KR102238095B1 - eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련된 상태의 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 본 발명은 eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련 상태의 진단 또는 치료용 조성물, 키트 또는 방법에 관한 것이다.

Description

eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련된 상태의 진단 또는 치료용 조성물{Composition for diagnosis or treatment of a condition associated with increased activity of eIF4E comprising an eIF4E inhibitor}
본 발명은 eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련 상태의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 eIF4E 활성증가와 관련된 상태 (condition), 예컨대 질병(disease) 또는 장애(disorder), eIF4E 활성증가와 관련된 질병 또는 장애의 증상, 및 동반 질환의 예방, 개선, 경감 또는 치료에 관한 것이다.
eIF4E는 진핵세포의 번역 개시 인자(Translation initiation factors)의 일종으로서 mRNA의 번역 개시에 주요한 역할을 하는 24 kDa 단백질이다. mRNA 번역의 개시 시에, eIF4E는 mRNA의 5' 말단에서 7-메틸구아노신 캡에 결합하여, 스캐폴딩(scaffolding) 단백질 eIF4G 및 헬리카제 eIF4A와 복합체(eIF4F로 불림)를 형성한다. 이러한 복합체의 형성은 캡-의존성 번역의 개시에 필요하며, 이에 eIF4G에 eIF4E가 결합되는 것이 번역 과정의 주요한 과정이다. eIF4F 복합체는 번역개시의 율속단계이며 eIF4E의 이용가능성에 의존한다.
eIF4E 복합체로의 도입을 위한 eIF4E 이용가능성은 저해 단백질의 결합뿐만 아니라 인산화를 통해 조절된다. 정상적인 상황에서 eIF4E는 4E-BPs에 결합되어 있어 eIF4E가 mRNA의 5' 말단에서 7-메틸구아노신 캡에 결합하는 것이 제한되어 있다. 그러나, 인산화된 4E-BP1/2/3는 기능이 억제되고 그 결과 4E-BP1/2/3(4E-BPs)가 억제제로 작용하는 eIF4E의 활성이 증가한다.
WO2001/096388 및 WO2001/096389는 인간 eIF4E를 코딩하는 핵산 분자를 개시하고, 환자에게 청구된 폴리뉴클레오티드의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암환자 치료에 대해 개시하고 있다.
선행연구에 의하면, 마우스를 대상으로 한 시험에서, eIF4E의 과잉발현과 활성화는 ODC, 사이클린 D1, c-myc와 같은 성장촉진유전자의 번역을 선택적으로 증가시킴으로써 세포의 변형, 종양의 발생·침윤·전이를 유도하였다고 기술하고 있다. 특히, 암에서 eIF4E의 발현 증가와 활성화는 성장촉진 관련 유전자의 번역을 증가시켜 세포 성장을 증가시키고 종양 발생 및 전이 등을 초래하게 된다. eIF4E의 발현증가는 종양의 형성과 관련이 있으며, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장암, 방광암, 폐암, 전립선암, 두경부암의 진행과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Oncogene. 2004 Apr 19;23(18):3189-99, eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases).
또한, eIF4E의 발현은 암에서 증가하여 혈관신생 및 종양 성장을 촉진하며, eIF4E 저해제는 eIF4E의 발현을 감소시키고 종양유전자인 c-myc, cyclin D1과 항아폽토시스 단백질인 survivin, Bcl-2의 발현을 감소시킨다. 따라서 eIF4E 저해제는 종양세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고 종양 세포의 생존(viability)을 감소시키는 것으로 알려져 있다(J. Clin. Invest. 117:2638-2648, 2007). 따라서, 종래에 eIF4E의 발현은 과증식성 질환 (hyper-proliferative disorders), 예를 들면 혈관신생 또는 고형 암 등에 대한 연구의 표적이었다.
본 발명은 본 발명은 eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련 상태의 진단 또는 치료용 조성물, 키트 또는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는, eIF4E 저해제를 유효성분으로 포함하는, eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 예를 들면 FMCD (Focal Malformation of Cortical Development, 국소 대뇌 피질 발달 기형), FMCD의 증상, 또는 동반질환의 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물, 키트, 또는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 진핵세포의 번역 개시 인자 4E (eIF4E) 저해제를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 뇌 신경세포 또는 신경 조직에서 eIF4E의 활성증가와 관련된 질환 또는 이의 증상을 개선, 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상 또는 동반질환을 진단하기 위한 바이오마커로서, eIF4E, eIF4E에 의해 발현 또는 활성이 조절되는 eIF4E 활성화 민감성 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 eIF4E, eIF4E에 의해 발현 또는 활성이 조절되는 eIF4E 활성화 민감성 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 검출할 수 있는 분자 또는 제제를 포함하는, eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환의 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 방법 또는 진단의 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 바이오마커를 검출할 수 있는 분자 또는 제제는 상기 바이오마커와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브 또는 압타머이거나, 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예는 eIF4E, eIF4E에 의해 발현 또는 활성이 조절되는 eIF4E 활성화 민감성 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 이용하여, eIF4E 저해제의 투여 대상을 선택, 대상(subject)에서 eIF4E 저해제의 반응성(susceptibility)를 예측, 또는 대상(subject)에서 eIF4E 저해제의 투여 효능을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 발명의 화합물의 생리학적 및 약제학적으로 허용되는 염: 즉, 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 그에 대해 원치않는 독성적 영향을 부여하지 않는 염을 말한다.
본원에서 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것, 병리 상태의 발병 여부, 발병 위험성 또는 발병 가능성을 탐지하는 것, 병리 상태를 모니터링하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "치료"는 상태, 질병, 장애 또는 이들의 증상을 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 eIF4E 활성증가 관련 상태 (예, 질환 및 장애와 이들의 증상 또는 동반 질환)을 갖는 환자에게 eIF4E 저해제를 투여함으로써 eIF4E 활성증가 관련 상태를 완화, 개선, 경감 또는 치료하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 "대상" 는 진단, 개선, 예방 또는 치료를 위해서 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다. 상기 대상은 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상 또는 동반질환을 가지거나, 발병 가능성을 갖거나, 또는 병변 부위를 수술한 대상일 수 있다.
상기 대상은 뇌 신경세포 또는 신경 조직에서 eIF4E의 활성증가와 관련된 질환 또는 이의 증상의 예방, 개선, 또는 치료가 필요한 대상일 수 있으며, 예를 들면 eIF4E의 발현, 세포 내 수준, 또는 활성의 증가로 인한 뇌 질환, 또는 이의 증상 또는 동반질환을 가질 수 있으며, eIF4E에 의해 발현 또는 활성이 조절되는 eIF4E 활성화 민감성 유전자의 활성화 및/또는 eIF4E의 활성화를 유발하는 뇌 신경조직 및 신경세포에서 PI3K-AKT-mTOR 신호전달경로에 있는 상류 유전자 (upstream gene)의 발현 또는 활성의 변화를 갖는 것일 수 있다. 상기 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 eIF4E의 증가된 활성에 의해 활성화되는 특성을 가지며 5’비번역 영역에 eIF4E에 의해 조절되는 부위를 포함하며, 예를 들면 5’비번역 영역에 U-rich motif, guanine quartet motif, A-rich motif 및 CERT motif로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 모티프를 포함할 수 있으며, 구체적인 유전자의 예시는 하기 표 1에 기재되어 있다.
상기 eIF4E 저해제는 eIF4E의 활성 저해 또는 감소시키는 것이거나, 저해제는 eIF4E의 발현 저해 또는 수준을 감소시키는 것일 수 있다. 구체적으로, eIF4E 저해제는 eIF4E의 생성 및/또는 발현을 억제하거나 eIF4E 활성을 저해하는 기능을 수행할 수 있으며, 예를 들면 eIF4E 저해 약물, 항체, shRNA, siRNA, micro RNA, antisense oligonucleotide 등일 수 있다. 본 발명은 eIF4E의 mRNA 발현 억제제, 예를 들면 eIF4E와 상보적으로 결합 가능한 물질로서, 예를 들면, eIF4E 저해 약물, 항체, siRNA, shRNA, micro RNA, antisense oligonucleotide 등을 포함한다.
본 발명의 일예는 진핵세포의 번역 개시 인자 4E(Translation initiation factors 4E)의 활성 또는 발현을 억제하며, 14 내지 30개, 15 내지 30개, 16 내지 30개, 17 내지 30개, 18 내지 30개 또는 19 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 eIF4E의 5'-비번역 부위, 개시 부위, 엑손 부위, 인트론 부위, 및 3'-비번역 부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 부위와 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산 분자일 수 있다.
본 발명의 일예는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 eIF4E 저해제로서 포함하는, eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 예를 들면 FMCD (Focal Malformation of Cortical Development, 국소 대뇌 피질 발달 기형), FMCD의 증상, 또는 동반질환의 진단, 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물, 키트, 또는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에서 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환, 이의 증산 또는 동반질환은 뇌 신경세포 또는 신경조직에서 eIF4E 활성증가에 의한 것일 수 있다. 상기 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환은 eIF4E의 발현, 세포 내 수준, 또는 활성의 증가에 의한 것일 수 있다. 예를 들면, eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환은 FMCD일 수 있으며, 예를 들면 국소 피질 이형성증(FCD), 편측 거대뇌증(HME), 편측비대증 (Hemihypertrophy), 다발성 경화증 (TSC), 또는 스터지웨버신드롬(SWS) 등을 포함한다.
상기 eIF4E의 발현, 세포 내 수준, 또는 활성의 증가는 eIF4E 활성 또는 발현을 조절하는 상류(upstream) 유전자, 예를 들면 활성을 촉진하는 유전자 및/또는 활성을 저해하는 유전자에 의한 eIF4E의 발현 또는 세포 내 수준의 조절에 의하거나, eIF4E의 인산화를 통한 조절일 수 있다.
상기 인산화에 의한 eIF4E가 활성화 되는 경로는 크게 두 가지로 eIF4E결합 단백질(4E-BPs)의 인산화 또는 eIF4E의 인산화를 포함한다. 예를 들면, eIF4E 활성 또는 발현을 조절하는 유전자는 mTOR유전자에 수행될 수 있으며, 상기 질환은 mTOR유전자의 활성, 또는 발현 증가에 따른 eIF4E의 활성 또는 발현 증가로 인한 것일 수 있다. mTOR 활성화 변이에 의한 eIF4E 활성화는 뇌 신경조직 및 신경세포에서 PI3K-AKT-mTOR 신호전달경로에 있는 상류 유전자 (upstream gene)에서 뇌 체성 변이에 의해 일어날 수 있다. 구체적으로, PI3K-AKT-mTOR 신호전달경로에 있는 상류 유전자 (upstream gene), 예를 들면 mTOR, PI3K, AKT, TSC 등의 뇌 체성 돌연변이, 예를 들면 아미노산 결실, 치환 또는 삽입, 바람직하게는 아미노산 치환일 수 있다. 상기 뇌 체성 변이에 의한 질환으로는 국소 피질 이형성증(FCD) (예, 예컨대 FCD type II), 편측 거대뇌증(HME), 또는 스터지웨버신드롬(SWS) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환은, 뇌 신경세포 또는 신경 조직에서 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환으로서, 뇌가 아닌 신체 부위, 또는 신경 세포 또는 신경 조직이 아닌 세포 또는 조직에서 eIF4E 활성증가에 의한 과증식성 질환, 예를 들면 악성 종양 등을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환의 증상 또는 동반질환은, 발작을 포함하는 뇌전증 (구체적으로 난치성 뇌전증), 대뇌에서 비정상적인 신경 세포의 발생, 및 신경정신질환(neuropsychiatric disorder)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 뇌전증의 구체적 증상은 자발적 발작, 행동발작 및/또는 뇌파 발작을 포함한다. 상기 신경정신질환은 불안 장애(anxiety), 인지 장애, 단기 기억 장애, 운동 기능 장애, 인지 장애, 사회적 행동 장애, 반복 행동 장애 (repetitive behavior disorder), 및 우울증 등을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "뇌전증"이란, 신경세포 중 일부가 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 발작이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환을 의미하며, "난치성 뇌전증"이란, 현재까지 개발된 항뇌전증 약물에 반응하지 않는 뇌전증을 의미한다. 상기 난치성 뇌전증의 원인 질환은 FCD, 특히 FCD Type II, HME 및 TSC와 같은 대뇌피질 발달기형을 포함한다.
상기 뇌전증은 mTOR 신호전달경로의 유전자의 뇌 체성변이에 의한 것일 수 있으며, 더욱 자세하게는 mTOR 신호전달경로의 유전자인 mTOR, PI3K, AKT, 또는 eIF4E 유전자의 뇌 체성 돌연변이, 예를 들면 아미노산 결실, 치환 또는 삽입, 바람직하게는 아미노산 치환일 수 있다.
FCD는 산발적으로 발생하는 대뇌피질 발달 기형 중 하나로 영향 받은 부위의 대뇌피질의 구조적 이상과 신경세포의 세포학적 이상을 동반한다. 국소 피질 이형성증은 병리학적 기준에 의해 몇 가지 형태로 구분된다. 이 중 FCD type II는 균일한 병리적 소견으로 보이는데 피질층 이형성과 이상신경세포(dysmorphic neuron) 또는 풍선 세포(balloon cell)을 확인할 수 있다(Epilepsia 52, 158-174　(2011)).
FCD로 인한 수술 환자의 뇌 조직 시료(brain tissue)에 대하여, 전체 엑솜 염기서열 분석법, 하이브리드 캡쳐 염기서열 분석법(hybrid capture sequencing), 앰플리콘 염기서열 분석법(amplicon sequencing)의 다양한 deep sequecing 기법을 사용하여 국소 피질 이형성증의 뇌 병변 특이적 체성 유전 변이를 탐지할 수 있다.
본 발명의 구체예에서 FMCD 모델 동물에서 확인한 바에 따르면, mTOR 활성화 돌연변이에 의하여 위 기전을 통해 eIF4E의 활성이 증가하며, 5'UTR에 A-rich, guanine quartet (GGC)4, CERT, 및/또는 U-rich motif를 가지고 있는 eIF4E의 활성화 민감성 유전자의 활성 및/또는 발현이 증가하게 되어, 난치성 뇌전증이 일어나게 됨을 확인하였다.
본 발명에서 eIF4E 활성증가-민감성 유전자는, 공통적으로 eIF4E에 의해 그 유전자 발현 또는 활성이 조절되며, 5’-UTR (비번역 부위)에 eIF4E에 의해 조절되는 부위, 특이적인 공통 모티프(motif)를 공유하고 있다. 상기 5'-UTR에 특이적인 공통 motif를 제거할 경우 eIF4E 활성증가에 의한 발현 증가 효과가 없어지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 eIF4E 활성증가-민감성 유전자가 갖는 5'-UTR에 특이적인 motif는 eIF4E에 특이적으로 조절되고 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에서 따른 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 U-rich, guanine quartet 모티프, A-rich 모티프 및 CERT 모티프로 이루어지는 군에서 선택된 모티프를 1종 이상 포함할 수 있으며, 예를 들면 상이한 모티프가 2개 이상 존재하거나, 동일한 모티프가 2회 이상으로 존재하거나, 또는 이들의 조합으로 존재할 수 있다. 상기 U-rich 모티프는 TTDWTTTTTNT(SEQ ID NO: 97)을 포함하며, guanine quartet 모티프는 GGCGGCGGCGGC(SEQ ID NO: 98)을 포함하며, 상기 A-rich 모티프는 AAAANATAAAA(SEQ ID NO: 99)을 포함하며, 상기 CERT 모티프는 GCCGCCGCCGCC(SEQ ID NO: 100)을 포함한다. ADK 유전자의 5’-UTR은 하나의 guanine quartet를 포함하며, CREB1 유전자의 5’-UTR은 guanine quartet, A-rich 및 CERT 모티프를 포함하며, IRSp53의 유전자의 5’-UTR은 은 U-rich 모티프를 포함한다.
상기 eIF4E 활성증가에 민감성을 갖는 유전자는 하기 표 1에 나타낸 것일 수 있으며, 바람직하게는 아데노신 인산화효소(adenosine kinase, ADK), cAMP 반응성 요소 결합 단백질 1 (cAMP responsive element binding protein 1,CREB1) 및 IRSp53으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 eIF4E 활성증가-민감성 유전자 또는 단백질은 eIF4E 활성증가로 인한 상태, 예를 들면 질환 및 장애와 이들의 증상 또는 동반 질환을 탐지, 검출 또는 진단용 바이오마커로 사용될 수 있다.
자세하게는, 상기 eIF4E 과활성화-민감성 단백질 또는 이의 유전자는, 개별 유전자의 전사효율(translational efficiencies, TEs)의 배수변화에서, eIF4E 과발현-민감성 유전자는 대조군과 각 시점 사이의 개별 유전자의 전사효율(translational efficiencies, TEs)의 배수 변화 분포 중 z-score가 MTOR-C1483Y와 MTOR-L2427P 두 모델에서 MTOR-WT 대비 1.2 이상인 유전자가 215개을 선정하였으며, 선정된 유전자를 하기 표 1에 나타낸다. 상기 배수 변화 분포 중 z-score가 1.2 이상의 의미는 log2(TE[p.C1483Y]/[WT])의 값이 2.142605598 이상이고 log2(TE[p.L2427P]/[WT])의 값이 2.232171262 이상인 경우를 의미한다.
Gene Symbol log2(TE[p.C1483Y]/[WT]) log2(TE[p.L2427P]/[WT]) Z-score(TE[p.C1483Y]/[WT]) Z-score(TE[p.L2427P]/[WT])
5830418K08Rik 3.2856631 4.5591033 1.7868901 2.5603092
9130011E15Rik 3.51417249 2.6823654 1.9028764 1.4671319
Abcd3 2.50073286 2.8555022 1.3884768 1.567982
Abhd11 3.90207066 3.6263167 2.0997649 2.0169722
Acp2 2.64286893 4.9551647 1.460622 2.7910102
Acss2 4.40712622 4.6151318 2.3561199 2.5929451
Adk 4.75289218 3.1865551 2.5316231 1.7608164
Akap12 2.79269016 2.8719541 1.5366679 1.5775651
Akap6 3.64116218 4.1969928 1.9673335 2.3493842
Aldh6a1 3.84339227 2.3184609 2.0699811 1.2551619
Aldh7a1 3.71542216 4.0948263 2.0050263 2.2898734
Alg10b 3.80165894 3.7793599 2.0487981 2.106118
Alkbh8 2.45996221 3.2205098 1.3677826 1.7805946
Anapc11 3.24367565 4.3904542 1.7655782 2.4620731
Ankrd13a 3.19254087 3.128509 1.7396233 1.7270052
Arfgap2 3.06321482 2.3417788 1.6739802 1.2687444
Arfip2 2.17275667 2.7423389 1.2220034 1.5020658
Atg2a 2.25567335 3.0777147 1.26409 1.6974181
Atp9b 3.86588752 3.085986 2.0813991 1.7022361
B4galt3 3.66297481 2.363857 1.9784051 1.2816046
Bag1 3.11791212 2.6654072 1.7017434 1.457254
Bai3 3.6397109 3.5282795 1.9665969 1.9598667
BC037034 4.42211929 4.0664985 2.3637301 2.2733728
Bcap31 5.89061681 3.0055392 3.1091069 1.6553768
Bicd2 4.31449403 3.9481991 2.3091019 2.2044648
C2cd2l 2.74187106 2.2321713 1.5108732 1.2048993
Cacng7 4.54392732 4.1402893 2.4255571 2.3163551
Casp8ap2 2.15343867 3.3493978 1.212198 1.8556703
Cbfb 2.93248177 4.305199 1.607623 2.412413
Ccdc85c 2.80008216 2.9677035 1.5404199 1.6333379
Ccna2 6.55094526 2.5901207 3.4442751 1.4134005
Ccng2 2.93037152 2.3633945 1.6065519 1.2813352
Cd99l2 2.23567856 2.3494794 1.2539411 1.2732298
Cdc26 2.27667706 4.1367687 1.2747511 2.3143043
Cdc37 2.33722519 2.7254588 1.305484 1.4922333
Cdc37l1 2.18987873 2.796954 1.2306942 1.5338784
Cdk1 4.11012324 3.7569592 2.2053678 2.0930699
Cep170b 2.97138905 2.9107013 1.6273715 1.6001348
Cep70 2.73848736 2.6855048 1.5091558 1.4689606
Chchd1 2.94115082 3.5703768 1.6120232 1.9843879
Chka 3.77709567 3.3294571 2.0363304 1.8440551
Clcn7 2.63037157 3.0387087 1.4542786 1.6746976
Cluap1 2.38917506 3.0370247 1.3318526 1.6737167
Cops3 3.02119963 3.8907357 1.6526543 2.1709931
Cplx1 2.56291271 2.6107044 1.4200379 1.4253902
Cr1l 4.10628594 2.6910166 2.2034201 1.4721712
Creb1 3.78627579 4.6574872 2.04099 2.6176166
Ctsa 4.70786584 4.0924853 2.5087687 2.2885098
Ctsz 4.28655898 3.7028614 2.2949227 2.0615585
Cttnbp2nl 3.22636487 3.4067755 1.7567916 1.8890921
Dcun1d1 4.35230961 2.3695016 2.3282962 1.2848926
Ddx28 2.79381592 2.312294 1.5372393 1.2515698
Ddx54 2.5603724 3.0298635 1.4187485 1.6695454
Dicer1 2.36124952 3.3004263 1.3176782 1.827145
Dimt1 2.36710718 2.9739816 1.3206514 1.6369949
Dlg3 2.46615436 2.4639877 1.3709255 1.3399296
Dmxl1 5.30365144 2.8198142 2.8111763 1.5471942
Dusp11 3.25281329 3.4605326 1.7702162 1.920405
Dync2h1 3.08234773 3.4810935 1.6836917 1.9323814
Dyrk2 2.90241867 5.1938115 1.5923637 2.9300191
E430025E21Rik 3.14365957 2.8084614 1.7148122 1.5405814
Eef1d 2.32632222 2.7207772 1.2999498 1.4895064
Efhd2 2.70490435 3.8944797 1.4921098 2.1731739
Efna4 4.53388702 3.2598453 2.4204609 1.803507
Eif4ebp2 2.19032536 3.222706 1.2309208 1.7818738
Epn2 2.3432873 3.418907 1.3085609 1.8961586
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Galnt2 2.20931657 3.0053342 1.2405604 1.6552574
Gas8 3.39376258 4.4158914 1.841759 2.4768899
Gbas 3.32439775 2.4686182 1.8065509 1.3426268
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Gmppa 7.44392554 3.1146183 3.8975321 1.7189141
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Lrrc16b 3.65134149 5.5159584 1.9725003 3.1176658
Lsm4 5.92260312 4.6432292 3.1253425 2.6093115
Lta4h 2.29319667 2.8477669 1.2831361 1.5634763
Lyz2 4.40107743 2.2536795 2.3530497 1.2174276
Mak16 2.76339212 2.8096904 1.5217969 1.5412972
Man1b1 4.41782659 3.1114358 2.3615512 1.7170603
Mapk9 5.30550998 4.7466957 2.8121197 2.6695795
Mesdc2 2.8210658 2.4839872 1.5510707 1.351579
Mfsd8 2.77168992 2.9983641 1.5260086 1.6511974
Mgst3 2.8464849 2.8503997 1.5639729 1.5650099
Mon2 2.22500165 2.3417553 1.2485218 1.2687306
Mrpl23 2.44827635 3.5112 1.3618511 1.9499181
Mrpl30 2.44828353 2.4608321 1.3618547 1.3380915
Mrpl43 3.72077909 2.765537 2.0077453 1.5155784
Mrpl45 2.20302539 2.2891612 1.2373671 1.2380952
Mrto4 2.20687131 3.5162877 1.2393192 1.9528817
Msantd3 2.29587326 2.4701118 1.2844946 1.3434967
Nampt 4.13781088 3.3783726 2.2194214 1.8725478
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Nelfa 5.73959286 2.619677 3.0324505 1.4306167
Nme7 2.75229653 2.767858 1.516165 1.5169303
Nploc4 3.89962171 2.4852057 2.0985219 1.3522888
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Osbpl2 4.78535716 3.3304507 2.5481016 1.8446338
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Pdxp 5.31809271 2.6260715 2.8185064 1.4343414
Pex13 3.49963446 3.167124 1.8954972 1.749498
Pfkfb2 2.96806352 3.6649636 1.6256835 2.0394835
Polr2c 4.05837061 3.173369 2.1790993 1.7531356
Pop4 3.33928325 2.6235951 1.8141065 1.4328989
Ppp1r10 2.32116548 3.0526632 1.2973324 1.6828259
Prkar2a 2.16590205 3.7084944 1.2185241 2.0648397
Prpf38a 3.25065058 3.1483157 1.7691185 1.7385424
Psd3 3.98929206 2.7247325 2.1440366 1.4918103
Ptcd3 3.82278389 3.7194961 2.0595207 2.0712481
Ptprn2 2.86899971 2.6882481 1.5754009 1.4705585
Ptpru 2.50900243 4.0679509 1.3926743 2.2742188
R3hcc1 2.24104709 2.2730127 1.2566661 1.2286889
Rab2a 6.5186579 4.844434 3.4278867 2.7265109
Rap1gap 5.19527675 4.4354615 2.7561677 2.4882893
Rap2b 2.34847275 2.4767369 1.311193 1.3473558
Rbm45 3.55196324 3.050396 1.9220581 1.6815054
Rcbtb2 3.51733022 2.3475437 1.9044792 1.2721023
Rgs3 2.9111232 2.772411 1.5967819 1.5195824
Rian 2.87076983 3.1755758 1.5762994 1.754421
Ric8 8.72513303 2.3826736 4.5478447 1.2925651
Rlf 4.3374585 3.9990296 2.3207581 2.234073
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Rnf24 6.70574007 4.6457462 3.5228455 2.6107776
Rpa2 2.51965707 2.8051124 1.3980823 1.5386306
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Samd4b 5.29992671 3.0706801 2.8092857 1.6933206
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Sept9 2.16801345 4.1109862 1.2195958 2.2992863
Sh3glb1 2.1426056 2.6075124 1.2066994 1.423531
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Sike1 2.78217733 2.4686615 1.5313318 1.342652
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Slc25a17 2.40962792 2.798179 1.342234 1.534592
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Slc30a5 3.3525133 3.1579409 1.8208217 1.7441489
Slc35b4 3.14790045 2.2767761 1.7169648 1.2308811
Smc6 3.57120524 3.0694862 1.9318249 1.6926252
Snapc3 3.04143459 2.4534287 1.6629251 1.3337791
Snx13 4.78391441 2.6276813 2.5473693 1.4352791
Socs6 3.67887016 4.3720688 1.9864733 2.4513639
Spns1 2.90741242 2.4968309 1.5948984 1.3590603
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Srsf4 5.5080472 2.5154349 2.9149231 1.3698969
Stk35 2.95341596 2.5856721 1.6182488 1.4108092
Stk36 2.54379578 5.682034 1.4103346 3.2144028
Sult4a1 2.194657 2.4852584 1.2331195 1.3523195
Tars2 2.46042694 3.0555761 1.3680184 1.6845227
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Tbp 5.41048128 3.9875535 2.8654008 2.2273883
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Tmub2 2.34540761 2.567316 1.3096372 1.400117
Traf4 2.2585901 3.8347851 1.2655705 2.1384025
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Zcchc17 4.23987298 4.1958037 2.2712259 2.3486915
Zfp128 3.27218513 2.7063625 1.7800489 1.4811099
Zfp553 2.37628249 3.5674136 1.3253086 1.9826619
Zfp623 4.16147602 3.125352 2.2314333 1.7251663
2310045N01Rik n.a. n.a. n.a. n.a.
