JP2007505627A - eIF4E発現の調整 - Google Patents

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Abstract

eIF4Eの発現を調整するためのオリゴマー化合物、組成物、および方法が提供される。アンチセンス化合物は、一本鎖または二本鎖であってもよく、eIF4Eをコードする核酸にターゲットされてもよい。eIF4E発現を調整するために、およびeIF4Eの発現と関連した疾患および症状を診断並びに処置するために、これらの化合物を使用する方法が提供される。

Description

本発明は、eIF4Eの発現を調整するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、一本鎖または二本鎖アンチセンス化合物、特にeIF4Eをコードする核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。このような化合物は、eIF4Eの発現を調整することを本明細書において示してある。
真核生物遺伝子発現は、細胞が広範な異なる条件に迅速に応答することができるように調節されなければならない。mRNA翻訳のプロセスは、遺伝子発現が高度に調節される一つの段階である。ホルモン、成長因子、サイトカイン、および栄養素との反応において、動物細胞は、一般に増殖反応に備えて翻訳を活性化する。タンパク質合成速度は、典型的には、酸化的または浸透圧性ストレス、DNA損傷、または栄養素離脱などのストレスの多い条件下において減少する。mRNA翻訳の活性化または抑制は、数分で生じ、このプロセスを通じた制御は、タンパク質合成の開始期に及ぶと考えられる(Rosenwaldら、Oncogene,1999,18,2507−2517;StrudwickおよびBorden,Differentiation,2002,70,10−22)。
翻訳開始は、いくつかの真核生物の開始因子(eIFs)(古典的には、これらが細胞質に位置すること、およびタンパク質合成の開始期を調節する能力によって定義されたタンパク質)の活性の調整を必要とする。これらの因子の一つ、真核生物開始因子4E(eIF4E)(真核生物翻訳開始因子4E、真核生物翻訳開始因子4E様1(eIF4EL1)、キャップ結合タンパク質(CBP)、およびメッセンジャーRNAキャップ結合タンパク質としても知られる)は、最初に翻訳に関与する25kDaのmRNAキャップ結合タンパク質として単離され(Rychlikら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,945−949)、以来、最も高度に特徴づけられたeIFsのうちの一つとなった。eIF4Eは、その他の開始因子と比較して限られた量が存在し、eIF4F開始複合体の1つの成分であり、また、骨格タンパク質eIF4GおよびRNAヘリカーゼeIF4Aで構成されている。細胞質において、eIF4Eは、ほとんど全ての成熟細胞mRNAに存在する5’末端7−メチルGpppXキャップ構造に対して特異的に結合することにより、キャップ依存的なタンパク質合成の律速段階を触媒し、これは、mRNAをeIF4F複合体に送達するのに役立つ。一旦結合すると、eIF4F複合体は、キャップの5’から3’末端へ走査して、eIF4AのRNAヘリカーゼ活性により5’非翻訳の領域(UTR)に存在する任意の二次構造を分解し、こうして翻訳開始コドンを明らかにして、mRNAに対するリボソームのロードを容易にする(Graffら、Clin.Exp.Metastasis,2003,20,265−273;Strudwickら、Differentiation,2002,70,10−22)。
eIF4E複合体へ組み入れるためのeIF4E利用の可能性は、リン酸化を介して、並びに阻害タンパク質の結合を介して調節される。eIF4Eは、分裂促進因子で活性化されるプロテインキナーゼ相互作用キナーゼMnk1によってセリン209でリン酸化されるリンタンパク質である(Flynnら、J.Biol.Chem.,1995,270,21684−21688;Wangら、J.Biol.Chem.,1998,273,9373−9377;およびWaskiewiczら、Embo J.,1997,16,1909−1920)。eIF4Eのリン酸化は、mRNAキャップに対するその親和性を増大し、したがって、翻訳速度を上昇させる(Waskiewiczら、Mol.Cell Biol.1999,19 1871−1880)。ホルボールエステル、細胞ストレス、およびサイトカインによるeIF4Eのリン酸化の増大は、p38分裂促進因子−活性化(MAP)キナーゼおよび/またはErkシグナリング経路を含み、これが次々にMnk1活性を刺激する。熱ショック、ソルビトール、および過酸化水素などのその他のストレスは、p38 MAPキナーゼを刺激し、Mnk1活性を増大するが、しかし、これらの刺激は、eIF4E結合タンパク質1(4E−BP1)に対するeIF4Eの結合を増大する(Wangら、J.Biol.Chem.,1998,273,9373−9377)。eIF4Eに対する4E−BP1の結合は、Mnk1によるeIF4Eのリン酸化をブロックする(Wangら、J.Biol.Chem.,1998,273,9373−9377)。4E結合タンパク質1および2は、eIF4Eの背面に対する結合に関して、eIF4Gと競合することによって有効な翻訳阻害剤として作用する(Ptushkinaら、Embo J.,1999,18,4068−4075)。MTORによる結合タンパク質のリン酸化は、これらのeIF4Eからの分離を引き起こして、eIF4E活性が可能になる。
ますます多くの観察により、翻訳因子が、核に、並びに細胞質に局在化して機能することを示唆する。転写および翻訳は、伝統的に、真核生物においては、空間的に分離されていると考えられるが;しかし、対になった転写とび翻訳が、哺乳動物細胞の核において観察される(Iborraら、Science,2001,293,1139〜1142)。一部分のeIF4Eは、核に局在化し、この翻訳因子が、核における翻訳を通じて、その制御の一部を示し得ることを示唆している(Lejbkowiczら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,612−9616)。eIF4Eは、核細胞質輸送タンパク質eIF4E−輸送体(4E−T)によって、インポルチンα/β経路を介して核に輸入される(Dostieら、Embo J.,2000,19,3142−3156)。核において、eIF4Eは、哺乳類細胞増殖およびアポトーシスの重要な調節因子である前骨髄球性白血病タンパク質(PML)に直接結合することができる(Cohenら、Embo J.,2001,20,4547−4559)。PMLは、そのRINGドメインを介して、mRNAの5’キャップに対するその親和性を非常に減少させることによって、eIF4E活性を調整する(Cohenら、Embo J.,2001,20,4547−4559)。
過剰のeIF4Eにより、全体的な高い翻訳速度に至ることはなく、むしろ選択的に、血管内皮成長因子(VEGF)、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子(ODC)、およびサイクリンD1などの増殖刺激因子を含むeIF4E感受性のものとして分類されるmRNAによってコードされるタンパク質の合成を増大する(Kevilら、Int.J.Cancer,1996,65,785−790;Rosenwald,Cancer Lett.,1995,98,77−82;およびShantzら、Cancer Res.,1994,54,2313−2316)。ODCおよびVEGFタンパク質レベルは、翻訳開始の増大を介して上昇される一方で、サイクリンD1レベルは、細胞質へのサイクリンD1 mRNAの多量の輸送によって上昇する(Kevilら、Int.J.Cancer,1996,65,785−790;Rosenwald,Cancer Lett.,1995,98,77−82;Rousseauら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,1065−1070)。従って、翻訳開始における役割を有することに加えて、eIF4Eは、mRNA核原形質の輸送にも影響を及ぼすことができる。
eIF4Eの機能は、全体的な細胞タンパク質合成および増殖に必須な決定因子である(De Benedettiら、Mol.Cell.Biol.,1991,11,5435−5445)。正常細胞において、eIF4Eは、限られた量が存在し、これが翻訳を制限する。細胞の増殖および生存のために必要なタンパク質をコードするmRNAは、典型的には複雑な高度に構築された5’UTRを含み、これらのmRNAを翻訳に関して乏しい基質にしてしまう。しかし、これらのmRNAの多くは、過剰なeIF4Eの存在下では十分に翻訳され、さらに腫瘍によってもアップレギュレートされる(GraffおよびZimmer,Clin.Exp.Metastasis,2003,20,265−273)。また、上皮肺腫瘍細胞株を含むいくつかの分化している細胞株において、eIF4Eのレベルの増大が見いだされるため、細胞分化に関連したmRNAの翻訳は、eIF4Eによって増強される可能性がある(Walshら、Differentiation,2003,71,126−134)。
eIF4Eの過剰発現は、多くのヒト癌および癌由来細胞株において報告されており、さらに細胞の腫瘍化転換および動物モデルにおける浸潤性/転移性表現型を生じる。形質転換されていない、培養細胞とは異なり、形質転換された細胞株は、血清成長因子の存在とは無関係にeIF4Eを発現する(Rosenwald,Cancer Lett.,1995,98,77−82)。過剰のeIF4Eは、HeLa細胞において異常増殖および新生物の形態を引き起こし、更に足場非依存的な増殖、培養における形質転換された病巣の形成、およびヌードマウスにおける腫瘍形成によって判断される、NIH 3T3およびRat2線維芽細胞の腫瘍化を生じさせる(De Benedettiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,8212−8216;およびLazaris−Karatzasら、Nature,1990,345,544−547)。さらにまた、eIF4Eを過剰発現する細胞によって示される腫瘍性形質転換は、ODCの翻訳の増大と関連する(Lazaris−Karatzasら、Nature,1990,345,544−547)。加えて、eIF4E発現の増大と関連するサイクリンD1の核外移行の上昇は、形質転換活性に直接結びついている(Cohenら、Embo J.,2001,20,4547−4559)。これらの知見は、過剰に存在するときは、eIF4Eが増殖調節mRNAの発現または核外移行を増大することができることを実証する。結果として、影響を受けた細胞は、正常な増殖制御メカニズムに非依存的に増殖することができる。srcチロシンキナーゼ腫瘍性タンパク質を形質転換した細胞では、eIF4Eリン酸化の増強が観察されており、eIF4E活性の上昇が、過剰発現に加えて、形質転換された細胞における増殖調節の減少に寄与することを示唆している(Fredericksonら、Mol.Cell.Biol.,1991,11,2896−2900)。
eIF4Eは、非ホジキンリンパ腫、結腸腺腫、癌腫、並びに喉頭癌、頭頸部癌、前立腺癌、乳癌、および膀胱癌を含むが、これらに限定されないいくつかのヒト癌において上昇が見いだされる(Crewら、Br.J.Cancer,2000,82,161−166;Graffら、Clin.Exp.Metastasis,2003,20,265−273;Haydonら、Cancer,2000,88,2803−2810;Kerekatteら、Int.J.Cancer,1995,64,27−31;Rosenwaldら、Oncogene,1999,18,2507−2517;Wangら、Am.J.Pathol.,1999,155,247−255)。eIF4Eのアップレギュレーションは、結腸発癌における初期のイベントであり、サイクリンD1レベルの増加を伴うことが多い(Rosenwaldら、Oncogene,1999,18,2507−2517)。また、過剰のeIF4Eは、頭頸部癌腫の腫瘍再発の信頼できる判断材料であり、浸潤性膀胱癌腫において選択的にアップレギュレートされ、喉頭扁平上皮癌における乏しい組織学的段階およびより高度な転移状態と相関している(Crewら、Br.J.Cancer,2000,82,161−166;Liangら、Laryngoscope,2003,113,1238−1243;およびNathanら、Oncogene,1997,15,579−584)。これらの知見は、eIF4Eの高いレベルが癌の進行、並びに開始に関与することを示唆する。
eIF4E発現および活性の阻害は、アンチセンス機構の使用を介して達成された。3’−オーバーハンギング・ヌクレオチドを備えたアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、5’−キャップされたオリゴリボヌクレオチドに対するeIF4Eの結合を調整する(Bakerら、J.Biol.Chem.,1992,267,11495−11499)。eIF4Eの翻訳開始領域の20ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを発現するように設計されたエピソーム・ベクターのHeLa細胞への導入により、eIF4Eのレベルが減少し、同時に細胞増殖およびタンパク質合成の速度を減少させ、eIF4Eが細胞増殖に必要とされることを実証する(Bommerら、Cell.Mol.Biol.Res.,1994,40,633−641;De Benedettiら、Mol.Cell.Biol.,1991,11,5435−5445)。eIF4F複合体の骨格タンパク質成分のeIF4Gのレベルも減少される。eIF4E阻害に続く翻訳レベルの減少にもかかわらず、一定のタンパク質が合成され続け、これらの多くが、ストレス誘導性または熱ショックタンパク質として同定された(Joshi−Barveら、J.Biol.Chem.,1992,267,21038−21043)。同じベクターが、ラット胚線維芽細胞においても50〜60パーセントまでeIF4Eを減少し、これらの細胞のrasを媒介した形質転換および腫瘍形成を阻害するために十分である(Graffら、Int.J.Cancer,1995,60,255−263;Rinker−Schaefferら、Int.J.Cancer,1993,55,841−847)。さらに、ODC翻訳およびポリアミン輸送も減少し、この観察は、rasで誘導される悪性化、eIF4E活性、およびポリアミン代謝の間の関連を提供する(Graffら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,1997,240,15−20)。eIF4Eアンチセンス・ベクターでの乳癌株および頭頸部扁平上皮癌細胞株の安定な形質転換により、線維芽細胞成長因子−2(FGF−2)の発現の減少、並びにマウスにおける細胞の腫瘍化および血管形成能の阻害を生じ、腫瘍血管新生におけるeIF4Eの思いがけない役割を示唆している(DeFattaら、Laryngoscope,2000,110,928−933;Nathanら、Oncogene,1997,15,1087−1094)。
若い成虫に注射された小さな干渉RNAによるヒトeIF4Eの線虫相同体、IFE−3のターゲットされた不活性化は、子孫の100%において胎児死亡を引き起こす(Keiperら、J.Biol.Chem.,2000,275,10590−10596)。また、eIF4Eにターゲットされる小干渉二本鎖RNAは、eIF4E制御の欠如が細胞形質転換に関与することを明らかにした。ヒトeIF4Eの一部のコード領域にターゲットされる遺伝子特異的な21ヌクレオチドの小干渉RNAを使用したeIF4Eの機能的な不活性化により、悪性胆管細胞の足場非依存的な増殖(形質転換された細胞に付随する表現型)の有意な減少を生じる。加えて、悪性胆管細胞におけるeIF4Eのリン酸化は、p38 MAPキナーゼ・シグナリングに依存的であり、p38 MAPキナーゼ・シグナリングと胆管癌増殖進行におけるタンパク質合成の制御との間の結びつきを実証している(Yamagiwaら、Hepatology,2003,38,158−166)。
eIF4E活性の阻害が細胞の腫瘍化の可能性を減少することのさらなる証拠は、eIF4E阻害剤4EBP−1の恒常的に活性な形態を発現する乳癌細胞において見られ、サイクリンD1のダウンレギュレーションおよびサイクリン依存的キナーゼp27Kip1のアップレギュレーションに付随して細胞周期停止に至る(Jiangら、Cancer Cell Int.,2003,3,2)。eIF4Eレベルが正常組織におけるよりも有意に高い胃腸癌における4E−BP1の過剰発現は、遠隔転移の減少と関連がある(Martinら、Int.J.Biochem.Cell.Biol.,2000,32,633−642)。
米国特許第5,646,009号は、1つのDNAセグメントがeIF4E、eIF4E因子、またはこれらの変異体からなるキャップ結合タンパク質をコードするハイブリッド・ベクターを請求し、開示する。また、この特許は、ヒトeIF4Eをコードする核酸配列を開示する。
癌細胞に対して、その発現を制御するプロモータに関して3’から5’配向にヒトeIF4Eを含む群より選択される遺伝子のコード配列の少なくとも12ヌクレオチドを含むアンチセンス構築物を投与することによって患者の癌を治療するための方法が、米国特許第6,171,798号に開示されている。
米国特許第6,596,854号は、ヒトeIF4Eの変異体をコードする単離された核酸分子であって、前記変異体が、アミノ酸112および114−121、または位置118もしくは位置119、または位置115または位置121の領域にアミノ酸置換を有する核酸分子を主張し、開示する。
欧州の公開特許公報第1 033 401号および日本国の公開特許公報第2001269182号は、ヒトeIF4Eをコードする核酸分子の一部を含むEST関連配列の群から選択される配列の少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む精製された核酸を主張する。また、これらの刊行物は、遺伝子治療に使用するためのアンチセンス構築物およびオリゴヌクレオチドの調製並びに使用を開示する。
PCT刊行物国際公開公報第01/96388号および国際公開公報第01/96389号は、以下から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドを開示し、および請求する:ヒトeIF4Eをコードする核酸分子を含む配列表に提供された配列、配列の相補物、配列の少なくとも20個の隣接する残基からなる配列、配列にハイブリダイズする配列、または配列に少なくとも75%もしくは少なくとも95%の同一性を有する配列を開示する。また、この刊行物は、患者に対して請求されたポリヌクレオチドの組成物を投与することを含む、患者における癌の治療のための方法を請求する。
PCT刊行物国際公開公報第03/039443号は、ヒトeIF4E核酸分子を含む群より選択されるマーカーに対応するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド相補物を薬学的化合物と混合することを特徴とする、白血病の治療のための薬学的組成物の調製のための方法を主張し、開示する。
米国付与前公開(U.S.pre−grant publication)第20030087852号は、eIF4EアンチセンスmRNAをコードするプラスミドおよびこのプラスミドでトランスフェクトされた培養マウス細胞を開示する。
eIF4Eを含む、本発明の核酸配列もしくはタンパク質の発現を減少し、またはなくすために使用してもよいアンチセンス分子が、米国プレ研究費刊行物第20030144190号に開示されている。また、eIF4EアンチセンスmRNAおよびこのプラスミドを恒常的に発現するプラスミドをコードする培養ラット線維芽細胞も開示されている。
多くの疾患におけるeIF4E関与の結果として、効率的にeIF4Eを調節することができるさらなる薬剤の必要が長く感じられたままである。したがって、eIF4E発現のアップレギュレーションがこのように多くの異なるタイプの癌と関連していることを考えると、阻害は、特に癌の治療で重要である。
アンチセンス技術は、特異的な遺伝子産物の発現を減少させるための有効な手段であり、多くの治療的、診断的、および研究的適用において独特に有用であることが証明されてきた。本発明は、eIF4E発現を調整するための組成物および方法を提供する。
発明の概要
本発明は、eIF4Eをコードする核酸分子にターゲットされ、かつeIF4Eの発現を阻害するアンチセンス化合物およびこれらの薬学的に許容される塩などのオリゴマー化合物に向けられる。オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドを含むRNA様またはDNA様のオリゴマー化合物であってもよい。オリゴマー化合物は、一本鎖または部分的に、もしくは完全に二本鎖オリゴマー化合物であってもよく、化学的に修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。また、これらの化合物を含む薬学的組成物およびその他の組成物も提供される。
eIF4Eのモジュレーターをスクリーニングする方法、および細胞、組織、または動物におけるeIF4Eの発現を調整する方法であって、前記細胞、組織、または動物を本発明の化合物または組成物のうちの1つもしくは複数と接触させることを含む方法がさらに提供される。また、動物、特にヒトを治療する方法も本明細書に記載される。このような方法は、本発明の化合物または組成物の1つもしくは複数の治療的または予防的に有効な量を投与することを含む。
発明の詳細な説明
A. 本発明の概要
本発明は、eIF4Eをコードする核酸分子の機能または効果を調整するために使用するための、アンチセンス化合物、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、および同様の種などのオリゴマー化合物を使用する。これは、eIF4Eをコードする1つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を提供することによって達成される。本明細書に使用される「標的核酸」および「eIF4Eをコードする核酸分子」という用語は、便宜上、eIF4EをコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(これらのプレmRNAおよびmRNAまたは一部を含む)、更にはこのようなRNAに由来するcDNAを包含するために使用した。これにハイブリダイズする化合物による、この標的核酸の機能の調整は、一般に「アンチセンス」といわれている。
干渉されるDNAの機能は、複製および転写を含むことができる。複製および転写は、たとえば内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構築物、またはその他に由来することができる。干渉されるRNAの機能は、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位置、RNA合成部位から遠く離れた細胞内部位へのRNAの転位置、RNAからのタンパク質の翻訳、およびRNAに関与し、またはRNAによって容易にされ得る、RNAに関与する触媒活性または複合体形成などの機能を含むことができる。標的核酸機能とのこのような干渉の1つの結果は、eIF4Eの発現の調整である。本発明の状況において、「調整」および「発現の調整」は、遺伝子をコードする核酸分子、たとえばDNAもしくはRNAの量またはレベルの増大(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。阻害は、発現の調整の1つの形態であり、たいていmRNAが標的核酸となる。
本発明の状況において、「ハイブリダイゼーション」は、実質的にオリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の1つの機構は、水素結合を含み、これは、オリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基(核酸塩基)間のワトソン−クリック、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。たとえば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、いろいろな状況下で生じさせることができる。
アンチセンス化合物は、標的核酸に対する化合物の結合が、標的核酸の正常機能を妨害して活性の減少を生じさせるときに、「特異的にハイブリダイズ可能」であり、特異的な結合が要求される条件下で、すなわちインビボアッセイ法または治療的処置の場合には生理学的条件下で、およびインビトロでのアッセイ法の場合にはアッセイ法が行われる条件下で、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するために十分な程度の相補性がある。
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という句は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列の最小数にしかハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なり、本発明の状況において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする状態での「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成並びにこれらが調査されるアッセイ法によって決定される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Na++またはK++などの無機カチオンとの低濃度(<0.15M)の塩(すなわち低イオン強度)、オリゴマー化合物:標的配列複合体のTm以下の20℃〜25℃より高い温度、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗浄剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの変性剤の存在を含む。たとえば、ハイブリダイゼーション率は、それぞれ1%のホルムアミドについて1.1%減少する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、0.1×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)/0.1%(w/v)SDS、60℃で30分間である。
本明細書に使用される「相補的」は、1つまたは2つのオリゴマー鎖上の2つの核酸塩基間で正確に対形成する能力をいう。たとえば、アンチセンス化合物の一定の位置の核酸塩基が、標的核酸の一定の位置において核酸塩基と水素結合することができる場合(前記標的核酸は、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である)、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。オリゴマー化合物、およびさらなるDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子は、それぞれの分子中の相補的位置において十分な数が核酸塩基によって占められており、これらが互いに水素結合することができるときは、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、オリゴマー化合物と標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が生じるように、十分な数の核酸塩基にわたる正確な対形成または十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸に対して100%相補的である必要はないことが当技術分野において理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメント(たとえば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造)がハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、1つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。本発明のオリゴマー化合物は、これらがターゲットされる標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも約70%、または少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約99%の配列相補性を含む。たとえば、アンチセンス化合物の20核酸塩基のうちの18個が、標的領域に対して相補的であり、従って特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性を示す。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補核酸塩基とクラスターを形成するか、または点在していてもよく、互いに、もしくは相補核酸塩基に隣接する必要はない。したがって、標的核酸と完全に相補的な2つの領域に隣接する4つの非相補的核酸塩基を有する長さが18核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8%の全体的相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に入る。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当技術分野において公知のBLASTプログラム(塩基の局部的整列検索ツール)およびPowerBLASTプログラム(Altschulら、J.Mol.Biol.,1990,215,403−410;Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649−656)を使用してルーチンで決定することができる。パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、たとえば、デフォルト設定を使用して、SmithおよびWarwemanのアルゴリズム(Adv.Appl.Math.,1981,2,482−489)を使用するギャップ・プログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison WI)によって決定することができる。
また、本発明のオリゴマー化合物は、化合物のヌクレオチド位置の1つまたは複数に異なる塩基が存在する変異体を含む。たとえば、第1のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン、またはシチジンを含む変異体を作製してもよい。これは、アンチセンス化合物の任意の位置で行ってもよい。次いで、これらの化合物をこれらがeIF4E mRNAの発現を阻害する能力を決定するための本明細書に記載されている方法を使用して試験する。
いくつかの態様において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性、または相補性は、約50%〜約60%である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約60%〜約70%である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約70%〜約80%である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約80%〜約90%である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または約100%である。
B. 本発明の化合物
本発明の状況において、「オリゴマー化合物」という用語は、核酸分子の領域にハイブリダイズすることができる重合体構造をいう。この用語は、これらのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬態、およびキメラ組み合わせを含む。オリゴマー化合物は、通常直線状に調製されるが、環状に連結すること、またはさもなければ調製することができ、また分枝を含んでいてもよい。オリゴマー化合物は、たとえば、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する2つの鎖、または十分な自己相補性をもち、完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成が可能な一本鎖などの二本鎖構築物を含むことができる。本発明の一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、短い干渉RNA(siRNAs)を包含する。本明細書で使用される「siRNA」という用語は、第1および第2の鎖を有する二本鎖化合物として定義され、前記第1と第2の鎖の間の中心的相補的部分と、任意に前記第1と第2の鎖の間に、または標的mRNAと相補である末端部とを含む。それぞれの鎖は、約8〜約80核酸塩基の長さ、10〜50核酸塩基の長さ、12もしくは13〜30核酸塩基の長さ、12もしくは13〜24核酸塩基の長さ、または19〜23核酸塩基の長さであってもよい。中心的相補的部分は、約8〜約80核酸塩基の長さ、10〜50核酸塩基の長さ、12もしくは13〜30核酸塩基の長さ、12もしくは13〜24核酸塩基の長さ、または19〜23核酸塩基の長さであってもよい。末端部は、1〜6核酸塩基の長さであることができる。また、siRNAsは、末端部を有していなくてもよい。siRNAの2本の鎖は、内部に3’もしくは5’末端を残したままで連結することができ、または連続的なヘアピン構造もしくはループを形成するように連結することができる。ヘアピン構造は、5’または3’末端のいずれかに一本鎖文字の伸張を生じるオーバーハングを含んでいてもよい。
本発明の一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、標準的siRNAsである。本明細書に使用される「標準的siRNA」という用語は、それぞれの鎖が21核酸塩基の長さであって、鎖が19核酸塩基にわたって相補的である第1の鎖および第2の鎖を有し、かつそれぞれの鎖のそれぞれの3’末端に、二本鎖化合物において3’オーバーハングとして作用するデオキシチミジンダイマー(dTdT)を有する二本鎖オリゴマー化合物として定義される。
もう一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、平滑末端化されたsiRNAsである。本明細書に使用される、「平滑末端化されたsiRNA」という用語は、末端オーバーハングを有さないsiRNAとして定義される。すなわち、二本鎖化合物の少なくとも1つの末端は、平滑である。siRNAsは、標準的または平滑であるかにかかわらず、dsRNAse酵素を導いて、RNAiアンチセンス機構の動員または活性化をトリガーするように作用する。さらなる態様において、RNAiアンチセンス機構を経て作用する一本鎖RNAi(ssRNAi)化合物も想定される。
二本鎖化合物に対してさらなる修飾を行うことができ、末端のうちの1つに、選択された核酸塩基位置、糖位置、またはヌクレオシド間結合のうちの1つに付着された抱合基を含んでもよい。あるいは、2つの鎖を非核酸部分またはリンカー基を経て連結することができる。1本の鎖だけから形成されるときは、dsRNAは、自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成することができる。従って、dsRNAは、完全に、または部分的に二本鎖であることができる。2本の鎖、または自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成する1本の鎖から形成されるときは、2本の鎖(または1本の鎖の二重鎖形成領域)は、ワトソン−クリック法で塩基対形成する相補的RNA鎖である。
本発明によれば、「アンチセンス化合物」は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、siRNA化合物などの一本鎖または二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、および少なくとも標的核酸の一部にハイブリダイズし、その機能を調整するその他のオリゴマー化合物を含む。したがって、これらは、DNA、RNA、DNA様、RNA様、もしくはこれらの混合物であってもよく、またはこれらの1つもしくは複数の擬態であってもよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物であってもよく、および内部または末端隆起、ミスマッチ、またはループなどの構造エレメントを含んでもよい。アンチセンス化合物は、通常直鎖状に調製されるが、環状および/または分枝状に連結すること、またはさもなければ調製することができる。アンチセンス化合物は、たとえば、ハイブリダイズして、完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物を形成する2本の鎖、または完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成が可能な十分な自己相補性を有する一本鎖などの構築物を含むことができる。2本の鎖は、内部に3’もしくは5’末端を残したままで連結することができ、または連続的なヘアピン構造もしくはループを形成するように連結することができる。ヘアピン構造は、5’または3’末端のいずれかに一本鎖文字の伸張を生じるオーバーハングを含んでいてもよい。二本鎖化合物は、任意に末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端のうちの一方に、選択された核酸塩基位置、糖位置、またはヌクレオシド間結合のうちの一方に付着された抱合基を含むことができる。あるいは、2つの鎖は、非核酸部分またはリンカー基を経て連結することができる。1本の鎖だけから形成されるときは、dsRNAは、自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成することができる。従って、dsRNAは、完全に、または部分的に二本鎖であることができる。遺伝子発現の特異的な阻害は、トランスジェニック細胞株におけるdsRNAヘアピンの安定な発現によって達成することができる(Hammondら、Nat.Rev.Genet.,1991,2,110−119;Matzkeら、Curr.Opin.Genet.Dev.,2001,11,221−227;Sharp,Genes Dev.,2001,15,485−490)。2本の鎖、または自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成する1本の鎖から形成されるときは、2本の鎖(または1本の鎖の二重鎖形成領域)は、ワトソン−クリック法で塩基対形成する相補的RNA鎖である。
一旦系に導入されると、本発明の化合物は、1つもしくは複数の酵素または構造タンパク質の作用を導き出して、標的核酸の切断もしくはその他の修飾を行ってもよく、または占有に基づいた機構を経て作用してもよい。一般に、核酸(オリゴヌクレオチドを含む)は、「DNA様」(すなわち、一般に1つまたは複数の2’−デオキシ糖、および一般にUよりもむしろT塩基を有する)または「RNA様」のもの(すなわち、一般に1つまたは複数の2’−ヒドロキシルまたは2’−修飾された糖、および一般にTよりもむしろU塩基を有する)として記載され得る。核酸ヘリックスは、複数の型の構造、最も一般的にはAおよびB型構造を採用することができる。一般に、B型様構造の構造を有するオリゴヌクレオチドは、「DNA様」であり、A型様構造を有するものは、「RNA様」と考えられる。いくつかの(キメラ)態様において、アンチセンス化合物は、AおよびB型領域の両方を含んでいてもよい。
標的核酸を修飾する酵素の一つの例は、RNAse H(RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼ)である。当技術分野において、約3または4つの連続した核酸塩基よりも長い「DNA様」領域(たとえば、2’−デオキシ領域)を含む一本鎖アンチセンス化合物は、RNAse Hを動員することができることが公知である。従って、RNase Hの活性化により、RNA標的の切断を生じ、これによりオリゴヌクレオチドを媒介した遺伝子発現の阻害の効率が非常に増強する。近年、dsRNAseは、RNA干渉(RNAi)プロセスにおいて観察されるRNA:RNA二重鎖のRNA鎖の切断に関与するという仮説がなされた。
アンチセンス化合物の1つの十分に受け入れられた形態は、一本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、その他の状況において、二重鎖RNAまたはこれらの類似体も有用である。多くの種において、二重鎖RNA(二本鎖RNA)分子などの二本鎖建造物の導入は、機能の強力かつ特異的な、遺伝子またはその関連する遺伝子産物のアンチセンスを媒介した減少を誘導することが示された。この現象は、植物および動物の両方において生じ、進化的にウイルスの防御およびトランスポゾン・サイレンシングと関連を有すると考えられている(Guoら、Cell,1995,81,611−620;Montgomeryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,15502−15507)。二重鎖RNA(二本鎖RNA)に対する曝露によって生じる線虫において定義される転写後アンチセンス機構は、それ以来RNA干渉(RNAi)と称された。この用語は、内因性のターゲットされたmRNAレベルの配列特異的な減少を生じるdsRNAの導入を含むアンチセンスを媒介した遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された(Fireら、Nature,1998,391,806−811)。RNAi化合物は、短い干渉RNAまたはsiRNAsと称されることが多い。近年では、これが、実際に、RNAiの強力な誘導因子であるdsRNAのアンチセンスポラリティーの一本鎖RNAオリゴマーであることが示された(Tijstermanら、Science,2002,295,694−697)。RNAi化合物(すなわち、一本鎖もしくは二本鎖RNAまたはRNA様化合物)および一本鎖RNase H依存的アンチセンス化合物は両方とも、塩基対形成(すなわち、ハイブリダイゼーション)によってこれらのRNAターゲットに結合して、特異的RNAsesによる標的RNAの部位特異的切断を誘導する;すなわち、両方ともアンチセンス機構を経て作用する。Vickersら、J.Biol.Chem.,2003,278,7108−7118。
本発明の状況において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)および/またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーもしくは重合体、またはこれらの擬態、キメラ、類似体、または相同体をいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合ヌクレオシド間(バックボーン)結合、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾されたか、または置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増大などの望ましい性質のため、天然の形態以上に望まれることが多い。
