SI9210294A - Polyethylene protein conjugates - Google Patents

Polyethylene protein conjugates Download PDF

Info

Publication number
SI9210294A
SI9210294A SI9210294A SI9210294A SI9210294A SI 9210294 A SI9210294 A SI 9210294A SI 9210294 A SI9210294 A SI 9210294A SI 9210294 A SI9210294 A SI 9210294A SI 9210294 A SI9210294 A SI 9210294A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
protein
alpha
peg
conjugate
oxy
Prior art date
Application number
SI9210294A
Other languages
English (en)
Inventor
John Hakimi
Patricia Kilian
Perry Rosen
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27101069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SI9210294(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Priority claimed from YU29492A external-priority patent/YU29492A/sh
Publication of SI9210294A publication Critical patent/SI9210294A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Description

(57) Izum se nanaša na fiziološko aktivne, pretežno neimunogene, vodotopne konjugate polietilenglikola s proteini, ki imajo vsaj del biološke aktivnosti proteina, ki tvori konjugat, vendar brez njegovih motečih imunogenih odzivov. Specifično se izum nanaša na spojine (I), kjer je R1 nižji alkil; R2je -0- ali -NH-; R3 je = N-R4, =S ali =0;R4 je nižji alkil ali cikloalkil; m in n sta izbrana izmed celih števil > ali =1, tako da ima konjugat vsaj del biološke aktivnosti nekonjugiranega (l) proteina s pridržkom, da kadar R2 stoji za -0-, je R3 različen od =N-R4; da kadar R2 stoji za -0- in R3 za =0 je protein interferon-alfa, interlevkin-1 ali interlevkin1 ra in kadar R2 stoji za -O- in R3 stoji za =S, protein in antigen E iz peloda grinta (rastline) ali albumina goveje plazme. Produkti so novi reagenti za pripravo in pa novi proteinski konjugati ki ohranijo bioaktivnost pri uporabi na človeškem telesu.
Π1-O-iCI^Cl^O^-CI^CH^R2 \ /
C
II
R3
ΝΗΠ-protein
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
Konjugati proteinov s polietilenom
Predloženi izum se nanaša na nove konjugate proteinov s polietilen glikolom (PEG).
Razni naravni in rekombinatni proteini so uporabni v medicini in farmaciji. Ko se jih enkrat očisti, izolira in formulira, se jih da parenteralno dajati za razne terapevtske indikacije. Vendar pa so parenteralno dajani proteini lahko imunogenski, sorazmerno netopni v vodi in imajo lahko kratko farmakološko razpolovno dobo. Zato je morebiti težavno dosegati terapevtsko koristne nivoje proteinov v krvi pacientov.
Te probleme se da premagati s konjugiranjem proteinov na polimere, kot je polietilen glikol. Davis et al., US patent št. 4,179,337 opisujejo konjugiranje polietilen glikola (PEG) na proteine, kot so encimi in inzulin, da nastanejo konjugati, kjer naj bi bil protein manj imunogen in bi ohranil znaten delež fiziološke aktivnosti. Nakagawa et al., US patent št. 4,791,192 opisujejo konjugiranje PEG na protein, ki aktivira Langerhansove otočke (islet-activating protein), da zmanjšajo njegove stranske učinke in imunogenost. Veronese et al., Applied Biochem. and Biotech., 11: 141-152 (1985) opisujejo aktiviranje polietilen glikolov s fenil kloroformiati za modificiranje ribonukleaze in superoksid dimutaze. Katre et al, US patenta št. 4,766,106 in 4,917,888, tudi opisujejo solubiliziranje proteinov s konjugacijo s polimeri. PEG in drugi polimeri so konjugirani na rekombinatne proteine, da zmanjšajo imunogenost in povečajo razpolovno dobo. Glej Nitecki, et al., U.S. patent št. 4,902,502, Enzon, Inc., prijava PCT/US90/02133, Nishimura et al., Evropska patentna prijava 154,316 in Tomasi, prijava PCT/US85/02572. King et al., Int. Archs. Allergy appl. Immun. 66, 439-446 (1981) opisujejo metodo za vezavo proteinov na PEG z uporabo O-(RO-PEG)-Skarboksamidometil-ditiokarbonatnih intermediatov.
Prejšnje metode za tvorbo konjugatov PEG-proteina in konjugati, ki nastajajo po navedenih metodah, predstavljajo številne probleme. Eden izmed teh problemov je, da nekatere metode za tvorbo teh konjugatov proteina-PEG lahko dezaktivirajo protein tako, da imajo nastali konjugati šibko biološko aktivnost. Poleg tega so nekateri vezalniki (linkerji), ki se jih uporablja pri tvorbi teh konjugatov PEG-proteina, lahko občutljivi na in vivo hidrolitično cepitev. Kjer se taka cepitev pojavi po dajanju, ti konjugati izgube ugodne lastnosti, kijih nudi PEG.
Predloženi izum nudi nove konjugate PEG-proteina z uporabo edinstvenih vezalnikov (linkerjev), ki vežejo razne proste amino skupine v proteinu na PEG, s katerimi obidemo probleme v zvezi s tvorbo konjugatov proteina s PEG.
Podrobneje nudi predloženi izum fiziološko aktivne konjugate proteinov s formulo
P
REO-tCHzCHzO^-CH^Ha-FF^ / C
II
NHTprotein kjer je R1 nižji alkil; R7 je -O- ali -NH-; R3 je = N-R4, =S ali =0; R4 je nižji alkil ali cikloalkil; m in n sta izbrana izmed celih števil >_ 1, tako, da ima konjugat vsaj delno biološko aktivnost nekonjugiranega proteina, s pridržkom, da kadar R7 stoji za -O-je R3 različen od -N-R4;
da v primeru, ko R2 pomeni -O- in R3 pomeni =0, protein pomeni interferon alfa, interlevkin-1 ali interlevkin-lra, in kadar R2 stoji za -O- in R3 je =S, protein ni antigen E iz peloda cvetnega prahu grinta (rastline) ali albumina goveje plazme.
Bolj specifično nudi predloženi izum konjugate s formulami
H H
N N-J-protein
R^OCCHzCHzO) -CHzCHz^ nr4 m
I-A pf -O(CH2CH2O) -CH2CH2-O yN —Protem
I-B
H
N NH4-protein FT-O(CH2CH2O^-CH2CH^ C
I-C
NH—protein
I-D
O
NH—protein
II
I-E kjer imajo Rl, R^, m, n in protein zgornje pomene.
V skladu s predloženim izumom smo tudi prvič dali na voljo protein interlevkin-1 receptor antagonist (IL-lra) in interlevkin-1 (IL-1) konjugiran na PEG.
V skladu s predloženim izumom pripravimo konjugat proteina s formulo I s kondenziranjem aktiviranega PEG oz. PEG, v katerem je bila ena hidroksi skupina nadomeščena z aktiviranim linkerjem, z eno ali več prostih amino skupin v proteinu. Aktivirane PEG spojine uporabljene za pripravo konjugata, imajo naslednje formule:
II-A
R1O(CH2CH2O)n- CH2CH2 -N= C = N -R4
II-B
R
II-C
II-D
II-E
II-F R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2—O
N'
II-G RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C—O-1^.
kjer je R1 nižji alkil, je nižji alkil ali cikloalkil, je nižji alkil ali H in n je celo število od 1 do 1000.
V skladu s predloženim izumom se z uporabo aktivirane PEG spojine s formulo
II-A, II-B, II-C, II-D, II-E, II-F ali II-G za pripravo konjugatov, tvori povezovalna vez med prostimi amino skupinami v proteinu ter PEG, tako, da nastali konjugat ohrani vsaj del biološke aktivnosti proteina ob zmanjšanju svoje imunogenosti. Poleg tega vezne skupine tvorjene v konjugatu v smislu izuma z uporabo katerega koli izmed aktiviranih polietilen glikolov s formulami II-A do II-G dajejo proteinski konjugat, ki ni zlahka podvržen in vivo hidrolitični cepitvi in nima mnogih pomanjkljivosti, ki so značilne za konjugate PEG-proteina iz stanja tehnike.
V smislu predloženega izuma sta R1 in R$ lahko katerikoli nižji alkil, prednostno metil. Izraz nižji alkil označuje nižje alkilne skupine, ki vsebujejo 1 do 6 atomov ogljika, kot so metil, etil, n-propil, izopropil itd. Na splošno je prednostna alkilna skupina nižja alkilna skupina, ki vsebuje 1 do 4 atome ogljika, pri čemer je najbolj prednosten metil.
V skladu s predloženim izumom lahko m in n izberemo izmed katerega koli celega števila >.1 tako, da ima nastali konjugat proteina vsaj del biološke aktivnosti proteina, ki tvori konjugat. Videti je, da je vsota n in m obratno sorazmerna množini biološke aktivnosti proteina, ki se ohrani v konjugatu. Numerična vrednost za n se nanaša na število enot etilen glikola v polietilen glikolu, ki tvori konjugat, in je med 1 in 1000. Izraz m se nanaša na število prostih amino skupin vsebovanih v proteinu, ki reagirajo z aktiviranim PEG. Prednostno je vrednost m v območju 1 do 5, pri čemer je 1 najbolj prednostna. Čim višja je vrednost m + n, tem višja je molekulska masa konjugata. Molekulske mase polimerov polietilen glikola s formulami II-A do II-G in proteinskih konjugatov s formulami I in I-A do I-E bo strokovnjak zlahka določil. Iz določenih molekulskih mas se da izvesti vrednosti za m in n. Izraz protein obsega po eni strani polipeptide in po drugi strani fiziološko sprejemljive adicijske soli.
Če spojina s katerokoli izmed formul II-A do Π-G reagira s proteinom in protein vsebuje več kot eno prosto amino skupino, lahko proizvedemo konjugat kot zmes raznih konjugatov proteina-PEG. V primerih, ko protein vsebuje dve prosti amino skupini, lahko reagira aktivirani PEG tako z eno izmed prostih amino skupin kot tudi z obema prostima amino skupinama. V tej situaciji vsebuje zmes en tvorjen konjugat, kjer reagirata dve prosti amino skupini s PEG ter drugi tvorjeni konjugat, kjer samo ena prosta amino skupina reagira s PEG. Ker imajo razni konjugati v tej zmesi različne molekulske mase, se da te konjugate ločiti z običajnimi metodami, kot je kromatografija. Za določitev, ali sta bila m in n pravilno izbrana, lahko izvedemo določevanje (screening) na biološko aktivnost za ločene konjugate, na enak način, kot ga uporabljamo za screening starševskega proteina za ugotovitev, ali konjugat še ohrani del biološke aktivnosti proteina uporabljenega za tvorbo konjugata. Na ta način se da števili m in n nastaviti na kakršenkoli želeni način, da dobimo želeno aktivnost.
V skladu s prednostno izvedbo predloženega izuma sta m in n kakršnokoli tako celo število, da je molekulska masa konjugata z izključitvijo mase proteina, med približno 300 in približno 30 000 daltoni. V skladu s prednostno izvedbo m stoji za 1. Kjer m stoji za 1, lahko dobimo ta konjugat celo takrat, kadar obstajata dve ali več prostih amino skupin. Aktivirana PEG spojina bo reagirala najprej z eno izmed prostih amino skupin vsebovanih v skupinah proteina. Z reguliranjem koncentracije reagentov kot proteina, ter reakcijskih pogojev v skladu s standardnimi metodami aminske kondenzacije, se da regulirati stopnjo PEG-iliranja prostih amino skupin vsebovanih v proteinu. V proteinih, ki vsebujejo eno ali več prostih amino skupin, kjer je ena izmed prostih amino skupin bolj reaktivna od drugih amino skupin, lahko izberemo pogoje tako, da protein reagira z aktivirano PEG-spojino ob tvorbi spojine s formulo I, kjer m stoji za
1. Druge proste amino skupine vsebovane v amino kislinah, ki tvorijo protein, lahko zatem reagirajo s PEG, pri čemer pustimo, da kondenzacijska reakcija dalj časa poteka, ali z uporabo drugih močnejših pogojev. V skladu s prednostno izvedbo, kjer m stoji za 1, je n katerokoli celo število, tako, da ima polietilen glikol, ki tvori konjugat, molekulsko maso 300 do 30 000 daltonov, kar ustreza n vrednosti približno 6 do 680. Bolj prednostno je n okoli 28, 112 in 225, kar ustreza molekulskim masam 1325, 5000 in 10000, pri čemer je n v področju 112 kot najbolj prednostna vrednost.
Karakterizacija polietilen glikolnega polimera z molekulsko maso je prednostno v primeri z označevanjem samo-ponavljajočih se enot v PEG polimeru s celim številom n, zaradi potencialne nehomogenosti izhodnih PEG spojin, ki so običajno definirane z njihovo povprečno molekulsko maso in ne s samo-ponavljajočimi se enotami. Izhodne
PEG spojine z raznimi molekulskimi masami se da pripraviti po metodah znanih v stroki, ali pa jih lahko dobimo od dobaviteljev na tržišču.
V primeru, da vrednosti za m in n, dobljene z določevanjem molekulskih mas, niso cela števila (kar bo običajno primer) se da te vredenosti na običajen način zaokrožiti navzgor ali navzdol.
Če je nižji alkil, je R^ lahko katerakoli nižja alkilna skupina, ki vsebuje 1 do 6 atomov ogljika, kot je zgoraj definirano. Če je R^ cikloalkil, je R$ prednostno cikloalkilna skupina, ki vsebuje 3 do 7 atomov ogljika, kot so ciklopropil, ciklopentil, ciklobutil in cikloheksil. Prednostna cikloalkilna skupina je cikloheksil.
Naslovne spojine vsakega izmed naslednjih Primerov so imenovane v skladu z IUPAC nomenklaturo. Vendar pa se da te spojine imenovati tudi kot sledi:
Primeri 1, 2, 3 in 4;
Alfa-[2-[(cikloheksilkarbonimidoil)-amino]etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-[2-[[(cikloheksilamino)metilen]amino]etil]omegametoksipoli-(oksi-l,2-etan diil).
Primeri 1A, la in ld;
Alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli(oksi-1,2-etan diil) je alternativno imenovan alfametoksi-omega-(2-kloroetil)poli(oksi- 1,2-etan diil).
Primeri IB, lb in le;
Alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli(oksi- 1,2-etan diil) je alternativno imenovan alfametoksi-omega-(2-azidoetil)poli(oksi- 1,2-etan diil).
Primeri IC, lc in lf;
Alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-1,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-metoksi-omega-(2-aminoetil)poli(oksi-l,2-etan diil).
Primeri 11, lla, llb, 12, 12A in 13-17: Alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridinil-oksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-1,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-[2-[[(2piridiniloksi)karbonil]amino]etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil).
Primeri 18,18a, 19,19A, 20, 20A, 21 in 22:
Alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli(oksi-1,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]oksi]etoksi]poli-(oksi-l,2etan diil).
Primeri 23-27:
Alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-[metoksi-omega-[2-(izotiocianato)etil]poli(oksi- 1,2-etan diil).
Primer 28:
Alfa-[(2-piridiniloksi)tiokarbonil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) je alternativno imenovan alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)tiokarbonil]oksi]-etoksi]poli-(oksi-l,2etan diil).
Predloženi izum obsega tudi postopek za pripravo konjugatov PEG-proteina s splošno formulo I ali formulami I-A do I-E, ki obsega reagiranje ene izmed aktiviranih spojin s splošnimi formulami
II-A R1O(CH2CH2O)irCH2CH2-N=C = N-R4
II-B
,5
II-C
Π-D
O
R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2—N =C=S
II-E
S
II-F R^CI^CHiO^CHi-O—C
II s
Π-G ROCC^CH/JV CH2CH2- O— kjer imajo Rl, in n zgoraj definirani pomen, s prosto amino skupino proteina ali njegove soli ter izolacijo konjugata proteina iz reakcijske zmesi.
Podrobneje lahko izvedemo sintezo posameznih PEG-derivatov, ki naj jih pripajamo s proteinom, kot tudi njihovo reakcijo s proteinom, tako, kot je opisano v naslednjih odstavkih in Primerih.
Za pripravo konjugata proteina, kjer R- stoji za -NH- in R^ stoji za -N-R^ (spojino s formulo I-A) lahko uporabimo naslednjo reakcijsko shemo:
R10(CH2CH2O)nCH2CH2-OH —► R10(CH2CH2O)nCH2CH2X
NaN3, DMF
R O(CH2CH2O)nCH2CH2NH2
R O(CH2CH2O)nCH2CH2N3
R4-N=C=S
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N-fiN-Ff (WlP’CC14^ R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N=C:N-tf
ΙΠ
Η Η Ν Ν·
R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 // Υ NR4 protein
Ι-Α kjer imajo R1, R4, n, m in protein zgoraj navedeni pomen.