Abat n.a. n.a. n.a. n.a.
Abhd13 n.a. n.a. n.a. n.a.
Acy1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Adamts18 n.a. n.a. n.a. n.a.
Adarb1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Adpgk n.a. n.a. n.a. n.a.
Atg13 n.a. n.a. n.a. n.a.
B230118H07Rik n.a. n.a. n.a. n.a.
Baiap2 (IRSp53) n.a. n.a. n.a. n.a.
Cers4 n.a. n.a. n.a. n.a.
Cln8 n.a. n.a. n.a. n.a.
Cmtr2 n.a. n.a. n.a. n.a.
Commd8 n.a. n.a. n.a. n.a.
Dhodh n.a. n.a. n.a. n.a.
Esyt2 n.a. n.a. n.a. n.a.
Fcf1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Galk1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Gmppb n.a. n.a. n.a. n.a.
Hmces n.a. n.a. n.a. n.a.
Kctd18 n.a. n.a. n.a. n.a.
Leng1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Mettl22 n.a. n.a. n.a. n.a.
Mrpl1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Mrpl57 n.a. n.a. n.a. n.a.
Nfxl1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Nsmaf n.a. n.a. n.a. n.a.
Pofut2 n.a. n.a. n.a. n.a.
Psrc1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Rev1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Rpap1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Slc15a4 n.a. n.a. n.a. n.a.
Smg5 n.a. n.a. n.a. n.a.
Suv420h2 n.a. n.a. n.a. n.a.
Tmem178b n.a. n.a. n.a. n.a.
Tor1aip1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Trub1 n.a. n.a. n.a. n.a.
Vamp3 n.a. n.a. n.a. n.a.
Zfp426 n.a. n.a. n.a. n.a.
Zfp566 n.a. n.a. n.a. n.a.
Zfyve9 n.a. n.a. n.a. n.a.
Zscan12 n.a. n.a. n.a. n.a.
본 발명에 따른 eIF4E 과활성화-민감성 유전자의 구체적인 일 예로서, 상기아데노표 신 키나제 (Adenosine kinase, ADK, EC 2.7.1.20)는 아데노신을 5′아데노신 모노포스페이트로 전환시키는 진화적으로 보존된 포스포트랜스퍼제이다. ADK는 아데노신농도를 조절함으로써 복합적인 항상성 및 대사 네트워크의 상류 조절자로 역할을 수행하고, ADK 기능장애는 당뇨병, 암을 포함한 여러 병리학에 관련된다. 사람 아데노신 키나제의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 알려져 있으며, 예를 들면 사람 아데노신 키나제의 아미노산 서열은 NCBI accession number NP_001114.2, NP_001189378.1, NP_001189379.1, NP_001356052.1, 또는 NP_006712.2 이며, 핵산서열은 NCBI accession number NC_000010.11일 수 있다. ADK의 과발현이 성상세포(astrocyte)에서 일어날 때 뇌전증이 일어나는 모델이 알려져 있으나, 본 발명에서는 ADK의 과발현이 신경세포 (neuron)에서 될 때 뇌전증이 일어나는 질환에 관한 것으로서 상이하다.
cAMP 반응성 요소 결합 단백질 1 (cAMP responsive element binding protein 1,CREB1)는 세포 내 전사인자(transcriptional factor)이며, cAMP response elements (CRE)라고 불리우는 특정 염기서열에 결합해 하류(downstream) 유전자의 전사를 조절하는 역할에 관여한다. 사람 CREB1의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 알려져 있으며, 예를 들면 사람 CREB1의 아미노산 서열은 NCBI accession number는 NP_001307722.1,　NP_004370.1, NP_604391.1일 수 있다. CREB1의 핵산서열은 NCBI accession number는 NG_023299.1 일 수 있다.
인슐린 수용체 기질 p53 (Insulin receptor substrate p53, IRSp53)은 brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2 (BAIAP2)와 동의어이며, brain-specific angiogenesis inhibitor 1와 상호작용하며, 인슐린 수용체 타이로신 키나제의 기질 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 사람 IRSp53의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 알려져 있으며, 예를 들면 사람 아데노신 키나제의 아미노산 서열은 NCBI accession number는 NP_001138360.1, NP_006331.1, NP_059344.1, NP_059345.1일 수 있다. 상기 IRSp53의 핵산 서열은 NCBI accession number는 NG_029486.2일 수 있다.
본 발명에 따른 eIF4E 저해제는 뇌에서 eIF4E 발현, 활성 또는 수준 억제능을 가지는 물질로서, 화합물 (예, 메트포르민), 폴리뉴클레오티드 (예, siRNA, shRNA, miRNA, antisense oligonclueotide 등), 펩타이드 및 항체 (예, 완전 항체, 항체 단편 등)등을 모두 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 안티센스 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 구체적으로표적 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산으로서, DNA 및 RNA을 포함하며 단일 사슬 및 이중 사슬을 포함한다. 상기 eIF4E 발현, 활성 또는 수준 억제능이라 함은 eIF4E 발현증가 관련 뇌질환이 없는 대상을 기준으로 eIF4E의 발현, 수준 또는 활성이 적어도 95%이하, 90%이하, 85%이하, 80%이하, 75%이하, 70%이하, 65%이하, 60%이하, 55%이하 또는 50%이 로 억제되는 것을 의미할 수 있다.
따라서, 알려진 eIF4E 저해제는 모두 본 발명에 적용될 수 있으며, 예를 들면, (i)eIF4E에 결합하여 그의 7-MeG-Capped mRNA에 결합을 저해하는 cap-binding antagonist로서 Ribavirin, Synthetic nucleotide derivative 7-benzyl guanosine monophosphate (7-BnGMP), 및 4Ei-1 (nontoxic small molecule)를 포함하며, (ii)eIF4E-eIF4G interaction 저해제로서 4EGI-1. 4E1RCat, Quabain, (a kind of cardiac glycoside), 및 Perilly alcohol (a kind of secondary product of plant mevalonate metabolism)을 포함하며, (iii)eIF4E와 binding 하여 free eIF4E 수준을 감소시키는 물질로서 4EBP mimetic peptide 및 GnRH agonist-4EBP fusion peptide을 포함하며, (iv) 4) eIF4E 인산화를 차단하는 Mnk 저해제로서 CGP052088 (a derivative of staurosporine, a broadspectrum kinase inhibitor), CGP57380 (a potent Mnk1 and Mnk2 inhibitor), Retinamides (a novel Mnk inhibitor/one of retinoic acid metabolism blocking agents/blocked eIF4E phosphorylation), (v) Antisense oligonucleotide를 포함한다.
상기 eIF4E 저해제는 cap-binding antagonist, eIF4E-eIF4G interaction 저해제, eIF4E와 binding 하여 free eIF4E 수준을 감소시키는 물질, eIF4E 인산화를 차단하는 Mnk 저해제, 또는 eIF4E에 결합가능한 핵산일 수 있으며, 더욱 자세하게는 메트포르민, Ribavirin, 7-BnGMP, 4Ei-1, 4EGI-1. 4E1RCat, Quabain, Perilly alcohol, 4EBP mimetic peptide, GnRH agonist-4EBP fusion peptide, CGP052088, CGP57380, 또는 eIF4E에 결합가능한 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide, ASO)는 종래에 항암제로 알려진 eIF4E 저해제라도 뇌에서 eIF4E 발현, 활성 또는 수준 억제능을 가지는 한 본 발명에 적용할 수 있으며, 자세하게는 US9,096,851, US 8,410,074, US8,252,762, 또는 US 7,601,700 등에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오타이드도 포함된다. 예시적인 eIF4E-특이적 ASO는 LY2275796 및 ISIS 183750 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 예에서, eIF4E의 mRNA 발현 억제제, 예를 들면 진핵 개시 인자 4E(eIF4E)와 상보적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 eIF4E 저해제에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 "mRNA 발현 억제제"는 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA가 코딩하는 단백질의 발현을 억제하는 것으로, 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 micro RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 shRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 shRNA는 형질감염 되었을 때, 분해 속도가 낮고, 회전율이 높기 때문에 목적하는 바를 더욱 효과적으로 이룰 수 있다.
본 발명에서 상기 eIF4E 저해제인 폴리뉴클레오티드는 eIF4E mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 eIF4E mRNA에 상보적으로 결합하여, RNase H에 의해 매개되는 eIF4E mRNA의 분해 기능을 수행하여 eIF4E 발현 증가오 관련된 질환, 이의 증상 또는 동반질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 eIF4E 저해제의 일 예로서 eIF4E 저해 약물, 예컨대 메트포르민 등일 수 있다. 또는 eIF4E 저해제의 일 예는 shRNA일 수 있으며, 예를 들면 SEQ ID NO: 203 및 SEQ ID NO: 204를 포함할 수 있다.
또한, eIF4E 저해제의 일 예는 antisense oligonucleotide (ASO)일 수 있으며, 예를 들면 하기 표 2에 자세히 기재하고 있으며 eIF4E 유전자의 발현 및/또는 활성을 저해할 수 있는 올리고뉴클레오티드라면 포함될 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 eIF4E의 활성 또는 발현을 억제하며, 14 내지 30개, 15 내지 30개, 16 내지 30개, 17 내지 30개, 18 내지 30개, 19 내지 30개, 14 내지 25개, 15 내지 25개, 16 내지 25개, 17 내지 25개, 18 내지 25개, 19 내지 25개, 14 내지 23개, 15 내지 23개, 16 내지 23개, 17 내지 23개, 18 내지 23개, 19 내지 23개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 eIF4E의 5'-비번역 부위, 개시 부위, 엑손 부위, 인트론 부위, 및 3'-비번역 부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 부위와 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산 분자일 수 있다.
일반적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산의 상응하는 분절에 대한 혼성화를 허용하는 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 일 예에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 eIF4E의 5'-비번역 부위, 개시 부위, 엑손 부위, 인트론 부위, 및 3'-비번역 부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 부위와 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산 분자이며, 혼성화를 통해 eIF4E 생성, 발현 수준 및/또는 활성을 감소시켜, 뇌 신경세포에서 eIF4E 과활성화 또는 활성 증가로 인한 상태(condition), 구체적으로 질병(disease) 또는 장애(disorder), 그리고 질병 또는 장애와 관련된 증상의 예방, 개선 또는 치료를 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 eIF4E 활성 증가를 억제 또는 감소할 수 있으며, 그리고 eIF4E 에 의해 조절되는 eIF4E 활성화-민감성 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 상기 eIF4E 활성화-민감성 유전자에 대해서는 상술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 201을 갖는 대조군을 기준으로 eIF4E의 mRNA의 상대적 발현 정도가 적어도 95%이하, 90%이하, 85%이하, 80%이하, 75%이하, 70%이하, 65%이하, 60%이하, 55%이하 또는 50%이하로 감소시킬 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 화학적 변형(chemical modification)을 가한 것일 수 있다.
안티센스 올리고머 화합물은 또한 예를 들어 뉴클레아제 안정성과 같은 성질을 증진시키기 위하여 올리고머 가닥의 적어도 일말단에 부착되는 하나 이상의 안정화 기을 갖도록 변형될 수 있다. "캡 구조 또는 말단 캡 모이어티"는 올리고뉴클레오티드의 어느 한 말단에 도입된, 화학적 변형을 의미한다.
또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage), 당 모이어티(moiety) 또는 뉴클레오염기를 가질 수 있다. "변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 뉴클레오시드간 연결, 변형된 당, 및/또는 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
상기 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드에 포함된 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드에 포함된 시토신이 5-위치에 메틸 치환기를 갖는 시토신으로 변형; 및 뉴클레오티드 사이 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포스페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형;으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태의 변형도 포함할 수 있다. 상기 LNA는 뉴클레오티드을 구성하는 리보스 당 분자의 2’-산소와 4’-탄소 사이에 형성된 메틸렌 브릿지 결합을 포함하는 것이다. "cEt" 또는 "제한된 에틸” 또는 “cEt 변형된 당”은 4'-탄소 및 2' 탄소를 연결하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 이환식 뉴클레오시드를 의미하며, 이때 상기 가교는 하기 화학식을 갖는다: 4’-CH(CH3)-O-2'.
본 발명의 구체예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage), 화학적으로 변형된 당 모이어티(moiety) 및 화학적으로 변형된 뉴클레오염기로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화학적 변형을 포함하는 것일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티에 포함된 각 뉴클레오드는 화학적으로 변형될 수 있으며, 예를 들면 MOE가 contrained ethyl(cET), 2′O-methoxyethyl(2′MOE), 및 locked nucleic acid (LNA)를 포함할 수 있으며, 상기 변형된 뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 양 말단에 각각 1개 내지 6개의 뉴클레오티드, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드에 포함된 각 뉴클레오드는 화학적으로 변형된 염기를는 아포함할 수 있으며, 예를 들면 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실 이외의 임의의 핵염기를 의미한다. "비변형된 염기"는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다. 예를 들면, 변형된 염기는 시토신이 5-위치에 메틸 치환기를 갖는 시토신을 의미할 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage)은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포스페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합일 수 있으며, 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합일 수 있다.
본 발명에서 antisense oligonucleotide의 투여, adeno associated virus (AAV)를 이용한 siRNA의 전달, eIF4E 활성 저해제 (예, eFT-508)의 투여, peptide에 RNA를 coating하여 전달하는 방법으로 사용할 수 있으며, 뇌전증의 치료용도로 사용하는 경우, antisense oligonucleotide의 투여, adeno associated virus (AAV)를 이용한 siRNA의 전달, eIF4E 활성 저해제 (예, eFT-508)의 투여, peptide에 RNA를 coating하여 전달하는 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 대상에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 비경구 투여일 수 있으며, 비경구 투여는 주사 (예컨대 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여 (subcutaneous injection), 정맥내 투여 (intravenous injection), 근육내 투여 (intramuscular injection), 동맥내 투여 (intra arterial injection), 복강내 투여 (intraperitoneal injection), 뇌내 투여 (Intracerebral injection), 척추 강내 투여 (intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)가 포함된다.
상기 안티센스 폴리뉴클레오티드의 구체적인 예는 하기 표 2에 나타낸 것일 수 있다. 표 2에서 SEQ ID NO: 1 내지 89 및 SEQ ID NO: 101 내지 200의 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3'방향으로 1 내지 5 및 16 내지 20 위치의 뉴클레오티드의 2′-MOE 변형을 포함하며, SEQ ID NO:81 내지 95의 올리고뉴클레오티드는 1-3 및 14-16 위치의 뉴클레오티드의 2′-MOE 변형을 포함하며, 표 2에 기재된 올리고뉴클레오티드는 모두 두 개 뉴클레오티드의 연결이 phorothioester bond로 변형되어 있다.
