JP2021019625A - 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年2月24日に出願された米国仮特許出願第62/120,256号;2015年11月18日に出願された米国仮特許出願第62/257,153号;及び2015年12月18日に出願された米国仮特許出願第62/269,758号の利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号EY016546;P50 GM081879;及びR01 GM055040の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表を、テキストファイル「UCSF−511WO_SeqList_ST25.txt」として本明細書と共に提供し、これは、2016年1月26日に作製され、サイズは、649KBである。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Notch受容体は、細胞間接触シグナル伝達を媒介し、細胞間コミュニケーション、例えば、一方の接触細胞が「受信側」細胞であり他方の接触細胞が「送信側」細胞である、2つの接触する細胞間のコミュニケーションの発達及び他の態様において中心的な役割を果たす膜貫通タンパク質である。受信側細胞において発現されるNotch受容体は、送信細胞上で発現される、それらのリガンド(タンパク質のデルタファミリー)を認識する。これらの接触細胞上でのnotchとデルタの係合は、notch受容体の2段階のタンパク質分解をもたらし、これは最終的には、膜から細胞質への受容体の細胞内部分の放出を引き起こす。この放出されたドメインが、転写調節因子として機能することにより受信側細胞の挙動を変える。Notch受容体は、発達中の様々な細胞の機能に関与し、そのために必要とされ、複数の種にわたって多数の細胞型の機能に重要である。
本開示は、結合誘発型(binding-triggered)転写スイッチポリペプチド、結合誘発型転写スイッチポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び該核酸で遺伝子改変された宿主細胞を提供する。本開示は、本開示の結合誘発型転写スイッチポリペプチドをコードする核酸を含むトランスジェニック生物を提供する。1つまたは複数の結合誘発型転写スイッチポリペプチドを使用して細胞の活性を局所的に調節する方法、及び1つまたは複数の結合誘発型転写スイッチポリペプチドを使用する局在性細胞活性化システムを提供する。本開示の結合誘発型転写スイッチポリペプチドは、様々な用途において有用であり、それも提供する。
に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Notch受容体ポリペプチドは、以下の配列:
に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位は、S1、S2、及びS3タンパク質分解切断部位から選択される。いくつかの場合では、S1タンパク質分解切断部位は、アミノ酸配列Arg−X−(Arg/Lys)−Argを含む、フューリン様プロテアーゼ切断部位であり、ここでXは任意のアミノ酸である。いくつかの場合では、S2タンパク質分解切断部位は、Ala−Valジペプチド配列を含むADAM−17型プロテアーゼ切断部位である。いくつかの場合では、S3タンパク質分解切断部位は、Gly−Valジペプチド配列を含むγ−セクレターゼ切断部位である。
i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第一の結合誘発型転写スイッチ;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第二の結合誘発型転写スイッチ
を発現し;第一の結合誘発型転写スイッチの細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能を提供し、第二の結合誘発型転写スイッチの細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能と異なる第二のエフェクター機能を提供し、この時、第一及び第二の特異的結合対の第一及び第二のメンバーの結合が、第一及び第二の細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように結合トランスデューサを誘導する、前記方法を提供する。
[本発明1001]
N末端からC末端に向かって、共有結合状態で、
a)特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメイン;
b)50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、かつ1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、Notch受容体ポリペプチド;及び
c)細胞内ドメイン
を含み、
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、前記Notch受容体ポリペプチドに対して異種であり、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出される、キメラポリペプチド。
[本発明1002]
前記Notch受容体ポリペプチドが、300アミノ酸〜400アミノ酸の長さを有する、本発明1001のキメラポリペプチド。
[本発明1003]
前記細胞外ドメインと前記Notch受容体ポリペプチドの間に介在するリンカーを含む、本発明1001または本発明1002のキメラポリペプチド。
[本発明1004]
前記細胞内ドメインが、転写活性化因子である、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1005]
前記細胞内ドメインが、転写抑制因子である、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1006]
前記細胞内ドメインが、部位特異的ヌクレアーゼである、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1007]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9ポリペプチドである、本発明1006のキメラポリペプチド
[本発明1008]
前記細胞内ドメインが、リコンビナーゼである、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1009]
前記細胞内ドメインが、抑制性免疫受容体である、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1010]
前記細胞内ドメインが、活性化免疫受容体である、本発明1001〜1003のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1011]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗体をベースとする認識足場を含む、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1012]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗体を含む、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1013]
前記抗体が、腫瘍特異的抗原、疾患関連抗原、病原体関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、または細胞外マトリックス成分と特異的に結合する、本発明1012のキメラポリペプチド。
[本発明1014]
前記抗体が、細胞表面抗原、可溶性抗原、または不溶性基体上に固定された抗原と特異的に結合する、本発明1012のキメラポリペプチド。
[本発明1015]
前記抗体が、一本鎖Fvである、本発明1012のキメラポリペプチド。
[本発明1016]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、本発明1011のキメラポリペプチド。
[本発明1017]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、非抗体をベースとする認識足場である、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1018]
前記非抗体をベースとする認識足場が、アビマー、DARPin、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、アンチカリン、またはアフィリンである、本発明1017のキメラポリペプチド。
[本発明1019]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗原である、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1020]
前記抗原が、内在性抗原である、本発明1019のキメラポリペプチド。
[本発明1021]
前記抗原が、外来性抗原である、本発明1019のキメラポリペプチド。
[本発明1022]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、受容体に対するリガンドである、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1023]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、受容体である、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1024]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、細胞接着分子である、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1025]
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、第一の二量体化ドメインを含み、前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の二量体化ドメインを含む、本発明1001〜1010のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1026]
前記第一の二量体化ドメインの、前記第二の二量体化ドメインへの結合が、小分子二量体化剤により誘導される、本発明1025のキメラポリペプチド。
[本発明1027]
前記第一の二量体化ドメインの、前記第二の二量体化ドメインへの結合が、光により誘導される、本発明1025のキメラポリペプチド。
[本発明1028]
前記Notch受容体ポリペプチドが、図2A〜2Gに示すアミノ酸配列のいずれか1つに対して、少なくとも75%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1027のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1029]
前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位が、S1、S2、及びS3タンパク質分解切断部位から選択される、本発明1001〜1028のいずれかのキメラポリペプチド。
[本発明1030]
前記S1タンパク質分解切断部位が、アミノ酸配列Arg−X−(Arg/Lys)−Argを含むフューリン様プロテアーゼ切断部位であり、ここでXは任意のアミノ酸である、本発明1029のキメラポリペプチド。
[本発明1031]
前記S2タンパク質分解切断部位が、Ala−Valジペプチド配列を含むADAM−17型プロテアーゼ切断部位である、本発明1029のキメラポリペプチド。
[本発明1032]
前記S3タンパク質分解切断部位が、Gly−Valジペプチド配列を含むγ−セクレターゼ切断部位である、本発明1029のキメラポリペプチド。
[本発明1033]
本発明1001〜1032のいずれかのキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
[本発明1034]
本発明1001〜1032のいずれかのキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター。
[本発明1035]
本発明1033の核酸または本発明1034の発現ベクターで遺伝子改変された宿主細胞。
[本発明1036]
真核細胞である、本発明1035の宿主細胞。
[本発明1037]
哺乳類細胞である、本発明1036の宿主細胞。
[本発明1038]
免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である、本発明1037の宿主細胞。
[本発明1039]
前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、制御性T細胞、ヘルパーT細胞、または細胞傷害性T細胞である、本発明1038の宿主細胞。
[本発明1040]
キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されており、前記キメラポリペプチドの前記細胞内ドメインが、転写活性化因子である、本発明1035〜1039のいずれかの宿主細胞。
[本発明1041]
前記CARまたは前記TCRをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記キメラポリペプチドの前記細胞内ドメインにより活性化される転写制御エレメントに作動可能に連結している、本発明1040の宿主細胞。
[本発明1042]
本発明1001〜1032のいずれかのキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出され、前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の活性を調節する、前記方法。
[本発明1043]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の増殖を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1046]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞におけるアポトーシスを調節する、本発明1042の方法。
[本発明1047]
前記細胞内ドメインの放出が、アポトーシス以外の機構による細胞死を誘導する、本発明1042の方法。
[本発明1048]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞における遺伝子発現を、転写調節、クロマチン制御、翻訳、トラフィッキングまたは翻訳後プロセシングを通して調節する、本発明1042の方法。
[本発明1049]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の分化を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1050]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の遊走を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1051]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞からの分子の発現及び分泌を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1052]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の、第二の細胞へのまたは細胞外マトリックスへの接着を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1053]
前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞における遺伝子産物のデノボ発現を誘導するまたは発現を調節する、本発明1042の方法。
[本発明1054]
前記遺伝子産物が、転写活性化因子、転写抑制因子、キメラ抗原受容体、第二のキメラNotch受容体ポリペプチド、翻訳調節因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、または抗体である、本発明1053の方法。
[本発明1055]
本発明1001〜1032のいずれかのキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、ここで前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出され、前記細胞内ドメインが、前記細胞の活性を調節するエフェクターポリペプチドをコードする核酸の転写を誘導する転写因子である、前記方法。
[本発明1056]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記エフェクターポリペプチドが、アポトーシス誘導因子、抑制因子にあるアポトーシス、活性化免疫受容体、抑制性免疫受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、受容体、抗体、部位特異的ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼである、本発明1055の方法。
[本発明1059]
細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む、本発明1001〜1032のいずれかの第一のキメラNotch受容体ポリペプチド;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む本発明1001〜1032のいずれかの第二のキメラNotch受容体ポリペプチド
を発現し、
前記第一及び前記第二の特異的結合対が互いに異なり、
前記第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能を提供し;前記第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインが、前記第一のエフェクター機能と異なる第二のエフェクター機能を提供し、前記放出された第一及び前記第二の細胞内ドメインが、前記細胞の活性を調節する、前記方法。
[本発明1060]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
T細胞を活性化させる方法であって、
本発明1040のT細胞と固定化抗原を接触させること
を含み、
前記キメラポリペプチドの前記細胞外ドメインが、第一の抗原に特異的な抗体を含み、
前記接触が、前記転写活性化因子の放出、及び前記細胞中の前記CARまたは前記TCRの産生をもたらし、前記CARまたはTCRが、第二の抗原の結合後に前記T細胞の活性化を提供する、前記方法。
[本発明1062]
細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む、本発明1001〜1032のいずれかの第一のキメラNotch受容体ポリペプチド;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む本発明1001〜1032のいずれかの第二のキメラNotch受容体ポリペプチド
を発現し、
前記第一及び前記第二の特異的結合対が互いに異なり、
前記第二のキメラNotch受容体をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインにより活性化または抑制される転写制御エレメントに作動可能に連結している、前記方法。
[本発明1063]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
T細胞を活性化させる方法であって、
本発明1040のT細胞と固定化抗原を接触させること
を含み、前記キメラポリペプチドの前記細胞外ドメインが、第一の抗原に特異的な抗体を含み、
前記接触が、前記転写活性化因子の放出、及び前記細胞における前記CARまたはTCRの産生をもたらし、前記CARまたは前記TCRが、第二の抗原の結合後に前記T細胞の活性化を提供する、前記方法。
[本発明1065]
細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と表面上に固定されている抗原を接触させること
を含み、前記細胞が、本発明1001のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現し、前記特異的結合対の前記第一のメンバーが前記抗原と結合し、
前記接触が、前記細胞内ドメインの放出及び前記細胞の活性の調節をもたらす、前記方法。
[本発明1066]
前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子である、本発明1065の方法。
[本発明1067]
細胞の活性を局所的に調節する方法であって、
前記細胞内で、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;及び
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導し、それにより、活性化した細胞内ドメインが産生され、前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される、前記細胞の活性を調節する、前記方法。
[本発明1068]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の内在性遺伝子産物の発現を調節する、本発明1067の方法。
[本発明1069]
前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、分泌された遺伝子産物である、本発明1068〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、表面発現遺伝子産物である、本発明1068〜1069のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の2つ以上の内在性遺伝子産物の発現を同時に調節する、本発明1068〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の異種遺伝子産物の発現を調節する、本発明1067の方法。
[本発明1074]
前記細胞の前記異種遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、病原体由来タンパク質、増殖誘導因子、受容体、RNA誘導型ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、毒素由来タンパク質、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抗体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、操作T細胞受容体、免疫活性化因子、免疫抑制因子、抑制性免疫受容体、RNA誘導型DNA結合タンパク質及び第二の結合誘発型転写スイッチからなる群より選択される、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記細胞の前記異種遺伝子産物が、抗体である、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記抗体が、806、9E10、3F8、81C6、8H9、アバゴボマブ、アバタセプト、アブシキシマブ、アビツズマブ、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ・ペゴル、ALD518、アレファセプト、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ・ペンテテート、アマツキシマブ、AMG 102、アナツモマブ・マフェナトクス、アネツマブ・ラブタンシン、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ(Ascrinvacumab)、アセリズマブ、アタシセプト、アテゾリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ/トシリズマブ、アトロリムマブ、AVE1642、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベゲロマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ(Bimekizumab)、ビバツズマブ・メルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、BMS−936559、ボコシズマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ(Brontictuzumab)、カナキヌマブ、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・ラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブ・ペンデチド、カルルマブ、カツマクソマブ、cBR96−ドキソルビシン免疫複合体、CC49、CDP791、セデリズマブ、セルトリズマブ・ペゴル、セツキシマブ、cG250、Ch.14.18、シタツズマブ・ボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、コドリツズマブ、コルツキシマブ・ラブタンシン(Coltuximab ravtansine)、コナツムマブ、コンシズマブ、CP 751871、CR6261、クレネズマブ、CS−1008、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブ・ペゴル(Dapirolizumab pegol)、ダラツムマブ、デクトレクマブ(Dectrekumab)、デムシズマブ、デニンツズマブ・マホドチン(Denintuzumab mafodotin)、デノスマブ、デルロツキシマブ・ビオチン(Derlotuximab biotin)、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ジリダブマブ、ドルリモマブ・アリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシジツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ(Elgemtumab)、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ(Emactuzumab)、エミベツズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブ・ベドチン、エンリモマブ・ペゴル、エノブリツズマブ(Enoblituzumab)、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブ・シツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマクソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、F19、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファーレツズマブ、ファシヌマブ、FBTA05、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィジツムマブ、フィリブマブ(Firivumab)、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ・ベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、HGS−ETR2、hu3S193、huA33、イバリズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、IGN101、IgN311、イゴボマブ、IIIA4、IM−2C6、IMAB362、イマルマブ(Imalumab)、IMC−A12、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブ・ラブタンシン、インデュサツマブ・ベドチン(Indusatumab vedotin)、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ、イクセキズマブ、J591、KB004、ケリキシマブ、KW−2871、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、ラムパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンジルマブ(Lenzilumab)、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リファスツズマブ・ベドチン、リゲリズマブ、リロトマブ・サテトラキセタン(Lilotomab satetraxetan)、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロキベトマブ(Lokivetmab)、ロルボツズマブ・メルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブ・ペゴル、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ(Lumretuzumab)、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、MEDI4736、メポリズマブ、メテリムマブ、METMAB、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブ・ソラブタンシン(Mirvetuximab soravtansine)、ミツモマブ、MK−0646、MK−3475、MM−121、モガムリズマブ、MORAb−003、モロリムマブ、モタビズマブ、MOv18、モキセツモマブ・パスドトクス、MPDL33280A、ムロモナブCD3、ナコロマブ・タフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ・メルペンタン、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オヅリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブ・モナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ(Pankomab)、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブ・ベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブ・ベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、PRO 140、キリズマブ、R1507、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ(Ralpancizumab)、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ(Refanezumab)、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ(Rinucumab)、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレヅマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブ・ゴビテカン、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブ・ペンデチド、SCH 900105、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、SGN−CD19A、SGN−CD33A、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブ・ベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブ・パプトクス、タレクスツマブ、テフィバズマブ、テリモマブ・アリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ(Tetulomab)、TGN1412、チシリムマブ/トレメリムマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、TNX−650、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ(Tosatoxumab)、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、TRBS07、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ(Trevogrumab)、ツコツズマブ・セルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ(Ulocuplumab)、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バンドルツズマブ・ベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ・マホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ及びゾリモマブ・アリトクスからなる群より選択される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記細胞の前記異種遺伝子産物が、分泌された遺伝子産物である、本発明1073〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記細胞の前記異種遺伝子産物が、表面発現遺伝子産物である、本発明1073〜1076のいずれかの方法。