本発明に従ったアンチセンス化合物は、約8〜約80核酸塩基の長さのアンチセンス部分(すなわち約8〜約80の連結されたヌクレオシド)を含む。これは、アンチセンス鎖の全長またはアンチセンス化合物の一部をいう。言い換えると、本発明の一本鎖アンチセンス化合物は、8〜約80核酸塩基を含み、本発明の二本鎖アンチセンス化合物(たとえば、dsRNAなど)は、8〜約80核酸塩基の長さのアンチセンス鎖または一部を含む。当業者であれば、これが、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、もしくは80核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を含むことを理解するであろう。
一つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、10〜50核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
一つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、12または13〜30核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
一部の態様において、本発明のアンチセンス化合物は、12または13〜24核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24の核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
一部の態様において、本発明のアンチセンス化合物は、19〜23核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが19、20、21、22、もしくは23核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
例示したアンチセンス化合物から選択される少なくとも8つの連続した核酸塩基のひと配列を含む長さのアンチセンス化合物8〜80核酸塩基も、同様に適切なアンチセンス化合物であると考えられる。
例示的な化合物は、例示のアンチセンス化合物のうちの1つの5’末端から少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む(残りの核酸塩基は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズ可能な、アンチセンス化合物の5’末端のすぐ上流で開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続したひと配列である)。その他の化合物は、例示のアンチセンス化合物のうちの1つの3’末端から少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表される(残りの核酸塩基は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズ可能な、アンチセンス化合物の3’末端のすぐ下流で開始し、オリゴヌクレオチドが約8〜約80核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続したひと配列である)。また、化合物は、例示の化合物の配列の内部部分からの少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表されてもよく、オリゴヌクレオチドが約8〜80核酸塩基を含むまで、一方向または両方向に伸長してもよいことが理解される。
本発明のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、核酸塩基配列5’−AGTCGCCATCTTAGATCGAT−3’(配列番号:454)または5’−AGUCGCCAUCUUAGAUCGAU−3’(配列番号:455)を含まないことに留意すべきである。 さらに、本発明によって包含されるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、本明細書に開示された特定のヌクレオチド配列からなり、本質的になり、または含むことができる。「本質的になる」、「本質的になっている」等の句は、本発明によって包含されるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩に適用されるときは、本明細書に開示したものなどのヌクレオチド配列をいうが、これは、さらなるヌクレオチド(本明細書において論議したリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの類似体もしくは誘導体)を含む。しかし、このようなさらなるヌクレオチドは、本明細書に開示された対応するオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩に対応するパラメーターと比較して、eIF4E遺伝子発現またはRNA機能(これらの分子の特定の定量的効果を含む)を調整し、減弱し、もしくは阻害する際に、これらのオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の塩基性および新規の特徴に著しい影響を及ぼさない。
本明細書に例示されたアンチセンス化合物を備えている当業者であれば、過度の実験なしで、さらにアンチセンス化合物を同定することができるであろう。
C. 本発明の標的
特定の核酸分子にオリゴマー化合物を「ターゲットする」ことは、本発明の状況において、多段階プロセスであることができる。本プロセスは、通常、その機能が調整される標的核酸を同定することから始まる。この標的核酸は、たとえば、その発現が特定の障害もしくは疾病状態と関連する細胞遺伝子(または遺伝子から転写されるmRNA)、または感染因子に由来する核酸分子であってもよい。本発明において、標的核酸は、eIF4Eをコードする。
また、ターゲティング・プロセスは、通常、アンチセンス相互作用を生じさせ、その結果所望の効果、例えば発現の調整を生じさせるための、標的核酸内の少なくとも1つの標的領域、セグメント、または部位を決定することを含む。本発明の状況の範囲内で、「領域」という用語は、少なくとも1つの定義可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部として定義される。標的核酸の領域内がセグメントである。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さなまたはサブ部分として定義される。本発明に使用される「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。
公知のように、翻訳開始コドンは、典型的には5’−AUG(転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては、5’ATG)であるので、翻訳開始コドンは、「AUGコドン」、「開始コドン」、または「AUG開始コドン」ともいわれる。少数の遺伝子は、RNA配列5’−GUG、5’−UUG、または5’−CUGを有する翻訳開始コドンを有し、5’−AUA、5’−ACG、および5’−CUGは、インビボで機能することが示された。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各例においてイニシエーターアミノ酸が、典型的にはメチオニン(真核生物において)またはホルミルメチオニン(原核生物において)である場合であっても、多くのコドン配列を包含することができる。また、真核生物および原核生物遺伝子は、2つ以上の代わりの開始コドンを有し、そのうちのいずれを特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件設定下において、翻訳開始のために優先して利用してもよいことが当技術分野において公知である。本発明の状況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの配列に関係なく、eIF4Eをコードする遺伝子から転写されるmRNAの翻訳を開始するためにインビボで使用されるコドンをいう。また、遺伝子の翻訳終止コドン(または「終止コドン」)は、3つの配列、すなわち5’−UAA、5’−UAG、および5’−UGA(対応するDNA配列は、それぞれ5’−TAA、5’−TAG、および5’−TGAである)のうちの1つを有してもよいことが当技術分野において公知である。
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの向き(すなわち、5’または3’)で、約25〜約50個の隣接するヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子などの一部をいう。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの向き(すなわち、5’または3’)で、約25〜約50個の隣接するヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子などの一部をいう。従って、「開始コドン領域」(または「翻訳開始コドン領域」)および「終止コドン領域」(または「翻訳終止コドン領域」)は全て、本発明のアンチセンス化合物で効率的にターゲットされ得る領域である。
また、当技術分野において翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域をいうことが公知であるオープンリーディングフレーム(ORF)または「コード領域」も、効率的にターゲットされ得る領域である。本発明の状況の範囲内で、1つの領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内の領域である。
その他の標的領域は、当技術分野において翻訳開始コドンから5’方向のmRNAの部分をいい、したがって、mRNA(または、遺伝子上の対応するヌクレオチド)の5’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含むことが公知の5’非翻訳領域(5’UTR)、並びに当技術分野において翻訳終止コドンから3’方向のmRNAの部分をいい、したがって、mRNA(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)の翻訳終止コドンと3’末端との間のヌクレオチドを含むことが公知の3’非翻訳の領域(3’UTR)を含む。mRNAの5’キャップ部位は、5’−5’三リン酸エステル結合を経てmRNAの最も5’の残基に連結されたN7メチル化されたグアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は、5’キャップ構造自体、並びにキャップ部位に隣接した最初の50ヌクレオチドを含むとみなされる。また、5’キャップ領域も標的である。
いくつかの真核生物のmRNA転写物は、直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として公知の1つまたは複数の領域を含み、これが翻訳される前に転写物から切除される。残りの(したがって、翻訳される)領域は、「エキソン」として公知であり、共にスプライスされて連続的なmRNA配列を形成する。また、スプライス部位(すなわちイントロン−エキソン接合部またはエキソン−イントロン接合部)をターゲットすることは、特に異常なスプライシングが疾患に関係するか、または特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する状況に有用な可能性がある。再編成または欠失による異常な融合接合部も、適切な標的部位である。異なる遺伝子源に由来する2つの(または、より多くの)mRNAのスプライシングのプロセスを経て産生されるmRNA転写物は、「融合転写物」として公知である。また、イントロンは、たとえばDNAまたはプレmRNAにターゲットされるアンチセンス化合物を使用して効率的にターゲットすることができることも公知である。RNase H機構を経て作用するオリゴヌクレオチド化合物などの一本鎖アンチセンス化合物は、プレmRNAをターゲットするために有効である。
また、オルターナティブRNA転写物をDNAの同じゲノム領域から産生することができることも当技術分野において公知である。これらのオルターナティブ転写物は、一般に「変異体」として公知である。より詳細には、「プレmRNA変異体」は、同じゲノムのDNAから産生される転写物であって、これらの開始または停止位置のいずれかが同じゲノムDNAから産生されるその他の転写物とは異なり、かつイントロンおよびエキソンの両配列を含む転写物である。
スプライシングの間の1つもしくは複数のエキソンまたはイントロン領域、またはこれらの一部の切除により、プレmRNA変異体は、より小さな「mRNA変異体」を生じる。従って、mRNA変異体は、プロセスされたプレmRNA変異体であり、それぞれの独特のプレmRNA変異体は、スプライシングの結果として常に独特のmRNA変異体を生じなければならない。また、これらのmRNA変異体は、「オルターナティブスプライス変異体」としても公知である。プレmRNA変異体のスプライシングが生じない場合は、プレmRNA変異体は、mRNA変異体と同一である。
また、変異体は、転写を開始または停止するためのオルターナティブシグナルを使用することによって産生することができること、並びにプレmRNAおよびmRNAは、複数の開始コドンまたは終止コドンを有することができることが、当技術分野において公知である。オルターナティブ開始コドンを使用するプレmRNAまたはmRNAから生じる変異体は、そのプレmRNAまたはmRNAの「オルターナティブ開始変異体」として公知である。オルターナティブ終止コドンを使用するこれらの転写物は、そのプレmRNAまたはmRNAの「オルターナティブ停止変異体」として公知である。オルターナティブ停止変異体の1つの特定タイプは、産生される複数の転写物が、転写機構による「ポリA停止シグナル」のうちの1つのオルターナティブ選択によって生じ、これにより独特のポリA部位で終わる転写物を産生する「ポリA変異体」である。本発明の状況の範囲内において、本明細書に記載されている変異体のタイプも適切な標的核酸である。
適切なオリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、以下において「適切な標的セグメント」と称する。本明細書に使用される「適切な標的セグメント」という用語は、活性なオリゴマー化合物がターゲットされる標的領域の少なくとも8核酸塩基部分として定義される。理論によって拘束されることは望まないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのためにアクセスできる標的核酸の部分を表すと考えられる。
一定の適切な標的セグメントの特定の配列を本明細書に記載してあるが、当業者であれば、これらが本発明の範囲内の特定の態様を例示し、記載する役割を果たすことを認識するであろう。当業者によって、さらなる適切な標的セグメントが同定される可能性がある。「適切な標的セグメント」は、この用語によって同定され、またはあるとしても「適切な標的セグメント」の表に含まれることは必要でない。
例示の適切な標的セグメントから選択された少なくとも8つの連続した核酸塩基のひと配列を含む8〜80核酸塩基の長さの標的セグメントは、同様にターゲットするために適していると考えられる。
標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントのうちの1つの5’末端から少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列を含む(残りの核酸塩基は、標的セグメントの5’末端のすぐ上流で開始し、DNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで続く、同じDNAまたはRNAの連続したひと配列である)。同様の適切な標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントのうちの1つの3’末端から少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列によって表される(残りの核酸塩基は、標的セグメントの3’末端のすぐ下流で開始し、DNAまたはRNAが約8〜約80核酸塩基を含むまで続く、同じDNAまたはRNAの連続したひと配列である)。また、適切なオリゴマーの標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントの配列の内部部分からの少なくとも8つの連続した核酸塩基を含むDNAまたはRNA配列によって表されてもよく、オリゴヌクレオチドが約8〜80核酸塩基を含むまで、一方向または両方向に伸長してもよいことが理解される。本明細書に例示した適切な標的セグメンを備えている当業者であれば、過度の実験なしで、さらに適切な標的セグメントを同定することができるであろう。
一旦、1つもしくは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定されたら、所望の効果を得るために、標的に対して十分に相補的、すなわち十分によく、および十分な特異性でハイブリダイズするオリゴマー化合物が選択される。
また、オリゴマー化合物は、核酸塩基1〜80、81〜160、161〜240、241〜320、321〜400、401〜480、481〜560、561〜640、641〜720、721〜800、801〜880、881〜960、961〜1040、1041〜1120、1121〜1200、1201〜1280、1281〜1360、1361〜1440、1441〜1520、1521〜1600、1601〜1680、1681〜1760、もしくは1761〜1842、またはこれらの任意の組み合わせを含む標的核酸塩基配列の領域(たとえば、下記の実施例に開示したものなどの)にターゲットしてもよい。
D. スクリーニングおよび標的バリデーション
さらなる態様において、本明細書において同定された「適切な標的セグメント」は、eIF4Eの発現を調整するさらなる化合物をスクリーンする際に使用してもよい。「モジュレーター」は、eIF4Eをコードする核酸分子の発現を減少または増大し、適切な標的セグメントに対して相補的(すなわち、アンチセンス)である少なくとも8核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング法は、eIF4Eをコードする核酸分子の適切な標的セグメントを、1つまたは複数の候補モジュレーターと接触させる工程、およびeIF4Eをコードする核酸分子の発現を減少または増大する1つもしくは複数の候補モジュレーターを選択する工程を含む。一旦、候補モジュレーターがeIF4Eをコードする核酸分子の発現を調整する(たとえば減少するか、または増大する)ことができることが示されれば、次いでモジュレーターは、eIF4Eの機能のさらなる調査研究において、または本発明の研究薬、診断薬、もしくは治療薬として使用するために使用してもよい。
一般に、dsRNA構築物の活性は、同じ部位にターゲットされたRNase H依存的な一本鎖アンチセンス化合物の活性と相関する。Vickersら、J.Biol.Chem.,2003,278,7108。したがって、いずれかの一本鎖アンチセンス化合物(たとえば、RNase H依存的化合物)として活性な配列を、二本鎖アンチセンス化合物(たとえば、siRNA)をデザインするために、およびその逆に使用することができる。本発明の適切な標的セグメントをこれらのそれぞれの相補アンチセンス化合物と組み合わせて、安定化された二本鎖(二重化された)化合物を形成してもよい。このような二本鎖オリゴマー化合物部分は、当技術分野において、標的発現を調整すること、翻訳並びにアンチセンス機構を経たRNAプロセシングを調節することが示された。さらに、二本鎖部分を化学修飾に供してもよい(Fireら、Nature,1998,391,806−811;TimmonsおよびFire,Nature 1998,395,854;Timmonsら、Gene,2001,263,103−112;Tabaraら、Science,1998,282,430−431;Montgomeryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95,15502−15507;Tuschlら、Genes Dev.,1999,13,3191−3197;Elbashirら、Nature,2001,411,494−498;Elbashirら、Genes Dev.2001,15,188−200)。たとえば、このような二本鎖部分は、古典的な、標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、これにより標的の酵素的分解をトリガーすることが示された。(Tijstermanら、Science,2002,295,694−697)。RNase Hに基づいたアンチセンス(通常、一本鎖化合物を使用する)およびsiRNA(通常、二本鎖化合物を使用する)は両方とも、典型的には標的RNA機能の損失を生じるアンチセンス機構である。最適化されたsiRNAおよびRNase H依存的オリゴマー化合物は、作用の強度、最大効果、特異性、および期間、並びに効率に関して同様に挙動する。さらに、一般に、dsRNA構築物の活性は、同じ部位にターゲットされるRNase H依存的一本鎖アンチセンス化合物の活性に相関されることが示された。一つの主な例外は、RNase H依存的アンチセンス化合物が、一般にプレmRNAの標的部位に対して活性であったが、siRNAsはそうでなかったということである。Vickersら、J.Biol.Chem.,203,278,7108。
また、本発明のオリゴマー化合物は、創薬および標的バリデーションの領域にも適用することができる。本発明は、eIF4Eと疾病状態、表現型、または症状との間に存在する関係を解明するために、創薬の試みにおいて本明細書において同定された化合物および適切な標的セグメントの使用を包含する。これらの方法は、試料、組織、細胞、または生物体を、本発明の1つまたは複数のアンチセンス化合物と接触させる工程、処置後のしばらくの間に、eIF4Eの核酸もしくはタンパク質レベル、および/または関連した表現型もしくは化学的指標を測定する工程、並びに任意に無処置の試料もしくは本発明のさらなる化合物で処置した試料と計測値を比較する工程を含むeIF4Eを検出または調整することを含む。また、これらの方法は、標的バリデーションのプロセスのための未知の遺伝子の機能を決定すること、または特定の疾患、症状、もしくは表現型の治療または予防のための標的としての特定の遺伝子産物の有効性を決定するためのその他の実験と平行して、または組み合わせて行うことができる。
E. キット、研究試薬、診断法、および治療
本発明のオリゴマー化合物は、診断、治療、予防のために、並びに研究試薬およびキットとして利用することができる。さらにまた、洗練された特異性で遺伝子発現を阻害することができるオリゴマー化合物は、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の種々のメンバーの機能間を区別するために、当業者によって使用されることが多い。
キットおよび診断に使用するためには、本発明の化合物を単独で、またはその他の化合物もしくは治療と組み合わせて、細胞および組織内に発現された遺伝子の一部または全てを補完するもの(complement)の発現パターンを解明するためのディファレンシャルおよび/または組み合わせ解析におけるツールとして使用することができる。
一つの非限定の例として、1つもしくは複数の化合物で処置した細胞または組織内の発現パターンを化合物で処置されていない対照細胞または組織と比較し、生じるパターンを、遺伝子発現のディファレンシャル・レベルについて、これらが、たとえば検査した遺伝子の疾患関連、シグナリング経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造、または機能に属することを解析する。これらの解析を、刺激されたか、または刺激されていない細胞で、および発現パターンに影響を及ぼすその他の化合物の存在または非存在下において行うことができる。
当技術分野において公知の遺伝子発現解析法の例は、DNAアレイまたはマイクロアレイ(Brazmaら、FEBS Lett.,2000,480,17−24;Celisら、FEBS Lett.,2000,480,2−16)、SAGE(serial analysis of gene expression)(Maddenら、Drug Discov.Today,2000,5,415−425)、READS(restriction enzyme amplification of digested cDNAs) (Prasharら、Methods Enzymol.,1999,303,258−72)、TOGA(total gene expression analysis)(Sutcliffeら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,1976−81)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celisら、FEBS Lett.,2000,480,2−16;Jungblutら、Electrophoresis,1999,20,2100−10)、発現シーケンス・タグ(EST)シーケンシング(Celisら、FEBS Lett.,2000,480,2−16;Larssonら、J.Biotechnol.,2000,80,143−57)、サブトラクティブRNAフィンガープリント法(SuRF)(Fuchsら、Anal.Biochem.,2000,286,91−98;Larsonら、Cytometry,2000,41,203−208)、サブトラクティブ・クローンニング・ディファレンシャル・ディスプレイ(DD)(Jurecicら、Curr.Opin.Microbiol.,2000,3,316−21)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(Carulliら、J.Cell Biochem.Suppl.,1998,31,286−96)、FISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼイション)技術(Goingら、Eur.J.Cancer,1999,35,1895−90)、および質量分析法(To,Comb.Chem.High Throughput Screen,2000,3,235−41)を含む。
また、アンチセンスの特異性および感受性も、当業者によって治療的用途のために利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物における疾患状態の治療の際に、治療的部分として使用されてきた。リボザイムを含むアンチセンス薬は、ヒトに対して、安全に、かつ効率的に投与されており、現在多くの臨床試験が行われている。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療法において有用となるように構成することができる有用な治療様式であることが確立される。ネコ、イヌ、齧歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、その他を含むが、これらに限定されないペット、動物園にいる動物、および家畜から選択される動物の治療も本発明によって想定される。
治療のためには、eIF4Eの発現を調整することによって治療することができる疾患または障害を有する疑いがあるヒトなどの動物は、本発明に従った化合物を投与することによって治療される。たとえば、一つの非限定の態様において、本方法は、治療の必要がある動物に対して、eIF4Eを阻害するオリゴマー化合物の治療上有効な量を投与する工程を含む。本発明のeIF4E化合物は、eIF4E RNAをコードする核酸の活性または発現を効率的に阻害する。同様に、eIF4E RNAレベルの減少により、eIF4Eタンパク質レベルの減少を生じるので、タンパク質発現またはレベルの減少も測定することができる。一部の態様において、動物は、治療の前に疾患または障害について診断される。一つの態様において、オリゴマー化合物は、少なくとも約10%まで、少なくとも約20%まで、少なくとも約25%まで、少なくとも約30%まで、少なくとも約40%まで、少なくとも約50%まで、少なくとも約60%まで、少なくとも約70%まで、少なくとも約75%まで、少なくとも約80%まで、少なくとも約85%まで、少なくとも約90%まで、少なくとも約95%まで、少なくとも約98%まで、少なくとも約99%まで、もしくは100%までeIF4E mRNAの活性または発現を調整する。
たとえば、eIF4Eの発現の減少は、動物の血清、脂肪組織、肝臓、もしくはその他のいずれかの体液、組織、または器官において測定してもよい。解析される前記液体、組織、または器官内に含まれる細胞は、eIF4Eタンパク質をコードする核酸分子および/またはeIF4Eタンパク質自体を含むことができる。
本発明の化合物は、適切な薬学的もしくは生理的に許容される賦形剤、希釈液、またはキャリアに化合物の有効な量を添加することによって、薬学的組成物において利用することができる。また、本発明の化合物および方法の使用は、予防的にも有用であり得る。従って、本発明は、医薬としての本明細書に開示された化合物の使用、並びに本明細書に開示された障害の治療のための薬物の調製のための、今回開示された化合物の使用を包含する。
本発明の化合物は、eIF4Eの発現を阻害する。これらの化合物は、eIF4E活性化の効果を阻害するので、本化合物は、eIF4E発現に関連した障害の治療に有用である。従って、本発明の化合物は、抗悪性腫瘍薬である。
本化合物は、中枢神経系の新生物などの癌腫:多形性神経膠芽腫、星細胞腫、オリゴデンドログリア腫、上衣および脈絡叢腫瘍、松果体腫瘍、ニューロン腫瘍、髄芽腫、シュワン腫、髄膜腫、髄膜肉腫;目の新生物:基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫;内分泌腺の新生物:下垂体腫瘍、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系の新生物、胃腸膵臓内分泌系の新生物、生殖腺の新生物;頭頸部の新生物:頭頚部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯性腫瘍;胸部の新生物:大細胞肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫、胸部の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の一次胚細胞腫瘍;消化管の新生物:食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵臓外分泌部の新生物、小腸の新生物、虫垂および腹膜、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物;尿生殖路の新生物:腎細胞癌、腎盂および輸尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物;女性生殖器の新生物:外陰部および膣の新生物、頸部の新生物、子宮体の腺癌、卵嚢癌、婦人科の肉腫;乳房の新生物;皮膚の新生物:基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫瘍;悪性黒色腫;骨および軟部組織の新生物:骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始的神経外胚様性腫瘍、血管肉腫;造血系の新生物:脊髄形成異常症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、HTLV−1およびT細胞白血病/リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞白血病;および児童の新生物:急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓腫瘍を治療する際に有用であると考えられている。
従って、一つの態様において、本発明は、感受性の新生物の治療のための方法であって、これらの必要な患者に対して、eIF4Eに向けられた単離された一本鎖RNAまたは二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの有効な量を投与することを含む方法を提供する。ssRNAまたはdsRNAオリゴヌクレオチドは、修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。すなわち、本発明は、感受性の新生物の治療のための、eIF4Eに対してターゲットされる単離された二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、またはこれらの薬学的組成物の使用を提供する。
もう一つの態様において、本発明は、eIF4E発現または過剰発現を阻害するための医薬の製造における、単離された二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの化合物の使用を提供する。従って、本発明は、上に記載されている方法によって感受性の新生物の治療のための薬物の製造における、eIF4Eに対してターゲットされる単離された二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
本発明の化合物は、高増殖性障害の治療のために有用である。特に、本発明の化合物は、癌の治療のために有用である。本発明の化合物は、特に固形腫瘍の治療のために有用である。従って、本発明の化合物は、特に乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫の治療のために有用である。本発明のアンチセンス化合物は、特に固形腫瘍の治療のために有用である。
F. 修飾
周知のとおり、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基(時に「核酸塩基」または単に「塩基」とも称される)である。このような複素環塩基の2つの最も一般的な分類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合性に連結されたリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部分のいずれに対しても連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際には、リン酸基を互いに隣接したヌクレオシドを共有結合性に連結して、直鎖状の重合体化合物を形成する。次に、この直鎖状重合体化合物のそれぞれの末端をさらに連結して、環状の化合物を形成することができるが、一般に直鎖状化合物が望まれる。加えて、直鎖状化合物は、内部核酸塩基相補性を有してもよく、従って、完全に、または部分的に二本鎖化合物を生じる様な方法で折りたたまれてもよい。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものといわれる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、5’に対する3’のホスホジエステル結合である。
修飾された糖およびヌクレオシド間結合
本発明に有用なオリゴマー・アンチセンス化合物の具体例は、修飾された、たとえば天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において定義したように、修飾されたヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合およびリン原子を有さないヌクレオシド間結合を含む。本明細書の目的のために、および時に当技術分野において参照されるとおり、これらのヌクレオシド間バックボーンにおけるリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
本発明のオリゴマー化合物は、1つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間結合を有することができる。1つのリンを含有する修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート・ヌクレオシド間結合である。リン原子をその中に含むその他の修飾されたオリゴヌクレオチド・バックボーンは、たとえば、ホスホロチオアート、キラルなホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、並びに3’−アルキレンホスホナート、5’−アルキレンホスホナート、およびキラルホスホナートを含むその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、3’−アミノホスホラミダートおよびアミノアルキルホスホラミダートを含むホスホラミダート、チオノホスホラミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホノアセテート、並びにチオホスホノアセテート(Sheehanら、Nucleic Acids Research,2003,31(14),4109−4118およびDellingerら、J.Am.Chem.Soc.,2003,125,940−950を参照されたい)、セレノホスフェート、および正常な3’−5’結合を有するボラノホスフェート、これらの2’−5’結合類似体、および逆の極性を有するものであって、1つまたは複数のヌクレオチド間結合が3’から3’、5’から5’、または2’から2’に対するものを含む。逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も3’のヌクレオチド間結合に単一の3’から3’への結合、すなわち塩基が無く(abasic)てもよい単一の逆位のヌクレオシド残基(核酸塩基は、ヒドロキシル基を失っているか、またはその所定の位置に有する)を含む。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
N3’−P5’−ホスホラミダートは、相補的RNA鎖に対する高い親和性およびヌクレアーゼ耐性の両方を示すことが報告された(Gryaznovら、J.Am.Chem.Soc.,1994,116,3143−3144)。N3’−P5’−ホスホラミダートは、インビボでc−myc遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートすることが研究されいくつかが成功した(Skorskiら、Proc.Natl.Acad.Sci.,1997,94,3966−3971;およびFairaら、Nat.Biotechnol.,2001,19,40−44)。
上記のリン含む結合の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;第5,194,599号;第5,565,555号;第5,527,899号;第5,721,218号;第5,672,697号、および第5,625,050号。
本発明のいくつかの態様において、オリゴマー化合物は、1つもしくは複数のホスホロチオアートおよび/またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特にCH−NH−O−CH−、−CH−N(CH)−O−CH−(メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーンとして公知)、−CH−O−N(CH)−CH−、−CH−N(CH)−N(CH)−CH−、および−O−N(CH)−CH−CH−(式中、天然のリン酸ジエステルヌクレオチド間結合は、−O−P(=O)(OH)−O−CH−として表される)を有してもよい。MMI型ヌクレオシド間結合は、上述した米国特許第5,489,677号に開示されている。アミドヌクレオシド間結合は、上述した米国特許第5,602,240号に開示されている。
その中にリン原子を含まないいくつかのオリゴヌクレオチド・バックボーンは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサン・バックボーン;スルフィド、スルホキシド、およびスルホン・バックボーン;ギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチル・バックボーン;メチレンギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチル・バックボーン;リボアセチル・バックボーン;アルケン含有バックボーン;スルファミン酸・バックボーン;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ・バックボーン;スルホナートおよびスルホンアミド・バックボーン;アミド・バックボーン;並びに混合されたN、O、S、およびCH構成要素を有するその他のものを含む。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第5,034,506号;第5,166,315号;第5,185,444号;第5,214,134号;第5,216,141号;第5,235,033号;第5,264,562号;第5,264,564号;第5,405,938号;第5,434,257号;第5,466,677号;第5,470,967号;第5,489,677号;第5,541,307号;第5,561,225号;第5,596,086号;第5,602,240号;第5,610,289号;第5,602,240号;第5,608,046号;第5,610,289号;第5,618,704号;第5,623,070号;第5,663,312号;第5,633,360号;第5,677,437号;第5,792,608号;第5,646,269号、および第5,677,439号。
本発明に受け入れられるオリゴマー化合物のもう一つの群は、オリゴヌクレオチド擬態を含む。擬態という用語は、これがオリゴヌクレオチドに適用される場合、フラノース環、またはフラノース環とヌクレオチド間結合とが、新規の基で置換されているオリゴマー化合物を含むことが企図され、フラノース環のみの置換は、当技術分野において糖代用物であるともいわれる。複素環塩基部分または修飾された複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
このようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬態は、ペプチド核酸(PNA)といわれる。Nielsenら、Science,1991,254,1497−1500。PNAは、有利なハイブリダイゼーション特性、高い生物学的安定性を有し、静電気的に中性の分子である。1つの最近の研究において、PNA化合物が、トランスジェニック・マウスモデルにおいて正確な異常スプライシングに使用された(Sazaniら、Nat.Biotechnol.,2002,20,1228−1233)。PNAオリゴマー化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンが、アミドを含むバックボーン、特にアミノエチルグリシン・バックボーンと置換されている。核酸塩基は、直接または間接的に、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に結合されている(以下に示すように−C(=O)−CH−)。PNAオリゴマー化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号。PNA化合物は、商業的にApplied Biosystems(Foster City,CA,USA)から得ることができる。塩基性PNAバックボーンに対する多くの修飾は、当技術分野において公知であり;一方または両方の末端に抱合された1つまたは複数のアミノ酸をもつPNA化合物が、特に有用である。特に、PNA分子の末端に抱合されるときは、1〜8つのリジンまたはアルギニン残基が有用である。
