JP2015534578A - ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体 - Google Patents
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Abstract
Description
いくつかのピロロベンゾジアゼピン(PBD)には、DNAの特定の配列を認識して結合する能力がある。好ましい配列はPuGPuである。最初のPBD抗腫瘍抗生物質であるアントラマイシンは、1965年に発見された(Leimgruber,外,J.Am.Chem.Soc.,87,5793−5795(1965);Leimgruber,外,J.Am.Chem.Soc.,87,5791−5793(1965))。それ以来、天然に存在する多数のPBDが報告されており、10を超える合成経路が様々なアナログに対して開発されている(Thurston,外,Chem.Rev.1994,433−465(1994);Antonow,D.及びThurston,D.E.,Chem.Rev.2011 111(4),2815−2864)。ファミリー化合物としては、アブベイマイシン(Hochlowski外,J.Antibiotics,40,145−148(1987))、キカマイシン(Konishi外,J.Antibiotics,37,200−206(1984))、DC−81(特開昭58−180487号公報;Thurston外,Chem.Brit.,26,767−772(1990);Bose外,Tetrahedron,48,751−758(1992))、マゼトラマイシン(Kuminoto外,J.Antibiotics,33,665−667(1980))、ネオトラマイシンA及びB(Takeuchi外,J.Antibiotics,29,93−96(1976))、ポロトラマイシン(Tsunakawa,外,J.Antibiotics,41,1366−1373(1988))、プロトラカルシン(Shimizu外,J.Antibiotics,29,2492−2503(1982);Langley及びThurston,J.Org.Chem.,52,91−97(1987))、シバノミシン(DC−102)(Hara外,J.Antibiotics,41,702−704(1988);Itoh外,J.Antibiotics,41,1281−1284(1988))、シビロマイシン(Leber外,J.Am.Chem.Soc.,110,2992−2993(1988))及びトママイシン(Arima外,J.Antibiotics,25,437−444(1972))が挙げられる。PBDは次の一般構造のものである:
癌、免疫疾患及び血管新生障害を有する患者の標的治療のために抗体療法が確立されてきている(Carter,P.(2006)Nature Reviews Immunology 6:343−357)。細胞毒性又は細胞増殖抑制剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を死滅させる又は阻害する薬剤の局所送達のための抗体−薬剤結合体(ADC)、すなわち免疫結合体の使用は、腫瘍への薬剤成分の送達及び細胞内蓄積を標的とするのに対し、これらの非結合薬剤の全身投与は、正常細胞に許容できないレベル毒性をもたらす場合がある(Xie外(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281−291;Kovtun外(2006)Cancer Res.66(6):3214−3121;Law外(2006)Cancer Res.66(4):2328−2337;Wu外(2005)Nature Biotech.23(9):1137−1145;Lambert J.(2005)Current Opin.in Pharmacol.5:543−549;Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents 15(9):1087−1103;Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207−212;Trail外(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328−337;Syrigos及びEpenetos(1999)Anticancer Research 19:605−614)。
本発明の第1の態様は、式L−(DL)pの結合体を含み、ここで、DLは、次式I又はIIである:
Lは以下に定義される抗体(Ab)であり;
C2’とC3’との間に二重結合が存在する場合には、R12は次のものよりなる群から選択され:
(ia)ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、C1~7アルキル、C3~7ヘテロシクリル及びビス−オキシ−C1~3アルキレンよりなる群から選択される1個以上の置換基で置換されていてよいC5~10アリール基;
(ib)C1~5飽和脂肪族アルキル基;
(ic)C3~6飽和シクロアルキル;
(id)
(ie)
(if)
C2’とC3’との間に単結合が存在する場合には、
R12は
R6及びR9は、独立して、H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、ニトロ、Me3Sn及びハロから選択され;
ここで、R及びR’は、独立して、置換されていてよいC1~12アルキル、C3~20ヘテロシクリル及びC5~20アリール基から選択され;
R7’は、H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR’、ニトロ、Me3Sn及びハロから選択され;
R”は、鎖が1個以上のヘテロ原子、例えばO、S、NRN2(ここでRN2は、H又はC1~4アルキルである)及び/又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジンによって中断されていてよいC3~12アルキレン基であり;
Y及びY’は、O、S、又はNHから選択され;
R6’、R7’、R9’は、それぞれR6、R7及びR9と同じ基から選択され;
[式I]
RL1’は、抗体(Ab)への結合のためのリンカーであり;
R11aは、OH、ORA(ここで、RAは、C1~4アルキルである。)及びSOzM(ここで、zは2又は3であり、Mは一価の薬学的に許容される陽イオンである。)から選択され;
R20及びR21は、一緒になって、これらが結合している窒素原子と炭素原子の間に二重結合を形成し;
R20はH及びRCから選択され、ここで、RCはキャッピング基であり;
R21はOH、ORA及びSOzMから選択され;
C2とC3との間に二重結合が存在する場合には、R2は、次のものよりなる群から選択され:
(ia)ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、C1~7アルキル、C3~7ヘテロシクリル及びビス−オキシ−C1~3アルキレンよりなる群から選択される1個以上の置換基で置換されていてよいC5~10アリール基;
(ib)C1~5飽和脂肪族アルキル基;
(ic)C3~6飽和シクロアルキル;
(id)
(ie)
(if)
C2とC3との間に単結合が存在する場合には、
R2は
[式II]
R22は、次式IIIa、次式IIIb又は次式IIIcであり:
(a)
(i)Q1は単結合であり、Q2は単結合及び−Z−(CH2)n−から選択され、ここで、Zは単結合、O、S及びNHから選択され、nは1〜3であり;又は
(ii)Q1は−CH=CH−であり、Q2は単結合である;
(b)
RC1、RC2及びRC3は、独立して、H及び非置換C1~2アルキルから選択され;
(c)
Xは次のものよりなる群から選択され:O−RL2’、S−RL2’、CO2−RL2’、CO−RL2’、NH−C(=O)−RL2’、NHNH−RL2’、CONHNH−RL2’、
RL2’は抗体(Ab)への結合のためのリンカーであり;
R10及びR11は、一緒になって、それらが結合している窒素原子と炭素原子間に二重結合を形成し;又は
R10はHであり、R11はOH、ORA及びSOzMから選択され;
R30及びR31は、一緒になって、それらが結合している窒素原子と炭素原子の間に二重結合を形成し;
R30はHであり、R31はOH、ORA及びSOzMから選択される。
ConjA
ConjB
ConjC:
ConjD
RL1は、抗体(Ab)への結合に好適なリンカーであり;
R22Lは、次の式IIIaL、式IIIbL又は式IIIcLのものであり;
(a)
(b)
(c)
XLは、次のものよりなる群から選択され:O−RL2、S−RL2、CO2−RL2、CO−RL2、N=C=O−RL2、NHNH−RL2、CONHNH−RL2、
RL2は、抗体(Ab)への結合に好適なリンカーであり;
残りの全て基は、第1の態様において定義したとおりである。
A:
本発明は、被験体における好ましい部位にPBD化合物を与えるのに使用するために好適である。この結合体は、リンカーの任意の部宇分を保持していない活性なPBDの化合物の放出を可能にする。PBDの化合物の反応性に影響を与える可能性がある断片は存在しない。したがってConjAは、次の化合物RelAを放出するであろう:
一態様では、抗体は、CD19に結合する抗体であり、該抗体は、配列番号1、2、3、4、5又は6のいずれかの配列を有するVHドメインを含む。
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号1;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号2;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号3;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号4;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号5;及び
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号6。例えば、配列番号7と対になった配列番号1、配列番号8と対になった配列番号2、配列番号9と対になった配列番号3、配列番号10と対になった配列番号4、配列番号11と対になった配列番号5又は配列番号12と対になった配列番号6である。
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号1;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号2;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号3;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号4;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号5;及び
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号6。例えば、配列番号7と対になった配列番号1、配列番号8と対になった配列番号2、配列番号9と対になった配列番号3、配列番号10と対になった配列番号4、配列番号11と対になった配列番号5又は配列番号12と対になった配列番号6である。
ここで、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、かつ、所望の生物学的活性、例えばCD19結合能を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、そのままの抗体及び抗体断片をカバーする(Miller外(2003)Jour.of Immunology 170:4854−4861)。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、又は他の種に由来することができる。抗体とは、特定の抗原を認識し、そしてそれに結合することのできる免疫系によって生成されるタンパク質のことである。(Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)Immuno Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。標的抗原は、一般に、複数の抗体上のCDRによって認識される多数の結合部位(エピトープとも呼ばれる)を有する。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は異なる構造を有する。したがって、一つの抗原は、複数の対応する抗体を有することができる。抗体は、全長免疫グロブリン分子又は全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、標的の抗原又はその部分に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、このような標的としては、自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する1種以上の癌細胞細胞が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の型(例えばIgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)若しくはサブクラス、又はアロタイプ(例えば、ヒトG1m1、G1m2、G1m3、非G1m1[すなわちG1m1以外の任意のアロタイプ]、G1m17、G2m23、G3m21、G3m28、G3m11、G3m5、G3m13、G3m14、G3m10、G3m15、G3m16、G3m6、G3m24、G3m26、G3m27、A2m1、A2m2、Km1、Km2及びKm3)のものであることができる。免疫グロブリンは、ヒト、マウス、又はウサギ起源を含めて任意の種に由来できる。
ここで開示される抗体を修飾して、例えば、これらをヒト被験体に対して免疫原性を少なくすることができる。これは、当業者によく知られた技術のいずれかを使用して達成できる。これらの技術のいくつかは、以下でより詳細に説明する。
非ヒト抗体又は抗体フラグメントの生体内免疫原性を低減させるための技術としては、「ヒト化」と呼ばれるものが挙げられる。
この技術では、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特性を有するマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギ又はウサギなどの非ヒト種のCDR(ドナー抗体)からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である(実際には、非ヒトCDRは、ヒトフレームワーク上に「グラフト」される)。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基で置換されている(これは、例えば、特定のFR残基が抗原結合に有意な効果を及ぼす場合に生じる可能性がある)。
この方法は、特定のエピトープに特異的な所定の非ヒト抗体のVH又はVLドメインとヒトVH又はVLライブラリーとを組み合わせることからなり、特異的ヒトVドメインは、目的の抗原に対して選択される。その後、この選択されたヒトVHをVLライブラリーと組み合わせて、完全にヒトのVHxVLの組み合わせを生成する。この方法は、Nature Biotechnology(N.Y.)12,(1994)899−903に記載されている。
この方法では、ヒト抗体のアミノ酸配列の2以上のセグメントを最終抗体分子内で組み合わせる。これらは、複数のヒトVH及びVL配列セグメントを、最終複合抗体のV領域中におけるヒトT細胞エピトープを制限又は回避する組み合わせで組み合わせることによって構築される。必要な場合には、T細胞エピトープは、T細胞エピトープに貢献する又はこれをコードするV領域セグメントを、T細胞エピトープを回避する別のセグメントに置換することによって制限又は回避される。この方法は、US2008/0206239 A1に記載されている。
この方法は、治療用抗体(又は他の分子)のV領域からヒト(又は他の第2種)T細胞エピトープを除去することを含む。治療用抗体V領域配列は、例えば、MHC結合モチーフのデータベースとの比較により、MHCクラスII−結合モチーフの存在について分析される(例えばwww.wehi.edu.auでホストされる「モチーフ」データベース)。あるいは、MHCクラスII−結合モチーフは、Altuvia外(J.Mol.Biol.249 244−250(1995))によって考案されたような 計算スレッド化手法を使用して同定できる;これらの方法では、V領域配列からの連続重複ペプチドを、MHCクラスIIタンパク質への結合エネルギーについて試験する。このデータを、両親媒性、ロスバードモチーフ及びカテプシンBの切断部位並びに他のプロセシング酵素などの正常に提示されるペプチドに関連する他の配列の特徴に関する情報と組み合わせることができる。
この方法は、次のことを含む:
(a)非ヒト抗体可変領域の三次元モデルを構築することによって非ヒト(例えば齧歯類)抗体(又はその断片)の可変領域の立体配座構造を決定すること;
(b)重鎖及び軽鎖フレームワーク位置のセットを与えるように十分な数の非ヒト及びヒト抗体可変領域重鎖及び軽鎖のX線結晶構造からの相対アクセシビリティ分布を使用して配列アラインメントを生成し、その際、アラインメント位置は、該十分な数の非ヒト抗体重鎖及び軽鎖の98%で同一である;
(c)ヒト化される非ヒト抗体について、工程(b)で生成されたフレームワーク位置のセットを使用して重鎖及び軽鎖表面露出アミノ酸残基のセットを定義する;
(D)ヒト抗体アミノ酸配列から、工程(c)で定義された表面露出アミノ酸残基のセットと最も同一性の高い重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基のセットを同定し、ここで、このヒト抗体からの重鎖及び軽鎖は、対になる又は自然には対にならない;
(e)ヒト化される非ヒト抗体のアミノ酸配列において、工程(c)で定義された重鎖及び軽鎖表面露出アミノ酸残基のセットを工程(d)で定義された重鎖及び軽鎖の表面露出アミノ酸残基のセットで置換すること;
(f)工程(e)で特定された置換により得られた非ヒト抗体の可変領域の三次元モデルを構築すること;
(g)工程(a)及び(F)で構築された三次元モデルを比較することにより、ヒト化される非ヒト抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の5Å内にある工程(c)又は(d)で同定されたセットから任意のアミノ酸残基を同定すること;及び
(h)工程(g)で同定された任意の残基をヒトから元の非ヒトアミノ酸残基に変更して、それによって表面露出アミノ酸残基の非ヒト抗体ヒト化セットを定義すること;
ただし工程(a)を最初に実施する必要はないが、工程(g)の前に実施しなければならないことを条件とする。
この方法は、非ヒト配列と機能的ヒト生殖系列遺伝子レパートリーとを比較する。非ヒト配列と同一又は密接に関連する正準構造をコードするヒト遺伝子が選択される。CDR内において最も高い相同性を有する選択されたヒトの遺伝子をFRドナーとして選択する。最後に、非ヒトCDRはこれらのヒトFRにグラフトされる。この方法は、WO2005/079479 A2号に記載されている。
この方法は、非ヒト(例えばマウス)の配列とヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリーとを比較し、それらの差異を、潜在的MHC/T細胞エピトープのレベルで配列を定量するヒトストリングコンテント(HSC)として記録する。標的配列を、グローバルな同一性指標を使用するのではなく、そのHSCを最大化することによってヒト化して複数の多様なヒト化変異体を生成する(Molecular Immunology,44,(2007)1986−1998に記載されている)。
非ヒト抗体のCDRは、全ての既知の重鎖及び軽鎖ヒト生殖細胞系遺伝子フレームワークを包含するcDNAプールにインフレームで融合される。その後、ヒト化抗体は、例えばファージ表示抗体ライブラリーのパニングによって選択される。これは、この方法は、Methods 36,43−60(2005)に記載されている。
薬学的に許容できる陽イオン
薬学的に許容できる1価又は2価の陽イオンの例は、Berge外,J.Pharm.Sci.,66,1−19(1977)に記載されている。この文献を引用によりここに含める。
本明細書で使用するときに、「置換されていてよい」という語句は、非置換であってもよく又は置換されていてもよい親基に関連する。
飽和単環式炭化水素化合物:
シクロプロパン(C3)、シクロブタン(C4)、シクロペンタン(C5)、シクロヘキサン(C6)、シクロヘプタン(C7)、メチルシクロプロパン(C4)、ジメチルシクロプロパン(C5)、メチルシクロブタン(C5)、ジメチルシクロブタン(C6)、メチルシクロペンタン(C6)ジメチルシクロペンタン(C7)、メチルシクロヘキサン(C7);不飽和単環式炭化水素化合物:
シクロプロペン(C3)、シクロブテン(C4)、シクロペンテン(C5)、シクロヘキセン(C6)、メチルシクロプロペン(C4)、ジメチルシクロプロペン(C5)、メチルシクロブテン(C5)、ジメチルシクロブテン(C6)、メチルシクロペンテン(C6)、ジメチルシクロペンテン(C7)及びメチルシクロヘキセン(C7);及び
飽和多環式炭化水素化合物:
ノルカラン(C7)、ノルピナン(C7)、ノルボルナン(C7)。
N1:アジリジン(C3)、アゼチジン(C4)、ピロリジン(テトラヒドロピロール)(C5)、ピロリン(例えば、3−ピロリン、2,5−ジヒドロピロール)(C5)、2H−ピロール又は3H−ピロール(イソピロール、イソアゾール)(C5)、ピペリジン(C6)、ジヒドロピリジン(C6)、テトラヒドロピリジン(C6)、アゼピン(C7);
O1:オキシラン(C3)、オキセタン(C4)、オキソラン(テトラヒドロフラン)(C5)、オキソール(ジヒドロフラン)(C5)、オキサン(テトラヒドロピラン)(C6)、ジヒドロピラン(C6)、ピラン(C6)、オキセピン(C7);
S1:チイラン(C3)、チエタン(C4)、チオラン(テトラヒドロチオフェン)(C5)、チアン(テトラヒドロチオピラン)(C6)、チエパン(C7);
O2:ジオキソラン(C5)、ジオキサン(C6)、及びジオキセパン(C7);
O3:トリオキサン(C6);
N2:イミダゾリジン(C5)、ピラゾリジン(ジアゾリジン)(C5)、イミダゾリン(C5)、ピラゾリン(ジヒドロピラゾール)(C5)、ピペラジン(C6);
N1O1:ヒドロオキサゾール(C5)、ジヒドロオキサゾール(C5)、テトラヒドロイソオキサゾール(C5)、ジヒドロイソオキサゾール(C5)、モルホリン(C6)、テトラヒドロオキサジン(C6)、ジヒドロオキサジン(C6)、オキサジン(C6);
N1S1:チアゾリン(C5)、チアゾリジン(C5)、チオモルホリン(C6);
N2O1:オキサジアジン(C6);
O1S1:オキサチオール(C5)及びオキサチアン(チオキサン)(C6);並びに
N1O1S1:オキサチアジン(C6)。
カルボアリール基の例としては、ベンゼン(すなわちフェニル)(C6)、ナフタレン(C10)、アズレン(C10)、アントラセン(C14)、フェナントレン(C14)、ナフタセン(C18)及びピレン(C16)から誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
N1:ピロール(アゾール)(C5)、ピリジン(アジン)(C6);
O1:フラン(オキソール)(C5);
S1:チオフェン(チオール)(C5);
N1O1:オキサゾール(C5)、イソオキサゾール(C5)、イソオキサジン(C6);
N2O1:オキサジアゾール(フラザン)(C5);
N3O1:オキサトリアゾール(C5);
N1S1:チアゾール(C5)、イソチアゾール(C5);
N2:イミダゾール(1,3−ジアゾール)(C5)、ピラゾール(1,2−ジアゾール)(C5)、ピリダジン(1,2−ジアジン)(C6)、ピリミジン(1,3−ジアジン)(C6)(例えば、シトシン、チミン、ウラシル)、ピラジン(1,4−ジアジン)(C6);
N3:トリアゾール(C5)、トリアジン(C6);及び
N4:テトラゾール(C5)。
次のものから誘導されるC9(2個の縮合環を有する):ベンゾフラン(O1)、イソベンゾフラン(O1)、インドール(N1)、イソインドール(N1)、インドリジン(N1)、インドリン(N1)、イソインドリン(N1)、プリン(N4)(例えば、アデニン、グアニン)ベンズイミダゾール(N2)、インダゾール(N2)、ベンゾオキサゾール(N1O1)、ベンズイソオキサゾール(N1O1)、ベンゾジオキソール(O2)、ベンゾフラザン(N2O1)、ベンゾトリアゾール(N3)、ベンゾチオフラン(S1)、ベンゾチアゾール(N1S1)、ベンゾチアジアゾール(N2S);
次のものから誘導されるC10(2個の縮合環を有する):クロメン(O1)、イソクロメン(O1)、クロマン(O1)、イソクロマン(O1)、ベンゾジオキサン(O2)、キノリン(N1)、イソキノリン(N1)、キノリジン(N1)、ベンゾオキサジン(N1O1)、ベンゾジアジン(N2)、ピリドピリジン(N2)、キノキサリン(N2)、キナゾリン(N2)、シンノリン(N2)、フタラジン(N2)、ナフチリジン(N2)、プテリジン(N4);
ベンゾジアゼピン(N2)から誘導されるC11(2個の縮合環を有する);
カルバゾール(N1)、ジベンゾフラン(O1)、ジベンゾチオフェン(S1)、カルボリン(N2)、ペリミジン(N2)、ピリドインドール(N2)から誘導されるC13(3個の縮合環を有する);及び
次のものから誘導されるC14(3個の縮合環を有する):アクリジン(N1)、キサンテン(O1)、チオキサンテン(S1)、オキサントレン(O2)、フェノキサチイン(O1S1)、フェナジン(N2)、フェノキサジン(N1O1)、フェノチアジン(N1S1)、チアントレン(S2)、フェナントリジン(N1)フェナントロリン(N2)、フェナジン(N2)。
シアナト:−OCN。