V reakcijski shemi se hidroksilna skupina na koncu PEG molekule pretvori v halogensko skupino z običajnimi sredstvi kot z obdelavo s tionil halidom. Nastali PEG halid pretvorimo v azid na običajen način, kot z obdelavo z natrijevim azidom. PEG azid se da nato pretvoriti v amin na običajen način, kot s hidrogeniranjem. PEG amin nato reagira z alkil ali cikloalkil izotiocianatom, kot cikloheksilizotiocianatom, da tvorimo tiosečnino s formulo III, katero nato desulfuriramo na običajen način, da tvorimo spojino s formulo II-A, ki vsebuje karbodiimidno funkcionalno skupino. Pri pretvorbi tiosečnine s formulo III v PEG karbodiimid s formulo II-A je prednostno desulfurirno sredstvo trifenil fosfin.
PEG karbodiimid s formulo II-A lahko nato kondenziramo s proteinom pri katerih koli običajnih pogojih za kondenziranje karbodiimidov z amini. Na splošno izvedemo to reakcijo v standardni vodni pufrski raztopini s pH med 7 in 9, da tvorimo konjugat s formulo I-A. Nastala reakcija kondezacije lahko daje zmes konjugatov PEG-proteina z raznimi molekulskimi masami, v odvisnosti od števila prostih amino skupin v proteinu in reakcijskega časa. Konjugate PEG-proteina lahko nato ločimo na posamezne komponente po običajnih metodah, kot npr. visoko storilno tekočinsko kromatografijo ali gelno elektroforezo.
Za pripravo konjugata proteina, kjer stoji za -O- in R^ stoji za =S (spojin s formulo
I-B), lahko uporabimo naslednjo reakcijsko shemo:
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH +
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2-O.
O
II-B
R1-O(GH2CH2OJ(1-CH2CH2O,
NH2-protein —protein
I-B m
kjer imajo Rl, m, n in protein zgoraj navedeni pomen.
Pri tej reakciji PEG refluktiramo z l,l-karbonotioilbis-2(lH)-piridinonom v ogljikovodičnem topilu z visokim vreliščem, da proizvedemo spojino s formulo II-B. Spojino s formulo II-B lahko kondenziramo z eno ali več prostih amino skupin proteina, da tvorimo konjugate s formulo I-B na enak način, kot je opisano v zvezi s kondenzacijo spojine s formulo II-A s proteinom, da pripravimo zmes konjugatov s formulo I-A. Ločbo te zmesi se da izvesti na osnovi molekulskih mas tvorjenih produktov, kot smo že opisali.
Alternativno lahko pripravimo konjugat proteina v smislu predloženega izuma, kjer R^ stoji za -O- in R^ stoji za =S (spojina s formulo I-B), po naslednji reakcijski shemi:
R1O(CH2CH2O)2CH2CH2OH +
H
R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-O N
-protein
I-B kjer imajo Rl, m, n in protein zgoraj navedeni pomen.
V skladu s to shemo PEG reagira s tiokarbonatom s formulo VI v organskem topilu, da tvori PEG tiokarbonat s formulo II-F. Pri izvedbi te reakcije lahko uporabimo katerokoli običajno metodo za kondenziranje tiokarbonata s hidroksi skupino.
Spojino s formulo II-F pretvorimo v konjugat s formulo I-B s kondenziranjem spojine s formulo II-F z najmanj eno prosto amino skupino proteina. To reakcijo izvedemo na način, opisan za pretvorbo spojine s formulo II-A v konjugat s formulo I-A. Produkt, dobljen s to reakcijo, je lahko zmes konjugatov z različnimi molekulskimi masami, v odvisnosti od množine prostih amino skupin v uporabljenem proteinu. Te konjugate lahko ločimo po molekulski masi v skladu z že opisanim postopkom.
Za pripravo konjugata proteina, kjer R7 stoji za -NH- in R^ stoji za = O (spojina s formulo I-C), lahko uporabimo naslednjo reakcijsko shemo:
R5
O
Cl-I-Cl
IV
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2NH2
R^CH^OVCI^CHr N N'
H
II-C
NH2-protein
R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH
H
N NH+protein /
C
II o
I-C kjer imajo R1, R2, m, n in protein zgoraj navedeni pomen.
Spojino s formulo IV pripravimo s kondenziranjem fosgena z 2-hidroksipiridinom (substituiranim, če je R2 = nižji alkil), ob uporabi katerekoli običajne metode za kondenziranje kislinskega halida z alkoholom.
Kondenzacijo PEG amina s spojino s formulo IV izvedemo z refluktiranjem v halogeniranem ogljikovodičnem topilu, da pripravimo spojino s formulo II-C. Spojino s formulo II-C kondenziramo s proteinom preko ene ali več prostih amino skupin na proteinu, da tvorimo spojino s formulo I-C. To reakcijo izvedemo na način, opisan za kondenzacijo spojine s formulo II-A, da pripravimo konjugat s formulo TA. V odvisnosti od števila prostih amino skupin vsebovanih v proteinu, ki reagirajo s spojino s formulo II-C, se konjugat s formulo I-C lahko tvori kot zmes konjugatov z različnimi molekulskimi masami. Ta zmes konjugatov se da ločiti na zgoraj opisani način. Za pripravo konjugata proteina v smislu predloženega izuma, kjer R^ pomeni -NH- in R^ pomeni = S ( spojina s formulo TD), lahko uporabimo naslednjo reakcijsko shemo:
RlO(CH2CH2O)nCH2CH2NH2 + di-2-piridil tionokarbonat
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N=C=S
II-D
NH2-protein
N Hx zNH
R1O-(CH2CH2O)nCH2CH2 / 'C S
I-D kjer imajo Rl, m, n in protein zgoraj navedeni pomen.
Pri tej reakcijski shemi PEG amin reagiramo z di-2-piridil tionokarbonatom, da pripravimo spojino s formulo II-D. Pri tem postopku lahko uporabimo katerokoli običajno metodo kondenziranja amina s tiokarbonatom, da pripravimo izotiocianat. Spojino s formulo II-D reagiramo s proteinom, da se tvori konjugat s formulo TD na način, opisan za pretvorbo spojine s formulo II-A v spojino s formulo I-A. V odvisnosti od množine prostih amino skupin vsebovanih v proteinu, daje kondenzacija spojine s formulo II-D s proteinom zmes konjugatov, ki jih lahko ločimo na njihove posamezne komponente na način, ki smo ga predhodno opisali za ločbo konjugata s formulo I.
-protein m
Alternativno se da pripraviti spojino s formulo I-D ob uporabi naslednje reakcijske sheme:
S ci-tci
A ! A •r5 v
+
R1O(CH2CH2O)2CH2CH2NH2
S
X J i
R 1O(CH2CH2O)nCH2CH2NH/Xo/^> N R5
Π-Ε
NH2-protein
I-D
Spojino s formulo V pripravimo s kondenziranjem tiofosgena z 2-hidroksipiridinom (substituiranim, če je nižji alkil), z uporabo katerekoli običajne metode za kondenziranje kislinskega halida z alkoholom. Nato spojino V reagiramo s PEGaminom na način, opisan za pripravo spojine II-C. Nastala spojina je II-E. Spojino s formulo II-E kondenziramo z eno ali več prostih amino skupin na proteinu, da pripravimo konjugat s formulo I-D. To reakcijo izvedemo na način opisan za tvorbo konjugata I-A.
Za pripravo proteinskega sestavka v smislu predloženega izuma, kjer R7 stoji za -O- in R^ stoji za O (spojina s formulo I-E), lahko uporabimo naslednjo reakcijsko shemo:
R1O(CH2CH2O)2CH2CH2OH +
JI
N' Ό Ό
R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 // ) N H--protein \ / c I-E kjer imajo Rl, m, n in protein zgoraj navedeni pomen.
Pri zgornji reakcijski shemi di-2-piridil karbonat reagira s PEG za pripravo spojine s formulo II-G. To reakcijo izvedemo pri pogojih, ki so običajni za kondenzacijo alkohola s karbonatom. Spojino s formulo II-G pretvorimo v spojino s formulo I-E s kondenziranjem spojine s formulo II-G z eno ali več prostih amino skupin v proteinu. To reakcijo izvedemo na enak način, kot smo opisali v zvezi s pretvorbo spojine s formulo II-A v spojino s fromulo I-A. Tako pripravljena reakcijska zmes lahko vsebuje zmes konjugatov s formulo I-E v odvisnosti od prostih amino skupin vsebovanih v proteinu. Ta zmes predstavlja zmes raznih konjugatov z različnimi molekulskimi masami. Te razne konjugate lahko izoliramo iz zmesi v skladu s predhodno opisanim postopkom.
V skladu s prednostno izvedbo predloženega izuma lahko pripravimo konjugat interferona-alfa s PEG po naslednji reakcijski shemi:
0 ΥΊ
R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2- N H
II-C
NH2-interferon-alfa
H
N N H— interferon-alfa r1-o(ch2ch2o)-ch2ch2 // xcz II
O kjer je Rl metil, n pa je okoli 112.
Ta reakcija je posebno zanimiva za interferon-alfa podtipa interferon-alfa A (imenovan tudi interferon-alfa 2).
Sinteza aktivirane PEG spojine II-C je opisana predhodno v zvezi s sintezo konjugata proteina, v katerem R^ stoji za -NH- in R^ stoji za = O. Končni konjugat interferonaalfa lahko dobimo na analogen način, kot smo opisali predhodno ali v Primerih za sintezo konjugata proteina I-C.
Za pripravo konjugata s PEG lahko uporabimo katerikoli protein s fiziološko aktivnostjo ali njegovo sol, pod pogojem, da ta protein vsebuje vsaj eno amino skupino za kondenzacijo.
Prednostni proteini, ki jih lahko uporabimo pri predloženem izumu so : interlevkin-1 (IL-1), interlevkin-1 receptor antagonist (IL-lra), interlevkin-2 (IL-2) in interferoni, oz. IFN-alfa (levkocit interferoni), IFN-beta (fibroblast interferon) in IFN-gama (imunski interferon), njihove v naravi nastopajoče oblike kot tudi njihovi analogi, homologi ali okrnjene oblike.
Interlevkin-1 receptor antagonist (IL-lra) lahko dobimo iz celičnih kultur ali z rekombinatnimi tehnikami. Ena izmed metod za pridobivanje IL-lra je obdelava U937 humanih mielomonocitičnih celic (ATCC CRL 1593) z diferenciacijskim sredstvom forbol miristat acetatom (PMA) in nato njihovo stimuliranje z Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF; dobljenega iz Amgena) ter izolacija in čiščenje IL-lra iz tekočega vrhnjega sloja (supernatant) kulture, kot so opisali Carter et al., Nature 344, 633-637 (1990).
Rekombinatna IL-lra se nanaša na IL-lra s primerljivo biološko aktivnostjo kot nativna IL-lra, vendar pripravljeno z rekombinantnimi tehnikami, kot so opisali Carter et al. zgoraj, ali Eisenberg et al., Nature 343, 341-346 (1990).
Interferon vključuje vse tipe interferonov, kot so α, β, 7 ali ω interferoni in vse podtipe navedenih tipov. Interferone se da dobiti iz tkiv ali tkivnih kultur, ali pa jih lahko pripravimo z uporabo rekombinatnih tehnik opisanih v literaturi, kot je npr. opisano v Evropski patentni prijavi, objava št. 43 980. V stroki so znane tudi druge metode za ustvarjanje in izolacijo naravnih ali rekombinatnih interferonov.
V skladu s predloženim izumom smo ugotovili, da imajo konjugati proteina v smislu predloženega izuma enako uporabnost kot protein uporabljen za tvorbo konjugata. Zato so ti konjugati terapevtsko učinkoviti na enak način kot protein, iz katerega so tvorjeni in se jih da uporabiti na enak način kot sam protein, brez izzvanja nezaželenih imunskih odzivov, ki so lahko povezani z dajanjem samih proteinov osebam (pacientom). Zato predloženi izum obsega tudi farmacevtske sestavke na osnovi spojin s formulo I ali njihovih soli in postopke za njihovo pripravo.
Farmacevtski sestavki v smislu predloženega izuma uporabljeni za kontrolo ali preventivo bolezni, obsegajo konjugat proteina s splošno formulo I in terapevtsko inerten, netoksičen in terapevtsko sprejemljiv nosilni material. Farmacevtske sestavke, namenjene za uporabo, lahko formuliramo in doziramo na način, ki je v skladu z dobro medicinsko prakso, pri čemer upoštevamo motnjo, ki jo zdravimo, stanje individualnega pacienta, lokus oddajanja proteinskega konjugata, metodo dajanja in druge faktorje, kijih strokovnjaki iz prakse poznajo.
Naslednji Primeri predstavljajo izvedbene primere predloženega izuma, ne da bi ga omejevali.
Primer 1
Priprava alfa-I2-Fi(Cikloheksilkarbonimidoil)-amino1etin-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 111.7.
A. Priprava alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 (Tukaj SRU označuje število samo-ponavljajočih se enot, prisotnih v PEG polimeru).
Iz gošče 50 mg MPEG (metoksipolietilen glikol, molekulska masa 5000) v 700 ml toluena smo destilirali 200 ml topila. Refluktirajoči raztopini smo dokapavali 0.8 ml suhega piridina in 2.2 ml tionil klorida. Po 4-urnem refluktiranju smo reakcijsko zmes pustili čez noč ob mešanju. Topilo smo nato odstranili ob zmanjšanem tlaku in dodali 500 ml CH2CI2 k preostanku. Nastalo raztopino smo nato sušili z brezvodnim K2CO3 in vodili skozi 50 g bazične glinice (Wolem Super I). Večino CH2CI2 smo nato odstranili ob znižanem tlaku in dodali 1 liter dietiletra k nastalemu sirupu. Eter smo odstranili z destilacijo in dodali dodaten dietileter, da smo povzročili obarjanje. Zmes smo mešali pri sobni temperaturi dve uri in nato filtrirali, da smo dobili 45 g alfa-(2kloroetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za: C3H7C1O(CH2CH2O)11L7 C, 53.97; H, 9.12; Cl, 0.71.
Ugot.: C, 54.21; H, 8.70; Cl, 0.71.
B. Priprava alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Zmes 20 g natrijevega azida in 50 g alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 smo segrevali pri 120-125 °C v 375 ml suhega DMF (dimetil formamida). Po 7 urah smo topilo odstranili v visokem vakuumu. Preostanek smo raztopili v 500 ml CH2CI2 in filtrirali skozi diatomejsko zemljo. Večino CH2CI2 smo nato odparili in dodali dietileter, da smo povzročili obarjanje. Zmes smo mešali čez noč in nato filtrirali. Ostanek smo nato raztopili v minimumu GLYME pri 50 °C, raztopino ohladili in oborjeni produkt filtrirali, da smo dobili alfa-(2-azidoetil)-omegametoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za C3H3N3O(CH2CH2O)11L7: C, 53.77; H, 9.09; N,0.84.
Ugot.: C, 53.61; H, 9.08; N, 0.89.
C. Priprava alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Zmesi 25 g alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 v 250 ml suhega GLYME (etilenglikol-dimetileter) smo dodali 3.5 g 10% Pd/C (paladija na oglju). Zmes smo nato '
namestili v atmosfero 3.5 kg/cm2 (50 p.s.i.) H2 in stresali pri 50 °C 18 ur. Zmes smo nato filtrirali, trdne snovi izprali s CH2CI2 in združenene organske raztopine namestili pod znižan tlak, da smo odstranili topilo. Ostanek smo nato raztopili v 100 ml toplega GLYME in produkt pustili oboriti iz ohlajene raztopine. Oborino smo filtrirali in sušili s segrevanjem ob znižanem tlaku, da smo dobili 23g alfa-(2-aminoetil)-omegametoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za C3H9NO(CH2CH2O)11L7: C,54.43; H,9.20; N,0.28.
Ugot.: C,54.43; H,9.18; N,0.36.
Alternativno smo raztopino 40 g alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 in 6.7 g (25.6 mmolov) trifenilfosfina raztopljenega v 200 ml suhega CH2CI2 mešali čez noč v atmosferi argona. Dodali smo vodo (2 ml) in zmes mešali dodatnih 12 ur. Večino metilen klorida smo odstranili v vakuumu in dodali 400 ml dietiletra. Oborino smo filtrirali, izprali z etrom in raztopili v 300 ml toplega (50 °C) GLYME. Raztopino smo pustili stati pri sobni temperaturi čez noč in nastalo oborino filtrirali, izprali z 2x100 ml GLYME, 2x100 ml dietiletra in sušili v vakumski peči v toku N2, da smo dobili 35 g alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil)
SRU 111.7.
D. Priprava alfa-[2-fffcikloheksilamino)tiokarbonill-amino]etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Raztopini 4 g alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 v 60 ml suhega GLYME pri 40 °C smo dodali 0.1 ml cikloheksil izotiocianata. Raztopino smo pustili ob mešanju pri 40 °C 18 ur. Zmes smo nato filtrirali in topilo odstranili v visokem vakuumu. Preostanek smo nato raztopili v 100 ml toplega GLYME, raztopino ohladili in nastalo oborino filtrirali in sušili v visokem vakuumu, da smo dobili 3.5 g alfa-[2-[[(cikloheksilamino)tiokarbonil]-amino]etil]omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za CioH2oN20S(CH2CH20)11L7: C,54.25; H,9.13; N,0.54, S,0.62.
