ES2635866T5 - Enlace modificado de compuestos oligomericos y usos de los mismos - Google Patents

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Description

DESCRIPCI N
Compuestos oligomericos objetos modificados de enlace y usos de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general a los oligonucleótidos modificados químicamente para su uso en la investigación, diagnóstica y/o terapéutica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los compuestos antisentido se han utilizado para modular los ácidos nucleicos diana. Se ha informado de compuestos antisentido que comprenden una variedad de modificaciones químicas y motivos. En ciertos casos, tales compuestos son útiles como herramientas de investigación, reactivos de diagnóstico, y como agentes terapéuticos. En ciertos casos compuestos antisentido han demostrado que modulan expresión de proteínas mediante la unión a un ARN mensajero diana (ARNm) que codifica la proteína. En ciertos casos, también se ha informado de tal unión de un compuesto antisentido a sus resultados de ARNm diana en la escisión del ARNm. Los compuestos antisentido que modulan el procesamiento de una pre-ARNm. Tales compuestos antisentido alteran empalme, interfieren con la poliadenilación o previenen la formación de la 5'-tapón de un pre-ARNm.
La síntesis y propiedades bioquímicas de oligonucleótidos que contienen fosfonoacetato modificado por fósforo y desoxirribonucleótidos de tio-fosfonoacetato se han descrito en revistas científicas y literatura de patentes (véase Dellinger et al, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 940,950; Nucleic Acids Research, 2003, 31 (14), 41094118); véase también solicitudes de patentes estadounidenses publicadas (US 2004/0116687 y US 2002/0058802) y patente estadounidense US 6.693.187.
ADN o ARN que contienen oligonucleótidos comprenden esqueleto de unión de internucleosídico de alquilfosfonato se han descrito (véase patentes de Estados Unidos 5.264.423 y 5.286.717).
La síntesis de oligodeoxiribonuclcotidcs que contienen un monómero de timina de ácido nucleico de fosfonato de metilo bloqueado (LNA) ha sido descrita. Los valores de Tm de los dúplex con sus complementos de ADN o ARN también se han reportado (véase Lauritsen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 253-256).
Diversas modificaciones de enlaces de defosfono (enlaces sin el átomo de fósforo) se han sintetizado y estudiado por sus propiedades antisentido., enlaces amida aquirales no iónicos (De Mesmaeker et al., Chem. Int. Ed. Engl, 1994, 33, 226-229.; Just et al., Synlett, 1994, 137139) se han divulgado. Una relación completa de la síntesis y las propiedades de las cinco modificaciones de amida isoméricas se ha descrito (De Mesmaeker et al., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonudeotides, In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580: 2439). Gogoi et al. presentaron la síntesis de ácidos nucleicos de tioacetamido (TANA) en estudios de cadena principal y estabilidad térmica con secuencias de ADN y ARN complementarias (Gogoi et al., Chem. Commun., 2006, 2373-2375).
Varias modificaciones del esqueleto que contienen nitrógeno similares a las amidas se evaluaron como nucleósidos diméricos (Sanghvi et al., Nucleósidos Nucleotides, 1997, 16, pp. 907­ 916). Peoc'h informó que la síntesis de cuatro dímeros de oligodesoxirribonucleótidos enlazados con metileno (metilimino) (MMI) modificaron la posición 2' con fluoro y/o grupos metoxi y su incorporación en diferentes secuencias (Peoc'h et al., Nucleósidos, Nucleotides & Nucleic Acids, 23, 411-438, 2004). Enlaces amino se han sintetizado y estudiado para la absorción celular mejorada (Saha et al, Tet Lett, 1993, 34, 6017-6020; De Mesmaeker et al., J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 395-398; Caulfield et al, Bioorg Med Chem Leu 1993, 3, 2771-2776). Otros esqueletos que contienen nitrógeno incluyen oxima (Sanghvi y A, In Nucleósidos and Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents; C.K. Chu y D.C. Baker Eds.: Plenum Press: Nueva York, 1993, 311-324), metilenimino (ibid), metilenoxi (metilimino) (MOMI) (ibid), metileno (dimetilhidrazo) (MDH) (Sanghvi et al., Collect. Checa. Chem. Commun., 1993, 58, pp. 158-162), hidroxilo (metiliminometileno) (HMIM) (Sanghvi et al., 11° IRT Nucleósidos & Nucleotides, Lovaina, Bélgica, 7-11 de septiembre de 1994 (presentación en póster)), carbamato (Dabkowski et al., J Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1994, 817-829), el enlace de oxiamida (Burgess et al, J. Chem Soc Chem Commun, 1994, 20 915-916), guanidina N-sustituida (Vandendrissche et al, J. Chem Soc, 1993, 1567-1575; Pannecouque et al, Tetrahedron, 1994, 50, 7231-7246), urea (Kutterer et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 3, 435-438) y enlaces de tiourea (Vandendrissche et al., J. Chem. Soc. 1993, 1567-1575).
Síntesis de modificaciones del esqueleto que contienen azufre, tales como sulfonamida (McEIroy et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1071-1076), sulfamoílo (Dewynter et al., Acad. Sci., 1992, 315, 1675-1682), sulfonato (Huang et al., Synlett, 1993, 83-84), sulfuro (Wang et al., Chin Chem Lett, 1993, 4, 101-104; Huang et al, Synlett, 1993, 83-84; Kawai et al., Nucleic Acids Res, 1993, 21, 1473-1479; Meng et al, Angew Chem Int Ed Engl, 1993, 32, 729-731; Just et al. (1994), Synthesis and Hybridization Properties of ADN Oligomers Containing Sulfide-Linked Dinucleósidos. In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook Eds ACS Symposium Series 580; (pp.
52-65) y enlaces de sulfona (Just et al. (1994), Synthesis and Hybridization Properties of ADN Oligomers Containing Sulfide-Linked Dinucleósidos. In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; (pp. 62-65)) se han logrado por varios grupos de investigación.
Otra sustitución de columna vertebral es la formacetal y la tioformacetal relacionada (Jones et al., J. Org. Chem., 1993, 58, 2983-2991). Matteucci informó de la síntesis de análogos de oligonucleótidos con uno o más enlaces fosfodiéster que son reemplazados por un enlace de tipo formacetal/cetal (véase Patente de Estados Unidos 5.264.562).
Los compuestos oligoméricos se han preparado utilizando química Click en la que enlaces de internucleósido de fosfonato de alquinilo en un compuesto oligomérico unido a un soporte sólido se convierten en enlaces de internucleósido 1,2,3-triazolilfosfonato y luego se escindió del soporte sólido (Krishna et al, J Am Chem Soc, DOl: 10102l/ja3026714, publicado en línea el 21 de mayo de 2012).
US 6.624.293 B1 se refiere a oligonucleótidos sintéticos, modificados complementarios a, y que se dicen que son capaces de la regulación negativa de la expresión del ácido nucleico que codifica la quinasa de proteína A subunidad RIa.
WO 95/14030 A1 se refiere a oligómeros que tienen enlaces de internucleosidilo de fosfonato quiralmente puro mezclados con enlaces de internucleosidilo no fosfonato que se hibridan con secuencias de ARN diana.
Hamma Tomoko et al. (BioChemistry, 1999, 38(46), páginas 15333-15342) describe análogos oligonucleótido 15-20 nucleótidos de longitud cuyas secuencias son complementarias a nucleótidos en la horquilla superior de RNA TAR del VIH.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se prevén en la presente memoria compuestos oligoméricos separados que comprenden al menos un enlace internucleosídico modificado que tiene Fórmula 1 en la región del hueco. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en este documento se hibridan a una porción de un ARN diana que resulta en la pérdida del funcionamiento normal del ARN diana. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos descritos en este documento proporcionan una selectividad mejorada para un ARN diana. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionan potencia mejorada para un ARN diana. En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en este documento oligoméricos proporcionan una mejora en el perfil de toxicidad. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en la presente memoria proporcionan una mejora en el perfil proinflamatorio. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionan una mejor potencia y selectividad para un ARN diana. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionan potencia mejorada, selectividad y una mejora en el perfil proinflamatorio.
Las variables se definen de forma individual en mayor detalle en este documento. Es de entenderse que los compuestos oligoméricos proporcionados en este documento incluyen todas las combinaciones de las realizaciones descritas y las variables definidas en el presente documento.
La presente invención proporciona compuestos oligoméricos con huecos que comprenden una secuencia contigua de subunidades monoméricas con enlaces que tienen una región de hueco situada entre una región 5' y una región 3' en la que las regiones 5' y 3', independientemente, tienen de 2 a 8 nucleósidos de furanosilo modificados de tipo ARN contiguos que adoptan una geometría conformacional 3'-endo cuando se colocan en un compuesto oligomérico y la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas contiguas seleccionadas de l3-D-2'-deoxiribonucleósidos y nucleósidos modificados que son de tipo ADN que cada adoptan un geometría conformacional 3'-endo cuando se ponen en un compuesto oligomérico y en el que al menos uno de los grupos de enlace internucleosídico en la región de hueco o que enlazan la región de hueco y la región 5' o la región 3' tiene la Fórmula I:
Figure imgf000004_0001
en la que independientemente para cada grupo de enlace intemudeosídico que tiene la Fórmula I:
X es O o S;
Q es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo sustituido C2-C6, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, C(=O)OH o CH2C(=O)OH;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1 y OC(=O)J1; y
cada J1 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
dicho compuesto oligomérico interrumpido que tiene sólo un grupo de enlace de internucleósido de fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo dos grupos de enlace de internucleósidos de fórmula I en la región de hueco, o que tiene
Figure imgf000004_0002
sólo tres grupos de enlace de internucleósidos de fórmula I en la región de hueco.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que consisten en una secuencia contigua de subunidades monoméricas con enlaces que tienen una región de hueco situada entre una región 5' y una region 3 en la que las regiones 5' y 3', independientemente, tienen de 2 a 8 nucleósidos de furanosilo modificados de tipo ARN contiguos que adoptan una geometría 3'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas contiguas seleccionadas de l3-D-2’-deoxiribonucleósidos y nucleósidos que son de tipo ADN que adoptan una geometría 2’-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y modificada en la que al menos uno de los grupos de enlace de internucleósidos en la región de hueco o enlace de la región de hueco, y la región 5’ o la región 3’ tiene la fórmula I:
Figure imgf000004_0003
I
en la que independientemente para cada grupo de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I:
X es O o S;
Q es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, C(=O)OH o CH2C(=O)OH;-cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1 y OC(=O)J1; y
cada J1 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
dicho compuesto oligomérico de hueco que tiene sólo un grupo de enlace de internucleósido de Fórmula I en la región de hueco, o que tienen sólo dos grupos de enlace internucleosídico de fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo tres grupos de enlace internucleosídico de Fórmula I en la región de hueco.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que consisten en una secuencia contigua de subunidades monoméricas con enlaces que tienen una región de hueco situado entre una región 5' y una región 3 en la que las regiones 5’ y 3’, independientemente, tienen de 2 a 8 nucleósidos de furanosilo contiguos de tipo ARN modificados que adoptan una geometría 3’-endo conformacional cuando se pongan en un compuesto oligomérico y la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas contiguas seleccionadas de l3-D-2’-deoxiribonucleósidos y en donde al menos uno de los grupos de enlace intemudeosídico en la región de hueco o enlace a la región de hueco, y la región 5' o la región 3' tiene la fórmula I:
Figure imgf000005_0001
en la que independientemente para cada grupo de enlace de internucleósido que tiene la Fórmula I:
X es O o S;
Q es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo sustituido C2-C6, C(O)OH o CH2C(=O)OH;
cada grupo sustituido que comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1 y OC(=O)J1; y
cada J1 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
dicho compuesto oligomérico de hueco que tiene sólo un grupo de unión internucleosídico de Fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo dos grupos de enlace de internucleósido de la fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo tres grupos de enlace a internucleósidos de fórmula I de la región de hueco.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que tienen sólo un grupo de enlace de internucleósidos de la Fórmula I en la región de hueco. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos que tienen sólo dos grupos de enlace de internucleósidos de Fórmula I en la región de hueco. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos de huecos que tienen sólo tres grupos de enlace de internucleósidos de Fórmula I en la región de hueco. En ciertas realizaciones, los grupos de enlace internucleosídico que tienen la Fórmula I son contiguos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos de huecos se proporcionan con al menos dos grupos de enlace de internucleósidos de la fórmula I en la región de hueco que están separados por al menos un grupo de enlace de internucleósidos de fosforotioato o fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos de huecos en los que el grupo de enlaces internucleosídicos que enlazan la región 5’ y la región de hueco tiene la Fórmula I. En ciertas formas de realización, se proporcionan compuestos oligoméricos de huecos en los que el grupo de enlace de internucleósido de la región 5’ y la región de hueco, y el enlace internucleosídico adyacente en la región de hueco tiene la Fórmula I. En ciertas realizaciones, el grupo de enlace que une el internucleósido la región 3' y la región de hueco tiene la fórmula I. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan en el que el grupo de enlace internucleosídico que une la región 3’ y la región de hueco, y el enlace internucleosídico adyacente en la región de hueco tiene la Fórmula I. En ciertas realizaciones, el grupo de enlace de internucleósido que une la región 5’ y la región de hueco tiene la Fórmula I y el grupo de enlace internucleosídico que une la región 3' y la región de hueco tiene la Fórmula I. En ciertas formas de realización, sólo un grupo de enlace de internucleósidos de Fórmula I se encuentra en la región de hueco.
En ciertas realizaciones, cada grupo de enlace internucleosídico en las regiones 5’ y 3’ y cada grupo de enlace de internucleósidos en la región de hueco distinto de los grupos de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I es un fosfodiéster o un fosforotioato internucleósido grupo de unión. En ciertas formas de realización, cada grupo de enlace internucleosídico que se une en las regiones 5' y 3' y cada grupo de enlace internucleosídico en la región de hueco distinta de los grupos de enlace de internucleósidos que tienen la Fórmula I es un grupo de enlace de internucleósidos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada grupo de enlace de internucleósidos en regiones 5’ y 3’ y cada grupo de enlace de internucleósidos en la región de hueco distinta de los grupos de enlace internucleosídico que tienen la Fórmula I es un grupo internucleosídico de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos, en los que cada subunidad de monómero comprende una base heterocíclica seleccionada independientemente de una purina opcionalmente protegida, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, cada subunidad de monómeros comprende una base heterocíclica seleccionada independientemente de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina o 2-N-isobutirilguanina.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos en los que cada Q es, independientemente, entre alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, C(O)oH y CH2C(O)OH. En ciertas realizaciones, cada Q es, independientemente, seleccionado entre CH3, C(=O)OH, CH2C(=O)OH, (CH2)2OCH3, CH=CH2, CH2CHCH2 y C=CH. En ciertas realizaciones, cada Q es CH2C(=O)OH. En ciertas realizaciones, cada Q es CH3. En ciertas realizaciones, cada Q es C=CH.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan en los que cada X es 0. En ciertas realizaciones, cada X es S.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos están dentro de la quiralidad de cada grupo de enlace de internucleósidos que tiene la Fórmula I es Rp. En ciertas realizaciones, la quiralidad de cada grupo de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I es Sp.
En ciertas realizaciones, cada nucleósido modificado en regiones 5' y 3' proporciona una mayor afinidad de hibridación para una diana de ARN en comparación con un nucleósido no modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido modificado en regiones 5' y 3' comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido modificado en regiones 5' y 3' es, independientemente, un nucleósido bicíclico que comprende un resto de azúcar de furanosilo bicíclico o un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar de furanosilo que tiene al menos un grupo sustituyente.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos en los que las regiones 5' y 3' comprenden uno o más nucleósidos modificados en 2' que tienen cada uno un grupo 2'-sustituyente seleccionado independientemente de halógeno, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2CH=CH2, O(CH2)2OCH3, -O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R3)(R4), O(CH2)2-ON(R3)(R4), O(CH2)2O(CH2)2N(R3)(R4), OCH2C(=O)N(R4)(R4), OCH2C(=O)N(R5)-(CH2)2N(R3)(R4) y O(CH2)2N(R5)-C(=NR6)[N(R3)(R4)] en la que R3, R4, R5 y Ra son cada uno, independientemente, H y alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, cada grupo 2'-sustituyente se selecciona independientemente de F, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2CH=CH2, -O(CH2)2OCH3, -O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)N(H)CH3, OCH2C(=O)N(H)-(CH2)2-N(CH3)2 y OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. En ciertas realizaciones, cada grupo 2'-sustituyente se selecciona independientemente de F, OCH3, -O(CH2)2OCH3 y OCH2C(=O)N(H)CH3. En ciertas realizaciones, cada grupo 2'-sustituyente es -O(CH2)2OCH3.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos en los que el las regiones 5' y 3' comprenden uno o más nucleósidos bicíclicos que tienen cada uno un grupo puente entre los átomos de carbono 4' y 2' del anillo de furanosilo independientemente seleccionado de 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)2-O-2', 4'-CH2-N(OCH3)-2', 4'-CH2-O-N(CH3)-2', 4'-CH2NCH3-O-2', 4'-CH2C(H)-(CH3)-2' y 4'-CH2C(=CH2)-2'. En ciertas realizaciones, cada uno de los grupos de puente se seleccionan independientemente de 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-NCH3-O-2', 4'-CH2C(H)-(CH3)-2' y 4'-CH2-C(=CH2)-2'. En ciertas realizaciones, cada grupo de puente es 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2'.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan en los que los restos de azúcar de cada nucleósido modificado en regiones 5' y 3' son los mismos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan comprendiendo al menos dos tipos diferentes de nucleósidos modificados en las regiones 5' y 3' en las que los diferentes tipos de nucleósidos modificados tienen por lo menos diferentes restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, los diferentes tipos de nucleósidos modificados incluyen nucleósidos bicíclicos que comprenden restos de azúcar de furanosilo bicíclico y nucleósidos modificados que comprenden restos de azúcar de furanosilo que tienen al menos un grupo sustituyente. En ciertas formas de realización, los diferentes tipos de nucleósidos modificados incluyen 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' nucleósidos bicíclicos y 2'-O(CH2)2-OCH3 nucleósidos sustituidos. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' incluyen sólo 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' nucleósidos bicíclicos y 2'-O(CH2)2OCH3 nucleósidos sustituidos.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos en los que uno o más nucleósidos modificados en regiones 5' y 3' comprenden un sustituto de azúcar. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos, en los que cada subunidad de monómero en la región de hueco es un l3-D-2'-deoxiribonucleósido. En ciertas realizaciones, al menos una subunidad de monómeros en la región de hueco es un nucleósido modificado que es de tipo ADN. En ciertas realizaciones, cada nucleósido modificado que es de tipo ADN es un nucleósido modificado 2'-(ara)-F.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos en los que las regiones 5' y 3' cada uno, independientemente, tienen de 2 a 8 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 3 a 6 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, la región de hueco tiene de 8 a 10 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 3 a 6 subunidades monoméricas y la región de hueco tiene de 8 a 14 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 3 a 6 subunidades monoméricas y la región de hueco tiene de 6 a 10 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 3 a 6 subunidades monoméricas y la región de hueco tiene de 6 a 8 subunidades monoméricas. En ciertas realizaciones, las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 4 a 5 subunidades de monómero y la región de hueco tiene de 7 a 8 subunidades monoméricas.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que al menos un nucleósido modificado en regiones 5' y 3' es distinto de un nucleósido 2'-OCH3 sustituido o un 2'-O-CH2-4 nucleósido bicíclico puenteado.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan que incluyen un grupo terminal 5'. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que incluyen un grupo terminal 3'. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan que incluyen al menos un grupo terminal 5' o 3'.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados en este documento son distintos de los compuestos oligoméricos con huecos enumerados a continuación:
SEQ ID NO. Secuencia Química de hueco alas 5'/3'
ISIS #
05/558257 TeAkAkATTpGTCATCAkCkCe -(P(=0)(CH3))- ekk kke 05/558256 TeAkAkATpT GT CATC AkCkCe -(P(=0)(CH3))- ekk kke 05/558255 TeAkAkApTTGTCATCAkCkCe -(P(=0)(CH3))- ekk kke 05/571123 TeAeAeAkTkTpGTmCATmCAkmCkmCe -(P(=0)(CH3))- eeekk kke 05/571124 TeAeAeAkxTTpGTmCATmCeAkmCkmC -(P(=0)(CH3))- eeek kke 05/579854 TeAeAeAkTTpGTmCATmCAkmCkmCe -(P(=0)(CH3))- eeek kke 09/571171 AeTkAeAkATTpGTmCATmCAkmCemCkAe -(P(=0)(CH3))- ekek keke 09/571041 AeTkAeAkAxTTpGTmCATmCAkmCemCkAe -(P(=0)(CH3))- ekek keke
En donde a menos que se indique lo contrario cada enlace internucleósido es un fosforotioato. Cada "XT" es un nucleósido modificado 2-tio-timidina. Un subíndice "p" indica un enlace internucleosídico de fosfonato de metilo (-(P(=O)(CH3))-). Nucleósidos no seguidos de un subíndice son desoxirribonucleósidos. Nucleósidos seguidos por un subíndice "e" son nucleósidos modificados 2'-O-metoxietilo (MOE). Nucleósidos seguidos de un subíndice "k" son nucleósidos modificados bicíclicos 6'-(S)-CH3 (cEt). Cada "mC" es un nucleósido modificado por citosina 5-metilo.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados en este documento son distintos de compuestos oligoméricos de huecos complementarios a al menos una región de un ácido nucleico que es un transcrito del gen de huntingtina. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados aquí son distintos de los compuestos oligoméricos con huecos complementarios a al menos una región de un ácido nucleico que comprende un polimorfismo de nucleótido único. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados en este documento son diferentes de los compuestos oligoméricos con huecos complementarios a al menos una región de un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico diana que comprende un polimorfismo de nucleótido único de un transcrito de gen de huntingtina. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados en este documento son distintos de los compuestos oligoméricos con huecos complementaria a al menos una región de un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico diana que comprende un polimorfismo de nucleótido único de un transcrito de gen distinto de huntingtina.
En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos para inhibir la expresión génica que comprende poner en contacto una o más células, un tejido o un animal con un compuesto oligomérico como se proporciona aquí en el que dicho compuesto oligomérico es complementario a un ARN diana. En ciertas realizaciones, las células están en un ser humano. En ciertas realizaciones, el ARN diana es ARNm humano. En ciertas realizaciones, el ARN diana se escinde inhibiendo de este modo su función.
En ciertas realizaciones, los métodos in vitro de la inhibición de la expresión génica se proporcionan, comprendiendo la puesta en contacto de una o más células o un tejido con un compuesto oligomérico como se proporciona aquí.
En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico como se proporciona aquí se utiliza en un método de inhibición in vivo de la expresión génica dicho método comprendiendo la puesta en contacto de una o más células, un tejido o un animal con un compuesto oligomérico como se proporciona aquí.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos como se proporcionan aquí se utilizan en la terapia médica.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Se proporcionan aquí compuestos oligoméricos con huecos modificados por enlace. Dichos compuestos oligoméricos con huecos comprenden una secuencia contigua de subunidades monoméricas con enlaces que tienen una región de hueco situada entre una región 5' y una región 3' donde las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 2 a 8 nucleósidos de furanosilo contiguos modificados de tipo ARN que adoptan una geometría 3'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas contiguas seleccionadas de l3-D-2'-deoxiribonucleósidos y nucleósidos modificados que son de tipo ADN que adoptan una geometría 2'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y en donde al menos uno de los grupos de unión internucleosídico en la región de hueco o entre la región de hueco y la región 5' o la región 3' tiene la fórmula I:
Figure imgf000008_0001
en la que independientemente para cada grupo de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I:
X es O o S;
Q es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, C(=O)OH o CH2C(=O)OH;
cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1 y OC(=O)Ji; y
cada J1 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
dicho compuesto oligomérico interrumpido que tiene sólo un grupo de enlace de internucleósido de fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo dos grupos de enlace a internucleósido de fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo tres grupos de enlace de internucleósidos de Fórmula I en la región de hueco.
Se ha demostrado que los compuestos oligoméricos con huecos proporcionados en este documento tienen propiedades mejoradas. En ciertas realizaciones, la actividad de un compuesto oligomérico de huecos no modificados de otro modo frente a un ácido nucleico diana se mejora mediante la incorporación de al menos un grupo de enlace internucleosídico que tiene una Fórmula I en la región de hueco. En ciertas realizaciones, al menos un grupo de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I se encuentra en la unión de hueco en el lado 5' en el que el enlace internucleosídico separa la región de hueco de la zona del ala. En ciertas realizaciones, al menos un grupo de enlace internucleósido que tiene la Fórmula I se encuentra en la unión de hueco en el lado 3'. Como se indica en los datos in vitro e in vivo, proporcionados en la sección de ejemplos en el presente documento, tales propiedades incluyen selectividad, potencia, mejor perfil de toxicidad y o un perfil proinflamatorio mejorado.
En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto oligomérico con huecos de interés y luego una serie de compuestos oligoméricos idénticos se preparan con un solo grupo de enlace internudeosídico que tiene la Fórmula I en toda la región de hueco. Si hay 8 subunidades monoméricas en el hueco entonces habrá 8 compuestos oligoméricos preparados, con el grupo de enlace de internucleósido que tiene la Fórmula I situado en una posición diferente en cada uno de los compuestos oligoméricos que se analizan posteriormente en uno o más ensayos como se ilustra en el presente documento para determinar el plomo de la serie.
En ciertas realizaciones, grupos internucleosídicos adicionale que tienen la Fórmula I están incorporados en la región de hueco de compuesto oligomérico de plomo y se ensayaron en uno o más ensayos como se ilustra en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto de plomo se funcionaliza adicionalmente con uno o más grupos terminales tales como, por ejemplo, un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto oligomérico de huecos de interés y luego una serie de compuestos oligoméricos idénticos se preparan con los bloques de al menos dos grupos de enlace internucleosídico que tienen la Fórmula I en toda la región de hueco.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que tienen una respuesta proinflamatoria reducida cuando se compara con compuestos oligoméricos con huecos no modificados. Como se muestra mediante el uso de un ensayo hPBMC in vitro (Ejemplo 21), un compuesto oligomérico de hueco que tiene enlaces internucleosídicos de tiofosfonato de metilo alterno (-P(CH3)(=S)-) en el hueco redujo la respuesta proinflamatoria en comparación con el compuesto oligomérico idéntico sin los enlaces de internucleósido modificados.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que tieen potencia mejorada (CI50) y la selectividad en comparación con los compuestos oligoméricos con huecos no modificados. Como se muestra mediante el uso de un ensayo in vitro HTT SNP (Ejemplo 23), un compuesto oligomérico con huecos que tiene un único enlace de internucleósido de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)-) en el hueco, ya sea en la posición 4 o 5 desde el extremo 5', mostró CI50 menor y mayor selectividad en comparación con un compuesto idéntico oligomérico sin los enlaces de internucleósido modificados.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que tienen una mejor selectividad con una potencia comparable (CI50) en comparación con compuestos oligoméricos con huecos no modificados. Como se muestra usando un ensayo in vitro HTT SNP (Ejemplo 24), un compuesto oligomérico con huecos tiene uno o dos fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)) o un enlace de internucleósido de fosfonoacetato (-P(CH2CO2)(=O)) en el hueco típicamente mostraron una mayor selectividad con una potencia comparable o ligeramente inferior.