C3~12アルキレン:ここで使用するときに、用語「C3~12アルキレン」とは、脂肪族又は脂環式であることができ、かつ、飽和、部分的に不飽和又は完全に不飽和であることができる3〜12個の炭素原子を有する炭化水素化合物(特に断らない限り)の2個の水素原子(両方とも同じ炭素原子からのもの又は2個の異なる炭素原子のいずれかからのもの)を除去することにより得られる二座部分をいう。したがって、「アルキレン」という用語には、以下に説明するサブクラスのアルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレンなどが含まれる。
本発明は、リンカー単位を介して抗体に結合されたPBD化合物を含む結合体を提供する。
−C(=O)NH−、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−、
−OC(=O)NH−、及び
−NHC(=O)NH。
一実施形態では、DはCHである。
一実施形態では、EはO又はSである。
一実施形態では、FはCHである。
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−、
−Val−Cit−、
−Phe−Cit−、
−Leu−Cit−、
−Ile−Cit−、
−Phe−Arg−、
−Trp−Cit−;
ここで、Citはシトルリンである。
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−、
−Val−Cit−。
一実施形態では、リジンなどの側鎖アミノ酸のアミノ基NH2は、NHR及びNRR’よりなる群から選択される誘導体化された形態である。
一実施形態では、アスパラギン酸などの側鎖アミノ酸のカルボキシ基COOHは、COOR、CONH2、CONHR及びCONRR’よりなる群から選択される誘導体化された形態である。
Arg:Z、Mtr、Tos;
Asn:Trt、Xan;
Asp:Bzl、t−Bu;
Cys:Acm、Bzl、Bzl−OMe、Bzl−Me、Trt;
Glu:Bzl、t−Bu;
Gln:Trt、Xan;
His:Boc、Dnp、Tos、Trt;
Lys:Boc、Z−Cl、Fmoc、Z、Alloc;
Ser:Bzl、TBDMS、TBDPS;
Thr:Bz;
Trp:Boc;
Tyr:Bzl、Z、Z−Br。
−C(=O)NH−、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−、
−OC(=O)NH−、
−NHC(=O)NH−、
−C(=O)NHC(=O)−、
−S−、
−S−S−、
−CH2C(=O)−及び
=N−NH−。
基Yは、次のものから選択される官能基であることができる:
−C(=O)−、
−NH−、
−O−、
−C(=O)NH−、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−、
−OC(=O)NH−、
−NHC(=O)NH−、
−NHC(=O)NH、
−C(=O)NHC(=O)−及び
−S−。
−C(=O)NH−、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−,
−OC(=O)NH−及び
−NHC(=O)NH−。
−C(=O)NH−、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−、
−OC(=O)NH−、
−NHC(=O)NH−、
−NHC(=O)NH、
−C(=O)NHC(=O)−、
−S−、
−S−S−、
−CH2C(=O)−、
−C(=O)CH2−、
=N−NH−及び
−NH−N=。
−C(=O)N<、
−C(=O)O−、
−NHC(=O)−、
−OC(=O)−、
−OC(=O)O−、
−NHC(=O)O−、
−OC(=O)N<及び
−NHC(=O)N<、
ここで、N<又はO−はDの一部である。
−C(=O)N<及び
−NHC(=O)−。
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−、
−Val−Cit−、
−Phe−Cit−、
−Leu−Cit−、
−Ile−Cit−、
−Phe−Arg−及び
−Trp−Cit−;
ここで、Citはシトルリンである。このようなジペプチドにおいて、−NH−はX1のアミノ基であり、COはX2のカルボニル基である。
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−及び
−Val−Cit−。
−Gly−Gly−、
−Pro−Pro−及び
−Val−Glu−。
リンカーは、1以上のアミノ酸単位を含むプロテアーゼ切断可能ペプチド部分を含むことができる。ペプチドリンカー試薬は、T−BOC化学(Geiser外「Automation of solid−phase peptide synthesis」,Macromolecular Sequencing and Synthesis,Alan R.Liss,Inc.,1988,pp.199−218)及びFmoc/ HBTU化学(Fields,G.及びNoble,R.(1990)「Solid phase peptide synthesis utilizing 9−fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids」,Int.J.Peptide Protein Res.35:161−214)を含め、ペプチド化学の分野で知られている固相又は液相合成法(E.Schroder及びK. Lubke,The Peptides,第1巻,pp76−136(1965)Academic Press)によって、レイニンシンフォニーペプチド合成機(米国アリゾナ州ツーソンのプロテイン・テクノロジーズ社)又はモデル433(米国カリフォルニア州フォスターシティーのアプライド・バイオシステムズ社)などの自動合成機で調製できる。
本発明の第1態様の結合体は、N10位にキャッピング基RCを有することができる。化合物Eは、キャッピング基RCを有することができる。
本発明の実施形態は、ConjA(ここで抗体は上で定義した通りである)を含む。
薬剤負荷は、抗体当たりPBD薬剤の数平均である。本発明の化合物がシステインに結合している場合には、薬剤負荷は、抗体当たり1〜8の薬剤(DL)の範囲であることができ、すなわち、この場合、1、2、3、4、5、6、7、及び8個の薬剤部分が抗体に共有結合している。結合体の組成物は、1〜8の薬剤の範囲と結合した抗体のコレクションを含む。本発明の化合物がリジンに結合している場合には、薬剤負荷は抗体当たり1〜80薬剤(DL)の範囲であることができるが、40、20、10又は8の上限がが好ましい場合がある。結合体の組成物は、1〜80、1〜40、1〜20、1〜10又は1〜8の範囲の薬剤と結合した抗体のコレクションを含む。
特に断らない限り、上に含まれるのは、これらの置換基の周知のイオン、塩、溶媒和物及び保護された形態である。例えば、カルボン酸(−COOH)への言及には、陰イオン性(カルボキシレート)型(−COO-)、その塩又は溶媒和物のみならず、通常の保護された形態が含まれる。同様に、アミノ基に対する言及には、アミノ基のプロトン化形態(−N+HR1R2)、塩又は溶媒和物、例えば、塩酸塩のみならず、アミノ基の通常の保護形態が含まれる。同様に、ヒドロキシル基に対する言及には、陰イオン形態(−O-)、塩又は溶媒和物のみならず、従来の保護形態が含まれる。
活性化合物の対応する塩、例えば、薬学的に許容される塩を調製し、精製し及び/又は取り扱うことが便利又は望ましい場合がある。薬学的に許容される塩の例は、Berge外,J.Pharm.Sci.,66,1−19(1977)で議論されている。
活性化合物の対応する溶媒和物を調製、精製、及び/又は処理することが好都合又は望ましい場合がある。用語「溶媒和物」は、ここでは、溶質(例えば、活性化合物、活性化合物の塩)と溶媒との複合体をいうために従来の意味で使用される。溶媒が水である場合、溶媒和物は、簡便には水和物、例えば、一水和物、二水和物、三水和物などと呼ぶことができる。
本発明の所定の化合物は、1種以上の特定の幾何、光学、エナンチオマー、ジアステレオマー、エピマー、アトロプ、立体異性、互変異性、立体配座又はアノマー形態で存在でき、これらのものとしては限定されないが、シス及びトランス型;E−及びZ型;c、t及びr型;エンド及びエキソ型;R、S及びメソ型;D及びL型;d及びl型;(+)及び(−)型;ケト、エノール及びエノラート型;syn型及びアンチ型;向斜及び背斜型;α及びβ型;軸及び赤道型;舟、椅子、ねじれ、エンベロープ及びいす型;並びにこれらの組み合わせが挙げられ、以下、まとめて「異性体」(又は「異性体型」)と呼ぶ。
試験管内細胞増殖アッセイ
一般に、抗体−薬剤結合体(ADC)の細胞毒性又は細胞増殖抑制活性は、細胞培養培地中におけるADCの抗体に受容体タンパク質を有する哺乳動物細胞を曝露し;約6時間〜約5日にわたって細胞を培養し;細胞生存率を測定することによって測定される。細胞ベースの試験管内アッセイを使用して、本発明のADCの生存率(増殖)、細胞傷害性及びアポトーシス(カスパーゼ活性化)の誘導を測定する。
本発明の結合体は、標的位置にPBDの化合物を与えるために使用される。
本発明の結合体は、治療方法に使用できる。また、提供されるのは、治療を必要とする被験体に、治療に有効な量の本発明の結合体化合物を投与することを含む治療方法である。「治療に有効な量」という用語とは、患者に対して利益を示すのに十分な量のことである。このような利益は少なくとも一つの症状の少なくとも改善であることができる。実際の投与量及び投与の割合と時間経過は、治療されるものの性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。
結合体化合物を単独で使用(例えば、投与)することが可能であるが、組成物又は諸方物として与えることが好ましい場合が多い。
結合体化合物及び結合体化合物を含む組成物の適切な投与量は、患者によって変更できることが当業者であれば分かるであろう。最適投与量の決定は、一般に、任意のリスク又は有害な副作用に対して治療効果のレベルのバランスをとることを伴う。選択される用量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、併用される他の薬物、化合物及び/又は材料、状態の重症度、並びに患者の種類、性別、年齢、体重、状態、一般的健康状態及び病歴(これらに限定されない)を含め、様々な要因に依存するであろう。化合物の量及び投与経路は、最終的には医師、獣医師、又は臨床医の判断になるが、一般に、用量は、重大な有害又は有毒な副作用を引き起こすことなく所望の効果を実現する作用部位での局所濃度を達成するように選択される。
症状を治療する文脈においてここで使用される用語「治療」とは、一般に、ヒト又は動物(例えば、獣医学用途における)かどうかを問わず、いくつかの所望の治療効果、例えば状態の進行の阻害が達成される治療及び治療をいい、かつ、進行速度の低下、進行速度の停止、症状の退縮、状態の寛解及び状態の治癒を含む。また、予防手段としての治療(すなわち、予防、防止)も含まれる。
抗体薬剤結合体は、抗体の求核基と薬剤−リンカー試薬との反応を含め、当業者に知られている有機化学反応、条件及び試薬を使用していくつかの経路によって調製できる。この方法を使用して本発明の抗体−薬剤結合体を調製することができる。
被験体/患者は、動物、哺乳動物、胎盤哺乳類、有袋類(例えば、カンガルー、ウォンバット)、単孔類(例えば、カモノハシカモノハシ)、げっ歯類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス)、ネズミ科(例えば、マウス)、ウサギ目(例えば、ウサギ)、鳥類(例えば、鳥)、イヌ科(例えば、犬)、ネコ科(例えば、猫)、ウマ科(例えば、馬)、ブタ(例えば、豚)、ヒツジ(例えば、羊)、ウシ属(例えば、雌牛)、霊長類、サル(例えば、猿又は類人猿)、サル(例えば、マーモセット、ヒヒ)、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)又はヒトであることができる。
次の優先は、上記本発明の全ての態様に適用される場合もあり又は単一の態様に関連する場合もある。これらの優先事項を任意の組み合わせで互いに組み合わせることができる。
Y及びY’は、好ましくはOである。
R9は、好ましくはHである。
C2’とC3’との間に二重結合が存在する場合には、R12は次のものから選択される:
(a)ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、C1~7アルキル、C3~7ヘテロシクリル及びビスオキシ−C1~3アルキレンよりなる群から選択される1個以上の置換基により置換されていてよいC5~10アリール基;
(b)C1~5飽和脂肪族アルキル;
(c)C3~6飽和シクロアルキル;
(d)
(e)
(f)
R12がC5~10アリール基であるときのR12の置換基がハロである場合には、これは好ましくはF又はClであり、より好ましくはFである。
いくつかの実施形態では、R24はH、メチル、エチル、エテニル及びエチニルから選択される。これらの実施形態のいくつかでは、R24はH及びメチルから選択される。
いくつかの実施形態では、R22は、式IIaのものである。
O−RL2’、S−RL2’、CO2−RL2’、CO−RL2’、NH−C(=O)−RL2’、NHNH−RL2’、CONHNH−RL2’、
ここで、RNは、H及びC1~4アルキルよりなる群から選択される。Xは、好ましくはOH、SH、CO2H、−N=C=O又はNHRNであることができ、より好ましくはO−RL2’、S−RL2’、CO2−RL2’、−NH−C(=O)−RL2’又はNH−RL2’であることができる。特に好ましい基としては、O−RL2’、S−RL2’及びNH−RL2’が挙げられ、NH−RL2’が最も好ましい基である。
いくつかの実施形態では、R10及びR11は、一緒になって、それらが結合している窒素と炭素原子と間に二重結合を形成する。
いくつかの実施形態では、R11aはOHである。
いくつかの実施形態では、R20及びR21は、一緒になって、それらが結合している窒素と炭素原子と間に二重結合を形成する。
いくつかの実施形態では、R30及びR31は、一緒になって、それらが結合している窒素と炭素原子と間に二重結合を形成する。
Mは、一価の薬学的に許容できる陽イオンであり、好ましくはNa+であることが好ましい。
nは1又は3であり;
R1aはメチル又はフェニルであり;
R12aは次のものから選択される:
(a)
(b)
(h)
nは1又は3であり;
R1aはメチル又はフェニルであり
nは1又は3であり、
R12aは次のものから選択される:
(a)
(b)
(h)
nは1又は3であり;
R1aはメチル又はフェニルであり;
R12aは次のものから選択される:
(a)
(b)
(h)
nは1又は3であり;
R1aはメチル又はフェニルであり;
R12aは次のものから選択される:
(a)
(b)
(h)
一般的な実験方法
旋光度は、ADP220旋光計(ベーリング・スタンリー社)で測定し、濃度(c)はg/100mLで与える。融点はデジタル融点装置(Electrothermal)を用いて測定した。IRスペクトルは、パーキン−エルマー・スペクトラム100FT IR分光計で記録した。1H及び13C NMRスペクトルは、ブルカーアバンスNMR分光計をそれぞれ400及び100MHzで用いて300Kで得た。化学シフトをTMS(δ=0.0ppm)に対して報告し、そしてシグナルを、s(一重項)、d(二重項)、t(三重項)、dt(二重三重項)、dd(二重項の二重項)、ddd(二重項の二重二重項)又はm(多重項)として示し、カップリング定数をヘルツ(Hz)で与える。質量分析(MS)データは、Waters2996PDAを有するWaters2695HPLCに連結されたWaters Micromass ZQ装置を用いて収集した。使用したWaters Micromass ZQパラメーターは、毛細管(kV)、3.38;コーン(V)、35;エクストラクター(V)、3.0;源温度(℃)、100;脱溶媒和温度(℃)、200;コーン流量(L/h)、50;脱溶媒和流量(L/h)、250であった。高分解能質量分析(HRMS)データを、器具にサンプルを導入するために金属被覆されたホウケイ酸ガラスのチップを用いてWaters Micromass QTOFグローバルによりポジティブWモードで記録した。薄層クロマトグラフィー(TLC)をシリカゲルアルミニウムプレート(メルク60、F254)上で実施し、そしてフラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル(メルク60、230〜400メッシュASTM)を用いた。HOBt(NovaBiochem社)及び固体担持試薬(アルゴノート社)を除き、他の全ての化学物質及び溶媒は、Sigma−Aldrich社から購入し、さらに精製することなく供給されたまま使用した。無水溶媒を、適切な乾燥剤の存在下に乾燥窒素雰囲気下で蒸留することによって調製し、4Åモレキュラーシーブ又はナトリウムワイヤを通して保存した。石油エーテルとは、40〜60℃で沸騰する留分をいう。
方法1(特に示さない限りにおいて使用されるデフォルト方法)
HPLC(ウォーターズ・アライアンス2695)を、水(A)(ギ酸0.1%)及びアセトニトリル(B)(ギ酸0.1%)の移動相を用いて行った。勾配:1.0分にわたり初期組成5%Bを保持し、続いて3分かけて5%Bから95%Bに増加させる。この組成を95%Bで0.1分間保持し、次いで0.03分で5%Bに戻し、そしてそこで0.87分間保持した。総勾配実行時間は5分に等しい。
HPLC(ウォーターズ・アライアンス2695)を、水(A)(ギ酸0.1%)及びアセトニトリル(B)(ギ酸0.1%)の移動相を用いて行った。勾配:初期組成5%Bを1.0分にわたって保持し、次いで2.5分かけて5%Bから95%Bまで増加させる。組成を95%Bで0.5分間保持し、次いで0.1分で5%Bに戻し、そこで0.9分間保持した。総勾配実行時間は5分に等しい。
流速は3.0mL/分であり、400μLを、質量分析計に入るゼロのデッドボリュームのティーピースを介して分割した。波長検出範囲:220〜400nm。機能種別:ダイオードアレイ(535スキャン)。カラム:Phenomenex(登録商標)オニキスモノリシックC1850×4.60mm。
ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(71.3mL、73.2g、362ミリモル)を、窒素雰囲気下において0〜5℃(氷/アセトン)で、バニリン酸メチル2(60.0g、329ミリモル)及びPh3P(129.4g、494ミリモル)の無水THF(800mL)へのオーバーヘッド攪拌溶液に60分間かけて滴下して添加した。この反応混合物をさらに1時間にわたって0〜5℃で撹拌し、その時間の後、1,3−プロパンジオール(11.4mL、12.0g、158ミリモル)のTHF溶液(12mL)を20分間かけて滴下添加した。この反応混合物を室温にまで加温し、そして5日間撹拌した。得られた白色沈殿物3を真空濾過により収集し、THFで洗浄し、そして一定重量まで真空デシケーター中で乾燥させた。収量=54.7g(1,3−プロパンジオールに基づいて84%)。LC/MSによる十分な純度(3.20分(ES+)m/z(相対強度)427([M+Na]+.,10);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(dd,2H,J=1.8,8.3Hz),7.54(d,2H,J=1.8Hz),6.93(d,2H,J=8.5Hz),4.30(t,4H,J=6.1Hz),3.90(s,6H),3.89(s,6H),2.40(p,2H,J=6.0Hz)。
固体のCu(NO3)2・3H2O(81.5g、337.5ミリモル)を、ビス−エステル3(54.7g、135ミリモル)の無水酢酸(650mL)へのオーバーヘッド攪拌スラリーに0〜5℃でゆっくりと添加した(氷/アセトン)。この反応混合物を0〜5℃で1時間撹拌し、次いで室温にまで加温した。この混合物の増粘を伴う軽度の発熱(約40〜50℃)及びNO2の放出がこの段階で観察された。追加の無水酢酸(300mL)を加え、そして反応混合物を室温で16時間撹拌した。この反応混合物を氷(〜1.5L)上に注ぎ、撹拌し、そして室温に戻した。得られた黄色沈殿物を真空濾過により回収し、デシケーター内で乾燥させて黄色固体として所望のビス−ニトロ化合物4を得た。収量=66.7g(100%)。LC/MSによる十分な純度(3.25 min(ES+)m/z(相対強度)517([M+Na]+.,40);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(s,2H),7.06(s,2H),4.32(t,4H,J=6.0Hz),3.95(s,6H),3.90(s,6H),2.45−2.40(m,2H)。
メチルエステル4(66.7g、135ミリモル)のTHF(700mL)へのスラリーを、1NのNaOH(700mL)で処理し、そしてこの反応混合物を室温で激しく撹拌した。4日間攪拌した後、スラリーは暗色溶液になり、この溶液に減圧下で回転蒸発を施してTHFを除去した。得られた水性残渣を濃HClでpH1に酸性化し、無色の沈殿物5を回収し、そして真空オーブン(50℃)内で完全に乾燥させた。収率=54.5g(87%)。LC/MSによる十分な純度(2.65 min(ES+)m/z(相対強度)489([M+Na]+.,30));1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ7.62(s,2H),7.30(s,2H),4.29(t,4H,J=6.0Hz),3.85(s,6H),2.30−2.26(m,2H)。
塩化オキサリル(24.5mL、35.6g、281ミリモル)を、ニトロ安息香酸5(43g、92.3ミリモル)及びDMF(6mL)の無水DCM(600mL)への攪拌懸濁液に添加した。初期の泡立ち後に、反応懸濁液は溶液になり、そしてこの混合物を室温で16時間撹拌した。酸塩化物への転化を、反応混合物のサンプルをMeOHで処理することによって確認し、そして得られたビス−メチルエステルをLC/MSで観察した。溶媒の大部分を減圧下で蒸発させて除去した;得られた濃縮溶液を最小量の乾燥DCMに再溶解させ、そしてジエチルエーテルで粉砕した。得られた黄色沈殿物を濾過により回収し、冷ジエチルエーテルで洗浄し、40℃の真空オーブン内で1時間乾燥させた。固体酸塩化物を(2S,4R)−メチル−4−ヒドロキシピロリジン−2−カルボキシレート塩酸塩(38.1g、210ミリモル)及びTEA(64.5mL、g、463ミリモル)のDCM(400mL)への撹拌懸濁液に−40℃(ドライアイス/CH3CN)で25分間かけて少しずつ加えた。LC/MS(2.47分(ES+)m/z(相対強度)721([M+H]+,100)によって判断されたときに直ちに反応を終了させた。この混合物をDCM(200mL)で希釈し、そして1NのHCl(300mL)、飽和NaHCO3(300mL)、食塩水(400ml)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、そして溶媒を減圧下で蒸発させて、橙色固体として純粋な生成物6を得た(66.7g、100%)。[α]22 D=−46.1°(c=0.47,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)(回転異性体)δ7.63(s,2H),6.82(s,2H),4.79−4.72(m,2H),4.49−4.28(m,6H),3.96(s,6H),3.79(s,6H),3.46−3.38(m,2H),3.02(d,2H,J=11.1Hz),2.48−2.30(m,4H),2.29−2.04(m,4H);13C NMR(100MHz,CDCl3)(回転異性体)δ172.4,166.7,154.6,148.4,137.2,127.0,109.7,108.2,69.7,65.1,57.4,57.0,56.7,52.4,37.8,29.0;IR(ATR,CHCl3)3410(br),3010,2953,1741,1622,1577,1519,1455,1429,1334,1274,1211,1177,1072,1050,1008,871cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)721([M+H]+.,47),388(80);HRMS[M+H]+。理論C31H36N4O16m/z721.2199,found(ES+)m/z721.2227。
方法A:ニトロ−エステル6(44g、61.1ミリモル)のメタノール(2.8L)溶液を、5Lの3ツ口丸底フラスコ中における新たに購入したラネー(登録商標)ニッケル(〜50%のH2Oへのスラリーの〜50g)及び突沸防止顆粒に添加した。この混合物を還流で加熱し、次いでヒドラジン水和物(21.6mL、22.2g、693ミリモル)のMeOH(200mL)溶液で滴下処理し、その時点で激しい泡立ちが観察された。添加を完了したときに(〜45分)、追加のラネー(登録商標)ニッケルを、発泡が停止し、そして反応混合物の最初の黄色が放出されるまで注意深く添加した。この混合物をさらに5分間加熱還流し、その時点で、TLC(90:10v/vのCHCl3/MeOH)及びLC/MS(2.12分(ES+)m/z(相対強度)597([M+H]+,100))によって反応が完了したとみなした。反応混合物を、セライトを含有する焼結漏斗を通して真空吸引により直ちに熱濾過した。濾液を真空中での蒸発により体積減少させ、その時点で、無色の沈殿物が形成され、これを濾過により回収し、真空デシケーター内で乾燥させたて7を得た(31g、85%)。[α]27 D=+404°(c=0.10,DMF);1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ10.2(s,2H,NH),7.26(s,2H),6.73(s,2H),5.11(d,2H,J=3.98Hz,OH),4.32−4.27(m,2H),4.19−4.07(m,6H),3.78(s,6H),3.62(dd,2H,J=12.1,3.60Hz),3.43(dd,2H,J=12.0,4.72Hz),2.67−2.57(m,2H),2.26(p,2H,J=5.90Hz),1.99−1.89(m,2H);13C NMR(100MHz,DMSO−d6)δ169.1,164.0,149.9,144.5,129.8,117.1,111.3,104.5,54.8,54.4,53.1,33.5,27.5;IR(ATR,ニート)3438,1680,1654,1610,1605,1516,1490,1434,1379,1263,1234,1216,1177,1156,1115,1089,1038,1018,952,870cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)619([M+Na]+.,10),597([M+H]+.,52),445(12),326(11);HRMS[M+H]+。理論C29H32N4O10m/z597.2191,found(ES+)m/z597.2205。
