RO109543B1 - Compusi conjugati cu proteine, procedee pentru prepararea acestora si intermediari de sinteza - Google Patents

Compusi conjugati cu proteine, procedee pentru prepararea acestora si intermediari de sinteza Download PDF

Info

Publication number
RO109543B1
RO109543B1 RO92-200383A RO92200383A RO109543B1 RO 109543 B1 RO109543 B1 RO 109543B1 RO 92200383 A RO92200383 A RO 92200383A RO 109543 B1 RO109543 B1 RO 109543B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
protein
compound
alpha
conjugate
sru
Prior art date
Application number
RO92-200383A
Other languages
English (en)
Inventor
John Hakimi
Patricia Kilian
Perry Rosen
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27101069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RO109543(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RO109543B1 publication Critical patent/RO109543B1/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/3332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carboxamide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33344—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carbamate group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3344—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing oxygen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3348—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing nitrogen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Vending Machines For Individual Products (AREA)

Description

Prezenta invenție se referă la compuși de polietilenglicol (PEG), conjugați cu proteine, folosiți în compoziții farmaceutice, destinate pentru tratamentul sau profilaxia tulburărilor imunomodulatorii, cum ar fi maladii neoplazice sau maladii infecțioase, la procedee pentru prepararea acestor compuși și la intermediari în sinteza acestora.
Se cunoaște că, diferitele proteine naturale și recombinate au utilizare medicală și farmaceutică. Odată ce aceste proteine au fost purificate, separate și formulate, s-au putut administra pe cale parenterală, cu diferite indicații farmaceutice, pot fi relativ insolubile în apă și pot avea o viață scurtă, înjumătățită din punct de vedere farmacologic. în consecință, este dificil să se obțină, în utilizarea terapeutică, la pacienți, nivelele sanguine cu proteine. Aceste probleme pot fi soluționate prin conjugarea proteinelor cu polimeri, cum ar fi, de exemplu, polietilenglicol.
Sunt cunoscute procedee de conjugare a polietilenglicolului (PEG) la proteine, cum ar fi, de exemplu, enzime și insulină, în vederea obținerii conjugatelor în care proteina va fi mai puțin imunogenică și va reține o proporție substanțială din activitatea sa fiziologică (US 4179337).
Se cunosc, de asemenea, proteine modificate chimic cu polietilenglicol și anume proteine produse de o bacterie care aparține genului Bordetella care se leagă chimic de polietilenglicol (US 4791192).
Se cunoaște, de asemenea, solubilizarea proteinelor, pentru compoziții farmaceutice, folosind conjugarea polimerică, proteina conjugată, activă biologic, fiind /Linterferonul, 2- interleukina sau imunotoxina, dizolvată într-un mediu de suport apos (US 4766106, 4917888).
Sunt cunoscute procedee pentru prepararea de compoziții farmaceutice care cuprind proteine conjugate, activ biologice, în scopul reducerii imunogenității și pentru a crește perioada de înju35 mătățire, folosind cloroformiați, în condiții de reacție specifice (US 4902502).
Procedeele pentru formarea conjugatelor proteine - polietilenglicol și conjugatele care rezultă din aceste procedee, prezintă diferite probleme. Astfel, anumite procedee pentru formarea acestor conjugate de proteine și polietilenglicol pot inactiva proteina, iar conjugatele rezultate pot avea o activitate biologică slabă. In plus, anumiți lianți utilizați pentru formarea acestor conjugate de proteine și polietilenglicol pot fi susceptibili la un clivaj hidrolitic - in vivo. Când un astfel de clivaj se produce după administrare, aceste conjugate pierd proprietățile benefice furnizate de polietilenglicol.
Invenția înlătură dezavantajele care apar în formarea conjugatelor unei proteine cu polietilenglicol, utilizând liganți care conectează diferite grupări amino libere în proteină și lărgește gama compușilor de polietilenglicol conjugați cu proteine, cu noi derivați, care prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale I:
proteină (I) m
R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- R2 NH xcz
II L i r3 - în care R reprezintă o grupare alchil inferior; R2 reprezintă -O- sau -NH-; R3 reprezintă o grupare =N- R , =S sau =O; R4 reprezintă o grupare alchil inferior sau cicloalchil; ah și n sunt alese dintre numere întregi egale sau mai mari ca 1, astfel încât conjugatul să posede cel puțin o parte din activitatea biologică a proteinei n^conjugate; cu condiția ca atunci când R2 este -O-, R3 este o grupare diferită de =N-R , astfel că atunci R2 este -O- și R3 este =O, proteina este «-interferon, interleukin-1 sau interleukin-lra și atunci când R2 este -O- și RJ este =S, proteina nu este antigenul E din polenul ruginei sau albumina plasmei de bovine.
Procedeul de preparare a compu109543 șilor conjugați cu proteină cu formula generală I, conform invenției, constă în aceea că, compușii activați pe bază de polietilenglicol reacționează cu o grupă amino liberă a unei proteine sau a unei sări a acesteia, într-o soluție apoasă tampon, având pll-ul între 7 și 10, cu o cantitate molară egală sau un exces molar al unui compus activat și izolând conjugatul de proteină din amestecul de reacție prin cromatografie sau electroforeză.
Invenția constă și în compușii polietilenglicolici activați, utilizați ca intermediari în procedeul de obținere a conjugatului care prezintă următoarele formule generale: R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=C=N-R4 II-A R^iCHzCH^n-CH^Hiî-O-C-N^ l] X II-B S O
R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-9- l ]}
O VII-C zent în special, invenția definește conjugatele de proteine cu formulele următoare:
Η H'
N N- proteină
R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 I-A
NR4 m
H
RLo(ai2CH2O)n-CH2CH2-O N
Y s
Γ H / Nx
R^OțCH^H^n-CH^HÎ 'c proteină I-B m
H ,N\\ proteină I-C m
Γ H Hi
NR1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 proteină I-D m
R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N= C= S II-D
R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O-^ Ί XS NR5
II-E
R^CCH^CHiOjn-CHîCH'i-O-q-O-r j) XS ^NZ II-F
O NHR1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 xb
R^CGllTCHsOjn-CH.zCîb.-O-^-O1 xnzh-g4 în care R1 reprezintă alchil inferior, R4 reprezintă alchil inferior sau cicloalchil, R reprezintă alchil inferior sau hidrogen și n este oricare număr întreg de la 1 până la 1000.
Invenția prezintă avantajul obținerii unor compuși conjugați cu proteine, care nu sunt susceptibile de un clivaj hidrolitic - in vivo - și nu prezintă problemele conjugatelor proteinei cu polietilenglicolul, cunoscute până în pre40 proteină I-E m în care R1, R\ m și n și proteina au semnificațiile de mai sus.
Conform prezentei invenții, s-au făcut așadar referiri pentru prima dată la proteina interleukin-1 rceptor antagonist (IL-Ira) și interleukin-1 (IL-1) conjugate cu polietilenglicolul (PEG).
Conform invenției, prin utilizarea compușilor activați de polietilenglicol, cu formulele II-A, II-B, II-C, II-D, II-E, II-F sau II-G, pentru a se produce compușii conjugați, o legătură între grupările amino libere din proteină și polietilenglicol se formează, astfel încât compusul conjugat care rezultă să rețină cel puțin o porțiune din activitatea biologică a proteinei, reducându-se în același timp imunogenitatea acesteia.
Conform prezentei invenții, R1 și
R ' pot fi orice grupare alchil inferior, de preferință metil. Termenul de alchil inferior desemnează grupările alchil având un număr de la 1 la 6 atomi de carbon, cum ar fi, de exemplu, metil, etil, npropil, izopropil etc. în general, grupările alchil preferate sunt grupările alchil având un număr de la 1 la 4 atomi de carbon, cea mai preferată fiind gruparea metil.
Conform invenției, m și n pot fi orice număr întreg, egal sau mai mare de 1, astfel încât conjugatul care rezultă, al proteinei, să aibă cel puțin o parte din activitatea biologică a proteinei care formează conjugatul. Se pare că suma n +m este invers proporțională cu cantitatea activității biologice a proteinei care este reținută de conjugat Valoarea numerică pentru n se referă la numărul de unități de etilenglicol în polietilenglicolul care formează conjugatul și este cuprinsă între 1 și 1000. Termenul m se referă la numărul de grupări amino conținute de proteină, care reacționează cu polietilenglicolul activat PEG. De preferință, valoarea rn este de ordinul a 1 până la 5, valoarea 1 fiind preferată. Valoarea cea mai ridicată m+n determină ca și greutatea moleculară a conjugatului să fie cea mai ridicată. Greutățile moleculare ale polimerilor de polietilenglicol cu formulele II-A...II-G și ale conjugaților de proteină cu formulele I și I-A până la I-E pot fi ușor determinate. Valorile pentru m și n pot fi deduse din determinarea greutății moleculare.
Termenul de proteină cuprinde, pe de o parte, polipeptidele și pe de altă parte, sărurile de adiție, acceptabile din punct de vedere fiziologic.
Când compușii cu oricare formulă de la Π-A până la II-G reacționează cu proteina și proteina conține mai mult decât o grupare liberă, conjugatul poate fi produs ca un amestec de diferite proteine conjugate cu polietilenglicoli PEG. în cazurile în care proteina conține 2 grupări amino libere, polietilenglicolul PEG activat poate reacționa atât cu una din grupările amino libere, cât și cu ambele grupări libere. în această situație, amestecul conține un conjugat format atunci când 2 grupări amino libere re6 acționează cu polietilenglicolul PEG și al doilea conjugat este format când numai o grupare amino liberă reacționează cu polietilenglicolul PEG. Deoarece diferiții conjugați în acest amestec au diferite greutăți moleculare, aceste conjugate pot fi separate prin metode convenționale, cum ar fi, de exemplu, cromatografia. Pentru determinarea propriu-zisă, pentru m și n selectați corect, conjuga ții separați pot fi ecranați pentru activitatea biologică prin aceleași mijloace utilizate pentru ecranarea proteinei de origine, pentru determinarea reținerii de către conjugat a porțiunii biologic active a proteinei utilizate pentru formarea conjugatului, în acest fel, numerele m și n pot fi ajustate de orice manieră dorită pentru a se obține activitatea dorită.
în mod preferat, conform prezentei invenții, valorile pentru m și n pot fi un număr întreg, astfel ca greutatea moleculară a conjugatului, excluzând greutatea proteinei, să fie cuprinsă între aproximativ 300 până la aproximativ 30000 Daltoni. De preferință, m este 1. Când m este 1, acest conjugat poate fi obținut chiar când există 2 sau mai multe grupări amino libere. Compusul polietilenglicol PEG activat reacționează mai întâi cu una din grupările amino libere, conținute în grupările de proteine. Prin reglarea concentrației reactivilor, cum ar fi proteina și condițiile de reacție, în conformitate cu metodele standard pentru condensarea aminelor, printr-una din aceste metode se poate regla gradul de pegilare a grupărilor amino conținute în proteină. în proteinele care conțin 1 sau mai multe grupări amino libere, când una din grupările amino libere este mult mai reactivă decât celelalte grupări amino, condițiile pot fi selectate astfel ca proteina să reacționeze cu compusul polietilenglicolic PEG activat, pentru a se forma compusul cu formula I în care m este 1.
Alte grupări amino, conținute în aminoacizii care formează proteina, pot să reacționeze suplimentar cu polietilenglicolul PEG, permițându-se în acest fel condensarea prin reacția care are loc mai departe sau prin utilizarea altor condiții mai j>utemice.
In conformitate cu o întruchipare preferată, atunci când m este 1, n este orice număr întreg, astfel ca polietilenglicolul care formează conjugatul are o greutate moleculară de la 300 la 30000 Daltoni, corespunzător valorii pentru n care este de aproximativ 6 până la 680. De preferința, n este de aproximativ 28, 112 și 225 corespunzător greutăților moleculare de 1325, 5000 și respectiv 10000, valoarea n fiind cea preferată pentru regiunea 112. Caracterizând polimerul polietilenglicolic prin greutatea moleculară, se preferă o supradesemnare a unităților acestuia care se repetă în polimerul polietilenglicolic PEG cu un număr întreg n, datorat neomogenității potențiale a compușilor de polietilenglicol PEG de plecare, care sunt, de obicei, definiți prin greutățile lor moleculare medii și nu prin unitățile lor care se repetă. Compușii de polietilenglicol PEG inițiali, cu diferite greutăți moleculare, pot fi preparați prin diferite metode, cunoscu te în domeniu sau pot fi obținuți din comerț.
In cazul în care valorile pentru m și n obținute prin determinarea greutăților moleculare nu sunt numere întregi (cum ar fi cazul în general), valorile trebuie să fie rotunjite în sus sau în jos în modul obișnuit.
In cazul în care R4 reprezintă o grupare alchil inferior, R4 poate fi orice grupare alchil inferior conținând de la 1 până la 6 atomi de carbon, așa cum s-a definit mai sus. Când R** reprezintă o grupare cicloalchil, el este de preferință o grupare cicloalchil care conține de la 3 până la 7 atomi de carbon, cum ar fi, de exemplu, ciclopropil, ciclopentil, ciclobutil și ciclohexil. Gruparea cicloalchil preferată este ciclohexil.
Compușii din titlul fiecăruia din următoarele exemple sunt denumiți în concordanță cu nomenclatura IUPAC.
Cu toate acestea, acești compuși pot fi denumiți așadar, după cum urmează: Exemplele 1, 2, 3 și 4: Alfa -/2((ciclohexilcarbonimidoil) - amino)etil) amega-metoxipoli(ad- 1,2-etandrii) este denumit alternativ a//a-/2-//(ciclohexilamino)metilen/amino/etil/ omega-metoxipoli-(oxz-l,2- etandiil).
Exemplele IA, la și ld: Alfa-(2cloroetil) -omega - m e to xi p o 1 i (oxi -1,2etandiil) este alternativ denumit alfa-metoxi-omega- (2-cloroetil)poli (oxi-1,2etandiil).
Exemplele 1B, lb și le:Alfa-(2-azidoetil) -omega -metoxipoli(oxî -1,2- etandiil)este alternativ denumit «//a-metoxiomega- (2-azidoetil) poli (an-1,2-e tandrii).
Exemplele IC, lc și lf:Alfa-(2-aminoetil) -omega - metoxi pol i (an - 1,2-etan diil) este alternativ denumit alfa-metoxi-omega- (2-aminoetil) poli(axz-l,2etandiil).
Exemplele 11, 11a, 11b, 12, 12A și
13...17: Alfa-metil- omega-/2- //(piridiniloxi)carbonil/amino/etoxi/poli(an-l,2- etandiil) este alternativ denumit αΖ/α-/2//(2-piridinil- an)carbonil/amino/etil/omega-metoxipoli(oxi- 1,2-etandiil).
Exemplele 18,18a, 19, 19A, 20, 20A, și 22:yl//h-/(2-piridiniloxi)carbonil/omega-metoxipoli(oxr-l,2- etandiil) este alternativ denumit alfa-metil-omega- /2//(2-piridiniloxi)carbonil/ori/- etoxi/poli(ori- 1,2-etandiil).
Exemplele 23...27: Alfa -/2-(izotiocianato) etil/- omega-met<xâpc>h(pxi-l,2etandiil) este alternativ denumit alfa-lvaetoxi-omega-/2- (izotiocianato)etil/po1ϊ(ί>Λ3 -1,2-e tandrii).
Exemplul 28: zl//ri-/(2-piridiiriioxi)tiocarbonil/- omega-metoxipoli(oja-
1,2-etandiil) este alternativ denumit alfa-raetil-omega-/2// (2- piridiniloxi)tiocarbonil/axr/etoxi/-poli(oja-l,2-etandiil).
Prezenta invenție cuprinde așadar procedeul pentru prepararea conjugatelor de proteină - polietilenglicol PEG, cu formula generală I sau formulele de la I-A până la I-E, procedeu care cuprinde reacția unuia dintre compușii activați cu formula generală:
π-A R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=C=N-R4
ii-c R1 * *O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-
ll-D R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N= C= S n-E
R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O-l '1
1I-F
R1O(CH2CH2O)„-CH2CH2-O-()J-Os
I1-G R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C-O-^'j!
N 15· în care R , R și n sunt definiți ca mai 5 înainte, cu o grupare amino liberă a proteinei sau o sare a acesteia și izolarea proteinei conjugate din amestecul de reacție.
In particular, sinteza derivaților indi10 viduali de polietilenglicol PEG care trebuie cuplați cu proteina, ca și reacția lor cu proteina, poate fi efectuată așa cum se va descrie în continuare.
Pentru a se produce conjugatul de 15 proteină în care Rz este ^4H- și R3 reprezintă o grupare =N-R4 (compusul cu formula I-A), se utilizează următoarea schemă de reacție:
, SOX2
RO(CH2CH2O)nCH2CH2-OH----> RO(CH2CH2O)nCH2CH2X
I NaN3, DMF H2 1 RO(CH2CH2O)nCH2CH2NH2- - - ^R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N3 r4-n=c=s
I s H ltH Λ
RO(CH2CH2O)„CH2CH2N-C-N- R4
III
S H|lH 4 1
RO(CH2CH2O)nCH2CH2N-C-N- R4 (CșHsjșfiC Ci^R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N =
IIA C= N-R4
III
Ή _.N R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 ' proteină
I-A // 4
NR4 în care R1, R4, n și m și proteina sunt definiți mai înainte.
în schema de reacție, gruparea hidroxil de la sfârșitul moleculei PEG este transformată în hidrogen prin metode convenționale, cum ar fi, de exemplu, prin tratarea cu halogenură de tionil. Halogenura de PEG, care rezultă, este transformată într-o azidă prin metode convenționale, cum ar fi, de exemplu, prin tratarea cu azida de sodiu. PEG azida poate fi apoi convertită într-o amina, prin metode convenționale, cum ar fi de exemplu, prin hidrogenare. PEG amina reacționează apoi cu izotiocianat de alchil sau cicloalchil, cum ar fi, de exemplu, izotiocianat de ciclohexil, pentru a forma tioureea cu formula III, care este apoi desulfurizată, prin metode convenționale, pentru a forma compusul cu formula II-A, care conține gruparea funcțională carbodiimidă. în transformarea tioureei cu formula III în PEG carbodiimidă cu formula II-A, agentul de desulfurizare preferat este trifenilfosfura.