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que tienen una mejor selectividad con una potencia comparable (CI50) cuando se compara con un compuesto oligomérico con huecos sin modificar. Como se muestra usando un ensayo in vitro HTT SNP (Ejemplo 25) , un compuesto oligómero con huecos que tiene uno o dos enlaces de internucleósido de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)) en el hueco típicamente mostraron una mayor selectividad con una potencia comparable o ligeramente inferior. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos de huecos que tienen perfiles de hepatotoxicidad mejorados en comparación con compuestos oligoméricos con huecos no modificados. Como se muestra en ensayos in vivo PTEN y SRB-1 (Ejemplo 26) , un compuesto oligomérico de huecos teniendo dos enlaces de internucleósido de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)) en el extremo 5' del hueco y el enlace al ala 5' bajó la ALT en comparación con los compuestos oligoméricos no modificados. La actividad y pesos de órganos son similares para el ensayo SRB-1. La actividad se reduce para el compuesto oligomérico modificado en el ensayo de PTEN. También para el ensayo de PTEN el hígado está ligeramente elevado para el compuesto oligomérico de hueco modificado mientras que para el compuesto oligomérico no modificado el hígado y los pesos del bazo son elevados.
Es de entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reivindica. En este documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" y "incluido", no es limitativo. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad y los elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito.
A. Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquellos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Las técnicas estándar se pueden utilizar para la síntesis química, y análisis químico. Ciertos de tales procedimientos y técnicas se pueden encontrar por ejemplo en "Carbohydrate Modifications in Antisense Researcg" Editado por Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington DC, 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications", editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados: Tal como se usa en este documento, "modificación química" significa una diferencia química en un compuesto cuando en comparación con un homólogo que se produce de forma natural. Las modificaciones químicas de oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluyendo modificaciones del resto de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlace internucleosídico. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias sólo en la secuencia de nucleobase.
Tal como se usa en este documento, "furanosilo" significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar de origen natural" significa un ribofuranosilo como se encuentra en ARN de origen natural o un 2'-deoxiribofuranosilo como se encuentra en ADN de forma natural.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar" significa un resto de azúcar de origen natural o un resto de azúcar modificado de un nucleósido.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar modificado" significa un resto de azúcar sustituido o un sustituto de azúcar.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar sustituido" significa un furanosilo que no es un resto de azúcar natural. Restos de azúcar sustituidos incluyen, pero no se limitan a furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Ciertos restos de azúcar sustituidos son restos de azúcar bicíclicos.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar 2'-sustituido" significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto a H u OH. A menos que se indique lo contrario, un resto de azúcar 2'-sustituido no es un resto de azúcar bicíclico (es decir, el 2'-sustituyente de un resto de azúcar 2'-sustituido no forma un puente a otro átomo del anillo de furanosilo.
Tal como se usa en este documento, "MOE" significa OCH2CH2OCH3.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido 2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un flúor que comprende azúcar en la posición 2'. A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido 2'-F se encuentra en la posición ribo (en sustitución del OH de una ribosa natural).
Tal como se usa en este documento, "2'-(ara)-F" se refiere a un nucleósido 2'-F sustituido, en el que el grupo fluoro está en la posición de arabino.
Tal como se utiliza aquí, el término "sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un anillo de furanosilo y que es capaz de reemplazar el resto de azúcar de origen natural de un nucleósido, de tal manera que las subunidades de nucleósido resultante o subunidades monoméricas son capaces de vincularse entre sí y/o ligarse a otros nucleósidos u otras subunidades monoméricas para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridarse a un compuesto oligomérico complementario tal como un ácido nucleico diana. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número diferente de átomos que furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6, o 7 miembros); sustitución del átomo de oxígeno de un furanosilo con un átomo sin oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre, o nitrógeno, en el que la sustitución del átomo de oxígeno con azufre en furanosa se considera generalmente un nucleósido modificado en lugar de un sustituto de azúcar, pero puede ser considerado); o tanto un cambio en el número de átomos y un reemplazo del oxígeno. Tales estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para restos de azúcar sustituidos (por ejemplo, sustitutos de azúcar bicíclicos carbocíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales. Sustitutos de azúcar también incluyen sustituciones más complejas de azúcar (por ejemplo, los sistemas no de anillo de ácido nucleico peptídico). sustitutos de azúcar incluyen, sin limitación, los morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
Tal como se usa en este documento, "resto de azúcar bicíclico" significa un resto de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (incluyendo pero no limitado a un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que resulta en una estructura bicíclica. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En ciertas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En ciertas de dichas realizaciones, el puente conecta la 2'-carbono y 4'-carbono del furanosilo.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido" se refiere a un compuesto que comprende un resto de nucleobase y un resto de azúcar. Nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, los nucleósidos de origen natural (como se encuentra en ADN y ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar enlazados a un resto fosfato.
Tal como se usa en el presente documento, "nucleótido" significa un nucleósido que comprende además un grupo de enlace fosfato. Tal como se usa en este documento, "enlaces de nucleósidos" pueden o no estar unidos por enlaces de fosfato y por lo tanto incluye, pero no se limita a "nucleótidos unidos." Tal como se usa en el presente documento, "nucleósidos ligados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no hay nucleósidos adicionales presentes entre los que están vinculados).
Tal como se utiliza aquí, el término "nucleobase" generalmente se refiere a la nucleobase de un nucleósido o nucleósido modificado. El término "resto de base heterocíclica" es más amplio que el término nucleobase en que incluye cualquier base heterocíclica que puede ser unida a un azúcar para preparar un nucleósido de nucleósido o modificado. Tales restos de bases heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a nucleobases de origen natural (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y formas protegidas de nucleobases no modificadas (4-N-benzoilcitosina, 6-N-benzoiladenina y 2-N-isobutirilguanina), así como (citosina 5-metilo) modificado o restos de bases heterocíclicas no naturales y miméticos sintéticos de los mismos (tales como por ejemplo fenoxazinas).
Tal como se utiliza aquí, el término "nucleósido modificado" se refiere a un nucleósido que comprende una base heterocíclica modificada y/o un resto del azúcar distinto de ribosa y 2'-deoxiribosa. En ciertas realizaciones, un nucleósido modificado comprende un resto de base heterocíclica modificada. En ciertas formas de realización, un nucleósido modificado comprende un resto de azúcar que no sea ribosa y 2'-deoxiribosa. En ciertas realizaciones, un nucleósido modificado comprende un resto de base heterocíclica modificada y un resto de azúcar que no sea ribosa y 2'-deoxiribosa. El término "nucleósido modificado" pretende incluir todo tipo de nucleósidos modificados que se pueden incorporar en un compuesto oligomérico utilizando protocolos de síntesis de oligómero estándar. Nucleósidos modificados incluyen nucleósidos abásicos pero en general un resto de base heterocíclica se incluye para la hibridación con una diana de ácido nucleico complementario.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados incluyen una furanosa o grupo de azúcar de furanosa modificado tal como un análogo 4'S (nucleósido 4'-S modificado y 4'-S-ribonucleósido se refieren a la sustitución del átomo de oxígeno de furanosa con S). Tales nucleósidos modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos sustituidos (tales como 2', 5', y/o 4' nucleósidos sustituidos) 4'-S-nucleósidos modificados, (tales como 4'-S-ribonucleósidos, 4'-S-2'-deoxiribonucleósidos y 4'-S-2'-ribonucleósidos sustituidos), nucleósidos bicíclicos modificados (tales como 2'-OCH(CH3)-4', 2'-O-CH2-4' o 2'-O(CH2)2-4' puenteados análogos de furanosa) y base modificada de nucleósidos. El azúcar puede ser modificado con más de una de estas modificaciones enumeradas tal como por ejemplo un nucleósido bicíclico modificado que incluye además una sustitución 5' o un nucleósido 5' o 4' sustituido que incluye además un sustituyente 2'. El término nucleósido modificado también incluye combinaciones de estas modificaciones tales como base y nucleósidos modificados en el azúcar. Estas modificaciones están destinadas a ser ilustrativas y no exhaustivas como otras modificaciones son conocidas en la técnica y también se contemplan como posibles modificaciones para los nucleósidos modificados descritos en este documento.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden un sustituto de azúcar en el que el anillo de furanosa ha sido sustituido por un sistema de anillos mono o policíclico o un sustituto de azúcar no cíclico tal como el utilizado en los ácidos nucleicos peptídicos. Ejemplos ilustrativos de restos de azúcar para tales nucleósidos modificados incluyen sin limitación morfolino, hexitol, ciclohexenilo, 2.2.2 y 3.2.1 ciclohexosa y los grupos no cíclicos abiertos.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar no natural y un resto de base heterocíclica modificada. Tales nucleósidos modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos modificados en los que el resto de base heterocíclica se reemplaza con un resto de fenoxazina (por ejemplo, el grupo 9-(2-aminoetoxi)-1,3-diazafenoxazina-2-ona, también referido como una pinza G que forma cuatro enlaces de hidrógeno cuando se hibrida con una base de guanosina) y más en sustitución del resto de azúcar con un grupo sustituto de azúcar tal como por ejemplo un morfolino, un ciclohexenilo o un biciclo[3.1.0]hexilo.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido bicíclico" o "BNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido de etilo constreñido" o "cEt" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'. En ciertas realizaciones, el cEt comprende un puente 4'-CH((S)-CH3)-O-2'. En ciertas realizaciones, el cEt comprende un puente 4'-CH((R)-CH3)-O-2'.
Tal como se usa en el presente documento, "nucleósido de ácido nucleico bloqueado" o "LNA" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un 4 -CH2-O-2'puente.
Tal como se usa en este documento, "2'-nucleósido sustituido" se refiere a un nucleósido de ribofuranosilo que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido 2'-sustituido no es un nucleósido bicíclico.
Tal como se usa en este documento, "2'-deoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-H(H) furanosilo, como se encuentra en desoxirribonucleósidos que se producen naturalmente (ADN). En ciertas realizaciones, un 2'-deoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o pueden comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
Tal como se usa en este documento, "nucleósido de tipo ARN" significa un otro nucleósido modificado que un nucleósido 13-D-ribosa que proporciona un duplex A-forma (northern) cuando se incorporan en un compuesto oligomérico y dúplex con un ARN complementario. nucleósidos de tipo ARN se utilizan como sustitutos de los nucleósidos de ARN en los compuestos oligoméricos para mejorar una o más propiedades tal como, por ejemplo, resistencia a la nucleasa y/o afinidad de hibridación. Nucleósidos de tipo ARN incluyen, pero no se limitan a nucleósidos de furanosilo modificados que adoptan una geometría 3'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico. Nucleósidos de tipo ARN también incluyen sustitutos de ARN tales como FHNA. Nucleósidos de tipo ARN incluyen pero no se limitan a nucleósidos modificados que comprenden un grupo 2'-sustituyente seleccionado de F, O(CH2)2OCH3-(MOE) y OCH3.
Nucleósidos de tipo ARN también incluyen, pero no se limitan a nucleósidos modificados que comprenden resto de azúcar bicíclico de furanosilo que comprende un grupo puente 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-C(H)[(R)-CH3]-O-2' o 4'-C(H)[(S)-CH3]-O-2'.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido de tipo ADN" significa un nucleósido modificado que no sea un IJ-D-2'-nucleósido de doxiribosa que proporciona un dúplex B-forma (southern) cuando se incorpora en un compuesto oligomérico y dúplex con un ADN complementario. Nucleósidos de tipo ADN proporcionan un duplex intermedio cuando se incorpora en un compuesto oligomérico y dúplex con un ARN complementario que se encuentra entre A-forma y B-forma. Nucleósidos de tipo ADN Tal como se utilizan como sustitutos de los nucleósidos de ADN en los compuestos oligoméricos para mejorar una o más propiedades. Nucleósidos de tipo ADN incluyen, pero no se limitan a nucleósidos modificados que adoptan una geometría 2'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico.
Tal como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos no modificados (ARN) y/o desoxirribonucleósidos no modificados (ADN) y/o uno o más nucleósidos modificados.
Tal como se usa en el presente documento "oligonucleósido" significa un oligonucleótido en el que ninguno de los enlaces de internucleósido contiene un átomo de fósforo. Tal como se usa en el presente documento, los oligonucleótidos incluyen oligonucleósidos.
Tal como se usa en este documento, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleósido modificado y/o al menos un enlace internucleosídico modificado.
Tal como se usa en el presente documento "enlace internucleosídico" significa un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido.
Tal como se usa en el presente documento, "enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace de fosfodiéster 3' a 5'.
Tal como se usa en el presente documento, "enlace internucleosídico modificado" significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico de origen natural.
Tal como se utiliza aquí, el término "subunidad de monómero" se entiende que incluye todo tipo de monómeros que son susceptibles de síntesis de oligómeros. En general, una subunidad monomérica incluye al menos un resto de azúcar que tiene al menos dos sitios reactivos que pueden formar enlaces con otras subunidades monoméricas. Esencialmente todas las subunidades de monómero incluyen un resto de base heterocíclica que es hibridable a un sitio complementario en una diana de ácido nucleico. Sitios reactivos en subunidades monoméricas situadas en los extremos de un compuesto oligomérico pueden ser protegidas o no protegidas (generalmente OH) o pueden formar un archivo adjunto a un grupo terminal (conjugado o de otro grupo). Subunidades monoméricas incluyen, sin limitación, nucleósidos y nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, subunidades monoméricas incluyen nucleósidos tales como ribonucleósidos y l3-D-2’-deoxiribnucleósidos y nucleósidos modificados incluyen pero no se limitan a nucleósidos sustituidos (tales como nucleósidos sustituidos 2', 5' y bis), 4’-S-nucleósidos modificados (tales como 4’-S-ribonucleósidos, 4’-S-2’-deoxiribonucleósidos y 4’-S-2’-ribonucleósidos sustituido), nucleósidos modificados bicíclicos (tales como nucleósidos bicíclicos en los que el resto de azúcar tiene un grupo puente 2’-O-CHRa-4’, en el que Ra es H, alquilo o alquilo sustituido), otros nucleósidos modificados y nucleósidos que tienen sustitutos de azúcar.
Tal como se usa en el presente documento, "conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidos, incluyendo, pero no limitado a farmacodinámica, farmacocinética, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o propiedades de aclaramiento.
Tal como se usa en el presente documento, "grupo de enlace de conjugado" significa cualquier átomo o grupo de átomos usado para enlazar un conjugado de un oligonucleótido o compuesto oligomérico.
Tal como se usa en el presente documento, "compuesto antisentido" significa un compuesto que comprende o consiste de un oligonucleótido o un compuesto oligomérico en el que al menos una parte de los cuales es complementaria a una diana de ácido nucleico a la que es capaz de hibridarse, lo que resulta en al menos una actividad antisentido.
Tal como se utiliza aquí, "actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o cuantificable atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana.
Tal como se usa en este documento, "detectar" o "medir" significa que una prueba o ensayo para detectar o medir se lleva a cabo. Dicha detección y/o medición puede resultar en un valor de cero. Por lo tanto, si una prueba para la detección o medición resulta en una constatación de no actividad (actividad de cero), la etapa de detección o medición de la actividad, sin embargo, se ha realizado.
Tal como se usa en este documento, "actividad detectable y/o medible" significa una actividad estadísticamente significativa que no es cero.
Tal como se usa aquí, "esencialmente sin cambios" significa poco o ningún cambio en un parámetro determinado, en particular con relación a otro parámetro que cambia mucho más. En ciertas realizaciones, un parámetro es esencialmente sin cambios cuando se cambia menos del 5%. En ciertas realizaciones, un parámetro es esencialmente sin cambios si cambia menos del doble, mientras que otro parámetro cambia al menos diez veces. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico diana. En ciertas de dichas realizaciones, la cantidad de un ácido nucleico no diana es esencialmente sin cambios si cambia mucho menos que el ácido nucleico diana, pero el cambio no tiene que ser cero.
Tal como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso por el cual un gen en última instancia resulta en una proteína. La expresión incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional (por ejemplo, corte y empalme, de poliadenilación, la adición de 5'-tapón), y el traslado.
Tal como se usa en este documento, "ácido nucleico diana" se refiere a una molécula de ácido nucleico al que se hibrida un compuesto antisentido.
Tal como se usa en este documento, "ARNm" significa una molécula de ARN que codifica una proteína.
Tal como se usa en este documento, "pre-ARNm" significa un transcrito de ARN que no ha sido completamente procesado en ARNm. Pre-ARN incluye uno o más intrón. Tal como se usa en el presente documento, "objeto de ARN" se refiere a una molécula de ARN que no sea un ARN diana, la cantidad, la actividad, el empalme, y/o la función de que se modula, ya sea directa o indirectamente, por un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico diana modula empalme de un ARN objeto. En ciertas de dichas realizaciones, un compuesto antisentido modula la cantidad o actividad del ácido nucleico diana, lo que resulta en un cambio en el corte y empalme de un ARN objetivo y en última instancia resulta en un cambio en la actividad o función del ARN objeto.
Tal como se usa en este documento, "microARN" significa un ARN de origen natural, pequeño, no codificante que reprime la expresión de genes de al menos un ARNm. En ciertas realizaciones, un microARN reprime la expresión de genes mediante la unión a un sitio diana dentro de la región no traducida 3' de un ARNm. En ciertas realizaciones, un microARN tiene una secuencia de nucleobase como se expone en miRBase, una base de datos de secuencias publicadas microARN encontradas en http://microma.sanger.ac.uk/sequencies/. En ciertas realizaciones, un microARN tiene una secuencia de nucleobase como se expone en miRBase versión 12.0 liberado de septiembre de 2008.
Tal como se usa en este documento, "imitador microARN" significa un compuesto oligomérico que tiene una secuencia que es al menos parcialmente idéntica a la de un microARN. En ciertas realizaciones, un imitador microARN comprende la región semilla microARN de un microARN. En ciertas realizaciones, un imitador microARN modula el traslado de más de un ácidos nucleico diana. En ciertas realizaciones, un imitador de microARN es de doble cadena.
Tal como se usa en este documento, "nucleobase diferenciadoraa" significa una nucleobase que se diferencia entre dos ácidos nucleicos. En ciertos casos, una región diana de un ácido nucleico diana difiere por 1-4 nucleobases de un ácido nucleico no diana. Cada una de esas diferencias se conoce como una base nitrogenada diferenciadora. En ciertos casos, una nucleobase diferenciadora es un polimorfismo singlenucleotide.
Tal como se usa en este documento, "nucleósido selectivo de diana" significa un nucleósido de un compuesto antisentido que corresponde a una nucleobase de diferenciación de un ácido nucleico diana.
Tal como se usa en este documento, "alelo" significa uno de un par de copias de un gen existente en un locus particular o marcador en un cromosoma específico, o un miembro de un par de nucleobases existentes en un locus particular, o marcador en un cromosoma específico, o un miembro de un par de secuencias de nucleobases existentes en un locus particular, o marcador en un cromosoma específico. Para un organismo diploide o célula o para los cromosomas autosómicos, cada par alélico normalmente ocupa posiciones correspondientes (loci) en un par de cromosomas homólogos, uno heredado de la madre y uno heredado del padre. Si estos alelos son idénticos, el organismo o célula se dice que es "homocigoto" para ese alelo; si difieren, se dice que el organismo o célula es "heterocigoto" para ese alelo. "Alelo de tipo silvestre" se refiere al genotipo normalmente no asociado con la enfermedad o disfunción del producto génico. "Alelo mutante" se refiere al genotipo asociado con la enfermedad o disfunción del producto génico.
Tal como se usa en el presente documento, "variante alélica" significa una identidad particular de un alelo, donde se produce más de una identidad. Por ejemplo, una variante alélica puede referirse al alelo mutante o al alelo de tipo silvestre. Tal como se usa en este documento, "polimorfismo de nucleótido único" o "SNP" significa una única variación de nucleótidos entre los genomas de individuos de la misma especie. En algunos casos, un SNP puede ser una única deleción o inserción de nucleótidos. En general, los SNPs ocurren con relativa frecuencia en los genomas y, por tanto contribuyen a la diversidad genética. La ubicación de un SNP es generalmente flanqueada por secuencias altamente conservadas. Un individuo puede ser homocigoto o heterocigoto para un alelo en cada sitio de SNP.
Tal como se usa en este documento, "sitio de polimorfismo de nucleótido único" o "sitio de SNP" se refiere a los nucleótidos que rodean un SNP contenido en un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido.
Tal como se usa en este documento, "orientación" o "orientado a" se refiere a la asociación de un compuesto antisentido a una molécula diana particular de ácido nucleico o una región particular de una molécula de ácido nucleico diana. Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico diana si es suficientemente complementario al ácido nucleico diana para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.
Tal como se usa en el presente documento, "complementariedad de nucleobase" o "complementariedad", cuando en referencia a nucleobases significa una nucleobase que es capaz de apareamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria de la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria a uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de apareamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es complementaria a ese par de nucleobase. Las nucleobases que comprenden ciertas modificaciones pueden mantener la capacidad de par con una nucleobase homóloga y, por tanto, son todavía capaces de complementariedad de nucleobase.
Tal como se usa en el presente documento, "no complementario" en referencia a nucleobases significa un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí.
Tal como se usa en el presente documento, "complementario" en referencia a los compuestos oligoméricos (por ejemplo, nucleósidos vinculados, oligonucleótidos, o ácidos nucleicos) significa la capacidad de tales compuestos o regiones oligoméricas de los mismos para hibridar con otro compuesto oligomérico o zona a través de la complementariedad de nucleobase en condiciones rigurosas. Compuestos oligoméricos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobase en cada nucleósido. Más bien, algunos desajustes son tolerados. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos complementarios o regiones son complementarios en un 70% de las nucleobases (70% complementarias). En ciertas realizaciones, compuestos oligoméricos complementarios o regiones son 80% complementarias. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos complementarios o regiones son 90% complementarias. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos complementarios o regiones son 95% complementarias.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos complementarios o regiones son 100% complementarias.
Tal como se usa en este documento, "desajuste" significa una nucleobase de un primer compuesto oligomérico que no es capaz de aparearse con una nucleobase en una posición correspondiente de un segundo compuesto oligomérico, cuando el primer y segundo compuesto oligomérico están alineados. Cualquiera o ambas del primer y segundo compuesto oligomérico pueden ser oligonucleótidos.
Tal como se usa en el presente documento, "hibridación" significa el apareamiento de compuestos oligoméricos complementarios (por ejemplo, un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no se limita a un determinado mecanismo, el mecanismo más común de apareamiento implica enlaces de hidrógeno, que puede ser Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno de Hoogsteen inverso, entre nucleobases complementarias.
Tal como se usa en este documento, "hibrida específicamente" significa la capacidad de un compuesto oligomérico para hibridar con un sitio de ácidos nucleicos con mayor afinidad de lo que se hibrida con otro sitio del ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido hibrida específicamente con más de un sitio de objetivo.
Tal como se usa en este documento, "totalmente complementario" en referencia a un oligonucleótido o parte del mismo, significa que cada nucleobase del oligonucleótido o parte del mismo es capaz de aparearse con una nucleobase de un ácido nucleico complementario o porción contigua de la misma. Por lo tanto, una región totalmente complementaria comprende sin falta de coincidencias o nucleobases no hibridadas en cualquiera de cualquiera de las hebras.
Tal como se usa en este documento, "complementariedad porcentual" significa el porcentaje de nucleobases de un compuesto oligomérico que son complementarios a una porción de igual longitud de un ácido nucleico diana. La complementariedad porcentual se calcula dividiendo el número de nucleobases del compuesto oligomérico que son complementarias a nucleobases en posiciones correspondientes en el ácido nucleico diana por la longitud total del compuesto oligomérico.
Tal como se usa en este documento, "porcentaje de identidad" significa el número de nucleobases en un primer ácido nucleico que son del mismo tipo (independiente de la modificación química) como nucleobases en posiciones correspondientes en un segundo ácido nucleico, dividido por el número total de nucleobases en el primer ácido nucleico.
Tal como se usa en este documento, "modulación' significa un cambio de cantidad o calidad de una molécula, la función, o actividad cuando se compara con la cantidad o calidad de una molécula, la función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, modulación incluye el cambio, ya sea un aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) en la expresión génica.
Como ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir un cambio en la selección del sitio de corte y empalme del procesamiento de pre-ARNm, que resulta en un cambio en la cantidad absoluta o relativa de una variante de escisión particular, en comparación con la cantidad en ausencia de modulación.
Tal como se usa en el presente documento, "modificación de motivo" significa un patrón de modificaciones químicas en un compuesto oligomérico o una región del mismo. Los motivos pueden ser definidos por modificaciones en ciertos nucleósidos y/o en ciertos grupos de unión de un compuesto oligomérico.
Tal como se usa en el presente documento, "motivo nucleósido" significa un patrón de modificaciones de nucleósidos en un compuesto oligomérico o una región del mismo. Los enlaces de tal compuesto oligomérico pueden estar modificados o sin modificar. A menos que se indique lo contrario, los motivos en el presente documento que describen sólo nucleósidos se destinan a ser motivos de nucleósidos. Por lo tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
Tal como se usa en el presente documento, "motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar en un compuesto oligomérico o una región del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, "enlace de motivo" significa un patrón de modificaciones de enlace en un compuesto oligomérico o zona del mismo. Los nucleósidos de tal compuesto oligomérico pueden ser modificados o no modificados. A menos que se indique lo contrario, los motivos en el presente documento que describen sólo los enlaces están destinados a ser motivos de enlace. Por lo tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
Tal como se usa en el presente documento, "motivo de modificación de nucleobase" significa un patrón de modificaciones para nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de nucleobases.
Tal como se usa en este documento, "motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de modificaciones químicas y por lo tanto pueden tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo sin modificaciones químicas.
Tal como se usa en este documento, "tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de una primer "tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
Tal como se usa en el presente documento, "modificado de manera diferente" significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes una de otra, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado son "modificados de manera diferente", aunque el nucleósido ADN es sin modificar. Del mismo modo, el ADN y el ARN son "modificados de manera diferente", a pesar de que ambos son nucleósidos no modificados naturales. Los nucleósidos que son iguales pero para comprender diferentes nucleobases no se modifican de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2'-OMe y una base nitrogenada de timina no modificada no se modifican de forma diferente.
