JP2023072010A5

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Publication number: JP2023072010A5
Application number: JP2023037742A
Authority: JP
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2023-12-25

Claims

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の製造方法であって、前記方法は、
ｍＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで合成すること；ならびに
バッチあたり、１グラムまたは１グラムを超える規模でｉｎｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製すること
を含み、ここで、前記精製は、以下：
（ａ）ｉｎｖｉｔｒｏｍＲＮＡ合成反応混合物を含む不純調製物からｍＲＮＡを沈殿させるステップ；および
（ｂ）沈殿されたｍＲＮＡを含む前記不純調製物を、前記沈殿されたｍＲＮＡが膜に捕捉されるよう、膜ろ過を含む精製工程に供するステップ；および
（ｃ）前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを洗浄するステップ；および
（ｄ）前記ｍＲＮＡを再可溶化することにより前記膜から前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離し、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得るステップ、
を含む、方法。
前記膜ろ過を含む精製工程が、ダイレクトフローろ過である、請求項１に記載の方法。
前記ｍＲＮＡを沈殿させるステップが、前記不純調製物を、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を含む溶液を用いて処理することを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記試薬が、チオシアン酸グアニジニウムである、請求項３に記載の方法。
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２に記載方法。
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び０．５％のラウリルサルコシルナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
前記ｍＲＮＡを沈殿させるステップが、無水エタノールを用いて前記不純調製物を処理するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記膜が、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾なし）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル類）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記洗浄ステップが、グアニジニウム緩衝液及びエタノールを含有する洗浄溶液、次いで７０～８０％のエタノールを用いた複数回のすすぎサイクルを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記複数回のすすぎサイクルは、５回より多いサイクルである、請求項１０に記載の方法。
前記溶離ステップが、ＲＮＡｓｅが含まれていない水を用いて前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを再可溶化することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＲＮＡｓｅが含まれていない水が、５～１０分間、再循環される、請求項１２に記載の方法。
前記方法が、前記精製されたｍＲＮＡ溶液を透析するステップをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を用いて、１ｍＭのクエン酸ナトリウムと透析される、請求項１４に記載の方法。
前記不純調製物が未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１６に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．５％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１６に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１６に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含有しない、請求項１６に記載の方法。
前記未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、銀染色、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、及び／またはキャピラリー電気泳動により測定される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記未完了で中断されたＲＮＡが、１５未満の塩基を含有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記未完了で中断されたＲＮＡが、８～１２の塩基を含有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記ｉｎｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、バッチ当たり１０グラム以上、１００グラム以上、１ｋｇ以上、１０ｋｇ以上、または１００ｋｇ以上の規模で精製される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加される前に精製される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加された後に精製される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、キャップが付加された後に精製される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、キャップ及び／またはテールが前記ｍＲＮＡに付加される前及び後の両方で精製される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、１ｋｂ以上、１．５ｋｂ以上、２ｋｂ以上、２．５ｋｂ以上、３ｋｂ以上、３．５ｋｂ以上、４ｋｂ以上、４．５ｋｂ以上、５ｋｂ以上、６ｋｂ以上、７ｋｂ以上、８ｋｂ以上、９ｋｂ以上、１０ｋｂ以上、１１ｋｂ以上、１２ｋｂ以上、１３ｋｂ以上、１４ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、または２０ｋｂ以上の長さである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、安定性を増強させるために１つ以上の修飾を含有する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上の修飾が、修飾ヌクレオチド及び／または修飾糖リン酸主鎖を含有し、任意選択的に前記修飾ヌクレオチドが１－メチル－シュードウラシルである、請求項３１に記載の方法。
前記ｍＲＮＡが、修飾されていない、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡが、９５％以上の完全性を有する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡが、９８％以上の完全性を有する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
前記精製されたｍＲＮＡが、９９％以上の完全性を有する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。