HU211945A9 - Polyethylene glycol protein conjugates - Google Patents
Polyethylene glycol protein conjugates Download PDFInfo
- Publication number
- HU211945A9 HU211945A9 HU95P/P00259P HU9500259P HU211945A9 HU 211945 A9 HU211945 A9 HU 211945A9 HU 9500259 P HU9500259 P HU 9500259P HU 211945 A9 HU211945 A9 HU 211945A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- peg
- ethanediyl
- oxy
- sru
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 186
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 186
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title abstract description 118
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title abstract description 111
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 67
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims description 62
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 62
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 31
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 31
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 30
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 15
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 101001094887 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001123576 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001123572 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000573177 Ambrosia artemisiifolia Pectate lyase 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000009342 ragweed pollen Substances 0.000 claims description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 abstract 1
- -1 η-propyl Chemical group 0.000 description 230
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 93
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 59
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 239000000047 product Substances 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 52
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 47
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 47
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 47
- 229940119178 Interleukin 1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 46
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 42
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 31
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 28
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 27
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 22
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 17
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 15
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 15
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 15
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 14
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 12
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 12
- 125000001340 2-chloroethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)C([H])([H])* 0.000 description 11
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 10
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000001810 isothiocyanato group Chemical group *N=C=S 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 8
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical group C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- PVVTWNMXEHROIA-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxypropyl)-1h-quinazolin-4-one Chemical compound C1=CC=C2NC(CCCO)=NC(=O)C2=C1 PVVTWNMXEHROIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000006012 2-chloroethoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-ol Chemical compound OC1=CC=CC=N1 UBQKCCHYAOITMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- GCSAXWHQFYOIFE-UHFFFAOYSA-N dipyridin-2-yl carbonate Chemical compound C=1C=CC=NC=1OC(=O)OC1=CC=CC=N1 GCSAXWHQFYOIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- AFFYTLSODCIHIH-UHFFFAOYSA-N bis(3-methylpyridin-2-yl) carbonate Chemical compound CC1=CC=CN=C1OC(=O)OC1=NC=CC=C1C AFFYTLSODCIHIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical group 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- IKYOVSVBLHGFMA-UHFFFAOYSA-N dipyridin-2-yloxymethanethione Chemical compound C=1C=CC=NC=1OC(=S)OC1=CC=CC=N1 IKYOVSVBLHGFMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZSJGCPBOVTKHR-UHFFFAOYSA-N isothiocyanatocyclohexane Chemical compound S=C=NC1CCCCC1 MZSJGCPBOVTKHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N thiophosgene Chemical compound ClC(Cl)=S ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGPJLYIFDLICMR-UHFFFAOYSA-N 1,4,2,3-dioxadithiolan-5-one Chemical compound O=C1OSSO1 BGPJLYIFDLICMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004182 2-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- MVKDNXIKAWKCCS-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-1h-pyridin-2-one Chemical compound CC1=CC=CN=C1O MVKDNXIKAWKCCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEAVIRYCMBDJIU-UHFFFAOYSA-N 6-methyl-1h-pyridin-2-one Chemical compound CC1=CC=CC(O)=N1 JEAVIRYCMBDJIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N Compound IV Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1 FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100412394 Drosophila melanogaster Reg-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034962 Photopsia Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N carbonothioic O,S-acid Chemical compound OC(S)=O HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002701 cell growth assay Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N chloro formate Chemical compound ClOC=O FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125890 compound Ia Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 230000003009 desulfurizing effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910000065 phosphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108700001787 polyethylene glycol-modified interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
- Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent
Description
A találmány tárgya fehérjék új polietilénglikol (PEG) konjugátumai.
Sokféle természetes és rekombináns fehérje alkalmazható a gyógyászatban és gyógyszerészetben. Először ezeket tisztítani, elválasztani és formulázni kell, ezt követően lehet parenterálisan beadni különféle terápiás indikáció esetén. Azonban a parenterálisan beadott proteinek immunizáló hatásúak, viszonylag vízoldhatatlanok és farmakológiailag rövid felezési idővel rendelkezők lehetnek. Következésképpen problémát jelenthet a terápiásán megfelelő szint alkalmazása a beteg vérében.
Ez a probléma megoldható a fehérjék konjugációjával polimerekkel, mint például polietilénglikollal. A 4 179 337. számú USA szabadalmi leírás fehérjék (pl. enzimek és inzulin) polietilénglikol (PEG) konjugátumát ismerteti, bár ezen konjugátumok a fehérjénél kevésbé immunogének, de az eredeti fiziológiai aktivitásnak csak egy töredékével rendelkeznek. Nakagawa és mtsai (4 791 192. sz. USA szabadalmi leírás) részlegesen aktivált, csökkent mellékhatású és immunogenecitású fehérje PEG konjugátumát ismerteti. Veronese és mtsai [Applied Biochem. and Biotechn. 11, 142-152 (1985)] klórhangyasav-fenil-észterrel aktivált polietilénglikollal módosított ribonukleáz és szuperoxid dimutáz előállításáról számolnak be. Katre és mtsai (4 766 106. és 4 917 888. sz. USA szabadalmi leírás) szintén polimer konjugációval oldhatóvá tett fehérjéket ismertet. PEG-gel és egyéb polimerekkel konjugálva a rekombináns fehérjéket csökken az immunogenicitásuk és nő a stabilitásuk (felezési idejük). Ilyen megoldások ismerhetők meg Nitecki és mtsai (4 902 502. sz. USA szabadalmi leírás), Enzon Inc. nemzetközi szabadalmi bejelentés (PCT/US90/02133). Nishimura és mtsai (EPA 154316) és Tomasi (PCT/US85/O2572) munkáiból. King és mtsai [Int. Archs. Allergy appl. Immun. 66, 439-446 (1981)] olyan módszert ismertet, amikor PEG-gel védik a fehérjéket O(RO-PEG)-S-karboxi-amidometil-ditiokarbonát intermediereket alkalmazva.
Az eddig ismert PEG-fehérje konjugátum előállítási módszerek és a keletkezett konjugátumok számos problémával rendelkeznek. A problémák többségét az okozza, hogy a fehérje-PEG konjugátum előállítása során a fehérje inaktiválódik és így biológiai aktivitása lecsökken. A további probléma, hogy az ilyen módon előállított PEG-protein konjugátumok alkalmazás során rendszerint in vivő hidrolitikus úton széthasadnak. Ha a hasadás a beadás után következik be, a konjugátum elveszti a PEG okozta kedvező sajátságait.
A jelen találmány tárgya új PEG-fehérje konjugátumok. melyekben a fehérjében levő különböző szabad aminocsoportok és a PEG közötti különleges kapcsoló ágenst (linker) alkalmazzuk, amivel a PEG fehérje alkotta konjugátumok során korábban felmerülő problémák kiküszöbölhetők.
A találmány közelebbről az (I) általános képletű fiziológiailag aktív fehérje konjugátumokra vonatkozik, ahol
R1 jelentése alacsony alkilcsoport;
R2 jelentése -O- vagy -NH-;
R3 jelentése =N-R4, =S vagy =O;
R4 jelentése alacsony alkil- vagy cikloalkilcsoport; m és n>l olyan egész szám, hogy a konjugátum a konjugálatlan fehérje biológiai aktivitásának legalább egy részével rendelkezik; azzal a megkötéssel, hogy ha
R2 jelentése -O-, az esetben R3 jelentése =N-R4-től különböző; és ha
R2 jelentése -0- és R3 jelentése =O, a protein interferon-alfa, interleukin-1 vagy interleukin-lra, és ha R2 jelentése -O- és R3 jelentése =S, a protein nem parlagfű pollenből vagy szarvasmarha plazma albuminból származó antigén E.
Még részletesebben jelen találmány az I-A, I-B,
I- C, I-D és I-E képletű fehérje konjugátumokra vonatkozik, ahol R1, R4, m, n és a protein jelentése a fenti.
Jelen találmánynak megfelelően mi állítottuk elő először a PEG és az interleukin-1 receptor antagonista (IL-l-ra), illetve interleukin-1 (IL-1) proteinek konjugátumát.
A jelen találmány szerinti (I) általános képletű protein konjugátumokat a megfelelő aktivált PEG, azaz olyan PEG alkalmazásával állítjuk elő, amikor is egy hidroxicsoport egy aktivált összekötő csoporton (linker) keresztül a proteinben levő egy vagy több szabad aminocsoporttal van helyettesítve.
Az alábbi aktivált PEG vegyületeket alkalmazzuk a konjugátumok előállítására: II-A, II-B, Π-C, II-D,
II- E, II-F, II-G; ahol R1 jelentése alacsony alkilcsoport, R4 jelentése alacsony alkil- vagy cikloalkilcsoport, R5 jelentése alacsony alkilcsoport vagy H és n egy 1 és 1000 közötti egész szám.
A jelen találmánynak megfelelően a II-A, Π-Β, II-C, II-D, II-E, II—F és II-G képletű aktivált PEG vegyületek alkalmazásával a PEG és a proteinekben levő szabad aminocsoportok között összekötő kötést oly módon alakítjuk ki, hogy a keletkezett konjugátum megtartsa a protein biológiai aktivitása legalább egy részét, míg az immunogenicitása csökken. Továbbá a kialakított összekötő csoportok a találmány szerinti konjugátumokban, melyeket a (II—A)—(II—G) képletű aktivált polietilénglikolok valamelyikének felhasználásával hoztunk létre, nem hasadnak ín vivő hidrolízissel és nem mutatják azokat a hátrányokat, melyek jelen vannak a technika állásából ismert PEG protein konjugátumokban.
A találmánynak megfelelően R1 és R5 valamilyen alacsony alkilcsoport, előnyösen metilcsoport. Az alacsony alkilcsoport kifejezés 1-6 szénatomos alkilcsoportot jelent, előnyösen metil-, etil-, η-propil-, izopropil- stb. csoport. Előnyösen az alacsony alkilcsoport 1-4 szénatomot tartalmaz, különösen előnyös a metilcsoport.
A találmány szerint m és n 1-nél nagyobb egész számok közül való és értékét úgy választjuk meg, hogy a keletkezett protein konjugátum rendelkezzék legalább egy részével annak a biológiai aktivitásnak, mellyel a konjugátumban levő protein eredetileg rendelkezett. Nyilvánvaló, hogy N és m összege fordítottan arányos a konjugátumban megmaradó biológiai aktivitás mennyiségével. Az n szám a konjugátumot
HU 211 945 A9 alkotó polietilénglikolban levő etilénglikol egységek számát mutatja és ez 1 és 1000 közötti szám. Az m szám az aktivált PEG-gel reagáltatott proteinben levő szabad aminocsoportok száma. Előnyösen m értéke 1-5 tartományba esik, legelőnyösebben 1. A magasabb m+n értékhez a konjugátum magasabb molekulatömege tartozik. A (II-A)-(H-G) képletű polietilénglikol polimerek és az (I), valamint (I—A)—(I—E) képletű protein konjugátumok molekulatömegének meghatározása a szakember számára kézenfekvő. A molekulatömeg meghatározásából az m és n értékek meghatározhatók. A „fehérjék” (proteinek) kifejezésen egyrészt polipeptideket, másrészt azok fiziológiailag hatásos sóit kell érteni.
Ha a (II—A)—(II—G) képletű vegyületek valamelyikét egy proteinnel reagáltatjuk és a protein egynél több szabad aminocsoportot tartalmaz, a keletkezett konjugátum különböző protein-PEG konjugátumok keveréke. Az esetben, ha a protein két szabad aminocsoportot tartalmaz, az aktivált PEG reagálhat az egyik szabad aminocsoporttal vagy reagálhat mindkét szabad aminocsoporttal. Ez esetben a keverék tartalmaz olyan konjugátumot, melyben két szabad aminocsoport reagált a PEG-gel és tartalmaz olyan konjugátumot, melyben a szabad aminocsoportok egyike reagált a PEG-gel. Mivel a keverékben levő konjugátumok molekulatömege eltérő, ezért ezek elválaszthatók egymástól, méghozzá hagyományos módszerekkel, mint például kromatográfiásan. Az m és n helyes megválasztásához a szeparált konjugátumokat biológiai aktivitásra screeneljük, ugyanolyan módszert alkalmazva, mint a kiindulási protein screenelésére alkalmaztunk, és meghatároztuk, hogy még rendelkezik a konjugátumot alkotó protein biológiai aktivitásnak egy részével. Ez esetben m és n számok alkalmazhatók a kívánt aktivitás biztosítása mellett.
A találmány előnyös megvalósítása szerint m és n olyan egész szám. mely esetén - a protein tömegét leszámítva - a konjugátum molekulatömege kb. 300 dalton és kb. 30 000 dalton között van. Egy előnyös megvalósítás szerint m értéke 1. Ha m = 1, akkor ezt a konjugátumot kapjuk abban az esetben is, ha két vagy több szabad aminocsoportot tartalmaz a protein. Az aktivált PEG komponens először a protein részben levő egyik szabad aminocsoporttal reagál. A reagensek (pl. a protein) koncentrációjának és a reakció körülményeinek az aminok standard kondenzációs módszerének megfelelően történő szabályozásával lehet szabályozni a proteinben levő szabad aminocsoportok pegilezési fokát. (Pegilezés = PEG-származék képzés.) Az egy vagy több szabad aminocsoportot tartalmazó proteinek esetében, ahol az első aminocsoport reaktívabb, mint a többi aminocsoport, a körülményeket meg tudjuk választani úgy, hogy aktivált PEG-gel reagálva olyan (I) képletű vegyület keletkezzen, ahol m = 1. A proteint alkotó aminosavakban levő további szabad aminocsoportok tovább reagálhatnak a PEG-gel hosszabb reakcióidő mellett, vagy erősebb reakciókörülményeket alkalmazva. A találmány előnyös megvalósítási módjának megfelelően m = 1 és n egy olyan egész szám, hogy a keletkező konjugátumot létrehozó polietilénglikol molekulatömege 300-30 000 dalton, ami 6-680-as n értéknek felel meg. Különösen előnyös, ha n értéke 28,112 és 225, ami 1325, 5000, illetve 10 000 molekulatömegnek felel meg, a legelőnyösebb az η 112-es tartománya.
A polietilénglikol polimer molekulatömeggel történőjellemzése előnyösebb a PEG polimerben ismétlődő egységeknek ay „n számmal történő megjelölésénél, minthogy a kiindulási PEG-vegyületek potenciálisan inhomogének; ezeket a kiindulási PEG-vegyületeket általában átlagos molekulatömegükkel jellemzik, nem pedig az ismétlődő egységekkel. A különböző molekuiatömegű kiindulási PEG-vegyületek ismert módszerekkel állíthatók elő, vagy kereskedelmi forrásokból szerezhetők be.
Abban az esetben, amikor m és n értékeinek a molekulatömegből történő meghatározásakor nem egész számot kapunk, akkor szokásos módon le- vagy felkerekítünk.
Ha R4 alacsony alkilcsoportként definiált, akkor 1-6 szénatomot tartalmaz. Ha R5 cikloalkilcsoport, R5 előnyösen 3-7 szénatomos, mint ciklopropil-. ciklopentil-, ciklobutil- és ciklohexilcsoport. Az előnyös cikloalkilcsoport a ciklohexilcsoport.
A találmány szerinti komponensek neveit az alábbi példákban az IUPAC nómenklatúra szerint adtuk meg. Ezen komponensek azonban az alábbiak szerint is megadhatók:
7., 2., 3. és 4. példa:
Alfa[2-[(ciklohexil-karbonimidoil)-amino]-etil]-omegametoxi-poli(oxi-l,2-etándiil), más néven alfa[2-[[(ciklohexil-amino)-metilén]-amino]-etil]-omega-metoxipoli(oxi-1,2-etándiil).
1A., la. és ld. példa
Alfa-(2-klóretil)-omega-metoxi-poli(oxi-l,2-etándiil), más néven alfa-metoxi-omega-(2-klóretil)-poli(oxi-l,2-etándiil).
1„ Jb. és le. példa
Alfa-(2-azidoetil)-omega-metoxi-poli(oxi-1,2-etándiil ), más néven alfa-metoxi-omega-(2-azidoetil)polif oxi-1,2-etándiil).
IC., le. és If. példa
Alfa-(2-aminoetill-omega-metoxi-poli{oxi-l ,2etándiil), más néven alfa-metoxi-omega-(2-aminoetil)-poli(oxi-l,2-etándiil).
11., 11a., 11b., 12. 12A. és 13-17. példa
Alfa-metil-omega[2-[l(2-piridiniloxi)-karbonil]amino]-etoxi]-poli(oxi-l,2-etándiil), más néven alfa-[2-[[(2-piridiniloxi)-karbonil]-amino]-etil]omega-metoxi-poli(oxi-l,2-etándiil).
18., 18a., 19., 19A„ 20., 20A„ 21. és 22. példa
Alfa-l(2-piridiniloxi)-karbonil]-omega-metoxi-poIi(oxi-l,2-etándiil), más néven alfa-metoxi-omega[2-[[(2-piridiniloxi)-karbonil]-etoxi]-poli-(oxi-I,2etándiil).
HU 211 945 A9
23-27. példa
Alfa-I2-(izo-tio-cianáto)-etil]-omega-metoxi-poli(oxi-],2-etándiilj, más néven alfa-[metoxi-omega[2-< izo-tio-cianáto)-etil ]-poli( oxi-],2-etándiil).
28. példa
Alfa-[(2-piridiniloxi)-tiokarbonil]-omega-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil), más néven alfa-metil-omegal2-[[ (2-piridiniloxi)-tiokarbonil ]-oxi ]-etoxi ]-poli(oxi-I,2-etándiil).
A jelen találmány vonatkozik az (I) általános képletű vagy az (I-A)-(I-E) képletű PEG-protein konjugátumok előállítására, mely során valamely II-A, Π-Β, II-C, II-D, II—E, II—F vagy II-G általános képletű aktivált vegyületet - ahol R1, R5 és n a fentiek szerint definiált - valamely fehérje vagy sója szabad aminocsoportjával reagáltatunk, és a reakcióelegyből a keletkezett protein konjugátumot izoláljuk.
Részletesen, a proteinnel összekapcsolandó egyedi PEG-származékok szintézise, valamint ezek reakciója a proteinekkel végrehajtható az alábbiakban és a példákban leírtak szerint.
Az olyan protein konjugátumok előállítására, ahol R2 jelentése -NH- és R3 jelentése =N-R4 (I-A képletű vegyület) előállítása a Reakcióvázlat I. alapján történhet, ahol R1, R4, n, m és a protein jelentése a fenti.
Ebben a reakciósorban a PEG molekula végén levő hidroxicsoportot tionilhalogeniddel kezelve hagyományos módon halogéncsoporttá alakítjuk. A kapott PEG halogenidet aziddá alakítjuk nátriumaziddal kezelve. A PEG azidot hidrogénezéssel aminná alakítjuk. A PEG amin származékát alkil- vagy cikloalkil-izo-tio-cianáttal. így ciklohexil-izo-tio-cianáttal reagáltatva (III) képletű tiokarbamiddá alakítjuk, melyet hagyományos módon deszulfurizáljuk és így II-A képletű vegyületté alakítjuk, mely karbo-diimid funkciós csoportot tartalmaz. A III képletű tiokarbamid átalakításakor a II-A képletű PEG karbo-diimiddé a deszulfurizáló ágens előnyösen trifenil-foszfin.
