JP6866433B2 - メッセンジャーｒｎａの精製方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１４年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８４，５０３号の優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容は参照により本明細書に援用される。

メッセンジャーＲＮＡ療法は、ますます様々な疾患治療のための重要な方法となりつつある。メッセンジャーＲＮＡ療法は、当該療法の必要がある患者に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡ）を投与し、当該患者体内で当該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を産生させることを含む。それゆえ、治療用途に適した高純度で高い安全性のｍＲＮＡ製品の大規模製造に対する高いニーズが存在する。

配列表
本明細書は、配列表（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けられ、．ｔｘｔファイルとして２０１５年４月２４日に電子的に提出されている）を参照するものである。当該．ｔｘｔファイルは２０１５年４月２２日に作成されたものであり、１１，１８４バイトのサイズがある。当該配列表の全内容が、参照により本明細書において援用される。

本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、特に治療用途に適したｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡの効率的な精製のための改善方法を提供するものである。本発明は、一つには、非常に珍しい組合せであるｍＲＮＡ沈殿後の膜ろ過が、高品質のｍＲＮＡの大規模製造という予想を超える成功をもたらしたという驚くべき発見に基づくものである。

従って、一つの態様において、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）不純調製物からｍＲＮＡを沈殿するステップ、（ｂ）沈殿したｍＲＮＡを含む当該不純調製物を、当該沈殿ｍＲＮＡが膜に捕捉されるよう膜ろ過を含む精製工程に供するステップ、及び（ｃ）当該ｍＲＮＡの再可溶化により当該膜から当該捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離させ、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得るステップを含む。一部の実施形態において、本発明に適した膜ろ過を含む精製工程は、タンジェンシャルフローろ過である。一部の実施形態において、本発明に適した膜ろ過を含む精製工程は、ダイレクトフローろ過である。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡを沈殿させるステップは、不純調製物を、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を含有する溶液を用いて処理することを含む。一部の実施形態において、適切な試薬は、チオシアン酸グアニジニウムである。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、約１Ｍ以上、約２Ｍ以上、約３Ｍ以上、約４Ｍ以上、約５Ｍ以上、約６Ｍ以上、約７Ｍ以上、約８Ｍ以上、約９Ｍ以上、または約１０Ｍ以上の濃度でチオシアン酸グアニジニウムを含有する。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、約４Ｍの濃度でチオシアン酸グアニジニウムを含有する。一部のかかる実施形態において、適切な溶液はさらにラウリルサルコシルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｙｌ）、及び／またはクエン酸ナトリウムを含有する。たとえばある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．５％ラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、及び０．５％ラウリルサルコシルナトリウムを含有する。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、及び２５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡを沈殿させるステップはさらに無水エタノールを用いて不純調製物を処理するステップを含む。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡを沈殿させるステップはさらにイソプロピルアルコールを用いて不純調製物を処理するステップを含む。

一部の実施形態において、本発明に適した膜は、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾なし）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル類）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される物質から作製される。

一部の実施形態において、本発明による方法はさらに溶離の前に捕捉された沈殿ｍＲＮＡを洗浄することを含む。一部の実施形態において、当該洗浄ステップは、グアニジニウム緩衝液及びエタノールを含有する洗浄溶液、続いて約７０〜８０％エタノール（例えば、約７０％、７５％、または８０％のエタノール）を用いた複数回のすすぎサイクルを含む。一部の実施形態において、本発明に適した当該複数回のすすぎサイクルは、少なくとも５回、または５回より多いサイクルである（たとえば、約５〜１０回のサイクル、または約５、６、７、８、９若しくは１０回のサイクル）。

一部の実施形態において、溶離ステップは、ＲＮＡｓｅが含まれていない水を用いて、捕捉された沈殿ｍＲＮＡを再可溶化することを含む。一部の実施形態において、当該ＲＮＡｓｅが含まれていない水は、約５〜１０分間（たとえば、約５、６、７、８、９または１０分間）、再循環される。

一部の実施形態において、本発明による方法は精製されたｍＲＮＡ溶液を透析するステップをさらに含む。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ）膜を用いて、１ｍＭクエン酸ナトリウムと透析される。

様々な実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成反応混合物を含有する不純調製物からｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製するために用いられてもよい。一部の実施形態において、当該不純調製物は、未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。

一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、約５％未満（たとえば、約４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．１％未満）の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。ある特定の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、約１％未満（たとえば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％未満）の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。ある特定の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、約０．５％未満（たとえば、約０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、約０．１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、実質的に、未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含まない。

一部の実施形態において、未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬は、銀染色、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及び／またはキャピラリー電気泳動により測定される。

一部の実施形態において、未完了で中断されたＲＮＡ配列は、１５個未満の塩基（たとえば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３個未満の塩基）を含有する。一部の実施形態において、未完了で中断されたＲＮＡ配列は、約８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、または８〜１０個の塩基を含有する。

一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、バッチ当たり、１グラム、５グラム、１０グラム、１５グラム、２０グラム、２５グラム、３０グラム、３５グラム、４０グラム、４５グラム、５０グラム、７５グラム、１００グラム、１５０グラム、２００グラム、２５０グラム、３００グラム、３５０グラム、４００グラム、４５０グラム、５００グラム、５５０グラム、６００グラム、６５０グラム、７００グラム、７５０グラム、８００グラム、８５０グラム、９００グラム、９５０グラム、１ｋｇ、２．５ｋｇ、５ｋｇ、７．５ｋｇ、１０ｋｇ、２５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇ、または１００ｋｇ以上の規模で精製される。以下の実施例において示されているとおり、本発明方法を用いることにより、１０グラム以上（２５グラム以上）の量で精製ｍＲＮＡを含有するバッチが容易に達成され得る。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ及び／またはテールが当該ｍＲＮＡに付加される前に精製される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ及び／またはテールが当該ｍＲＮＡに付加された後に精製される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップが付加された後に精製される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ及び／またはテールが当該ｍＲＮＡに付加される前及び後の両方で精製される。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上の長さである。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、安定性を増強させるために１以上の修飾を含有する。一部の実施形態において、当該１以上の修飾は、修飾ヌクレオチド及び／または修飾糖リン酸主鎖を含有する。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、修飾されていない。

一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡは、約９５％以上（たとえば、約９６％、９７％、９８％、または９９％以上）の完全性を有している。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡは、約９８％以上の完全性を有している。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡは、約９９％以上の完全性を有している。

一部の実施形態において、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法を提供するものであり、当該方法は、（ａ）不純調製物からｍＲＮＡを沈殿させること、（ｂ）当該沈殿したｍＲＮＡがろ過膜により捕捉される一方で不純物が透過により廃棄されるよう、沈殿したｍＲＮＡを含む当該不純調製物をタンジェンシャルフローろ過に供すること、及び（ｃ）当該沈殿したｍＲＮＡの再可溶化により当該捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離させ、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得ること、を含む。

他の態様において、本発明によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を製造するための方法が提供され、当該方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成すること、及び本明細書に記載される方法を用いて当該ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製すること、を含む。

とりわけ、本発明はまた、本明細書に記載される方法を用いて精製されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供するものである。

他の態様において、本発明はまた、ヒト対象への投与に適した５グラム以上の単一種のｍＲＮＡを含有する精製ｍＲＮＡのバッチを提供するものである。一部の実施形態において、当該バッチは、１０グラム以上の単一種のｍＲＮＡを含有する。一部の実施形態において、当該バッチは、２５グラム以上の単一種のｍＲＮＡを含有する。一部の実施形態において、当該バッチは、ｍＲＮＡ合成工程由来の不純物を実質的に含まない。一部の実施形態において、当該バッチは、未完了で中断されたＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型及び／または単一種のｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成に用いられた酵素試薬を実質的に含まない。一部の実施形態において、当該精製ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を約５％未満含有する。一部の実施形態において、当該精製ｍＲＮＡは、約９５％を超える完全性を有する。

他の態様において、本発明はまた、本明細書に記載される方法を用いて精製されたメッセンジャーＲＮＡを含有する組成物を提供するものである。

他の態様において、本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたメッセンジャーＲＮＡを含有する組成物を提供するものであり、ここで当該組成物は、１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で用いられた酵素試薬を含有している。

他の態様において、本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含有する組成物を提供するものであり、ここで当該ｍＲＮＡは、９５％以上の完全性を有している。
特定の態様において、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法であって、
（ａ）不純調製物からｍＲＮＡを沈殿させること、及び
（ｂ）沈殿したｍＲＮＡを含有する前記不純調製物を、前記沈殿したｍＲＮＡが膜に捕捉される膜ろ過を含む精製工程に供すること、及び
（ｃ）前記ｍＲＮＡを再可溶化することにより前記膜から前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離し、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得ること、
を含む前記方法。
（項目２）
膜ろ過を含む前記精製工程が、タンジェンシャルフローろ過である、項目１に記載の方法。
（項目３）
膜ろ過を含む前記精製工程が、ダイレクトフローろ過である、項目１に記載の方法。
（項目４）
ｍＲＮＡを沈殿させる前記ステップが、前記不純調製物を、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を含有する溶液を用いて処理することを含む項目１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記試薬が、チオシアン酸グアニジニウムである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び０．５％のラウリルサルコシルナトリウムを含有する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ｍＲＮＡを沈殿させるステップが、無水エタノールを用いて前記不純調製物を処理するステップを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記膜が、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾なし）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル類）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記方法が、溶離の前に前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを洗浄することをさらに含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記洗浄ステップが、グアニジニウム緩衝液及びエタノールを含有する洗浄溶液、次いで約７０〜８０％のエタノールを用いた複数回のすすぎサイクルを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記複数回のすすぎサイクルは、５回より多いサイクルである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記溶離ステップは、ＲＮＡｓｅが含まれていない水を用いて前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを再可溶化することを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＲＮＡｓｅが含まれていない水が、５〜１０分間、再循環される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記方法がさらに、前記精製されたｍＲＮＡ溶液を透析するステップを含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を用いて、１ｍＭのクエン酸ナトリウムと透析される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成され、前記不純調製物がＩｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成反応混合物を含有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記不純調製物が未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．５％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、銀染色、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、及び／またはキャピラリー電気泳動により測定される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記未完了で中断されたＲＮＡ配列が、１５未満の塩基を含有する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記未完了で中断されたＲＮＡ配列が、約８〜１２の塩基を含有する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記ｍＲＮＡが、バッチ当たり１グラム、１０グラム、１００グラム、１ｋｇ、１０ｋｇ、または１００ｋｇ以上の規模で精製される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加される前に精製される、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加された後に精製される、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記ｍＲＮＡが、キャップが付加された後に精製される、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ｍＲＮＡが、キャップ及び／またはテールが前記ｍＲＮＡに付加される前及び後の両方で精製される、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記ｍＲＮＡが、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上の長さである、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記ｍＲＮＡが、安定性を増強させるために１つ以上の修飾を含有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記１つ以上の修飾が、修飾ヌクレオチド及び／または修飾糖リン酸主鎖を含有する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ｍＲＮＡが修飾されていない、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記精製されたｍＲＮＡが、９５％以上の完全性を有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記精製されたｍＲＮＡが、９８％以上の完全性を有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記精製されたｍＲＮＡが、９９％以上の完全性を有する、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製方法であって、
（ａ）不純調製物からｍＲＮＡを沈殿させること、及び
（ｂ）沈殿されたｍＲＮＡを含有する前記不純調製物を、前記沈殿されたｍＲＮＡがろ過膜に捕捉される一方で不純物が透過により廃棄されるよう、タンジェンシャルフローろ過に供すること、及び
（ｃ）前記沈殿したｍＲＮＡの再可溶化により前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離させ、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得ること、
を含む前記方法。
（項目４１）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の作製方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成すること、及び
先行項目のいずれか１項に記載の方法を用いて前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製すること、
を含む前記方法。
（項目４２）
先行項目のいずれか１項に記載の方法を用いて精製されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。
（項目４３）
ヒト対象への投与に適した単一種のｍＲＮＡを５グラム以上含有する精製されたｍＲＮＡのバッチ。
（項目４４）
１０グラム以上の単一種のｍＲＮＡを含有する、項目４３に記載のバッチ。
（項目４５）
２５グラム以上の単一種のｍＲＮＡを含有する、項目４３に記載のバッチ。
（項目４６）
ｍＲＮＡ合成工程からの不純物が実質的に含まれていない、項目４２〜４５のいずれか１項に記載のバッチ。
（項目４７）
前記バッチが、未完了で中断されたＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型、及び／または前記単一種のｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記精製されたｍＲＮＡが、約５％未満のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目４３〜４７のいずれか１項に記載のバッチ。
（項目４９）
前記精製されたｍＲＮＡが、約９５％を超える完全性を有する、項目４３〜４８のいずれか１項に記載のバッチ。
（項目５０）
先行項目のいずれか１項に記載の方法を用いて精製されたメッセンジャーＲＮＡを含有する組成物。
（項目５１）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたメッセンジャーＲＮＡを含有する組成物であって、前記組成物は、１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、前記組成物。
（項目５２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含有する組成物であって、前記ｍＲＮＡは、９５％以上の完全性を有する、前記組成物。