Tal como se usa en el presente documento, "el mismo tipo de modificaciones" se refiere a modificaciones que son las mismas una de otra, incluyendo la ausencia de modificaciones. Así, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen "el mismo tipo de modificación," a pesar de que el nucleósido de ADN es sin modificar. Tales nucleósidos que tienen la misma modificación de tipo pueden comprender diferentes nucleobases.
Tal como se usa en este documento, "vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia adecuada para uso en la administración a un animal. En ciertas realizaciones, un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril. En ciertas realizaciones, tal solución salina estéril es solución salina de calidad farmacéutica.
Tal como se usa en este documento, "sustituyente" y "grupo sustituyente," significa un átomo o grupo que reemplaza el átomo o grupo de un compuesto padre nombrado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido de origen natural (por ejemplo, un 2'-sustituyente modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un otro nucleósido distinto de H o OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o sin proteger. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente invención tienen sustituyentes en una o en más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden estar unidos directamente o mediante un grupo de enlace tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo a un compuesto parental. Del mismo modo, tal como se usa en el presente documento, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos que normalmente están presentes en el grupo funcional. En ciertas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sustituyente de un grupo de metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles para su uso como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (C(O)Raa), carboxilo (C(O)ORaa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, (-O-Raa) oxi sustituido, arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (C(O)N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)-C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)-C(O)OR), ureido (-N(Rbb)-C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)-C(=NRbb)(Raa)), tiol (SRbb), sulfinilo (S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) o N(Rbb)S(O)2Rbb). En el que cada Raa, Rbb y R es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente unido o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida incluyendo, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en este documento están presentes en un grado recursivo.
Tal como se usa en este documento, "alquilo" significa un radical hidrocarbonado saturado recto o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Ejemplos de grupos de alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos de alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente desde 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferidos de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Tal como se usa en el presente documento, "alquenilo", significa un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos de alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metilo-2-buten-1-ilo, dienos tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos de alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos de alquenilo tal como se usa en la presente memoria pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes.
Tal como se usa en el presente documento, "alquinilo", significa un radical de hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos de grupos de alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1-butinilo, y similares. Los grupos alquinilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono siendo más preferidos de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo tal como se utiliza en la presente memoria pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se usa en el presente documento, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)X, donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo como se usan en este documento pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes.
Tal como se usa en este documento, "alicíclico" significa un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillo puede comprender uno o más anillos en la que al menos un anillo es alifático. Alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico tal como se usa en el presente documento puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes.
Tal como se usa en este documento, "alifático" significa un radical de hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en los que la saturación entre dos átomos de carbono es un enlace único, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono con de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono siendo más preferido. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede interrumpirse con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas, y poliaminas. Los grupos alifáticos como se usan en la presente memoria pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes.
Tal como se usa en este documento, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en el que el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula parental. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, véase butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi, tal como se usa en el presente documento, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes.
Tal como se usa en este documento, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C1-C12 sustituido por amino. La porción de alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula parental. El grupo amino puede situarse en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con un grupo sustituyente adicional en las partes de alquilo y/o amino.
Tal como se usa en el presente documento, "aralquilo" y "arilalquilo" significa un grupo aromático que está unido covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción radical alquilo del aralquilo resultante (o arilalquilo) grupo forma un enlace covalente con una molécula parental. Ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo tal como se utilizan en la presente memoria pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes unidos a los grupos alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Tal como se usa en el presente documento, "arilo" y "aromático" significa radicales de sistema de anillo mono o carbocíclico policíclicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Ejemplos de grupos de arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. Sistemas de anillo de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo tales como se usa en la presente memoria pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes.
Tal como se usa en el presente documento, "halo" y "halógeno", significa un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
Tal como se usa en este documento, "heteroarilo" y "heteroaromático", quiere decir que comprende un radical de un anillo aromático mono- o policíclico, sistema de anillo o sistema de anillo condensado en el que al menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. Heteroarilo también pretende incluir sistemas de anillos condensados, incluyendo sistemas en los que uno o más de los anillos condensados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen típicamente un átomo de anillo seleccionado de azufre, nitrógeno u oxígeno. Ejemplos de los grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridiniloo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo pueden estar unidos a una molécula de matriz directamente o a través de un resto de unión tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo, tal como se usa en el presente documento pueden opcionalmente incluir además grupos sustituyentes.
B. Compuestos oligoméricos
Tal como se utiliza aquí, el término "compuesto oligomérico" se refiere a una secuencia contigua de subunidades monoméricas unidas. Cada subunidad de monómeros enlazada normalmente incluye un resto de base heterocíclica pero subunidades monoméricas también incluyen aquellas sin un resto de base heterocíclica tal como subunidades monoméricas abásicas. Al menos algunas y en general la mayoría si no esencialmente todas las bases heterocíclicas en un compuesto oligomérico son capaces de hibridarse con una molécula de ácido nucleico, normalmente un ARN diana preseleccionado. El término "compuesto oligomérico" incluye por lo tanto los oligonucleótidos, análogos de oligonucleótidos y oligonucleósidos. También incluye polímeros que tienen uno o una pluralidad de nucleósidos que tienen grupos sustitutos de azúcar. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden una pluralidad de subunidades monoméricas seleccionadas independientemente entre nucleósidos que se producen naturalmente, nucleósidos no naturales, nucleósidos modificados y nucleósidos que tienen grupos sustitutos de azúcar. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son monocatenarios. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son de cadena doble que comprende un dúplex de doble cadena. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos, tal como se prevé en este documento, pueden ser modificados por la unión covalente de uno o más grupos de terminales a los grupos terminales 5' o 3'. Un grupo terminal también puede estar unido a cualquier otra posición en uno de los extremos terminales del compuesto oligomérico. Tal como se usa en el presente documento, los términos grupo terminal "5', grupo terminal "3', y combinaciones de los mismos están destinados a incluir grupos útiles conocidos por el experto en la técnica que se puede colocar en uno o ambos de los extremos terminales, incluyendo, pero no limitado a los extremos 5' y extremos 3' de un compuesto oligomérico, respectivamente, para diversos fines tales como habilitar el seguimiento del compuesto oligomérico (un marcador fluorescente u otro grupo informador), la mejora de la farmacocinética o la farmacodinámica del compuesto oligomérico (tales como por ejemplo: captación y/o entrega) o la mejora de una o más propiedades deseables del compuesto oligomérico (un grupo para mejorar la estabilidad de nucleasa o afinidad de unión) En ciertas realizaciones, grupos terminales 5' y 3' incluyen, sin limitación, nucleósidos modificados o no modificados, dos o más enlaces de nucleósidos que son independientemente, modificados o no modificados; grupos conjugados, grupos de tapado; restos de fosfato;. y grupos protectores La presente invención proporciona compuestos oligoméricos. Tales compuestos oligoméricos comprenden oligonucleótidos que comprenden opcionalmente uno o más conjugados y/o grupos terminales. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico se compone de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una o más modificaciones químicas. Tales modificaciones químicas incluyen modificaciones de uno o más de los nucleósidos (incluyendo modificaciones en el resto de azúcar y/o la nucleobase) y/o modificaciones a uno o más enlaces internucleosídicos.
a. Nucleósidos modificados determinados
Previstos en este documento son compuestos oligoméricos que comprenden nucleósidos modificados. Tales nucleósidos modificados comprenden un resto modificado de azúcar, una base nucleotídica modificada, o tanto un resto de azúcar modificado como una nucleobase modificada.
i. Restos de azúcar modificados determinados
Compuestos de la invención comprenden uno o más modifed nucleósidos que comprenden un resto de azúcar modifed. Tales compuestos que comprenden uno o más nucleósidos modificados por azúcar pueden tener propiedades deseables, tales como la estabilidad de nucleasa mejorada o mayor afinidad de unión con un ácido nucleico diana con relación a un oligonucleótido que comprende sólo nucleósidos que comprenden restos de azúcar de origen natural. En ciertas realizaciones, restos de azúcar modificados son restos de azúcar sustituidos. En ciertas realizaciones, restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. Tales sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de restos de azúcar sustituidos. En ciertas realizaciones, restos de azúcar modificados son restos de azúcar sustituidos que comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no enlazantes, incluyendo, pero no limitado a los sustituyentes en las posiciones 2 ' y/o 5'. Los ejemplos de sustituyentes de azúcar adecuados para la posición 2 ', incluyen, pero no se limitan a: 2 '-F, 2'-o Ch 3 ("OMe" o "O-metilo"), y 2'-O(CH2)2OCH3 ("MOE"). En ciertas realizaciones, los sustituyentes de azúcar en la posición 2 ' se seleccionan de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, alquilo O-C1-C10, alquilo O-C1-C10 sustituido; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-ON(Rm)(Rn), y OCH2C(=O)N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los ejemplos de sustituyentes de azúcar en la posición 5', incluyen, pero no se limitan a:, 5'-metilo (R o S); 5-vinilo y 5'-metoxi. En ciertas realizaciones, azúcares sustituidos comprenden más de un sustituyente de azúcar no enlazante, por ejemplo, restos de azúcar 2 '-F-5'-metilo (véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157, para restos de azúcar 5', 2 '-bis sustituidos y nucleósidos adicionales).
Los nucleósidos que comprenden restos de azúcar 2'-sustituidos se conocen como nucleósidos 2 '-sustituidos. En ciertas realizaciones, un nucleósido 2 '-sustituido comprende un grupo 2 '-sustituyente seleccionado de halo, alilo, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S, o N(Rm-alquilo; O, S, o N(Rm)-alquenilo; O, S o N(Rm)-alquinilo; O-alquilenilo-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn) o OCH2C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rmy Rn es, independientemente, H, un grupo protector de amino o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Estos grupos 2 '-sustituyentes pueden estar sustituidos adicionalmente con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO2), tiol, tioalcoxi (S-alquilo), halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido 2' comprende un grupo 2 '-sustituyente seleccionado de F, NH2, N3, OCF3, OCH3, O-(CH2)-3NH2, CH2CH=CH2, OCH2CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O-(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn), O-(CH2)2O-(CH2)2-N(CH3)2, y acetamida N-sustituida (OCH2C(=O)N(Rm)(Rn), donde cada Rm y R es, independientemente, H, un grupo amino o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido protector.
En ciertas realizaciones, una nucleósido sustituido 2 ' comprende un resto de azúcar que comprende un grupo 2 '-sustituyente seleccionado entre F, OCF3, OCH3, OCH2CH2OCH3, O-(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON (CH3)2, O-(CH2)(CH2)2-N(CH3)2, y OCH2C(=O)N(H)CH3.
En ciertas realizaciones, un nucleósido sustituido 2' comprende un resto de azúcar que comprende un grupo 2 '-sustituyente seleccionado entre F, OCH3, y OCH2CH2OCH3.
Ciertos restos de azúcar modificados comprenden un sustituyente azúcar de puente que forma un segundo anillo que resulta en un resto de azúcar bicíclico. En ciertas de dichas realizaciones, el resto de azúcar bicíclico comprende un puente entre átomos en el anillo de furanosa 4' y 2'. Ejemplos de tales 4' a 2' sustituyentes de azúcar, incluyen, pero no se limitan a: -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(R)(Rb)]nO, -C(RaRb)-N(R)-O- o, -C(RaRb)-O-N(R); 4’-CH2)-2', 4’-(CH2)2-2', 4’-(CH)3-2’, 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CHs)-O-2’ (cEt) y 4’-CH(CH2OCHs)-O-2’, y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.399.845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2’ y análogos de los mismos, (véase, por ejemplo, WO2009/006478, publicada el 8 de enero de, 2009); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, WO2008/150729, publicado en diciembre 11, 2008); 4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (véase, por ejemplo, US 2004/0171570, publicado el 2 de septiembre del 2004); 4’-CH2-O-N(R)-2’, y 4’-CH2N(R)-O-2’, en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector, o alquilo C1-C12; 4’-CH2N(R)-O-2’, en donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (véase, Patente de Estados Unidos 7.427.672, expedida el 23 de septiembre, 2008); 4’-CH2C(H)-(CH3)-2’ (véase, por ejemplo, Chattopadhyaya, et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118,134); y 4’-CH2C(=CH2)-2’ y análogos de los mismos (véase, la Solicitud Internacional PCT publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre, 2008).
En ciertas realizaciones, tales puentes 4' a 2' comprenden independientemente de 1 a 4 grupos vinculados (generalmente formando un anillo de 4 a 6 miembros con el resto de azúcar parental) independiente seleccionados de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N, -C(=NRa)-, -C(=O), -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2, -S(=O)x-, y -N(Ra)-;
donde:
x es 0, 1, o 2;
n es 1, 2, 3, o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, heterociclo radical, heterociclo sustituido radical, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical C5-C7 alicíclico, radical C5-C7 sustituido alicíclico, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1), o sulfoxilo (S(=O)J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido, o un grupo protector.
Los nucleósidos que comprenden restos de azúcares bicíclicos se refieren a nucleósidos como bicíclicos o BNAs. Nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA, (B) p-D-Metilenoxi (4’-CH2-O-2’) BNA (también referido como ácido nucleico bloqueado o LNA), (C) Etilenoxi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA, (D) Aminooxi (4’-CH2-O-N(R)z) BNA, (E) Oxiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, (F) Metilo(metilenoxi) (4’-CH(CH3)-O-2’) BNA (también denominado etilo constreñido o cEt), (G) metilentio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilenamino (4’-CH2N(R)-2’) BNA, (I) metilo carbocíclico (4’-CH2CH(CH3)-2’) BNA, (J) propileno carbocíclico (4’-(CH2)3-2’) BNA, y (K) Etileno (metoxi) (4 ’-(CH(CH2OMe)-O-2’) BNA (también conocido como MOE constreñido o cMOE) tal como se representa a continuación.
Figure imgf000020_0001
en donde Bx es un resto de nucleobase y R es, independientemente, H, un grupo protector, o alquilo C1-C12. restos de azúcares bicíclicos adicionales son conocidos en la técnica, por ejemplo: Singh et
una, Chem. Commun., 1998, 4, 455,456.; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630.; Wahlestedt
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Medicina. Chem. Lett,
1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem, 1998, 63, 10035-10039.; Srivastava et al., J. Am.
Chem. Soc., 129 (26) 8362-8379 (jul 4, de 2007.); Elayadi et al., Curr. Invens opinión. Drugs, 2001, 2,
558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7.; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther, 2001, 3, 239­
243.; Patente de EE.UU. n° 7.053.207, 6.268.490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191,
6.670.461, y 7.399.845.; WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570, y WO 2007/134181;
Publicación de patentes de EE.UU. n° US2004/0171570, US2007/0287831, y US2008/0039618;
Patente de Estados Unidos n° de Serie 12/129.154 (US2009/0012281), 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/097.787 y 61/099.844.; y las solicitudes internacionales PCT
Nos. PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, y PCT/US2008/068922.
En ciertas realizaciones, restos de azúcares bicíclicos y nucleósidos que incorporan tales
restos de azúcares bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un
nucleósido que comprende un puente 4'-2' metilenoxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2') nucleósidos bicíclicos que se han
incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic
Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, restos de azúcar sustituidos comprenden uno o más sustituyentes de
azúcar no enlazantes y uno o más de puente sustituyente de azúcar (por ejemplo, azúcares
puenteados 5'-sustituidos y 4'-2'). (véase, la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada el
11/22/07, en el que LNA está sustituido con, por ejemplo, un 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo). En ciertas realizaciones, restos de azúcar modificados son sustitutos de azúcar. En ciertas de dichas realizaciones, el átomo de oxígeno del azúcar de origen natural está sustituido, por ejemplo, con un
sulfer, carbono o átomo de nitrógeno. En ciertas de dichas realizaciones, tales restos de azúcar modificados también comprenden sustituyentes de puente y/o no enlazantes como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, ciertos sustitutos de azúcar comprenden un átomo de 4'-sulfuro y una
sustitución en la posición 2' (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US200S/0130923, publicada el 16 de junio, 2005) y/o la posición 5'. A modo de ejemplo adicional, se
han descrito nucleósidos bicíclicos carbocíclicos que tienen un puente 4'2' (véase, por ejemplo, Freier
et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731­
7740).
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen otros de 5-átomos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un sustituto de azúcar comprende un tetrahidropiran de
seis miembros. Tales tetrahidropiranos pueden ser modificados o sustituidos adicionalmente. Los
nucleósidos que comprenden tales tetrahidropiranos modificados incluyen, pero no se limitan a, ácido
nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase
Leumann, CJ. Bioorg. Y Med. Chem. (2002) 10: 841-854), fluoro HNA (F-HNA), y aquellos compuestos
que tienen la Fórmula VII:
Figure imgf000021_0001
en el que de forma independiente para cada uno de dicho al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropiran de fórmula VII:
Bx es un resto de nucleobase;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el
análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de
enlace de internucleósido que une el análogo nucleosídico de tetrahidropirano al compuesto antisentido
y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o a o grupo 5' o 3'-terminal;
q-i, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno, independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de
R1 y R2 se selecciona independientemente entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJsC(=X)NJ1J2 y CN, en donde X es O, S o NJ1, y cada J1, J2, y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP modificados de Fórmula VII en los que q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q, q, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de THP de fórmula VII se proporcionan en donde uno de R1 y R2 es F. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
Muchos otros sistemas de anillo de sustituto de azúcar biciclo y triciclo también son conocidos en la técnica que se pueden utilizar para modificar los nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
Las combinaciones de modificaciones también se proporcionan sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos de 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 Publicada el 8/21/08 por otros nucleósidos 5', 2'-bis sustituidos descritos) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente publicada de EE.UU. US2005-0130923, publicada el 16 de junio, 2005) o, alternativamente, 5'-sustitución de ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181, publicada en 11/22/07 en el que un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' está sustituido adicionalmente en la posición 5' con un 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo). La síntesis y la preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito (véase, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
La presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos modificados. Esos nucleótidos modificados pueden incluir azúcares modificados, nucleobases modificadas, y/o enlaces modificados. Las modificaciones específicas se seleccionan de tal manera que los oligonucleótidos resultantes poseen características deseables. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos de tipo ARN. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos de tipo a Dn .
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en la presente memoria incluyen nucleósidos de tipo ARN que han sido modificados para influir en la conformación del azúcar para tener geometría predominantemente 3'-endo conformacional. En ciertas realizaciones, dichos nucleósidos modificados incluyen modificaciones sintéticas del resto de base heterocíclica, el resto de azúcar o ambos para inducir una conformación de azúcar 3'-endo. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de tipo ARN se seleccionan a partir de sustitutos de ARN tales como incluyendo, pero no limitados a, F-HNA o ácido nucleico de ciclohexenilo. Nucleósidos de tipo ARN se utilizan para reemplazar e imitar nucleósidos de ARN en un compuesto oligomérico de modo que las propiedades particulares del compuesto oligomérico pueden ser mejoradas. Típicamente nucleósidos de tipo ARN se utilizan en las regiones 5' y 3' (alas) de compuestos oligoméricso de huecos para mejorar la estabilidad en presencia de nucleasas y también para aumentar la afinidad por una diana de ácido nucleico nucleico. Otras propiedades que también se pueden mejorar mediante el uso de nucleósidos de tipo ARN incluyen, pero no se limitan a la modulación de las propiedades farmacocinéticas a través de la modificación de la proteína de unión, proteína, la absorción y aclaramiento, así como estabilidad química y la especificidad del compuesto oligomérico (afinidad y especificidad para las enzimas, así como para secuencias complementarias); y el aumento de la eficacia de la escisión de RNA.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos de tipo ARN incluyen nucleósidos modificados que comprenden uno o más grupos sustituyentes 2', 3', 4' y 5', nucleósidos bicíclicos y sustitutos ARN. En ciertas realizaciones, nucleósidos de tipo ARN incluyen, pero no se limitan a nucleósidos modificados que comprenden grupos 2'-ribo-sustituyente seleccionados de: F, OCH3, alquilo O-C2-C4, OCH2CH=CH2, O-(CH2)2OCH3 (MOE), O-(CH2)3-NH2, O-(CH2)2-O-N(R1)2, OCH2C(=O)-N(R1)2, O-(CH2)2O-(CH2)2N(R-i)2, -O-(CH2)-3NHR1 y OCH2N(H)-C(=NR1)[N(R-,)2] en la que cada R1 es, típicamente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector. nucleósidos de tipo ARN también incluyen pero no se limitan a los nucleósidos modificados que tienen un resto de azúcar de furanosilo bicíclico (nucleósidos bicíclicos) que comprende un grupo de puente entre átomos de carbono 4' y 2'. Tales nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a grupos de puente que consisten en de 1 a 3 grupos birradicales enlazados seleccionados entre O, S, NR, -C(Rb)(Rc), C=O, -C(Rb)=C(Rc) y C[=C(Rb)(Rc)] en la que C(Rb)=C(Rc) cuenta como 2 de dichos grupos birradicales en la que cada Ra, Rb y Rc es, independientemente, H, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6. En ciertas realizaciones, los grupos puente incluyen, pero no se limitan a 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)2-O-2', 4'-CH2N(OCH3)-2', 4'-CH2ON (CH3)-2', 4' CH2NCH3-O-2 ', 4'-CH2C(H)-(CH3)-2' y 4'CH2-C(=CH2)-2'. En ciertas realizaciones, los grupos puente incluyen, pero no se limitan a 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-C(H)[(R)-CH3]-O-2' y 4'-C(H)[(S)-CH3]-O-2'.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en la presente memoria incluyen nucleósidos de tipo ADN que han sido modificados para influir en la conformación de azúcar para tener predominantemente geometría conformacional 2'-endo. Tales nucleósidos modificados pueden incluir modificaciones sintéticas del resto de base heterocíclica, el resto de azúcar o ambos para inducir la conformación de azúcar 2'-endo deseada. Estos nucleósidos modificados se utilizan para imitar nucleósidos de ARN de modo que propiedades particulares de un compuesto oligomérico se puede mejorar manteniendo la geometría conformacional 2'-endo deseable.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos de tipo ADN incluyen, pero no se limitan a nucleósidos de furanosilo 2'-sustituidos comprenden: 2'=CH2, 2'-ara-CN, 2'-ara-F, 2'-ara-Br o 2'-ara-Cl, 2'-ara-N3, 2'-ara-OH, 2'-ara-O-CH3 o 2'-dehidr-O-2'-ara-CH3.
Las geometrías conformacionales C3'-endo y C2'-endo se muestran a continuación:
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ii Ciertas nucleobases modificadas
En ciertas realizaciones, los nucleósidos de la presente invención comprenden una o más nucleobases no modificadas. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de la presente invención comprenden una o más nucleobases modificadas (restos de bases heterocíclicas).
En una realización, un resto de base heterocíclica es cualquier sistema heterocíclico que contiene uno o más átomos o grupos de átomos capaces de formar enlaces de hidrógeno a una base heterocíclica de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, nucleobase se refiere a purinas, purinas, pirimidinas modificadas y pirimidinas modificadas. En ciertas realizaciones, nucleobase se refiere a nucleobases no modificadas o naturales que incluyen, pero no se limitan a las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de timina pirimidina (T), citosina (C) y uracilo (U) y análogos de los mismos tales como 5-metilo citosina. Los términos de nucleobase y resto de base heterocíclica también incluyen la protección opcional para cualesquiera grupos funcionales reactivos, tales como 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, 6-N-benzoiladenina o 2-N-isobutirilguanina.
En ciertas realizaciones, restos de bases heterocíclicas incluyen sin limitación nucleobases modificadas tales como 5-metilcitosina (5-me-C), citosina 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiuracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, uracilo 6-azo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiuracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tiolalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos 5-sustituidos y citosinas, 7-metiloguanina y 7-metiloadenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3-deazaadenina, bases universal, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño ampliado, y bases fluoradas como se definen en el presente documento.
En ciertas realizaciones, restos de bases heterocíclicas incluyen sin limitación pirimidinas tricíclicas tales como 1,3-diazafenoxazina-2-ona, 1,3-diazafenotiazina-2-ona y 9-(2-aminoetoxi)-1,3-diazafenoxazina-2-ona (pinza G). Restos de bases heterocíclicos también incluyen aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplazan con otros heterociclos, por ejemplo 7-deazaadenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otros restos de bases heterocíclicas incluyen sin limitación los conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, n° de Patente de Estados Unidos 3,687,808; Swayze et al., The Medicinal Chemistry of Oligonucleotides en Antisense a Drug Technology, Capítulo 6, páginas 143-182, Crooke, S.T., ed, 2008).; The Concise Enciclopedia Of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed, John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al, Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613.; Sanghvi, YS, capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T. y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-302).
Compuestos heterocíclicos policíclicos modificados útiles como restos de bases heterocíclicos se describen en los anteriormente mencionados U.S. 3.687.808, así como los US: 4,845,205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.434.257; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.646.269; 5.681,941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653; 6.005.096; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. 20030158403.
b. Ciertos enlaces entre nucleósidos
En ciertas realizaciones, los nucleósidos pueden unirse entre sí utilizando cualquier enlace internucleosídico para formar oligonucleótidos. Las dos clases principales de grupos de enlaces internucleosídicos son definidas por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Enlaces de internucleósido que contienen fósforo representativo que incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres (P=O), fosfotriésteres, metilofosfonatos, fosforamidato, y fosforotioatos (P=S). Grupos de enlace de internucleósidos que contienen aditivos reforzantes representativos incluyen, pero no se limitan a, metiloenometiloimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiester (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)-(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); y N,N'-dimetilohidrazina (-CH2-N(c Hs)-N(Ch3)-). Los enlaces modificados, en comparación con los enlaces de fosfodiéster natural, se pueden utilizar para alterar, normalmente aumentar, la resistencia a nucleasa del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, enlaces de internucleósido que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica, o los enantiómeros separados. enlaces quirales representativos incluyen, pero no se limitan a, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Métodos de preparación de enlaces de internucleósido que contienen fosforo y no fosforo son bien conocidos para los expertos en la técnica.
Los oligonucleótidos descritos en este documento contienen uno o más centros asimétricos y por lo tanto dan lugar a enantiómeros, diastereómeros, y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden estar definidas, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), a o p tal como para anómeros de azúcar, o como (D) o (L), tales como los aminoácidos, etc., incluidos en los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.