A II-A képletű PEG karbo-diimid proteinnel kondenzálható olyan körülmények között, mint ahogy általában szokásos a karbo-diimidek aminokkal történő kondenzációja során. Általában ezt a reakciót 7-9 közötti pH-jú standard vizes pufferben lehet végrehajtani és így az I-A képletű konjugátum terméket kapunk. A koncenzációs reakció eredményeképpen különböző móltömegű PEG protein konjugátumok keverékét kapjuk, a proteinben levő szabad aminocsoportok számától. illetve a reakcióidőtől függően. A PEG protein konjugátumok elválaszthatók egyedi komponensekre hagyományos módszerekkel, így HPLC vagy gélelektroforézis segítségével.
Az olyan protein konjugátumok. melyekben R2 jelentése -0- és R3 jelentése =S (IB képletű vegyület) a Reakcióvázlat II. alapján állítható elő, ahol R', m, n és a protein a fenti. Ebben a reakcióban a PEG-t magas forrásponté szénhidrogén oldószerben, 1,1-karbonotioil-bisz-2( 1 H)-piridinonnal refluxáljuk és így II—B képletű vegyületet kapjuk. A II—B képletű vegyület kondenzálható a protein egy vagy több szabad aminocsoportjával, amikor is I-B képletű konjugátumot kapunk, hasonló módon, mint II-A képletű vegyület és egy protein I-A képletű vegyületek keverékét eredményező kondenzációjánál leírtuk. A kapott keverék szétválasztását a képződő termékek molekulatömege alapján, a korábbiakban leírt módon végezhetjük el.
Alternatív módon olyan találmány szerinti konjugátumok, ahol R2 jelentése -O- és R3 jelentése =S (I-B képletű vegyület) a Reakcióvázlat ΙΠ. alapján állítható elő, ahol R1, m, n és a protein a fenti. Ennek a reakcióútnak megfelelően a PEG-et VI képletű tiokarbonáttal reagáltatjuk szerves oldószerben és így II-F képletű PEG tiokarbonátokat nyerjük. A tiokarbonátok hidroxicsoporttal végzett szokásos kondenzációját alkalmazhatjuk ezen reakcióban, önmagában ismert módon.
A II—F képletű vegyület átalakítható I-B képletű konjugátummá a II—F képletű vegyületet kondenzáltatva legalább egy szabad aminocsoportot tartalmazó proteinnel. A reakció oly módon valósítható meg, mint ahogy a Π-A képletű vegyület átalakítása történt I-A képletű konjugátummá. A reakció során keletkező termék különböző móltömegű konjugátumok keveréke, az alkalmazott proteinben levő szabad aminocsoportok számától függően. A konjugátumok molekulatömeg alapján szokásos módon, mint korábban említettük, szétválaszthatok.
Az olyan protein konjugátumok, ahol R2 jelentése -NH- és R3 jelentése =0 (I-C képletű vegyület) a Reakcióvázlat IV. szerint állíthatók elő, ahol R1, R5, m, n és a protein a fenti.
A IV képletű vegyület foszgén és 2-hidroxi-piridin kondenzációjával állítható elő (szubsztituált, ha R5 jelentése alacsony alkil) oly módon, ahogy egy savhalogenid és egy alkohol kondenzációját hagyományosan szokásos végezni.
A PEG amin és a IV képletű vegyület kondenzációja reflux mellett, halogénezett szénhidrogén oldószerben történik és így a II-C képletű vegyületet eredményezi. AII-C képletű vegyületet proteinnel kondenzáltatjuk a protein egy vagy több aminocsoportján keresztül és így az I-C képletű vegyületet kapjuk. Ezt a reakciót oly módon végezzük, ahogy a Π-A képletű vegyület I-A képletű konjugátummá történő kondenzációja történt. A Π-C vegyülettel reagáltatott proteinben levő szabad aminocsoportok számától függően különböző molekulatömegű konjugátumok keverékeként kapjuk az I-C képletű konjugátumot. A konjugátum keverék a már említett módon szétválasztható.
A találmány szerinti olyan konjugátumok, ahol R2 jelentése -NH- és R3 jelentése =S (I-D képletű komponens) a Reakcióvázlat V. szerint állíthatók elő, ahol R1, m, n és a protein a fenti.
Ezen reakciósorban a PEG amint reagáltatjuk di-2piridil-tiono-karbonáttal és így II-D képletű vegyületet kapjuk. Az amin és a tiokarbonát reakciója során az izo-tio-cianátok előállítása céljából szokásosan alkalmazott módszert lehet használni. A II-D képletű vegyületet proteinnel reagáltatva I-D képletű konjugátumot kapjuk oly módon, mint ahogy az I-A képletű vegyület II-A képletű vegyület kondenzációjával törté4
HU 211 945 A9 nő előállításánál leírtuk. Attól függően, hogy a Il-D képletű vegyület kondenzációjánál alkalmazott protein mennyi szabad aminocsoportot tartalmaz, konjugátumok keverékét kapjuk, melyek egyedi konjugátumokra választhatók a már említett módszerrel.
Alternatív módon az I-D képletű vegyület a Reakcióvázlat VI. szerint is előállítható.
Az V képletű vegyület tiofoszgén és 2-hidroxi-piridin kondenzációjával állítható elő (szubsztituált, ha R5 jelentése alacsony alkil) olyan módszert alkalmazva, ahogy hagyományosan szokták a savhalogenidet és alkoholt kondenzáltat™ egymással. Az V képletű vegyületet PEG-aminnal reagáltatjuk úgy, ahogy a Π-C komponens előállításánál leírtuk. II-E képletű vegyület keletkezik. A II—E képletű vegyületet egy protein egy vagy több aminocsoportjával kondenzáltatjuk és így I-D képletű konjugátumot kapjuk. A reakciót az I-A konjugátum előállításánál leírt módon végezzük.
A találmány szerinti olyan konjugátumokat, ahol R2 jelentése -O- és R3 jelentése =0 (I-E képletű vegyület) a Reakcióvázlat VII. szerint lehet előállítani, ahol R1, m, n és a protein a fenti.
A reakcióvázlat szerint di-2-piridil-karbonátot PEG-gel reagáltatjuk és így II-G képletű terméket nyerjük. A reakció az alkoholok karbonátokkal végzett kondenzációjának szokásos körülményei között végezhető el. A II-G képletű vegyületet I-E képletű vegyületté alakítjuk oly módon, hogy a II-G képletű vegyületet egy protein egy vagy több szabad aminocsoportjával kondenzáltatjuk. A reakciót a szokásos módon lehet kivitelezni, a II-A képletű vegyületnek az I-A képletű vegyületté történő alakításával analóg módon. Az ily módon kapott reakcióelegy a fehérjében levő szabad aminocsoportoktól függően a konjugált I-E képletű vegyületek keverékét tartalmazhatja. A keverékből a különböző konjugátumokat a korábban leírt eljárással választhatjuk szét.
A találmány szerinti interferon-alfa PEG konjugát a Reakcióvázlat VIII. szerint állítható elő, ahol R1 jelentése metilcsoport, n értéke 112 körüli szám. Ez a reakció különösen fontos az interferon-alfa egy altípusa, az interferon-alfa A (interferon-alfa-2-nek is nevezik) esetében.
A II—C képletű aktivált PEG szintézisét leírtuk az olyan konjugátok szintézisénél, ahol R2 jelentése -NHés R3 jelentése =0. Az interferon-alfa végső konjugátjának előállítása a korábbiakban leírtakkal analóg módon végezhető, illetve oly módon, ahogy az I-C képletű protein konjugát előállítási példái ismertetik.
Bármely fiziológiai aktivitással rendelkező protein vagy annak sója alkalmas PEG konjugát előállítására, mely legalább egy szabad aminocsoportot tartalmaz a kondenzációhoz.
Előnyösen proteinek, melyek a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók, az interleukin-1 (IL-1), interleukin-1 receptor antagonista (IL-lra), interleukin-2 (IL-2) és interferonok, úgy mint IFN-alfa (leukocita interferonok), IFN-béta (fibroblast interferon) és IFNgamma (immun interferon), ezek természetben előforduló formái, valamint analógjai, homológjai, illetve ezek fragmensei.
Az interleukon-1 receptor antagonista (IL-lra) sejttenyészetekből vagy rekombináns módszerekkel nyerhető. Az IL-lra egyik előállítási eljárása szerint U937 humán mielomonocitikus sejteket (ATCC CRL 1594) forbol-mirisztát-acetát (PMA) differenciáló szerrel kezelünk, a sejteket granulocita makrofág telep stimuláló faktorral (GM-CSF; Amgen-től szerezhető be) stimuláljuk, majd az IL-lra-t a sejttenyészet felülúszó folyadékából a Carter és tsai által leírt módon [Natúré 344, 633-637 (1990)] izoláljuk és tisztítjuk.
A rekombináns IL-lra az IL-lra hivatkozik, a natív IL-lra-hoz hasonló biológiai aktivitást mutat, azonban rekombináns módszerekkel állítják elő [lásd Carter és mtsai fent idézett közleménye, vagy Eisenberg és tsai: Natúré 343, 341-346 (1990)].
Az interferonok különböző típusai, mint alfa, béta, gamma és ómega interferonok, ezek típusai és altípusai tartoznak az interferonokhoz. Az interferonok sejtekből, sejtkultúrákból nyerhetők, rekombináns technikával előállíthatók, amit többek között az EPA, Publ. No. 43 980 helyen ismertetnek. Egyéb módszerek is jól ismertek az előállítására, kinyerésére a természetes vagy rekombináns interferonoknak.
A találmány szerinti protein konjugátumok ugyanolyan felhasználásra alkalmasak, mint azok a proteinek, melyekből előállítottuk. A konjugátumok terápiásán hasonlóan aktívak és alkalmazhatók, mint az előállításukhoz használt proteinek, az immun hatások jelentkezése nélkül. A találmány részét képezik az (I) képletű vegyületeken és ezek sóin alapuló gyógyszerkészítmények, illetve ezek előállítási eljárása.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények, melyek az (I) általános képletű protein konjugátumot és terápiásán inért, nem toxikus és terápiásán alkalmazható vivőanyagot tartalmaznak, alkalmasak betegségek megelőzésére vagy kezelésére. A gyógyszerkészítmények előállítása, formálása, a dozírozás, az egyes betegek kezelése a gyakorlatból jól ismert módon történik, a GMP (good medical practice) előírásainak megfelelően. Az alkalmazandó dózis a kezelendő beteg állapotától, a fehérje-konjugátum szervezetbe juttatásának helyétől, az adagolás módjától és a gyakorló orvos által jól ismert más tényezőktől függ.
Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk.
1. példa
Ct.-[2-[l(cik.lohexilkarbonimidoil)-amino]-etil]-tí)metoxipoli(oxi-l,2-elándiil) SRU 111.7 készítése.
A. a-(2-klóretil)-(ü-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil),
SRU 111.7 készítése (Az SRU ebben a leírásban a PEG polimer önismétlő egységeinek számát jelenti.) g MPEG-et (metoxipolietilénglikol, molekulasúlya 5000) 700 ml toluolban szuszpendálunk, és az oldószerből 200 ml-t ledesztillálunk. Az oldathoz reflux közben cseppenként 0,8 ml száraz piridint és 2,2 ml tionilkloridot adunk. Az elegyet további 4 órán
HU 211 945 A9 át forraljuk, majd egy éjszakán át kevertetjük. Ezután az oldószert lepároljuk, és a maradékhoz 500 ml CH2Cl2-l adunk. Az így nyert oldatot vízmentes KjCOrta! szárítjuk és átvezetjük 50 g bázikus alumíniumoxidon (Wolem Super I). A diklórmetán nagy részét enyhe vákuumban lepároljuk, és a kapott sziruphoz 1 liter dietilétert adunk. Ledesztilláljuk az étert, és a maradékhoz újabb adag étert adunk, aminek hatására csapadék keletkezik. Az elegyet két órán át szobahőmérsékleten keverjük, azután szűrjük. 45 g a-(2-klóretil)-(ű-metoxipoli-(oxi-1,2-etándi i 1) SRU 111.7-et kapunk.
Analízis: C3H7C10(CH2CH20)|i17 számított C: 53,97, H:9,12, Cl: 0,71;
talált C: 54,21, H: 8,70, Cl: 0,71.
B. a-(2-azidoeti!)-(ü-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil),
SRU 111. 7 készítése g nátriumazidot és 50 g a-(2-klóretil)-ü>-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et 375 ml száraz DMF-ben 120-125 “C-ra melegítünk. 7 óra után az oldószert nagyvákuumban lepároljuk. A maradékot 500 ml diklórmetánban oldjuk és diatómaföldön megszűrjük. A diklórmetán nagy részét lepároljuk és dietilétert adunk az elegyhez, aminek hatására csapadék válik ki. Az elegyet egy éjszakán át kevertetjük, majd szűrjük. A szüredéket minimális mennyiségű etilénglikol dimetiléterben oldjuk 50 °C-on. lehűtjük, és a kivált csapadékot kiszűrjük. A termék oc-(2-azidoetil)-a>metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7.
Analízis: C?H3N3O(CH2CH2O),,, 7 számított C: 53.77,' H: 9.09 N; 0,84;
talált C: 53,61, H: 9,08, N: 0,89.
C. a-t2-aminoetil)-io-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil),
SRU IJ1.7készítése g a-(2-aminoetil)-to-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et 250 ml száraz etilénglikol dimetiléterben felszuszpendálunk és hozzáadunk 3,5 g 10% Pd/Cet. Az elegyet hidrogénnel megnyomatjuk 50 psi nyomásra, és 50 “C-on 18 órán át rázatjuk. Ezután az elegyet szűrjük, a szüredéket diklórmetánnal kimossuk, és az egyesített oldatokat enyhe vákuumban bepároljuk. A maradékot 100 ml meleg etilénglikol dimetiléterben oldjuk. Hűtésre a termék kiválik, ezt szűrjük és vákuumban melegítve megszárítjuk. 23 g a-(2-aminoetil)tú-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et kapunk.
Analízis: C3H9NO(CH2CH2O)|n 7 számított C: 54,43, H: 9,20, N: 0,20;
talált C: 54.43, H:9,18, N: 0,36.
Egy másik módszer szerint 40 g a-(2-azidoetil)-o>metoxipoli(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et és 6,7 g (225,6 millimól) trifenilfoszfint 200 ml száraz diklórmetánban oldunk és argon atmoszférában egy éjszakán át keverünk. 2 ml vizet adva az elegyhez, további 12 órán át kevertetjük. A diklórmetán nagy részét vákuumban lepároljuk és a maradékot 400 ml dietiléterben felvesszük. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk és feloldjuk 300 ml meleg (50 ’C-os) etilénglikol dimetiléterben. Az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk másnapig, a csapadékot szűrjük, a szűrőn 2x100 ml etilénglikol dimetiléterrel és 2x100 ml dietiléterrel mossuk, végül nitrogénáramban vákuum-szárítószekrényben szárítjuk, A termék 35 g a-(2-aminoetil)-o> metoxipoli-(oxi-l ,2-etándiil) SRU 111.7.
D. a-[2-[[(ciklohexilamino)tiokarbonil)amino]etil]-(ü-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil), SRU 111.7 készítése g a-(2-aminoetil)-(ú-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et 60 ml száraz etilénglikol dimetiléterben oldunk 40 ’C-on, hozzáadunk 0,1 ml ciklohexil izotiocianátot és 18 órán át kevertetjük ezen a hőmérsékleten. Az elegyet ezután megszűrjük és az oldószert vákuumban lepároljuk. A maradékot feloldjuk 100 ml meleg etilénglikol dimetiléterben, az oldatot lehűtjük, a kivált csapadékot szűrjük és nagy vákuumban megszárítjuk. A termék 3,5 g a-[2-[[(ciklohexilamino)fiokarbonil]amino]etil-ű)-metoxipoli(oxi1,2-etándiil) SRU 111.7.
Analízis: CI0H20N2OS(CH2CH2O)1,, 7 számított C: 54,25, H: 9,13, N: 0,54, S; 0,62;
talált C: 54,39, H: 8,87, N: 0,55, S: 0,59.
E. a-[2-[/(ciklohexilkarbonimidoil)amino]etil]-(ümetoxipoli(oxi-l,2-etándiil). SRU 111.7 készítése g a(2-[[(ciklohexilamino)tiokarbonil]amino]etil](0-metoxipob-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et, 120 mg trifenilfoszfint, 90 μΐ széntetrakloridot és 84 μΐ trietilamint 5 ml száraz diklórmetánban refluxáltatunk 72 órán át. Az oldószert vákuumban lepároljuk, és a maradékot minimális mennyiségű száraz etilénglikol dimetiléterben oldjuk. A hűtésre kiváló terméket szűrjük és vákuumban szárítjuk. A termék a-[2-[[(ciklohexilkarbonimidoil)amino]etil]-iú-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7.
Analízis: Cl0H18N2O(CH2CH2O)1i17 számított C: 54,61. H:9,15, N: 0,55, S: 0,62;
talált C: 54,95. H: 9,27, N: 0,50.
la. példa a-(2-klóretil)-<ű-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil), SRU
225 készítése
Az 1A. példában leírt eljárás szerint a-(2-klóretil)(ü-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 225-öt állítunk elő 10 000-es molekulasúlyú MPEG-ből.
Analízis: CjH7C1O(CH2CH2O)225 számított C: 54,37, H: 9,14, Cl: 0,35;
talált C: 54,30, H:9,15, Cl: 0,41.
lb. példa a-(2-azidoetil )-(a-metoxipoli( oxi-l,2-etándiil),
SRU 225 készítése
Az 1B. példában leírt eljárás szerint a-(2-azidoetil)-0)-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 225-öt állítottunk elő a-(2-klóretiI)-o>metoxipoJi-(oxi-l,2-etándiil) SRU 225-ből.
Analízis: C3H7N3O(CH2CH2O)225 számított C: 54,34, H:9,13, N: 0,42;
talált C: 54,32, H: 9,28, N: 0,50.
HU 211 945 A9 le. példa a-(2-aminoetil)-(ü-metoxipoli(oxi-1,2-etándiil),
SRU 225 készítése
Az IC. példában leírt eljárás szerint a-(2-aminoetil)-cú-metoxipoli-(oxi-],2-etándiil) SRU 225-öt állítottunk elő a-(2-azidoetil)-(ú-metoxipoli-( oxi-1,2-etándiil) SRU 225-ből.