SEQ ID NO Id Nucleotide sequence
(5'->3')		 Target Position
1 EIF4E_98879841 AAACAAAGATAGCCACATCA 3′ UTR
2 EIF4E_98879924 TCAAACTAGTGCTCCAAACT 3′ UTR
3 EIF4E_98880043 AGGACAAATCTAGTTGTCTA 3′ UTR
4 EIF4E_98880044 GGACAAATCTAGTTGTCTAA 3′ UTR
5 EIF4E_98880054 AGTTGTCTAAAAGACAATTC 3′ UTR
6 EIF4E_98881125 CTTTCCTTGTATACCCTCCT Exon7
7 EIF4E_98881126 TTTCCTTGTATACCCTCCTA Exon7
8 EIF4E_98882525 AGGATAGGTTTTTTTTATAC Intron6
9 EIF4E_98882527 GATAGGTTTTTTTTATACCT Intron6
10 EIF4E_98883689 CACTGCGCCTGGTGTCAAAT Intron6
11 EIF4E_98883695 GCCTGGTGTCAAATATTACT Intron6
12 EIF4E_98885582 GGCATACATACAGGGACATG Intron5
13 EIF4E_98885583 GCATACATACAGGGACATGT Intron5
14 EIF4E_98886839 GCTTACTGTGGTGAGAGTCA Intron5
15 EIF4E_98886840 CTTACTGTGGTGAGAGTCAA Intron5
16 EIF4E_98887070 AAACCTTACTGTCTCTAGCC Exon5
17 EIF4E_98887071 AACCTTACTGTCTCTAGCCA Exon5
18 EIF4E_98887260 AACAGTTAAGCAACAACACT Intron4
19 EIF4E_98887261 ACAGTTAAGCAACAACACTG Intron4
20 EIF4E_98887650 CTGGATAATCAAAGCTCTCA Intron4
21 EIF4E_98887651 TGGATAATCAAAGCTCTCAT Intron4
22 EIF4E_98887880 TAAGCATACCTTAAAAAGTG Exon4
23 EIF4E_98887881 AAGCATACCTTAAAAAGTGA Exon4
24 EIF4E_98887882 AGCATACCTTAAAAAGTGAG Exon4
25 EIF4E_98887883 GCATACCTTAAAAAGTGAGT Exon4
26 EIF4E_98887884 CATACCTTAAAAAGTGAGTA Exon4
27 EIF4E_98888747 TCTCCAATATTAGATGGCAG Intron3
28 EIF4E_98888750 CCAATATTAGATGGCAGAAA Intron3
29 EIF4E_98889967 AAATTATTAGGCCTTAAATG Intron3
30 EIF4E_98889970 TTATTAGGCCTTAAATGTAG Intron3
31 EIF4E_98891226 TGGTTACTTACGCCCAAAAG Exon3
32 EIF4E_98891227 GGTTACTTACGCCCAAAAGT Exon3
33 EIF4E_98891228 GTTACTTACGCCCAAAAGTC Exon3
34 EIF4E_98891229 TTACTTACGCCCAAAAGTCT Exon3
35 EIF4E_98891231 ACTTACGCCCAAAAGTCTTC Exon3
36 EIF4E_98901055 CCAAGTCAGCACGGACTTTT Intron2
37 EIF4E_98901056 CAAGTCAGCACGGACTTTTT Intron2
38 EIF4E_98901057 AAGTCAGCACGGACTTTTTT Intron2
39 EIF4E_98901649 TCCATTATGACCAATACTTT Intron2
40 EIF4E_98901650 CCATTATGACCAATACTTTT Intron2
41 EIF4E_98901651 CATTATGACCAATACTTTTC Intron2
42 EIF4E_98901863 TTAGAAAGCTTACCTGTTCT Exon2
43 EIF4E_98901864 TAGAAAGCTTACCTGTTCTG Exon2
44 EIF4E_98901865 AGAAAGCTTACCTGTTCTGT Exon2
45 EIF4E_98916244 TATAACAATTACAGGAAGCT Intron1
46 EIF4E_98916247 AACAATTACAGGAAGCTATA Intron1
47 EIF4E_98923992 CATGCTCATTTCCACTTCTC Intron1
48 EIF4E_98928252 TACAGCGATCTGTAGGCCTC Intron1
49 EIF4E_98928259 ATCTGTAGGCCTCGCTCCTC Intron1
50 EIF4E_98928283 TTCCCTCCTCCATGACAGCC Intron1
51 EIF4E_98929081 AAGGCAATACTCACCGGTTC Exon1
52 EIF4E_98929101 GACAGTCGCCATCTTAGATC Exon1
53 EIF4E_98929115 TAGATCGATCTGATCGCACA 5′ UTR
54 EIF4E_98929123 TCTGATCGCACAACCGCTCC 5′ UTR
55 EIF4E_98929166 AATGAGATTCAAACCGGATT 5′ UTR
56 EIF4E_98929170 AGATTCAAACCGGATTGGCC 5′ UTR
57 EIF4E_98929269 GGCTTCTGGGAAGTGGAGTC 5′ UTR
58 EIF4E_98929547 ATAAGGCTTCATTTGCTTAG 5′ UTR
59 EIF4E_98930006 GGGTCAACTATGACTCTTGA 5′ UTR
60 EIF4E_98930012 ACTATGACTCTTGACGTTGA 5′ UTR
61 EIF4E_98930017 GACTCTTGACGTTGACTCAT 5′ UTR
62 EIF4E_98930038 CTCCTTAGGCGAGTGACTTA 5′ UTR
63 EIF4E_98930102 GATACACTTACCTCACAAGG 5′ UTR
64 EIF4E_98930109 TTACCTCACAAGGGTGTGCT 5′ UTR
65 EIF4E_98880048 AAATCTAGTTGTCTAAAAGA 3′ UTR
66 EIF4E_98880053 TAGTTGTCTAAAAGACAATT 3′ UTR
67 EIF4E_98928260 TCTGTAGGCCTCGCTCCTCC Intron1
68 EIF4E_98928261 CTGTAGGCCTCGCTCCTCCC Intron1
69 EIF4E_98928284 TCCCTCCTCCATGACAGCCC Intron1
70 EIF4E_98929933 AGATGCCAGCCAGGGAAGCC 5′ UTR
71 EIF4E_98929937 GCCAGCCAGGGAAGCCACTC 5′ UTR
72 EIF4E_98884969 TGCTATCTTATCACCTTTAG Exon6
73 EIF4E_98880876 GGCGAATGAGACTTCTCTTA 3′ UTR
74 EIF4E_98880414 TCCTGGATCCTTCACCAATG 3′ UTR
75 EIF4E_98880406 (ASO-1) TGTCATATTCCTGGATCCTT 3′ UTR
76 EIF4E_98880417 (ASO-2) TGGATCCTTCACCAATGTTA 3′ UTR
77 EIF4E_98880419 (ASO-3) GATCCTTCACCAATGTTACA 3′ UTR
78 EIF4E_98884977 (ASO-4) TATCACCTTTAGCTCTAACA Exon6
79 EIF4E_98887921 (ASO-5) AATTACTAGACAACTGGATA Exon4
80 EIF4E_98929104 CATCTTAGATCGATCTGATC Exon1
81 EIF4E_98880414_shortform CTGGATCCTTCACCAA 3′ UTR
82 EIF4E_98884969_shortform CTATCTTATCACCTTT Exon6
83 EIF4E_98887921_shortform TTACTAGACAACTGGA Exon4
84 EIF4E_98929104_shortform ATCTTAGATCGATCTG Exon1
85 EIF4E_98891227_shortform TTACTTACGCCCAAAA Exon3
86 EIF4E_98881125_shortform TTCCTTGTATACCCTC Exon7
87 EIF4E_98887070_shortform ACCTTACTGTCTCTAG Exon5
88 EIF4E_98901864_shortform GAAAGCTTACCTGTTC Exon2
89 EIF4E_98930017_shortform CTCTTGACGTTGACTC 5′ UTR
90 EIF4E_98928261_shortform GTAGGCCTCGCTCCTC Intron1
91 EIF4E_98901649_shortform CATTATGACCAATACT Intron2
92 EIF4E_98888750_shortform AATATTAGATGGCAGA Intron3
93 EIF4E_98887650_shortform GGATAATCAAAGCTCT Intron4
94 EIF4E_98886839_shortform TTACTGTGGTGAGAGT Intron5
95 EIF4E_98883695_shortform CTGGTGTCAAATATTA Intron6
101 EIF4E_98929109 CCATCTTAGATCGATCTGAT EXON1
102 EIF4E_98929111 ATCTTAGATCGATCTGATCG EXON1
103 EIF4E_98929201 ACGTGACGGATATGTCCGTT EXON1
104 EIF4E_98929463 TGCCAGGCAAGCCTACTGTG EXON1
105 EIF4E_98929873 GAAGTTCTGTGCAACCGTTC EXON1
106 EIF4E_98929875 AGTTCTGTGCAACCGTTCCA EXON1
107 EIF4E_98929917 GAAATAGCCTAAGTCCAGAT EXON1
108 EIF4E_98929921 TAGCCTAAGTCCAGATGCCA EXON1
109 EIF4E_98930010 CAACTATGACTCTTGACGTT EXON1
110 EIF4E_98930095 AGGTGATGATACACTTACCT EXON1
111 EIF4E_98930164 GACTCTAGAAATGATTCATA EXON1
112 EIF4E_98902048 ACTAAACCTGAACTGATATG Intron1
113 EIF4E_98902052 AACCTGAACTGATATGCTGA Intron1
114 EIF4E_98902946 CTATCGTAACCTAAAAGTTC Intron1
115 EIF4E_98902976 TATTTTCAATGGAACCTAAC Intron1
116 EIF4E_98904158 GTATTTGTGAAACGTAAGCA Intron1
117 EIF4E_98906453 ATTCAGGCTTACATATTGTA Intron1
118 EIF4E_98908332 ACGTGTTCGGTCAATGCTAC Intron1
119 EIF4E_98908338 TCGGTCAATGCTACAGCACC Intron1
120 EIF4E_98910345 TCATATATCAATCATGATTC Intron1
121 EIF4E_98910440 ACTGGATTACTAAAGAGTTG Intron1
122 EIF4E_98910444 GATTACTAAAGAGTTGTGAT Intron1
123 EIF4E_98911027 CCAGGCCTAAAACTTGGATG Intron1
124 EIF4E_98911030 GGCCTAAAACTTGGATGAAT Intron1
125 EIF4E_98912603 TACATACGTTGAACATTATG Intron1
126 EIF4E_98913964 CGTTTATGATGTAAGCACTA Intron1
127 EIF4E_98917268 AGTTCAGCTTTAATCCAATC Intron1
128 EIF4E_98920149 GGAGATAGGTTTTCCACATT Intron1
129 EIF4E_98920153 ATAGGTTTTCCACATTAGAC Intron1
130 EIF4E_98925375 AGAAACACGACCTACTGGAG Intron1
131 EIF4E_98901927 TTAGATTCCGTTTTCTCCTC EXON2
132 EIF4E_98901929 AGATTCCGTTTTCTCCTCTT EXON2
133 EIF4E_98901937 TTTTCTCCTCTTCTGTAGTC EXON2
134 EIF4E_98901940 TCTCCTCTTCTGTAGTCGGG EXON2
135 EIF4E_98901943 CCTCTTCTGTAGTCGGGGGA EXON2
136 EIF4E_98901946 CTTCTGTAGTCGGGGGATTA EXON2
137 EIF4E_98901950 TGTAGTCGGGGGATTAGGAG EXON2
138 EIF4E_98901953 AGTCGGGGGATTAGGAGTAG EXON2
139 EIF4E_98891637 GGTGATTGCCACTAGCCAAA Intron2
140 EIF4E_98891970 CGGAATTCACAGAAATGACG Intron2
141 EIF4E_98893710 GCTTCAAAGTCATCAATACG Intron2
142 EIF4E_98894256 AGTCATTGGCTGCAAGATCC Intron2
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144 EIF4E_98897930 TAAGCAGTGTATGATGTTAA Intron2
145 EIF4E_98900200 GTTAAACTATATAAGACTGC Intron2
146 EIF4E_98900208 ATATAAGACTGCCTCTAACG Intron2
147 EIF4E_98901760 CCTCAACCTTAGCATATCTA Intron2
148 EIF4E_98901769 TAGCATATCTAAAACTAGTC Intron2
149 EIF4E_98901104 GACATCTTGCTTCATTTGAC Intron2
150 EIF4E_98887991 GTAATATAGAGTTTAGGTGC Intron3
151 EIF4E_98887997 TAGAGTTTAGGTGCTTACAT Intron3
152 EIF4E_98888000 AGTTTAGGTGCTTACATATA Intron3
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154 EIF4E_98888641 CTTAGTTGCTTGCCTGAAGG Intron3
155 EIF4E_98889221 CACAAATATAGTTTAGGTGA Intron3
156 EIF4E_98889228 ATAGTTTAGGTGAGACAACC Intron3
157 EIF4E_98890236 ATGAGCAGAATATCTTGAGG Intron3
158 EIF4E_98890336 TTAGATAACTGCTAGGTAAT Intron3
159 EIF4E_98890730 GAGGTTGATCAAAGTATAAT Intron3
160 EIF4E_98887924 TACTAGACAACTGGATATGG Exon4
161 EIF4E_98887927 TAGACAACTGGATATGGTTG Exon4
162 EIF4E_98887930 ACAACTGGATATGGTTGTAC Exon4
163 EIF4E_98887933 ACTGGATATGGTTGTACAGA Exon4
164 EIF4E_98887357 GCATGACATTGCAGAATTAG Intron4
165 EIF4E_98887647 AGACTGGATAATCAAAGCTC Intron4
166 EIF4E_98887648 GACTGGATAATCAAAGCTCT Intron4
167 EIF4E_98887092 AAGCGATCGAGGTCACTTCG Exon5
168 EIF4E_98887095 CGATCGAGGTCACTTCGTCT Exon5
169 EIF4E_98887098 TCGAGGTCACTTCGTCTCTG Exon5
170 EIF4E_98887101 AGGTCACTTCGTCTCTGCTG Exon5
171 EIF4E_98887103 GTCACTTCGTCTCTGCTGTT Exon5
172 EIF4E_98885135 TTTGCATAGAAACTAAAGGC Intron5
173 EIF4E_98885140 ATAGAAACTAAAGGCAGTTT Intron5
174 EIF4E_98885275 TTGGCAGTTAATGTCATGGC Intron5
175 EIF4E_98885278 GCAGTTAATGTCATGGCAGA Intron5
176 EIF4E_98885327 TGCTCTGCTGCTGCTTATAT Intron5
177 EIF4E_98886329 TGTCTTGTAAAGCCAGAAGT Intron5
178 EIF4E_98884989 CTCTAACATTAACAACAGCG Exon6
179 EIF4E_98884993 AACATTAACAACAGCGCCAC Exon6
180 EIF4E_98884997 TTAACAACAGCGCCACATAC Exon6
181 EIF4E_98885000 ACAACAGCGCCACATACATC Exon6
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183 EIF4E_98881534 GACCTGTATCACATGCATAC Intron6
184 EIF4E_98881537 CTGTATCACATGCATACTTA Intron6
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187 EIF4E_98882037 TGAGATAAAGCTGACAAGGT Intron6
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190 EIF4E_98884163 AAATTATACGTAGTAAACAC Intron6
191 EIF4E_98873115 CAACCTTCATAAAAGTACTA Exon7
192 EIF4E_98874238 TGCCACTTGATACTGCTGAA Exon7
193 EIF4E_98875120 AGTTTCTAGACACGTACAAG Exon7
194 EIF4E_98875416 ACTTTACTTGGACAATCATA Exon7
195 EIF4E_98877382 CTTTTGAATGCAACTTTAGC Exon7
196 EIF4E_98879129 TATGTACAGTATGCTGAGAT Exon7
197 EIF4E_98879807 CTAAGACTGAATGACTGTGC Exon7
198 EIF4E_98879820 ACTGTGCCTTACTTTATAAA Exon7
199 EIF4E_98880301 CACTGATTTGAATGAAATGC Exon7
200 EIF4E_98880973 CCAAATCTCGATTGCTTGAC Exon7
본 발명에 따른 치료적 유효량의 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하는 방법은 피하 투여 (subcutaneous injection), 정맥내 투여 (intravenous injection), 근육내 투여 (intramuscular injection), 동맥내 투여 (intra arterial injection), 복강내 투여 (intraperitoneal injection), 뇌내 투여 (Intracerebral injection), 척추 강내 투여 (intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)일 수 있다. eIF4E 저해제가 신경계 외의 항암제로 알려져 있는 것도 있으나 이는 정맥 주사로 소정의 효과를 달성하는 것이며 정맥주사로는 eIF4E 저해제가 뇌혈관 장벽을 통과하여 뇌에 전달되지 않기 때문에 뇌내 투여 (Intracerebral injection), 척추 강내 투여 (intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 척추 강내 투여 일 수 있다.
본 발명에 따른 eIF4E 저해제를 포함하는 약학적 조성물은 질환 치료를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 뇌전증을 예방하거나 증상을 완화하고 치료하기 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 다양한 투여 경로에 따라 적절한 제제 조성으로 제제화될 수 있다.
본 발명은 eIF4E 및 eIF4E 과활성화-민감성 단백질 및 이를 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커에 관한 것으로서, 상기 바이오마커는 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환을 탐지, 검출 또는 진단하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 일예는 바이오마커를 검출할 수 있는 분자 또는 제제를 포함하는, eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환의 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 방법 또는 진단의 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가 일예는 상기 바이오마커를 검출할 수 있는 분자 또는 제제를 포함하는, eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환의 탐지, 검출 또는 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는 eIF4E, eIF4E에 의해 발현 또는 활성이 조절되는 eIF4E 활성화 민감성 단백질, 및 이들을 암호화하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 바이오마커를 이용하여, eIF4E 저해제의 투여 대상을 선택, eIF4E 저해제에 대한 대상(subject)의 반응성(susceptibility)를 예측, 또는 대상(subject)에서 eIF4E 저해제의 투여 효능을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
구체적인 일예에서, 본 발명은 시험 대상의 생물학적 시험 시료에서 바이오마커의 활성, 발현 또는 농도 수준을 측정하고, 참조 시료에서 측정된 바이오마커의 활성, 발현 또는 농도 수준을 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 추가로 상기 비교하는 단계에서 시험 대상의 생물학적 시료에서 바이오마커의 활성, 발현 또는 농도 수준이 참조 시료의 바이오마커 값보다 높은 경우 eIF4E 저해제를 필요로 하는 대상으로 선택하는 단계, 및 상기 선택된 대상에게 eIF4E 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 참조 시료 (reference sample)는 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 증상 또는 동반질환을 가지지 않은 대상(subject)에서 얻어진 것일 수 있고, 상기 시험 시료는 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 증상 또는 동반질환의 발생 위험을 갖는 대상, 또는 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환으로 인한 외과적 수술 경험이 있는 대상일 수 있다.
본 발명에서 용어 "환자의 시료" 또는 "대상의 시료""란 바이오마커 단백질 또는 유전자를 검출할 수 있는 조직, 세포와 같은 시료 등을 포함하며, 바람직하게, 뇌 조직, 뇌 세포, 뇌 조직의 용해액, 또는 뇌 척수액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 eIF4E 활성증가에 의한 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환과, eIF4E 및 eIF4E 과활성화-민감성 단백질 및 이를 암호화하는 핵산분자는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 바이오마커를 검출할 수 있는 분자 또는 제제는 상기 바이오마커와 혼성화 가능한 프라이머, 프로브 또는 압타머이거나, 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 "유전자를 검출할 수 있는 제제"는 대상 시료 내에서 대상 유전자를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 구체적인 일예로, 대상 유전자의 핵산서열에 상보적으로 결합 가능한 프라이머 (primer), 프로브 (probe), 안티센스 핵산 (antisnense oligonucleotide), 압타머 등 일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 대상 유전자에 특이적으로 결합하고 다른 핵산서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다. 상기 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서 대상 유전자와 상보적인 프로브, 프라이머 또는 안티센스 핵산으로 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 진단할 수 있다. 적적한 서열 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 따른 eIF4E 활성증가와 관련된 뇌 질환, 예를 들면 FMCD, FMCD의 증상, 또는 동반질환의 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 방법 또는 진단의 정보를 제공하는 방법에서, 대상의 시료로부터 바이오마커 유전자를 검출하는 방법은, 환자의 시료로부터 핵산을 증폭하는 단계, 및/또는 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 핵산을 증폭하는 단계는, 중합효소 연쇄반응(PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, 테일-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계는, 생거(Sanger) 시퀀싱, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 샷건(Shotgun) 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, TaqMan 기법, 자동염기서열분석, 또는 차세대 염기서열 분석에 의하여 수행될 수 있다. 차세대 염기서열 분석은, 당업계에 널리 사용되는 염기서열 분석 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Roche 사의 454 GS FLX, Illumina 사의 Genome Analyzer, Applied Biosystems 사의 SOLid Platform 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서 "단백질을 검출할 수 있는 제제"는 대상 시료 내에서 대상 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게, 상기 대상 단백질을 타겟(target)으로 하는 특정 화합물, 펩타이드, 항체, 압타머, 또는 합성 물질일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 대상 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 상기 키트에는 mTOR 활성화-민감성 유전자 또는 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 핵산, 압타머, 항체, 펩타이드 및 화합물을 포함하는 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
상기 eIF4E 활성화 민감성 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 분자를 검출하는 경우, eIF4E의 신호전달 경로 하류에 위치하는 유전자를 검출하여 뇌 조직의 절제 없이 최소침습적인 방법으로 진단을 할 수 있으며, 유전자 검출 방법에 비해 시간과 비용적으로 장점이 있다.
본 발명에서 eIF4E는 약리적 또는 유전적 억제를 통해 난치성 간질에서 새로운 치료 표적으로 확인하고, eIF4E 억제제 또는 eIF4E 저해제를 이용하여 뇌전증을 억제함을 보여준다.
도 1은 TSC, FCD, HME 환자의 뇌 조직에서 4E-BPs와 S6 인산화 증가를 면역형광염색법으로 분석한 결과이며, 대조군 1은 UMB5309의 사후조직이고 대조군 2는 UMB5408의 사후조직이고, 대조구 3은 FCD247 환자의 정상 뇌조직이다.
도 2는 TSC, FCD, HME 환자의 뇌 조직에서 얻어진 단백질 용해액에서 ADK, IRSp53, CREB1, p-S6의 발현 증가를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타내는 것으로서, α-tubulin은 loading control로 사용되며, 대조군 1은 UMB5309의 사후조직이고 대조군 2는 UMB5408의 사후조직이고, 대조구 3은 FCD247 환자의 정상 뇌조직이고, 대조군 4는 UMB1712의 사후조직과, 대조군 5는 UMB4917 사후조직 뇌조직이다.
도 3는 TSC, FCD, HME 환자의 병변 조직에서 ADK, IRSp53, CREB1 발현 증가를 면역형광염색법으로 분석한 결과이며, 대조군 1은 UMB5309의 사후조직이고 대조군 2는 UMB5408의 사후조직이고, 대조구 3은 FCD247 환자의 정상 뇌조직이다.
도 4는 FMCD 동물 모델 (Embryonic day 18일)에서 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가를 확인하였다. 4E-BPs의 인산화 증가와 S6K의 활성 증가는 eIF4E가 포함된 eIF4F 복합체의 활성을 증가시킨다.
도 5는 FMCD 동물 모델 (adult - 생후 56일 - 120일 사이)에서 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가를 확인하였다. 4E-BP의 인산화 증가와 S6K의 활성 증가는 eIF4E가 포함된 eIF4F 복합체의 활성을 증가시킨다.
도 6 내지 도 8은 실시예 1-6에 따른 FMCD 동물 모델에서 확인되는 대뇌 피질 형성 이상, 간질, 세포 크기의 증가를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 실시예 2에 따라 pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-shScramble 또는 pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector의 제작과 sheIF4E의 eIF4E 저해 작용을 세포 용해액에서 western blot을 통해 확인함을 나타낸다.
도 9c 및 9d는 실시예 2에 따라 pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector로 실시예 1-6과 실시예 2-1과 같이 제작된 동물 모델의 생후 21일 뇌 조직에서 eIF4E 발현의 감소를 나타낸다.
도 9e는 실시예 2에 따라 pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector로 실시예 1-6과 실시예 2-1과 같이 제작된 동물 모델의 생후 21일 뇌 조직에서 eIF4E 발현 감소에 따라 ADK, IRSp53, CREB1의 발현 감소를 면역염색법을 분석한 결과를나타낸다.
도 9f는 실시예 2에 따라 CIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector로 제작된 FMCD 동물도델 및 sheIF4E 를 이용한 eIF4E 발현이 감소한 동물 동물 모델에서 뇌전증의 현저한 감소를 나타낸다.
도 10은 실시예 2에 따라 eIF4E 발현이 감소한 동물 모델에서 발작이 발병한 경우 발작의 빈도와 시간을 나타낸다.
도 11은 실시예 2에 따라 FMCD 뇌전증 동물 모델에서 eIF4E를 타겟하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 감소시킬 경우 대뇌 피질 형성 이상이 현저히 개선되었음을 보여준다.( *** P < 0.001 (n = 5 in each case, one-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test). Scale bar = 100 um. Mean±s.e.m.)
도 12는 실시예 2에 따라 FMCD 뇌전증 동물 모델에서 eIF4E를 타겟하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 mTOR 돌연변이를 발현하는 세포에서 감소시킬 경우, mTOR 돌연변이에 의한 세포 크기 증가가 현저히 개선됨. 치료 효과를 비교하기 위하여 대뇌 피질의 2/3 층의 세포의 크기를 비교하였음. 생후 21일의 FMCD 뇌전증 동물 모델을 이용한 것이다.
도 13은 실시예 2에 따라 뇌전증에서 synaptic spine 수의 이상을 나타내는 것으로서 eIF4E 발현이 감소한 동물 모델에서 치료됨을 확인하였다. FMCD 뇌전증 동물 모델에서 eIF4E를 타겟하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 mTOR 돌연변이를 발현하는 세포에서 감소시킬 경우, mTOR 돌연변이에 의해 감소한 synaptic spine 수가 다시 증가하여 치료 효과를 확인함. 생후 21일의 FMCD 뇌전증 동물 모델을 이용함. *** P < 0.001 (n = 10 branches, 5 mice per condition, one-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test). Scale bar = 2 um. Mean±s.e.m.)
도 14 및 도 15는 실시예 3에 따라 metformin을 이용한 eIF4E에서 활성을 감소시킨 뇌전증 동물 모델에서 발작이 발병한 모델에서 발작의 빈도와 시간이 현저히 감소하였음을 나타낸다(** P < 0.01 and *** P < 0.001 (p.C1483Y-shScramble : n = 20, p.L2427P-shScramble : n = 25, p.C1483Y-sheIF4E : n = 15, p.L2427P-sheIF4E : n =20, 10 mice for condition in 도 14, 5 mice for condition in 도 15, one-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test). Mean±s.e.m)
도 16a는 본 발명의 일 예에 따른 ASO 후보 물질을 세포주에 처리하여 eIF4E 발현 억제하는 정도를 웨스턴 분석한 결과이다.
도 16b 및 도 16c는 본 발명의 일 예에 따른 ASO 후보 물질을 세포주에 처리하여 eIF4E 단백질의 상대적인 mRNA 발현량의 비율을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 16d는 본 발명의 일 예에 선정된 ASO 서열의 공통 motif를 나타낸다.
도 16e는 본 발명의 일 예에 따른 선정된 ASO 서열의 mRNA 발현량을 분석한 결과 및 IC50 값을 나타낸다.
도 16f 및 도 16g는 본 발명의 일 예에 따른 ASO 서열의 off-target 발현량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 16h는 본 발명의 일 예에 따른 ASO 물질의 화학적 변형체에 대해 eIF4E 발현 억제 효율을 분석한 결과이다.
도 17 내지 도 19는 본 발명의 일 예에 따른 ASO 후보 물질을 일반 마우스에서 뇌실 내 투여한 이후에 대뇌 피질, 소뇌, 척수에서 eIF4E의 발현이 감소하는 것을 확인한 것이며, 실시예 1-6에 따른 FMCD 동물 모델에서 ASO 후보 물질 뇌실 내 투여후 발작 빈도가 감소함을 확인한 것이다.
도 20a 및 도 20b은 대조구 ASO의 뇌실 내 주사 (intracerebroventricular injection) 이후의 뇌 세포 내 분포를 확인한 것으로서, 도 20a는 일반 마우스에서 ASO에 형광물질인 Cy3를 부착하여 ASO의 분포를 Cy3 (빨간색)을 통해 확인한다. 도 20b는 실시예 1에서 제작된 p.C1483Y와 p.L2427P 마우스의 돌연변이를 발현하는 세포 (GFP로 표지)에 ASO가 투과되는 것을 ASO에 Cy3 (빨간색)을 부착하여 확인한다.
도 21a는 실시예 6에 따라 ASO 투여에 따른 뇌 세포 내 eIF4E 발현 감소의 면역형광염색법을 통한 확인한 것이다.
도 21b는 실시예 5에따른 ASO 투여 이후 ADK, IRSp53, CREB1 발현이 정상적으로 복구를 나타내는 결과이다.
도 22는 실시예 5에 따른 ASO의 세포 크기 치료 효과를 나타내는 결과이다.
도 23a 내지 도 23c는 실시예 6에 따른 ASO의 적은 부작용(Body temperature, weight, neuropsychiatric effect)을 확인한 결과이다.
도 24 내지 도 25는 실시예 6에 따른 ASO를 이용한 대조구 동물모델에 동반되는 neuropsychiatric disorder 확인한 결과이다.