Enlaces de internucleósido neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilofosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CH3)-O-5'), amida-3 (3'-CH2C(=O)N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2N(H)C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), y tioformacetal (3'-S-CH2O5'). Otros enlaces de internucleósido neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster, carboxamida, éster de sulfuro, y amidas (véase, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi y P.D. Cook, Eds, ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, 40-65). Otros enlaces de internucleósido neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes N, O, S y CH2 mixtas.
c. Ciertos motivos
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden o consisten en oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, dichos oligonucleótidos comprenden una o más modificaciones químicas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos químicamente modificados comprenden uno o más azúcares modificados. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden una o más nucleobases modificadas. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos modificados químicamente comprenden uno o más enlaces de internucleósido modificados. En ciertas realizaciones, las modificaciones químicas (modificaciones de azúcares, modificaciones de nucleobases y/o modificaciones de enlace) definen un patrón o motivo. En ciertas realizaciones, los patrones de modificaciones químicas de restos de azúcar, enlaces de internucleósido, y nucleobases son cada uno independientes uno de otro. Por lo tanto, un oligonucleótido puede ser descrito por su modificación de motivo de azúcar, motivo de enlace internucleosídico y/o motivo de modificación de nucleobase (tal como se usa en el presente documento, motivo de modificación de nucleobase describe las modificaciones químicas a las nucleobases independientes de la secuencia de nucleobases).
i. Ciertos motivos de azúcar
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de restos de azúcar modificado y/o restos de azúcar de origen natural dispuestos a lo largo de un oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de azúcar. Tales motivos de azúcar incluyen pero no se limitan a cualquiera de las modificaciones de azúcar descritas en este documento.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en el presente documento comprenden un motivo de azúcar de gápmero, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o "hueco" (también conocida como región 5' y región 3'). Las tres regiones de un motivo de azúcar gápmero (el ala 5', el hueco, y ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en la que al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos los restos de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca del hueco (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren del resto de azúcar de los nucleósidos de hueco adyacentes, definiendo por lo tanto el límite entre las alas y el hueco. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar dentro de la separación son los mismos que el uno al otro. En ciertas realizaciones, el hueco incluye uno o más nucleósidos que tienen un resto de azúcar que difieren del resto de azúcar de uno o más otros nucleósidos del hueco. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar de las dos alas son iguales entre sí (gápmero de azúcar simétrico). En ciertas realizaciones, los restos de azúcar del ala 5' difieren de los restos de azúcar del ala 3' (gápmero de azúcar asimétrico). En ciertas realizaciones, los restos de azúcar en las dos alas se seleccionan a partir de al menos dos tipos diferentes que son diferentes a partir de los restos de azúcar en el hueco y al menos uno de cada uno están en cada ala.
En ciertas realizaciones, el término "compuesto oligomérico con huecos" se refiere a un oligómero compuesto que tiene dos regiones o alas externas y una región interna o espacio de separación (también denominado como región 5' y región 3'). Las tres regiones forman una secuencia contigua de subunidades monoméricas con los restos de azúcar de las regiones externas (alas) siendo diferentes de los restos de azúcar de la región interna (GAP). En ciertas realizaciones, los restos de azúcar de cada subunidad de monómero dentro de una región particular, son esencialmente iguales.
En ciertas realizaciones, los restos de azúcar de cada subunidad de monómero dentro de cada zona del ala se seleccionan independientemente de 2 tipos diferentes de nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar de cada subunidad de monómero dentro de cada zona del ala se seleccionan independientemente de 3 tipos diferentes de nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, los restos de azúcar de cada subunidad de monómero dentro de cada zona del ala se seleccionan independientemente entre 4 diferentes tipos de nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar de esencialmente cada subunidad de monómero dentro de la región interna es esencialmente el mismo.
En ciertas realizaciones, el resto de azúcar de cada subunidad de monómero dentro de la región interna es un D2'-deoxiribonucleósido, un nucleósido que es de tipo ADN y/o un nucleósido que soporta RNasaH cuando en la región de hueco.
En ciertas realizaciones, cada subunidad de monómero dentro de una región particular tiene el mismo resto de azúcar. Cuando los restos de azúcar de las regiones externas son los mismos del gápmero es un gápmero simétrico y cuando el resto de azúcar utilizado en la región external 5' es diferente del resto de azúcar utilizado en la región external 3', el gápmero es un gápmero asimétrico. En ciertas formas de realización, las regiones externas son pequeñas (cada una independientemente 2, 3, 4, 5 o aproximadamente 6 subunidades monoméricas) y las subunidades monoméricas comprenden restos de azúcar no naturales comprendiendo la región interna l3-D-2’-deoxiribonucleósidos. En ciertas realizaciones, las regiones externas cada una, independientemente, comprenden de 2 a aproximadamente 8 subunidades monoméricas que tienen restos de azúcar no naturales y la región interna comprende de 6 a 14 nucleósidos modificados. La región interna o el hueco comprenden generalmente l3-D-2’-deoxiribonucleósidos pero pueden comprender restos de azúcar no naturales. La base heterocíclica y enlace internucleosídico es independientemente variable en cada posición de un compuesto oligomérico con huecos. Un compuesto oligomérico de hueco puede incluir además uno o más grupos incluyendo pero no limitado a grupos de tapado, grupos conjugados y otros grupos terminales 5' o 3’.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos comprenden una región interna de l3-D-2’-deoxiribonucleósidos con un solo enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos comprenden una región interna de I3-D-2’-deoxiribonucleósidos que tiene dos enlaces de internucleósido que tienen la Fórmula I. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos comprenden una región interna de I3-D-2’-deoxiribonucleósidos que tiene tres enlaces de internucleósido que tienen la Fórmula I.
En ciertas realizaciones, las regiones de ala 5' y 3' de compuestos oligoméricos con huecos comprenden nucleósidos modificados en los que todos los restos de azúcar tienen el mismo tipo de modificación tal como cEt o MOE. En ciertas realizaciones, regiones de ala 5' y 3' de compuestos oligoméricos con huecos comprenden dos tipos de nucleósidos modificados que tienen restos de azúcar independientemente seleccionados de restos de azúcar 2’-sustituidos y restos de azúcares bicíclicos de furanosilo. En ciertas formas de realización, la regiones de ala 5’ y 3’ de compuestos oligoméricos con huecos comprenden dos tipos de nucleósidos modificados que tienen restos de azúcar seleccionados independientemente de restos de azúcar 2'-MOE sustituidos y restos de azúcares bicíclicos de furanosilo teniendo cada uno un puente 4'-CH((S)-CH3)-O-2'.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan que son de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 subunidades monoméricas de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos están dentro de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 subunidades monoméricas de longitud. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos con huecos se proporcionan que son de aproximadamente 14 a aproximadamente 20 subunidades monoméricas de longitud. En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos oligoméricos con huecos que son de aproximadamente 14 a aproximadamente 18 subunidades monoméricas de longitud.
ii. Motivos de modificación nucleobásicos determinados
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden modificaciones químicas a nucleobases dispuestas a lo largo del oligonucleótido o zona de la misma en un patrón definido o motivo de modificación de nucleobases. En ciertas realizaciones, se modifica cada nucleobase. En ciertas realizaciones, ninguna de las nucleobases se modifica químicamente.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden un bloque de nucleobases modificadas. En ciertas de dichas realizaciones, el bloque está en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones el bloque está dentro de de 3 nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de dichas realizaciones, el bloque está en el extremo 5' del oligonucleótido. En ciertas realizaciones el bloque está dentro de 3 nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido.
En ciertas realizaciones, las modificaciones de nucleobases son una función de la base natural en una posición particular de un oligonucleótido. Por ejemplo, en ciertas realizaciones se modifican cada purina o pirimidina cada una en un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, se modifica cada adenina. En ciertas realizaciones, se modifica cada guanina. En ciertas realizaciones, se modifica cada timina.
En ciertas realizaciones, se modifica cada citosina. En ciertas realizaciones, se modifica cada uracilo. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo de azúcar gápmero comprenden un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En ciertas de dichas realizaciones, un nucleósido que comprende una nucleobase modificada está en el hueco de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar de gápmero. En ciertas realizaciones, el azúcar es un 2'-deoxinucleósido sin modificar. En ciertas formas de realización, la nucleobase modificada se selecciona de: una pirimidina 2-tio y una pirimidina de 5-propin
En ciertas realizaciones, algunos, todos o ninguno de los restos de citosina en un oligonucleótido son restos de citosina 5-metilo. En este documento, citosina 5-metilo no es una "base nitrogenada modificada." Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, nucleobases no modificadas incluyen tanto los residuos de citosina que tienen un 5-metilo y los que carecen de un 5 metilo. En ciertas realizaciones, el estado de metiloación de todas o algunas nucleobases de citosina se especifica.
iii. Ciertos motivos de nucleósidos
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden nucleósidos modificados que comprenden restos de azúcar y/o nucleósidos que comprenden nucleobases modificadas. Tales motivos pueden ser descritos por su motivo de azúcar y su motivo de nucleobase por separado o por su motivo de nucleósido, que proporciona posiciones o patrones de nucleósidos modificados (ya sea azúcar modificado, nucleobase, o tanto el azúcar como la base nitrogenada) en un oligonucleótido.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden o consisten en una región que tiene un motivo gápmero nucleósido, que comprende dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o el "hueco". Las tres regiones de un motivo gápmero nucleósido (el ala 5', el hueco, y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en el que al menos algunos de los restos de azúcar y/o nucleobases de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunos de los restos de azúcar y/o nucleobase de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos los nucleósidos de cada ala que están más cerca del hueco (el más nucleósido 3' de el ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren de los nucleósidos de huecos vecinos, definiendo así el límite entre la las alas y el hueco. En ciertas realizaciones, los nucleósidos dentro de la separación son los mismos que el uno al otro. En ciertas realizaciones, el hueco incluye uno o más nucleósidos que difieren de uno o más otros nucleósidos del hueco. En ciertas realizaciones, los motivos de nucleósidos de las dos alas son los mismos que los otros (gápmero simétrico). En ciertas realizaciones, los motivos de nucleósidos del ala 5' difieren del motivo nucleósido del ala 3' (gápmero asimétrico).
1. Ciertas alas 5'
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consiste en 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gápmero consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 1 o 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consiste en 2 o 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gápmero consta de 1 nucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consiste en 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero consta de 8 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos dos nucleósidos bicíclicos. En ciertas formas de realización, el ala 5' de un gápmero comprende al menos tres nucleósidos bicíclicos. En determinadas formas de realización, el ala 5' de un gápmero comprende al menos cuatro nucleósidos bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido acetato restringido.
En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido no bicíclico modificado. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos nucleósido 2' sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido no bicíclico modificado. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 5' de un gápmero es un nucleósido 2'-OMe.
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un no nucleósido bicíclico modificado. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe.
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende acetato de al menos un nucleósido constreñido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende nucleósido acetato de al menos un constreñido y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido constreñido de etilo y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido y al menos un nucleósido 2'-OMe.
En ciertas realizaciones, el ala 5' de un gápmero tiene un motivo de nucleósido seleccionado de entre los siguientes: ABBA; abb; ABAA; AAbAa ; AAABAA; AAAABAA; AAAAABAA; AAABAA; AABAA; ABAB; AAABB; AAAAA; ABBC; AA; AAA; AAAA; AAAAB; AAAAAAA; AAAAAAAA; ABBB; AB; ABAB; AAAAB; AABBB; AAAAB; y AABBB, en donde cada A es un nucleósido modificado de un primer tipo, cada B es un nucleósido modificado de un segundo tipo y cada C es un nucleósido modificado de un tercer tipo. En ciertas realizaciones, tal compuesto oligomérico es un gápmero. En ciertas de dichas realizaciones, el ala 3' del gápmero puede comprender cualquier motivo nucleósido.
2. Ciertas alas 3
En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 1 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 1 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3 'de un gápmero consta de 1 o 2 con nucleósidos enlazados. En formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 o 3 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero se compone de 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 1 nucleósido. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consiste de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 3 a 5 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 4 o 5 nucleósidos enlazados. En ciertasformas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 4 nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero consta de 2 a 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consiste en 3 o 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 2 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 3 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 4 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 5 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero consta de 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico.
En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido de etilo constreñido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido LNA. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido no bicíclico modificado. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos dos nucleósidos no bicíclicos modificados. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos tres nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos cuatro nucleósidos modificados no bicíclicos. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, cada nucleósido de ala 3' de un gápmero es un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un no nucleósido bicíclico modificado. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido bicíclico y al menos un nucleósido 2'-OMe.
En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende acetato de al menos un nucleósido constreñido y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido y al menos un nucleósido 2' MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido de etilo constreñido y al menos un nucleósido 2'-OMe. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido modificado no bicíclico. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas formas de realización, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-MOE. En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero comprende al menos un nucleósido LNA y al menos un nucleósido 2'-OMe.
En ciertas realizaciones, el ala 3' de un gápmero tiene un motivo de nucleósido seleccionado de entre los siguientes: ABB; ABAA; AAABAA, AAAAABAA; AABAA; AAAABAA; AAABAA; ABAB; AAAAA; AAABB; AAAAAAAA; AAAAAAA; AAAAAA; AAAAB; AAAA; AAA; AA; AB; ABBB; ABAB; AABBB; en la que cada A es un nucleósido modificado de un primer tipo, cada B es un nucleósido modificado de un segundo tipo. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende cualquier motivo de ala 3' proporcionado en el presente documento. En ciertas de dichas realizaciones, el ala 5' del gápmero puede comprender cualquier motivo nucleósido.
3. Ciertas regiones centrales (regiones de hueco)
En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 a 20 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 a 14 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 a 12 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones,el hueco de un gápmero consta de 6 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 a 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consiste de 6 a 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 6 o 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 7 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero se compone de 7 a 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 7 u 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 8 a 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 8 o 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consiste de 6 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 7 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 8 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 9 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 10 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consiste 5 de 11 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 12 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 13 nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, el hueco de un gápmero consta de 14 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gápmero es un 2'-deoxinucleósido. En ciertas realizaciones, el hueco comprende uno o más nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, cada nucleósido del hueco de un gápmero es un 2'-desoxinucleósido o es un nucleósido modificado que es 'de tipo ADN'. En ciertas realizaciones, "de tipo ADN" significa que el nucleósido tiene características similares a ADN, de manera que un dúplex que comprende el gápmero y una molécula de ARN es capaz de activar la RNasa H. En ciertas realizaciones, los nucleósidos que son de tipo ADN modificado son 2'-endo. Por ejemplo, bajo ciertas condiciones, 2'-(ara)-F se ha demostrado para apoyar la RNasa H de activación, y por lo tanto es de tipo ADN y tiene además geometría 2'-endo conformacional. En ciertas realizaciones, uno o más nucleósidos del hueco de un gápmero no es un 2'-deoxinucleósido y no es de tipo ADN. En ciertas de dichas realizaciones, el gápmero, no obstante, compatible con la activación de la RNasa H (por ejemplo, en virtud del número o colocación de los nucleósidos no ADN).
En ciertas realizaciones, el hueco comprende un tramo de 2'-deoxinucleósidos no modificados interrumpidos por uno o más nucleósidos modificados, lo que resulta en tres subregiones (dos tramos de uno o más 2'-deoxinucleósidos y un tramo de uno o más nucleósidos modificados interrumpidos). En ciertas realizaciones, ningún esfuerzo de 2'-desoxinucleósidos no modificados es más de 5, 6, o 7 nucleósidos. En ciertas realizaciones, dichos tramos cortos se logran mediante el uso de regiones cortas de huecos. En ciertas realizaciones, tramos cortos se consiguen mediante la interrupción de una región de hueco más largo.
4. Ciertos motivos de gápmero
En ciertas realizaciones, un gápmero comprende un ala 5', un hueco que comprende al menos un enlace internucleosídico de Fórmula I, y un ala 3', en el que el ala 5', hueco, y ala 3' están seleccionados independientemente de entre los descritos anteriormente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un gápmero tiene un ala 5', un hueco, y un ala 3' que tiene características seleccionadas de entre las enumeradas en la siguiente tabla no limitativa:
Tabla 1
Ciertos motivos de nucleósidos de gápmero
Figure imgf000030_0001
en la que cada A es un nucleósido modificado de un primer tipo, cada B es un nucleósido modificado de un segundo tipo y cada D es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido o un nucleósido que es de tipo ADN. Cada región de hueco incluye al menos un enlace internucleósido de Fórmula I.
En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar 2’-sustituido seleccionado entre F, OCH3, OCH2-C(=O)N(H)-(CH3) y O(CH2)2-OCH3. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar bicíclico seleccionado de entre cEt, cMOE, LNA, a-L-LNL, ENA y 2’-tio LNA. En ciertas realizaciones, cada A comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, cada A comprende una nucleobase modificada seleccionada de entre nucleósido de 2-tio-timidina y nucleósido de uridina 5-propin.
En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar 2’-sustituido seleccionado entre F, OCH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH3) y O-(CH2)2OCH3. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar bicíclico. En ciertas formas de realización, cada B comprende un resto de azúcar bicíclico seleccionado de entre los cEt, cMOE, LNA, a-L-LNL, ENA y 2’-tio LNA. En ciertas realizaciones, cada B comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, cada B comprende una nucleobase modificada seleccionada de entre nucleósido de 2-tio-timidina y nucleósido de uridina 5-propin.
En ciertas realizaciones, al menos uno de A o B comprende un resto de azúcar bicíclico, y el otro comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas formas de realización, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido a-L-LNL y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-MOE. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-MOE. En ciertas formas de realización, uno de A o B es un un nucleósido LLNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2’-F. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido a-L-LNL y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-F.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2' sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas formas de realización, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-F.
En ciertas realizaciones, B comprende un resto de azúcar bicíclico, y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido LNA y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido cEt y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido a-L-LNL y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE.
En ciertas realizaciones, B comprende un resto de azúcar bicíclico, y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido LNA y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido cEt y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas formas de realización, B es un nucleósido a-L-LNL y A comprende un resto de azúcar 2'-F.
En ciertas realizaciones, cada A y B es, independientemente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-OCH2CH2OCH3-(MOE). En ciertas realizaciones, cada A y B es, de forma independiente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo de sustituyente 2'-OCH2CH2OCH3 (MOE). En ciertas realizaciones, cada A y B es, independientemente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH[(R)-(CH3)]-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-OCH2CH2OCH3-(MOE). En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido que comprende una (MOE) grupo sustituyente 2'-OCH2CH2OCH3 y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2' se encuentra en cada una de las alas 3' y 5'. En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-OCH2CIT2 OCH3 (MOE) y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' que se encuentra en cada una de las alas 3' y 5'. En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-OCH2CH2OCH3 (MOE) y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH[(R)-(CH3)]-O-2' se encuentra en cada una de las alas 3' y 5'.
iv. Ciertos motivos de enlaces internucleosídicos
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden enlaces modificados internucleosídicos dispuestos a lo largo del compuesto oligomérico o zona en un patrón definido o motivo de enlaces modificado internucleosídico siempre que al menos un enlace internucleósido tenga la Fórmula I. En ciertas realizaciones, los enlaces de internucleósido están dispuestos en un motivo de huecos BLAST, como se describe anteriormente por motivo de nucleósido. En tales realizaciones, los enlaces de internucleósido en cada una de dos regiones de alas son diferentes de los enlaces de internucleósido en la región de hueco. En ciertas realizaciones los enlaces entre nucleósidos en las alas son fosfodiéster y enlaces de internucleósido en el hueco son fosforotioato. El motivo de nucleósido se selecciona independientemente, por lo que tales compuestos oligoméricos que tienen un motivo de enlaces de huecos internucleosídicos puede o no puede tener un motivo nucleósido con huecos y si no tiene un motivo de nucleósido con huecos, las longitudes de las alas y huecos pueden o pueden no ser iguales.
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos que comprenden una región que tiene una motivo de enlace entre nucleósidos alterno. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos de la presente invención comprenden una región de enlaces de internucleósido modificados uniformemente. En ciertas de dichas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende una región que está uniformemente ligado por enlaces de fosforotioato internucleosídicos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido es uniformemente unido por fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace intemucleosídico del compuesto oligomérico se selecciona de entre fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del compuesto oligomérico se selecciona de entre fosfodiéster y fosforotioato y al menos un enlace internucleósido es fosforotioato. En ciertas realizaciones, se selecciona al menos un enlace internucleosídico del compuesto oligomérico de otro que de fosfodiéster y fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos 6 enlaces de internucleósido de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos 8 enlaces de internucleósido de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos 10 enlaces de internucleósido de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos un bloque de al menos 6 enlaces de internucleósido de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos un bloque de al menos 8 enlaces de internucleósido de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos un bloque de al menos 10 enlaces de internucleósido de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el compuesto oligomérico comprende al menos un bloque de al menos 12 enlaces de internucleósido de fosforotioato consecutivos. En ciertas de dichas realizaciones, al menos uno de tales bloques se encuentra en el extremo 3' del compuesto oligomérico. En ciertas de dichas realizaciones, al menos uno de tales bloques se encuentra dentro de los 3 nucleósidos del extremo 3' del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico a un enlace de internucleósido de fosforotioato.
v. Ciertos motivos de modificación
Motivos de modificación definen oligonucleótidos por motivo de nucleósido (motivo de azúcar y motivo nitrogenado) y el motivo de enlace. Por ejemplo, ciertos oligonucleótidos tienen el siguiente motivo de la modificación:
AAADDDDDDDDDBBB;
en donde cada A es un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar 2'-sustituido; cada D es un U-D-2-deoxiribonucleósido o un nucleósido modificado que tiene geometría de conformación de forma B que tiene y cada B es un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico en el que al menos un enlace internucleosídico tenía Fórmula I. La siguiente Tabla no limitante ilustra adicionalmente ciertos motivos de modificación:
Tabla 2
Motivo de modificación determinado
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en la que cada A es un nucleósido modificado de un primer tipo, cada B es un nucleósido modificado de un segundo tipo y cada D es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido o un nucleósido que es de tipo ADN. Cada región de hueco incluye al menos un enlace internucleosídico de Fórmula I.
En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar 2’-sustituido. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar 2’-sustituido seleccionado entre F, OCH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH3) y O-(CH2)2OCH3. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, cada A comprende un resto de azúcar bicíclico seleccionado de entre los cEt, cMOE, LNA, a-L-LNA, ENA y 2'-tio LNA. En ciertas realizaciones, cada A comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, cada A comprende una nucleobase modificada seleccionada de entre nucleósido de timidina 2-tio y nucleósido de uridina 5-propin.
En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido seleccionado entre F, OCH3, OCH2-C(=O)-N(H)-(CH3) y O-(CH2)2OCH3. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar bicíclico. En ciertas realizaciones, cada B comprende un resto de azúcar bicíclico seleccionado de entre los cEt, cMOE, LNA, a-L-LNA, ENA y lNa 2'-tio. En ciertas realizaciones, cada B comprende una nucleobase modificada. En ciertas realizaciones, cada B comprende una nucleobase modificada seleccionada de entre nucleósido de timidina 2-tio y nucleósido urindina de 5-propin.
En ciertas realizaciones, al menos uno de A o B comprende un resto de azúcar bicíclico, y el otro comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido a-L-LNL y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un un nucleósido L-LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido cEt y el otro de A o B comprende un resto 2'-F azúcar. En ciertas realizaciones, uno de A o B es un nucleósido a-L-LNA y el otro de A o B comprende un resto de azúcar 2'-F.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende un resto de azúcar 2'sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-sustituido.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende una resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-MOE.
En ciertas realizaciones, A comprende un resto de azúcar bicíclico, y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido LNA y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido cEt y B comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, A es un nucleósido a-L-LNL y B comprende un resto de azúcar 2'-F.
En ciertas realizaciones, B comprende un resto de azúcar bicíclico, y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido LNA y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido cEt y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido a-L-LNL y A comprende un resto de azúcar 2'-MOE. En ciertas realizaciones, B comprende un resto de azúcar bicíclico, y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido LNA y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En 5 ciertas realizaciones, B es un nucleósido cEt y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, B es un nucleósido a-L-LNL y A comprende un resto de azúcar 2'-F. En ciertas realizaciones, cada A y B es, independientemente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3-(MOE). En ciertas realizaciones, cada A y B es, independientemente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3 (MOE). En ciertas realizaciones, cada A y B es, independientemente, un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH[(R)-(CH3)]-O-2' o un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3-(MOE). En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3 (MOE) y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2' se encuentra en cada uno de las alas 3' y 5'. En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3 (MOE) y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' se encuentra en cada uno de las alas 3' y 5'. En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido modificado que comprende un grupo sustituyente 2'-O-CH2CH2OCH3 (MOE) y al menos un nucleósido modificado que comprende un puente 4'-CH[(R)-(CH3)]-O-2' se encuentra en cada uno de las alas 3' y 5'.
d . Ciertas longitudes generales
La presente invención proporciona compuestos oligoméricos que incluyen oligonucleótidos de cualquiera de una variedad de gamas de longitudes. La invención proporciona compuestos oligoméricos u oligonucleótidos que constan de nucleósidos enlazados X a Y, donde X representa el menor número de nucleósidos en el intervalo e Y representa el mayor número de nucleósidos de la gama. En ciertas de dichas realizaciones, X e Y se seleccionan cada uno independientemente de entre 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30; siempre y cuando X<Y. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la invención proporciona compuestos oligoméricos que comprenden oligonucleótidos que constan de 10 a 11, 10 a 12, 10 a 13, 10 a 14, 10 a 15, 10 a 16, 10 a 17, 10 a 18, 10 a 19, 10 a 20, 10 a 21, 10 a 22, 10 a 23, 10 a 24, 10 a 25, 10 a 26, 10 a 27, 10 a 28, 10 a 29, 10 a 30,11 a 12,11 a 13,11 a 14, 11 a 15,11 a 16,11 a 17,11 a 18, 11 a 19,11 a 20, 11 a 21, 11 a 22, 11 a 23, 11 a 24, 11 a 25, 11 a 26, 11 a 27, 11 a 28, 11 a 29,11 a 30, 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26,13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 al 25, 14 a 26, del 14 al 27, 14 a 28, 14 y 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 a 23, 15 a 24, 15 a 25, de 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19,16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23,16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17to22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 a 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, de 18 a 10 20,18 a 21,18 a 22, 18 a 23,18 a 24,18 a 25,18 a 26,18 a 27,18 a 28,18 a 29,18 a 30,19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21,20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, de 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 y 23 de, de 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, de 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, de 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 1523 a 29,23 a 30, 24 a 25,24 a 26,24 a 27, 24 a 28,24 a 29,24 a 30,25 a 26,25 a 27,25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, de 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, de 27 a 28, 27 a 29, de 27 a 30, de 28 a 29, 28 a 30, o 29 a 30 nucleósidos enlazados.