Ugot.: C,54.39; H,8.87; N,0.55; S,0.59.
E. Priprava alfa-i2-[[(cikloheksilkarbonimidoil)amino]etil]-omega-metoksipoli-(oksi1,2-etan diil) SRU 111.7.
Raztopino 1 g alfa-[2-[[(cikloheksilamino)tiokarbonil]-amino]etil-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, 120 mg trifenilfosfina, 90 μΐ CCI4 in 84 μΐ trietilamina v 5 ml suhega CH2CI2 smo refluktirali 72 ur. Topilo smo nato odstranili ob znižanem tlaku in preostanek raztopili v minimumu suhega GLYME. Po ohlajenju smo produkt oborili, filtrirali in sušili v vakuumu, da smo dobili alfa-[2[[(cikloheksilkarbonimidoil)amino]etil]-omega-metoksipoli-(oksi-l,2-etan diil)
SRU 111.7.
Anal. Izrač. za C39Hi8N2O(CH2CH2O)1117: C,54.61; H,9.15; N,0.55.
Ugot.: C,54.95; H,9.27; N,0.50.
Primer IA
Priprava alfa-(2-kloroetiI)-omega-metoksipolifoksi-l,2-etan diil) SRU 225
Po postopku, opisanem v Primeru IA, smo MPEG z molekulsko maso 10000 pretvorili v alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za C3H7C1O(CH2CH2O)225: C,54.37; H,9.14; Cl,0.35.
Ugot.: C,54.30; H,9.15; Cl,0.41.
Primer IB
Priprava alfa-(2-azidoetiI)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Po postopku, opisanem v Primeru IB, smo alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 225 pretvorili v alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Anal.Izrač. za C3H7N3O(CH2CH2O)225: C,54.34; H,9.13; N,0.42.
Ugot: C,54.32; H,9.28; N,0.50.
Primer 1C
Priprava alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Po postopku, opisanem v Primeru 1C, smo alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 225 pretvorili v alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Anal. Izrač. za C3H9NO(CH2CH2O)225: C,54.48; H,9.17; N,0.14.
Ugot.: C,54.80; H,9.21; N,0.12.
Primer ID
Priprava alfa-(2-kloroetiI)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3
Raztopini sveže destiliranega oksalil klorida (0.5 ml) v 40 ml suhega CH2CI2 pri 0 °C smo dokapavali 0.5 ml suhega DMF v 10 ml CH2CI2. Nastalo raztopino smo ogreli na sobno temperaturo, mešali 15 minut in nato spet ohladili na 0 °C. Nato smo dodali MPEG z molekulsko maso 1325 (5.6 g) ter nastalo raztopino refluktirali 5 ur. Zmes smo nato izlili v vodo in jo ekstrahirali s CH2CI2. Raztopino CH2CI2 smo sušili (MgSO4) in topilo odstranili ob znižanem tlaku, da smo dobili 1.7 g alfa-(2-kloroetil)omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3 v obliki belega prahu.
Anal. Izrač. za C3H7C1O(CH2CH2O)28 3: C,53.38; H,9.03; Cl,2.64.
Ugot.: C,53.48; H,9.10; Cl,2.41.
Primer le
Priprava alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 283
Po postopku, opisanem v Primeru IB, smo alfa-(2-kloroetil)-omega-metoksipoli (oksi1,2-etan diil) SRU 28.3 pretvorili v alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3.
Anal. Izrač. za C,53.12; H,8.99; N,3.11.
Ugot.: C,53.21; H,9.07; N,2.98.
Primer 1F
Priprava alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3
Po postopku, opisanem v Primeru 1C, smo alfa-(2-azidoetil)-omega-metoksipoli (oksi1,2-etan diil) SRU 28.3 pretvorili v alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3.
Anal. Izrač. za C3H9NO(CH2CH2O)28.3: C,54.47; H,9.17; N,0.14.
Ugot.: C,54.44; H,9.19; N,0.15.
Primer 2
Priprava rekombinantnega interferona-alfa (IFN-alfa) konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-I2-II(cikloheksilkarbonimidoil)amino1-etin-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alfa-[2-[[(cikloheksilkarbonimidoil)amino]-etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, pripravljenega po postopku opisanem v Primeru 1, smo dodali k 1 mg homogenega IFN-alfa v 200 μ\ pufra (0.1 M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 10 molov reagenta na 1 mol IFN-alfa. Raztopine smo temeljito premešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati 60 minut pri sobni temperaturi.
Množino derivatiziranja (ali PEG-iliranja) IFN-alfa smo ocenili s SDS-poliakrilamid gelno elektroforezo (SDS-PAGE) (Tabela I). Proteine smo prikazali s Coomassie Blue obarvanjem. Analiza produktov po 60 minutah reakcije razkrije novo zvrst proteina z višjo molekulsko maso, ki ustreza PEG-konjugiranemu IFN-alfa. IFN-alfa ima navidezno molekulsko maso 15 kD po SDS-PAGE. Nemodificirani IFN-alfa, katerega navidezna molekulska masa ostane neizpremenjena, torej ni konjugiran s PEG. S PEG-modificirani IFN-alfa produkt ima navidezno molekulsko maso 28 kD.
Tabela I: Modifikacija IFN-alfa z reagentom, opisanim v Primeru 1
Navidezna molekulska masa
IFN proteina (kD) (nemodificiran) % Celokupnega proteina iz reakcije
Primer 3
Priprava rekombinantnega interlevkina-2 (rIL-2) konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-12-11 (cikloheksilkarbonimidoil)aminol-etiH-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alfa-[2-[[(cikloheksilkarbonimidoil]amino]etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 pripravljen, kot smo opisali v Primeru 1 smo dodali k 2 mg rIL-2 v 200 μ\ pufra (0.1 M natrijevega borata, pH 9.0) v molskem razmerju 10 molov reagenta na 1 mol rIL-2. Raztopine smo temeljito premešali in pustili, reakcijo PEG-iliranja napredovati pri sobni temperaturi 60 minut.
Množino derivatiziranja (ali PEG-iliranja) proteina smo ocenili s SDS-PAGE (Tabela II). Proteine smo prikazali s Coomassie Blue obarvanjem. Analiza produktov po 60 minutah reakcije razkrije novo zvrst proteina z višjo molekulsko maso, ki ustreza PEGkonjugiranemu rIL-2. rIL-2 ima navidezno molekulsko maso 15 kD po SDS-PAGE. Nemodificirani rIL-2 je protein izoliran iz reakcijske zmesi, katerega molekulska masa ostane neizpremenjena, torej ni konjugiran s PEG. Predominantni s PEG-modificirani rIL-2 produkt ima navidezno molekulsko maso 28 kD.
Tabela II: Modifikacija rIL-2 z reagentom, opisanim v Primeru 1
Navidezna molekulska masa rIL-2 proteina (kD) (nemodificirano) % Celokupnega proteina iz reakcije
PEG-ilirani rIL-2 smo očistili iz reakcijske zmesi na način, opisan v Katre et al. [Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 84:1483-1491, (1987)] ob uporabi hidrofobne izmenjalne kromatografije (Bio-Rad; Biogel-fenil 5-PW). Uporabili smo linearen gradient s pojemajočo množino soli od 1.53 na 0.0 M (NH^SC^ v 50 mM natrijevem fosfatu s pH 7.0 ter porabili 30 minut, da smo ločili s PEG-modificirani in nemodificirani rIL-2. Alikvote frakcij smo ovrednotili s SDS-PAGE in zbrane frakcije testirali, da smo določili njihovo specifično aktivnost pri poskusu CTLL celične proliferacije po metodi, ki so jo opisali Gillis et al. [J. Immunology 120:2027-2032. (1978)]. Koncentracije proteina smo določili spektrofotometrično pri 280 nm ob uporabi ekstinkcijskega koeficienta 0.667 za rIL-2. Specifično aktivnost rIL-2 izoliranih proteinov smo izrazili kot enote/mg proteina in rezultate zbrali v Tabeli III. Videti je, da specifična aktivnost rIL-2 ni signifikantno spremenjena zaradi konjugacije s PEG.
Tabela III: Bioaktivnost rIL-2 konjugiranega na PEG z reagentom, opisanim v
Primeru 1
Navidezna molekulska masa rIL-2 proteina (kD) (nemodificiran IL2) % Specifična aktivnost (enote/mg)
2.0 xl07 2.4 χ 107
Primer 4
Priprava rekombinantnega interlevkina 1-alfa (rIL-1 alfa) konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[2-f [cikloheksilkarbonimidoillaminoletil-omegametoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Reagent, opisan v Primeru 1, smo dodali k 2.0 mg homogenega rIL-1 alfa v 1.0 ml 0.1 M natrijevega borata, pH 9.0, v molskem razmerju 10 molov reagenta na 1 mol rIL-1 alfa. Raztopino smo temeljito pomešali in pustili, da je reakcija PEG-iliranja potekala pri sobni temperaturi 60 minut.
Množino derivatizacije (ali PEG-iliranja) proteina smo ocenili s SDS-PAGE (Tabela IV). Proteine smo prikazali z obarvanjem s Coomassie Blue. Analiza produktov po 60 minutah reakcije razkrije nove proteinske zvrsti z višjo molekulsko maso, ki ustrezajo PEG konjugiranemu rIL-1 alfa proteinu. rIL-1 alfa ima navidezno molekulsko maso 17 kD po SDS-PAGE. Nemodificirani rIL-1 alfa je protein iz reakcijske zmesi, katerega navidezna molekulska masa ostane neizpremenjena in zato ni konjugirana s PEG. S PEG-modificirani rIL-1 alfa produkt ima navidezno molekulsko maso 30 kD.
TABELA IV. Modifikacija rIL-1 alfa, z reagentom opisanim v Primeru 1
Navidezna molekulska masa % Celokupnega proteina rIL-1 alfa proteina (kD) iz reakcije (nemodificiran) 85
15
Primer 5
Priprava alfa-f(l,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonin-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 111.7
Iz raztopine 1 g (0.2 mmola) MPEG (metoksipolietilenglikol) z molekulsko maso 5000 v 15 ml suhega toluena smo destilirali 5 ml topila. Dobljeno raztopino smo ohladili in dodali 46.5 mg (0.2 mmola) l,l-karbonotioilbis-2(lH)-piridinona. Zmes smo nato refluktirali v atmosferi argona 4 ure. Nato smo topilo odstranili v vakuumu in ostanek raztopili v 5 ml suhega GLYME in pustili stati preko noči. Nastalo oborino smo nato filtrirali in izprali z 2x5 ml suhega GLYME in 5 ml dietil etra. Produkt smo nato sušili v vakuumski peči v počasnem toku dušika, da smo dobili 0.96 g alfa-[(l,2-dihidro-2-oksol-piridinil)tiokarbonil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za C9H11NO3S(CH2CH2O)1117: C,54.37; H,8.99; N,0.27; S,0.62.
Ugot.: C,54.03; H,8.98; N,0.18; S,0.59.
Primer 5A
Priprava alfa-[fl,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonin-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 225
S postopkom, opisanim v Primeru 5, smo MPEG (metoksipolietilen glikol) z molekulsko maso 10000 pretvorili v alfa-[(l,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarboniljomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za CpHj C,54.54; H,9.08; N,0.14; S,0.32.
Ugot.: C,54.38; H,9.16; N,0.15; S,0.31.
Primer 6
Priprava interlevkin 1 receptor antagonista (IL-lra) konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-f(l,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonillomega>metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alfa-[(l,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonil]omega-metoksi-poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, pripravljenega kot je opisano v Primeru 5, smo dodali k 10 mg homogenega IL-lra v 1.0 ml pufra (0.1 M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 5 molov reagenta na en mol IL-lra. Raztopino smo temeljito pomešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati pri sobni temperaturi 60 minut.
Množino derivatizacije (ali PEG-iliranja) proteina smo ocenili s SDS-PAGE (Tabela V). Proteine smo prikazali z obarvanjem s Coomassie Blue. Analiza produktov po 60 minutah reakcije razkrije nove proteinske zvrsti z višjo molekulsko maso, ki ustrezajo PEG-konjugiranemu IL-lra proteinu. IL-lra ima navidezno molekulsko maso 19 kD po SDS-PAGE. Nemodificirani IL-lra je protein iz reakcijske zmesi, katerega navidezna molekulska masa ostane neizpremenjena in zato ni konjugirana s PEG.
Prevladujoči s PEG-modificirani IL-lra proteini imajo navidezne molekulske mase 26 in 33 kD.
TABELA V. Modifikacija IL-lra z reagentom, opisanim v Primeru 5.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) (nemodificirano) >33 % Celokupnega proteina iz reakcije
PEG-ilirani IL-lra smo očistili iz reakcijske zmesi z uporabo hidrofobne izmenjalne kromatografije. (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC). Linearen gradient s padajočimi koncentracijami soli od 0.43 na 0.0 M (NH4)2SO4 v 50 mM natrijevega fosfata pH 7.0 v 20 minutah, smo uporabili za ločitev PEG-iliranega IL-lra in nemodificiranega ILlra. Alikvote frakcij smo ovrednotili s SDS-PAGE in zbrane frakcije preizkusili s testom kompetitivne vezave IL-1 radioreceptorja. [Kilian et al., J. Immunol., 136, 45094514, (1986)]. Na kratko smo IL-lra in PEG-IL-lra inkubirali pri spremenljivih koncentracijah z EL-4 membranami v teku 30 minut pri 37 °C. Nato smo dodali [125i]il_i aifa ter nadaljevali z inkubacijo 30 minut. Preizkus smo zaključili z vakuumsko filtracijo in z zbranjem na celico vezanih [125i]fL_f na fjltmih ploščah. Koncentracijo IL-lra ali PEG-IL-lra, ki inhibira vezavo [125f]iL-i za 50 % (IC50), smo grafično določili. Rezultati so prikazani v Tabeli VI. IC50 za IL-lra pri tem poskusu je 1-2.0 ng/ml. PEG-ilirana IL-lra zmes je ohranila sposobnost vezave z IL-1 receptorjem na EL-4 membranah s faktorjem 2 do 3-kratno z ozirom na nemodificirani IL-lra.
TABELA VI. Inhibicija [125I1 IL-1 vezave z IL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v Primeru 5.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) ICgp (ng/ml)
19K (nemodificirano) 2.0
26K, 33K (zmes) 5.0
Farmakodinamiko IL-lra proteina smo ovrednotili in vivo s sposobnostjo IL-lra za inhibicijo rIL-1 alfa induciranja interlevkina-6. Serumi miši, ki so dobile rIL-1 alfa, vsebujejo visoke nivoje IL-6, [Mclntosh et al., Immunol. 143: 162-167, (1989)]. Dajanje nemodificiranega IL-lra skupaj z IL-1 alfa (časovna točka 0. ure ) inhibira induciranje IL-6. Ta testni sistem smo uporabili za primerjavo farmakodinamičnih lastnosti nemodificiranega in PEG IL-lra. Skupinam po tri samice C57B1/6 smo injicirali subkutano 200 gg nemodificiranega IL-lra ali PEG-IL-lra v časovnem razdobju 48 ur, 24 ur ali 6 ur pred ali istočasno (0 ur) z 0.2 gg rIL-1 alfa. Tri ure kasneje smo serumske vzorce zbrali. Določili smo nivoje IL-6 poskusu (enote) z uporabo modifikacije IL-6 poskusa, ki je bil predhodno opisan [Van Snick et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA 83:9679-9683, (1986)]. Pri IL-6 smo B9 hibridoma celice obdelali z dvojnimi serijskimi razredčinami testnih serumov v mikrotitrirnih ploščah s 96 vdolbinami. Po 3 dneh inkubacije pri 37 °C v vlažni atmosferi iz 5 % CO2 in 95 % zraka, smo v vdolbine pulzirajoče vnesli 0.5 gCi tritiiranega timidina in inkubirali dodatnih 18 ur. Celice smo nato zbrali na filtrih iz steklenih vlaken in določili nivo vgradnje tritiiranega timidina s scintilacijskim števcem. IL-6 aktivnost je izražena kot enote/ml. IL-6 enote so definirane kot obratna vrednost serumskega razredčenj a, ki tvori polovično maksimalno vrednost vgradnje tritiiranega timidina v primeri z referenčnim standardom.
Farmakodinamični podatki so zbrani v Tabeli Dl. Miši, obdelane samo z IL-1, so pokazale 28852 enot/ml IL-6. Oba, tako nemodificirani kot tudi modificirani IL-lra, sta inhibirala IL-6 induciranje pri 0 uri. Vendar pa je PEG-ilirani IL-lra kazal daljši IL-6 inhibitorski učinek v primeri z nemodificiranim IL-lra v času 8. in 24. ure po dajanju.
TABELA Dl. Farmakodinamični profil IL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v Primeru 5.
Čas (ure)_pred dajanjem IL-6 (enot/ml)
IL-1 19 kD 26 kD
0 772 705
6 8361 1587
24 22525 9844
48 18485 21119
72 13220 21470
Primer 6A
Priprava interlevkin 1 receptor antagonista (IL-lra) kon jugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-f(L2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonillomega-metoksi-poli-(oksi1,2-etan diil) SRU 225.