도 26 내지 도 27는 실시예 7에 따른 FMCD 모델에서 동반되는 neuropsychiatric disorder 확인한 결과이다.
도 28 내지 도 29는 실시예 7에 따른 sheIF4E를 이용한 FMCD 모델에 동반되는 neuropsychiatric disorder 치료한 결과이다.
도 30 내지 도 31는 실시예 7에 따른 ASO 3를 통한 난치성 뇌전증 모델에 동반되는 신경정신질환(neuropsychiatric disorder) 치료 효과를 확인하였다.
도 32는 eIF4E 활성화-민감성 유전자들은 5′UTR의 consensus sequence (모티프)를 가지며, U-rich, guanine quartet (GGC)4, A-rich와 Cytosine enriched regulator of translation (CERT) motif가 eIF4E 활성화-민감성 유전자들에서 Multiple Em for motif elicitation (MEME) 분석에 따라 통계적으로 유의하게 enrichment 되어 있는 것으로 확인되었다. 전체 eIF4E 활성화-민감성 유전자 중 U-rich, guanine quartet (GGC)4, A-rich와 CERT motif를 포함하고 있는 유전자의 percent를 나타낸다.
도 33는 본 발명의 일예에 따른 FMCD 마우스에서 eIF4E 활성화-민감성 유전자 중에서 5' UTR motif를 가지고 있는 비율을 나타내는 그래프이다.
도 34a 및 도 34b은 5'-UTR 부위에 의한 eIF4E 활성화-민감성 유전자의 mTOR 활성 돌연변이에 의한 발현 증가를 나타낸다. eIF4E 활성화-민감성 유전자인 Adk-S, Adk-L, Creb1, IRSp53의 5'이 리포터 유전자인 luciferase 앞에 있을 시 mTOR 활성돌연변이에 의하여 luciferase의 발현이 증가함. mTOR 활성 돌연변이는 mTOR p.C1483Y와 mTOR p.L2427P를 사용하였으며 mTOR WT은 대조군으로 사용함. mTOR WT, mTOR p.C1483Y, mTOR p.L2427P는 HEK293T 세포주에서 발현시킴. Pro는 프로모터를 나타냄. Actb는 -actin 유전자를 나타냄. pGL3는 5'부위가 없는 empty vector를 나타냄. 실험 결과는 mTOR WT의 transfection 된 luciferase의 발현량으로 평균화한 것이다.
도 35은 eIF4E 활성증가-민감성 유전자에서 5' UTR motif 제거에 따른 발현 차이를 확인하기 위한 것으로서, Adk-S, IRSp53, Creb1에서 5' UTR motif 의 위치를 표기함. 각 유전자에서 5’-UTR motifs를 제거하였을 경우 mTOR 활성에 따른 luciferase 발현 증가가 사라짐. 이는 mTOR 활성화 돌연변이에 의한 eIF4E 활성화-민감성 유전자의 번역 효율 증가의 원인이 해당 유전자의 5' UTR motif에 있음을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> mTOR 돌연변이를 가진 FMCD 환자의 뇌조직에서 단백질 발현의 이미지 분석
1-1: 대상 환자의 선정
구체적으로 환자 진단방법은, HME, FCD 또는 TSC 진단을 받았으며 2004 년부터 Severance Children 's Hospital에서 간질 수술을 받은 개인이 확인되었다. 등록 된 개인은 FCDII에 대한 연구 진입 기준을 충족 시켰으며 비디오 -EEG 모니터링, 고해상도 MRI, 플루오로옥시 글루코스 양전자 방출 단층 촬영 및 빼기 ictal 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영을 포함하여 MRI에 공동 등록하여 해부학 적 병변을 국소화하기 위해 광범위한 수술 전 평가를 받았습니다. 완전 절제술은 두개 내 뇌파에 발작 및 자극 영역의 모든 영역의 절제로 정의되었다.
HME, FCD 또는 TSC를 가진 연구 대상 개인의 병리학적 진단은 국제 간질 진단법위원회 (International League Against Epilepsy Diagnostic Methods Commission)의 최근 합의 분류에 따라이 연구를 위해 재구성되었습니다. 연구는 Severance Children 's Hospital과 한국 과학 기술원 (KAIST) 기관 검토위원회 및 인간 연구위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며 모든 인간 조직이 얻어졌다. HME, FCD 및 TSC를 가진 개인의 부모로부터 사전 동의를 얻었습니다. 메릴랜드 대학교 뇌 조직 은행 (Maryland Brain & Tissue Bank)에서 건강한 성인 대조군 뇌 샘플을 획득했다. 신경계 질환이 없는 개인의 뇌 조직을 획득했다.
구체적으로, 본 실험에 사용된 시료의 환자 정보를 하기 표 3에 나타낸다. 하기 표에서 UMB 그룹은 메릴랜드 대학교 뇌 조직 은행 (Maryland Brain & Tissue Bank)에서 건강한 성인 대조군 뇌 샘플을 획득했다.
Ppatient ID Age Sex Age at first seizure Age at surgery Seizure frequency Tissue region Etc
UMB1712 20Y male - - - Frontal Postmortem tissues
UMB4917 22Y male - - - Frontal Postmortem tissues
UMB5309 14Y female - - - Temporal Postmortem tissues
UMB5408 6Y male - - - Temporal Postmortem tissues
FCD56 10Y female 2Y 6Y 3/day Frontal -
FCD247 11Y female 1Y 9Y N.A. Temporal -
FCD254 12Y male 4Y 9Y 10/day Frontal -
FCD348 6Y male 4Y 5Y N.A. Frontal -
HME20 5Y female 2M 9M 10/day Frontal -
HME255 20Y female 8Y 17Y 3/day Temporal -
HME338 17Y female 5Y 15Y N.A. Temporal -
TSC2 8Y female 2Y 4Y N.A. Temporal -
TSC264 2Y female 1Y 1Y 6/day Frontal -
TSC357 20Y male 1Y 18Y N.A. Frontal -
1-2: 돌연변이 검사
상기 실시예 1-1의 표 4에서 환자 TSC2, FCD254, HME255, TSC264 및 TSC357에 대해서 WES(whole exom sequencing), panel sequencing 및 amplicon sequencing을 통한 돌연변이 정보를 확인하였으며, 구체적인 분석 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 상기 환자 중에서, 결절성 경화증 (TSC), 국소 피질 이형성증 (FCD) 및 hemimegalencephaly (HME)을 갖는 것으로 진단된 환자를 선정하고, 상기 선정된 TSC, FCD, HME 환자는 각각 TSC2, FCD254, HME255 이다.
Patient ID Sequencing Mutation type Mutated gene Nucleotide
changes		 Protein
change		 Frequency (%)
TSC2 Whole exome sequencing Germline TSC2 c.3355C>T p.Gln1119* 36.75
FCD254 Targeted hybrid capture sequencing Somatic MTOR c.4376C>A p.Ala1459Asp 3.29
HME255 Targeted hybrid capture sequencing Somatic MTOR c.4448G>A p.Cys1483Tyr 9.43
TSC264 Targeted hybrid capture sequencing Germline TSC2 c.3007delG p.Ala1003fs 10.86
TSC357 Targeted hybrid capture sequencing Germline TSC2 c.5153A>C p.His1718Pro 31.99
1-3: 환자 시료의 인산화된 4E-BP1/2/3(4E-BPs)와 S6 발현 증가 확인
상기 실시예 1-1의 FMCD 뇌전증 환자 (TSC2, FCD254, HME255)에서 4E-BPs의 인산화와 p-S6의 활성이 증가되어 있음을 면역형광염색을 이용하여 확인하였으며(도 1), 이들 인산화 단백질에 의해 eIF4E 활성증가 특성을 갖는 동물 모델에서 동일한 양상을 나타냄을 확인하였다.
구체적으로 상기 실시예 1-1에서 선정된 TSC2, FCD254, 및 HME255의 환자에서 얻어진 병변 조직을 절제하여 시료를 얻고, 시료에 대해 면역형광염색을 수행하였다. 상기 질환을 갖는 환자의 병변 조직을 절제하여 시료를 얻고, 시료에 대해 면역형광염색을 수행하고, 면역형광법으로 염색된 시료는 2 - 5개의 피질 영역에서 NeuN-양성 신경세포 중에서 p-4E-BPs-양성 또는 p-S6- 양성 세포 수를 각각 측정하여 평균을 구하고 이를 퍼센트로 표시한 결과를 도 1에 나타냈다.
구체적인 면역 형광 방법은, 마우스 뇌 블록을 조사하는 경우, 뇌 조직을 수확하고 새로 준비한 인산 버퍼에 용해된 4 % 파라포름알데히드에서 2 시간 동안 고정하고, 30 % 버퍼 설탕 용액에서 하룻밤 동안 냉동 보존한 다음 드라이 아이스 상 OCT로 냉동하고, -80 ℃에서 저장되었다. clryostat-cut 절편 (20㎛ 두께)을 수집하여 유리 슬라이드 상에 놓았다.
조직 절편을 실온에서 1 시간 동안 인산 퍼버 식염수 (PBS) -GT (0.2 % 젤라틴 및 0.2 % Triton X-100 PBS)에서 블로킹하고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 블로킹 버퍼로 희석한 1 차 항체와 반응하고, PBS (3 x 5 분)로 세척하였다. 블로킹 버퍼로 희석한 2 차 항체와 실온에서 1 시간 동안 반응하였다. 다시 세척한 후 DAPI (P36931, Life technologies)가 포함된 장착 용액에 coverslips를 탑재했다.
사용된 항체는 인산화 된 S6 (Ser240 / 244) (Cell signaling(회사명), 5364, 1 : 800), 인산화된 4E-BP (Thr37/46) (Cell Signaling, 2855, 1:200) 및 NeuN (Millipore, MAB377, 1 : 100)이다. 샘플을 PBS로 세척하고 하기 2 차 항체로 염색하였다: 토끼에 대한 Alexa Fluor 594-접합 염소 항체 (1 : 200 희석액, A11012, Thermo scientific) 및 마우스에 대한 Alexa Fluor 488-결합 염소 항체 (1 : 200 희석액; A11001 , Thermo scientific). DAPI (P36931, Life Technology)를 함유하는 탑재 용액을 핵 염색에 사용하였다. 공초점 이미지는 2048 x 2048 픽셀의 해상도로 순차적으로 장착된 Zeiss LSM780 (Carl Zeiss) 또는 LSM800 (Carl Zeiss) 공초점 현미경으로 얻었다.
NeuN, 인산화된 S6 (Ser240 / 244) 및 인산화된 4E-BP (Thr37 / 46)에 대한 양성 세포의 수를 10X 또는 20X 대물 렌즈를 사용하여 측정하였다. 주제 당 4 개 또는 5 개의 필드가 획득되었다.
도 1의 그래프에서, 상기 선정된 TSC2, FCD254, HME255의 뇌 조직에서 얻어진 면역형광분석에서 인산화된 4E-BP1/2/3(4E-BPs)와 S6의 발현 증가를 나타내는 것으로서, 대조군 1은 UMB5309의 사후조직이고 대조군 2는 UMB5408의 사후조직이고, 대조구 3은 FCD247 환자의 정상 뇌조직이다. 상기 선정된 TSC2, FCD254, HME255 환자 모두에서 4E-BP와 S6의 인산화가 증가되었음을 확인하여, 해당 환자의 뇌 병변에서 모두 mTOR 과활성화가 있음을 확인하였다. 4E-BP와 S6 인산화 증가는 eIF4E가 포함된 eIF4F 복합체의 활성을 증가시킴을 확인한 것이다.
mTOR는 kinase로 4E-BP1/2/3(4E-BPs)와 S6K를 타겟으로 하며, mTOR 과활성화는 4E-BP1/2/3와 S6의 인산화가 증가하게 되고, 인산화된 4E-BP1/2/3는 기능이 억제되고 그 결과 4E-BP1/2/3(4E-BPs)가 억제제로 작용하는 eIF4E의 활성이 증가한다. eIF4B는 활성화되어 eIF4E의 기능을 보조적으로 활성화시킨다. S6K의 활성 증가는 S6와 eIF4B의 인산화를 증가시켜 eIF4E의 활성을 증가시킨다. eIF4B는 eIF4E를 핵심으로 하는 복합체인 eIF4F의 활성을 증가시킨다.
1-4: 웨스턴 블랏을 이용한 환자 시료에 대한 ADK, CREB1, IRSp53의 발현 증가 확인
상기 실시예 1-1의 FMCD 뇌전증 환자에서, eIF4E 과발현 민감성 유전자인 ADK, CREB1, IRSp53은 translatome 분석을 통해 eIF4E 과발현에 의해 발현이 증가함을 확인하였고 뇌전증 환자에서 그 발현이 증가함을 확인하였다(도 2).
Translatome은 단일 세포에서 번역되는 모든 mRNA 단편으로 구성되는 것을 말하며, Translatome 정보를 얻기 위해서는 Tranlsatome 프로파일링 또는 리보솜 프로파일링을 수행하여 얻을 수 있으며, Tranlsatome 프로파일링이라 함은 mRNA의 단백질로 번역을 게놈-수준에서 분석하는 방법이라 할 수 있다.
도 2는 FMCD 환자의 뇌 조직에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석으로 확인하여 mTOR 활성의 확인 및 ADK, IRSp53, CREB1, p-S6의 발현 증가를 정량적으로 나타내는 그래프이며, 각 타겟 단백질의 값은 대조군 샘플의 평균값에 대한 퍼센트로 나타낸다(* P < 0.05, ** P < 0.01, and *** P < 0.001 (one-way analysis of variance with Bonferroni post-hoc test). Mean±s.e.m.) 도 2에서, α-tubulin은 loading control로 사용하였다.
상기 실험에 사용한 항체는 ADK (Human atlas, HPA038409, 1 : 500), IRSp53 (Novus, NBP1-88711, 1 : 1000), CREB1 (Cell signaling, 9197, 1 : 1000) 및 인산화 된 S6 (Ser240 / 244) (Cell signaling, 5364, 1:1000)이다.
뇌전증 증상을 보인 FMCD 환자에서, eIF4E 과발현 민감성 유전자인 ADK, CREB1, IRSp53은 translatome 분석을 통해 eIF4E 과발현에 의해 발현이 증가함을 확인하였고 뇌전증 증상을 보인 FMCD 환자에서 그 발현이 증가함을 확인하였다(도 2). 이와 관련하여, 하기 실시예 12에서 ADK-S, CREB1, IRSp53에 대해 각각에 대해 야생형과 모티프를 결실한 5′UTR을 이용한 실험결과 eIF4E에 의해 변역(translation)이 조절되는 mTOR 과활성-민감성 유전자들에서 특이적인 motif를 제거할 경우 mTOR 돌연변이 및 eIF4E 과활성화에 의한 상기 유전자의 발현 증가가 사라졌다. 이에, ADK, CREB1, IRSp53는 eIF4E 활성화에 의한 발현이 증가하는 공통적 모티프를 가지며, 환자 시료에 대한 ADK, CREB1, IRSp53의 발현 증가는 eIF4E가 활성증가를 나타낸다.
1-5: 면역형광법을 이용한 환자 시료의 ADK, IRSp53과, CREB 발현 증가 확인
상기 실시예 1-1의 FMCD 뇌전증 환자 (TSC2, FCD254, HME255)에서 ADK, IRSp53과, CREB 발현이 증가되어 있음을 면역형광염색을 이용하여 확인하였으며(도 3), 이들 단백질 발현 증가가 eIF4E 활성증가 특성을 갖는 동물 모델에서 동일한 양상을 나타냄을 확인하였다
상기 실시예 1-1에서 선정된 TSC2, FCD254, 및 HME255의 환자에서 얻어진 병변 조직을 절제하여 시료를 사용하여 실시예 1-3과 동일 실험 방식으로 면역형광염색을 수행하였다. 상기 질환을 갖는 환자의 병변 조직을 하여 시료를 얻고, 시료에 대해 면역형광염색을 수행하고, 면역형광법으로 염색된 시료는 2 - 5개의 피질 영역에서 NeuN-양성 신경세포 중에서 ADK-양성, IRSp53- 양성, 또는 CREB1- 양성 세포 수를 각각 측정하여 평균을 구하고 이를 퍼센트로 표시한 결과를 도 3에 나타냈다.
사용된 항체는 NeuN (Millipore, MAB377, 1 : 100), ADK (Human atlas, HPA038409, 1 : 200), CREB1 (Cell signaling(회사명), 9197, 1 : 800), 및 IRSp53 (Novus, NBP1-88711, 1 : 100)이다. NeuN, ADK, CREB1 및 IRSp53에 대한 양성 세포의 수를 10X 또는 20X 대물 렌즈를 사용하여 측정하였다. 주제 당 4 개 또는 5 개의 필드가 획득되었다.
도 3에서 대조군 1은 UMB5309의 사후조직이고 대조군 2는 UMB5408의 사후조직이고, 대조구 3은 FCD247 환자의 정상 뇌조직이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조구 1 내지 3에 비하여, 상기 TSC, FCD, HME의 환자의 신경세포에서 ADK, IRSp53, CREB1의 발현이 증가하였음을 확인하였다.
1-6:환자 시료와 동물 모델과의 비교
미국특허 9,629,346에 기재된 뇌 체성 변이를 갖는 FCD type II 동물모델은 mTOR 변이체(C1483Y, 또는 L2427P)가 도입되어 mTOR가 과잉 활성화(hyperactivation)가 됨을 S6 단백질의 인산화를 통하여 확인하였다.
상기 실시예 1-3에서 얻어진 FMCD 환자의 조직에서 얻어진 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가를 확인한 결과(도 1)은, 도 4 및 도 5의 FMCD 동물 모델, 자세하게는 mTOR 변이체(C1483Y, 또는 L2427P)가 도입되어 mTOR가 과잉 활성화된 FCD type II 동물모델에서 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가와 동일한 양상을 나타낸다. 구체적으로 도 4는 FMCD 동물 모델 (Embryonic day 18일)에서 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가를 확인한 것이고, 도 5는 FMCD 동물 모델 (adult - 생후 56일 - 120일 사이)에서 4E-BPs의 인산화와 S6K의 활성 증가를 확인한 것이다. 4E-BP의 인산화 증가와 S6K의 활성 증가는 eIF4E가 포함된 eIF4F 복합체의 활성을 증가시킨다.
배아 14일(E14)에 전기천공된 배아 18일(E18) 마우스와 생후 56일 - 120일(P56 - P140)의 마우스에서 mTOR 유전 변이에 의한 과도한 mTOR 활성화로 인하여 인산화된 S6 단백질과 인산화된 4E-BP 단백질이 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). 본 실험을 통해 in vivo에서 mTOR 변이체가 mTOR 인산화 단백질을 과잉활성화 시켜 정상 피질의 발달에 장애를 일으키는 것을 확인하였다.
상기 동물모델의 비디오-뇌전도감시 결과, 또한, 비디오-뇌전도감시(Video-Electroencephalography monitoring)를 소뇌를 기준으로 사용하여, 전두엽 (AP 2.8 mm, ML ± 1.5 mm)과 측두엽 (AP-2.4 mm, ML ± 2.4 mm)에 위치한 경막 외 전극으로부터의 뇌파 신호를 기록하고, 수술 후 10 일 이상 회복된 후 뇌파 신호는 2 일 이상 (하루 12 시간) 기록되었다 (도 7). 그 결과, 마우스의 대뇌 피질에서는 신경 세포의 이동에 심각한 장애가 관찰되었으며 모델 동물에서 실제 환자와 같은 양상의 전형적인 발작을 보였으나 야생형 mTOR 유전자를 삽입한 마우스는 발작을 보이지 않았다. 마우스의 대뇌 피질에서는 신경 세포의 이동에 심각한 장애는 피질의 방사방향 신경세포 이동에 장애가 발생함을 보여주는 것이다. 동물 모델의 실험 결과를 정리하여 하기 표 5에 나타내었다.
Group No. of GFP+pups No. of mice with seizure %
Wild type 8 0 0
p.Cys1483Tyr 15 14 93.3
p.Leu2427Pro 23 21 91.3
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 mTOR 변이 유전자를 삽입한 플라스미드로 전기 천공된 마우스의 신경세포는 정상 신경세포에 비해 크기가 유의미하게 증가하였으나, 야생형 mTOR 유전자를 사용한 마우스의 신경세포는 크기변화가 없는 것을 확인하였다. 이는 대뇌피질 발달기형 환자에서 나타나는 dysmorphic neuron과 같은 양상으로, mTOR 변이체를 이용하는 경우 뇌전증 동물 모델을 제조할 수 있다는 것을 입증하였다. 수상돌기 가지의 수는 염기서열 변이가 일어난 mTOR 변이 유전자를 삽입한 플라스미드로 전기 천공된 마우스의 수상돌기 가지의 수는 정상 신경세포에 비해 크기가 유의미하게 감소하였으나, 야생형 mTOR 유전자를 사용한 마우스의 synaptic spine의 수 변화가 없는 것을 확인하였다.
<실시예 2> sheIF4E 를 이용한 eIF4E 발현 감소를 통한 뇌전증 발병 예방 (Gnetic inhibition of eIF4E)
2-1: sheIF4E 를 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델의 준비
eIF4F의 증가된 활성에 의해 매개되는 번역 장애(translation dysregulation)가 FMCD의 주요 표현형, 예컨대 뇌전증, cytomegalic dysmorphic 뉴런, 결함 있는 대뇌 피질의 라미네이션을 유도하지는 확인하고자 하였다.
이러한 확인사항을 입증하고자, eIF4E 에 대한 scrambled shRNA (shScramble) 및 shRNA를 함께 발현하는 mTOR 돌연변이 구조체 또는 야생형 구조체를 FMCD mice 에서 자궁 내 전기천공(in utero electroporation)을 통해, eIF4F 복합체의 핵심 성분인 eIF4F의 in vivo knockdown을 수행하여 eIF4F 활성을 감소시켰다(도 9a 및 도 9b).
구체적으로, 치료효과를 입증을 위한 FMCD 및 뇌전증을 갖는 동물 모델을 준비하기 위해, 미국특허 9,629,346에 기재된 뇌 체성 변이를 갖는 FCD type II 동물모델의 제조방법과 실질적으로 동일하게 mTOR 변이체(C1483Y, 또는 L2427P)를 발현하는 벡터를 이용하여 제조하되, pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터의 뒤쪽에 eIF4E의 발현 감소를 일으키는 shRNA 서열을 추가한 후 (pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP; mU6-sheIF4E) 동물 모델을 제작하였다.
구체적으로, FCD type II 동물모델의 제조 방법에 있어서, pCIG-mTOR-IRES-EGFP plasmid의 후반 서열에 sheIF4E sequence를 추가하여 벡터를 제조하였다. shScramble 또는 sheIF4E sequence는 pSicoR 벡터를 통하여 얻었다. pSicoR 벡터를 HpaI과 XhoI 제한효소를 통해 절단하였다. 사용된 shRNA의 서열은 다음과 같다. shRNA의 대조를 위해 shScramble을 발현시켰다. shRNA가 작동하기 위해서 sense strand에서 전사된 RNA가 필요하므로, sense strand의 발현을 위하여 vector를 제작할 때 double strand sequence로 제작하기 위해 anti-sense strand를 추가하며, 이들 서열은 하기 표 6에 나타냈다.
sheIF4E는 타겟 부위와 상보적으로 결합하는 CGATTGATCTCTAAGTTTGAT(SEQ ID NO: 202)을 포함하는 센스서열(SEQ ID NO: 203) 및 안티-센스 서열(SEQ ID NO: 203)으로 구성되며, shScramble sequence은 타겟 부위와 상보적으로 결합하는 GGAATCTCATTCGATGCAT (SEQ ID NO: 205)을 포함하는 센스서열(SEQ ID NO: 206) 및 안티-센스 서열(SEQ ID NO: 207)으로 구성된다.