PEG carbodiimida cu formula II-A poate fi condensată cu o proteină, în orice condiții convenționale, pentru condensarea carbodiimidelor cu aminele. în general, această reacție este efectuată într-o soluție standard apoasă, având un p cuprins între 7 și 9, pentru a se produce conjugatul cu formula I-A. Reacția de condensare care rezultă poate produce un amestec de PEG conjugat cu proteină de diferite greutăți moleculare, dependent de numărul de grupări amino libere de proteină și de timpul de reacție.
H
R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2O N
L . s proteină I-B w 1 - 1 ™ în care R ,m,n și proteina sunt definiți ca mai sus.
în această reacție, un PEG este refluxat cu 1,1-carbonotioil-to- 2(lH)-piridinonă într-un solvent hidrocarbură, cu punct de fierbere ridicat, pentru a se produce compusul cu formula II-B. Compusul cu formula II-B poate fi condensat cu una sau mai multe grupări amino libere ale proteinei pentru a produce conjugatul cu formula I-B, în același mod, așa cum s-a descris în legătură cu condesarea compusului cu formula II-A cu o proteină pentru a prepara amestecul conjugat cu formula I-A. Separarea acestui amestec poate fi realizată în funcție de greutățile moleculare ale produselor formate, așa cum s-a descris mai înainte.
Alternativ, conjugatul de proteină, conform invenției, în care R2 este -Oși 1\ este =S (compusul cu formula I-B), poate fi produs prin următoarea schemă de reacție:
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2OH +
Conjugații PEG-proteină pot fi separați în componentele individuale prin metode convenționale, cum ar fi, de exemplu, cromatografie lichidă de înaltă performanță sau electroforeză pe gel.
Pentru a produce conjugatul cu proteină în care R2 este -O- și RJ este =S
R1O(CH2CH2OXCH2CM2O
NH2-proteină (compusul cu formula I-B), se poate utiliza următoarea schemă de reacție: i θ’ 0
ROCCHsCHsOlnCHzCHz-OH + Y Y V t 0 'Λ
--> R1O(CH2CH2O)nCHZCH2-O N ) V S:
s xo
II-B
NHî-proteină
H
R1-O(CH2CH2O)b-CH2CH2-O N proteină II-B m
Y s în care R , m, n și proteina sunt definiți mai înainte.
Conform cu această schemă, PEG este reacționat cu tiocarbamatul de formula VI, într-un solvent organic, pentru a se forma PEG- tiocarbonatul cu formula
II-F. Orice metodă convențională de condensare a tiocaibonatului cu o grupare hidroxi, poate fi utilizata pentru efectuarea acestei reacții. Compusul cu formula II-F este transformat în conjugatul cu formula I-B, prin condensarea compusului cu formula II-F cu cel puțin o grupare amino liberă a proteinei. Reacția este efectuată în modul descris mai înainte pentru transformarea compusului cu formula II-A în conjugatul cu formula I-A. Produsul, care este obținut prin această reacție, poate fi un amestec de conjugați cu diferite greutăți moleculare, dependent de cantitatea de grupări amino libere din proteina utilizată. Acești conjugați pot fi separați după greutățile moleculare, în conformitate cu procedeul descris mai înainte.
Pentru producerea conjugatului de proteină în care Rz este -NH- și R5 este =O (compusul cu formula I-C), poate fi utilizată următoarea schemă de reacție:
N OH
O
II Cl-C-Cl
refluxarea într-un solvent hidrocarbonat halogenat pentru a produce compusul cu formula II-C. Compusul cu formula II-C este condensat cu proteina printr-una sau 5 mai multe grupări amino libere ale proteinei pentru a produce compusul cu formula I-C. Această reacție este efectuată în modul descris mai sus, pentru condensarea compusului cu formula II-A, 10 pentru a produce conjugatul cu formula
I- A. Dependent de numărul grupărilor amino libere, conținute în proteina care reacționează cu compusul cu formula
II- C, conjugatul cu formula I-C poate fi format ca un amestec de conj ugați, având diferite greutăți moleculare. Acest amestec conjugat poate fi separat în modul descris mai înainte.
Pentru a produce un conjugat de 20 proteină, conformi invenției, în care Rz este -NH- și reprezintă =S (compusul cu formula I-D), se utilizează următoarea schemă de reacție: R1O(CH2CH2Q)nCH2CH2NH2 + tionocarbonat de dj-2-piridi 1
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N= C= S
H NHR1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 0^
R1O(CH2CH 2O)n-CH2CH2-NH2
Y o
RÎOCCH^H^n-CH/WN O
H
II-C NH2-proteină
V proteină I-C
Μ™ în care R1, R , m, n și proteina sunt definite mai sus.
Compusul cu formula IV este produs prin condensarea fosgenului cu 2-hidroxipiridina (substituită dacă R? reprezintă o grupare alchil inferior), utilizându-se orice metodă convențională pentru condensarea halogenurii acide cu un alcool.
Condensarea PEG-aminei cu compusul cu formula IV este efectuată prin
II-D NH2-proteină
Ψ
H
N NH - proteină R1-O(CH2CH2O)nCH2CH2 θ' *S m I-D în care R,m,n și proteina sunt definiți ca mai înainte.
în această schemă de reacție, PEGamina reacționează cu tionocarbonatul de di-2-piridil pentru a produce compusul cu formula II-D. In acest procedeu, poate fi folosită orice metodă convențională de condensare a aminei cu tionocarbonatul pentru producerea izotiocianatului. Compusul cu formula II-ț) reacționează cu proteina pentru a forma conjugatul cu formula I-D, în modul descris pentru transformarea compusului cu formula II-A în compusul cu formula I-A. Depinzând de cantitatea grupărilor amino libere, conținute în proteină, condensa109543 rea compusului cu formula II-D cu proteina produce un amestec de conjugați care pot fi separați în componentele individuale în modul descris mai înainte pentru separarea conjugatului cu formula 5 I.
Alternativ, compusul cu formula I-D poate fi produs, utilizându- se următoarea schemă de reacție:
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2O
proteină
I-E m
NHi-proteină
R^(CH2CH2O)nCH2CH2NH2 χΟ NH
R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 CZ
O x
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2NH
I
I-D
NH2-proteină II-E
Compusul cu formula V este produs prin condensarea tiofosgenului cu 2-hidroxipiridina (substituită când este o grupare alchil inferior), utilizându-se orice metodă convențională pentru condensarea halogenurii acide cu un alcool. Compusul cu formula V reacționează apoi cu PEG-amina, în modul descris mai sus, pentru a se obține compusul cu formula II-C. Compusul rezultat este IIE. Compusul cu formula II-E este condensat cu un sau mai multe grupări amino libere din proteină, pentru a se produce conjugatul cu formula I-D. Această reacție este efectuată în modul descris mai sus, pentru formarea conjugatului I-A.
Pentru a se produce o compoziție de proteină, confonn invenției, în care Rz este -O- și R“ este O (compusul cu formula I-E), poate fi folosită următoarea în care R ,m,n și proteina sunt definite maiînainte.
în schema de reacție de mai sus, carbonatul de di -2-piridil reacționează cu PEG pentru a produce compusul cu formula II-G. Această reacție este efectuată în condițiile convenționale de condensare a unui alcool cu un carbonat Compusul cu formula II-G este transformat în compusul cu formula II-E prin condensarea compusului cu formula II-G cu una sau mai multe grupări amino libere în proteină. Această reacție este efectuată în același mod cum s-a descris în legătură cu transformarea compusului cu formula II-A în compusul cu formula I-A. Amestecul de reacție astfel produs poate conține un amestec de conjugat cu formula I- E, în funcție de grupările amino libere, conținute de proteină. Acest amestec este constituit din diferiți conjugați, cu diferite greutăți moleculare. Diferiții conjugați pot fi separați din amestec conform procedeului descris mai înainte.
Conform cu o întruchipare preferată a prezentei invenții, un conjugat al alfainterferonului cu PEG poate fi produs prin următoarea schemă de reacție:
schemă de reacție:
R1O(CH2CH2O)nCH2CH2OH +
R1O(CH2CH2O) „-CH2CH2-N
II-C
NH2-aZ/a-interferon
U
NH- âZ/â-interferon Y-O/CHzCHiOjn-CHîCHz C' în care R este metil, n este aproximativ 112. Această reacție este de un interes special pentru «//h-interferon din subtipul aZfa-interfeion A (denumit, de asemenea, «//«-interferon 2).
Sinteza compusului PEG activat II-C este descrisă mai înainte în legătură cu sinteza unei proteine conjugate, în care R2 este -NH- §i R3 este =O. Conjugatul final al alfa- interferonului poate fi obținut în mod analog, așa cum s-a descris mai înainte sau în exemplele pentru sinteza conjugatului de proteină I-C.
Orice proteină cu o activitate fiziologică sau o sare a acesteia, poate fi utilizată pentru prepararea conjugatului cu PEG, cu condiția ca această proteină să conțină cel puțin o grupare amino pentru condensare.
Proteinele preferate, care pot fi utilizate în prezenta invenție, sunt interleukin-1 (IL-1), antagonistul receptor de interleukin-1 (IL-lra), interleukin-2 (IL-
2) și interferonii, de exemplu IFN- alfa (interferoni de leucocite), IFN-be/α (interferon de fibroplast) și IFN-gama (interferon imun), formele lor produse în mod natural ca și analogii lor, omologii sau formele ramificate.
Antagonistul receptor interleukin-1 (IL-lra) de mai înainte, poate fi obținut din culturi de țesut sau prin metode recombinate. O metodă de obținere a IL-lra este de a se trata celule mielomonocitice umane U937 (ATCC CRL1594) cu agentul de diferențiere phorbol miristat acetat (PMA) și prin stimularea lor cu Factorul de Stimulare Colonie de Granulocite Macrofage (GM-CSF obținut din Amgen) și izolarea și purificarea IL-lra din lichidul supernatant al culturii, așa cum se descrie în Carter ș.a., Nature 344, 633-637 (1990).
Recombinantul IL-lra se referă la
IL-lra, având o activitate biologică com18 parabilă cu cea a compusului nativ IL-lra, dar preparat prin metode recombinate, așa cum este descris de Carter ș.a., Eisenberg s.a., Nature 343,341-346 (1990).
Interferonul include toate tipurile de interferoni, cum sunt interferonii a, β, γ sau a), precum și orice subtipuri ale oricăror tipuri. Interferonii pot fi obținuți din țesuturi sau din culturi de țesuturi sau pot fi produși utilizându-se metode recombinate, cum sunt cele descrise în ΕΡ,Α, 43 980. Alte metode pentru generarea și izolarea interferonilor naturali sau recombinați sunt, de asemenea, cunoscute în domeniu. Conform invenției, s-a descoperit că, conjugatele de proteină, au aceeași utilizare ca și proteinele utilizate pentru formarea conjugatului. De aceea, acești compuși conjugați sunt terapeutic activi, în a-ceiași manieră cu proteinele, fără a se produce răspunsurile imune nedorite, care pot apărea odată cu administrarea la subiecți a proteinelor. De aceea, sunt prevăzute compoziții farmaceutice pe baza compușilor cu formula I și metode de producere a acestora.
Compozițiile farmaceutice, utilizate pentru controlul sau prevenirea maladiilor, cuprind o proteină conjugată cu formula I și un suport cu rol de vehicul terapeutic inert, netoxic și acceptabil terapeutic. Compozițiile farmaceutice pot fi formulate și dozate într-o manieră cunoscută în domeniu, luând în considerație tulburările care trebuie tratate, condiția pacientului individual, partea de eliberare a proteinei conjugate, metoda de administrare și alți factori cunoscuți.
Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției.
Exemplul 1. Prepararea compusului alfa-/2- //(ciclohexilcarbonimidoil) amino/-etil/-omega-metoxipoli(oxi-1,2- etandiil) SRU 111.7
N Prepararea compusului alfa-(2-cloroetil)-omega- metoxipoli(oxi- 1,2-etandiil) SRU 111.7 (SRU desemnează numărul de unități care se repetă, pre109543 zente în polimerul PEG).
Dintr-o suspensie formată din 50 g metoxipolietilenglicol (MPEG), cu greutate moleculară 5000, în 700 ml toluen se distilează 200 ml solvent La soluția 5 menținută sub reflux, se adaugă sub formă de picături 0,8 ml piridina uscată și 2,2 ml clorură de tionil. După refluxare, timp de 4 h, reacția este lăsată sub agitare până a doua zi. Solventul este apoi 10 îndepărtat sub presiune redusă și se adaugă la reziduu 500 ml clorură de metilen CH2CI2. Soluția astfel rezultată este apoi uscată cu carbonat de potasiu anhidru K2CO3 și apoi este trecută prin 15 50 g alumină bazică. Cea mai mare parte de CH2CI2 este apoi îndepărtată sub presiune redusă și se adaugă la siropul rezultat 1 1 de eter dietilic. Eterul este apoi îndepărtat sub distilare și se adaugă 20 în plus, eter dietilic pentru a se forma un precipitat Amestecul este agitat la temperatura camerei, timp de 2 h și apoi este filtrat pentru a se obține o cantitate de 45 g alfa-(2-cloroetH)-ome- 25 giî-metoxipoli(orz-l,2- etandiil) SRU
111.7.
Analiză: calculat pentru C3H7CIO (CH2CH2) 111.7 C 53,97; H 9,12; CI 0,71; găsit: C 54,21; H 8,70; CI 0,71. 30
B. Prepararea alfa- (2-azidoetil)-omega-metoxipoli(oxi-l,2- etandiil) SRU
111.7.
Un amestec format din 20 g azidă de sodiu și 50 g alfa-(2- cloroetil)-omega- 35 metoxipoli(eri-l,2-etandiii) SRU 111,7 se încălzește la 120...125°C în 375 ml dimetilformamidă (DMF) uscată. După 7 h, solventul este îndepărtat sub vacuum puternic. Reziduul este dizolvat în 500 40 ml CH2CI2 și se filtrează prin pământ de diatomee. Cea mai mare parte de CH2CI2 este apoi îndepărtată prin fierbere și se adaugă eter dietilic, pentru a determina precipitarea. Amestecul este 45 agitat peste noapte și apoi este filtrat Rezidul este dizolvat apoi într-o cantitatea minimă de glim, la 50°C, după care soluția este răcită și produsul precipitat este filtrat, pentru a se obține alfa-(2- 50 azidoetil)- omegu-mctoxipoli (pxi-1,2etandiil) SRU 111,7.
Analiză: calculat pentru C3H3N3O (CH2CH2O) 111,7: C53,77; H 9,09; N 0,84; găsit: C 53,61; H 9,08; N 0,89.
C. Prepararea alfa- (2-aminoetil)omega-metoxipoli(oxi-l,2- etandiil) SRU
111,7
La un amestec de 25 g alfa-(2-azidoetil)-owega- metoxipoli(ori-l,2-etandiil) SRU 111,7 în 25 ml glim uscat s-au adăugat 3,5 g Pd/C 10%. Amestecul este apoi introdus sub atmosferă de H2 de 3,5 kgf/cm2 și agitat la 50°C, timp de 18 h. Amestecul este apoi filtrat, partea solidă este spălată cu CH2CI2 și soluțiile organice combinate sunt plasate sub presiune redusă pentru îndepărtarea solventului. Reziduul este apoi dizolvat în 100 ml glim fierbinte și produsul este lăsat să precipite din soluția răcită. Precipitatul este filtrat și uscat prin încălzire sub presiune redusă, pentru a se obține o cantitate de 23 g din compusul alfa-(2.aminoetil)- omega-metoxipoh(pxi-l,2etandiil) SRU 111,7.
Analiză: calculat pentru C3H9NO (CH2CH2O) 111,7: C 54,43; H 9,20; N 0,28; găsit: C 54,43; H 9,18; N 0,36.
Alternativ, o soluție formată din 40 g izZ/h-(2-azidoetil)- omega-metoxipoli(oxz-l,2-etandiil) SRU 111,7 și 6,7 g (25,6 mmoli) de trifenilfosfină, dizolvate în 200 ml CH2CI2 uscată, se agită peste noapte sub atmosfera de argon. Se adaugă apoi 2 ml apă și amestecul este agitat încă 12 h. Majoritatea clorurii de metilen este îndepărtată sub vacuum și se adaugă la soluție 400 ml eter dietilic. Precipitatul este apoi filtrai spălat cu eter și dizolvat în 300 ml glimă la cald, la 50°C. Soluția este lăsată în repaus, la temperatura camerei, peste noapte și precipitatul rezultat este filtrat, spălat de 2 ori cu câte 100 ml glimă și apoi de 2 ori cu câte 100 ml eter dietilic și apoi se usucă într-o etuvă vidată, sub un curent de azot, pentru a se obține 35 g alfa-(2aminoetil)-omega-metoxipoli (oxi-1,2109543 etandiil) SRU 111,7.
D. Prepararea alfa-12-1/(ciclohexilamino)tiocarbonill- aminoetill-omega-metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
La o soluție de 4 g «//b-(2-aminoetil)-omega - metoxipolițori-1,2-etandiil) SRU 111,7 în 60 ml glimă uscata se adaugă, la 40°C, 0,1 ml izotiocianat de ciclohexil. Soluția se lasă sub agitare la 40°C, timp de 18 h. Amestecul se filtrează apoi §i solventul se îndepărtează sub vid înaintat Reziduul se dizolvă apoi în 100 ml glimă, la cald, soluția se răcește și precipitatul rezultat se filtrează și se usucă sub vid înaintat, pentru a se obține 3,5 g alfa-12- //(ciclohexilamino)tiocarbonil/ -amino-etil/-omega- metoxipoli(<9?a-l,2-etandiil) SRU 111,7.
Analiză: calculat pentru C10H20N2 OS(CH2CH2O) 111,7: C 54,25; H 9,13; N 0,54; S 0,62; găsit: C 54,39; H 8,87; N 0,55; S 0,59.