Analízis: C3H9NO(CH2CH2O)225 számított C: 54,48. H:9,17, N:0,14;
talált C: 54,80, H: 9,21, N:0,12.
ld. példa
U-(2-klóreliÍ)-(ú-metoxipoli(oxi-1,2-etándiil), SRU
28.3 készítése
0,5 ml frissen desztillált oxalilkloridot 40 ml száraz diklórmetánban oldunk és 0 °C-on cseppenként hozzáadunk 0,5 ml száraz DMF-ot 10 ml diklórmetánban. Az oldatot szobahőmérsékletig melegítjük, 15 percig keverjük és újra 0 °C-ra hűtjük. Hozzáadunk 5,6 g MPEG-et (molekulasúly 1325), és az így kapott oldatot 5 órán át refluxáljuk. Ezután az elegyet vízre öntjük és diklórmetánnal extraháljuk a vizet. A diklórmetános oldatot magnéziumszulfáton szárítjuk, az oldószert vákuumban lepároljuk. A termék 1.7 g a-(2-klóretil)-tömetoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 28.3,
Analízis: C3H7C1O(CH2CH2O)28 3 számított C: 53,38.’ H: 9.03, Cl: 2,64;
talált C: 53.48, H: 9,10, Cl: 2.41.
le. példa
CL-t2-azidoetil)-(ü-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil),
SRU 28.3 készítése
Az 1B. példában leírt eljárás szerint a-(2-azidoetil)-u>metoxipoli-loxi-1,2-etándiil) SRU 28.3-at állítottunk elő a-(2-klóretil)-co-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 28.3-ból.
Analízis: C3H7N3O(CH2CH2O)28 3 számított C: 53,12,’ H: 8.99. N:3.11;
talált C: 53.21. H: 9.07, N: 2,98.
lf. példa
O.-(2-aminoetil)-(ü-metoxipoli(oxi-1,2-etándiií),
SRU 28.3 készítése
Az IC. példában leírt eljárás szerint ot-(2-aminoetil)-cu-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 28.3-at állítottunk elő a-(2-azidoetiI)-o)-metoxipoli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 28.3-ból.
Analízis: C3H9NO(CH2CH2O)28 3 számított C: 54,47, H:9,17, N:0,14;
talált C: 54,44, H: 9,19, N:0,15.
2. példa
PEG-hez kötött rekombináns lnterferon-(t (lFN-a) előállítása a-[2-H(c;klohexilkarbonimidoil)-amino]etil)-u>-meroxipoli(oxi-l,2-etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az 1. példa szerint előállított a-[2-[[(ciklohexilkarbonimidoil)-amino]etil]-(ü-metoxipoli-(oxi-l, 2-etándiil) SRU 111.7-et 10-szeres moláris feleslegben 1 mg, 200 pl pufferoldatban oldott (0,1 M nátrium borát, pH 9) homogén IFN-a-hoz adunk. Az oldatokat összekeverjük és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 percen át hagyjuk végbemenni.
Az INF-α átalakulásának mértékét SDS poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) határoztuk meg (1. táblázat). A fehérjéket Coomassie kék színezékkel tettük láthatóvá. A 60 perces reakció termékei között új, nagyobb molekulasúlyú fehérjék mutathatók ki, amelyek megfelelnek a PEG-hez kötött IFN-a-nak. A reagálatlan IFN-α látszólagos molekulasúlya változatlan, és ezért nem kötődik a PEG-hez. A terméknek, a PEG-hez kötött IFN-a-nak a látszólagos molekulasúlya 28 kD.
1. táblázat
IFN-a módosítása az 1. példa szerinti reagenssel
| IFN fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 15 (módosítatlan) | 80 |
| 28 | 20 |
3. példa
PEG-hez kötött rekombináns lnterleukin-2 (rlL-2) előállítása a-[2-[{(ciklohexilkarbonimidoil)-aminojetil]-ü)-metoxipoli(oxi-],2-etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az 1. példa szerint előállított oc-[2-[[(ciklolhexilkarbonimidoil)-amino]-etil-cu-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et 10-szeres moláris feleslegben 2 mg. 200 pl pufferoldatban oldott (0,1 M nátrium borát, pH 9) rIL-2-höz adunk. Az oldatokat összekevertük, és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 perces át hagytuk végbemenni.
A fehérje átalakulásának mértékét SDS poliakrilamid gél elektroforézissel SDS-PAGE módszerrel határoztuk meg (2. táblázat). A fehérjéket Coomassie kék színezékkel tettük láthatóvá. A 60 percen reakció termékei között új, nagyobb molekulasúlyú fehérjék mutathatók ki. amelyek megfelelnek a PEG-hez kötött rIL-2-nek. A reagálatlan rIL-2 látszólagos molekulasúlya változatlan, és ezért nem kötődik a PEG-hez. A terméknek, a PEG-hez kötött rIL-2-nek a látszólagos molekulasúlya 28 kD.
2. táblázat rlL-2 módosítása az 1. példa szerinti reagenssel
| rIL-2 fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 15 (módosítatlan) | 20 |
| 28 | 50 |
| 33 | 20 |
| 43 | 10 |
A PEG-hez kötött rIL-2-t a reakcióelegyből a Katre és szerzőtársai által leírt (Proc. Nat. Sci. USA, 84 1483-1491, (1987)] hidrofil folyadék-kromatográfiás módszerrel nyertük ki (Bio-Rad; Biogel-phenyl 5-PW). A PEG-hez kötött és módosítatlan rIL-2 elválasztását
HU 211 945 A9 úgy végeztük, hogy 30 percen át lineárisan 1,53 M-róI 0,0 M-ra csökkenő koncentrációjú (ΝΗ4)25Ο4 oldattal eluáltunk: az oldószer 7,0 pH-jú 50 mM-os nátriumfoszfát oldat. A frakciókból vett mintákat SDS-PAGE módszemel elemeztük, majd meghatároztuk az összegyűjtött frakciók fajlagos aktivitását, azzal a CTLL sejtszaporítási teszttel, amelyet Gillis és munkatársai írtak le [J. Immunology 120 2027-2032, (1978)]. A fehérjekoncentrációt spektrofotometriásán határoztuk meg, az rIL-2 extinkciós koefficiensét 280 nm-en 0,667-nek vettük. Az rIL-2 származékok fajlagos aktivitását egység/mg fehérje értékekben a 3. táblázat tartalmazza. Látható, hogy az rIL-2 fajlagos aktivitása nem változott meg jelentősen a PEG-hez való kapcsolás hatására.
3. táblázat
Az 1 példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött rlL-2 bioaktivitása
| rIL-2 fehérje látszólagos | fajlagos aktivitás (egy- |
| mólsúly (kD) | ség/mg) |
| 15 (módosítatlan 112) | 2,0xl07 |
| 28 | 2,4xl07 |
| 4. példa |
A PEG-hez körött rekombináns Interleukin 1-a
IrIL-lo.) előállítása Ct-[2-l[(ciklohexilkarbonimidoil)-amino}eti!]-(ü-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az 1. példa szerint előállított reagenst 10-szeres moláris feleslegben 2 mg, 200 μΐ pufferoldatban oldott (0.1 M nátrium borát. pH 9) rIL-1 α-hoz adunk. Az oldatokat összekeverjük, és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 percen át hagytuk végbemenni.
A fehérje átalakulásának mértékét SDS poliakrilamid gél elektroforézissel SDS-PAGE módszerrel határoztuk meg (4. táblázat). A fehérjéket Coomassie kék színezékkel tettük láthatóvá. A 60 perces reakció termékei között új, nagyobb molekulasúlyú fehérjék mutathatók ki, amelyek megfelelnek a PEG-hez kötött rIL-a-nak. Az rIL-1-α látszólagos molekulasúlya SDSPAGE módszerrel 17 kD. A reagálatlan rIL-1-α látszólagos molekulasúlya változatlan, és ezért nem kötődik a PEG-hez. A terméknek, a PEG-hez kötött rIL-1-αnak a látszólagos molekulasúlya 30 kD.
4. táblázat rIL-l-a módosítása az 7. példa szerinti reagenssel
| rlL-la-fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 17 (módosítatlan) | 85 |
| 30 | 15 |
5. példa a-[( 1,2-Dihidro-2-oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-iümetoxipoliloxi-l,2-etándiil), SRU 111.7 készítése 1 g (0,2 mmól) 5000 molekulasúlyú MPEG-et (metoxipolietilénglikol) 15 ml száraz toluolban oldunk, és ledesztillálunk 5 ml oldószert. Az oldatot lehűtjük, és hozzáadunk 46,5 mg (0,2 mmól) 1,1-karbonotionilbis2(lH)-piridinont. Az elegyet argon atmoszférában 4 órán át refluxáljuk. Ezután az oldószert vákuumban lepároljuk, a maradékot 5 ml száraz etilénglikol-dimetiléterben oldjuk, és másnapig állni hagyjuk. A kivált csapadékot szűrjük, 2x5 ml száraz etilénglikol-dimetiléterrel és 5 ml dietiléterrel mossuk. A terméket ezután vákuumban lassú nitrogénáramban szárítjuk. 0,96 mg a- [ -1,2-dihidro-2-oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-a>-metoxipoli(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et kapunk.
Analízis: C9H i ]NO3S(CH2CH2O)i j ] 7 számított C: 54,37, H: 8,99, N: 0,27, S: 0,62;
talált C; 54,03, H; 8,98, N:0,18, S: 0,59.
5a. példa a-{( 1,2-Dihidm-2-oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil j-(ömetoxipoli(oxi-l,2-etándiil), SRU 225 készítése Az 5. példában leírt eljárással a-[(l,2-dihidro-2oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-ü)-metoxipoli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 225-öt készítünk 10 000-es molekulasúlyú MPEG-ből.
Analízis: C.jHuNCLSfCH^CHiO^? számított C: 54,54, H: 9,08, N:0,14, S: 0,32;
talált C: 54,38, H:9,16, N:0,15, S.0,31.
6. példa
PEG-hez kötött Interleukin 1 receptor antagonista (IL-lra) készítése a-l( 1,2-Dihidro-2-oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-üs-metoxipoli(oxi-l ,2-etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az 5. példában leírt eljárással a-[(l,2-dihidro-2oxo-l-piridinil)-tiokarbonil]-ü>metoxipoli(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et készítünk és 5-szörös moláris feleslegben 10 mg, 1 ml pufferoldatban oldott (0,1 M nátrium borát, pH 9) IL-lra-hoz adunk. Az oldatokat összekeverjük és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 percen át hagyjuk végbemenni.
A fehérje átalakulásának mértékét, SDS-PAGE módszerrel határoztuk meg (5. táblázat). A fehérjéket Coomassie kék színezékkel tettük láthatóvá. A 60 perces reakció termékei között új, nagyobb molekulasúlyú fehérjék mutathatók ki, amelyek megfelelnek a PEGhez kötött IL- Ira-nak. Az IL-lra-α látszólagos molekulasúlya SDS-PAGE módszerre] 19 kD. A reagálatlan rIL-l-oc látszólagos molekulasúlya változatlan, és ezért nem kötődik a PEG-hez.
A főterméknek, a PEG-hez kötött IL-l-ra-nak a látszólagos molekulasúlya 26 és 33 kD.
5. táblázat
IL-l-ra módosítása az 5. példa szerinti reagenssel
| IL-1 ra-fehétje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 19 (módosítatlan) | 36 |
| 26 | 33 |
| 33 | 21 |
| >33 | 10 |
HU 211 945 A9
A PEG-hez kötött IL-lra-t a reakcióelegyből hidrofób folyadék-kromatográfiás módszerrel nyertük ki (Bio.Rad; HRLC MP7 HIC). A PEG-hez kötött és módosítatlan IL-lra elválasztását úgy végeztük, hogy 20 percen át lineárisan 0,43 M-ról 0,0 M-ra csökkenő koncentrációjú (NH4)2SO4 oldattal eluáltunk; az oldószer 7,0 pH-jú 50 mM-os nátriumfoszfát oldat. A frakciókból vett mintákat SDS-PAGE módszerrel elemeztük, majd az összegyűjtött frakciókat azzal az IL-1 radioreceptor kötődési teszttel jellemeztük, amelyet Kilián és munkatársai írtak le [J. Immunoi., 736, 4509-4514, (1986)]. Ennek lényege, hogy különböző koncentrációjú IL-lra és PEG-IL-lra oldatokat EL-4 membrán jelenlétében 30 percig 37 °C-on inkubáltunk, ezután [125I]IL-1 ’α-t adtunk az elegyhez és további 30 percig inkubáltuk. Végül vákuumban szűrtük, és a szűrőről összegyűjtöttüK a sejtekhez kötött [125I]IL-1 -et. Grafikusan meghatároztuk azt az IL-lra vagy PEG-IL-lra koncentrációt, amely a [,25I]IL-1 kötődését 50%-bán meggátolja (IC50). Az eredményeket a 6. táblázat tartalmazza. E szerint a mérés szerint az IL-lra ILC50 értéke 1-2,0 ng/ml. A PEG-IL-lra keverék a módosítás nélküli IL-lra-hoz képest 2-3szoros értéken belül kötődik az EL-4 membrán IL-1 receptoraihoz.
6. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra gátló hatása [12!iI]IL-] kötődésére
IL-lra-fehérje látszólagos [ molekulasúlya (kD) > 1C5O (ng/ml)
| í 19 (módosítatlan) | 2,0 |
| [ 26K. 36K (keverék) | 5,0 |
Az IL-lra farmakodinamikáját in vivő mértük, éspedig azzal, hogy mennyire képes megakadályozni az rIL-la-t abban, hogy megindítsa az interleukin-6 szintézisét. rIL-la-val kezelt egerekből nyert szérum IL-6 tartalma magas [Mclntosh et al., Immunoi. 143: 162-167, (1989)]. Ha az IL-la-val együtt módosítatlan IL-lra-t adagolunk (0. óra időpont), az meggátolja az IL-6 szintézisét. Ezt a tesztrendszert használtuk a módosítatlan és a PEG-hez kötött ILlra összehasonlítására. Nőstény C57B1/6 egerek hármas csoportjai szubkután injekció formájában 200 gg módosítatlan IL-lra-t vagy PEG-IL-lra-t kaptak, majd 48, 24, vagy 6 óra múlva vagy egyidejűleg 0,2 gg rIL-la-t. Az IL-6 szintet egy, az irodalomból ismert meghatározás variánsával mértük [Van Snick et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9679-9683, (1986)]. Az IL-6 meghatározása során B9 hibridóma sejteket kezeltünk kétszeres hígítású vizsgálandó szérummal 96 férőhelyes mikrotitráló készülékben. 3 napon át 37 °C-on inkubáltuk 95% levegőt és 5% COi-t tartalmazó nedves atmoszférában. ezután a küvettákba 0,5 gCi triciált timidint adtunk és további 18 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket üveggyapoton kiszűrtük, és meghatároztuk a triciált timidin beépülését szcintillációs számlálással. Az IL-6 aktivitást U/ml értékben fejeztük ki. Az IL-6 egység definíció szerint annak a szérumhígítási értéknek az inverze, amely mellett a referencia standardhoz képest fele mennyiségű triciált timidin épül be.
A farmakodinamikai adatokat a Dl. táblázat tartalmazza. A kizárólag IL-1 -gyei kezelt egerek IL-6 értéke 28 852 U/ml volt. A módosítatlan és a módosított IL-1 ra egyaránt meggátolta az IL-6 képződést a 0. órában. A PEG-IL-lra inhibitor hatása azonban még 8 és 24 óra múlva is jelentős volt, szemben a módosítatlan IL-lra-val.
Dl. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra farmakodinamikai profilja
| Idő (óra) | IL-6 (U/ml) | |
| az IL-1 adagolása előtt | 19 kD | 26 kD |
| 0 | 772 | 705 |
| 6 | 8 361 | I 587 |
| 24 | 22 525 | 9 844 |
| 48 | 18 485 | 21 119 |
| 72 | 13 220 | 21 470 |
6A. példa
PEG-hez kötött Interleukin 1 receptor antagonista (IL-lra) készítése a-[(l,2-Dihidro-2-oxo-l-piridinil)-tiokarbonil]-tü-metoxipoli(oxi-1,2-etándiil), SRU 225 reagenssel
Az IL-lra-t a 6. példában leírt módon, az 5a. példában leírt reagenssel kapcsoltuk a PEG-hez és tisztítottuk meg.
A főtermék PEG-IL-lra, látszólagos molekulasúlya 33 kD és 48 kD. Arányuk a reakcióelegy fehérjetartalmában 46, illetve 27%.
Ezen fehérjéknek az IL-1 kötődését gátló képességét (a 6. példa értelmezése szerint) a 7. táblázatban foglaltuk össze. A 33 kD mólsúlyú PEG-IL-lra-nak az IL-1 kötődését gátló képessége mintegy hatszorosa a módosítatlan IL-lra értékének. A PEG tartalom további növekedése, mint azt a 48 kD mólsúlyú fehérje példája mutatja, gátolja az IL-lra kötődését az IL-1 receptorokhoz.
7. táblázat
Az 5a. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra gátló hatása [!251]IL-1 kötődésére
| IL-1 ra-fehéije látszólagos molekulasúlya (kD) | 1C5O (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 1,6 |
| 33 | 9,0 |
| 48 | 50,0 |
A PEG-IL-lra farmakokinetikai profiljának meghatározása érdekében C57BF/6 egereket 100 μgnenynyiséggel szubkután kezeltünk. A módosítatlan IL9
HU 211 945 A9 lra-val kezelt egerekből 1, 2, 3, 4, és 6 óra után, a PEG-IL-lra-val kezeitektől pedig 2, 4, 8, 10 és 24 óra után vettünk szérummintát. A szérumszintet a 6. példában leírt EL4 membrános módszerrel határoztuk meg. Az eredményeket a D2. táblázat tartalmazza. A PEG-IL-lra a szérummintákban az IL-lra-hoz képest nagyobb koncentrációban és hosszabb ideig volt kimutatható, és ez hosszabb szérumidőre utal.
D2. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra farmakokinetikai profilja a 6a. példa szerint
| Idő (óra) az | IL-1 ra szérum koncentráció | |
| adagolás után | 19 kD | 33 kD |
| 1 | 400 | |
| 2 | 130 | 2500 |
| 40 | ||
| 4 | 15 | 800 |
| 6 | 16 | — |
| 8 | 300 | |
| 10 | 250 | |
| 24 | _ | 15 |
7. példa
PEG-hez kötött rIL-l-a készítése a-[( l ,2-dihidro2-oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-(0-nietoxipoli(oxi1,2-etándiil), SRU 111.7 reagenssel
A rekombináns IL-la-t az 5. példában leírt reagenssel, a 4. példában leírt módon kapcsoltuk a PEGhez. SDS-PAGE módszerrel háromféle főterméket különböztettünk meg, látszólagos molekulasúlyuk 17 (módosítatlan anyag), 26 és 33 kD. Ezen két utóbbi, PEG-hez kötött fehérjék aránya az összes fehérjetartalom 25, illetve 55%-a.
A PEG-hez kötött IL-lra-t a reakcióelegyből 60 perc után hidrofób folyadék-kromatográfiás módszerrel nyertük ki (Bio.Rád; HRLC MP7 HIC). A PEGhez kötött és módosítatlan IL-lra elválasztását úgy végeztük, hogy 20 percen át lineárisan 0,43 M-ról 0,0 M-ra csökkenő koncentrációjú (NH4)2SO4 oldattal eluáltunk; az oldószer 7,0 pH-jú 50 mM-os nátriumfoszfát oldat. A frakciókból vett mintákat SDSPAGE módszerrel elemeztük, majd az összegyűjtött frakciókat D10. sejtszaporodási teszttel jellemeztük, amelyet Kaye és munkatársai írtak le [J. Exp. Med., 158, 836-854 (1983)]. A fehérjekoncentrációt spektrofotometriásán határoztuk meg 280 nm-en, az rlLla extinkciós koefficiensét 1-nek vettük. Az rIL-la fajlagos aktivitása körülbelül Ι,ΟχΙΟ8 egység/mg. A fajlagos aktivitásokat a 8. táblázat tartalmazza. A 26 kD mólsúlyú PEG-IL-Ια biológiai aktivitása az IL-la-hoz képest 2-3-szoros értéken belül marad. A PEG tartalom további, 33 kD mólsúlyú fehérjét eredményező növelése a biológiai aktivitás jelentés csökkenésével jár.
8. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött rIL-la bioaktivitása
| rIL-Ια fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egység/mg) |
| 17 (módosítatlan) | 4,6xl07 |
| 26 | l,9xl07 |
| 33 | 4,5x106 |
8. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-[(l,2-dihidro-2oxo-I-piridinil)-tiokarbonil]-üy-metoxipoli(oxi-1,2etándiil), SRU II 1.7 reagenssel
Az 5. példában leírt eljárással a-[(l,2-dihidro-2oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-o>metoxipoli(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et készítünk és 8-szoros moláris feleslegben 1 mg, 100 μΐ pufferoldatban oldott (0,1 M nátrium borát, pH 9) tisztított IFN-a-hoz adunk. Az oldatokat összekeverjük, és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 percen át hagyjuk végbemenni.
SDS-PAGE módszerrel két fő molekulasúly mutatható ki; 15 (módosítatlan) és 28 kD. A 28 kD mólsúlyú PEG-IFN-α a teljes fehérjemennyiség 40%-a.
A PEG-hez kötött IFN-a-t a reakcióelegyből 60 perc után kinyertük, és hidrofób folyadék-kromatográfiás módszerrel minősítettük (Bio-rad; Biogel-phenyl-SPW). A PEG-hez kötött és módosítatlan BL-lra elválasztását úgy végeztük, hogy 20 percen át lineárisan 0,42 Mról 0,0 M-ra csökkenő koncentrációjú (NH4)2SO4 oldattal eluáltunk; az oldószer 7,0 pH-jú 50 mM-os nátriumfoszfát oldat. A frakciókból vett mintákat SDS-PAGE módszerrel elemeztük, majd az összegyűjtött frakciókat fajlagos vírusölő aktivitásukkal jellemeztük, a Familletti és munkatársai által leírt MDBK teszt alapján [Methods Enzym. 78, 387-394 (1987)].
A fehérjekoncentrációt spektrofotometriásán határoztuk meg 280 nm-en, az 1 mg/ml koncentrációjú IFN-oc extinkciós koefficiensét 1-nek vettük. A fehérjék fajlagos aktivitásait egység/mg fehérje mértékegységben a 9. táblázat tartalmazza.
Az eredmények azt mutatják, hogy a 28 kD mólsúlyú PEG-IFN-α aktivitása nem változott jelentősen a módosítatlan IFN-a-hoz képest.
9. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött IFN-a bioaktivitása
| IFN-α fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egység/mg) |
| 15 (módosítatlan) | Ι,ΙχΙΟ8 |
| 28 | l,4x!08 |
8A. példa
PEG-hez kötött IFN-ct készítése a-[(l,2-dihidro-2oxo-1 -piridinil)-tiokarbonil]-tís-metoxipoli(oxi-l ,2etándiil), SRU 225 reagenssel
Az IFN-a-t a 8. példában leírt reagenssel, az 5a. példában leírt módon kapcsoltuk a PEG-hez. SDS10
HU 211 945 A9
PAGE módszerrel háromféle főterméket különböztettünk meg, látszólagos molekulasúlyuk 15 (módosítatlan anyag), 35 és 43 kD. Ezen két utóbbi, PEG-hez kötött fehérjék aránya az összes fehérjetartalom 35, illetve 33%-a.
A PEG-IFN-α fajlagos aktivitásait a 8. példában leírt módon határoztuk meg, és az eredményeket a 10. táblázat tartalmazza. Az eredmények azt mutatják, hogy a 35 kD mólsúlyú PEG-IFN-α biológiai aktivitása 2-3-szoros értéken belül marad az IFN-a-hoz képest. A PEG tartalom további, 43 kD mólsúlyú fehérjét eredményező növelése a biológiai aktivitás lényeges csökkenését eredményezi.
10. táblázat
Az 5a. példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött IFN-a bioaktivitása
| IFN-α fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egység/mg) |
| 15 (módosítatlan) | 3,3x108 |
| 35 | ],2xlO8 |
| 43 | l,5xlO7 |
8B. példa
PEG-hez kötött ríL-2 készítése a-[( l,2-dihidro-2oxo-1 -piridinil )-tiokarbonil ]-(ü-metoxipoli(oxi-1,2etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az rIL-2-t a 3. példában leírt módon, az 5. példában leírt reagenssel kapcsoltuk a PEG-hez és tisztítottuk meg.
SDS-PAGE módszerrel két fő molekulasúly mutatható ki: 15 (módosítatlan) és 25 kD. A 25 kD mólsúlyú PEG fehérje a teljes fehérjemennyiség 60%-a.
Az rIL-2 fehérjék fajlagos aktivitását a 3. példában leírt módon határoztuk meg. Az eredményeket egység/mg értékben kifejezve all. táblázatban foglaltuk össze.
Látható, hogy az IL-2 biológiai aktivitása nem változott a PEG-hez való kapcsolás hatására.
11. táblázat
Az 5. példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött rlL-2 bioaktivitása
| rIL-2 fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egyég/mg) |
| 15 (módosítatlan) | 2,0x107 |
| 25 | 2,0x107 |
8C. példa
PEG-hez kötött rlL-2 készítése a-[(l,2-dihidro-2oxo-1 -piridinil )-tiokarbonil ]-(£>-metoxipoli(oxi-1,2etándiil), SRU 225 reagenssel
Az rIL-2-t a 3. példában leírt módon, az 5a. példában leírt reagenssel kapcsoltuk a PEG-hez és tisztítottuk meg.
SDS-PAGE módszerrel három fő molekulasúly mutatható ki: 15 (módosítatlan), 33 és 43 kD. Utóbbiak a teljes fehérjemennyiség 60, illetve 20%-át teszik ki.
9. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-[(l,2-dihidro-2oxo-l-piridinil)-tiokarbonil]-(á-metoxipoli(oxi-l,2etándiil), SRU 111.7 reagenssel
Az IFN-a a PEG-hez egy másik módszerrel is kapcsolható, az alábbiak szerint:
mg/ml IFN-a-t dializáltunk egy 5,0 pH-jú pufferrel szemben, amelynek összetétele: 5 mM nátriumacetát, 120 mM NaCl. A dializált fehérjeoldathoz szilárd kálium tiocianátot adtunk, amíg a sókoncentráció 0,5 M lett; a pH-t egytized térfogatnyi, 11,9 pH-jú 1 M tricin-nátriumhidroxid oldattal állítottuk be 10,0-re. Ezután 1 mól fehérjére számítva 3 mól a-[(l,2-dihidroxi-2-oxo-l-piridinil)tiokarbonil]-o>metoxipoli(oxi-l,2etándiil) reagenst adtunk a mintához. A kapcsolási reakciót szobahőmérsékleten 30 percig végeztük; úgy állítottuk meg, hogy az elegyhez 1 M koncentrációjú, 6,3 pH-jú glicin oldatot adtunk, amíg annak koncentrációja 20 mM lett. A PEG-hez kötött fehérjét kicsaptuk 7,0 pH-jú, 3,5 M ammóniumszulfátot és 50 mM nátriumfoszfátot tartalmazó pufferrel, 1,1 M ammóniumszulfát koncentrációig, és a csapadékot centrifugáltuk (10 000 g, 12 perc). A szüredéket kicsapáshoz használt pufferoldattal mostuk, majd újra feloldottuk 5,0 pH-jú, 25 mM ammóniumacetátot tartalmazó pufferoldatban. A PEG-hez kapcsolt fehérjét a 2. példában leírt módon tisztítottuk és minősítettük. Egyféle PEG-IFN terméket kaptunk, amelynek látszólagos molekulasúlya 28 kD. A módosított fehérje vírusölő aktivitását a 8. példában leírt módon határoztuk meg. Az IFN-α fajlagos aktivitása 2,6x108 U/mg, a PEG-IFN-a-é l,0xl08 U/mg, tehát a háromszoros értéken belül marad a kiindulási anyaghoz képest.
70. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-{(l,2-dihidro-2oxo-1-piridinil 1-tiokarbonil ]-(ü-metoxipoli( oxi-1,2etándiil), SRU 225 reagenssel
Az IFN-a-t a 9. példában leírt eljárással kapcsoltuk a PEG-hez. A termék fehérjéket a 2. és 9. példában leírt módon tisztítottuk és jellemeztük. Az INF-α fajlagos aktivitása 2,6x108 U/mg, a 31 kD látszólagos mólsúlyú PEG-IFN-a-é 1,0x108 U/mg, tehát a háromszoros értéken belül marad a kiindulási anyaghoz képest.
11. példa a-Metil-(ü-[ 2-[[ (2-piridiniloxi fkarbonil jamino ]etoxi]-poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7 készítése 1 g (0,2 mmól), IC. példa szerint előállított a-(2aminoetil)-(ű-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7et 40 ml száraz diklórmetánban oldunk, és lepárolunk 15 ml oldószert. Az oldathoz 0 C-on hozzáadunk 65 mg (0,3 mmól) di-2-piridil karbonátot, és további 4 órán át kevertetjük az elegyet. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, és a maradékot eldörzsöljük dietiléterrel. A csapadékot szűrjük, 50 ml éterrel, majd 50 ml hexánnal mossuk. Lassú nitrogénáramban vákuumban megszárítva 1 g a-metil-ω [2[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et nyerünk, fehér por formában.
ll
HU 211 945 A9
Analízis: CqH^NjO^C^CHjO)]!) 7 számított C: 54,56, H: 9,04, N: 0,55;
talált C: 54.26, H: 9,00, N: 0,53.
IIa. példa a-Metil-(ü-{ 2-[{ (2-piridiniloxi jkarbonil jamino Jetoxi]-poli(oxi-],2-etándiil) SRU 225 készítése IC. példa szerint előállított a-(2-aminoetil)-(ü-metoxipoli(oxi-l ,2-etándiil) SRU 225-öt a 11. példában leírt módon átalakítunk a-metil-íü-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli-(oxi-1,2-etándíil) SRU 225-té.
Analízis: C9Hj2N2O3(CH2CH2O)225 számított C: 54,54, H: 9,10, N: 0,28;
talált C: 54,49, H: 9,27, N:0,31.
JJb. példa a-Metil-(á-[ 2-H f 2-^2-idiniloxi )karbonil jamino jetoxij-poliioxi-1,2-etándiil) SRU 28.3 készítése 1F. példa szerint előállított ot-(2-aminoetil)-w-metoxipoli(oxi-l ,2-etándiil) SRU 28.3-at all. példában leírt módon átalakítunk ot-metil-to-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 28.3-dé.
Analízis: CqH^I^ChíCfyC^O^g 3 számított C: 54,61. H: 8,75. N: 1,94;
talált C: 54,67, H: 8,96. N: 1,63.
12. példa
PEG-hez kötött IL-Ira készítése a-metil-(O-[2-[l(2pirídiniloxi jkarbonil jamino jetoxijpolifoxi-1,2etándiill SRU 111.7 reagenssel a-metil-tú-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et adtunk 25 mg tisztított IL-lra-hoz, amelyet 2,5 ml pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IL-lra mólaránya 1 : 1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. A PEG-ILra-t a 6. példában leírt módon tisztítottuk.
A 60 perces reakció termékelegyében kétféle PEGhez kötött termék mulatható ki, látszólagos molekulasúlyuk 28 kD és 38 kD; arányuk az összes fehérjéhez képest 42, illet 29%.
Az IL-lra-nak az IL-1 kötődését gátló képességét a 6. példában leírt módon vizsgáltuk, és az eredményeket a 12. táblázatban foglaltuk össze. A 28 kD mólsúlyú termék kötődési tulajdonságai nem változtak meg lényegesen; a 28 kD mólsúlyúé az IL-lra-hoz képest ötszörös értéken belül marad.
72. táblázat
A 11. példa szerinti reagenssel készített PEG-ÍLl-ra gátló hatása p-^ljlL-l kötődésére
| IL-1 ra-fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | IC50 (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 2,0 |
| 28 | 3,0 |
| 38 | 10,0 |
A PEG-IL- lra farmakodinamikus profilját a 6. példában leírt módon határoztuk meg. Az IL-1 önmagában 27 283 U/ml IL-6 keletkezését idézte elő. A módosítatlan IL-lra az IL-1 aktivitás kevesebb mint 50%-át gátolta meg az adagolás után hat órán belül. Ezzel szemben, bár a PEG-IL-lra kezdetben kevésbé aktív, 24 és 48 óra után már sokkal aktívabb. Ezért a PEG-IL-lra elnyújtott farmakodinamikai profilt mutat.
D3. táblázat
A 11. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra farmakodinamikai profilja
| Idő (óra) az IL-1 | IL-6 (U/ml) | |
| adagolása előtt | 19 kD | 28 kD |
| 0 | 4 789 | 23 806 |
| 6 | 15 324 | 10 833 |
| 24 | 24 841 | 5 727 |
| 48 | 16 348 | 9 364 |
| 72 | 12 067 | 12 054 |
12a. példa
PEG-hez kötött IL-lra készítése a-metil-tís-l2-[j(2piridiniloxi jkarbonil jamino jetoxi jpoli( oxi-1.2etándiil) SRU 225 reagenssel a-metiI-m-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225-öt adtunk 25 mg tisztított IL-lra-hoz, amelyet 2,5 ml pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IL-lra mólaránya 4 : 1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. A PEG-ILra-t a 6. példában leírt módon tisztítottuk.
A 60 perces reakciós termékelegyében kétféle PEG-hez kötött termék mutatható ki, látszólagos molekulasúlyuk 33 kD és 48 kD; arányuk az összes fehérjéhez képest 76, illetve 15%.
Az IL-lra-nak az IL-1 kötődését gátló képességét megvizsgáltuk, és az eredményeket a 13. táblázatban foglaltuk össze. A 33 kD mólsúlyú termék kötődést gátló képessége az IL-lra-hoz képest nyolcszoros értéken belül marad. A 48 kD mólsúlyú termék kötődési képessége lényegesen csökkent.
13. táblázat
A 11a. példa szerinti reagenssel készített PEG-lLl-ra gátló hatása [}25ljIL-l kötődésére
| IL-1 ra-fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | IC50 (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 0,8 |
| 33 | 6,0 |
| 48 | 18,0 |
A PEG-IL-lra farmakokinetikus profilját a 6A. példában leírt módon határoztuk meg. Az eredmények a D4. táblázatban találhatók. A PEG-IL-lra a szérum mintákban nagyobb koncentrációban és hosszabb ideig mutatható ki, mint a módosítatlan IL-lra.
HU 211 945 A9
D4, táblázat
A Ha. példa szerinti reagenssel készített PEG-lLl-ra farmakokínetikai profilja
| Idő (óra) az | IL-1 ra szérum koncentráció (nl/ml) | |
| adagolás után | 19 kD | 33 kD |
| 1 | 220 | |
| 2 | 33 | 700 |
| 3 | 13 | |
| 4 | 5,3 | 500 |
| 6 | 1,5 | |
| 8 | 150 | |
| 10 | 83 | |
| 24 1 | 5 |
13. példa
PEG-hez kötött r/L-2 készítése a-nietil-(js-[2-[[(2piridiniloxi jkarbonil jaminojetoxijpolif oxi-1,2etándiil) SRU 11.7 reagenssel a-metil-u>-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel PEGhez kötöttük az rIL-2-t a 3. és 8b. példa leírása szerint. Az IL-2 fehérje fajlagos aktivitását a 8. példában ismertetett módon határoztuk meg. A reagálatlan 15 kD mólsúlyú rIL-2 fajlagos aktivitása 2xl07 egység/mg, a 29 kD mólsúlyú PEG-IL-2-é 2,4x107 egység/mg IL-2 volt. tehát a PEG-hez való kapcsolása nem járt a biológiai aktivitás csökkenésével.
14. példa
PEG-hez kötött rIL-lra készítése a-metil-tí)-[21112-piridiniloxi jkarbonil jamino jetoxi lpoli( oxi1,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel a-metil-a>-[2-[[(2-piridiniIoxi)karbonil]amino]etoxi]poli-(oxi-l ,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel PEG-hez kötöttük az rIL-la-t a 4. és 7. példa leírása szerint. Két PEG-IL-Ια származékot kaptunk, látszólagos molekulasúlyuk 28 kD és 38 kD. Arányuk az összes fehérjék között 50, illetve 25%, 60 perces reagáltatás után.
15. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-metil-(ü-[2-[[(2piridiniloxi)karbonil ]amino]etoxi Ipolif oxi-1,2etándiil) SRU 111.7 reagenssel a-metil-Cü-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel PEGhez kötöttük az IFN-a-t a 8. példa leírása szerint. A fehérje 40%-a a kötődött20PEG-hez 60 perc alatt, a termék látszólagos molekulasúlya 26 kD.
16. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-metil-(ü-[2-[[(2piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-l,2etándiilj SRU 111.7 reagenssel a-metil-(tí-[2-[[(2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi ]poli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel PEG-hez kötöttük az IFN-a-t a 9. példa leírása szerint. Az IFN-a fajlagos aktivitását a 8. példában ismertetett módon határoztuk meg. Az alapanyag IFN-α fajlagos aktivitása 1,7x 108 U/mg, a PEG-IFN-a-é 0,8x108 U/mg, tehát a két-háromszoros értéken belül van.
17. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-metil-ω-[2-[[(2piridiniloxijkarbonil jamino jetoxi jpolifoxi-1,2etándiilj SRU 225 reagenssel
A 9. példában leírt reagenssel és a 11a. példában leírt eljárással elkészítettük a PEG-IFN-a-t. Ez utóbbi fajlagos aktivitását a 8. pont szerint meghatározva 0,4x108 U/mg értéket kaptunk, tehát a biológiai aktivitás nem csökkent lényegesen.
18. példa a-[(2-piridiniloxijkarbonil]-<ü-metoxipoli <oxi1,2-etándiil) SRU 111.7 készítése g MPEG-et (mólsúly 5000) 30 ml száraz diklórmetánban oldunk, és 10 ml oldószert ledesztillálunk. Az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, és hozzáadunk 132 mg (0,6 mM) di-2-piridil karbonátot és 4 mg DMAP-t. Az így kapott oldatot 14 órán át kevertük, majd az oldószert vákuumban lepároltuk. A maradékot eldörzsöltük dietiléterrel, és a kivált csapadékot szűrtük, feloldottuk 7 ml száraz etilénglikol-dimetiléterben (melegíteni kellett, hogy oldódjon), majd szobahőmérsékletre hűtve néhány órán át állni hagytuk. A kivált csapadékot szűrtük és 2x5 ml száraz etilénglikol-dimetiléterrel mostuk. A szilárd anyagot ezután nitrogénáramban vákuumban szárítottuk. A termék 0,7 g a- [(2-piridiniloxi )-karboniI]-tú-metoxipoli-(oxi-l ,2etándiil) SRU 111.7.