研究されたオリゴヌクレオチド擬態のもう一つのクラスは、モルホリノ環に付着された複素環塩基を有する連結されたモルホリノ単位(モルホリノ核酸)に基づく。モルホリノ核酸のモルホリノ単量体単位に連結される多くの連結基が報告された。連結基の1つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物を与えるように選択された。非イオン性モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と望まれない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望まれない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性擬態である(Braaschら、Biochemistry,2002,41(14),4503−4510)。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、ゼブラフィッシュの胚において研究されてきた(Genesis,volume 30,issue 3,2001およびHeasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209−214を参照されたい)。また、モルホリノに基づいたオリゴマー化合物のさらなる研究も報告された(Naseviciusら、Nat.Genet.,2000,26,216−220;および Lacerraら、Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591−9596を参照されたい)。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、1991年7月23日に発行された米国特許第5,034,506号に開示されている。単量体サブユニットを連結する種々の異なる連結基を有するオリゴマー化合物のモルホリノ・クラスが調製された。連結基は、キラルなものからアキラルなものに、また荷電したものから中性のものに変更することができる。米国特許第5,166,315号は、−O−P(=O)(N(CH)−O−を含む結合を開示し;米国特許第5,034,506号は、アキラルなモルホリノ間結合を開示し;および米国特許第5,185,444号は、キラルなモルホリノ間結合を含むリンを開示する。
オリゴヌクレオチド擬態のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸(CeNA)といわれる。DNAまたはRNA分子に通常存在するフラノース環は、シクロヘニル環で置換されている。CeNA DMT保護されたホスホラミダイト単量体は、古典的なホスホラミダイト化学に従って調製され、オリゴマー化合物合成のために使用された。CeNAで修飾された特異的位置を有する完全に修飾されたCeNAオリゴマー化合物およびオリゴヌクレオチドが調製され、研究された(Wangら、J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595−8602を参照されたい)。一般に、DNA鎖へのCeNA単量体の組み込みは、そのDNA/RNAハイブリッドの安定性を増大する。CeNAオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性をもつRNAおよびDNA相補物と複合体を形成した。天然の核酸構造にCeNA構造を組み込むための研究は、NMRおよび円偏光二色性によって簡単な高次構造適応で進行することが示された。さらに、配列ターゲティングRNAへのCeNAの組み込みは、血清に対して安定であり、大腸菌RNaseを活性化して標的RNA鎖の切断を生じることができる。
さらなる修飾は、リボシル糖骨格環の2’−ヒドロキシル基が、糖骨格環の4’炭素原子に連結することにより、2’−C、4’−C−オキシメチレン結合を形成して二環式の糖残基が形成された「ロック核酸」(Locked Nucleic Acids:LNA)などの二環式の糖残基を含む(Elayadiら、Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558−561;Braaschら、Chem.Biol.,2001,8 1−7;およびOrumら、Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239−243に概説されており;また、米国特許第6,268,490号および第6,670,461号も参照されたい)。結合は、2’酸素原子と4’炭素原子を架橋するメチレン(−CH−)基であることができ、これに関して、LNAという用語は、二環式部分のために使用され;この位置におけるエチレン基の場合、ENATMという用語が使用される(Singhら、Chem.Commun.,1998,4,455−456;ENATM:Moritaら、Bioorganic Medicinal Chemistry,2003,11,2211−2226)。LNAおよびその他の二環式糖類似体は、相補的DNAおよびRNAとの非常に高い二重鎖熱安定性(Tm=+3〜+10 C)、3’−エキソヌクレオ溶解性分解に対する安定性、および優れた溶解性を示す。LNAは、ProLigo(Paris,FranceおよびBoulder,CO,USA)から商業的に入手可能である。
また研究されたLNAの異性体も、3’−エキソヌクレアーゼに対して優れた安定性を有することが示されたα−L−LNAである(Friedenら、Nucleic Acids Research,2003,21,6365−6372)。α−L−LNAは、強力なアンチセンス活性を示したアンチセンス・ギャップマー(gapmers)およびキメラに組み入れられた。
調製され、および研究されたもう一つの同様の二環式の糖残基は、3’−ヒドロキシル基から単一のメチレン基を経て糖骨格環の4’炭素原子に向かう架橋を有し、これにより3’−C、4’−C−オキシメチレン結合を形成する(米国特許第6,043,060号を参照されたい)。
2D NMR分光法によって決定されるLNAの高次構造により、一本鎖LNAおよび二重鎖の両方において、LNAヌクレオチドの向きがロックされていることにより、より高いN型高次構造の集団を導入するような方法で、リン酸バックボーンを拘束することを示した(Petersenら、J.Mol.Recognit.,2000,13,44−53)。これらの高次構造は、核酸塩基のスタッキングの改善と関連する(Wengelら、Nucleosides Nucleotides,1999,18,1365−1370)。
LNAは、非常に安定なLNA:LNA二重鎖を形成することが示された(Koshkinら、J.Am.Chem.Soc.,1998,120,13252−13253)。LNA:LNAハイブリダイゼーションは、最も熱的に安定な核酸型二重鎖系であることが示され、LNAのRNAを模倣する特徴が二重鎖レベルで確立した。3つのLNA単量体(TまたはA)の導入により、DNA相補物に対して有意に融点を増大した(Tm=+15/+11)。LNAを媒介したハイブリダイゼーションの一般性は、非常に安定なLNA:LNA二重鎖の形成によって強調された。LNAのRNA模倣は、単量体のN型高次構造の制限に関して、およびLNA:RNA二重鎖の二次構造に関して反映された。
また、LNAは、高い熱的親和性で相補的DNA、RNA、またはLNAと二重鎖を形成する。円偏光二色性(CD)スペクトルは、完全に修飾されたLNAを含む二重鎖(特に、LNA:RNA)が、構造的にA型RNA:RNA二重鎖に似ていることを示した。LNA:DNA二重鎖の核磁気共鳴(NMR)調査により、LNA単量体の3’エンド(3’−endo)高次構造を確認した。また、二本鎖DNAの認識が証明されたことから、LNAによる鎖侵入を示唆している。ミスマッチ配列の研究は、LNAが対応する無修飾参照鎖と比較して、一般に改善された選択性でワトソン−クリック型塩基対規則に従うことを示す。DNA LNAキメラは、ルシフェラーゼmRNA内の種々の領域(5’非翻訳領域、開始コドン領域、またはコード領域)にターゲットされるときに、効率的に遺伝子発現を阻害することを示した(Braaschら、Nucleic Acids Research,2002,30,5160−5167)。
強力かつ無毒のLNAを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドが記載されている(Wahlestedtら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633−5638)。著者は、LNAがアンチセンス薬に対していくつかの所望の性質を与えることを証明した。LNA/DNA共重合体は、血清および細胞抽出物で容易に分解されなかった。LNA/DNA共重合体は、生きたラット脳におけるGタンパク質結合受容体シグナリングおよび大腸菌(Escherichia coli)におけるリポーター遺伝子の検出とは異なり、アッセイ系において強力なアンチセンス活性を示した。また、生きているヒト乳癌細胞へのLNAのリポフェクチンを媒介した効率的なデリバリーが達成された。LNAのものを含むさらに良好なインビボ研究は、毒性を伴わないラット・デルタ・オピオイド受容体のノックダウンを示し(Wahlestedtら、Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,5633−5638)、もう一つの研究は、RNAポリメラーゼIIの大サブユニットの翻訳の遮断を示した(Fluiterら、Nucleic Acids Res.,2003,31,953−962)。
LNA単量体アデニン、シトシン、グアニン、5−メチル−シトシン、チミン、およびウラシルの合成並びに調製は、これらのオリゴマー形成、および核酸認識性質と共に、記載された(Koshkinら、Tetrahedron,1998,54,3607−3630)。LNAおよびこれらの調製は、国際公開公報第98/39352号および国際公開公報第99/14226号にも記載されている。
LNAの最初の類似体、ホスホロチオアート−LNAおよび2’−チオ−LNAも調製された(Kumarら、Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219−2222)。核酸ポリメラーゼのために基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロック・ヌクレオシド類似体の調製も記載されていた(Wengelら、国際公開公報第99/14226号)。さらに、2’−アミノ−LNAの合成、新規の高次構造的に制限された高い親和性のオリゴヌクレオチド類似体が当技術分野において記載されていた(Singhら、J.Org.Chem.,1998,63,10035−10039)。加えて、2’−アミノ−および2’−メチルアミノ−LNAも調製されており、相補的RNAおよびDNA鎖とのこれらの二重鎖の熱安定性も、以前に報告された。
もう一つの、調製され、および研究された本発明に受け入れられるオリゴヌクレオチド擬態は、トレオース核酸である。このオリゴヌクレオチド擬態は、リボース・ヌクレオシドの代わりにトレオース・ヌクレオシドに基づく。(3’,2’)−α−L−トレオース核酸(TNA)の最初の関心は、TNAを複製するであろうDNAポリメラーゼが存在するかどうかの問題に向けられた。一定のDNAポリメラーゼが、TNAテンプレートの限定された範囲を複製することができることが判明した(C&EN/2003年1月13日において報告された)。もう一つの研究では、TNAが相補的DNA、RNA、およびTNAオリゴヌクレオチドと逆平行ワトソン−クリック型塩基対形成できることが決定された(Chaputら、J.Am.Chem.Soc.,2003,125,856−857)。
1つの研究では、(3’,2’)−α−L−トレオース核酸を調製し、2’および3’アミダート類似体と比較した(Wuら、Organic Letters,2002,4(8),1279−1282)。アミダート類似体は、RNA/DNAのものに匹敵する強度でRNAおよびDNAと結合することが示された。
二環式および三環式ヌクレオシド類似体を含むように、さらなるオリゴヌクレオチド擬態が調製された(Steffensら、Helv.Chim.Acta,1997,80,2426−2439;Steffensら、J.Am.Chem.Soc.,1999,121,3249−3255;Rennebergら、J.Am.Chem.Soc.,2002,124,5993−6002;および Rennebergら、Nucleic Acids Res.,2002,30,2751−2757を参照されたい)。これらの修飾されたヌクレオシド類似体は、ホスホラミダイト・アプローチを使用してオリゴマー形成され、生じる三環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物が、DNA、RNA、およびそれ自体にハイブリダイズするときに、熱安定性(Tm)の増大を示した。二環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、DNA二重鎖のものに近い熱安定性を示した。
オリゴヌクレオチド擬態のもう一つのクラスは、ホスホノモノエステル核酸といわれ、バックボーンにリン基を組み込む。オリゴヌクレオチド擬態のこのクラスは、遺伝子発現を阻害する領域において(アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド)、核酸の検出のためのプローブとして、および分子生物学に使用するための補助として、有用な物理的および生物学的および薬理学的性質を有することが報告されている。本発明に受け入れられるさらなるオリゴヌクレオチド擬態(シクロブチル環が天然に存在するフラノシル環と置換する)が調製された。
また、オリゴマー化合物は、1つまたは複数の置換された糖残基を含んでいてもよい。適切な化合物は、2’位に以下のうちの1つを含むことができる:OH;F;O−、S−、もしくはN−アルキル;O−、S−、もしくはN−アルケニル;O−、S−、もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル、式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換されたか、または非置換のC〜C10アルキルまたはC〜C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい。O((CHO)CH、O(CHOCH、O(CHNH、O(CHCH、O(CHONH、およびO(CHON((CHCHは、特に適しており、式中nおよびmは、1〜約10である。その他のオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの1つを含む:C〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH、OCN、Cl、Br、CN、CF、OCF、SOCH、SOCH、ONO、NO、N、NH、ヘテロ・シクロアルキル、ヘテロシクロアルクカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドおよび同様の性質を有するその他の置換基の薬力学的性質を改善するための基。1つの修飾は、2’−メトキシエトキシ(2’−O−CHCHOCH、別名2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOE)(Martinら、Helv.Chim.Acta,1995,78,486−504)、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらなる修飾は、以下に実施例に記載されているように、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CHON(CH)基(2’−DMAOEとしても知られる)、並びに以下に実施例にも記載されているように、2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当技術分野において2’−O−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは2’−DMAEOEとしても知られる)、すなわち2’−O−CH−O−CH−N(CHを含む。
その他の修飾は、2’−メトキシ(2’−O−CH)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCHCHCHNH)、2’−アリル(2’−CH−CH=CH)、2’−O−アリル(2’−O−CH−CH=CH)、および2’−フルオロ(2’−F)を含む。2’−修飾は、アラビノ(上)位置またはリボ(下)位置にあってもよい。1つの2’−アラビノ修飾は、2’−Fである。また、オリゴヌクレオチドのその他の位置に、特に3’末端ヌクレオチドの糖の3’位または2’−5’連結されたオリゴヌクレオチドおよび5’末端ヌクレオチドの5’位に、同様の修飾を行ってもよい。また、アンチセンス化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬態を有してもよい。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書にその全体が参照として組み入れられる:第4,981,957号;第5,118,800号;第5,319,080号;第5,359,044号;第5,393,878号;第5,446,137号;第5,466,786号;第5,514,785号;第5,519,134号;第5,567,811号;第5,576,427号;第5,591,722号;第5,597,909号;第5,610,300号;第5,627,053号;第5,639,873号;第5,646,265号;第5,658,873号;第5,670,633号;第5,792,747号;および第5,700,920号。
本発明の一つの局面において、オリゴマー化合物は、3’−エンド糖高次構造を誘導するように合成で修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の3’−エンド糖高次構造を誘導するために、複素環塩基、糖残基、または両方の合成で修飾を組み入れることができる。これらの修飾されたヌクレオシドは、望ましい3’−エンド高次構造上の形状を維持すると共に、オリゴマー化合物の特定の性質を増強することができるように、RNA様ヌクレオシドを模倣するために使用される。RNA干渉の要求(たとえばトリガー)として、RNA型二重鎖(A型ヘリックス、主に3’−エンドである)に対して明らかな優先(preference)があり、これは、2’−デオキシ−2’−F−ヌクレオシドで構成される二重鎖が線虫(C.elegans)系においてRNAi反応をトリガーする際に効率的に見えるという事実により、部分的に支持される。より安定な3’−エンドヌクレオシドを使用することによって増強される性質は、以下を含むが、これらに限定されない:タンパク質結合、タンパク質解離速度、吸収およびクリアランスの修飾を介した薬物動態学的性質の調整;ヌクレアーゼ安定性、および化学的安定性の調整;オリゴマーの結合親和性および特異性(酵素に対する、並びに相補配列に対する親和性および特異性)の調整;並びにRNA切断の有効性の増大。本発明は、C3’−エンド型高次構造を支持するような方法で、修飾された1つまたは複数のヌクレオシドを有するRNAiのオリゴマー性トリガーを提供する。
ヌクレオシド高次構造は、ペントフラノシル糖の2’、3’、または4’−位での置換を含む種々の因子によって影響される。電気陰性置換基は、一般に軸方向の位置を好むが、立体的要求がきびしい置換基は、一般にエクアトリアル位を好む(Principles of Nucleic Acid Structure,Wolfgang Sanger,1984,Springer−Verlag.)。3’−エンド高次構造に有利な2’位の修飾は、図2において以下に図示したとおり、一方で認識エレメントとして2’−OHを維持しつつ達成することができる(Galloら、Tetrahedron,2001,57,5707−5713.Harry−O’kuruら、J.Org.Chem.,1997,62(6),1754−1759およびTangら、J.Org.Chem.,1999,64,747−754)。
あるいは、3’−エンド高次構造に対する優先は、2’デオキシ−2’F−ヌクレオシドによって例示される2’−OHの欠失によって達成することができ(Kawasakiら、J.Med.Chem.,1993,36,831−841)、これは、軸位置に電気陰性フッ素原子が位置する3’−エンド高次構造を採用する。リボース環のその他の修飾、たとえば、4’−F修飾されたヌクレオシドを得るための4’−位の置換(Guillermら、BioorganicおよびMedicinal Chemistry Letters,1995,5,1455−1460;およびOwenら、J.Org.Chem.,1976,41,3010−3017)、またはたとえばメタノカルバ(methanocarba)ヌクレオシド類似体を得るための修飾(Jacobsonら、J.Med.Chem.Lett.,2000,43,2196−2203;およびLeeら、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2001,11,1333−1337)も、3’−エンド高次構造に対する優先を誘導する。同系統に沿って、RNAi反応のオリゴマーのトリガーは、高次構造がC3’−エンド型高次構造に閉じ込められるような方法で修飾された1つまたは複数のヌクレオシド、すなわちロック核酸(LNA,Singhら、Chem.Commun.,1998,4,455−456)、およびエチレン架橋された核酸(ENA,Moritaら、Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2002,12,73−76)で構成されるかもしれない。
一つの修飾されたヌクレオシドおよびこれらのオリゴマーの高次構造は、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法、およびCD測定などの種々の方法によって推定することができる。それ故、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドに使用するために、RNA様高次構造、オリゴマーの状況にA型二重鎖形状を誘導することが予測される修飾が選択される。本発明に受け入れられる多くの修飾されたヌクレオシドの合成は、当技術分野において公知である(たとえば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol 1−3,ed.Leroy B.Townsend,1988,Plenum press、および下記の実施例の節を参照されたい)。
ホモ二重鎖核酸の高次構造上の形状を記載するために使用される用語は、RNAに関して「A型」およびDNAに関して「B型」である。RNAおよびDNA二重鎖に関するそれぞれの高次構造上の形状は、核酸繊維のX線回折解析から決定された(Arnott and Hukins,Biochem.Biophys.Res.Comm.,1970,47,1504)。一般に、RNA:RNA二重鎖は、より安定であり、DNA:DNA二重鎖よりも高い融解温度(Tm)を有する(Sangerら、Principles of Nucleic Acid Structure,1984,Springer−Verlag;New York,NY.;Lesnikら、Biochemistry,1995,34,10807−10815;Conteら、Nucleic Acids Res.,1997,25,2627−2634)。RNAの安定性の増大は、いくつかの構造的な特徴、最も著しくはA型構造形状から生じる改善された塩基スタッキング相互作用に起因していた(Searleら、Nucleic Acids Res.,1993,21,2051−2056)。RNAに2’ヒドロキシルが存在すると、C3’エンドの方に糖の歪みが偏り(すなわちノーザン歪み(Northern pucker)としても示される)、二重鎖がA型構造形状の方を生じる。加えて、RNAの2’ヒドロキシル基は、水を媒介した水素結合のネットワークを形成してRNA二重鎖の安定化を補助することができる(Egliら、Biochemistry,1996,35,8489−8494)。一方で、デオキシ核酸は、C2’エンド糖の歪みを好み(すなわち、サザン歪み(Southern pucker)としても知られる)、あまり安定でないB型形状を与えると考えられる(Sanger,W.(1984)Principles of Nucleic Acid Structure,Springer−Verlag,New York,NY)。本明細書で使用される、B型構造形状は、C2’エンドの歪みおよびO4’エンドの歪みの両方を含む。これは、B型構造二重鎖を生じるフラノース高次構造を考える際に、O4’エンドの歪みの寄与も考慮されるべきであることを指摘したBerger,et. al.,Nucleic Acids Research,1998,26,2473−2480と一致する。
しかし、DNA:RNAハイブリッド二重鎖は、通常、純粋なRNA:RNA二重鎖よりも安定ではなく、これらの配列に応じて、DNA:DNA二重鎖よりも安定化、または安定でないかもしれない(Searleら、Nucleic Acids Res.,1993,21,2051−2056)。ハイブリッド二重鎖の構造は、A型とB型の構造形状間の中間体であり、不十分なスタッキング相互作用を生じ得る(Laneら、Eur.J.Biochem.,1993,215,297−306;Fedoroffら、J.Mol.Biol.,1993,233,509−523;Gonzalezら、Biochemistry,1995,34,4969−4982;Hortonら、J.Mol.Biol.,1996,264,521−533)。標的RNAと合成配列との間で形成される二重鎖の安定性は、アンチセンスおよびRNA干渉など(しかし、これらに限定されない)の療法において、これらの機構がRNA標的鎖に対する合成オリゴマー鎖の結合を必要とするために、中心となる。アンチセンスの場合、mRNAの有効な阻害は、アンチセンスDNAがmRNAと非常に高結合親和性を有することが必要である。さもなければ、合成オリゴマー鎖と標的mRNA鎖との間の所望の相互作用は、めったに生じず、有効性が減少してしまう。
1つの通常使用される糖の歪みを修飾する方法は、糖形状に影響を及ぼす置換基での2’−位の糖の置換である。環の高次構造に対する影響は、2’位での置換基の性質に依存する。多くの異なる置換基の糖を歪める効果を決定するために、これらが研究されている。たとえば、2’−ハロゲンが研究されており、2’−フルオロ誘導体がC3’エンド形で最も大きな集団(65%)を示し、および2’−ヨードが最も低い集団(7%)を示すことを示している。アデノシン(2’−OH)対デオキシアデノシン(2’−H)の集団は、それぞれ36%および19%である。さらにまた、アデノシン二量体(2’−デオキシ−2’−フルオロアデノシン−2’−デオキシ−2’−フルオロ−アデノシン)の2’−フルオロ基の効果は、積み重ねられた高次構造の安定化に対してさらに相関される。
予想通り、相対的な二重鎖安定性は、2’−F基で2’−OH基を置換することによって増強することができ、これによりC3’エンド集団を増大することができる。2’−F結合の高い極性状態およびC3’エンドの糖の歪みに対する極度の優先により、A型二重鎖における積み重ねられた高次構造を安定化し得る。UV淡色性、円偏光二色性、およびH NMRからのデータは、ハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれてスタッキングの程度も減少することを示す。さらにまた、糖残基の2’位の立体的な嵩は、B型構造二重鎖よりもA型構造二重鎖においてよりうまく収められている。従って、ジヌクレオシド一リン酸の3’末端上2’置換基は、スタッキング高次構造に対して多くの効果を及ぼすことが考えられる:立体反発、フラノースの歪みの優先、静電反発、疎水性引力、および水素結合能力。これらの置換基の効果は、置換基の分子サイズ、電気陰性度、および疎水性によって決定されると考えられる。また、相補鎖の融解温度は、2’置換されたアデノシン二リン酸で増大される。高次構造の3’エンド優先または置換基の存在が、結合の増大の原因となるかどうかは明らかではない。しかし、隣接した塩基の優れた重なり(スタッキング)は、3’エンド高次構造で達成することができる。
RNA標的鎖にターゲットされる修飾されたオリゴヌクレオチドにおけるC3’エンド糖の割合を増大するには、RNAに対する結合のためのこの鎖を予め組織化する(preorganize)べきである。文献に報告され、および研究されたいくつかの糖修飾のうち、2’−フルオロまたは2’−アルコキシなどの電気陰性置換基を組み入れることにより、糖高次構造が3’エンド(ノーザン)歪み高次構造の方に変化する。これにより、オリゴヌクレオチドを予め組織化して、A型高次構造形状を有するようにこのような修飾を組み入れる。このA型高次構造は、標的RNA鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性の増大を生じる。
本発明に受け入れられる、生じる二重鎖に対してA型の高次構造特性を与える代表的な2’置換基(3’−エンド)は、2’−O−アルキル、2’−O−置換されたアルキル、および2’−フルオロ置換基を含む。種々のアルキルおよびアリールエーテルおよびチオエーテル、アミンおよびモノアルキルおよびジアルキル置換アミンは、置換基のために適している。選択された適用における活性(しかし、限定されない)などの性質を増強するために、本発明のオリゴマー化合物の1つもしくは複数に対して、1つもしくは複数の単量体サブユニット(ヌクレオシドが適している)の複数部位およびまたはヌクレオシド間結合に、複数の修飾を行うことができることがさらに企図される。
天然および修飾された核酸塩基
また、オリゴマー化合物は、核酸塩基(当技術分野において、複素環塩基として、または単に「塩基」といわれることが多い)の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書に使用される、「無修飾」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、並びにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を含む。修飾された核酸塩基は、5‐メチルシトシン(5−me−C)、5‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチル並びにアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、2−プロピル並びにアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニル(−C≡C−CH)ウラシルおよびシトシン並びにピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、並びにその他の8置換されたアデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル、並びにその他の5置換されたウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、並びに3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどのその他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらに修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン(1H−ピリミド(5,4−b)(1,4)ベンゾキサジン−2(3H)−オン)、フェノチアジンシチジン(1H−ピリミド(5,4−b)(1,4)ベンゾチアジン−2(3H)−オン)、置換されたフェノキサジンシチジン(たとえば、9−(2−アミノエトキシ)−H−ピリミド(5,4−b)(1,4)ベンゾキサジン−2(3H)−オン)などのG−クランプ、カルバゾールシチジン(2H−ピリミド(4,5−b)インドール−2−オン)、ピリドインドールシチジン(H−ピリド(3’,2’:4,5)ピロロ(2,3−d)ピリミジン−2−オン)などの三環系のピリミジンを含む。また、修飾された核酸塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が、その他の複素環、たとえば7−デアザ−アデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジン、および2−ピリドンで置換されたものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858−859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990に開示されたもの、Englischら、Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されたもの、およびSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages 289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993によって開示されたものを含む。一定のこれらの核酸塩基は、特に本発明の化合物の結合親和性を増大するために有用である。これらは、5−置換されたピリミジン、6−アザピリミジン、並びに2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、および5−プロピニルシトシンを含むN−2、N−6、およびO−6置換されたプリンを含む。5−メチルシトシン置換は、0.6〜1.2℃まで核酸二重鎖安定性を増大すること、および特に2’−O−メトキシメチル糖修飾と組み合わせたときに、現在適切な塩基置換であることが示された。
いくつかの上記の修飾された核酸塩基、並びにその他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記の米国特許第3,687,808号、並びに以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,594,121号;第5,596,091号;第5,614,617号;第5,645,985号;第5,830,653号;第5,763,588号;第6,005,096号;および第5,681,941号、並びに米国特許5,750,692号(これは、本明細書に参照として組み入れられる)。
また、本発明のオリゴマー化合物は、1つまたは複数の複素環塩基部分の代わりに多環式複素環化合物を含むことができる。多くの三環系の複素環化合物が以前に報告されている。これらの化合物は、標的鎖に対する修飾された鎖の結合性質を増大するために、アンチセンス適用において日常的に使用されている。最も研究された修飾は、グアノシンに対してターゲットされ、それゆえ、これらは、G−クランプまたはシチジン類似体と呼ばれた。第2の鎖のグアノシンと3つの水素結合を生じる代表的なシトシン類似体は、1,3−ジアザフェノキサジン−2−オン(R10=O、R11〜R14=H)(Kurchavovら、Nucleosides and Nucleotides,1997,16,1837−1846)、1,3−ジアザフェノチアジン−2−オン(R10=S、R11〜R14=H)(Linら、J.Am.Chem.Soc.,1995,117,3873−3874)、および6,7,8,9−テトラフルオロ−1,3−ジアザフェノキサジン−2−オン(R10=O、R11〜R14=F)(Wangら、Tetrahedron Lett.,1998,39,8385−8388)を含む。オリゴヌクレオチドに組み入れると、これらの塩基修飾は、相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示され、後者がアデニンとハイブリダイズし、スタッキング相互作用を拡張することによってヘリックスの熱安定性を増強することが示された(また、2002年5月24日に出願された表題「Modified Peptide Nucleic Acids」の米国特許出願第10/155,920号;および2002年5月24日に出願された表題「Nuclease Resistant Chimeric Oligonucleotides」の米国特許出願第10/013295号を参照されたい(これらは両方とも、これらの全体が共通に本明細書に参照として組み入れられる))。
シトシン類似体/置換が、強固な1,3−ジアザフェノキサジン−2−オン足場(R10=O、R11=−O−(CH−NH、R12−14=H)に付着されたアミノエトキシ部分を有するときに、さらなるヘリックス安定化特性が観察された(Linら、J.Am.Chem.Soc.,1998,120,8531−8532)。結合研究により、単一の組み込みにより、5−メチルシトシン(dC5me)と比較して、18°までのΔTmで、モデル・オリゴヌクレオチドの、その相補的標的DNAまたはRNAに対する結合親和性を増強することができることが証明され、これは、なおも単一の修飾について公知の最高の親和性の増強である。一方、ヘリックスの安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの特異性を損なわない。
本発明に使用することが受け入れられるさらなる三環系の複素環化合物およびこれらを使用する方法は、2000年5月22日に発行された米国特許第6,028,183号、および1999年12月28日に発行された米国特許第6,007,992号に開示されている(いずれの内容も、これらの全体が本明細書に組み入れられる)。
フェノキサジン誘導体の増強された結合親和性は、これらの配列特異性が損なわれていないことと共に、これらをより強力なアンチセンスに基づいた薬物の開発のための価値のある核酸塩基の類似体にする。実際に、フェノキサジン置換を含むヘプタヌクレオチドが、RNase Hを活性化すること、細胞取り込みを増強すること、およびアンチセンス活性の増大を示すことができることを証明する有望なデータが、インビトロでの実験で導き出された(Linら、J.Am.Chem.Soc.,1998,120,8531−8532)。単一の置換により、20merの2’−デオキシホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドのインビトロでの能力を有意に改善することが示されたとおり(Flanaganら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96,3513−3518)、活性の増強は、G−クランプの場合にさらに明白であった。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド・デザインを最適化するために、および生物活性に対するこれらの複素環式修飾の影響をよりよく理解するために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に対するこれらの効果を評価することが重要である。
複素環塩基として有用なさらなる修飾された多環式複素環化合物は、上記の米国特許第3,687,808号、並びに以下の米国特許:第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,434,257号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,594,121号;第5,596,091号;第5,614,617号;第5,645,985号;第5,646,269号;第5,750,692号;第5,830,653号;第5,763,588号;第6,005,096号;および第5,681,941号、並びに2001年11月28日に出願された米国特許出願第09/996292号に開示されているが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる。
抱合体
本発明のアンチセンス化合物のもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、もしくは細胞取り込みを増強する1つまたは複数の部分または抱合体をオリゴマー化合物に対して化学的に連結することを含む。これらの部分または抱合体は、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合された基を含むことができる。本発明の抱合体基は、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基を含む。典型的な抱合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレッセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含む。薬力学的性質を増強する基は、本発明の状況において、取り込みを改善する基、耐崩壊性を増強する基、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的性質を増強する基は、本発明の状況において、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的抱合体基は、1992年10月23日に出願された国際特許出願第PCT/US92/09196号および米国特許第6,287,860号(その全ての開示が、参照として本明細書に組み入れられる)に開示されている。抱合体部分は、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−S−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム、1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分を含むが、これらに限定されない。また、本発明のアンチセンス化合物は、活性な原体、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)−(+)−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン(indomethicin)、バルビツール剤、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬、または抗生物質に対して抱合してもよい。オリゴヌクレオチド−薬物複合体およびこれらの調製は、米国特許出願第09/334130号(1999年6月15日に出願された)に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
このようなオリゴヌクレオチド抱合体の調製を教示する米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第4,828,979号;第4,948,882号;第5,218,105号;第5,525,465号;第5,541,313号;第5,545,730号;第5,552,538号;第5,578,717号;第5,580,731号;第5,580,731号;第5,591,584号;第5,109,124号;第5,118,802号;第5,138,045号;第5,414,077号;第5,486,603号;第5,512,439号;第5,578,718号;第5,608,046号;第4,587,044号;第4,605,735号;第4,667,025号;第4,762,779号;第4,789,737号;第4,824,941号;第4,835,263号;第4,876,335号;第4,904,582号;第4,958,013号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,082,830号;第5,112,963号;第5,214,136号;第5,245,022号;第5,254,469号;第5,258,506号;第5,262,536号;第5,272,250号;第5,292,873号;第5,317,098号;第5,371,241号;第5,391,723号;第5,416,203号;第5,451,463号;第5,510,475号;第5,512,667号;第5,514,785号;第5,565,552号;第5,567,810号;第5,574,142号;第5,585,481号;第5,587,371号;第5,595,726号;第5,597,696号;第5,599,923号;第5,599,928号、および第5,688,941号。
