩフラグメントを脱離し、再度連結される。これは、hＦＫＢＰ１２ −Ｇａ１４ＤＮＡ結合領域蛋白質融合を生ずる。hＦＫＢＰは、プライマー＃１ １２０６および＃１１２１０で再度増幅された。プライマーの表： プライマーの表： 代償性突然変異をスクリーニングするのに使用される局 所的に局在化したhＦＫＢＰ１２cＤＮＡライブラリーの構成に使用されるプライ マー ついで、ポリメラーゼ連鎖反応によって限られた位置にランダム化されたhＦ ＫＢＰの突然変異体シーケンスを含有する以下に掲示したプライマーを用いて、 突然変異体hＦＫＢＰ１２cＤＮＡフラグメントを製造し、Ｇａ１４ＤＮＡ結合領 域−hＦＫＢＰ（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）構造に挿入した。 ４． 酵母菌株 S，cerevisiae Y153は、ゲノムに結合された二つの選択可能な標識ジーン（ｈ ｉｓ３／β−ガルクトシダーゼ）を担持し、Ｇａ１４プロモータによって駆動さ れる（Durfee，supra）。 ベイトとしてのカルシニューリン−Ｇａ１４活性化領域の使用 ＦＫＢＰ１２−ＦＫ５０６錯体は、高い親和性で、カルシニューリンタイプ２ Ｂ蛋白質ホスファターゼに結合する。我々は、２−ハイブリッドシステムで架橋 として機能させるためにＣ９−またはＣ１０−バンプリガンドを使用するので、 代償性突然変異を含有するcＤＮＡライブラリーよりのこれらＦＫＢＰ類のみが 転写活性化剤を生成する。便宜上、各々、８，０００個の突然変異体ＦＫＢＰ１ ２類を含有する（プライマー表のプライマー１１２０７〜１１２０９を用いて） 、少なくとも３種の異なるライブラリーを製造することができる。ＦＫＢＰ１２ −ＦＫ５０６構造を点検することによって、ランダム化された部位が選択され、 これは、その突然変異がバンプされたＦＫ５０６類上のＣ９またはＣ１０置換基 に逆らって結合することを可能とする残基のクラスターを示唆する。ついで、ラ イブラリーは、Ｃ９−およびＣ１０−バンプＦＫ５０６類を用いて、個々に、ス クリーニングされる。バンプ−ＦＫ５０６と代償性hＦＫＢＰ１２突然変異体と の間の相互作用は、ホスト酵母のｈｉｓドロップアウト培地上で成長する能力と β−ガラクトシダーゼジーンの発現とによって検出することができる。この選択 は、バンプＦＫ５０６の存在に依存し、虚偽の陽性は、バンプＦＫ５０６リガン ドを満たすか、満たさないレプリカプレートで消去スクリーニングすることによ って除くことができる。 ベイトとしてのhＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域の使用 hＦＫＢＰ１２突然変異を生ずるcＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた めにカルシニューリンＡ−Ｇａ１４活性化領域を使用することは、ＦＫＢＰ１２ 上の代償性突然変異を同定する簡単な方法である。しかし、バンプＦＫ５０６類 をhＦＫＢＰ１２と結合可能とする突然変異は、突然変異体ＦＫＢＰ１２…バン プＦＫ５０６錯体とカルシニューリンとの間の相互作用を妨げる。ベイトとして カルシニューリンを用いる最初のスクリーニングが失敗した場合、ワイルドタイ プのhＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域が、代わりに、使用される。固有のＦ Ｋ５０６−バンプＦＫ５０６（図１６）からなるＦＫ１０１２ＨＥＤ試薬が合成 され、フックとして使用することが可能である。ＦＫ１０１２のＦＫ５０６部分 は、ＦＫＢＰ１２−Ｇａ１４活性化領域と結合することができる。ＦＫ１０１２ のバンプＦＫ５０６部分とＦＫＢＰ１２の代償性突然変異体との間の相互作用は 、ホスト酵母をｈｉｓドロップアウト培地上で成長可能とし、β−ガラクトシダ ーゼを発現する。このように、選択は、hＦＫＢＰ１２突然変異体のバンプＦＫ ５０６と相互作用する能力にのみ基づく。虚偽の陽性を除くために、同様の消去 スクリーニング法を使用することができる。 バンプ−ＦＫ５０６類の代償性hＦＫＢＰ１２突然変異体に対する結合親和性 を決定するために、先に検討したインビトロの結合分析法以外に、インビボ分析 法を使用することができる。