IL-lra smo konjugirali in očistili po postopku prikazanem v Primeru 6, ob uporabi reagenta opisanega v Primeru 5 A.
Prevladujoči PEG-modificirani IL-lra proteini imajo navidezne molekulske mase 33 kD in 48 kD. 33 kD in 48 kD protein tvorita 46 oz. 27 % celokupnega proteina v reakcijski zmesi.
Sposobnost teh proteinov za inhibiranje IL-1 vezave, kot je opisano v Primeru 6, je povzeta v Tabeli VIL S 33 kD PEG-modificirani protein ohrani sposobnost za inhibiranje IL-1 vezave za 6-krat z ozirom na IL-lra in bolj izražena modifikacija proteina s PEG, opazovana pri tem 48 kD proteinu, izzove znatno izgubo njegove vezave na IL-1 receptor.
TABELA VII. Inhibiranje IL-1 vezave z IL-lra proteini konjugiranimi z reagentom, opisanim v Primeru 5 A.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) (nemodificirano)
IC5Q_(ng/ml)
1.6
9.0
50.0
Za določitev farmakokinetičnega profila zvrsti PEG-IL-lra smo C57BF/6 mišim dajali subkutano 100 /tg modificiranih ali PEG-iliranih zvrsti IL-lra. Serumske vzorce smo zbrali po 1, 2, 3, 4 in 6 urah od miši, ki so bile dobile nemodificirani IL-lra in po 2, 4, 8, 10 in 24 urah od miši, ki so bile dobile PEG-IL-lra. Serumske nivoje smo določali s testom EL4 membranske vezave, opisanim v Primeru 6. Podatki so zbrani v Tabeli D2. PEG-IL-lra se je dal ugotoviti v serumskih vzorcih pri višjih koncentracijah in v daljšem časovnem razdobju v primeri z IL-lra, kar dokazuje podaljšan serumski časovni potek.
TABELA D2. Farmakokinetični profil IL-lra PEG-iliranega kot v Primeru 6A.
Serumska koncentracija
Čas (ure) po daianiu IL-lra
19 kD 33 kD
1 400
2 130 40 2500
4 15 800
6 16
8 300
10 250
24 15
Primer 7
Priprava rIL-lalfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-IYl,2-dihidro-2okso-l-piridinil)-tiokarboninomega-metoksi-poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Rekombinantni IL-1 alfa smo PEG-ilirali z reagentom, opisanim v Primeru 5, z metodo opisano v Primeru 4. Tri prevladujoče zvrsti z molekulskimi masami smo identificirali iz reakcijske zmesi s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimi masami, ki ustrezajo 17 (nemodificirano), 26 in 33 kD. Slednja dva PEG-ilirana proteina sta tvorila 25 oziroma 55 % celokupnega proteina.
PEG-ilirani rIL-1 alfa smo očistili iz reakcijske zmesi, po 60 minutah ob uporabi hidrofobne izmenjalne kromatografije (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC). Linearni gradient s pojemajočo koncentracijo soli od 0.43 na 0.0 M (NH^SC^ v 50 mM natrijevega fosfata pH 7.0 v 20 minutah smo uporabili, za ločitev PEG-iliranega rIL-1 alfa in nemodificiranega rIL-1 alfa. Alikvote frakcij smo ovrednotili s SDS-PAGE in zbrane frakcije testirali na specifično aktivnost s testi D10 celične proliferacije po metodi, ki so jo opisali Kaye et al. [J. Exp. Med. 158:836-854, (1983)]. Proteinske koncentracije smo določili spektrofotometrično pri 280 nM ob uporabi ekstinkcijskega koeficienta 1.0 za rIL-1 alfa. Specifična aktivnost rIL-1 alfa je približno 1.0 x 10^ enot/mg. Rezultate za specifično aktivnost smo zbrali v Tabeli VIII. S 26 kD PEG-ilirani IL-1 alfa konjugat ohrani bioaktivnost za 2 do 3-krat z ozirom na IL-1 alfa. Nadaljnja modifikacija, ki vodi do 33 kD proteina, izzove znatno izgubo bioaktivnosti.
TABELA VIII. Bioaktivnost rIL-lalfa konjugiranega z reagentom, opisanim v
Primeru 5A.
Navidezna molekulska masa rIL-1 alfa proteina (kD) (nemodificirano)
Specifična aktivnost (enot/mg)
4.6 xl07
1.9 χ 107 4.5 χ 106
Primer 8
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo alfa-i(l,2-dihidro-2-okso-lpiridinil)-tiokarbonil1omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 alfa-[(l,2-dihidro-2-okso- l-piridinil)-tiokarbonil]omega-metoksipoli(oksi- 1,2-etan diil) SRU 111.7 pripravljen na način opisan v Primeru 5, smo dodali k 1 mg očiščenega IFNalfa v 100 μΐ pufra (0.1 M natrijevega borata, pH 9.0) v molskem razmerju 8 molov PEG reagenta na 1 mol IFN-alfa. Raztopine smo temeljito pomešali in pustili, da je reakcija PEG-iliranja napredovala pri sobni temperaturi 60 minut.
Identificirali smo zvrsti s prevladujočimi molekulskimi masami iz reakcijske zmesi s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimi masami 15 (nemodificirano) in 28 kD. 28 kD PEG-ilirani protein je predstavljal 40 % celokupnega proteina. PEG-ilirani IFN-alfa smo očistili iz 60-minutne reakcijske zmesi in karakterizirali ob uporabi hidrofobne izmenjalne kromatografije (Bio-Rad; Biogel-fenil-S-PW). Uporabili smo linearen gradient s pojemajočimi koncentracijami soli od 0.42 M na 0.0 M (NH^SC^ v 50 mM natrijevega fosfata pH 7.0 ter porabili 20 minut, da smo ločili PEG-ilirani IFN-alfa in nemodificirani IFN-alfa. Alikvote frakcij smo ovrednotili s SDS-PAGE in zbrane frakcije testirali na antivirusno aktivnost (specifično aktivnost) s MDBK testom po metodi, ki sojo opisali Familletti et. al. [Methods Enzym. 78,387-394 (1987)].
Proteinske koncentracije smo določili spektrofotometrično pri 280 nM ob uporabi ekstinkcijskega koeficienta 1.0 za 1 mg/ml IFN-alfa zapufrane raztopine. Specifično aktivnost izoliranih proteinov smo izrazili kot enote/mg proteina in rezultate zbrali v Tabeli IX.
Rezultati kažejo, da specifična aktivnost 28 kD PEG-iliranega IFN-alfa ni bila signifikantno spremenjena z ozirom na IFN-alfa.
TABELA IX. Bioaktivnost IFN-alfa konjugiranega z reagentom iz Primera 5.
Navidezna molekulska masa Specifična aktivnost
IFN-alfa proteina fkD) fenot/me)
15 (nemodificirano) 1.1 χ 108
28 1.4 χ 108 Primer 8A
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-i(l,2-dihidro-2-
okso-l-piridinil)-tiokarbonil]omega-metoksipoli(oksi-L2-etan diil) SRU 225.
IFN-alfa smo PEG-ilirali kot v Primeru 8 z reagentom opisanim v Primeru 5A. Tri zvrsti s prevladujočo molekulsko maso iz reakcijske zmesi po 60 minutah smo identificirali s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimimi masami, ki ustrezajo 15 kD (nemodificirano), 35 in 43 kD. Slednja dva PEG-ilirana proteina sta predstavljala 35 oz. 33 % celokupnih proteinov v reakcijski zmesi. Specifične aktivnosti, določene s postopki opisanimi v Primeru 8, za PEG-ilirane predstavnike IFN-alfa smo zbrali v Tabeli X. Rezultati kažejo, da je 35 kD PEG-ilirani IFN-alfa produkt ohranil biološko aktivnost v območju 2 do 3-kratne vrednosti za IFN-alfa. 43 kD konjugat je izgubil znatno aktivnost.
TABELA X. Bioaktivnost IFN-alfa konjugiranega z reagentom iz Primera 5A
Navidezna molekulska masa Specifična aktivnost
IFN-alfa proteina (kD) (enot/mg) (nemodificirano) 3.3 x 108
1.2 χ 108 1.5 χ 107
Primer 8B
Priprava rIL-2 konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-i(L2-dihidro-2-okso-lpiridinil)-tiokarboninomega-metoksipoli(oksi-L2-etan diil) SRU 111.7 rIL-2 smo PEG-ilirali z reagentom, opisanim v Primeru 5, in očistili z uporabo postopka opisanega v Primeru 3.
Predstavnike s prevladujočimi molekulskimi masami iz reakcijske zmesi po 60 minutah smo identificirali s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimi masami 15 (nemodificirano) in 25 kD. S 25 kD PEG-ilirani protein je predstavljal 60 % celokupnega proteina pri reakciji.
Specifično aktivnost rIL-2 izoliranih proteinov smo izmerili tako, kot smo opisali v Primeru 3, in izrazili kot enote/mg proteina ter rezultate zbrali v Tabeli XI.
Kot je razvidno iz Tabele XI se biološka aktivnost IL-2 ni spremenila po konjugaciji s PEG.
TABELA XI. Bioaktivnost rIL-2 konjugiranega na PEG z reagentom opisanim v
Primeru 5
Navidezna molekulska masa rIL-2 proteina (kD) (nemodificirano)
Specifična aktivnost (enot/mg)
2.0 xlO7 2.0 xl07
Primer 8C
Priprava rIL-2 konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-1(1,2-dihidro-2-okso-lpiridinil)-tiokarboninomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225 rIL-2 smo PEG-ilirali na način opisan v Primeru 3, z reagentom opisanim v Primeru 5a.
Predstavnike s prevladujočimi molekulskimi masami iz reakcijske zmesi po 60 minutah smo identificirali s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimi masami 15 kD (nemodificirano), 33 kD in 43 kD. S 33 in 43 kD PEG-ilirani proteini so predstavljali 60 oz. 20 % celokupnega proteina pri reakciji.
Primer 9
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-l(l,2-dihidro-2okso-l-piridinil)-tiokarboninomega-metoksipoli(oksi-L2-etan diil) SRU 111.7
Alternativna metoda za konjugiranje IFN-alfa na PEG je bila izvedena kot sledi:
IFN-alfa (5 mg v 1 ml) smo dializirali proti pufru, ki je vseboval 5 mM natrijevega acetata, pH 5.0, 120 mM NaCl. K dializirani raztopini proteina smo dodali trden kalijev tiocianat, da smo dobili končno koncentracijo 0.5 M soli, nakar smo nastavili pH z dodatkom 1/10 volumna IM tricin-natrijevega hidroksida, pH 11.9, da smo dobili končno raztopino s pH 10.0. K vzorcu smo dodali alfa-[(l,2-dihidro-2-okso-l-piridinil)tiokarbonil]omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) pri molskem razmerju tri mole reagenta na 1 mol proteina. Reakcijo modificiranja smo pustili napredovati pri sobni temperaturi 30 minut in jo ustavili z dodatkom IM glicina, pH 6.3, do končne koncentracije 20 mM. S PEG-modificirani protein smo oborili iz raztopine z dodatkom pufra, ki je vseboval 3.5 M amonijevega sulfata, 50 mM natrijevega fosfata, pH 7.0, do končne koncentracije 1.1 M amonijevega sulfata in oborino zbrali s centrifugiranjem (10000 x g v teku 12 minut). Po splaknjenju peletke s pufrom, ki je vseboval 1.1M amonijevega sulfata, 50 mM natrijevega fosfata, pH 7.0, smo peletko ponovno raztopili v pufru, ki je vseboval 25 mM amonijevega acetata, pH 5.0. S PEG-modificirani protein smo očistili in karakterizirali, kot smo opisali v Pirmeru 2. Dobljen je en sam predstavnik PEG-iliranega IFN z navidezno molekulsko maso 28 kD. Antivirusno aktivnost (specifično aktivnost) modificiranega proteina smo določili s postopkom, opisanim v Primeru 8. Specifična aktivnost izhodnega IFN-alfa je bila 2.6 χ 103 enot/mg in specifična aktivnost IFN-alfa konjugiranega na PEG je bila 1.0 χ 103 enot/mg, kar dokazuje, da je s PEG konjugirani IFN-alfa ohranil 3-kratno biološko aktivnost z ozirom na IFN-alfa.
Primer 10
Priprava IFN alfa kon jugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-f(l,2-dihidro-2okso-l-piridinil)-tiokarbonillomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
IFN-alfa smo konjugirali na PEG po postopku opisanem v Primeru 9. Proteine smo očistili in karakterizirali tako, kot je opisano v Primerih 2 in 9. Izhodni IFN-alfa je imel specifično aktivnost 2.6 χ 103 enot/mg ob uporabi IFN-alfa konjugiranega na PEG, ki je imel navidezno molekulsko maso 31 kD in specifično aktivnost 1.0 χ 103 enot/mg, kot je opisano v Primeru 8. Bioaktivnost konjugiranega IFN-alfa je bila 3-kratna vrednost v primeri z IFN-alfa.
Primer 11
Priprava alfa -metil-omega-r2-ff(piridinijoksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2etan diil) SRU 111.7
Iz raztopine 1 g (0.2 mmola) alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli(oksi-1,2-etan diil) SRU 111.7 (pripravljenega kot v Primeru IC) v 40 ml suhega CH2CI2 smo destilirali 15 ml topila. K dobljeni raztopini smo pri 0 °C nato dodali 65 mg (0.3 mmole) di-2piridil karbonata in zmes mešali dodatne 4 ure. Topilo smo nato odstranili ob znižanem tlaku in ostanek triturirali z dietil etrom. Oborino smo nato filtrirali in izprali s 50 ml etra, čemur je sledilo 50 ml heksana. Produkt smo nato osušili v vakuumski peči v počasnem toku dušika, da smo dobili 1 g alfa-metil-omega-[2-[[(piridiniloksi)karbonil]-amino]etoksi]poli(oksi-1,2-etan diil) SRU 111.7 v obliki belega prahu.
Anal. Izrač. za C9Hi2N2O3(CH2CH2O)11L7: C,54.56; H,9.04; N,0.55. Ugot.: C,54.26; H,9.00; N,0.53.
Primer 11A
Priprava alfa-metil-omega- f 2- i f (2-piridiniloksi)karboniI1 aminol etoksi! poli(oksi-l,2etan di») SRU 225
Po postopku opisanem v Primeru 11, smo alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli (oksi1,2-etan diil) SRU 225 (pripravljen kot v Primeru lc), pretvorili v alfa-metil-omega-[2[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za C,54.54; H,9.10; N,0.28.
Ugot.: C,54.49; H,9.27; N,0.31.
Primer 11Β
Priprava alfa-metil-omega-i2-fi(2-piridiniloksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2etan diil) SRU 28.3
Po postopku opisanem v Primeru 11, smo alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli (oksi1,2-etan diil) SRU 28.3 (pripravljen kot v Primeru lf), pretvorili v alfa-metil-omega-[2[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 28.3.
Anal.Izrač. za CgH^^C^CEGCI^O^g 3: C,54.61; H,8.75; N,1.94;
Ugot.: C,54.67; H,8.96; N,1.63.
Primer 12
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-[2-Γ 1(2piridiniloksi)karboninaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 smo dodali k 25 mg očiščenega IL-lra v 2.5 ml pufra (0.1 M natrijevega borata, pH 9.0) v molskem razmerju 1 mol reagenta na en mol IL-lra. Raztopini smo temeljito pomešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati pri sobni temperaturi 60 minut. S PEG mofificirani IL-ra smo nato očistili po postopku, prikazanem v Priimeru 6.
Prevladujoči PEG-ilirani produkti iz 60 minutne reakcije so imeli navidezne molekulske mase 28 kD in 38 kD in so predstavljali približno 42 in 29 % celokupnega proteina iz reakcijske zmesi.
Sposobnost očiščenih IL-lra proteinov iz reakcijske zmesi za inhibiranje IL-1 vezave smo določili tako, kot je opisano v Primeru 6 in zbrali v Tabeli XII. Vezivne karakteristike 28 kD produkta se niso signifikantno spremenile in sposobnost vezave 38 kD proteina se je ohranila na 5-kratni vrednosti v primeri z IL-lra.
TABELA XII. Inhibicija vezave [^^1] IL-1 z IL-lra proteinom PEG-iliranim z reagentom, opisanim v Primeru 11.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) (nemodificirano)
IC50,, (ng/ml) 2.0 3.0 10.0
Farmakodinamični profil PEG IL-lra smo določili, tako kot je opisano v Primeru 6. Podatki so zbrani v Tabeli D3. Sam IL-1 je izzval 27283 enot/ml IL-6. Nemodificirani IL-lra je inhibiral pod 50 % IL-1 odziva v teku 6 ur po dajanju. Nasprotno pa je bil PEG IL-lra sicer manj aktiven pri zgodnjih časovnih točkah, vendar pa je bil mnogo aktivnejši 24. in 48. uro po injekciji. Tako je PEG-IL-lra pokazal podaljšan farmakodinamičen profil.