SEQ ID NO name Nucleotide sequence (5' -> 3')
202 SheIF4E CGATTGATCTCTAAGTTTGAT
203 sheIF4E sense strand T- CGATTGATCTCTAAGTTTGAT -TTCAAGAGA- ATCAAACTTAGAGATCAATCG -TTTTTTCTCGA
204 sheIF4E anti-sense strand TCGAGAAAAAA-CGATTGATCTCTAAGTTTGAT-TCTCTTGAA- ATCAAACTTAGAGATCAATCG-A
205 shScramble GGAATCTCATTCGATGCAT
206 shScramble sense strand T-GGAATCTCATTCGATGCAT-TTCAAGAGA-ATGCATCGAATGAGATTCC-TTTTTTCTCGA
207 shScramble anti-sense strand TCGAGAAAAAA-GGAATCTCATTCGATGCAT-TCTCTTGAA- ATGCATCGAATGAGATTCC-A
HpaI과 XhoI 제한효소로 잘려진 pSicoR vector에 상기 shScramble과 sheIF4E sequnece를 ligase를 통해 이어 붙여 pSicoR-shScramble 벡터와 pSicoR-sheIF4E 벡터를 제작하였다. pSicoR-sheIF4E를 이용한 eIF4E 단백질 발현 감소 기능은 실시예 1.2와 같은 방법으로 Neuro2A cell 배양 및 형질도입하여 세포에서 eIF4E 발현 감소를 확인하였다.
상기 pSicoR-shScramble 벡터와 pSicoR-sheIF4E 벡터에서 아래의 primer를 이용하여 mU6 promoter와 함께 shScramble와 sheIF4E를 PCR로 증폭한다. PCR 프라이머는 Forward와 reverse로 구성되며 서열은 아래와 같다.
Forward primer(SEQ ID NO: 208):
ggccgaggcctcctgggcccgctctagagatccgac
Reverse primer(SEQ ID NO: 209):
cgagtactaggatccattaggcgg
PCR로 증폭된 mU6 promoter를 포함하는 shScramble과 sheIF4E 서열을 SfiI 제한효소로 절단하였다. pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터는 PsiI과 SfiI 제한효소로 절단하였다. 제한효소로 자른 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터와 제한효소로 자른 mU6 promoter를 포함하는 shScramble와 sheIF4E 서열을 ligase를 이용해 연결하였다. 상기 sheIF4E sequence가 추가된 벡터 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP; mU6-sheIF4E 플라스미드를 상기 방법으로 제작하였다.
하기에서, 도 9a 내지 도 9f는 실시예 2에 따라 sheIF4E 를 이용한 eIF4E 발현이 감소한 동물 모델의 경우 뇌전증 발병을 예방할 수 있음을 나타낸다.
2-2: eIF4E 의 효과적인 knockdown 유효성 및 ADK, IRSp53 및 CREB1의 발현에 대한 eIF4E의 생체 내 녹다운 확인
상기 실시예 2-1에서 준비한 sheIF4E를 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델에서, 미국특허 9,629,346에 기재된 방법으로 mTOR 변이 유전자가 도입된 플라스미드로 배아기 14일(E14)에 전기천공한 배아를 태어나게 한 후 flashlight(Electron Microscopy Science, USA)로 형광을 발현하는 마우스만을 분류하였다.
구체적으로, 상기 마우스에서 eIF4E의 면역염색을 진행하였고 eIF4E의 발현이 감소함을 확인하여 기능을 입증하였다 (도 9a 내지 도 9d).
구체적으로, 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로, sheIF4E 를 이용한 eIF4E 의 효과적인 knockdown 유효성을 Western blot 분석으로 확인하였다 (도 9a 및 도 9b). pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-shScramble 또는 pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector의 제작과 sheIF4E의 eIF4E 저해 작용을 세포 용해액에서 western blot을 통해 확인함을 나타낸다.
실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 마우스에서 eIF4E의 면역염색을 수행하여, sheIF4E 발현 뉴런에서 eIF4E 발현이 유의하게 감소함을 확인하였다 (도 9c 및 도 9d). pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector로 실시예 1-6과 실시예 2-1과 같이 제작된 동물 모델의 생후 21일 뇌 조직에서 eIF4E 발현의 감소를 나타낸다.
따라서, 본 발명자들은 FMCD 마우스에서 ADK, IRSp53 및 CREB1의 발현에 대한 eIF4E의 생체 내 녹다운 효과를 조사하기 위해 추가의 면역 염색을 수행하였고, 이들의 발현이 상당히 감소된 것을 확인하였다 (도 9e). 즉, pCIG-MTOR mutant-IRES-GFP; mU6-sheIF4E vector로 실시예 1-3과 실시예 3-1과 같이 제작된 동물 모델의 생후 21일 뇌 조직에서 eIF4E 발현 감소에 따라 ADK, IRSp53, CREB1의 발현 감소를 나타낸다. 이에, sheIF4E에 의한 eIF4E knockdown이, shScramble 마우스와 비교하여 mTOR p.Cys1483Tyr 및 p.Leu2427Pro 마우스 모두에서 eIF4E 민감성 유전자인 ADK, IRSp53, CREB1의 조직 염색을 한 결과 발현이 유의미 하게 줄어 드는 것을 확인 하였다.
2-3: shScramble을 발현시킨 동물모델의 뇌전증 발병 확인
FMCD 동물 모델은, 뇌전증 발병 시기가 평균적으로 생후 21일 이후이며 생후 50일 이내에 발병이 완료된다. 생후 3주 이후부터 비디오 뇌전도 감시를 시행하였다. Lifecam 카메라를 이용하여 생후 21일부터 생후 120일까지 12 시간 분량의 영상을 일주일에 3 회 촬영하였다. 발작 측정은 12 시간 영상 촬영을 하여 발작의 횟수와 발작의 길이를 측정하였다.
상기 실시예 2-1에서 제작한 shScramble을 발현시킨 동물모델로서, 상기 mTOR p.C1483Y 돌연변이를 가진 모델은 20마리 중 19마리에서 발작이 확인되며 mTOR p.L2427P 돌연변이를 가진 모델은 25마리 중 23마리에서 발작이 확인되었다. 발작은 생후 21일부터 120일까지 동영상 촬영을 매 회당 12시간 한 후 행동학적인 발작을 촬영한 영상에서 확인하였다 (도 9f).
2-4: sheIF4E 를 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델의 뇌전증 발병 예방 확인(발작 측정)
실시예 2-1에서 제조한 eIF4E 발현이 감소한 동물 모델에 대해, Lifecam 카메라를 이용하여 생후 21일부터 생후 120일까지 12 시간 분량의 영상을 일주일에 3 회 촬영하였다. 발작 측정은 12 시간 영상 촬영을 하여 발작의 횟수와 발작의 길이를 측정하였다 (도 10).
도 10에 나타낸 바와 같이, sheIF4E를 통해 eIF4E의 발현이 감소된 경우 생후 120일까지 관찰한 결과 mTOR p.C1483Y 돌연변이를 가진 모델은 15마리 중 0마리에서 발작이 관찰되었으며 mTOR p.L2427P 돌연변이를 가진 모델은 20마리 중 5마리에서만 발작이 관찰되었다. 따라서, sheIF4E를 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델에서 뇌전증의 발병이 예방됨을 확인하였다. 일반적으로 FMCD 마우스 모델이 생후 21일부터 생후 56일 이내에 대부분 발작이 시작됨을 고려할 때 생후 120일까지 발작을 하지 않는 경우는 뇌전증의 발병이 예방되었음을 입증한다.
뇌전증이 발병한 경우 발작의 빈도와 시간이 현저히 감소하였다. FMCD 동물 모델에서 eIF4E를 타겟하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 mTOR 돌연변이를 발현하는 세포에서 감소시킬 경우 난치성 뇌전증의 빈도와 발작 시간이 현저히 감소하였다. FMCD 뇌전증 동물 모델에서 eIF4E를 타겟하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 mTOR 돌연변이를 발현하는 세포에서 감소시킬 경우 난치성 뇌전증의 빈도와 발작 시간이 현저히 감소하였다.
2-5: sheIF4E를 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델의 대뇌 피질 형성 이상, 신경세포 크기 및 수상돌기 가지 수의 분석
상기 실시예 2-1에서 제작한 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP; mU6 sheIF4E 벡터로 제작된 동물 모델은 mTOR mutant를 발현하는 신경세포에서 eIF4E 단백질의 발현이 감소되어 있다.
그런 후에, 실시예 1-6과 동일한 방법으로 전기천공 후 태어난 마우스의 신경세포 크기 및 synaptic spine 수를 분석하였다. 즉, 신경 세포 크기는 ImageJ 소프트웨어 (http://rsbweb.nih.gov/ij/)에서 측정되었다. 수지상 돌기(Synaptic spine)의 수는 63X 대물 렌즈를 사용하여 결정되었다. 10 개의 기초 수상 돌기(basal synaptic spine)가 개체당 획득되었고 수동 계수 방법으로 GFP 리포터를 발현하는 전기천공된 세포에서 측정되었다. 신경세포 크기의 증가 (도 12)의 경우, 생후 21일의 마우스 뇌 조직을 얻었으며 GFP (녹색)으로 표기된 돌연변이 세포 (shScramble or sheIF4E 발현)의 크기를 측정하였고, 수상돌기(Synaptic spine) 수의 이상 (도 13)의 경우, 생후 21일의 마우스 뇌 조직을 얻었으며 GFP (녹색)으로 표기된 돌연변이 세포 (shScramble or sheIF4E 발현)에서 basal dendrite에서의 수상돌기 가지의 수를 측정하였다.
또한, 대뇌 피질 형성 이상 (도 11)의 경우, 실시예 2-1에서 생후 7일의 마우스 뇌 조직을 얻었으며 GFP (녹색)으로 표시된 돌연변이 세포 (shScramble or sheIF4E 발현)의 대뇌 피질에서의 위치를 측정하였다(n = 5 in each case. Scale bar = 100 um. Mean ± SEM). 도 9a 및 도 9b에서 FMCD 뇌전증 동물 모델에서 eIF4E를 표적하는 shRNA를 발현하여 eIF4E의 발현을 mTOR 돌연변이를 발현하는 세포에서 감소시킬 경우 대뇌 피질 형성의 이상이 현저히 개선되었다.
따라서 eIF4E의 발현을 억제시킬 경우 난치성 뇌전증 환자에서 확인되는 mTOR pathway 유전자의 활성화 돌연변이에 대뇌 피질 형성 이상을 개선할 수 있으며, eIF4E의 발현 조절을 대뇌 피질 형성 이상의 치료 표적이 됨을 확인하였다.
2-6: in vivo knockdown of eIF4E 의 효과
실시예 2-1의 sheIF4E에 의한 in vivo knockdown에 의한 eIF4E 발현 저해가 FMCD의 주요 표현형을 완화시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 본 실험을 수행하였다. sheIF4E에 의한 eIF4E knockdown이, shScramble 마우스와 비교하여 mTOR p.Cys1483Tyr 및 p.Leu2427Pro 마우스 모두에서 이러한 모든 병리학적 표현형을 성공적으로 제거할 수 있음을 확인하였다(도 10, 도 11, 도 12, 도 13).
구체적으로, eIF4E knockdown이 뇌전증을 갖는 FMCD 마우스(도 10)에서 관찰된 자연 발작을 거의 완전히 억제한다는 것을 확인하였다. 또한, eIF4E의 발현 저해가 FMCD에서 발견되는 변이형 뉴런의 대표적인 형태인 hypertrophic soma 및 감소된 수상돌기 가지의 밀도를 회복시켰다(도 12 및 도 13). 또한, eIF4E knockdown은 mTOR 돌연변이 마우스에서 결손된 뉴런의 이동을 상당히 완화시켰다 (도 11).
2-7: sheIF4E를 이용한 in vivo knockdown of eIF4E 의 효과의 회복
상기 실시예 2-1에서 제작한 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP; mU6 sheIF4E 벡터로 제작된 FMCD 동물 모델은 신경세포에서 eIF4E 단백질의 발현이 감소되어 있다. 이에, sheIF4E에 의한 in vivo knockdown에 의한 eIF4E 발현 저해가 eIF4E 민감성 유전자 발현을 저하시키는 지 여부를 확인하고자 면역형광법을 이용하여 eIF4E 민감성 유전자 발현을 분석하였다. 상기 면역형광법에 의한 실험결과를 도 9e에 나타냈다. 상기 sheIF4E에 의한 eIF4E knockdown 특성을 갖는 동물모델 및 shScramble 마우스는 실시예 2-1와 실질적으로 동일하다.
도 9e에 나타낸 바와 같이, sheIF4E에 의한 eIF4E knockdown이, shScramble 마우스와 비교하여 mTOR p.Cys1483Tyr 및 p.Leu2427Pro 마우스 모두에서 eIF4E 민감성 유전자인 ADK, IRSp53, CREB1의 조직 염색을 한 결과 발현이 유의미 하게 줄어 드는 것을 확인 하였다.
<실시예 3> 약물을 이용한 동물 모델에서 뇌전증 치료 (Pharmacologic inhibition of eIF4E)
본 실험에서 메트포르민을 200 mg/kg의 용량으로, 초기 치료에서 P14내지 P56, 후기 치료에서 P84내지 P114로 실시예 1에 기재된 FMCD 동물 모델의 복강 내 주사했다(intraperitoneally inject). 그런 후에, 12 시간 동안 비디오-전기 뇌 영상을 기록 및 분석을 통해, FMCD 마우스에서 metformin을 이용한 초기 치료가 발작(seizure) 발병을 예방하고 후기 치료가 FMCD 마우스에서 발작 빈도를 억제한다는 것을 입증했다 (도 14 및 도 15).
따라서, eIF4F의 증가된 활성은, 이에 대한 민감성 유전자 (예, ADK, IRSp53 및 CREB1)의 증가된 번역을 통해 FMCD의 표현형을 유도하고, metformin에 의한 eIF4E 저해를 통해 뇌전증 발작이 치료되었음을 확인하였다.
<실시예 4> eIF4E 저해제의 in vitro 효능 분석
4-1: ASO 디자인 및 제작
eIF4E 발현, 활성 또는 수준 증가로 인한 뇌전증 예방 또는 치료 활성이 있는 ASO 서열 확보를 위하여 in vitro screening을 통해 eIF4E 발현 억제 효율이 높은 ASO 치료제 서열을 선별하였다.
구체적으로, human의 eIF4E 유전자의 UTR, intron 및 exon을 포함하는 pre-mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 16 내지 20mer의 ASO 서열을 BLAST 프로그램을 이용해 설계하였다.
구체적인 ASO 제조방법은, ASO 후보 서열 모두에 대해서, 모든 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고, 20-mer ASO는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 번역되는 뉴클레오티드 위치 1 내지 5, 및 16 내지 20 각각이 2'-0-(2-메톡시에틸) 당을 포함하며, 뉴클레오티드 위치 6 내지 15가 2'-데옥시뉴클레오티드이고, 모든 시토신 잔기가 5-메틸시토신인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 제조되었다. 16-mer ASO는 20-mer ASO와 실질적으로 동일하나 2'-0-(2-메톡시에틸) 당을 포함하는 뉴클레오티드 위치가 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 뉴클레오티드 위치 1 내지 3, 및 14 내지 16번인 것만 상이하게 제조되었다. 또한, phophodiester bond를 phosphothioester bond로 화학적으로 변경하였다.
4-2: 웨스턴 블롯 분석을 이용한 ASO 스크리닝
ASO 제작 및 정제를 위하여, 상기 설계된 eIF4E 저해 ASO는 Integrated DNA technologies(IDT, 회사명) 를 통하여 제작하였으며 HPLC, Na+ exchange purification을 거쳐 정제하였다.
ASO를 선별하는 방법은, Human cell line인 HEK293T (Human) 또는 mouse cell line인 Neuro2A (mouse) 세포주에, lipofectamine 2000을 이용하여 ASO 후보 물질을 주입하고, ASO의 도입 이후 72시간이 경과한 후에 세포를 수확 및 용해하여 단백질을 추출하고, 상기 추출한 단백질을 western blot을 통해 eIF4E의 발현을 확인하였다. eIF4E의 발현을 조절하는 ASO를 in vitro screening 하여 효과적인 서열을 확인하였다. 각 세포주에서 α-tubulin에 대한 eIF4E 단백질 발현량을 정량하며, 대조군 (scrambled ASO-1: CTCAGTAACAGTGACACCAG (SEQ ID NO: 201)을 사용하여 eIF4E 상대적인 발현량의 비율을 정량적으로 그래프에 도시하였다(도 16a). 도 16a, 16b 및 16c에 기재된 control은 상기 scrambled ASO이다.
도 16a의 웨스턴 블랏 분석결과, One ANOVA test 결과 p-value 0.05 이하인 후보물질을 eIF4E 저해제로서 뇌전증 치료 활성이 있는 ASO로 결정하였다. 실험 결과, 대조군에 비하여 SEQ ID NO: 75 내지 79의 핵산 서열에 각각 해당하는 ASO # 75 내지 #79 는 모두 통계적으로 유의하게 HEK293T 세포와 Neuro2A 세포에서 eIF4E 단백질 발현의 감소를 입증하였다.
4-3: Real-time PCR을 이용한 ASO 스크리닝
상기 4-2에서는 세포에서 추출한 단백질을 western blot을 통해 eIF4E의 발현을 확인하여, eIF4E의 발현을 조절하는 ASO를 스크리닝 하였으나, 본 실시예에서는 세포에서 RNA 추출하여 Real-time PCR을 이용하여 eIF4E mRNA 발현을 확인하여, eIF4E의 발현을 조절하는 ASO를 스크리닝하였다.
설계된 ASO 후보물질을 또 다른 선별하는 방법은, Human cell line인 HEK293T (Human) 세포는 96-well culture plate에 배양후 24시간째에 iNfect transfection reagent (iNtRON, 15081)를 사용하여 ASO 후보 물질을 주입하여 24시간이 경과한 후에 세포를 수확하여 SuperPrepTM II Cell Lysis & RT Kit reagent (Toyobo, SCQ-401)를 사용해 용해하여 RNA를 추출후 Reverse transcription PCR을 통해 cDNA 합성을 진행하였다. SYBR green real-time PCR Master mix (Toyobo, QPK-201) 사용하여 CXF384 Real-Time System (Bio-Rad) 장비를 이용해 real-time PCR 분석을 진행하였다. eIF4E과 GAPDH에 대한 PCR 프라이머는 forward와 reverse로 구성되며 서열은 아래와 같다.
EIF4E forward primer (SEQ ID NO: 210): TGGCGACTGTCGAACCG
EIF4E reverse primer (SEQ ID NO: 211): AGATTCCGTTTTCTCCTCTTCTGTAG
GAPDH forward primer (SEQ ID NO: 212): GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG
GAPDH forward primer (SEQ ID NO: 213): GAAGATGGTGATGGGATTTCC
CXF384 Real-Time System 장비 Real-time PCR 시험 조건은 95 °C에서 1분간 처리과정 이후 95 °C 15초, 59.5 °C 20초와, 72°C 30초에 대한 39번 반복 cycle로 수행되었다. 각각의 샘플은 3번의 기술적인 반복시험을 통해 분석하였으며, GAPDH 를 internal control로 사용하여 상대적인 mRNA 발현 수준은 2-ΔΔCq 방법을 통해 계산되었고, 대조군 scrambled ASO-1 (CTCAGTAACAGTGACACCAG: (SEQ ID NO: 201))를 사용하여 eIF4E 상대적인 발현량의 비율을 정량적으로 측정한 그래프를 도 16b 및 도 16c로 나타낸다. 도 16b 및 도 16c는 ASO 후보 물질을 이용하여 HEK293T 세포에서, 상기 GAPDH를 사용하여 eIF4E 상대적인 발현량의 비율을 정량적으로 분석한 그래프이다.
상기 선별 방법을 거쳐 대조군 scrambled ASO-1 (CTCAGTAACAGTGACACCAG; SEQ ID NO: 201) 대비 eIF4E 상대적인 발현 억제가 우수한 것을 선별하였으며, 그 결과 선정된 ASO 서열은 상기 표 2에 나타냈다.
4-4: ASO의 2차 선정
상기 표 2에 나타낸 eIF4E 저해제로 1차 선정된 ASO 중에서 eIF4E의 발현 저해 정도가 SEQ ID NO: 75 (ASO-1)의 eIF4E 발현 저해 정도와 동등하거나 더 큰 저해 정도, 예를 들면 eIF4E mRNA 발현 정도를 정량 결과 ASO #75 (ASO-1)의 eIF4E 발현 정도를 기준으로 특정 범위 내 (예, ASO #75 대비 eIF4E mRNA 발현량이(%)가 125% 이하, 120%이하, 115%이하, 110%이하, 또는 100%이하을 나타내는 ASO를 선정하고, 추가로 off-target 및/또는 mismatch base pairing 등의 선정기준으로 하여 2차로 더욱 바람직한 ASO를 선정하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.
하기 표 7에서 off-target에 대한 유전자수는, 상기 선정된 각각 ASO 서열에 대해 in silico 분석을 수행하는 방식으로 off-target 유전자를 분석하여, 해당 ASO 서열에서 1개, 2개, 혹은 3개 뉴클레오티드를 시퀀스를 제외하고 일치하는 eif4E외 다른 타겟 유전자의 개수를 기술한 것이며, eIF4E 발현은 실시예 4-3과 같은 방식으로 Real-time PCR을 이용한 mRNA 발현양을 측정한 것을, ASO #75를 억제 효율 100%를 기준으로 각 ASO의 상대적인 발현 억제 효율을 %로 계산한 수치를 의미한다.
SEQ ID No
　		 Number of gene in the Off target 　ASO #75번 대비 eIF4E의 발현 정도(%)
1bp 2bp 3bp
#16 0 2 59 93%
#20 0 5 70 71%
#21 0 6 78 68%
#27 0 1 64 97%
#28 2 9 132 94%
#35 0 1 18 72%
#75 0 3 67 100%
#77 0 2 48 121%
#89 4 N/D N/D 65%
#132 2 14 5 45%
#143 0 3 27 45%
#147 0 5 18 91%
#149 0 3 29 73%
#161 2 5 24 122%
#162 2 4 25 63%
#171 0 8 25 59%
#178 0 7 40 38%
#179 0 5 34 92%
#180 1 4 31 70%
#182 0 0 37 99%
#183 0 4 9 89%
#184 0 3 27 82%
4-5: ASO 서열의 공통 motif 분석
표 2에 나타낸 서열에 대해 Multiple Em for motif elicitation (MEME, http://meme-suite.org/tools/meme)은 MEME 브라우저 응용 프로그램 (버전 5.1.1)을 사용하여 eIF4E 억제 효율이 높은 ASO 서열 시퀀스에 대한 공동 motif 분석을 수행하였다. (Bailey TL, Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in bipolymers. Proc. Second Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 1994;28-36).
상기 실시예 4-4에서 선정된 ASO 중에서 일부에 대해 Multiple Em for motif elicitation (MEME) 분석을 통해 특이적인 공동 motif가 통계적으로 유의하게 enrichment 되어 있음을 확인하였다.
도 16d는 ASO 서열에 위치한 공통 모티프로서 ACAWYAGC (SEQ ID NO: 96)을 나타내며, 이는 표 2의 ASO #27, ASO #28, ASO #35, ASO #147, ASO #178, ASO #179, ASO #180 및 ASO #182을 포함한다. 도 16d는 상기 motif에서 A, G, T, C 의 4가지 nucleotides 에 대한 점유율을 보여주는 결과이며 1개 nucleotide는 최소 0 bit에서 최대 2 bits 를 가지며, 20개 nucleotide을 갖는 ASO 서열에서 공동 ACAWYAGC motif가 위치한 곳(빨간색 줄)을 표시한 그림이다. 상기 공통 모티프 서열에서 Y는 피리미딘으로서 T 또는 C이고, W는 A 또는 T이다.
4-6: eIF4E mRNA에 대한 저해 농도 (IC 50 ) 분석(Real-time PCR)
In vitro screening 방법을 통해 확보된 eIF4E 발현 억제 효율이 높은 ASO 서열 ASO #21, ASO #27, ASO #35, ASO #75 (ASO-1), ASO #77 (ASO-3), 및 ASO #182에 대한 각각의 eIF4E mRNA 발현 억제에 대한 저해 농도 (IC50)를 비교하고자 하였다.