酵母の２−ハイブリッドシステムにおいて、β−ga l活性は、“ベイト（bait）”と“プレイ（prey）”との間の相互作用の度合い によって決定される。かくして、バンプＦＫ５０６と代償性ＦＫＢＰ１２突然変 異体との間の親和性は、異なるＨＥＤ（固有のＦＫ５０６−バンプＦＫ５０６） 濃度でホスト酵母によって生成される対応するβ−ガラクトシダーゼ活性によっ て評価することができる。 同様の方法を用いると、原型として低親和性代償性ＦＫＢＰ１２突然変異体を 有する他のバンプ接触残基中に、さらにランダム化された突然変異を生ずるＦＫ ＢＰ１２cＤＮＡライブラリーを生成し、同様にスクリーニングすることができ る。高親和性代償性ＦＫＢＰ突然変異に対するファージデイスプレイスクリーニング バンプＦＫ５０６に対するある種の高親和性hＦＫＢＰ１２突然変異体は、別 個の蛋白質領域で数個の組み合わせ点突然変異を含有する。適当な組み合わせ突 然変異を含有するライブラリーの寸法は、酵母の２−ハイブリッドシステムの容 量に対しては大きすぎる（例えば、＞１０⁸突然変異）。全ての機能官能性蛋白 質を暴露するためのビヒクルとしてのバクテリオファージの使用は、大多数の突 然変異をスクリーニングする能力を著しく増大させる。例えば、Bass et al.，P roteins：Structure，Function & Genetics 8 4（1990）：309-14；McCaffery e t al.，Nature 348 6301(1990)：552-4;および、Hoogenboom，Nucl Acid Res 19 15（1991）：4133-7参照。所望の高親和性代償性突然変異体が酵母の２−ハイ ブリッ ドシステムで同定できない場合には、大多数の組み合わせ突然変異は、キャリヤ ーとしてのファージベクトルを有するhＦＫＢＰ１２上に形成することができる 。突然変異を生ずるhＦＫＢＰ１２融合ファージは、親和性マトリックスとして のバンプＦＫ５０６−セファロースでスクリーニングすることができ、これは、 我々の独特のＦＫ５０６−基体親和性マトリックスに類似した方法で合成するこ とができる。Fretz et al.，J．Am．Chem．Soc．113 4（1991）：1409-1411。結 合およびファージ増幅を繰り返し行うと、高親和性の代償性突然変異体を同定す ることができる。（Ｃ） “バンプ（bumped）（ＣｓＡ）２類”の合成：ＭｅＶａｌ（１１）Ｃｓ Ａの修飾 上記詳細に記載したように、我々は、二量化領域としてのシクロフィリンの使 用および細胞死信号伝達路のコンテキスト中でのＨＯＤ試薬としての（ＣｓＡ） ２の使用の実現を示した。しかし、（ＣｓＡ）２試薬の細胞活性をさらに最適化 するために、ＦＫ１０１２類で記載したのと類似の方法に従うのがよい。かくし て、特に、試薬がそのターゲットを識別できることが望ましい用途に、修飾され た（バンプ）ＣｓＡ基体のオリゴマー化試薬を使用するのが好ましく、人工の蛋 白質を内因性シクロフィリン類より構成する。 本発明の修飾ＣｓＡ誘導体の一つの類は、（ａ）ＮＭｅＶａｌ１１が、ＮＭｅ Ｐｈｅ（置換もしくは非置換であってもよい）またはＮＭｅＴｈｒ（スレオニン β−ヒドロキシル基が非置換もしくは置換であってもよい）で置換されているか 、あるいは、（ｂ）ＮＭｅＶａｌ１１のpro−Ｓメチル基が、炭素原子少なくと も２個を有するか、好ましくは、３個以上を有する嵩高い基で置換されており、 これは、直鎖、分岐であってもよく、および／または、環式部分を含有していて もよく、アルキル（エチル、もしくは、好ましくは、プロピル、ｔ−ブチル等の ブチル）、アリール、または、アリールアルキルであってもよい、ＣｓＡ類縁体 である。これらの化合物としては、ＭｅＶａｌ１１の代わりに、ＮＭｅＬｅｕ、 ＮＭｅＩＩｅ、ＮＭｅＰｈｅ、または、特に、非天然産のＮＭｅ［β−ＭｅＰｈ ｅ］を含有するＣｓＡ類縁体が挙げられる。“（ｂ）”ＣｓＡ化合物は、式２： ［式 中、Ｒは、上記検討した官能基を表す。］の化合物である。 本発明は、さらに、一以上のこのようなＣｓＡ類縁体を含有する、ホモダイマ ーおよびヘテロダイマーならびにそれより高次のオリゴマー類を包含する。