E. Prepararea alfa-l-H(ciclohexilcarbonimidoil)aminol-etill- omega-metoxipoli (oxi-1,2-etandiil) SRU 111,7
O soluție de 1 g alfa-12-1/(ciclohexilamino)-tiocarbonil/- amino/etil/-omeg«metoxipoli(ftn-l,2-etandiil) SRU 111,7, 120 mg trifenilfosfină, 90 μ\ CCI4 și 84 μ\ trietilamină în 5 ml CH2CI2 uscat se refluxează timp de 72 h. Solventul este îndepărtat apoi sub presiune redusă și reziduul se dizolvă într-o cantitate minimă de glimă uscată. După răcire, produsul precipitat este filtrat și uscat sub vacuum, pentru a se obține alfa-12- // (ciclohexilcarbonimidoil) amino/etil/omegfl-metoxipoli (oxi-1,2-etandiil) SRU
111,7.
Analiză: calculat pentru C10H18N2 O(CH2CH2O)111,7: C 54,61; H 9,15; N 0,55; găsit: C 54,95; H 9,27; N 0,50.
Exemplul la. Prepararea alfa- (2-cloroetil)-omega- metoxipoli (oxi-1,2-etandiil) SRU 225 în aceleași condiții ca în exemplul IA, metoxipolietilenglicolul cu greutate moleculara 10000 (MPEG) se transformă în compusul a//a-(2-cloroetil)- omega 22 metoxipoli (oxi-1,2- etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C3H7CIO (CH2CH2O)225: C 54,37; H 9,14; Cl 0,35; găsit: C 54,30; H 9,15; Cl 0,41.
Exemplul lb. Prepararea alfa-(2azido-etil)- omega- metoxipoli(oxi-l,2etandiil) SRU 225 în condițiile de reacție descrise în exemplul IB, alfa-(2- cloroetil) -omega metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 225 se transformă în alfa-(2-azidoetil)-omegametoxipoli(o.n-l,2-etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C3H7N3O (CH2CH2O)225: C 54,34; H 9,13; N 0,42; găsit: C 54,32; H 9,28; N 0,50.
Exemplul le.Prepararea alfa-(2-aminoetil)-omega- metoxipoli (oxi-1,2-etandiil)SRU 225 în aceleași condiții de reacție ca în exemplul IC, compusul «Z/a-(2-azidoetil) -o/negfl-metoxipoli(ori-1,2- etandiil) SRU 225 este transformat în «Z/«-(2-aminoetil)- omega- metoxipoli(oxz-l,2-etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C3H9NO (CH2CH2O)225: C 54,48; H 9,17; N 0,14; găsit C 54,80; H 9,21; N 0,12.
Exemplul ld. Prepararea alfa- (2-cloroetil)-omega- metoxipoli(oxi-1,2-etandiil) SRU 28,3
La o soluție de 0,5 ml clorură de oxalil proaspăt distilată în 40 ml CH2CI2 uscată, se adaugă, în picături, la 0°C, 0,5 ml DMF uscată, în 10 ml CH2CI2· Soluția rezultată se încălzește la temperatura camerei, se agită timp de 15 min și apoi se răcește la 0°C. Se adaugă apoi 5,6 g MPEG, cu greutatea moleculară 132,5 și soluția rezultată se refluxează timp de 5 h. Amestecul se toarnă apoi în apă și amestecul format se extrage apoi cu CH2CI2. Soluția de CH2CI2 se usucă pe MgSCM și solventul se îndepărtează sub presiune redusă, obținându-se 1,7 galfa(2-cloroetil) -omega- metoxipoli(oixz -1,2etandiil) SRU 28,3, ca o pulbere albă.
Analiză: calculat pentru C3H7CIO (CH2CH2O)28,3; C 53,38; H 9,03; Cl 2,64;
găsit: C 53,48; H 9,10; Cl 2,41.
Exemplul le. Prepararea alfa- (2-azi109543 doetil)-omega- metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 28,3 în aceleași condiții de reacție ca în exemplul IB, compusul Wfa-(2-cloroetil)-omega-metoxipoli(oxi-1,2- etandiil) SRU 28,3 este transformat în alfa-(2-azidoetil)- amega-metoxipoli/oxi-l^-etandiil) SRU 28,3.
Analiză: calculat pentru C3H7N3O (CH2CH2O)28,3: C 53.12; H 8,99; N 3,11; găsit: C 53,21; H 9,07; N 2,98.
Exemplul IE. Prepararea alfa- (2-aminoetil)-omega- metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 28,3 în aceleași condiții ca în exemplul IC, compusul alfa-(2- azidoetil) -omega metoxipoli(<9xz-l,2-etandiil) SRU 28,3 este transformat în a//a-(2-aminoetil)-omega- metoxipoli(orM,2-etandiil) SRU
28,3.
Analiză: calculat pentru C3H9NO (CH2CH2O)28,3: C 54,47; H 9,17; N 0,14; găsit: C 54,44; H 9,19; N 0,15.
Exemplul 2. Prepararea alfa-interferonului recombinat (IFN- alfa), conjugat cu PEG, cu ajutorul reactivului alfa-/2//(ciclohexilcarbonimidoil) amino l-etillomega-metoxipoli(oxi-l,2- etandiil) SRU
111,7
Compusul αΖ/α-/2-//(ciclohexilcarbonimidoil)amino/etil/- omega-metoxipoli(ak7-l,2-etandiil) SRU 111,7, preparat ca în exemplul 1, se adaugă la 1 mg IFN-α//α omogen, în 200 μ\ soluție tampon de 0,1 M borat de sodiu cu pH = 9,0, în raport molar, la 10 moli reactiv per 1 mol IFN-αΖ/α. Soluțiile se amestecă rapid și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min.
Cantitatea de derivatizare (sau pegilare) a IFN-αΖ/α este estimată prin electroforeză de gel cu SDS-poliacrilamidă (SDS- PAGE), așa cum se arată în tabelul 1, alăturat Proteinele sunt vizualizate prin colorare cu Coomasie Blue. Analiza produselor, după 60 min de reacție, arată specii noi de proteine, cu greutate moleculară înaltă, corespunzând la conjugatul de PEG-IFN- alfa conjugat ÎFN-alfa are o greutate moleculară aparentă de 15 kD prin SDS-PAGE. IFN-alfa nemodificat, a cărui greutate moleculară aparentă rămâne neschimbată, este astfel neconjugat cu PEG. Produsul IFN-alfa -PEG modificat are o greutate moleculară aparentă de 28 kD.
Tabelul I
Modificarea alfa-interferonului alfa-IFN cu reactivul descris în exemplul 1
Greutate Proteine totale
moleculară aparentă din reacție,
a proteinei IFN (kD) %
15 (nemodificat) 80
28 20
Exemplul l.Prepararea interleukinei2 recombinate (rIl-2) conjugată cu PEG cu ajutorul reactivului alfa-/2- H(ciclohexilcarbonimidoil-amino/etill-omega-metoxipoli(oxi-l,2- etandiil) SRU 111,7
Compusul a//a-/2-//(ciclohexilcarbonimidoil/amino/etil/- omega- metoxipoli(oxî-l,2-etandiil) SRU 111,7, preparat conform exemplului 1, este adăugat la 2 mg de rIl-2 în 200 μΐ soluție tampon (borat de sodiu 0,1 M, pH=9,0), într-un raport molar de 10 moli reactiv per mol de rIl-2. Soluțiile sunt bine amestecate și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min.
Cantitatea de derivatizare (sau pegilare) a proteinei este estimată prin SDSPAGE (tabelul II). Proteinele sunt vizualizate prin colorare cu Coomassie Blue. Analiza produselor obținute din reacție după 60 min, prezintă noi specii de proteine cu greutate moleculară mai ridicată, corespunzând produselor conjugate PEG- rÎL-2. Compusul rIL-2 are o greutate moleculară aparentă de 15 kD determinată prin SDS-PAGE. Compusul rIL-2 nemodificat este proteina separată din amestecul de reacție a cărei greutate moleculară rămâne neschimbată și de aceea nu este conjugată cu PEG. Com pusul predominant PEG-modificat rIL-2 are o greutate moleculară aparentă de
Tabelul II Modificarea compusului rIL-2 cu reactivul descris în exemplul 1
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-2 (kD) Proteine totale din reacție, %
15 (nemodificat) 2Jd
28 50
33 20
43 10
Compusul rEL-2 pegilat este purificat din amestecul de reacție, așa cum se menționează în Katre ș.a., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 84:1483-1491, (1991), utilizându-se cromatografia de schimb hidrofic (Bio-Rad; Biogelfenil 5-PW). Un gradient linear cu o descreștere în sare de la 1,53 la 0,0 M (NH4)2SO4 în 50 mM fosfat de sodiu la pH=7,0 în 30 min, s-a folosit pentru a separa compusul PEG-modificat și rIL-2 nemodificat Porțiuni alicote din aceste fracțiuni se evaluează prin SDS-PAGE și fracțiunile marcate sunt analizate pentru determinarea activității lor specifice într-o analiză de proliferare a celulelor CTLL, prin metoda descrisă de Gillia ș.a., J.Immunology 120: 2027-2032, (1978). Concentrațiile de proteine sunt determinate spectrofotometric la 280 nm, folosind un coeficient de extincție de 0,667 pentru rIL-2. Activitatea specifică a proteinelor izolate rIL-2este exprimată ca unități/mg de proteină și rezultatele sunt prezentate în tabelul III. Se pare că activitatea specifică a rIL-2 nu este semnificativ alterată prin conjugare cu PEG.
Tabelul IU
Bioactivitatea compusului rIL-2 conjugat cu PEG cu reactivul descris în exemplul 1 (continuare tabelul ΠΙ)
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-2 (kD) Activitatea specifică unită ti/mp
15 (nemodificat) 28 2,0 x ΙΟΖ 2,4 x IO7
Exemplul 4. Prepararea 1-alfa-interleukină recombinată (rIL-1- alfa) conjugată cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/2- //(ciclohexilcarbonimidoillamino/etil/-omega-metoxipoli(oxi-1,2- etandiil) SRU 111,7
Reactivul descris în exemplul 1 este adăugat la 2,0 mg de rIL-l-a//a omogen în 1,0 ml soluție de borat de sodiu 0,1 M, la pH =9,0, într-un raport molar de 10 moli reactiv per un mol rlL-1-alfa. Soluția se amestecă temeinic și reacția de pegilare este lăsată să decurgă la temperatura camerei, timp de 60 min.
Cantitatea de derivatizare (sau pegilare) a proteinei a fost estimată prin SDS-PAGE (tabelul IV). Proteinele s-au vizualizat prin colorare cu Coomassie Blue. Analiza produselor după 60 min de reacție arată noi specii de proteine, cu greutate moleculară mai mare, care corespund la proteina rIL-l-^//ă conjugata cu PEG. rIL-l-o/p prezintă o greutate moleculară aparentă de 17 kD prin SDS-PAGE. Compusul rIL-W/h este o proteină din amestecul de reacție a cărui greutate moleculară aparentă rămâne neschimbată și deci nu este conjugată cu PEG. Produsul PEG-rlL-l-a/fa nemodificat are o greutate moleculară aparentă de 30 kD.
Tabelul IV
Modificarea produsului rIL-1-alfa cu reactivul descris în exemplul 1
Greutate moleculară Proteine totale
aparentă a proteinei din reacție,
rIL-l-«//a(kD) %
17 (nemodificat) 85
30 15
Exemplul 5. Prepararea compusului alfa -/(l,2-dihidro-2-oxo-l- piridinil)-tiocarbortil/- omega- m etoxipoli (oxi-1,2- etandiil) SRU 111,7
Dintr-o soluție de 1 g (0,2 mmol) MPEG (metoxipolietilenglicol) cu greutate moleculară 5000, în 15 ml toluen uscat s-au distilat 5 ml solvent Soluția rezultată este răcită și se adaugă 46,5 mg (0,2 mmol) de 1,1-carbonotioilbis2(H)-piridinonă. Amestecul este apoi refluxat în atmosferă de argon, timp de
h. Solventul este apoi îndepărtat sub vacuum și reziduul este dizolvat în 5 ml glim uscat și este lăsat în repaus până a doua zi. Precipitatul astfel rezultat este filtrat și spălat de două ori cu câte ml glim uscat și 5 ml dietileter. Produsul se usucă apoi în vid în cuptor, sub un curent slab de hidrogen, pentru a se obține o cantitate de 0,96 g «//«-/(1,2-di hidro-2O»-l-piridinil)-tiocarbonil/-omega- metoxipoli(ari-l,2-etandiil) SRU 111,7.
Analiză:calculat pentru C9H11NO3 S(CH2CH2O) 111,7: C 54,37; H 8,99; N 0,27; S 0,62; găsit: C 54,03; H 8,98; N 0,18; S 0,59.
Exemplul Sa. Prepararea compusului alfa- l(l,2-dihidro-2-oxo-l- piridinil)-tiocarbonil/- omega-metoxipoli (oxi-1,2- etandiil) SRU 225
Prin procedeul descris în exemplul 5, MPEG (metoxipolietilenglicol) cu greutate moleculară 10000 se transformă în alfa -/(l,2-dihidro-2-<m> -1 -piridinil) - tiocarbonil/- omegiz-metoxipoli (oxi-1,2etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C9H11NO3S (CH2CH2O)225: C 54,54; H 9,08; N 0,14; S 0,32; găsit: C 54,38; H 9,16; N 0,15; S 0,13.
Exemplul 6. Prepararea antagonistului receptor interleukin-1 (IL-lra) conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa/(1,2- dihidro-2-oxo-1 -piridinil)-tiocarbonil/- om ega-metoxipoli (oxi-1,2- etandiil) SRU 111,7
Compusul alfa-/(l,2-dihidro-2-oxo1-piridinil)- tiocarbonil/-€>megii-metoxipoli(ori-l,2-etandiil) SRU 111,7 preparat conform exemplului 5, se adaugă la 10 mg IL-lra omogen în 1 ml soluție tampon (soluție de borat de sodiu 0,1 M,pH=9,0), într-un raport molar de 5 moli reactiv per 1 mol IL-lra. Soluția este amestecată total și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min.
Cantitatea de derivatizare (sau pegilare) a proteinei este estimată prin SDSPAGE (tabelulV). Proteinele sunt vizualizate prin colorare cu Coomassie Blue. Analiza produselor după 60 min de reacție arată noi specii de proteine, cu greutate moleculară mai înaltă, corespunzând la proteină IL-lra conjugată cu PEG. Produsul IL-lra prezintă o greutate moleculară aparentă de 19 kD prin SDS-PAGE. IL-lra nemodificată este proteina din amestecul de reacție a cărei greutate moleculară aparentă rămâne neschimbată și deci nu este conjugată cu PEG.
Proteinele PEG-IL-lra modificat prezintă greutăți moleculare aparente de la 26 la 33 kD.
Tabelul V Modificarea IL-lra cu reactivul descris în exemplul 5
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) Total proteine din reacție, %
19 (nemodificat) 36
26 33
33 21
>33 10
Compusul IL-lra pegilat este purificat din amestecul de reacție, utilizându-se cromatografia cu schimb hidrofobic (BioRad; HRLC MP7 HIC). Se folosește un gradient linear cu concentrații de sare descrescătoare de la 0,43 la 0,0M (NH4)2 SO4 în 50 mM fosfat de sodiu, pH=7,0, în 20 min, pentru a separa IL-lra pegilat de IL-lra nemodificat. Se evaluează porțiuni alicote din fracțiuni prin SDS-PAGE și fracțiunile comasate sunt analizate într-un radioreceptor cu experiment obli109543 gatoriu de competiție. (Kilian s.a., J. Immunol., 136, 5409-4514, (1986)). Pe scurt, IL-lra și PEG-IL-lra sunt incubate la concentrații care variază, cu membrane EL-4, timp de 30 min. U 37°C. Este apoi adăugat compusul /1/ IL-1alfa și incubația este continuată timp de 30 min. Analiza este terminată prin filtrare sub vacuum și colectarea de /1Z>I/IL-1 cu celule legate, pe plăci de filtrare. Concentrația compusului IL-lra sau PEG-IL-lra care inhibă legarea compusului /125I/IL-1 50% (IC50) este determinată grafic. Rezultatele sunt prezentate în tabelul VI. Valorile pentru IC50 ale IL-lra, în această analiză, sunt de 1...2,0 ng/ml. Amestecul IL-lra pegilat își menține capacitatea de a se lega la receptorul IL-1 pe membrane EL-4 în cadrul unui factor 2 până la 3 relativ înfășurat la IL-lra nemodificat
Tabelul VI
Inhibarea compusului rHIL-1 legat prin IL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 5
Greutatea moleculară aparentă a proteinei IL-lra IC50 (ng/ml)
19K (nemodificat) 2,0
26K, 33K (amestec) 5.0
Farmacodinamia proteinei IL-lra este evaluată -in vivo- prin abilitatea compusului IL-lra de a inhiba inducția rIL-1alfa a interleukinei-6. Serul de șoareci tratat cu rîL-1-alfa conține nivele înalte de IL-6 (Mclntosh ș.a., Immunol. 143: 162-167, (1989)). Administrarea de compus IL- lra nemodificat împreună cu IL-1-alfa (punctul de timp ora zece) inhibă inducția de IL-6. Acest sistem de testare este utilizat pentru compararea proprietăților farmacodinamice ale compusului IL-lra nemodificat și IL-lraPEG. Grupuri de trei femele șoareci C57B1/6 sunt injectate subcutan cu 200 pg de compus IL-lra nemodificat sau PEG-IL-lra cu 48 h, 24 h sau 6 h înainte sau simultan (ora 0) cu 0,2 pg rîL-l-alfa. Trei ore mai târziu se colectează probele de serum. Nivelele (unitățile) IL-6 sunt determinate folosind o modificare a analizei IL-6, care este descrisă în Van Snick ș.a., Proc. Natl Acad Sci. USA 83:96199683, (1986). în analiza IL-6, celulele hibridome sunt tratate cu două diluții seriale ale serului de testare pe plăci de microtitrare cu 96 canale. După a treia zi de incubare la 37°C, într-o atmosferă umidificată cuprinzând 5% CO2 și 95% aer, în canale se mai adaugă 0,5 uCi timidină tritiată și se incubează încă 18 h. Celulele sunt apoi recoltate pe filtre de fibre de sticlă și nivelul de încorporare a timidinei tritiat este determinat prin numărarea scintilațiilor. Activitatea compusului IL-6 este exprimată în U/ml. Unitățile de IL-6 sunt definite ca inversul diluției de ser car produce încorporarea timidinei tritiat în comparație cu standardul de referință.
