KR20240010752A

KR20240010752A - 결합-촉발된 전사 스위치 및 이들의 이용 방법

Info

Publication number: KR20240010752A
Application number: KR1020247000665A
Authority: KR
Inventors: 웬델 에이. 림; 레오나르도 모르수트; 콜 티. 로이발
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2015-02-24
Filing date: 2016-02-23
Publication date: 2024-01-24
Also published as: MX2017010721A; MX2022011180A; JP2018506293A; AU2022252737A1; KR102624023B1; JP2021019625A; IL287914A; US20180079812A1; WO2016138034A1; CN108064283B; JP6784687B2; EP3262166A1; BR112017017884A2; KR20170126897A; JP7357731B2; IL253463B; US20180208636A1; JP2022145748A; AU2016222887A1; US10836808B2

Abstract

본 발명은 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드, 이들 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 이들 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 이들 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 이들 핵산으로 형질도입된 및/또는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 결합 촉발된 전사 스위치 폴리펩티드 및/또는 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 생물체를 제공한다. 본 발명의 결합 촉발된 전사 스위치 폴리펩티드 및 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다양한 적용에서 유용하고, 이들 역시 제공된다.

Description

결합-촉발된 전사 스위치 및 이들의 이용 방법{BINDING-TRIGGERED TRANSCRIPTIONAL SWITCHES AND METHODS OF USE THEREOF}

교차 참조

본 출원은 2015년 2월 24일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/120,256; 2015년 11월 18일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/257,153; 그리고 2015년 12월 18일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/269,758에 우선권을 주장하고, 이들 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

연방 정부의 지원을 받은 연구에 관한 진술

본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 보조금 번호 EY016546; P50 GM081879; 그리고 R01 GM055040 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.

텍스트 파일로서 제공된 서열 목록의 참조로서 편입

서열 목록은 2016년 1월 26일자 작성되고, 그리고 649 KB의 크기를 갖는 텍스트 파일, "UCSF-511WO_SeqList_ST25.txt"로서 본원에서 제공된다. 상기 텍스트 파일의 내용은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

도입

Notch 수용체는 세포-세포 접촉 신호전달을 매개하고, 그리고 세포-대-세포 통신, 예를 들면, 두 접촉 세포 사이에 통신의 발달 및 다른 양상에서 핵심적인 역할을 수행하는 막경유 단백질인데, 여기서 한 접촉 세포는 "수신자" 세포이고 다른 접촉 세포는 "발송자" 세포이다. 수신자 세포에서 발현된 Notch 수용체는 발송 세포 상에서 발현된 그들의 리간드 (단백질의 델타 패밀리)를 인식한다. 이들 접촉 세포 상에서 노치 (notch) 및 델타의 포용은 세포질 내로 막으로부터 수용체의 세포내 부분의 방출을 궁극적으로 유발하는 노치 수용체의 2-단계 단백질분해를 야기한다. 이러한 방출된 도메인은 전사 조절인자로서 기능함으로써 수신자 세포 행동을 변경한다. Notch 수용체는 발달 동안 다양한 세포 기능에 관련되고 이들에 필요하고, 그리고 모든 종에 걸쳐서 방대한 숫자의 세포 유형의 기능에 대해 결정적이다.

요약

본 발명은 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드, 이들 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 이들 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 생물체를 제공한다. 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드를 이용하여 세포의 활성을 국부 조정하는 방법, 그리고 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드를 이용하는 국부화된 세포 활성화 시스템 역시 제공된다. 본 발명의 결합-촉발된 전사 스위치 폴리펩티드는 다양한 적용에서 유용하고, 이들 역시 제공된다.

본 발명은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 이들 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 이들 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 생물체를 제공한다. 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다양한 적용에서 유용하고, 이들 역시 제공된다.

본 발명은 N 말단으로부터 C 말단으로 및 공유 연쇄에서 다음을 포함하는 키메라 폴리펩티드 (본원에서 "키메라 Notch 수용체 폴리펩티드"로서 또한 지칭됨)를 제공한다: a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인; b) Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산의 길이를 갖고, 그리고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 Notch 수용체 폴리펩티드에 이종성이고, 그리고 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 300개 아미노산 내지 400개 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 세포외 도메인 및 Notch 수용체 폴리펩티드 사이에 삽입된 링커를 포함한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 억제인자이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 부위 특이적 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 부위 특이적 뉴클레아제는 Cas9 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 재조합효소이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 저해성 면역수용체이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 활성화 면역수용체이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체-기초된 인식 골격을 포함한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체를 포함한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 종양 특이적 항원, 질환-연관된 항원, 또는 세포외 기질 성분에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 세포 표면 항원, 가용성 항원, 또는 불용성 기질 위에 고정된 항원에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 단일 사슬 Fv이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 나노바디, 단일-도메인 항체, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 비항체-기초된 인식 골격이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 비항체-기초된 인식 골격인 일부 경우에, 비항체-기초된 인식 골격은 아비머, DARPin, 아드넥틴, 아비머, 어피바디, 안티칼린, 또는 아필린이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항원이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항원인 일부 경우에, 상기 항원은 내인성 항원이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항원인 일부 경우에, 상기 항원은 외인성 항원이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체에 대한 리간드이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 세포 부착 분자 (가령, 세포 부착 분자의 세포외 영역의 전부 또는 일부)이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 첫 번째 이합체화 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 이합체화 도메인을 포함한다; 예로서, 일부 경우에, 두 번째 이합체화 도메인에 첫 번째 이합체화 도메인의 결합은 소형 분자 이합체화 작용제에 의해 유도되고, 그리고 다른 경우에, 두 번째 이합체화 도메인에 첫 번째 이합체화 도메인의 결합은 광에 의해 유도된다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a-2g에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a-2g에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a-2g에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a-2g에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a-2g에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 3에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 3에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 3에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 3에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 3에서 묘사된 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:1). 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFTGGAGRDIPPPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:2). 일부 경우에, 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 S1, S2 및 S3 단백질분해 개열 부위에서 선택된다. 일부 경우에, S1 단백질분해 개열 부위는 아미노산 서열 Arg-X-(Arg/Lys)-Arg를 포함하는 퓨린-유사 프로테아제 개열 부위이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, S2 단백질분해 개열 부위는 Ala-Val 디펩티드 서열을 포함하는 ADAM-17-유형 프로테아제 개열 부위이다. 일부 경우에, S3 단백질분해 개열 부위는 Gly-Val 디펩티드 서열을 포함하는 γ -세크레타아제 개열 부위이다.

본 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 상기 핵산, 또는 상기 발현 벡터로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 면역 세포, 뉴런, 상피 세포 및 내피 세포, 또는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 대식세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되고, 그리고 여기서 키메라 폴리펩티드의 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 키메라 폴리펩티드의 세포내 도메인에 의해 활성화되는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.

본 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 세포내 도메인의 방출은 상기 세포의 활성을 조정한다. 일부 경우에, 상기 접촉은 생체내, 탈체, 또는 시험관내에서 실행된다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에 있거나, 불용성 기질 위에 고정되거나, 세포외 기질 내에 존재하거나, 인공 매트릭스 내에 존재하거나, 또는 가용성이다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포의 증식을 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포에서 아폽토시스를 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 아폽토시스 이외의 기전에 의해 세포 사멸을 유도한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 전사 조절, 염색질 조절, 번역, 트래피킹 또는 번역후 처리를 통해 세포에서 유전자 발현을 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포의 분화를 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포의 이주를 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포로부터 분자의 발현 및 분비를 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 두 번째 세포에 또는 세포외 기질에 세포의 부착을 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 방출은 세포에서 유전자 산물의 데노보 발현을 유도한다. 세포내 도메인의 방출이 세포에서 유전자 산물의 데노보 발현을 유도하는 일부 경우에, 유전자 산물은 전사 활성인자, 전사 억제인자, 키메라 항원 수용체, 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 번역 조절인자, 사이토킨, 호르몬, 케모킨, 또는 항체이다.

본 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 세포내 도메인은 상기 세포의 활성을 조정하는 작동체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 전사를 유도하는 전사 인자이다. 일부 경우에, 상기 접촉은 생체내, 탈체, 또는 시험관내에서 실행된다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에 있거나, 불용성 기질 위에 고정되거나, 세포외 기질 내에 존재하거나, 인공 매트릭스 내에 존재하거나, 또는 가용성이다. 일부 경우에, 작동체 폴리펩티드는 아폽토시스 유도인자, 아폽토시스 저해제, 활성화 면역수용체, 저해성 면역수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 수용체, 항체, 또는 부위 특이적 뉴클레아제이다.

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 다음을 발현하고: i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 그리고 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는, 본원에서 설명된 바와 같은 발명의 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 서로 상이하고, 여기서 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능을 제공하고; 그리고 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능과 상이한 두 번째 작동체 기능을 제공하고, 그리고 여기서 방출된 첫 번째 및 두 번째 세포내 도메인은 상기 세포의 활성을 조정한다. 일부 경우에, 상기 접촉은 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 상기 접촉은 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 상기 접촉은 시험관내에서 실행된다.

본 발명은 T 세포를 활성화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 T 세포 (여기서 T 세포는 i) 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 그리고 ii) CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 유전적으로 변형된다)를 고정된 항원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포외 도메인은 첫 번째 항원에 특이적인 항체를 포함하고, 그리고 여기서 상기 접촉은 세포 내에서 전사 활성인자의 방출 및 CAR의 생산을 유발하고, 여기서 상기 CAR은 두 번째 항원의 결합 이후에 T 세포의 활성화를 제공한다.

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는, 본 발명의 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 그리고 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는, 본 발명의 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 서로 상이하고, 여기서 두 번째 키메라 Notch 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 상기 접촉은 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 상기 접촉은 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 상기 접촉은 시험관내에서 실행된다.

본 발명은 T 세포를 활성화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 T 세포 (여기서 T 세포는 i) 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 그리고 ii) CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 또는 그 이상의 핵산으로 유전적으로 변형되고, 여기서 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 전사 활성인자이다)를 고정된 항원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 키메라 폴리펩티드의 세포외 도메인은 첫 번째 항원에 특이적인 항체를 포함하고, 그리고 여기서 상기 접촉은 세포 내에서 전사 활성인자의 방출 및 CAR의 생산을 유발하고, 여기서 상기 CAR은 두 번째 항원의 결합 이후에 T 세포의 활성화를 제공한다.

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 표면 위에 고정되는 항원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항원에 결합하고, 그리고 여기서 상기 접촉은 세포내 도메인의 방출 및 세포의 활성의 조정을 유발한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 세포의 분화를 조정하는 전사 인자이다.

본 발명은 세포의 활성을 국부 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 결합-촉발된 전사 스위치를 세포에서 발현하고; 그리고 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 활성화시키는 것을 유도하고, 따라서 활성화된 세포내 도메인을 생산하고, 여기서 활성화된 세포내 도메인은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 세포의 활성을 조정한다: 세포의 유전자 산물의 발현, 세포의 증식, 세포의 아폽토시스, 세포의 비-아폽토시스성 사멸, 세포의 분화, 세포의 탈분화, 세포의 이주, 세포로부터 분자의 분비 및 세포의 세포 부착.

일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포의 내인성 유전자 산물의 발현을 조정한다.

일부 경우에, 세포의 내인성 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 2차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제 및 저해성 면역수용체.

일부 경우에, 세포의 내인성 유전자 산물은 분비된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 세포의 내인성 유전자 산물은 표면 발현된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포의 2개 또는 그 이상의 내인성 유전자 산물의 발현을 동시에 조정한다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포의 이종성 유전자 산물의 발현을 조정한다.

일부 경우에, 세포의 이종성 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 케모킨, 케모킨 수용체, 키메라 항원 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 병원체 유래된 단백질, 증식 유도인자, 수용체, RNA 보도된 뉴클레아제, 부위 특이적 뉴클레아제, 소형 분자 2차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 독소 유래된 단백질, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 항체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 가공된 T 세포 수용체, 면역활성인자, 면역저해제, 저해성 면역수용체, RNA 보도된 DNA 결합 단백질 및 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치.

일부 경우에, 세포의 이종성 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 항체이다: 806, 9E10, 3F8, 81C6, 8H9, 아바고보맙, 아바타셉트, 아브식시맙, 아비투주맙, 아브릴루맙, 악토주맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알레파셉트, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, AMG 102, 아나투모맙 마페나톡스, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아크리투모맙, 아스크린바쿠맙, 아젤리주맙, 아타시셉트, 아테졸리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙/토실리주맙, 아토롤리무맙, AVE1642, 바피네우주맙, 바실리지맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베겔로맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, BMS-936559, 보코시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론티크주맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카를루맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, CC49, CDP791, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, cG250, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 시주투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트라제탄, 코드리투주맙, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, CP 751871, CR6261, 크레네주맙, CS-1008, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 데크트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에풍구맙, 엘델루맙, 엘겜무투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에밀베투주맙, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타네르셉트, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, F19, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 겜투주맙 오조가미신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베보틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, HGS-ETR2, hu3S193, huA33, 이발리주맙, 이브리투모맙 티우제탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, IGN101, IgN311, 이고보맙, IIIA4, IM-2C6, IMAB362, 이말루맙, IMC-A12, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이플리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 이제키주맙, J591, KB004, 켈릭시맙, KW-2871, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌지루맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트락섹탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루일주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 마파투무맙, 마게툭시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, MEDI4736, 메폴리주맙, 메텔리무맙, METMAB, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, MK-0646, MK-3475, MM-121, 모가물리주맙, MORAb-003, 모롤리무맙, 모타비주맙, MOv18, 목세투모맙 파수도톡스, MPDL33280A, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌리톡사시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨브로리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리토작시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, R1507, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데타이드, SCH 900105, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세토작시맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라제탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 테플리바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, TGN1412, 티실리무맙/트레멜리무맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, TNX-650, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀모루킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로시지맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스.

일부 경우에, 세포의 이종성 유전자 산물은 분비된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 세포의 이종성 유전자 산물은 표면 발현된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포의 2개 또는 그 이상의 이종성 유전자 산물의 발현을 동시에 조정한다. 일부 경우에, 접촉은 생체내, 탈체, 또는 시험관내에서 실행된다.

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에 있거나, 불용성 기질 위에 고정되거나, 세포외 기질 내에 존재하거나, 인공 매트릭스 내에 존재하거나, 또는 가용성이다. 일부 경우에, 세포내 전사 인자는 세포의 분화를 직접적으로 조정한다. 일부 경우에, 전사 인자는 두 번째 전사 인자의 발현을 조정함으로써 세포의 분화를 간접적으로 조정한다.

일부 경우에, 세포는 면역 세포이고, 그리고 세포의 활성은 면역 세포의 분화이다. 일부 경우에, 세포는 면역 세포이고, 세포내 도메인은 세포의 분화를 조정하는 전사 인자이고, 그리고 세포의 활성은 면역 세포의 분화이다. 일부 경우에, 전사 인자는 면역 세포의 분화를 직접적으로 조정한다. 일부 경우에, 전사 인자는 두 번째 전사 인자의 발현을 조정함으로써 면역 세포의 분화를 간접적으로 조정한다.

일부 경우에, 세포는 줄기 세포이고, 그리고 세포의 활성은 줄기 세포의 분화이다. 일부 경우에, 세포는 선조체 또는 전구체 세포이고, 그리고 세포의 활성은 선조체 또는 전구체 세포의 분화이다.

일부 경우에, 세포내 도메인의 활성화는 전사 조절, 염색질 조절, 번역, 트래피킹 또는 번역후 처리를 통해 세포의 내인성 유전자의 발현을 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 활성화는 두 번째 세포에 또는 세포외 기질에 세포의 세포 부착을 조정한다.

일부 경우에, 결합 전달기는 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 결합 전달기의 개열을 유도하고, 따라서 결합 신호를 전달하고, 그리고 세포내 도메인을 단백질분해적으로 방출함으로써 세포내 도메인을 활성화시킨다.

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 및 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 다음을 발현하고: i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치; 그리고 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 최소한 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치; 여기서 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능을 제공하고, 그리고 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인은 첫 번째와 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원의 결합이 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 첫 번째와 두 번째 세포내 도메인을 활성화시키도록 유도할 때, 첫 번째 작동체 기능과 상이한 두 번째 작동체 기능을 제공한다.

일부 경우에, 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인의 작동체 기능은 세포의 유전자 산물의 발현을 조정한다.

일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 세포의 내인성 유전자 산물이다. 일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 세포의 이종성 유전자 산물이다. 일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 2차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제 및 저해성 면역수용체.

일부 경우에, 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인의 작동체 기능은 세포의 유전자 산물의 발현을 조정한다. 일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 세포의 내인성 유전자 산물이다. 일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 세포의 이종성 유전자 산물이다.

일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 2차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제 및 저해성 면역수용체.

일부 경우에, 첫 번째와 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 결합 전달기 중에서 최소한 하나는 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고, 여기서 개별 특이적 결합 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원의 결합은 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 결합 전달기의 개열을 유도하고, 따라서 결합 신호를 전달하고, 그리고 세포내 도메인을 단백질분해적으로 방출함으로써 개별 세포내 도메인을 활성화시킨다.

일부 경우에, 첫 번째와 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치 둘 모두의 결합 전달기가 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다.

일부 경우에, 상기 방법은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합을 경쟁적으로 저해하고, 따라서 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 활성화시키는 결합 전달기의 유도를 예방하는 가용성 저해제 분자와 세포를 접촉시키는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 세포를 상기 가용성 저해제 분자와 접촉시키는 것은 가용성 저해제 분자를 첫 번째 세포에 적용하거나 또는 투여하고 및/또는 가용성 저해제 분자를 발현하는 두 번째 세포의 존재에서 상기 세포를 배치하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 두 번째 세포는 가용성 저해제 분자를 구조성으로 발현한다. 일부 경우에, 두 번째 세포는 가용성 저해제 분자를 조건적으로 발현한다.

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 세포는 다음을 발현하고: i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치; 그리고 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 최소한 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치, 여기서 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 접촉은 생체내, 탈체, 또는 시험관내에서 실행된다. 일부 경우에, 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에 있거나, 불용성 기질 위에 고정되거나, 세포외 기질 내에 존재하거나, 인공 매트릭스 내에 존재하거나, 또는 가용성이다.

일부 경우에, 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인의 활성화는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 세포의 활성을 조정한다: 세포의 유전자 산물의 발현, 세포의 증식, 세포의 아폽토시스, 세포의 비-아폽토시스성 사멸, 세포의 분화, 세포의 탈분화, 세포의 이주, 세포로부터 분자의 분비 및 세포의 세포 부착.

일부 경우에, 세포의 활성은 세포의 유전자 산물의 발현이다. 일부 경우에, 세포의 유전자 산물은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 2차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제 및 저해성 면역수용체.

본 발명은 세포-세포 접촉을 추적하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫 번째 복수의 세포의 각 세포에서 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 결합-촉발된 전사 스위치를 발현하고; 두 번째 복수의 세포의 각 세포에서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원을 발현하고; 그리고 첫 번째 복수의 세포를 두 번째 복수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 결합 전달기가 결합-촉발된 전사 스위치의 결합 신호를 전달하고, 따라서 세포내 도메인을 활성화하도록 유도하고, 여기서 세포내 도메인의 활성화는 공간, 시간 또는 이들의 조합에서 세포-세포 접촉을 추적하는데 충분한 검출가능 리포터의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 첫 번째 복수의 세포, 두 번째 복수의 세포 또는 둘 모두 뉴런이다. 일부 경우에, 결합 전달기는 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 결합 전달기의 개열을 유도하고, 따라서 결합 신호를 전달하고, 그리고 세포내 도메인을 단백질분해적으로 방출함으로써 세포내 도메인을 활성화시킨다.

일부 경우에, 상기 및 여기에서 설명된 것들을 비롯한 결합-촉발된 전사 스위치는 SynNotch 폴리펩티드이다.

본 발명은 또한, 국부화된 세포 활성화 시스템을 제공하고, 상기 시스템은 다음을 포함한다: 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 발현된 결합-촉발된 전사 스위치; 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 결합-촉발된 활성화 폴리펩티드를 인코딩하는, 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인에 의해 유도되는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 세포; 여기서 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과의 접촉 시에 결합-촉발된 활성화 폴리펩티드는 발현되고, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과의 접촉 시에 결합-촉발된 활성화 폴리펩티드는 상기 세포를 활성화시킨다.

일부 경우에, 세포는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 면역 세포, 선조체 또는 전구체 세포, 줄기 세포 및 뉴런. 일부 경우에, 세포는 면역 세포이고, 결합-촉발된 전사 스위치는 항원 촉발된 전사 스위치이고, 그리고 결합-촉발된 활성화 폴리펩티드는 항원 촉발된 활성화 폴리펩티드이고, 여기서 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과의 접촉 시에 항원 촉발된 활성화 폴리펩티드는 발현되고, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과의 접촉 시에 항원 촉발된 활성화 폴리펩티드는 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 발현하는 표적 세포를 인식하도록 면역 세포를 활성화시킨다.

일부 경우에, 항원 촉발된 활성화 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, 항원 촉발된 활성화 폴리펩티드는 가공된 T 세포 수용체 또는 이의 변이체이다. 일부 경우에, 발현된 결합-촉발된 전사 스위치는 SynNotch 폴리펩티드이다.

본 발명은 세포의 활성을 국부 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫 번째 세포에서 결합 전달기, 세포내 도메인 및 가용성 어댑터 분자 상에서 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 첫 번째 어댑터 결합 도메인을 포함하는 첫 번째 세포외 도메인을 포함하는 결합-촉발된 전사 스위치를 발현하고; 첫 번째 세포를 i) 가용성 어댑터 분자 상에서 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하는 두 번째 어댑터 결합 도메인을 포함하는 두 번째 세포외 도메인을 발현하는 두 번째 세포; 그리고 ii) 효과적인 농도의 가용성 어댑터 분자와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 어댑터 분자에 첫 번째 어댑터 결합 도메인 및 두 번째 어댑터 결합 도메인의 결합은 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 활성화시키고, 따라서 활성화된 세포내 도메인을 생산하도록 유도하고, 여기서 활성화된 세포내 도메인은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 첫 번째 세포의 활성을 조정한다: 세포의 유전자 산물의 발현, 세포의 증식, 세포의 아폽토시스, 세포의 비-아폽토시스성 사멸, 세포의 분화, 세포의 탈분화, 세포의 이주, 세포로부터 분자의 분비 및 세포의 세포 부착. 일부 경우에, 접촉은 시험관내 또는 탈체에서 가용성 어댑터 분자를 세포에 적용하거나 또는 생체내에서 가용성 어댑터 분자를 세포에 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 첫 번째 세포를 효과적인 농도의 가용성 어댑터 분자와 접촉시키는 것은 어댑터 분자를 발현하는 세 번째 세포의 존재에서 첫 번째 세포를 배치하는 것을 포함하고, 여기서 세 번째 세포는 어댑터 분자를 구조성으로 또는 조건적으로 발현한다. 일부 경우에, 첫 번째 세포외 도메인 및 가용성 어댑터 분자가 특이적 결합 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원이다. 일부 경우에, 두 번째 세포외 도메인 및 가용성 어댑터 분자가 특이적 결합 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원이다. 일부 경우에, 첫 번째 세포외 도메인 및 두 번째 세포외 도메인은 항체 또는 나노바디이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 인자이다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 첫 번째 세포의 내인성 또는 이종성 유전자 산물의 발현을 조정한다. 일부 경우에, 결합 전달기는 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고, 여기서 가용성 어댑터 분자에 첫 번째 세포외 도메인 및 두 번째 세포외 도메인의 결합은 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 결합 전달기의 개열을 유도하고, 따라서 결합 신호를 전달하고, 그리고 세포내 도메인을 단백질분해적으로 방출함으로써 세포내 도메인을 활성화시킨다.

본 발명은 다음을 포함하는 숙주 세포를 제공한다: 첫 번째 항원에 반응성인 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산; 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치에 반응성이고, 그리고 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 첫 번째 프로모터; 두 번째 항원에 반응성인 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산; 그리고 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치에 반응성이고, 그리고 세포내 CAR 저해성 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 두 번째 프로모터, 여기서 두 번째 항원의 존재에서 세포내 CAR 저해성 도메인이 발현되어 CAR에 의한 세포의 활성화를 저해하고, 그리고 첫 번째 항원의 존재에서, 하지만 두 번째 항원의 부재에서 CAR이 발현되고 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 의해 활성화가능하다.

본 발명은 다음을 포함하는 숙주 세포를 제공한다: 첫 번째 항원에 반응성인 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산; 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치에 반응성이고, 그리고 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR의 첫 번째 부분을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 첫 번째 프로모터; 두 번째 항원에 반응성인 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산; 그리고 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치에 반응성이고, 그리고 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR의 두 번째 부분을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 두 번째 프로모터, 여기서 첫 번째 항원 및 두 번째 항원의 존재에서 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분이 발현되고, 그리고 CAR이 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 의해 활성화가능하다. 일부 경우에, 세포는 세 번째 항원에 반응성인 세 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산; 그리고 세 번째 결합-촉발된 전사 스위치에 반응성이고, 그리고 세포내 CAR 저해성 도메인을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 세 번째 프로모터를 더욱 포함하고, 여기서 세 번째 항원의 존재에서 세포내 CAR 저해성 도메인이 발현되어 CAR에 의한 세포의 활성화를 저해한다.

도면의 간단한 설명
도면 1은 Notch 수용체 폴리펩티드의 도식적 묘사이다.
도면 2a-2g는 다양한 종의 Notch 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 번호:131-137)을 제공한다.
도면 3은 다양한 포유류 종의 Notch 수용체 폴리펩티드의 부분의 아미노산 서열 정렬 (생쥐 - 서열 번호:138; 인간 - 서열 번호:139; 소 - 서열 번호:140)을 제공한다.
도면 4a-4g는 본 발명의 예시적인 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 5는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 이용하여, 작동체 기능의 직접적인 제어의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 6은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 이용하여, 작동체 기능의 직접적인 제어의 실례의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 7은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 이용하여, 작동체 기능의 간접적인 제어의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 8은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 이용하여, 작동체 기능의 간접적인 제어의 실례의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 9a 및 9b는 복수 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 병렬적 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 10은 복수 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 연속적 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 11은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 및 키메라 항원 수용체 (CAR)의 연속적 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 12는 멀티-세포 협동성을 보여주는, 2개 또는 그 이상의 세포에서 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 13은 다세포 환경에서 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 14는 2개 또는 그 이상의 세포를 갖는 복수 수용체 회로의 이용의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 15는 특정한 세포외 구조에 대한 응답으로 생물제제의 국부화된/표적화된 생산의 도식적 묘사를 제공한다.
도면 16a-16c는 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례 (서열 번호:141-143)를 묘사한다.
도면 17-29는 예시적인 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 아미노산 서열 (도면 17a-c - 서열 번호:144-146; 도면 18 - 서열 번호:147; 도면 19a-b - 서열 번호:148-149; 도면 20 - 서열 번호:150-153; 도면 21 - 서열 번호:154; 도면 22 - 서열 번호:155; 도면 23 - 서열 번호:156; 도면 24 - 서열 번호:157; 도면 25 - 서열 번호:158; 도면 26 - 서열 번호:159; 도면 27 - 서열 번호:160; 도면 28 - 서열 번호:161; 도면 29 - 서열 번호:162)을 제공한다.
도면 30a 및 30b는 TRE 리포터 라인에서 항-CD19로 키메라 Notch에 대한 대표적인 결과를 묘사한다.
도면 31a 및 31b는 TRE 리포터 라인에서 항-메소텔린으로 키메라 Notch에 대한 대표적인 결과를 묘사한다.
도면 32a 및 33b는 UAS 리포터 라인에서 키메라 Notch 항-CD19에 대한 대표적인 결과를 묘사한다.
도면 33a 및 33b는 항-CD19 키메라 Notch로 형질도입된 SV40/UAS 리포터 세포에서 결과를 묘사하는데, 여기서 세포내 도메인은 Gal4 DNA-결합 도메인 및 전사 억제인자 도메인 KRAB의 융합이다.
도면 34는 신호전달 릴레이의 연쇄 반응에서 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 이용을 묘사한다.
도면 35a-35c는 암 세포에서 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 및 T 세포 활성화에 대한 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 효과를 묘사한다.
도면 36은 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열 번호:163)을 제공한다.
도면 37-83은 예시적인 전사 활성인자 및 억제인자의 아미노산 서열 (도면 37 - 서열 번호:164; 도면 38 - 서열 번호:165; 도면 39 - 서열 번호:165; 도면 40 - 서열 번호:166; 도면 41 - 서열 번호:167; 도면 42 - 서열 번호:169; 도면 43 - 서열 번호:170; 도면 44 - 서열 번호:171; 도면 45 - 서열 번호:172; 도면 46 - 서열 번호:173; 도면 47 - 서열 번호:174; 도면 48 - 서열 번호:175; 도면 49 - 서열 번호:176; 도면 50 - 서열 번호:177; 도면 51 - 서열 번호:178; 도면 52 - 서열 번호:179; 도면 53 - 서열 번호:180; 도면 54 - 서열 번호:181; 도면 55 - 서열 번호:182; 도면 56 - 서열 번호:183; 도면 57 - 서열 번호:184; 도면 58 - 서열 번호:185; 도면 59 - 서열 번호:186; 도면 60 - 서열 번호:187; 도면 61 - 서열 번호:188; 도면 62 - 서열 번호:189; 도면 63 - 서열 번호:190; 도면 64 - 서열 번호:191; 도면 65 - 서열 번호:192; 도면 66 - 서열 번호:193; 도면 67 - 서열 번호:194; 도면 68 - 서열 번호:195; 도면 69 - 서열 번호:196; 도면 70 - 서열 번호:197; 도면 71 - 서열 번호:198; 도면 72 - 서열 번호:199; 도면 73 - 서열 번호:200; 도면 74 - 서열 번호:201; 도면 75 - 서열 번호:202; 도면 76 - 서열 번호:203; 도면 77 - 서열 번호:204; 도면 78 - 서열 번호:205; 도면 79 - 서열 번호:206; 도면 80 - 서열 번호:207; 도면 81 - 서열 번호:208; 도면 82 - 서열 번호:209; 도면 83 - 서열 번호:210)을 제공한다.
도면 84a 및 84b는 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 활성화에 대한 γ -세크레타아제 저해제의 효과를 묘사한다.
도면 85a 및 85b는 synNotch 수용체의 예시적인 모듈식 형상을 묘사한다.
도면 86a-86c는 SynNotch 수용체가 접촉 의존성 전사 조절을 프로그래밍하는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
도면 87a-87d는 도면 85a 및 85b에 관련된 추가 데이터를 제공한다.
도면 88a-88c는 도면 86a-c에 관련된 추가 데이터를 제공한다.
도면 89a 및 89b는 SynNotch 수용체가 다양한 세포 유형에서 기능한다는 것을 증명한다.
도면 90a-90c는 도면 89a 및 89b에 관련된 추가 데이터를 제공한다.
도면 91a-91d는 SynNotch 수용체가 다양한 세포 행동의 공간적 제어를 산출한다는 것을 증명한다.
도면 92a-92c는 도면 91a-d에 관련된 추가 데이터를 제공한다.
도면 93a-93c는 SynNotch 수용체가 서로에 직각이고, 그리고 조합 조절에 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
도면 94a-94c는 복수 synNotch 수용체가 다중층 자가-조직화 상피 패턴을 산출하는데 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
도면 95a-95c는 synNotch 수용체의 모듈성이 포유류 세포의 감지/반응 가공을 확대한다는 것을 보여준다.
도면 96a-96c는 synNotch 수용체를 이용하여 맞춤형 치료적 T 세포 반응을 정교하게 설계하는 잠재력을 보여준다.
도면 97a-97f는 synNotch 수용체가 CD4+ 및 CD8+ 인간 일차 T 림프구에서 항원-유도된 전사를 주동할 수 있다는 것을 보여준다.
도면 98a-98f는 synNotch 수용체가 항원-유도된 맞춤 사이토킨 프로그램을 주동할 수 있다는 것을 증명한다.
도면 99a-99e는 synNotch 수용체가 항종양 Th1 운명으로 T 세포 분화의 항원-의존성 편중화를 주동할 수 있다는 것을 증명한다.
도면 100a-100e는 비선천적 치료제의 맞춤 T 세포 전달 - synNotch 주동된 TRAIL 생산을 보여준다.
도면 101a-101c는 synNotch 수용체 가공된 T 세포를 통한 고형 종양에서 사이토킨의 생체내 국부 발현을 보여준다.
도면 102a-102b는 synNotch 수용체는 T 세포가 그들의 미세환경을 모니터링하고 선별적으로 조정할 수 있도록 허용하는 다능한 조절인자라는 것을 증명한다.
도면 103a-103f는 도면 97a-97f에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 104a-104i는 도면 98a-98f에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 105a-105g는 도면 99a-99e에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 106a-106h는 도면 100a-100e에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 107a-107e는 도면 101a-101c에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 108a-108d는 T 세포에서 조합 항원 감지를 위한 synNotch 수용체의 구체예를 제공한다.
도면 109a-109d는 synNotch-게이팅된 CAR 발현 - Jurkat T 세포 활성화를 위한 조합 항원 요건을 보여준다.
도면 110a-110f는 인간 일차 T 세포에서 synNotch 게이팅된 CAR 발현 - 치료적 T 세포 활성화 및 종양 사멸에 대한 조합 항원 제어를 보여준다.
도면 111a-111c는 생체내에서 종양 국부화된 CAR 발현을 주동하는 synNotch 수용체를 보여준다.
도면 112a-112d는 synNotch 게이팅된 CAR 발현에 의한 생체내 선별적 조합 항원 종양 사멸을 보여준다.
도면 113a-113c는 synNotch 수용체가 정밀 면역요법을 위해 CAR T 세포 반응을 제어하고 국부화한다는 것을 보여준다.
도면 114a-114d는 도면 109a-109d에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 115a-115i는 도면 110a-110f에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 116a-116c는 도면 111a-111c에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 117a-117e는 도면 112a-112d에 관련된 보충 데이터를 제공한다.
도면 118은 synNotch를 이용하여 인간 T 세포에서 Foxp3 발현의 유도를 보여준다.
도면 119는 인간 T 세포로부터 SynNotch 제어된 항체 분비를 위한 일반적인 항체 구조체 설계를 제공한다.
도면 120은 SynNotch 유도된 항체 분비를 시험하는데 이용된 시험관내 검정의 개략적 표시를 제공한다.
도면 121은 세포 표면 "샌드위치 ELISA" 유세포분석법 검정의 개략적 표시를 제공한다.
도면 122는 SynNotch T 세포가 항원 자극에 대한 응답으로 이종성 항체를 생산하도록 유도될 수 있다는 것을 증명한다.
도면 123은 분할 SynNotch 신호전달 시스템의 개략적 표시를 제공한다.
도면 124는 본 발명의 분할 SynNotch 신호전달 시스템의 한 구체예에 따른 가용성 어댑터 분자의 다양한 농도에서 수신자 세포 활성화를 보여준다.
도면 125는 본 발명의 한 구체예에 따른 3 세포 분할 SynNotch 신호전달 시스템의 개략적 표시를 제공한다.
도면 126은 본 발명의 한 구체예에 따른 3 세포 분할 SynNotch 신호전달 시스템에서 SynNotch 수신자 세포 활성화를 보여준다.
도면 127은 본 발명의 한 구체예에 따른 3 세포 분할 SynNotch 저해 신호전달 시스템의 개략적 표시를 제공한다.
도면 128은 본 발명의 한 구체예에 따른 3 세포 분할 SynNotch 저해 신호전달 시스템에서 SynNotch 수신자 세포 활성화의 저해를 보여준다.
도면 129a-129f는 본원에서 설명된 바와 같은 분할 CAR 시스템의 특정한 구체예의 개략적 표시를 제공한다 (도면 129f는 도면 129a-129e에서 표시된 계통도의 요소를 확인한다).
도면 130은 2 항원 게이팅된 분할 CAR 회로의 한 구체예를 묘사한다.
도면 131은 2 항원 게이팅된 분할 CAR 회로의 추가 구체예를 묘사한다.
도면 132는 3 입력 게이팅된 회로의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 133은 3 항원 게이팅된 SynNotch, 분할 CAR 회로의 한 형상의 다이어그램을 제공한다.
도면 134는 4 입력 게이팅된 회로의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 135는 5 입력 게이팅된 회로의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 136은 본 발명의 3 입력 AND + NOT 게이트의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 137은 분할 전사 인자 AND 기능성 및 우성 음성 NOT 기능성을 갖는 멀티입력 게이트의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 138은 멀티입력 게이팅된 CAR T 세포 활성화 회로의 한 구체예의 개략적 표시를 제공한다.
도면 139는 펨브로리주맙을 조건적으로 분비하도록 변형된 SynNotch CD4 T 세포의, 도면 122에서 수행된 분석과 유사한 분석의 결과를 제공한다.
도면 140은 펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch E6-1 Jurkat 세포의, 도면 122에서 수행된 분석과 유사한 분석의 결과를 제공한다.
도면 141은 대안 구조체를 이용하여 펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch E6-1 Jurkat 세포의, 도면 122에서 수행된 분석과 유사한 분석의 결과를 제공한다.
도면 142는 트레멜리무맙을 분비하도록 변형된 SynNotch CD4 T 세포의, 도면 122에서 수행된 분석과 유사한 분석의 결과를 제공한다.
도면 143은 트레멜리무맙을 분비하도록 변형된 SynNotch E6-1 Jurkat 세포의, 도면 122에서 수행된 분석과 유사한 분석의 결과를 제공한다.

정의

본원에서 교체가능하게 이용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"와 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)의 중합성 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어에는 단일-, 이중-, 또는 복수 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린과 피리미딘 염기 또는 다른 자연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

"작동가능하게 연결된"은 이렇게 설명된 성분이 그들이 그들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 근접위치를 지칭한다. 가령, 프로모터는 이러한 프로모터가 이의 전사 또는 발현에 영향을 주면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

"벡터" 또는 "발현 벡터"는 레플리콘, 예를 들면, 플라스미드, 파지, 바이러스, 또는 코스미드이고, 여기에 다른 DNA 분절, 다시 말하면, "삽입물"이 세포 내에서 부착된 분절의 복제를 야기하기 위해 부착될 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, "이종성"은 각각, 선천적 (가령, 자연발생) 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다.

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 Fab, Fv, scFv 및 Fd 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체 (scAb), 단일 도메인 항체 (dAb), 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, 나노바디, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그리고 항체의 항원 결합 (본원에서 항원 결합으로서 또한 지칭됨) 부분 및 비항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 임의의 아이소타입의 항체 또는 면역글로불린, 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 항체의 단편을 포함한다. 항체는 예로서, 방사성 동위원소, 검출가능한 산물을 산출하는 효소, 형광 단백질 등으로 검출가능하게 표지화될 수 있다. 항체는 다른 모이어티, 예를 들면, 특이적 결합 쌍의 구성원, 예를 들면, 비오틴 (비오틴-아비딘 특이적 결합 쌍의 구성원) 등에 더욱 접합될 수 있다. 항체는 또한, 폴리스티렌 평판 또는 비드 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고체 지지체에 결합될 수 있다. Fab', Fv, F(ab')₂, 및 또는 항원에 대한 특이적 결합을 유지하는 다른 항체 단편, 그리고 단일클론 항체 역시 상기 용어에 의해 포괄된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 단일클론 항체는 일군의 동일한 세포에 의해 생산된 항체인데, 이들 모두 반복성 세포 복제에 의해 단일 세포로부터 생산되었다. 다시 말하면, 세포의 클론은 단지 단일 항체 종류만을 생산한다. 단일클론 항체가 하이브리도마 생산 기술을 이용하여 생산될 수 있긴 하지만, 당업자에게 공지된 다른 생산 방법 역시 이용될 수 있다 (가령, 항체 파지 전시 라이브러리로부터 유래된 항체). 항체는 일가 또는 이가일 수 있다. 항체는 Ig 단위체일 수 있는데, 이것은 4개의 폴리펩티드 사슬: 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되는 "Y-모양" 분자이다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간화 면역글로불린"은 상이한 기원의 면역글로불린의 부분을 포함하는 면역글로불린을 지칭하는데, 여기서 최소한 한 부분은 인간 기원의 아미노산 서열을 포함한다. 가령, 인간화 항체는 필수적인 특이성을 갖는 비인간 기원, 예를 들면, 생쥐의 면역글로불린으로부터 및 인간 기원의 면역글로불린 서열로부터 유래된 부분 (가령, 키메라 면역글로불린), 전통적인 기술 (가령, 합성)에 의해 화학적으로 함께 연결된 부분, 또는 유전공학 기술을 이용하여 인접한 폴리펩티드로서 제조된 부분 (가령, 키메라 항체의 단백질 부분을 인코딩하는 DNA가 발현되어 인접한 폴리펩티드 사슬을 생산할 수 있다)을 포함할 수 있다. 인간화 면역글로불린의 다른 실례는 비인간 기원의 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 프레임워크 영역을 포함하는 하나 또는 그 이상의 면역글로불린 사슬을 내포하는 면역글로불린 (가령, 프레임워크 변화가 있거나 또는 없는 CDR-합체된 항체)이다. 키메라 또는 CDR-합체된 단일 사슬 항체 역시 용어 인간화 면역글로불린에 의해 포괄된다. 가령, Cabilly et al., U.S. 특허 번호 4,816,567; Cabilly et al., 유럽 특허 번호 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. 특허 번호 4,816,397; Boss et al., 유럽 특허 번호 0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., 유럽 특허 번호 0,194,276 B1; Winter, U.S. 특허 번호 5,225,539; Winter, 유럽 특허 번호 0,239,400 B1; Padlan, E. A. et al., 유럽 특허 출원 번호 0,519,596 A1을 참조한다. 또한, 단일 사슬 항체와 관련하여, Ladner et al., U.S. 특허 번호 4,946,778; Huston, U.S. 특허 번호 5,476,786; 그리고 Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988))을 참조한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "나노바디" (Nb)는 자연발생 중쇄 항체로부터 유래된 가장 작은 항원 결합 단편 또는 단일 가변 도메인 (V_HH)을 지칭하고, 그리고 당업자에게 알려져 있다. 이들은 낙타에서 목격된 바와 같이, 중쇄 단독 항체로부터 유래된다 (Hamers-Casterman et al., 1993; Desmyter et al., 1996). "낙타"의 패밀리에서, 가벼운 폴리펩티드 사슬을 결여하는 면역글로불린이 발견된다. "낙타"는 구세계 낙타 (쌍봉낙타 (Camelus bactrianus) 및 단봉낙타 (Camelus dromedarius)) 및 신세계 낙타 (가령, 라마 파코스 (Llama paccos), 라마 글라마 (Llama glama), 라마 구아니코에 (Llama guanicoe) 및 라마 비쿠그나 (Llama vicugna))를 포함한다. 단일 가변 도메인 중쇄 항체는 본원에서 나노바디 또는 V_HH 항체로서 지칭된다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 부분, 예를 들면, 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')₂, 그리고 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 도메인 항체 (dAb; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484); 단일 사슬 항체 분자; 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산하고, 이들은 각각 단일 항원 결합 부위를 갖고, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')₂단편을 산출하는데, 이것은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 교차연결할 수 있다.

"Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 부위를 내포하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단한, 비공유 연관에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 이러한 형상에서 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 V_H-V_L 이합체의 표면 상에서 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개 CDR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특정한 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.

"Fab" 단편은 또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH₁)을 내포한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH₁ 도메인의 카르복실 말단에서 소수 잔기의 부가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파와 람다로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM이 있고, 그리고 이들 부류 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 그리고 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 이들 하위부류는 IgG2a 및 IgG2b와 같은 유형으로 더욱 세분될 수 있다.

"단일 사슬 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H와 V_L 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 존재한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩티드는 V_H와 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 내에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이에 대합을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 짝을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 창출하도록 강제된다. 디아바디는 예로서, EP 404,097; WO 93/11161; 그리고 Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448에서 더욱 충분히 설명된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 2가지 작용제 (가령, 항체 및 항원)의 가역성 결합에 대한 평형 상수를 지칭하고 해리 상수 (K_D)로서 표시된다. 친화성은 관련 없는 아미노산 서열에 대한 항체의 친화성보다 최소한 1-배 크거나, 최소한 2-배 크거나, 최소한 3-배 크거나, 최소한 4-배 크거나, 최소한 5-배 크거나, 최소한 6-배 크거나, 최소한 7-배 크거나, 최소한 8-배 크거나, 최소한 9-배 크거나, 최소한 10-배 크거나, 최소한 20-배 크거나, 최소한 30-배 크거나, 최소한 40-배 크거나, 최소한 50-배 크거나, 최소한 60-배 크거나, 최소한 70-배 크거나, 최소한 80-배 크거나, 최소한 90-배 크거나, 최소한 100-배 크거나, 또는 최소한 1,000-배 크거나, 또는 그 이상이다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화성은 예로서, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 또는 그 이상일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "결합능"은 희석 후 해리에 대한 2개 또는 그 이상의 작용제의 복합체의 내성을 지칭한다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합한다"는 항체 및/또는 항원 결합 단편에 대하여 본원에서 교체가능하게 이용된다.

용어 "결합하는"은 예로서, 염 가교와 수분 가교와 같은 상호작용을 비롯하여, 공유, 정전, 소수성, 그리고 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인해 두 분자 사이에 직접적인 연관을 지칭한다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포외 도메인 내에 존재하는 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적으로 결합한다. "특이적 결합"은 최소한 약 10^-7 M 또는 그 이상, 예를 들면, 5x 10^-7 M, 10^-8 M, 5 x 10^-8 M, 그리고 그 이상의 친화성으로 결합을 지칭한다. "비특이적 결합"은 약 10^-7 M보다 적은 친화성으로 결합, 예를 들면, 10^-6 M, 10^-5 M, 10^-4 M 등의 친화성으로 결합을 지칭한다.

본원에서 교체가능하게 이용되는 용어 "폴리펩티드," "펩티드," 그리고 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합성 형태를 지칭하는데, 이것은 유전적으로 코딩된 아미노산과 비유전적으로 코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 그리고 변형된 폴리펩티드 중추를 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 용어는 이종성 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, 이종성과 상동성 리더 서열을 갖는 융합 단백질, N 말단 메티오닌 잔기를 갖거나 갖지 않는 융합 단백질; 면역학적으로 태그된 단백질; 기타 등등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 융합 단백질을 포함한다.

"단리된" 폴리펩티드는 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염체 성분은 상기 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 이용을 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 (1) 로리법에 의해 결정될 때 항체의 중량으로 90%보다 크게, 95%보다 크게, 또는 98%보다 크게, 예를 들면, 중량으로 99%보다 크게, (2) 회전 컵 배열결정장치의 이용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 최소한 15개 잔기를 획득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에서 원지에서 폴리펩티드를 포함하는데, 그 이유는 폴리펩티드의 자연 환경의 최소한 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 일부 경우에, 단리된 폴리펩티드는 최소한 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에서 교체가능하게 이용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 및 "CAR"은 세포외 도메인 (가령, 리간드/항원 결합 도메인), 막경유 도메인 및 하나 또는 그 이상의 세포내 신호전달 도메인을 배타적이 아닌 일반적으로 포함하는 면역 세포의 활성화를 촉발하거나 또는 저해할 수 있는 인공 멀티-모듈 분자를 지칭한다. 용어 CAR은 CAR 분자에 특이적으로 한정되지 않고 CAR 변이체를 또한 포함한다. CAR 변이체는 분할 CAR을 포함하는데, 여기서 CAR의 세포외 부분 (가령, 리간드 결합 부분) 및 세포내 부분 (가령, 세포내 신호전달 부분)은 2개의 별개 분자 상에 존재한다. CAR 변이체는 또한, 온 (ON)-스위치 CAR을 포함하는데, 이들은 예로서, 분할 CAR을 포함하는 조건적으로 활성화가능 CAR이고, 여기서 분할 CAR의 두 부분의 조건적 헤테로-이합체화가 약리학적으로 제어된다. CAR 변이체는 또한, 이중특이적 CAR을 포함하는데, 이들은 일차 CAR의 활성을 증폭하거나 또는 저해할 수 있는 이차 CAR 결합 도메인을 포함한다. CAR 변이체는 또한, 저해성 키메라 항원 수용체 (iCARs)를 포함하는데, 이들은 예로서, 이중특이적 CAR 시스템의 성분으로서 이용될 수 있고, 여기서 이차 CAR 결합 도메인의 결합은 일차 CAR 활성화의 저해를 유발한다. CAR 분자 및 이들의 유도체 (즉, CAR 변이체)는 예로서, PCT 출원 번호 US2014/016527; Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304에서 설명된다; 이들의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

본원에서 이용된 바와 같이, GFP 나노바디는 본원에서, Fridy et al. (2014) Nat. Methods. 11(12):1253-1260에 따른 그들의 "LaG" (GFP에 대한 라마 항체) 명명법에 따라 지칭될 수 있다; 관련된 보충 자료를 비롯하여, 상기 문헌의 개시는 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 따라서, 예로서, GFP (또는 GFP의 돌연변이체 또는 GFP에 관련된 다른 자포류 형광 단백질 (가령, AmCFP, DsRed 등)이 어댑터 분자로서 이용되는 경우에, LaG 나노바디의 다양한 조합은 LaG 나노바디 쌍의 구성원이 GFP에 대한 그들의 결합에서 서로 간섭하지 않으면, 예를 들면, LaG 나노바디의 쌍의 구성원이 GFP의 상이한 에피토프에 결합하면, 용도를 발견할 수 있다. LaG 나노바디는 예로서, LaG-2, LaG-3, LaG-6, LaG-9, LaG-10, LaG-12, LaG-14, LaG-16, LaG-17, LaG-19, LaG-21, LaG-24, LaG-26, LaG-27, LaG-29, LaG-30, LaG-35, LaG-37, LaG-41, LaG-42, LaG-43, LaG-5, LaG-8, LaG-11, LaG-18, LaG16-G₄S-2, LaG16-3xFLAG-2, LaG41-G₄S-2 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, mCherry에 대한 라마 항체 (LaM) 또한, 본원에서 설명된 바와 같은 시스템 및 장치에서 용도를 발견할 수 있는데, 여기서 가령, LaM 나노바디는 예로서, LaM-1, LaM-2, LaM-3, LaM-4, LaM-6, LaM-8을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는", "치료한다" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전하게 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "치료"는 포유동물, 특히, 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, 그리고 (a) 질환에 대한 소인이 있지만 이를 앓는 것으로 아직 진단되지 않은 개체에서 질환이 발생하는 것을 예방하고; (b) 질환을 저해하고, 다시 말하면, 이의 발달을 중지시키고; 그리고 (c) 질환을 경감하는, 다시 말하면, 질환의 관해를 유발하는 것을 포함한다.

본원에서 교체가능하게 이용되는 용어 "개인", "개체", "숙주" 및 "환자"는 뮤린 (쥐, 생쥐), 비-인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류 (가령, 말, 소, 양, 돼지, 염소), 토끼류 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 포유동물을 지칭한다. 일부 경우에, 개체는 인간이다. 일부 경우에, 개체는 비인간 영장류이다. 일부 경우에, 개체는 설치류, 예를 들면, 쥐 또는 생쥐이다. 일부 경우에, 개체는 토끼류, 예를 들면, 토끼이다.

본 발명을 더욱 설명하기에 앞서, 본 발명은 설명된 특정 구체예에 한정되지 않고, 따라서 당연히 변할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.

값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 상기 범위의 상한선과 하한선 사이에 하한선의 단위의 1/10까지 각 개재성 값, 그리고 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재성 값은 본 발명의 범위 안에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더욱 작은 범위의 상하선과 하한선은 더욱 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 그리고 또한, 본 발명의 범위 안에 포괄되고, 언급된 범위 내에 임의의 특정적으로 배제된 한계에 종속된다. 언급된 범위가 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계의 한쪽 또는 양쪽을 배제하는 범위 역시 본 발명에서 포함된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료 역시 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료가 하기에 설명된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 이들 간행물이 관련하여 인용되는 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로서 편입된다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 유의되어야 한다. 따라서, 예로서, "키메라 Notch 수용체 폴리펩티드"에 대한 참조는 복수의 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 "유전적으로 변형된 숙주 세포"에 대한 참조는 하나 또는 그 이상의 유전적으로 변형된 숙주 세포 및 당업자에게 공지된 이들의 등가물에 대한 참조를 포함하고, 그리고 기타 등등이다. 청구항은 임의의 임의선택적 원소를 배제하도록 작성될 수 있는 것으로 더욱 유의된다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 원소의 열거와 관련하여 "오로지", "단독으로" 등과 같은 배타적 용어의 이용, 또는 "부정적인" 제한의 이용에 대한 선행 기초로서 역할하는 것으로 의도된다.

명료함을 위해, 별개의 구체예의 문맥에서 설명되는 본 발명의 일정한 특질은 또한, 단일 구체예에서 합동으로 제공될 수도 있는 것으로 인지된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 구체예의 문맥에서 설명되는 본 발명의 다양한 특질은 또한, 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위조합에서 제공될 수도 있다. 본 발명에 관계하는 이들 구체예의 모든 조합은 본 발명에 의해 특이적으로 포섭되고, 그리고 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에서 개시된다. 이에 더하여, 다양한 구체예 및 이들의 원소의 모든 하위조합 역시 본 발명에 의해 특이적으로 포섭되고, 그리고 마치 각각의 모든 이런 하위조합이 본원에서 개별적으로 및 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에서 개시된다.

본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 오로지 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해서 이런 공개보다 선행할 권리가 없다는 것을 시인하는 것으로 해석되지 않는다. 게다가, 제공된 공개의 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있고, 이것은 독립적으로 확증될 필요가 있을 수 있다.

상세한 설명

본 발명은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 이들 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 그리고 이들 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다양한 적용에서 유용하고, 이들 역시 제공된다.

본 발명은 결합-촉발된 전사 스위치 및 결합-촉발된 전사 스위치를 이용하는 방법을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "결합-촉발된 전사 스위치"는 일반적으로, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 갖는 폴리펩티드를 상호작용시키는 합성 모듈식 폴리펩티드 또는 시스템을 지칭한다. 결합-촉발된 전사 스위치에 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합 시에, 세포내 도메인이 활성화되고, 그리고 결합 신호의 부재에서 수행되지 않는 일부 기능을 세포 내에서 수행하도록, 결합 신호가 세포내 도메인으로 전달된다.

결합-촉발된 전사 스위치의 성분 및 서로에 대하여 스위치의 성분의 배열은 예로서, 원하는 결합 촉발, 세포내 도메인의 활성, 결합-촉발된 전사 스위치의 전반적인 기능, 결합-촉발된 전사 스위치를 포함하는 분자 회로의 더욱 넓은 배열 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 많은 인자에 따라 변할 것이다. 첫 번째 결합 구성원은 예로서, 본원에서 설명된 특이적 결합 쌍의 이들 첫 번째 및/또는 두 번째 결합 구성원을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 세포내 도메인은 예로서, 이들 세포내 도메인 및 또는 본원에서 설명된 바와 같은 생물학적 기능을 갖는 도메인을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

결합-촉발된 전사 스위치의 결합 전달기는 또한, 결합 신호의 전달의 원하는 방법에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 결합 전달기는 예로서, 다양한 신호전달 경로의 수용체에 의해 실행된 바와 같이, 세포외 신호를 세포내 신호전달에 전달하는 폴리펩티드 및/또는 이들 폴리펩티드의 도메인을 포함할 수 있다. 결합 신호의 전달은 예로서, 결합-유도된 단백질분해 개열, 결합-유도된 인산화, 결합-유도된 입체형태적 변화 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기전을 통해 달성될 수 있다. 일부 경우에, 결합 전달기는 결합 시에 결합-신호가 결합-촉발된 전사 스위치의 개열에 의해 전달되어, 예로서 세포내 도메인을 해방시키도록, 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 내포할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 결합-촉발된 전사 스위치는 Notch 유래된 개열가능한 결합 전달기, 예를 들면, 예로서 본원에서 설명된 바와 같은 키메라 노치 수용체 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

다른 경우에, 결합 신호는 유도성 단백질분해 개열의 부재에서 전달될 수 있다. 신호전달 경로의 임의의 신호전달 성분 또는 성분들은 단백질분해 개열이 신호 전파에 필요한 지에 상관없이, 결합-촉발된 전사 스위치에서 용도를 발견할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 예로서 Jak-Stat 경로의 하나 또는 그 이상의 신호전달 성분을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 인산화-기초된 결합 전달기는 비-단백질분해 결합-촉발된 전사 스위치에서 용도를 발견할 수 있다.

단순함을 위해, 키메라 노치 수용체 폴리펩티드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 결합-촉발된 전사 스위치는 일차적으로 단일 폴리펩티드 사슬로서 설명된다. 하지만, 본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 키메라 노치 수용체 폴리펩티드를 포함하는 결합-촉발된 전사 스위치는 2개 또는 그 이상의 별개 폴리펩티드 사슬을 교차하여 분리되거나 또는 분할될 수 있는데, 여기서 기능적 결합-촉발된 전사 스위치, 예를 들면, 키메라 노치 수용체 폴리펩티드를 형성하는 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬의 연결은 구조성이거나 또는 조건적으로 제어될 수 있다. 가령, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 두 부분의 구조성 연결은 이형이합체화 시에 분할 부분이 기능적으로 결합되도록, 분할 폴리펩티드의 첫 번째와 두 번째 부분 사이에 구조성 이형이합체화 도메인을 삽입함으로써 달성될 수 있다.

일부 경우에, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 연결 및/또는 분할 결합-촉발된 전사 스위치로부터 신호전달은 예로서, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째와 두 번째 부분의 기능적 연결을 매개하는 "어댑터"의 이용을 통해 조건적으로 제어될 수 있다. 분할 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달을 매개하기 위해, 어댑터는 직접적으로 첨가되거나 또는 투여될 수 있고, 또는 예로서, 조건적으로 또는 구조성으로 이런 발현을 위해 설정된 세포로부터 어댑터의 발현을 통해 간접적으로 생산될 수 있다. 유용한 어댑터는 2개의 상이한 결합 분자에 의해 동시에 활용될 수 있는 첫 번째와 두 번째 결합 표면을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 어댑터는 2개의 항체가 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 단백질을 포함할 수 있다.

가령, 일부 경우에, 항원이 어댑터로서 용도를 발견할 수 있는데, 여기서 활용된 결합 분자는 상기 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항체일 수 있다. 이런 형상에서, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째와 두 번째 부분에 항체, 또는 이들의 부분의 부착은 항원의 단일 분자에 양쪽 항체의 동시적 결합에 의해 매개될 때 상기 항원의 존재에서 이들 부분의 기능적 연결을 유발한다. 어댑터로서 기능할 수 있는 항원은 병원체의 항원, 암-연관된 항원, 질환-연관된 항원, 항체 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 어댑터 항원은 가용성이다 (가령, 세포의 표면에 결합되지 않는다). 일부 경우에, 어댑터 항원은 세포의 표면에 결합된다.

가령, 일부 경우에 GFP가 어댑터로서 용도를 발견할 수 있는데, 여기서 활용된 결합 분자는 GFP의 2개의 상이한 표면에 결합하는 2개의 상이한 항체일 수 있다. 이런 형상에서, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째와 두 번째 부분에 항체, 또는 이들의 부분의 부착은 GFP의 단일 분자에 양쪽 항체의 동시적 결합에 의해 매개될 때 GFP의 존재에서 이들 부분의 기능적 연결을 유발한다.

일부 경우에, 분할 결합-촉발된 전사 스위치, 예를 들면, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째와 두 번째 부분의 결합이 항원 어댑터에 의해 매개되고 이들 부분의 기능적 연결을 유발하는 경우에 분할 결합-촉발된 전사 스위치는 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째와 두 번째 부분의 인근에서 항원의 존재의 검출을 허용한다. 가령, 일정한 구체예에서, 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째 부분은 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현되고, 결합-촉발된 전사 스위치의 두 번째 부분은 두 번째 세포 상에서 발현되고, 그리고 이런 첫 번째와 두 번째 부분은 가용성 항원이 첫 번째와 두 번째 세포의 인근에 존재할 때, 첫 번째와 두 번째 부분이 상기 항원에 의해 기능적으로 연결되어 활성화된 결합-촉발된 전사 스위치에 의한 리포터의 활성화를 유발하도록 설정된다.

분할 결합-촉발된 전사 스위치의 양쪽 부분은 항원의 검출에서 기능하기 위해 세포에 반드시 고정될 필요는 없다. 가령, 일부 경우에, 결합-촉발된 전사 스위치의 첫 번째 부분은 가용성으로 발현되고, 결합-촉발된 전사 스위치의 두 번째 부분은 세포 상에서 발현되고, 그리고 이런 첫 번째와 두 번째 부분은 가용성 항원이 첫 번째와 두 번째 부분의 인근에 존재할 때, 이들 부분이 상기 항원에 의해 기능적으로 연결되어, 예로서 결합-촉발된 전사 스위치를 활성화시키는 두 번째 항원의 존재를 포함하는 두 번째 사건에 응답할 수 있는, 예를 들면, 이를 보고할 수 있는 점화된 결합-촉발된 전사 스위치를 만들어내는 결합-촉발된 전사 스위치의 점화를 유발하도록 설정된다. 이런 두 번째 항원은 세포의 표면 상에서 존재할 수 없거나 또는 세포에 부착될 수 없다 (다시 말하면, 가용성이다).

분할 결합-촉발된 전사 스위치의 부분의 연결의 조건적 제어는 분할 결합-촉발된 전사 스위치로부터 신호전달의 추가 제어를 제공한다. 가령, 분할 결합-촉발된 전사 스위치로부터 어댑터 신호전달을 제공하거나 또는 발현함으로써 연결을 매개함에 의해, 상기 스위치로부터 신호전달에 허용적인 환경이 창출된다. 반대로, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 부분의 연결을 예방하는 경쟁적 저해제를 제공함으로써 연결을 저해함에 의해, 상기 스위치로부터 신호전달이 예방될 수 있다. 일부 경우에, 이런 효과는 용량 의존성이다, 다시 말하면, 제공된 어댑터 및/또는 경쟁적 저해제의 양에 근거하여 더욱 제어될 수 있다.

따라서, 본원에서 제공된 분할 결합-촉발된 전사 스위치에 관한 설명 및 단일 폴리펩티드 결합-촉발된 전사 스위치에 관한 설명을 고려할 때, 당업자는 분할 폴리펩티드가 이런 스위치 및 이런 스위치를 내포하는 분자 회로로부터 신호전달에 대한 추가 구조성 및/또는 조건적 제어를 제공하는데 활용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

키메라 Notch 수용체 폴리펩티드

본 발명은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인; b) Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산의 길이를 갖고, 그리고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다; 그리고 c) 세포내 도메인. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 세포내 도메인의 방출은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 생산하는 세포의 활성을 조정한다. 세포외 도메인은 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함한다; 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 Notch 수용체 폴리펩티드에 이종성인 아미노산 서열을 포함한다. 세포내 도메인은 Notch 수용체 폴리펩티드에 이종성인 아미노산 서열을 포함한다.

Notch 수용체 폴리펩티드의 도식적 묘사는 도면 1에서 제공된다. 도면 1에서 묘사된 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) i) 표피 성장 인자 (EGF) 반복; ii) 리간드 결합 부위; iii) LNR-A, LNR-B 및 LNR-C로서 지정된 3개의 Lin-12 Notch 반복 (LNR); iv) 2개의 이형이합체화 도메인 (HD-N 및 HD-C)을 포함하는 세포외 부분; b) 막경유 (TM) 부분; 그리고 c) i) RAM 도메인; ii) 안키린 반복; iii) 전사 활성화 도메인; 및 iv) PEST 영역을 포함하는 세포내 부분. Notch 수용체 폴리펩티드는 S1, S2 및 S3으로 명명된 3개의 단백질분해 부위를 포함한다. S1, 퓨린 개열 부위는 HD-N 및 HC-C 사이에 위치된다; S2, ADAM17 개열 부위는 HD-C 내에 위치된다; 그리고 S3, 감마 세크레타아제 개열 부위는 TM 부분 내에 있다. Notch 수용체 폴리펩티드는 세포-대-세포 통신, 예를 들면, 접촉하는 세포 사이에 통신을 매개하고, 여기서 한 접촉 세포는 "수신자" 세포이고, 그리고 다른 접촉 세포는 "발송자" 세포이다. 발송 세포 상에 존재하는 델타 폴리펩티드 ("리간드")에 의한 수신 세포 상에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드의 포용은 Notch 수용체 폴리펩티드의 리간드-유도된 개열을 유발하고, 막으로부터 수용체의 세포내 부분의 세포질로의 방출을 유발한다. 이러한 방출된 부분은 전사 조절인자로서 기능함으로써 수신자 세포 행동을 변경한다.

세포외 도메인

전술한 바와 같이, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 세포외 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 결합하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드 상에 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 떨어져 있다 (가령, 공유 연결되지 않는다). 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포의 표면 상에서 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 불용성 지지체 위에 고정될 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성일 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포외 환경 (가령, 세포외 기질)에서 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 인공 매트릭스 내에 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 무세포 환경에서 존재할 수 있다.

세포외 도메인은 Notch 수용체 폴리펩티드에 이종성인 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함한다. 다시 말하면, 세포외 도메인 내에 존재하는 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 Notch 수용체 폴리펩티드에서 자연적으로 존재하지 않는다.

특이적 결합 쌍의 적합한 첫 번째 구성원은 항체-기초된 인식 골격; 항체 (즉, 항원 결합 항체 단편을 비롯한 항체-기초된 인식 골격); 비항체-기초된 인식 골격; 항원 (가령, 내인성 항원; 외인성 항원; 등); 수용체에 대한 리간드; 수용체; 비항체-기초된 인식 골격의 표적; Fc 수용체 (가령, Fcγ RIIIa; Fcγ RIIIb; 등); 세포외 기질 성분; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

특이적 결합 쌍은 예로서, 다음을 포함한다: 항원 항체 특이적 결합 쌍, 여기서 첫 번째 구성원은 항원인 두 번째 구성원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 항체-기초된 인식 골격)이거나, 또는 여기서 첫 번째 구성원은 항원이고 두 번째 구성원은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 항체-기초된 인식 골격)이고; 리간드-수용체 특이적 결합 쌍, 여기서 첫 번째 구성원은 리간드이고 두 번째 구성원은 상기 리간드가 결합하는 수용체이거나, 또는 여기서 첫 번째 구성원은 수용체이고 두 번째 구성원은 상기 수용체에 결합하는 리간드이고; 비항체-기초된 인식 골격-표적 특이적 결합 쌍, 여기서 첫 번째 구성원은 비항체-기초된 인식 골격이고 두 번째 구성원은 상기 비항체-기초된 인식 골격에 결합하는 표적이거나, 또는 여기서 첫 번째 구성원은 표적이고 두 번째 구성원은 상기 표적에 결합하는 비항체-기초된 인식 골격이고; 부착 분자-세포외 기질 결합 쌍; Fc 수용체-Fc 결합 쌍, 여기서 첫 번째 구성원은 Fc 수용체인 두 번째 구성원에 결합하는 면역글로불린 Fc를 포함하거나, 또는 여기서 첫 번째 구성원은 면역글로불린 Fc를 포함하는 두 번째 구성원에 결합하는 Fc 수용체이고; 그리고 수용체-공동수용체 결합 쌍, 여기서 첫 번째 구성원은 공동수용체인 두 번째 구성원에 특이적으로 결합하는 수용체이거나, 또는 여기서 첫 번째 구성원은 수용체인 두 번째 구성원에 특이적으로 결합하는 공동수용체이다.

적합한 세포외 도메인의 무제한적 실례는 예로서, 카드헤린 (CDH1-20), 인테그린 (알파 및 베타 동종형), 에프린, NCAMs, 코넥신, CD44, 신데칸, CD47, DG알파/베타, SV2, 프로토카드헤린, Fas, 덱틴-1, CD7, CD40, 뉴레귤린, KIR, BTLA, Tim-2, Lag-3, CD19, CTLA4, CD28, TIGIT, 그리고 ICOS를 포함한다.