Analízis: C9H1|NO4(CH2CH2O)|li 7 számított C: 54,57. ‘ Η:\,02, N: 0,28;
talált C: 54.51, H: 9,19, N: 0,28.
18a. példa a-[(2-piridiniloxi jkarbonilj-ta-metoxipoli (oxi-1,2etándiil) SRU 225 készítése A 18. példában leírt eljárás szerint MPEG-t (mólsúly 10 000 a-[(2-piridiniloxi)-karbonil]-ü>-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 225-té alakítunk.
Analízis: C9H11NO4(CH2CH2O)225 számított C: 54,54, H: 9,08, N: 0,14;
talált C: 54,54, H: 9,12, N:0,ll.
19. példa
PEG-hez kötött IL-lra készítése a[(2-piridiniloxi)karbonil]-(ü-metoxipoli (oxi-I,2-etándiil) SRU
111.7 reagenssel
Az IL-lra-t a 6. és 12. példában már leírt módon kapcsoltuk a-[(2-piridiniloxi)-karboniI]-u>metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel a PEG-hez. A főtermékek látszólagos molekulasúlya 26 kD és 33 kD volt, ezek aránya az összes fehérjék között 31, illetve 57%, 60 perc után. Az IL-lra azon képességét, hogy az IL-1 kötődését megakadályozza, a 6. példában leírt módon határoztuk meg, és az eredményeket a 14. táb13
HU 211 945 A9 lázatban foglaltuk össze. A 26 kD mólsúlyú PEG-ILlra kötődési képessége az eredeti IL-lra-hoz képest négyszeres értéken belül maradt. A 33 kD mólsúlyú termék kötődési képessége viszont lényegesen, tizenötöd részére csökkent.
14, táblázat
A 18. példa szerinti reagenssel készített PEG-ILl-ra gátló hatása [,25I]1L-1 kötődésére
| IL-lra-fehéije látszólagos molekulasúlya (kD) | 1C5O (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 2,0 |
| 26 | 8,0 |
| 33 | 30,0 |
19A. példa
PEG-hez kötött IL-1 ra készítése a-[(2-piridiniloxi)karbonil]-tü-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 225 reagenssel
Az IL-lra-t a 19. példában már leírt módon kapcsoltuk a-[(2-piridiniloxi)-karbonil]-ü)-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 225 reagenssel a PEG-hez. A főtermékek látszólagos molekulasúlya 33 kD és 48 kD volt. ezek aránya az összes fehérjék között 47, illetve 25%, 60 perc után. Az IL-lra azon képességét, hogy az IL-1 kötődését megakadályozza, a 6. és 12. példában leírt módon határoztuk meg, és az eredményeket a 15. táblázatban foglaltuk össze. A 33 kD mólsúlyú PEGIL-lra kötődési képessége az eredeti IL-lra-hoz képest hatszoros értéken belül maradt. A nagyobb mólsúlyú termék aktivitása jelentősen csökkent.
75. táblázat
Λ 18a. példa szerinti reagenssel készített PEG-1L1 -ra gátló hatása l,25I]IL-l kötődésére
| 1 . ----- ---1 IL-lra-fehére látszólagos molekulasúlya (kD) | IC50 (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 1.5 |
| 33 | 9,0 |
| 48 | 40,0 |
A PEG-IL-lra farmakokinetikai profilját a 6A. példában leírt módon határoztuk meg, az eredményeket a D5. táblázat tartalmazza. A PEG-IL-lra a szérummintákban az IL-lra-nál hosszabb ideig volt kimutatható, ami hosszabb szérum felezési időt jelent. A farmakodinamikai profilt a 6. példában leírt módon határoztuk meg, azzal a különbséggel, hogy 0,05 pg rIL-la-t adagoltunk. Az eredményeket a D6. táblázat tartalmazza. Önmagában az IL-1 9203 egység/ml IL-6 képződését indukálta. A PEG-IL-lra meghosszabbodott inhibitor hatása a módosítatlan IL-lra-hoz képest 72 óráig az adagolás után világosan látható; ez javított farmakodinamikai tulajdonságokat jelez. Röviden összefoglalva a fenti adatok azt mutatják, hogy ha a PEG fehérjék in vitro aktivitása csökken is, in vivő farmakodinamikai tulajdonságai akkor is javulhatnak.
D5. táblázat
A 18a. példa szerinti reagenssel készített PEG-ILl-ra farmakokinetikai profilja
| Idő (óra) az | IL-lra szérum koncentráció (ng/ml) | |
| adagolás után | 19 kD | 33 kD |
| 1 | 580 | |
| 2 | 75 | 100 |
| 3 | 30 | |
| 4 | 30 | 60 |
| 6 | 8 | |
| 8 | 12 | |
| 10 | 17 | |
| 24 | 10 |
D6. táblázat
A 18a. példa szerinti reagenssel készített PEG-1L1 -ra farmakodinamikai profilja
| Idő (óra) az IL-1 | IL-6 (U/ml) | |
| adagolása előtt | 19 kD | 26 kD |
| 0 | 521 | 454 |
| 6 | 2 334 | 416 |
| 24 | 13 486 | 2552 |
| 48 | 16 577 | 4667 |
| 72 | 12 800 | 5148 |
20. példa
PEG-hez kötött IFN-ct készítése a-[(2-piridiniloxi)karbonilj-(ü-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU
111.7 reagenssel a-[(2-piridiniloxi )karbonil]-cu-metoxipoli (οχι-1,2etándiil) SRU 111.7-et adtunk 1 mg tisztított IFN-ahoz, amelyet 200 pl pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IFN-α mólaránya 10 : 1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. A PEG-IFN-a-t a 8. példában leírt módon tisztítottuk. A fehérje 36%-a alakult ál 28 kD látszólagos molekulasúlyú származékká.
A tisztított IFN fehérjék fajlagos aktivitását a 8. példában leírt módon határoztuk meg, az eredményeket a 16. táblázat tartalmazza. A módosítás hatására az IFN in vitro biológiai aktivitása ötöd-hatod részére csökken.
76. táblázat
A 18. példa szernti reagenssel PEG-hez kötött IFN-a bioaktivitósa
| IFN-a-fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egység/mg) |
| 15 (módosítatlan) | L88xlO8 |
| 28 | 8,0x107 |
HU 211 945 A9
20A. példa
PEG-hez kötött rlL-2 készítése a-[(2-piridiniloxi)karbonil]-tís-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU
111.7 reagenssel
A 18. példában leírt eljárással a-[(2-piridiniloxi)karbonil]-<o-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7-et készítünk és 5-szörös moláris feleslegben 1 mg, 200 μΐ pufferoldatban oldott (0,1 M nátrium borát, pH 9), rEL-2-höz adunk. Az oldatokat összekeverjük, és a reakciót szobahőmérsékleten, 60 percen át hagyjuk végbemenni.
SDS-PAGE módszerrel két fő molekulasúly mutatható ki: 15 (módosítatlan) és 25 kD. A 25 kD mólsúlyú PEG-rIL-2 a teljes fehérjemennyiség 60%-a.
/. példa
PEG-hez kötött ÍFN-a készítése a.-[(2-piridiniloxilkarbonil]-(ü-metoxipoli (oxi-7,2-etándiil) SRU Hl. 7 reagenssel
Az IFN-a-t a 18. példában leírt reagenssel és a 9. példában leírt eljárással kötöttük a PEG-hez.
A fajlagos aktivitást a 8. példában leírt módon mértük meg. A módosítatlan IFN-a-é 1,0x108 U/mg, a PEG-IFNa-é 0,4x108 U/mg volt, tehát nincs lényeges csökkenés.
22. példa
PEG-hez kötött 1FN-cl készítése CL-[(2-piridiniloxi)karbonil]-(ü-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 225 reagenssel
Az IFN-a-t a 18a. példában leírt reagenssel és a 9. példában leírt eljárással kötöttük a PEG-hez. A fajlagos aktivitást a 8. példában leírt módon mérve a PEG-IFNOt-ra0,3xl08 U/mg-ot kaptunk.
23. példa tt-[2-(izotiocianato)etill-(ü-metoxipoli (oxi-1,2etándiil) SRU 111.7 reagenssel 2 g a-(2-aminoetil)-o>-metoxipoli(oxi-l,2-etándiil)
SRU 111.7-et 100 ml diklórmetánban oldunk és hozzáadunk 94,2 mg di-2-piridiltionokarbonátot. Az oldatot 18 órán át kevertük, majd kevés hideg vízzel extraháltuk. A diklórmetán nagy részét vákuumban lepároltuk, a maradékhoz étert adtunk, amikor is csapadék képződik. A terméket kiszűrtük, nagy vákuumban szárítottuk. a-[2-(izotiocianato)etil]-(o-metoxipoli (oxi-1,2etándiil) SRU 111.7-et kapunk.
Analízis: C4H7NOS(CH2CH2O)]|17 számított C: 53,88, H: 9,07, N: 0,28, S: 0,64;
talált C: 54,45, H: 8,93, N: 0,28, S: 0,53.
24. példa
PEG-hez kötött IFN-a készítése a-[2-(izotiocanato)etil}-(ü-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel
A 23. példában szerint készített a-[2-(izotiocianato)eti]]-(ű-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et adtunk 1 mg tisztított IFN-a-hoz, amelyet 200 μΐ pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IFN-α mólaránya 10:1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. 30%-a alakult át 26 kD látszólagos molekulasúlyú származékká.
25. példa
PEG-hez kötött rlL-2 készítése a-[2-(izotiocanato)etil]-(si-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel
A 23. példa szerint készített a-[2-(izotiocianato)etil]-o>metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7-et adtunk 1 mg tisztított rekombináns IL-2-höz (rIL-2), melyet 200 μΐ pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IFN-α mólaránya 10 : 1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. A PEG-rIL-2-t a
3. példában ismertetett módon nyertük. A származékok eloszlását a 17. táblázat mutatja be.
17. táblázat rIL-2 módosítása a 23. példa szerinti reagenssel
| rIL-2 fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest. % |
| 15 (módosítatlan) | 70 |
| 26 | 20 |
| ™ | 10 |
26. példa
PEG-hez kötött lL-lra készítése a-[2-(izotiocanato(etil]-tís-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel
Az BL-lra-t a 6. példában leírt módon kapcsoltuk a[2-(izotiocianato)-etil]-a>-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel a PEG-hez. A főtermékek látszólagos molekulasúlya 26, 31. 38 és 48 kD volt, ezek aránya az összes fehérjék között 17, 44, 15, illetve 10%.
Az IL-1 ra azon képességét, hogy az IL-1 kötődését megakadályozza, a 6. példában leírt módon határoztuk meg, és az eredményeket a 18. táblázatban foglaltuk össze. A PEG-IL-lra kötődési képessége az eredeti IL1 ra-hoz képest kél-háromszoros értéken belül maradt.
18. táblázat
A 23. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra gátló hatása [,2S1]IL-1 kötődésére
| IL-1 ra-fehétje látszólagos molekulasúlya (kD) | IC50 (ng/ml) |
| 19 | 2,0 |
| 26 | 5,0 |
27. példa
PEG-hez kötött rlL-la készítése a-l2-(izotiocanato)etil]-(ü-metoxipoli (oxi-l,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel
A rekombináns IL-la-t a 4. példában leírt módon kapcsoltuk a-[2-(izotiocianato)-etil]-íű-metoxipoli(oxi1,2-etándiil) SRU 111.7 reagenssel a PEG-hez. A reakcióelegyből SDS-PAGE módszerrel látszólagos molekulasúlyuk alapján két főtermék mutatható ki (26 és 38 kD). Ezek a teljes fehérjetartalom 46, illetve 48%-át
HU 211 945 A9 teszik ki. A PEG-rIL-la-t a 4. példában leírt eljárással tisztítottuk és jellemeztük.
A tisztított, összegyűjtött frakciókat a 7. példában leírt D10. sejtbuijánzási teszttel minősítettük, az eredményeket a 19. táblázat tartalmazza. A táblázatban keverékként jelölt minták egynél több fehérjét tartalmaztak, és nem tisztítottuk őket tovább. A 26 kD PEG fehérje fajlagos aktivitása gyakorlatilag azonos az IL-l-ével.
19. táblázat
A 23. példa szerinti reagenssel PEG-hez kötött rIL-la bioaktivitása
| rIL-Ia-fehérje látszólagos mólsúly (kD) | Fajlagos aktivitás (egység/mg) |
| 17 | l.lxlO8 |
| 26 | l,7xlO8 |
| 26,38 (keverék | 2,0x108 |
| >38 (keverék) | 6,0x106 |
28. példa a-l<2-piridiniloxi)tiokarbonil]-tü-metoxipoli (oxi1.2-etándiil) SRU 225 készítése g MPEG-et (metoxipolietilén glikol, mólsúly 10 000) 30 ml száraz diklórmetánban oldunk, és 10 ml oldószert ledesztillálunk. Az oldatot lehűtjük, és hozzáadunk 69,7 mg (0,3 mM) di-2-piridil-tionokarbonátot és 2 mg DMAP-t. Az így kapott oldatot 18 órán át kevertük argon atmoszférában, majd az oldószert vákuumban lepároltuk. A maradékot minimális mennyiségű diklórmetánban újra oldottuk, és dietilétert adtunk hozzá. A kivált csapadékot szűrtük, feloldottuk 5 ml meleg etilénglikoldimetiléterben, majd egy éjszakán át állni hagytuk. Akivált csapadékot szűrtük és 2x5 ml száraz etilénglikol-dimetiléterrel mostuk. A terméket ezután nitrogénáramban vákuumban szárítottuk. A termék 0,9 g a-[(2-piridiniloxi)-úokarbonil]-o>-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil) SRU 225.
Analízis: CqH^NO^CHiCHiO^ számított C: 54,46, H: 9,04:
talált C: 54,67, H: 9,30.
29. példa
PEG-hez kötött IL-lra készítése a-[(2-piridiniloxi)tiokarbonilj-íü-metoxipoli (oxi-1,2-etándiil)
SRU 225 reagenssel a-[(2-piridiniloxi)tiokarbonil]-(o-metoxipoli(oxi1.2-etándiil) SRU 225-öt, a 28. példa szerint előállítva 2 mg IL-lra-hoz adunk, amelyet 200 μΐ pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az IL-lra mólaránya 2 : 1 volt. Az oldatokat alaposan összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni. A PEG-IL-lra-t a 6. példában leírt módon tisztítottuk. A PEG termék látszólagos molekulasúlya 33 kD, az összes fehérjék 17%-a, 60 perc után. Az IL-lra azon képességét, hogy az IL-1 kötődését megakadályozza, a 6. példában leírt módon határoztuk meg, és az eredményeket a 20. táblázatban foglaltuk össze. A PEG-IL-lra kötődési képessége az eredeti IL-lra-hoz képest három-négyszeres értéken belül maradt.
20. táblázat
A 28. példa szerinti reagenssel készített PEG-IL-lra gátló hatása [12SI]IL-1 kötődésére
| IL-lra fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | lC50(ng/ml) |
| 19 | 1,4 |
| 33 | 5,0 |
30. példa
Tioszénsav o,o-di-(6-metil-2-piridinil) észter 10 g (0,09 mól) 6-metil-2-hidroxipiridint 250 ml száraz diklórmetánban oldunk és hozzáadunk 12,7 ml trietilamint. Az oldatot 0 'C-ra hűtöttük, és argon atmoszférában hozzáadtunk cseppenként 4,1 ml (0,046 mól) tiofoszgént 85%-os széntetrakloridos oldatban. Az elegyet 5 órán át szobahőmérsékleten kevertük, szűrtük, és a diklórmetános oldatot 2x100 ml telített NaHCO3 oldattal mostuk. A szerves részt megszárítottuk, és az oldószert vákuumban lepároltuk. A maradékhoz 100 ml hexánt adtunk, és az elegyet egy éjszakán át állni hagytuk. A kivált csapadékot szűrtük, és vákuumban lassú nitrogénáramban megszárítottuk. 5.7 g tioszénsav o,o-di-(6metil-2-piridinil)-észtert kapunk, o.p. 155-156 °C.
Analízis: Ci3Hi2N2O2S számított C: 54,98, H: 4,65, N: 10,76, S: 12,32;
talált C: 59.65, H: 4,59, N: 10,75, S: 12,06.
31. példa a-Metil-tí>-[2[[(6-metil-2-piridiniloxi)tiokarbonil]amino]etoxi]-poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225 1 g, le példa szerint előállított a-metoxi-m-(2-aminoetil)poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225-öt és 52,7 mg, 30. példa szerint előállított tioszénsav o,o-di-(6-metil2-piridinil) észtert 15 ml száraz diklórmetánban oldottunk, és szobahőmérsékleten egy éjszakán át kevertük. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároltuk, és a maradékot eldörzsöltük dietilészterrel. A csapadékot szűrtük, és éterrel mostuk. A terméket feloldottuk 5 ml meleg etilénglikol dimetiléterben, és megszűrtük egy 0,75 mikronos Millipor szűrőn. Az oldatot állni hagytuk szobahőmérsékleten 48 óráig, majd a kivált csapadékot szűrtük. A terméket nitrogén atmoszférában vákuum-szárítószekrényben 18 órát szárítottuk. 0,9 g ametil-tü-[2-[[(6-metil-2-piridiniloxi)tiokarbonil]amino ]etoxi]-poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225 terméket kaptunk.
Analízis:
számított C: 54,50, H: 9,09, N: 0^27, S: 0,32;
talált C: 54,38, H: 9,20, N:0,21, S: 0,37.
32. példa
PEG-hez kötött rIL-lra készítése a-metil-tís-[2[[(6-metil-2-piridiniloxi jtiokarbonil Jamino ]etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225 reagenssel Az előző példa szerint előállított reagenst 5 mg tisztított rIL-lra-hoz adtuk, amelyet 1 ml pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az rIL-lra mólaránya 2 : 1 volt. Az oldatot összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni.
HU 211 945 A9
Az rIL-lra termékeket a 6. példában leírt módon minősítettük. A 21. táblázatban mutatjuk be a reakcióelegyben talált módosított molekulasúlyú termékeket.
21. táblázat rIL-lra módosítása a 31. példa szerinti reagenssel
| rIL-lra fehérje látszólagos | Mennyisége, az összes fehér- |
| mólsúly (kD) | jéhez képest, % |
| 19 (módosítatlan) | 30 |
| 35 | 65 |
| 48 | 5 |
Az rIL-lra termékeket a 6. példában leírt módon nyertük ki a reakcióelegyből.
A tisztított frakciókat a 6. példában leírt rIL-1 radioreceptoros kompetitív kötődési vizsgálattal minősítettük. Az eredményeket a 22. táblázat tartalmazza. Ezek szerint a 35 kD fehérje az IL-1 kötődésének gátlásában hatszor kevésbé aktív, mint az eredeti IL-lra, míg a 48 kD termék hússzor kevésbé aktív.