Datele farmacodinamice sunt prezentate în tabelul Dl. Șoarecii tratați numai cu compusul IL-1 prezintă o valoare de 28852 U/ml IL-6. Ambii compuși IL-lra modificat și nemodificat inhibă inducția compusului IL-6 la 0 h. Totuși, compusul IL-lra pegilat a demonstrat un efect inhibitor prelungit IL-6, comparat cu IL- lra nemodificat la 8 h și la 24 h după administrare.
Tabelul Dl Profilul farmacodinamic al compusului IL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 5
Timp (h) înainte de administrarea compusului IL-1 IL-6 unități/ml
19 kD 26 kD
0 772 705
6 8361 1587
24 22525 9844
48 18485 21119
72 13220 21470
Exemplul 6A. Prepararea antagonistului receptor interleukină-1 (IL-lra) con109543 jugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/(1,2- dihidro-2-oxo-l-piridinil)-tiocarbonill-omega-metoxipoli (oxi-1,2- etandiil) SRU 225
Compusul IL-lra este conjugat și purificat conform procedeului ilustrat în exemplul 6, utilizându-se reactivul descris în exemplul 5a.
Proteinele IL-lra PEG-modificat predominante au greutățile moleculare aparente de 33 kD și 48 kD. Proteinele cu 33 kD și 48 kD au fost găsite în 46 și 27% din proteinele totale ale amestecului de reacție, respectiv.
Capacitatea acestor proteine de a inhiba legarea IL-1, așa cum este descris în exemplul 6, este prezentata în tabelul VII. Proteinele PEG modificate cu 33 kD rețin capacitatea de inhibare a legării IL-1 relativ de 6 ori față de ILl-ra și o modificare mai extensivă a proteinei cu PEG, așa cum se observă cu această proteină cu 48 kD are ca rezultat o pierdere substanțială în legătura acesteia cu receptorul IL-1.
Tabelul VII Inhibarea legării compusului r^I/IL-l prin proteine IL-lra conjugate cu reactivul descris în exemplul 5a
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 1,6
33 9,0
48 50,0
Pentru determinarea profilului farmacocinetic al speciilor PEG- IL-lra, la 6 șoareci de tipul C57BF, se administrează 100 /zg specii modificate sau pegilate de IL-lra, subcutanat Probele de serum se colectează după 1, 2, 3, 4 și 6 h, după ce șoarecii au primit IL-lra nemodificat și după 2, 4, 8, 10 și 24 h, după ce șoarecii au primit PEG-IL-lra. Nivelele serice sunt determinate prin analiza membranei de legătură EL 4, așa cum este descris în exemplul 6.
Datele obținute simt prezentate în tabelul D2. Compusul PEG-IL-lra este detectabil în probele de serum la concentrații mai ridicate și pentru un timp prelungit de comparație cu IL-lra care demonstrează un timp seric prelungit
Tabelul D2 Profilul farmacocinetic al compusului IL-lra pegilat ca în exemplul 6a
Timp (h) după administrare! Concentrația de ser a compusului IL-lra2
19 kD 33 kD
1 400
2 130 2500
4 40
6 15 800
8 16
10 300
24 250 ÎS
Exemplul 7. Prepararea compusului rlL-l-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(l,2-dihidro-2-oxo-lpiridinil)- tiocarbonilf-omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
Recombinatul IL-l-alfa este pegilat cu reactivul descris în exemplul 5, prin metoda descrisă în exemplul 4. Cele trei specii cu greutate moleculară predominantă, din amestecul de reacție, sunt identificate prin SDS-PAGE, cu greutăți moleculare evidente corespunzătoare la valorile 17 (nemodificat), 26 și 33 kD. Ultimile două proteine pegilate se referă la 25 și 55% din proteina totală, respectiv.
Compusul rlL-l-alfa pegilat este purificat din amestecul de reacție după 60 min, folosind cromatografie de schimb hidrofobic (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC). Un gradient linear cu o concentrație de sare descrescătoare de la 0,43 până la 0,0 M (NH4)2SO4 în 50 mM soluție fosfat desodiupH=7,0 în 20 min, se folosește pentru a separa compusul rIL-1-alfa pegilat și rîL-l-alfa nemodificat Porțiuni alicote din aceste fracțiuni se evaluează prin SDS-PAGE și fracțiunile comasate sunt analizate pentru activitatea specifică prin încercări de proliferare a celulelor D10, prin metoda descrisă de Kaye ș.a., J. Exp. Med. 158:336- 854 (1983). Concentrațiile de proteine sunt determinate spectrofotometric la 280 nM folosind un coeficient de extincție de 1,0 pentru rIL-l-tf//h. Activitatea specifică a compusului rîE-l-alfa este aproximativ 1,0 x 108 unități/mg. Rezultatele activității specifice sunt prezentate în tabelul VIII. Compusul VL-1-alfa pegilat de 26 kD reține bioactivitate între 2 și 3 ori față de compusul IL-1-alfa. O modificare în continuare, rezultă în proteina 33 kD la care apare o pierdere substanțială a bioactivității.
Tabelul VIII Bioactivitatea compusului rIL-1-alfa conjugat cu reactivul descris în exemplul 5
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-1 -alfa (kD) Activitatea specifică, unită ti/me
17 (nemodificat) 26 33 4,6 x 10? 1,9 x 10? 4,5 x IO6
Exemplul 8. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul compusului alfa-!(l,2-dihidro-2-oxo-l- piridin il)- tiocarbonil/- om ega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
Compusul «Zfa-/(l,2-dihidro-2-oxo1-piridinil)- tiocarbonil/- omega-metoxipoli(oxz-l,2-etandiil) SRU 111,7 preparat conform exemplului 5, se adaugă la 1 mg de compus IFN-«Z/α în 100 μ\ soluție tampon (soluție de borat de sodiu 0,lM, pH=9,0) în raport molar de 8 moli reactiv PEG per 1 mol IFN-flZ/h. Soluțiile sunt amestecate temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se efectueze la temperatura camerei, timp de 60 min.
Speciile cu greutate moleculară predominantă din amestecul de reacție, sunt identificate prin SDS-PAGE, cu greutăți moleculare aparente de 15 (nemodificat) și 20 kD. S-a găsit proteină pegilată 28 kD până la 40% din proteina totală. Compusul IFN- alfa pegilat este purificat din amestecul de reacție, după 60 min, și este caracterizat folosind cromatografie de schimb hidrofobic (Bio-Rad; Biogel-fenil-PW). Un gradient linear cu concentrații de sare descrescătoare de la 0,42M până la 0,0 M (NH4)2SO4 mM în 50 mM fosfat de sodiu pH=7,0, timp de 20 min, este folosit pentru a separa IFN-alfa pegilat și IFN-alfa nemodificat Porțiuni alicote ale acestor fracțiuni sunt evaluate prin SDS-PAGE și fracțiunile marcate sunt analizate pentru activitatea antivirală (activitate specifică) prin analiza MDBK cu metoda descrisă de Familletti ș.a., MetodsEnzym. 75,387-394 (1987).
Concentrațiile de proteină sunt determinate spectrofotometric la 280 nM, folosind un coeficient de extincție de 1,0 pentru 1 mg/ml soluție tamponată de IFN-alfa. Activitatea specifică a proteinelor izolate este exprimată în unități per mg proteină și rezultatele sunt prezentate în tabelul IX.
Rezultatele arată că activitatea specifică a compusului IFN- alfa pegilat cu 28 kD nu este semnificativ alterată în raport cu IFN-alfa.
Tabelul IX Bioactivitatea compusului IFN-alfa conjugat cu reactivul din exemplul 5
Greutate moleculară aparentă a proteinei IFN-a/fa (kD) Activitatea specifică, unită ti/me
15 (nemodificat) 28 1,1 x io? 1,4 x IO8
Exemplul 3A. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(l,2-dihidro-2-oxo-l-piridinil)- tiocarbonil/- omega-metoxipoU (oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Compusul IFN-alfa este pegilat ca în exemplul 8, cu reactivul descris în exemplul 5a. Trei specii cu greutate moleculară predominantă din amestecul de reacție, la 60 min, sunt identificate prin SDS-PAGE, cu greutăți moleculare aparente corespunzând la 15 (nemodificat), 35 și 43 kD. Ultimile două proteine pegilate au fost găsite în proporție de 33% și 35% din proteinele totale în amestecul de reacție, respectiv.
Activitățile specifice, determinate prin procedurile descrise în exemplul 8, ale speciilor pegilate de IFN-aZ/h, sunt prezentate în tabelul X Rezultatele arată că produsul IFN- alfa pegilat 35 kD reține activitatea biologică de 2...3 ori a compusului IFN -alfa. Conjugatul 43 kD pierde substanțial din activitate.
Tabelul X Bioactivitatea compusului IFN-alfa conjugat cu reactivul din exemplul 5a
Greutate moleculară Activitatea
aparentă a proteinei specifică,
IFN-fl/fa (kD) unități/mg
15 (nemodificat) 35 3,3 x 10^ 1,2x10°
43 1,5 x 10'
Exemplul ^.Prepararea compusului rIL-2 conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/(l,2-dihidro-2-oxo- 1-piridinil)- tiocarbonil/-omega-metoxipoli(oxi-
1,2-etandiU) SRU 111,7
Compusul rIL-2 este pegilat cu reactivul descris în exemplul 5 și purificat folosind procedeul descris în exemplul
3.
Speciile cu greutate moleculară predominantă din amestecul de reacție, după 60 min, sunt identificate cu SDS-PAGE, cu greutăți moleculare aparente de 15 (nemodificat) și 25 kD. Proteina pegilata 25 kD a fost găsită în proporție de 60% din proteinele totale din reacție.
Activitatea specifică a proteinelor izolate rIL-2 este măsurată așa cum s-a descris în exemplul 3 și este exprimată în unități/mg proteină și rezultatele sunt totalizate în tabelul XI.
Așa cum se vede din tabelul XI, activitatea biologică a compusului IL-2 nu este alterată după conjugarea cu PEG.
Tabelul XI Bioactivitatea compusului rIL-2 conjugat cu PEG, cu reactivul descris în exemplul 5
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-2 (kD) Activitatea specifică, unități/mg
15 (nemodificat) 25 2,0 x IO7 2,0 x IO7
Exemplul 8C.Prepararea compusului rIL-2 conjugat cu PEG, prin intermediul reactivului alfa- /(l,2-dihidro-2-oxo-l-piridinil)- tiocarbonil/- omega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Compusul 2IL-2 este pegilat, folosind procedeul descris în exemplul 3, cu reactivul descris în exemplul 5a.
Speciile cu greutate moleculară aparentă din amestecul de reacție, după 60 min, sunt identificate prin SDS-PAGE, cu greutăți moleculare de 15 kD (nemodificat), 33 kD și 43 KD. Proteinele pegilate 33 și 43 kD s-au găsit în proporție de 60 și 20% din proteina totală în reacție, respectiv.
Exemplul 9. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEGprin intermediul reactivului alfa- /(l,2-dihidro-2-oxo-l- piridinil)- tiocarbonil/-omega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
O metodă alternativă pentru conjugarea compusului IFN-«Z/â cu PEG este dată, după cum urmează: compusul IFNalfa, în cantitate de 5 mg în 1 ml, este dializatcu un amestec tampon, conținând acetat de sodiu 5 mM, pH=5,0, NaCl 120 mM. La soluția de proteină dializată, se adaugă tiocianat de potasiu solid, pentru a se obține o concentrație finală de sare de 0,5 M și pH-ul se ajustează prin adăugare de o zecime din volumul de 1 M tricină-hidroxid de sodiu, pH =
11,9, pentru a da în final o soluție cu pH=10,0. Alfa-/(1,2-dihidro-2- oxo-1-pi109543 ridinil)-tiocarbonil/ -omega- metoxipoli (o.ri-1,2- etandiil) se adaugă la probă la un raport molar de 3 moli de reactiv la 1 mol proteină. Reacția de modificare este lăsată să se efectueze la temperatura camerei timp de 30 min și este stopată prin adăugarea de glicină IM, pH=6,3 la o concentrație finală de 20 mM. Proteina modificată este precipitată din soluție, prin adăugare de amestec tampon conținând sulfat de amoniu 3,5 M, fosfat de sodiu 50 mM,pH=7,0 până la o concentrație finală de sulfat de amoniu 1,1 M și precipitatul colectat prin centrifugare (10000xg, timp de 12 min). După clătirea peletelor cu o soluție tampon conținând sulfat de amoniu 1,1 M, fosfat de sodiu 50 mM, pH=7,0, peletele se redizolvă într-o soluție tampon conținând acetat de amoniu 25 mM, pH=5,0. Proteina modificată cu PEG este purificată și caracterizată, așa cum este descris în exemplul 2. Este obținută o singură specie de IFN pegilată, cu o greutate moleculară aparentă de 28 kD. Activitatea antivirală (activitatea specifică) a proteinei modificate este determinată prin procedeul descris în exemplul 8. Activitatea specifică, a compusului IFN-alfa, inițial, a fost
2,6 x 10° U/mg și activitatea specifică a compusului IFN-a//a, conjugat cu PEG, a fost 1,0 x 10° U/mg, demonstrând că IFN-alfa, conjugat cu PEG, a reținut activitatea biologică de 4 ori față de IFN-a//a.
Exemplul 10. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/(l,2-dihidro-2-oxo-l- piridinil)-tiocarbonil/- omega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Compusul IFN-alfa este conjugat cu PEG conform procedeului descris în exemplul 9. Proteinele sunt purificate și caracterizate, așa cum s-a descris în exemplele 2 și 9. Compusul inițial IFNalfa are o activitate specifică de 2,6 x 10° U/mg, folosind IFN-alfa conjugat cu PEG care are o greutate moleculară aparentă de 31 kD și o activitate specifică de 1,0 x 10° U/mg, așa cum s-a descris în exemplul 8. Bioactivitatea compusului IFN^/fa conjugat a fost de 3 ori față de cea a compusului IFN-alfa.
Exemplul 11. Prepararea compusului alfa-metil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/ etoxi/poli (oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
Dintr-o soluție de 1 g (0,2 mmol) de compus alfa-(2- aminoetil)-omega-metoxipoli(ori-l,2-etandiil) SRU 111,7 (preparat ca în exemplul IC) în 40 ml CH2CI2 uscată, se distilează 15 ml solvent La soluția rezultată, la 0°C, se adaugă apoi 65 mg (0,3 mmol) carbonat de dz-2-piridil și amestecul se agită încă 4 h. Solventul este apoi îndepărtat sub presiune redusă și reziduul se triturează cu dietileter. Precipitatul se filtrează, apoi se spală cu 50 ml eter, urmat de 50 ml hexan. Produsul este apoi uscat într-un cuptor sub vacuum, sub un curent ușor de azot, obținându-se 1 g de a/fa-metil-omega-/2-//(2-piridiniloxi)- carbonil/amino/etoxi/poli (ori-1,2etandiil) SRU 111,7, sub formă de pulbere albă.
Analiză: calculat pentru C9H12N2O3 (CH2CH2O) 111,7: C54,56; H 9,04; N 0,55; găsit C 54,26; H 9,00; N 0,53.
Exemplul 11a. Prepararea compusului alfa-metil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/aminol etoxi/poli (oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Prin procedeul descris în exemplul 11, compusul alfa-(2- aminoetil)-omegametoxipoli (ari-l,2-etandiil) SRU 225, (preparat ca în exemplul lc) este transformat în compusul αΖ/α-me ti 1-omega/2- //(2-piridiniîoxi)- carbonil/ amino/ etoxi/poli(ori-l,2-etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C9H12N2O3 (CH2CH2O)225: C 54,54; H 9,10; N 0,28; găsit: C 54,49; H 9,27; N 0,31.
Exemplul 11b. Prepararea compusului alfa-metil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etoxi/poli(oxi-l,2-etandii l) SRU 28,3
Prin procedeul descris în exemplul
11, compusul alfa-(2- aminoetil)-omegametoxipoli (oxi-1,2-etandiil) SRU 28,3 (preparat ca în exemplul lf) este convertit la compusul o^i-metil-i>mega-/2-//(2-piridiniloxi)- carbonil/-amino/ etoxi? poli(ari-l,2-etandiil) SRU 28,3.
Analiza: calculat pentru C9H12N2O3 (CH2CH2O)28,3: C 54,61; H 8,75; N 1,94; găsit: C 54,67; H 8,96; N 1,63.
ExempluI12. Prepararea compusului IL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/ 2-//(2-piridiniloxi)- carbonil/amino/ etoxilpoli(oxi-
1,2-etandiil) SRU 111,7
Compusul αΖ/α-metil-omega- /2-//(2piridiniloxi)- carbonil/amino/ etoxi/poli (oxz-l,2-etandiil) SRU 111,7 este adăugat la 25 mg compus IL-lra purificat în 2,5 ml soluție tampon (borat de sodiu 0,1 M, pH=9,0), într-un raport molar de 1 mol reactiv per 1 mol IL-lra. Soluțiile se amestecă temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se efectueze la temperatura camerei, timp de 60 min. Compusul ILra modificat cu PEG este apoi purificat, conform procedeului efectuat în exemplul 6.
Produsele pegilate, predominante, din reacția de 60 min, prezintă greutăți moleculare aparente de 28 kD și 38 kD, în proporție de aproximativ 42 și 29% din proteinele totale ale amestecului de reacție, respectiv.
Capacitatea proteinelor IL-lra purificate din amestecul de reacție de a inhiba legarea IL-1 este determinată, așa cum s-a descris în exemplul 6 și este prezentată în tabelul XII. Proprietățile de legare ale produsului cu 28 kD nu au fost semnificativ alterate și capacitatea de legare a proteinei cu 38 kD a reținut activitatea compusului IL-lra de 5 ori.