TBSCl(27.6g、182.9ミリモル)及びイミダゾール(29.9g、438.8ミリモル)を0℃(氷/アセトン)でテトララクタム7(21.8g、36.6ミリモル)の無水DMF(400 mL)への濁った溶液に添加した。この混合物を3時間にわたって窒素雰囲気下で撹拌させ、その後、LC/MS(3.90分(ES+)m / z(相対強度)825([M+H]+,100)によって判断されるように、反応が完了したとみなした。この反応混合物を氷(〜1.75L)に注ぎ、そして攪拌しながら室温まで加温した。得られた白色沈殿物を真空濾過により集め、H2O、ジエチルエーテルで洗浄し、そして真空デシケーター中で乾燥させて純粋な8を得た(30.1g、99%)。[α]23 D=+234°(c=0.41,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,2H,NH),7.44(s,2H),6.54(s,2H),4.50(p,2H,J=5.38Hz),4.21−4.10(m,6H),3.87(s,6H),3.73−3.63(m,4H),2.85−2.79(m,2H),2.36−2.29(m,2H),2.07−1.99(m,2H),0.86(s,18H),0.08(s,12H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.4,165.7,151.4,146.6,129.7,118.9,112.8,105.3,69.2,65.4,56.3,55.7,54.2,35.2,28.7,25.7,18.0,−4.82及び−4.86;IR(ATR,CHCl3)3235,2955,2926,2855,1698,1695,1603,1518,1491,1446,1380,1356,1251,1220,1120,1099,1033cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)825([M+H]+.,62),721(14),440(38);HRMS[M+H]+。理論C41H60N4O10Si2m/z825.3921,found(ES+)m/z825.3948。
n−BuLi(ヘキサン中1.6 M溶液の68.3mL、109ミリモル)の溶液を、−30℃(ドライアイス/エチレングリコール)でテトララクタム8(30.08g、36.4ミリモル)の無水THF(600mL)攪拌懸濁液に窒素雰囲気下で滴下した。反応混合物をこの温度で1時間撹拌し(ここでは赤みを帯びたオレンジ色)、その時点で、SEMCl(19.3mL、18.2g、109ミリモル)の無水THF(120mL)溶液を滴下添加した。この反応混合物を室温までゆっくりと温め、そして窒素雰囲気下で16時間撹拌した。TLC(EtOAc)及びLC/MS(4.77分(ES+)m/z(相対強度)1085([M+H]+,100)によって判断されたときに反応が完了したとみなした。THFを真空中で蒸発させて除去し、そして得られた残渣をEtOAc(750mL)に溶解し、H2O(250mL)、食塩水(250mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、そして真空中で蒸発させて、オイルとしての粗N10−SEM保護テトララクタム9を得た(最大39.5g、100%)。この生成物を精製せずに次の工程でそのまま使用した。[α]23 D=+163°(c=0.41,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(s,2H),7.22(s,2H),5.47(d,2H,J=9.98Hz),4.68(d,2H,J=9.99Hz),4.57(p,2H,J=5.77Hz),4.29−4.19(m,6H),3.89(s,6H),3.79−3.51(m,8H),2.87−2.81(m,2H),2.41(p,2H,J=5.81Hz),2.03−1.90(m,2H),1.02−0.81(m,22H),0.09(s,12H),0.01(s,18H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.0,165.7,151.2,147.5,133.8,121.8,111.6,106.9,78.1,69.6,67.1,65.5,56.6,56.3,53.7,35.6,30.0,25.8,18.4,18.1,−1.24,−4.73;IR(ATR,CHCl3)2951,1685,1640,1606,1517,1462,1433,1360,1247,1127,1065 cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)1113([M+Na]+.,48),1085([M+H]+.,100),1009(5),813(6);HRMS[M+H]+。理論C53H88N4O12Si4m/z1085.5548,found(ES+)m/z1085.5542。
TBAFの溶液(1.0MのTHF溶液の150mL、150ミリモル)を、粗ビス−シリルエーテル9[84.0g(最大56.8g)、52.4ミリモル]のTHF(800mL)撹拌溶液に室温で添加した。1時間撹拌した後、TLC(95:5v/vのCHCl3/MeOH)による反応混合物の分析から、反応の完了が明らかになった。THFを減圧下における室温での蒸発により除去し、得られた残渣をEtOAc(500mL)に溶解し、NH4Cl(300mL)で洗浄した。一緒にした有機層をブライン(60mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、そして減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー(勾配溶出:100%CHCl3〜96:4(v /v)のCHCl3/MeOH)による精製で、白色泡状物として純粋なテトララクタム10を得た(36.0g、79%)。LC/MS3.33分(ES+)m/z(相対強度)879([M+Na]+.,100),857([M+H]+.,40);[α]23 D=+202°(c=0.34,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(s,2H),7.20(s,2H),5.44(d,2H,J=10.0Hz),4.72(d,2H,J=10.0Hz),4.61−4.58(m,2H),4.25(t,4H,J=5.83Hz),4.20−4.16(m,2H),3.91−3.85(m,8H),3.77−3.54(m,6H),3.01(br s,2H,OH),2.96−2.90(m,2H),2.38(p,2H,J=5.77Hz),2.11−2.05(m,2H),1.00−0.91(m,4H),0.00(s,18H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.5,165.9,151.3,147.4,133.7,121.5,111.6,106.9,79.4,69.3,67.2,65.2,56.5,56.2,54.1,35.2,29.1,18.4,−1.23;IR(ATR,CHCl3)2956,1684,1625,1604,1518,1464,1434,1361,1238,1058,1021 cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)885([M+29]+.,70),857([M+H]+.,100),711(8),448(17);HRMS[M+H]+。理論C41H60N4O12Si2m/z857.3819,found(ES+)m/z857.3826。
ジオール10(25.6g、30ミリモル、1当量)、NaOAc(6.9g、84ミリモル、2.8当量)及びTEMPO(188mg、1.2ミリモル、0.04当量)をアルゴン下でDCM(326mL)に溶解させた。これを−8℃(内部温度)に冷却し、TCCA(9.7g、42ミリモル、1.4当量)を15分かけて少しずつ加えた。30分後に、TLC(EtOAc)及びLC/MS[3.60分(ES+)m/z(相対強度)854.21([M+H]+,40),(ES−)m/z(相対強度)887.07([M−H+Cl]−,10)]により、反応が完了したことが示された。冷DCM(200mL)を加え、そしてこの混合物をセライトのパッドを通して濾過してから、飽和炭酸水素ナトリウム/チオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄した(1:1v/v、200mL×2)。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去して黄色/オレンジ色のスポンジを得た(25.4g、99%)。LC/MS[3.60分(ES+)m/z(相対強度)854.21([M+H]+.,40);[α]20 D=+291°(c=0.26,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(s,2H),7.25(s,2H),5.50(d,2H,J=10.1Hz),4.75(d,2H,J=10.1Hz),4.60(dd,2H,J=9.85,3.07Hz),4.31−4.18(m,6H),3.89−3.84(m,8H),3.78−3.62(m,4H),3.55(dd,2H,J=19.2,2.85Hz),2.76(dd,2H,J=19.2,9.90Hz),2.42(p,2H,J=5.77Hz),0.98−0.91(m,4H),0.00(s,18H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ206.8,168.8,165.9,151.8,148.0,133.9,120.9,111.6,107.2,78.2,67.3,65.6,56.3,54.9,52.4,37.4,29.0,18.4,−1.24;IR(ATR,CHCl3)2957,1763,1685,1644,1606,1516,1457,1434,1360,1247,1209,1098,1066,1023 cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)881([M+29]+.,38),853([M+H]+.,100),707(8),542(12);HRMS[M+H]+。理論C41H56N4O12Si2m/z853.3506,found(ES+)m/z853.3502。
無水2,6−ルチジン(5.15mL、4.74g、44.2ミリモル)を、窒素雰囲気下において−45℃(ドライアイス/アセトニトリル)でビス−ケトン11(6.08g、7.1ミリモル)の乾燥DCM(180mL)への激しく撹拌した溶液に一度に注入した。新たに開かれたアンプルから採取された無水トリフルオロメタンスルホン酸無水物(7.2mL、12.08g、42.8ミリモル)を急速に滴下注入すると共に、−40℃以下の温度を維持した。反応混合物を1時間にわたり−45℃で撹拌し、その時点で、TLC(50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により、出発物質の完全な消費が明らかになった。冷反応混合物を直ちにDCM(200mL)で希釈し、そして激しく振盪しながら、水(1×100mL)、5%クエン酸溶液(1×200mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(200mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥させた(MgSO4)。溶媒を減圧下で濾過し蒸発させて粗生成物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製(勾配溶離:90:10(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜70:30v/vのn−ヘキサン/EtOAc)して黄色の泡状物としてビス−エノールトリフレート12を得た(5.5g、70%)。LC/MS4.32分(ES+)m/z(相対強度)1139([M+Na]+.,20);[α]24 D=+271°(c=0.18,CHCl3);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(s,2H),7.26(s,2H),7.14(t,2H,J=1.97Hz),5.51(d,2H,J=10.1Hz),4.76(d,2H,J=10.1Hz),4.62(dd,2H,J=11.0,3.69Hz),4.32−4.23(m,4H),3.94−3.90(m,8H),3.81−3.64(m,4H),3.16(ddd,2H,J=16.3,11.0,2.36Hz),2.43(p,2H,J=5.85Hz),1.23−0.92(m,4H),0.02(s,18H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.1,162.7,151.9,148.0,138.4,133.6,120.2,118.8,111.9,107.4,78.6,67.5,65.6,56.7,56.3,30.8,29.0,18.4,−1.25;IR(ATR,CHCl3)2958,1690,1646,1605,1517,1456,1428,1360,1327,1207,1136,1096,1060,1022,938,913cm-1;MS(ES+)m/z(相対強度)1144([M+28]+.,100),1117([M+H]+.,48),1041(40),578(8);HRMS [M+H]+。理論C43H54N4O16Si2S2F6m/z1117.2491,found(ES+)m/z1117.2465。
Pd(PPh3)4(116.9mg、0.101ミリモル)を、ビス−エノールトリフレート12(5.65g、5.06ミリモル)と、4−アミノフェニル酸ピナコールエステル(1g、4.56ミリモル)と、Na2CO3(2.46g、23.2ミリモル)と、MeOH(37mL)と、トルエン(74mL)と、水(37mL)との攪拌混合物に添加した。この反応混合物を24時間にわたって窒素雰囲気下に30℃で撹拌し、その後に、全てのボロン酸エステルが消費された。次いで、この反応混合物を蒸発乾固させてから、残渣をEtOAc(150mL)に溶解させ、そしてH2O(2×100mL)、塩水(150mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、そして減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィーによる精製(勾配溶出:60:40(v/v)のヘキサン/EtOAc〜80:20(v/v)のヘキサン/EtOAc)で、黄色がかった泡状物として生成物13を得た(2.4g、45%)。LC/MS4.02分(ES+)m/z(相対強度)1060.21([M+H]+.,100);1H−NMR:(CDCl3,400 MHz)δ7.40(s,1H),7.33(s,1H),7.27(bs,3H),7.24(d,2H,J=8.5Hz),7.15(t,1H,J=2.0Hz),6.66(d,2H,J=8.5Hz),5.52(d,2H,J=10.0Hz),4.77(d,1H,J=10.0Hz),4.76(d,1H,J=10.0Hz),4.62(dd,1H,J=3.7,11.0Hz),4.58(dd,1H,J=3.4,10.6Hz),4.29(t,4H,J=5.6Hz),4.00−3.85(m,8H),3.80−3.60(m,4H),3.16(ddd,1H,J=2.4,11.0,16.3Hz),3.11(ddd,1H,J=2.2,10.5,16.1Hz),2.43(p,2H,J=5.9Hz),1.1−0.9(m,4H),0.2(s,18H)。13C−NMR:(CDCl3,100MHz)δ169.8,168.3,164.0,162.7,153.3,152.6,149.28,149.0,147.6,139.6,134.8,134.5,127.9,127.5,125.1,123.21,121.5,120.5,120.1,116.4,113.2,108.7,79.8,79.6,68.7,68.5,67.0,66.8,58.8,58.0,57.6,32.8,32.0,30.3,19.7,0.25。
トリフェニルアルシン(0.24g、0.8ミリモル)、酸化銀(I)(1.02g、4.4ミリモル)、シクロプロピルボロン酸(0.47g、5.5ミリモル)及び出発物質13(1.15g、1.1ミリモル)をアルゴン雰囲気下でジオキサン(30mL)に溶解した。リン酸三カリウム(2.8g、13.2ミリモル)を、乳棒及び乳鉢ですり潰し、そしてすぐに反応混合物に添加した。反応混合物を排出し、アルゴンで3回フラッシュし、71℃に加熱した。パラジウム(II)ビス(塩化ベンゾニトリル)(84mg、0.22ミリモル)を添加し、そして反応容器を3回排気し、アルゴンでフラッシュした。10分後、少量のサンプルを、TLC(80:20v/v酢酸エチル/ヘキサン)及びLC/MSによる分析のために採取した。30分後、反応が完了し(LC/MS分析から、出発物質の完全な消費が示された)、そしてこの反応物をセライトを通して濾過し、そしてフィルターパッドを酢酸エチル(400mL)で洗浄した。濾液を水(2×200mL)及びブライン(2×200mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(30:70v/vのヘキサン/酢酸エチル)により精製することで、オレンジ色/黄色の固体として生成物14を得た(0.66g、63%)。方法1、LC/MS(3.85分(ES+)m/z(相対強度)952.17([M+H]+,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(d,2H,J=8.4Hz),7.30(s,1H),7.25−7.19(m,4H),6.68(s,1H),6.62(d,2H,J=8.4Hz),5.49(dd,2H,J=5.6,10.0Hz),4.73(app. t,2H,J=10.8Hz),4.54(dd,1H,J=3.2,10.4Hz),4.40(dd,1H,J=3.2,10.4Hz),4.29−4.23(m,4H),3.91−3.85(m,7H),3.80−3.71(m,2H),3.70−3.61(m,2H),3.38−3.32(m,1H),3.12−3.01(m,1H),2.50−2.69(m,1H),2.40(q,2H,J=5.6Hz),1.50−1.43(m,1H),0.99−0.71(m,6H),0.54−0.59(m,2H),0.00(s,18H)ppm。
SEMジラクタム14(0.66g、0.69ミリモル)をTHF(23 mL)に溶解し、そしてアルゴン雰囲気下で−78℃に冷却した。Super−Hydride(登録商標)溶液(1.7mL、THF中1M)を5分かけて滴下すると共に、温度を監視した。20分後、少量のサンプルを採取し、そしてLC/MS分析のために水で洗浄した。水(50mL)を加え、そして冷浴を除去した。有機層を抽出し、そしてブライン(60mL)で洗浄した。一緒にした水層をCH2Cl2/MeOH(90/10v/v)(2×50mL)で洗浄した。一緒にした有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去した。粗生成物をMeOH(48mL)、塩化メチレン(18mL)及び水(6mL)に溶解させ、そして十分なシリカゲルを添加して濃厚な懸濁液を得た。5日間撹拌した後、懸濁液を、焼結漏斗を通して濾過し、生成物が溶出しなくなるまでCH2Cl2/メタノール(9:1)(〜200mL)で洗浄した。有機層をブライン(2×70mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(100%のCHCl3から96/4(v/v)のCHCl3/MeOH)により精製して、黄色の固体として生成物15を得た(302mg、66%)。方法1、LC/MS(2.42分(ES+)m/z(相対強度)660.74([M+ H]+,30)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,1H,J=3.6Hz),7.78(d,1H,J=3.6Hz),7.58−7.44(m,3H),7.34−7.20(m,3H),6.88−6.66(m,4H),4.35−4.15(m,6H),3.95−3.75(m,7H),3.39−3.22(m,1H),3.14−3.04(m,1H),2.93−2.85(m,1H),2.46−2.36(m,2H),1.49−1.41(m,1H),0.80−0.72(m,2H),0.58−0.51(app.s,2H)ppm。
アルゴンを充填した脱気丸底フラスコ中において、HO−Ala−Val−alloc(149.6mg、0.549ミリモル)及びEEDQ(135.8mg、0.549ミリモル)を、乾燥CH2Cl2/MeOH(5mL)の9:1混合物に溶解させた。フラスコをアルミ箔で包み、そして反応混合物を室温で1時間撹拌してから、出発材料15(302mg、0.457ミリモル)を添加した。この反応混合物を室温でさらに40時間攪拌してから、揮発性物質を減圧下で回転蒸発により除去した(反応をLC/MS、RT出発物質2.32分(ES+660.29([M+ H]+,100)で追跡した)。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより直接精製(100%のCHCl3〜90/10v/vのCHCl3/MeOH)して純粋な生成物(16)を42%収率(174mg)で得た。方法2、LC/MS(2.70分(ES+)m/z(相対強度)914.73([M+H]+,60),660.43(60),184.31(100))。
出発物質16(170mg、0.185ミリモル)を、アルゴンを充填した丸底フラスコ中の乾燥塩化メチレン(5mL)に溶解させてから、ピロリジン(41μL、0.21mmol)を添加した。フラスコをアルゴンで三回パージ/再充填してから、Pd(PPh3)4(14mg、0.084ミリモル)を添加し、そしてフラッシュ操作を繰り返した。1時間後、出発物質の完全な消費が観察され(反応をLC/MSで追跡した)、そしてEt2O(50mL)を反応混合物に添加し、これを全ての生成物が溶液から崩れるまで攪拌した。この固体を、焼結漏斗を通して濾過し、Et2O(2×25mL)で2回洗浄した。収集フラスコを交換し、そして単離した固体をCHCl3中に溶解させた(100mL又は全ての生成物が焼結漏斗を通過するまで)。続いて、揮発性物質を減圧下での回転蒸発により除去して粗生成物17を得、このものを次の工程で直接使用した(168mg)。LC/MS方法2(2.70分(ES+)m/z(相対強度)830.27([M+H]+,50),660.13(80),171.15(100))。
出発物質17(154mg、0.185ミリモル)及びEDCI・HCl(110mg、0.185ミリモル)を、パージされかつアルゴンが充填された丸底フラスコ中の乾燥塩化メチレン(5mL)中に溶解させた。この混合物を室温で1時間にわたって攪拌してから、PEG8マレイミド(35.6mg、0.185ミリモル)を添加し、そしてその反応混合物をさらに16時間撹拌した(又は反応が完了するまで、LC/MSによって監視した)。反応溶液を、塩化メチレン(50mL)で希釈し、そして有機物をH2O(50mL)及びブライン(50mL)で洗浄してから、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(100%のCHCl3〜85/15v/vのCHCl3/MeOH)での精製により、所望の生成物を得た(135mg)が、未反応PEG8マレイミドの微量残留量が認められた(LC/MS、2.21分、方法2により)。自動化逆相シリカゲルクロマトグラフィー(H2O/CH3CN)(条件については一般的な情報を参照)は、不純物を正常に除去し、純粋な最終生成物を得た(出発物質37mg、33%から純粋な生成物18、110mg)。全体の収率=17%。方法2、LC/MS(2.58分(ES+)m/z(相対強度)1404.03([M+H]+,20),702.63(100))。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(t,J=3.5Hz,1H),7.80(d,J=4.0Hz,1H),7.75(d,J=8.8Hz,1H),7.69(d,J=8.7Hz,1H),7.54−7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39−7.31(m,2H),6.87(d,J=10.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.72−6.68(m,2H),4.74−4.62(m,1H),4.45−4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67−3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J=10.2,5.2Hz,2H),3.16−3.07(m,1H),2.92(dd,J=16.1,4.1Hz,1H),2.62−2.49(m,4H),2.48−2.39(m,2H),2.37−2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52−1.44(m,3H),1.10−0.93(m,6H),0.79(dd,J=9.2,5.3Hz,2H),0.57(dd,J=9.2,5.3Hz,2H),NHが観察された。