ASO 서열에 대한 IC50 값을 확인하는 방법은, Human cell line인 HEK293T (Human) 세포주에 iN-fectTM in vitro transfection reagent (15081, iNtRON, Republic of Korea) 이용하여 ASO 후보 물질들에 대해 농도별 (20nM, 80nM, 320nM,)로 주입하고, ASO의 도입 이후 24시간이 경과한 후에 세포를 수확하여 eIF4E mRNA 발현 감소에 대한 Real-time PCR 분석을 수행하였다. GAPDH mRNA 발현을 internal control로 사용하여 eIF4E mRNA 발현량을 정량하였으며 상대적인 발현 수준은 2-ΔΔCq 방법을 통해 계산되었다.
HEK293T 세포주에서의 분석 결과, ASO #75, ASO #77, ASO #21, ASO #27과, ASO #35에서 농도별 ASO #77 서열에 8-9-10-11 염기 CACC에서 TGTT로 변경된 mismatch ASO: GATCCTTTGTTAATGTTACA (SEQ ID NO: 214) 대비 eIF4E mRNA 발현이 억제되었으며, 표준화된 비선형 회귀법 (Normalized nonlinear regression)을 통해 도출되었으며, ASO 후보 물질 간 저해농도(IC50) 비교를 위해 Prism8 (GraphPad Software, USA) 프로그램을 이용하여 표준화된 비선형 회귀법(Normalized nonlinear regression)을 통해 용량반응곡선을 도출하였다 (도 16e).
IC50 값을 비교한 결과, HEK293T 세포주에서 ASO #35 (IC50 = 22.77 nM), ASO # 77 (IC50 = 53.82 nM), ASO #21 (IC50 = 86.69 nM), ASO #182 (IC50 = 91,07 nM), 및 ASO #27 (IC50 = 92.45 nM)과, ASO# 75 (IC50 = 93.93 nM)의 순서로 eIF4E mRNA 발현 억제 효능(potency)이 있음을 입증하였다.
4-7: Off-target 유전자 발현량 분석
상기 표 2에서 ASO #35 및 ASO #75에 대해, off-target 유전자에 대한 발현 억제 영향을 미치는가에 대한 여부를 확인하고자 본 실험을 수행하였다.
In Silico 분석을 통한 off-target 유전자로, ASO #35에 대한 2개의 뉴클레오티드 mismatch off-target 유전자 1개 (ERBB4)가, ASO #75에 대한 유전자로 2개 염기서열에 mismatch off-target 유전자 4개 (TNFAIP8L3, STK32A, TTPA, TTC28)가 확인되었으며, ASO #35에 ERBB4와 ASO #75에 TTC28 (Tetratricopeptide repeat domain 28) off-target 유전자에 분석을 수행하였다.
구제척으로, HEK293T (Human) 세포주에 iN-fectTM in vitro transfection reagent (15081, iNtRON, Republic of Korea)를 이용하여 ASO #35와 ASO#1을 농도별 (5nM, 20nM, 80nM, 320nM, 1280nM)로 주입하고, ASO의 도입 이후 24시간이 경과한 후에 세포를 수확하여 SuperPrepTM II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (SCQ-401, TOYOBO, Japan)를 사용해 세포 용해(Lysis), RNA 추출, cDNA 합성을 진행하였다. 이후, SYBR® Green Realtime PCR Master Mix (QPK-201, TOYOBO, Japan)를 사용하여 CXF384 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) 장비로 ERBB4와 TTC28 mRNA 발현에 대한 Real-time PCR 분석을 수행하였다. CXF384 Touch Real-Time PCR Detection System 장비를 이용한 Real-time PCR 시험 조건은 95℃에서 1분간 처리 과정 이후, 95℃ 15초, 59.5℃ 20초, 72℃ 30초에 대한 40번 반복 cycle로 수행되었다. 각각의 샘플은 3번의 기술적인 반복시험을 통해 분석하였으며, GAPDH mRNA 발현을 internal control로 사용하여 ERBB4와 TTC28 mRNA 발현량을 정량하였으며, 상대적인 발현 수준은 2-ΔΔCq 방법을 통해 계산되었다. Real-time PCR 분석에 사용한 EIF4E와 GAPDH 프라이머는 실시예 4-3과 동일하며, ERBB4와 TTC28 유전자에 대한 프라이머는 forward와 reverse로 구성되며 서열은 아래와 같다.
ERBB4 forward primer (SEQ ID NO: 215): CAGTCAGTGTGTGCAGGAAC
ERBB4 reverse primer (SEQ ID NO: 216): AGCCTGTGACTTCTCGAACA
TTC28 forward primer (SEQ ID NO: 217): CTCATGGGAATCTGGGCTCT
TTC28 reverse primer (SEQ ID NO: 218): TGATGAAGCTGCCTCTCGAT
Scrambled ASO-2 (TAAGGCTATGAAGAGATACG, SEQ ID NO: 219)를 사용하여 상대적인 발현량의 비율을 그래프에 도 16f 및 도 16g에 도시하였다. Real-time PCR에 대한 Two-way ANOVA 분석 결과, ASO #35에 대한 off-target 유전자인 ERBB4 mRNA 발현에 영향을 미치치 않는 반면에, ASO#1을 1280nM 농도로 처리하였을 때 off-target 유전자인 TTC28의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 저해농도(IC50) 비교를 위해 표준화된 비선형 회귀법(Normalized nonlinear regression)을 통해 용량반응곡선을 도출하였을 때, ASO#1의 off-target 유전자인 TTC28에 대한 IC50 값은 400.6nM으로 ASO#1의 eIF4E에 대한 IC50값인 83.72nM에 비해 약 5배 정도 높음을 확인할 수 있었다.
4-8: Chemical modification (cEt/LNA)
제한 에틸(cEt) 뉴클레오티드9(constrained ethyl nucleotide) 변형은 통상 2.5 세대 ASO로 불리는 것으로서, cEt 변형된 당은 4'-탄소 및 2' 탄소를 연결하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 이환식 뉴클레오시드를 의미하며, 이때 상기 가교는 화학식(4’-CH(CH3)-O-2’)을 갖는다. 또한, 잠금 핵산 (LNA)을 포함하는 화학적구조 변형은 통상 3세대 ASO로 불리는 것으로서, 뉴클레오티드에 포함된 리보스에서 4'탄소와 2' 산소를 연결하는 여분의 브릿지로 고정된(locked) 변형된 구조(4'-(CH2)-O-2')을 갖는 리보스를 포함하는 locked nucleic acid인 것이다. 상기 LNA는 왓슨-크릭 base-paring 강도를 더욱 강화해 주는 고친화력 RNA 유사체로 알려져 있다.
실시예 4-1에서 얻어진 ASO 서열 #21, #35과, #78에 대하여 1-5 및 16-20 위치의 뉴클레오티드의 cEt 변경과 모든 뉴클레오티드 사이의 결합이 phosphothiester bond로 변형된 eIF4E 저해 ASO는 Bio-Synthesis를 통해, 그리고 ASO 서열 #77, #27과, #35에 대하여 1-5 및 16-20 위치의 뉴클레오티드의 LNA 변경과 모든 뉴클레오티드 사이의 결합이 phosphothiester bond로 변형된 eIF4E 저해 ASO는 IDT를 통해 제작하였으며, 제작된 모든 ASO는 HPLC, Na+ exchange purification을 거쳐 정제하였다.
제한 에틸과 잠금 핵산 화학적 구조 변형을 갖는 ASO 제조방법은, 모든 뉴클레오시드간 결합이 포스포로티오에이트 결합이고, 5' 말단에서 3' 말단으로 번역되는 뉴클레오티드 위치 1 내지 5 및 16 내지 20 각각이 2',4'-constrained ethyl 와 2',4'-LNA 당을 포함하며, 뉴클레오티드 위치 6 내지 15가 2'-데옥시뉴클레오티드이고, 모든 시토신 잔기가 5-메틸시토신인 안티센스 올리고뉴클레오티드로 제조되었다. mismatch control (MM)은 ASO #77번 서열의 8-9-10 번째 염기가 CAC에서 TGT로 변경한 2’MOE gapmer 구조의 control ASO를 GATCCTTTGTTAATGTTACA (SEQ ID NO: 214)로 나타낸다.
eIF4E 저해제로서 화학적 구조가 변경된 cEt 혹은 LNA ASO에 대한 EIF4E 발현 억제 효과를 확인하고자 Human cell line인 HEK293T (Human) 세포주에 iNfect transfection reagent (iNtRON, 15081)를 사용하여 ASO 후보 물질을 주입하고, ASO 도입 이후 24시간이 경과한 후에 세포를 수확하여 Real-time PCR 분석방법을 통해 EIF4E 발현 억제 효율을 확인하였다. 대조군으로서 eIF4E 3개의 뉴클레오티드가 mismatch된 ASO를 사용하여 상대적인 발현량의 비율을 정량적으로 그래프에 도시하였다(도 16h). Real-time PCR 분석결과, One ANOVA test 결과 p-value 0.05 이하로 대조군 EIF4E mismatch ASO 비하여 모두 통계적으로 유의하게 HEK293T 세포에서 eIF4E mRNA 발현 감소를 입증하였다. Mismatch control (MM)은 ASO #77 서열에서 5’에서 3’방향으로 8-9-10 염기가 CAC에서 TGT로 변경된 것이다.
<실시예 5> ASO를 이용한 뇌전증을 갖는 FMCD 동물모델의 치료
5-1: 동물 모델에서 eIF4E 발현 감소를 통한 뇌전증 치료 (발작 확인)
실시예 4-1에서 제작한 표 2의 ASO #75 및 ASO #77을 사용하여 in vivo 동물 모델에서 eIF4E의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에 기재된 pCIG-mTOR p.C1483Y-IRES-EGFP, pCIG-mTOR p.L2427P-IRES-EGFP로 제작한 동물 모델과 대조군으로 pCIG-mTOR (WT)-IRES-EGFP로 제작한 동물모델 (mTOR p.C1483Y 또는 mTOR p.L2427P)을 사용하였다. 상기 뇌전증이 발병하여 발작이 확인된 마우스의 뇌의 ventricle에 뇌 실내 주사(intracerebroventricular injection, ICV 주사)를 통해 100 - 500 ug의 ASO를 각각 투여하였다. 각 ASO 투여 이후 3일차부터 최장 70일차까지 12시간짜리 영상 촬영을 통해 발작을 확인하였고, 일주일에 뇌전증 마우스 1마리 당 2-3회 측정하였다.
상기 실험 결과, ASO #75 (ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)을 투여 시 두 종류의 뇌전증 모델 (mTOR p.C1483Y 또는 mTOR p.L2427P))에서 발작 횟수가 현저히 감소함을 확인하였다.
ASO 후보 물질을 동물 모델에 intraventricular injection으로 투여한 이후 대뇌 피질, 소뇌, 척수에서 eIF4E의 발현이 감소하는 것을 확인하며 이에 따라 발작의 빈도가 감소함을 확인한 것이다. 도 17 내지 도 19는 실시예 4에 따른 ASO 후보 물질을 마우스에서 intraventricular injection으로 투여한 이후 대뇌 피질, 소뇌, 척수에서 eIF4E의 발현이 감소하는 것을 확인하며 이에 따라 발작의 빈도가 감소함을 확인한 것이다. 도 17의 (A), 도 18의 (E), (F) 및 (G)에는 ASO 1을 사용하고, 도 17의 (B), (C) 및 (D)와 도 18 (H)에는 ASO-3을 사용한 결과이며, 도 19에는 ASO #75 (ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)을 사용한 결과이다.
5-2: ASO의 뇌 세포 내 분포 확인
ASO가 실제 뇌에서 세포에 uptake가 되는가를 확인하고자, cy3-ASO (형광물질)이 결합된 ASO를 뇌 실내 주사를 하여 뇌 세포 내 분포를 확인하였다.
마우스(C57BL/6J)(다물사이언스) 또는 상기 실시예 1에 기재된 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터로 제작된 동물 모델에서 아이소플루레인(isoflurane) (0.4L/min of oxygen and isoflurane vaporizer gauge 2 during surgery operation)으로 마취하였다. 마우스의 목뒤부터 두 눈 사이까지의 피부를 절개한다. 노출된 두개골을 면봉을 이용해 닦는다.
증기 멸균된 26G 주사기 내부를 70% Ethanol로 3회 소독하고, 증기멸균된 증류수로 주사기 내부 추가 1회 소독하였다. 주사기의 바늘을 bregma를 기준으로 AP -0.3 mm, ML +1.0mm에 위치하였다. 주사기의 바늘을 bregma를 기준으로 DL -3.0 mm으로 내려 외측 내실 (lateral ventricle)에 위치하였다. 주사기 위치 후 3 분간 대기하였다. ASO를 0.5 ul/sec의 속도로 주입한다. 주입 후 3 분간 대기하였다. 주사기를 체외로 빼내며 주사 위치를 면봉으로 1분간 누르고, 피부를 봉합하였다.
마우스의 뇌실에 ASO 주입 결과를 도 20a 및 도 20b에 나타냈으며, 도 20a는도 정상 마우스이고, 도 20b은 실시예 1-5에 기재된 FMCD 질환에 의한 뇌전증 모델 동물에 관한 것이다.
도 20a 및 도 20b은 control ASO의 뇌실 내 주사 (intracerebroventricular injection) 이후의 뇌 세포 내 분포를 확인한 것으로서, 도 20a는 일반 마우스에서 ASO에 형광물질인 Cy3를 부착하여 ASO의 분포를 Cy3 (빨간색)을 통해 확인한다. 도 20b는 실시예 1-5에 기재된 FMCD 질환에 의한 뇌전증 모델 동물로서 p.C1483Y와 p.L2427P 마우스의 돌연변이를 발현하는 세포 (GFP로 표지)에 ASO가 투과되는 것을 ASO에 Cy3 (빨간색)을 부착하여 확인한다.
5-3 동물 모델에서 ASO 투여에 따른 DK, IRSp53, CREB1의 발현 복구 및 뇌 세포 내 eIF4E 발현 감소 확인
상기 실시예 1에서 기재된 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터로 제작된 동물 모델에 ASO를 뇌실내 주사로 투여한 4-5주차 이후 마우스에서 뇌를 수확, 고정, 절편의 채집, 면역염색을 수행하였다.
실시예 2와 동일하게 항체를 이용하여 ADK, CREB1, IRSp53 및 eIF4E를 면역염색을 하고 형광현미경 분석을 동일하게 진행하였다.
도 21a는 ASO #75(ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)의 투여에 따른 뇌 세포 내 eIF4E 발현 감소의 형광면역염색법을 통한 확인한 것이다. 뇌전증 마우스 모델의 뇌 조직에서 돌연변이를 발현하는 세포(GFP로 표지)에 ASO 1 및 ASO 3의 (빨간색으로 표지)가 효과적으로 투여됨을 나타낸다.
도 21b는 ASO #75(ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)를 투여 이후 돌연변이 세포에서 ADK, IRSp53, CREB1 발현이 정상적으로 복구됨을 확인한다. ADK, IRSp53, CREB1은 mTOR 경로 활성화 돌연변이에 의한 eIF4E 활성증가로 특이적으로 번역이 증가하는 유전자이다. 돌연변이 세포에서 eIF4E의 발현을 ASO로 억제하면 이에 따라 ADK, IRSp53, CREB1의 발현이 정상 복구되게 된다.
5-4: 마우스의 뇌실에 ASO 주입을 이용한 eIF4E 발현 감소된 동물모델의 대뇌 피질 형성 이상 및 신경세포 크기 분석
상기 실시예 1에 기재된 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터로 제작된 FMCD동물 모델에 ASO #75(ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)를 뇌실내 주사로 투여한 4-5주차 이후 마우스에서 뇌를 수확, 고정, 절편의 채집, 염색을 수행. 신경세포 크기의 증가 (도 22)의 경우 마우스 뇌 조직을 얻었으며 GFP (녹색)으로 표기된 돌연변이 세포 (ASO control or ASO eIF4E)의 크기를 측정하였다.
도 22는 ASO #75(ASO-1) 및 ASO #77 (ASO-3)의 투여에 따른 난치성 뇌전증 모델의 돌연변이 세포 크기의 치료 효과를 확인하였다. 따라서 eIF4E의 발현을 ASO를 통해 억제시킬 경우 난치성 뇌전증 환자에서 확인되는 mTOR pathway 활성 돌연변이에 의한 신경 세포 크기 증가를 개선할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> ASO 투여에 따른 정상 동물의 행동이상 평가
6-1: 실험에 사용된 마우스와 ASO
ASO 투여에 따른 대조구 정상 모델(C57BL/6J 마우스)에 동반되는 행동 이상의 치료 효과를 확인하고자, ASO를 뇌실내(ICV) 주사로 투여하였다. 상기 실험에 사용된 ASO는 ASO #77을 사용하였다.
ASO를 투여한 대조구 동물모델의 행동 이상을 실시예 6-2 내지 6-10에기재된 방법으로 평가하였다. 상기 마우스에서 ASO의 투여로 인한 행동이상 평가 결과를 도 23 내지 도 24에 나타냈다.
6-2: 몸무게 및 체온 측정
ASO 투여 이후 1주 간격으로 마우스의 몸무게를 측정하였다.
마우스의 체온은 마취 후 측정하였다. 구체적으로 마우스는 마취 유도 상자에 넣었다. 마취는 0.4 L/min의 산소와 isoflurane으로 유지되었다. 마취 유도는 2분간 진행하였다. 마우스는 마취가 유지되는 상태에서 rectal 체온을 측정하였다. Rodent warmer x1 (STOELTING) 장비가 사용되었다. 체온 측정 프로브는 항문을 통해 2 cm 삽입되었고 10 초 이후 온도를 측정하였다.
도 23a는 C57BL/6J 마우스 8주령에 ASO 주입 후 8주간 몸무게 변화를 확인하며 ASO 투여에 따른 몸무게 변화가 없음을 확인하였다. 도 23b는 mTOR mutant 마우스 8주령에 ASO 3 주입 후 8주간 몸무게 변화를 확인하며 ASO 투여에 따른 몸무게 정상 회복을 확인하였다. 도 23b는 C57BL/6J 마우스 ASO 주입 후 21일 차에 체온 변화를 측정하여 ASO 투여에 따른 체온 변화가 없음을 확인하였다. 도 23c의 (A)는 난치성 뇌전증 모델 마우스(mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P)와 대조군 (mTOR-WT) 에서 ASO 주입 후 21 일 차에 체온 변화를 측정하여 ASO 투여에 따른 체온 변화가 없음을 확인하였다.
6-3: 마우스 핸들링 (handling)
행동 실험 대상의 마우스에 행동 실험 이전에 매일 10분씩 같은 시간 5일 동안 실험자의 손에 익숙해지는 핸들링을 수행하였다. 각 행동 실험 마다 하루의 간격을 두고 수행하여 최소의 스트레스로 수행하도록 하였다. 모든 행동 실험은 이중 맹검 분석하였다.
6-4: Open field test
마우스는 실험 수행 전에 실험 공간에서 10분간 습관화 (habituation) 과정을 거친다. 마우스는 40 x 40 (cm) 크기의 상자에 놓여져 자유롭게 이동하게 되고 10분간 open field activity를 측정하였다. EthoVision XT (Noldus)는 장치 내에서 운동 활동을 측정하고 자료를 분석하였다. 마우스는 본래 케이지로 돌려보내지고 실험 장치는 70% EtOH로 세척하였다.
도 24의 (A)는 C57BL/6J 마우스 ASO 주입 후 21일차부터 행동 실험을 진행하여 ASO 투여에 따른 운동 이상이 없음을 확인하였다. 도 24의 (B)는 open field test의 결과로 정상 마우스에서 ASO 투여에 따라 불안 정도의 지표인 time spent in center (중앙에 머문 시간)의 변화가 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
6-5: Light & Dark box test
마우스는 실험 수행 전에 실험 공간에서 10분간 습관화 (habituation) 과정을 거친다. 마우스는 20 x 20 (cm) 크기의 light & dark 장치에 위치하고 10분간 자유롭게 행동하였다. EthoVision XT (Noldus)는 장치 내에서 운동 활동을 측정하고 자료를 분석하였다. 마우스는 본래 케이지로 돌려보내지고 실험 장치는 70% EtOH로 세척하였다.
도 24의 (C)는 light & dark box test의 결과로 정상 마우스에서 ASO의 투여에 따라 불안 정도의 지표인 time spent in center (light box에서의 시간)의 변화가 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
6-6: Social avoidance test
비디오 추적 프로그램을 이용하여 익숙하지 않은 타겟에 대한 approach-avoidance 행동을 측정하였다. 장치는 검은 상자 (400 x 400 mm)을 사용하였다. 각 실험 마우스는 검은 상자에 놓여지고 2 번의 2.5 분간의 세션을 거치며 움직임이 촬영된다. 첫 번째 세션 ("타겟 없음") 동안 상자에는 빈 창살 케이지 (10 x 6.5 cm)을 둔다. 두 번째 세션 ("타겟 있음")에는 social target (낯선 CD1 마우스)를 빈 창살 케이지에 넣는 것을 제외하고는 동일하게 진행하였다. 2 세션 사이에 실험 생쥐는 상자에서 옮겨지고 1분간 사육 케이지에 위치하였다. "타겟 없음"과 "타겟 있음"의 조건에서 빈 창살 케이지 근처를 "interaction zone"로 설정하고 interaction zone에 머문 시간을 측정하였다.
도 24의 (D)는 social avoidance test의 결과로 정상 마우스에서 ASO의 투여에 따라 사회상과 우울 정도의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)의 변화가 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
6-7: 3-chamber test (Social interaction test)
이 행동 실험은 사회적 상호 작용과 사회적 새로움 인식을 측정하였다. 이 장치는 3개의 챔버로 구성되며 가운데 챔버는 12 x 20 x 26 cm이고 양 옆 챔버는 14 x 20 x 26 cm으로 구성된다. 양 옆 챔버는 모두 구석에 물체 또는 마우스가 위치할 수 있는 플라스틱 챔버(지름 11 cm, 높이 21.5 cm)를 포함하고 있다. 이 실험은 3 개의 세션으로 구성되며 이는 습관화 (10 분), 물체/마우스 탐색 (10 분), 익숙한/새로운 마우스 탐색 (10 분)으로 구성된다. 두 번째 세션에서, WT 낯선 마우스는 무작위적으로 플라스틱 케이지에 위치하고 반대 플라스틱 케이지는 비어있다. 마우스는 자유롭게 움직이거나 탐색하며, 각 챔버에 있는 시간은 측정되어 이후 사회적 상호 작용 측정에 사용된다. 마지막 세션에서 새로운 WT stranger를 비어있던 플라스틱 케이지에 위치하게 된다.
도 25의 (E)는 3-chamber test (Social interaction)의 결과로 정상 마우스에서 ASO의 투여에 따라 암수 모두에서 사회성의 지표인 time spent in sniffing zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)의 변화가 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
6-8:Marble burying test
필터가 되어 있는 뚜껑으로 덮은 일반 마우스 케이지를 사용하였다. 신선하고, 마우스 냄새가 배어있지 않은 깔집을 각 케이지에 5 cm 두께로 쌓고 평평하게 하였다. 지름 15 mm, 무게 5g의 유리 구슬을 깔집위에 1 줄 당 4 개씩 6열로 배열하였다. 구슬은 세제로 세척한 후, 증류 탈이온수로 세척하였다. 마우스를 케이지에 넣고 뚜껑을 덮은 후 20 분 후 깔집으로 절반 이상 덮인 구슬의 수를 측정하였다.
도 25의 (F)는 marble burying test의 결과로 정상 마우스에서 ASO의 투여에 따라 암수 모두에서 반복 행동의 지표인 number of buried marble이 변화 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
6-9: Sucrose preference test
마우스는 2개의 물병을 선택할 수 있는 케이지에서 3-5일관 습관화된다. 이후 실험 일시에, 마우스는 사육 케이지와 동일한 실험 케이지에 1 마리씩 배치된다. 이후 마우스는 수돗물 또는 1% 설탕물이 담긴 물병 중 선택하여 물을 마시게 된다. 각 액체의 섭취량은 24 시간 후에 측정하며 sucrose preference는 설탕물 섭취량 / 전체 섭취량 x 100%로 측정하였다.