Tabelul XII
Inhibarea legării compusului r^H-IL-l prin proteina IL-lra pegilată cu reactivul descris în exemplul 11 (continuare tabelul XII)
1 2
19 (nemodificat) 2,0
28 3,0
38 10,0
Profilul farmacodinamic al compusului PEG-IL-lra este determinat așa cum s-a descris în exemplul 6. Datele sunt totalizate în tabelul D3. Compusul IL-1 singur a indus 27283 u/ml din IL-6. Compusul IL-lra nemodificat a inhibat mai puțin de 50% de IL-1 (răspunsul acestuia) în timp de 6 h de la administrare, în contrast, compusul PEG-IL-lra așadar, mai puțin activ în primele perioade de timp, este mult mai activ la 24 și la 48 h de la injectare. Astfel, compusul PEG-IL-lra a manifestat un profil farmacodinamic prelungit
Tabelul D3 Profilul farmacodinamic al compusului IL-lra conjugat, cu reactivul descris în exemplul 11
Timp (h) înainte de administrarea IL-1 IL-6 unități/ml
19 kD 26 kD
0 4789 23806
6 15324 10833
24 24841 5727
48 16348 9364
72 12067 12054
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
1 2
Exemplul 12A Prepararea compusului I\-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)-carbonil/amino/etoxi/poli(oxi-lf 2-etandiil) SRU 225
Compusul alfa-vae\i\-omega-j2.- //(2piridiniloxi)- carbonil/amino/ etoxi/poli (oxz-1,2-etandiil) SRU 225, (descris anterior în exemplul 11a) se adaugă la 25 mg IL-lra purificat, în 2,5 ml soluție tampon (borat de sodiu 0,1 M, pH=9,0) într-un raport molar de 4 moli reactiv per 1 mol IL-lra. Soluțiile sunt amestecate temeinic și reacția este lăsată să se efectueze la temperatura camerei, timp de 60 min. Compusul IL-lra modificat cu PEG este apoi purificat, urmând procedeul descris în exemplul 6.
Produsele pegilate, predominante din reacția de 60 min, au greutăți moleculare aparente de 33 kD și 48 kD și reprezintă aproximativ 76 și 15% din proteina totală din amestecul de reacție, respectiv.
Capacitatea proteinelor IL-lra purificate din amestecul de reacție de a inhiba legarea IL-1 este prezentată în tabelul XIII. Proteina modificată cu PEG de 33 kD reține din capacitatea de inhibare a legăturii IL-1 de 8 ori față de IL-lra. Produsul 48 kD pierde substanțial din capacitatea de legare.
Tabelul XIII Inhibarea legăturii lui
P^IIIL-l de proteine IL-lra pegilate cu reactivul descris în exemplul 11a
Greutate moleculară aparenta a proteinei IL-lra ikD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 0,8
33 6,0
48 18,0
Profilul farmacocinetic al compusului PEG-IL-lra este determinat așa cum s-a descris în exemplul 6A. Datele sunt totalizate în tabelul D4. Compusul PEGIL-lra este detectabil în probele serice la concentrații mai ridicate și pentru un timp prelungit față de IL-lra.
Tabelul D4 Profilul farmacocinetic al compusului IL-lra conjugat, cu reactivul descris în exemplul 11a
Timp (h) după administrare Nivelul seric al IL-lra (ng/ml)
19 kD 33 kD
1 2 3
fcontinuai re tabelul D4)
1 2 3
1 220
2 33 700
3 13
4 5,3 500
6 1,5
8 150
10 83
24 5
Exemplul 13. Prepararea compusului rIL-2 conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-12- H(2-piridiniloxi)- carbonillaminoletoxil poli(oxi-
1,2-etandiil) SRU 111,7
Compusul rIL-2 este pegilat cu alfametil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)-carbonil/ amino/etoxi/ poli(ori-l,2-etandiil) SRU 111,7, conform procedeului menționat în exemplele 3 și 8b. Activitatea specifică a proteinei IL-2 este determinată, așa cum s-a descris în exemplul
8. Activitatea specifică a compusului rIL-2 nemodificat cu 15 kD este de 2 x 10' unități/mg și a compusului IL-2 pegilat cu 29 kD este 2,4 x IO7 unități/mg IL-2, neindicând o pierdere substanțială a activității biologice ca rezultat al pegilării.
Exemplul 14. Prepararea compusului rIL-1-alfa modificat cu PEG, conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-12- H(2-piridimloxi)- carbonilf amino/etoxil poli (oxi-1,2- etandiil) SRU
111,7
Compusul rIL-l-«//a este pegilat cu reactivul descris în exemplul 11, alfametil- omega-12- //(2-piridiniloxi)-carbonil/ amino/ etoxi/poli (acz-l,2-etandiil) SRU 111,7 conform cu procedeul menționat în exemplele 4 și 7. Cele două proteine rIL-1-ΰΖ/α pegilate, cu greutăți moleculare aparente de 28 kD și 38 kD, sunt purificate și reprezintă 50 și 25% din proteinele totale din amestecul de reacție la 60 min, respectiv.
Exemplul 15. Prepararea compusului
IFN-alfa conjugat cu PEGprin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2- H(2- piri109543 diniloxi)-carbonillamino/ etoxi/poli (oxi-
1,2-etandiil) SRU 111,7
Compusul IFN-«Z/« este pegilat cu reactivul descris în exemplul 11, alfametil-omega-/2 -//(2-piridiniloxi)-carbonil/ amino/etoxi/poH (ori-l,2-etandiil) SRU 111,7, conform procedeului menționat în exemplul 8.40% din proteină este derivatizată după 60 min și produsul are o greutate moleculară aparentă de 26 kD.
Exemplul 16. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2- U(2- piridmiloxi)-carbonil/amino/etoxil poli (oxi-
1,2-etandiil) SRU 111,7. Metodă alternativă de pegilare a IFN-alfa
Utilizând procedeul ilustrat în exemplul 9, IFN-eZ/a este conjugat cu PEG prin a/f«-metil-omeg«-/2-//(2-piridiniloxi)- caibonil/amino/ etoxi/poli(ari-l,2etandiil) SRU 111,7. Activitatea specifică a IFN-aZfe este determinată așa cum s-a descris în exemplul 8. Activitatea specifică a IFN-alfa inițial este 1,7 x 10δ U/mg și activitatea specifică a IFN- alfa conjugat cu PEG prin alfa-metil-omega/2-//(2- piridiniloxi)-carbonil/amino/etoxi/poli(o.ri-l,2-etandiil) este 0,8 x 10° U/mg, ceea ce reprezintă de 2...3 ori din cea a IPN-aZ/h.
Exemplul 17. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2-//(2- piridiniloxi)- carbonil/amino/ etoxi/poli (oxi-
1,2-etandiil) SRU 225
Utilizând procedeul ilustrat în exemplul 9, IFN-alfa este pegilat prin intermediul reactivului descris în exemplul 11a. Activitatea specifică determinată prin metoda descrisă în exemplul 8 a IFN-«Z/îî conjugat cu PEG este 0,4 x 10° U/mg, demonstrând nici o pierdere semnificativă a bioactivității.
Exemplul 18. Prepararea compusului alfa- /(2- piridiniloxi)carbonil/ omega-metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
Dintr-o soluție de 1 g MPEG, cu greutate moleculară 5000 dizolvat în 30 ml CH2CI2 uscată, se distilează 10 ml solvent Soluția este răcită la temperatura camerei și se adaugă 132 mg (0,6 mM) carbonat de <fi-2-piridil și 4 mg DMAP. Soluția rezultată este apoi agitată timp 5 de 14 h și solventul se îndepărtează sub vacuum. Reziduul este triturat cu eter dietilic și precipitatul rezultat se filtrează. Produsul este apoi dizolvat în 7 ml glim uscat, încălzit pentru a facilita 10 dizolvarea și soluția rezultată este lăsată să se răcească și se menține la temperatura camerei câteva ore. Precipitatul rezultat este apoi filtrat și spălat cu 2 x ml glim uscat Solidul se usucă apoi 15 într-un cuptor sub vacuum și sub un curent de azot, ob-ținându-se 0,7 g «//«/(2-piridiniloxi)carbonil/- omega -metoxipoli (eri-l,2-etandiil) SRU 111,7.
Analiză: calculat pentru C9H11NO4 20 (CH2CH2O) 111,7: C 54,57; H 9,02; N 0,28;
găsitC 54,51; H 9,19; N 0,28.
Exemplul 18a. Prepararea compusului alfa-/(2- piridiniloxi)carbonil/-omegametoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Prin procedeul descris în exemplul 18, metoxipolietilenglicolul (MPEG), cu greutate moleculară 10000, este transformat în alfa- /(2-piridiniloxi) carbonil/omega- metoxipoli (ori-l,2-etandiil) SRU 30 225.
Analiză: calculat pentru C9H11NO4 (CH2CH2O)225: C 54,54; H 9,08; N 0,14; găsit: C 54,54; H 9,12; N 0,11.
Exemplul 19. Prepararea compusului 35 IL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/(2-piridmiloxi)carbonil/omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Compusul IL-lra este pegilat cu al40 fa-/(2- piridiniloxi)carbonil/-<?meg«-metoxipoli (oxz-l,2-etandiil) SRU 111,7 prin procedeul descris anterior în exemplele și 12. Produsele pegjlate predominante au greutăți moleculare aparente de 26 kD și 33 kD și reprezintă aproximativ și 57% din proteina totală din amestecul de reacție de 60 min, respectiv.
Capacitatea proteinelor IL-lra purificate din amestecul de reacție de a inhiba legarea IL-1 este determinată așa cum se descrie în exemplul 6 și totalizată în tabelul XIV. Conjugatul IL-lra pegilat de 26 kD reține capacitatea sa de legare de 4 ori din IL-lra. Conjugatul de 33 kD își pierde activitatea de legare semnificativă, așa cum s-a indicat prin scăderea de 15 ori din activitatea de legare competitivă.
Tabelul XIV Inhibarea legării compusului tl/IL-lde proteinele ILlra pegilate cu reactivul descris în exemplul 18
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 2,0
26 8,0
33 30,0
Exemplul 19a. Prepararea compusului IL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- !(2-piridiniloxi) carbonil /- omega-metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Compusul IL-lra este pegilat cu alfa -/(2- piridiniloxi)carbonil/-c>megi7 -metoxipoli(aa-l,2- etandiil) SRU 225, conform procedeului menționat în exemplul
19. Produsele pegilate predominante din amestecul de reacție de 60 min au greutăți moleculare aparente de 33 kD și 48 kD și reprezintă aproximativ 47 și 25% din proteina totală din amestecul de reacție, respectiv.
Capacitatea proteinelor IL-lra purificate, din amestecul de reacție, de a inhiba legarea lui IL-1, este determinată așa cum s-a descris în exemplele 6 și 12 și totalizată în tabelul XV. Proteina cu 33 kD reține activitate de 6 ori din cea a IL-lra. Conjugatul cu greutate moleculară mai mare pierde semnificativ din activitate.
Tabelul XV Inhibarea legării / I/IL-lde proteinele ILlra pegilate cu reactivul descris în exemplul 18a
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 1,5
33 9,0
48 40,0
Profilul farmacocinetic al compusului PEG-IL-lra este determinat așa cum s-a descris în exemplul 6A. Datele sunt totalizate în tabelul D5. Compusul PEGIL-lra este detectabil în probele de serum un timp prelungit, comparat cu compusul IL-lra nemodificat, demonstrând un timp de înjumătățire prelungit Profilul farmacodinamic al compusului PEG-IL-lra este determinat, așa cum s-a descris în exemplul 6, cu excepția că se administrază 0,05 /ig de compus rIL-1. Datele sunt totalizate în tabelul D6. Răspunsul numai la compusul IL-1 este de 9203 unități/ml IL-6. Un efect inhibitor prelungit, comparat cu IL- lra nemodificat, poate fi văzut la 72 h după administrarea compusului PEG-IL-lra, demonstrând proprietăți farmacodinamice îmbunătățite. In colectiv, aceste date ilustrează că, chiar dacă o proteină pegilată și-a diminuat activitatea in vitro, ea poate sa aibă proprietăți farmacodinamice îmbunătățite in vivo.
Tabelul D5 Profilul farmacocinetic al compusului IL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 18a
Timp (h) Serul IL-lra (mg/ml)
după administrare 19 kD 33 kD
1 580
2 75 100
3 30
4 30 60
6 8
8 12
10 17
24 10
Tabelul D6 Profilul farmacodinamic al compusului IL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 18
Timp (h) înainte de adminis-trarea IL-1 IL-6 (unități/ml)
19 kD 26 kD
0 521 454
6 2334 416
24 13485 2552
48 16577 4667
72 12800 5148
Exemplul 20. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(2-piridimloxi) carbonil /- omega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Reactivul «Z/«-/(2-piridiniloxi)carbotÂIl-omega- metoxipoli(ftu-l,2-etandiil) SRU 111,7 esteadăugatla 1 mg de compus IFN-aZ/fl în 200 ml soluție tampon (borat de sodiu 0,1 M,pH=9,0) într-un raport molar de 10 moli reactiv per mol de IFN-îz//h. Soluțiile se amestecă temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se efectueze la temperatura camerei, timp de 60 min. Compusul IFN-alfa modificat cu PEG, purificat, este apoi obțint conform procedeului menționat în exemplul 8.36% din proteină se derivatizează astfel și produsul are o greutate moleculară de 28 kD.
Activitatea specifică a proteinelor IFN purificate din amestecul de reacție este determinată așa cum s-a descris în exemplul 8 și valorile sunt totalizate în tabelul XVI. IFN modificat are o descreștere de 5...6 ori a activității biologice in vitro.
Tabelul XVI
Bioactivitatea compusului IFN-alfa conjugat cu reactivul descris în exemplul 18
Greutate moleculară aparentă a proteinei IFN-flZfo (kD) Activitatea specifică, unităti/mg
15 (nemodificat) 28 1,88 x IO8 8,0 x IO7
Exemplul 20A. Prepararea compusului rIE2 conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-[(2-piridiniloxi)carbonillomega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Reactivul α//α-/(2-piridiniloxi) carbonil/-owega- metoxipoli(ori-l,2-etandiil) SRU 111,7, descris anterior în exemplul 18, este adăugat la 1 mg de rIL-2 în 200 ml soluție tampon (borat de sodiu 0,1, pH=9,0) într-un raport molar de 5 moli reactiv per 1 mol rIL-2. Soluțiile se amestecă temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min.
Speciile cu greutate moleculară predominantă, din amestecul de reacție, după 60 min, sunt identificate prin SDS-PAGE, cu greutăți moleculare aparente de 15 kD (nemodificat) și 25 kD. Proteina pegilată cu 25 kD reprezintă 60% din proteina totală.
Exemplul 21. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(2-piridiniloxi) carbonil /- omega-metoxipoli (oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Compusul IFN-tfZ/a este pegilat cu reactivul descris în exemplul 18, conform procedeului descris în exemplul 9.
Activitatea specifică, așa cum s-a determinat prin metodele descrise în exemplul 8, ale compusului inițial IFNalfa nemodificat, este 1,0 x 10° U/mg și activitatea specifică a compusului IFNalfa, conjugat cu PEG, este 0,4 x 10° U/mg demonstrând nici o pierdere semnificativă în bioactivitate.
Exemplul 22. Prepararea compusului
IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(2-piridiniloxi) carbonil /- omega-metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
225
PEG este conjugat la IFN-alfa, folosind reactivul descris în exemplul 18a, cu procedeul din exemplul 9. Activitatea specifica, determinată prin metodele descrise în exemplul 8, al compusului IFNalfa, conjugat cu PEG, este 0,3 x IO8 U/mg.
Exemplul 13. Prepararea compusului alfa-12- (izotiocianato) etiU-omegame-toxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7 La 2 g de alfa-(2-aminoetiî)-omegametoxipoli(oxî-l,2-etandiil) SRU 111,7, în 100 ml CH2CI2, se adaugă 94,2 mg tionocarbonat de di-2- piridiL Soluția este lăsată sub agitare 18 h și apoi extrasă cu o cantitate mică de apă rece. Cea mai mare parte de CH2CI2 este îndepărtată sub presiune redusă și se adaugă eter pentru a facilita precipitarea. Produsul se filtrează și se usucă sub vid înalt, pentru a se obține alfa-12- (izotiocianato)etil/- omega-metoxipoli(«ri-l,2- etandiil) SRU 111,7.
Analiză: calculat pentru C4H7NOS (CH2CH2O)ui,7: C 53,88; H 9,07; N 0,28; S 0,64; găsit: C 54,45; H 8,93; N 0,28; S 0,53.
Exemplul 24. Prepararea compusului IFN-alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- 12- (izotiocianato) etil /-omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Reactivul alfa-12 -(izotiocianato) et&l-omega- metoxipoli(«ri-l,2-etandiil) SRU 111,7, descris anterior în exemplul 23, este adăugat la 1 mg IFN-alfa, purificat în 200 μΐ soluție tampon (borat de sodiu O,1M,/>H=9,O), într-un raport molar de 10 moli reactiv per 1 mol IFN-alfa. Soluțiile sunt amestecate temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min. 30% din produs este derivatizat astfel și prezintă o greutate moleculară aparentă de 26 kD.
Exemplul 25. Prepararea compusului rIL-2 conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /2- (izotiocianato) etil l-omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Reactivul a/fa-/2-(izotiocianato) etil/- omega- metoxipoli(«ri-l,2-etandiil) SRU 111,7, anterior descris în exemplul 23, este adăugat la 1,0 mg IL-2 (rIL-2) recombinat în 100 ml soluție tampon (borat de sodiu 0,lM, pH=9,0) într-un raport molar de 10 moli reactiv PEG per mol de rIL-2. Soluțiile sunt amestecate temeinic și reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min. Compusul rIL-2 modificat cu PEG este apoi obținut conform procedeului menționat în exemplul 3. Rezultatele derivatizării sunt totalizate în tabelul XVII.
Tabelul XVII
Modificarea compusului rIL-2 cu reactivul descris în exemplul 23
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-2 fkD) % din proteina totală din reacție
15 (nemodificat) 70
26 20
30 10
Exemplul 26. Prepararea IL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-12- (izotiocianato) etill-omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 111,7
Compusul IL-lra este pegilat cu aZfa-!2- (izotiocianato)etil/-o/nega-metoxipoli(aa-l,2- etandiil) SRU 111,7, conform procedeului descris în exemplul 6. Produsele pegilate predominante au greutăți moleculare de 26, 31, 38 și 48 kD și reprezintă aproximativ 17, 44, 15 și 10% din proteina totală, respectiv.
Capacitatea proteinei IL-lra de 26 kD purificate din amestecul de reacție după 60 min, de a inhiba legarea IL-1 este determinată prin metodele descrise în exemplul 6 și este prezentata în tabelul XVIII. Proteina pegilată reține din capacitatea de legare de 2...3 ori din IL-lra.