好ま しくは、本発明に従いこれらを含む化合物およびオリゴマー類は、天然、もしく は、好ましくは、突然変異体シクロフィリン蛋白質に、シクロフィリンに対する ＣｓＡの親和性より少なくとも０．１％、好ましくは、少なくとも約１％、さら に好ましくは、少なくとも１０％大きい親和性で結合する。 ＣｓＡから出発して、修飾［ＭｅＶａｌ¹¹］ＣｓＡ誘導体を製造するために、 ２工程法を使用することもできる。第１の工程では、残基ＭｅＶａｌ１１が、マ クロサイクルから除かれる。第２の工程では、選択されたアミノ酸が、（前者の ）ＭｅＶａｌ１１部位に導入され、鎖状のペプチドが環化される。この方法の利 点 は、全合成と比較して、数個の修飾［ＭｅＶａｌ¹¹］ＣｓＡ誘導体に容易にアク セスすることができることである。合成スキームは、以下の通りである。 アミド結合を識別するために、アミノ基とＭｅＢｍｔ１からのヒドロキシル基 との間で、Ｎ，Ｏシフトを達成すると、ＩｓｏＣｓＡ［Ruegger et al.，Helv． Chim．Acta．59 4（1976）：1075-91］を与えた（上記スキーム参照）。反応は 、メタンスルホン酸の存在で、ＴＨＦ中で行った［Oliyai et al.，Pharm Res 9 5（1992）：617-22］。ピリジンと無水酢酸とのワンポット処理法で、遊離のア ミンをアセチル基で保護した。Ｎ−アセチル保護ＩｓｏＣｓＡの総収率は９０％ である。ついで、エステルＭｅＢｍｔ１−ＭｅＶａｌ１１結合を、Ｎ−メチルア ミド結合の存在中、例えば、ＤＩＢＡＬＨを用いて、選択的に還元する。ついで 、得られるジオールをもう一つの酸誘導Ｎ，Ｏシフトで対応するジエステルに変 換する。これは、新たに形成されたエステルの水性塩基による加水分解を通して 除去するために、Ｎ−アセチル基とＭｅＶａｌ１１残基とを用意する。 遊離のアミノ基を保護した後、新たなアミノ酸残基を、例えば、ピブロップ（ PyBrop）のカップリング剤で導入する。鎖状ペプチドのＤＭＡＰ［Alberg and S chreiber，Science 262 5131(1993):248-250］存在中でのＢＯＰによる脱保護お よび環化は、２の合成を完了させる。バンプＣｓＡ類のシクロフィリン類への結 合は、ＦＫ５０６類およびＦＫ１０１２類に対して記載したのと同様の方法によ って測定することができる。シクロフィリンを代償性突然変異で一度同定すると 、バンプ（ＣｓＡ）２ＨＥＤおよびＨＯＤ試薬は、先に検討した方法に従い合成 することができる。それら自体シクロフィリン蛋白質と１：２の化学量論比で結 合することのできるダイマーを形成するバンプＣｓＡ化合物が特に重要である。 少なくとも一つのこのようなＣｓＡまたは修飾ＣｓＡ部分を含有するホモダイマ ーおよびそれより高次のホモオリゴマー類、ヘテロダイマーおよびそれより高次 のヘテロオリゴマー類は、ＦＫ１０１２Ａおよび（ＣｓＡ）２に対して開発され た方法によってデザインされ、測定され、ＦＫ１０１２の研究に類似した方法で リンカー素子を最適化する。 リガンド上に特に嵩高い基を収容することによって、我々の位置１１ＣｓＡ変 種（２）を結合する突然変異体シクロフィリン類を新たに製造することができる 。これらの代償性突然変異を有するシクロフィリン類は、ＦＫ１０１２の研究で 記 載した構造基体部位指向およびランダム突然変異／スクリーニングプロトコール を介して同定することができる。 上記結果より、本方法および組成物が多種多様な目的のための細胞の生産にお いて非常な融通性を与えることは明らかである。本構造物を使用することによっ て、治療目的に細胞を使用することが可能であり、この場合、細胞は、必要とさ れるまで不活性なままであり、ついで、安全な薬剤を投与することによって活性 化される。細胞は、ホスト中で、多種多様の寿命を有することができるので、短 期間または長期間の保護を付与するために、慢性および急性の徴候を処置する機 会が存在する。また、特別な部位、例えば、解剖部位または官能部位に応じた細 胞を提供することができ、それら部位で、治療効果を生ずる。 