HO−Ala−Val−H 20a(350mg、1.86ミリモル)及びNa2CO3(493mg、4.65ミリモル)を蒸留H2O(15mL)に溶解させ、そして混合物を0℃に冷却してから、ジオキサン(15mL)を添加した(アミノ酸塩の部分的な沈殿が生じた)。Fmoc−Cl(504mg、1.95ミリモル)のジオキサン(15mL)溶液を10分間かけて激しく撹拌しながら滴下添加した。得られた混合物を0℃で2時間攪拌してから、氷浴を除去し、そして撹拌を16時間維持した。溶媒を減圧下での回転蒸発により除去し、そして残渣を水(150mL)に溶解させた。pHを1NのHClで9から2に調整し、その後水層をEtOAc(3×100mL)で抽出した。一緒にして有機物をブライン(100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして揮発性物質を減圧下での回転蒸発により除去して純粋なHO−Ala−Val−Fmoc 20bを得た(746mg、収率97%)。LC/MS2.85分(ES+)m/z(相対強度)410.60;1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J=7.77Hz,2H),7.60(d,J=7.77Hz,2H),7.43(d,J=7.5Hz,2H),7.34(d,J=7.5Hz,2H),6.30(bs,1H),5.30(bs,1H),4.71−7.56(m,1H),4.54−4.36(m,2H),4.08−3.91(m,1H),2.21−2.07(m,1H),1.50(d,J=7.1Hz,3H),1.06−0.90(m,6H)。
4−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル(146.9mg、0.67ミリモル)を、アルゴンでフラッシュしたフラスコ中において予めで室温で30分間撹拌したHO−Ala−Val−Fmoc 20b(330mg、0.8ミリモル)、DCC(166mg、0.8ミリモル)及びDMAP(5mg、触媒)の乾燥DCM(8mL)溶液に添加した。次いで、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応をLCMS及びTLCで追跡した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、そして有機層をH2O及びブラインで洗浄してから、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカラムに乾式充填し(ヘキサン/EtOAc、6:4)、そして純粋な生成物20を白色固体として88%収率(360mg)で単離した。
ビス−トリフレート12(2.03g、1.81ミリモル)、ボロン酸ピナコールエステル(1g、1.63ミリモル)及びNa2CO3(881mg、8.31ミリモル)をトルエン/メタノール/H2Oの2:1:1(40mL)混合物に溶解させた。反応フラスコをパージし、アルゴンを3回充填してから、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(41mg、0.035ミリモル)を添加し、そしてこの反応混合物を一晩30℃に加熱した。溶媒を減圧下で除去し、そして残留物をH2O(100mL)に溶解させ、EtOAc(3×100mL)で抽出した。一緒にした有機物をブライン(100mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして揮発性物質を減圧下での回転蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカラム(ヘキサン/EtOAc、8:2〜25:75)で精製して純粋な21を33%収率(885mg)で得た。LC/MS3.85分(ES+)m/z(相対強度)1452.90;1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78−7.16(m,17H),7.13(s,1H),6.51−6.24(m,1H),5.51(dd,J=10.0,5.1Hz,2H),5.36−5.11(m,1H),4.74(dd,J=10.1,4.4Hz,2H),4.70−4.53(m,2H),4.47(d,J=6.4Hz,1H),4.37(d,J=7.2Hz,1H),4.27(m,4H),4.20−4.14(m,1H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.77(ddd,J=16.7,9.0,6.4Hz,3H),3.71−3.61(m,2H),3.24−2.91(m,3H),2.55−2.33(m,2H),2.22−2.07(m,1H),1.52−1.37(m,3H),1.04−0.86(m,10H),0.00(s,18H)。
トリフェニルアルシン(42mg、0.137ミリモル)を、乾燥ジオキサン(10mL)中PBD−トリフレート21(250mg、0.172ミリモル)、シクロプロピルボロン酸(73.9mg、0.86ミリモル)、酸化銀(159mg、0.688ミリモル)及びリン酸三カリウムの混合物(438mgの、2.06ミリモル)にアルゴン雰囲気下で添加した。反応をアルゴンで3回フラッシュし、そして塩化ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II)(13.2mg、0.034ミリモル)を添加した。反応をアルゴンで3回以上フラッシュしてから、75℃に温め、そして10分間攪拌した。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、その後、これを酢酸エチルですすいだ。溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;1%メタノール/クロロホルム)。純粋な画分を集め、一緒にし、そして過剰な溶出液を減圧下での回転蒸発により除去して所望の生成物22を得た(132mg、収率50%)。LC/MS3.83分(ES+)m/z(相対強度)1345.91;1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88−7.14(m,17H),6.69(s,1H),6.45−6.25(m,1H),5.57−5.41(m,2H),5.34−5.14(m,1H),4.78−4.67(m,2H),4.62−4.55(m,1H),4.50−4.45(m,2H),4.51−4.44(m,1H),4.31−4.21(m,4H),4.16(m,1H),3.92(s,3H),3.86(s,3H),3.82−3.71(m,2H),3.66(m,3H),3.40−3.28(m,1H),3.07(m,1H),2.70−2.57(m,1H),2.47−2.36(m,2H),2.15(m,1H),1.51−1.40(m,3H),1.03−0.87(m,11H),0.77−0.71(m,2H),0.60−0.54(m,2H),0.00(t,J=3.0Hz,18H)。
Super−Hydride(登録商標)の溶液(0.5mL、THF中1M)を、アルゴン雰囲気下において−78℃でSEMジラクタム22(265mg、0.19ミリモル)のTHF(10mL)溶液に滴下して添加した。この添加を、反応混合物の内部温度を一定に維持するために、5分間かけて完了させた。20分後、アリコートをLC/MS分析のために水でクエンチし、その分析から、反応が完了したことが明らかになった。水(20mL)を反応混合物に添加し、冷浴を除去した。有機層をEtOAcで抽出し(3×30mL)、一緒にした有機物をブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。粗生成物をMeOH(12mL)、塩化メチレン(6mL)、水(2mL)及び十分なシリカゲルに溶解し、濃厚撹拌懸濁液を形成させた。5日後、懸濁液を焼結漏斗を通して濾過し、そして生成物の溶出が完了するまで塩化メチレン/メタノール(9:1)(200mL)で洗浄した。有機層をブライン(2×70mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(100%のCHCl3〜96%のCHCl3/4%のMeOH)により精製して、黄色の固体として生成物23を得た(162mg、78%)。LC/MS3.02分(ES+)m/z(相対強度)1052.37。
過剰のピペリジン(0.2mL、2ミリモル)をSEMジラクタム23(76mg、0.073ミリモル)のDMF(1mL)溶液に加えた。この混合物を室温で20分間攪拌し、その時点で、反応が完了した(LC/MSによって監視)。この反応混合物をCH2Cl2(75mL)で希釈し、そして有機相をピペリジンが完全に除去されるまでH2O(3×75mL)で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して粗生成物17を得、これを次の工程でそのまま使用した。LC/MS2.32分(ES+)m/z(相対強度)830.00。
EDCI塩酸塩(14mg、0.0732ミリモル)をアルゴン雰囲気下でマレイミドPEG8酸(43.4mg、0.0732ミリモル)の乾燥CH2Cl2(5mL)への懸濁液を添加した。この混合物を室温で1時間攪拌してからPBD17(60.7mg、0.0732ミリモル)を加えた。反応が完了するまで(通常は5時間)攪拌を維持した。反応物をCH2Cl2で希釈し、そして有機相をH2O及びブラインで洗浄してから、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。生成物を、注意深くシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し(100%のCHCl3から出発して9:1のCHCl3/MeOHまで緩やかな溶出)、その後逆相クロマトグラフィーによって生成して、未反応のマレイミドPEG8酸を除去した。生成物18を17.6%(21.8mg)で単離した。LC/MS2.57分(ES+)m/z(相対強度)1405.30;1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(t,J=3.5 Hz,1H),7.80(d,J=4.0 Hz,1H),7.75(d,J=8.8 Hz,1H),7.69(d,J=8.7 Hz,1H),7.54−7.50(m,2H),7.45(s,1H),7.39−7.31(m,2H),6.87(d,J=10.5 Hz,2H),6.76(s,1H),6.72−6.68(m,2H),4.74−4.62(m,1H),4.45−4.17(m,7H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),3.67−3.58(m,34H),3.54(m,2H),3.42(dd,J=10.2,5.2 Hz,2H),3.16−3.07(m,1H),2.92(dd,J=16.1,4.1 Hz,1H),2.62−2.49(m,4H),2.48−2.39(m,2H),2.37−2.25(m,1H),1.92(s,1H),1.52−1.44(m,3H),1.10−0.93(m,6H),0.79(dd,J=9.2,5.3 Hz,2H),0.57(dd,J=9.2,5.3 Hz,2H)、NHは観察されなかった。
Pd(PPh3)4(20.6mg、0.018ミリモル)を、ビスエノールトリフレート12(500mg、0.44ミリモル)、N−メチルピペラジンボロン酸エステル(100mg、0.4ミリモル)、Na2CO3(218mg、2.05ミリモル)、MeOH(2.5mL)、トルエン(5mL)及び水(2.5mL)の撹拌混合物に添加した。この反応混合物を24時間にわたって窒素雰囲気下に30℃で撹拌し、その時間後、全てのボロン酸エステルが消費された。次いで、反応混合物を蒸発乾固させてから、残留物をEtOAc(100mL)に溶解させ、そしてH2O(2×50mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、ろ過し、そして減圧下で蒸発させて粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー(勾配溶出:80:20(v/v)のヘキサン/ EtOAc〜60:40(v/v)のヘキサン/ EtOAc)で精製して、黄色がかった泡状物として生成物24を得た(122.6mg、25%)。LC/MS3.15分(ES+)m/z(相対強度)1144([M+H]+、20%)。
PBD−トリフレート24(359mg、0.314ミリモル)、ボロン酸ピナコールエステル20(250mg、0.408ミリモル)及びトリエチルアミン(0.35mL、2.51ミリモル)をトルエン/メタノール/H2O、2:1:1(3mL)の混合物に溶解した。マイクロ波容器を3回パージし、アルゴンを充填してから、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(21.7mg、0.018ミリモル)を添加し、そして反応混合物を80℃で10分間マイクロ波内に置いた。次に、CH2Cl2(100mL)を加え、そして有機層を水(2×50mL)及びブライン(50mL)で洗浄してから、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、揮発性物質を減圧下での回転蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカラムにより精製(CHCl3/MeOH、100%〜9:1)して、純粋な25を得た(200mg、43%の収率)。LC/MS3.27分(ES+)m/z(相対強度)1478([M+H]+.,100%)。
Super−Hydride(登録商標)(0.34mL、THF中1M)を、アルゴン雰囲気下において−78℃でSEMジラクタム25(200mg、0.135ミリモル)のTHF(5mL)溶液に滴下して添加した。この反応混合物の内部温度を一定に維持するために添加を5分間かけて完了させた。20分後、アリコートをLC/MS分析のために水でクエンチし、この分析からこの反応が完了したことが明らかになった。水(20mL)を反応混合物に添加し、冷浴を除去した。有機層をEtOAc(3×30mL)で抽出し、一緒にした有機物をブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。粗生成物をMeOH(6mL)、CH2Cl2(3mL)、水(1mL)及び十分なシリカゲルに溶解させて濃厚な撹拌懸濁液を形成さでる。5日後、この懸濁液を、焼結漏斗を通して濾過し、生成物の溶出が完了するまでCH2Cl2/メタノール(9:1)(100mL)で洗浄した。有機層をブライン(2×50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(100%のCHCl3〜96%のCHCl3/4%のMeOH)により精製して、黄色の固体として生成物26を得た(100mg、63%)。LC/MS2.67分(ES+)m/z(相対強度)1186([M+H]+.,5%)。
過剰のピペリジン(0.1mL、1ミリモル)をPBD26(36.4mg、0.03ミリモル)のDMF(0.9mL)溶液に加えた。この混合物を室温で20分間攪拌し、その時点で反応が完了した(LC/MSによって監視)。この反応混合物をCH2Cl2(50mL)で希釈し、ピペリジンが完全に除去されるまで有機相をH2Oで洗浄した(3×50mL)。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して粗生成物27を得、これを次の工程でそのまま使用した。LC/MS2.20分(ES+)m/z(相対強度)964([M+H]+.,5%)。
EDCI塩酸塩(4.7mg、0.03ミリモル)をアルゴン雰囲気下で6−マレイミドヘキサン酸(6.5mg、0.03ミリモル)の乾燥CH2Cl2(3mL)への懸濁液に添加した。この混合物を室温で1時間攪拌してから、PBD27(34mg、粗製)を加えた。反応が完了するまで(6時間)攪拌を維持した。反応物をCH2Cl2で希釈し、そして有機相をH2O及びブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。生成物を、注意深くシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し(100%のCHCl3から出発して9:1のCHCl3/MeOHまでの緩やかな溶出)、その後逆相クロマトグラフィーで生成して、未反応のマレイミドPEG8酸を除去した。生成物28を、2工程にわたって41%で単離した(14.6mg)。LC/MS2.40分(ES+)m/z(相対強度)1157([M+H]+.,5%)。
3,4−(メチレンジオキシ)フェニルボロン酸(356mg、2.1ミリモル、1.3当量)、TEA(1.8mL、12.9ミリモル、8当量)及びトリフレート/アニリン13(1.75g、1.7ミリモル、1当量)をAr雰囲気下でエタノール(7mL)、トルエン(13mL)及び水(2mL)の混合物に溶解させた。この反応混合物を排出し、アルゴンで3回フラッシュしてから、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(114mg、0.1ミリモル、0.06当量)を添加した。フラスコを再度排気し、そしてArで3回フラッシュし、30秒予備攪拌時間しながら8分間にわたって80℃でマイクロ波加熱した。TLC(80:20v/vの酢酸エチル/ヘキサン)による分析から、出発物質の完全な消費が示された。反応混合物をジクロロメタン(50mL)で希釈し、水(50mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(60:40〜20:80(v/v)のヘキサン/酢酸エチル)により精製して、黄色固体として生成物29を得た(1.21g、71%)。LC/MS(3.92分(ES+)m/z(相対強度)1032.44([M+H]+.,100)。
SEMジラクタム29(0.25g、0.24ミリモル、1当量)をTHF(8mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下で78℃に冷却した。温度を監視しながら、Super−Hydride(登録商標)(0.6mL、THF中1M、2.5当量)を5分間かけて滴下して加えた。20分後、少量のサンプルを採取し、そしてLCMS分析の準備をした。水(50mL)を添加し、冷浴を除去し、そして溶液を酢酸エチル(50mL)で洗浄した。有機層を抽出し、そしてブライン(60mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空中で除去した。粗生成物をEtOH(15mL)、CH2Cl2(7.5mL)及び水(2.5mL)に溶解し、そして濃厚な懸濁液になるまで十分なシリカゲルを添加した。5日間攪拌した後、これを焼結漏斗を通して濾過し、生成物が溶出しなくなるまでCH2Cl2/メタノール(9:1)(100mL)で洗浄した。有機層をブライン(2×50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空中で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%〜4%MeOH勾配と共にCHCl3)によって精製して、黄色固体として生成物30を得た(94mg、53%)。LC/MS(2.53分(ES+)m/z(相対強度)739.64([M]+.,70)。
Ar雰囲気下で、Alanine−Valine−Alloc(180mg、0.66ミリモル、1.2当量)を無水CH2Cl2(21mL)及びメタノール(1mL)中においてEEDQ(163mg、0.66ミリモル、1.2当量)と共に1時間撹拌した。PBD30(407mg、0.55ミリモル、1当量)を無水CH2Cl2(21mL)及びメタノール(1mL)に溶解し、そして反応物に添加した。室温で5日日撹拌した後に、LC/MSは大部分の生成物の形成を示した。溶媒を減圧下で除去してからカラムクロマトグラフィーで精製(1%〜6%MeOH勾配でのCH2Cl2)して、黄色の固体として生成物31を得た(184mg、34%)。LC/MS(2.95分(ES+)m/z(相対強度)994.95([M+H]+.,60)。
イミン31(100mg、0.1ミリモル、1当量)をAr雰囲気下で無水DCM(10mL)(溶解を助けるために一滴のメタノールを用いる)に溶解させた。ピロリジン(30μL、0.15ミリモル、1.5当量)を滴下して添加してから、フラスコを排気し、そしてアルゴンで3回フラッシュした。Pd(PPh3)4(7mg、6μmol、0.06当量)を添加し、フラスコを排気し、そしてアルゴンで3回フラッシュした。1時間後のLC/MS分析から、生成物の形成及び出発物質の完全な消失が示された。Et2O(60mL)を反応混合物に添加し、そして全ての生成物が溶液から崩れるまでこれを攪拌した。沈殿物を焼結漏斗を通して濾過し、Et2O(2×20mL)で2回洗浄した。収集フラスコを交換し、単離した固体を溶解させ、そしてCHCl3(100mL)で焼結体を介して洗浄した。溶媒を減圧下で除去して黄色の固体として粗生成物32を得、これを次の工程で直接使用した。LC/MS(1.14分(ES+)m/z(相対強度)910.40([M+H]+.,67)。
イミン32(92mg、0.1ミリモル、1.1当量)を、溶解を助けるための一滴の無水MeOHと共にCHCl3(6mL)に溶解させた。マレイミドPEG8酸(53mg、0.09ミリモル、1当量)を添加し、その後EEDQ(33mg、0.14ミリモル、1.5当量)を添加した。これを、LC/MS分析により大部分の生成物の形成が示されるまで4日間にわたりアルゴン下において室温で激しく攪拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%〜10%のMeOH勾配を用いたCHCl3)により部分的に生成して33を得た(81mg)。この物質を分取HPLCによってさらに精製して、黄色の固体として33を得た(26.3mg、18%)。急速ギ酸実施:LC/MS(1.39分(ES+)m/z(相対強度)1485.00([M+H]+.,64)。
トリフレート21(0.5g、0.35ミリモル、1当量)、3,4−(メチレンジオキシ)フェニルボロン酸(75mg、0.45ミリモル、1.3当量)及びNa2CO3(0.17g、1.6ミリモル、4.5当量)をアルゴン雰囲気下でトルエン(11mL)、EtOH(5.5mL)及び水(5.5mL)に溶解させた。フラスコを排気し、そしてアルゴンで3回フラッシュした。Pd(PPh3)4(24mg、0.02ミリモル、0.06当量)を添加し、再びフラスコを排気し、アルゴンで3回フラッシュした。これを30℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。LC/MSによる分析から、出発物質の完全な消失が示された。溶媒を真空中で除去し、残留物を水(60mL)に溶解させてから酢酸エチル(60mL×3)で洗浄した。一緒にした有機層をブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空下で除去した。カラムクロマトグラフィー(50:50〜25:75(v/v)のヘキサン/酢酸エチル)により精製して、黄色の固体として生成物34を得た(310mg、64%)。LC/MS(1.44分(ES-)m/z(相対強度)1423.35([M−H]-,79)。
SEMジラクタム34(0.31g、0.22ミリモル、1当量)をTHF(10mL)に溶解し、そしてアルゴン雰囲気下で78℃に冷却した。Super−Hydride(登録商標)(0.5mL、THF中1M、2.5当量)を、温度を監視しつつ5分間かけてを滴下添加した。30分後、少量のサンプルを採取し、LC/MS分析のための準備をした。水(50mL)を添加し、冷浴を除去し、そして溶液を酢酸エチル(50mL)で洗浄した。有機層を抽出し、そしてブライン(60mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空下で除去した。粗生成物をEtOH(13.2mL)、CH2Cl2(6.6mL)及び水(2.2 mL)に溶解させ、濃厚な懸濁液になるまで十分なシリカゲルを添加した。5日間攪拌した後、これを焼結漏斗を通して濾過し、生成物が溶出しなくなるまでCH2Cl2/メタノール(9:1)(100mL)で洗浄した。有機層をブライン(2×50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空下で除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(1%〜4%MeOH勾配を用いたCHCl3)により精製して、黄色の固体として純粋な生成物35を得た(185mg、75%)。LC/MS(1.70分(ES+)m/z(相対強度)1132.85([M+H]+.,60)。
イミン35(82mg、0.07ミリモル、1当量)(1mL)をDMFに溶解させてから、ピペリジン(0.2mL、2ミリモル、過剰)をゆっくりと添加した。この溶液をLC/MS分析により出発物質の完全な消費が示されるまで室温で20分間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2(50mL)で希釈し、水(50mL×4)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を真空下で除去した。生成物33を次の工程でさらに精製することなく使用した。LC/MS(1.15分(ES+)m/z(相対強度)910.60([M+H]+.,58)。
(i)(S)−(2−アミノ−5−メトキシ−4−((トリイソプロピルシリル)オキシ)フェニル)(2−(((t−ブチルジメチルシリル)オキシ)メチル)−4−メチル−2,3−ジヒドロ−1H−ピロール−1−イル)メタノン(49)
ニートのトリイソプロピルシリルクロリド(56.4mL、262ミリモル)イミダゾール(48.7g、715.23ミリモル)と4−ヒドロキシ−5−メトキシ−2−ニトロベンズアルデヒド41(47g、238ミリモル)との混合物(一緒に粉砕)に添加した。この混合物を、フェノール及びイミダゾールが融解し、溶液になるまで加熱した(100℃)。この反応混合物を15分間撹拌した後、冷却させ、それによってフラスコの底部に固形物が形成することが観察された(塩化イミダゾール)。反応混合物を5%EtOAc/ヘキサンで希釈し、シリカゲル上に直接ロードし、そしてパッドを5%EtOAc/ヘキサンで溶出し、その後10%EtOAc/ヘキサンで溶出した(低過剰のため、非常にわずかの未反応TIPSClが生成物中に見出された)。所望の生成物をヘキサン中5%酢酸エチルで溶出した。過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去し、その後高真空下で乾燥させて結晶性感光性固体を得た(74.4g、88%)。LC/MS(4.22分(ES+)m/z(相対強度)353.88([M+H]+.,100))による十分な純度;1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.43(s,1H),7.60(s,1H),7.40(s,1H),3.96(s,3H),1.35−1.24(m,3H),1.10(m,18H)。