일부 경우에, 세포외 도메인은 톨 유사 수용체 (TLR)를 포함한다. 일부 경우에, 세포외 도메인은 병원성 균류 및 암 세포의 표면 상에 존재하는 N-글리칸을 인식하는 덱틴을 포함한다. 가령, Xie (2012) Glycoconj. 29:273; 그리고 Brown et al. (2007) Protein Sci. 16:1042를 참조한다. 일부 경우에, 세포외 도메인은 세균 표면 분자를 인식하는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드의 세포외 도메인은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: GVLSSPCPPNWIIYEKSCYLFSMSLNSWDGSKRQCWQLGSNLLKIDSSNELGFIVKQVSSQPDNSFWIGLSRPQTEVPWLWEDGSTFSSNLFQIRTTATQENPSPNCVWIHVSVIYDQLCSVPSYSICEKKFSM (서열 번호:3).

당업자는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형되는 세포의 원하는 국부화 또는 기능에 근거하여 세포외 도메인을 선별할 수 있다. 가령, 세포외 도메인은 세포를 세포 표면 상에서 증가된 숫자의 에스트로겐 수용체를 갖는 에스트로겐-의존성 유방암 세포로 표적화할 수 있는데, 여기서 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 에스트로겐 수용체 (특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원)에 결합한다. 리간드/수용체 상호작용의 다른 무제한적 실례는 CCRI (가령, 류마티스성 관절염 및/또는 다발성 경화증에서 염증이 생긴 관절 조직 또는 뇌로의 표적화를 위해), CCR7, CCR8 (가령, 림프절 조직으로의 표적화), CCR6, CCR9, CCRIO (가령, 장관 조직으로의 표적화를 위해), CCR4, CCRIO (가령, 피부로의 표적화를 위해), CXCR4 (가령, 전반적인 증강된 이행을 위해), HCELL (가령, 염증 및 염증성 장애, 골수의 표적화를 위해), Alpha4beta7 (가령, 장관 점막층 표적화를 위해), VLA-4/VCAM-I (가령, 내피로의 표적화를 위해)를 포함한다. 일반적으로, 표적화 (가령, 암 전이)에 관련된 임의의 수용체가 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포외 도메인으로서 이용될 수 있다.

항체-기초된 인식 골격

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체이다. 항체는 임의의 항원-결합 항체-기초된 폴리펩티드일 수 있는데, 이들은 매우 다양하게 당분야에서 공지된다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 단일 사슬 Fv (scFv)이다. 다른 항체 기초된 인식 도메인 (cAb VHH (낙타 항체 가변 도메인)과 인간화 이형, IgNAR VH (상어 항체 가변 도메인)와 인간화 이형, sdAb VH (단일 도메인 항체 가변 도메인) 및 "낙타화" 항체 가변 도메인이 이용에 적합하다. 일부 경우에, T 세포 수용체 (TCR) 기초된 인식 도메인, 예를 들면, 단일 사슬 TCR (scTv, 단일 사슬 2개-도메인 TCR 내포 VαVβ) 또한 이용에 적합하다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에서 특이적 결합 쌍의 구성원이 항체-기초된 인식 골격인 경우에, 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 존재에서 활성화될 수 있고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 항체-기초된 인식 골격에 결합하는 항원이다.

본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드에서 포함에 적합한 항체는 다양한 항원 결합 특이성을 가질 수 있다.

일부 경우에, 항원 결합 도메인은 암 세포에 의해 발현되는 (합성되는) 항원, 다시 말하면, 암 세포 연관된 항원에서 존재하는 에피토프에 특이적이다. 암 세포 연관된 항원은 예로서, 유방암 세포, B 세포 림프종, 췌장암, 호지킨 림프종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종, 폐암 세포 (가령, 소세포 폐암 세포), 비호지킨 B-세포 림프종 (B-NHL) 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종 세포, 폐암 세포 (가령, 소세포 폐암 세포), 흑색종 세포, 만성 림프성 백혈병 세포, 급성 림프구 백혈병 세포, 신경모세포종 세포, 신경교종, 교모세포종, 수모세포종, 대장암 세포 등과 연관된 항원일 수 있다. 암 세포 연관된 항원은 또한, 비암성 세포에 의해 발현될 수 있다.

일부 경우에, 항원 결합 도메인은 조직 특이적 항원 내에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은 질환-연관된 항원 내에 존재하는 에피토프에 특이적이다.

주제 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 항원 결합 도메인이 결합할 수 있는 항원의 무제한적 실례는 예로서, CD19, CD20, CD38, CD30, Her2/neu, ERBB2, CA125, MUC-1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메소텔린, 암배아 항원 (CEA), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 (VEGFR2), 고분자량-흑색종 연관된 항원 (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, 기타 등등을 포함한다.

주제 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 항원 결합 도메인이 결합할 수 있는 항원의 무제한적 실례는 예로서, 카드헤린 (CDH1-20), 인테그린 (알파 및 베타 동종형), 에프린, NCAMs, 코넥신, CD44, 신데칸, CD47, DG알파/베타, SV2, 프로토카드헤린, Fas, 덱틴-1, CD7, CD40, 뉴레귤린, KIR, BTLA, Tim-2, Lag-3, CD19, CTLA4, CD28, TIGIT, 그리고 ICOS를 포함한다.

일부 경우에, 항체는 사이토킨에 특이적이다. 일부 경우에, 항체는 사이토킨 수용체에 특이적이다. 일부 경우에, 항체는 성장 인자에 특이적이다. 일부 경우에, 항체는 성장 인자 수용체에 특이적이다. 일부 경우에, 항체는 세포 표면 수용체에 특이적이다.

일부 경우에, 항체는 세포 표면 표적에 특이적이고, 여기서 세포 표면 표적의 무제한적 실례는 CD19, CD30, Her2, CD22, ENPP3, EGFR, CD20, CD52, CD 11a 및 알파-인테그린을 포함한다.

일부 경우에, 항체-기초된 골격에 의해 결합된 항원 (특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원)은 가용성이다. 일부 경우에, 항원은 막-결합된다, 예를 들면, 일부 경우에, 항원은 세포의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 항원은 불용성 지지체 위에 고정되는데, 여기서 불용성 지지체는 다양한 물질 (가령, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로오스 등) 중에서 한 가지를 포함할 수 있고; 그리고 여기서 불용성 지지체는 다양한 형태, 예를 들면, 평판, 조직 배양 접시, 칼럼 등을 취할 수 있다. 일부 경우에, 항원은 세포외 기질 (ECM) 내에 존재한다 (가령, 항원은 ECM 성분이다). 일부 경우에, 항원은 인공 매트릭스 내에 존재한다. 일부 경우에, 항원은 무세포 환경에서 존재한다.

비항체-기초된 인식 골격

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 비항체-기초된 인식 골격이다. 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에서 특이적 결합 쌍의 구성원이 비항체-기초된 인식 골격인 경우에, 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 존재에서 활성화될 수 있고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 비항체-기초된 인식 골격에 결합하는 표적이다.

비항체-기초된 인식 골격은 예로서, 어피바디; 가공된 Kunitz 도메인; 모노바디 (아드넥틴); 안티칼린; 설계된 안키린 반복 도메인 (DARPins); 시스테인-풍부한 폴리펩티드 (가령, 시스테인-풍부한 크노틴 펩티드)의 결합 부위; 아비머; 아필린; 기타 등등을 포함한다. 가령, Gebauer and Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13:245를 참조한다.

비항체-기초된 골격 (본원에서 "항체 모방 분자"로서 또한 지칭됨)은 인위적으로 다양화된 결합 부위를 갖는 결합 분자의 라이브러리로부터 표적-결합 변이체의 선별 또는 단리에 의해 확인될 수 있다. 다양화된 라이브러리가 완전하게 무작위 접근법 (가령, 오류 가능성 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 엑손 뒤섞음, 또는 유도 진화)을 이용하여 산출되거나 또는 당분야에서 인정된 설계 전략에 의해 보조될 수 있다. 가령, 결합 부위가 이의 동계 표적 분자와 상호작용할 때 통상적으로 관련되는 아미노산 위치는 결합 부위를 인코딩하는 핵산 내에 상응하는 위치에서 축중성 코돈, 트리뉴클레오티드, 무작위 펩티드, 또는 전체 루프의 삽입에 의해 무작위화될 수 있다 (가령, U.S. 공개 번호 20040132028을 참조한다). 아미노산 위치의 위치선정은 표적 분자와의 단백질 실체 내에 결합 부위의 결정 구조의 조사에 의해 확인될 수 있다. 무작위화를 위한 후보 위치는 결합 부위의 루프, 편평한 표면, 나선 및 결합 공동을 포함한다. 일정한 구체예에서, 아마도 다양화를 위한 후보인 결합 부위 내에 아미노산은 면역글로불린 폴드와의 그들의 상동성에 의해 확인될 수 있다. 가령, 섬유결합소의 CDR-유사 루프 내에 잔기는 섬유결합소 결합 분자의 라이브러리를 산출하기 위해 무작위화될 수 있다 (가령, Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)을 참조한다). 무작위화될 수 있는 결합 부위의 다른 부분은 편평한 표면을 포함한다. 무작위화 이후에, 다양화된 라이브러리는 이후, 원하는 결합 특징을 갖는 결합 분자를 획득하기 위한 선별 또는 선별검사 절차에 종속될 수 있다. 가령, 선별은 당분야에서 인정된 방법, 예를 들면, 파지 전시, 효모 전시, 또는 리보솜 전시에 의해 달성될 수 있다.

가령, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 섬유결합소 결합 분자로부터 결합 부위를 포함한다. 섬유결합소 결합 분자 (가령, 섬유결합소 유형 I, II, 또는 III 도메인을 포함하는 분자)는 CDR-유사 루프를 전시하는데, 이들은 면역글로불린과 대조적으로, 사슬내 이황화 결합에 의존하지 않는다. FnIII 루프는 무작위 돌연변이, 그리고 유용한 치료적 도구를 개발하기 위한 표적 결합, 선별 및 추가 돌연변이의 반복적인 라운드의 유도 진화 계획에 종속될 수 있는 영역을 포함한다. 표적 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 섬유결합소-기초된 "다룰 수 있는" 치료적 결합 분자 ("FATBIM")가 개발될 수 있다. 섬유결합소 결합 폴리펩티드를 만들기 위한 방법은 예로서, WO 01/64942에서 및 U.S. 특허 번호 6,673,901, 6,703,199, 7,078,490 및 7,119,171에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 어피바디로부터 결합 부위를 포함한다. 어피바디는 포도상구균 단백질 A (SPA)의 면역글로불린 결합 도메인으로부터 유래된다 (가령, Nord et al., Nat. Biotechnol., 15: 772-777 (1997)을 참조한다). 어피바디는 특정한 표적에 결합하는 독특한 결합 부위를 갖는 항체 모방체이다. 어피바디는 작을 수 있고 (가령, 58개 아미노산을 갖는 3개의 알파 나선으로 구성되고 약 6 kDa의 몰 질량을 가질 수 있고), 비활성 형식 (Fc 기능 없음)을 갖고, 그리고 인간에서 표적화 모이어티로서 성공적으로 시험되었다. 어피바디 결합 부위는 SPA의 도메인 (가령, 도메인 B)로부터 유래된 SPA-관련된 단백질 (가령, 단백질 Z)을 돌연변이시키고, 그리고 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는 돌연변이체 SPA-관련된 폴리펩티드를 선별함으로써 합성될 수 있다. 어피바디 결합 부위를 만들기 위한 다른 방법은 U.S. 특허 번호 6,740,734와 6,602,977에서 및 WO 00/63243에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 안티칼린으로부터 결합 부위를 포함한다. 안티칼린은 인간 리포칼린으로부터 유래된 항체 기능적 모방체이다. 리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들면, 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질에 결합하고 이들을 수송하는 자연발생 결합 단백질의 패밀리이다. 안티칼린의 주요 구조는 야생형 리포칼린과 유사하다. 이러한 단백질 구조의 중심 요소는 8개 역평행 가닥의 베타-배럴 구조인데, 이것은 이의 개방 단부에서 4개의 루프를 뒷받침한다. 이들 루프는 리포칼린의 자연 결합 부위를 형성하고, 그리고 광범위한 아미노산 대체에 의해 시험관내에서 재성형되고, 따라서 신규한 결합 특이성을 창출할 수 있다. 안티칼린은 그들의 리간드에 대한 높은 친화성 및 특이성뿐만 아니라 빠른 결합 동역학을 소유하고, 따라서 그들의 기능적 성질이 항체의 것들과 유사하다. 안티칼린은 예로서, U.S. 특허 번호 7,723,476에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 시스테인-풍부한 폴리펩티드로부터 결합 부위를 포함한다. 시스테인-풍부한 도메인은 일부 경우에, 알파-나선, 베타-시트, 또는 베타-배럴 구조를 형성하지 않는다. 일부 경우에, 이황화 결합은 도메인의 3차원 구조로의 접힘을 증진한다. 일부 경우에, 시스테인-풍부한 도메인은 최소한 2개의 이황화 결합, 예를 들면, 최소한 3개의 이황화 결합을 갖는다. 예시적인 시스테인-풍부한 폴리펩티드는 A 도메인 단백질이다. A-도메인 (때때로 "보체-유형 반복"으로 불림)은 약 30-50개 또는 30-65개 아미노산을 내포한다. 일부 경우에, 이들 도메인은 약 35-45개 아미노산 및 일부 경우에, 약 40개 아미노산을 포함한다. 30-50개 아미노산 내에, 약 6개의 시스테인 잔기가 있다. 6개 시스테인 중에서, 이황화 결합은 전형적으로, 다음의 시스테인 사이에서 발견된다: C1 및 C3, C2 및 C5, C4 및 C6. A 도메인은 리간드 결합 모이어티를 구성한다. 도메인의 시스테인 잔기는 이황화 연결되어 치밀하고, 안정된, 기능적으로 독립된 모이어티를 형성한다. 이들 반복의 클러스터는 리간드 결합 도메인을 구성하고, 그리고 차별적 군집화는 리간드 결합에 대하여 특이성을 부여할 수 있다. A-도메인을 내포하는 예시적인 단백질은 예로서, 보체 성분 (가령, C6, C7, C8, C9 및 인자 I), 세린 프로테아제 (가령, 엔테로펩티다아제, 매트립타아제 및 코린), 막경유 단백질 (가령, ST7, LRP3, LRP5 및 LRP6) 및 식작용 수용체 (가령, 소르틸린-관련된 수용체, LDL-수용체, VLDLR, LRP1, LRP2 및 ApoER2)를 포함한다. 원하는 결합 특이성의 A-도메인 단백질을 만들기 위한 방법은 예로서, WO 02/088171 및 WO 04/044011에서 개시된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 반복 단백질로부터 결합 부위를 포함한다. 반복 단백질은 함께 포개져 인접한 도메인을 형성하는 작은 (가령, 약 20개 내지 약 40개 아미노산 잔기) 구조 단위 또는 반복의 연속 사본을 내포하는 단백질이다. 반복 단백질은 단백질 내에 반복의 숫자를 조정함으로써, 특정 표적 결합 부위에 알맞게 변형될 수 있다. 예시적인 반복 단백질은 설계된 안키린 반복 단백질 (즉, DARPins) (가령, Binz et al., Nat. Biotechnol., 22: 575-582 (2004)를 참조한다) 또는 류신-풍부한 반복 단백질 (즉, LRRPs) (가령, Pancer et al., Nature, 430: 174-180 (2004)을 참조한다)을 포함한다. 다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 DARPin을 포함한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "DARPin"은 고도로 특이적인 높은 친화성 표적 단백질 결합을 전형적으로 전시하는 유전적으로 가공된 항체 모방 단백질을 지칭한다. DARPin은 자연 안키린 단백질로부터 최초 유래되었다. 일부 경우에, DARPin은 안키린 단백질의 3개, 4개 또는 5개 반복 모티프를 포함한다. 일부 경우에, 안키린 반복의 단위는 30-34개 아미노산 잔기로 구성되고, 그리고 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 기능을 한다. 일부 경우에, 각 안키린 반복은 나선-회전-나선 입체형태를 전시하고, 그리고 이런 일렬 반복의 스트링은 거의 선형 배열에서 묶여 상대적으로 유연한 루프에 의해 연결된 나선-회전-나선 묶음을 형성한다. 일부 경우에, 안키린 반복 단백질의 전역 구조는 반복내 및 반복간 소수성 및 수소 결합 상호작용에 의해 안정된다. 안키린 반복의 반복적이고 가늘고 긴 본성은 단백질 안정성, 접힘 및 중첩풀림, 그리고 결합 특이성에서 안키린 반복 단백질의 독특한 특징에 대한 분자 기초를 제공한다. DARPin 도메인의 분자 질량은 각각, 4- 또는 5-반복 DARPin에 대해 약 14 또는 18 kDa일 수 있다. DARPin은 예로서, U.S. 특허 번호 7,417,130에서 설명된다. 일부 경우에, 안키린 반복 단위의 삼차 구조는 베타-헤어핀, 그 이후에 2개의 역평행 알파-나선으로 구성되고, 그리고 반복 단위를 그 다음 반복 단위와 연결하는 루프로 끝나는 특징을 공유한다. 안키린 반복 단위로 만들어진 도메인은 반복 단위를 연장된 곡선 구조에 포갬으로써 형성될 수 있다. LRRP 결합 부위는 바다 칠성장어 및 다른 무악 어류의 적응성 면역계의 일부를 형성하고, 그리고 이들이 림프구 성숙 동안 한 묶음의 류신-풍부한 반복 유전자의 재조합에 의해 형성된다는 점에서 항체와 유사하다. DARpin 또는 LRRP 결합 부위를 만들기 위한 방법은 WO 02/20565 및 WO 06/083275에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 Src 상동성 도메인 (가령, SH2 또는 SH3 도메인), PDZ 도메인, 베타 락타마아제, 높은 친화성 단백질분해효소 저해제, 또는 작은 이황화 결합 단백질 골격, 예를 들면, 전갈 독소로부터 유래된 결합 부위를 포함한다. 이들 분자로부터 유래된 결합 부위를 만들기 위한 방법은 당분야에서 개시되었다, 예를 들면, Panni et al., J. Biol. Chem., 277: 21666-21674 (2002), Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17: 170-175 (1999); Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003); 그리고 Vita et al., PNAS, 92: 6404-6408 (1995)을 참조한다. 또 다른 결합 부위는 EGF-유사 도메인, 크링글-도메인, PAN 도메인, Gla 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/소 췌장 트립신 저해제 도메인, Kazal-유형 세린 단백질분해효소 저해제 도메인, Trefoil (P-유형) 도메인, 폰빌레브란트 인자 유형 C 도메인, 아나필락시스독소-유사 도메인, CUB 도메인, 티로글로불린 유형 I 반복, LDL-수용체 부류 도메인, Sushi 도메인, Link 도메인, 트롬보스폰딘 유형 I 도메인, 면역글로불린-유사 도메인, C-유형 렉틴 도메인, MAM 도메인, 폰빌레브란트 인자 유형 A 도메인, 소마토메딘 B 도메인, WAP-유형 4 이황화물 코어 도메인, F5/8 유형 C 도메인, 응혈효소 도메인, 라미닌-유형 EGF-유사 도메인, C2 도메인, 단위체성 또는 삼합체성 형태에서 테트라넥틴으로부터 유래된 결합 도메인, 그리고 당업자에게 공지된 다른 이런 도메인뿐만 아니라 이들의 유도체 및/또는 변이체로 구성된 군에서 선택되는 결합 도메인으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 비항체-기초된 골격, 그리고 이들을 만드는 방법은 또한, Stemmer et al., "Protein scaffolds and uses thereof", U.S. 특허 공개 번호 20060234299 (Oct. 19, 2006), 그리고 Hey, et al., Artificial, Non-Antibody Binding Proteins for Pharmaceutical and Industrial Applications, TRENDS in Biotechnology, vol. 23, No. 10, Table 2 및 pp. 514-522 (October 2005)에서 발견될 수 있다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 Kunitz 도메인을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Kunitz 도메인"은 일정한 프로테아제, 예를 들면, 세린 프로테아제를 저해하는 보존된 단백질 도메인을 지칭한다. Kunitz 도메인은 상대적으로 작고, 전형적으로 약 50 내지 60개 아미노산 길이이고 약 6 kDa의 분자량을 갖는다. Kunitz 도메인은 전형적으로, 염기성 전하를 운반하고, 그리고 접힘된 펩티드의 치밀하고 안정된 본성에 기여하는 이황화 연쇄를 형성하는 2개, 4개, 6개 또는 8개 또는 그 이상의 배치에 의해 특징화된다. 가령, 많은 Kunitz 도메인은 3개의 이황화 연쇄를 형성하는 6개의 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. Kunitz 도메인의 이황화물-풍부한 α/β 폴드는 2개, 3개 (전형적으로), 또는 4개 또는 그 이상의 이황화 결합을 포함할 수 있다.

Kunitz 도메인은 안정되고 (가령, 3개의 이황화 결합), 그리고 강성 형태에서 주요 결정인자 P1 잔기를 특징으로 하는 반응성 부위 영역을 내포하는 배-모양 구조를 갖는다. 이들 저해제는 활성 부위 틈새 내로 P1 잔기의 삽입을 통해 생리학적으로 유관한 거대분자 기질에 대한 표적 단백질 (가령, 세린 프로테아제)의 접근을 경쟁적으로 예방한다. 단백질분해효소-저해성 루프 내에 P1 잔기는 일차 특이성 결정인자를 제공하고, 그리고 특정 Kunitz 단백질이 표적화된 단백질분해효소를 향하여 갖는 저해 활성 중에서 다수를 지배한다. 일반적으로, 반응성 부위 (P)의 N 말단 측면은 P' C 말단 측면보다 활동적으로 더욱 중요하다. 많은 경우에, 리신 또는 아르기닌이 P1 위치를 점유하여, 단백질 기질 내에 이들 잔기에 인접하게 개열하는 단백질분해효소를 저해한다. 다른 잔기, 특히 저해제 루프 영역 내에 다른 잔기는 결합 강도에 기여한다. 일반적으로, 표적 단백질 내에 약 10-12개 아미노산 잔기 및 단백질분해효소 내에 20-25개 잔기는 안정된 단백질분해효소-저해제 단백질 실체의 형성에서 직접적으로 접촉하고, 그리고 약 600 내지 900 A의 매몰된 구역을 제공한다. P 부위 내에 잔기 및 주변 잔기를 변형함으로써, Kunitz 도메인은 선택되는 단백질을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. Kunitz 도메인은 예로서, U.S. 특허 번호 6,057,287에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 아필린이다. 아필린은 단백질 및 작은 화합물을 향하여 특정한 친화성을 갖도록 설계되는 작은 항체 모방체 단백질이다. 새로운 아필린은 2개의 라이브러리에서 매우 빠르게 선택될 수 있는데, 이들은 각각, 상이한 인간 유래된 골격 단백질에 근거된다. 아필린은 면역글로불린 단백질에 어떤 구조적 상동성도 보여주지 않는다. 2개의 통상적으로-이용되는 아필린 골격이 있는데, 이들 중에서 한 가지는 감마 결정성, 인간 구조적 눈 렌즈 단백질이고, 그리고 다른 것은 "유비퀴틴" 상과 단백질이다. 양쪽 인간 골격은 매우 작고, 높은 온도 안정성을 보여주고, 그리고 pH 변화 및 변성제에 거의 내성이다. 이러한 높은 안정성은 이들 단백질의 확대된 베타 시트 구조에 주로 기인한다. 감마 결정성 유래된 단백질의 실례는 WO200104144에서 설명되고, 그리고 "유비퀴틴-유사" 단백질의 실례는 WO2004106368에서 설명된다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 비항체-기초된 골격은 아비머이다. 아비머는 시험관내 엑손 뒤섞음 및 파지 전시에 의해 인간 세포외 수용체 도메인의 큰 패밀리로부터 진화되어, 결합 및 저해 성질을 갖는 멀티도메인 단백질을 산출한다. 복수의 독립된 결합 도메인을 연결하는 것은 결합능을 창출하고, 그리고 전통적인 단일-에피토프 결합 단백질과 비교하여 향상된 친화성 및 특이성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 일정한 구체예에서, 아비머는 각각, 스페이서 영역 펩티드에 의해 연결된, 30 내지 35개 아미노산의 2개 또는 그 이상의 펩티드 서열로 구성된다. 개별 서열은 다양한 막 수용체의 A 도메인으로부터 유래되고, 그리고 이황화 결합 및 칼슘에 의해 안정된 강성 구조를 갖는다. 각 A 도메인은 표적 단백질의 일정한 에피토프에 결합할 수 있다. 동일한 단백질의 상이한 에피토프에 결합하는 도메인의 조합은 이러한 단백질에 대한 친화성을 증가시킨다 (결합능으로서 알려져 있는 효과 (이름이 여기서 유래함)). 나노몰 이하 친화성을 갖는 아비머가 다양한 표적에 대하여 획득되었다. 대안으로, 이들 도메인은 상이한 표적 단백질 상에 에피토프에 대해 지향될 수 있다. 아비머에 관한 추가 정보는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756에서 발견될 수 있다.

비항체-기초된 골격의 적합한 표적은 항체-기초된 골격이 결합할 수 있는 전술한 항원 중에서 한 가지를 포함한다.

일부 경우에, 비항체-기초된 골격에 의해 결합된 표적 (특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원)은 가용성이다. 일부 경우에, 표적은 막-결합된다, 예를 들면, 일부 경우에, 표적은 세포의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 표적은 불용성 지지체 위에 고정되고, 여기서 불용성 지지체는 다양한 물질 (가령, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로오스 등) 중에서 한 가지를 포함할 수 있고; 그리고 여기서 불용성 지지체는 다양한 형태, 예를 들면, 평판, 조직 배양 접시, 칼럼 등을 취할 수 있다. 일부 경우에, 표적은 세포외 기질 (ECM) 내에 존재한다 (가령, 항원이 ECM 성분이다). 일부 경우에, 표적은 인공 매트릭스 내에 존재한다. 일부 경우에, 표적은 무세포 환경에서 존재한다.

세포 부착 분자

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 세포 부착 분자 (CAM), 다시 말하면, 세포외 기질 (ECM)의 성분에 결합하거나 또는 세포 표면 분자에 결합하는 폴리펩티드이다. 가령, 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 CAM의 세포외 영역이다. 일부 경우에, CAM은 칼슘-독립된 부착 분자이다; 가령, 일부 경우에, CAM은 면역글로불린 상과 CAM이다. 일부 경우에, CAM은 칼슘-의존성 부착 분자이다; 가령, CAM은 인테그린, 카드헤린, 또는 셀렉틴이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 인테그린이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 카드헤린, 예를 들면, E-카드헤린, P-카드헤린, N-카드헤린, R-카드헤린, M-카드헤린 등이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 셀렉틴, 예를 들면, E-셀렉틴, L-셀렉틴, 또는 P-셀렉틴이다. CAM의 결합 단편은 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원으로서 이용될 수 있다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 CAM인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 ECM의 성분 또는 CAM에 결합하는 세포 표면 분자이다. 가령, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 인테그린인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 콜라겐, 피브리노겐, 섬유결합소, 또는 비트로넥틴의 성분이다. 다른 실례로서, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 카드헤린인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 카드헤린에 의해 결합된 세포 표면 항원이다. 다른 실례로서, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 셀렉틴인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 푸코실화된 탄수화물이다.

리간드

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체에 대한 리간드이다. 리간드는 폴리펩티드, 핵산, 당단백질, 소형 분자, 탄수화물, 지질, 당지질, 지질단백질, 지질다당류 등을 포함한다. 일부 경우에, 리간드는 가용성이다.

리간드는 사이토킨 (가령, IL-13 등); 성장 인자 (가령, 헤레굴린; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 등); 펩티드 호르몬; 인테그린-결합 펩티드 (가령, 서열 Arg-Gly-Asp를 포함하는 펩티드); N-글리칸; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에서 특이적 결합 쌍의 구성원이 리간드인 경우에, 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 존재에서 활성화될 수 있고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 리간드에 대한 수용체이다. 가령, 리간드가 VEGF인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성 VEGF 수용체를 비롯한 VEGF 수용체일 수 있다. 대안으로, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 VEGF 수용체일 수 있고; 그리고 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 VEGF일 수 있다. 다른 실례로서, 리간드가 헤레굴린인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 Her2일 수 있다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 리간드인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 상기 리간드에 결합하는 분자이다, 가령, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 리간드, 리간드에 대한 수용체 등에 특이적으로 결합하는 항체이다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 리간드인 경우에, 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 (상기 리간드에 결합하는 분자)은 가용성이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 막-결합된다, 예를 들면, 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 불용성 지지체 위에 고정되고, 여기서 불용성 지지체는 다양한 물질 (가령, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로오스 등) 중에서 한 가지를 포함할 수 있고; 그리고 여기서 불용성 지지체는 다양한 형태, 예를 들면, 평판, 조직 배양 접시, 칼럼 등을 취할 수 있다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 무세포 환경에서 존재한다.

항원

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체가 특이적으로 결합하는 항원이다. 항원은 임의의 항원, 예를 들면, 자연발생 (내인성) 항원; 합성 (가령, 자연발생 항원과 더 이상 동일하지 않도록 하는 방식으로 변형된; 이의 자연 상태로부터 변형된; 기타 등등) 항원 등일 수 있다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에서 특이적 결합 쌍의 구성원이 항원인 경우에, 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 존재에서 활성화될 수 있고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 상기 항원에 결합하는 항체 (항체-기초된 인식 골격)이다.

일부 경우에, 항원은 질환-연관된 항원, 예를 들면, 암-연관된 항원, 자가면역 질환-연관된 항원, 병원체-연관된 항원, 염증-연관된 항원, 또는 기타 유사한 것이다.

가령, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원이 암-연관된 항원에 특이적인 항체인 경우에, 상기 항원은 암-연관된 항원일 수 있고, 여기서 암-연관된 항원은 예로서, CD19, CD20, CD38, CD30, Her2/neu, ERBB2, CA125, MUC-1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메소텔린, 암배아 항원 (CEA), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 (VEGFR2), 고분자량-흑색종 연관된 항원 (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2 등을 포함한다. 암-연관된 항원은 또한, 예로서 4-1BB, 5T4, 선암종 항원, 알파 태아단백질, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산 탈수효소 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNTO888, CTLA-4, DRS, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 섬유결합소 추가 도메인-B, 엽산염 수용체 1, GD2, GD3 강글리오시드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란 인자 수용체 키나아제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 점액소 CanAg, N-글리콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R α, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 그리고 비멘틴을 포함한다.

항원은 염증성 질환과 연관될 수 있다. 염증성 질환과 연관된 항원의 무제한적 실례는 예로서, AOC3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (에오탁신-1), CD125, CD147 (바시긴), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (IgE 수용체), CD25 (IL-2 수용체의 α 사슬), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 α4, 인테그린 α4β7, LFA-1 (CD11a), 미오스타틴, OX-40, 스클레로스스신, SOST, TGF 베타 1, TNF-α, 그리고 VEGF-A를 포함한다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항원인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 항체-기초된 골격 (가령, 항체) 또는 비항체-기초된 골격일 수 있다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 불용성 지지체 위에 고정된다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포외 환경 (가령, 세포외 기질)에서 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 인공 매트릭스 내에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 무세포 환경에서 존재한다.

비항체-기초된 인식 골격의 표적

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 비항체-기초된 골격의 표적이다. 표적은 예로서, 폴리펩티드, 핵산, 당단백질, 소형 분자, 탄수화물, 지질, 당지질, 지질단백질, 지질다당류 등을 포함한다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 비항체-기초된 골격의 표적인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 비항체-기초된 골격이다.

수용체

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체이다. 일부 경우에, 수용체는 성장 인자 수용체이다. 일부 경우에, 수용체는 사이토킨 수용체이다. 일부 경우에, 수용체는 세포 상에서 공동수용체에 결합하는 세포 표면 수용체이다. 일부 경우에, 수용체는 신경전달물질 수용체이다. 일부 경우에, 수용체는 세포외 기질 성분에 결합한다. 일부 경우에, 수용체는 면역글로불린 Fc 수용체이다.

적합한 수용체는 성장 인자 수용체 (가령, VEGF 수용체); 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 아과 K, 구성원 1 (NKG2D) 폴리펩티드 (MICA, MICB 및 ULB6에 대한 수용체); 사이토킨 수용체 (가령, IL-13 수용체; IL-2 수용체 등); 표피 성장 인자 (EGF) 수용체; Her2; CD27; 자연 세포독성 수용체 (NCR) (가령, NKP30 (NCR3/CD337) 폴리펩티드 (HLA-B-연관된 전사체 3 (BAT3) 및 B7-H6에 대한 수용체) 등); T 세포 항원 수용체; 디히드로폴레이트 수용체; 키메라 사이토킨 수용체; Fc 수용체; 세포외 기질 수용체 (가령, 인테그린); 세포 부착 수용체 (가령, 카드헤린); 양성 공동수용체 (가령, CD28) 및 음성 (면역억제) 공동수용체 (가령, PD1) 둘 모두를 포함하는 면역조절성 수용체; 사이토킨 수용체; 그리고 면역조절성 분자 (가령, TGFβ)에 대한 수용체 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 수용체는 야생형 수용체에 비하여 절두된다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 수용체인 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 상기 수용체의 표적이고, 여기서 표적은 수용체, 또는 공동수용체에 대한 리간드일 수 있다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 불용성 지지체 위에 고정된다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포외 환경 (가령, 세포외 기질)에서 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 인공 매트릭스 내에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 무세포 환경에서 존재한다.

Notch 수용체 폴리펩티드

전술한 바와 같이, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산의 길이를 갖고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 (aa) 내지 1000개 aa, 예를 들면, 50개 aa 내지 75개 aa, 75개 aa 내지 100개 aa, 100개 aa 내지 150개 aa, 150개 aa 내지 200개 aa, 200개 aa 내지 250개 aa, 250개 a 내지 300개 aa, 300개 aa 내지 350개 aa, 350개 aa 내지 400개 aa, 400개 aa 내지 450개 aa, 450개 aa 내지 500개 aa, 500개 aa 내지 550개 aa, 550개 aa 내지 600개 aa, 600개 aa 내지 650개 aa, 650개 aa 내지 700개 aa, 700개 aa 내지 750개 aa, 750개 aa 내지 800개 aa, 800개 aa 내지 850개 aa, 850개 aa 내지 900개 aa, 900개 aa 내지 950개 aa, 또는 950개 aa 내지 1000개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 300개 aa 내지 400개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 300개 aa 내지 350개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 300개 aa 내지 325개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 350개 aa 내지 400개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 750개 aa 내지 850개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 aa 내지 75개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 310개 aa 내지 320개 aa, 예를 들면, 310개 aa, 311개 aa, 312개 aa, 313개 aa, 314개 aa, 315개 aa, 316개 aa, 317개 aa, 318개 aa, 319개 aa, 또는 320개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 315개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 360개 aa 내지 370개 aa, 예를 들면, 360개 aa, 361개 aa, 362개 aa, 363개 aa, 364개 aa, 365개 aa, 366개 aa, 367개 aa, 368개 aa, 369개 aa, 또는 370개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 367개 aa의 길이를 갖는다.

TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4); 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 (aa) 내지 65개 aa, 예를 들면, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 또는 65개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4); 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 56개 아미노산의 길이를 갖는다.

LNR 분절, HD-N 분절, HD-C 분절 및 TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) LNR-A 분절; ii) LNR-B 분절; iii) LNR-C 분절; iv) HD-N 분절, v) HD-C 분절; 그리고 vi) TM 도메인. LNR-A 분절, LNR-B 분절, 및 LNR-C 분절은 집합적으로, "LNR 분절"로서 지칭될 수 있다. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4a에서 개략적으로 묘사된다.

LNR 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1442-1562, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 90개 아미노산 내지 150개 아미노산, 예를 들면, 90개 아미노산 (aa) 내지 100개 aa, 100개 aa 내지 110개 aa, 110개 aa 내지 120개 aa, 120개 aa 내지 130개 aa, 130개 aa 내지 140개 aa, 또는 140개 aa 내지 150개 aa의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, LNR 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1442-1562, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 115개 aa 내지 125개 aa, 예를 들면, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125 aa의 길이를 갖는다.

LNR 분절은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDC (서열 번호:5); 그리고 118개 내지 122개 아미노산 (가령, 118, 119, 120, 121, 또는 122개 아미노산)의 길이를 가질 수 있다.

HD-N 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1563-1664, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 90개 아미노산 (aa) 내지 110개 aa, 예를 들면, 90개 aa 내지 95개 aa, 95개 aa 내지 100개 aa, 100개 aa 내지 105개 aa, 또는 105개 aa 내지 110개 aa의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, HD-N 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1563-1664, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 95개 aa 내지 105개 aa, 예를 들면, 95, 96, 98, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 또는 105개 aa의 길이를 갖는다.

HD-C 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1665-1733, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 60개 아미노산 (aa) 내지 80개 aa, 예를 들면, 60개 aa 내지 65개 aa, 65개 aa 내지 70개 aa, 70개 aa 내지 75개 aa, 또는 75개 aa 내지 80개 aa의 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, HD-C 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1665-1733, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 65개 아미노산 내지 75개 아미노산, 예를 들면, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 또는 75개 아미노산의 길이를 갖는다.

HD 분절 (HD-N 플러스 HD-C)은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: AAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLP (서열 번호:6); 그리고 150, 151, 152, 153, 또는 154개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

막경유 분절은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1736 내지 1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 15개 아미노산 (aa) 내지 25개 아미노산, 예를 들면, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

막경유 분절은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:7); 그리고 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 약 310개 아미노산 (aa) 내지 약 320개 aa (가령, 310개 aa, 311개 aa, 312개 aa, 313개 aa, 314개 aa, 315개 aa, 316개 aa, 317개 aa, 318개 aa, 319개 aa, 또는 320개 aa)의 길이를 갖고, 그리고 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1442-1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사된다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:1); 그리고 300개 아미노산 내지 310개 아미노산 (가령, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 또는 310개 아미노산)의 길이를 갖는다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCHILDYSFTGGAGRDIPPPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:2); 그리고 350개 아미노산 내지 370개 아미노산 (가령, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 또는 370개 아미노산)의 길이를 갖는다.

단일 EGF 반복, LNR 분절, HD-N 분절, HD-C 분절 및 TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 단일 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4b에서 개략적으로 묘사된다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1390 내지 1430, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 (aa) 내지 45개 aa (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 45개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCH (서열 번호:8); 그리고 35개 아미노산 내지 40개 아미노산 (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 아미노산)의 길이를 가질 수 있다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 약 360개 아미노산 (aa) 내지 약 375개 aa (가령, 360개 aa, 361개 aa, 362개 aa, 363개 aa, 364개 aa, 365개 aa, 366개 aa, 367개 aa, 368개 aa, 369개 aa, 370개 aa, 371개 aa, 372개 aa, 373개 aa, 374개 aa, 또는 375개 aa)의 길이를 갖고, 그리고 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1390-1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사된다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 합성 링커를 포함한다. 가령, 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 합성 링커; ii) EGF 반복; iii) LNR 분절; iv) HD-N 분절, v) HD-C 분절; 그리고 vi) TM 도메인. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4c에서 개략적으로 묘사된다.

합성 링커는 약 10개 아미노산 (aa) 내지 약 200개 aa, 예를 들면, 10개 aa 내지 25개 aa, 25개 aa 내지 50개 aa, 50개 aa 내지 75개 aa, 75개 aa 내지 100개 aa, 100개 aa 내지 125개 aa, 125개 aa 내지 150개 aa, 150개 aa 내지 175개 aa, 또는 175개 aa 내지 200개 aa의 길이를 가질 수 있다. 합성 링커는 10개 aa 내지 30개 aa, 예를 들면, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 aa의 길이를 가질 수 있다. 합성 링커는 30개 aa 내지 50개 aa, 예를 들면, 30개 aa 내지 35개 aa, 35개 aa 내지 40개 aa, 40개 aa 내지 45개 aa, 또는 45개 aa 내지 50개 aa의 길이를 가질 수 있다.

일부 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 합성 링커는 세포외 단백질 구조적 도메인 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 합성 링커로서 이용에 적합한 세포외 단백질 구조적 도메인은 예로서, Ig-유사 세포외 구조적 도메인, Fc 세포외 구조적 도메인, 섬유결합소 세포외 구조적 도메인 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 합성 링커는 복수의 세포외 단백질 구조적 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 복수는 복수의 동일한 도메인 또는 복수의 상이한 도메인을 포함할 수 있다.

2-11개 EGF 반복, LNR 분절, HD-N 분절, HD-C 분절 및 TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 2개 내지 11개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4d에서 개략적으로 묘사된다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 2개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 3개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 4개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 5개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 6개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 7개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 8개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 9개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 10개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 11개 EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) HD-N 분절, iv) HD-C 분절; 그리고 v) TM 도메인.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 869-905 (DINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCE; 서열 번호:9), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 907-943 (DIDDCRPNPCHNGGSCTDGINTAFCDCLPGFRGTFCE; 서열 번호:10), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 945-981 (DINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCE; 서열 번호:11), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 988-1019 (TESSCFNGGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQ; 서열 번호:12), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 30개 아미노산 (aa) 내지 35개 aa (가령, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1021-1057 (DVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQ; 서열 번호:13), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1064-1090 (DSSPCKNGGKCWQTHTQYRCECPSGWT; 서열 번호:14), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 25개 아미노산 (aa) 내지 30개 aa (가령, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1146-1180 (LVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNC; 서열 번호:15), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1184-1219 (IDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKCSCPRGTQGVHCE; 서열 번호:16), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1238-1265 (CFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCE; 서열 번호:17), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 25개 아미노산 (aa) 내지 30개 aa (가령, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

EGF 반복은 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1267-1305 (DVNECLSNPCDARGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTGRRCE; 서열 번호:18), 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 35개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 (aa) (가령, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 약 490개 아미노산 (aa) 내지 약 900개 aa의 길이를 갖고, 그리고 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 i) 아미노산 1267-1756; ii) 1238-1756; iii) 1184-1756; iv) 1146-1756; v) 1064-1756; vi) 1021-1756; vii) 988-1756; viii) 945-1756; ix) 907-1756; 또는 x) 869-1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사된다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 합성 링커를 포함한다. 가령, 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: i) 2개 내지 11개 EGF 반복; ii) 합성 링커; iii) LNR 분절; iv) HD-N 분절, v) HD-C 분절; 그리고 vi) TM 도메인. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4e에서 개략적으로 묘사된다.

HD-C 분절 및 TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함하고: i) HD-C 분절; 및 ii) TM 도메인, 여기서 Notch 수용체 폴리펩티드는 LNR 분절을 포함하지 않는다. 일부 경우에, LNR 분절은 이종성 폴리펩티드로 대체된다. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 4f에서 개략적으로 묘사된다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1665 내지 1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 85개 아미노산 (aa) 내지 95개 aa (가령, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95개 aa)의 길이를 가질 수 있다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 2a에서 묘사된 아미노산 서열의 아미노산 1665 내지 1756, 또는 다른 Notch 수용체 폴리펩티드의 상응하는 분절에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상응하는 분절의 실례는 도면 2b-2g에서 묘사되고; 그리고 Notch 수용체 폴리펩티드의 N 말단에서 인프레임 융합된 이종성 폴리펩티드를 포함한다.

리간드-유도성 단백질분해 개열 부위

전술한 바와 같이, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산의 길이를 갖고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 앞서 논의된 바와 같이, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인; b) 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산의 길이를 갖고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 ("리간드")은 접촉 (가령, "전송") 세포 상에 존재할 수 있다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 단지 하나의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위만을 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 2개의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 3개의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다. 단순함을 위해, 리간드-유도성 개열 부위는 본원에서 "S1" "S2" 및 "S3" 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위로서 지칭될 것이다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다. S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 HD-N 분절 및 HD-C 분절 사이에 위치될 수 있다. 일부 경우에, S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 퓨린-유사 프로테아제 개열 부위이다. 퓨린-유사 프로테아제 개열 부위는 정준 서열 Arg-X-(Arg/Lys)-Arg를 가질 수 있고, 여기서 X는 임의의 아미노산이고; 프로테아제는 정준 서열의 바로 C 말단을 개열한다. 가령, 일부 경우에, S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열 GRRRRELDPM (서열 번호:19)을 가질 수 있고, 여기서 개열은 "RE" 서열 사이에서 발생한다. 다른 실례로서, S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열 RQRRELDPM (서열 번호:20)을 가질 수 있고, 여기서 개열은 "RE" 서열 사이에서 발생한다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다. S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 HD-C 분절 내에 위치될 수 있다. 일부 경우에, S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 ADAM-17-유형 프로테아제 개열 부위이다. ADAM-17-유형 프로테아제 개열 부위는 Ala-Val 디펩티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 효소는 Ala 및 Val 사이를 개열한다. 가령, 일부 경우에, S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열 KIEAVKSE (서열 번호:21)을 가질 수 있고, 여기서 개열은 "AV" 서열 사이에서 발생한다. 다른 실례로서, S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하는 아미노산 서열은 아미노산 서열 KIEAVQSE (서열 번호:22)을 가질 수 있고, 여기서 개열은 "AV" 서열 사이에서 발생한다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함한다. S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 TM 도메인 내에 위치될 수 있다. 일부 경우에, S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 감마-세크레타아제 (γ -세크레타아제) 개열 부위이다. γ -세크레타아제 개열 부위는 Gly-Val 디펩티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 효소는 Gly 및 Val 사이를 개열한다. 가령, 일부 경우에, S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 아미노산 서열 VGCGVLLS (서열 번호:23)을 가질 수 있고, 여기서 개열은 "GV" 서열 사이에서 발생한다. 일부 경우에, S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위는 아미노산 서열 GCGVLLS (서열 번호:24)을 포함한다.

일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 결여한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 결여한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 결여한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위 및 S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위 둘 모두를 결여한다. 일부 경우에, Notch 수용체 폴리펩티드는 S3 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 S1 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위 및 S2 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위 둘 모두를 결여한다. 실례는 도면 4g에서 개략적으로 묘사된다.

세포내 도메인

전술한 바와 같이, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 결합 이후에 방출되는 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 결합은 전술한 단백질분해 개열 부위의 개열을 유도한다.

세포내 도메인은 Notch 수용체 폴리펩티드에 이종성인 아미노산 서열을 포함한다. 다시 말하면, 세포내 도메인은 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하지 않는 아미노산 서열을 포함한다.

세포내 도메인은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 방출될 때, 작동체 기능을 제공하고, 여기서 작동체 기능은 예로서, 세포에 의한 하나 또는 그 이상의 사이토킨의 증가된 생산; 세포에 의한 하나 또는 그 이상의 사이토킨의 감소된 생산; 세포에 의한 호르몬의 증가된 또는 감소된 생산; 세포에 의한 항체의 생산; 소기관 활성에서 변화; 세포 내에 폴리펩티드의 트래피킹에서 변화; 표적 유전자의 전사에서 변화; 단백질의 활성에서 변화; 세포 행동, 예를 들면, 세포 사멸에서 변화; 세포 증식; 세포 분화에 대한 효과; 세포 생존에 대한 효과; 세포 신호전달 반응의 조정 등을 포함한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 방출될 때, 표적 유전자의 전사에서 변화를 제공한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 방출될 때, 표적 유전자의 전사에서 증가를 제공한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 방출될 때, 표적 유전자에서 감소를 제공한다.

세포내 도메인은 매우 다양한 폴리펩티드 중에서 한 가지일 수 있는데, 여기서 실례는 전사 활성인자; 전사 억제인자; 전사 보조활성인자; 전사 보조억제인자; DNA 결합 폴리펩티드; RNA 결합 폴리펩티드; 번역 조절 폴리펩티드; 호르몬; 사이토킨; 독소; 항체; 염색질 조절인자; 자살 단백질; 소기관 특정한 폴리펩티드 (가령, 핵 구멍 조절인자, 미토콘드리아 조절인자, 소포체 조절인자 등); 친아폽토시스 폴리펩티드; 항아폽토시스 폴리펩티드; 다른 기전을 통해 세포 사멸을 증진하는 다른 폴리펩티드; 친증식 폴리펩티드; 항증식성 폴리펩티드; 면역 동시자극성 폴리펩티드; 부위 특이적 뉴클레아제; 재조합효소; 저해성 면역수용체; 활성화 면역수용체; Cas9 및 RNA 표적화된 뉴클레아제의 변이체; 및 DNA 인식 폴리펩티드; 폴리펩티드의 우성 음성 변이체; 신호전달 폴리펩티드; 수용체 티로신 키나아제; 비-수용체 티로신 키나아제; 분화를 증진하는 폴리펩티드; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 신호전달 폴리펩티드는 예로서, STAT3/5, Akt, Myc 등을 포함한다. 일부 경우에, 신호전달 폴리펩티드는 PI3K/mTOR-, NFκB-, MAPK-, STAT-, FAK-, MYC, 또는 TGF-β 매개된 신호전달 경로의 부분이다. 일부 경우에, 신호전달 폴리펩티드는 Ras/Raf/Mek/Erk1/2, JAK/STAT3, 또는 PI3K/Akt 신호전달 경로의 부분이다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 폴리펩티드의 우성 음성 변이체, 예를 들면, 신호전달 폴리펩티드의 우성 음성 변이체를 포함한다. 우성 음성 변이체의 실례는 예로서, 우성 음성 TGF-β 수용체; 우성 음성 변이체로서 기능하는 STAT3의 DNA 결합 도메인에 영향을 주는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 STAT3의 우성 음성 변이체; 기타 등등을 포함한다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드로부터 방출될 때 세포 활성을 차단하거나 또는 변경하는 항체-기초된 골격 또는 비항체-기초된 골격이다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 면역수용체, 예를 들면, 활성화 면역수용체 또는 저해성 면역수용체를 포함한다. 적합한 활성화 면역수용체는 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)를 포함할 수 있다. ITAM 모티프는 YX₁X₂L/I이고, 여기서 X₁과 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 적합한 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 모티프를 내포하는 폴리펩티드로부터 유래되는 ITAM 모티프-내포 부분일 수 있다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 임의의 ITAM 모티프-내포 단백질로부터 ITAM 모티프-내포 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 자신이 유래되는 전체 단백질의 전체 서열을 내포할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드의 실례에는 DAP12; FCER1G (Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD3Z (CD3 제타); 그리고 CD79A (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 한 가지 무제한적 실례로서, 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: ESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQ (서열 번호:25), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다. 다른 실례로서, 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: DGV YTGL STRNQET YETL KHE (서열 번호:26), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다. 상기 폴리펩티드는 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 다른 실례로서, 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: RVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (서열 번호:27); NQL YNEL NLGRREE YDVL DKR (서열 번호:28); EGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMK (서열 번호: 29); 또는 DGL YQGL STATKDT YDAL HMQ (서열 번호:30), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드에서 이용에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)-내포 세포내 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. ITAM 모티프는 YX₁X₂L/I이고, 여기서 X₁과 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, 키메라 Notch 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 경우에, ITAM 모티프는 세포내 신호전달 도메인에서 2회 반복되고, 여기서 ITAM 모티프의 첫 번째와 두 번째 사례는 6 내지 8개 아미노산, 예를 들면, (YX₁X₂L/I)(X₃)_n(YX₁X₂L/I)에 의해 서로로부터 분리되고, 여기서 n은 6 내지 8의 정수이고, 그리고 각각의 6-8 X₃은 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 Notch 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인은 3개의 ITAM 모티프를 포함한다.

적합한 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 모티프를 내포하는 폴리펩티드로부터 유래되는 ITAM 모티프-내포 부분일 수 있다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 임의의 ITAM 모티프-내포 단백질로부터 ITAM 모티프-내포 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 자신이 유래되는 전체 단백질의 전체 서열을 내포할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드의 실례에는 DAP12; FCER1G (Fc 엡실론 수용체 1 감마 사슬); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD3Z (CD3 제타); 그리고 CD79A (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 DAP12 (또한, TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-연관된 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나아제-결합 단백질; 킬러 활성화 수용체 연관된 단백질; 킬러-활성화 수용체-연관된 단백질 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 (4가지 동종형) 중에서 한 가지에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQRPYYK (서열 번호:31); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQRPYYK (서열 번호:32); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQRPYYK (서열 번호:33); 또는 MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQRPYYK (서열 번호:34), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 DAP12 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: ESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQ (서열 번호:25), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 FCER1G (또한, FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬; Fc 수용체 감마-사슬; fc-엡실론 RI-감마; fcR감마; fceRI 감마; 높은 친화성 면역글로불린 엡실론 수용체 아단위 감마; 면역글로불린 E 수용체, 높은 친화성, 감마 사슬 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV YTGL STRNQET YETL KHEKPPQ (서열 번호:35), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 FCER1G 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: DGV YTGL STRNQET YETL KHE (서열 번호:26), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬 (또한, CD3D; CD3-델타; T3D; CD3 항원, 델타 아단위; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩티드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타 사슬; T 세포 수용체 T3 델타 사슬; T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 (2개의 동종형) 중에서 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 170개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV YQPL RDRDDAQ YSHL GGNWARNK (서열 번호:36) 또는 MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV YQPL RDRDDAQ YSHL GGNWARNK (서열 번호:37), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 델타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: DQV YQPL RDRDDAQ YSHL GGN (서열 번호:38), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬 (또한, CD3e, T-세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 사슬, T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬, AI504783, CD3, CD3엡실론, T3e 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 205개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD YEPI RKGQRDL YSGL NQRRI (서열 번호:39), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 엡실론 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: NPD YEPI RKGQRDL YSGL NQR (서열 번호:40), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 감마 사슬 (또한, CD3G, T 세포 수용체 T3 감마 사슬, CD3-감마, T3G, 감마 폴리펩티드 (TiT3 복합체) 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 180개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL YQPL KDREDDQ YSHL QGNQLRRN (서열 번호:41), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 감마 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: DQL YQPL KDREDDQ YSHL QGN (서열 번호:42), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 T-세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬 (또한, CD3Z, T 세포 수용체 T3 제타 사슬, CD247, CD3-제타, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 (2개의 동종형) 중에서 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 또는 약 150개 aa 내지 약 160개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (서열 번호:43) 또는 MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (서열 번호:44), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: RVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (서열 번호:27); NQL YNEL NLGRREE YDVL DKR (서열 번호:28); EGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMK (서열 번호:29); 또는 DGL YQGL STATKDT YDAL HMQ (서열 번호:30), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 CD79A (또한, B-세포 항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬; CD79a 항원 (면역글로불린-연관된 알파); MB-1 막 당단백질; ig-알파; 막-결합된 면역글로불린-연관된 단백질; 표면 IgM-연관된 단백질 등으로서 알려져 있음)로부터 유래된다. 가령, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열 (2개의 동종형) 중에서 어느 한쪽의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 150개 aa, 약 150개 aa 내지 약 200개 aa, 또는 약 200개 aa 내지 약 220개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL YEGL NLDDCSM YEDI SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열 번호:45); 또는

MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열 번호:46), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

유사하게, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 전장 CD79A 아미노산 서열의 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 신호전달 도메인 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: ENL YEGL NLDDCSM YEDI SRG (서열 번호:47), 여기서 ITAM 모티프는 굵게 표시되고 밑줄 그어진다.

DAP10/CD28

본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드에서 이용에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 사슬을 포함한다.

DAP10 신호전달 사슬의 실례는 다음의 아미노산 서열이다: RPRRSPAQDGKV YINM PGRG (서열 번호:48). 일부 구체예에서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 아미노산 서열 RPRRSPAQDGKV YINM PGRG (서열 번호:48)의 전체 길이에 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

CD28 신호전달 사슬의 실례는 다음의 아미노산 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호:49)이다. 일부 구체예에서, 적합한 세포내 신호전달 도메인은 아미노산 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호:49)의 전체 길이에 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

ZAP70

본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드에서 이용에 적합한 세포내 신호전달 도메인은 ZAP70 폴리펩티드, 예를 들면, 다음의 아미노산 서열의 약 300개 아미노산 내지 약 400개 아미노산, 약 400개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 또는 약 500개 아미노산 내지 619개 아미노산의 인접한 스트레치에 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 최소한 약 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA (서열 번호:50).

수용체로부터 유래된 동시자극성 도메인은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드의 세포내 도메인으로서 이용에 적합하다. 동시자극성 도메인은 막경유 단백질의 세포내 부분일 수 있다 (즉, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질로부터 유래될 수 있다). 적합한 동시자극성 폴리펩티드의 무제한적 실례에는 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 그리고 HVEM이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 CD28 (또한, Tp44로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호:51)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 4-1BB (또한, TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDw137; ILA 등으로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열 번호:52)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 OX-40 (또한, TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX40, TXGP1L로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (서열 번호:53)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 BTLA (또한, BTLA1과 CD272로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (서열 번호:54)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 CD27 (또한, S152, T14, TNFRSF7, 그리고 Tp55로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (서열 번호:55)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 CD30 (또한, TNFRSF8, D1S166E, 그리고 Ki-1로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK (서열 번호:56)의 약 100개 아미노산 내지 약 110개 아미노산 (aa), 약 110개 aa 내지 약 115개 aa, 약 115개 aa 내지 약 120개 aa, 약 120개 aa 내지 약 130개 aa, 약 130개 aa 내지 약 140개 aa, 약 140개 aa 내지 약 150개 aa, 약 150개 aa 내지 약 160개 aa, 또는 약 160개 aa 내지 약 185개 aa의 인접한 스트레치에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 GITR (또한, TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357, 그리고 GITR-D로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (서열 번호:57)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 동시자극성 도메인은 막경유 단백질 HVEM (또한, TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, 그리고 TR2로서 알려져 있음)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 가령, 적합한 동시자극성 도메인은 다음의 아미노산 서열: CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH (서열 번호:58)에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

적합한 저해성 면역수용체는 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프 (ITIM), 면역수용체 티로신-기초된 스위치 모티프 (ITSM), NpxY 모티프, 또는 YXXΦ 모티프를 포함할 수 있다. 적합한 저해제 면역수용체는 PD1; CTLA4; BTLA; CD160; KRLG-1; 2B4; Lag-3; 및 Tim-3을 포함한다. 가령, Odorizzi and Wherry (2012) J. Immunol. 188:2957; 그리고 Baitsch et al. (2012) PLoSOne 7:e30852를 참조한다.

일부 경우에, 적합한 저해성 면역수용체는 다음의 PD1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV (서열 번호: 59)

일부 경우에, 적합한 저해성 면역수용체는 다음의 CTLA4 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (서열 번호:60).

일부 경우에, 적합한 저해성 면역수용체는 다음의 CD160 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: MLLEPGRGCCALAILLAIVDIQSGGCINITSSASQEGTRLNLICTVWHKKEEAEGFVVFLCKDRSGDCSPETSLKQLRLKRDPGIDGVGEISSQLMFTISQVTPLHSGTYQCCARSQKSGIRLQGHFFSILFTETGNYTVTGLKQRQHLEFSHNEGTLSSGFLQEKVWVMLVTSLVALQAL (서열 번호:61).

일부 경우에, 적합한 저해성 면역수용체는 다음의 T-세포 면역글로불린 및 점액소 도메인-3 (Tim-3) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:

MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP (서열 번호:62).

일부 경우에, 적합한 저해성 면역수용체는 다음의 림프구 활성화 유전자 3 (Lag-3) 아미노산 서열의 아미노산 23-525에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL (서열 번호:63).

일부 경우에, 세포내 도메인은 Siglec이다. 가령, Varki and Angata (2006) Glycobiol. 16:1R을 참조한다. 일부 경우에, Siglec는 Siglec-15이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 KIR2DL4이다. Miah et al. (2008) J. Immunol. 180:2922.

일부 경우에, 세포내 도메인은 재조합효소이다. 적합한 재조합효소는 Cre 재조합효소; Flp 재조합효소; Dre 재조합효소 등을 포함한다. 적합한 재조합효소는 FLPe 재조합효소이다 (가령, Akbudak and Srivastava (2011) Mol. Biotechnol. 49:82를 참조한다). 적합한 재조합효소는 Flpo 재조합효소이다.

본원에서 설명된 바와 같이, 재조합효소는 무손상 재조합효소 또는 분할 재조합효소일 수 있다. 분할 재조합효소의 부분은 동일하거나 상이한 발현 구조체로부터 발현될 수 있다. 일부 경우에, 분할 재조합효소의 두 부분은 상이한 결합-촉발된 전사 스위치에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 경우에, 분할 재조합효소의 첫 번째 부분은 결합 촉발된 전사 스위치에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 분할 재조합효소의 두 번째 부분은 발현 구조체로부터 별개로 발현될 수 있다.

분할 재조합효소가 예로서, 논리 게이팅된 SynNotch 회로에서처럼 활용되는 경우에, 분할 재조합효소의 부분은 분할 전사 인자에 관하여 본질적으로 아래에 설명된 바와 같이 다양한 방식으로 다른 성분과 함께 하나 또는 그 이상의 발현 카세트에서 배열되고 이들로부터 발현될 수 있다.

따라서, 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 분할 재조합효소의 부분의 발현을 유도하여, 분할 재조합효소 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 재조합효소의 형성을 유발할 수 있다. 대안으로, 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치로부터 재조합효소 부분의 방출을 유발하여, 분할 재조합효소 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 재조합효소의 형성을 유발할 수 있다. 이에 더하여, 분할 재조합효소 부분의 유도 및 방출은 합동될 수 있는데, 예로서 여기서 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 분할 재조합효소의 부분의 발현 및 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치로부터 분할 재조합효소 부분의 방출을 유도하여, 분할 재조합효소 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 재조합효소의 형성을 유발할 수 있다.

적합한 분할 재조합효소는 가령, Beckervordersandforth R et al., Stem Cell Reports. 2014; 2(2):153-62Wen M et al., PLoS One. 2014; 9(10):e110290O'Brien SP et al., Biotechnol J. 2014; 9(3):355-61Wang P et al., Sci Rep. 2012; 2:497Hirrlinger J et al., PLoS One. 2009; 4(12):e8354Hirrlinger J et al., PLoS One. 2009; 4(1):e4286에서 설명된 바와 같이, 예로서 분할 Cre 재조합효소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다; 이들의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

적합한 Cre 재조합효소는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: VSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD (서열 번호:64); 그리고 335개 아미노산 (aa) 내지 350개 aa의 길이를 가질 수 있다.

적합한 FLPe 재조합효소는 다음의 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고: MSQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIASCAAELTYLCWMITHNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTIIPYNGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILNSFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTETKTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVRSYNKALKKNAPYPIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVARTTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIRYPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRIGPVEQKLISEEDL (서열 번호:65); 그리고 430개 아미노산 (aa) 내지 445개 aa의 길이를 가질 수 있다.

적합한 부위 특이적 뉴클레아제는 뉴클레아제 활성을 갖는 RNA-보도된 DNA 결합 단백질, 예를 들면, Cas9 폴리펩티드; 전사 활성인자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN); 아연 핑거 뉴클레아제; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

Cas9 폴리펩티드는 당분야에서 공지된다; 가령, Fonfara et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:2577; 그리고 Sander and Joung (2014) Nat. Biotechnol. 32:347을 참조한다. Cas9 폴리펩티드는 도면 36에서 묘사된 아미노산 서열에 최소한 약 75%, 최소한 약 80%, 최소한 약 85%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 최소한 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 뉴클레아제 활성을 결여하지만, DNA 표적-결합 활성을 유지하는 Cas9 변이체이다. 이런 Cas9 변이체는 본원에서 "죽은 Cas9" 또는 "dCas9"로서 지칭된다. 가령, Qi et al. (2013) Cell 152:1173을 참조한다. dCas9 폴리펩티드는 도면 36에서 묘사된 아미노산 서열 또는 다른 Cas9 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산의 D10A 및/또는 H840A 아미노산 치환을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 dCas9, 예를 들면, dCas9 및 융합 상대를 포함하는 융합 단백질이고, 여기서 적합한 융합 상대는 예로서, 효소 활성을 제공하는 비-Cas9 효소를 포함하고, 여기서 효소 활성은 메틸전달효소 활성, 탈메틸효소 활성, 아세틸전달효소 활성, 탈아세틸화효소 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 (SUMOylating) 활성, 탈수모화 (deSUMOylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 dCas9, 예를 들면, dCas9 및 융합 상대를 포함하는 융합 단백질이고, 여기서 적합한 융합 상대는 예로서, 효소 활성을 제공하는 비-Cas9 효소를 포함하고, 여기서 효소 활성은 뉴클레아제 활성, 메틸전달효소 활성, 탈메틸효소 활성, DNA 수복 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스뮤타아제 활성, 알킬화 활성, 탈푸린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이합체 형성 활성, 인테그라아제 활성, 유전자전위효소 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가아제 활성, 헬리카아제 활성, 포토일라아제 활성 또는 글리코실라아제 활성이다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 키메라 dCas9, 예를 들면, dCas9 및 융합 상대를 포함하는 융합 단백질이고, 여기서 적합한 융합 상대는 예로서, 전사 활성인자 또는 전사 억제인자 도메인 (가령, Kruppel 연관된 상자 (KRAB 또는 SKD); Mad mSIN3 상호작용 도메인 (SID); ERF 억제인자 도메인 (ERD) 등); 아연-핑거-기초된 인공 전사 인자 (가령, Sera (2009) Adv. Drug Deliv. 61:513을 참조한다); TALE-기초된 인공 전사 인자 (가령, Liu et al. (2013) Nat. Rev. Genetics 14:781을 참조한다); 기타 등등을 포함한다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 아폽토시스 유도인자이다. 적합한 아폽토시스 유도인자는 tBID를 포함한다. 용어 "tBID"는 세포질 BID의 효소적 개열 (가령, 활성 카스파제에 의한)로부터 발생하는 BH3 상호작용 사멸 효현제 (BID) 단백질의 C 말단 절두된 단편을 지칭한다. 아폽토시스의 초기 단계에서, tBID는 미토콘드리아로 전위하고 그것으로부터 Cyt c의 방출을 매개한다. tBID 단백질의 무제한적 실례는 인간 tBID (GenBank 수탁 번호 CAG30275에서 제공된 아미노산 서열의 아미노산 61-195)를 포함한다.

인간 tBID는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: gnrsshsrlgrieadsesqediirniarhlaqvgdsmdrsippglvnglaedrnrdlataleqllqayprdmekektmlvlalllakkvashtpsllrdvfhttvnfinqnlrtyvrslarngmd (서열 번호:66).