En realizaciones en las que el número de nucleósidos de un compuesto oligomérico o un oligonucleótido es limitado, ya sea a un rango o a un número específico, el compuesto oligomérico o oligonucleótido puede, sin embargo comprender además otros sustituyentes adicionales. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende 8-30 nucleósidos excluye oligonucleótidos que tienen 31 nucleósidos, pero, a menos que se indique otra cosa, un oligonucleótido de este tipo puede comprender además, por ejemplo uno o más conjugados, grupos terminales, u otros sustituyentes. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido gápmero tiene alguna de las longitudes anteriores.
Además, cuando un oligonucleótido se describe mediante un rango de longitud total y por regiones que tienen longitudes especificadas, y donde la suma de las longitudes especificadas de las regiones es menor que el límite superior del rango de longitud total, el oligonucleótido puede tener nucleósidos adicionales, más allá de los de las regiones determinadas, siempre que el número total de nucleósidos no excede el límite superior del rango de longitud total.
e. Ciertos oligonucleótidos
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos de la presente invención se caracterizan por su motivo de modificación y la longitud total. En ciertas realizaciones, dichos parámetros son cada uno independientes uno de otro. Por lo tanto, cada enlace internucleosídico de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gápmero puede ser modificado o no modificado y puede o no seguir el patrón de modificación de gápmero de las modificaciones de azúcar. Por ejemplo, los enlaces de internucleósido dentro de las regiones de ala de un sugargápmero pueden ser iguales o diferentes uno del otro y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces de internucleósido de la región de hueco. Del mismo modo, tales oligonucleótidos de sugargápmero pueden comprender uno o más nucleobases modificadas independientes del patrón de gápmero de las modificaciones de azúcar. Un experto en la técnica apreciará que tales motivos se pueden combinar para crear una variedad de oligonucleótidos.
En este documento, si una descripción de un oligonucleótido o compuesto de oligómero descrito con respecto a uno o más parámetros, tal parámetro no está limitado. Por lo tanto, un compuesto oligomérico descrito por tener sólo un motivo de azúcar gápmero sin descripción adicional puede tener cualquier longitud, motivo de enlace internucleosídico, y el motivo de modificación de nucleobase. A no ser que se indique lo contrario, todas las modificaciones químicas son independientes de la secuencia de nucleobase.
F. Ciertos grupos de conjugado
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son modificados por unión de uno o más grupos conjugados. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto oligomérico adjunto incluyendo pero no limitado a la farmacodinámica, farmacocinética, estabilidad, unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y despacho. Los grupos conjugados se usan rutinariamente en las técnicas químicas y están enlazados directamente o a través de un resto de unión de conjugado opcional o grupo de enlace conjugado a un compuesto original tal como un compuesto oligomérico, tales como un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, restos de ácido cólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Ciertos grupos conjugados se han descrito anteriormente, por ejemplo: resto de colesterol (Letsinger et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), atioether, por ejemplo, hexilo-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 25306-309; Manoharan et al., Bioorg. Medicina. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, dodecanodiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBS Lett, 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al, Tetrahedron Left, 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nucl Acids Res, 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleósidos & Nucleótidos, 1995, 14, 969-973), o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto octadecilamina o hexiloamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
En ciertas realizaciones, un grupo conjugado comprende una sustancia de farmacológica activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, 2,3,5-ácido triiodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, internucleósido, un barbitúrico, una cefalosporina, un fármaco de sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
En ciertas realizaciones, grupos conjugados están unidos directamente a los oligonucleótidos en compuestos oligoméricos. En ciertas realizaciones, grupos conjugados se unen a oligonucleótidos por un grupo conjugado de enlace. En ciertas de dichas realizaciones, grupos de enlace de conjugado, incluyendo, pero no limitado a, restos de unión bifuncionales, tales como los conocidos en la técnica son susceptibles a los compuestos proporcionados en el presente documento. Grupos de unión conjugados son útiles para grupos de enlace de conjugado, tales como grupos estabilizadores químicos, grupos funcionales, grupos indicadores y otros grupos para sitios selectivos en un compuesto parental, tales como por ejemplo un compuesto oligomérico. En general, un resto de enlace bifuncional comprende un resto de hidrocarbilo que tiene dos grupos funcionales. Uno de los grupos funcionales se selecciona para unirse a una molécula parental o compuesto de interés y el otro se selecciona para unirse esencialmente cualquier grupo seleccionado, tal como grupo funcional químico o un grupo conjugado. En algunas realizaciones, el enlazador conjugado comprende una estructura de cadena o un oligómero de unidades de repetición tales como glicol de etileno o unidades de ácido amino. Ejemplos de grupos funcionales que se usan de forma rutinaria en un resto de unión bifuncional incluyen, pero no se limitan a, electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrófilos. En algunas realizaciones, restos de unión bifuncionales incluyen amino, hidroxilo, ácido carboxílico, tiol, insaturaciones (por ejemplo, dobles o triples enlaces), y similares.
Algunos ejemplos no limitativos de restos de conjugado de enlace incluyen pirrolidina, 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanoico (ADO), succinimidilo 4-(N-maleimidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) y 6-ácido aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros grupos de unión incluyen, pero no se limitan a, alquilo C1-C10 sustituido, alquenilo sustituido o C2-C10 sustituido o no sustituido o, alquinilo C2-C10 no sustituido, en el que una lista no limitante de grupos sustituyentes preferidos incluye hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
Los grupos conjugados pueden estar unidos a uno o ambos extremos de un oligonucleótido (grupos conjugados terminales) y/o en cualquier posición interna.
En ciertas realizaciones, grupos conjugados se encuentran en el extremo 3' de un oligonucleótido de un compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, grupos conjugados están cerca del extremo 3'. En ciertas formas de realización, los conjugados se unen en el extremo Y de un compuesto oligomérico, pero antes de uno o más grupos terminales de nucleósidos. En ciertas realizaciones, grupos conjugados se colocan dentro de un grupo terminal.
La presente invención proporciona compuestos oligoméricos. Tales compuestos oligoméricos comprenden un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido y uno o más conjugados y/o grupos terminales. Tal conjugado y/o grupos terminales pueden añadirse a oligonucleótidos que tienen cualquiera de los motivos discutidos anteriormente. Así, por ejemplo, un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido que tiene una región de nucleósidos alternos pueden comprender un grupo terminal.
C. Compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos proporcionados en el presente documento son compuestos antisentido. Tales compuestos antisentido son capaces de hibridarse a un ácido nucleico diana, lo que resulta en al menos una actividad antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido se hibridan específicamente con una o más dianas de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido de hibridización específica tiene una secuencia de nucleobase que comprende una región que tiene suficiente complementariedad a un ácido nucleico diana para permitir la hibridación y resultar en actividad antisentido e insuficiente complementariedad a cualquier no diana a fin de evitar la hibridación no específica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico no diana bajo condiciones en las que se desea la hibridación específica (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para usos in vivo o terapéuticos, y bajo condiciones en las que los ensayos se realizan en el caso de ensayos in vitro).
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona compuestos antisentido que comprenden oligonucleótidos que son completamente complementarios al ácido nucleico diana sobre toda la longitud del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, oligonucleótidos son 99% complementario al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos son 95% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, tales oligonucleótidos son 90% complementarios al ácido nucleico diana.
En ciertas realizaciones, tales oligonucleótidos son 85% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, tales oligonucleótidos son 80% complementarios al ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido comprende una región que es completamente complementaria a un ácido nucleico diana y es al menos 80% complementario con el ácido nucleico diana sobre toda la longitud del oligonucleótido. En ciertas de dichas realizaciones, la región de plena complementariedad es de 6 a 14 nucleobases de longitud.
a. Ciertas actividades antisentido y mecanismos
En ciertas actividades antisentido, la hibridación de un compuesto antisentido da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde un ácido nucleico diana. Por ejemplo, ciertos compuestos antisentido resultan en escisión mediada de RNasa H de ácido nucleico diana. RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN. El "ADN" en tal dúplex ARN:ADN, no necesitan ser ADN sin modificar. En ciertas realizaciones, la invención proporciona compuestos antisentido que son suficientemente "de tipo ADN" para provocar la actividad de RNasa H. Tales compuestos de antisentido de tipo ADN, incluyen, pero no se limitan a gápmeros que tienen restos de azúcar de deoxifuranosa no modificados en los nucleósidos del hueco y restos de azúcar modificados en los nucleósidos de las alas.
Actividades antisentido pueden ser observadas directamente o indirectamente. En ciertas realizaciones, observación o detección de una actividad antisentido implica la observación o detección de un cambio en una cantidad de un ácido nucleico diana o la proteína codificada por tal ácido nucleico diana; un cambio en la proporción de variantes de empalme de un ácido nucleico o proteína; y/o un cambio fenotípico en una célula o animal.
En ciertas realizaciones, los compuestos que comprenden oligonucleótidos que tienen un motivo de nucleósido gápmero descrito aquí tienen propiedades deseables en comparación con oligonucleótidos no gápmeros o para gápmeros que tienen otros motivos. En ciertas circunstancias, es deseable identificar los motivos que resultan en una combinación favorable de actividad antisentido potente y relativamente baja toxicidad. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente invención tienen un índice terapéutico favorable (medida de la potencia dividida por medida de la toxicidad).
b. Compuestos antisentido selectivos
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en este documento son selectivos para una diana con relación a un ácido nucleico no diana. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleobases de la diana y los ácidos nucleicos no diana difieren en no más de 4 nucleobases diferenciadoras en la región de diana. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleobases de la diana y los ácidos nucleicos no diana difieren por no más de 3 nucleobases diferenciadoras en la región de diana. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleobases de la diana y los ácidos nucleicos no diana difieren en no más de 2 nucleobases diferenciadoras en la región de diana. En ciertas realizaciones, las secuencias de nucleobase de la diana y los ácidos nucleicos no de diana difieren por una sola nucleobase diferenciadora en la región diana. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de diana y no de diana y son transcritos de diferentes genes. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos diana y no diana son alelos diferentes para el mismo gen.
Se consigue selectividad de los compuestos antisentido, principalmente, por complementariedad de nucleobase. Por ejemplo, si un compuesto antisentido no tiene desajustes para un ácido nucleico diana y uno o más desapareamientos de un ácido nucleico no diana, resultará una cierta cantidad de selectividad para el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, proporcionadas en este documento son compuestos antisentido con selectividad mejorada (es decir, la relación de la actividad para la diana a la actividad para no diana es mayor). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un nucleósido selectivo comprende una característica particular o combinación de características (por ejemplo, modificación química, motivo, colocación de nucleósido selectiva, y/o región autocomplementaria) que aumenta la selectividad de un compuesto antisentido en comparación con un compuesto antisentido que no tiene esa característica o combinación de características. En ciertas realizaciones, tales características o combinación de características aumentan la actividad antisentido para la diana. En ciertas realizaciones, tal característica o combinación de características disminuye la actividad de la diana, pero disminuye la actividad para la no diana por una cantidad mayor, lo que resulta en un aumento en la selectividad.
Sin estar limitado por el mecanismo, una mejor selectividad puede resultar de una mayor diferencia en la afinidad de un compuesto antisentido por su diana en comparación con su afinidad por la no diana y/o una mayor diferencia en la actividad de RNasa H para los dúplex resultantes. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido selectivo comprende un nucleósido modificado en esa misma posición como una nucleobase de diferenciación (es decir, el nucleósido selectivo se modifica). Esa modificación puede aumentar la diferencia en la afinidad del compuesto antisentido de unión para la diana con respecto a la no diana. Además, o en la alternativa, la modificación química puede aumentar la diferencia en la actividad RNAsa H para el dúplex formado por el compuesto antisentido y su diana en comparación con la actividad de RNasa para el dúplex formado por el compuesto antisentido y la no diana. Por ejemplo, la modificación puede exagerar una estructura que es menos compatible para la RNasa H para unirse, escindirse y/o liberarse de la no diana.
Los compuestos antisentido que tienen ciertos motivos especificados han mejorado la selectividad, incluyendo, pero no limitado a los motivos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, se consigue una mayor selectividad por oligonucleótidos que comprenden uno cualquiera o más de:
un motivo de modificación que comprende un ala larga 5' (más de 5, 6, o 7 nucleósidos); un motivo de modificación que comprende un ala larga 3' (más de 5, 6, o 7 nucleósidos); un motivo de modificación que comprende una región de hueco corto (menos de 8, 7, o 6 nucleósidos); y
una modificación de motivo que comprende una región de hueco interrumpido (que no tiene tramo ininterrumpido de 2'-deoxinucleósidos no modificados de más de 7, 6 o 5).
i. Ciertos elementos de secuencia de nucleobase selectivos
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido selectivos comprenden elementos de secuencia de nucleobase. Tales elementos de la secuencia de nucleobases son independientes de los motivos de modificación. En consecuencia, los oligonucleótidos que tengan cualquiera de los motivos (motivos de modificación, motivos de nucleósidos, motivos de azúcar, motivos de modificación de nucleobase, y/o motivos de enlace) también puede comprender uno o más de los siguientes elementos de secuencia de nucleobases.
1. Alineación de Nucleobase diferenciadora/nucleósidos de selección de diana
En ciertas realizaciones, una región diana y una región de un ácido nucleico no diana difieren por 1-4 nucleobase diferenciadora. En tales realizaciones, los compuestos antisentido selectivos tienen una secuencia de nucleobases que se alinea con el ácido nucleico no diana con 14 desajustes. Un nucleósido del compuesto antisentido que corresponde a una nucleobase de diferenciación del ácido nucleico diana se denominan en este documento como un nucleósido de selección de diana. En ciertas realizaciones, compuestos de antisentido selectivos que tienen un motivo de gápmero se alinean con un ácido nucleico no diana, de tal manera que un nucleósido de selección de diana se coloca en el hueco. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el nucleósido del hueco desde el extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 2° nucleósido del hueco desde el extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 3er nucleósido del hueco del extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 4° nucleósido del hueco del extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 5° nucleósido del hueco del extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 6° nucleósido del hueco del extremo 5'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 8° nucleósido del hueco del extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 7° nucleósido del hueco del extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 6° nucleósido del hueco del extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 5° nucleósido del hueco del extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 4° nucleósido del hueco del extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 3er nucleósido del hueco desde el extremo 3'. En ciertas realizaciones, un nucleósido de selección de diana es el 2° nucleósido del hueco del extremo 3'.
2. Desajustes en el ácido nucleico diana
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido selectivos comprenden una o más nucleobases desajustadas en relación con el ácido nucleico diana. En ciertas de dichas realizaciones, la actividad antisentido contra la diana se reduce en tal desajuste, pero la actividad en contra de la no diana se reduce en una cantidad mayor. Por lo tanto, en ciertas realizaciones se mejora la selectividad. Cualquier otra base nitrogenada de la nucleobase diferenciadora es adecuada para una falta de coincidencia. En ciertas realizaciones, sin embargo, el desajuste se coloca específicamente dentro del hueco de un oligonucleótido que tiene un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, un desajuste en relación con el ácido nucleico diana está en las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 desde el extremo 5' de la región de hueco. En ciertas realizaciones, un desajuste en relación con el ácido nucleico de diana está en las posiciones 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 de los compuestos antisentido del extremo 3' de la región de hueco. En ciertas realizaciones, un desajuste en relación con el ácido nucleico diana está en las posiciones 1, 2, 3, o 4 de los compuestos antisentido del extremo 5' de la región de ala. En ciertas realizaciones, un desajuste en relación con el ácido nucleico diana está en las posiciones 4, 3, 2, o 1 de los compuestos antisentido desde el extremo 3' de la región de ala.
3. Regiones auto complementarias
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido selectivos comprenden una región que no es complementaria a la diana. En ciertas realizaciones, tal región es complementaria a otra región del compuesto antisentido. Tales regiones se denominan aquí como regiones auto complementarias. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una primera región en un extremo que es complementario a una segunda región en el otro extremo. En ciertas realizaciones, una de las regiones primera y segunda es complementaria al ácido nucleico diana. A menos que el ácido nucleico diana incluye también una región auto complementaria, la otra de la región primera y segunda del compuesto antisentido no será complementario al ácido nucleico diana. Para fines ilustrativos, ciertos compuestos antisentido tienen el siguiente motivo de nucleobase:
ABCXXXXXXXXXC'B'A';
ABCXXXXXXX(X/C')(X/B')(X/A');
(X/A)(X/B)(X/C)XXXXXXXXXC'B'A'
donde cada uno de A, B, y C son cualquier nucleobase; A 'B', y C' son las bases complementarias a A, B, y C, respectivamente; cada X es una nucleobase complementaria al ácido nucleico diana; y dos letras entre paréntesis (por ejemplo, (X/C')) indica que la nucleobase es complementaria al ácido nucleico diana y al nucleósido designado dentro del oligonucleótido antisentido.
Sin estar enlazados a ningún mecanismo, en ciertas realizaciones, se espera que tales compuestos antisentido para formar auto-estructura, que está interrumpida al entrar en contacto con un ácido nucleico diana. El contacto con un ácido nucleico no diana se espera que interrumpa la autoestructura en un grado menor, aumentando así la selectividad en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece de las regiones auto complementarias.
4. Combinaciones de características
Aunque es evidente para un experto en la técnica, los motivos anteriores y otros elementos para incrementar la selectividad se pueden usar solos o en combinación. Por ejemplo, un único compuesto antisentido puede incluir uno cualquiera, dos, tres, o más de: regiones auto complementarias, un desajuste en relación con el ácido nucleico de diana, un hueco de nucleósido corto, una hueco interrumpido, y la colocación específica del nucleósido selectivo.
D. Ciertos ácidos nucleicos de diana
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden o consisten en un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es una molécula de ARN endógeno. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante. En ciertas de dichas realizaciones, el ARN de diana no codificante se selecciona de: un ARN no codificante largo, un ARN no codificante corto, una molécula de ARN intrónica, un ARNsno, un ARNsca, un microARN (incluyendo premicroARN y madurar microARN), un ARN ribosomal, y ARN dirigida a promotor. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana codifica una proteína. En ciertas de dichas realizaciones, el ácido nucleico diana se selecciona de: un ARNm y pre-ARNm, incluyendo las regiones intrónicas, exónicas y no traducidas. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos están al menos parcialmente complementarios a más de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, compuestos antisentido de la presente invención pueden imitar microARNs, que normalmente se unen a múltiples dianas.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico distinto de ARNm maduro. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico que distinto de ARNm maduro o un microARN. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante distinto de un microARN. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante distinto de un microARN o una región intrónica de un pre-ARNm. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante de longitud. En ciertas realizaciones, el ARN diana es un ARNm. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico diana es un pre-ARNm. En ciertas de dichas realizaciones, la región diana es del todo dentro de un intrón. En ciertas realizaciones, la región diana se extiende por una unión intrón/exón. En ciertas realizaciones, la región diana es de al menos 50% dentro de un intrón. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico diana se selecciona de entre el ARN no codificante, incluyendo las regiones exónicas de pre-ARNm. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN ribosomal (ARNr). En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante asociado con la unión de otros preARNms. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN no codificante de retención nuclear.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en este documento son complementarios a una
diana de ácido nucleico que comprende un polimorfismo de nucleótido único. En ciertas de dichas realizaciones, el compuesto antisentido es capaz de modular la expresión de un alelo del ácido nucleico diana que contiene polimorfismo de nucleótido único en un grado mayor o menor de lo que modula otro alelo. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido hibrida con un ácido nucleico diana que contiene polimorfismo de nucleótido único en el sitio de polimorfismo de nucleótido único. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico diana es un transcrito de gen de la huntingtina. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana que contiene polimorfismo de nucleótido único de un transcrito de gen de la huntingtina. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana no es un transcrito de gen de huntingtina. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ácido nucleico diana que contiene polimorfismo de nucleótido único de un transcrito de gen distinto de huntingtina. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico diana es cualquier ácido nucleico que no sea un transcrito de gen de huntingtina.
a. Polimorfismo de nucleótido único
Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos, compuestos y composiciones para inhibir selectivamente ARNm y la expresión de proteínas de una variante alélica de un gen particular o secuencia de ADN. En ciertas realizaciones, la variante alélica contiene un polimorfismo de nucleótido (SNP). En ciertas realizaciones, un SNP se asocia con un alelo mutante. En ciertas realizaciones, un SNP mutante está asociado con una enfermedad. En ciertas realizaciones, un SNP mutante está asociado con una enfermedad, pero no es causal de la enfermedad. En ciertas realizaciones, el ARNm y la proteína de expresión de un alelo mutante está asociado con la enfermedad.
En ciertas realizaciones, el producto génico expresado de un mutante resulta de los alelos en la agregación de las proteínas mutantes que causa la enfermedad. En ciertas realizaciones, el producto génico expresado de un mutante resulta de los alelos en la ganancia de la función de causar la enfermedad. En ciertas realizaciones, los genes con una mutación autosómica dominante que resulta en una ganancia tóxica de función de la proteína son el gen que codifica la proteína precursora de amiloide APP involucrada en la enfermedad de Alzheimer (Gene, 371: 68, 2006); la proteína prión que codifica gen PrP implicada en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y en el insomnio familiar fatal; (Nat Med 1997, 3 1009.). Proteína glial fibrilar ácida que codifica gen GFAP implicada en la enfermedad Alexander (J. Neurosci 2006, 26 111-623). Gen alfa-sinucleína que codifica la proteína de alfasinucleína implicada en la enfermedad de Parkinson (J. Clin Invest 2003, 111: 145); gen SOD1 que codifica la proteína SOD1 implicado en la esclerosis lateral amiotrófica (Science 1998, 281: 1851); gen de atrofin-1 que codifica proteína de atrofin-1 implicada en la atrofia dentatorubral y palidoIuisiana (DRPA) (Trends Mol. Med 2001, 7: 479); proteína ataxina-1 de codificación de gen s Ca 1 involucrada en espinocerebelosa de ataxia-1 (SCA1); (Protein Sci 2003, 12: 953). Proteína proteolipídica que codifica gen PLP implicada en la enfermedad Pelizaeus-Merzbacher; (NeuroMol Med 2007, 4: 73). Gen DYT1 que codifica la proteína torsinA involucrada en la distoma de torsión; (Brain Res 2000, 877: 379). y gen cristalino alfa-B que codifica proteína cristalina alfa-B implicada en enfermedades de agregación de proteínas, incluyendo cardiomiopatía (Cell 2007, 130: 427); gen de alfa1-antitripsina que codifica la proteína alfa1-antitripsina implicada en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática y carcinoma hepatocelular (New Engl J Med 2002,346: 45); gen Ltk que codifica la proteína de quinasa de tirosina de leucocitos involucrada en eritematoso de lupus sistémico sistémico (Hum Mol Gen. 2004, 13: 171); gen PCSK9 que codifica la proteína Pc Sk9 involucrada en la hipercolesterolemia; (Hum Mutat 2009, 30: 520). Proteína receptora de prolactina que codifica el gen receptor de prolactina implicada en tumores de mama (Proc Natl Assoc Sci 2008, 105: 4533); gen CCL5 que codifica la CCL5 de quimiocinas implicadas en la EPOC y el asma (Eur Respir J. 2008, 32: 327); gen PTPN22 codifica la proteína PTPN22 involucrado en la diabetes de tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, y SLE (Proc Natl Assoc Sci 2007, 104: 19767); gen receptor de andrógenos que codifica la proteína del receptor de andrógenos involucrado en la atrofia muscular espinal y bulbar o la enfermedad de Kennedy (J Steroid Biochem Mol Biol 2008, 108: 245); proteína-4B modificadora de cromatina que codifica gen de CHMP4B involucrada en cataratas subcapsulares posteriores progresivas de la infancia (Am J. Hum Genet 2007, 81: 596); proteína receptora de farnesoide X que codifica gen FXR/NR1H4 implicada en enfermedad de colesterol de cálculo biliar, arterosclerosis y diabetes (Mol Endocrinol 2007, 21: 1769); gen ABCA1 que codifica la proteína ABCA1 implicada en la enfermedad cardiovascular (Transl Res 2007, 149: 205); gen CaSR que codifica la proteína receptora sensora de calcio implicada en hipercalciuria primaria (Kidney Int 2007, 71: 1155); proteína alfa-globin que codifica gen alfa-globina implicada en alfa-talasemia (Science 2006, 312: 1215); proteína HTTLPR que codifica gen httlpr involucrada en el trastorno obsesivo compulsivo (Am J. Hum Genet 2006, 78: 815); proteína de vasopresina de arginina que codifica gen AVP en trastornos relacionados con el estrés tales como trastornos de ansiedad y depresión concomitante (CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5: 167); proteínas G que codifican gen GNAS implicadas en defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico; (Trends Pharmacol Sci 2006, 27: 260); proteína APAF1 que codifica gen APAF1 involucrada en una predisposición a la depresión mayor (Mol. Psychiatry 2006, 11: 76); proteína TGF-beta1 que codifica gen TGF-beta1 implicada en el cáncer de mama y cáncer de próstata (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2004, 13: 759); receptor de acetilcolina que codifica gen AChR implicada en el síndrome miasténico congénito (Neurología 2004, 62: 1090); proteína receptora de difosfato de adenosina (ADP) que codifica gen P2Y12 involucrada en el riesgo de enfermedad arterial periférica (Circulation 2003, 108: 2971); proteína LQT1 que codifica gen LQT1 involucrada en la fibrilación auricular (Cardiología 2003, 100: 109); proteína RET que codifica protooncogén RET implicada en el feocromocitoma esporádico (J. Clin Endocrinol Metab 2003, 88: 4911); proteína de filamina A que codifica gen de filamina A implicada en varias malformaciones congénitas (Nat Genet 2003, 33: 487); proteína TDP43 que codifica gen TARDBP implicada en la esclerosis lateral amiotrófica (Hum Mol Gene.t 2010, 19: 671); proteína de ataxina-3 que codifica gen SCA3 implicada en la enfermedad Machado-Joseph (PLoS One 2008, 3: e3341); proteína ataxina-7 que codifica gen SCA7 implicada en ataxia-7 espinocerebelosa (PLoS One 2009, 4: e7232); y proteína huntingtina que codifica el gen de HTT implicada en la enfermedad de Huntington; (Neurobiol Dis 1996, 3: 183); y la proteína de anhidrasa carbónica 4 que codifica el gen CA4, proteína factor de transcripción homeobox de varilla cónica que codifica gen CRX, proteína homólogo 2 de fascina retinal que codifica el gen FSCN2, proteína de deshidrogenasa de monofosfato de inosina 1 que codifica el gen IMPDH1, proteína de grupo E3 subfamilia 2 de receptor nuclear que codifica gen NR2E3, proteína de cremallera de leucina de retina neural que codifica gen de NRL, proteína de factor de empalme 3 de pre-ARNm que codifica gen de PRPF3 (RP18), proteína de factor de empalme 8 de pre-ARNm que codifica gen de PRPF8 (RP13), proteína de factor de empalme 31 de pre-ARNm que codifica gen de PRPF31 (RP11), proteína de periferina 2 que codifica el gen de RDS, proteína de proteína de membrana de barra externa 1 que codifica gen ROM1, proteína rodopsina que codifica gen RHO, proteína de RP1 que codifica gen r P1, proteína reguladora de GTPasa de pigmentosa de retinitis que codifica el gen de RPGR, todos los cuales están involucrados en la enfermedad de Pigmentosa de Retinitis Dominante Autosómica (Adv Exp Med Biol. 2008, 613:203).