本明細書において用いられる「約」及び「およそ」という用語は、同等なものとして用いられる。本明細書において、約／およそと共に、または約／およそを伴わずに用いられるすべての数字は、関連分野の当業者により認識される任意の通常の変動を包含することが意図される。

本発明の他の特長、目的、及び利点は、以下に続く詳細な記述において明らかである。しかし、当該詳細な記述は本発明の実施形態を示しているが、解説のみを目的として提示されるものであり、限定を与えるものではないことを理解されたい。本発明の範囲内にある様々な変更及び改変は、当該詳細な記述から当分野の当業者に明らかとなる。

以下の図面は、解説の目的のためのみであり、限定を目的とはしていない。

負荷、洗浄及び溶離ステップを含む、ｍＲＮＡの大規模精製のための例示的な工程を図示する。たとえば、沈殿したｍＲＮＡが残留物として捕捉される一方で、可溶性不純物ならびに０．２２ｕｍ未満の不溶性不純物が透過により廃棄され得るように、当該沈殿したｍＲＮＡは、膜に負荷されることができる。捕捉の後、当該固形沈殿物は、様々な緩衝液を用いて洗浄され、次いで、再可溶化され、純粋なメッセンジャーＲＮＡ産物として溶離される。 提示される方法による、１グラムの初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からの修飾嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ（３回の溶離を用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 提示される方法による、１．５グラムの初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からの修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（６回の溶離を用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 アガロースゲル電気泳動により示される、提示される方法により精製及びろ過された修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料中の例示的なｍＲＮＡの長さを示す。大規模沈殿後の修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 提示される方法による、１グラムの初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からのアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ（５回の溶離を用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 提示される方法による、１グラムの初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からのアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ（５回の溶離を用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的なＳＹＰＲＯ染色タンパク質ゲルを示す。 アガロースゲル電気泳動により示される、提示される方法により精製及びろ過されたＡＳＳ１ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料中の例示的なｍＲＮＡの長さを示す。大規模沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 提示される方法による、初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からの蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（一または二重沈殿のいずれかを用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 提示される方法による、初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応からの蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（一または二重沈殿のいずれかを用いた）及びＩＶＴ反応に含まれる対照酵素の例示的なＳＹＰＲＯ染色タンパク質ゲルを示す。 アガロースゲル電気泳動により示される、提示される方法により精製及びろ過された蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料中の例示的なｍＲＮＡの長さを示す。大規模沈殿及び再沈殿後のＦＦＬ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 最終キャップ付加及びテール付加反応からのアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ（３回の溶離を用いた）ならびにキャップ付加及びテール付加反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 アガロースゲル電気泳動により示される、提示される方法により精製及びろ過された例示的な最終ＡＳＳ１ ｍＲＮＡの長さを示す。大規模沈殿及び再沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 ＦＦＬ ｍＲＮＡ処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物内で観察された例示的な発光を示す。細胞はトランスフェクション後２４時間で回収された。供給業者が作製したｍＲＮＡとスピンカラム精製したｍＲＮＡ（市販キット）と沈殿−ＴＦＦ精製ＦＦＬ ｍＲＮＡの翻訳能の比較が表されている。 ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物内で観察された例示的なＣＦＴＲタンパク質のレベルを示す。細胞はトランスフェクション後２４時間で回収された。ＴＦＦ精製ｍＲＮＡとスピンカラム（市販キット）ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡの翻訳能の比較が表されている。 提示される方法により精製及びろ過されたアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料からの例示的なｍＲＮＡの長さを示す。大規模（５グラム）沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 提示される方法により精製及びろ過されたアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料からの例示的なｍＲＮＡ（キャップ付加／テール付加される前及び後）の長さを示す。大規模（５グラム）沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 提示される方法による最終精製（５グラム）後のアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡならびに当該反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 ＡＳＳ１ ｍＲＮＡで処理されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物内で観察された例示的なヒトＡＳＳ１タンパク質産物を示す。細胞はトランスフェクション後２４時間で回収された。スピンカラム精製ｍＲＮＡ（市販キット）と沈殿−ＴＦＦ精製ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（５グラム）の翻訳能の比較が表されている。 アガロースゲル電気泳動により示される、提示される方法により精製及びろ過された嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料中の例示的なｍＲＮＡ（キャップ付加／テール付加される前及び後）の長さを示す。大規模（１０グラム）沈殿後のＣＦＴＲ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。 提示される方法による最終精製（１０Ｇ）後の嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡならびに当該反応に含まれる対照酵素の例示的な銀染色タンパク質ゲルを示す。 大規模産生及び精製からのｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物内で観察された例示的なＣＦＴＲタンパク質レベルを示す。細胞はトランスフェクション後２４時間で回収された。 アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡの２５グラムスケールの産生でのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料中の例示的なｍＲＮＡの長さを示す。大規模（２５グラム）単離後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性は完全に維持されていた。

定義
本発明がさらに簡便に理解されるために、まず若干数の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体を通して記述されている。

動物：本明細書において、「動物」という用語は、動物界の任意の種を指す。一部の実施形態において、「動物」とは、任意の発達段階にあるヒトを指す。一部の実施形態において、「動物」とは、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、当該非ヒト動物は哺乳類（たとえば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／またはブタ等）である。一部の実施形態において、動物は、ほ乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物及び／またはクローンでありうる。

およそまたは約：本明細書において、対象の１以上の値に対して適用された場合の「およそ」または「約」とは、規定された基準値に類似する値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載が無い限り、または文脈から別様に明白ではない限り（かかる数値が、可能値の１００％を超える場合を除く）、規定された基準値のいずれかの方向（規定された基準値より大きい、または規定された基準値より小さい）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲に入る値の範囲を指す。

生物学的に活性な：本明細書において、「生物学的に活性な」という表現は、生物学的システムにおいて、特に生物体中において活性を有する任意の剤の特性を指す。たとえば、生物体に投与されたときにその生物体に対する生物学的効果を有する剤は、生物学的に活性であるとみなされる。

発現：本明細書において、核酸配列の「発現」とは、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳、完全なタンパク質への複数のポリペプチドの組み立て、及び／またはポリペプチド若しくは完全に組み立てられたタンパク質の翻訳後修飾を指す。本出願において、「発現」及び「産生」という用語、ならびに文法的に同等の用語は、相互交換可能に用いられる。

機能的な：本明細書において、「機能的な」生物学的分子とは、それを特徴づける特性及び／または活性を示す形態にある生物学的分子である。

改善する、増加する、または減少する：本明細書において、「改善する」、「増加する」若しくは「減少する」または文法的に同等の用語は、たとえば本明細書に記述される処置の開始前の同一個体における測定値または本明細書に記述される処置を行わない対照の対象（複数含む）における測定値等の基準となる測定値に対し相対的な値を示す。「対照の対象」は、当該対象が処置される疾患の同一形態に罹患した対象であり、当該処置される対象とほぼ同じ年齢である。

不純物：本明細書において、「不純物」という用語は、限定された量内の液体、ガスまたは固体の物質を指し、当該物質は標的物質または化合物の化学的組成とは異なっている。不純物はまた汚染物質とも呼称される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書において、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物体内ではなく、たとえば試験管または反応槽中、細胞培養中等の人工的環境中で発生する事象を指す。

ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書において、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、たとえばヒト及び非ヒト動物等の多細胞生物体内で発生する事象を指す。細胞をベースとした系の状況下では、当該用語は、（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ系中とは対照的に）生細胞内で発生する事象を指すために用いられ得る。

単離された：本明細書において、「単離された」という用語は、（１）（自然環境下、及び／または実験的設定下のいずれでも）当初それらが産生されたときに伴う構成要素の少なくとも一部から分離された、及び／若しくは（２）ヒトの手により産生、調製、及び／または製造された、物質ならびに／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、当初伴っていた他の構成要素の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％より多くら分離されていてもよい。一部の実施形態において、単離された剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高い純度である。本明細書において、他の構成要素が実質的に無い場合、物質は「純粋」である。本明細書において、単離された物質及び／または実体の純度の割合の算出は、添加剤（たとえば緩衝剤、溶媒、水等）を除外するものとする。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書において、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書において用いられるｍＲＮＡは、修飾ＲＮＡ及び非修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１以上のコード領域及び非コード領域を含有し得る。

ｍＲＮＡの完全性：本明細書において、「ｍＲＮＡの完全性」という用語は通常、ｍＲＮＡの質を指す。一部の実施形態において、ｍＲＮＡの完全性は、精製工程（たとえばタンジェンシャルフローろ過）の後で分解されていないｍＲＮＡの割合（％）を指す。ｍＲＮＡの完全性は、当分野に公知の方法を用いて、たとえばＲＮＡアガロースゲル電気泳動（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｅｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）により決定されてもよい。

核酸：本明細書において、「核酸」という用語は、そのもっとも広い意味で、ポリヌクレオチド鎖へと組み込まれる、若しくは組み込まれることができるすべての化合物及び／または物質を指す。一部の実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖へと組み込まれる、若しくは組み込まれることができる化合物及び／または物質である。一部の実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（たとえばヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含有するポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び／若しくは二本鎖ＤＮＡならびに／またはｃＤＮＡを包含する。さらに「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語及び／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体を含む。たとえばいわゆる「ペプチド核酸」が当分野において公知であり、それらは当該主鎖においてホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有しており、本発明の範囲内にあるとみなされる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重版であり、及び／または同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のすべてを含む。タンパク質及び／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。核酸は、天然源から精製されることができ、組み換え発現系を用いて産生されることができ、及び任意選択的に精製され、化学的に合成されること等ができる。たとえば化学的に合成された分子の場合等、適切な場合には、核酸は、たとえば化学的修飾された塩基または糖類、主鎖修飾等を有するヌクレオシド類似体等を含むことができる。核酸配列は、別段の表示がない限り、５’から３’の方向で表される。一部の実施形態において、核酸は、天然型ヌクレオシド（たとえばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（たとえば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物修飾された塩基（たとえばメチル化塩基）、挿入された塩基、修飾糖（たとえば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）、及び／若しくは修飾リン酸基（たとえばホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）である、またはそれらを含有する。一部の実施形態において、本発明は、送達を促進または送達を成し得るために化学的に修飾されていない核酸（たとえば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドならびに残基）を意味する、「非修飾核酸」を特に目的とするものである。

患者：本明細書において、「患者」または「対象」という用語は、実験目的、診断目的、予防目的、美容目的及び／または治療目的のために提供される組成物が投与され得るすべての生物体を指す。典型的な患者としては、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類及び／またはヒト等の哺乳類）が挙げられる。一部の実施形態において、患者はヒトである。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。

薬学的に許容される：本明細書において用いられる「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題若しくは合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒト及び動物の組織と接触する使用に適している物質を指す。

未完了で中断されたＲＮＡ配列：本明細書において用いられる「未完了で中断されたＲＮＡ配列」という用語は、ｍＲＮＡ合成反応（たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応）の不完全な産物を指す。様々な理由により、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型を常に完全には転写しない。すなわち、ＲＮＡ合成が未完了の状態で終結する。ＲＮＡ合成の未完了の終結の考えられる理由としては、ＤＮＡ鋳型の質、鋳型中に存在する特定のポリメラーゼに対するポリメラーゼ終了配列、劣化した緩衝液、温度、リボヌクレオチドの枯渇、及びｍＲＮＡの二次構造が挙げられる。未完了で中断されたＲＮＡ配列は、所望される転写産物の予定される長さよりも短い任意の長さであり得る。たとえば、未完了で中断されたｍＲＮＡ配列は、１０００塩基未満、５００塩基未満、１００塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３０塩基未満、２０塩基未満、１５塩基未満、１０塩基未満、またはより短くともよい。

塩：本明細書において用いられる「塩」という用語は、酸と塩基の間の中和反応から生じる、または生じうるイオン性化合物を指す。

対象：本明細書において、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態において、対象は、ヒトである。対象は、患者であってもよく、患者とは、医療提供者に対して疾患の診断または治療を申し出ているヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と相互交換可能に用いられる。対象は、疾患または障害に罹患していてもよく、または罹患しやすくてもよいが、当該疾患または障害の症状を示している可能性も、示していない可能性もある。