[本発明1079]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の2つ以上の異種遺伝子産物の発現を同時に調節する、本発明1073〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1067〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、本発明1067〜1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子である、本発明1067の方法。
[本発明1083]
前記転写因子が、前記細胞の分化を直接調節する、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記転写因子が、前記細胞の分化を、第二の転写因子の発現を調節することにより間接的に調節する、本発明1082の方法。
[本発明1085]
前記細胞が免疫細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記免疫細胞の分化である、本発明1067の方法。
[本発明1086]
前記細胞が免疫細胞であり、前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子であり、前記細胞の前記活性が、前記免疫細胞の分化である、本発明1067の方法。
[本発明1087]
前記転写因子が、前記免疫細胞の分化を直接調節する、本発明1086の方法。
[本発明1088]
前記転写因子が、前記免疫細胞の分化を、第二の転写因子の前記発現を調節することにより間接的に調節する、本発明1086の方法。
[本発明1089]
前記細胞が幹細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記幹細胞の分化である、本発明1067の方法。
[本発明1090]
前記細胞が始原細胞または前駆細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記始原細胞または前駆細胞の分化である、本発明1067の方法。
[本発明1091]
前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の内在性遺伝子の発現を、転写調節、クロマチン制御、翻訳、トラフィッキングまたは翻訳後プロセシングを通して調節する、本発明1067の方法。
[本発明1092]
前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の、第二の細胞へのまたは細胞外マトリックスへの細胞接着を調節する、本発明1067の方法。
[本発明1093]
前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、本発明1067の方法。
[本発明1094]
前記細胞と、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合を競合的に阻害する可溶性阻害分子とを接触させることをさらに含み、それにより、前記細胞内ドメインを活性化させるための結合シグナルを伝達するように結合トランスデューサを誘導することを防ぐ、本発明1067〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記細胞と前記可溶性阻害分子の接触が、前記可溶性阻害分子を第一の細胞に適用または投与することを含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
前記細胞と前記可溶性阻害分子の接触が、前記細胞を、前記可溶性阻害分子を発現する第二の細胞の存在下に置くことを含む、本発明1094の方法。
[本発明1097]
前記第二の細胞が、前記可溶性阻害分子を構成的に発現する、本発明1096の方法。
[本発明1098]
前記第二の細胞が、前記可溶性阻害分子を条件的に発現する、本発明1096の方法。
[本発明1099]
細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバー及び第二の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)前記第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第一の結合誘発型転写スイッチ;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第二の結合誘発型転写スイッチ
を発現し;
前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能を提供し、前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインが、前記第一のエフェクター機能と異なる第二のエフェクター機能を提供し、この時、前記第一及び第二の特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記第一及び第二の細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導する、前記方法。
[本発明1100]
前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの前記エフェクター機能が、前記細胞の遺伝子産物の発現を調節する、本発明1099の方法。
[本発明1101]
前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の内在性遺伝子産物である、本発明1100の方法。
[本発明1102]
前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の異種遺伝子産物である、本発明1100の方法。
[本発明1103]
前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、本発明1100の方法。
[本発明1104]
前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの前記エフェクター機能が、前記細胞の遺伝子産物の発現を調節する、本発明1100の方法。
[本発明1105]
前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の内在性遺伝子産物である、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の異種遺伝子産物である、本発明1104の方法。
[本発明1107]
前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、本発明1104の方法。
[本発明1108]
前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサのうちの少なくとも1つが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、それぞれの特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、それぞれの細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、本発明1099の方法。
[本発明1109]
前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサが、両方ともリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、本発明1108の方法。
[本発明1110]
細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)前記第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第一の結合誘発型転写スイッチ;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第二の結合誘発型転写スイッチ
を発現し、
前記第二の結合誘発型転写スイッチをコードするヌクレオチド配列が、前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインにより活性化または抑制される転写制御エレメントに作動可能に連結している、前記方法。
[本発明1111]
前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、本発明1110の方法。
[本発明1112]
前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、本発明1110の方法。
[本発明1113]
前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される、前記細胞の活性を調節する、本発明1110の方法。
[本発明1114]
前記細胞の前記活性が、前記細胞の遺伝子産物の発現である、本発明1113の方法。
[本発明1115]
前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、前記細胞の遺伝子産物である、本発明1114の方法。
[本発明1116]
前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサの少なくとも1つが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記それぞれの特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記それぞれの細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、本発明1110の方法。
[本発明1117]
細胞間接触を追跡する方法であって、
第一の複数の細胞の各細胞において、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;
第二の複数の細胞の各細胞において、前記特異的結合対の第二のメンバーを発現させること;及び
前記第一の複数の細胞と前記第二の複数の細胞を接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合誘発型転写スイッチの結合シグナルを伝達するように結合トランスデューサを誘導し、それにより前記細胞内ドメインが活性化され、前記細胞内ドメインの活性化が、空間的な、時間的なまたはその組み合わせにおける細胞間接触を追跡するのに十分な検出可能レポーターの発現を誘導する、前記方法。
[本発明1118]
前記第一の複数の細胞、前記第二の複数の細胞または両方が、ニューロンである、本発明1117の方法。
[本発明1119]
前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、本発明1117の方法。
[本発明1120]
前記結合誘発型転写スイッチが、SynNotchポリペプチドである、本発明1067〜1119のいずれかの方法。
[本発明1121]
局在性細胞活性化システムであって、
第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む発現された結合誘発型転写スイッチ;及び
前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインにより誘導される転写制御エレメントに作動可能に連結した、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む結合誘発型活性化ポリペプチドをコードする核酸
を含む細胞を含み、
前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが発現され、前記第二の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが前記細胞を活性化させる、前記システム。
[本発明1122]
前記細胞が、免疫細胞、始原細胞または前駆細胞、幹細胞、及びニューロンからなる群より選択される、本発明1121のシステム。
[本発明1123]
前記細胞が免疫細胞であり、前記結合誘発型転写スイッチが抗原誘発型転写スイッチであり、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが抗原誘発型活性化ポリペプチドであり、前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが発現され、前記第二の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが前記免疫細胞を活性化させて、前記第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを発現する標的細胞を認識する、本発明1122のシステム。
[本発明1124]
前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが、キメラ抗原受容体またはその変異体である、本発明1123のシステム。
[本発明1125]
前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが、操作T細胞受容体またはその変異体である、本発明1123のシステム。
[本発明1126]
前記発現された結合誘発型転写スイッチが、SynNotchポリペプチドである、本発明1121〜1125のいずれかのシステム。
[本発明1127]
細胞の活性を局所的に調節する方法であって、
第一の細胞において、結合トランスデューサと、細胞内ドメインと、可溶性アダプター分子上の第一のエピトープと特異的に結合する第一のアダプター結合ドメインを含む第一の細胞外ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;
前記第一の細胞と:
i)前記可溶性アダプター分子上の第二のエピトープと特異的に結合する第二のアダプター結合ドメインを含む第二の細胞外ドメインを発現する第二の細胞;及び
ii)有効濃度の前記可溶性アダプター分子
を接触させること
を含み、前記第一のアダプター結合ドメイン及び前記第二のアダプター結合ドメインの、前記アダプター分子への結合が、前記細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導し、それにより、活性化した細胞内ドメインが産生され、前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される前記第一の細胞の活性を調節する、前記方法。
[本発明1128]
前記接触が、前記可溶性アダプター分子を前記細胞にin vitroまたはex vivoで適用することを含む、本発明1127の方法。
[本発明1129]
前記接触が、前記可溶性アダプター分子を前記細胞にin vivoで投与することを含む、本発明1127の方法。
[本発明1130]
前記第一の細胞と有効濃度の前記可溶性アダプター分子を接触させることが、前記第一の細胞を、前記アダプター分子を発現する第三の細胞の存在下に置くことを含む、本発明1127の方法。
[本発明1131]
前記第三の細胞が、前記アダプター分子を構成的に発現する、本発明1130の方法。
[本発明1132]
前記第三の細胞が、前記アダプター分子を条件的に発現する、本発明1130の方法。
[本発明1133]
前記第一の細胞外ドメイン及び前記可溶性アダプター分子が、特異的対合対の第一及び第二のメンバーである、本発明1127〜1132のいずれかの方法。
[本発明1134]
前記第二の細胞外ドメイン及び前記可溶性アダプター分子が、特異的結合対の第一及び第二のメンバーである、本発明1127〜1132のいずれかの方法。
[本発明1135]
前記第一の細胞外ドメイン及び第二の細胞外ドメインが、抗体である、本発明1127〜1134のいずれかの方法。
[本発明1136]
前記第一の細胞外ドメイン及び第二の細胞外ドメインの一方または両方が、ナノボディである、本発明1135の方法。
[本発明1137]
前記細胞内ドメインが、転写因子である、本発明1127〜1136のいずれかの方法。
[本発明1138]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記第一の細胞の内在性遺伝子産物の発現を調節する、本発明1127〜1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
前記活性化した細胞内ドメインが、前記第一の細胞の異種遺伝子産物の発現を調節する、本発明1127〜1137のいずれかの方法。
[本発明1140]
前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記第一の細胞外ドメイン及び前記第二の細胞外ドメインの、前記可溶性アダプター分子への結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、本発明1127〜1139のいずれかの方法。
[本発明1141]
第一の抗原に応答する第一の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;
前記第一の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ特異的結合対の第一のメンバーに特異的に結合する細胞外ドメインを含むCARをコードする核酸に作動可能に連結している、第一のプロモーター;
第二の抗原に応答する第二の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第二の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内CAR阻害ドメインをコードする核酸に作動可能に連結している、第二のプロモーター
を含み、前記第二の抗原の存在下で、前記細胞内CAR阻害ドメインが発現されて前記CARによる前記細胞の活性化が阻害され、前記第一の抗原の存在下かつ前記第二の抗原の非存在下で、前記特異的結合対の前記第二のメンバーによりCARが発現されて活性化可能である、宿主細胞。
[本発明1142]
第一の抗原に応答する第一の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;
前記第一の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ特異的結合対の第一のメンバーに特異的に結合する細胞外ドメインを含むCARの第一の部分をコードする核酸に作動可能に連結している、第一のプロモーター;
第二の抗原に応答する第二の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第二の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARの第二の部分をコードする核酸に作動可能に連結している、第二のプロモーター
を含み、前記第一の抗原及び第二の抗原の存在下で、前記CARの前記第一及び第二の部分が発現され、前記CARが前記特異的結合対の前記第二のメンバーにより活性化可能である、宿主細胞。
[本発明1143]
第三の抗原に応答する第三の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第三の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内CAR阻害ドメインをコードする核酸に作動可能に連結している、第三のプロモーター
をさらに含み、前記第三の抗原の存在下で、前記細胞内CAR阻害ドメインが発現されて前記CARによる前記細胞の活性化が阻害される、本発明1142の細胞。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書で互換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ゆえに、この用語には、一本鎖、二本鎖、または複数鎖DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA−RNAハイブリッド、あるいはプリンもしくはピリミジン塩基を含むポリマー、もしくは他の天然、化学的、生物学的に修飾された、非天然もしくは誘導化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。
本開示は、キメラNotch受容体ポリペプチド、キメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び該核酸で遺伝子改変された宿主細胞を提供する。キメラNotch受容体ポリペプチドは、様々な用途において有用であり、それも提供する。
本開示は、キメラNotch受容体ポリペプチドを提供する。本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、a)特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメイン;b)Notch受容体ポリペプチド、ここでNotch受容体ポリペプチドは、50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む;及びc)細胞内ドメインを含む。特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合が、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。細胞内ドメインの放出は、キメラNotch受容体ポリペプチドを産生する細胞の活性を調節する。細胞外ドメインは、特異的結合対の第一のメンバーを含み;特異的結合対の第一のメンバーは、Notch受容体ポリペプチドに対して異種であるアミノ酸配列を含む。細胞内ドメインは、Notch受容体ポリペプチドに対して異種であるアミノ酸配列を含む。
上記のように、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、特異的結合対の第一のメンバーを含む。特異的結合対の第一のメンバーは、特異的結合対の第二のメンバーに結合し、この場合、特異的結合対の第二のメンバーは、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドと異なるポリペプチドの上にある。特異的結合対の第二のメンバーは、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインを含むキメラNotch受容体ポリペプチドとは離れている(例えば、共有結合していない)。特異的結合対の第二のメンバーは、細胞の表面上に存在することができる。特異的結合対の第二のメンバーは、不溶性支持体上に固定されることができる。特異的結合対の第二のメンバーは、可溶性であることができる。特異的結合対の第二のメンバーは、細胞外環境(例えば、細胞外マトリックス)中に存在することができる。特異的結合対の第二のメンバーは、人工マトリックス中に存在することができる。特異的結合対の第二のメンバーは、無細胞環境中に存在することができる。
抗原−抗体特異的結合対、ここで、第一のメンバーは、抗原である第二のメンバーに特異的に結合する抗体(または抗体をベースとする認識足場)であるか、あるいはここで、第一のメンバーは抗原であり、第二のメンバーは、抗原に特異的に結合する抗体(または抗体をベースとする認識足場)である;
リガンド−受容体特異的結合対、ここで、第一のメンバーはリガンドであり、第二のメンバーはリガンドが結合する受容体であるか、あるいはここで、第一のメンバーは受容体であり、第二のメンバーは、受容体に結合するリガンドである;
非抗体をベースとする認識足場−標的特異的結合対、ここで、第一のメンバーは、非抗体をベースとする認識足場であり、第二のメンバーは、非抗体をベースとする認識足場に結合する標的であるか、あるいはここで、第一のメンバーは、標的であり、第二のメンバーは標的に結合する非抗体をベースとする認識足場である;
接着分子−細胞外マトリックス結合対;
Fc受容体−Fc結合対、ここで、第一のメンバーは、Fc受容体である第二のメンバーに結合する免疫グロブリンFcであるか、あるいはここで、第一のメンバーは、免疫グロブリンFcを含む第二のメンバーに結合するFc受容体である;及び、
受容体−共受容体結合対、ここで、第一のメンバーは、共受容体である第二のメンバーに特異的に結合する受容体であるか、あるいはここで、第一のメンバーは、受容体である第二のメンバーに特異的に結合する共受容体である。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、抗体である。抗体は、任意の抗原結合性の抗体をベースとするポリペプチドであることができ、広く様々なそれが当該分野で公知である。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、一本鎖Fv(scFv)である。他の抗体をベースとする認識ドメイン(cAb VHH(ラクダ科抗体可変ドメイン)及びヒト化版、IgNAR VH(サメ抗体可変ドメイン)及びヒト化版、sdAb VH(単一ドメイン抗体可変ドメイン)及び「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に好適である。いくつかの例では、T細胞受容体(TCR)をベースとする認識ドメイン、例えば、一本鎖TCR(scTv、VαVβを含有する一本鎖2ドメインTCR)も使用に好適である。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、非抗体をベースとする認識足場である。本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドにおける特異的結合対のメンバーが、非抗体をベースとする認識足場である場合、キメラNotch受容体ポリペプチドは、特異的結合対の第二のメンバーの存在下で活性化することができ、この場合、特異的結合対の第二のメンバーは、非抗体をベースとする認識足場に結合する標的である。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、細胞接着分子(CAM)である、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)の成分と結合するまたは細胞表面分子と結合するポリペプチドである。例えば、いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、CAMの細胞外領域である。いくつかの場合では、CAMは、カルシウム非依存性接着分子であり;例えば、いくつかの場合では、CAMは、免疫グロブリンスーパーファミリーCAMである。いくつかの場合では、CAMは、カルシウム依存性接着分子であり;例えば、CAMは、インテグリン、カドヘリン、またはセレクチンである。いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、インテグリンである。いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、カドヘリン、例えば、E−カドヘリン、P−カドヘリン、N−カドヘリン、R−カドヘリン、M−カドヘリン等である。いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、セレクチン、例えば、E−セレクチン、L−セレクチン、またはP−セレクチンである。CAMの結合性断片は、特異的結合対の第一のメンバーとして使用することができる。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、受容体に対するリガンドである。リガンドは、ポリペプチド、核酸、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、リポ多糖類等を含む。いくつかの場合では、リガンドは、可溶性である。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、抗体が特異的に結合する抗原である。抗原は、任意の抗原、例えば、天然に存在する(内在性)抗原;合成(例えば、天然に存在する抗原とはもはや同一ではないように改変された;その天然の状態から改変された;等)抗原;等であることができる。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、非抗体をベースとする足場の標的である。標的には、例えば、ポリペプチド、核酸、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、リポ多糖類等が含まれる。
いくつかの場合では、特異的結合対の第一のメンバーは、受容体である。いくつかの場合では、受容体は、成長因子受容体である。いくつかの場合では、受容体は、サイトカイン受容体である。いくつかの場合では、受容体は、細胞上の共受容体に結合する細胞表面受容体である。いくつかの場合では、受容体は、神経伝達物質受容体である。いくつかの場合では、受容体は、細胞外マトリックス成分に結合する。いくつかの場合では、受容体は、免疫グロブリンFc受容体である。
上記のように、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むNotch受容体ポリペプチドを含む。
いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド中に存在するNotch受容体ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含み;Notch受容体ポリペプチドは、50アミノ酸(aa)〜65aa、例えば、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、または65aaの長さを有する。いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド中に存在するNotch受容体ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含み;Notch受容体ポリペプチドは、56アミノ酸の長さを有する。
いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド中に存在するNotch受容体ポリペプチドは、N末端からC末端の順で、i)LNR−Aセグメント;ii)LNR−Bセグメント;iii)LNR−Cセグメント;iv)HD−Nセグメント、v)HD−Cセグメント;及びvi)TMドメインを含む。LNR−Aセグメント、LNR−Bセグメント、及びLNR−Cセグメントは、まとめて、「LNRセグメント」と称することができる。かかるNotch受容体ポリペプチドを図4Aに概略的に示す。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;118〜122アミノ酸(例えば、118、119、120、121、または122アミノ酸)の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;150、151、152、153、または154アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;21、22、23、24、または25アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;300アミノ酸〜310アミノ酸(例えば、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、または310アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;350アミノ酸〜370アミノ酸(例えば、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、または370アミノ酸)の長さを有する。
いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド中に存在するNotch受容体ポリペプチドは、N末端からC末端の順で、i)単一のEGFリピート;ii)LNRセグメント;iii)HD−Nセグメント、iv)HD−Cセグメント;及びv)TMドメインを含む。かかるNotch受容体ポリペプチドを図4Bに概略的に示す。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;35アミノ酸〜40アミノ酸(例えば、35、36、37、38、39、または40アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;118〜122アミノ酸(例えば、118、119、120、121、または122アミノ酸)の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;150、151、152、153、または154アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;21、22、23、24、または25アミノ酸の長さを有することができる。
いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド中に存在するNotch受容体ポリペプチドは、N末端からC末端の順で、i)2〜11個のEGFリピート;ii)LNRセグメント;iii)HD−Nセグメント、iv)HD−Cセグメント;及びv)TMドメインを含む。かかるNotch受容体ポリペプチドを図4Dに概略的に示す。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;30アミノ酸(aa)〜35aa(例えば、30、31、32、33、34、または35aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;25アミノ酸(aa)〜30aa、例えば、25、26、27、28、29、または30aaの長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;25アミノ酸(aa)〜30aa、例えば、25、26、27、28、29、または30aaの長さを有することができる。
、または別のNotch受容体ポリペプチドの対応するセグメントに対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、対応するセグメントの例を図2B〜2Gに示す;35アミノ酸〜約40アミノ酸(aa)(例えば、35、36、37、38、39、または40aa)の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;35アミノ酸〜40アミノ酸(例えば、35、36、37、38、39、または40アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;118〜122アミノ酸(例えば、118、119、120、121、または122アミノ酸)の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;150、151、152、153、または154アミノ酸の長さを有することができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;21、22、23、24、または25アミノ酸の長さを有することができる。
いくつかの場合では、Notch受容体ポリペプチドは、N末端からC末端の順で、i)HD−Cセグメント;及びii)TMドメインを含み、ここでNotch受容体ポリペプチドは、LNRセグメントを含まない。いくつかの場合では、LNRセグメントは、異種ポリペプチドと置換される。かかるNotch受容体ポリペプチドを図4Fに概略的に示す。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含むことができ;21、22、23、24、または25アミノ酸の長さを有することができる。
上記のように、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むNotch受容体ポリペプチドを含む。上に考察するように、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、a)特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメイン;b)50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むNotch受容体ポリペプチド;及びc)細胞内ドメインを含み、ここで、特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合が、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。特異的結合対の第二のメンバー(「リガンド」)は、接触する(例えば、「送信」)細胞上に存在することができる。
を有することができ、この場合、切断は「RE」配列間で生じる。別の例として、S1リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列は、アミノ酸配列
を有することができ、この場合、切断は「RE」配列間で生じる。
を有することができ、この場合、切断は「AV」配列間で生じる。別の例として、S2リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列は、アミノ酸配列
を有することができ、この場合、切断は「AV」配列間で生じる。
を有し、この場合、切断は「GV」配列間で生じる。いくつかの場合では、S3リガンド誘導性タンパク質分解切断部位は、アミノ酸配列
を含む。
上記のように、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、細胞内ドメインを含み、これは、キメラNotch受容体ポリペプチドの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合の後に放出され、ここで、キメラNotch受容体ポリペプチドの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、上述のタンパク質分解切断部位の切断を誘導する。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。別の例として、好適なITAMモチーフ含有ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。ポリペプチドは、完全長CD3ゼータアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。別の例として、好適なITAMモチーフ含有ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
のいずれかに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
のいずれかに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
のいずれかの約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約170aaの連続したストレッチ(contiguous stretch)に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
の約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約205aaの連続したストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
の約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約180aaの連続したストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
のいずれかの、約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、または約150aa〜約160aaの連続したストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
のいずれかに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
のいずれかの約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約150aa、約150aa〜約200aa、または約200aa〜約220aaの連続したストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで、ITAMモチーフは太字かつ下線を引いている。
本開示のキメラNotchポリペプチドにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインには、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖が含まれる。
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列
の全体長さに対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
である。いくつかの実施形態では、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列
の全体長さに対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示のキメラNotchポリペプチドにおける使用に好適な細胞内シグナル伝達ドメインには、ZAP70ポリペプチド、例えば、以下のアミノ酸配列:
の約300アミノ酸〜約400アミノ酸、約400アミノ酸〜約500アミノ酸、または約500アミノ酸〜619アミノ酸の連続したストレッチに対して少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
の約100アミノ酸〜約110アミノ酸(aa)、約110aa〜約115aa、約115aa〜約120aa、約120aa〜約130aa、約130aa〜約140aa、約140aa〜約150aa、約150aa〜約160aa、または約160aa〜約185aaの連続したストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
のアミノ酸23〜525に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;335アミノ酸(aa)〜350aaの長さを有することができる。
に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ;430アミノ酸〜445アミノ酸の長さを有することができる。
が挙げられる。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;105〜115アミノ酸(例えば、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、または115アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;200アミノ酸〜210アミノ酸(例えば、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、または210アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;約245アミノ酸〜252アミノ酸(例えば、248、249、250、251、または252アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;208〜214アミノ酸(例えば、208、209、210、211、212、213、または214アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;530アミノ酸〜540アミノ酸(例えば、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、または540アミノ酸)の長さを有する。
に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;305〜325アミノ酸(例えば、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、または325アミノ酸)の長さを有する。
いくつかの場合では、細胞内ドメインは、特異的結合対の第一のメンバーの特異的結合対の第二のメンバーへの結合の際に放出されるとき、キメラNotchポリペプチドを発現する細胞において、遺伝子産物の産生を誘導する、ポリペプチドである。例えば、いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインは、特異的結合対の第一のメンバーの特異的結合対の第二のメンバーへの結合の際に放出されるとき、キメラNotchポリペプチドを発現する細胞において、遺伝子産物(ポリペプチド;核酸)の産生を誘導する。いくつかの場合では、遺伝子産物は、核酸である。いくつかの場合では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。放出された細胞内ドメインにより誘導されるポリペプチド遺伝子産物には、内在性ポリペプチド(例えば、細胞により天然にコードされるポリペプチド)及び異種ポリペプチド(例えば、細胞により天然にはコードされないポリペプチド;細胞を遺伝子改変するために使用される異種核酸によりコードされるポリペプチド)が含まれる。放出された細胞内ドメインにより誘導されるポリペプチド遺伝子産物には、分泌ポリペプチドが含まれる。放出された細胞内ドメインにより誘導されるポリペプチド遺伝子産物には、細胞表面ポリペプチドが含まれる。放出された細胞内ドメインにより誘導されるポリペプチド遺伝子産物には、細胞内ポリペプチド(通常は細胞内に存在するポリペプチド、例えば、転写因子)が含まれる。放出された細胞内ドメインにより誘導されるポリペプチド遺伝子産物には、受容体、サイトカイン、ホルモン、成長因子、ケモカイン、細胞表面ポリペプチド、転写因子(例えば、転写活性化因子;転写抑制因子)、アポトーシス誘導因子、アポトーシス抑制因子、ドミナントネガティブ変異体等が含まれる。その産生が放出された細胞内ドメインにより誘導され得るポリペプチド遺伝子産物には、転写活性化因子、転写抑制因子、キメラ抗原受容体、T細胞受容体(TCR)、第二のキメラNotchポリペプチド、CAR、翻訳調節因子、免疫抑制性受容体、免疫抑制性タンパク質、免疫活性化タンパク質、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、DNA結合タンパク質、エピジェネティック調節因子、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9ポリペプチド)、酵素的に不活性なCas9ポリペプチド、部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、分化を誘導する転写因子、脱分化を誘導する転写因子等が含まれる。
が挙げられる。転写調節因子の追加の例は、上記の通りである。転写因子(転写活性化因子;転写抑制因子)の非限定的な例を、図37〜83に示す。例えば、転写因子は、図37〜83のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
等が含まれる。
a)標的細胞において本開示の第一のsynNotchポリペプチドを発現させること、ここで、第一のsynNotchポリペプチドは、可溶性アダプター分子(例えば、抗原)上の第一のエピトープと結合する抗原結合ドメイン(例えば、scFv、ナノボディ等)を含む;
b)標的細胞と、
i)本開示の第二のsynNotchポリペプチドを発現する第二の細胞、ここで、第二のsynNotchポリペプチドは、可溶性アダプター分子(例えば、抗原)上の第二のエピトープと結合する抗原結合ドメイン(例えば、scFv、ナノボディ等)を含む;及び
ii)可溶性アダプター分子(例えば、抗原)
を接触させること、ここで、第一のsynNotchポリペプチドの抗原結合ドメイン及び第二のsynNotchポリペプチドの抗原結合ドメインの、可溶性アダプター分子(例えば、抗原)への結合が、第一のsynNotchポリペプチドの細胞内ドメインの切断を誘導し、それにより、細胞内ドメインが放出され、放出された細胞内ドメインが標的細胞の活性を調節する。標的細胞の活性は、細胞の遺伝子産物の発現、細胞の増殖、細胞のアポトーシス、細胞の非アポトーシス性死、細胞の分化、細胞の脱分化、細胞の遊走、細胞からの分子の分泌及び細胞の細胞接着からなる群より選択されることができる。アダプター分子は、癌関連抗原、病原体関連抗原、抗体等であることができる。
本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、1つまたは複数の追加のポリペプチドをさらに含むことができ、ここで、好適な追加のポリペプチドには、シグナル配列;エピトープタグ;親和性ドメイン;核局在化シグナル(NLS);及び検出可能シグナルを産生するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドにおける使用に好適なシグナル配列には、天然に存在するシグナル配列、合成の(例えば、人工)シグナル配列等を含む任意の真核生物シグナル配列が含まれる。
親和性ドメインは、結合パートナーと相互作用することができるペプチド配列、例えば、同定または精製に有用な、固体支持体の上に固定されたものなどを含む。複数の連続する単一のアミノ酸、例えば、ヒスチジンは、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドに融合したとき、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムへの高親和性結合による組換えキメラポリペプチドのワンステップ精製のために使用されてよい。例示的な親和性ドメインには、
、ヘマグルチニン、例えば、HAタグ
、GST、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、RYIRS(SEQ ID NO:79)、Phe−His−His−Thr(SEQ ID NO:80)、キチン結合ドメイン、S−ペプチド、T7ペプチド、SH2ドメイン、C末端RNAタグ、
、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合ドメイン、例えばカルシウム結合タンパク質からのもの、例えば、カルモジュリン、トロポニンC、カルシニューリンB、ミオシン軽鎖、リカバリン、S−モジュリン、ビシニン、VILIP、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、S100タンパク質、パルブアルブミン、カルビンディンD9K、カルビンディンD28K、及びカルレチニン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、MyoD、Id、ロイシンジッパー配列、並びにマルトース結合タンパク質が含まれる。
好適な核局在化シグナル(「NLS」;本明細書で「核局在化配列」とも称される)には、例えば、
等が含まれる。NLSは、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドのN末端;本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドのN末端付近(例えば、N末端の5アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または20アミノ酸以内);本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドのC末端;本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドのC末端付近(例えば、C末端の5アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または20アミノ酸以内);または本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドの内部に存在することができる。
好適な検出可能シグナル産生タンパク質には、例えば、蛍光タンパク質;検出可能シグナルを産物として生成する反応を触媒する酵素;等が含まれる。
上記の通り、本開示のキメラNotchポリペプチドの特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。上記の通り、特異的結合対の第二のメンバーは、様々な分子のいずれかであることができる。いくつかの場合では、キメラNotchポリペプチドは、抗原と特異的に結合する;例えば、特異的結合対の第二のメンバーは、抗原である。かかる抗原の例としては、例えば、腫瘍抗原;癌細胞関連抗原;血液学的悪性疾患抗原;固形腫瘍抗原;細胞表面抗原(例えば、T細胞受容体(TCR)により標的とされる細胞表面抗原;細胞内抗原;等が挙げられる。血液学的悪性疾患抗原の例としては、例えば、CD19(例えば、B細胞において発現する)、CD20(例えば、B細胞において発現する)、CD22(例えば、B細胞において発現する)、CD30(例えば、B細胞において発現する)、CD33(例えば、骨髄系細胞において発現する)、CD70(例えば、B細胞/T細胞において発現する)、CD123(例えば、骨髄系細胞において発現する)、カッパ(例えば、B細胞において発現する)、ルイスY(例えば、骨髄系細胞において発現する)、NKG2Dリガンド(例えば、骨髄系細胞において発現する)、ROR1(例えば、B細胞において発現する)、SLAMF7/CS1(例えば、骨髄腫細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞、及び大半のB細胞型において発現する)、CD138(例えば、多発性骨髄腫の悪性形質細胞において発現する)、CD56(例えば、骨髄腫細胞、神経細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞、及び小柱骨芽細胞(trabecular osteoblasts)において発現する)CD38(例えば、B細胞/T細胞にいて発現する)及びCD160(例えば、NK細胞/T細胞において発現する)等が挙げられる。固形腫瘍抗原の例としては、例えば、B7H3(例えば、肉腫、神経膠腫において発現する)、CAIX(例えば、腎臓において発現する)、CD44 v6/v7(例えば、子宮頸部において発現する)、CD171(例えば、神経芽細胞腫において発現する)、CEA(例えば、結腸において発現する)、EGFRvIII(例えば、神経膠腫において発現する)、EGP2(例えば、癌腫において発現する)、EGP40(例えば、結腸において発現する)、EphA2(例えば、神経膠腫、肺において発現する)、ErbB2(HER2)(例えば、乳房、肺、前立腺、神経膠腫において発現する)、ErbB受容体ファミリー(例えば、乳房、肺、前立腺、神経膠腫において発現する)、ErbB3/4(例えば、乳房、卵巣において発現する)、HLA−A1/MAGE1(例えば、メラノーマにおいて発現する)、HLA−A2/NY−ESO−1(例えば、肉腫、メラノーマにおいて発現する)、FR−a(例えば、卵巣において発現する)、FAP†(例えば、癌関連線維芽細胞において発現する)、FAR(例えば、横紋筋肉腫において発現する)、GD2(例えば、神経芽細胞腫、肉腫、メラノーマにおいて発現する)、GD3(例えば、メラノーマ、肺癌において発現する)、HMW−MAA(例えば、メラノーマにおいて発現する)、IL11Ra(例えば、骨肉腫において発現する)、IL13Ra2(例えば、神経膠腫において発現する)、ルイスY(例えば、乳房/卵巣/膵臓において発現する)、メソテリン(例えば、中皮腫、乳房、膵臓において発現する)、Muc1(例えば、卵巣、乳房、前立腺において発現する)、NCAM(例えば、神経芽細胞腫、結腸直腸において発現する)、NKG2Dリガンド(例えば、卵巣、肉腫(sacoma)において発現する)、PSCA(例えば、前立腺、膵臓において発現する)、PSMA(例えば、前立腺において発現する)、TAG72(例えば、結腸において発現する)、VEGFR−2(例えば、腫瘍血管系において発現する)、Axl(例えば、肺癌において発現する)、Met(例えば、肺癌において発現する)、α5β3(例えば、腫瘍血管系において発現する)、α5β1(例えば、腫瘍血管系において発現する)、TRAIL−R1/TRAIL−R2(例えば、固形腫瘍(結腸、肺、膵臓)及び血液学的悪性疾患において発現する)、RANKL(例えば、前立腺癌及び骨転移において発現する)、テネイシン(例えば、神経膠腫、上皮性腫瘍(乳房、前立腺)において発現する)、EpCAM(例えば、上皮性腫瘍(乳房、結腸、肺)において発現する))、CEA(例えば、上皮性腫瘍(乳房、結腸、肺)において発現する))、gpA33(例えば、大腸癌腫において発現する)、ムチン(例えば、上皮性腫瘍(乳房、結腸、肺、卵巣)において発現する))、TAG−72(例えば、上皮性腫瘍(乳房、結腸、肺)において発現する))、EphA3(例えば、肺、腎臓、メラノーマ、神経膠腫、血液学的悪性疾患において発現する)及びIGF1R(例えば、肺、乳房、頭頸部、前立腺、甲状腺、神経膠腫において発現する)が挙げられる。表面及び細胞内抗原の例としては、例えば、Her2(遺伝子記号ERBB2)、MAGE−A1(遺伝子記号MAGEA1)、MART−1(遺伝子記号MLANA)、NY−ESO(遺伝子記号CTAG1)、WT1(遺伝子記号WT1)、MUC17及びMUC13が挙げられる。他の抗原の例としては、例えば、BCMA(遺伝子記号TNFRSF17)、B7H6(遺伝子記号NCR3LG1)、CAIX(遺伝子記号CA9)、CD123(遺伝子記号IL3RA)、CD138(遺伝子記号SDC1)、CD171(遺伝子記号L1CAM)、CD19(遺伝子記号CD19)、CD20(遺伝子記号CD20)、CD22(遺伝子記号CD22)、CD30(遺伝子記号TNFRSF8)、CD33(遺伝子記号CD33)、CD38(遺伝子記号CD38)、CD44、スプライス変異体incl 7及び8(文献にてvXと示される)(遺伝子記号CD44)、CEA、CS1(遺伝子記号SLAMF7)、EGFRvIII(遺伝子記号EGFR、vIII欠失変異体)、EGP2、EGP40(遺伝子記号EPCAM)、Erbファミリーメンバー(遺伝子記号ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、FAP(遺伝子記号FAP)、胎児性アセチルコリン受容体(遺伝子記号AChR)、葉酸受容体アルファ(遺伝子記号FOLR1)、葉酸受容体ベータ(遺伝子記号FOLR2)、GD2、GD3、GPC3(遺伝子記号GPC3)、Her2/neu(遺伝子記号ERBB2)、IL−13Ra2(遺伝子記号IL13RA2)、カッパ軽鎖(遺伝子記号IGK)、ルイス−Y、メソテリン(遺伝子記号MSLN)、ムチン−1(遺伝子記号MUC1)、ムチン−16(遺伝子記号MUC16)、NKG2Dリガンド、前立腺特異的膜抗原(PSMA)(遺伝子記号FOLH1)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)(遺伝子記号PSCA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(遺伝子記号ROR1)、及び未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ(遺伝子記号ALK)が挙げられる。
以下は、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドの非限定的な例である。
を有し;ヘテロ二量体化ドメイン(HD−Nセグメント及びHD−Cセグメント)は、以下のアミノ酸配列:
を有し、ここで、S1タンパク質分解切断部位は、配列RQRR(SEQ ID NO:86)を含み、S2タンパク質分解切断部位は、配列AVを含み;TMドメインは、以下のアミノ酸配列:
を含み、ここで、S3タンパク質分解切断部位は、配列VLLS(SEQ ID NO:87)を含む。
を有し;LNRセグメント、ヘテロ二量体化ドメイン、TMドメイン、S1タンパク質分解切断部位、S2タンパク質分解切断部位、及びS3タンパク質分解切断部位は、図16Aに示す通りである。
を含むNotch受容体ポリペプチドを含み;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含み;Notch受容体ポリペプチドは、56アミノ酸の長さを有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、以下のアミノ酸配列:
を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Bに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Bに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Bに示すアミノ酸配列を含み;tTA転写因子は、図16Cに示すアミノ酸配列を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Aに示すアミノ酸配列を含み;Gal4−VP64転写活性化因子は、以下のアミノ酸配列:
を有する。
を有する。
を有し;Notch受容体ポリペプチドは、図16Bに示すアミノ酸配列を含み;VP64 Zip(+)転写活性化因子は、以下のアミノ酸配列:
を有する。
を有する。
を有し、ここでCreリコンビナーゼは、NLS
を含む。
を有する。
を有する。
を含むNotch受容体ポリペプチド;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含む;ならびにc)細胞内ドメインを含む。1つの非限定的な実施形態では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、a)細胞外ドメイン;b)以下のアミノ酸配列:
を含むNotch受容体ポリペプチド;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含む;ならびにc)細胞内ドメインを含み、ここで、細胞内ドメインは、転写活性化因子である。1つの非限定的な実施形態では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、a)細胞外ドメイン、ここで、細胞外ドメインは、免疫細胞(T細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞)の表面上で見いだされるポリペプチドである;b)以下のアミノ酸配列:
を含むNotch受容体ポリペプチド;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含む;ならびにc)細胞内ドメインを含み、ここで、細胞内ドメインは、転写活性化因子である。1つの非限定的な実施形態では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドは、a)細胞外ドメイン、ここで、細胞外ドメインはCD4細胞外ドメインである;b)以下のアミノ酸配列:
を含むNotch受容体ポリペプチド;ここで、TMドメインは下線を引いており;Notch受容体ポリペプチドは、S2タンパク質分解切断部位及びS3タンパク質分解切断部位を含む;ならびにc)細胞内ドメインを含み、ここで、細胞内ドメインは、tTA転写活性化因子である。かかるキメラNotch受容体ポリペプチドの一例を図29に示す。
本開示は、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター内に含有される。ゆえに、本開示は、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの場合では、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント(例えば、プロモーター;エンハンサー;等)に作動可能に連結している。いくつかの場合では、転写制御エレメントは、誘導可能である。いくつかの場合では、転写制御エレメントは、構成的である。いくつかの場合では、プロモーターは、真核細胞において機能的である。いくつかの場合では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの場合では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
本開示は、本開示の核酸で遺伝子改変された宿主細胞、すなわち、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変された宿主細胞を提供する。本開示は、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。該方法は、概して、細胞と特異的結合対の第二のメンバーを接触させることを必然的に含む。特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。細胞内ドメインの放出が、細胞の活性を調節する。
本開示は、本開示のキメラNotchポリペプチドをコードする核酸を含む非ヒトトランスジェニック生物を提供する。本開示のトランスジェニック非ヒト生物は、本開示のキメラNotchポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むように遺伝子改変されているゲノムを含む。
本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド、及び本開示の核酸(キメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸)、及び本開示の核酸を含む組換え発現ベクターが、様々な用途で有用である。本開示は、かかる用途を提供する。
本開示は、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。いくつかの場合では、該方法は、細胞と特異的結合対の第二のメンバーを接触させることを含み、特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出され、細胞内ドメインの放出が、細胞の活性を調節する。細胞内ドメインは、「エフェクター機能」を提供し、ここで、エフェクター機能は、転写活性化;転写抑制;翻訳活性化;翻訳抑制;細胞小器官機能の調節;免疫細胞活性化;免疫細胞抑制;アポトーシスの誘導;アポトーシスの抑制;ヌクレアーゼ活性;分化の調節;標的核酸の置換;標的核酸の改変;等であることができる。本開示の方法を使用して調節することができる細胞の活性には、免疫細胞活性化(例えば、T細胞活性化等);アポトーシス;エフェクター分子(例えば、サイトカイン、抗体、成長因子等)の産生;標的核酸の転写;標的mRNAの翻訳;細胞小器官活性;細胞内トラフィッキング;分化;等が含まれるが、これらに限定されない。本開示の方法は、形質膜で作用するエフェクターの放出を引き起こすために使用することもでき、それにより細胞の活性の改変(例えば、免疫活性化を提供する免疫共抑制受容体モチーフの放出)がもたらされる。
i)個体から得たTリンパ球またはナチュラルキラー(NK)細胞を、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで遺伝子改変すること、ここで、キメラNotch受容体ポリペプチドは個体の癌細胞上のエピトープに対して特異的であり、遺伝子改変は、ex vivoで実行される;
ii)遺伝子改変されたTリンパ球またはNK細胞を個体に導入すること、ここで、遺伝子改変されたTリンパ球またはNKが癌細胞を認識して殺傷し、それにより癌を処置する。
本開示は、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。上に詳述するように、キメラNotchポリペプチドは、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインを含む。キメラNotchポリペプチドは、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位;及び細胞内ドメインを含むNotch受容体ポリペプチドも含む。いくつかの場合では、該方法は、細胞と特異的結合対の第二のメンバーを接触させることを含み、ここで、特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出され、細胞内ドメインの放出が、細胞の活性を調節する。いくつかの場合では、特異的結合対の第二のメンバーは、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞と接触する第二の細胞の細胞表面上に存在する。いくつかの場合では、特異的結合対の第二のメンバーは、可溶性である。
本開示は、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。上に詳述するように、キメラNotchポリペプチドは、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインを含む。キメラNotchポリペプチドは、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位;及び細胞内ドメインを含むNotch受容体ポリペプチドも含む。いくつかの場合では、該方法は、細胞と特異的結合対の第二のメンバーを接触させることを含み、ここで、特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。いくつかの場合では、特異的結合対の第二のメンバーは、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞と接触する第二の細胞の細胞表面上に存在する。いくつかの場合では、特異的結合対の第二のメンバーは、可溶性である。
本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドを使用して、生物学的分子、例えば、サイトカイン、成長因子、抗体、及び、遺伝子コードされている他の結合剤、アゴニスト、捕捉剤、またはブロッキング剤の発現及び分泌を制御することができる。
本開示は、i)本開示のキメラNotchポリペプチド;及びb)キメラ抗原受容体を発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。該方法は、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチド及びCARの両方を発現する細胞を、i)特異的結合対の第二のメンバー(ここで、特異的結合対の第二のメンバーは、特異的結合対の、キメラNotch受容体ポリペプチドに存在する、第一のメンバーに結合する);及びii)CARが結合する抗原と接触させることを必然的に含む。これらの実施形態では、細胞の活性の調節は、特異的結合対の第二のメンバー、及びCARが特異的に結合する抗原の両方が必要とされる。
本開示は、i)第一の本開示のキメラNotchポリペプチド;及びb)第二の本開示のキメラNotchポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。例えば、いくつかの場合では、細胞は、i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む第一のキメラNotch受容体ポリペプチド;及びii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む第二のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現し、ここで、第一及び第二の特異的結合対は互いに異なり、そのため、第一の特異的結合対の第二のメンバーの第一の特異的結合対の第一のメンバーへの結合は、第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインの放出をもたらさず、第二の特異的結合対の第二のメンバーの第二の特異的結合対の第一のメンバーへの結合は、第一の第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインの放出をもたらさない。これらの実施形態では、第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインは、第一のエフェクター機能を提供し;第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインは、第一のエフェクター機能とは異なる第二のエフェクター機能を提供する。これらの実施形態の概略図を図9Aに提示する。
本開示は、a)本開示のキメラNotchポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸;及びb)キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されている細胞の活性を調節する方法であって、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある、前記方法を提供する。該方法は、以下を必要とする:
i)本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する(がCARは発現しない)細胞と、特異的結合対の第二のメンバー(ここで、特異的結合対の第二のメンバーは、特異的結合対の、キメラNotch受容体ポリペプチドに存在する、第一のメンバーに結合する)を接触させること、ここで、細胞と特異的結合対の第二のメンバーの接触は、キメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインの放出を誘導し、ここで、細胞内ドメインは、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の転写を活性化させる転写因子であり、これによりCARの発現がもたらされる;及び
ii)(i)の接触ステップの後に、細胞と、CARが結合する抗原を接触させること。二回目の接触ステップは、CARによる活性の調節をもたらす。これらの実施形態では、細胞の活性の調節は、特異的結合対の第二のメンバー、及びCARが特異的に結合する抗原の両方を必要とする。これらの実施形態の一例を図10に概略的に示す。
i)2つ以上の本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する(がCARは発現しない)細胞と、特異的結合対の第二のメンバー(ここで、特異的結合対の第二のメンバーは、特異的結合対の、キメラNotch受容体ポリペプチドに存在する、第一のメンバーに結合する)を接触させること、ここで、細胞と特異的結合対の第二のメンバーとの接触が、2つ以上のキメラNotch受容体ポリペプチドの少なくとも1つの細胞内ドメインの放出を誘導し、ここで、細胞内ドメインは、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の転写を活性化する転写因子であり、これによりCARの発現がもたらされる;及び
ii)(i)の接触ステップの後に、細胞と、CARが結合する抗原を接触させること。二回目の接触ステップは、CARによる活性の調節をもたらす。これらの実施形態では、細胞の活性の調節は、特異的結合対の第二のメンバー、及びCARが特異的に結合する抗原の両方を必要とする。
本開示は、i)第一の本開示のキメラNotchポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸;及びb)第二の本開示のキメラNotchポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されている細胞の活性を調節する方法を提供する。例えば、いくつかの場合では、細胞は、i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む第一のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸;及びii)第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む少なくとも第二のキメラNotch受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されており、ここで第一及び第二の特異的結合対は互いに異なり、そのため、第一の特異的結合対の第二のメンバーの第一の特異的結合対の第一のメンバーへの結合は、第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインの放出をもたらさず、第二の特異的結合対の第二のメンバーの第二の特異的結合対の第一のメンバーへの結合は、第一の第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインの放出をもたらさない。これらの実施形態では、第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインは、第一のエフェクター機能を提供し、ここでエフェクター機能は第二のキメラNotchポリペプチドの転写の誘導を提供し;第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの細胞内ドメインは、第一のエフェクター機能とは異なる第二のエフェクター機能を提供する。
本開示は、第一の細胞の活性を調節するための方法であって、第一の細胞と第二の細胞を接触させることを含み、第二の細胞が、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインを含むキメラNotch受容体ポリペプチドを発現し;第二の細胞が、その表面上で特異的結合対の第二のメンバーを含む分子を発現する、前記方法を提供する。いくつかの場合では、第一の細胞と第二の細胞を接触させることは、第一の細胞における活性を調節する。いくつかの場合では、第一の細胞と第二の細胞を接触させることは、第二の細胞の活性を調節する。
細胞の活性を調節するための本開示の方法は、多細胞環境において実行することができる。例えば、第一のキメラNotch受容体ポリペプチドは、第一の細胞(「第一の受信側細胞」)に存在し、近接する細胞(例えば、「送信側」細胞)上の第一のリガンドへの結合の後に放出されたとき、第二の細胞上の第二のキメラNotch受容体ポリペプチドが結合する第二のリガンドの転写を提供する、細胞内ドメインを含むことができ、ここで、第二のリガンドは、第一の細胞の表面上に発現される。第二の細胞(「第二の受信側細胞」)は、その表面上で第二のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現し;第一の受信側細胞との相互作用の際、第二の受信側細胞における細胞内エフェクター機能は、放出され、第二の受信側細胞の活性の調節を提供する。これらの実施形態を図13に概略的に示す。このような方法は、、例えば、構造化された組織を構築すること;細胞結合性をトラッキングすること;等に有用である。
いくつかの場合では、細胞の活性を調節するための本開示の方法は、標的細胞上の2つの別々の標的分子の認識を必然的に含む。例えば、本開示のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する第一の細胞は、標的細胞上の第一の標的分子;及び標的細胞上の第二の標的分子と結合する受容体または他の認識分子をその細胞表面上で発現する第二の細胞を認識する。第一及び第二の細胞の、標的細胞上の第一及び第二の標的分子への結合は、第二の細胞による新しいエフェクター機能(例えば、新しいポリペプチドなどの新しい遺伝子産物)の発現をもたらす。いくつかの場合では、第一の細胞の、標的細胞上の第一の標的分子への結合は、第一の細胞において遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)の発現を誘導し;ここで、いくつかの場合では、第一の細胞により産生される新しい遺伝子産物は、第一の細胞の表面上で発現され、第二の細胞の表面上にある受容体または他の認識分子と結合し、この結合が、第二の細胞の活性(例えば、第二の細胞が新しいエフェクター機能(例えば、新しいポリペプチドなどの新しい遺伝子産物を発現するように、核酸の転写の誘導)の調節をもたらし得る。いくつかの場合では、第一及び第二の細胞の、標的細胞上の第一及び第二の標的分子への結合は、第二の細胞による標的細胞の殺傷、または第二の細胞により発現される新しいエフェクター機能による標的細胞の殺傷をもたらす。いくつかの場合では、第一及び第二の細胞の、標的細胞上の第一及び第二の標的分子への結合は、標的細胞の活性の調節をもたらす;例えば、標的細胞の活性の調節が、第二の細胞により産生された新しいエフェクター機能により誘導される場合である。これらの実施形態を図14に概略的に示す。
本開示は、結合誘発型転写スイッチ(例えば、本開示のキメラNotchポリペプチド;MESAポリペプチド;TANGOポリペプチド;等)を発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。細胞の活性を調節するための本開示の方法は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで実行されることができる。細胞の活性を調節するための本開示の方法は、単一細胞において、または多細胞環境(例えば、天然に存在する組織;人工の組織;等)において実行されることができる。細胞の活性を調節するための本開示の方法は、並行してまたは一連で実行されることができる。
a)細胞において、本開示のキメラNotchポリペプチドを発現させること、ここで、キメラNotchポリペプチドは、i)特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメイン;ii)Notch受容体ポリペプチド、ここで、Notch受容体ポリペプチドは、上記の通りであり、1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む;及びiii)細胞内ドメインを含む;ならびに
b)細胞と特異的結合対の第二のメンバーを接触させること。特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合が、Notch受容体ポリペプチドの1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより細胞内ドメインが放出される。放出された細胞内ドメインは、細胞の活性を調節する。本方法を使用して調節することができる細胞の活性には、i)細胞の遺伝子産物の発現;ii)細胞の増殖;iii)細胞のアポトーシス;iv)細胞の非アポトーシス性死;v)細胞の分化;vi)細胞の脱分化;vii)細胞の遊走;viii)細胞からの分子の分泌;及びix)細胞の細胞接着が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、接触工程は、in vivoで実行される。いくつかの場合では、接触工程は、ex vivoで実行される。いくつかの場合では、接触工程は、in vitroで実行される。
本開示の方法における使用に好適なモジュラー細胞外センサー構造(MESA)ポリペプチドは、米国特許公開第2014/0234851号に記載のMESAポリペプチドであることができる。MESAポリペプチドは、a)リガンド結合ドメイン;b)膜貫通ドメイン;c)プロテアーゼ切断部位;及びd)機能的なドメインを含む。機能的なドメインは、転写調節因子(例えば、転写活性化因子、転写抑制因子)であることができる。いくつかの場合では、MESA受容体は、2つのポリペプチド鎖を含む。いくつかの場合では、MESA受容体は、単一のポリペプチド鎖を含む。
好適なTANGOポリペプチドは、第一はタバコエッチ病ウイルス(Tev)プロテアーゼを含み、第二のポリペプチドは、転写因子に融合したTevタンパク質分解切断部位(PCS)を含む、ヘテロ二量体である。2つのポリペプチドが、互いに近接するとき、この近接は、自然なタンパク質間相互作用により媒介され、Tevは、PCSを切断して、転写因子を放出する。Barnea et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2008 Jan.8;105(1):64−9)。
いくつかの場合では、結合誘発型スイッチは、細胞内でT細胞受容体(TCR)の発現を誘導する。本開示の方法を使用して誘導することができるTCRは、例えば、癌細胞の表面上にあるエピトープ、ウイルス感染細胞の表面上にあるエピトープ、自己抗原内に存在するエピトープ、等を含む、様々なエピトープのいずれかに対して特異的であるTCRを含む。TCRは、アルファ鎖及びベータ鎖を通常含み;主要組織適合性複合体により提示されるときに抗原を認識する。いくつかの場合では、TCRは、操作TCRである。
いくつかの場合では、結合誘発型スイッチは、細胞におけるCARの発現を誘導する。「キメラ抗原受容体」及び「CAR」という用語は、本明細書で互換可能に使用され、免疫細胞の活性化を誘発するまたは阻害することができる人工のマルチモジュール分子を指し、通常、排他的ではなく、細胞外ドメイン(例えば、リガンド/抗原結合ドメイン)、膜貫通ドメイン及び1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CARという用語は、CAR分子に限定されず、CAR変異体も含む。CAR変異体は、分割CARを含み、CARの細胞外部分(例えば、リガンド結合部分)及び細胞内部分(例えば、細胞内シグナル伝達部分)は、2つの別々の分子上に存在する。CAR変異体は、例えば、分割CARを含む、条件的に活性化可能なCARである、オンスイッチCARも含み、分割CARの2つの部分の条件的ヘテロ二量体化は、薬理学的に制御される。CAR変異体は、一次CARの活性を増幅または阻害することができる二次CAR結合ドメインを含む、二重特異性CARも含む。CAR変異体は、阻害性キメラ抗原受容体(iCAR)も含み、これは、例えば、二重特異性CARシステムの構成要素として使用してよく、ここで、二次CAR結合ドメインの結合は、一次CAR活性化の阻害をもたらす。CAR分子及びその誘導体(すなわち、CAR変異体)は、例えば、PCT出願番号US2014/016527;Fedorov et al Sci Transl Med(2013);5(215):215ra172;Glienke et al Front Pharmacol(2015)6:21;Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J(2014)20(2):151−5;Riddell et al Cancer J(2014)20(2):141−4;Pegram et al Cancer J(2014)20(2):127−33;Cheadle et al Immunol Rev(2014)257(1):91−106;Barrett et al Annu Rev Med(2014)65:333−47;Sadelain et al Cancer Discov(2013)3(4):388−98;Cartellieri et al.,J Biomed Biotechnol(2010)956304に記載されており;これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特異的結合対の第一のメンバーは、種々の特異的結合対のいずれかの第一のメンバーであることができる。好適な特異的結合対は、上に詳述している。
特異的結合対には、例えば、抗原−抗体特異的結合対、ここで、第一のメンバーは、抗原である第二のメンバーに特異的に結合する抗体(または抗体をベースとする認識足場)であるか、または第一のメンバーは抗原であり、第二のメンバーが抗原に特異的に結合する抗体(または抗体をベースとする認識足場)である;リガンド−受容体特異的結合対、ここで、第一のメンバーはリガンドであり、第二のメンバーはリガンドが結合する受容体であるか、または第一のメンバーは受容体であり、第二のメンバーが受容体に結合するリガンドである;非抗体をベースとする認識足場−標的特異的結合対、ここで、第一のメンバーは非抗体をベースとする認識足場であり、第二のメンバーは非抗体をベースとする認識足場に結合する標的であるか、または第一のメンバーは標的であり、第二のメンバーが標的に結合する非抗体をベースとする認識足場である;接着分子−細胞外マトリックス結合対;Fc受容体−Fc結合対、ここで、第一のメンバーは、Fc受容体である第二のメンバーに結合する免疫グロブリンFcを含むか、または第一のメンバーが免疫グロブリンFcを含む第二のメンバーに結合するFc受容体である;及び受容体−共受容体結合対を含み、ここで、第一のメンバーは、共受容体である第二のメンバーに特異的に結合する受容体であるか、または第一のメンバーが受容体である第二のメンバーに特異的に結合する共受容体である。
いくつかの場合では、細胞内ドメインは、転写調節因子、例えば、転写活性化因子または転写抑制因子などの転写因子である。いくつかの場合では、転写因子は、細胞の分化を直接調節する。いくつかの場合では、転写因子は、細胞の分化を、第二の転写因子の発現を調節することにより間接的に調節する。
が挙げられる。転写調節因子の追加の例は、上記の通りである。転写因子(転写活性化因子;転写抑制因子)の非限定的な例を、図37〜83に示す。例えば、転写因子は、図37〜83のいずれか1つに示すアミノ酸配列に対して、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
結合トランスデューサは、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含むことができ、ここで、特異的結合対の第一のメンバーの、特異的結合対の第二のメンバーへの結合は、結合トランスデューサのリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、結合シグナルが伝達されかつ、細胞内ドメインが、細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される。synNotchにおけるタンパク質分解切断部位の例は、上記の通りである。
カテプシンBにより切断される
;エプスタイン・バー・ウイルスプロテアーゼにより切断される
;MMP−3(ストロメライシン)により切断される
;MMP−7(マトリライシン)により切断される
;MMP−9により切断される
;サーモライシン様MMPにより切断される
;マトリックスメタロプロテアーゼ2(MMP−2)により切断される
;カテスピン(cathespin)Lにより切断される
;カテプシンDにより切断される
;マトリックスメタロプロテアーゼ1(MMP−1)により切断される
;ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子により切断される
;膜型マトリックスメタロプロテアーゼ1(MT−MMP)により切断される
;ストロメライシン3(またはMMP−11)、サーモライシン、線維芽細胞コラゲナーゼ及びストロメライシン−1により切断される
;マトリックスメタロプロテアーゼ13(コラゲナーゼ−3)により切断される
;組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)により切断される
;ヒト前立腺特異的抗原により切断される
;カリクレイン(hK3)により切断される
;好中球エラスターゼにより切断される
;及び、カルパイン(カルシウム活性化中性プロテアーゼ)により切断される
の1つまたは複数を含むリンカーが含まれる。
本開示の方法を使用して、任意の真核細胞の活性を調節することができる。いくつかの場合では、細胞は、in vivoである。いくつかの場合では、細胞は、ex vivoである。いくつかの場合では、細胞は、in vitroである。いくつかの場合では、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの場合では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの場合では、細胞は、非ヒト霊長類細胞である。いくつかの場合では、細胞は、げっ歯類細胞である。いくつかの場合では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの場合では、細胞は、ラット細胞である。
本開示は、細胞の活性を調節する方法を実行するためのキットを提供する。
材料及び方法
Jurkat T細胞を、レンチウイルスを介して、Tet応答エレメント(TRE)抗メソテリンCAR−EGFP/pGK mCherryデュアルベクターで安定して形質導入した。形質導入された細胞は、mCherryを構成的に発現し、抗メソテリンCAR−EGFP融合体を、Tetトランス活性化因子(tTa)の存在下で誘導性に発現した。この安定した株を、次いで、抗CD19 Notch tTA受容体で形質導入した。結果得られたJurkat細胞を、次いで、抗原CD19、メソテリン、または両方を発現する慢性骨髄性白血病K562癌細胞との共培養を介してアッセイした。T細胞を、EGFPタグ付きCARの発現及び活性化マーカーであるCD69に関してフローサイトメトリーにより24時間でアッセイした。共培養物の上清も回収し、IL−2の分泌をELISAにより決定した。
キメラNotch受容体特徴決定
キメラNotchプラットフォームを使用して、リガンド結合の際に受信側細胞において転写を誘導できることを示すために、以下のレポーター細胞株を生成した:マウスL929線維芽細胞レポーターラインを、Tet応答エレメント(TRE)−>EGFPレポーター/pGK mCherryデュアルベクター(TREレポーター)またはGal4 UAS−>EGFP/pGKピューロマイシン耐性デュアルベクター(UASレポーター)での形質導入により生成した。キメラNotch変異体を、対応するL929レポーター細胞株へと形質導入して、キメラNotchレポーター細胞を生成した。これらのキメラNotchレポーター細胞を、2つの方法により並行して刺激した。まず、キメラNotch発現細胞を、受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する固定化抗体に暴露した。次に、細胞を、同族キメラNotchリガンドを発現するK562細胞またはL929線維芽細胞とインキュベートした。キメラNotch発現細胞を、EGFP蛍光に関して、フローサイトメトリーによりアッセイして、レポーター活性を測定した。図30〜32は、TREレポーターラインにおけるキメラNotchと抗CD19(図30A〜B)及び抗メソテリン(図31A〜B)に、及びUASレポーターラインにおけるキメラNotch抗CD19(図32A〜B)に関する結果を示す。