En ciertas realizaciones, el alelo mutante está asociado con cualquier enfermedad del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad Creutzfeldt-Jakob, insomnio fatal familiar, enfermedad de Alexander, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, dentatorubral y DRPA de atrofia de palidoluisiana, ataxia espinocerebelosa, la distonía de torsión, cardiomiopatía, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad hepática, carcinoma hepatocelular, lupus eritematoso sistémico, la hipercolesterolemia, cáncer de mama, asma, diabetes de tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, LES, atrofia muscular espinal y bulbar, enfermedad de Kennedy, cataratas subcapsulares posteriores progresivas de la niñez, enfermedad de cálculos biliares de colesterol, arteriosclerosis, enfermedades cardiovasculares, hipercalciuria primaria, alfa-talasemia, trastorno obsesivo compulsivo, ansiedad, depresión comórbida, defectos visuales congénitos, hipertensión, síndrome metabólico, cáncer de próstata, síndrome miasténico congénito, enfermedad arterial periférica, fibrilación auricular, feocromocitoma esporádico, malformaciones congénitas, enfermedad de Machado-Joseph, enfermedad de Huntington y enfermedad pigmentosa de retinitis autosómica dominante.
i. Ciertas dianas de Huntingtin
En ciertas realizaciones, una variante alélica de la huntingtina se reduce selectivamente. Secuencias de nucleótido que codifican la huntingtina incluyen, sin limitación, los siguientes: n° de acceso GENBANK NT_006081.18, truncado de los nucleótidos 1.566.000 a 1.768.000 (reemplazado por n° de acceso GENBANK NT_006051), incorporado aquí como SEQ ID NO: 8, y NM_002111.6, incorporado en este documento como SEQ ID NO: 10.
La Tabla 3 proporciona SNPs encontrados en las célula líneas GM04022, GM04281, GMO2171, y GMO2173B. También se proporcionan las variantes alélicas que se encuentran en cada posición de SNP, el genotipo para cada una de las líneas celulares, y el porcentaje de pacientes en HD que tienen una variante alélica particular. Por ejemplo, dos variantes alélicas para SNP rs6446723 son línea de células T y C. La línea celular GM04022 es TC homocigótico, la línea celular GM02171 es CC homocigótico, la línea celular GMO2173 es TC homocigótico, y la línea celular GM04281 es TT homocigótico. El cincuenta por ciento de los pacientes con EH tiene una posición rs6446723 T en SNP.
Variaciones alélicas para SNIP asociados con HD
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E. Ciertas composiciones farmacéuticas
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos antisentido. En ciertas formas de realización, dicha composición farmacéutica comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable o portador adecuado. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, dicha composición farmacéutica consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es solución salina de calidad farmacéutica. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica comprende uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica se compone de uno o más compuestos antisentido y agua estéril. En ciertas realizaciones, la solución salina estéril es agua de calidad farmacéutica. En ciertas realizaciones, una composición de producto farmacéutico comprende uno o más compuestos antisentido y solución salina con fosfato (PBS). En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica se compone de uno o más compuestos antisentido y solución salina con fosfato estéril (PBS). En ciertas realizaciones, la solución salina estéril de grado farmacéutico es PBS.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido se pueden mezclar con sustancias farmacéuticamente activas y/o inertes aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas o formulaciones. Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas que dependen de un número de criterios, incluyendo, pero no limitados a, vía de administración, extensión de la enfermedad, o la dosis a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualesquier sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos antisentido comprenden uno o más oligonucleótidos que, tras la administración a un animal, incluyendo un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se señala a sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de potasio, y sodio. Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto oligomérico que se escinde por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto oligomérico activo antisentido.
Restos lipídicos se han utilizado en terapias de ácidos nucleicos en una variedad de métodos. En ciertos de tales métodos, el ácido nucleico se introduce en liposomas preformados o lipoplexos hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En ciertos métodos, complejos de ADN con lípidos mono o policatiónicos se forman sin la presencia de un lípido neutro. En ciertas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
tejido particular. En ciertas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
de un agente farmacéutico para el tejido de grasa. En ciertas realizaciones, se selecciona un resto lipídi
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente invención comprenden uno o más oligonucleótidos modificados y uno o más excipientes. En ciertas de dichas realizaciones, los excipientes son seleccionados de agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilocelulosa y polivinilpirrolidona.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende una sistema de administración. Ejemplos de sistemas de administración incluyen, pero no se limitan a, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de liberación son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas que incluyen las que comprenden compuestos hidrófobos. En ciertas realizaciones, se utilizan ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilosulfóxido.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende uno o más moléculas de administración de tejido específico diseñadas para ofrecer uno o más agentes farmacéuticos de la presente invención a tejidos específicos o tipos de células. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo de tejido específico.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende un sistema de codisolvente. Ciertos de dichos sistemas de codisolvente comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible con agua, y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, dichos sistemas de codisolvente se usan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitante de dicho sistema co-disolvente es el sistema de codisolvente de VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del Polysorbate 80TM de tensioactivo no polar y 65% p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de dichos sistemas de codisolvente se pueden variar considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes codisolventes se puede variar: por ejemplo, otros agentes tensioactivos se pueden utilizar en lugar de Polysorbate 80TM; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, pirrolidona de polivinilo; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria se prepara para la administración oral. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se preparan para administración bucal.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica se prepara para administración por inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). En ciertas de dichas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un vehículo y se formula en solución acuosa, tal como agua o tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. En ciertas realizaciones, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas realizaciones, las suspensiones inyectables se preparan usando vehículos líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. Ciertas composiciones farmacéuticas para la inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis.
Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Ciertos disolventes adecuados para su uso en productos farmacéuticos.
Las composiciones para inyección incluyen, pero no se limitan a, disolventes lipófilos y aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilocelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, dichas suspensiones también pueden contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes farmacéuticos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica se prepara para administración transmucosal. En ciertas de dichas realizaciones penetrantes apropiadas para que la barrera se penetre se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende un oligonucleótido en una cantidad terapéuticamente eficaz. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, uno o más oligonucleótidos modificados proporcionados en el presente documento se formulan como un profármaco. En ciertas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco es químicamente convertido a la forma biológicamente, farmacéuticamente o terapéuticamente más activa de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la forma activa correspondiente. Por ejemplo, en ciertos casos, un profármaco puede ser más biodisponible (por ejemplo, a través de la administración oral) que es la forma activa correspondiente. En ciertos casos, profármacos pueden haber mejorado la solubilidad en comparación con la correspondiente forma activa. En ciertas realizaciones, los profármacos son menos solubles en agua que la forma activa correspondiente. En ciertos casos, dichos profármacos poseen transmisión superior a través de las membranas celulares, en donde la solubilidad en agua es perjudicial para la movilidad. En ciertas realizaciones, un profármaco es un éster. En ciertas de dichas realizaciones, el éster se hidroliza metabólicamente al ácido carboxílico tras la administración. En ciertos casos, el compuesto ácido que contiene carboxílico es la correspondiente forma activa. En ciertas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En ciertas de dichas realizaciones, el péptido se escinde tras la administración para formar la forma activa correspondiente.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones útiles para los métodos para reducir la cantidad o actividad de un ácido nucleico diana en una célula. En ciertas realizaciones, la célula está en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero. En ciertas realizaciones, el animal es un roedor. En ciertas realizaciones, el animal es un primate. En ciertas realizaciones, el animal es un primate no humano. En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para uso en métodos de administración de dicha composición, comprendiendo dicho método la administración de un compuesto oligomérico de la presente invención a un animal. Vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a, oral, rectal, transmueosal, intestinal, enteral, tópica, de supositorio, por inhalación, intratecal, intracerebroventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular, intratumoral, y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular y subcutánea). En ciertas realizaciones, intratecales farmacéuticas se administran para alcanzar exposiciones locales en lugar de sistémicas. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden inyectar directamente en el área de efecto deseado (por ejemplo, en el hígado).
Divulgación no limitante
Mientras que ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no a modo de limitación.
Aunque la lista de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como "ARN" o "ADN" según se requiera, en realidad, las secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que tal designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende un resto de azúcar 2'-OH y una base de citosina se podría describir como un ADN que tiene un azúcar modificado (2'-OH para la 2'H natural de ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metiloado) para uracilo natural de ARN).
En consecuencia, las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en este documento, incluyendo, pero no limitadas a las de la lista de secuencias, pretenden abarcar ácidos nucleicos que contienen cualquier combinación de los recursos naturales o modificados ARN y/o ADN, incluyendo, pero no limitado a tales ácidos nucleicos que tienen nucleobases modificadas. A modo de otro ejemplo y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobase "ATCGATCG" abarca todos los compuestos oligoméricos que tienen tal secuencia de nucleobases, ya sea modificada o no modificada, incluyendo, pero no limitado a, tales compuestos que comprenden bases de ARN, tales como los que tienen la secuencia "AUCGAUCG" y aquellos que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN tales como "AUCGATCG" y compuestos oligoméricos que tienen otras bases modificadas o de origen natural, tales como ATmeCGAUCG, en el que meC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en la posición 5.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente invención y no son limitantes. Además, cuando se proporcionan formas de realización específicas, los inventores han contemplado aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona apoyo razonable para los oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo o similar motivo. Y, por ejemplo, donde aparece una modificación de afinidad alta en particular en una posición particular, otras modificaciones de afinidad alta en la misma posición se consideran adecuadas, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1
Síntesis de fosforamiditas de nucleósidos
La preparación de fosforamiditos de nucleósidos se realiza mediante los procedimientos que se ilustran en este documento y en la técnica tales como, pero no limitado a la patente de EE.UU.
6.426.220 y PCT WO 02/36743 publicada.
Ejemplo 2
Síntesis de compuestos oligoméricos
Los compuestos oligoméricos usados de acuerdo con esta invención pueden ser convenientemente y rutinariamente mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis es vendido por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro medio para dicha síntesis conocida en la técnica puede adicional o alternativamente emplearse. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los derivados alquilados y los que tienen enlaces de fosforotioato.
Compuestos oligoméricos: compuestos oligoméricos de fosfodiéster (P=O) no sustituidos y sustituidos, incluyendo, sin limitación, los oligonucleótidos pueden ser sintetizados en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 394) utilizando la química estándar de la fosforamidita con la oxidación por yodo.
En ciertas realizaciones, los enlaces de internucleósido de fosforotioato (P=S) se sintetizan similarmente a enlaces de internucleósido de fosfodiéster con las siguientes excepciones: la tiación se efectúa mediante la utilización de una solución 10% p/v de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona 1,1-dióxido en acetonitrilo para la oxidación de los enlaces fosfito. El tiempo de la etapa de tiación de reacción se aumenta a 180 seg y se precede por la etapa de protección terminal normal. Después de la escisión de la columna y el desbloqueo de la GPC en hidróxido de amonio concentrado a 55°C (12-16 h), los compuestos oligoméricos son recuperados por precipitación con más de 3 volúmenes de dimetilol a partir de una solución 1 M NH4OAc. Enlaces de internucleósido de fosfinato se pueden preparar como se describe en la patente US 5.508.270. Enlaces de internucleósido de fosfonato de alquilo se pueden preparar como se describe en la patente US 204.469.863.
Enlaces de internucleósido de fosfonato de 3'-Deoxi-3'-metiloeno se pueden preparar como se describe en las Patentes US 5.610.289 o 5.625.050.
Enlaces de internucleósido de fosforamidita se pueden preparar como se describe en la Patente US, 5.256.775 o en la Patente US 5.366.878.
Enlaces de internucleósido de alquilfosfonotioato se pueden preparar como se describe en solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicada como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Enlaces de internucleósido de fosforamidato 3'-Deoxi-3'-amino se pueden preparar como se describe en la patente US 5.476.925.
Enlaces de internucleósido de fosfotriéster se pueden preparar como se describe en la patente US 5.023.243.
Enlaces de internucleósido de fosfato de borano se pueden preparar como se describe en las patentes de EE.UU. 5.130.302 y 5.177.198.
Los compuestos oligoméricos que tienen uno o más aditivos reforzantes que contienen enlaces internucleosídicos incluyendo, sin limitación, oligonucleósidos enlazados a metiloenometiloimino, también identificados como oligonucleósidos enlazados a MMI, oligonucleósidos enlazados a metiloenodimetilohidrazo, también identificados como oligonucleósidos enlazados a MDH, oligonucleósidos enlazados a metiloenocarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos enlazados a amida-3, y oligonucleósidos enlazados a metiloenoamino-carbonilo, también identificados como oligonucleósidos enlazados a amida-4, así como compuestos oligoméricos de columna vertebral mixtos que tienen, por ejemplo, enlaces alternantes MMI y P=O o P=S se pueden preparar como se describe en EE.UU. Las patentes 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5.602.240 y 5.610.289.
Enlaces de internucleósido formacetal y tioformacetal se pueden preparar como se describe en patentes de EE.UU 5.264.562 y 5.264.564.
Enlaces de óxido de etileno internucleósido se pueden preparar como se describe en la patente de EE.UU. 5.223.618.
Ejemplo 3
Aislamiento y purificación de compuestos oligoméricos
Después de la escisión del soporte sólido de vidrio de poro controlado o de otro medio de soporte y desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55°C durante 12-16 horas, los compuestos de oligómero, incluyendo, sin limitación de oligonucleótidos y oligonucleósidos, se recuperan por precipitación de 1 M NH4OAc con >3 volúmenes de dimetilol. Compuestos oligoméricos sintetizados se analizan mediante espectroscopia de masas por electropulverización (determinación del peso molecular) y por electroforesis en gel capilar. Las cantidades relativas de fosforotioato y enlaces de fosfodiéster obtenidos en la síntesis está determinado por la relación del peso molecular correcto en relación con el producto -16 amu (+/-32 /-48). Para algunos estudios los compuestos oligoméricos se purifican mediante HPLC, como se describe por Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con material purificado HPLC son generalmente similares a los obtenidos con material purificado no HPLC.
Ejemplo 4
Síntesis de compuestos oligoméricos utilizando el formato de la placa de 96 pocilios
Los compuestos oligoméricos, incluyendo, sin limitación de oligonucleótidos, se pueden sintetizar a través de química de fosforamidita de fase sólida P(III) en un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos. Enlaces de fosfodiéster internucleósido son proporcionados por oxidación con yodo acuoso. Se generan enlaces de internucleósido de fosforotioato por sulfuración utilizando 3,H-1,2 benzoditiol-3-ona 1,1 dióxido (reactivo Beaucage) en acetonitrilo de anhidro. Fosforamiditas beta-cianoetilo-diiso-propilo protegidas por base estándar se pueden adquirir de proveedores comerciales (por ejemplo PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). nucleósidos no estándar se sintetizan de acuerdo con métodos estándar o patentados y se pueden funcionalizar como fosforamiditas de betacianoetildiiso-propilo de base protegida.
Los compuestos oligoméricos pueden ser escindidos de soporte y se desprotegieron con NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60°C) durante 12-16 horas y el producto liberado después se secó a vacío. El producto seco se resuspendió entonces en agua estéril para proporcionar una placa maestra a partir de la cual todas las muestras de placas analíticas y de ensayo se diluyen a continuación utilizando pipetas robóticas.
Ejemplo 5
Análisis de compuestos oligoméricos utilizando el formato de placa de 96 pocillos
La concentración de compuestos oligoméricos en cada pocillo se puede evaluar mediante la dilución de muestras y espectroscopia de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se puede evaluar por electroforesis capilar (CE), ya sea en el formato de 96 pocillos (Beckman P/ACETM MDQ) o, para muestras preparadas individualmente, en un aparato de CE comercial (por ejemplo, Beckman P/ACETM 5000, ABI 270). La composición de base y columna vertebral se confirmó por análisis de masas de los compuestos oligoméricos utilizando espectroscopia de electropulverización-masa. Todas las placas de prueba de ensayo se diluyen a partir de la placa maestra usando pipetas robóticas individuales y multicanales. Las placas se consideraron aceptables si al menos el 85% de los compuestos oligoméricos de la placa es al menos un 85% de longitud completa.
Ejemplo 6
El tratamiento in vitro de células con compuestos oligoméricos
El efecto de los compuestos oligoméricos sobre la expresión de ácido nucleico diana se prueba en cualquiera de una variedad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico diana está presente en niveles medibles. Esto puede determinarse de forma rutinaria usando, por ejemplo, PCR o análisis de transferencia Northern. Las líneas celulares derivadas a partir de múltiples tejidos y especies pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA).
Se proporciona el siguiente tipo de células con fines ilustrativos, pero otros tipos de células se pueden utilizar de forma rutinaria, siempre que la diana se expresa en el tipo celular elegido. Esto puede fácilmente determinarse por métodos rutinarios en la técnica, por ejemplo análisis de transferencia Northern, ensayos de protección de ribonucleasa o RT-PCR.
Células b.END: La línea de células endoteliales de cerebro de ratón b.END se obtuvo de Dr. Werner Risau en el Instituto Max Plank (Bad Nauheim, Alemania). Células b.END son rutinariamente cultivadas en DMEM, alto contenido de glucosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización y dilución cuando alcanzaron aproximadamente el 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria # 353872, BD Biosciences, Bedford, MA) a una densidad de aproximadamente 3.000 células/pocillo para usos que incluyen, pero no se limitan a los experimentos de transfección de compuestos oligoméricos.
Los experimentos que implican el tratamiento de células con compuestos oligoméricos: Cuando las células alcanzan la confluencia apropiada, se tratan con compuestos oligoméricos utilizando un método de transfección como se describe.
UPOFECTIN™
Cuando las células alcanzaron 65-75% de confluencia, se tratan con uno o más compuestos oligoméricos. El compuesto oligomérico se mezcla con LIPOFECTIN™ Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) en suero medio reducido Opti-MEMTM-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para alcanzar la concentración deseada del compuesto oligomérico y una concentración de LIPOFECTIN™ de 2,5 o 3 pg/ml por 100 nM de compuesto oligomérico. Se incuba esta mezcla de transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 0,5 horas. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 100 pL OPTI-MEMtm-1 y luego tratados con 130 pL de la mezcla de transfección. Las células cultivadas en placas de 24 pocillos u otras placas de cultivo tisular estándar son tratados de manera similar, utilizando volúmenes apropiados de compuesto medio y oligomérico. Las células se trataron y los datos se obtuvieron por duplicado o triplicado. Después de aproximadamente 47 horas de tratamiento a 37°C, el medio que contiene la mezcla de transfección se reemplazó con medio de cultivo fresco. Las células se cosechan 16-24 horas después del tratamiento con el compuesto oligomérico.
Otros reactivos de transfección adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, CYTOFECTIN™, LIPOFECTAMINE™, OLIGOFECTAMINA™ y FUGENE™. Otros métodos de transfección adecuados conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a electroporación.
Ejemplo 7
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARNm de diana
La cuantificación de los niveles de ARNm diana se logra mediante la PCR en tiempo real cuantitativa usando el ABI PRISM™ 7600, 7700, o 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Se trata de un sistema de detección de fluorescencia de tubo cerrado, no basado en gel, que permite la cuantificación de alto rendimiento de productos de reacción de cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. A diferencia de la PCR estándar en la que los productos de amplificación se cuantifican después de que la PCR se haya completado, los productos en la PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican a medida que se acumulan. Esto se logra incluyendo en la reacción PCR una sonda de oligonucleótido que se hibrida específicamente entre cebadores de PCR de avance y retroceso, y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante indicador (por ejemplo, FAM o j Oe , obtenidos a partir de cualquiera de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA or Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) está unido al extremo 5' de la sonda y un colorante extintor (por ejemplo, TAMRA, obtenido a partir de cualquiera de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) está unido al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión de colorante indicador se sofoca por la proximidad del extintor colorante 3'. Durante la amplificación, la hibridación de la sonda a la secuencia diana crea un sustrato que puede ser escindido por la actividad 5'-exonucleasa de Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación PCR, la escisión de la sonda por la polimerasa Taq libera el colorante indicador del resto de la sonda (y por lo tanto desde el resto atenuador) y se genera una señal fluorescente de de secuencia específica. Con cada ciclo, moléculas de tinte reportero adicionales se escinden de sus respectivas sondas, y la intensidad de fluorescencia se monitoriza a intervalos regulares por óptica láser integrada en el ABI PRISM™ Sequence Detection System. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie de ARNm a partir de muestras de control no tratadas genera una curva estándarque se utiliza para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento oligonucleótido antisentido de muestras de prueba.
Antes del análisis cuantitativo PCR, conjuntos de sonda de cebador específicos para el gen objetivo que se está midiendo se evalúan por su capacidad de ser "multiplexados" con una reacción de amplificación GAPDH. En la multiplexación, tanto el gen diana como el gen GAPDH interno estándar se amplifican al mismo tiempo en una sola muestra. En este análisis, el ARNm aislado de células no tratadas se diluye en serie. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos de sonda de cebador específicos para GAPDH solamente, gen diana solamente ("plexado único"), o ambos (multiplexación). Después de la amplificación PCR, curvas estándar de GAPDH y señal de ARNm diana como una función de la dilución se generan a partir tanto de las muestras de plexado único y multiplexads. Si tanto el coeficiente de la pendiente y correlación de la GAPDH y señales de diana generadas a partir de las muestras multiplexadas caen dentro del 10% de sus valores correspondientes generados a partir de las muestras de plexado único, el conjunto de sonda de cebador específico para ese objetivo se considera multiplexable. También se conocen otros métodos de PCR en la técnica.
Reactivos RT y PCR se obtuvieron de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). RT, PCR en tiempo real se lleva a cabo mediante la adición de mezcla de 20 pL PCR (tampón de PCR 2.5x menos MgCh, 6,6 mM MgCh, 375 pM cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de cebador directo y cebador inverso, 125 nM de sonda, 4 Unidades de inhibidor de RNasa, 1,25 unidades de PLATINUM® Taq, 5 Unidades MuLV transcriptasa inversa, y 2,5x tinte ROX) a placas de 96 pocillos que contienen 30 pL solución de ARN total (20-200 ng). La reacción RT se lleva a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48°C. Después de una incubación durante 10 minutos a 95°C para activar la PLATINUM® Taq, 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas se llevan a cabo: 95°C durante 15 segundos (desnaturalización) seguido de 60°C durante 1,5 minutos (hibridación/extensión).
Cantidades de diana de gen obtenidas por RT, PCR en tiempo real se normalizan utilizando ya sea el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o mediante la cuantificación del ARN total utilizando RIBOGREEN™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantifica por RT-PCR en tiempo real, al ejecutarse simultáneamente con la diana, la multiplexación, o por separado. El ARN total se cuantificó usando reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación del ARN por RIBOGREEN™ se enseñan en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374).
En este ensayo, 170 pL de reactivo de trabajo RIBOGREEN™ (reactivo RIBOGREEN™ diluido 1: 350 en 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) se pipetea en una placa de 96 pocillos que contiene 30 pL de ARN purificada, ARN celular. La placa se lee en un CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
Ejemplo 8
Análisis de la inhibición de la expresión diana
Modulación antisentido de una expresión diana puede ensayarse en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un nivel de ARNm diana se puede cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción competitiva en cadena de polimerasa (PCR), o PCR en tiempo real. PCR cuantitativa en tiempo real es actualmente deseada. El análisis de ARN puede llevarse a cabo en el ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Un método de análisis de ARN de la presente descripción es el uso de ARN celular total como se describe en otros ejemplos de esta memoria. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. (PCR) cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el ABI PRISM™ 7600, 7700, or 7900 Sequence Detection System, disponible en el mercado, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, Ca y se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles de proteína de una diana se pueden cuantificar en una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoenzimático enlazado a enzima (ELISA) o separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden ser identificados y obtenidos a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo MSRs de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se puede preparar a través de métodos de generación de anticuerpos convencionales monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los métodos para la preparación de antisueros policlonales se enseñan en, por ejemplo, Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se enseña en, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.
Métodos de inmunoprecipitación son estándar en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. transferencia Western (inmunotransferencia) es estándar en la técnica y se puede encontrar a, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Los ensayos de inmunoabsorción enlazada a enzimas (ELISA) son estándar en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.
Ejemplo 9
Diseño de ensayos fenotípicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores de la diana Ensayos fenotípicos
Una vez que los inhibidores de diana han sido identificados por los métodos descritos en el presente documento, los compuestos oligoméricos son investigados adicionalmente en uno o más ensayos fenotípicos, teniendo cada uno de los puntos finales mensurables predictivos de la eficacia en el tratamiento de un estado de enfermedad particular, o condición.
Ensayos fenotípicos, kits y reactivos para su uso son bien conocidos para los expertos en la técnica y se utilizan en el presente documento para investigar el papel y/o de la asociación de una diana en la salud y la enfermedad. Ensayos fenotípicos representativos, que se pueden comprar a partir de cualquiera de varios vendedores comerciales, incluyen aquellos para la determinación de la viabilidad celular, la citotoxicidad, la proliferación o la supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA), ensayos a base de proteína incluyendo ensayos enzimáticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA), regulación celular, transducción de señales, la inflamación, procesos oxidativos y apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubo, ensayos de citoquinas y hormonas y ensayos metabólicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
En un ejemplo no limitante, las células determinadas para ser apropiadas para un ensayo particular fenotípico (es decir, células MCF7 seleccionadas para estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) se tratan con un inhibidor de destino identificado a partir de los estudios in vitro, así como compuestos de control en concentraciones óptimas que son determinadas por los métodos descritos anteriormente. Al final del período de tratamiento, células tratadas y no tratadas se analizaron mediante uno o más métodos específicos para el ensayo para determinar los resultados fenotípicos y puntos finales.
Criterios de valoración fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular en el tiempo o la dosis de tratamiento, así como los cambios en los niveles de los componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Las mediciones de estado celular que incluyen el pH, la etapa del ciclo celular, la ingesta o la excreción de indicadores biológicos por la célula, también son puntos finales de interés.