도 25의 (G)는 sucrose preference test의 결과로 정상 마우스에서 ASO 투여에 따라 암수 모두에서 쾌락 또는 보상 기능 이상의 지표인 % sucrose preference의 차이가 없음을 통해 ASO의 신경계에서의 안정성을 확인하였다.
<실시예 7> eIF4E 저해제에 의한 신경정신질환의 치료능 분석
7-1: FMCD 동물모델의 적합성 평가
실시예 1에 기재된 FMCD 모델 동물(mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 을 이용하여 FMCD 및 뇌전증 모델에 동반되는 신경정신질환의 평가를 위한 적합성을 확인하였다.
상기 뇌전증을 갖는 FMCD 모델 동물 모델 마우스에서, 실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 FMCD 에 따른 행동이상 평가 결과를 수행하였으며, 그 결과를 도 26 및 도 27에 나타냈다. 즉, 본 실험에서는 뇌전증 모델 동물에 치료제를 투여하지 않는 결과이다.
도 26의 (A)는 행동 실험을 진행하여 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 운동 이상이 없음을 확인하였다.
도 26의 (B)는 open field test의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (중앙에 머문 시간)의 감소를 통해 불안 정도의 증가를 확인하였다.
도 26의 (C)는 light & dark test의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (light box에서의 시간)의 감소를 통해 불안 정도의 증가를 확인하였다.
도 26의 (D)는 social avoidance test의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 사회성과 우울 정도의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)의 감소를 통해 사회성의 감소와 우울 정도의 증가를 확인하였다.
도 27의 (E)는 3-chamber test (Social interaction test)의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 사회성의 지표인 time spent in sniffing zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)의 감소를 통해 사회성 감소를 확인하였다.
도 27의 (F)는 marble burying test의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 반복 행동의 지표인 number of buried marble의 감소를 통해 반복 행동의 감소를 확인하였다. 즉, marble burying test의 결과로, 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 반복 행동 이상의 지표인 number of buried marbles 의 감소를 통해 반복 행동의 이상을 확인하였다.
도 27의 (G) sucrose preference test의 결과로 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P) 암수 모두에서 쾌락 또는 보상 기능 이상의 지표인 % sucrose preference의 감소를 통해 쾌락 또는 보상 기능의 감소를 확인하였다.
7-2: sheIF4E의 신경정신질환의 치료능 분석
실시예 7-1에 기재된 FMCD 및 뇌전증 모델 동물(mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P)와 정상 동물 모델인 대조군 (mTOR-WT)를 사용하여 시험을 수행하였다. sheIF4E는 실시예 2에 기재된 것과 동일하다. sheIF4E 투여 이후 2주차에 handling을 진행하였다. sheIF4E 투여 이후 3주차부터 행동 실험을 수행하였다.
실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 뇌전증 모델 마우스에서 동반되는 행동이상 평가 결과를 수행하였으며, 그 결과를 도 28 내지 도 29에 나타냈다
도 28 내지 도 29는 sheIF4E를 통한 난치성 뇌전증 모델에 동반되는 신경정신 (neuropsychiatric) 질환의 치료 효과를 확인하였다.
도 28의 (A)는 sheIF4E를 통한 난치성 뇌전증 모델에서 운동 이상이 없음을 확인하였다.
도 28의 (B)는 open field test의 결과로 shRNA를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (중앙에 머문 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 불안 정도의 치료를 확인하였다.
도 28의 (C)는 light & dark test의 결과로 shRNA를 통해 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (light box에서의 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 불안 정도의 치료를 확인하였다.
도 28의 (D)는 social avoidance test의 결과로 shRNA를 통해 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 사회성과 우울 정도의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 사회성의 감소와 우울 정도의 치료를 확인하였다.
도 29의 (E)는 3-chamber test (Social interaction test)의 결과로 shRNA를 통해 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 사회성의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 사회성 치료를 확인하였다.
도 29의 (F)는 marble burying test의 결과로 shRNA를 통해 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 반복 행동의 지표인 number of buried marble가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 반복 행동의 치료를 확인하였다.
도 29의 (G)는 sucrose preference test의 결과로 shRNA를 통해 eIF4E 발현을 억제한 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-sheIF4E, mTOR-p.L2427P;mU6-sheIF4E)에서 쾌락 또는 보상 기능 이상의 지표인 % sucrose preference가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;mU6-shscramble, mTOR-p.L2427P;mU6-shscramble)에 비하여 증가함을 통해 쾌락 또는 보상 기능의 치료를 확인하였다.
7-3: ASO의 신경정신질환의 치료능 분석
실시예 7-1에 기재된 FMCD 및 뇌전증 모델 마우스(mTOR-p.C1483Y, mTOR-p.L2427P)와 대조군 (mTOR-WT)를 사용하여 시험을 수행하였다. 본 실험에 사용된 ASO는 상기 eIF4E의 발현을 감소시키는 ASO #77 서열이었다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 기재된 pCIG-mTOR mutant-IRES-EGFP 벡터로 제작된 FMCD 및 뇌전증 동물 모델은 mTOR mutant에 ASO #77 를 뇌실내 주사(ICV)로 투여하였다. ASO #77를 투여한 뇌전증을 갖는 FMCD 동물 모델에 동반되는 신경정신질환의 치료능을 실시예 6과 실질적으로 동일한 방법으로 평가하였다.
상기 뇌전증 모델 마우스에서 ASO의 eIF4E 저해로 FMCD 동물 모델의 신경정신질환 치료능 평가 결과를 도 30 내지 도 31에 나타냈다. 도 30 및 도 31은 ASO #77 (ASO3)를 통한 난치성 뇌전증 모델에 동반되는 신경정신질환(neuropsychiatric disorder) 치료 효과를 확인하였다.
도 30의 (A)는 ASO #77 (ASO3)을 주입한 후 21일차부터 행동 실험을 진행하여 ASO 투여에 따른 운동 이상이 없음을 확인하였다.
도 30의 (B)는 open field test의 결과로서, ASO #77 (ASO3)를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 동물 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (중앙에 머문 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 불안 정도의 치료를 확인하였다.
도 30의 (C)는 light & dark test의 결과로서, ASO를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 동물 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 불안 정도의 지표인 time spent in center (light box에서의 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 불안 정도의 치료를 확인하였다.
도 30의 (D)는 social avoidance test의 결과로서, ASO를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 동물 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 사회성과 우울 정도의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 사회성의 감소와 우울 정도의 치료를 확인하였다.
도 31의 (E)는 3-chamber test (Social interaction test)의 결과로 ASO를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 사회성의 지표인 time spent in center zone (stranger mouse와 interaction 한 시간)가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 사회성 치료를 확인하였다.
도 31의 (F)는 marble burying test의 결과로 ASO를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 반복 행동의 지표인 number of buried marble가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 반복 행동의 치료를 확인하였다.
도 31의 (G)는 sucrose preference test의 결과로 ASO를 이용하여 eIF4E 발현을 억제한 FMCD 및 뇌전증의 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-eIF4E, mTOR-p.L2427P;ASO-eIF4E)에서 쾌락 또는 보상 기능 이상의 지표인 % sucrose preference가 난치성 뇌전증 모델 (mTOR-p.C1483Y;ASO-control, mTOR-p.L2427P;ASO-control)에 비하여 증가함을 통해 쾌락 또는 보상 기능의 치료를 확인하였다.
<실시예 8> eIF4E 과활성-민감성 유전자 확인
8-1: mTOR 돌연변이를 가진 신경세포 제작
실시예 1에 기재된 FMCD 동물 모델에서 돌연변이 세포를 GFP로 표지하여 GFP 발현 세포들을 FACS(fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 통해 분획하여 mTOR 변이 세포를 확보하였다.
구체적으로, 상기 전기천공된 마우스(in utero electroporated mice)에서 GFP 리포터와 함께 MTOR - WT, MTOR - P.Cys1483Tyr, 또는 MTOR - P.Leu2427Pro을 발현하는 피질 뉴런은, 10mM HEPES (Gibco, 15630-080) 및 Pen/Strep (Life Technologies, 15140-122)가 보충된 Hank's balanced salt solution에서 E18.5일에 해부되었다(Gibco, 15630-080) 및 Pen / Strep (Life Technologies, 15140-122). 단백질 발현 조절을 분석하기 위해 ribosome elongation inhibitor인 100 ug/ml의 cycloheximide (Millipore, 239764)을 배지에 첨가하여 사용하였다.
전기천공된 영역 중 돌연변이를 발현하는 세포를 구분하기 위해 GlutaMAX-I (Gibco, 35050-061) 및 B27 (Gibco, 17504-044)으로 보충된 Hibernate-E 배지 (Gibco, A12476-01)에서 GFP 양성 피질 부분을 확인 후 절제하였다. GFP 양성 피질을 0.05 % 트립신 (Life Technologies, 15090-046)을 포함하는 해부 배지에서 4 ℃에서 30 분 동안 분해시켰다. 분해 후에, 펠릿을 원심분리하고 Glutamax-I 및 B27이 첨가된 Hibernate-E 배지에 3 회 재현탁하였다.
세포를 분리하기 위해, 방화 연마된 파스퇴르 피펫 (Corning, CO-7095B-9)을 사용했다. 이어서, 100um 및 40um strainers를 사용하여 큰 파편을 제거하였다. 세포 정렬은 FITC 게이팅을 갖춘 BD FACSAria II Flow Cytometer (BD Biosciences)로 수행되었다. 분리된 피질 뉴런은 6 개월까지 -80 ℃ 온도에서 보관되었다.
8-2: mTOR 변이를 갖는 세포를 이용한 번역체 프로파일링 (translatome profiling)
번역체 분석을 통하여 mTOR 돌연변이에 의해 mRNA의 번역이 증가하는 유전자들을 확인하였다. 이 유전자들은 mTOR 돌연변이에 의해 mRNA의 번역이 증가하였다. 도 2는 mTOR에서 뇌 체성 변이를 갖는 난치성 간질의 마우스 모델에서의 리보좀 프로파일링을 통해 FMCD에 기여하는 신규 mTOR 표적 유전자를 규명할 수 있다. 상기 mTOR 돌연변이에 의해 발현이 증가하는 유전자은 mTOR 돌연변이에 의해 mRNA의 번역이 증가하였다.
8-3: Ribo-seq 및 RNA-seq 라이브러리의 준비
(1)리보좀 프로파일링 (Ribo-seq) 및 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)
세포를 10-cm 접시에 confluence 50 %로 접종하였다. 다음 날까지 세포가 최대 confluence에 도달하지 않았음을 확인했다. NIH 3T3 세포를 200nM Torin1 또는 비히클로 처리하고 CRISPR로 편집한 mTOR (G4448A)-pC1483Y NIH 3T3 세포를 3 시간 동안 비히클로 처리하였다. 상기 처리된 세포를 100ug / ml의 cycloheximide가 보충된 빙냉 PBS로 1 회 세척하고 포유류 폴리솜 완충액 (10mM Tris-HCl, pH 7.4, 5mM MgCl2, 100mM KCl, 2mM DTT, 1 % Triton X- 1 μL의 프로테아제 억제제 칵테일, 2 uL의 RNasin 및 2 uL의 SUPERase가 보충된 100 ㎍/ml의 시클로헥시미드)를 사용하여 리보솜과 mRNA 사이의 결합을 유지시켰다. 샘플을 회전기에서 20 분 동안 항온 반응시켜 세포 용해를 유도하였다. FACS로 분획된 피질 뉴런에 대해, 동일한 처리법이 적용되었다. 세포 용해물을 2개의 튜브에, Ribo-seq 용 샘플의 75 %와 RNA-seq 용 나머지 분리하였고, 각각은 Ribo-seq 및 RNA-seq 라이브러리를 준비하는 데 사용되었다.
(2) Ribo-seq 및 RNA-seq 준비
Ribo-seq 준비를 위해, 상기 준비된 세포 용해액을 RNase I (Ambion, AM2294)로 처리하여 리보솜-mRNA 복합체로부터 mRNA에서 리보솜이 결합되지 않은 영역을 제거하였다. 이어서, Sephacryl S-400 컬럼 (GE healthcare, 27-5140-01)을 사용하여 리보솜-mRNA 복합체를 정제하였다. TRIzol LS (Ambion, 10296-010)를 사용하여 RNA 풋 프린트 (즉, mRNA의 리보솜 결합 영역)을 샘플로부터 추출하였다. Ribo-zero rRNA 제거 키트 (Epicenter, RZH110424)를 사용하여 rRNA를 샘플에서 제거했다.
RNA-seq 준비를 위해, TRIzol LS를 사용하여, 세포 용해물로부터 전체 RNA를 정제하였다. 이어서, RNA Clean & Concentrator -5 or -25 (Zymo research, R1015 or R1017)를 이용하여 RNA 샘플을 농축시켰다. Ribo-zero rRNA removal kit (Epicentre, RZH110424)를 이용하여 rRNA를 제거하였다. rRNA를 제거한 후에, NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, E6150S)를 이용한 알칼리 가수분해방법으로 시료 RNA을 단편화하였다.
리보솜 풋 프린트 (30 nt 크기) 및 RNA 단편 (40 - 60 nt 크기)을 우레아 -PAGE로 크기 분획을 수행하고, 겔 용출물로부터 정제하여 후속 공정에 사용하였다.
(3)Antarctic 포스파타제 및 PNK 처리
리보좀 풋 프린트와 RNA 단편의 3 ′말단이 각각 RNase I 절단과 알칼리 가수 분해로 인해 모노포스페이트 그룹을 가지기 때문에, 모노포스페이트 그룹을 Antarctic 인산가수분해효소 (NEB, M0289S)로 제거하고, 아데닐화된 3′링커의 5′말단에 연결하였다. 이를 위해, antarctic 포스파타아제 1 μL를 함유한 1X 반응 혼합물 20 μL에서 시료를 37 ℃에서 1 시간 동안 반응한 다음, 65 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하여 효소를 불활성화시켰다. 반응 후, 2 μL의 PNK (Takara, 2021A)와 1 μL의 [γ32P]-ATP (Perkin Elmer, NEG502Z)를 포함하는 1X 반응 혼합물 45 μl를 37 ℃에서 5 분 동안 반응하였다. RNA에 32P로 표지하였다. 표지에 이어 1 mM ATP (NEB, P0756L) 5 μL를 첨가하고 샘플을 37 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하여 RNA의 5′말단을 인산화시켜 후속 5′링커 연결에 사용했다. 리보솜 풋프린트와 RNA 단편을 산성 페놀 매개 RNA 추출법으로 정제한 후, 우레아-PAGE를 이용하여 크기-분획화하고 정제하여 유리 ATP를 제거하였다.
(4)링커 라이게이션, RT-PCR 및 서열분석
TruSeq small RNA 키트 (Illumina, RS-200-0012)를 3′링커, 5′링커, RT 프라이머, 5′프라이머 및 3′프라이머 라이게이션에 사용했다.
3′링커를 연결하기 위해, T4 RNA ligase 2 (Epicenter, LR2D1132K) 1.5 μL, 10X 완충액 1 μL, 3′링커 (RA3, TruSeq small RNA kit) 0.5 μL, 및 SUPERase-In 1 μL을 각 RNA 샘플에 첨가하고 22 ℃에서 4 시간 동안 반응하였다. 링커가 연결된 RNA를 우레아 -PAGE로 크기 분획한 다음 겔 용출물을 정제하여 잔류 3′링커를 제거하였다.
이어서, 5′링커를 연결하기 위해, T4 RNA ligase 2 1 μL, 10X 완충액 1 μL, 10 mM ATP 1 μL, 5′링커 (RA5, TruSeq Small RNA Kit) 0.5 μL, 및 SUPERase- In을 각 샘플에 첨가하고 22 ℃에서 16 시간 동안 반응하였다.
cDNA 라이브러리를 구성하기 위해, 링커가 연결된 RNA를 2.5 mM dNTP 4 μL, Superscript II RT 효소 1 μL, 5 X 버퍼 4 μL, 및 0.1 M DTT 2 μL를 함유하는 1X 반응 혼합물 20 μL에서 역전사시켰다. Illumina DNA 시퀀싱에 사용할 cDNA를 증폭하기 위해, 총 20 μL의 RT 시료에서 1 μL을 취하여 Phusion HF polymerase (Thermo Scientific, F-530L) 1 μL, 5X 버퍼 5 μL, 2.5 mM dNTP, 0.2 μL of 5′ primer (TruSeq Small RNA Kit), 0.2 μL of 3℃(TruSeq Small RNA Kit), and 33.6 μL 증류수와 혼합하였다. 상기 PCR 혼합물은 T1 Thermocycler에서 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 20 초의 22-25 사이클 동안 작동되었다. 증폭된 cDNA 라이브러리를 Native-PAGE 및 겔 용출액으로 정제하였다.
상기 정제된 cDNA 라이브러리를, Illumina HiSeq 2000 또는 HiSeq 2500 시퀀싱 시스템을 사용하여 서열분석을 수행하였다. 번역체 분석을 통하여 mTOR 돌연변이에 의해 발현이 증가하는 유전자들을 확인하였다.
8-4: Ribo-seq 및 RNA-seq 라이브러리의 서열 처리 및 정렬
서열 분석의 처음 몇 단계는 Assaf Gordon의 FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)을 사용하여 수행되었다. 얻어진 리드를 3′-말단에서 잘라서, 리드의 나머지 길이는 26 뉴클레오타이드가 되도록 하였다. Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) version 1.1.2 to UCSC mm10 assembly로 상기 리드를 정렬하여 rRNA 및 tRNA를 제거했다. 그런 다음, 새로운 junction이없는 경우를 제외하고는, 기본 옵션으로 TopHat (http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) 버전 2.1.1을 사용하여 UCSC mm10 게놈 시퀀스에 맞춰 정렬되었다.
8-5: Ribo-seq 및 RNA-seq 라이브러리의 mRNA 전사체 정량 및 정규화
개별 유전자의 리보좀 풋 프린트 및 mRNA 존재량을 정량화하기 위해, HTSeq (https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.9.1/)과 정렬한 후, 개별 전사체 당 Ribo-seq 및 RNA-seq 태그의 수를 계산했다. Ribo-seq 및 RNA-seq 라이브러리에서 낮은 리드 카운트를 갖는 전사체 (즉, 모든 라이브러리에서, FMCD 마우스 모델 < 100 raw read)를 제거하여 노이즈를 감소시켰다. 개별 mRNA 전사체 당 각 리드 카운트를, Ribo-seq 또는 RNA-seq 라이브러리의 리드 카운트의 중간값으로 정규화하였다.
8-6: 개별 mRNA 전사체의 번역 효율 정량
5,000여 개의 유전자에 대하여 mRNA 전사체의 번역 효율 (TE: translational efficiency)은 리보솜 - 보호 mRNA 단편 (RPFs)의 개별 전사체의 정규화 리드카운트를, 코딩 서열 (CDS)에 매핑된 정규화 RNA-seq 태그 카운트로 나눈 값으로서 계산하였다. CDS에 매핑된 RNA-seq 태그 카운트는 RNA-seq 라이브러리에서 중간 값으로 정규화되었다. 대조군과 각 시점 사이의 개별 유전자의 번역 효율(translational efficiencies, TEs)의 배수 변화는 log2 규모로 확인하였다.
8-7: eIF4E 과활성-민감성 유전자 확인
개별 유전자의 번역 효율(translational efficiencies, TEs)의 배수변화에서, eIF4E 과활성-민감성 유전자는 대조군과 각 시점 사이의 개별 유전자의 전사효율(translational efficiencies, TEs)의 배수 변화 분포 중 z-score가 MTOR-C1483Y와 MTOR-L2427P 두 군에서 MTOR-WT 대비 1.2 이상인 유전자가 215개를 선정하였다. 배수 변화 분포 중 z-score가 1.2 이상의 의미는 log2(TE[p.C1483Y]/[WT])의 값이 2.142605598 이상이고 log2(TE[p.L2427P]/[WT])의 값이 2.232171262 이상인 경우를 의미한다. 상기 선정된 eIF4E 과활성-민감성 유전자 256개를 상기 표 1에 나타냈다.
<실시예 9> eIF4E 과활성-민감성 유전자 분석
9-1: 5′UTR의 일반적 특성 분석
5′UTRs는 UCSC 게놈 브라우저 (GRCm38 / mm10, https://genome.ucsc.edu/)에서 리보솜 프로파일링에 존재하는 모든 유전자에 대해 얻어졌다. RefSeq에 주석 처리된 개별적인 mRNA의 가장 긴 5′UTR 서열을 분석을 위해 선택하였다.
상기 표 1에 나타낸, FMCD 마우스에서 mTOR과활성화 민감성 유전자 256 개의mRNA를 5′UTR에서 GC 함량, 길이 및 깁스 자유 에너지에 대해, 검출된 모든 유전자와 비교하였다.
최소 폴딩 △G°는 QuikFold2, RNA 폴딩 에너지 규칙 (Lee JH et al. De novo somatic mutations in components of the PI3K-AKT3-mTOR pathway cause hemimegalencephaly Nat. Genet. 2012;44(8):941-945)의 기본 매개 변수로 설정된 버전 3.0 (http://mfold.rna.albany.edu/?q = DINAMelt / Quickfold)을 사용하여 각 시퀀스에 대해 예측되었다.
9-2: eIF4E 과활성-민감성 유전자들의 공통 모티프
Multiple Em for motif elicitation (MEME, http://meme-suite.org/tools/meme)은 MEME 브라우저 응용 프로그램 (버전 4.12.0)을 사용하여 수행되었다(Bailey TL, Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in bipolymers. Proc. Second Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 1994;28-36).
5′UTR는 UCSC 게놈 브라우저 (GRCm38 / mm10)에서 호출되었으며, 알려진 5′UTRs가 있는 RefSeq 주석이 첨부된 mRNA를 추가 분석을 위해 선택했다. 각 유전자에 대한 가장 긴 5′UTR은 트레이닝 세트로서 MEME에 입력하기 위해 집계되었다. 상기 표 1에서 나타낸 FMCD 모델에서 eIF4E 활성증가-민감성 유전자에 대해, guanine quartet (GGC)4, CERT, A-rich 및 U-rich 모티프는, 주어진 사슬만을 사용하고 임의의 반복수를 가지는 12 개의 염기 서열 대한 검색 변수를 사용하여 확인하였다.
FMCD 마우스의 경우에, 알려진 5′UTRs가 있는 RefSeq 주석이 첨부된 mRNA로, FMCD와 eIF4E 활성증가-민감성 유전자에 대해, Find Individual Motif Occurrences (FIMO, http://meme-suite.org/tools/fimo)를 이용하여, guanine quartet (GGC)4, CERT, A-rich 및 U-rich의 존재에 대해 평가하였다.
분석 결과, eIF4E 과활성-민감성 유전자들에서 5 ′-UTR에 특이적인 motif를 공유하고 있음을 확인하였다(도 32 및 도 33).
도 32는 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 새로운 mTOR-반응성 5’-UTR 모티프를 제공하며, 5′UTR의 consensus sequence을 가진다. 구체적으로, FMCD 마우스를 MEME 분석한 결과에 따르면, 표 1에 나타낸 256개 eIF4E 활성증가-민감성 유전자에서 U-rich, guanine quartet (GGC)4, A-rich 및 CERT 모티프의 컨센서스 서열 및 풍부 수치(E-값)를 확인하였다.
도 33은 FMCD 마우스에서 U-rich, guanine quartet, A-rich 및 CERT 모티프를 포함하는 mTOR 활성화 - 민감성 유전자의 빈도를 도시한 다이어그램를 제시하며, 동일 유전자에 2개 이상의 모티프가 있는 경우 모티프 별로 독립적으로 중복 계산되었다. 그 결과, mTOR 과활성화 - 민감성 유전자 중에서 5 ′UTR 모티프를 가지고 있는 유전자의 비율은 80%이다.