実質的に：本明細書において、「実質的に」という用語は、対象の特徴または特性の完全若しくはほぼ完全な度合いまたは程度を示す質的な状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象は、仮にあるとしても、まれにしか完了まで到達しない、及び／または完全な状態まで進行しない、または完全な結果を達成しない、若しくは完全な結果を回避しないことを理解するであろう。ゆえに「実質的に」という用語は、本明細書において、多くの生物学的現象及び化学的現象に本来的に備わっている完全性の欠落の可能性を表現するために用いられる。

実質的に含まれない：本明細書において、「実質的に含まれない」という用語は、除去される物質（たとえば、未完了で中断されたＲＮＡ配列）が比較的少ない量で存在するか、または全く存在しない状態を指す。たとえば、「未完了で中断されたＲＮＡ配列が実質的に含まれない」とは、当該未完了で中断されたＲＮＡ配列が、不純物のおよそ５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．０％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満またはそれ以下のレベル（ｗ／ｗ）で存在していることを意味する。あるいは、「未完了で中断されたＲＮＡ配列が実質的に含まれない」とは、当該未完了で中断されたＲＮＡ配列が、約１００ｎｇ未満、９０ｎｇ未満、８０ｎｇ未満、７０ｎｇ未満、６０ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、１ｎｇ未満、５００ｐｇ未満、１００ｐｇ未満、５０ｐｇ未満、１０ｐｇ未満またはそれより少ないレベルで存在していることを意味する。

詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡを沈殿させ、次いで膜ろ過（たとえば、タンジェンシャルフローろ過）を行うことを含む工程に基づいた、不純調製物（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応混合物）からｍＲＮＡを精製するための改善された方法を提供するものである。

本発明の様々な態様が以下の項に詳細に記述されている。当該項の使用は、本発明を限定することを意味しない。各項は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、別段の表示がない限り、「または」の使用は「及び／または」を意味する。

ｍＲＮＡの合成
本発明を用いて、任意のｍＲＮＡを精製してもよい。ｍＲＮＡとは一般的にＤＮＡからリボソームへと情報を運搬するＲＮＡ型と考えられている。ｍＲＮＡの存在は一般的に非常に短く、プロセッシングと翻訳、その後の分解を含んでいる。一般的に、真核生物体においてｍＲＮＡのプロセッシングは、Ｎ−終末（５’）末端上に「キャップ」を、及びＣ−終末（３’）末端上に「テール」を付加することを含む。典型的なキャップは、７−メチルグアノシンキャップであり、７−メチルグアノシンキャップは最初の転写ヌクレオチドに５’−５’−三リン酸結合を介して結合されるグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に存在しているヌクレアーゼに対する抵抗性をもたらすという点で重要である。テールは一般的にポリアデニル化事象であり、それによりポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「テール」の存在により、エキソヌクレアーゼ分解からのｍＲＮＡの保護が供される。メッセンジャーＲＮＡはリボソームにより一連のアミノ酸へと翻訳され、当該アミノ酸がタンパク質を形成する。

本発明によるｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかにより合成されてもよい。たとえば、本発明によるｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）により合成されてもよい。簡潔に記載すると、ＩＶＴは通常、プロモーターを含有する直線状または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸塩のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含有し得る緩衝液系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は具体的な応用方法によって変化し得る。これら試薬の存在は、いくつかの実施形態による最終産物中においては望ましいものではなく、それ故、不純物と呼称され得、これら不純物を１つ以上含有する調製物は不純調製物と呼称され得る。

様々な実施形態によると、本発明を用いて、様々な長さのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製してもよい。一部の実施形態において、本発明を用いて、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上の長さのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製してもよい。一部の実施形態において、本発明を用いて、約１〜２０ｋｂ、約１〜１５ｋｂ、約１〜１０ｋｂ、約５〜２０ｋｂ、約５〜１５ｋｂ、約５〜１２ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、約８〜２０ｋｂ、または約８〜１５ｋｂの長さの範囲にあるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製してもよい。たとえば、一般的なｍＲＮＡは約１ｋｂ〜約５ｋｂの長さでありうる。より一般的には、ｍＲＮＡは約１ｋｂ〜約３ｋｂの長さを有する。しかし、一部の実施形態において、本発明組成物中のｍＲＮＡはよりずっと長い（約２０ｋｂ超）。一部の実施形態において、本発明を用いて、一般的に安定性を増強させる修飾を１つ以上含有するｍＲＮＡを精製してもよい。一部の実施形態において、１つ以上の修飾は修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸主鎖、５’及び／または３’非翻訳領域から選択される。一部の実施形態において、本発明を用いて修飾されていないｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製してもよい。

一般的に、ｍＲＮＡは安定性を増強させるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾としては、たとえばＲＮＡのヌクレオチドの修飾が挙げられる。従って、本発明による修飾ｍＲＮＡはたとえば主鎖修飾、糖修飾、または塩基修飾を含有し得る。一部の実施形態において、抗体をコードするｍＲＮＡ（たとえば重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡ）は、限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））若しくはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびにたとえば１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−シュードウラシル、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、．ベータ．−Ｄ−マンノシル−キュエオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）及びホスホロアミド酸塩、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸塩、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシン、及びイノシン等のプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体若しくは誘導体をはじめとする天然型ヌクレオチドならびに／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよい。かかる類似体の調製は、たとえばその開示内容が参照によりその全範囲で本明細書に含有される米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び第５，７００，６４２号から当分野の当業者に公知である。

一般的に、ｍＲＮＡの合成は、Ｎ−終末（５’）末端上の「キャップ」、及びＣ−終末（３’）末端上の「テール」の付加を含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に存在しているヌクレアーゼに対する抵抗性を提供するという点において重要である。「テール」の存在により、エキソヌクレアーゼ分解からのｍＲＮＡの保護が供される。

それ故、一部の実施形態において、ｍＲＮＡは５’キャップ構造を含む。５’キャップは一般的に以下のように付加される。最初にＲＮＡ末端ホスファターゼが当該５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残す。次いで、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端のリン酸にグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が付加され、５’５’５三リン酸結合が形成される。次いでグアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。

一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から合成されたｍＲＮＡが望ましい場合がある一方で、細菌、真菌、植物及び／または動物から産生された野生型ｍＲＮＡを含む他の源のｍＲＮＡも本発明の範囲内にあると企図される。

一部の実施形態において、ｍＲＮＡは５’及び／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態において、５’非翻訳領域は、たとえば鉄応答要素等のｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える要素を１つ以上含有する。一部の実施形態において、５’非翻訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さでありうる。

一部の実施形態において、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡの細胞内局在性の安定性に影響を与えるタンパク質に対する結合部位、またはｍｉＲＮＡに対する１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含有する。一部の実施形態において、３’非翻訳領域は、５０〜５００ヌクレオチド以上の長さでありうる。

本発明を用いて様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを精製してもよい。蛍ルシフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、第ＩＸ因子、及びＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡの精製に関する非限定的な例を実施例において詳細に記述する。

典型的には、本発明を用いて単一種のｍＲＮＡを精製するものであり、すなわち、精製されるｍＲＮＡ調製物は、一つの遺伝子、または単回の合成若しくは一つの発現構築物から誘導されたｍＲＮＡを含有する。対照的に、細胞から精製された総ｍＲＮＡは複数種のｍＲＮＡを含有する。

本発明による精製工程は合成の間に、または合成後に引き続き行われてもよい。たとえばｍＲＮＡはキャップ及び／またはテールがｍＲＮＡに付加される前に本明細書に記述されるように精製されてもよい。一部の実施形態において、ｍＲＮＡはキャップ及び／またはテールがｍＲＮＡに付加された後に精製される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡはキャップが付加された後に精製される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡはキャップ及び／またはテールがｍＲＮＡに付加される前及び後の両方で精製される。一般に、本明細書に記述される精製ステップは、任意選択的にたとえば透析等の他の精製工程とともにｍＲＮＡ合成の各ステップの後で行われてもよい。たとえばｍＲＮＡは初期合成（たとえばテールを伴う、または伴わない）後にショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）を除去するために透析を経てもよく、次いで本明細書に記述されるように沈殿及び精製に供され、次いでキャップ及び／またはテールの付加の後に再度沈殿及び精製により精製されてもよい。

ｍＲＮＡの沈殿
本発明によると、ｍＲＮＡはたとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応混合物等の不純調製物から当分野に公知の様々な沈殿法を用いて沈殿されてもよい。本明細書において、「沈殿」という用語（またはその文法的に同等のすべての用語）は、溶液中での固体の形成を指す。ｍＲＮＡに関連して使用されるとき、当該「沈殿」という用語は、液体中のｍＲＮＡの不溶性形態または固体形態の形成を指す。

ｍＲＮＡの沈殿に適したすべての方法を、本発明の実施に用いることができる。典型的には、ｍＲＮＡの沈殿は変性条件を含む。本明細書において、「変性条件」という用語は、ｍＲＮＡの固有立体配座の破壊をもたらし得る任意の化学的条件または物理的条件を指す。分子の固有立体配座は通常、最も水溶性であるので、分子の二次構造または三次構造の破壊は、可溶性に変化をもたらし得、溶液からのｍＲＮＡの沈殿を発生させ得る。

たとえば、不純調製物からのｍＲＮＡの適切な沈殿法は、ｍＲＮＡを沈殿させる変性試薬を用いて当該不純調製物を処理することを含む。本発明に適した変性試薬の例としては、限定されないが、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適切な試薬は、固形形態または溶液中で供給されてもよい。

非限定的な例として、チオシアン酸グアニジニウムを用いてｍＲＮＡを沈殿させてもよい。典型的には、チオシアン酸グアニジニウムは、約１Ｍ以上、約２Ｍ以上、約３Ｍ以上、約４Ｍ以上、約５Ｍ以上、約６Ｍ以上、約７Ｍ以上、約８Ｍ以上、約９Ｍ以上、または約１０Ｍ以上の濃度で溶液中に供給されてもよい。一部の実施形態において、ｍＲＮＡ沈殿に適した溶液は、約４Ｍの濃度でチオシアン酸グアニジニウムを含有する。

変性試薬に加え、ｍＲＮＡの沈殿に適した溶液は、追加の塩、界面活性剤、及び／または緩衝剤を含有してもよい。たとえば適切な溶液はラウリルサルコシルナトリウム及び／またはクエン酸ナトリウムをさらに含有してもよい。非限定的な例として、ｍＲＮＡに適した溶液は、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有してもよく、または４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び０．５％のラウリルサルコシルナトリウムを含有してもよく、または４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有してもよい。

典型的には、相当量のｍＲＮＡの沈殿が可能となる望ましい温度で、一定の期間、本明細書に記載される変性試薬の１つ以上と不純調製物をインキュベートすることが望ましい。たとえば不純調製物と変性剤の混合物は、室温または大気温度で一定の期間インキュベートされてもよい。典型的には、適切なインキュベート時間は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または６０分以上の期間である。一部の実施形態において、適切なインキュベート時間は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、または５分以下の期間である。一部の実施形態において、当該混合物は室温で約５分間インキュベートされる。典型的には、「室温」または「大気温度」とは、たとえば約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、または２５℃等の約２０〜２５℃の範囲にある温度を指す。一部の実施形態において、不純調製物と変性剤の混合物は、室温よりも高い温度（たとえば、約３０〜３７℃、または特に約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、若しくは３７℃）または室温よりも低い温度（たとえば、約１５〜２０℃、または特に約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、若しくは２０℃）でインキュベートされてもよい。インキュベーション期間は、インキュベート温度に基づき調節され得る。典型的には、高いインキュベーション温度では短いインキュベーション時間が必要となる。

あるいは、またはさらに、溶媒を用いてｍＲＮＡ沈殿を促進させてもよい。適切な溶媒の例としては、限定されないが、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。たとえば溶媒（たとえば無水エタノール）は、ｍＲＮＡ沈殿をさらに増強及び／または促進させるために、本明細書に記述される変性剤とともに不純調製物に添加されてもよく、または変性剤の添加及びインキュベーションの後に添加されてもよい。典型的には、適切な溶媒（たとえば無水エタノール）の添加の後、当該混合物を室温で新たな期間インキュベートしてもよい。典型的には、適切なインキュベーション期間は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または６０分以上である。一部の実施形態において、適切なインキュベーション期間は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、または５分以下である。典型的には、当該混合物は室温で新たに約５分間インキュベートされる。室温を上回る温度、または下回る温度を、インキュベーション時間の適した調節とともに用いてもよい。あるいは、沈殿のためにインキュベーションを４℃、または−２０℃で行うこともあり得る。