La Medición de la expresión de uno o más de los genes de la célula después del tratamiento también se utiliza como un indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de la diana. Genes de sello, o aquellos genes sospechosos de estar asociados con un estado específico de la enfermedad, afección o fenotipo, se miden tanto en las células tratadas como no tratadas.
Estudios in vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos en este documento son animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen a los humanos.
Ejemplo 10
Aislamiento de ARN
Poli(A)+ aislamiento ARNm
Poli(A)+ ARNm se aísla de acuerdo con Miura et al., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Otros métodos para la poli(A)+ de aislamiento de ARNm son de rutina en la técnica. En resumen, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, medio de crecimiento se retira de las células y cada pocillo se lava con 200 pL de PBS frío. 60 pL de tampón de lisis (10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5% de NP-40, 20 mM de complejo vanadilo-ribonucleósido) se añade a cada pocillo, la placa se agitó suavemente y luego se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. 55 pL de lisado se transfiere a placas de 96 pocillos recubiertas de Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA). Las placas se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 pL de tampón de lavado (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM de EDTA, 0,3 M de NaCl). Después del lavado final, la placa se transfirió sobre toallas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y luego se secó al aire durante 5 minutos. 60 pL de tampón de elución (5 mM Tris-HCl pH 7,6), precalentado a 70°C, se añade a cada pocillo, la placa se incubó en una placa caliente a 90°C durante 5 minutos, y el eluato se transfiere después a una placa de 96 pocillos fresca. Las células cultivadas en 100 mm u otras placas estándar pueden tratarse de manera similar, utilizando volúmenes apropiados de todas las soluciones. Aislamiento ARN total
ARN total se aisló utilizando un kit RNEASY 96TM y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. En resumen, para células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retira de las células y cada pocillo se lava con 200 pL de PBS frío. 150 pL de RLT de tampón se añade a cada pocillo y la placa se agitó vigorosamente durante 20 segundos. 150 pL de 70% de etanol se añade a cada pocillo y se mezclaron los contenidos mediante pipeteo tres veces hacia arriba y hacia abajo. Las muestras se transfieren a la placa de pocillos RNEASY 96tm conectada a un colector QIAVACTM equipado con una bandeja de recogida de residuos y unido a una fuente de vacío. Se aplica vacío durante 1 minuto. 500.pL de Tampón RW1 se añade a cada pocillo de la placa RNEASY 96TM y se incubaron durante 15 minutos y el vacío se aplicó de nuevo durante 1 minuto. Un 500 pL adicional de Tampón RW1 se añade a cada pocillo de la placa RNEASY 96TM y se aplica el vacío durante 2 minutos. 1 ml de tampón RPE se añade a continuación a cada pocillo de la placa RNEASY 96TM y el vacío aplicado durante un período de 90 segundos. El tampón de lavado RPE se repite entonces y se aplica el vacío durante 3 minutos adicionales. La placa se retira a continuación del colector QIAVACTM y secó con papel secante sobre toallas de papel. La placa entonces se vuelve a conectar al colector QIAVACTM equipado con un bastidor de tubo de recogida que contiene 1,2 ml de tubos de recogida. ARN se eluye a continuación pipeteando 140 pL de RNasa libre de agua en cada pocillo, incubándose durante 1 minuto, y después aplicándose el vacío durante 3 minutos. Las etapas de pipeteado y elución repetitivas pueden ser automatizadas usando un BioRobot QIAGEN 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). Esencialmente, después de lisar las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a la cubierta de robot en el que el pipeteado, tratamiento con DNasa y etapas de elución se llevan a cabo.
Ejemplo 11
Cebadores y sondas de diana específica
Las sondas y cebadores pueden ser diseñados para hibridarse a una secuencia diana, utilizando la información de secuencia publicada.
Por ejemplo, para PTEN humano, el siguiente conjunto de sonda de cebador fue diseñado usando la información de secuencia publicada (número de acceso GENBANK™ U92436.1, SEQ ID NO: 1).
Cebador delantero: AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT (SEQ ID NO: 2)
Cebador inverso: TGCACATATCATTACACCAGTTCGT (SEQ ID NO: 3)
Y la sonda de PCR:
FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA (SEQ ID NO: 4), donde FAM es el tinte fluorescente y TAMRA es el colorante inactivador.
Ejemplo 12
El análisis de transferencia Western de los niveles de proteína diana
El análisis de transferencia Western (análisis de inmunotransferencia) se lleva a cabo utilizando métodos estándar. Las células se cosecharon 16-20 h después del tratamiento con oligonucleótido, se lavaron una vez con PBS, se suspendieron en tampón de Laemmli (100 pl/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 16%. Los geles se ejecutan durante 1,5 horas a 150 V, y se transfirieron a membrana de transferencia de Western. El anticuerpo primario apropiado dirigido a un objetivo se utiliza, con un anticuerpo secundario marcado radiactivamente o marcado fluorescentemente dirigido contra la especie de anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron utilizando un PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA).
Ejemplo 13
Método general para la preparación de fosforamiditas, compuestos 1-4
Bx es una base heterocíclica;
Ri y R2 son cada uno H, OH, o un grupo sustituyente 2'-azúcar independientemente
Los compuestos 1 y 2 están disponibles comercialmente de Glen Research. Los compuestos 3 y 4 se preparan según los procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en la especificación en este documento (véase Seth et al., Bioorg. Medicina. Chem., 2011, 21 (4), 1122­ 1125, J Org. Chem., 2010, 75 (5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52-(1), 553-554); y también véase PCT Internacional Aplications publicada (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071), y patente de EE.UU. 7.569.686).
Ejemplo 14
Preparación del Compuesto 10
Ph O
p - N(>'Pr)2
Figure imgf000053_0001
N(/Pr)2
Figure imgf000053_0002
Bx es una base heterocíclica
Ph es un grupo fenilo
Bis(diisopropilamino) clorofosfina, el Compuesto 5 y desoxirribonucleósido protegido por DMT, el Compuesto 9 están disponibles comercialmente de Sigma-Aldrich, y BOC Biosciences.
Los compuestos 7 y 10 se preparan usando procedimientos similares a los publicados en la literatura (Yamada et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (15), 5251-5261).
Ejemplo 15
Preparación del Compuesto 13
Figure imgf000053_0003
R3 es -CH2CH3, -CH=CH2, -CH2CH=CH2, -CH2CH2OCH3, -CH2CH2OPG o -CH2CH2OCH2F;
PG es un grupo protector;
Bx es una base heterocíclica
Bis(diisopropilamino) clorofosfina, el Compuesto 5 y desoxirribonucleósido protegido por DTM, el Compuesto 9 están disponibles comercialmente de Sigma-Aldrich, y BOC Biosciences. El reactivo de Grignard, el Compuesto 11 está disponible comercialmente de varias fuentes o pueden prepararse usando procedimientos similares a los publicados en la literatura (Oppolzer et aL, Tet. Let., 1982, 23-(38), 3901-3904).
Ejemplo 16
Método general para la preparación del compuesto 16
Figure imgf000054_0001
Bx es una base heterocíclica;
R4 es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, acilo o acilo
sustituido; donde los grupos sustituyentes se seleccionan independientemente de halógeno, oxo,
hidroxilo, amino, tio, azido, ciano o carboxilo;
Bis(diisopropilamino) clorofosfina, el Compuesto 5 y desoxirribonucleósido protegido por DTM,
el Compuesto 9 están disponibles comercialmente de Sigma-Aldrich, y BOC Biosciences. El reactivo de
Grignard, el Compuesto 14 está disponible comercialmente de diversas fuentes o se pueden preparar
según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 15.
El Compuesto 15 utilizado en la etapa de fosfitilación sólo sirve para ilustrar los compuestos
descritos en este documento y no se pretende que sean limitantes. Reactivos fosfitilantes adicionales
conocidos en la técnica como se describe en la especificación en este documento también pueden
emplearse para generar diversos análogos de fosforamidita del Compuesto 16 y se utilizan como
bloques de construcción para síntesis de oligonucleótido.
Ejemplo 17
Preparación de fosforamiditas diméricas, compuestos 20 y 21
Figure imgf000055_0001
Los compuestos 1 y 17 están comercialmente disponibles en Glen Research y Chemexpress. Los compuestos 18 y 19 se separaron mediante cromatografía en columna. Aunque uno de los enlaces de metilofosfonato de internucleósido en dímero de fosforamidita DMT 20 o 21 es Rp y el otro es Sp, la estereoquímica absoluta en el centro quiral de fósforo (P*) de los dímeros no ha sido determinada. El análisis espectral de los Compuestos 20 y 21 fue coherente con las estructuras.
Ejemplo 18
Método General para la Preparación de Compuesto Oligomérico 25
Figure imgf000056_0001
)
El Unylinker™ 22 está disponible comercialmente. El compuesto oligomérico 25 que comprende un enlace modificado internucleósido (por ejemplo, fosfonato de metilo, fosfonoacetato o fosfonoformiato) se prepararon usando procedimientos estándar en la síntesis ADN/ARN automatizado (véase Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Bloques de construcción de fosforamidita, los compuestos 1, 2, 3, 10 y 13 se preparan según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 13 a 15. Las etapas sintéticas ilustradas están destinadas a ser representativas y no pretenden ser limitativas como otros bloques de construcción de fosforamidita que se describen en los Ejemplos 13 a 16a se pueden utilizar en lugar del Compuesto 1, 2, 3, 10 o 13 para preparar un compuesto oligomérico que tiene una secuencia y composición predeterminada. El orden y la cantidad de fosforamiditas añadido al soporte sólido se pueden ajustar para preparar compuestos oligoméricos con huecos como se describe en el presente documento. Tales compuestos oligoméricos con huecos pueden tener una composición predeterminada y la base de secuencia según lo dictado por cualquier diana dada.
Ejemplo 19
Método general para la preparación de compuestos oligoméricos que comprenden un fósforo
modificado que contienen enlace internucleósido a través de técnicas de fase sólida (preparación de 460209, 558255, 573815, 560221, A01 y A02)
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos y soluciones utilizadas para la síntesis de compuestos oligoméricos se adquirieron de fuentes comerciales. Bloques de construcción de fosforamidita estándar y soporte sólido se utilizan para los residuos de incorporación de nucleósidos que incluyen, por ejemplo, residuos T, A, U, G, C y mC. Una solución de fosforamidita de 0,1 M en acetonitrilo anhidro se utilizó para l3-D-2’-deoxiribonucleósido, fosfonato de metilo y fosfonoacetato.
Para (R)- o (S)-metilo fosforamidita dimérica de fosfonato, se utilizó una solución de 0,1 M en acetonitrilo. Para fosforamidita de 2’-O-MOE, se utilizó una solución de 0,2 M en acetonitrilo. Para fosforamidita BNA de etilo constreñido (cEt), se utilizó una solución de 0,2 M en una mezcla 1:1 (v/v) de acetonitrilo y tolueno.
El compuesto oligomérico se sintetizó sobre un soporte sólido VIMAD UnyLinker™ y las cantidades apropiadas de soporte sólido se envasaron en la columna para la síntesis. El ácido dicloroacético (3%) en DCM se utilizó como reactivo detritilante. 4,5-Dicianoimidazol en presencia de N-metilo-imidazol o 1H-tetrazol en CH3CN se utilizó como activador durante la etapa de acoplamiento. La síntesis de compuestos oligoméricos se realizó en un sintetizador de ABI394 (Applied Biosystems) en una escala 2 pmol utilizando los procedimientos establecidos a continuación. Un soporte sólido precargado con el UnyLinker se cargó en una columna de síntesis después de cerrar la salida de fondo de la columna y se añadió CH3CN para formar una suspensión. El Unylinker™ de soporte hinchado se trató con un reactivo que contiene ácido detritilante dicloroacético 3% en DCM para proporcionar los grupos de hidroxilo libres. Durante la etapa de acoplamiento, cuatro a catorce equivalentes de soluciones de fosforamidita fueron entregados con acoplamiento durante 6 minutos para fosforamiditas de desoxirribonucleósidos no modificadas y 13 minutos para otras modificaciones. Todas las demás etapas siguieron los protocolos estándar. Enlaces de fosfodiéster se introdujeron por oxidación con solución tBuOOH al 10% en CH3CN durante un tiempo de contacto de 10 minutos. Enlaces de fosforotioato se introdujeron por sulfuración con PADS (0,2 M) en 1:1 de piridina/CH3CN durante un tiempo de contacto de 5 minutos.
Después de ensamblarse la secuencia deseada, los grupos protectores de fosfato de cianoetilo se desprotegieron utilizando una mezcla 1:1 (v/v) de trietilamina y acetonitrilo. Para fosfonoacetato que contiene compuesto oligomérico, se utilizó solución de DBU al 1,5% en CH3CN. El compuesto oligomérico de soporte sólido unido se lavó con acetonitrilo y se secó a alto vacío. El compuesto oligomérico de soporte sólido unido se suspendió en amoniaco (2,830% en peso) a temperatura ambiente durante 48 h para eliminar grupos protectores de nucleobases y para escindir del soporte sólido.
Se filtró entonces el compuesto oligomérico no unido y el soporte se enjuagó y se filtró con agua:dimetilol (1:1) seguido de agua. El filtrado se combinó y se concentró a sequedad. El residuo obtenido se purificó por HPLC de intercambio iónico catiónico (resina Fuente 30Q, un bicarbonato de sodio - 50 mM en CH3CN:H2O 3:7 (v/v), bicarbonato de sodio B - 50 mM, 1,5 M de bromuro de sodio en CH3CN:H2O 3:7 (v/v), 0-30% en 110 min, flujo 6 mL/min, A =260 nm). Las fracciones que contenían compuesto oligomérico de longitud completa se agruparon (evaluadas por análisis LC/Ms >95%). El residuo se desaló por HPLC en un cartucho de fase inversa para producir el compuesto oligomérico deseado.
SEQ ID NO. Com posición (5' a 3') Química de hueco (motivo) /ISIS NO.
05/460209 r0AkAi<AdTdTdGdIdn,CdA<iTdmCdAk,nCkmCe Control positivo (3/9/3) 05/558255 TeAkAkA<hrdTdGdTdmCdAdTd,,,CdAkmCl(mC, Individual -P(CHj)(=0)- (3/9/3) 05/573815 TeAkAkAdTdyT<|GdTdmCdAdTdn,CdAkn’CkmCe lndiv.dual -P(CHkC02)(=O )
(3/9/3)
06/560221 Ten’Cen’C<!CdwAdTdwTdT<h,mCdAdwGdGd*Ad Alternante -P(CH3)(=S>-GdwAdCdwn’CdTeGeGe motivo diferente (3/14/3) 05/A01 TeAkAkAdTdITdGdTdmCdAdTdmCdAkmCkn,Ce Individual -P((R)-CH3)(=0)- (3/9/3) 05/A02 TeAkAkAdTd<lTdGdTdmCdAdTdmCdAk,"C|tmC, Individual -P((S)-CHj)(=0>- (3/9/3)
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico que tiene un subíndice "x", "y", "w", "z" o "q". Cada nucleósido seguido por un subíndice "x" indica un enlace internucleosídico de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "y" indica un enlace internucleosídico fosfonoacetato (-P(CH2C02)(=O)). Cada nucleósido seguida por un subíndice "w" indica un enlace internucleosídico de tiofosfonato de metilo (-P(CH3)(=S)-). Cada nucleósido seguido de un subíndice "z" indica un enlace internucleosídico de fosfonato (R)-metilo (-P(R)-CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "q" indica un enlace internucleosídico de fosfonato (S)-metilo (-P-(S)-CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado 2’-O-metoxietilo (MOE). Cada nucleósido seguido de un subíndice "k" indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4’-CH((S)-CH3)-O-2’ también se conoce como un nucleósido modificado (S)-cEt. Cada "mCt" es un nucleósido modificado de citosina 5-metilo. Nucleósidos seguidos por subíndices "e", o "k" se ilustran más adelante.
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 20
Protocolo de ensayo de células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC)
El ensayo hPBMC se realizó utilizando el método de tubo BD Vautainer CPT. Una muestra de sangre entera de donantes voluntarios con consentimiento informado en la clínica US HealthWorks (Faraday & El Camino Real, Carlsbad) se obtuvo y se recogió en 4-15 BD Vacutainer CPT de tubos de 8 ml (VWR Cat. n° BD362753). El volumen total de sangre entera de partida aproximado en los tubos CPT para cada donante se registró usando la hoja de datos del ensayo de PBMC.
La muestra de sangre fue remezclada inmediatamente antes de la centrifugación invirtiendo suavemente los tubos 8-10 veces. Tubos CPT se centrifugaron a temperatura ambiente (18-25°C) en un rotor horizontal (hacia fuera) durante 30 min. a 1500-1800 RCF con freno (2700 RPM Beckman Allegra 6R). Las células se recuperaron de la interfaz de la capa leucocitaria (entre Ficoll y capas de gel de polímero); se transfirieron a un tubo cónico estéril de 50 ml y se agruparon hasta 5 tubos CPT/50 ml tubo cónico/donante. Después, las células se lavaron dos veces con PBS (Ca++, Mg++ libre; GIBCO). Los tubos se reponían a 50 ml y se mezclaron mediante la inversión varias veces. A continuación, la muestra se centrifugó a 330 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente (1215 RPM en Beckman Allegra 6R) y se aspiró tanto sobrenadante como sea posible sin perturbar el granulado.
El granulado celular se desprendió girando suavemente el tubo y las células se resuspendieron en RPMI+10% de FBS+pen/strep (~1 ml/10 ml de volumen de sangre entera de partida). Una muestra de 60 pl se pipeteó en un vial de muestra (Beckman Coulter) con 600 pL de reactivo VersaLyse (Beckman Coulter Cat n° A09777) y se agitó con vórtex suavemente durante 10-15 seg. La muestra se dejó incubar durante 10 min. a ta y se mezcló de nuevo antes de cómputo. La suspensión de células se contó con analizador de la viabilidad celular Vicell XR (Beckman Coulter) utilizando el tipo de células PBMC (factor de dilución de 1:11 se almacenó con otros parámetros). Se registraron la célula viva/ml y viabilidad. La suspensión celular se diluyó a 1 x 107 PBMC vivo/ml en RPMI+ 10% de FBS+pen/strep.
Las células se sembraron a 5 x 105en 50 pl/pocillo de placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Falcon Microtest). 50 pl/pocillo de 2x concentración oligos/controles diluidos en RPMI+10% FBS+pen/strep. Se añadió de acuerdo con la plantilla de experimento (100 pL/pocillo total). Las placas se colocaron en el agitador y se mezclaron durante aprox. 1 min. Después de incubarse durante 24 horas a 37°C; 5% de CO2, las placas se centrifugaron a 400 x g durante 10 minutos antes de retirar el sobrenadante para el ensayo de citoquinas de MSD (es decir, IL-6, IL-10, IL-8 y MCPL humanas).
Ejemplo 21
Evaluación de los efectos proinflamatorios en el ensayo hPBMC para un oligonucleótido modificado comprendiendo enlaces internucleosídicos de tiofosfonato de metilo - ensayo in vitro
Un oligonucleótido modificado fue diseñado sobre la base del gápmero 3/14/3 MOE, ISIS 353512. Este oligonucleótido modificado fue creado por tener enlaces de internucleósido de tiofosfonato de metilo alterno (-P(CH3)(=S)-) por la región de hueco. El efecto proinflamatorio del oligonucleótido modificado de orientación HCRP se evaluó en el ensayo de hPBMC utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 20.
Los hPBMCs se aislaron de donantes frescos, voluntarios y se trataron con oligonucleótidos modificados en concentraciones de 0, 0,0128, 0,064, 0,32, 1,6, 8, 40 y 200 pM. Después de un tratamiento de 24 h, se midieron los niveles de citoquinas.
Los niveles de IL-6 se utilizaron como la lectura primaria y en comparación con el control positivo, oligonucleótido, ISIS 353512 y control negativo, ISIS 104838. Los resultados de dos donantes denotados como "Donante 1" y "Donante 2" se presentan a continuación.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
/ISIS NO.
06/353512 TemCemCemC dA dTdTdTdmCdA dGdGdA dGdA dmCdmCdTeGeGe 06/560221 TcmCemCeCdwA dT dwTdT dwmCdA dwGdGdwA dGdwA dCdwmCdTeGeGe 07/104838 GemCeTeGeAcTdT dA dGdA<,GdA dGdA <,GdGeTemCe,nCemCe
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción de nucleósidos seguidos de un subíndice "w". Cada nucleósido seguido por un subíndice "w" indica un grupo metilo tiofosfonato enlace internucleosídico (-P(CH3)(=S)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un desoxirribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado 2'-O-metoxietilo (MOE). Cada "TMC" es un nucleósido modificada 5-metilo citosina. Nucleósidos seguidos por subíndices "e' se ilustran más adelante.
Figure imgf000059_0001
subíndice e
SEQ ID NO. Conc, IL-ó [Donante 1] IL 45(Oonano 2) Hueco
Üu ímica 1
/ISIS NO. (uM) (p t'm l-l (r>^niL) (motivo de hueco)
06/333512 0 6,3 7,8 Control oositivo
0.0128 8.3 10.2 (3/14/3)
0.064 77.2 II 8.2
0,32 131,9 394.3
L,6 152.4 395.3
8 147.6 337.2
40 122.5 228.4
200 119.7 193.5
06/560221 0 5.6 7 6 Alternante 0.0128 6.4 6 9 P(CHtX=S)-
0.064 6,7 7,6 (3/14/3)
0.32 7.6 8,9
1.6 9.1 11.8
8 17.5 24.3
40 65.8 50.2
200 60.0 100.4
07/104838 0 5.8 7.3 Control negativo
0.0128 7.7 7 9 (5/10/5)
0.064 7.5 1! .6
0.32 151 22.0
1.6 73.1 112.8
8 29.6 51.5
40 41.6 69.5
200 55 4 4018.
Ejemplo 22
Polimorfismos de nucleótido único (SNP) de la secuencia del gen de huntingtina (HTT)
Posiciones de SNP (identificadas por Hayden et al, WO/2009/135322) asociadas con el gen HTT fueron asignadas a la secuencia genómica HTT, designada aquí como SEQ ID NO: 08 (NT_006.081,18 truncado de los nucleótidos 1566000 a 1768000). La siguiente tabla proporciona las posiciones de SNP asociadas con el gen HTT y un número de referencia de SNP ID de la base de datos Entrez SNP en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.n¡h.gov/sites/-entrez?db=snp). La tabla a continuación proporciona más detalles sobre cada SNP. El 'número de referencia de SNP ID' o 'número RS' es el número designado para cada SNP de la base de datos Entrez SNP en el NCBI. 'Posición SNP' se refiere a la posición del nucleótido del SNP en SEQ ID NO: 08. 'Polimorfismo' indica que las variantes de nucleótido en esa posición SNP. 'Major alelo' indica que el nucleótido asociado con el alelo principal, o el nucleótido presente en una proporción estadísticamente significativa de los individuos en la población humana. 'Alelo menor' indica el nucleótido asociado con el alelo menor, o el nucleótido presente en una proporción relativamente pequeña de individuos en la población humana.
Polimorfismos nucleares individuales (SNPs) y sus posiciones en la SEQ ID NO: 08
A le lo
N» RS . P os ic ión A lo lo
P o lim o rfism o
SNP m a y o r m e n o r
1*2857936 1963 OT C T
rs 12506200 3707 A/G G A
1*762855 14449 A/G G A
rs3856973 19826 G/A G A
r*2285086 28912 G/A A G
r*7659!44 37974 C/G C G
1*16843804 44043 C/T € T
r*2024115 44221 G/A A G
1*10015979 49095 A/G A G
1*7691627 51063 A/G G A
rs2798235 54485 G/A G A
r*4690072 62160 G/T T O
1*6446723 66466 C/T T C
i*36308l 73280 G/A G A
1*363080 73564 T/C C T
i*363075 77327 G/A G A
1*363064 81063 T/C C T
rs3025849 83420 A/G A G
r*685598l 87929 A/G G A
1*363102 88669 G/A A G
1*11731237 91466 OT C T
r*4690073 99803 A/G G A
i*363144 100948 T/G T G
r*3025838 101099 C/T C T
1*34315806 101687 A/G G A
1*363099 101709 T/C C T
r*363096 119674 T/C T C
1*2298967 125400 C/T T C
r*2298969 125897 A/G G A
r*6844859 130139 C/T T C
i*363092 135682 C/A C A
rs7685686 146795 A /G A G
rs363088 149983 A /T A T
rs362331 155488 C /T T C
« 916171 156468 G /C C G
« 362322 161018 A /G A G
« 362275 164255 T /C C T
« 362273 167080 A /G A G
« 2276881 171314 G /A G A
« 3121419 171910 T /C C T
« 362272 174633 G /A G A
« 362271 175171 G /A G A
« 3775061 178407 C /T C T
« 362310 179429 A /G G A
« 362307 181498 T /C C T
« 362306 181753 G /A G A
« 362303 181960 T /C C T
« 362296 186660 C /A C A
« 1006798 198026 A /G A G .
Ejemplo 23
Los oligonucleótidos modificados que comprenden enlace internucleosídico de fosfonato de metilo que se destina a HTT SNP - estudio in vitro
Una serie de oligonucleótidos modificados se diseñaron basándose en ISIS 460209 en el que la región de hueco contiene nueve l3-D-2’-deoxiribonucleósidos. Los oligonucleótidos modificados fueron diseñados mediante la introducción de un enlace internucleósido de fosfonato de metilo dentro de la región de hueco. Los oligonucleótidos con fósforo modificados que contienen columna vertebral se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir selectivamente mutante (mut) alcanzaron niveles de expresión de ARNm de orientación a rs7685686, dejando la expresión del tipo silvestre (en peso) intacto. La potencia y la selectividad de los oligonucleótidos modificados se evaluaron y se compararon con ISIS 460209. La posición en los oligonucleótidos opuestos a la posición SNP, contados a partir del extremo 5’ es la posición 8.
La línea celular de fibroblastos heterocigóticos GM04022 se utilizó para el ensayo in vitro (de Coriell Institute). Células cultivadas GM04022 a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con 0.12, 0.37, 1,1, 3.3 y 10 pM de concentraciones de los oligonucleótidos modificados. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, las células se lavaron con tampón DPBS y se lisaron. El ARN se extrajo usando purificación Qiagen RNeasy y los niveles de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real usando el ensayo de ABI C_2229297_10 que mide en dbSNP rs362303. Método RT-PCR en corto; Se preparó una mezcla usando 2.020 pL de tampón 2X PCR, 101 pL de cebadores (300 pM dedesde ABI), 1000 pL de agua y 40,4 pL RT MIX. A cada pocillo se añadió 15 pL de esta mezcla y 5 pL de ARN purificado. Se midieron los niveles ARNm HTT mutantes y de tipo silvestre simultáneamente mediante el uso de dos fluoróforos diferentes, FAM para el alelo mutante y VIC para alelo de tipo silvestre. Los niveles de ARNm de PITT se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN.