일부 구체예에서, 세포내 도메인은 앞서 제공된 인간 tBID 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 약 120개 아미노산 (aa) 내지 150개 aa, 예를 들면, 120개 aa 내지 125개 aa, 125개 aa 내지 130개 aa, 130개 aa 내지 135개 aa, 135개 aa 내지 140개 aa, 140개 aa 내지 145개 aa, 또는 145개 aa 내지 150개 aa의 길이를 갖는다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 앞서 제공된 인간 tBID 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 135개 aa의 길이를 갖는다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 인자이다. 적합한 전사 인자의 실례는 U.S. 특허 출원 번호 2014/0308746의 표 1에서 제공된 것들이다. 적합한 전사 인자의 무제한적 실례는 도면 37-66에서 묘사된다. 적합한 전사 활성인자 및 전사 억제인자의 무제한적 실례는 도면 37-83에서 묘사된다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 조절인자이다. 적합한 전사 조절인자의 무제한적 실례는 예로서, ABT1, ACYP2, AEBP1, AEBP2, AES, AFF1, AFF3, AHR, ANK1, ANK2, ANKFY1, ANKIB1, ANKRD1, ANKRD10, ANKRD2, ANKRD32, ANKRD46, ANKRD49, ANKRD56, ANKRD57, ANKS4B, AR, ARHGAP17, ARID1A, ARID1B, ARID3A, ARID4A, ARID5B, ARNT, ARNT2, ARNTL, ARNTL2, ARX, ASB10, ASB11, ASB12, ASB15, ASB2, ASB5, ASB8, ASB9, ASH1L, ASH2L, ASXL1, ASZ1, ATF1, ATF3, ATF4, ATF4, ATF5, ATF6, ATF7, ATF7IP, ATM, ATOH1, ATXN3, 1300003B13RIK, B3GAT3, B930041F14RIK, BACH1, BACH2, BARX1, BARX2, BATF, BATF2, BATF3, BAZ2A, BBX, BC003267, BCL11A, BCL11B, BCL3, BCL6, BCL6B, BCLAF1, BCOR, BHLHA15, BHLHE40, BHLHE41, BLZF1, BMYC, BNC1, BNC2, BPNT1, BRCA1, BRWD1, BTBD11, BTF3, 6030408C04RIK, CAMK4, CARHSP1, CARM1, CBX4, CBX7, CCNC, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDC5L, CDK2, CDK4, CDK9, CDKN2C, CDX1, CDX1, CDX2, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, CEBPG, CEBPZ, CHD4, CHD7, CHGB, CIC, CIITA, CITED1, CITED2, CITED4, CLOCK, CLPB, CML3, CNOT7, COPS2, CREB1, CREB3, CREB3L1, CREB3L1, CREB3L2, CREB3L3, CREB5, CREBBP, CREBL2, CREM, CSDA, CSDA, CSDC2, CSDE1, CTBP2, CTCF, CTCFL, CTNNB1, CTNNBL1, CXXC1, D11BWG0517E, 2300002D11RIK, DACH1, DAXX, DBP, DDIT3, DDX20, DDX54, DDX58, DEAF1, DEK, DIDO1, DLX2, DMRT1, DMRT2, DMRTB1, DNMT1, DNMT3A, DR1, DRG1, DUSP26, DYSFIP1, E2F1, E2F2, E2F3, E2F5, E2F6, EBF1, EBF2, EBF3, EBF3, EED, EGR1, EGR2, EGR3, EHF, EHMT2, EID2, ELAVL2, ELF1, ELF1, ELF2, ELF3, ELF4, ELF5, ELK3, ELK4, ELL2, EMX2, EMX2, EN2, ENPP2, EOMES, EP300, EPAS1, ERF, ERG, ESR1, ESRRA, ESRRB, ESRRG, ETS1, ETS2, ETV1, ETV3, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EZH1, EZH2, FAH, FBXL10, FBXL11, FBXW7, FEM1A, FEM1B, FEM1C, FHL2, FLI1, FMNL2, FOS, FOSB, FOSL1, FOSL2, FOXA1, FOXA2, FOXA3, FOXC1, FOXD1, FOXD2, FOXD3, FOXF1, FOXF1A, FOXF2, FOXG1, FOXI1, FOXJ2, FOXJ3, FOXK1, FOXK2, FOXL1, FOXL2, FOXM1, FOXN1, FOXN2, FOXN3, FOXO1, FOXO3, FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4, FOXQ1, FUS, FUSIP1, 2810021G02RIK, GABPA, GABPB1, GARNL1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA5, GATA5, GATA6, GBX2, GCDH, GCM1, GFI1, GFI1B, GLI2, GLI3, GLIS1, GLIS2, GLIS3, GLS2, GMEB1, GMEB2, GRHL1, GRHL2, GRHL3, GRLF1, GTF2A1, GTF2B, GTF2E2, GTF2F1, GTF2F2, GTF2H2, GTF2H4, GTF2I, GTF2IRD1, GTF2IRD1, GZF1, HAND2, HBP1, HCLS1, HDAC10, HDAC11, HDAC2, HDAC5, HDAC9, HELZ, HES1, HES4, HES5, HES6, HEXIM1, HEY2, HEYL, HHEX, HHEX, HIC1, HIC2, HIF1A, HIF1AN, HIPK2, HIVEP1, HIVEP2, HIVEP2, HIVEP3, HLF, HLTF, HLX, HMBOX1, HMG20A, HMGA2, HMGB2, HMGB3, HNF1B, HNF4A, HNF4G, HOMEZ, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC10, HOXC11, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD8, HOXD9, HR, HSBP1, HSF2BP, HTATIP2, HTATSF1, HUWE1, 5830417I10RIK, ID1, ID2, ID3, ID3, IFNAR2, IKBKB, IKBKG, IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4, IL31RA, ILF3, ING1, ING2, ING3, ING4, INSM1, INTS12, IQWD1, IRF1, IRF1, IRF2, IRF3, IRF4, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, IRF8, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, ISL1, ISL2, ISX, ISX, IVNS1ABP, 2810021J22RIK, JARID1A, JARID1B, JARID1C, JARID1D, JDP2, JUN, JUNB, JUND, KLF1, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF15, KLF16, KLF2, KLF3, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KRR1, 6330416L07RIK, L3MBTL2, LASS2, LASS4, LASS6, LBA1, LBH, LBX1, LCOR, LDB1, LDB2, LEF1, LHX1, LHX2, LHX5, LIMD1, LIN28, LMO1, LMO4, LMX1A, LSM11, LSM4, LYL1, 9030612M13RIK, 1810007M14RIK, 3632451O06RIK, MAF, MAFA, MAFB, MAFF, MAFG, MAFK, MAGED1, MAP3K12, MAPK1, MAPK3, MAPK8, MAPK8IP1, MAX, MAZ, MBD2, MCM2, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, MECOM, MECP2, MED12, MED8, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D, MEIS1, MEIS1, MEIS2, MEOX2, MESP2, MID1, MITF, MKI67IP, MKL1, MLL1, MLL3, MLLT10, MLLT3, MLX, MLXIP, MLXIPL, MNT, MNX1, MPL, MSC, MSRB2, MSX2, MTA3, MTF1, MTF2, MTPN, MXD1, MXD4, MXI1, MYB, MYBBP1A, MYBL2, MYC, MYCBP, MYCL1, MYCN, MYEF2, MYF6, MYNN, MYOCD, MYOD1, MYOG, MYST3, MYST4, MYT1L, MZF1, NAB1, NAB2, NANOG, NARG1, NCOA1, NCOA2, NCOA3, NCOR1, NCOR2, NDN, NEUROD1, NEUROD4, NEUROD6, NEUROG1, NEUROG2, NFAT5, NFATC1, NFATC2, NFATC2IP, NFATC3, NFATC3, NFATC4, NFE2, NFE2L1, NFE2L2, NFIA, NFIA, NFIB, NFIC, NFIL3, NFIX, NFKB1, NFKB2, NFKBIB, NFKBIE, NFKBIZ, NFX1, NFXL1, NFYA, NFYB, NHLH1, NKX2-2, NKX2-3, NKX2-5, NKX2-6, NKX6-2, NMI, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NPAS1, NPAS2, NPAS3, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1D2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NRARP, NRIP1, NRIP2, NSBP1, NSD1, NUDT12, NULL, NUPR1, 1700065O13RIK, OLIG1, OLIG2, OLIG2, ONECUT1, ONECUT2, ONECUT3, ORC2L, OSGIN1, OSR1, OSR2, OSTF1, OVOL1, OVOL2, PAPOLA, PAPOLG, PAPPA2, PATZ1, PAWR, PAX2, PAX5, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBX1, PBX2, PBX3, PBX4, PCBD1, PCGF6, PDCD11, PDLIM4, PDX1, PEG3, PER1, PFDN1, PGR, PHF1, PHF10, PHF12, PHF13, PHF14, PHF20, PHF21A, PHF5A, PHF7, PHOX2A, PHOX2B, PIAS2, PIR, PITX1, PITX2, PKNOX1, PKNOX2, PLA2G6, PLAGL1, PLAGL2, PLRG1, PML, POGK, POLR2B, POLR2E, POLR2H, POLR3E, POLR3H, POLRMT, POU1F1, POU2AF1, POU2F1, POU2F2, POU3F2, POU3F3, POU3F3, POU5F1, POU6F1, PPARA, PPARD, PPARG, PPARGC1A, PPARGC1B, PPP1R12C, PPP1R13B, PPP1R16B, PPP1R1B, PPP2R1A, PPP3CB, PQBP1, PRDM1, PRDM14, PRDM15, PRDM16, PRDM2, PRDM4, PRDM5, PRDM6, PRDM8, PREB, PRKAR1A, PRKCBP1, PROX1, PRRX1, PRRX2, PSMC5, PSMD10, PSMD9, PTF1A, PTGES2, PURB, PWP1, RAB11A, RAB11B, RAB15, RAB18, RAB1B, RAB25, RAB8A, RAB8B, RAI14, RARA, RARB, RARG, RASSF7, RB1, RBBP7, RBL1, RBM14, RBM39, RBM9, RBPJ, RBPJL, RCOR2, REL, RELA, RELB, RERE, REST, REXO4, RFC1, RFX1, RFX2, RFX3, RFX5, RFX7, RFX8, RHOX5, RHOX6, RHOX9, RIPK4, RNF12, RNF14, RNF141, RNF38, RNF4, RORA, RORA, RORB, RORC, RPS6KA4, RREB1, RSRC1, RUNX1, RUNX1T1, RUNX2, RUNX2, RUNX3, RUVBL1, RUVBL2, RXRA, RXRG, RYBP, SAFB2, SALL1, SALL1, SALL2, SALL4, SAP30, SAP30BP, SATB1, SATB2, SATB2, SCAND1, SCAP, SCRT2, SEC14L2, SERTAD1, SF1, SFPI1, SFRS5, SH3D19, SH3PXD2B, SHANK3, SHOX2, SHPRH, SIN3A, SIN3B, SIRT2, SIRT3, SIRT5, SIX1, SIX1, SIX2, SIX3, SIX4, SIX5, SKI, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, SMARCA1, SMARCA2, SMARCA5, SMARCB1, SMYD1, SNAI1, SNAI2, SNAPC2, SNAPC4, SNIP1, SOLH, SOX1, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX15, SOX17, SOX18, SOX2, SOX21, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX9, SP1, SP110, SP140L, SP2, SP3, SP4, SP6, SP8, SPDEF, SPEN, SPI1, SPIB, SQSTM1, SREBF1, SREBF2, SREBF2, SRF, SSBP2, SSBP3, SSBP4, SSRP1, ST18, STAG1, STAT1, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT5B, STAT6, SUB1, SUZ12, TADA2L, TAF13, TAF5, TAF5L, TAF7, TAF9, TAL1, TAL1, TARDBP, TBPL1, TBR1, TBX1, TBX10, TBX15, TBX18, TBX2, TBX2, TBX20, TBX21, TBX3, TBX4, TBX5, TBX6, TCEA1, TCEA3, TCEAL1, TCEB3, TCERG1, TCF12, TCF15, TCF19, TCF20, TCF21, TCF21, TCF3, TCF4, TCF7, TCF7L2, TCFAP2A, TCFAP2B, TCFAP2C, TCFCP2L1, TCFE2A, TCFE3, TCFEB, TCFEC, TCFL5, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, TEF, TFAP2A, TFAP2C, TFCP2L1, TFDP2, TFEB, TFEC, TGFB1I1, TGIF1, TGIF2, TGIF2LX, THRA, THRAP3, THRB, THRSP, TIAL1, TLE1, TLE6, TMEM131, TMPO, TNFAIP3, TOB1, TOX4, TP63, TRERF1, TRIB3, TRIM24, TRIM28, TRIM30, TRIP13, TRIP4, TRIP6, TRP53, TRP53BP1, TRP63, TRPS1, TRPS1, TSC22D1, TSC22D2, TSC22D3, TSC22D4, TSHZ1, TSHZ1, TSHZ3, TTRAP, TUB, TULP4, TWIST1, TWIST2, TYSND1, UBE2W, UBN1, UBP1, UBTF, UGP2, UHRF1, UHRF2, UNCX, USF1, USF2, UTF1, VDR, VEZF1, VGLL2, VSX1, WASL, WHSC1, WHSC2, WT1, WWP1, WWTR1, XBP1, YAF2, YY1, ZBED1, ZBED4, ZBTB1, ZBTB10, ZBTB16, ZBTB16, ZBTB17, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB22, ZBTB25, ZBTB32, ZBTB38, ZBTB4, ZBTB43, ZBTB45, ZBTB47, ZBTB7A, ZBTB7B, ZBTB7C, ZCCHC8, ZDHHC13, ZDHHC16, ZDHHC21, ZDHHC5, ZDHHC6, ZEB2, ANK2ZEB2, ZFHX2, ZFHX3, ZFHX4, ZFP105, ZFP110, ZFP143, ZFP148, ZFP161, ZFP192, ZFP207, ZFP219, ZFP238, ZFP263, ZFP275, ZFP277, ZFP281, ZFP287, ZFP292, ZFP35, ZFP354C, ZFP36, ZFP36L1, ZFP386, ZFP407, ZFP42, ZFP423, ZFP426, ZFP445, ZFP451, ATF5ZFP451, ZFP467, ZFP52, ZFP57, ZFP592, ZFP593, ZFP597, ZFP612, ZFP637, ZFP64, ZFP647, ZFP748, ZFP810, ZFP9, ZFP91, ZFPM1, ZFPM2, ZFX, ZHX2, ZHX3, ZIC1, ZIC2, ZIC3, ZIC4, ZIC5, ZKSCAN1, ZKSCAN3, ZMYND11, ZNF143, ZNF160, ZNF175, ZNF184, ZNF192, ZNF213, ZNF217, ZNF219, ZNF22, ZNF238, ZNF24, ZNF267, ZNF273, ZNF276, ZNF280D, ZNF281, ZNF292, ZNF311, ZNF331, ZNF335, ZNF337, ZNF33B, ZNF366, ZNF394, ZNF398, ZNF41, ZNF410, ZNF415, ZNF423, ZNF436, ZNF444, ZNF445, ZNF451, ZNF460, ZNF496, ZNF498, ZNF516, ZNF521, ZNF532, ZNF536, ZNF546, ZNF552, ZNF563, ZNF576, ZNF580, ZNF596, ZNF621, ZNF628, ZNF648, ZNF649, ZNF652, ZNF655, ZNF664, ZNF668, ZNF687, ZNF692, ZNF696, ZNF697, ZNF710, ZNF80, ZNF91, ZNF92, ZNRD1, ZSCAN10, ZSCAN16, ZSCAN20, ZSCAN21, ZXDC, 그리고 ZZZ3을 포함한다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 인자이다. 적합한 전사 인자는 예로서, ASCL1, BRN2, CDX2, CDX4, CTNNB1, EOMES, JUN, FOS, HNF4a, HOXAs (가령, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA10, HOXA11, HOXA13), HOXBs (가령, HOXB9), HOXCs (가령, HOXC4, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXC10, HOXC11, HOXC12, HOXC13), HOXDs (가령, HOXD1, HOXD3, HOXD4, HOXD8, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD12, HOXD13), SNAI1-3, MYOD1, MYOG, NEUROD1-6 (가령, NEUROD1, NEUROD2, NEUROD4, NEUROD6), PDX1, PU.1, SOX2, Nanog, Klf4, BCL-6, SOX9, STAT1-6, TBET, TCF, TEAD1-4 (가령, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4), TAF6L, CLOCK, CREB, GATA3, IRF7, MycC, NFkB, RORyt, RUNX1, SRF, TBX21, NFAT, MEF2D, 그리고 FoxP3을 포함한다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 하나 또는 그 이상의 면역 세포에서 조절 역할을 갖는 전사 인자 (즉, 면역 세포 조절 전사 인자)이다. 적합한 면역 세포 조절 전사 인자는 예로서, 2210012G02Rik, Akap8l, Appl2, Arid4b, Arid5b, Ash1l, Atf7, Atm, C430014K11Rik, Chd9, Dmtf1, Fos, Foxo1, Foxp1, Hmbox1, Kdm5b, Klf2, Mga, Mll1, Mll3, Myst4, Pcgf6, Rev3l, Scml4, Scp2, Smarca2, Ssbp2, Suhw4, Tcf7, Tfdp2, Tox, Zbtb20, Zbtb44, Zeb1, Zfml, Zfp1, Zfp319, Zfp329, Zfp35, Zfp386, Zfp445, Zfp518, Zfp652, Zfp827, Zhx2, Eomes, Arntl, Bbx, Hbp1, Jun, Mef2d, Mterfd1, Nfat5, Nfe2l2, Nr1d2, Phf21a, Taf4b, Trf, Zbtb25, Zfp326, Zfp451, Zfp58, Zfp672, Egr2, Ikzf2, Taf1d, Chrac1, Dnajb6, Aplp2, Batf, Bhlhe40, Fosb, Hist1h1c, Hopx, Ifih1, Ikzf3, Lass4, Lin54, Mxd1, Mxi1, Prdm1, Prf1, Rora, Rpa2, Sap30, Stat2, Stat3, Taf9b, Tbx21, Trps1, Xbp1, Zeb2, Atf3, Cenpc1, Lass6, Rb1, Zbtb41, Crem, Fosl2, Gtf2b, Irf7, Maff, Nr4a1, Nr4a2, Nr4a3, Obfc2a, Rbl2, Rel, Rybp, Sra1, Tgif1, Tnfaip3, Uhrf2, Zbtb1, Ccdc124, Csda, E2f3, Epas1, H1f0, H2afz, Hif1a, Ikzf5, Irf4, Nsbp1, Pim1, Rfc2, Swap70, Tfb1m, 2610036L11Rik, 5133400G04Rik, Apitd1, Blm, Brca1, Brip1, C1d, C79407, Cenpa, Cfl1, Clspn, Ddx1, Dscc1, E2f7, E2f8, Ercc6l, Ezh2, Fen1, Foxm1, Gen1, Gsg2, H2afx, Hdac1, Hdgf, Hells, Hist1h1e, Hist3h2a, Hjurp, Hmgb2, Hmgb3, Irf1, Irf8, Kif22, Kif4, Lig1, Lmo2, Lnp, Mbd4, Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6, Mcm7, Mybl2, Neil3, Nusap1, Orc6l, Pola1, Pola2, Pole, Pole2, Polh, Polr2f, Polr2j, Ppp1r8, Prim2, Psmc3ip, Rad51, Rad51c, Rad54l, Rfc3, Rfc4, Rnps1, Rpa1, Smarcc1, Spic, Ssrp1, Taf9, Tfdp1, Tmpo, Topbp1, Trdmt1, Uhrf1, Wdhd1, Whsc1, Zbp1, Zbtb32, Zfp367, Car1, Polg2, Atr, Lef1, Myc, Nucb2, Satb1, Taf1a, Ift57, Apex1, Chd7, Chtf8, Ctnnb1, Etv3, Irf9, Myb, Mybbp1a, Pms2, Preb, Sp110, Stat1, Trp53, Zfp414, App, Cdk9, Ddb1, Hsf2, Lbr, Pa2g4, Rbms1, Rfc1, Rfc5, Tada2l, Tex261, Xrcc6 등을 포함한다.

일부 경우에, 전사 인자는 예로서, 아연-핑거-기초된 인공 전사 인자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 인공 전사 인자 (ATF)일 수 있다 (가령, Sera T. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61(7-8):513-26; Collins et al. Curr Opin Biotechnol. 2003 14(4):371-8; Onori et al. BMC Mol Biol. 2013 14:3에서 설명된 것들 포함, 이들의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다).

가령, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 37에서 묘사된 아폽토시스-길항 전사 인자 (AATF) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 38에서 묘사된 기저 전사의 활성인자 (ABT1) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 39에서 묘사된 지방세포 인핸서 결합 단백질 2 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 40에서 묘사된 활성화 전사 인자 1 (ATF1) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 41에서 묘사된 전사 조절인자 단백질 BACH1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 42에서 묘사된 부류 E 기본 나선-루프-나선 단백질 41 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 43에서 묘사된 브로모도메인-내포 단백질 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 44에서 묘사된 CCAAT/인핸서-결합 단백질 제타 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 45에서 묘사된 크로모도메인-헬리카아제-DNA-결합 단백질 1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 46에서 묘사된 사멸-유도인자 말살자 1 동종형 c 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 47에서 묘사된 단백질 Dr1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 48에서 묘사된 초기 성장 반응 단백질 1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 49에서 묘사된 ETS-관련된 전사 인자 Elf-2 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 50에서 묘사된 에스트로겐 수용체 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 51에서 묘사된 아연 핑거 및 BTB 도메인-내포 단백질 7A 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 52에서 묘사된 4와 1/2 LIM 도메인 단백질 1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 53에서 묘사된 포크헤드 상자 단백질 P3 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 54에서 묘사된 GA-결합 단백질 알파 사슬 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 55에서 묘사된 간 백혈병 인자 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 56에서 묘사된 HOP 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 57에서 묘사된 DNA-결합 단백질 저해제 ID-1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 58에서 묘사된 DNA-결합 단백질 저해제 ID-2 (우성 음성 나선-루프-나선) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 59에서 묘사된 인터페론 조절 1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 60에서 묘사된 Krueppel-유사 인자 12 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 61에서 묘사된 LIM 도메인-결합 단백질 1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 62에서 묘사된 LIM/호메오복스 단백질 Lhx1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 63에서 묘사된 아연 핑거 전사 인자 E2S-VP64 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: VDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSGGSGGSGGSLEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK (서열 번호:67); 그리고 105-115개 아미노산 (가령, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 또는 115개 아미노산)의 길이를 갖는다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 64에서 묘사된 GAL4 DNA 결합 도메인 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGPLGGGKGGSGGSGGSMKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAA (서열 번호:68); 그리고 200개 아미노산 내지 210개 아미노산 (가령, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 또는 210개 아미노산)의 길이를 갖는다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 65에서 묘사된 신호 전달기 및 전사 활성인자 3 (STAT3) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 66에서 묘사된 Myc 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 67에서 묘사된 ASCL1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 68에서 묘사된 CDX2 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 69에서 묘사된 CREB1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 70에서 묘사된 CTNNB1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 71에서 묘사된 EOMES 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 72에서 묘사된 Fos 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 73에서 묘사된 GATA3 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 74에서 묘사된 HOXA1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 75에서 묘사된 인터페론 조절 인자 7 (IRF7) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 76에서 묘사된 Jun 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 77에서 묘사된 근세포 인핸서 인자 2D (MEF2D) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 78에서 묘사된 뉴런 분화 인자 1 (NEUROD1) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 79에서 묘사된 NFAT 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 80에서 묘사된 NFκB 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 81에서 묘사된 SNAI1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 82에서 묘사된 STAT1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실례로서, 일부 경우에, 세포내 도메인은 도면 83에서 묘사된 TEAD1 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 테트라사이클린-제어된 전사 활성인자 (tTA) 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG (서열 번호:69); 그리고 약 245개 아미노산 내지 252개 아미노산 (가령, 248, 249, 250, 251, 또는 252개 아미노산)의 길이를 갖는다.

일부 구체예에서, 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, 전사 활성인자는 GAL4-VP16이다. 일부 경우에, 전사 활성인자는 GAL4-VP64이다. 일부 경우에, 전사 활성인자는 Tbx21이다. 일부 경우에, 전사 활성인자는 작동체 도메인, 예를 들면, VP64 (전사 활성화) 또는 KRAB (전사 억제)에 융합된 가공된 단백질, 예를 들면, 아연 핑거 또는 TALE 기초된 DNA 결합 도메인이다. 당분야에서 공지된 다양한 다른 전사 전이활성인자가 이용에 적합하다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 GAL4-VP64 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAAAGGSGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS (서열 번호:70); 그리고 208개 내지 214개 아미노산 (가령, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 또는 214개 아미노산)의 길이를 갖는다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 Tbx21 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: MGIVEPGCGDMLTGTEPMPGSDEGRAPGADPQHRYFYPEPGAQDADERRGGGSLGSPYPGGALVPAPPSRFLGAYAYPPRPQAAGFPGAGESFPPPADAEGYQPGEGYAAPDPRAGLYPGPREDYALPAGLEVSGKLRVALNNHLLWSKFNQHQTEMIITKQGRRMFPFLSFTVAGLEPTSHYRMFVDVVLVDQHHWRYQSGKWVQCGKAEGSMPGNRLYVHPDSPNTGAHWMRQEVSFGKLKLTNNKGASNNVTQMIVLQSLHKYQPRLHIVEVNDGEPEAACNASNTHIFTFQETQFIAVTAYQNAEITQLKIDNNPFAKGFRENFESMYTSVDTSIPSPPGPNCQFLGGDHYSPLLPNQYPVPSRFYPDLPGQAKDVVPQAYWLGAPRDHSYEAEFRAVSMKPAFLPSAPGPTMSYYRGQEVLAPGAGWPVAPQYPPKMGPASWFRPMRTLPMEPGPGGSEGRGPEDQGPPLVWTEIAPIRPESSDSGLGEGDSKRRRVSPYPSSGDSSSPAGAPSPFDKEAEGQFYNYFPN (서열 번호:71); 그리고 530개 아미노산 내지 540개 아미노산 (가령, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 또는 540개 아미노산)의 길이를 갖는다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 다음의 MyoD 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고: MELLSPPLRDIDLTGPDGSLCSFETADDFYDDPCFDSPDLRFFEDLDPRLVHMGALLKPEEHAHFPTAVHPGPGAREDEHVRAPSGHHQAGRCLLWACKACKRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLRDQDAAPPGAAAFYAPGPLPPGRGSEHYSGDSDASSPRSNCSDGMMDYSGPPSGPRRQNGYDTAYYSEAARESRPGKSAAVSSLDCLSSIVERISTDSPAAPALLLADAPPESPPGPPEGASLSDTEQGTQTPSPDAAPQCPAGSNPNAIYQVL (서열 번호:72); 그리고 305개 내지 325개 아미노산 (가령, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 또는 325개 아미노산)의 길이를 갖는다.

일부 경우에, 세포내 도메인은 독소를 포함한다. 독소의 실례는 예로서, 디프테리아 독소 A 단편, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, α-사크린, 일정한 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 일정한 디안틴 단백질, 미국자리공 (Phytolacca americana) 단백질 (PAP, PAPII 및 PAP-S), 여주 (Morodica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀 (Saponaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토길린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 네오마이신을 포함한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 유형 II 분비 시스템을 통해 세균 병원체에 의해 정상적으로 분비되는 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 세포내 도메인은 유형 III (가령, 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (Shigella), 예르시니아 (Yersinia), 비브리오 (Vibrio)) 및 유형 IV (가령, 백일해균 (Bordetella pertussis), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 아그로박테리움 투메파키엔스 (Agrobacterium tumefaciens)) 분비 시스템으로부터 독성 세균 작동체를 포함한다. 유형 III 세균 분비 시스템으로부터 독성 세균 작동체의 실례는 예로서, VopQ, YopH 등을 포함한다. 가령, Dean (2011) FEMS Microbiol. Rev. 35:1100을 참조한다. 유형 IV 세균 분비 시스템으로부터 독성 세균 작동체의 실례는 예로서, 백일해 독소, CagA 등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 호르몬이다. 적합한 호르몬의 실례는 예로서, 에리트로포이에틴 (EPO), 인슐린, 세크레틴, 글루카곤-유사 폴리펩티드 1 (GLP-1) 등을 포함한다. 이런 호르몬의 추가 실례는 액티빈, 인히빈, 아디포넥틴, 지방-유래된 호르몬, 부신 피질자극 호르몬, 아파멜라노티드, 아구티 신호전달 펩티드, 알라토스타틴, 아밀린, 아밀린 패밀리, 안지오텐신, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 가스트린, 소마토트로핀, 브래디키닌, 뇌-유래된 신경영양 인자, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 섬모 신경영양 인자, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 코신트로핀, 엔도텔리안, 엔테로글루카곤, 섬유모세포 성장 인자 15 (FGF15), GFG15/19, 난포-자극 호르몬, 가스트린, 위 억제 펩티드, 그렐린, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드-1, 성선자극호르몬, 생식선자극호르몬 분비 호르몬, 과립구-집락 자극 인자, 성장 호르몬, 성장-호르몬-방출 호르몬, 헵시딘, 인간 융모생식선자극호르몬, 인간 태반 락토겐, 인크레틴, 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데글루덱, 인슐린 글라진, 인슐린 리스프로, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 인슐린-유사 성장 인자-2, 렙틴, 리라글루티드, 황체형성 호르몬, 멜라노코르틴, 멜라닌세포 자극 호르몬, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 멜라노틴 II, 미니가스트린, 뇌 나트륨이뇨 펩티드의 N 말단 프로호르몬, 신경 성장 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, NPH 인슐린, 오베스타틴, 오렉신, 오스테오칼신, 췌장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 펩티드 호르몬, 펩티드 YY, 혈장 레닌 활성, 프라믈린티드, 프레프리호르몬, 프로락틴, 렐락신, 렐락신 패밀리 펩티드 호르몬, 레닌, 살카토닌, 세크레틴, 세크레틴 패밀리 펩티드 호르몬, 신칼리드, 텔레오스트 렙틴, 템포린, 테사모렐린, 갑상선-자극 호르몬, 갑상선자극호르몬-분비 호르몬, 우로코르틴, 우로코르틴 II, 우로코르틴 III, 혈관작용 장관 펩티드, 그리고 비텔로게닌을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 성장 인자이다. 적합한 성장 인자의 실례는 간세포 자극 인자, 형질세포종 성장 인자, 뇌 유래된 신경영양 인자 (BDNF), 신경교 유래된 신경영양 인자 (GDNF), 신경영양 인자 3 (NT3), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 전환 성장 인자 (TGF), 혈소판 전환 성장 인자, 우유 성장 인자, 내피 성장 인자 (EGF), 내피 세포-유래된 성장 인자 (ECDGF), 알파-내피 성장 인자, 베타-내피 성장 인자, 신경영양 성장 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 4-1 BB 수용체 (4-1BBR), TRAIL (TNF-관련된 아폽토시스 유도 리간드), 아르테민 (GFR알파3-RET 리간드), BCA-1 (B 세포-유인 케모킨), B 림프구 화학유인물질 (BLC), B 세포 성숙 단백질 (BCMA), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뼈 성장 인자, 예를 들면, 오스테오프로테게린 (OPG), 뼈-유래된 성장 인자, 거대핵세포 유래된 성장 인자 (MGDF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 트롬보포이에틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 거대핵세포 유래된 성장 인자 (MGDF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 뉴로트로핀-2 (NT-2), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4 (NT4), 뉴로트로핀-5 (NT-5), 신경아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 뼈 형성 단백질 2 (BMP2), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 집락 자극 인자 (CSF) 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 사이토킨이다. 적합한 사이토킨의 실례는 예로서, 인터페론 (가령, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론); 인터류킨 (가령, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-18, IL-19, IL-20, IL-24); 종양 괴사 인자 (가령, TNF-α); 전환 성장 인자-베타; TRAIL; 기타 등등을 포함한다. 적합한 사이토킨의 실례는 또한, flexi-12 (Anderson et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1125), IL-12 이형이합체의 두 폴리펩티드 사슬을 합동하는 단일 사슬 폴리펩티드); IL-12 슈퍼카인 H9 (Levin et al. (2012) Nature 484:529); 기타 등등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 케모킨이다. 적합한 케모킨의 실례는 예로서, MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES, IP10 등을 포함한다. 적합한 케모킨의 추가 실례는 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-2 (CCL2; 단핵구 화학주성 단백질-1 또는 MCP1로서 또한 지칭됨); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-3 (CCL3; 대식세포 염증성 단백질-1A 또는 MIP1A로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-5 (CCL5; RANTES로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-17 (CCL17; 흉선 및 활성화 조절된 케모킨 또는 TARC로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-19 (CCL19; EBI1 리간드 케모킨 또는 ELC로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-21 (CCL21; 6Ckine으로서 또한 알려져 있음); C-C 케모킨 수용체 유형 7 (CCR7); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 9 (CXCL9; 감마 인터페론 또는 MIG에 의해 유도된 모노카인으로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10; 인터페론 감마-유도된 단백질 10 또는 IP-10으로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 11 (CXCL11; 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학유인물질 또는 I-TAC로 또한 불림); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 16 (CXCL16; 케모킨 (C 모티프) 리간드 (XCL1; 림포탁틴으로서 또한 알려져 있음); 그리고 대식세포 집락 자극 인자 (MCSF)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 결합 촉발된 전사 스위치, 예를 들면, 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 항체 (또는 항체의 항원 결합 단편이다). 적합한 항체는 예로서, α4β1 및 α4β7 인테그린의 α4 아단위를 표적으로 하는 나탈리주맙 (티사브리; Biogen Idec/Elan) (MS 및 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); α4β7 인테그린을 표적으로 하는 베돌리주맙 (MLN2; Millennium Pharmaceuticals/Takeda) (UC 및 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); BAFF를 표적으로 하는 벨리무맙 (베닐스타; Human Genome Sciences/ GlaxoSmithKline) (SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); BAFF 및 APRIL을 표적으로 하는 아타시셉트 (TACI-Ig; Merck/Serono) (SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); CD2를 표적으로 하는 알레파셉트 (아메비브; Astellas) (플라크 건선, GVHD의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 오텔릭시주맙 (TRX4; Tolerx/GlaxoSmithKline) (T1D의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 테플리주맙 (MGA031; MacroGenics/Eli Lilly) (T1D의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 리툭시맙 (리툭산/마브테라; Genentech/Roche/Biogen Idec) (비호지킨 림프종, RA (TNF 차단에 부적당한 반응을 갖는 환자에서) 및 CLL의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 오파투무맙 (아르제라; Genmab/GlaxoSmithKline) (CLL, RA의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 오크렐리주맙 (2H7; Genentech/Roche/Biogen Idec) (RA 및 SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); CD22를 표적으로 하는 에프라투주맙 (hLL2; Immunomedics/UCB) (SLE 및 비호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD52를 표적으로 하는 알렘투주맙 (캄패스/맙캄패스; Genzyme/Bayer) (CLL, MS의 치료에서 이용된 바와 같이); CD80 및 CD86을 표적으로 하는 아바타셉트 (오렌시아; Bristol-Myers Squibb) (RA 및 JIA, UC 및 크론병, SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); C5 보체 단백질을 표적으로 하는 에쿨리주맙 (솔리리스; Alexion pharmaceuticals) (발작성 야간 혈색소뇨증의 치료에서 이용된 바와 같이); IgE를 표적으로 하는 오말리주맙 (솔라이르; Genentech/Roche/Novartis) (중등도 내지 중증도 지속 알레르기 천식의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-1β를 표적으로 하는 카나키누맙 (일라리스; Novartis) (크리오피린-연관된 주기적 증후군, 전신 JIA, 신생아-발병 다중시스템 염증성 질환 및 급성 통풍의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-5를 표적으로 하는 메폴리주맙 (보사트리아; GlaxoSmithKline) (과-호산성 증후군의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-5를 표적으로 하는 레슬리주맙 (SCH55700; Ception Therapeutics) (호산성 식도염의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-6R을 표적으로 하는 토실리주맙 (악템라/로악템라; Chugai/Roche) (RA, JIA의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-12 및 IL-23을 표적으로 하는 우스테키누맙 (스텔라라; Centocor) (플라크 건선, 건선성 관절염, 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-12 및 IL-23을 표적으로 하는 브리아키누맙 (ABT-874; Abbott) (건선 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 에타네르셉트 (엔브렐; Amgen/Pfizer) (RA, JIA, 건선성 관절염, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 인플릭시맙 (레미케이드; Centocor/Merck) (크론병, RA, 건선성 관절염, UC, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 아달리무맙 (휴미라/트루덱사; Abbott) (RA, JIA, 건선성 관절염, 크론병, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 세르톨리주맙 페골 (씸지아; UCB) (크론병 및 RA의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 골리무맙 (심포니; Centocor) (RA, 건선성 관절염 및 AS의 치료에서 이용된 바와 같이); 기타 등등을 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인에 의해 생산이 유도되는 항체는 암의 치료를 위한 치료 항체이다. 이런 항체는 예로서, CTLA-4를 표적으로 하는 이플리무맙 (흑색종, 전립선암, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); CTLA-4를 표적으로 하는 트레멜리무맙 (CRC, 위, 흑색종, NSCLC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 니볼루맙 (흑색종, NSCLC, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 MK-3475 (흑색종의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 피딜리주맙 (혈액암의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-L1을 표적으로 하는 BMS-936559 (흑색종, NSCLC, 난소, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-L1을 표적으로 하는 MEDI4736; PD-L1을 표적으로 하는 MPDL33280A (흑색종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 리툭시맙 (비호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); 이브리투모맙 티우제탄 및 토시투모맙 (림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD30을 표적으로 하는 브렌툭시맙 베도틴 (호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD33을 표적으로 하는 겜투주맙 오조가미신 (급성 골수성 백혈병의 치료에서 이용된 바와 같이); CD52을 표적으로 하는 알렘투주맙 (만성 림프성 백혈병의 치료에서 이용된 바와 같이); EpCAM을 표적으로 하는 IGN101 및 아데카투무맙 (상피 종양 (가슴, 결장 및 폐)의 치료에서 이용된 바와 같이); CEA를 표적으로 하는 라베투주맙 (가슴, 결장 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); gpA33을 표적으로 하는 huA33 (결장직장 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); Mucin을 표적으로 하는 펨투모맙 및 오레고보맙 (가슴, 결장, 폐 및 난소 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); TAG-72를 표적으로 하는 CC49 (민레투모맙) (가슴, 결장 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); CAIX를 표적으로 하는 cG250 (신장 세포 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); PSMA를 표적으로 하는 J591 (전립선 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); 엽산염-결합 단백질을 표적으로 하는 MOv18 및 MORAb-003 (파를레투주맙) (난소 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 강글리오시드를 표적으로 하는 3F8, ch14.18 및 KW-2871 (가령, GD2, GD3 및 GM2) (신경외배엽성 종양 및 일부 상피 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); Le y를 표적으로 하는 hu3S193 및 IgN311 (가슴, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); VEGF를 표적으로 하는 베바시주맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); VEGFR을 표적으로 하는 IM-2C6 및 CDP791 (상피-유래된 고형 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 인테그린 _V_3을 표적으로 하는 에타라시주맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); 인테그린 _5_1을 표적으로 하는 볼로시지맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); EGFR을 표적으로 하는 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 및 806 (신경교종, 폐, 가슴, 결장 및 두경부 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); ERBB2를 표적으로 하는 트라스투주맙 및 페르투주맙 (가슴, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); ERBB3을 표적으로 하는 MM-121 (가슴, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); MET를 표적으로 하는 AMG 102, METMAB 및 SCH 900105 (가슴, 난소 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); IGF1R을 표적으로 하는 AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507 및 CP 751871 (신경교종, 폐, 가슴, 두경부, 전립선 및 갑상선암의 치료에서 이용된 바와 같이); EPHA3을 표적으로 하는 KB004 및 IIIA4 (폐, 신장 및 결장 종양, 흑색종, 신경교종 및 혈액학적 악성의 치료에서 이용된 바와 같이); TRAILR1을 표적으로 하는 마파투무맙 (HGS-ETR1) (결장, 폐 및 췌장 종양 및 혈액학적 악성의 치료에서 이용된 바와 같이); TRAILR2를 표적으로 하는 HGS-ETR2 및 CS-1008; RANKL을 표적으로 하는 데노수맙 (전립선암 및 뼈 전이의 치료에서 이용된 바와 같이); FAP를 표적으로 하는 시브로투주맙 및 F19 (결장, 가슴, 폐, 췌장, 및 두경부 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 테나신을 표적으로 하는 81C6 (신경교종, 가슴 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 블리나투모맙 (블린사이토; Amgen) (ALL의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 펨브로리주맙 (암 면역요법에서 이용된 바와 같이); c-Myc를 표적으로 하는 9E10 항체; 기타 등등을 포함한다.

결합 촉발된 전사 스위치의 세포내 도메인에서 전체적으로 또는 부분적으로 용도를 발견할 수 있는 항체는 또한, 8H9, 아바고보맙, 아브식시맙, 아비투주맙, 아브릴루맙, 악토주맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아크리투모맙, 아스크린바쿠맙, 아젤리주맙, 아테졸리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙/ 토실리주맙, 아토롤리무맙, 바피네우주맙, 바실리지맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베겔로맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙/라니비주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비바투주맙 메르탄신, 블로소주맙, 보코시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론티크주맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카를루맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 시주투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트라제탄, 코드리투주맙, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, CR6261, 크레네주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 데크트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에풍구맙, 엘델루맙, 엘겜투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에밀베투주맙, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베보틴, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이발리주맙, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이고보맙, IMAB362, 이말루맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 이제키주맙, 켈릭시맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌지루맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트락섹탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루일주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 마게툭시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모롤리무맙 이뮨, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌리톡사시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오둘리모맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오르티쿠맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 페라키주맙, 펙셀리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리토작시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데타이드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세토작시맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라제탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 테플리바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, TGN1412, 티실리무맙/트레멜리무맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, TNX-650, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀모루킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙, 졸리모맙 아리톡스 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 신경펩티드이다. 적합한 신경펩티드의 실례는 N-아세틸아스파르틸글루탐산, 아구티-관련된 펩티드, 알파-엔도르핀, 빅 디놀핀, 봄베신, 봄베신-유사 펩티드, 카르베토신, 코카인-및-암페타민 조절된 전사체 (CART), 콜레시스토키닌, 코라조닌, 부신겉질자극호르몬-유사 중간 펩티드, 코르티스타틴, 데목시토신, 디놀핀 A, 디놀핀 B, 엘레도이신, 엔케팔린, 갈라닌, 갈라닌-유사 펩티드, 갈믹, 갈논, 감마-엔도르핀, 그렐린, 헤모프레신, 키스펩틴, 뉴로키닌 B, 뉴로메딘 B, 뉴로메딘 N, 뉴로메딘 S, 뉴로메딘 U, 뉴로메딘 S, 뉴로메딘 Y, 신경펩티드 Y, 뉴로텐신, 노시셉틴, 오피오르핀, 오렉신, 오렉신-A, 옥시토신, 피살라에민, 프레프로타키키닌, 프록톨린, 프로엔켈팔린, 프로오피오멜라노코르틴, 단백질 에피스테메, 렐락신-3, 소마토스타틴, 물질 P, TAC1, 탁키키닌 펩티드, 바소프레신, 그리고 바소토신을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 유전자 산물

일부 경우에, 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 유전자 산물의 생산을 유도하는 폴리펩티드이다. 가령, 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 유전자 산물 (폴리펩티드; 핵산)의 생산을 유도한다. 일부 경우에, 유전자 산물은 핵산이다. 일부 경우에, 유전자 산물은 폴리펩티드이다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 폴리펩티드 유전자 산물은 내인성 폴리펩티드 (가령, 세포에 의해 자연적으로 인코딩된 폴리펩티드) 및 이종성 폴리펩티드 (가령, 세포에 의해 자연적으로 인코딩되지 않은 폴리펩티드; 세포를 유전적으로 변형하는데 이용된 이종성 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드)를 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 폴리펩티드 유전자 산물은 분비된 폴리펩티드를 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 폴리펩티드 유전자 산물은 세포 표면 폴리펩티드를 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 폴리펩티드 유전자 산물은 세포내 폴리펩티드 (세포내에서 정상적으로 존재하는 폴리펩티드, 예를 들면, 전사 인자)를 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도된 폴리펩티드 유전자 산물은 수용체, 사이토킨, 호르몬, 성장 인자, 케모킨, 세포 표면 폴리펩티드, 전사 인자 (가령, 전사 활성인자; 전사 억제인자), 아폽토시스 유도인자, 아폽토시스 저해제, 우성 음성 변이체 등을 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 생산이 유도될 수 있는 폴리펩티드 유전자 산물은 전사 활성인자, 전사 억제인자, 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 (TCR), 두 번째 키메라 Notch 폴리펩티드, CAR, 번역 조절인자, 면역 저해성 수용체, 면역 저해성 단백질, 면역 활성화 단백질, 사이토킨 수용체, 케모킨 수용체, DNA-결합 단백질, 후성적 조절인자, RNA-보도된 엔도뉴클레아제 (가령, Cas9 폴리펩티드), 효소적으로 비활성 Cas9 폴리펩티드, 부위 특이적 뉴클레아제, 재조합효소, 분화를 유도하는 전사 인자, 탈분화를 유도하는 전사 인자 등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 내인성 유전자 산물의 생산을 유도한다. 내인성 유전자 산물은 예로서, 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 이차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제 및 저해성 면역수용체를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 이종성 유전자 산물의 생산을 유도한다. 이종성 유전자 산물은 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 유전자 산물을 포함한다. 가령, 세포는 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 이종성 유전자 산물은 예로서, 케모킨, 케모킨 수용체, 키메라 항원 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 병원체 유래된 단백질, 증식 유도인자, 수용체, RNA 보도된 뉴클레아제, 부위 특이적 뉴클레아제, 소형 분자 이차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 독소 유래된 단백질, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 항체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 가공된 T 세포 수용체, 면역활성인자, 면역저해제, 저해성 면역수용체, RNA 보도된 DNA 결합 단백질, T 세포 수용체 (TCR), MESA 폴리펩티드, TANGO 폴리펩티드, 그리고 두 번째 synNotch 폴리펩티드 (여기서 두 번째 synNotch 폴리펩티드는 두 번째 synNotch 폴리펩티드의 생산을 유도하는 세포내 도메인을 갖는 synNotch 폴리펩티드와 상이하다)를 포함한다.

방출된 세포내 도메인에 의해 유도될 수 있는 폴리펩티드 유전자 산물은 분비된 폴리펩티드를 포함한다. 분비된 폴리펩티드의 무제한적 실례는 예로서, IL-2, IL-7, TNF알파, IL-12, GMCSF, EGF, TGF베타, IL-10, IL-17, IL-4, IL-5, IL-13, IFN알파, IFN감마, HMG-B1, 분비된 PTEN, Wnt, 그리고 단일 사슬 항체를 포함한다. 방출된 세포내 도메인에 의해 유도될 수 있는 폴리펩티드 유전자 산물은 우성 음성 폴리펩티드를 포함한다. 우성 음성 폴리펩티드의 실례는 예로서, 우성 음성 TGF-β 수용체; 우성 음성 변이체로서 기능하는 STAT3의 DNA 결합 도메인에 영향을 주는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 STAT3의 우성 음성 변이체; 기타 등등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 호르몬의 생산을 유도한다. 이런 호르몬의 실례는 예로서, 에리트로포이에틴 (EPO), 인슐린, 세크레틴, 글루카곤-유사 폴리펩티드 1 (GLP-1) 등을 포함한다. 이런 호르몬의 추가 실례는 액티빈, 인히빈, 아디포넥틴, 지방-유래된 호르몬, 부신 피질자극 호르몬, 아파멜라노티드, 아구티 신호전달 펩티드, 알라토스타틴, 아밀린, 안지오텐신, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 가스트린, 소마토트로핀, 브래디키닌, 뇌-유래된 신경영양 인자, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 섬모 신경영양 인자, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 코신트로핀, 엔도텔리안, 엔테로글루카곤, 섬유모세포 성장 인자 15 (FGF15), GFG15/19, 난포-자극 호르몬, 가스트린, 위 억제 펩티드, 그렐린, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드-1, 성선자극호르몬, 생식선자극호르몬 분비 호르몬, 과립구-집락 자극 인자, 성장 호르몬, 성장-호르몬-방출 호르몬, 헵시딘, 인간 융모생식선자극호르몬, 인간 태반 락토겐, 인크레틴, 인슐린, 인슐린 유사체, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데글루덱, 인슐린 글라진, 인슐린 리스프로, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 인슐린-유사 성장 인자-2, 렙틴, 리라글루티드, 황체형성 호르몬, 멜라노코르틴, 멜라닌세포 자극 호르몬, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 멜라노틴 II, 미니가스트린, 뇌 나트륨이뇨 펩티드의 N 말단 프로호르몬, 신경 성장 인자, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, NPH 인슐린, 오베스타틴, 오렉신, 오스테오칼신, 췌장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 펩티드 호르몬, 펩티드 YY, 혈장 레닌 활성, 프라믈린티드, 프레프리호르몬, 프로락틴, 렐락신, 렐락신 패밀리 펩티드 호르몬, 레닌, 살카토닌, 세크레틴, 세크레틴 패밀리 펩티드 호르몬, 신칼리드, 텔레오스트 렙틴, 템포린, 테사모렐린, 갑상선-자극 호르몬, 갑상선자극호르몬-분비 호르몬, 우로코르틴, 우로코르틴 II, 우로코르틴 III, 혈관작용 장관 펩티드, 그리고 비텔로게닌을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 성장 인자의 생산을 유도한다. 이런 성장 인자의 실례는 간세포 자극 인자, 형질세포종 성장 인자, 뇌 유래된 신경영양 인자 (BDNF), 신경교 유래된 신경영양 인자 (GDNF), 신경영양 인자 3 (NT3), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 전환 성장 인자 (TGF), 혈소판 전환 성장 인자, 우유 성장 인자, 내피 성장 인자 (EGF), 내피 세포-유래된 성장 인자 (ECDGF), 알파-내피 성장 인자, 베타-내피 성장 인자, 신경영양 성장 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 4-1 BB 수용체 (4-1BBR), TRAIL (TNF-관련된 아폽토시스 유도 리간드), 아르테민 (GFR알파3-RET 리간드), BCA-1 (B 세포-유인 케모킨), B 림프구 화학유인물질 (BLC), B 세포 성숙 단백질 (BCMA), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뼈 성장 인자, 예를 들면, 오스테오프로테게린 (OPG), 뼈-유래된 성장 인자, 거대핵세포 유래된 성장 인자 (MGDF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 트롬보포이에틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 거대핵세포 유래된 성장 인자 (MGDF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PGDF), 뉴로트로핀-2 (NT-2), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4 (NT4), 뉴로트로핀-5 (NT-5), 신경아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 뼈 형성 단백질 2 (BMP2), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 집락 자극 인자 (CSF) 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 사이토킨의 생산을 유도한다. 이런 사이토킨의 실례는 예로서, 인터페론 (가령, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론); 인터류킨 (가령, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17A, IL-18, IL-19, IL-20, IL-24); 종양 괴사 인자 (가령, TNF-α); 전환 성장 인자-베타; TRAIL; 기타 등등을 포함한다. 이런 사이토킨의 실례는 또한, flexi-12 (Anderson et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8:1125), IL-12 이형이합체의 두 폴리펩티드 사슬을 합동하는 단일 사슬 폴리펩티드); IL-12 슈퍼카인 H9 (Levin et al. (2012) Nature 484:529); 기타 등등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 케모킨의 생산을 유도한다. 이런 케모킨의 실례는 예로서, MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES, IP10 등을 포함한다. 적합한 케모킨의 추가 실례는 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-2 (CCL2; 단핵구 화학주성 단백질-1 또는 MCP1로서 또한 지칭됨); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-3 (CCL3; 대식세포 염증성 단백질-1A 또는 MIP1A로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-5 (CCL5; RANTES로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-17 (CCL17; 흉선 및 활성화 조절된 케모킨 또는 TARC로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-19 (CCL19; EBI1 리간드 케모킨 또는 ELC로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-C 모티프) 리간드-21 (CCL21; 6Ckine으로서 또한 알려져 있음); C-C 케모킨 수용체 유형 7 (CCR7); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 9 (CXCL9; 감마 인터페론 또는 MIG에 의해 유도된 모노카인으로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 10 (CXCL10; 인터페론 감마-유도된 단백질 10 또는 IP-10으로서 또한 알려져 있음); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 11 (CXCL11; 인터페론-유도성 T-세포 알파 화학유인물질 또는 I-TAC로 또한 불림); 케모킨 (C-X-C 모티프) 리간드 16 (CXCL16; 케모킨 (C 모티프) 리간드 (XCL1; 림포탁틴으로서 또한 알려져 있음); 그리고 대식세포 집락 자극 인자 (MCSF)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 결합 촉발된 전사 스위치, 예를 들면, 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 항체의 생산을 유도한다. 이런 항체는 예로서, α4β1 및 α4β7 인테그린의 α4 아단위를 표적으로 하는 나탈리주맙 (티사브리; Biogen Idec/Elan) (MS 및 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); α4β7 인테그린을 표적으로 하는 베돌리주맙 (MLN2; Millennium Pharmaceuticals/Takeda) (UC 및 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); BAFF를 표적으로 하는 벨리무맙 (베닐스타; Human Genome Sciences/ GlaxoSmithKline) (SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); BAFF 및 APRIL을 표적으로 하는 아타시셉트 (TACI-Ig; Merck/Serono) (SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); CD2를 표적으로 하는 알레파셉트 (아메비브; Astellas) (플라크 건선, GVHD의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 오텔릭시주맙 (TRX4; Tolerx/GlaxoSmithKline) (T1D의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 테플리주맙 (MGA031; MacroGenics/Eli Lilly) (T1D의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 리툭시맙 (리툭산/마브테라; Genentech/Roche/Biogen Idec) (비호지킨 림프종, RA (TNF 차단에 부적당한 반응을 갖는 환자에서) 및 CLL의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 오파투무맙 (아르제라; Genmab/GlaxoSmithKline) (CLL, RA의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 오크렐리주맙 (2H7; Genentech/Roche/Biogen Idec) (RA 및 SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); CD22를 표적으로 하는 에프라투주맙 (hLL2; Immunomedics/UCB) (SLE 및 비호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD52를 표적으로 하는 알렘투주맙 (캄패스/맙캄패스; Genzyme/Bayer) (CLL, MS의 치료에서 이용된 바와 같이); CD80 및 CD86을 표적으로 하는 아바타셉트 (오렌시아; Bristol-Myers Squibb) (RA 및 JIA, UC 및 크론병, SLE의 치료에서 이용된 바와 같이); C5 보체 단백질을 표적으로 하는 에쿨리주맙 (솔리리스; Alexion pharmaceuticals) (발작성 야간 혈색소뇨증의 치료에서 이용된 바와 같이); IgE를 표적으로 하는 오말리주맙 (솔라이르; Genentech/Roche/Novartis) (중등도 내지 중증도 지속 알레르기 천식의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-1β를 표적으로 하는 카나키누맙 (일라리스; Novartis) (크리오피린-연관된 주기적 증후군, 전신 JIA, 신생아-발병 다중시스템 염증성 질환 및 급성 통풍의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-5를 표적으로 하는 메폴리주맙 (보사트리아; GlaxoSmithKline) (과-호산성 증후군의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-5를 표적으로 하는 레슬리주맙 (SCH55700; Ception Therapeutics) (호산성 식도염의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-6R을 표적으로 하는 토실리주맙 (악템라/로악템라; Chugai/Roche) (RA, JIA의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-12 및 IL-23을 표적으로 하는 우스테키누맙 (스텔라라; Centocor) (플라크 건선, 건선성 관절염, 크론병의 치료에서 이용된 바와 같이); IL-12 및 IL-23을 표적으로 하는 브리아키누맙 (ABT-874; Abbott) (건선 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 에타네르셉트 (엔브렐; Amgen/Pfizer) (RA, JIA, 건선성 관절염, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 인플릭시맙 (레미케이드; Centocor/Merck) (크론병, RA, 건선성 관절염, UC, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 아달리무맙 (휴미라/트루덱사; Abbott) (RA, JIA, 건선성 관절염, 크론병, AS 및 플라크 건선의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 세르톨리주맙 페골 (씸지아; UCB) (크론병 및 RA의 치료에서 이용된 바와 같이); TNF를 표적으로 하는 골리무맙 (심포니; Centocor) (RA, 건선성 관절염 및 AS의 치료에서 이용된 바와 같이); 기타 등등을 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인에 의해 생산이 유도되는 항체는 암의 치료를 위한 치료 항체이다. 이런 항체는 예로서, CTLA-4를 표적으로 하는 이플리무맙 (흑색종, 전립선암, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); CTLA-4를 표적으로 하는 트레멜리무맙 (CRC, 위, 흑색종, NSCLC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 니볼루맙 (흑색종, NSCLC, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 MK-3475 (흑색종의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 피딜리주맙 (혈액암의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-L1을 표적으로 하는 BMS-936559 (흑색종, NSCLC, 난소, RCC의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-L1을 표적으로 하는 MEDI4736; PD-L1을 표적으로 하는 MPDL33280A (흑색종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD20을 표적으로 하는 리툭시맙 (비호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); 이브리투모맙 티우제탄 및 토시투모맙 (림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD30을 표적으로 하는 브렌툭시맙 베도틴 (호지킨 림프종의 치료에서 이용된 바와 같이); CD33을 표적으로 하는 겜투주맙 오조가미신 (급성 골수성 백혈병의 치료에서 이용된 바와 같이); CD52을 표적으로 하는 알렘투주맙 (만성 림프성 백혈병의 치료에서 이용된 바와 같이); EpCAM을 표적으로 하는 IGN101 및 아데카투무맙 (상피 종양 (가슴, 결장 및 폐)의 치료에서 이용된 바와 같이); CEA를 표적으로 하는 라베투주맙 (가슴, 결장 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); gpA33을 표적으로 하는 huA33 (결장직장 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); Mucin을 표적으로 하는 펨투모맙 및 오레고보맙 (가슴, 결장, 폐 및 난소 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); TAG-72를 표적으로 하는 CC49 (민레투모맙) (가슴, 결장 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); CAIX를 표적으로 하는 cG250 (신장 세포 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); PSMA를 표적으로 하는 J591 (전립선 암종의 치료에서 이용된 바와 같이); 엽산염-결합 단백질을 표적으로 하는 MOv18 및 MORAb-003 (파를레투주맙) (난소 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 강글리오시드를 표적으로 하는 3F8, ch14.18 및 KW-2871 (가령, GD2, GD3 및 GM2) (신경외배엽성 종양 및 일부 상피 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); Le y를 표적으로 하는 hu3S193 및 IgN311 (가슴, 결장, 폐 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); VEGF를 표적으로 하는 베바시주맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); VEGFR을 표적으로 하는 IM-2C6 및 CDP791 (상피-유래된 고형 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 인테그린 _V_3을 표적으로 하는 에타라시주맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); 인테그린 _5_1을 표적으로 하는 볼로시지맙 (종양 맥관구조의 치료에서 이용된 바와 같이); EGFR을 표적으로 하는 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 및 806 (신경교종, 폐, 가슴, 결장 및 두경부 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); ERBB2를 표적으로 하는 트라스투주맙 및 페르투주맙 (가슴, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); ERBB3을 표적으로 하는 MM-121 (가슴, 결장, 폐, 난소 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); MET를 표적으로 하는 AMG 102, METMAB 및 SCH 900105 (가슴, 난소 및 폐 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); IGF1R을 표적으로 하는 AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507 및 CP 751871 (신경교종, 폐, 가슴, 두경부, 전립선 및 갑상선암의 치료에서 이용된 바와 같이); EPHA3을 표적으로 하는 KB004 및 IIIA4 (폐, 신장 및 결장 종양, 흑색종, 신경교종 및 혈액학적 악성의 치료에서 이용된 바와 같이); TRAILR1을 표적으로 하는 마파투무맙 (HGS-ETR1) (결장, 폐 및 췌장 종양 및 혈액학적 악성의 치료에서 이용된 바와 같이); TRAILR2를 표적으로 하는 HGS-ETR2 및 CS-1008; RANKL을 표적으로 하는 데노수맙 (전립선암 및 뼈 전이의 치료에서 이용된 바와 같이); FAP를 표적으로 하는 시브로투주맙 및 F19 (결장, 가슴, 폐, 췌장, 및 두경부 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); 테나신을 표적으로 하는 81C6 (신경교종, 가슴 및 전립선 종양의 치료에서 이용된 바와 같이); CD3을 표적으로 하는 블리나투모맙 (블린사이토; Amgen) (ALL의 치료에서 이용된 바와 같이); PD-1을 표적으로 하는 펨브로리주맙 (암 면역요법에서 이용된 바와 같이); c-Myc를 표적으로 하는 9E10 항체; 기타 등등을 포함한다.