TabelulXVIII
Inhibarea legării iI/IL-1 prin proteina pegilată cu reactivul descris în exemplul 23
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
19 2,0
26 5,0
Exemplul 27. Prepararea compusului eIL-1 alfa conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-/2- (izotiocianato)etil[omega- metoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU
111,7
Compusul IL-l-a//a recombinat este pegilat cu alfa- /2-(izotiocianato)etil/o/niga-metoxipoli(inî-l,2- etandiil) SRU
111,7 așa cum s-a descris în exemplul
4. Două specii pegilate cu greutate moleculară predominantă din amestecul de reacție după 60 min sunt identificate prin SDS-PAGE cu greutăți moleculare aparente de 26 și 38 kD. Ultimile două proteine pegilate reprezintă 46 și 48% din proteina totală, respectiv. Compusul rIL-l-«//« pegilat este purificat din amestecul de reacție și caracterizat așa cum s-a descris în exemplul 4.
Bioactivitatea fracțiunilor purificate marcate este evaluată prin analiza de proliferare de celule D10, așa cum s-a descris în exemplul 7 și rezultatele sunt totalizate în tabelul XIX. Probele notate ca amestecuri în tabel, conțin mai mult de o specie de proteină și nu se purifică mai departe. Proteina pegilată de 26 kD are o activitate specifică, în mod esențial de nedistins de IL-1.
Tabelul XIX Bioactivitatea compusului rIL-1-alfa conjugat cu cu reactivul descris în exemplul 23
Greutate moleculară aparentă a proteinei rIL-l-«//h(kD) Activitatea specifică unități/mg
1 2
1 2
17 26 26,38 (amestec) >38 (amestec) 1,1 X 10® 1,7x10’ 2,0 x 10° 6,0 x IO6
Exemplul 28. Prepararea compusului alfa- !(2- piridiniloxi) tiocarbonil/-omegametoxipoli(oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Dintr-o soluție de 1 g (0,1 mmol) MPEG (metoxipolietilenglicol, cu greutate moleculară 10000) în 30 ml CH2CI2 15 sunt distilate 10 ml solvent Soluția rezultată este răcită și se adaugă 69,7 mg (0,3 mmol) tionocarbonat de dz-2-piridil și 2 mg DMAP. Amestectul este apoi agitat sub o atmosferă de argon, timp de 20 18 h. Solventul este apoi îndepărtat sub vacuum și reziduul se redizolvă într-o cantitate minimă de CH2CI2. Se adaugă apoi eter și precipitatul rezultat este filtrat și spălat cu eter. Produsul se 25 dizolvă apoi în 5 ml glim cald și soluția rezultată este lăsată peste noapte. Precpitatul rezultat este apoi filtrat și spălat cu 2 x 5 ml glim și 5 ml eter dietilic. Produsul este apoi uscat într-un cuptor 30 sub vacuum, sub un curent slab de azot și se obțin 0,9 g iz//h-/(2-piridiniloxi) tiocarbonil/-om€ga- metoxipoli (oxi-1,2etandiil) SRU 225.
Analiza: calculat pentru C9H11NO3S 35 (CH2CH2O)225,3: C 54,46; H 9,04; găsit:
C 54,67; H 9,30.
Exemplul 29. Prepararea compusului IL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa- /(2-piridiniloxi) tiocarbo40 nilt-omega- metoxipoli (oxi-1,2-etandiil) SRU 225
Compusul alfa- /(2-piridiniloxi) tiocarbonil /-omega- metoxipoli(oxi-1,2etandiil) SRU 225, preparat așa cum 45 s-a descris în exemplul 28, este adăugat la 2,0 mg IL-lra în 1,0 ml soluție tampon (borat de sodiu Ο,ΙΜ, pH=9,0), într-un raport molar de 2 moli reactiv per 1 mol IL-lra. Soluțiile sunt amestecate temeinic 50 §i reacția de pegilare este lăsată să se continue la temperatura camerei, timp de 60 min. Compusul IL-lra modificat cu PEG este apoi purificat, conform procedeului menționat în exemplul 6.
Produsul pegilat predominant are o greutate moleculară aparentă de 33 kD și reprezintă aproximativ 17% din proteina totală din amestecul de reacție după 60 min. Capacitatea proteinelor IL-lra purificate din amestecul de reacție de a inhiba legătura IL-1 este determinată așa cum s-a descris în exemplul 6 și este prezentată în tabelul XX. Capacitatea de legare a proteinei de 33 kD este de 3...4 ori din cea a IL-lra.
Tabelul XX Inhibarea legării tl/IL-l la proteinele ILlra pegilate cu reactivul descris în exemplul 28
Greutate moleculară aparentă a proteinei IL-lra ikD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 1,4
33 5.0
Exemplul 30. Esterul 0,Q-di-(6-metil2-piridinil) al acidului carbonotioic
La o soluție de 10 g (0,09 mol) de 6metil -2- hidroxi-piridină în 250 ml CH2CI2 uscată se adaugă 12,7 ml trietilamină. Soluția este răcită la 0°C și sub atmosferă de argon, se adaugă, în picături,
4,1 ml (0,046mol) soluție 85% de tîofosgen în CCI4. Amestecul este lăsat sub agitare la temperatura camerei, timp de 5 h, se filtrează și soluția de CH2CI2 se spală de 2 ori cu 100 ml soluție saturată de NaHCO3. Stratul organic este uscat și solventul se îndepărtează sub presiune redusă. Se adaugă apoi 100 ml hexan la reziduu și amestecul rezultat este lăsat pentru digestie peste noapte. Precipitatul rezultat este filtrat, spălat cu hexan și uscat într-un cuptor sub vacuum, sub un curent slab de azot, obținându-se 5,7 g ester 0,0- di-(6-metil-2-piridinil) al acidului carbonotioic, cu punct de topire
155...156°C.
Analiză: calculat pentru C13H12N2 O2S: C 59,98; H 4,65; N 10,76; S 12,32; găsit: C 59,65; H 4,59; N 10,75; S 12,06.
Exemplul 31. Prepararea compusului alfa-metil-omega-/2- //(6- metil-2- piridiniloxi) tiocarbonil/ amino/etoxi/poli (oxi-
1,2- etandiil) SRU 225
O soluție de 1 g alfa-meUxâ-omega(2-aminoetil) poli(oxz-l,2-etandiil) SRU 225 (preparat ca în exemplul lc) și 52,7 mg acid carbontioic sub formă de ester 0,0-di(6-metil-2-piridinil) (exemplul 30) sunt dizolvate în 15 ml CH2CI2 uscată și se agită la temperatura camerei, peste noapte. Solventul se îndepărtează sub presiune redusă și reziduul se triturează cu eter dietilic. Produsul se dizolvă apoi în 5 ml glim cald și se filtrează prin filtru Millipore de 0,75 u. Soluția este apoi lăsată la temperatura camerei, timp de 48 h și precipitatul rezultat este filtrat Produsul este apoi uscat într-un cuptor sub vacuum, sub atmosferă de azot, timp de 18 h și se obțin 0,9 g alfa-metil-omega-/2- //(6- metil-2-piridiniloxi)tiocarbonil /amino /etoxi /poli(oxi-
1,2- etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C10H14N2 O2S(CH2CH2O)225: C 54,50; H 9,09; N 0,27; S 0,32; găsit: C 54,38; H 9,20; N 0,21; S 0,37.
Exemplul 32. Prepararea compusului rlL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2-//(6-metil2- piridiniloxi) tiocarbonil /amino/ etoxi/ poli (oxi-1,2-etandiil) SRU 225
Reactivul preparat așa cum s-a descris anterior în exemplul 31 este adăugat la 5,0 mg compus rlL-lra purificat în 1 ml borat de sodiu 0, IM, pH=9,0, într-un raport molar de 2,0 moli reactiv per mol rlL-lra. Soluția este amestecată temeinic și amestecul de reacție se lasă să reacționeze la temperatura camerei, timp de 60 min.
Produsele rlL-lra sunt evaluate prin procedeul descris în exemplul 6. în tabelul
XXI sunt prezentate modificările, în procente ale speciilor cu greutate moleculara principală din amestecul de reacție.
Tabelul XXI Modificarea compusului rlL-lra cu reactivul descris în exemplul 31
Greutate moleculară aparenta a proteinei rlL-lra (kD) % din proteina totală din reacție
19 (nemodificat) 30,0
35 65,0
48 5,0
Produsele rlL-lra din amestecul de reacție sunt purificate folosind metoda descrisă în exemplul 6.
Fracțiunile purificate din amestecul de reacție sunt analizate printr-o analiză de legare competitivă cu radioreceptor rIL-1, așa cum s-a descris anterior în exemplul 6. Rezultatele sunt prezentate în tabelul XXII. Aceste rezultate arată că proteina de 35 kD este de 6 ori mai puțin activă decât IL-lra nemodificat pentru inhibarea legăturii IL-1, în timp ce proteina de 48 kD este de 20 ori mai puțin activă.
Tabelul XXII
Inhibarea legăturii r^I/IL-l prin compusul rlL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 31
Greutate moleculară aparentă a proteinei rlL-lra (kD) IC50 (ng/rnl)
19 (nemodificat) 1,5
35 9,0
48 30,0
Exemplul 33. Compusul alfa- [2- //(2piridiniloxi) carbonil /amino /etil/- omega/2- //(2- piridiniloxi) carbonil/amino/etoxi lpoli(oxi-l,2-etandiil) SRU180
A. Prepararea compusului alfa- (2doroeâl)- omega- (2-cloroetoxi)- poli (oxi-
1,2-etandiU) SRU 180
Dintr-o suspensie de 80 MPEG (polietilenglicol cu greutate moleculară 8000) în 750 ml toluen se distilează 200 ml solvent La soluția menținută sub reflux se adaugă, în picături, 1,7 ml piridină uscată și 4,7 ml clorură de tionil. După refluxare, timp de 12 h, reacția este lăsată sub agitare peste noapte. Se adaugă apoi 50 ml clorură de metilen și soluția rezultată se filtrează prin 60 g alumină bazica. Coloana este apoi eluată cu 500 ml CH2CI2, straturile organice se combină și solventul este îndepărtat sub presiune redusă. Reziduul este apoi dizolvat în 300 ml CH2CI2 și se adaugă lent, eter, în timp ce solvenții sunt îndepărtați pe o baie de aburi. Procedeul este continuat până ce se dezvoltă o suspensie fumegândă. Amestecul rezultat este apoi agitat la temperatura camerei, timp de câteva ore și produsul este apoi filtrat, obținându-se 73 ga//«-(2-cloroe til)-omega-(2-cloroetoxi)-poli (aa-l,2-etandiil) SRU 180.
Analiză: calculat pentru C2H4CI2 (CH2CH2O)i80: C 54,16; H 9,09; CI 0,88; găsit: C 53,40; H 8,81; CI 0,93.
B. Prepararea compusului alfa- (2aâdoetil)-omega- (2- azidoetoxi)- poli(oxi-
1,2-etandiil) SRU 180
Un amestec format din 72 g alfa-(2cloroetil)-omega- (2- cloroetoxi)poli(oxi-
1,2-etandiil) SRU 180,25 g azidă de sodiu și 700 ml DMF uscata se agită și se încălzește la 125°C, timp de 12 h. Solventul este apoi îndepărtat sub vacuum înalt și reziduul se dizolvă în 11 CH2CI2 și se filtrează prin Celit CH2CI2 este apoi îndepărtată pe o baie cu aburi, în timp ce se adaugă eter dietilic pentru a favoriza precipitarea. Amestecul se agită peste noapte și apoi se filtrează. Precipitatul se dizolvă apoi într-o cantitate minimă de glim la 50°C, se răcește lent și se filtrează. Produsul se usucă apoi într-un cuptor sub vacuum, sub un curent de azot și se obțin 60 g alfa(2-azidoetil) -omega- (2-azidoetoxi)poli (a»-l,2-etandiil) SRU 180.
Analiză: calculat pentru C2H4N6 (CH2CH2O) 180’· C54,07; H 9,08; N 1,044; găsit: C 53,76; H 9,28; N 0,96.
C. Prepararea compusului alfa- (2109543 aminoetil)- omega- (2- aminoetoxi)-poli(oxi-1,2-etandiil) SRU180
O soluție formata din 69 g alfa-(2aâdoetil)-omega- (2-azidoetoxi)poli(cu«-
1,2-etandiil) SRU 180 și 6,7 g (25,6 mmol) trifenilfosfina dizolvata în 200 ml CH2CI2 uscată, se agită peste noapte sub o atmosferă de argon. Se adaugă 2 ml apă și amestecul se agită încă 12 h. Cea mai mare parte din clorură de metilen se îndepărtează sub vacuum și se adaugă 400 ml eter dietetic. Precipitatul se filtrează, se spală cu eter și se dizolvă în 300 ml glim cald (50°C). Soluția este lăsata la temperatura camerei peste noapte și precipitatul rezultat se filtrează, se spală cu 2 x 100 ml glim, 2 x 100 ml eter dietilic și se usucă într-un cuptor sub vacuum, sub un curent de azot, obținânduse 66 g alfa-(2-aminoetiî)-omega-(2- aminoetoxi)poli(<?ja-l,2-etandiil) SRU 180.
Analiză: calculat pentru C2H8N2 (CH2CH2O)i80: C 54,42; H 9,18; N 0,35; găsit: C 53,85; H 9,20; N 0,43.
D. Compusul alfa-/2-l/(2-piridiniloxi)carbonil/amino fetii/- omega-/2-//(2piridiniloxi/carbonil/amino/etojâ/poli (oxi-1,2- etandiil) SRU 180
Dintr-o soluție de 1 g a//h-(2-aminoetiî)-omega-(2- amimoetoxi)poli(<za-
1,2-etandiil) SRU 180, dizolvat în 40 ml CH2Q2 uscată, se distilează 15 ml solvent Soluția se răcește la 0°C și se adaugă 85 mg (6,39 mmol) carbonat de di-2-piridiL Amestecul se agită apoi la 0°C, timp de 4 h și solventul se îndepărtează sub vacuum. Reziduul se triturează cu eter dietilic și produsul se filtrează și se spală cu 2 x 75 ml eter. Produsul se usucă sub vacuum și se dizolvă în 8 ml glim uscat (50°C). Soluția este lăsata apoi să se răcească și se menține la temperatura camerei timp de 12 h. Produsul precipitat se filtrează, se spală cu 2 x 5 ml glim și se usucă într-un cuptor sub vacuum, sub un curent de azot obținându-se 1 g alfa-/2//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etil/omega -/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/ amino/ etil/poli(ari-l,2-etandiil) SRU 180.
Analiză: calculat pentru C14H14N4O4 (CH2CH2O)i80: C 54,57; H 8,99; N 0,68; găsit: C 54,32; H 8,79; N 0,77.
Exemplul 34. Compusul alfa-l2-ll(2piridiniloxi)carbonil/aminoletil-omega-l 2-//(2- piridiniloxi)carbonill carbonil/amino/etoxilpoli(oxi-l,2- etandiil) SRU 452
A Prepararea compusului alfa- (2-cloroetil)-omega- (2- cloroetoxi)-poli(oxi-1,2etandiil) SRU 452
Prin procedeul descris în exemplul 33A, polietilenglicolul cu greutate moleculară 20000 este transformat în alfa -(2cloroetil) -omega -(2-cloroetoxi)poli(«xz -
1,2-etandiil) SRU 452.
Analiză: calculat pentru C2H4CI2 (CH2CH2O)452: C 54,38; H 9,13; CI 0,35; găsit: C 54,36; H 9,23; Ci 0,40.
B. Prepararea compusului alfa- (2-azidoetil)-omega- (2-azidoetoxi)poli (oxi-1,2etandiil) SRU 452
Prin procedeul descris în exemplul 33B, compusul alfa-(2- c.\oroetiî)-omega(2-cloroetoxi)poli(oxz-l,2-etandiil) SRU 452 este transformat în alfa-(2-azidoetil)-omega- (2-azidoetoxi) poli(oa- 1,2etandiil) SRU 452.
Analiză: calculat pentru C2H4N6 (CH2CH2O)452: C 54,35; H 9,12; N 0,42; găsit: C 54,38; H 9,30; N 0,47.
C. Prepararea compusului alfa-(2aminoetil)-omega- (2-aminoetoxi)poli(oxi-l,2-etandiil) SRU 452
Prin procedeul descris în exemplul 33C, compusul alfa-(2- azidoetil)-omega-(2-azidoetoxi)-poli(oxî-1,2- etandiil) SRU 452 este transformat în alfa-(2-aminoetil)- <?mega-(2-aminoetoxi)poli(oiid-
1.2- etandiil) SRU 452.
Analiza: calculat pentru C2H8N2 (CH2CH2O)452: C 54,49; H 9,17; N 0,14; găsit: C 54,44; H 9,19; N 0,15.
D. Prepararea atfa-/2-H(2-piridiniloxi)carbonil/amino/etil/- omega-/2-H(2-piridiniloxtycarbonil/aminoletoxi/poli (oxi-
1.2- etandiil) SRU 452
Prin procedeul descris în exemplul
33D, compusul alfa-(2- aminoetil)-omega-(2-aminoetoxi) poli(<?xi-l,2-etandiil)
SRU 452 este transformat în compusul alfa -/2-//(2- piridiniloxi) carbonil/ami109543 no/etil/-omega -/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etoxi/-poli(<9A2-l,2-etandiil) SRU 452.
Analiza: calculat pentru C14H14N4O4 (CH2CH2O)452: C 54,56; H 9,08; N 0,28; găsit: C 54,33; H 9,13; N 0,33.
Exemplul 35. Prepararea compusului rlL-lra conjugat cu PEG prin intermediul reactivului alfa-12-//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etil/-omega-12-11(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etil/-omega-/2-//(2- piridiniloxi)carbonil/amino/etoxipoU (oxi-
1,2-etandiil) SRU 180
Reactivul preparat, așa cum s-a descris anterior în exemplul 34, este adăugat la 5,0 mg rlL-lra purificat în 1,0 ml borat de sodiu 0,1 M,pH=9,0 la un raport molar de 1,0 moli reactiv per 4,0 mol rlL-lra. Soluția este amestecată temeinic la temperatura camerei, timp de 60 min.