また、たとえばヌクレアーゼ安定性などの性質を増強するために、オリゴマー化合物を、一般にオリゴマーの鎖の一方または両方の末端に付着されている1つまたは複数の安定化基を有するように修飾することができる。安定化基に含まれるものには、キャップ構造がある。「キャップ構造または末端キャップ部分」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端組み込まれた化学修飾を意味する(たとえばWincottら、国際公開公報第97/26270号を参照されたい、参照として本明細書に組み入れられる)。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から末端核酸分子を有するオリゴマー化合物を保護して、細胞内のデリバリーおよび/または局在化を補助することができる。キャップは、5’末端(5’−キャップ)に、または3’末端(3’−キャップ)に、いずれかに存在することができ、または一本鎖の両方の末端に、もしくは二本鎖化合物の両方の鎖の1つもしくは複数の末端に存在することができる。このキャップ構造は、天然のmRNA分子の5’末端に存在する反転したメチルグアノシン「5’キャップ」と混乱しないことである。非限定の例において、5’−キャップは、以下を含む:反転した塩基のない残基(部分)、4’,5’−メチレンヌクレオチド;1−(β−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;1,5−無水ヘキシトールヌクレオチド;L−ヌクレオチド;α−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオアート結合;スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’,4’−セコヌクレオチド;非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド(riucleotide)、3’−3’反転したヌクレオチド部分;3’−3’反転した塩基のない部分;3’−2’反転したヌクレオチド部分;3’−2’反転した塩基のない部分;1,4−ブタンジオールホスフェート;3’−ホスホラミダート;ヘキシルホスフェート;アミノヘキシルホスフェート;3’−ホスフェート;3’−ホスホロチオアート;ホスホロジチオアート;または架橋もしくは非架橋メチルホスホナート部分(より詳細については、Wincottら、国際PCT公開第WO97/26270号を参照されたい、本明細書に参照として組み入れられる)。siRNA構築物については、5’末端(5’キャップ)は、一般に5’−ヒドロキシルまたは5’−ホスフェートであるが、これらに限定されない。
特に適した3’−キャップ構造は、例えば4’,5’−メチレンヌクレオチド;1−(β−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;5’−アミノアルキル−ホスフェート;1,3−ジアミノ−2−プロピルホスフェート、3−アミノプロピルホスフェート;6−アミノヘキシルホスフェート;1,2−アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5−無水ヘキシトールヌクレオチド;L−ヌクレオチド;α−ヌクレオチド;修飾塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオアート;スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3’,4’−セコヌクレオチド;3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5’−5’反転したヌクレオチド部分;5’−5’反転した塩基のない部分;5’−ホスホラミダート;5’−ホスホロチオアート;1,4−ブタンジオールホスフェート;5’−アミノ;架橋および/または非架橋5’−ホスホラミダート、ホスホロチオアート、および/またはホスホロジチオアート、架橋もしくは非架橋メチルホスホナート、および5’−メルカプト部分(より詳細については、BeaucageおよびTyer,1993,Tetrahedron 49,1925を参照されたい;本明細書に参照として組み入れられる)。
ヌクレアーゼ安定性を与えるためにオリゴマー化合物のキャップの一方または両方の末端に使用することができるさらなる3’および5’安定化基は、2003年1月16日に発行された国際公開公報第03/004602号に開示されたものを含む。
キメラ化合物
所与のアンチセンス化合物の全ての位置を均一に修飾することは必要とされず、実際に、上述した修飾のうちの1つ以上が、単一化合物に、またはアンチセンス化合物内の単一のヌクレオシド内にさえ組み入れてもよい。
また、本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の状況において、それぞれが少なくとも1つの単量体単位(すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド)で作製された2つ以上の化学的に異なった領域を含む一本鎖または二本鎖アンチセンス化合物(例えばオリゴヌクレオチド)である。キメラ・アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の1つの形態である。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的にはオリゴヌクレオチドに対して、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大、電荷の変化、安定性の増大、および/または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように修飾された少なくとも1つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNAsesまたはその他の酵素の基質として役立ってもよい。例として、RNAse Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従って、RNase Hの活性化は、RNA標的の切断を生じ、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチドを媒介した阻害の効率が非常に増強する。RNA:RNAハイブリッドの切断は、同様の様式で、細胞およびウイルスのRNAの両方を切断するRNase IIIまたはRNAseLなどのエンドリボヌクレアーゼの作用を介して達成することができる。RNA標的の切断産物は、ゲル電気泳動および必要に応じて、当技術分野において公知の関連した核酸ハイブリダイゼーション技術によってルーチンで検出することができる。
本発明のキメラ・アンチセンス化合物は、上記の通りに、2つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および/またはオリゴヌクレオチド擬態の複合構造として形成されてもよい。また、このような化合物は、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーともいわれる。このようなハイブリッド構造物の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書にその全体が参照として組み入れられる:第5,013,830号;第5,149,797号;第5,220,007号;第5,256,775号;第5,366,878号;第5,403,711号;第5,491,133号;第5,565,350号;第5,623,065号;第5,652,355号;第5,652,356号;および第5,700,922号。
塩、プロドラッグ、および生物学的同等物
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に対して投与することにより、これらの生物学的に活性な代謝産物または残基を(直接または間接的に)提供することができる任意のその他の化合物を包含する。従って、たとえば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、およびその他の生物学的同等物ももたらす。
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素もしくはその他の化学物質および/または条件の作用によって、これらの体または細胞内で活性型(すなわち薬物)に変換される不活性型または低活性型に調製される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ・バージョンは、1993年12月9日に公表されたGosselinらに対する国際公開公報第93/24510号に、またはImbachらに対する国際公開公報第94/26764号に開示された方法に従って、SATE((S−アセチル−2−チオエチルリン酸)誘導体として調製される。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的および薬学的に許容される塩:すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつそれに対して望まれない中毒学的効果を与えない塩をいう。
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属もしくは有機アミンなどの金属またはアミンで形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、等である。適切なアミンの例は、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N−メチルグルカミン、およびプロカインである(たとえば、Bergeら、“Pharmaceutical Salts,”J.of Pharma Sci.,1977,66,1−19を参照されたい)。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態を所望の塩基の十分な量と接触させて、慣用的方法で塩を生成することによって調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させること、および慣用的方法で遊離酸を単離することによって再生してもよい。遊離酸形態は、極性溶媒中における溶解度などの一定の物性において、これらのそれぞれの塩形態といくぶん異なるが、さもなければ、塩は、本発明の目的のためのこれらのそれぞれの遊離酸と同等である。本明細書で使用される「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の成分のうちの1つの酸形態の薬学的に許容される塩を含む。これらは、アミンの有機または無機酸の塩を含む。酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸、硝酸塩、およびリン酸塩である。その他の適切な薬学的に許容される塩が当業者に周知であり、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などの無機酸と;有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸、もしくはホスホ酸、またはN置換されたスルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシ・マレイン酸、シトラコン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4−アミノサリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、2−アセトキシ安息香酸、エンボ酸(embonic)、ニコチン酸、またはイソニコチン酸と;および、天然においてタンパク質の合成に関与する20αアミノ酸、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸と、更にフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−二スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ナフタレン−1,5−二スルホン酸、2−もしくは3−ホスホグリセリン酸、グルコース−6−リン酸、N−シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートを形成して)と、またはアスコルビン酸などのその他の酸性有機化合物となどの、たとえば種々の無機酸および有機酸の塩基性塩を含む。また、薬学的に許容される陽イオンで、化合物の薬学的に許容される塩を調製してもよい。適切な薬学的に許容される陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、および四級アンモニウムカチオンを含む。また、炭酸塩または酸性炭酸塩であることもできる。
オリゴヌクレオチドについては、薬学的に許容される塩の例は、以下を含むが、これらに限定されない:(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジン、その他などのポリアミンと形成された塩;(b)無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成された酸付加塩;(c)たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ酸などの有機酸と形成された塩;並びに(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの基本的陰イオンから生じた塩。アンチセンス・オリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であり、ヒトに対する治療的投与のために十分に受け入れられる。もう一つの態様において、dsRNA化合物のナトリウム塩も提供される。
G. 製剤
また、本発明の化合物は、取り込み、分布、および/または吸収を助けるために、混合され、カプセル化され、抱合され、またはさもなければその他の分子、分子構造、もしくは化合物の混合物、たとえばリポソーム、受容体にターゲットされる分子、経口、直腸、局所的、またはその他の製剤と結合されていてもよい。このような取り込み、分布、および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる:第5,108,921号;第5,354,844号;第5,416,016号;第5,459,127号;第5,521,291号;第5,543,158号;第5,547,932号;第5,583,020号;第5,591,721号;第4,426,330号;第4,534,899号;第5,013,556号;第5,108,921号;第5,213,804号;第5,227,170号;第5,264,221号;第5,356,633号;第5,395,619号;第5,416,016号;第5,417,978号;第5,462,854号;第5,469,854号;第5,512,295号;第5,527,528号;第5,534,259号;第5,543,152号;第5,556,948号;第5,580,575号;および第5,595,756号。
また、本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤を含む。本発明の薬学的組成物は、局部的または全身性の治療が要求されるかどうかに応じて、および治療される領域に応じて、多くの方法で投与してもよい。投与は、局所的(眼並びに膣および直腸のデリバリーを含む粘膜を含む)、経肺、たとえば噴霧器によるものを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入またはガス注入によって;気管内、鼻腔内、経上皮、および経皮)、経口的、または非経口的であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射または注入;または頭蓋内、たとえばクモ膜下もしくは心室内投与を含む。少なくとも1つの2’−O−メトキシメチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、特に経口投与のために有用であると考えられている。透過増強剤は、経口的に投与されたオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を増強することが見いだされた。透過増強剤は、界面活性物質、胆汁酸塩、脂肪酸、キレート薬、または非キレート界面活性物質を含む。カプリン酸(C10)および/またはラウリン酸(C12)、並びにこれらの塩は、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能(biavailability)を増強するための有効な脂肪酸であることが示されたものの一つである;ウルソデオキシコール酸(UDCA)およびケノデオキシコール酸(CDCA)は、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能(biavailability)を増強するための有効な胆汁酸塩であることが示されたものの一つである。また、遅放性(たとえば、パルスまたは拍動性放出)製剤および徐放性製剤は、生物学的利用能を増強するために有用である。生体付着性材料は、粘膜の膜に対する薬物キャリア粒子を付着して、取り込みを増強するために添加してもよい。
局所的投与のための薬学的組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末を含んでもよい。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性基材、増粘剤等が必要であっても、または望ましくかもしれない。また、被覆コンドーム、手袋なども有用かもしれない。
本発明の薬学的製剤は、便利には、単位用量形態で提示されてもよく、医薬品工業において周知の従来技術に従って調製してもよい。このような技術は、薬学的キャリアまたは賦形剤と活性成分を結合させる工程を含む。一般に、製剤は、液体キャリアもしくは微粉固体キャリア、または両方と活性成分を均一かつ完全に結合させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、タブレット、カプセル、ゲル・カプセル、液体シロップ、柔らかいゲル、坐薬、および浣腸などの(しかし、これらに限定されない)任意の多くの可能性剤形に処方してもよい。また、本発明の組成物は、水溶性、非水溶性、または混合された媒体中に懸濁液として処方してもよい。水性懸濁液は、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大する物質をさらに含んでもよい。また、懸濁液は、安定剤を含んでもよい。
本発明の薬学的組成物は、溶液、エマルジョン、フォーム、およびリポソームを含む製剤を含むが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物および製剤は、1つまたは複数の透過増強剤、キャリア、賦形剤、またはその他の活性もしくは不活性成分を含んでもよい。
エマルジョンは、典型的には、通常直径0.1μmを越える液滴の形態で別のものに分散された1つの液体の不均一な系である。エマルジョンは、分散相と活性薬物(これは、水相、油相、または分離相としてそれ自体のいずれかに溶液として存在してもよい)とに加えてさらなる成分を含んでもよい。ミクロエマルジョンは、本発明の態様として含まれる。エマルジョンおよびこれらの用途は、当技術分野において周知であり、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明に使用される「リポソーム」という用語は、球面二重層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料および送達される組成物を含む水性内部から形成された膜を有する単層または多層状の小胞である。陽イオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている。pH感受性または負に荷電したリポソームは、これと複合体をなすのではなく、むしろDNAに入り込むと考えられている。陽イオン性および非陽イオン性リポソームは、DNAを細胞に送達するために使用されてきた。
また、リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームを含み、本明細書に使用されるこの用語は、リポソームに組み込まれたときに、このような特定化された脂質を欠いているリポソームと比較して、増強された循環寿命を生じる1つまたは複数の特定化された脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が1つもしくは複数の糖脂質を含むか、または1つもしくは複数のポリエチレングリコール(PEG)部分などの親水性重合体で誘導体化されたものである。リポソームおよびこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
また、本発明の薬学的製剤および組成物は、界面活性物質を含んでいてもよい。製剤、処方、およびエマルジョンにおける界面活性物質の使用は、当技術分野において周知である。界面活性物質およびこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
一つの態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的なデリバリーを行うために種々の透過増強剤を使用する。また、透過増強剤は、細胞膜全体の非親油性薬物の拡散を助けることに加えて、親油性薬物の透過性を増強する。透過増強剤は、5つの広いカテゴリー、すなわち界面活性物質、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート薬、非キレート非界面活性物質のうちの1つに属するものとして分類してもよい。透過増強剤およびこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。透過増強剤として作用する種々の脂肪酸およびこれらの誘導体は、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸(C12)、カプリン酸(C10)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、レシンレアート(recinleate)、モノレイン酸(a.k.a. 1−モノオレオイル−rac−グリセロール)、ジラウリン酸、カプリル酸、アラキドン酸(arichidonic)、グリセリル 1−モノカプリン酸、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−およびジ−グリセリド、並びにこれらの生理的に許容される塩(すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩、その他)を含む(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,8:2,91−192;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7:1,1−33;El−Haririら、J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651−654)。いくつかの脂肪酸の例には、カプロン酸ナトリウム(C10)およびラウリン酸ナトリウム(C12)があり、0.5〜5%の濃度で単独または組み合わせて使用される。
例示的な胆汁酸塩は、たとえば、コール酸(または、その薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(glucholic)(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリコール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシ−コール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシ−コール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ−24,25−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(POE)を含む(Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92;Swinyard,Chapter 39 In:Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990,pages 782−783;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1−33;Yamamotoら、J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25;Yamashitaら、J.Pharm.Sci.,1990,79,579−583)。UDCAおよびCDCAは、オリゴヌクレオチドのための透過増強剤として効率的に使用されており、組み合わせらたときに、より効率的であった。
1つまたは複数の胆汁酸塩および1つまたは複数の脂肪酸を含む複合製剤、特にラウリン酸塩およびカプリン酸塩と組みあわせたCDCA(UDCAの有無にかかわらず)は、さらに有効であった(1998年7月1日に出願された米国特許出願第09/108673号、Teng and Hardee)。
当業者であれば、これらの使用目的、すなわち投与の経路にしたがってルーチンで製剤がデザインされることを認識するであろう。
局所的投与のための製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが局所的なデリバリー薬剤(例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート薬および界面活性物質)との混合物中にあるものを含む。脂質およびリポソームは、中性の(たとえば、ジオレイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン)、負の(たとえば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)、および陽イオン性の(たとえば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA)ものを含む。
局所的またはその他の投与については、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内にカプセル化してもよく、またはそれに対して、特に陽イオン性リポソームに対して複合体を形成させてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質に、特にカチオン脂質に対して複合となってもよい。脂肪酸およびエステル、これらの薬学的に許容される塩、並びにこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。局所製剤は、1999年5月20日に出願された米国特許出願第09/315298号に詳述されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、ミクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、ゲル・カプセル、サッシェ、タブレット、またはミニタブレットを含む。増粘剤、香料、希釈液、乳化剤、分散援助剤、または結合剤が望ましい。経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドを1つまたは複数の透過増強剤界面活性物質およびキレート薬とともに投与するものである。界面活性物質は、脂肪酸および/またはエステルまたはこれらの塩、胆汁酸および/またはこれらの塩を含む。胆汁酸/塩および脂肪酸並びにこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。また、透過増強剤、例えば胆汁酸/塩との組み合わせた脂肪酸/塩の組み合わせも適している。1つの組み合わせは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸、およびUDCAである。さらなる透過増強剤は、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧された乾燥粒子を含む粒状形態で、またはマイクロもしくはナノ粒子を形成するように複合体にして経口的に送達してもよい。オリゴヌクレオチド複合化剤およびこれらの使用は、米国特許第6,287,860号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチドのための経口製剤およびこれらの調製は、米国出願第09/108673号(1998年7月1日に出願された)、第09/315298号(1999年5月20日に出願された)、および2002年2月8日に出願された第10/071822号に詳述されており、そのそれぞれが、参照としてこれらの全体が本明細書に組み入れられる。
非経口的、くも膜下腔内、または脳室内投与のための組成物および製剤は、透過増強剤、キャリア化合物、およびその他の薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤などの(しかし、限定されない)緩衝液、希釈液およびその他の適切な添加物をまた含んでもよい無菌の水溶液を含んでもよい。
本発明のある態様は、1つまたは複数のオリゴマー化合物と1つまたは複数の非アンチセンス機構によって機能するその他の化学療法薬とを含む薬学的組成物を提供する。このような化学療法薬の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない:ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン(esorubicin)、ブレオマイシン、マホスファミド(mafosfamide)、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素(bis−chloroethylnitrosurea)、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素(methylcyclohexylnitrosurea)、ニトロゲンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、5−フルオロウラシル(5−FU)、5−フルオロデオキシウリジン(5−FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP−16)、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン(gemcitabine)、テニポシド、シスプラチン、ペメトレキシド(pemetrexed)、およびジエチルスチルベストロール(DES)などの癌化学療法薬。本発明の化合物と共に使用するときに、このような化学療法薬は、個々に(たとえば、5−FUおよびオリゴヌクレオチド)、経時的に(たとえば、期間中の5−FUおよびオリゴヌクレオチド、続くMTXおよびオリゴヌクレオチド)、または1つもしくは複数のその他のこのような化学療法薬と組み合わせて(たとえば、5−FU、MTXおよびオリゴヌクレオチド、または5−FU、放射線療法、およびオリゴヌクレオチド)使用してもよい。また、リビビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含むが、これらに限定されない非ステロイド系抗炎症薬および副腎皮質ステロイド、並びに抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない抗炎症剤は、本発明の組成物中に組み合わせてもよい。また、アンチセンス化合物およびその他の非アンチセンス薬物の組み合わせも、本発明の範囲内である。2つ以上組み合わせた化合物を、共に、または経時的に使用してもよい。
もう一つの関連した態様において、本発明の組成物は、第1の核酸にターゲットされた1つまたは複数のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第2の核酸標的にターゲットされた1つまたは複数のさらなるアンチセンス化合物とを含んでもよい。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域に対してターゲットされる2つ以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。アンチセンス化合物の多数の例が、当技術分野において公知である。2つ以上組み合わせた化合物を、共に、または経時的に使用してもよい。
H. 投薬
本明細書に使用される「患者」という用語は、eIF4E発現または過剰発現と関連する1つもしくは複数の障害で苦しむ哺乳類をいう。最も望まれる患者は、ヒトであることが理解される。また、本発明は、哺乳類eIF4E発現または過剰発現の特異的阻害に関することが理解される。
当業者は、現在障害で苦しむ患者を本発明の化合物の有効な量で治療することによって、eIF4E発現または過剰発現と関連する障害に影響を及ぼし得ることが認識される。従って、「治療」および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されている障害の進行を緩徐化し、中断し、抑え、制御し、遅延し、または中止し得る全てのプロセスをいうことが企図され、必ずしも全ての症状の全体を除去することを示すわけではない。
本明細書に使用される、本発明の化合物の「有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、本明細書に記載されている障害を治療または防止する際に有効である量をいう。
治療組成物の製剤およびこれらのその後の投与(投薬)は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投薬は、数日から数月続く治療期間、または治癒が遂行されるか、もしくは疾病状態の縮小が達成されるまでと共に、治療される疾病状態の重篤さおよび応答性に依存的である。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積を測定することにより算出することができる。当業者であれば、最適用量、投薬法、および反復速度を容易に決定することができる。最適用量は、個体のオリゴヌクレオチドの相対的な能力に応じて変化してもよく、一般にインビトロで、およびインビボでの動物モデルにおいて有効であることが見いだされたEC50に基づいて推定することができる。一般に、用量は、体重のkgあたり0.0001μg〜100gであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年、またはさらに2〜20年ごとに一度、一回または複数回与えてもよい。一部の態様において、用量は、体重のkgあたり0.0001μg〜100μg、体重のkgあたり0.001μg〜10g、体重のkgあたり0.01μg〜1g、体重のkgあたり0.1μg〜100g、体重のkgあたり1μg〜10mg、体重のkgあたり10μg〜1mg、体重のkgあたり100μg〜500mgであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年、またはさらに2〜20年ごとに一度、一回または複数回与えてもよい。二本鎖化合物については、用量は、第2の鎖の増大された核酸負荷(2つの鎖を含む化合物について)またはさらなる核酸長(自己相補的な化合物について)に相当するように算出しなければならない。当業者であれば、測定された体液または組織中の薬物の滞流時間および濃度に基づいて、投薬に関する反復割合を容易に推定することができる。
オリゴヌクレオチドの吸光度、分布、代謝、および排出(ひとまとめにして、ADMEとして公知)に対して多くの研究がなされてきた。ADMEは、所与の化学の全ての配列(たとえば、P=Sバックボーンをもつ全て2’MOEギャップマー)が水溶性、分子量(約7000)、およびpKaなどの同様の物理的/化学的性質を有する独立した配列である。オリゴヌクレオチドは、組織に、主に(しかし、限定されない)肝臓、腎臓、脾臓、および骨髄に分布することによって比較的迅速に血漿から除去される(分布半減期約1時間、24時間までに完全な分布)。腎臓、肝臓、骨髄、脂肪組織、脾臓、リンパ節、肺(エアロゾルを経て)、および中枢神経系(脳室内に与える)を含む組織において、薬物動態と薬動力学との間の強力な相関が証明された。組織半減期は、第一世代アンチセンス医薬(ホスホロチオアート・バックボーンをもつ2’−デオキシ)について1〜5日であり、ホスホロチオアート・バックボーンをもつ2’−MOEギャップド・オリゴヌクレオチドについて10〜28日である。Henryら、Curr.Opin.Invest.Drugs,2001,2,1444−1449。
治療成功に続いて、疾病状態の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましく、オリゴヌクレオチドが、体重のkgあたり0.0001μg〜100gまでの範囲での維持量で、毎日から20年ごと一度、一回または複数回投与される。
本発明は、一定のその態様に従った特異性で記載してあるが、以下の実施例は、本発明を例示するだけであり、これを限定することは企図されない。本出願において引用された各々の参照、GenBankアクセッション番号などは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
実施例1:ヌクレオシド・ホスホラミダイトの合成
アミダイトおよびこれらの中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号および発行されたPCT国際公開公報第02/36743号に記載されているように調製した;5−メチルdCアミダイトのための5’−O−ジメトキシトリチル−チミジン中間体、5−メチル−dCアミダイトのための5’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシ−5−メチルシチジン中間体、5−メチルdCアミダイトのための5’−O−ジメトキシトリチル−2’−デオキシ−N4−ベンゾイル−5−メチルシチジン最後から2番目の中間体、(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル)−2’−デオキシ−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン−3’−O−イル)−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(5−メチルdCアミダイト)、2’−フルオロデオキシアデノシン、2’−フルオロデオキシグアノシン、2’−フルオロウリジン、2’−フルオロデオキシシチジン、2’−O−(2−メトキシメチル)修飾アミダイト、2’−O−(2−メトキシエチル)−5−メチルウリジン中間体、5’−O−DMT−2’−O−(2−メトキシエチル)−5−メチルウリジン最後から2番目の中間体、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル)−2’−O(2−メトキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−O−イル)−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Tアミダイト)、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−(2−メトキシエチル)−5−メチルシチジン中間体、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−(2−メトキシエチル)−N−ベンゾイル−5−メチル−シチジン最後から2番目の中間体、5’−O−(4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル)−2’−O−(2−メトキシエチル)−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン−3’−O−イル)−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE 5−Me−Cアミダイト)、(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル)−2’−O−(2−メトキシエチル)−N−ベンゾイルアデノシン−3’−O−イル)−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE A アミダイト)、(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリフェニルメチル)−2’−O−(2−メトキシエチル)−N−イソブチルグアノシン−3’−O−イル)−2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Gアミダイト)、2’−O−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、および2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2’−(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−O−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(2−ヒドロキシエチル)−5−メチルウリジン、2’−O−((2−フタリミドオキシ)エチル)−5’−t−ブチルジフェニルシリル−5−メチルウリジン、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−((2−ホルマドキシミノオキシ)エチル)−5−メチルウリジン、5’−O−tert−ブチルジフェニルシリル−2’−O−(N,N ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン、2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン、5’−O−DMT−2’−O−(ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン、5’−O−DMT−2’−O−(2−N,N−ジメチルアミノオキシエチル)−5−メチルウリジン−3’−((2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト)、2’−(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2−イソブチリル−6−O−ジフェニルカルバモイル−2’−O−(2−エチルアセチル)−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)グアノシン−3’−((2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト)、2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’−DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2’−O−(2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル)−5−メチルウリジン、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−(2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)−エチル))−5−メチルウリジン、および5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−(2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)−エチル))−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホラミダイト。