キメラ抗原受容体(CAR)として知られる人工のT細胞受容体を発現するように操作されたT細胞は、ある特定のB細胞癌に対する治療薬として有効である。しかしながら、CAR T細胞癌免疫療法での主な懸念事項は、オフターゲット作用であり、この場合、治療用T細胞が正常組織を破壊して、深刻な副作用、そして死亡さえももたらす。このような問題を軽減する可能性がある戦略は、治療用T細胞が、腫瘍微小環境においてのみCARを発現し、より局在化したT細胞応答を提供することである。このような戦略を実現するために、キメラNotchを治療用T細胞において用いて、最初に、腫瘍特異的細胞表面抗原と結合することにより腫瘍を検出し、腫瘍内にある第二の腫瘍特異抗原に対してのみCARの発現を開始させることができると推論された。効果的に、これは、T細胞活性に対する二重抗原制御及び腫瘍局在化応答の両方を提供する。In vitroデータでの原理証明をJurkat細胞において提示する。
図30Aに示し、実施例1に記載するような、(抗CD19 scFvを細胞外ポリペプチドとして、及びtTA転写活性化因子を細胞内ドメインとして含む)キメラNotchポリペプチドを発現し、pTet−GFP構築物を含む「受信側」細胞と、CD19をその表面上に発現する「送信側」細胞を、1mMのN−[(3,5−ジフルオロフェニル)アセチル]−L−アラニル−2−フェニル]グリシン−1,1−ジメチルエチルエステル(DAPT)の存在下または不在下で接触させた。DAPTは、ガンマセクレターゼ阻害因子である。データは、GFP+「受信側」細胞として表す。図84A及び84Bに示すように、送信側細胞及びDAPTの存在下では、GFP+「受信側」細胞は、対象、未処置レベルであり;DAPTの不在下では、送信側細胞との接触は、キメラNotchポリペプチド及びGFPの発現を強く活性化した。
最小notch膜貫通領域を、新規の細胞外及び細胞内ドメインと組み合わせて、多様なキメラ受容体を構築することができる。
Notch伝達経路のコアは、膜貫通領域にある。この設計は、多様なアレイの膜提示リガンドを検出する一連の受容体を操作するためのプラットフォームであるとして考えることができる(図85A)。細胞内側では、Notch細胞内ドメイン(NICD)を、Notchシグナル伝達活性化について報告するために、直交転写因子により置き換えることができる。細胞外では、内在性デルタ結合ドメインは、タンパク質結合ドメイン(例えば、FKBP、抗GFPナノボディ等)により置き換えることができ、切断は、同族結合パートナーが結合するときに誘導される。従って、異なる細胞内ドメインとそれぞれカップリングした異なる細胞外ドメインを有する受容体分子のライブラリーが生成された(図85B)。図86Aに示すように、合成受容体の応答は、切断依存性様式で同族リガンドを発現する送信側細胞との細胞間接触により活性化される。異なる細胞外及び細胞内ドメイン組み合わせでの結果を、図87Aに提供する。
SynNotch細胞株は、受容体活性化の際に強い活性化を示した。この結果が細胞株特異的であるか否かを検査するために、synNotch受信側細胞株を、一連の樹立細胞株:上皮性MDCK細胞、L929及びC3Hマウス線維芽細胞株、HEK293ヒト上皮性細胞株、Jurkat T細胞を操作することにより産生した。これらの全ては、synNotch受容体活性化の際に、レポーター遺伝子活性化の強い誘導を不変的に示した(図89B)。重要なことに、初代細胞も、synNotch受容体で操作することができ、こうして、これらは新規のリガンド刺激に応答するようになる。図89A(及び図90)では、synNotch及びレポーターを発現する一次海馬ニューロンを誘導して、リガンド発現送信側細胞との接触によりGFPレポーターカセットを発現することができることが示される。
SynNotch受信側細胞は、隣接細胞がリガンドを発現しているかどうかを検出することができる。上皮細胞層に配置されたsynNotch受信側細胞を、空間的に誘導してレポーター遺伝子を発現することができるかどうかを検査した。リガンド発現送信側細胞が、受信側細胞の層に低密度に播種されるとき、送信側細胞と直接接触する受信側細胞のみが、合成Notch受容体を活性化し、これは緑色送信側細胞の周囲の青色細胞(活性化受信側)の環により目視できる。一方で、離れた受信側細胞は不活性のままである(図91A)。
複数のsynNotch受容体が、クロストークすることなく、同じ細胞内で機能し得るかどうかを探求した。直交機能は、細胞が複数の入力の有無に応じて異なる出力を生成することを可能にするだろう。synNotch受容体は、シグナル伝達の機構のために、互いに直交して機能し得ると仮定された。異なる受容体の細胞内転写調節因子が異なる場合、クロストークを生じさせ得る共通の中間体(例えば、活性化キナーゼ)は存在しない。synNotchと内因性Notchとの間に何らかのクロストークがあった場合、シグナル伝達を最初に検査した。これを示すために、抗CD19−synNotchならびに異なる蛍光タンパク質を有する完全長Notchについて報告するように細胞を操作した。細胞をデルタのみで刺激したとき、完全長Notch応答のみが活性化された;同じことがCD19に対するsynNotchの応答にも当てはまる:2つの経路は独立した活性化を示す(図93A)。
複数のsynNotch受容体を同じ細胞内で使用して、多様な応答を生成することができる。組み合わせの環境の合図をインテグレートし、ある特定の基準が満たされたときにのみ応答する細胞の操作が設計された。具体的には、それらの環境上で2つの異なる抗原の存在下でのみ応答するが、それぞれに単独では応答しないだろう細胞の生成に、専念した。これを達成するために、抗CD19及び抗GFP細胞外ドメインを有する二重synNotch発現細胞(各synNotchの活性化により分割Gal4タンパク質の半分が活性化される)を操作した。このようにして、2つの入力が受信側細胞のみに提示される場合、活性化は見られない(図93C、列1〜3)。2つの受容体が活性化されたときにのみ、分割された分子が再構成され、受信側細胞における応答が誘導される(図93C、最後の列)。
細胞間コミュニケーションのための複数のsynNotch受容体を用いて、細胞間コミュニケーションの多細胞シグナル伝達システムを設計した。具体的には、上皮細胞層における自己組織化多層空間的パターニングの誘導に焦点をあてた。このために、受信側細胞は、2つのsynNotchを有し、そのうちの1つは他方のリガンドを誘導する。この特定の例において、抗GFP−synNotchは、CD19リガンド発現(及びレポータータンパク質mCherry)を誘導し;抗CD19−synNotchは、レポータータンパク質tagBFPを誘導する。次に、層のカスケードの誘導を開始するために、GFP送信側細胞を、二重synNotch受信側細胞の単層に低密度に播く。この回路は、送信側細胞島の周りに活性化の2つの同心円環の形成を可能にした:第一の隣接細胞は、抗GFP−synNotchの活性化後に赤色になり、それらはCD19送信側になる(図94A、1日目)。そして、送信側細胞から一直径離れた細胞は、第一の隣接細胞によって発現されたCD19リガンドに応答することができ、図94A、2日の二重環パターンを生成する。このようにして、2つの異なる細胞型が、空間的に制御された様式で受信側細胞の均一な集団から産生される(図94C)。ゆえに、複数のsyn−Notch受容体を使用して、自然発達過程で観察されるものと同様の、より複雑な多段階パターン形成応答を操作することができる(図94B)。
(図85A)Notchレポーター、synNotch受容体への、野生型Notchから開始した連続的な操作としての、synNotch受容体システムの概念設計。後者は、notchレポーターの細胞内直交転写因子の柔軟性を利用し、細胞外ドメインを置換することによって新規の入力に応答するプラットフォームを構築する。
(図87A)異なる細胞外及び細胞内ドメインを有する一連のsynNotch受信側細胞は、同族リガンドを用いた刺激の際に活性化を示す。細胞は、マウス線維芽細胞株L929であり、プレート結合型刺激により、またはリガンドを発現する送信側細胞を用いるかのいずれかで刺激され、これは図に示す通りである。
(図86A〜B)合成notch受容体を使用して、内因性疾患抗原を検出し、レポーター遺伝子の転写を増減させることができる。
(図88A)細胞外ドメイン上へのEGFリピートの付加は、抗メソテリンsynNotchにおける基礎活性化を低下させる。抗メソテリンScFvの前にEGFリピートを有するまたは有さない抗メソテリンsynNotch受容体を、L929線維芽細胞において誘導する。これらの受容体の活性化は、GFPレポーターを活性化する。示したデータは、2つのシナリオにおけるFACSプロットである:上、EGFリピート無し、レポーターの誘導は、リガンドの不在下であっても構成的である;下、EGFリピート有り、基礎レポーター活性化は消滅し(オフライン)、誘導によりGFP強度はオン状態になる。
(図89A)海馬ニューロン。一次海馬ニューロンを、E18ラット胚から解離し、核酸遺伝子導入(nucleofected)して、抗CD19 synNotch及びカップリングしたGFPレポーターを発現した。ニューロンは、ポリ−D−リジン及びラミニンでコーティングされたガラス底35mm培養皿上に播種する。ニューロンプレーティングの2時間後、送信側細胞(K562)を培養物に加えて共培養系を形成する。画像は、プレーティング後4日目に生細胞から取得する。右に、プレーンなK562細胞(上のパネル)またはCD19+K562送信側細胞(下のパネル)と共培養されたニューロンの代表的な画像を示す。リガンド提示送信側細胞と共培養したニューロンは、対照細胞より有意に高いGFP発現を有する。
(図90A)実験及びニューロンにおいて発現される構築物の実証。一次海馬ニューロンを、E18ラット胚から解離し、cNotch受容体ならびにTetO−GFPレポーターを発現する構築物で核酸遺伝子導入する。ニューロンを、ポリ−D−リジン及びラミニンでコーティングされたガラス底35mm培養皿上に播種する。ニューロンプレーティングの2時間後、K562送信側細胞を培養物に加えて共培養系を形成する。画像は、プレーティング後4日目に生細胞から取得する。
(図91A)上皮単層における境界検出。上皮細胞(MDCK)を以下のように操作する:送信側細胞は、膜貫通ドメインに連結した細胞外GFPを発現する;受信側細胞は、LaG17抗GFPナノボディを細胞外ドメインとして、及びGal4−VP64を細胞内ドメインとして、UAS−>BFPレポーター構築物とともに有する抗GFP synNotchを発現する。送信側及び受信側を1:50の比率で一緒に混ぜ、コンフルエントな単層のプレーティングの48時間後に共焦点画像を取得する。高倍率及び低倍率の代表的な画像を、距離に対する蛍光強度の代表的なラインとともに示す。緑色送信側細胞と接触している受信側細胞のみが青色のレポーターをオンにし、送信側細胞の周りに環を形成する。
(図92A;図91Bとの比較)C3Hマウス線維芽細胞を以下のように操作する:送信側細胞は、膜貫通ドメインに連結した細胞外CD19を、さらにtagBFPマーカーを発現する。受信側細胞は、tTA細胞内ドメインを、TRE−>myoDエフェクター構築物及び構成的mCherryマーカーとともに有する抗CD19 synNotchを発現する。送達線維芽細胞を、まずプレートの限られた領域に播種する;1時間後、送信側細胞をプレートに付着させ、受信側細胞を、ガラスプレート全体を覆うように播種する。画像は右側で10時間ごとに取得する。
下に、送信側細胞と受信側細胞の共培養(上)または受信側細胞単独(下)の実験の代表的な視野を示す。
右端の棒グラフは、様々な条件における、受信側細胞の、または親細胞のE−カドヘリン発現レベルを報告する。E−カドヘリンレベルは、同族抗原GFPを発現する送信側細胞の存在下でのみ低下する。
上パネル:L929マウス線維芽細胞を以下のように操作する:送信側細胞は、膜貫通ドメインに連結した細胞外CD19、さらにtagBFPマーカーを発現する;受信側細胞は、tTA細胞内ドメインを、TRE−>E−カドヘリン−GFPエフェクター構築物、及び構成的赤色マーカー(mCherry)とともに有する抗CD19 synNotchを発現する。顕微鏡で収集した蛍光シグナルを、送信側及び受信側細胞を有する代表的なスフェロイドについて、ならびに示すように受信側細胞のみを有するものについて、t=20時間で示す。緑色蛍光は、送信側細胞の存在下でのみ、受信側細胞において誘導される(E−カドヘリンチャネル、右端)。
下パネル:L929マウス線維芽細胞を以下のように操作する:送信側細胞は、膜貫通ドメインに連結した細胞外GFPを発現する;受信側細胞は、tTA細胞内ドメインを、TRE−>mCherryレポーター構築物、及び構成的青色マーカー(tagBFP)とともに有する抗GFP synNotchを発現する。共焦点顕微鏡で収集した蛍光シグナルを、送信側+受信側細胞を有する代表的なスフェロイドについて、及び受信側細胞のみを有するものについて、t=0 t=20時間で示す。赤色蛍光は、送信側細胞の存在下でのみ、受信側細胞において誘導される(mCherryレポーターチャネル、右端)。送信側細胞と受信側細胞の再編成は認められない。
(図93A)synNotch及び野生型Notchは、直交シグナル伝達経路を活性化する。L929マウス線維芽細胞受信側を、(i)tTA細胞内ドメイン及びTRE−>GFPレポーターを有する野生型Notch受容体、ならびに(ii)抗CD19細胞外ドメインとGal4−VP64細胞内ドメイン、及びUAS−>tagBFPレポーターを有するsynNotch受容体を発現するように操作する。右側のグラフは、異なる条件におけるBFP及びGFPレポーターに関する受信側細胞蛍光シグナルを報告する。黒色点は未処理細胞であり、青色点受信側細胞はCD19発現送信側で刺激され、橙色点はデルタ送信側で刺激した受信側細胞であり、赤色点はCD19及びデルタの両方を発現する送信側細胞で刺激された受信側細胞である。送信側細胞は、マウスL929線維芽細胞である。
上皮細胞(MDCK)を以下のように操作する:送信側細胞は、膜貫通ドメインに連結した細胞外GFPを発現する;受信側細胞は、(i)tTA細胞内ドメインを、TRE−>CD19−mCherryエフェクターカセットとともに有する抗GFP synNotch;(ii)Gal4−VP64細胞内ドメイン、及びUAS−>tagBFPレポーターを有する抗CD19受容体を発現する。
(図95A)synNotch受容体の活性化の推定上の構造機構。LNRドメインは、未結合立体構造においてプロテアーゼ切断部位をマスクする(左)。リガンドが受容体と係合すると、この部位は露出し、この事象が伝達を開始する(右)。
材料及び方法
別段の指示がない限り、以下の材料及び方法が、実施例4に記載の結果に適用される。
synNotch受容体は、CD19 scFv、LaG17(低親和性)、またはLaG16_2(高親和性)GFPナノボディをマウスNotch1(NM_008714)最小調節領域(Ile1427〜Arg1752)及びGal4VP64に融合させることにより構築した。全てのsynNotch受容体は、n末端CD8αシグナルペプチド
を膜標的化のために、及びmyc−タグ
をα−myc A647を伴う表面発現の容易な決定のために含有する(cell−signaling #2233)。受容体を、全ての初代T細胞実験に関してPGKプロモーターを含有する改変pHR’SIN:CSWベクターへとクローニングした。pHR’SIN:CSWベクターは、応答エレメントプラスミドを作成するようにも改変された。Gal4 DNA結合ドメイン標的配列
の5つのコピーを5’で最小CMVプロモーターにクローニングした。ヒトIL−2、IL−10、Tbet、またはTRAILコドン最適化mRNA配列を、Gal4誘導性プロモーターのMCS下流及びIRES mCherryレポーターの5’にクローニングした。全ての構築物は、In−Fusionクローニング(Clontech #ST0345))を介してクローニングした。
初代CD4+及びCD8+T細胞を、陰性選択によるアフェレーシスの後に匿名のドナー血液から単離した(STEMCELL Technologies #15062及び15063)。血液は、University Institutional Review Boardの承認を得て、Blood Centers of the Pacific(カリフォルニア州サンフランシスコ)から得た。T細胞を、20%ヒトAB血清(Valley Biomedical Inc.,#HP1022)及び10%DMSOを含むRPMI−1640(UCSF cell culture core)中で凍結保存した。解凍後、実施例4の全ての実験について、30単位/mL IL−2(NCI BRB Preclinical Repository)を補充した、X−VIVO 15(Lonza #04−418Q)、5%ヒトAB血清及び10mM中和N−アセチルL−システイン(Sigma−Aldrich #A9165)からなるヒトT細胞培地中でT細胞を培養した。
汎親和性VSV−G偽型レンチウイルスを、Fugene HD(Promega #E2312)を使用して、pHR’SIN:CSW導入遺伝子発現ベクターならびにウイルスパッケージングプラスミドpCMVdR8.91及びpMD2.Gを用いたレンチ−X 293T細胞(Clonetech #11131D)のトランスフェクションを介して産生した。初代T細胞を、同日に解凍し、培養24時間後、1:3の細胞:ビード比率でDynabeads Human T−Activator CD3/CD28(Life Technologies #11131D)で刺激した。48時間で、ウイルス上清を回収し、初代T細胞を24時間ウイルスに曝露した。T細胞刺激後4日目に、Dynabeadsを除去し、それらを静止させアッセイに使用できる9日目までT細胞を増殖させた。T細胞を、FACs ARIA IIを用いたアッセイのために選別した。
使用した癌細胞株は、K562骨髄性白血病細胞(ATCC #CCL−243)、Daudi B細胞リンパ芽球(ATCC #CCL−213)、及びHCT115結腸癌細胞(ATCC #CCL−247)とした。Daudi腫瘍と同等のレベルでヒトCD19を安定して発現させるために、K562をレンチウイルスで形質導入した。CD19レベルは、細胞をα−CD19 APC(Biolegend #302212)で染色することによって決定した。K562を、表面GFP(PDGF膜貫通ドメインに融合したGFP)を安定して発現するためにも形質導入した。全ての細胞株を導入遺伝子の発現について選別した。
全てのin vitro synNotch T細胞刺激について、2×105個のT細胞を1:1の比率で送信側細胞と共培養した。丸底96ウェル組織培養プレートでT細胞及び送信側細胞を混合した後、細胞を400xgで1分間遠心分離して、細胞の相互作用を引き起こし、培養物をレポーター発現またはカスタム遺伝子誘導の発現について、BD LSR IIを用いたフローサイトメトリーを介して24時間で分析した。全てのフローサイトメトリー分析は、FlowJoソフトウェア(TreeStar)で行った。
α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びヒトIL−2またはIL−10発現のいずれかを制御する5xGal4応答エレメントを発現する初代CD4+T細胞を、K562骨髄性白血病細胞(CD19−またはCD19+)で上に記載したように刺激した。参考として、α−CD19 4−1BBζ CARを発現するCD4+T細胞は、1:3の比率でα−CD3/CD28 Dynabeadsで刺激した形質導入していないT細胞とともに刺激した。上清を24時間で回収し、製造者のプロトコルに従って、Luminex MAGPIX(Luminex Corp.)ヒトサイトカインマグネティック25−プレックスパネル(Invitrogen参照番号LHC0009M)で分析した。全てのサイトカインレベルを、xPONENTソフトウェア(Luminex Corp.)を用いて標準曲線に基づいて算出した。
IL−2産生を制御するsynNotch T細胞をアッセイして、細胞内サイトカイン染色(ICS)によって、これらがIL−2を基礎的に産生したかどうかを決定した。synNotch T細胞及び形質導入していないT細胞対照を、GolgiPlug(BD Biosciences #555029)の存在下で6時間培養した。T細胞を、次いで、α−IL−2 FITC(BD #340448)でBD Biosciences ICSキット(#555028)を用いて染色した。IL−2のレベルを、BD LSRIIを用いたフローサイトメトリーを介して分析した。
初代ヒトCD4+T細胞を、Dynabeads Human T−Activator CD3/CD28で上記のように刺激した。活性化中にT細胞をTh1サブセットへと分化するために、細胞を上記の通り、ただし、2.5ng/mLの組換えIL−12(R&Dシステム)及び12.5μg/mLのα−IL−4クローンMP4−25D2(BD Pharmigen #554481)を加えて培養した。IL−12及びα−IL−4を、少なくとも週二回加えた。並行して、初代CD4 T細胞を、レンチウイルスで形質導入して、ヒトTbet T2A mCherry(TBX21、NCBI #EAW94804.1)を発現させ、IL−2を補充したT細胞培地において正常に培養した。α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びTbet T2A GFP発現を制御する5x Gal4応答エレメントを発現するCD4+T細胞を、CD19−またはCD19+K562送信側細胞の存在下でウイルス形質導入24時間後に培養した。synNotch T細胞を、K562の存在下でIL−2を補充したT細胞培地において培養した。全てのT細胞を11〜14日間培養し、次いで、細胞内サイトカイン染色(ICS)に供して、Th1 T細胞の割合(%)を決定した。
HCT116結腸癌細胞及びK562を、組換えTRAIL(1〜200ng/mL、1:2希釈シリーズ)で24時間処理した。次いで、細胞を回収し、live/dead染色、SYTOX Blue(Thermo Scientific #S34857)で染色し、死滅細胞の割合をBD LSR IIでのフローサイトメトリーによって決定した。K562により発現されるデスレセプター4(DR4)のレベルを、α−TRAIL R1(DR4)APC(Biolegend #307208)で染色することによって評価した。
動物試験を、UCSF Institutional Animal Care and Use Committeeに承認されたプロトコル下にてUCSF Preclinical Therapeutics Coreで実施した。NOD scidガンマ(NSG)(雌、8〜12週齢、Jackson Laboratory #005557)マウスを、全てのin vivoマウス実験に使用した。α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びヒトIL−2 IRES mCherryを制御する5x Gal4応答エレメントを発現する初代CD4+及びCD8+T細胞を、選別し、実験において使用した。
統計学的有意性を、別段の指定がない限り、スチューデントのt検定(両側検定)によって決定した。実施例4に関する全ての統計学的分析は、Prism 6(Graphpad)を用いて行い、p値を報告した(有意差無し=p>0.05、*=p≦0.05、**=p≦0.01、***=p≦0.001、****=p≦0.0001)。全てのエラーバーは平均の標準誤差または標準偏差のいずれかを表す。
synNotch受容体は、CD4+及びCD8+ヒト初代Tリンパ球において抗原誘導型転写を推進することができる
Notch受容体は、3つの重要な要素を有する:1)リガンド結合上皮成長因子(EGF)リピート、2)活性化中に受容体の切断を制御するコア調節領域、及び3)放出され、転写を調節するNotch細胞内ドメイン(NICD)。完全にカスタマイズ可能な受容体標的化及び転写調節を可能にするsynNotch受容体プラットフォームを構築するために、リガンド依存性切断及び活性化を制御するNotchコア調節領域を最小の足場として利用したが、その後カスタマイズした入力認識及び出力転写モジュールを追加した(実施例3を参照されたい)。Notchコア調節領域には、S2切断部位のメタロプロテアーゼへのアクセス可能性を制御するLin12−Notchリピート(LNR)、ヘテロ二量体化ドメイン(HD)、及びNotch細胞内ドメイン(NICD)の放出に必要なγ−セクレターゼ切断部位を含有する膜貫通ドメイン(TMD)である。天然リガンドデルタの認識に通常関与する細胞外EGFリピートを除去し、癌抗原CD19を対象とする一本鎖可変断片(scFv)または表面提示GFPなどの直交抗原に対するナノボディで置換した(図96B〜96C)。転写調節に通常必要とされるNICDを、四量体ウイルス転写活性化因子ドメインであるVP64に融合したGal4 DNA結合ドメインで置換した(図96B〜96C)。この全体のアプローチを使用して、目的の任意の表面抗原に対するsynNotch受容体を操作し、受容体活性を、直交転写因子及びそれらの会合する応答エレメントによって制御されるカスタマイズされた細胞出力につなげることができる(実施例3を参照されたい)。ある範囲の他の細胞外及び細胞内ドメインもsynNotchと機能することが示された。
全身の免疫細胞及び組織は、サイトカインとして知られる可溶性タンパク質を分泌して、細胞挙動を情報伝達及び調節して、全体的な免疫応答を形作る。特定のサイトカインプロファイルは、病原体及び腫瘍を根絶するために重要である。多くの場合、異なるセットのサイトカインは、免疫応答を抑制する反対の効果を有する。さらに、サイトカインが癌に対する免疫を増強するか、または自己免疫設定における有害な炎症を抑制し得るある特定のシナリオでは、これらのサイトカインは存在しない。治療用T細胞がどのサイトカインを分泌するかを精密に制御することが望ましい。しかしながら、いくつかの例では、T細胞がCARまたは天然T細胞受容体を介して活性化されるとき、産生されるサイトカインに対する制御はほとんどなく、しばしばサイトカインプロファイルは、疾患及び活性化の状況ならびに受容体の特性に依存する(図98A〜98C)。多くのT細胞療法では、特定の疾患または治療の必要性に免疫応答を合わせるように特定のサイトカインの産生にバイアスをかけることが有益であり得る。
治療用T細胞の結果を精密に形作るための別の方法は、その分化を制御することである。サイトカインのようなタンパク質エフェクターを産生することを超えて、T細胞は、有効なサブタイプの免疫応答を開始するために重要な特定の分化プログラムを受ける。これらのサブタイプ分化プログラムは、通常、T細胞活性化、特定のサイトカイン、及び最終的に特定のT細胞運命を開始するマスターレギュレーター転写因子の調節の組み合わせによって決定される。Tヘルパー細胞1(Th1)またはTヘルパー細胞2(Th2)T細胞は、マスターレギュレーター転写因子であるTbet及びGATA3によりそれぞれ制御される、2つの正準のCD4+T細胞運命選択である(図99A)。Th1細胞は、病原体及び癌に対する細胞免疫のために重要であり、一方でTh2細胞は、抗体産生の刺激に関与する。多くの疾患では、局所環境は、それらが無効にされるように誤った経路に沿ってT細胞の分化を傾斜させる。これは、癌において特に当てはまり、この場合、T細胞は抑制表現型に押し込まれ、免疫反応を妨げ、腫瘍拡大がもたらされる可能性がある。
将来のT細胞治療薬の別の重要な要素は、T細胞を、それらが非未変性のものであってもカスタマイズされた治療ペイロードを送達することを可能にする、新しい能力で操作することである。天然T細胞またはCAR T細胞は、感染細胞または癌細胞を直接認識し、溶解性顆粒の送達を通してそれらを死滅させる(図100A)。しかしながら、天然のT細胞応答は、疾患を安全に根絶させるには不十分であるかまたは極端すぎることが多い。分泌された生物製剤などの、T細胞による治療用ペイロードのカスタム送達は、例えば、細胞傷害性活性を局所的に増強することにより、または免疫系により認識され殺傷されるように疾患の部位をプライミングすることにより処置困難な疾患を補助し得る。
synNotch受容体がin vitroでT細胞応答のスペクトルを精密に調節することができるため、受容体がin vivoで固形腫瘍に対して初代ヒトT細胞を選択的に標的とし、サイトカインIL−2などのカスタムペイロードの送達を誘導できるかどうかを調査した。これらの実験のために、免疫無防備状態のNOD scidガンマ(NSG)マウスにおいて、両側K562異種移植固形腫瘍モデルを確立し、ここで、非標的CD19−腫瘍及び標的CD19+腫瘍をそれぞれ左側腹部及び右側腹部に皮下移植した(図101A)。腫瘍を4日間確立させ、次にα−CD19 synNotch受容体ならびにIL−2発現及びIRES mCherryレポーターを制御する応答エレメントで操作したCD4+及びCD8+T細胞を静脈内(i.v.)注射した(図107A)。6日後、腫瘍を回収し、腫瘍浸潤T細胞をIL−2 IRES mCherryレポーターの発現について分析した(図101A〜101C)。腫瘍局在化T細胞のみが、標的CD19腫瘍においてIL−2発現に関するmCherryレポーターを発現し、レポーターレベルは、in vitroで刺激されたときに同じT細胞について観察されたレベルと同様であった(図101A〜101Cならびに図107B及び107C)。T細胞の頻度は腫瘍内で高くなかったが(CD4+では1000個の細胞中1個、CD8+T細胞では500個中1個)、T細胞の活性は標的腫瘍に対して高度に特異的であった(図101B及び101Cならびに図107D)。synNotch−>IL−2 T細胞の静脈内注射に加えて、T細胞は、非標的及び標的腫瘍にも直接注射された。次いで、腫瘍を回収し、注射2日後にフローサイトメトリーを介して分析し、同じく同様のレベルで標的腫瘍におけるIL−2レポーターの選択的発現を示して、in vitroで刺激したT細胞にマッチした(図107E)。これらの腫瘍に浸潤するsynNotch T細胞の能力はさらに改善され得るが、これらのデータは、synNotch受容体がT細胞を原発腫瘍に標的化し、局所的様式で治療物質の産生を選択的に誘導することができることを明確に示す。ゆえに、synNotch操作T細胞は、有効性を増強し、全身投与の毒性を低減する、この両方のために、局所送達から利益を得ることができる広範囲の遺伝的にコード可能な治療剤の送達に有効であると証明し得る。
(A)TCR及びCARは、T細胞応答の再形成をほとんど制御しない未変性T細胞活性化プログラムを推進するキナーゼベースのシグナル伝達カスケードを活性化する。synNotch受容体は、細胞表面抗原(例えば疾患関連抗原)を認識し、T細胞応答に対するより精密な制御を伴ってカスタム転写プログラムを直接調節する。ゆえに、synNotch受容体を用いて、アラカルト応答を操作することができる。(B)synNotch受容体は、目的の細胞表面抗原を検出するカスタムリガンド結合ドメイン(例えば、scFvまたはナノボディ)、Notchのコア調節領域、及び直交転写因子を含有する細胞質ドメイン(例えば、Gal4 VP64)を有し得る。カスタム転写プログラムを制御する直交転写因子の対応する応答エレメントは、受容体とともにT細胞へと操作されてよい。(C)癌関連抗原CD19を対象とするscFv及び直交抗原GFPに対するナノボディを有するsynNotch受容体を操作し、synNotch受容体プラットフォームの多能性を実証する。
(A)CD4+及びCD8+初代ヒトT細胞を、α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びBFPレポーターの発現を制御する5x Gal4応答エレメントで操作した。(B)24時間の共培養後の、CD19−もしくはCD19+K562またはDaudi癌細胞(CD19+)を伴う送信側細胞での刺激に応答するα−CD19 synNotch受容体受信側T細胞におけるBFPレポーターの選択的誘導を示すヒストグラム(3回以上の実験の代表値)。(C)パネルBに示す複製データから算出された、送信側細胞を用いた24時間の刺激後にBFPレポーターを上方制御するα−CD19 synNotch T細胞の割合(%)(全ての条件についてn≧3、エラーバー=平均の標準誤差)。(D)CD4+及びCD8+初代ヒトT細胞を、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体親和性変異体及びBFPレポーターで、パネルAと同様に操作した。(E)24時間の共培養後の、表面GFP−またはGFP+K562送信側細胞に応答するα−GFP synNotch受容体受信側T細胞におけるBFPレポーターの選択的誘導を示すヒストグラム(3回以上の実験の代表値、エラーバー=平均の標準誤差)。(F)パネルHに示す複製データから算出された、送信側細胞を用いた24時間の刺激後にBFPレポーターを上方制御するα−GFP synNotch T細胞の割合(%)(全ての条件についてn>3、エラーバー=平均の標準誤差)。