9-3: 5′UTR luciferase reporter 분석
5′UTRs는 UCSC 게놈 브라우저 (GRCm38 / mm10)에서 얻은 것이다. ADK-S, CREB1, IRSp53에 대해 각각 야생형(WT), 트랜스 버전 및 결실 서열을 갖는 5′UTR을 합성하였다.
하기 표 8에서, ADK-S 야생형(WT) 서열에서 밑줄로 표시한 진한 글씨표시는 guanine quartet (GGC)4 을 나타내고, CREB1 야생형 서열에서 밑줄로 표시한 진한 글씨의 첫번째 표시는 A-rich이고, 세번째 표시는 U-rich 모티프이며, IRSp53의 야생형 서열에서 밑줄로 표시한 진한 글씨는 U-rich 모티프이다. Type에서 결실(Deletion)로 표시한 경우는 WT에서 각 모티프를 제거한 염기서열이다.
Gene /Type Strand type
(SEQ ID NO)		 Sequence
ADK-S -WT Sense
(SEQ ID NO: 220)		 GGGCCGCCCGCGCGCGGGGTGTGTAAGGACGAGCTCTCCGACGCTGAGTGCCAGAGCTAGGGAGCAGTTGCTGTGGTACCTACTGCTACCTGGGCAGACGCTGAGCATCGGACATCAGGCGCGGGGCGCTGC GGTGCGGGACGGGTAGG TGCAGTC
Antisense
(SEQ ID NO: 221)		 GACTGCACCTACCCGTCCCGCACCGCAGCGCCCCGCGCCTGATGTCCGATGCTCAGCGTCTGCCCAGGTAGCAGTAGGTACCACAGCAACTGCTCCCTAGCTCTGGCACTCAGCGTCGGAGAGCTCGTCCTTACACACCCCGCGCGCGGGCGGCCC
ADK-S -Deletion Sense
(SEQ ID NO: 222)		 GGGCCGCCCGCGCGCGGGGTGTGTAAGGACGAGCTCTCCGACGCTGAGTGCCAGAGCTAGGGAGCAGTTGCTGTGGTACCTACTGCTACCTGGGCAGACGCTGAGCATCCGCTGCTGCAGTC
Antisense
(SEQ ID NO: 223)		 GACTGCAGCAGCGGATGCTCAGCGTCTGCCCAGGTAGCAGTAGGTACCACAGCAACTGCTCCCTAGCTCTGGCACTCAGCGTCGGAGAGCTCGTCCTTACACACCCCGCGCGCGGGCGGCCC
CREB1-WT Sense
(SEQ ID NO: 224)		 TC GGCACTGGGCGGCGCTGG CTGGCTC CCTGGCTGCGGCTCC TCAGTCGGCGGCGGCTGCTGCTGCCTGTGGCCCGGGCGGCTGGGAGAAGCGGAGTGTTGGTGAGTGACGCGGCGGAGGTGTAGTTTGACGCGGTGTGTTACGTGGGGG AGAGAATAAAA CTCCAGCGAGATCCGGGCCGCGAACGAAAGCAGTGACGGAGGAGCTTGTACCACCGGTATCC
Antisense
(SEQ ID NO: 225)		 GGATACCGGTGGTACAAGCTCCTCCGTCACTGCTTTCGTTCGCGGCCCGGATCTCGCTGGAGTTTTATTCTCTCCCCCACGTAACACACCGCGTCAAACTACACCTCCGCCGCGTCACTCACCAACACTCCGCTTCTCCCAGCCGCCCGGGCCACAGGCAGCAGCAGCCGCCGCCGACTGAGGAGCCGCAGCCAGGGAGCCAGCCAGCGCCGCCCAGTGCCGA
CREB1-Deletion1 Sense
(SEQ ID NO: 226)		 TCCTGGCTCCCTGGCTGCGGCTCCTCAGTCGGCGGCGGCTGCTGCTGCCTGTGGCCCGTGAGTGACGCGGCGGAGGTGTAGTTTGACGCGGTGTGTTACGTGGGGGAGAGAATAAAACTCCAGCGAGATCCGGGCCGCGAACGAAAGCAGTGACGGAGGAGCTTGTACCACCGGTATCC
Antisense
(SEQ ID NO: 227)		 GGATACCGGTGGTACAAGCTCCTCCGTCACTGCTTTCGTTCGCGGCCCGGATCTCGCTGGAGTTTTATTCTCTCCCCCACGTAACACACCGCGTCAAACTACACCTCCGCCGCGTCACTCACGGGCCACAGGCAGCAGCAGCCGCCGCCGACTGAGGAGCCGCAGCCAGGGAGCCAGGA
CREB1-Deletion2 Sense
(SEQ ID NO: 228)		 TCGGCACTGGGCGGCGCTGGCTGGCTCCCTGGCTGCGGCTCCTCAGTCGGCGGCGGCTGCTGCTGCCTGTGGCCCGGGCGGCTGGGAGAAGCGGAGTGTTGGTGAGTGACGCGGCGGAGGTGTAGTTTGACGCGGTGTGTTACGTGGGGGCTCCAGCGAGATCCGGGCCGCGAACGAAAGCAGTGACGGAGGAGCTTGTACCACCGGTATCC
Antisense
(SEQ ID NO: 229)		 GGATACCGGTGGTACAAGCTCCTCCGTCACTGCTTTCGTTCGCGGCCCGGATCTCGCTGGAGCCCCCACGTAACACACCGCGTCAAACTACACCTCCGCCGCGTCACTCACCAACACTCCGCTTCTCCCAGCCGCCCGGGCCACAGGCAGCAGCAGCCGCCGCCGACTGAGGAGCCGCAGCCAGGGAGCCAGCCAGCGCCGCCCAGTGCCGA
CREB1-Deletion3 Sense
(SEQ ID NO: 230)		 TCGGCACTGGGCGGCGCTGGCTGGCTCTCATGCTGCCTGTGGCCCGGGCGGCTGGGAGAAGCGGAGTGTTGGTGAGTGACGCGGCGGAGGTGTAGTTTGACGCGGTGTGTTACGTGGGGGAGAGAATAAAACTCCAGCGAGATCCGGGCCGCGAACGAAAGCAGTGACGGAGGAGCTTGTACCACCGGTATCC
Antisense
(SEQ ID NO: 231)		 GGATACCGGTGGTACAAGCTCCTCCGTCACTGCTTTCGTTCGCGGCCCGGATCTCGCTGGAGTTTTATTCTCTCCCCCACGTAACACACCGCGTCAAACTACACCTCCGCCGCGTCACTCACCAACACTCCGCTTCTCCCAGCCGCCCGGGCCACAGGCAGCATGAGAGCCAGCCAGCGCCGCCCAGTGCCGA
IRSp53-WT Sense
(SEQ ID NO: 232)		 GTGGTCCTGGTCTGCGCGCC TTTTCCTGTTGCTGC AGTTGTCGCTTTCCTCACCGCCACCCGTGCCCCTGCTCTGGTCTGTGGTGTAGCCGGGACCCAGGACC
Antisense
(SEQ ID NO: 233)		 GGTCCTGGGTCCCGGCTACACCACAGACCAGAGCAGGGGCACGGGTGGCGGTGAGGAAAGCGACAACTGCAGCAACAGGAAAAGGCGCGCAGACCAGGACCAC
IRSp53-Deletion Sense
(SEQ ID NO: 234)		 GTGGTCCTGGTCTGCGCGCCAGTTGTCGCTTTCCTCACCGCCACCCGTGCCCCTGCTCTGGTCTGTGGTGTAGCCGGGACCCAGGACC
Antisense
(SEQ ID NO: 235)		 GGTCCTGGGTCCCGGCTACACCACAGACCAGAGCAGGGGCACGGGTGGCGGTGAGGAAAGCGACAACTGGCGCGCAGACCAGGACCAC
상기 합성된 5′UTR을 HindIII (NEB, R3104) 및 NcoI (NEB, R3193)를 사용하여 pGL3-프로모터 벡터 (Promega, E1761)의 SV40 프로모터와 Firefly 루시퍼라제 오픈 리딩 프레임 사이에 클로닝하였다. Renilla pGL4.74를 대조군 리포터로 사용하였다. iNfect transfection reagent를 사용하여 pGL3-SV40 5′UTRA 리포터(플래그 태그 mTOR WT, 플래그 태그 mTOR p.C1483Y 또는 플래그 태그 mTOR p.L2427P) 및 pGL4.74 대조군 리포터를 30 : 30 : 1로 비율로 HEK293T 세포를 함께 형질 감염시켰다.
상기 형질감염된 세포를 24 시간 후에 용해물로 수확하고, Dual Luciferase Assay kit (Promega, E1960) 를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 반딧불이 루시퍼라제 활성은 Renilla 활성에 대해 정규화되었고 플래그 태깅된 mTOR WT로 형질감염된 HEK293T 세포에 대한 상대적인 수치로 나타낸다.
도 34a 및 도 34b는 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 5′UTR 부위에 의한 발현 증가를 나타낸다. 구체적으로, eIF4E 활성화-민감성 유전자인 Adk-S, Adk-L, Creb1, IRSp53의 5′UTR이 luciferase 유전자 앞에 있을 시 mTOR 활성돌연변이에 의하여 luciferase의 발현이 증가하였다. mTOR 활성 돌연변이는 mTOR p.C1483Y와 mTOR p.L2427P를 사용하였으며 mTOR WT은 대조군으로 사용하였다. mTOR WT, mTOR p.C1483Y, mTOR p.L2427P는 HEK293T 세포주에서 발현시켰다. Pro는 프로모터를 나타낸다. Actb는 β-actin 유전자이고, pGL3는 5′UTR 부위가 없는 empty vector를 나타낸다. 실험 결과는 mTOR WT의 transfection 된 luciferase로 평균화한 것이다.
도 34b는 5′UTR 부위에 의한 발현 증가를 나타내는 것으로서, 구체적으로 mTOR WT (WT) 및 mTOR p.C1483Y (p.C1483Y)-형질감염 또는 mTOR WT (WT) 및 p.L2427P (p.L2427P)-형질감염된 HEK293T 세포에서 5′UTR 루시퍼라제 리포터 분석에 따르며, 표적 mRNA (ADK-S, ADK-L, CREB1 및 IRSp53) 및 대조 mRNA (ACTB 및 GAPDH)은 5′UTR에 의해 매개된 번역이 수행된다.
도 34a에서 Pro는 프로모터를 나타내고. Actb는 β-actin 유전자를 나타내고, pGL3은 5′UTR이 없는 시험 벡터를 나타낸다. 분석 결과는 형질감염된 mTOR-WT 세포에서 5′UTR 리포터 활성으로 정규화된다. 도 34b는 도 34a의 정량값을 나타낸다.
도 35에 나타낸 바와 같이, eIF4E 과활성-민감성 유전자들에서 특이적인 motif를 제거할 경우 mTOR 돌연변이 및 eIF4E 과활성화에 의한 상기 유전자의 발현 증가가 사라졌다. 도 35는 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 새로운 eIF4E-반응성 5′UTR 모티프를 제공하며, 5′UTR 모티프 제거에 따른 발현 차이 확인하였다. 도 35의 상단에 Adk-S, IRSp53 및 Creb1에서 5′UTR 모티프의 위치를 표시하였다. 도 35의 하단 그래프에서 Adk-S, IRSp53 및 Creb1의 5′UTR 모티프 도메인에서 결실 돌연변이의 효과를, mTOR WT (WT)-형질감염된 세포에 대한 mTOR 활성화 (mTOR p.C1483Y [p.C1483Y] 또는 p.L2427P [p.L2427P])세포에서 5′UTR 루시퍼라제 리포터 활성으로 나타냈다. 도면에서 Pro는 프로모터이다.
<실시예 10> 반복투여 독성시험 분석
실시예 4에서 선정된 ASO #16, #21, #27, #35, #75, #77 및 #89 각각의 서열에 대한 독성을 비교분석하고자 피하주사 (subcutaneous injection)를 통한 반복투여 독성시험을 수행하였다.
ASO 서열에 대한 반복투여 독성시험은 바이오톡스텍(Biotoxtech Co., Ltd.)에 의뢰하여 진행하였다. 반복투여 독성시험 수행 방법은 각각의 ASO 서열에 대하여 100 mg/kg 농도로 시험군별 4 마리의 수컷 마우스에 피하주사 (subcutaneous injection)를 통하여 ASO를 한 달간 총 7회(1일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일) 주입하여 마지막 투여후 2일째에 검시를 진행하였다.
반복투여 독성시험 결과, ASO 서열 #16, #21, #27, #35, #75과, #77를 제외한 ASO #89 시험군에서 투여후 22일차에 모든 개체에서 빈폐사가 확인되었으며, 빈폐사가 확인된 ASO #89 시험군을 제외한 다른 시험군에서는 행동이상 증상은 관찰되지 않았다.
상기 ASO 서열 #89 독성에 관한 결과로, 일반적으로 알려진 2’MOE gapmer 화학적 변형 구조적 특성에 의한 독성이 아닌 시퀀스에 따른 독성 혹은 타겟 유전자가 아닌 off-target 유전자의 발현 영향에 의해 있을 수 있다. 실시예 4-4 in silico off-target 유전자 분석결과로 eIF4E를 타겟하는 ASO 서열 #16, #21, #27, #35, #75과, #77은 1개 뉴클레오티드 시퀀스를 제외하고 나머지 19개 뉴틀레오티드 시퀀스가 일치하는 eIF4E외 off-target 유전자가 없는 서열인 반면에, ASO #89는 4개의 off-target 유전자가 있음을 확인하였다.
<110> SoVaGen Co., Ltd. KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for diagnosis or treatment of a condition associated with increased activity of eIF4E comprising an eIF4E inhibitor <130> DPP20203125KR <150> 10-2019-0109090 <151> 2019-09-03 <150> 10-2019-0109091 <151> 2019-09-03 <160> 235 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 1 aaacaaagat agccacatca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 2 tcaaactagt gctccaaact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 3 aggacaaatc tagttgtcta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 4 ggacaaatct agttgtctaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 5 agttgtctaa aagacaattc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Antisense oligonucleotide <400> 14 gcttactgtg gtgagagtca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 15 cttactgtgg tgagagtcaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 16 aaaccttact gtctctagcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 17 aaccttactg tctctagcca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 18 aacagttaag caacaacact 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 19 acagttaagc aacaacactg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 20 ctggataatc aaagctctca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 21 tggataatca aagctctcat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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tctaagtttg atttcaagag aatcaaactt agagatcaat cgttttttct 60 cga 63 <210> 204 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sheIF4E anti-sense strand <400> 204 tcgagaaaaa acgattgatc tctaagtttg attctcttga aatcaaactt agagatcaat 60 cga 63 <210> 205 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shScramble <400> 205 ggaatctcat tcgatgcat 19 <210> 206 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shScramble sense strand <400> 206 tggaatctca ttcgatgcat ttcaagagaa tgcatcgaat gagattcctt ttttctcga 59 <210> 207 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shScramble anti-sense strand <400> 207 tcgagaaaaa aggaatctca ttcgatgcat tctcttgaaa tgcatcgaat gagattcca 59 <210> 208 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for sheIF4E <400> 208 ggccgaggcc tcctgggccc gctctagaga tccgac 36 <210> 209 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for sheIF4E <400> 209 cgagtactag gatccattag gcgg 24 <210> 210 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EIF4E forward primer <400> 210 tggcgactgt cgaaccg 17 <210> 211 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EIF4E reverse primer <400> 211 agattccgtt ttctcctctt ctgtag 26 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 212 gaaggtgaag gtcggagtca acg 23 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 213 gaagatggtg atgggatttc c 21 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mismatch ASO <400> 214 gatcctttgt taatgttaca 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB4 forward primer <400> 215 cagtcagtgt gtgcaggaac 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB4 reverse primer <400> 216 agcctgtgac ttctcgaaca 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTC28 forward primer <400> 217 ctcatgggaa tctgggctct 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTC28 reverse primer <400> 218 tgatgaagct gcctctcgat 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled ASO-2 <400> 219 taaggctatg aagagatacg 20 <210> 220 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADK-WT-UTR sense <400> 220 gggccgcccg cgcgcggggt gtgtaaggac gagctctccg acgctgagtg ccagagctag 60 ggagcagttg ctgtggtacc tactgctacc tgggcagacg ctgagcatcg gacatcaggc 120 gcggggcgct gcggtgcggg acgggtaggt gcagtc 156 <210> 221 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADK-WT-UTR antisense <400> 221 gactgcacct acccgtcccg caccgcagcg ccccgcgcct gatgtccgat gctcagcgtc 60 tgcccaggta gcagtaggta ccacagcaac tgctccctag ctctggcact cagcgtcgga 120 gagctcgtcc ttacacaccc cgcgcgcggg cggccc 156 <210> 222 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADK-Deletion-UTR sense <400> 222 gggccgcccg cgcgcggggt gtgtaaggac gagctctccg acgctgagtg ccagagctag 60 ggagcagttg ctgtggtacc tactgctacc tgggcagacg ctgagcatcc 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226 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion1-UTR sense <400> 226 tcctggctcc ctggctgcgg ctcctcagtc ggcggcggct gctgctgcct gtggcccgtg 60 agtgacgcgg cggaggtgta gtttgacgcg gtgtgttacg tgggggagag aataaaactc 120 cagcgagatc cgggccgcga acgaaagcag tgacggagga gcttgtacca ccggtatcc 179 <210> 227 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion1-UTR antisense <400> 227 ggataccggt ggtacaagct cctccgtcac tgctttcgtt cgcggcccgg atctcgctgg 60 agttttattc tctcccccac gtaacacacc gcgtcaaact acacctccgc cgcgtcactc 120 acgggccaca ggcagcagca gccgccgccg actgaggagc cgcagccagg gagccagga 179 <210> 228 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion2-UTR sense <400> 228 tcggcactgg gcggcgctgg ctggctccct ggctgcggct cctcagtcgg cggcggctgc 60 tgctgcctgt ggcccgggcg gctgggagaa gcggagtgtt ggtgagtgac gcggcggagg 120 tgtagtttga cgcggtgtgt tacgtggggg ctccagcgag atccgggccg cgaacgaaag 180 cagtgacgga ggagcttgta ccaccggtat cc 212 <210> 229 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion2-UTR antisense <400> 229 ggataccggt ggtacaagct cctccgtcac tgctttcgtt cgcggcccgg atctcgctgg 60 agcccccacg taacacaccg cgtcaaacta cacctccgcc gcgtcactca ccaacactcc 120 gcttctccca gccgcccggg ccacaggcag cagcagccgc cgccgactga ggagccgcag 180 ccagggagcc agccagcgcc gcccagtgcc ga 212 <210> 230 <211> 193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion3-UTR sense <400> 230 tcggcactgg gcggcgctgg ctggctctca tgctgcctgt ggcccgggcg gctgggagaa 60 gcggagtgtt ggtgagtgac gcggcggagg tgtagtttga cgcggtgtgt tacgtggggg 120 agagaataaa actccagcga gatccgggcc gcgaacgaaa gcagtgacgg aggagcttgt 180 accaccggta tcc 193 <210> 231 <211> 193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CREB1-Deletion3-UTR antisense <400> 231 ggataccggt ggtacaagct cctccgtcac tgctttcgtt cgcggcccgg atctcgctgg 60 agttttattc tctcccccac gtaacacacc gcgtcaaact acacctccgc cgcgtcactc 120 accaacactc cgcttctccc agccgcccgg gccacaggca gcatgagagc cagccagcgc 180 cgcccagtgc cga 193 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Claims (46)

  1. 진핵세포의 번역 개시 인자 4E (eIF4E) 저해제를 포함하는, 뇌 신경세포에서 eIF4E의 증가된 활성과 관련된 질환 또는 이의 증상을 개선, 예방 또는 치료용 약학 조성물으로서,
    상기 질환은 국소 대뇌피질 발달기형(Malformations of Cortical Developments, MCD)인 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 국소 대뇌피질 발달기형은 국소 피질 이형성증 (focal cortical dysplasia, FCD), 편측 거대뇌증(hemimegalencephaly, HME), 또는 결절성 경화증(Tuberous sclerosis complex, TSC)인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 국소 대뇌피질 발달기형은 뇌 체성 변이에 의한 대뇌피질 발달기형인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 국소 대뇌피질 발달기형은 국소 피질 이형성증 (focal cortical dysplasia, FCD) type II인 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 증상은 뇌전증, 불안 장애(anxiety), 인지 장애, 단기 기억 장애, 운동 기능 장애, 인지 장애, 사회적 행동 장애, 반복 행동 장애 (repetitive behavior disorder), 및 우울증으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 증상은 자발적 발작, 행동발작, 또는 뇌파 발작인 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 eIF4E의 활성을 저해 또는 감소시키는 것인 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 eIF4E의 발현을 저해 또는 수준을 감소시키는 것인 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 U-rich motif, guanine quartet motif, A-rich motif 및 CERT motif로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 모티프를 5’-비번역영역에 포함하는 eIF4E 활성화-민감성 유전자의 발현 증가를 억제 또는 감소시키는 것인 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 eIF4E 활성화-민감성 유전자는 ADK 유전자, CREB1 유전자 또는 IRSp53의 유전자인 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 화합물, 폴리뉴클레오티드, 펩타이드, 또는 항체인 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 캡-결합 길항제(cap-binding antagonist), eIF4E와 eIF4G의 상호작용 저해제(eIF4E-eIF4G interaction inhibitor), eIF4E와 결합하여 유리 (free) eIF4E 수준을 감소시키는 물질, eIF4E 인산화를 차단하는 Mnk 저해제, 또는 eIF4E에 결합가능한 핵산분자인 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 메트포르민, 리바비린(Ribavirin), 7-BnGMP, 4Ei-1, 4EGI-1. 4E1RCat, Quabain, 페릴릴 알코올(Perilly alcohol), 4EBP 모방체 펩타이드(4EBP mimetic peptide), GnRH 작용제-4EBP의 융합 펩타이드 (GnRH agonist-4EBP fusion peptide), CGP052088, CGP57380, 또는 eIF4E에 결합가능한 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 eIF4E의 활성 또는 발현을 저해하며, 14 내지 30개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드인 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 eIF4E의 5'-비번역 부위, 개시 부위, 엑손 부위, 인트론 부위, 및 3'-비번역 부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 부위와 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 것인 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 201을 갖는 대조군을 기준으로 eIF4E의 mRNA의 상대적 발현 정도가 90% 이하인 것인 약학 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합(internucleoside linkage), 화학적으로 변형된 당 모이어티(moiety) 및 화학적으로 변형된 뉴클레오염기로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화학적 변형을 포함하는 것인 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드에 포함된 적어도 1종의 뉴클레오티드는 2'-O-메톡시에틸 리보스, cET 리보스 및 locked nucleic acid로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 변형된 뉴클레오티드인 것인 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 양 말단으로 부터 1개 내지 6개의 뉴클레오티드인 것인 약학 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이거나, 상기 화학적으로 변형된 당 모이어티가 2'-O-메톡시에틸 리보스이거나, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오염기가 5-메틸시토신인 약학 조성물.
  23. 제16항에 있어서, SEQ ID NOs: 1 내지 95 및 SEQ ID Nos: 101 내지 200으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 96의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  25. 제23항에 있어서, SEQ ID NOs: 16, 20, 21, 27, 28, 35, 75, 77, 132, 143, 147, 149, 161, 162, 171, 178, 179, 180, 182, 183 및 184의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합, 2'-O-메톡시에틸 리보스 및 5-메틸시토신을 포함하는 것인 약학 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 eIF4E 저해제는 피하 투여 (subcutaneous injection), 정맥내 투여 (intravenous injection), 근육내 투여 (intramuscular injection), 동맥내 투여 (intra arterial injection), 복강내 투여 (intraperitoneal injection), 뇌내 투여 (Intracerebral injection), 척추 강내 투여 (intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)으로 제공되는 것인 약학 조성물.
  28. 삭제
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