Produsele rlL-lra sunt evaluate prin metoda descrisă anterior în exemplul 6. în tabelul XXIII, este prezentată, în procente, modificarea speciilor cu greutate moleculară principală din amestecul de reacție.
Tabelul XXIII Modificarea compusului rlL-lra cu reactivul descris în exemplul 33
Greutate moleculară aparentă a proteinei rlL-lra (kD) % din proteina totală din reacție
19 (nemodificat) 50,0
55 35,0
75 15,0
Exemplul 36. Carbonatul de bis-(3metil-2-piridil)
O soluție de 4,6 g (42 mmol) de
3-metil-2-hidroxipiridină și 6 ml trietilamină, dizolvată în 20 ml CH2Q2 se adaugă, în picaturi, la 0°C, la o soluție de 50 ml CH2CI2 și 11 ml fosfen în toluen (1,93 molar). Amestecul se agită la 0°C, timp de 2 h și apoi la temperatura camerei, timp de 2 h. Amestecul de reacție este apoi spălat cu o soluție saturată de
NaHCXZh urmată de o soluție saturată de NaCl și apoi uscata pe Na2SO4. Solventul este îndepărtat sub presiune redusă și reziduul este cristalizat din acetat de etil/hexan, obținându-se 3 g carbonat de b£y-(3-metil-2-piridil), cu punct de topire
11O...112°C.
Analiză: calculat pentru C13H12 N2O3: C 63,93; H 4,95; N 11,47; găsiri C 63,78; H 4,86; N 11,23.
Exemplul 37. Compusul alfa-metilomega-/2-H(3-metil-2- piridiniloxi)carbonil/amino/etoxi/poli (oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Dintr-o soluție de 1 g alfa -metoxi omega-(2- aminoetil)poli(oca-l,2-etandiil) SRU 225 dizolvat în 25 ml CH2CI2 se distilează 10 ml solvent. La soluție se adaugă apoi 49,2 mg (0,2 mmol) carbonat de bis-(3-metil-2-piridil) și amestecul rezultat se agită peste noapte sub atmosferă de argon. Solventul este apoi îndepărtat sub presiune redusă și se adaugă la reziduu 80 ml eter dietilic. Solidul se filtrează, se spală cu eter și apoi se dizolvă în 10 ml CH2CI2. Se adaugă apoi, lent, eter, în timp ce solventul este îndepărat prin fierberea soluției, până ce aceasta devine tulbure. Amestecul este apoi lăsat 18 h, la temperatura camerei și precipitatul este filtrat Solidul este apoi dizolvat în 8 ml glim cald și este lăsat la temperatura camerei încă 18 h. Produsul este apoi filtrat și se usucă într-un cuptor sub vacuum, sub o atmosfera de azot, obținându-se 0,6 galfa -metil- omega-/2-//(3metil-2-piridiniloxi)carbonil/amino/etoxi/poli(«xz-l,2-etandiil) SRU 225.
Analiză: calculat pentru C10H14N2O3 (CH2CH2O)225: C 54,59; H 9,09; N 0,28; găsit: C 54,64; H 9,14; N 0,22.
Exemplul 38. Prepararea compusului rlL-lra conjugat cu PEGprin intermediul reactivului alfa-metil-omega-/2-//(3-metil2- piridiniloxi) carbonil/ amino/ etoxi/ poli(oxi-l,2-etandiil) SRU 225
Reactivul, preparat așa cum s-a descris anterior în exemplul 37, este adăugat la 5 mg de compus rlL-lra purificat în 1,0 ml borat de sodiu 0,1 M, pH=9,0, într-un raport molar de 2,0 moli reactiv per mol rlL-lra. Soluția este amestecată temeinic și reacția este lăsată să se efectueze la temperatura camerei, timp de 60 min.
Produsele rlL-lra sunt evaluate prin procedeul descris în exemplul 6. în tabelul XXIV, se prezintă, în procente, modificarea speciilor, cu greutate moleculară principală, din amestecul de reacție.
Tabelul XXIV
Modificarea compusului rlL-lra cu reactivul descris în exemplul 37
Greutate moleculară aparentă a proteinei rlL-lra (kD) % din proteina totală din reacție
19 (nemodificat) 45,0
35 43,0
45 120
Produsele rEL-lra din amestecul de reacție sunt purificate așa cum s-a descris în exemplul 6. Fracțiunile purificate din amestecul de reacție sunt analizate printro analiză de legare competitivă la radioreceptor rIL-1, așa cum s-a descris în exemplul 6. Rezultatele sunt prezentate în tabelul XXV. A rezultat că proteina de 35 kD este de 4 ori mai puțin activă decât compusul rlL-lra nemodificat pentru inhibarea legăturii IL-1. Proteina 45 kD a fost de 30 ori mai puțin activă.
Tabelul XXV
Inhibarea legării tl/IL-l prin compus rlL-lra conjugat cu reactivul descris în exemplul 35
Greutate moleculară aparentă a proteinei rlL-lra (kD) IC50 (ng/ml)
19 (nemodificat) 1,0
35 4,0
45 30,0

Claims (19)

  1. Revendicări
    1. Compuși conjugați cu proteine, activ fiziologic, caracterizați prin aceea ca prezintă formula generală I: RFO-(CH2CH2O)n-CH2CH2- R2 NH! proteină X/ c
    H (I) L R3 ] m în care: R este un alchil inferior; R este -O- sau d>iH-; R3 este =N-R , =S sau =O; R4 este alchil inferior sau cicloalchil; m și n sunt alese dintre numere întregi 1 astfel încât, conjugatul să posede cel puțin o parte din activitatea biologică a proteinei neconjugate; cu condiția ca atunci când R2 este -O-, R3 este altul decât =N- R4; care atunci când R2 este -O- și R3 este =O, proteina este interferon-α, interleukin-1 sau interleukin-fra și care atunci când Reste -O- și R3 este =S proteina nu este antigen Edin polenul ruginii sau albumina plasmei de bovină.
  2. 2 Compus conjugat cu proteine, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea cam și n sunt alese în așa fel, încât greutatea moleculară a reziduului (reziduurilor) de pegilare per moleculă de proteină să fie de la 300 până la 30000 Daltoni.
  3. 3. Compus conjugat cu proteine, conform revendicării 1 sau 2, caracterizat prin aceea ca m este 1 sau 2
  4. 4. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...3, caracterizat prin aceea ca, conjugatul are formula:
    Η H
    N N proteină R1-O(CH2CH2O)n-CH2CH2 V
    II I-A
    NR4 1 m în care R1, R , m, n și proteina sunt ca în revendicare 1.
  5. 5. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...3, caracterizat prin aceea ca, conjugatul are formula:
    R1-O(CH2CH20)n-CH2CH2-0 N , . . S proteină I-B
    - i 4 - Jm în care R , R , m, n și proteina sunt ca în revendicarea 1.
  6. 6. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...3, caracterizat prin aceea că, conjugatul are formula:
    XN NHR1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 Cz \\ în care R1, m, n și proteina sunt ca în revendicarea 1.
  7. 7. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...3, caracterizat prin aceea că, conjugatul are formula:
    proteină
    I-C m
    interleukin-lra.
    12. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicrile 1...9, caracterizat prin aceea că proteina este
    5 interferon-<x.
    13. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicrile 1...7, caracterizat prin aceea că proteina este interleukin-2.
    10 14. Compus conjugat cu proteine, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că are formula:
    H
    N NH - interferon-flZ/â
    15 H3C-O(CH2CH2 c x // o în care n este aproximativ 112.
    15. Compus conjugat cu proteine,
    20 conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că are formula:
    proteină
    I-D m
    ÎN
    NH· R’-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 Cx w
    L 1 s în care R , m, n și proteina sunt ca in revendicarea 1.
  8. 8. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...3, caracterizat prin aceea că, conjugatul are formula:
    NH
    R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 bZ
    W
    O proteină
    I-E m
    în care R1, m, n și proteina sunt ca în revendicarea 1.
  9. 9. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...8, caracterizat prin aceea că R1 este CH3.
  10. 10. Compus conjugat cu proteine conform oricăreia din revendicările 1...9, caracterizat prin aceea că proteina este interleukin-1.
  11. 11. Compus conjugat cu proteine, conform oricăreia din revendicările 1...9, caracterizat prin aceea că proteina este
    NH - iotetieron-alfa H3CO-(CH2CH2O)n-CH2CH2 C
    O în care n este aproximativ 112,
    16. Compus conjugat cu proteine, conform revendicării 12 sau 14, caracterizat prin aceea că interferonul-<z este interferon-α A.
    17. Procedeu de preparare a unui compus conjugat cu proteine, activ fiziologic, de formulă:
    R1-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-R2^ proteină // I R3 m în care substituenții cu semnificațiile menționate mai sus sunt aleși în așa fel, încât compusul conjugat să aibă cel puțin o parte din activitatea biologică a proteinei neconjugate; cu condiția ca atunci când R2 este -O-, R? să fie altul decât =R-R4; care, când R2 este -O- și R3 este =O, proteina este interferon interleukin-1 sau interleukin-lra; și care, când R2 este -O- și R3 este =S, proteina nu este antigen E din polenul ruginii sau albumină din plasma de bovină, caracterizat prin aceea că un compus activat cu formula generală:
    II-A
    ΙΙ-Β
    II-C
    Il-D
    R1O(CH2CH2O)1I-CH2CH2-N= c= n-r4
    R10(CH20120)n-CH2CH2-0-C-N O S Y
    O
    R1O(CH2CH20)n-CH2CH2-NH-^O- ζΐ|
    R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N= C= S
    Il-D R1O(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N= C= S
    Il-E
    R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C-O- n-E
    R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-C>O- ζ W
    S N R5
    Il-F R^CCHzCHîOjn-CHzCHî-O-qO -C J Xs ^NZ
    1I-G R^(OT2CH2O)n-CH2CH2-O-£o-0
  12. 1 4N în care R este alchil inferior, R7 este alchil inferior sau cicloalchil, R^ este alchil inferior sau H și n este orice număr întreg de la 1 până la 1000; este pus să reacționeze cu o grupă amino liberă a unei proteine sau a unei sări a acesteia, într-o soluție apoasă tampon având pH-ul între 7 și 10, cu o cantitate molară egală sau un exces molar al unui compus activat și izolând conjugatul de proteină din amestecul de reacție prin cromatografie sau electroforeză.
  13. 18. Compus PEG activat, caracterizat prin aceea că, compusul este ales dintr-un grup, constând din:
    1I-A
    R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-N= C= N-R4
    II-B
    Π-C
    R1O(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C;N S II O r5-V>) R1O(CH2CH2!0)n-CH2CH2-NH-GO- L
    N
    Grupa 12
    Il-G R1O(CH2GH2O)n-CH2CH2-O-C-O-(0I
    1 4N în care R este alchil inferior, R este alchil inferior sau cicloalchil, R^ este alchil inferior sau H și n este oricare număr întreg de la 1 până la 1000.
  14. 19. Compus, conform revendicării 18, caracterizat prin aceea că, R4 este ciclohexil.
  15. 20. Compus, confonn revendicării 18, caracterizat prin aceea că R5 este H.
  16. 21. Compus,conform revendicării 18, caracterizat prin aceea că R5 este CH3.
  17. 22. Compus, conform oricăreia din revendicările 18...21, caracterizat prin aceea că R1 este CH3.
  18. 23. Compus, conform oricăreia din revendicările 18...21, caracterizat prin aceea că, compusul are formula:
    ch3 RxO(CH2CH2O)nCH2CH2NH-C-O k / 'b N în care R1 este CH3 și n este aproximativ 112
  19. 24. Compuși, confonn oricăreia din revendicările 1...16, caracterizați prin aceea că, ei, împreună cu un agent de vehiculare, neutru din punct de vedere terapeutic, eliberează (degajă) compuși acceptabili din punct de vedere farmaceutic, care sunt utilizați pentru tratamentul sau profilaxia tulburărilor imunomodulatorii, cum ar fi, de exemplu, maladii neoplazice sau maladii infecțioase.
RO92-200383A 1991-03-25 1992-03-23 Compusi conjugati cu proteine, procedee pentru prepararea acestora si intermediari de sinteza RO109543B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67400191A 1991-03-25 1991-03-25
US07/767,000 US5595732A (en) 1991-03-25 1991-09-27 Polyethylene-protein conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO109543B1 true RO109543B1 (ro) 1995-03-30

Family

ID=27101069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO92-200383A RO109543B1 (ro) 1991-03-25 1992-03-23 Compusi conjugati cu proteine, procedee pentru prepararea acestora si intermediari de sinteza

Country Status (32)

Country Link
US (7) US5595732A (ro)
EP (1) EP0510356B1 (ro)
JP (1) JP2637010B2 (ro)
KR (1) KR920018079A (ro)
CN (2) CN1038035C (ro)
AT (1) ATE176159T1 (ro)
AU (2) AU657311B2 (ro)
BG (1) BG60800B2 (ro)
BR (1) BR9201015A (ro)
CA (1) CA2063886C (ro)
CS (1) CS87192A3 (ro)
CY (1) CY2169B1 (ro)
DE (1) DE69228269T2 (ro)
DK (1) DK0510356T3 (ro)
EE (1) EE9400356A (ro)
ES (1) ES2128329T3 (ro)
FI (2) FI107927B (ro)
GR (1) GR3030049T3 (ro)
HU (2) HUT60512A (ro)
IE (1) IE920936A1 (ro)
IL (1) IL101348A0 (ro)
IS (1) IS3824A (ro)
MW (1) MW1892A1 (ro)
MX (1) MX9201298A (ro)
MY (1) MY131095A (ro)
NO (1) NO921142L (ro)
NZ (2) NZ248022A (ro)
OA (1) OA09760A (ro)
RO (1) RO109543B1 (ro)
SI (1) SI9210294A (ro)
ZA (1) ZA922110B (ro)
ZW (1) ZW4392A1 (ro)

Families Citing this family (255)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1994004193A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5478860A (en) * 1993-06-04 1995-12-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery
KR100361933B1 (ko) 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
AU8052194A (en) * 1993-10-20 1995-05-08 Enzon, Inc. 2'- and/or 7- substituted taxoids
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
HUT75533A (en) * 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US7008624B1 (en) * 1995-02-22 2006-03-07 Immunex Corporation Antagonists of interleukin-15
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
DE19514087A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff, einem Polyether und ggfs. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
CA2236591C (en) 1995-11-02 2012-01-03 Schering Corporation Continuous low-dose cytokine infusion therapy
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
AU5773798A (en) * 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
EP0973384A4 (en) 1997-02-13 2004-10-13 Sky High Llc ORGAN PRESERVATION SOLUTION
IL131406A0 (en) 1997-02-21 2001-01-28 Genentech Inc Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies
US7122636B1 (en) * 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US6468532B1 (en) 1998-01-22 2002-10-22 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US7005504B2 (en) * 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
US6180096B1 (en) 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
BR9910023A (pt) * 1998-04-28 2000-12-26 Applied Research Systems Conjugados de poliol-ifn-beta
KR100694345B1 (ko) 1998-05-15 2007-03-12 쉐링 코포레이션 리바비린 및 인터페론 알파를 포함하는, 만성 ｃ형 간염에 걸린 항-바이러스 치료에 대한 나이브 환자의 치료용 약제학적 조성물
TR200003635T2 (tr) * 1998-06-08 2001-04-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Peg-IFN-ALFA ve ribavirinin kronik hepatit C tedavisinde kullanılması.
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
HU229888B1 (en) 1998-10-16 2014-11-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses
EE05111B1 (et) * 1998-10-16 2008-12-15 Biogen, Incorporated Interferoon-beetaga sulandatud valgud ja nende kasutamine
DK2319928T3 (da) 1998-10-23 2013-06-24 Kirin Amgen Inc Dimere trombopoietiske peptidomimetika, der binder til MPL-receptor og har trombopoietisk aktivitet
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
CA2303992A1 (en) 1999-04-08 2000-10-08 Schering Corporation Melanoma therapy
US7169889B1 (en) 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
WO2001005819A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-25 Kuhnil Pharm. Co., Ltd. Novel water soluble-cyclosporine conjugated compounds
YU32402A (sh) 1999-11-12 2005-03-15 Maxygen Holdings Ltd. Konjugati gama interferona
IL149267A0 (en) * 1999-11-12 2002-11-10 Maxygen Holdings Ltd Interferon gamma conjugates
SK11672002A3 (sk) 2000-01-10 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd. Polypeptidový konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
PL204285B1 (pl) 2000-02-11 2009-12-31 Bayer Healthcare Llc Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
CN1434726A (zh) 2000-06-08 2003-08-06 拉卓拉药物公司 包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子
US7208167B2 (en) * 2000-08-07 2007-04-24 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU2001273385B2 (en) * 2000-09-08 2005-04-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
JP2004534523A (ja) 2001-02-27 2004-11-18 マキシゲン・エイピーエス 新規なインターフェロンβ様分子
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
EP1419191B1 (en) 2001-08-22 2007-10-17 Bioartificial Gel Technologies Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
UA78726C2 (en) * 2001-11-01 2007-04-25 Sciclone Pharmaceuticals Inc Pharmaceutical composition of thymosin alpha 1 conjugated with polyethylene glycol, method for production, and method for treatment
US20040058865A1 (en) * 2001-11-26 2004-03-25 Danishefsky Samuel J Homing peptide multimers, their preparation and uses
US7041855B2 (en) * 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) * 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6956135B2 (en) * 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100888371B1 (ko) 2002-01-17 2009-03-13 동아제약주식회사 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
DK1476181T3 (en) 2002-01-18 2016-05-23 Biogen Ma Inc POLYALKYLENE POLYMER COMPOUNDS AND USE THEREOF
US20030191056A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US7601688B2 (en) 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
ATE503498T1 (de) 2002-06-21 2011-04-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
TW200500375A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenix Cayman Ltd Modified 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae
AU2003239774A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-23 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
EP1382352A1 (de) 2002-07-19 2004-01-21 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Bisacyloxypropylcystein-Konjugate und deren Verwendung
JP4723244B2 (ja) 2002-07-19 2011-07-13 オメロス コーポレイション 生分解性トリブロックコポリマー、その合成方法、ならびにそれから作製されるヒドロゲルおよび生体材料
WO2004012773A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
US7563507B2 (en) * 2002-08-16 2009-07-21 University Of Massachusetts Pyridine and related ligand compounds, functionalized nanoparticulate composites and methods of preparation
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
RS20050502A (sr) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polimerni konjugati interferona- beta sa povećanom biološkom aktivnošću
PL396711A1 (pl) * 2002-12-26 2011-12-19 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty polimerów z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu, hormonami polipeptydowymi i ich antagonistami, kompozycja farmaceutyczna i sposób zapobiegania, diagnozowania lub leczenia
US20040176655A1 (en) * 2003-02-05 2004-09-09 Ayoub Paul Marie Methods of preparing branched alkyl aromatic hydrocarbons
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
CA2458085A1 (en) 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
CN100503628C (zh) 2003-05-30 2009-06-24 法莫赛特股份有限公司 修饰的氟化核苷类似物
GB0320638D0 (en) 2003-09-03 2003-10-01 Novartis Ag Organic compounds
ES2737837T3 (es) * 2003-10-09 2020-01-16 Ambrx Inc Derivados poliméricos
EP1673387B1 (en) 2003-10-10 2010-09-15 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
US8778880B2 (en) 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
CN101001866A (zh) * 2004-02-02 2007-07-18 Ambrx公司 经修饰的人类干扰素多肽和其用途
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US7318918B2 (en) 2004-05-19 2008-01-15 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US20060194726A1 (en) * 2004-05-25 2006-08-31 Rueger David C Methods of treating cartilage defects
WO2005123113A2 (en) * 2004-06-14 2005-12-29 Intermune, Inc. Interferon compositions and methods of use thereof
KR101699142B1 (ko) * 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2006005058A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
CA2572765C (en) * 2004-07-08 2013-05-21 Amgen Inc. Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen
MX2007000883A (es) 2004-07-19 2007-04-02 Biocon Ltd Conjugados de insulina-oligomero, formulaciones y usos de los mismos.