22. táblázat
Λ 31. példa szerinti reagenssel PEG-rlL-lra gátló hatása [,2'I]IL-1 kötődésére
| 1- rIL-1 ra-fehérje látszólagos i | IC50 (ng/rnl) |
| molekulasúlya (kD) í | |
| 19 (módosítatlan) j [ | 1,5 |
| 35 | 9.0 |
| 48 | 30.0 |
| 33. példa |
a-í 2-[ [< 2-Piridiniloxi )karbonil jamino Jetilj-tí>-[2I [<2-piridiniloxi)karbonil jamino j-etoxtjpoli(oxi1,2-etándiil) SRU 180
A. U-(2-klóretil)-u>-(2-klóretoxi)-poli(oxi-l,2-etándiil), SRU 180 készítése g MPEG-et (polietilénglikol, molekulasúlya 8000) 750 ml toluolban szuszpendálunk, és az oldószerből 200 ml-t ledesztillálunk. Az oldathoz reflux közben cseppenként 1,7 ml száraz piridint és 4,7 ml tionilkloridot adunk. Az elegyet további 12 órán át forraljuk, majd egy éjszakán át kevertetjük. 50 ml CH2Cl2-t adunk az elegyhez, és az így nyert oldatot átvezetjük 60 g bázikus alumíniumoxidon (Wolem Super I). Az oszlopot 500 ml diklórmetánnal eluáljuk, az egyesített szerves oldatokról az oldószert enyhe vákuumban lepároljuk. A maradékhoz 300 ml diklórmetánt adunk, majd az oldószert vízfürdőn lassan lepároljuk és közben éterrel pótoljuk. Ezt addig csináljuk. amíg az elegy zavaros szuszpenzióvá válik. Az elegyet ezután néhány órán át szobahőmérsékleten keverjük, azután szűrjük. 73 g a-(2-klór-etil)-tú(2-klór-etoxj)-poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 180-at kapunk.
Analízis: C2H4Cl2(CH2CH2O)lg0 számított C: 54,16, H: 9,09, Cl: 0,88;
talált C: 53,40. H: 8,81, Cl: 0,93.
B. a.-(2-azidoetil)-0)-(2-azidoetoxi)-poli<oxi-l,2etándiil) SRU 180 készítése g a-(2-klóretil)-co-(2-klóretoxi)poli-(oxi-l,2etándiil) SRU 180-at és 25 g nátriumazidot 700 ml száraz DMF-ben 125 °C-on kevertetünk. 12 óra után az oldószert nagyvákuumban lepároljuk. A maradékot 500 ml diklórmetánban oldjuk és Celite-en megszűrjük. A diklórmetánt vízfürdőn lepároljuk és közben dietilétert adunk az elegyhez, aminek hatására csapadék válik ki. Az elegyet egy éjszakán át kevertetjük, majd szűrjük. A szüredéket minimális mennyiségű etilénglikol dimetiléterben oldjuk 50 °C-on, lassan lehűtjük, és szüljük. A terméket vákuum-szárítószekrényben nitrogénáramban szárítjuk. 69 g a-(2-azidoetil)-m-(2azidoetoxi)poli-(oxi-1,2-etándiil) SRU 180-at kapunk.
Analízis: C2H4N6(CH1CH2O)|80 számított C: 54,07, H: 9,08, N: 1,44;
talált C: 53,76, H: 9,28, N: 0,96.
C. a-(2-aminoetil)-üy-(2-aminoetoxi)poli(oxi-l,2etándiil) SRU 180 g a-(2-azidoetil)-tü-(2-azidoetoxi)poli(oxi-l,2etándiil), SRU 180-at és 6,7 g (25,6 mmól) trifenilfoszfint 200 ml száraz diklórmetánban oldunk és argon atmoszférában egy éjszakán át keverünk. 2 ml vizet adva az elegyhez, további 12 órán át kevertetjük. A diklórmetán nagy részét vákuumban lepároljuk és a maradékot 400 ml dietiléterben felvesszük. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk és feloldjuk 300 ml meleg (50 °C-os) etilénglikol dimetiléterben. Az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk másnapig, a csapadékot szűrjük, a szűrőn 2x100 ml etilénglikol dimetilétenel és 2x100 ml dietiléterrel mossuk, végül nitrogénáramban vákuum-szárítószekrényben szárítjuk. A termék 66 g a-(2-aminoetil)-(ú-(2-aminoetoxi)poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 180.
Analízis: C2H8N2(CH2CH20)|go számított C: 54,42, H:9,18, N: 0,35;
talált C: 53,85, H: 9,20, N: 0,43.
D. a-[2-l[(2-Piridiniloxi)-karbonil}aminojetil]-(ül2-ll(2-piridiniloxi)karbonil)amino]-etoxijpoli(oxi-l,2-etándiil SRU 180 g a-(2-aminoetil)-ü)-(2-aminoetoxi)poli-(oxi-l,2etándiil) SRU 180-at 40 ml diklórmetánban oldunk, és az oldószerből 15 ml-t ledesztillálunk. Az oldatot 0 °Cra hűtjük és hozzáadunk 85 mg (6,39 mmól) di-2-piridil karbonátot. 0 °C-on 4 órán át kevertetünk, majd vákuumban lepároljuk az oldószert. A maradékot dietiléterrel eldörzsöljük, a terméket szűrjük és 2x75 ml éterrel mossuk. A terméket vákuumban megszárítjuk és feloldjuk 8 ml száraz etilénglikol dimetiléterben 50 °C-on. Az oldatot hagytuk szobahőmérsékletre hűlni és 12 órán át állni. A keletkezeti csapadékot kiszűrtük, 2x5 ml etilénglikol dimetiléterrel mostuk, és vákuumban nitrogénáramban szárítottuk. A termék 1 g
HU 211 945 A9 ot-[2-[[(2-Piridiniloxi)karboniI]amino]etil]-a>-[2-[[(2-p iridiniloxi)karboni]]amino]-etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil SRU 180.
Analízis: C^H^N^íC^CfyOluo számított C: 54,57, H: 8,99, N: 0,68;
talált C: 54,32, H: 8,79, N: 0,77.
34. példa
a.-[2-[[(2-Piridiniloxi)-karbonil]amino]etil]-üi-[2[ [ (2-piridiniloxi)karbonil jamino ]-etoxi ]poli(oxi1,2-etándiil) SRU 452
A. a.-(2-klóretil)-tö-(2-klóretoxi)-poli(oxi-],2-etándiil), SRU 452 készítése
A 33A. példában leírt eljárás szerint a-(2-klóretil)-tű(2-klóretoxi)-poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 452-t állítottunk elő 20 000-es molekulasúlyú polietilén glikolból.
Analízis: C2H4C12(CH2CH2O)4J2 számított C: 54,38, H: 9,13, Cl: 0,35;
talált C: 54.36, H: 9,23, Cl: 0,40.
D. a-t 2-azidoetiI)-(H-( 2-azidoetoxi )-poli(oxi-1,2etándiil) SRU452 készítése A 33B. példában leírt eljárás szerint a-(2-azidoetil)-ü>-(2-azidoetoxi)poli-(oxi-l,2-etándiil) SRU 452-t állítottunk elő a-(2-klóretil)-u)-(2-klóretoxí)-poIi(oxi1,2-etándiil) SRU 452-ből.
Analízis: C2H4N6(CH2CH2O)452 számított * C: 54,35. H:9,’l2, N: 0,42;
talált C: 54.38. H: 9,30, N: 0,47.
C. a-(2-aminoetil)-íü-(2-aminoetoxi)poli(oxi-I,2etándiil/, SRU 452
A 33C. példában leírt eljárás szerint oc-(2-aminoetil )-a>-(2-aminoetoxi )poli-(oxr-1,2-etándiil) SRU 452t állítottunk elő o:-(2-azidoetil)-<ö-(2-azidoetoxi)-poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 452-ből.
Analízis: C2HgN2(CH2CH2O)452 számított ‘ C: 54.49, H:9,’l7. N:0,14;
talált C: 54.44. H: 9.19, N:0,15.
D. a-[2-[[(2-Piridiniloxi)karbonilJamino]etil]-Wj2-j[( 2-piridiniloxi )karbonil jamino ]-etoxi jpoli(oxi-l,2-etándiil) SRU 452
A 33D. példában leírt eljárás szerint előállítottunk a-[2-[[(2-Piridiniloxi)-karbonil]amino]etil]-co-[2-[[(2piridiniloxi)karbonil]amino]-etoxijpoli(oxi-1,2-etándiil SRU 452-t, oc-(2-aminoetil)-(ü-(2-aminoetoxi)poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 452-ből.
Analízis:
számított C: 54,56, H: 9,08, N: 0,28;
talált C: 54,33, H:9,13, N: 0,33.
35. példa
PEG-hez kötött rlL-ira előállítása O.-[2-[[(2-Piridiniloxi )karbonil]amino]etil]-(ü-[2-[ [(2-piridiniloxi )karbonil jamino ]-etoxi]poli( oxi-1,2-etándiil)
SRU 452 reagenssel
A 34. példa szerint előállított reagenst 5 mg tisztított rIL-lra-hoz adunk, amelyet 1 ml pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és a rIL-lra mólaránya 4 : 1 volt. Az oldatokat összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni.
Az rIL-lra származékokat a 6. példában leírt módon értékeltük. A 23. táblázat a reakcióelegyből kimutatható különböző molekulasúlyú származékok arányát mutatja be.
23. táblázat rIL-lra módosítása a 33. példa szerinti reagenssel
| rIL-lra fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 19 (módosítatlan) | 50 |
| 55 | 35 |
| 75 | 15 |
36. példa Bis-(3-metil-2-piridil)karbonát
4,6 g (42 mmól) 3-metil-2-hidroxilpiridint és 6 ml trietilamint 20 ml diklórmetánban oldottunk, és 0 Χοή cseppenként hozzáadtuk 11 ml foszfén 50 ml diklórmetánnal készült oldatához (1,93 mólos oldat). Az elegyet 0 °C-on 2 órán át, majd szobahőmérsékleten további 2 órán át kevertük. Az elegyet kimostuk telített NaHCO, oldattal, telített NaCl oldattal, majd nátriumszulfáttal megszárítottuk. Az oldószert vákuumban lepároltuk. a maradékot etilacetát-hexán elegyből átkristályosítottuk. A termék 3 g bis-(3-metil-2-piridil) karbonát, o.p. 110-112 °C.
Analízis: c13h12n2o3 számított C: 63,93. H: 4,95, N: 11,47;
talált C: 63.78, H: 4,86, N: 11,23.
37. példa a-Metil-(ü-[2-[[(3-metil-2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225 1 g a-metoxi-m-(2-aminoetil)poli(oxi-l ,2-etándiil)
SRU 225-öt 25 ml diklórmetánban oldunk és ledesztillálunk 10 ml oldószert. Az oldathoz hozzáadunk 49,2 mg (0,2 mmól) bis-(3-metil-2-piridil)-karbonátot, és az elegyet argon atmoszférában egy éjszakán át kevertük. Az oldószert vákuumban lepároltuk, a maradékhoz 80 ml dietilétert adtunk. A csapadékot szűrtük, étemel mostuk és feloldottuk 10 ml diklórmetánban. Az oldószert lassan lepároltuk, és közben étemel pótoltuk, amíg az oldat zavarossá kezd válni. 18 órán át állni hagytuk az elegyet szobahőmérsékleten, a kivált csapadékot szűrtük, feloldottuk 8 ml meleg etilénglikol dimetiléterben, és további 18 órát hagytuk állni. A terméket ezután kiszűrtük, és nitrogén atmoszférában vákuumban szárítottuk. 0,6 g a-MetiI-to-[2-[[(3-metil-2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi]poli(oxi-l,2-etándiil) SRU 225 terméket kaptunk.
Analízis: CI0H|4N2O3(CH2CH2O)225 számított C: 54,59, H: 9,09, N: 0,28;
talált C: 55,64, H:9,14, N: 0,22.
HU 211 945 A9
38. példa
PEG-hez kötött rIL-lra előállítása a-Metil-(ú-[2[ [(3-metil-2-piridiniloxi)karbonil]amino]etoxi ]poli(oxi-1,2-etándiil) SRU 225 reagenssel A 37. példa szerint előállított reagenst 5 mg tisztított rIL-l-ra-hoz adtunk, amelyet 1 ml pufferben oldottunk fel (0,1 M nátrium borát, pH 9,0). A reagens és az rIL-lra mólaránya 2 : 1 volt. Az oldatot összekevertük, és 60 percig szobahőmérsékleten hagytuk reagálni.
Az rIL-lra származékokat a 6. példában leírt módon értékeltük. A 24. táblázat a reakcióelegyből kimutatható különböző molekulasúlyú származékok arányát mutatja be.
24. táblázat ríL-lra módosítása a 37. példa szerinti reagenssel
| rIL- lra fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | Mennyisége, az összes fehérjéhez képest, % |
| 19 (módosítatlan) | 45 |
| 35 | 43 |
| 45 | 12 |
Az rIL-lra termékeket a 6. példában leírt módon nyertük ki a reakcióelegyből.
A tisztított frakciókat a 6. példában leírt rIL-1 radioreceptoros kompetitív kötődési vizsgálattal minősítettük. Az eredményeket a 25. táblázat tartalmazza. Ezek szerint a 35 kD fehérje az IL-1 kötődésének gátlásában négyszer kevésbé aktív, mint az eredeti rlLIra, míg a 4 kD termék harmincszor kevésbé aktív.
25. táblázat
A 35. példa szerinti reagenssel készített PEG-rlL-Ira
| gátló hatása j125j jIL-i kötődésére | |
| rIL-Ιra-fehérje látszólagos molekulasúlya (kD) | IC50 (ng/ml) |
| 19 (módosítatlan) | 1.0 |
| 35 | 4,0 |
| 45 | 30,0 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (34)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. (I) általános képletű fiziológiailag aktív fehérje konjugátumok - mely képletben R1 jelentése alacsony alkilcsoport;R2 jelentése -O- vagy -NH-;R3 jelentése =NR-R4, =S vagy =O;R4 jelentése alacsony alkil- vagy cikloalkilcsoport; m és n>l olyan egész szám, hogy a konjugátum a konjugálásán fehérje biológiai aktivitásának legalább egy részével rendelkezik;azzal a megkötéssel, hogy haR2 jelentése -O-. az esetben R3 jelentése =N -R4-től különböző; és haR2 jelentése -O- és R3 jelentése =0. a protein interferon-alfa, interleukin-1 vagy interleukin-lra, és haR2 jelentése -O- és R3 jelentése =S, a protein nem parlagfű pollenből vagy szarvasmarha plazma albuminból származó antigén E.
- 2. Az 1. igénypont szerinti protein konjugátum, azzal jellemezve, hogy m és n értékét úgy választjuk meg, hogy a pegiláló csoport(ok) molekulatömege fehérje molekulánként 300 és 30 000 dalton közötti érték.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti protein konjugátum, azzal jellemezve, hogy m értéke 1 vagy 2.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti (I—A) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben R1, R4, m, n és a protein jelentése az 1. igénypontban megadott.
- 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti (I-B) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben R1, m, n és a protein jelentése az 1. igénypontban megadott.
- 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti (I—C) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben R1, m. n és a protein jelentése az 1. igénypontban megadott.
- 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti (I-D) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben R1, m. n és a protein jelentése az 1. igénypontban megadott.
- 8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti (I-E) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben R1, m, n és a protein jelentése az 1. igénypontban megadott.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy R1 jelentése metilcsoport.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a protein interleukin-1.
- 11. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a protein interleukin-lra.
- 12. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a protein interferon-alfa.
- 13. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy a protein interleukin-2.
- 14. Az 1. igénypont szerinti (VII) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben n értéke kb. 112.
- 15. Az 1. igénypont szerinti (VIII) általános képletű protein konjugátumok - ahol a képletben n értéke kb. 112.
- 16. A 12. vagy 13. igénypont szerinti protein konjugátumok, azzal jellemezve, hogy az interferon-alfa interferon-alfa A.
- 17. (II—A), (II-B), (II-C), (II-D), (II-E), (II-F) és (II—G) általános képletű vegyületek - ahol a képletekben R1 jelentése alacsony alkilcsoport; R4 jelentése alacsony alkil- vagy cikloalkilcsoport; R5 jelentése alacsony alkilcsoport vagy hidrogénatom és n értéke 1 és 1000 közötti egész szám.HU 211 945 A9
- 18. A 17. igénypont szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R4 jelentése ciklohexilcsoport.
- 19. A 17. igénypont szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R5 jelentése hidrogénatom.
- 20. A 17. igénypont szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R5 jelentése metilcsoport.
- 21. A 17-20. igénypontok bármelyike szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R1 jelentése metilcsoport.
- 22. (IX) általános képletű vegyületek - ahol a képletben R' jelentése metilcsoport és n értéke kb. 112.
- 23. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok, gyógyászati hatóanyagként történő felhasználásra, betegségek kezelésénél vagy megelőzésénél.
- 24. Eljárás az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 17. igénypont szerinti vegyületet valamely fehéije vagy sója szabad aminocsoportjával reagáltatunk, és a fehérje konjugátumot a reakcióelegyből izoláljuk.
- 25. Gyógyászati készítmények, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumot és gyógyászatilag inért hordozóanyagot tartalmaznak.
- 26. Gyógyászati készítmények immunomodulációs rendellenességek - pl. neopláziás betegségek vagy fertőzéses betegségek - kezelésére vagy megelőzésére.azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumot és gyógyászatilag inért hordozóanyagot tartalmaznak.
- 27. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok felhasználása betegségek kezelésére vagy megelőzésére a nem-humángyógyászatban.
- 28. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti vegyületek felhasználása betegségek kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmények előállítására.
- 29. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok, amelyeket a 24. igénypont szerinti eljárással vagy annak nyilvánvaló kémiai ekvivalensével állíthatunk elő.
- 30. Új fehérje konjugátumok, lényegében ahogyan azokat a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.
- 31. Anyagok vagy készítmények, kezelési eljárásban történő új felhasználására, lényegében ahogyan azokat a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.
- 32. Új eljárások az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok előállítására, lényegében ahogyan azokat a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.
- 33. Új gyógyászati készítmények, lényegében ahogyan azokat a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.