亜塩素酸ナトリウム(47.3g、523ミリモル、80%工業等級)及びリン酸二水素ナトリウム一塩基(35.2g、293ミリモル)(NaH2PO4)の水溶液(800mL)を、室温で化合物2(74g、209ミリモル)のテトラヒドロフラン(500mL)溶液に添加した。過酸化水素(60%w/w、140mL、2.93モル)を激しく撹拌した二相混合物に直ちに添加した。反応混合物はガス(酸素)発生し、出発物質が溶解し、反応混合物の温度が45℃に上昇した。30分後、LC/MSから、反応が完了したことが明らかになった。反応混合物を氷浴で冷却し、塩酸(1M)を添加してpHを3に低下させた(この工程は、多くの場合不必要であることが分かった。というのは、反応終了時のpHは既に酸性だからである;抽出前のpHを確認することが必要である)。次いで、反応混合物を酢酸エチル(1L)及びブライン(2×100mL)で洗浄し、有機相を抽出し、そして硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を濾過し、過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して生成物43を黄色の固体として定量的収率で得た。LC/MS(3.93分(ES−)m/z(相対強度)367.74([M−H]-.,100));1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(s,1H),7.24(s,1H),3.93(s,3H),1.34−1.22(m,3H),1.10(m,18H)。
DCC(29.2g、141ミリモル、1.2当量)を0℃で酸3(43.5g、117.8ミリモル、1当量)及びヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(19.8g、129.6ミリモル、1.1当量)のジクロロメタン溶液(200mL)に添加した。冷浴を除去し、そして反応を室温で30分間進行させ、その時点で、(2S,4R)−2−t−ブチルジメチルシリルオキシ−4−ヒドロキシピロリジン44(30g、129.6ミリモル、1.1当量)及びトリエチルアミン(24.66mL、176ミリモル、1.5当量)のジクロロメタン溶液(100mL)をアルゴン下において−10℃で迅速に添加した(大規模では、添加時間は、反応混合物をさらに冷却することによって短縮できる)。この反応混合物を1時間40分間にわたって室温で撹拌し、そしてLC/MS及びTLC(EtOAc)により監視した。固形物をセライトで濾過により除去し、そして有機相をpHが4又は5と測定されるまで冷水性0.1M HClで洗浄した。次いで、有機相を水で洗浄し、その後飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。残留物にフラッシュカラムクロマトグラフィーを施した(シリカゲル;勾配40/60酢酸エチル/ヘキサン〜80/20酢酸エチル/ヘキサン)。過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して、純粋な生成物45を得た(純粋な生成物66%の45.5g、及びわずかに不純な生成物の17g、合計90%)。LC/MS4.43分(ES+)m/z(相対強度)582.92([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),6.74(s,1H),4.54(s,1H),4.40(s,1H),4.13(s,1H),3.86(s,3H),3.77(d,J=9.2Hz,1H),3.36(dd,J=11.3,4.5 Hz,1H),3.14−3.02(m,1H),2.38−2.28(m,1H),2.10(ddd,J=13.3,8.4,2.2 Hz,1H),1.36−1.19(m,3H),1.15−1.05(m,18H),0.91(s,9H),0.17−0.05(m,6H),(回転異性体の存在)。
TCCA(8.82g、40ミリモル、0.7当量)を0℃で45(31.7g、54ミリモル、1当量)及びTEMPO(0.85g、5.4ミリモル、0.1当量)の乾燥ジクロロメタン攪拌溶液(250mL)に添加した。この反応混合物を激しく20分間撹拌し、その時点で、TLC(50/50酢酸エチル/ヘキサン)は出発物質の完全な消費を示した。反応混合物をセライトを通して濾過し、ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(100mL)、チオ硫酸ナトリウム(300mL中9g)、ブライン(100mL)で洗浄し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させた。減圧下での回転蒸発により生成物46を定量的収率で得た。LC/MS4.52分(ES+)m/z(相対強度)581.08([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78−7.60(m,1H),6.85−6.62(m,1H),4.94(dd,J=30.8,7.8 Hz,1H),4.50−4.16(m,1H),3.99−3.82(m,3H),3.80−3.34(m,3H),2.92−2.17(m,2H),1.40−1.18(m,3H),1.11(t,J=6.2 Hz,18H),0.97−0.75(m,9H),0.15−0.06(m,6H),(回転異性体の存在)。
トリフルオロメタンスルホン酸無水物(27.7mL、46.4g、165ミリモル、3当量)を、2,6−ルチジン(25.6mL、23.5g、220ミリモル、4当量、ふるい上で乾燥)の存在下において−50℃(アセトン/ドライアイス浴)で、ケトン46(31.9g、55ミリモル、1当量)の乾燥ジクロロメタン(900mL)への激しく撹拌した懸濁液に注入した(温度を制御)。この反応混合物を1.5時間撹拌し、そのときに、ミニワークアップ(水/ジクロロメタン)後のLC/MSから、反応が完了したことが明らかになった。水をまだ冷たい反応混合物に加え、そして有機層を分離し、飽和重炭酸ナトリウム、ブライン及び硫酸マグネシウムで洗浄した。有機相をろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル;10/90(v/v)酢酸エチル/ヘキサン)に付した後、過剰の溶離液を除去して、生成物47を得た(37.6g、96%)。LC/MS、方法2、 4.32分(ES+)m/z(相対強度)712.89([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),6.75(s,1H),6.05(d,J=1.8Hz,1H),4.78(dd,J=9.8,5.5 Hz,1H),4.15−3.75(m,5H),3.17(ddd,J=16.2,10.4,2.3 Hz,1H),2.99(ddd,J=16.3,4.0,1.6 Hz,1H),1.45−1.19(m,3H),1.15−1.08(m,18H),1.05(s,6H),0.95−0.87(m,9H),0.15−0.08(m,6H)。
トリフェニルアルシン(1.71g、5.60ミリモル、0.4当量)を、アルゴン雰囲気下で、トリフレート47(10.00g、14ミリモル、1当量)、メチルボロン酸(2.94g、49.1ミリモル、3.5当量)、酸化銀(13g、56ミリモル、4当量)及びリン酸カリウム三塩基(17.8g、84ミリモル、6当量)の乾燥ジオキサン(80mL)中の混合物に添加した。反応物をアルゴンで3回フラッシュした後、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II)クロリド(540mg、1.40ミリモル、0.1当量)を加えた。反応物をアルゴンで3回フラッシュしてから、110℃に瞬時に加温した(drysyn加熱ブロックを、フラスコの追加前に110℃に予め加温しておいた)。10分後、反応物を室温にまで冷却し、セライトパッドを通して濾過した。溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィーに付した(シリカゲル;10%酢酸エチル/ヘキサン)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰な溶出液を減圧下での回転蒸発により除去して、生成物48を得た(4.5g、55%)。LC/MS,4.27分(ES+)m/z(相対強度)579.18([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),6.77(s,1H),5.51(d,J=1.7Hz,1H),4.77−4.59(m,1H),3.89(s,3H),2.92−2.65(m,1H),2.55(d,J=14.8 Hz,1H),1.62(d,J=1.1Hz,3H),1.40−1.18(m,3H),1.11(s,9H),1.10(s,9H),0.90(s,9H),0.11(d,J=2.3Hz,6H)。
亜鉛粉末(28g、430ミリモル、37当量)を、約15℃で、化合物48(6.7g、11.58ミリモル)のエタノール中5%ギ酸v/v溶液(70mL)に添加した。生じた発熱を氷浴を用いて制御して30℃未満の反応混合物の温度を維持した。30分後、反応混合物をセライトのパッドを通して濾過した。ろ液を酢酸エチルで希釈し、そして有機相を水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機相を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;ヘキサン中10%酢酸エチル)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去して、生成物49を得た(5.1g、80%)。LC/MS,4.23分(ES+)m/z(相対強度)550.21([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(s,1H),6.67(s,1H),6.19(s,1H),4.64−4.53(m,J=4.1Hz,1H),4.17(s,1H),3.87(s,1H),3.77−3.69(m,1H),3.66(s,3H),2.71−2.60(m,1H),2.53−2.43(m,1H),2.04−1.97(m,J=11.9Hz,1H),1.62(s,3H),1.26−1.13(m,3H),1.08−0.99(m,18H),0.82(s,9H),0.03−−0.03(m,J=6.2Hz,6H)。
アリルクロロホルメート(0.30mL、3.00ミリモル、1.1当量)を、−78℃(アセトン/ドライアイス浴)で、乾燥ピリジン(0.48mL、6.00ミリモル、2.2当量)の存在下でのアミン49(1.5g、2.73ミリモル)の乾燥ジクロロメタン溶液(20mL)に添加した。30分後、浴を取り除き、反応混合物を室温にまで加温した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和水性硫酸銅を添加した。次いで、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発によって除去して、生成物50を得、これを次の反応に直接使用した。LC/MS,4.45分(ES+)m/z(相対強度)632.91([M+H]+.,100)。
粗生成物50を、酢酸/メタノール/テトラヒドロフラン/水の7:1:1:2混合物(28:4:4:4:8mL)に溶解し、そして室温で撹拌した。3時間後、出発物質の完全な消失をLC/MSで観察した。この反応混合物を酢酸エチルで希釈し、そして水(2×500mL)、飽和水性重炭酸ナトリウム(200mL)及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして過剰の酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物にフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った(シリカゲル、ヘキサン中25%酢酸エチル)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して、所望の生成物51を得た(1g、71%)。LC/MS,3.70分(ES+)m/z(相対強度)519.13([M+H]+.,95);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(s,1H),7.69(s,1H),6.78(s,1H),6.15(s,1H),5.95(ddt,J=17.2,10.5,5.7Hz,1H),5.33(dq,J=17.2,1.5Hz,1H),5.23(ddd,J=10.4,2.6,1.3Hz,1H),4.73(tt,J=7.8,4.8Hz,1H),4.63(dt,J=5.7,1.4Hz,2H),4.54(s,1H),3.89−3.70(m,5H),2.87(dd,J=16.5,10.5Hz,1H),2.19(dd,J=16.8,4.6Hz,1H),1.70(d,J=1.3Hz,3H),1.38−1.23(m,3H),1.12(s,10H),1.10(s,8H)。
ジメチルスルホキシド(0.35mL、4.83ミリモル、2.5当量)をアルゴン雰囲気下において−78℃(ドライアイス/アセトン浴)で塩化オキサリル(0.2mL、2.32ミリモル、1.2当量)の乾燥ジクロロメタン溶液(10mL)に滴下添加した。10分後、51(1g、1.93ミリモル)の乾燥ジクロロメタン溶液(8mL)をなお−78℃の温度でゆっくりと添加した。15分後、トリエチルアミン(1.35mL、4Åモレキュラーシーブ上で乾燥、9.65ミリモル、5当量)を滴下添加し、そしてドライアイス/アセトン浴を除去した。反応混合物を室温に到達させ、そして冷塩酸(0.1M)、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去して、生成物52を得た(658mg、66%)。LC/MS,3.52分(ES+)m/z(相対強度)517.14([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,1H),6.75−6.63(m,J=8.8,4.0Hz,2H),5.89−5.64(m,J=9.6,4.1Hz,2H),5.23−5.03(m,2H),4.68−4.38(m,2H),3.84(s,3H),3.83−3.77(m,1H),3.40(s,1H),3.05−2.83(m,1H),2.59(d,J=17.1Hz,1H),1.78(d,J=1.3Hz,3H),1.33−1.16(m,3H),1.09(d,J=2.2Hz,9H),1.07(d,J=2.1Hz,9H)。
t−ブチルジメチルシリルトリフレート(0.70mL、3.00ミリモル、3当量)を、アルゴン下0℃で、化合物52(520mg、1.00ミリモル)及び2,6−ルチジン(0.46mL、4.00ミリモル、4当量)の乾燥ジクロロメタン溶液(40mL)に添加した。10分後、冷浴を除去し、そして反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰分を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;勾配、ヘキサン中10%酢酸エチル〜ヘキサン中20%酢酸エチル)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して、生成物53を得た(540mg、85%)。LC/MS,4.42分(ES+)m/z(相対強度)653.14([M+Na]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(s,1H),6.71−6.64(m,J=5.5Hz,2H),5.83(d,J=9.0Hz,1H),5.80−5.68(m,J=5.9Hz,1H),5.14−5.06(m,2H),4.58(dd,J=13.2,5.2Hz,1H),4.36(dd,J=13.3,5.5Hz,1H),3.84(s,3H),3.71(td,J=10.1,3.8Hz,1H),2.91(dd,J=16.9,10.3Hz,1H),2.36(d,J=16.8Hz,1H),1.75(s,3H),1.31−1.16(m,3H),1.12−1.01(m,J=7.4,2.1Hz,18H),0.89−0.81(m,9H),0.25(s,3H),0.19(s,3H)。
酢酸リチウム(87mg、0.85ミリモル)を化合物53(540mg、0.85ミリモル)の湿潤ジメチルホルムアミド(6mL、50:1DMF/水)溶液に添加した。4時間後、反応が完了し、そして反応混合物を酢酸エチル(25mL)で希釈し、クエン酸水溶液(pH〜3)、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;勾配、ヘキサン中25%〜75%の酢酸エチル)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して生成物54を得た(400mg、定量的)。LC/MS,(3.33分(ES+)m/z(相対強度)475.26([M+H]+,100)。
ジヨードペンタン(0.63mL、4.21ミリモル、5当量)及び炭酸カリウム(116mg、0.84ミリモル、1当量)をフェノール54(400mg、0.84ミリモル)のアセトン(4mL、モレキュラーシーブ上で乾燥)溶液に添加した。次いで、この反応混合物を60℃に加温し、そして6時間攪拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;50/50v/vのヘキサン/酢酸エチル)。純粋な画分を集めて一緒にし、そして過剰な溶離液を除去して55を90%の収率で得た。LC/MS,3.90分(ES+)m/z(相対強度)670.91([M]+,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.23(s,1H),6.69(s,1H),6.60(s,1H),5.87(d,J=8.8Hz,1H),5.83−5.68(m,J=5.6Hz,1H),5.15−5.01(m,2H),4.67−4.58(m,1H),4.45−4.35(m,1H),4.04−3.93(m,2H),3.91(s,3H),3.73(td,J=10.0,3.8Hz,1H),3.25−3.14(m,J=8.5,7.0Hz,2H),2.92(dd,J=16.8,10.3Hz,1H),2.38(d,J=16.8Hz,1H),1.95−1.81(m,4H),1.77(s,3H),1.64−1.49(m,2H),0.88(s,9H),0.25(s,3H),0.23(s,3H)。
トリエチルアミン(2.23mL、18.04ミリモル、2.2当量)を、5℃(氷浴)で、アミン49(4g、8.20ミリモル)及びトリホスゲン(778mg、2.95ミリモル、0.36当量)の乾燥テトラヒドロフラン攪拌溶液(40mL)に加えた。イソシアネート反応の進行を、この反応混合物からアリコートを取り出し、メタノールでクエンチし、そしてLC/MS分析を行うことによって定期的に監視した。イソシアネート形成が完了したら、alloc−Val−Ala−PABOH(4.12g、12.30ミリモル、1.5当量)及びトリエチルアミン(1.52mL、12.30ミリモル、1.5当量)の乾燥テトラヒドロフラン溶液(40mL)を、新たに調製されたイソシアネートに注入により迅速に添加した。反応混合物を4時間にわたって40℃で撹拌した。過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;勾配、ジクロロメタン中1%メタノール〜5%メタノール)。(EtOAc及びヘキサンを使用した別のクロマトグラフィー条件も成功した)。純粋な画分を集めて合わせ、そして過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して生成物56を得た(3.9g、50%)。LC/MS,4.23分(ES+)m/z(相対強度)952.36([M+H]+.,100);1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(br s,1H),8.46(s,1H),7.77(br s,1H),7.53(d,J=8.4Hz,2H),7.32(d,J=8.5Hz,2H),6.76(s,1H),6.57(d,J=7.6Hz,1H),6.17(s,1H),6.03−5.83(m,1H),5.26(dd,J=33.8,13.5Hz,3H),5.10(s,2H),4.70−4.60(m,2H),4.58(dd,J=5.7,1.3Hz,2H),4.06−3.99(m,1H),3.92(s,1H),3.82−3.71(m,1H),3.75(s,3H),2.79−2.64(m,1H),2.54(d,J=12.9Hz,1H),2.16(dq,J=13.5,6.7Hz,1H),1.67(s,3H),1.46(d,J=7.0Hz,3H),1.35−1.24(m,3H),1.12(s,9H),1.10(s,9H),0.97(d,J=6.8Hz,3H),0.94(d,J=6.8Hz,3H),0.87(s,9H),0.07−0.02(m,6H)。
TBSエーテル56(1.32g、1.38ミリモル)を、酢酸/メタノール/テトラヒドロフラン/水の7:1:1:2の混合物(14:2:2:4mL)に溶解させ、そして室温で撹拌した。3時間後、もはや出発物質はLC/MSでは観察されなかった。反応混合物を酢酸エチル(25mL)で希釈し、そして水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物にフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ジクロロメタン中2%メタノール)を行った。純粋な画分を集めて合わせ、過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して所望の生成物57を得た(920mg、80%)。LC/MS,3.60分(ES+)m/z(相対強度)838.18([M+H]+.,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(s,1H),8.35(s,1H),7.68(s,1H),7.52(d,J=8.1Hz,2H),7.31(d,J=8.4Hz,2H),6.77(s,1H),6.71(d,J=7.5Hz,1H),6.13(s,1H),5.97−5.82(m,J=5.7Hz,1H),5.41−5.15(m,3H),5.10(d,J=3.5Hz,2H),4.76−4.42(m,5H),4.03(t,J=6.6Hz,1H),3.77(s,5H),2.84(dd,J=16.7,10.4Hz,1H),2.26−2.08(m,2H),1.68(s,3H),1.44(d,J=7.0Hz,3H),1.30(dt,J=14.7,7.4Hz,3H),1.12(s,9H),1.10(s,9H),0.96(d,J=6.8Hz,3H),0.93(d,J=6.8Hz,3H)。
ジメチルスルホキシド(0.2mL、2.75ミリモル、2.5当量)を、アルゴンの雰囲気下において−78℃(ドライアイス/アセトン浴)で、塩化オキサリル(0.11mL、1.32ミリモル、1.2当量)の乾燥ジクロロメタン溶液(7mL)に滴下して加えた。10分後、57(920mg、1.10ミリモル)の乾燥ジクロロメタン(5mL)溶液を依然として−78℃の温度でゆっくりと添加した。15分後、トリエチルアミン(0.77mL、4Åモレキュラーシーブ上で乾燥、5.50ミリモル、5当量)を滴下添加し、そしてドライアイス/アセトン浴を除去した。反応混合物を室温に到達させ、そして冷塩酸(0.1M)、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及びブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、過剰量のジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル;勾配ジクロロメタン中2%メタノール〜5%メタノール)にかけた。純粋な画分を回収して一緒にし、そして減圧下での回転蒸発によって過剰な溶離液の除去して、生成物58を得た(550mg、60%)。LC/MS,3.43分(ES+)m/z(相対強度)836.01([M]+.,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(s,1H),7.52−7.40(m,2H),7.21−7.08(m,J=11.5Hz,2H),6.67(s,1H),6.60−6.47(m,J=7.4Hz,1H),5.97−5.83(m,1H),5.79−5.66(m,1H),5.38−4.90(m,6H),4.68−4.52(m,J=18.4,5.5Hz,4H),4.04−3.94(m,J=6.5Hz,1H),3.87−3.76(m,5H),3.00−2.88(m,1H),2.66−2.49(m,2H),2.21−2.08(m,2H),1.76(s,3H),1.45(d,J=7.0Hz,3H),1.09−0.98(m,J=8.9Hz,18H),0.96(d,J=6.7Hz,3H),0.93(d,J=6.9Hz,3H)。
t−ブチルジメチルシリルトリフレート(0.38mL、1.62ミリモル、3当量)を、アルゴン下0℃で、化合物58(450mg、0.54 mmol)及び2,6−ルチジン(0.25mL、2.16ミリモル、4当量)の乾燥ジクロロメタン溶液(5mL)に添加した。10分後、冷浴を除去し、そして反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰の溶媒を減圧下での回転蒸発により除去した。得られた三流物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル;50/50v/vのヘキサン/酢酸エチル)にかけた。純粋な画分を回収して一緒にし、そして過剰な溶出液を減圧下での回転蒸発により除去して生成物59を得た(334mg、65%)。LC/MS,4.18分(ES+)m/z(相対強度)950.50([M]+.,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J=8.2Hz,2H),6.72−6.61(m,J=8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97−5.79(m,J=24.4,7.5Hz,2H),5.41−5.08(m,5H),4.86(d,J=12.5Hz,1H),4.69−4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J=6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J=9.6,3.6Hz,1H),2.43−2.09(m,J=34.8,19.4,11.7Hz,3H),1.76(s,3H),1.43(d,J=6.9Hz,3H),1.30−1.21(m,3H),0.97(d,J=6.7Hz,3H),0.92(t,J=8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。