본원에서 설명된 바와 같이, 결합 촉발된 전사 스위치의 활성화의 결과로서 전체적으로 또는 부분적으로 발현될 수 있는 항체는 또한, 8H9, 아바고보맙, 아브식시맙, 아비투주맙, 아브릴루맙, 악토주맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아크리투모맙, 아스크린바쿠맙, 아젤리주맙, 아테졸리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙/ 토실리주맙, 아토롤리무맙, 바피네우주맙, 바실리지맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베겔로맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙/라니비주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비바투주맙 메르탄신, 블로소주맙, 보코시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론티크주맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카를루맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 시주투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트라제탄, 코드리투주맙, 콜툭시맙 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, CR6261, 크레네주맙, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 데크트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 비오틴, 데투모맙, 디누툭시맙, 디리다부맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에풍구맙, 엘델루맙, 엘겜투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에밀베투주맙, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베보틴, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이발리주맙, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, 이고보맙, IMAB362, 이말루맙, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이톨리주맙, 이제키주맙, 켈릭시맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌지루맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트락섹탄, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로키베트맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루일주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, 마게툭시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모롤리무맙 이뮨, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오빌리톡사시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오둘리모맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오르티쿠맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 페라키주맙, 펙셀리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리토작시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데타이드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세토작시맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트라제탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, 테플리바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, TGN1412, 티실리무맙/트레멜리무맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, TNX-650, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레보그루맙, 투코투주맙 셀모루킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙, 졸리모맙 아리톡스 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 신경펩티드의 생산을 유도한다. 이런 신경펩티드의 실례는 N-아세틸아스파르틸글루탐산, 아구티-관련된 펩티드, 알파-엔도르핀, 빅 디놀핀, 봄베신, 봄베신-유사 펩티드, 카르베토신, 코카인-및-암페타민 조절된 전사체 (CART), 콜레시스토키닌, 코라조닌, 부신겉질자극호르몬-유사 중간 펩티드, 코르티스타틴, 데목시토신, 디놀핀 A, 디놀핀 B, 엘레도이신, 엔케팔린, 갈라닌, 갈라닌-유사 펩티드, 갈믹, 갈논, 감마-엔도르핀, 그렐린, 헤모프레신, 키스펩틴, 뉴로키닌 B, 뉴로메딘 B, 뉴로메딘 N, 뉴로메딘 S, 뉴로메딘 U, 뉴로메딘 S, 뉴로메딘 Y, 신경펩티드 Y, 뉴로텐신, 노시셉틴, 오피오르핀, 오렉신, 오렉신-A, 옥시토신, 피살라에민, 프레프로타키키닌, 프록톨린, 프로엔켈팔린, 프로오피오멜라노코르틴, 단백질 에피스테메, 렐락신-3, 소마토스타틴, 물질 P, TAC1, 탁키키닌 펩티드, 바소프레신, 그리고 바소토신을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 전사 조절인자 (가령, 전사 인자; 전사 유도인자; 전사 억제인자)의 생산을 유도한다. 전사 조절인자의 실례는 예로서, ABT1, ACYP2, AEBP1, AEBP2, AES, AFF1, AFF3, AHR, ANK1, ANK2, ANKFY1, ANKIB1, ANKRD1, ANKRD10, ANKRD2, ANKRD32, ANKRD46, ANKRD49, ANKRD56, ANKRD57, ANKS4B, AR, ARHGAP17, ARID1A, ARID1B, ARID3A, ARID4A, ARID5B, ARNT, ARNT2, ARNTL, ARNTL2, ARX, ASB10, ASB11, ASB12, ASB15, ASB2, ASB5, ASB8, ASB9, ASH1L, ASH2L, ASXL1, ASZ1, ATF1, ATF3, ATF4, ATF4, ATF5, ATF6, ATF7, ATF7IP, ATM, ATOH1, ATXN3, 1300003B13RIK, B3GAT3, B930041F14RIK, BACH1, BACH2, BARX1, BARX2, BATF, BATF2, BATF3, BAZ2A, BBX, BC003267, BCL11A, BCL11B, BCL3, BCL6, BCL6B, BCLAF1, BCOR, BHLHA15, BHLHE40, BHLHE41, BLZF1, BMYC, BNC1, BNC2, BPNT1, BRCA1, BRWD1, BTBD11, BTF3, 6030408C04RIK, CAMK4, CARHSP1, CARM1, CBX4, CBX7, CCNC, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDC5L, CDK2, CDK4, CDK9, CDKN2C, CDX1, CDX1, CDX2, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, CEBPG, CEBPZ, CHD4, CHD7, CHGB, CIC, CIITA, CITED1, CITED2, CITED4, CLOCK, CLPB, CML3, CNOT7, COPS2, CREB1, CREB3, CREB3L1, CREB3L1, CREB3L2, CREB3L3, CREB5, CREBBP, CREBL2, CREM, CSDA, CSDA, CSDC2, CSDE1, CTBP2, CTCF, CTCFL, CTNNB1, CTNNBL1, CXXC1, D11BWG0517E, 2300002D11RIK, DACH1, DAXX, DBP, DDIT3, DDX20, DDX54, DDX58, DEAF1, DEK, DIDO1, DLX2, DMRT1, DMRT2, DMRTB1, DNMT1, DNMT3A, DR1, DRG1, DUSP26, DYSFIP1, E2F1, E2F2, E2F3, E2F5, E2F6, EBF1, EBF2, EBF3, EBF3, EED, EGR1, EGR2, EGR3, EHF, EHMT2, EID2, ELAVL2, ELF1, ELF1, ELF2, ELF3, ELF4, ELF5, ELK3, ELK4, ELL2, EMX2, EMX2, EN2, ENPP2, EOMES, EP300, EPAS1, ERF, ERG, ESR1, ESRRA, ESRRB, ESRRG, ETS1, ETS2, ETV1, ETV3, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EZH1, EZH2, FAH, FBXL10, FBXL11, FBXW7, FEM1A, FEM1B, FEM1C, FHL2, FLI1, FMNL2, FOS, FOSB, FOSL1, FOSL2, FOXA1, FOXA2, FOXA3, FOXC1, FOXD1, FOXD2, FOXD3, FOXF1, FOXF1A, FOXF2, FOXG1, FOXI1, FOXJ2, FOXJ3, FOXK1, FOXK2, FOXL1, FOXL2, FOXM1, FOXN1, FOXN2, FOXN3, FOXO1, FOXO3, FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4, FOXQ1, FUS, FUSIP1, 2810021G02RIK, GABPA, GABPB1, GARNL1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA5, GATA5, GATA6, GBX2, GCDH, GCM1, GFI1, GFI1B, GLI2, GLI3, GLIS1, GLIS2, GLIS3, GLS2, GMEB1, GMEB2, GRHL1, GRHL2, GRHL3, GRLF1, GTF2A1, GTF2B, GTF2E2, GTF2F1, GTF2F2, GTF2H2, GTF2H4, GTF2I, GTF2IRD1, GTF2IRD1, GZF1, HAND2, HBP1, HCLS1, HDAC10, HDAC11, HDAC2, HDAC5, HDAC9, HELZ, HES1, HES4, HES5, HES6, HEXIM1, HEY2, HEYL, HHEX, HHEX, HIC1, HIC2, HIF1A, HIF1AN, HIPK2, HIVEP1, HIVEP2, HIVEP2, HIVEP3, HLF, HLTF, HLX, HMBOX1, HMG20A, HMGA2, HMGB2, HMGB3, HNF1B, HNF4A, HNF4G, HOMEZ, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC10, HOXC11, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD8, HOXD9, HR, HSBP1, HSF2BP, HTATIP2, HTATSF1, HUWE1, 5830417I10RIK, ID1, ID2, ID3, ID3, IFNAR2, IKBKB, IKBKG, IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4, IL31RA, ILF3, ING1, ING2, ING3, ING4, INSM1, INTS12, IQWD1, IRF1, IRF1, IRF2, IRF3, IRF4, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, IRF8, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, ISL1, ISL2, ISX, ISX, IVNS1ABP, 2810021J22RIK, JARID1A, JARID1B, JARID1C, JARID1D, JDP2, JUN, JUNB, JUND, KLF1, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF15, KLF16, KLF2, KLF3, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KRR1, 6330416L07RIK, L3MBTL2, LASS2, LASS4, LASS6, LBA1, LBH, LBX1, LCOR, LDB1, LDB2, LEF1, LHX1, LHX2, LHX5, LIMD1, LIN28, LMO1, LMO4, LMX1A, LSM11, LSM4, LYL1, 9030612M13RIK, 1810007M14RIK, 3632451O06RIK, MAF, MAFA, MAFB, MAFF, MAFG, MAFK, MAGED1, MAP3K12, MAPK1, MAPK3, MAPK8, MAPK8IP1, MAX, MAZ, MBD2, MCM2, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, MECOM, MECP2, MED12, MED8, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D, MEIS1, MEIS1, MEIS2, MEOX2, MESP2, MID1, MITF, MKI67IP, MKL1, MLL1, MLL3, MLLT10, MLLT3, MLX, MLXIP, MLXIPL, MNT, MNX1, MPL, MSC, MSRB2, MSX2, MTA3, MTF1, MTF2, MTPN, MXD1, MXD4, MXI1, MYB, MYBBP1A, MYBL2, MYC, MYCBP, MYCL1, MYCN, MYEF2, MYF6, MYNN, MYOCD, MYOD1, MYOG, MYST3, MYST4, MYT1L, MZF1, NAB1, NAB2, NANOG, NARG1, NCOA1, NCOA2, NCOA3, NCOR1, NCOR2, NDN, NEUROD1, NEUROD4, NEUROD6, NEUROG1, NEUROG2, NFAT5, NFATC1, NFATC2, NFATC2IP, NFATC3, NFATC3, NFATC4, NFE2, NFE2L1, NFE2L2, NFIA, NFIA, NFIB, NFIC, NFIL3, NFIX, NFKB1, NFKB2, NFKBIB, NFKBIE, NFKBIZ, NFX1, NFXL1, NFYA, NFYB, NHLH1, NKX2-2, NKX2-3, NKX2-5, NKX2-6, NKX6-2, NMI, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NPAS1, NPAS2, NPAS3, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1D2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NRARP, NRIP1, NRIP2, NSBP1, NSD1, NUDT12, NULL, NUPR1, 1700065O13RIK, OLIG1, OLIG2, OLIG2, ONECUT1, ONECUT2, ONECUT3, ORC2L, OSGIN1, OSR1, OSR2, OSTF1, OVOL1, OVOL2, PAPOLA, PAPOLG, PAPPA2, PATZ1, PAWR, PAX2, PAX5, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBX1, PBX2, PBX3, PBX4, PCBD1, PCGF6, PDCD11, PDLIM4, PDX1, PEG3, PER1, PFDN1, PGR, PHF1, PHF10, PHF12, PHF13, PHF14, PHF20, PHF21A, PHF5A, PHF7, PHOX2A, PHOX2B, PIAS2, PIR, PITX1, PITX2, PKNOX1, PKNOX2, PLA2G6, PLAGL1, PLAGL2, PLRG1, PML, POGK, POLR2B, POLR2E, POLR2H, POLR3E, POLR3H, POLRMT, POU1F1, POU2AF1, POU2F1, POU2F2, POU3F2, POU3F3, POU3F3, POU5F1, POU6F1, PPARA, PPARD, PPARG, PPARGC1A, PPARGC1B, PPP1R12C, PPP1R13B, PPP1R16B, PPP1R1B, PPP2R1A, PPP3CB, PQBP1, PRDM1, PRDM14, PRDM15, PRDM16, PRDM2, PRDM4, PRDM5, PRDM6, PRDM8, PREB, PRKAR1A, PRKCBP1, PROX1, PRRX1, PRRX2, PSMC5, PSMD10, PSMD9, PTF1A, PTGES2, PURB, PWP1, RAB11A, RAB11B, RAB15, RAB18, RAB1B, RAB25, RAB8A, RAB8B, RAI14, RARA, RARB, RARG, RASSF7, RB1, RBBP7, RBL1, RBM14, RBM39, RBM9, RBPJ, RBPJL, RCOR2, REL, RELA, RELB, RERE, REST, REXO4, RFC1, RFX1, RFX2, RFX3, RFX5, RFX7, RFX8, RHOX5, RHOX6, RHOX9, RIPK4, RNF12, RNF14, RNF141, RNF38, RNF4, RORA, RORA, RORB, RORC, RPS6KA4, RREB1, RSRC1, RUNX1, RUNX1T1, RUNX2, RUNX2, RUNX3, RUVBL1, RUVBL2, RXRA, RXRG, RYBP, SAFB2, SALL1, SALL1, SALL2, SALL4, SAP30, SAP30BP, SATB1, SATB2, SATB2, SCAND1, SCAP, SCRT2, SEC14L2, SERTAD1, SF1, SFPI1, SFRS5, SH3D19, SH3PXD2B, SHANK3, SHOX2, SHPRH, SIN3A, SIN3B, SIRT2, SIRT3, SIRT5, SIX1, SIX1, SIX2, SIX3, SIX4, SIX5, SKI, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, SMARCA1, SMARCA2, SMARCA5, SMARCB1, SMYD1, SNAI1, SNAI2, SNAPC2, SNAPC4, SNIP1, SOLH, SOX1, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX15, SOX17, SOX18, SOX2, SOX21, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX9, SP1, SP110, SP140L, SP2, SP3, SP4, SP6, SP8, SPDEF, SPEN, SPI1, SPIB, SQSTM1, SREBF1, SREBF2, SREBF2, SRF, SSBP2, SSBP3, SSBP4, SSRP1, ST18, STAG1, STAT1, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT5B, STAT6, SUB1, SUZ12, TADA2L, TAF13, TAF5, TAF5L, TAF7, TAF9, TAL1, TAL1, TARDBP, TBPL1, TBR1, TBX1, TBX10, TBX15, TBX18, TBX2, TBX2, TBX20, TBX21, TBX3, TBX4, TBX5, TBX6, TCEA1, TCEA3, TCEAL1, TCEB3, TCERG1, TCF12, TCF15, TCF19, TCF20, TCF21, TCF21, TCF3, TCF4, TCF7, TCF7L2, TCFAP2A, TCFAP2B, TCFAP2C, TCFCP2L1, TCFE2A, TCFE3, TCFEB, TCFEC, TCFL5, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, TEF, TFAP2A, TFAP2C, TFCP2L1, TFDP2, TFEB, TFEC, TGFB1I1, TGIF1, TGIF2, TGIF2LX, THRA, THRAP3, THRB, THRSP, TIAL1, TLE1, TLE6, TMEM131, TMPO, TNFAIP3, TOB1, TOX4, TP63, TRERF1, TRIB3, TRIM24, TRIM28, TRIM30, TRIP13, TRIP4, TRIP6, TRP53, TRP53BP1, TRP63, TRPS1, TRPS1, TSC22D1, TSC22D2, TSC22D3, TSC22D4, TSHZ1, TSHZ1, TSHZ3, TTRAP, TUB, TULP4, TWIST1, TWIST2, TYSND1, UBE2W, UBN1, UBP1, UBTF, UGP2, UHRF1, UHRF2, UNCX, USF1, USF2, UTF1, VDR, VEZF1, VGLL2, VSX1, WASL, WHSC1, WHSC2, WT1, WWP1, WWTR1, XBP1, YAF2, YY1, ZBED1, ZBED4, ZBTB1, ZBTB10, ZBTB16, ZBTB16, ZBTB17, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB22, ZBTB25, ZBTB32, ZBTB38, ZBTB4, ZBTB43, ZBTB45, ZBTB47, ZBTB7A, ZBTB7B, ZBTB7C, ZCCHC8, ZDHHC13, ZDHHC16, ZDHHC21, ZDHHC5, ZDHHC6, ZEB2, ANK2ZEB2, ZFHX2, ZFHX3, ZFHX4, ZFP105, ZFP110, ZFP143, ZFP148, ZFP161, ZFP192, ZFP207, ZFP219, ZFP238, ZFP263, ZFP275, ZFP277, ZFP281, ZFP287, ZFP292, ZFP35, ZFP354C, ZFP36, ZFP36L1, ZFP386, ZFP407, ZFP42, ZFP423, ZFP426, ZFP445, ZFP451, ATF5ZFP451, ZFP467, ZFP52, ZFP57, ZFP592, ZFP593, ZFP597, ZFP612, ZFP637, ZFP64, ZFP647, ZFP748, ZFP810, ZFP9, ZFP91, ZFPM1, ZFPM2, ZFX, ZHX2, ZHX3, ZIC1, ZIC2, ZIC3, ZIC4, ZIC5, ZKSCAN1, ZKSCAN3, ZMYND11, ZNF143, ZNF160, ZNF175, ZNF184, ZNF192, ZNF213, ZNF217, ZNF219, ZNF22, ZNF238, ZNF24, ZNF267, ZNF273, ZNF276, ZNF280D, ZNF281, ZNF292, ZNF311, ZNF331, ZNF335, ZNF337, ZNF33B, ZNF366, ZNF394, ZNF398, ZNF41, ZNF410, ZNF415, ZNF423, ZNF436, ZNF444, ZNF445, ZNF451, ZNF460, ZNF496, ZNF498, ZNF516, ZNF521, ZNF532, ZNF536, ZNF546, ZNF552, ZNF563, ZNF576, ZNF580, ZNF596, ZNF621, ZNF628, ZNF648, ZNF649, ZNF652, ZNF655, ZNF664, ZNF668, ZNF687, ZNF692, ZNF696, ZNF697, ZNF710, ZNF80, ZNF91, ZNF92, ZNRD1, ZSCAN10, ZSCAN16, ZSCAN20, ZSCAN21, ZXDC, 그리고 ZZZ3을 포함한다. 전사 조절인자의 추가 실례는 전술한 바와 같다. 전사 인자 (전사 활성인자; 전사 억제인자)의 무제한적 실례는 도면 37-83에서 묘사된다. 가령, 전사 인자는 도면 37-83에서 묘사된 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

앞서 설명된 바와 같은 전사 조절인자의 추가 실례는 하나 또는 그 이상의 면역 세포에서 조절 역할을 갖는 전사 인자 (다시 말하면, 면역 세포 조절 전사 인자)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 적합한 면역 세포 조절 전사 인자는 예로서, 2210012G02Rik, Akap8l, Appl2, Arid4b, Arid5b, Ash1l, Atf7, Atm, C430014K11Rik, Chd9, Dmtf1, Fos, Foxo1, Foxp1, Hmbox1, Kdm5b, Klf2, Mga, Mll1, Mll3, Myst4, Pcgf6, Rev3l, Scml4, Scp2, Smarca2, Ssbp2, Suhw4, Tcf7, Tfdp2, Tox, Zbtb20, Zbtb44, Zeb1, Zfml, Zfp1, Zfp319, Zfp329, Zfp35, Zfp386, Zfp445, Zfp518, Zfp652, Zfp827, Zhx2, Eomes, Arntl, Bbx, Hbp1, Jun, Mef2d, Mterfd1, Nfat5, Nfe2l2, Nr1d2, Phf21a, Taf4b, Trf, Zbtb25, Zfp326, Zfp451, Zfp58, Zfp672, Egr2, Ikzf2, Taf1d, Chrac1, Dnajb6, Aplp2, Batf, Bhlhe40, Fosb, Hist1h1c, Hopx, Ifih1, Ikzf3, Lass4, Lin54, Mxd1, Mxi1, Prdm1, Prf1, Rora, Rpa2, Sap30, Stat2, Stat3, Taf9b, Tbx21, Trps1, Xbp1, Zeb2, Atf3, Cenpc1, Lass6, Rb1, Zbtb41, Crem, Fosl2, Gtf2b, Irf7, Maff, Nr4a1, Nr4a2, Nr4a3, Obfc2a, Rbl2, Rel, Rybp, Sra1, Tgif1, Tnfaip3, Uhrf2, Zbtb1, Ccdc124, Csda, E2f3, Epas1, H1f0, H2afz, Hif1a, Ikzf5, Irf4, Nsbp1, Pim1, Rfc2, Swap70, Tfb1m, 2610036L11Rik, 5133400G04Rik, Apitd1, Blm, Brca1, Brip1, C1d, C79407, Cenpa, Cfl1, Clspn, Ddx1, Dscc1, E2f7, E2f8, Ercc6l, Ezh2, Fen1, Foxm1, Gen1, Gsg2, H2afx, Hdac1, Hdgf, Hells, Hist1h1e, Hist3h2a, Hjurp, Hmgb2, Hmgb3, Irf1, Irf8, Kif22, Kif4, Lig1, Lmo2, Lnp, Mbd4, Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6, Mcm7, Mybl2, Neil3, Nusap1, Orc6l, Pola1, Pola2, Pole, Pole2, Polh, Polr2f, Polr2j, Ppp1r8, Prim2, Psmc3ip, Rad51, Rad51c, Rad54l, Rfc3, Rfc4, Rnps1, Rpa1, Smarcc1, Spic, Ssrp1, Taf9, Tfdp1, Tmpo, Topbp1, Trdmt1, Uhrf1, Wdhd1, Whsc1, Zbp1, Zbtb32, Zfp367, Car1, Polg2, Atr, Lef1, Myc, Nucb2, Satb1, Taf1a, Ift57, Apex1, Chd7, Chtf8, Ctnnb1, Etv3, Irf9, Myb, Mybbp1a, Pms2, Preb, Sp110, Stat1, Trp53, Zfp414, App, Cdk9, Ddb1, Hsf2, Lbr, Pa2g4, Rbms1, Rfc1, Rfc5, Tada2l, Tex261, Xrcc6 등을 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 면역수용체 (가령, 활성화 면역수용체 또는 저해성 면역수용체의 생산을 유도한다. 이런 면역수용체의 실례는 활성화 면역수용체를 포함한다. 적합한 활성화 면역수용체는 면역수용체 티로신-기초된 활성화 모티프 (ITAM)를 포함할 수 있다. ITAM 모티프는 YX₁X₂L/I이고, 여기서 X₁과 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 적합한 면역수용체는 ITAM 모티프를 내포하는 폴리펩티드로부터 유래되는 ITAM 모티프-내포 부분을 포함할 수 있다. 가령, 적합한 면역수용체는 임의의 ITAM 모티프-내포 단백질로부터 ITAM 모티프-내포 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 면역수용체는 자신이 유래되는 전체 단백질의 전체 서열을 내포할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드의 실례에는 DAP12; FCER1G (Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD3Z (CD3 제타); 그리고 CD79A (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 적합한 ITAM 모티프-내포 폴리펩티드의 추가 실례는 전술한 바와 같다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬 (CD3D; CD3-델타; T3D; CD3 항원, 델타 아단위; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩티드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타 사슬; T 세포 수용체 T3 델타 사슬; T-세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬 등으로서 또한 알려져 있음)의 생산을 유도한다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬 (CD3e, T-세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 사슬, T-세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬, AI504783, CD3, CD3엡실론, T3e 등으로서 또한 알려져 있음)의 생산을 유도한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 동시자극성 폴리펩티드의 생산을 유도한다. 적합한 동시자극성 폴리펩티드의 무제한적 실례에는 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 그리고 HVEM이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 적합한 동시자극성 폴리펩티드의 추가 실례는 전술한 바와 같다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 저해성 면역수용체의 생산을 유도한다. 저해성 면역수용체는 면역수용체 티로신-기초된 저해 모티프 (ITIM), 면역수용체 티로신-기초된 스위치 모티프 (ITSM), NpxY 모티프, 또는 YXXΦ 모티프를 포함할 수 있다. 적합한 저해제 면역수용체는 PD1; CTLA4; BTLA; CD160; KRLG-1; 2B4; Lag-3; 및 Tim-3을 포함한다. 가령, Odorizzi and Wherry (2012) J. Immunol. 188:2957; 그리고 Baitsch et al. (2012) PLoSOne 7:e30852를 참조한다. 저해성 면역수용체의 추가 실례는 전술한 바와 같다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 재조합효소의 생산을 유도한다. 재조합효소의 무제한적 실례는 Cre 재조합효소; Flp 재조합효소; Dre 재조합효소 등을 포함한다. 재조합효소의 추가 실례는 FLPe 재조합효소이다 (가령, Akbudak and Srivastava (2011) Mol. Biotechnol. 49:82를 참조한다). 적합한 재조합효소는 Flpo 재조합효소이다. 재조합효소의 추가 실례는 전술한 바와 같다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 부위 특이적 뉴클레아제의 생산을 유도한다. 부위 특이적 뉴클레아제의 무제한적 실례는 뉴클레아제 활성을 갖는 RNA-보도된 DNA 결합 단백질, 예를 들면, Cas9 폴리펩티드; 전사 활성인자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN); 아연 핑거 뉴클레아제; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 부위 특이적 뉴클레아제의 추가 실례는 전술한 바와 같다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 아폽토시스 유도인자의 생산을 유도한다. 아폽토시스 유도인자의 무제한적 실례는 tBID 폴리펩티드이다. 용어 "tBID"는 세포질 BID의 효소적 개열 (가령, 활성 카스파제에 의한)로부터 발생하는 BH3 상호작용 사멸 효현제 (BID) 단백질의 C 말단 절두된 단편을 지칭한다. 아폽토시스의 초기 단계에서, tBID는 미토콘드리아로 전위하고 그것으로부터 Cyt c의 방출을 매개한다. tBID 단백질의 무제한적 실례는 인간 tBID (GenBank 수탁 번호 CAG30275에서 제공된 아미노산 서열의 아미노산 61-195)를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 결합-촉발된 전사 스위치의 생산을 유도한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 TCR의 생산을 유도한다. TCR은 일부 경우에, 항원의 에피토프에 특이적이다. 이런 항원의 실례는 예로서, 종양 항원; 암 세포-연관된 항원; 혈액학적 악성 항원; 고형 종양 항원; 세포 표면 항원 (가령, T 세포 수용체 (TCR)에 의해 표적화된 세포 표면 항원; 세포내 항원; 기타 등등을 포함한다. 혈액학적 악성 항원의 실례는 예로서, CD19 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD20 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD22 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD30 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD33 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), CD70 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), CD123 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), 카파 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), ROR1 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), SLAMF7/CS1 (가령, 골수종 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 대부분의 B-세포 유형에서 발현된 바와 같이), CD138 (가령, 다발성 골수종에서 악성 형질 세포에서 발현된 바와 같이), CD56 (가령, 골수종 세포, 신경 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 섬유주 조골세포에서 발현된 바와 같이), CD38 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), 그리고 CD160 (가령, NK 세포/T-세포에서 발현된 바와 같이) 등을 포함한다. 고형 종양 항원의 실례는 예로서, B7H3 (가령, 육종, 신경교종에서 발현된 바와 같이), CAIX (가령, 신장에서 발현된 바와 같이), CD44 v6/v7 (가령, 경부에서 발현된 바와 같이), CD171 (가령, 신경모세포종에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EGFRvIII (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), EGP2 (가령, 암종에서 발현된 바와 같이), EGP40 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EphA2 (가령, 신경교종, 폐에서 발현된 바와 같이), ErbB2(HER2) (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB 수용체 패밀리 (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB3/4 (가령, 가슴, 난소에서 발현된 바와 같이), HLA-A1/MAGE1 (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), HLA-A2/NY-ESO-1 (가령, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), FR-a (가령, 난소에서 발현된 바와 같이), FAP† (가령, 암 연관된 섬유모세포에서 발현된 바와 같이), FAR (가령, 횡문근육종에서 발현된 바와 같이), GD2 (가령, 신경모세포종, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), GD3 (가령, 흑색종, 폐암에서 발현된 바와 같이), HMW-MAA (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), IL11Ra (가령, 골육종에서 발현된 바와 같이), IL13Ra2 (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 가슴/난소/췌장에서 발현된 바와 같이), 메소텔린 (가령, 중피종, 가슴, 췌장에서 발현된 바와 같이), Muc1 (가령, 난소, 가슴, 전립선에서 발현된 바와 같이), NCAM (가령, 신경모세포종, 결장직장에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 난소, 육종에서 발현된 바와 같이), PSCA (가령, 전립선, 췌장에서 발현된 바와 같이), PSMA (가령, 전립선에서 발현된 바와 같이), TAG72 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), VEGFR-2 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), Axl (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), Met (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), α5β3 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), α5β1 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), TRAIL-R1/TRAIL-R2 (가령, 고형 종양 (결장, 폐, 췌장) 및 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), RANKL (가령, 전립선암 및 뼈 전이에서 발현된 바와 같이), Tenacin (가령, 신경교종, 상피 종양 (가슴, 전립선)에서 발현된 바와 같이), EpCAM (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), gpA33 (가령, 결장직장 암종에서 발현된 바와 같이), Mucins (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐, 난소)에서 발현된 바와 같이), TAG-72 (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), EphA3 (가령, 폐, 신장, 흑색종, 신경교종, 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), 그리고 IGF1R (가령, 폐, 가슴, 두경부, 전립선, 갑상선, 신경교종에서 발현된 바와 같이)을 포함한다. 표면 및 세포내 항원의 실례는 예로서, Her2 (유전자 기호 ERBB2), MAGE-A1 (유전자 기호 MAGEA1), MART-1 (유전자 기호 MLANA), NY-ESO (유전자 기호 CTAG1), WT1 (유전자 기호 WT1), MUC17 및 MUC13을 포함한다. 다른 항원의 실례는 예로서, BCMA (유전자 기호 TNFRSF17), B7H6 (유전자 기호 NCR3LG1), CAIX (유전자 기호 CA9), CD123 (유전자 기호 IL3RA), CD138 (유전자 기호 SDC1), CD171 (유전자 기호 L1CAM), CD19 (유전자 기호 CD19), CD20 (유전자 기호 CD20), CD22 (유전자 기호 CD22), CD30 (유전자 기호 TNFRSF8), CD33 (유전자 기호 CD33), CD38 (유전자 기호 CD38), CD44, 스플라이스 변이체 incl 7 및 8 (기존 문헌에서 vX로 표시됨) (유전자 기호 CD44), CEA, CS1 (유전자 기호 SLAMF7), EGFRvIII (유전자 기호 EGFR, vIII 결실 변이체), EGP2, EGP40 (유전자 기호 EPCAM), Erb 패밀리 구성원 (유전자 기호 ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), FAP (유전자 기호 FAP), 태아 아세틸콜린 수용체 (유전자 기호 AChR), 엽산염 수용체 알파 (유전자 기호 FOLR1), 엽산염 수용체 베타 (유전자 기호 FOLR2), GD2, GD3, GPC3 (유전자 기호 GPC3), Her2/neu (유전자 기호 ERBB2), IL-13Ra2 (유전자 기호 IL13RA2), 카파 경쇄 (유전자 기호 IGK), Lewis-Y, 메소텔린 (유전자 기호 MSLN), Mucin-1 (유전자 기호 MUC1), Mucin-16 (유전자 기호 MUC16), NKG2D 리간드, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) (유전자 기호 FOLH1), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (유전자 기호 PSCA), 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1 (유전자 기호 ROR1), 그리고 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 (유전자 기호 ALK)를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 MESA 폴리펩티드의 생산을 유도한다. MESA 폴리펩티드는 일부 경우에, 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 이런 항원의 실례는 예로서, 종양 항원; 암 세포-연관된 항원; 혈액학적 악성 항원; 고형 종양 항원; 세포 표면 항원 (가령, T 세포 수용체 (TCR)에 의해 표적화된 세포 표면 항원; 세포내 항원; 기타 등등을 포함한다. 혈액학적 악성 항원의 실례는 예로서, CD19 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD20 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD22 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD30 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD33 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), CD70 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), CD123 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), 카파 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), ROR1 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), SLAMF7/CS1 (가령, 골수종 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 대부분의 B-세포 유형에서 발현된 바와 같이), CD138 (가령, 다발성 골수종에서 악성 형질 세포에서 발현된 바와 같이), CD56 (가령, 골수종 세포, 신경 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 섬유주 조골세포에서 발현된 바와 같이), CD38 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), 그리고 CD160 (가령, NK 세포/T-세포에서 발현된 바와 같이) 등을 포함한다. 고형 종양 항원의 실례는 예로서, B7H3 (가령, 육종, 신경교종에서 발현된 바와 같이), CAIX (가령, 신장에서 발현된 바와 같이), CD44 v6/v7 (가령, 경부에서 발현된 바와 같이), CD171 (가령, 신경모세포종에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EGFRvIII (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), EGP2 (가령, 암종에서 발현된 바와 같이), EGP40 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EphA2 (가령, 신경교종, 폐에서 발현된 바와 같이), ErbB2(HER2) (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB 수용체 패밀리 (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB3/4 (가령, 가슴, 난소에서 발현된 바와 같이), HLA-A1/MAGE1 (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), HLA-A2/NY-ESO-1 (가령, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), FR-a (가령, 난소에서 발현된 바와 같이), FAP† (가령, 암 연관된 섬유모세포에서 발현된 바와 같이), FAR (가령, 횡문근육종에서 발현된 바와 같이), GD2 (가령, 신경모세포종, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), GD3 (가령, 흑색종, 폐암에서 발현된 바와 같이), HMW-MAA (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), IL11Ra (가령, 골육종에서 발현된 바와 같이), IL13Ra2 (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 가슴/난소/췌장에서 발현된 바와 같이), 메소텔린 (가령, 중피종, 가슴, 췌장에서 발현된 바와 같이), Muc1 (가령, 난소, 가슴, 전립선에서 발현된 바와 같이), NCAM (가령, 신경모세포종, 결장직장에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 난소, 육종에서 발현된 바와 같이), PSCA (가령, 전립선, 췌장에서 발현된 바와 같이), PSMA (가령, 전립선에서 발현된 바와 같이), TAG72 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), VEGFR-2 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), Axl (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), Met (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), α5β3 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), α5β1 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), TRAIL-R1/TRAIL-R2 (가령, 고형 종양 (결장, 폐, 췌장) 및 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), RANKL (가령, 전립선암 및 뼈 전이에서 발현된 바와 같이), Tenacin (가령, 신경교종, 상피 종양 (가슴, 전립선)에서 발현된 바와 같이), EpCAM (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), gpA33 (가령, 결장직장 암종에서 발현된 바와 같이), Mucins (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐, 난소)에서 발현된 바와 같이), TAG-72 (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), EphA3 (가령, 폐, 신장, 흑색종, 신경교종, 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), 그리고 IGF1R (가령, 폐, 가슴, 두경부, 전립선, 갑상선, 신경교종에서 발현된 바와 같이)을 포함한다. 표면 및 세포내 항원의 실례는 예로서, Her2 (유전자 기호 ERBB2), MAGE-A1 (유전자 기호 MAGEA1), MART-1 (유전자 기호 MLANA), NY-ESO (유전자 기호 CTAG1), WT1 (유전자 기호 WT1), MUC17 및 MUC13을 포함한다. 다른 항원의 실례는 예로서, BCMA (유전자 기호 TNFRSF17), B7H6 (유전자 기호 NCR3LG1), CAIX (유전자 기호 CA9), CD123 (유전자 기호 IL3RA), CD138 (유전자 기호 SDC1), CD171 (유전자 기호 L1CAM), CD19 (유전자 기호 CD19), CD20 (유전자 기호 CD20), CD22 (유전자 기호 CD22), CD30 (유전자 기호 TNFRSF8), CD33 (유전자 기호 CD33), CD38 (유전자 기호 CD38), CD44, 스플라이스 변이체 incl 7 및 8 (기존 문헌에서 vX로 표시됨) (유전자 기호 CD44), CEA, CS1 (유전자 기호 SLAMF7), EGFRvIII (유전자 기호 EGFR, vIII 결실 변이체), EGP2, EGP40 (유전자 기호 EPCAM), Erb 패밀리 구성원 (유전자 기호 ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), FAP (유전자 기호 FAP), 태아 아세틸콜린 수용체 (유전자 기호 AChR), 엽산염 수용체 알파 (유전자 기호 FOLR1), 엽산염 수용체 베타 (유전자 기호 FOLR2), GD2, GD3, GPC3 (유전자 기호 GPC3), Her2/neu (유전자 기호 ERBB2), IL-13Ra2 (유전자 기호 IL13RA2), 카파 경쇄 (유전자 기호 IGK), Lewis-Y, 메소텔린 (유전자 기호 MSLN), Mucin-1 (유전자 기호 MUC1), Mucin-16 (유전자 기호 MUC16), NKG2D 리간드, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) (유전자 기호 FOLH1), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (유전자 기호 PSCA), 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1 (유전자 기호 ROR1), 그리고 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 (유전자 기호 ALK)를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 CAR의 생산을 유도한다. CAR은 일부 경우에, 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 이런 항원의 실례는 예로서, 종양 항원; 암 세포-연관된 항원; 혈액학적 악성 항원; 고형 종양 항원; 세포 표면 항원 (가령, T 세포 수용체 (TCR)에 의해 표적화된 세포 표면 항원; 세포내 항원; 기타 등등을 포함한다. 혈액학적 악성 항원의 실례는 예로서, CD19 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD20 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD22 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD30 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD33 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), CD70 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), CD123 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), 카파 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), ROR1 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), SLAMF7/CS1 (가령, 골수종 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 대부분의 B-세포 유형에서 발현된 바와 같이), CD138 (가령, 다발성 골수종에서 악성 형질 세포에서 발현된 바와 같이), CD56 (가령, 골수종 세포, 신경 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 섬유주 조골세포에서 발현된 바와 같이), CD38 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), 그리고 CD160 (가령, NK 세포/T-세포에서 발현된 바와 같이) 등을 포함한다. 고형 종양 항원의 실례는 예로서, B7H3 (가령, 육종, 신경교종에서 발현된 바와 같이), CAIX (가령, 신장에서 발현된 바와 같이), CD44 v6/v7 (가령, 경부에서 발현된 바와 같이), CD171 (가령, 신경모세포종에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EGFRvIII (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), EGP2 (가령, 암종에서 발현된 바와 같이), EGP40 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EphA2 (가령, 신경교종, 폐에서 발현된 바와 같이), ErbB2(HER2) (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB 수용체 패밀리 (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB3/4 (가령, 가슴, 난소에서 발현된 바와 같이), HLA-A1/MAGE1 (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), HLA-A2/NY-ESO-1 (가령, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), FR-a (가령, 난소에서 발현된 바와 같이), FAP† (가령, 암 연관된 섬유모세포에서 발현된 바와 같이), FAR (가령, 횡문근육종에서 발현된 바와 같이), GD2 (가령, 신경모세포종, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), GD3 (가령, 흑색종, 폐암에서 발현된 바와 같이), HMW-MAA (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), IL11Ra (가령, 골육종에서 발현된 바와 같이), IL13Ra2 (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 가슴/난소/췌장에서 발현된 바와 같이), 메소텔린 (가령, 중피종, 가슴, 췌장에서 발현된 바와 같이), Muc1 (가령, 난소, 가슴, 전립선에서 발현된 바와 같이), NCAM (가령, 신경모세포종, 결장직장에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 난소, 육종에서 발현된 바와 같이), PSCA (가령, 전립선, 췌장에서 발현된 바와 같이), PSMA (가령, 전립선에서 발현된 바와 같이), TAG72 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), VEGFR-2 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), Axl (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), Met (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), α5β3 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), α5β1 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), TRAIL-R1/TRAIL-R2 (가령, 고형 종양 (결장, 폐, 췌장) 및 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), RANKL (가령, 전립선암 및 뼈 전이에서 발현된 바와 같이), Tenacin (가령, 신경교종, 상피 종양 (가슴, 전립선)에서 발현된 바와 같이), EpCAM (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), gpA33 (가령, 결장직장 암종에서 발현된 바와 같이), Mucins (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐, 난소)에서 발현된 바와 같이), TAG-72 (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), EphA3 (가령, 폐, 신장, 흑색종, 신경교종, 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), 그리고 IGF1R (가령, 폐, 가슴, 두경부, 전립선, 갑상선, 신경교종에서 발현된 바와 같이)을 포함한다. 표면 및 세포내 항원의 실례는 예로서, Her2 (유전자 기호 ERBB2), MAGE-A1 (유전자 기호 MAGEA1), MART-1 (유전자 기호 MLANA), NY-ESO (유전자 기호 CTAG1), WT1 (유전자 기호 WT1), MUC17 및 MUC13을 포함한다. 다른 항원의 실례는 예로서, BCMA (유전자 기호 TNFRSF17), B7H6 (유전자 기호 NCR3LG1), CAIX (유전자 기호 CA9), CD123 (유전자 기호 IL3RA), CD138 (유전자 기호 SDC1), CD171 (유전자 기호 L1CAM), CD19 (유전자 기호 CD19), CD20 (유전자 기호 CD20), CD22 (유전자 기호 CD22), CD30 (유전자 기호 TNFRSF8), CD33 (유전자 기호 CD33), CD38 (유전자 기호 CD38), CD44, 스플라이스 변이체 incl 7 및 8 (기존 문헌에서 vX로 표시됨) (유전자 기호 CD44), CEA, CS1 (유전자 기호 SLAMF7), EGFRvIII (유전자 기호 EGFR, vIII 결실 변이체), EGP2, EGP40 (유전자 기호 EPCAM), Erb 패밀리 구성원 (유전자 기호 ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), FAP (유전자 기호 FAP), 태아 아세틸콜린 수용체 (유전자 기호 AChR), 엽산염 수용체 알파 (유전자 기호 FOLR1), 엽산염 수용체 베타 (유전자 기호 FOLR2), GD2, GD3, GPC3 (유전자 기호 GPC3), Her2/neu (유전자 기호 ERBB2), IL-13Ra2 (유전자 기호 IL13RA2), 카파 경쇄 (유전자 기호 IGK), Lewis-Y, 메소텔린 (유전자 기호 MSLN), Mucin-1 (유전자 기호 MUC1), Mucin-16 (유전자 기호 MUC16), NKG2D 리간드, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) (유전자 기호 FOLH1), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (유전자 기호 PSCA), 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1 (유전자 기호 ROR1), 그리고 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 (유전자 기호 ALK)를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 (가령, 첫 번째 synNotch 폴리펩티드)의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 두 번째 synNotch 폴리펩티드의 생산을 유도한다. 두 번째 synNotch 폴리펩티드는 일부 경우에, 항원에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 이런 항원의 실례는 예로서, 종양 항원; 암 세포-연관된 항원; 혈액학적 악성 항원; 고형 종양 항원; 세포 표면 항원 (가령, T 세포 수용체 (TCR)에 의해 표적화된 세포 표면 항원; 세포내 항원; 기타 등등을 포함한다. 혈액학적 악성 항원의 실례는 예로서, CD19 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD20 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD22 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD30 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD33 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), CD70 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), CD123 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), 카파 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), ROR1 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), SLAMF7/CS1 (가령, 골수종 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 대부분의 B-세포 유형에서 발현된 바와 같이), CD138 (가령, 다발성 골수종에서 악성 형질 세포에서 발현된 바와 같이), CD56 (가령, 골수종 세포, 신경 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 섬유주 조골세포에서 발현된 바와 같이), CD38 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), 그리고 CD160 (가령, NK 세포/T-세포에서 발현된 바와 같이) 등을 포함한다. 고형 종양 항원의 실례는 예로서, B7H3 (가령, 육종, 신경교종에서 발현된 바와 같이), CAIX (가령, 신장에서 발현된 바와 같이), CD44 v6/v7 (가령, 경부에서 발현된 바와 같이), CD171 (가령, 신경모세포종에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EGFRvIII (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), EGP2 (가령, 암종에서 발현된 바와 같이), EGP40 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EphA2 (가령, 신경교종, 폐에서 발현된 바와 같이), ErbB2(HER2) (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB 수용체 패밀리 (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB3/4 (가령, 가슴, 난소에서 발현된 바와 같이), HLA-A1/MAGE1 (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), HLA-A2/NY-ESO-1 (가령, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), FR-a (가령, 난소에서 발현된 바와 같이), FAP† (가령, 암 연관된 섬유모세포에서 발현된 바와 같이), FAR (가령, 횡문근육종에서 발현된 바와 같이), GD2 (가령, 신경모세포종, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), GD3 (가령, 흑색종, 폐암에서 발현된 바와 같이), HMW-MAA (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), IL11Ra (가령, 골육종에서 발현된 바와 같이), IL13Ra2 (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 가슴/난소/췌장에서 발현된 바와 같이), 메소텔린 (가령, 중피종, 가슴, 췌장에서 발현된 바와 같이), Muc1 (가령, 난소, 가슴, 전립선에서 발현된 바와 같이), NCAM (가령, 신경모세포종, 결장직장에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 난소, 육종에서 발현된 바와 같이), PSCA (가령, 전립선, 췌장에서 발현된 바와 같이), PSMA (가령, 전립선에서 발현된 바와 같이), TAG72 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), VEGFR-2 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), Axl (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), Met (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), α5β3 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), α5β1 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), TRAIL-R1/TRAIL-R2 (가령, 고형 종양 (결장, 폐, 췌장) 및 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), RANKL (가령, 전립선암 및 뼈 전이에서 발현된 바와 같이), Tenacin (가령, 신경교종, 상피 종양 (가슴, 전립선)에서 발현된 바와 같이), EpCAM (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), gpA33 (가령, 결장직장 암종에서 발현된 바와 같이), Mucins (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐, 난소)에서 발현된 바와 같이), TAG-72 (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), EphA3 (가령, 폐, 신장, 흑색종, 신경교종, 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), 그리고 IGF1R (가령, 폐, 가슴, 두경부, 전립선, 갑상선, 신경교종에서 발현된 바와 같이)을 포함한다. 표면 및 세포내 항원의 실례는 예로서, Her2 (유전자 기호 ERBB2), MAGE-A1 (유전자 기호 MAGEA1), MART-1 (유전자 기호 MLANA), NY-ESO (유전자 기호 CTAG1), WT1 (유전자 기호 WT1), MUC17 및 MUC13을 포함한다. 다른 항원의 실례는 예로서, BCMA (유전자 기호 TNFRSF17), B7H6 (유전자 기호 NCR3LG1), CAIX (유전자 기호 CA9), CD123 (유전자 기호 IL3RA), CD138 (유전자 기호 SDC1), CD171 (유전자 기호 L1CAM), CD19 (유전자 기호 CD19), CD20 (유전자 기호 CD20), CD22 (유전자 기호 CD22), CD30 (유전자 기호 TNFRSF8), CD33 (유전자 기호 CD33), CD38 (유전자 기호 CD38), CD44, 스플라이스 변이체 incl 7 및 8 (기존 문헌에서 vX로 표시됨) (유전자 기호 CD44), CEA, CS1 (유전자 기호 SLAMF7), EGFRvIII (유전자 기호 EGFR, vIII 결실 변이체), EGP2, EGP40 (유전자 기호 EPCAM), Erb 패밀리 구성원 (유전자 기호 ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), FAP (유전자 기호 FAP), 태아 아세틸콜린 수용체 (유전자 기호 AChR), 엽산염 수용체 알파 (유전자 기호 FOLR1), 엽산염 수용체 베타 (유전자 기호 FOLR2), GD2, GD3, GPC3 (유전자 기호 GPC3), Her2/neu (유전자 기호 ERBB2), IL-13Ra2 (유전자 기호 IL13RA2), 카파 경쇄 (유전자 기호 IGK), Lewis-Y, 메소텔린 (유전자 기호 MSLN), Mucin-1 (유전자 기호 MUC1), Mucin-16 (유전자 기호 MUC16), NKG2D 리간드, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) (유전자 기호 FOLH1), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (유전자 기호 PSCA), 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1 (유전자 기호 ROR1), 그리고 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 (유전자 기호 ALK)를 포함한다. 일부 경우에, 첫 번째 synNotch 폴리펩티드 및 두 번째 synNotch 폴리펩티드는 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 TANGO 폴리펩티드의 생산을 유도한다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인이 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 방출될 때, 본원에서 설명된 바와 같은 다양한 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있기 때문에, 일부 경우에, 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드의 유도된 발현은 논리 게이팅된 회로를 산출할 수 있다. 이런 논리 게이팅된 회로는 예로서, "AND 게이트", "OR 게이트", "NOT 게이트", 그리고 예로서, 고차 AND 게이트, 고차 OR 게이트, 고차 NOT 게이트, 고차 합동된 게이트 (다시 말하면, AND, OR 및/또는 NOT 게이트의 일부 조합을 이용한 게이트)를 비롯한 고차 게이트를 포함하는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 "AND" 게이트는 신호의 전파를 위해 2개 또는 그 이상 입력이 필요한 경우를 포함한다. 가령, 일부 경우에, AND 게이트는 2개 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 또는 이들의 부분을 통한 신호전달을 허용하는데, 여기서 2개의 입력, 예를 들면, 2개의 항원이 2개 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 또는 이들의 부분을 통한 신호전달에 필요하다.

본 발명의 "OR" 게이트는 2개 또는 그 이상의 입력 중에서 어느 하나가 신호의 전파를 허용할 수 있는 경우를 포함한다. 가령, 일부 경우에, OR 게이트는 2개 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 또는 이들의 부분을 통한 신호전달을 허용하고, 여기서 임의의 한 가지 입력, 예를 들면, 2개의 항원 중에서 어느 하나가 2개 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치 또는 이들의 부분의 신호 출력을 유도할 수 있다.

본 발명의 "NOT" 게이트는 입력이 신호의 전파를 예방할 수 있는 경우를 포함한다. 가령, 일부 경우에, NOT 게이트는 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달을 저해한다. 한 구체예에서, NOT 게이트는 결합 상호작용의 저해를 포함할 수 있다. 가령, 분할 결합-촉발된 전사 스위치의 부분의 결합을 예방하는 경쟁적 저해제는 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달을 예방하는 NOT 게이트로서 역할을 할 수 있다. 다른 구체예에서, NOT 게이트는 회로의 요소의 기능적 저해를 포함할 수 있다. 가령, 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달 또는 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달의 결과를 기능적으로 예방하는 저해제는 본원에서 설명된 바와 같은 분자 회로의 NOT 게이트로서 역할을 할 수 있다. 한 가지 실례로서, 저해제 도메인, 예를 들면, 저해성 PD-1 도메인은 예로서, 세포 활성화를 유발하는, 결합-촉발된 전사 스위치를 통한 신호전달을 예방하는 NOT 게이트로서 역할을 할 수 있다.

멀티입력 게이트는 NOT 게이트 (가령, 특정 음성 항원)를 활성화하는 신호가 존재할 때 및/또는 존재하는 경우에 회로의 일부 다른 성분을 통한 신호전달을 예방하거나 또는 세포 반응을 멈추기 위해, NOT 게이트를 다양한 상이한 방식으로 이용할 수 있다. 가령, AND+NOT 게이트는 첫 번째 항원의 존재에서 특정 세포 활성에 긍정적으로 영향을 주는 결합 촉발된 스위치 및 두 번째 항원의 존재에서 세포 활성에 부정적으로 영향을 주는 결합 촉발된 스위치를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 항원 A에 반응성인 첫 번째 결합-촉발된 전사 스위치는 항원 A 및 X의 존재에서 CAR이 활성이고 T 세포 활성화가 유발되도록, 항원 X에 반응성인 CAR의 발현을 주동한다 (도면 136을 참조한다). 회로는 항원 B의 존재에서, CAR (가령, 저해성 세포내 도메인 (가령, PD-1, CLTA4, CD45 등)을 통해)을 억제하고 T 세포 활성화를 예방하는 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치를 더욱 포함한다 (도면 136). 이런 이유로, 3 입력 AND+NOT 게이트의 설명된 구체예에서, 항원 A 및 X만 존재하고 항원 B가 존재하지 않을 때에만 T 세포 활성화의 세포 활성이 유도된다.

일부 경우에, 고차 멀티입력 게이트는 NOT 게이트 기능을 포함한다. 가령, 활성화가 원하는 세포 활성을 유도하기 위해 AND 게이트에서 분할 전사 인자의 2 부분의 발현에 의존하는 회로에서, NOT 기능성은 예로서, 분할 전사 인자의 활성을 억제하는데 이용될 수 있다.

한 구체예에서, 분할 전사 인자의 첫 번째와 두 번째 부분이 존재하고 및/또는 자유로울 때, 전사 인자가 예로서, 항원 D에 반응성인 CAR의 발현을 비롯한 일부 하류 활성을 활성화시키도록, 항원 A에 반응성인 첫 번째 SynNotch는 항원 A의 존재에서 분할 전사 인자의 첫 번째 부분의 발현 또는 방출을 유도하고, 그리고 항원 B에 반응성인 두 번째 SynNotch는 항원 B의 존재에서 분할 전사 인자의 두 번째 부분의 발현 또는 방출을 유도한다 (도면 137을 참조한다). 이런 구체예에서, 회로는 예로서, 항원 C의 존재에서 분할 전사 인자의 우성 음성 저해제를 유도하거나 또는 방출하는 항원 C에 반응성인 세 번째 SynNotch 수용체의 형태에서 NOT 기능성을 포함할 수 있다. 전사 인자의 임의의 편의한 우성 음성 저해제는 예로서, 이들 2 부분이 기능적 전사 인자를 형성하기 위해 필요한 도메인 (가령, 상호작용 도메인)을 결여하는 분할 전사 인자의 부분을 포함하지만 이에 한정되지 않는 이런 NOT 기능성에서 용도를 발견할 수 있다. 이런 이유로, NOT 기능성을 갖는 멀티입력 게이트의 설명된 구체예 (도면 137)에서, 항원 A, B 및 D만 존재하고 하원 C가 존재하지 않을 때에만 CAR의 세포 활성, 예를 들면, T 세포 활성화가 유도된다.

다른 구체예에서, 항원 A 및 B가 존재할 때 분할 CAR의 2 부분이 항원 X의 존재에서 T 세포 활성화를 유발하는 항원 X에 반응성인 기능적 CAR을 형성하도록, 항원 A에 반응성인 첫 번째 SynNotch는 항원 X에 반응성인 분할 CAR의 첫 번째 부분의 발현을 유도하고, 그리고 항원 B에 반응성인 두 번째 SynNotch는 항원 X에 반응성인 분할 CAR의 두 번째 부분의 발현을 유도한다 (도면 138을 참조한다). 이런 회로는 항원 C의 존재에서 분할 CAR로부터 T 세포 활성화를 저해하는 세포내 저해성 도메인이 발현되거나 또는 방출되도록, 항원 C에 반응성인 세 번째 SynNotch의 형태에서 NOT 기능성을 더욱 포함할 수 있다 (도면 138을 참조한다). 이런 이유로, NOT 기능성을 갖는 4-입력 게이트의 설명된 구체예 (도면 138)에서, 항원 A, B 및 X만 존재하고 항원 C가 존재하지 않을 때에만 상기 게이트의 세포 활성, 예를 들면, 분할 CAR을 통한 T 세포 활성화가 유도된다.

일부 경우에, 2 입력 게이팅된 회로는 개별 항원에 의해 특이적으로 결합될 때, 분할 CAR의 부분의 발현을 유도하는 첫 번째 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 세포는 분할 CAR의 첫 번째 부분을 구조성으로 발현할 수 있고, 그리고 따라서, 분할 CAR의 두 번째 부분의 유도된 발현 시에 분할 CAR은 존재할 때 이의 항원에 반응성이 된다. 분할 CAR의 두 번째 부분의 발현에 대한 필요성은 분할 CAR의 두 번째 부분의 발현이 분할 CAR이 반응성인 항원에 대한 반응을 위해 시스템을 점화하도록, 일부 경우에 "점화"로서 지칭될 수 있다.

이런 2 항원 게이팅된 회로의 형상은 변할 수 있다. 일부 경우에, 첫 번째 항원 (다시 말하면, 항원 A)에 반응성인 SynNotch는 두 번째 항원 (다시 말하면, 항원 X)에 반응성인 항원 인식 도메인을 내포하는 분할 CAR의 부분의 발현을 유도한다 (가령, 도면 130을 참조한다). 이런 형상에서 분할 CAR은 세포가 SynNotch 폴리펩티드에 의해 유도된 분할 CAR의 부분의 발현에 의해 점화될 때까지, 항원 X를 인식하지 못한다. 따라서, 항원 A 및 항원 X 둘 모두의 존재가 T 세포 활성화에 필요하다.

일부 경우에, 첫 번째 항원 (다시 말하면, 항원 A)에 반응성인 SynNotch는 두 번째 항원 (다시 말하면, 항원 X)에 반응성인 분할 CAR의 부분의 발현을 유도하고, T 세포 활성화에 필요한 하나 또는 그 이상의 세포내 성분을 내포한다 (가령, 도면 131을 참조한다). 이런 형상에서 분할 CAR은 점화에 앞서 항원 X를 인식하지만, 항원 A의 부재에서, 항원 X의 결합은 T 세포 활성화를 유도하도록 전파되지 않는다. 하지만, SynNotch 폴리펩티드에 의해 유도된 분할 CAR의 부분이 발현될 때, 항원 X의 결합은 전파되어 T 세포 활성화를 야기한다. 따라서, 항원 A 및 항원 X 둘 모두의 존재가 T 세포 활성화에 필요하다.

일부 경우에, 3 입력 AND 게이트는 2개의 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 이들은 그들의 개별 첫 번째와 두 번째 항원에 의해 특이적으로 결합될 때, 세 번째 항원의 결합 시에 활성화되는 세 번째 항원-반응성 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 가령, 한 구체예에서 3 입력 AND 게이트는 첫 번째 항원에 반응성인 첫 번째 SynNotch 폴리펩티드 및 두 번째 항원에 반응성인 두 번째 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 SynNotch 폴리펩티드는 세 번째 항원에 반응성인 분할 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분의 발현을 유도한다. 따라서, 첫 번째와 두 번째 항원 (다시 말하면, 항원 A 및 B)의 존재에서 분할 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분은 발현되고, 그리고 세 번째 항원 (다시 말하면, 항원 C)의 존재에서 분할 CAR은 이것이 발현되는 T 세포를 활성화시킨다 (도면 132를 참조한다). 항원 A 및 항원 B를 인식하는 2개의 SynNotch 폴리펩티드가 항원 X를 인식하는 분할 CAR의 부분의 발현을 유도하는 3 항원 게이팅 시스템의 추가 계통도가 도면 133에서 묘사된다. 이런 시스템에서, 항원 A, B 및 X가 T 세포 활성화에 필요하다.

일부 경우에, 4 입력 AND 게이트는 개별 첫 번째, 두 번째와 세 번째 항원에 의해 특이적으로 결합될 때, 네 번째 항원의 결합 시에 활성화되는 네 번째 항원-반응성 폴리펩티드의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 유도하는 3개의 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가령, 한 구체예에서 4 입력 AND 게이트는 첫 번째 항원에 반응성인 첫 번째 SynNotch 폴리펩티드, 두 번째 항원에 반응성인 두 번째 SynNotch 폴리펩티드 및 세 번째 항원에 반응성인 세 번째 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 첫 번째 SynNotch 폴리펩티드는 네 번째 항원에 반응성인 분할 CAR의 첫 번째 부분의 발현을 유도하고, 그리고 두 번째와 세 번째 SynNotch 폴리펩티드는 전사 인자의 첫 번째와 두 번째 부분의 발현을 유도하고, 상기 전사 인자는 양쪽 부분이 존재할 때, 네 번째 항원에 반응성인 분할 CAR의 두 번째 부분의 발현을 유도한다. 따라서, 첫 번째, 두 번째와 세 번째 항원 (다시 말하면, 항원 A, B 및 C)의 존재에서 분할 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분은 발현되고, 그리고 네 번째 항원 (다시 말하면, 항원 D)의 존재에서 분할 CAR은 이것이 발현되는 T 세포를 활성화시킨다 (도면 134를 참조한다).

일부 경우에, 5 입력 AND 게이트는 개별 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 항원에 의해 특이적으로 결합될 때, 다섯 번째 항원의 결합 시에 활성화되는 다섯 번째 항원-반응성 폴리펩티드의 발현을 유도하는 4개의 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가령, 한 구체예에서 5 입력 AND 게이트는 양쪽 부분이 존재할 때, 분할 CAR의 첫 번째 부분의 발현을 유도하는 첫 번째 전사 인자의 첫 번째와 두 번째 부분의 발현을 유도하는, 첫 번째와 두 번째 항원에 반응성인 첫 번째와 두 번째 SynNotch 폴리펩티드, 그리고 양쪽 부분이 존재할 때, 다섯 번째 항원에 반응성인 분할 CAR의 두 번째 부분의 발현을 유도하는 두 번째 전사 인자의 첫 번째와 두 번째 부분의 발현을 유도하는, 세 번째 및 네 번째 항원에 반응성인 세 번째와 네 번째 SynNotch 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 항원 (다시 말하면, 항원 A, B, C 및 D)의 존재에서 분할 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분은 발현되고, 그리고 다섯 번째 항원 (다시 말하면, 항원 E)의 존재에서, 분할 CAR은 이것이 발현되는 T 세포를 활성화시킨다 (도면 135를 참조한다).

분할 전사 인자가 예로서, 논리 게이팅된 SynNotch 회로에서처럼 활용되는 경우에, 전사 인자 또는 이의 부분은 시스템의 다른 발현 카세트, 예를 들면, SynNotch 또는 이의 부분을 인코딩하는 서열, CAR 또는 이의 부분을 인코딩하는 서열 등을 내포하는 발현 카세트로부터 독립된 발현 카세트로부터 세포 내에서 발현될 수 있다. 전사 인자 또는 이의 부분, 예를 들면, 분할 전사 인자의 부분이 회로의 다른 성분으로부터 독립된 발현 카세트에서 내포되는 경우에, 전사 인자 발현 카세트는 전사 인자 또는 이의 부분을 인코딩하는 서열 및 예로서, 프로모터, 인핸서 등을 비롯하여 이의 발현에 필요한 서열 요소만을 내포할 수 있다. 별개의 전사 인자 또는 이의 부분은 예로서, 리포터를 인코딩하는 서열, 태그를 인코딩하는 서열 등을 비롯하여 발현 또는 전사의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가 원소를 내포하거나 또는 내포하지 않을 수 있다.

분할 전사 인자가 예로서, 논리 게이팅된 SynNotch 회로에서처럼 활용되는 다른 경우에, 전사 인자 또는 이의 부분은 시스템의 다른 성분과 공유된 발현 카세트, 예를 들면, SynNotch 또는 이의 부분을 인코딩하는 발현 카세트, CAR 또는 이의 부분을 인코딩하는 발현 카세트 등으로부터 세포 내에서 발현될 수 있다. 시스템의 다른 성분과 공유된 발현 카세트 상에 존재하는 전사 인자 또는 이의 부분을 인코딩하는 서열은 독립적으로 제어될 수 있거나, 다시 말하면, 카세트의 다른 시스템 요소로부터 독립적으로 발현 제어 요소 (즉, 프로모터, 인핸서 등)을 내포하거나, 또는 발현 카세트의 다른 시스템 요소로 동시에 제어될 수 있다, 다시 말하면, 전사 인자 및 하나 또는 그 이상의 다른 시스템 요소가 동일한 발현 제어 요소로부터 제어된다. 전사 인자 또는 이의 부분을 인코딩하는 서열이 발현 카세트의 다른 시스템 요소로 동시에 제어되는 경우에, 전사 인자 또는 이의 부분은 하나 또는 그 이상의 다른 시스템 요소에 부착되도록 인코딩될 수 있다.

일정한 구체예에서, 결합-촉발된 전사 스위치를 인코딩하는 핵산은 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화 시에, 분할 전사 인자의 부분이 방출되고 분할 전사 인자의 하나 또는 그 이상의 다른 부분과 복합체를 형성하는데 가용하여 기능적 전사 인자를 형성하도록, 결합-촉발된 전사 스위치의 하나 또는 그 이상의 도메인에 작동가능하게 연결된 분할 전사 인자의 부분을 인코딩하도록 설정된다.

따라서, 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 분할 전사 인자의 부분의 발현을 유도하여, 분할 전사 인자 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 전사 인자의 형성을 유발할 수 있다. 대안으로, 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치로부터 분할 전사 인자 부분의 방출을 유발하여, 분할 전사 인자 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 전사 인자의 형성을 유발할 수 있다. 이에 더하여, 분할 전사 인자 부분의 유도 및 방출은 합동될 수 있는데, 예로서 여기서 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치의 활성화는 분할 전사 인자의 부분의 발현 및 하나 또는 그 이상의 결합-촉발된 전사 스위치로부터 분할 전사 인자 부분의 방출을 유도하여, 분할 전사 인자 부분의 이형이합체화 및/또는 복합체 형성을 유발하고 기능적 전사 인자의 형성을 유발할 수 있다.

본 발명의 논리 게이팅된 시스템은 특정적으로 설명된 것들에 한정되지 않고, 그리고 설명된 것들과 비교하여 대안적 형상 및/또는 고차 게이트를 포함할 수 있다. 가령, 일부 경우에 본 발명의 논리 게이팅된 시스템은 2 입력 게이트, 3 입력 게이트, 4 입력 게이트, 5 입력 게이트, 6 입력 게이트, 7 입력 게이트, 8 입력 게이트, 9 입력 게이트, 10 입력 게이트 또는 그 이상일 수 있다. 게다가, 본 발명의 논리 게이팅된 시스템의 성분은 추가 회로 성분의 발현의 유도를 위한 SynNotch에 한정되지 않고, 그리고 예로서, 본원에서 설명된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 결합-촉발된 전사 스위치를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 전술한 실례가 단순함을 위해, 분할 CAR의 부분의 유도된 발현의 면에서 설명되긴 했지만, 예로서 분할 SynNotch 폴리펩티드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 분할 분자가 본 발명의 논리 게이팅된 회로에서 용도를 발견할 수 있다.

본 발명은 표적 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다: a) 본 발명의 첫 번째 synNotch 폴리펩티드를 표적 세포에서 발현하고, 여기서 첫 번째 synNotch 폴리펩티드는 가용성 어댑터 분자 (가령, 항원) 상에 첫 번째 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 (가령, scFv, 나노바디 등)을 포함하고; b) 표적 세포를 i) 본 발명의 두 번째 synNotch 폴리펩티드를 발현하는 두 번째 세포, 여기서 두 번째 synNotch 폴리펩티드는 가용성 어댑터 분자 (가령, 항원) 상에 두 번째 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 (가령, scFv, 나노바디 등)을 포함하고; 및 ii) 가용성 어댑터 분자 (가령, 항원)와 접촉시키고, 여기서 가용성 어댑터 분자 (가령, 항원)에 첫 번째 synNotch 폴리펩티드의 항원 결합 도메인 및 두 번째 synNotch 폴리펩티드의 항원 결합 도메인의 결합은 첫 번째 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 방출된 세포내 도메인은 표적 세포의 활성을 조정한다. 표적 세포의 활성은 다음과 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: 세포의 유전자 산물의 발현, 세포의 증식, 세포의 아폽토시스, 세포의 비-아폽토시스성 사멸, 세포의 분화, 세포의 탈분화, 세포의 이주, 세포로부터 분자의 분비 및 세포의 세포 부착. 어댑터 분자는 암-연관된 항원, 병원체-연관된 항원, 항체 등일 수 있다.

추가 서열

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함할 수 있는데, 여기서 적합한 추가 폴리펩티드는 신호 서열; 에피토프 태그; 친화성 도메인; 핵 국부화 신호 (NLS); 그리고 검출가능한 신호를 생산하는 폴리펩티드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.

신호 서열

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에서 이용에 적합한 신호 서열은 자연발생 신호 서열, 합성 (가령, 인공) 신호 서열 등을 비롯한 임의의 진핵 신호 서열을 포함한다.

에피토프 태그

적합한 에피토프 태그에는 적혈구응집소 (HA; 가령, YPYDVPDYA (서열 번호:73); FLAG (가령, DYKDDDDK (서열 번호:74); c-myc (가령, EQKLISEEDL; 서열 번호:75), 기타 등등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

친화성 도메인

친화성 도메인은 확인 또는 정제에 유용한 결합 상대, 예를 들면, 예로서 고체 지지체 위에 고정된 것과 상호작용할 수 있는 펩티드 서열을 포함한다. 복수 연속성 단일 아미노산, 예를 들면, 히스티딘은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드에 융합될 때, 수지 칼럼, 예를 들면, 니켈 세파로오스에 높은 친화성 결합에 의한 재조합 키메라 폴리펩티드의 일-단계 정제에 이용될 수 있다. 예시적인 친화성 도메인은 His5 (HHHHH) (서열 번호:76), HisX6 (HHHHHH) (서열 번호:77), C-myc (EQKLISEEDL) (서열 번호:75), Flag (DYKDDDDK) (서열 번호:74), StrepTag (WSHPQFEK) (서열 번호:78), 혈구응집소, 예를 들면, HA 태그 (YPYDVPDYA) (서열 번호:73), GST, 티오레독신, 셀룰로오스 결합 도메인, RYIRS (서열 번호:79), Phe-His-His-Thr (서열 번호:80), 키틴 결합 도메인, S-펩티드, T7 펩티드, SH2 도메인, C-단부 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열 번호:81), 금속 결합 도메인, 예를 들면, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인, 예를 들면, 칼슘-결합 단백질, 예를 들면, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시뉴린 B, 미오신 경쇄, 리코베린, S-모듈린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프레쿠에닌, 칼트락틴, 칼페인 큰-아단위, S100 단백질, 파브알부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K 및 칼레티닌으로부터 유래된 것들, 인테인, 비오틴, 스트렙타비딘, MyoD, Id, 류신 지퍼 서열, 그리고 말토오스 결합 단백질을 포함한다.

핵 국부화 서열

적합한 핵 국부화 신호 ("NLS"; 본원에서 "핵 국부화 서열"로서 또한 지칭됨)는 예로서, PKKKRKV (서열 번호:82); KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:83); MVPKKKRK (서열 번호:84); MAPKKKRKVGIHGVPAA (서열 번호:85); 기타 등등을 포함한다. NLS는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 N 말단에서; 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 N 말단 인근에서 (가령, N 말단의 5개 아미노산 이내에, 10개 아미노산 이내에, 또는 20개 아미노산 이내에); 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 C 말단에서; 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 C 말단 인근에서 (가령, C 말단의 5개 아미노산 이내에, 10개 아미노산 이내에, 또는 20개 아미노산 이내에); 또는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 내적으로 존재할 수 있다.

검출가능한 신호-생산 폴리펩티드

적합한 검출가능한 신호-생산 단백질은 예로서, 형광 단백질; 검출가능한 신호를 산물로서 산출하는 반응을 촉매작용하는 효소; 기타 등등을 포함한다.

적합한 형광 단백질에는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 이의 변이체, GFP의 청색 형광 변이체 (BFP), GFP의 시안색 형광 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광 변이체 (YFP), 증강된 GFP (EGFP), 증강된 CFP (ECFP), 증강된 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 토파즈 (TYFP), 비너스, 시트린, mCitrine, GFPuv, 불안정화된 EGFP (dEGFP), 불안정화된 ECFP (dECFP), 불안정화된 EYFP (dEYFP), mCFPm, 세루리안, T-Sapphire, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-단위체, J-레드, 이합체2, t-이합체2(12), mRFP1, 포실로포린, 레닐라 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, 카에데 단백질과 점화현상 단백질, 피코빌리단백질, 그리고 B-피코에리트린, R-피코에리트린과 알로피코시아닌을 포함하는 피코빌리단백질 접합체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 형광 단백질의 다른 실례는 mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape1, mRaspberry, mGrape2, mPlum (Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909), 기타 등등을 포함한다. 가령, Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973에서 설명된 바와 같은, 산호충류 (Anthozoan) 종으로부터 다양한 형광과 착색된 단백질 중에서 한 가지가 이용에 적합하다.

적합한 효소에는 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소 (AP), 베타-갈락토시다아제 (GAL), 글루코오스-6-인산탈수소효소, 베타-N-아세틸글루코사미니다아제, β-글루쿠론산분해효소, 전화효소, 크산틴 옥시다아제, 개똥벌레 루시페라아제, 글루코오스 옥시다아제 (GO), 기타 등등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 실례

전술한 바와 같이, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드의 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 전술한 바와 같이, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 다양한 분자 중에서 한 가지일 수 있다. 일부 경우에, 키메라 Notch 폴리펩티드는 항원에 특이적으로 결합한다; 가령, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 항원이다. 이런 항원의 실례는 예로서, 종양 항원; 암 세포-연관된 항원; 혈액학적 악성 항원; 고형 종양 항원; 세포 표면 항원 (가령, T 세포 수용체 (TCR)에 의해 표적화된 세포 표면 항원; 세포내 항원; 기타 등등을 포함한다. 혈액학적 악성 항원의 실례는 예로서, CD19 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD20 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD22 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD30 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), CD33 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), CD70 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), CD123 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), 카파 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 골수 세포에서 발현된 바와 같이), ROR1 (가령, B-세포에서 발현된 바와 같이), SLAMF7/CS1 (가령, 골수종 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 대부분의 B-세포 유형에서 발현된 바와 같이), CD138 (가령, 다발성 골수종에서 악성 형질 세포에서 발현된 바와 같이), CD56 (가령, 골수종 세포, 신경 세포, 자연 살해 세포, T 세포 및 섬유주 조골세포에서 발현된 바와 같이), CD38 (가령, B-세포/T-세포에서 발현된 바와 같이), 그리고 CD160 (가령, NK 세포/T-세포에서 발현된 바와 같이) 등을 포함한다. 고형 종양 항원의 실례는 예로서, B7H3 (가령, 육종, 신경교종에서 발현된 바와 같이), CAIX (가령, 신장에서 발현된 바와 같이), CD44 v6/v7 (가령, 경부에서 발현된 바와 같이), CD171 (가령, 신경모세포종에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EGFRvIII (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), EGP2 (가령, 암종에서 발현된 바와 같이), EGP40 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), EphA2 (가령, 신경교종, 폐에서 발현된 바와 같이), ErbB2(HER2) (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB 수용체 패밀리 (가령, 가슴, 폐, 전립선, 신경교종에서 발현된 바와 같이), ErbB3/4 (가령, 가슴, 난소에서 발현된 바와 같이), HLA-A1/MAGE1 (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), HLA-A2/NY-ESO-1 (가령, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), FR-a (가령, 난소에서 발현된 바와 같이), FAP† (가령, 암 연관된 섬유모세포에서 발현된 바와 같이), FAR (가령, 횡문근육종에서 발현된 바와 같이), GD2 (가령, 신경모세포종, 육종, 흑색종에서 발현된 바와 같이), GD3 (가령, 흑색종, 폐암에서 발현된 바와 같이), HMW-MAA (가령, 흑색종에서 발현된 바와 같이), IL11Ra (가령, 골육종에서 발현된 바와 같이), IL13Ra2 (가령, 신경교종에서 발현된 바와 같이), Lewis Y (가령, 가슴/난소/췌장에서 발현된 바와 같이), 메소텔린 (가령, 중피종, 가슴, 췌장에서 발현된 바와 같이), Muc1 (가령, 난소, 가슴, 전립선에서 발현된 바와 같이), NCAM (가령, 신경모세포종, 결장직장에서 발현된 바와 같이), NKG2D 리간드 (가령, 난소, 육종에서 발현된 바와 같이), PSCA (가령, 전립선, 췌장에서 발현된 바와 같이), PSMA (가령, 전립선에서 발현된 바와 같이), TAG72 (가령, 결장에서 발현된 바와 같이), VEGFR-2 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), Axl (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), Met (가령, 폐암에서 발현된 바와 같이), α5β3 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), α5β1 (가령, 종양 맥관구조에서 발현된 바와 같이), TRAIL-R1/TRAIL-R2 (가령, 고형 종양 (결장, 폐, 췌장) 및 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), RANKL (가령, 전립선암 및 뼈 전이에서 발현된 바와 같이), Tenacin (가령, 신경교종, 상피 종양 (가슴, 전립선)에서 발현된 바와 같이), EpCAM (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), CEA (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), gpA33 (가령, 결장직장 암종에서 발현된 바와 같이), Mucins (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐, 난소)에서 발현된 바와 같이), TAG-72 (가령, 상피 종양 (가슴, 결장, 폐)에서 발현된 바와 같이), EphA3 (가령, 폐, 신장, 흑색종, 신경교종, 혈액학적 악성에서 발현된 바와 같이), 그리고 IGF1R (가령, 폐, 가슴, 두경부, 전립선, 갑상선, 신경교종에서 발현된 바와 같이)을 포함한다. 표면 및 세포내 항원의 실례는 예로서, Her2 (유전자 기호 ERBB2), MAGE-A1 (유전자 기호 MAGEA1), MART-1 (유전자 기호 MLANA), NY-ESO (유전자 기호 CTAG1), WT1 (유전자 기호 WT1), MUC17 및 MUC13을 포함한다. 다른 항원의 실례는 예로서, BCMA (유전자 기호 TNFRSF17), B7H6 (유전자 기호 NCR3LG1), CAIX (유전자 기호 CA9), CD123 (유전자 기호 IL3RA), CD138 (유전자 기호 SDC1), CD171 (유전자 기호 L1CAM), CD19 (유전자 기호 CD19), CD20 (유전자 기호 CD20), CD22 (유전자 기호 CD22), CD30 (유전자 기호 TNFRSF8), CD33 (유전자 기호 CD33), CD38 (유전자 기호 CD38), CD44, 스플라이스 변이체 incl 7 및 8 (기존 문헌에서 vX로 표시됨) (유전자 기호 CD44), CEA, CS1 (유전자 기호 SLAMF7), EGFRvIII (유전자 기호 EGFR, vIII 결실 변이체), EGP2, EGP40 (유전자 기호 EPCAM), Erb 패밀리 구성원 (유전자 기호 ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), FAP (유전자 기호 FAP), 태아 아세틸콜린 수용체 (유전자 기호 AChR), 엽산염 수용체 알파 (유전자 기호 FOLR1), 엽산염 수용체 베타 (유전자 기호 FOLR2), GD2, GD3, GPC3 (유전자 기호 GPC3), Her2/neu (유전자 기호 ERBB2), IL-13Ra2 (유전자 기호 IL13RA2), 카파 경쇄 (유전자 기호 IGK), Lewis-Y, 메소텔린 (유전자 기호 MSLN), Mucin-1 (유전자 기호 MUC1), Mucin-16 (유전자 기호 MUC16), NKG2D 리간드, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA) (유전자 기호 FOLH1), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (유전자 기호 PSCA), 수용체 티로신 키나아제-유사 고아 수용체 1 (유전자 기호 ROR1), 그리고 역형성 림프종 수용체 티로신 키나아제 (유전자 기호 ALK)를 포함한다.