典型的には、本明細書に記載される方法により、不純調製物から相当量のｍＲＮＡの沈殿が発生する。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、不純調製物から少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の総ｍＲＮＡの沈殿を生じさせる。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、不純調製物から実質的に１００％の総ｍＲＮＡの沈殿を生じさせる。

膜ろ過
本発明によると、沈殿したｍＲＮＡを含有する不純調製物を、当該沈殿したｍＲＮＡが膜に捕捉または保持される、膜ろ過を含む精製工程に供してもよい。したがって、一部の実施形態において、不純調製物は、不溶物を除去するための前処理を行わずに沈殿を行った後に膜ろ過に供される。

様々なタイプの膜ろ過を用いて、沈殿したｍＲＮＡを捕捉または保持してもよい。典型的には、膜ろ過は、１つ以上の挿入された透過膜を用いて液体から個体を分離することを含む。また膜ろ過を用いてガス性試料から粒子をろ過してもよい。一般的に言えば、膜ろ過には受動ろ過と能動ろ過の２つの主要な形態があり、受動ろ過は単に溶液の拡散によって進行し、能動ろ過は液体またはガスが強制的に膜を通り抜けるように陽圧または陰圧（すなわち真空）を使用する。

ｍＲＮＡを精製するための膜ろ過を含む工程の例を図１に示す。典型的には、かかる工程は、負荷、洗浄及び溶離ステップを含む。

負荷
典型的には、負荷ステップは、膜上に供給物（たとえば沈殿ｍＲＮＡを含有する不純調製物）を負荷し、供給物を陽圧または陰圧により強制的に通過させ、残留物を膜上に捕捉または保持させることを含む。本明細書において、「残留物」という用語は、膜により保持される任意の非透過性の溶質及び／または不溶性物質を指す。本発明によると沈殿したｍＲＮＡは残留物として膜に捕捉される。本明細書において、「膜」という用語は、任意の多孔質の層または物質のシートを指す。本出願において、「膜」という用語は、フィルターと相互交換可能に用いられる。

一部の実施形態において、適切な膜は、不純物（可溶性不純物及び／または孔のサイズよりも小さいサイズの不溶性不純物を含む）は透過させながら通過させ、一方で沈殿したｍＲＮＡは捕捉または保持するのに適した孔のサイズを有する。一部の実施形態において、適切な膜は、約０．１０μｍ、０．２０μｍ、０．２２μｍ、０．２４μｍ、０．２６μｍ、０．２８μｍ、０．３０μｍ、０．４０μｍ、０．５０μｍ、または１．０μｍ以上の平均孔サイズを有する。特定の実施形態において。適切な膜は約０．２２μｍの平均孔サイズを有する。特定の実施形態において、沈殿したｍＲＮＡの保持に適した孔サイズは、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ）とも呼称される、沈殿ｍＲＮＡの公称分画分子量（ＮＭＷＬ：ｎｏｍｉｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｌｉｍｉｔｓ）により決定され得る。典型的には、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯよりも小さい孔サイズの膜が使用される。一部の実施形態において、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯよりも２〜６（たとえば、２、３、４、５または６）倍小さい孔サイズの膜が使用される。一部の実施形態において、本発明に適した膜は、約１００キロダルトン（ｋＤａ）、３００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ、３，５００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ、４，５００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ、５，５００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ、６，５００ｋＤａ、７，０００ｋＤａ、７，５００ｋＤａ、８，０００ｋＤａ、８，５００ｋＤａ、９，０００ｋＤａ、９，５００ｋＤａ、または１０，０００ｋＤａ以上の孔サイズを有し得る。

本発明に適した膜は、任意の材料から作製されてもよい。例示的な膜の材料としては、限定されないが、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾なし）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル類）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、塩化ポリビニル及びそれらの組み合わせが挙げられる。

本発明に適した膜は、様々な表面積を有し得る。一部の実施形態において、適切な膜は、ｍＲＮＡの大規模産生を促進するための十分な大きさの表面積を有する。たとえば適切な膜は、約２，０００ｃｍ^２、２，５００ｃｍ^２、３，０００ｃｍ^２、３，５００ｃｍ^２、４，０００ｃｍ^２、４，５００ｃｍ^２、５，０００ｃｍ^２、７，５００ｃｍ^２、１０，０００ｃｍ^２、５ｍ^２、１０ｍ^２、１２ｍ^２、１５ｍ^２、２０ｍ^２、２４ｍ^２、２５ｍ^２、３０ｍ^２、または５０ｍ^２以上の表面積を有し得る。

膜ろ過は沈殿したｍＲＮＡを捕捉するための様々な形式で行われてもよい。一部の実施形態において、膜ろ過はタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）の一部として行われる。

タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）はクロスフローろ過とも呼称され、ろ過される材料がフィルターを通過するのではなく接線方向にフィルターを横切るタイプのろ過である。ＴＦＦにおいて、望ましくない透過物はフィルターを通過し、一方で望ましい残留物（たとえば沈殿したｍＲＮＡ）はフィルターに沿って通過し、下流でフィルターもしくは膜上に捕捉または保持される。

タンジェンシャルフローろ過の主な利点は、従来的な「袋小路」のろ過の場合には、フィルターに凝集し、塞いでしまう可能性のある非透過性の残留物（場合により、「フィルターケーキ」と呼称される）が、そうではなくフィルターの表面に沿って押し流されていくという点である。この利点によって、タンジェンシャルフローろ過は、沈殿ｍＲＮＡの大規模精製に特に適したものとなる。一部の実施形態において、バッチあたり、約１グラム、１０グラム、５０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラム、４００グラム、５００グラム、６００グラム、７００グラム、８００グラム、９００グラム、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、または１００ｋｇ以上のｍＲＮＡの処理量が適用され得る。

典型的なＴＦＦ工程において少なくとも３つの工程変量が重要である。膜透過圧、供給速度、そして透過物の流速である。膜透過圧は、透過性分子を運びながらフィルターに液体を通過させる力である。一部の実施形態において、膜透過圧は１ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）以上、３０ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）以下である。

供給速度（クロスフロー速度としても知られる）は、供給チャンネルを通り、フィルターを横切る溶液の流れの速度である。供給速度は、フィルターを塞ぎ、または詰まらせ、それによりろ過速度を制限し得る分子を押し流す力を決定する。一部の実施形態において、供給速度は、１〜５００Ｌ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、５０〜８００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、５０〜７５０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、５０〜３００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、５０〜２００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、７５〜２００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、１００〜２００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、１２５〜１７５ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、１３０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、６０ｍＬ／分〜２２０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、供給速度は、６０ｍＬ／分以上である。一部の実施形態において、供給速度は、１００ｍＬ／分以上である。一部の実施形態において、供給速度は、１５０ｍＬ／分以上である。一部の実施形態において、供給速度は、２００ｍＬ／分以上である。一部の実施形態において、供給速度は、２２０ｍＬ／分以上である。

透過物の流速は、透過物が当該系から除去される速度である。一定の供給速度に対して、透過物の流速を上げることにより、フィルターを通る圧を増加させることができ、それによりろ過速度は上昇する一方で、フィルターの閉塞または目詰まりのリスクも増加する可能性がある。ＴＦＦに用いられる原理、理論、及び装置は、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓにおいて、Ｍｉｃｈａｅｌｓらの”Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ”（Ｗ． Ｐ． Ｏｌｓｏｎ（編）、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ， Ｉｌｌ． １９９５）に記載されている。また、高速タンジェンシャルフローろ過（ＨＰ−ＴＦＦ）の記述に関しては、ＴＦＦに対する改良を説明している、米国特許第５，２５６，２９４号及び第５，４９０，９３７号を参照のこと。一部の実施形態において、流速は、１〜１００Ｌ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜１００ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜９０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜８０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜７０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜６０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜５０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、１０〜４０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、２０〜４０ｍＬ／分である。一部の実施形態において、流速は、３０ｍＬ／分である。

本明細書に記載される様々な工程変量の任意の組み合わせを用いてもよい。一部の実施形態において、タンジェンシャルフローろ過はおよそ１００〜２００ｍＬ／分（たとえば、およそ１００〜１８０ｍＬ／分、１００〜１６０ｍＬ／分、１００〜１４０ｍＬ／分、１１０〜１９０ｍＬ／分、１１０〜１７０ｍＬ／分、または１１０〜１５０ｍＬ／分）の供給速度、及び／またはおよそ１０〜５０ｍＬ／分（たとえば、およそ１０〜４０ｍＬ／分、１０〜３０ｍＬ／分、２０〜５０ｍＬ／分、または２０〜４０ｍＬ／分）の流速で行われる。一部の実施形態において、タンジェンシャルフローろ過は、およそ１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００ｍＬ／分の供給速度、及び／またはおよそ１０、２０、３０、４０若しくは５０ｍＬ／分の流速で行われる。他の実施形態において、タンジェンシャルフローろ過は、およそ５００、７５０ｍＬ／分、１、２、３、４、もしくは５Ｌ／分の供給速度、及び／または１００、２００、２５０、５００、７５０ｍＬ／分もしくは１Ｌ／分の流速で行われる。

洗浄
典型的には、捕捉された不溶性ｍＲＮＡは、膜上に保持された不純物を取り除くため、溶離の前に洗浄され得る。一部の実施形態において、洗浄ステップは、１以上の洗浄溶液を用いた複数回のすすぎサイクルを含む。たとえば、洗浄ステップは、グアニジニウム緩衝液及びエタノール、その後に７０〜８０％のエタノール（たとえば、約７０％、７５％、または８０％のエタノール）を用いた複数回のすすぎサイクルにより行われてもよい。ある特定の実施形態において、当該複数回のすすぎサイクルは、２回より多い、３回より多い、４回より多い、５回より多い、６回より多い、７回より多い、８回より多い、９回より多い、または１０回より多いサイクルである。

溶離
典型的には、捕捉または保持されたｍＲＮＡは、当該沈殿ｍＲＮＡの溶液への再可溶化により溶離される。たとえば、捕捉されたｍＲＮＡはＲＮＡｓｅが含まれていない水を用いて溶離されてもよい。ある特定の実施形態において、捕捉されたｍＲＮＡの溶離は、ＲＮＡｓｅを含まない水の再循環が含まれる。たとえば、当該ＲＮＡｓｅを含まない水は、約５〜３０分間（たとえば、約５〜２５分、約５〜２０分、または約５〜１５分）循環されてもよい。特定の実施形態において、当該ＲＮＡｓｅを含まない水は、約５〜１０分間（たとえば、約５、６、７、８、９、または１０分間）再循環される。

一部の実施形態において、再可溶化されたｍＲＮＡは、所望される濃度で所望される配合組成物へと透析され得る。様々な配合組成物を透析に用いてもよい。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、１ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いて透析される。一部の実施形態において、精製されたｍＲＮＡ溶液は、酢酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、酢酸ピリジニウム、ギ酸ピリジニウム、酢酸アンモニウム、尿素、塩化カリウム等を用いて透析される。対象ｍＲＮＡのサイズに応じて、適切な分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する透析膜が用いられ得る。たとえば適切な透析膜は、約５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３５０ｋＤａ、４００ｋＤａ、４５０ｋＤａ、または５００ｋＤａのＭＷＣＯを有し得る。

精製されたｍＲＮＡの特徴解析
本発明により提供される特有の利点は、ｍＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを大規模で、または工業規模で精製する能力である。たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり約１グラム、１グラム、１０グラム、５０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラム、４００グラム、５００グラム、６００グラム、７００グラム、８００グラム、９００グラム、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、または１００ｋｇ以上の規模で精製され得る。一つの特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡはバッチ当たり１０グラムの規模で精製され得る。他の特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡはバッチ当たり１００グラムの規模で精製され得る。さらに他の特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡはバッチ当たり１ｋｇの規模で精製され得る。

様々な実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、限定されないが、未完了で中断されたＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含むｍＲＮＡ合成工程由来の不純物を実質的に含まない。

特に、本発明は、未完了で中断されたＲＮＡ配列（「ショートマー」としても知られる）を高度に除去または排除する。一部の実施形態において、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える、または実質的にすべての未完了で中断されたＲＮＡ配列を除去する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、未完了で中断されたＲＮＡ配列を実質的に含まない。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（たとえば、約４％、３％、２％、または１％未満）の未完了で中断されたＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（たとえば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の未完了で中断されたＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、たとえばエチジウムブロミド染色及び／またはクマシン染色等により測定される、検出限界以下の未完了で中断されたＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態において、未完了で中断されたＲＮＡ配列は、１５未満の塩基（たとえば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または３未満の塩基）を含有する。一部の実施形態において、未完了で中断されたＲＮＡ配列は、約８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、または８〜１０塩基を含有する。