2’−デオキシおよび2’−メトキシアミダイト
2’−デオキシおよび2’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトは、市販の供与源(たとえば、Chemgenes,Needham,MA または Glen Research,Inc.Sterling,VA)から購入した。その他の2’−O−アルコキシ置換されたヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,506,351号(これは、本明細書に参照として組み入れられる)に記載されているように調製した。2’−アルコキシアミダイトを使用して合成されるオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールおよび塩基のパルス・デリバリー後の待機工程を360秒まで増大したことを除いて、無修飾オリゴヌクレオチドのための標準的なサイクルは利用した。
5−メチル−2’−デオキシシチジン(5−Me−C)ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なホスホラミダイト(Glen Research,Sterling VAまたは ChemGenes,Needham,MA)を使用して、発行された方法(Chemgenes,Needham,MA or Glen Research,Inc.Sterling,VA)にしたがって合成した。
2’−フルオロアミダイト
2’−フルオロ・オリゴヌクレオチドは、以前(Kawasakiら、J.Med.Chem.,1993,36,831−841)および米国特許第5,670,633号(本明細書に参照として組み入れられる)に記載されているとおりに合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドN6−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロアデノシンを、出発原料として商業的に入手可能な9−β−D−アラビノフラノシルアデニンを利用して、文献手順を修飾することによって合成し、これにより、2’−α−フルオロ原子が2’−β−トリチル基のS2−置換によって導入される。こうして、N6−ベンゾイル−9−β−D−アラビノフラノシルアデニンを3’,5’−ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として適度な収率で選択的に保護した。THPおよびN6−ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法論を使用して達成し、5’−ジメトキシトリチル−(DMT)および5’−DMT−3’−ホスホラミダイト中間体を得るために標準的な方法を使用した。
2’−デオキシ−2’−フルオログアノシンの合成は、開始材料としてテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)保護された9−β−D−アラビノフラノシルグアニンを、および中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転換を使用して達成した。TPDS基の脱保護をTHPでのヒドロキシル基の保護によって行い、ジイソブチリルジ−THP被保護アラビノフラノシルグアノシンを得た。選択的なO−脱アシルおよびトリフレート化(triflation)をフッ化物での粗生成物の処置によって行い、次いでTHP基を脱保護した。5’−DMT−および5’−DMT−3’−ホスホラミダイトを得るために、標準的な方法を使用した。
2’−デオキシ2’−フルオロウリジンの合成は、2,2’−無水−1−β−D−アラビノフラノシルウラシルを70%のフッ化水素−ピリジンで処置するという文献手順を修飾することによって達成した。標準的方法を使用して5’−DMTおよび5’−DMT−3’ホスホラミダイトを得た。
2’−デオキシ2’−フルオロシチジンを2’−デオキシ−2’−フルオロウリジンのアミノ化、続く選択的な保護を経て合成し、N4−ベンゾイル−2’−デオキシ−2’−フルオロシチジンを得た。標準的な方法を使用して5’−DMTおよび5’−DMT−3’ホスホラミダイトを得た。
2’−O−(2−メトキシメチル)修飾されたアミダイト
2’−O−メトキシメチル置換されたヌクレオシドアミダイトは、Martin,Helvetica Chimica Acta,1995,78,486−50.の方法に従って調製される。
2’−(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2’−(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトは、米国特許出願第6,127,533号(本明細書に参照として組み入れられる)の方法に従って調製される。
実施例2:オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って使用されるオリゴマー化合物は、周知の固相合成の技術を介して、便利かつルーチンで作製してもよい。このような合成のための設備は、たとえば、Applied Biosystems(Foster City,CA)を含むいくつかの売り手によって販売されている。加えて、またはあるいは、当技術分野において公知のこのような合成のための任意のその他の手段を使用してもよい。ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも周知である。
オリゴヌクレオチド:非置換および置換されたリン酸ジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化での標準的なホスホラミダイト化学を使用して自動化DNA合成装置(Applied Biosystemsモデル394)で合成される。
ホスホロチオアート(P=S)は、以下の例外を除いてリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成される:硫化は、亜リン酸結合の酸化のための、3,H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン 1,1−ジオキシドの10% w/vアセトニトリル溶液を利用することによって遂行した。硫化反応段階の時間は、180秒まで増大し、正常なキャッピング工程の後におこなった。CPGカラムからの切断および55℃(12〜16時間)での濃水酸化アンモニウム中におけるデブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを1MのNHOAc溶液から>3体積のエタノールで沈殿させることによって回収した。ホスフィナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,508,270号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
アルキルホスホナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
3’−デオキシ−3’−メチレンホスホナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,610,289号または第5,625,050号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,256,775号または米国特許第5,366,878号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
アルキルホスホノチオアートオリゴヌクレオチドは、発行されたPCT出願第PCT/US94/00902号および第PCT/US93/06976号(それぞれ、国際公開公報第94/17093号および国際公開公報第94/02499号として公表された)に記載されているように調製され、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
3’−デオキシ−3’−アミノホスホラミダート・リゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
リン酸トリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号に記載されているように調製され、これは明細書に参照として組み入れられる。
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および第5,177,198号に記載されているように調製され、これらは、両方とも本明細書に参照として組み入れられる。
4’−チオ含有オリゴヌクレオチドは、米国特許第5,639,873号に記載されているように合成され、その内容は、これらの全体が本明細書に参照として組み入れられる。
オリゴヌクレオシド:メチレンメチリミノ連結されたオリゴヌクレオシド(MMI連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された)、メチレンジメチルヒドラゾ連結されたオリゴヌクレオシド(MDH連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された)、およびメチレンカルボニルアミノ連結されたオリゴヌクレオシド(アミド−3連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定される)、およびメチレンアミノカルボニル連結されたオリゴヌクレオシド(アミド−4連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された)、並びに例えば、交互にMMIおよびP=OまたはP=S結合を有する混合されたバックボーン化合物は、米国特許第5,378,825号、第5,386,023号、第5,489,677号、第5,602,240号、および第5,610,289号に記載されているように調製され、これらの全てが、本明細書に参照として組み入れられる。
ギ酸アセタールおよびチオギ酸アセタール連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および第5,264,564号に記載されているように調製され、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
エチレンオキシド連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載されているように調製され、これは、本明細書に参照として組み入れられる。
PNA合成
ペプチド核酸(PNAs)は、Peptide Nucleic Acids(PNA):Synthesis,Properties and Potential Applications,Bioorganic&Medicinal Chemistry,1996,4,5−23において言及される種々の手順のいずれかに従って調製される。これらは、また米国特許第5,539,082号、第5,700,922号、および第5,719,262号に従って調製してもよく、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
実施例3:RNA合成
一般に、RNA合成化学は、ストラテジーの中間反応において、種々の保護基を選択的に組み入れることに基づく。当技術分野の当業者であれば、有機合成において、シリルエーテルを含む保護基の有用なクラスの保護基の使用を理解するであろう。特に大きなシリルエーテルが、2’−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルソエステル保護基と組み合わせて、5’−ヒドロキシルを保護するために使用される。次いで、この保護基のセットを標準的な固相合成技術と共に使用する。他の全ての合成工程後に、最後に酸に不安定なオルソエステル保護基を除去することが重要である。さらに、合成の間にシリル保護基を早めに使用すると、必要に応じて、2’ヒドロキシルの望まれない脱保護を伴わずに安易な除去が確実になる。
差動的に除去され、かつ差動的に化学的に不安定である保護基による2’−ヒドロキシルの保護と組み合わせた5’−ヒドロキシルの経時的保護のためのこの手順に続いて、RNAオリゴヌクレオチドを合成した。
RNAオリゴヌクレオチドは、段階的な方法で合成される。それぞれのヌクレオチドを経時的に(3’−から5’−方向に)固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドに添加する。鎖の3’末端の第1ヌクレオシドは、固体支持体に共有結合で付着されている。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホラミダイト、および活性化因子を添加して第2の塩基を第1のヌクレオシドの5’−末端に対して結合する。支持体を洗浄し、任意の反応していない5’−ヒドロキシル基を無水酢酸でキャップして5’−アセチル部分を得る。次いで、結合をより安定な、かつ最終的に望まれるP(V)結合へと酸化する。ヌクレオチド添加サイクルの終了後、5’−シリル基をフッ化物で切断する。本サイクルを、それぞれのその後のヌクレオチドに対して繰り返す。
合成に続いて、リン酸上のメチル保護基は、1Mの二ナトリウム−2−カルバモイル−2−シアノエチレン−1,1−ジチオラート3水和物(SNa)のDMF溶液を利用して30分間切断する。脱保護溶液を、水を使用して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗浄する。次いで、支持体を55℃で10分間、40%のメチルアミン水溶液中で処置する。これにより、RNAオリゴヌクレオチドを溶液に放出して、環外のアミンを脱保護し、2’基を修飾する。オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換HPLCによって解析することができる。
2’−オルソエステル基が、最後に除去される保護基である。Dharmacon Research,Inc.(Lafayette,CO)によって開発されたエチレングリコールモノアセテートオルソエステル保護基は、以下の重要な性質を有する有用なオルソエステル保護基の一例である。これは、ヌクレオシド・ホスホラミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である。しかし、オリゴヌクレオチド合成の後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンで処置すると、これにより、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断するだけでなく、オルソエステルからアセチル基を除去する。生じるオルソエステル上の2−エチル−ヒドロキシル置換基は、アセチル化された前駆体よりも電子吸引性が低い。その結果、修飾されたオルソエステルは、酸接触加水分解に対してより不安定になる。特に、切断速度は、アセチル基が除去された後に約10倍速い。従って、このオルソエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合する十分な安定性を有し、さらに、その後に修飾されたときに、最終的なRNAオリゴヌクレオチド産物に適合する比較的穏やかな水性条件下で脱保護を行うことができる。
加えて、RNA合成の方法は、当技術分野において周知である(Scaringe,S.A.Ph.D.Thesis,University of Colorado,1996;Scaringeら、J.Am.Chem.Soc.,1998,120,11820−11821;Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.,1981,103,3185−3191;Beaucageら、Tetrahedron Lett.,1981,22,1859−1862;Dahlら、Acta Chem.Scand.,1990,44,639−641;Reddyら、Tetrahedrom Lett.,1994,25,4311−4314;Wincottら、Nucleic Acids Res.,1995,23,2677−2684;Griffinら、Tetrahedron,1967,23,2301−2313;Griffinら、Tetrahedron,1967,23,2315−2331)。
本発明のRNAアンチセンス化合物(RNAオリゴヌクレオチド)は、本明細書の方法によって合成することができ、またはDharmacon Research,Inc (Lafayette,CO)から購入することができる。一旦合成されれば、次いで、当技術分野において公知の方法によって相補的RNAアンチセンス化合物をアニールさせて、二本鎖(二重鎖)アンチセンス化合物を形成することができる。たとえば、二重鎖は、30μlのRNAオリゴヌクレオチドの各々の相補鎖(50μM RNAオリゴヌクレオチド溶液)と15μlの5×アニーリング緩衝液(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH pH 7.4、2mM酢酸マグネシウム)を組み合わせ、続いて90℃で1分、次いで37℃で1時間の加熱することによって形成することができる。生じる二重化アンチセンス化合物は、キット、アッセイ法、スクリーニング法、または標的核酸の役割を調査するため、または診断もしくは治療的な目的のその他の方法に使用することができる。
実施例4:キメラ・オリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラ・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合されたオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものであることができる。これらは、連結されたヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、連結されたヌクレオシドの5’および3’「ウイング」セグメントの間に位置する第1型と、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の3’または5’末端のいずれかに位置する第2の「開放末端」を含む。また、第1型のオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー」またはギャップド・オリゴヌクレオチドとして当技術分野において公知である。また、第2型のオリゴヌクレオチドは「ヘミマー(hemimers)」、または「ウイングマー(wingmers)」として当技術分野において公知である。
(2’−O−Me)−−(2’−デオキシ)−−(2’−O−Me)キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド
2’−O−アルキルホスホロチオアートおよび2’−デオキシホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド・セグメントを有するキメラ・オリゴヌクレオチドは、上記のように、Applied Biosystems自動DNA合成装置モデル394を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動合成機、並びにDNA部分のための2’−デオキシ−5’−ジメトキシトリチル−3’−O−ホスホラミダイトおよび2’−O−アルキル部分のための5’−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホラミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルは、5’−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホラミダイトのために反応時間を増大したカップリング工程を組み入れることによって修飾されている。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、55℃で12〜16時間、濃アンモニア(NHOH)中で脱保護する。次いで、脱保護されたオリゴを適切な方法によって回収する(沈澱、カラムクロマトグラフィー、真空中での体積の減少、およびキャピラリー電気泳動法による、および質量分析による収率についての、および純度についての質量測光法(spetrophotometrically)による解析)。
(2’−O−(2−メトキシエチル))−−(2’−デオキシ)−−(2’−O−(メトキシエチル))キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド
(2’−O−(2−メトキシエチル))(−−(2’−デオキシ)−−(−2’−O(メトキシエチル))キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルキメラ・オリゴヌクレオチドについての上記の手順に従って、2’−O−メチルアミダイトについての2’−O−(メトキシエチル)アミダイトの置換により調製した。
(2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル)−−(2’−デオキシホスホロチオアート)−−(2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル)キメラ・オリゴヌクレオチド
(2’−O−(2−メトキシエチル)ホスホジエステル)−−(2’−デオキシホスホロチオアート)−−(2’−O−(メトキシエチル)ホスホジエステル)キメラ・オリゴヌクレオチドは、2’−O−メチルキメラ・オリゴヌクレオチドについての上記手順に従って、2’−O−メチルアミダイトに対する2’−O−(メトキシエチル)アミダイトの置換、キメラ構造のウイング部分内のリン酸ジエステルヌクレオチド間結合を生じさせるためのヨウ素で酸化、中心のギャップに対してホスホロチオアートヌクレオチド間結合を生じさせるための3,H−1,2 ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を利用した硫化で調製した。
その他のキメラ・オリゴヌクレオチド、キメラ・オリゴヌクレオシド、および混合されたキメラ・オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,623,065号に従って合成され、これは明細書に参照として組み入れられる。
実施例5:eIF4Eをターゲットする二重化されたアンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物およびこれらの相補体を含む一連の核酸二重鎖を、eIF4Eをターゲットするようにデザインすることができる。二重鎖アンチセンス鎖の核酸塩基配列は、少なくとも表1のオリゴヌクレオチドの8−核酸塩基部分を含む。鎖の末端は、オーバーハングを形成するように1つもしくは複数の天然または修飾された核酸塩基を付加することによって修飾してもよい。次いで、dsRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖の相補体としてデザインし、および合成し、また、いずれかの末端に修飾または付加を含んでいてもよい。たとえば、一つの態様において、dsRNA二重鎖の両方の鎖は、中心的核酸塩基を通して相補で、それぞれ一方または両方の末端にオーバーハングを有する。二重鎖の一端を平滑にすること、および他端にオーバーハング核酸塩基を有することができる。一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重鎖のそれぞれの鎖の3’末端上の1〜6個である。もう一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重鎖の一方の鎖のみの3’末端上の1〜6個である。さらなる態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重化された鎖の一方または両方の5’末端上の1〜6個である。もう一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、ゼロである。
例として、配列CGAGAGGCGGACGGGACCG(配列番号:456)を有するアンチセンス鎖を含み、かつデオキシチミジン(dT)の2核酸塩基オーバーハングを有する二重鎖は、以下の構造を有する:
Figure 2007505627
もう一つの態様において、同じ配列CGAGAGGCGGACGGGACCGを有するアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下に示したように平滑断端(一本鎖のオーバーハングがない)で調製してもよい:
Figure 2007505627
二重鎖は、単分子でも、または二分子でもよく、すなわち、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ分子の一部(これは、ヘアピンまたはその他の自己構造を形成する)または2つの(または、より多くの)別々の分子であってもよい。
二重鎖のRNA鎖は、本明細書に開示される方法によって合成することができ、またはDharmacon Research Inc.,(Lafayette,CO)から購入することができる。一旦合成されれば、相補鎖がアニールされる。一本鎖の一定分量をとり、50μMの濃度に希釈する。一旦希釈したら、30μLのそれぞれの鎖を15μLのアニーリング緩衝液の5×溶液と合わせる。前記緩衝液の終濃度は、100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH pH7.4、および2mM酢酸マグネシウムである。最終体積は、75μLである。この溶液を90℃で1分間インキュベートして、次いで15秒間遠心した。チューブを37℃で1時間おいて、そのときにdsRNA二重鎖を実験に使用する。dsRNA二重鎖の終濃度は、20μMである。この溶液を凍結させて(−20℃)て貯蔵し、5回まで凍結融解することができる。
一旦調製されたら、二重化アンチセンス化合物を、これらがeIF4E発現を調整する能力について評価する。
細胞が80%のコンフルエンシーに到達するときに、これらを本発明の二重化されたアンチセンス化合物で処置する。96ウェル・プレートで培養した細胞については、ウェルを200μL OPTI−MEM−1減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで12μg/mL LIPOFECTIN(Gibco BRL)および200nMの終濃度の所望の二重鎖アンチセンス化合物を含む130μLのOPTI−MEM−1で処置する。処置の5時間後、培地を新しい培地と置き換える。細胞を処置の16時間後に集め、そのときに、RNAを単離して、標的減少をRT−PCRによって測定する。
実施例6:オリゴヌクレオチドの単離
制御された細孔ガラス固体支持体からの切断および濃水酸化アンモニウム溶液中において55℃で12〜16時間デブロッキング後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを>3体積のエタノールで1M NHOAcから沈澱することによって回収する。合成されたオリゴヌクレオチドをエレクトロスプレー質量分析(分子量の決定)によって、およびキャピラリーゲル電気泳動によって解析し、少なくとも70%の全長材料であると判断した。合成で得られたホスホロチオアートおよびホスホジエステル結合の相対量は、−16原子質量単位産物(+/−32 +/−48)と比較して正確な分子量比によって決定した。いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドをChiangら、J.Biol.Chem.1991,266,18162−18171によって記載されているとおりにHPLCによって精製した。HPLCで精製した材料で得られた結果は、HPLCで精製されていない材料で得られたものと同じであった。
実施例7:オリゴヌクレオチド合成−96ウェル・プレート形式
オリゴヌクレオチドは、96ウェル形式で同時に96配列を構築することができる自動合成機で固相P(III)ホスホラミダイト化学を介して合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化によって得た。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、3,H−1,2 ベンゾジチオール−3−オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)のアセトニトリル無水物溶液を利用する硫化によって作製した。標準的な塩基で保護されたβ−シアノエチル−ジイソ−プロピルホスホラミダイトは、市販の売り手(たとえば、PE−Applied Biosystems,Foster City,CA,またはPharmacia,Piscataway,NJ)から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的または特許を受けた方法に従って合成する。これらは、塩基で保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトを利用する。
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、高温(55〜60℃)で12〜16時間濃NHOHで脱保護し、次いで放出された産物を真空中で乾燥した。次いで、乾燥産物を滅菌水に再懸濁してマスタープレートを提供し、次いでここから、全ての解析および試験プレート試料をロボット・ピペッターを利用して希釈した。
実施例8:オリゴヌクレオチド解析−96ウェル・プレート形式
それぞれのウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度を試料およびUV吸収分光学の希釈によって評価した。個々の産物の全長完全性は、96ウェル形式(Beckman P/ACETMMDQ)か、または個々に調製された試料については、市販のCE装置(たとえば、Beckman P/ACETM5000、ABI 270)で、いずれかでキャピラリー電気泳動法(CE)によって評価した。塩基およびバックボーン組成物は、エレクトロスプレー−質量分光法を利用する化合物の質量分析によって確認した。全てのアッセイ試験プレートは、単一およびマルチ・チャンネル・ロボット・ピペッターを使用してマスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%で、少なくとも85%が全長である場合に許容されると判断した。
実施例9:細胞培養およびオリゴヌクレオチド処置−一本鎖アンチセンス化合物
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、任意の種々の細胞型で試験することができる。これは、たとえば、PCRまたはノーザンブロット解析を使用してルーチンで決定することができる。以下の細胞型は、例示の目的で提供されるが、その他の細胞型も、標的が選択される細胞型に発現されていることを条件として、ルーチンで使用することができる。これは、当技術分野においてルーチンの方法、たとえばノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法、またはRT−PCRによって容易に決定することができる。
T−24細胞:
ヒト移行細胞膀胱癌腫細胞株T−24は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(Manassas,VA)から得た。T−24細胞は、10% ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、1mLにつき100ユニットのペニシリンおよび1mLにつき100マイクログラムのストレプトマイシン(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を補った完全マッコイ5A基本培地(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中でルーチンで培養した。細胞は、これらが90%のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、RT−PCR解析に使用するために、7000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレート(Falcon−Primaria #353872)に接種した。
ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、100mmまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
A549細胞:
ヒト肺癌腫細胞株A549は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(Manassas,VA)から得た。A549細胞は、10%のウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、1mLにつき100ユニットのペニシリン、および1mLにつき100マイクログラムのストレプトマイシン(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を補ったDMEM基本培地(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中でルーチンで培養した。細胞は、これらが90%のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。
NHDF細胞:
ヒト新生児の真皮性線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville,MD)から得た。NHDFは、供給元によって推奨されるとおりに補った線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation,Walkersville,MD)中でルーチンで維持した。細胞は、供給元によって推奨されるとおりに最高10継代の間維持した。
HEK細胞:
ヒト胚ケラチのサイト(HEK)は、Clonetics Corporation(Walkersville,MD)から得た。HEKは、供給元によって推奨されるとおりに処方されたケラチノサイト増殖培地(Clonetics Corporation,Walkersville,MD)中でルーチンで維持した。細胞は、供給元によって推奨されるとおりに最高10継代の間維持した。
b. END細胞:
マウス脳内皮細細胞株b.ENDは、Max Plank Instititute (Bad Nauheim,Germany)で、Dr.Werner Risauから得た。b.END細胞は、DMEM(10%のウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD)を補った高グルコース(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD))中でルーチンで培養した。細胞は、これらが90%のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、RT−PCR解析に使用するために、3000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレート(Falcon−Primariaa #3872)にまいた。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、100mmまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
HeLa細胞:
ヒト上皮癌腫細胞株HeLaは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から得た。HeLa細胞は、DMEM(10%のウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を補った高グルコース(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA))中でルーチンで培養した。細胞は、これらが90%のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、約50,000細胞/ウェルの密度で24ウェル・プレート(Falcon−Primaria #3846)に、またはRT−PCR解析に使用するためには、約5,000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまいた。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、これらが約90%のコンフルエンスに到達したときに、細胞を集めた。
U−87 MG細胞:
ヒト・グリア芽細胞腫U−87 MG細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から得た。U−87 MG細胞は、10%のウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)および抗生物質を補ったDMEM(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中で培養した。細胞は、これらが適切なコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、RT−PCR解析に使用するために、約10,000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレート(Falcon−Primaria #3872)にまいた。
ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞は、100mmまたはその他の標準的な組織培養プレート上へ接種してもよい、および培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に治療してもよい。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、100mmまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
MHS細胞:
マウスMH−S細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から購入した。細胞は、10%の熱で不活性化したウシ胎児血清(FCS)(Hyclone Laboratories,Logan,UT)を含むRPMI 1640培地中で維持した。細胞は、5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにおいてプレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。
アンチセンス化合物での処置:
細胞が65〜75%のコンフルエンシーに到達したときに、これらをオリゴヌクレオチドで処置した。96ウェル・プレート中で培養した細胞については、ウェルを100μLのOPTI−MEMTM−1減少血清培地(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)で一旦洗浄し、次いで3.75g/mLのLIPOFECTINTM(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む130μLのOPTI−MEMTM−1で処置した。細胞を処置し、データを三通りで得る。37℃での処置の4〜7時間後、培地を新しい培地と置き換えた。オリゴヌクレオチド処置の16〜24時間後に細胞を集めた。
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で変更する。特定の細胞株のための最適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を濃度の範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドで処置する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH−rasにターゲットされるISIS 13920:
Figure 2007505627
またはヒトJun−N末端キナーゼ−2(JNK2)にターゲットされるISIS 18078:
Figure 2007505627
のいずれかから選択される。両対照は、ホスホロチオアート・バックボーンでをもつ2’−O−メトキシエチル・ギャップマー(太字で示した2’−O−メトキシエチル)である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ISIS 15770:
Figure 2007505627
配列番号:3、マウスおよびラットc−rafの両方にターゲットされるホスホロチオアート・バックボーンをもつ2’−O−メトキシメチル・ギャップマー(太字で示した2’−O−メトキシエチル)である。次いで、c−H−ras(ISIS 13920に対する)、JNK2(ISIS 18078に対する)、またはc−raf(ISIS 15770に対する)mRNAの80%の阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株に対するその後の実験において新たなオリゴヌクレオチドをスクリーニングする濃度として利用する。80%の阻害が達成されない場合、c−H−ras、JNK2、またはc−raf mRNAの60%の阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドでの最も低い濃度を、その細胞株に対するその後の実験においてオリゴヌクレオチドをスクリーニングする濃度として利用する。60%の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチド・トランスフェクション実験のために適していないとみなされる。本明細書に使用されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの濃度は、50nM〜300nMである。
実施例10:eIF4E発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