酢酸リチウム(50mg、0.49ミリモル)を化合物59(470mg、0.49ミリモル)の湿潤ジメチルホルムアミド(4mL、50:1DMF/水)溶液に添加した。4時間後、反応が完了し、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、そしてクエン酸(pH〜3)、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィーに付した(シリカゲル;勾配50/50〜25/75(v/v)のヘキサン/酢酸エチル)。純粋な画分を回収して一緒にし、そして過剰な溶出液を減圧下での回転蒸発により除去して生成物60を得た(400mg、定量的)。LC/MS,3.32分(ES+)m/z(相対強度)794.18([M+H]+.,100)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.44(d,J=7.6Hz,2H),7.21(s,1H),7.08(d,J=8.2Hz,2H),6.72−6.61(m,J=8.9Hz,2H),6.16(s,1H),5.97−5.79(m,J=24.4,7.5Hz,2H),5.41−5.08(m,5H),4.86(d,J=12.5Hz,1H),4.69−4.60(m,1H),4.57(s,1H),4.03(t,J=6.7Hz,1H),3.87(s,3H),3.74(td,J=9.6,3.6Hz,1H),2.43−2.09(m,J=34.8,19.4,11.7Hz,3H),1.76(s,3H),1.43(d,J=6.9Hz,3H),1.30−1.21(m,3H),0.97(d,J=6.7Hz,3H),0.92(t,J=8.4Hz,3H),0.84(s,9H),0.23(s,3H),0.12(s,3H)。
炭酸カリウム(70mg、0.504ミリモル、1当量)を55(370mg、0.552ミリモル、1.2当量)及びフェノール60(400mg、0.504ミリモル)の乾燥アセトン(25mL)溶液に添加した。反応物を70℃で8時間撹拌した。LC/MSにより、全ての出発物質が消費されなかったことが示されたため、反応物を室温で一晩撹拌し、そして翌日にさらに2時間攪拌した。アセトンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;ヘキサン中80%酢酸エチル〜100%酢酸エチル)。純粋な画分を集めて合わせ、そして過剰な溶離液を減圧下での回転蒸発により除去して生成物61を得た(385mg、57%)。LC/MS,4.07分(ES+)m/z(相対強度)1336.55([M+H]+.,50)。
フッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(1M、0.34mL、0.34ミリモル、2当量)を61(230mg、0.172ミリモル)の乾燥テトラヒドロフラン(3mL)溶液に添加した。出発材料は10分後には完全に消費された。反応混合物を酢酸エチル(30mL)で希釈し、そして水及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰な酢酸エチルを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物62を次の反応のための粗混合物として使用した。LC/MS,2.87分(ES+)m/z(相対強度)1108.11([M+H]+.,100)。
テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(12mg、0.01ミリモル、0.06当量)を粗生成物62(0.172ミリモル)及びピロリジン(36μL、0.43ミリモル、2.5当量)の乾燥ジクロロメタン(10mL)溶液に添加した。反応混合物を20分間撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、そして飽和塩化アンモニウム水溶液及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物63を次の反応のための粗混合物として使用した。LC/MS,2.38分(ES+)m/z(相対強度)922.16([M+H]+ .,40)。
1−エチル−3−(3’−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI、33mg、0.172ミリモル)を粗生成63(0.172ミリモル)及びMal−(PEG)8酸(100mg、0.172ミリモル)の乾燥ジクロロメタン(10mL)溶液に添加した。反応物を2時間撹拌し、出発物質の存在はもはやLC/MSでは観察されなかった。反応物をジクロロメタンで希釈し、水及びブラインで順次洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして過剰なジクロロメタンを減圧下での回転蒸発により除去した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた(シリカゲル;100%クロロホルム〜クロロホルム中10%メタノール)。純粋な画分を回収して一緒にし、そして過剰な溶出液を減圧下での回転蒸発により除去して、64(E)を得た(60mg、3工程で25%)。
N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、4.71μL、0.0304ミリモル)をアミン65(0.0276ミリモル)及びヨード−(PEG)4−酸(13.1mg、0.0304ミリモル)の乾燥ジクロロメタン(0.8mL)溶液に添加した。反応物を3時間撹拌し、そして出発物質の存在はもはやLC/MSでは観察されなかった。反応混合物を薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート上に直接ロードし、そして分取TLC(クロロホルム中10%メタノール)によって精製した。純粋なバンドをTLCプレートから掻き取り、クロロホルム中10%メタノールに溶解させ、ろ過し、そして過剰の溶離液を減圧下での回転蒸発によって除去して66(D)を得た(20.9mg、56%)。LC/MS、方法2、3.08分(ES+)m/z(相対強度)1361.16([M+H]+,100)。
LCMSデータを、エレクトロスプレーイオン化と共にAgilent6110四重極MSを備えたAgilent1200シリーズLC/MSを用いて得た。移動相A−水中0.1%酢酸。移動相B−アセトニトリル中0.1%。1.00mL/分の流量。勾配を3分かけて5%Bから95%Bに上昇させ、1分間にわたって95%Bで保持し、次いで6秒間で5%Bまで落とす。総実行時間は5分である。カラム:フェノメネックスジェミニ−NX3μmC18、30×2.00mm。クロマトグラムは254nmでのUV検出に基づく。質量スペクトルを、MSをポジティブモードで用いて達成した。プロトンNMR化学シフト値を、Bruker AV400を用いて400MHzでデルタスケールで測定した。以下の略語を用いた:sは一重項、dは二重項、tは三重項、qは四重項、mは多重項;brはブロードである。カップリング定数はHzで報告する。特に明記しない限り、(フラッシュ法による)カラムクロマトグラフィーは、Merck Kieselgelシリカ(Art.9385)で行った。質量分析(MS)データは、Waters2795 HPLC分離モジュールに連結されたWatersマイクロマスLCT機器を用いて収集した。薄層クロマトグラフィー(TLC)をシリカゲルアルミニウムプレート(メルク60、F254)で行った。他の全ての化学物質及び溶媒は、シグマ・オルドリッチ社又はフィッシャーサイエンティフィック社から購入し、さらに精製することなく供給されたまま使用した。
(i)重要な中間体
(a)
アリルクロロホルメート(36.2mL、340.59ミリモル、1.2当量)をL−バリン(I1)(33.25g、283.82ミリモル、1.0当量)及び炭酸カリウム(59.27g、425.74ミリモル、1.5当量)の撹拌水(650mL)及びTHF(650mL)溶液に滴下添加した。次いで、反応混合物を18時間室温で攪拌し、その後溶媒を減圧下で濃縮し、そして残った溶液をジエチルエーテル(3×100mL)で抽出した。水性部分を濃塩酸でpH2に酸性化し、そしてDCM(3×100mL)で抽出した。一緒にした有機物をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、生成物を無色の油状物として得た(57.1g、収率100%と仮定される)。LC/MS(1.966分(ES+)),m/z:202.1 [M+H]+. 1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ12.57(br s,1H),7.43(d,1H,J=8.6Hz),5.96−5.86(m,1H),5.30(ddd,1H,J=17.2,3.4,1.7Hz),5.18(ddd,1H,J=10.4,2.9,1.6Hz),4.48(dt,2H,J=5.3,1.5Hz),3.85(dd,1H,J=8.6,6.0Hz),2.03(oct,1H,J=6.6Hz),0.89(d,3H,J=6.4Hz),0.87(d,3H,J=6.5Hz)。
保護酸I2(60.6g、301.16ミリモル、1.0当量)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(34.66g、301.16ミリモル、1.0当量)の乾燥THF(800mL)撹拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド(62.14g、301.16ミリモル、1当量)を添加した。反応物を室温で18時間撹拌し、次いでこの反応混合物を濾過し、そして固体をTHFで洗浄し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残留物をDCMに再溶解させ、そして0℃で30分間放置した。この懸濁液を濾過し、冷DCMで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮して、生成物を粘性の無色のオイルとして得(84.7g、100%の収率と推定)、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。LC/MS(2.194分(ES+)),m/z:321.0[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ8.0(d,1H,J=8.3Hz),5.97−5.87(m,1H),5.30(ddd,1H,J=17.2,3.0,1.7Hz),5.19(ddd,1H,J=10.4,2.7,1.4Hz),4.52(dt,2H,J=5.3,1.4Hz),4.32(dd,1H,J=8.3,6.6Hz),2.81(m,4H),2.18(oct,1H,J=6.7Hz),1.00(d,6H,J=6.8Hz)。
スクシンイミドエステルI3(12.99g、43.55ミリモル、1.0当量)のTHF(50mL)溶液を、L−アラニン(4.07g、45.73ミリモル、1.05当量)及びNaHCO3(4.02g、47.90ミリモル、1.1当量)のTHF(100mL)及びH2O(100mL)溶液に添加した。この混合物を72時間室温で撹拌し、そのときにTHFを減圧下で除去した。pHをクエン酸で3〜4に調整して白色のガムを沈殿させた。酢酸エチル(6×150mL)で抽出した後に、合わせた有機物をH2O(200mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルで粉砕して、生成物を白色粉末として得、これを濾過により回収し、そしてジエチルエーテルで洗浄した(5.78g、49%)。LC/MS(1.925分(ES+)),m/z:273.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ12.47(br s,1H),8.17(d,1H,J=6.8Hz),7.16(d,1H,J=9.0Hz),5.95−5.85(m,1H),5.29(dd,1H,J=17.2,1.7Hz),5.17(dd,1H,J=10.4,1.5Hz),4.46(m,2H),4.18(quin,1H,J=7.2Hz),3.87(dd,1H,J=9.0,7.1Hz),1.95(oct,1H,J=6.8Hz),1.26(d,3H,J=7.3Hz),0.88(d,3H,J=6.8Hz),0.83(d,3H,J=6.8Hz)。
EEDQ(5.51g、22.29ミリモル、1.05当量)を、p−アミノベンジルアルコール(2.74g、22.29ミリモル、1.05当量)及び酸I4(5.78g、21.23ミリモル、1当量)の乾燥THF(100 mL)溶液に添加し、そして72時間室温で撹拌した。次いで、この反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた茶色の固体をジエチルエーテルで粉砕し、そしてろ過し、その後過剰のジエチルエーテルで洗浄して、生成物をオフホワイトの固体として得た(7.1g、88%)。LC/MS(1.980分(ES+)),m/z:378.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ9.89(br s,1H),8.13(d,1H,J=7.0Hz),7.52(d,2H,J=8.5Hz),7.26(m,1H),7.23(d,2H,J=8.5Hz),5.91(m,1H),5.30(m,1H),5.17(m,1H),4.46(m,2H),5.09(t,1H,J=5.6Hz),4.48(m,2H),4.42(m,3H),3.89(dd,1H,J=8.6,6.8Hz),1.97(m,1H),1.30(d,3H,J=7.1Hz),0.88(d,3H,J=6.8Hz),0.83(d,3H,J=6.7Hz)。
ヨード酢酸無水物(0.250g、0.706ミリモル、1.1当量)の乾燥DCM(1mL)溶液をDCM(1mL)中アミノ−PEG(4)− 酸I6(0.170g、0.642ミリモル、1.0当量)に添加した。この混合物を室温で一晩暗所で撹拌した。この反応混合物を0.1MのHCl、水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム中3%MeOH及び0.1%ギ酸〜クロロホルム中10%MeOH及び0.1%ギ酸)により精製して、生成物をオレンジ色の油状物として得た(0.118g、42%)。LC/MS(1.623分(ES+)),m/z:433.98[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.069(s,1H),7.22(br s,1H),3.79(t,2H,J=5.8Hz),3.74(s,2H),3.72−3.58(m,14H),3.50−3.46(m,2H),2.62(t,2H,J=5.8Hz)。
トリフルオロメタンスルホン酸無水物(28.4g、100.0ミリモル、3.0当量)を、−50℃で、ケトン46(19.5g、30.0ミリモル、1.0当量)の2,6−ルチジン(14.4g、130.0ミリモル、4.0当量)を含むDCM(550 mL)の激しく撹拌した溶液に、25分かけて滴下添加した。この反応混合物を1.5時間撹拌し、そのときにLC/MSが反応の完了を示した。有機相を水(100mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(150mL)、ブライン(50mL)で順次洗浄し、そして有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、90/10(v/v)のn−ヘキサン/酢酸エチル)で精製して、生成物を淡黄色油状物として得た(19.5g、82%)。LC/MS(4.391分(ES+)),m/z:713.25[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),6.72(s,1H),6.02(t,1H,J=1.9Hz),4.75(m,1H),4.05(m,2H),3.87(s,3H),3.15(ddd,1H,J=16.2,10.3,2.3Hz),2.96(ddd,1H,J=16.2,4.0,1.6Hz),1.28−1.21(m,3H),1.07(d,18H,J=7.2Hz),0.88(s,9H),0.09(s,3H),0.08(s,3H)。
テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.41g、0.35ミリモル、0.03当量)を、窒素雰囲気下で、乾燥ジオキサン(60mL)中におけるトリフレート47(8.4g、11.8ミリモル、1.0当量)、E−1−プロペン−1−イルボロン酸(1.42グラム、16.5ミリモル、1.4当量)及びリン酸カリウム(5.0g、23.6ミリモル、2.0当量)の混合物に添加した。この混合物を120分間にわたって25℃で攪拌し、そのときにLC/MSが反応の完了を示した。酢酸エチル(120mL)及び水(120mL)を添加し、有機相を除去し、ブライン(20mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、95/5(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜90/10(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により精製して、生成物を黄色泡状物として得た(4.96g、70%)。LC/MS(4.477分(ES+)),m/z:605.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),6.74(s,1H),5.93(d,1H,J=15.4Hz),5.67(s,1H),4.65(m,1H),4.04(m,2H),3.86(s,3H),2.85(m,1H),2.71(m,1H),1.72(dd,3H,J=6.8,1.0Hz),1.30−1.22(m,3H),1.07(d,18H,J=7.2Hz),0.87(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。
亜鉛粉末(22.0g、0.33モル、37当量)を、氷浴を使用して温度を25〜30℃に維持して、プロペニル中間体67(5.5g、9.1ミリモル、1.0当量)の5%v/vギ酸/エタノール溶液(55mL)に20分かけて少しずつ添加した。30分後、反応混合物をセライト(登録商標)の短い床を通して濾過した。セライト(登録商標)を酢酸エチル(65mL)で洗浄し、一緒にした有機層を水(35mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(35mL)及びブライン(10mL)で連続的に洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、90/10(v/v)のn−ヘキサン/酢酸エチル)で精製して、生成物を淡黄色のオイルとして得た(3.6g、69.0%)。LC/MS(4.439分(ES+)),m/z:575.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.75(m,1H),6.40(br s,1H),6.28(m,1H),6.11(d,1H,J=15.4Hz),5.53(m,1H),4.67(m,1H),4.36(m,2H),3.93(br s,1H),3.84(br s,1H),3.73(s,3H),2.86(dd,1H,J=15.7,10.4Hz),2.73(dd,1H,J=15.9,4.5Hz),1.80(dd,3H,J=6.8,1.3Hz),1.35−1.23(m,3H),1.12(d,18H,J=7.3Hz),0.89(s,9H),0.08(s,3H),0.07(s,3H)。
クロロギ酸アリル(0.83g、6.88ミリモル、1.1当量)を、−78℃で、アミン68(3.6g、6.26ミリモル、1.0当量)の、乾燥ピリジン(1.09g、13.77ミリモル、2.2当量)を含む乾燥DCM(80mL)の溶液に添加した。ドライアイスを除去し、反応混合物を室温にまで加温した。さらに15分間撹拌した後、LC/MSは反応の完了を示した。有機相を0.01NのHCl(50mL)、飽和重炭酸ナトリウム(50mL)、ブライン(10mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮して、淡黄色の油を残し、これをさらに精製することなく次の工程で使用した(4.12g、100%の収率と推定)。LC/MS(4.862分(ES+)),m/z:659.2[M+H]+。
粗中間体69(100%収率と推定、4.12g、6.25ミリモル、1.0当量)を、酢酸(70mL)と、メタノール(10mL)と、THF(10mL)と、水(20mL)との混合物に溶解させ、そして室温で撹拌した。6時間後、反応混合物を酢酸エチル(500mL)で希釈し、そして水(2×500mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(300mL)及びブライン(50mL)で連続的に洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、1/99v/vのメタノール/DCM〜5/95v/vのメタノール/DCM)で精製して、生成物を黄色の油状物として得、そしてさらに未反応の出発材料1gを回収した。この物質を上と同じ反応条件に供したが、ただし16時間撹拌した。ワークアップ及び精製の後、追加の生成物を単離した(2.7g、79%、2段階)。LC/MS(3.742分(ES+)),m/z:545.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(m,1H),7.72(m,1H),6.81(s,1H),6.37(m,1H),6.10(d,1H,J=15.8Hz),5.97(m,1H),5.53(m,1H),5.36(ddd,1H,J=17.2,3.1,1.5Hz),5.25(ddd,1H,J=10.4,2.5,1.3Hz),4.78(m,1H),4.65(dt,2H,J=5.7,1.3Hz),3.84(m,3H),3.79(s,3H),3.04(dd,1H,J=16.7,10.5Hz),2.40(dd,1H,J=16.0,4.5Hz),1.82(dd,3H,J=6.8,1.0Hz),1.36−1.26(m,3H),1.14(d,18H,J=7.3Hz)。
乾燥ジメチルスルホキシド(1.16g、14.87ミリモル、3.0当量)を、窒素雰囲気下−78℃で塩化オキサリル(0.94g、7.43ミリモル、1.5当量)のDCM(25mL)溶液に滴下添加した。−78℃の温度を維持し、10分後に、第一級アルコール70(2.7g、4.96ミリモル、1.0当量)のDCM(20mL)溶液を滴下添加した。さらに15分後、乾燥トリエチルアミン(2.5g、24.78ミリモル、5.0当量)を添加し、そして反応混合物を室温に加温した。反応混合物を0.1Nの冷HCl(50mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(50mL)及びブライン(10mL)で連続的に洗浄し、そして有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して生成物を黄色の油状物として得、これをさらに精製することなく次の工程で使用した(2.68gは、100%の収率と推定)。LC/MS(3.548分(ES+)),m/z:543.2[M+H]+。
t−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(3.93g、14.87ミリモル、3.0当量)を、窒素雰囲気下0℃で、カルビノールアミン71(収率100%と推定、2.68g、4.96ミリモル、1.0当量)、2,6−ルチジン(2.12g、19.83ミリモル、4.0当量)の乾燥DCM(40mL)溶液に添加した。10分後、反応混合物を室温に温め、さらに60分間撹拌した。有機相を水(10mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(10mL)及びブライン(5mL)で順次洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム〜2/98(v/v)のメタノール/クロロホルム)により精製して、生成物を黄色の油状物として得た(2.0g、63%、2工程)。LC/MS(4.748分(ES+)),m/z:657.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(s,1H),6.86(m,1H),6.66(s,1H),6.22(d,1H,J=15.4Hz),5.81(d,1H,J=8.8Hz),5.78(m,1H),5.48(m,1H),5.11(d,1H,J=5.0Hz),5.08(m,1H),4.58(dd,1H,J=13.4,5.4Hz),4.35(dd,1H,J=13.2,5.7Hz),3.83(s,3H),3.76(s,1H),3.00(dd,1H,J=15.6,11.0Hz),2.53(m,1H),1.81(dd,3H,J=6.8,0.9Hz),1.30−1.18(m,3H),1.08(d,9H,J=2.3Hz),1.06(d,9H,J=2.3Hz),0.86(s,9H),0.25(s,3H),0.18(s,3H)。