一部の実施形態において、本発明による方法は、限定されないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を高い割合で除去または排除する。一部の実施形態において、本発明は特にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの除去に有効である。一部の実施形態において、本発明による方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬の約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超または実質的にすべてを除去する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を約５％未満（たとえば、約４％、３％、２％、または１％未満）含有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を約１％未満（たとえば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）含有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、たとえばエチジウムブロミド染色及び／またはクマシン染色等により測定され、検出限界以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する。

精製されたｍＲＮＡ中の未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／または酵素試薬のレベルは、当分野に公知の様々な方法を用いて測定され得る。たとえば未完了で中断されたＲＮＡ配列及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬は、銀染色、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、及び／またはキャピラリー電気泳動を介して測定され得る。

様々な実施形態において、本明細書に記載される方法を用いて精製されたｍＲＮＡは、高度な完全性を維持している。本明細書において、「ｍＲＮＡの完全性」という用語は、一般的に、精製後のｍＲＮＡの質を指す。一部の実施形態において、ｍＲＮＡの完全性とは、タンジェンシャルフローろ過後に分解されていないｍＲＮＡの割合（％）を指す。ｍＲＮＡの完全性は、たとえばＲＮＡアガロースゲル電気泳動（たとえばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｅｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）等の当分野に公知の方法を用いて測定され得る。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約９５％超の（たとえば約９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはそれを超える）完全性を有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、９８％超の完全性を有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、９９％超の完全性を有する。一部の実施形態において、本発明により精製されたｍＲＮＡは、およそ１００％の完全性を有する。

治療応用のための、ｍＲＮＡの大規模バッチ産生
本発明は、治療応用に要求される高度な純度及び完全性を有する精製ｍＲＮＡの大規模産生に対する緊急の必要性に取り組むものである。従来からある方法は一般的に規模の小さいものであり、充分に費用効率が高く、ヒト対象への投与に適した工業規模でのｍＲＮＡ製造に必要とされる程度にまで規模を拡張することができない。対照的に、本発明方法は実施例において示されるように十分に拡張可能なものであり、医薬グレードのｍＲＮＡの費用効率が高い大規模製造が可能である。

本発明に従い生産された精製ｍＲＮＡの各バッチは、ヒト対象への投与に適した単一種のｍＲＮＡを５グラム以上含有する。一部の実施形態において、１つのバッチは、１０グラム以上の単一種ｍＲＮＡを含有する。特定の実施形態において、１つのバッチは、２５グラム以上の単一種ｍＲＮＡを含有する。

本発明方法により、ｍＲＮＡ合成工程由来の不純物を実質的に含まない精製ｍＲＮＡバッチが産生される。特に、当該バッチは、未完了で中断されたＲＮＡ配列、ＤＮＡ鋳型、及び／または単一種ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない。たとえば本発明に従い産生された精製ｍＲＮＡのバッチは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を約５％未満含有する。各バッチの精製ｍＲＮＡは通常、約９５％を超える完全性を有する。

本発明方法に従い産生されたｍＲＮＡバッチは、１つ以上の下流処理ステップ（複数を含む）を必要とする、治療剤の調製に用いることができる。典型的には、各ｍＲＮＡバッチは、患者への投与が可能なたとえば脂質ナノ粒子、リポソーム、ポリマーベースのポリプレックス等へとｍＲＮＡをカプセル化させることにより製剤化される。典型的な投与経路は、限定されないが、精製ｍＲＮＡの静脈内送達または肺送達を含む。

実施例１．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の作製及び精製
メッセンジャーＲＮＡの合成
蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、及びヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のメッセンジャーＲＮＡを、当該遺伝子をコートするプラスミドＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成し、次いでそれらに５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ， Ｐ．； Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， Ｇ．Ｇ． “Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５， ８６， １２３９−１２４９）、及びゲル電気泳動で測定して、およそ２００ヌクレオチドの長さの３’ポリ（Ａ）テールを付加した。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’及び３’非翻訳領域はそれぞれＸ及びＹと表され、記述されるように定義される（以下を参照のこと）。標的メッセンジャーＲＮＡ構築物の合成は、５’及び３’非翻訳領域に隣接するコード配列からなる初期鎖が合成される２ステップの工程を含んだ。このキャップ及びテールを有さない構築物は精製され、さらにキャップ付加ステップで処理され、次いでポリ−Ａ付加テール付加ステップが行われた。テール付加反応の最後に、初期精製工程と同様の方法で第二の精製ステップが行われた。

例示的なコドン最適化された嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のｍＲＮＡ
構築物の設計：
Ｘ_１−配列番号１−Ｙ_１
ＡＵＧＣＡＧＣＧＧＵＣＣＣＣＧＣＵＣＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＵＧＵＣＧＵＧＵＣＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＵＵＣＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＣＵＵＡＧＡＡＡＧＧＧＧＵＡＵＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＵＵＧＡＧＵＵＧＵＣＵＧＡＣＡＵＣＵＡＣＣＡＧＡＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＧＡＵＵＣＧＧＣＧＧＡＵＡＡＣＣＵＣＵＣＧＧＡＧＡＡＧＣＵＣＧＡＡＣＧＧＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＧＣＧＡＡＣＵＣＧＣＧＵＣＵＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＣＡＵＣＡＡＣＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＵＵＣＵＵＣＵＧＧＣＧＧＵＵＣＡＵＧＵＵＣＵＡＣＧＧＵＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＣＵＣＧＧＧＧＡＧＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＵＣＣＡＡＣＣＣＣＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＣＡＵＵＡＵＣＧＣＣＵＣＧＵＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＵＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＵＣＧＣＧＡＵＣＵＡＣＣＵＣＧＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＵＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＵＣＧＵＣＡＧＡＡＣＡＣＵＵＵＵＧＵＵＧＣＡＵＣＣＡＧＣＡＡＵＣＵＵＣＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＡＣＡＵＣＧＧＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＣＧＡＡＵＣＧＣＵＡＵＧＵＵＵＡＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＣＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＵＧＡＡＡＣＵＣＵＣＧＵＣＧＣＧＧＧＵＧＵＵＧＧＡＵＡＡＧＡＵＵＵＣＣＡＵＣＧＧＵＣＡＧＵＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＡＣＣＵＣＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＵＧＡＧＧＧＡＣＵＧＧＣＧＣＵＧＧＣＡＣＡＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＡＵＵＧＣＣＣＣＧＵＵＧＣＡＡＧＵＣＧＣＣＣＵＵＵＵＧＡＵＧＧＧＣＣＵＵＡＵＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＣＡＧＧＣＡＵＣＵＧＣＣＵＵＵＵＧＵＧＧＣＣＵＧＧＧＡＵＵＵＣＵＧＡＵＵＧＵＧＵＵＧＧＣＡＵＵＧＵＵＵＣＡＧＧＣＵＧＧＧＣＵＵＧＧＧＣＧＧＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＡＵＣＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＣＧＧＧＵＡＡＡＡＵＣＵＣＧＧＡＡＡＧＡＣＵＣＧＵＣＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧＡＡＡＵＧＡＵＣＧＡＡＡＡＣＡＵＣＣＡＧＵＣＧＧＵＣＡＡＡＧＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＧＡＧＡＡＧＡＵＧＡＵＵＧＡＡＡＡＣＣＵＣＣＧＣＣＡＡＡＣＵＧＡＧＣＵＧＡＡＡＣＵＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＵＡＵＧＵＣＣＧＧＵＡＵＵＵＣＡＡＵＵＣＧＵＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＵＵＣＣＧＧＧＵＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＣＵＵＵＣＵＣＵＣＧＧＵＵＵＵＧＣＣＵＵＡＵＧＣＣＵＵＧＡＵＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＵＣＣＧＣＡＡＧＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＡＵＵＵＣＧＵＵＣＵＧＣＡＵＵＧＵＡＵＵＧＣＧＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＵＵＵＣＣＧＵＧＧＧＣＣＧＵＧＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＡＵＧＡＣＵＣＧＣＵＵＧＧＡＧＣＧＡＵＣＡＡＣＡＡＡＡＵＣＣＡＡＧＡＣＵＵＣＵＵＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＡＧＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＣＵＡＣＵＡＣＧＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＧＡＣＧＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＵＵＵＵＧＧＡＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＵＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＡＵＵＣＣＣＵＧＵＵＵＵＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＣＵＣＣＣＵＧＣＵＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＵＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＵＵＣＵＣＧＣＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＡＧＣＡＣＵＧＧＵＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＣＵＡＧＣＣＵＣＵＵＧＡＵＧＧＵＧＡＵＵＡＵＧＧＧＧＧＡＧＣＵＵＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＵＵＡＡＡＣＡＣＵＣＣＧＧＧＣＧＵＡＵＣＵＣＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＣＡＧＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＵＣＡＵＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＵＣＡＵＵＵＵＣＧＧＡＧＵＡＵＣＣＵＡＵＧＡＵＧＡＧＵＡＣＣＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＧＧＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＧＵＧＣＣＡＧＵＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＵＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＵＡＡＣＡＵＣＧＵＣＵＵＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＵＡＵＵＡＣＡＵＵＧＵＣＧＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＵＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＵＡＵＡＣＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＵＵＵＧＵＡＵＣＵＧＣＵＵＧＡＵＵＣＡＣＣＧＵＵＵＧＧＡＵＡＣＣＵＣＧＡＣＧＵＡＵＵＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＣＵＵＣＧＡＧＵＣＧＵＧＣＧＵＧＵＧＵＡＡＡＣＵＵＡＵＧＧＣＵＡＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＵＧＡＣＡＵＣＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＣＡＣＣＵＵＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＣＵＣＣＡＣＧＡＡＧＧＡＵＣＧＵＣＣＵＡＣＵＵＵＵＡＣＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＡＧＡＧＵＵＧＣＡＡＡＡＣＵＵＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＵＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＡＣＵＣＡＵＧＧＧＧＵＧＵＧＡＣＵＣＡＵＵＣＧＡＣＣＡＧＵＵＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＵＣＧＡＵＣＵＵＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧＣＵＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＡＧＧＧＵＧＡＵＧＣＣＣＣＧＧＵＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＵＵＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＵＵＵＧＧＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＵＣＵＵＧＡＡＵＣＣＵＡＵＵＡＡＣＵＣＡＡＵＵＣＧＣＡＡＧＵＵＣＵＣＡＡＵＣＧＵＣＣＡＧＡＡＡＡＣＵＣＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＵＧＧＡＡＵＵＧＡＡＧＡＧＧＡＵＵＣＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＧＣＣＧＧＡＵＵＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＣＣＣＧＧＡＵＵＵＣＧＧＵＧＡＵＵＵＣＡＡＣＣＧＧＡＣＣＵＡＣＡＣＵＵＣＡＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＵＣＣＧＵＧＣＵＣＡＡＣＣＵＣＡＵＧＡＣＧＣＡＵＵＣＧＧＵＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＵＵＣＡＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＵＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＧＵＧＵＣＡＣＵＵＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡＵＵＵＧＡＣＵＧＡＡＣＵＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＣＣＧＵＡＧＧＣＵＵＵＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＵＣＡＡＵＧＡＡＧＡＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＵＵＵＧＡＵＧＡＣＡＵＧＧＡＡＵＣＡＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＡＣＡＡＣＧＵＧＧＡＡＣＡＣＡＵＡＣＵＵＧＣＧＵＵＡＣＡＵＣＡＣＧＧＵＧＣＡＣＡＡＧＵＣＣＵＵＧＡＵＵＵＵＣＧＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＧＵＧＵＣＵＣＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＵＣＧＣＵＧＡＧＧＵＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＣＵＵＧＵＧＧＵＣＣＵＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＧＧＵＡＡＵＡＣＧＣＣＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＵＵＣＵＡＣＡＣＡＣＵＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＡＵＧＣＣＧＵＧＡＵＵＡＵＣＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡＧＣＵＣＧＵＡＵＵＡＣＧＵＧＵＵＵＵＡＣＡＵＣＵＡＣＧＵＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＡＣＡＣＵＣＵＧＣＵＣＧＣＧＡＵＧＧＧＵＵＵＣＵＵＣＣＧＡＧＧＡＣＵＣＣＣＡＣＵＣＧＵＵＣＡＣＡＣＧＣＵＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＵＣＣＡＡＧＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡＵＡＡＧＡＵＧＣＵＵＣＡＵＡＧＣＧＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＵＣＣＣＡＵＧＵＣＣＡＣＣＵＵＧＡＡＵＡＣＧＣＵＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＧＡＵＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＧＡＣＣＵＵＣＵＧＣＣＣＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＵＣＧＡＣＵＵＣＡＵＣＣＡＧＵＵＧＵＵＧＣＵＧＡＵＣＧＵＧＡＵＵＧＧＧＧＣＵＡＵＵＧＣＡＧＵＡＧＵＣＧＣＵＧＵＣＣＵＣＣＡＧＣＣＵＵＡＣＡＵＵＵＵＵＧＵＣＧＣＧＡＣＣＧＵＵＣＣＧＧＵＧＡＵＣＧＵＧＧＣＧＵＵＵＡＵＣＡＵＧＣＵＧＣＧＧＧＣＣＵＡＵＵＵＣＵＵＧＣＡＧＡＣＧＵＣＡＣＡＧＣＡＧＣＵＵＡＡＧＣＡＡＣＵＧＧＡＧＵＣＵＧＡＡＧＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＵＡＵＣＵＵＵＡＣＧＣＡＵＣＵＵＧＵＧＡＣＣＡＧＵＵＵＧＡＡＧＧＧＡＵＵＧＵＧＧＡＣＧＵＵＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＵＡＣＵＵＵＧＡＡＡＣＡＣＵＧＵＵＣＣＡＣＡＡＡＧＣＧＣＵＧＡＡＵＣＵＣＣＡＵＡＣＧＧＣＡＡＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＵＡＵＵＵＧＡＧＵＡＣＣＣＵＣＣＧＡＵＧＧＵＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＣＡＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＵＧＡＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＣＧＣＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵＣＵＵＧＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＵＣＧＧＵＡＵＵＡＵＣＣＵＧＡＣＡＣＵＣＧＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＵＡＵＧＡＧＣＡＣＵＵＵＧＣＡＧＵＧＧＧＣＡＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＧＡＵＵＧＡＵＧＵＧＧＡＵＡＧＣＣＵＧＡＵＧＡＧＧＵＣＣＧＵＵＵＣＧＡＧＧＧＵＣＵＵＵＡＡＧＵＵＣＡＵＣＧＡＣＡＵＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＡＧＵＡＣＧＡＡＡＣＣＣＵＡＵＡＡＧＡＡＵＧＧＧＣＡＡＵＵＧＡＧＵＡＡＧＧＵＡＡＵＧＡＵＣＡＵＣＧＡＧＡＡＣＡＧＵＣＡＣＧＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＵＧＡＣＡＵＣＵＧＧＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＣＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＧＣＡＡＵＣＣＵＵＧＡＡＡＡＣＡＵＣＵＣＧＵＵＣＡＧＣＡＵＵＡＧＣＣＣＣＧＧＵＣＡＧＣＧＵＧＵＧＧＧＧＵＵＧＣＵＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＵＣＡＧＧＡＡＡＡＵＣＧＡＣＧＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＣＣＵＵＣＵＵＧＡＧＡＣＵＵＣＵＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＧＧＵＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＣＧＧＣＧＵＵＵＣＧＵＧＧＧＡＵＡＧＣＡＵＣＡＣＣＵＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＵＵＵＧＧＡＧＵＡＡＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＵＣＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＣＧＧＡＡＣＣＵＵＣＣＧＡＡＡＧＡＡＵＣＵＣＧＡＵＣＣＵＵＡＵＧＡＡＣＡＧＵＧＧＵＣＡＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＵＵＵＧＧＡＡＡＧＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡＧＧＵＵＧＧＣＣＵＵＣＧＧＡＧＵＧＵＡＡＵＣＧＡＧＣＡＧＵＵＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＵＣＣＵＵＧＵＡＧＡＵＧＧＧＧＧＡＵＧＣＧＵＣＣＵＧＵＣＧＣＡＵＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＡＵＧＵＧＣＣＵＧＧＣＧＣＧＡＵＣＣＧＵＣＣＵＣＵＣＵＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＵＧＧＡＵＧＡＡＣＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＧＵＡＡＣＧＵＡＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＵＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＵＵＵＧＣＣＧＡＣＵＧＣＡＣＧＧＵＧＡＵＵＣＵＣＵＧＵＧＡＧＣＡＵＣＧＵＡＵＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＣＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＵＵＧＵＣＡＵＣＧＡＡＧＡＧＡＡＵＡＡＧＧＵＣＣＧＣＣＡＧＵＡＣＧＡＣＵＣＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡＵＧＡＧＡＧＡＵＣＡＵＵＧＵＵＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＡＵＵＵＣＡＣＣＡＵＣＣＧＡＵＡＧＧＧＵＧＡＡＡＣＵＵＵＵＵＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＣＧＵＣＧＡＡＧＵＧＣＡＡＧＵＣＣＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＵＣＧＣＧＧＣＣＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣＧＵＣＵＵＵＡＡ（配列番号１）