TABELA D3. Farmakodinamičen profil IL-lra konjugiranega z reagentom opisanim v
Primeru 11
Čas (ure) pred dajanjem IL-6 (enot/ml)
IL-1 19 kD 26 kD
0 4789 23806
6 15324 10833
24 24841 5727
48 16348 9364
72 12067 12054
Primer 12A
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-[2-f [(2piridiniloksi)karbonillamino1etoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225, (predhodno opisan v Primeru 1 la), smo dodali k 25 mg očiščenega IL-lra v
2.5 ml pufra (0.1 M natrijevega borata, pH 9.0) v molskem razmerju 4 moli reagenta na en mol IL-lra. Raztopini smo temeljito pomešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati pri sobni temperaturi 60 minut. S PEG modificirani IL-lra smo nato prečistili po postopku opisanem v Primeru 6.
Prevladujoči PEG-ilirani produkti iz 60 minutne reakcije so imeli navidezne molekulske mase 33 kD in 48 kD ter so predstavljali približno 76 oz. 15 % celokupnega proteina iz reakcijske zmesi. Karakteristike očiščenih IL-lra proteinov iz reakcijske zmesi za inhibiranje IL-1 vezave so zbrane v Tabeli 13. 33 kD s PEG modificirani protein je ohranil sposobnost za inhibiranje IL-1 vezave za 8-krat z ozirom na IL-lra. 48 kD produkt je izgubil znatno vezivno kapaciteto.
TABELA XIII. Inhibicija [323I1 IL-1 vezave z IL-lra proteini PEG-iliranimi z reagentom, opisanim v Primeru 11 A.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) IC50 (ng/ml) (nemodificirano) 0.8
6.0
18.0
Farmakokinetični profil PEG-IL-lra smo določili tako, kot je opisano v Primeru 6A. Podatki so zbrani v Tabeli D4.
PEG-IL-lra se je dalo ugotoviti v serumskih vzorcih pri višjih koncentracijah in v daljšem časovnem razdobju v primeri z nemodificiranim IL-lra.
TABELA D4. Farmakokinetični profil IL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v
Primeru 11A
Serumski nivo
Čas (urej po daianiu IL-lra (ng/ml)
19 kD 33 kD
1 220
2 33 700
3 13
4 5.3 500
6 1.5
8 150
10 83
24 Primer 13 5
Priprava rIL-2 konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-[2-if(2piridiniloksilkarbonillaminoletoksi!poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 rIL-2 smo PEG-ilirali z alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, v skladu s postopkom prikazanim v Primerih 3 in 8B. Specifično aktivnost IL-2 proteina smo določili na način, opisan v Primeru 8. Specifična aktivnost 15 kD nemodificiranega rIL-2 je bila 2 x 10^ enot/mg in 29 kD PEG-iliranega IL-2 je bila 2.4 x 10? enot/mg, pri čemer IL-2 ni kazal znatne izgube biološke aktivnosti kot posledice PEG-iliranja.
Primer 14
Priprava s PEG-modificiranega rIL-1 alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-12-ί [ (2-piridiniloksi)karbonil1amino1etoksi1poli(oksi-l,2-etan diil)
SRU 111.7 rIL-1 alfa smo PEG-ilirali z reagentom opisanim v Primeru 11, alfa-metil-omega-[2[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, po postopku prikazanem v Primerih 4 in 7. Dva PEG-ilirana rIL-1 alfa proteina z navideznima molekulskima masama 28 kD in 38 kD smo očistili in sta predstavljala 50 oziroma 25% celotnih proteinov iz reakcijske zmesi pri 60 minutah.
Primer 15
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-F2r[(2-piridiniloksi)karbonil1amino1etoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
IFN-alfa smo PEG-ilirali z reagentom opisanim v Primeru 11, alfa-metil-omega-[2-[[(2piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, v skladu s postopkom opisanim v Primeru 8. Štirideset odstotkov proteina je bilo derivatiziranega po 60 minutah in produkt je imel navidezno molekulsko maso 26 kD.
Primer 16
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-[2[r(2-piridiniloksi)karbonil1amino1etoksi1poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alternativna metoda PEG-iliranja IFN-alfa.
Ob uporabi postopka opisanega v Primeru 9, smo konjugirali IFN-alfa na PEG z alfametil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU
111.7. Specifično aktivnost IFN-alfa smo določili tako, kot je opisano v Primeru 8. Specifična aktivnost izhodnega IFN-alfa je bila 1.7 χ 102 enot/mg in specifična aktivnost IFN-alfa konjugiranega na PEG z alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) je bila 0.8 χ 102 enot/mg, kar je v območju 2-3 kratne vrednosti za IFN-alfa.
Primer 17
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-i2if(2-piridiniloksi)karboninamino1etoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Z uporabo postopka prikazanega v Primeru 9, smo IFN-alfa PEG-ilirali s pomočjo reagenta, opisanega v Primeru Ila. Specifična aktivnost določena z metodo opisano v Primeru 8 za IFN-alfa konjugiran na PEG, je bila 0.4 χ 102 enot/mg, kar dokazuje, da ni signifikantne izgube bioaktivnosti.
Primer 18
Priprava alfa-f(2-piridiniloksi)karboninomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU
111.7
Primer 15
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-f2[r(2-piridiniloksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
IFN-alfa smo PEG-ilirali z reagentom opisanim v Primeru 11, alfa-metil-omega-[2-[[(2piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, v skladu s postopkom opisanim v Primeru 8. Štirideset odstotkov proteina je bilo derivatiziranega po 60 minutah in produkt je imel navidezno molekulsko maso 26 kD.
Primer 16
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-[2rr(2-piridiniloksi)karbonillamino1etoksi1poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Alternativna metoda PEG-iliranja IFN-alfa.
Ob uporabi postopka opisanega v Primeru 9, smo konjugirali IFN-alfa na PEG z alfametil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poIi(oksi- 1,2-etan diil) SRU
111.7. Specifično aktivnost IFN-alfa smo določili tako, kot je opisano v Primeru 8. Specifična aktivnost izhodnega IFN-alfa je bila 1.7 χ 103 enot/mg in specifična aktivnost IFN-alfa konjugiranega na PEG z alfa-metil-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-1,2-etan diil) je bila 0.8 χ 103 enot/mg, kar je v območju 2-3 kratne vrednosti za IFN-alfa.
Primer 17
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-f2[f(2-piridiniloksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Z uporabo postopka prikazanega v Primeru 9, smo IFN-alfa PEG-ilirali s pomočjo reagenta, opisanega v Primeru lla. Specifična aktivnost določena z metodo opisano v Primeru 8 za IFN-alfa konjugiran na PEG, je bila 0.4 χ 103 enot/mg, kar dokazuje, da ni signifikantne izgube bioaktivnosti.
Primer 18
Priprava alfa»f(2-piridiniloksi)karboninomega»metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU
111.7
Iz raztopine 1 g MPEG z molsko maso 5000, raztopljenega v 30 ml suhega CH2CI2 smo destilirali 10 ml topila. Raztopino smo ohladili do sobne temperature in dodali 132 mg (0.6 mmolov) di-2-piridil karbonata in dodali 4 mg DMAP. Dobljeno raztopino smo nato mešali 14 ur in topilo odstranili v vakuumu. Ostanek smo triturirali z dietil etrom in nastalo oborino filtrirali. Produkt smo nato raztopili v 7 ml suhega GLYME, raztopili z ogrevanjem ter nastalo raztopino pustili ohladiti in stati pri sobni temperaturi nekaj ur. Nastalo oborino smo nato filtrirali in izprali z 2x5 ml suhega GLYME. Trdno snov smo nato osušili v vakuumski peči in v toku dušika, da smo dobili 0.7 g alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7. Anal. Izrač. za C9H1iNO4(CH2CH2O)11L7: C,54.57; H,9.02; N,0.28.
Ugot.: C,54.51; H,9.19; N,0.28.
Primer 18A
Priprava alfa-KŽ-piridiniloksijkarbonillomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil)
SRU 225
Po postopku, opisanem v Primeru 18, smo MPEG (metoksipolietilenglikol) z molekulsko maso 10.000 pretvorili v alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil), SRU 225.
Anal. Izrač. za CpHj 1NO4(CH2CH2O)225: C,54.54; H,9.08; N,0.14.
Ugot.: C,54.54; H,9.12; N,0.11.
Primer 19
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-i(2-piridiniloksi)karbonillomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
IL-lra smo PEG-ilirali z alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli (oksi-1,2etan diil) SRU 111.7, s postopkom predhodno opisanim v Primerih 6 in 12. PEG-ilirani prevladujoči produkti so imeli navidezne molekulske mase 26 kD in 33 kD in so predstavljali približno 31 oz. 57 % celotnega proteina iz 60 minutne reakcijske zmesi. Sposobnost očiščenih IL-lra proteinov iz reakcijske zmesi za inhibiranje IL-1 vezave smo določili na način, opisan v Primeru 6 in povzeto v Tabeli XIV. S 26 kD PEG-ilirani IL-lra konjugat je ohranil svojo vezivno sposobnost v 4 kratni vrednosti z ozirom na IL-lra. 33 kD konjugat je signifikantno izgubil vezivno sposobnost, kar dokazuje 15kratno zmanjšanje kompetitivne vezivne aktivnosti.
-TABELA XIV. Inhibicija vezave z IL-lra proteini PEG-iliranimi z reagentom, opisanim v Primeru 18.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) (nemodificirano)
IC50. (ng/ml) 2.0 8.0 30.0
Primer 19A
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-i(2-piridiniloksi)karboniΠomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 225
IL-ra smo PEG-ilirali z alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli (oksi-1,2etan diil) SRU 225, v skladu s postopkom opisanim v Primeru 19. Prevladujoči PEGilirani produkti iz zmesi po 60 minutah reakcije so imeli navidezne molekulske mase 33 kD in 48 kD in so predstavljali približno 47 oz. 25 % celokupnega proteina iz reakcijske zmesi.
Sposobnost očiščenih IL-lra proteinov iz reakcijske zmesi za inhibiranje IL-1 vezave smo določili tako, kot je opisano v Primerih 6 in 12 ter zbrali v Tabeli XV. 33 kD protein je ohranil aktivnost v 6-kratni vrednosti z ozirom na IL-lra. Konjugat z višjo molekulsko maso je izgubil signifikantno aktivnost.
TABELA XV. Inhibicija [125I1 IL-1 vezave z IL-lra proteini PEG-iliranimi z reagentom, opisanim v Primeru 18A.
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD) (nemodificirano)
IC50 (ng/ml) 1.5 9.0 40.0
Farmakokinetični profil PEG-IL-lra smo določili tako, kot je opisano v Primeru 6A. Podatki so zbrani v Tabeli D5. PEG-IL-lra se ja dalo ugotavljati v serumskih vzorcih v daljšem časovnem razdobju v primeri z nemodificiranim IL-lra, kar dokazuje podaljšano razpolovno dobo v serumu. Farmakodinamični profil PEG-IL-lra smo določili tako, kot je opisano v Primeru 6, le da smo dali 0.05 /zg rIL-1 alfa. Podatki so zbrani v Tabeli D6. Odziv na sam IL-1 je znašal 9203 enot/ml IL-6. Podaljšan
inhibitorski učinek v primeri z nemodificiranim IL-lra se da videti do 72 ur po dajanju PEG-IL-lra, kar dokazuje izboljšane farmakodinamične lastnosti. Skupno torej ti podatki ponazarjajo, da ima PEG-ilirani protein celo takrat, kadar ima zmanjšano aktivnost in vitro, lahko izboljšane farmakodinamične lastnosti in vivo.
TABELA D5. Farmakokinetični profil IL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v
Primeru 18A.
Serumski nivo
Čas (ure) po dajanju IL-lra (ng/ml)
19 kD 33 kD
1 580
2 75 100
3 30
4 30 60
6 8
8 12
10 17
24 10
TABELA D6. Farmakodinamični profil IL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim
v Primeru 18.
Čas (ure) pred Serumski nivo
IL-1 dajanjem IL-6 (enot/ml)
19 kD 26 kD
0 521 454
6 2334 416
24 13486 2552
48 16577 4667
72 12800 5148
Primer 20
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-f (2-piridiniloksilkarbonillomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Reagent alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoli(oksi-1,2-etan diil) SRU
111.7, smo dodali k 1 mg očiščenega IFN-alfa v 200 μΐ pufra (0.1 natrijev borat, pH 9.0), v molskem razmerju 10 molov reagenta na 1 mol IFN-alfa. Raztopini smo temeljito pomešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati 60 minut pri sobni temperaturi. Nato smo dobili očiščeni PEG-modificirani IFN-alfa skladno s postopkom opisanim v Primeru 8. Derivatizirano je bilo 36 % proteina in produkt je imel navidezno molekulsko maso 28 kD.
Specifično aktivnost očiščenih IFN proteinov iz reakcijske zmesi smo določili na način opisan v Primeru 8 in vrednosti zbrali v TABELI XVI. Modificirani IFN je imel 5 do 6kratno zmanjšanje biološke aktivnosti in vitro.
TABELA XVI. Bioaktivnost IFN-alfa konjugiranega z reagentom, opisanim v
Primeru 18
Navidezna molekulska masa
IFN-alfa proteina (kD) (nemodificirano)
Specifična aktivnost fenot/mg)
1.88 χ 108 8.0 xl07
Primer 20A
Priprava rIL-2 konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil1omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Reagent alfa-[(2-piridiniloksi)karbonil]omega-metoksipoIi(oksi-1,2-etan diil) SRU
111.7, predhodno opisan v Primeru 18, smo dodali k 1 mg rIL-2 v 200 μΐ pufra (0.1M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 5 molov reagenta na 1 mol rIL-2. Raztopini smo temeljito pomešali in pustili napredovati reakcijo PEG-iliranja pri sobni temperaturi 60 minut.
Predstavnike s prevladujočimi molekulskimi masami iz 60 minutne reakcijske zmesi smo identificirali s SDS-PAGE z navideznimi molekulskimi masami 15 kD (nemodificirano) in 25 kD. 25 kD PEG-ilirani protein je predstavljal 60 % celokupnega proteina.
Primer 21
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-f(2-piridiniloksi)karbonillomega-metoksipoli (bksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
IFN-alfa smo PEG-ilirali z reagentom opisanim v Primeru 18, po postopku opisanem v Primeru 9. Specifična aktivnost, določena z metodami opisanimi v Primeru 8, izhodnega nemodificiranega IFN-alfa je bila 1.0 x 10^ enot/mg in specifična aktivnost IFN-alfa konjugiranega na PEG, je bila 0.4 x 10^ enot/mg, kar kaže, da ni bilo signifikantne izgube bioaktivnosti.
Primer 22
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-KŽ-piridiniloksi)karbonillomega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 225
PEG smo konjugirali na IFN-alfa ob uporabi reagenta opisanega v Primeru 18a s postopki iz Primera 9. Specifična aktivnost, določena z metodami opisanimi v Primeru 8, za IFN-alfa konjugiran na PEG je znašala 0.3 x 10^ enot/mg.
Primer 23
Priprava alfa-[2-(izotiocianato)etill-omega-metoksipoIi (oksi-l,2-etan diil)
SRU 111.7
K 2 g alfa-(2-aminoetil)-omega-metoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7 v 100 ml CH2CI2 smo dodali 94.2 mg di-2-piridiltionokarbonata. Raztopino smo pustili mešati 18 ur in jo nato ekstrahirali z majhno množino mrzle vode. Večino CH2CI2 smo odstranili ob znižanem tlaku in dodali eter, da smo izzvali obarjanje. Produkt smo filtrirali in osušili v visokem vakuumu, da smo dobili alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omegametoksipoli (oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7.
Anal. Izrač. za C4H7NOS(CH2CH2O)1117: C,53.88; H,9.07; N,0.28; S,0.64.
Ugot.: C,54.45; H,8.93; N,0.28; S,0.53.
Primer 24
Priprava IFN-alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[2(izotiocianato)etii1omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil)
SRU 111.7
Reagent alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, predhodno opisan v Primeru 23, smo dodali k 1 mg očiščenega IFN-alfa v 200 μϊ pufra (0.1M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 10 molov reagenta na 1 mol IFNalfa. Raztopine smo temeljito pomešali in pustili reakcijo PEG-iliranja napredovati pri sobni temperaturi 60 minut. Derivatizirano je bilo 30 % produkta z navidezno molekulsko maso 26 kD.
Primer 25
Priprava rIL-2 konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[2-(izotiocianato)etinomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Reagent alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, predhodno opisan v Primeru 23, smo dodali k 1.0 mg rekombinantnega IL-2 (rIL-2) v 100 /zl pufra (0.1 M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 10 molov reagenta PEG na 1 mol rIL-2. Raztopini smo temeljito pomešali in reakcijo PEG-iliranja pustili napredovati pri sobni temperaturi 60 minut. Očiščeni PEG-modificiran rIL-2 smo nato pridobili na način opisan v Primeru 3. Rezultati za derivatizacijo so zbrani v Tabeli XVII.