예시적인 구체예

다음은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 무제한적 실례이다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, i) Lin Notch 반복 A-C (LNR 분절); ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); iii) TM 도메인을 순서대로 포함하고; 그리고 S1 단백질분해 개열 부위, S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 16a에서 묘사된다. 도면 16a에서, Lin Notch 반복 A-C (LNR 분절)은 다음의 아미노산 서열을 갖고: PPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDC (서열 번호:5); 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절)은 다음의 아미노산 서열을 갖고: AAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGG RQRR ELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIE AV KSEPVEPPLP (서열 번호:6), 여기서 S1 단백질분해 개열 부위는 서열 RQRR (서열 번호:86)을 포함하고, 그리고 S2 단백질분해 개열 부위는 서열 AV를 포함하고; 그리고 TM 도메인은 다음의 아미노산 서열을 갖고: HLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (서열 번호:7), 여기서 S3 단백질분해 개열 부위는 서열 VLLS (서열 번호:87)를 포함한다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, i) EGF 반복; ii) Lin Notch 반복 A-C (LNR 분절); iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); iv) TM 도메인을 순서대로 포함하고; 그리고 S1 단백질분해 개열 부위, S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 이런 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 16b에서 묘사된다. 도면 16b에서, EGF 반복은 다음의 아미노산 서열을 갖고: PCVGSNPCYNQGTCEPTSENPFYRCLCPAKFNGLLCH (서열 번호:8); 그리고 LNR 분절, 이형이합체화 도메인, TM 도메인, S1 단백질분해 개열 부위, S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위는 도면 16a에서 묘사된 바와 같다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4)를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함하고; 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 56개 아미노산의 길이를 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) Fc 수용체 Fcγ IIIa (CD16A); b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) Fc 수용체 Fcγ IIIa (CD16A); i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 16c에서 묘사된다. S1, S2 및 S3 개열 부위의 위치는 도면 16a에서 묘사된다. 도면 16c에서, CD16A는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPG (서열 번호:88); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; 그리고 tTA 전사 인자는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGGPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPG (서열 번호:69).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) CD19 폴리펩티드; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 17a에서 묘사된다. 도면 17a에서, CD19 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 갖고: RPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK (서열 번호:89); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 17b에서 묘사된다. 도면 17b에서, 항-CD19 scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (서열 번호:90); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 17c에서 묘사된다. 도면 17c에서, 항-CD19 scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (서열 번호:90); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16b에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체, 예를 들면, 암 세포의 표면 상에 존재하는 세포 표면 항원 (가령, 암-특이적 항원; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-메소텔린 scFv; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 18에서 묘사된다. 도면 18에서, 항-메소텔린 scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: GSQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTYGAGTKLEIKAS (서열 번호:91); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16b에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 전사 인자에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-myc scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 19a 및 19b에서 묘사된다. 도면 19a 및 19b에서, 항-Myc scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: GSQVQLQQQVQLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSHYGMSWVRQTPDKRLEWVATIGSRGTYTHYPDSVKGRFTISRDNDKNALYLQMNSLKSEDTAMYYCARRSEFYYYGNTYYYSAMDYWGQGASVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAFLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAISNRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDPAMYFCQQTKEVPWTFGGGTKLEIK (서열 번호:92); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) LaG 9 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 20a에서 묘사된다. 도면 20a에서, LaG 9 나노바디는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MADVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTSAMGWFRQAPGKEREFVARITWSAGYTAYSDSVKGRFTISRDKAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASRSAGYSSSLTRREDYAYWGQGTQVTVS (서열 번호:93); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) LaG 50 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 20b에서 묘사된다. 도면 20b에서, LaG 50 나노바디는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MADVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTISMAAMSWFRQAPGKEREFVAGISRSAGSAVHADSVKGRFTISRDNTKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCAVRTSGFFGSIPRTGTAFDYWGQGTQVTVS (서열 번호:94); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) LaG 18 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 20c에서 묘사된다. 도면 20c에서, LaG 18 나노바디는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MAQVQLVESGGGLVQTGGSLKLSCTASVRTLSYYHVGWFRQAPGKEREFVAGIHRSGESTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCAQRVRGFFGPLRSTPSWYDYWGQGTQVTVS (서열 번호:95); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) LaG 16/LaG 2 나노바디; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 20d에서 묘사된다. 도면 20d에서, LaG 16/LaG 2 나노바디는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MAQVQLVESGGRLVQAGDSLRLSCAASGRTFSTSAMAWFRQAPGREREFVAAITWTVGNTILGDSVKGRFTISRDRAKNTVDLQMDNLEPEDTAVYYCSARSRGYVLSVLRSVDSYDYWGQGTQVTVSGGGGSGGGGSGGGGSMAQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWTGVSTYYADSVKGRFTISRDNDKNTVYVQMNSLIPEDTAIYYCAAVRARSFSDTYSRVNEYDYWGQGTQVTV (서열 번호:96); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 아폽토시스 조절 단백질; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 세포외 도메인; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 21에서 묘사된다. 도면 21에서, PD1 세포외 도메인은 다음의 아미노산 서열을 갖고: MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQEQKLISEEDL (서열 번호:97); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16b에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 tTA 전사 인자는 도면 16c에서 묘사된 아미노산 서열을 갖는다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 Gal4-VP64 전사 활성인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 22에서 묘사된다. 도면 22에서, 항-CD19 scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (서열 번호:90); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Gal4-VP64 전사 활성인자는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAAAGGSGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGS (서열 번호:70).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 DNA 결합 폴리펩티드이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 Zip(-) Gal4 DNA 결합 폴리펩티드이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 23에서 묘사된다. 도면 23에서, 항-CD19 scFv는 도면 22에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Zip(-) Gal4 DNA 결합 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRYGPLGGGKGGSGGSGGSMKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSAA (서열 번호:68).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-메소텔린 scFv; b) i) EGF 반복; ii) LNR 분절; iii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iv) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 NLS를 포함하는 VP64 Zip(+)이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 24에서 묘사된다. 도면 24에서, 항-메소텔린 scFv는 다음의 아미노산 서열을 갖고: GSQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYD (서열 번호:98); Notch 수용체 폴리펩티드는 도면 16b에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 VP64 Zip(+) 전사 활성인자는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: PKKKRKVDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSGGSGGSGGSLEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK (서열 번호:99).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 재조합효소이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 재조합효소이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 FLPe 재조합효소이다. (가령, Akbudak and Srivastava (2011) Mol. Biotechnol. 49:82를 참조한다). 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 25에서 묘사된다. 도면 25에서, 항-CD19 scFv는 도면 22에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; Notch 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 FLPe 재조합효소는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: MSQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIASCAAELTYLCWMITHNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTIIPYNGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILNSFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTETKTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVRSYNKALKKNAPYPIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVARTTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIRYPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRIGPVEQKLISEEDL (서열 번호:65).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 재조합효소이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 재조합효소이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 NLS를 포함하는 Cre 재조합효소이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 26에서 묘사된다. 도면 26에서, 항-CD19 scFv는 도면 22에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; Notch 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Cre 재조합효소는 다음의 아미노산 서열을 갖고: MVPKKKRKVSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD (서열 번호:100), 여기서 Cre 재조합효소는 NLS (MVPKKKRK; 서열 번호:84)를 포함한다.

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 조절 인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 근원성 조절 인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 MyoD 폴리펩티드이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 27에서 묘사된다. 이러한 실례에서, MyoD는 적색 형광 단백질 (RFP)에 융합된다. 도면 27에서, 항-CD19 scFv는 도면 22에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; Notch 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 MyoD 폴리펩티드는 다음의 아미노산 서열을 갖는다: MELLSPPLRDIDLTGPDGSLCSFETADDFYDDPCFDSPDLRFFEDLDPRLVHMGALLKPEEHAHFPTAVHPGPGAREDEHVRAPSGHHQAGRCLLWACKACKRKTTNADRRKAATMRERRRLSKVNEAFETLKRCTSSNPNQRLPKVEILRNAIRYIEGLQALLRDQDAAPPGAAAFYAPGPLPPGRGSEHYSGDSDASSPRSNCSDGMMDYSGPPSGPRRQNGYDTAYYSEAARESRPGKSAAVSSLDCLSSIVERISTDSPAAPALLLADAPPESPPGPPEGASLSDTEQGTQTPSPDAAPQCPAGSNPNAIYQVL (서열 번호:72).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 세포 표면 항원에 특이적인 항체; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 T-상자-내포 전사 인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 N 말단으로부터 C 말단으로, 다음을 순서대로 포함한다: a) 항-CD19 scFv; b) i) LNR 분절; ii) 이형이합체화 도메인 (HD-N 분절 및 HD-C 분절); 및 iii) TM 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 Tbx21 폴리펩티드 (Tbet (GenBank BC039739)로서 또한 알려져 있음)이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 28에서 묘사된다. Tbx21 단백질은 인터페론-감마, Th1 사이토킨의 발현을 제어하는 Th1 세포 특이적 전사 인자이다. 도면 28에서, 항-CD19 scFv는 도면 22에서 묘사된 아미노산 서열을 갖고; Notch 폴리펩티드는 도면 16a에서 묘사된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 Tbx21 단백질은 다음의 아미노산 서열을 갖는다: MGIVEPGCGDMLTGTEPMPGSDEGRAPGADPQHRYFYPEPGAQDADERRGGGSLGSPYPGGALVPAPPSRFLGAYAYPPRPQAAGFPGAGESFPPPADAEGYQPGEGYAAPDPRAGLYPGPREDYALPAGLEVSGKLRVALNNHLLWSKFNQHQTEMIITKQGRRMFPFLSFTVAGLEPTSHYRMFVDVVLVDQHHWRYQSGKWVQCGKAEGSMPGNRLYVHPDSPNTGAHWMRQEVSFGKLKLTNNKGASNNVTQMIVLQSLHKYQPRLHIVEVNDGEPEAACNASNTHIFTFQETQFIAVTAYQNAEITQLKIDNNPFAKGFRENFESMYTSVDTSIPSPPGPNCQFLGGDHYSPLLPNQYPVPSRFYPDLPGQAKDVVPQAYWLGAPRDHSYEAEFRAVSMKPAFLPSAPGPTMSYYRGQEVLAPGAGWPVAPQYPPKMGPASWFRPMRTLPMEPGPGGSEGRGPEDQGPPLVWTEIAPIRPESSDSGLGEGDSKRRRVSPYPSSGDSSSPAGAPSPFDKEAEGQFYNYFPN (서열 번호:71).

한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 세포외 도메인; b) 다음의 아미노산 서열: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4)를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드; 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 세포외 도메인; b) 다음의 아미노산 서열: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4)를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드; 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 세포외 도메인, 여기서 상기 세포외 도메인은 면역 세포 (T 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포)의 표면 상에서 발견되는 폴리펩티드이고; b) 다음의 아미노산 서열: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4)를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드; 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 한 무제한적 구체예에서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a) 세포외 도메인, 여기서 상기 세포외 도메인은 CD4 세포외 도메인이고; b) 다음의 아미노산 서열: IPYKIEAVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQLCIQKL (서열 번호:4)를 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드; 여기서 TM 도메인은 밑줄 표시되고; 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 S2 단백질분해 개열 부위 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 그리고 c) 세포내 도메인, 여기서 상기 세포내 도메인은 tTA 전사 활성인자이다. 이런 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 실례는 도면 29에서 묘사된다.

핵산

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 발현 벡터 내에 내포된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전사 제어 요소 (가령, 프로모터; 인핸서 등)에 작동가능하게 연결된다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 유도성이다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 구조성이다. 일부 경우에, 프로모터는 진핵 세포에서 기능적이다. 일부 경우에, 프로모터는 세포 유형-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다.

활용된 숙주/벡터 시스템에 따라, 구조성 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등을 비롯한 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소 중에서 한 가지가 발현 벡터에서 이용될 수 있다 (가령, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544를 참조한다).

프로모터는 구조성으로 활성 프로모터 (다시 말하면, 구조성으로 활성/"온 (ON)" 상태에 있는 프로모터)일 수 있고, 이것은 유도성 프로모터 (다시 말하면, 활성/"온 (ON)" 또는 비활성/"오프 (OFF)" 상태가 외부 자극, 예를 들면, 특정 온도, 화합물 또는 단백질의 존재에 의해 제어되는 프로모터)일 수 있고, 이것은 공간적으로 한정된 프로모터 (다시 말하면, 전사 제어 요소, 인핸서 등)(가령, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)일 수 있고, 그리고 이것은 시간적으로 한정된 프로모터 (다시 말하면, 배아 발달의 특정한 시기 동안 또는 생물학적 과정의 특정한 시기 동안, 예를 들면, 생쥐에서 모낭 주기 동안 "온 (ON)" 상태 또는 "오프 (OFF)" 상태에 있는 프로모터)일 수 있다.

적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당분야에서 공지된다. 세균 세포에서 발현을 위해, 적합한 프로모터에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P와 trc가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 진핵 세포에서 발현을 위해, 적합한 프로모터에는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터와 인핸서 요소; 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터; 초기와 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터 긴 말단 반복 내에 존재하는 프로모터; 생쥐 메탈로티오닌-I 프로모터; 그리고 다양한 공지된 조직 특이적 프로모터가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

가역성 유도성 프로모터를 비롯한 적합한 가역성 프로모터는 당분야에서 공지된다. 이런 가역성 프로모터는 많은 생물체, 예를 들면, 진핵생물과 원핵생물로부터 단리되고 유래될 수 있다. 두 번째 생물체에서 이용을 위한 첫 번째 생물체, 예를 들면, 첫 번째 원핵생물과 두 번째 진핵생물, 첫 번째 진핵생물과 두 번째 원핵생물, 기타 등등으로부터 유래된 가역성 프로모터의 변형은 당분야에서 널리 공지된다. 이런 가역성 프로모터, 그리고 이런 가역성 프로모터에 기초되지만 추가 제어 단백질을 또한 포함하는 시스템은 알코올 조절된 프로모터 (가령, 알코올 탈수소효소 I (alcA) 유전자 프로모터, 알코올 전이활성인자 단백질 (AlcR)에 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린 조절된 프로모터, (가령, TetActivators, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터 (가령, 쥐 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절된 프로모터 (가령, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 병인-관련된 조절된 프로모터 (가령, 살리실산 조절된 프로모터, 에틸렌 조절된 프로모터, 벤조티아디아졸 조절된 프로모터 등), 온도 조절된 프로모터 (가령, 열 쇼크 유도성 프로모터 (가령, HSP-70, HSP-90, 콩 열 쇼크 프로모터 등), 광 조절된 프로모터, 합성 유도성 프로모터, 기타 등등을 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

이용에 적합한 유도성 프로모터는 본원에서 설명된 또는 당업자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 실례는 제한 없이, 화학적으로/생화학적으로-조절된 및 물리적으로-조절된 프로모터, 예를 들면, 알코올-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터 (가령, 안히드로테트라사이클린 (aTc)-반응성 프로모터 및 다른 테트라사이클린-반응성 프로모터 시스템, 이것은 테트라사이클린 억제인자 단백질 (tetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO) 및 테트라사이클린 전이활성인자 융합 단백질 (tTA)을 포함한다), 스테로이드-조절된 프로모터 (가령, 쥐 글루코코르티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑디손 수용체에 기초된 프로모터, 그리고 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 상과로부터 프로모터), 금속-조절된 프로모터 (가령, 효모, 생쥐 및 인간으로부터 메탈로티오네인 (금속 이온에 결합하고 이를 격리하는 단백질) 유전자로부터 유래된 프로모터), 병인-조절된 프로모터 (가령, 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아디아졸 (BTH)에 의해 유도된), 온도/열-유도성 프로모터 (가령, 열 충격 프로모터), 그리고 광-조절된 프로모터 (가령, 식물 세포로부터 광 반응성 프로모터)를 포함한다.

일부 경우에, 프로모터는 CD8 세포 특이적 프로모터, CD4 세포 특이적 프로모터, 호중구-특이적 프로모터, 또는 NK-특이적 프로모터이다. 가령, CD4 유전자 프로모터가 이용될 수 있다; 가령, Salmon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7739; 그리고 Marodon et al. (2003) Blood 101:3416을 참조한다. 다른 실례로서, CD8 유전자 프로모터가 이용될 수 있다. NK 세포 특이적 발현은 Ncr1 (p46) 프로모터의 이용에 의해 달성될 수 있다; 가령, Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565를 참조한다.

일부 경우에, 프로모터는 심근세포-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 평활근 세포 특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 지방세포-특이적 프로모터이다. 다른 세포 유형-특이적 프로모터는 당분야에서 공지되고 본원에서 이용에 적합하다.

일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 발현 벡터이다. 일부 구체예에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 구조체, 예를 들면, 재조합 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 구조체, 재조합 아데노바이러스 구조체, 재조합 렌티바이러스 구조체, 재조합 레트로바이러스 구조체 등이다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 재조합 AAV 벡터이다.

적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터 (가령, 우두 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스에 기초된 바이러스 벡터 (가령, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., Hum Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655를 참조한다); 아데노-연관된 바이러스 (가령, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; WO 93/09239에서 Srivastava, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:38223828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154165; 그리고 Flotte et al., PNAS (1993) 90:1061310617을 참조한다); SV40; 단순 헤르페스 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스 (가령, Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999를 참조한다); 레트로바이러스 벡터 (가령, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 그리고 레트로바이러스, 예를 들면, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터); 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 트랜스포손-매개된 벡터, 예를 들면, 피기백 및 잠자는 미녀 벡터 역시 적합하다.

숙주 세포

본 발명은 본 발명의 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포, 다시 말하면, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 세포내 도메인의 방출은 세포의 활성을 조정한다.

일부 경우에, 세포는 진핵 세포이다. 일부 경우에, 세포는 포유류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 조류 세포, 또는 식물 세포이다. 일부 경우에, 세포는 식물 세포이다.

일부 경우에, 세포는 포유류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 인간 세포이다. 일부 경우에, 세포는 생쥐 세포이다. 일부 경우에, 세포는 쥐 세포이다. 일부 경우에, 세포는 비인간 영장류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 토끼류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 유제류 세포이다.

일부 경우에, 세포는 면역 세포, 예를 들면, T 세포, B 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 단핵구 등이다. 일부 경우에, 세포는 T 세포이다. 일부 경우에, 세포는 세포독성 T 세포 (가령, CD8⁺ T 세포)이다. 일부 경우에, 세포는 보조 T 세포 (가령, CD4⁺ T 세포)이다. 일부 경우에, 세포는 조절 T 세포 ("Treg")이다. 일부 경우에, 세포는 B 세포이다. 일부 경우에, 세포는 대식세포이다. 일부 경우에, 세포는 수지상 세포이다. 일부 경우에, 세포는 말초혈 단핵 세포이다. 일부 경우에, 세포는 단핵구이다. 일부 경우에, 세포는 자연 킬러 (NK) 세포이다. 일부 경우에, 세포는 CD4⁺, FOXP3⁺ Treg 세포이다. 일부 경우에, 세포는 CD4⁺, FOXP3^- Treg 세포이다.

일부 경우에, 세포는 개체로부터 획득된다. 가령, 일부 경우에, 세포는 일차 세포이다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 줄기 세포 또는 선조체 세포이다.

한 무제한적 실례로서, 일부 경우에, 세포는 개체로부터 획득된 면역 세포이다. 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 T 림프구일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 세포독성 세포 (가령, 세포독성 T 세포)이다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 보조 T 세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 조절 T 세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 NK 세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 대식세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 수지상 세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 B 세포일 수 있다. 다른 실례로서, 세포는 개체로부터 획득된 말초혈 단핵 세포일 수 있다.

일부 경우에, 숙주 세포는 체세포, 예를 들면, 섬유모세포, 조혈 세포, 뉴런, 췌장 세포, 근육 세포, 뼈 세포, 간세포, 췌장 세포, 상피 세포, 내피 세포, 심근세포, T 세포, B 세포, 골세포 등이다.

일부 경우에, 세포는 본 발명의 2개의 상이한 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 가령, 일부 경우에, 숙주 세포는 i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 및 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형되고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 첫 번째 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록 서로 상이하다.

일부 경우에, 세포는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 세포는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형되고; 그리고 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전적으로 더욱 변형된다. 가령, 일부 경우에, 숙주 세포는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되고, 그리고 키메라 폴리펩티드의 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 키메라 폴리펩티드의 세포내 도메인에 의해 활성화되는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 많은 CAR 폴리펩티드가 당분야에서 설명되었고, 이들 중에서 한 가지가 본원에서 이용에 적합하다.

일부 경우에, CAR은 세포외 도메인, 막경유 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 세포외 도메인은 세포외 도메인을 세포 표면에 결박할 수 있는 임의선택적 지원 영역에 연결된 리간드 또는 수용체를 포함하고, 그리고 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 사슬 (CD3제타)로부터 신호전달 도메인 및 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인, 예를 들면, CD28, 4-1BB 및 OX-40으로부터 유래된 것들을 포함한다. 세포외 도메인은 CAR이 표적에 결합할 수 있게 하는 인식 요소 (가령, 항체 또는 다른 표적-결합 골격)을 내포한다. 일부 경우에, CAR은 T-세포 신호전달 도메인에 연결된 항체 (가령, scFv)의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 경우에, T 세포의 표면 상에서 발현될 때, CAR은 이러한 인식 요소가 특이적인 수용체 또는 리간드를 발현하는 세포에 대한 T 세포 활성을 주도할 수 있다. 실례로서, 종양 항원에 특이적인 인식 요소를 내포하는 세포외 도메인을 내포하는 CAR은 종양 항원을 보유하는 종양 세포에 대한 T 세포 활성을 주도할 수 있다. 세포내 영역은 세포 (가령, T 세포)가 동시자극성 신호를 수신할 수 있게 한다. 동시자극성 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 또는 이들의 임의의 조합에서 선택될 수 있다. 예시적인 CAR은 인간 CD4 막경유 영역, 인간 IgG4 Fc, 그리고 종양 특이적인 수용체 또는 리간드, 예를 들면, IL13 또는 IL3 분자를 포함한다.

세포외 도메인은 세포외 도메인을 세포 표면에 결박할 수 있는 임의선택적 지원 영역에 연결된 가용성 수용체 리간드 (이것은 표적 종양 항원 또는 다른 종양 세포 표면 분자에 특이적이다)로 구성된다. 일부 경우에, CAR은 WO 2014/127261에서 설명된 바와 같이, 이형이합체성, 조건적으로 활성 CAR이다. 일부 구체예에서, 이형이합체성, 조건적으로 활성 CAR은 i) CAR이 특이적인 항원에 결합; 및 ii) 이형이합체성, 조건적으로 활성 CAR의 두 폴리펩티드 사슬의 이합체화를 유도하는 이합체화 작용제에 의해 활성화된다. 이합체화 작용제는 소형 분자일 수 있거나, 또는 광일 수 있다.

유전자도입 생물체

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 비인간 유전자도입 생물체를 제공한다. 본 발명의 유전자도입 비인간 생물체는 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형된 유전체를 포함한다.

유전적으로 변형된 생물체를 생산하는 방법은 당분야에서 공지된다. 가령, Cho et al., Curr Protoc Cell Biol. 2009 Mar;Chapter 19:Unit 19.11: Generation of transgenic mice; Gama et al., Brain Struct Funct. 2010 Mar;214(2-3):91-109. Epub 2009 Nov 25: Animal transgenesis: an overview; 그리고 Husaini et al., GM Crops. 2011 Jun-Dec;2(3):150-62. Epub 2011 Jun 1: Approaches for gene targeting and targeted gene expression in plants를 참조한다.

본 발명의 비인간 유전자도입 생물체에서, 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 알려지지 않은 프로모터 (가령, 핵산이 숙주 세포 유전체 내로 무작위로 통합될 때)의 제어 하에 있을 수 있거나 (다시 말하면, 여기에 작동가능하게 연결될 수 있거나), 또는 공지된 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다 (다시 말하면, 여기에 작동가능하게 연결될 수 있다). 적합한 공지된 프로모터는 임의의 공지된 프로모터일 수 있고, 그리고 구조성으로 활성 프로모터 (가령, CMV 프로모터), 유도성 프로모터 (가령, 열 충격 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절된 프로모터 등), 공간적으로 한정된 및/또는 시간적으로 한정된 프로모터 (가령, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등), 기타 등등을 포함한다.

주제 유전적으로 변형된 생물체 (가령, 유전체가 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생물체)는 예로서, 식물; 무척추동물 (가령, 자포류, 극피동물, 기생충, 파리 등); 비포유류 척추동물 (가령, 어류 (가령, 제브라피시, 복어, 금붕어 등)); 양서류 (가령, 도롱뇽, 개구리 등); 파충류; 조류; 포유동물 등); 유제류 (가령, 염소, 돼지, 양, 소 등); 설치류 (가령, 생쥐, 쥐, 햄스터, 기니 피그); 토끼류 (가령, 토끼); 기타 등등을 포함하는 임의의 생물체일 수 있다. 일부 경우에, 유전자도입 비인간 생물체는 생쥐이다. 일부 경우에, 유전자도입 비인간 생물체는 쥐이다. 일부 경우에, 유전자도입 비인간 생물체는 식물이다.

일부 구체예에서, 유전자도입 비인간 동물은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 도입유전자에 동형접합성이다. 일부 구체예에서, 유전자도입 비인간 동물은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 도입유전자에 이형접합성이다.

방법

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드, 그리고 본 발명의 핵산 (키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산), 그리고 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터는 다양한 적용에서 유용하다. 본 발명은 이런 적용을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내, 탈체, 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 단일 세포에서, 또는 다세포 환경 (가령, 자연발생 조직; 인공 조직 등)에서 실행될 수 있다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 병렬적으로 또는 연속적으로 실행될 수 있다.

세포의 활성을 조정하는 방법

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 세포내 도메인의 방출은 상기 세포의 활성을 조정한다. 세포내 도메인은 "작동체 기능"을 제공하는데, 여기서 작동체 기능은 전사 활성화; 전사 억제; 번역 활성화; 번역 억제; 소기관 기능의 조정; 면역 세포 활성화; 면역 세포 억제; 아폽토시스의 유도; 아폽토시스의 억제; 뉴클레아제 활성; 분화의 조절; 표적 핵산의 대체; 표적 핵산의 변형; 기타 등등일 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 조정될 수 있는 세포의 활성은 면역 세포 활성화 (가령, T 세포 활성화 등); 아폽토시스; 작동체 분자 (가령, 사이토킨, 항체, 성장 인자 등)의 생산; 표적 핵산의 전사; 표적 mRNA의 번역; 소기관 활성; 세포내 트래피킹; 분화; 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법은 또한, 원형질막에서 행동하고, 따라서 세포 활성의 변형을 야기하는 작동체의 방출 (가령, 면역 활성화를 제공하는 면역 동시저해성 수용체 모티프의 방출)을 유발하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 작동체 기능을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 작동체 기능을 제공하고, 여기서 상기 세포내 도메인의 방출은 상기 세포에서 작동체 기능의 작용을 제공한다.

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 아폽토시스 유도인자이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 재조합효소이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 Cas9 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 dCas9 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 활성인자이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 전사 억제인자이다.

본 발명의 방법은 생체내, 시험관내, 또는 탈체에서 실행될 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 방법은 탈체에서 실행되고, 여기서 세포는 개체로부터 획득되고, 그리고 i) 본 발명의 단일 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; ii) 본 발명의 2개 또는 그 이상의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; iii) 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 및 CAR; 또는 iv) 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 및 세포에서 비-내인성 반응 능력을 제공하는 자연발생 또는 합성 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된다.

한 무제한적 실례로서, 본 발명은 암을 앓는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: i) 개체로부터 획득된 T 림프구 또는 자연 킬러 (NK) 세포를 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 유전적으로 변형하고, 여기서 상기 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 개체에서 암 세포 상에 에피토프에 특이적이고, 그리고 여기서 상기 유전자 변형은 탈체에서 실행되고; ii) 유전적으로 변형된 T 림프구 또는 NK 세포를 개체 내로 도입하고, 여기서 상기 유전적으로 변형된 T 림프구 또는 NK는 암 세포를 인식하고 이를 사멸시키고, 따라서 암을 치료한다.

일부 경우에, 본 발명의 방법은 예로서, 생체내에서 실행되는데, 여기서 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 치료가 필요한 개체에 투여된다. 발현 벡터를 개체에 투여하는 방법은 당분야에서 널리 공지된다; 발현 벡터를 개체에 투여하기 위한 임의의 공지된 방법이 본 발명의 방법에서 이용에 적합하다.

일부 경우에, 본 발명의 방법은 시험관내에서, 예를 들면, 현탁액에서 단일 세포로서 성장된 세포, 고체 지지체 상에서 성장된 세포, 3차원 골격에서 성장된 세포 등으로 시험관내 세포 배양에서 실행된다.

작동체 기능의 직접적인 제어

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이, 키메라 Notch 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 키메라 Notch 폴리펩티드는 또한, 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위; 및 세포내 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고, 여기서 세포내 도메인의 방출은 상기 세포의 활성을 조정한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에 접촉하는 두 번째 세포의 세포 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성이다.

일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포를 직접적으로 조정한다. 이런 구체예는 도면 5에서 개략적으로 도해된다.

작동체 기능의 직접적인 제어의 무제한적 실례로서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 리간드에 특정한 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 세포내 도메인으로서 아폽토시스 조절인자 (가령, tBID)를 포함한다. 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현된다. 두 번째 세포의 표면 상에서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 (이것은 이 경우에서, scFv에 의해 특이적으로 결합된 리간드 (항원)이다)에 결합 시에, tBID는 첫 번째 세포에서 방출되고 첫 번째 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 이러한 실례는 도면 6에서 개략적으로 도해된다.

작동체 기능의 간접적인 제어

본 발명은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이, 키메라 Notch 폴리펩티드는 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 키메라 Notch 폴리펩티드는 또한, 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위; 및 세포내 도메인을 포함하는 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포에 접촉하는 두 번째 세포의 세포 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성이다.

일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 방출될 때, 표적 핵산의 발현을 조절하는 (가령, 전사를 증가시키는; 전사를 감소시키는; 번역을 증가시키는; 번역을 감소시키는; 기타 등등) 전사 인자 또는 번역 인자이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 방출될 때, 작동체 유전자의 전사를 유도하고, 작동체 유전자에 의해 인코딩된 유전자 산물 (가령, 작동체 폴리펩티드; 작동체 핵산)의 생산을 유발하는 전사 인자이다. 작동체 기능의 이런 "간접적인" 제어의 실례는 도면 7에서 묘사된다. 일부 경우에, 작동체 폴리펩티드는 아폽토시스 유도인자, 활성화 면역수용체, 저해성 면역수용체, 전사 인자, 아폽토시스 저해제, 분비된 인자 (가령, 사이토킨; 호르몬; 케모킨; 항체; 하나 또는 그 이상의 내인성 인자에 반응하는 세포의 능력을 변경하는 수용체; 우성 음성 조절 단백질; 세포내 차단 단백질; 기타 등등) 또는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 방출될 때, 표적 유전자 산물의 번역, mRNA 안정성 또는 단백질 처리를 조정하는 (증가시키는 또는 감소시키는) 폴리펩티드이고, 여기서 상기 표적 유전자 산물은 작동체 기능을 제공한다.

작동체 기능의 간접적인 제어의 무제한적 실례로서, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 리간드에 특정한 scFv를 포함하는 세포외 도메인 및 전사 인자 (가령, tTa)를 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현된다. 두 번째 세포의 표면 상에서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 (이것은 이 경우에서, scFv에 의해 특이적으로 결합된 리간드 (항원)이다)에 결합 시에, 전사 인자 (이 경우에서, tTa)는 첫 번째 세포에서 방출되고 아폽토시스 유도인자 (이 경우에서, tBID)를 인코딩하는 핵산의 전사를 유도한다. tBID는 첫 번째 세포에서 생산되고, 그리고 첫 번째 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 이러한 실례는 도면 8에서 개략적으로 도해된다.

생물학적 제제의 표적화된 전달 및 분비에서 키메라 노치 수용체 폴리펩티드의 이용

본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 생물학적 분자, 예를 들면, 사이토킨, 성장 인자, 항체, 그리고 유전적으로 인코딩되는 다른 결합, 효현제, 포획, 또는 차단 작용제의 발현 및 분비를 제어하는데 이용될 수 있다.

키메라 Notch 수용체 (또는 협력적으로 작동하는 키메라 Notch 수용체의 조합)의 결합은 체내에서 특정 영역, 조직 또는 세포 유형을 감지하는데 이용될 수 있는데, 이것은 이후, 분비된 생물학적 제제의 상기 부위로의 국부화된 발현/전달을 촉발한다. 생물학적 제제의 전달의 제어는 간접적인 제어 (작용제의 전사의 제어)를 통해, 또는 생물학적 제제의 발현, 처리 및 분비에 관련된 다른 과정의 제어를 통해 이루어질 수 있었다.

키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 - 병렬적으로 복수 수용체; 키메라 Notch 폴리펩티드 및 CAR의 조합 이용

본 발명은 i) 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드; 및 b) 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 및 CAR 둘 모두를 발현하는 세포를, i) 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 (여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 결합한다); 및 ii) CAR이 결합하는 항원과 접촉시키는 것을 수반한다. 이들 구체예에서, 세포의 활성의 조정은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원, 그리고 CAR이 특이적으로 결합하는 항원 둘 모두를 필요로 한다.

일부 경우에, CAR은 세포외 도메인, 막경유 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 여기서 세포외 도메인은 세포외 도메인을 세포 표면에 결박할 수 있는 임의선택적 지원 영역에 연결된 리간드 또는 수용체를 포함하고, 그리고 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 사슬로부터 신호전달 도메인 (CD3제타) 및 하나 또는 그 이상의 동시자극성 신호전달 도메인, 예를 들면, CD28, 4-1BB 및 OX-40으로부터 유래된 것들을 포함한다. 세포외 도메인은 CAR이 표적에 결합할 수 있게 하는 인식 요소 (가령, 항체 또는 다른 표적-결합 골격)을 내포한다. 일부 경우에, CAR은 T-세포 신호전달 도메인에 연결된 항체 (가령, scFv)의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 경우에, T 세포의 표면 상에서 발현될 때, CAR은 이러한 인식 요소가 특이적인 수용체 또는 리간드를 발현하는 세포에 대한 T 세포 활성을 주도할 수 있다. 실례로서, 종양 항원에 특이적인 인식 요소를 내포하는 세포외 도메인을 내포하는 CAR은 종양 항원을 보유하는 종양 세포에 대한 T 세포 활성을 주도할 수 있다. 세포내 영역은 세포 (가령, T 세포)가 동시자극성 신호를 수신할 수 있게 한다. 동시자극성 신호전달 도메인은 CD28, 4-1BB, OX-40 또는 이들의 임의의 조합에서 선택될 수 있다. 예시적인 CAR은 인간 CD4 막경유 영역, 인간 IgG4 Fc, 그리고 종양 특이적인 수용체 또는 리간드, 예를 들면, IL13 또는 IL3 분자를 포함한다.

세포외 도메인은 세포외 도메인을 세포 표면에 결박할 수 있는 임의선택적 지원 영역에 연결된 가용성 수용체 리간드 (이것은 표적 종양 항원 또는 다른 종양 세포 표면 분자에 특이적이다)로 구성된다. 일부 경우에, CAR은 WO 2014/127261에서 설명된 바와 같이, 이형이합체성, 조건적으로 활성 CAR이다.

키메라 노치 수용체는 또한, 활성이 세포 내에 구조성으로 존재하지 않거나, 또는 활성이 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 다른 자연, 키메라, 또는 직교 수용체의 활성을 유사하게 조정하고, 따라서 세포가 반응하는 신호를 변경하는데 이용될 수 있다.

키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 - 병렬적으로 복수 수용체; 2개의 상이한 키메라 Notch 폴리펩티드의 조합 이용

본 발명은 i) 본 발명의 첫 번째 키메라 Notch 폴리펩티드; 및 b) 본 발명의 두 번째 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 가령, 일부 경우에, 세포는 i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 및 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 첫 번째 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록 서로 상이하다. 이들 구체예에서, 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능을 제공하고; 그리고 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능과 상이한 두 번째 작동체 기능을 제공한다. 이들 구체예의 개략적 도해는 도면 9a에서 제공된다.

본 발명은 i) 본 발명의 첫 번째 키메라 Notch 폴리펩티드; 및 b) 본 발명의 두 번째 키메라 Notch 폴리펩티드를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 가령, 일부 경우에, 세포는 i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드; 및 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 첫 번째 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록 서로 상이하다. 이들 구체예에서, 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인에 결합하여 (또는 만약 그렇지 않으면, 이것과 작동가능하게 상호작용하여) 작동체 기능을 제공한다. 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 그것만으로는 작동체 기능을 제공하지 않는다; 그리고 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 그것만으로는 작동체 기능을 제공하지 않는다. 하지만, 이들 2개의 방출된 세포내 도메인은 함께 작동체 기능을 제공한다. 이들 구체예의 개략적 도해는 도면 9a에서 제공된다.

유사한 구체예는 2개의 상이한 키메라 Notch 수용체에 의한 간접적인 조절을 활용할 수 있었는데, 여기서 이들 2개의 상이한 키메라 Notch 수용체 각각은 단지 함께 발현될 때에만, 작동체 기능을 유도하게 될 작동체들의 발현을 유도할 것이다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체는 또한, 활성이 세포 내에 구조성으로 존재하지 않거나 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 다른 자연, 키메라, 또는 직교 수용체의 활성을 유사하게 조정하는데 이용될 수 있다.

키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 - 연속적으로 복수 수용체; 키메라 Notch 폴리펩티드 및 CAR의 조합 이용

본 발명은 a) 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 여기서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 방법은 다음을 수반한다: i) 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 세포 (하지만 CAR을 발현하지 않는다)를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키고 (여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 결합한다), 여기서 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유도하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 전사를 활성화시켜 CAR의 발현을 유발하는 전사 인자이고; 그리고 ii) (i)의 접촉 단계 후, 상기 세포를 CAR이 결합하는 항원과 접촉시킨다. 두 번째 접촉 단계는 CAR에 의한 활성의 조정을 유발한다. 이들 구체예에서, 세포의 활성의 조정은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 및 CAR이 특이적으로 결합하는 항원 둘 모두를 필요로 한다. 이들 구체예의 실례는 도면 10에서 개략적으로 도해된다.

일부 경우에, 세포는 본 발명의 2개 또는 그 이상의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 생산하도록 유전적으로 변형된다. 따라서, 일부 경우에, 본 발명은 a) 본 발명의 2개 또는 그 이상 (가령, 2, 3, 4개, 또는 그 이상)의 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 여기서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 방법은 다음을 수반한다: i) 본 발명의 2개 또는 그 이상의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 세포 (하지만 CAR을 발현하지 않는다)를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키고 (여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 결합한다), 여기서 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것은 2개 또는 그 이상의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 중에서 최소한 하나의 세포내 도메인의 방출을 유도하고, 여기서 상기 세포내 도메인은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 전사를 활성화시켜 CAR의 발현을 유발하는 전사 인자이고; 그리고 ii) (i)의 접촉 단계 후, 상기 세포를 CAR이 결합하는 항원과 접촉시킨다. 두 번째 접촉 단계는 CAR에 의한 활성의 조정을 유발한다. 이들 구체예에서, 세포의 활성의 조정은 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원 및 CAR이 특이적으로 결합하는 항원 둘 모두를 필요로 한다.

본 발명의 키메라 Notch 수용체는 또한, 활성이 세포 내에 구조성으로 존재하지 않거나 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 다른 자연, 키메라, 또는 직교 수용체의 활성을 유사하게 조정하는데 이용될 수 있다. 함께 기능하는 복수 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 활성이 세포 내에 구조성으로 존재하지 않거나 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 다른 자연, 키메라, 또는 직교 수용체의 활성을 조정하는데 유사하게 이용될 수 있다.

키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 - 연속적으로 복수 수용체; 2개의 상이한 키메라 Notch 폴리펩티드의 조합 이용

본 발명은 i) 본 발명의 첫 번째 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) 본 발명의 두 번째 키메라 Notch 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 가령, 일부 경우에, 세포는 i) 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 ii) 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 최소한 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되고, 여기서 첫 번째 및 두 번째 특이적 결합 쌍은 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록, 그리고 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원의 결합이 첫 번째 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하지 않도록 서로 상이하다. 이들 구체예에서, 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능을 제공하고, 여기서 작동체 기능은 두 번째 키메라 Notch 폴리펩티드의 전사의 유도를 제공하고; 그리고 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 첫 번째 작동체 기능과 상이한 두 번째 작동체 기능을 제공한다.

상기 방법은 다음을 수반한다: i) 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 세포 (하지만 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하지 않는다)를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키고 (여기서 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는, 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 결합한다), 여기서 상기 세포를 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것은 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유도하고, 여기서 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 전사를 활성화시켜 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 발현을 유발하는 전사 인자이고; 그리고 ii) (i)의 접촉 단계 후, 상기 세포를 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시킨다 (여기서 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는, 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원에 결합한다). 두 번째 접촉 단계는 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하고, 여기서 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 세포의 활성을 조정하는 작동체 기능을 제공한다. 이들 구체예에서, 세포의 활성의 조정은 세포를 먼저 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원, 그리고 이후, 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 필요로 한다. 이들 구체예의 실례는 도면 11에서 개략적으로 도해된다.

본 발명의 2개 또는 그 이상의 키메라 Notch 수용체는 또한, 활성이 세포 내에 구조성으로 존재하지 않거나 또는 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 다른 자연, 키메라, 또는 직교 수용체의 활성을 유사하게 조정하기 위해 이러한 방식으로 연속적으로 이용될 수 있다.

2개 또는 그 이상의 세포를 갖는 복수 수용체 회로를 수반하는 방법

본 발명은 첫 번째 세포의 활성을 조정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫 번째 세포를 두 번째 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 두 번째 세포는 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고; 그리고 여기서 두 번째 세포는 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원을 포함하는 분자를 표면 상에서 발현한다. 일부 경우에, 첫 번째 세포를 두 번째 세포와 접촉시키는 것은 첫 번째 세포에서 활성을 조정한다. 일부 경우에, 첫 번째 세포를 두 번째 세포와 접촉시키는 것은 두 번째 세포에서 활성을 조정한다.

본 발명은 첫 번째 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫 번째 세포를 두 번째 세포와 접촉시키는 것을 수반하고, 여기서 두 번째 세포는 첫 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고; 그리고 첫 번째 세포는 두 번째 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하고, 그리고 여기서 첫 번째 세포는 CAR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 두 번째 세포는 첫 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉되어, 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발하고, 여기서 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원을 인코딩하는 핵산의 전사를 유도하는 전사 인자이다. 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에서 발현된다. 두 번째 세포의 표면 상에서 발현된, 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원이 첫 번째 세포와 접촉할 때, 두 번째 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 첫 번째 세포의 세포 표면 상에 존재하는 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 내에 존재하는 첫 번째 구성원에 결합하여, 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인의 방출을 유발한다. 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 세포내 도메인은 CAR이 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현되도록, 예로서 CAR의 전부 또는 일부의 전사를 유도하는 전사 인자일 수 있다. 일부 경우에, 두 번째 세포의 표면 상에 존재하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드 및 첫 번째 세포의 표면 상에 존재하는 CAR은 세 번째 세포의 표면 상에 존재하는 2개의 별개 항원을 인식한다. 일부 경우에, 세 번째 세포는 표적 세포이다. 일부 경우에, 두 번째 세포는 첫 번째 항원과 접촉될 때, 첫 번째 세포의 표면 상에서 CAR의 발현을 유발하는 "보조 세포"이고, 여기서 CAR은 표적 세포 상에서 두 번째 항원을 인식한다. 이들 구체예는 도면 12에서 개략적으로 도해된다.

다세포 환경에서 세포 활성을 조정하는 방법

세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 다세포 환경에서 실행될 수 있다. 가령, 첫 번째 세포 ("첫 번째 수신자 세포") 내에 존재하는 첫 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드는 세포내 도메인을 포함할 수 있고, 상기 세포내 도메인은 인접한 세포 (가령, "발송자" 세포) 상에서 첫 번째 리간드에 결합 후 방출될 때, 두 번째 세포 상에서 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드가 결합하는 두 번째 리간드의 전사를 제공하고, 여기서 두 번째 리간드는 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현된다. 두 번째 세포 ("두 번째 수신자 세포")는 이의 표면 상에서 두 번째 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현한다; 첫 번째 수신자 세포와의 상호작용 시에, 두 번째 수신자 세포에서 세포내 작동체 기능이 방출되고 두 번째 수신자 세포의 활성의 조정을 제공한다. 이들 구체예는 도면 13에서 개략적으로 도해된다. 이런 방법은 예로서, 조직화된 조직을 구축하고; 세포 연결성을 추적하고; 기타 등등을 하는데 유용하다.

표적 세포의 이중 인식을 수반하는 세포 활성을 조정하는 방법

일부 경우에, 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 표적 세포 상에서 2개의 별개 표적 분자의 인식을 수반한다. 가령, 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 발현하는 첫 번째 세포는 표적 세포 상에서 첫 번째 표적 분자를 인식하고; 그리고 세포 표면 상에서 수용체 또는 다른 인식 분자를 발현하는 두 번째 세포는 표적 세포 상에서 두 번째 표적 분자에 결합한다. 표적 세포 상에서 첫 번째와 두 번째 표적 분자에 첫 번째와 두 번째 세포의 결합은 두 번째 세포에 의한 새로운 작동체 기능 (가령, 새로운 유전자 산물, 예를 들면, 새로운 폴리펩티드)의 발현을 유발한다. 일부 경우에, 표적 세포 상에서 첫 번째 표적 분자에 첫 번째 세포의 결합은 첫 번째 세포에서 유전자 산물 (가령, 폴리펩티드)의 발현을 유도하고; 여기서 일부 경우에, 첫 번째 세포에 의해 생산된 새로운 유전자 산물은 첫 번째 세포의 표면 상에서 발현되고 두 번째 세포의 표면 상에서 수용체 또는 다른 인식 분자에 결합하고, 이러한 결합은 두 번째 세포의 활성의 조정 (가령, 두 번째 세포가 새로운 작동체 기능 (가령, 새로운 유전자 산물, 예를 들면, 새로운 폴리펩티드)을 발현하도록, 핵산의 전사의 유도)을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포 상에서 첫 번째와 두 번째 표적 분자에 첫 번째와 두 번째 세포의 결합은 두 번째 세포에 의한 표적 세포의 사멸, 또는 두 번째 세포에 의해 발현된 새로운 작동체 기능에 의한 표적 세포의 사멸을 유발한다. 일부 경우에, 표적 세포 상에서 첫 번째와 두 번째 표적 분자에 첫 번째와 두 번째 세포의 결합은 표적 세포의 활성의 조정을 유발하고; 예로서, 여기서 표적 세포의 활성의 조정은 두 번째 세포에 의해 생산된 새로운 작동체 기능에 의해 유도된다. 이들 구체예는 도면 14에서 개략적으로 도해된다.

방법

본 발명은 결합-촉발된 전사 스위치 (가령, 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드; MESA 폴리펩티드; TANGO 폴리펩티드; 기타 등등)를 발현하는 세포의 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내, 탈체, 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 단일 세포에서, 또는 다세포 환경 (가령, 자연발생 조직; 인공 조직 등)에서 실행될 수 있다. 세포의 활성을 조정하기 위한 본 발명의 방법은 병렬적으로 또는 연속적으로 실행될 수 있다.

본 발명은 세포의 활성을 국부적으로 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 결합-촉발된 전사 스위치를 세포 내에서 발현하고; 그리고 b) 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 활성화시키고, 따라서 활성화된 세포내 도메인을 생산하도록 유도한다. 활성화된 세포내 도메인은 세포의 활성을 조정한다. 상기 방법을 이용하여 조정될 수 있는 세포의 활성은 i) 세포의 유전자 산물의 발현; ii) 세포의 증식; iii) 세포의 아폽토시스; iv) 세포의 비-아폽토시스성 사멸; v) 세포의 분화; vi) 세포의 탈분화; vii) 세포의 이주; viii) 세포로부터 분자의 분비; 및 ix) 세포의 세포 부착을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 접촉 단계는 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 시험관내에서 실행된다.

본 발명은 세포의 활성을 국부적으로 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, a) 본 발명의 키메라 Notch 폴리펩티드를 세포 내에서 발현하고, 여기서 상기 키메라 Notch 폴리펩티드는 다음을 포함하고: i) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인; ii) Notch 수용체 폴리펩티드, 여기서 상기 Notch 수용체 폴리펩티드는 전술한 바와 같고 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함하고; 및 iii) 세포내 도메인; 그리고 b) 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 Notch 수용체 폴리펩티드의 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출한다. 방출된 세포내 도메인은 세포의 활성을 조정한다. 상기 방법을 이용하여 조정될 수 있는 세포의 활성은 i) 세포의 유전자 산물의 발현; ii) 세포의 증식; iii) 세포의 아폽토시스; iv) 세포의 비-아폽토시스성 사멸; v) 세포의 분화; vi) 세포의 탈분화; vii) 세포의 이주; viii) 세포로부터 분자의 분비; 및 ix) 세포의 세포 부착을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 접촉 단계는 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 시험관내에서 실행된다.

본 발명은 세포의 활성을 국부적으로 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 MESA 폴리펩티드를 세포 내에서 발현하고; 그리고 b) 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 방출하고, 따라서 방출된 세포내 도메인을 생산하도록 유도한다. 방출된 세포내 도메인은 세포의 활성을 조정한다. 상기 방법을 이용하여 조정될 수 있는 세포의 활성은 i) 세포의 유전자 산물의 발현; ii) 세포의 증식; iii) 세포의 아폽토시스; iv) 세포의 비-아폽토시스성 사멸; v) 세포의 분화; vi) 세포의 탈분화; vii) 세포의 이주; viii) 세포로부터 분자의 분비; 및 ix) 세포의 세포 부착을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 접촉 단계는 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 시험관내에서 실행된다.

본 발명은 세포의 활성을 국부적으로 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로, a) 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원을 포함하는 세포외 도메인, 결합 전달기 및 세포내 도메인을 포함하는 TANGO 폴리펩티드를 세포 내에서 발현하고; 그리고 b) 상기 세포를 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 결합 전달기가 결합 신호를 전달하여 세포내 도메인을 방출하고, 따라서 방출된 세포내 도메인을 생산하도록 유도한다. 방출된 세포내 도메인은 세포의 활성을 조정한다. 상기 방법을 이용하여 조정될 수 있는 세포의 활성은 i) 세포의 유전자 산물의 발현; ii) 세포의 증식; iii) 세포의 아폽토시스; iv) 세포의 비-아폽토시스성 사멸; v) 세포의 분화; vi) 세포의 탈분화; vii) 세포의 이주; viii) 세포로부터 분자의 분비; 및 ix) 세포의 세포 부착을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 접촉 단계는 생체내에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 탈체에서 실행된다. 일부 경우에, 접촉 단계는 시험관내에서 실행된다.

일부 경우에, 활성화된 (또는 방출된) 세포내 도메인은 세포의 내인성 유전자 산물의 발현을 조정한다. 일부 경우에, 세포의 내인성 유전자 산물은 케모킨, 케모킨 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 증식 유도인자, 수용체, 소형 분자 이차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 면역활성인자, 면역저해제, 또는 저해성 면역수용체이다. 일부 경우에, 내인성 유전자 산물은 분비된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 내인성 유전자 산물은 세포 표면 유전자 산물이다. 일부 경우에, 내인성 유전자 산물은 세포내 유전자 산물이다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포에서 2개 또는 그 이상의 내인성 유전자 산물의 발현을 동시에 조정한다. "활성화된 세포내 도메인"은 방출된 세포내 도메인 (가령, 결합-촉발된 전사 스위치의 단백질분해 개열에 의해 방출된)일 수 있다. "활성화된 세포내 도메인"은 예로서, 인산화된 세포내 도메인일 수 있고, 여기서 상기 세포내 도메인은 이의 비인산화된 상태에서 비활성이고, 그리고 이의 인산화된 상태에서 활성이다.

일부 경우에, 활성화된 (또는 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 조정한다. 이종성 유전자 산물은 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는 것이다. 가령, 세포는 이종성 유전자 산물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 경우에, 이종성 유전자 산물은 케모킨, 케모킨 수용체, 키메라 항원 수용체, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 분화 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 물질대사 효소, 병원체 유래된 단백질, 증식 유도인자, 수용체, RNA 보도된 뉴클레아제, 부위 특이적 뉴클레아제, 소형 분자 이차 전령 합성 효소, T 세포 수용체, 독소 유래된 단백질, 전사 활성인자, 전사 억제인자, 전사의 활성인자, 전사의 억제인자, 번역 조절인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 활성화 면역수용체, 항체, 아폽토시스 저해제, 아폽토시스 유도인자, 가공된 T 세포 수용체, 면역활성인자, 면역저해제, 저해성 면역수용체, RNA 보도된 DNA 결합 단백질, 본 발명의 synNotch 폴리펩티드, MESA 폴리펩티드, TANGO 폴리펩티드, CAR, TCR, 또는 두 번째 결합-촉발된 전사 스위치이다. 일부 경우에, 이종성 유전자 산물은 분비된 유전자 산물이다. 일부 경우에, 이종성 유전자 산물은 세포 표면 유전자 산물이다. 일부 경우에, 이종성 유전자 산물은 세포내 유전자 산물이다. 일부 경우에, 활성화된 세포내 도메인은 세포에서 2개 또는 그 이상의 이종성 유전자 산물의 발현을 동시에 조정한다. "활성화된 세포내 도메인"은 방출된 세포내 도메인 (가령, 결합-촉발된 전사 스위치의 단백질분해 개열에 의해 방출된)일 수 있다. "활성화된 세포내 도메인"은 예로서, 인산화된 세포내 도메인일 수 있고, 여기서 상기 세포내 도메인은 이의 비인산화된 상태에서 비활성이고, 그리고 이의 인산화된 상태에서 활성이다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 첫 번째 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 첫 번째 synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 두 번째 synNotch 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 CAR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 CAR의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 MESA 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TANGO 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TCR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 synNotch 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 TCR의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 MESA 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 첫 번째 MESA 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 첫 번째 MESA 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 두 번째 MESA 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 CAR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 MESA 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 CAR의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 MESA 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TANGO 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 MESA 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TCR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 MESA 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 TCR의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TANGO 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 첫 번째 TANGO 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 첫 번째 TANGO 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 두 번째 TANGO 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 CAR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 TANGO 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 CAR의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 TANGO 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 본 발명의 synNotch 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 MESA 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 TANGO 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 MESA 폴리펩티드의 발현을 유도한다.

일부 경우에, 활성화된 (가령, 방출된) 세포내 도메인은 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하고, 여기서 상기 이종성 유전자 산물은 TCR이다. 일부 경우에, 방출된 세포내 도메인은 TANGO 폴리펩티드의 세포내 도메인이고, 여기서 TANGO 폴리펩티드의 방출된 세포내 도메인은 TCR의 발현을 유도한다.

전술한 구체예 중에서 한 가지에서, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 세포의 표면 상에 있을 수 있거나, 불용성 기질 위에 고정될 수 있거나, 세포외 기질 내에 존재할 수 있거나, 인공 매트릭스 내에 존재할 수 있거나, 또는 가용성일 수 있다.

MESA

본 발명의 방법에서 이용에 적합한 모듈식 세포외 센서 구조 (MESA) 폴리펩티드는 U.S. 특허 공개 번호 2014/0234851에서 설명된 바와 같은 MESA 폴리펩티드일 수 있다. MESA 폴리펩티드는 a) 리간드 결합 도메인; b) 막경유 도메인; c) 프로테아제 개열 부위; 및 d) 기능적 도메인을 포함한다. 기능적 도메인은 전사 조절인자 (가령, 전사 활성인자, 전사 억제인자)일 수 있다. 일부 경우에, MESA 수용체는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 경우에, MESA 수용체는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함한다.

TANGO

적합한 TANGO 폴리펩티드는 이형이합체인데, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 담배 식각 바이러스 (Tev) 프로테아제를 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 전사 인자에 융합된 Tev 단백질분해 개열 부위 (PCS)를 포함한다. 이들 2개의 폴리펩티드가 서로에 근접할 때 (이러한 근접은 선천적 단백질-단백질 상호작용에 의해 매개된다), Tev는 PCS를 개열하여 전사 인자를 방출한다. Barnea et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan. 8; 105(1):64-9).

TCR

일부 경우에, 결합-촉발된 스위치는 세포에서 T 세포 수용체 (TCR)의 발현을 유도한다. 본 발명의 방법을 이용하여 유도될 수 있는 TCR은 예로서, 암 세포의 표면 상에서 에피토프, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서 에피토프, 자가항원 내에 존재하는 에피토프 등을 비롯한 다양한 에피토프 중에서 한 가지에 특이적인 TCR을 포함한다. TCR은 일반적으로, 알파 사슬 및 베타 사슬을 포함하고; 그리고 주요 조직적합성 복합체에 의해 제시될 때 항원을 인식한다. 일부 경우에, TCR은 가공된 TCR이다.

면역 세포 활성화 기능을 갖는 임의의 가공된 TCR은 본 발명의 방법을 이용하여 유도될 수 있다. 이런 TCR은 가령, PCT 공개 번호 WO 2003/020763, WO 2004/033685, WO 2004/044004, WO 2005/114215, WO 2006/000830, WO 2008/038002, WO 2008/039818, WO 2004/074322, WO 2005/113595, WO 2006/125962; Strommes et al. Immunol Rev. 2014; 257(1):145-64; Schmitt et al. Blood. 2013; 122(3):348-56; Chapuls et al. Sci Transl Med. 2013; 5(174):174ra27; Thaxton et al. Hum Vaccin Immunother. 2014; 10(11):3313-21 (PMID:25483644); Gschweng et al. Immunol Rev. 2014; 257(1):237-49 (PMID:24329801); Hinrichs et al. Immunol Rev. 2014; 257(1):56-71 (PMID:24329789); Zoete et al. Front Immunol. 2013; 4:268 (PMID:24062738); Marr et al. Clin Exp Immunol. 2012; 167(2):216-25 (PMID:22235997); Zhang et al. Adv Drug Deliv Rev. 2012; 64(8):756-62 (PMID:22178904); Chhabra et al. Scientific World Journal. 2011; 11:121-9 (PMID:21218269); Boulter et al. Clin Exp Immunol. 2005; 142(3):454-60 (PMID:16297157); Sami et al. Protein Eng Des Sel. 2007; 20(8):397-403; Boulter et al. Protein Eng. 2003; 16(9):707-11; Ashfield et al. IDrugs. 2006; 9(8):554-9; Li et al. Nat Biotechnol. 2005; 23(3):349-54; Dunn et al. Protein Sci. 2006; 15(4):710-21; Liddy et al. Mol Biotechnol. 2010; 45(2); Liddy et al. Nat Med. 2012; 18(6):980-7; Oates, et al. Oncoimmunology. 2013; 2(2):e22891; McCormack, et al. Cancer Immunol Immunother. 2013 Apr;62(4):773-85; Bossi et al. Cancer Immunol Immunother. 2014; 63(5):437-48 및 Oates, et al. Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt A):67-74에서 설명된 것들을 비롯하여, 예로서 항원 특이적 TCRs, 단일클론 TCRs (MTCRs), 단일 사슬 MTCRs, 높은 친화성 CDR2 돌연변이체 TCRs, CD1-결합 MTCRs, 높은 친화성 NY-ESO TCRs, VYG HLA-A24 텔로머라아제 TCRs을 포함한다; 이들의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

CAR

일부 경우에, 결합-촉발된 스위치는 세포에서 CAR의 발현을 유도한다. 본원에서 교체가능하게 이용되는 용어 "키메라 항원 수용체" 및 "CAR"은 세포외 도메인 (가령, 리간드/항원 결합 도메인), 막경유 도메인 및 하나 또는 그 이상의 세포내 신호전달 도메인을 배타적이 아닌 일반적으로 포함하는, 면역 세포의 활성화를 촉발하거나 또는 저해할 수 있는 인공 멀티-모듈 분자를 지칭한다. 용어 CAR은 CAR 분자에 특이적으로 한정되지 않고 CAR 변이체를 또한 포함한다. CAR 변이체는 분할 CAR을 포함하는데, 여기서 CAR의 세포외 부분 (가령, 리간드 결합 부분) 및 세포내 부분 (가령, 세포내 신호전달 부분)은 2개의 별개 분자 상에 존재한다. CAR 변이체는 또한, 온 (ON)-스위치 CAR을 포함하는데, 이들은 예로서, 분할 CAR을 포함하는 조건적으로 활성화가능 CAR이고, 여기서 분할 CAR의 두 부분의 조건적 헤테로-이합체화가 약리학적으로 제어된다. CAR 변이체는 또한, 이중특이적 CAR을 포함하는데, 이들은 일차 CAR의 활성을 증폭하거나 또는 저해할 수 있는 이차 CAR 결합 도메인을 포함한다. CAR 변이체는 또한, 저해성 키메라 항원 수용체 (iCARs)를 포함하는데, 이들은 예로서, 이중특이적 CAR 시스템의 성분으로서 이용될 수 있고, 여기서 이차 CAR 결합 도메인의 결합은 일차 CAR 활성화의 저해를 유발한다. CAR 분자 및 이들의 유도체 (즉, CAR 변이체)는 예로서, PCT 출원 번호 US2014/016527; Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304에서 설명된다; 이들의 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.

분할 CAR은 세포외에서 분할되거나 또는 세포내에서 분할될 수 있고, 그리고 조건적으로 이형이합체화가능하거나 또는 가능하지 않을 수 있다. 가령, 조건적으로 이형이합체화가능하지 않은 분할 CAR 시스템은 분할 부분의 어셈블리로부터 활성 CAR의 형성을 유발하는 이형이합체화를 위해 하나 또는 그 이상의 추가 분자의 존재에 의존하지 않는 구조성 이형이합체화 도메인 또는 다른 결합 쌍 (가령, Fc 결합 쌍 또는 다른 직교 결합 쌍)을 내포할 수 있다.

일부 경우에, 세포외에서 분할된 CAR은 예로서, 도면 129a에서 전반적으로 묘사된 바와 같이, 분할 CAR의 첫 번째 부분이 항원 인식 도메인을 내포하는 분할 CAR의 두 번째 부분에 특이적으로 결합하는 세포외 Fc 결합 도메인을 내포하는 경우를 비롯하여, 항원 결합 도메인에서 두 부분으로 세포외에서 분할될 수 있다.

일부 경우에, 세포외에서 분할된 CAR은 예로서, 도면 129b에서 전반적으로 묘사된 바와 같이, 분할 CAR의 첫 번째 부분이 항원 인식 도메인을 내포하는 분할 CAR의 두 번째 부분에서 내포되는 직교 단백질 결합 쌍의 두 번째 부분에 특이적으로 결합하는 직교 단백질 결합 쌍의 첫 번째 부분을 내포하는 경우를 비롯하여, 항원 결합 도메인에서 두 부분으로 세포외에서 분할될 수 있다.

일부 경우에, 세포내에서 분할된 CAR은 예로서, 도면 129c에서 전반적으로 묘사된 바와 같이, 분할 CAR의 첫 번째 부분이 항원 인식 도메인, 막경유 도메인 및 구조성 이형이합체화 도메인의 세포내 첫 번째 부분을 포함하고, 그리고 분할 CAR의 두 번째 부분이 막경유 도메인, 막경유 도메인의 근위에 구조성 이형이합체화 도메인의 두 번째 부분, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 도메인 및 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인 (가령, ITAM 도메인)을 포함하는 경우를 비롯하여, 막경유 도메인의 근위에서 두 부분으로 세포내에서 분할될 수 있다.

일부 경우에, 세포내에서 분할된 CAR은 예로서, 도면 129d에서 전반적으로 묘사된 바와 같이, 분할 CAR의 첫 번째 부분이 항원 인식 도메인, 막경유 도메인, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 도메인 및 구조성 이형이합체화 도메인의 세포내 첫 번째 부분을 포함하고, 그리고 분할 CAR의 두 번째 부분이 막경유 도메인, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 도메인, 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인 (가령, ITAM 도메인) 및 하나 또는 그 이상의 동시자극성 도메인과 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인 사이에 구조성 이형이합체화 도메인의 두 번째 부분을 포함하는 경우를 비롯하여, 세포내 도메인의 근위에서 또는 2개의 세포내 도메인 사이에서 두 부분으로 세포내에서 분할될 수 있다.

일부 경우에, 세포내에서 분할된 CAR은 예로서, 도면 129e에서 전반적으로 묘사된 바와 같이, 분할 CAR의 첫 번째 부분이 항원 인식 도메인, 막경유 도메인, 하나 또는 그 이상의 동시자극성 도메인 및 분할 CAR의 첫 번째 부분의 세포내 말단의 근위에 구조성 이형이합체화 도메인의 세포내 첫 번째 부분을 포함하고, 그리고 분할 CAR의 두 번째 부분이 막경유 도메인, 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인 (가령, ITAM 도메인) 및 막경유 도메인과 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인 사이에 구조성 이형이합체화 도메인의 두 번째 부분을 포함하는 경우를 비롯하여, 세포내 도메인 사이에서 두 부분으로 세포내에서 분할될 수 있다.

당업자는 분할 CAR의 첫 번째와 두 번째 부분 내에 도메인의 배열이 본원에서 특정적으로 설명된 배열에 한정되지 않는다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 단일 CAR이 분할되어 분할 CAR을 산출할 수 있는 특정한 위치는 이런 분할 또는 복수의 분할로부터 발생하는 2개 또는 그 이상 폴리펩티드가 단일 세포 내에 그들의 동시 존재 시에 기능적 CAR을 기능적으로 형성할 수 있기만 하면, 변할 수 있다. 이런 기능적 활성은 예로서, 본원에서 설명된 검정 중에서 하나 또는 그 이상의 이용을 통해 쉽게 결정될 수 있다.