eIF4E発現のアンチセンス調整は、当技術分野において公知の種々の方法でアッセイすることができる。たとえば、eIF4E mRNAレベルは、とえば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、またはリアルタイムPCR(RT−PCR)によって定量化することができる。リアルタイム定量的PCRは、現在適している。RNA解析は、総細胞RNAまたはポリ(A)+ mRNAに対して行うことができる。本発明のRNA解析の1つの方法は、本明細書のその他の実施例に記載されているように、総細胞RNAの使用である。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。また、ノーザンブロット解析も当技術分野においてルーチンである。リアルタイム定量的(PCR)は、便利には、PE−Applied Biosystems,Foster City,CAから入手可能な、商業的に入手可能なABI PRISMTM7600、7700、または7900配列検出システムをおよび使用して達成することができ、製造業者の説明書に従って使用される。
eIF4Eのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット解析(免疫ブロッティング)、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ方(ELISA)、またはFACS(FACS)などの当該技術分野において周知の種々の方法で定量化することができる。eIF4Eに向けられた抗体は抗体のMSRSカタログ (Aerie Corporation,Birmingham,MI)などの種々の供与源から同定すること、および得ることができ、または従来のモノクローナルまたは当該技術分野において周知のポリクローナル抗体生成方法を経て調製することができる。
実施例11:eIF4E阻害剤の使用のための表現型アッセイ法のデザイン
一旦、本明細書に開示される方法によってeIF4E阻害剤が同定したら、化合物を、それぞれ、予測的な特定の疾病状態または症状の治療における有効性を予測する測定可能な指標を有する1つまたは複数の表現型アッセイ法でさらに調査する。
表現型アッセイ法、キット、およびこれらに使用するための試薬については、当業者に周知であり、本明細書において、健康と疾患におけるeIF4Eの役割および/または関連を調査するために使用される。いくつかの市販の売り手のいずれか一つから購入することができる代表的な表現型アッセイ法は、細胞生存度、細胞障害性、増殖または細胞生存(Molecular Probes,Eugene,OR;PerkinElmer,Boston,MA)、酵素アッセイ法を含むタンパク質に基づいたアッセイ法(Panvera,LLC,Madison,WI;BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ;Oncogene Research Products,San Diego,CA)、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス、およびアポトーシス(Assay Designs Inc.,Ann Arbor,MI),triglyceride accumulation(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)、血管形成アッセイ法、チューブ形成アッセイ法、サイトカインおよびホルモン・アッセイ法、並びに代謝アッセイ法(Chemicon International Inc.,Temecula,CA;Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を決定するためのものを含む。
一つの非限定の例において、特定の表現型アッセイ法に適していることが決定された細胞(すなわち、MCF−7細胞は、乳癌研究のために;脂肪細胞は、肥満研究のために選択された)を、上記した方法によって決定された最適濃度で、インビトロ研究から同定されたeIF4E阻害剤、並びに対照化合物で処置する。処置期間の終わりに、処置された細胞および未処置の細胞を表現型の結果および指標を決定するためのアッセイ法に特異的な1つもしくは複数の方法によって解析する。
表現型の指標は、時間にわたる細胞形態の変化または治療用量、並びにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類、または金属などの細胞成分のレベルの変化を含む。pH、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の摂取または排出を含む細胞状態の測定も関心対象の指標である。
eIF4E阻害剤の有効性または能力の指標のように、処置後の細胞の遺伝子型の解析(細胞の遺伝子の1つまたは複数の発現の測定)も使用される。ホールマーク遺伝子、または特定の疾病状態、症状、もしくは表現型と関連することが疑われる遺伝子が、処置した細胞および未処置の細胞の両方において測定される。
実施例12:RNA単離ポリ(A)+mRNA単離
ポリ(A)+mRNAは、Miuraら、(Clin.Chem.,1996,42,1758−1764)に従って単離した。ポリ(A)+mRNA単離のためのその他の方法は、当技術分野においてルーチンのものである。簡単には、96ウェル・プレート上で培養した細胞については、増殖培地を細胞から除去して、それぞれのウェルを200μLの冷却PBSで洗浄した。60μLの溶解緩衝液(10mMトリス−HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5% NP−40、20mMバナジル−リボヌクレオシド複合体)をそれぞれのウェルに添加し、プレートを穏やかに撹拌して、室温で5分間インキュベートした。55μLの可溶化液をOligo d(T)被覆された96ウェル・プレート(AGCT Inc.,Irvine CA)へ移した。プレートを室温で60分間インキュベートして、200μLの緩洗浄衝液(10mM トリス−HCl pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl)で3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートを紙タオル上で吸い取って過剰な洗浄緩衝液を除去し、5分間風乾させた。70℃に予熱した60μLの溶離緩衝液(5mMトリス−HCl pH7.6)をそれぞれのウェルに添加し、プレートを90℃ホットプレート上で5分間インキュベートして、次いで溶出液を新たな96ウェル・プレートに移した。
100mmまたはその他の標準的なプレートの上で培養した細胞を、全ての溶液の適切な量を使用して同様に処置してもよい。
総RNA単離
総RNAは、Qiagen Inc.(Valencia,CA)から購入したRNEASY96TMキットおよび緩衝液を使用して、製造業者の推奨される手順にしたがって単離した。簡単には、96ウェル・プレート上で培養した細胞については、増殖培地を細胞から除去し、それぞれのウェルを200μLの冷却PBSで洗浄した。150μL 緩衝液 RLTをそれぞれのウェルに添加して、プレートを20秒間激しく撹拌した。次いで、150μLの70%のエタノールをそれぞれのウェルに添加し、上下に3回をピペッティングすることによって内容物を混合した。次いで、廃物の収集トレイと共に装着されたQIAVACTMマニフォールドに付着され、かつ負圧源に付着されたRNEASY96TMウェル・プレートに試料を移した。真空は、1分間適用した。500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートのそれぞれのウェルに添加して、15分間インキュベートし、再び真空を1分間適用した。さらに500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートのそれぞれのウェルに添加して、真空を2分間適用した。次いで、1mLの緩衝液RPEをRNEASY96TMプレートのそれぞれのウェルに添加して、真空を90秒間適用した。次いで、緩衝液RPE洗浄を繰り返して、真空をさらに3分間適用した。次いで、プレートをQIAVACTMマニフォールドから除去して、紙タオル上で吸い取って乾燥させた。次いで、プレートを、1.2mLの収集管を含む収集管ラックに装着されたQIAVACマニフォールドに再び付けた。次いで、それぞれのウェル内で140μLのRNAseのない水をピペッティングすること、1分インキュベートすること、次いで3分間真空を適用することによってRNAを溶出した。
繰り返しピペッティングおよび溶出工程は、 QIAGEN Bio−Robot 9604 (Qiagen,Inc.,Valencia CA)を使用して自動化してもよい。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後に、プレートをロボット・デッキへ移して、ここでピペッティング、DNase治療、および溶出工程が実施される。
実施例13:eIF4E mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR解析
eIF4E mRNAレベルの定量化は、製造業者の説明書に従ってABI PRISMTM7600、7700、または7900のSequence Detection System(PE−Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用してリアルタイム定量的PCRによって達成した。これは、閉管の、ゲルに基づかない蛍光検出システムであり、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)産物の高スループットの定量化が可能である。増幅産物が、PCRの完了後に定量化される標準的なPCRに対して、リアルタイム定量的PCRの産物は、これらが蓄積するにつれて定量化される。これは、PCR反応に、フォワードおよびリバースのPCRプライマー間で特異的にアニールし、かつ2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを含むことによって達成される。レポーター色素(たとえば、PE−Applied Biosystems,Foster City,CA,Operon Technologies Inc.,Alameda,CAもしくはIntegrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IAのいずれかから得られるFAMまたはJOE)がプローブの5’末端に付着されており、クエンチャー色素(たとえばPE−Applied Biosystems,Foster City,CA,Operon Technologies Inc.,Alameda,CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IAのいずれかから得られるTAMRA)がプローブの3’末端に付着されている。プローブおよび色素が無処置のときには、レポーター色素発光が、近くの3’クエンチャー色素によってクエンチされる。増幅の間に、標的配列に対するプローブのアニーリングにより、Taqポリメラーゼの5’−エキソヌクレアーゼ活性によって切断することができる基質を生じる。PCR増幅サイクルの伸張期の間に、Taqポリメラーゼによるプローブの切断により、プローブの残部(およびそれ故、クエンチャー部分)からレポーター色素が放出され、配列特異的蛍光性シグナルが生じる。それぞれのサイクルで、さらなるレポーター色素分子がこれらのそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度は、ABI PRISMTMSequence Detection Systemに組み込まれたレーザー光学によって規則的な間隔でモニターされる。それぞれのアッセイ法において、無処置の対照試料に由来するmRNAの段階希釈を含む一連の平行反応により検量線を作製し、これを試験試料のアンチセンス・オリゴヌクレオチド処置後のパーセント阻害を定量化するために使用する。
定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブ・セットを、これらのGAPDH増幅反応で「多重化される」能力について評価する。多重化の際に、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方が、単一の試料中で並行して増幅される。この解析において、未処置の細胞から単離されたmRNAは、連続的に希釈してある。それぞれの希釈を、GAPDHだけ、標的遺伝子(「一重化(single−plexing)」)だけ、または両方(多重化)に特異的なプライマー−プローブ・セットの存在下で増幅させる。PCR増幅に続いて、希釈の関数として、GAPDHと標的mRNAシグナルの検量線を一重化および多重化試料から作製する。多重化試料から作製されたGAPDHおよび標的シグナルの勾配並びに相関係数が、一重化された試料から作製される対応する値の10%に入る場合、その標的に特異的なプライマー−プローブ・セットは、多重化可能であると考えられる。PCRのその他の方法も、当技術分野において公知である。
PCR試薬は、Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA)から得た。RT−PCR反応は、20μLのPCRカクテル(2.5×PCR緩衝液マイナスMgCl、6.6mM MgCl、それぞれ375μMのdATP、dCTP、dCTP、およびdGTP、それぞれ375nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、125nMのプローブ、4 Unit RNAse阻害剤、1.25 Unit PLATINUM(登録商標)Taq、5 Unit MuLV逆転写酵素、および2.5×ROX色素)を30μLの総RNA溶液(20〜200ng)を含む96ウェル・プレートに添加することによって実施した。RT反応は、48℃で30分間インキュベーションすることによって実施した。PLATINUM(登録商標)Taqを活性化するための95℃での10分間のインキュベーションに続いて、二段階のPCRプロトコルを40サイクル実施した:95℃を15秒(変性)、続く60℃を1.5分(アニーリング/拡張)。
リアルタイムRT−PCRによって得られた遺伝子標的量は、GAPDH(その発現が一定である遺伝子)の発現レベル、またはRiboGreenTM(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を使用して総RNAを定量化することによって、いずれかを使用して規準化する。GAPDH発現は、リアルタイムRT−PCRによって、標的と共に同時に実行すること(多重化)によって、または別々に定量化される。総RNAは、RiboGreenTMRNA定量化試薬(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を使用して定量化される。RiboGreenTMによるRNA定量化法は、Jones,L.J.ら(Analytical Biochemistry,1998,265,368−374)に教示されている。
このアッセイ法では、170μLのRiboGreenTM作業試薬(10mMトリス−HCl、1mM EDTA、pH7.5に1:350希釈されたRiboGreenTM試薬)を、30μLの精製された細胞RNAを含む96ウェル・プレートにピペットで移す。プレートを485nmでの励起および530nmでの発光を備えたCytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)で読み込む。
ヒトeIF4Eに対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報(GenBankアクセッション番号M15353.1、配列番号:4として本明細書に組み入れられる)を使用して、ヒトeIF4E配列にハイブリダイズするように設計した。 ヒトeIF4Eについては、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:TGGCGACTGTCGAACCG(配列番号:5)、
リバースプライマー:AGATTCCGTTTTCTCCTCTTCTGTAG(配列番号:6)、
およびPCRプローブは:FAM−AAACCACCCCTACTCCTAATCCCCCG−TAMRA(配列番号:7)であって、FAMは蛍光色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である。ヒトGAPDHについては、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(配列番号:8)、
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(配列番号:9)、
およびPCRプローブは:5’JOE−CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC−TAMRA 3’(配列番号:10)であって、JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である。
マウスeIF4Eに対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報(GenBankアクセッション番号NM007917.1、配列番号:11として本明細書に組み入れられる)を使用して、マウスeIF4E配列にハイブリダイズするように設計した。マウスeIF4Eについては、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:AGGACGGTGGCTGATCACA(配列番号:12)、
リバースプライマー:TCTCTAGCCAGAAGCGATCGA(配列番号:13)、
およびPCRプローブは:FAM−TGAACAAGCAGCAGAGACGGAGTGA−TAMRA(配列番号:14)であって、FAMは蛍光色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である。マウスGAPDHについては、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(配列番号:15)、
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(配列番号:16)、
およびPCRプローブは:5’JOE−AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC−TAMRA 3’(配列番号:17)であって、JOEは蛍光レポーター色素であり、TAMRAはクエンチャー色素である。
実施例14:eIF4E mRNAレベルのノーザンブロット解析
アンチセンス処置の18時間後に、細胞単層を冷却PBSで2回洗浄し、1mLのRNAZOLTM(TEL−TEST“B”Inc.,Friendswood,TX)に溶解する。総RNAは、製造業者の推奨プロトコルに従って調製する。20マイクログラムの総RNAをMOPS緩衝系(AMRESCO,Inc.Solon,OH)を使用して1.1%のホルムアルデヒドを含む1.2%のアガロースゲルによる電気泳動法によって分画する。RNAは、ノーザン/サザン・トランスファー・緩衝系(TEL−TEST“B”Inc.,Friendswood,TX)を使用して、一晩キャピラリー転移によってゲルからHYBONDTM−N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)に移す。RNA転移は、UV視覚化によって確認する。膜をSTRATALINKERTMUV Crosslinker2400(Stratagene,Inc,La Jolla,CA)を使用してUV架橋によって固定して、ストリンジェント条件についての製造業者の推奨を使用してQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene,La Jolla,CA)を使用してプローブした。
ヒトeIF4Eを検出するために、フォワードプライマーTGGCGACTGTCGAACCG(配列番号:5)およびリバースプライマーAGATTCCGTTTTCTCCTCTTCTGTAG(配列番号:6)を使用するPCRにより、ヒトeIF4E特異的なプローブを調製した。充填および転写効率におけるバリエーションを規準化するために、膜をはがして、ヒト・グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)RNA(Clontech,Palo Alto,CA)をプローブする。
マウスeIF4Eを検出するために、フォワードプライマーAGGACGGTGGCTGATCACA(配列番号:12)およびリバースプライマーTCTCTAGCCAGAAGCGATCGA(配列番号:13)を使用するPCRにより、マウスeIF4E特異的なプローブを調製した。充填および転写効率におけるバリエーションを規準化するために、膜をはがして、マウス・グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)RNA(Clontech,Palo Alto,CA)をプローブする。
ハイブリダイズした膜を視覚化して、PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTMソフトウエアV3.3(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を使用して定量化する。データを未処置の対照におけるGAPDHレベルに対して規準化する。
実施例15:2’−MOEウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドによるヒトeIF4E発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、公表された配列(GenBankアクセッション番号NM_007917.1、配列番号:4として本明細書に組み入れられる)を使用して、一連のアンチセンス化合物をヒトeIF4E RNAの異なる領域をターゲットするようにデザインした。化合物は、表1に示してある。「標的部位」は、化合物が結合する特定のヒトeIF4E標的配列上の最初の(最も5’の)ヌクレオチド番号を示す。表1の全ての化合物は、20ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、5ヌクレオチド「ウイング」に両側(5’および3’方向)で隣接する10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。ウイングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたってホスホロチオアート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5−メチルシチジンである。
第2の一連の化合物アンチセンスは、発行された配列(GenBankアクセッション番号NM_007917.1、配列番号:11として本明細書に組み入れられる)を使用して、マウスeIF4E RNAの異なる領域をターゲットするようにデザインした。化合物は、表1に示してある。「標的部位」は、化合物が結合する特定のヒトeIF4E標的配列上の最初の(最も5’の)ヌクレオチド番号を示す。表1の全ての化合物は、20ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド(「gapmers」)であり、5ヌクレオチド「ウイング」に両側(5’および3’方向)で隣接する10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。表1の全ての化合物は、20ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、5−ヌクレオチド「ウイング」に両側(5’および3’方向)で隣接する10個の2’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。ウイングは、2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたってホスホロチオアート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5−メチルシチジンである。
表1の中の化合物は、ヒトおよびマウスeIF4E配列に対して相補的であるので、本明細書のその他の実施例に記載されているように、化合物を定量的リアルタイムPCRによってヒトeIF4E mRNAレベルに対するこれらの効果について解析した。データは、A549細胞を本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処置した3回の実験からの平均である。それぞれのデータポイントに対する陽性対照は、表において配列番号によって同定される。存在する場合、「N.D.」は「データなし」を示す。
表1
2’−MOEウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるヒトeIF4E mRNAレベルの阻害
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
表1に示すように、配列番号20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、107、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120、および122は、このアッセイ法においてヒトeIF4E発現の少なくとも50%阻害を証明し、従って、適切である。配列番号80、65、40、97、および105も適切である。
これらの適切な配列に対して相補である標的領域は、本明細書において「適切な標的セグメント」といい、従って、本発明の化合物によってターゲットするために適している。これらの適切な標的セグメントを表3に示してある。これらの配列は、チミン(T)を含むことが示されているが、当業者であれば、チミン(T)が一般にRNA配列においてウラシル(U)に置換されることを認識するであろう。本配列は、表1に示した適切なアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の(最も5’の)ヌクレオチド番号を示す。また、各々の適切な標的セグメントが見いだされた種も表3に示してある。
実施例16:2’−MOEウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるマウスeIF4E発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、ヒトおよびマウスeIF4E(たとえば、マウスeIF4E GenBankアクセッション番号NM_007917.1、配列番号:11として本明細書に組み入れられる)の両方に対して相補的である表1の中の化合物を、本明細書のその他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムPCRによってマウスeIF4E mRNAレベルに対するこれらの効果についてさらに解析した。表2において、「標的部位」は、化合物が結合する特定のマウスeIF4E標的核酸上の最初の(最も5’の)ヌクレオチド番号を示す。表2に示したデータは、b.END細胞を本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処置した3回の実験からの平均である。それぞれのデータポイントに対する陽性対照は、表において配列番号によって同定される。存在する場合、「N.D.」は「データなし」を示す。
表2
2’−MOEウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるマウスeIF4E mRNAレベルの阻害
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
表2に示したように、配列番号21、23、24、29、30、40、45、57、58、59、60、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、111、112、115、116、117、118、120、122は、この実験においてマウスeIF4E発現の少なくとも70%の阻害を証明し、従って適切である。配列番号105、40、97、および80も適切である。
これらの適切な配列に対して相補である標的領域は、本明細書において「適切な標的セグメント」といい、従って、本発明の化合物によってターゲットするために適している。これらの適切な標的セグメントを表3に示してある。これらの配列は、チミン(T)を含むことが示されているが、当業者であれば、チミン(T)が一般にRNA配列においてウラシル(U)に置換されることを認識するであろう。本配列は、表1およびに示した適切なアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の(最も5’の)ヌクレオチド番号を示す。また、各々の適切な標的セグメントが見いだされた種も表3に示してある。
表3
eIF4Eにおいて同定された適切な標的セグメントの配列および位置
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
これらの「適切な標的セグメント」は、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションのために開放されていること、およびアクセスできることが実験によって見いだされたので、当業者であれば、ルーチン試験だけを使用して、これらの適切な標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、従ってeIF4Eの発現を阻害するその他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を認識し、または確認することができる。
本発明によれば、アンチセンス化合物は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、siRNA化合物、一本鎖または二本鎖RNA干渉(RNAi)化合物、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズして、その機能を調整するその他のオリゴマー化合物を含む。
実施例17:eIF4Eタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析(免疫ブロット分析)は、標準的な方法を使用することによって行ってもよい。細胞をオリゴヌクレオチド処置の16〜20時間後に集め、PBSで一度洗浄し、Laemmli緩衝液(100μl/ウェル)に懸濁して、5分間煮沸し、16%のSDS−PAGEゲルに充填する。ゲルを150Vで1.5時間流し、ウエスタンブロッティングのための膜に転写した。eIF4Eに向けられた適切な一次抗体を、一次抗体種に向けられた放射ラベルされたか、または蛍光ラベルされた二次抗体と共に使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)を使用して視覚化する。
実施例18:細胞増殖に対するeIF4E発現のアンチセンス阻害の効果
HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)、1×10細胞/100μlを、3.25、7.5、15、および30μMオリゴヌクレオチドで電気穿孔した。使用したeIF4E ISISのアンチセンス阻害剤は、ISIS 183750(配列番号:40)およびISIS 298815(配列番号:97)であった。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ISIS 29848(NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;配列番号:207であって、Nは、A、C、G、およびTの混合物である)および無関係な対照オリゴヌクレオチドISIS 129688(TTCGCGGCTGGACGATTCAG;配列番号:208)であった。ニセものをトランスフェクトした対照も使用した。細胞増殖は、CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit(Molecular Probes,Inc.,Eugene OR)を使用して15μMオリゴヌクレオチドで処置した細胞において測定した。ヒトeIF4E ISIS 183750およびISIS 298815のアンチセンス・オリゴヌクレオチド阻害剤は、ニセもので処置した対照と比較して、72時間後の細胞増殖をそれぞれ31%および36%まで阻害した。対照オリゴヌクレオチドで処置した細胞は、少なくともニセもので処置した対照と同程度で増殖する。
また、eIF4A標的mRNAの減少をこの実験で測定した。ISIS 183750およびISIS 299815は、3μM未満(eIF4E mRNAレベルを50%まで阻害するために必要な濃度)のIC50を生じ、7.5μM以上のオリゴヌクレオチド濃度で70〜80%の阻害を示した。対照オリゴヌクレオチド29848および129688は、20%(7.5μM 129688)の最大阻害を生じたが、その他の濃度では、一般に約10%の阻害を与えた。
また、細胞増殖に対するeIF4Eのアンチセンス阻害の効果をU87−MGヒト・グリア芽細胞腫細胞において測定した。U87−MG細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)、1×10 細胞/100μlをISIS 183750(配列番号:40)およびISIS 298815(配列番号:97)、並びに無関係な(対照)オリゴヌクレオチドISIS 129699(GGATAGAACGCGAAAGCTTG;配列番号:209)で7.5μMで電気穿孔した。eIF4E、ISIS 183750、およびISIS 298815の2つのアンチセンス阻害剤は、対照(ISIS 129699)と比較して、96時間後にそれぞれ約12%および10%までU87−MG細胞増殖を減少した。EIF4E標的mRNAを処置の開始の48時間後に測定し、無処置対照と比較したときに、ISIS 183750によって約31%まで、およびISIS 298815によって36%まで減少された。eIF4E mRNAレベルは、対照オリゴヌクレオチドISIS 129699によって減少されず、実際にわずかに増大した。
実施例19:細胞周期に対するeIF4E発現のアンチセンス阻害の効果
細胞周期に対するeIF4Eアンチセンス化合物の効果を検査した。HeLa細胞を30μMアンチセンス・オリゴヌクレオチド(ISIS 183750または299815)もしくは対照オリゴヌクレオチド(ISIS 29848またはISIS 129688)で電気穿孔するか、またはニセものをトランスフェクトした。フローサイトメトリを使用して48時間でのDNA含量を測定するために、蛍光性のDNAインターカレーターヨウ化プロピジウム(PI)を使用した。結果(2回行った)を表4に示してある。
表4
アンチセンス処置後の細胞周期プロフィール
Figure 2007505627
表4に示した結果から、両方のeIF4Eアンチセンス化合物(ISIS 183750またはISIS 298815)での処置により、一般にアポトーシスを表すSubG1期の細胞部分を増大したことが分かる。また、G2Mの細胞部分は、ISIS 298815処置後に増大される。
実施例20:血管形成/管形成に対するeIF4E発現のアンチセンス阻害の効果
血管形成は、互いに、および細胞外基質分子で内皮細胞の相互作用を促進する多数の因子によって刺激されて、毛細管の形成を生じる。このプロセスは、組織培養において、内皮細胞による管状構造の形成によって再生することができる。インビトロでの管形成の減少は、インビボでの血管形成の阻害と関連があり(Carmelietら、Nature,2000,407,249−257;およびZhangら、Cancer Research,2002,62,2034−42)、これは、血管形成の指標としてのインビトロでの管形成の使用を支持する。
管形成アッセイ法は、In vitro Angiogenesis Assay Kit(Chemicon International,Temecula,CA)、または成長因子減少Matrigel(BD Biosciences,Bedford,MA)を使用して行われる。HUVECを96ウェル・プレートに4000細胞/ウェルでプレートにまいた。1日後、細胞をリポフェクチン(Gibco,Grand Island,NY)中の75nMオリゴヌクレオチドを使用して、標準的な公表された手順(Moniaら、J.Biol.Chem.,1993,268(19),14514−22)に従って、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。形質移入の約50時間後、細胞をECMatrixTM(Chemicon International)で被覆した96ウェル・プレートか、または成長因子減少Matrigelに移した。これらの条件下で、無処置のHUVECは、管状構造を形成する。37℃において一晩インキュベーション後、処置した細胞および未処置の細胞を光学顕微鏡によって検査した。個々のウェルは、管形成の程度に応じて、1〜5までの別々のスコアを割り当てた。1のスコアは、管形成のないウェルを指し、一方5のスコアは、全ての細胞が広範な管状ネットワークを形成するウェルを示す。
割り当てられた別々のスコアから算出すると、アンチセンス阻害剤ISIS 183750およびISIS 298815で処置した細胞は、それぞれ、約1.5および2.25の平均管形成スコアを有した。ランダムな対照オリゴヌクレオチドISIS 29848(NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;配列番号:207であって、Nは、A、C、GおよびTの混合物である)で処置した細胞は、約4.25の平均管形成スコアを有し、ISIS 334163(TGTTACAGTCTTGTACCCTT;配列番号:210)、ISIS 183750の6塩基ミスマッチで処理した細胞は、約4.5の平均管形成スコアを有した。従って、チューブ形成は、eIF4Eアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって47〜67%まで特異的に阻害される。従って、eIF4Eのアンチセンス阻害剤は、血管形成を阻害することができる。
実施例21:マウスにおけるeIF4E発現の阻害
8週齢のC57BL6マウスに、毎週2回3週間(合計6用量)、40mg/kgのオリゴヌクレオチド濃度でオリゴヌクレオチドの塩類溶液を腹腔内に注射した。使用した化合物は、eIF4Eアンチセンス化合物ISIS 183750(配列番号:40)、ISIS 299815(配列番号:97)、ISIS 298797(配列番号:80)、およびISIS 298823(配列番号:105)であった。全てが、ヒトおよびマウスeIF4Eに対して交差−種アンチセンス・オリゴヌクレオチドである。ISIS 141923は、無関係な(対照)オリゴヌクレオチドである(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC;配列番号:211)。塩類(媒体)対照も使用した。塩類対照と比較して、ISIS 183750は、マウス肝臓におけるeIF4E mRNAレベルを対照の20%未満に減少させた(80%以上の阻害)。また、ISIS 298815は、対照の約20%までeIF4E mRNAレベルを減少させた。ISIS 298797処置は、対照の約30%にeIF4E mRNAレベルを減少させ(70%の阻害)、ISIS 298823処置は、対照の約37%にeIF4E mRNAレベルを減少させた(63%の阻害)。対照的に、ISIS 141923での処置は、eIF4E mRNAレベルを減少させず、実際にこれらを塩類対照の約140%に増大した。
また、マウス肝臓におけるeIF4Eタンパク質レベルを測定した。塩類対照と比較して、ISIS 183750、ISIS 299815、ISIS 298797、およびISIS 298823での処置は、それぞれ77%、47%、50%、および47%までeIF4Eタンパク質レベルを減少させ;対照オリゴヌクレオチドISIS 141923での処置は、12%までeIF4Eタンパク質レベルを減少させた。
eIF4Eアンチセンス化合物のいずれか1つで処置したマウスは、肝臓、脾臓、または総体重に本質的に変化を示さなかった。肝酵素レベル(AST/ALT)に有意な変化もなく、肝臓組織学は、塩類処置した対照マウスと同じように見えた。
実施例22:マウスにおけるヒト腫瘍異種移植に対するeIF4E発現のアンチセンス阻害の効果
雄のヌードマウスには、5×10 PC−3ヒト前立腺癌腫細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)を横腹に皮下注射した。腫瘍が100mmの平均サイズに到達したときに(移植後約3〜3.5週)、アンチセンス処置を開始した。マウスには、最初の投与でeIF4Eに対するアンチセンス、ISIS 183750(配列番号:40)または対照オリゴヌクレオチドISIS 141923(配列番号:211)の静脈内注射によって50mg/kgを、次いで、その後に月曜日、水曜日、および金曜日ごとに25mg/kgを与えた。腫瘍移植後の54日まで、ISIS 183750で処置したマウスにおける腫瘍は、サイズが約450mmで、対照ISIS 141923(約930mm)で処置したマウスの腫瘍と比較してほぼ50%の減少であった。この減少のレベルは、57日目の研究の終わりまで続いた。
また、異種移植は、雌のマウスにおけるMDA−231ヒト乳がん細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)を使用して同様に行った。この実験においてISIS 183750およびISIS 298815の両方を試験し、塩類対照と比較して、それぞれ55%および50%の腫瘍細胞増殖とほとんど同じ減少を示した。eIF4Eタンパク質発現をウエスタンブロット解析(Pharmingen,San Diego CAからのeIF4Eに対する抗体を使用する)によってこれらのMDA−231異種移植において測定し、無関係な対照オリゴヌクレオチド(ISIS 141923、配列番号:211)で処置したマウスにおける異種移植と比較して、ISIS 183750(配列番号:40)で処置したマウスにおいて45%まで、およびISIS 298815(配列番号:97)で処置したマウスにおいて39%まで減少されることが見いだされた。
eIF4Eは、インビボにおいてヒト配列のセリン残基209をリン酸化することができる。リン酸化された形態は、タンパク質の活性な状態と考えられることが多く、リン酸化の増大は、タンパク質合成の割合のアップレギュレーションと相関されることが多い。リン酸化(pS209)eIF4Eに特異的な抗体(BioSource,Camarillo CA)を使用するウエスタンブロットにより、アンチセンス化合物ISIS 183750および298815での処置後にeIF4Eのリン酸化された形態が減少するが、アンチセンス対照(ISIS 129699)では減少しないことを確認した。
サイクリンD1は、eIF4E標的タンパク質であり、サイクリンD1タンパク質は、eIF4Eに対するアンチセンスで処置したマウスにおいてMDA−231異種移植片を減少することも見いだされた。サイクリンD1は、無関係な対照オリゴヌクレオチドISIS 141923で処置したマウスにおける異種移植片のサイクリンD1発現と比較したときに、ISIS 183750での処置後に40%までおよびISIS 298815での処置後にほとんど50%まで減少された。
同じように行われた第3の異種移植研究では、雌のヌードマウスに、5×10のH460ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)を横腹に皮下注射した。一旦腫瘍が100mmの平均サイズに到達したら、オリゴヌクレオチドでの静脈内投薬を開始した。アンチセンス処置スケジュールは、50mg/kgでの単一用量のISIS 141923またはISIS 183750で開始し、その後に月曜日、水曜日、および金曜日ごとに25mg/kgで、17日間の合計処置時間続いた。研究終了後、ISIS 141923対照処置群の平均腫瘍体積は、ISIS 183750に対して約2000mm対550mmであった(p<0.001)。