酢酸リチウム二水和物(0.31g、3.04ミリモル、1.0当量)を25℃でジアゼピン72(2.0g、3.04ミリモル、1.0当量)の湿潤DMF(20mL)溶液に加え、そして4時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル(200mL)で希釈し、そして0.1Mクエン酸(50mL、pH3)、水(50mL)及びブライン(10mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜25/75(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により精製して生成物を淡黄色の固体として得た(0.68g、45%)。LC/MS(3.352分(ES+)),m/z:501.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.02(s,1H),6.66(m,1H),6.53(s,1H),6.03(d,1H,J=15.5Hz),5.80(s,1H),5.63(d,1H,J=8.9Hz),5.55(m,1H),5.29(m,1H),4.87(m,2H),4.39(dd,1H,J=13.5,4.2Hz),4.20(dd,1H,J=13.2,5.7Hz),3.73(s,3H),3.59(m,1H),2.81(dd,1H,J=16.1,10.5Hz),2.35(d,1H,J=15.7Hz),1.61(d,3H,J=6.4Hz),0.67(s,9H),0.05(s,3H),0.00(s,3H)。
ジヨードプロパン(0.295g、1.00ミリモル、5.0当量)及び炭酸カリウム(0.028g、0.20ミリモル、1.0当量)を、フェノール33(0.100g、0.020ミリモル、1.0当量)の乾燥アセトン(5mL)溶液に添加した。反応混合物を6時間にわたり60℃で加熱し、そのときにLC/MSは反応の完了を示した。反応混合物を減圧下で濃縮乾固し残、留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、75/25(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により精製して、生成物を無色の油状物として得た(0.074g、56%)。LC/MS(3.853分(ES+)),m/z:669.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(s,1H),6.90(s,1H),6.68(s,1H),6.24(d,1H,J=15.3Hz),5.87(d,1H,J=8.9Hz),5.78(m,1H),5.53(m,1H),5.12(m,2H),4.65(m,2H),4.41(m,1H),4.11(m,1H),3.93(s,3H),3.81(m,1H),3.40(t,2H,J=6.7Hz),3.05(dd,1H,J=16.3,10.1Hz),2.57(m,1H),2.34(m,2H),1.84(d,3H,J=6.6Hz),0.92(s,9H),0.28(s,3H),0.26(s,3H)。
トリエチルアミン(0.256mL、1.84ミリモル、2.2当量)を、5℃(氷浴)で、アミン68(0.480g、0.835ミリモル、1.0当量)及びトリホスゲン(0.089g、0.301ミリモル、0.36当量)の乾燥THF(15mL)撹拌溶液に添加した。イソシアネート反応の進行を、この反応混合物からアリコートを取り出し、メタノールでクエンチし、そしてLCMS分析を行うことによって定期的に監視した。イソシアネート反応が完了した後に、Alloc−Val−Ala−PABOH I5(0.473g、1.25ミリモル、1.5当量)及びトリエチルアミン(0.174mL、1.25ミリモル、1.5当量)の乾燥THF(10mL)溶液を新たに調製されたイソシアネートに注入によって迅速に添加した。反応物を4時間にわたって40℃で撹拌し、その後室温で一晩撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、20/80(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc、その後1/99(v/v)のDCM/MeOH〜5/95(v/v)のDCM/MeOH)によって精製して、生成物を黄色の固体として得た(0.579g、71%)。LC/MS(4.468分(ES+)),m/z:978.55[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(br s,1H),8.42(s,1H),7.78(br s,1H),7.53(d,2H,J=8.1Hz),7.31(d,2H,J=8.6Hz),6.76(s,1H),6.59(d,1H,J=7.6Hz),6.36(br s,1H),6.04(d,1H,J=15.9Hz),5.90(m,1H),5.55(m,1H),5.33−5.21(m,3H),5.10(s,2H),4.66(m,2H),4.57(dd,2H,J=5.6,1.0Hz),3.98(dd,1H,J=7.3,6.8Hz),3.90(m,1H),3.81(m,1H),3.78(s,3H),2.82(dd,1H,J=15.4,9.6Hz),2.72(dd,1H,J=15.9,3.5Hz),2.17(m,1H),1.78(dd,3H,J=6.5,0.8Hz),1.46(d,3H,J=7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J=7.1Hz),0.97(d,3H,J=6.8Hz),0.92(d,3H,J=6.8Hz),0.83(s,9H),0.04(s,3H),0.01(s,3H)。
シリルエーテル75(1.49g、1.52ミリモル、1.0当量)を酢酸/メタノール/テトラヒドロフラン/水の7:1:1:2混合物(14:2:2:4mL)に溶解し、そして室温で撹拌した。2時間後、反応物をEtOAc(100mL)で希釈し、水、重炭酸ナトリウム水溶液、次いでブラインで順次洗浄した。次いで、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、100/0、その後99/1〜92/8v/vのDCM/MeOH)により精製して、生成物をオレンジ色の固体として得た(1.2g、92%)。LC/MS(3.649分(ES+)),m/z:865.44[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),8.35(s,1H),7.69(br s,1H),7.53(d,2H,J=8.7Hz),7.32(d,2H,J=8.3Hz),6.78(s,1H),6.56(m,2H),6.32(br s,1H),6.05(d,1H,J=14.9Hz),5.90(m,1H),5.56(m,1H),5.30(m,2H),5.22(m,1H),5.10(d,2H,J=3.1Hz),4.73(m,1H),4.64(m,1H),4.57(d,2H,J=5.8Hz),4.01(m,1H),3.79(m,2H),3.76(s,3H),2.98(dd,1H,J=16.3,10.2Hz),2.38(dd,1H,J=16.6,4.1Hz),2.16(m,1H),1.78(dd,3H,J=6.8,0.9Hz),1.46(d,3H,J=7.1Hz),1.29(m,3H),1.11(d,18H,J=7.4Hz),0.97(d,3H,J=6.7Hz),0.92(d,3H,J=6.8Hz)。
乾燥ジメチルスルホキシド(0.180g、2.3ミリモル、3.0当量)を窒素雰囲気下−78℃で塩化オキサリル(0.147g、1.1ミリモル、1.5当量)のDCM(10mL)溶液に滴下添加した。−78℃の温度を維持し、20分後に、第一級アルコール76(0.666g、0.77ミリモル、1.0当量)のDCM(10mL)溶液を滴下添加した。さらに15分後、乾燥トリエチルアミン(0.390g、3.85ミリモル、5.0当量)を添加し、そして反応混合物を室温まで温めた。反応混合物を0.1Nの冷HCl(10mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(10mL)及びブライン(5mL)で順次洗浄した。次いで、有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。次いで残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc〜25/75(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により精製して、生成物を白色の固体として得た(0.356g、54%)。LC/MS(3.487分(ES+)),m/z:862.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(br s,1H),7.47(d,2H,J=7.6Hz),7.17(s,1H),7.14(d,2H,J=7.5Hz),6.86(br s,1H),6.65(br s,1H),6.42(d,1H,J=7.6Hz),6.22(d,1H,J=14.4Hz),5.80(m,1H),5.40(m,1H),5.53(m,1H),5.32(m,1H),5.21(d,2H,J=9.6Hz),5.06(d,1H,J=12.3Hz),4.90(m,1H),4.58(m,3H),3.98(m,1H),3.84(m,1H),3.81(s,3H),3.50(m,1H),3.05(dd,1H,J=16.0,10.3Hz),2.76(m,1H),2.15(m,1H),1.80(dd,3H,J=6.7,0.8Hz),1.44(d,3H,J=7.1Hz),1.16(m,3H),1.01(d,18H,J=6.6Hz),0.96(d,3H,J=6.8Hz),0.92(d,3H,J=6.8Hz)。
t−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(0.46g、1.74mmol、3.0当量)を、窒素雰囲気下0℃で、第二級アルコール77(0.5g、0.58ミリモル、1.0当量)及び2,6−ルチジン(0.25g、2.32ミリモル、4.0当量)の乾燥DCM(10mL)溶液に添加した。10分後、反応混合物を室温まで温め、さらに120分間撹拌した。次いで、有機相を水(10mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(10mL)及びブライン(5mL)で順次洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、50/50(v/v)のn−ヘキサン/EtOAc)により精製して、生成物を白色固体として得た(0.320g、57%)。LC/MS(4.415分(ES+)),m/z:976.52[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(br s,1H),7.48(d,2H,J=8.0Hz),7.21(s,1H),7.14(d,2H,J=8.3Hz),6.89(s,1H),6.65(s,1H),6.38(d,1H,J=7.3Hz),6.25(d,1H,J=14.6Hz),5.93(m,1H),5.85(d,1H,J=8.8Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.24(m,2H),5.15(d,1H,J=12.5Hz),4.86(d,1H,J=12.2Hz),4.62(m,3H),4.01(m,1H),3.86(s,3H),3.78(m,1H),3.04(m,1H),2.56(m,1H),2.20(m,1H),1.84(dd,3H,J=6.6,0.7Hz),1.48(d,3H,J=6.8Hz),1.20(m,3H),1.05(d,9H,J=2.9Hz),1.03(d,9H,J=2.9Hz),0.99(d,3H,J=6.8Hz),0.95(d,3H,J=6.8Hz),0.88(s,9H),0.27(s,3H),0.14(s,3H)。
酢酸リチウム二水和物(0.010g、0.10ミリモル、1.0当量)を、3時間にわたり25℃でシリルエーテル78(0.100g、0.10ミリモル、1.0当量)の湿潤DMF(2mL)溶液に添加した。次いで、反応混合物を酢酸エチル(20mL)で希釈し、そして0.1Mクエン酸(20mL、pH3)、水(20mL)及びブライン(5mL)で連続的に洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、5/95(v/v)のメタノール/DCM)により精製して、生成物を淡黄色油状物として得た(0.070g、83%)。LC/MS(3.362分(ES+)),m/z:820.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(s,1H),7.48(d,2H,J=8.2Hz),7.25(s,1H),7.12(d,2H,J=8.1Hz),6.88(s,1H),6.68(s,1H),6.47(d,1H,J=7.6Hz),6.24(d,1H,J=15.2Hz),6.03(s,1H),5.92(m,1H),5.84(d,1H,J=8.9Hz),5.50(m,1H),5.34(m,1H),5.26(m,2H),5.18(d,1H,J=12.3Hz),4.80(d,1H,J=12.4Hz),4.66−4.60(m,3H),4.02(m,1H),3.95(s,3H),3.81(m,1H),3.03(m,1H),2.57(m,1H),2.19(m,1H),1.84(dd,3H,J=6.8,0.8Hz),1.48(d,3H,J=7.1Hz),1.00(d,3H,J=6.8Hz),0.95(d,3H,J=6.8Hz),0.87(s,9H),0.26(s,3H),0.12(s,3H)。
炭酸カリウム(0.030g、0.21ミリモル、1.0当量)をフェノール79(0.175g、0.21ミリモル、1.0当量)及びヨードリンカー74(0.214g、0.32ミリモル、1.5当量)のアセトン(10mL)溶液に添加した。反応混合物を17時間にわたり密閉フラスコ中において75℃で窒素雰囲気下に加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮乾固し、フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、2/98v/vのメタノール/DCM〜5/95v/vのメタノール/DCM)により精製して、生成物を淡黄色の固体として得た(0.100g、35%)。LC/MS(4.293分(ES+)),m/z:1359.13[M]+。
フッ化テトラ−n−ブチルアンモニウム(1M、0.22mL、0.22ミリモル、2.0当量)をシリルエーテル80(0.150g、0.11ミリモル、1.0当量)の乾燥THF(2mL)溶液に添加した。反応混合物を室温で20分間攪拌し、その後LC/MSは反応の完了を示した。反応混合物を酢酸エチル(10mL)で希釈し、水(5mL)及びブライン(5mL)で順次洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮して黄色の固体が残った。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、6/94v/vのメタノール/ DCM〜10/90v/vのメタノール/DCM)によって精製して、生成物を淡黄色の固体として得た(0.090g、73%)。LC/MS(2.947分(ES+)),m/z:1154.0 [M+Na]+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.39(br s,1H),7.39(d,2H,J=7.6Hz),7.18(d,2H,J=10.6Hz),7.10(m,3H),6.86(d,2H,J=10.0Hz),6.74(s,1H),6.55(s,1H),6.22(dd,2H,J=15.3,6.6Hz),5.85(m,2H),5.74(m,3H),5.52(m,2H),5.22(m,1H),5.00(m,2H),4.57(m,6H),4.41(m,2H),4.09(m,4H),3.85(m,11H),3.06(m,2H),2.76(m,2H),2.20(m,2H),2.08(m,1H),1.79(d,6H,J=6.4Hz),1.40(d,3H,J=6.1Hz),0.90(m,6H)。
テトラキス(トリフェニルホスフェン)パラジウム(0)(0.005g、0.005ミリモル、0.06当量)を、ビス−カルビノールアミン81(0.090g、0.08ミリモル、1.0当量)及びピロリジン(16μL、0.20ミリモル、2.5当量)の乾燥DCM(5mL)溶液に添加した。20分後、反応混合物をDCM(10mL)で希釈し、そして飽和塩化アンモニウム(5mL)及びブライン(5mL)で順次洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして溶媒を減圧下で除去して淡黄色の固体として粗生成物が残り、これをさらに精製することなく次の工程で使用した(0.075g、100%の収率と推定)。LC/MS(2.060分(ES+)),m/z:947.2[M+H]+。
EDCI(0.015g、0.08ミリモル、1.0当量)を、アミン65(収率100%と推定、0.075g、0.08ミリモル、1.0当量)及びヨードアセトアミド−PEG4−酸I7(0.034g、0.08ミリモル、1.0当量)の乾燥ジクロロメタン(5mL)溶液に添加し、そしてこの反応物を暗所で攪拌した。50分後、追加量のヨードアセトアミド−PEG4−酸I7(0.007g、0.016ミリモル、0.2当量)を追加量のEDCI(0.003g、0.016ミリモル、0.2当量)と共に添加した。合計2.5時間後に、この反応混合物をジクロロメタン(15mL)で希釈し、水(10mL)及びブライン(10mL)で順次洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、そして減圧下で濃縮した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム100%〜90:10v/vのクロロホルム:メタノール)により精製した。純粋な画分を併せて生成物を得た(0.0254g、23%、2工程)。これらの粗画分を集め、そして分取TLCによって精製(シリカゲル、90:10v/vのクロロホルム:メタノール)して、生成物の第2バッチを得た(0.0036g、3%、2工程)。LC/MS(2.689分(ES+)),m/z:681.0 1/2[M+2H]+。
K562アッセイ
K562ヒト慢性骨髄性白血病細胞を、5%CO2を含む加湿雰囲気中において37℃で、10%ウシ胎児血清及び2mMグルタミンを補充したRPM11640培地中で維持し、そして暗所において37℃で1時間又は96時間にわたり特定の用量の薬剤と共にインキュベートした。このインキュベーションを遠心分離(5分、300g)で停止させ、そして細胞を、薬剤を含まない培地で1回洗浄した。適切な薬剤処理の後に、細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに移した(ウェル当たり104個の細胞、サンプル当たり8ウェル)。次いで、プレートを、5%のCO2を含む加湿雰囲気中において37℃で暗所において保持した。このアッセイは、生細胞が黄色の可溶性テトラゾリウム塩の3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(MTT、シグマアルドリッチ)を不溶性の紫色ホルマザン沈殿物に還元する能力に基づくものである。4日間にわたるプレートのインキュベーション後(対照細胞の数を約10倍増加させるため)、20μLのMTT溶液(リン酸緩衝生理食塩水中5mg/mL)を各ウェルに加え、そしてプレートをさらに5時間インキュベートした。次いで、プレートを300gで5分間遠心分離し、そして培地の大部分をウェル当たり10〜20μLを残して細胞ペレットからピペットで移した。DMSO(200μL)を各ウェルに添加し、そしてサンプルを、完全な混合を確実にするように撹拌した。その後、光学密度をタイターテックマルチスキャンELISAプレートリーダーにより550nmの波長で読み取り、そして用量応答曲線を作成した。それぞれの曲線について、IC50値を、最終光学密度を対照値の50%に減少させるのに必要な用量として読み取った。
一般的な抗体結合手順
抗体を、還元緩衝液(例:リン酸緩衝生理食塩水PBS、ヒスチジン緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液、TRIS緩衝液)で1〜5mg/mLに希釈する。TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)の新たに調製された溶液を添加してシステインジスルフィド架橋を選択的に減少させる。TCEPの量は、抗体当たり1〜4モル当量以内で還元目標レベルに比例し、2〜8個の反応性チオールを生成する。37℃で数時間還元した後、この混合物を室温まで冷却し、そして過剰の薬剤−リンカー(A、B、C、D、E)を希釈DMSO溶液として添加した(反応混合物の10%容量/容量までの最終DMSO含有量)。混合物を穏やかに、適切な時間、一般に1〜3時間にわたって4℃又は室温で振盪した。過剰の反応性チオールは、結合の終了時にN−エチルマレイミド(NEM)のような「チオールキャッピング剤」と反応できる。抗体−薬剤結合体を、10kDa以上の分子量カットオフを有する遠心スピンフィルターを用いて濃縮し、次いで接線流濾過(tFF)又は高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によって精製する。対応する抗体−薬剤結合体を、逆相クロマトグラフィー(RP)又は疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)をUV−可視、蛍光又は質量分析計検出と共に使用して薬剤当たりの抗体比(DAR)を評価するために高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又は超高性能液体クロマトグラフィー(UHPLC)によって分析することによって決定できる;凝集体レベル及び単量体純度は、サイズ排除クロマトグラフィーをUV可視、蛍光又は質量分析計検出とと共に使用するHPLC又はUHPLCによって分析できる。最終結合体濃度を、分光(280、214及び330nmでの吸光度)及び生化学的アッセイ(ビシンコニン酸アッセイBCA;Smith,P.K.,外(1985)Anal.Biochem.150 (1):76−85;基準として既知濃度のIgG抗体を使用)の組み合わせにより決定する。抗体−薬剤結合体を、一般に無菌条件下で0.2μmフィルターを使用して濾過滅菌し、そして+4℃、−20℃又は−80℃で保存する。
抗体又はADC(35μL中約35μg)を10μLのホウ酸緩衝液(100mM、pH8.4)及び5μLのDTT(水中0.5M)に添加することによって還元させ、そして15分間にわたり37℃で加熱した。サンプルを1容量のアセトニトリル:水:ギ酸(49%:49%:2%v/v)で希釈し、そして80℃でWidepore 3.6μXB−C18 150×2.1mm(P/N 00F−4482−AN)カラム(Phenomenex社Aeris)に、UPLCシステム(島津製作所Nexera)で、75%緩衝液A(水、トリフルオロ酢酸(0.1%v/v)(tFA))、25%緩衝液B(アセトニトリル:水:TFA90%:10%:0.1%v/v)で平衡化された1ml/分の流量で注入した。結合した物質を10分で25%から55%までの緩衝液Bの勾配を使用して溶離させた。214nmでのUV吸収のピークを積分した。次のピークを、各ADC又は抗体に対して同定した:天然の抗体の軽鎖(L0)、天然の抗体の重鎖(H0)及び薬剤−リンカーが付加されたこれらの鎖のそれぞれ(1の薬剤を有する軽鎖についてはL1及び1、2又は3の結合薬剤−リンカーを有する重鎖についてはH1、H2、H3と標識)。330 nmでのUVクロマトグラムを、薬剤−リンカーを含有する断片の同定のために使用した(すなわち、L1、H1、H2、H3)。
抗体A((配列番号7と対になった配列番号1である可変ドメインを含む)を薬剤リンカーAに結合させてConjA−Aを得、そしてDARは、2.35であると測定された。
細胞培養
WSU−DLCL2及びSU−DHL−1細胞は、微生物細胞培養のライプニッツ研究所DSMZ−ドイツコレクションからのものであった。Ramos及びDaudi細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞培養培地は、L−グルタミン及び10%FBSを補充したRPMI1640であった。細胞を加湿インキュベーター中において37℃、5%CO2で増殖させた。
懸濁細胞の培養液(1×106/mlまでで)の濃度及び生存率を、トリパンブルーで1:1混合し、そして透明(生)/青(死)細胞を血球計数器で計数することによって決定した。細胞懸濁液を、必要な播種密度(一般に105/ml)にまで希釈し、そして96ウェル平底プレートに分注した。アラマーブルーアッセイについては、100μl/ウェルをブラックウェルプレートに分注した。MTSアッセイについては、50μL/ウェルを透明なウェルプレートに分注した。ADC(20μg/ml)のストック溶液(1ml)を、フィルター滅菌ADCを細胞培養培地に希釈することによって作製した。ストックADCの8×10倍希釈のセットを、細胞培養培地900μlに100μlをシリアル転送することにより24ウェルプレートで作製した。それぞれのADC希釈(アラマーブルーについては100μl/ウェル、MTSについては50μL/ウェル)を、細胞懸濁液を含む96ウェルプレートの4つの複製ウェルに分注した。対照ウェルには、同じ量の培地のみを与えた。4日間のインキュベーション後、細胞生存率をアラマーブルー又はMTSアッセイのいずれかにより測定しました。
RB4v1.2−Aの有効性をCD19+ve細胞株、Daudi、Ramos及びWSU−DLCL2に対して試験した。CD19−veコントロールとして、SU−DHL−1細胞を使用した。
CD19+(ve)ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株Ramosを使用して、生体内でRB4v1.2のために最も可能性の高いPBD薬剤リンカーを決定した。抗体を、上記のようにA、E又はD薬剤リンカーに結合させ、そしてRamos異種移植片モデルで試験した。非CD19結合コントロールとして、A又はEに結合された抗HIVgp120の抗体、B12を使用した。同時に、PBD頭部なしのRB4v1.2で観察される任意の潜在的な抗腫瘍活性を調査するために、RB4v1.2を、チューブリン阻害剤として作用するメイタンシノイド誘導体であるDM4への結合を生体内で試験した。
薬剤及び処置:
・脇腹において0%マトリゲル皮下でI xRamos−SPN腫瘍細胞を有するCR雌NCr nu/nuマウスをセットアップする。