TABELA XVII. Modifikacija rIL-2 z reagentom opisanim v Primeru 23
Navidezna molekulska masa r!L-2ra proteina (kD) (nemodificirano) % celotnega proteina iz reakcije
Primer 26
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[2-(izotiocianato)etinomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
IL-lra smo PEG-ilirali z alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, na način opisan v Primeru 6. Prevladujuči PEG-ilirani produkti so imeli molekulske mase 26, 31, 38 in 48 kD in so predstavljali približno 17, 44,15 in 10 % celotnega proteina.
Sposobnost očiščenega 26 kD IL-lra proteina iz zmesi dobljene v 60 minutah reakcije, za inhibiranje IL-1 vezave smo določili po metodah, opisanih v Primeru 6 ter zbrali v Tabeli XVIII. PEG-ilirani protein je ohranil svojo vezivno kapaciteto v 2 do 3-kratni vrednosti z ozirom na IL-lra.
TABELA XVIII. Inhibicija ί^ΐ] IL-1 vezave z IL-lra proteinom PEG-iliranim z reagentom, opisanim v Primeru 23
Navidezna molekulska masa
IL-lra proteina (kD)
IC5Q._(ng/ml)
2.0
5.0
Primer 27
Priprava rIL-1 alfa konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-12-(izotiocianato)etillomega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7
Rekombinanten IL-1 alfa smo PEG-ilirali z alfa-[2-(izotiocianato)etil]-omegametoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 111.7, kot smo opisali v Primeru 4. Pva PEGilirana predstavnika s prevladujočo molekulsko maso iz 60 minutne reakcijske zmesi smo identificirali s pomočjo SPS-PAGE z navideznima molekulskima masama 26 in 38 kP. Slednja dva PEG-ilirana proteina sta predstavljala 46 oz. 48 % celotnega proteina. PEG-iliran rIL-1 alfa smo očistili iz reakcijske zmesi in karakterizirali, kot smo opisali v Primeru 4.
Bioaktivnost zbranih očiščenih frakcij smo ovrednotili na poskusu PIO celične proliferacije, kot smo opisali v Primeru 7, in rezultate zbrali v Tabeli XIX. Vzorci, označeni kot zmesi v Tabeli, so vsebovali več kot eno zvrst proteina, ki jih nismo dalje čistili. Specifična aktivnost 26 kP PEG-iliranega proteina je bila v bistvu neločljiva od IL-1.
TABELA XIX. Bioaktivnost rIL-1 alfa konjugiranega na PEG z reagentom, opisanim v Primeru 23
Navidezna molekulska masa rIL-1 alfa proteina (kD)
26,38 (zmes) >38 (zmes)
Specifična aktivnost (Enot/mg)
1.1 xl08
1.7x11)8 2.0 xl08 6.0 χ 1θ6
Primer 28
Priprava alfa-[(2-piridiniloksi)tiokarbonill-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil)
SRU 225
Iz raztopine 1 g (0.1 mmol) MPEG (metoksipolietilen glikol z molekulsko maso 10000) v 30 ml CH2CI2 smo destilirali 10 ml topila. Nastalo raztopino smo ohladili in dodali 69.7 mg (0.3 mmole) di-2-piridil-tionokarbonata in 2 mg DMAP. Zmes smo nato mešali v atmosferi argona 18 ur. Topilo smo odstranili v vakuumu in preostanek ponovno raztopili v minimumu CH2CI2. Dodali smo eter, nastalo oborino filtrirali in izprali z etrom. Produkt smo nato raztopili v 5 ml toplega GLYME in nastalo raztopino pustili stati preko noči. Nastalo oborino smo nato filtrirali in izprali z 2 x 5 ml GLYME in 5 ml dietiletra. Produkt smo nato sušili v vakuumski peči v počasnem toku dušika, da smo dobili 0.9 g alfa-[(2-piridiniloksi)tiokarbonil]-omega-metoksipoli(oksi1,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za C9H11NO3S(CH3CH2O)225.3: C,54.46; H,9.04.
Ugot.: C,54.67; H,9.30.
Primer 29
Priprava IL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa -[(2-piridiniloksi)tiokarbonill-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Alfa-[(2-piridiniloksi)tiokarbonil]-omega-metoksipoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225, pripravljenega kot smo opisali v Primeru 28, smo dodali k 2.0 mg IL-lra v 1.0 ml pufra (0.1 M natrijev borat, pH 9.0) v molskem razmerju 2 mola reagenta na 1 mol IL-lra. Raztopine smo temeljito pomešali in pustili, da je reakcija PEG-iliranja napredovala minut pri sobni temperaturi. S PEG modificirani IL-lra smo nato očistili po postopku, navedenem v Primeru 6.
Prevladujoči PEG-ilirani produkt je imel navidezno molekulsko maso 33 kD in je predstavljal približno 17 % celokupnega proteina iz reakcijske zmesi po 60 minutah. Sposobnost očiščenih IL-lra proteinov iz reakcijske zmesi, da inhibirajo IL-1 vezavo, smo določili tako, kot je opisano v Primeru 6, ter zbrali v Tabeli XX. Vezivna kapaciteta 33 kD proteina je bila 3-4 krat večja od IL-lra.
TABELA XX. Inhibicija [·*^Ι] IL-1 vezave z IL-lra proteini PEG-iliranimi z reagentom, opisanim v Primeru 28.
Molekulska masa IL-lra proteina (kD) (nemodificirano) 33
IC5Q,(ng/ml)
1.4
5.0
Primer 30 o,o-Di-(6-metil-2-piridinil)ester karbonotioiske kisline
Raztopini 10 g (0.09 molov) 6-metil-2-hidroksipiridina v 250 ml suhega CH2CI2 smo dodali 12.7 ml trietilamina. Raztopino smo ohladili na 0 °C in v atmosferi argona dokapavali 4.1 ml (0.046 molov) raztopine tiofosgena v CCI4 (85%). Zmes smo nato pustili ob mešanju pri sobni temperaturi 5 ur, filtrirali in CH2CI2 raztopino dvakrat izprali s 100 ml nasičene NaHCO3 raztopine. Organski sloj smo sušili in odstranili topilo pod znižanim tlakom. Nato smo ostanku dodali heksan (100 ml) in nastalo zmes pustili digerirati preko noči. Nastalo oborino smo filtrirali, izprali s heksanom in sušili v vakuumski peči v počasnem toku dušika, da smo dobili 5.7 g o,o-di-(6-metil-2-piridinil) estra karbonotiojske kisline s tal. 155-156°C.
Anal. Izrač. za ¢43^2^028: C,59.98; H,4.65; N,10.76; S,12.32.
Ugot.: C,59.65; H,4.59; N,10.75; S,12.06.
Primer 31
Alfa-metil-omega- [ 2- [ i (6-metil-2-piridiniloksi)tiokarboniU aminol etoksil poliioksi1,2-etan diil) SRU 225
Raztopino 1 g alfa-metoksi-omega-(2-aminoetil) poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225 (pripravljenega kot v Primeru IC) in 52.7 mg o,o-di(6-metil-2-piridinil)estra karbono49 tiojske kisline (Primer 30), raztopljenega v 15 ml suhega CH2CI2, smo mešali čez noč pri sobni temperaturi. Topilo smo odstranili ob znižanem tlaku in preostanek triturirali z dietil etrom. Oborino smo filtrirali in izprali z etrom. Produkt smo nato raztopili v 5 ml toplega GLYME in filtrirali skozi 0.75 μτη MILIPORE filter. Raztopino smo nato pustili stati pri sobni temperaturi 48 minut, ter nastalo oborino filtrirali. Produkt smo nato sušili v vakuumski peči v atmosferi N2 , v teku 18 ur, da smo dobili 0.9 g alfametil-omega-[2-[[(6-metil-2-piridiniloksi)tiokarbonil]-amino]etoksi]-poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za C,54.50; H,9.09; N,0,27; S,0.32;
Ugot.: C,54.38; H,9.20; N,0.21; S,0.37.
Primer 32
Priprava rlL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-12rf(6-metil-2-piridiniloksi)tiokarbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 225
Reagent, pripravljen na način opisan v Primeru 31, smo dodali k 5.0 mg očiščenega rlL-lra v 1.0 ml 0.1 M natrijevega borata, pH 9.0, v molskem razmerju 2.0 molov reagenta na en mol rlL-lra. Raztopino smo temeljito pomešali in pustili reakcijo napredovati 60 minut pri sobni temperaturi.
rlL-lra produkte smo ovrednotili ob uporabi postopka opisanega v Primeru 6. Tabela XXI prikazuje odstotek modifikacije predstavnikov s primarno molekulsko maso iz reakcijske zmesi.
Tabela XXI
Modificiranie rlL-lra z reagentom opisanim v Primeru 31
Navidezna molekulska masa rlL-lra proteina (kD) (nemodificirano) % celotnega proteina iz reakcije
30.0
65.0
5.0 rlL-lra produkte iz reakcijske zmesi smo očistili na način opisan v Primeru 6.
Očiščene frakcije iz reakcijske zmesi smo preizkusili s testom kompetitivne vezave na rIL-1 radioreceptor, kot smo opisali v Primeru 6. Rezultati so prikazani v Tabeli XXII.
Ti rezultati kažejo, da je bil 35 kD protein 6-krat manj aktiven od nemodificiranega ILlra za inhibiranje IL-1 vezave, medtem ko je bil 48 kD protein 20-krat manj aktiven.
TABELA XXII. Inhibicija [^11 IL-1 vezave z rlL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v Primeru 31
Navidezna molekulska masa rlL-lra proteina (kDj (nemodificirano)
ICsoJng/mn
1.5
9.0
30.0
Primer 33
Alfa- f 2- f f (2-piridiniloksi)karbonin amino! etil! -omega- [2- Γ r(2-piridiniloksi)karbonillaminoletoksilpolifoksi-1,2-etan diil) SRU 180
A. Priprava alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)-poli(oksi-1.2-etan-diil) SRU 180
Iz gošče 80 g MPEG (polietilen glikol z molekulsko maso 8000) v 750 ml toluena smo destilirali 200 ml topila. Refluktirajoči raztopini smo po kapljicah dodali 1.7 ml suhega piridina in 4.7 ml tionil klorida. Po 12-urnem refluktiranju smo pustili reakcijsko zmes ob mešanju čez noč. Nato smo dodali metilen klorid (50 ml) in nastalo raztopino filtrirali skozi 60 g bazične glinice (Wolem Super 1). Kolono smo nato eluirali s 500 ml CH2CI2, organske sloje smo združili in topilo odstranili ob znižanem tlaku. Preostanek smo nato raztopili v 300 ml CH2CI2 in počasi dodajali eter med odstranjevanjem topil na parni kopeli. S tem postopkom smo nadaljevali, dokler se ni razvila motna suspenzija. Nastalo zmes smo nato mešali pri sobni temperaturi več ur in nato produkt filtrirali, da smo dobili 73 g alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 180.
Anal. Izrač. za C2H4Cl2(CH2CH2O)180: C,54.16; H,9.09; Cl,0,88.
Ugot.: C,53.40; H,8.81; Cl,0.93.
B. Priprava alfa-(2-azidoetil)-omega-(2-azidoetoksi)-poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 180
Zmes 72 g alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)-poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 180, 25 g natrijevega azida in 700 ml suhega DMF smo mešali in segrevali 12 ur pri 125 °C. Topilo smo nato odstranili v visokem vakuumu in preostanek raztopili v 1 litru CH2CI2
Primer 34 alfa- f 2- f f (2-piridiniloksi)karbonilIaminoI etill -omega- f 2- I f (2-piridiniIoksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452
A. Priprava alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)-poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452
S postopkom opisanim v Primeru 33A, smo polietilen glikol z molekulsko maso 20000 pretvorili v alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)-poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 452. Anal. Izrač. za C2H4Cl2(CH2CH2O)452: C,54.38; H,9.13; Cl,0,35.
Ugot.: C,54.36; H,9.23; Cl,0.40.
B. Priprava alia-(2-azidoetil)-omega-(2-azidoetoksi)-poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452
S postopkom opisanim v primeru 33B, smo alfa-(2-kloroetil)-omega-(2-kloroetoksi)poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 452, pretvorili v alfa-(2-azidoetil)-omega-(2-azidoetoksi)poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452.
Anal. Izrač. za C2H4N6(CH2CH2O)452: C,54.35; H,9.12; N,0.42.
Ugot.: C,54.38; H,9.30; N0.47.
C. Priprava alfa-(2-aminoetil)-omega-(2-aminoetoksi)-poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452
S postopkom opisanim v Primeru 33C, smo alfa-(2-azidoetil)-omega-(2-azidoetoksi)poli(oksi-l,2-etan diil) SRU 452 pretvorili v alfa-(2-aminoetil)-omega-(2-aminoetoksi)poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452.
Izrač. za C2H8N2(CH2CH2O)452: C,54.49; H,9.17; N,0.14.
Ugot.: C,54.44; H,9.19 N,0.15.
D. Alfa-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonillamino]etil]-omega-f2-[[(2-piridiniloksi)-karbonil)amino]etoksi]poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452
S postopkom opisanim v Primeru 33D, smo alfa-(2-aminoetil)-omega-(2-aminoetoksi)poli(oksi-l,2-etan-diil) SRU 452 pretvorili v alfa-[2-[[(2-piridiniloksi)karbonil]amino]etil]-omega-[2-[[(2-piridiniloksi)-karbonil]amino]etoksi]-poli(oksi-l,2-etan-diil)
SRU 452.
Anal, Izrač. za C14H14N4O4(CH2CH2O)452: C,54.56; H,9.08; N,0.28.
Ugot.: C,54.33; H,9.13 N,0.33.
Primer 35
Priprava rlL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-[2-ff(2piridiniloksi)karbonillamino1etin-omega-i2-ff(2-piridiniloksi)karbonillaminoletoksilpoli(oksi-l,2-etan diil) SRU 452
Reagent, pripravljen kot smo predhodno opisali v Primeru 34, smo dodali k 5.0 mg očiščenega rlL-lra v 1.0 ml 0.1 M natrijevega borata, pH 9.0, v molskem razmerju 1.0 molov reagenta na 4.0 mole rlL-lra. Raztopino smo temeljito pomešali pri sobni temperaturi v teku 60 minut.
rlL-lra produkte smo ovrednotili ob uporabi metode, predhodno opisane v Primeru 6. Tabela XXIII kaže odstotek predstavnika modifikacije zvrsti s primarno molekulsko maso iz reakcijske zmesi.
TABELA XXIII. Modifikacija rlL-lra z reagentom opisanim v Primeru 33
Navidezna molekulska masa rlL-lra proteina (kD) (nemodificirano) % celotnega proteina iz reakcije
50.0
35.0
15.0
Primer 36
Bis-(3-metiI-2-piridil)karbonat
Raztopino 4.6 g (42 mmolov) 3-metil-2-hidroksipiridina in 6 ml trietil amina raztopljenega v 20 ml CH2CI2, smo dokapavali pri 0 °C raztopini 50 ml CH2CI2 in 11 ml fosgena v toluenu (1.93 molarno). Zmes smo mešali pri 0 °C 2 uri in nato pri sobni temperaturi 2 uri. Reakcijsko zmes smo nato izprali z nasičeno raztopino NaHCC>3, nato pa z nasičeno raztopino NaCl in zatem sušili (Na2SC>4). Topilo smo odstranili ob znižanem tlaku in ostanek kristalizirali iz EtOAc/heksana, da smo dobili 3 g bis-(3-metil-2-piridil)karbonata s tališčem pri 110-112 °C.
Anal. Izrač. za C13H12N2O3: C,63.93; H,4.95; N, 11.47.
Ugot.: C,63.78; H,4.86 N, 11.23.
Primer 37
AIfa-metil-omega-i2-[f(3-metiI-2-piridiniloksi)karbonillamino1etoksiIpoli(oksi-l,2etan diil) SRU 225
Iz raztopine 1 g alfa-metoksi-omega-(2-aminoetil)poli(oksi-1,2-etan diil) SRU 225, raztopljenega v 25 ml CH2CI2 smo destilirali 10 ml topila. Raztopini smo nato dodali
49.2 mg (0.2 mmola) bis-(3-metil-2-piridil)karbonta in nastalo zmes mešali čez noč v atmosferi argona. Topilo smo nato odstranili ob znižanem tlaku in dodali 80 ml dietil etra k preostanku. Trdno snov smo filtrirali, izprali z etrom in nato raztopili v 10 ml CH2CI2. Nato smo počasi dodajali eter ob odparevanju topila, dokler ni raztopina postala motna. Zmes smo nato pustili stati 18 ur pri sobni temperaturi in nastalo oborino filtrirali. Trdno snov smo nato raztopili v 8 ml toplega GLYME in pustili stati pri sobni temperaturi dodatnih 18 ur. Produkt smo nato filtrirali in sušili v vakuumski peči v atmosferi dušika, da smo dobili 0.6 g alfa-metil-omega-[2-[[(3-metil-2-piridiniloksi)karbonil]amino]etoksi]poli(oksi-1,2-etan diil) SRU 225.
Anal. Izrač. za C10H14N2O3 (CP^CF^O^: C,54.59; H,9.09; N,0.28.