実施例23:短い二本鎖RNAオリゴヌクレオチドによるeIF−4Eの阻害
dsRNAオリゴヌクレオチドの設計および合成
ヒトeIF−4E配列Genbank #M15353の配列を照会した。選択された配列のG+C含量は、30%〜70%に及ぶ。eIF−4Eに特異的で、下記に示した各々のdsRNA配列は、RNAオリゴヌクレオチド二重鎖のそれぞれの鎖の3’末端に2つのデオキシチミジン・ヌクレオチドを含む(図示せず)。遺伝子特異的siRNAsの合成、二重鎖形成、および精製は、Dharmacon Research Inc.によって行われた。3つのeIF−4E siRNA配列を選択して試験し、以下に示してある:
eIF4E_1:
遺伝子配列の位置:141−159
GC含量:53%
5’−CAGAUGGGCACUCUGGUUU−3’ 配列番号:212
3’−GUCUACCCGUGAGACCAAA−5’配列番号:213
eIF4E_2:
遺伝子配列の位置:195−213
GC含量:63%
5’−CCUGCGGCUGAUCUCCAAG−3’ 配列番号:214
3’−GGACGCCGACUAGAGGUUC−5’ 配列番号:215
eIF4E_3:
遺伝子配列の位置:1010−1028
GC含量:37%
5’−CAACUUGGCAUUUCUAUAC−3’ 配列番号:216
3’−GUUGAACCGUAAAGAUAUG−5’ 配列番号:217。
対照dsRNA化合物(また、それぞれの鎖の3’末端に2つのデオキシチミジン・ヌクレオチドを含み、かつpGL3ルシフェラーゼに対して相補的である)は、Dharmacon Research Inc.から購入し、下記のアッセイ法に使用した。
対照:
5’−CUUACGCUGAGUACUUCGA−3’ 配列番号:218
3’−GAAUGCGACUCAUGAAGCU−5’ 配列番号:219
細胞培養
LNCaP、PC3、HCT116、MDA−231、MCF−7、T24、およびCWR22RV1細胞株は、ATCCを介して得て、L−グルタミンを含み、フェノールレッド(Gibco)を含まない10%のFBS(Hyclone)を含むRPMI Medium 1640中で培養する。
哺乳動物細胞に対するsiRNAのトランスフェクション
トランスフェクションの24時間前に、哺乳類細胞株を24ウェル・プレート内に1×10細胞でプレートにまく。一過性トランスフェクションは、オリゴフェクトアミン(Invitrogen)を使用して行う。簡単には、5〜500nM(最終量)の間の濃度の個々のdsRNAをOptiMEM(Invitrogen)に希釈し、一方でOptiMEMおよびオリゴフェクトアミンの別々の溶液を室温で5分間インキュベートする。2つの溶液を混合して、続いて室温で30分インキュベーションする。血清含有培地を、0.5ml/ウェルの最終量に向けてトランスフェクション複合体に添加する。既存の細胞培地を吸引し、トランスフェクション複合体と置き換えて、37℃(5%のCO)で48〜72時間インキュベートする。
免疫ブロット
72時間後、トランスフェクション混合物を穏やかに吸引し、細胞を完全タブレットプロテアーゼ阻害剤(Complete tablet protease inhibitors:Roche Molecular Biochemicals)、1mMの活性化された NaVOを含む150μlの氷冷RIPA緩衝液(50mM トリス−HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1%NP−40、0.25%Na−デオキシコレート、1mM EDTA)に溶解し、室温で30分間インキュベートし、−20℃で1〜24時間貯蔵する。30μlの解凍した可溶化液を0.2MのDTTを含む10μlの4×NuPage試料緩衝液(Invitrogen)に添加する。試料を85℃で5分間加熱し、4〜20%のトリス−グリシン・ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)に充填する。ゲルを1×転写緩衝液/20%のメタノール中で1100mAHでHybond−P PVDF膜(Amersham Pharmacia Biotech)に転写する。膜を5%の脱脂乳を含むPBS中で1時間ブロックする。一次抗体、抗eIF4E(BD Biosciences)および抗アクチン(Sigma)をそれぞれ1:500および1:10,000でブロッキング緩衝液に希釈して、4℃で16時間インキュベートした。膜をPBS中で3×洗浄し、続いて室温で2時間の抗マウス二次抗体(Santa Cruz)をインキュベーションする。ブロットをPBS中で3×洗浄し、SuperSignal West Pico化学発光基質(Pierce)で1分間処置する。捕獲されたシグナルをLumi−Imager F1(Roche Molecular Biochemicals)で記録する。eIF4Eおよびアクチンに対応するバンドをLumiAnalystソフトウエアを使用して定量化し、ゲル充填および転写を調節するためにアクチンに対して規準化した後にeIF4E発現レベルを決定する。
LNCaP細胞株では、eIF4E−1、eIF4E−2、およびeIF4E−3のそれぞれが、50nM未満の濃度でeIF−4Eタンパク質レベルを50%以上阻害した。CWR22RV1細胞株において、5nM未満のeIF4E−2の濃度により、eIF−4Eタンパク質レベルを50%以上阻害した。LNCaP、PC3、HCT116、MDA−231、およびMCF−7細胞株のそれぞれにおいて、50nM未満のeIF4E−1およびeIF4E−2の濃度により、eIF−4Eタンパク質発現を50%以上減少させた。
細胞増殖アッセイ法
細胞をトランスフェクションの24時間前に1.5〜3.0×10細胞/ウェルの間の細胞密度でポリ−D−リジン被覆した96ウェル・プレート(Becton Dickinson)にまく。eIF−4Eおよび対照siRNAsのトランスフェクションは、5nM〜500nMまでの範囲のsiRNA濃度で三通りに行う。細胞を50μg/ml終濃度でヨウ化プロピジウム(Sigma)を添加することによって3、6、および8日に集め、光から保護して室温で30分間インキュベーションする。プレートを凍結前および後にVictor 1420多重ラベルカウンター(Wallac)で測定する。凍結後から凍結前の測定を減算することによって修正した合計を得る。
LNCaP、PC3、およびMDA−231細胞株のそれぞれにおいて、50nM未満のeIF4E−1およびeIF4E−2の濃度により、細胞増殖を50%以上減少させた。
実施例24:HeLa細胞におけるeIF4EにターゲットされたsiRNA構築物の活性
下記の表5に示される二重化したオリゴマーRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用した培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。
細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき25nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定し、Ribogreenに対して規準化した。ヒト・プライマー/プローブ・セットは、以前の例において使用した配列番号:5、6、および7である。
結果を表5に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表5に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖であり、特に明記しない限り平滑末端である(dTdTまたはその他のオーバーハングはない)。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるCにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
表5
HeLa細胞においてeIF4E−活性にターゲットされるsiRNA構築物
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。RNA定量化は、RT−PCRによって示される。この場合、「%阻害」は、ネガティブであり、標的RNAが増大された。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするGenbankアクセッション番号M15353.1の標的部位の最も5’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト(h)、ラット(h)、マウス(m)、および/またはウサギ(rab)eIF4Eに対して相補的であるかどうかを示す、
このスクリーニングにおいて、eIF4Eを導くMOE ギャプマーは、最高のsiRNA(88%の阻害)よりもわずかに活性である(94%の阻害)ことが見いだされた。以前に同定されたMOE ギャプマー導出部位における5つのsiRNA構築物のうちの3つが活性である。8つのeIF4E siRNA構築物は、70%以上の標的減少を示し、7つは、75%以上の減少を示す。これは、Vickersら(J.Biol.Chem.,2003,278,7108−7118)の結論と一致しており、すなわち、一般にsiRNAオリゴヌクレオチド二重鎖の活性は、同じ部位にターゲットされるRNase H依存的なオリゴヌクレオチド(たとえば、MOE ギャプマー)の活性と相関され、最適化されたsiRNAおよびRNase H依存的なオリゴヌクレオチドは、効力、最大効果、特異性、並びに作用および効率の期間に関して同様に挙動する。
また、上記の表中の化合物がHeLa細胞においてPTEN RNAレベルを減少させる能力を試験した。eIF4Eターゲットされた化合物(siRNAまたは一本鎖のMOEギャプマー)のいずれも、約20%以上までPTEN標的RNAレベルを減少させなかった。siRNA陽性対照335449構築物は、約85%までPTEN RNAを阻害し、一本鎖MOEギャプマー陽性対照ISIS 116847は、約80%までPTEN RNAを阻害した。
実施例25:MH−S細胞におけるeIF4EにターゲットされるsiRNA構築物の活性
以前の表中のsiRNA化合物のほとんど全ては、完全にマウスおよびヒトeIF4E mRNAに対して相補的である。本明細書において、これらをマウスMH−Sネズミ肺胞マクロファージ細胞株で試験する。マウスMH−S細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から購入した。細胞は、10%の熱不活性化されたウシ胎児血清(FCS)(Hyclone Laboratories,Logan,UT)を含むRPMI 1640培地中で維持した。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまいて、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL OPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いでオリゴマー化合物の鎖につき20nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含むOPTI−MEM−1TMの130μLで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置き換えた。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離し、標的減少を測定した。
結果を表6に示してある。示したsiRNA構築物は、1つのアンチセンス鎖および1つのセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表6に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二重鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、Cごとにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
標的部位、種、化学、および配列を以前の表に記載してある。
表6
マウスMH−S細胞におけるeIF4E siRNA構築物の活性
Figure 2007505627
Figure 2007505627
実施例26:eIF4EにターゲットされるさらなるsiRNA構築物およびHeLa細胞における活性
さらなる遺伝子歩行により、eIF4Eを阻害するさらなるsiRNAsを同定した。構築物は、HeLa細胞において50nMの濃度でスクリーニングした。
下記の表7に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用した培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。
細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき50nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表7に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表7に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二重鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるCにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
表7
HeLa細胞におけるeIF4E siRNAの活性
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。この場合、「%阻害」は、ネガティブであり、標的RNAが増大された。RNA定量化は、RT−PCRによって示される。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするGenbankアクセッション番号M15353.1の標的部位の最も5’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト(h)、ラット(h)、マウス(m)、および/またはウサギ(rab)eIF4Eに対して相補的であるかどうかを示す。
実施例27:MH−S細胞においてeIF4EにターゲットされるsiRNA構築物の活性
以前の表におけるsiRNA化合物のほとんど全ては、完全にマウスおよびヒトeIF4E mRNAに対して相補的である。本明細書において、これらをマウスMH−Sネズミ肺胞マクロファージ細胞株で試験する。マウスMH−S細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から購入した。細胞は、10%の熱不活性化されたウシ胎児血清(FCS)(Hyclone Laboratories,Logan,UT)を含むRPMI 1640培地中で維持した。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまいて、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL OPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いでオリゴマー化合物の鎖につき50nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置き換えた。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離し、標的減少を測定した。結果を表8に示してある。示したsiRNA構築物は、1つのアンチセンス鎖および1つのセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)を示してあり;センス鎖、標的部位、種、化学、および配列を以前の表と同じである。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるCにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。
表8
マウスMH−S細胞におけるeIF4E siRNA構築物の活性
Figure 2007505627
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。「%阻害」がネガティブである場合、標的RNAが増大される。RNA定量化は、RT−PCRによって示される。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするGenbankアクセッション番号M15353.1の標的部位の最も5’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト(h)、ラット(h)、マウス(m)、および/またはウサギ(rab)eIF4Eに対して相補的であるかどうかを示す。
実施例28:HeLa細胞におけるeiF4E siRNA構築物の用量反応の実験−IC50
用量反応実験を上記の処置方法および0.1nM、1.0nM、10nM、および100nMのsiRNA濃度を使用して、HeLa細胞において行い、IC50(未処置の制御と比較したeIF4Eの50%の阻害を生じる化合物の濃度)を上記化合物において確実に算出した。結果を表9に示してある。アンチセンス鎖同一性を示してある。センス鎖、標的部位、種、化学、および配列は、以前の表に記載してある。
表9
HeLa細胞におけるsiRNA化合物のIC50
Figure 2007505627
上記のsiRNA構築物のうちの4つをさらなる評価およびSAR(構造活性相関)解析のために選択した。siRNA SAR解析のためのこれらの親構築物は、本明細書に示したとおりである。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
「338918の構築物」
センス:5’−UAGAGCUAAAGGUGAUAAGA−3’ ISIS 338943(配列番号:237)
AS:3’−AUCUCGAUUUCCACUAUUCU−5 ISIS 338918(配列番号:236)
「338910の構築物」
センス:5’−AAGGAUCCAGGAAUAUGACA−3’ ISIS 338935(配列番号:221)
AS:3’−UUCCUAGGUCCUUAUACUGU−5’ ISIS 338910(配列番号:220)
「338927の構築物」
センス:5’−AGAAGACACCUUCUGAGUAU−3’ ISIS 338952(配列番号:255)
AS:3’−UCUUCUGUGGAAGACUCAUA−5’ ISIS 338927(配列番号:254)
「338914の構築物」
センス:5’−CAUUGGUGAAGGAUCCAGGA−3’ ISIS 338939(配列番号:229)
AS:3’−GUAACCACUUCCUAGGUCCU−5’ ISIS 338914(配列番号:228)。
実施例29:他の2’修飾をもつeIF4E siRNA構築物
以前の実施例において選択した4つのsiRNA構築物(「親」構築物)を他の2’−O−メチル(2’−O−Meまたは2’OMe)および2’−フルオロ(2’−F)修飾を有するsiRNA構築物と比較した。
下記の表10において示した二重化されたオリゴマーのRNA(二本鎖RNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用した培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.2、2および20nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表10に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。他の2’−OMe/2’−F修飾された化合物については、センスおよびアンチセンス鎖の両方を修飾して、2種類の修飾が二重鎖化された分子においてレジスタ外となるようにセンス鎖に対して最も5’ヌクレオシドを2’−Fにし、またアンチセンス鎖に対して最も5’ヌクレオシドを2’−O−Meにする。親化合物は、20mersであり、示した2’修飾された化合物は、19mersであり、センス鎖の(すなわち、示したとおりの二重鎖の)最も5’の対に対応する塩基対を欠いていることに留意すべきである。これらを表10に示してある。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してあり;2’−フルオロは、下線を引いてある。無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
表10
他の2’−O−Meおよび2’−F修飾をもつeIF4E siRNA構築物
Figure 2007505627
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。
通常のタイプの大文字=(NORMAL UYPE UPPER CASE =リン酸バック)ボーンで修飾されていないRNA。
2’−O−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり;2’−フルオロは、下線を引いてある。
いくつかの構築物については、他の2’−O−メチル/2’−フルオロ(2’−OMe/2’F)構築物が、eIF4E mRNA減少の有効性において、親(無修飾RNA)構築物と同等か、またはより優れていることが示された。さらにまた、試験した修飾された構築物の安定性は、無修飾化合物の8倍を超えた(以下の実施例に詳細)。
実施例30:マウス血漿における他の2’−O−メチル/2’−フルオロsiRNA構築物の安定性
無処置の二重鎖RNAは、前述したものと同様の抽出およびキャピラリー電気泳動法を使用して、希釈したマウス血漿から解析した(Leedsら、Anal.Biochem.,1996,235,36−43;Gearyら、Anal.Biochem.,1999,274,241−248)。3〜6ヵ月の雌のBalb/cマウス(Charles River Lab)由来のヘパリン処置したマウス血漿を−80℃から融解し、リン酸緩衝食塩水(140mM NaCl、3mM KCl、2mM リン酸カリウム、10mM リン酸ナトリウム)で25%(v/v)に希釈した。約10nmolのプレ・アニールされたsiRNAを、100μMの濃度で25%の血漿に添加し、0、15、30、45、60、120、180、240、360、および420分間37℃でインキュベートした。一定分量を示した時間に除去し、EDTAで処置して2mMの終濃度にし、キャピラリーゲル電気泳動(eCap DNA キャピラリーチューブでのBeckman P/ACE MDQ−UV)によって解析するまで0℃で氷上に置いた。siRNA二重鎖ピークの領域を測定して、残っている無処置のsiRNAの割合を算出するために使用した。内部較正標準のように、アデノシン三リン酸(ATP)をそれぞれの注射に対して2.5mMの濃度で添加した。0時間点を、リン酸緩衝食塩水中にsiRNAを希釈し、続いてキャピラリー電気泳動法によって採取した。パーセント無処置のsiRNAを時間に対してプロットし、疑似一次半減期を算出した。結果を表11に示してある。
表11
マウス血漿における他の2’−O−メチル/2’−フルオロ siRNA構築物の安定性
Figure 2007505627
親(無修飾)構築物は、30分後に約50%分解され、4時間後にほとんどなくなる(6時間で完全になくなる)。対照的に、他の2’−O−メチル/2’−フルオロ構築物は、比較的不変のままであり、6時間後でさえも75%が残っている。
実施例31:eIF4E siRNAのさらなる修飾
種々の修飾をもつさらなるsiRNA構築物を調製し、以前の実施例に記載されているように試験した。
下記の表12に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用した培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき濃度範囲の所望のdsRNAと2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。安定性解析については、siRNA二重鎖を25%ヘパリン処置したマウス血漿中で37℃においてインキュベートし、内部参照標準と共にキャピラリーゲル電気泳動によって解析した。
結果を表12に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるCにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドは、太字で示してある;2’−フルオロは、下線を引いてあり、4’−チオヌクレオシドは、小文字で示してあり、無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。
化合物338918_338943は、無修飾(リボース、P=Oバックボーン)親構築物である。349892_338943は、アンチセンス鎖の位置1〜5、8、9、12〜17に2’Fを、および位置6,7、10、11、18〜20に2’OMeを有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
345847_345849は、両方の鎖に他のリボースおよび2’OMeヌクレオシド(レジスタの外)をもつ19merである。センス鎖の最も5’のヌクレオシドは、リボースであり、アンチセンス鎖の最も5’のヌクレオシドは、2’OMeである。
351831_351832は、両方の鎖に他の2’−Fおよび2’OMeヌクレオシド(レジスタの外)をもつ19merである。センス鎖の最も5’のヌクレオシドは、2’−Fであり、アンチセンス鎖の最も5’のヌクレオシドは、2’OMeである。
352824_342764は、アンチセンス鎖のそれぞれの末端に3つの4’−チオヌクレオシドをもつ19merである(センス鎖は、変更されていない)。
352827_342764は、アンチセンス鎖の5’末端に3つの4’−チオヌクレオシド、およびアンチセンス鎖の3’末端に3つの2’−OMeヌクレオシドをもつ19merである(センス鎖は、変更されていない)。
349890_338935は、混合されたアンチセンス鎖の2’−F/2’−OMe修飾をもつ20merである(センス鎖は、変更されていない)。アンチセンス鎖は、位置1〜5、8、9および12〜17に2’−Fを、位置6、7、10、11、18〜20に2’−OMeを有する(5’末端で始まる)。
349891_338939は、混合されたアンチセンス鎖の2’−F/2’−OMe修飾をもつ20merである(センス鎖は、変更されていない)。アンチセンス鎖は、位置1〜5、8、9、および12〜17に2’−Fを、位置6、7、10、11、18〜20に2’−OMeを有する(5’末端で始まる)。
351097_338952は、混合されたアンチセンス鎖の2’−F/2’−OMe修飾をもつ20merである(センス鎖は、変更されていない)。アンチセンス鎖は、位置1〜5、8、9、および12〜17に2’−Fを、位置6、7、10、11、18〜20に2’−OMeを有する(5’末端で始まる)。
親化合物は、20mersであり、示した2’修飾された化合物は、19mersであり、センス鎖の(すなわち、示したとおりの二本鎖の)最も5’の対に対応する塩基対を欠いていることに留意すべきである。これらを表12に示してある。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してあり;2’−フルオロは、下線を引いてあり、4’−チオヌクレオシドは小文字で示してあり、無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。
表12
eIF4E siRNAおよび活性のさらなる修飾−概要
Figure 2007505627
通常タイプの大文字=ホスフェートバックボーンで修飾されていないリン酸バックボーン
太字=リン酸バックボーンをもつ2’−O−メチルRNA;
下線=リン酸バックボーンをもつ2’−フルオロRNA、
小文字=リン酸バックボーンをもつ4’−チオRNA、
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。
2’−O−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり;2’−フルオロは下線を引いてある。
混合された(ブロック)2’−O−メチル/2’−フルオロ(2’−OMe/2’F)構築物349892_338943は、eIF4E mRNA減少の有効性において、親(無修飾RNA)構築物と同等か、またはより優れていることが示された。
他の2’−O−メチル/無修飾構築物345847_345849構築物を2回試験して、eIF4E mRNA減少の有効性において親(無修飾RNA)構築物と同等か、またはより優れていることが示され、安定性が増強された。
4’−チオブロック修飾された構築物352824_342764は、親よりも活性ではなかったが、非常に安定であった。
4’−チオ/2’−O−メチル構築物352827_342764は、有効性において親と同等であった。安定性データは、いまだ得られなかった。
実施例32:HeLa細胞におけるギャップのある修飾されたsiRNA構築物−活性
さらなるsiRNA構築物をHeLa細胞において試験した。下記の表13に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用した培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.1、1、10、および100nMの濃度の所望のdsRNAと2.5μ/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)とを含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
安定性解析については、siRNA二重鎖を25%ヘパリン処置したマウス血漿中で37℃においてインキュベートし、内部参照標準と共にキャピラリーゲル電気泳動によって解析した。結果を表13に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド1〜5および16〜20に2’−MOEと、位置6〜15に2’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるCにホスホロチオアート(P=S)バックボーンおよび5−メチルシトシンをもつ。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
化合物338918_338943は、無修飾(リボース、P=Oバックボーン)親構築物である。349892_338943は、アンチセンス鎖の位置1〜5、8、9、12〜17に2’Fを、位置6、7、10、11、18〜20に2’Omeで有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
349896_338943は、AS鎖の5’末端から数えてアンチセンス鎖の位置1〜5に2’Fを、位置6〜15にリボースを、および位置16〜20に2’Omeを有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
349894_338935は、AS鎖の5’末端から数えてアンチセンス鎖の位置1〜5に2’Fを、位置6〜15にリボースを、および位置16〜20に2’Omeを有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
349895_338939は、AS鎖の5’末端から数えて位置1〜5に2’Fを、位置6〜15にリボースを、および位置16〜20に2’Omeを有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
349897_338952は、AS鎖の5’末端から数えて位置1〜5に2’Fを、位置6〜15にリボースを、およびアンチセンス鎖の位置16〜20に2’Omeを有し;センス鎖は、修飾されていない(リボース、P=Oバックボーン)。
これらは、表13に示してある。2’−O−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり;2’−フルオロは、下線を引いてあり、4’−チオヌクレオシドは、小文字で示してあり、無修飾リボースは、非修飾テキストで示してある。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
表13
ギャップのある修飾されたeIF4E siRNAの活性
Figure 2007505627
通常タイプの大文字=ホスフェートバックボーンで修飾されていないリン酸バックボーン
太字=リン酸バックボーンをもつ2’−O−メチルRNA;
下線=リン酸バックボーンをもつ2’−フルオロRNA、
小文字=リン酸バックボーンをもつ4’−チオRNA、
「%阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、siRNA二重鎖(または、示したとおりのその他の化合物)で処置した細胞におけるeIF4E RNAの%減少を示す。
2’−O−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり;2’−フルオロは下線を引いてある。
実施例33:HeLa細胞における他の2’−Ome修飾された平滑断端(dTオーバーハングがない)19mer siRNAの活性−eIF4E_1(341887)周辺のミクロ歩行
下記の表14に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.2、2、および20nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表14に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表14に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
338932は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース20merであり、eIF4E_1(341887)19merの部位にターゲットされる。
338957は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
346658は、リン酸バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース19merであり、eIF4E_1(341887)部位(dTでない)にターゲットされる。
346660は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
346661は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸を持つ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
346659は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸を持つ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
346662は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
346664は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
346665は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
346663は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
346666は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
346668は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
346669は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
346667は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 19merである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17および、19に2’OMe。
表14
他の2’−O−Me/リボース平滑末端19mersのeIF4E_1(341887)周辺のミクロ歩行
Figure 2007505627
実施例34:HeLa細胞における他の2’−Ome修飾された平滑断端21mer siRNAの活性−eIF4E_1(341887)周辺のミクロ歩行
下記の表15に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.2、2、および20nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表15に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表15に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
338932は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merであり、eIF4E_1部位にターゲットされる。
338957は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
346674は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース21merである。
346676は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース21merである。
346675は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 21merである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、および21に2’OMe。
346677は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 21merである。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、18、および20に2’OMe。
346678は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース21merである。
346680は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース21merである。
346679は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 21merである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、および21に2’OMe。
346681は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ他のリボースおよび2’−OMe 21merである。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、18、および20に2’OMe。
表15
HeLa細胞における他の2’−Ome修飾された平滑末端21merのsiRNA−eIF4E_1(341887)周辺のミクロ歩行
Figure 2007505627
実施例35:HeLa細胞における4’−チオリボース修飾された19mer siRNAの活性
下記の表16に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.2、2、および20nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表16に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表16に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で、無修飾リボース・ヌクレオシドは、無装飾の大文字で、チオ4’は小文字で示してある。表16中の全ての配列は、配列番号:301(アンチセンス鎖)/配列番号:302(センス鎖の)19mersである。
342744は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
342764は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
352824は、ヌクレオシド位置1、2、3、17、18、および19(すなわち、それぞれの末端に3つ)に4’−チオを有し、位置4〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352819は、位置1、2、3、4、16、17、18、および19(すなわち、それぞれの末端に4つ)に4’−チオを有し、位置5〜14にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352827は、位置1、2、3に4’−チオヌクレオシドを、位置17、18、および19に2’−OMeを有し、位置4〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352826は、位置1、2、3、10、13および17〜19に4’−チオヌクレオシドを有し、位置4〜9、11、12、および14〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352825は、位置1、2、3、7、10、13、および17〜19に4’−チオヌクレオシド、位置4、5、6、8、9、11、12、および14〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
表16
4’−チオリボース修飾された19mer siRNAの活性
Figure 2007505627
いくつかの4’−チオ構築物は、ピコモル範囲のIC50を有することが示された。
実施例36:338914の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAsの活性
下記の表17に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.5、5、および50nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表17に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表17に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で、無修飾リボース・ヌクレオシドは、無装飾の大文字で示してある。
338914は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338939は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
345840は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
345842は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