- 34. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti fehérje konjugátumok új felhasználásai, lényegében ahogyan azokat a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67400191A | 1991-03-25 | 1991-03-25 | |
| US07/767,000 US5595732A (en) | 1991-03-25 | 1991-09-27 | Polyethylene-protein conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211945A9 true HU211945A9 (en) | 1996-01-29 |
Family
ID=27101069
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9200955A HUT60512A (en) | 1991-03-25 | 1992-03-23 | Process for producing polyethylene glycol conjugates of proteins |
| HU95P/P00259P HU211945A9 (en) | 1991-03-25 | 1995-06-19 | Polyethylene glycol protein conjugates |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9200955A HUT60512A (en) | 1991-03-25 | 1992-03-23 | Process for producing polyethylene glycol conjugates of proteins |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US5595732A (hu) |
| EP (1) | EP0510356B1 (hu) |
| JP (1) | JP2637010B2 (hu) |
| KR (1) | KR920018079A (hu) |
| CN (2) | CN1038035C (hu) |
| AT (1) | ATE176159T1 (hu) |
| AU (2) | AU657311B2 (hu) |
| BG (1) | BG60800B2 (hu) |
| BR (1) | BR9201015A (hu) |
| CA (1) | CA2063886C (hu) |
| CS (1) | CS87192A3 (hu) |
| CY (1) | CY2169B1 (hu) |
| DE (1) | DE69228269T2 (hu) |
| DK (1) | DK0510356T3 (hu) |
| EE (1) | EE9400356A (hu) |
| ES (1) | ES2128329T3 (hu) |
| FI (2) | FI107927B (hu) |
| GR (1) | GR3030049T3 (hu) |
| HU (2) | HUT60512A (hu) |
| IE (1) | IE920936A1 (hu) |
| IL (1) | IL101348A0 (hu) |
| IS (1) | IS3824A (hu) |
| MW (1) | MW1892A1 (hu) |
| MX (1) | MX9201298A (hu) |
| MY (1) | MY131095A (hu) |
| NO (1) | NO921142L (hu) |
| NZ (2) | NZ248022A (hu) |
| OA (1) | OA09760A (hu) |
| RO (1) | RO109543B1 (hu) |
| SI (1) | SI9210294A (hu) |
| ZA (1) | ZA922110B (hu) |
| ZW (1) | ZW4392A1 (hu) |
Families Citing this family (245)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| WO1994004193A1 (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-03 | Enzon, Inc. | Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
| NZ250375A (en) * | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
| US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| US5478860A (en) * | 1993-06-04 | 1995-12-26 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery |
| US5622986A (en) * | 1993-10-20 | 1997-04-22 | Enzon, Inc. | 2'-and/or 7-substituted taxanes |
| US5965566A (en) * | 1993-10-20 | 1999-10-12 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
| US5880131A (en) * | 1993-10-20 | 1999-03-09 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
| US5919455A (en) * | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| EP0730470B1 (en) * | 1993-11-10 | 2002-03-27 | Enzon, Inc. | Improved interferon polymer conjugates |
| US5951974A (en) * | 1993-11-10 | 1999-09-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates |
| US5730990A (en) | 1994-06-24 | 1998-03-24 | Enzon, Inc. | Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5738846A (en) * | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
| US7008624B1 (en) * | 1995-02-22 | 2006-03-07 | Immunex Corporation | Antagonists of interleukin-15 |
| DE19512484A1 (de) * | 1995-04-04 | 1996-10-17 | Bayer Ag | Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika |
| DE19514087A1 (de) * | 1995-04-13 | 1996-10-17 | Deutsches Krebsforsch | Konjugat aus einem Wirkstoff, einem Polyether und ggfs. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein |
| ZA963530B (en) * | 1995-05-05 | 1996-11-05 | Hoffmann La Roche | Recombinant obese (ob) proteins |
| DE741187T1 (de) * | 1995-05-05 | 1997-04-30 | Hoffmann La Roche | Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine |
| EP0858343B1 (en) | 1995-11-02 | 2004-03-31 | Schering Corporation | Continuous low-dose cytokine infusion therapy |
| US5908621A (en) | 1995-11-02 | 1999-06-01 | Schering Corporation | Polyethylene glycol modified interferon therapy |
| US6025324A (en) * | 1996-05-15 | 2000-02-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Pegylated obese (ob) protein compositions |
| TW517067B (en) * | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
| ATE200030T1 (de) * | 1997-01-29 | 2001-04-15 | Polymasc Pharmaceuticals Plc | Pegylationsverfahren |
| EP0973384A4 (en) | 1997-02-13 | 2004-10-13 | Sky High Llc | ORGAN PRESERVATION SOLUTION |
| US7122636B1 (en) * | 1997-02-21 | 2006-10-17 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same |
| BR9807464A (pt) | 1997-02-21 | 2000-05-09 | Genentech Inc | Conjugado, composição, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir um polipeptìdeo e polipeptìdeo. |
| US5981709A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-09 | Enzon, Inc. | α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same |
| US5985263A (en) * | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
| US7005504B2 (en) * | 1998-01-22 | 2006-02-28 | Genentech, Inc. | Antibody fragment-peg conjugates |
| US6468532B1 (en) | 1998-01-22 | 2002-10-22 | Genentech, Inc. | Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates |
| US6458355B1 (en) | 1998-01-22 | 2002-10-01 | Genentech, Inc. | Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates |
| FR2774687B1 (fr) * | 1998-02-06 | 2002-03-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques |
| US6180096B1 (en) * | 1998-03-26 | 2001-01-30 | Schering Corporation | Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates |
| CN100335503C (zh) * | 1998-04-28 | 2007-09-05 | 应用研究系统Ars股份公司 | 多元醇干扰素β偶联物 |
| DE69901321T2 (de) | 1998-05-15 | 2002-12-12 | Schering Corp | Kombinationstherapie enthaltend Ribavirin und Interferon alpha bei Patienten mit chronischer Hepatitis C Infektion, die nicht antiviral vorbehandelt sind |
| ES2251196T3 (es) * | 1998-06-08 | 2006-04-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Uso de peg-ifn-alfa y ribavirina para el tratamiento de hepatitis c cronica. |
| US6703381B1 (en) | 1998-08-14 | 2004-03-09 | Nobex Corporation | Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier |
| ES2257884T3 (es) * | 1998-10-16 | 2006-08-01 | Biogen Idec Ma Inc. | Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos. |
| EA005005B1 (ru) | 1998-10-16 | 2004-10-28 | Байоджен, Инк. | ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ |
| DE69934425T2 (de) | 1998-10-23 | 2007-09-27 | Amgen Inc., Thousand Oaks | Thrombopoietin substitute |
| CO5170404A1 (es) | 1999-04-08 | 2002-06-27 | Schering Corp | Terapia para melanomas |
| US6362162B1 (en) | 1999-04-08 | 2002-03-26 | Schering Corporation | CML Therapy |
| US6605273B2 (en) | 1999-04-08 | 2003-08-12 | Schering Corporation | Renal cell carcinoma treatment |
| US6923966B2 (en) | 1999-04-08 | 2005-08-02 | Schering Corporation | Melanoma therapy |
| PE20010288A1 (es) | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
| AU4934299A (en) * | 1999-07-15 | 2001-02-05 | Kuhnil Pharm. Co., Ltd. | Novel water soluble-cyclosporine conjugated compounds |
| SK8292002A3 (en) * | 1999-11-12 | 2002-12-03 | Maxygen Holdings Ltd | A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof |
| CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
| MXPA02006795A (es) | 2000-01-10 | 2005-04-19 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados g-csf. |
| US6806063B2 (en) | 2000-02-11 | 2004-10-19 | Maxygen Aps | Factor VII or VIIa-like molecules |
| US7309694B2 (en) * | 2000-02-15 | 2007-12-18 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Modified cytokines for use in cancer therapy |
| US7109303B2 (en) * | 2000-02-15 | 2006-09-19 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Modified cytokines for use in cancer therapy |
| IT1317835B1 (it) * | 2000-02-15 | 2003-07-15 | San Raffaele Centro Fond | Citochine modificate per uso nella terapia del cancro. |
| US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
| SG98393A1 (en) | 2000-05-19 | 2003-09-19 | Inst Materials Research & Eng | Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels |
| US7208167B2 (en) * | 2000-08-07 | 2007-04-24 | Sciclone Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy |
| US7118737B2 (en) * | 2000-09-08 | 2006-10-10 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Polymer-modified synthetic proteins |
| JP2004508338A (ja) * | 2000-09-08 | 2004-03-18 | グリフォン セラピューティクス，インコーポレーテッド | ポリマー修飾合成タンパク質 |
| US20020065397A1 (en) * | 2000-10-12 | 2002-05-30 | Joseph Roberts | Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation |
| SK11882003A3 (sk) | 2001-02-27 | 2004-03-02 | Maxygen Aps | Variant štandardného ľudského interferónu ß, nukleotidová sekvencia kódujúca tento variant, expresný vektor a hostiteľská bunka s jej obsahom, farmaceutický prostriedok s obsahom uvedeného variantu a jeho použitie |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US7038015B2 (en) * | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6713452B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6828305B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US7713932B2 (en) | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
| US6858580B2 (en) * | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6835802B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
| EP1419191B1 (en) | 2001-08-22 | 2007-10-17 | Bioartificial Gel Technologies Inc. | Process for the preparation of activated polyethylene glycols |
| US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| US6913903B2 (en) | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7166571B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
| US7312192B2 (en) | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| UA78726C2 (en) | 2001-11-01 | 2007-04-25 | Sciclone Pharmaceuticals Inc | Pharmaceutical composition of thymosin alpha 1 conjugated with polyethylene glycol, method for production, and method for treatment |
| US20040058865A1 (en) * | 2001-11-26 | 2004-03-25 | Danishefsky Samuel J | Homing peptide multimers, their preparation and uses |
| US6956135B2 (en) * | 2001-12-11 | 2005-10-18 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| US7041855B2 (en) * | 2001-12-11 | 2006-05-09 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| KR100488351B1 (ko) * | 2001-12-11 | 2005-05-11 | 선바이오(주) | 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체 |
| US6916962B2 (en) * | 2001-12-11 | 2005-07-12 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| KR100888371B1 (ko) | 2002-01-17 | 2009-03-13 | 동아제약주식회사 | 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제 |
| PL397261A1 (pl) | 2002-01-18 | 2012-03-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktywowany polimer glikolu polialkilenowego, kompozycja i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie |
| US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
| GB0209896D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| GB0209893D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Molmed Spa | Conjugate |
| US20040002451A1 (en) * | 2002-06-20 | 2004-01-01 | Bruce Kerwin | Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing |
| JP4634145B2 (ja) | 2002-06-21 | 2011-02-16 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ペジル化されたｖｉｉ因子糖形体 |
| KR20050048544A (ko) | 2002-06-28 | 2005-05-24 | 이데닉스 (케이만) 리미티드 | 플라비비리다에 감염 치료용의 변형된 2' 및3'-뉴클레오사이드 프로드럭 |
| WO2004005341A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
| CA2490007C (en) | 2002-07-19 | 2011-05-24 | Omeros Corporation | Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefor, and hydrogels and biomaterials made there from |
| EP1382352A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-01-21 | GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH | Bisacyloxypropylcystein-Konjugate und deren Verwendung |
| JP4451308B2 (ja) * | 2002-07-24 | 2010-04-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ポリアルキレングリコール酸添加剤 |
| WO2004065362A2 (en) * | 2002-08-16 | 2004-08-05 | University Of Massachusetts | Pyridine and related ligand compounds, functionalized nanoparticulate composites and methods of preparation |
| US7314613B2 (en) | 2002-11-18 | 2008-01-01 | Maxygen, Inc. | Interferon-alpha polypeptides and conjugates |
| US7217845B2 (en) * | 2002-11-25 | 2007-05-15 | Sun Bio, Inc. | Bifunctional polyethylene glycol derivatives |
| MXPA05006945A (es) * | 2002-12-26 | 2005-12-14 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor. |
| MXPA05006944A (es) | 2002-12-26 | 2005-12-14 | Mountain View Pharmaceuticals | Conjugados polimericos de interferon-beta cion potencia biologica aumentada. |
| US20040176655A1 (en) * | 2003-02-05 | 2004-09-09 | Ayoub Paul Marie | Methods of preparing branched alkyl aromatic hydrocarbons |
| WO2004084949A2 (en) * | 2003-03-20 | 2004-10-07 | Xencor | Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages |
| CA2458085A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-09-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Transcriptional activity assay |
| ES2726998T3 (es) * | 2003-05-30 | 2019-10-11 | Gilead Pharmasset Llc | Análogos de nucleósidos fluorados modificados |
| GB0320638D0 (en) | 2003-09-03 | 2003-10-01 | Novartis Ag | Organic compounds |
| ES2831379T3 (es) * | 2003-10-09 | 2021-06-08 | Ambrx Inc | Derivados poliméricos para la modificación selectiva de proteínas |
| CA2542179A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Novo Nordisk A/S | Il-21 derivatives |
| EP2633866A3 (en) | 2003-10-17 | 2013-12-18 | Novo Nordisk A/S | Combination therapy |
| ZA200606225B (en) * | 2004-02-02 | 2007-11-28 | Ambrx Inc | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| EP1718664A4 (en) | 2004-02-02 | 2008-08-13 | Ambrx Inc | MODIFIED HUMAN FOUR FIXED PROPELLANT (4HB) BEAM POLYPEPTIDES, AND USE THEREOF |
| US7351787B2 (en) * | 2004-03-05 | 2008-04-01 | Bioartificial Gel Technologies, Inc. | Process for the preparation of activated polyethylene glycols |
| JP2008507298A (ja) | 2004-05-19 | 2008-03-13 | マキシジェン， インコーポレイテッド | インターフェロンαポリペプチドおよび結合体 |
| US20060194726A1 (en) * | 2004-05-25 | 2006-08-31 | Rueger David C | Methods of treating cartilage defects |
| US20060018875A1 (en) * | 2004-06-14 | 2006-01-26 | Blatt Lawrence M | Interferon compositions and methods of use thereof |
| KR101699142B1 (ko) * | 2004-06-18 | 2017-01-23 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| MXPA06015234A (es) * | 2004-06-30 | 2007-11-22 | Nektar Therapeutics Al Corp | Conjugados de fraccion polimero-factor ix. |
| JP2008505928A (ja) * | 2004-07-08 | 2008-02-28 | アムジェン インコーポレーテッド | 治療用ペプチド |
| JP5220410B2 (ja) | 2004-07-19 | 2013-06-26 | バイオコン・リミテッド | インスリン−オリゴマー複合体、その処方物及び使用 |
| CN101023094B (zh) * | 2004-07-21 | 2011-05-18 | 法莫赛特股份有限公司 | 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备 |
| BRPI0512396A (pt) * | 2004-07-21 | 2008-03-11 | Ambrx Inc | polipeptìdeos biossintéticos utilizando aminoácidos codificados não naturalmente |
| EP1796647B1 (en) * | 2004-08-12 | 2010-08-11 | Schering Corporation | Stable pegylated interferon formulation |
| EP3109244B1 (en) | 2004-09-14 | 2019-03-06 | Gilead Pharmasset LLC | Preparation of 2'fluoro-2'-alkyl-substituted or other optionally substituted ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives |
| US8080391B2 (en) | 2004-12-22 | 2011-12-20 | Ambrx, Inc. | Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer |
| US7939496B2 (en) * | 2004-12-22 | 2011-05-10 | Ambrx, Inc. | Modified human growth horomone polypeptides and their uses |
| BRPI0519170A8 (pt) * | 2004-12-22 | 2018-05-08 | Ambrx Inc | formulações de hormônio de crescimento humano que compreendem um aminoácido não naturalmente codificado |
| ATE541934T1 (de) * | 2004-12-22 | 2012-02-15 | Ambrx Inc | Zusammensetzungen von aminoacyl-trna-synthetase und verwendungen davon |
| ES2434035T3 (es) * | 2004-12-27 | 2013-12-13 | Baxter International Inc. | Conjugados de polímero-factor von Willebrand |
| WO2006080171A1 (ja) | 2005-01-31 | 2006-08-03 | Effector Cell Institute, Inc. | 免疫増強剤 |
| EP1888633A4 (en) | 2005-05-18 | 2010-01-27 | Maxygen Inc | UNFOLDED INTERFERON ALPHA POLYPEPTIDE |
| US20070015701A1 (en) * | 2005-06-01 | 2007-01-18 | Samuel Zalipsky | Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7 |
| CN101247821B (zh) * | 2005-06-03 | 2013-01-23 | Ambrx公司 | 经改良人类干扰素分子和其用途 |
| US8633300B2 (en) | 2005-06-17 | 2014-01-21 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine |
| CN101242842A (zh) | 2005-06-17 | 2008-08-13 | 诺瓦提斯公司 | Sanglifehrin在hcv中的用途 |
| CA2613355C (en) * | 2005-06-24 | 2014-04-22 | Duke University | A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers |
| DK1937824T3 (da) * | 2005-08-18 | 2013-04-02 | Ambrx Inc | Sammensætninger af tRNA og anvendelser deraf |
| US20070123646A1 (en) * | 2005-09-13 | 2007-05-31 | Lele Bhalchandra S | Protein-polymer conjugates and synthesis thereof |
| EP1776963A1 (en) * | 2005-10-19 | 2007-04-25 | Gbf-Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh | Hexosylceramides as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions |
| WO2007056448A2 (en) * | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Ambrx, Inc. | Accelerants for the modification of non-natural amino acids and non-natural amino acid polypeptides |
| CN106443006A (zh) | 2005-11-16 | 2017-02-22 | Ambrx公司 | 包括非天然氨基酸的方法和组合物 |
| DK1968635T3 (en) * | 2005-12-14 | 2014-12-15 | Ambrx Inc | Compositions and Methods of, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| US20130172274A1 (en) | 2005-12-20 | 2013-07-04 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
| CA2634034A1 (en) | 2005-12-20 | 2007-06-28 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
| US8841255B2 (en) | 2005-12-20 | 2014-09-23 | Duke University | Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides |
| EP1985303B1 (en) | 2006-01-12 | 2012-11-21 | Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. | Oral composition containing Interferon-alpha |
| WO2007088051A2 (en) | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Modulation of mdl-1 activity for treatment of inflammatory disease |
| EP1818392B1 (en) * | 2006-02-14 | 2010-08-25 | Genetix Limited | Cell culture medium |
| US7645860B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
| CA2647314A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Baxter International Inc. | Pegylated factor viii |
| WO2007133865A2 (en) | 2006-04-11 | 2007-11-22 | Novartis Ag | Hcv/hiv inhibitors an their uses |
| JO3324B1 (ar) | 2006-04-21 | 2019-03-13 | Amgen Inc | مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية |
| MX2008014685A (es) | 2006-05-24 | 2008-11-27 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Analogos de factor ix con semivida prolongada in vivo. |
| EP1897557A1 (en) * | 2006-09-07 | 2008-03-12 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Use of glycolipids as adjuvants |
| MX2009002523A (es) | 2006-09-08 | 2009-03-20 | Ambrx Inc | Polipeptido de plasma humano modificado o andamios fc y sus usos. |
| CN106190983B (zh) * | 2006-09-08 | 2019-05-28 | Ambrx公司 | 用于脊椎动物细胞的杂合抑制tRNA |
| DK2064333T3 (da) * | 2006-09-08 | 2014-05-05 | Ambrx Inc | Suppressor-trna-transkription i hvirveldyrceller |
| US7964580B2 (en) | 2007-03-30 | 2011-06-21 | Pharmasset, Inc. | Nucleoside phosphoramidate prodrugs |
| KR20140012199A (ko) | 2007-03-30 | 2014-01-29 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도 |