(A)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体(mycタグ付き)及びBFPの発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+(左プロット)及びCD8+(右プロット)初代ヒトT細胞の2次元ドットプロット。応答エレメントベクターは、挿入された応答エレメントを有するT細胞を同定するためにmCherryの構成的発現を推進するPGKプロモーターも含有する。全てのBFPレポーター発現分析は、synNotch受容体及びBFP発現を制御する対応する5xGal4応答エレメントの両方を有したT細胞(右上枠の囲った集団)で行った。(B)24時間の共培養後に、CD19−K562対照細胞と比較してCD19+K562またはDaudi腫瘍細胞に応答するsynNotch受容体受信側T細胞におけるBFPレポーターの選択的誘導を示すヒストグラム(3回以上の実験の代表値)。(C)K562及びDaudi腫瘍細胞上のCD19レベルを示すヒストグラム。Daudi腫瘍は天然にCD19を発現し、K562は異所的にCD19を同様のレベルで発現する。(D)α−GFPナノボディsynNotch Gal4VP64受容体を発現するCD4(上段)及びCD8(下段)初代ヒトT細胞に関する、図103Aと同様の二次元ドットプロット。各カラムは、特定のα−GFPナノボディ親和性変異体(LaG17、LaG16−2)に関するものである。全てのBFPレポーター発現分析は、図103Aのように右上に輪郭を描いたゲート内のT細胞で行った。(E)24時間の共培養後に、表面GFP−K562と比較して表面GFP+K562癌細胞に応答するsynNotch受容体受信側T細胞におけるBFPレポーターの選択的誘導を示すヒストグラム(3回以上の実験の代表値)。(F)K562 GFP−対照と比較した、表面GFPを発現するK562癌細胞における総GFPレベルを示すヒストグラム。
(A)CAR活性化は、T細胞が多様なセットのサイトカインを産生するように推進する。(B)24時間の刺激後の、標的CD19+K562細胞(y軸)または陰性対照CD19−K562(x軸)で活性化された初代ヒトα−CD19 CAR CD4+T細胞により産生された、25種のサイトカイン(サイトカインの一覧については図98Cを参照されたい)のレベル(pg/mL)を示す散布図(n=3、エラーバー=平均の標準誤差)。(C)標的CD19+K562により刺激されたCD4+α−CD19 CAR T細胞により産生された25種のサイトカインのレベル(n=3、エラーバー=平均の標準誤差)。(D)CD4+T細胞を、α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びIL−2またはIL−10のいずれかの発現を制御する対応する応答エレメントで操作した。細胞を、標的CD19+K562またはCD19−非標的K562と共培養した。(E)CD19+K562刺激に応答する単一サイトカインの産生を示すパネルBと同様の散布図(n=3、エラーバー=平均の標準誤差)。(F)CD19+K562細胞に応答してIL−2またはIL−10産生を推進するα−CD19 synNotch T細胞により産生されたサイトカインのレベル。単一のサイトカイン(IL−2またはIL−10)のみが、バックグラウンドレベルを超えて産生された(n=3、エラーバー=平均の標準誤差)。
(A)CD4+ヒト初代T細胞を、α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びIL−2産生を制御する会合する5xGal4応答エレメントで操作した。(B)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及び発現IL−2発現IRES mCherryを制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4初代ヒトT細胞の2次元ドットプロット(左パネル)。応答エレメントベクターは、応答エレメントが挿入されているT細胞を同定するためにBFPの構成的発現を推進するPGKプロモーターも含有する。synNotch受容体及びIL−2 IRES mCherry発現を制御する対応する5xGal4応答エレメントの両方を有するT細胞を、選別し、図98及び図104の全ての対応するアッセイのために使用した。(右上四角)。左パネルは、形質導入していないT細胞と比較して、二重陽性T細胞においてIL−2 IRES mCherryレポーターの基礎誘導がないことを示す。(C)刺激されていないCD4+及びCD8+T細胞、IL−2産生を制御する刺激されていないα−CD19 synNotch Gal4VP64T細胞、及びPMA/イオノマイシンで6時間刺激された陽性対照T細胞について、IL−2に関する細胞内サイトカイン染色のドットプロットを示す。(D)基礎及び刺激IL−2レベルを、形質導入していないCD4+T細胞、α−CD19 4−1BBζ CAR T細胞、及びIL−2産生を制御するα−CD19 synNotch Gal4VP64 T細胞から回収された上清について提供する(n=4)。(E)α−CD3/CD28 dynabeadsで刺激された対照CD4+T細胞及びCD19−またはCD19+K562で刺激されたIL−2産生を制御するα−CD19 synNotch Gal4VP64 T細胞のCD69レベル(左カラム)及びIL−2 IRES mCherryレポーターレベル。CD69は、同族抗原での刺激の際にはsynNotch T細胞で上方制御されない。(F)CD4+ヒト初代T細胞を、α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びIL−10産生を制御する会合する5xGal4応答エレメントで操作した。(G)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びIL−10 IRES mCherry発現の発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+初代ヒトT細胞に関するパネルBに同等のデータ。(H)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及び発現IL−10 IRES mCherry発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+初代ヒトT細胞に関するパネルDに同等のデータ。(I)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及び発現IL−10 IRES mCherry発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+初代ヒトT細胞に関する図104Eに同等のデータ。
(A)天然のT細胞分化:CD4+T細胞が、抗原提示細胞上のMHC分子により提示される病原体由来ペプチドの係合を通して活性化されるとき、それらは感染に応じて特定のT細胞サブタイプへと分化する。Th1及びTh2は、異なる免疫反応を推進する正準のCD4+T細胞運命である。Th1細胞は、転写因子Tbetを発現し、IFNγを産生し、細胞免疫及び腫瘍クリアランスを助ける。Th2細胞は、B細胞による抗体産生の刺激のための重要なサイトカインであるIL−4を産生する。(B)SynNotch推進性T細胞分化:CD4+α−CD19 synNotch T細胞を、発現Tbetを、ゆえにT細胞によるTh1運命選択を調節するように操作した。synNotch T細胞を、標的CD19+または非標的CD19−K562細胞と11日間共培養して、synNotch推進性Tbet発現がCD4+T細胞をTh1運命へとCD19依存性様式で傾斜できるかどうかを決定した。(C)24時間のCD4+α−CD19 synNotch T細胞とCD19+K562の後のTbet T2A EGFPの選択的発現を示すヒストグラム(少なくとも3回の実験の代表値)。(D)CD19+またはCD19−K562のいずれかとの11日間の培養後のTbet及びIFNγに関する細胞内染色CD4+α−CD19 synNotch Gal4VP64 T細胞の2次元ドットプロット。T細胞を、染色する前にPMA/イオノマイシンで4時間にわたって刺激してサイトカイン産生を推進した(少なくとも3回の実験の代表値)。(E)11日間の指定した処理後のIFNγ+(Th1)T細胞の割合(%)(全ての処理についてn≧3、エラーバー=平均の標準誤差、有意性はスチューデントのt検定により決定、有意差無しp>0.05)。
(A)図99Cからの複製データの定量。Tbet T2A GFP発現を制御するα−CD19 synNotch Gal4VP64受容体応答エレメントを有するCD4+T細胞を、CD19+またはCD19−K562と24時間共培養した。Tbet T2A GFP発現を伴うT細胞の割合(%)を定量化し、これは、TbetはT細胞がCD19+K562に曝露されたときにのみ上方制御されたことを示す(n=3)。(B)α−CD3/CD28 dynabeadsで刺激され、Th1サイトカインIFNγについて細胞内染色された、11日間の培養後のCD4 T細胞の代表的なドットプロット。IFNγ陽性ゲートを赤色で囲った。(C)Th1分化条件(IL−12+α−IL−4)において11日間培養されたCD4+T細胞に関するパネルBと同様の代表的なドットプロット(n=4)。(D)形質導入の48時間後のTbet T2A mCherryの構成的過剰発現を伴うCD4 T細胞の代表的なヒストグラム。(E)11日間の培養後での、Tbet及びIFNγに関する、Tbet T2A mCherryの構成的過剰発現を伴うCD4+T細胞の細胞内染色の代表的なドットプロット(n=6)。二重陽性Tbet及びIFNγ T細胞を赤色で囲った。(F)対照CD19−K562と共培養したTbet T2A GFP発現を制御するα−CD19 synNotch Gal4VP64受容体応答エレメント(構成的にmCherryを発現する)を有するCD4+T細胞の代表的な顕微鏡検査。synNotch T細胞(赤色細胞)は、癌細胞と会合しないまたはTbet発現のレポーター(GFP)を上方制御しない。(G)パネルFと同様だが、T細胞をCD19+T細胞と共培養した代表的な顕微鏡検査。synNotch T細胞(赤色細胞)は、CD19+K562と会合体を形成し、Tbet T2A GFP発現を上方制御する。活性化したsynNotch T細胞は、mCherry及びGFP共発現のために黄色である。
(A)天然T細胞の細胞傷害性:CD8+細胞傷害性T細胞は、それらのTCRを介して感染細胞を認識し、パーフォリンで細胞内に孔を作製し、これによりプログラムされた細胞死を開始するグランザイムの送達を可能にし、感染した細胞を直接殺傷する。(B)SynNotchでカスタマイズしたキラーT細胞:CD4+T細胞を、表面GFPに応答してアポトーシス調節因子TRAILの発現を制御するα−GFP synNotchで操作した。(C)24時間のCD4+α−GFP synNotch T細胞と表面GFP+K562の後の表面TRAILの選択的発現を示すヒストグラム。(D)24時間後の死染色SYTOX Blueの取込みを介した表面GFP+K562細胞死を示すヒストグラム。指定したT細胞型との共培養(T細胞:標的細胞比率=1:1)。(E)パネルDに示す複製データから算出した標的細胞生存率(%)(n=4、エラーバー=平均の標準誤差)。
(A)静止させたCD4+及びCD8+T細胞を24時間にわたってα−CD3/CD28 dynabeadsで再刺激し、細胞表面TRAILについて染色した。いずれのT細胞サブセットもTRAIL発現を急性に上方制御しなかった。(B)癌細胞は、組換えTRAILが媒介するアポトーシスに対するそれらの感受性において変動する。HCT116結腸癌は、デスレセプターがTRAILに結合され、低レベルTRAIL処置に対して感受性であった。K562は、TRAILに対してデスレセプターを発現するが、TRAIL処置に対して非感受性であった。(C)表面GFP−もしくはGFP+K562またはHCT116癌細胞を、0〜200ng/mLの組換えTRAILで24時間にわたって処置し、死亡を死染色SYTOX Blueを用いた染色によりフローサイトメトリーを介してモニターした(n=4)。(D)TRAILに結合されたデスレセプター4(DR4)に関して染色したK562のヒストグラム。K562は、受容体を発現し、それらはTRAIL媒介性アポトーシスに対して耐性。(E)LaG17 α−GFPナノボディsynNotch Gal4VP64及びロイシンジッパーTRAIL(LZ−TRAIL左パネル)または完全長表面TRAIL(右パネル)の発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+T細胞の代表的なドットプロット。TRAIL発現のmCherryレポーターのレベルを、二重陽性T細胞及び対照の形質導入していないT細胞について以下に示す。(F)LaG17 α−GFPナノボディsynNotch Gal4VP64及び発現LZ−TRAILを制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+T細胞を、表面GFP−またはGFP+K562と24時間共培養して、LZ−TRAILがGFP+K562に応答してのみ分泌されるかどうかを決定した。(G)表面GFP=またはGFP+K562と共培養された図106Eに示す選別されたSynNotch CD4 LZ−TRAIL T細胞におけるTRAIL産生のmCherryレポーターレベルのレベルを示すヒストグラム。レポーターは、表面GFP+K562に応答して排他的に活性化した。(H)表面GFP−またはGFP+K562のいずれかと24時間にわたって共培養された、選別されたSynNotch CD4 LZ−TRAIL T細胞からの上清のTRAIL ELISA(n=2)。
(A)NSGマウスに、CD19−非標的K562及び標的CD19+をそれぞれ左側腹部及び右側腹部に皮下注射した。IL−2 iRES mCherry発現を制御するα−CD19 synNotch T細胞を、腫瘍が確立した後にマウスに注射し、腫瘍を指定した時点で回収して、synNotch T細胞が腫瘍に浸潤し、IL−2及びmCherryレポーターの発現が誘導されたかどうかを決定した。(B)腫瘍に浸潤した静脈内注射されたCD4+及びCD8+synNotch T細胞におけるIL−2 IRES mCherryレポーターレベルのヒストグラムであり、これは、標的CD19+腫瘍におけるmCherryレポーターの選択的発現を示す(データは、3匹の複製マウスの代表値を表す)。(C)パネルBに示す複製データからIL−2発現のmCherryレポーターの発現を誘導した腫瘍浸潤T細胞の割合(%)の定量(n=3、有意性はスチューデントのt検定により決定**p<0.01)。
(A)α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体(mycタグ付き)及びIL−2 IRES mCherryの発現を制御する5xGal4応答エレメントで形質導入されたCD4+(左プロット)及びCD8+(右プロット)初代ヒトT細胞の2次元ドットプロット。応答エレメントベクターは、応答エレメントを挿入されたT細胞を同定するためにBFPの構成的発現を推進するPGKプロモーターも含有する。右上影付き四角内のT細胞を選別し、全てのin vivo及びin vitro実験で使用した。(B)in vitroでCD19−またはCD19+K562で刺激されたIL−2発現を制御するCD4+及びCD8+synNotch T細胞の代表的なヒストグラム。IL−2 IRES mCherry発現は、CD19の存在下でのみ生じた。(C)図107Bに示す複製データからのIL−2発現のmCherryレポーターの発現を誘導したCD4+及びCD8+T細胞の割合(%)の定量(n=3、有意性はスチューデントのt検定により決定***p<0.001及び****p<0.0001)。(D)腫瘍内注射した腫瘍浸潤CD4+及びCD8+synNotch T細胞におけるIL−2 IRES mCherryレポーターレベルのヒストグラムであり、これは、標的CD19+腫瘍におけるmCherryレポーターの選択的発現を示す(データは、3匹の複製マウスの代表値を表す)。腫瘍内注射実験に関するプロトコルを示す。結果は、静脈内注射したT細胞及びin vitro刺激したT細胞で観察されるものと同様であった。(E)静脈内注射及び腫瘍内注射の後にCD19−及びCD19+腫瘍に浸潤しているCD4+及びCD8+T細胞の割合(%)(n=3、エラーバー=平均の標準誤差、有意性はスチューデントのt検定で決定、有意差無しp>0.05)。
(A)synNotch受容体は、T細胞応答の多能調節因子であり:synNotch受容体は、初代ヒトT細胞において多様な挙動を推進することができる。synNotch受容体はカスタムサイトカイン産生プロファイルを推進し、非未変性治療薬を有効に送達し、T細胞分化を制御することができ、それは全て抗原依存性でありT細胞活性化に依存しない様式である。(B)synNotchは、in vivoでT細胞を標的として治療用ペイロードを局所的に産生するのに十分である。
材料及び方法
以下の材料及び方法を、別段の指定がない限り、実施例5に記載の結果に適用する。
synNotch受容体は、CD19 scFv、LaG17(低親和性)、またはLaG16_2(高親和性)ナノボディをマウスNotch1(NM_008714)最小調節領域(Ile1427〜Arg1752)及びGal4VP64またはTetR VP64(tTa)に融合させることにより構築した。全てのsynNotch受容体は、n末端CD8αシグナルペプチド
を膜標的化のために、及びmyc−タグ
をα−myc A647を伴う表面発現の容易な決定のために含有する(cell−signaling #2233)。受容体を、全ての初代T細胞実験に関してPGKプロモーターを含有する改変pHR’SIN:CSWベクターへとクローニングした。pHR’SIN:CSWベクターは、応答エレメントプラスミドを作成するようにも改変された。Gal4 DNA結合ドメイン標的配列
の5つのコピーを、最小CMVプロモーターの5末端にクローニングした。またこれに含まれる応答エレメントプラスミドは、構成的にmCherry発現を推進するPGKプロモーターであるため、形質導入されたT細胞を容易に区別することができる。全ての誘導性CARベクターについて、CARをc末端にてGFPでタグ付けし、Gal4応答エレメントにマルチクローニング部位3’にてBamHI部位を介してクローニングした。全ての構築物は、In−Fusionクローニング(Clontech #ST0345))を介してクローニングした。
初代CD4+及びCD8+T細胞を、陰性選択によるアフェレーシスの後に匿名のドナー血液から単離した(STEMCELL Technologies #15062及び15063)。血液は、University Institutional Review Boardの承認を得て、Blood Centers of the Pacific(カリフォルニア州サンフランシスコ)から得た。T細胞を、20%ヒトAB血清(Valley Biomedical Inc.,#HP1022)及び10%DMSOを含むRPMI−1640(UCSF cell culture core)中で凍結保存した。解凍後、全ての実験について、30単位/mL IL−2(NCI BRB Preclinical Repository)を補充した、X−VIVO 15(Lonza #04−418Q)、5%ヒトAB血清及び10mM中和N−アセチルL−システイン(Sigma−Aldrich #A9165)からなるヒトT細胞培地中でT細胞を培養した。
汎親和性VSV−G偽型レンチウイルスを、Fugene HD(Promega #E2312)を使用して、pHR’SIN:CSW導入遺伝子発現ベクターならびにウイルスパッケージングプラスミドpCMVdR8.91及びpMD2.Gを用いたレンチ−X 293T細胞(Clonetech #11131D)のトランスフェクションを介して産生した。初代T細胞を、同日に解凍し、培養24時間後、1:3の細胞:ビードの比率でDynabeads Human T−Activator CD3/CD28(Life Technologies #1113ID)で刺激した。48時間で、ウイルス上清を回収し、初代T細胞を24時間ウイルスに曝露した。T細胞刺激後4日目に、Dynabeadsを除去し、それらを静止させアッセイに使用できる9日目までT細胞を増殖させた。T細胞を、FACs ARIA IIを用いたアッセイのために選別した。
使用した癌細胞株は、K562骨髄性白血病細胞(ATCC #CCL−243)、Daudi B細胞リンパ芽球(ATCC #CCL−213)、及びHCT115結腸癌細胞(ATCC #CCL−247)とした。Daudi腫瘍と同等のレベルでヒトCD19を安定して発現させるために、K562をレンチウイルスで形質導入した。CD19レベルは、細胞をα−CD19 APC(Biolegend #302212)で染色することによって決定した。K562を、表面GFP(PDGF膜貫通ドメインに融合したGFP)を安定して発現するためにも形質導入した。全ての細胞株を導入遺伝子の発現について選別した。
全てのin vitro synNotch T細胞刺激について、2×105個のT細胞を1:1の比率で送信側細胞と共培養した。丸底96ウェル組織培養プレートでT細胞及び送信側細胞を混合した後、細胞を400xgで1分間遠心分離して、細胞の相互作用を引き起こし、培養物を、CD4+T細胞の活性化のマーカー(例えば、CD69)及びCD8+T細胞の標的腫瘍細胞の特異的溶解について、BD LSR IIを用いて、24時間で分析した。全てのフローサイトメトリー分析は、FlowJoソフトウェア(TreeStar)で行った。
α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びCARを制御する5xGal4応答エレメントを発現する初代CD4+T細胞を、指定の標的癌細胞株で上に記載したように刺激した。上清を24時間で回収し、製造者のプロトコルに従って、Luminex MAGPIX(Luminex Corp.)ヒトサイトカインマグネティック25−プレックスパネル(Invitrogen参照番号LHC0009M)で分析した。全てのサイトカインレベルを、xPONENTソフトウェア(Luminex Corp.)を用いて標準曲線に基づいて算出した。
CD4+synNotch ANDゲートT細胞を、上記のように24時間にわたって指定した癌細胞株で刺激し、上清を回収した。上清におけるIL−2レベルは、IL−2 ELISA(eBiosciences #BMS2221HS)を介して決定した。T細胞も採取し、α−CD69 APC(Biolegend #310910)で染色して、それらが活性かどうかを決定した。
CD8+synNotch ANDゲートT細胞を、24時間にわたって上記のように、指定の抗原を発現する標的細胞で刺激した。標的癌細胞の特異的溶解のレベルを、形質導入していないT細胞対象を用いた処置と比べて培養物中で生存している標的細胞の割合を比較することによって決定した。細胞死を、live/dead染色SYTOX Blueの取込み、及び通常は標的細胞によって占有される正常なSSC/FSC領域から標的細胞をシフトさせることによりモニターした(Thermo Scientific #S34857)。
α−GFPナノボディ(LaG17)synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR IRES effluc発現を制御する対応する応答エレメントを発現するように操作した、選別されたCD4+及びCD8+初代ヒトT細胞を、GFP+またはGFP−K562細胞で24時間刺激した(2×105個のT細胞及び2×105個のK562)。efflucの産生は、ONE−gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega #E6110)でアッセイした。生物発光は、FlexStation 3(Molecular Devices)で測定した。
動物試験を、UCSF Institutional Animal Care and Use Committeeに承認されたプロトコル下にてUCSF Preclinical Therapeutics Coreで実施した。T細胞注射の10日前に、Daudi腫瘍及び表面GFP Daudi腫瘍をNOD scidガンマ(NSG)マウス(雌、8〜12週齢、Jackson Laboratory #005557)の左右に皮下注射した。α−GFPナノボディ(LaG17)synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR IRES effluc発現を制御する対応する応答エレメントを発現するように操作した、選別されたCD4+及びCD8+初代ヒトT細胞を、1:1のCD4+対CD8+T細胞割当で(1×106個の各T細胞型)、腫瘍を有するマウスに腫瘍移植の10日後に静脈内注射した。ルシフェラーゼ発現を、11日間にわたってモニターし、生物発光イメージングを、IVIS 100(Xenogen)前臨床イメージングシステムを使用して指定の時点で行った。画像は、150mg/kgのD−ルシフェリン(Gold Technology #LUCK−100)の腹腔内注射の10分後に取得した。統合した生物発光強度の定量を、ImageJ(NIH)にて定量化した。
NSGマウスに、5×106個のCD19 K562及びGFP/CD19 K562腫瘍細胞を、それぞれ左側腹部及び右側腹部で皮下移植した。腫瘍移植の4日後、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR発現を調節する対応する応答エレメントで操作した1×106個の初代ヒトCD4+及びCD8+T細胞(2×106個の総T細胞)、または形質導入していないT細胞を、マウスに静脈内注射した。腫瘍サイズは、UCSF Preclinical Therapeutics CoreのスタッフによりキャリパーによりT細胞注射後20日間にわたりモニターした。カプラン・マイヤー実験では、同一のプロトコルを使用したが、単一の腫瘍が注射された。マウスは、腫瘍サイズが安楽死基準(2000mm3)に達したときに死亡したとみなされた。
別段の記載がない限り、統計学的有意性をスチューデントのt検定(両側検定)により決定した。全ての統計学的分析及び曲線適合は、Prism 6(Graphpad)を用いて行い、p値を報告した(有意差無し=p>0.05、*=p≦0.05、**=p≦0.01、***=p≦0.001、****=p≦0.0001)。全てのエラーバーは、平均の標準誤差または標準偏差のいずれかを表す。
2つの抗原ANDゲート回路の設計:synNotch受容体は、CAR発現を誘導する。
CARの発現を制御するためにsynNotch受容体を使用するこの方法を検査するために、Jurkat T細胞の活性化に対して組み合わせ抗原制御を操作する試みがなされた。これらの実験では、2つのモデル腫瘍抗原であるCD19及びメソテリンを標的とした。Jurkat T細胞を、細胞内テトラサイクリン制御トランス活性化因子(tTa)ドメインを有するα−CD19 synNotch受容体で操作した。α−メソテリン4−1BBζ CAR遺伝子を、synNotch受容体により活性化された対応するテトラサイクリン応答エレメント(TRE)を伴うプロモーターの制御下で、挿入した(図109A及び109B)。操作したJurkatを、in vitroで、CD19、メソテリン、または両抗原一緒の異所的発現を伴う標的K562骨髄性白血病細胞と共培養した(図109A)。これらの操作したJurkat細胞が、α−CD19 synNotch刺激に応答してのみα−メソテリンCARを発現するため、T細胞は、メソテリン単独に応答して活性化するはずがない。T細胞がCD19に曝露された場合、α−メソテリンCARが発現され、T細胞は活性化のためにプライムされる(図109A及び109Bならびに図114A)。次いで、T細胞は、メソテリンを感知し、活性化することができる。
Jurkat T細胞におけるsynNotch ANDゲートの成功を考慮し、初代T細胞において同じタイプのsynNotch推進性CAR発現回路が複数の抗原を識別するように機能し得るかどうかを検査した。あるスペクトラムの異なるsynNotch Gal4VP64受容体が初代T細胞において十分に発現し、Gal4応答エレメントは初代T細胞において最小基礎活性を有することがわかった。これは、synNotch推進性CAR発現ANDゲートにとって理想的なシナリオである。それは、T細胞がsynNotch抗原を感知するまでは、CARを活性化する基礎発現がないべきであるからである。
synNotch受容体が、in vitroで初代T細胞においてCAR発現を確かにゲートするため、in vivoでT細胞がsynNotch受容体を介して腫瘍を標的とし、腫瘍微小環境にある時にのみCARを発現し得るかどうかを検査した。この実験のために、両側異種移植CD19 Daudi B細胞リンパ芽球腫瘍を、免疫無防備状態のNOD scid IL−2Rγ−/−(NSG)マウスへと注射した。野生型Daudi細胞(synNotchリガンドを含有しない)を、左側腹部に皮下注射し、一方で表面GFPを発現するDaudi腫瘍細胞を右側腹部に注射した。移植のために腫瘍に10日間を与えた後、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体ならびにα−CD19 4−1BBζ CAR及びIRES増強ホタルルシフェラーゼ(effluc)レポーターの発現を制御する対応する応答エレメントを備えた初代CD4+及びCD8+ヒトT細胞(図116A及び116B)を注射した。ルシフェラーゼ発現を、11日間の経過にわたってCAR発現に対するレポーターとしてモニターした(図111A、図116C)。T細胞は、1日目までにGFP+Daudi腫瘍においてCARを選択的に発現し始め、二重抗原腫瘍において11日の期間にわたってCARの局所的発現を増加させ続けた(図111B及び111C)。標的腫瘍におけるルシフェラーゼシグナルの増加は、二重抗原標的腫瘍におけるsynNotch推進性CAR発現及び細胞の拡大の組み合わせである可能性が高い。(図116B)。対照GFP−腫瘍では、ルシフェラーゼの増加は観察されなかった。
α−GFP synNotch受容体がT細胞を腫瘍に対して標的化し、α−CD19 CARの局所発現を制御し得ることが示された。次いで、synNotch ANDゲートT細胞がin vivoで二重抗原腫瘍を選択的に排除し得るかどうかを検査した。これらの実験のために、同様の両側腫瘍モデルをK562腫瘍細胞で構築した(図112A及び図117A及び117B)。腫瘍を移植し、移植に4日間かけた(K562腫瘍は、Daudi細胞と比較して、より迅速に増殖し、より大きい腫瘍を確立する)。4日目に、α−GFP synNotch−>α−CD19 CAR ANDゲート回路を有するCD4+及びCD8+T細胞を注射し、腫瘍増殖を、キャリパーにより20日間モニターした(図112A)。マウスの一群を形質導入していない対照T細胞で処置して、腫瘍増殖の基準を用意した。この実験では、T細胞を、全てが同じ動物内にある、二重抗原「疾患」腫瘍を単一抗原「バイスタンダー」組織から識別するために直接攻撃する。
(A)CARまたは腫瘍特異的TCR T細胞は、通常単一抗原を標的とし、それによりしばしばオフターゲット組織損傷を引き起こす。改善された治療用T細胞は、腫瘍抗原及び組織特異的抗原の両方の組み合わせを認識する多数のセンサーを必要とするだろう。これは、細胞がそれらの環境を評価し、いつ活性化させるかをより精密に決断することを可能にする。そのような治療用細胞は、標的罹患組織を正常組織から区別するよりために備えられた方がよい。(B)抗原の組み合わせを感知し、T細胞シグナル伝達及び転写を調節する新しいタイプの受容体は、精巧な細胞の判断及びより精密な治療用T細胞応答を可能にするように組み立てなければならない。(C)synNotch受容体を、カスタム細胞外リガンド結合ドメイン、例えば、目的の抗原を対象とするscFvまたはナノボディ(例えば、腫瘍または組織特異的抗原)で操作する。synNotch受容体によるリガンド認識の際、直交転写因子(例えば、TetRVP64またはGal4VP64)は、カスタム遺伝子回路を制御する細胞質尾部から切断される。(D)synNotch ANDゲート回路の設計であり、T細胞は活性化するために2つの抗原を感知することを必要とする。このANDゲートシグナル伝達回路は、2つの連続するステップで作動する:1)synNotch受容体は、T細胞が第一の抗原Aを認識することを可能にし、2)T細胞は、第二の腫瘍抗原Bを対象とするCARを発現する。A及びBが存在する場合、T細胞は、活性化し、標的腫瘍を殺傷することができる。