Análisis de CI50 y Selectividad
La concentración media máxima inhibidora (CI50) de cada oligonucleótido se presenta a continuación y se calculó representando gráficamente las concentraciones de oligonucleótidos utilizados frente al porcentaje de inhibición de la expresión de HTT ARNm lograda en cada concentración, y tomando nota de la concentración de oligonucleótido a la que 50% de inhibición de la expresión HTT ARNm fue lograda en comparación con el control. El CI50 en el que cada oligonucleótido inhibe la expresión HTT ARNm mutante se denomina como 'CI50 mut'. El CI50 en el que cada oligonucleótido inhibe la expresión de HTT ARNm de tipo silvestre se denomina 'peso CI50'. Selectividad tal como se expresa en "pliegue" se calculó dividiendo el CI50 para la inhibición de la HTT de tipo silvestre frente al CI50 para inhibir la expresión del HTT ARNm mutante y los resultados se presentan a continuación.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
ISIS NO.
05/460209 TeAkAkAdTdTdGdTdMCdAdTdra€ dAkraCkmCe
05/558255 T eAfeAtAdxT dTdGdT dmCdAdTdmCdAkmCkmCe
05/558256 TeAkAkA dTdxTdGdTdmCílAdTdmCdAk“Cic“Ce
Cada enlace internucleósido es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico, teniendo un subíndice "x", que indica un enlace internucleosídico de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado de 2’-O-metoxietilo (MOE). Cada nucleósido seguido de un subíndice "k" indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4’-CH((S)-CH3)-O-2’ también conocido como un nucleósido modificado (S)-cEt. Cada "mC" es un nucleósido modificado por citosina de 5-metilo. Nucleósidos seguidos por subíndices "e" o "k" se ilustran más adelante.
SEQ ID NO. CI50 Selectividad de pliegue Química de hueco
/ISIS NO. (HM) (mut vs. peso)
05/460209 0,30 3,3 Control positivo (3/9/3) 05/558255 0,19 6,8 Individual -P(CHa)(=O)-(3/9/3) 05/558256 0,20 6,5 Individual -P(CHa)(=O)-(3/9/3)
Ejemplo 24
Los oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces internucleosídicos de fosfonato de metilo o de fosfonoacetato que se destinan a H T T SNP - estudio in vitro
Una serie de oligonucleótidos modificados fueron diseñados sobre la base de ISIS 460209 en el que la región de hueco contiene nueve D2'-deoxiribonudeósidos. Los oligonucleótidos modificados se sintetizaron para incluir una o más modificaciones de enlace internucleosídico de fosfonato de metilo o fosfonoacetato dentro de la región de hueco. Los oligonucleótidos con fósforo modificados que contienen columna vertebral se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir selectivamente la expresión de niveles de HTT ARNm mutante (mut) que se destinan rs7685686, dejando intacta la expresión de tipo silvestre (peso). La potencia y selectividad de los oligonucleótidos modificados se evaluaron y se compararon con ISIS 460209.
La posición en los oligonucleótidos opuesta a la posición SNP, contada a partir del extremo 5' es la posición 8.
Los oligonucleótidos modificados se ensayaron in vitro. La línea celular de fibroblastos heterocigotas GM04022 se utilizó (de Coriell Institute). Las células GM04022 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con 0,12, 0,37, 1,1, 3,3 y 10 pM concentraciones de oligonucleótidos modificados. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, las células se lavaron con tampón DPBS y se lisaron. El ARN se extrajo usando purificación Qiagen RNeasy y los niveles de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el ensayo ABI C_2229297_10 que se mide en dbSNP rs362303. El método de RT-pCr en corto; Se preparó una mezcla usando tampón 2X PCR 2020 pL, cebadores 101 pL (300 pM de ABI), 1000 uL de agua y 40,4 pL de RT MIX. A cada pocillo se añadieron 15 pL de esta mezcla y 5 pL de ARN purificado. Los niveles HTT ARNm mutantes y de tipo silvestre se midieron simultáneamente mediante el uso de dos fluoróforos diferentes, FAM para el alelo mutante y VIC para el alelo de tipo silvestre. Los niveles de HTT ARNm se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN.
Los CI 50 y selectividades como se expresan en "pliegue" se midieron y se calcularon utilizando métodos descritos previamente en el Ejemplo 23. Los resultados se presentan a continuación.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
/ISIS NO.
05/460209 TeA»(A|(AdTdTdGdT(jmCtjAdTtjrnCdAkmC|(mCe 05/566276 TeAl(AkAdTdTdGdxTdn'CdAdTdmCdAkmCkmCe 05/566277 TeAkAkAdTdTdGdTdxnx:dAdTd"’CdAk'"C k^ C e 05/566278 TeAkA)(AdTdTdGdTdmcdxAdTd"’C A mCkmCe 05/566279 TeA((AkAdTdTdGdTdmCdAd)(Tdn'C dA)lmCkmCe 05/566280 TeAkAkAdTdTdGdTdmcdAdTdx"’C A mCkmCe 05/566283 T A ^ ^ T dxTdxGdTdrrCdAdTdmCdAkmCkmCe 05/573815 T A ^ A dTdyTdGdTdmCdAdTdmCdAkmCkmCe 05/573816 T A A kAdTdTdyGdTdn'CdAdTdmC A mCkmCe 05/573817 T A A kAdTdTdGdTdyn 'C A T dmC A mCkmCe 05/573818 T A AkAdTdTdGdTd^ C A T dymC A mCkmCe
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico que tiene un subíndice "x" o "y". Cada nucleósido seguido por un subíndice "x" indica un enlace intemucleosídico de metilo de fosfonato (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "y" indica un enlace intemucleosídico de fosfonoacetato (-P(CH2CO2)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado por 2’-O-metoxietilo (MOE). Cada nucleósido seguido por un subíndice 'k' indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4’-CH ((S)-CH3)-O-2’ también denominado nucleósido modificado (S)-cEt. Cada "mC" es un nucleósido modificado citosina 5-metilo. Nucleósidos seguidos por subíndices "e" o "k" se ilustran más adelante.
Figure imgf000063_0001
SEQ ID NO. CI50 (|JM) Selectividad de pliegue Química de hueco
/ ISIS NO. (mut vs. peso)
05/460209 0,15 9,4 Control positivo (3/9/3) 05/566276 0,76 12,8 Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 05/566277 0,20 17 Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 05/566278 0,25 8,9 Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 05/566279 0,38 -- Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3 05/566280 0,27 47 Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3 05/566283 0,8 >100 Dos -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 05/573815 0,16 18,8 Individual -P(CH2CO2)(=O)-(3/9/3) 05/573816 0,55 18,1 Individual -P(CH2CO2)(=O)(3/9/3) 05/573817 0,17 22,5 Individual -P(CH2CO2)(=O)(3/9/3) 05/573818 0,24 13,5 Individual -P(CH2CO2)(=O)(3/9/3)
Ejemplo 25
Los oligonucleótidos modificados que comprenden enlace internucleosídicos de fosfonato de metilo que se destinan a H T T SNP - estudio in vitro
Una serie de oligonucleótido modificado fue diseñada con base en ISIS 460209 o ISIS 476333, en la que la región de hueco contiene nueve l3-D-2’-deoxiribonucleósidos. Los oligonucleótidos modificados fueron diseñados mediante la introducción de enlace internucleosídico de metilo de fosfonato dentro de la región de hueco en una posición fija y el uso de diferentes motivos de ala para motivos de gápmero 3/9/3 y 4/9/4. Los oligonucleótidos modificados se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir selectivamente niveles de expresión de HTT ARNm mutante (mut) de orientación a rs7685686, dejando la expresión de tipo silvestre (peso) intacta. La potencia y selectividad de los oligonucleótidos modificados se evaluaron y se compararon con ISIS 460209 o ISIS 476333.
La posición en los oligonucleótidos opuesta a la posición SNP, contada desde el terminal 5' es la posición 8 para ISIS 460209 o la posición 9 para ISIS 476333.
Los oligonucleótidos modificados se ensayaron in vitro. La línea celular de fibroblastos heterocigotas 0M04022 fue utilizada (de Coriell Institute). Células GM04022 cultivadas a una densidad de 25.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con 0,1, 0,4, 1,1, 3,3 y 10 concentraciones de 10|j M de oligonucleótidos modificados. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, las células se lavaron con tampón DPBS y se lisaron. El ARN se extrajo usando purificación Qiagen RNeasy y los niveles de ARNm se midieron por PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el ensayo ABI C_2229297_10 que se mide a dbSNP rs362303. El método de RT-PCR en corto; Se preparó una mezcla usando el tampón 2X PCR de 2020 j L, cebadores de 101 j L (300 j M de ABI), 1000 j L de agua y 40,4 j L de RT MIX. A cada pocillo se le añadió 15 j L de esta mezcla y 5 uL de ARN purificado. Los niveles de HTT ARNm mutantes y de tipo silvestre se midieron simultáneamente mediante el uso de dos fluoróforos diferentes, FAM para el alelo mutante y VIC para el alelo de tipo silvestre. Los niveles de HTT ARNm se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, tal como se mide por RIBOGREEN.
Las CI 50 y selectividades como se expresan en "pliegue" se midieron y se calcularon utilizando métodos descritos previamente en el Ejemplo 23. Los resultados se presentan a continuación.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
/ISIS NO.
05/460209 T e A k A k A d T d T d G d T /C d A d T d ^ d A ^ C rC e 05/558257 TeAkA kAdTdTdxGdTdmCdA dTdmCdAkmCkmCe 05/571123 TeAeA eA kTkTdxGdTdmCdAdTdmCdAkmCkmCe 05/579854 TeA eA cA kTdTdXGdTdmCdAdTdmCdA kmCkmCe 05/566282 Te A k AkAdxTdxTdGdT dmCd A dTdmCdA fcn,CkmCe 09/476333 AeTfcAeA kA dTdTdGdTdmC(1A dTdn,CdÁ kinCemCkA e 09/571171 A cTkA eA kA dTdTd!CGdTdmCdA dTdmCdA k,nC “ CkAe
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico que tiene un subíndice "x", que indica un enlace internucleosídico de metilo de fosfonato (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un D2'-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado de 2'-O-metoxietilo (MOE). Cada nucleósido seguido por un subíndice "k" indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4 '-CH((S)-CH3)-O-2 ' también se conoce como un nucleósido modificado de (S)-cEt Cada "mC" es un nucleósido modificado de citosina 5-metilo. Nucleósidos seguidos por subíndices "e" o "k" o se ilustran más adelante.
Figure imgf000064_0001
SEQ ID CI50 Mut CI5 0 Peso (hM) Selectividad de Química de hueco NO. (HM) pliegue
/ ISIS NO. (mut vs. peso)
05/460209 0,56 3,8 6,8 Control positivo (3/9/3) 05/558257 1,7 > 10 > 5,9 Individual -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 05/571123 0,96 > 10 > 10,4 Individual -P(CH3)(=O)-(5/7/3) 05/579854 0,63 > 10 > 15,9 Individual -P(CH3)(=O)-(4/8/3) 05/566282 0,51 6,3 12,4 Dos -P(CH3)(=O)-(3/9/3) 09/476333 0,56 3,4 6,1 Control positivo (4/9/4) 09/571171 0,54 > 10 > 18,5 Individual -P(CH3)(=O)-(4/9/4)
Ejemplo 26
Oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces internucleosídicos de fosfonato de metilo que se destinan a PTEN y SRB-1 - estudio in vivo
Oligonucleótidos modificados adicionales se diseñaron basándose en ISIS 482050 y 449093 en los que la región de hueco contiene diez l3-D-2’-deoxiribonucleósidos. Los oligonucleótidos modificados fueron diseñados mediante la introducción de dos enlaces de internucleósido de fosfonato de metilo en el extremo 5’ de la región de hueco con un motivo de 3/10/3. Se evaluaron los oligonucleótidos para la reducción en niveles de expresión in vivo de ARNm PTEN y- SRB-1. Los gápmeros parentales, ISIS 482050 y 449093 fueron incluidos en el estudio para la comparación.
Tratamiento
Ratones de BALB/C de seis semanas de edad (comprados de Charles River) fueron inyectados por vía subcutánea dos veces a la semana durante tres semanas a la dosis de 10 mg/kg o 20 mg/kg con los oligonucleótidos modificados mostrados a continuación o con control de solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última administración, y los órganos y el plasma se recogieron para su análisis posterior.
Análisis de ARNm
Los tejidos hepáticos se homogeneizaron y los niveles de ARNm se cuantificaron utilizando PCR en tiempo real y se normalizaron a RIBOGREEN como se describe en el presente documento. Los resultados se enumeran a continuación como expresión del ARNm de PTEN o SRB-1 para cada grupo de tratamiento en relación al control tratado con salina (% UTC). Como se ilustra, la reducción en niveles de expresión de ARNm de PTEN o SRB-1 se consiguió con los oligonucleótidos que comprenden dos enlaces de internucleósido de fosfonato de metilo en el extremo 5' de la región de hueco, ISIS 582073 y 582074.
Marcadores de química de plasma
Los marcadores de química de plasma, tales como los niveles de transaminasas hepáticas, aminotranferasa de alanina (ALT) en suero se midieron con respecto a los ratones inyectados con solución salina y los resultados se presentan a continuación. El tratamiento con los oligonucleótidos dio como resultado una reducción en el nivel de ALT en comparación con el tratamiento con el gápmero parental, ISIS 482050 o 449093. Los resultados sugieren que la introducción de enlace internucleosídico de fosfonato de metilo pueden ser útiles para la reducción de perfil de hepatotoxicidad de gápmeros de origen no modificado.
Pesos de cuerpo y órganos
Los pesos corporales, así como el peso de hígado, riñones y bazo se midieron al final del estudio. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los pesos corporales y de órganos para cada grupo de tratamiento en relación al control tratado con salina. Tal como se ilustra, el tratamiento con ISIS 582073 resultó en una reducción en el peso del hígado y el bazo en comparación con el tratamiento con el gápmero parental, ISIS 482050. El oligonucleótido restante, ISIS 582074 no causó ningún cambio en los pesos corporales y de órganos fuera del rango esperado, en comparación con ISIS 449093.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
/ISIS NO.
11/482050 AkTkmCfcAdTdGdGdmCdT{,Ge,mCdAdGdmCkTkTk 11/582073 AkTkmCkAdxTdxG£lGdn,CdTdGdraCdAdGdmCkTkTk 12/449093 TkTkmCkAdGdTdmCdAdTdGdAdmCdTdTkmCkmCk 12/582074 TkTkmCkAdxGdxTdmCdAdTdGdAdn,CdTdTkmCkmCk
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico que tiene un subíndice "x". Cada nucleósido seguido por un subíndice "x" indica un enlace internucleosídico de fosfonato de metilo (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido de un subíndice "k" indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4’-CH((S)-CH3)-O-2’ también se conoce como un nucleósido modificado (S)-cEt. Cada "mC" es un nucleósido modificado de citosina 5-metilo. Nucleósidos seguidos de subíndice "k" se ilustran adicionalmente a continuación.
Figure imgf000065_0001
SEQ ID NO. Diana Dosificación % UTC ALT Química /ISIS NO. (Mg/kg/semana) (calma)
SalinA -- 0 100 30 --11/482050 PTEN 10 50 228 Completa (P=S) 11/482050 20 36,1 505
11/582073 10 72,2 47,7 Dos P (CHaX=O)-11/582073 20 57,4 46
12/449093 SRB-1 10 48 543 Completa (P=S) 12/449093 20 18,5 1090
12/582074 10 51,3 58,3 Dos -P(CHaX=O)-12/582074 20 30,3 126,3
SEQ ID NO. Diana Dosis Peso corporal Peso Peso Peso /ISIS NO. (Mg/kg/ antes de hígado/cuerpo bazo/cuerpo riñon/cu sem) dosis (%) (%) (%) erpo (%) Salina -- - 0 108,4 100 100 100 11/482050 PTEN 10 107,4 154,9 141,8 115,7 5 11/482050 20 111,3 176,7 142,3 112.5 11/582073 10 108,9 122,9 111,7 100,0 11/582073 20 107,9 133,8 114,6 102,9
12/449093 SRB-1 10 101,3 105,9 117,9 89,3
12/449093 20 95,3 118,6 129,6 93,0
12/582074 10 107,1 92,2 116,4 89,2
12/582074 20 103,8 95,5 128,8 91,9
Ejemplo 27
Los oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces de internudeósido de fosfonato de metilo que se destinan a Diana-Y - estudio in vivo
Oligonucleótidos modificados adicionales fueron diseñados de la misma manera que los oligonucleótidos antisentido descritos en el Ejemplo 25, en el que dos enlaces de internudeósido de fosfonato de metilo se introducen en el extremo 5' de la región de hueco. Los oligonucleótidos modificados se diseñaron sobre la base de ISIS 464917, 465178, 465984 y 466456 con un motivo de 3/10/3. Los oligonucleótidos se evaluaron para la reducción en Diana-Y de ARNm de los niveles de expresión in vivo. Los gápmeros parentales, ISIS 464917, 465178, 465984 y 466456 se incluyeron en el estudio para la comparación.
Tratamiento
Ratones Balb/c de seis semanas de edad (comprados de Charles River) por vía subcutánea dos veces a la semana durante tres semanas a la dosis 10 mg/kg o 20 mg/kg con los oligonucleótidos modificados se muestran a continuación o con control de solución salina. Cada grupo de tratamiento consistió en 3 animales. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última administración, y los órganos y el plasma se recogieron para su posterior análisis.
Análisis de ARNm
Los tejidos hepáticos se homogeneizaron y los niveles de ARNm se cuantificaron utilizando PCR en tiempo real y se normalizaron a RIBOGREEN como se describe en el presente documento. Los resultados siguientes se enumeran como expresión de ARNm de Diana-Y para cada grupo de tratamiento en relación al control tratado con salina (% UTC). Tal como se ilustra, la reducción en los niveles de expresión de ARNm de Diana-Y se consiguió con los oligonucleótidos que comprenden dos enlaces de internucleósido de fosfonato de metilo en el extremo 5' de la región de hueco, ISIS 582.071, 582.072, 582.069 y 582.070.
Marcadores de química del plasma
Los marcadores de química del plasma, tales como los niveles de transaminasas hepáticas, aminotranferasas de alanina (ALT) en suero se midieron con respecto a los ratones tratados con solución salina y los resultados se presentan a continuación. El tratamiento con los oligonucleótidos dio como resultado una reducción en el nivel de ALT en comparación con el tratamiento con el gápmero parental, ISIS 464917, 465178, 465984 o 466456. Los resultados sugieren que la introducción de enlace internucleosídicos de fosfonato de metilo puede ser útil para reducir el perfil de hepatotoxicidad de gápmeros parentales no modificados de otro modo.
Pesos de cuerpo y de órganos
Los pesos corporales, así como pesos de hígado, riñón y bazo se midieron al final del estudio. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los pesos corporales y de órganos para cada grupo de tratamiento en relación al control tratado con salina. Como se ilustra, el tratamiento con ISIS 582070 resulta en una reducción en el peso del hígado y el bazo en comparación con el tratamiento con el gápmero parental, ISIS 466456. Se observó un aumento en los pesos corporales y de órganos para ISIS 582071, en comparación con ISIS 464917. Los restantes oligonucleótidos, ISIS 582072 y 582069 no causó ningún cambio en los pesos corporales y de órganos fuera del rango esperado, en comparación con ISIS 465178 y 465984.
SEQ ID NO. Composición (5' a 3')
/ISIS NO.
13/464917 NkNkNkNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNkNkNk
13/582071 NkNkNkN^N^NdNdNdNdNdNdNdNdNkNkNk
14/465178 NkNkNkNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNkNkNk
14/582072 NkNkNkNdxNdxNdNdNdNdNdNdNdNdNkNkNk
15/465984 NkNkNkNdNdNdNdNdNdNdNdNdNdNeNeNe
15/582069 NkNkNkN^N^NdNdNdNdNdNdNdNdNkNkNk
16/466456 NkNdNkNdNkNdNdNdNdNdNdNdNdNdNeNe
16/582070 NkNdNkNdxNdxNdNdNdNdNdNdNdNdNdNeNe
Cada enlace internucleosídico es un fosforotioato (P=S) a excepción del enlace internucleosídico que tiene un subíndice "x". Cada nucleósido seguido por un subíndice "x" indica un enlace internucleosídico de metilo de fosfonato (-P(CH3)(=O)-). Cada nucleósido seguido por un subíndice "d" es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido. Cada nucleósido seguido por un subíndice "e" indica un nucleósido modificado 2'-O-metoxietilo (MOE). Cada nucleósido seguido por un subíndice "k' indica un nucleósido bicíclico que tiene un puente 4’-CH ((S)-CH3)-O-2’ también denominado nucleósido modificado (S)-cEt. Cada 'n' es una nucleobase modificada o de origen natural (A, T, C, G, U, o 5-metilo C). Nucleósidos seguidos por subíndices "e" o "k" se ilustran más adelante.
Figure imgf000067_0001

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto oligomérico con huecos que comprende una secuencia contigua de subunidades monoméricas con enlaces que tienen una región de hueco situada entre una región 5' y una región 3'en la que las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 2 a 8 nucleósidos modificados de tipo ARN de furanosilo contiguos que adoptan una geometría 3'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y la región de hueco tiene de 6 a 14 subunidades monoméricas contiguas seleccionadas de l3-D-2'-deoxiribonucleósidos y nucleósidos modificados que son ADN que adoptan una geometría 2'-endo conformacional cuando se ponen en un compuesto oligomérico y en donde al menos uno de los grupos de enlace internucleosídico en la región de hueco o enlace de la región de hueco y la región 5' o la región 3' tiene la fórmula I:
Figure imgf000131_0001
donde independientemente para cada grupo de enlace internucleosídico que tiene la Fórmula I:
X es O o S;
Q es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2-C6 sustituido, -C(=O)0h o CH2C(=O)oH; cada grupo sustituido comprende uno o más grupos sustituyentes opcionalmente protegidos seleccionados independientemente de halógeno, OJ1, SJ1 y OC(=O)J1 ; y
cada J1 es, independientemente, H o alquilo C1-C6;
dicho compuesto oligomérico de hueco que tiene sólo un grupo de enlace internucleosídico de fórmula I en la región de hueco, o que tiene sólo dos grupos de enlace internucleosídico de fórmula I en la región de hueco, o tienen sólo tres grupos de enlace internucleosídico de fórmula I en la región de hueco.
2. El compuesto oligomérico con huecos de la reivindicación 1, que comprende sólo un grupo de enlace internucleosídico de fórmula I en la región de hueco.
3. El compuesto oligomérico con huecos de la reivindicación 1, que comprende sólo dos grupos de enlace de internucleósido de fórmula I en la región de hueco.
4. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde cada grupo de enlaces internucleosídicos de las regiones 5' y 3' y cada grupo de enlace de internucleósidos en la región de hueco que no sean grupos internucleosídicos que tienen la Fórmula I es, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico de fosfodiéster o fosforotioato.
5. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos un grupo de enlace de internucleósidos es un grupo de enlace internucleosídico de fosforotioato.
6. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde cada subunidad de monómeros comprende una base heterocíclica seleccionada independientemente de uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilocitosina, 4-N-benzoílo-5-metilocitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina o 2-N-isobutirilguanina.
7. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que cada uno es, independientemente, seleccionado de cHa,C(=O)OH, CH2C(=O)OH, (CH2)2OCH3, CH=CH2, CH2CHCH2 y CCH.
8. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que cada Q es CH2C(=O)OH o cada Q es CH3.
9. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la que cada X es O.
10. El compuesto oligomérico de huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que cada nucleósido modificado en regiones 5' y 3' es, independientemente, un nucleósido bicíclico que comprende un resto de azúcar de furanosilo bicíclico o un nucleósido modificado que comprende un resto de azúcar de furanosilo que tiene al menos un grupo sustituyente;
en el que el compuesto oligomérico con huecos comprende uno o más nucleósidos modificados en 2' que tienen cada uno un grupo 2'-sustituyente seleccionado independientemente de halógeno, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O-(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2CH=CH2, -O(CH2)2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2OCF3, O(CH2)3-N(R3)(R4), O(CH2)2-ON(R3)(R4), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R3)(R4), OCH2C(=O)N(R4)(R4), OCH2C(=O)N(R5)-(CH2)2-N(R3)(R4) y O(CH2)2N(R5)-C(=NR6)[N(R3)(R4)] en la que R3, R4, R5 y R6 son cada uno, independientemente, H o alquilo C1-C6.
11. El compuesto oligomérico con huecos de la reivindicación 10 en donde cada grupo 2'-sustituyente es seleccionado independientemente entre F, OCH3, O(CH2)2-OCH3 y OCH2C(=O)N(H)CH3.
12. El compuesto oligomérico con huecos de la reivindicación 1 en el que uno o más de los nucleósidos modificados de tipo ARN comprenden un resto de azúcar de furanosilo bicíclico que tiene un grupo puente seleccionado independientemente de 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4’-CH(CH3)-O-2', 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 4'-C(CH3)2-O-2', 4'-CH2N(OCH)-2', 4'-CH2ON (CH3)-2', 4'-CH2NCH3-O-2', 4'-CH2C(H)-(CH3)-2' y 4'-CH2C(=CH2)-2'.
13. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que las regiones 5' y 3' incluyen sólo nucleósidos bicíclicos 4'-CH[(S)-(CH3)]-O-2' y nucleósidos sustituidos 2'-O-(CH2)2OCH3.
14. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde cada subunidad de monómero en la región de hueco es un l3-D-2’-deoxiribonucleósido.
15. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que las regiones 5' y 3' cada una, independientemente, tienen de 3 a 6 subunidades monoméricas y la región de hueco tiene de 6 a 10 subunidades monoméricas.
16. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende además al menos un grupo conjugado y/o al menos un grupo terminal 5’ o 3’.
17. El compuesto oligomérico con huecos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el compuesto es selectivo para una diana con respecto a un ácido nucleico no diana y las secuencias de nucleobases de la diana y los ácidos nucleicos no diana difieren en no más de 4 nucleobases diferenciadoras en la región diana.
18. Un método in vitro de inhibición de la expresión génica comprende la puesta en contacto de una o más células o un tejido con un compuesto oligomérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
19. Un compuesto oligomérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso en un método in vivo de inhibir la expresión génica de dicho método terapéutico que comprende la puesta en contacto de una o más células, un tejido o un animal con un compuesto oligomérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
20. El compuesto oligomérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso en terapia.
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