例示的なコドン最適化された蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）のｍＲＮＡ
構築物の設計：
Ｘ_１−配列番号２−Ｙ_１
ＡＵＧＧＡＡＧＡＵＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＡＣＣＣＡＣＵＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＣＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＧＣＣＵＵＵＡＣＣＧＡＣＧＣＡＣＡＵＡＵＣＧＡＧＧＵＧＧＡＣＡＵＵＡＣＣＵＡＣＧＣＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＧＡＵＧＡＧＣＧＵＵＣＧＧＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＡＡＧＣＧＣＵＡＵＧＧＧＣＵＧＡＡＵＡＣＡＡＡＣＣＡＵＣＧＧＡＵＣＧＵＧＧＵＧＵＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＵＡＧＣＵＵＧＣＡＧＵＵＣＵＵＣＡＵＧＣＣＣＧＵＧＵＵＧＧＧＵＧＣＣＣＵＧＵＵＣＡＵＣＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＣＣＣＡＧＣＵＡＡＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＡＵＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＵＣＧＵＡＵＵＣＧＵＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＵＧＣＡＡＡＡＧＡＵＣＣＵＣＡＡＣＧＵＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＵＡＣＣＧＡＵＣＡＵＡＣＡＡＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＵＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＣＡＡＡＧＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＵＵＣＧＵＧＡＣＵＵＣＣＣＡＵＵＵＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＣＵＵＣＧＵＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＵＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＧＵＡＧＵＧＧＣＡＧＵＡＣＣＧＧＡＵＵＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＵＡＧＣＣＣＵＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＣＵＵＧＵＧＵＣＣＧＡＵＵＣＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＧＣＧＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＡＵＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＵＡＵＣＣＵＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＣＡＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＡＵＧＵＵＣＡＣＣＡＣＧＣＵＧＧＧＣＵＡＣＵＵＧＡＵＣＵＧＣＧＧＣＵＵＵＣＧＧＧＵＣＧＵＧＣＵＣＡＵＧＵＡＣＣＧＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＵＡＵＵＣＵＵＧＣＧＣＡＧＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＧＡＵＵＣＡＡＵＣＵＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＣＡＣＡＣＵＡＵＵＵＡＧＣＵＵＣＵＵＣＧＣＵＡＡＧＡＧＣＡＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＣＵＡＡＧＣＡＡＣＵＵＧＣＡＣＧＡＧＡＵＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＣＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＵＡＧＧＵＧＡＧＧＣＣＧＵＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＵＵＣＣＡＣＣＵＡＣＣＡＧＧＣＡＵＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＣＵＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＵＵＣＵＧＡＵＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＧＣＧＣＡＧＵＡＧＧＣＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＣＣＵＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＵＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＵＵＧＧＡＣＡＣＣＧＧＵＡＡＧＡＣＡＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＧＣＣＣＣＡＵＧＡＵＣＡＵＧＡＧＣＧＧＣＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣＵＡＣＡＡＡＣＧＣＵＣＵＣＡＵＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＵＧＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＡＵＣＡＡＡＵＡＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＵＧＧＡＧＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＵＣＵＵＣＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＵＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＡＣＧＧＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＣＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＣＧＧＵＧＧＵＧＵＵＧＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＣＣＵＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＵＵＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＧＡＧＡＵＵＣＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＡＵＣＧＣＣＧＵＧＵＡＡ（配列番号２）

例示的なコドン最適化されたヒトアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）のｍＲＮＡ
構築物の設計：
Ｘ_１−配列番号３−Ｙ_２
ＡＵＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＵＧＣＡＵＣＣＵＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＡＣＧＵＧＡＵＣＧＣＣＵＡＣＣＵＧＧＣＣＡＡＣＡＵＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＵＧＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＵＧＵＡＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＵＡＣＣＵＧＣＵＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＵＧＧＡＧＡＵＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＵＡＣＧＵＧＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＧＵＧＣＧＣＵＵＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＡＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＵＣＧＣＣＣＣＣＵＧＧＣＧＣＡＵＧＣＣＣＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＡＣＣＵＧＡＵＧＧＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＵＣＣＣＣＡＵＣＣＣＣＧＵＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＧＣＡＣＡＵＣＡＧＣＵＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＵＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣＧＵＧＡＡＧＧＵＧＡＣＣＡＡＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＧＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＵＣＧＧＣＡＵＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＵＣＵＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＧＡＧＧＣＣＵＵＣＡＣＣＡＵＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＵＧＵＡＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＵＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＵＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＣＧＣＣＡＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＧＵＧＡＧＣＧＵＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＵＧＵＡＣＡＵＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＵＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＡＧＣＡＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＡＵＣＡＡＣＡＧＣＣＵＧＣＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＣＣＡＣＣＧＣＣＵＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＵＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＵＧＡ（配列番号３）

５’及び３’のＵＴＲ配列
Ｘ_１＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ（配列番号４）
Ｙ_１＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ（配列番号５）
Ｙ_２＝
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ（配列番号６）

ｍＲＮＡの合成
以下の各実施例において、ｍＲＮＡの合成はＲＮＡｓｅが完全に無い状態で行われた。すべての試験管、バイアル、ピペットチップ、ピペット、緩衝液等は別段の明示が無い限り、ヌクレアーゼ不含有であることが必要であった。

以下の実施例において、別段の表示がない限り、ｍＲＮＡは直線型ＤＮＡ鋳型からｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写を介して合成された。所望されるｍＲＮＡ前駆体（ＩＶＴ）構築物を作製するために、約８ｍｇの直線型ＤＮＡ、ｒＮＴＰ（７．２５ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、及び反応緩衝液（１０ｘで、８００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭのスペルミジン、２５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．７）の混合物を、ＲＮａｓｅが含まれていない水を用いて調製し、最終体積を１８０ｍＬとした。反応混合物を２０分〜６０分の間の時間幅で、３７℃でインキュベートする。終了した時点で、当該混合物をＤＮａｓｅＩでさらに１５分間処理し、適切にクエンチする。

５’キャップ及び３’テールの付加
上記のＩＶＴステップからの精製ｍＲＮＡ産物（及び場合によって同様に最初のＴＦＦろ過物）を１０分間、６５℃で変性させた。別個に、ある分量のＧＴＰ（１．０ｍＭ）、Ｓ−アデノシルメチオニン、ＲＮＡｓｅ阻害剤、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、及びグアニリルトランスフェラーゼを反応緩衝液（１０ｘで、５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２）とともに混合し、最終濃度は１．６Ｌとする。変性が行われた時点で、ｍＲＮＡを氷上で冷却させ、次いで当該反応混合物へ加えた。混合溶液を３７℃で２５〜９０分の間の時間幅でインキュベートした。完了後、ＡＴＰ（２．０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼ、及びテール付加反応緩衝液（１０ｘで、５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ_２）のアリコートを添加し、総反応混合物をさらに３７℃、２０〜４５分の間の時間幅でインキュベートした。完了後、最終反応混合物をクエンチし、適切に精製した。