CN101023094B (zh) * 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
US7638299B2 (en) 2004-07-21 2009-12-29 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
CA2576549C (en) * 2004-08-12 2011-01-18 Schering Corporation Stable pegylated interferon formulation
BRPI0515279A (pt) 2004-09-14 2008-07-15 Pharmasset Inc preparação de ribofuranosil pirimidinas e purinas 2'fluoro-2'-alquil- substituìdas ou outras opcionalmente substituìdas e seus derivados
WO2006071840A2 (en) * 2004-12-22 2006-07-06 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
EP2284191A3 (en) 2004-12-22 2011-07-20 Ambrx, Inc. Process for the preparation of hGH
WO2006068802A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
DK1835938T3 (da) 2004-12-27 2013-11-04 Baxter Int Polymer-von Willebrand-faktor-konjugater
JPWO2006080171A1 (ja) 2005-01-31 2008-06-19 株式会社 エフェクター細胞研究所 免疫増強剤
BRPI0609809A2 (pt) 2005-05-18 2011-10-11 Maxygen Inc polipeptìdeo isolado ou recombinante, conjugado, composição, polinucleotìdeo isolado ou recombinante, célula hospedeira, vetor, métodos para preparar o polipeptìdeo, para preparar um conjugado, para inibir replicação de um vìrus em células infectadas com o vìrus para reduzir o numero de cópias de um vìrus em células infectadas com o vìrus, para reduzir o nìvel de rna de hcv no soro de um paciente infectado com hcv, para reduzir o nìvel de dna de hbv em soro de um paciente infectado com hbv e para reduzir o nìvel de rna de hiv em soro de um paciente infectado com hiv, e, uso do polipeptìdeo ou do conjugado
US20070015701A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Samuel Zalipsky Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7
CA2609205A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
RU2427372C2 (ru) 2005-06-17 2011-08-27 Новартис Аг Применение санглиферина для лечения вируса гепатита с
EP3725299A1 (en) * 2005-06-24 2020-10-21 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
WO2007021297A1 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF tRNA AND USES THEREOF
US20070123646A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-31 Lele Bhalchandra S Protein-polymer conjugates and synthesis thereof
EP1776963A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-25 Gbf-Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Hexosylceramides as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
HRP20110404T1 (hr) * 2005-11-08 2011-08-31 Ambrx Ubrzivači za modifikaciju ne-prirodnih aminokiselina i polipeptida ne-prirodnih aminokiselina
US20090018029A1 (en) 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
ES2529065T3 (es) * 2005-12-14 2015-02-16 Ambrx, Inc. Composiciones que contienen, procedimientos que implican y usos de aminoácidos no naturales y polipéptidos
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
EP1985303B1 (en) 2006-01-12 2012-11-21 Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. Oral composition containing Interferon-alpha
TW200738752A (en) 2006-01-31 2007-10-16 Bayer Schering Pharma Ag Modulation of MDL-1 activity for treatment of inflammatory disease
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) * 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
UA100666C2 (uk) 2006-04-11 2013-01-25 Новартіс Аг Інгібітори нсv/віл та їх застосування
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
EP1897557A1 (en) 2006-09-07 2008-03-12 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Use of glycolipids as adjuvants
DK2064333T3 (da) * 2006-09-08 2014-05-05 Ambrx Inc Suppressor-trna-transkription i hvirveldyrceller
DK2615108T3 (en) 2006-09-08 2017-01-30 Ambrx Inc Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their applications
PT2061878E (pt) * 2006-09-08 2014-04-22 Ambrx Inc Supressor híbrido arnt para células de vertebrados
PL2068909T3 (pl) 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowanie
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
BRPI0818004B8 (pt) 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
US8946148B2 (en) 2007-11-20 2015-02-03 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
US9938333B2 (en) 2008-02-08 2018-04-10 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
TW200946541A (en) * 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
TWI541020B (zh) 2008-04-17 2016-07-11 巴克斯歐塔公司 生物活性胜肽
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
PL2318029T3 (pl) 2008-07-23 2018-03-30 Elanco Us Inc. Zmodyfikowane polipeptydy bydlęcego G-CSF i ich zastosowania
CN101671390B (zh) * 2008-09-10 2012-10-03 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
US8278418B2 (en) 2008-09-26 2012-10-02 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
CA2738033C (en) 2008-09-26 2019-11-26 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
CA2748057C (en) 2008-12-23 2018-07-03 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidates
US8551973B2 (en) 2008-12-23 2013-10-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside analogs
EP2376515A1 (en) 2008-12-23 2011-10-19 Pharmasset, Inc. Synthesis of purine nucleosides
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI598358B (zh) 2009-05-20 2017-09-11 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
ES2602629T3 (es) * 2009-06-04 2017-02-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso
US20110097302A1 (en) * 2009-07-16 2011-04-28 Ta Tung Yuan Il-1ra-polymer conjugates
US20110027229A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Medtronic, Inc. Continuous subcutaneous administration of interferon-alpha to hepatitis c infected patients
WO2011020091A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
US8475652B2 (en) 2009-10-19 2013-07-02 Jan A. K. Paul Method for purification of uncatalyzed natural fuels from metal ions by means of at least one hemeprotein and use of the at least on hemeprotein
PH12012500827A1 (en) 2009-10-30 2013-01-07 Boehringer Ingelheim Int Dosage regimens for hcv combination therapy comprising bi201335, interferon alpha and ribavirin
US20120283172A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
BR112012015461A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-10 Ambrx Inc polipeptídeos de somatotropina boviina modificados e seus usos
AU2011222883B2 (en) 2010-03-05 2016-05-26 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
PL3290428T3 (pl) 2010-03-31 2022-02-07 Gilead Pharmasset Llc Tabletka zawierająca krystaliczny (S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymidyn-1(2H)-ylo)-4-fluoro-3-hydroksy-4-metylotetrahydrofuran-2-ylo)metoksy)(fenoksy)fosforylo)amino)propanian izopropylu
CL2011000718A1 (es) 2010-03-31 2012-04-09 Gilead Pharmasset Llc Proceso para la preparacion de compuestos fosforados enantiomericos.
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
AU2011268498A1 (en) 2010-06-24 2013-01-31 Genoscience Pharma Sas Treatment of hepatitis C virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent
EP3572091B1 (en) 2010-08-17 2023-12-13 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
RU2013114783A (ru) 2010-09-03 2014-10-10 Академиа Синика Anti-с-мет антитела и способы их применения
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
KR20140035305A (ko) 2010-10-05 2014-03-21 노파르티스 아게 C형 간염 바이러스 감염의 새로운 치료법
AU2011311880B2 (en) 2010-10-08 2014-07-24 Novartis Ag Vitamin E formulations of sulfamide NS3 inhibitors
HRP20210642T1 (hr) 2010-11-12 2021-05-28 Nektar Therapeutics Konjugati il-2 ostatka i polimera
PT3042910T (pt) 2010-11-30 2019-04-16 Gilead Pharmasset Llc 2'-espiro-nucleósidos para utilização na terapia da hepatite c
CN105381450A (zh) 2010-11-30 2016-03-09 诺华有限公司 丙型肝炎病毒感染的新疗法
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
CN105749246A (zh) 2011-03-31 2016-07-13 诺华股份有限公司 治疗丙肝病毒感染的阿拉泊韦
RS53911B1 (sr) 2011-04-01 2015-08-31 Novartis Ag Tretman u infekciji virusom hepatitis b zasebno ili u kombinaciji sa hepatitis delta virusom i bolesti jetre koje ih prate
KR20140011379A (ko) 2011-04-13 2014-01-28 노파르티스 아게 알리스포리비르를 사용하는 c형 간염 바이러스 감염의 치료
EP2717902B1 (en) 2011-06-06 2018-01-24 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
ES2724778T3 (es) 2011-06-10 2019-09-16 Bioverativ Therapeutics Inc Compuestos procoagulantes y procedimientos de uso de los mismos
RU2014103288A (ru) 2011-07-01 2015-08-10 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Слитые полипептиды релаксина и их применение
JP2014528947A (ja) 2011-09-27 2014-10-30 ノバルティス アーゲー Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療のためのアリスポリビル
US8767214B2 (en) 2011-10-06 2014-07-01 Nordson Corporation Powder flow detection
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
WO2013137869A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population
WO2013143581A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population
CN104379171A (zh) * 2012-04-25 2015-02-25 第一三共株式会社 骨修复促进剂
ES2718478T3 (es) 2012-06-08 2019-07-02 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden restos de aminoácidos no naturales de localización específica, métodos para su preparación y métodos para su uso
DK2863955T3 (en) 2012-06-26 2017-01-23 Sutro Biopharma Inc MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
SI2885010T1 (sl) 2012-08-16 2020-07-31 Ipierian, Inc. Metode zdravljenja tauopatije
SG11201501464TA (en) 2012-08-31 2015-03-30 Sutro Biopharma Inc Modified amino acids comprising an azido group
CN104870475B (zh) 2012-10-25 2019-11-08 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
CA2889197A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
EP2922870B1 (en) 2012-11-21 2019-08-07 The Governors of the University of Alberta Immunomodulatory peptides and methods of use thereof
US20140205566A1 (en) 2012-11-30 2014-07-24 Novartis Ag Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof
EA039554B1 (ru) 2013-06-10 2022-02-09 АйПИЕРИАН, ИНК. Способ снижения уровней a40 и/или a42 в нервной клетке и/или во внеклеточной жидкости
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3650014B1 (en) 2013-08-27 2021-10-06 Gilead Pharmasset LLC Combination formulation of two antiviral compounds
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015081085A2 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
US11052132B2 (en) 2014-05-08 2021-07-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
EP3782652A1 (en) 2014-08-19 2021-02-24 Biogen MA Inc. Pegylation method
CN107108710B (zh) 2014-10-24 2022-02-15 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
CA2976038A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
RU2021133819A (ru) 2015-09-02 2021-12-10 Иммутеп С.A.С. Анти-lag-3 антитела
JP7407511B2 (ja) 2015-10-08 2024-01-04 ネクター セラピューティクス ＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬と長時間作用型ＩＬ－１５作動薬との併用
MX377531B (es) 2015-11-03 2025-03-10 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de un inhibidor del ensamble de la cápside del hbv y un interferón.
US10934347B2 (en) 2016-04-04 2021-03-02 Genzyme Corporation Anti-complement factor BB antibodies and uses thereof
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
TW202426655A (zh) 2017-07-11 2024-07-01 美商新索思股份有限公司 非天然核苷酸之導入及其方法
MA49767A (fr) 2017-08-03 2021-05-26 Synthorx Inc Conjugués de cytokine pour le traitement de maladies auto-immunes
DK3849614T3 (da) 2018-09-11 2024-02-26 Ambrx Inc Interleukin-2-polypeptidkonjugater og anvendelser deraf
WO2020082057A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CA3127689A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use thereof
AU2020223031B2 (en) 2019-02-12 2024-08-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-TLR agonist conjugates
MX2022011163A (es) 2020-03-11 2022-10-18 Ambrx Inc Conjugados de polipeptidos de interleucina-2 y sus usos.
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
EP4313163A1 (en) 2021-04-03 2024-02-07 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CN119431229A (zh) * 2023-08-04 2025-02-14 华为技术有限公司 缩合剂及其在制备异硫氰酸酯中的用途
WO2026043823A2 (en) 2024-08-19 2026-02-26 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of preparation and uses thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE337223B (ro) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3619371A (en) * 1967-07-03 1971-11-09 Nat Res Dev Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
SE343210B (ro) * 1967-12-20 1972-03-06 Pharmacia Ab
DK132327A (ro) * 1968-07-16
BE758425A (fr) * 1969-12-02 1971-04-16 Baxter Laboratories Inc Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate (
DE2247163A1 (de) * 1972-09-26 1974-03-28 Merck Patent Gmbh Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4100271A (en) * 1976-02-26 1978-07-11 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
US4094744A (en) * 1976-11-18 1978-06-13 W. R. Grace & Co. Water-dispersible protein/polyurethane reaction product
US4275000A (en) * 1977-08-22 1981-06-23 National Research Development Corporation Peptide macromolecular complexes
JPS55110105A (en) * 1979-02-19 1980-08-25 Japan Atom Energy Res Inst Preparation of polymer composition containing physiologically active material
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896785A (ja) * 1981-12-04 1983-06-08 Stanley Electric Co Ltd 発光ダイオ−ドの合成樹脂レンズ成形方法
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4486344A (en) * 1983-03-28 1984-12-04 Miles Laboratories, Inc. Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method
JPS6098988A (ja) * 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4847079A (en) * 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
US5100664A (en) * 1985-09-20 1992-03-31 Cetus Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US5034514A (en) * 1986-03-17 1991-07-23 Cetus Corporation Novel cross-linking agents
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
JPH0443882Y2 (ro) * 1986-06-23 1992-10-16
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4851220A (en) * 1986-11-26 1989-07-25 Schering Corporation Stable oleaginous gel
US4871538A (en) * 1987-07-13 1989-10-03 Schering Corporation Insoluble copper-alpha interferon complex
AU611932B2 (en) * 1987-08-21 1991-06-27 Wellcome Foundation Limited, The Novel complex
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) * 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
WO1990013540A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-15 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
JP3187044B2 (ja) * 1989-12-01 2001-07-11 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
AU657311B2 (en) 1995-03-09
ES2128329T3 (es) 1999-05-16
US5747646A (en) 1998-05-05
EP0510356B1 (en) 1999-01-27
ZW4392A1 (en) 1992-09-23
CN1038035C (zh) 1998-04-15
FI921267A0 (fi) 1992-03-24
NZ248022A (en) 1993-12-23
OA09760A (fr) 1993-11-30
US5559213A (en) 1996-09-24
US5834594A (en) 1998-11-10
HU211945A9 (en) 1996-01-29
FI107927B (fi) 2001-10-31
GR3030049T3 (en) 1999-07-30
US5595732A (en) 1997-01-21
EP0510356A1 (en) 1992-10-28
HUT60512A (en) 1992-09-28
MW1892A1 (en) 1994-01-12
US5539063A (en) 1996-07-23
AU7761594A (en) 1995-01-12
MY131095A (en) 2007-07-31
US5849860A (en) 1998-12-15
IE920936A1 (en) 1992-10-07
EE9400356A (et) 1996-04-15
JPH05117300A (ja) 1993-05-14
CA2063886C (en) 2002-08-20
DE69228269T2 (de) 1999-07-08
IS3824A (is) 1992-09-26
AU671045B2 (en) 1996-08-08
BG60800B2 (bg) 1996-03-29
CN1175465A (zh) 1998-03-11
CS87192A3 (en) 1992-10-14
CA2063886A1 (en) 1992-09-26
SI9210294A (en) 1995-10-31
MX9201298A (es) 1992-10-01
CY2169B1 (en) 2002-08-23
FI20011554L (fi) 2001-07-17
NZ242084A (en) 1993-12-23
DK0510356T3 (da) 1999-09-13
CN1065465A (zh) 1992-10-21
ZA922110B (en) 1992-11-25
IL101348A0 (en) 1992-11-15
JP2637010B2 (ja) 1997-08-06
AU1316092A (en) 1992-10-01
KR920018079A (ko) 1992-10-21
NO921142L (no) 1992-09-28
HU9200955D0 (en) 1992-05-28
US5792834A (en) 1998-08-11
ATE176159T1 (de) 1999-02-15
FI20011554A7 (fi) 2001-07-17
CN1108814C (zh) 2003-05-21
BR9201015A (pt) 1992-11-24
NO921142D0 (no) 1992-03-24
FI921267L (fi) 1992-09-26
DE69228269D1 (de) 1999-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO109543B1 (ro) Compusi conjugati cu proteine, procedee pentru prepararea acestora si intermediari de sinteza
KR100295520B1 (ko) 피이지(peg)-인터페론결합체
US6709679B2 (en) Antineoplastic conjugates of transferin, albumin and polyethylene glycol
EP0862455B1 (en) Interferon-polymer conjugates and process for preparing the same
CN102145178B (zh) Peg化白介素15
RU2318004C2 (ru) Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты
PL186949B1 (pl) Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne
US20040176270A1 (en) Use of isocyanate linkers to make hydrolyzable active agent biopolymer conjugates
EP0368668A2 (en) Antibody-drug conjugates
JP2005514505A (ja) マルチアーム樹枝状および機能的なｐｅｇの調製法および用途
US20030103934A1 (en) Drugs having long-term retention in target tissue
KR100480432B1 (ko) Ｇ-ｃｓｆ와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
KR20030045416A (ko) 에리트로포이에틴과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
KR20030045413A (ko) 인터페론-알파와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체