(A)2つの受容体ANDゲート回路の操作:α−CD19 synNotch受容体は、α−メソテリンCAR発現を誘導する。(B)Jurkat T細胞を、α−CD19 synNotch tTa受容体及びα−メソテリンCAR発現を制御する対応する応答エレメントで操作した。Jurkat T細胞は、それらのsynNotch受容体を介して標的細胞上のCD19をまず認識して、CAR発現を開始しなければいけない。T細胞がCD19によりプライムされて活性化された後、α−メソテリンCARは、メソテリンと結合し、Jurkat細胞を活性化することができる。T細胞活性化の2つの正準のマーカーは、CD69上方制御及びIL−2産生である。synNotch ANDゲートJurkat T細胞は、CD19及びメソテリンの両方を発現する標的腫瘍細胞に曝露されたときにのみ活性化するべきである。(C)単一抗原(メソテリン単独)または二重抗原(CD19/メソテリン)K562腫瘍細胞と48時間にわたって共培養されたsynNotch ANDゲートJurkat T細胞における活性化マーカーCD69のヒストグラム。CD69は、T細胞が二重陽性K562に曝露されたときにのみ発現された(3つの独立した実験の代表値)。(D)二重抗原K562に暴露されたときにのみsynNotch AND−ゲートJurkatによるIL−2産生を示すIL−2 ELISA(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、有意性はスチューデントのt検定により決定、****=p≦0.0001)
(A)ヒト初代CD4+及びCD8+T細胞を、α−GFPナノボディsynNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CARの発現を制御する対応する応答エレメントで操作した。これらのCD4+またはCD8+synNotch ANDゲートT細胞は、まずそれらのsynNotch受容体を介して表面GFPを感知しなければならず、その後でのみ、それらはα−CD19 CARを発現し、プライミングされて活性化される。synNotch ANDゲート初代T細胞は、それらがGFPとCD19の両方を感知した場合にのみ、活性化し、サイトカインを産生するまたは標的細胞を殺傷するべきである。(B)パネルAに記載した初代CD4+synNotch ANDゲートT細胞を、CD19単独または表面GFP/CD19 K562と共培養した。α−CD19 CAR GFP受容体発現レベルのヒストグラムは、GFPが標的細胞の表面上に存在するときにのみCARが発現されることを示す(少なくとも3つの独立した実験の代表値)。(C)CD19単独またはGFP/CD19 K562のいずれかにより活性化されたCD4+synNotch ANDゲートT細胞からの上清を、Luminexを介して25種のサイトカインの存在について分析した。サイトカインは、T細胞がGFP/CD19 T細胞に曝露された時にのみ産生された(エラーバーは平均の標準誤差である、n=3)。(D)CD8+synNotch ANDゲート初代T細胞を、パネルAに記載したように操作した。CD4+T細胞と同様に、α−CD19 CAR GFP受容体発現レベルのヒストグラムは、GFPが標的細胞の表面上に存在するときにのみCARが発現されることを示す(少なくとも3つの独立した実験の代表値)。(E)CD8+synNotch ANDゲート初代T細胞とCD19単独またはGFP/CD19腫瘍細胞のいずれかとの24時間の共培養後の前方及び側方散乱フローサイトメトリープロット。T細胞は、青色ゲートの中にあり、標的K562は赤色ゲート内にある。synNotch ANDゲートT細胞は、GFP/CD19 K562のみを殺傷し、それは、K562ゲート内で減少する細胞により示される(3つの実験の代表値)。(F)パネルEに示す複製CD8+synNotch ANDゲート初代T細胞の細胞傷害性データの定量(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、有意性はスチューデントのt検定により決定*=p≦0.05)。
(A)初代ヒトCD4+及びCD8+T細胞を、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR IRES effluc発現を調節する対応する応答エレメントで操作し、マウスに、Daudi腫瘍(CD19単独)を左側腹部で、表面GFP Daudi(GFP/CD19)腫瘍を右側腹部で静脈内注射した。ルシフェラーゼ発現を、操作したT細胞の静脈内注射後11日間にわたってモニターした。(B)T細胞注射の7日後の、パネルAに記載のように処置されたマウスにおけるルシフェラーゼ発現の代表的な画像。ルシフェラーゼ発現は、GFP/CD19腫瘍においてのみ高く、これは、二重抗原腫瘍における局在化したCAR発現を示す(n=2マウス)。(C)左側腹部Daudi腫瘍(CD19単独)及び右側腹部の表面GFP Daudi腫瘍(GFP/CD19)におけるルシフェラーゼレベルの統合強度の定量。ルシフェラーゼ発現は、全ての時点で、二重抗原腫瘍において高い(エラーは標準偏差である、n=2)。
(A)初代ヒトCD4+及びCD8+T細胞を、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR発現を調節する対応する応答エレメントで操作し、マウスに、CD19 K562を左側腹部で、表面GFP/CD19 K562腫瘍を右側腹部で静脈内注射した。腫瘍サイズを、操作したT細胞または形質導入していないT細胞対照の静脈内注射後16日間にわたってモニターした。(B)synNotch ANDゲートT細胞(上)及び形質導入していない対照T細胞(下)で処置したマウスのCD19及びGFP/CD19腫瘍体積を示すグラフ。synNotch ANDゲートT細胞は、二重抗原腫瘍を排他的に標的とし、CD19単独腫瘍は、形質導入していない対照T細胞で処置したマウスと同一の速度で増殖した(n=5マウス、エラーバーは平均の標準誤差である、有意性はスチューデントのt検定により決定する**=p≦0.01、***=p≦0.001)。(C)synNotch ANDゲートT細胞で処置した個別のマウスに関する腫瘍体積測定。全てのマウスは、二重抗原腫瘍の選択的殺傷を示した。(D)synNotch ANDゲートT細胞がGFP/CD19腫瘍を排除し、100%のマウスが生存していることを示すカプラン・マイヤーグラフ。CD19単独腫瘍を有するマウスは、synNotch ANDゲートT細胞により排除されず、腫瘍成長は制御されない。対応する腫瘍成長曲線を、パネルDの右に提示する(n=5マウス、エラーバーは平均の標準誤差である、有意性はスチューデントのt検定により決定する**=p≦0.01)。
(A)T細胞を、腫瘍抗原を感知し、第二の抗原に対するCARの発現を上方制御するsynNotch受容体で操作した(を産生するように遺伝子改変した)。ゆえに、これらのsynNotch ANDゲートT細胞は、腫瘍微小環境における組み合わせ抗原認識に応答してのみ活性化し、単一抗原認識により媒介されるオフターゲット毒性を防ぐ。(B)単一抗原を標的とする治療用T細胞とは異なるsynNotch ANDゲートT細胞は、組み合わせ抗原標的を単一抗原バイスタンダー組織から確実に識別することができる。synNotch−CAR T細胞による組み合わせ抗原感知は、腫瘍に対するT細胞の精密な標的化を助けることができ、オフターゲット毒性を防ぐ。(C)標的可能抗原空間の拡大。腫瘍特異的抗原は、腫瘍関連抗原(正常組織において発現されるが、腫瘍上により高く発現される抗原)と比較して稀である。CARはT細胞を完全に活性化して標的組織の殺傷をもたらすため、致命的なオフターゲット毒性を減少させるために、単一CAR T細胞を腫瘍特異的抗原に標的化しなければならない(上のベン図)。synNotch受容体は、CAR発現をゲートし、T細胞が武装している場所を制御することができる。腫瘍特異的抗原の組み合わせを標的とするときには、腫瘍関連抗原を対象とするCAR受容体を使用することが可能であり得る。これは、身体の他の部分でCAR抗原を発現する組織へのオフターゲット損傷を減少させるはずである。
(A)GFPに融合したα−メソテリンCARの発現を制御するα−CD19 synNotch Jurkat T細胞を、48時間にわたってメソテリン単独またはCD19及びメソテリン+K562とインキュベートした。α−メソテリンCAR GFPレベルのヒストグラムは、CARが、JurkatがCD19に曝露されたときにのみ発現することを示す。(B)パネルA及び図2Bのヒストグラムから算出した正規化したα−メソテリンCAR GFP及びCD69レベルのプロット。CAR及びCD69の最大発現の半減期は、それぞれ6時間及び13時間であった。(C)synNotch ANDゲートJurkat T細胞を、synNotch受容体の細胞外ドメイン上のmyc−タグと結合するプレート結合型α−myc抗体で24時間刺激した。24時間後、細胞をα−myc刺激から取り除き、CAR発現を24時間モニターした。(D)synNotch刺激の除去後のα−メソテリンCAR GFP発現のヒストグラム。正規化したCARをプロットし、1フェーズ減衰にあてはめ、これは、下方制御の8時間半減期を示す。
(A)CD4+初代T細胞を、α−CD19 synNotch Gal4VP64受容体及びα−メソテリン4−1BBζ CAR EGFP発現を制御する対応する応答エレメントで操作した。次いで、T細胞を、メソテリン単独、CD19単独、またはCD19/メソテリンK562と、24時間にわたって共培養し、CD69上方制御及びIL−2産生をアッセイした。(B)パネルAに記載のように培養されたCD4+synNotch初代T細胞上のα−メソテリンCAR EGFPレベル及びCD69レベルを示すヒストグラム。α−メソテリンCARは、CD19が標的K562上にあるときにのみ発現され、T細胞は、活性化マーカーCD69を、CD19及びメソテリンの両方が標的K562上にあるときにのみ発現した(3つの実験の代表値)。(C)パネルAに記載の培養物から回収した上清からのIL−2レベル。IL−2は、T細胞がCD19及びメソテリンの両方を発現する標的細胞に曝露されたときにのみ産生された(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、有意性はスチューデントのt検定により決定***=p≦0.001)。(D)CD8+初代ヒトT細胞をパネルAに記載のように操作した。CD8+T細胞について、メソテリン単独、CD19単独、またはCD19/メソテリン標的K562の特異的細胞傷害性を決定した。synNotch ANDゲートCD8+T細胞は、二重陽性K562のみを殺傷するべきである。(E)パネルAに記載のように培養されたCD8+synNotch初代T細胞上のα−メソテリンCAR EGFPレベルを示すヒストグラム。α−メソテリンCARは、CD19が標的K562上にあるときにのみ発現された(3つの実験の代表値)。(F)CD19及びメソテリンの両方の発現を伴う標的K562の特異的殺傷を示す複製CD8+synNotch ANDゲート初代T細胞の細胞傷害性の定量(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、***=p≦0.001)。(G)CD4+初代T細胞を、α−GFPナノボディsynNotch Gal4VP64受容体及びα−メソテリン4−1BBζ CAR EGFP発現を制御する対応する応答エレメントで操作した。次いで、T細胞をメソテリン単独、GFP単独、またはGFP/メソテリンK562と24時間にわたって共培養し、CD69上方制御及びIL−2産生をアッセイした。(H)パネルGに記載のように培養されたCD4+synNotch初代T細胞上のα−メソテリンCAR EGFPレベル及びCD69レベルを示すヒストグラム。α−メソテリンCARは、GFPが標的K562上にあるときにのみ発現され、T細胞は、活性化マーカーCD69を、GFP及びメソテリンの両方が標的K562上にあるときにのみ発現した(3つの実験の代表値)。(I)パネルGに記載の培養物から回収した上清からのIL−2レベル。IL−2は、T細胞がGFP及びメソテリンの両方を発現する標的細胞に曝露されたときにのみ産生された(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、****=p≦0.0001)。
(A)初代CD4+及びCD8+T細胞におけるα−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR IRES efflucを調節する対応する応答エレメントの発現を示す代表的なドットプロット。赤色枠で囲ったT細胞を選別し、in vivo及びin vitro実験のために使用した。(B)GFP−またはGFP+K562を用いた24時間にわたる曝露後のパネルAからのsynNotch AND CD4+及びCD8+T細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す棒グラフ。ルシフェラーゼは、GFPに応答して特異的に発現された(n=3、エラーバーは平均の標準誤差である、****=p≦0.0001)。(C)腫瘍成長曲線を、図4Cで分析したマウスについて提供する。
(A)初代ヒトCD4+及びCD8+T細胞におけるα−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CARを調節する対応する応答エレメントの発現を示す操作した代表的なドットプロット。T細胞の赤色で囲った四分の一区画を選別し、図112における実験に使用した。(B)in vitro及びin vivo実験に使用したK562におけるCD19(紫)ならびにGFP及びCD19(緑)の発現を示すフローサイトメトリープロット。(C)対照の形質導入していないCD4+及びCD8+T細胞で処置した両側CD19(左側腹部)ならびにGFP及びCD19(右側腹部)腫瘍を有する個別のマウスの腫瘍成長曲線。データは、図5B下パネルの基となる。(D)初代ヒトCD4+及びCD8+T細胞を、α−GFP synNotch Gal4VP64受容体及びα−CD19 4−1BBζ CAR発現を調節する対応する応答エレメントで操作し、マウスに、CD19 K562を左側腹部で、表面GFP K562腫瘍を右側腹部で静脈内注射して、T細胞がGFP+「プライミング腫瘍」から遊走するかどうか、及びオフターゲットCD19単独腫瘍を殺傷するかどうかを検査した。腫瘍サイズを、操作したT細胞または形質導入していないT細胞対照の静脈内注射の後16日間にわたってモニターした。(E)synNotch ANDゲートT細胞(実線)または形質導入していない対照T細胞(点線)で処置したマウスのCD19腫瘍体積を示すグラフ。CD19腫瘍は、標的とされず、これは、GFP+腫瘍からのプライムしたT細胞の遊走がないことを示す(n=5、エラーバーは平均の標準誤差である、スチューデントのt検定に基づいて有意差はいずれの時点での見られなかった、p>0.05)。
Foxp3の直接細胞内染色を使用して、抗CD19 synNotchを発現するヒトCD4 T細胞におけるFoxp3誘導を測定した。抗CD19 synNotchを発現するCD4 T細胞を、CD19+(CD19陽性)K562細胞またはCD19−(CD19陰性)K562細胞のいずれかで刺激した。Foxp3は、CD19 synNotch細胞において、CD19+K562細胞で刺激したときに発現した(図118、「cN Foxp3+刺激K562」)。比較して、CD19 synNotch細胞をCD19−K562細胞で刺激したときは、誘導は見られなかった(図118、「cN Foxp3+無関係K562」)。形質導入していない細胞は、陰性対照として使用した(図118、「形質導入していない」)。
抗体発現構築物を、ヒトT細胞synNotch誘導型抗体分泌のために設計した。全体的な抗体構築物設計を示す概略図を図119に提示する。図119では、左から右に、全体構築物のドメイン設計は、ヒトIgG重鎖シグナルペプチド、Mycタグ、VHドメイン、CHドメイン、フューリン切断部位、SGSGスペーサー、T2A配列、ヒトIgG軽鎖シグナルペプチド、HAタグ、VLドメイン及びCLドメインである。構築物は、以下の抗体のsynNotch誘導型分泌のために設計された:ペムブロリズマブ(抗PD−1)、トレメリムマブ(抗CTLA4)及び9E10(抗myc)。
分割SynNotchシグナル伝達システムを構築し、これは、GFPの異なるエピトープと結合する2つの異なる抗GFPナノボディを有し、一方のナノボディ(「LaG2」)は、「アンカー細胞」上で発現され、他方のナノボディ(「LaG17」)は、SynNotch受容体の一部分として「受信側細胞」上で発現され、GFPは可溶性アダプターとして機能する(図123を参照されたい)。LaG17ナノボディSynNotch受容体を、活性化の際に、TRE発現構築物からmCherryレポーターの発現を誘導するtTa細胞内ドメインを有するように操作した。従って、設計した分割SynNotchシステムでは、可溶性アダプター分子(すなわち、GFP)を加えることは、アンカー細胞の存在下でのみ受信側細胞においてSynNotchシグナル伝達を誘導する。
Claims (143)
- N末端からC末端に向かって、共有結合状態で、
a)特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメイン;
b)50アミノ酸〜1000アミノ酸の長さを有し、かつ1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、Notch受容体ポリペプチド;及び
c)細胞内ドメイン
を含み、
前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、前記Notch受容体ポリペプチドに対して異種であり、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出される、キメラポリペプチド。 - 前記Notch受容体ポリペプチドが、300アミノ酸〜400アミノ酸の長さを有する、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞外ドメインと前記Notch受容体ポリペプチドの間に介在するリンカーを含む、請求項1または請求項2に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞内ドメインが、転写活性化因子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞内ドメインが、転写抑制因子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞内ドメインが、部位特異的ヌクレアーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9ポリペプチドである、請求項6に記載のキメラポリペプチド
- 前記細胞内ドメインが、リコンビナーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞内ドメインが、抑制性免疫受容体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記細胞内ドメインが、活性化免疫受容体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗体をベースとする認識足場を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗体を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗体が、腫瘍特異的抗原、疾患関連抗原、病原体関連抗原、自己免疫疾患関連抗原、または細胞外マトリックス成分と特異的に結合する、請求項12に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗体が、細胞表面抗原、可溶性抗原、または不溶性基体上に固定された抗原と特異的に結合する、請求項12に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗体が、一本鎖Fvである、請求項12に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、請求項11に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、非抗体をベースとする認識足場である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記非抗体をベースとする認識足場が、アビマー、DARPin、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、アンチカリン、またはアフィリンである、請求項17に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、抗原である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗原が、内在性抗原である、請求項19に記載のキメラポリペプチド。
- 前記抗原が、外来性抗原である、請求項19に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、受容体に対するリガンドである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、受容体である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、細胞接着分子である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記特異的結合対の前記第一のメンバーが、第一の二量体化ドメインを含み、前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の二量体化ドメインを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記第一の二量体化ドメインの、前記第二の二量体化ドメインへの結合が、小分子二量体化剤により誘導される、請求項25に記載のキメラポリペプチド。
- 前記第一の二量体化ドメインの、前記第二の二量体化ドメインへの結合が、光により誘導される、請求項25に記載のキメラポリペプチド。
- 前記Notch受容体ポリペプチドが、図2A〜2Gに示すアミノ酸配列のいずれか1つに対して、少なくとも75%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位が、S1、S2、及びS3タンパク質分解切断部位から選択される、請求項1〜28のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記S1タンパク質分解切断部位が、アミノ酸配列Arg−X−(Arg/Lys)−Argを含むフューリン様プロテアーゼ切断部位であり、ここでXは任意のアミノ酸である、請求項29に記載のキメラポリペプチド。
- 前記S2タンパク質分解切断部位が、Ala−Valジペプチド配列を含むADAM−17型プロテアーゼ切断部位である、請求項29に記載のキメラポリペプチド。
- 前記S3タンパク質分解切断部位が、Gly−Valジペプチド配列を含むγ−セクレターゼ切断部位である、請求項29に記載のキメラポリペプチド。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項33に記載の核酸または請求項34に記載の発現ベクターで遺伝子改変された宿主細胞。
- 真核細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。
- 哺乳類細胞である、請求項36に記載の宿主細胞。
- 免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である、請求項37に記載の宿主細胞。
- 前記免疫細胞が、T細胞、B細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、制御性T細胞、ヘルパーT細胞、または細胞傷害性T細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されており、前記キメラポリペプチドの前記細胞内ドメインが、転写活性化因子である、請求項35〜39のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記CARまたは前記TCRをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記キメラポリペプチドの前記細胞内ドメインにより活性化される転写制御エレメントに作動可能に連結している、請求項40に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出され、前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の活性を調節する、前記方法。 - 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項42に記載の方法。
- 前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の増殖を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞におけるアポトーシスを調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、アポトーシス以外の機構による細胞死を誘導する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞における遺伝子発現を、転写調節、クロマチン制御、翻訳、トラフィッキングまたは翻訳後プロセシングを通して調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の分化を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の遊走を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞からの分子の発現及び分泌を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞の、第二の細胞へのまたは細胞外マトリックスへの接着を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの放出が、前記細胞における遺伝子産物のデノボ発現を誘導するまたは発現を調節する、請求項42に記載の方法。
- 前記遺伝子産物が、転写活性化因子、転写抑制因子、キメラ抗原受容体、第二のキメラNotch受容体ポリペプチド、翻訳調節因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、または抗体である、請求項53に記載の方法。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、ここで前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記Notch受容体ポリペプチドの前記1つまたは複数のリガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより前記細胞内ドメインが放出され、前記細胞内ドメインが、前記細胞の活性を調節するエフェクターポリペプチドをコードする核酸の転写を誘導する転写因子である、前記方法。 - 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項55に記載の方法。
- 前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、請求項55に記載の方法。
- 前記エフェクターポリペプチドが、アポトーシス誘導因子、抑制因子にあるアポトーシス、活性化免疫受容体、抑制性免疫受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、受容体、抗体、部位特異的ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼである、請求項55に記載の方法。
- 細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の第一のキメラNotch受容体ポリペプチド;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む請求項1〜32のいずれか一項に記載の第二のキメラNotch受容体ポリペプチド
を発現し、
前記第一及び前記第二の特異的結合対が互いに異なり、
前記第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能を提供し;前記第二のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインが、前記第一のエフェクター機能と異なる第二のエフェクター機能を提供し、前記放出された第一及び前記第二の細胞内ドメインが、前記細胞の活性を調節する、前記方法。 - 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項59に記載の方法。
- T細胞を活性化させる方法であって、
請求項40に記載のT細胞と固定化抗原を接触させること
を含み、
前記キメラポリペプチドの前記細胞外ドメインが、第一の抗原に特異的な抗体を含み、
前記接触が、前記転写活性化因子の放出、及び前記細胞中の前記CARまたは前記TCRの産生をもたらし、前記CARまたはTCRが、第二の抗原の結合後に前記T細胞の活性化を提供する、前記方法。 - 細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の第一のキメラNotch受容体ポリペプチド;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む請求項1〜32のいずれか一項に記載の第二のキメラNotch受容体ポリペプチド
を発現し、
前記第一及び前記第二の特異的結合対が互いに異なり、
前記第二のキメラNotch受容体をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一のキメラNotch受容体ポリペプチドの前記細胞内ドメインにより活性化または抑制される転写制御エレメントに作動可能に連結している、前記方法。 - 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項62に記載の方法。
- T細胞を活性化させる方法であって、
請求項40に記載のT細胞と固定化抗原を接触させること
を含み、前記キメラポリペプチドの前記細胞外ドメインが、第一の抗原に特異的な抗体を含み、
前記接触が、前記転写活性化因子の放出、及び前記細胞における前記CARまたはTCRの産生をもたらし、前記CARまたは前記TCRが、第二の抗原の結合後に前記T細胞の活性化を提供する、前記方法。 - 細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と表面上に固定されている抗原を接触させること
を含み、前記細胞が、請求項1に記載のキメラNotch受容体ポリペプチドを発現し、前記特異的結合対の前記第一のメンバーが前記抗原と結合し、
前記接触が、前記細胞内ドメインの放出及び前記細胞の活性の調節をもたらす、前記方法。 - 前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子である、請求項65に記載の方法。
- 細胞の活性を局所的に調節する方法であって、
前記細胞内で、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;及び