ｍＲＮＡの精製
ｍＲＮＡの精製
メッセンジャーＲＮＡは様々な方法を用いて沈殿させることができる。たとえば塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及び他の塩の使用により、反応混合物からｍＲＮＡが効率的に沈殿される。

タンジェンシャルフローろ過
以下の実施例において、他で別段の表記が無い限り、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）系は、ろ過膜及び蠕動ポンプ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｙｓｔｅｍ社）から構成され、膜を通過する液体のタンジェンシャル循環は約１３０ｍＬ／分の供給速度であり、透過に対する流速は３０ｍＬ／分であった。使用されたＴＦＦ膜は、ＭｉｄｉＫｒｏｓ ５００ｋＤａ ｍＰＥＳ １１５ｃｍ^２（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社）であった。使用前に、フィルターカートリッジはヌクレアーゼが含まれていない水を用いて洗浄され、さらに０．２ＮのＮａＯＨを用いて清浄化された。最終的に当該系は、透過物及び残留物のｐＨが約ｐＨ６に達するまでヌクレアーゼが含まれていない水を用いて清浄化された。ＴＦＦを介したｍＲＮＡの単離は図１に記載されるように行うことができる。

蛍ルシフェラーゼｍＲＮＡの精製
ｍＲＮＡ精製の代表的な例として、１グラムのバッチの蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて転写し、キャップ及びポリＡテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約１８０ｍＬを維持し、完了した時点でＤＮＡｓｅＩ（約９．０ＫＵ）を添加することによりクエンチされた。得られた溶液は４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの均一な溶液（１５００ｍＬ）を用いて処理され、総量は１．６８Ｌとした。得られた混合物は約５分間、大気温度中に置かれ、次いで１．１Ｌの無水エタノールでさらに処理された。ｍＲＮＡはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約５分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通した。

本実施例において、２６００ｃｍ^２の表面積を有する修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜が用いられた。得られた不均一混合物（沈殿後）は、小分けされ、７５０ｍＬ／分の流速でおよそ８分間、フィルターシステムにポンプで通された。完了した時点で、得られた捕捉沈殿物を、グアニジニウム緩衝液／エタノール混合緩衝液、次いで８０％エタノール（５００ｍＬ、７５０ｍＬ／分）を用いてすすぎ、これを複数回（５回超）繰り返した。洗浄が完了した時点で、膜に分散されたｍＲＮＡ固体物を、ＲＮＡｓｅが含まれていない水（２５０ｍＬ）を用いて処理し、確実に溶解させるために５〜１０分かけて再循環させた。この工程は、回収されるｍＲＮＡが無くなるまで繰り返された。完了した時点で、１ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）とともに１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いて得られたｍＲＮＡ溶液をさらに透析し、すべての残留エタノールを除去し、適切な保管用溶液中に最終ｍＲＮＡ産物を得た。最終濃度は、２６０ｎｍ（λ_ｍａｘ）での吸光度により測定された。メッセンジャーＲＮＡの純度はＵＶ吸光度（２６０／２８０の比）ならびにタンパク質ゲル（銀染色、ＳＹＰＲＯ染色、クマシン等）により測定された。メッセンジャーＲＮＡの完全性はゲル電気泳動ならびにタンパク質産物のｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ解析により測定された。

ＡＳＳ１ ｍＲＮＡの精製
ｍＲＮＡ精製の第二の代表例として、１グラムのバッチのＡＳＳ１ ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて転写し、キャップ及びポリＡテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約１８０ｍＬを維持し、完了した時点でＤＮＡｓｅＩ（約９．０ＫＵ）を添加することによりクエンチされた。得られた溶液を４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの均一な溶液（１５００ｍＬ）を用いて処理し、総量は１．６８Ｌとした。得られた混合物は約５分間、大気温度中に置かれ、次いで１．１Ｌの無水エタノールでさらに処理された。メッセンジャーＲＮＡはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約５分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通し、上述のように単離した。

ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの精製
ｍＲＮＡ精製の第三の代表例として、１．５グラムのバッチの修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて転写し、キャップ及びポリＡテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約２７０ｍＬを維持し、完了した時点でＤＮＡｓｅＩ（約１３．５ＫＵ）を添加することによりクエンチされた。得られた溶液を４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの均一な溶液（１５００ｍＬ）を用いて処理し、総量は１．７７Ｌとした。得られた混合物は約５分間、大気温度中に置かれ、次いで１．１Ｌの無水エタノールでさらに処理された。ｍＲＮＡはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約５分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通し、上述のように単離した。

実施例２．精製されたｍＲＮＡの解析
精製されたｍＲＮＡ中の酵素の存在に関する検証
ＳＹＰＲＯ染色ゲル
標準的なＳＹＰＲＯ染色タンパク質ゲルを行い、精製の前後に存在するすべての残留試薬酵素の有無を測定した。ゲルは３５分間、２００Ｖで泳動された。

銀染色ゲル
すべてのｍＲＮＡバッチ及び分画の銀染色は、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号ＬＣ６０７０）を用いて、メーカーのプロトコールを使用し行われた。簡潔に述べると、試料を負荷し（ＲＮＡｓｅの処理有り、またはなし）、負荷された酵素対照のレーンと比較しながらモニターされた。ゲルは３５分間、２００Ｖで泳動された。露出時間は８分間、割り当てられた。

アガロースゲル電気泳動解析を用いたｍＲＮＡの完全性の評価
別段の表記が無い限り、ｍＲＮＡのサイズ及び完全性は、ゲル電気泳動を用いて評価された。自分達で注ぎ作製した１．０％のアガロースゲル、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＥ−Ｇｅｌプレキャスト１．２％アガロースゲルのいずれかを用いた。メッセンジャーＲＮＡはウェル当たり１．０〜１．５μｇの量で負荷した。完了した時点で、ｍＲＮＡのバンドはエチジウムブロミドを用いて可視化させた。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ完全性の解析
別段の記載がない限り、蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）のｍＲＮＡ、及びＣＦＴＲのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて行われた。１マイクログラムの各ｍＲＮＡ構築物のトランスフェクションは、リポフェクタミンを用いて別々のウェル中で行われた。細胞は、選択時点（たとえば４時間、８時間等）で回収され、各タンパク質産物が解析された。ＦＦＬ ｍＲＮＡに対しては、生物発光アッセイ法を用いて、細胞溶解物がルシフェラーゼ産生に関し解析された。ＡＳＳ１ ｍＲＮＡに対しては、ＥＬＩＳＡアッセイ法を用いて、細胞溶解物がＡＳＳ１産生に関し解析された。ＣＦＴＲ ｍＲＮＡに対しては、ウェスタンブロット法を用いて、細胞溶解物がＣＦＴＲ産生に関し解析された。

ルシフェラーゼアッセイ
Ｐｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（商品番号Ｅ１５００）を用いて生物発光アッセイ法が行われた。ルシフェラーゼアッセイ試薬は、１０ｍＬのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に加え、ボルテックスにより混合することにより調製された。２０μＬの均一な試料を９６ウェルプレート上に負荷し、次いで２０μＬの各試料に対するプレート対照を負荷した。それとは別に、１２０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（上述のように調製）を９６ウェルの平底プレートの各ウェルに負荷した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＦｌｅｘ Ｓｔａｔｉｏｎ装置を用いて適切なチャンバーに各プレートを挿入し、発光量を相対発光量（ＲＬＵ）にて測定した。

ＡＳＳ１ ＥＬＩＳＡアッセイ
続いて標準的なＥＬＩＳＡ法を、捕捉抗体としてマウス抗ＡＳＳ１ ２Ｄ１−２Ｅ１２
ＩｇＧを、二次（検出）抗体としてウサギ抗ＡＳＳ１ ＃３２８５ ＩｇＧ（Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ社）を用いて行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性化のために用いた。２０分後、反応は２ＮのＨ_２ＳＯ_４を用いてクエンチされた。検出はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ装置上で吸光（４５０ｎｍ）によりモニターされた。未処理のマウス血清及び器官、ならびにヒトＡＳＳ１タンパク質を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として用いた。

ＣＦＴＲのウェスタンブロット解析
ウェスタンブロットは免疫沈降法（ＤｙｎａｂｅａｄｓＧ）を用いて得られたタンパク質試料上で行われた。概略すると、細胞及び組織のホモジネートを処理し、抗ヒトＣＦＴＲ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ２５０３１）に前もって結合されたＤｙｎａｂｅａｄ Ｇを用いて処理した。ヒトＣＦＴＲタンパク質の検出はＡｂ５７０を用いて行われた。

実施例３．精製結果
本実施例は、沈殿後にタンジェンシャルフローろ過を用いることにより、酵素試薬ならびにショートマーが除去され、蛍ルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ、及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡの精製が成功したことを示す。多くの典型的なカオトロピック条件の使用に成功し、上記に列記されるｍＲＮＡを沈殿させた。

この成功を示すために、修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ ＩＶＴ反応混合物の大規模産物（約１グラム）を、４Ｍのグアニジニウム緩衝液（上述）に供した。得られた混合物を、次いで、無水エタノールで処理し、室温で５分間インキュベートした。沈殿したｍＲＮＡの単離は上述のＴＦＦにより得られた。図２は銀染色されたタンパク質ゲルを表し、得られたｍＲＮＡは、上述の条件を用いたＴＦＦ後に単離されたことを示す。完了時点で検出可能な酵素（Ｔ７ ポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ＲＮＡｓｅ阻害剤）は存在しなかった。レーン１〜３は、溶離１（Ｅ１）、溶離２（Ｅ２）、及び溶離３（Ｅ３）後の修飾ＣＦＴＲであった。レーン４〜７はＩＶＴ反応中に存在する対照酵素であった。図３は銀染色タンパク質ゲルを表しており、より大きな規模（１．５グラムバッチ）の沈殿及びろ過工程から得られた純粋なｍＲＮＡに残留酵素が無いことを示す。レーン１〜６は溶離１〜６後のｍＲＮＡであった。レーン７〜１０はＩＶＴ反応中に存在する対照酵素（Ｔ７ ポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ＲＮＡｓｅ阻害剤及びピロホスファターゼ）であった。図４は、修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡがかかる精製後に全く損なわれていないことを示す。図４は沈殿及びろ過による精製後の修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡのアガロース（１．０％）ゲル電気泳動の結果を示すものである。レーン１はＲｉｂｏＲｕｌｅｒ ＨＲラダーであった。レーン２〜７は沈殿後のろ過により精製された修飾ＣＦＴＲ ｍＲＮＡであった。

この工程は複数の異なるｍＲＮＡ構築物に広く適用可能である。たとえば第二のｍＲＮＡ構築物を合成し、本方法を用いて精製した。この例において、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡが作製され、上述の方法を用いて沈殿された。固形沈殿物はＴＦＦ系に負荷され、記載される工程に従い単離された。図５は得られたＡＳＳ１ ｍＲＮＡの銀染色解析を表しており、残留酵素（Ｔ７ ポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ）が存在しないことを示す。レーン１〜５は溶離１〜５後のｍＲＮＡであった。レーン６〜９はＩＶＴ反応中に存在する対照酵素であった。ｍＲＮＡ試料が負荷される前にＲＮＡｓｅＡで前処理されていたので、レーン１０は対照としてＲＮａｓｅＡを含んでいた。図５に示されるように、銀染色発色に広範にさらされた後、酵素は存在しなかったことが示された。これは、図６に示されるように、残留酵素に対するＳＹＰＲＯ染色を用いてさらに確認された。本方法を用いることにより、本工程を用いて単離されたＡＳＳ１ ｍＲＮＡの純度を再度示すことができる。レーン１〜５は溶離１〜５後のｍＲＮＡであった。レーン６〜９はＩＶＴ反応中に存在した対照酵素であった。これに加え、ＲＮＡゲル電気泳動は、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡの完全性が維持されており、この工程後も全長ＡＳＳ１ ｍＲＮＡは完全に損なわれていないことを示した（図７）。図７において、レーン１はＲｉｂｏＲｕｌｅｒ ＨＲラダーを含み、レーン２〜６は溶離１〜５後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡを含んだ。