・細胞注入量は0.1mL/マウスである。
・開始日における年齢:8〜12週間。
・腫瘍が100〜150mm3の平均サイズに達したときにペアマッチを実行し、そして治療を開始する。
・体重:1日4回×5、その後終了まで二週間。
・キャリパー測定:終了まで二週間。
・任意の副作用又は死亡を直ちに報告する。
・>30%の体重減少が1回観察された又は>25%の体重減少が3回連続して測定された任意の個々の動物を安楽死させる。
・>20%の平均体重減少又は>10%の死亡率の2つの測定値を有する任意の群は、投与を中止する。この群は安楽死されず、回復が可能となる。>20%の重量減少を有する群内では、個々の体重減少の終点に当たる個体を安楽死させる。群の治療に関連する体重減少が元の体重の10%以内に回復した場合には、投与をより低い用量又はより少ない頻度の投薬スケジュールで再開することができる。非処置体重回復(%)の例外を、ケースバイケースで許可することができる。
・終点TGD。動物を個別に監視すべきである。実験の終点は、2000mm3の腫瘍体積又は60日であり、最初に来たいずれかである。レスポンダーをさらに長く追跡することができる。終点に達したときには、動物を安楽死させなければならない。
群平均腫瘍容積の算出については、次の規則を適用した:動物が腫瘍のサイズのため調査を終了したときに、この動物について記録された最終的な腫瘍体積を、その後の時点での平均体積を算出するために使用されたデータと共に含めた。エラーバーは、平均標準誤差(SEM)を示す。腫瘍体積値は、群中に50%未満の動物しかその研究では残ならかった場合には群平均腫瘍体積を算出するためには使用しなかった。プリズム(カリフォルニア州サンディエゴのグラフパッド社)を図形表現及び統計分析のために使用した。
図4は、RB4v1.2−ADCに対する薬剤リンカー選択を示す。実験群当たりの平均腫瘍体積が0.1cm3に達したときにマウスに投与し、そしてマウスを、尾静脈にIVを介して0.3及び1mg/kg(結合ADCについて)並びに1mg/kg(非結合ADCについて)でのADCの単回投与で処置した。データは、各群における10匹のマウスからの平均腫瘍体積(±SEM)を表す。
Ac アセチル
Acm アセトアミドメチル
Alloc アリルオキシカルボニル
Boc ジ−t−ブチルジカーボネート
t−Bu t−ブチル
Bzl ベンジル、この場合、Bzl−OMeはメトキシベンジルであり、Bzl−Meはメチルベンゼンである
Cbz又は Zベンジルオキシカルボニル、この場合、Z−Cl及びZ−Brは、それぞれクロロベンジルオキシカルボニル及びブロモベンジルオキシカルボニルである
DMF N,N−ジメチルホルムアミド
Dnp ジニトロフェニル
DTT ジチオトレイトール
Fmoc 9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル
Imp N−10イミン保護基:3−(2−メトキシエトキシ)プロパノエートヴァル−Val−Ala−PAB
MC−OSu マレイミドカプロイル−O−N−スクシンイミド
Moc メトキシカルボニル
MP マレイミドプロパンアミド
Mtr 4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル
PAB p−アミノベンジルオキシカルボニル
PEG エチレンオキシ
PNZ p−ニトロベンジルカルバメート
Psec 2−(フェニルスルホニル)エトキシカルボニル
TBDMS t−ブチルジメチルシリル
TBDPS t−ブチルジフェニルシリル
Teoc 2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニル
Tos トシル
Troc 塩化2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル
Trt トリチル
Xan キサンチル
配列番号1 (RB4v1.0 VH):
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQRPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFKGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
配列番号2 (RB4v1.2 VH):
QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVS
配列番号3 (B43 VH):
QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLRSEDSAVYSCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVT
配列番号4 (HD37 VH):
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVS
配列番号5 (4G7 VH):
EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVS
配列番号6 (FMC63 VH):
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVS
SEQ ID NO.7 (RB4v1.0 VK):
EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIK
配列番号8 (RB4v1.2 VK):
EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIK
配列番号9 (B43 VK):
ELVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
配列番号10 (HD37 VK):
DILLTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
配列番号11 (4G7 VK):
DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELK
配列番号12 (FMC63 VK):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
Claims (114)
- 式L−(DL)pの結合体であって、該DLは、次式I又はIIである:
Lは、CD19に結合する抗体である抗体(Ab)であり、該抗体は、配列番号1、2、3、4、5又は6のいずれかの配列を有するVHドメインを含み、任意に配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかの配列を有するVLドメインをさらに含み;
C2’とC3’との間に二重結合が存在する場合には、R12は次のものよりなる群から選択され:
(ia)ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、C1~7アルキル、C3~7ヘテロシクリル及びビス−オキシ−C1~3アルキレンよりなる群から選択される1個以上の置換基で置換されていてよいC5~10アリール基;
(ib)C1~5飽和脂肪族アルキル基;
(ic)C3~6飽和シクロアルキル;
(id)
(ie)
(if)
C2’とC3’との間に単結合が存在する場合には、
R12は
R6及びR9は、独立して、H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、ニトロ、Me3Sn及びハロから選択され;
ここで、R及びR’は、独立して、置換されていてよいC1~12アルキル、C3~20ヘテロシクリル及びC5~20アリール基から選択され;
R7’は、H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NHRR’、ニトロ、Me3Sn及びハロから選択され;
R”は、鎖が1個以上のヘテロ原子、例えばO、S、NRN2(ここでRN2は、H又はC1~4アルキルである)及び/又は芳香環、例えばベンゼン又はピリジンによって中断されていてよいC3~12アルキレン基であり;
Y及びY’は、O、S、又はNHから選択され;
R6’、R7’、R9’は、それぞれR6、R7及びR9と同じ基から選択され;
[式I]
RL1’は、抗体(Ab)への結合のためのリンカーであり;
R11aは、OH、ORA(ここで、RAは、C1~4アルキルである。)及びSOzM(ここで、zは2又は3であり、Mは一価の薬学的に許容される陽イオンである。)から選択され;
R20及びR21は、一緒になって、これらが結合している窒素原子と炭素原子の間に二重結合を形成し;
R20はH及びRCから選択され、ここで、RCはキャッピング基であり;
R21はOH、ORA及びSOzMから選択され;
C2とC3との間に二重結合が存在する場合には、R2は、次のものよりなる群から選択され:
(ia)ハロ、ニトロ、シアノ、エーテル、カルボキシ、エステル、C1~7アルキル、C3~7ヘテロシクリル及びビス−オキシ−C1~3アルキレンよりなる群から選択される1個以上の置換基で置換されていてよいC5~10アリール基;
(ib)C1~5飽和脂肪族アルキル基;
(ic)C3~6飽和シクロアルキル;
(id)
(ie)
(if)
C2とC3との間に単結合が存在する場合には、
R2は
[式II]
R22は、次式IIIa、次式IIIb又は次式IIIcであり:
(a)
(i)Q1は単結合であり、Q2は単結合及び−Z−(CH2)n−から選択され、ここで、Zは単結合、O、S及びNHから選択され、nは1〜3であり;又は
(ii)Q1は−CH=CH−であり、Q2は単結合である;
(b)
RC1、RC2及びRC3は、独立して、H及び非置換C1~2アルキルから選択され;
(c)
Xは次のものよりなる群から選択され:O−RL2’、S−RL2’、CO2−RL2’、CO−RL2’、NH−C(=O)−RL2’、NHNH−RL2’、CONHNH−RL2’、
RL2’は抗体(Ab)への結合のためのリンカーであり;
R10及びR11は、一緒になって、それらが結合している窒素原子と炭素原子間に二重結合を形成し;又は
R10はHであり、R11はOH、ORA及びSOzMから選択され;
R30及びR31は、一緒になって、それらが結合している窒素原子と炭素原子の間に二重結合を形成し;
R30はHであり、R31はOH、ORA及びSOzMから選択される。 - 前記結合体が次のものではない、請求項1に記載の結合体:
ConjA
- R7がH、OH及びORから選択される、請求項1又は2に記載の結合体。
- R7がC1~4アルキルオキシ基である、請求項3に記載の結合体。
- YがOである、請求項1〜4のいずれかに記載の結合体。
- R”がC3~7アルキレンである、請求項1〜5のいずれかに記載の結合体。
- R9がHである、請求項1〜6のいずれかに記載の結合体。
- R6がH及びハロから選択される、請求項1〜7のいずれかに記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12がC5~7アリール基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R12がフェニルである、請求項9に記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12がC8~10アリール基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R12が1〜3個の置換基を保持する、請求項9〜11のいずれかに記載の結合体。
- 前記置換基がメトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビスオキシメチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ及びメチルチオフェニルから選択される、請求項9〜12のいずれかに記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12がC1~5飽和脂肪族アルキル基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R12がメチル、エチル又はプロピルである、請求項16に記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12がC3~6飽和シクロアルキル基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R12がシクロプロピルである、請求項16に記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12が次式の基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- 前記R12基における炭素原子の総数が4以下である、請求項18に記載の結合体。
- 前記R12基における炭素原子の総数が3以下である、請求項19に記載の結合体。
- R21、R22及びR23の一つがHであり、他の二つの基がH、C1~3飽和アルキル、C2~3アルケニル、C2~3アルキニル及びシクロプロピルから選択される、請求項18〜20のいずれかに記載の結合体。
- R21、R22及びR23の二つがHであり、その他の基がH、C1~3飽和アルキル、C2~3アルケニル、C2~3アルキニル及びシクロプロピルから選択される、請求項18〜20のいずれかに記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12が次式の基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R12が次の基である、請求項23に記載の結合体。
- C2’とC3’との間に二重結合が存在し、R12が次式の基である、請求項1〜8のいずれかに記載の結合体。
- R24がH、メチル、エチル、エテニル及びエチニルから選択される、請求項25に記載の結合体。
- R24がH及びメチルから選択される、請求項26に記載の結合体。
- C2’とC3’との間に単結合が存在し、R12が
- C2’とC3’との間に単結合が存在し、R12が
- C2’とC3’との間に単結合が存在し、R12が
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R2がC5~7アリール基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R2がフェニルである、請求項31に記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R1がC8~10アリール基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R2が1〜3個の置換基を保持する、請求項31〜33のいずれかに記載の結合体。
- 前記置換基がメトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビスオキシメチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ及びメチルチオフェニルから選択される、請求項31〜34のいずれかに記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R2がC1~5飽和脂肪族アルキル基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R2がメチル、エチル又はプロピルである、請求項36に記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R2がC3~6飽和シクロアルキル基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R2がシクロプロピルである、請求項38に記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R12が次式の基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- 前記R2基における炭素原子の総数が4以下である、請求項40に記載の結合体。
- 前記R2基における炭素原子の総数が3以下である、請求項41に記載の結合体。
- R11、R12及びR13の一つがHであり、他の二つの基がH、C1~3飽和アルキル、C2~3アルケニル、C2~3アルキニル及びシクロプロピルから選択される、請求項40〜42のいずれかに記載の結合体。
- R11、R12及びR13の二つがHであり、その他の基がH、C1~3飽和アルキル、C2~3アルケニル、C2~3アルキニル及びシクロプロピルから選択される、請求項40〜42のいずれかに記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R2が次式の基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R2が次の基である、請求項45に記載の結合体。
- C2とC3との間に二重結合が存在し、R2が次式の基である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R14がH、メチル、エチル、エテニル及びエチニルから選択される、請求項48に記載の結合体。
- R24がH及びメチルから選択される、請求項48に記載の結合体。
- C2とC3との間に単結合が存在し、R2が
- C2とC3との間に単結合が存在し、R2が
- C2とC3との間に単結合が存在し、R2が
- R11aがOHである、請求項1〜52のいずれかに記載の結合体。
- R21がOHである、請求項1〜53のいずれかに記載の結合体。
- R21がOMeである、請求項1〜53のいずれかに記載の結合体。
- R20がHである、請求項1〜55のいずれかに記載の結合体。
- R20 がRCである、請求項1〜55のいずれかに記載の結合体。
- RCがAlloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz及びPNZよりなる群から選択される、請求項57に記載の結合体。
- RCが次の基である、請求項57に記載の結合体:
- G2がAc若しくはMocであり又はAlloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz及びPNZよりなる群から選択される、請求項60に記載の結合体。
- R20及びR21が一緒になってこれらが結合する窒素原子と炭素原子との間に二重結合を形成する、請求項1〜53のいずれかに記載の結合体。
- R22が式IIIaのものであり、Aがフェニルである、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R22が式IIaのものであり、Q1が単結合である、請求項1〜30及び請求項63のいずれかに記載の結合体。
- Q2が単結合である、請求項63に記載の結合体。
- Q2が−Z−(CH2)n−であり、ZがO又はSであり、nが1又は2である、請求項63に記載の結合体。
- R22が式IIIaのものであり、Q1が−CH=CH−である、請求項1〜30及び請求項63のいずれかに記載の結合体。
- R22が式IIIbのものであり、RC1、RC2及びRC3が独立してH及びメチルから選択される、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- RC1、RC2及びRC3が全てHである、請求項68に記載の結合体。
- RC1、RC2及びRC3が全てメチルである、請求項68に記載の結合体。
- R22が式IIIa又はIIIbのものであり、XがO−RL2’、S−RL2’、CO2−RL2’、−N−C(=O)−RL2’及びNH−RL2から選択される、請求項1〜30及び請求項63〜70のいずれかに記載の結合体。
- XがNH−RL2’である、請求項71に記載の結合体。
- R22が式IIIcのものであり、QがNRN−RL2’である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- RNがH又はメチルである、請求項73に記載の結合体。
- R22が式IIIcのものであり、QがO−RL2’又はS−RL2’である、請求項1〜30のいずれかに記載の結合体。
- R11がOHである、請求項1〜30及び請求項63〜75のいずれかに記載の結合体。
- R11がOMeである、請求項1〜30及び請求項63〜75のいずれかに記載の結合体。
- R10がHである、請求項1〜30及び請求項63〜77のいずれかに記載の結合体。
- R10及びR11が一緒になってこれらが結合する窒素原子と炭素原子との間に二重結合を形成する、請求項1〜30及び請求項63〜75のいずれかに記載の結合体。
- R31がOHである、請求項1〜30及び請求項63〜79のいずれかに記載の結合体。
- R31がOMeである、請求項1〜30及び請求項63〜79のいずれかに記載の結合体。
- R30がHである、請求項1〜30及び請求項63〜81のいずれかに記載の結合体。
- R30及びR31が一緒になってこれらが結合する窒素原子と炭素原子との間に二重結合を形成する、請求項1〜30及び請求項63〜79のいずれかに記載の結合体。
- R6’、R7’、R9’及びY’がR6、R7、R9及びYと同一である、請求項1〜83のいずれかに記載の結合体。
- L−RL1’又はL−RL2’が次の基である、請求項1〜84のいずれかに記載の結合体:
- L1が酵素切断可能である、請求項85に記載の結合体。
- L1がアミノ酸の連続配列を含む、請求項85又は86に記載の結合体。
- L1がジペプチドを含み、ジペプチド中の基−X1−X2−、すなわち−NH−X1−X2−CO−が次のものから選択される、請求項87に記載の結合体:
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−、
−Val−Cit−、
−Phe−Cit−、
−Leu−Cit−、
−Ile−Cit−、
−Phe−Arg−、
−Trp−Cit−。 - ジペプチド中の基−X1−X2−、すなわち−NH−X1−X2−CO−が次のものから選択される、請求項88に記載の結合体:
−Phe−Lys−、
−Val−Ala−、
−Val−Lys−、
−Ala−Lys−、
−Val−Cit−。 - ジペプチド中の基−X1−X2−、すなわち−NH−X1−X2−CO−が−Phe−Lys−、−Val−Ala−又は−Val−Cit−である、請求項89に記載の結合体。
- 前記基X2−CO−がL2に結合している、請求項88〜90のいずれかに記載の結合体。
- 前記基NH−X1−がAに結合している、請求項88〜91のいずれかに記載の結合体。
- L2がOC(=O)と共に自壊性リンカーを形成する、請求項88〜92のいずれかに記載の結合体。
- −C(=O)O−及びL2が一緒になって次の基を形成する、請求項93に記載の結合体:
- YがNHである、請求項94に記載の結合体。
- nが0である、請求項94又は95に記載の結合体。
- L1及びL2が−OC(=O)−と共に、次のものから選択される基を形成する、請求項95に記載の結合体:
ここで、アスタリスクは前記PBDへの結合点を示し、波線はリンカーL1の残部への結合点又はAへの結合点を示す。 - 前記波線がAへの結合点を示す、請求項97に記載の結合体。
- Aが、
(i)
(ii)
(ここで、アスタリスクはL1への結合点を示し、波線は前記抗体への結合点を示し、nは0〜30である。)
である、請求項85〜98のいずれかに記載の結合体。 - 次式ConjA、ConjB、ConjC、ConJD又はConjEの請求項1に記載の結合体:
ConjA
- 前記抗体がVLドメインと対になったVHドメインを含み、該VH及びVLドメインは、次よりなる群から選択される配列を有する請求項1〜100のいずれかに記載の結合体:
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号1;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号2;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号3;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号4;
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号5;及び
配列番号7、8、9、10、11又は12のいずれかと対になった配列番号6。 - 前記対になったVH及びVLドメインが次の配列を有する請求項101に記載の結合体:配列番号7と対になった配列番号1、配列番号8と対になった配列番号2、配列番号9と対になった配列番号3、配列番号10と対になった配列番号4、配列番号11と対になった配列番号5又は配列番号12と対になった配列番号6。
- 前記抗体がそのままの抗体である、請求項1〜102のいずれかに記載の結合体。
- 前記抗体がヒト化、脱免疫化又は再表面化されている、請求項1〜103のいずれかに記載の結合体。
- 抗体(Ab)に対する薬剤(D)の薬剤負荷(p)が1〜約8の整数である、請求項1〜104のいずれかに記載の結合体。
- Pが1、2、3又は4である、請求項105に記載の結合体。
- 前記抗体−薬剤結合体化合物の混合物を含み、前記抗体−薬剤結合体化合物の混合物中における抗体当たりの平均薬剤負荷が約2〜約5である、請求項105に記載の結合体。
- 治療に使用するための、請求項1〜107のいずれかに記載の結合体。
- 被験体における増殖性疾患の治療に使用するための、請求項1〜107のいずれかに記載の結合体。
- 前記疾患が癌である、請求項109に記載の結合体。
- 請求項1〜107のいずれかに記載の結合体と、薬学的に許容される希釈剤、キャリア又は賦形剤とを含む医薬組成物。
- 化学療法剤の治療有効量をさらに含む、請求項111に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜107のいずれかに記載の結合体の、被験体における増殖性疾患の治療に使用するための薬剤の製造における使用。
- 被検体に請求項111に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
- 前記被検体に、前記結合体と組み合わせて化学療法剤を投与する、請求項114に記載の方法。
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