Ugot.: C,55.64; H,9.14; N,0.22.
Primer 38
Priprava rlL-lra konjugiranega na PEG s pomočjo reagenta alfa-metil-omega-f2[[(3-metil-2-piridiniIoksi)karboninaminoletoksilpoli(oksi-h2-etan diil) SRU 225
Reagent, ki smo ga pripravili kot smo opisali v Primeru 37, smo dodali k 5.0 mg očiščenega rlL-lra v 1.0 ml 0.1 M natrijevega borata, pH 9.0, v molskem razmerju 2.0 molov reagenta na en mol rlL-lra. Raztopino smo temeljito pomešali in reakcijo pustili napredovati 60 minut pri sobni temperaturi.
rlL-lra produkte smo ovrednotili ob uporabi postopka, opisanega v Primeru 6. Tabela XXIV prikazuje odstotek modifikacije zvrsti s primarno molekulsko maso iz reakcijske zmesi.
TABELA XXIV. Modifikacija rlL-lra z reagentom, opisanim v Primeru 37.
Navidezna molekulska masa rlL-lra proteina (kD) (nemodificirano) % celotnega proteina iz reakcije
45.0
43.0
12.0 rlL-lra produkte iz reakcijske zmesi smo očistili, kot smo opisali v Primeru 6. Očiščene frakcije iz reakcijske zmesi smo preizkusili s testom kompetitivne vezave na rIL-1 radioreceptor, kot smo opisali v Primeru 6. Rezultati so prikazani v Tabeli XXV.
kD protein je bil 4-krat manj aktiven od nemodificiranega IL-lra za inhibiranje IL-1 vezave. 45 kD protein je bil 30-krat manj aktiven.
TABELA XXV. Inhibicija f^^Ij IL-1 vezave z rlL-lra konjugiranega z reagentom, opisanim v Primeru 35.
Navidezna molekulska masa rlL-lra proteina (kD) (nemodificirano)
IC50 (ng/ml) 1.0 4.0 30.0
Za dodatno pojasnilo navajamo Tabelo XXVI za prikaz korelacije med molekulsko maso in odgovarjajočimi enotami v PEG delu reagenta in proteinskega konjugata pripravljenega v vsakem Primeru ob uporabi odgovarjajočega reagenta.
a
TABELA XXVI
PEG reagenti Primeri
n = 28.3 Mm = 1325 11B
n =111.7 Mm = 5000 1, 5, 11, 18, 23
n = 180 Mm = 8000 33
n = 225 Mm = 10000 5A, 11A, 31, 37
n = 452 Mm = 20000 34
Proteinski konjugati s PEG ostanki Primeri
n = 111.7 Mm = 5000 2, 3, 4,6, 7, 8, 8B, 9, 12-16, 19, 20A, 20,21, 24,25, 26, 27
n = 225 Mm = 10000 6A, 8A, 8C, 10, 12A, 13-17, 19A, 22, 29, 32, 38
n = 452 Mm = 20000 35
Za:
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
AVRPJJ-h GOtUUP

Claims (28)

1. Konjugati proteinov s polietilenom s formulo
NHTprotein
R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-R2xx / C
RJ kjer je Rl nižji alkil; R2 je -O- ali -NH-; R^ je =N-R4, =S ali =0; R^ je nižji alkil ali cikloalkil; m in n sta izbrana izmed celih števil j> 1, tako, da ima konjugat vsaj del biološke aktivnosti nekonjugiranega proteina, s pridržkom, da kadar R2 stoji za -0-, je R^ različen od =N-R^;
da kadar R2 stoji za -O- in R^ za =0, protein pomeni interferon-alfa, interlevkin-1 ali interlevkin-lra in kadar R2 stoji za -O- in R^ stoji za =S, protein ni antigen E iz peloda grinta (rastline) ali albumina goveje plazme.
2. Konjugat proteina po zahtevku 1, označen s tem, da sta m in n izbrana tako, da je molekulska masa enega ali več ostankov PEG-iliranja na molekulo proteina 300 do 30000 daltonov.
3. Konjugat proteina po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, da m stoji za 1 ali 2.
4. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 3, s formulo
R^OfCHsCHjjOJ-CHsjCH^ Y
H H
N. N f-protein
I-A
NR kjer imajo Rl, r4, m, n in protein pomene, navedene v zahtevku 1.
5. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 3, s formulo
R1 -O(CH2CH2O) -CH2CH2-O( —protein
I-B m
kjer imajo R1, m, n in protein pomene, navedene v zahtevku 1.
6. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 3, s formulo,
H
N NH
R1-O(CH2CH2O\1-CH2CH// C O
-protein
I-C m
kjer imajo Rl, m, n in protein pomene, navedene v zahtevku 1.
7. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 3, s formulo
R^O-iC^CHgO) -CHjjCh/,
N
H NH {-protein \ /
I-D kjer imajo R1, m, n in protein pomene, navedene v zahtevku 1.
8. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 3, s formulo,
R1-O-(CH2CH2O) -ch2ch/^ X /
II o
Ov NH—protein
I-E kjer imajo Rl, m, n in protein pomene, navedene v zahtevku 1.
9. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1-8, kjer R1 stoji za CH3.
10. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov od interlevkin-1.
do 9, kjer je protein
11. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov od interlevkin-lra.
do 9, kjer je protein
12. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov od interferon-alfa.
do 9, kjer je protein
13. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov od interlevkin-2.
do 9, kjer je protein
14. Konjugat proteina po zahtevku 1, s formulo
H3C-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 //
H
N, _NH—interferon-alfa kjer je n okoli 112.
15. Konjugat proteina po zahtevku 1, s formulo /NH—interferon-alfa
H3C-O-(CH2CH2O) -CH2CHf c
II o
kjer je n okoli 112.
16. Konjugat proteina po zahtevku 12 ali 13, kjer interferon-alfa pomeni interferon alfa A.
17. Spojina izbrana iz skupine, ki jo tvorijo
RJO(CH2CH2O)n- CH2CH2-N= C = N-R4
R^CH^O)- CH2CH2— O - C
R^CHjCHjO);· CH2CH2-NH — C —O —%N J O
R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2—N = C=S
R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2—NH — C -O R5
RO(CH2CH2O)n-CH2CH2“O —C—O .-N S
O
-o-O
RO(CH2CH2O)n-CH2CH2— O— C kjer je Rl nižji alkil, R^ je nižji alkil ali cikloalkil, je nižji alkil ali H in je n katerokoli celo število od 1 do 1000.
18. Spojina po zahtevku 17, kjer R^ stoji za cikloheksil.
19. Spojina po zahtevku 17, kjer stoji za H.
20. Spojina po zahtevku 17, kjer R^ stoji za CH3.
21. Spojina po kateremkoli izmed zahtevkov 17 do 20, kjer R1 stoji za CH3.
22. Spojina s formulo
R‘O(CH2CH2O)nCH2CH-NH — C -O O kjer Rl stoji za CH3 in je n okoli 112.
23. Konjugati proteinov po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16, označeni s tem, da so namenjeni za uporabo kot terapevtsko aktivne spojne pri zdravljenju ali profilaksi bolezni.
24. Postopek za pripravo konjugatov proteinov po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16, označen s tem, da spojino po zahtevku 17 reagiramo s prosto amino skupino proteina ali njegovo soljo, nakar izoliramo konjugat proteina iz reakcijske zmesi.
25. Farmacevtski sestavki, označeni s tem, da obsegajo konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16 in terapevtsko inerten nosilec.
26. Farmacevtski sestavki, označeni s tem, da vsebujejo konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16 in terapevtsko inerten nosilec.
27. Uporaba konjugatov proteinov po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16, za pripravo zdravil namenjenih za uporabo pri zdravljenju ali profilaksi bolezni.
28. Konjugat proteina po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 16, označen s tem, da je pripravljen po postopku zahtevka 24, ali njegovega očitnega kemijskega ekvivalenta.
Za:
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
IZVLEČEK
Konjugati proteinov s polietilenom
Izum se nanaša na fiziološko aktivne, pretežno neimunogene, vodotopne konjugate polietilenglikola s proteini, ki imajo vsaj del biološke aktivnosti proteina, ki tvori konjugat, vendar brez njegovih motečih imunogenih odzivov.
Specifično se izum nanaša na spojine
RI-O-(CH2CH2O1;1-CH2CH2-R2\X /Nl-F-protein C
II I
R3 J m kjer je R1 nižji alkil; R2 je -O- ali -NH-; R2 je =N-R^, =S ali =0; R^ je nižji alkil ali cikloalkil; m in n sta izbrana izmed celih števil >. 1, tako, da ima konjugat vsaj del biološke aktivnosti nekonjugiranega proteina s pridržkom, da kadar R2 stoji za -O-, je R-3 različen od =N-R^;
da kadar R2 stoji za -O- in R^ za =0 je protein interferon-alfa, interlevkin-1 ali interlevkin-lra in kadar R2 stoji za -O- in R^ stoji za =S, protein ni antigen E iz peloda grinta (rastline) ali albumina goveje plazme.
Produkti so novi reagenti za pripravo in pa novi proteinski konjugati ki ohranijo bioaktivnost pri uporabi na človeškem telesu.
SI9210294A 1991-03-25 1992-03-24 Polyethylene protein conjugates SI9210294A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67400191A 1991-03-25 1991-03-25
US07/767,000 US5595732A (en) 1991-03-25 1991-09-27 Polyethylene-protein conjugates
YU29492A YU29492A (sh) 1991-03-26 1992-03-24 Konjugati proteina sa polietilenom

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI9210294A true SI9210294A (en) 1995-10-31

Family

ID=27101069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9210294A SI9210294A (en) 1991-03-25 1992-03-24 Polyethylene protein conjugates

Country Status (32)

Country Link
US (7) US5595732A (sl)
EP (1) EP0510356B1 (sl)
JP (1) JP2637010B2 (sl)
KR (1) KR920018079A (sl)
CN (2) CN1038035C (sl)
AT (1) ATE176159T1 (sl)
AU (2) AU657311B2 (sl)
BG (1) BG60800B2 (sl)
BR (1) BR9201015A (sl)
CA (1) CA2063886C (sl)
CS (1) CS87192A3 (sl)
CY (1) CY2169B1 (sl)
DE (1) DE69228269T2 (sl)
DK (1) DK0510356T3 (sl)
EE (1) EE9400356A (sl)
ES (1) ES2128329T3 (sl)
FI (2) FI107927B (sl)
GR (1) GR3030049T3 (sl)
HU (2) HUT60512A (sl)
IE (1) IE920936A1 (sl)
IL (1) IL101348A0 (sl)
IS (1) IS3824A (sl)
MW (1) MW1892A1 (sl)
MX (1) MX9201298A (sl)
MY (1) MY131095A (sl)
NO (1) NO921142L (sl)
NZ (2) NZ248022A (sl)
OA (1) OA09760A (sl)
RO (1) RO109543B1 (sl)
SI (1) SI9210294A (sl)
ZA (1) ZA922110B (sl)
ZW (1) ZW4392A1 (sl)

Families Citing this family (245)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1994004193A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5478860A (en) * 1993-06-04 1995-12-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery
US5622986A (en) * 1993-10-20 1997-04-22 Enzon, Inc. 2'-and/or 7-substituted taxanes
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
EP0730470B1 (en) * 1993-11-10 2002-03-27 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US7008624B1 (en) * 1995-02-22 2006-03-07 Immunex Corporation Antagonists of interleukin-15
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
DE19514087A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff, einem Polyether und ggfs. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
DE741187T1 (de) * 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
EP0858343B1 (en) 1995-11-02 2004-03-31 Schering Corporation Continuous low-dose cytokine infusion therapy
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ATE200030T1 (de) * 1997-01-29 2001-04-15 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylationsverfahren
EP0973384A4 (en) 1997-02-13 2004-10-13 Sky High Llc ORGAN PRESERVATION SOLUTION
US7122636B1 (en) * 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
BR9807464A (pt) 1997-02-21 2000-05-09 Genentech Inc Conjugado, composição, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método para produzir um polipeptìdeo e polipeptìdeo.
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US7005504B2 (en) * 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
US6468532B1 (en) 1998-01-22 2002-10-22 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
US6180096B1 (en) * 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
CN100335503C (zh) * 1998-04-28 2007-09-05 应用研究系统Ars股份公司 多元醇干扰素β偶联物
DE69901321T2 (de) 1998-05-15 2002-12-12 Schering Corp Kombinationstherapie enthaltend Ribavirin und Interferon alpha bei Patienten mit chronischer Hepatitis C Infektion, die nicht antiviral vorbehandelt sind
ES2251196T3 (es) * 1998-06-08 2006-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de peg-ifn-alfa y ribavirina para el tratamiento de hepatitis c cronica.
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
ES2257884T3 (es) * 1998-10-16 2006-08-01 Biogen Idec Ma Inc. Conjugados de polimero e interferon beta-1a y sus usos.
EA005005B1 (ru) 1998-10-16 2004-10-28 Байоджен, Инк. ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
DE69934425T2 (de) 1998-10-23 2007-09-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Thrombopoietin substitute
CO5170404A1 (es) 1999-04-08 2002-06-27 Schering Corp Terapia para melanomas
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
PE20010288A1 (es) 1999-07-02 2001-03-07 Hoffmann La Roche Derivados de eritropoyetina
AU4934299A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Kuhnil Pharm. Co., Ltd. Novel water soluble-cyclosporine conjugated compounds
SK8292002A3 (en) * 1999-11-12 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
MXPA02006795A (es) 2000-01-10 2005-04-19 Maxygen Holdings Ltd Conjugados g-csf.
US6806063B2 (en) 2000-02-11 2004-10-19 Maxygen Aps Factor VII or VIIa-like molecules
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US7208167B2 (en) * 2000-08-07 2007-04-24 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
JP2004508338A (ja) * 2000-09-08 2004-03-18 グリフォン　セラピューティクス，インコーポレーテッド ポリマー修飾合成タンパク質
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
SK11882003A3 (sk) 2001-02-27 2004-03-02 Maxygen Aps Variant štandardného ľudského interferónu ß, nukleotidová sekvencia kódujúca tento variant, expresný vektor a hostiteľská bunka s jej obsahom, farmaceutický prostriedok s obsahom uvedeného variantu a jeho použitie
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
EP1419191B1 (en) 2001-08-22 2007-10-17 Bioartificial Gel Technologies Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
UA78726C2 (en) 2001-11-01 2007-04-25 Sciclone Pharmaceuticals Inc Pharmaceutical composition of thymosin alpha 1 conjugated with polyethylene glycol, method for production, and method for treatment
US20040058865A1 (en) * 2001-11-26 2004-03-25 Danishefsky Samuel J Homing peptide multimers, their preparation and uses
US6956135B2 (en) * 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US7041855B2 (en) * 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) * 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100888371B1 (ko) 2002-01-17 2009-03-13 동아제약주식회사 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
PL397261A1 (pl) 2002-01-18 2012-03-26 Biogen Idec Ma Inc. Aktywowany polimer glikolu polialkilenowego, kompozycja i kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
JP4634145B2 (ja) 2002-06-21 2011-02-16 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト ペジル化されたｖｉｉ因子糖形体
KR20050048544A (ko) 2002-06-28 2005-05-24 이데닉스 (케이만) 리미티드 플라비비리다에 감염 치료용의 변형된 2' 및3'-뉴클레오사이드 프로드럭
WO2004005341A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
CA2490007C (en) 2002-07-19 2011-05-24 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefor, and hydrogels and biomaterials made there from
EP1382352A1 (de) * 2002-07-19 2004-01-21 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Bisacyloxypropylcystein-Konjugate und deren Verwendung
JP4451308B2 (ja) * 2002-07-24 2010-04-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ポリアルキレングリコール酸添加剤
WO2004065362A2 (en) * 2002-08-16 2004-08-05 University Of Massachusetts Pyridine and related ligand compounds, functionalized nanoparticulate composites and methods of preparation
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
MXPA05006945A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas polipeptidicas y sus antagonistas con actividad conservada de union al receptor.
MXPA05006944A (es) 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de interferon-beta cion potencia biologica aumentada.
US20040176655A1 (en) * 2003-02-05 2004-09-09 Ayoub Paul Marie Methods of preparing branched alkyl aromatic hydrocarbons
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
CA2458085A1 (en) 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
ES2726998T3 (es) * 2003-05-30 2019-10-11 Gilead Pharmasset Llc Análogos de nucleósidos fluorados modificados
GB0320638D0 (en) 2003-09-03 2003-10-01 Novartis Ag Organic compounds
ES2831379T3 (es) * 2003-10-09 2021-06-08 Ambrx Inc Derivados poliméricos para la modificación selectiva de proteínas
CA2542179A1 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
ZA200606225B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
EP1718664A4 (en) 2004-02-02 2008-08-13 Ambrx Inc MODIFIED HUMAN FOUR FIXED PROPELLANT (4HB) BEAM POLYPEPTIDES, AND USE THEREOF
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
JP2008507298A (ja) 2004-05-19 2008-03-13 マキシジェン， インコーポレイテッド インターフェロンαポリペプチドおよび結合体
US20060194726A1 (en) * 2004-05-25 2006-08-31 Rueger David C Methods of treating cartilage defects
US20060018875A1 (en) * 2004-06-14 2006-01-26 Blatt Lawrence M Interferon compositions and methods of use thereof
KR101699142B1 (ko) * 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
MXPA06015234A (es) * 2004-06-30 2007-11-22 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de fraccion polimero-factor ix.