多種多様な蛋白質の分泌を生ずる細胞を提供することができ、これは、不足分 を補ったり、望ましくない結果、例えば、破壊剤を失活させたり、限られた細胞 ポピュレーションを殺したりする細胞溶解細胞の活性化を抑制する機能を果たす 。ホスト中に限られた期間細胞を存在させることによって、細胞は、ホスト中の 細胞の迅速な応答を生ずることのできる用量で薬剤を取り込み、容易に活性化す ることができる。発現したキメラレセプターが細胞内に存在する細胞が提供され 、細胞表面上での異質蛋白質による免疫応答を回避することができる。さらに、 細胞内キメラレセプター蛋白質は、リガンドが結合する際に、有効な信号変換を 生じ、細胞外レセプター領域でのレセプター結合よりも明らかに有効である。キ メラ膜に結合したレセプターに結合する比較的単純な分子を使用し、重要な生成 物の発現を生じさせたり、生成物の発現を抑制したりすることによって、細胞治 療処置法を提供することができる。投与することのできる化合物は、安全であり 、種々の方法で投与することができ、極めて特異的な応答を確実に生じ、動的平 衡を損なわない。 本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特 許出願を、参考のために、特別、かつ、個々に指摘して、本明細書中に引用した 。 理解しやすくするために、本発明を図および実施例によって幾分詳細に説明し たが、当業者であれば、本発明の請求の精神および範囲から逸脱することなく、 ある種の変形および変更をなすことができることは、本発明の教示に照らして容 易に理解できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／１７９，７４８ (32)優先日 1994年１月７日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ ，ＮＬ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ (72)発明者 クラブトゥリー，ジェラルド・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94062, ウッドサイド，ダーラム・ロード ７ (72)発明者 シュレイバー，スチュアート・エル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー (72)発明者 スペンサー，デービッド・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，イースト・エディス・ア ベニュー 115 (72)発明者 ワンドレス，トーマス・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー (72)発明者 ベルショー，ピーター アメリカ合衆国マサチューセッツ州02138, ケンブリッジ，オックスフォード・ストリ ート 12，ハーバード・ユニバーシティ, デパートメント・オブ・ケミストリー 【要約の続き】 伝子療法における新しい可能性を与える。遺伝子転移技 術を用いて本発明者の人工受容体を導入すると、活性 「ダイマライザー」または「脱ダイマライザー」をそれ ぞれ経口投与することによって治療用タンパク質の過剰 発現をもたらすシグナリング経路を開始させることがで きるしまたは停止させることができる。異なる受容者か らの細胞は、種々の疾患において用いるための異なる治 療用タンパク質を過剰発現する経路を有するような構造 でありうるので、ダイマライザーは「万能薬」として役 立つ可能性がある。それらは、更に、他の状況では静脈 内注射または細胞内発現を必要とすると考えられる治療 用アンチセンス薬またはタンパク質（例えば、ＬＤＬ受 容体またはＣＦＴＲタンパク質）の細胞透過性有機代替 物と考えることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）ある選択されたリガンドに対して結合することができる少なくと も一つの受容体ドメインを、（ｂ）該リガンドに対する暴露によって生物学的過 程を開始することができる異種の追加タンパク質ドメインに対して融合して含む キメラタンパク質をコードしているＤＮＡ構築物であって、該リガンドは２個ま たはそれ以上のキメラタンパク質分子に対して結合することができる上記ＤＮＡ 構築物。 ２． キメラタンパク質が、望ましい細胞区分に対してキメラタンパク質を向 けることができる細胞内標的ドメインを更に含む請求項１に記載のＤＮＡ構築物 。 ３． 細胞内標的ドメインが、分泌リーダー配列、膜スパニングドメイン、膜 結合ドメイン、または小胞若しくは核と結合するようにタンパク質を支配する配 列を含む請求項２に記載のＤＮＡ構築物。 ４． 選択されたリガンドに対する結合のためのキメラタンパク質のＫｄ値が 約１０^-6Ｍであるかまたはそれ未満である請求項１に記載のＤＮＡ構築物。 ５． 選択されたリガンドの分子量が約５ｋＤａ未満である請求項１に記載の ＤＮＡ構築物。 ６． 異種の追加タンパク質ドメインが、 （ａ）リガンドに対する暴露によって、検出可能な細胞内シグナルを開始させ ることができるタンパク質ドメイン； （ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質；または （ｃ）転写活性化ドメイン を含む請求項１に記載のＤＮＡ構築物。 ７． 細胞内シグナルが、前記オリゴマー化に対して応答性の転写制御要素の 転写制御下の遺伝子の転写を活性化することができる請求項６に記載のＤＮＡ構 築物。 ８． 追加タンパク質ドメインがＣＤ３のゼータサブユニットである請求項７ に記載のＤＮＡ構築物。 ９． キメラタンパク質が、ＦＫ５０６型リガンド、シクロスポリンＡ型リガ ンド、テトラサイクリンまたはステロイドリガンドに対して結合することができ る請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。 １０．請求項１〜９のいずれかに記載のキメラタンパク質のオリゴマー化に対 して応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子をコードしているＤＮＡ構 築物。 １１．標的遺伝子が、本来は応答性転写制御要素の転写制御下にない請求項１ ０に記載のＤＮＡ構築物。 １２．（ａ）請求項１〜９の記載のキメラタンパク質のオリゴマー化に対して 応答性の転写制御要素および（ｂ）標的遺伝子と一緒に宿主細胞中への転写制御 要素の相同的組換えを可能にする標的遺伝子からのフランキングＤＮＡ配列を有 するＤＮＡ構築物。 １３．標的遺伝子が、表面膜タンパク質、分泌タンパク質、細胞質タンパク質 若しくはリボザイムまたはアンチセンス配列をコードする請求項１０〜１２に記 載のＤＮＡ構築物。 １４．請求項１〜１３のいずれかに記載のＤＮＡ構築物と、宿主細胞中へのＤ ＮＡ構築物のトランスフェクションおよび該構築物を含むトランフェクタントの 選択を可能にする選択可能なマーカーとを含むＤＮＡベクター。 １５．ベクターがウイルスベクターである請求項１４に記載のＤＮＡベクター 。 １６．アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクターまたはレトロ ウイルスベクターである請求項１５に記載のＤＮＡベクター。 １７．請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物によってコードされたキ メラタンパク質。 １８．請求項１〜１３のいずれかに記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含 む且つ発現することができる細胞。 １９．哺乳動物細胞である請求項１８に記載の細胞。 ２０．（ａ）（ｉ）ある選択されたリガンドに対して結合することができる少 なくとも一つの受容体ドメインおよび（ｉｉ）該受容体ドメインに関して異種で あるが、１種類またはそれ以上の他の類似のドメインとのオリゴマー化によって 、前記オリゴマー化に対して応答性の転写制御要素の転写制御下の標的遺伝子の 転写の活性化を引き起こすことができるもう一つのタンパク質ドメインを含むキ メラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；および （ｂ）前記オリゴマー化に対して応答性の転写制御要素の発現制御下の標的遺 伝子を含み； しかも選択されたリガンドに対する暴露後に標的遺伝子を発現する請求項１８に 記載の細胞。 ２１．（ａ）ＤＮＡ結合ドメインおよび第一の選択されたリガンド残基に対し て結合することができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第一キメラタン パク質；並びに （ｂ）転写活性化ドメインおよび（第一の選択されたリガンド残基と同じであ ってよいしまたは異なっていてよい）第二の選択されたリガンドに対して結合す ることができる少なくとも一つの受容体ドメインを含む第二キメラタンパク質を コードしているＤＮＡ構築物の第一セットと、 ＤＮＡ結合ドメインと結合し且つ転写活性化ドメインに対して応答性である異種 転写制御配列の転写制御下の標的遺伝子をコードしている第二ＤＮＡ構築物とを 含む請求項１８に記載の細胞であって、１種類または複数の選択されたリガンド 残基を有する物質に対する暴露後に標的遺伝子を発現する上記細胞。 ２２．（ａ）（ｉ）ある選択されたリガンドに対して結合することができる少 なくとも一つの受容体ドメインを、（ｉｉ）該リガンドに対する暴露によって生 物学的過程を開始することができる異種の追加タンパク質ドメインに対して融合 して含むキメラタンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；および （ｂ）キメラタンパク質のオリゴマー化に対して応答性の転写制御要素の転写 制御下の標的遺伝子をコードしている第二ＤＮＡ構築物 を含むＤＮＡ組成物。 ２３．（ａ）（ｉ）ある選択された第一リガンド残基に対して結合することが できる少なくとも一つの第一受容体ドメインを、（ｉｉ）第二キメラタンパク質 の存在下において該リガンドに対する暴露によって生物学的過程を開始すること ができる異種の追加タンパク質ドメインに対して融合して含む第一キメラタンパ ク質をコードしているＤＮＡ構築物；および （ｂ）（ｉ）ある選択された第二リガンド残基に対して結合することができる 少なくとも一つの受容体ドメインを、（ｉｉ）第一キメラタンパク質の存在下に おいて該リガンドに対する暴露によって生物学的過程を開始することができる異 種の追加タンパク質ドメインに対して融合して含む第二キメラタンパク質をコー ドしているＤＮＡ構築物を含み； 但し、第一および第二受容体残基は同じであってよいしまたは異なっていてよい し、しかも第一および第二の選択されたリガンド残基は同じであってよいしまた は異なっていてよいし；および （ｃ）キメラタンパク質のオリゴマー化に応答性の転写制御要素の転写制御下 の標的遺伝子をコードしている標的ＤＮＡ構築物 を含むＤＮＡ組成物。 ２４．請求項１〜９に記載の２個またはそれ以上のキメラタンパク質分子に対 して結合して、それらのオリゴマーを生成することができるリガンドであって、 式 リンカー−｛ｒｂｍ₁，ｒｂｍ₂，・・・ｒｂｍ_n｝ （式中、ｎは、２〜約５の整数であり、ｒｂｍ₍₁₎〜ｒｂｍ_(n)は、同じであって よいしまたは異なっていてよいし、しかも１種類または複数のキメラタンパク質 に対して結合することができる受容体結合残基である） を有し、該ｒｂｍ残基は、２個またはそれ以上のｒｂｍ残基に対して共有結合（ 「−」）することができる二官能性または多官能性分子であるリンカー残基に対 して共有結合している上記リガンド。 ２５．分子量が約５ｋＤａ未満である請求項２４に記載のリガンド。 ２６．ｒｂｍ残基が同じであるかまたは異なり、しかもＦＫ５０６型残基、シ クロスポリン型残基、ステロイドまたはテトラサイクリンを含む請求項２４に記 載のリガンド。 ２７．天然に存在する受容体に対して、約１０^-5より大のＫｄ値で結合する請 求項２４に記載のリガンド。 ２８．少なくとも一つのｒｂｍが、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシンま たはそのＣ９、Ｃ１０若しくは両方が修飾された誘導体の分子を含む請求項２４ に記載のリガンド。 ２８．