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원

특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 다양한 특이적 결합 쌍 중에서 한 가지의 첫 번째 구성원일 수 있다. 적합한 특이적 결합 쌍은 상기에서 상세하게 설명된다.

일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체-기초된 인식 골격을 포함한다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항체를 포함한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 종양 특이적 항원, 질환-연관된 항원, 또는 세포외 기질 성분에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 세포 표면 항원, 가용성 항원, 또는 불용성 기질 위에 고정된 항원에 특이적으로 결합한다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항체인 일부 경우에, 상기 항체는 단일 사슬 Fv이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 나노바디, 단일-도메인 항체, 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 비항체-기초된 인식 골격이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 비항체-기초된 인식 골격인 일부 경우에, 비항체-기초된 인식 골격은 아비머, DARPin, 아드넥틴, 아비머, 어피바디, 안티칼린, 또는 아필린이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 항원이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항원인 일부 경우에, 상기 항원은 내인성 항원이다. 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원이 항원인 일부 경우에, 상기 항원은 외인성 항원이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체에 대한 리간드이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 수용체이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 세포 부착 분자 (가령, 세포 부착 분자의 세포외 영역의 전부 또는 일부)이다. 일부 경우에, 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원은 첫 번째 이합체화 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 두 번째 이합체화 도메인을 포함한다; 예로서, 일부 경우에, 두 번째 이합체화 도메인에 첫 번째 이합체화 도메인의 결합은 소형 분자 이합체화 작용제에 의해 유도되고, 그리고 다른 경우에, 두 번째 이합체화 도메인에 첫 번째 이합체화 도메인의 결합은 광에 의해 유도된다.

특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원

특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포의 표면 상에서 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 불용성 지지체 위에 고정될 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 가용성일 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 세포외 환경 (가령, 세포외 기질) 내에 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 인공 매트릭스 내에 존재할 수 있다. 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원은 무세포 환경에서 존재할 수 있다.

세포내 도메인

일부 경우에, 세포내 도메인은 전사 조절인자, 예를 들면, 전사 인자, 예를 들면, 전사 활성인자 또는 전사 억제인자이다. 일부 경우에, 전사 인자는 세포의 분화를 직접적으로 조절한다. 일부 경우에, 전사 인자는 두 번째 전사 인자의 발현을 조정함으로써 세포의 분화를 간접적으로 조정한다.

전사 조절인자의 실례는 예로서, ABT1, ACYP2, AEBP1, AEBP2, AES, AFF1, AFF3, AHR, ANK1, ANK2, ANKFY1, ANKIB1, ANKRD1, ANKRD10, ANKRD2, ANKRD32, ANKRD46, ANKRD49, ANKRD56, ANKRD57, ANKS4B, AR, ARHGAP17, ARID1A, ARID1B, ARID3A, ARID4A, ARID5B, ARNT, ARNT2, ARNTL, ARNTL2, ARX, ASB10, ASB11, ASB12, ASB15, ASB2, ASB5, ASB8, ASB9, ASH1L, ASH2L, ASXL1, ASZ1, ATF1, ATF3, ATF4, ATF4, ATF5, ATF6, ATF7, ATF7IP, ATM, ATOH1, ATXN3, 1300003B13RIK, B3GAT3, B930041F14RIK, BACH1, BACH2, BARX1, BARX2, BATF, BATF2, BATF3, BAZ2A, BBX, BC003267, BCL11A, BCL11B, BCL3, BCL6, BCL6B, BCLAF1, BCOR, BHLHA15, BHLHE40, BHLHE41, BLZF1, BMYC, BNC1, BNC2, BPNT1, BRCA1, BRWD1, BTBD11, BTF3, 6030408C04RIK, CAMK4, CARHSP1, CARM1, CBX4, CBX7, CCNC, CCNH, CCNT1, CCNT2, CDC5L, CDK2, CDK4, CDK9, CDKN2C, CDX1, CDX1, CDX2, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, CEBPG, CEBPZ, CHD4, CHD7, CHGB, CIC, CIITA, CITED1, CITED2, CITED4, CLOCK, CLPB, CML3, CNOT7, COPS2, CREB1, CREB3, CREB3L1, CREB3L1, CREB3L2, CREB3L3, CREB5, CREBBP, CREBL2, CREM, CSDA, CSDA, CSDC2, CSDE1, CTBP2, CTCF, CTCFL, CTNNB1, CTNNBL1, CXXC1, D11BWG0517E, 2300002D11RIK, DACH1, DAXX, DBP, DDIT3, DDX20, DDX54, DDX58, DEAF1, DEK, DIDO1, DLX2, DMRT1, DMRT2, DMRTB1, DNMT1, DNMT3A, DR1, DRG1, DUSP26, DYSFIP1, E2F1, E2F2, E2F3, E2F5, E2F6, EBF1, EBF2, EBF3, EBF3, EED, EGR1, EGR2, EGR3, EHF, EHMT2, EID2, ELAVL2, ELF1, ELF1, ELF2, ELF3, ELF4, ELF5, ELK3, ELK4, ELL2, EMX2, EMX2, EN2, ENPP2, EOMES, EP300, EPAS1, ERF, ERG, ESR1, ESRRA, ESRRB, ESRRG, ETS1, ETS2, ETV1, ETV3, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EZH1, EZH2, FAH, FBXL10, FBXL11, FBXW7, FEM1A, FEM1B, FEM1C, FHL2, FLI1, FMNL2, FOS, FOSB, FOSL1, FOSL2, FOXA1, FOXA2, FOXA3, FOXC1, FOXD1, FOXD2, FOXD3, FOXF1, FOXF1A, FOXF2, FOXG1, FOXI1, FOXJ2, FOXJ3, FOXK1, FOXK2, FOXL1, FOXL2, FOXM1, FOXN1, FOXN2, FOXN3, FOXO1, FOXO3, FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4, FOXQ1, FUS, FUSIP1, 2810021G02RIK, GABPA, GABPB1, GARNL1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GATA4, GATA5, GATA5, GATA6, GBX2, GCDH, GCM1, GFI1, GFI1B, GLI2, GLI3, GLIS1, GLIS2, GLIS3, GLS2, GMEB1, GMEB2, GRHL1, GRHL2, GRHL3, GRLF1, GTF2A1, GTF2B, GTF2E2, GTF2F1, GTF2F2, GTF2H2, GTF2H4, GTF2I, GTF2IRD1, GTF2IRD1, GZF1, HAND2, HBP1, HCLS1, HDAC10, HDAC11, HDAC2, HDAC5, HDAC9, HELZ, HES1, HES4, HES5, HES6, HEXIM1, HEY2, HEYL, HHEX, HHEX, HIC1, HIC2, HIF1A, HIF1AN, HIPK2, HIVEP1, HIVEP2, HIVEP2, HIVEP3, HLF, HLTF, HLX, HMBOX1, HMG20A, HMGA2, HMGB2, HMGB3, HNF1B, HNF4A, HNF4G, HOMEZ, HOXA10, HOXA11, HOXA13, HOXA2, HOXA3, HOXA4, HOXA5, HOXA6, HOXA7, HOXA9, HOXB1, HOXB2, HOXB3, HOXB4, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, HOXC10, HOXC10, HOXC11, HOXC5, HOXC6, HOXC8, HOXC9, HOXD8, HOXD9, HR, HSBP1, HSF2BP, HTATIP2, HTATSF1, HUWE1, 5830417I10RIK, ID1, ID2, ID3, ID3, IFNAR2, IKBKB, IKBKG, IKZF1, IKZF2, IKZF3, IKZF4, IL31RA, ILF3, ING1, ING2, ING3, ING4, INSM1, INTS12, IQWD1, IRF1, IRF1, IRF2, IRF3, IRF4, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, IRF8, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, ISL1, ISL2, ISX, ISX, IVNS1ABP, 2810021J22RIK, JARID1A, JARID1B, JARID1C, JARID1D, JDP2, JUN, JUNB, JUND, KLF1, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF15, KLF16, KLF2, KLF3, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KRR1, 6330416L07RIK, L3MBTL2, LASS2, LASS4, LASS6, LBA1, LBH, LBX1, LCOR, LDB1, LDB2, LEF1, LHX1, LHX2, LHX5, LIMD1, LIN28, LMO1, LMO4, LMX1A, LSM11, LSM4, LYL1, 9030612M13RIK, 1810007M14RIK, 3632451O06RIK, MAF, MAFA, MAFB, MAFF, MAFG, MAFK, MAGED1, MAP3K12, MAPK1, MAPK3, MAPK8, MAPK8IP1, MAX, MAZ, MBD2, MCM2, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, MECOM, MECP2, MED12, MED8, MEF2A, MEF2B, MEF2C, MEF2D, MEIS1, MEIS1, MEIS2, MEOX2, MESP2, MID1, MITF, MKI67IP, MKL1, MLL1, MLL3, MLLT10, MLLT3, MLX, MLXIP, MLXIPL, MNT, MNX1, MPL, MSC, MSRB2, MSX2, MTA3, MTF1, MTF2, MTPN, MXD1, MXD4, MXI1, MYB, MYBBP1A, MYBL2, MYC, MYCBP, MYCL1, MYCN, MYEF2, MYF6, MYNN, MYOCD, MYOD1, MYOG, MYST3, MYST4, MYT1L, MZF1, NAB1, NAB2, NANOG, NARG1, NCOA1, NCOA2, NCOA3, NCOR1, NCOR2, NDN, NEUROD1, NEUROD4, NEUROD6, NEUROG1, NEUROG2, NFAT5, NFATC1, NFATC2, NFATC2IP, NFATC3, NFATC3, NFATC4, NFE2, NFE2L1, NFE2L2, NFIA, NFIA, NFIB, NFIC, NFIL3, NFIX, NFKB1, NFKB2, NFKBIB, NFKBIE, NFKBIZ, NFX1, NFXL1, NFYA, NFYB, NHLH1, NKX2-2, NKX2-3, NKX2-5, NKX2-6, NKX6-2, NMI, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, NPAS1, NPAS2, NPAS3, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1D2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NRARP, NRIP1, NRIP2, NSBP1, NSD1, NUDT12, NULL, NUPR1, 1700065O13RIK, OLIG1, OLIG2, OLIG2, ONECUT1, ONECUT2, ONECUT3, ORC2L, OSGIN1, OSR1, OSR2, OSTF1, OVOL1, OVOL2, PAPOLA, PAPOLG, PAPPA2, PATZ1, PAWR, PAX2, PAX5, PAX6, PAX7, PAX8, PAX9, PBX1, PBX2, PBX3, PBX4, PCBD1, PCGF6, PDCD11, PDLIM4, PDX1, PEG3, PER1, PFDN1, PGR, PHF1, PHF10, PHF12, PHF13, PHF14, PHF20, PHF21A, PHF5A, PHF7, PHOX2A, PHOX2B, PIAS2, PIR, PITX1, PITX2, PKNOX1, PKNOX2, PLA2G6, PLAGL1, PLAGL2, PLRG1, PML, POGK, POLR2B, POLR2E, POLR2H, POLR3E, POLR3H, POLRMT, POU1F1, POU2AF1, POU2F1, POU2F2, POU3F2, POU3F3, POU3F3, POU5F1, POU6F1, PPARA, PPARD, PPARG, PPARGC1A, PPARGC1B, PPP1R12C, PPP1R13B, PPP1R16B, PPP1R1B, PPP2R1A, PPP3CB, PQBP1, PRDM1, PRDM14, PRDM15, PRDM16, PRDM2, PRDM4, PRDM5, PRDM6, PRDM8, PREB, PRKAR1A, PRKCBP1, PROX1, PRRX1, PRRX2, PSMC5, PSMD10, PSMD9, PTF1A, PTGES2, PURB, PWP1, RAB11A, RAB11B, RAB15, RAB18, RAB1B, RAB25, RAB8A, RAB8B, RAI14, RARA, RARB, RARG, RASSF7, RB1, RBBP7, RBL1, RBM14, RBM39, RBM9, RBPJ, RBPJL, RCOR2, REL, RELA, RELB, RERE, REST, REXO4, RFC1, RFX1, RFX2, RFX3, RFX5, RFX7, RFX8, RHOX5, RHOX6, RHOX9, RIPK4, RNF12, RNF14, RNF141, RNF38, RNF4, RORA, RORA, RORB, RORC, RPS6KA4, RREB1, RSRC1, RUNX1, RUNX1T1, RUNX2, RUNX2, RUNX3, RUVBL1, RUVBL2, RXRA, RXRG, RYBP, SAFB2, SALL1, SALL1, SALL2, SALL4, SAP30, SAP30BP, SATB1, SATB2, SATB2, SCAND1, SCAP, SCRT2, SEC14L2, SERTAD1, SF1, SFPI1, SFRS5, SH3D19, SH3PXD2B, SHANK3, SHOX2, SHPRH, SIN3A, SIN3B, SIRT2, SIRT3, SIRT5, SIX1, SIX1, SIX2, SIX3, SIX4, SIX5, SKI, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, SMARCA1, SMARCA2, SMARCA5, SMARCB1, SMYD1, SNAI1, SNAI2, SNAPC2, SNAPC4, SNIP1, SOLH, SOX1, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX15, SOX17, SOX18, SOX2, SOX21, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX9, SP1, SP110, SP140L, SP2, SP3, SP4, SP6, SP8, SPDEF, SPEN, SPI1, SPIB, SQSTM1, SREBF1, SREBF2, SREBF2, SRF, SSBP2, SSBP3, SSBP4, SSRP1, ST18, STAG1, STAT1, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT5B, STAT6, SUB1, SUZ12, TADA2L, TAF13, TAF5, TAF5L, TAF7, TAF9, TAL1, TAL1, TARDBP, TBPL1, TBR1, TBX1, TBX10, TBX15, TBX18, TBX2, TBX2, TBX20, TBX21, TBX3, TBX4, TBX5, TBX6, TCEA1, TCEA3, TCEAL1, TCEB3, TCERG1, TCF12, TCF15, TCF19, TCF20, TCF21, TCF21, TCF3, TCF4, TCF7, TCF7L2, TCFAP2A, TCFAP2B, TCFAP2C, TCFCP2L1, TCFE2A, TCFE3, TCFEB, TCFEC, TCFL5, TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, TEF, TFAP2A, TFAP2C, TFCP2L1, TFDP2, TFEB, TFEC, TGFB1I1, TGIF1, TGIF2, TGIF2LX, THRA, THRAP3, THRB, THRSP, TIAL1, TLE1, TLE6, TMEM131, TMPO, TNFAIP3, TOB1, TOX4, TP63, TRERF1, TRIB3, TRIM24, TRIM28, TRIM30, TRIP13, TRIP4, TRIP6, TRP53, TRP53BP1, TRP63, TRPS1, TRPS1, TSC22D1, TSC22D2, TSC22D3, TSC22D4, TSHZ1, TSHZ1, TSHZ3, TTRAP, TUB, TULP4, TWIST1, TWIST2, TYSND1, UBE2W, UBN1, UBP1, UBTF, UGP2, UHRF1, UHRF2, UNCX, USF1, USF2, UTF1, VDR, VEZF1, VGLL2, VSX1, WASL, WHSC1, WHSC2, WT1, WWP1, WWTR1, XBP1, YAF2, YY1, ZBED1, ZBED4, ZBTB1, ZBTB10, ZBTB16, ZBTB16, ZBTB17, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB22, ZBTB25, ZBTB32, ZBTB38, ZBTB4, ZBTB43, ZBTB45, ZBTB47, ZBTB7A, ZBTB7B, ZBTB7C, ZCCHC8, ZDHHC13, ZDHHC16, ZDHHC21, ZDHHC5, ZDHHC6, ZEB2, ANK2ZEB2, ZFHX2, ZFHX3, ZFHX4, ZFP105, ZFP110, ZFP143, ZFP148, ZFP161, ZFP192, ZFP207, ZFP219, ZFP238, ZFP263, ZFP275, ZFP277, ZFP281, ZFP287, ZFP292, ZFP35, ZFP354C, ZFP36, ZFP36L1, ZFP386, ZFP407, ZFP42, ZFP423, ZFP426, ZFP445, ZFP451, ATF5ZFP451, ZFP467, ZFP52, ZFP57, ZFP592, ZFP593, ZFP597, ZFP612, ZFP637, ZFP64, ZFP647, ZFP748, ZFP810, ZFP9, ZFP91, ZFPM1, ZFPM2, ZFX, ZHX2, ZHX3, ZIC1, ZIC2, ZIC3, ZIC4, ZIC5, ZKSCAN1, ZKSCAN3, ZMYND11, ZNF143, ZNF160, ZNF175, ZNF184, ZNF192, ZNF213, ZNF217, ZNF219, ZNF22, ZNF238, ZNF24, ZNF267, ZNF273, ZNF276, ZNF280D, ZNF281, ZNF292, ZNF311, ZNF331, ZNF335, ZNF337, ZNF33B, ZNF366, ZNF394, ZNF398, ZNF41, ZNF410, ZNF415, ZNF423, ZNF436, ZNF444, ZNF445, ZNF451, ZNF460, ZNF496, ZNF498, ZNF516, ZNF521, ZNF532, ZNF536, ZNF546, ZNF552, ZNF563, ZNF576, ZNF580, ZNF596, ZNF621, ZNF628, ZNF648, ZNF649, ZNF652, ZNF655, ZNF664, ZNF668, ZNF687, ZNF692, ZNF696, ZNF697, ZNF710, ZNF80, ZNF91, ZNF92, ZNRD1, ZSCAN10, ZSCAN16, ZSCAN20, ZSCAN21, ZXDC, 그리고 ZZZ3을 포함한다. 전사 조절인자의 추가 실례는 전술한 바와 같다. 전사 인자 (전사 활성인자; 전사 억제인자)의 무제한적 실례는 도면 37-83에서 묘사된다. 가령, 전사 인자는 도면 37-83에서 묘사된 아미노산 서열에 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 세포내 도메인의 활성화 (가령, 인산화; 방출)는 전사 조절, 염색질 조절, 번역, 트래피킹 또는 번역후 처리를 통해 세포의 내인성 유전자의 발현을 조정한다. 일부 경우에, 세포내 도메인의 활성화 (가령, 인산화; 방출)는 두 번째 세포에 또는 세포외 기질에 세포의 세포 부착을 조정한다.

결합 전달기

결합 전달기는 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 포함할 수 있고, 여기서 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합은 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위에서 결합 전달기의 개열을 유도하고, 따라서 결합 신호를 전달하고, 그리고 세포내 도메인을 단백질분해적으로 방출함으로써 세포내 도메인을 활성화시킨다. synNotch에서 단백질분해 개열 부위의 실례는 전술한 바와 같다.

다른 실례로서, 단백질분해 개열 부위는 예로서, 금속단백분해효소 개열 부위, 예를 들면, 콜라겐분해효소-1, -2와 -3 (MMP-1, -8과 -13), 젤라틴분해효소 A와 B (MMP-2와 -9), 스트로멜리신 1, 2와 3 (MMP-3, -10과 -11), 마트릴리신 (MMP-7), 그리고 막 금속단백분해효소 (MT1-MMP와 MT2-MMP)에서 선택되는 MMP에 대한 개열 부위일 수 있다. 가령, MMP-9의 개열 서열은 Pro-X-X-Hy (여기서, X는 임의적인 잔기; Hy, 소수성 잔기), 예를 들면, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr), 예를 들면, Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser (서열 번호:101) 또는 Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr (서열 번호:102)이다. 프로테아제 개열 부위의 다른 실례는 플라스미노겐 활성인자 개열 부위, 예를 들면, uPA 또는 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA) 개열 부위이다. 적합한 프로테아제 개열 부위의 다른 실례는 프로락틴 개열 부위이다. uPA와 tPA의 개열 서열의 특정한 실례는 Val-Gly-Arg를 포함하는 서열을 포함한다. 단백질분해적으로 개열가능한 링커 내에 포함될 수 있는 프로테아제 개열 부위의 다른 실례는 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제 개열 부위, 예를 들면, ENLYTQS (서열 번호:103)이고, 여기서 상기 프로테아제는 글루타민 및 세린 사이를 개열한다. 단백질분해적으로 개열가능한 링커 내에 포함될 수 있는 프로테아제 개열 부위의 다른 실례는 엔테로키나아제 개열 부위, 예를 들면, DDDDK (서열 번호:104)이고, 여기서 개열은 리신 잔기 뒤에서 발생한다. 단백질분해적으로 개열가능한 링커 내에 포함될 수 있는 프로테아제 개열 부위의 다른 실례는 트롬빈 개열 부위, 예를 들면, LVPR (서열 번호:105)이다. 프로테아제 개열 부위를 포함하는 추가 적합한 링커는 다음의 아미노산 서열 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 링커를 포함한다: PreScission 프로테아제 (인간 리노바이러스 3C 프로테아제 및 글루타티온-S-전달효소를 포함하는 융합 단백질; Walker et al. (1994) Biotechnol. 12:601)에 의해 개열되는 LEVLFQGP (서열 번호:106); 카텝신 B에 의해 개열되는 트롬빈 개열 부위, 예를 들면, CGLVPAGSGP (서열 번호:107); SLLKSRMVPNFN (서열 번호:108) 또는 SLLIARRMPNFN (서열 번호:109); 엡스타인 바르 바이러스 프로테아제에 의해 개열되는 SKLVQASASGVN (서열 번호:110) 또는 SSYLKASDAPDN (서열 번호:111); MMP-3 (스트로멜리신)에 의해 개열되는 RPKPQQFFGLMN (서열 번호:112); MMP-7 (마트릴리신)에 의해 개열되는 SLRPLALWRSFN (서열 번호:113); MMP-9에 의해 개열되는 SPQGIAGQRNFN (서열 번호:114); 서몰리신-유사 MMP에 의해 개열되는 DVDERDVRGFASFL (서열 번호: 115); 매트릭스 금속단백분해효소 2(MMP-2)에 의해 개열되는 SLPLGLWAPNFN (서열 번호:116); 카텝신 L에 의해 개열되는 SLLIFRSWANFN (서열 번호:117); 카텝신 D에 의해 개열되는 SGVVIATVIVIT (서열 번호:118); 매트릭스 금속단백분해효소 1(MMP-1)에 의해 개열되는 SLGPQGIWGQFN (서열 번호:119); 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성인자에 의해 개열되는 KKSPGRVVGGSV (서열 번호:120); 막 유형 1 매트릭스 금속단백분해효소 (MT-MMP)에 의해 개열되는 PQGLLGAPGILG (서열 번호:121); 스트로멜리신 3 (또는 MMP-11), 서몰리신, 섬유모세포 콜라겐분해효소 및 스트로멜리신-1에 의해 개열되는 HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT (서열 번호:122); 매트릭스 금속단백분해효소 13 (콜라겐분해효소-3)에 의해 개열되는 GPQGLAGQRGIV (서열 번호:123); 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (tPA)에 의해 개열되는 GGSGQRGRKALE (서열 번호:124); 인간 전립선-특이적 항원에 의해 개열되는 SLSALLSSDIFN (서열 번호:125); 칼리크레인 (hK3)에 의해 개열되는 SLPRFKIIGGFN (서열 번호:126); 호중구 엘라스타아제에 의해 개열되는 SLLGIAVPGNFN (서열 번호:127); 및 칼페인 (칼슘 활성화된 중성 프로테아제)에 의해 개열되는 FFKNIVTPRTPP (서열 번호:128).

세포

본 발명의 방법은 임의의 진핵 세포의 활성을 조정하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 생체내에 있다. 일부 경우에, 세포는 탈체에 있다. 일부 경우에, 세포는 시험관내에 있다. 일부 경우에, 세포는 포유류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 인간 세포이다. 일부 경우에, 세포는 비인간 영장류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 설치류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 생쥐 세포이다. 일부 경우에, 세포는 쥐 세포이다.

적합한 세포는 망막 세포 (가령, 뮐러 세포, 신경절 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 그리고 막대와 원뿔, 뮐러 신경아교 세포 및 망막 색소 상피를 비롯한 광수용기 세포); 신경 세포 (가령, 시상, 감각 피질, 부정대 (ZI), 복측 피개부 (VTA), 전전두 피질 (PFC), 중격의지핵 (NAc), 편도 (BLA), 흑색질, 배쪽 창백, 담창구, 배측 줄무늬체, 복부 줄무늬체, 시상하 핵, 해마, 치상회, 대상회, 내후각 피질, 후각 피질, 일차 운동 피질, 또는 소뇌의 세포); 간 세포; 신장 세포; 면역 세포; 심장 세포; 골격근 세포; 평활근 세포; 폐 세포; 기타 등등을 포함한다.

적합한 세포는 줄기 세포 (가령, 배아 줄기 (ES) 세포, 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포; 생식 세포 (가령, 난모세포, 정자, 난원세포, 정조세포 등); 체세포, 예를 들면, 섬유모세포, 희소돌기아교세포, 신경아교 세포, 조혈 세포, 뉴런, 근육 세포, 뼈 세포, 간세포, 췌장 세포 등을 포함한다.

적합한 세포는 인간 배아 줄기 세포, 태아 심근세포, 근섬유모세포, 중간엽 줄기 세포, 자가이식된 확대된 심근세포, 지방세포, 전능성 세포, 다능성 세포, 혈액 줄기 세포, 근모세포, 성체 줄기 세포, 골수 세포, 중간엽 세포, 배아 줄기 세포, 실질성 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중피 세포, 섬유모세포, 조골세포, 연골세포, 외인성 세포, 내인성 세포, 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 골수 유래된 선조체 세포, 심근 세포, 골격 세포, 태아 세포, 미분화 세포, 다분화성 선조체 세포, 단분화성 선조체 세포, 단핵구, 심장 근모세포, 골격 근모세포, 대식세포, 모세관 내피 세포, 이종유전성 세포, 동종이계 세포, 그리고 출생후 줄기 세포를 포함한다.

일부 경우에, 세포는 면역 세포, 뉴런, 상피 세포 및 내피 세포, 또는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 대식세포이다. 일부 경우에, 면역 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 경우에, 면역 세포는 보조 T 세포이다. 일부 경우에, 면역 세포는 조절 T 세포 (Treg)이다.

일부 경우에, 세포는 줄기 세포이다. 일부 경우에, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다. 일부 경우에, 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 경우에, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 경우에, 세포는 성체 줄기 세포이다.

적합한 세포는 세기관지 줄기 세포 (BASCs), 돌출 상피 줄기 세포 (bESCs), 각막 상피 줄기 세포 (CESCs), 심장 줄기 세포 (CSCs), 표피 신경 능선 줄기 세포 (eNCSCs), 배아 줄기 세포 (ESCs), 내피 선조체 세포 (EPCs), 간 난원형 세포 (HOCs), 조혈 줄기 세포 (HSCs), 각질세포 줄기 세포 (KSCs), 중간엽 줄기 세포 (MSCs), 뉴런 줄기 세포 (NSCs), 췌장 줄기 세포 (PSCs), 망막 줄기 세포 (RSCs), 그리고 피부-유래된 전구체 (SKPs)를 포함한다.

일부 경우에, 줄기 세포는 조혈 줄기 세포 (HSC)이고, 그리고 전사 인자는 적혈구, 혈소판, 림프구, 단핵구, 호중구, 호염기구, 또는 호산구로 분화하도록 HSC의 분화를 유도한다. 일부 경우에, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이고, 그리고 전사 인자는 MSC의 결합 조직 세포, 예를 들면, 뼈, 연골, 평활근, 힘줄, 인대, 버팀질, 골수, 진피, 또는 지방의 세포로의 분화를 유도한다.

키트

본 발명은 세포의 활성을 조정하는 방법을 실행하기 위한 키트를 제공한다.

일부 경우에, 주제 키트는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 주제 키트는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 포함한다.

일부 경우에, 주제 키트는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 유전적으로 변형되는 숙주 세포를 포함한다. 일부 경우에, 주제 키트는 본 발명의 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로 유전적으로 변형되는 숙주 세포를 포함한다. 키트 성분은 동일한 용기 내에, 또는 별개의 용기 내에 있을 수 있다.

임의의 전술한 키트는 하나 또는 그 이상의 추가 시약을 더욱 포함할 수 있는데, 여기서 이런 추가 시약은 다음에서 선택될 수 있다: 희석 완충액; 재구성 용액; 세척 완충액; 대조 시약; 대조 발현 벡터; 음성 대조 폴리펩티드 (가령, 특이적 결합 쌍의 두 번째 구성원에 특이적 결합 쌍의 첫 번째 구성원의 결합 시에 세포내 도메인이 방출되지 않도록, 하나 또는 그 이상의 리간드-유도성 단백질분해 개열 부위를 결여하는 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드); 양성 대조 폴리펩티드; 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 시험관내 생산을 위한 시약 등.

전술한 성분에 더하여, 주제 키트는 주제 방법을 실시할 때 키트의 성분을 이용하기 위한 사용설명서를 더욱 포함할 수 있다. 주제 방법을 실시하기 위한 사용설명서는 일반적으로, 적합한 기록 매체 상에 기록된다. 가령, 사용설명서는 기질, 예를 들면, 페이퍼 또는 플라스틱 등에 인쇄될 수 있다. 따라서, 사용설명서는 포장 삽입물로서 키트 내에, 키트 또는 이의 성분의 용기의 라벨링 내에 (다시 말하면, 포장 또는 하위포장과 결부됨), 기타 등등에서 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 사용설명서는 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예를 들면, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구체예에서, 실제 사용설명서가 키트 내에 존재하지 않고, 원격 공급원으로부터, 예를 들면, 인터넷을 통해 사용설명서를 획득하기 위한 수단이 제공된다. 이러한 구체예의 실례는 사용설명서가 개관될 수 있고 및/또는 사용설명서가 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 사용설명서에서처럼, 사용설명서를 획득하기 위한 이러한 수단은 적합한 기질 상에 기록된다.

실시예

다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 제공하기 위해 제안되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않고, 또한 이들은 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압 또는 이에 가깝다. 표준 약어가 이용될 수 있다, 예를 들면, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오티드(들); i.m., 근육내; i.p., 복막내; s.c., 피하; 기타 등등.

실시예 1: 키메라 Notch 수용체 폴리펩티드의 산출 및 특징화

재료와 방법

Jurkat T 세포는 렌티바이러스를 통해 Tet 반응 요소 (TRE) 항-메소텔린 CAR-EGFP/pGK mCherry 이중 벡터로 안정되게 형질도입되었다. 형질도입된 세포는 mCherry를 구조성으로 발현하고, 그리고 Tet 전이활성인자 (tTa)의 존재에서 항-메소텔린 CAR-EGFP 융합을 유도적으로 발현하였다. 이러한 안정된 라인은 이후, 항-CD19 Notch tTA 수용체로 형질도입되었다. 결과의 Jurkat 세포는 이후, 항원 CD19, 메소텔린, 또는 둘 모두를 발현하는 만성 골수성 백혈병 K562 암 세포와의 공동배양을 통해 검정되었다. T 세포는 EGFP 태깅된 CAR 및 활성화 마커, CD69의 발현에 대해 유세포분석법에 의해 24 시간 시점에 사정되었다. 공동배양 상층액 역시 수집되었고, 그리고 IL-2의 분비가 ELISA에 의해 결정되었다.

결과

키메라 Notch 수용체 특징화

키메라 Notch 플랫폼이 리간드 결합 시에 수신자 세포에서 전사를 유도하는데 이용될 수 있다는 것을 보여주기 위해, 다음의 리포터 세포주가 산출되었다: 생쥐 L929 섬유모세포 리포터 라인은 Tet 반응 요소 (TRE) -->EGFP 리포터/pGK mCherry 이중 벡터 (TRE 리포터) 또는 Gal4 UAS-->EGFP / pGK 퓨로마이신 내성 이중 벡터 (UAS 리포터)로 형질도입에 의해 산출되었다. 이들 키메라 Notch 변이체는 상응하는 L929 리포터 세포주 내로 형질도입되어, 키메라 Notch 리포터 세포가 산출되었다. 이들 키메라 Notch 리포터 세포는 2가지 방법에 의해 병렬적으로 자극되었다. 첫 번째, 키메라 Notch 발현 세포는 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합된 고정된 항체에 노출되었다. 두 번째, 이들 세포는 동계 키메라 Notch 리간드를 발현하는 K562 세포 또는 L929 섬유모세포와 함께 배양되었다. 키메라 Notch 발현 세포는 리포터 활성을 계측하기 위해 유세포분석법에 의해 EGFP 형광에 대해 검정되었다. 도면 30-32는 TRE 리포터 라인에서 키메라 Notch 항-CD19 (도면 30a-b) 및 항-메소텔린 (도면 31a-b), 그리고 UAS 리포터 라인에서 키메라 Notch 항-CD19 (도면 32a-b)에 대한 대표적인 결과를 보여준다.

키메라 Notch 플랫폼이 전사를 억제하는데 이용될 수 있다는 것을 보여주기 위해, 복합 SV40 / UAS 프로모터의 하류에 EGFP를 발현하는 다른 리포터 라인이 산출되었다 (SV40/UAS 리포터). 도면 33a 이들 SV40/UAS 리포터 세포주는 높은 수준에서 GFP를 발현한다. 이들 SV40/UAS 리포터 세포는 항-CD19 키메라 Notch로 형질도입되었는데, 여기서 세포내 도메인은 Gal4 DNA-결합 도메인 및 전사 억제인자 도메인 KRAB의 융합이다. 도면 33b에서 보여지는 바와 같이, 처리되지 않은 키메라 Notch SV40/UAS 리포터 세포는 높은 EGFP 발현을 전시한다; 키메라 Notch 수용체에 대한 리간드의 존재에서, EGFP 발현은 하향조절된다.

신호전달 릴레이의 연쇄 반응이 만들어질 수 있다는 것을 보여주기 위해, 복수 키메라 Notch 폴리펩티드의 연쇄 반응이 다음의 방식으로 설계되었다. 세포 A는 첫 번째 리간드 A (메소텔린)를 발현한다. 세포 B는 세포외 도메인으로서 항-메소텔린 scFv 및 세포내 도메인으로서 tTA를 갖는 키메라 Notch를 발현한다; 세포 B는 또한, TRE 서열의 제어 하에 두 번째 리간드, CD19, 및 청색 형광 단백질 (BFP)을 발현한다. 세포 C는 세포내 도메인으로서 tTA를 갖는 항-CD19 키메라 Notch를 발현한다; 게다가, 세포 C는 TRE 서열에 의해 제어된 GFP를 발현한다. 도면 34는 세포 A + 세포 B + 세포 C의 한 가지 대표적인 응집의 현미경 사진의 시간 코스를 보여준다. 세포 A에 의해 발현된 리간드에 의해 활성화된 세포 B는 배양의 1 일자에 BFP 및 CD19의 발현을 유도한다; 세포 B로부터 CD19는 차례로, 2 일자로부터 시작하여 세포 C에서 GFP의 발현을 유도한다.

키메라 Notch 게이트 키메라 항원 수용체 발현 및 암 세포에 대한 T 세포 활성화

키메라 항원 수용체 (CAR)로서 알려져 있는 인공 T 세포 수용체를 발현하도록 가공된 T 세포는 일정한 B 세포 암에 대한 치료제로서 효과적이다. 하지만, CAR T 세포 암 면역요법에서 주요 우려 사항은 부정확한 효과인데, 여기서 치료적 T 세포는 정상적인 조직을 파괴하고 심각한 부작용 및 심지어 사망을 야기한다. 이런 문제점을 경감하는 잠재적 전략은 치료적 T 세포가 종양 미세환경에서 더욱 국부화된 T 세포 반응을 제공할 때, CAR만을 발현하도록 하는 것이다. 이런 전략을 실행하기 위해, 키메라 Notch는 먼저 종양 특이적 세포 표면 항원에 결합함으로써 종양을 검출하고, 그리고 단지 종양에서만 두 번째 종양 특이적 항원에 대한 CAR의 발현을 개시하기 위해 치료적 T 세포에서 이용될 수 것으로 추론되었다. 효과적으로, 이것은 T 세포 활성에 대한 이중 항원 제어 및 종양-국부화된 반응 둘 모두를 제공한다. 주요 시험관내 데이터의 증거는 Jurkat 세포에서 제공된다.

메소텔린 scFv CAR-EGFP의 발현을 주동하는 TRE가 구비된 CD19scFv 키메라 Notch tTA를 발현하는 Jurkat T 세포는 메소텔린+ 또는 CD19/메소텔린+ K562 암 세포에 노출되었고, 그리고 CAR 발현 및 T 세포 활성화가 24 시간 시점에 사정되었다 (도면 35a). 활성화 마커, CD69의 상향조절 및 IL-2 분비는 T 세포 활성화의 지표로서 이용되었다. 키메라 Notch 가공된 T 세포는 단지 CAR만을 발현하고, 그리고 양쪽 항원을 발현하는 암 세포에 노출될 때 활성화되었다 (도면 35b-c).

도면 35a-c. 키메라 Notch 게이트 키메라 항원 수용체 발현 및 암 세포에 대한 T 세포 활성화. (a) 항-메소텔린 CAR의 항-CD19 키메라 Notch tTA 게이팅된 발현에 의한 T 세포 활성화의 2-항원 대조의 계통도. (b) 지정된 항원에 대해 양성인 K562 암 세포에 노출 후 메소텔린 scFv CAR-EGFP의 발현을 주동하는 TRE가 구비된 CD19scFV 키메라 Notch tTA를 발현하는 Jurkat T 세포의 CAR-GFP 발현 (왼쪽 패널) 및 CD69 수준 (오른쪽 패널)의 유세포분석법 분석. (c) 패널 B에서 설명된 동일한 실험으로부터 공동배양 상층액에서 IL-2 수준.

실시예 2: 감마 세크레타아제 프로테아제 활성 및 키메라 Notch 신호전달

도면 30a에서 묘사된 바와 같이 및 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 키메라 Notch 폴리펩티드 (세포외 폴리펩티드로서 항-CD19 scFv 및 세포내 도메인으로서 tTA 전사 활성인자를 포함)를 발현하고, 그리고 pTet-GFP 구조체를 포함하는 "수신자" 세포는 1 mM N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신-1,1-디메틸에틸 에스테르 (DAPT)의 존재 또는 부재에서, 표면 상에서 CD19를 발현하는 "발송자" 세포와 접촉되었다. DAPT는 감마 세크레타아제 저해제이다. 데이터는 GFP⁺ "수신자" 세포로서 표현된다. 도면 84a 및 84b에서 보여지는 바와 같이, 발송자 세포 및 DAPT의 존재에서, GFP⁺ "수신자" 세포는 대조, 처리되지 않은 수준에 있었다; DAPT의 부재에서, 발송자 세포와의 접촉은 GFP의 키메라 Notch 폴리펩티드 및 발현을 강건하게 활성화시켰다.

실시예 3: 합성 Notch 수용체는 맞춤형 세포 감지와 반응 행동을 가공하기 위한 모듈식 플랫폼이다

최소 노치 막경유 영역은 다양한 키메라 수용체를 작제하기 위해 신규한 세포외 및 세포내 도메인과 합동될 수 있다.

Notch 전달 경로의 코어는 막경유 영역 내에 있다. 이러한 설계는 막-제시된 리간드의 다양한 어레이를 검출하는 일련의 수용체를 가공하기 위한 플랫폼으로서 생각될 수 있다 (도면 85a). 세포내 측면에서, Notch 세포내 도메인 (NICD)은 Notch 신호전달 활성화에 관해 보고하기 위해, 직교 전사 인자에 의해 대체될 수 있다. 세포외 측면에서, 내인성 델타 결합 도메인은 단백질 결합 도메인 (가령, FKBP, 항-GFP 나노바디 등)에 의해 대체될 수 있고, 그리고 개열은 동계 결합 상대가 결합될 때 유도된다. 이런 이유로, 상이한 세포내 도메인과 각각 연계된 상이한 세포외 도메인을 갖는 수용체 분자의 라이브러리가 산출되었다 (도면 85b). 도면 86a에서 보여지는 바와 같이, 합성 수용체 반응은 개열-의존성 방식으로, 동계 리간드를 발현하는 발송자 세포와의 세포-세포 접촉에 의해 활성화된다. 상이한 세포외 및 세포내 도메인 조합에서 결과가 도면 87a에서 제공된다.

합성 수용체 반응의 활성화는 리간드 발현 세포의 제거 시에 가역성이고, 그리고 24 시간 시점에 전사 반응은 짧게는 1 시간 자극의 펄스에 의해 활성화될 수 있다 (도면 87b); 게다가, 리간드 양 및 수용체 활성화 사이에 용량/반응 관계가 등급 분류되는데, 내인성 Notch 신호전달의 특질을 모사한다 (도면 87c). 세포에 의해 발현된 수용체의 양은 리포터의 유도의 강도와 선형으로 상관한다 (도면 87d). 일정한 세포외 도메인의 경우에, 준최적 배경 활성 또는 불량한 유도성이 관찰되었다. 하나 또는 그 이상의 EGF-반복을 통합하도록 합성 Notch의 조절된 개열 막경유 영역을 약간 연장하는 것은 때때로, 합성 수용체 기능을 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 가령, 세포외 항-메소텔린 scFv를 갖는 synNotch 분자는 이러한 연장이 통합될 때, 활성화에 대한 향상된 역치를 전시하였다 (도면 88a).

GFP 및 CD19 검출 synNotch는 상이한 형식에서 제시된 리간드에 대하여 시험되었다 - 가용성, 세포 표면 발현된, 그리고 시스 세포 표면 발현된 (다시 말하면, 수용체와 동일한 세포 상에서) (도면 86c). 이들 synNotch는 그들의 리간드가 마주보는 표면 상에 제시될 때에만 신호를 전달하는 것으로 밝혀졌다; 동계 리간드가 용해 상태에 있거나 또는 수용체와 동일한 표면 상에 제시될 때 (시스), 어떤 활성화도 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 리간드가 synNotch 수용체를 발현하는 세포 상에 시스-제시될 때, 이들 수용체는 선천적 Notch에서 시스-저해로서 알려져 있는 특질인 평활화된 활성화 (도면 86c, 칼럼 "세포" 대 "세포+시스", 그리고 도면 88b-c)를 전시한다.

세포내 측면에서, 전사 억제뿐만 아니라 활성화가 지향될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이를 위해, 세포내 도메인으로서 Gal4DNA-결합 도메인에 융합된 전사 억제인자 도메인 (KRAB)을 갖는 수용체의 이형이 산출되었다. 이러한 synNotch를 발현하는 세포는 발송자 세포와 공동배양될 때, 리포터 유전자를 하향조절함으로써 반응한다 (도면 86b).

Cre 재조합효소 및 마스터 전사 인자, 예를 들면, MyoD 및 Snail을 비롯한 다른 세포내 도메인 역시 syn-Notch 내로 삽입되었다. 이들 중에서 일부가 조절된 활성을 보여주긴 하지만, 일반적으로 이들 활성은 아마도 synNotch 수용체 출력 도메인이 화학양론적으로 기능하고 증폭을 보여주지 않기 때문에, 매우 낮다. 따라서 이러한 수용체 시스템은 고도로 증폭된 출력을 위해 더욱 우수하게 작동할 수 있다.

합성 Notch 수용체는 다양한 일차 세포: 뉴런 & 면역 세포에서 작동한다.

SynNotch 세포주는 수용체 활성화 시에 견실한 활성화를 보여주었다. 이러한 결과가 세포주 특정인지를 시험하기 위해, 일련의 확립 세포주: 상피 MDCK 세포, L929 및 C3H 생쥐 섬유모세포 세포주, HEK293 인간 상피 세포주, Jurkat T 세포를 가공함으로써 synNotch 수신자 세포주가 생산되었다. 이들 모두 synNotch 수용체 활성화 시에 리포터 유전자 활성화의 견실한 유도를 변함없이 보여주었다 (도면 89b). 중요하게는, 일차 세포는 또한, synNotch 수용체로 가공될 수 있고, 그리고 이러한 방식으로 이들은 신규한 리간드 자극에 반응하게 된다. 도면 89a (및 도면 90)에서, synNotch 및 리포터를 발현하는 일차 해마 뉴런은 리간드-발현 발송자 세포와의 접촉에 의해 GFP 리포터 카세트를 발현하도록 유도될 수 있는 것으로 나타난다.

합성 Notch 수용체는 다양한 세포 행동을 공간적으로 제어된 방식으로 조절할 수 있다.

SynNotch 수신자 세포는 이웃 세포가 리간드를 발현하는 지를 검출할 수 있다. 상피 세포 층 내에 배치된 synNotch 수신자 세포가 리포터 유전자를 발현하도록 공간적으로 유도될 수 있는 지의 여부가 시험되었다. 리간드-발현 발송자 세포가 수신자 세포의 층에서 희소하게 도말될 때, 발송자 세포에 직접적으로 접촉하는 수신자 세포만 녹색 발송자 세포 주변에 청색 세포 (활성화된 수신자)의 고리에 의해 가시화되는 바와 같이, 합성 Notch 수용체를 활성화시키고, 반면 더욱 멀리 떨어진 수신자 세포는 비활성 상태로 머무른다 (도면 91a).

이러한 합성 세포-세포 신호전달이 세포 운명을 공간적으로 제어된 방식으로 조절하는데 이용될 수 있는 지의 여부가 이후 시험되었다. 구체적으로, syn-Notch 수용체가 세포 운명 마스터 조절인자, 예를 들면, MyoD, 근육 세포 운명의 제어자의 발현을 유도하는데 이용될 수 있는 지의 여부가 시험되었다. 도면 89b에서 보여지는 바와 같이, synNotch 섬유모세포의 전환분화는 리간드-발현 세포의 인근에서만 유도될 수 있다. 이러한 실험에서, CD19-발현 세포가 먼저 국부 도말되고, 그리고 이후, 항-CD19-synNotch 섬유모세포가 균일하게 덧씌워진다. synNotch 수용체가 이의 리간드와 맞물리는 경우에, 수신자 섬유모세포는 myoD, 근육발생을 위한 원형적 마스터 전사 인자를 상향조절하는데, 이것은 단지 국부적으로만 근관세포의 전환분화 및 형성을 야기한다 (수신자 세포에서 myoD-GFP로부터 녹색 통로는 발송자 세포에서 BFP로부터 청색 통로와 공간적으로 중첩된다, 도면 89b; 시간-코스에 대해 도면 92a를 참조한다).

다른 실례에서, synNotch가 상피에서 중간엽으로의 이행을 제어하는데 이용될 수 있다는 것이 증명되었다. 항-GFP (또는 항-CD19)는 EMT 마스터 조절 유전자 snail의 발현을 제어하는데 이용되었다. 이들 상피 세포에서, 상피에서 중간엽으로의 이행은 이들을 리간드-GFP 발현 세포에 노출시킴으로써 유도되지만, 비-리간드 발현 세포에서는 그렇지 않았다 (도면 91c 및 92b).

synNotch는 다세포 어셈블리의 공간적 자가-조직화를 제어하는데 이용될 수 있는 것으로 또한 나타났다. 이들 실험을 위해, 가공된 섬유모세포는 낮은 접착성 평판에서 회전타원체로서 배양되었는데, 이러한 셋업에서는 상대적 세포-세포 부착 강도가 기하학을 지배한다. 항-CD19 synNotch를 발현하는 수신자 세포는 CD19를 발현하는 발송자 세포에 의한 자극 시에 E-카드헤린을 유도한다. 실험의 시작 시점에서, CD19-발송자 및 항-CD19-synNotch 수신자 세포는 무작위로 혼합된다 (도면 91d, 왼쪽). 수신자 세포에서 synNotch의 하류에서 E-카드헤린 발현의 유도는 그들의 부착 잠재력을 증가시킨다. 활성화된 수신자 세포는 서로 강하게 부착되고 회전타원체의 내부로 이동하여, 발송자 세포가 외부 층에 남게 된다 (도면 91d). 대조적으로, 발송자 및 수신자 세포의 이러한 인사이드-아웃 비대칭은 형광 단백질이 E-카드헤린 대신에 synNotch 활성화에 대한 응답으로 활성화될 때에만, 자가-조직화하는 것으로 밝혀졌다 (도면 92c).

합성 Notch 수용체는 서로 및 선천적 notch에 직교이다.

복수 synNotch 수용체가 혼선 없이 동일한 세포 내에서 기능할 수 있는 지의 여부가 탐구되었다. 직교 기능은 세포가 복수 입력의 존재 또는 부재에 따라 상이한 출력을 정교하게 하도록 허용할 것이다. synNotch 수용체는 상이한 수용체 내에 세포내 전사 조절인자가 상이하면, 신호전달의 기전 - 혼선을 유발할 수 있었던 공통의 중간체 (가령, 활성화된 키나아제)가 없음으로 인해, 서로에 직교로 기능할 수도 있는 것으로 가정되었다. synNotch 및 내인성 Notch 신호전달 사이에 임의의 혼선이 있는 지의 여부가 먼저 시험되었다. 이것을 증명하기 위해, 세포는 항-CD19-synNotch뿐만 아니라 상이한 형광 단백질을 갖는 전장-Notch에 관해 보고하도록 가공되었다. 이들 세포가 델타 단독으로 자극될 때, 전장-Notch 반응만 활성화되었다; 동일한 사항이 CD19에 대한 synNotch 반응에 적용된다: 이들 두 경로는 독립된 활성화를 보여준다 (도면 93a).

2개의 상이한 synNotch 수용체가 동일한 세포 내에서 독립적으로 기능할 수 있는 지의 여부가 이후 시험되었다. 도면 93b에서, 2가지 독립된 synNotch 수용체, 항-CD19 수용체 및 항-GFP 수용체에 대한 단일 리간드뿐만 아니라 합동된 리간드로 자극의 결과가 보고되었다. 각각은 상이한 세포내 전사 활성화 도메인 (각각, Gal4 및 tTA)에 연결되고, 이것은 차례로, 상이한 리포터 형광 단백질을 주동한다. CD19에 의해 활성화될 때, 단지 항-CD19-synNotch 반응만 활성화된다; 반대로, GFP-발현 발송자 세포에 의해 활성화될 때, 단지 항-GFP-synNotch 반응만 활성화된다. 중요하게는, 세포가 CD19 및 GFP 둘 모두에 의해 자극될 때, 이들 2가지 반응이 함께 활성화된다 (도면 94b). 따라서 복수의 synNotch 수용체가 동일한 세포 내에서 격리된 신호 전달 경로로서 작동할 수 있다.

복수 synNotch 수용체는 복수 입력을 조합적으로 통합하는 세포를 가공하는데 이용될 수 있다.

복수 synNotch 수용체는 다양한 반응을 산출하기 위해 동일한 세포에서 이용될 수 있다. 조합 환경적 신호를 통합하고 일정한 규준이 부합될 때에만 반응하는 세포의 가공이 설계되었다. 특히, 환경 상에서 2개의 상이한 항원이 존재할 때에만 반응하고, 각각 단독에는 반응하지 않을 세포의 산출이 집중되었다. 이것을 달성하기 위해, 항-CD19 및 항-GFP 세포외 도메인을 갖는 이중 synNotch 발현 세포 (각 synNotch의 활성화는 분할-Gal4 단백질의 절반을 활성화시킨다)가 가공되었다. 이러한 방식으로, 이들 2가지 입력이 수신자 세포에 단독으로 제시될 때, 어떤 활성화도 가시화되지 않는다 (도면 93c, 칼럼 1-3). 2개의 수용체가 활성화될 때에만 분할 분자가 재구성되고, 그리고 수신자 세포에서 반응이 유도된다 (도면 93c, 마지막 칼럼).

복수 synNotch 수용체로 세포-세포 신호전달의 연쇄 반응을 가공.

세포-세포 통신을 위한 복수 synNotch 수용체로, 세포-세포 통신의 다세포 신호전달 시스템이 설계되었다. 특히, 상피 세포 층 내에서 자가-조직화된 다중층 공간적 패턴화의 유도가 집중되었다. 이를 위해, 수신자 세포는 2개의 synNotch를 갖는데, 이들 중에서 하나는 다른 하나에 대한 리간드를 유도한다. 이러한 특정 실례에서, 항-GFP-synNotch는 CD19 리간드 발현 (및 리포터 단백질 mCherry)을 유도하고; 그리고 항-CD19-synNotch는 리포터 단백질 tagBFP를 유도한다. 이후, 층의 연쇄 반응의 유도를 시작하기 위해, GFP 발송자 세포가 이중 synNotch 수신자 세포의 단층에서 희소하게 파종된다. 이러한 회로는 발송자 세포 섬 주변에 활성화의 2개 동심성 고리의 형성을 가능하게 하였다: 첫 번째 이웃은 항-GFP-synNotch의 활성화 후 적색이 되고, 그리고 이들은 CD19 발송자가 되었다 (도면 94a, 1 일자). 발송자 세포로부터 1 직경 떨어진 세포는 첫 번째 이웃에 의해 발현된 CD19 리간드에 반응할 수 있고, 도면 94a, 2 일자의 이중-고리 패턴이 산출된다. 이러한 방식으로, 2개의 상이한 세포 유형이 수신자 세포의 균일한 개체군으로부터 공간적으로 제어된 방식으로 생산된다 (도면 94c). 따라서 복수 syn-Notch 수용체는 자연 발달 과정에서 관찰되는 것과 유사하게, 더욱 복잡한 다단계 패턴화 반응을 가공하는데 이용될 수 있다 (도면 94b).

도면 85. synNotch 수용체의 모듈식 형상

(도면 85a) 야생형 Notch로부터 시작하여 Notch 리포터로, synNotch 수용체로의 연속적인 가공으로서 synNotch 수용체 시스템의 개념적 설계. 후자는 노치 리포터의 세포내 직교 전사 인자의 유연성을 활용하고, 그리고 세포외 도메인을 대체함으로써 신규한 입력에 반응하는 플랫폼을 구축한다.

(도면 85b) 플랫폼의 모듈성: Notch 도메인 구조로부터 추출된 세포외, 막경유 및 세포내 도메인은 외측에서 다양한 도메인 (항체 기초된, 또는 펩티드 태그가 도시된다) 및 내측에서 다양한 작동체 (전사 억제인자뿐만 아니라, 상이한 DNA-결합 도메인을 갖는 전사 활성인자가 도시된다)와 교환될 수 있다.

도면 87은 도면 85에 관련된 데이터를 제공한다.

(도면 87a) 상이한 세포외 및 세포내 도메인을 갖는 일련의 synNotch 수신자 세포는 동계 리간드로 자극 시에 활성화를 보여준다. 세포는 생쥐 섬유모세포 라인 L929이고, 그리고 도면에서 지시된 바와 같이, 평판-결합된 자극에 의해 또는 리간드를 발현하는 발송자 세포로 자극된다.

(도면 87b) 발송자 세포 첨가 시에 수신자 세포의 활성화의 시간 코스 (왼쪽); 완전한 활성화가 도달된 후에, 발송자 세포의 제거는 수신자 세포의 비활성화를 유도한다 (오른쪽).

(도면 87c) 상이한 양의 평판-결합된 리간드로 수신자 세포의 활성화의 용량 반응. Myc-태그 synNotch (왼쪽) 및 항-GFP synNotch (오른쪽) 수신자 세포는 증가하는 양의 리간드에 노출된다; 24 시간 시점에 리포터 통합된 강도가 그래프에서 도시된다.

(도면 87d) SynNotch 발현 수준은 리포터 활성화의 강도에 선형으로 영향을 준다. myc-태그 세포외 도메인, 유도 GFP를 리포터로서 갖는 synNotch를 발현하는 섬유모세포의 n=24 클론 개체군에 대한 수용체 발현 수준에 대하여 리포터 강도가 그래프에 도시된다. 청색 반점은 자극되지 않은 세포로부터 데이터이고, 녹색 반점은 자극 후 기록된 데이터이다. 수용체 발현 및 GFP 강도 사이에 양성 상관이 감지가능하다.

도면 86. SynNotch 수용체는 접촉-의존성 전사 조절을 프로그래밍하는데 이용될 수 있다.

(도면 86a-b). 합성 노치 수용체는 내인성 질환 항원을 검출하고, 그리고 리포터 유전자의 전사를 증가 또는 감소시키는데 이용될 수 있다.

(도면 86a) 항-CD19/tTA synNotch를 갖는 생쥐 섬유모세포 (L929 라인)는 델타, 또는 CD19, 또는 감마-세크레타아제 저해제 DAPT의 존재에서 CD19를 발현하는 발송자 세포와 함께 배양된다. 수신자 세포에서 결과의 GFP 강도의 FACS 플롯이 도시된다.

(도면 86b) 전사 억제인자 세포내 도메인을 갖는 항-CD19 synNotch를 갖는 생쥐 섬유모세포 (L929 라인)는 발송자 세포와 공동배양되거나 또는 이들 없이 배양된다. 수신자 세포는 SV40/UAS 합동된 프로모터의 하류에서 GFP를 구조성으로 발현한다. 막에 CD19가 있거나 또는 없는 발송자 세포의 존재에서, 수신자 세포 GFP 강도의 FACS 플롯이 도시된다.

(도면 86c) 상이한 형식에서 리간드로 synNotch 자극을 발현하는 생쥐 섬유모세포 (L929) 라인. 왼쪽: 항-GFP/tTA synNotch 수신자 세포는 가용성, 또는 발송자-세포 제시된, 또는 수신자 세포 상에 시스-제시된 GFP로 자극된다. 막대 그래프는 다양한 리간드 제시 선택의 존재에서 리포터 활성화를 보여준다: 활성화는 리간드가 마주보는 표면 상에 존재할 때에만 발생한다. 오른쪽: myc-태깅된 항-CD19/tTA synNotch 수신자 세포는 상이한 형식에서 리간드, 항-myc 가용성 항체, 또는 발송자 세포로부터 CD19 또는 동일한 수신자 세포에서 CD19 (시스)로 자극된다. 막대 그래프는 리포터의 활성화를 보여준다: 활성화는 리간드가 마주보는 표면 상에 제시될 때에만 유도된다.

도면 88. 도면 86에 관련됨.

(도면 88a) 세포외 도메인에 EGF-반복의 부가는 항-메소텔린 synNotch에서 기저 활성화를 감소시킨다. 항-메소텔린 ScFv 앞에 EGF 반복이 있거나 또는 없는 항-메소텔린 synNotch 수용체가 생쥐 L929 섬유모세포에서 도입된다. 이들 수용체의 활성화는 GFP 리포터를 활성화시킨다. 도시된 데이터는 2가지 시나리오에서 FACS 플롯이다: 위쪽, EGF 반복 없이, 리포터의 유도가 심지어 리간드의 부재에서도 구조성이다; 아래쪽, EGF 반복으로, 기저 리포터 활성화가 전폐되고 (오프라인), 그리고 이러한 유도가 GFP 강도를 온 상태로 가져온다.

(도면 88b) 펄싱된 활성화. 짧은 양의 시간 동안 항-GFP synNotch 수신자 세포를 자극하기 위해, 수신자 세포가 24 시간 동안 평판 상에 파종되고, 그리고 이후, 현탁 발송자 세포 (막경유 GFP를 발현하는 K562s)와 함께 1 시간 또는 4 시간 동안 배양되고; 그 후에, 현탁 발송자 세포는 씻겨 내려가고, 그리고 발송자 세포의 첫 번째 첨가로부터 t=24h에 수신자 세포에서 형광이 FACS에 의해 계측된다. 막대 그래프는 각 조건에 대한 최소한 10,000개 세포의 통합된 형광 반응이다. 데이터는 평균 및 표준 오차이다. 데이터는 항-GFP LaG17 및 LaG16/2 세포외 도메인에 대한 것이다.

(도면 88c) 주요 도면 86c의 시스-저해 결과에 대한 FACS 플롯. 플롯은 각 조건에 대한 최소한 10,000개 세포의 리포터 형광에 대하여 세포의 숫자이다. 발송자 세포는 가공된 K562s이고, 그리고 수신자 세포는 가공된 L929 생쥐 섬유모세포이다. 왼쪽에, 항-GFP synNotch에 대한 데이터가 도시된다; 오른쪽에, 항-CD19 synNotch에 대한 데이터가 도시된다.

도면 89. SynNotch 수용체는 뉴런 및 림프구를 비롯한 다양한 세포 유형에서 기능한다.

(도면 89a) 해마 뉴런. 일차 해마 뉴런은 E18 쥐 배아로부터 해리되고, 그리고 항-CD19 synNotch 및 연계된 GFP 리포터를 발현하도록 핵내 도입된다. 뉴런은 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅된 유리-바닥 35mm 배양 접시 상에 도말된다. 뉴런 도말 후 2 시간에, 발송자 세포 (K562s)가 배양액에 첨가되어 공동배양 시스템을 형성한다. 이미지는 도말 후 4 일자에 생존 세포로부터 촬영된다. 오른쪽에, 보통의 K562 세포 (위쪽 패널) 또는 CD19+ K562 발송자 세포 (아래쪽 패널)와 공동배양되는 뉴런에 대한 대표적인 이미지가 도시된다. 리간드 제시 발송자 세포와 공동배양되는 뉴런은 대조 세포에서보다 훨씬 높은 GFP 발현을 갖는다.

(도면 89b) T 세포주. Jurkat T 세포주는 항-CD19/tTA synNotch 수용체를 안정되게 발현하도록 가공되는데, 이것은 리포터로서 GFP를 주동한다. 오른쪽에 데이터는 t=24h에서 CD19+ 또는 CD19- 발송자 세포 (K562s)로 자극 시에 Jurkat 세포의 형광을 보여준다. T 세포는 이들이 synNotch 동계 리간드를 만날 때에만 활성화된다.

도면 90. 도면 89에 관련됨.

(도면 90a) 실험의 입증 및 뉴런에서 발현되는 구조체. 일차 해마 뉴런은 E18 쥐 배아로부터 연결해제되고, 그리고 cNotch 수용체뿐만 아니라 TetO-GFP 리포터를 발현하는 구조체로 핵내 도입된다. 뉴런은 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅된 유리-바닥 35mm 배양 접시 상에 도말된다. 뉴런 도말 후 2 시간에, K562 발송자 세포가 배양액에 첨가되어 공동배양 시스템을 형성한다. 이미지는 도말 후 4 일자에 생존 세포로부터 촬영된다.

(도면 90b) 각 처리에 대한 100개 뉴런에서 GFP 형광 강도의 분포. GFP 강도는 형광 공초점 이미지로부터 계산된다.

(도면 90c) 각 처리에 대한 약 100개 뉴런으로부터 평균 GFP 형광 강도의 정량.

도면 91. SynNotch 수용체는 다양한 세포 행동의 공간적 제어를 산출한다

(도면 91a) 상피 단층에서 경계 검출. 상피 세포 (MDCKs)는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 막경유 도메인에 연결된 세포외 GFP를 발현하고; 수신자 세포는 UAS→BFP 리포터 구조체와 함께, 세포외 도메인으로서 LaG17 항-GFP 나노바디 및 세포내 도메인으로서 Gal4-VP64를 갖는 항-GFP synNotch를 발현한다. 발송자 및 수신자는 1:50 비율에서 함께 혼합되고, 그리고 합류성 단층의 도말 후 48 시간에 공초점 이미지가 촬영된다. 높은 배율 및 낮은 배율의 대표적인 사진이 거리에 걸쳐서 형광의 강도의 대표적인 라인과 함께 도시된다. 녹색 발송자 세포와 접촉하는 수신자 세포만 청색 리포터를 켜고, 발송자 세포 주변에 고리를 형성한다.

(도면 91b) 섬유모세포에서 근육발생 마스터 조절인자 (myoD)의 synNotch 활성화는 전환분화를 공간적으로 제어된 방식으로 유도한다. C3H 생쥐 섬유모세포는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 tagBFP 마커와 함께, 막경유 도메인에 연결된 세포외 CD19를 발현하고; 수신자 세포는 TRE→myoD 리포터 구조체 및 구조성 mCherry 마커와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-CD19 synNotch를 발현한다. 발송자 섬유모세포가 먼저 평판의 제한된 영역에서 도말된다; 1 시간 후, 발송자 세포가 평판에 부착되고, 그리고 수신자 세포가 유리 평판 전체를 덮기 위해 도말된다. 도시된 이미지는 공동배양 후 48 시간 시점이다 (시간 코스에 대해 도면 92를 참조한다). GFP 통로는 발송자 세포를 표지하는 청색 통로와 중첩되는 영역에서 myoD-GFP의 유도를 보여준다. 녹색 통로에 대한 더욱 높은 배율의 필드가 오른쪽에 도시된다.

(도면 91c) synNotch는 배양된 상피 세포에서 상피의 중간엽으로의 이행을 유도할 수 있다. 상피 세포 (MDCKs)는 아래와 같이 가공된다: 수신자 세포는 TRE→Snail-ires-BFP 작동체 구조체와 함께, 세포외 도메인으로서 LaG17 항-GFP 나노바디 및 세포내 도메인으로서 tTA를 갖는 항-GFP synNotch를 발현한다. 발송자 세포는 GFP-발현 K562s이다. 발송자 세포의 첨가 전후에 상피 세포의 대표적인 명시야 현미경 이미지가 도시된다. 정량에 대해 도면 92를 참조한다.

(도면 91d) 섬유모세포에서 부착의 synNotch 유도는 섬유모세포 회전타원체 배양액에서 대칭-파괴 재배열을 지배할 수 있다. L929 생쥐 섬유모세포는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 tagBFP 마커와 함께, 막경유 도메인에 연결된 세포외 CD19를 발현하고; 수신자 세포는 TRE→E-카드헤린-GFP 작동체 구조체 및 구조성 적색 마커 (mCherry)와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-CD19 synNotch를 발현한다. 현미경으로 수집된 대로의 형광 신호는 대표적인 회전타원체에 대해 t=0 (왼쪽) 및 t=20h (오른쪽)에서 도시된다. t=0에서 세포는 혼합된다; t=20h에서 수신자 세포는 E-카드헤린 (녹색 통로)을 유도하고 회전타원체의 내부 층 (적색)에서 정렬하고, 반면 발송자 세포 (청색)는 외측에 있다.

도면 92. 도면 91에 관련됨

(도면 92a; 도면 91b에 비하여) C3H 생쥐 섬유모세포는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 tagBFP 마커와 함께, 막경유 도메인에 연결된 세포외 CD19를 발현하고; 수신자 세포는 TRE→myoD 작동체 구조체 및 구조성 mCherry 마커와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-CD19 synNotch를 발현한다. 발송자 섬유모세포가 먼저 평판의 제한된 영역에서 도말된다; 1 시간 후, 발송자 세포가 평판에 부착되고, 그리고 수신자 세포가 유리 평판 전체를 덮기 위해 도말된다. 이미지는 오른쪽에 10 시간 마다 촬영된다.

아래에, 발송자와 수신자 세포의 공동배양 (위쪽) 또는 수신자 세포 단독 (아래쪽)의 실험의 대표적인 필드가 도시된다.

(도면 92b; 도면 91c에 비하여) 상피 세포 (MDCKs)는 아래와 같이 가공된다: 수신자 세포는 TRE→Snail-ires-BFP 작동체 구조체와 함께, 세포외 도메인으로서 LaG17 항-GFP 나노바디 및 세포내 도메인으로 tTA를 갖는 항-GFP synNotch를 발현한다. 발송자 세포는 GFP-발현 K562s이다. 수신자 세포 BFP 신호의 FACS 플롯은 발송자 세포 없음, 관련 없는 리간드를 발현하는 발송자 세포, 그리고 동계 리간드 GFP를 발현하는 발송자 세포의 존재에서 도시된다. 형광의 정량은 막대 그래프 상에 제공된다.

오른쪽 끝에서, 막대 그래프는 수신자 세포에서, 또는 다양한 조건에서 부모 세포의 E-카드헤린 발현 수준을 보고한다. E-카드헤린 수준은 동계 항원 GFP-발현 발송자 세포의 존재에서만 하락한다.