JP2008505928A (ja) * 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
JP5220410B2 (ja) 2004-07-19 2013-06-26 バイオコン・リミテッド インスリン−オリゴマー複合体、その処方物及び使用
CN101023094B (zh) * 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
BRPI0512396A (pt) * 2004-07-21 2008-03-11 Ambrx Inc polipeptìdeos biossintéticos utilizando aminoácidos codificados não naturalmente
EP1796647B1 (en) * 2004-08-12 2010-08-11 Schering Corporation Stable pegylated interferon formulation
EP3109244B1 (en) 2004-09-14 2019-03-06 Gilead Pharmasset LLC Preparation of 2'fluoro-2'-alkyl-substituted or other optionally substituted ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
US7939496B2 (en) * 2004-12-22 2011-05-10 Ambrx, Inc. Modified human growth horomone polypeptides and their uses
BRPI0519170A8 (pt) * 2004-12-22 2018-05-08 Ambrx Inc formulações de hormônio de crescimento humano que compreendem um aminoácido não naturalmente codificado
ATE541934T1 (de) * 2004-12-22 2012-02-15 Ambrx Inc Zusammensetzungen von aminoacyl-trna-synthetase und verwendungen davon
ES2434035T3 (es) * 2004-12-27 2013-12-13 Baxter International Inc. Conjugados de polímero-factor von Willebrand
WO2006080171A1 (ja) 2005-01-31 2006-08-03 Effector Cell Institute, Inc. 免疫増強剤
EP1888633A4 (en) 2005-05-18 2010-01-27 Maxygen Inc UNFOLDED INTERFERON ALPHA POLYPEPTIDE
US20070015701A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Samuel Zalipsky Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7
CN101247821B (zh) * 2005-06-03 2013-01-23 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
US8633300B2 (en) 2005-06-17 2014-01-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
CN101242842A (zh) 2005-06-17 2008-08-13 诺瓦提斯公司 Sanglifehrin在hcv中的用途
CA2613355C (en) * 2005-06-24 2014-04-22 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
DK1937824T3 (da) * 2005-08-18 2013-04-02 Ambrx Inc Sammensætninger af tRNA og anvendelser deraf
US20070123646A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-31 Lele Bhalchandra S Protein-polymer conjugates and synthesis thereof
EP1776963A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-25 Gbf-Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Hexosylceramides as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
WO2007056448A2 (en) * 2005-11-08 2007-05-18 Ambrx, Inc. Accelerants for the modification of non-natural amino acids and non-natural amino acid polypeptides
CN106443006A (zh) 2005-11-16 2017-02-22 Ambrx公司 包括非天然氨基酸的方法和组合物
DK1968635T3 (en) * 2005-12-14 2014-12-15 Ambrx Inc Compositions and Methods of, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CA2634034A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
EP1985303B1 (en) 2006-01-12 2012-11-21 Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. Oral composition containing Interferon-alpha
WO2007088051A2 (en) 2006-01-31 2007-08-09 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Modulation of mdl-1 activity for treatment of inflammatory disease
EP1818392B1 (en) * 2006-02-14 2010-08-25 Genetix Limited Cell culture medium
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
CA2647314A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
WO2007133865A2 (en) 2006-04-11 2007-11-22 Novartis Ag Hcv/hiv inhibitors an their uses
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
MX2008014685A (es) 2006-05-24 2008-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag Analogos de factor ix con semivida prolongada in vivo.
EP1897557A1 (en) * 2006-09-07 2008-03-12 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Use of glycolipids as adjuvants
MX2009002523A (es) 2006-09-08 2009-03-20 Ambrx Inc Polipeptido de plasma humano modificado o andamios fc y sus usos.
CN106190983B (zh) * 2006-09-08 2019-05-28 Ambrx公司 用于脊椎动物细胞的杂合抑制tRNA
DK2064333T3 (da) * 2006-09-08 2014-05-05 Ambrx Inc Suppressor-trna-transkription i hvirveldyrceller
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
JP2010525821A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾ＩＦＮβポリペプチドおよびこれらの使用
RU2453332C2 (ru) 2007-10-16 2012-06-20 Байокон Лимитид Твердая фармацевтическая композиция (варианты) и способ контроля концентрации глюкозы с ее помощью, способ получения твердой фармацевтической композиции (варианты), таблетка (варианты) и способ получения амфорных частиц
KR101656107B1 (ko) 2007-11-20 2016-09-08 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 인슐린 폴리펩티드 및 이의 용도
NZ602170A (en) 2008-02-08 2014-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
TW200946541A (en) * 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
AR071478A1 (es) 2008-04-17 2010-06-23 Baxter Healthcare Sa Peptidos de bajo peso molecular con actividad procoagulante para el tratamiento de pacientes con deficiencia de factor v (fv), fvii, fviii, fx y/o fxi
US8173621B2 (en) * 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
CA2729851C (en) 2008-07-23 2019-01-15 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
CN101671390B (zh) * 2008-09-10 2012-10-03 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
CN107022020A (zh) 2008-09-26 2017-08-08 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
US9121024B2 (en) 2008-09-26 2015-09-01 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
CN102753563A (zh) 2008-12-23 2012-10-24 吉利德制药有限责任公司 核苷类似物
TW201031675A (en) 2008-12-23 2010-09-01 Pharmasset Inc Synthesis of purine nucleosides
NZ593648A (en) 2008-12-23 2013-09-27 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
TWI576352B (zh) 2009-05-20 2017-04-01 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
ES2602629T3 (es) * 2009-06-04 2017-02-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso
US20110097302A1 (en) * 2009-07-16 2011-04-28 Ta Tung Yuan Il-1ra-polymer conjugates
EP2459211A1 (en) 2009-07-31 2012-06-06 Medtronic, Inc. Continuous subcutaneous administration of interferon- to hepatitis c infected patients
AU2010282250B2 (en) * 2009-08-14 2015-11-12 Immunoforge Co., Ltd. Modified Vasoactive Intestinal Peptides
US8475652B2 (en) 2009-10-19 2013-07-02 Jan A. K. Paul Method for purification of uncatalyzed natural fuels from metal ions by means of at least one hemeprotein and use of the at least on hemeprotein
MX2012004971A (es) 2009-10-30 2012-06-12 Boehringer Ingelheim Int Regimenes de dosificacion para terapia combinada del vhc, que comprende b1201335, interferon alfa y ribavirina.
CN107674121A (zh) 2009-12-21 2018-02-09 Ambrx 公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
CN104017063A (zh) 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
EP2542569B1 (en) 2010-03-05 2020-09-16 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
PL3290428T3 (pl) 2010-03-31 2022-02-07 Gilead Pharmasset Llc Tabletka zawierająca krystaliczny (S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymidyn-1(2H)-ylo)-4-fluoro-3-hydroksy-4-metylotetrahydrofuran-2-ylo)metoksy)(fenoksy)fosforylo)amino)propanian izopropylu
CN102858790A (zh) 2010-03-31 2013-01-02 吉利德制药有限责任公司 核苷氨基磷酸酯
US20120135912A1 (en) 2010-05-10 2012-05-31 Perseid Therapeutics Llc Polypeptide inhibitors of vla4
AU2011268498A1 (en) 2010-06-24 2013-01-31 Genoscience Pharma Sas Treatment of hepatitis C virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
EP3572091B1 (en) 2010-08-17 2023-12-13 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
WO2012030842A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Academia Sinica Anti-c-met antibody and methods of use thereof
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
JP2013542206A (ja) 2010-10-05 2013-11-21 ノバルティス アーゲー Ｃ型肝炎ウイルス感染症の新規治療
KR20130120481A (ko) 2010-10-08 2013-11-04 노파르티스 아게 술파미드 ｎｓ3 억제제의 비타민 ｅ 제제
ES2866674T3 (es) * 2010-11-12 2021-10-19 Nektar Therapeutics Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero
AU2011336632B2 (en) 2010-11-30 2015-09-03 Gilead Pharmasset Llc Compounds
EP2646038A1 (en) 2010-11-30 2013-10-09 Novartis AG New treatments of hepatitis c virus infection
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
CN103476409A (zh) 2011-03-31 2013-12-25 诺华股份有限公司 治疗丙肝病毒感染的阿拉泊韦
CN103458913A (zh) 2011-04-01 2013-12-18 诺华股份有限公司 对乙型肝炎病毒感染或其与丁型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病结合的治疗
CN103648516A (zh) 2011-04-13 2014-03-19 诺华股份有限公司 使用阿拉泊韦治疗丙型肝炎病毒感染
CA2873553C (en) 2011-06-06 2020-01-28 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
SI2717898T1 (sl) 2011-06-10 2019-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Spojine prokoagulantov in metode za njihovo uporabo
US9382305B2 (en) 2011-07-01 2016-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
AU2012314517A1 (en) 2011-09-27 2014-04-17 Novartis Ag Alisporivr for treatment of Hepatis C virus infection
US8767214B2 (en) 2011-10-06 2014-07-01 Nordson Corporation Powder flow detection
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
WO2013137869A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population
WO2013143581A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population
CA2871579A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Use of a c-type natriuretic peptide as a bone repair promoter
BR112014030278A2 (pt) 2012-06-08 2017-06-27 Sutro Biopharma Inc anticorpo, e, composição.
EP3135690A1 (en) 2012-06-26 2017-03-01 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
KR102182800B1 (ko) 2012-08-31 2020-11-25 서트로 바이오파마, 인크. 아지도 기를 포함하는 변형된 아미노산
CN110818798A (zh) 2012-10-25 2020-02-21 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
WO2014071206A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
US10550171B2 (en) 2012-11-21 2020-02-04 The Governors Of The University Of Alberta Immunomodulatory peptides and methods of use thereof
US20140205566A1 (en) 2012-11-30 2014-07-24 Novartis Ag Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof
EP3760228A1 (en) 2013-06-10 2021-01-06 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
NZ716840A (en) 2013-08-27 2017-06-30 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
EP3055298B1 (en) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
CN105899230B (zh) 2013-11-27 2020-06-09 伊皮埃里安股份有限公司 治疗tau病变的方法
EP3139949B1 (en) 2014-05-08 2020-07-29 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising a vip-elp fusion protein for use in treating cystic fibrosis
EP3782652A1 (en) 2014-08-19 2021-02-24 Biogen MA Inc. Pegylation method
TWI705071B (zh) 2014-10-24 2020-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 經修飾之fgf-21多肽及其用途
CA2976038A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
JP7074341B2 (ja) 2015-09-02 2022-05-24 イムテップ エス．アー．エス． 抗ｌａｇ－３抗体
MX2018005230A (es) 2015-11-03 2018-08-15 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion de un inhibidor del ensamble de la capside del hbv y un interferon.
EP3452510A4 (en) 2016-04-04 2020-01-15 Bioverativ USA Inc. ANTI-COMPLEMENT FACTOR BB ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
SG10201912034UA (en) 2017-02-08 2020-02-27 Bristol Myers Squibb Co Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
CN111051512A (zh) 2017-07-11 2020-04-21 辛索克斯公司 非天然核苷酸的掺入及其方法
JP2020529976A (ja) 2017-08-03 2020-10-15 シンソークス，インク． 自己免疫疾患の処置のためのサイトカイン抱合体
CN116948006A (zh) 2018-09-11 2023-10-27 北京泰德制药股份有限公司 白介素-2多肽偶联物及其用途
AU2019361206A1 (en) 2018-10-19 2021-06-03 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CN114949240A (zh) 2019-02-06 2022-08-30 新索思股份有限公司 Il-2缀合物及其使用方法
KR20210136014A (ko) 2019-02-12 2021-11-16 암브룩스, 인코포레이티드 항체-tlr 작용제 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 방법 및 이의 용도
MX2022011163A (es) 2020-03-11 2022-10-18 Ambrx Inc Conjugados de polipeptidos de interleucina-2 y sus usos.
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
AU2022249223A1 (en) 2021-04-03 2023-10-12 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE337223B (sl) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3619371A (en) * 1967-07-03 1971-11-09 Nat Res Dev Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
SE343210B (sl) * 1967-12-20 1972-03-06 Pharmacia Ab
DK132327A (sl) * 1968-07-16
BE758425A (fr) * 1969-12-02 1971-04-16 Baxter Laboratories Inc Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate (
DE2247163A1 (de) * 1972-09-26 1974-03-28 Merck Patent Gmbh Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4100271A (en) * 1976-02-26 1978-07-11 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
US4094744A (en) * 1976-11-18 1978-06-13 W. R. Grace & Co. Water-dispersible protein/polyurethane reaction product
US4275000A (en) * 1977-08-22 1981-06-23 National Research Development Corporation Peptide macromolecular complexes
JPS55110105A (en) * 1979-02-19 1980-08-25 Japan Atom Energy Res Inst Preparation of polymer composition containing physiologically active material
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896785A (ja) * 1981-12-04 1983-06-08 Stanley Electric Co Ltd 発光ダイオ−ドの合成樹脂レンズ成形方法
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4486344A (en) * 1983-03-28 1984-12-04 Miles Laboratories, Inc. Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method
JPS6098988A (ja) * 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0229108B1 (en) * 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847079A (en) * 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US5100664A (en) * 1985-09-20 1992-03-31 Cetus Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
US5034514A (en) * 1986-03-17 1991-07-23 Cetus Corporation Novel cross-linking agents
JPH0443882Y2 (sl) * 1986-06-23 1992-10-16
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4851220A (en) * 1986-11-26 1989-07-25 Schering Corporation Stable oleaginous gel
US4871538A (en) * 1987-07-13 1989-10-03 Schering Corporation Insoluble copper-alpha interferon complex
AU611932B2 (en) * 1987-08-21 1991-06-27 Wellcome Foundation Limited, The Novel complex
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) * 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ATE300519T1 (de) * 1989-04-19 2005-08-15 Enzon Inc Verfahren zum herstellen von modifizierten polypeptiden die eine polypeptid und ein polyalkylenoxid enthalten
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
WO1991008229A1 (de) * 1989-12-01 1991-06-13 Basf Aktiengesellschaft Hirudinpolyalkylenglykolkonjugate
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CS87192A3 (en) 1992-10-14
HUT60512A (en) 1992-09-28
US5849860A (en) 1998-12-15
IS3824A (is) 1992-09-26
AU671045B2 (en) 1996-08-08
BR9201015A (pt) 1992-11-24
ES2128329T3 (es) 1999-05-16
IL101348A0 (en) 1992-11-15
EP0510356B1 (en) 1999-01-27
ATE176159T1 (de) 1999-02-15
NO921142D0 (no) 1992-03-24
US5539063A (en) 1996-07-23
US5559213A (en) 1996-09-24
EP0510356A1 (en) 1992-10-28
CN1065465A (zh) 1992-10-21
MW1892A1 (en) 1994-01-12
US5747646A (en) 1998-05-05
IE920936A1 (en) 1992-10-07
FI921267A (fi) 1992-09-26
NO921142L (no) 1992-09-28
BG60800B2 (bg) 1996-03-29
EE9400356A (et) 1996-04-15
MX9201298A (es) 1992-10-01
AU657311B2 (en) 1995-03-09
OA09760A (fr) 1993-11-30
DE69228269D1 (de) 1999-03-11
DK0510356T3 (da) 1999-09-13
GR3030049T3 (en) 1999-07-30
ZW4392A1 (en) 1992-09-23
CN1175465A (zh) 1998-03-11
AU1316092A (en) 1992-10-01
HU211945A9 (en) 1996-01-29
US5834594A (en) 1998-11-10
MY131095A (en) 2007-07-31
FI107927B (fi) 2001-10-31
HU9200955D0 (en) 1992-05-28
FI20011554A (fi) 2001-07-17
AU7761594A (en) 1995-01-12
US5595732A (en) 1997-01-21
US5792834A (en) 1998-08-11
CY2169B1 (en) 2002-08-23
CN1108814C (zh) 2003-05-21
CA2063886A1 (en) 1992-09-26
KR920018079A (ko) 1992-10-21
CN1038035C (zh) 1998-04-15
JP2637010B2 (ja) 1997-08-06
CA2063886C (en) 2002-08-20
NZ242084A (en) 1993-12-23
JPH05117300A (ja) 1993-05-14
ZA922110B (en) 1992-11-25
DE69228269T2 (de) 1999-07-08
FI921267A0 (fi) 1992-03-24
NZ248022A (en) 1993-12-23
RO109543B1 (ro) 1995-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI9210294A (en) Polyethylene protein conjugates
RU2318004C2 (ru) Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты
JP4574007B2 (ja) ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
EP0593868B1 (en) PEG-interferon conjugates
PL186949B1 (pl) Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne
EP0950665A1 (en) Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
KR100888371B1 (ko) 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제