本精製技術が複数の異なるｍＲＮＡ構築物に広く適用可能であることをさらに示すために、ＦＦＬ ｍＲＮＡを合成し、本方法を用いて精製した。ｍＲＮＡは４Ｍのグアニジニウム緩衝液系を用いて沈殿され、ろ過された。図８は、得られた単離ＦＦＬ ｍＲＮＡの銀染色解析を表しており、残留酵素は存在しなかったことを示している。レーン１〜４は、一度の沈殿（ＸＬ１）または二度の沈殿（ＸＬ２）により精製されたＦＦＬ ｍＲＮＡであり、レーン２〜４は第二の沈殿回収からの別の溶離物であった。レーン６〜９はＩＶＴ反応中に存在する対照酵素であった。図８に示されるように、銀染色発色の広範な露出の後でも酵素は存在しなかった。さらに、望まれない残留酵素すべての除去は、一度の沈殿で十分と思われることが理解できるであろう。これは図９に示されるように、残留酵素に対するＳＹＰＲＯ染色によりさらに確認された。本方法を用いることにより、本工程を用いて単離されたＦＦＬ ｍＲＮＡの純度を再度示すことができる。図９において、レーン１〜４は一度の沈殿（ＸＬ１）または二度の沈殿（ＸＬ２）により精製されたＦＦＬ ｍＲＮＡであり、レーン２〜４は第二の沈殿回収からの別の溶離物であった。レーン６〜９はＩＶＴ反応中に存在した対照酵素であった。これに加え、ＲＮＡゲル電気泳動は、ＦＦＬ ｍＲＮＡの完全性が維持されており、この工程後も全長ＦＦＬ ｍＲＮＡは完全に損なわれていないことを示した（図１０）。さらに、ｍＲＮＡは複数回の再沈殿後であっても差が無い。図１０において、レーン１はＲｉｂｏＲｕｌｅｒ ＨＲラダーであり、レーン２〜５は一度の沈殿（ＸＬ１）または二度の沈殿（ＸＬ２）により精製されたＦＦＬ
ｍＲＮＡであった。

この単離ｍＲＮＡをさらにキャップ付加及びテール付加された最終産物とした時点で、ＴＦＦ法をさらに用いて最終標的ｍＲＮＡ精製した。図１１は、沈殿後にタンジェンシャルフローろ過を用いて捕捉及び溶離することにより、純粋な最終ｍＲＮＡ産物を得ることに成功したことを示す。図１１において、レーン１〜３は一度の沈殿で精製されたキャップ／テール反応からのＡＳＳ１ ｍＲＮＡであった（Ｅ１〜３＝溶離１〜３）。レーン４〜６は両反応ステップ中に存在する主要な対照酵素であった。レーン７は、ｍＲＮＡ試料が負荷前にＲＮＡｓｅＩを用いて前処理されていたので、ＲＮａｓｅＩ対照を含んだ。これに加え、ＲＮＡゲル電気泳動より、ＦＦＬ ｍＲＮＡの完全性が、この工程の後でも全長ＦＦＬ ｍＲＮＡが全く損なわれていないことが示された（図１２）。図１２において、レーン１〜３はキャップ付加及びテール付加されたＡＳＳ１ ｍＲＮＡであった。

かかる特徴解析により純度及びｍＲＮＡのサイズ／完全性に関する情報が得られる一方で、ｍＲＮＡの質の真の評価基準は、所望されるタンパク質を産生するその能力のうちにある。ゆえに、単離されたＦＦＬ ｍＲＮＡ構築物の各々の比較（ＴＦＦとスピンカラム）が行われた。以下に列記される３つの構築物の各々をＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトし、対応するＦＦＬタンパク質の産生を、ルシフェリンに曝露された際のＦＦＬ発光の形式でのＦＦＬタンパク質活性により評価した（上記参照）。細胞はトランスフェクト後２４時間で回収された。
ＦＦＬ構築物：
１．外部供給業者から購入したＦＦＬ ｍＲＮＡ
２．市販キットで精製したＦＦＬ ｍＲＮＡ
３．沈殿−ＴＦＦ法で精製したＦＦＬ ｍＲＮＡ

各々から産生されたＦＦＬタンパク質の発光量の比較を図１３に表す。ＴＦＦ−精製されたＦＦＬ ｍＲＮＡの完全性は、記載される条件下の沈殿及びタンジェンシャルフローろ過の工程を通じて維持されていた。

さらに、ヒトＣＦＴＲタンパク質検出の成功は、上記の工程を用いて単離されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションから達成された。図１４において、市販キットまたは上記のＴＦＦ−ベースの沈殿法のいずれかにより精製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、ヒトＣＦＴＲタンパク質の産生が成功したことを示す。適切に輸送された全長ＣＦＴＲタンパク質の指標である、ＣＦＴＲタンパク質に対するこの「Ｃ−バンド」の可視化により、かかる条件により単離されたｍＲＮＡの完全性及び活性状態が十分に支持される。この工程はさらに容易に拡張可能である。たとえば別のｍＲＮＡ構築物を合成し、本方法を用いて５グラムの規模で精製した。この例において、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡが産生され、上述の方法を用いて沈殿された。固形沈殿物をＴＦＦ系上に負荷し、記載される工程に従い単離した。

製造されたｍＲＮＡ薬剤物質の完全性は２つの別々の方法を用いて示された。図１５は提示された方法に従い精製及びろ過されたアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）試料からの典型的なｍＲＮＡの長さを示す。ｍＲＮＡの長さはアガロースゲル−オン−チップ−電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により示された。ＩＶＴ前駆物質ならびにキャップ付加及びテール付加最終構築物の両方に対し、損なわれていない、全長のｍＲＮＡがゲル電気泳動を用いて確認された（図１６）。大規模（５グラム）沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡに関し、充分な完全性が保持されていた。

従前に示されたように、図１７は、沈殿後のタンジェンシャルフローろ過を用いた捕捉及び溶離により、純粋な最終ｍＲＮＡ産物の作製に成功したことを示す。レーン１は一度の沈殿で精製されたキャップ／テール反応からのＡＳＳ１ ｍＲＮＡであった。レーン２〜８は両反応ステップ中に存在する主要な対照酵素であった。レーン９は、ｍＲＮＡ試料が負荷前にＲＮＡｓｅＩを用いて前処理されていたので、ＲＮａｓｅＩ対照を含んだ。かかる銀染色法により、残留酵素が存在しないことが示される。

かかる特徴解析により純度及びｍＲＮＡのサイズ／完全性に関する情報が得られる一方で、ｍＲＮＡの質の真の評価基準は、所望されるタンパク質を産生するその能力のうちにある。ゆえに、単離されたＡＳＳ１ ｍＲＮＡ構築物の比較（ＴＦＦとスピンカラム）が行われた（図１８）。以下に列記される構築物の各々をＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトし、対応するＡＳＳ１タンパク質の産生を、ＥＬＩＳＡ法により評価した。細胞はトランスフェクト後、約１８時間で回収された。

拡張性のさらなる証拠は、本方法を用いた１０グラム規模でのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの合成及び精製を用いて得られた。この例において、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡが産生され、上述の方法を用いて沈殿された。固形沈殿物をＴＦＦ系上に負荷し、記載される工程に従い単離した。製造されたｍＲＮＡ薬剤物質の完全性はアガロースゲル電気泳動を用いて示された。損なわれていない全長ｍＲＮＡが、ＩＶＴ前駆物質ならびにキャップ付加及びテール付加最終構築物の両方に対して確認された（図１９）。大規模（１０Ｇ）沈殿後のＣＦＴＲ ｍＲＮＡに関し、充分な完全性が保持されていた。

１０グラム規模で作製された産物の純度を、図２０に示される銀染色により再度示した。レーン１は一度の沈殿から精製されたキャップ／テール反応からのＣＦＴＲ ｍＲＮＡであった。レーン２〜８は、両反応ステップ中に存在する主要な対照酵素であった。レーン９は、ｍＲＮＡ試料が負荷前にＲＮＡｓｅＩを用いて前処理されていたので、ＲＮａｓｅＩ対照を含んだ。かかる銀染色法により、残留酵素が存在しないことが示される。

かかる特徴解析により純度及びｍＲＮＡのサイズ／完全性に関する情報が得られたが、ｍＲＮＡの質の真の評価基準はさらに、所望されるタンパク質を産生するその能力のうちにある。ゆえに、様々な量のＣＦＴＲ ｍＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトし、対応するＣＦＴＲタンパク質の産生を、ウェスタンブロット法により評価した（図２１）。細胞はトランスフェクト後、約１８時間で回収された。

他の実施形態において、拡張性のさらなる証拠が、本方法を用いて２５グラムの規模で合成及び精製されたＡＳＳ１ ｍＲＮＡにより得られた。この例において、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡが作製され、上述の方法を用いて沈殿された。固形沈殿物をＴＦＦ系上に負荷し、記載される工程に従い単離した。製造されたｍＲＮＡ薬剤物質の完全性はアガロースゲル電気泳動を用いて示された。損なわれていない全長ｍＲＮＡが、大規模（２５グラム）沈殿後のＡＳＳ１ ｍＲＮＡに対し確認された（図２２）。

均等及び範囲
当分野の当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識する、または日常的な実験の範囲を超えずに確認することができるであろう。本発明の範囲は上記の詳細な説明に限定されず、以下の請求項において記載される通りである。

Claims (38)

1. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の大規模精製の方法であって、前記方法は、
   １グラムを超えるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡ及び未完了で中断されたＲＮＡを含む不純調製物を提供すること、
   前記不純調製物を、変性剤を用いて処理すること、
   前記処理された不純調製物から前記ｍＲＮＡを沈殿させること、
   前記沈殿されたｍＲＮＡを含む不均一懸濁液を、前記沈殿されたｍＲＮＡがろ過膜に捕捉されるよう、タンジェンシャルフローろ過に供すること、ならびに
   前記ｍＲＮＡを再可溶化することにより前記膜から前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを溶離し、それにより精製されたｍＲＮＡ溶液を得ること、
   を含み、ここで、
   前記ｍＲＮＡが、嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子タンパク質をコードするコード領域を有する、方法。
2. 前記ｍＲＮＡを沈殿させるステップが、前記不純調製物を、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を含む溶液を用いて処理することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記試薬が、チオシアン酸グアニジニウムである、請求項２に記載の方法。
4. 前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、０．５％のラウリルサルコシルナトリウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する、請求項２に記載の方法。
5. 前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び０．５％のラウリルサルコシルナトリウムを含有する、請求項２に記載の方法。
6. 前記溶液が、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、及び２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する、請求項２に記載の方法。
7. 前記ｍＲＮＡを沈殿させるステップが、無水エタノールを用いて前記不純調製物を処理するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記膜が、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾なし）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル類）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記方法が、溶離の前に前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを洗浄することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記洗浄ステップが、グアニジニウム緩衝液及びエタノールを含有する洗浄溶液、次いで７０〜８０％のエタノールを用いた複数回のすすぎサイクルを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記複数回のすすぎサイクルは、５回より多いサイクルである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記溶離ステップが、ＲＮＡｓｅが含まれていない水を用いて前記捕捉された沈殿ｍＲＮＡを再可溶化することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ＲＮＡｓｅが含まれていない水が、５〜１０分間、再循環される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記方法が、前記精製されたｍＲＮＡ溶液を透析するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を用いて、１ｍＭのクエン酸ナトリウムと透析される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ｍＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成され、前記不純調製物がＩｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成反応混合物を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記不純調製物が未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．５％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１７に記載の方法。
20. 前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、０．１％未満の未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を含有する、請求項１７に記載の方法。
21. 前記精製されたｍＲＮＡ溶液が、未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない、請求項１７に記載の方法。
22. 前記未完了で中断されたＲＮＡ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、銀染色、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、及び／またはキャピラリー電気泳動により測定される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記未完了で中断されたＲＮＡが、１５未満の塩基を含有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記未完了で中断されたＲＮＡが、８〜１２の塩基を含有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成において用いられた酵素試薬が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記ｍＲＮＡが、バッチ当たり１０グラム、１００グラム、１ｋｇ、１０ｋｇ、または１００ｋｇ以上の規模で精製される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加される前に精製される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記ｍＲＮＡが、キャップ及びテールが前記ｍＲＮＡに付加された後に精製される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記ｍＲＮＡが、キャップが付加された後に精製される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記ｍＲＮＡが、キャップ及び／またはテールが前記ｍＲＮＡに付加される前及び後の両方で精製される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ｍＲＮＡが、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上の長さである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記ｍＲＮＡが、安定性を増強させるために１つ以上の修飾を含有する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記１つ以上の修飾が、修飾ヌクレオチド及び／または修飾糖リン酸主鎖を含有する、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ｍＲＮＡが修飾されていない、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記精製されたｍＲＮＡが、９５％以上の完全性を有する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記精製されたｍＲＮＡが、９８％以上の完全性を有する、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記精製されたｍＲＮＡが、９９％以上の完全性を有する、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子タンパク質をコードするコード領域を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の作製方法であって、
    ｉｎ ｖｉｔｒｏで嚢胞性線維症コンダクタンス制御因子タンパク質をコードするコード領域を有するｍＲＮＡを合成すること、及び
    請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法を用いて前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製すること、
    を含む、方法。

Images