| JP2010525821A (ja) | 2007-05-02 | 2010-07-29 | アンブルックス，インコーポレイテッド | 修飾ＩＦＮβポリペプチドおよびこれらの使用 |
| RU2453332C2 (ru) | 2007-10-16 | 2012-06-20 | Байокон Лимитид | Твердая фармацевтическая композиция (варианты) и способ контроля концентрации глюкозы с ее помощью, способ получения твердой фармацевтической композиции (варианты), таблетка (варианты) и способ получения амфорных частиц |
| KR101656107B1 (ko) | 2007-11-20 | 2016-09-08 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인슐린 폴리펩티드 및 이의 용도 |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| TW200946541A (en) * | 2008-03-27 | 2009-11-16 | Idenix Pharmaceuticals Inc | Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound |
| AR071478A1 (es) | 2008-04-17 | 2010-06-23 | Baxter Healthcare Sa | Peptidos de bajo peso molecular con actividad procoagulante para el tratamiento de pacientes con deficiencia de factor v (fv), fvii, fviii, fx y/o fxi |
| US8173621B2 (en) * | 2008-06-11 | 2012-05-08 | Gilead Pharmasset Llc | Nucleoside cyclicphosphates |
| EP3412300A1 (en) | 2008-06-27 | 2018-12-12 | Duke University | Therapeutic agents comprising elastin-like peptides |
| CA2729851C (en) | 2008-07-23 | 2019-01-15 | Ambrx, Inc. | Modified bovine g-csf polypeptides and their uses |
| CN101671390B (zh) * | 2008-09-10 | 2012-10-03 | 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 | 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途 |
| CN107022020A (zh) | 2008-09-26 | 2017-08-08 | Ambrx公司 | 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途 |
| US9121024B2 (en) | 2008-09-26 | 2015-09-01 | Ambrx, Inc. | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
| CN102753563A (zh) | 2008-12-23 | 2012-10-24 | 吉利德制药有限责任公司 | 核苷类似物 |
| TW201031675A (en) | 2008-12-23 | 2010-09-01 | Pharmasset Inc | Synthesis of purine nucleosides |
| NZ593648A (en) | 2008-12-23 | 2013-09-27 | Gilead Pharmasset Llc | Nucleoside phosphoramidates |
| US20110182850A1 (en) | 2009-04-10 | 2011-07-28 | Trixi Brandl | Organic compounds and their uses |
| US8512690B2 (en) | 2009-04-10 | 2013-08-20 | Novartis Ag | Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors |
| CN101870728A (zh) | 2009-04-23 | 2010-10-27 | 派格生物医药(苏州)有限公司 | 新型Exendin变体及其缀合物 |
| TWI576352B (zh) | 2009-05-20 | 2017-04-01 | 基利法瑪席特有限責任公司 | 核苷磷醯胺 |
| US8618076B2 (en) | 2009-05-20 | 2013-12-31 | Gilead Pharmasset Llc | Nucleoside phosphoramidates |
| ES2602629T3 (es) * | 2009-06-04 | 2017-02-21 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso |
| US20110097302A1 (en) * | 2009-07-16 | 2011-04-28 | Ta Tung Yuan | Il-1ra-polymer conjugates |
| EP2459211A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-06-06 | Medtronic, Inc. | Continuous subcutaneous administration of interferon- to hepatitis c infected patients |
| AU2010282250B2 (en) * | 2009-08-14 | 2015-11-12 | Immunoforge Co., Ltd. | Modified Vasoactive Intestinal Peptides |
| US8475652B2 (en) | 2009-10-19 | 2013-07-02 | Jan A. K. Paul | Method for purification of uncatalyzed natural fuels from metal ions by means of at least one hemeprotein and use of the at least on hemeprotein |
| MX2012004971A (es) | 2009-10-30 | 2012-06-12 | Boehringer Ingelheim Int | Regimenes de dosificacion para terapia combinada del vhc, que comprende b1201335, interferon alfa y ribavirina. |
| CN107674121A (zh) | 2009-12-21 | 2018-02-09 | Ambrx 公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
| CN104017063A (zh) | 2009-12-21 | 2014-09-03 | Ambrx公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
| EP2542569B1 (en) | 2010-03-05 | 2020-09-16 | Omeros Corporation | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
| PL3290428T3 (pl) | 2010-03-31 | 2022-02-07 | Gilead Pharmasset Llc | Tabletka zawierająca krystaliczny (S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymidyn-1(2H)-ylo)-4-fluoro-3-hydroksy-4-metylotetrahydrofuran-2-ylo)metoksy)(fenoksy)fosforylo)amino)propanian izopropylu |
| CN102858790A (zh) | 2010-03-31 | 2013-01-02 | 吉利德制药有限责任公司 | 核苷氨基磷酸酯 |
| US20120135912A1 (en) | 2010-05-10 | 2012-05-31 | Perseid Therapeutics Llc | Polypeptide inhibitors of vla4 |
| AU2011268498A1 (en) | 2010-06-24 | 2013-01-31 | Genoscience Pharma Sas | Treatment of hepatitis C virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| EP3572091B1 (en) | 2010-08-17 | 2023-12-13 | Ambrx, Inc. | Modified relaxin polypeptides and their uses |
| WO2012030842A2 (en) | 2010-09-03 | 2012-03-08 | Academia Sinica | Anti-c-met antibody and methods of use thereof |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| JP2013542206A (ja) | 2010-10-05 | 2013-11-21 | ノバルティス アーゲー | Ｃ型肝炎ウイルス感染症の新規治療 |
| KR20130120481A (ko) | 2010-10-08 | 2013-11-04 | 노파르티스 아게 | 술파미드 ｎｓ3 억제제의 비타민 ｅ 제제 |
| ES2866674T3 (es) * | 2010-11-12 | 2021-10-19 | Nektar Therapeutics | Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero |
| AU2011336632B2 (en) | 2010-11-30 | 2015-09-03 | Gilead Pharmasset Llc | Compounds |
| EP2646038A1 (en) | 2010-11-30 | 2013-10-09 | Novartis AG | New treatments of hepatitis c virus infection |
| US8440309B2 (en) | 2011-01-31 | 2013-05-14 | Confluent Surgical, Inc. | Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release |
| CN103476409A (zh) | 2011-03-31 | 2013-12-25 | 诺华股份有限公司 | 治疗丙肝病毒感染的阿拉泊韦 |
| CN103458913A (zh) | 2011-04-01 | 2013-12-18 | 诺华股份有限公司 | 对乙型肝炎病毒感染或其与丁型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病结合的治疗 |
| CN103648516A (zh) | 2011-04-13 | 2014-03-19 | 诺华股份有限公司 | 使用阿拉泊韦治疗丙型肝炎病毒感染 |
| CA2873553C (en) | 2011-06-06 | 2020-01-28 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension |
| SI2717898T1 (sl) | 2011-06-10 | 2019-07-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Spojine prokoagulantov in metode za njihovo uporabo |
| US9382305B2 (en) | 2011-07-01 | 2016-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Relaxin fusion polypeptides and uses thereof |
| AU2012314517A1 (en) | 2011-09-27 | 2014-04-17 | Novartis Ag | Alisporivr for treatment of Hepatis C virus infection |
| US8767214B2 (en) | 2011-10-06 | 2014-07-01 | Nordson Corporation | Powder flow detection |
| US8889159B2 (en) | 2011-11-29 | 2014-11-18 | Gilead Pharmasset Llc | Compositions and methods for treating hepatitis C virus |
| WO2013137869A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population |
| WO2013143581A1 (en) | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population |
| CA2871579A1 (en) * | 2012-04-25 | 2013-10-31 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Use of a c-type natriuretic peptide as a bone repair promoter |
| BR112014030278A2 (pt) | 2012-06-08 | 2017-06-27 | Sutro Biopharma Inc | anticorpo, e, composição. |
| EP3135690A1 (en) | 2012-06-26 | 2017-03-01 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use |
| WO2014014821A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Redwood Biosciences, Inc. | Antibody specific for cd22 and methods of use thereof |
| BR112015003326A2 (pt) | 2012-08-16 | 2017-07-04 | Ipierian Inc | métodos de tratamento de uma tauopatia |
| KR102182800B1 (ko) | 2012-08-31 | 2020-11-25 | 서트로 바이오파마, 인크. | 아지도 기를 포함하는 변형된 아미노산 |
| CN110818798A (zh) | 2012-10-25 | 2020-02-21 | 美国比奥维拉迪维股份有限公司 | 抗补体C1s抗体和其用途 |
| WO2014071206A1 (en) | 2012-11-02 | 2014-05-08 | True North Therapeutics, Inc. | Anti-complement c1s antibodies and uses thereof |
| US10550171B2 (en) | 2012-11-21 | 2020-02-04 | The Governors Of The University Of Alberta | Immunomodulatory peptides and methods of use thereof |
| US20140205566A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-07-24 | Novartis Ag | Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof |
| EP3760228A1 (en) | 2013-06-10 | 2021-01-06 | Ipierian, Inc. | Methods of treating a tauopathy |
| US9764039B2 (en) | 2013-07-10 | 2017-09-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
| NZ716840A (en) | 2013-08-27 | 2017-06-30 | Gilead Pharmasset Llc | Combination formulation of two antiviral compounds |
| EP3055298B1 (en) | 2013-10-11 | 2020-04-29 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
| EP3065769A4 (en) | 2013-11-08 | 2017-05-31 | Biogen MA Inc. | Procoagulant fusion compound |
| CN105899230B (zh) | 2013-11-27 | 2020-06-09 | 伊皮埃里安股份有限公司 | 治疗tau病变的方法 |
| EP3139949B1 (en) | 2014-05-08 | 2020-07-29 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising a vip-elp fusion protein for use in treating cystic fibrosis |
| EP3782652A1 (en) | 2014-08-19 | 2021-02-24 | Biogen MA Inc. | Pegylation method |
| TWI705071B (zh) | 2014-10-24 | 2020-09-21 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 經修飾之fgf-21多肽及其用途 |
| CA2976038A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | Phasebio Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating muscle disease and disorders |
| JP7074341B2 (ja) | 2015-09-02 | 2022-05-24 | イムテップ エス．アー．エス． | 抗ｌａｇ－３抗体 |
| MX2018005230A (es) | 2015-11-03 | 2018-08-15 | Hoffmann La Roche | Terapia de combinacion de un inhibidor del ensamble de la capside del hbv y un interferon. |
| EP3452510A4 (en) | 2016-04-04 | 2020-01-15 | Bioverativ USA Inc. | ANTI-COMPLEMENT FACTOR BB ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| WO2018087345A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON |
| SG10201912034UA (en) | 2017-02-08 | 2020-02-27 | Bristol Myers Squibb Co | Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof |
| CN111051512A (zh) | 2017-07-11 | 2020-04-21 | 辛索克斯公司 | 非天然核苷酸的掺入及其方法 |
| JP2020529976A (ja) | 2017-08-03 | 2020-10-15 | シンソークス，インク． | 自己免疫疾患の処置のためのサイトカイン抱合体 |
| CN116948006A (zh) | 2018-09-11 | 2023-10-27 | 北京泰德制药股份有限公司 | 白介素-2多肽偶联物及其用途 |
| AU2019361206A1 (en) | 2018-10-19 | 2021-06-03 | Ambrx, Inc. | Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses |
| CN114949240A (zh) | 2019-02-06 | 2022-08-30 | 新索思股份有限公司 | Il-2缀合物及其使用方法 |
| KR20210136014A (ko) | 2019-02-12 | 2021-11-16 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 항체-tlr 작용제 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 방법 및 이의 용도 |
| MX2022011163A (es) | 2020-03-11 | 2022-10-18 | Ambrx Inc | Conjugados de polipeptidos de interleucina-2 y sus usos. |
| AU2021327396A1 (en) | 2020-08-20 | 2023-03-23 | Ambrx, Inc. | Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof |
| AU2022249223A1 (en) | 2021-04-03 | 2023-10-12 | Ambrx, Inc. | Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof |
Family Cites Families (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE337223B (hu) * | 1967-05-23 | 1971-08-02 | Pharmacia Ab | |
| US3619371A (en) * | 1967-07-03 | 1971-11-09 | Nat Res Dev | Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto |
| SE343210B (hu) * | 1967-12-20 | 1972-03-06 | Pharmacia Ab | |
| DK132327A (hu) * | 1968-07-16 | |||
| BE758425A (fr) * | 1969-12-02 | 1971-04-16 | Baxter Laboratories Inc | Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate ( |
| DE2247163A1 (de) * | 1972-09-26 | 1974-03-28 | Merck Patent Gmbh | Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US4100271A (en) * | 1976-02-26 | 1978-07-11 | Cooper Laboratories, Inc. | Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes |
| GB1578348A (en) * | 1976-08-17 | 1980-11-05 | Pharmacia Ab | Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic |
| US4094744A (en) * | 1976-11-18 | 1978-06-13 | W. R. Grace & Co. | Water-dispersible protein/polyurethane reaction product |
| US4275000A (en) * | 1977-08-22 | 1981-06-23 | National Research Development Corporation | Peptide macromolecular complexes |
| JPS55110105A (en) * | 1979-02-19 | 1980-08-25 | Japan Atom Energy Res Inst | Preparation of polymer composition containing physiologically active material |
| JPS6023084B2 (ja) * | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| US4640835A (en) * | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| JPS5896785A (ja) * | 1981-12-04 | 1983-06-08 | Stanley Electric Co Ltd | 発光ダイオ−ドの合成樹脂レンズ成形方法 |
| US4609546A (en) * | 1982-06-24 | 1986-09-02 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Long-acting composition |
| US4486344A (en) * | 1983-03-28 | 1984-12-04 | Miles Laboratories, Inc. | Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method |
| JPS6098988A (ja) * | 1983-11-01 | 1985-06-01 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| EP0154316B1 (en) * | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| GB8430252D0 (en) * | 1984-11-30 | 1985-01-09 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4732863A (en) * | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| EP0229108B1 (en) * | 1985-06-26 | 1990-12-27 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4917888A (en) * | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4847079A (en) * | 1985-07-29 | 1989-07-11 | Schering Corporation | Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal |
| US5102872A (en) * | 1985-09-20 | 1992-04-07 | Cetus Corporation | Controlled-release formulations of interleukin-2 |
| US5100664A (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-31 | Cetus Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
| US4818769A (en) * | 1985-09-20 | 1989-04-04 | Cetus Corporation | Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2 |
| US4797491A (en) * | 1986-03-17 | 1989-01-10 | Cetus Corporation | Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane |
| US5034514A (en) * | 1986-03-17 | 1991-07-23 | Cetus Corporation | Novel cross-linking agents |
| JPH0443882Y2 (hu) * | 1986-06-23 | 1992-10-16 | ||
| US4791192A (en) * | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| US4810638A (en) * | 1986-07-24 | 1989-03-07 | Miles Inc. | Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group |
| US4894226A (en) * | 1986-11-14 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation |
| US4851220A (en) * | 1986-11-26 | 1989-07-25 | Schering Corporation | Stable oleaginous gel |
| US4871538A (en) * | 1987-07-13 | 1989-10-03 | Schering Corporation | Insoluble copper-alpha interferon complex |
| AU611932B2 (en) * | 1987-08-21 | 1991-06-27 | Wellcome Foundation Limited, The | Novel complex |
| US5153265A (en) * | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5214131A (en) * | 1988-05-06 | 1993-05-25 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof |
| GB8824591D0 (en) * | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
| AU4660789A (en) * | 1988-11-23 | 1990-06-12 | Genentech Inc. | Polypeptide derivatives |
| US5089261A (en) * | 1989-01-23 | 1992-02-18 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
| US4902502A (en) * | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
| US5122614A (en) * | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| ATE300519T1 (de) * | 1989-04-19 | 2005-08-15 | Enzon Inc | Verfahren zum herstellen von modifizierten polypeptiden die eine polypeptid und ein polyalkylenoxid enthalten |
| US5234903A (en) * | 1989-11-22 | 1993-08-10 | Enzon, Inc. | Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute |
| WO1991008229A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-13 | Basf Aktiengesellschaft | Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate |
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
-
1991
- 1991-09-27 US US07/767,000 patent/US5595732A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-18 ES ES92104729T patent/ES2128329T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-18 DK DK92104729T patent/DK0510356T3/da active
- 1992-03-18 EP EP92104729A patent/EP0510356B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-18 DE DE69228269T patent/DE69228269T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-18 AT AT92104729T patent/ATE176159T1/de active
- 1992-03-23 NZ NZ248022A patent/NZ248022A/en unknown
- 1992-03-23 ZW ZW43/92A patent/ZW4392A1/xx unknown
- 1992-03-23 ZA ZA922110A patent/ZA922110B/xx unknown
- 1992-03-23 NZ NZ242084A patent/NZ242084A/en unknown
- 1992-03-23 CS CS92871A patent/CS87192A3/cs unknown
- 1992-03-23 HU HU9200955A patent/HUT60512A/hu unknown
- 1992-03-23 RO RO92-200383A patent/RO109543B1/ro unknown
- 1992-03-23 KR KR1019920004757A patent/KR920018079A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-03-24 IL IL101348A patent/IL101348A0/xx unknown
- 1992-03-24 IS IS3824A patent/IS3824A/is unknown
- 1992-03-24 FI FI921267A patent/FI107927B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-03-24 MX MX9201298A patent/MX9201298A/es unknown
- 1992-03-24 NO NO92921142A patent/NO921142L/no unknown
- 1992-03-24 JP JP4097261A patent/JP2637010B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-24 SI SI9210294A patent/SI9210294A/sl unknown
- 1992-03-24 BR BR929201015A patent/BR9201015A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-24 CN CN92101994A patent/CN1038035C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-24 IE IE093692A patent/IE920936A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-24 MY MYPI92000495A patent/MY131095A/en unknown
- 1992-03-24 AU AU13160/92A patent/AU657311B2/en not_active Ceased
- 1992-03-24 CA CA002063886A patent/CA2063886C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-25 MW MW1892A patent/MW1892A1/xx unknown
- 1992-03-25 OA OA60176A patent/OA09760A/fr unknown
-
1994
- 1994-02-25 BG BG98578A patent/BG60800B2/bg unknown
- 1994-11-01 AU AU77615/94A patent/AU671045B2/en not_active Ceased
- 1994-11-23 EE EE9400356A patent/EE9400356A/xx unknown
-
1995
- 1995-06-01 US US08/457,058 patent/US5747646A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 US US08/456,450 patent/US5539063A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 US US08/457,068 patent/US5834594A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 US US08/456,449 patent/US5849860A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 US US08/457,057 patent/US5559213A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-01 US US08/456,455 patent/US5792834A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-19 HU HU95P/P00259P patent/HU211945A9/hu unknown
-
1997
- 1997-06-10 CN CN97112755A patent/CN1108814C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-26 GR GR990401126T patent/GR3030049T3/el unknown
-
2000
- 2000-05-08 CY CY0000015A patent/CY2169B1/xx unknown
-
2001
- 2001-07-17 FI FI20011554A patent/FI20011554A/fi unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211945A9 (en) | Polyethylene glycol protein conjugates | |
| EP0593868B1 (en) | PEG-interferon conjugates | |
| US6620916B1 (en) | Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same | |
| CA1291708C (en) | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation | |
| US4766106A (en) | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation | |
| PL186949B1 (pl) | Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne | |
| EA008866B1 (ru) | ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | |
| CZ298597B6 (cs) | Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid | |
| US20070117924A1 (en) | Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same | |
| US20050281778A1 (en) | Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer | |
| KR100888371B1 (ko) | 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제 | |
| KR100480432B1 (ko) | Ｇ-ｃｓｆ와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체 | |
| KR100761652B1 (ko) | 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 다가지의 고분자유도체와 접합체 | |
| KR20040086521A (ko) | 생물학적 활성물질과 생체적합성 고분자의 1:1 접합체,이의 제조방법과 이를 함유하는 약학 조성물 |