(도면 92c; 도면 91d에 비하여)

위쪽 패널: L929 생쥐 섬유모세포는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 tagBFP 마커와 함께, 막경유 도메인에 연결된 세포외 CD19를 발현하고; 수신자 세포는 TRE→E-카드헤린-GFP 작동체 구조체 및 구조성 적색 마커 (mCherry)와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-CD19 synNotch를 발현한다. 현미경으로 수집된 대로의 형광 신호는 발송자 및 수신자 세포를 갖는 대표적인 회전타원체에 대해, 그리고 지시된 바와 같이 수신자 세포만을 갖는 대표적인 회전타원체에 대해 t=20h에서 도시된다. 녹색 형광은 발송자 세포의 존재에서만 수신자 세포에서 유도된다 (E-cad 통로, 오른쪽 끝).

아래쪽 패널: L929 생쥐 섬유모세포는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 막경유 도메인에 연결된 세포외 GFP를 발현한다; 수신자 세포는 TRE→mCherry 리포터 구조체 및 구조성 청색 마커 (tagBFP)와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-GFP synNotch를 발현한다. 공초점 현미경으로 수집된 대로의 형광 신호는 발송자 + 수신자 세포를 갖는 대표적인 회전타원체에 대해, 그리고 수신자 세포만을 갖는 대표적인 회전타원체에 대해 t=0 t=20h에서 도시된다. 적색 형광은 발송자 세포의 존재에서만 수신자 세포에서 유도된다 (mCherry 리포터 통로, 오른쪽 끝). 발송자 및 수신자 세포의 어떤 재배열도 감지되지 않는다.

도면 93. SynNotch 수용체는 서로에 직교이고 조합 조절에 이용될 수 있다

(도면 93a) synNotch 및 야생형 Notch는 직교 신호전달 경로를 활성화시킨다. L929 생쥐 섬유모세포 수신자는 (i) tTA 세포내 도메인 및 TRE→GFP 리포터를 갖는 야생형 Notch 수용체, 그리고 (ii) 항-CD19 세포외 도메인 및 Gal4-VP64 세포내 도메인 및 UAS→tagBFP 리포터를 갖는 synNotch 수용체를 발현하도록 가공된다. 그래프는 오른쪽에, 상이한 조건에서 BFP 및 GFP 리포터에 대한 수신자 세포 형광 신호를 보고한다: 흑색 반점은 처리되지 않은 세포이고, 청색 반점은 CD19 발현 발송자로 자극된 수신자 세포이고, 오렌지색 반점은 델타 발송자로 자극된 수신자 세포이고, 그리고 적색 반점은 CD19 및 델타 둘 모두를 발현하는 발송자 세포로 자극된 수신자 세포이다. 발송자 세포는 생쥐 L929 섬유모세포이다.

(도면 93b) 복수 synNotch는 서로 직교이다. L929 생쥐 섬유모세포 수신자는 (i) tTA 세포내 도메인 및 TRE→BFP 리포터를 갖는 항-CD19 synNotch 수용체; 그리고 또한, (ii) 항-CD19 세포외 도메인 및 Gal4-VP64 세포내 도메인 및 UAS→mCherry 리포터를 갖는 synNotch 수용체를 발현하도록 가공된다. 그래프는 오른쪽에, 상이한 조건에서 BFP 및 GFP 리포터에 대한 수신자 세포 형광 신호를 보고한다: 흑색 반점은 처리되지 않은 세포이고, 적색 반점은 CD19 발현 발송자로 자극된 수신자 세포이고, 녹색 반점은 GFP 발송자로 자극된 수신자 세포이고, 그리고 청색 반점은 GFP 및 CD19 둘 모두를 발현하는 발송자 세포로 자극된 수신자 세포이다. 발송자 세포는 K562s이다.

(도면 93c) 2개의 synNotch로 가공된 세포는 양쪽 입력이 존재할 때에만 반응할 수 있다. L929 생쥐 섬유모세포 수신자는 (i) tTA 세포내 도메인 및 류신 지퍼 도메인에 융합된 Gal4의 DNA-결합 도메인 (DBD)의 발현을 주동하는 TRE 프로모터를 갖는 항-CD19 synNotch 수용체, 그리고 (ii) 항-GFP 세포외 도메인 및 세포내 도메인으로서 상보성 류신 지퍼에 융합된 VP64 전사 활성화 도메인을 갖는 synNotch 수용체, 그리고 (iii) 적색 형광 단백질을 주동하는 Gal4-반응성 프로모터 (mCherry)를 발현하도록 가공된다. 그래프는 오른쪽에, 2가지 리간드를 단독으로 (GFP 또는 CD19), 또는 양쪽 리간드를 함께 발현하는 상이한 발송자 세포 (K562s)와의 공동배양 동안 수신자 세포로부터 수집된 정규화된 mCherry 형광을 보여준다. 활성화는 양쪽 입력의 존재에서만 발생한다.

도면 94. 복수 synNotch 수용체는 다중층 자가-조직화 상피 패턴을 산출하는데 이용될 수 있다.

상피 세포 (MDCKs)는 아래와 같이 가공된다: 발송자 세포는 막경유 도메인에 연결된 세포외 GFP를 발현한다; 수신자 세포는 (i) TRE→CD19-mCherry 작동체 카세트와 함께, tTA 세포내 도메인을 갖는 항-GFP synNotch; (ii) Gal4-VP64 세포내 도메인 및 UAS→tagBFP 리포터를 갖는 항-CD19 수용체를 발현한다.

(도면 94a) 10 시간 (시작) 34 시간 (1 일자) 및 58 시간 (2 일자) 동안 1:50 비율에서 공동배양된 발송자 세포 및 수신자 세포의 상피 층에 대한 대표적인 이미지가 도시된다.

(도면 94b) 2 일자에 공동배양의 상이한 시계의 복수 이미지.

(도면 94c) 2 일자에 발송자 세포 주변의 패턴에 대해 형광 이미지로부터 계산될 때 형광 신호의 대표적인 정량.

도면 95. synNotch 수용체의 모듈성은 포유류 세포의 감지/반응 가공을 확대한다.

(도면 95a) synNotch 수용체의 활성화의 추정 구조적 기전. LNR 도메인은 결합되지 않은 입체형태에서 프로테아제 개열 부위를 가린다 (왼쪽). 리간드가 수용체를 포용할 때, 상기 부위는 노출되고, 그리고 이러한 사건은 전달이 시작되도록 한다 (오른쪽).

(도면 95b) 초기 후생동물로부터 LNR-내포 분자의 정렬.

(도면 95c) synNotch 수용체 플랫폼의 모듈성은 사용자가 세포가 현재 반응하는 세포외 신호뿐만 아니라 수용체 활성화의 하류에서 유도되는 세포 반응을 명시하도록 허용한다.

실시예 4: 합성 Notch 수용체를 이용한 맞춤형 치료적 반응 프로그램으로 T 세포를 가공

재료와 방법

다음의 재료와 방법이 달리 지시되지 않으면, 실시예 4에서 설명된 결과에 적용된다.

synNotch 수용체 및 반응 요소 구조체 설계

synNotch 수용체는 CD19 scFv, LaG17 (더욱 낮은 친화성), 또는 LaG16_2 (높은 친화성) GFP 나노바디를 생쥐 Notch1 (NM_008714) 최소 조절 영역 (Ile1427 내지 Arg1752) 및 Gal4VP64에 융합함으로써 만들어졌다. 모든 synNotch 수용체는 막 표적화를 위한 n-말단 CD8α 신호 펩티드 (MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열 번호:129)), 그리고 α-myc A647 (세포-신호전달 #2233)로 표면 발현의 쉬운 결정을 위한 myc-태그 (EQKLISEEDL (서열 번호:75))를 내포한다. 이들 수용체는 모든 일차 T 세포 실험을 위해 PGK 프로모터를 내포하는 변형된 pHR'SIN:CSW 벡터 내로 클로닝되었다. pHR'SIN:CSW 벡터는 또한, 반응 요소 플라스미드를 만들기 위해 변형되었다. Gal4 DNA 결합 도메인 표적 서열 (GGAGCACTGTCCTCCGAACG (서열 번호:130))의 5개 사본이 최소 CMV 프로모터의 5'에 클로닝되었다. 인간 IL-2, IL-10, Tbet, 또는 TRAIL 코돈 최적화된 mRNA 서열은 Gal4 유도성 프로모터의 하류 및 IRES mCherry 리포터의 5'에서 MCS 내로 클로닝되었다. 모든 구조체는 인-융합 클로닝 (Clontech #ST0345))을 통해 클로닝되었다.

일차 인간 T 세포 단리 및 배양

일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 성분채집술 후 음성 선별 (StemCell Technologies #15062 & 15063)에 의해 익명 공여 혈액으로부터 단리되었다. 혈액은 University Institutional Review Board에 의해 승인된 바와 같이, Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA)으로부터 획득되었다. T 세포는 20% 인간 AB 혈청 (Valley Biomedical Inc., #HP1022) 및 10% DMSO으로 보충된 RPMI-1640 (UCSF 세포 배양 코어)에서 냉동보존되었다. 해동한 후, T 세포는 실시예 4의 모든 실험을 위해 30 단위/mL IL-2 (NCI BRB Preclinical Repository)로 보충된, X-VIVO 15 (Lonza #04-418Q), 5% 인간 AB 혈청 및 10 mM 중화된 N-아세틸 L-시스테인 (Sigma-Aldrich #A9165)으로 구성되는 인간 T 세포 배지에서 배양되었다.

인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입

범친화성 VSV-G 가성유형 렌티바이러스가 Fugene HD (Promega #E2312)를 이용하여 pHR'SIN:CSW 도입유전자 발현 벡터 및 바이러스 포장 플라스미드 pCMVdR8.91과 pMD2.G로 Lenti-X 293T 세포 (Clonetech #11131D)의 형질감염을 통해 생산되었다. 일차 T 세포는 동일자에 해동되고, 그리고 24 시간 배양 후, 1:3 세포:비드 비율에서 Dynabeads 인간 T-활성인자 CD3/CD28 (Life Technologies #11131D)로 자극되었다. 48 시간 시점에, 바이러스 상층액은 수확되고, 그리고 일차 T 세포는 24 시간 동안 상기 바이러스에 노출되었다. T 세포 자극 후 4 일자에, Dynabeads는 제거되고, 그리고 T 세포는 9 일자까지 확대되었는데, 이때 이들은 안정되고 검정에서 이용될 수 있었다. T 세포는 FACs ARIA II로 검정을 위해 분류되었다.

암 세포주

이용된 암 세포주는 K562 골수성 백혈병 세포 (ATCC #CCL-243), Daudi B 세포 림프모구 (ATCC #CCL-213), 그리고 HCT115 결장암 세포 (ATCC #CCL-247)이었다. K562s는 Daudi 종양과 동등한 수준에서 인간 CD19를 안정되게 발현하도록 렌티바이러스에 의해 형질도입되었다. CD19 수준은 이들 세포를 α-CD19 APC (Biolegend #302212)로 염색함으로써 결정되었다. K562s는 또한, 표면 GFP (PDGF 막경유 도메인에 융합된 GFP)를 안정되게 발현하도록 형질도입되었다. 모든 세포주는 도입유전자의 발현에 대해 분류되었다.

synNotch T 세포의 시험관내 자극

모든 시험관내 synNotch T 세포 자극의 경우, 2x10⁵T 세포가 1:1 비율에서 발송자 세포와 공동배양되었다. T 세포 및 발송자 세포를 둥근 바닥 96-웰 조직 배양 평판에서 혼합한 후, 이들 세포는 세포의 상호작용을 강제하기 위해 400xg에서 1 분 동안 원심분리되고, 그리고 배양액은 BD LSR II를 이용한 유세포분석법을 통해 리포터 발현 또는 맞춤 유전자 유도의 발현에 대해 24 시간 시점에 분석되었다. 모든 유세포분석법 분석은 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar)에서 수행되었다.

Luminex MAGPIX 사이토킨 정량

α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 인간 IL-2 또는 IL-10 발현을 제어하는 5x Gal4 반응 요소를 발현하는 일차 CD4+ T 세포는 K562 골수성 백혈병 세포 (CD19- 또는 CD19+)로 앞서 설명된 바와 같이 자극되었다. 참고로서, α-CD19 4-1BBζ CAR을 발현하는 CD4+ T 세포가 1:3 비율에서 α-CD3/CD28 Dynabeads로 자극된 형질도입되지 않은 T 세포와 함께 자극되었다. 상층액은 24 시간 시점에 수집되고, 그리고 제조업체의 프로토콜에 따라서, Luminex MAGPIX (Luminex Corp.) 인간 사이토킨 Magentic 25-plex 패널 (Invitrogen ref#LHC0009M)로 분석되었다. 모든 사이토킨 수준은 xPONENT 소프트웨어 (Luminex Corp.)를 이용한 표준 곡선에 근거하여 계산되었다.

IL-2 세포내 사이토킨 염색 및 CD69 염색

IL-2 생산을 제어하는 synNotch T 세포는 이들이 IL-2를 기저로 생산하는 지를 결정하기 위해 세포내 사이토킨 염색 (ICS)에 의해 검정되었다. synNotch T 세포 및 형질도입되지 않은 T 세포 대조는 GolgiPlug (BD Biosciences #555029)의 존재에서 6 시간 동안 배양되었다. 이들 T 세포는 이후, BD Biosciences ICS 키트 (#555028)를 이용하여 α-IL-2 FITC (BD #340448)로 염색되었다. IL-2의 수준은 BD LSRII을 이용한 유세포분석법을 통해 분석되었다.

synNotch 수용체가 T 세포를 활성화시키는 지를 사정하기 위해, 이들 T 세포는 활성화 마커 CD69에 대해 자극 후 염색되었다. CD69 발현은 이들 세포를 α-CD69 APC (Biolegend #310910)로 염색함으로써 결정되었다.

synNotch 주동된 T 세포 분화

일차 인간 CD4+ T 세포는 앞서 설명된 바와 같이, Dynabeads 인간 T-활성인자 CD3/CD28로 자극되었다. 활성화 동안 T 세포를 T_h1 부분집합으로 분화하기 위해, 이들 세포는 2.5 ng/mL 재조합 IL-12 (R&D systems) 및 12.5 μg/mL α-IL-4 클론 MP4-25D2 (BD Pharmigen #554481)의 첨가를 제외하고, 앞서 설명된 바와 같이 배양되었다. IL-12 및 α-IL-4는 최소한 주 2회 첨가되었다. 병렬적으로, 일차 CD4 T 세포는 인간 Tbet T2A mCherry (TBX21, NCBI #EAW94804.1)을 발현하도록 렌티바이러스에 의해 형질도입되고, 그리고 IL-2로 보충된 T 세포 배지에서 정상적으로 배양되었다. α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 Tbet T2A GFP 발현을 제어하는 5x Gal4 반응 요소를 발현하는 CD4+ T 세포는 바이러스 형질도입 후 24 시에 CD19- 또는 CD19+ K562 발송자 세포의 존재에서 배양되었다. synNotch T 세포는 IL-2로 보충된 T 세포 배지에서 K562s의 존재에서 배양되었다. 모든 T 세포는 11 내지 14 일 동안 배양되고, 그리고 이후, T_h1 T 세포의 백분율을 결정하기 위해 세포내 사이토킨 염색 (ICS)에 종속되었다.

ICS를 위해, 이들 T 세포는 먼저 GolgiPlug의 존재에서 6 시간 동안 50 ng/mL Phorbal 미리스트산염 아세트산염 및 1 μg/mL 이오노마이신 (둘 모두 Sigma로부터)으로 처리되었다. 이들 T 세포는 이후, α-Tbet BV421 (Biolegend #644816) 및 α-IFNγ APC (Biolegend #502512)로 염색되었다. Tbet 및 IFNγ의 수준은 BD LSRII를 이용한 유세포분석법을 통해 분석되었다.

재조합 TRAIL에 암 세포주의 감수성 및 일차 T 세포에서 synNotch 주동된 TRAIL 생산

HCT116 결장암 세포 및 K562s는 24 시간 동안 재조합 TRAIL (1 내지 200 ng/mL, 1:2 희석 계열)로 처리되었다. 이들 세포는 이후, 수확되고, 라이브/데드 염색제, SYTOX Blue (Thermo Scientific #S34857)로 염색되고, 그리고 죽은 세포의 분율은 BD LSR II에서 유세포분석법에 의해 결정되었다. K562s에 의해 발현된 사멸 수용체 4 (DR4)의 수준은 α-TRAIL R1 (DR4) APC (Biolegend #307208)로 염색에 의해 사정되었다.

synNotch 주동된 TRAIL 세포독성 검정을 위해, 일차 인간 CD4+ T 세포는 α-GFP 나노바디 (LaG17) synNotch Gal4VP64 수용체 및 LZ-TRAIL 또는 세포 표면 야생형 TRAIL의 발현을 제어하는 5x Gal4 반응 요소를 발현하도록 형질도입되었다. synNotch TRAIL 킬러 세포는 24 시간 동안 표면 GFP+ 또는 GFP- K562s와 공동배양되고, 그리고 사멸이 SYTOX blue로 염색에 의해 결정되었다. TRAIL의 표면 수준은 T 세포를 α-TRAIL (CD253) APC (Biolegend #308210)로 염색함으로써 결정되었다. LZ-TRAIL의 생산 및 분비는 TRAIL ELISA (R&D systems #DTRL00)에 의해 결정되었다.

이종이식 종양 모형, 세포 단리, 그리고 유세포분석법

동물 연구는 UCSF Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인된 프로토콜 하에 UCSF Preclinical Therapeutics Core에서 수행되었다. NOD scid 감마 (NSG) (암컷, 8~12 주령, Jackson Laboratory #005557) 생쥐가 모든 생체내 생쥐 실험에 이용되었다. α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 인간 IL-2 IRES mCherry를 제어하는 5x Gal4 반응 요소를 발현하는 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 분류되고 이들 실험에서 이용되었다.

이들 생쥐는 0 일자에 생쥐의 오른쪽 옆구리 및 왼쪽 옆구리에 각각, 5x10⁶ CD19+ 및 CD19- K562s가 피하 주사되었다. 종양은 4 일 동안 확립하도록 허용되었고, 그리고 T 세포가 4 일자에 꼬리 정맥 (i.v.)을 통해 또는 8 일자에 종양내 주사되었다. T 세포는 모든 주사의 경우에 PBS에서 현탁되었다. CD4+ 및 CD8+ synNotch T 세포는 1:1 비율에서 주사되었다. i.v. 주사의 경우, 6x10⁶ 전체 T 세포가 주사되었고, 그리고 종양내 주사의 경우, 5x10⁵ 전체 T 세포가 주사되었다.

종양은 10 일자에 1% FBS로 보충된 RPMI (UCSF Cell Culture Core) 내로 수확되었다. 이들 종양은 이후, 면도날에 의해 다져지고, 그리고 0.1 mg/mL DNA분해효소 (Roche #10104159001) 및 0.2 mg/mL 콜라겐분해효소 P (Roche # 11249002001)를 포함하는 RPMI에서 37 ℃에서 1 시간 동안 소화되었다. 배양 후, 소화된 종양은 75 μm 셀 스트레이너 위에 통과되었고, 그리고 종양 세포는 원심분리에 의해 수집되었다. 이들 세포는 이후, 적혈구 용해 완충액 (Biolegend #420301)으로 처리되고 PBS로 세척되었다. 종양은 이후, 종양 침윤성 T 세포를 분석하기 위해 라이브/데드 Green (Thermo Scientific #34969) 및 α-CD4 A647 (BD 557707) 및 α-CD8 BV786 (BD #583823)로 염색되었다. IL-2 IRES mCherry의 발현은 BD LSR II를 이용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포 개체군에서 사정되었다.

통계학적 분석

통계학적 유의성은 달리 언급되지 않으면, 스튜던트 t 검증 (양측)에 의해 결정되었다. 실시예 4에 대한 모든 통계학적 분석은 Prism 6 (Graphpad)으로 수행되었고, 그리고 p 값이 보고된다 (n.s. = p > 0.05, ^* = p ≤ 0.05, ^** = p ≤ 0.01, ^*** = p ≤ 0.001, ^**** = p ≤ 0.0001). 모든 오차 막대는 S.E.M. 또는 S.D.를 나타낸다.

결과

synNotch 수용체는 CD4+ 및 CD8+ 인간 일차 T 림프구에서 항원-유도된 전사를 주동할 수 있다

Notch 수용체는 3가지 결정적인 성분: 1) 리간드-결합 표피 성장 인자 (EGF) 반복, 2) 활성화 동안 수용체의 개열을 제어하는 코어 조절 영역, 그리고 3) 방출되고 전사를 조절하는 Notch 세포내 도메인 (NICD)을 갖는다. 완전히 맞춤가능한 수용체 표적화 및 전사 조절을 허용하는 synNotch 수용체 플랫폼을 구축하기 위해, 리간드-의존성 개열 및 활성화를 제어하는 Notch 코어 조절 영역이 최소 골격으로 활용되었지만, 이후 맞춤형 입력 인식 및 출력 전사 모듈이 부가되었다 (실시예 3을 참조한다). Notch 코어 조절 영역은 금속단백분해효소에 S2 개열 부위의 접근성을 제어하는 Lin12-Notch 반복 (LNRs), 이형이합체화 도메인 (HD), 그리고 Notch 세포내 도메인 (NICD)의 방출에 필요한 γ-세크레타아제 개열 부위를 내포하는 막경유 도메인 (TMD)을 포함한다. 자연 리간드 델타의 인식에 정상적으로 관련된 세포외 EGF 반복은 제거되고, 그리고 암 항원 CD19에 대해 지향된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 직교 항원, 예를 들면, 표면 전시된 GFP에 대한 나노바디로 대체되었다 (도면 96b-96c). 전사 조절에 정상적으로 필요한 NICD는 사합체성 바이러스 전사 활성인자 도메인, VP64에 융합된 Gal4 DNA 결합 도메인으로 대체되었다 (도면 96b-96c). 이러한 일반적인 접근법은 관심되는 임의의 표면 항원에 대한 synNotch 수용체를 가공하고, 그리고 직교 전사 인자 및 이들의 연관된 반응 요소에 의해 제어된 맞춤형 세포 출력에 수용체 활성을 연계하는데 이용될 수 있다 (실시예 3을 참조한다). 다양한 다른 세포외 및 세포내 도메인 역시 synNotch에서 기능하는 것으로 나타났다.

synNotch 수용체가 세포-기초된 요법을 위해 유관한 세포 유형에서 기능할 수 있다는 것을 보여주기 위해, 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 암-관련된 항원 CD19 또는 직교 항원 - 표면 전시된 GFP에 대해 지향된 synNotch 수용체로 가공되었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 각 synNotch 수용체 및 BFP 리포터 유전자의 발현을 제어하는 연관된 프로모터 (5x Gal4 반응 요소)를 발현하도록 가공되었다 (도면 97). α-CD19 synNotch 수용체로 가공된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 동계 리간드 CD19를 발현하는 세포 -- CD19를 자연적으로 발현하는 Daudi B 세포 림프모구 종양, 또는 이소성으로 발현된 CD19를 갖는 K562 골수성 백혈병 세포와 공동배양의 24 시간 이내에 T 세포 중에서 80 내지 90%에서 BFP 리포터 발현을 주동하였다 (도면 97a-97c 및 도면 103a-103c). 이들 T 세포는 자극되지 않거나 또는 동계 CD19 항원을 발현하지 않는 세포로 처리될 때 BFP 발현을 보여주지 않았다. 이들 데이터는 synNotch 수용체가 일차 T 세포에서 제어된 항원-의존성 방식으로 기능할 수 있고, 그리고 암 세포의 표면 상에서 자연 수준의 항원을 검출할 수 있다는 것을 보여준다. synNotch 수용체는 또한, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 동등한 기능을 갖는데, 이들 세포는 종종, T 세포 면역요법을 위해 일제히 이용된다 (도면 97c 및 도면 103a와 103b).

T 세포가 직교 표면 단백질을 인식하도록 가공될 수 있는 지의 여부가 또한, 표면 발현된 GFP를 인식하는 synNotch 수용체를 작제함으로써 시험되었다. 낮은 (Kd = 50 nM) 또는 높은 친화성 (Kd = 0.036 nM)을 갖는 2개의 α-GFP 나노바디 (Fridy et al., 2014)가 이용되었다. 이들 수용체는 표면 GFP를 발현하는 K562 세포에 노출 시에 리포터 발현을 자극하였다 (상기 항원을 결여하는 세포에서는 그러지 않았다). 결과의 전사 반응은 α-CD19 synNotch에 대해 관찰된 것과 유사하였는데, 이것은 synNotch 플랫폼의 모듈성을 강조하였다 (도면 97d-97f 및 도면 103g-103i). 더욱 높은 친화성 α-GFP 나노바디 synNotch 수용체는 더욱 낮은 친화성 수용체와 비교할 때, K562 발송자 세포에 노출 시에 더욱 큰 분율의 T 세포가 리포터 발현을 상향조절하도록 주동하긴 하지만, 양쪽 수용체는 T 세포의 절반 이상에서 유전자 발현을 활성화시켰다 (도면 97d-97f 및 도면 103h). 이것은 synNotch 리간드-결합 도메인의 친화성을 변화시키는 것이 세포 반응의 크기를 미세 조정할 수 있다는 것을 암시한다.

synNotch 수용체는 맞춤형 T 세포 사이토킨 프로필을 주동할 수 있다

신체 전반에서 면역 세포와 조직은 통신하고, 세포 행동을 조절하고, 그리고 전반적인 면역 반응을 형성하는 사이토킨으로서 알려져 있는 가용성 단백질을 분비한다. 특정한 사이토킨 프로필은 병원체 및 종양을 근절하는데 결정적이다. 많은 경우에, 상이한 세트의 사이토킨은 면역 반응을 억제하는 반대 효과를 갖는다. 게다가, 사이토킨이 암을 향한 면역성을 부양하거나 또는 자가면역 환경에서 손상성 염증을 억제할 수 있었던 일정한 시나리오에서, 이들 사이토킨은 부재한다. 치료적 T 세포가 분비하는 사이토킨의 정밀한 제어가 바람직하다. 하지만, 일부 경우에, T 세포가 CARs 또는 자연 T 세포 수용체를 통해 활성화될 때, 생산되는 사이토킨에 대한 제어가 거의 없고, 그리고 종종 사이토킨 프로필은 질환 및 활성화 맥락뿐만 아니라 수용체 특징에 의존한다 (도면 98a-98c). 많은 T 세포 요법의 경우, 특정한 질환 또는 치료적 요구를 위한 면역 반응을 재단하기 위해 특정한 사이토킨의 생산을 향하여 편향시키는 것이 유익할 수 있다.

이를 염두에 두고, CD4+ T 세포는 α-CD19 synNotch 수용체 및 단일 사이토킨의 발현을 제어하는 상응하는 전사 반응 요소로 가공되었다. 이들 조건 하에, T 세포는 CD19 항원에 대한 응답으로 단지 규정된 "알 라 카르트" 사이토킨 프로필만을 선별적으로 생산하였다 (도면 98d-98f). synNotch 수용체는 항원 감지에 앞서 기저 분비 없이 T 세포 자극성 사이토킨 IL-2의 높은-수준 생산을 주동하였다 (도면 104a-104d). synNotch 활성화에 의해 생산된 IL-2의 양은 T 세포의 CAR 또는 TCR 자극 (α-CD3/α-CD28 비드)에 대한 응답으로 생산되는 것과 유사하다 (도면 104d). TCR 경로를 통한 T 세포의 정상적인 자극과 달리, synNotch-주동된 사이토킨 생산은 활성화 마커 CD69의 상향조절의 결여에 의해 증명되는 바와 같이, T 세포 활성화를 야기하지 않는다 (도면 104e).

T 세포는 면역억제 사이토킨 IL-10 (도면 98d-98f 및 도면 104f-104h)을 생산하도록 가공되었는데, 이것은 IL-2와 달리, 활성화된 CAR T 세포의 사이토킨 프로필에 부재하였다 (도면 98c). 이것은 synNotch 수용체의 적용 - 특정 사이토킨, 심지어 자연적으로 발현되지 않는 것을 추가하거나 또는 이의 수준을 조정하는 능력을 강조한다 (도면 98 및 도면 104). 게다가, 이런 반응은 T 세포의 정상적인 활성화를 필요로 하지 않는다. T 세포에서 synNotch 회로의 맞춤화 및 정밀화는 질환에 대한 반응을 효과적으로 조정하기 위해 자가분비 및 주변분비 세포 통신에 의존하는 면역계 기능의 국소 제어를 허용해야 한다.

synNotch 수용체는 항종양 T _h1 운명으로 T 세포 분화의 항원-의존성 편중화를 주동할 수 있다

치료적 T 세포의 출력을 정확하게 형성하는 다른 방식은 이의 분화를 제어하는 것이다. 사이토킨과 같은 단백질 작동체를 생산하는 것 이외에, T 세포는 효과적인 아형 면역 반응을 마운팅하는데 중요한 특정한 분화 프로그램을 겪는다. 이들 아형 분화 프로그램은 T 세포 활성화, 특정 사이토킨 및 궁극적으로, 특정한 T 세포 운명을 개시하는 마스터 조절인자 전사 인자의 조절의 조합에 의해 정상적으로 결정된다. T 보조 세포 1 (T_h1) 또는 T 보조 세포 2 (T_h2) T 세포는 각각, 마스터 조절인자 전사 인자, Tbet 및 GATA3에 의해 제어되는 2가지 정준 CD4+ T 세포 운명 선택이다 (도면 99a). T_h1 세포는 병원체 및 암을 향한 세포 면역에 중요하고, 반면 T_h2세포는 항체 생산의 자극에 관련된다. 많은 질환에서, 국부 환경은 T 세포가 무효하게 되도록, T 세포의 분화를 잘못된 경로를 따라서 편중시킨다. 이것은 T 세포가 억제 표현형으로 밀어 넣어져, 면역 반응이 방해되고 종양 확대가 야기될 수 있는 암에서 특히 그러하다.

암 제거를 위한 T 세포 운명 선택의 중요성을 고려하여, synNotch 수용체가 T 세포가 항암 면역성에 중요한 IFNγ 생산 T_h1 세포로 분화하도록 편중시킬 수 있는 지의 여부가 조사되었다. IFNγ는 종양 제거를 보조하는 선천성 면역 세포, 예를 들면, 대식세포 및 수지상 세포의 활성화에 결정적이고, 그리고 IFNγ에 암 세포의 직접적인 노출은 세포독성 T 세포에 대한 이들의 감수성을 증강할 수 있다. T 세포 분화를 편중시키기 위해, CD4+ T 세포는 T_h1 전사 인자, Tbet의 발현을 제어하는 α-CD19 synNotch 수용체로 가공되었다 (도면 99b). Tbet의 이소성 발현이 CD4+ T 세포에서 T_h1 운명 선택을 주동하는데 충분한 것으로 알려져 있기 때문에, synNotch는 종양 항원 CD19에 대한 응답으로 Tbet의 수준을 조절함으로써 T_h1 운명 조절에 대한 항원-의존성 제어를 제공할 수 있는 것으로 추론되었다.

이것을 시험하기 위해, 가공된 일차 CD4+ T 세포는 분화를 유도하기 위해 11 일 동안 CD19+ 표적 K562 세포 또는 CD19- 대조 K562 세포와 공동배양되었다. 비교 대조로서, CD4+ T 세포의 정합된 개체군은 T_h1 분화 작용제 (IL-12 및 α-IL-4)의 칵테일로 처리되거나 또는 Tbet 구조성 과다발현에 종속되었다. 이들 2가지 조건은 synNotch 주동된 T_h1 분화 및 당해 분야에서 이전 최적 표준의 비교를 허용하였다. 가공된 synNotch CD4+ T 세포는 자극의 24 시간 이내에 CD19에 대한 응답으로 Tbet를 발현하였다 (도면 99c 및 도면 105a). CD19+ K562s와 11 일의 장기간 공동배양 후, T 세포는 이들 T 세포가 T_h1 세포가 되는 지의 여부를 드러내기 위해, 세포내 사이토킨 염색을 위한 Phorbal 미리스트산염 아세트산염 (PMA) 및 이오노마이신으로 자극되었다. 11 일 동안 CD19+ K562 세포로 자극된 T 세포의 경우, >60%가 IFNγ+ T_h1 세포인 것으로 밝혀졌다 (도면 99d). 편중된 분화의 이러한 크기는 T_h1 분화 칵테일로 처리에서 관찰된 것과 동등하고, 그리고 구조성 Tbet 과다발현에서보다 단지 약간 작다 (도면 99e 및 도면 105a-105e). 따라서, synNotch 수용체는 T 세포를 항종양 T_h1 운명으로 편중시키는데 이용될 수 있고, 그리고 규정 마스터 조절인자 전사 인자의 발현이 운명 결정을 위해 충분하기만 하면, 원칙적으로 T 세포를 많은 공지된 T 세포 운명 (가령, T_h2, T_reg, T_h17)으로 편중시키는데 이용될 수 있었다.

맞춤 치료제의 SynNotch 주동된 T 세포 전달 - TRAIL 생산

장래 T 세포 치료제의 다른 중요한 성분은 이들이 맞춤형 치료적 유상하중, 심지어 비선천적인 것들을 전달하도록 허용하는 새로운 능력을 갖는 T 세포를 정교하게 설계하는 것이다. 자연 T 세포 또는 CAR T 세포는 감염된 세포 또는 암 세포를 직접적으로 인식하고, 그리고 용해성 과립의 전달을 통해 이들을 사멸시킨다 (도면 100a). 하지만, 자연 T 세포 반응은 종종, 질환을 안전하게 근절하는데 불충분하거나 또는 너무 극심하다. T 세포, 예를 들면, 분비된 생물제제에 의한 치료적 유상하중의 맞춤 전달은 예로서, 세포독성 활성을 국부 증강함으로써 또는 면역계에 의해 인식되고 사멸되는 질병 부위를 점화함으로써 질환을 치료하는 어려움을 보조할 수 있었다.

원리 증명 실험으로서, CD4+ T 세포 - 최소한으로 세포독성인 T 세포 부분집합이 아폽토시스 유도 유상하중을 생산하도록 설계함으로써 이것의 합성 "킬러 T 세포"로의 가공이 조사되었다. α-GFP 나노바디 synNotch 수용체 및 아폽토시스의 유도인자이고 암 치료제인 종양 괴사 인자 수용체 리간드 (TRAIL)의 생산을 제어하는 반응 요소가 이용되었다 (도면 100b). T 세포는 TCR 자극 시에 TRAIL을 정상적으로 생산하지 않고, 이런 이유로, 제어된 방식으로 합성적으로 발현되면, 이것은 이들의 세포독성 활성을 보조할 수 있었다 (도면 106a). TRAIL의 가용성 형태는 고도로 감수성인 결장암 세포주 HCT116을 사멸시키는데 효과적이지만, K562 세포와 같은 다른 암 라인의 경우, 가용성 TRAIL은 심지어 고용량에서도 아폽토시스를 유도하지 않는다 (도면 106a-106d). 하지만, 한 최근 연구는 TRAIL이 막 고정된 형태 (가령, 지지된 지질 이중층 또는 리포솜)로 전달되면, 이것이 심지어 내성 암 세포, 예를 들면, K562 세포에 대한 아폽토시스를 유도하는데 더욱 효과적이라는 것을 보여주었다. 이런 이유로, CD4+ T 세포는 2가지 TRAIL 변이체 중에서 한 가지를 생산하도록 가공되었다: 1) 가용성 단위체성 TRAIL보다 더욱 강력한 것으로 공지된 GCN4 삼합체성 류신 지퍼에 융합된 TRAIL (LZ-TRAIL)의 분리된 형태, 또는 2) 자연 표면 전시된 TRAIL (도면 106e 106h).

TRAIL 생산을 주동하는 synNotch T 세포는 T 세포가 TRAIL의 아폽토시스성 효과를 증강하는 효과적인 전달 플랫폼인지를 결정하기 위해, TRAIL-내성 K562 세포와 공동배양되었다. synNotch T 세포는 세포 표면 TRAIL 발현 (도면 100c) 및 공동배양의 24 시간 이내에 LZ-TRAIL 분비 (도면 106f-106h)를 주동하긴 하지만, 라이브/데드 염색제 SYTOX 블루의 흡수에 의해 지시된 바와 같이, 단지 세포 표면 TRAIL 개시된 K562 세포 사멸만을 주동하였다. 대조적으로, LZ-TRAIL을 분비하는 synNotch T 세포는 최근 연구와 일관되게, 내성 K562 세포를 사멸시키는데 효과적이지 않았다 (도면 100d-100e).

전반적으로, 이들 조사 결과는 synNotch T 세포가 치료제, 예를 들면, TRAIL에 대한 효율적이고 효과적인 전달 작용제일 수 있다는 것을 암시한다. 전신적으로 전달될 때 무효하거나 또는 독성인 임의의 생물학적 제제가 이러한 방식으로 국부 전달되면 더욱 효과적이고 더욱 안전할지도 모른다. synNotch 가공된 T 세포는 증강된 유용성 및 감소된 전신 부정확한 독성을 위한 임의의 유전자 인코딩된 치료적 작용제를 국부 전달하는 잠재력을 갖는다.

synNotch 수용체 가공된 T 세포를 통한 고형 종양에서 사이토킨의 생체내 발현

synNotch 수용체는 시험관내에서 T 세포 반응의 스펙트럼을 정확하게 조절할 수 있기 때문에, 이들 수용체가 일차 인간 T 세포를 생체내에서 고형 종양으로 선별적으로 표적화하고, 그리고 맞춤 유상하중, 예를 들면, 사이토킨 IL-2의 전달을 유도할 수 있는 지의 여부가 조사되었다. 이들 실험을 위해, 양측성 K562 이종이식 고형 종양 모형이 면역손상된 NOD scid 감마 (NSG) 생쥐에서 확립되었는데, 여기서 비표적 CD19- 종양 및 표적 CD19+ 종양이 각각, 왼쪽 옆구리 및 오른쪽 옆구리에 피하 이식되었다 (도면 101a). 이들 종양은 4 일 동안 확립하도록 허용되고, 그리고 이후, IL-2 발현과 IRES mCherry 리포터의 제어 하에 α-CD19 synNotch 수용체 및 반응 요소로 가공된 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 정맥내 (i.v.) 주사되었다 (도면 107a). 6 일 후, 이들 종양은 수확되고, 그리고 종양 침윤성 T 세포는 IL-2 IRES mCherry 리포터의 발현에 대해 분석되었다 (도면 101a - 101c). 단지 종양 국부화된 T 세포만 표적 CD19 종양에서 IL-2 발현을 위한 mCherry 리포터를 발현하였고, 그리고 리포터 수준은 시험관내에서 자극될 때 동일한 T 세포에 대해 관찰된 것과 유사하였다 (도면 101a - 101c 및 도면 107b와 107c). T 세포의 빈도가 종양에서 높진 않지만 (CD4+의 경우 1000개 세포 중에서 1개 및 CD8+ T 세포의 경우 500개 중에서 1개), 이들 T 세포의 활성은 표적 종양에 고도로 특이적이다 (도면 101b와 101c 및 도면 107d). synNotch → IL-2 T 세포의 i.v. 주사에 더하여, 이들 T 세포는 또한, 비표적 및 표적 종양 내로 직접적으로 주사되었다. 그 다음, 이들 종양은 주사 후 2 일에 수확되고 유세포분석법을 통해 분석되었는데, 이들 역시 정합된 시험관내 자극된 T 세포와 유사한 수준에서 표적 종양 내에 IL-2 리포터의 선별적 발현을 보여주었다 (도면 107e). 이들 종양을 침윤하는 synNotch T 세포의 능력이 여전히 향상될 수 있긴 하지만, 이들 데이터는 synNotch 수용체가 T 세포를 원발성 종양으로 표적화하고, 그리고 국부 방식으로 치료적 작용제의 생산을 선별적으로 유도할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. 따라서 synNotch 가공된 T 세포는 국부 전달로부터 유용성을 증강하고 전신 투여의 독성을 감소시키는 이익을 얻을 수 있는 넓은-범위의 유전적으로 인코딩가능 치료제의 전달에 효과적인 것으로 입증될 수 있었다.

도면 96. synNotch 수용체를 이용하여 맞춤형 치료적 T 세포 반응을 정교하게 설계하는 잠재력.

(a) TCRs 및 CARs는 T 세포 반응을 재형성하는 것에 대한 제어를 거의 제공하지 못하는 선천적 T 세포 활성화 프로그램을 주동하는 키나아제-기초된 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. synNotch 수용체는 세포 표면 항원 (가령, 질환 관련된 항원)을 인식하고, 그리고 T 세포 반응에 대한 더욱 정밀한 제어로 맞춤 전사 프로그램을 직접적으로 조절한다. 따라서, synNotch 수용체는 알 라 카르트 반응을 정교하게 설계하는데 이용될 수 있었다. (b) synNotch 수용체는 관심되는 세포 표면 항원을 검출하는 맞춤 리간드 결합 도메인 (가령, scFv 또는 나노바디), Notch의 코어 조절 영역, 그리고 직교 전사 인자를 내포하는 세포질 도메인 (가령, Gal4 VP64)을 가질 수 있다. 직교 전사 인자 제어 맞춤 전사 프로그램을 위한 상응하는 반응 요소는 상기 수용체와 함께 T 세포 내로 가공될 수 있다. (c) 암-관련된 항원 CD19에 대해 지향된 scFvs 및 직교 항원 GFP에 대해 지향된 나노바디를 갖는 synNotch 수용체가 가공되었고, 그리고 synNotch 수용체 플랫폼의 융통성을 입증한다.

도면 97. synNotch 수용체는 CD4+ 및 CD8+ 인간 일차 T 림프구에서 항원-유도된 전사를 주동할 수 있다

(a) CD4+ 및 CD8+ 일차 인간 T 세포는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 BFP 리포터의 발현을 제어하는 5x Gal4 반응 요소로 가공되었다. (b) 24 시간의 공동배양 후 CD19- 또는 CD19+ K562s 또는 Daudi 암 세포 (CD19+)와 함께 발송자 세포로 자극에 대한 응답으로 α-CD19 synNotch 수용체 수신자 T 세포에서 BFP 리포터의 선별적 유도를 보여주는 히스토그램 (≥ 3회 실험의 대표). (c) 패널 B에서 도시된 복제 데이터로부터 계산된, 발송자 세포로 24 시간의 자극 후 BFP 리포터를 상향조절하는 α-CD19 synNotch T 세포의 백분율 (모든 조건에 대해 n ≥ 3, 오차 막대 = SEM). (d) CD4+ 및 CD8+ 일차 인간 T 세포는 패널 A에서처럼 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 친화성 변이체 및 BFP 리포터로 가공되었다. (e) 24 시간의 공동배양 후 표면 GFP- 또는 GFP+ K562 발송자 세포에 대한 응답으로 α-GFP synNotch 수용체 수신자 T 세포에서 BFP 리포터의 선별적 유도를 보여주는 히스토그램 (≥ 3회 실험의 대표, 오차 막대 = SEM). (f) 패널 H에서 도시된 복제 데이터로부터 계산된, 발송자 세포로 24 시간의 자극 후 BFP 리포터를 상향조절하는 α-GFP synNotch T 세포의 백분율 (모든 조건에 대해 n ≥ 3, 오차 막대 = SEM).

도면 103. 도면 97a-97f에 관련된 보충 데이터.

(a) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 (myc 태깅됨) 및 BFP의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ (왼쪽 플롯) 및 CD8+ (오른쪽 플롯) 일차 인간 T 세포의 2차원 반점 플롯. 상기 반응 요소 벡터는 또한, 삽입된 반응 요소를 갖는 T 세포를 확인하기 위한, mCherry의 구조성 발현을 주동하는 PGK 프로모터를 내포한다. 모든 BFP 리포터 발현 분석은 synNotch 수용체 및 BFP 발현을 제어하는 상응하는 5xGal4 반응 요소 둘 모두를 갖는 T 세포 (위쪽 오른쪽 상자에서 개설된 집단)에서 수행되었다. (b) 24 시간의 공동배양 후 CD19- K562 대조 세포와 비교하여 CD19+ K562s 또는 Daudi 종양 세포에 대한 응답으로 synNotch 수용체 수신자 T 세포에서 BFP 리포터의 선별적 유도를 보여주는 히스토그램 (≥ 3회 실험의 대표). (c) K562s 및 Daudi 종양 세포에서 CD19 수준을 보여주는 히스토그램. Daudi 종양은 CD19를 자연적으로 발현하고, 그리고 K562s는 CD19를 유사한 수준에서 이소성으로 발현한다. (d) CD4 (위쪽 열) 및 CD8 (아래쪽 열) 일차 인간 T 세포를 발현하는 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 수용체에 대한 도면 103a와 유사한 2차원 반점 플롯. 각 칼럼은 특정 α-GFP 나노바디 친화성 변이체 (LaG17, LaG16-2)에 대한 것이다. 모든 BFP 리포터 발현 분석은 도면 103a에서처럼 위쪽 오른쪽 개설된 게이트에서 T 세포에서 수행되었다. (e) 24 시간의 공동배양 후 표면 GFP- K562s와 비교하여 표면 GFP+ K562 암 세포에 대한 응답으로 synNotch 수용체 수신자 T 세포에서 BFP 리포터의 선별적 유도를 보여주는 히스토그램 (≥ 3회 실험의 대표). (f) K562 GFP- 대조와 비교하여 표면 GFP를 발현하는 K562 암 세포에서 전체 GFP 수준을 보여주는 히스토그램.

도면 98. synNotch 수용체는 항원-유도된 맞춤 사이토킨 프로그램을 주동할 수 있다.

(a) CAR 활성화는 T 세포가 다양한 세트의 사이토킨을 생산하도록 주동한다. (b) 24 시간의 자극 후 표적 CD19+ K562 세포 (y 축) 또는 음성 대조 CD19- K562s (x 축)로 활성화된 일차 인간 α-CD19 CAR CD4+ T 세포에 의해 생산된 25가지 사이토킨 (사이토킨의 목록에 대해 도면 98c를 참조한다)의 수준 (pg/mL)을 보여주는 산점도 (n=3, 오차 막대 = SEM). (c) 표적 CD19+ K562s에 의해 자극된 CD4+ α-CD19 CAR T 세포에 의해 생산된 25가지 사이토킨의 수준 (n=3, 오차 막대 = SEM). (d) CD4+ T 세포는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-2 또는 IL-10의 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되었다. 이들 세포는 표적 CD19+ K562s 또는 CD19- 비표적 K562s와 공동배양되었다. (e) CD19+ K562 자극에 대한 응답으로 단일 사이토킨의 생산을 보여주는 패널 B에서와 같은 산점도 (n=3, 오차 막대 = SEM). (f) CD19+ K562 세포에 대한 응답으로 IL-2 또는 IL-10 생산을 주동하는 α-CD19 synNotch T 세포에 의해 생산된 사이토킨의 수준. 단지 단일 사이토킨 (IL-2 또는 IL-10)만 배경 수준을 초과하여 생산된다 (n=3, 오차 막대 = SEM).

도면 104. 도면 98a-98f에 관련된 보충 데이터.

(a) CD4+ 인간 일차 T 세포는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-2 생산의 제어 하에 연관된 5xGal4 반응 요소로 가공되었다. (b) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-2 발현 IRES mCherry의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4 일차 인간 T 세포의 2차원 반점 플롯 (왼쪽 패널). 상기 반응 요소 벡터는 또한, 삽입된 반응 요소를 갖는 T 세포를 확인하기 위한, BFP의 구조성 발현을 주동하는 PGK 프로모터를 내포한다. synNotch 수용체 및 IL-2 IRES mCherry 발현을 제어하는 상응하는 5xGal4 반응 요소 둘 모두를 갖는 T 세포는 분류되고, 그리고 도면 98 및 104에서 모든 상응하는 검정에 이용되었다 (위쪽 오른쪽 상자). 왼쪽 패널은 형질도입되지 않은 T 세포와 비교하여 이중 양성 T 세포에서 IL-2 IRES mCherry 리포터의 기저 유도 없음을 보여준다. (c) IL-2에 대한 세포내 사이토킨 염색의 반점 플롯이 자극되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 세포, IL-2 생산을 제어하는 자극되지 않은 α-CD19 synNotch Gal4VP64 T 세포, 그리고 6 시간 동안 PMA/이오노마이신으로 자극된 양성 대조 T 세포에 대해 도시된다. (d) 기저 및 자극된 IL-2 수준이 형질도입되지 않은 CD4+ T 세포, α-CD19 4-1BBζ CAR T 세포, 그리고 IL-2 생산을 제어하는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 T 세포로부터 수확된 상층액에 대해 제공된다 (n = 4). (e) α-CD3/CD28 dynabeads로 자극된 대조 CD4+ T 세포에서 및 CD19- 또는 CD19+ K562s로 자극된, IL-2 생산을 제어하는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 T 세포에서 CD69 수준 (왼쪽 칼럼) 및 IL-2 IRES mCherry 리포터 수준. CD69는 동계 항원으로 자극 시에 synNotch T 세포에서 상향조절되지 않는다. (f) CD4+ 인간 일차 T 세포는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-10 생산의 제어 하에 연관된 5xGal4 반응 요소로 가공되었다. (g) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-10 IRES mCherry 발현의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ 일차 인간 T 세포에 대한 패널 B와 동등한 데이터. (h) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-10 IRES mCherry 발현의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ 일차 인간 T 세포에 대한 패널 D와 동등한 데이터. (i) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 IL-10 IRES mCherry 발현의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4 일차 인간 T 세포에 대한 도면 104e와 동등한 데이터.

도면 99. SynNotch 수용체는 T 세포 분화의 항종양 T _h1 운명으로의 항원-의존성 편중화를 주동할 수 있다.

(a) 자연 T 세포 분화: CD4+ T 세포가 항원 제시 세포 상에서 MHC 분자에 의해 제시된 병원체-유래된 펩티드의 포용을 통해 활성화될 때, 이들은 감염에 따라 특정 T 세포 아형으로 분화한다. T_h1 및 T_h2는 상이한 면역 반응을 주동하는 정준 CD4+ T 세포 운명이다. T_h1 세포는 전사 인자 Tbet를 발현하고, IFNγ을 생산하고, 그리고 세포 면역 및 종양 제거를 보조한다. T_h2 세포는 B 세포에 의한 항체 생산의 자극을 위한 중요한 사이토킨인 IL-4를 생산한다. (b) SynNotch 주동된 T 세포 분화: CD4+ α-CD19 synNotch T 세포는 Tbet의 발현 및 따라서, T 세포에 의한 T_h1 운명 선택을 조절하도록 가공되었다. synNotch T 세포는 synNotch 주동된 Tbet 발현이 CD4+ T 세포를 CD19-의존성 방식으로 T_h1 운명으로 편중시킬 수 있는 지를 결정하기 위해, 11 일 동안 표적 CD19+ 또는 비표적 CD19- K562 세포와 공동배양되었다. (c) CD4+ α-CD19 synNotch T 세포 및 CD19+ K562s의 24 시간의 공동배양 후 Tbet T2A EGFP의 선별적 발현을 보여주는 히스토그램 (최소한 3회 실험의 대표). (d) CD19+ 또는 CD19- K562s와 함께 11 일의 배양 후 Tbet 및 IFNγ에 대한 세포내 염색된 CD4+ α-CD19 synNotch Gal4VP64 T 세포의 2차원 반점 플롯. T 세포는 사이토킨 생산을 주동하기 위해, 염색에 앞서 4 시간 동안 PMA/이오노마이신으로 자극되었다 (최소한 3회 실험의 대표). (e) 11 일의 지정된 처리 후 IFNγ+ (T_h1) T 세포의 백분율 (모든 처리에 대해 n ≥ 3, 오차 막대 = SEM, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성, n.s. p>0.05).

도면 105. 도면 99a-99e에 관련된 보충 데이터.

(a) 도면 99c로부터 복제 데이터의 정량. Tbet T2A GFP 발현을 제어하는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 반응 요소를 갖는 CD4+ T 세포는 24 시간 동안 CD19+ 또는 CD19- K562s와 공동배양되었다. Tbet T2A GFP 발현을 갖는 T 세포의 백분율이 정량되는데, 이것은 T 세포가 CD19+ K562s에 노출될 때에만 Tbet이 상향조절되었다는 것을 보여준다 (n=3). (b) 11 일의 배양 후 α-CD3/CD28 dynabeads로 자극되고 T_h1 사이토킨 IFNγ에 대해 세포내에서 염색된 CD4 T 세포의 대표적인 반점 플롯. IFNγ 양성 게이트는 적색 상자로 표시된다. (c) T_h1 분화 조건 (IL-12 + α-IL-4)에서 11 일 동안 배양된 CD4+ T 세포에 대한 패널 B와 유사한 대표적인 반점 플롯 (n=4). (d) 형질도입 후 48 시간에 Tbet T2A mCherry의 구조성 과다발현을 갖는 CD4 T 세포의 대표적인 히스토그램. (e) 11 일의 배양 후 Tbet 및 IFNγ에 대한 Tbet T2A mCherry의 구조성 과다발현을 갖는 CD4+ T 세포의 세포내 염색의 대표적인 반점 플롯 (n=6). 이중 양성 Tbet 및 IFNγ T 세포는 적색 상자로 표시된다. (f) 대조 CD19- K562s와 공동배양된, Tbet T2A GFP 발현을 제어하는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 반응 요소를 갖는 CD4+ T 세포 (mCherry를 구조성으로 발현한다)의 대표적인 현미경검사. synNotch T 세포 (적색 세포)는 암 세포와 연관되지 않거나 또는 Tbet 발현의 리포터 (GFP)를 상향조절한다. (g) T 세포가 CD19+ T 세포와 공동배양된 점을 제외하고, 패널 F에서와 같은 대표적인 현미경검사. synNotch T 세포 (적색 세포)는 CD19+ K562s와 어셈블리를 형성하고 Tbet T2A GFP 발현을 상향조절한다. 활성화된 synNotch T 세포는 mCherry 및 GFP 공동발현으로 인해 황색이다.

도면 100. SynNotch 주동된 TRAIL 생산 - 비선천적 치료제의 맞춤 T 세포 전달.

(a) 자연 T 세포 세포독성: CD8+ 세포독성 T 세포는 그들의 TCR을 통해 감염된 세포를 인식하고, 그리고 예정된 세포 사멸을 개시하는 그랜자임의 전달을 허용하는 퍼포린으로 세포 내에 구멍을 발생시킴으로써, 감염된 세포를 직접적으로 사멸시킨다. (b) SynNotch 맞춤형 킬러 T 세포: CD4+ T 세포는 표면 GFP에 대한 응답으로 아폽토시스 조절인자 TRAIL의 발현을 제어하는 α-GFP synNotch로 가공되었다. (c) CD4+ α-GFP synNotch T 세포 및 표면 GFP+ K562s의 24 시간의 공동배양 후 표면 TRAIL의 선별적 발현을 보여주는 히스토그램. (d) 지정된 T 세포 유형과 24 시간 공동배양 (T 세포:표적 세포 비율 = 1:1) 후 데드 염색제 SYTOX 블루의 흡수를 통한 표면 GFP+ K562 세포 사멸을 보여주는 히스토그램. (e) 패널 D에서 도시된 복제 데이터로부터 계산된 표적 세포 생존의 백분율 (n=4, 오차 막대 = SEM).

도면 106. 도면 100a-100e에 관련된 보충 데이터.

(a) 안정된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 24 시간 동안 α-CD3/CD28 dynabeads로 재자극되고 세포 표면 TRAIL에 대해 염색되었다. 어떤 T 세포 부분집합도 TRAIL 발현을 급성으로 상향조절하지 않는다. (b) 암 세포는 재조합 TRAIL-매개된 아폽토시스에 대한 그들의 감수성에서 서로 다르다. HCT116 결장암은 TRAIL에 의해 결합된 사멸 수용체를 갖고 낮은 수준 TRAIL 처리에 민감하다. K562s는 TRAIL에 대한 사멸 수용체를 발현하지만, TRAIL 처리에 둔감하다. (c) 표면 GFP- 또는 GFP+ K562s 또는 HCT116 암 세포는 24 시간 동안 0 내지 200 ng/mL의 재조합 TRAIL로 처리되고, 그리고 사멸이 데드 염색제 SYTOX 블루로 염색함으로써 유세포분석법을 통해 모니터링되었다 (n=4). (d) TRAIL에 의해 결합된 사멸 수용체 4 (DR4)에 대해 염색된 K562s의 히스토그램. K562s는 TRAIL-매개된 아폽토시스에 대한 그들의 내성에 의해 상기 수용체를 발현한다. (e) LaG17 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 및 류신 지퍼 TRAIL (LZ-TRAIL 왼쪽 패널) 또는 전장 표면 TRAIL (오른쪽 패널)의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ T 세포의 대표적인 반점 플롯. TRAIL 발현의 mCherry 리포터의 수준은 이중 양성 T 세포 및 대조 형질도입되지 않은 T 세포에 대해 아래에 도시된다. (f) LaG17 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 및 LZ-TRAIL의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ T 세포는 LZ-TRAIL이 단지 GFP+ K562s에 대한 응답으로만 분비되는 지를 결정하기 위해, 24 시간 동안 표면 GFP- 또는 GFP+ K562s와 공동배양되었다. (g) 표면 GFP= 또는 GFP+ K562s와 공동배양된, 도면 106e에서 도시된 분류된 synNotch CD4 LZ-TRAIL T 세포에서 TRAIL 생산의 mCherry 리포터 수준의 수준을 보여주는 히스토그램. 상기 리포터는 표면 GFP+ K562s에 대한 응답으로 배타적으로 활성화되었다. (h) 24 시간 동안 표면 GFP- 또는 GFP+ K562s와 공동배양된 분류된 synNotch CD4 LZ-TRAIL T 세포로부터 상층액의 TRAIL ELISA (n=2).

도면 101. synNotch 수용체 가공된 T 세포를 통한 고형 종양에서 사이토킨의 생체내 국부 발현.

(a) NSG 생쥐는 CD19- 비표적 K562s 및 표적 CD19+가 각각, 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피하 주사되었다. 종양이 확립된 후, IL-2 iRES mCherry 발현의 제어 하에 α-CD19 synNotch T 세포가 생쥐 내로 주사되었고, 그리고 synNotch T 세포가 종양을 침윤하고 IL-2 및 mCherry 리포터의 발현이 유도되는 지를 결정하기 위해, 종양이 지정된 시점에서 수확되었다. (b) 표적 CD19+ 종양에서 mCherry 리포터의 선별적 발현을 보여주는, i.v. 주사된 종양 침윤된 CD4+ 및 CD8+ synNotch T 세포에서 IL-2 IRES mCherry 리포터 수준의 히스토그램 (3마리 복제 생쥐를 대표하는 데이터). (c) 패널 B에서 도시된 복제 데이터로부터, IL-2 발현의 mCherry 리포터의 발현을 유도한 종양 침윤된 T 세포의 백분율의 정량 (n=3, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^** p<0.01).

도면 107. 도면 101a-101c에 관련된 보충 데이터.

(a) α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 (myc 태깅됨) 및 IL-2 IRES mCherry의 발현을 제어하는 5xGal4 반응 요소로 형질도입된 CD4+ (왼쪽 플롯) 및 CD8+ (오른쪽 플롯) 일차 인간 T 세포의 2차원 반점 플롯. 상기 반응 요소 벡터는 또한, 삽입된 반응 요소를 갖는 T 세포를 확인하기 위해, BFP의 구조성 발현을 주동하는 PGK 프로모터를 내포한다. 위쪽 오른쪽 음영된 상자에서 T 세포는 분류되고 모든 생체내 및 시험관내 실험에 이용되었다. (b) CD19- 또는 CD19+ K562s로 시험관내 자극된, IL-2 발현의 제어 하에 CD4+ 및 CD8+ synNotch T 세포의 대표적인 히스토그램. IL-2 IRES mCherry 발현은 CD19의 존재에서만 일어났다. (c) 도면 107b에서 도시된 복제 데이터로부터, IL-2 발현의 mCherry 리포터의 발현을 유도한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율의 정량 (n=3, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^*** p<0.001 및 ^**** p<0.0001). (d) 표적 CD19+ 종양에서 mCherry 리포터의 선별적 발현을 보여주는, 종양내 주사된 종양 침윤된 CD4+ 및 CD8+ synNotch T 세포에서 IL-2 IRES mCherry 리포터 수준의 히스토그램 (3마리 복제 생쥐를 대표하는 데이터). 종양내 주사 실험을 위한 프로토콜은 도시된다. 결과는 i.v. 주사된 T 세포 및 시험관내 자극된 T 세포에 대해 관찰되는 것과 유사하다. (e) i.v. 및 종양내 주사 후 CD19- 및 CD19+ 종양을 침윤한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율 (n=3, 오차 막대 = SEM, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성, n.s. p>0.05).

도면 102. SynNotch 수용체는 T 세포가 그들의 미세환경을 모니터링하고 선별적으로 조정하도록 허용하는 다능한 조절인자이다.

(a) synNotch 수용체는 T 세포 반응의 다능한 조절인자이다: synNotch 수용체는 일차 인간 T 세포에서 다양한 행동을 주동할 수 있다. synNotch 수용체는 항원-의존성 및 T 세포 활성화 독립된 방식으로, 맞춤 사이토킨 생산 프로필을 주동하고, 비선천적 치료제를 효과적으로 전달하고, 그리고 T 세포 분화를 제어할 수 있다. (b) synNotch는 생체내에서 T 세포를 표적으로 하여 치료적 유상하중을 국부 생산하는데 충분하다.

실시예 5: 합성 Notch를 통합하는 치료적 T 세포에 의한 정밀 종양 인식 및 조합 항원 서명을 검출하기 위한 키메라 항원 수용체 신호전달

재료와 방법

다음의 재료와 방법이 달리 지시되지 않으면, 실시예 5에서 설명된 결과에 적용된다.

synNotch 수용체 및 반응 요소 구조체 설계

synNotch 수용체는 CD19 scFv, LaG17 (더욱 낮은 친화성), 또는 LaG16_2 (높은 친화성) 나노바디를 생쥐 Notch1 (NM_008714) 최소 조절 영역 (Ile1427 내지 Arg1752) 및 Gal4VP64 또는 TetR VP64 (tTa)에 융합함으로써 만들어졌다. 모든 synNotch 수용체는 막 표적화를 위한 n-말단 CD8α 신호 펩티드 (MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열 번호:129)), 그리고 α-myc A647 (세포-신호전달 #2233)로 표면 발현의 쉬운 결정을 위한 myc-태그 (EQKLISEEDL (서열 번호:75))를 내포한다. 이들 수용체는 모든 일차 T 세포 실험을 위해 PGK 프로모터를 내포하는 변형된 pHR'SIN:CSW 벡터 내로 클로닝되었다. pHR'SIN:CSW 벡터는 또한, 반응 요소 플라스미드를 만들기 위해 변형되었다. Gal4 DNA 결합 도메인 표적 서열 (GGAGCACTGTCCTCCGAACG (서열 번호:130))의 5개 사본이 최소 CMV 프로모터의 5'에 클로닝되었다. 형질도입된 T 세포가 쉽게 식별될 수 있도록, mCherry 발현을 구조성으로 주동하는 PGK 프로모터 역시 이러한 반응 요소 플라스미드 내에 포함된다. 모든 유도성 CAR 벡터의 경우, CAR은 GFP로 c-말단에 태깅되고, 그리고 Gal4 반응 요소의 3'에 복수 클로닝 부위에서 BamHI 부위를 통해 클로닝되었다. 모든 구조체는 인-융합 클로닝 (Clontech #ST0345))을 통해 클로닝되었다.

일차 인간 T 세포 단리 및 배양

일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 성분채집술 후 음성 선별 (StemCell Technologies #15062 & 15063)에 의해 익명 공여 혈액으로부터 단리되었다. 혈액은 University Institutional Review Board에 의해 승인된 바와 같이, Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA)으로부터 획득되었다. T 세포는 20% 인간 AB 혈청 (Valley Biomedical Inc., #HP1022) 및 10% DMSO으로 보충된 RPMI-1640 (UCSF 세포 배양 코어)에서 냉동보존되었다. 해동한 후, T 세포는 모든 실험을 위해 30 단위/mL IL-2 (NCI BRB Preclinical Repository)로 보충된, X-VIVO 15 (Lonza #04-418Q), 5% 인간 AB 혈청 및 10 mM 중화된 N-아세틸 L-시스테인 (Sigma-Aldrich #A9165)으로 구성되는 인간 T 세포 배지에서 배양되었다.

인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입

암 세포주

synNotch T 세포의 시험관내 자극

모든 시험관내 synNotch T 세포 자극의 경우, 2x10⁵T 세포가 1:1 비율에서 발송자 세포와 공동배양되었다. T 세포 및 발송자 세포를 둥근 바닥 96-웰 조직 배양 평판에서 혼합한 후, 이들 세포는 세포의 상호작용을 강제하기 위해 400xg에서 1 분 동안 원심분리되고, 그리고 배양액은 BD LSR II를 이용하여 CD4+ T 세포의 경우 활성화의 마커 (가령, CD69) 및 CD8+ T 세포의 경우 표적 종양 세포의 특정한 용해에 대해 24 시간 시점에 분석되었다. 모든 유세포분석법 분석은 FlowJo 소프트웨어 (TreeStar)에서 수행되었다.

Luminex MAGPIX 사이토킨 정량

α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 CAR을 제어하는 5x Gal4 반응 요소를 발현하는 일차 CD4+ T 세포는 지정된 표적 암 세포주로 앞서 설명된 바와 같이 자극되었다. 상층액은 24 시간 시점에 수집되고, 그리고 제조업체의 프로토콜에 따라서, Luminex MAGPIX (Luminex Corp.) 인간 사이토킨 Magentic 25-plex 패널 (Invitrogen ref#LHC0009M)로 분석되었다. 모든 사이토킨 수준은 xPONENT 소프트웨어 (Luminex Corp.)를 이용한 표준 곡선에 근거하여 계산되었다.

IL-2 ELISA 및 CD69 염색

CD4+ synNotch AND 게이트 T 세포는 24 시간 동안 앞서 설명된 바와 같이 지정된 암 세포주로 자극되고, 그리고 상층액이 수확되었다. 상층액에서 IL-2 수준은 IL-2 ELISA (eBiosciences #BMS2221HS)를 통해 결정되었다. 이들 T 세포는 또한, 이들이 활성화되는 지를 결정하기 위해 수집되고 α-CD69 APC (Biolegend #310910)로 염색되었다.

synNotch AND 게이트 T 세포 세포독성의 사정

CD8+ synNotch AND 게이트 T 세포는 24 시간 동안 앞서 설명된 바와 같이, 지정된 항원을 발현하는 표적 세포로 자극되었다. 표적 암 세포의 특정한 용해의 수준은 형질도입되지 않은 T 세포 대조로 처리와 비교하여 배양액 내에 살아있는 표적 세포의 분율을 비교함으로써 결정되었다. 세포 사멸은 라이브/데드 염색제 SYTOX Blue의 흡수, 그리고 표적 세포 (Thermo Scientific #S34857)에 의해 정상적으로 채워진 정상적인 SSC/FSC 영역을 벗어난 표적 세포의 이동에 의해 모니터링되었다.

synNotch T 세포에서 루시페라아제 리포터 활성의 시험관내 정량

α-GFP 나노바디 (LaG17) synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR IRES effluc 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소를 발현하도록 가공된 분류된 CD4+ 및 CD8+ 일차 인간 T 세포는 24 시간 동안 GFP+ 또는 GFP- K562 세포 (2x10⁵T 세포 및 2x10⁵ K562s)로 자극되었다. effluc의 생산은 ONE-glo 루시페라아제 검정 시스템 (Promega #E6110)으로 사정되었다. 생물발광은 FlexStation 3 (Molecular Devices)으로 계측되었다.

synNotch T 세포의 생체내 루시페라아제 영상

동물 연구는 UCSF Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인된 프로토콜 하에 UCSF Preclinical Therapeutics Core에서 수행되었다. T 세포 주사에 앞서 10 일에, Daudi 종양 및 표면 GFP Daudi 종양이 NOD scid 감마 (NSG) 생쥐 (암컷, 8~12 주령, Jackson Laboratory #005557)의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리 내로 피하 주사되었다. α-GFP 나노바디 (LaG17) synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR IRES effluc 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소를 발현하도록 가공된 분류된 CD4+ 및 CD8+ 일차 인간 T 세포는 종양 이식 후 10 일에 종양 보유 생쥐 내로 1:1 CD4+ 대 CD8+ T 세포 비율 (1x10⁶의 각 T 세포 유형)에서 i.v. 주사되었다. 루시페라아제 발현은 지정된 시점에서 IVIS 100 (Xenogen) 전임상 영상 시스템을 이용하여 수행된 생물발광 영상으로 11 일에 걸쳐 모니터링되었다. 이미지는 150 mg/kg D-루시페린 (Gold Technology #LUCK-100)의 i.p 주사 후 10 분에 획득되었다. 통합된 생물발광 강도의 정량은 ImageJ (NIH)에서 정량되었다.

synNotch AND 게이트 T 세포에 의한 생체내 이중 항원 종양 표적화

NSG 생쥐는 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 각각, 5x10⁶ CD19 K562s 및 GFP/CD19 K562 종양 세포가 피하 이식되었다. 종양 이식 후 4 일에, α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR 발현을 조절하는 상응하는 반응 요소로 가공된 1x10⁶일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포 (2x10⁶ 전체 T 세포), 또는 형질도입되지 않은 T 세포가 생쥐 내로 i.v. 주사되었다. 종양 크기는 T 세포 주사 후 20 일에 걸쳐, UCSF Preclinical Therapeutics Core 직원에 의해 캘리퍼스를 통해 모니터링되었다. 카플란 마이어 실험의 경우, 단일 종양이 주사된 점을 제외하고, 동일한 프로토콜이 이용되었다. 생쥐는 종양 크기가 안락사 규준 (2000 mm³)에 도달할 때 죽은 것으로 간주되었다.