リンカー残基が、Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン残基、Ｃ４〜Ｃ１８アザアル キレン残基、Ｃ６〜Ｃ２４Ｎ−アルキレンアザアルキレン残基、Ｃ６〜Ｃ１８ア リーレン残基、Ｃ８〜Ｃ２４アルジアルキレン残基またはＣ８〜Ｃ３６ビスカル ボキサミドアルキレン残基を含む請求項２４に記載のリガンド。 ２９．標的遺伝子の転写を活性化するための薬剤組成物を製造するための、請 求項２４に記載のリガンドの使用。 ３０．細胞において標的遺伝子の転写を活性化する方法であって、 （ａ）（ｉ）請求項７に記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物および（ｉｉ） 該ＤＮＡ構築物のオリゴマー化に対して応答性の転写制御要素の発現制御下の標 的遺伝子を含む且つ発現することができる細胞を提供し；そして （ｂ）該細胞を、標的遺伝子の発現を引き起こすための有効量のＤＮＡ構築物 によってコードされたキメラタンパク質に対して結合することができるリガンド に対して暴露することを含む上記方法。 ３１．細胞を培地中で増殖させ、そして培地に対してリガンドを加えることに よって暴露を行なう請求項３０に記載の方法。 ３２．細胞が宿主生物中に存在し、そして宿主生物に対してリガンドを投与す ることによって暴露を行なう請求項３０に記載の方法。 ３３．宿主生物が哺乳動物であり、そしてリガンドを下記の投与に適当なビヒ クル中で、経口、頬、舌下、経皮、皮下、筋内、静脈内、関節内または吸入投与 によって投与する請求項３２に記載の方法。 ３４．請求項２４に記載のリガンドに対して応答性の哺乳動物を提供する方法 であって、請求項１８に記載の細胞を宿主哺乳動物中に導入することを含む上記 方法。 ３５．請求項１４に記載のリガンドに対して応答性の哺乳動物を提供する方法 であって、１種類またはそれ以上の宿主哺乳動物細胞のトランスフェクションを 可能にする条件下において請求項１４に記載の少なくとも１種類のベクターを宿 主哺乳動物中に導入することを含む上記方法。 ３６．請求項１〜９のいずれかに記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物を含む キット。 ３７．１種類または複数の構築物によってコードされた１種類またはそれ以上 のキメラタンパク質が結合するリガンドを更に含む請求項３６に記載のキット。 ３８．リガンド−キメラタンパク質結合のアンタゴニストとしてモノマーリガ ンド試薬を更に含む請求項３７に記載のキット。 ３９．請求項１０〜１３に記載の少なくとも一つのＤＮＡ構築物を更に含む請 求項３６に記載のキット。 ４０．転写活性化因子ドメインに対して融合した（ある選択されたリガンドに 対して結合することができる）少なくとも一つの受容体ドメインを含むキメラタ ンパク質をコードしている第一ＤＮＡ構築物；ＤＮＡ結合ドメインに対して融合 した（ある選択されたリガンドに対して結合することができる）少なくとも一つ の受容体ドメインを含む第二キメラタンパク質をコードしている第二ＤＮＡ構築 物；並びにＤＮＡ結合ドメインが結合するＤＮＡ配列であって、第一および第二 キメラタンパク質の存在下でのリガンドに対する暴露によって転写活性化される 該ＤＮＡ配列を含む転写制御要素の制御下の標的遺伝子をコードしている第三Ｄ ＮＡ構築物を含むキット。 ４０．それぞれのＤＮＡ構築物が、１種類または複数の該ＤＮＡ構築物を含む 細胞の選択を可能にする、それぞれ異なるＤＮＡ構築物のための同じであってよ いしまたは異なっていてよい選択マーカーに対して結合している請求項３６〜３ ８のいずれかに記載のキット。 ４１．１種類またはそれ以上のＤＮＡ構築物が、作用ドメインまたは標的遺伝 子の代わりにクローニング部位を含む請求項３６〜３８のいずれかに記載のキッ ト。 ４２．キットで提供される１種類または複数のＤＮＡ構築物によって安定して 形質転換された陽性対照細胞を更に含む請求項３９に記載のキット。 ４３．請求項１８に記載の細胞を含む宿主生物。 ４４．植物または動物である請求項４３に記載の宿主生物。 ４５．蠕虫、昆虫または哺乳動物である請求項４４に記載の動物。 ４６．マウス若しくは他の齧歯類動物またはヒトである請求項４５に記載の哺 乳動物。