345735は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merであり、5’末端から開始して位置16〜20に2’O−Meヌクレオシドおよび位置1〜15にリボースを持つ。
345843は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merであり5’末端から開始して位置2〜19に2’O−Meヌクレオシド並びに位置1および20にリボースを持つ。
345838は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merであり、5’末端から開始して位置6、12、15、および18〜20に2’O−Meヌクレオシド並びに位置1〜5、7〜11、13、14、16、17、および20にリボースをもつ。
345839は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merであり、5’末端から開始して位置6、7、10、11、18〜20に2’O−Meヌクレオシド並びに位置1〜5、8、9、および12〜17にリボースをもつ。
表17
338914の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAsの活性
Figure 2007505627
実施例37:338910の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
下記の表18に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μL のOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.5、5、および50nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表18に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表18に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
338910は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338935は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
345731は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
345733は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
345713は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜15にリボースおよび位置16〜20に2’OMeヌクレオシド。
345734は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1および20にリボース並びに位置2〜19に2’OMeヌクレオシド。
345729は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、7、8、10、13、14、16、および17にリボース並びに位置6、9、12、15、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
345730は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸で20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、8、9、12、13、14、15、16、および17にリボース並びに位置6、7、10、11、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
表18
338910の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
Figure 2007505627
実施例38:338927の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
下記の表19に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.5、5、および50nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表19に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表19に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
338927は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338952は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
345854は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
345856は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16および18に2’OMe。
345851は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜15にリボースおよび位置16〜20に2’OMeヌクレオシドをもつ。
345857は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1および20にリボース並びに位置2〜19に2’OMeヌクレオシド。
345852は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、7、8、10、11、13、14、16、および17にリボース並びに位置6、9、12、15、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
345853は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、8、9、12、13、14、15、16、および17にリボース並びに位置6、7、10、11、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
表19
338927の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
Figure 2007505627
実施例39:338918の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
下記の表20に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.5、5、および50nMの濃度の所望のds鎖RNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表20に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表20に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
338918は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338943は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
345847は、他のリボースで19merおよびリン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ2’−OMeである。5’末端から開始してヌクレオシド1、3、5、7、9、11、13、15、17、および19に2’OMe。
345849は、他のリボースおよび2’−OMeをもつ19merであり、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ。5’末端から開始してヌクレオシド2、4、6、8、10、12、14、16、および18に2’OMe。
345844は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜15にリボースおよび位置16〜20に2’OMeヌクレオシド。
345850は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1および20にリボース並びに位置2〜19に2’OMeヌクレオシド。
345845は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、7、8、10、11、13、14、16、および17にリボース並びに位置6、9、12、15、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
345846は、リン酸バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ20merである。5’末端から開始してヌクレオシド1〜5、8、9、12、13、14、15、16、および17にリボース並びに位置6、7、10、11、および18〜20に2’OMeヌクレオシド。
表20
338918の構築物に基づく2’−O−メチル修飾をもつさらなるeIF4E siRNAs
Figure 2007505627
実施例40:HeLa細胞における4’−チオリボース修飾された、および混合された19mer siRNA
下記の表21に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。HeLa細胞のために使用する培養方法は、ATCCから入手可能であり、たとえば、www.atcc.orgで見いだしてもよい。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.02、0.2、2、および20nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表21に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表21に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。全てが、配列番号:301(アンチセンス鎖)/配列番号:302(センス鎖)の19mersである。
342744は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
342764は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース19merである。
352824は、ヌクレオシド位置1、2、3、17、18、および19(すなわち、それぞれの末端に3つ)に4’−チオを有し、位置4〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352819は、位置1、2、3、4、16、17、18、および19(すなわち、それぞれの末端に4つ)に4’−チオヌクレオシドを有し、位置5〜14にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352827は、位置17、18および19で、位置1、2、3、および2’−OMeに4’チオヌクレオシドを有し、位置4〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352826は、位置1、2、3、10、13、および17〜19に4’−チオヌクレオシドを有し、位置4〜9、11、12、および14〜16でリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
352825は、位置1、2、3、7、10、13、および17〜19に4’−チオヌクレオシドを有し、位置4、5、6、8、9、11、12、および14〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
354604は、位置1、2、3に4’−チオヌクレオシドを、並びに位置17、18、および19に2’−OMeを有し、位置4〜16にリボースをもつ。バックボーンは、P=O(5’末端リン酸)である。
表21
HeLa細胞における4’−チオリボース修飾され、および混合された19mer siRNA
Figure 2007505627
いくつかの4’−チオ構築物は、ピコモル範囲のIC50を有することが示された。
実施例41:U−87 MGグリア芽細胞腫細胞においてeIF4EにターゲットされるsiRNA構築物の活性
以前の表に示した修飾されたか、または無修飾siRNA構築物は、上に記載された方法を使用して、これらがU−87 MG細胞においてヒトeIF4E mRNAのレベルを減少させる能力について試験する。U−87ヒト・グリア芽細胞腫細胞株は、ATCC(Rockville Md.)から得て、熱不活性化した10%ウシ胎児血清を補ったIscove’s DMEM培地中で維持する。用量反応の実験は、IC50値を得るための以前の実施例に記載したとおりに行う。
実施例42:ヒトeIF4EにターゲットされるさらなるsiRNAs
さらなるsiRNAsをヒトeIF4E mRNAに対してデザインした(Genbankアクセッション番号M15353.1、配列番号:4)。全て、アンチセンス鎖に他の2’−O−メチル/2’−OHがあり、センス鎖に他の2’−OH/2’−O−メチルがある。バックボーンはホスフェート(P=O)であり、かつ5’末端は、5’−OHであるが、これらおよびその他のsiRNA構築物も、5’−リン酸基で合成してもよいことが理解されるであろう。
アンチセンス鎖を表22に示してあり;センス鎖は、完全には相補的であり、示していない。
「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるM15353.1ヒトeIF4E配列(配列番号:4)上の標的領域の最も5’の位置をいう。
表22
ヒトeIF4Eに対してターゲットされるさらなるsiRNAs
Figure 2007505627
Figure 2007505627
実施例43:eIF4Eにターゲットされるさらなるアンチセンス化合物
全てがeIF4E mRNAの5’キャップ領域、すなわち5’キャップに隣接したmRNAの極5’末端にターゲットされる、均一な2’−O−メトキシメチル(2’−MOE)ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドのセットを合成した。これらを表23に示してある。全てのシトシンは、5−メチルシトシンである。理論によって拘束されることは望まないが、完全には、2’−MOEオリゴヌクレオチドは、RNAse Hのための基質であると考えられておらず、したがって、mRNA標的の分解を経る以外に、占有のみ、または立体的妨害メカニズムを経てタンパク質翻訳を妨害すると考えられる。「標的部位」は、eIF4E mRNA上の位置(示したとおりの配列番号:4または11)をいう。
表23
eIF4E mRNAの5’キャップ領域にターゲットされる2’−O−メトキシメチルアンチセンスオリゴヌクレオチド
Figure 2007505627
表23において、オリゴヌクレオチドと同じ部位にターゲットされる一連のPNAオリゴマーも合成した。これらを表24に示してある。それぞれが、オリゴマーの3’末端上にリジンを有する。完全に修飾された2’MOE化合物と同様に、PNAオリゴマーは、RNAse Hの基質であるとは考えられていない。
表24
eIF4E mRNAの5’キャップ領域にターゲットされるPNAアンチセンス・オリゴマー
Figure 2007505627
実施例44:LNAおよび2’−OMe修飾されたsiRNA
下記の表14に示した二重化されたオリゴマーのRNA(dsRNA)化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、HeLa細胞(American Type Culture Collection,Manassas VA)において評価した。細胞を5000細胞/ウェルの密度で96ウェル・プレートにまき、高グルコース、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で培養した。ウェルを200μLのOPTI−MEM−1TM減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき0.2、2、および20nMの濃度の所望のdsRNAプラス2.5μl/mlのLIPOFECTINTM(Gibco BRL)を含む130μLのOPTI−MEM−1TMで処置した。処置は、二回行った。処置の4または5時間後、培地を新しい培地と置換した。dsRNA処置の16または18時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにRT−PCRによってRNAを単離して標的減少を測定した。
結果を表25に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表25に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾RNA、すなわちリン酸(P=O)バックボーンおよび5’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。2’−O−メチルヌクレオシドを太字で示してある。LNAヌクレオシドは、イタリックである。
338910は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338935は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
352493は、位置6、9、12、および15(イタリック)にLNAを、位置18〜20(太字)に2’−O−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ20merである。
338914は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338939は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
352494は、位置6、9、12、および15(イタリック)にLNAを、位置18〜20(太字)に2’−O−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ20merである。
338918は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338943は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
352495は、位置6、9、12、および15(イタリック)にLNAを、位置18〜20(太字)に2’−O−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ20merである。
338927は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
338952は、リン酸(P=O)バックボーンおよび5’末端リン酸をもつ無修飾リボース20merである。
352496は、位置6、9、12、および15(イタリック)にLNAを、位置18〜20(太字)に2’−O−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ20merである。
表25
LNAおよび2’−OMe修飾されたsiRNA
Figure 2007505627
実施例45:ヒトeIF4E siRNAsにターゲットされるさらなるsiRNAsの活性
表22からのsiRNAsを、HeLa細胞においてeIF4E RNAレベルを減少させる能力について試験した。これらの化合物は、ヒトeIF4E mRNAに対してデザインされた(Genbankアクセッション番号M15353.1、配列番号:4)。強調されない限り、アンチセンス鎖は、位置1の2’−O−メチルで開始する他の2’−O−メチル/リボースであり(すなわち、奇数の位置は、2’−O−メチルであり、偶数の位置はリボースである)、センス鎖は、位置1のリボースで開始するほかのリボース/2’−O−メチルである(すなわち、奇数の位置はリボースであり、偶数の位置は2’−O−メチルである)。バックボーンはホスフェート(P=O)であり、かつ5’末端は、5’−OHであるが、これらおよびその他のsiRNA構築物も、5’−リン酸基で合成してもよいことが理解されるであろう。ISIS 351831_351832構築物は、345847_345849構築物と同じ配列を有するが、前者のものは、他の2’−O−メチル/2’−フルオロであることに留意されたい(アンチセンス鎖は、奇数の位置に2’−O−メチルを、偶数に2’−フルオロを有し;センス鎖は、奇数の位置に2’Fを、偶数に2’−O−メチルを有する)。
表26に示した化合物を、上記実施例と同様に、HeLa細胞において5nMの低用量で試験した。結果を表26に示してある。示したsiRNA構築物は、1本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖(AS)は、下記の表に最初に示してあり、続いてセンス鎖(S)は、次の列に示してある。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。結果は、表26においてeIF4E RNAのパーセント減少(「%阻害」)として示してある。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるM15353.1ヒトeIF4E配列(配列番号:4)上の標的領域の最も5’位置をいう。
表26
ヒトeIF4EにターゲットされるさらなるsiRNAsの活性
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
Figure 2007505627
アンチセンス鎖が、配列番号:236、301、343、347、355、359、360、361、363、364、365、367、370、372、373、374、375、376、384、387、または391を有するsiRNA二重鎖は、このアッセイ法において少なくとも10%までeIF4Eを阻害した。
実施例46:eIF4Eにターゲットされる一本鎖アンチセンスRNA(asRNA)
ヒトeIF4E(配列番号:4)にターゲットされる一連の一本鎖RNAアンチセンス・オリゴヌクレオチドを合成した。全てが、全体にホスホロチオアート・バックボーン結合および5’リン酸・キャップをもつRNA(リボース糖)である。ヒト臍静脈内皮細胞株HuVECは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)から得られる。HuVEC細胞は、SingleQuots supplements (Clonetics Corporation,Walkersville,MD)を補ったEBM(Clonetics Corporation Walkersville,MD)中でルーチンで培養する。細胞は、これらが90%のコンフルエンスに到達するときに、トリプシン処置して希釈することによってルーチンで継代し、15継代まで維持する。細胞をRNAオリゴヌクレオチド(30nMオリゴヌクレオチド濃度)で処置するために、10000細胞/ウェルの密度、96ウェル・プレート(Falcon−Primaria #3872)にまく。処置(eIF4E RNAレベルの減少)の順序および結果を表27に示してある。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。上記の実施例のように、「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるM15353.1ヒトeIF4E配列(配列番号:4)上の標的領域の最も5’の位置をいう。「%阻害」は、eIF4E RNAのパーセント減少をいう(示した±標準偏差)。
表27
HuVEC細胞におけるeIF4Eにターゲットされる一本鎖アンチセンスRNAの活性
Figure 2007505627
上記の表に示したように、一本鎖アンチセンスRNA化合物の全ては、ヒトeIF4E RNAレベルを少なくとも10%まで減少させることができた。eIF4E RNAレベルを少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%まで減少した化合物は、eIF4E発現の阻害剤として使用するために特に適している。
ISIS 347402(配列番号:228)は、この実験においてeIF4E発現に最も優れた減少をもたらした。この一本鎖アンチセンスRNA化合物の用量反応解析は、1nM、10nM、および100nMのアンチセンスRNA濃度を使用してHeLa細胞で行った。ISIS 347402は、eIF4E発現の用量依存的な阻害をもたらし、10nMでeIF4E発現の41%の減少および100nMで67%の減少であった(この実験では、1nM用量で効果が観察されなかった)。
実施例47:一本鎖アンチセンスRNA化合物に対応するアンチセンス鎖配列をもつ二本鎖siRNA化合物の活性
以前の実施例と同様に二本鎖RNA化合物を調製した。二重鎖のアンチセンス鎖は、配列が、以前の実施例に使用した一本鎖アンチセンスRNA化合物と同一であるが、リン酸ジエステル(P=O)バックボーンで作製した。センス鎖は、完全にアンチセンス鎖に対して相補的であって(したがって、平滑末端20mer二重鎖を形成する)、さらにP=Oバックボーンを有する。両方の鎖とも無修飾RNAである。siRNA二重鎖を25nMの濃度で使用し、以前のsiRNA実施例に記載されたとおりにHeLa細胞を処置した。HeLa細胞におけるeIF4E RNAレベルに対する処置の効果は、表28に示したとおりである。「%阻害」は、eIF4E RNAのパーセント減少をいう(示した±標準偏差)。アンチセンス鎖の配列のみを表28に示してある。RNA配列については、U(ウラシル)は、一般に、DNAまたはDNA様配列において通常見いだされるT(チミン)に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
表28
一本鎖のアンチセンスRNA化合物に対応する二本鎖siRNA化合物の活性
Figure 2007505627
アンチセンス鎖が配列番号:220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266、または268を有する二本鎖RNAアンチセンス化合物は、eIF4E RNAレベルの少なくとも10%の阻害を与えた。アンチセンス鎖が配列番号:220、224、226、228、230、232、236、238、240、246、250、254、256、260、262、264、または268を有する二本鎖RNAアンチセンス化合物は、eIF4E RNAレベルの少なくとも50%の阻害を与え、従って、特にeIF4E発現の適切な阻害剤である。
したがって、一本鎖および二本鎖アンチセンスRNA化合物は、eIF4E RNAレベルの阻害を生じさせることができる。一本鎖および二本鎖バージョンにおいて活性である化合物(すなわち、相補的センス鎖有無において活性なアンチセンス鎖)は、特に有用であると考えられる。
本発明の種々の修飾は、本明細書に記載されているものに加えて、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような修飾は、添付の請求の範囲内にはいることが企図される。本出願において引用されるそれぞれの参照(学術誌論文、米国および米国以外の特許、特許出願刊行物、国際特許出願刊行物、遺伝子バンクアクセッション番号などを含むが、これらに限定されない)は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。2004年9月18日に出願の米国仮出願第60/504,110号、および2004年6月3日に出願の米国仮出願 第60/576,534号は、それぞれその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

Claims (54)

  1. オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって:
    8〜80核酸塩基の長さであり;
    8〜80核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有し;
    eIF4Eをコードする核酸分子にターゲットされ;および、
    これは、eIF4Eの発現を調整し、
    前記オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、核酸塩基配列5’−AGTCGCCATCTTAGATCGAT−3’または5’−AGUCGCCAUCUUAGAUCGAU−3’を含まないことを条件とし、および、
    前記調整がeIF4Eの発現阻害であるときは、前記阻害の程度は、少なくとも約50%であるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  2. 19〜23核酸塩基の長さであり、かつ前記アンチセンス部分が19〜23核酸塩基の長さである、請求項1記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  3. オリゴヌクレオチドを含む、請求項1もしくは2記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  4. キメラ・オリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  5. 一本鎖である、請求項1〜4のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  6. 完全に、または部分的に二本鎖である、請求項1〜4のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  7. 前記eIF4Eをコードする核酸分子の5’非翻訳領域、開始領域、コード領域、停止領域、もしくは3’非翻訳領域と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  8. 少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシド間結合、糖残基、もしくは核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  9. 前記化学的に修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項8記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  10. 前記化学的に修飾された糖残基が、2’−O−メトキシメチル置換基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項8記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  11. 前記化学的に修飾された糖残基が、2’−O−メチル、2’−フルオロ、または4’−チオ置換基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項8記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  12. 前記化学的に修飾された核酸塩基が、シトシンであるオリゴヌクレオチドを含み、前記シトシンが、5−位置でメチル置換基を有する、請求項8記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  13. 一本鎖20核酸塩基オリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜5もしくは7〜12のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、5’末端から3’末端に読んでヌクレオチド1〜5および16〜20は、2’−O−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド6〜15は、2’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、5−メチル−シトシンである、オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  14. 少なくとも1つのペプチド核酸部分を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  15. 少なくとも1つのロックされた核酸部分を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  16. 前記化合物の少なくとも1つの末端が平滑である、siRNA化合物である請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
  17. 前記化合物の少なくとも1つの鎖が、1つまたは複数のオーバーハンギング・ヌクレオシドを含む、siRNA化合物である請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
  18. オーバーハンギング・ヌクレオシドの数が1〜6である、請求項17記載の化合物。
  19. オーバーハンギング・ヌクレオシドまたはヌクレオシドが、デオキシチミジン(dT)ヌクレオシドである、請求項17記載の化合物。
  20. ナトリウム塩の形態である、請求項1〜19のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  21. 前記eIF4Eをコードする核酸分子と少なくとも約95%の相補性を有する、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
    こと。
  22. 配列番号:20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120、もしくは122の少なくとも8つの核酸塩基部分を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  23. 配列番号:20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、51、52、54、56、57、58、59、60、63、64、65、66、67、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、110、111、112、114、115、116、117、118、119、120、および122からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  24. すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアート結合である、請求項22もしくは23記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  25. 5’末端から3’末端に読んでヌクレオチド1〜5および16〜20は、2’−O−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド6〜15は、2’−デオキシヌクレオチドである、請求項22もしくは23記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  26. すべてのシトシン残基が5−メチルシトシン残基である、請求項22もしくは23記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  27. 配列番号:40もしくは配列番号:97を含む、請求項23記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  28. 請求項22〜27のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、5’末端から3’末端に読んでヌクレオチド1〜5および16〜20は、2’−O−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド6〜15は、2’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、5‐メチルシトシンである、オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  29. 前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号:213、215、217、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266、268、270、272、274、283、285、287、289、291、293、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、もしくは337の少なくとも8つの核酸塩基部分を含む、請求項1〜21または24のいずれか一項記載の化合物。
  30. 前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号:213、215、217、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、260、262、264、266、268、270、272、274、283、285、287、289、291、293、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、もしくは337を含む、請求項1〜21または24のいずれか一項記載の化合物。
  31. 前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号339〜394のうちの1つの少なくとも8つの核酸塩基部分を含む、請求項1〜21または24のいずれか一項記載の化合物。
  32. ナトリウム塩の形態である、請求項22〜31のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
  33. 請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩と、薬学的または生理的に許容されるキャリア、賦形剤、もしくは希釈液とを含む、薬学的または獣医学的組成物。
  34. 細胞、組織、または器官におけるeIF4Eの発現を阻害する方法であって、eIF4Eの発現が阻害されるように、前記細胞、組織、または器官と、前記請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させることを含む方法。
  35. eIF4Eが発現される細胞の増殖を減少する方法であって、前記細胞の増殖が阻害されるように、前記細胞と前記請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させることを含む方法。
  36. eIF4E発現もしくは過剰発現と関連する症状または疾患を予防または処置する方法であって、患者に対して請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
  37. 前記症状または疾患が、過剰増殖症状または疾患である、請求項36記載の方法。
  38. 前記過剰増殖症状または疾患が、感受性の癌、腫瘍、または異常もしくは不必要な血管形成によって特徴づけられる症状である、請求項37記載の方法。
  39. 前記eIF4E発現もしくは過剰発現と関連する過剰増殖症状または疾患が、乳癌、頭頚部癌、結直腸癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
  40. 血管形成を予防または減少させる方法であって、患者に対して前記請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
  41. 患者における腫瘍成長を予防または減少させる方法であって、患者に対して請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
  42. 前記患者が哺乳類である、請求項36〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. 前記患者がヒトである、請求項36〜41のいずれか一項記載の方法。
  44. 配列番号:40および配列番号:97からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドであって、
    すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、5’末端から3’末端に読んでヌクレオチド1〜5および16〜20は、2’−O−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド6〜15は、2’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、5−メチルシトシンであり、かつ、
    ナトリウム塩の形態である、アンチセンス・オリゴヌクレオチド。
  45. 前記請求項44記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドと、薬学的または生理的に許容されるキャリア、賦形剤、もしくは希釈液とを含む、薬学的または獣医学的組成物。
  46. eIF4E発現もしくは過剰発現と関連する症状を予防または処置する方法であって、患者に対して請求項44記載のオリゴヌクレオチドの有効な量を投与することを含む方法。
  47. 前記eIF4E発現または過剰発現と関連する症状が、乳癌、頭頚部癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
  48. 血管形成を減少する方法であって、患者に対して請求項44記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
  49. 細胞、組織、または器官におけるeIF4Eの発現を阻害する方法であって、前記細胞、組織、または器官と、前記請求項44記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させること、およびeIF4Eの発現を阻害することを含む方法。
  50. eIF4E発現もしくは過剰発現と関連する症状の予防または処置のための薬物の製造のための、請求項1〜32のいずれか一項記載のオリゴマー化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩、または請求項44記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用。
  51. 前記化合物が、eIF4Eをコードする核酸分子の5’−キャップ領域に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、請求項1記載の化合物。
  52. 少なくとも1つのPNAまたは2’−O−メトキシメチル部分を有する一本鎖化合物である、請求項51記載の化合物。
  53. 均一にPNAまたは均一に2’−O−メトキシメチルである、請求項52記載の化合物。
  54. 配列番号:395、396、397、または398の少なくとも8つの核酸塩基部分を含む、請求項51記載の化合物。


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