前記細胞と前記特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導し、それにより、活性化した細胞内ドメインが産生され、前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される、前記細胞の活性を調節する、前記方法。 - 前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の内在性遺伝子産物の発現を調節する、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、分泌された遺伝子産物である、請求項68〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記内在性遺伝子産物が、表面発現遺伝子産物である、請求項68〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の2つ以上の内在性遺伝子産物の発現を同時に調節する、請求項68〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の異種遺伝子産物の発現を調節する、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞の前記異種遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、病原体由来タンパク質、増殖誘導因子、受容体、RNA誘導型ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、毒素由来タンパク質、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抗体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、操作T細胞受容体、免疫活性化因子、免疫抑制因子、抑制性免疫受容体、RNA誘導型DNA結合タンパク質及び第二の結合誘発型転写スイッチからなる群より選択される、請求項73に記載の方法。
- 前記細胞の前記異種遺伝子産物が、抗体である、請求項74に記載の方法。
- 前記抗体が、806、9E10、3F8、81C6、8H9、アバゴボマブ、アバタセプト、アブシキシマブ、アビツズマブ、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ・ペゴル、ALD518、アレファセプト、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ・ペンテテート、アマツキシマブ、AMG 102、アナツモマブ・マフェナトクス、アネツマブ・ラブタンシン、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ(Ascrinvacumab)、アセリズマブ、アタシセプト、アテゾリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ/トシリズマブ、アトロリムマブ、AVE1642、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベゲロマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ(Bimekizumab)、ビバツズマブ・メルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、BMS−936559、ボコシズマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ(Brontictuzumab)、カナキヌマブ、カンツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・ラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブ・ペンデチド、カルルマブ、カツマクソマブ、cBR96−ドキソルビシン免疫複合体、CC49、CDP791、セデリズマブ、セルトリズマブ・ペゴル、セツキシマブ、cG250、Ch.14.18、シタツズマブ・ボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、コドリツズマブ、コルツキシマブ・ラブタンシン(Coltuximab ravtansine)、コナツムマブ、コンシズマブ、CP 751871、CR6261、クレネズマブ、CS−1008、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブ・ペゴル(Dapirolizumab pegol)、ダラツムマブ、デクトレクマブ(Dectrekumab)、デムシズマブ、デニンツズマブ・マホドチン(Denintuzumab mafodotin)、デノスマブ、デルロツキシマブ・ビオチン(Derlotuximab biotin)、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ジリダブマブ、ドルリモマブ・アリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシジツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ(Elgemtumab)、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ(Emactuzumab)、エミベツズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブ・ベドチン、エンリモマブ・ペゴル、エノブリツズマブ(Enoblituzumab)、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブ・シツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマクソマブ、エタネルセプト、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、F19、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファーレツズマブ、ファシヌマブ、FBTA05、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィジツムマブ、フィリブマブ(Firivumab)、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ・ベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、HGS−ETR2、hu3S193、huA33、イバリズマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、IGN101、IgN311、イゴボマブ、IIIA4、IM−2C6、IMAB362、イマルマブ(Imalumab)、IMC−A12、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブ・ラブタンシン、インデュサツマブ・ベドチン(Indusatumab vedotin)、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ、イクセキズマブ、J591、KB004、ケリキシマブ、KW−2871、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、ラムパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンジルマブ(Lenzilumab)、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リファスツズマブ・ベドチン、リゲリズマブ、リロトマブ・サテトラキセタン(Lilotomab satetraxetan)、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロキベトマブ(Lokivetmab)、ロルボツズマブ・メルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブ・ペゴル、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ(Lumretuzumab)、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、MEDI4736、メポリズマブ、メテリムマブ、METMAB、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブ・ソラブタンシン(Mirvetuximab soravtansine)、ミツモマブ、MK−0646、MK−3475、MM−121、モガムリズマブ、MORAb−003、モロリムマブ、モタビズマブ、MOv18、モキセツモマブ・パスドトクス、MPDL33280A、ムロモナブCD3、ナコロマブ・タフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ・メルペンタン、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オヅリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブ・モナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ(Pankomab)、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブ・ベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポラツズマブ・ベドチン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、PRO 140、キリズマブ、R1507、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ(Ralpancizumab)、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ(Refanezumab)、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ(Rinucumab)、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレヅマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブ・ゴビテカン、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブ・ペンデチド、SCH 900105、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、SGN−CD19A、SGN−CD33A、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブ・ベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブ・パプトクス、タレクスツマブ、テフィバズマブ、テリモマブ・アリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ(Tetulomab)、TGN1412、チシリムマブ/トレメリムマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、TNX−650、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ(Tosatoxumab)、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、TRBS07、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ(Trevogrumab)、ツコツズマブ・セルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ(Ulocuplumab)、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バンドルツズマブ・ベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ・マホドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ及びゾリモマブ・アリトクスからなる群より選択される、請求項75に記載の方法。
- 前記細胞の前記異種遺伝子産物が、分泌された遺伝子産物である、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記異種遺伝子産物が、表面発現遺伝子産物である、請求項73〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の2つ以上の異種遺伝子産物の発現を同時に調節する、請求項73〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項67〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、請求項67〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子である、請求項67に記載の方法。
- 前記転写因子が、前記細胞の分化を直接調節する、請求項82に記載の方法。
- 前記転写因子が、前記細胞の分化を、第二の転写因子の発現を調節することにより間接的に調節する、請求項82に記載の方法。
- 前記細胞が免疫細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記免疫細胞の分化である、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞が免疫細胞であり、前記細胞内ドメインが、前記細胞の分化を調節する転写因子であり、前記細胞の前記活性が、前記免疫細胞の分化である、請求項67に記載の方法。
- 前記転写因子が、前記免疫細胞の分化を直接調節する、請求項86に記載の方法。
- 前記転写因子が、前記免疫細胞の分化を、第二の転写因子の前記発現を調節することにより間接的に調節する、請求項86に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記幹細胞の分化である、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞が始原細胞または前駆細胞であり、前記細胞の前記活性が、前記始原細胞または前駆細胞の分化である、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の内在性遺伝子の発現を、転写調節、クロマチン制御、翻訳、トラフィッキングまたは翻訳後プロセシングを通して調節する、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の、第二の細胞へのまたは細胞外マトリックスへの細胞接着を調節する、請求項67に記載の方法。
- 前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、請求項67に記載の方法。
- 前記細胞と、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合を競合的に阻害する可溶性阻害分子とを接触させることをさらに含み、それにより、前記細胞内ドメインを活性化させるための結合シグナルを伝達するように結合トランスデューサを誘導することを防ぐ、請求項67〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞と前記可溶性阻害分子の接触が、前記可溶性阻害分子を第一の細胞に適用または投与することを含む、請求項94に記載の方法。
- 前記細胞と前記可溶性阻害分子の接触が、前記細胞を、前記可溶性阻害分子を発現する第二の細胞の存在下に置くことを含む、請求項94に記載の方法。
- 前記第二の細胞が、前記可溶性阻害分子を構成的に発現する、請求項96に記載の方法。
- 前記第二の細胞が、前記可溶性阻害分子を条件的に発現する、請求項96に記載の方法。
- 細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバー及び第二の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)前記第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第一の結合誘発型転写スイッチ;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第二の結合誘発型転写スイッチ
を発現し;
前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインが、第一のエフェクター機能を提供し、前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインが、前記第一のエフェクター機能と異なる第二のエフェクター機能を提供し、この時、前記第一及び第二の特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記第一及び第二の細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導する、前記方法。 - 前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの前記エフェクター機能が、前記細胞の遺伝子産物の発現を調節する、請求項99に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の内在性遺伝子産物である、請求項100に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の異種遺伝子産物である、請求項100に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、請求項100に記載の方法。
- 前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの前記エフェクター機能が、前記細胞の遺伝子産物の発現を調節する、請求項100に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の内在性遺伝子産物である、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、前記細胞の異種遺伝子産物である、請求項104に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサのうちの少なくとも1つが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、それぞれの特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、それぞれの細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、請求項99に記載の方法。
- 前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサが、両方ともリガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含む、請求項108に記載の方法。
- 細胞の活性を調節する方法であって、
前記細胞と第一の特異的結合対の第二のメンバーを接触させること
を含み、前記細胞が、
i)前記第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第一の結合誘発型転写スイッチ;及び
ii)少なくとも、第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む第二の結合誘発型転写スイッチ
を発現し、
前記第二の結合誘発型転写スイッチをコードするヌクレオチド配列が、前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインにより活性化または抑制される転写制御エレメントに作動可能に連結している、前記方法。 - 前記接触が、in vivo、ex vivo、またはin vitroで実行される、請求項110に記載の方法。
- 前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーが、第二の細胞の表面上にあるか、不溶性基体上に固定されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である、請求項110に記載の方法。
- 前記第二の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインの活性化が、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される、前記細胞の活性を調節する、請求項110に記載の方法。
- 前記細胞の前記活性が、前記細胞の遺伝子産物の発現である、請求項113に記載の方法。
- 前記細胞の前記遺伝子産物が、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導因子、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、T細胞受容体、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、活性化免疫受容体、抑制因子にあるアポトーシス、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制因子及び抑制性免疫受容体からなる群より選択される、前記細胞の遺伝子産物である、請求項114に記載の方法。
- 前記第一及び第二の結合誘発型転写スイッチの前記結合トランスデューサの少なくとも1つが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記それぞれの特異的結合対の前記第一及び第二のメンバーの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記それぞれの細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、請求項110に記載の方法。
- 細胞間接触を追跡する方法であって、
第一の複数の細胞の各細胞において、特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;
第二の複数の細胞の各細胞において、前記特異的結合対の第二のメンバーを発現させること;及び
前記第一の複数の細胞と前記第二の複数の細胞を接触させること
を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合誘発型転写スイッチの結合シグナルを伝達するように結合トランスデューサを誘導し、それにより前記細胞内ドメインが活性化され、前記細胞内ドメインの活性化が、空間的な、時間的なまたはその組み合わせにおける細胞間接触を追跡するのに十分な検出可能レポーターの発現を誘導する、前記方法。 - 前記第一の複数の細胞、前記第二の複数の細胞または両方が、ニューロンである、請求項117に記載の方法。
- 前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記特異的結合対の前記第一のメンバーの、前記特異的結合対の前記第二のメンバーへの結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、請求項117に記載の方法。
- 前記結合誘発型転写スイッチが、SynNotchポリペプチドである、請求項67〜119のいずれか一項に記載の方法。
- 局在性細胞活性化システムであって、
第一の特異的結合対の第一のメンバーを含む細胞外ドメインと、結合トランスデューサと、細胞内ドメインとを含む発現された結合誘発型転写スイッチ;及び
前記第一の結合誘発型転写スイッチの前記細胞内ドメインにより誘導される転写制御エレメントに作動可能に連結した、第二の特異的結合対の第一のメンバーを含む結合誘発型活性化ポリペプチドをコードする核酸
を含む細胞を含み、
前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが発現され、前記第二の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが前記細胞を活性化させる、前記システム。 - 前記細胞が、免疫細胞、始原細胞または前駆細胞、幹細胞、及びニューロンからなる群より選択される、請求項121に記載のシステム。
- 前記細胞が免疫細胞であり、前記結合誘発型転写スイッチが抗原誘発型転写スイッチであり、前記結合誘発型活性化ポリペプチドが抗原誘発型活性化ポリペプチドであり、前記第一の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが発現され、前記第二の特異的結合対の前記第二のメンバーとの接触の際に、前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが前記免疫細胞を活性化させて、前記第二の特異的結合対の前記第一のメンバーを発現する標的細胞を認識する、請求項122に記載のシステム。
- 前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが、キメラ抗原受容体またはその変異体である、請求項123に記載のシステム。
- 前記抗原誘発型活性化ポリペプチドが、操作T細胞受容体またはその変異体である、請求項123に記載のシステム。
- 前記発現された結合誘発型転写スイッチが、SynNotchポリペプチドである、請求項121〜125のいずれか一項に記載のシステム。
- 細胞の活性を局所的に調節する方法であって、
第一の細胞において、結合トランスデューサと、細胞内ドメインと、可溶性アダプター分子上の第一のエピトープと特異的に結合する第一のアダプター結合ドメインを含む第一の細胞外ドメインとを含む結合誘発型転写スイッチを発現させること;
前記第一の細胞と:
i)前記可溶性アダプター分子上の第二のエピトープと特異的に結合する第二のアダプター結合ドメインを含む第二の細胞外ドメインを発現する第二の細胞;及び
ii)有効濃度の前記可溶性アダプター分子
を接触させること
を含み、前記第一のアダプター結合ドメイン及び前記第二のアダプター結合ドメインの、前記アダプター分子への結合が、前記細胞内ドメインを活性化するための結合シグナルを伝達するように前記結合トランスデューサを誘導し、それにより、活性化した細胞内ドメインが産生され、前記活性化した細胞内ドメインが、前記細胞の遺伝子産物の発現、前記細胞の増殖、前記細胞のアポトーシス、前記細胞の非アポトーシス性死、前記細胞の分化、前記細胞の脱分化、前記細胞の遊走、前記細胞からの分子の分泌及び前記細胞の細胞接着からなる群より選択される前記第一の細胞の活性を調節する、前記方法。 - 前記接触が、前記可溶性アダプター分子を前記細胞にin vitroまたはex vivoで適用することを含む、請求項127に記載の方法。
- 前記接触が、前記可溶性アダプター分子を前記細胞にin vivoで投与することを含む、請求項127に記載の方法。
- 前記第一の細胞と有効濃度の前記可溶性アダプター分子を接触させることが、前記第一の細胞を、前記アダプター分子を発現する第三の細胞の存在下に置くことを含む、請求項127に記載の方法。
- 前記第三の細胞が、前記アダプター分子を構成的に発現する、請求項130に記載の方法。
- 前記第三の細胞が、前記アダプター分子を条件的に発現する、請求項130に記載の方法。
- 前記第一の細胞外ドメイン及び前記可溶性アダプター分子が、特異的対合対の第一及び第二のメンバーである、請求項127〜132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二の細胞外ドメイン及び前記可溶性アダプター分子が、特異的結合対の第一及び第二のメンバーである、請求項127〜132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の細胞外ドメイン及び第二の細胞外ドメインが、抗体である、請求項127〜134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の細胞外ドメイン及び第二の細胞外ドメインの一方または両方が、ナノボディである、請求項135に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、転写因子である、請求項127〜136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化した細胞内ドメインが、前記第一の細胞の内在性遺伝子産物の発現を調節する、請求項127〜137のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化した細胞内ドメインが、前記第一の細胞の異種遺伝子産物の発現を調節する、請求項127〜137のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合トランスデューサが、リガンド誘導性タンパク質分解切断部位を含み、前記第一の細胞外ドメイン及び前記第二の細胞外ドメインの、前記可溶性アダプター分子への結合が、前記結合トランスデューサの前記リガンド誘導性タンパク質分解切断部位での切断を誘導し、それにより、前記結合シグナルが伝達されかつ、前記細胞内ドメインが、前記細胞内ドメインをタンパク質分解的に放出することによって活性化される、請求項127〜139のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の抗原に応答する第一の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;
前記第一の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ特異的結合対の第一のメンバーに特異的に結合する細胞外ドメインを含むCARをコードする核酸に作動可能に連結している、第一のプロモーター;
第二の抗原に応答する第二の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第二の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内CAR阻害ドメインをコードする核酸に作動可能に連結している、第二のプロモーター
を含み、前記第二の抗原の存在下で、前記細胞内CAR阻害ドメインが発現されて前記CARによる前記細胞の活性化が阻害され、前記第一の抗原の存在下かつ前記第二の抗原の非存在下で、前記特異的結合対の前記第二のメンバーによりCARが発現されて活性化可能である、宿主細胞。 - 第一の抗原に応答する第一の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;
前記第一の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ特異的結合対の第一のメンバーに特異的に結合する細胞外ドメインを含むCARの第一の部分をコードする核酸に作動可能に連結している、第一のプロモーター;
第二の抗原に応答する第二の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第二の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARの第二の部分をコードする核酸に作動可能に連結している、第二のプロモーター
を含み、前記第一の抗原及び第二の抗原の存在下で、前記CARの前記第一及び第二の部分が発現され、前記CARが前記特異的結合対の前記第二のメンバーにより活性化可能である、宿主細胞。 - 第三の抗原に応答する第三の結合誘発型転写スイッチをコードする核酸;及び
前記第三の結合誘発型転写スイッチに応答し、かつ細胞内CAR阻害ドメインをコードする核酸に作動可能に連結している、第三のプロモーター
をさらに含み、前記第三の抗原の存在下で、前記細胞内CAR阻害ドメインが発現されて前記CARによる前記細胞の活性化が阻害される、請求項142に記載の細胞。
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