통계학적 분석 및 곡선 적합

통계학적 유의성은 달리 언급되지 않으면, 스튜던트 t 검증 (양측)에 의해 결정되었다. 모든 통계학적 분석 및 곡선 적합은 Prism 6 (Graphpad)으로 수행되었고, 그리고 p 값이 보고된다 (n.s. = p > 0.05, ^* = p ≤ 0.05, ^** = p ≤ 0.01, ^*** = p ≤ 0.001, ^**** = p ≤ 0.0001). 모든 오차 막대는 S.E.M. 또는 S.D.를 나타낸다.

결과

2개 항원 AND-게이트 회로의 설계: synNotch 수용체는 CAR 발현을 유도한다

단순한 2개 수용체 AND 게이트 회로의 설계는 도면 108d에서 개설된다. T 세포는 항원 A를 인식하는 synNotch 수용체를 기저로 발현하도록 가공된다. 이에 더하여, 항원 B를 인식하는 CAR에 대한 유전자가 또한 세포 내로 삽입될 것이지만, 이것은 synNotch 유도된 전사 인자에 의한 활성화를 필요로 하는 프로모터의 제어 하에 있을 것이다 (synNotch 포용은 전사 활성화 도메인의 수용체 개열 및 방출을 유발한다, 실시예 3 참조). 따라서, synNotch 수용체가 활성화될 때까지 어떤 CAR 발현 또는 활성도 세포 내에 존재하지 않을 것이다. 이러한 순차적 수용체 활성화 회로는 설계에서 고도로 모듈식이어야 하는데, 그 이유는 양쪽 수용체의 항원 인식 성질이 세포외 도메인을 스와핑함으로써 쉽게 변화될 수 있기 때문이다.

Jurkat T 세포에서 synNotch-게이팅된 CAR 발현의 시험 - Jurkat T 세포 활성화를 위한 조합 항원 요건

CAR의 발현을 제어하기 위해 synNotch 수용체를 활용하는 이러한 방법을 시험하기 위해, Jurkat T 세포의 활성화에 대한 조합 항원 제어를 정교하게 설계하려는 시도가 있었다. 이들 실험에서 2가지 모형 종양 항원, CD19 및 메소텔린이 표적화되었다. Jurkat T 세포는 세포내 테트라사이클린-제어된 전이활성인자 (tTa) 도메인을 보유하는 α-CD19 synNotch 수용체로 가공되었다. α-메소텔린 4-1BBζ CAR 유전자는 synNotch 수용체에 의해 활성화된 상응하는 테트라사이클린 반응 요소 (TRE)를 갖는 프로모터의 제어 하에 삽입되었다 (도면 109a 및 109b). 가공된 Jurkat는 CD19, 메소텔린, 또는 양쪽 항원 둘 모두의 이소성 발현을 갖는 표적 K562 골수성 백혈병 세포와 시험관내에서 공동배양되었다 (도면 109a). 이들 가공된 Jurkat 세포가 α-CD19 synNotch 자극에 대한 응답으로 단지 α-메소텔린 CAR만을 발현하기 때문에, 이들 T 세포는 메소텔린 단독에 대한 응답으로 활성화되지 않을 것이다. 이들 T 세포가 CD19에 노출되면, α-메소텔린 CAR은 발현되고, 그리고 이들 T 세포는 활성화를 위해 점화된다 (도면 109a와 109b 및 도면 114a). 이들 T 세포는 이후, 메소텔린을 감지하고 활성화될 수 있다.

이들 세포가 시험될 때, 활성화 마커 CD69의 상향조절 및 IL-2의 분비에 의한 계측에서 단지 CD19 및 메소텔린 둘 모두를 발현하는 종양 세포에 의한 활성화만 실제로 관찰되었다 (도면 109c와 109d 및 도면 114a-114b). 어느 한쪽 단일 항원을 발현하는 종양 세포는 활성화를 야기하지 않았다. 이중 항원 자극의 경우에, Jurkat synNotch AND 게이트 T 세포는 6 시간 이내에 종양 세포에 대한 응답으로 CAR 발현을 상향조절하고 24 시간 시점까지 그들의 활성화 피크에 도달할 수 있는 것으로 보였다 (도면 114a 및 114b). T 세포 활성화 (CD69를 통해 모니터링됨)는 CAR 발현이 개시된 직후에 발생하는데, 수시간의 추가 지연이 예상된다 (도면 114b).

synNotch 유도된 CAR 발현의 동역학을 더욱 특징짓기 위해, synNotch T 세포는 점화 항원 CD19의 대용품에 노출되었다. α-CD19 synNotch 수용체가 자신의 세포외 도메인 상에 myc-태그를 갖기 때문에, 상기 수용체는 또한, α-myc 항체 코팅된 평판에 이들 세포의 노출에 의해 활성화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 활성화 접근법은 평판-결합된 항원으로부터 세포를 제거함으로써 synNotch 활성화의 신속한 휴지를 허용한다. α-myc 항체로 24 시간의 자극 후, T 세포가 이전되었고, 그리고 α-메소텔린 CAR 발현의 붕괴가 24 시간에 걸쳐 모니터링되었다. 이들 T 세포는 CAR 발현을 24 시간 시점까지, 자극되지 않은 수준으로 완전하게 하향조절하였다 (발현의 반감기 = 8 시간) (도면 114c 및 114d).

인간 일차 T 세포에서 SynNotch-게이팅된 CAR 발현 - T 세포 활성화 및 종양 사멸에 대한 조합 항원 제어

Jurkat T 세포에서 synNotch AND 게이트의 성공을 고려하여, 동일한 유형의 synNotch-주동된 CAR 발현 회로가 일차 T 세포에서 복수 항원을 구별하는데 기능할 수 있는 지가 시험되었다. 상이한 synNotch Gal4VP64 수용체의 스펙트럼이 일차 T 세포에서 충분히 발현되고, 그리고 Gal4 반응 요소가 일차 T 세포에서 최소 기저 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것은 synNotch 주동된 CAR 발현 AND 게이트에 대한 이상적인 시나리오인데, 그 이유는 T 세포가 synNotch 항원을 감지할 때까지 활성화 CAR의 어떤 기저 발현도 없어야 하기 때문이다.

이러한 접근법의 원리 증명으로서, α-CD19 4-1BBζ CAR의 발현을 주동하는 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 수용체 (표면 발현된 GFP를 인식한다) (도면 110a)가 활용되었다. 이러한 모형 셋업을 선택하는 것에 대한 이론적 근거는 α-CD19 CAR이 면역요법의 분야에서 최적 표준이고, 그리고 이것이 생체내에서 강력한 종양 제거를 보여준다는 것이다.

인간 일차 CD4+ T 세포는 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되고, 이후 CD19 단독, GFP 단독, 또는 GFP 및 CD19를 발현하는 K562 표적 세포에 노출되었다. CD4+ T 세포는 synNotch 리간드, GFP를 발현하는 세포로 자극될 때, 단지 α-CD19 4-1BBζ CAR의 발현만을 전시하였다 (도면 110b). 게다가, 이들 T 세포는 사이토킨 생산에 의해 검정될 때, 그들의 표면 상에서 양쪽 항원, GFP 및 CD19를 발현하는 표적 세포에 노출될 때에만 활성화를 보여주었다 (도면 110b 및 110c).

동일한 이중 수용체 회로를 내포하는 인간 일차 CD8+ 세포 역시 AND 게이트 행동을 보여주었는데, GFP 및 CD19가 표적 세포 표면 상에 존재할 때에만 표적을 사멸시켰다 (도면 110d-110f). 따라서, synNotch AND 게이트는 인간에서 T 세포 면역요법에 필요한 결정적인 세포 유형에서 기능적이다. 이러한 접근법의 융통성 및 모듈성을 증명하기 위해, 3가지 다른 synNotch/CAR AND 게이트 형상이 시험되었다. 이들 모두 CD4+ 및 CD8+ T 세포 활성화를 위한 조합 항원 요건을 증명하였다 (도면 115a - 115i).

synNotch 수용체는 생체내에서 종양 국부화된 CAR 발현을 주동한다

synNotch 수용체가 시험관내에서 일차 T 세포에서 CAR 발현을 확실하게 게이팅하기 때문에, T 세포가 synNotch 수용체를 통해 생체내에서 종양에 표적화되고, 그리고 종양 미세환경에 있을 때에만 CAR을 발현할 수 있는 지가 시험되었다. 이러한 실험을 위해, 양측성 이종이식 CD19 Daudi B 세포 림프모구 종양이 면역손상된 NOD scid IL-2Rγ ^-/- (NSG) 생쥐 내로 주사되었다. 야생형 Daudi 세포 (synNotch 리간드를 내포하지 않음)는 왼쪽 옆구리에 피하 주사되고, 반면 표면 GFP를 발현하는 Daudi 종양 세포는 오른쪽 옆구리에 주사되었다. 이식되도록 10 일 동안 종양을 제공한 후, α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR와 IRES 증강된 개똥벌레 루시페라아제 (effluc) 리포터의 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소가 구비된 일차 CD4+ 및 CD8+ 인간 T 세포 (도면 116a 및 116b)가 주사되었다. 루시페라아제 발현은 11 일의 코스에 걸쳐 CAR 발현에 대한 리포터로서 모니터링되었다 (도면 111a, 도면 116c). 이들 T 세포는 1 일자 시점까지 GFP+ Daudi 종양에서 선별적으로 CAR을 발현하기 시작하고, 그리고 이중 항원 종양에서 11 일 기간에 걸쳐 CAR의 국부 발현을 끊임없이 증가시켰다 (도면 111b 및 111c). 표적 종양에서 루시페라아제 신호의 증가는 아마도 이중 항원 표적 종양에서 세포의 synNotch-주동된 CAR 발현 및 확대의 조합이다 (도면 116b). 루시페라아제의 증가는 대조 GFP- 종양에서 전혀 관찰되지 않았다.

synNotch 게이팅된 CAR 발현에 의한 생체내에서 고도로 선별적인 조합 항원 종양 제거

α-GFP synNotch 수용체는 T 세포를 종양으로 표적화하고 α-CD19 CAR의 국부 발현을 제어할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이후, synNotch AND 게이트 T 세포가 생체내에서 이중 항원 종양을 선별적으로 제거할 수 있는 지가 시험되었다. 이들 실험을 위해, 유사한 양측성 종양 모형이 K562 종양 세포로 설정되었다 (도면 112a 및 도면 117a와 117b). 종양은 이식되고, 그리고 이식을 위해 4 일이 허용되었다 (K562 종양은 Daudi 세포와 비교하여 더욱 급속히 성장하고 큰 종양을 확립한다). 4 일자에, α-GFP synNotch→α-CD19 CAR AND 게이트 회로를 보유하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 주사되었고, 그리고 종양 성장이 20 일 동안 캘리퍼스를 통해 모니터링되었다 (도면 112a). 일군의 생쥐는 종양 성장에 대한 참조를 확보하기 위해, 형질도입되지 않은 대조 T 세포로 처리되었다. 이러한 실험에서, 이들 T 세포는 동일한 동물 내에서 이중 항원 "질환" 종양을 단일 항원 "방관자" 조직으로부터 구별하기 위해 직접적으로 도전되었다.

synNotch AND 게이트 T 세포는 동일한 동물 내에 존재하는 이들 두 종양에 대항하여 두드러지게 높고 재현가능한 차별적인 작용을 전시하였다. 모든 동물에서 이들은 단일 항원 "방관자" 종양 (CD19+ 단독)을 비섭동된 상태로 남겨두면서, 이중 항원 "질환" 종양 (GFP/CD19+)을 선별적으로 제거하였다. 이들 방관자 단일 항원 종양은 형질도입되지 않은 T 세포로 처리된 음성 대조 종양과 유사한 비율에서 성장하였다 (도면 112b, 112c, 117b). 따라서 "방관자" 단일 항원 종양의 부정확한 사멸은 거의 검출되지 않는다.

단일 종양 실험이 설정되었는데, 여기서 생쥐는 단일 항원 (CD19+ 단독) 또는 이중 항원 (GFP/CD19+) K562 종양이 이식되었다. 이들 생쥐는 이후, synNotch AND 게이트 T 세포 또는 형질도입되지 않은 대조 T 세포로 처리되었다. 대조 T 세포로 처리된 생쥐 모두 종양 유형에 상관없이 안락사 규준에 급속히 도달하였다. synNotch AND 게이트 T 세포로 처리된, GFP/CD19 종양을 보유하는 생쥐 모두 생존하였고, 그리고 종양이 종양 주입 후 25 일자 시점까지 완전하게 소실되었다 (도면 112d). synNotch AND 게이트 T 세포로 처리된, CD19 단독 종양을 보유하는 생쥐는 형질도입되지 않은 T 세포로 처리된 생쥐와 동일한 비율에서 안락사 규준에 도달하였는데, 이것은 단일 항원 종양의 부정확한 사멸이 없다는 것을 암시한다 (도면 112d). 이들 생체내 데이터는 synNotch-게이팅된 CAR 발현은 T 세포가 그들의 활성을 종양 미세환경으로만 한정하고, 그리고 복수 항원에 대한 응답으로만 활성화되고 사멸 작용을 하도록 허용하는 효과적인 AND 게이트라는 것을 집합적으로 보여준다.

한 가지 우려 사항은 AND-게이트 T 세포가 synNotch 리간드 (GFP)를 발현하는 종양을 포용하고, a-CD19 CAR을 발현함으로써 점화되고, 이후 다른 곳으로 이주하여 단일 항원 (CD19+ 단독) 방관자 조직을 사멸시킬 수 있는 지의 여부이다. 이것을 시험하기 위해, 실험이 양측성 종양 모형으로 수행되었는데, 다만 이 경우에 있어서 CD19+ 단독 세포를 보유하는 한 가지 종양 및 GFP+ 단독 세포를 보유하는 다른 종양 (다시 말하면, 2가지 단일 항원 종양)이 이용되었다 (도면 117d). 이들 생쥐에서, T 세포가 GFP+ 단독 종양에 의해 점화되고, 이후 CD19+ 단독 종양을 사멸시키는 것이 가능할 것이다. CD19+ 종양의 성장이 AND 게이트 세포를 이용하여 모니터링될 때, 이것은 음성 대조 T 세포 (형질도입되지 않음)로 처리될 때 관찰된 성장과 동일한 것으로 밝혀졌다. 따라서, AND 게이트 T 세포의 점화 및 다른 곳에서 방관자 CD19+ 세포의 차후 사멸에 대한 어떤 증거도 없는 것으로 보인다. 이들 AND 게이트 T 세포에서, 유도된 CAR 발현의 붕괴 비율은 아마도 점화 종양을 벗어난 이주의 비율보다 빠르거나 또는 이에 필적하는 것으로 가정되었는데, 이것은 고도의 국부 이중 항원에 대한 요건을 설명할 것이다.

도면 108. T 세포에서 조합 항원 감지를 위한 synNotch 수용체

(a) CAR 또는 종양 특이적 TCR T 세포는 일반적으로 단일 항원을 표적으로 하고, 따라서 부정확한 조직 손상을 종종 유발한다. 향상된 치료적 T 세포는 종양 항원 및 조직 특이적 항원 둘 모두의 조합을 인식하여, 이들 세포가 그들의 환경을 사정하고 활성화하는 시기에 대한 더욱 정확한 결정을 내리도록 허용하는 복수 센서를 필요로 할 것이다. 이런 치료적 세포는 표적 병든 조직을 정상적인 조직으로부터 식별하는데 더욱 우수하게 준비될 것이다. (b) 항원의 조합을 감지하고 T 세포 신호전달 및 전사를 조절하는 새로운 유형의 수용체는 정교한 세포 의사 결정 및 더욱 정확한 치료적 T 세포 반응을 허용하도록 만들어져야 한다. (c) synNotch 수용체는 맞춤 세포외 리간드-결합 도메인, 예를 들면, 관심되는 항원 (가령, 종양 또는 조직 특이적 항원)에 대해 지향된 scFv 또는 나노바디로 가공된다. synNotch 수용체에 의한 리간드 인식 시에, 직교 전사 인자 (가령, TetRVP64 또는 Gal4VP64)는 맞춤 유전자 회로를 조절하는 세포질 꼬리로부터 개열된다. (d) T 세포가 2가지 항원을 감지하여 활성화되는 것을 필요로 하는 synNotch AND-게이트 회로의 설계. 이러한 AND-게이트 신호전달 회로는 2가지 순차적 단계에서 작동한다: 1) synNotch 수용체는 T 세포가 첫 번째 항원 A를 인식하도록 허용하고, 그리고 2) T 세포는 두 번째 종양 항원 B에 대해 지향된 CAR을 발현한다. A 및 B가 존재하면, T 세포는 활성화되고 표적 종양을 사멸시킬 수 있다.

도면 109. synNotch-게이팅된 CAR 발현 - Jurkat T 세포 활성화를 위한 조합 항원 요건

(a) 2 수용체 AND-게이트 회로의 가공: α-CD19 synNotch 수용체는 α-메소텔린 CAR 발현을 유도한다. (b) Jurkat T 세포는 α-CD19 synNotch tTa 수용체 및 α-메소텔린 CAR 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되었다. Jurkat T 세포는 CAR 발현을 개시하기 위해, 먼저 그들의 synNotch 수용체를 통해 표적 종양 상에 CD19를 인식해야 한다. T 세포가 CD19에 의해 점화되어 활성화된 후, α-메소텔린 CAR은 메소텔린에 결합하고 Jurkat 세포를 활성화시킬 수 있다. T 세포 활성화의 2가지 정준 마커는 CD69 상향조절 및 IL-2 생산이다. synNotch AND 게이트 Jurkat T 세포는 CD19 및 메소텔린 둘 모두를 발현하는 표적 종양 세포에 노출될 때에만 활성화될 것이다. (c) 48 시간 동안 단일 항원 (메소텔린 단독) 또는 이중 항원 (CD19/메소텔린) K562 종양 세포와 공동배양된 synNotch AND 게이트 Jurkat T 세포에서 활성화 마커 CD69의 히스토그램. CD69는 T 세포가 이중 양성 K562s에 노출될 때에만 발현되었다 (3회 독립된 실험의 대표). (d) 이중 항원 K562s에 노출될 때에만 synNotch AND-게이트 Jurkat에 의한 IL-2 생산을 보여주는 IL-2 ELISA (n=3, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성, ^**** = p ≤ 0.0001)

도면 110. 인간 일차 T 세포에서 synNotch 게이팅된 CAR 발현 - 치료적 T 세포 활성화 및 종양 사멸에 대한 조합 항원 제어

(a) 인간 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR의 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되었다. 이들 CD4+ 또는 CD8+ synNotch AND 게이트 T 세포는 먼저, 그들의 synNotch 수용체를 통해 표면 GFP를 감지해야 하고, 그리고 그 이후에만 이들은 α-CD19 CAR을 발현하고 점화되어 활성화된다. synNotch AND 게이트 일차 T 세포는 이들이 GFP 및 CD19 둘 모두를 감지하는 경우에만 활성화되고 사이토킨을 생산하거나 또는 표적 세포를 사멸시킬 것이다. (b) 패널 A에서 설명된 일차 CD4+ synNotch AND 게이트 T 세포는 CD19 단독 또는 표면 GFP/CD19 K562s와 공동배양되었다. α-CD19 CAR GFP 수용체 발현 수준의 히스토그램은 GFP가 표적 세포의 표면 상에 존재할 때에만 CAR이 발현된다는 것을 보여준다 (최소한 3회 독립된 실험의 대표). (c) CD19 단독 또는 GFP/CD19 K562s에 의해 활성화된 CD4+ synNotch AND 게이트 T 세포로부터 상층액은 Luminex를 통해 25가지 사이토킨의 존재에 대해 분석되었다. 사이토킨은 T 세포가 GFP/CD19 T 세포에 노출될 때에만 생산되었다 (오차 막대는 SEM이다, n=3). (d) CD8+ synNotch AND 게이트 일차 T 세포는 패널 A에서 설명된 바와 같이 가공되었다. CD4+ T 세포에서처럼, α-CD19 CAR GFP 수용체 발현 수준의 히스토그램은 GFP가 표적 세포의 표면 상에 존재할 때에만 CAR이 발현된다는 것을 보여준다 (최소한 3회 독립된 실험의 대표). (e) CD8+ synNotch AND 게이트 일차 T 세포 및 CD19 단독 또는 GFP/CD19 종양 세포의 24 시간 공동배양 후 전방 및 측면 산란 유세포분석법 플롯. T 세포는 청색 게이트 범위에 들어가고, 그리고 표적 K562s는 적색 게이트에 있다. synNotch AND 게이트 T 세포는 K562 게이트에서 세포의 감소에 의해 도시된 바와 같이, 단지 GFP/CD19 K562s만을 사멸시켰다 (3회 실험의 대표). (f) 패널 E에서 도시된 복제 CD8+ synNotch AND 게이트 일차 T 세포 세포독성 데이터의 정량. (n=3, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^* = p ≤ 0.05).

도면 111. synNotch 수용체는 생체내에서 종양 국부화된 CAR 발현을 주동한다.

(a) 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR IRES effluc 발현을 조절하는 상응하는 반응 요소로 가공되고, 그리고 왼쪽 옆구리에 Daudi 종양 (CD19 단독) 및 오른쪽 옆구리에 표면 GFP Daudi (GFP/CD19) 종양이 생쥐 내로 i.v. 주사되었다. 루시페라아제 발현은 가공된 T 세포의 i.v. 주사 후 11 일에 걸쳐 모니터링되었다. (b) T 세포 주사 후 7 일자에 패널 A에서 설명된 바와 같이 처리된 생쥐에서 루시페라아제 발현의 대표적인 이미지. 루시페라아제 발현은 GFP/CD19 종양에서만 높았는데, 이것은 이중 항원 종양에서 국부화된 CAR 발현을 지시한다 (n=2마리 생쥐). (c) 왼쪽 옆구리 Daudi 종양 (CD19 단독)에서 및 오른쪽 옆구리 표면 GFP Daudi 종양 (GFP/CD19)에서 루시페라아제 수준의 통합된 강도의 정량. 루시페라아제 발현은 모든 시점에서 이중 항원 종양에서 강화된다 (오차는 SD n=2).

도면 112. synNotch 게이팅된 CAR 발현에 의한 생체내에서 선별적 조합 항원 종양 사멸

(a) 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR 발현을 조절하는 상응하는 반응 요소로 가공되고, 그리고 왼쪽 옆구리에 CD19 K562s 및 오른쪽 옆구리에 표면 GFP/CD19 K562 종양이 생쥐 내로 i.v. 주사되었다. 종양 크기는 가공된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포 대조의 i.v. 주사 후 16 일에 걸쳐 모니터링되었다. (b) synNotch AND 게이트 T 세포 (위쪽) 및 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (아래쪽)로 처리된 생쥐에 대한 CD19 및 GFP/CD19 종양 체적을 보여주는 그래프. synNotch AND 게이트 T 세포는 이중 항원 종양을 배타적으로 표적으로 하고, 그리고 CD19 단독 종양은 형질도입되지 않은 대조 T 세포로 처리된 생쥐에서와 동일한 비율에서 성장하였다 (n=5마리 생쥐, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^** = p ≤ 0.01, ^*** = p ≤ 0.001). (c) synNotch AND 게이트 T 세포로 처리된 개별 생쥐에 대한 종양 체적 계측. 모든 생쥐는 이중 항원 종양의 선별적 사멸을 보여주었다. (d) synNotch AND 게이트 T 세포가 생존 생쥐 중에서 100%에서 GFP/CD19 종양을 제거한다는 것을 보여주는 카플란 마이어 그래프. CD19 단독 종양을 보유하는 생쥐는 synNotch AND 게이트 T 세포에 의해 제거되지 않고 통제되지 않는 종양 성장을 갖는다. 상응하는 종양 성장 곡선이 패널 D의 오른쪽에 제공된다 (n=5마리 생쥐, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^** = p ≤ 0.01).

도면 113. synNotch 수용체는 정밀 면역요법을 위해 CAR T 세포 반응을 제어하고 국부화한다.

(a) T 세포는 종양 항원을 감지하고 두 번째 항원에 대한 CAR의 발현을 상향조절하는 synNotch 수용체로 가공되었다 (생산하도록 유전적으로 변형됨). 따라서, 이들 synNotch AND 게이트 T 세포는 단지 종양 미세환경에서 조합 항원 인식에 대한 응답으로만 활성화되어, 단일 항원 인식에 의해 매개된 부정확한 독성을 예방한다. (b) 단일 항원을 표적으로 하는 치료적 T 세포와 달리 synNotch AND 게이트 T 세포는 조합 항원 표적을 단일 항원 방관자 조직으로부터 확실하게 구별할 수 있다. synNotch-CAR T 세포에 의한 조합 항원 감지는 T 세포를 종양에 정확하게 표적화하여 부정확한 독성을 예방하는데 보조할 수 있었다. (c) 표적화가능 항원 공간의 확대. 종양 특이적 항원은 종양-연관된 항원 (정상적인 조직에서 발현되긴 하지만, 종양에서 더욱 고도로 발현되는 항원)과 비교하여 희유하다. CAR이 T 세포를 완전히 활성화시켜 표적 조직의 사멸을 유발하기 때문에, 단일 CAR T 세포는 치명적인 부정확한 독성을 감소시키기 위해 종양 특이적 항원에 표적화되어야 한다 (위쪽 벤 다이어그램). synNotch 수용체는 CAR 발현을 게이팅하고 T 세포가 무장되는 곳을 제어할 수 있다. 종양 특이적 항원 조합을 표적으로 할 때, 종양-연관된 항원에 대해 지향된 CAR 수용체를 이용하는 것이 가능해질 수 있게 된다. 이것은 다른 신체 부위에서 CAR 항원을 발현하는 조직에 대한 부정확한 손상을 감소시킬 것이다.

도면 114. synNotch-게이팅된 CAR 발현 - Jurkat T 세포 활성화를 위한 조합 항원 요건.

(a) GFP에 융합된 α-메소텔린 CAR의 발현을 제어하는 α-CD19 synNotch Jurkat T 세포는 Meso 단독 또는 CD19 및 Meso+ K562s와 함께 48 시간 동안 배양되었다. α-메소텔린 CAR GFP 수준의 히스토그램은 Jurkat가 CD19에 노출될 때에만 CAR이 발현된다는 것을 보여준다. (b) 패널 A 및 도면 2b에서 히스토그램으로부터 계산된 정규화된 α-메소텔린 CAR GFP 및 CD69 수준의 플롯. CAR 및 CD69의 최대 발현에 대한 반감기는 각각, 6 시간 및 13 시간이었다. (c) synNotch AND 게이트 Jurkat T 세포는 synNotch 수용체의 세포외 도메인 상에 myc-태그에 결합하는 평판-결합된 α-myc 항체로 24 시간 동안 자극되었다. 24 시간 후, 이들 세포는 α-myc 자극으로부터 제거되었고, 그리고 CAR 발현이 24 시간 동안 모니터링되었다. (d) synNotch 자극의 제거 후 α-메소텔린 CAR GFP 발현의 히스토그램. 정규화된 CAR은 플롯팅되고, 그리고 8 시간 반감기의 하향조절을 보여주는 1-위상 붕괴에 적합된다.

도면 115. 인간 일차 T 세포에서 synNotch 게이팅된 CAR 발현 - 치료적 T 세포 활성화 및 종양 사멸에 대한 조합 항원 제어

(a) CD4+ 일차 T 세포는 α-CD19 synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-메소텔린 4-1BBζ CAR EGFP 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되었다. 이들 T 세포는 이후, 메소텔린 단독, CD19 단독, 또는 CD19/메소텔린 K562s와 24 시간 동안 공동배양되었고, 그리고 CD69 상향조절 및 IL-2 생산이 검정되었다. (b) 패널 A에서 설명된 바와 같이 배양된 CD4+ synNotch 일차 T 세포에서 α-메소텔린 CAR EGFP 수준 및 CD69 수준을 보여주는 히스토그램. α-메소텔린 CAR은 CD19가 표적 K562s 상에 있을 때에만 발현되었고, 그리고 이들 T 세포는 CD19 및 메소텔린 둘 모두 표적 K562s 상에 있을 때에만 활성화 마커 CD69를 발현하였다 (3회 실험의 대표). (c) 패널 A에서 설명된 배양액으로부터 수확된 상층액으로부터 IL-2 수준. IL-2은 이들 T 세포가 CD19 및 메소텔린 둘 모두를 발현하는 표적 세포에 노출될 때에만 생산되었다 (n=3, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 의해 결정된 유의성 ^*** = p ≤ 0.001). (d) CD8+ 일차 인간 T 세포는 패널 A에서 설명된 바와 같이 가공되었다. CD8+ T 세포의 경우, 메소텔린 단독, CD19 단독, 또는 CD19/메소텔린 표적 K562s의 특정한 세포독성이 결정되었다. synNotch AND 게이트 CD8+ T 세포는 단지 이중 양성 K562s만을 사멸시킬 것이다. (e) 패널 A에서 설명된 바와 같이 배양된 CD8+ synNotch 일차 T 세포에서 α-메소텔린 CAR EGFP 수준을 보여주는 히스토그램. α-메소텔린 CAR은 CD19가 표적 K562s 상에 있을 때에만 발현되었다 (3회 실험의 대표). (f) CD19 및 메소텔린 둘 모두의 발현을 갖는 표적 K562s의 특정한 사멸을 보여주는 복제 CD8+ synNotch AND 게이트 일차 T 세포 세포독성의 정량 (n=3, 오차 막대는 SEM이다, ^*** = p ≤ 0.001). (g) CD4+ 일차 T 세포는 α-GFP 나노바디 synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-메소텔린 4-1BBζ CAR EGFP 발현을 제어하는 상응하는 반응 요소로 가공되었다. 이들 T 세포는 이후, 메소텔린 단독, GFP 단독, 또는 GFP/메소텔린 K562s와 24 시간 동안 공동배양되었고, 그리고 CD69 상향조절 및 IL-2 생산이 검정되었다. (h) 패널 G에서 설명된 바와 같이 배양된 CD4+ synNotch 일차 T 세포에서 α-메소텔린 CAR EGFP 수준 및 CD69 수준을 보여주는 히스토그램. α-메소텔린 CAR은 GFP가 표적 K562s 상에 있을 때에만 발현되었고, 그리고 이들 T 세포는 GFP 및 메소텔린 둘 모두 표적 K562s 상에 있을 때에만 활성화 마커 CD69를 발현하였다 (3회 실험의 대표). (i) 패널 G에서 설명된 배양액으로부터 수확된 상층액으로부터 IL-2 수준. IL-2는 이들 T 세포가 GFP 및 메소텔린 둘 모두를 발현하는 표적 세포에 노출될 때에만 생산되었다 (n=3, 오차 막대는 SEM이다, ^**** = p ≤ 0.0001).

도면 116. synNotch 수용체는 생체내에서 종양 국부화된 CAR 발현을 주동한다.

(a) 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR IRES effluc를 조절하는 상응하는 반응 요소의 발현을 보여주는 대표적인 반점 플롯. 적색 상자에 의해 개설된 T 세포는 분류되고 생체내 및 시험관내 실험에 이용되었다. (b) GFP- 또는 GFP+ K562s로 24 시간 동안 노출 후 패널 A로부터 synNotch AND CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 루시페라아제 활성을 보여주는 막대 그래프. 루시페라아제는 GFP에 대한 응답으로 특이적으로 발현되었다 (n=3, 오차 막대는 SEM이다, ^**** = p ≤ 0.0001). (c) 종양 성장 곡선은 도면 4c에서 분석된 생쥐에 대해 제공된다.

도면 117. synNotch 게이팅된 CAR 발현에 의한 생체내에서 선별적 조합 항원 종양 사멸

(a) 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR을 조절하는 상응하는 반응 요소의 발현을 보여주는 대표적인 가공된 반점 플롯. 적색 상자형 사분면에 의해 개설된 T 세포는 분류되고 도면 112에서 실험에 이용되었다. (b) 시험관내 및 생체내 실험에 활용된 K562s에서 CD19 (자주색) 및 GFP와 CD19 (녹색)의 발현을 보여주는 유세포분석법 플롯. (c) 대조 형질도입되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 처리된 양측성 CD19 (왼쪽 옆구리) 및 GFP와 CD19 (오른쪽 옆구리) 종양을 갖는 개별 생쥐에 대한 종양 성장 곡선. 상기 데이터는 도면 5b 아래쪽 패널의 기초가 된다. (d) 일차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 α-GFP synNotch Gal4VP64 수용체 및 α-CD19 4-1BBζ CAR 발현을 조절하는 상응하는 반응 요소로 가공되고, 그리고 이들 T 세포가 GFP+ '점화 종양'으로부터 이주하고 부정확한 CD19 단독 종양을 사멸시키는 지를 시험하기 위해, 왼쪽 옆구리에 CD19 K562s 및 오른쪽 옆구리에 표면 GFP K562 종양이 생쥐 내로 i.v. 주사되었다. 종양 크기는 가공된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포 대조의 i.v. 주사 후 16 일에 걸쳐 모니터링되었다. (e) synNotch AND 게이트 T 세포 (실선) 또는 형질도입되지 않은 대조 T 세포 (점선)로 처리된 생쥐에 대한 CD19 종양 체적을 보여주는 그래프. CD19 종양은 표적화되지 않는데, 이것은 GFP+ 종양으로부터 점화된 T 세포의 이주가 없다는 것을 암시한다 (n=5, 오차 막대는 SEM이다, 스튜던트 t 검증에 근거하여 임의의 시점에서 유의미한 차이 없음, p>0.05).

실시예 6: 인간 CD4 T 세포에서 Foxp3의 SynNotch 유도된 발현

Foxp3의 직접적인 세포내 염색이 항-CD19 synNotch를 발현하는 인간 CD4 T 세포에서 Foxp3 유도를 계측하는데 이용되었다. 항-CD19 synNotch 발현 CD4 T 세포는 CD19+ (CD19 양성) K562 세포 또는 CD19- (CD19 음성) K562 세포로 자극되었다. Foxp3은 CD19+ K562 세포로 자극될 때 CD19 synNotch 세포에서 유도되었다 (도면 118, "cN Foxp3 + stim K562"). 대조적으로, CD19 synNotch 세포가 CD19- K562 세포로 자극될 때에는 유도가 목격되지 않았다 (도면 118, "cN Foxp3 + 무관한 K562"). 형질도입되지 않은 세포는 음성 대조로서 이용되었다 (도면 118, "형질도입되지 않음").

CD19 반응성 SynNotch를 이용한, 조절 T 세포의 발달 및 기능에서 조절 경로의 마스터 조절인자인 Foxp3의 유도는 조절 T 세포 운명의 국부 항원 주동된 유도를 증명한다.

실시예 7: 항-CD19 synNotch 발현 CD4 T 세포에 의한 제어된 항체 생산

인간 T 세포 synNotch 유도된 항체 분비를 위한 항체 발현 구조체가 설계되었다. 전반적인 항체 구조체 설계를 보여주는 계통도는 도면 119에서 제공된다. 도면 119에서, 왼쪽에서 오른쪽으로, 전반적인 구조체 설계의 도메인은 인간 IgG 중쇄 신호 펩티드, Myc 태그, VH 도메인, CH 도메인, 퓨린 개열 부위, SGSG 스페이서, T2A 서열, 인간 IgG 경쇄 신호 펩티드, HA 태그, VL 도메인 및 CL 도메인이다. 다음의 항체의 synNotch 유도된 분비를 위한 구조체가 설계되었다: 펨브로리주맙 (항-PD-1), 트레멜리무맙 (항-CTLA4) 및 9E10 (항-myc).

SynNotch 유도된 항체 분비를 시험하는데 이용된 시험관내 검정을 위한 전반적인 계획은 도면 120에서 제공된다. 간단히 말하면, CD4 T 세포는 활성화될 때, 도입된 항체 구조체로부터 발현 (가령, 도면 119를 참조한다) 및 항체의 차후 분비를 주동하는 항-CD19 synNotch 구조체로 형질도입되었다. 상기 항체 구조체의 발현은 항-CD19 synNotch 세포내 도메인, 이 경우에 있어서 tTA 세포내 도메인에 의해 활성화된다. 이러한 검정에서, 이런 형질도입된 T 세포는 CD19 발현 (CD19+; "synNotch 리간드+"로서 또한 지칭됨) K562 표적 세포 또는 형질도입되지 않은 (CD19-) K562 표적 세포와 접촉되었다. 형질도입된 CD4 T 세포 및 이들 K562 표적 세포는 배양 상층액의 수집에 앞서 24, 48 및 72 시간 동안 공동배양되었다.

항-CD19 synNotch CD T 세포에 의해 분비된 항체는 세포 표면 "샌드위치 ELISA" 유세포분석법 검정에 의해 정량되었다 (도면 121을 참조한다). 간단히 말하면, 항체 리간드를 발현하는 세포 ("항체 리간드+ 표적 세포"), 다시 말하면, 펨브로리주맙 항체 검정의 경우에 PD-1을 발현하는 세포는 10 분 인간 Fc 차단에 종속되었다. 차단 이후에, CD19+ 또는 CD19- 표적 세포 공동배양으로부터 50 μl의 계열 희석된 상층액이 첨가되고 이들 세포와 함께 30 분 동안 배양되었다. 일차 항체 배양 이후에, 이들 세포는 3회 세척되었고, 그리고 50 μl의 형광 접합된 이차 항체가 첨가되었다. 본 사례에서, 항-myc-AF647이 이차 항체로서 이용되었고, 그리고 이차 배양이 30 분 동안 수행되었다. 이차 항체와 함께 배양 이후에, 이들 세포는 3회 세척되고, 그리고 이후, BD LSR II 유세포분석기를 이용한 분석에 종속되었다.

펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch T 세포에 대한 이러한 분석의 결과는 도면 122에서 제공된다. 도면 122에서 위쪽에서 아래쪽으로, 결과는 다음의 시험 군에 상응한다:

군	자극	일차 배양	공동배양 시간
1	CD19+ K562 세포	리간드+ K562 상층액	72 시간
2	CD19- K562 세포	형질도입되지 않은 K562 상층액	72 시간
3	CD19+ K562 세포	리간드+ K562 상층액	48 시간
4	CD19- K562 세포	형질도입되지 않은 K562 상층액	48 시간
5	CD19+ K562 세포	리간드+ K562 상층액	24 시간
6	CD19- K562 세포	형질도입되지 않은 K562 상층액	24 시간
7	해당사항 없음	PBS	해당사항 없음

PD-1 발현 표적 세포는 CD19 발현 K562 세포와 공동배양된 항-CD19 synNotch T 세포로부터 상층액 ("리간드+ K562 상층액")과 함께 배양될 때 높은 항-myc-AF674 이차 염색을 보여주었는데, 이것은 공동배양 시간 (24 시간, 48 시간 및 72 시간)이 증가함에 따라서 증가하였다. 대조적으로, PD-1 발현 표적 세포는 형질도입되지 않은 (CD19-) K562 세포와 공동배양된 항-CD19 synNotch T 세포로부터 상층액 ("형질도입되지 않은 K562 상층액")과 함께 배양될 때 낮은 항-myc-AF674 이차 염색을 보여주었다.

본 데이터는 항-CD19 synNotch T 세포가 이종성 펨브로리주맙 항체를 발현하고 분비하도록 CD19 발현 (CD19+) K562 세포에 의해 유도되었다는 것을 증명한다. 상응하게는, 항-CD19 synNotch T 세포는 형질도입되지 않은 K562 세포와 공동배양될 때 펨브로리주맙을 분비하도록 유도되지 않았다. 도면 139는 대안적 발현 구조체, UAS_Prembro_IRES_mC_pGK_tBFP로 펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch CD4 T 세포의 유사한 분석의 결과를 제공한다. 도면 140은 도면 138의 구조체를 이용하여 펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch E6-1 Jurkat 세포의 유사한 분석의 결과를 제공한다. 도면 141은 도면 139의 대안적 구조체를 이용하여 펨브로리주맙을 분비하도록 변형된 SynNotch E6-1 Jurkat 세포의 유사한 분석의 결과를 제공한다. 도면 142 및 도면 143은 각각, UAS_트레멜리무맙_pGK_mC 발현 구조체로 트레멜리무맙 (항-CLTA4)을 분비하도록 변형된 SynNotch CD4 T 세포 및 E6-1 Jurkat 세포의 유사한 분석의 결과를 제공한다. 도면 139-143에서 제공된 각 열의 데이터는 상기 표 1에서 제공된 군에 전반적으로 상응한다.

따라서, SynNotch는 인간 CD4 T 세포에서 이종성 항체의 생산을 유도하는데 이용될 수 있는데, 여기서 상기 항체는 SynNotch 세포가 상응하는 항원 (가령, CD19)에 의해 자극될 때에만 생산된다. 따라서, 한 구체예에서, SynNotch 시스템은 특정한 표적 항원의 인식에 대한 응답으로 치료 항체의 국부 생산을 주동하는데 이용될 수 있다.

실시예 8: 어댑터 분자로 분할 SynNotch 조정

GFP의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항-GFP 나노바디를 갖는 분할 SynNotch 신호전달 시스템이 작제되었는데, 여기서 한 나노바디 ("LaG2")는 "앵커 세포"에서 발현되고, 다른 나노바디 ("LaG17")는 SynNotch 수용체의 부분으로서 "수신자 세포"에서 발현되고, 그리고 GFP는 가용성 어댑터로서 역할을 한다 (도면 123을 참조한다). LaG17 나노바디 SynNotch 수용체는 활성화 시에, TRE 발현 구조체로부터 mCherry 리포터의 발현을 유도하는 tTa 세포내 도메인을 갖도록 가공되었다. 따라서, 설계된 분할 SynNotch 시스템에서 가용성 어댑터 분자 (다시 말하면, GFP)의 부가는 앵커 세포의 존재에서만 수신자 세포에서 SynNotch 신호전달을 유도한다.

설명된 분할 SynNotch 시스템의 성분은 공동배양 동안 그들의 상응하는 세포에서 발현되었다. 구체적으로, 표면 결합된 LaG2 항-GFP 나노바디는 L929 세포 (다시 말하면, "앵커 세포")에서 발현되었고, 그리고 세포외 LaG17 항-GFP 나노바디 및 세포내 tTa를 갖는 SynNotch는 TRE/mCherry 발현 리포터 카세트를 갖는 "수신자 세포"에서 발현되었다. 음성 대조로서, 수신자 세포는 표면 결합된 LaG2 (다시 말하면, "앵커")를 발현하지 않는 L929 세포와 공동배양되었다. GFP가 일련 농도 (0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM 및 1000 nM)에서 공동배양 배지에 첨가되었고, 그리고 수신자 세포 활성화의 징조로서 mCherry 발현이 유세포분석법에 의해 정량되었다.

수신자 세포 활성화는 LaG2 발현 앵커 세포의 존재에서만 관찰되었고, 그리고 mCherry 발현은 GFP "어댑터" 용량 의존성이었다 (도면 124를 참조한다). LaG2를 발현하는 L929 앵커 세포와 공동배양된 수신자 세포에 첨가된 0 nM 정제된 GFP에서 이들 수신자 세포는 "오프" 상태로 남아있었다 (다시 말하면, mCherry 발현이 L929 음성 대조 세포와 공동배양된 수신자 세포의 것과 본질적으로 동일하고, 그리고 2개의 피크가 겹친다). 증가하는 농도의 정제된 가용성 GFP에서, 활성화 (mCherry 발현에 의해 지시된 바와 같이)는 LaG2를 발현하는 L929 앵커 세포와 공동배양된 수신자 세포에서 관찰되었다 (0.1 nM, 1 nM, 10 nM 및 1000 mM GFP에서 가장 오른쪽 피크). 심지어 증가하는 농도의 GFP의 존재에서도, L929 음성 대조 세포와 공동배양된 수신자 세포는 활성화되지 않고 "오프" 상태로 남아있었다 (0.1 nM, 1 nM, 10 nM 및 1000 mM GFP에서 가장 왼쪽 피크).

따라서, 수신자 세포 활성화는 상대 앵커 세포 및 충분한 농도의 가용성 GFP 어댑터 분자 둘 모두의 존재에 의존하였다. 따라서, 수신자 세포 활성화는 앵커 세포의 국부 존재를 통해 공간적으로뿐만 아니라 충분한 농도의 어댑터 분자의 존재를 조정함으로써 조건적으로 제어될 수 있다.

이러한 분할 SynNotch 신호전달 패러다임은 3 세포 시스템을 더욱 보여주는데 이용되었는데, 여기서 수신자 세포 활성화는 상기 시스템의 세포에 의해 생산된 가용성 어댑터에 의해 조정된다.

3 세포 분할 SynNotch 신호전달 시스템의 개략적 표시는 도면 125에서 제공된다. 간단히 말하면, 상기 도면 123에서 설명된 2 세포 분할 SynNotch 시스템이 활용되지만, GFP를 구조성으로 분비하는 세 번째 세포가 상기 시스템에 첨가되었다. "발송자 세포"로 명명된 상기 세포에서, 가용성 GFP는 구조성으로 활성 E1a 프로모터의 제어 하에 발현 카세트로부터 발현된다. 0.5:0.25:0.25의 발송자 세포 대 수신자 세포 대 앵커 세포의 비율을 이용하여, GFP를 분비하는 발송자 세포의 존재에서 수신자 세포 및 표면 LaG2 항-GFP 나노바디를 발현하는 앵커 세포의 공동배양 시에, 수신자 세포의 활성화 (증가된 mCherry 발현에 의해 지시된 바와 같이)가 목격되었다 (도면 126, 중앙 패널, "온"을 참조한다). 대조적으로, 동일한 비율의 세포가 이용되지만, 앵커 세포가 LaG2를 발현하지 않는 음성 대조 L929 세포로 대체될 때, 어떤 수신자 세포 활성화도 목격되지 않았다 (도면 126, 위쪽 패널, "오프"를 참조한다). 이에 더하여, 상기 비율이 극소수의 GFP 발현 발송자 세포를 내포하도록 변경될 때에도 (0.01:0.495:0.495의 발송자 세포 대 수신자 세포 대 앵커 세포의 비율), 수신자 세포는 활성화되지 않았다 (도면 126, 아래쪽 패널, "오프"를 참조한다).

따라서, 수신자 세포 활성화는 상대 앵커 세포 및 GFP 발현 발송자 세포 둘 모두의 존재에 의존하였다. 따라서, 수신자 세포 활성화는 앵커 세포의 국부 존재를 통해 공간적으로뿐만 아니라 어댑터 분자 발현 세포의 존재를 조정함으로써 조건적으로 제어될 수 있다. 추가 수준의 제어는 예로서, 발송자 세포에서 어댑터 분자의 발현 동안 조절가능 프로모터의 이용에 의해 발송자 세포 내에 어댑터 분자의 발현을 조정함으로써 가용하다.

이러한 3 세포 분할 SynNotch 신호전달 시스템은 synNotch 신호전달의 멀티입력 제어를 허용한다. 이에 더하여, 발송자 세포로부터 확산성 어댑터의 발현 및 분비를 제어함으로써, SynNotch 활성화는 인접한 세포-세포 접촉에 반드시 의존하지는 않고, 그리고 확산성 분비된 어댑터의 반경에 근거하여 공간적으로 조율될 수도 있다.

이러한 분할 SynNotch 신호전달 패러다임은 3 세포 시스템을 더욱 보여주는데 이용되었는데, 여기서 수신자 세포 활성화의 저해는 상기 시스템의 세포에 의해 생산된 가용성 어댑터에 의해 조정된다.

3 세포 분할 SynNotch 저해 신호전달 시스템의 개략적 표시는 도면 127에서 제공된다. 상기 도면 123에서 설명된 2 분할 SynNotch 시스템의 수신자 세포가 활용되었다. 표면 발현된 GFP 세포가 "발송자 세포"로서 활용되었는데, 이것은 수신자 세포 발현된 SynNotch의 LaG17 항-GFP 나노바디 부분에 표면 발현된 GPF의 결합 시에 "수신자 세포"를 활성화시킨다. 상기와 유사하게, 수신자 세포의 활성화는 TRE/mCherry 리포터 카세트로부터 발현을 계측함으로써 정량될 수 있다. "저해제 세포"로 명명된 이러한 시스템의 세 번째 세포는 발송자 세포의 표면 발현된 GFP 및 수신자 세포의 LaG17의 결합에 대한 경쟁적 저해제로서 행동하는 가용성 LaG16-LaG2 항-GFP 나노바디를 구조성으로 발현한다. 따라서, 발송자 세포 및 수신자 세포의 공동배양액에 저해제 세포의 도입은 발송자 세포 및 수신자 세포 사이에 결합을 경쟁적으로 저해하고, 감소된 mCherry 발현에 의해 계측될 수 있는 수신자 세포의 활성화를 저해한다.

수신자 세포 단독의 대조 배양액, 다시 말하면, 발송자 또는 저해제 세포를 내포하지 않는 수신자 세포의 배양액은 수신자 세포의 활성화를 유발하지 않았다 (도면 128, 위쪽 패널 "오프"를 참조한다). 수신자 세포의 활성화는 발송자 세포, 수신자 세포 및 경쟁적 저해제를 발현하지 않는 부모 L929 세포주의 음성 대조 저해제 세포를 내포하는 공동배양액에서 목격되었다 (0.25:0.25:0.5의 발송자 세포 대 수신자 세포 대 음성 대조 저해제 세포의 비율) (도면 128, 중앙 패널 "온"을 참조한다). 동일한 세포 비율 (0.25:0.25:0.5)이 발송자 세포, 수신자 세포 및 경쟁적 저해제를 발현하는 저해제 세포 (sLaG16-LaG2-발현 L929 세포)의 공동배양액에서 활용될 때, 수신자 세포 활성화의 저해가 mCherry 발현에서 감소에 의해 지시된 바와 같이 관찰되었다 (도면 128, 아래쪽 패널 "오프"를 참조한다).

따라서, 발송자 세포의 표면 GFP에 수신자 세포의 SynNotch의 결합에 의존한 수신자 세포 활성화는 저해제 세포로부터 발현된 가용성 경쟁적 저해제의 발현에 의해 저해되었다. 따라서, 양성 및 음성 신호전달 둘 모두를 갖는 3-세포 조절 시스템은 SynNotch 발현 수신자 세포 활성화를 둘 모두 제어하는데 이용될 수 있다. 이런 이유로, 공간적 및 조건적 수신자 세포 조정은 양성 신호에 한정되지 않고, 그리고 음성 신호 및 이들의 조합을 이용하여 제어될 수 있다.

본 발명이 특정한 구체예에 관하여 설명되긴 했지만, 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 그리고 등가물이 발명의 진정한 사상과 범위로부터 벗어남 없이 치환될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해되어야 하다. 이에 더하여, 특정 환경, 물질, 물질 조성물, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상과 범위에 적합하게 하는 많은 변형이 만들어질 수 있다. 이런 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Lim, Wendell A. Morsut, Leonardo Roybal, Kole T. <120> BINDING-TRIGGERED TRANSCRIPTIONAL SWITCHES AND METHODS OF USE THEREOF <130> UCSF-511WO <150> US 62/120,256 <151> 2015-02-24 <150> US 62/257,153 <151> 2015-11-18 <150> US 62/269,758 <151> 2015-12-18 <160> 210 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Pro Pro Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val Asp 1 5 10 15 Ala Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly 20 25 30 Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys Asn 35 40 45 Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His Cys 50 55 60 Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys 65 70 75 80 Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys 85 90 95 Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser Ala Glu 100 105 110 Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu Arg Leu 115 120 125 Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val Leu Leu Pro Pro Asp Gln Leu 130 135 140 Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser His Val Leu His 145 150 155 160 Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile Phe 165 170 175 Pro Tyr Tyr Gly His Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg 180 185 190 Ser Thr Val Gly Trp Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly 195 200 205 Gly Arg Gln Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser Ile 210 215 220 Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser Gln 225 230 235 240 Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala 245 250 255 Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser 260 265 270 Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr Val 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu 290 295 300 Leu Ser 305 <210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro 1 5 10 15 Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn 20 25 30 Gly Leu Leu Cys His Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly 35 40 45 Arg Asp Ile Pro Pro Pro Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu 50 55 60 Cys Gln Val Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn 65 70 75 80 His Ala Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp 85 90 95 Pro Trp Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser 100 105 110 Asp Gly His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp 115 120 125 Gly Phe Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp 130 135 140 Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys 145 150 155 160 Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val 165 170 175 Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val Leu Leu Pro 180 185 190 Pro Asp Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser 195 200 205 His Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala Gln Gly Gln 210 215 220 Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu Glu Glu Leu Arg Lys His 225 230 235 240 Pro Ile Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro 245 250 255 Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile 260 265 270 Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln 275 280 285 Ser Ser Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu 290 295 300 Gly Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu 305 310 315 320 Ala Val Lys Ser Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His 325 330 335 Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 340 345 350 Cys Gly Val Leu Leu Ser 355 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Gly Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile Tyr Glu Lys 1 5 10 15 Ser Cys Tyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp Gly Ser Lys 20 25 30 Arg Gln Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ser Ser 35 40 45 Asn Glu Leu Gly Phe Ile Val Lys Gln Val Ser Ser Gln Pro Asp Asn 50 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Leu Gly Ala Leu Ala 115 120 125 Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser 130 135 140 Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro 145 150 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 His Leu Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val 1 5 10 15 Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser 20 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro 1 5 10 15 Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn 20 25 30 Gly Leu Leu Cys His 35 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Asp Ile Asn Glu Cys Val Leu Ser Pro Cys Arg His Gly Ala Ser Cys 1 5 10 15 Gln Asn Thr His Gly Gly Tyr Arg Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr Ser 20 25 30 Gly Arg Asn Cys Glu 35 <210> 10 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Asp Ile Asp Asp Cys Arg 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polypeptide <400> 14 Asp Ser Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Lys Cys Trp Gln Thr His Thr 1 5 10 15 Gln Tyr Arg Cys Glu Cys Pro Ser Gly Trp Thr 20 25 <210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro Ser Pro Cys Gln Asn Gly Ala Thr Cys 1 5 10 15 Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Tyr Ser Cys Lys Cys Val Ala Gly Tyr His 20 25 30 Gly Val Asn Cys 35 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Ile Asp Glu Cys Leu Ser His Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu 1 5 10 15 Asp Leu Pro Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly 20 25 30 Val His Cys Glu 35 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln Val Gly Gly Tyr Ser Cys 1 5 10 15 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Arg Cys Glu 20 25 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Asp Val 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Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 115 Asp Val Asp Glu Arg Asp Val Arg Gly Phe Ala Ser Phe Leu 1 5 10 <210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 116 Ser Leu Pro Leu Gly Leu Trp Ala Pro Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 117 Ser Leu Leu Ile Phe Arg Ser Trp Ala Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 118 Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 1 5 10 <210> 119 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 119 Ser Leu Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Phe Asn 1 5 10 <210> 120 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 120 Lys Lys Ser Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Val 1 5 10 <210> 121 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 121 Pro 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<400> 127 Ser Leu Leu Gly Ile Ala Val Pro Gly Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 128 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 128 Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro 1 5 10 <210> 129 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 129 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 130 ggagcactgt cctccgaacg 20 <210> 131 <211> 2555 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Met Pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gln Pro Gly Glu Thr Cys Leu 20 25 30 Asn Gly Gly Lys Cys Glu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys 35 40 45 Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Gln Asp Pro Asn Pro Cys Leu 50 55 60 Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp Arg Arg 65 70 75 80 Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys 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Ser Asp Ile Glu Leu Arg Lys Gly Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Asn 530 535 540 Thr Arg Val Arg Leu Val Phe Arg Val His Val Pro Gln Pro Ser Gly 545 550 555 560 Arg Thr Leu Ser Leu Gln Val Ala Ser Asn Pro Ile Glu Cys Ser Gln 565 570 575 Arg Ser Ala Gln Glu Leu Pro Leu Val Glu Lys Gln Ser Thr Asp Ser 580 585 590 Tyr Pro Val Val Gly Gly Lys Lys Met Val Leu Ser Gly His Asn Phe 595 600 605 Leu Gln Asp Ser Lys Val Ile Phe Val Glu Lys Ala Pro Asp Gly His 610 615 620 His Val Trp Glu Met Glu Ala Lys Thr Asp Arg Asp Leu Cys Lys Pro 625 630 635 640 Asn Ser Leu Val Val Glu Ile Pro Pro Phe Arg Asn Gln Arg Ile Thr 645 650 655 Ser Pro Val His Val Ser Phe Tyr Val Cys Asn Gly Lys Arg Lys Arg 660 665 670 Ser Gln Tyr Gln Arg Phe Thr Tyr Leu Pro Ala Asn Val Pro Ile Ile 675 680 685 Lys Thr Glu Pro Thr Asp Asp Tyr Glu Pro Ala Pro Thr Cys Gly Pro 690 695 700 Val Ser Gln Gly Leu Ser Pro Leu Pro Arg Pro Tyr Tyr Ser Gln Gln 705 710 715 720 Leu Ala Met Pro Pro Asp Pro Ser Ser Cys Leu Val Ala Gly Phe Pro 725 730 735 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Gly 115 120 125 Pro Lys Asp Met Val Val Gly Phe Ala Asn Leu Gly Ile Leu His Val 130 135 140 Thr Lys Lys Lys Val Phe Glu Thr Leu Glu Ala Arg Met Thr Glu Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gly Tyr Asn Pro Gly Leu Leu Val His Pro Asp Leu Ala 165 170 175 Tyr Leu Gln Ala Glu Gly Gly Gly Asp Arg Gln Leu Gly Asp Arg Glu 180 185 190 Lys Glu Leu Ile Arg Gln Ala Ala Leu Gln Gln Thr Lys Glu Met Asp 195 200 205 Leu Ser Val Val Arg Leu Met Phe Thr Ala Phe Leu Pro Asp Ser Thr 210 215 220 Gly Ser Phe Thr Arg Arg Leu Glu Pro Val Val Ser Asp Ala Ile Tyr 225 230 235 240 Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met Asp 245 250 255 Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu Cys 260 265 270 Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu Glu 275 280 285 Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr Asp 290 295 300 Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Asp 305 310 315 320 Ile Asn Ile Thr Lys Pro Ala Ser Val Phe Val Gln Leu Arg Arg 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530 535 540 Ser Val Leu His Leu Ala Ile Ile His Leu His Ser Gln Leu Val Arg 545 550 555 560 Asp Leu Leu Glu Val Thr Ser Gly Leu Ile Ser Asp Asp Ile Ile Asn 565 570 575 Met Arg Asn Asp Leu Tyr Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr 580 585 590 Lys Gln Glu Asp Val Val Glu Asp Leu Leu Arg Ala Gly Ala Asp Leu 595 600 605 Ser Leu Leu Asp Arg Leu Gly Asn Ser Val Leu His Leu Ala Ala Lys 610 615 620 Glu Gly His Asp Lys Val Leu Ser Ile Leu Leu Lys His Lys Lys Ala 625 630 635 640 Ala Leu Leu Leu Asp His Pro Asn Gly Asp Gly Leu Asn Ala Ile His 645 650 655 Leu Ala Met Met Ser Asn Ser Leu Pro Cys Leu Leu Leu Leu Val Ala 660 665 670 Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Glu Gln Lys Ser Gly Arg Thr Ala 675 680 685 Leu His Leu Ala Val Glu His Asp Asn Ile Ser Leu Ala Gly Cys Leu 690 695 700 Leu Leu Glu Gly Asp Ala His Val Asp Ser Thr Thr Tyr Asp Gly Thr 705 710 715 720 Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gly Arg Gly Ser Thr Arg Leu Ala Ala 725 730 735 Leu Leu Lys Ala Ala Gly Ala Asp Pro Leu Val Glu Asn Phe Glu Pro 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185 190 Trp Leu Leu Gln Gly His Val Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe 195 200 205 Ser Cys Pro His Cys Ser Arg Ala Phe Ala Asp Arg Ser Asn Leu Arg 210 215 220 Ala His Leu Gln Thr His Ser Asp Val Lys Lys Tyr Gln Cys Gln Ala 225 230 235 240 Cys Ala Arg Thr Phe Ser Arg Met Ser Leu Leu His Lys His Gln Glu 245 250 255 Ser Gly Cys Ser Gly Cys Pro Arg 260 <210> 209 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Met Ser Gln Trp Tyr Glu Leu Gln Gln Leu Asp Ser Lys Phe Leu Glu 1 5 10 15 Gln Val His Gln Leu Tyr Asp Asp Ser Phe Pro Met Glu Ile Arg Gln 20 25 30 Tyr Leu Ala Gln Trp Leu Glu Lys Gln Asp Trp Glu His Ala Ala Asn 35 40 45 Asp Val Ser Phe Ala Thr Ile Arg Phe His Asp Leu Leu Ser Gln Leu 50 55 60 Asp Asp Gln Tyr Ser Arg Phe Ser Leu Glu Asn Asn Phe Leu Leu Gln 65 70 75 80 His Asn Ile Arg Lys Ser Lys Arg Asn Leu Gln Asp Asn Phe Gln Glu 85 90 95 Asp Pro Ile Gln Met Ser Met Ile Ile Tyr Ser Cys Leu Lys Glu Glu 100 105 110 Arg Lys Ile Leu Glu Asn Ala Gln Arg Phe Asn Gln Ala Gln Ser Gly 115 120 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Pro Ala Trp Gln Gly 195 200 205 Arg Ser Ile Gly Thr Thr Lys Leu Arg Leu Val Glu Phe Ser Ala Phe 210 215 220 Leu Glu Gln Gln Arg Asp Pro Asp Ser Tyr Asn Lys His Leu Phe Val 225 230 235 240 His Ile Gly His Ala Asn His Ser Tyr Ser Asp Pro Leu Leu Glu Ser 245 250 255 Val Asp Ile Arg Gln Ile Tyr Asp Lys Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly 260 265 270 Leu Lys Glu Leu Phe Gly Lys Gly Pro Gln Asn Ala Phe Phe Leu Val 275 280 285 Lys Phe Trp Ala Asp Leu Asn Cys Asn Ile Gln Asp Asp Ala Gly Ala 290 295 300 Phe Tyr Gly Val Thr Ser Gln Tyr Glu Ser Ser Glu Asn Met Thr Val 305 310 315 320 Thr Cys Ser Thr Lys Val Cys Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys 325 330 335 Val Glu Thr Glu Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Gly Arg Phe Val Tyr Arg 340 345 350 Ile Asn Arg Ser Pro Met Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys 355 360 365 Leu Lys His Leu Pro Glu Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn 370 375 380 Phe Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Asn Arg Asp Thr Gln Glu Thr Leu 385 390 395 400 Leu Cys Met Ala Cys Val Phe Glu Val Ser Asn Ser Glu His Gly Ala 405 410 415 Gln His His Ile Tyr Arg Leu Val Lys Asp 420 425

Claims

N 말단으로부터 C 말단으로, 그리고 공유 연쇄에서
a) 항원에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 Fv (scFv)또는 나노바디를 포함하는 세포외 도메인;
b) Lin 12-노치 반복, S2 단백질분해 개열 부위를 포함하는 이형이합체화 도메인 및 S3 단백질분해 개열 부위를 포함하는 막경유 도메인을 포함하는 노치 조절 영역; 및
c) 노치 조절 영역에 이종성인, DNA 결합 도메인을 포함하는 전사 활성인자를 포함하는 세포내 도메인
을 포함하는 키메라 노치(Notch) 폴리펩티드로서, 전사 활성인자는 자연발생 세포내 노치 도메인을 대체하고, 트랜스 방향으로(in trans) 항원에 scFv 또는 나노바디의 결합은 S2 및 S3 단백질분해 개열 부위에서 개열을 유도하고, 따라서 세포내 도메인을 방출하고 키메라 노치 폴리펩티드는 그것의 자연발생 리간드 델타에 결합하지 않는, 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 세포내 도메인의 방출은 전사 활성인자가 핵산을 포함하는 세포에서 내인성 유전자 산물의 발현을 유도하게 하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 세포내 도메인의 방출은 전사 활성인자가 핵산을 포함하는 세포에서 이종성 유전자 산물의 발현을 유도하게 하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 핵산은 전사 활성인자에 반응성인, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 제어 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 핵산은 전사 활성인자에 반응성인, 암의 치료를 위한 치료 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 제어 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제5 항에 있어서, 암의 치료를 위한 치료 항체는 펨브로리주맙 및 트레멜리무맙에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 노치 조절 영역은 서열 번호:131, 132 및 135-137의 노치 조절 영역 중 어느 하나에 최소한 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 노치 조절 영역은 N 말단에서 하나 이상의 표피 성장 인자 (EGF) 반복을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제8 항에 있어서, 노치 조절 영역은 N 말단에서 2 내지 11개의 EGF 반복을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 키메라 노치 폴리펩티드는 합성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제8 항에 있어서, 키메라 노치 폴리펩티드는 하나 이상의 EGF 반복 사이에 합성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 항원은 암-관련된 항원인 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, S2 단백질분해 개열 부위는 Ala-Val 디펩티드 서열을 포함하는 ADAM-17-유형 프로테아제 개열 부위인 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, S3 단백질분해 개열 부위는 Gly-Val 디펩티드 서열을 포함하는 감마-세크레타아제 (7-세크레타아제) 개열 부위인 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 키메라 노치 폴리펩티드는 S1 단백질분해 개열 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제15 항에 있어서, S1 단백질분해 개열 부위는 아미노산 서열 Arg-X-(Arg/Lys)-Arg를 포함하는 퓨린-유사 프로테아제 개열 부위이며, 상기 식에서 X는 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항에 있어서, 키메라 노치 폴리펩티드는 S1 단백질분해 개열 부위를 결여하는 것을 특징으로 하는 키메라 노치 폴리펩티드.
제1 항의 키메라 노치 폴리펩티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제18 항에 있어서, 재조합 발현 벡터는 전사 활성인자에 반응성인, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 제어 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
제18 항에 있어서, 재조합 발현 벡터는 전사 활성인자에 반응성인, 암의 치료를 위한 치료 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 제어 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
제1 항의 키메라 노치 폴리펩티드를 포함하는 유전적으로 변형된 단리된 세포.
제21 항에 있어서, 단리된 세포는 면역 세포, 뉴런, 상피 세포 및 내피 세포, 또는 줄기 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제22 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포, 보조 T 세포, 또는 세포독성 T 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제23 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 단리된 세포.